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Studies on the role of Ca²⁺ in the pancreatic acinar cell Ansah, Twum-Ampofo 1983

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STUDIES ON THE ROLE OF Ca*"1" IN THE PANCREATIC ACINAR CELL B y TWUM-AMPOFO ANSAH M . S c . T he U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1980 A T H E S I S SUBMITTED I N P A R T I A L F U L F I L M E N T OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PH I LOSOPHY i n THE FACULTY OF GRADUATE STUD IES ( F a c u l t y o f P h a r m a c e u t i c a l S c i e n c e s ) We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H COLUMBIA D e c e m b e r 1 9 8 3 ©Twum-Ampofo A n s a h , 1983 In presenting t h i s thesis i n p a r t i a l f u l f i l m e n t of the requirements for an advanced degree at the University of B r i t i s h Columbia, I agree that the Library s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of t h i s thesis for scholarly purposes may be granted by the head of my department or by h i s or her representatives. I t i s understood that copying or p u b l i c a t i o n of t h i s thesis for f i n a n c i a l gain s h a l l not be allowed without my written permission. Department of Pharmaceutical Sciences The University of B r i t i s h Columbia 2075 Wesbrook Place Vancouver, Canada V6T 1W5 D a t e - ! D e c e m b e r 8, 19 83 7<n - i i -ABSTRACT C a l c i u m i o n s p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e s t i m u l a t i o n o f e n z y m e s e c r e t i o n f r o m t h e e x o c r i n e p a n c r e a s . I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t a s e c r e t a g o g u e - i n d u c e d r i s e i n c y t o p l a s m i c f r e e c a l c i u m t r i g g e r s e n z y m e r e l e a s e f r o m p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . 2+ The m e c h a n i s m by w h i c h Ca c a n r e g u l a t e e n z y m e s e c r e t i o n w a s i n v e s t i g a t e d u s i n g I s o l a t e d i n t a c t p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s a n d p l a s m a m e m b r a n e - e n r i c h e d p r e p a r a t i o n s o b t a i n e d f r o m t h e s e c e l l s . T he v i a b i l i t y o f t h e c e l l s i s o l a t e d wa s g r e a t e r t h a n 95% a s e v a l u a t e d b y t h e e x c l u s i o n o f t r y p a n b l u e d y e . S e c r e t i n , p a n c r e o z y m i n a n d c a r b a c h o l p r o d u c e d a d o s e - d e p e n d e n t r e l e a s e o f a m y l a s e i n t h e a c i n a r c e l l s . T he r o l e o f t h e c a l c i u m b i n d i n g p r o t e i n , c a l m o d u l i n i n e n z y m e s e c r e t i o n was s t u d i e d i n d i r e c t l y b y d e t e r m i n i n g t h e e f f e c t s o f c a l m o d u l i n a n t a g o n i s t s on t h e s e c r e t o r y p r o c e s s . T r i f l u o p e r a z i n e i n h i b i t e d c a r b a c h o l - s t i m u l a t e d a m y l a s e r e l e a s e ( E D 5 0 o f 10 | jM) . C h l o r p r o m a z i n e a t a c o n c e n t r a t i o n o f 10 |jM i n h i b i t e d b o t h c a r b a c h o l - a n d p a n c r e o z y m i n - s t i m u l a t e d a m y l a s e r e l e a s e t o a s i g n i f i c a n t d e g r e e w i t h o u t a f f e c t i n g s e c r e t i n s t i m u l a t e d ( n o n - c a l c i u m m e d i a t e d ) r e l e a s e . P r o p r a n o l o l d i d n o t s how t h i s s e l e c t i v e i n h i b i t i o n . T h e s e s t u d i e s i n d i c a t e t h e p o s s i b i l i t y t h a t p h e n o t h i a z i n e s i n h i b i t c a l c i u m - m e d i a t e d a m y l a s e r e l e a s e f r o m p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s b y a c t i n g on a c a l m o d u l i n -r e g u l a t e d s t e p i n t h e s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g p r o c e s s . 24- 2-A h i g h ATP h y d r o l y t i c a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f e i t h e r Mg o r C a was l o c a l i z e d i n a c i n a r c e l l p r e p a r a t i o n s e n r i c h e d i n p l a s m a m e m b r a n e s . K i n e t i c a n a l y s i s r e v e a l e d t h a t t h e e n z y m e h a d a s i g n i f i c a n t l y h i g h e r a f f i n i t y ( p < 0 . 0 5 ) f o r C a 2 + ( K d o f 1 . 73 uM) t h a n M g 2 + (Krf o f 2 . 9 8 - i i i -pM) b u t a s i m i l a r m a x i m a l r a t e o f a c t i v i t y . F u r t h e r s t u d i e s w e r e c a r r i e d o u t i n o r d e r t o d e t e r m i n e i f t h i s A T P a s e a c t i v i t y r e p r e s e n t e d one o r m o r e e n z y m e s . A c o m p a r i s o n o f s u b s t r a t e r e q u i r e m e n t s r e v e a l e d v e r y s i m i l a r p r o f i l e s f o r t h e M g 2 + - a n d C a ^ - s t i m u l a t e d a c t i v i t i e s w i t h ATP a n d GTP b e i n g t h e m o s t e f f e c t i v e f o l l o w e d b y A D P . T h e pH c u r v e s f o r b o t h a c t i v i t i e s w e r e i d e n t i c a l . I n a d d i t i o n , c o m b i n a t i o n s o f s a t u r a t i n g 2+ 2+ c o n c e n t r a t i o n s o f Mg o r Ca p r o d u c e d t h e same d e g r e e o f m a x i m a l a c t i v i t y . T h e s e d a t a t e n d t o i n d i c a t e t h a t t h e A T P a s e a c t i v i t y may b e d u e t o one e n z y m e w i t h a c t i v a t i o n s i t e s f o r b o t h i o n s . A r r h e n i u s p l o t s t h o u g h , r e v e a l e d a d i f f e r e n c e i n t h e t r a n s i t i o n t e m p e r a t u r e s . I n a d d i t i o n , w h e n SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s w a s u s e d t o i d e n t i f y t h e p h o s p h o p r o t e i n i n t e r m e d i a t e s o f t h e A T P a s e , o n e p h o s p h o p r o t e i n i n t e r m e d i a t e ( a p p r o x M.W. o f 1 1 5 , 0 0 0 ) wa s o b s e r v e d i n t h e 2+ 2+ p r e s e n c e o f Ca a l o n e ( e n d o g e n o u s Mg " r = 1 . 5 - 2 uM) b u t u p o n t h e a d d i t i o n 2+ 2+ o f b o t h Ca a n d Mg , a s e c o n d p h o s p h o p r o t e i n i n t e r m e d i a t e wa s r e v e a l e d (M .W . 1 3 0 , 0 0 0 ) . B o t h o f t h e s e p h o s p h o p r o t e i n s w e r e h y d r o x y l a m i n e - s e n s i t i v e , i n d i c a t i n g t h a t t h e y w e r e a c y l p h o s p h a t e s . T h e p r e s e n c e o f t w o a c y l p h o s p h o p r o t e i n s w o u l d i n d i c a t e p o s s i b l e s e p a r a t e 2+ 24-i n t e r m e d i a t e r e a c t i o n s y s t e m s f o r t h e Mg a n d Ca s t i m u l a t e d A T P a s e a c t i v i t y . C a l m o d u l i n i s k n o w n t o r e g u l a t e a n u m b e r o f e n z y m e s y s t e m s i n c l u d i n g 2+ Ca - t r a n s p o r t A T P a s e s . T h e e f f e c t o f e x o g e n o u s c a l m o d u l i n on t h e 2+ C a - s t i m u l a t e d c o m p o n e n t o f t h i s A T P a s e a c t i v i t y was t h e r e f o r e 2+ i n v e s t i g a t e d . I n t h e p r e s e n c e o f e n d o g e n o u s Mg , s i g n i f i c a n t 2+ s t i m u l a t i o n b y c a l m o d u l i n o f C a - A T P a s e a c t i v i t y was o b s e r v e d . T h i s e f f e c t was d o s e - d e p e n d e n t w i t h a f o r c a l m o d u l i n o f a p p r o x i m a t e l y 2 0 . 7 pM. C a l m o d u l i n i n c r e a s e d t h e C a + - s e n s i t i v i t y o f t h i s e n z y m e - i v -2+ s y s t e m ; Mg a p p e a r e d t o be r e q u i r e d f o r t h i s e f f e c t . T h i s c a l m o d u l i n s t i m u l a t i o n was i n h i b i t e d by t r i f l u o p e r a z i n e ( E D 5 0 o f 30 \M), c h l o r p r o m a z i n e ( E D 5 0 o f 55 (jM) a n d c o m p o u n d 4 8 / 8 0 . U s i n g a n 125 I - l a b e l e d c a l m o d u l i n g e l o v e r l a y t e c h n i q u e , i t was s hown t h a t c a l m o d u l i n b i n d s i n a C a 2 + - d e p e n d e n t f a s h i o n t o 1 3 3 , 0 0 0 a n d 2 3 0 , 0 0 0 d a l t o n p r o t e i n s p r e s e n t i n t h e p l a s m a m e m b r a n e - e n r i c h e d f r a c t i o n . F u r t h e r s t u d i e s r e v e a l e d t h a t u n d e r c o n d i t i o n s t h a t f a v o u r 2+ C a - d e p e n d e n t k i n a s e a c t i v i t y , c a l m o d u l i n e n h a n c e d t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f a 3 0 , 0 0 0 a n d a 1 9 , 0 0 0 d a l t o n p r o t e i n . T h e C a 2 + - A T P a s e w a s a l s o s t i m u l a t e d by a c i d i c p h o s p h o l i p i d s . 2+ C a - f l u x m e a s u r e m e n t s i n p l a s m a membrane v e s i c l e s i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f t w o p r o c e s s e s : t h e r e w e r e s i g n i f i c a n t l y l o w e r l e v e l s o f 5 C a a s s o c i a t e d w i t h v e s i c l e s ' l o a d e d ' i n t h e p r e s e n c e o f ATP t h a n t h o s e ' l o a d e d ' i n t h e a b s e n c e o f ATP i n d i c a t i n g a n e n e r g y - d e p e n d e n t e f f l u x s y s t e m . A s w e l l , a v e r y r a p i d A T P - d e p e n d e n t Ca - u p t a k e s y s t e m , t h a t was M g ^ - d e p e n d e n t was o b s e r v e d i n s e a l e d v e s i c l e s . I n o r d e r t o r e l a t e t h e ( M g 2 + + C a 2 + ) - A T P a s e a c t i v i t y a n d t h e C a 2 + f l u x e s o b s e r v e d t o a p o s s i b l e f u n c t i o n a l r o l e i n t h e a c i n a r c e l l , t h e o r i e n t a t i o n o f t h e c a t a l y t i c s i t e o f t h e e n z y m e was d e t e r m i n e d . T h e d e g r e e o f A T P a s e a c t i v i t y o b s e r v e d when i n t a c t v i a b l e a c i n a r c e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h ATP a n d e i t h e r Mg o r C a was s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d i n b r o k e n m e m b r a n e s . T h i s p r o v i d e s e v i d e n c e t h a t t h i s A T P a s e a c t i v i t y may be e x t e r n a l l y - o r i e n t e d . T h e r o l e o f t h i s s y s t e m i n a c i n a r c e l l f u n c t i o n r e m a i n s t o be e l u c i d a t e d . S i g n a t u r e o f S u p e r v i s o r - v -TABLE OF CONTENTS P a g e ABSTRACT i i T A B L E OF CONTENTS v L I S T OF T A B L E S v i i i L I S T OF F I G U R E S i x L I S T OF A B B R E V I A T I O N S x i i I NTRODUCT ION 1 L I T E R A T U R E REVIEW 2 1 . S t r u c t u r e a n d F u n c t i o n o f t h e E x o c r i n e P a n c r e a s 2 A . S e c r e t o r y P r o d u c t s 2 B. T h e S e c r e t o r y P a t h w a y 3 C . S e c r e t a g o g u e s o f E n z y m e S e c r e t i o n 7 2 . T h e R o l e o f C a l c i u m a n d C y c l i c N u c l e o t i d e s i n E n z y m e S e c r e t i o n 13 A . C a l c i u m 14 B . C y c l i c GMP 19 C . C y c l i c AMP 21 D. P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l T u r n o v e r 23 24-3 . P l a s m a M e m b r a n e Ca - A T P a s e s 24 24-4 . R e g u l a t i o n o f P l a s m a M e m b r a n e Ca - A T P a s e s 3 0 A . R o l e o f C a l m o d u l i n 30 B . R o l e o f A c i d i c P h o s p h o l i p i d s , L o n g - C h a i n F a t t y A c i d s a n d C o n t r o l l e d P r o t e o l y s i s 34 C . R e g u l a t i o n o f t h e A c t i o n o f C a l m o d u l i n a n d O t h e r A c t i v a t o r s o f C a 2 + - A T P a s e A c t i v i t i e s 36 5 . O b j e c t i v e s o f t h e P r e s e n t S t u d y 4 0 M A T E R I A L S AND METHODS 42 I . M A T E R I A L S 42 I I . METHODS 4 5 - v i -P a g e 1 . P r e p a r a t i o n o f D i s p e r s e d R a t P a n c r e a t i c A c i n a r C e l l s . . 4 5 2 . D e t e r m i n a t i o n o f t h e I n s u l i n C o n t e n t o f E n z y m a t l c a l l y D i s p e r s e d P a n c r e a t i c C e l l s 46 3 . C y t o c h e m i c a l S t a i n i n g o f P a n c r e a t i c A c i n a r C e l l s 47 4 . M e a s u r e m e n t o f A m y l a s e R e l e a s e f r o m A c i n a r C e l l s 47 5 . P r e p a r a t i o n o f P a n c r e a t i c A c i n a r P l a s m a M e m b r a n e s . . . . . 4 8 6 . T r e a t m e n t o f M e m b r a n e s w i t h EDTA 49 7 . M e a s u r e m e n t o f D i v a l e n t C a t i o n s i n M e m b r a n e P r e p a r a t i o n s 49 8 . D e t e r m i n a t i o n o f C a l m o d u l i n C o n t e n t o f P l a s m a M e m b r a n e P r e p a r a t i o n s 49 9 . E n z y m e A s s a y s 50 a . M e a s u r e m e n t o f Ca - A T P a s e A c t i v i t y 50 b . M e a s u r e m e n t o f ( N a + + K + ) A T P a s e A c t i v i t y 50 c . M e a s u r e m e n t o f 5 ' - n u c l e o t i d a s e A c t i v i t y 50 d . M e a s u r e m e n t o f C y t o c h r o m e C O x i d a s e A c t i v i t y 51 e . M e a s u r e m e n t o f L a c t a t e D e h y d r o g e n a s e A c t i v i t y 52 1 0 . P r e p a r a t i o n o f P h o s p h o l i p i d D i s p e r s i o n 52 2+ 1 1 . M e a s u r e m e n t o f Ca - t r a n s p o r t A c t i v i t i e s . . . . . 53 a . M e a s u r e m e n t o f C a l c i u m E f f l u x f r o m P l a s m a M e m b r a n e V e s i c l e P r e p a r a t i o n s 53 b . M e a s u r e m e n t o f C a 2 + - T J p t a k e b y P l a s m a M e m b r a n e V e s i c l e P r e p a r a t i o n s 53 1 2 . C a l m o d u l i n G e l O v e r l a y T e c h n i q u e 54 1 3 . M e a s u r e m e n t o f A c y l - P h o s p h o p r o t e i n F o r m a t i o n 55 1 4 . P h o s p h o r y l a t i o n o f E n d o g e n o u s A c i n a r M e m b r a n e P r o t e i n s 56 1 5 . P o l y a c r y l a m i d e G e l E l e c t r o p h o r e s i s a n d A u t o r a d i o g r a p h y o f P h o s p h o r y l a t e d P l a s m a M e m b r a n e P r e p a r a t i o n s 56 a . G r a d i e n t G e l E l e c t r o p h o r e s i s 56 b . A c i d - P o l y a c r y l a m i d e G e l E l e c t r o p h o r e s i s 57 c . S t a i n i n g , D e s t a i n i n g a n d A u t o r a d i o g r a p h y . . . . 58 - v i i -P a g e 1 6 . M i s c e l l a n e o u s M e t h o d s 5 9 a . P r o t e i n a s s a y 5 9 b . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s 59 c . D e t e r m i n a t i o n o f F r e e C a l c i u m C o n c e n t r a t i o n s . . 59 R E S U L T S 60 2+ 1 . D e t e r m i n a t i o n o f C a - A T P a s e A c t i v i t y i n P a n c r e a t i c P l a s m a M e m b r a n e s 60 2+ 2 . D e t e r m i n a t i o n o f a P o s s i b l e R e l a t i o n s h i p o f Ca -A T P a s e A c t i v i t y t o A m y l a s e S e c r e t i o n 65 a . C h a r a c t e r i z a t i o n o f A m y l a s e S e c r e t i o n i n P a n c r e a t i c A c i n a r C e l l s 65 b . D e t e r m i n a t i o n o f t h e E f f e c t s o f A n t i c a l m o d u l i n A g e n t s o n A m y l a s e S e c r e t i o n 71 2+ 3 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f C a - A T P a s e a c t i v i t y i n p a n c r e a t i c A c i n a r P l a s m a M e m b r a n e s 79 4 . R e g u l a t i o n o f P a n c r e a t i c A c i n a r P l a s m a M e m b r a n e C a + - A T P a s e b y C a l m o d u l i n 91 5 . R e g u l a t i o n o f P a n c r e a t i c A c i n a r P l a s m a M e m b r a n e C a - A T P a s e b y P h o s p h o l i p i d s 117 2+ 6 . D e t e r m i n a t i o n o f t h e P r e s e n c e o f a Ca - T r a n s p o r t P r o c e s s i n A c i n a r P l a s m a M e m b r a n e V e s i c l e P r e p a r a t i o n s 125 7 . D e t e r m i n a t i o n o f t h e O r i e n t a t i o n o f t h e C a t a l y t i c S i t e o f t h e C a 2 + - A T P a s e A c t i v i t y i n t h e P l a s m a M e m b r a n e s o f A c i n a r C e l l s 135 D I S C U S S I O N 143 CONCLUS IONS 157 B I B L I O G R A P H Y 158 - v i i i -LIST OF TABLES T a b l e P a g e I I n s u l i n c o n t e n t o f e n z y m a t i c a l l y d i s p e r s e d p a n c r e a t i c c e l l h o m o g e n a t e s a n d i s o l a t e d a c i n a r c e l l s 66 I I S p e c i f i c a c t i v i t y o f C a 2 + - A T P a s e a n d m a r k e r e n z y m e s i n c e l l h o m o g e n a t e s a n d s u b c e l l u l a r f r a c t i o n s 80 I I I K , . a n d V o f t h e A T P a s e a c t i v i t y o f d i s s max p a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a membrane p r e p a r a t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f C a 2 + o r M g 2 + 84 I V A T P a s e a c t i v i t y o f p a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a membrane p r e p a r a t i o n s i n t h e p r e s e n c e o f d i v a l e n t c a t i o n s 85 V E f f e c t o f m o n o v a l e n t c a t i o n s a n d d r u g s o n t h e A T P a s e a c t i v i t y o f p a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a memb r ane p r e p a r a t i o n s 86 V I E f f e c t o f EGTA a n d EDTA o n c a l m o d u l i n s t i m u l a t e d C a + - A T P a s e a c t i v i t y 1 08 V I I M g 2 + - A T P a s e a c t i v i t y o f EDTA t r e a t e d p l a s m a memb r ane p r e p a r a t i o n s o f p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s 112 V I I I A T P a s e a n d l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t i e s o f i n t a c t p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s a n d h o m o g e n a t e s 140 I X The o r i e n t a t i o n o f C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a memb r ane v e s i c l e p r e p a r a t i o n s 142 - i x -LIST OP FIGURES F i g u r e P a g e 1 R e a c t i o n s e q u e n c e o f ( C a + Mg " r ) - A T P a s e p r o p o s e d b y M u a l l e m a n d K a r l i s h ( 1 9 8 0 , 1 9 8 1 ) 27 2 C a 2 + o r M g 2 + a c t i v a t i o n o f A T P a s e a c t i v i t y i n p a n c r e a t i c p l a s m a memb r ane p r e p a r a t i o n s . . . . 61 3 E f f e c t o f ATP o n A T P a s e a c t i v i t y i n p a n c r e a t i c p l a s m a memb rane p r e p a r a t i o n s 63 4 L i g h t m i c r o g r a p h o f i s o l a t e d p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s 67 5 T i m e c o u r s e o f a m y l a s e s e c r e t i o n b y d i s s o c i a t e d r a t p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . 6 9 6 C o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c e o f a m y l a s e s e c r e t i o n b y d i s s o c i a t e d r a t p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . . . . 72 7 E f f e c t o f t r i f l u o p e r a z i n e o n a m y l a s e s e c r e t i o n b y d i s s o c i a t e d r a t p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . . . . 75 8 a E f f e c t o f c h l o r p r o m a z i n e o n a m y l a s e s e c r e t i o n b y d i s s o c i a t e d p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s 77 8 b E f f e c t o f p r o p r a n o l o l o n a m y l a s e s e c r e t i o n b y d i s s o c i a t e d p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s 77 9 T h e e f f e c t o f M g 2 + a n d C a 2 + o n A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a - m e m b r a n e e n r i c h e d f r a c t i o n s o f p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s 8 2 2+ 10 S u b s t r a t e r e q u i r e m e n t o f Ca - A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a m e m b r a n e p r e p a r a t i o n s o f a c i n a r c e l l s 87 2+ 11 S u b s t r a t e r e q u i r e m e n t o f Mg ^ - A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a memb r ane p r e p a r a t i o n s o f a c i n a r c e l l s 89 12 E f f e c t o f a d e n y l 3 1 , 5 ' - a d e n o s i n e ( A p 5 A ) o n C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a memb rane p r e p a r a t i o n s o f a c i n a r c e l l s 92 13 E f f e c t o f pH on ATP h y d r o l y t i c a c t i v i t y I n p l a s m a m e m b r a n e s o f a c i n a r c e l l s 94 - x -F i g u r e P a g e 14 A r r h e n i u s p l o t s o f A T P a s e a c t i v i t y a s a f u n c t i o n o f t e m p e r a t u r e 96 15 C o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n c e o f c a l m o d u l i n s t i m u l a t i o n o f Ca + - A T P a s e a c t i v i t y 99 16 E f f e c t o f p h e n o t h i a z i n e s o n c a l m o d u l i n s t i m u l a t i o n o f C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a m e m b r a n e s o f a c i n a r c e l l s 101 17 E f f e c t o f Compound 4 8 / 8 0 o n c a l m o d u l i n s t i m u l a t i o n o f Ca + - A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a m e m b r a n e s o f a c i n a r c e l l s 1 03 2+ 18 The e f f e c t o f e x o g e n o u s c a l m o d u l i n on Ca -A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a memb r ane e n r i c h e d p r e p a r a t i o n s o f p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s 106 19 ( C a 2 + + M g 2 + ) - A T P a s e a c t i v i t y i n EDTA t r e a t e d p l a s m a m e m b r a n e s o f a c i n a r c e l l s . . . . . 109 20 T h e e f f e c t o f c a l m o d u l i n a n d M g 2 + o n t h e c a l c i u m a c t i v a t i o n c u r v e o f EDTA t r e a t e d p l a s m a m e m b r a n e s o f a c i n a r c e l l s 113 21 C a l m o d u l i n g e l o v e r l a y a n d a u t o r a d i o g r a p h y o f t a r g e t p r o t e i n s i n p l a s m a m e m b r a n e s o f a c i n a r c e l l s 115 22 A s o l e c t i n s t i m u l a t i o n o f C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a membrane e n r i c h e d f r a c t i o n s o f a c i n a r c e l l s 118 2+ 2 3 T h e e f f e c t o f e x o g e n o u s p h o s p h o l i p i d s o n Ca -A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a memb rane e n r i c h e d f r a c t i o n s o f a c i n a r c e l l s 120 24 SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d a u t o r a d i o g r a p h y o f a c y l p h o s p h a t e i n t e r m e d i a t e s o f p a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a m e m b r a n e s 123 25 SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d a u t o r a d i o g r a p h y o f p h o s p h o r y l a t e d p a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a m e m b r a n e s . . . . 126 - x i -F i g u r e P a g e k5 26 Ca f l u x e s i n p r e l o a d e d p l a s m a m e m b r a n e v e s i c l e s p r e p a r e d f r o m p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s 129 27 C a c o n t e n t o f p r e l o a d e d p l a s m a m e m b r a n e v e s i c l e s p r e p a r e d f r o m p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s 131 2+ 28 T i m e d e p e n d e n t C a - u p t a k e i n p a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a memb r ane v e s i c l e s 133 2+ 29 A T P - d e p e n d e n t Ca - u p t a k e a s a f u n c t i o n o f C a - c o n c e n t r a t i o n i n p a n c r e a t i c a c i n a r memb r ane v e s i c l e s 136 30 A T P a s e a c t i v i t y o f i n t a c t p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s a n d h o m o g e n a t e s 138 - x i i -LIST OF ABBREVIATIONS ADP ATP Ap5A GTP P i c y c l i c AMP c y c l i c GMP E E P A T P a s e ( C a 2 + + M g 2 + ) - A T P a s e EDTA EGTA SEM T r i s TCA SDS PAGE T F P CPZ NADH a d e n o s i n e 5 ' - d i p h o s p h a t e a d e n o s i n e 5 ' - t r i p h o s p h a t e a d e n y l 3 ' , 5 ' - a d e n o s i n e g u a n o s i n e t r i p h o s p h a t e i n o r g a n i c p h o s p h a t e c y c l i c a d e n o s i n e 5 ' - m o n o p h o s p h a t e c y c l i c g u a n o s i n e 5 ' - m o n o p h o s p h a t e e n z y m e p h o s p h o r y l a t e d e n z y m e i n t e r m e d i a t e a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e 2+ Mg d e p e n d e n t c a l c i u m s t i m u l a t e d A T P a s e e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e , d i s o d i u m s a l t e t h y l e n e g l y c o l - b i s - ( p - a m i n o e t h y l e t h e r ) N , N ' - t e t r a a c e t i c a c i d s t a n d a r d e r r o r o f t h e mean t r i s ( H y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e t r i c h l o r o a c e t i c a c i d s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s t r i f l u o p e r a z i n e c h l o r p r o m a z i n e n i c o t i n a m i d e a d e n i n e d i n u c l e o t i d e ( r e d u c e d ) K C a 2 + d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f t h e e n z yme f o r Ca 2+ - x i i i -g G r a v i t a t i o n a l C o n s t a n t K , . d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t d i s s Vmax max imum v e l o c i t y m m i l l i u m i c r o M m o l a r M m o l e c u l a r w e i g h t r mg m i l l i g r a m s e c s e c o n d m i n m i n u t e m l m i l l i l i t e r u l m i c r o l i t e r mM m i l l i m o l a r c o n c e n t r a t i o n uM m i c r o m o l a r c o n c e n t r a t i o n n m o l e s n a n o m o l e s v / v u n i t o f v o l u m e p e r u n i t o f v o l u m e w / v u n i t o f w e i g h t p e r u n i t o f v o l u m e - x i v -ACKNOWLEDGEMENTS I w i s h t o e x p r e s s my p r o f o u n d g r a t i t u d e t o D r . S . K a t z f o r h i s a d v i c e , e n c o u r a g e m e n t a n d h e l p t h r o u g h o u t t h e c o u r s e o f t h i s s t u d y . I w o u l d l i k e t o e x t e n d my s p e c i a l t h a n k s t o membe r s o f my a d v i s o r y c o m m i t t e e , D r . D . A . A p p l e g a r t h , D r . J . D i a m o n d , D r . C . M c i n t o s h , D r . J . M c N e i l l a n d D r . B . D . R o u f o g a l i s f o r t h e i r c o n s t r u c t i v e c r i t i c i s m a n d s u g g e s t i o n s . I am g r a t e f u l t o D r . M . B r i d g e s , D r . D. J e f f e r y , D r . A . M o l l a a n d D r . W. O v a l l e f o r t h e i r h e l p f u l c o n t r i b u t i o n s d u r i n g t h i s s t u d y . I w i s h t o g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e t h e C a n a d i a n C y s t i c F i b r o s i s F o u n d a t i o n f o r f i n a n c i a l a s s i s t a n c e . I a l s o w i s h t o t h a n k a l l m e m b e r s o f t h e F a c u l t y , S t a f f a n d g r a d u a t e s t u d e n t s i n t h e f a c u l t y o f P h a r m a c e u t i c a l S c i e n c e s f o r m a k i n g my p r o g r a m a t UBC a n e n j o y a b l e e x p e r i e n c e . F i n a l l y I w i s h t o e x p r e s s my s i n c e r e g r a t i t u d e t o a l l my f r i e n d s a n d L a b o r a t o r y c o l l e a g u e s , M r s . L o a n H o a n g , B r u c e A l l e n , B a r r y E i b s c h u t z a n d R a j e s h M a h e y f o r t h e i r p a t i e n c e a n d a s s i s t a n c e . - 1 -INTRODUCTION C y s t i c f i b r o s i s ( C F ) i s a n i n h e r i t e d m e t a b o l i c d i s e a s e w h i c h i s c h a r a c t e r i z e d b y a u n i v e r s a l d y s f u n c t i o n i n t h e e x o c r i n e g l a n d s o f a f f e c t e d i n d i v i d u a l s . T he b a s i c m o l e c u l a r d e f e c t a n d t h e p a t h o g e n e t i c m e c h a n i s m s o f t h e d i s e a s e i s s t i l l u n k n o w n . I t h a s l o n g b e e n r e c o g n i z e d t h a t m u c u s s e c r e t i o n s f r o m CF p a t i e n t s h a v e a b n o r m a l p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s . T h e y p r e c i p i t a t e a n d o b s t r u c t o r g a n p a s s a g e s , g i v i n g r i s e t o c h r o n i c p u l m o n a r y d i s e a s e , p a n c r e a t i c i n s u f f i c i e n c y , h e p a t i c c i r r h o s i s , i n t e s t i n a l o b s t r u c t i o n a n d o t h e r c o m p l i c a t i o n s ( d i S a n t ' A g n e s e a n d D a v i s 1 9 7 6 ) . L a r g e d e c r e a s e s i n t h e amoun t o f p a n c r e a t i c j u i c e p r o d u c e d a s w e l l a s e l e v a t i o n s i n t h e p r o t e i n a n d c a l c i u m c o n t e n t o f t h e j u i c e h a v e b e e n r e p o r t e d ( H a d o r n et^ a l 1 9 6 8 ; J o h a n s e n e t a l 1 9 6 8 ) . T he a b n o r m a l i t i e s o f e x o c r i n e s e c r e t i o n s c o u l d e i t h e r be r e l a t e d t o t h e s y n t h e s i s a n d s e c r e t i o n o f m a c r o m o l e c u l e s o r t h e r e s u l t o f t h e i r c o m p o s i t i o n a l m o d i f i c a t i o n s i n t h e d u c t s y s t e m s . R e c e n t l y , M a n g o s a n d D o n n e l l y ( 1 9 8 1 ) h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t i s o l a t e d p a r o t i d a c i n a r c e l l s f r o m p a t i e n t s w i t h CF a r e l a r g e r t h a n c e l l s f r o m c o n t r o l s a n d h a v e h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f a m y l a s e , c a l c i u m a n d s o d i u m a n d l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f p o t a s s i u m w h i c h i s s u g g e s t i v e o f a d e f e c t i n t h e a c i n a r c e l l p h y s i o l o g y o f t h e s e p a t i e n t s . H o w e v e r , t h e c e l l u l a r c o n t r o l m e c h a n i s m s r e s p o n s i b l e f o r e l e c t r o l y t e , w a t e r a n d m a c r o m o l e c u l a r s e c r e t i o n i n e x o c r i n e t i s s u e a r e n o t f u l l y u n d e r s t o o d . A l t h o u g h t h e p a n c r e a s i s one o f t h e g l a n d s m o s t p r o f o u n d l y a f f e c t e d b y t h e d i s e a s e , v e r y l i t t l e i n f o r m a t i o n i s p r e s e n t l y a v a i l a b l e r e g a r d i n g t h e m o l e c u l a r e v e n t s i n v o l v e d i n t h e s e c r e t i o n o f p r o t e i n s . - 2 -LITERATURE REVIEW 1. Structure and Function of the Exocrine Pancreas T h e p a n c r e a s c o m p r i s e s e x o c r i n e a n d e n d o c r i n e t i s s u e . T h e e x o c r i n e t i s s u e , i n a d d i t i o n t o s e c r e t i n g d i g e s t i v e h y d r o l a s e s , a l s o s e c r e t e s a f l u i d c o n t a i n i n g e l e c t r o l y t e s . T o g e t h e r t h e s e f o r m p a n c r e a t i c j u i c e w h i c h e n t e r s t h e d u o d e n u m v i a t h e p a n c r e a t i c d u c t ( C a s e 1 9 7 8 ) . T h e e n d o c r i n e t i s s u e , w h i c h a c c o u n t s f o r o n l y 4% o f t h e g l a n d i n t h e r a t ( K e m p e n et^ al^ 1 9 7 7 ) s e c r e t e s i n s u l i n , g l u c a g o n , s o m a t o s t a t i n a n d w h a t i s now b e i n g r e f e r r e d t o a s p a n c r e a t i c p o l y p e p t i d e ( K i m m e l et_ a l 1 9 7 5 ) . T h e f u n c t i o n a l u n i t o f t h e e x o c r i n e p a n c r e a s c o n s i s t s o f p y r a m i d a l - s h a p e d a c i n a r c e l l s g r o u p e d a r o u n d a n a r r o w l u m e n t o f o r m a n a c i n u s . The t e r m i n a l c e l l s o f t h e a c i n a r l u m e n a r e c a l l e d c e n t r o - a c i n a r c e l l s . T h e m a j o r f u n c t i o n o f t h e p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s w h i c h c o m p r i s e 77% o f t h e p a n c r e a t i c c e l l m a s s i n t h e r a t ( K e m p e n et^ a l 1 9 7 7 ) i s t o s y n t h e s i z e a n d s e c r e t e a v a r i e t y o f d i g e s t i v e e n z y m e s w h i l e t h e c e n t r o - a c i n a r c e l l s s e c r e t e a b i c a r b o n a t e - r i c h f l u i d i m p o r t a n t i n n e u t r a l i z i n g g a s t r i c a c i d i n t h e i n t e s t i n e . A. Secretory Products U s i n g t w o - d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s , w h i c h s e p a r a t e s p r o t e i n s i n t h e f i r s t d i m e n s i o n a c c o r d i n g t o t h e i r i s o e l e c t r i c p o i n t a n d i n t h e s e c o n d d i m e n s i o n a c c o r d i n g t o t h e i r m o l e c u l a r w e i g h t , S c h e e l e ( 1 9 7 5 ) s h o w e d t h a t t h e a c i n a r c e l l o f t h e e x o c r i n e p a n c r e a s s e c r e t e s a m i x t u r e o f a p p r o x i m a t e l y 20 e n z y m e s a n d z y m o g e n s . T h e s e i n c l u d e p r o t e a s e s - 3 -( t r y p s i n o g e n a n d c h y m o t r y p s i n o g e n ) , a m y l a s e , l i p a s e a n d r i b o n u c l e a s e s . C h y m o t r y p s i n o g e n , p r o e l a s t a s e , p r o c a r b o x y p e p t i d a s e A , a n d l i p a s e a p p e a r e d i n m u l t i p l e f o r m s . B. The Secretory Pathway P a n c r e a t i c e n z y m e s , l i k e a l l p r o t e i n s , a r e s y n t h e s i z e d o n p o l y s o m e s ( a g g r e g a t i o n s o f r i b o s o m e s ) j o i n e d t o t h e r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( R E R ) . F r o m t h e i r s i t e o f s y n t h e s i s , t h e y move i n t o t h e s o - c a l l e d t r a n s i t i o n a l e l e m e n t s . Wha t a p p e a r s t o o c c u r n e x t i s t h a t t h e t r a n s i t i o n a l e l e m e n t s bud o f f t h e RER a s s m a l l t r a n s p o r t i n g v e s i c l e s t h a t c a r r y t h e i r l o a d o f s e c r e t o r y p r o t e i n s t o t h e G o l g i c o m p l e x . T h e s e c r e t o r y p r o t e i n s u n d e r g o e x t e n s i v e m o d i f i c a t i o n s d u r i n g t h e i r r e s i d e n c e i n t h e G o l g i c o m p l e x . F o l l o w i n g f u s i o n o f t h e t r a n s p o r t i n g v e s i c l e s w i t h t h e G o l g i s t a c k s , s a c c u l e s n e a r e s t t h e c o n c a v e s i d e g r a d u a l l y f i l l w i t h s e c r e t o r y m a t e r i a l , b e c ome r o u n d e d u p , a n d e v e n t u a l l y bud o f f a s a n i m m a t u r e s t o r a g e g r a n u l e . G r a d u a l l y , t h e c o n c e n t r a t i o n o f p r o t e i n s i n t h e " c o n d e n s i n g v a c u o l e " i n c r e a s e s . T h e e v e n t u a l r e s u l t i s t h e z y m o g e n g r a n u l e p a c k e d w i t h e x p o r t a b l e p r o t e i n s . U n d e r a p p r o p r i a t e e x t e r n a l s t i m u l i , t h e s e g r a n u l e s f u s e w i t h t h e a p i c a l p l a s m a l e m m a , e j e c t i n g t h e i r c o n t e n t s i n t o t h e i r a c i n a r l u m e n b y t h e p r o c e s s o f e x o c y t o s i s ( C a s e 1 9 7 8 ) . E x p e r i m e n t a l e v i d e n c e o n t h e r o u t e a n d t i m e c o u r s e o f i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t o f s e c r e t o r y p r o t e i n s was o b t a i n e d m a i n l y f r o m t h e c l a s s i c e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a n d a u t o r a d i o g r a p h i c s t u d i e s o f J a m i e s o n a n d P a l a d e ( 1 9 6 7 a a n d b; 1 9 7 1 a a n d b ; 1 9 7 7 ) . U s i n g g u i n e a p i g p a n c r e a t i c s l i c e s - 4 -a n d a n I n v i t r o ' p u l s e - c h a s e ' t e c h n i q u e , t h e y d e t e r m i n e d t h a t p r o t e i n s p u l s e - l a b e l e d w i t h [ H ] - l e u c i n e f i r s t a p p e a r e d i n t h e a r e a o f t h e c e l l o c c u p i e d b y t h e R E R . A f t e r 17 m i n o f ' c h a s e ' w i t h a c o m p l e t e m i x t u r e o f n o n - r a d i o a c t i v e a m i n o a c i d s , max imum l a b e l i n g was a s s o c i a t e d w i t h t h e G o l g i c o m p l e x . A f t e r 37 m i n o f ' c h a s e ' a u t o r a d i o g r a p h i c g r a i n s w e r e o b s e r v e d on t h e s i d e o f t h e G o l g i c o m p l e x f a c i n g t h e a p i c a l memb rane a n d many g r a i n s w e r e a s s o c i a t e d w i t h c o n d e n s i n g v a c u o l e s . A f t e r 57 m i n o f ' c h a s e ' , m o s t o f t h e g r a i n s w e r e o b s e r v e d i n t h e a p i c a l p o r t i o n o f t h e a c i n a r c e l l i n a s s o c i a t i o n w i t h m a t u r e z y m o g e n g r a n u l e s . The r o u t e a n d t i m e c o u r s e o f movemen t o f p u l s e - l a b e l e d p r o t e i n s w e r e f o u n d t o be t h e same i n u n s t i m u l a t e d p a n c r e a t i c s l i c e s o r i n s l i c e s t h a t h a d r e c e i v e d a p r i o r t h r e e - h o u r s t i m u l a t i o n w i t h c a r b a c h o l ( J a m i e s o n a n d P a l a d e 1 9 7 1 b ) . B l e g e r e t a l ( 1 9 7 6 ) h o w e v e r f o u n d t h a t c o n t i n u o u s s t i m u l a t i o n ( 6 - 2 4 h ) o f t h e in_ v i t r o r a t p a n c r e a s w i t h c a e r u l e i n a c c e l e r a t e d t o a c o n s i d e r a b l e e x t e n t t h e r a t e o f movemen t o f p u l s e - l a b e l e d p r o t e i n s a l o n g t h i s p a t h w a y . C e l l f r a c t i o n a t i o n t e c h n i q u e s , i n w h i c h t h e r o u g h m i c r o s o m e s , s m o o t h m i c r o s o m e s , z y m o g e n g r a n u l e s a n d p o s t - m i c r o s o m a l s u p e r n a t a n t s w e r e s e p a r a t e d b y d i f f e r e n t i a l r a t e s e d i m e n t a t i o n f o l l o w i n g t i s s u e h o m o g e n i z a t i o n , c o n f i r m e d t h e a u t o r a d i o g r a p h i c f i n d i n g s ( J a m i e s o n a n d P a l a d e 1 9 6 7 a ) . I t a l s o d e t e r m i n e d t h a t t h e k i n e t i c s o f movemen t o f p u l s e - l a b e l e d p r o t e i n s f r o m one m e m b r a n e - e n c l o s e d c o m p a r t m e n t t o a n o t h e r w a s n e i t h e r s h a r p n o r u n a m b i g u o u s . T h i s wa s a d d i t i o n a l l y c o m p l i c a t e d b y t h e a p p e a r a n c e o f s i g n i f i c a n t q u a n t i t i e s ( 5 - 2 0 % ) o f p u l s e - l a b e l e d p r o t e i n i n t h e p o s t m i c r o s o m a l s u p e r n a t a n t f r a c t i o n a t a l l t i m e p o i n t s s t u d i e d . T h e s e f i n d i n g s h a v e g i v e n r i s e t o a n o t h e r s c h o o l o f t h o u g h t - 5 -w h i c h s u g g e s t s t h a t u n d e r p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s s e c r e t o r y p r o t e i n s p a s s t h r o u g h t h e c y t o p l a s m i c s p a c e d u r i n g t h e i r i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t ( R o t h m a n 1 9 8 0 ) . R e c e n t f i n d i n g s o f S c h e e l e a n d c o - w o r k e r s ( 1 9 7 8 ) h a v e i n d i c a t e d t h a t t h e a m b i g u i t y s e e n i n e a r l y s t u d i e s was s e c o n d a r y t o l e a k a g e a n d a d s o r p t i o n a r t i f a c t s a s s o c i a t e d w i t h t i s s u e h o m o g e n i z a t i o n a n d c e l l f r a c t i o n a t i o n . T h e w i d e l y h e l d v i e w i s t h a t : a . a t a l l t i m e s , s e c r e t o r y p r o t e i n s a r e s e g r e g a t e d w i t h i n m e m b r a n e - b o u n d c o m p a r t m e n t s a n d t h e r e f o r e e x c l u d e d f r o m t h e c y t o s o l i c s p a c e ; b . t r a n s p o r t o f s e c r e t o r y p r o t e i n s i s v e c t o r i a l a n d i r r e v e r s i b l e p r o c e e d i n g f r o m t h e b a s i l a r p o r t i o n o f t h e c e l l t o t h e a p i c a l p o r t i o n t h r o u g h a s e r i e s o f i n t e r c o n n e c t a b l e m e m b r a n e - e n c l o s e d c o m p a r t m e n t s ; a n d c . t r a n s p o r t i s t i m e - d e p e n d e n t r e q u i r i n g , u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s , a p p r o x i m a t e l y 30 m i n t o p o s i t i o n s e c r e t o r y p r o t e i n s f o r d i s c h a r g e i n t o t h e e x t r a c e l l u l a r s p a c e ( J a m i e s o n a n d P a l a d e 1 9 7 1 b ; S c h e e l e a n d P a l a d e 1 9 7 5 ) . S t u d i e s h a v e b e e n c o n d u c t e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e e n z y m e s a n d z y m o g e n s o f t h e e x o c r i n e p a n c r e a s a r e s y n t h e s i z e d , s t o r e d a n d s e c r e t e d a s a g r o u p b y a s i n g l e s e c r e t o r y p a t h w a y ( p a r a l l e l d i s c h a r g e ) o r i n d i v i d u a l l y b y a m u l t i p l i c i t y o f s e c r e t o r y p a t h w a y s ( n o n p a r a l l e l d i s c h a r g e ) . T h e a v a i l a b l e e v i d e n c e s eems t o f a v o u r a s i n g l e s e c r e t o r y p a t h w a y : I m m u n o c y t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n s t u d i e s o f K r a e h e n b u h l e t a l ( 1 9 7 7 ) i n d i c a t e d t h a t e a c h o f f i v e m o n o s p e c i f i c a n t i b o d i e s d i r e c t e d t o w a r d i n d i v i d u a l b o v i n e p a n c r e a t i c p r o t e i n s ( t r y p s i n o g e n , - 6 -c h y m o t r y p s i n o g e n A , c a r b o x y p e p t i d a s e A , r i b o n u c l e a s e , a n d d e o x y r i b o n u c l e a s e ) r e a c t e d w i t h t h e c o n t e n t o f a l l z y m o g e n g r a n u l e s i n a l l b o v i n e p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . A l t h o u g h t h e s e f i n d i n g s do n o t p r o v i d e q u a n t i t a t i v e i n f o r m a t i o n , t h e y i n d i c a t e t h a t e a c h z y m o g e n g r a n u l e i n e a c h a c i n a r c e l l c o n t a i n s a m i x t u r e o f t h e f i v e s e c r e t o r y p r o t e i n s t e s t e d . S t u d y i n g g u i n e a p i g p a n c r e a t i c l o b u l e s , S c h e e l e a n d P a l a d e ( 1 9 7 5 ) u s e d o p t i m a l c o n c e n t r a t i o n s o f c a r b a c h o l o r c a e r u l e i n a n d f o l l o w e d t h e d i s c h a r g e o f t h r e e e n z y m e s , a m y l a s e , l i p a s e a n d r i b o n u c l e a s e a n d f o u r z y m o g e n s , t r y p s i n o g e n , c h y m o t r y p s i n o g e n a n d p r o c a r b o x y p e p t i d a s e s A a n d B i n t o t h e i n c u b a t i o n m e d i u m a t v a r y i n g t i m e i n t e r v a l s u p t o 2 h a f t e r s t i m u l a t i o n . T h e y ( S c h e e l e a n d P a l a d e 1 9 7 5 ) f o u n d t h a t e a c h o f t h e e n z y m e s a n d z y m o g e n s m e a s u r e d w e r e d i s c h a r g e d i n c o n s t a n t p r o p o r t i o n a t e a c h t i m e p o i n t . F u r t h e r m o r e , t h e p r o p o r t i o n s o f t h e s e e n z y m e s a n d z y m o g e n s f o u n d i n t h e t i s s u e a t t h e e n d o f t h e e x p e r i m e n t w e r e i d e n t i c a l t o t h o s e d i s c h a r g e d i n t o t h e m e d i u m . P a r a l l e l d i s c h a r g e o f e n z y m e s u p o n s t i m u l a t i o n h a v e b e e n c o n f i r m e d b y o t h e r w o r k e r s ( G l a z e r a n d S t e e r 1 9 7 7 ; R o t h m a n a n d W i l k i n g 1 9 7 8 ) . H o w e v e r , w h i l e S c h e e l e a n d P a l a d e ( 1 9 7 5 ) a n d S t e e r a n d c o - w o r k e r s ( S t e e r a n d G l a z e r 1 9 7 6 ; S t e e r a n d M a n a b e 1 9 7 9 ) i n t h e i r i n v i t r o s t u d i e s f o u n d t h a t t h e p r o p o r t i o n o f e n z y m e s a n d z y m o g e n s w e r e u n c h a n g e d when s t i m u l a t e d d i s c h a r g e was c o m p a r e d t o b a s a l d i s c h a r g e , i n v i v o s t u d i e s o n t h e r a t ( D a g o r n 1 9 7 8 ) , p i g ( B e a u d o i n 1 9 8 3 ) a n d human s u b j e c t s ( R i n d e r k n e c h t e t a l 1 9 7 8 ) i n d i c a t e d t h a t t h e p r o p o r t i o n was c h a n g e d . T h o u g h t h e s e n o n p a r a l l e l p a t t e r n s o f s e c r e t i o n c o u l d be v i e w e d a s s u p p o r t i n g t h e e x i s t e n c e o f a n a l t e r n a t i v e s e c r e t o r y p a t h w a y w h i c h i n v o l v e s t h e - 7 -m o v e m e n t o f s e c r e t o r y p r o t e i n s t h r o u g h t h e c y t o p l a s m i c s p a c e ( R o t h m a n 1 9 8 0 ) i t i s a l s o p o s s i b l e t h a t one p o p u l a t i o n o f a c i n a r c e l l s m i g h t b e r e s p o n s i b l e p r i m a r i l y f o r b a s a l d i s c h a r g e a n d a n o t h e r f o r s t i m u l a t e d d i s c h a r g e ( S c h e e l e 1 9 8 0 ) . C. Secretagogues of Enzyme Secretion T h e p h y s i o l o g i c a l s t i m u l a n t s o f e n z y m e s e c r e t i o n f r o m p a n c r e a t i c a c i n i a r e t h e n e u r o t r a n s m i t t e r a c e t y l c h o l i n e ( A C h ) a n d t h e o l i g o p e p t i d e c h o l e c y s t o k i n i n - p a n c r e o z y m i n ( C C K ) . W i t h r e c e n t p r o g r e s s i n t h e d e v e l o p m e n t o f i n v i t r o p r e p a r a t i o n s s u c h a s s l i c e s o f p a n c r e a s , i n t a c t a c i n i a n d d i s p e r s e d a c i n a r c e l l s , many d i f f e r e n t a g e n t s h a v e b e e n f o u n d t o be c a p a b l e o f i n c r e a s i n g p a n c r e a t i c e n z y m e s e c r e t i o n . The g e n e r a l l y , r e c o g n i z e d g r o u p s a r e : a. Muscarinic Cholinergic Agents A c e t y l c h o l i n e a n d o t h e r m u s c a r i n i c c h o l i n e r g i c a g e n t s c a u s e m o b i l i z a t i o n o f c e l l u l a r c a l c i u m a s w e l l a s s t i m u l a t i o n o f e n z y m e s e c r e t i o n i n p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s ( G a r d n e r 1 9 7 9 ) . T h e s e a c t i o n s a r e b l o c k e d b y a t r o p i n e ( G a r d n e r 1 9 7 9 ) . U s i n g t r i t i a t e d q u i n u c l i d i n y l b e n z i l a t e ( [ 3 H ] Q N B ) , L a r o s e e t a l ( 1 9 7 9 ) a n d Ng e t a l ( 1 9 7 9 ) h a v e d e m o n s t r a t e d t h e p r e s e n c e o f m u s c a r i n i c c h o l i n e r g i c r e c e p t o r s i n p a n c r e a t i c b r o k e n c e l l p r e p a r a t i o n s . H o w e v e r , t h e c o r r e s p o n d i n g a g o n i s t - i n d u c e d en z yme s e c r e t i o n c o u l d n o t be m e a s u r e d i n t h e s e p r e p a r a t i o n s ( L a r o s e e t a l 1 9 7 9 ; Ng ^ t a l 1 9 7 9 ) . R e c e n t l y , b i n d i n g q s t u d i e s w i t h [ H ]QNB p e r f o r m e d o n r a t p a n c r e a t i c d i s p e r s e d a c i n i w i t h - 8 -c o n c o m i t a n t s e c r e t o r y s t u d i e s h a v e e s t a b l i s h e d t h a t t h e m u s c a r i n i c r e c e p t o r i s c o u p l e d t o e n z y m e s e c r e t i o n ( L a r o s e e t a l 1 9 8 1 ) . T h e r e c e p t o r p o p u l a t i o n c o n s i s t e d o f h i g h a n d l o w a f f i n i t y s i t e s w i t h a o f 65 pM a n d a p p r o x i m a t e l y 2 6 0 0 b i n d i n g s i t e s ( L a r o s e e t al^ 1 9 8 1 ) . b. Cholecystoklnln-Gastrin-Caerulein Peptides C h o l e c y s t o k i n i n - p a n c r e o z y m i n i s a p e p t i d e t h a t was o r i g i n a l l y i s o l a t e d a n d p u r i f i e d f r o m h o g u p p e r s m a l l i n t e s t i n e a n d f o u n d t o c o n t a i n 33 a m i n o a c i d r e s i d u e s ( M u t t a n d J o r p e s 1 9 6 8 ) . T h e two o t h e r n a t u r a l l y o c c u r r i n g p e p t i d e s t h a t a r e s t r u c t u r a l l y s i m i l a r t o CCK a r e g a s t r i n a n d c a e r u l e i n . L i k e CCK a n d A C h ( C h r i s t o p h e £ t a l 1 9 7 6 ) t h e y s t i m u l a t e e n z yme s e c r e t i o n , i n c r e a s e c e l l u l a r g u a n o s i n e 3 ' , 5 ' - c y c l i c m o n o p h o s p h a t e ( c y c l i c GMP) a n d c a u s e t h e r e l e a s e o f c e l l u l a r c a l c i u m f r o m p a n c r e a t i c f r a g m e n t s a n d d i s p e r s e d a c i n a r c e l l s ( D e s c h o d t - L a n c k m a n ejt a l 1 9 7 6 ; May e t a l 1 9 7 8 ) . G a s t r i n o c c u r s n a t u r a l l y i n s e v e r a l d i f f e r e n t c h e m i c a l f or ras a n d i s s i m i l a r t o CCK i n i t s c a r b o x y l ( C ) - t e r m i n a l a m i n o a c i d s e q u e n c e ( G r e g o r y a n d T r a c y 1 9 6 4 ) . C a e r u l e i n i s a d e c a p e p t i d e o r i g i n a l l y i s o l a t e d f r o m t h e s k i n o f t h e A u s t r a l i a n h y l i d f r o g H y l a c a e r u l e a ( A n a s t a s i 1 9 6 8 ) a n d s u b s e q u e n t l y f o u n d t o s h a r e s e v e n o f i t s e i g h t C - t e r m i n a l a m i n o a c i d s w i t h t h e C - t e r m i n a l o c t a p e p t i d e o f C C K . T h e i n t r i n s i c b i o l o g i c a c t i v i t y o f CCK r e s i d e s i n t h e C - t e r m i n a l p o r t i o n o f t h e m o l e c u l e . T h e s m a l l e s t a c t i v e f r a g m e n t i s t h e C - t e r m i n a l t e t r a p e p t i d e ( C C K 4 ) . A l l t h e a c t i v e p e p t i d e s h a v e t h e same e f f i c a c y b u t v a r y i n g p o t e n c i e s ( J e n s e n a n d G a r d n e r 1 9 8 1 ) . T h e m o s t p o t e n t a r e CCK8 a n d c a e r u l e i n ( 1 0 t i m e s m o r e p o t e n t t h a n - 9 -n a t i v e C C K ) . S t u d i e s w i t h 1 2 5 I - l a b e l e d CCK33 h a v e r e v e a l e d h i g h - a f f i n i t y b i n d i n g s i t e s o n p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s ( J e n s e n et^ a l 1 9 8 0 ; S a n k a r a n e t a l 1 9 8 0 ) . F r o m t h e s t u d i e s o f J e n s e n e t a l ( 1 9 8 0 ) , i t a p p e a r s t h a t t h e r e may be a p p r o x i m a t e l y 9 000 b i n d i n g s i t e s p e r a c i n a r c e l l w i t h a K^ o f a b o u t 2nM f o r CCK33 a n d 0 . 3 nM f o r c a e r u l e i n . B u t y r y l d e r i v a t i v e s o f c y c l i c GMP s e l e c t i v e l y a n d c o m p e t i t i v e l y i n h i b i t v a r i o u s p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s t o s t i m u l a t i o n w i t h CCK p e p t i d e s ( P e i k i n e t a l 1 9 7 9 ; P h i l p o t t a n d P e t e r s e n 1 9 7 9 ) . T h e s e c y c l i c GMP d e r i v a t i v e s 125 a l s o s e l e c t i v e l y a n d c o m p e t i t i v e l y b l o c k t h e b i n d i n g o f I - l a b e l e d CCK33 t o t h e a c i n a r c e l l s ( J e n s e n e t a l 1 9 8 0 ) . R e c e n t l y , i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n d i b u t y r y l c y c l i c GMP a n d C C K , r a t h e r t h a n r e c e p t o r b l o c k a d e , may be t h e m e c h a n i s m f o r i n h i b i t i o n o f CCK a c t i v i t y ( M i l l e r e t a l^ 1 9 8 3 ) . H o w e v e r , t h e l a c k o f c e r t a i n c o n t r o l e x p e r i m e n t s make t h i s i n t e r p r e t a t i o n i n c o n c l u s i v e . T h e r e f o r e t h e c u r r e n t v i e w r e m a i n s t h a t d i b u t y r y l c y c l i c GMP a c t s a s a n a n t a g o n i s t o f CCK b y i n t e r a c t i n g w i t h t h e r e c e p t o r ( G a r d n e r 1 9 8 3 ) . I t h a s b e e n s h o w n t h a t p r o g l u m i d e a n d b e n z o t r i p t , c o m p o u n d s t h a t a r e s t r u c t u r a l l y v e r y d i f f e r e n t f r o m c y c l i c n u c l e o t i d e s , s p e c i f i c a l l y a n d c o m p e t i t i v e l y a n t a g o n i z e t h e b i n d i n g a s w e l l a s t h e a c t i o n s o f t h e CCK p e p t i d e s ( H a h n e e t a l 1 9 8 1 ) . c. Bombesln-llke Peptides A n o t h e r g r o u p o f n a t u r a l l y o c c u r r i n g p e p t i d e s t h a t c a n s t i m u l a t e p a n c r e a t i c e n z y m e s e c r e t i o n b y c a u s i n g r e l e a s e o f c e l l u l a r c a l c i u m c o m p r i s e s b o m b e s i n , a l y t e s i n , r a n a t e n s i n a n d l i t o r i n . T h e s e p e p t i d e s , l i k e c a e r u l e i n , w e r e o r i g i n a l l y i s o l a t e d f r o m t h e s k i n s o f v a r i o u s f r o g s - 10 -a n d w e r e named a f t e r t h e p a r t i c u l a r c l a s s o f f r o g f r o m w h i c h t h e y w e r e i s o l a t e d ( E r s p a m e r et_ a l 1 9 7 2 ; E r s p a m e r a n d M e l c h i o r r i 1 9 7 3 ; E r s p a m e r a n d M e l c h i o r r i 1 9 7 5 ) . A s i n t h e c a s e w i t h C C K , t h e i n t r i n s i c b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f b o m b e s i n a n d s t r u c t u r a l l y r e l a t e d p e p t i d e s i s a p r o p e r t y o f t h e C - t e r m i n a l p o r t i o n o f t h e m o l e c u l e ; t h e C - t e r m i n a l n o n a p e p t i d e o f b o m b e s i n h a s t h e same p o t e n c y a n d e f f i c a c y a s t h e n a t i v e t e t r a d e c a - p e p t i d e ( D e s c h o d t - L a n c k m a n e t a l 1 9 7 6 ; E r s p a m e r a n d M e l c h i o r r i 1 9 7 3 ; E r s p a m e r a n d M e l c h i o r r i 1 9 7 5 ; J e n s e n et_ a l^ 1 9 7 8 ; R i v i e r a n d B r o w n 1 9 7 8 ) . S i n c e b o m b e s i n i s a b l e t o r e l e a s e g a s t r i n a n d CCK f r o m t h e g u t ( K o n t u r e k et^ a l^ 1 9 7 6 ) i t was o r i g i n a l l y t h o u g h t t h a t b o m b e s i n o n l y a c t i v a t e d p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s i n d i r e c t l y v i a C C K - g a s t r i n p e p t i d e s . D e s c h o d t - L a n c k m a n et^ a l^ ( 1 9 7 6 ) d e m o n s t r a t e d t h a t b o m b e s i n e v o k e d s e c r e t i o n a n d c a l c i u m - f l u x c h a n g e s i n i s o l a t e d f r a g m e n t s o f r a t p a n c r e a s a n d s u g g e s t e d t h a t b o m b e s i n a c t e d d i r e c t l y o n t h e a c i n a r c e l l s . O t h e r w o r k e r s ( J e n s e n et_ a l 1 9 7 8 ; I w a t s u k i a n d P e t e r s e n 1 9 7 8 ; P h i l p o t t a n d P e t e r s e n 1 9 7 9 ; P e t e r s e n a n d P h i l p o t t 1 9 7 9 ) h a v e p r e s e n t e d c l e a r a n d d i r e c t e v i d e n c e s h o w i n g c o e x i s t e n c e o f s e p a r a t e CCK a n d b o m b e s i n a c t i v a t i o n s i t e s on t h e same a c i n a r u n i t s . B i n d i n g s t u d i e s w i t h a r a d i o l a b e l e d a n a l o g u e o f b o m b e s i n [ 1 2 5 I ] T y r ^ - b o m b e s i n h a v e r e v e a l e d h i g h a f f i n i t y b i n d i n g s i t e s i n g u i n e a p i g p a n c r e a t i c a c i n i . T h e r e a r e a b o u t 5 0 0 0 b o m b e s i n r e c e p t o r s p e r a c i n a r c e l l w i t h a d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r b o m b e s i n o f 4 nM ( J e n s e n et_ a l^ 1 9 7 8 ) . W h i l e d i r e c t b o m b e s i n a c t i o n s o n a c i n a r c e l l s h a v e b e e n o b s e r v e d i n t h e m o u s e , r a t a n d g u i n e a p i g ( D e s c h o d t - L a n c k m a n et_ a l 1 9 7 6 ; I w a t s u k i a n d P e t e r s e n 1 9 7 8 ; P e t e r s e n a n d P h i l o p o t t 1 9 7 9 ; J e n s e n e t a l 1 9 7 8 ) i t a p p e a r s t h a t - 11 -d o g a c i n a r c e l l s d o n o t r e s p o n d t o b o m b e s i n ( B o m m e l a e r et^ a l 1 9 8 0 ) . d. Substance P-llke Peptides L i t t l e w o r k h a s b e e n d o n e on t h e p a n c r e a t i c a c i n a r a c t i o n s o f t h e s e p e p t i d e s . I n t h e g u i n e a p i g , h i g h a f f i n i t y b i n d i n g s i t e s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d u s i n g [ I ] p h y s a l a e m i n ( J e n s e n a n d G a r d n e r 1 9 8 1 ) . I t a p p e a r s t h a t t h e r e may be a b o u t 500 b i n d i n g s i t e s p e r c e l l w i t h a d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f a b o u t 2 riM f o r p h y s a l a e m i n a n d 5 nM f o r s u b s t a n c e P ( J e n s e n a n d G a r d n e r 1 9 8 1 ) . T h e s e p e p t i d e s a p p e a r t o a c t l i k e A C h , CCK a n d b o m b e s i n i n e v o k i n g c a l c i u m r e l e a s e a n d a n i n c r e a s e i n c y c l i c GMP, b u t t h e m a x i m a l e f f e c t s a r e much s m a l l e r t h a n t h o s e e v o k e d b y t h e o t h e r t y p e s o f s e c r e t a g o g u e s ( J e n s e n a n d G a r d n e r 1 9 8 1 ) . e. Secretin and Vasoactive Intestinal Polypeptide S e c r e t i n a n d V a s o a c t i v e I n t e s t i n a l P o l y p e p t i d e ( V I P ) h a v e a s i m i l a r s p e c t r u m o f b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s t h a t r e f l e c t s t h e s i m i l a r i t i e s i n t h e i r a m i n o a c i d s e q u e n c e s ( S c h u l z a n d S t o l z e 1 9 8 0 ) . I n c o n t r a s t t o t h e p e p t i d e s t h a t i n c r e a s e c a l c i u m r e l e a s e f r o m a c i n a r c e l l s a n d h a v e t h e i r i n t r i n s i c b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s i n t h e C - t e r m i n a l p o r t i o n o f t h e m o l e c u l e , t h e i n t r i n s i c b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f s e c r e t i n a n d V I P r e s i d e s i n t h e N - t e r m i n a l p o r t i o n o f t h e m o l e c u l e ( C h r i s t o p h e e t a l 1 9 7 6 ; R o b b e r e c h t e t a l 1 9 7 6 ) . B i n d i n g s t u d i e s ( C h r i s t o p h e e t a l 1 9 7 6 ; R o b b e r e c h t e t al_ 1 9 7 6 ; G a r d n e r e t a l 1 9 7 9 ) h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t a c i n a r c e l l s p o s s e s s two c l a s s e s o f r e c e p t o r s , e a c h o f w h i c h i n t e r a c t w i t h V I P a n d s e c r e t i n a n d e a c h c a u s i n g a n i n c r e a s e i n a d e n o s i n e 3 ' , 5 ' - c y c l i c - 12 -m o n o p h o s p h a t e ( c y c l i c A M P ) . T h e r e i s a h i g h a f f i n i t y V I P r e c e p t o r (K , j= 0 . 7 nM) w h i c h h a s a l o w a f f i n i t y f o r t h e h o r m o n e s e c r e t i n (K^ = 7 nM) a n d a h i g h a f f i n i t y s e c r e t i n r e c e p t o r (K^ = 0 . 3 nM) w i t h a r e l a t i v e l y l o w a f f i n i t y f o r V I P ( K d = 80 n M ) . T h e r e a r e a p p r o x i m a t e l y 9 0 0 0 h i g h a f f i n i t y V I P r e c e p t o r s p e r a c i n a r c e l l a n d a b o u t 1 3 5 , 0 0 0 h i g h a f f i n i t y s e c r e t i n r e c e p t o r s ( G a r d n e r e t a l 1 9 7 9 ) . A l t h o u g h i n t e r a c t i o n w i t h b o t h c l a s s e s o f r e c e p t o r s c a n c a u s e a n i n c r e a s e i n c y c l i c A M P , i t i s o n l y t h e i n c r e a s e i n c y c l i c AMP e v o k e d b y o c c u p a t i o n o f t h e V I P - p r e f e r r i n g r e c e p t o r s t h a t m e d i a t e s e n z y m e s e c r e t i o n . I t m u s t be n o t e d t h a t t h e r e i s a s p e c i e s s p e c i f i c i t y w i t h r e g a r d t o t h e a b i l i t y o f V I P t o s t i m u l a t e e n z y m e r e l e a s e . V I P e v o k e s e n z y m e s e c r e t i o n i n g u i n e a p i g a n d r a t , b u t n o t i n d o g , c a t o r mou se ( R o b b e r e c h t et_ a l 1 9 7 7 ) . The p o s s i b l e e x p l a n a t i o n i s t h a t a c i n a r c e l l s f r o m d o g , c a t a n d mouse p a n c r e a s may p o s s e s s s e c r e t i n - p r e f e r r i n g r e c e p t o r s t h a t m e d i a t e t h e i n c r e a s e i n c y c l i c AMP b u t may l a c k t h e V I P - p r e f e r r i n g r e c e p t o r s t h a t m e d i a t e t h e s t i m u l a t i o n o f e n z yme s e c r e t i o n . One f i n d i n g i n 12 5 s u p p o r t o f t h i s p o s s i b i l i t y i s t h a t s t u d i e s o f I - s e c r e t i n b i n d i n g t o p a r t i a l l y p u r i f i e d p l a s m a m e m b r a n e s f r o m c a t p a n c r e a s s howed a s i n g l e c l a s s o f b i n d i n g s i t e s t h a t h a d a h i g h a f f i n i t y f o r s e c r e t i n a n d a l o w a f f i n i t y f o r V I P ( M i l u t i n o v i c e t a l 1 9 7 6 ) . S e c r e t i n a n d V I P c o n t r o l t h e s e c r e t i o n o f b i c a r b o n a t e - r i c h f l u i d f r o m p a n c r e a t i c d u c t c e l l s b y i n c r e a s i n g c e l l u l a r c y c l i c AMP c o n c e n t r a t i o n ( C a s e e t a l 1 9 8 0 ) . H o w e v e r , t h e r e i s no i n f o r m a t i o n a v a i l a b l e w i t h r e g a r d t o t h e m e c h a n i s m b y w h i c h c y c l i c AMP t u r n s o n t h e i o n - f l u i d t r a n s p o r t m a c h i n e r y n o r t h e p r e c i s e i o n memb rane t r a n s p o r t m e c h a n i s m s ( S c r a t c h e r d e t a l 1 9 8 1 ) . - 13 -f . Cholera Toxin I n a c i n a r c e l l s f r o m g u i n e a p i g a n d r a t p a n c r e a s , c h o l e r a t o x i n i n c r e a s e s e n z yme s e c r e t i o n b y v i r t u e o f i t s a b i l i t y t o a c t i v a t e a d e n y l a t e c y c l a s e a n d i n c r e a s e c e l l u l a r c y c l i c AMP ( G a r d n e r a n d R o t t a m 1 9 7 9 ; S i n g h 1 9 8 2 ) . T h e "B s u b u n i t " o f c h o l e r a t o x i n , a l s o r e f e r r e d t o a s c h o l e r a g e n o i d c a n a l s o b i n d t o t h e c h o l e r a t o x i n r e c e p t o r a n d t h e r e b y f u n c t i o n a s a c o m p e t i t i v e a n t a g o n i s t . The p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l i s e s t i m a t e d t o h a v e a p p r o x i m a t e l y 2 1 , 0 0 0 r e c e p t o r s f o r c h o l e r a t o x i n w i t h a K d o f 1 nM ( G a r d n e r a n d R o t t a m 1 9 7 9 ) . g. Insulin T h e f i n d i n g o f h i g h - a n d a l o w - a f f i n i t y b i n d i n g s i t e s u s i n g 125 b i o l o g i c a l l y a c t i v e I - i n s u l i n s u g g e s t s t h a t i n s u l i n may d i r e c t l y r e g u l a t e s p e c i f i c f u n c t i o n s i n t h e e x o c r i n e p a n c r e a s ( K o r c et^ a l 1 9 7 8 ) . S t u d i e s e m p l o y i n g e i t h e r i n t a c t , p e r f u s e d o r p a n c r e a t i c f r a g m e n t s h a v e i n d i c a t e d t h a t i n s u l i n may r e g u l a t e g l u c o s e o x i d a t i o n ( D a n i e l s s o n a n d S e h l i n 1 9 7 4 ) a n d a m y l a s e s y n t h e s i s a n d s e c r e t i o n ( S o l i n g a n d U n g e r 1 9 7 2 ; K a n n o a n d S a i t o 1 9 7 6 ) . T h e r e l a t i o n s h i p o f i n s u l i n b i n d i n g t o s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g i s n o t c l e a r . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t i n s u l i n may n o t d i r e c t l y s t i m u l a t e a m y l a s e s e c r e t i o n b u t r a t h e r p o t e n t i a t e t h e e f f e c t s o f h o r m o n a l s e c r e t a g o g u e s ( W i l l i a m s et^ al^ 1 9 8 1 ) . 2. The Role of Calcium and Cyclic Nucleotides i n Enzyme Secretion P a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s a r e c o n n e c t e d b y t i g h t j u n c t i o n s . W h i l e t h e p r i m a r y f u n c t i o n o f t h e s e " f u s e d " p l a s m a m e m b r a n e s i s t o p r e v e n t - 14 -l e a k a g e o f p a n c r e a t i c s e c r e t i o n s i n t o t h e i n t r a c e l l u l a r s p a c e s , t h e y a l s o b l o c k o f f t h e a p i c a l r e g i o n o f t h e c e l l s f r o m t h e c i r c u l a t i o n , t h e m e a n s b y w h i c h t h e h o r m o n e s r e a c h t h e i r t a r g e t o r g a n s . T h u s s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l p o l a r i z a t i o n e x i s t s , w i t h s e c r e t a g o g u e - r e c e p t o r i n t e r a c t i o n a t t h e b a s a l memb rane a n d e n z y m e r e l e a s e a t t h e a p i c a l m e m b r a n e . A n i n t r a c e l l u l a r m e d i a t o r ( s e c o n d m e s s e n g e r ) f o r s e c r e t i o n i s t h e r e f o r e r e q u i r e d . A. Calcium A n u m b e r o f s t u d i e s i n w h i c h c a l c i u m r e m o v a l , e i t h e r a l o n e o r w i t h a d d i t i o n o f a c h e l a t o r s u c h a s e t h y l e n e g l y c o l - b i s ( p - a m i n o e t h y l e t h e r ) -- N , N ' t e t r a a c e t i c a c i d ( E G T A ) c a r r i e d o u t u s i n g i n c u b a t e d p a n c r e a t i c f r a g m e n t s o r p e r f u s e d p a n c r e a s , h a v e e m p h a s i z e d a c a l c i u m r e q u i r e m e n t f o r a m y l a s e s e c r e t i o n ( H o k i n 1 9 6 6 ; R o b b e r e c h t a n d C h r i s t o p h e 1 9 7 1 ; B e n z e t a l 1 9 7 2 ; H e i s l e r e t a l 1 9 7 2 ; 1 9 7 2 ; A r g e n t e t a l 1 9 7 3 ) . H o w e v e r i n c o n t r a s t t o s t u d i e s o n n e r v e t e r m i n a l s ( K a t z a n d M i l e d i 1 9 6 7 ) a n d p o s t e r i o r p i t u i t a r y ( D o u g l a s a n d P o i s n e r 1 9 6 4 ) i n w h i c h a d e p e n d e n c e o n e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m o f s e c r e t a g o g u e - i n d u c e d s e c r e t i o n wa s c l e a r l y e s t a b l i s h e d , i n t h e p a n c r e a s an i m m e d i a t e b l o c k a d e o f s t i m u l a t e d s e c r e t i o n i n t h e a b s e n c e o f e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m c o u l d n o t b e s h o w n ( W i l l i a m s a n d C h a n d l e r 1 9 7 5 ) . W i l l i a m s a n d C h a n d l e r ( 1 9 7 5 ) o b s e r v e d o n l y a 50% d e p r e s s i o n o f b e t h a n e c h o l - s t i m u l a t e d s e c r e t i o n f r o m mouse 2+ p a n c r e a t i c f r a g m e n t s a f t e r 3 0 - 9 0 m i n o f p r e i n c u b a t i o n i n a Ca - f r e e m e d i u m i n t h e a b s e n c e o f c a l c i u m c h e l a t o r . I n c o n t r a s t , H o k i n ( 1 9 6 6 ) f o u n d a c o m p l e t e l o s s o f t h e A C h r e s p o n s e i n p i g e o n p a n c r e a t i c s l i c e s - 15 -" p r e s o a k e d " i n a C a ^ - f r e e s a l i n e s o l u t i o n c o n t a i n i n g EDTA a n d f u r t h e r i n c u b a t e d f o r 40 m i n i n a K r e b s - R i n g e r b i c a r b o n a t e m e d i u m w i t h o u t c a l c i u m . T h e s i g n i f i c a n c e o f t h e s e o b s e r v a t i o n s i s d i f f i c u l t t o a s s e s s s i n c e l a c k o f i m m e d i a t e e f f e c t s o f c a l c i u m o m i s s i o n m i g h t r e s u l t f r o m i n s u f f i c i e n t c a l c i u m r e m o v a l . On t h e o t h e r h a n d , c o m p l e t e a n d p r o l o n g e d r e m o v a l o f e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m m i g h t e v e n t u a l l y d e c r e a s e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m o r p r o v o k e n o n s p e c i f i c damage t h a t m i g h t b e r e s p o n s i b l e f o r t h e m i s s i n g r e s p o n s e . A s t u d y o n s u p e r f u s e d mouse p a n c r e a t i c f r a g m e n t s ( P e t e r s e n a n d U e d a 1 9 7 6 ) s h o w e d t h a t a m y l a s e s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o s h o r t p u l s e s o f A C h s t i m u l a t i o n a t h a l f - h o u r i n t e r v a l s wa s n o t a f f e c t e d 24-by e x p o s u r e t o a Ca - f r e e s o l u t i o n e v e n when EGTA was p r e s e n t . H o w e v e r , i n a C a 2 + - f r e e s o l u t i o n c o n t a i n i n g E G T A , A C h s t i m u l a t i o n , n o r m a l l y c a u s i n g s u s t a i n e d e n z y m e s e c r e t i o n , r e s u l t e d i n o n l y a s h o r t b u r s t o f s e c r e t i o n . I t a p p e a r s t h a t a m y l a s e r e l e a s e i s i n d e p e n d e n t d u r i n g t h e f i r s t m i n u t e s o f s e c r e t i o n b u t a t l a t e r t i m e s d e p e n d e n t o n e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m . T h a t t h i s may be t h e c a s e comes f r o m s t u d i e s i n w h i c h t h e e f f e c t o f c a e r u l e i n o n a m y l a s e r e l e a s e f r o m i s o l a t e d p a n c r e a t i c a c i n i was e x a m i n e d i n m e d i u m c o n t a i n i n g n o r m a l c a l c i u m a n d i n C a 2 + - f r e e m e d i u m c o n t a i n i n g EGTA ( W i l l i a m s 1 9 8 0 ) . I t was o b s e r v e d t h a t c a e r u l e i n - s t i m u l a t e d a m y l a s e r e l e a s e was s i m i l a r i n t h e two m e d i a f o r t h e f i r s t 10 m i n , b u t t h e r e a f t e r t h e a b i l i t y o f c a e r u l e i n t o s t i m u l a t e 24-r e l e a s e was l o s t i n t h e a c i n i s u s p e n d e d i n Ca - f r e e m e d i u m . U n d e r s t a n d i n g how en z yme r e l e a s e c a n be c o n t r o l l e d b y i n t r a c e l l u l a r a n d / o r e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m r e q u i r e d t h e u s e o f r a d i o i s o t o p e s t o - 16 -m o n i t o r c a l c i u m f l u x e s . I n i t i a l o b s e r v a t i o n s w e r e c o n t r o v e r s i a l . I n 45 p a n c r e a t i c f r a g m e n t s a n d s u p e r f u s e d i n t a c t t i s s u e , w h i l e Ca i n f l u x a f t e r a d d i t i o n o f s e c r e t a g o g u e s c o u l d be o b s e r v e d b y H e i s l e r a n d G r o n d i n ( 1 9 7 3 ) u s i n g t h e " l a n t h a n u m m e t h o d " , o t h e r i n v e s t i g a t o r s o b s e r v e d 4 5 4-5 i n c r e a s e d C a e f f l u x f r o m C a p r e l o a d e d t i s s u e a n d w e r e n o t a b l e t o d e t e c t a n y e f f e c t o n Ca i n f l u x ( C a s e a n d C l a u s e n 1 9 7 3 ; M a t t h e w s et^ a_l 1 9 7 3 ; C h a n d l e r a n d W i l l i a m s 1 9 7 4 ; D e s c h o d t - L a n c k m a n e t a l 1 9 7 6 ) . S i m i l a r l y , u s i n g e n z y m a t i c a l l y d i s s o c i a t e d d i s p e r s e d a c i n a r c e l l s , a n i n c r e a s e d 4 5 C a i n f l u x wa s o b s e r v e d b y K o n d o a n d S c h u l z ( 1 9 7 6 a a n d b ) , w h i l e Ca e f f l u x f r o m p r e l o a d e d c e l l s was o b s e r v e d i n o t h e r s t u d i e s ( G a r d n e r e t a l 1 9 7 5 ; C h r i s t o p h e e t a l 1 9 7 6 ) . T h e d i v e r s i t y o f r e s u l t s • 2+ c o u l d be a t t r i b u t e d t o w h e t h e r o r n o t t r a c e r Ca e x c h a n g e was m e a s u r e d a t s t e a d y - s t a t e a n d t h e r e f o r e w h e t h e r t h e movemen t o f 4 5 C a was a n 2+ i n d i c a t i o n o f n e t Ca f l u x . F r o m t h e d a t a o b t a i n e d b y u n i d i r e c t i o n a l ** 5Ca f l u x m e a s u r e m e n t s a t s t e a d y - s t a t e c o n d i t i o n s ( K o n d o a n d S c h u l z 2+ 1 9 7 6 a a n d b ) a s w e l l a s b y m e a s u r e m e n t s o f " C a n e t f l u x " ( G a r d n e r e_t a l 1 9 7 5 ; R e n c k e n s et^ a l 1 9 7 8 ; S t o l z e a n d S c h u l z 1 9 8 0 ) , i t a p p e a r s t h a t c a l c i u m f l u x e s d u r i n g s e c r e t a g o g u e - s t i m u l a t e d e n z y m e s e c r e t i o n a r e b i p h a s i c . T h e r e i s a n i n i t i a l C a " ' ' - e x t r u s i o n f r o m t h e c e l l d u e t o r e l e a s e o f C a 2 + f r o m I n t r a c e l l u l a r s t o r e s f o l l o w e d b y a r e u p t a k e p h a s e i n t o a c o m p a r t m e n t d i f f e r e n t f r o m w h e r e c a l c i u m h a s b e e n r e l e a s e d . Wha t r e m a i n e d t o be d e t e r m i n e d w e r e t h e s i t e ( s ) o f t h e s e c r e t a g o g u e - e v o k e d c a l c i u m r e l e a s e a n d t h e b i o c h e m i c a l m e c h a n i s m t h a t c o u l d m e d i a t e t h e c a l c i u m t r a n s p o r t p r o c e s s e s . V a r i o u s a p p r o a c h e s h a v e b e e n u s e d t o d e t e r m i n e t h e s i t e ( s ) o f t h e - 17 -s e c r e t a g o g u e - e v o k e d c a l c i u m r e l e a s e . S u b c e l l u l a r f r a c t i o n a t i o n c a r r i e d 45 o u t on c e l l s o r t i s s u e s t h a t h a v e b e e n l o a d e d w i t h C a s u g g e s t e d t h a t c a l c i u m was r e l e a s e d f r o m m i t o c h o n d r i a ( C l e m e n t a n d M e l d o l e s i 1 9 7 5 a a n d b ) , f r o m a m i c r o s o m a l f r a c t i o n c o n s i s t i n g o f e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m , e l e m e n t s o f t h e G o l g i c o m p l e x a n d p e r h a p s a l s o t h e p l a s m a membrane ( D o r m e r a n d W i l l i a m s 1 9 8 1 ) . C h a n g e s i n membrane b o u n d c a l c i u m w e r e m o n i t o r e d by C h a n d l e r a n d W i l l i a m s ( 1 9 7 8 a a n d b ) u s i n g t h e f l u o r e s c e n t p r o b e c h l o r o t e t r a c y c l i n e . I t was o b s e r v e d t h a t m i t o c h o n d r i a l m e t a b o l i c i n h i b i t o r s m i m i c k e d t h e e f f e c t o f s e c r e t a g o g u e s o n t h e c h l o r o t e t r a c y c l i n e s i g n a l . T h e s e a u t h o r s c o n c l u d e d t h a t c a l c i u m wa s r e l e a s e d f r o m e i t h e r t h e m i t o c h o n d r i a o r b y a n o r g a n e l l e r e q u i r i n g ATP p r o d u c e d b y m i t o c h o n d r i o n . A n o t h e r a p p r o a c h , u s i n g a g e n t s w i t h s p e c i f i c s i t e s o f a c t i o n h a s b e e n e m p l o y e d . L a n t h a n u m a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 mM a b o l i s h e d Ca r e l e a s e i n r e s p o n s e t o c h o l i n e r g i c s t i m u l a t i o n ( W a k a s u g i e t a l 1 9 8 1 ) . L a n t h a n u m was f o u n d b o u n d t o t h e p l a s m a m e m b r a n e , b u t n o t i n s i d e t h e c e l l s . W a k a s u g i et^ a l^ ( 1 9 8 1 ) t h e r e f o r e c o n c l u d e d t h a t c a l c i u m wa s r e l e a s e d f r o m t h e p l a s m a m e m b r a n e . T h e p o s s i b i l i t y t h o u g h t h a t l a n t h a n u m c o u l d be a c t i n g on t h e p l a s m a membrane t o i n t e r f e r e w i t h t h e g e n e r a t i o n o f a s i g n a l t h a t c o n t r o l s a t r i g g e r c a l c i u m p o o l l o c a t e d e l s e w h e r e wa s n o t r u l e d o u t . I n s p i t e o f a c c u m u l a t i n g e v i d e n c e s u g g e s t i n g t h a t s t i m u l a t i o n o f e n z y m e s e c r e t i o n i s t r i g g e r e d b y a n i n c r e a s e i n c y t o s o l i c c a l c i u m ( S c h u l z 1 9 8 0 ; W i l l i a m s 1 9 8 0 ; O ' D o h e r t y a n d S t a r k 1 9 8 2 ; D o r m e r 1 9 8 3 ) t h e t r a n s p o r t m e c h a n i s m ( s ) r e q u i r e d t o c r i t i c a l l y c o n t r o l t h e i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n i s n o t f u l l y w o r k e d o u t . So f a r , - 18 -e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s h a v e f a i l e d t o i d e n t i f y a c a l c i u m c o m p o n e n t i n t h e A C h - e v o k e d membrane p o t e n t i a l a n d c o n d u c t a n c e c h a n g e a l t h o u g h s u s t a i n e d A C h - e v o k e d a c i n a r membrane d e p o l a r i z a t i o n i s a c u t e l y d e p e n d e n t o n e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m ( P e t e r s e n a n d M a r u y a m a 1 9 8 3 ) . R a t h e r , t h e i n c r e a s e i n i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m a p p e a r s t o o p e n up t h e i o n i c p a t h w a y s p e r m e a b l e t o s o d i u m , c h l o r i d e a n d p o t a s s i u m ( M a r u y a m a a n d P e t e r s e n 1 9 8 2 ) . A t p r e s e n t , b i o c h e m i c a l s t u d i e s a r e b e i n g d i r e c t e d t o w a r d s i d e n t i f y i n g a c t i v e c a l c i u m t r a n s p o r t p r o c e s s e s i n v a r i o u s c e l l u l a r 24-o r g a n e l l e s . A n A T P - d e p e n d e n t Ca - t r a n s p o r t i n p a n c r e a t i c m i c r o s o m e s , p r o b a b l y c o n s i s t i n g o f v e s i c l e s f r o m b o t h p l a s m a m e m b r a n e s a n d e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m h a s b e e n r e p o r t e d ( A r g e n t j i l t j a l 1 9 7 5 ; L u c a s e t a l 1 9 7 8 ; P o n n a p p a et^ a l 1 9 8 1 ) . The a c t i v e C a 2 + - t r a n s p o r t was n o t i n h i b i t e d b y m i t o c h o n d r i a l i n h i b i t o r s s u c h a s a n t i m y c i n A , a z i d e o r o l i g o m y c i n a n d 2+ 2+ was a s s o c i a t e d w i t h a Mg - d e p e n d e n t , Ca - s t i m u l a t e d A T P a s e a c t i v i t y ( P o n n a p p a et^ a l 1 9 8 1 ) . I n a c i n a r c e l l s t r e a t e d w i t h s a p o n i n ( W a k a s u g i e t a l 1 9 8 2 ) o r d i g i t o n i n ( L u c a s et^ a l^ 1 9 8 3 ) t o make t h e p l a s m a memb r ane 24-p e r m e a b l e , b o t h m i t o c h o n d r i a l a n d n o n - m i t o c h o n d r i a l Ca - u p t a k e s y s t e m s 24-w e r e i d e n t i f i e d . A Ca - A T P a s e a c t i v i t y h a s b e e n d e s c r i b e d i n p l a s m a memb r ane e n r i c h e d f r a c t i o n s p r e p a r e d f r o m w h o l e t i s s u e h o r a o g e n a t e s ( M i l u t i n o v i c et^ a l 1 9 7 7 ) . I t h a s b e e n s h o w n b y o t h e r w o r k e r s ( F o r g e t a n d H e i s l e r 1 9 7 6 ; L a m b e r t a n d C h r i s t o p h e 1 9 7 8 ; L e B e l e t a l 1 9 8 0 ; M a r t i n a n d S e n i o r 1 9 8 0 ) u s i n g s i m i l a r p r e p a r a t i o n s t h a t t h e A T P a s e a c t i v i t y i s 24- 24-s t i m u l a t e d a l m o s t e q u a l l y by Ca o r Mg . S i n c e t h e c e l l u l a r o r i g i n o f t h e A T P a s e a c t i v i t y i s n o t c e r t a i n i t s r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m i n t h e p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s t i l l r e m a i n s o b s c u r e . - 19 -A n o t h e r t r a n s p o r t m e c h a n i s m t h a t may p l a y a r o l e i n t h e r e g u l a t i o n i 24-o f i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m i s t h e N a / C a c o u n t e r t r a n s p o r t s y s t e m . T h i s s y s t e m u s e s t h e e l e c t r o c h e m i c a l N a + g r a d i e n t a c r o s s t h e p l a s m a memb rane a s a s o u r c e o f e n e r g y a n d h a s b e e n w e l l c h a r a c t e r i z e d i n n e r v e a x o n s a n d c a r d i a c m u s c l e ( D i P o l o a n d B e a u g e 1 9 8 0 ; M u l i n s 1 9 7 9 ) . U s i n g i s o l a t e d 22 p a n c r e a t i c p l a s m a memb rane v e s i c l e s l o a d e d w i t h N a , S c h u l z a n d H e i l ( 1 9 7 9 ) h a v e s hown t h a t a n i n c r e a s e i n i n t e r n a l C a 2 + i n c r e a s e d t h e N a + 24- 4-p e r m e a b i l i t y w h e r e a s a n i n c r e a s e i n t h e e x t e r n a l Ca d e c r e a s e d Na p e r m e a b i l i t y . T h i s a p p e a r s t o b e a n i m p o r t a n t s y s t e m s i n c e i t i s k n o w n f r o m e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s t h a t one m a j o r e f f e c t o f c h o l i n e r g i c s t i m u l a t i o n i s t o i n c r e a s e memb rane s o d i u m p e r m e a b i l i t y ( M a r u y a m a a n d P e t e r s e n 1 9 8 2 ) . B. Cyclic GMP P a n c r e a t i c s e c r e t a g o g u e s t h a t c a u s e r e l e a s e o f c e l l u l a r c a l c i u m a l s o i n c r e a s e c e l l u l a r c y c l i c GMP ( A l b a n o e t a l 1 9 7 6 ; C h r i s t o p h e e t al^ 1 9 7 6 ; D e s c h o d t - L a n c k m a n e t a l 1 9 7 6 ; May e t a l 1 9 7 8 ) . T h e r e i s a c l o s e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e d o s e - r e s p o n s e c u r v e f o r t h e a c t i o n o f a s e c r e t a g o g u e on c e l l u l a r c y c l i c GMP a n d t h a t f o r i t s a c t i o n o n c a l c i u m r e l e a s e ( C h r i s t o p h e et^ a l 1 9 7 6 ) . T h r e e f i n d i n g s s u g g e s t t h a t s e c r e t a g o g u e s i n c r e a s e c e l l u l a r c y c l i c GMP b y c a u s i n g m o b i l i z a t i o n o f c e l l u l a r c a l c i u m : 1 ) C a l c i u m c a n s t i m u l a t e g u a n y l a t e c y c l a s e a c t i v i t y i n b r o k e n c e l l p r e p a r a t i o n s ( C h r i s t o p h e e t a l 1 9 8 0 ) . B o t h p a r t i c u l a t e a n d s o l u b l e f o r m s o f t h e e n z yme h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n t h e p a n c r e a s ( C h r i s t o p h e e t a l 1 9 8 0 ) . C a l c i u m a n d M g 2 + c a n s u b s t i t u t e f o r M n 2 + a t - 20 -t h e m e t a l a c t i v a t o r s i t e o n t h e s o l u b l e f o r m . T h e p a r t i c u l a t e f o r m i s s t i m u l a t e d b y mono a n d p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s ( C h r i s t o p h e et^ al^ 1 9 8 0 ) . i i ) T h e c a l c i u m i o n o p h o r e , A 2 3 1 8 7 i n c r e a s e s c e l l u l a r c y c l i c GMP i n d i s p e r s e d a c i n a r c e l l s ( C h r i s t o p h e et^ a l 1 9 7 6 ) . a n d i i i ) E x o g e n o u s d e r i v a t i v e s o f c y c l i c GMP do n o t c a u s e c a l c i u m e f f l u x f r o m i n v i t r o p r e p a r a t i o n s o f p a n c r e a s ( C h r i s t o p h e et^ a l 1 9 7 6 ) . T h e s t i m u l a n t - e v o k e d i n c r e a s e i n c y c l i c GMP c o n c e n t r a t i o n i s t r a n s i e n t , r e a c h i n g max imum l e v e l s a f t e r 1 t o 2 m i n ( C h r i s t o p h e e t a l 1 9 8 0 ) . The t r a n s i e n t e l e v a t i o n o f t h e c y c l i c GMP c o n c e n t r a t i o n d e s p i t e c o n t i n u e d a g o n i s t e x p o s u r e may r e s u l t f r o m a s e q u e n t i a l s t i m u l a t i o n o f 2+ g u a n y l a t e c y c l a s e a n d a Ca - d e p e n d e n t c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e . I n d e e d , t h r e e d i f f e r e n t f o r m s o f c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e h a v e b e e n f o u n d i n t h e p a n c r e a s ( T e r a i e t a l 1 9 7 6 ; V a n d e r m e e r s e_t a l 1 9 7 7 ) . V a n d e r m e e r s et^ a l ( 1 9 7 7 ) h a v e s hown t h a t i n t h e p r e s e n c e o f c y c l i c GMP a s s u b s t r a t e t h e a c t i v i t y o f one o f t h e s e p h o s p h o d i e s t e r a s e s ( P 3 ) i s s p e c i f i c a l l y s t i m u l a t e d b y c a l m o d u l i n . T h e r e a r e two f o r m s o f t h e c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e f r o m r a t p a n c r e a s ( M r 1 7 5 , 0 0 0 a n d 1 1 6 , 0 0 0 ) t h a t e x h i b i t h i g h e r a f f i n i t y f o r c y c l i c GMP t h a n c y c l i c AMP ( V a n d e r m e e r s e t a l 1 9 8 3 ) . T h e r o l e o f c y c l i c GMP a s a p o t e n t i a l m e d i a t o r o f t h e a c t i o n o f s e c r e t a g o g u e s o n p a n c r e a t i c e n z y m e s e c r e t i o n i s s t i l l u n c l e a r . S c h e e l e a n d H a y m o v i t s ( 1 9 7 9 ) o b s e r v e d t h a t i n c u b a t i o n o f g u i n e a p i g p a n c r e a t i c l o b u l e s i n c a l c i u m - f r e e m e d i u m c o n t a i n i n g ImM EGTA r e s u l t e d i n a s e v e r e r e d u c t i o n i n c a r b a c h o l - s t i m u l a t e d e n z y m e s e c r e t i o n , w h e r e a s t h e t i s s u e - 21 -r e s p o n s e t o c y c l i c GMP r e m a i n e d l a r g e l y i n t a c t . I t wa s a l s o s h o w n t h a t d e p o l a r i z a t i o n o f t h e a c i n a r c e l l memb rane b y e l e v a t e d K C 1 c o n c e n t r a t i o n s , i n t h e p r e s e n c e o f a t r o p i n e , c a u s e d e n z y m e r e l e a s e w i t h o u t e l e v a t i o n o f c y c l i c GMP l e v e l s ( S c h e e l e a n d H a y m o v i t s 1 9 8 0 ) . F u r t h e r m o r e , G u n t h e r a n d J a m i e s o n ( 1 9 7 9 ) s h o w e d t h a t n i t r o s o u r e a c o m p o u n d s e l e v a t e d c y c l i c GMP l e v e l s d r a m a t i c a l l y w i t h o u t c a u s i n g s e c r e t i o n . On t h e o t h e r h a n d , a p h o r b o l e s t e r , 1 2 - 0 - t e t r a d e c a n o y l p h o r b o l - 1 3 - a c e t a t e , c a u s e d m a r k e d e n z y m e s e c r e t i o n w i t h no e l e v a t i o n o f c y c l i c GMP l e v e l s ( G u n t h e r a n d J a m i e s o n 1 9 7 9 ) . T h e r e a r e some r e p o r t s o f a s l i g h t s t i m u l a t o r y e f f e c t o f e x o g e n o u s d e r i v a t i v e s o f c y c l i c GMP o n a c i n a r e n z y m e s e c r e t i o n ( A l b a n o e t a l 1 9 7 6 ; H a y m o v i t s a n d S c h e e l e 1 9 7 6 ; G a r d n e r a n d J a c k s o n 1 9 7 7 ) . H o w e v e r , t h i s o b s e r v a t i o n c o u l d n o t b e s u b s t a n t i a t e d b y o t h e r s ( H e i s l e r a n d G r o n d i n 1 9 7 5 ; U e d a e t a l 1 9 8 0 ) . C. Cyclic AMP T h e i n c r e a s e i n a m y l a s e s e c r e t i o n e l i c i t e d b y s e c r e t i n o r V I P i s a c c o m p a n i e d b y a n i n c r e a s e i n c e l l u l a r c y c l i c AMP l e v e l s ( C h r i s t o p h e e_t a l 1 9 7 6 ; R o b b e r e c h t e t a l 1 9 7 6 ; G a r d n e r e t a l 1 9 7 9 ) w i t h n o c h a n g e i n c a l c i u m f l u x o r c e l l u l a r c y c l i c GMP ( G a r d n e r et^ a l 1 9 7 5 ; C h r i s t o p h e et_ a l 1 9 7 6 ) . I n h i b i t o r s o f c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e a r e k n o w n t o a u g m e n t t h e a c t i o n o f s e c r e t i n o r V I P on c e l l u l a r c y c l i c AMP l e v e l s a s w e l l a s o n e n z y m e s e c r e t i o n ( D e s c h o d t - L a n c k m a n e t a l 1 9 7 5 ; G a r d n e r a n d J a c k s o n 1 9 7 7 ) a n d b o t h p e p t i d e s c a n a c t i v a t e a d e n y l a t e c y c l a s e i n memb rane p r e p a r a t i o n s f r o m p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s ( R u t t e n et^ a l 1 9 7 2 ; S v o b o d a et^ a l 1 9 7 6 ; L o n g a n d G a r d n e r 1 9 7 7 ) . F u r t h e r m o r e , d e r i v a t i v e s o f - 22 -c y c l i c AMP c a n i n c r e a s e e n z y m e s e c r e t i o n f r o m t h e p a n c r e a s i n v i t r o ( H a y m o v i t s a n d S c h e e l e 1 9 7 6 ; G a r d n e r a n d J a c k s o n 1 9 7 7 ) ; T h e i n c r e a s e i n e n z y m e s e c r e t i o n p r o d u c e d by s e c r e t i n o r V I P p l u s e x o g e n o u s d e r i v a t i v e s o f c y c l i c AMP i s t h e same a s t h a t o b t a i n e d w i t h s e c r e t i n o r V I P a l o n e ( G a r d n e r a n d J a c k s o n 1 9 7 7 ) . The f i n d i n g t h a t CCK c o u l d i n c r e a s e c y c l i c AMP c o n c e n t r a t i o n s i n t h e p a n c r e a s ( D e s c h o d t - L a n c k m a n j i l t j i l 1 9 7 5 ) t o g e t h e r w i t h t h e o b s e r v a t i o n t h a t CCK a s w e l l a s C - t e r m i n a l f r a g m e n t s a n d a n a l o g s c o u l d a c t i v a t e a d e n y l a t e c y c l a s e i n b r o k e n c e l l p r e p a r a t i o n s ( R u t t e n e t a l 1 9 7 2 ; S v o b o d a et^ a l 1 9 7 6 ; L o n g a n d G a r d n e r 1 9 7 7 ) s u g g e s t e d t h a t c y c l i c AMP m e d i a t e d t h e a c t i o n o f C C K . H o w e v e r , s i n c e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f CCK t h a t i n c r e a s e c a l c i u m e f f l u x , c y c l i c GMP a n d a m y l a s e r e l e a s e do n o t i n c r e a s e c e l l u l a r c y c l i c AMP i n i n t a c t a c i n a r c e l l s ( L o n g a n d G a r d n e r 1 9 7 7 ) , t h e s e f i n d i n g s may r e f l e c t c o n t a m i n a t i o n o f t h e CCK w i t h s m a l l a m o u n t s o f s e c r e t i n - o r V I P - l i k e m a t e r i a l . T he m e c h a n i s m o f a d e n y l a t e c y c l a s e a c t i v a t i o n i n t h e p a n c r e a s i s s i m i l a r t o t h a t f o u n d i n o t h e r s y s t e m s ( C a s s e l a n d S e l i n g e r 1 9 7 8 ) : I t h a s b e e n s hown t h a t GTP a n d p a r t i c u l a r l y i t s a n a l o g g u a n y l y l i m i d o d i p h o s p h a t e [ G p p ( N H ) p ] , s t i m u l a t e p a n c r e a t i c a d e n y l a t e c y c l a s e a c t i v i t y ( D e P o n t et^ a l 1 9 7 7 ; S v o b o d a et^ a l 1 9 7 8 ) . T h e s t i m u l a t o r y e f f e c t o f t h e GTP a n a l o g wa s h i g h e r t h a n t h a t o f s e c r e t i n , CCK8 o r f l u o r i d e , a n u b i q u i t o u s a c t i v a t o r o f m e m b r a n e - b o u n d a d e n y l a t e c y c l a s e s i n a n i m a l c e l l s ( P e r k i n s 1 9 7 3 ) . I t was r e c e n t l y s h o w n t h a t e l e c t r i c a l s t i m u l a t i o n o f n o n - c h o l i n e r g i c , n o n - a d r e n e r g i c n e r v e s i n i s o l a t e d g u i n e a - p i g p a n c r e a t i c - 23 -s e g m e n t s e v o k e s a m y l a s e s e c r e t i o n w h i c h i s p r e c e d e d a n d a c c o m p a n i e d b y m a r k e d a n d c o m p l e x c h a n g e s i n c e l l u l a r c y c l i c n u c l e o t i d e c a n c e n t r a t i o n s ( P e a r s o n e t a l 1 9 8 1 ) . T h e p a t t e r n o f c y c l i c AMP a n d c y c l i c GMP c o n c e n t r a t i o n c h a n g e s c o u l d be m i m i c k e d by e x o g e n o u s V I P , b u t n o t b y c a e r u l e i n . T h e p h o p h o d i e s t e r a s e i n h i b i t o r t h e o p h y l l i n e h a d a p o t e n t i a t i n g e f f e c t on b o t h t h e n e r v e - s t i m u l a t i o n - a n d V I P - e v o k e d s e c r e t o r y r e s p o n s e a s w e l l a s t h e i n c r e a s e i n c y c l i c AMP c o n c e n t r a t i o n ( P e a r s o n e £ a l 1 9 8 1 ) . D. Phoshatidyllnosltol Turnover T h e i n c r e a s e d t u r n o v e r o f p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ( P I ) i n t h e p r e s e n c e o f A C h o r CCK was f i r s t d e s c r i b e d b y H o k i n a n d H o k i n ( 1 9 5 5 , 1 9 5 6 ) i n p i g e o n p a n c r e a t i c s l i c e s . T h i s o b s e r v a t i o n h a s s i n c e b e e n c o n f i r m e d i n t h e p a n c r e a s ( B a u d u i n a n d C a n t r a i n e 1 9 7 2 ; C a l d e r o n et^ a l _ 1 9 8 0 ) a n d i n o t h e r t i s s u e s ( M i c h e l l 1 9 7 5 ) . F u r t h e r m o r e , t h e c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 d o e s n o t a c c e l e r a t e d e g r a d a t i o n o f P I u n d e r c o n d i t i o n s w h e r e t h e i o n o p h o r e c a u s e s c h a n g e s i n o t h e r c e l l u l a r f u n c t i o n s ( J o n e s a n d M i c h e l l 1 9 7 5 ; M i c h e l l 1 9 7 5 ) . T h u s , i n t i s s u e s i n w h i c h c a l c i u m may m e d i a t e t h e a c t i o n s o f v a r i o u s a g o n i s t s , t h e c h a n g e i n P I t u r n o v e r i s t h o u g h t t o p r e c e e d c a l c i u m m o b i l i z a t i o n . T h e P I r e s p o n s e s eems t o c o r r e l a t e w i t h t h e c a l c i u m - m e d i a t e d s e c r e t o r y p r o c e s s . I n t h e p a n c r e a s , c h o l i n e r g i c a g e n t s a n d CCK i n c r e a s e P I t u r n o v e r w h i l e s e c r e t i n ( c a l c i u m - i n d e p e n d e n t r e s p o n s e ) d o e s n o t a f f e c t d e g r a d a t i o n o f P I ( M i c h e l l 1 9 7 5 ) . I t h a s b e e n r e c o g n i z e d f o r some t i m e t h a t p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l s , e s p e c i a l l y d i p h o s p h o i n o s i t i d e ( D P I ) a n d t r i p h o s p h o i n o s i t i d e ( T P I ) h a v e a - 24 -h i g h a f f i n i t y f o r c a l c i u m ( H a u s e r a n d D a w s o n 1 9 6 7 ) a n d a r e t h e r e f o r e p o s s i b l e c a l c i u m s t o r a g e s i t e s i n t h e m e m b r a n e . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t a c t i v a t i o n o f m u s c a r i n i c r e c e p t o r s l e a d s t o h y d r o l y s i s o f P I i n p l a s m a m e m b r a n e s a n d t h u s d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y t o c a l c i u m r e l e a s e o r , t h e e n t r y o f c a l c i u m f r o m t h e e x t r a c e l l u l a r f l u i d ( M i c h e l l 1 9 7 5 ) . 3. Plasma Membrane Ca^-ATPases C a l c i u m i s i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f a n u m b e r o f c e l l u l a r f u n c t i o n s i n c l u d i n g s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g ( D o u g l a s 1 9 6 8 ) , e x c i t a t i o n - c o n t r a c t i o n c o u p l i n g ( H u x l e y 1 9 7 3 ) , c o n t r o l o f memb r ane t r a n s p o r t ( P o r z i g 1 9 7 2 ) a n d r e l e a s e o f t r a n s m i t t e r f r o m m o t o r n e r v e t e r m i n a l s ( K a t z a n d M i l e d i 1 9 6 7 ) . T h e c o n t r o l o f f r e e c y t o s o l i c Ca i s a n e c e s s a r y r e q u i r e m e n t f o r m e t a b o l i c r e g u l a t i o n . T h e f r e e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n i n t h e c e l l c y t o p l a s m i s t y p i c a l l y — 5 —7 b e t w e e n 10 a n d 10 M i n c o n t r a s t t o t h e much h i g h e r l e v e l s o f c a l c i u m ( a p p r o x i m a t e l y 1 0 ~ 3 M ) i n t h e e x t r a c e l l u l a r s p a c e s . C a l c i u m t h e r e f o r e p e n e t r a t e s i n t o c e l l s c o n t i n u o u s l y b y p a s s i v e d i f f u s i o n down i t s c h e m i c a l g r a d i e n t . T h e r e a r e v a r i o u s c e l l u l a r m e c h a n i s m s t h a t a r e r e s p o n s i b l e f o r r e m o v i n g c a l c i u m f r o m t h e c y t o s o l : I n t r a c e l l u l a r c a l c i u m c a n be s e q u e s t e r e d b y t h e m i t o c h o n d r i a a n d e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . F o r t h e l o n g - t e r m m a i n t e n a n c e o f l o w i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m , t h e Na / C a e x c h a n g e s y s t e m a n d t h e Ca - A T P a s e i n t h e p l a s m a m e m b r a n e a r e t h e i m p o r t a n t m e c h a n i s m s . I t i s now a p p a r e n t t h a t N a + / C a 2 + e x c h a n g e i s n o t a n e x c l u s i v e - 25 -f e a t u r e o f e x c i t a b l e c e l l s . I t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d , n o t o n l y i n n e r v e a x o n s a n d c a r d i a c m u s c l e ( D i P o l o a n d B e a u g e 1 9 8 0 ; M u l i n s 1 9 7 9 ) , b u t a l s o i n n o n e x c i t a b l e c e l l s l i k e l i v e r ( F a m u l s k i a n d C a r a f o l i 1 9 8 2 ) , i n t e s t i n a l e p i t h e l i u m ( M u r e r a n d H i l d m a n 1 9 8 1 ) , k i d n e y b a s o l a t e r a l m e m b r a n e s (Gma j e t a l 1 9 7 9 ) a n d e x o c r i n e p a n c r e a s ( S c h u l z a n d H e i l 1 9 7 9 ) . T h e p l a s m a memb rane C a 2 + - A T P a s e i s a l s o p r e s e n t i n e x c i t a b l e c e l l s s u c h a s n e r v e a x o n s a n d c a r d i a c m u s c l e ( D i P o l o a n d B e a u g e 1 9 7 9 ) a n d c a r d i a c s a r c o l e m m a ( C a r o n i a n d C a r a f o l i 1 9 8 1 ) . W h e r e t h e t w o s y s t e m s h a v e b e e n c o m p a r e d d i r e c t l y i t a p p e a r s t h a t t h e y a r e c o m p l i m e n t a r y : t h e e x c h a n g e r b e i n g a l o w a f f i n i t y , h i g h - c a p a c i t y t r a n s p o r t i n g s y s t e m , a n d t h e C a - p u m p i n g A T P a s e , a h i g h e r a f f i n i t y b u t l o w c a p a c i t y s y s t e m ( P e n n i s t o n 1 9 8 2 ) . 24- 24-A C a - A T P a s e a s s o c i a t e d w i t h C a - t r a n s p o r t w a s f i r s t d e m o n s t r a t e d i n e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s ( S c h a t z m a n n 1 9 6 6 ; S c h a t z m a n n a n d V i n c e n z i 1 9 6 9 ) . S i n c e t h e n a h i g h a f f i n i t y C a 2 + - A T P a s e h a s b e e n d e s c r i b e d i n a w i d e v a r i e t y o f c e l l s : T h e s e i n c l u d e , g r a n u l o c y t e s ( S c h n e i d e r e t a l 1 9 7 9 ) , a x o n s ( D i P o l o a n d B e a u g e 1 9 7 9 ) , m a c r o p h a g e s ( L e w a n d S t o s s e l 1 9 8 0 ) , l i v e r ( L o t e r s z t a j n et_ a l 1 9 8 1 ) , c o r p u s l u t e u m ( V e r m a a n d P e n n i s t o n 1 9 8 1 ) , L y m p h o c y t e s ( L i c h t m a n e t a l 1 9 8 1 ) , h e a r t ( C o r o n i a n d C a r a f o l i 1 9 8 1 ) , b r a i n s y n a p t o s o m e s ( G i l l et_ al^ 1 9 8 1 ) , a d i p o c y t e s ( M c D o n a l d e t a l 1 9 8 2 ) , i s l e t c e l l s ( K o t a g a l e t a l 1 9 8 2 ) , t h y r o i d ( K a s a i a n d F i e l d 1 9 8 2 ) a n d b o n e c e l l s ( S h e n e t a l 1 9 8 3 ) . T h e human e r y t h r o c y t e C a 2 + - A T P a s e i s b y f a r t h e m o s t s t u d i e d a n d h a s b e e n r e g a r d e d a s t h e p r o t o t y p e by w h i c h o t h e r s u c h A T P a s e s a r e j u d g e d . I t s p r o p e r t i e s w i l l t h e r e f o r e be d e s c r i b e d i n d e t a i l h e r e . S e v e r a l l i n e s o f e v i d e n c e 24- 24-s u g g e s t t h a t t h e ( C a -+Mg ) - A T P a s e o r i g i n a l l y d e s c r i b e d by Dunham a n d - 26 -G l y n n ( 1 9 6 1 ) i s t h e e n z y m a t i c e x p r e s s i o n o f t h e Ca - p u m p , e x t r u d i n g 24-Ca f r o m t h e e r y t h r o c y t e c y t o p l a s m ( S c h a t z m a n n a n d V i n c e n z i 1 9 6 9 ) . R e c e n t l y , t h i s h a s b e e n u n e q u i v o c a l l y c o n f i r m e d b y p u r i f i c a t i o n o f t h e 24-e n z y m e a n d d e m o n s t r a t i o n o f i t s Ca - t r a n s p o r t p r o p e r t i e s i n r e c o n s t i t u t e d l i p o s o m e s ( C a r a f o l i e t a l 1 9 8 2 ) . The m e c h a n i s m b y w h i c h e n e r g y f r o m t h e h y d r o l y s i s o f ATP i s u t l i z e d 24-t o t r a n s p o r t Ca a g a i n s t a n e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t i s n o t c l e a r l y u n d e r s t o o d . I n r e c e n t y e a r s c o n s i d e r a b l e p r o g r e s s h a s b e e n made i n t h e e l u c i d a t i o n o f t h e p a r t i a l r e a c t i o n s o f t h e Ca - A T P a s e i n e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s . T h e r e a c t i o n p r o c e e d s t h r o u g h a p h o s p h o r y l a t e d - p r o t e i n i n t e r m e d i a t e [ E P ] , a l a b i l e a c y l - p h o s p h a t e w h i c h i s s e n s i t i v e t o h y d r o x y l a m i n e a n d b a s i c c o n d i t i o n s . F o r m a t i o n o f t h i s i n t e r m e d i a t e i s e n h a n c e d b y C a 2 + ( K n a u f e t a l 1 9 7 4 ; K a t z a n d B l o s t e i n 1 9 7 5 ; R e g a a n d G a r r a h a n 1 9 7 5 ) i n a m a n n e r s i m i l a r t o t h e c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c e o f t h e C a 2 + s t i m u l a t i o n o f t h e A T P a s e a c t i v i t y ( K a t z a n d B l o s t e i n 1 9 7 5 ; R e g a a n d G a r r a h a n 1 9 7 5 ; S z a s z et^ a l^ 1 9 7 8 ) . T h e p h o s p h o r y l a t e d i n t e r m e d i a t e i s a 1 5 0 , 0 0 0 d a l t o n p r o t e i n ( K n a u f e t a l 1 9 7 4 ; K a t z a n d B l o s t e i n 1 9 7 5 ; W o l f et^ a l 1 9 7 7 ) w h i c h i s c h e m i c a l l y d i s t i n c t f r o m t h e ( N a + + K + ) - A T P a s e p h o s p h o e n z y m e o f m o l e c u l a r w e i g h t a r o u n d 1 0 0 , 0 0 0 d a l t o n s ( K n a u f et^ a l _ 1 9 7 4 ; K a t z a n d B l o s t e i n 1 9 7 5 ) . W h e r e a s t h e s u b s t r a t e f o r 24-t h e Ca pump was i n i t i a l l y p r o p o s e d t o be f r e e ATP ( R e g a a n d G a r r a h a n 1 9 7 5 ; S c h a t z m a n n 1 9 7 7 ; R i c h a r d s e t a l 1 9 7 8 ) . G r a f a n d P e n n i s t o n ( 1 9 8 1 ) p r o p o s e d t h a t a t l o w ATP c o n c e n t r a t i o n s , CaATP was t h e s u b s t r a t e . S u b s t r a t e b i n d i n g r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f a n i n i t i a l p h o s p h o e n z y m e , E ^ . T h e K d f o r t h e f o r m a t i o n o f E ^ ( 1 - 6 uM) i s s i m i l a r t o t h e K d - 27 -f o r ATP h y d r o l y s i s ( 2 - 5 uM) ( R i c h a r d s e t a l 1 9 7 8 ) . P h o s p h o r y l a t i o n i n 24- 24-t h e p r e s e n c e o f Ca o c c u r s i n t h e a b s e n c e o f a d d e d Mg ( R e g a a n d Q i G a r r a h a n 1 9 7 5 ) . H o w e v e r , Ca d e p e n d e n t f o r m a t i o n o f t h e p h o s p h o e n z y m e i s a c c e l e r a t e d b y Mg ( S c h a t z m a n n a n d B i i r g i n 1 9 7 8 ; R e g a a n d G a r r a h a n 1 9 7 8 ; E n y e d i e t a l 1 9 8 0 ) . T h e m a j o r e f f e c t o f M g 2 + a p p e a r s t o be t h e c o n v e r s i o n o f E^P t o a s e c o n d s t a t e , E2P ( R e g a a n d G a r r a h a n 1 9 7 5 ; G a r r a h a n a n d R e g a 1 9 7 8 ) . T h e E 2 P i n t e r m e d i a t e i s m o r e r e a c t i v e t h a n E^P a n d c a n u n d e r g o r a p i d h y d r o l y s i s t o r e l e a s e P i ( R e g a a n d G a r r a h a n 1 9 7 8 ) , 24-c o n s i s t e n t w i t h t h e h i g h e r t u r n o v e r o f Ca A T P a s e i n t h e p r e s e n c e o f M g 2 + ( K a t z a n d B l o s t e i n 1 9 7 5 ; G a r r a h a n R e g a 1 9 7 8 ) . T h e f i n a l s t e p i n t h e s e q u e n c e i s t h e c o n v e r s i o n o f E 2 t o E^, a s t e p w h i c h i s b e l i e v e d t o be r e g u l a t e d b y c a l m o d u l i n ( M u a l l e m a n d K a r l i s h 1 9 8 0 ) . The a c t u a l 24-t r a n s p o r t o f Ca a c r o s s t h e p l a s m a memb rane i s t h o u g h t t o b e t h r o u g h c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n t h e t r a n s l o c a t i n g p r o t e i n ( S c h a t z m a n n a n d B i i r g i n 1 9 7 8 ) . F i g u r e 1 d e s c r i b e s t h e f u l l r e a c t i o n s e q u e n c e . C a 2 + , ATP C a l m o d u l i n F i g u r e 1 . R e a c t i o n s e q u e n c e o f fca2++ M g 2 + ) - A T P a s e p r o p o s e d b y M u a l l e m a n d K a r l i s h ( 1 9 8 0 , 1 9 8 1 ) 24- 24-A l t h o u g h t h e r e i s g e n e r a l a g r e e m e n t o n t h e r o l e o f Ca , Mg a n d 24-ATP i n t h e r e g u l a t i o n o f t h e e r y t h r o c y t e Ca - A T P a s e , c o n s i d e r a b l e - 28 -d i s c r e p a n c y e x i s t s i n t h e l i t e r a t u r e a s t o t h e k i n e t i c p r o p e r t i e s o f t h e 24- 24-e n z y m e . A n a l y s i s o f t h e Ca a c t i v a t i o n o f t h e Ca - A T P a s e r e v e a l e d b o t h a h i g h a n d l o w a f f i n i t y a c t i v i t y ( H o r t o n e t a l 1 9 7 0 ; S c h a t z m a n n a n d R o s s i 1 9 7 1 ; S c h a r f f 1 9 7 2 ) . T h e C a 2 + d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t ( K d ) f o r t h e s e a c t i v i t i e s was e s t i m a t e d t o be 4 uM a n d 100 uM , r e s p e c t i v e l y ( S c h a t z m a n n a n d R o s s i 1 9 7 1 ; S c h a r f f a n d F o d e r 1 9 7 7 ) . S c h a r f f ( 1 9 7 2 ) a n d S c h a t z m a n n ( 1 9 7 3 ) h o w e v e r c o n c l u d e d t h a t t h e l o w a f f i n i t y a c t i v i t y wa s 24-a n a r t i f a c t d u e t o t h e c o n v e r s i o n o f t h e h i g h C a a f f i n i t y f o r m b y t h e u s e o f c h e l a t i n g a g e n t s s u c h a s EGTA a n d EDTA i n t h e memb rane p r e p a r a t i o n . T h i s c o n c l u s i o n i s a t v a r i a n c e w i t h t h e r e s u l t s o f H o r t o n e t a l . ( 1 9 7 0 ) , who u s e d m e m b r a n e s p r e p a r e d i n t h e a b s e n c e o f c h e l a t i n g a g e n t s a n d d e m o n s t r a t e d t h e p r e s e n c e o f h i g h a n d l o w a f f i n i t y C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t i e s . T h e v a r i a b i l i t y i n t h e a p p a r e n t a f f i n i t i e s o f t h e e n z y m e may d e p e n d on w h e t h e r c a l m o d u l i n i s a s s o c i a t e d o r d i s s o c i a t e d 2+ 24-f r o m t h e Ca pump due t o t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f Ca i n t h e h e m o l y s i n g b u f f e r ( K a t z et^ al^ 1 9 7 9 ) . A l s o i t h a s b e e n o b s e r v e d t h a t t h e 24-p r e s e n c e o f Ca T c h e l a t i n g s u b s t a n c e s s u c h a s EGTA a n d EDTA i n t h e a s s a y m e d i u m w i l l a f f e c t t h e k i n e t i c s o f t h e C a 2 + - A T P a s e ( S a r k a d i et^ a l 1 9 7 9 ; A l - J o b o r e a n d R o u f o g a l i s 1 9 8 1 a ) . 24-A t t e m p t s t o d e t e r m i n e t h e s t o i c h i o m e t r y o f t h e e r y t h r o c y t e C a pump h a v e y i e l d e d c o n f l i c t i n g r e s u l t s . S c h a t z m a n n a n d V i n c e n z i ( 1 9 6 9 ) a n d S c h a t z m a n n ( 1 9 7 3 ) s u g g e s t e d a c a l c i u m t o P i r a t i o o f o n e . Q u i s t a n d R o u f o g a l i s ( 1 9 7 5 ) a n d S a r k a d i e t a l ( 1 9 7 7 ) s h o w e d t h a t max imum 24-i n h i b i t i o n o f Ca t r a n s p o r t b y l a n t h a n u m was a s s o c i a t e d w i t h o n l y 50% 34-i n h i b i t i o n o f A T P a s e a c t i v i t y . T h e y c o n c l u d e d t h a t L a - i n s e n s i t i v e - 29 -A T P a s e a c t i v i t y wa s n o t a s s o c i a t e d w i t h Ca t r a n s p o r t a n d s h o u l d be s u b t r a c t e d f r o m t h e t o t a l A T P a s e a c t i v i t y y i e l d i n g a s t o i c h i o m e t r i c e s t i m a t e o f 2 Ca i o n s pumped p e r P i r e l e a s e d . L a r s e n e t a l ( 1 9 7 8 a ) u s i n g a n i o n - s e l e c t i v e e l e c t r o d e m e t h o d f o r r a p i d , a n d c o n t i n u o u s 24-a s s e s s m e n t o f Ca e f f l u x f r o m r e s e a l e d r e d c e l l " g h o s t s " p r e p a r e d f r o m 34- 24-o u t d a t e d b l o o d d i d n o t f i n d a s i g n i f i c a n t L a - i n s e n s i t i v e C a - A T P a s e a c t i v i t y a n d h e n c e r e p o r t e d a s t o i c h i o m e t r y o f 1 : 1 . R e c e n t l y , r e p o r t s f r o m v a r i o u s l a b o r a t o r i e s c l e a r l y p o i n t t o t h e f a c t t h a t t h e s t o i c h i o m e t r y o f t h e pump c a n v a r y d e p e n d i n g o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f e f f e c t o r s u s e d ( S a r k a d i 1 9 8 0 ; L a r s e n et^ a l^ 1 9 8 1 ; A k y e m p o n a n d R o u f o g a l i s 1 9 8 1 ) , w h i c h may e x p l a i n t h e d i f f e r e n c e s p r e v i o u s l y e n c o u n t e r e d i n v a r i o u s l a b o r a t o r i e s . V e r y l i t t l e i n f o r m a t i o n e x i s t s i n t h e l i t e r a t u r e c o n c e r n i n g t h e 24-p r o p e r t i e s o f o t h e r p l a s m a memb rane C a - A T P a s e s . I n c o n t r a s t t o t h e 24-m a j o r i t y o f h i g h a f f i n i t y A T P a s e s t h a t r e q u i r e Mg , t h e A T P a s e s o f t h e p l a s m a m e m b r a n e s f r o m r a t c o r p u s l u t e u m ( V e r m a a n d P e n n i s t o n 1 9 8 1 ) , r a t l i v e r ( L o t e r s z t a j n ^it a l 1 9 8 1 ) a n d p a n c r e a t i c i s l e t s ( K o t a g a l e t a l 1 9 8 2 ) do n o t s e em t o h a v e a s i m i l a r r e q u i r e m e n t . B y t h e u s e o f t h e m e t a l i o n c h e l a t o r t r a n s - c y c l o h e x a n e - 1 , 2 - d i a m i n e - N , N , N ' , N ' - t e t r a a c e t i c a c i d ( C D T A ) i t wa s p o s s i b l e t o s how a n a p p a r e n t r e q u i r e m e n t f o r a d d e d 2+ 24-Mg i n t h e s e s y s t e m s , s u g g e s t i n g t h a t e n d o g e n o u s Mg w a s d i f f i c u l t t o r e m o v e f r o m t h e s e m e m b r a n e s b u t was s t i l l r e q u i r e d f o r t h e a c t i v i t y o f t h e e n z y m e . I n n u m e r o u s o t h e r s y s t e m s s u c h a s t h e h e a r t ( C a r o n i a n d C a r a f o l i 1 9 8 1 ) , s y n a p t o s o m e s ( G i l l e t a l 1 9 8 1 ) , s q u i d n e r v e ( D i P o l o a n d B e a u g e - 30 -1 9 7 9 ) , a d i p o c y t e s ( M c D o n a l d e t a l 1 9 8 2 ) a n d m a c r o p h a g e s ( L ew a n d S t o s s e l 2+ 1 9 8 0 ) t h e p r e s e n c e o f a h i g h a f f i n i t y Ca T - A T P a s e a n d a s s o c i a t e d 2+ Ca - t r a n s p o r t h a v e b e e n o b s e r v e d . I n t h e l i v e r s u c h a c o r r e l a t i o n h a s n o t y e t b e e n d e m o n s t r a t e d ( L o t e r s z t a j n et^ a l 1 9 8 1 ) . 4. Regulation of Plasma Membrane Ca2+-ATPases A. Role of Calmodulin B o n d a n d C l o u g h ( 1 9 7 3 ) f i r s t r e p o r t e d t h a t a n o n - h e m o g l o b i n p r o t e i n p r e s e n t i n t h e h e m o l y s a t e s o f human e r y t h r o c y t e s i n c r e a s e d t h e 2+ Ca - A T P a s e a c t i v i t y o f i s o l a t e d e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s . F o l l o w i n g p u r i f i c a t i o n b y a n u m b e r o f l a b o r a t o r i e s ( L u t h r a et^ a l 1 9 7 7 ; J a r r e t t a n d P e n n i s t o n 1 9 7 7 , 1 9 7 8 ) t h i s f a c t o r was s hown t o be i n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m t h e p u r i f i e d b r a i n p h o s p h o d i e s t e r a s e o r a d e n y l a t e c y c l a s e a c t i v a t o r p r o t e i n ( G o p i n a t h a n d V i n c e n z i 1 9 7 7 ; J a r r e t t a n d P e n n i s t o n 1 9 7 7 ) . C a l m o d u l i n , a s i t was t e r m e d b y C h e u n g et^ a l^ ( 1 9 7 8 ) a l s o s t i m u l a t e d C a u p t a k e i n t o i n s i d e - o u t r e d c e l l v e s i c l e s ( H i n d s e t a l 1 9 7 8 ; L a r s e n a n d V i n c e n z i 1 9 7 9 ; M a c l n t y r e a n d G r e e n 1 9 7 8 ) . C a l m o d u l i n h a s t h e u n i q u e p r o p e r t y , o f r e g u l a t i n g a v a r i e t y o f c e l l u l a r f u n c t i o n s . I t i s i n v o l v e d i n s y n a p t i c t r a n s m i s s i o n ( D e L o r e n z o e t a l 1 9 7 9 ) , c a l c i u m i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e a n d i n t e s t i n a l s e c r e t i o n ( H u n d a i n a n d N a f t a l i n 1 9 7 9 ) . O t h e r c e l l u l a r p r o c e s s e s r e g u l a t e d b y c a l m o d u l i n a r e c a l c i u m t r a n s p o r t i n t o s a r c o p l a s m i c r e t i c u l u m ( K a t z a n d R e m t u l l a 1 9 7 8 ) a n d s y n a p t o s o m e s ( S o b u e e t a l 1 9 7 9 ) , c e l l m u l t i p l i c a t i o n ( W h i t f i e l d e t a l 1 9 7 9 ) a n d f e r t i l i z a t i o n o f o o c y t e s b y s p e r m a t o z o a - 31 -( J o n e s £ t a l 1 9 7 8 ) . C a l m o d u l i n e x e r t s i t s e f f e c t s b y s t i m u l a t i n g a n u m b e r o f e n z y m e s i n c l u d i n g c a l c i u m t r a n s p o r t A T P a s e s , p h o s p h o d i e s t e -r a s e , a d e n y l a t e c y c l a s e , m y o s i n l i g h t c h a i n k i n a s e , p h o s p h o r y l a s e B k i n a s e a n d s e v e r a l o t h e r p r o t e i n k i n a s e s ( S c h a r f f 1 9 8 1 ) . 2+ C a l m o d u l i n b e l o n g s t o a g r o u p o f h o m o l o g o u s C a - b i n d i n g p r o t e i n s s u c h a s t r o p o n i n C , p a r v a l b u m i n , m y o s i n l i g h t c h a i n s , v i t a m i n D i n d u c i b l e p r o t e i n a n d c a l s e q u e s t r i n . C a l m o d u l i n I s u n i q u e among t h i s g r o u p o f p r o t e i n s i n t h a t i t i s u b i q u i t o u s l y d i s t r i b u t e d i n m o s t e u c a r y o t i c c e l l s a n d s h o w s l a c k o f t i s s u e o r s p e c i e s s p e c i f i c i t y ( S t e v e n s et^ a l 1 9 7 6 ) . I n m a m m a l i a n t i s s u e s , i t i s h i g h e s t i n b r a i n a n d t e s t i s ( W a t t e r s o n e t a l 1 9 7 6 ; Dedman e t a l 1 9 7 7 ) . T h e r i c h e s t s o u r c e r e p o r t e d t o d a t e i s t h e e l e c t r o p l a x o f t h e e l e c t r i c e e l w h e r e c a l m o d u l i n c o n s t i t u t e s 2% o f t h e t o t a l p r o t e i n ( C h i l d e r s a n d S i e g e l 1 9 7 5 ) . I n a l l t i s s u e s , c a l m o d u l i n i s d i s t r i b u t e d b e t w e e n t h e s o l u b l e a n d p a r t i c u l a t e f r a c t i o n s ( S m o a k e e t a l 1 9 7 4 ) . C a l m o d u l i n b i n d i n g t o p a r t i c u l a t e 2+ f r a c t i o n s r e q u i r e s Ca a n d a p p e a r s t o o c c u r a t s p e c i f i c s i t e s ( V a n d e r m e e r s et_ a l 1 9 7 8 ) . B i n d i n g i s s a t u r a b l e , r e v e r s i b l e a n d t e m p e r a t u r e a n d t r y p s i n - s e n s i t i v e ( B r o s t r o m a n d W o l f f 1 9 8 1 ) . C a l m o d u l i n i s a h e a t s t a b l e a c i d i c g l o b u l a r p r o t e i n w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t o f 1 6 , 7 9 0 , a s d e t e r m i n e d f r o m i t s a m i n o a c i d s e q u e n c e ( K l e e e t a l 1 9 8 0 ) . T h e a c i d i c a m i n o a c i d s , a s p a r t i c a n d g l u t a m i c a c i d s c o n s t i t u t e o n e - t h i r d o f t h e t o t a l a m i n o a c i d r e s i d u e s , a c c o u n t i n g f o r i t s l o w i s o l e l e c t r i c p o i n t ( 3 . 5 - 4 . 3 ) . I t l a c k s c y s t e i n e , h y d r o x y p r o l i n e a n d t r y p t o p h a n a n d h a s f e w t y r o s i n e r e s i d u e s . A d i s t i n g u i s h i n g c h a r a c t e r i s t i c i s t h e p r e s e n c e o f a t r i m e t h y l l y s y l r e s i d u e ( W a t t e r s o n - 32 -2 i e t j i l 1 9 8 0 ) . On t h e o t h e r h a n d , l i k e t h e o t h e r C a b i n d i n g p r o t e i n s u c h a s t r o p o n i n C ( R e i d a n d H o d g e s 1 9 8 0 ) c a l m o d u l i n e x h i b i t s f o u r i n t e r n a l l y h o m o l o g o u s s e q u e n c e s o r d o m a i n s , e a c h o f w h i c h c o n t a i n s t h e a p p r o p r i a t e a m i n o a c i d s f o r m i n g t h e h e l i x - l o o p - h e l i x C a 2 + b i n d i n g s t r u c t u r e ( W a t t e r s o n e t a l 1 9 8 0 ) . B a s e d on K r e t s i n g e r ' s h y p o t h e s i s ( K r e t s i n g e r 1 9 7 6 ) , c a l m o d u l i n b i n d s f o u r C a 2 + i o n s a n d t h e f o u r C a 2 + b i n d i n g s i t e s c o r r e s p o n d t o t h e f o u r d o m a i n s . I t h a s b e e n s h o w n t h a t o f 24-t h e f o u r C a b i n d i n g s i t e s , t h r e e s i t e s e x h i b i t h i g h a f f i n i t y f o r c a l c i u m ( K d = 0 . 2 uM) b u t l o w a f f i n i t y f o r M g 2 + ( k d = 140 p M ) . T h e f o u r t h s i t e h a s s i m i l a r a f f i n i t i e s f o r b o t h C a 2 + a n d M g 2 + ( W o l f f e t a l 24-1 9 7 7 ) . A v a r i e t y o f d a t a s u p p o r t s t h e c o n c l u s i o n t h a t Mg a n d o t h e r 24-d i v a l e n t c a t i o n s c o m p e t e f o r t h e C a b i n d i n g s i t e s o n c a l m o d u l i n . 24-D i r e c t b i n d i n g s t u d i e s i n d i c a t e d t h a t 4 m o l e s o f Mg o r Mn b i n d p e r 94-m o l e o f c a l m o d u l i n a n d a r e d i s p l a c e d b y C a ( W o l f f eit a l 1 9 7 7 ) . A l s o , 21 24-Mg i n c r e a s e s t h e a p p a r e n t K d f o r Ca o f v a r i o u s c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t e n z y m e s ( K a t z e t a_l 1 9 7 9 ; B r o s t r o m ^t^ a l 1 9 7 7 ) . C a l m o d u l i n r e g u l a t i o n o f e n z y m e a c t i v i t y h a s g e n e r a l l y b e e n f o u n d t o 21 24-r e q u i r e C a a l t h o u g h Ca ^ - i n d e p e n d e n t c a l m o d u l i n e f f e c t s h a v e b e e n r e p o r t e d i n s y s t e m s s u c h a s B o r d e t e l l a p e r t u s i s a d e n y l a t e c y c l a s e ( G r e e n l e e e t a l 1 9 8 2 ; K i l h o f f e r et^ a l 1 9 8 3 ) , p i g l u n g c y c l i c GMP d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e ( Y a m a k i a n d H i d a k a 1 9 8 0 ) a n d h i s t o n e d e p h o s p h o r y l a t i o n b y l i v e r p h o s p h o p r o t e i n p h o s p h a t a s e s ( K h a n d e l w a l e t ajL 1 9 8 0 ) . The m e c h a n i s m o f a c t i v a t i o n i n t h e s e s y s t e m i s n o t f u l l y u n d e r s t o o d . 2+ R e g u l a t i o n o f Ca - d e p e n d e n t e n z y m e ( E ) b y c a l m o d u l i n ( C ) i s - 33 -\ x b e l i e v e d t o p r o c e e d b y 2 s e q u e n t i a l , f u l l y r e v e r s i b l e m a s s a c t i o n e q u a t i o n s ( B r o s t r o m a n d W o l f f 1 9 8 1 ) . n C a 2 + + C x s ( C a 2 + ) n C ( 1 ) [ ( C a ^ + ) n C ] x E ( 2 ) a c t i v e W h e r e n e q u a l s t h e n u m b e r o f b i n d i n g s i t e s w h i c h m u s t be o c c u p i e d b y 2+ C a t o c o n v e r t c a l m o d u l i n t o a n a c t i v a t i n g f o r m f o r t h e e n z y m e a n d x e q u a l s t h e u n k n o w n n u m b e r o f ( C a 2 + ) n c a l m o d u l i n c o m p l e x e s . I n t h i s 2+ m o d e l , Ca f i r s t i n t e r a c t s w i t h c a l m o d u l i n t o f o r m a c o m p l e x c a p a b l e o f a c t i v a t i n g t h e e n z y m e ( E q n 1 ) . T h i s c o m p l e x t h e n a s s o c i a t e s w i t h t h e i n a c t i v a t e d f o r m o f t h e e n z y m e f o r m i n g a n a c t i v a t e d t e r n a r y c o m p l e x ( E q n 2 ) . S a t u r a t i o n o f c a l m o d u l i n w i t h C a 2 + r e s u l t s i n a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n v o l v i n g a n i n c r e a s e i n t h e a - h e l i c a l c o n t e n t f r o m 28% t o 42% ( B r o s t r o m a n d W o l f f 1 9 8 1 ) . T a n a k a a n d H i d a k a ( 1 9 8 0 ) h a v e s hown t h a t t h e 2+ c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e p r o d u c e d i n c a l m o d u l i n b y b i n d i n g o f Ca t o t h e h i g h a f f i n i t y s i t e s e x p o s e s h y d r o p h o b i c g r o u p s w h i c h i n t u r n a p p e a r t o be i n v o l v e d i n a c t i v a t i n g c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t e n z y m e s . T h u s , b o t h t h e 24-a c i d i c n a t u r e o f c a l m o d u l i n a n d i t s Ca - i n d u c i b l e h y d r o p h o b i c p r o p e r t i e s s e em t o be i m p o r t a n t i n r e g u l a t i n g c a l m o d u l i n d e p e n d e n t e n z y m e s . I n t h e r e d b l o o d c e l l , c a l m o d u l i n s t i m u l a t e s t h e d e c o m p o s i t i o n 2+ 24-o f t h e EP c o m p l e x o f t h e C a - A T P a s e , i n a m a n n e r s i m i l a r t o Mg ( J e f f e r y e t a l 1 9 8 1 ) . E v e n t h o u g h c a l m o d u l i n i s k n o w n t o r e g u l a t e a m a j o r i t y o f p l a s m a 24-membrane Ca - A T P a s e s a c l e a r d e m o n s t r a t i o n o f t h i s e f f e c t i s l a c k i n g i n - 34 -t h e Ca - A T P a s e s o f r a t c o r p u s l u t e u m ( V e r m a a n d P e n n i s t o n 1 9 8 1 ) a n d r a t l i v e r ( L o t e r s z t a j n et^ a l^ 1 9 8 1 ) . T h e s e s y s t e m s d i d n o t r e s p o n d t o a d d e d c a l m o d u l i n e v e n a f t e r w a s h i n g o f t h e m e m b r a n e s w i t h EGTA ( V e r m a a n d P e n n i s t o n 1 9 8 1 ) o r p u r i f i c a t i o n o f t h e e n z y m e on D E A E - c e l l u l o s e ( L o t e r s z t a j n et_ a l 1 9 8 1 ) . T h e p o s s i b i l i t y r e m a i n s t h o u g h t h a t e n d o g e n o u s c a l m o d u l i n i s b o u n d s u c h t h a t i t c o u l d n o t be r e m o v e d b y t h e s e t r e a t m e n t s . H o w e v e r t h e e x i s t e n c e o f o t h e r modes o f r e g u l a t i o n c a n n o t be r u l e d o u t . I n d e e d L o t e r s z t a j n et^ a l^ ( 1 9 8 1 ) h a v e r e p o r t e d t h a t 24-r a t l i v e r p l a s m a memb rane Ca - A T P a s e i s a c t i v a t e d b y a n e n d o g e n o u s p r o t e i n a c t i v a t o r w h i c h i s d i s t i n c t f r o m c a l m o d u l i n i n a n u m b e r o f 24-p r o p e r t i e s . I n c o n t r a s t , t h e h e a r t s a r c o l e m m a l Ca - A T P a s e i s r e g u l a t e d b y b o t h c a l m o d u l i n a n d a c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p h o s p h o r y l a t i o n p r o c e s s ( C a r o n i e t a l 1 9 8 2 ) . B. Role of Acidic Phospholipids, Long-chain Fatty Acids and Controlled  Proteolysis I t was f i r s t s h o w n b y R o n n e r ^ t al^ ( 1 9 7 7 ) a n d l a t e r b y A l - J o b o r e a n d R o u f o g a l i s ( 1 9 8 1 b ) t h a t e r y t h r o c y t e Ca - A T P a s e d i s s o l v e d f r o m t h e membrane b y d e t e r g e n t s c o u l d be a c t i v a t e d by a v a r i e t y o f a c i d i c p h o s p h o l i p i d s a n d b y p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s . N i g g l i et^ al^ ( 1 9 7 9 ) 24-o b s e r v e d t h a t e r y t h r o c y t e Ca - A T P a s e p u r i f i e d i n t h e p r e s e n c e o f p h o s p h a t i d y l s e r i n e e x h i b i t e d h i g h s p e c i f i c a c t i v i t y b u t c o u l d n o t b e s t i m u l a t e d b y c a l m o d u l i n . I n c o n t r a s t , G i e t z e n ^it a l ( 1 9 8 0 a ) i s o l a t e d t h e p u r i f i e d e n z y m e i n t h e p r e s e n c e o f p h o s p h a t i d y c h o l i n e a n d r e p o r t e d a n e i g h t - t o n i n e - f o l d s t i m u l a t i o n o f t h e p u r i f i e d e n z y m e b y c a l m o d u l i n . - 35 -I t s o o n be came a p p a r e n t t h a t a c i d i c p h o s p h o l i p i d s a n d u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s c o u l d m i m i c t h e e f f e c t o f c a l m o d u l i n . E x t e n s i v e s t u d i e s d o n e o n t h e p u r i f i e d e r y t h r o c y t e C a 2 + - A T P a s e ( N i g g l i est a l 1 9 8 1 ) i n d i c a t e d t h a t i t i s s t i m u l a t e d b y a v a r i e t y o f a c i d i c p h o s p h o l i p i d s ( p h o s p h a t i d y l s e r i n e , c a r d i o l i p i n , p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l a n d p h o s p h a t i d i c a c i d ) . U n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s ( o l e i c a n d l i n o l e i c a c i d ) h a d a s i m i l a r e f f e c t . On t h e o t h e r h a n d , n e u t r a l p h o s p h o l i p i d s ( p h o s p h a t i d y l c h o l i n e , s p h i n g o m y e l i n a n d p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ) h a d no e f f e c t on t h e C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y ( N i g g l i e t a l 1 9 8 1 ) . I t h a s now b e e n f o u n d t h a t d i p h o s p h o i n o s i t i d e ( D P I ) a n d t r i p h o s p h o i n o s i t i d e ( T P I ) a r e a l s o p o w e r f u l a c t i v a t o r s o f t h e r e c o n s t i t u t e d C a 2 + - A T P a s e ( C a r a f o l i et a l 1 9 8 2 ) ; t h e s i g n i f i c a n c e o f t h e f i n d i n g l i e s i n t h e f a c t t h a t t h e y a c t i v a t e a t a m u c h l o w e r c o n c e n t r a t i o n t h a n a c i d i c p h o s p h o l i p i d s a n d f a t t y a c i d s , a n d c o u l d f u n c t i o n a s a p h y s i o l o g i c a l r e g u l a t o r o f t h e e n z y m e . T a v e r n a a n d H a n a h a n ( 1 9 8 0 ) a n d S a r k a d i £ t a l ( 1 9 8 0 ) o b s e r v e d t h a t l i m i t e d p r o t e o l y s i s o f e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s was a n o t h e r m e t h o d o f 24-a c t i v a t i o n o f t h e Ca - A T P a s e . M a x i m u m p r o t e o l y t i c a c t i v a t i o n r e s u l t e d i n t h e r e m o v a l f r o m t h e A T P a s e o f a f r a g m e n t o f Mj. a b o u t 3 0 , 0 0 0 ( S a r k a d i ^it a l 1 9 8 0 ) . S i n c e t h e t r e a t m e n t r e m o v e d t h e s e n s i t i v i t y t o c a l m o d u l i n , S a r k a d i e t a l ( 1 9 8 0 ) s u g g e s t e d t h a t t h e 3 0 , 0 0 0 M r f r a g m e n t i s t h e c a l m o d u l i n r e c e p t o r o f t h e e n z y m e m o l e c u l e . On t h e c o n t r a r y , 24-s t u d i e s w i t h p u r i f i e d Ca - A T P a s e i n d i c a t e d t h a t c a l m o d u l i n b i n d i n g c a p a c i t y was l o s t u p o n r e m o v a l o f a 1 0 , 0 0 0 Mj. p o l y p e p t i d e b y t r y p t i c d i g e s t i o n ( C a r a f o l i ^it a l 1 9 8 2 ) . T h e p o s s i b l e e x p l a n a t i o n i s t h a t 24-a c i d i c p h o s p h o l i p i d s , f a t t y a c i d s , a n d t h e c a l m o d u l i n - C a c o m p l e x a c t - 36 -b y i n t r o d u c i n g i n t o t h e r e g i o n o f t h e a c t i v e s i t e o f t h e e n z y m e a r e l a t i v e l y h y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n t ( C a r a f o l i e t a l 1 9 8 2 ) . T h i s w i l l r e s u l t i n a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s u c h t h a t t h e a c t i v e s i t e b e c o m e s m o r e a c c e s s i b l e . R e m o v i n g a h y p o t h e t i c a l i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e f r o m t h e e n z y m e m o l e c u l e b y p r o t e o l y t i c t r e a t m e n t w o u l d a l s o e x p o s e t h e a c t i v e 2-4-s i t e . T h u s i n t h e c a s e o f c a l m o d u l i n , Ca w o u l d be r e q u i r e d t o i n c r e a s e i t s h y d r o p h o b i c i t y ( T a n a k a a n d H i d a k a 1 9 8 0 ) w h e r e a s o t h e r 2+ t r e a t m e n t s w o u l d n o t r e q u i r e Ca C. Regulation of the Action of Calmodulin and other Activators of Ca +-ATPase a c t i v i t i e s A t p r e s e n t , r e l a t i v e l y l i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e f a c t o r s w h i c h c o n t r o l c a l m o d u l i n m e d i a t e d f u n c t i o n s . R e c e n t r e p o r t s t h a t i n s u l i n i n h i b i t s C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y i n r a t a d i p o c y t e s ( M c D o n a l d e t a l 1 9 8 2 ) h a s g e n e r a t e d some i n t e r e s t d u e t o t h e p o s s i b i l i t y t h a t i n s u l i n may a n t a g o n i z e c a l m o d u l i n a c t i v a t i o n i n t h i s s y s t e m . E v i d e n c e f o r d i r e c t b i n d i n g o f c a l m o d u l i n t o v a r i o u s c e l l u l a r p r o t e i n s h a s a l s o b e e n c i t e d i n t h e l i t e r a t u r e . Wang a n d D e s a i ( 1 9 7 7 ) i s o l a t e d a n d c h a r a c t e r i z e d a c a l m o d u l i n - b i n d i n g p r o t e i n ( C a M - B P ) f r o m b o v i n e b r a i n : c a l m o d u l i n b i n d i n g t o t h e p r o t e i n was Ca - d e p e n d e n t . K l e e et^ a l ( 1 9 7 9 ) s u g g e s t e d t h e name c a l c i n e u r i n t o r e f e r t o t h e h e a t l a b i l e C a M - B P t h e y i s o l a t e d f r o m n e r v e t i s s u e . H e a t s t a b l e ( S h a r m a est a l 1 9 7 8 ) a n d h e a t l a b i l e ( A u 1 9 7 8 ) f o r m s o f C a M - B P s h a v e b e e n i s o l a t e d f r o m b o v i n e b r a i n a n d e r y t h r o c y t e s , r e s p e c t i v e l y . I t wa s d e m o n s t r a t e d t h a t C a M -BP s e l e c t i v e l y 2+ a n t a g o n i z e d c a l m o d u l i n a c t i v a t i o n o f e r y t h r o c y t e Ca - A T P a s e a n d - 37 -C a - t r a n s p o r t ( A u 1 9 7 8 ; L a r s e n £ t a l 1 9 7 8 b ) . L i t t l e i s k n o w n a b o u t t h e f u n c t i o n o r r e g u l a t i o n o f t h e l e v e l s o f C a M - B P s i n c e l l s . H o w e v e r , i t i s b e l i e v e d t h a t C a M - B P s may r e p r e s e n t a mean s o f r e g u l a t i n g c a l m o d u l i n a c t i v i t y . T h e d e m o n s t r a t i o n b y L e v i n a n d W e i s s ( 1 9 7 7 ) t h a t c e r t a i n a n t i p s y c h o t i c d r u g s , s u c h a s t r i f l u o p e r a z i n e a n d r e l a t e d p h e n o t h i a z i n e s , b l o c k e d c a l m o d u l i n a c t i v a t i o n o f p h o s p h o d i e s t e r a s e a c t i v i t y r e s u l t e d i n a m a j o r a d v a n c e m e n t i n t h e i n v e s t i g a t i o n o f c a l m o d u l i n - r e g u l a t e d s y s t e m s . S u b s e q u e n t l y i t was s h o w n t h a t p h e n o t h i a z i n e s a l s o a n t a g o n i z e d 24- 24-c a l m o d u l i n a c t i v a t i o n o f Ca - A T P a s e a n d C a - t r a n s p o r t i n human e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s ( G i e t z e n e t j i l 1 9 8 0 b ; R a e s s a n d V i n c e n z i 1 9 8 0 ; R o u f o g a l i s 1 9 8 1 ) . T h e b i n d i n g o f t r i f l u o p e r a z i n e ( L e v i n a n d W e i s s 1 9 7 7 ) a n d r e l a t e d p h e n o t h i a z i n e s ( L e v i n a n d W e i s s 1 9 7 9 ) t o c a l m o d u l i n i s c a l c i u m - d e p e n d e n t . S c h a t c h a r d p l o t a n a l y s i s r e v e a l e d t w o t y p e s o f t r i f l u o p e r a z i n e b i n d i n g s i t e s , o f h i g h a f f i n i t y ( K d = 1 - 1 . 5 uM) a n d l o w a f f i n i t y ( K d = 5 u M ) . T h e l o w a f f i n i t y s i t e s a r e 24- 24-C a - i n d e p e n d e n t , i n c o n t r a s t t o t h e h i g h Ca a f f i n i t y s i t e s ( L e v i n a n d W e i s s 1 9 7 9 ) . A s i m i l a r d i s t r i b u t i o n o f s i t e s was f o u n d f o r c h l o r p r o m a z i n e ( K d = 5 uM a n d 130 u M ) . S i n c e t h e d i s c o v e r y t h a t p h e n o t h i a z i n e s i n h i b i t c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t a c t i v a t i o n o f e n z y m e s y s t e m s , a v a r i e t y o f c o m p o u n d s h a v e b e e n s h o w n t o a n t a g o n i z e t h e a c t i o n o f c a l m o d u l i n . T h e s e a g e n t s i n c l u d e a n t i p s y c h o t i c a g e n t s , a n t i d e p r e s s a n t s , l o c a l a n e s t h e t i c s , v i n c r i s t i n e , r a u w o l f i a a l k a l o i d s , a n t i h y p e r t e n s i v e s , N - ( 6 - a m i n o h e x y l ) - 5 - c h l o r o - l - n a p h t h a l e n e -s u l f o n a m i d e ( W 7 ) , l - [ b i s ( p - c h l o r o p h e n y l ) m e t h y l ] - 3 - [ 2 , 4 - d i c h l o r o - f ? -- 38 -( 2 , 4 - d i c h l o r o b e n z y l o x y l ) p h e n e t h y l ] i m i d a z o l i n i u m c h l o r i d e ( R 2 4 5 7 1 o r c a l m i d a z o l i u m ) , T r i t o n X - 1 0 0 ( R o u f o g a l i s 1 9 8 2 ) a n d Compound 4 8 / 8 0 ( G i e t z e n et_ a l 1 9 8 3 ) . T h e m o s t p o t e n t c o m p o u n d r e p o r t e d t o d a t e i s c a l m i d a z o l i u m . T h e I 5 0 f o r i n h i b i t i o n o f c a l m o d u l i n a c t i v a t i o n o f p h o s p h o d i e s t e r a s e b y t h i s c o m p o u n d i s 0 . 0 1 uM ( B e l l e 1 9 8 1 ) . O f t h e c o m m o n l y u s e d d r u g s , p i m o z i d e ( I 5 0 = 0 . 7 u M ) , p e n f l u r i d o l ( I 5 0 = 2 . 5 u M ) , a n d t r i f l u o p e r a z i n e ( I 5 0 = 10 uM) a r e among t h e m o s t p o t e n t a n t i c a l m o d u l i n d r u g s ( R o u f o g a l i s 1 9 8 2 ) . L e v i n a n d W e i s s ( 1 9 7 6 ) n o t e d t h a t t h e a n t i a n x i e t y a g e n t s , m e d a z e p a m a n d c h l o r d i a z e p o x i d e , a n d t h e a n t i d e p r e s s a n t s , a m i t r y p t y l i n e , p r o t r i p t y l i n e a n d d e s i p r a m i n e , a s w e l l a s t h e n o n - a n t i p s y c h o t i c a n a l o g s o f p h e n o t h i a z i n e s , c h l o r p r o m a z i n e s u l f o x i d e a n d t r i f l u o p e r a z i n e s u l f o x i d e ( L e v i n a n d W e i s s 1 9 7 9 ) a r e l e s s p o t e n t a n d show l e s s 2+ Ca - d e p e n d e n c e a s i n h i b i t o r s o f c a l m o d u l i n a c t i o n . I t was t h e r e f o r e s u g g e s t e d t h a t t h e r e i s a c o r r e l a t i o n b e t w e e n c a l m o d u l i n a n t a g o n i s m a n d a n t i p s y c h o t i c a c t i v i t y . H o w e v e r , r e c e n t f i n d i n g s a r e n o t c o n s i s t e n t w i t h t h i s h y p o t h e s i s : H a l o p e r i d o l , a member o f t h e b u t y r o p h e n o n e c l a s s o f c l i n i c a l a n t i p s y c h o t i c a g e n t s i s 5 0 - f o l d mo r e p o t e n t t h a n c h l o r p r o m a z i n e c l i n i c a l l y , y e t i t h a s a s i m i l a r o r l o w e r p o t e n c y a s a n a n t a g o n i s t o f c a l m o d u l i n - a c t i v a t e d p h o s p h o d i e s t e r a s e ( L e v i n a n d W e i s s 1 9 7 9 ; N o r m a n e t al 1 9 7 9 ) a n d i s i n e f f e c t i v e a g a i n s t c a l m o d u l i n O 1 a c t i v a t i o n o f e r y t h r o c y t e Ca - A T P a s e ( R a e s s a n d V i n c e n z i 1 9 8 0 a ) . A n o t h e r p i e c e o f e v i d e n c e a g a i n s t t h i s h y p o t h e s i s i s t h e l a c k o f s t e r e o s p e c i f i c i t y o f c a l m o d u l i n i n h i b i t i o n i n c o n t r a s t t o a n t i s y c h o t i c a c t i v i t y : R o u f o g a l i s ( 1 9 8 1 ) d e m o n s t r a t e d t h a t a l l o f a s e r i e s o f - 39 -chlorpromazine analogs; i n which the c h l o r i n e s u b s t i t u t i o n was v a r i e d from p o s i t i o n 1 to 4 on the A r i n g of the t r i c y c l i c nucleus i n h i b i t e d 24-calmodulin a c t i v a t i o n of e r ythrocyte Ca -ATPase a c t i v i t y , yet only the compound w i t h c h l o r i n e s u b s t i t u t e d on p o s i t i o n 2 showed t r a n q u i l i z e r a c t i v i t y . In view of these d i s c r e p a n c i e s , the r e l a t i o n s h i p between the antagonism of calmodulin and the c l i n i c a l e f f i c a c y of the a n t i p s y c h o t i c agents seems u n l i k e l y . A c r i t i c a l study of the wide v a r i e t y of a n t i c a l m o d u l i n agents by Norman et a l (1979) revealed that hydrophobicity i s a major f a c t o r c o n t r i b u t i n g to t h e i r a c t i o n . Indeed i n a diverse s e r i e s of drugs, these workers found a l i n e a r r e l a t i o n s h i p between the logarithm of the potency of antagonism of calmodulin a c t i v a t i o n of phosphodiesterase and the l o g o c t a n o l : water p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t . The potent calmodulin i n h i b i t o r s are amphipathic compounds that contain large hydrophobic regions and carry a p o s i t i v e charge at n e u t r a l pH. The i n t e r a c t i o n s of these drugs w i t h calmodulin appear to i n v o l v e two processes: There i s the hydrophobic i n t e r a c t i o n between l i p o p h i l i c p o r t i o n s of the drug and non-polar regions of calmodulin and an e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n o c c u r r i n g between a p o s i t i v e l y charged group on the drug and a n e g a t i v e l y charged a c i d i c residue on calmodulin (Weiss et^ al^ 1982). The s p e c i f i c i t y of phenothiazines f o r i n h i b i t i o n of calmodulin-mediated events has been a major concern of many i n v e s t i g a t o r s . I t i s now known that phenothiazines and other a n t i c a l m o d u l i n agents a l s o e f f e c t i v e l y block the a c t i v a t i o n of phosphodiesterase and e r y t h r o c y t e Ca 2 +-ATPase by a c i d i c phospholipids - 40 -a n d u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s ( G i e t z e n et^ a l 1 9 8 2 ) . P h e n o t h i a z i n e s h a v e b e e n s h o w n t o b i n d t o some " c a l m o d u l i n - l i k e " p r o t e i n s i s o l a t e d f r o m C h l a m y d o m o n a s f l a g e l l a ( V a n E l d i k ^ t a l 1 9 8 0 ) a n d r a t h e a r t ( M a c M a n u s 1 9 8 1 ) . P h e n o t h i a z i n e s a l s o h a v e a - a d r e n e r g i c a n d m u s c a r i n i c r e c e p t o r b l o c k i n g a c t i v i t i e s , a s w e l l a s s p e c i f i c d o p a m i n e a n d s e r o t o n i n b l o c k i n g a c t i v i t i e s ( R o u f o g a l i s 1 9 8 2 ) . T h u s d e s p i t e t h e i r u s e f u l n e s s a s t o o l s i n s t u d y i n g c a l m o d u l i n a c t i v a t i o n o f v a r i o u s e n z y m e s y s t e m s i n v i t r o , t h e r e l a t i o n s h i p o f t h e s e e f f e c t s t o t h e i r m e c h a n i s m o f a c t i o n in_ v i v o i s u n c e r t a i n . 5. Objectives of the Present Study C a l c i u m i o n s p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e s t i m u l a t i o n o f e n z y m e s e c r e t i o n f r o m t h e e x o c r i n e p a n c r e a s . I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t a s e c r e t a g o g u e - i n d u c e d r i s e i n c y t o s o l i c f r e e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n t r i g g e r s e n z y m e r e l e a s e f r o m p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s ( S c h u l z 1 9 8 0 ; W i l l i a m s 1 9 8 0 ; O ' D o h e r t y a n d S t a r k 1 9 8 2 ; D o r m e r 1 9 8 3 ) . T h e r e f o r e , t h e p r e c i s e r e g u l a t i o n o f c y t o s o l i c f r e e c a l c i u m i s c r i t i c a l f o r t h e p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n o f t h e a c i n a r c e l l . I n a n u m b e r o f d i f f e r e n t 2+ 2+ c e l l t y p e s , a p l a s m a membrane Ca - A T P a s e a n d a s s o c i a t e d Ca - t r a n s p o r t h a s b e e n s h o w n t o be r e s p o n s i b l e f o r m a i n t e n a n c e o f l o w i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n s ( S c h a t z m a n n a n d V i n c e n z i 1 9 6 9 ; C a r o n i a n d C a r a f o l i 1 9 8 1 ; M c D o n a l d e t a l 1 9 8 2 ) . 2+ A Ca - A T P a s e a c t i v i t y h a s b e e n d e s c r i b e d i n p l a s m a m e m b r a n e - e n r i c h e d f r a c t i o n s p r e p a r e d f r o m p a n c r e a t i c t i s s u e h o m o g e n a t e s ( M i l u t i n o v i c e t a l 1 9 7 7 ) . V a r i o u s i n v e s t i g a t o r s ( F o r g e t a n d H e i s l e r - 41 -1 9 7 6 ; L a m b e r t a n d C h r i s t o p h e 1 9 7 8 ; L e B e l e t a l 1 9 8 0 ; M a r t i n a n d S e n i o r 1 9 8 0 ) h a v e s h o w n t h a t t h i s e n z y m e i s s t i m u l a t e d b y b o t h Ca a n d Mg t o a s i m i l a r e x t e n t . I t wa s n o t p o s s i b l e t h o u g h t o d e t e r m i n e t h e e x a c t c e l l u l a r o r i g i n o f t h e p l a s m a memb rane f r a c t i o n i n t h e p r e p a r a t i o n s u s e d s i n c e t h e p a n c r e a s i s a m u l t i c e l l u l a r o r g a n . M o r e o v e r , t h e r e i s n o r e p o r t o n t h e mode o f r e g u l a t i o n o f t h i s e n z y m e . T h e r e f o r e t h e o b j e c t i v e s o f t h e p r e s e n t s t u d y a r e : 2+ 1 . D e t e r m i n a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a p o s s i b l e Ca - A T P a s e a c t i v i t y i n p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l p l a s m a m e m b r a n e s . 2 . D e t e r m i n a t i o n o f t h e m e c h a n i s m o f r e g u l a t i o n o f t h i s e n z y m e b y i n v e s t i g a t i n g t h e e f f e c t s o f c a l m o d u l i n , a n d a c i d i c p h o s p h o l i p i d s . 24-3 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f Ca - t r a n s p o r t p r o c e s s e s i n v e s i c l e s p r e p a r e d f r o m p a n c r e a t i c a c i n a r m e m b r a n e s . 24-4 . D e t e r m i n a t i o n o f t h e p o s s i b l e r e l a t i o n s h i p o f Ca - A T P a s e a n d 24-Ca - t r a n s p o r t t o a m y l a s e s e c r e t i o n b y -a . i n v e s t i g a t i o n o f t h e e f f e c t o f p h e n o t h i a z i n e s ( a n t i c a l m o d u l i n d r u g s ) o n a m y l a s e r e l e a s e f r o m p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s a n d , b . i d e n t i f i c a t i o n o f t h e o r i e n t a t i o n o f t h e c a t a l y t i c s i t e o f 24-t h e Ca - t r a n s p o r t p r o c e s s i n t h e i n t a c t a c i n a r c e l l . - 42 -MATERIALS AND METHODS I. MATERIALS T h e c h e m i c a l s a n d / o r p r o t e i n s w e r e p u r c h a s e d f r o m t h e f o l l o w i n g s o u r c e s : 1 . S i g m a C h e m i c a l C o . C o l l a g e n a s e C a r b a m y l c h o l i n e c h l o r i d e ( C a r b a c h o l ) P a n c r e o z y m i n S e c r e t i n S o y b e a n t r y p s i n i n h i b i t o r T y p e I - S A p r o t i n i n A s c o r b i c a c i d EGTA EDTA T r i s - A T P 2 - M e r c a p t o e t h a n o l C a r d i o l i p i n P h o s p h a t i d y l s e r i n e P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l P h o s p h a t i d y l c h o l i n e O l e i c a c i d C o m p o u n d 4 8 / 8 0 - 43 -T r i s b a s e T r i s h y d r o c h l o r i d e T r i t o n X - 1 0 0 G l u c o s e L i t h i u m d o d e c y l s u l p h a t e C h l o r p r o m a z i n e B o v i n e s e r u m a l b u m i n S o d i u m a z i d e T r i c h l o r o a c e t i c a c i d H y d r o x y l a m i n e m o n o h y d r o c h l o r i d e B r o m p h e n o l b l u e 2 . A m e r s h a m [ Y 3 2 P ] - A T P ( S p e c i f i c a c t i v i t y = 5 - 1 0 x 1 0 6 DPM/p .mo l e ) 1 + 5 C a C l 2 ( S p e c i f i c a c t i v i t y = 1 . 5 x 1 0 6 C P M / u r a o l e ) 3 . C a l b i o c h e m C a l m o d u l i n A d e n y l 3 1 , 5 ' - a d e n o s i n e 4 . S m i t h , K l i n e a n d F r e n c h T r i f l u o p e r a z i n e ( a g i f t ) 5 . G r a n d I s l a n d B i o l o g i c a l C o . M i n i m u m E a g l e s m e d i u m a m i n o a c i d s T r y p a n b l u e - 44 -6 . BDH B i o c h e m i c a l s S o d i u m d o d e c y l s u l p h a t e C a l c i u m c h l o r i d e 7 . B i o - R a d A c r y l a m i d e N , N ' - m e t h y l e n e - b i s a c r y l a m i d e C o o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e R - 2 5 0 Ammon ium p e r s u l p h a t e 8 . F i s h e r S c i e n t i f i c C o . S o d i u m c h l o r i d e S o d i u m p h o s p h a t e m o n o b a s i c ( N a ^ P O ^ ) S o d i u m p h o s p h a t e d i b a s i c ( N a 2 H P 0 i t ) L a n t h a n u m c h l o r i d e H y d r o c h l o r i c a c i d ( H C 1 ) G l a c i a l a c e t i c a c i d ( C H 3 C 0 0 H ) 9 . MCB M a n u f a c t u r i n g A s o l e c t i n 1 0 . B o e h r i n g e r - M a n n h e i m H y a l u r o n i d a s e II. METHODS 1. Preparation of Dispersed Rat Pancreatic Acinar Cells T h e c e l l s w e r e i s o l a t e d by t h e m e t h o d o f K o n d o a n d S c h u l t z ( 1 9 7 6 a ) a s m o d i f i e d b y C h a u v e l o t ejt a l _ ( 1 9 7 9 ) . P a n c r e a s was o b t a i n e d f r o m r a t s , k i l l e d b y a b l o w t o t h e n e c k . A l l t h e s t e p s i n t h e i s o l a t i o n o f t h e c e l l s w e r e d o n e u s i n g a K r e b s - R i n g e r - b i c a r b o n a t e ( K R B ) s o l u t i o n e q u i l i b r a t e d w i t h 95% 0 2 a n d 5% C 0 2 c o n t a i n i n g 15 mM g l u c o s e a n d 0 . 3 6 mg s o y b e a n t r y p s i n i n h i b i t o r p e r m l . ( a ) F i r s t d i g e s t i o n : t h e p a n c r e a s wa s t r i m m e d f r e e o f f a t a n d m e s e n t e r y a n d 10 m l o f t h e e n z y m e m i x t u r e ( 0 . 9 mg o f c r u d e c o l l a g e n a s e / m l a n d 1 . 5 mg h y a l u r o n i d a s e / m l i n KRB s o l u t i o n c o n t a i n i n g 2+ 2+ 0 . 1 mM C a a n d 1.2 mM Mg ) was i n o c u l a t e d i n t o t h e i n t e r s t i t i u m o f t h e t i s s u e b y mean s o f a 1 m l s y r i n g e w i t h a 25 g a u g e 5 / 8 n e e d l e . T h e d i s t e n d e d g l a n d a n d e x c e s s e n z y m e s o l u t i o n was t r a n s f e r r e d t o a s i l i c o n i z e d 100 m l E r l e n m e y e r f l a s k , e q u i l i b r a t e d w i t h 95% 0 2 a n d 5% C 0 2 a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 15 m i n . w i t h a g i t a t i o n a t 108 o s c i l l a t i o n s / m i n . ( b ) R e m o v a l a n d r e p l a c e m e n t o f d i v a l e n t c a t i o n s : t h e s u p e r n a t a n t w a s d e c a n t e d a n d t h e t i s s u e t h e n i n c u b a t e d t w i c e f o r 5 m i n . a t 3 7 ° C i n 20 m l o f KRB s o l u t i o n w i t h o u t C a 2 + a n d M g 2 + a n d c o n t a i n i n g 2 mM E D T A . D i v a l e n t c a t i o n s w e r e s u b s e q u e n t l y a d d e d b a c k by b r i e f l y w a s h i n g t h e 2+ t i s s u e t w i c e w i t h 20 m l o f KRB s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 1 mM Ca a n d 1 . 2 mM M g 2 + . 2+ ( c ) S e c o n d d i g e s t i o n : f r e s h c o l l a g e n a s e ( 1 0 m l w i t h 0 . 1 mM C a - 46 -a n d 1 .2 mM Mg ) a t c o n c e n t r a t i o n o f 1 . 5 m g / m l was a d d e d a n d t h e c e l l s i n c u b a t e d f o r 25 - 30 m i n . a t 3 7 ° C . ( d ) F i n a l d i s s o c i a t i o n a n d h a r v e s t i n g o f t h e c e l l s : T h e c e l l s w e r e d i s s o c i a t e d by s e q u e n t i a l p a s s a g e ( t w o t i m e s ) t h r o u g h E p p e n d o r f 1 m l p i p e t t e s w i t h t i p s c u t t o d i a m e t e r s 3 mm a n d 1 . 5 mm r e s p e c t i v e l y . T h e i s o l a t e d c e l l s w e r e f i l t e r e d two t i m e s t h r o u g h n y l o n f i l t e r ( 1 4 9 um, C o l e - P a r m e r ) a n d l a y e r e d i n c e n t r i f u g e t u b e s o v e r 10 m l c o l u m n s o f KRB s o l u t i o n w i t h 0 . 1 mM C a 2 + a n d 1 .2 mM M g 2 + c o n t a i n i n g 4% b o v i n e s e r u m a l b u m i n . T h e t u b e s w e r e c e n t r i f u g e d a t 50 x g f o r 6 m i n . T h e c e l l s w e r e r e s u s p e n d e d i n 15 m l o f t h e same s o l u t i o n a n d c o u n t e d u s i n g a h e m a t o c y t o m e t e r . T h e c e l l s w e r e a g a i n c e n t r i f u g e d a n d t h e p e l l e t wa s f i n a l l y s u s p e n d e d i n KRB s o l u t i o n w i t h 0 . 1 mM C a 2 + , 1 .2 mM M g 2 + , 10 mM g l u c o s e , 10 m g / m l o f b o v i n e s e r u m a l b u m i n , 0 . 3 6 m g / m l t r y p s i n i n h i b i t o r a n d k e p t a t r o o m t e m p e r a t u r e . 2. Determination of the Insulin Content of Enzymatlcally Dispersed  Pancreatic Cells E n z y m a t l c a l l y d i s p e r s e d p a n c r e a t i c c e l l s a n d t h e p e l l e t o b t a i n e d f r o m t h e f i n a l c e n t r i f u g a t i o n s t e p d e s c r i b e d a b o v e w e r e w a s h e d t w i c e i n a 20 mM T r i s - H C l b u f f e r ( p H 7 . 5 ) c o n t a i n i n g 154 mM N a C l a n d t h e n h o m o g e n i z e d i n t h e same b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 1% T r i t o n X - 1 0 0 a n d 5 M u r e a . T h e c e l l u l a r h o m o g e n a t e was c e n t r i f u g e d a t 3 0 0 0 x g f o r 30 m i n a n d t h e s u p e r n a t a n t a s s a y e d f o r i n s u l i n u s i n g an i n s u l i n 125 [ I ] r a d i o i m m u n o a s s a y k i t ( B e c t o n D i c k i n s o n ) . - 47 -3. Cytochemlcal Staining of Pancreatic Acinar Cells T h e p e l l e t f r o m t h e 4% B S A c e n t r i f u g a t i o n s t e p was e m b e d d e d i n t o a p i e c e o f m u s c l e t i s s u e . T h e t i s s u e was m o u n t e d o n a c o r k d i s c b y m e a n s o f T a g a c a n t gum a n d q u i c k l y f r o z e n i n i s o p e n t a n e ( 2 - m e t h y l b u t a n e ) s i t t i n g i n a f l a s k o f l i q u i d n i t r o g e n . The f r o z e n t i s s u e wa s t h e n k e p t a t - 3 0 ° C f o r 3 h o u r s f o l l o w i n g w h i c h i t was s e c t i o n e d i n a c r y o s t a t ( D e m o n / I E C D i v i s i o n ) a n d m o u n t e d o n g l a s s s l i d e s . S e c t i o n s w e r e s t a i n e d i n C o x - L i l l i e - M e y e r h a e m a t o x y l i n f o r 3 - 6 m i n , w a s h e d t h r e e t i m e s i n t a p w a t e r a n d t h e n s t a i n e d f o r a n o t h e r m i n u t e w i t h 1% e o s i n . T h i s w a s f o l l o w e d b y d e h y d r a t i o n t h r o u g h a l c o h o l s , c l e a r e d i n x y l e n e a n d t h e n m o u n t e d . 4. Measurement of Amylase Release from Acinar Cells C e l l s w e r e r e s u s p e n d e d i n KRB s o l u t i o n c o n t a i n i n g 2 . 5 mM C a 2 + , 1 .2 mM Mg , 10 mM g l u c o s e , 10 m g / m l b o v i n e s e r u m a l b u m i n a n d 0 . 1 2 m g / m l s o y b e a n t r y p s i n i n h i b i t o r a t a c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 5 x 1 0 6 c e l l s / m l i n a f i n a l v o l u m e o f 2 . 5 m i s . T h e c e l l s w e r e i n c u b a t e d i n a 10 m l s i l i c o n i z e d E r l e n m e y e r f l a s k a t 3 7 ° C i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f s e c r e t a g o g u e s a n d o t h e r d r u g s . A t d i f f e r e n t p e r i o d s o f i n c u b a t i o n , 100 L i l a l i q u o t s w e r e t a k e n i n t o m i c r o c e n t r i f u g e t u b e s a n d c e n t r i f u g e d ( E p p e n d o r f C e n t r i f u g e M o d e l 3 2 0 0 ) a t 1 0 , 0 0 0 r pm f o r 45 s e c . A l i q u o t s o f 50 u l w e r e t r a n s f e r r e d t o 9 5 0 u l o f h y p o t o n i c m e d i u m c o n s i s t i n g o f 1 m g / m l b o v i n e s e r u m a l b u m i n a n d 1 m g / m l s o d i u m d o d e c y l s u l p h a t e ( S D S ) i n 10 mM p h o s p h a t e b u f f e r pH 7 . 4 . T h e n a 50 u l a l i q u o t was a s s a y e d f o r a m y l a s e u s i n g t h e P h a d e b a s ( P h a r m a c i a ) K i t . To d e t e r m i n e t o t a l a m y l a s e , - 48 -50 u l o f t h e c e l l s u s p e n s i o n was a d d e d t o 9 . 9 5 m l o f h y p o t o n i c m e d i u m a n d v o r t e x e d v i g o r o u s l y . A 50 u l a l i q u o t was t h e n a s s a y e d f o r a m y l a s e . A m y l a s e r e l e a s e d wa s e x p r e s s e d a s a p e r c e n t a g e o f t o t a l a m y l a s e : U n i t s a m y l a s e t - U n i t s a m y l a s e t % R e l e a s e = — „ ; - — ; x D i l u t i o n F a c t o r x 100 U n i t s a m y l a s e i n c e l l l y s a t e w h e r e t n = t i m e a t e n d o f i n c u b a t i o n t Q = z e r o t i m e s a m p l e 5. Preparation of Pancreatic Acinar Plasma Membranes P l a s m a m e m b r a n e s w e r e p r e p a r e d f r o m a c i n a r c e l l s a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f S v o b o d a e t al ( 1 9 7 6 ) w i t h s l i g h t m o d i f i c a t i o n s . T h e c e l l s w e r e h o m o g e n i z e d i n a g l a s s - t e f l o n h o m o g e n i z e r a t 9 0 0 r e v / m i n f o r 1 m i n i n a c o l d b u f f e r ( 2 - 4 ° C ) c o n s i s t i n g o f 10 mM T r i s - H C l ( p H 7 . 4 ) , 0 . 3 M s u c r o s e , 5 mM 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , A p r o t i n i n ( 5 0 0 k a l l i k r e i n i n a c t i v a t o r u n i t s / m l ) , 1 mM EDTA a n d 2 mM M g C l 2 « T h e h o m o g e n a t e wa s f u r t h e r d i l u t e d w i t h 120 m l o f b u f f e r , f i l t e r e d t h r o u g h two l a y e r s o f c h e e s e c l o t h a n d c e n t r i f u g e d a t 180 x g f o r 10 m i n . The s u p e r n a t a n t was c e n t r i f u g e d a g a i n a t 1 5 0 0 0 x g f o r 15 m i n a n d t h e r e s u l t i n g p e l l e t wa s r e s u s p e n d e d i n 15 m l o f b u f f e r c o n t a i n i n g 2 mM E D T A . T h e n 6 m l o f t h i s s u s p e n s i o n wa s l a y e r e d o n t o p o f a d i s c o n t i n u o u s s u c r o s e d e n s i t y g r a d i e n t o f 27%, 35% a n d 38% ( w / w ) s u c r o s e a n d c e n t r i f u g e d a t 2 5 , 0 0 0 r pm f o r 3 h i n a B e c k m a n U l t r a c e n t r i f u g e ( M o d e l L 5 - 5 0 ) w i t h SW 27 r o t o r . V a r i o u s f r a c t i o n s w e r e a s p i r a t e d , d i l u t e d w i t h s u c r o s e - f r e e b u f f e r a n d - 49 -c e n t r i f u g e d a t 7 0 , 0 0 0 x g f o r 3 5 m i n . T h e f i n a l p e l l e t was r e s u s p e n d e d i n s u c r o s e - f r e e b u f f e r a n d u s e d i m m e d i a t e l y o r s t o r e d f r o z e n a t - 8 0 ° C . 6. Treatment of Membranes with EDTA T h e membrane p r e p a r a t i o n ( 1 - 2 m g / m l ) was d i l u t e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f b u f f e r c o n t a i n i n g 1 mM T r i s EDTA ( p H 8 . 0 ) a n d i n c u b a t e d f o r 30 m i n a t 3 7 ° C . A f t e r c o o l i n g o n i c e , t h e s u s p e n s i o n wa s c e n t r i f u g e d a t 2 0 , 0 0 0 x g f o r 20 m i n . T h e p e l l e t was w a s h e d t w i c e a n d r e s u s p e n d e d i n t h e o r i g i n a l v o l u m e o f b u f f e r . 7. Measurement of Divalent Cations i n Membrane Preparations C a l c i u m a n d m a g n e s i u m w e r e e x t r a c t e d f r o m memb rane p r e p a r a t i o n s b y t h e m e t h o d o f S p a r r o w a n d J o h n s t o n e ( 1 9 6 4 ) . T h i s i n v o l v e d t r e a t i n g t h e memb r ane p r e p a r a t i o n s w i t h a s o l u t i o n o f 0 . 6 M t r i c h l o r o a c e t i c a c i d ( T C A ) : g l a c i a l a c e t i c a c i d m i x t u r e , 1 mM EDTA a n d 0 . 5 mM L a C l 3 . T h e s u s p e n s i o n was c e n t r i f u g e d a t 2 0 , 0 0 0 x g f o r 35 m i n a n d t h e s u p e r n a t a n t was c o l l e c t e d f o r a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o m e t r y i n a T e c h t r o n AA5 s p e c t r o p h o t o m e t e r a t 4 2 2 . 8 nm , u s i n g n i t r o u s o x i d e - a c e t y l e n e f o r c a l c i u m o r a t 2 8 5 . 2 nm , u s i n g a c e t y l e n e f o r m a g n e s i u m . T h e s t a n d a r d s c o n t a i n e d i d e n t i c a l c o n c e n t r a t i o n s o f T C A : g l a c i a l a c e t i c a c i d m i x t u r e , L a C l 3 a n d EDTA ; t h e s t a n d a r d c u r v e wa s l i n e a r f r o m 0 - 2 0 uM . 8. Determination of Calmodulin Content of Plasma Membrane Preparations P l a s m a membrane p r e p a r a t i o n s (2 m g / m l ) w e r e b o i l e d f o r 5 m i n i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 2 mM E G T A . A f t e r c o o l i n g on i c e , c a l c i u m was a d d e d t o - 50 -c h e l a t e t h e EGTA a n d t h e s o l u t i o n wa s c e n t r i f u g e d a t 7 0 , 0 0 0 x g f o r 3 0 m i n . T h e s u p e r n a t a n t was t h e n a s s a y e d f o r c a l m o d u l i n u s i n g a c a l m o d u l i n [ I ] r a d i o i m m u n o a s s a y k i t (New E n g l a n d N u c l e a r ) . 9. Enzyme Assays a. Measurement of Ca2+-ATPase Activity: C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y was d e t e r m i n e d i n a 0 . 2 5 m l m e d i u m c o n t a i n i n g 48 mM T r i s - H C l pH 7 . 4 , 0 . 0 6 mM EGTA [ E t h y l e n e g l y c o l b i s ( p - a m i n o e t h y l e t h e r ) - N , N ' - t e t r a a c e t i c a c i d ] , 0 . 1 mM o u a b a i n , 2 mM N a N 3 , 0 . 0 7 m l o f memb rane p r e p a r a t i o n ( 0 . 7 - 1 . 0 m g / m l ) a n d t h e d e s i r e d f r e e Ca a n d / o r Mg c o n c e n t r a t i o n . C a l m o d u l i n a n d / o r p h e n o t h i a z i n e s w e r e a d d e d t o t h i s m e d i u m w h e n r e q u i r e d . A f t e r p r e i n c u b a t i o n f o r 15 m i n a t 3 7 ° C , t h e a s s a y wa s s t a r t e d b y t h e a d d i t i o n o f 25 u l o f 5 mM A T P , a n d t h e r e a c t i o n was t e r m i n a t e d a f t e r 15 m i n b y t a k i n g 210 u l a l i q u o t s i n t o 0 . 5 m l o f 3% ( w / v ) s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ( S D S ) . A T P a s e a c t i v i t y was m e a s u r e d b y d e t e r m i n i n g P i r e l e a s e d b y a n a u t o m a t e d F i s k e a n d S u b b a r o w ( 1 9 2 5 ) p r o c e d u r e d e s c r i b e d b y R a e s s a n d V i n c e n z i ( 1 9 8 0 b ) . U n d e r t h e a s s a y c o n d i t i o n s , t h e e n z y m e a c t i v i t y was l i n e a r f o r a t l e a s t 30 m i n . b. Measurement of (Na + + K+j-ATPase Activity: ( N a + + K + ) - A T P a s e w a s a s s a y e d i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 75 mM T r i s - H C l b u f f e r pH 7 . 4 , 100 mM N a C l , 20 mM K C 1 , 3 mM M g C l 2 , 3 mM A T P , 0 . 1 mM EGTA a n d i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f 1 mM o u a b a i n . I n o r g a n i c p h o s p h a t e r e l e a s e d a f t e r 20 m i n i n c u b a t i o n was d e t e r m i n e d a s f o r C a 2 + - A T P a s e . ( N a + + K + ) - A T P a s e was d e f i n e d a s t h a t a c t i v i t y w h i c h wa s i n h i b i t e d b y o u a b a i n . c. Measurement of 5'-Nucleotidase Activity: 5 ' - N u c l e o t i d a s e a c t i v i t y was d e t e r m i n e d i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 100 mM T r i s - H C l ( p H - 51 -8 . 5 ) , 10 mM M g C l 2 , 10 mM 5 ' - A M P a n d 200 mM K C 1 . 5 ' - N u c l e o t i d a s e a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f 3 ' - A M P was s u b t r a c t e d f r o m t h e t o t a l 5 ' - N u c l e o t i d a s e i n t h e p r e s e n c e o f 5 ' - A M P t o a c c o u n t f o r n o n s p e c i f i c p h o s p h a t a s e a c t i v i t y . d. Measurement of Cytochrome c Oxidase Activity: C y t o c h r o m e c o x i d a s e a c t i v i t y wa s m e a s u r e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y u s i n g t h e m e t h o d o f W h a r t o n a n d T z a g a l o f f ( 1 9 6 7 ) . To e a c h o f 2 c u v e t t e s , 100 u l o f 10 uM p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r , pH 7 . 0 , 70 u l 1% f e r r o c y t o c h r o m e c , a n d 0 . 8 3 m l o f w a t e r was a d d e d . The f e r r o c y t o c h r o m e c was r e d u c e d w i t h a s c o r b i c a c i d a n d d i a l y z e d o v e r n i g h t p r i o r t o i t s a d d i t i o n t o t h e r e a c t i o n m e d i u m . T e n u l o f 0 . 1 M p o t a s s i u m f e r r o c y a n a t e was a d d e d t o t h e " b l a n k " c u v e t t e i n o r d e r t o o x i d i z e t h e f e r r o c y t o c h r o m e p r e s e n t . B o t h c u v e t t e s w e r e i n c u b a t e d f o r 10 m i n u t e s a t 3 7 ° C a t w h i c h t i m e t h e r e a c t i o n was i n i t i a t e d b y t h e a d d i t i o n o f 10 u l o f t h e membrane p r e p a r a t i o n ( a p p r o x i m a t e l y 5 ug p r o t e i n ) t o t h e " r e a c t i o n " c u v e t t e . T h e d e c r e a s e i n a b s o r b a n c e a t 5 5 0 nm was u s e d a s a n i n d e x o f t h e r a t e o f o x i d a t i o n o f f e r r o c y t o c h r o m e c a n d was m o n i t o r e d f o r 3 m i n u t e s . C y t o c h r o m e c O x i d a s e a c t i v i t y o f t h e memb rane p r e p a r a t i o n was d e t e r m i n e d u s i n g t h e f o l l o w i n g f i r s t o r d e r r a t e e q u a t i o n s : ( a b s o r b a n c e a t t i m e 0 ) m i n ( a b s o r b a n c e a t 1 m i n u t e ) _ 1 k = I n S p e c i f i c A c t i v i t y ( c o n c e n t r a t i o n o f c y t o c h r o m e c ) ( c o n c e n t r a t i o n o f p r o t e i n ) The s p e c i f i c a c t i v i t y was e x p r e s s e d a s n m o l e o f c y t o c h r o m e c o x i d i z e d p e r mg p r o t e i n p e r m i n u t e . - 52 -e. Measurement of Lactate Dehydrogenase Activity: A c i n a r c e l l s u s p e n s i o n s ( 1 0 6 c e l l s / m l ) o r c e l l s t h a t h a d b e e n d i s r u p t e d b y f r e e z i n g a n d t h a w i n g w e r e c e n t r i f u g e d ( E p p e n d o r f C e n t r i f u g e M o d e l 3 2 0 0 ) a t 1 0 , 0 0 0 r p m f o r 4 5 s e c a n d t h e s u p e r n a t a n t a s s a y e d f o r l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y . L a c t a t e d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y was m e a s u r e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y u s i n g t h e m e t h o d o f K o r n b e r g ( 1 9 5 5 ) : t o a 3 - m l c a p a c i t y c u v e t t e wa s a d d e d 0 . 1 m l o f 10 mM s o d i u m p y r u v a t e , 0 . 1 m l o f 2 uM NADH, 1 .0 m l o f 100 mM p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 4 ) a n d 1 . 75 m l w a t e r . T h e ' b l a n k ' c u v e t t e w a s s i m i l a r l y t r e a t e d e x c e p t t h a t 0 . 1 m l b u f f e r was a d d e d i n s t e a d o f NADH . B o t h c u v e t t e s w e r e i n c u b a t e d f o r 10 m i n a t 3 7 ° C a n d t h e r e a c t i o n was s t a r t e d b y t h e a d d i t i o n o f 50 u l o f c e l l e x t r a c t . T h e d e c r e a s e i n a b s o r b a n c e a t 340 nm was u s e d a s a n i n d e x o f t h e r a t e o f o x i d a t i o n o f NADH a n d wa s m o n i t o r e d f o r 3 m i n . One u n i t o f e n z y m e i s d e f i n e d a s t h a t a m o u n t w h i c h c a u s e s a n i n i t i a l r a t e o f o x i d a t i o n o f 1 u m o l e o f NADH p e r m i n u t e u s i n g a n e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t o f 6 . 2 2 . S p e c i f i c a c t i v i t y was e x p r e s s e d a s u m o l e s p e r m i l l i g r a m o f p r o t e i n . 10. Preparation of Phospholipid Dispersions A l i q u o t s o f c h l o r o f o r m s o l u t i o n s o f t h e l i p i d s w e r e e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r a s t r e a m o f n i t r o g e n a n d t h e n r e c o n s t i t u t e d i n 48 mM T r i s - H C l ( p H 7 . 4 ) b y s o n i c a t i o n f o r 3 m i n i n a B r a u n s o n i c 1 510 u l t r a s o n i c a t o r a t max imum p o w e r . T h e t r a n s l u c e n t s o l u t i o n o b t a i n e d w a s c e n t r i f u g e d a t 3 0 0 0 x g f o r 30 m i n t o r e m o v e s m a l l m e t a l p a r t i c l e s a n d l a r g e a g g r e g a t e s o f p h o s p h o l i p i d s . - 53 -11. Measurement of Ca -Transport Ac t i v i t i e s a. Measurement of Calcium Efflux from Plasma Membrane Vesicle  Preparations: V e s i c l e s w e r e p r e p a r e d f r o m membrane p r e p a r a t i o n s b y t h e m e t h o d o f S c h u l z a n d H e i l ( 1 9 7 9 ) e x c e p t t h a t 0 . 3 M s u c r o s e was u s e d i n s t e a d o f m a n n i t o l s i n c e i t was o b s e r v e d t h a t m a n n i t o l i n t e r f e r e d w i t h t h e c o l o r i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f i n o r g a n i c p h o s p h a t e . F o r p r e l o a d i n g , p l a s m a m e m b r a n e s w e r e h o m o g e n i z e d 5 t i m e s w i t h a h a n d h o m o g e n i z e r a n d v e s i c u l a t e d i n a m e d i u m c o n t a i n i n g 0 . 3 M s u c r o s e , 20 mM T r i - H C l b u f f e r ( p H 7 . 4 ) , 100 mM K C 1 , 5 mM M g C l 2 , 2 mM N a N 3 , 5 mM T r i s A T P , t h e d e s i r e d f r e e C a 2 + c o n c e n t r a t i o n , t * 5 C a C l 2 ( 1 0 u C i / m m o l ) a n d k e p t a t 4 °C f o r 18 h o u r s . To d e t e r m i n e C a 2 + e f f l u x ; 50 u l o f t h e p r e l o a d e d v e s i c l e s ( 2 - 3 m g / m l ) w e r e t r a n s f e r r e d t o 1 . 4 5 m l o f a n o n - r a d i o a c t i v e s u c r o s e b u f f e r a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C . A t v a r i o u s t i m e d i n t e r v a l s , a l i q u o t s o f 50 u l w e r e f i l t e r e d t h r o u g h p r e s o a k e d 0 . 4 5 urn membrane f i l t e r s ( M i l l i p o r e C o . ) u n d e r v a c u u m , a n d t h e f i l t e r s w a s h e d w i t h t w o 5 m l p o r t i o n s o f s u c r o s e b u f f e r c o n t a i n i n g 1 . 2 mM L a C l 3 . T h e d r i e d f i l t e r s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d t o v i a l s a n d t h e r a d i o a c t i v i t y p r e s e n t d e t e r m i n e d by l i q u i d s c i n t i l l a t i o n s p e c t r o p h o t o m e t r y i n A q u a s o l (New E n g l a n d N u c l e a r ) . B l a n k s i n t h e a b s e n c e o f p a n c r e a t i c m e m b r a n e s w e r e d e t e r m i n e d i n a s i m i l a r m a n n e r a n d a n y a c t i v i t y o b t a i n e d s u b t r a c t e d f r o m t h e e x p e r i m e n t a l v a l u e s . 2+ b. Measurement of Ca -Uptake by Plasma Membrane Vesicle  Preparations: V e s i c l e s w e r e p r e p a r e d i n 0 . 3 M s u c r o s e a s d e s c r i b e d a b o v e . T h e s e a l e d v e s i c l e s w e r e t h e n s u s p e n d e d i n a s u c r o s e b u f f e r c o n t a i n i n g 20 mM T r i s H C l - b u f f e r ( p H 7 . 4 ) , 100 mM K C 1 , 0 . 1 mM M g C l 2 , 2 - 54 -mM N a N 3 , t h e d e s i r e d f r e e C a c o n c e n t r a t i o n , CaCl2 ( 1 0 C i / m m o l e ) a n d 5 mM T r i s ATP i n a t o t a l v o l u m e o f 1 .0 m l . B e c a u s e o f t h e h i g h n o n - s p e c i f i c b i n d i n g o f c a l c i u m t o t h e memb rane v e s i c l e s , t h e r e a c t i o n 45 a t 37 C was s t a r t e d by t h e a d d i t i o n o f CaCl2. A t t i m e d i n t e r v a l s , 5 0 u l a l i q u o t s w e r e t r a n s f e r r e d t o 1 m l i c e - c o l d s u c r o s e b u f f e r c o n t a i n i n g 2 mM EGTA b e f o r e f i l t r a t i o n . S u b s e q u e n t s t e p s a r e s i m i l a r t o t h o s e d e s c r i b e d a b o v e . I t wa s o b s e r v e d t h a t t h e EGTA t r e a t m e n t w h i c h r e m o v e s 2+ 2+ b o u n d Ca r e s u l t e d i n h i g h e r Ca u p t a k e r a t e s . 12. Calmodulin Gel Overlay Technique T h e c a l m o d u l i n g e l o v e r l a y t e c h n i q u e wa s p e r f o r m e d u s i n g a m o d i f i c a t i o n o f t h e p r o c e d u r e u s e d b y C a r l i n et^ a l^ ( 1 9 8 1 ) : F o l l o w i n g SDS g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( 2 0 0 \ig p r o t e i n / l a n e , 5-20% g r a d i e n t ) o f p a n c r e a t i c p l a s m a membrane f r a c t i o n s , t h e g e l s w e r e w a s h e d i n a s o l u t i o n o f 25% ( v / v ) i s o p r o p a n o l a n d 10% ( v / v ) a c e t i c a c i d t o r e m o v e S D S . T h e s o l u t i o n was c h a n g e d f o u r t i m e s i n a 2 h o u r p e r i o d . F o l l o w i n g t w o , 5 m i n i n c u b a t i o n s i n d i s t i l l e d w a t e r , t h e g e l s w e r e s o a k e d f o r 30 m i n i n a d e n a t u r i n g b u f f e r ( 0 . 1 5 M N a C l , 20% ( v / v ) g l y c e r o l , 1 mM m a g n e s i u m a c e t a t e , 1 mM d i t h i o t h r e i t o l , 0 . 1 mM E D T A , 0 . 1 m g / m l b o v i n e s e r u m a l b u m i n , 5 0 mM T r i s - H C l , pH 7 . 5 ) s u p p l e m e n t e d w i t h 6 M g u a n i d i n e - H C l . T h e g e l s w e r e t h e n c o n t i n u o u s l y w a s h e d f o r a t l e a s t 24 h o u r s i n t h e a b o v e b u f f e r , w i t h o u t g u a n i d i n e - H C l , p r i o r t o e q u i l i b r a t i o n f o r 12 h o u r s i n b u f f e r A ( 0 . 1 5 M N a C l , 1 mM m a g n e s i u m a c e t a t e , 1 mM CaCl2, 1 mM d i t h i o t h r e i t o l , 0 . 1 mM E D T A , 10 m g / m l b o v i n e s e r u m a l b u m i n , 50 mM T r i s - H C l , pH 7 . 5 ) . T h e g e l s w e r e t h e n s o a k e d i n b u f f e r A c o n t a i n i n g - 55 -1 2 5 I - l a b e l e d c a l m o d u l i n ( 2 4 0 n M , I0k - 1 0 5 c p m / p m o l , 50 m l / s l a b ) f o r 24 h o u r s . N o n - s p e c i f i c a l l y b o u n d c a l m o d u l i n was r e m o v e d by c o n t i n u o u s w a s h i n g f o r 24 h o u r s i n b u f f e r A . C o n t r o l e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d i n w h i c h 5 mM EGTA was i n c l u d e d i n t h e f i n a l w a s h s o l u t i o n s . T h e g e l s w e r e d r i e d a n d t h e n s u b j e c t e d t o a u t o r a d i o g r a p h y . T o d e t e r m i n e m o l e c u l a r w e i g h t s , t h e l a n e s , c o n t a i n i n g a p p r o p r i a t e s t a n d a r d s , w e r e c u t f r o m t h e r e s t o f t h e g e l i m m e d i a t e l y f o l l o w i n g e l e c t r o p h o r e s i s a n d s t a i n e d b y C o o m a s s i e b l u e . Rp v a l u e s w e r e u s e d t o a s s i g n m o l e c u l a r w e i g h t s t o t h e c a l m o d u l i n - l a b e l e d b a n d s . 13. Measurement of Acyl-Phosphoproteln Formation M e m b r a n e - A T P a s e p h o s p h o p r o t e i n wa s m e a s u r e d b y t h e m e t h o d o f K a t z a n d B l o s t e i n ( 1 9 7 5 ) . P a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a m e m b r a n e s ( 1 3 0 u g / 1 0 0 u l f i n a l i n c u b a t i o n v o l u m e ) w e r e i n c u b a t e d f o r 1 5 s a t 10°C i n a m e d i u m c o n t a i n i n g 48 mM T r i s - H C l ( p H 7 . 4 ) , 0 . 1 mM o u a b a i n , 2 uM [ y - 3 2 P ] ATP ( 1 0 0 0 - 3 0 0 0 c p m / p m o l ) , 60 uM EGTA i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f 0 . 4 mM 2+ m a g n e s i u m a c e t a t e . When Ca was a d d e d i t was p r e s e n t i n a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 80 uM f r e e . T h e r e a c t i o n was s t a r t e d b y t h e a d d i t i o n o f m e m b r a n e s t o t h e r e a c t i o n m e d i u m . A f t e r 1 5 s t h e r e a c t i o n was t e r m i n a t e d b y t h e a d d i t i o n o f 45 u l o f ' s t o p ' s o l u t i o n c o n s i s t i n g o f 50 mM T r i s p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 . 5 ) , 5% l i t h i u m d o d e c y l s u l p h a t e ( L i D S ) , 30% u r e a , 0 . 5 mM d i t h i o t h r e i t o l a n d 0 . 0 0 2 % b r o m p h e n o l b l u e a s t h e t r a c k i n g d y e . To d e t e r m i n e t h e s t a b i l i t y o f t h e p h o s p h o p r o t e i n f o r m e d , s o m e s a m p l e s w e r e t r e a t e d w i t h 0 . 6 M h y d r o x y l a m i n e i n 0 . 8 M s o d i u m a c e t a t e ( pH 5 . 2 ) f o r 10 m i n a t 2 2 °C b e f o r e t h e a d d i t i o n o f t h e - 56 -' s t o p ' s o l u t i o n . T h e s a m p l e s ( 6 0 u l p e r l a n e ) w e r e t h e n a n a l y z e d b y a c i d - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o h o r e s i s . 14. Phosphorylation of Endogeneous Acinar Membrane Proteins P h o s p h o r y l a t i o n o f e n d o g e n o u s s u b s t r a t e p r o t e i n s was c a r r i e d o u t a t 3 0 ° C i n a 100 u l r e a c t i o n m i x t u r e c o n t a i n i n g 130 ug memb r ane p r o t e i n s , 3 2 0 . 1 mM d i t h i o t h r e i t o l , 10 mM m a g n e s i u m a c e t a t e , 0 . 5 mM [y P ] A T P ( 1 0 0 0 - 3 0 0 0 c p m / p m o l ) , 20 mM T r i s - H C l b u f f e r ( p H 7 . 0 ) i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f 90 uM C a 2 + , 2 . 2 mM EGTA o r 100 nM c a l m o d u l i n . A f t e r 5 m i n o f i n c u b a t i o n , t h e r e a c t i o n wa s t e r m i n a t e d b y t h e a d d i t i o n o f 45 u l o f ' s t o p ' s o l u t i o n c o n s i s t i n g o f 50 mM T r i s p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 . 8 ) , 5% S D S , 30% u r e a , 0 . 5 mM d i t h i o t h r e i t o l a n d 0 . 002% b r o m p h e n o l b l u e a s t h e t r a c k i n g d y e . T h e s a m p l e s ( 6 0 u l / l a n e ) w e r e t h e n a n a l y z e d b y SDS p o l y a c r y l a r a i d e g r a d i e n t g e l e l e c t r o p h o r e s i s . 15. Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Autoradiography of  Phosphorylated Plasma Membrane Preparations a. Gradient Gel Electrophoresis: P o l y a c r y l a m i d e g r a d i e n t ( 5 - 2 0 % ) g e l s o f 1 . 5 mm t h i c k n e s s w e r e c a s t a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f L a e m m l i a n d F a v r e ( 1 9 7 3 ) . T h e 5% ' r e s o l v i n g ' g e l c o n s i s t e d o f 3 . 3 3 m l o f a c r y l a m i d e - m e t h y l e n e - b i s a c r y l a m i d e (30%: 0 . 8%) m i x t u r e , 3 75 mM T r i s - H C l ( p H 8 . 8 ) , 1.35% g l y c e r o l , 0 . 1% S D S , 0 . 0 25% t e t r a e t h y l m e t h y l e n e d i a m i n e ( TEMED) a n d 0 . 4 m l ammon ium p e r s u l p h a t e ( 1 5 m g / m l ) i n a t o t a l o f 20 m l . The 20% ' r e s o l v i n g ' g e l c o n t a i n e d 1 3 . 3 3 m l o f a c r y l a m i d e - m e t h y l e n e -b i s a c r y l a m i d e (30%: 0 . 8%) m i x t u r e , 375 mM T r i s - H C l b u f f e r ( p H 8 . 8 ) , - 57 -5 . 75% g l y c e r o l , 0 . 1% S D S , 0 . 0 5% TEMED a n d 0 . 3 m l ammon ium p e r s u l p h a t e ( 1 5 m g / m l ) i n a t o t a l o f 20 m l . T h e 5% a n d t h e 20% ' r e s o l v i n g ' g e l s o l u t i o n s w e r e i m m e d i a t e l y a d d e d t o t h e g e l c h a m b e r w i t h t h e a i d o f a g r a d i e n t f o r m e r . A b o u t 2 m l o f b u f f e r was c a r e f u l l y l a y e r e d on t o p o f t h e g e l a n d t h e g e l wa s a l l o w e d t o p o l y m e r i z e f o r 12 h o u r s a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e b u f f e r wa s d e c a n t e d p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f t h e ' s t a c k i n g ' g e l . T he ' s t a c k i n g ' g e l (5%) c o n s i s t e d o f 1 . 25 m l o f a c r y l a m i d e - m e t h y l e n e - b i s a c r y l a m i d e (30%: 0 . 8%) m i x t u r e , 3 15 mM T r i s - H C l b u f f e r ( p H 6 . 8 ) , 0 . 1 % S D S , 0 . 1 3 6 % TEMED a n d 0 . 2 m l ammon ium p e r s u l p h a t e ( 1 5 m g / m l ) i n a t o t a l o f 7 . 3 m l . A f t e r m i x i n g , t h e ' s t a c k i n g ' g e l s o l u t i o n was g e n t l y p o u r e d i n t o t h e g e l c h a m b e r o v e r t h e p o l y m e r i z e d ' r e s o l v i n g ' g e l . A t e f l o n ' c o m b ' wa s t h e n i n s e r t e d i n t o t h e s t a c k i n g g e l a n d t h e g e l a l l o w e d t o p o l y m e r i z e f o r a t l e a s t 2 h o u r s . T r i s - G l y c i n e b u f f e r ( 2 5 mM T r i s - 1 9 2 mM G l y c i n e ) pH 8 . 3 c o n t a i n i n g 0 . 1 % SDS was a d d e d t o b o t h c h a m b e r s o f t h e e l e c t r o p h o r e s i s c e l l , f o l l o w e d b y t h e a p p l i c a t i o n o f 60 u l o f t h e p r o t e i n s a m p l e s t o t h e w e l l s c r e a t e d b y t h e t e f l o n ' c o m b ' u s i n g a 100 m l H a m i l t o n s y r i n g e a n d t h e g e l r u n a t 25 mA ( c o n s t a n t c u r r e n t ) f o r 12 h o u r s . T h e p r o t e i n s t a n d a r d s u s e d f o r e s t i m a t i o n o f m o l e c u l a r w e i g h t s ( i n d a l t o n s ) w e r e ; m y o s i n ( 2 0 0 , 0 0 0 ) , p - g a l a c t o s i d a s e ( 1 1 6 , 2 5 0 ) , p h o s j p h o r y l a s e ( 9 2 , 5 0 0 ) , b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( 6 6 , 2 0 0 ) , o v a l b u m i n ( 4 5 , 0 0 0 ) , c a r b o n i c a n h y d r a s e ( 3 1 , 0 0 0 ) , s o y b e a n t r y p s i n i n h i b i t o r ( 2 1 , 5 0 0 ) a n d l y s o z y m e ( 1 4 , 4 0 0 ) . b. Acld-Polyacrylamlde Gel Electrophoresis: T h e a c y l p h o s p h a t e 2+ i n t e r m e d i a t e o f p l a s m a memb rane Ca - A T P a s e was d e t e c t e d b y - 58 -a c i d - p o l y a c r y l a m i d e (8%) s l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f L i c h t n e r a n d W o l f ( 1 9 7 9 ) . T h e ' r e s o l v i n g ' g e l c o n s i s t e d o f 1 0 . 7 m l a c r y l a m i d e - m e t h y l e n e - b i s a c r y l a m i d e (30%: 0 .8%) m i x t u r e , 100 mM T r i s - p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) , 0 .2% l i t h i u m d o d e c y l s u l p h a t e ( L i D S ) , 0 . 0 8 5 % TEMED a n d 0 . 8 m l ammon ium p e r s u l p h a t e ( 1 5 m g / m l ) i n a t o t a l o f 40 m l . T he ' s t a c k i n g ' g e l (5%) c o n t a i n e d 1 . 25 m l o f a c r y l a r a i d e - m e t h y l e n e -b i s a c r y l a m i d e (30%: 0 . 8%) m i x t u r e , 125 mM T r i s - p h o s p h a t e b u f f e r ( pH 6 . 5 ) , 0 .2% L i D S , 0 . 13% TEMED a n d 0 . 3 m l ammon ium p e r s u l p h a t e ( 1 5 m g / m l ) i n a t o t a l o f 7 . 4 m l . P r o t e i n s a m p l e s ( 6 0 u l ) w e r e r u n i n a 0 . 2 M T r i s - p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) c o n t a i n i n g 0 .2% L i D S a t 4 ° C u n d e r t h e c o n s t a n t c u r r e n t ( 4 0 mA) f o r 7 h o u r s . T h e p r o t e i n s t a n d a r d s u s e d w e r e s i m i l a r t o t h o s e u s e d f o r t h e g r a d i e n t g e l s t u d i e s . c. Staining, destaining and Autoradiography: T h e g e l s w e r e s t a i n e d w i t h 0 . 2 5 % C o o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e i n m e t h a n o l / a c e t i c a c i d / w a t e r ( 5 : 1 : 4 ) f o r 30 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e , f o l l o w e d b y a f i r s t d e s t a i n i n g p r o c e d u r e i n m e t h a n o l / a c e t i c a c i d / w a t e r ( 4 5 : 9 : 4 6 ) f o r 1 h o u r (3 c h a n g e s ) a n d a s e c o n d d e s t a i n i n g p r o c e d u r e i n m e t h a n o l / a c e t i c a c i d / w a t e r ( 4 : 1 : 1 5 ) u n t i l t h e b a c k g r o u n d wa s t r a n s p a r e n t . P r i o r t o d r y i n g , t h e g e l s w e r e f i x e d i n a c e t i c a c i d / g l y c e r o l / w a t e r ( 1 0 : 3 : 8 7 ) f o r 3 0 m i n , t h e n 70% m e t h a n o l f o r 20 m i n . T h e g e l s w e r e i m m e d i a t e l y d r i e d u n d e r v a c u u m a t 8 0 ° C f o r 2 h o u r s . T h e d r i e d g e l s w e r e e x p o s e d t o X - r a y f i l m ( K o d a k M i n - R ) a l o n g w i t h a n i n t e n s i f y i n g s c r e e n ( C r o n e x L i g h t n i n g P l u s , D u P o n t ) f o r 7 - 1 6 d a y s a t - 8 0 ° C f o l l o w i n g w h i c h t h e f i l m s w e r e d e v e l o p e d . - 59 -16. Miscellaneous Methods a. Protein Assay: P a n c r e a t i c a c i n a r memb rane p r e p a r a t i o n s ( 1 0 - 1 5 0 ug p r o t e i n ) w e r e s u s p e n d e d i n d i s t i l l e d w a t e r t o a f i n a l v o l u m e o f 1 .5 m l . T o t h i s was a d d e d 1 2 . 5 u l o f a 2% d e o x y c h o l a t e s o l u t i o n . F o l l o w i n g a t e n m i n u t e i n c u b a t i o n a t r o o m t e m p e r a t u r e , 0 . 5 m l o f c o l d t r i c h l o r o a c e t i c a c i d (24%) wa s a d d e d t o p r e c i p i t a t e a n y p r o t e i n . T h e s u s p e n s i o n was c e n t r i f u g e d a t 3 0 0 0 x g f o r t h i r t y m i n u t e s , t h e s u p e r n a t a n t a s p i r a t e d , a n d t h e p e l l e t r e s u s p e n d e d i n w a t e r a n d a s s a y e d f o r p r o t e i n u s i n g t h e s t a n d a r d L o w r y ( 1 9 5 1 ) p r o t e i n a s s a y . B o v i n e s e r u m a l b u m i n w a s u s e d a s t h e s t a n d a r d p r o t e i n . b . S t a t i s t i c a l Analysis: S t u d e n t s " t " t e s t f o r u n p a i r e d , common v a r i a n c e d a t a wa s u s e d a s a m e a s u r e o f s i g n i f i c a n c e . S t a n d a r d e r r o r o f t h e mean ( S . E . M . ) wa s u s e d a s a m e a s u r e o f v a r i a t i o n . c . Determination of Free Calcium Concentrations: F r e e c a l c i u m v a l u e s w e r e c a l c u l a t e d u s i n g t h e F o r t r a n p r o g r a m CAT IONS ( G o l d s t e i n , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . T h e p r o g r a m c a l c u l a t e s t h e a p p a r e n t a s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f E G T A , EDTA a n d ATP f o r c a l c i u m a n d m a g n e s i u m , a d j u s t e d f o r t e m p e r a t u r e , pH a n d i o n i c s t r e n g t h . L o g a s s o c i a t i o n c o n s t a n t s u s e d w e r e f i r s t t o f o u r t h p r o t o n a s s o c i a t i o n w i t h E G T A : 9 . 2 3 5 , 8 . 6 1 5 , 2 . 6 6 0 , 2 . 0 0 0 ; C a E G T A : 1 0 . 6 3 0 , 5 . 1 9 0 : MgEGTA : 5 . 4 2 2 , 3 . 8 1 0 ; H A T P : 6 . 5 4 4 , 3 . 9 4 5 ; C a A T P : 3 . 7 4 2 , 1 . 8 9 0 ; MgATP : 4 . 2 2 8 , 2 . 2 4 0 ; E D T A : 1 0 . 0 0 9 , 5 . 9 8 7 , 2 . 7 2 0 , 2 . 0 0 9 ; C a E D T A : 1 0 . 4 2 3 ; MgEDTA : 8 . 9 2 9 , 2 . 7 7 0 . - 60 -RESULTS 1. Determination of C a 2 + -ATPase Activity In Pancreatic Plasma  Membranes I n p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s A T P a s e a c t i v i t y wa s d e t e r m i n e d i n p l a s m a m e m b r a n e s p r e p a r e d f r o m w h o l e t i s s u e h o m o g e n a t e s . A h i g h ATP h y d r o l y t i c a c t i v i t y wa s o b s e r v e d i n t h e p a n c r e a t i c p l a s m a membrane p r e p a r a t i o n s . 21 2-4-T h e a c t i v i t y was s t i m u l a t e d b y Ca i n t h e a b s e n c e o f a d d e d Mg . A l s o M g 2 + c o u l d s u b s t i t u t e f o r C a 2 + i n a c t i v a t i o n o f t h e e n z y m e . F i g u r e 2 s h o w s t h a t t h e A T P a s e a c t i v i t y i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f Ca o r Mg up t o 0 . 2 5 mM a n d l e v e l l e d o f f . A c o m b i n a t i o n o f 24- 24-s a t u r a t i n g c o n c e n t r a t i o n s o f C a a n d Mg p r o d u c e d t h e same max imum 24- 24-a c t i v i t y , s u g g e s t i n g t h a t t h e Ca o r Mg s t i m u l a t e d a c t i v i t i e s r e p r e s e n t t h e same e n z y m e . F i g u r e 3 i n d i c a t e s t h e ATP d e p e n d e n c y o f t h e 24- 24-A T P a s e a c t i v i t y . A T P a s e a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f e i t h e r Ca o r Mg i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g ATP c o n c e n t r a t i o n , r e a c h i n g a max imum a t 0 . 3 5 mM. H i g h e r c o n c e n t r a t i o n s t h a n 0 . 5 mM w e r e i n h i b i t o r y . 24-S i n c e t h e p a n c r e a s i s a h e t e r o c e l l u l a r o r g a n , t h e Ca - A T P a s e a c t i v i t y o b s e r v e d i n p l a s m a m e m b r a n e s p r e p a r e d f r o m p a n c r e a t i c t i s s u e h o m o g e n a t e s c o u l d n o t be d i r e c t l y r e l a t e d t o a c i n a r c e l l f u n c t i o n . 24-C h a r a c t e r i z a t i o n o f a Ca - A T P a s e a c t i v i t y i n p a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a m e m b r a n e s w o u l d r e q u i r e p r e p a r a t i o n o f h o r m o n e r e s p o n s i v e d i s s o c i a t e d 24-p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s , a n d i d e n t i f i c a t i o n o f p o s s i b l e Ca - m e d i a t e d p r o c e s s e s t h a t c o u l d be r e l a t e d t o a m y l a s e s e c r e t i o n i n t h e a c i n a r c e l l . - 61 -F i g u r e 2 Ca o r Mg i " a c t i v a t i o n o f A T P a s e a c t i v i t y i n p a n c r e a t i c p l a s m a membrane p r e p a r a t i o n s . A T P a s e a c t i v i t y was d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s a t 0.5^ mM ATP i n t h e p r e s e n c e o f v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s o f Ca + ( • • ) o r Mg (O---o). R e s u l t s r e p r e s e n t t h e mean ± SEM o f f i v e d i f f e r e n t d e t e r m i n a t i o n s . - 63 -F i g u r e 3 E f f e c t o f ATP o n A T P a s e a c t i v i t y i n p a n c r e a t i c p l a s m a membrane p r e p a r a t i o n s . A T P a s e a c t i v i t y was d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s a t v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s o f ATP (0.01 - 1.0 mM) i n t h e p r e s e n c e o f 0.5 mM C a 2 + ( • • ) a n d 0.5 mM M g 2 + (o o). R e s u l t s r e p r e s e n t t h e mean ± SEM o f f i v e d i f f e r e n t d e t e r m i n a t i o n s . ATP cone (mM) - 65- -2. Determination of a Possible Relationship of Ca "'"-ATPase Activity to  Amylase Secretion a. Characterization of Amylase Secretion i n Pancreatic Acinar Cells T h e i n i t i a l o b j e c t i v e wa s t o p r e p a r e h o r m o n e r e s p o n s i v e a c i n a r c e l l s f r o m r a t p a n c r e a s a n d t o d e t e r m i n e t h e p u r i t y o f t h e a c i n a r c e l l p o p u l a t i o n . T h e f i r s t a p p r o a c h was t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e p o p u l a t i o n o f c e l l s o b t a i n e d was e n r i c h e d w i t h r e s p e c t t o a c i n a r c e l l s . T h e c e l l u l a r m a r k e r u s e d was t h e p r e s e n c e o f i n s u l i n . A s s h o w n i n T a b l e I t h e r e was a 35 - 75% d e c r e a s e i n i n s u l i n l e v e l s a s s o c i a t e d w i t h a c i n a r c e l l s c o m p a r e d t o t h e m i x e d c e l l p o p u l a t i o n . S i n c e t h e p r e s e n c e o f i n s u l i n r e c e p t o r s on a c i n a r c e l l s h a s b e e n r e p o r t e d ( K o r c et_ al^ 1 9 7 8 ) , t h e i n s u l i n l e v e l s m e a s u r e d i n t h e f i n a l p r e p a r a t i o n m i g h t r e p r e s e n t i n s u l i n b o u n d t o t h e a c i n a r c e l l s , r a t h e r t h a n c o n t a m i n a t i o n f r o m p - c e l l s . T o v e r i f y t h i s , c y t o c h e m i c a l m e t h o d s w e r e e m p l o y e d . F i g u r e 4 s h o w s a n h a e m a t o x y l i n a n d e o s i n s t a i n i n g o f t h e a c i n a r c e l l s . A c i n a r c e l l s w e r e c h a r a c t e r i z e d b y t h e i r s i z e a n d g r a n u l a r a p p e a r a n c e . T h e F i g u r e ( F i g u r e 4 ) s h o w s p r e d o m i n a n t l y one c e l l t y p e w i t h f e a t u r e s t y p i c a l o f a c i n a r c e l l s . T h e m a j o r i t y o f t h e c e l l s m a i n t a i n e d t h e i r s h a p e a n d e x h i b i t e d a n a c i n a r c o n f i g u r a t i o n . The v i a b i l i t y o f t h e c e l l s wa s g r e a t e r t h a n 95% a s e v a l u a t e d b y t h e e x c l u s i o n o f t r y p a n b l u e d y e . To d e t e r m i n e t h e t i m e c o u r s e o f a m y l a s e s e c r e t i o n , d i s s o c i a t e d r a t p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s w e r e i n c u b a t e d u n d e r c o n t r o l c o n d i t i o n s a n d t h e s e c r e t i o n o f a m y l a s e i n r e s p o n s e t o 1 0 - 5 M c a r b a c h o l was m o n i t o r e d a t 1 5 , 3 0 , 4 5 , 6 0 , 75 a n d 90 m i n ( F i g u r e 5 ) . A m y l a s e s e c r e t i o n i n c r e a s e d - 66 -T a b l e I I n s u l i n C o n t e n t o f E n z y m a t i c a l l y D i s p e r s e d P a n c r e a t i c C e l l H o m o g e n a t e s a n d I s o l a t e d A c i n a r C e l l s . I n s u l i n C o n t e n t ( m U / m g T i s s u e ) H o m o g e n a t e A c i n a r C e l l s P u r i f i c a t i o n P r e p a r a t i o n 1 P r e p a r a t i o n 2 5 . 6 6 5 . 9 4 3 . 7 1 1 . 6 6 1 . 5 f o l d 3 . 5 f o l d I n s u l i n was e x t r a c t e d f r o m c e l l s a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . I n s u l i n c o n t e n t was a s s a y e d u s i n g a r a d i o i m m u n o a s s a y k i t a n d i s e x p r e s s e d a s mU/mg o f c e l l u l a r p r o t e i n . F i g u r e 4 L i g h t m i c r o g r a p h o f i s o l a t e d p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . M a g n i f i c a t i o n : X 1 0 1 9 . - 68-- 69 -F i g u r e 5 T i m e c o u r s e o f a m y l a s e s e c r e t i o n by d i s s o c i a t e d r a t p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . C e l l s w e r e i n c u b a t e d i n s t a n d a r d i n c u b a t i o n s o l u t i o n a s d e s c r i b e d i n M | t h o d s i n t h e p r e s e n c e ( • • ) o r a b s e n c e ( O - — O ) o f 10~ M c a r b a c h o l . R e s u l t s s h o w n a r e t h e mean ± SEM f r o m t h r e e s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . - " 7 0 -T i m e (min) - 71 -l i n e a r l y w i t h t i m e up t o 6 0 m i n , l e v e l l i n g o f f t h e r e a f t e r . A m y l a s e r e l e a s e i n c r e a s e d a b o u t t h r e e - f o l d o v e r b a s a l a t a l l t i m e p o i n t s s t u d i e d . F i g u r e 6 i l l u s t r a t e s t h e e f f e c t o f v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s o f c a r b a c h o l , s e c r e t i n a n d p a n c r e o z y m i n o n a m y l a s e r e l e a s e f r o m d i s s o c i a t e d p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . W i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f c a r b a c h o l a n d p a n c r e o z y m i n , t h e r a t e o f a m y l a s e s e c r e t i o n i n c r e a s e d , b e c o m i n g m a x i m a l a t 10 M a n d 0 . 0 1 U / m l r e s p e c t i v e l y , a n d t h e n d e c r e a s e d . W i t h s e c r e t i n a s t h e a g o n i s t , a m y l a s e r e l e a s e wa s s u b m a x i m a l a t t h e h i g h e s t c o n c e n t r a t i o n t e s t e d ( 1 0 - 6 M ) . T h e r a t e o f a m y l a s e s e c r e t i o n o b s e r v e d i n t h e s e s t u d i e s i s c o m p a r a b l e t o t h o s e r e p o r t e d b y o t h e r w o r k e r s u s i n g s i m i l a r p r e p a r a t i o n s ( G a r d n e r a n d J a c k s o n 1 9 7 7 ; W i l l i a m s e t a l 1 9 7 8 ) . The d e c r e a s e d a m y l a s e r e l e a s e a t h i g h e r c a r b a c h o l a n d p a n c r e o z y m i n c o n c e n t r a t i o n s h a s b e e n t e r m e d " d e s e n s i t i z a t i o n " ( W i l l i a m s e t a l 1 9 7 8 ) . T h i s i s a t t r i b u t e d t o t h e f a c t t h a t t h e s e s e c r e t a g o g u e s p r o d u c e much h i g h e r i n c r e a s e s i n 2+ i n t r a c e l l u l a r Ca l e v e l s t h a n i s r e q u i r e d f o r a m y l a s e s e c r e t i o n . T h e O I e x c e s s Ca l e v e l s t h e n e i t h e r d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y i n h i b i t a m y l a s e r e l e a s e . b. Determination of the Effect of Anticalmodulin Agents on Amylase  Secretion C a l m o d u l i n p l a y s a m a j o r r o l e i n t h e m o d u l a t i o n o f a w i d e v a r i e t y o f 24-C a - d e p e n d e n t c e l l u l a r f u n c t i o n s ( S c h a r f f 1 9 8 1 ) . B a s e d o n t h e r e p o r t e d p r e s e n c e o f c a l m o d u l i n i n t h e p a n c r e a s ( V a n d e r m e e r s ^ t a l 1 9 7 7 ; B a r t e l t a n d S c h e e l e 1 9 8 0 ) , i t s r o l e i n a m y l a s e s e c r e t i o n f r o m d i s s o c i a t e d r a t - 72 -F i g u r e 6 C o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c e o f a m y l a s e s e c r e t i o n b y d i s s o c i a t e d r a t p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . A m y l a s e s e c r e t i o n s t i m u l a t e d by s e c r e t i n ( • • ) , c a r b a c h o l ( o O) a n d p a n c r e o z y m i n ( A — A ) was m e a s u r e d i n c e l l s s u s p e n d e d i n s t a n d a r d i n c u b a t i o n m e d i u m c o n t a i n i n g 2 . 5 mM Ca a n d 1 .2 mM M g 2 + a t 3 7 ° C f o r 45 m i n . R e s u l t s s hown a r e mean ± SEM o f f i v e d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s . - u - 74 -a c i n a r c e l l s was s t u d i e d i n d i r e c t l y b y d e t e r m i n i n g t h e e f f e c t s o f p h e n o t h i a z i n e s o n t h e s e c r e t o r y p r o c e s s . T h e s e a g e n t s a r e k n o w n t o b i n d 2+ t o c a l m o d u l i n i n a Ca - d e p e n d e n t m a n n e r a n d t h e r e b y i n h i b i t c a l m o d u l i n m e d i a t e d e v e n t s ( L e v i n and W e i s s 1 9 7 7 ) . A s s hown i n F i g u r e 7 , t h e p h e n o t h i a z i n e t r i f l u o p e r a z i n e ( T F P ) i n h i b i t e d c a r b a c h o l s t i m u l a t e d a c t i v i t y i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r , w i t h no s i g n i f i c a n t e f f e c t o n b a s a l a m y l a s e r e l e a s e . The c o n c e n t r a t i o n o f T F P r e q u i r e d f o r 50% i n h i b i t i o n was f o u n d t o be 10 uM . I n F i g u r e 8 a t h e e f f e c t o f a n o t h e r p h e n o t h i a z i n e , c h l o r p r o m a z i n e ( C P Z ) o n a m y l a s e r e l e a s e i n d u c e d b y v a r i o u s c l a s s e s o f s e c r e t a g o g u e s was d e t e r m i n e d . CPZ a t a c o n c e n t r a t i o n o f 10 M i n h i b i t e d b o t h c a r b a c h o l - ( 1 0 M ) a n d p a n c r e o z y m i n - ( 0 . 0 1 U / m l ) s t i m u l a t e d a m y l a s e r e l e a s e b y a b o u t 60 a n d 65% r e s p e c t i v e l y w h e r e a s s e c r e t i n - ( 1 0 ~ 5 M) s t i m u l a t e d r e l e a s e wa s s t i l l v i r t u a l l y i n t a c t (98% o f m a x i m a l r e s p o n s e ) . A t h i g h e r CPZ c o n c e n t r a t i o n s ( l O - 4 - 0 . 5 x 1 0 - 3 M ) a l l t h r e e s e c r e t a g o g u e s w e r e i n h i b i t e d t o a s i m i l a r d e g r e e . CPZ d i d n o t t h o u g h , h a v e a n y e f f e c t o n t h e b a s a l r e l e a s e o f a m y l a s e . I t a p p e a r s t h a t a t l o w e r c o n c e n t r a t i o n s ( 1 0 ~ 6 - 1 0 ~ 5 M ) , CPZ i n h i b i t s a m y l a s e r e l e a s e b y s e c r e t a g o g u e s ( c a r b a c h o l a n d p a n c r e o z y m i n ) t h a t a c t b y m o b i l i z i n g i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m . CPZ a t t h e same c o n c e n t r a t i o n h a s n o e f f e c t o n a m y l a s e r e l e a s e i n d u c e d b y s e c r e t i n , a n o n - c a l c i u m m e d i a t e d s e c r e t a g o g u e . P r o p r a n o l o l , w h i c h c a n p r o d u c e n o n - s p e c i f i c memb r ane s t a b i l i z i n g e f f e c t s , d i d n o t show t h i s s e l e c t i v e i n h i b i t i o n ( F i g u r e 8 b ) . T h e s e s t u d i e s i n d i c a t e t h e p o s s i b i l i t y t h a t p h e n o t h i a z i n e s i n h i b i t c a l c i u m m e d i a t e d a m y l a s e r e l e a s e f r o m p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s b y a c t i n g o n a c a l m o d u l i n r e g u l a t e d s t e p i n t h e s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g - 75 -F i g u r e 7 E f f e c t o f t r i f l u o p e r a z i n e o n a m y l a s e s e c r e t i o n f r o m d i s s o c i a t e d p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . E n z y m e s e c r e t i o n w a s m e a s u r e d i n t h e p r e s e n c e ( • — • ) a n d a b s e n c e ( O — - O ) o f 1 0 - 5 M c a r b a c h o l . R e s u l t s r e p r e s e n t t h e mean ± S . E . M . o f f i v e s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . Amylase release (% of total) - 77 -F i g u r e 8 a E f f e c t o f c h l o r p r o m a z i n e on a m y l a s e s e c r e t i o n b y d i s s o c i a t e d p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . A m y l a s e s e c r e t i o n wa s m e a s u r e d i n t h e p r e s e n c e o f 1 0 ~ 5 M c a r b a c h o l ( • — • ) . 0 . 0 1 U / m l p a n c r e o z y m i n ( A A ) a n d 1 0 ~ 6 M s e c r e t i n ( 0 - - - 0 ) . C e l l s w e r e s u s p e n d e d i n s t a n d a r d i n c u b a t i o n m e d i u m c o n t a i n i n g 2 . 5 mM Ca + a n d 1 .2 mM M g 2 + a t 3 7 ° C f o r 45 m i n . R e s u l t s r e p r e s e n t t h e mean ± SEM o f t h r e e s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . F i g u r e 8 b E f f e c t o f p r o p r a n o l o l o n a m y l a s e s e c r e t i o n b y d i s s o c i a t e d p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l | . A m y l a s e s e c r e t i o n was m e a s u r e d i n t h e p r e s e n c e o f 1 0 " M c a r b a c h o l ( • — • ) a n d 1 0 " M s e c r e t i n ( O — o ) . C e l l s w e r e s u s p e n d e d i n s t a n d a r d i n c u b a t i o n s o l u t i o n c o n t a i n i n g 2 . 5 mM C a 2 + a n d 1 .2 mM Mg + a t 3 7 ° C f o r 45 m i n . R e s u l t s r e p r e s e n t t h e mean ±SEM o f t h r e e s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . -73 -A m y l a s e r e l e a s e (% of maximum) - 79 -p r o c e s s . T h e m e c h a n i s m by w h i c h c a l m o d u l i n w o u l d r e g u l a t e p a n c r e a t i c e n z y m e s e c r e t i o n i s n o t k n o w n . A c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t e n z y m e t h a t may p l a y a r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f f r e e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m i s t h e 2+ p l a s m a m e m b r a n e C a - A T P a s e . T h e r e f o r e s u b s e q u e n t s t u d i e s i n v o l v e d 2+ c h a r a c t e r i z a t i o n o f a Ca - A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a m e m b r a n e s o b t a i n e d f r o m p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . 3. Characterization of Ca2+-ATPase Activity In Pancreatic Acinar Plasma  Membranes M e m b r a n e p r e p a r a t i o n s o b t a i n e d f r o m w h o l e t i s s u e h o m o g e n a t e s c o u l d be c o n t a m i n a t e d w i t h p l a s m a m e m b r a n e s o f c e l l s f r o m t h e e n d o c r i n e p a n c r e a s , t h e c o l l e c t i n g d u c t a n d some c e n t r o a c i n a r c e l l s . T h e r e f o r e a t t e m p t s w e r e made t o p r e p a r e p l a s m a m e m b r a n e s f r o m a c i n a r c e l l s , t h e c e l l s m a i n l y c o n c e r n e d w i t h s e c r e t i o n o f d i g e s t i v e e n z y m e s . T h e p r o c e d u r e f i r s t i n v o l v e d t h e I s o l a t i o n o f a c i n a r c e l l s a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s a n d t h e n t h e p r e p a r a t i o n o f p l a s m a m e m b r a n e s f r o m t h e s e c e l l s . T he a c i n a r c e l l s w e r e v i a b l e a n d r e s p o n s i v e t o s t i m u l a t i o n b y a n u m b e r o f a g e n t s ( s e e a b o v e ) . T h i s p r o c e d u r e y i e l d e d p u r e a c i n a r p l a s m a m e m b r a n e s w i t h o u t a p p r e c i a b l e l o s s o f e n d o g e n o u s A T P a s e a c t i v i t y . T a b l e I I i l l u s t r a t e s t h e s u b - c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f m a r k e r e n z y m e s among v a r i o u s f r a c t i o n s o b t a i n e d f r o m a c i n a r c e l l h o m o g e n a t e s . T h e f r a c t i o n c o l l e c t e d f r o m t h e 27%/35% s u c r o s e i n t e r f a c e wa s e n r i c h e d i n e n z y m e s c h a r a c t e r i s t i c o f p l a s m a m e m b r a n e s . T h e r e was a 1 2 - f o l d i n c r e a s e i n ( N a + + K + ) - A T P a s e , 4 - f o l d i n c r e a s e i n 5 ' - n u c l e o t i d a s e a n d T a b l e I I S p e c i f i c A c t i v i t y o f Ca - A T P a s e a n d M a r k e r E n z y m e s i n C e l l H o m o g e n a t e s a n d S u b c e l l u l a r F r a c t i o n s . C y t o c h r o m e c ( N a + + K + ) - A T P a s e 3 5 ' - N u c l e o t i d a s e 3 O x i d a s e C a 2 + - A T P a s e a ' C H o m o g e n a t e 0 . 6 4 + 0 . 0 5 1 . 5 2 + 0 . 0 9 4 . 5 1 + 0 . 1 5 0 . 1 8 + 0 . 0 2 10 -25% s u c r o s e i n t e r f a c e 3 . 6 2 + 0 . 3 1 2 . 4 5 + 0 . 1 6 0 . 3 4 + 0 . 0 8 0 . 3 2 + 0 . 0 1 2 7 - 3 5 % s u c r o s e i n t e r f a c e 7 . 8 9 + 0 . 1 2 5 . 5 1 + 0 . 1 0 0 . 6 7 + 0 . 0 5 0 . 8 0 + 0 . 0 3 B o t t o m p e l l e t 0 . 3 1 + 0 . 0 3 0 . 2 6 + 0 . 0 6 6 . 5 7 + 0 . 2 7 0 . 0 5 + 0 . 0 1 a u m o l e s P i / m g p r o t / h r . ^ n m o l e s c y t c o x i d i z e d / m g p r o t / m i n . c C a c o n c e n t r a t i o n i s 0 . 4 uM f r e e . - 8 1 -4 - f o l d i n c r e a s e i n C a 2 + s t i m u l a t e d A T P a s e a c t i v i t i e s . C y t o c h r o m e c o x i d a s e a c t i v i t y was s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d i n d i c a t i n g t h a t m i t o c h o n d r i a l c o n t a m i n a t i o n was m i n i m a l i n t h i s f r a c t i o n . T h e d i f f e r e n t i a l d e g r e e s o f p u r i f i c a t i o n o f m a r k e r e n z y m e s f o r p l a s m a m e m b r a n e s may be d u e t o t h e d i f f e r e n t s t a b i l i t i e s o f t h e e n z y m e s s t u d i e d . A h i g h ATP h y d r o l y t i c a c t i v i t y wa s o b s e r v e d i n t h e p l a s m a membrane e n r i c h e d f r a c t i o n . A s s h o w n i n F i g u r e 9 , t h e A T P a s e a c t i v i t y i n c r e a s e d 2+ 2-4-w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f C a o r Mg up t o a max imum o f 88 uM f r e e i o n c o n c e n t r a t i o n . K i n e t i c a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t t h e s y s t e m h a s a s i g n i f i c a n t l y h i g h e r a f f i n i t y f o r C a 2 + t h a n M g 2 + (P < 0 . 0 5 ) w i t h a s i m i l a r max imum r a t e o f a c t i v i t y ( T a b l e I I I ) . T he A T P a s e a c t i v i t y w a s a l s o a c t i v a t e d b y M n 2 + a n d Z n 2 + w i t h S r 2 + a n d B a 2 + s h o w i n g t h e l e a s t a c t i v i t y ( T a b l e I V ) . A c o m b i n a t i o n o f s a t u r a t i n g c o n c e n t r a t i o n s o f C a 2 + a n d M g 2 + p r o d u c e d t h e same max imum a c t i v i t y ( T a b l e I V ) . M o n o v a l e n t c a t i o n s t h o u g h , d i d n o t a f f e c t t h e a c t i v i t y o f t h e e n z y m e ( T a b l e V ) . S i m i l a r l y , c a r b a c h o l a n d p a n c r e o z y m i n a t c o n c e n t r a t i o n s t h a t p r o d u c e m a x i m a l a m y l a s e r e l e a s e f r o m a c i n a r c e l l s h a d no e f f e c t on t h e a c t i v i t y o f t h e e n z y m e ( T a b l e V ) . W h e r e a s 10 uM CPZ was w i t h o u t e f f e c t , 1 mM m a r k e d l y i n h i b i t e d t h e e n z y m e a c t i v i t y , p o s s i b l y d ue t o memb r ane d i s r u p t i o n ( T a b l e V ) . T h e C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y was i n s e n s i t i v e t o 5 mM s o d i u m a z i d e , i n d i c a t i n g t h a t t h i s e n z y m e i s d i f f e r e n t f r o m t h e m i t o c h o n d r i a l A T P a s e . A c o m p a r i s o n o f t h e s u b s t r a t e r e q u i r e m e n t f o r t h e p h o s p h o h y d r o l a s e a c t i v i t y i s s h o w n i n F i g u r e s 10 a n d 1 1 . T h e p r o f i l e 2+ 2+ f o r t h e s u b s t r a t e r e q u i r e m e n t i s s i m i l a r f o r b o t h Ca a n d Mg - 82 -F i g u r e 9 T he e f f e c t o f M g / : + a n d Ca + on A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a - m e m b r a n e e n r i c h e d f r a c t i o n s o f p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . ATP h y d r o l y t i c a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f i n c r e a s i n g C a 2 + ( • — • ) a n d M g 2 + (O O) c o n c e n t r a t i o n s . R e s u l t s r e p r e s e n t t h e mean ± S . E . M . o f f i v e d i f f e r e n t d e t e r m i n a t i o n s . - 84"--T a b l e I I I a n d V „ „ o f t h e A T P a s e A c t i v i t y o f P a n c r e a t i c Q1SS IUctX A c i n a r P l a s m a M e m b r a n e P r e p a r a t i o n s i n t h e P r e s e n c e o f Ca + o r Mg . K ( u M ) V ( u m o l e s P i / m g p r o t / h r ) Q l S S TTlctX 1 . 7 3 ± 0 . 2 5 b , C 1 5 . 2 9 ± 0 . 7 6 2 . 9 8 ± 0 . 3 9 1 6 . 3 2 ± 0 . 6 1 C a 2 + ( 5 ) a M g 2 + ( 5 ) a N u m b e r of preparations. ^Mean ± SEM i n each case. S i g n i f i c a n t (p < 0 . 0 5 ) when compared to M g 2 + - s t i m u l a t e d a c t i v i t y . - 85 -x a b l e I V A T P a s e A c t i v i t y o f P a n c r e a t i c A c i n a r P l a s m a M e m b r a n e P r e p a r a t i o n s i n t h e P r e s e n c e o f D i v a l e n t C a t i o n s . C a t i o n S p e c i f i c A c t i v i t y ( u m o l e s P i / m g p r o t / h r ) C a 2 + 1 3 . 4 2 + 0 . 6 9 M g 2 + 1 3 . 4 5 + 0 . 9 9 M n 2 + 1 0 . 3 2 + 0 . 4 6 Z n 2 + 8 . 6 9 + 0 . 3 2 S r 2 + 1 . 4 0 + 0 . 0 5 B a 2 + 1 . 0 2 + 0 . 0 7 ' + M g 2 + 1 3 . 5 6 + 0 . 0 8 A T P a s e a c t i v i t y was m e a s u r e d i n a m e d i u m c o n t a i n i n g 48 mM T r i s - H C l pH 7 . 4 , 0 . 5 mM A T P , 0 . 1 mM o u a b a i n , 2 mM N a N 3 a n d 0 . 2 5 mM d i v a l e n t c a t i o n a t 3 7 ° C . R e s u l t s r e p r e s e n t t h e mean ± S . E . M . o f f o u r s e p a r a t e d e t e r m i n a t i o n s . - 86 -T a b l e V E f f e c t o f M o n o v a l e n t C a t i o n s a n d D r u g s o n t h e A T P a s e A c t i v i t y o f P a n c r e a t i c A c i n a r P l a s m a M e m b r a n e P r e p a r a t i o n s . A T P a s e A c t i v i t y ( u m o l e s P i / m g p r o t / h r ) C a 2 + M g 2 + C o n t r o l 1 6 . 0 1 + 1 .5 1 6 . 0 3 + 1 . 2 100 mM N a + 1 5 . 0 1 + 1 .3 1 4 . 8 5 + 1 . 1 100 mM K + 1 3 . 7 2 + 0 . 9 1 4 . 7 8 + 0 . 9 1 0 " 5 M C a r b a c h o l 1 5 . 7 3 + 2 . 3 1 5 . 5 9 + 1 .4 10 M C h l o r p r o m a z i n e 1 4 . 0 4 + 1 .2 1 6 . 5 9 + 2 . 0 _ 3 10 M C h l o r p r o m a z i n e 3 . 4 6 + 0 . 2 1 . 9 5 + 0 . 5 0 . 0 1 U / m l P a n c r e o z y m i n 1 6 . 9 2 + 0 . 2 1 6 . 6 6 + 1 . 0 5 mM s o d i u m a z i d e 1 5 . 2 3 + 1 .5 1 5 . 0 1 + 1 .7 A T P a s e a c t i v i t y was m e a s u r e d i n a m e d i u m c o n t a i n i n g 48 mM T r i s - H C l p H 7 . 4 , 0 . 0 6 mM E G T A . 1 mM o u a b a i n , 2 mM N a N 3 a n d 0 . 5 mM ATP a t 3 7 ° C . When e i t h e r C a 2 + o r Mg + was a d d e d , i t was p r e s e n t a t a c o n c e n t r a t i o n o f 88 uM f r e e . R e s u l t s r e p r e s e n t t h e mean ± S . E . M . o f f i v e d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s . - 87 -F i g u r e 10 S u b s t r a t e r e q u i r e m e n t o f Ca - A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a membrane p r e p a r a t i o n s o f a c i n a r c e l l s . E n z y m e a c t i v i t y wa s d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s a t v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s ( 0 . 0 1 - 1 .0 mM) o f ATP ( • • ) , GTP ( A A) AD? (O O) a n d AMP (A A ) i n t h e p r e s e n c e o f 88 uM Ca . T h e r e s u l t s r e p r e s e n t t h e mean ± SEM o f f i v e d i f f e r e n t d e t e r m i n a t i o n s . -88-Nucleotide cone. (mM) - 89 -F i g u r e 11 S u b s t r a t e r e q u i r e m e n t o f Mg " ' " -ATPase a c t i v i t y i n p l a s m a membrane p r e p a r a t i o n s o f a c i n a r c e l l s . E n z y m e a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s a t v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s ( 0 . 0 1 - 1 . 0 mM) o f ATP ( • • ) , GTP ( A A ) , ADP (O O) a n d AMP (A A ) i n t h e p r e s e n c e o f 88 uM M g 2 + . T h e r e s u l t s r e p r e s e n t t h e mean ± SEM o f f i v e d i f f e r e n t d e t e r m i n a t i o n s . Nucleotide cone. (mM) - 91 -s t i m u l a t e d a c t i v i t i e s . ATP a n d GTP w e r e t h e m o s t s u i t a b l e s u b s t r a t e s , f o l l o w e d by A D P . AMP s h o w e d m i n i m a l a c t i v i t y p o s s i b l y due t o t h e p r e s e n c e o f 5 ' - N u c l e o t i d a s e . P y r r o p h o s p h a t e c o u l d n o t be u s e d a s a s u b s t r a t e , s u g g e s t i n g t h a t t h e e n z y m e i s n o t a n o n - s p e c i f i c p h o s p h a t a s e . T h e p o s s i b i l i t y e x i s t e d t h a t t h e e f f e c t o f ADP was d u e t o ATP p r o d u c e d by c o n v e r s i o n o f ADP b y a d e n y l a t e k i n a s e p r e s e n t i n t h e m e m b r a n e p r e p a r a t i o n . T o d e m o n s t r a t e t h a t t h i s was n o t t h e c a s e , A D P a s e a c t i v i t y was d e t e r m i n e d i n t h e p r e s e n c e o f t h e a d e n y l a t e k i n a s e i n h i b i t o r , a d e n y l 3 ' , 5 ' - A d e n o s i n e ( A p 5 A ) . A s s h o w n i n F i g u r e 1 2 , A p 5 A a t c o n c e n t r a t i o n s t h a t g e n e r a l l y i n h i b i t a d e n y l a t e k i n a s e a c t i v i t y i n v a r i o u s s y s t e m s ( F e l d h a u s et_ a l 1 9 7 5 ) , d i d n o t i n h i b i t A D P a s e a c t i v i t y . R a t h e r , s t i m u l a t i o n o f t h e A D P a s e a c t i v i t y was o b s e r v e d a t 0 . 5 a n d 1 mM A p 5 A . F i g u r e 13 i l l u s t r a t e s t h e e f f e c t o f pH on t h e e n z y m e a c t i v i t y . C a 2 + o r M g 2 + s t i m u l a t e d A T P a s e a c t i v i t i e s e x h i b i t e d a s i m i l a r pH d e p e n d e n c y w i t h a r e l a t i v e l y b r o a d pH o p t i m u m a r o u n d pH 8 . F i g u r e 14 i s a n A r r h e n i u s p l o t o f d a t a o b t a i n e d on t h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e on t h e a c t i v i t y o f t h e e n z y m e , i n d i c a t i n g a t r a n s i t i o n t e m p e r a t u r e o f 2 5 ° C f o r C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y a n d 20 °C f o r M g 2 + - A T P a s e a c t i v i t y . 2+ 4. Regulation of Pancreatic Acinar Plasma Membrane Ca -ATPase by  Calmodulin H a v i n g d e m o n s t r a t e d t h a t t h e p h e n o t h i a z i n e s i n h i b i t a m y l a s e 24-s e c r e t i o n i n a C a - d e p e n d e n t m a n n e r , p o s s i b l y t h r o u g h c a l m o d u l i n 24-i n h i b i t i o n , i t wa s o f i n t e r e s t t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e C a - A T P a s e i s a l s o r e g u l a t e d b y c a l m o d u l i n . I n t h e s e e x p e r i m e n t s l o w C a 2 + - 92 -F i g u r e 12 E f f e c t o f a d e n y l 3 ' , 5 ' - a d e n o s i n e ( A p 5 A ) o n C a ^ - A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a membrane p r e p a r a t i o n s o f a c i n a r c e l l s . C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y wa s d e t e r m i n e d a t 88 uM Ca a n d 0 . 5 mM A D P . D a t a r e p r e s e n t t h e mean ±SEM o f t h r e e s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . o Ol Ca 2 + -ATPase Activity: gmoles Pi/mg prot/hr O) — i — > Ol > o o 3 O o • o o ro Ol C-OJ - 94 -F i g u r e 13 E f f e c t o f pH o n ATP h y d r o l y t i c a c t i v i t y i n p l a s m a m e m b r a n e s o f a c i n a r c e l l s . A T P a s e a c t i v i t y was d e t e r m i n e d a t 0 . 5 mM ATP a n d 88 uM C a 2 + ( • • ) o r 88 uM M g 2 + (O O ) . T h e r e a c t i o n m e d i u m was b u f f e r e d w i t h T r i s - g l y c i n e - m a l e i c a c i d a n d a d j u s t e d b e t w e e n pH 6 a n d 9 . R e s u l t s r e p r e s e n t t h e mean o f two d i f f e r e n t d e t e r m i n a t i o n s e a c h d o n e i n d u p l i c a t e . - 96 -F i g u r e 14 A r r h e n i u s p l o t s o f A T P a s e a c t i v i t y a s a f u n c t i o n o f t e m p e r a t u r e . A T P a s e a c t i v i t y was d e t e r m i n e d i n a c i n a r memb rane p r e p a r a t i o n s a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s i n t h e p r e s e n c e o f 88 uM C a 2 + ( • — • ) o r 88 uM M g 2 + ( 0 . . . . 0 ) . T h e pH was a d j u s t e d t o pH 7 . 4 a t e a c h t e m p e r a t u r e s e t t i n g . R e s u l t s r e p r e s e n t t h e mean o f two d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s e a c h d o n e i n d u p l i c a t e . - 97- -1/Tx1000 - 98 -c o n c e n t r a t i o n s w e r e u s e d a s c a l m o d u l i n a c t i v a t i o n o f t h e Ca + - A T P a s e was f o u n d t o be o n l y m a r g i n a l a t h i g h e r Oa 2"*" c o n c e n t r a t i o n s . I n t h e p r e s e n c e o f e n d o g e n o u s Mg ( 1 . 5 - 2 uM) c a l m o d u l i n a c t i v a t i o n o f t h e 2+ C a s t i m u l a t e d a c t i v i t y was o b s e r v e d . A s s h o w n i n F i g u r e 1 5 , e x o g e n o u s c a l m o d u l i n s t i m u l a t e d t h e C a - A T P a s e a c t i v i t y i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r . A t 280 nM c a l m o d u l i n , t h e e n z y m e a c t i v i t y was i n c r e a s e d b y 244%, i n c r e a s i n g t o 890% a t 1 uM a n d s h o w e d s a t u r a t i o n b e y o n d 1 .7 uM . U s i n g a r a d i o i m m u n o a s s a y t e c h n i q u e , t h e c a l m o d u l i n c o n t e n t o f t h e p l a s m a memb r ane p r e p a r a t i o n s was f o u n d t o be 4 1 . 8 ± 3 . 5 n g / m g p r o t e i n . T h e p r e s e n c e o f b o u n d c a l m o d u l i n c o u l d i n p a r t e x p l a i n t h e p o o r r e s p o n s e o f t h e e n z y m e t o e x o g e n o u s l y a d d e d c a l m o d u l i n . I t w a s d e t e r m i n e d i f t h e ' a n t i c a l m o d u l i n ' a g e n t s T F P a n d CPZ w o u l d b l o c k c a l m o d u l i n s t i m u l a t i o n o f t h e C a - A T P a s e a c t i v i t y . C a - A T P a s e a c t i v i t y wa s m e a s u r e d a t 0 . 4 |jM f r e e C a 2 + a n d i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f 280 nM c a l m o d u l i n . F i g u r e 16 s h o w s t h a t w h i l e T F P a n d CPZ ( u p t o 175 uM) d i d n o t a f f e c t 2+ t h e b a s a l C a ^ - A T P a s e a c t i v i t y , t h e p h e n o t h i a z i n e s i n h i b i t e d c a l m o d u l i n o _ i _ s t i m u l a t e d C a - A T P a s e a c t i v i t y i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r . T h e h a l f m a x i m a l i n h i b i t i o n o f t h e c a l m o d u l i n s t i m u l a t e d a c t i v i t y o c c u r r e d a t 3 0 uM T F P a n d 55 uM C P Z , w i t h m a x i m a l i n h i b i t i o n o b s e r v e d a t 125 uM . I t was r e p o r t e d b y G i e t z e n et^ a l _ ( 1 9 8 3 ) t h a t Compound 4 8 / 8 0 , u n r e l a t e d t o t h e p h e n o t h i a z i n e s , i s a m o r e s p e c i f i c i n h i b i t o r o f c a l m o d u l i n s t i m u l a t e d C a - A T P a s e s . A s s h o w n i n F i g u r e 1 7 , c ompound 4 8 / 8 0 o x i n h i b i t e d a c t i v a t i o n o f a c i n a r p l a s m a membrane C a - A T P a s e a c t i v i t y b y c a l m o d u l i n ( 2 0 0 nM) i n a d o s e - d e p e n d e n t f a s h i o n . Compound 4 8 / 8 0 , up t o 4 0 0 u g / m l , d i d n o t h a v e a n y e f f e c t on t h e b a s a l a c t i v i t y . - 99 -F i g u r e 15 C o n c e n t r a t i o n s d e p e n d e n c e o f c a l m o d u l i n s t i m u l a t i o n o f C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y . A T P a s e a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 4 uM C a 2 + a n d e n d o g e n o u s M g 2 + ( m e a s u r e d t o be l - 2 u M ) . D a t a r e p r e s e n t t h e mean ± S . E . M . o f t h r e e s e p a r a t e d e t e r m i n a t i o n s . -MOO •-[Calmodulin^ pM - 101 -F i g u r e 16 E f f e c t o f p h e n o t h i a z i n e s on c a l m o d u l i n s t i m u l a t i o n o f C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a m e m b r a n e s o f a c i n a r c e l l s . R e a c t i o n m e d i u m c o n t a i n e d 0 . 4 uM C a 2 + , e n d o g e n o u s M g 2 + ( 1 - 2 pM) a n d t r i f l u o p e r a z i n e ( A A ) c h l o r p r o m a z i n e (0....0) o r 2 8 0 nM c a l m o d u l i n , t r i f l u o p e r a z i n e ( A — A ) a n d c h l o r p r o m a z i n e ( • • ) . D a t a r e p r e s e n t t h e mean ± S . E . M . o f f o u r s e p a r a t e d e t e r m i n a t i o n s . ATPase ACTIVITY (%) - 103 -F i g u r e 17 E f f e c t o f Compound 48/80 o n c a l m o d u l i n s t i m u l a t i o n o f Ca - A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a m e m b r a n e s o f a c i n a r c e l l s . A T P a s e a c t i v i t y was d e t e r m i n e d a t 0.4 uM C a 2 + , e n d o g e n o u s M g 2 + (1-2 pM) a n d i n t h e p r e s e n c e ( • — • ) a n d a b s e n c e (o o) o f 280 nM c a l m o d u l i n . D a t a r e p r e s e n t t h e mean o f two e x p e r i m e n t s e a c h d o n e i n d u p l i c a t e s . - 104 -- 105 -2+ T h e e f f e c t o f c a l m o d u l i n on t h e Ca a c t i v a t i o n c u r v e i s s h o w n i n F i g u r e 1 8 . C a l m o d u l i n i n c r e a s e d t h e s e n s i t i v i t y o f t h e e n z y m e s y s t e m f o r c a l c i u m ; n o s i g n i f i c a n t e f f e c t was o b s e r v e d a t h i g h e r C a c o n c e n t r a t i o n s ( > 0 . 4 u M ) . C a l m o d u l i n s t i m u l a t i o n was o b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o f e n d o g e n o u s c a l c i u m , d e t e r m i n e d b y a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o m e t r y t o be i n t h e r a n g e o f 6 - 7 uM. M a x i m a l c a l m o d u l i n 24-s t i m u l a t i o n o c c u r r e d a t 0 . 0 3 uM f r e e Ca , w i t h t h e d e g r e e o f 24-s t i m u l a t i o n d e c r e a s i n g w i t h i n c r e a s i n g f r e e Ca c o n c e n t r a t i o n s . I n t h e p r e s e n c e o f e n d o g e n o u s C a 2 + , c a l m o d u l i n s t i m u l a t i o n o f t h e C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y was d e c r e a s e d b y 20% when 1 mM EGTA was a d d e d t o t h e r e a c t i o n m e d i u m ( T a b l e V I ) . I n t h e p r e s e n c e o f 1 mM E D T A , c a l m o d u l i n s t i m u l a t i o n was a b o l i s h e d . T h i s c o u l d s u g g e s t t h a t e i t h e r c a l m o d u l i n s t i m u l a t i o n o f 24- 24-t h e C a - A T P a s e a c t i v i t y i s d e p e n d e n t o n e n d o g e n o u s Mg ( 1 . 5 - 2 uM 2 t t o t a l ) , o r t h a t e n d o g e n o u s Mg ^ i s r e q u i r e d f o r t h e e x p r e s s i o n o f t h e b a s a l C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y . I n o r d e r t o f u r t h e r e s t a b l i s h t h e r o l e o f M g 2 + i n t h i s s y s t e m , p l a s m a m e m b r a n e s w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 mM EDTA a t 3 7 ° C f o r 30 m i n t o p r o d u c e m e m b r a n e s d e p l e t e d o f d i v a l e n t c a t i o n s ( E D T A - t r e a t e d 24-raembranes). F i g u r e 19 i l l u s t r a t e s t h e e f f e c t o f e x o g e n o u s l y a d d e d Mg on ( C a 2 + + M g 2 + ) - A T P a s e a c t i v i t y i n E D T A - t r e a t e d m e m b r a n e s . ( C a 2 + + 24-Mg ) - A T P a s e a c t i v i t y r e f e r s t o t h a t a c t i v i t y p r e s e n t f o l l o w i n g 24-s u b t r a c t i o n o f t h e a c t i v i t y m e a s u r e d i n t h e a b s e n c e o f a d d e d C a a n d i n 24- 24-t h e p r e s e n c e o f Mg . W h i l e 0 . 0 5 uM f r e e C a f a i l e d t o s t i m u l a t e t h e 24- 24-( C a + Mg ) - A T P a s e a c t i v i t y o f E D T A - t r e a t e d memb rane p r e p a r a t i o n s , 24-a d d i t i o n o f 0 . 5 uM Mg r e s u l t e d i n s t i m u l a t i o n o f t h e A T P a s e a c t i v i t y . 24-T h i s a c t i v i t y was f u r t h e r i n c r e a s e d b y 1 , 2 , a n d 5 uM Mg . T h e - 106 -Figure 18 The effect of exogenous calmodulin on Ca -ATPase activity in plasma membrane enriched preparations of pancreatic acinar ce l l s . ATPase activity in the presence of increasing Ca 2 +-concentrations (0....0) (Mg 2 + estimated to be 1-2 uM), and a calmodulin concentration (CaM) of 280 nM (•—•) Data represent mean ±SEM of four different experiments. ATPase ACTIVITY (umoles Pi • mg protT 1- h r . 1 ) - 108 -T a b l e V I E f f e c t o f EGTA a n d EDTA on C a l m o d u l i n S t i m u l a t e d 2+ C a - A T P a s e A c t i v i t y . A d d i t i o n C a 2 + - A T P a s e A c t i v i t y (% C o n t r o l ) C o n t r o l C a l m o d u l i n C a l m o d u l i n + 1 mM EDTA C a l m o d u l i n + 1 mM EGTA 100 1438 ± 7 0 100 ± 10 1154 ± 50 A T P a s e a c t i v i t y wa s a s s a y e d i n 4 8 mM T r i s - H C l pH 7 . 4 , c o n t a i n i n g 0 . 0 6 mM E G T A , 0 . 1 mM o u a b a i n , 2 mM N a N 3 , 0 . 5 mM ATP a n d e n d o g e n o u s C a 2 + ( e s t i m a t e d t o be 7 uM t o t a l ) . When c a l m o d u l i n wa s p r e s e n t i t was a d d e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 280 n M . D a t a r e p r e s e n t mean ± S . E . M . o f f i v e d i f f e r e n t d e t e r m i n a t i o n s . E n d o g e n o u s f r e e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n i s 9 . 4 n M . - 109 -F i g u r e 19 ( C a + + Mg + ) - A T P a s e a c t i v i t y i n EDTA t r e a t e d p l a s m a m e m b r a n e s o f a c i n a r c e l l s . C a l c i u m a c t i v a t i o n c u r v e 2+ d e t e r m i n e d i n t h e a b s e n c e o f Mg ( 0 ) a n d i n t h e p r e s e n o o f 0 . 5 uM ( • ) , 1 uM ( A ) , 2 uM ( • ) a n d 5 uM ( • ) Mg f ( C a + Mg ) - A T P a s e a c t i v i t y r e f e r s t o t h a t a c t i v i t y p r e s e n t f o l l o w i n g s u b t r a c t i o n o f t h e a c t i v i t y m e a s u r e d i n t h e a b s e n c e o f a d d e d c a l c i u m a n d i n t h e p r e s e n c e o f Mg + . D a t a r e p r e s e n t t h e mean ± S . E . M . o f t h r e e s e p a r a t e d e t e r m i n a t i o n s . ( C a 2 + + Mg 2 + )-ATPase ACTIVITY (pmolesPimg protT1- hr."1) - I l l -i n c r e a s e i n a c t i v i t y was n o t d ue t o t h e a d d i t i v e e f f e c t o f Mg " ' " -ATPase 2+ b e c a u s e t h e c o n t r i b u t i o n o f Mg - A T P a s e h a d b e e n s u b t r a c t e d f r o m t h e t o t a l A T P a s e a c t i v i t y ( T a b l e V I I ) . T h e r e f o r e i t a p p e a r s t h a t t h e e f f e c t 2+ o f Mg i s t o i n c r e a s e t h e s e n s i t i v i t y o f t h e e n z y m e f o r c a l c i u m . I t was o f i n t e r e s t t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f M g 2 + a n d c a l m o d u l i n o n t h e c a l c i u m a c t i v a t i o n c u r v e o f E D T A - t r e a t e d m e m b r a n e s . F i g u r e 20 i n d i c a t e s t h a t c a l m o d u l i n s t i m u l a t i o n o f E D T A - t r e a t e d m e m b r a n e s was 2+ o b s e r v e d i r r e s p e c t i v e o f t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f Mg . T h i s i s i n a g r e e m e n t w i t h t h e p r e v i o u s c o n c l u s i o n t h a t M g 2 + i s r e q u i r e d o n l y f o r 2+ 2+ t h e e x p r e s s i o n o f t h e Ca - A T P a s e a c t i v i t y . C a l m o d u l i n a n d Mg s e e m t o p r o d u c e a s i m i l a r e f f e c t o n t h e a f f i n i t y o f t h e e n z y m e f o r c a l c i u m . I n o r d e r t o o b t a i n i n f o r m a t i o n o n t h e m e c h a n i s m b y w h i c h c a l m o d u l i n 2+ a c t i v a t e s t h e Ca - A T P a s e , i t i s i m p o r t a n t t o k n o w i f c a l m o d u l i n i n t e r a c t s d i r e c t l y w i t h t h e A T P a s e m o l e c u l e . To r e s o l v e t h i s p r o b l e m , 125 a n I - l a b e l e d c a l m o d u l i n g e l o v e r l a y t e c h n i q u e wa s e m p l o y e d . T h i s p r o c e d u r e i n d i c a t e s t h e a b i l i t y o f c a l m o d u l i n t o b i n d t o d e n a t u r e d t a r g e t p r o t e i n s p r e s e n t o n t h e g e l . T h e a u t o r a d i o g r a m s h o w s t h e b i n d i n g I O C o f I - l a b e l e d c a l m o d u l i n t o a n u m b e r o f memb rane p r o t e i n s ( F i g u r e 2 1 ) . I n c o n t r a s t t o o t h e r c a l m o d u l i n b i n d i n g p r o t e i n s t h a t a p p e a r e d o n t h e a u t o r a d i o g r a m , c a l m o d u l i n b i n d i n g t o a 1 3 3 , 0 0 0 a n d a 2 3 0 , 0 0 0 d a l t o n 2+ p r o t e i n w e r e Ca - d e p e n d e n t a s n o b i n d i n g o c c u r r e d i n t h e p r e s e n c e o f E G T A . - 112 -T a b l e V I I M g 2 + - A T P a s e A c t i v i t y i n EDTA T r e a t e d P l a s m a M e m b r a n e P r e p a r a t i o n s f r o m P a n c r e a t i c A c i n a r C e l l s . Mg + C o n e . uM Mg - A T P a s e A c t i v i t y ( u m o l e s P i / m g p r o t / h r ) 0 . 5 0 . 1 6 + 0 . 0 7 1 .0 0 . 2 3 + 0 . 0 5 2 . 0 0 . 5 2 + 0 . 1 2 5 . 0 2 . 0 5 + 0 . 3 5 1 0 . 0 3 . 3 7 + 0 . 6 6 M e m b r a n e p r e p a r a t i o n s w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 mM T r i s E D T A , pH 8 . 0 f o r 30 m i n a t 3 7 ° C . T h e m e m b r a n e s w e r e w a s h e d t w i c e a n d r e s u s p e n d e d i n T r i s - H C l b u f f e r pH 7 . 4 . M g 2 + - A T P a s e a c t i v i t y r e f e r s t o t h e a c t i v i t y i n t h e a b s e n c e o f a d d e d Ca a n d i n t h e p r e s e n c e o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f M g 2 + . - 113 -F i g u r e 20 T h e e f f e c t o f c a l m o d u l i n a n d Mg + o n t h e c a l c i u m a c t i v a t i o n c u r v e o f EDTA t r e a t e d p l a s m a m e m b r a n e s o f a c i n a r c e l l s . M e m b r a n e s w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 mM T r i s EDTA pH 8 . 0 f o r 30 m i n a t 3 7 ° C , w a s h e d f r e e o f EDTA a n d a s s a y e d f o r A T P a s e a c t i v i t y . T h e c a l c i u m a c t i v a t i o n c u r v e i n t h e a b s e n c e o f Mg ( o ) , i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 5 uM Mg ( • ) , 2 8 0 nM C a l m o d u l i n ( A ) a n d M g 2 + p l u s c a l m o d u l i n (A) i s s h o w n . D a t a r e p r e s e n t t h e mean ± S . E . M . o f t h r e e s e p a r a t e d e t e r m i n a t i o n s . Ca 2 + -ATPase Activity: prnoles Pi/mg prot/hr i o <Q o 0) 00 r\ _ •-•.-I I Ol - 115 -F i g u r e 21 C a l m o d u l i n g e l o v e r l a y a n d a u t o r a d i o g r a p h y o f t a r g e t p r o t e i n s i n p l a s m a m e m b r a n e s o f a c i n a r c e l l s . [ I ] - C a l m o d u l i n b i n d i n g i n t h e p r e s e n c e o f 1 mM Ca ( L a n e A ) a n d i n t h e a b s e n c e o f Ca + ( 5 mM E G T A ; L a n e B ) . - 117 -5. Regulation of Pancreatic Acinar Plasma Membrane CarJ-ATPase by  Phospholipids I t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t a c i d i c p h o s p h o l i p i d s , u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s a n d l i m i t e d p r o t e o l y s i s m i m i c t h e e f f e c t o f c a l m o d u l i n o n m e m b r a n e - b o u n d ( G i e t z e n e t j i l 1 9 8 2 ) , s o l u b i l i z e d ( A l - J o b o r e a n d R o u f o g a l i s 1 9 8 1 b ) o r p u r i f i e d ( N i g g l i e t a l 1 9 8 1 ) e r y t h r o c y t e 24- 24-C a - A T P a s e . S i n c e t h e p a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a memb r ane Ca - A T P a s e i s a c t i v a t e d b y c a l m o d u l i n , i t wa s i n v e s t i g a t e d w h e t h e r p h o s p h o l i p i d s h a d a s i m i l a r e f f e c t o n t h i s s y s t e m . F i g u r e 22 d e m o n s t r a t e s t h a t a s o l e c t i n ( a 2-4-m i x t u r e o f p h o s p h o l i p i d s ) s t i m u l a t e d t h e C a - A T P a s e a c t i v i t y o f a c i n a r p l a s m a m e m b r a n e s by a p p r o x i m a t e l y 7 - f o l d . T h i s a c t i v a t i o n d i d n o t r e q u i r e t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m . A s i m i l a r a c t i v a t i n g e f f e c t w a s o b s e r v e d by A d u n y a h e t a l ( 1 9 8 2 ) when p u r i f i e d e r y t h r o c y t e C a 2 + - A T P a s e wa s r e c o n s t i t u t e d i n a s o l e c t i n . T h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y r e v e a l e d t h a t a s o l e c t i n i s c o m p o s e d m a i n l y o f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e , p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l , p h o s p h a t i d y l s e r i n e a n d t h e i r l y s o d e r i v a t i v e s . When t h e p h o s p h o l i p i d s w e r e t e s t e d s e p a r a t e l y , i t was o b s e r v e d t h a t t h e a c i d i c p h o s p h o l i p i d s c a r d i o l i p i n , p h o s p h a t i d y l s e r i n e , 24-a n d p h o s p h a t i d y l l n o s i t o l s t i m u l a t e d t h e Ca - A T P a s e a c t i v i t y ( F i g u r e 2 3 ) . A s e x p e c t e d , p h o s p h a t i d y l c h o l i n e w h i c h i s a n e u t r a l p h o s p h o l i p i d f a i l e d t o s t i m u l a t e t h e A T P a s e a c t i v i t y ( F i g u r e 2 3 ) . H o w e v e r , i t was f o u n d t h a t t h e p u r e p h o s p h o l i p i d s w e r e n o t a s e f f e c t i v e a s a s o l e c t i n i n s t i m u l a t i n g t h e e n z y m e . I t r e q u i r e d a p p r o x i m a t e l y 1 0 - f o l d h i g h e r p u r e p h o s p h o l i p i d s t o p r o d u c e max imum a c t i v a t i o n t h a n t h a t d e t e r m i n e d f o r s o l u b i l i z e d e r y t h r o c y t e C a 2 + - A T P a s e ( A l - J o b o r e a n d R o u f o g a l i s 1 9 8 1 ) . T h e r e a s o n f o r t h i s i s n o t a p p a r e n t b u t p e r h a p s t h e e n z yme r e q u i r e s a - 118 -F i g u r e 22 A s o l e c t i n s t i m u l a t i o n o f Ca - A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a membrane e n r i c h e d f r a c t i o n s o f a c i n a r c e l l s . A s o l e c t i n s t i m u l a t i o n i n t h e p r e s e n c e ( • ) a n d a b s e n c e ( o ) o f 0 . 4 pM Ca + . R e s u l t s r e p r e s e n t mean ± S . E . M . o f t h r e e s e p a r a t e d e t e r m i n a t i o n s . -ATPase Activity: prnoles Pi/mg prot/hr - 120 -F i g u r e 23 T h e e f f e c t o f e x o g e n o u s p h o s p h o l i p i d s on Ca - A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a memb rane e n r i c h e d f r a c t i o n s o f a c i n a r c e l l s . E n z y m e a c t i v i t y was a s s a y e d i n t h e p r e s e n c e o f p h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( O - — o ) , p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ( • — • ) , p h o s p h a t i d y l s e r i n e ( * " • — * ) a n d c a r d i o l i p i n ( A ^ A ) . D a t a r e p r e s e n t t h e mean o f two d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s e a c h i n d u p l i c a t e s . -121 -T °- 7 5r I PHOSPHOLIPID I jjg/ml - 122 -m i l i e u o f d i f f e r e n t p h o s p h o l i p i d s r a t h e r t h a n a s p e c i f i c p h o s p h o l i p i d f o r o p t i m u m a c t i v a t i o n . T h u s f a r i t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t h a t t h e a c i n a r p l a s m a membrane C a 2 + - A T P a s e h a s a n umbe r o f p r o p e r t i e s c h a r a c t e r i s t i c o f t h e 2+ C a - t r a n s p o r t A T P a s e i n o t h e r s y s t e m s . A common f e a t u r e o f t h e s e 2+ A T P a s e s i s t h e f o r m a t i o n o f a C a - d e p e n d e n t l a b i l e p h o s p h o r y l a t e d i n t e r m e d i a t e . A n a u t o r a d i o g r a m o f e x p e r i m e n t s d e s i g n e d t o i d e n t i f y t h e h y d r o x y l a m i n e s e n s i t i v e a c y l - p h o s p h a t e i n t e r m e d i a t e i s s h o w n i n F i g u r e Q I 2 4 . I n t h e a b s e n c e o f C a ( i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 4 mM E G T A ) n o p h o s p h o r y l a t e d i n t e r m e d i a t e was f o r m e d ( F i g u r e 24 l a n e A ) . A d d i t i o n o f 2+ 8 0 uM C a r e s u l t e d i n t h e f o r m a t i o n o f a p h o s p h o r y l a t e d i n t e r m e d i a t e i n t h e r e g i o n o f 1 1 5 , 0 0 0 d a l t o n s ( F i g u r e 24 l a n e B ) . I n t h e p r e s e n c e o f O j o j Mg a l o n e ( i n t h e p r e s e n c e o f e n d o g e n o u s C a ) , o r i n t h e p r e s e n c e o f 2+ 2+ C a a n d Mg , t w o p h o s p h o r y l a t e d i n t e r m e d i a t e s w e r e f o r m e d ( M r 1 3 2 , 0 0 0 a n d 1 1 5 , 0 0 0 F i g u r e 2 4 , l a n e C a n d D ) . B o t h p h o s p h o p r o t e i n s w e r e u n s t a b l e i n t h e p r e s e n c e o f h y d r o x y l a m i n e ( n o t s h o w n ) . I t h a s b e e n k n o w n f o r s o m e t i m e t h a t memb rane p h o s p h o r y l a t i o n may r e g u l a t e c e r t a i n c e l l u l a r f u n c t i o n s . M e m b r a n e p h o s p h o r y l a t i o n c a n b e c a t a l y s e d b y p r o t e i n k i n a s e e n z y m e s a s s o c i a t e d w i t h t h e memb rane o r b y c y t o p l a s m i c p r o t e i n k i n a s e s . I n t h i s e x p e r i m e n t a t t e m p t s w e r e made t o i d e n t i f y a n y memb rane p r o t e i n s p h o s p h o r y l a t e d b y e n d o g e n o u s p r o t e i n k i n a s e s u n d e r v a r i o u s e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s . S t a n d a r d p r o c e d u r e s f o r m e a s u r i n g p r o t e i n k i n a s e p h o s p h o r y l a t i o n w e r e u t i l i z e d , s u c h a s a h i g h - 123 -F i g u r e 24 SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d a u t o r a d i o g r a p h y o f a c y l p h o s p h a t e i n t e r m e d i a t e s o f p a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a m e m b r a n e s . 2 p - b o u n d t o p h o s p h o p r o t e i n s s e p a r a t e d on 8% s l a b g e l . A l a n e : n o a d d e d i o n s ( p r e s e n c e o f E G T A ) ; B l a n e : C a + ( 8 0 u M ) ; C l a n e : M g 2 + ( 8 0 u M ) ; D l a n e C a + + M g 2 + ( 8 0 uM a n d 80 u M ) . Mol. wt." 200-116-67-45-30-14-x10 . - 125 -ATP c o n c e n t r a t i o n ( 0 . 5 mM) a n d a l o n g e r i n c u b a t i o n t i m e (5 m i n ) . A s s h o w n i n F i g u r e 2 5 , s i m i l a r p h o s p h o r y l a t i o n p a t t e r n s w e r e o b s e r v e d b o t h i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f C a 2 + . H o w e v e r c a l m o d u l i n i n t h e p r e s e n c e o f Ca 2 " 1 " p r o d u c e d a g r e a t e r d e g r e e o f p h o s p h o r y l a t i o n o f a 1 9 , 0 0 0 a n d a 3 0 , 0 0 0 d a l t o n p r o t e i n ( F i g u r e 25 l a n e C ) . T h e l o w m o l e c u l a r b a n d s a t t h e g e l f r o n t ( F i g u r e 24 a n d 2 5 ) may r e p r e s e n t p h o s p h o r y l a t i o n o f membrane l i p i d s . E n y e d i e _ _ 1 ( 1 9 8 3 ) h a s r e p o r t e d t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f p o l y p h o s p h o i n o s i t e s i n l y m p h o c y t e , p l a t e l e t a n d r e d c e l l p l a s m a m e m b r a n e s b y c y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f membrane l i p i d s may p l a y a r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f c e l l u l a r f u n c t i o n s . 2+ 6. Determination of the Presence of a Ca -Transport Process In Acinar  Plasma Membrane Vesicle Preparations 2+ M a n y Ca - t r a n s p o r t p r o c e s s e s a r e m e d i a t e d b y a membrane b o u n d h i g h a f f i n i t y C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y ( P e n n i s t o n 1 9 8 2 ) . T h e r e f o r e i t wa s 2+ i n v e s t i g a t e d w h e t h e r a n A T P - d e p e n d e n t Ca - t r a n s p o r t p r o c e s s e x i s t e d i n p l a s m a m e m b r a n e s o b t a i n e d f r o m p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . F o r t h e s e s t u d i e s , p l a s m a m e m b r a n e s w e r e r e s u s p e n d e d i n 0 . 3 M s u c r o s e t o f a v o u r v e s i c l e f o r m a t i o n . I n v i e w o f t h e u n c e r t a i n t y o f t h e ' s i d e d n e s s ' o f t h e (Mg + 2+ C a ) - A T P a s e a t t h i s s t a g e o f t h e s t u d i e s a n d t h e c o n t r o v e r s y e x i s t i n g i n t h e l i t e r a t u r e , i t was d e c i d e d t h a t b o t h A T P - d e p e n d e n t Ca e f f l u x 2+ f r o m p r e - l o a d e d v e s i c l e s a n d A T P - d e p e n d e n t Ca - i n f l u x s h o u l d be m e a s u r e d . - 126 -F i g u r e 25 SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d a u t o r a d i o g r a p h y o f p h o s p h o r y l a t e d p a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a m e m b r a n e s . 2 P - p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i n s s e p a r a t e d o n a g r a d i e n t ( 5 - 2 0 % ) g e l . A l a n e : no a d d e d i o n s ( 2 . 2 mM E G T A ) ; B l a n e : C a 2 * ( 9 0 u M ) ; C l a n e : C a 2 + + C a l m o d u l i n ( 9 0 uM a n d 100 n M ) ; D l a n e ; c a l m o d u l i n + EGTA ( 1 0 0 nM a n d 2 . 2 mM); E l a n e : n o a d d e d i o n s . -U7-A B C D E - 128 -I n p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s , i t was o b s e r v e d t h a t t h e a m o u n t o f 45 2+ Ca a s s o c i a t e d w i t h t h e v e s i c l e s was c o n s i s t e n t l y l o w e r when v e s i c l e s w e r e l o a d e d i n t h e p r e s e n c e o f ATP t h a n w h e n ATP wa s a b s e n t . T h i s 24-s u g g e s t e d t h a t p e r h a p s t h e r e was a n A T P - d e p e n d e n t C a - e x t r u s i o n p r o c e s s i n v o l v e d . A s e r i e s o f e x p e r i m e n t s w e r e t h e n p e r f o r m e d i n w h i c h ' t 5 C a e f f l u x f r o m p r e l o a d e d v e s i c l e s was d e t e r m i n e d . F i g u r e 26 i l l u s t r a t e s t h e p r e s e n c e o f a n A T P - d e p e n d e n t Ca e x t r u s i o n s y s t e m i n t h e membrane v e s i c l e s , f o l l o w e d b y a s l o w b u t s t e a d y u p t a k e . The o b v i o u s c o n c e r n a t 24-t h i s p o i n t was w h e t h e r t h e i n i t i a l Ca T c o n t e n t o f t h e v e s i c l e s i n t h e 24-p r e s e n c e o r a b s e n c e o f ATP was s i m i l a r , a s w o u l d be e x p e c t e d i f Ca e x t r u s i o n wa s t h e o n l y e x i s t i n g p r o c e s s . To t e s t t h i s , o x a l a t e was 24-i n c l u d e d i n t h e p r e l o a d i n g m e d i u m i n o r d e r t o p r e v e n t Ca - e f f l u x . A s 24-s h o w n i n F i g u r e 2 7 , Ca - e f f l u x wa s g r e a t l y r e d u c e d u n d e r t h e s e 45 c o n d i t i o n s . H o w e v e r , t h e C a c o n t e n t o f t h e v e s i c l e s p r e l o a d e d i n t h e p r e s e n c e o f ATP was m u c h h i g h e r , s u g g e s t i n g t h e e x i s t e n c e o f a n 2-4-A T P - d e p e n d e n t a c c u m u l a t i o n p r o c e s s . ATP d e p e n d e n t Ca - u p t a k e w a s t h e r e f o r e m e a s u r e d . I n t h e s e s t u d i e s v e s i c l e s w e r e f o r m e d i n t h e 45 a b s e n c e o f ATP a n d Ca a n d t h e n t h e s e a g e n t s w e r e a d d e d t o t h e 24-i n c u b a t i o n m e d i a . T h e Ca - u p t a k e o b s e r v e d w a s r a p i d , r e a c h i n g a 24-max imum i n 2 m i n ( F i g u r e 2 8 ) . The a c c u m u l a t e d Ca c o u l d be r e l e a s e d b y t h e c a l c i u m i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 (5 u M ) . I t wa s o b s e r v e d t h a t t r a n s f e r r i n g t h e v e s i c l e s t o a n EGTA c o n t a i n i n g b u f f e r p r i o r t o f i l t r a t i o n i n c r e a s e d 24-t h e u p t a k e r a t e s . T h e EGTA w a s h i n g s t e p t o r e m o v e b o u n d Ca T w a s i n c o r p o r a t e d i n s u b s e q u e n t e x p e r i m e n t s . - 129 -F i g u r e 26 Ca f l u x e s I n p r e l o a d e d p l a s m a membrane v e s i c l e s p r e p a r e d f r o m p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . C a l c i u m l o a d e d v e s i c l e s i n t h e p r e s e n c e ( • — • ) a n d a b s e n c e ( O — O ) o f 5 mM ATP a t 0 ° C w e r e r e s u s p e n d e d i n n o n - r a d i o a c t i v e m e d i u m a n d t h e t r a n s p o r t a s s a y p e r f o r m e d a t 3 7 ° C . T h e r e s u l t i s t h e mean ± S . E . M . o f t h r e e d e t e r m i n a t i o n s . - 130 --!d" t6 6X» TIME (minutes) - 131 -F i g u r e 27 Ca c o n t e n t o f p r e l o a d e d p l a s m a memb rane v e s i c l e s p r e p a r e d f r o m p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . O x a l a t e f a c i l i t a t e d c a l c i u m l o a d e d v e s i c l e s i n t h e p r e s e n c e ( • ) a n d a b s e n c e ( o ) o f 5 mM ATP a t 0 ° C w e r e r e s u s p e n d e d i n n o n - r a d i o a c t i v e m e d i u m a n d t r a n s p o r t a s s a y p e r f o r m e d a t 3 7 ° C . R e s u l t s r e p r e s e n t t h e mean ± S . E . M . o f t h r e e d e t e r m i n a t i o n s . - 132 -Time (min.) - 133 -F i g u r e 28 T i m e - d e p e n d e n t Ca - u p t a k e i n p a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a membrane v e s i c l e s . C a - u p t a k e i n a m e d i u m c o n t a i n i n g 7 5 uM C a 2 + i n t h e p r e s e n c e (• • ) a n d a b s e n c e (0....0) o f 5 mM A T P . T h e v e s i c l e s w e r e p r e t r e a t e d w i t h 2 mM EGTA p r i o r t o t h e t r a n s p o r t a s s a y . R e s u l t s r e p r e s e n t t h e mean ± S . E . M . o f f o u r d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s . -134---- 135 -F i g u r e 29 r e p r e s e n t s t h e e f f e c t o f Mg + o n Ca - u p t a k e a c t i v i t y a t v a r y i n g f r e e C a 2 + c o n c e n t r a t i o n s . A d d i t i o n o f M g 2 + p r o d u c e d a m a r k e d 2-4- 2+ i n c r e a s e i n Ca - u p t a k e a c t i v i t y i n d i c a t i n g t h a t Mg i s e s s e n t i a l f o r 2-4-t h e C a - u p t a k e p r o c e s s . 7. Determination of the Orientation of the Catalytic Site of the Ca -ATPase Activity i n the Plasma Membranes of Acinar Cells I n o r d e r t o r e l a t e t h e ( M g 2 + + C a 2 + ) - A T P a s e a c t i v i t y o b s e r v e d i n p l a s m a memb r ane p r e p a r a t i o n s t o a p o s s i b l e f u n c t i o n a l r o l e i n t h e a c i n a r c e l l i t wa s i m p o r t a n t t o d e t e r m i n e t h e o r i e n t a t i o n o f t h e c a t a l y t i c s i t e o f t h i s e n z y m e . W i t h t h e a v a i l a b i l t y o f d i s p e r s e d p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s i t wa s p o s s i b l e t o m e a s u r e t h e ATP h y d r o l y t i c a c t i v i t y o f t h e c e l l s s u s p e n d e d i n t h e i n c u b a t i o n m e d i u m . I f t h e a c t i v e s i t e o f t h e 2_i 2-4-C a - A T P a s e f a c e s t h e c y t o p l a s m a s i n a m a j o r i t y o f Ca - t r a n s p o r t A T P a s e s , n o ATP h y d r o l y t i c a c t i v i t y w o u l d be o b s e r v e d . On t h e c o n t r a r y , a h i g h ATP h y d r o l y t i c a c t i v i t y was o b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o f e i t h e r C a 2 + o r M g 2 + ( F i g u r e 3 0 ) . T h e A T P a s e a c t i v i t y r e m a i n e d l a r g e l y u n c h a n g e d a f t e r d i s r u p t i o n o f t h e c e l l s by f r e e z i n g a n d t h a w i n g i n d i c a t i n g t h a t g r e a t e r t h a n 90% o f t h e a c t i v i t y i s e x t e r n a l l y - o r i e n t e d ( T a b l e V I I I ) . T a b l e V I I I i n d i c a t e s t h a t t h e A T P a s e a c t i v i t y o b s e r v e d i n i n t a c t c e l l s wa s n o t d ue m a i n l y t o b r o k e n o r d amaged c e l l s s i n c e t h e c y t o p l a s m i c e n z y m e m a r k e r , l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e was h a r d l y d e t e c t a b l e ( 0 . 0 0 5 % o f t o t a l ) i n t h e s e p r e p a r a t i o n s . A n i n v e s t i g a t i o n o f t h e ' s i d e d n e s s ' o f t h e ( M g 2 + + C a 2 + ) - A T P a s e was a l s o c a r r i e d o u t i n t h e v e s i c l e p r e p a r a t i o n u s e d t o m e a s u r e - 136 -F i g u r e 29 A T P - d e p e n d e n t C a ^ - u p t a k e a s a f u n c t i o n o f C a 2 + _ c o n c e n t r a t i o n i n p a n c r e a t i c a c i n a r memb r ane v e s i c l e s . C a 2 + - u p t a k e i n t h e p r e s e n c e ( • — • ) a n d a b s e n c e ( o - — O ) o f 5 mM M g 2 + a d d e d t o t h e i n c u b a t i o n m e d i u m f o l l o w i n g v e s i c l e s e a l i n g . T h e v e s i c l e s w e r e p r e t r e a t e d w i t h 2 mM EGTA p r i o r t o t h e t r a n s p o r t a s s a y . D a t a r e p r e s e n t t h e mean ± S . E . M . o f f o u r d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s . - 137 -400 ICa 2 +l free - 138 -F i g u r e 30 A T P a s e a c t i v i t y o f i n t a c t p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s a n d h o m o g e n a t e s . ATP h y d r o l y t i c a c t i v i t y i n c e l l s u s p e n s i o n ( 1 0 6 c e l l s / m l ) i n t h e p r e s e n c e o f C a , + ( • • ) a n d M g 2 + ( A — A ) o r c e l l h o m o g e n a t e s i n t h e p r e s e n c e o f Ca + (O O) a n d Mg ( A — A ) . D a t a r e p r e s e n t t h e mean ± S . E . M . o f f o u r d i f f e r e n t d e t e r m i n a t i o n s . - • 1 3 9 — 0 050 tx>o I ION I mM - 140 -T a b l e V I I I A T P a s e a n d L a c t a t e D e h y d r o g e n a s e A c t i v i t i e s o f I n t a c t P a n c r e a t i c A c i n a r C e l l s a n d H o m o g e n a t e s . S p e c i f i c A c t i v i t y ( u m o l e s / m g p r o t / h r ) I n t a c t C e l l s C e l l H o m o g e n a t e s 4 . 1 6 ± 0 . 8 5 . 7 8 ± 0 . 5 1 . 8 1 ± 0 . 5 I n t a c t a c i n a r c e l l s w e r e r e s u s p e n d e d i n p h o s p h a t e f r e e K r e b s - R i n g e r -b i ^ a r b o n a t e s o l u t i o n c o n t a i n i n g 2 mM A T P , 5 mM N a N 3 a n d 1 mM C a 2 o r Mg + a t a c o n c e n t r a t i o n o f 10 c e l l s / m l f o r 15 m i n a t 3 7 ° C . A p o r t i o n o f t h e c e l l s u s p e n s i o n wa s s i m i l a r l y t r e a t e d e x c e p t t h a t i t wa s s u b j e c t e d t o f r e e z i n g a n d t h a w i n g b e f o r e e n z yme a s s a y ( c e l l h o m o g e n a t e s ) . I n b o t h c a s e s a l i q u o t s o f t h e i n c u b a t i o n m e d i a w e r e c e n t r i f u g e d a t 1 0 , 0 0 0 r pm f o r 45 s e c a n d t h e s u p e r n a t a n t a s s a y e d f o r i n o r g a n i c p h o s p h a t e o r l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y . S p e c i f i c a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s u m o l e s p e r mg c e l l p r o t e i n . R e s u l t s r e p r e s e n t mean ± S . E . M . o f f o u r d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s . C a " ' " -ATPase 4 . 2 6 ± 0 . 6 M g 2 + - A T P a s e 5 . 2 2 ± 0 . 3 L a c t a t e d e h y d r o g e n a s e 0 . 0 1 ± 0 . 0 - 141 -A T P - d e p e n d e n t Ca - t r a n s p o r t ( s e e t h e p r e v i o u s s e c t i o n ) . A s i m i l a r o r i e n t a t i o n a s t h a t n o t e d i n t h e i n t a c t c e l l s wa s o b s e r v e d ; t h e v e s i c l e s e x h i b i t e d a n a c c e s s i b l e (Mg " r + Ca ) - A T P a s e a c t i v i t y c o m p a r a b l e w i t h t h a t o f b r o k e n m e m b r a n e s ( T a b l e I X ) . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e m a j o r i t y o f t h e s e v e s i c l e s w e r e r i g h t - s i d e o u t (> 9 5 % ) . C o n s i s t e n t w i t h a f u l l y a c c e s s i b l e c a t a l y t i c s i t e , n e i t h e r d e o x y c h o l a t e ( 0 . 0 4 - 0 . 2 5 mM) n o r f r e e z i n g a n d t h a w i n g c o u l d u n m a s k l a t e n t a c t i v i t y ( T a b l e I X ) . - 142 -T a b l e I X T h e O r i e n t a t i o n o f C a 2 + - A T P a s e A c t i v i t y i n P l a s m a M e m b r a n e V e s i c l e P r e p a r a t i o n s . T r e a t m e n t % C o n t r o l C o n t r o l 100 DOC 40 uM 1 0 1 . 3 80 uM 1 0 3 . 8 120 uM 9 8 . 7 160 uM 9 8 . 5 200 uM 9 1 . 0 2 4 0 uM 9 0 . 7 F r e e z e t h a w l x 1 0 1 . 2 F r e e z e t h a w 2 x 9 7 . 5 P l a s m a memb rane v e s i c l e p r e p a r a t i o n s w e r e i n c u b a t e d i n 20 mM T r i s b u f f e r pH 7 . 4 c o n t a i n i n g 0 . 3 M s u c r o s e , 2 mM N a N 3 , 0 . 5 mM A T P , 21 uM f r e e C a 2 + a n d i n t h e p r e s e n c e o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f d e o x y c h o l a t e ( D O C ) . D a t a r e p r e s e n t t h e mean o f two d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s , e a c h d o n e i n d u p l i c a t e . - 143 -DISCUSSION A Ca " ' " -ATPase a c t i v i t y h a s b e e n c h a r a c t e r i z e d i n p l a s m a m e m b r a n e e n r i c h e d p r e p a r a t i o n s f r o m p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . I t s s u b c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n p a r a l l e l s t h a t o f p l a s m a membrane m a r k e r e n z y m e s , s u g g e s t -i n g t h a t t h e C a " ' " -ATPase a c t i v i t y i s e n d o g e n o u s t o t h e p l a s m a m e m b r a n e . V a r i o u s w o r k e r s ( F o r g e t a n d H e i s l e r 1 9 7 6 ; M i l u t i n o v i c _ _ a l 1 9 7 7 ; L a m b e r t a n d C h r i s t o p h e 1 9 7 8 ; L e B e l e t a l 1 9 8 0 ; M a r t i n a n d S e n i o r 1 9 8 0 ) 2+ h a v e d e s c r i b e d a Ca - A T P a s e a c t i v i t y i n p l a s m a m e m b r a n e s p r e p a r e d f r o m p a n c r e a t i c t i s s u e h o m o g e n a t e s . S i n c e t h e p a n c r e a s i s a h e t e r o c e l l u l a r 2+ o r g a n , t h e C a - A T P a s e a c t i v i t y o b s e r v e d c o u l d n o t b e d i r e c t l y r e l a t e d t o a c i n a r c e l l f u n c t i o n . T h e p r e s e n t s t u d y e m p l o y e d a h o m o g e n e o u s p o p u l a t i o n o f a c i n a r c e l l s . R a d i o i m m u n o a s s a y s h o w e d a 35 - 75% d e c r e a s e i n i n s u l i n l e v e l s i n t h e f i n a l p r e p a r a t i o n . T h e r e s i d u a l i n s u l i n d e t e c t e d may be i n s u l i n d i s l o d g e d f r o m b i n d i n g s i t e s on a c i n a r c e l l s ( K o r c _ t a l 1 9 7 8 ) r a t h e r t h a n c o n t a m i n a t i o n b y p - c e l l s . C y t o -c h e m i c a l a n a l y s i s r e v e a l e d one c e l l t y p e w i t h f e a t u r e s c h a r a c t e r i s t i c s o f a c i n a r c e l l s . T h e s t a i n i n g t e c h n i q u e u s e d was g e n e r a l e n o u g h t o d e t e c t a n y o t h e r c e l l t y p e p r e s e n t . I n c o n t r a s t t o p r e v i o u s s t u d i e s ( F o r g e t a n d H e i s l e r 1 9 7 6 ; M i l u t i n o v i c _ _ a l 1 9 7 7 ; L a m b e r t a n d C h r i s t o p h e 1 9 7 8 ; L e B e l et_ a l 1 9 8 0 ; M a r t i n a n d S e n i o r 1 9 8 0 ) w h i c h r e p o r t e d c a l c i u m s e n s i t i v i t y o f t h e A T P a s e i n t h e m i l l i m o l a r r a n g e , a h i g h a f f i n i t y C a 2 + - A T P a s e w i t h a K j f o r 2+ C a o f 1 .7 uM wa s o b s e r v e d i n t h e s e p l a s m a memb rane p r e p a r a t i o n s . - 144 -S i n c e t h e f r e e c o n c e n t r a t i o n o f c a l c i u m i n t h e a c i n a r c e l l c y t o s o l i s t y p i c a l l y b e t w e e n 0 . 1 a n d 10 u M , t h i s e n z y m e may p l a y a r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n s . T h e C a - E G T A b u f f e r s y s t e m a n d t h e l o w ATP c o n c e n t r a t i o n s ( 0 . 5 mM) u s e d a r e n e c e s s a r y t o r e v e a l t h e h i g h a f f i n i t y c o m p o n e n t o f t h e C a 2 + - A T P a s e ( L o t e r s z t a j n et_ a l 1 9 8 1 ) . T h e s e c o n d i t i o n s w e r e n o t e m p l o y e d b y p r e v i o u s w o r k e r s a n d c o u l d e x p l a i n why t h e h i g h a f f i n i t y c o m p o n e n t wa s n o t o b s e r v e d i n t h e i r s t u d i e s . B y t h e u s e o f E D T A - t r e a t e d m e m b r a n e s , a n a p p a r e n t r e q u i r e m e n t o f 24- 24-t h i s Ca - A T P a s e a c t i v i t y f o r Mg wa s d e m o n s t r a t e d . P r e s u m a b l y , e n d o g e n o u s o r t i g h t l y b o u n d M g 2 + i s s u f f i c i e n t t o s a t i s f y t h e M g 2 + 2+ 24-r e q u i r e m e n t o f t h i s C a - A T P a s e . T h e p l a s m a memb rane Ca - A T P a s e o f c e l l s f r o m c o r p u s l u t e u m ( V e r m a a n d P e n n i s t o n 1 9 8 1 ) , l i v e r ( L o t e r s z t a j n e t a l 1 9 8 1 ) p a n c r e a t i c i s l e t s ( K o t a g a l e t a l 1 9 8 2 ) a n d e m b r y o n i c b o n e c e l l s i n c u l t u r e ( S h e n j^t a l 1 9 8 3 ) h a v e b e e n s hown t o h a v e s i m i l a r M g 2 + 24-r e q u i r e m e n t s . I n c r e a s i n g t h e Mg c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e s t h e A T P a s e a c t i v i t y , e v e n t u a l l y r e a c h i n g ATP h y d r o l y t l c r a t e s s i m i l a r t o t h a t 24-o b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o f C a a l o n e . E v i d e n c e o b t a i n e d i n d i c a t e s t h a t t h e a c t i v i t y m e a s u r e d i n t h e p r e s e n c e o f C a 2 + o r M g 2 + i s o n e e n z y m e w i t h a c a t a l y t i c s i t e t h a t h a s d i f f e r e n t a f f i n i t i e s f o r t h e c a t i o n s : F i r s t , s a t u r a t i n g c o n c e n t r a t i o n s o f C a 2 + a n d M g 2 + p r o d u c e t h e same 24- 24-max imum a c t i v i t y . S e c o n d , b o t h Ca - A T P a s e a n d Mg - A T P a s e a c t i v i t i e s h a v e s i m i l a r pH o p t i m a . T h i r d , t h e r e i s a s t r i k i n g s i m i l a r i t y i n t h e i r s u b s t r a t e r e q u i r e m e n t p r o f i l e . H o w e v e r , d i f f e r e n c e s o b s e r v e d i n t r a n s i t i o n t e m p e r a t u r e s f o r t h e M g 2 + a n d C a 2 + a c t i v i t y a n d t h e p o s s i b l e - 145 -p r e s e n c e o f d i f f e r e n t p h o s p h o e n z y m e i n t e r m e d i a t e s c a n n o t be e x p l a i n e d o n t h e b a s i s o f a s i n g l e e n z y m e . 2+ T h e a c i n a r p l a s m a memb rane Ca - A T P a s e a c t i v i t y was s t i m u l a t e d by c a l m o d u l i n ; t h i s s t i m u l a t i o n wa s b l o c k e d b y m i c r o m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f t r i f l u o p e r a z i n e a n d c h l o r p r o m a z i n e . T h e c o n c e n t r a t i o n s o f t r i f l u o p e r a z i n e ( 3 0 uM) a n d c h l o r p r o m a z i n e ( 5 5 uM) t h a t p r o d u c e d h a l f m a x i m a l i n h i b i t i o n o f t h e c a l m o d u l i n s t i m u l a t e d a c t i v i t y a r e s i m i l a r t o t h o s e r e p o r t e d f o r o t h e r s y s t e m s ( R o u f o g a l i s 1 9 8 2 ) . A l t h o u g h t h e c o n c e n t r a t i o n s o f c a l m o d u l i n u s e d w e r e h i g h (K^ = 750 nM) c o m p a r e d t o t h o s e r e q u i r e d f o r a c t i v a t i o n o f p h o s p h o d i e s t e r a s e a n d e r y t h r o c y t e C a 2 + - A T P a s e ( S c h a r f f 1 9 8 1 ) , m u c h h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f c a l m o d u l i n a r e 2+ r e q u i r e d f o r t h e a c t i v a t i o n o f t h e Ca - A T P a s e o f i s l e t c e l l p l a s m a memb r ane ( K o t a g a l e _ _ 1 1 9 8 2 ) a n d c a n i n e v e n t r i c l e s a r c o p l a s m i c r e t i c u l u m ( K i r c h b e r g e r a n d A n t o n e t z 1 9 8 2 ) . T h e c a l m o d u l i n ( 4 2 n g / m g p r o t e i n ) t h a t r e m a i n e d b o u n d t o t h e m e m b r a n e s d u r i n g i s o l a t i o n c o u l d e x p l a i n t h i s d e c r e a s e d r e s p o n s i v e n e s s . T h e s a t u r a t i n g c o n c e n t r a t i o n o f c a l m o d u l i n u s e d ( 1 . 7 uM) i s o n l y a f r a c t i o n o f t h e t o t a l a m o u n t o f c a l m o d u l i n i n t h e c y t o p l a s m o f a c i n a r c e l l s ( e s t i m a t e d t o be 5 uM; V a n d e r m e e r s e t a l 1 9 7 7 ) . C a l m o d u l i n s t i m u l a t i o n o f t h e C a 2 + - A T P a s e o b s e r v e d I n t h e a b s e n c e o f a d d e d c a l c i u m ( T a b l e V I ) c o u l d be due t o t h e p r e s e n c e o f e n d o g e n o u s c a l c i u m ; u n d e r t h e c o n d i t i o n o f t h e a s s a y , t h i s i s e s t i m a t e d t o be 9nM (7 uM t o t a l ) . I n t h e p r e s e n c e o f 1 mM E G T A , o n l y 20% o f t h e c a l m o d u l i n a c t i v a t i o n was l o s t , s u g g e s t i n g t h a t p e r h a p s n o t 2+ a l l e n d o g e n o u s Ca w a s c h e l a t e d . T h e EGTA c o n c e n t r a t i o n s w e r e n o t f u r t h e r i n c r e a s e d t o a v o i d t h e d i r e c t e f f e c t o f EGTA on A T P a s e a c t i v i t y - 146 -o b s e r v e d b y o t h e r s ( S a r k a d i et_ j i l 1 9 7 9 ; A l - J o b o r e a n d R o u f o g a l i s 1 9 8 1 a ; K o t a g a l et^ al^ 1 9 8 3 ) . T h e l a c k o f c a l m o d u l i n s t i m u l a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 1 mM EDTA c a n be r e l a t e d t o t h e f a c t t h a t M g 2 + c o n f e r s C a 2 + s e n s i t i v i t y t o t h e A T P a s e a c t i v i t y a s s h o w n b y e x p e r i m e n t s w i t h E D T A - t r e a t e d m e m b r a n e s ( F i g 1 9 ) . E x p e r i m e n t s p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f c a l m o d u l i n o n E D T A - t r e a t e d m e m b r a n e s r e v e a l e d c o m p l e x k i n e t i c s ( F i g . 2 0 ) . C a l m o d u l i n 2+ s t i m u l a t i o n was o b s e r v e d b o t h i n t h e a b s e n c e o f a d d e d Ca a n d i n t h e p r e s e n c e o f Mg a l o n e . T h e d e g r e e o f s t i m u l a t i o n wa s f o u n d t o be 2+ c o n s i s t e n t l y l o w e r u p o n a d d i t i o n o f 0 . 0 1 5 uM C a i n b o t h c a s e s . I n l i g h t o f t h e o b s e r v a t i o n s o f K o t a g a l et^ j a l ( 1 9 8 3 ) i n d i c a t i n g t h a t 2+ C a - E G T A s t i m u l a t e s p a n c r e a t i c i s l e t p l a s m a memb r ane C a - A T P a s e , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e C a - E G T A b u f f e r u s e d may h a v e p r o d u c e d d i r e c t e f f e c t s on t h e A T P a s e u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s . 125 T h e I - l a b e l e d c a l m o d u l i n g e l o v e r l a y t e c h n i q u e r e v e a l e d a 2+ C a - d e p e n d e n t b i n d i n g t o a 1 3 3 , 0 0 0 d a l t o n p r o t e i n . T h e m o l e c u l a r w e i g h t o f t h i s p r o t e i n c o m p a r e s f a v o u r a b l y w i t h t h a t o f e r y t h r o c y t e C a 2 + - A T P a s e , r e p o r t e d t o be 1 3 8 , 0 0 0 ( C a r a f o l i e t a l 1 9 8 2 ) . The p r e s e n c e o f a 1 3 3 , 0 0 0 d a l t o n c a l m o d u l i n b i n d i n g p r o t e i n , c o u p l e d t o t h e i d e n t i f i c a t i o n o f a h y d r o x y l a m i n e s e n s i t i v e p h o s p h o p r o t e i n o f s i m i l a r 2 i 2+ m o l e c u l a r w e i g h t o b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o f Ca " r a n d Mg i n t h i s s t u d y p r o v i d e s c o n v i n c i n g e v i d e n c e t h a t t h e 1 3 3 , 0 0 0 d a l t o n p r o t e i n i s t h e 2 i Ca —ATPa s e m o l e c u l e , a n d t h a t l i k e many o t h e r c a l m o d u l i n d e p e n d e n t e n z y m e s i t i s s t i m u l a t e d b y a d i r e c t i n t e r a c t i o n w i t h c a l m o d u l i n . T a w a t a a n d F i e l d ( 1 9 8 2 ) h a v e r e p o r t e d t h e p r e s e n c e o f 2 2 0 , 0 0 0 a n d - 147 -1 5 0 , 0 0 0 d a l t o n c a l m o d u l i n b i n d i n g p r o t e i n s i n r a t l i v e r a n d b o v i n e t h y r o i d p l a s m a m e m b r a n e s b u t n o t i n e r y t h r o c y t e p l a s m a m e m b r a n e s . T h e s e c a l c i u m - d e p e n d e n t c a l m o d u l i n b i n d i n g p r o t e i n s a p p e a r t o be c o m p o n e n t s o f t h e c y t o s k e l e t o n s i n c e t h e y r e m a i n e d i n t h e p e l l e t a f t e r t r e a t m e n t o f t h e m e m b r a n e s w i t h T r i t o n X - 1 0 0 . I n t e r e s t i n g l y , a s i m i l a r c a l m o d u l i n b i n d i n g p r o t e i n ( M r = 2 3 0 , 0 0 0 ) w a s o b s e r v e d i n p a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a m e m b r a n e s ( F i g . 2 1 ) . T h i s p r o t e i n may i n t e r a c t w i t h o t h e r c o m p o n e n t s o f t h e c y t o s k e l e t o n t o r e g u l a t e e x o c y t o s i s i n t h e e x o c r i n e p a n c r e a s . I t m u s t b e n o t e d , t h o u g h , t h a t s e v e r a l c a l c i u m - i n d e p e n d e n t c a l m o d u l i n - b i n d i n g p r o t e i n s w e r e p r e s e n t i n p a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a m e m b r a n e s , ( p r e s e n c e o f e n d o g e n o u s C a 2 + a n d E G T A ) . The f u n c t i o n o f t h e s e c a l m o d u l i n b i n d i n g p r o t e i n s i s n o t k n o w n . I t h a s b e e n s hown t h a t d u r i n g t h e p u r i f i c a t i o n o f e r y t h r o c y t e ( C a r a f o l i _ t a l 1 9 8 2 ) a n d h e a r t s a r c o l e m m a ( C a r o n i _ t a l 1 9 8 2 ) C a - A T P a s e , a l a r g e p r o p o r t i o n o f t h e p r o t e i n s t h a t b i n d t o t h e c a l m o d u l i n a f f i n i t y c o l u m n c a n be e l u t e d w i t h 2+ a C a w a s h . I n i n t a c t a c i n a r c e l l s i t wa s s h o w n t h a t p h e n o t h i a z i n e s i n h i b i t c a l c i u m m e d i a t e d a m y l a s e r e l e a s e , p o s s i b l y b y a c t i n g on a c a l m o d u l i n - r e g u l a t e d s t e p i n t h e s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g p r o c e s s . T h i s c o r r o b o r a t e s t h e o b s e r v a t i o n s o f H e i s l e r e _ a l ( 1 9 8 1 ) who h a v e s u g g e s t e d t h a t c a l m o d u l i n may h a v e a f u n c t i o n a l r o l e i n e x o c r i n e p a n c r e a t i c e n z y m e s e c r e t i o n . A t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s ( 1 0 - l t M o r g r e a t e r ) , p h e n o t h i a z i n e s may h a v e o t h e r e f f e c t s o n t h e f u n c t i o n o f i n t a c t c e l l s t h a t may a c c o u n t f o r t h e i n h i b i t o r y e f f e c t s o n p a n c r e a t i c a m y l a s e s e c r e t i o n a s i n d i c a t e d b y W i l l i a m s _ t a l ( 1 9 7 7 ) a n d S i n g h - 148 -( 1 9 8 0 ) . P h e n o t h i a z i n e s a r e h y d r o p h o b i c m o l e c u l e s w h i c h p a r t i t i o n n o n - s e l e c t i v e l y i n t o m e m b r a n e s a n d o t h e r h y d r o p h o b i c s i t e s , w i t h p o s s i b l e c o n s e q u e n c e s o t h e r t h a n a n t a g o n i s m o f Ca - d e p e n d e n t e n z y m e s y s t e m s . P h e n o t h i a z i n e s c a n i n h i b i t ( N a + + K + ) - A T P a s e w h i c h may a f f e c t i o n g r a d i e n t s o r t u b u l i n , w h i c h i n t u r n c o u l d a f f e c t t h e d i s t r i b u t i o n o f m e m b r a n e - b o u n d r e c e p t o r s a n d s e c r e t i o n p r o c e s s e s ( R o u f o g a l i s 1 9 8 2 ) . I n a d d i t i o n , t h e p h e n o t h i a z i n e s h a v e a - a d r e n e r g i c a n d m u s c a r i n i c r e c e p t o r b l o c k i n g a c t i v i t i e s ( R o u f o g a l i s 1 9 8 2 ) w h i c h may c o m p l i c a t e t h e b i o l o g i c a l e f f e c t s o f t h e s e a g e n t s . T h e r e f o r e , d a t a o b t a i n e d o n i s o l a t e d t i s s u e p r e p a r a t i o n s s h o u l d be i n t e r p r e t e d w i t h c a u t i o n . N e v e r t h e l e s s , u n d e r c o n t r o l l e d c o n d i t i o n s , t h e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f p h e n o t h i a z i n e s h a v e b e e n u s e d t o i n v o k e t h e r o l e o f c a l m o d u l i n i n t h e f u n c t i o n o f a n u m b e r o f c e l l s i n c l u d i n g p a n c r e a t i c i s l e t s ( G a g l i a r d i n o et^ a l 1 9 8 0 ) , a n t e r i o r p i t u i t a r y c e l l s ( M e r i t t et^ a l 1 9 8 2 ) a n d m a s t c e l l s ( D o u g l a s a n d N e m e t h 1 9 8 2 ) . C l e a r l y , m o r e s p e c i f i c a n t i c a l m o d u l i n a g e n t s a r e n e e d e d f o r s t u d i e s i n v o l v i n g i s o l a t e d t i s s u e p r e p a r a t i o n s . Some o f t h e m o r e s p e c i f i c a n t i c a l m o d u l i n a g e n t s c i t e d i n t h e l i t e r a t u r e a r e c a l m i d a z o l i u m ( B e l l e 1 9 8 1 ) , W7 ( H i d a k a a n d T a n a k a 1 9 8 2 ) a n d Compound 4 8 / 8 0 ( G i e t z e n e t a l 1 9 8 3 ) . I n t h e p a n c r e a s , c a l m o d u l i n h a s b e e n s h o w n t o s t i m u l a t e n o t o n l y t h e n i p l a s m a memb rane C a - A T P a s e a c t i v i t y ( s e e a b o v e ) b u t a l s o c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e ( V a n d e r m e e r s et^ al_ 1 9 8 3 ) . I n v i e w o f t h e f a c t t h a t t h e r o l e o f c y c l i c n u c l e o t i d e s i n c a l c i u m - m e d i a t e d e n z y m e r e l e a s e f r o m t h e e x o c r i n e p a n c r e a s i s s t i l l n o t c o n c l u s i v e , t h e m e c h a n i s m by w h i c h c a l m o d u l i n a c t i v a t i o n o f p h o s p h o d i e s t e r a s e r e g u l a t e s - 149 -p a n c r e a t i c e n z y m e s e c r e t i o n i s u n c e r t a i n . T h e r o l e o f p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n i n t h e r e g u l a t i o n o f p a n c r e a t i c f u n c t i o n h a s b e e n e x a m i n e d r e c e n t l y . B u r n h a m a n d W i l l i a m s ( 1 9 8 2 ) h a v e s h o w n t h a t c a r b a c h o l a n d CCK8 a t c o n c e n t r a t i o n s t h a t p r o d u c e a m y l a s e s e c r e t i o n i n c r e a s e d t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f a M r = 3 2 , 0 0 0 p a r t i c u l a t e p r o t e i n a n d Mj. = 1 6 , 0 0 0 a n d 2 3 , 0 0 0 s o l u b l e p r o t e i n s . T h e s e a g e n t s a l s o a l t e r e d t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f Mj. = 2 1 , 0 0 0 a n d 2 0 , 5 0 0 s o l u b l e p r o t e i n s . S i n c e i n s u l i n w h i c h d o e s n o t p r o d u c e d i r e c t s t i m u l a t i o n o f a m y l a s e r e l e a s e d i d n o t a l t e r t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 2 1 , 0 0 0 a n d 2 0 , 5 0 0 d a l t o n s o l u b l e p r o t e i n s , t h e s e a u t h o r s c o n c l u d e d t h a t t h e two p r o t e i n s a r e s p e c i f i c a l l y i n v o l v e d i n t h e p r o c e s s o f e x o c y t o s i s ( B u r n h a m a n d W i l l i a m s 1 9 8 2 ) . M o r e r e c e n t l y , a p h o s p h o l i p i d - s e n s i t i v e 2+ Ca - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e a n d i t s e n d o g e n o u s s u b s t r a t e p r o t e i n s ( M r = 3 8 , 0 0 0 , 3 0 , 0 0 0 , 2 2 , 0 0 0 a n d 1 5 , 0 0 0 ) h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d i n p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l e x t r a c t s ( W r e n n 1 9 8 3 ) . C a l m o d u l i n was p a r t i a l l y e f f e c t i v e a s a c o f a c t o r f o r p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 3 8 , 0 0 0 s u b s t r a t e p r o t e i n ( W r e n n 1 9 8 3 ) . T h e s e a u t h o r s e x a m i n e d p h o s p h o r y l a t i o n r e a c t i o n s i n e i t h e r t o t a l p a r t i c u l a t e ( B u r n h a m a n d W i l l i a m s 1 9 8 2 ) o r s o l u b l e f r a c t i o n s ( B u r n h a m a n d W i l l i a m s 1 9 8 2 ; W r e n n 1 9 8 3 ) w i t h n o r e f e r e n c e t o t h e s u b c e l l u l a r o r i g i n o f t h e s u b s t r a t e . I n t h e s e p r e s e n t s t u d i e s when p a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a m e m b r a n e s a r e i n c u b a t e d i n t h e p r e s e n c e o f C a 2 + , M g 2 + a n d 0 . 5 mM ATP f o r 5 m i n a t 3 0 ° C , c o v a l e n t p h o s p h o p r o t e i n f o r m a t i o n was o b s e r v e d i n a n u m b e r o f p r o t e i n s ( F i g . 2 5 ) . The d e g r e e o f p h o s p h o r y l a t o n o f t h e 1 9 , 0 0 0 a n d 3 0 , 0 0 0 d a l t o n p r o t e i n s wa s e n h a n c e d b y c a l m o d u l i n . O f p a r t i c u l a r - 150 -i n t e r e s t i s t h e s i m i l a r i t y o f t h i s 3 0 , 0 0 0 d a l t o n p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n t o t h e r e p o r t e d p h o s p h o r y l a t i o n o f a 3 2 , 0 0 0 d a l t o n p a r t i c u l a t e p r o t e i n u p o n s t i m u l a t i o n o f a c i n a r c e l l s w i t h c a r b a c h o l a n d CCK8 ( B u r n h a m a n d W i l l i a m s 1 9 8 2 ) . T h i s l a t t e r r e s u l t p r o v i d e s a p o s s i b l e l i n k b e t w e e n p h o s p h o r y l a t i o n o f p l a s m a membrane p r o t e i n s a n d t h e r e s p o n s e o f a c i n a r c e l l s t o s e c r e t a g o g u e s . T h e e f f e c t o f c a l m o d u l i n o n p a n c r e a t i c e n z y m e s e c r e t i o n c a n t h u s be e n v i s a g e d a s t h r e e - f o l d : C a l m o d u l i n c o u l d a c t on a p l a s m a m e m b r a n e c a l c i u m pump t o r e g u l a t e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m , r e g u l a t e t h e s e c r e t o r y p r o c e s s b y i n t e r a c t i n g w i t h t h e c y t o s k e l e t o n v i a t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t c a l m o d u l i n b i n d i n g p r o t e i n o b s e r v e d , o r e n h a n c e p h o s p h o r y l a t i o n o f t a r g e t p r o t e i n s i n t h e p l a s m a m e m b r a n e . T h e A T P a s e a c t i v i t y d e s c r i b e d i n t h i s p r e s e n t s t u d y h a s c e r t a i n c h a r a c t e r i s t i c s s i m i l a r t o t h e ATP d i p h o s p h o h y d r o l a s e p r e s e n t i n a n u m b e r o f t i s s u e s . T h e e n z y m e c a n h y d r o l y s e n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e s ( A T P , G T P ) a n d d i p h o s p h a t e ( A D P ) a t h i g h r a t e s i n t h e p r e s e n c e o f C a 2 + o r Mg . T h e l a c k o f s e n s i t i v i t y t o a z i d e a n d m o n o v a l e n t c a t i o n s ( t h i s s t u d y ) , a s w e l l a s o u a b a i n , r u t h e n i u m r e d , o l i g o m y c i n ( L e B e l e t a l 1 9 8 0 ) a n d v a n a d a t e ( M a r t i n a n d S e n i o r 1 9 8 0 ) d i s t i n g u i s h e s t h e ATP d i p h o s p h o h y d r o l a s e f r o m o t h e r A T P a s e s . A s i m i l a r e n z y m e h a s b e e n c h a r a c t e r i z e d i n a n u m b e r o f t i s s u e s i n c l u d i n g t h e l i v e r ( G a r n e t t e t al^ 1 9 7 6 ) , k i d n e y ( S a f f r a n a n d K i n n e 1 9 7 4 ) , m a s t c e l l s ( C o o p e r a n d S t a n w o r t h 1 9 7 6 ) , s k e l e t a l ( M a l o u f a n d M e i s s n e r 1 9 7 9 ) , S m o o t h ( Kwan 1 9 8 2 ) a n d c a r d i a c m u s c l e s ( A n a n d - S r i v a s t a r a et^ a l , 1 9 8 2 ) a n d mouse s a r c o m a s , human a s t r o c y t o m a , o a t c e l l c a r c i n o m a a n d m e l a n o m a ( K n o w l e s , j e t al^ 1 9 8 3 ) . T h e - 151 -f u n c t i o n o f t h i s enzymie s y s t e m i s l a r g e l y u n k n o w n . K w a n ( 1 9 8 2 ) h a s 2+ 2+ s h o w n t h a t t h e Mg o r Ca A T P a s e a c t i v i t y o f p l a s m a m e m b r a n e s i s o l a t e d f r o m v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e wa s d e c r e a s e d i n s p o n t a n e o u s l y h y p e r t e n s i v e r a t s . I n r a t h e a r t s a r c o l e m m a , i t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h e 2+ Ca - A T P a s e c o m p o n e n t may be i n v o l v e d i n o p e n i n g o f c a l c i u m c h a n n e l s ( A n a n d - S r i v a s t a v a e t a l 1 9 8 2 ) . A f e a t u r e o f some o f t h e ATP d i p h o s p h o h y d r o l a s e s i s a n e x t e r n a l l y - o r i e n t e d a c t i v e s i t e . U s i n g i s o l a t e d i n t a c t c e l l s i n t h i s p r e s e n t s t u d y i t was d e m o n s t r a t e d t h a t p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s c a n h y d r o l y s e e x t e r n a l l y a d d e d ATP i n t h e p r e s e n c e o f C a 2 + o r M g 2 + ( F i g 3 0 ) . D u r i n g t h e c o u r s e o f t h i s s t u d y H a m l y n a n d S e n i o r ( 1 9 8 3 ) p r e s e n t e d e v i d e n c e t o s u g g e s t t h a t 9 0 - 9 5 % o f t h e p a n c r e a t i c a c i n a r p l a s m a m e m b r a n e C a o r Mg - A T P a s e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s a n e c t o - e n z y m e . W h i l e t h i s i s i n a g r e e m e n t w i t h t h e p r e s e n t s t u d i e s , t h e q u e s t i o n s t i l l r e m a i n s w h e t h e r a l l t h e A T P a s e a c t i v i t y a s s o c i a t e d w i t h t h e p l a s m a membrane i s e x t e r n a l l y o r i e n t e d a n d n a t i v e t o t h e p l a s m a m e m b r a n e . B o t h b i o c h e m i c a l a n d c y t o c h e m i c a l s t u d i e s h a v e s hown t h a t C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y e x i s t s i n z y m o g e n g r a n u l e m e m b r a n e s ( B e a u d o i n a l 1 9 8 0 ) . T h e p r e s e n c e o f l e a d d e p o s i t s o v e r t h e l u m i n a l s u r f a c e o f a c i n a r c e l l s a n d o n t h e i n n e r s u r f a c e o f z y m o g e n g r a n u l e m e m b r a n e s a t t h e o u t s e t o f f u s i o n i n d i c a t e s t h a t p a r t o f t h e p l a s m a memb rane Ca - A T P a s e c o u l d be d e r i v e d f r o m z y m o g e n g r a n u l e m e m b r a n e s a s a r e s u l t o f e x o c y t o s i s ( B e a u d o i n _ t a l 1 9 8 0 ) . I f t h e a c t i v e s i t e o f t h e C a 2 + - A T P a s e i s s i t u a t e d o n t h e c y t o p l a s m i c s i d e o f t h e z y m o g e n g r a n u l e s , t h e n f o l l o w i n g f u s i o n w i t h t h e p l a s m a m e m b r a n e , t h e e n z y m e w o u l d be i n t e r n a l l y o r i e n t e d . So f a r t h i s - 152 -h a s n o t b e e n d e m o n s t r a t e d c y t o c h e m i c a l l y . T h e r e f o r e , u n t i l t h e m e c h a n i s m o f memb r ane f u s i o n i s f u l l y u n d e r s t o o d t h e q u e s t i o n o f t h e d i s t r i b u t i o n a n d o r i g i n o f p l a s m a memb rane Ca - A T P a s e w i l l r e m a i n u n r e s o l v e d . M o r e o v e r , t r e a t m e n t o f i n t a c t a c i n a r c e l l s w i t h t h e s l o w l y p e n e t r a t i n g c o v a l e n t r e a g e n t , d i a z o t i z e d s u l p h a n i l i c a c i d ( D S A ) d e s t r o y e d a b o u t 90% o f t h e t o t a l A T P a s e a c t i v i t y p r e s e n t i n p a n c r e a t i c p l a s m a m e m b r a n e s ( H a m l y n a n d S e n i o r 1 9 8 3 ) . T h i s c o u l d s u g g e s t t h a t t h e r e may be a p o o l o f p l a s m a memb rane A T P a s e t h a t was n o t a c c e s s i b l e t o t h e e x t e r n a l l y a p p l i e d p r o b e . n i I n a d d i t i o n t o t h e z y m o g e n g r a n u l e C a - A T P a s e r e p o r t e d ( B e a u d o i n e_t a l 1 9 8 0 ) , P o n n a p p a e t a l ( 1 9 8 1 ) h a v e d e s c r i b e d a C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y a s s o c i a t e d w i t h m i c r o s o m a l p r e p a r a t i o n s o b t a i n e d f r o m a c i n a r c e l l s . I t I s p o s s i b l e t h a t t h i s a c t i v i t y r e p r e s e n t s c o n t a m i n a t i o n f r o m p l a s m a 2-4-m e m b r a n e s p r e s e n t i n t h i s f r a c t i o n . A n i n d i g e n o u s C a - A T P a s e a c t i v i t y t h o u g h may be p r e s e n t a s t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e a c t i v i t y d e s c r i b e d b y P o n n a p p a e_t a l^ ( 1 9 8 1 ) a p p e a r d i f f e r e n t f r o m t h a t a c t i v i t y a s s o c i a t e d w i t h t h e p l a s m a membrane o b s e r v e d i n t h e c u r r e n t w o r k : T h e m i c r o s o m a l 2-4-C a - A T P a s e a c t i v i t y was n o t s t i m u l a t e d b y c a l m o d u l i n ( W i l l i a m s , 2-4-p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) a n d t h e h i g h Mg - s t i m u l a t i o n o f t h e p l a s m a m e m b r a n e - r e l a t e d a c t i v i t y was n o t o b s e r v e d . 2-4-T h u s i n a d d i t i o n t o t h e p l a s m a memb rane Ca - A T P a s e s y s t e m 2_i_ d e s c r i b e d , t h e a c i n a r c e l l may a l s o p o s s e s s a m i c r o s o m a l C a - A T P a s e p o s s i b l y a s s o c i a t e d w i t h t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m o r m i t o c h o n d r i a l a c t i v i t y a n d a z y m o g e n g r a n u l e s y s t e m . T h e p r e s e n c e o f e c t o - A T P a s e s h a v e b e e n r e p o r t e d i n p l a t e l e t s ( C h a m b e r s e t a l 1 9 6 7 ) , p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u c o c y t e s (De P i e r r e a n d - 153 -K a r n o v s k y 1 9 7 4 ) , m a s t c e l l s ( C o o p e r a n d S t a n w o r t h 1 9 7 6 ) , a n d r a t mammary g l a n d c e l l s ( C a r r a w a y _ _ _ _ _ 1 9 8 0 ) . D e s p i t e t h e i r w i d e s p r e a d o c c u r r e n c e , t h e p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n o f t h e e c t o - A T P a s e s i s n o t c l e a r . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e e c t o - A T P a s e s may p r o v i d e a m e c h a n i s m f o r t h e t e r m i n a t i o n o f t h e A T P s i g n a l i n p r o c e s s e s w h e r e ATP may be a c t i n g a s a n e u r o t r a n s m i t t e r ( C a r r a w a y _ _ _ _ _ 1 9 8 0 ) . R e c e n t l y , G a l l a c h e r ( 1 9 8 2 ) s h o w e d t h a t e x t e r n a l ATP c a n s t i m u l a t e a m y l a s e r e l e a s e f r o m s u p e r f u s e d mouse p a r o t i d g l a n d s i n t h e p r e s e n c e o f a t r o p i n e , p h e n t o l a m i n e a n d p r o p r a n o l o l , a n e f f e c t w h i c h c a n be b l o c k e d b y q u i n i d i n e . A l t h o u g h t h i s i s a n i n t e r e s t i n g o b s e r v a t i o n , f u r t h e r w o r k i s r e q u i r e d t o e s t a b l i s h t h e r o l e o f ATP a s a s e c r e t a g o g u e o f a m y l a s e s e c r e t i o n . I t i s now k n o w n t h a t c a l c i u m f l u x e s d u r i n g s e c r e t a g o g u e - s t i m u l a t e d 2+ e n z y m e s e c r e t i o n a r e b i p h a s i c . T h e r e i s a n i n i t i a l C a - e x t r u s i o n f r o m t h e c e l l d u e t o r e l e a s e f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s ( M a t t h e w s e _ a l 1 9 7 3 ; C a s e a n d C l a u s e n 1 9 7 3 ) , f o l l o w e d b y a r e u p t a k e p h a s e ( K o n d o a n d S c h u l z 1976 a a n d b ) i n t o a n i n t r a c e l l u l a r c o m p a r t m e n t d i f f e r e n t f r o m t h e t r i g g e r p o o l ( S t o l z e a n d S c h u l z 1 9 8 0 ) . A l t h o u g h t h e p r e s e n c e o f a n A T P - d e p e n d e n t c a l c i u m s e q u e s t r a t i o n i n m i t o c h o n d r i a a n d r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m h a s b e e n r e c o g n i z e d ( P o n n a p p a et_ a l 1 9 8 1 ; W a k a s u g i e t a l 1 9 8 2 ) l i t t l e i s k n o w n a b o u t C a 2 + - t r a n s p o r t p r o c e s s e s a t t h e l e v e l 2+ o f t h e p l a s m a m e m b r a n e . I n v i e w o f t h e b i d i r e c t i o n a l C a f l u x e s 2+ r e p o r t e d i n i n t a c t c e l l s , b o t h A T P - d e p e n d e n t Ca e f f l u x f r o m p r e - l o a d e d 2+ v e s i c l e s a n d A T P - d e p e n d e n t C a - i n f l u x w e r e m e a s u r e d i n t h e s e p r e s e n t k5 s t u d i e s . T h e Ca e f f l u x o b s e r v e d i n p r e l o a d e d v e s i c l e s r e p r e s e n t e d t h e r e l e a s e o f C a s e q u e s t e r e d s i n c e L a ( 1 . 2 mM) p r e s e n t i n t h e w a s h i n g - 154 -m e d i u m w o u l d d i s p l a c e b o u n d c a l c i u m . M o r e o v e r , Ca + e f f l u x f r o m p r e l o a d e d v e s i c l e s wa s c o n s i d e r a b l y r e d u c e d w h e n v e s i c l e s w e r e p r e l o a d e d i n t h e p r e s e n c e o f o x a l a t e . I t was r e c o g n i z e d , t h o u g h t h a t t h e r e was a c o n s i d e r a b l e d e g r e e o f c a l c i u m b i n d i n g w h i c h h a d t h e t e n d e n c y t o o b s c u r e 24- 2-4-A T P - d e p e n d e n t Ca T i n f l u x . Ca - u p t a k e t h o u g h , was c o n s i s t e n t l y o b s e r v e d when t h e v e s i c l e s w e r e t r a n s f e r r e d t o a n EGTA c o n t a i n i n g b u f f e r b e f o r e M i l l i p o r e f i l t r a t i o n . T h i s A T P - d e p e n d e n t C a 2 + - u p t a k e was a b o l i s h e d i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m i o n o p h o r e i n d i c a t i n g t h a t c a l c i u m wa s s e q u e s t e r e d i n t o v e s i c l e s a n d n o t j u s t b o u n d t o t h e s u r f a c e o f t h e v e s i c l e s . K r i b b e n e t aj^ ( 1 9 8 3 ) h a v e a l s o r e p o r t e d a n A T P - d e p e n d e n t 2+ C a - u p t a k e i n p a n c r e a t i c p l a s m a membrane p r e p a r a t i o n s . A s i n t h e 24-o b s e r v a t i o n s o f K r i b b e n et^ a j l ( 1 9 8 3 ) , Ca - u p t a k e wa s f o u n d t o b e 24-Mg - d e p e n d e n t a l t h o u g h some l e v e l o f u p t a k e was o b s e r v e d i n t h e a b s e n c e o f a d d e d Mg ( F i g . 2 9 ) . H o w e v e r , t h e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n s u s e d i n t h e s e s t u d i e s w e r e much h i g h e r t h a n t h o s e u s e d b y K r i b b e n j i t j a l ( 1 9 8 3 ) . P o n n a p p a et^ a l^ ( 1 9 8 1 ) r e p o r t e d t h e p r e s e n c e o f C a - t r a n s p o r t p r o c e s s e s i n b o t h m i c r o s o m a l a n d p l a s m a membrane p r e p a r a t i o n s . I t t h u s a p p e a r s 24-t h a t , s i m i l a r t o c o n t r a c t i l e s y s t e m s , t h e r e g u l a t i o n o f c y t o s o l i c Ca i n t h e a c i n a r c e l l may be a f u n c t i o n o f b o t h a ' m i c r o s o m a l ' ( p o s s i b l y e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ) C a - u p t a k e s y s t e m a n d a p l a s m a - m e m b r a n e 24-A T P - d e p e n d e n t Ca e x t r u s i o n s y s t e m . 24-T h e g r e a t m a j o r i t y o f t h e v e s i c l e s u s e d i n t h e Ca - f l u x s t u d i e s s e a l e d r i g h t - s i d e o u t a s 95% o r m o r e o f t h e A T P a s e a c t i v i t y a p p e a r e d a c c e s s i b l e f r o m t h e o u t s i d e , s i m i l a r t o t h e o r i e n t a t i o n o b s e r v e d i n t h e I n t a c t c e l l s . B a s e d o n t h e p r e s e n c e o f a C a 2 + u p t a k e s y s t e m i n t h e - 155 -v e s i c l e p r e p a r a t i o n s , i t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a t s u c h a s y s t e m may a l s o e x i s t i n i n t a c t c e l l s . A n u m b e r o f p r o b l e m s w i t h t h i s a s s u m p t i o n a r e w o r t h c o n s i d e r i n g . F i r s t l y , C a 2 + i n t h i s s i t u a t i o n w o u l d be m o v i n g down a n e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t s o a n A T P - d e p e n d e n t u p t a k e w o u l d n o t b e n o r m a l l y r e q u i r e d . S e c o n d l y , t h e a c i n a r memb rane a p p e a r s t o be 2-4-a d e q u a t e l y p e r m e a b l e t o Ca . T h e r e f o r e a n a c t i v e p r o c e s s d o e s n o t a p p e a r t o be n e c e s s a r y . T h i r d l y , t h e s o u r c e o f t h e e x t r a c e l l u l a r ATP i s u n c e r t a i n , t h o u g h t h e r e i s e v i d e n c e t h a t ATP may be t r a n s l o c a t e d f r o m t h e c y t o s o l t o t h e c e l l e x t e r i o r ( T r a n s 1 9 7 4 ) . I t i s k n o w n t h a t z y m o g e n g r a n u l e s c o n t a i n ATP ( G r i n s t e i n , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) a n d c a l m o d u l i n ( H e i s l e r , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . T h e r e f o r e e x o c y t o s i s o f z y m o g e n g r a n u l e s c o u l d r e l e a s e t h e s e e f f e c t o r s t o t h e e x t e r i o r o f t h e a c i n a r c e l l . C a l c i u m i n f l u x I n t o r e d b l o o d c e l l s h a s b e e n d e m o n s t r a t e d a f t e r i n h i b i t i n g t h e o u t w a r d t r a n s p o r t o f c a l c i u m by v a n a d a t e ( V e r e c k a a n d C a r a f o l i 1 9 8 2 ) . T h i s c a l c i u m i n f l u x was s h o w n t o be c a r r i e r - m e d i a t e d s i n c e i t was s a t u r a b l e , K + s e n s i t i v e a n d was i n h i b i t e d b y v e r a p a m i l , q u i n i d i n e a n d Co ( V e r e c k a a n d C a r a f o l i 1 9 8 2 ) . S i m i l a r l y , i t h a s b e e n s h o w n t h a t p r o v i s i o n o f r e s p i r a t o r y e n e r g y s u p p o r t s c a l c i u m a c c u m u l a t i o n i n i s o l a t e d h e p a t o c y t e s ( K l e i n e k e a n d S t r a t m a n 1 9 7 4 ; D u b i n s k y a n d C o c k r e l l 1 9 7 5 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t , i n r e s t i n g c e l l s , a 2-4-s l o w c y c l i n g o f C a a c r o s s t h e p l a s m a memb rane o c c u r s . T h i s p h e n o m e n o n t h o u g h , h a s n o t b e e n d e m o n s t r a t e d i n p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . T h e r e g u l a t o r y r o l e o f c a l c i u m i n c e l l u l a r f u n c t i o n s d e p e n d s o n t h e m a i n t e n a n c e o f l o w c o n c e n t r a t i o n s o f c y t o s o l i c c a l c i u m . S t u d i e s b y - 156 -S c h u l z a n d H e i l ( 1 9 7 9 ) h a v e i n d i c a t e d t h a t t h e N a + / C a + e x c h a n g e s y s t e m may be r e s p o n s i b l e a t l e a s t i n p a r t f o r c a l c i u m e x t r u s i o n f r o m a c i n a r c e l l s . I t i s k n o w n t h a t t h e s e c r e t o r y p r o t e i n s i n t h e p a n c r e a t i c f l u i d 2+ 2+ a r e a c c o m p a n i e d by a c o n s t a n t a m o u n t o f C a a n d Mg ( B e a u d o i n e _ a l 1 9 8 0 ) . T h e Ca - s e c r e t o r y p r o t e i n a s s o c i a t i o n p r e s u m a b l y t a k e s p l a c e d u r i n g m a t u r a t i o n o f t h e s e c r e t o r y v e s i c l e s . T h o u g h a p o s s i b l e c a l c i u m e x t r u s i o n m e c h a n i s m , t h e t i m e c o u r s e o f s u c h a n e v e n t i s s u c h t h a t i t may n o t be a m a j o r c o m p o n e n t o f t h e c a l c i u m e x t r u s i o n p r o c e s s . 2+ 2+ T h e e c t o - M g o r C a - A T P a s e p r e s e n t i n a c i n a r p r e p a r a t i o n s e n r i c h e d i n p l a s m a m e m b r a n e s r e p r e s e n t s t h e m a j o r ATP h y d r o l y z i n g a c t i v i t y i n t h e 2+ p a n c r e a s . U n l i k e o t h e r p l a s m a membrane C a - A T P a s e s t h a t p l a y a n i m p o r t a n t r o l e I n t h e m a i n t e n a n c e o f i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n s , t h i s e n z y m e s y s t e m by v i r t u e o f t h e o r i e n t a t i o n o f i t s c a t a l y t i c s i t e d o e s n o t a p p e a r t o s h a r e t h i s p r o p e r t y . The C a 2 + - A T P a s e a c t i v i t y c h a r a c t e r i z e d , t h o u g h , h a s many s i m i l a r p r o p e r t i e s t o o t h e r 2+ Ca - t r a n s p o r t A T P a s e s i n c l u d i n g s t i m u l a t i o n by c a l m o d u l i n a n d a c i d i c p h o s p h o l i p i d s , a C a - d e p e n d e n t - h y d r o x y l a m i n e s e n s i t i v e p h o s p h o r y l a t e d i n t e r m e d i a t e a n d a n a f f i n i t y f o r c a l c i u m i n t h e m i c r o m o l a r r a n g e . I n a d d i t i o n , t h i s a c t i v i t y h a s p r o p e r t i e s s i m i l a r t o o t h e r 2+ A T P - d i p h o s p h o l y d r o l a s e s i n c l u d i n g h i g h Mg - s e n s i t i v i t y , u t i l i z a t i o n o f ADP a s s u b s t r a t e a n d t h e p r e s e n c e o f i t s c a t a l y t i c s i t e o n t h e o u t s i d e o f t h e c e l l s u r f a c e . I t i s n o t k n o w n w h e t h e r t h e e n z y m e s p a n s t h e p l a s m a memb rane o r i f t h i s t o t a l a c t i v i t y r e p r e s e n t s t h e p r e s e n c e o f b o t h a h i g h a n d l o w a f f i n i t y s y s t e m w i t h s e p a r a t e f u n c t i o n s . 2+ 2+ T h e e c t o p i c n a t u r e o f t h e C a o r Mg - A T P a s e a c t i v i t y c h a r a c t e r i z e d - 157 -o p e n s t o q u e s t i o n t h e p o s s i b l e m e c h a n i s m ( s ) o f r e g u l a t i o n a n d f u n c t i o n o f t h i s e n z y m e . F o r e x a m p l e , w h a t w o u l d be t h e p o s s i b l e s o u r c e o f 2+ c a l m o d u l i n a n d s i n c e e x t r a c e l l u l a r C a i s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n 2+ i n t r a c e l l u l a r Ca , w h a t w o u l d be t h e f u n c t i o n o f a h i g h a f f i n i t y 2+ C a - A T P a s e u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s ? One p o s s i b i l i t y i s t h a t t h i s - , s y s t e m f u n c t i o n s a s a s i g n a l t o o t h e r e v e n t s f o l l o w i n g e x o c y t o s i s . C a l m o d u l n p r e s e n t i n z y m o g e n g r a n u l e s a n d / o r r e l e a s e d b y e x o c y t o s i s may b i n d t o 2+ Ca - A T P a s e s i t e s l e a d i n g t o a l o c a l i z e d t r a n s p o r t t h a t may e f f e c t t h e 2+ n e x t e v e n t . T h e C a l e v e l s i n t h e s e c r e t o r y d u c t s ( e x t r a c e l l u l a r t o a c i n a r c e l l s ) a r e n o t c o n s t a n t b u t a r e a l t e r e d a t v a r i o u s s t a g e s i n t h e 2+ s e c r e t i o n c y c l e . T h e r e f o r e t h e a c t i v i t y o f t h e C a - A T P a s e may v a r y 2+ d e p e n d i n g on t h e e n v i r o n m e n t a l C a . O f s i g n i f i c a n t i m p o r t a n c e i s t h e e x a c t l o c a l i z a t i o n o f t h i s 2+ C a T - A T P a s e : I t i s n o t k n o w n i f t h i s a c t i v i t y i s p r e s e n t on t h e b a s o l a t e r a l o r l u m i n a l membrane o f t h e a c i n a r c e l l . T h e a v a i l a b i l i t y o f t h i s i n f o r m a t i o n w i l l be o f v a l u e i n s p e c u l a t i n g on t h e i n t e r a c t i o n o f t h e A T P a s e w i t h o t h e r e v e n t s i n t h e s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g p r o c e s s . - 158 -BIBLIOGRAPHY A d u n y a h , E . S . , N i g g l i , V . a n d C a r a f o l i , E . ( 1 9 8 2 ) T h e a n t i c a l m o d u l i n d r u g s t r i f l u o p e r a z i n e a^d R 2 4 5 7 1 r e m o v e t h e a c t i v a t i o n o f t h e p u r i f i e d e r y t h r o c y t e Ca + - A T P a s e b y a c i d i c p h o s p h o l i p i d s a n d b y c o n t r o l l e d p r o t e o l y s i s . FEBS L e t t . 1 4 3 , 6 5 - 6 8 . A k y e m p o n , C . K . a n d R o u f o g a l i s , B . D . ( 1 9 8 2 ) The s t o i c h i o m e t r y , o f t h e Ca + pump i n human e r y t h r o c y t e v e s i c l e s : m o d u l a t i o n b y Ca + , Mg + a n d c a l m o d u l i n . C e l l C a l c i u m 3 , 1 - 1 7 . A l b a n o , J . , B h o o l a , K . D . , a n d H a r v e y , R . F . ( 1 9 7 6 ) I n t r a c e l l u l a r m e s s e n g e r r o l e o f c y c l i c GMP i n e x o c r i n e p a n c r e a s . N a t u r e 2 6 2 , 4 0 4 - 4 0 6 . A l - J o b o r e , A . a n d R o u f o g a l i s , B . D . ( 1 9 8 1 a ) I n f l u e n c e o f EGTA on t h e a p p a r e n t C a + a f f i n i t y o f Mg + - d e p e n d e n t , Ca + - s t i m u l a t e d A T P a s e I n t h e human e r y t h r o c y t e m e m b r a n e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t 6 4 5 , 1 - 9 . A l - J o b o r e , A . a n d R o u f o g a l i s , B . D . ( 1 9 8 1 b ) P h o s p h o l i p i d a n d c a l m o d u l i n a c t i v a t i o n o f s o l u b i l i z e d C a t r a n s p o r t A T P a s e f r o m human e r y t h r o c y t e s : r e g u l a t i o n b y m a g n e s i u m . C a n . J . B i o c h e m . 5 9 , 8 8 0 - 8 8 8 . A n a n d - S r ^ v a s t a v a , 2 M . B . , P a n a g i a , V . a n d D h a l l a , N . S . ( 1 9 8 2 ) P r o p e r t i e s o f Ca + - o r Mg + - D e p e n d e n t A T P a s e i n r a t h e a r t s a r c o l e m m a . A d v . M y o c a r d i o l . 3 , 3 5 9 - 3 7 1 . A r g e n t , B . E . , C a s e , R . M . a n d S c r a t c h e r d , T . ( 1 9 7 3 ) A m y l a s e s e c r e t i o n b y t h e p e r f u s e d c a t p a n c r e a s i n r e l a t i o n t o t h e s e c r e t i o n o f c a l c i u m a n d o t h e r e l e c t r o l y t e s a n d a s i n f l u e n c e d b y t h e e x t e r n a l i o n i c e n v i r o n m e n t . J . P h y s i o l . 2 3 0 , 5 7 5 - 5 9 3 . A r g e n t , B . E . , S m i t h , R . K . a n d C a s e , R . M . ( 1 9 7 5 ) T h e d i s t r i b u t i o n o f b i v a l e n t - c a t i o n - s t i m u l a t e d a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e h y d r o l y s i s a n d c a l c i u m a c c u m u l a t i o n i n s u b c e l l u l a r f r a c t i o n s o f r a t p a n c r e a s . B i o c h e m . S o c . T r a n s . 3 , 7 1 3 - 7 1 4 . A u , K . S . ( 1 9 7 8 ) A n e n d o g e n o u s i n h i b i t o r o f e r y t h r o c y t e membrane ( C a 2 + + M g 2 + ) - A T P a s e . I n t . J . B i o c h e m . 9 , 4 7 7 - 4 8 0 . B a u d u i n , H . a n d C a n t r a i n e , F . ( 1 9 7 2 ) " P h o s p h o l i p i d e f f e c t " a n d s e c r e t i o n i n t h e r a t p a n c r e a s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 2 7 0 , 2 4 8 - 2 5 3 . B e a u d o i n , A . R . , L a l i b e r t e , J . F . , L e B e l , D . , L o r d , A . , G r o n d i n , G . , P h a n e u f , S . a n d S t - J e a n , P . ( 1 9 8 0 ) L o c a l i z a t i o n a n d p h y s i o l o g i c a l r o l e o f t h e A T P - d i p h o s p h o h y d r o l a s e i n t h e p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l . I n : B i o l o g y o f N o r m a l a n d C a n c e r o u s E x o c r i n e P a n c r e a t i c C e l l s . R i b e t A . , P r a d a y r o l , L . a n d S u s i n i , C . e d s . p p . 2 7 3 - 2 8 0 . E l s e v i e r / N o r t h -H o l l a n d , A m s t e r d a m . B e a u d o i n , A . R . , V a c h e r e a u , A . a n d S t - J e a n , P . ( 1 9 8 3 ) . E v i d e n c e t h a t a m y l a s e i s r e l e a s e d f r o m two d i s t i n c t p o o l s o f s e c r e t o r y p r o t e i n s i n t h e p a n c r e a s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 7 5 7 , 3 0 2 - 3 0 5 . - 159 -B e l l e , H . V . ( 1 9 8 1 ) . R 2 4 5 7 1 : A p o t e n t i n h i b i t o r o f c a l m o d u l i n -a c t i v a t e d e n z y m e s . C e l l C a l c i u m 2 , 4 8 3 - 4 9 4 . B e n z , L . , E c k s t e i n , B . , M a t t h e w s , E . K . a n d W i l l i a m s , J . A . ( 1 9 7 2 ) C o n t r o l o f p a n c r e a t i c a m y l a s e r e l e a s e i n v i t r o : e f f e c t s o f i o n s , c y c l i c AMP a n d c o l c h i c i n e , B r . J . P h a r m a c o l . 4 6 , 6 6 - 7 7 . B i e g e r , W . , S e y b o l d , S . a n d K e r n , H . ( 1 9 7 6 ) S t u d i e s on i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t o f t h e s e c r e t o r y p r o t e i n s i n r a t e x o c r i n e p a n c r e a s . C e l l T i s s u e R e s . 1 7 0 , 2 0 3 - 2 1 9 . B o m m e l a e r , G . , R o z e n t a l , G . , L a v a l , J . , S e n a r e n s , C , V o y s s e , N . , a n d R i b e t , A . ( 1 9 8 0 ) R e g u l a t i o n o f a m y l a s e r e l e a s e b y d o g p a n c r e a t i c a c i n i . I n : B i o l o g y o f N o r m a l a n d C a n c e r o u s E x o c r i n e P a n c r e a t i c C e l l s . R i b e t , A . , P r a d a y r o l , L . , S u s i n i , C . e d s . p p . 1 9 - 2 5 E l s e v i e r / N o r t h - H o l l a n d , A m s t e r d a m . B o n d , G . H . a n d C l o u g h , D . L . ( 1 9 7 3 ) A s o l u b l e p r o t e i n a c t i v a t o r o f ( M g 2 + + C a 2 + ) - d e p e n d e n t A T P a s e i n human r e d c e l l m e m b r a n e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 3 2 3 , 5 9 2 - 5 9 9 . B r o s t r o m , C O . , B r o s t r o m , M . A . a n d W o l f f , D . J . ( 1 9 7 7 ) C a l c i u m d e p e n d e n t a d e n y l a t e c y c l a s e f r o m r a t c e r e b r a l c o r t e x . R e v e r s i b l e a c t i v a t i o n b y s o d i u m f l u o r i d e . J . B i o l . C h e m . 2 5 2 , 5 6 7 7 - 5 6 8 5 . B r o s t r o m , C O . a n d W o l f f , D . G . ( 1 9 8 1 ) P r o p e r t i e s a n d f u n c t i o n s o f c a l m o d u l i n . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 3 0 , 1 3 9 5 - 1 4 0 5 . B u r n h a m , D . B . a n d W i l l i a m s , J . A . ( 1 9 8 2 ) E f f e c t s o f c a r b a c h o l , a n d i n s u l i n o n p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n i n i s o l a t e d p a n c r e a t i c a c i n i . J . B i o l . Chem . 2 5 7 , 1 0 5 2 3 - 1 0 5 2 8 . C a l d e r o n , P . , F u r n e l l e , J . a n d C h r i s t o p h e , J . ( 1 9 8 0 ) P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l t u r n o v e r a n d c a l c i u m movemen t i n t h e r a t p a n c r e a s . Am . J . P h y s i o l . 2 3 8 , G 2 4 7 - G 2 5 4 . C a r a f o l i , E . , Z u r i n i , M . , N i g g l i , V . a n d K r e b s , J . ( 1 9 8 2 ) T h e c a l c i u m - t r a n s p o r t i n g A T P a s e o f e r y t h r o c y t e s . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 4 0 2 , 3 0 4 - 3 2 8 . C a r l i n , R . K . , G r a b , D . J . a n d S i e k e v i t z , P . ( 1 9 8 1 ) F u n c t i o n o f c a l m o d u l i n i n p o s t s y n a p t i c d e n s i t i e s . I I I . C a l m o d u l i n - b i n d i n g p r o t e i n s o f t h e p o s t s y n a p t i c d e n s i t y . J . C e l l . B i o l . 8 9 , 4 4 9 - 4 5 5 . C a r o n i , P . a n d C a r a f o l i , E . ( 1 9 8 1 ) T h e C a 2 + - p u m p i n g A T P a s e o f h e a r t s a r c o l e m m a . C h a r a c t e r i z a t i o n , c a l m o d u l i n d e p e n d e n c e , a n d p a r t i a l p u r i f i c a t i o n . J . B i o l . Chem . 2 5 6 , 3 2 6 3 - 3 2 7 0 . C a r o n i , P . , Z u r i n i , M . a n d C l a r k , A . ( 1 9 8 2 ) . T h e c a l c i u m - p u m p i n g A T P a s e o f h e a r t s a r c o l e m m a . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 4 0 2 , 4 0 2 - 4 2 1 . - 160 -C a r r a w a y , C . A . C . , C o r r a d o , F . J . , F o g l e , D . D . a n d C a r r a w a y , K . L . ( 1 9 8 0 ) E c t o - e n z y m e s o f mammary g l a n d a n d i t s t u m o u r s . Ca + o r Mg + - s t i m u l a t e d a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e a n d i t s p e r t u r b a t i o n b y c o n c a n a v a l i n A . B i o c h e m . J . 1 9 1 , 4 5 - 5 1 . C a s e , R . M . ( 1 9 7 8 ) S y n t h e s i s , i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t a n d d i s c h a r g e o f e x p o r t a b l e p r o t e i n s i n t h e p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l a n d o t h e r c e l l s . B i o l . R e v . 5 3 , 2 1 1 - 3 5 4 . C a s e , R . M . , C h a r l t o n , M . , S m i t h , P . A . a n d S c r a t c h e r d , T . ( 1 9 8 0 ) E l e c t r o l y t e s e c r e t o r y p r o c e s e s i n e x o c r i n e p a n c r e a s a n d t h e i r i n t r a c e l l u l a r c o n t r o l . I n : B i o l o g y o f N o r m a l a n d C a n c e r o u s E x o c r i n e P a n c r e a t i c C e l l s . R i b e t , A . , P r a d a y r o l L . , S u s i n i , C . e d s . p p . 4 1 - 5 4 . E l s e v i e r / N o r t h - H o l l a n d , A m s t e r d a m . C a s e , R . M . , a n d C l a u s e n , T . ( 1 9 7 3 ) T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c a l c i u m e x c h a n g e a n d e n z y m e s e c r e t i o n i n t h e i s o l a t e d r a t p a n c r e a s . J . P h y s i o l . 2 3 5 , 7 5 - 1 0 2 . C a s s e l , D. a n d S e l i n g e r , Z . ( 1 9 7 7 ) M e c h a n i s m o f a d e n y l a t e c y c l a s e a c t i v a t i o n b y c h o l e r a t o x i n : I n h i b i t i o n o f GTP h y d r o l y s i s a t t h e r e g u l a t o r y s i t e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A , 7 4 , 3 3 0 7 - 3 3 1 1 . C h a m b e r s , D . A . , S a l z m a n , E . W . a n d N e r i , L . L . ( 1 9 6 7 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f " E c t o - A T P a s e " o f human b l o o d p l a t e l e t s . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 1 9 , 1 7 3 - 1 7 8 . C h a n d l e r , D . E . a n d W i l l i a m s , J . A . ( 1 9 7 8 a ) I n t r a c e l l u l a r d i v a l e n t c a t i o n r e l e a s e i n p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s d u r i n g s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g . I : U s e o f c h l o r o t e t r a c y c l i n e a s a f l u o r e s c e n t p r o b e . J . C e l l B i o l . 7 6 , 3 7 1 - 3 8 5 . C h a n d l e r , D . E . a n d W i l l i a m s , J . A . ( 1 9 7 8 b ) I n t r a c e l l u l a r d i v a l e n t c a t i o n r e l e a s e i n p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s d u r i n g s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g . I I : S u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f t h e f l u o r e s c e n t p r o b e c h l o r o t e t r a c y c l i n e . J . C e l l B i o l . 7 6 , 3 8 6 - 3 9 9 . C h a n d l e r , D . E . a n d W i l l i a m s , J . A . ( 1 9 7 4 ) P a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s : E f f e c t s o f l a n t h a n u m i o n s o n a m y l a s e r e l e a s e a n d c a l c i u m i o n f l u x e s . J . P h y s i o l . 2 4 3 , 8 3 1 - 8 4 6 . C h a u v e l o t , L . , H e i s l e r , S . , H u o t , J . a n d G a g n o n , D . ( 1 9 7 9 ) P r o s t a g l a n d i n s a n d e n z y m e s e c r e t i o n f r o m d i s p e r s e d r a t p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . L i f e S c i . 2 5 , 9 1 3 - 9 2 0 . C h e u n g . W . Y . , L y n c h , T . J . a n d W a l l a c e , R .W . ( 1 9 7 8 ) A n e n d o g e n o u s Ca + - d e p e n d e n t a c t i v a t o r p r o t e i n o f b r a i n a d e n y l a t e c y c l a s e a n d c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e . A d v . C y c l i c N u c l e o t i d e R e s . 9 , 2 3 3 - 2 5 1 . - 161 -C h i l d e r s , S . R . a n d S i e g e l , F . L . ( 1 9 7 5 ) I s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f c a l c i u m b i n d i n g p r o t e i n f r o m e l e c t r o p l a x o f e l e c t r o p h o r u s e l e c t r i c u s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 4 0 5 , 9 9 - 1 0 8 . C h r i s t o p h e , J . , C a l d e r o n - A t t a s , P . , D e s c h o d t - L a n c k m a n , M . , L a m b e r t , M . , R o b b e r e c h t , P . , S v o b o d a , M . , V a n d e r m e e r s , A . , V a n d e r m e e r s - P i r e t , M . a n d W i n a n d , J . ( 1 9 8 0 ) S t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g i n p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s e x p o s e d t o p a n c r e o z y m i n : m e m b r a n o u s a n d i n t r a c e l l u l a r p h e n o m e n a . I n : B i o l o g y o f N o r m a l a n d C a n c e r o u s E x o c r i n e P a n c r e a t i c C e l l s . R i b e t A . , P r a d a y r o l , L . , S u s i n i s , C e d s . p p . 1 0 3 - 1 1 8 . E l s e v i e r / N o r t h - H o l l a n d A m s t e r d a m . C h r i s t o p h e , J . P . , C o n l o n , T . P . a n d G a r d n e r , J . D . ( 1 9 7 6 ) I n t e r a c t i o n o f p o r c i n e v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p e p t i d e w i t h d i s p e r s e d p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s f r o m t h e g u i n e a p i g . B i n d i n g o f r a d i o i o d i n a t e d p e p t i d e . J . B i o l . C h e m . 2 5 1 , 4629 - 4634 . C h r i s t o p h e , J . P . , F r a n d s e n , E . K . , C o n l o n , T . P . , K r i s h n a , G . a n d G a r d n e r , J . D . ( 1 9 7 6 ) A c t i o n o f c h o l e c y s t o k i n i n , c h o l i n e r g i c a g e n t s , a n d A - 2 3 1 8 7 on a c c u m u l a t i o n o f g u a n o s i n e 3 1 : 5 ' - m o n o - p h o s p h a t e i n d i s p e r s e d g u i n e a p i g p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . J . B i o l . C hem . 2 5 1 , 4 6 4 0 - 4 6 4 5 . C l e m e n t e , F . a n d M e d o l e s i , J . ( 1 9 7 5 a ) C a l c i u m a n d p a n c r e a t i c s e c r e t i o n . I : S u b c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f c a l c i u m a n d m a g n e s i u m i n t h e e x o c r i n e p a n c r e a s o f t h e g u i n e a p i g . J . C e l l B i o l . 6 5 , 8 8 - 1 0 2 . C l e m e n t e , F . a n d M e l d o l e s i , J . ( 1 9 7 5 b ) C a l c i u m a n d p a n c r e a t i c s e c r e t i o n - d y n a m i c s o f s u b c e l l u l a r c a l c i u m p o o l s i n r e s t i n g a n d s t i m u l a t e d a c i n a r c e l l s . B r . J . P h a r m a c o l . 5 5 , 3 6 9 - 3 7 9 . C o o p e r , P . H . a n d S t a n w o r t h , D . R . ( 1 9 7 6 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f c a l c i u m - i o n - a c t i v a t e d a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e i n t h e p l a s m a memb rane o f r a t m a s t c e l l s . B i o c h e m . J . 1 5 6 , 6 9 1 - 7 0 0 . D a g o m , J . C . ( 1 9 7 8 ) N o n - p a r a l l e l e n z y m e s e c r e t i o n f r o m r a t p a n c r e a s : i n v i v o s t u d i e s . J . P h y s i o l . 2 8 0 , 4 3 5 - 4 4 8 . D a n i e l s s o n , A . a n d S e h l i n , J . ( 1 9 7 4 ) T r a n s p o r t a n d o x i d a t i o n o f a m i n o a c i d s a n d g l u c o s e i n t h e i s o l a t e d e x o c r i n e mouse p a n c r e a s : E f f e c t s o f i n s u l i n a n d p a n c r e o z y m i n . A c t a P h y s i o l . S c a n d . 9 1 , 5 5 7 - 5 6 5 . D e d m a n , J . R . , P o t t e r , J . D . , J a c k s o n , R . L . , J o h n s o n , J . D . a n d M e a n s , A . R . ( 1 9 7 7 ) P h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f r a t t e s t i s C a 2 + - d e p e n d e n t r e g u l a t o r p r o t e i n o f c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e . R e l a t i o n s h i p o f C a 2 + b i n d i n g , c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s , a n d p h o s p h o d i e s t e r a s e a c t i v i t y . J . B i o l . C hem . 2 5 2 , 8 4 1 5 - 8 4 2 2 . - 162 -D e L o r e n z o , R . J . , F r e e d m a n , S . D . , Y o h e , W . B . a n d M a u r e r , S . C . ( 1 9 7 9 ) . S t i m u l a t i o n o f C a 2 + - d e p e n d e n t n e u r o t r a n s m i t t e r r e l e a s e a n d p r e s y n a p t i c n e r v e t e r m i n a l p r o t e i n p h o s p h o r y l a t i o n b y c a l m o d u l i n a n d a c a l m o d u l i n - l i k e p r o t e i n i s o l a t e d f r o m s y n a p t i c v e s i c l e s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . , U . S . A . 7 6 , 1 8 3 8 - 1 8 4 2 . D e P i e r r e , J . W . a n d K a r n o v s k y , M . L . ( 1 9 7 4 ) E c t o - e n z y m e s o f t h e g u i n e a p i g p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u k o c y t e . I : E v i d e n c e f o r a n e c t o - a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t a s e , - a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e a n d p - n i t r o p h e n y l p h o s p h a t a s e . J . B i o l . C h e m . 2 4 9 , 7 1 1 1 - 7 1 2 0 . De P o n t , J . J . H . H . M . , K e m p e n , H . J . a n d B o n t i n g , S . L . ( 1 9 7 7 ) H o r m o n a l a c t i v a t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e a n d i t s e f f e c t s i n e x o c r i n e p a n c r e a t i c f u n c t i o n . I n : H o r m o n a l R e c e p t o r s i n D i g e s t i v e T r a c t P h y s i o l o g y . B o n f i l s , S . , F r o m a g e o t , P . , R o s s e l i n , G . e d s . p p . 2 8 9 - 3 0 0 E l s e v i e r / N o r t h - H o l l a n d , A m s t e r d a m . D e s c h o d t - L a n c k m a n , M . , R o b b e r e c h t , P . , De N e e f , P . , L a b r i e , F . a n d C h r i s t o p h e , J . ( 1 9 7 5 ) I n v i t r o i n t e r a c t i o n s o f g a s t r o i n t e s t i n a l h o r m o n e s o n c y c l i c a d e n o s i n e 3 ' , 5 ' - m o n o p h o s p h a t e l e v e l s a n d a m y l a s e o u t p u t i n t h e r a t p a n c r e a s . G a s t r o e n t e r o l o g y . 6 6 , 3 1 8 - 3 2 5 . D e s c h o d t - L a n c k m a n , M . , R o b b e r e c h t , P . , De N e e f , P . , L a m m e n s , M . a n d C h r i s t o p h e , J . ( 1 9 7 6 ) . I n v i t r o a c t i o n o f b o m b e s i n a n d b o m b e s i n - l i k e p e p t i d e s o n a m y l a s e s e c r e t i o n , c a l c i u m e f f l u x , a n d a d e n y l a t e c y c l a s e a c t i v i t y i n t h e r a t p a n c r e a s . A c o m p a r i s o n w i t h o t h e r s e c r e t a g o g u e s . J . C l i n . I n v e s t . 5 8 - 8 9 1 - 8 9 8 . D i P o l o , R. a n d B e a u g e , L . ( 1 9 7 9 ) P h y s i o l o g i c a l r o l e o f A T P - d r i v e n c a l c i u m pump i n s q u i d a x o n . N a t u r e . 2 7 8 , 2 7 1 - 2 7 3 . D i P o l o , R. a n d B e a u g e , L . ( 1 9 8 0 ) M e c h a n i s m s o f c a l c i u m t r a n s p o r t i n t h e g i a n t a x o n o f t h e s q u i d a n d t h e i r p h y s i o l o g i c a l r o l e . C e l l C a e l u m . 1 , 1 4 7 - 1 6 9 . d i S a n t ' A g n e s e , P . A . a n d D a v i s , P . B . ( 1 9 7 6 ) R e s e a r c h i n c y s t i c f i b r o s i s . N . E n g l . J . M e d . 2 9 5 , 4 8 1 - 4 8 5 , 5 3 4 - 5 4 1 , 5 9 7 - 6 0 2 . D o r m e r , R . L . ( 1 9 8 3 ) D i r e c t d e m o n s t r a t i o n o f i n c r e a s e s i n c y t o s o l i c f r e e C a 2 + d u r i n g s t i m u l a t i o n o f p a n c r e a t i c e n z y m e s e c r e t i o n . B i o s c i e n c e R e p o r t s . 3 , 2 3 3 - 2 4 0 . D o r m e r , R . L . a n d W i l l i a m s , J . A . ( 1 9 8 1 ) S e c r e t a g o g u e - I n d u c e d c h a n g e s i n s u b c e l l u l a r C a 2 + d i s t r i b u t i o n i n i s o l a t e d p a n c r e a t i c a c i n i . Am . J . P h y s i o l . 2 4 0 , G 1 3 0 - G 1 4 0 . D o u g l a s , W.W. ( 1 9 6 8 ) S t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g : t h e c o n c e p t a n d c l u e s f r o m c h r o m a f f i n a n d o t h e r c e l l s . B r i t . J . P h a r m a c o l . 3 4 , 4 5 1 - 4 7 4 . - 163 -D o u g l a s , W.W. a n d N e m e t h , E . F . ( 1 9 8 2 ) On t h e c a l c i u m r e c e p t o r a c t i v a t i n g e x o c y t o s i s : i n h i b i t o r y e f f e c t s o f c a l m o d u l i n - i n t e r a c t i n g d r u g s o n r a t m a s t c e l l s . J . P h y s i o l . 3 2 3 , 2 2 9 - 2 4 4 . D o u g l a s , W.W. a n d P o i s n e r , A . M . ( 1 9 6 4 ) S t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g i n a n e u r o s e c r e t o r y o r g a n : The r o l e o f c a l c i u m i n t h e r e l e a s e o f v a s o p r e s s i n f r o m t h e n e u r o h y p o p h y s i s . J . P h y s i o l . 1 7 2 , 1 - 1 8 . E n y e d i , A . , F a r a g o , A . , S a r k a d i , B . , S z a s z , I . a n d G a r d o s , G . ( 1 9 8 3 ) C y c l i c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e s t i m u l a t e s t h e f o r m a t i o n o f p o l y p h o s p h o i n o s i t e s i n t h e p l a s m a m e m b r a n e s o f d i f f e r e n t b l o o d c e l l s . F EBS L e t t . 1 6 1 , 1 5 8 - 1 6 2 . E n y e d i , A . , S a r k a d i , B . , S z a s z , I . , B o t , G . a n d G a r d o s , G . ( 1 9 8 0 ) M o l e c u l a r p r o p e r t i e s o f r e d c e l l c a l c i u m pump . C e l l C a l c i u m 1 , 2 9 9 - 3 1 0 . E r s p a m e r , V . , F a l c o n i e r i E r s p a m e r , G . , I n s e l v i n i , M . a n d N e g r i , L . ( 1 9 7 2 ) O c c u r r e n c e o f b o m b e s i n a n d a l y t e s i n i n e x t r a c t s o f t h e s k i n o f t h r e e E u r o p e a n d i s c o g l o s s i d f r o g s a n d p h a r m a c o l o g i c a l a c t i o n s o f b o m b e s i n o n e x t r a v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e . B r . J . P h a r m a c o l . 4 5 , 3 3 3 - 3 4 8 . E r s p a m e r , V . a n d M e l c h i o r r i , P . ( 1 9 7 3 ) A c t i v e p o l y p e p t i d e s o f t h e a m p h i b i a n s k i n a n d t h e i r s y n t h e t i c a n a l o g s . P u r e A p p l . C hem . 3 5 , 4 6 3 - 4 9 4 . E r s p a m e r , V . a n d M e l c h i o r r i , P . ( 1 9 7 5 ) A c t i o n s o f b o m b e s i n o n s e c r e t i o n s a n d m o t i l i t y o f t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t . T h o m p s o n , J . C . e d . G a s t r o i n t e s t i n a l h o r m o n e s . A u s t i n : U n i v e r s i t y o f T e x a s P r e s s , 5 7 5 - 5 8 9 . F a m u l s k i , K. a n d C a r a f o l i , E . ( 1 9 8 2 ) C a 2 + t r a n s p o r t i n g a c t i v i t y o f memb rane f r a c t i o n s i s o l a t e d f r o m t h e p o s t - m i t o c h o n d r i a l s u p e r n a t a n t o f r a t l i v e r . C e l l C a l c i u m . 3 , 2 6 3 - 2 8 1 . F e l d h a u s , P . , F r b h l i c h , T . , G o o d y , R . S . , I s a k o v , M . , a n d S c h i r m e r , R . H . ( 1 9 7 5 ) S y n t h e t i c i n h i b i t o r s o f a d e n y l a t e k i n a s e s i n t h e a s s a y s f o r A T P a s e a n d p h o s p h o k i n a s e s . E u r . J . B i o c h e m . 5 7 , 1 9 7 - 2 0 4 . F i s k e , C H . a n d S u b b a r o w , Y . ( 1 9 2 5 ) . T h e c o l o r i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f p h o s p h o r u s . J . B i o l . Chem . 6 6 , 3 7 5 - 4 0 0 . F o r g e t , G . a n d H e i s l e r , S . ( 1 9 7 6 ) C a l c i u m - a c t i v a t e d A T P a s e a c t i v i t y i n a p l a s m a m e m b r a n e - r i c h p r e p a r a t i o n o f r a t p a n c r e a s . C l i n . E x p . P h a r m a c o l . P h y s i o l . 3 , 6 7 - 7 2 . G a g l i a r d i n o , J . J . , H a r r i s o n , D . E . , C h r i s t i e , M . R . , G a g l i a r d i n o , E . G . a n d A s h c r o f t , S . J . H . ( 1 9 8 0 ) E v i d e n c e f o r t h e p a r t i c i p a t i o n o f c a l m o d u l i n i n s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g i n t h e p a n c r e a t i c ( 3 - c e l l . B i o c h e m . J . 1 9 2 , 9 1 9 - 9 2 7 . - 164 -G a l l a c h e r , D.V. (1982) Are there p u r i n e r g i c receptors on p a r o t i d a c i n a r c e l l s ? Nature. 296, 83-86. Gardner, J.D. (1979) Regulation of pancreatic exocrine f u n c t i o n i n v i t r o . I n i t i a l steps i n the a c t i o n of secretagogues. Annu. Rev. P h y s i o l . 41, 55-66. Gardner, J.D. (1983) Mechanism by which d i b u t y r y l c y c l i c guanosine monophosphate antagonizes the a c t i o n of c h o l e c y s t o k i n i n . Gastroenterology. 84, 1619-1620. Gardner, J.D., Conlon, T.P., Klaeveraan, H.L., Adams, T.D. and O n d e t t i , M.A. (1975) A c t i o n of c h o l e c y s t o k i n i n and c h o l i n e r g i c agents on calcium transport i n I s o l a t e d p a n c r e a t i c acinar c e l l s . 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C a l m o d u l i n a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y y i e l d s a f u n c t i o n a l p u r i f i e d e r y t h r o c y t e ( C a 2 + + Mg + ) - d e p e n d e n t A T P a s e . B i o c h e m . J . 1 8 9 , 8 1 - 8 8 . G i l l , D . L . , G r o l l m a n , E . F . a n d K o h n , L . ( 1 9 8 1 ) C a l c i u m t r a n s p o r t m e c h a n i s m s i n memb r ane v e s i c l e s f r o m g u i n e a p i g b r a i n s y n a p t o s o m e s . J . B i o l . Chem. 2 5 6 , 1 8 4 - 1 9 2 . G l a z e r , G . a n d S t e e r , M . L . ( 1 9 7 7 ) R e q u i r e m e n t s f o r a c t i v a t i o n o f t r y p s i n o g e n a n d c h y m o t r y p s i n o g e n i n r a b b i t p a n c r e a t i c j u i c e . A n a l . B i o c h e m . 7 7 , 1 3 0 - 1 4 0 . G m a j , P . , M u r e r , H . a n d K i n n e , R. ( 1 9 7 9 ) C a l c i u m i o n t r a n s p o r t a c r o s s p l a s m a m e m b r a n e s i s o l a t e d f r o m r a t k i d n e y c o r t e x . B i o c h e m . J . 1 7 8 , 5 4 9 - 5 5 7 . G o p i n a t h , R . M . a n d V i n c e n z i , F . F . ( 1 9 7 7 ) P h o s p h o d i e s t e r a s e p r o t e i n a c t i v a t o r m i m i c s r e d b l o o d c e l l c y t o p l a s m i c a c t i v a t o r o f ( C a 2 + + Mg + ) - A T P a s e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 7 7 , 1 2 0 3 - 1 2 0 9 . G r a f , E . a n d P e n n i s t o n , J . T . ( 1 9 8 1 ) C a A T P : T h e s u b s t r a t e , a t l o w ATP c o n c e n t r a t i o n s , o f C a 2 + - A T P a s e f r o m human e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s . J . B i o l . Chem . 2 5 6 , 1 5 8 7 - 1 5 9 2 . G r e e n l e e , D . V . , A n d r e a s e n , T . J . a n d S t o r m , D . R . ( 1 9 8 2 ) C a l c i u m - i n d e p e n d e n t s t i m u l a t i o n o f B o r d e t e l l a p e r t u s s i s a d e n y l a t e c y c l a s e b y c a l m o d u l i n . B i o c h e m i s t r y 2 1 , 2 7 5 9 - 2 7 6 4 . G r e g o r y , R . A . , a n d T r a c y , H . J . ( 1 9 6 4 ) T h e c o n s t i t u t i o n a n d p r o p e r t i e s o f two g a s t r i n s e x t r a c t e d f r o m h o g a n t r a l m u c o s a . G u t 5 , 1 0 3 - 1 1 7 . G u n t h e r , G . R . a n d J a m i e s o n , J . D . ( 1 9 7 9 ) I n c r e a s e d i n t r a c e l l u l a r c y c l i c GMP d o e s n o t c o r r e l a t e w i t h p r o t e i n d i s c h a r g e f r o m p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . N a t u r e . 2 8 0 , 3 1 8 - 3 2 0 . H a d o r n , B . , J o h a n s e n , P . G . a n d A n d e r s o n , C M . ( 1 9 6 8 ) P a n c r e o z y m i n s e c r e t i n t e s t o f e x o c r i n e p a n c r e a t i c f u n c t i o n i n c y s t i c f i b r o s i s a n d t h e s i g n i f i c a n c e o f t h e r e s u l t f o r t h e p a t h o g e n e s i s o f t h e d i s e a s e . C a n . M e d . A s s n . J . 9 8 , 3 7 7 - 3 8 5 . H a h n e , W . F . , J e n s e n , R . T . , L e m p , G . F . a n d G a r d n e r , J . D . ( 1 9 8 1 ) P r o g l u m i d e a n d b e n z o t r i p t : M e m b e r s o f a d i f f e r e n t c l a s s o f c h o l e c y s t o k i n i n r e c e p t o r a n t a g o n i s t s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A , 7 8 , 6 3 0 4 - 6 3 0 8 . H a m l y n , J . M . a n d S e n i o r , A . E . ( 1 9 8 3 ) E v i d e n c e t h a t M g 2 + + Ca - a c t i v a t e d a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e i n r a t p a n c r e a s i s a p l a s m a - m e m b r a n e e c t o - e n z y m e . B i o c h e m . . J . 2 1 4 , 5 9 - 6 8 . - 166 -H a u s e r , H . a n d D a w s o n , R . M . C . ( 1 9 6 7 ) T h e b i n d i n g o f c a l c i u m a t l i p i d - w a t e r i n t e r f a c e s . E u r . J . B i o c h e m . 1, 6 1 - 6 9 . H a y m o v i t z , A . a n d S c h e e l e , G . A . ( 1 9 7 6 ) C e l l u l a r c y c l i c n u c l e o t i d e s a n d e n z y m e s e c r e t i o n i n t h e p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A , 7 3 , 1 5 6 - 1 6 0 . H e i s l e r , S . , C h a u v e l o t , L . , D e s j a r d i n s , D . , N o e l , C , L a m b e r t , H . a n d D e s y - A u d e t , L . ( 1 9 8 1 ) S t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g i n e x o c r i n e p a n c r e a s : p o s s i b l e r o l e o f c a l m o d u l i n . C a n . J . P h y s i o l . P h a r m a c o l . 5 9 , 9 9 4 - 1 0 0 1 . H e i s l e r , S . , F a s t , D. a n d T e n e n h o u s e , A . ( 1 9 7 2 ) R o l e o f C a 2 + a n d c y c l i c AMP i n p r o t e i n s e c r e t i o n f r o m r a t e x o c r i n e p a n c r e a s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 2 7 9 , 5 6 1 - 5 7 2 . H e i s l e r , S . a n d G r o n d i n , G . ( 1 9 7 3 ) . E f f e c t o f l a n t h a n u m o n ' + 5 C a f l u x a n d s e c r e t i o n o f p r o t e i n f r o m r a t e x o c r i n e p a n c r e a s . L i f e S c i . 1 3 , 7 8 3 - 7 9 4 . H e i s l e r , H . a n d G r o n d i n , G . ( 1 9 7 5 ) A b s e n c e o f e f f e c t s o f d i b u t y r y l c y c l i c g u a n o s i n e 3 ' , 5 ' - m o n o p h o s p h a t e o n r e l e a s e o f a - a m y l a s e , C a e f f l u x , a n d p r o t e i n s y n t h e s i s i n r a t p a n c r e a s in v i t r o . E x p e r i e n t i a . 3 1 , 9 3 6 - 9 3 8 . H i d a k a , H . a n d T a n a k a , T . ( 1 9 8 2 ) B i o p h a r m a c o l o g i c a l a s s e s s m e n t o f c a l m o d u l i n f u n c t i o n : u t i l i t y o f c a l m o d u l i n a n t a g o n i s t s I n : C a l m o d u l i n a n d C a l c i u m R e c e p t o r s . K a k i u c h i , S . , H i d a k a , H . a n d M e a n s , A . R . e d s . p p . 1 9 - 3 3 . N . Y . P l e n u m P r e s s . H i n d s , T . R . , L a r s e n , F . L . a n d V i n c e n z i , F . F . ( 1 9 7 8 ) P l a s m a memb rane c a l c i u m t r a n s p o r t : s t i m u l a t i o n b y s o l u b l e p r o t e i n s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 8 1 , 4 5 5 - 4 6 1 . H o k i n , L . E . ( 1 9 6 6 ) E f f e c t s o f c a l c i u m o m i s s i o n o n a c e t y l c h o l i n e s t i m u l a t e d a m y l a s e s e c r e t i o n a n d p h o s p h o l i p i d s y n t h e s i s i n p i g e o n p a n c r e a s s l i c e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 1 1 5 , 2 1 9 - 2 2 1 . H o k i n , L . E . , a n d H o k i n , M . R . ( 1 9 5 5 ) E f f e c t s o f a c e t y l c h o l i n e o n t h e t u r n o v e r o f p h o s p h o r y l u n i t s i n i n d i v i d u a l p h o s p h o l i p i d s o f p a n c r e a s s l i c e s a n d b r a i n c o r t e x s l i c e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 1 8 , 1 0 2 - 1 1 0 . H o k i n , L . E . a n d H o k i n , M . R . ( 1 9 5 6 ) T h e a c t i o n s o f p a n c r e o z y m i n i n p a n c r e a s s l i c e s a n d t h e r o l e o f p h o s p h o l i p i d s i n e n z y m e s e c r e t i o n . J . P h y s i o l . 1 3 2 , 4 4 2 - 4 5 3 . H o r t o n , C . R . , C o l e , W . Q . a n d B a d e r , H . ( 1 9 7 0 ) D e p r e s s e d ( C a ) - t r a n s p o r t A T P a s e i n c y s t i c f i b r o s i s e r y t h r o c y t e s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 4 0 , 5 0 5 - 5 0 9 . - 167 -H u x l e y , H . E . ( 1 9 7 3 ) M u s c u l a r c o n t r a c t i o n a n d c e l l m o t i l i t y . N a t u r e . 2 4 3 , 4 4 5 - 4 4 9 . I l u n d a i n , A . a n d N a f t a l i n , R . J . ( 1 9 7 9 ) R o l e o f C a 2 + - d e p e n d e n t r e g u l a t o r p r o t e i n i n i n t e s t i n a l s e c r e t i o n . N a t u r e . 2 7 9 4 4 6 - 4 4 8 . I w a t s u k i , N . a n d P e t e r s e n , O . H . ( 1 9 7 8 ) . I n v i t r o a c t i o n o f b o m b e s i n o n a m y l a s e s e c r e t i o n , memb rane p o t e n t i a l a n d memb rane r e s i s t a n c e i n r a t a n d mou se p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . A c o m p a r i s o n w i t h o t h e r s e c r e t a g o g u e s . J . C l i n . I n v e s t . 6 1 , 4 1 - 4 6 . J a m i e s o n , J . D . a n d P a l a d e , G . E . ( 1 9 7 6 a ) I n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t o f s e c r e t o r y p r o t e i n s i n t h e p a n c r e a t i c e x o c r i n e c e l l s . I : R o l e o f t h e p e r i p h e r a l e l e m e n t s o f t h e G o l g i c o m p l e x . J . C e l l B i o l . 3 4 , 5 7 7 - 5 9 6 . J a m i e s o n , J . D . a n d P a l a d e , G . E . ( 1 9 7 6 b ) I n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t o f s e c r e t o r y p r o t e i n s i n t h e p a n c r e a t i c e x o c r i n e c e l l s . I I : T r a n s p o r t t o c o n d e n s i n g v a c u o l e s a n d z y m o g e n g r a n u l e s . J . C e l l B i o l . 3 4 , 5 9 7 - 6 1 5 . J a m i e s o n , J . D . a n d P a l a d e , G . E . ( 1 9 7 1 a ) C o n d e n s i n g v a c u o l e c o n v e r s i o n a n d z y m o g e n g r a n u l e d i s c h a r g e i n p a n c r e a t i c e x o c r i n e c e l l s : m e t a b o l i c s t u d i e s . J . C e l l B i o l . 4 8 , 5 0 3 - 5 2 2 . J a m i e s o n , J . D . a n d P a l a d e , G . E . ( 1 9 7 1 b ) S y n t h e s i s , i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t a n d d i s c h a r g e o f s e c r e t o r y p r o t e i n s i n s t i m u l a t e d p a n c r e a t i c e x o c r i n e c e l l s . J . C e l l B i o l . 5 0 , 1 3 5 - 1 5 8 . J a m i e s o n , J . D . a n d P a l a d e , G . E . ( 1 9 7 7 ) P r o d u c t i o n o f s e c r e t o r y p r o t e i n s i n a n i m a l c e l l s . I n : I n t e r n a t i o n a l C e l l B i o l o g y . E d s B . R . B r i n k l e y a n d K . R . P o r t e r . New Y o r k : R o c k e f e l l e r U n i v . P r e s s , p p . 3 0 8 - 3 1 7 . J a r r e t t , H .W. a n d P e n n i s t o n , J . T . ( 1 9 7 7 ) P a r t i a l p u r i f i c a t i o n o f t h e ( C a 2 ^ " + M g 2 + ) - A T P a s e a c t i v a t o r f r o m human e r y t h r o c y t e s : I t s s i m i l a r i t y t o t h e a c t i v a t o r o f 3 ' : 5 ' - c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 7 7 , 1 2 1 0 - 1 2 1 6 . J a r r e t t , H .W. a n d P e n n i s t o n , J . T . ( 1 9 7 8 ) P u r i f i c a t i o n o f t h e C a + - s t i m u l a t e d A T P a s e a c t i v a t o r f r o m human e r y t h r o c y t e s . I t s m e m b e r s h i p i n t h e c l a s s o f C a 2 + - b i n d i n g m o d u l a t o r p r o t e i n s . J . B i o l . C h e m . 2 5 3 , 4 6 7 6 - 4 6 8 2 . J e f f e r y , D . A . , R o u f o g a l i s , B . D . a n d K a t z , S . ( 1 9 8 1 ) T h e e f f e c t o f c a l m o d u l i n o n t h e p h o s p h o p r o t e i n i n t e r m e d i a t e o f M g 2 + d e p e n d e n t Ca + s t i m u l a t e d a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e i n human e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s . B i o c h e m . J . 1 9 8 , 4 8 1 - 4 8 6 . J e n s e n , R . T . a n d G a r d n e r , J . D . ( 1 9 8 1 ) I d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f r e c e p t o r s f o r s e c r e t a g o g u e s on p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . F e d e r a t i o n P r o c . 4 0 , 2 4 8 6 - 2 4 9 6 . - 168 -J e n s e n , R . T . , Le rap , G . F . a n d G a r d n e r , J . D . ( 1 9 8 0 ) I n t e r a c t i o n o f c h o l e c y s t o k i n i n w i t h s p e c i f i c memb r ane r e c e p t o r s o n p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 7 , 2 0 7 9 - 2 0 8 3 . J e n s e n , R . T . , M o o d y , T . , P e r t , C . , R i v i e r , J . E . a n d G a r d n e r , J . D . ( 1 9 7 8 ) I n t e r a c t i o n o f b o m b e s i n a n d l i t o r i n w i t h s p e c i f i c m e m b r a n e r e c e p t o r s o n p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 5 , 6 1 3 9 - 6 1 4 3 . J o h a n s e n , P . G . , A n d e r s o n , C . M . a n d H a d o r n , B . ( 1 9 6 8 ) C y s t i c f i b r o s i s o f t h e p a n c r e a s : A g e n e r a l i z e d d i s t u r b a n c e o f w a t e r a n d e l e c t r o l y t e movemen t i n e x o c r i n e t i s s u e s . L a n c e t 1 , 4 5 5 - 4 6 0 . J o n e s , H . P . , B r a d f o r d , M . M . , M c R o r i e , R . A . a n d C o r n m i e r , M . J . ( 1 9 7 8 ) H i g h l e v e l s o f c a l c i u m d e p e n d e n t m o d u l a t o r p r o t e i n i n s p e r m a t o z o a a n d i t s s i m i l a r i t y t o b r a i n m o d u l a t o r p r o t e i n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 8 2 , 1 2 6 4 - 1 2 7 2 . J o n e s , L . M . a n d M i c h e l l , R . H . ( 1 9 7 5 ) T h e r e l a t i o n s h i p o f c a l c i u m t o r e c e p t o r - c o n t r o l l e d s t i m u l a t i o n o f p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l t u r n o v e r . B i o c h e m . J . 1 4 8 , 4 7 9 - 4 8 5 . K a n n o , T . ( 1 9 7 2 ) C a l c i u m - d e p e n d e n t a m y l a s e r e l e a s e a n d e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l m e a s u r e m e n t s i n c e l l s o f t h e p a n c r e a s . J . P h y s i o l . 2 2 6 , 3 5 3 - 3 7 1 . K a n n o , T . a n d S a i t o , A . ( 1 9 7 6 ) The p o t e n t i a t i n g i n f l u e n c e s o f i n s u l i n o n p a n c r e o z y m i n - i n d u c e d h y p e r p o l a r i z a t i o n a n d a m y l a s e r e l e a s e i n t h e p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l . J . P h y s i o l . 1 8 9 , 5 3 5 - 5 4 4 . K a s a i , K. a n d F i e l d , J . B . ( 1 9 8 2 ) C a 2 + - s t i m u l a t e d , M g 2 + - d e p e n d e n t A T P a s e i n b o v i n e t h y r o i d p l a s m a m e m b r a n e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 6 8 5 , 2 2 5 - 2 2 9 . K a t z , B . a n d M i l e d i , R. ( 1 9 6 7 ) T h e t i m i n g o f c a l c i u m a c t i o n d u r i n g n e u r o m u s c u l a r t r a n s m i s s i o n . J . P h y s i o l . 1 8 9 , 5 3 5 - 5 4 4 . K a t z , S . a n d B l o s t e i n , R . ( 1 9 7 5 ) C a - s t i m u l a t e d m e m b r a n e p h o s p h o r y l a t i o n a n d A T P a s e a c t i v i t y o f t h e human e r y t h r o c y t e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 3 8 9 , 3 1 4 - 3 2 4 . K a t z , S . a n d R e r a t u l l a , M . A . ( 1 9 7 8 ) P h o s p h o d i e s t e r a s e p r o t e i n a c t i v a t o r s t i m u l a t e s c a l c i u m t r a n s p o r t i n c a r d i a c m i c r o s o m a l p r e p a r a t i o n s e n r i c h e d i n s a r c o p l a s m i c r e t i c u l u m . B i o c h i m . B i o p h y s . R e s . Commun . 8 3 , 1 3 7 3 - 1 3 7 9 . K a t z , S . , R o u f o g a l i s , B . D . , L a n d m a n , A . D . a n d H o , L . ( 1 9 7 9 ) P r o p e r t i e s o f ( C a 2 + + M g 2 + ) - A T P a s e o f e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s p r e p a r e d b y d i f f e r e n t p r o c e d u r e s : i n f l u e n c e o f M g 2 + , C a 2 + , ATP a n d p r o t e i n a c t i v a t o r . J . S u p r a m o l . S t r u c t . 1 0 , 2 1 5 - 2 2 5 . - 169 -K e m p e n , H . J . M . , De P o n t , J . J . H . H . M . a n d B o n t i n g , S . L . ( 1 9 7 7 ) R a t p a n c r e a t i c a d e n y l a t e c y c l a s e . V : I t s p r e s e n c e i n i s o l a t e d r a t p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 4 9 6 , 5 2 1 - 5 3 1 . K h a n d e l w a l , R . K . , K o t e l l o , M . C . a n d W a n g , J . H . ( 1 9 8 0 ) T h e e f f e c t o f c a l m o d u l i n a n d T r o p o n i n - C on a c t i v i t i e s o f h o m o g e n o u s l i v e r p h o s p h o p r o t e i n p h o s p h a t a s e s . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 0 3 , 2 4 4 - 2 5 0 . K i l h o f f e r , M . C , C o o k , G . H . a n d W o l f f , J . ( 1 9 8 3 ) C a l c i u m - i n d e p e n d e n t a c t i v a t i o n o f a d e n y l a t e c y l a s e b y c a l m o d u l i n . E u r . J . B i o c h e m . 1 3 3 , 1 1 - 1 5 . K i m m e l , J . R . , H a y d e n , L . J . a n d P o l l a c k , H . G . ( 1 9 7 5 ) I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a new p a n c r e a t i c p o l y p e p t i d e h o r m o n e . J . B i o l . C h e m . 2 5 0 , 9369 - 9376 . K i r c h b e r g e r , M . A . a n d A n t o n e t z , T . ( 1 9 8 2 ) C a l m o d u l i n - m e d i a t e d r e g u l a t i o n o f c a l c i u m t r a n s p o r t a n d ( C a 2 + + M g 2 + ) - a c t i v a t e d A T P a s e a c t i v i t y i n i s o l a t e d c a r d i a c s a r c o p l a s m i c r e t i c u l u m . J . B i o l . C hem . 2 5 7 , 5 6 8 5 - 5 6 9 1 . K l e e , C . B . , C r o u c h , T . H . a n d K r i n k s , M . H . ( 1 9 7 9 ) C a l c i n e u r i n : A c a l c i u m a n d c a l m o d u l i n b i n d i n g p r o t e i n o f t h e n e r v o u s s y s t e m . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 6 , 6 2 7 0 - 6 2 7 3 . K l e e , C . B . , C r o u c h , T . H . a n d R i c h m a n , P . G . ( 1 9 8 0 ) C a l m o d u l i n . A n n . R e v . B i o c h e m . 4 9 , 4 8 9 - 5 1 5 . K n a u f , P . A . , P r o v e r b i o , F . a n d H o f f m a n , J . F . ( 1 9 7 4 ) E l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n o f d i f f e r e n t p h o s p h o p r o t e i n s a s s o c i a t e d w i t h C a - A T P a s e a n d N a , K - A T P a s e i n human r e d c e l l g h o s t s . J . G e n . P h y s i o l . 6 3 , 3 2 4 - 3 3 6 . K n o w l e s , A . F . , I s l e r , R . E . a n d R e e c e , J . F . ( 1 9 8 3 ) T h e common o c c u r r e n c e o f ATP d i p h o s p h o h y d r o l a s e i n m a m m a l i a n p l a s m a m e m b r a n e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 7 3 1 - , 8 8 - 9 6 . K o n d o , S . a n d S c h u l z , I . ( 1 9 7 6 a ) C a l c i u m i o n u p t a k e i n i s o l a t e d p a n c r e a s c e l l s i n d u c e d b y s e c r e t a g o g u e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 1 9 , 7 6 - 9 2 . K o n d o , S . a n d S c h u l z , I . ( 1 9 7 6 b ) C a 2 + f l u x e s i n i s o l a t e d c e l l s o f r a t p a n c r e a s . E f f e c t o f s e c r e t a g o g u e s a n d d i f f e r e n t C a + c o n c e n t r a t i o n s . J . M e m b r a n e B i o l . 2 9 , 1 8 5 - 2 0 3 . K o n t u r e k , S . J . , K r o l , R. a n d T a s l e r , J . ( 1 9 7 6 ) E f f e c t o f b o m b e s i n a n d r e l a t e d p e p t i d e s o n t h e r e l e a s e a n d a c t i o n o f i n t e s t i n a l h o r m o n e s o n p a n c r e a t i c s e c r e t i o n . J . P h y s i o l . 2 5 7 , 6 6 3 - 6 7 2 . K o r c , M . , S a n k a r a n , H . , W o n g , K . Y . , W i l l i a m s , J . A . a n d G o l d f i n e , L . D . ( 1 9 7 8 ) I n s u l i n r e c e p t o r s i n i s o l a t e d mouse p a n c r e a t i c a c i n i . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 8 4 , 2 9 3 - 2 9 9 . - 170 -R o m b e r g , A . ( 1 9 5 5 ) L a c t i c d e h y d r o g e n a s e o f m u s c l e . M e t h o d s E n z y m o l . 1 , 4 4 1 - 4 4 3 . K o t a g a l , N . , C o l c a , J . R . a n d M c D a n i e l , M . L . ( 1 9 8 3 ) A c t i v a t i o n o f a n i s l e t c e l l p l a s m a membrane ( C a 2 + + Mg + ) - A T P a s e b y c a l m o d u l i n a n d C a - E G T A . J . B i o l . C hem . 2 5 8 , 4 8 0 8 - 4 8 1 3 . K o t a g a l , N . , P a t k e , C , L a n d t , M . , M c D o n a l d , J . , C o l c a , J . , L a c y , P . a n d M c D a n i e l , M , ( 1 9 8 2 ) R e g u l a t i o n o f p a n c r e a t i c i s l e t - c e l l p l a s m a memb rane Ca + + Mg - A T P a s e by c a l m o d u l i n . FEBS L e t t . 1 3 7 , 2 4 9 - 2 5 2 . K r a e h e n b u h l , J . P . , R a c i n e , L . a n d J a m i e s o n , J . D . ( 1 9 7 7 ) I m m u n o c y t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f s e c r e t o r y p r o t e i n s i n b o v i n e p a n c r e a t i c e x o c r i n e c e l l s . J . C e l l B i o l . 7 2 , 4 0 6 - 4 2 3 . K r e t s i n g e r , R . ( 1 9 7 6 ) C a l c i u m - b i n d i n g p r o t e i n . A n n . R e v . B i o c h e m . 4 5 , 2 3 9 - 2 6 6 . K r i b b e n , A . , T y r a k o w s k ^ , T . a n d S c h u l z , I . ( 1 9 8 3 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f M g - A T P d e p e n d e n t Ca t r a n s p o r t i n c a t p a n c r e a t i c m i c r o s o m e s . Am. J . P h y s i o l . 2 4 4 , G 4 8 0 - G 4 9 0 . K w a n , C . Y . ( 1 9 8 2 ) M g 2 + - o r C a 2 + - A c t i v a t e d A T P a s e a c t i v i t i e s o f p l a s m a m e m b r a n e s i s o l a t e d f r o m v a s c u l a r s m o o t h m u s c l e . E n z y m e s , 2 8 , 3 1 7 - 3 2 7 . L a e m m l i , V . K . a n d F a v r e , M . ( 1 9 7 3 ) M a t u r a t i o n o f h e a d o f b a c t e r i o p h a g e T 4 : 1 . DNA p a c k a g i n g e v e n t s . J . M o l e c . B i o l . 8 0 , 5 7 5 - 5 9 9 . L a m b e r t , M . a n d C h r i s t o p h e , J . ( 1 9 7 8 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f ( M g , C a ) - A T P a s e a c t i v i t y i n r a t p a n c r e a t i c p l a s m a m e m b r a n e s . E u r . J . B i o c h e m . 9 1 , 4 8 5 - 4 9 2 . L a r o s e , L . , D u m o n t , Y . , A s s e l i n , J . , M o r r i s s e t , J . a n d P o i r i e r , G . G . ( 1 9 8 1 ) M u s c a r i n i c r e c e p t o r o f r a t p a n c r e a t i c a c i n i : [ H]QNB b i n d i n g a n d a m y l a s e s e c r e t i o n . E u r . J . P h a r m a c o l . 7 6 , 2 4 7 - 2 5 4 . L a r o s e , L . , L a n o e , J . , M o r r i s s e t , J . , G e o f f r i o n , L . , D u m o n t , Y . , L o r d , A . a n d P o i r i e r , G . G . ( 1 9 7 9 ) R a t p a n c r e a t i c m u s c a r i n i c c h o l i n e r g i c r e c e p t o r s . R o s s e l i n , G . , F r o m a g e o t , P . , B o n f i l s , S . e d s . H o r m o n e r e c e p t o r s i n d i g e s t i o n a n d n u t r i t i o n . A m s t e r d a m : E l s e v i e r / N o r t h - H o l l a n d , p p . 2 2 9 - 2 3 8 . L a r s e n , F . ^ . , H i n d s , T . R . a n d V i n c e n z i , F . F . ( 1 9 7 8 a ) On t h e r e d b l o o d c e l l C a + - p u m p : a n e s t i m a t e o f s t o i c h i o m e t r y . J . M e m b r a n e B i o l . 4 1 , 3 6 1 - 3 7 6 . L a r s e n , F . L . , K a t z , S . a n d R o u f o g a l i s , B . D . ( 1 9 8 1 ) C a l m o d u l i n r e g u l a t i o n o f C a - t r a n s p o r t i n human e r y t h r o c y t e s . B i o c h e m . J . 2 0 0 , 1 8 5 - 1 9 1 . - 171 -L a r s e n , F . L . , R a e s s , B . O . , H i n d s , T . R . a n d V i n c e n z i , F . F . ( 1 9 7 8 b ) M o d u l a t o r b i n d i n g p r o t e i n a n t a g o n i z e s a c t i v a t i o n o f ( C a 2 + + M g 2 + ) - A T P a s e a n d C a 2 + - t r a n s p o r t o f r e d b l o o d c e l l m e m b r a n e s . J . S u p r a m o l . S t r u c t . 9 , 2 6 9 - 2 7 4 . L a r s e n , F . L . a n d V i n c e n z i , F . F . ( 1 9 7 9 ) C a l c i u m t r a n s p o r t a c r o s s t h e p l a s m a m e m b r a n e : S t i m u l a t i o n b y c a l m o d u l i n . S c i e n c e . 2 0 4 , 3 0 6 - 3 0 9 . L e B e l , D . , P o i r i e r , G . G . , P h a n e u f , S . , S t - J e a n , P . , L a l i b e r t e , J . F . a n d B e a u d o i n , A . R . ( 1 9 8 0 ) C h a r a c t e r i z a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f a c a l c i u m - s e n s i t i v e ATP d i p h o s p h o h y d r o l a s e f r o m p i g p a n c r e a s . J . B i o l . C hem . 2 5 5 , 1 2 2 7 - 1 2 3 3 . L e v i n , R . M . , a n d W e i s s , B . ( 1 9 7 6 ) M e c h a n i s m b y w h i c h p s y c h o t r o p i c d r u g s i n h i b i t a d e n o s i n e c y c l i c 3 1 , 5 ' - m o n o p h o s p h a t e p h o s p h o d i e s t e r a s e o f b r a i n . M o l . P h a r m a c o l . 1 2 , 5 8 1 - 5 8 9 . L e v i n , R . M . a n d W e i s s , B . ( 1 9 7 7 ) B i n d i n g o f t r i f l u o p e r a z i n e t o t h e c a l c i u m - d e p e n d e n t a c t i v a t o r o f c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e . M o l . P h a r m a c o l . 1 3 , 6 9 0 - 6 9 7 . L e v i n , R . M . a n d W e i s s , B . ( 1 9 7 8 ) S p e c i f i c i t y o f t h e b i n d i n g o f t r i f l u o p e r a z i n e t o t h e c a l c i u m - d e p e n d e n t a c t i v a t o r o f p h o s p h o d i e s t e r a s e a n d t o a s e r i e s o f o t h e r c a l c i u m - b i n d i n g p r o t e i n s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 5 4 0 , 1 9 7 - 2 0 4 . L e v i n , R . M . a n d W e i s s , B . ( 1 9 7 9 ) S e l e c t i v e b i n d i n g o f a n t i p s y c h o t i c s a n d o t h e r p s y c h o a c t i v e a g e n t s t o t h e c a l c i u m - d e p e n d e n t a c t i v a t o r o f c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e . J . P h a r m a c o l . E x p . T h e r a p . 2 0 8 , 4 5 4 - 4 5 9 . L e w , P . D . a n d S t o s s e l , T . P . ( 1 9 8 0 ) C a l c i u m t r a n s p o r t by m a c r o p h a g e p l a s m a m e m b r a n e s . J . B i o l . C h e m . 2 5 5 , 5 8 4 1 - 5 8 4 6 . L i c h t m a n , A . H . , S e g e l , G . B . a n d L i c h t m a n , M . A . ( 1 9 8 1 ) C a l c i u m t r a n s p o r t a n d c a l c i u m - A T P a s e a c t i v i t y i n human l y m p h o c y t e p l a s m a memb rane v e s i c l e s . J . B i o l . C h e m . 2 5 6 , 6 1 4 8 - 6 1 5 4 . L i c h t n e r , R . , a n d W o l f , H . U . ( 1 9 7 9 ) D o d e c y l s u l p h a t e / p o l y a c r y l a m i d e - g e l e l e c t r o p h o r e s i s a t l o w pH v a l u e s a n d l o w t e m p e r a t u r e s . B i o c h e m . J . 1 8 1 , 7 5 9 - 7 6 1 . L o n g , B .W . a n d G a r d n e r , J . D . ( 1 9 7 7 ) E f f e c t s o f c h o l e c y s t o k i n i n o n a d e n y l a t e c y c l a s e a c t i v i t y i n d i s p e r s e d p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . G a s t r o e n t e r o l o g y . 7 3 , 1 0 0 8 - 1 0 1 4 . L o t e r s z t a j n , S . , H a n o u n e , J . a n d P e c k e r , F . ( 1 9 8 1 ) A h i g h a f f i n i t y c a l c i u m - s t i m u l a t e d m a g n e s i u m - d e p e n d e n t A T P a s e i n r a t l i v e r p l a s m a m e m b r a n e s . D e p e n d e n c e o n a n e n d o g e n o u s p r o t e i n a c t i v a t o r d i s t i n c t f r o m c a l m o d u l i n . J . B i o l . C hem . 2 5 6 , 1 1 2 0 9 - 1 1 2 1 5 . L o w r y , O . H . , R o s e b r o u g h , N . J . , F a r r , A . L . , a n d R a n d a l l , R . J . ( 1 9 5 1 ) P r o t e i n m e a s u r e m e n t w i t h t h e f o l i n p h e n o l r e a g e n t . J . B i o l . C h e m . 1 9 3 , 2 6 5 - 2 7 5 . - 172 -L u c a s , M . , G a l v a n , A . , S o l a n o , P . a n d G o b e r n a , R . ( 1 9 8 3 ) C o m p a r t m e n t a t l o n o f c a l c i u m i n d i g i t o n i n - d i s r u p t e d g u i n e a p i g p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 7 3 1 , 1 2 9 - 1 3 6 . L u c a s , M . , S c h m i d , G . , K r o m a s , R. a n d L o f f l e r , G . ( 1 9 7 8 ) C a l c i u m m e t a b o l i s m a n d e n z y m e s e c r e t i o n i n g u i n e a p i g p a n c r e a s . U p t a k e , s t o r a g e a n d r e l e a s e o f c a l c i u m i n w h o l e c e l l s a n d m i t o c h o n d r i a l a n d m i c r o s o m a l f r a c t i o n s . E u r . J . B i o c h e m . 8 5 , 6 0 9 - 6 1 9 . L u t h r a , M . G . , A u , K . S . a n d H a n n a h a n , D . J . ( 1 9 7 7 ) P u r i f i c a t i o n o f a c t i v a t o r o f human e r y t h r o c y t e memb rane ( C a 2 + + Mg + ) - A T P a s e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 7 7 , 6 7 8 - 6 8 7 . M a c l n t y r e , J . a n d G r e e n , J . W . ( 1 9 7 8 ) S t i m u l a t i o n o f Ca - t r a n s p o r t i n i n s i d e - o u t v e s i c l e s o f human e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s b y a s o l u b l e c y t o p l a s m i c a c t i v a t o r . B i o c h i m . B i o p h y s . a c t a . 5 1 0 , 3 7 3 - 3 7 7 . M a c M a n u s , J . P . ( 1 9 8 1 ) T h e s t i m u l a t i o n o f c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e b y a Mj. 1 1 5 0 0 c a l c i u m b i n d i n g p r o t e i n f r o m h e p a t o m a . F E B S L e t t . 1 2 6 , 2 4 5 - 2 4 9 . M a l o u f , N . N . , M e i s s n e r , G . ( 1 9 7 9 ) L o c a l i z a t i o n o f a M g 2 + o r C a 2 + a c t i v a t e d ( b a s i c ) A T P a s e i n s k e l e t a l m u s c l e . E x p l . C e l l R e s . 1 2 2 , 2 3 3 - 2 5 0 . M a n g o s , J . A . a n d D o n n e l l y , W . H . ( 1 9 8 1 ) I s o l a t e d p a r o t i d a c i n a r c e l l s f r o m p a t i e n t s w i t h c y s t i c f i b r o s i s . M o r p h o l o g y a n d c o m p o s i t i o n . J . D e n t . R e s . 6 0 , 1 9 - 2 5 . M a r t i n , S . S . a n d S e n i o r , A . E . ( 1 9 8 0 ) M e m b r a n e a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e a c t i v i t i e s i n r a t p a n c r e a s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 6 0 2 , 4 0 1 - 4 1 8 . M a r u y a m a , Y . a n d P e t e r s e n , O . H . ( 1 9 8 2 ) S i n g l e - c h a n n e l c u r r e n t s i n i s o l a t e d p a t c h e s o f p l a s m a memb rane f r o m b a s a l s u r f a c e o f p a n c r e a t i c a c i n i . N a t u r e . 2 9 9 , 1 5 9 - 1 6 1 . M a t t h e w s , E . K . , P e t e r s e n , O . H . a n d W i l l i a m s , J . A . ( 1 9 7 3 ) P a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s : A c e t y l c h o l l n e - i n d u c e d memb rane d e p o l a r i z a t i o n , c a l c i u m e f f l u x a n d a m y l a s e r e l e a s e . J . P h y s i o l . 2 3 4 , 6 8 9 - 7 0 1 . M a y , R . J . , C o n l o n , T . P . , E r s p a m e r , V . a n d G a r d n e r , J . D . ( 1 9 7 8 ) A c t i o n s o f p e p t i d e s i s o l a t e d f r o m a m p h i b i a n s k i n o n p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . Am . J . P h y s i o l . 2 3 5 , E 1 1 2 - E 1 1 8 . M c D o n a l d , J . M . , C h a n , K - M , G o e w e r t , R . R . , M o o n e y , R . A . a n d P e r s h a d s i n g h , H . A . ( 1 9 8 2 ) T h e ( C a 2 + + M g 2 + ) - A T P a s e o f a d i p o c y t e p l a s m a m e m b r a n e : r e g u l a t i o n b y c a l m o d u l i n a n d i n s u l i n . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 4 0 2 , 3 8 1 - 4 0 1 . - 173 -M e r r i t t , J . E . , W a l k e r , S . W . , W o j c i k i e w i c z , R . J . H . , M a c N e i l , S . , B r o w n , B . L . a n d T o m l i n s o n , S . ( 1 9 8 2 ) The r o l e o f c a l m o d u l i n i n s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g i n t h e a n t e r i o r p i t u i t a r y . B i o c h e m . S o c . T r a n s . 1 0 , 3 9 7 . M l c h e l l , R . H . ( 1 9 7 5 ) I n o s i t o l p h o s p h o l i p i d s a n d c e l l s u r f a c e r e c e p t o r f u n c t i o n . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 1 5 , 8 1 - 1 4 7 . M i l l e r , L . J . , R e i l l y , W . M . , R o s e n z w e i g , S . A . , J a m i e s o n , J . D . a n d G o , V . L . W . ( 1 9 8 3 ) A s o l u b l e i n t e r a c t i o n b e t w e e n d i b u t y r y l c y c l i c g u a n o s i n e 3 ' : 5 ' - m o n o p h o s p h a t e a n d c h o l e c y s t o k i n i n : A p o s s i b l e m e c h a n i s m f o r t h e i n h i b i t i o n o f c h o l e c y s t o k i n i n a c t i v i t y . G a s t r o e n t e r o l o g y . 8 4 , 1 5 0 5 - 1 5 1 1 . M i l u t i n o v i c , S . , S a c h s , G . , H a a s e , W. a n d S c h u l z , I . ( 1 9 7 7 ) S t u d i e s o n i s o l a t e d s u b c e l l u l a r c o m p o n e n t s o f c a t p a n c r e a s . J . M e m b r a n e B i o l . 3 6 , 2 5 3 - 2 7 9 . M i l u t i n o v i c , S . , S c h u l z , I a n d R o s s e l i n , G . ( 1 9 7 6 ) T h e i n t e r a c t i o n s o f s e c r e t i n w i t h p a n c r e a t i c m e m b r a n e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 3 6 , 1 1 3 - 1 2 7 . M u a l l e m , S . a n d K a r l i s h , S . ( 1 9 8 0 ) R e g u l a t o r y i n t e r a c t i o n b e t w e e n c a l m o d u l i n a n d '-ATP on t h e r e d c e l l c a l c i u m pump . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 5 9 7 , 6 3 1 - 6 3 6 . M u a l l e m , S . a n d K a r l i s h , S . ( 1 9 8 1 ) S t u d i e s o n t h e m e c h a n i s m o f r e g u l a t i o n o f t h e r e d - c e l l Ca pump b y C a l m o d u l i n a n d A T P . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 6 4 7 , 7 3 - 8 6 . M u l l i n s , L . J . ( 1 9 7 9 ) T h e g e n e r a t i o n o f e l e c t r i c c u r r e n t s i n C a r d i a c f i b e r s b y N a / C a e x c h a n g e . Am . J . P h y s i o l . 2 3 6 , C 1 0 3 - C 1 1 0 . M u r e r , H a n d H i l d m a n n , B . ( 1 9 8 1 ) T r a n s c e l l u l a r t r a n s p o r t o f c a l c i u m a n d i n o r g a n i c p h o s p h a t e i n t h e s m a l l i n t e s t i n a l e p i t h e l i u m . Am. J . P h y s i o l . 2 4 0 , G 4 0 9 - G 4 1 6 . M u t t , V . a n d J o r p e s , J . E . ( 1 9 6 8 ) S t r u c t u r e o f p o r c i n e c h o l e c y s t o k i n i n - p a n c r e o z y m i n I . C l e a v a g e w i t h t h r o m b i n a n d t r y p s i n . E u r . J . B i o c h e m . 6 , 1 5 6 - 1 6 2 . N g , K . H . , M o r r i s s e t , J . a n d P o i r i e r , G . G . ( 1 9 7 9 ) M u s c a r i n i c r e c e p t o r s o f t h e p a n c r e a s : a c o r r e l a t i o n b e t w e e n d i s p l a c e m e n t o f [ H ] - q u i n u c l i d i n y l b e n z i l a t e b i n d i n g a n d a m y l a s e s e c r e t i o n . P h a r m a c o l o g y 1 8 , 2 6 3 - 2 7 0 . N i g g l i , V . , A d u n y a h , E . S . a n d C a r a f o l i E . ( 1 9 8 1 ) A c i d i c p h o s p h o l i p i d s , u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s , a n d l i m i t e d p r o t e o l y s i s m i m i c t h e e f f e c t o f c a l m o d u l i n o n t h e p u r i f i e d e r y t h r o c y t e Ca + - A T P a s e . J . B i o l . Chem . 2 5 6 , 8 5 8 8 - 8 5 9 2 . - 174 -N i g g l i , V . , P e n n i s t o n , J . T . a n d C a r a f o l i , E . ( 1 9 7 9 ) P u r i f i c a t i o n o f t h e ( C a + + M g 2 + ) - A T P a s e f r o m human e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s u s i n g a c a l m o d u l i n a f f i n i t y c o l u m n . J . B i o l . C hem . 2 5 4 , 9 9 5 5 - 9 9 5 8 . N o r m a n , J . A . , D r ummond , A . H . , a n d M o s e r , P . ( 1 9 7 9 ) I n h i b i t i o n o f c a l c i u m d e p e n d e n t r e g u l a t o r - s t i m u l a t e d p h o s p h o d i e s t e r a s e a c t i v i t y b y n e u r o l e p t i c d r u g s i s u n r e l a t e d t o t h e i r c l i n i c a l e f f i c a c y . M o l . P h a r m a c o l . 1 6 , 1 0 8 9 - 1 0 9 4 . O ' D o h e r t y , J . a n d S t a r k , R . J . ( 1 9 8 2 ) S t i m u l a t i o n o f p a n c r e a t i c a c i n a r s e c r e t i o n : i n c r e a s e s i n c y t o s o l i c c a l c i u m a n d s o d i u m . Am. J . P h y s i o l . 2 4 2 , G 5 1 3 - G 5 2 1 . P e a r s o n , G . T . , S i n g h , J . , D a o u d , M . S . , D a v i s o n , J . S . a n d P e t e r s e n , O . H . ( 1 9 8 1 ) C o n t r o l o f p a n c r e a t i c c y c l i c n u c l e o t i d e l e v e l s a n d a m y l a s e s e c r e t i o n b y n o n c h o l i n e r g i c , n o n a d r e n e r g i c n e r v e s : a s t u d y e m p l o y i n g e l e c t r i c a l f i e l d s t i m u l a t i o n o f g u i n e a p i g s e g m e n t s . J . B i o l . C hem . 2 5 6 , 1 1 0 2 5 - 1 1 0 3 1 . P e r k i n , S . R . , C o s t e n b a d e r , C L . a n d G a r d n e r , J . D . ( 1 9 7 9 ) A c t i o n s o f d e r i v a t i v e s o f c y c l i c n u c l e o t i d e s o n d i s p e r s e d a c i n i f r o m g u i n e a p i g p a n c r e a s : d i s c o v e r y o f a c o m p e t i t i v e a n t a g o n i s t o f t h e a c t i o n o f c h o l e c y s t o k i n i n . J . B i o l . Chem . 2 5 4 , 5 3 2 1 - 5 3 2 7 . P e n n i s t o n , J . T . ( 1 9 8 2 ) . P l a s m a memb rane Ca - p u m p i n g A T P a s e s . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 4 0 2 , 2 9 6 - 3 0 3 . P e r k i n s , J . P . ( 1 9 7 3 ) A d e n y l c y c l a s e . A d v . C y c l i c N u c l e o t i d e R e s . 3 , 1 - 6 4 . P e t e r s e n , O . H . a n d M a r u y a m a , Y . ( 1 9 8 3 ) Wha t i s t h e m e c h a n i s m o f t h e c a l c i u m i n f l u x t o p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s e v o k e d b y s e c r e t a g o g u e s ? P f l u g e r s A r c h . 3 9 6 , 8 2 - 8 4 . P e t e r s e n , O . H . a n d P h i l p o t t , H . G . ( 1 9 7 9 ) P a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s : e f f e c t s o f m i c r o i o n t o p h o r e t i c p o l y p e p t i d e a p p l i c a t i o n o n m e m b r a n e p o t e n t i a l a n d r e s i s t a n c e . J . P h y s i o l . 2 9 0 , 3 0 5 - 3 1 5 . P e t e r s e n , O . H . a n d U e d a , N . ( 1 9 7 6 ) P a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s : t h e r o l e o f c a l c i u m i n s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g . J . P h y s i o l . 2 5 4 , 5 8 3 - 6 0 6 . P h i l p o t t , H . G . , a n d P e t e r s e n , O . H . ( 1 9 7 9 ) S e p a r a t e a c t i v a t i o n s i t e s f o r c h o l e c y s t o k i n i n a n d b o m b e s i n o n p a n c r e a t i c a c i n i . A n e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d y e m p l o y i n g a c o m p e t i t i v e a n t a g o n i s t f o r t h e a c t i o n o f CCK . P f l u g e r s A r c h . 3 8 2 , 2 6 3 - 2 6 7 . P o n n a p p a , B . C . , D o r m e r , R . L . a n d W i l l i a m s , J . A . ( 1 9 8 1 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f a n A T P - d e p e n d e n t C a 2 + u p t a k e s y s t e m i n mouse p a n c r e a t i c m i c r o s o m e s . Am . J . P h y s i o l . 2 4 0 , G 1 2 2 - G 1 2 9 . - 175 -P o r z i g , H . ( 1 9 7 2 ) A T P - i n d e p e n d e n t c a l c i u m n e t movemen t i n human r e d c e l l g h o s t s . J . M e m b r a n e B i o l . 8 , 2 3 7 - 2 5 8 . Q u i s t , E . E . a n d R o u f o g a l i s , B . D . ( 1 9 7 5 ) D e t e r m i n a t i o n o f t h e s t o i c h i o m e t r y o f t h e c a l c i u m pump i n human e r y t h r o c y t e s u s i n g l a n t h a n u m a s a s e l e c t i v e i n h i b i t o r F EBS L e t t . 5 0 , 1 3 5 - 1 3 9 . R a e s s , B . U . a n d V i n c e n z i , F . F . ( 1 9 8 0 a ) C a l m o d u l i n a c t i v a t i o n o f r e d b l o o d c e l l ( C a 2 + + Mg + ) - A T P a s e a n d i t s a n t a g o n i s m by p h e n o t h i z i n e s . M o l . P h a r m a c o l . 1 8 , 2 5 3 - 2 5 8 . R a e s s , B . U . a n d V i n c e n z i , F . F . ( 1 9 8 0 b ) A s e m i - a u t o m a t e d m e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f m u l t i p l e memb r ane A T P a s e a c t i v i t i e s . J . P h a r m a c o l . M e t h o d s 4 , 2 7 3 - 2 8 3 . R e g a , A . F . a n d G a r r a h a n , P . J . ( 1 9 7 5 ) . C a l c i u m i o n - d e p e n d e n t p h o s p h o r y l a t i o n o f human e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s . J . M e m b r a n e B i o l . 2 2 , 3 1 3 - 3 2 7 . R e g a , A . F . a n d G a r r a h a n , P . J . ( 1 9 7 8 ) C a l c i u m i o n - d e p e n d e n t d e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e Ca + - A T P a s e o f human r e d - c e l l s b y A D P . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 5 0 7 , 1 8 2 - 1 8 4 . R e i d , R . E . a n d H o d g e s , R . S . ( 1 9 8 0 ) C o - o p e r a t i v i t y a n d C a 2 + / M g 2 + b i n d i n g t o t r o p o n i n C a n d m u s c l e c a l c i u m b i n d i n g p a r v a l b u m i n : a n h y p o t h e s i s . J . T h e o r . B i o l . 8 4 , 4 0 1 - 4 4 4 . R e n c k e n s , B . A . M . , S c h r i j e n , J . J . , S w a r t z , H . G . P . , De P o n t , J . J . H . H . M . a n d B o n t i n g , S . L . ( 1 9 7 8 ) R o l e o f c a l c i u m i n e x o c r i n e p a n c r e a t i c s e c r e t i o n . I V . C a l c i u m m o v e m e n t s i n i s o l a t e d a c i n a r c e l l s o f r a b b i t p a n c r e a s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 5 4 4 , 3 3 8 - 3 5 0 . R i c h a r d s , D . E . , R e g a , A . F . a n d G a r r a h a n , P . J . ( 1 9 7 8 ) Two c l a s s e s o f s i t e f o r ATP i n t h e C a 2 + - A T P a s e f r o m human r e d c e l l m e m b r a n e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 5 1 1 , 1 9 4 - 2 0 1 . R i n d e r k n e c h t , H . , R e n n e r , I . G . , D o u g l a s , A . P . a n d A d h a m , N . F . ( 1 9 7 8 ) P r o f i l e s o f p u r e p a n c r e a t i c s e c r e t i o n s o b t a i n e d b y d i r e c t p a n c r e a t i c d u c t c a n n u l a t i o n i n n o r m a l h e a l t h y human s u b j e c t s . G a s t r o e n t e r o l o g y . 7 5 , 1 0 8 3 - 1 0 8 9 . R i v i e r , J . a n d B r o w n , M . ( 1 9 7 8 ) B o m b e s i n , b o m b e s i n a n d a n a l o g u e s a n d r e l a t e d p e p t i d e s : e f f e c t s o n t h e r m o r e g u l a t i o n . B i o c h e m i s t r y . 1 7 , 1 7 6 6 - 1 7 7 1 . R o b b e r e c h t , P . a n d C h r i s t o p h e , J . ( 1 9 7 1 ) S e c r e t i o n o f h y d r o l a s e s b y p e r f u s e d f r a g m e n t s o f r a t p a n c r e a s : e f f e c t o f c a l c i u m . Am. J . P h y s i o l . 2 2 0 , 9 1 1 - 9 1 7 . - 176 -R o b b e r e c h t , P . , C o n l o n , T . P . a n d G a r d n e r , J . D . ( 1 9 7 6 ) I n t e r a c t i o n o f p o r c i n e v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p e p t i d e w i t h d i s p e r s e d a c i n a r c e l l s f r o m t h e g u i n e a p i g : S t r u c t u r a l r e q u i r e m e n t s f o r e f f e c t s o f V I P a n d s e c r e t i n on c e l l u l a r c y c l i c AMP . J . B i o l . C h e m . 2 5 1 , 4 6 3 5 - 4 6 3 9 . R o b b e r e c h t , P . , D e s c h o d t - L a n c k m a n , M . , L a m m e n s , M . , D e N e e f P . , a n d C h r i s t o p h e , J . ( 1 9 7 7 ) I n v i t r o e f f e c t s o f s e c r e t i n a n d v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e o n h y d r o l a s e s e c r e t i o n a n d c y c l i c AMP l e v e l s i n t h e p a n c r e a s o f f i v e a n i m a l s p e c i e s . A c o m p a r i s o n w i t h c a e r u l e i n . G a s t r o e n t e r o l . C l i n . B i o l . 1 , 5 1 9 - 5 2 5 . R o n n e r , P .^ G a z z o | t i , P . a n d C a r a f o l i , E . ( 1 9 7 7 ) A l i p i d r e q u i r e m e n t f o r ( C a + Mg + ) A c t i v a t e d A T P a s e o f e r y t h r o c y t e m e m b r a n e s . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 7 9 , 5 7 8 - 5 8 3 . R o t h m a n , S . S . ( 1 9 8 0 ) P a s s a g e o f p r o t e i n s t h r o u g h m e m b r a n e s - o l d a s s u m p t i o n s a n d new p e r s p e c t i v e s . Am . J . P h y s i o l . 2 3 8 , G 3 9 1 - G 4 0 2 . R o t h m a n , S . S . a n d W i l k i n g , H . ( 1 9 7 8 ) D i f f e r e n t i a l r a t e s o f d i g e s t i v e e n z y m e t r a n s p o r t i n t h e p r e s e n c e o f c h o l e c y s t o k i n i n - p a n c r e o z y m i n . J . B i o l . C hem . 2 5 3 , 3 5 4 3 - 3 5 4 9 . R o u f o g a l i s , B . D . ( 1 9 8 1 ) P h e n o t h i z i n e a n t a g o n i s m o f c a l m o d u l i n : a s t r u c t u r a l l y - n o n s p e c i f i c i n t e r a c t i o n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 9 8 , 6 0 7 - 6 1 3 . R o u f o g a l i s , B . D . ( 1 9 8 2 ) S p e c i f i c i t y o f t r i f l u o p e r a z i n e a n d r e l a t e d p h e n o t h i z i n e s f o r C a 2 + b i n d i n g p r o t e i n s . I n : C a l c i u m a n d C e l l F u n c t i o n , V o l . 3 ( C h e u n g , E . Y . e d ) A c a d . P r e s s , N . Y . R u t t e n , W . J . , D e P o n t , J . J . H . H . M . a n d B o n t i n g , S . L . ( 1 9 7 2 ) A d e n y l a t e c y c l a s e i n t h e r a t p a n c r e a s . P r o p e r t i e s a n d s t i m u l a t i o n b y h o r m o n e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 2 7 4 , 2 0 1 - 2 1 3 . S a f f r a n , E . K . a n d K i n n e , R. ( 1 9 7 4 ) L o c a l i z a t i o n o f a c a l c i u m - s t i m u l a t e d A T P a s e i n t h e b a s a l - l a t e r a l p l a s m a m e m b r a n e s o f t h e p r o x i m a l t u b u l e o f r a t k i d n e y c o r t e x . J . M e m b r . B i o l . 1 7 , 2 6 3 - 2 7 4 . S a n k a r a n , H . , G o l d f i n e , I . D . , D e v e n e y , C . W . , W o n g , K - Y a n d W i l l i a m s , J . A . ( 1 9 8 0 ) B i n d i n g o f c h o l e c y s t o k i n i n t o h i g h a f f i n i t y r e c e p t o r s o n i s o l a t e d r a t p a n c r e a t i c a c i n i . J . B i o l . C hem . 2 5 5 , 1 8 4 9 - 1 8 5 3 . S a r k a d i , B . ( 1 9 8 0 ) A c t i v e c a l c i u m t r a n s p o r t i n human r e d c e l l s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 6 0 4 , 1 5 9 - 1 9 0 . S a r k a d i , B . , E n y e d i , A . a n d G a r d o s , G . ( 1 9 8 0 ) M o l e c u l a r p r o p e r t i e s o f t h e r e d c e l l c a l c i u m pump . I I E f f e c t s o f c a l m o d u l i n , p r o t e o l y t i c d i g e s t i o n a n d d r u g s o n t h e k i n e t i c s o f a c t i v e c a l c i u m u p t a k e i n i n s i d e - o u t r e d c e l l membrane v e s i c l e s . C e l l C a l c i u m 1, 2 8 7 - 2 9 7 . - 177 -S a r k a d i , B . , S c h u b e r t , A . a n d G a r d o s , G . ( 1 9 7 9 ) E f f e c t s o f C a - E G T A b u f f e r s on a c t i v e c a l c i u m - t r a n s p o r t i n i n s i d e - o u t r e d c e l l m e m b r a n e v e s i c l e s . E x p e r i e n t i a 3 5 , 1 0 4 5 - 1 0 4 7 . S a r k a d i , B . , S z a s z , I . , G e r l o c z y , A . a n d G a r d o s , G . ( 1 9 7 7 ) T r a n s p o r t p a r a m e t e r s a n d s t o i c h i o m e t r y o f a c t i v e c a l c i u m i o n e x t r u s i o n i n i n t a c t human r e d c e l l s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 4 6 4 , 9 3 - 1 0 7 ) . S c h a r f f , 0 . ( 1 9 7 2 ) T h e i n f l u e n c e o f c a l c i u m i o n s o n t h e p r e p a r a t i o n o f t h e ( C a 2 + + M g ) - a c t i v a t e d memb r ane A T P a s e i n human r e d c e l l s . S c a n d . J . C l i n . L a b . I n v e s t . 3 0 , 3 1 3 - 3 2 0 . S c h a r f f , 0 . ( 1 9 8 1 ) C a l m o d u l i n - a n d i t s r o l e i n c e l l u l a r a c t i v a t i o n . C e l l C a l c i u m 2 , 1 - 2 7 . S c h a r f f , 0 . a n d F o d e r , B . ( ^ 9 7 7 ) . L o w C a 2 + c o n c e n t r a t i o n s c o n t r o l l i n g two k i n e t i c s t a t e s o f Ca + - A T P a s e f r o m human e r y t h r o c y t e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 4 8 3 , 4 1 6 - 4 2 4 . S c h a t z m a n n , H . J . ( 1 9 6 6 ) ATP d e p e n d e n t c a l c i u m e x t r u s i o n f r o m human r e d c e l l s . E x p e r i e n t i a . 2 2 , 3 6 4 - 3 6 5 . 9 -L. S c h a t z m a n n , H . J . ( 1 9 7 7 ) R o l e o f m a g n e s i u m i n t h e ( C a + M g 2 + ) - s t i m u l a t e d memb r ane A T P a s e o f human r e d b l o o d c e l l s . J . M e m b r a n e B i o l . 3 5 , 1 4 9 - 1 5 8 . S c h a t z m a n n , H . J . a n d B u r g i n , H . ( 1 9 7 8 ) C a l c i u m i n human r e d b l o o d c e l l s . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 3 0 7 , 1 2 5 - 1 4 7 . S c h a t z m a n n , H . J . a n d R o s s i , G . L . ( 1 9 7 1 ) ( C a 2 + + M g 2 + ) - a c t i v a t e d memb rane A T P a s e s i n human r e d c e l l s a n d t h e i r p o s s i b l e r e l a t i o n t o c a t i o n t r a n s p o r t . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 2 4 1 , 3 7 9 - 3 9 2 . S c h a t z m a n n , H . J . a n d V i n c e n z i , F . F . ( 1 9 6 9 ) C a l c i u m m o v e m e n t s a c r o s s t h e m e m b r a n e s o f human r e d c e l l s . J . P h y s i o l . 2 0 1 , 3 6 9 - 3 9 5 . S c h e e l e , G . ( 1 9 7 5 ) Two d i m e n s i o n a l g e l a n a l y s i s o f s o l u b l e p r o t e i n s . C h a r a c t e r i z a t i o n o f g u i n e a p i g e x o c r i n e p a n c r e a t i c p r o t e i n s . J . B i o l . Chem . 2 5 0 , 5 3 7 5 - 5 3 8 5 . S c h e e l e , G . A . ( 1 9 8 0 ) B i o s y n t h e s i s , S e g r e g a t i o n a n d s e c r e t i o n o f e x p o r t a b l e p r o t e i n s b y t h e e x o c r i n e p a n c r e a s . Am . J . P h y s i o l . 2 3 8 , G 4 6 7 - G 4 7 7 . S c h e e l e , G . a n d H a y m o v i t s , A . ( 1 9 7 9 ) C h o l i n e r g i c a n d p e p t i d e s t i m u l a t e d d i s c h a r g e o f s e c r e t o r y p r o t e i n i n g u i n e a p i g p a n c r e a t i c l o b u l e s : R o l e o f i n t r a c e l l u l a r a n d e x t r a c e l l u l a r C a l c i u m . J . B i o l . C hem . 2 5 4 , 1 0 3 4 6 - 1 0 3 5 3 . - 178 -S c h e e l e , G . a n d H a y m o v i t s , A . ( 1 9 8 0 ) P o t a s s i u m a n d i o n o p h o r e A 2 3 1 8 7 - i n d u c e d d i s c h a r g e o f s e c r e t o r y p r o t e i n i n g u i n e a p i g p a n c r e a t i c l o b u l e s : R o l e o f e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m . J . B i o l . Chem . 2 5 5 , 4 9 1 8 - 4 9 2 7 . S c h e e l e , G . A . a n d P a l a d e , G . E . ( 1 9 7 5 ) S t u d i e s o n t h e g u i n e a p i g p a n c r e a s . P a r a l l e l d i s c h a r g e o f e x o c r i n e e n z y m e a c t i v i t i e s . J . B i o l . C hem . 2 5 0 , 2 6 6 0 - 2 6 7 0 . S c h e e l e , G . A . P a l a d e , G . E . a n d T a r t a k o f f , A . ( 1 9 7 8 ) C e l l f r a c t i o n a t i o n s t u d i e s on t h e g u i n e a p i g p a n c r e a s . R e d i s t r i b u t i o n o f e x o c r i n e p r o t e i n s d u r i n g t i s s u e h o m o g e n i z a t i o n . J . C e l l B i o l . 7 8 , 1 1 0 - 1 3 0 . S c h n e i d e r , C , M o t t o l a , C . a n d R o m e o , D. ( 1 9 7 9 ) C a l c i u m i o n - d e p e n d e n t a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e a c t i v i t y a n d p l a s m a - m e m b r a n e p h o s p h o r y l a t i o n i n t h e human n e u t r o p h i l . B i o c h e m . J . 1 8 2 , 6 5 5 - 6 6 0 . S c h u l z , I . ( 1 9 8 0 ) M e s s e n g e r r o l e o f c a l c i u m i n f u n c t i o n o f p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . A m . J . P h y s i o l . 2 3 9 , G 3 3 5 - G 3 4 7 . S c h u l z , I . a n d H e i l , K . ( 1 9 7 9 ) C a 2 + c o n t r o l o f e l e c t r o l y t e p e r m e a b i l i t y i n p l a s m a memb rane v e s i c l e s f r o m c a t p a n c r e a s . J . M e m b r a n e B i o l . 4 6 , 4 1 - 7 0 . S c h u l z , I . a n d S t o l z e , H . ( 1 9 8 0 ) T h e e x o c r i n e p a n c r e a s : t h e r o l e o f s e c r e t a g o g u e s , c y c l i c n u c l e o t i d e s , a n d c a l c i u m i n e n z y m e s e c r e t i o n . A n n . R e v . P h y s i o l . 4 2 , 1 2 7 - 1 5 6 . S c r a t c h e r d , T . H u t s o n , D. a n d C a s e , R . M . ( 1 9 8 1 ) I o n i c t r a n s p o r t m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g f l u i d s e c r e t i o n b y t h e p a n c r e a s . P h i l . T r a n s . R. S o c . L o n d . B . 2 9 6 , 1 6 7 - 1 7 8 . S h a r m a , R . K . , D e s a i , R . , T h o m p s o n , T . R . a n d W a n g , J . H . ( 1 9 7 8 ) . P u r i f i c a t i o n o f t h e h e a t s t a b l e i n h i b i t o r p r o t e i n o f t h e C a - a c t i v a t e d c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e b y a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y . C a n . J . B i o c h e m . 5 6 , 5 9 8 - 6 0 4 . S h e n , V . , K o h l e r , G . a n d P e c k , W . A . ( 1 9 8 3 ) A h i g h a f f i n i t y , c a l m o d u l i n - r e s p o n s i v e ( C a + Mg ) - A T P a s e i n i s o l a t e d b o n e c e l l s B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 7 2 7 , 2 3 0 - 2 3 8 . S i n g h , M . ( 1 9 8 0 ) A m y l a s e r e l e a s e f r o m d i s s o c i a t e d mou se p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s s t i m u l a t e d b y g l u c a g o n : e f f e c t o f membrane s t a b i l i z e r s . J . P h y s i o l . 3 0 9 , 8 1 - 9 1 . S i n g h , M . ( 1 9 8 2 ) R o l e o f c y c l i c a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e i n a m y l a s e r e l e a s e f r o m d i s s o c i a t e d r a t p a n c r e a t i c a c i n i . J . P h y s i o l . 3 3 1 , 5 4 7 - 5 5 5 . S m o a k e , J . A . , S o n g , S . Y . , a n d C h e u n g , W . Y . ( 1 9 7 4 ) C y c l i c 3 1 , 5 ' - n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e d i s t r i b u t i o n a n d d e v e l o p m e n t a l c h a n g e s o f t h e e n z y m e a n d i t s p r o t e i n a c t i v a t o r i n m a m m a l i a n t i s s u e s a n d c e l l s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 3 4 1 , 4 0 2 - 4 1 1 . - 179 -S o b u e , K . , I c h i d a , S . , Y o s h i d a , H . , Y a m a z a k i , R. a n d K a k i u c h i , S . ( 1 9 7 9 ) . O c c u r r e n c e o f a Ca a n d m o d u l a t o r p r o t e i n a c t i v a t a b l e A T P a s e i n t h e S y n a p t i c p l a s m a m e m b r a n e s o f b r a i n . F E B S L e t t . 9 9 , 1 9 9 - 2 0 2 . S o l i n g , H . D . a n d U n g e r , K . O . ( 1 9 7 2 ) The r o l e o f i n s u l i n i n t h e r e g u l a t i o n o f a - a m y l a s e s y n t h e s i s i n t h e r a t p a n c r e a s . E u r . J . C l i n . I n v e s t . 2 , 1 9 9 - 2 1 2 . S p a r r o w , M . P . a n d J o h n s t o n e , B . M . ( 1 9 6 4 ) A r a p i d m i c r o m e t h o d f o r e x t r a c t i o n o f c a l c i u m a n d m a g n e s i u m f r o m t i s s u e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 9 0 , 4 2 5 - 4 2 6 . S t e e r , M . L . a n d G l a z e r , G . ( 1 9 7 6 ) P a r a l l e l s e c r e t i o n o f d i g e s t i v e e n z y m e s b y t h e i n v i t r o r a b b i t p a n c r e a s . Am. J . P h y s i o l . 2 3 1 , 1 8 6 0 - 1 8 6 5 . S t e e r , M . L . a n d M a n a b e , T . ( 1 9 7 9 ) C h o l e c y s t o k i n i n - p a n c r e o z y m i n i n d u c e s t h e p a r a l l e l d i s c h a r g e o f d i g e s t i v e e n z y m e s f r o m t h e in v i t r o r a b b i t p a n c r e a s . J . B i o l . C h e m . 2 5 4 , 7 2 2 8 - 7 2 2 9 . S t e v e n s , F . C . , W a l s h , M . , H o , H . T e o , T . S . a n d W a n g , J . H . ( 1 9 7 6 ) . C o m p a r i s o n o f c a l c i u m b i n d i n g p r o t e i n s : b o v i n e h e a r t a n d b r a i n p r o t e i n a c t i v a t o r s o f c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e a n d r a b b i t s k e l e t a l m u s c l e t r o p o n i n C . J . B i o l . C hem . 2 5 1 , 4 4 9 5 - 4 5 0 0 . S t o l z e , H . a n d S c h u l z , I . ( 1 9 8 0 ) E f f e c t o f a t r o p i n e , o u a b a i n , a n t i m y c i n A . a n d A 2 3 1 8 7 on t h e " t r i g g e r C a 2 + p o o l " i n e x o c r i n e p a n c r e a s . Am. J . P h y s i o l . 2 3 8 , G 3 3 8 - G 3 4 8 . S v o b o d a , M . , R o b b e r e c h t , P . , C a m u s , J . , D e s c h o d t - L a n c k m a n , M . a n d C h r i s t o p h e , J . ( 1 9 7 6 ) S u b c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n a n d r e s p o n s e t o g a s t r o i n t e s t i n a l h o r m o n e s o f a d e n y l a t e c y c l a s e i n r a t p a n c r e a s . E u r . J . B i o c h e m . 6 9 , 1 8 5 - 1 9 3 . S v o b o d a , M . , R o b b e r e c h t , P . , C a m u s , J . , D e s c h o d t - L a n c k m a n , M . a n d C h r i s t o p h e , J . ( 1 9 7 8 ) A s s o c i a t i o n o f b i n d i n g s i t e s f o r g u a n i n e n u c l e o t i d e s w i t h a d e n y l a t e c y c l a s e a c t i v a t i o n i n r a t p a n c r e a t i c p l a s m a m e m b r a n e s . I n t e r a c t i o n o f g a s t r o i n t e n s t i n a l h o r m o n e s . E u r . J . B i o c h e m . 8 3 , 2 8 7 - 2 9 7 . S z a s z , I . S a r k a d i , B . , S c h u b e r t , A . a n d G a r d o s , G . ( 1 9 7 8 ) E f f e c t s o f l a n t h a n u m o n c a l c i u m - d e p e n d e n t p h e n o m e n a i n human r e d c e l l s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 5 1 2 , 3 3 1 - 3 4 0 . T a n a k a , T . a n d H i d a k a , H . ( 1 9 8 0 ) H y d r o p h o b i c r e g i o n s f u n c t i o n s i n c a l m o d u l i n - e n z y m e i n t e r a c t i o n . J . B i o l . C hem . 2 5 5 , 1 1 0 7 8 - 1 1 0 8 0 . T a v e r n a , R . D . a n d H a n a h a n , D . J . ( 1 9 8 0 ) M o d u l a t i o n o f human e r y t h r o c y t e C a + / M g + A T P a s e a c t i v i t y b y p h o s p h o l i p a s e A 2 a n d p r o t e a s e s . A c o m p a r i s o n w i t h c a l m o d u l i n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 9 4 , 6 5 2 - 6 5 9 . - 180 -T a w a t a , M . a n d F i e l d , J . B . ( 1 9 8 2 ) C a l m o d u l i n - b i n d i n g p r o t e i n s o f b o v i n e t h y r o i d p l a s m a m e m b r a n e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 7 1 9 , 4 0 6 - 4 1 0 . T e r a i , M . , F u r i h a t a , C , M a t s u s h i m a , T . a n d S u g i m u r a , T . ( 1 9 7 6 ) P a r t i a l p u r i f i c a t i o n o f a d e n o s i n e 3 ' , 5 ' - c y c l i c m o n o p h o s p h a t e p h o s p h o d i e s t e r a s e s f r o m r a t p a n c r e a s i n t h e p r e s e n c e o f e x c e s s p r o t e a s e i n h i b i t o r s . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 7 6 , 6 2 1 - 6 2 9 . T r a m s , E . G . ( 1 9 7 4 ) E v i d e n c e f o r ATP a c t i o n o n t h e c e l l s u r f a c e . N a t u r e 2 5 2 , 4 8 0 - 4 8 2 . U e d a , N . , S u z u k i , Y . , O k o m u r a , K . a n d N a m i k i , M . ( 1 9 8 0 ) D i b u t y r y l c y c l i c GMP i n h i b i t s c a e r u l e i n - b u t n o t A C h - , b o m b e s i n - o r s e c r e t i n - e v o k e d f l u i d s e c r e t i o n i n t h e p e r f u s e d r a t p a n c r e a s . I n : B i o l o g y o f N o r m a l a n d C a n c e r o u s E x o c r i n e P a n c r e a t i c C e l l s . R i b e t , A . , P r a d a y r o l , L . a n d S u s i n i , C . e d s . pp 5 5 - 6 0 , E l s e v i e r / N o r t h - H o l l a n d , A m s t e r d a m . V a n E l d i k , L . J . , P i p e r n o , G . a n d W a t t e r s o n , D . M . ( 1 9 8 0 ) S i m i l a r i t i e s a n d d i s s i m i l a r i t i e s b e t w e e n c a l m o d u l i n a n d a C h l a m y d o m o n a s f l a g e l l a r p r o t e i n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . , U . S . A . 7 7 , 4 7 7 9 - 4 7 8 3 . V a n d e r m e e r s , A . , R o b b e r e c h t , P . a n d V a n d e r m e e r s - P i r e t , M . ( 1 9 7 8 ) . S p e c i f i c b i n d i n g o f t h e c a l c i u m d e p e n d e n t r e g u l a t o r p r o t e i n t o b r a i n m e m b r a n e s f r o m t h e g u i n e a p i g . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 8 4 , 1 0 7 6 - 1 0 8 1 . V a n d e r m e e r s , A . , V a n d e r m e e r s - P i r e t , M . , R a t h e , J . a n d C h r i s t o p h e , J . ( 1 9 8 3 ) P u r i f i c a t i o n a n d k i n e t i c p r o p e r t i e s o f two s o l u b l e f o r m s o f c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e f r o m r a t p a n c r e a s . B i o c h e m . J . 2 1 1 , 3 4 1 - 3 4 7 . V a n d e r m e e r s , A . , V a n d e r m e e r s - P i r e t , M . R a t h e , J . , K u t z n e r , R . , D e l f o r g e , A . a n d C h r i s t o p h e , J . ( 1 9 7 7 ) A c a l c i u m - d e p e n d e n t p r o t e i n a c t i v a t o r o f g u a n o s i n e 3 ' - 5 ' - m o n o p h o s p h a t e p h o s p h o d i e s t e r a s e i n b o v i n e a n d r a t p a n c r e a s : i s o l a t i o n , p r o p e r t i e s a n d l e v e l s i n v i t r o . E u r . J . B i o c h e m . 8 1 , 3 7 9 - 3 8 6 . V e r e c k a , L . a n d C a r a f o l i , E . ( 1 9 8 2 ) V a n a d a t e i n d u c e d m o v e m e n t s o f C a 2 + a n d K + i n human r e d b l o o d c e l l s . J . B i o l . C hem . 2 5 7 , 7 4 1 4 - 7 4 2 1 . V e r m a , A . K . a n d P e n n i s t o n , J . T . ( 1 9 8 1 ) A h i g h a f f i n i t y C a 2 + - d e p e n d e n t A T P a s e i n r a t c o r p u s l u t e u m p l a s m a memb rane f r a c t i o n s . J . B i o l . C h e m . 2 5 6 , 1 2 6 9 - 1 2 7 5 , 1 9 8 1 . W a k a s u g i , H . K i m u r a , T . , H a a s e , W . , K r i b b e n , A . K a u f m a n n , R. a n d S c h u l z , I . ( 1 9 8 2 ) C a l c i u m u p t a k e i n t o a c i n i f r o m r a t p a n c r e a s : E v i d e n c e f o r i n t r a c e l l u l a r A T P - d e p e n d e n t c a l c i u m s e q u e s t r a t i o n . J . M e m b r a n e B i o l . 6 5 , 2 0 5 - 2 2 0 . - 181 -W a k a s u g i , H . , S t o l z e , H . , H a a s e , W. a n d S c h u l z , I . ( 1 9 8 1 ) E f f e c t o f L a on s e c r e t a g o g u e - i n d u c e d C a 2 + f l u x e s i n r a t i s o l a t e d p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . Am. J . P h y s i o l . 2 4 0 , G 2 8 1 - G 2 8 9 . W a n g , J . H . a n d D e s a i , R. ( 1 9 7 7 ^ M o d u l a t o r b i n d i n g p r o t e i n - A b o v i n e b r a i n p r o t e i n e x h i b i t i n g C a + - d e p e n d e n t a s s o c i a t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 5 2 , 4 1 7 5 - 4 1 8 4 . W a t t e r s o n , D . M . , H a r v e l s o n , W . G . K e l l e r , P . M . S h a r i e f , F . a n d V a n a m a n , T . C . ( 1 9 7 6 ) S t r u c t u r a l s i m i l a r i t i e s b e t w e e n t h e C a 2 + - d e p e n d e n t r e g u l a t o r y p r o t e i n s o f 3 ' : 5 ' c y c l i c n u c l e o t i d e p h o s p h o d i e s t e r a s e a n d a c t o m y o s i n A T P a s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 1 , 4 5 0 1 - 4 5 1 3 . W a t t e r s o n , D . , S h a r i e f , F . , a n d V a n a m a n , T . C . ( 1 9 8 0 ) T h e c o m p l e t e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f t h e C a 2 + - d e p e n d e n t m o d u l a t o r p r o t e i n ( c a l m o d u l i n ) o f b o v i n e b r a i n . J . B i o l . C h e m . 2 5 5 , 9 6 2 - 9 7 5 . W e i s s , B . , P r o z i a l e c k , W . C . a n d W a l l a c e , T . L . ( 1 9 8 2 ) I n t e r a c t i o n o f d r u g s w i t h c a l m o d u l i n : B i o c h e m i c a l , p h a r m a c o l o g i c a l a n d c l i n i c a l i m p l i c a t i o n s . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 3 1 , 2 2 1 7 - 2 2 2 6 . W h a r t o n , D . C . a n d T z a g o l o f f , A . ( 1 9 6 7 ) C y t o c h r o m e o x i d a s e f r o m b e e f h e a r t m i t o c h o n d r i a . M e t h o d s E n z y m o l . 1 0 , 2 4 5 - 2 5 0 . W h i t f i e l d , J . F . , B o y n t o n , A . L . , M a c M a n u s , J . P . , S i k o r s k a , M . a n d T s a n g , B . K . ( 1 9 7 9 ) . T h e r e g u l a t i o n o f c e l l p r o l i f e r a t i o n b y c a l c i u m a n d c y c l i c AMP . M o l . C e l l . B i o c h e m . 2 7 , 1 5 5 - 1 7 9 . W i l l i a m s , J . A . ( 1 9 8 0 ) R e g u l a t i o n o f p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l f u n c t i o n b y i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m . Am. J . P h y s i o l . 2 3 8 , G 2 6 9 - G 2 7 9 . W i l l i a m s , J . A . a n d C h a n d l e r , D. ( 1 9 7 5 ) Ca"1-*" a n d p a n c r e a t i c a m y l a s e r e l e a s e . Am. J . P h y s i o l . 2 2 8 , 1 7 2 9 - 1 7 3 2 . W i l l i a m s , J . A . , K o r c , M . , a n d D o r m e r , R . L . ( 1 9 7 8 ) A c t i o n o f s e c r e t a g o g u e s on a new p r e p a r a t i o n o f f u n c t i o n a l l y i n t a c t , i s o l a t e d p a n c r e a t i c a c i n i . Am. J . P h y s i o l . 2 3 5 , E 5 1 7 - E 5 2 4 . W i l l i a m s , J . A . , P o u l s e n , J . H . a n d L e e , M . ( 1 9 7 7 ) E f f e c t s o f memb rane s t a b i l i z e r s o n p a n c r e a t i c a m y l a s e r e l e a s e . J . M e m b r a n e B i o l . 3 3 , 1 8 5 - 1 9 5 . W i l l i a m s , J . A . , S a n k a r a n , H . , K o r c , M . a n d G o l d f i n e , I . D . ( 1 9 8 1 ) R e c e p t o r s f o r c h o l e c y s t o k i n i n a n d i n s u l i n i n i s o l a t e d p a n c r e a t i c a c i n i : h o r m o n a l c o n t r o l o f s e c r e t i o n a n d m e t a b o l i s m . F e d e r a t i o n P r o c . 4 0 , 2 4 9 7 - 2 5 0 2 . W o l f f , D . J . , P o i r i e r , P . G . , B r o s t r o m , C D . a n d B r o s t r o m , M . A . ( 1 9 7 7 ) D i v a l e n t c a t i o n b i n d i n g p r o p e r t i e s o f b o v i n e b r a i n C a 2 + - d e p e n d e n t r e g u l a t o r p r o t e i n J . B i o l . C h e m . 2 5 2 , 4 1 0 8 - 4 1 7 7 . - 182 -W r e n n , R .W. ( 1 9 8 3 ) P h o s p h o l i p i d - s e n s i t i v e c a l c i u m d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e a n d i t s e n d o g e n o u s s u b s t r a t e p r o t e i n s i n r a t p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s . L i f e S c i . 3 2 , 2 3 8 5 - 2 3 9 2 . Y a m a k i , T . a n d H i d a k a , H . ( 1 9 8 0 ) C a 2 + - i n d e p e n d e n t s t i m u l a t i o n o f c y c l i c G M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e b y c a l m o d u l i n B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 9 4 , 7 2 7 - 7 3 3 . 

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