UBC Theses and Dissertations

UBC Theses Logo

UBC Theses and Dissertations

The effect of climate change-related environmental acidification on the growth, development and energetics… Ou, Michelle 2014

Your browser doesn't seem to have a PDF viewer, please download the PDF to view this item.

Item Metadata


24-ubc_2014_september_ou_michelle.pdf [ 1.42MB ]
JSON: 24-1.0167559.json
JSON-LD: 24-1.0167559-ld.json
RDF/XML (Pretty): 24-1.0167559-rdf.xml
RDF/JSON: 24-1.0167559-rdf.json
Turtle: 24-1.0167559-turtle.txt
N-Triples: 24-1.0167559-rdf-ntriples.txt
Original Record: 24-1.0167559-source.json
Full Text

Full Text

	  The	  effect	  of	  climate	  change-­‐related	  environmental	  acidification	  on	  the	  growth,	  development	  and	  	  energetics	  of	  the	  early	  life	  stages	  of	  pink	  salmon	  (Oncorhynchus	  gorbuscha)	  	   by	  	  	  Michelle	  Ou	  	  	  B.Sc.,	  The	  University	  of	  British	  Columbia,	  2011	  	  	  	  	   	  A	  THESIS	  SUMBMITTED	  IN	  PARTIAL	  FULFILLMENT	  OF	  THE	  REQUIREMENTS	  FOR	  THE	  DEGREE	  OF	  	  MASTER	  OF	  SCIENCE	  	  in	  	  THE	  FACULTY	  OF	  GRADUATE	  AND	  POSTDOCTORAL	  STUDIES	  	  (Zoology)	  	  	  	  	   	  	  	  	   The	  University	  of	  British	  Columbia	  (Vancouver)	  	  July	  2014	  	  	   ©Michelle	  Ou	  2014	   ii Abstract	  As	  a	  consequence	  of	  increasing	  atmospheric	  CO2,	  the	  partial	  pressure	  of	  CO2	  (pCO2)	  in	  the	  oceans	  is	  rising,	  causing	  a	  decrease	  in	  pH	  and	  carbonate	  ions	  known	  as	  ocean	  acidification	  (OA).	  Since	  freshwater	  systems	  have	  the	  same	  potential	  for	  atmospheric	  equilibrium	  with	  CO2,	  similar	  scenarios	  of	  acidification	  will	  occur	  in	  freshwater,	  yet	  little	  is	  known	  about	  the	  potential	  impacts	  of	  climate	  change-­‐related	  acidification	  on	  freshwater	  species	  and	  ecosystems.	  Moreover,	  virtually	  no	  research	  has	  investigated	  the	  effect	  of	  oscillating	  pCO2	  tensions	  on	  fish,	  which	  are	  more	  likely	  to	  reflect	  natural	  coastal	  conditions.	  The	  goal	  of	  this	  thesis	  is	  to	  address	  some	  of	  these	  knowledge	  gaps	  by	  studying	  the	  potential	  effects	  of	  climate	  change-­‐related	  acidification	  on	  pink	  salmon	  (Oncorhynchus	  gorbuscha)	  at	  a	  sensitive	  and	  critical	  life-­‐stage	  during	  development	  in	  both	  freshwater	  and	  seawater	  under	  future	  elevated	  and	  fluctuating	  pCO2	  tensions	  (freshwater:	  400	  μatm,	  1000	  μatm,	  2000	  μatm,	  400-­‐2000	  μatm	  (over	  24hr);	  seawater:	  400	  μatm,	  1600	  μatm,	  400-­‐1600	  μatm).	  Growth,	  production	  efficiencies	  and	  aerobic	  scope	  were	  measured	  starting	  2	  weeks	  pre-­‐hatch	  in	  freshwater	  up	  until	  2	  weeks	  post-­‐seawater	  transfer.	  Growth	  was	  reduced	  during	  freshwater	  rearing	  and	  following	  seawater	  transfer.	  Specifically,	  size,	  production	  efficiencies	  and	  absolute	  growth	  rates	  were	  reduced	  at	  freshwater	  tensions	  of	  1000	  and	  2000	  μatm	  and	  seawater	  tensions	  of	  1600	  μatm.	  However,	  no	  significant	  effects	  on	  growth	  were	  seen	  in	  response	  to	  oscillating	  pCO2	  tensions.	  Similarly,	  aerobic	  scope	  was	  reduced	  at	  high	  pCO2	  following	  seawater	  transfer	  through	  a	  reduction	  in	  maximal	  oxygen	  consumption	  rate	  (MO2max)	  (but	  not	  routine	  (MO2routine)),	  indicating	  that	  exercise	  in	  pink	  salmon	  fry	  may	  be	  particularly	  affected	   iii by	  climate	  change-­‐related	  acidification.	  Given	  that	  control	  fish	  exhibit	  a	  dramatic	  increase	  in	  MO2max	  7	  days	  post-­‐seawater	  transfer,	  which	  is	  likely	  associated	  with	  a	  change	  in	  life	  history	  from	  a	  sedentary	  to	  a	  migratory	  stage,	  elevations	  in	  seawater	  pCO2	  may	  have	  implications	  for	  their	  seaward	  migration	  success.	  Overall,	  this	  thesis	  demonstrates	  that	  pink	  salmon,	  under	  predicted	  future	  increases	  in	  pCO2,	  may	  be	  faced	  with	  sublethal	  impacts	  of	  acidification	  on	  various	  aspects	  of	  their	  physiology	  at	  a	  very	  critical	  time	  in	  their	  life	  history.	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   iv Preface	  	   Chapter	  2	  of	  this	  thesis	  is	  co-­‐authored	  by	  Michelle	  Ou,	  Emily	  Lyall,	  and	  Colin	  J.	  Brauner.	  I	  conducted	  all	  of	  the	  research	  in	  chapter	  2	  (research	  questions,	  experimental	  design,	  experimentation	  and	  data	  analysis)	  under	  the	  supervision	  of	  Dr.	  Colin	  J.	  Brauner.	  Emily	  Lyall,	  an	  undergraduate	  student	  (UBC),	  assisted	  with	  the	  experimental	  design	  and	  experimentation	  for	  chapter	  2.	  I	  wrote	  all	  3	  chapters	  of	  this	  thesis	  and	  received	  editorial	  feedback	  from	  my	  committee	  members,	  Drs.	  Colin	  J.	  Brauner,	  Patricia	  M.	  Schulte,	  and	  William	  K.	  Milsom.	  	   All	  experimental	  animals	  were	  treated	  according	  to	  the	  University	  of	  British	  Columbia	  Animal	  protocol	  #	  A11-­‐0235.	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   v Table	  of	  contents	  	  Abstract……………………………………………………………………………………………………………….ii	  Preface…………………………………………………………………………………………………………..……iv	  Table	  of	  contents……………………………………………………………………………….…………………v	  List	  of	  tables..……..………………………………………………………………………………………………vii	  List	  of	  figures..…..………………………………………………………………………………………………viii	  List	  of	  abbreviations……..………………………………………………………………………………..……x	  Acknowledgements….……..………………………………………………………………………………..…xi	  Dedication…………….….……..……………………………………………………………………………….…xii	  [1]	   General	  introduction…………………………………………………………………………………1	  	   1.1	  Ocean	  acidification……………………………………...………………………………………1	  	   1.2	  Acid-­‐base	  regulation	  in	  teleost	  fish…..…………………………………………………5	  	   1.3	  Acid-­‐base	  regulation	  in	  larval	  fish…..……………….…………………………………7	  	   1.4	  The	  energetics	  of	  growth	  in	  developing	  fish…..……………………………………8	  	   1.5	  The	  early	  life	  stages	  of	  salmonids…..……………….………..………………………10	  	   1.6	  Model	  species:	  pink	  salmon	  (Oncorhynchus	  gorbuscha)…....……………12	  	   1.7	  Thesis	  objectives	  and	  hypotheses…..……………….………..………………………14	  [2]	   	  The	  effect	  of	  climate	  change-­‐related	  environmental	  acidification	  on	  the	  growth,	  development	  and	  energetics	  of	  the	  early	  life	  stages	  of	  pink	  salmon	  (Oncorhynchus	  gorbuscha)……..……………….………..………………………16	  	  	   2.1	  Introduction…..……………………………………….…………………………………………16	  	   2.2	  Materials	  and	  methods…..…………………………………………………………………21	  	   2.21	  Experimental	  animals…..………………………………………………………………………21	  	   2.22	  Experimental	  design	  and	  CO2	  manipulation	  in	  freshwater….…………………21	   vi 	   2.23	  Seawater	  transfer	  and	  CO2	  manipulation	  in	  seawater….………………..………23	  	   2.24	  Growth	  and	  yolk	  consumption….………………………………………..……………….…25	  	   2.25	  Respirometry….……………………………………………………………………………………..25	  	   2.26	  Statistical	  analysis….……………………………………………….……………………………27	  2.3	  Results……….…………………………….…………….………………………………………….28	  	   2.31	  Growth	  and	  development….…………………………………….………………………….…28	  	   2.32	  Metabolic	  rates……………………….….………………..…………………………………….…29	  2.4	  Discussion…..…………………………………....…….…………………………………………31	  	   2.41	  Growth	  and	  development….……………………….…………………………………….……31	  	   2.42	  Aerobic	  scope….………………………………………...………………………………………….34	  	   2.43	  Temporal	  fluctuations	  in	  pCO2…………..………………………………………………….35	  	   2.44	  Current	  and	  future	  implications	  on	  pink	  salmon…………..……………………….36	  	   2.45	  Summary….…………………………………….…………………………………………………….38	  [3]	  General	  discussion	  and	  conclusions……….………………….….……….…………………….57	  3.1	  Thesis	  summary…..…………………………….………..…………………………………….57	  3.2	  Potential	  for	  acclimation	  and	  adaptation…..…………………………………….57	  3.3	  Increase	  in	  𝑴O2max	  following	  seawater	  entry…..………………………………..61	  3.4	  Freshwater	  acidification……………………………..…………………………………….62	  3.5	  Research	  limitations	  and	  future	  directions…..………………….……………….63	  References……….…..…………………………….………………………...……………………………………66	  	  	  	  	   vii List	  of	  tables	  	  	   Table	  2.1	   Time	  in	  weeks	  post	  CO2	  exposure	  in	  freshwater	  and	  following	  seawater	  transfer	  with	  corresponding	  age	  of	  pink	  salmon	  embryos/alevin/fry	  in	  accumulated	  thermal	  units	  (ATU)	  from	  2	  weeks	  pre-­‐hatch	  up	  until	  2	  weeks	  following	  seawater	  transfer……………………………………………………………………………55	  	   Table	  2.2	   Fork	  lengths	  of	  pink	  salmon	  fry	  2	  weeks	  post-­‐seawater	  transfer	  (week	  13	  of	  CO2	  exposure).	  Fish	  were	  reared	  at	  different	  pCO2	  tensions	  in	  freshwater	  for	  11	  weeks	  prior	  to	  seawater	  transfer……………………………………………………………………………56	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   viii List	  of	  figures	  	  	   Figure	  2.1	   Total	  alevin	  pink	  salmon	  wet	  mass	  (yolk	  included)	  during	  development	  in	  freshwater	  from	  2	  weeks	  pre-­‐hatch	  (time	  0	  of	  CO2	  exposure)	  up	  until	  1	  week	  before	  seawater	  transfer	  (week	  10	  of	  CO2	  exposure)	  at	  different	  pCO2	  tensions……………….…....39	  	  Figure	  2.2	   Pink	  salmon	  tissue	  wet	  mass	  (yolk	  excluded)	  during	  development	  in	  freshwater	  from	  2	  weeks	  post-­‐hatch	  (week	  4	  of	  CO2	  exposure)	  up	  until	  1	  week	  before	  seawater	  transfer	  (week	  10	  of	  CO2	  exposure)	  at	  different	  pCO2	  tensions…………..40	  	  Figure	  2.3	   Pink	  salmon	  tissue	  dry	  mass	  (yolk	  excluded)	  at	  week	  10	  (1	  week	  before	  seawater	  transfer)……..………….….……………..……...41	  	  Figure	  2.4	   Pink	  salmon	  fork	  lengths	  during	  development	  in	  freshwater	  from	  3	  weeks	  post-­‐hatch	  (week	  5	  of	  CO2	  exposure)	  up	  until	  1	  week	  before	  seawater	  transfer	  (week	  10	  of	  CO2	  exposure)	  at	  different	  pCO2	  tensions……………………………………………………….42	  	  Figure	  2.5	   Pink	  salmon	  yolk	  wet	  mass	  during	  development	  in	  freshwater	  from	  2	  weeks	  post-­‐hatch	  (week	  4	  of	  CO2	  exposure)	  up	  until	  1	  week	  before	  seawater	  transfer	  (week	  10	  of	  CO2	  exposure)	  at	  different	  pCO2	  tensions……………………………………………………….43	  	  Figure	  2.6	   Pink	  salmon	  yolk	  wet	  mass	  at	  week	  10	  (1	  week	  before	  seawater	  transfer)……………………………………………………………...44	  	  Figure	  2.7	   Pink	  salmon	  yolk	  dry	  mass	  at	  week	  10	  (1	  week	  before	  seawater	  transfer)……………………………………………………………...45	  	  Figure	  2.8	   Production	  efficiencies	  at	  week	  10	  (1	  week	  before	  seawater	  transfer)…………………………………………………………………..………...46	  	  Figure	  2.9	   Absolute	  growth	  rates	  after	  2	  weeks	  following	  seawater	  transfer	  into	  different	  pCO2	  tensions….....…………………….………47	  	  Figure	  2.10	   Routine	  MO2	  during	  development	  in	  freshwater	  from	  2	  weeks	  pre-­‐hatch	  (time	  0	  of	  CO2	  exposure)	  up	  until	  1	  week	  before	  seawater	  transfer	  (week	  10	  of	  CO2	  exposure)	  at	  different	  pCO2	  tensions…………………………………………………………………………..…48	  	   Figure	  2.11	   Routine	  MO2	  at	  day	  1,	  7	  and	  14	  post-­‐seawater	  transfer	  into	  different	  pCO2	  tensions……………………………………………………….49	   ix 	  Figure	  2.12	   Maximum	  MO2	  at	  day	  1,	  7	  and	  14	  post-­‐seawater	  transfer	  into	  different	  pCO2	  tensions……………………………………………………….50	  	  Figure	  2.13	   Aerobic	  scope	  at	  day	  1,	  7	  and	  14	  post-­‐seawater	  transfer	  into	  different	  pCO2	  tensions……………………………………………………….51	  	  Figure	  2.14	   Routine	  and	  maximum	  MO2	  during	  development	  in	  freshwater	  and	  following	  seawater	  transfer	  at	  control	  (400→400	  μatm)	  or	  high	  CO2	  (2000→1600	  μatm)………………………………………………52	  	  Figure	  2.15	   Aerobic	  scope	  3	  weeks	  before	  and	  3	  weeks	  following	  seawater	  transfer	  at	  control	  (400→400	  μatm)	  or	  high	  CO2	  (2000→1600	  μatm)…………………………………………………………………………………53	  	  Figure	  2.16	   Factorial	  scope	  3	  weeks	  before	  and	  3	  weeks	  following	  seawater	  transfer	  at	  control	  (400→400	  μatm)	  or	  high	  CO2	  (2000→1600	  μatm)…………………………………………………………………………………54	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   x List	  of	  abbreviations	  	  AT	   	   Total	  alkalinity	  DIC	   	   Dissolved	  inorganic	  carbon	  E	   	   Energy	  allocated	  for	  excretion	  IPCC	   	   Intergovernmental	  panel	  on	  climate	  change	  MO2  Oxygen consumption rate  MO2max Maximum oxygen consumption rate  MO2routine Routine oxygen consumption rate  MRC	   	   Mitochondria-­‐rich	  cells	  NKA	   	   Na+/K+	  ATPase	  OA	   	   Ocean	  acidification	  P	   	   Energy	  allocated	  for	  growth	  pCO2	   	   Partial	  pressure	  of	  CO2	  pHe	   	   extracellular	  pH	  pHi	   	   intracellular	  pH	  R	   	   Respiration/metabolism	  Ra	   	   Respiration	  for	  activity	  Rg	   	   Respiration	  for	  growth	  Rm	   	   Respiration	  for	  maintenance	  SRM	   	   Seawater	  reference	  materials	  Ucrit	   	   Critical	  swimming	  speed	  wtm	   	   wet	  mass	   xi YSA	   	   Yolk	  sac	  absorption	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   xii Acknowledgements	  	   First	  and	  foremost,	  I	  wish	  to	  thank	  my	  awesome	  supervisor,	  Dr.	  Colin	  Brauner,	  for	  his	  support	  and	  mentorship	  during	  my	  time	  here	  at	  the	  University.	  Colin,	  I	  thank	  you	  for	  your	  encouragement,	  your	  words	  of	  wisdom	  and	  your	  willingness	  and	  trust	  in	  allowing	  me	  to	  pursue	  my	  own	  research	  interests	  and	  goals.	  	  	   To	  my	  fellow	  Braunerites	  (past	  and	  present),	  Emily	  Lyall,	  Katelyn	  Tovey,	  Emily	  Gallagher,	  Mike	  Sackville,	  Till	  Harter,	  Jonathon	  Wong,	  Phil	  Morrison,	  Ryan	  Shartau,	  Tara	  McBryan	  and	  Josh	  Emerman,	  thank	  you	  for	  all	  your	  help	  and	  support.	  I	  couldn’t	  have	  done	  it	  without	  you	  lot.	  You	  guys	  were	  there	  through	  the	  good	  and	  the	  bad,	  making	  even	  the	  most	  stressful	  times	  fun	  and	  enjoyable	  (the	  occasional	  drink	  definitely	  helped).	  	  	   My	  experience	  in	  the	  Zoology	  department	  has	  been	  nothing	  short	  of	  awesome.	  I	  have	  had	  the	  pleasure	  of	  getting	  to	  know	  numerous	  wonderful	  individuals,	  many	  of	  whom	  I	  consider	  good	  friends.	  Special	  thanks	  to	  Pat	  Tamkee	  for	  your	  fish	  expertise,	  for	  the	  many	  hours	  you	  have	  spent	  helping	  me	  with	  my	  project,	  and	  most	  importantly,	  for	  your	  kindness	  and	  friendship.	  To	  Ann	  Daziel,	  Tim	  Healy,	  Milica	  Mandic	  and	  Georgie	  Cox,	  thanks	  for	  being	  great	  mentors	  and	  allowing	  me	  to	  harass	  you	  with	  my	  many	  science	  questions.	  I	  also	  want	  to	  thank	  my	  committee	  members,	  Trish	  Schulte	  and	  Bill	  Milsom,	  for	  their	  guidance	  and	  kind	  words	  of	  encouragement	  throughout	  my	  degree.	  To	  all	  the	  “Comphy”	  peeps,	  I	  will	  cherish	  all	  the	  fun	  and	  ridiculous	  memories	  we	  have	  shared.	  It	  has	  been	  a	  blast.	  	  	  	   Finally,	  I	  wish	  to	  thank	  Geoff	  for	  his	  patience	  and	  support,	  and	  for	  always	  being	  there	  for	  me.	  Words	  cannot	  express	  how	  grateful	  I	  am	  to	  have	  you	  in	  my	  life.	  	   xiii 	   	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   For	  Duffy	  Fonan	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   1 [1]	  General	  introduction	  	   	  	  General	  overview	  As	  a	  result	  of	  increasing	  aerial	  CO2	  emissions,	  the	  partial	  pressure	  of	  CO2	  (pCO2)	  in	  the	  oceans	  is	  rising,	  causing	  a	  decrease	  in	  pH	  and	  carbonate	  ion	  concentrations	  (Calderia	  and	  Wickett,	  2003).	  Little	  is	  known	  about	  the	  potential	  impacts	  of	  oceanic	  acidification	  (OA)	  on	  fish,	  especially	  at	  early	  life-­‐stages.	  In	  addition,	  virtually	  no	  work	  has	  investigated	  the	  effect	  of	  climate	  change-­‐related	  acidification	  in	  freshwater	  systems	  and	  the	  effect	  of	  oscillating	  pCO2	  tensions	  on	  fish.	  This	  thesis	  aims	  to	  address	  the	  effects	  of	  climate	  change	  relevant	  increases	  in	  pCO2	  on	  the	  energetics	  of	  growth	  and	  development	  in	  the	  early	  life-­‐stages	  of	  pink	  salmon,	  in	  freshwater	  and	  following	  initial	  seawater	  entry.	  By	  using	  environmentally	  realistic	  levels	  of	  CO2	  consistent	  with	  those	  predicted	  by	  climate	  change	  models	  and	  those	  already	  occurring	  in	  coastal	  systems,	  this	  thesis	  will	  shed	  light	  on	  the	  potential	  effects	  of	  climate	  change	  on	  a	  commercially	  and	  ecologically	  valuable	  species.	  The	  remainder	  of	  this	  introduction	  will	  summarize	  the	  current	  knowledge	  of	  ocean	  acidification,	  acid-­‐base	  regulation	  in	  both	  adult	  and	  larval	  fish	  and	  the	  energetics	  of	  development,	  with	  a	  specific	  focus	  on	  salmonid	  species.	  	  	  1.1	  Ocean	  acidification	  Atmospheric	  CO2	  has	  risen	  almost	  40%	  from	  pre-­‐industrial	  levels	  of	  280	  μatm	  to	  current	  levels	  of	  390	  μatm	  (Solomon	  et	  al.,	  2007),	  and	  continues	  to	  increase	  at	  unprecedented	  rates.	  The	  increase	  in	  atmospheric	  CO2	  levels	  is	  buffered	  by	  the	   2 oceanic	  uptake	  of	  CO2	  (Sabine	  and	  Feely,	  2007)	  and	  as	  a	  consequence,	  pCO2	  in	  the	  oceans	  is	  rising,	  causing	  a	  decrease	  in	  pH	  and	  carbonate	  ion	  (CO32-­‐)	  concentrations.	  	  This	  is	  known	  as	  ocean	  acidification.	  Atmospheric	  CO2	  is	  expected	  to	  rise	  above	  800-­‐1000	  μatm	  in	  the	  next	  100	  years	  (IPCC,	  Solomon	  et	  al.,	  2007),	  which	  has	  been	  predicted	  to	  reduce	  ocean	  pH	  by	  0.3-­‐0.4	  units	  (Calderia	  and	  Wickett,	  2005).	  By	  2300,	  predicted	  values	  of	  1600	  μatm	  will	  cause	  a	  corresponding	  0.6-­‐0.8	  unit	  decrease	  in	  ocean	  pH	  (IPCC,	  Solomon	  et	  al.,	  2007).	  	  Although	  numerous	  models	  for	  predicting	  future	  CO2	  scenarios	  exist	  (Calderia	  and	  Wickett,	  2005;	  Wotton	  et	  al.,	  2008),	  there	  are	  few	  large-­‐scale	  measurements	  and	  long-­‐term	  historical	  records	  of	  oceanic	  pH	  and	  pCO2,	  especially	  on	  the	  West	  Coast	  of	  British	  Columbia.	  Based	  on	  one	  of	  the	  first	  basin-­‐wide	  studies	  of	  pH	  in	  the	  North	  Pacific,	  there	  appears	  to	  be	  significant	  variation	  in	  pH	  within	  the	  water	  column,	  with	  the	  largest	  changes	  in	  pH	  occurring	  in	  the	  first	  500	  m	  of	  the	  ocean	  (Byrne	  et	  al.,	  2010).	  This,	  in	  addition	  to	  seasonal	  upwelling	  of	  acidic	  water	  from	  the	  deep	  (Feely	  et	  al.,	  2008),	  and	  the	  continued	  rise	  in	  atmospheric	  CO2	  may	  contribute	  to	  large	  temporal	  fluctuations	  in	  ocean	  pH.	  Through	  recent	  modeling,	  Melzner	  et	  al.	  (2013)	  showed	  that	  OA	  could	  be	  further	  compounded	  by	  seasonal	  hypoxia	  in	  coastal	  habitats.	  In	  combination	  with	  acidic	  upwelling,	  seasonal	  hypoxia	  may	  result	  in	  peak	  pCO2	  values	  of	  1700-­‐3200	  μatm	  under	  current	  conditions	  (Melzner	  et	  al.,	  2013).	  More	  recently,	  work	  characterizing	  the	  variability	  of	  dissolved	  oxygen	  and	  pH	  on	  the	  California	  coast	  estimated	  that	  pCO2	  could	  peak	  as	  high	  as	  1016	  μatm	  at	  depths	  of	  17	  m	  and	  persist	  for	  5-­‐7	  days	  (Frieder	  et	  al.,	  2012).	  Similar	  fluctuations	  from	  200-­‐1000	  μatm	  have	  also	  been	  recorded	  at	  surface	  waters	   3 on	  the	  Oregon	  shelf	  (Evans	  et	  al.,	  2011),	  suggesting	  that	  the	  West	  Coast	  of	  British	  Columbia	  may	  also	  be	  subjected	  to	  comparable	  fluctuations.	  In	  Puget	  Sound,	  a	  large	  estuary	  on	  the	  West	  Coast	  of	  North	  America,	  carbonate	  chemistry	  data	  indicate	  that	  pCO2	  values	  may	  exceed	  2500	  μatm	  during	  autumn	  near	  surface	  waters	  (Reum	  et	  al.,	  2014).	  Furthermore,	  records	  of	  pH	  in	  the	  Strait	  of	  Georgia	  from	  the	  year	  2001	  and	  onward	  show	  that	  pH	  can	  periodically	  drop	  as	  low	  as	  7.5	  (Marliave	  et	  al.,	  2011).	  Taken	  together,	  it	  is	  possible	  that	  our	  coastal	  communities	  along	  the	  West	  Coast	  of	  British	  Columbia	  are	  already	  experiencing	  projected	  end-­‐of-­‐century	  levels	  of	  pCO2.	  	  Natural	  variations	  in	  pCO2	  are	  quite	  prevalent	  in	  coastal	  ecosystems	  (Frieder	  et	  al.,	  2012;	  Evans	  et	  al.,	  2011;	  Reum	  et	  al.,	  2014);	  however,	  the	  majority	  of	  research	  investigating	  the	  effects	  of	  OA	  on	  marine	  organisms	  has	  been	  conducted	  under	  constant	  pCO2	  tensions	  projected	  by	  the	  IPCC.	  These	  elevated	  levels	  only	  represent	  average	  global	  conditions	  and	  do	  not	  necessarily	  take	  into	  account	  local	  conditions,	  making	  it	  difficult	  to	  infer	  how	  species	  and	  communities	  will	  respond	  to	  climate	  change	  (Reum	  et	  al.,	  2014).	  Given	  that	  temporal	  pCO2	  fluctuations	  normally	  occur	  in	  our	  oceans,	  studies	  considering	  these	  more	  realistic	  conditions	  should	  be	  explored.	  	  	  Although	  the	  negative	  effects	  of	  OA	  have	  been	  well	  documented	  in	  various	  marine	  invertebrates	  (Kurihara,	  2008;	  Raven	  et	  al.,	  2005;	  Doney	  et	  al.,	  2009	  for	  a	  review),	  fish	  were	  generally	  thought	  to	  be	  unaffected	  by	  these	  changes	  (Doney	  et	  al.,	  2009).	  However,	  a	  growing	  body	  of	  work	  has	  shown	  a	  range	  of	  sublethal	  effects	  of	  OA	  on	  a	  variety	  of	  fish	  species.	  Effects	  include	  changes	  in	  olfactory	  responses	  to	  predator,	  prey	  and	  substrate	  cues	  (Dixson	  et	  al.,	  2010;	  Cripps	  et	  al.,	  2011;	  Munday	  et	  al.,	  2009),	  interference	  with	  neurotransmitter	  function	  (Nilsson	  et	  al.,	  2012),	   4 alterations	  in	  behavioral	  lateralization	  (Jutfelt	  et	  al.,	  2013),	  heightened	  anxiety	  (Hamilton	  et	  al.,	  2014),	  and	  higher	  otolith	  growth	  rates	  (Checkley	  et	  al.,	  2009;	  Bignami	  et	  al.,	  2013).	  	  Despite	  comprising	  only	  0.8%	  of	  the	  Earth’s	  surface,	  freshwater	  ecosystems	  support	  over	  10,000	  fish	  species,	  representing	  approximately	  40%	  of	  total	  fish	  diversity	  (Lundberg	  et	  al.,	  2000).	  	  Yet,	  little	  is	  known	  about	  the	  effects	  of	  climate	  change-­‐related	  acidification	  in	  these	  systems.	  Streams	  and	  rivers	  have	  the	  same	  potential	  for	  atmospheric	  CO2	  uptake	  and	  thus	  similar	  scenarios	  of	  acidification	  will	  occur	  in	  freshwater.	  However,	  the	  majority	  of	  freshwater	  research	  investigating	  the	  physiological	  effects	  of	  CO2-­‐mediated	  acidification	  in	  fish	  was	  originally	  geared	  towards	  understanding	  the	  mechanisms	  associated	  with	  acid-­‐base	  regulation,	  which	  involved	  pCO2	  values	  that	  far	  exceed	  levels	  relevant	  to	  climate	  change	  (ie.	  10,000	  μatm	  and	  greater;	  Ishimatsu	  et	  al.,	  2005).	  Since	  freshwater	  and	  seawater	  differ	  greatly	  in	  ion	  composition,	  which	  can	  have	  large	  effects	  on	  buffering	  capacity,	  osmotic	  balance	  and	  various	  other	  physiological	  processes	  in	  fish	  (Evans	  et	  al.,	  2005),	  the	  physiological	  impacts	  of	  climate	  change-­‐related	  acidification	  in	  freshwater	  might	  be	  quite	  different	  from	  those	  in	  seawater.	  Compared	  to	  seawater,	  freshwater	  buffer	  values	  are	  generally	  lower	  (Perry,	  1982),	  and	  as	  a	  result,	  larger	  pH	  changes	  would	  occur	  in	  freshwater	  for	  a	  given	  pCO2	  tension.	  Furthermore,	  compensation	  for	  an	  acid-­‐base	  disturbance	  tends	  to	  occur	  faster	  and	  to	  a	  greater	  degree	  in	  seawater,	  as	  opposed	  to	  freshwater	  (Iwama	  and	  Heisler,	  1991).	  This,	  along	  with	  larger	  pH	  changes	  at	  a	  given	  pCO2	  tension,	  may	  make	  compensation	  during	  an	   5 acid-­‐base	  disturbance	  in	  freshwater	  more	  challenging;	  however,	  this	  has	  not	  previously	  been	  investigated	  and	  is	  a	  focus	  of	  my	  thesis.	  	  1.2	  Acid-­‐base	  regulation	  in	  teleost	  fish	  	   In	  most	  vertebrates,	  acid-­‐base	  regulation	  is	  essential	  for	  life	  and	  its	  processes.	  Changes	  in	  intracellular	  and	  extracellular	  pH	  affect	  physiological	  processes,	  such	  as	  cell	  signaling,	  gene	  expression,	  muscle	  contraction,	  regulation	  of	  cell-­‐volume	  and	  metabolism	  by	  altering	  the	  charges	  and	  molecular	  shapes	  of	  proteins	  (Putnam	  and	  Roos,	  1997).	  Although	  the	  relative	  ability	  for	  pH	  regulation	  differs	  among	  species,	  most	  teleosts	  respond	  to	  hypercarbia	  (exposure	  to	  elevated	  environmental	  CO2)	  in	  a	  general	  way.	  During	  hypercarbia,	  CO2	  from	  the	  water	  readily	  diffuses	  across	  the	  gills	  and	  equilibrates	  with	  arterial	  blood	  (reviewed	  by	  Brauner	  and	  Baker,	  2009).	  This	  results	  in	  a	  corresponding	  drop	  in	  extracellular	  and	  intracellular	  pH	  (pHe	  and	  pHi,	  respectively),	  referred	  to	  as	  a	  respiratory	  acidosis	  (Brauner	  and	  Baker,	  2009).	  Fish	  are	  able	  to	  compensate	  in	  three	  ways:	  1)	  physiochemical	  buffering	  with	  bicarbonate	  (HCO3-­‐)	  and	  non-­‐bicarbonate	  buffers,	  2)	  net	  transport	  of	  acid-­‐base	  related	  ions	  between	  the	  animal	  and	  the	  surrounding	  water,	  and	  3)	  alteration	  of	  ventilation	  to	  change	  pCO2	  (Evans	  et	  al.,	  2005).	  Unlike	  terrestrial	  vertebrates,	  fish	  mainly	  utilize	  the	  first	  two	  compensatory	  mechanisms	  noted	  above	  (Evans	  et	  al.,	  2005).	  In	  general,	  90%	  of	  net	  acid-­‐base	  transport	  is	  thought	  to	  occur	  at	  the	  gill,	  with	  the	  kidney	  and	  intestine	  playing	  minor	  roles	  (Heisler	  1984;	  1993;	  Evans	  et	  al.	  2005).	  When	  exposed	  to	  elevated	  water	  pCO2,	  adult	  and	  juvenile	  fish	  are	  able	  to	  compensate	  for	  reductions	  in	  blood	  pH	  through	  increases	  in	  plasma	  HCO3-­‐	  (Evans	  et	   6 al.,	  2005).	  This	  net	  increase	  in	  plasma	  HCO3-­‐	  is	  matched	  by	  an	  equivalent	  net	  decrease	  in	  plasma	  Cl¯ˉ	  implicating	  that	  net	  HCO3¯ˉ/Cl¯ˉ	  exchange	  at	  the	  gills	  may	  be	  involved	  (Toews	  et	  al.,	  1983;	  Cameron	  and	  Iwama,	  1989;	  Larsen	  and	  Jensen,	  1997).	  Following	  a	  respiratory	  acidosis	  in	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss),	  recovery	  of	  pHe	  is	  accompanied	  by	  net	  branchial	  HCO3¯ˉ/Cl¯ˉ	  exchange	  (Larsen	  and	  Jensen,	  1997).	  Generally,	  fish	  tend	  to	  fully	  compensate	  for	  acid-­‐base	  disturbances	  faster	  and	  to	  a	  greater	  degree	  in	  seawater,	  as	  opposed	  to	  freshwater	  (Iwama	  and	  Heisler,	  1991).	  The	  lower	  ion	  composition	  in	  freshwater	  may	  result	  in	  lower	  HCO3¯ˉ	  availability,	  which	  is	  essential	  in	  buffering	  changes	  in	  blood	  pH	  (Brauner	  and	  Baker,	  2009).	  Water	  hardness	  also	  plays	  a	  role,	  with	  faster	  and	  more	  complete	  compensation	  occurring	  in	  hard	  water	  (higher	  [Ca2+])	  (Larsen	  and	  Jensen,	  1997).	  The	  main	  site	  for	  acid-­‐base	  transport	  is	  thought	  to	  be	  in	  mitochondrion-­‐rich	  cells	  (MRC)	  of	  the	  gills	  in	  both	  freshwater	  and	  marine	  fish	  (Evans	  et	  al.,	  2005;	  Brauner,	  2008).	  H+	  secretion	  via	  apical	  V-­‐type	  ATPases	  is	  proposed	  to	  be	  the	  dominant	  mechanism	  for	  acid	  excretion	  in	  freshwater	  teleosts,	  while	  NHEs	  are	  proposed	  to	  primarily	  carry	  out	  this	  function	  in	  marine	  teleosts	  (Claiborne	  et	  al.,	  2002;	  Evans	  et	  al.,	  2005).	  Base	  excretion	  in	  both	  freshwater	  and	  marine	  teleosts	  is	  thought	  to	  occur	  via	  an	  apical	  Cl¯ˉ/	  HCO3¯ˉ	  anion	  exchanger	  (Claiborne	  et	  al.,	  2002;	  Evans	  et	  al.,	  2005).	  Although	  numerous	  studies	  have	  investigated	  the	  role	  of	  different	  transporters	  in	  various	  species	  of	  fish,	  at	  this	  time	  the	  exact	  molecular	  mechanisms	  and	  transporters	  involved	  in	  acid-­‐base	  compensation	  have	  yet	  to	  be	  elucidated	  (Evans	  et	  al.,	  2005;	  Perry	  and	  Gilmour,	  2006;	  Brauner	  and	  Baker,	  2009).	  	  	   7 1.3	  Acid-­‐base	  regulation	  in	  larval	  fish	  The	  majority	  of	  our	  knowledge	  of	  acid-­‐base	  regulation	  is	  based	  on	  adult	  and	  juvenile	  fish,	  while	  little	  is	  known	  about	  this	  process	  in	  developing	  fish	  (Brauner,	  2008).	  During	  short-­‐term	  exposure	  to	  hypercarbia	  (10,000	  μatm),	  zebrafish	  (Danio	  rerio)	  embryos	  are	  able	  to	  compensate	  for	  pH	  within	  a	  couple	  of	  hours	  (Molich	  and	  Heisler,	  2005).	  This	  recovery	  is	  associated	  with	  a	  net	  increase	  in	  HCO3¯ˉ	  in	  both	  the	  intracellular	  and	  extracellular	  compartments	  (Molich	  and	  Heisler,	  2005).	  Embryonic	  and	  larval	  fish	  do	  appear	  to	  have	  acid-­‐base	  regulatory	  ability	  but	  nothing	  is	  known	  about	  the	  associated	  mechanisms	  (Brauner,	  2008).	  The	  molecular	  mechanisms	  of	  acid-­‐base	  regulation	  and	  osmoregulation	  are	  tightly	  linked,	  since	  these	  processes	  utilize	  similar	  transporters	  and	  enzymes	  in	  MRCs.	  Most	  of	  the	  work	  on	  larval	  MRCs	  relates	  to	  osmoregulation	  (Brauner,	  2008).	  In	  chum	  salmon,	  before	  the	  gills	  become	  functional,	  a	  large	  number	  of	  MRCs	  are	  found	  on	  the	  yolk	  sac	  epithelium	  (Kaneko	  et	  al.,	  1995)	  and	  appear	  to	  function	  much	  like	  the	  MRCs	  in	  the	  developed	  gill	  (Kaneko	  et	  al.,	  2002).	  In	  addition	  to	  the	  yolk	  sac,	  MRCs	  are	  also	  found	  in	  the	  skin	  of	  embryos	  and	  larvae	  of	  various	  fish	  species	  (Shen	  and	  Leatherland,	  1978;	  Hwang,	  1989).	  Following	  hatch,	  active	  uptake	  of	  Na+	  increases	  exponentially	  in	  salmonid	  embryos	  (Brauner	  &	  Wood	  2002).	  However,	  this	  is	  not	  the	  case	  for	  Cl¯ˉ	  uptake,	  which	  remains	  low	  and	  stays	  constant	  from	  hatch	  through	  emergence	  (Misiaszek,	  1996).	  This	  suggests	  that	  a	  compensatory	  mechanism	  other	  than	  net	  HCO3¯ˉ/Cl¯ˉ	  exchange	  may	  be	  present	  in	  larval	  fish.	  At	  this	  stage,	  acid-­‐base	  compensation	  may	  primarily	  be	  associated	  with	  Na+/H+	  exchange	  (Brauner,	  2008).	   8 1.4	  The	  energetics	  of	  growth	  in	  developing	  fish	  	   Unlike	  adults	  and	  juveniles,	  developing	  fish	  have	  very	  different	  metabolic	  constraints	  placed	  upon	  them,	  and	  as	  a	  result,	  are	  under	  tight	  energy	  budgets,	  which	  has	  profound	  effects	  on	  their	  physiology.	  Most	  species	  of	  fish	  lay	  cleidoic	  eggs,	  which	  allow	  water,	  gases,	  and	  waste	  products	  to	  be	  exchanged	  with	  the	  environment	  while	  retaining	  the	  nutrients	  contained	  within	  (Rombough,	  2011).	  Larval	  fish	  that	  feed	  endogenously,	  such	  as	  salmonids,	  rely	  primarily	  on	  resources	  in	  the	  yolk	  sac	  (Kunz,	  2004).	  The	  yolk	  contains	  proteins	  and	  free	  amino	  acids	  for	  building	  new	  tissue,	  lipids	  as	  the	  main	  fuel	  for	  metabolism,	  and	  some	  carbohydrates	  (Rombough,	  2011).	  Given	  that	  energy	  budgets	  balance,	  the	  total	  amount	  of	  available	  yolk	  resources	  (Y)	  is	  equal	  to	  the	  sum	  of	  the	  building	  materials	  required	  for	  the	  production	  of	  new	  tissue	  (P),	  and	  the	  energy	  allocated	  for	  metabolism/respiration	  (R),	  and	  excretion	  (E)	  (Rombough,	  2011).	  R	  can	  be	  subdivided	  into	  respiration	  for	  growth	  (Rg),	  respiration	  for	  maintenance	  of	  homeostasis	  (Rm)	  and	  respiration	  for	  activity	  (Ra)	  (Rombough,	  2011).	  Any	  increases	  in	  Rm	  for	  maintenance	  activities,	  such	  as	  acid-­‐base	  regulation,	  will	  ultimately	  reduce	  the	  energy	  available	  for	  growth	  (Rg).	  	   Developing	  fish	  have	  extremely	  high	  growth	  rates	  compared	  to	  mature	  fish	  with	  values	  exceeding	  150%/day	  (Conceição	  et	  al.,	  1997;	  Smith	  and	  Ottema,	  2006).	  Moreover,	  they	  have	  high	  production	  efficiencies	  (calculated	  as	  tissue	  production	  divided	  by	  yolk	  assimilation)	  that	  exceed	  85%	  (Rombough,	  1998;	  Yufera	  et	  al.,	  1999),	  This	  may	  be	  possible	  given	  that	  tissue	  maintenance	  during	  the	  early	  stages	  of	  development	  is	  low	  (Rombough,	  2011),	  and	  that	  there	  appear	  to	  be	  maternal	  stocks	  of	  mRNA,	  organic	  molecules	  and	  growth	  factors	  in	  the	  yolk	  (Finn	  and	  Fyhn,	  2010).	   9 Approximately	  80%	  of	  the	  yolk	  is	  thought	  to	  go	  towards	  growth,	  of	  which	  60%	  goes	  towards	  tissue	  production	  and	  the	  other	  20%	  towards	  the	  energy	  needed	  to	  build	  tissue	  (Rombough,	  2011).	  Of	  the	  remaining	  20%,	  5%	  is	  lost	  to	  metabolic	  waste,	  leaving	  only	  15%	  for	  non-­‐growth	  related	  activities,	  such	  as	  movement,	  stress	  responses	  and	  maintenance	  activities,	  such	  as	  acid-­‐base	  regulation	  and	  osmoregulation	  (Rombough,	  2011).	  	  In	  developing	  fish,	  the	  excess	  energy	  for	  non-­‐growth	  related	  activities	  could	  be	  quantified	  as	  aerobic	  scope.	  Aerobic	  scope	  is	  the	  difference	  between	  resting	  and	  maximal	  oxygen	  consumption	  (MO2),	  and	  in	  adult	  fish,	  represents	  the	  available	  energy	  left	  over	  for	  processes	  such	  as	  reproduction	  and	  exercise	  (Fry,	  1947;	  Farrell,	  2009).	  Since	  the	  capacity	  for	  exercise	  is	  crucial	  for	  evading	  predators,	  prey	  capture	  and	  thus	  survival,	  aerobic	  scope	  is	  commonly	  used	  as	  a	  performance	  indicator	  (eg.	  Eliason	  et	  al.	  2011).	  In	  addition,	  exercise	  pushes	  cellular,	  respiratory,	  and	  cardiovascular	  systems	  to	  their	  limit,	  revealing	  physiological	  limitations	  in	  the	  form	  of	  ionic	  perturbations	  and	  premature	  fatigue	  (Randall	  and	  Brauner,	  1991).	  Therefore,	  aerobic	  scope	  may	  be	  correlated	  to	  an	  individual’s	  ecological	  fitness	  (Plaut,	  2001;	  Nendick	  et	  al.,	  2011).	  	  As	  a	  result	  of	  high	  routine	  metabolic	  rates	  and	  a	  limited	  ability	  to	  increase	  aerobic	  metabolism	  above	  routine	  levels,	  larval	  fish	  have	  small	  aerobic	  scopes	  (Rombough,	  1988;	  Killen	  et	  al.,	  2007).	  Since	  larger	  hatchlings	  are	  subject	  to	  lower	  predation	  rates	  (Hendry	  et	  al.,	  2001;	  Pepin,	  1991),	  rapid	  and	  efficient	  growth	  tends	  to	  be	  selected	  for	  (Rombough,	  2011).	  This,	  however,	  leaves	  little	  energy	  available	  for	  other	  activities.	  Rainbow	  trout	  alevin	  have	  limited	  ability	  to	  increase	  their	   10 metabolism	  above	  routine	  levels	  during	  high	  bouts	  of	  activity	  (Ninness	  et	  al.,	  2006).	  Conversely,	  adults	  and	  juveniles	  can	  increase	  their	  metabolism	  in	  an	  additive	  way,	  such	  that	  the	  metabolic	  demands	  of	  increased	  activity	  are	  matched	  by	  increases	  in	  metabolism	  (Wieser,	  1989).	  Unlike	  mature	  fish,	  larvae	  have	  limited	  ability	  to	  increase	  their	  metabolism	  as	  activity	  increases,	  suggesting	  that	  they	  follow	  a	  compensatory	  partitioning	  model,	  whereby	  energy	  from	  elsewhere,	  such	  as	  growth,	  is	  diverted	  to	  heightened	  activity	  (Rombough,	  2011).	  	  If	  environmental	  stress,	  such	  as	  OA,	  increases	  the	  energy	  expenditure	  for	  acid-­‐base	  regulation,	  then	  growth	  would	  likely	  be	  compromised.	  For	  example,	  initial	  exposure	  to	  elevated	  CO2	  reduces	  aerobic	  scope	  in	  adult	  sturgeon,	  suggesting	  that	  pH	  compensation	  may	  be	  metabolically	  costly	  (Baker	  and	  Brauner,	  2012).	  Given	  this,	  the	  potential	  effects	  of	  long-­‐term	  hypercarbia	  on	  growth	  and	  development	  may	  be	  great.	  	  1.5	  The	  early	  life	  stages	  of	  salmonids	  	   Salmon	  have	  a	  unique	  life	  history,	  making	  them	  an	  excellent	  model	  to	  study	  the	  effects	  of	  environmental	  stressors,	  such	  as	  climate	  change,	  on	  an	  anadromous	  species.	  Salmonid	  eggs	  are	  deposited	  in	  gravel	  redds	  of	  freshwater	  streambeds,	  where	  they	  are	  then	  fertilized	  (Kunz,	  2004).	  At	  hatch,	  the	  fish	  are	  referred	  to	  as	  alevin,	  and	  remain	  in	  the	  gravel,	  feeding	  endogenously	  on	  their	  yolk	  sac	  (Jobling,	  1995;	  Kunz,	  2004).	  Near	  the	  end	  of	  yolk	  sac	  absorption,	  the	  fish	  emerge	  from	  the	  gravel	  as	  fry.	  Anadromous	  salmonids,	  including	  most	  species	  of	  salmon,	  will	  eventually	  head	  out	  to	  sea	  where	  they	  spend	  the	  majority	  of	  their	  juvenile	  and	  adult	   11 lives	  before	  returning	  to	  their	  native	  streams	  to	  spawn	  (Stefansson	  et	  al.,	  2008).	  The	  duration	  of	  freshwater	  residency	  prior	  to	  their	  seaward	  migration	  varies	  among	  species.	  Some	  salmon	  may	  reside	  in	  streams	  for	  a	  year	  or	  more,	  whereas	  others,	  such	  as	  pink	  salmon,	  migrate	  to	  sea	  soon	  after	  emergence	  (Stefansson	  et	  al.	  2008).	  	   Prior	  to	  migration,	  salmonids	  undergo	  smoltification.	  Smoltification	  is	  an	  environmentally	  elicited	  process	  that	  involves	  major	  changes	  in	  the	  physiology,	  morphology,	  and	  behavior	  of	  a	  fish	  in	  preparation	  for	  seawater	  entry	  (reviewed	  in	  Stefansson	  et	  al.,	  2008).	  These	  changes	  transform	  a	  fish	  from	  its	  freshwater-­‐adapted	  form	  to	  its	  seawater-­‐adapted	  form	  while	  it	  is	  still	  in	  freshwater	  (Stefansson	  et	  al.,	  2008).	  Modifications	  include	  changes	  in	  osmoregulation,	  body	  shape	  and	  coloring,	  metabolism,	  growth,	  rheotaxis,	  buoyancy,	  and	  schooling	  behavior	  (Stefansson	  et	  al.,	  2008).	  Since	  these	  alterations	  are	  suited	  for	  a	  marine	  existence	  and	  not	  a	  freshwater	  one,	  a	  window	  of	  salinity	  tolerance,	  termed	  the	  “smolt-­‐window”,	  may	  exist	  whereby,	  following	  seawater	  entry,	  smolts	  can	  quickly	  acclimate	  to	  the	  changing	  salinity	  with	  minor	  detriments	  to	  survival	  (Stefansson	  et	  al.,	  2008;	  Gallagher	  et	  al.,	  2012).	  	  Among	  this	  host	  of	  changes,	  acquiring	  the	  ability	  for	  hypo-­‐osmoregulation	  is	  arguably	  most	  essential	  for	  the	  transition	  from	  freshwater	  to	  seawater.	  	  Compared	  to	  smolts,	  parr	  have	  relatively	  poor	  seawater	  tolerance	  and	  exhibit	  increased	  mortality,	  higher	  ionic	  disturbances,	  and	  stunted	  growth	  during	  direct	  transfer	  to	  seawater	  (McCormick	  et	  al.,	  1987;	  Stefansson	  et	  al.,	  1991;	  2007).	  The	  biochemical	  and	  cellular	  basis	  for	  salinity	  tolerance	  can	  be	  linked	  to	  changes	  in	  the	  expression	  patterns,	  protein	  levels,	  and	  activity	  of	  relevant	  transport	  proteins,	  along	  with	  increases	  in	  the	  number	  and	  size	  of	  MRCs	  in	  which	  these	  proteins	  are	  located	   12 (reviewed	  in	  Stefansson	  et	  al.,	  2008).	  Given	  the	  multitude	  of	  physiological	  changes	  required	  for	  smoltification,	  the	  transition	  from	  freshwater	  to	  seawater	  is	  a	  time	  of	  heightened	  mortality	  for	  most	  salmonids	  (Parker,	  1962;	  Durkin,	  1982;	  Healy,	  1982),	  and	  thus	  additional	  stressors,	  such	  as	  OA,	  may	  exacerbate	  the	  challenge	  of	  seawater	  entry.	  	  1.6	  Model	  species:	  pink	  salmon	  (Oncorhynchus	  gorbuscha)	  	   Pink	  salmon	  exhibit	  arguably	  one	  of	  the	  most	  impressive	  and	  extreme	  forms	  of	  anadromy	  in	  the	  family	  Salmonidae.	  Unlike	  other	  salmon,	  pinks	  migrate	  to	  sea	  soon	  after	  gravel	  emergence	  (Heard	  et	  al.,	  1991),	  and	  are	  the	  smallest	  (0.2	  g)	  of	  all	  salmon	  species	  at	  the	  time	  of	  seawater	  entry	  (Heard	  1991;	  Grant	  et	  al.,	  2009).	  In	  addition	  to	  their	  impressive	  life	  history,	  pinks	  also	  have	  great	  ecological	  and	  economic	  value.	  Compared	  to	  other	  Pacific	  salmon,	  they	  are	  the	  most	  abundant	  and	  widely	  distributed	  (Heard	  et	  al.,	  1991).	  Of	  all	  the	  commercially	  caught	  salmon	  in	  British	  Columbia	  and	  Alaska,	  pink	  salmon	  represent	  40%	  by	  weight	  and	  60%	  by	  numbers	  of	  the	  total	  estimate	  (Neave	  et	  al.,	  1967).	  Furthermore,	  their	  sheer	  biomass	  along	  with	  their	  vital	  roles	  in	  both	  marine	  and	  freshwater	  food	  webs	  makes	  pinks	  an	  excellent	  indicator	  of	  ecosystem	  health.	  Therefore,	  using	  pink	  salmon	  as	  a	  model	  species	  may	  shed	  insight	  into	  the	  potential	  effects	  of	  OA	  on	  a	  commercially	  and	  ecologically	  valuable	  species.	  	   Since	  pink	  salmon	  migrate	  to	  sea	  at	  a	  small	  size	  of	  0.2	  g,	  their	  high	  surface	  area-­‐to-­‐volume	  ratios	  may	  make	  them	  more	  vulnerable	  to	  environmental	  stressors,	  such	  as	  sea	  lice	  (Nendick	  et	  al.,	  2011)	  and	  OA.	  Recent	  work	  suggests	  that	  pinks	  do	   13 undergo	  some	  degree	  of	  smoltification	  but	  appear	  to	  enter	  seawater	  somewhat	  precociously	  (Gallagher	  et	  al.,	  2012;	  Grant	  et	  al.,	  2009).	  Prior	  to	  seawater	  entry,	  smolts	  increase	  whole-­‐body	  Na+	  levels	  5-­‐fold	  and	  appear	  to	  have	  a	  window	  of	  salinity	  tolerance	  near	  the	  time	  of	  emergence	  (Gallagher	  et	  al.,	  2012).	  Changes	  in	  the	  relative	  expression	  of	  specific	  isoforms	  of	  Na+/K+	  ATPase	  (NKA)	  have	  been	  used	  as	  indicators	  of	  seawater	  readiness,	  and	  thus	  smoltification	  (Gallagher	  et	  al.,	  2012).	  During	  this	  window	  of	  salinity	  tolerance,	  the	  ratio	  of	  the	  NKA	  seawater	  isoform,	  α1b,	  to	  the	  freshwater	  isoform,	  α1a,	  increases	  in	  pink	  salmon,	  suggesting	  that	  some	  seawater	  preparatory	  mechanisms	  are	  present	  (Gallagher	  et	  al.,	  2012).	  However,	  NKA	  activity	  remains	  relatively	  low	  and	  increases	  following	  seawater	  entry	  (Grant	  et	  al.,	  2009;	  Gallagher	  et	  al.,	  2012).	  Seawater	  entry	  is	  a	  time	  of	  heightened	  mortality	  for	  all	  species	  of	  salmon	  (Parker,	  1962;	  Durkin,	  1982;	  Healy,	  1982).	  Even	  Atlantic	  salmon	  smolts,	  which	  are	  much	  larger	  than	  pinks,	  appear	  to	  be	  more	  sensitive	  to	  additional	  stressors,	  such	  as	  elevated	  CO2,	  when	  held	  in	  freshwater	  (Fivelstad	  et	  al.,	  2003).	  Pink	  salmon	  smolts	  may	  be	  more	  vulnerable	  than	  other	  teleosts	  at	  this	  stage,	  making	  them	  a	  good	  model	  species	  to	  study	  the	  effects	  of	  OA	  on	  a	  critical	  life-­‐stage	  in	  salmonids.	  Furthermore,	  their	  anadromous	  life	  history	  can	  provide	  the	  first	  look	  into	  the	  effects	  of	  climate	  change-­‐related	  acidification	  in	  both	  freshwater	  and	  seawater	  on	  a	  migrating	  species	  of	  fish.	  	  1.7	  Thesis	  objectives	  and	  hypotheses	  The	  general	  objective	  of	  this	  thesis	  is	  to	  determine	  the	  potential	  effects	  of	  climate	  change-­‐related	  acidification	  on	  the	  physiology	  of	  fish	  at	  a	  sensitive	  and	   14 critical	  life-­‐stage	  under	  forecasted	  increases	  in	  pCO2.	  This	  thesis	  incorporates	  a	  novel	  oscillating	  pCO2	  treatment,	  which	  reflects	  naturally	  occurring	  temporal	  fluctuations.	  Specifically,	  I	  assessed	  the	  growth,	  development	  and	  energetics	  of	  pink	  salmon	  during	  their	  early	  life-­‐stages.	  This	  thesis	  consists	  of	  three	  main	  objectives:	  Objective	  1:	  To	  assess	  the	  effects	  of	  freshwater	  and	  marine	  acidification	  on	  the	  growth	  and	  development	  of	  pink	  salmon	  alevin	  and	  fry.	  	  Since	  acid-­‐base	  compensation	  may	  need	  to	  occur	  constantly	  during	  temporal	  fluctuations	  in	  pCO2,	  the	  latter	  may	  be	  more	  metabolically	  costly	  over	  time.	  Therefore,	  I	  hypothesized	  that	  growth	  under	  oscillating	  CO2	  conditions	  would	  decrease	  while	  little	  or	  no	  effect	  on	  growth	  would	  be	  seen	  at	  constantly	  elevated	  conditions.	  Objective	  2:	  To	  assess	  the	  metabolic	  cost	  of	  development	  under	  future	  elevated	  and	  fluctuating	  pCO2	  tensions.	  	  Metabolic	  costs	  were	  assessed	  by	  measuring	  routine	  oxygen	  consumption	  (MO2routine)	  and	  production	  efficiencies	  under	  the	  different	  CO2	  scenarios	  at	  various	  time	  points	  during	  development.	  Larval	  fish	  are	  under	  tight	  energy	  constraints	  and	  have	  lower	  aerobic	  scope	  than	  adults	  (Rombough,	  2011);	  therefore,	  the	  extra	  energy	  needed	  for	  acid-­‐base	  compensation	  during	  hypercarbia	  may	  reduce	  the	  energy	  allotted	  to	  growth.	  I	  hypothesized	  that	  acid-­‐base	  regulation	  would	  be	  metabolically	  costly	  early	  in	  development,	  with	  larger	  consequences	  to	  growth	  under	  fluctuating	  pCO2	  conditions.	  I	  predicted	  that	  routine	  MO2	  would	  increase	  and	  that	  production	  efficiencies	  would	  decrease	  at	  higher	  and	  oscillating	  pCO2	  tensions.	   15 Objective	  3:	  To	  assess	  the	  performance	  capacity	  of	  pink	  salmon	  prior	  to	  and	  following	  seawater	  entry	  under	  future	  elevated	  and	  fluctuating	  pCO2	  tensions.	  	  Aerobic	  scope	  was	  used	  to	  assess	  performance	  capacity.	  Since	  seawater	  entry	  is	  a	  time	  of	  heightened	  stress	  and	  mortality	  for	  salmonids,	  I	  hypothesized	  that	  elevated	  CO2	  levels	  would	  reduce	  aerobic	  scope	  following	  seawater	  transfer.	           	  	  	  	  	  	  	  	  	   16 [2]	  The	  effect	  of	  climate	  change-­‐related	  environmental	  acidification	  on	  the	  growth,	  development	  and	  energetics	  of	  the	  early	  life	  stages	  of	  pink	  salmon	  (Oncorhynchus	  gorbuscha)	  	  2.1	  Introduction	  As	  a	  consequence	  of	  increasing	  atmospheric	  CO2,	  the	  partial	  pressure	  of	  CO2	  in	  the	  oceans	  is	  rising,	  causing	  a	  decrease	  in	  pH	  and	  carbonate	  ions	  (Calderia	  and	  Wickett,	  2003).	  This	  change	  in	  ocean	  chemistry	  resulting	  from	  rising	  atmospheric	  CO2	  is	  known	  as	  ocean	  acidification.	  Atmospheric	  CO2	  has	  risen	  from	  pre-­‐industrial	  levels	  of	  280	  μatm	  to	  current	  levels	  of	  390	  μatm	  (Solomon	  et	  al.,	  2007),	  and	  is	  predicted	  to	  increase	  to	  800-­‐1000	  μatm	  by	  the	  end	  of	  the	  century	  (IPCC,	  Climate	  change,	  2007),	  which	  will	  further	  decrease	  ocean	  pH	  by	  0.3-­‐0.4	  units	  (Calderia	  and	  Wickett,	  2005).	  However,	  many	  coastal	  ecosystems	  are	  already	  routinely	  experiencing	  this	  elevated	  pCO2	  (Feely	  et	  al.,	  2008;	  Cai	  et	  al.,	  2011).	  Upwelling	  of	  acidic	  waters	  from	  the	  deep,	  along	  with	  significant	  pH	  variation	  within	  the	  water	  column,	  may	  contribute	  to	  large	  temporal	  pCO2	  fluctuations	  (Feely	  et	  al.,	  2008;	  Byrne	  et	  al.,	  2010).	  This	  is	  further	  compounded	  by	  the	  higher	  incidence	  of	  hypoxic	  “dead	  zones”	  as	  a	  result	  of	  eutrophication	  (Melzner	  et	  al.,	  2013).	  Given	  current	  conditions,	  seasonal	  hypoxia	  in	  combination	  with	  acidic	  upwelling	  may	  result	  in	  peak	  pCO2	  values	  in	  coastal	  ocean	  areas	  of	  1700-­‐3200	  μatm	  (Melzner	  et	  al.,	  2012).	  Long-­‐term	  records	  of	  pH	  on	  Tatoosh	  Island	  off	  of	  the	  Washington	  coast	  show	  large	  seasonal	  and	  diurnal	  fluctuations	  in	  pH	  (Wotton	  et	  al.,	  2008).	  Recent	  work	  characterizing	  the	  variability	  of	  dissolved	  oxygen	  and	  pH	  on	  the	  California	  coast	   17 estimated	  that	  pCO2	  could	  peak	  as	  high	  as	  1016	  μatm	  at	  depths	  of	  17	  m	  and	  persist	  for	  5-­‐7	  days	  (Frieder	  et	  al.,	  2012).	  Furthermore,	  similar	  fluctuations	  from	  200-­‐1000	  μatm	  have	  been	  recorded	  at	  surface	  waters	  on	  the	  Oregon	  shelf	  (Evans	  et	  al.,	  2011),	  suggesting	  that	  the	  West	  Coast	  of	  North	  America	  is	  presently	  experiencing	  the	  100-­‐year	  predicted	  levels.	  	  To	  date,	  the	  majority	  of	  work	  on	  the	  effect	  of	  OA	  on	  marine	  organisms	  has	  focused	  mainly	  on	  calcifying	  marine	  invertebrates	  and	  phytoplankton	  (Kurihara,	  2008;	  Raven	  et	  al.,	  2005;	  Riebesell	  et	  al.,	  2000),	  and	  until	  recently,	  fish	  were	  generally	  thought	  to	  be	  unaffected	  by	  OA	  (Doney	  et	  al.,	  2009).	  However,	  recent	  work	  indicates	  that	  sub-­‐lethal	  effects	  such	  as	  altered	  olfactory	  responses	  to	  cues	  (Dixson	  et	  al.,	  2010;	  Munday	  et	  al.,	  2010;	  Munday	  et	  al.	  2009;	  Cripps	  et	  al.,	  2011),	  interference	  with	  neurotransmitter	  function	  (Nilsson	  et	  al.,	  2012),	  heightened	  anxiety	  (Hamilton	  et	  al.,	  2014),	  changes	  in	  behavioral	  lateralization	  (Nilsson	  et	  al.,	  2012;	  Jutfelt	  et	  al.,	  2013),	  and	  increased	  otolith	  growth	  rates	  (Checkley	  et	  al.,	  2009;	  Bignami	  et	  al.,	  2013)	  may	  occur	  at	  pCO2	  tensions	  projected	  by	  the	  end	  of	  the	  century.	  Although	  there	  is	  a	  growing	  body	  of	  work	  on	  the	  effects	  of	  OA	  on	  fish,	  no	  work	  has	  investigated	  the	  effect	  of	  fluctuating	  pCO2	  tensions	  on	  fish	  (Reum	  et	  al.,	  2014),	  which	  are	  more	  likely	  to	  reflect	  natural	  conditions.	  Moreover,	  the	  current	  research	  on	  climate	  change-­‐related	  acidification	  has	  been	  on	  marine	  environments;	  virtually	  none	  has	  investigated	  the	  effects	  in	  freshwater	  environments.	  	  As	  with	  the	  marine	  environment,	  streams	  and	  rivers	  will	  equilibrate	  with	  atmospheric	  CO2,	  and	  thus,	  climate	  change	  related	  acidification	  would	  also	  take	  place	  in	  freshwater	  systems.	  Compared	  to	  seawater,	  freshwater	  contains	  a	  lower	  ion	   18 composition	  and	  buffer	  capacity,	  which	  may	  make	  processes	  such	  as	  acid-­‐base	  regulation	  more	  challenging	  (Larsen	  and	  Jensen,	  1997).	  Although	  freshwater	  only	  comprises	  0.8%	  of	  the	  water	  on	  the	  Earth’s	  surface,	  freshwater	  ecosystems	  support	  almost	  6%	  of	  the	  world’s	  biodiversity	  (Dudgeon	  et	  al.,	  2006).	  For	  example,	  freshwater	  ecosystems	  support	  approximately	  40%	  of	  all	  fish	  species	  and	  are	  vital	  nurseries	  for	  anadromous	  fish	  (Lundberg	  et	  al.,	  2000).	  Therefore,	  investigating	  the	  effects	  of	  CO2-­‐mediated	  acidification	  in	  both	  marine	  and	  freshwater	  systems	  may	  provide	  a	  more	  extensive	  and	  global	  insight	  into	  how	  species	  and	  communities	  respond	  to	  climate	  change.	  	   Pink	  salmon	  (Oncorhynchus	  gorbuscha)	  are	  anadromous	  salmonids	  and	  spend	  the	  majority	  of	  their	  juvenile	  and	  adult	  lives	  in	  seawater,	  before	  returning	  to	  their	  freshwater	  natal	  streams	  to	  spawn	  (Stefansson	  et	  al.,	  2008).	  In	  comparison	  to	  all	  other	  Pacific	  salmon,	  they	  are	  the	  most	  abundant	  and	  widely	  distributed,	  making	  them	  an	  excellent	  indicator	  of	  ecosystem	  health	  (Neave	  et	  al.,	  1967).	  Salmon	  are	  often	  considered	  a	  keystone	  species	  in	  marine,	  freshwater	  and	  terrestrial	  ecosystems	  because	  of	  their	  role	  in	  supporting	  food	  webs	  (Wilson	  and	  Halupka,	  1995;	  Quinn,	  2005)	  and	  as	  such,	  may	  help	  link	  distinct	  and	  relatively	  isolated	  systems.	  	  The	  study	  of	  pink	  salmon,	  therefore,	  may	  provide	  insight	  into	  the	  effects	  of	  environmental	  stressors	  in	  multiple	  ecosystems	  and	  the	  interaction	  between	  those	  systems.	  	  Developing	  pink	  salmon	  are	  under	  tight	  energy	  constraints,	  which	  have	  profound	  impacts	  on	  their	  growth	  and	  development	  (Rombough	  2012).	  At	  hatch,	  pink	  salmon	  remain	  in	  the	  gravel	  while	  feeding	  endogenously	  from	  their	  yolk	   19 (Jobling,	  1995;	  Kunz,	  2004).	  During	  this	  early	  life-­‐stage,	  larval	  fish	  have	  exceptionally	  high	  routine	  metabolic	  rates	  with	  little	  ability	  to	  increase	  metabolism	  beyond	  that	  required	  for	  growth	  (Rombough,	  2012;	  Killen	  et	  al.,	  2007).	  	  The	  latter	  is	  often	  quantified	  through	  the	  measurement	  of	  aerobic	  scope,	  which	  is	  calculated	  as	  the	  difference	  between	  routine	  and	  maximum	  oxygen	  consumption	  (MO2).	  Aerobic	  scope	  thus	  represents	  the	  energy	  available	  beyond	  that	  for	  maintenance,	  such	  as	  exercise	  (Fry,	  1947;	  Farrell,	  2009),	  and	  in	  larval	  fishes,	  this	  is	  thought	  to	  be	  quite	  limited	  (Rombough	  2012;	  Killen	  et	  al.,	  2007).	  An	  increase	  in	  water	  pCO2	  (hypercarbia)	  may	  have	  energetic	  costs	  associated	  with	  acid-­‐base	  regulation	  (see	  Chapter	  1),	  and	  thus	  implications	  on	  the	  aerobic	  scope	  of	  larval	  pink	  salmon.	  Since	  compensation	  for	  an	  acid-­‐base	  disturbance	  occurs	  over	  a	  span	  of	  24-­‐96	  h	  in	  fish	  studied	  to	  date	  (reviewed	  in	  Brauner	  and	  Baker,	  2009),	  exposure	  to	  oscillating	  pCO2	  tensions	  may	  be	  even	  more	  energetically	  costly;	  however,	  this	  has	  not	  previously	  been	  investigated	  and	  is	  a	  focus	  of	  this	  thesis.	  Unlike	  most	  other	  anadromous	  salmonids,	  pink	  salmon	  migrate	  to	  sea	  soon	  after	  emergence,	  and,	  at	  0.2	  g,	  are	  the	  smallest	  at	  the	  time	  of	  seawater	  entry	  (Grant	  et	  al.,	  2009;	  Heard	  1991).	  By	  contrast,	  most	  Pacific	  salmon	  reside	  in	  their	  natal	  streams	  for	  up	  to	  a	  year	  or	  more,	  and	  enter	  seawater	  between	  2-­‐30	  g	  (Clarke,	  1982;	  Rounsefell,	  1958).	  Prior	  to	  seawater	  migration,	  many	  salmonids	  undergo	  a	  host	  of	  complex	  physiological,	  morphological,	  and	  behavioral	  changes	  in	  preparation	  for	  the	  transition	  to	  seawater	  known	  as	  smoltification	  (reviewed	  in	  Boeuf,	  1993;	  Folmar	  and	  Dickhoff,	  1980;	  Hoar,	  1976;	  Hoar,	  1988;	  McCormick,	  1994;	  McCormick	  and	  Saunders,	  1987).	  Recent	  work	  suggests	  that	  pinks	  do	  undergo	  some	  degree	  of	   20 smoltification,	  but	  appear	  to	  enter	  seawater	  somewhat	  precociously	  (Gallagher	  et	  al.,	  2012;	  Grant	  et	  al.	  2009).	  Since	  seawater	  entry	  is	  a	  time	  of	  heightened	  mortality	  for	  all	  species	  of	  salmon	  (Parker,	  1962;	  Durkin,	  1982;	  Healy,	  1982),	  their	  small	  size	  and	  high	  surface	  area-­‐to-­‐volume	  ratio	  may	  make	  pink	  salmon	  more	  vulnerable	  to	  environmental	  stressors	  such	  as	  OA.	  At	  this	  stage,	  pink	  salmon	  may	  be	  more	  vulnerable	  than	  other	  salmonids,	  making	  them	  a	  good	  model	  species	  to	  investigate	  the	  effects	  of	  OA	  on	  a	  critical	  life-­‐stage	  in	  fish.	  In	  addition,	  their	  anadromous	  life	  history	  can	  also	  provide	  insight	  into	  the	  effects	  of	  climate	  change-­‐related	  acidification	  in	  both	  freshwater	  and	  marine	  environments.	  	  This	  insight	  may,	  in	  turn,	  facilitate	  the	  creation	  of	  models	  that	  will	  predict	  the	  wider-­‐spread	  impact	  of	  climate	  change	  on	  marine	  and	  freshwater	  communities	  and	  ecosystems.	  This	  thesis	  aims	  to	  address	  some	  of	  the	  current	  knowledge	  gaps	  in	  the	  OA	  literature	  by	  incorporating	  pCO2	  fluctuations	  and	  by	  investigating	  the	  effects	  of	  climate	  change-­‐related	  acidification	  on	  an	  anadromous	  salmonid	  during	  growth	  in	  freshwater	  and	  seawater.	  This	  thesis	  consists	  of	  three	  main	  objectives:	  1)	  To	  assess	  the	  effects	  of	  marine	  and	  freshwater	  acidification	  on	  the	  growth	  and	  development	  of	  pink	  salmon	  from	  hatch	  up	  to	  seawater	  entry,	  2)	  to	  assess	  the	  metabolic	  cost	  of	  development	  under	  future	  elevated	  and	  fluctuating	  pCO2	  tensions,	  and	  3)	  to	  assess	  the	  effects	  of	  climate	  change-­‐related	  acidification	  on	  the	  aerobic	  scope	  of	  pink	  salmon	  prior	  to	  and	  following	  seawater	  entry.	  	  	  	   21 2.2	  Materials	  and	  methods	  	  2.21	  Experimental	  animals	  	   Pink	  salmon	  eyed	  embryos	  were	  transported	  from	  Quinsam	  River	  Hatchery	  to	  the	  University	  of	  British	  Columbia	  (UBC)	  on	  November	  8th	  2012.	  Embryos	  were	  incubated	  in	  total	  darkness	  at	  4.0	  ±	  1.0	  °C	  in	  small	  containers	  filled	  with	  dechlorinated	  Vancouver	  City	  tap	  water	  ([Na+],	  0.17	  mM;	  [Cl¯ˉ],	  0.21mM;	  hardness,	  30mgL–1	  CaCO3;	  pH,	  6.8	  ±	  0.2).	  Water	  changes	  were	  conducted	  daily	  to	  ensure	  good	  water	  quality.	  At	  470	  accumulated	  thermal	  units	  (ATU’s;	  days	  x	  temperature	  in	  °C),	  embryos	  were	  pooled,	  sorted	  based	  on	  size	  and	  uniform	  sized	  embryos	  (weight	  of	  169	  ±	  14	  mg	  and	  a	  diameter	  of	  7.0	  ±	  0.7	  mm)	  were	  transferred	  into	  their	  respective	  CO2	  treatments	  in	  freshwater	  (approximately	  2	  weeks	  pre-­‐hatch).	  At	  9	  weeks	  post-­‐hatch,	  fish	  nearing	  yolk-­‐sac	  absorption	  were	  transferred	  to	  seawater	  and	  remained	  in	  seawater	  treatments	  for	  2	  weeks.	  In	  freshwater,	  embryos	  and	  alevin	  were	  reared	  in	  darkness	  to	  mimic	  gravel	  conditions,	  whereas,	  in	  seawater,	  fry	  were	  exposed	  to	  natural	  photoperiod	  (12L:12D).	  Throughout	  the	  experiment,	  mortality	  was	  negligible	  in	  all	  treatments	  and	  thus	  was	  not	  reported	  in	  the	  results.	  Experimental	  animals	  were	  treated	  according	  to	  the	  UBC	  animal	  protocol	  #A11-­‐0235.	  	  2.22	  Experimental	  design	  and	  CO2	  manipulation	  in	  freshwater	  	   Eyed	  embryos	  were	  transferred	  into	  1	  of	  4	  different	  systems	  with	  constantly	  flowing	  dechlorinated	  tap	  water.	  The	  4	  systems	  consisted	  of	  a	  control	  treatment	  (477	  ±	  20	  μatm),	  a	  constant	  medium	  CO2	  treatment	  (1036	  ±	  47	  μatm),	  a	  constant	   22 high	  CO2	  treatment	  (2031	  ±	  93	  μatm),	  and	  a	  24h	  oscillating	  CO2	  treatment	  (400-­‐2000	  μatm).	  All	  systems	  were	  housed	  in	  a	  temperature-­‐controlled	  environmental	  chamber.	  In	  each	  system,	  oxygenated	  tap	  water	  flowed	  through	  a	  reservoir	  tank	  where	  water	  was	  equilibrated	  with	  the	  respective	  CO2	  tension	  prior	  to	  being	  distributed	  to	  3	  independent	  flow-­‐through	  replicate	  tanks	  (100L).	  Dissolved	  oxygen	  in	  all	  tanks	  always	  exceeded	  93%	  saturation.	  Desired	  pCO2	  tensions	  were	  set	  and	  maintained	  by	  mass	  flow	  controllers	  (Sierra	  Instruments,	  Model	  SmartTrak100	  C100L)	  that	  bubbled	  either	  air,	  which	  had	  been	  partially	  stripped	  of	  CO2,	  or	  a	  mixture	  of	  compressed	  CO2	  (5-­‐30%	  CO2	  balanced	  with	  air)	  into	  the	  reservoir	  tank.	  Once	  target	  tensions	  were	  achieved,	  mass	  flow	  controller	  rates	  and	  water	  flow	  rates	  through	  the	  replicate	  tanks	  (0.3Lmin-­‐1)	  were	  held	  constant	  throughout	  the	  entire	  10-­‐week	  experiment.	  For	  the	  oscillating	  treatment,	  the	  CO2	  mass	  flow	  controller	  was	  controlled	  by	  an	  Ardunio	  Uno	  circuit	  board,	  which	  varied	  the	  voltage	  output	  supplying	  the	  mass	  flow	  controller.	  The	  voltage	  was	  varied	  according	  to	  a	  sine	  function	  with	  a	  period	  of	  24	  hrs.	  Water	  pH	  and	  temperature	  in	  each	  treatment	  system	  was	  monitored	  continuously	  in	  one	  of	  the	  replicate	  tanks	  with	  a	  glass	  electrode	  (Thermo	  Scientific,	  Orion	  Ross	  Ultra	  Triode)	  in	  conjunction	  with	  the	  Orion	  Star	  A211	  pH	  meter	  (Thermo	  Scientific).	  Water	  pH	  values	  were	  stable	  over	  the	  10	  week	  exposure	  period	  with	  average	  values	  for	  the	  treatments	  at:	  control,	  7.25	  ±	  0.02;	  medium,	  6.94	  ±	  0.03;	  high,	  6.65	  ±	  0.03;	  oscillating,	  6.66	  ±	  0.03	  (high),	  7.19	  ±	  0.04	  (low).	  Total	  dissolved	  inorganic	  carbon	  (DIC)	  was	  determined	  with	  a	  DIC	  analyzer	  (Apollo	  SciTech,	  Model	  AS-­‐C3)	  using	  Andrew	  Dickson’s	  Seawater	  Reference	  Materials	  (SRM;	  batch	  #117)	  over	  the	  duration	  of	  the	  experiment	  to	  verify	  that	   23 target	  pCO2	  values	  were	  achieved	  (control,	  191	  ±	  7	  μmol/kgSW;	  medium,	  233	  ±	  3	  μmol/kgSW;	  high,	  292	  ±	  11	  μmol/kgSW).	  In	  the	  weeks	  without	  DIC	  analysis,	  water	  directly	  from	  each	  system	  was	  bubbled	  with	  a	  known	  tension	  of	  pCO2	  (410,1025	  and	  2050	  μatm)	  and	  the	  corresponding	  pH	  was	  measured	  and	  compared	  with	  replicate	  tank	  values.	  This	  was	  used	  as	  a	  secondary	  method	  of	  water	  analysis	  to	  validate	  our	  measurements	  and	  ensure	  accuracy	  of	  our	  pH	  electrodes.	  Freshwater	  pCO2	  was	  calculated	  from	  pH	  and	  DIC	  with	  CO2SYS	  (Lewis	  and	  Wallace,	  1998)	  using	  freshwater	  constants	  from	  Millero,	  1979.	  Water	  temperature	  was	  also	  measured	  continuously	  at	  3	  hour	  intervals	  in	  each	  replicate	  tank	  using	  iButtons	  (Thermochron,	  DS19212-­‐F5#)	  and	  was	  on	  average	  6.75	  ±	  1.1	  °C	  throughout	  the	  entire	  10	  week	  exposure.	  	  2.23	  Seawater	  transfer	  and	  CO2	  manipulation	  in	  seawater	  	   At	  995	  ATU’s	  (Table	  2.1;	  week	  9	  post-­‐hatch;	  week	  11	  post	  CO2	  exposure),	  fry	  were	  transferred	  from	  their	  freshwater	  treatments	  into	  100L	  static	  aquaria	  containing	  seawater	  from	  the	  Vancouver	  Aquarium	  (salinity,	  29.1	  ±	  0.6;	  temperature,	  7.0	  ±	  0.4,	  Total	  Alkalinity:	  2015	  ±	  72	  μmol/kgSW).	  At	  this	  age,	  fry	  were	  actively	  swimming	  and	  were	  at	  the	  yolk	  sac	  absorption	  stage,	  which	  typically	  corresponds	  to	  gravel	  emergence	  and	  seaward	  migration.	  Time	  to	  yolk	  sac	  absorption	  was	  consistent	  with	  the	  age	  at	  which	  pink	  salmon	  fry	  start	  to	  emerge	  at	  the	  hatchery	  and	  yolk	  sac	  absorption	  times	  from	  previous	  studies	  (Gallagher	  et	  al.	  2012).	  Since	  migrating	  fry	  still	  possess	  an	  internal	  supply	  of	  yolk	  reserves,	  fish	  were	  not	  fed	  during	  the	  entire	  2-­‐week	  seawater	  exposure.	  Fry	  reared	  in	  control	   24 freshwater	  conditions,	  were	  randomly	  transferred	  into	  1	  of	  3	  different	  seawater	  treatments:	  a	  control	  CO2	  treatment	  (448	  ±	  11	  μatm),	  a	  high	  CO2	  treatment	  (1593	  ±	  30	  μatm),	  or	  a	  24hr	  oscillating	  CO2	  treatment	  (400-­‐1600	  μatm).	  Fry	  reared	  in	  high	  CO2	  freshwater	  conditions	  were	  randomly	  transferred	  to	  a	  high	  CO2	  seawater	  treatment	  (1593	  ±	  30	  μatm).	  To	  mimic	  seawater	  transfer	  conditions	  from	  the	  previous	  year’s	  experiment,	  a	  high	  pCO2	  tension	  of	  1600	  μatm	  and	  not	  2000	  μatm	  was	  used.	  Each	  treatment	  consisted	  of	  3	  independent	  and	  static	  replicate	  tanks,	  which	  were	  all	  housed	  in	  a	  temperature-­‐controlled	  environmental	  chamber.	  For	  each	  treatment,	  desired	  pCO2	  tensions	  were	  set	  and	  maintained	  by	  Sierra	  mass	  flow	  controllers	  that	  bubbled	  either	  air,	  partially	  stripped	  of	  CO2,	  or	  a	  mixture	  of	  compressed	  CO2	  (5-­‐15%	  CO2	  balanced	  with	  air)	  through	  3	  separate	  lines	  into	  each	  of	  the	  static	  replicate	  tanks.	  Once	  target	  tensions	  were	  achieved,	  mass	  flow	  controller	  rates	  were	  held	  constant	  throughout	  the	  entire	  2-­‐week	  exposure.	  CO2	  oscillations	  were	  achieved	  using	  the	  same	  method	  as	  noted	  above.	  Seawater	  pH	  and	  temperature	  in	  each	  treatment	  was	  monitored	  continuously	  in	  one	  of	  the	  replicate	  tanks	  with	  a	  glass	  electrode	  (Thermo	  Scientific,	  Orion	  Ross	  Ultra	  Triode)	  and	  averaged	  8.05	  ±	  0.01	  (control),	  7.54	  ±	  0.01	  (high)	  and	  7.57	  ±	  0.02	  to	  8.04	  ±	  0.02	  (oscillating).	  Analysis	  of	  seawater	  samples	  for	  DIC	  was	  conducted	  in	  a	  manner	  similar	  to	  that	  of	  freshwater	  samples.	  DIC	  was	  measured	  at	  the	  beginning	  and	  at	  the	  end	  of	  the	  seawater	  exposure	  (control,	  1884	  ±	  30	  μmol/kgSW;	  high,	  2058	  ±	  32	  μmol/kgSW).	  Seawater	  samples	  were	  taken	  for	  total	  alkalinity	  (AT)	  at	  day	  14	  post-­‐transfer	  and	  were	  analyzed	  according	  to	  Dickson	  et	  al.,	  2007	  at	  The	  Ocean	  Acidification	  Lab	  in	  Friday	  Harbor	  Labs,	  Washington.	  Similar	  to	  freshwater	  analysis,	   25 seawater	  from	  one	  of	  the	  replicate	  tanks	  per	  treatment	  was	  sampled	  and	  bubbled	  with	  a	  known	  tension	  of	  pCO2	  (410	  and1640	  μatm)	  and	  the	  corresponding	  pH	  was	  measured	  and	  compared	  with	  replicate	  tank	  values	  to	  ensure	  consistency.	  The	  dissociation	  constants	  from	  GEOSECS	  (NBS	  scale)	  were	  used	  to	  calculate	  pCO2	  in	  CO2SYS.	  	  	  2.24	  Growth	  and	  yolk	  consumption	  	   Measurements	  of	  alevin	  wet	  mass	  (wtm)	  and	  length	  (n=8	  for	  wet	  mass;	  n=8	  for	  length)	  were	  taken	  weekly	  from	  2	  weeks	  pre-­‐hatch	  up	  until	  2	  weeks	  post-­‐seawater	  transfer	  (11	  weeks	  post-­‐hatch).	  Alevin	  were	  then	  fixed	  in	  5%	  neutral	  buffered	  formalin	  for	  up	  to	  21	  days	  before	  the	  yolk	  was	  dissected	  from	  the	  fish	  to	  obtain	  yolk	  wtm	  and	  tissue	  wtm	  measurements.	  These	  samples	  were	  then	  dried	  in	  an	  oven	  at	  58ºC	  for	  at	  least	  5	  days	  to	  obtain	  dry	  weights	  for	  alevin	  tissue	  and	  yolk.	  Gross	  production	  efficiencies	  at	  week	  10	  were	  calculated	  as	  the	  increase	  in	  tissue	  dry	  mass	  divided	  by	  the	  loss	  in	  yolk	  dry-­‐mass	  multiplied	  by	  100.	  Growth	  rates	  in	  seawater	  were	  calculated	  as	  the	  difference	  in	  alevin	  wtm	  at	  day	  14	  and	  at	  day	  0	  post-­‐seawater	  transfer.	  	  	  2.25	  Respirometry	  	   To	  accommodate	  the	  growing	  size	  of	  developing	  fish,	  3	  different-­‐sized	  closed	  respirometers	  were	  used:	  	  3.41	  ±	  0.1	  ml	  for	  week	  1-­‐	  4;	  7.43	  ±	  0.3	  ml	  for	  week	  5-­‐	  10;	  and	  10.60	  ±	  0.4	  ml	  for	  day	  1-­‐14	  post-­‐seawater	  transfer.	  Chambers	  were	  rinsed	  in	  VIRCON	  at	  the	  end	  of	  each	  day	  to	  reduce	  background	  bacterial	  respiration,	  which	   26 was	  determined	  to	  be	  negligible	  from	  blank	  experiments.	  To	  ensure	  adequate	  water	  mixing,	  a	  mini	  stir	  bar	  was	  placed	  beneath	  a	  false	  bottom	  mesh	  in	  all	  the	  chambers.	  A	  total	  of	  8	  fish	  per	  treatment	  (4	  treatments)	  per	  time	  point	  (weekly)	  were	  used	  for	  measurement	  of	  routine	  and	  maximum	  MO2	  in	  the	  water	  from	  the	  respective	  pCO2	  treatment	  in	  which	  the	  fish	  were	  reared.	  	  Routine	  MO2	  (MO2routine)	  was	  measured	  weekly	  throughout	  development	  in	  freshwater	  up	  until	  14	  days	  post-­‐seawater	  transfer.	  Fish	  were	  placed	  in	  the	  chambers,	  where	  they	  were	  acclimated	  in	  darkness	  at	  an	  appropriate	  acclimation	  time	  (2	  h	  for	  eggs,	  3	  h	  for	  alevin,	  4	  h	  for	  fry)	  in	  flow-­‐through	  water	  of	  their	  respective	  pCO2	  treatments.	  Acclimation	  times	  were	  determined	  by	  preliminary	  testing,	  which	  indicated	  that	  longer	  periods	  (8	  h)	  did	  not	  significantly	  reduce	  MO2routine.	  After	  the	  acclimation	  period,	  the	  chamber	  was	  sealed	  and	  the	  decline	  in	  oxygen	  was	  monitored	  over	  time,	  using	  a	  fiber	  optic	  oxygen	  sensor	  (PreSens,	  Model	  NFSL)	  to	  calculate	  mass-­‐specific	  MO2routine.	  Once	  O2	  levels	  reached	  60%	  saturation,	  the	  measurement	  was	  terminated	  and	  the	  chamber	  was	  re-­‐supplied	  with	  flow	  through	  water.	  The	  sensor	  was	  connected	  to	  a	  4-­‐channel	  oxygen	  meter	  (PreSens,	  OYY-­‐4	  Micro),	  allowing	  the	  simultaneous	  recording	  of	  4	  chambers.	  Data	  was	  obtained	  using	  the	  accompanying	  software	  (OXY-­‐4v2_11TX),	  with	  temperature	  compensation.	  	  	   Maximum	  MO2	  (MO2max)	  was	  measured	  weekly	  from	  week	  8-­‐10	  in	  freshwater	  and	  from	  day	  1-­‐14	  post-­‐seawater	  transfer,	  using	  a	  chase	  protocol	  similar	  to	  the	  one	  outlined	  in	  Healy	  and	  Schulte,	  2012.	  Briefly	  following	  the	  determination	  of	  MO2routine,	  the	  fish	  was	  removed	  from	  the	  chamber,	  placed	  in	  a	  container	  filled	  with	  the	   27 respective	  pCO2	  water	  and	  then	  chased	  to	  exhaustion	  with	  a	  plastic	  pipette	  for	  a	  minimum	  of	  4	  minutes.	  The	  inability	  to	  right	  itself	  within	  3	  seconds	  following	  inversion	  was	  defined	  as	  complete	  exhaustion.	  At	  this	  point	  the	  fish	  was	  immediately	  returned	  to	  the	  chamber	  and	  MO2max	  was	  measured	  (all	  within	  30s).	  MO2max	  was	  calculated	  from	  the	  initial	  decrease	  in	  oxygen	  following	  closure	  of	  the	  chamber	  (within	  5	  min	  of	  initial	  decrease).	  Although	  maximum	  sustained	  swimming	  speed	  (Ucrit)	  is	  typically	  used	  to	  obtain	  MO2max	  in	  fish,	  previous	  studies	  have	  shown	  that	  chase	  protocols	  can	  yield	  similar	  or	  higher	  values	  of	  MO2max	  in	  some	  species	  of	  fish	  (Reidy	  et	  al.,	  1995;	  Sylvestre	  et	  al.,	  2007;	  Killen	  et	  al.	  2007).	  	  2.26	  Statistical	  analysis	  	   Data	  are	  expressed	  as	  means	  ±	  SEM,	  and	  were	  log-­‐transformed	  when	  necessary	  to	  meet	  the	  assumptions	  of	  normality	  and	  equal	  variance.	  Two-­‐way	  analyses	  of	  variance	  (ANOVA)	  were	  used	  to	  analyze	  all	  the	  wet	  mass,	  length,	  production	  efficiency,	  and	  growth	  data,	  using	  the	  software	  SigmaPlot	  (version	  12,	  Systat	  Software	  Inc.,	  San	  Jose,	  CA,	  USA).	  Pairwise	  comparisons	  among	  treatments	  and	  comparisons	  to	  the	  control	  were	  made	  using	  the	  Holm-­‐Sidak	  post-­‐hoc	  test	  when	  significance	  was	  found.	  	  Multiway	  ANOVAs	  with	  treatment	  and	  time	  as	  factors	  were	  used	  to	  analyze	  log-­‐transformed	  mass-­‐specific	  MO2routine,	  mass-­‐specific	  MO2max,	  and	  aerobic	  scope	  data	  using	  the	  program	  RStudio	  (version	  3,	  RStudio	  Inc.).	  Preliminary	  multiway	  ANOVAs	  including	  log-­‐transformed	  mass	  as	  a	  factor	  showed	  no	  significant	  effects	  of	  mass	  on	  mass-­‐specific	  MO2routine/max	  and	  aerobic	  scope,	  and	  as	  a	  result,	  mass	  was	   28 dropped	  from	  our	  models.	  This	  is	  consistent	  with	  the	  finding	  that	  early	  in	  development,	  MO2routine	  and	  MO2max	  scales	  isometrically	  with	  body	  mass	  (Killen	  et	  al.,	  2007,	  Rombough,	  2011).	  Scaling	  exponents	  during	  early	  life-­‐stages	  for	  MO2routine	  and	  MO2max	  have	  been	  shown	  to	  be	  >0.96	  and	  >1.0,	  respectively,	  for	  athletic	  salmonid	  species	  (Wieser,	  1985;	  Post	  and	  Lee,	  1996).	  All	  MO2	  data	  are	  expressed	  as	  mass-­‐specific	  metabolic	  rates.	  TukeyHSD	  pairwise	  comparisons	  among	  treatments	  were	  made	  when	  significance	  was	  detected.	  For	  all	  tests,	  a	  significance	  level	  of	  p<0.05	  was	  used.	   	  2.3	  Results	  	  2.31	  Growth	  and	  development	  	   Total	  alevin	  wet	  mass	  (wtm)	  increased	  significantly	  throughout	  freshwater	  development	  (Fig.	  2.1;	  F	  =	  2.768,	  df	  =	  10,	  p<0.001),	  and	  was	  significantly	  different	  among	  the	  different	  CO2	  treatments	  (F	  =	  3.342,	  df	  =	  3,	  p	  =	  0.019).	  At	  10	  weeks	  following	  CO2	  exposure,	  total	  alevin	  wtm	  in	  the	  control	  group	  was	  12-­‐15%	  higher	  than	  the	  medium	  and	  high	  CO2	  groups	  (p	  =	  0.027	  and	  p<0.001,	  respectively).	  Similarly,	  tissue	  wtm	  (without	  yolk)	  was	  also	  significantly	  different	  throughout	  freshwater	  development	  (Fig.	  2.2;	  F	  =	  273.86,	  df	  =	  6,	  p<0.001),	  and	  among	  treatments	  (F	  =	  8.081,	  df	  =	  3,	  p<0.001).	  At	  10	  weeks	  following	  CO2	  exposure,	  tissue	  wtm	  in	  the	  high	  CO2	  group	  was	  reduced	  by	  13-­‐15%	  relative	  to	  the	  fluctuating	  CO2	  and	  control	  group	  (p	  =	  0.048	  and	  p	  =	  0.013,	  respectively).	  Consistent	  with	  tissue	  wtm,	  tissue	  dry	  mass	  at	  week	  10	  was	  significantly	  different	  among	  groups	  (Fig.	  2.3;	   29 F	  =	  3.737,	  df	  =	  3,	  p	  =	  0.022).	  Fork	  lengths	  also	  revealed	  similar	  trends,	  with	  significant	  differences	  occurring	  throughout	  development	  (Fig.	  2.4;	  F	  =	  175.178,	  df	  =	  6,	  p<0.001)	  and	  among	  treatments	  (F	  =	  8.355,	  df	  =	  3,	  p<0.001).	  At	  week	  10,	  control	  fish	  were	  significantly	  longer	  than	  all	  other	  groups	  (p≤0.001).	  	  Yolk	  wtm,	  on	  the	  other	  hand,	  decreased	  throughout	  freshwater	  development	  (Fig.	  2.5)	  and	  was	  not	  significantly	  different	  among	  the	  different	  treatments	  at	  week	  10	  (Fig.	  2.6;	  F	  =	  2.723,	  df	  =	  3,	  p	  =	  0.063).	  Similarly,	  yolk	  dry	  mass	  was	  also	  not	  significantly	  different	  among	  treatments	  at	  week	  10	  (Fig.	  2.7;	  F	  =	  2.415,	  df	  =	  3,	  p	  =	  0.088),	  indicating	  that	  yolk	  stores	  were	  consumed	  at	  similar	  rates.	  Production	  efficiencies	  near	  yolk	  sac	  absorption	  (week	  10)	  were	  significantly	  different	  among	  the	  groups	  (Fig.	  2.8;	  F	  =	  4.715,	  df	  =	  3,	  p	  =	  0.009),	  with	  the	  control	  group	  having	  a	  25%	  higher	  production	  efficiency	  than	  the	  high	  CO2	  group	  (p	  =	  0.007).	  	  	   In	  seawater,	  growth	  rates	  were	  significantly	  different	  among	  the	  different	  CO2	  seawater	  treatments	  (Fig.	  2.9;	  F	  =	  4.63,	  df	  =	  3,	  p	  =	  0.009).	  At	  day	  14,	  growth	  rates	  were	  almost	  4	  times	  higher	  in	  control	  fish	  reared	  in	  control	  freshwater	  and	  transferred	  into	  control	  seawater	  (low→low)	  than	  fish	  reared	  in	  control	  freshwater	  and	  transferred	  into	  high	  CO2	  seawater	  (low→high)	  (p	  =	  0.007).	  Fork	  lengths	  of	  control	  seawater	  fish	  were	  also	  greater	  compared	  to	  all	  other	  groups	  (Table	  2.2).	  	  	  2.32	  Metabolic	  rates	  	   During	  development	  in	  freshwater,	  MO2routine	  increased	  significantly	  after	  hatch	  and	  plateaued	  around	  week	  9-­‐10.	  There	  was	  a	  significant	  effect	  of	  time	  (Fig.	  2.10;	  F	  =	  287.183,	  df	  =	  10,	  p<0.001)	  but	  no	  effect	  of	  treatment	  (F	  =	  0.816,	  df	  =	  3,	  p	  =	   30 0.486)	  on	  MO2routine	  with	  a	  significant	  interaction	  between	  factors	  (F	  =	  1.708,	  df	  =	  30,	  p	  =	  0.0146).	  From	  week	  8-­‐10,	  MO2max	  did	  not	  change	  during	  development	  (F	  =	  0.361,	  df	  =	  2,	  p	  =	  0.699)	  but	  there	  was	  a	  significant	  effect	  of	  treatment	  (F	  =	  4.943,	  df	  =	  3,	  p	  =	  0.003)	  with	  no	  interaction	  effects	  between	  factors	  (F	  =	  1.053,	  df	  =	  6,	  p	  =	  0.398).	  	  	   At	  day1,	  7	  and	  14	  post-­‐seawater	  transfer,	  there	  were	  no	  significant	  effects	  of	  time	  (Fig.	  2.11;	  F	  =	  2.319,	  df	  =	  2,	  p	  =	  0.105),	  treatment	  (F	  =	  0.646,	  df	  =	  3,	  p	  =	  0.588),	  and	  interaction	  between	  factors	  (F	  =	  2.657,	  df	  =	  6,	  p	  =	  0.068)	  on	  MO2routine.	  Conversely,	  MO2max	  increased	  significantly	  during	  exposure	  in	  seawater	  (Fig.	  2.12;	  F	  =	  23.895,	  df	  =	  2,	  p<0.001)	  with	  significant	  differences	  among	  treatments	  (F	  =	  10.363,	  df	  =	  3,	  p<0.001);	  however,	  no	  significant	  interaction	  effects	  were	  detected	  between	  factors	  (F	  =	  0.963,	  df	  =	  6,	  p	  =	  0.456).	  At	  day	  7,	  the	  control	  low→low	  group	  had	  significantly	  higher	  MO2max	  than	  the	  low→high	  group	  (p	  =	  0.026).	  Similar	  to	  MO2max,	  aerobic	  scope	  increased	  throughout	  seawater	  exposure	  (Fig.	  2.13;	  F	  =	  23.014,	  df	  =	  2,	  p<0.001)	  and	  was	  significantly	  different	  among	  the	  groups	  (F	  =	  8.341,	  df	  =	  3,	  p<0.001)	  with	  no	  interaction	  effects	  between	  factors	  (F	  =	  0.301,	  df	  =	  6,	  p	  =	  0.936).	  	   Throughout	  development	  in	  freshwater	  and	  transfer	  into	  seawater,	  MO2routine	  of	  fish	  reared	  in	  control	  conditions	  and	  then	  transferred	  into	  control	  seawater	  (low→low),	  and	  fish	  reared	  in	  high	  CO2	  and	  then	  transferred	  into	  high	  CO2	  seawater	  (high→high)	  were	  not	  significantly	  different	  (Fig.	  2.14;	  F	  =	  0.576,	  df	  =	  1,	  p	  =	  0.4488).	  MO2max	  and	  aerobic	  scope	  increased	  in	  both	  groups	  following	  seawater	  transfer	  (Fig.	  2.14;	  Fig.	  2.15).	  At	  7	  days	  post-­‐transfer,	  aerobic	  scope	  increased	  by	  60%	  in	  the	  control	  group	  and	  43%	  in	  the	  high→high	  group.	  The	  high→high	  group	  however,	  had	   31 a	  significantly	  lower	  MO2max	  (F	  =	  17.021,	  df	  =	  1,	  p<0.001),	  and	  a	  smaller	  aerobic	  scope	  (F	  =	  17.209,	  df	  =	  1,	  p<0.001)	  than	  the	  control	  group.	  	  	  2.4	  Discussion	  	  	   This	  study	  demonstrates	  that	  pink	  salmon,	  under	  predicted	  future	  increases	  in	  pCO2,	  may	  be	  faced	  with	  sublethal	  impacts	  of	  acidification	  on	  various	  aspects	  of	  their	  physiology	  at	  a	  very	  critical	  time	  in	  their	  life	  history.	  Growth	  in	  both	  freshwater	  and	  seawater	  was	  significantly	  reduced	  at	  high	  pCO2	  with	  a	  25%	  reduction	  in	  production	  efficiency	  occurring	  at	  2000	  μatm.	  However,	  no	  effect	  on	  growth	  was	  seen	  at	  oscillating	  tensions.	  Similarly,	  MO2max	  and	  aerobic	  scope	  were	  reduced	  at	  high	  pCO2	  following	  seawater	  transfer	  with	  no	  change	  in	  MO2routine.	  	  	  2.41	  Growth	  and	  development	  	   According	  to	  our	  findings,	  growth	  during	  the	  early	  life-­‐stages	  of	  pink	  salmon	  may	  be	  affected	  at	  pCO2	  levels	  predicted	  to	  occur	  within	  the	  next	  century.	  Total	  alevin	  wtm	  and	  tissue	  wtm	  were	  lower	  in	  fish	  reared	  at	  medium	  and	  high	  pCO2	  compared	  to	  those	  reared	  in	  control	  conditions	  near	  the	  end	  of	  yolk	  absorption.	  Since	  pink	  salmon	  begin	  their	  seawater	  migration	  around	  this	  period,	  their	  smaller	  size	  relative	  to	  other	  smolts,	  may	  have	  a	  large	  impact	  on	  their	  survival	  at	  this	  crucial	  life-­‐stage.	  Smaller	  individuals	  may	  be	  more	  susceptible	  to	  predation	  and	  have	  lower	  foraging	  success	  at	  a	  time	  when	  yolk	  reserves	  become	  limiting.	  Previous	  work	  looking	  at	  growth	  in	  fish	  at	  OA-­‐relevant	  levels	  shows	  varying	  responses	  (Tseng	  et	   32 al.,	  2013;	  Baumann	  et	  al.,	  2011;	  Munday	  et	  al.,	  2009),	  indicating	  that	  OA	  impacts	  on	  growth	  may	  be	  species	  specific.	  Ocean	  acidification	  appears	  to	  reduce	  growth	  and	  survival	  in	  the	  inland	  silverside,	  Menidia	  beryllina	  (Baumann	  et	  al.,	  2011),	  whereas	  it	  appears	  to	  be	  enhanced	  in	  the	  clown	  fish,	  Amphiprion	  percula	  (Munday	  et	  al.,	  2009).	  Early	  in	  development	  (3-­‐5	  dph),	  Japanese	  medaka	  show	  stunted	  growth	  under	  constant	  elevated	  pCO2	  (1200	  and	  4200	  μatm)	  but	  were	  able	  to	  catch	  up	  to	  the	  control	  group	  before	  hatch	  (Tseng	  et	  al.,	  2013).	  This	  developmental	  delay	  has	  also	  been	  documented	  in	  various	  marine	  invertebrates	  at	  early	  developmental	  stages	  (Walther	  et	  al.,	  2010;	  Stumpp	  et	  al.,	  2011,	  Hu	  et	  al.,	  2011).	  In	  the	  case	  of	  pink	  salmon,	  a	  shift	  in	  developmental	  time	  does	  not	  appear	  to	  be	  occurring.	  Near	  yolk	  absorption	  (week	  10),	  yolk	  wtm	  is	  not	  significantly	  different	  among	  the	  different	  CO2	  groups,	  suggesting	  that	  yolk	  consumption	  rates	  were	  similar.	  Given	  that	  gravel	  emergence	  in	  pink	  salmon	  occurs	  at	  yolk	  sac	  absorption,	  these	  data	  indicate	  that	  elevated	  CO2	  in	  freshwater	  would	  likely	  lead	  to	  comparable	  times	  of	  gravel	  emergence	  but	  in	  fish	  that	  are	  smaller,	  which	  may	  have	  implications	  for	  survival.	  Following	  seawater	  entry,	  growth	  rates	  were	  negative	  in	  groups	  transferred	  into	  high	  CO2,	  whereas	  control	  fish	  continued	  to	  grow	  throughout	  the	  full	  2	  weeks	  in	  seawater.	  Fish	  were	  not	  fed	  during	  seawater	  exposure;	  however,	  internal	  yolk	  stores	  were	  still	  present,	  which	  were	  presumably	  the	  basis	  for	  growth.	  Growth	  is	  indicated	  by	  changes	  in	  weight	  and	  length,	  and	  consistent	  with	  the	  growth	  data,	  lengths	  were	  also	  reduced	  during	  development	  in	  high	  CO2	  seawater.	  This	  suggests	  that	  tissue	  production	  may	  be	  impaired	  at	  high	  CO2.	  However,	  since	  growth	  rates	  are	  based	  on	  total	  wtm,	  the	  inability	  to	  hypo-­‐osmoregulate	  efficiently	  at	  high	  pCO2	  could	   33 have	  also	  contributed	  to	  the	  apparent	  negative	  growth	  rate	  estimates	  (due	  to	  water	  loss)	  during	  the	  transition	  to	  seawater.	  In	  seawater,	  fish	  continuously	  lose	  water	  to	  their	  hyperosmotic	  environment	  and	  to	  compensate,	  marine	  fish	  actively	  drink	  seawater	  and	  excrete	  ions	  to	  maintain	  osmotic	  balance	  (Evans	  et	  al.,	  2005).	  Near	  the	  time	  of	  seawater	  entry,	  pink	  salmon	  appear	  to	  undergo	  some	  degree	  of	  smoltification	  as	  indicated	  by	  a	  large	  increase	  in	  the	  ratio	  of	  gill	  NKA	  isoform	  α1b/	  α1a	  in	  fish	  maintained	  in	  freshwater	  (Gallagher	  et	  al.,	  2012).	  These	  changes,	  among	  others,	  may	  help	  maintain	  water	  balance,	  which	  is	  key	  to	  seawater	  survival.	  If	  the	  lower	  growth	  rates	  at	  high	  pCO2	  are	  associated	  with	  impaired	  hypo-­‐osmoregulatory	  ability,	  then	  the	  osmoregulatory	  challenge	  of	  seawater	  entry	  may	  be	  further	  compounded	  by	  OA.	  	   Lower	  yolk-­‐to-­‐tissue	  conversion	  efficiencies	  in	  pink	  salmon	  alevin	  may	  indicate	  that	  development	  at	  pCO2	  levels	  projected	  by	  the	  end	  of	  the	  century	  may	  be	  more	  energetically	  costly.	  In	  the	  gravel,	  alevin	  feed	  exclusively	  on	  their	  yolk	  reserves,	  which	  proves	  convenient	  in	  creating	  energy	  budgets	  and	  estimating	  the	  relative	  cost	  of	  growth.	  Assuming	  100%	  yolk	  assimilation,	  the	  total	  amount	  of	  available	  yolk	  stores	  (Y)	  is	  equal	  to	  the	  sum	  of	  the	  materials	  from	  the	  yolk	  that	  are	  required	  for	  tissue	  production	  (P),	  and	  the	  energy	  that	  is	  allocated	  towards	  total	  metabolism/respiration	  (R)	  and	  excretion	  (E)	  of	  waste	  (Rombough,	  2011).	  Respiration	  can	  be	  further	  broken	  into	  respiration	  for	  growth	  (Rg),	  respiration	  for	  maintenance	  of	  tissues	  (Rm)	  and	  respiration	  for	  activity	  (Ra)	  (Rombough,	  2011).	  Given	  that	  energy	  budgets	  balance,	  if	  development	  in	  OA-­‐relevant	  tensions	  is	  more	  energetically	  costly,	  then	  one	  would	  expect	  a	  decrease	  in	  overall	  tissue	  production.	   34 Consistent	  with	  our	  predictions,	  there	  was	  a	  substantial	  decrease	  in	  gross	  production	  efficiencies	  at	  high	  pCO2.	  	  2.42	  Aerobic	  scope	  	   Following	  seawater	  transfer,	  an	  increase	  in	  CO2	  reduced	  aerobic	  scope	  in	  pink	  salmon	  fry	  through	  a	  decrease	  in	  MO2max.	  These	  results	  indicate	  that	  pink	  salmon	  fry	  may	  be	  particularly	  sensitive	  to	  climate	  change-­‐related	  acidification	  during	  exercise,	  which	  may	  have	  implications	  on	  the	  success	  of	  their	  seaward	  migration.	  Similarly,	  Munday	  et	  al.	  (2009)	  found	  reductions	  in	  MO2max	  and	  aerobic	  scope	  in	  2	  species	  of	  coral	  reef	  fish,	  Ostorhinchus	  doederleini	  and	  O.	  cyanosoma,	  at	  pCO2	  levels	  of	  1000	  μatm.	  MO2routine	  in	  both	  O.	  doederleini	  and	  O.	  cyanosoma	  were	  slightly	  elevated	  at	  high	  CO2,	  suggesting	  that	  there	  may	  be	  energetic	  costs	  associated	  with	  OA-­‐relevant	  levels	  of	  acidification	  (Munday	  et	  al.,	  2009).	  In	  contrast,	  hypercarbia	  at	  much	  higher	  levels	  (7,500-­‐92,000	  μatm)	  did	  not	  significantly	  change	  MO2routine	  in	  various	  species	  of	  fish	  (Ishimatsu	  et	  al.,	  2005).	  However,	  most	  of	  these	  studies	  involved	  short-­‐term	  exposure	  of	  CO2	  on	  adult	  and	  juvenile	  fish	  and	  thus,	  may	  not	  be	  representative	  of	  what	  is	  happening	  in	  larval	  fish	  in	  the	  long	  term.	  	  	   Factorial	  scope,	  which	  is	  the	  ratio	  of	  MO2max	  to	  MO2routine,	  is	  extremely	  small	  in	  larval	  fish	  and	  tends	  to	  increase	  throughout	  development.	  Near	  the	  end	  of	  yolk-­‐sac	  absorption,	  factorial	  scopes	  average	  around	  1.5	  to	  2.0	  (Rombough,	  2011;	  Post	  and	  Lee,	  1996;	  Killen	  et	  al.,	  2007).	  Our	  findings	  show	  factorial	  scopes	  of	  2.5	  –	  3.5	  in	  developing	  pink	  salmon	  alevin,	  with	  scopes	  as	  high	  as	  5.5	  following	  seawater	  transfer	  (Fig.	  2.16).	  By	  contrast,	  factorial	  scopes	  of	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	   35 mykiss)	  at	  the	  same	  development	  stage	  were	  only	  slightly	  higher	  than	  1.0	  (Wieser,	  1985),	  suggesting	  that	  pink	  salmon	  fry	  may	  have	  unusually	  high	  factorial	  scopes	  compared	  to	  other	  active	  species	  of	  salmonids.	  This	  is	  not	  surprising	  given	  their	  unique	  life	  history.	  Since	  pinks	  migrate	  to	  sea	  soon	  after	  emergence,	  their	  heightened	  capacity	  for	  activity	  may	  be	  crucial	  to	  their	  survival	  in	  a	  predator-­‐dense	  environment.	  Compared	  to	  other	  anadromous	  salmonids,	  adult	  pink	  salmon	  show	  an	  unrivaled	  capacity	  for	  exercise	  (Clark	  et	  al.,	  2011).	  They	  have	  exceptionally	  high	  aerobic	  scopes	  over	  a	  broad	  range	  of	  temperatures	  (Clark	  et	  al.,	  2011).	  	  This	  enhanced	  capacity	  for	  performance	  at	  different	  life-­‐stages	  may	  contribute	  to	  their	  impressive	  ecological	  success.	  However,	  there	  is	  clearly	  an	  effect	  of	  OA	  on	  the	  factorial	  and	  aerobic	  scope	  at	  a	  critical	  and	  sensitive	  life-­‐stage	  of	  pink	  salmon,	  which	  in	  turn,	  may	  have	  large	  implications	  on	  their	  survival	  and	  thus	  future	  pink	  salmon	  populations.	  	  	  2.43	  Temporal	  fluctuations	  in	  pCO2	  	   Currently,	  large	  temporal	  fluctuations	  in	  pCO2,	  reaching	  projected	  end-­‐of-­‐century	  levels,	  are	  occurring	  in	  many	  coastal	  ecosystems.	  Since	  acid-­‐base	  compensation	  in	  fish	  involves	  the	  accumulation	  of	  HCO3¯ˉ	  in	  exchange	  for	  Cl¯ˉ	  to	  reach	  a	  new	  steady	  state,	  we	  predicted	  that	  compensation	  would	  be	  more	  costly	  under	  oscillating	  pCO2	  tensions.	  Contrary	  to	  our	  predictions,	  daily	  fluctuations	  from	  400–2000	  μatm	  had	  no	  effect	  on	  growth	  and	  MO2routine	  in	  freshwater.	  Therefore,	  either	  compensation	  for	  hypercarbia	  was	  not	  metabolically	  costly	  as	  we	  had	  predicted	  or	  the	  time	  course	  of	  oscillation	  in	  this	  study	  was	  insufficient	  to	  resolve	  the	  metabolic	   36 cost.	  Complete	  compensation	  for	  acid-­‐base	  disturbances	  occurs	  over	  a	  period	  of	  24-­‐96	  h	  in	  most	  teleosts	  (reviewed	  in	  Brauner	  and	  Baker,	  2009).	  Given	  that	  our	  oscillation	  was	  over	  24	  hrs,	  the	  fish	  may	  not	  have	  had	  sufficient	  time	  or	  real	  need	  to	  fully	  compensate.	  Since	  our	  changes	  in	  pCO2	  were	  extremely	  gradual	  with	  short	  exposure	  times	  at	  the	  pCO2	  extremes,	  the	  fish	  would	  have	  been	  exposed	  to	  medium	  pCO2	  tensions	  for	  the	  majority	  of	  the	  day.	  Broader	  periods	  of	  oscillating	  and	  more	  dramatic	  changes	  in	  pCO2	  during	  oscillations	  should	  be	  investigated	  in	  the	  future	  to	  provide	  a	  more	  in-­‐depth	  look	  into	  the	  impacts	  of	  temporal	  pCO2	  fluctuations	  on	  fish,	  which	  are	  more	  likely	  to	  reflect	  natural	  coastal	  conditions.	  	  2.44	  Current	  and	  future	  implications	  on	  pink	  salmon	  	   From	  our	  findings,	  future	  increases	  in	  pCO2	  may	  have	  negative	  impacts	  on	  the	  physiology	  of	  pink	  salmon.	  Development	  at	  elevated	  pCO2	  tensions	  reduces	  growth	  in	  alevin,	  resulting	  in	  smaller-­‐sized	  fry	  at	  the	  time	  of	  seaward	  migration.	  Since	  predation,	  in	  most	  cases,	  is	  strongly	  size-­‐selective	  (Pepin,	  1991),	  larger	  hatchlings	  will	  generally	  fare	  better	  than	  smaller	  ones	  (Hendry	  et	  al.,	  2001).	  This	  has	  large	  implications	  on	  the	  survival	  of	  pink	  salmon	  in	  the	  ocean	  as	  they	  make	  the	  transition	  from	  a	  predator-­‐sparse	  environment	  in	  freshwater	  to	  a	  predator-­‐rich	  marine	  environment.	  In	  addition,	  their	  larger	  surface	  area-­‐to-­‐volume	  ratios	  may	  heighten	  the	  osmoregulatory	  challenges	  associated	  with	  the	  transition	  to	  seawater.	  At	  this	  pivotal	  time,	  the	  aerobic	  capacity	  of	  migrating	  fry	  may	  also	  be	  reduced	  under	  elevated	  pCO2.	  Since	  aerobic	  scope	  represents	  the	  energy	  available	  for	  processes	  such	  as	  growth	  and	  activity,	  pinks	  may	  be	  more	  susceptible	  to	  predation	  and	  have	   37 lower	  foraging	  success.	  The	  reduction	  of	  aerobic	  scope	  at	  high	  temperatures	  is	  thought	  to	  be	  a	  key	  factor	  in	  limiting	  the	  distribution	  and	  abundance	  of	  species	  (Pörtner	  and	  Farrell,	  2008).	  Additional	  environmental	  stressors,	  such	  as	  OA,	  are	  hypothesized	  to	  further	  compound	  the	  effects	  of	  temperature	  on	  the	  narrowing	  of	  thermal	  windows	  (Pörtner	  and	  Farrell,	  2008).	  Since	  the	  sustainability	  of	  fish	  populations	  is	  highly	  dependent	  on	  survival	  during	  early	  life-­‐stages	  (Hamilton	  et	  al.,	  2008),	  future	  increases	  in	  CO2	  may	  have	  large	  implications	  on	  the	  health	  of	  future	  pink	  salmon	  populations	  and	  thus,	  the	  health	  of	  our	  freshwater	  and	  coastal	  ecosystems.	  	   Recent	  oceanic	  surveys	  of	  the	  West	  Coast	  of	  North	  America	  suggest	  that	  our	  coastal	  ecosystems	  may	  already	  be	  experiencing	  the	  future	  projected	  increases	  in	  pCO2.	  The	  Oregon	  coast,	  which	  is	  contiguous	  with	  the	  waters	  of	  Vancouver	  Island,	  may	  be	  subject	  to	  high	  variations	  in	  pCO2,	  ranging	  from	  <200	  μatm	  to	  >1000	  μatm	  (Evans	  et	  al.,	  2011).	  In	  fact,	  elevated	  surface	  water	  pCO2	  of	  about	  1000	  μatm	  has	  been	  repeatedly	  measured	  over	  a	  2-­‐month	  period	  in	  that	  region	  (Evans	  et	  al.,	  2011).	  Near-­‐shore	  environments,	  such	  as	  estuaries,	  which	  provide	  refuge	  to	  schools	  of	  pink	  salmon	  before	  they	  double	  in	  size	  and	  begin	  their	  offshore	  migration	  (Heard,	  1991),	  may	  also	  be	  subjected	  to	  large	  variations	  in	  pCO2.	  Carbonate	  chemistry	  data	  from	  Puget	  Sound,	  a	  large	  estuary	  on	  the	  West	  Coast	  of	  North	  America,	  indicate	  that	  pCO2	  may	  exceed	  2500	  μatm	  during	  autumn	  near	  surface	  waters	  (Reum	  et	  al.,	  2014).	  In	  addition,	  long-­‐term	  records	  of	  pH	  in	  the	  Georgia	  Strait	  show	  pH	  regularly	  dropping	  to	  as	  low	  as	  7.5	  from	  the	  year	  2001	  and	  onward	  (Marliave	  et	  al.,	  2011).	  This	  pH	  drop	  corresponds	  to	  a	  pCO2	  estimate	  of	  1600	  μatm,	  at	  which	  level	  our	  study	  found	   38 detriments	  to	  growth	  and	  aerobic	  performance	  in	  pink	  salmon.	  Taken	  together,	  pink	  salmon	  fry	  may	  currently	  be	  exposed	  to	  prolonged	  detrimental	  levels	  of	  pCO2	  during	  their	  seaward	  migration.	  	  2.45	  Summary	  	   This	  study	  provides	  the	  first	  investigation	  into	  the	  impacts	  of	  climate	  change-­‐related	  acidification	  on	  an	  anadromous	  fish	  species	  during	  development	  in	  both	  freshwater	  and	  seawater.	  We	  show	  that	  the	  growth	  and	  performance	  capacity	  of	  pink	  salmon	  are	  substantially	  reduced	  at	  an	  extremely	  critical	  and	  sensitive	  life-­‐stage	  under	  future	  projected	  increases	  in	  pCO2.	  Based	  on	  recent	  oceanic	  surveys,	  the	  pCO2	  levels	  we	  investigated	  may	  already	  be	  occurring	  on	  our	  coasts.	  If	  this	  is	  the	  case,	  then	  our	  current	  pink	  salmon	  populations	  may	  already	  be	  vulnerable,	  which	  could	  have	  large	  implications	  on	  the	  future	  health	  of	  our	  coastal	  ecosystems.	  	   	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   39 	          Figure	  2.1.	  Total	  alevin	  pink	  salmon	  wet	  mass	  (yolk	  included)	  during	  development	  in	  freshwater	  from	  2	  weeks	  pre-­‐hatch	  (time	  0	  of	  CO2	  exposure)	  up	  until	  1	  week	  before	  seawater	  transfer	  (weeks	  10	  of	  CO2	  exposure)	  at	  different	  pCO2	  tensions	  (indicated	  in	  the	  figure	  where	  400-­‐2000	  μatm	  represents	  a	  diurnal	  cycle	  and	  other	  tensions	  are	  constant	  throughout).	  Dashed	  line	  represents	  time	  of	  hatch.	  Arrow	  indicates	  yolk	  sac	  absorption	  (YSA).	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  8).	  There	  was	  a	  significant	  effect	  of	  CO2	  treatment	  throughout	  freshwater	  development.	  Letters	  that	  differ	  indicate	  statistically	  significant	  differences	  among	  groups	  at	  YSA	  (p<0.05).	           2 4 6 8 (weeks)Total Alevin Wet Mass (g)!""#$%&'("""#$%&')"""#$%&'!""*)"""#$%&'%%+%++,-. 40         Figure	  2.2.	  Pink	  salmon	  tissue	  wet	  mass	  (yolk	  excluded)	  during	  development	  in	  freshwater	  from	  2	  weeks	  post-­‐hatch	  (week	  4	  of	  CO2	  exposure)	  up	  until	  1	  week	  before	  seawater	  transfer	  (week	  10	  of	  CO2	  exposure)	  at	  different	  pCO2	  tensions	  (indicated	  in	  the	  figure	  where	  400-­‐2000	  μatm	  represents	  a	  diurnal	  cycle	  and	  other	  tensions	  are	  constant	  throughout).	  Arrow	  indicates	  yolk	  sac	  absorption	  (YSA).	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  8).	  There	  was	  significant	  effect	  of	  CO2	  treatment	  throughout	  freshwater	  development.	  Letters	  that	  differ	  indicate	  statistically	  significant	  differences	  among	  groups	  at	  YSA	  (p<0.05).	  	  	        ! " # $ % & '(()(%()'(()'*()'!()'#()'%()*(()**Time (weeks)Tissue Wet Mass (g)1000 μatm400-2000 μatm400 μatm2000 μatm++,,--./0 41             Figure	  2.3.	  Pink	  salmon	  tissue	  dry	  mass	  (yolk	  excluded)	  at	  week	  10	  (1	  week	  before	  seawater	  transfer).	  Values	  below	  bars	  represent	  the	  pCO2	  levels	  in	  μatm	  (400-­‐2000	  μatm	  represents	  a	  diurnal	  cycle	  and	  other	  tensions	  are	  constant	  throughout).	  Dashed	  line	  represents	  mean	  value	  of	  the	  control	  group	  (400	  μatm).	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  8).	  Asterisks	  indicate	  statistically	  significant	  difference	  from	  the	  control	  group	  (p<0.05).	             400 1000 2000 400-20005101520253035Tissue Dry Mass (mg)! 42          Figure	  2.4.	  Pink	  salmon	  fork	  lengths	  during	  development	  in	  freshwater	  from	  3	  weeks	  post-­‐hatch	  (week	  5	  of	  CO2	  exposure)	  up	  until	  1	  week	  before	  seawater	  transfer	  (week	  10	  of	  CO2	  exposure)	  at	  different	  pCO2	  tensions	  (indicated	  in	  the	  figure	  where	  400-­‐2000	  μatm	  represents	  a	  diurnal	  cycle	  and	  other	  tensions	  are	  constant	  throughout).	  Arrow	  indicates	  yolk	  sac	  absorption	  (YSA).	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  8).	  There	  was	  significant	  effect	  of	  CO2	  treatment	  throughout	  freshwater	  development.	  Letters	  that	  differ	  indicate	  statistically	  significant	  differences	  among	  groups	  at	  YSA	  (p<0.05)	          5 6 7 8 9 1028303234Time (weeks)Length (mm)!""#$%&'("""#$%&')"""#$%&'!""*)"""#$%&'%++,,-./ 43            Figure	  2.5.	  Pink	  salmon	  yolk	  wet	  mass	  during	  development	  in	  freshwater	  from	  2	  weeks	  post-­‐hatch	  (week	  4	  of	  CO2	  exposure)	  up	  until	  1	  week	  before	  seawater	  transfer	  (week	  10	  of	  CO2	  exposure)	  at	  different	  pCO2	  tensions	  (indicated	  in	  the	  figure	  where	  400-­‐2000	  μatm	  represents	  a	  diurnal	  cycle	  and	  other	  tensions	  are	  constant	  throughout).	  Arrow	  indicates	  yolk	  sac	  absorption	  (YSA).	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  8).	  There	  was	  no	  significant	  effect	  of	  CO2	  treatment	  throughout	  freshwater	  development.	           ! " # $ % & '(()(*()(!()(#()(%()'(Time (weeks)Yolk Wet Mass (g)1000 μatm400-2000 μatm400 μatm2000 μatm+,- 44             Figure	  2.6.	  Pink	  salmon	  yolk	  wet	  mass	  at	  week	  10	  (1	  week	  before	  seawater	  transfer).	  Values	  below	  bars	  represent	  the	  pCO2	  levels	  in	  μatm	  (400-­‐2000	  μatm	  represents	  a	  diurnal	  cycle	  and	  other	  tensions	  are	  constant	  throughout).	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  8).	  No	  significant	  differences	  among	  groups.	  	              400 1000 2000 400-2000481216202428Yolk Wet Mass (mg) 45            Figure	  2.7.	  Pink	  salmon	  yolk	  dry	  mass	  at	  week	  10	  (1	  week	  before	  seawater	  transfer).	  Values	  below	  bars	  represent	  the	  pCO2	  levels	  in	  μatm	  (400-­‐2000	  μatm	  represents	  a	  diurnal	  cycle	  and	  other	  tensions	  are	  constant	  throughout).	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  8).	  No	  significant	  differences	  among	  groups.	  	              400 1000 2000 400-20002468101214Yolk Dry Mass (mg) 46            Figure	  2.8.	  Production	  efficiencies	  (net	  tissue	  produced/net	  yolk	  consumption	  x	  100)	  at	  week	  10	  (1	  week	  before	  seawater	  transfer).	  Values	  below	  bars	  represent	  the	  pCO2	  levels	  in	  μatm	  (400-­‐2000	  μatm	  represents	  a	  diurnal	  cycle	  and	  other	  tensions	  are	  constant	  throughout).	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  8).	  Asterisks	  indicate	  statistically	  significant	  difference	  from	  the	  control	  group	  (p<0.05).	              400 1000 2000 400-2000020406080Production Efficency! 47          Figure	  2.9.	  Absolute	  growth	  rates	  after	  2	  weeks	  following	  seawater	  transfer.	  *High	  CO2	  group	  represent	  fish	  reared	  in	  high	  CO2	  in	  freshwater	  (2000	  μatm)	  and	  transferred	  into	  high	  CO2	  in	  seawater	  (1600	  μatm).	  The	  remaining	  3	  groups	  were	  all	  reared	  in	  control	  freshwater	  (400	  μatm)	  and	  transferred	  into	  different	  seawater	  CO2	  treatments	  (high,	  1600	  μatm;	  fluctuating,	  400-­‐1600	  μatm;	  control,	  400	  μatm).	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  8).	  Asterisks	  indicate	  significant	  difference	  from	  the	  control	  group	  (p<0.05).	  	  	         !"#$%"&'&()$(*+#,-!./01,2-!./301,2-!./-2-10123!"#$%&'()%*'+,-./)01! 48          Figure	  2.10.	  Routine	  MO2	  during	  development	  in	  freshwater	  from	  2	  weeks	  pre-­‐hatch	  (time	  0	  of	  CO2	  exposure)	  up	  until	  1	  week	  before	  seawater	  transfer	  (week	  10	  of	  CO2	  exposure)	  at	  different	  pCO2	  tensions	  (indicated	  in	  the	  figure	  where	  400-­‐2000	  μatm	  represents	  a	  diurnal	  cycle	  and	  other	  tensions	  are	  constant	  throughout).	  Dashed	  line	  represents	  time	  of	  hatch.	  Arrow	  indicates	  yolk	  sac	  absorption	  (YSA).	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  6-­‐8).	  There	  was	  no	  significant	  effect	  of	  CO2	  treatment	  throughout	  freshwater	  development.	         ! " # $ %&!"#$%&Time (weeks)Routine MO2 (umol/g/h)1000 μatm400-2000 μatm400 μatm2000 μatmYSA 49            Figure	  2.11.	  Routine	  MO2	  at	  day	  1,	  7	  and	  14	  post-­‐seawater	  transfer.	  Fish	  were	  reared	  at	  different	  pCO2	  tensions	  in	  freshwater	  for	  11	  weeks	  prior	  to	  seawater	  transfer.	  Fish	  reared	  in	  control	  freshwater	  conditions	  were	  transferred	  into	  1	  of	  3	  different	  seawater	  treatments:	  a	  control	  CO2	  treatment	  (400→400	  μatm),	  a	  high	  CO2	  treatment	  (400→1600	  μatm),	  or	  a	  24hr	  oscillating	  CO2	  treatment	  (400→400-­‐1600	  μatm).	  Fish	  reared	  in	  high	  CO2	  freshwater	  conditions	  were	  transferred	  to	  a	  high	  CO2	  seawater	  treatment	  (2000→1600	  μatm).	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  6-­‐8).	  No	  significant	  differences	  among	  groups.	           ! " # $ %& %! %"#'$(%&%%%!Time (days)Routine MO2 (umol/g/h)!&&&)*+,-! %#&&)*+,"&&)*+,-! %#&&)*+,"&&)*+,-! "&&.%#&&)*+,"&&)*+,-! "&&)*+, 50            Figure	  2.12.	  Maximum	  MO2	  at	  day	  1,	  7	  and	  14	  post-­‐seawater	  transfer.	  Fish	  were	  reared	  at	  different	  pCO2	  tensions	  in	  freshwater	  for	  11	  weeks	  prior	  to	  seawater	  transfer.	  Fish	  reared	  in	  control	  freshwater	  conditions	  were	  transferred	  into	  1	  of	  3	  different	  seawater	  treatments:	  a	  control	  CO2	  treatment	  (400→400	  μatm),	  a	  high	  CO2	  treatment	  (400→1600	  μatm),	  or	  a	  24hr	  oscillating	  CO2	  treatment	  (400→400-­‐1600	  μatm).	  Fish	  reared	  in	  high	  CO2	  freshwater	  conditions	  were	  transferred	  to	  a	  high	  CO2	  seawater	  treatment	  (2000→1600	  μatm).	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  6-­‐8).	  There	  was	  a	  significant	  effect	  of	  CO2	  treatment	  throughout	  seawater	  exposure.	  Asterisks	  indicate	  statistically	  significant	  differences	  among	  groups	  (p<0.05).	           ! " # $ %& %! %"!&!"!$'!'#"&Time (days)Max MO2 (umol/g/h)!&&&()*+,! %#&&()*+"&&()*+,! %#&&()*+"&&()*+,! "&&-%#&&()*+"&&()*+,! "&&()*+! 51             Figure	  2.13.	  Aerobic	  scope	  at	  day	  1,	  7	  and	  14	  post-­‐seawater	  transfer.	  Fish	  were	  reared	  at	  different	  pCO2	  tensions	  in	  freshwater	  for	  11	  weeks	  prior	  to	  seawater	  transfer.	  Fish	  reared	  in	  control	  freshwater	  conditions	  were	  transferred	  into	  1	  of	  3	  different	  seawater	  treatments:	  a	  control	  CO2	  treatment	  (400→400	  μatm),	  a	  high	  CO2	  treatment	  (400→1600	  μatm),	  or	  a	  24hr	  oscillating	  CO2	  treatment	  (400→400-­‐1600	  μatm).	  Fish	  reared	  in	  high	  CO2	  freshwater	  conditions	  were	  transferred	  to	  a	  high	  CO2	  seawater	  treatment	  (2000→1600	  μatm).	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  6-­‐8).	  There	  was	  a	  significant	  effect	  of	  CO2	  treatment	  throughout	  seawater	  exposure	  (p<0.05).	           ! " # $ %& %! %"%&%"%$!!!#'&'"Time (days)Aerobic Scope (umol/g/h)!&&&()*+,! %#&&()*+"&&()*+,! %#&&()*+"&&()*+,! "&&-%#&&()*+"&&()*+,! "&&()*+ 52            Figure	  2.14.	  Routine	  and	  maximum	  MO2	  during	  development	  in	  freshwater	  and	  following	  seawater	  transfer	  at	  control	  (400→400	  μatm)	  or	  high	  CO2	  (2000→1600	  μatm).	  Dashed	  line	  indicates	  time	  of	  seawater	  transfer.	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  6-­‐8).	  No	  significant	  differences	  in	  routine	  MO2	  between	  the	  control	  and	  high	  CO2	  group	  during	  freshwater	  development	  and	  following	  seawater	  transfer.	  There	  was	  a	  significant	  effect	  of	  CO2	  treatment	  on	  maximum	  MO2	  3	  weeks	  prior	  to	  and	  following	  seawater	  transfer	  (p<0.05).	          ! " # $ %& %! %"'%&%'!&!'(&('"&Time (weeks)MO2 (umol/g/h)Control RoutineHigh CO2 RoutineControl MaxHigh CO2 Max 53             Figure	  2.15.	  Aerobic	  scope	  3	  weeks	  before	  and	  3	  weeks	  following	  seawater	  transfer	  at	  control	  (400→400	  μatm)	  or	  high	  CO2	  (2000→1600	  μatm).	  Dashed	  line	  indicates	  time	  of	  seawater	  transfer.	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  6-­‐8).	  There	  was	  a	  significant	  effect	  of	  CO2	  treatment	  3	  weeks	  prior	  to	  and	  following	  seawater	  transfer	  (p<0.05).	  	  (p<0.05).	         ! " #$ ## #% #&#$#'%$%'&$&'Time (weeks)Aerobic Scope (umol/g/h)ControlHigh CO2 54              Figure	  2.16.	  Factorial	  scope	  3	  before	  and	  3	  weeks	  following	  seawater	  transfer	  at	  control	  (400→400	  μatm)	  or	  high	  CO2	  (2000→1600	  μatm).	  Dashed	  line	  indicates	  time	  of	  seawater	  transfer.	  Values	  are	  means	  ±	  SEM	  (n	  =	  6-­‐8).	  There	  was	  a	  significant	  effect	  of	  CO2	  treatment	  3	  weeks	  prior	  to	  and	  following	  seawater	  transfer	  (p<0.05).	         ! " #$ ## #% #&%&'()Time (weeks)Factorial ScopeControlHigh CO2 55 Table	  2.1.	  Time	  in	  weeks	  post	  CO2	  exposure	  in	  freshwater	  and	  following	  seawater	  transfer	  with	  corresponding	  age	  of	  pink	  salmon	  embryos/alevin/fry	  in	  accumulated	  thermal	  units	  (ATU).	  CO2	  exposure	  was	  initiated	  in	  this	  experiment	  at	  2	  weeks	  pre-­‐hatch	  (week	  0)	  up	  until	  2	  weeks	  following	  seawater	  transfer	  (week	  13).	  YSA	  indicates	  yolk-­‐sac	  absorption.	    Time	  (weeks)	   Age	  (ATU)	   Notes	  0	   470.1	   transfer	  into	  of	  CO2	  treatments	  1	   529.8	   	  2	   586.6	   hatch	  3	   641.1	   	  	  4	   692.3	   	  	  5	   741.4	   	  	  6	   785.4	   	  	  7	   825.9	   	  	  8	   868.4	   	  	  9	   910.5	   	  	  10	   952.6	   	  11	   994.7	   seawater	  transfer/	  YSA	  12	   1037.5	   	  	  13	   1072.4	   end	  of	  CO2	  exposure	                     56 Table	  2.2.	  Fork	  lengths	  of	  pink	  salmon	  fry	  2	  weeks	  post-­‐seawater	  transfer	  (week	  13	  of	  CO2	  exposure).	  Fish	  were	  reared	  at	  different	  pCO2	  tensions	  in	  freshwater	  for	  11	  weeks	  prior	  to	  seawater	  transfer.	  Fish	  reared	  in	  control	  freshwater	  conditions	  were	  transferred	  into	  1	  of	  3	  different	  seawater	  treatments:	  a	  control	  CO2	  treatment	  (400→400	  μatm),	  a	  high	  CO2	  treatment	  (400→1600	  μatm),	  or	  a	  24hr	  oscillating	  CO2	  treatment	  (400→400-­‐1600	  μatm).	  Fish	  reared	  in	  high	  CO2	  freshwater	  conditions	  were	  transferred	  to	  a	  high	  CO2	  seawater	  treatment	  (2000→1600	  μatm).	  Data	  are	  means	  ±	  SEM	  (n=8).	  	   CO2	  Treatment	   Fork	  Length	  (mm)	  400→400	  μatm	   33.1	  ±	  0.2	  400→1600	  μatm	   32.0	  ±	  0.2	  400→400-­‐1600	  μatm	   32.4	  ±	  0.4	  2000→1600	  μatm	   32.2	  ±	  0.5	   	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   57 [3]	  General	  Discussion	  and	  conclusions	  	  3.1	  Thesis	  Summary	  	   This	  study	  provides	  some	  of	  the	  first	  work	  on	  the	  effects	  of	  climate	  change-­‐related	  acidification	  in	  an	  anadromous	  fish	  species	  during	  development	  in	  both	  freshwater	  and	  seawater.	  According	  to	  my	  study,	  pink	  salmon	  exhibit	  reduced	  growth	  at	  multiple	  development	  stages	  under	  elevated	  pCO2.	  Growth	  was	  reduced	  during	  freshwater	  development	  as	  alevin	  and	  also	  following	  seawater	  transfer	  as	  fry.	  Specifically,	  size,	  production	  efficiencies	  and	  absolute	  growth	  rates	  were	  reduced	  at	  freshwater	  tensions	  of	  1000	  and	  2000	  μatm	  and	  seawater	  tensions	  of	  1600	  μatm.	  In	  terms	  of	  performance	  capacity,	  aerobic	  scope	  was	  reduced	  at	  high	  pCO2	  following	  seawater	  transfer,	  through	  a	  reduction	  in	  MO2max	  and	  not	  MO2routine.	  MO2max	  dramatically	  increased	  7	  days	  post-­‐seawater	  transfer	  in	  the	  control	  and	  oscillating	  pCO2	  groups.	  By	  contrast,	  fish	  transferred	  into	  high	  CO2,	  regardless	  of	  their	  rearing	  conditions,	  showed	  a	  significantly	  reduced	  increase	  in	  MO2max.	  	  	  3.2	  Potential	  for	  acclimation	  and	  adaptation	  	   	  The	  results	  from	  my	  thesis	  indicate	  substantial	  negative	  impacts	  of	  elevated	  pCO2	  on	  pink	  salmon.	  While	  this	  information	  informs	  upon	  the	  impact	  of	  developing	  pink	  salmon	  migrating	  into	  high	  pCO2	  tensions	  currently	  seen	  in	  coastal	  marine	  environments	  (see	  Chapter	  2),	  it	  is	  more	  difficult	  to	  predict	  how	  these	  changes	  may	  impact	  future	  pink	  salmon	  populations	  without	  studying	  their	  capacity	  for	  adaptation.	  In	  order	  to	  make	  insightful	  predictions	  about	  how	  species	  will	  respond	   58 to	  climate	  change,	  an	  evolutionary	  perspective	  is	  required	  (Ho	  and	  Burggren,	  2009;	  Pandolfi	  et	  al.,	  2011;	  Munday	  et	  al.,	  2013).	  While	  there	  are	  many	  examples	  of	  a	  negative	  effect	  of	  OA	  on	  marine	  invertebrates	  and	  fish,	  few	  have	  taken	  into	  account	  the	  potential	  for	  acclimation	  and	  adaptation.	  Since	  species	  have	  the	  capacity	  to	  acclimate	  and	  adapt	  to	  changing	  environmental	  conditions,	  climate	  change	  models	  that	  do	  not	  account	  for	  this	  possibility	  may	  misrepresent	  the	  severity	  of	  ecological	  consequences	  (Pandolfi	  et	  al.,	  2011).	  	  In	  the	  face	  of	  rapid	  environmental	  change,	  phenotypic	  plasticity	  may	  help	  mitigate	  the	  adverse	  effects	  of	  climate	  change,	  allowing	  time	  for	  genetic	  adaptation	  (Chevin,	  2010).	  Acclimation	  is	  a	  type	  of	  phenotypic	  plasticity,	  which	  results	  in	  reversible	  changes	  in	  an	  individual’s	  phenotype	  in	  response	  to	  environmental	  change	  (Schulte	  et	  al.,	  2011).	  Acclimation	  can	  occur	  within	  the	  lifetime	  of	  an	  individual	  or	  trans-­‐generationally	  through	  parental	  epigenetic	  effects	  (Ho	  and	  Burggren,	  2009;	  Donselson	  et	  al.,	  2012).	  Under	  future	  climate	  change	  conditions,	  the	  capacity	  for	  developmental	  and	  transgenerational	  acclimation	  has	  been	  documented	  in	  two	  species	  of	  tropical	  reef	  fish	  (Donselson	  et	  al.,	  2012;	  Miller	  et	  al.,	  2012).	  During	  exposure	  to	  elevated	  temperature,	  the	  damselfish,	  Acanthochromis	  polyacanthus,	  showed	  a	  reduction	  in	  aerobic	  scope;	  however,	  development	  at	  high	  temperatures	  resulted	  in	  the	  partial	  recovery	  of	  scope	  (Donselson	  et	  al.,	  2012).	  Furthermore,	  offspring	  from	  parents	  reared	  at	  high	  temperatures	  were	  able	  to	  compensate	  for	  the	  reduction	  in	  scope	  with	  complete	  recovery	  occurring	  over	  3	  generations	  (Donselson	  et	  al.,	  2012).	  Similarly,	  elevated	  temperature	  and	  CO2	  resulted	  in	  increases	  in	  MO2routine	  and	  decreases	  in	  the	  growth	  of	  the	  juvenile	  anemone	  fish,	  A.	  melanopus,	   59 with	  reversal	  of	  effects	  occurring	  in	  offspring	  from	  parents	  exposed	  to	  high	  temperature	  and	  CO2	  (Miller	  et	  al.,	  2012).	  	  By	  comparison,	  our	  work	  is	  unable	  to	  shed	  light	  on	  the	  potential	  for	  transgenerational	  acclimation	  in	  pink	  salmon	  in	  response	  to	  climate	  change.	  However,	  development	  in	  high	  CO2	  in	  freshwater	  does	  not	  appear	  to	  mitigate	  the	  effects	  of	  high	  CO2	  following	  seawater	  transfer.	  Regardless	  of	  CO2	  rearing	  conditions	  in	  freshwater,	  transfer	  to	  high	  CO2	  seawater	  reduced	  growth	  rates	  and	  aerobic	  capacity	  in	  pink	  salmon.	  Since	  embryos	  were	  transferred	  into	  their	  CO2	  freshwater	  treatments	  at	  the	  eyed	  egg	  stage,	  the	  potential	  for	  developmental	  acclimation	  may	  be	  restricted	  to	  early	  stages	  after	  fertilization;	  therefore,	  our	  study	  is	  unable	  to	  fully	  address	  whether	  pink	  salmon	  have	  the	  potential	  for	  acclimation	  during	  development.	  For	  adaptation	  to	  occur,	  there	  must	  be	  genetic	  variation	  in	  heritable	  traits	  that	  are	  subject	  to	  differential	  selection.	  Research	  investigating	  thermal	  tolerance	  among	  distinct	  populations	  of	  Fraser	  River	  sockeye	  salmon	  suggests	  that	  these	  salmon	  populations	  may	  possess	  the	  genetic	  potential	  to	  adapt	  to	  elevated	  river	  temperatures	  (Eliason	  et	  al.,	  2011).	  Although	  we	  show	  considerable	  detriments	  to	  the	  early	  life-­‐stages	  of	  pink	  salmon	  at	  pCO2	  levels	  projected	  by	  the	  end	  of	  the	  century,	  we	  cannot	  predict	  how	  wild	  populations	  of	  pink	  salmon	  may	  respond	  to	  the	  acidifying	  effects	  of	  climate	  change.	  It	  appears,	  however,	  that	  pink	  salmon	  possess	  an	  unrivaled	  capacity	  for	  aerobic	  performance	  within	  a	  broad	  range	  of	  environmental	  temperatures	  (Clark	  et	  al.,	  2011).	  While	  this	  does	  not	  suggest	  that	  they	  will	  be	  resilient	  to	  acidification,	  their	  ability	  to	  withstand	  higher	  temperatures	   60 will	  undoubtedly	  ease	  the	  combined	  stress	  of	  acidification	  and	  temperature.	  In	  addition,	  pink	  salmon	  have	  high	  fecundity	  and	  relatively	  short	  generation	  times	  with	  adults	  returning	  to	  spawn	  after	  only	  2	  years	  of	  ocean	  residency	  (Heard,	  1991),	  which	  could	  allow	  ample	  time	  for	  adaptation	  over	  the	  next	  century	  or	  two;	  the	  time	  over	  which	  the	  projected	  increases	  in	  pCO2	  are	  proposed.	  However,	  more	  recent	  research	  suggests	  that	  coastal	  ecosystems	  are	  currently	  experiencing	  large	  seasonal	  variations	  in	  pCO2	  at	  levels	  that	  far	  surpass	  future	  climate	  change-­‐related	  estimates	  (Reum	  et	  al.	  2014;	  Frieder	  et	  al.,	  2012;	  Evans	  et	  al.,	  2011).	  Interestingly,	  the	  evolution	  of	  plasticity	  is	  favored	  when	  environmental	  variation	  is	  frequent	  and	  temporally	  defined	  (Schlichting	  and	  Smith	  2002).	  Although	  detriments	  to	  growth	  and	  aerobic	  performance	  may	  occur	  during	  short-­‐term	  exposure	  to	  high	  pCO2,	  natural	  coastal	  variations	  in	  pCO2	  may	  help	  drive	  the	  evolution	  of	  plasticity	  in	  pink	  salmon,	  which	  has	  large	  implications	  on	  their	  capacity	  to	  adapt	  to	  climate	  change.	  The	  potential	  for	  adaptation	  also	  requires	  that	  there	  be	  adequate	  standing	  genetic	  variation	  within	  a	  population	  (Endler,	  1986).	  Microsatellite	  data	  on	  various	  pink	  salmon	  populations	  show	  substantial	  heterogeneity	  of	  allelic	  frequencies	  at	  multiple	  loci	  between	  odd	  and	  even-­‐year	  broodlines	  as	  well	  as	  within	  odd-­‐year	  broodlines	  (Beacham	  et	  al.,	  1985).	  Populations	  of	  Fraser	  River,	  Canadian	  non-­‐Fraser	  River	  and	  Puget	  Sound	  pink	  salmon	  appear	  to	  be	  fairly	  distinct	  (Beacham	  et	  al.,	  1985).	  The	  Fraser	  River	  population,	  however,	  showed	  the	  least	  genetic	  variability	  (Beacham	  et	  al.,	  1985).	  Despite	  this,	  pink	  salmon	  populations	  may	  have	  greater	  potential	  for	  gene	  flow	  relative	  to	  other	  Pacific	  salmon,	  since	  they	  display	  low	  site	  fidelity	  and	  thus	  are	  often	  considered	  colonizers	  (Clark	  et	  al.,	  2011).	  	  	   61 3.3	  Increase	  in	  MO2max	  following	  seawater	  entry	  	   The	  dramatic	  increase	  in	  MO2max	  following	  seawater	  transfer	  is	  arguably	  one	  of	  the	  most	  interesting	  findings	  in	  this	  thesis.	  Naturally,	  this	  leads	  to	  the	  formulation	  of	  two	  new	  questions:	  1)	  what	  are	  the	  physiological	  mechanisms	  underlying	  this	  rapid	  increase	  in	  MO2max	  following	  seawater	  transfer,	  and	  2)	  what	  is	  limiting	  MO2max	  at	  elevated	  tensions	  of	  pCO2?	  	   The	  inability	  to	  match	  oxygen	  supply	  with	  oxygen	  demand	  is	  thought	  to	  be	  key	  in	  limiting	  MO2	  (Lindstedt	  and	  Conely,	  2001).	  The	  transport	  of	  oxygen	  from	  the	  environment	  to	  the	  mitochondria	  consists	  of	  the	  5	  following	  steps:	  1)	  ventilation,	  which	  brings	  oxygen	  in	  contact	  with	  respiratory	  surfaces,	  2)	  the	  diffusion	  of	  oxygen	  across	  the	  respiratory	  surface	  into	  the	  blood,	  3)	  the	  delivery	  of	  oxygen	  throughout	  the	  body	  via	  circulation,	  4)	  tissue	  diffusion	  from	  the	  capillaries	  to	  the	  mitochondria,	  and	  5)	  oxygen	  consumption	  at	  the	  mitochondria	  (Weibel,	  1984).	  If	  the	  transport	  of	  oxygen	  is	  limiting	  aerobic	  capacity,	  then	  natural	  selection	  should	  work	  to	  maximize	  oxygen	  flux.	  A	  theory	  known	  as	  symmorphosis	  suggests	  that	  every	  step	  in	  the	  transport	  pathway	  must	  be	  matched	  in	  oxygen	  flux	  in	  order	  to	  enhance	  overall	  capacity	  (Weibel,	  1984;	  Weibel	  et	  al.,	  1991).	  By	  this	  theory,	  the	  release	  of	  developmental	  bottlenecks	  at	  one	  or	  multiple	  steps	  of	  the	  transport	  cascade	  could	  explain	  the	  dramatic	  and	  rapid	  increase	  in	  MO2max	  of	  pink	  salmon	  following	  seawater	  transfer.	  In	  developing	  embryos,	  the	  developmental	  trajectory	  of	  different	  organ	  systems	  may	  vary,	  with	  certain	  organs	  functioning	  well	  before	  others	  (Burggren	  and	  Reyna,	  2011).	  If	  organs	  or	  tissues	  from	  one	  or	  multiple	  steps	  in	  the	  transport	  cascade	  are	  no	  longer	  rate-­‐limiting,	  then	  significant	  increases	  in	  MO2	  are	   62 possible.	  Perhaps	  pink	  salmon	  are	  developing	  as	  fast	  as	  possible	  with	  systems	  becoming	  optimal	  near	  the	  end	  of	  yolk	  absorption.	  In	  the	  context	  of	  their	  remarkable	  life	  history,	  the	  capability	  of	  quickly	  elevating	  performance	  capacity	  is	  highly	  advantageous	  as	  their	  life	  history	  transitions	  from	  a	  sedentary	  (within	  gravel)	  to	  migratory	  strategy,	  and	  they	  move	  into	  a	  high	  predator	  environment	  at	  a	  vulnerable	  size.	  	  Reductions	  in	  MO2max	  under	  elevated	  tensions	  suggest	  that	  migrating	  pink	  salmon	  fry	  may	  be	  particularly	  sensitive	  to	  acidification;	  however,	  what	  are	  the	  specific	  physiological	  determinants	  underlying	  this	  reduction?	  Since	  fry	  exhibit	  negative	  growth	  rates	  post-­‐seawater	  transfer,	  indicating	  water	  loss	  and/or	  tissue	  catabolism,	  the	  combined	  stress	  of	  acidification	  and	  salinity	  may	  impair	  hypo-­‐osmoregulatory	  capabilities,	  thus	  reducing	  overall	  performance	  capacity.	  Alternatively,	  development	  at	  high	  pCO2	  may	  be	  impaired	  or	  delayed.	  In	  this	  case,	  developmental	  bottlenecks	  in	  the	  oxygen	  transport	  cascade,	  such	  as	  a	  smaller	  relative	  heart	  size	  or	  lower	  gill	  surface,	  may	  result	  in	  a	  reduced	  capacity	  for	  oxygen	  flux	  and	  thus	  a	  reduced	  capacity	  for	  performance.	  Clearly,	  there	  are	  many	  areas	  for	  further	  investigation	  into	  what	  I	  consider	  to	  be	  one	  of	  the	  most	  interesting	  findings	  of	  my	  thesis,	  which	  I	  expand	  upon	  below.	  	  3.4	  Freshwater	  acidification	  	  	   Climate	  change-­‐related	  acidification	  is	  occurring	  in	  our	  freshwater	  environments,	  yet	  little	  is	  known	  about	  its	  potential	  impacts	  on	  freshwater	  communities	  and	  ecosystems.	  One	  large	  contributor	  to	  our	  lack	  of	  knowledge	  is	  the	   63 difficulty	  of	  characterizing	  and	  monitoring	  large	  numbers	  of	  freshwater	  streams	  and	  rivers,	  which	  may	  vary	  greatly	  in	  their	  water	  chemistry.	  By	  contrast,	  the	  ocean	  is	  generally	  more	  homogenous	  with	  large	  coastal	  regions	  showing	  very	  similar	  characteristics	  and	  patterns.	  As	  a	  result,	  it	  may	  be	  hard	  to	  generalize	  and	  apply	  our	  results	  to	  most	  freshwater	  systems.	  Since	  pH	  is	  dependent	  on	  factors	  other	  than	  just	  pCO2,	  streams	  varying	  in	  ion	  composition	  may	  differ	  considerably	  in	  total	  alkalinity	  and	  thus	  pH	  at	  a	  given	  pCO2.	  If	  the	  observed	  effects	  are	  pH-­‐induced	  and	  not	  CO2-­‐induced,	  then	  it	  may	  be	  difficult	  to	  make	  general	  inferences	  on	  the	  ecological	  implications	  of	  climate	  change-­‐related	  acidification	  in	  freshwater	  systems.	  Therefore,	  to	  address	  CO2-­‐induced	  acidification	  in	  freshwater,	  research	  investigating	  both	  pCO2	  and	  pH	  effects	  in	  varying	  types	  of	  freshwater	  sources	  is	  required	  to	  better	  understand	  the	  mechanistic	  basis	  for	  impaired	  growth	  and	  development	  observed	  in	  this	  thesis	  as	  discussed	  below.	  	   	   	  3.5	  Research	  limitations	  and	  future	  directions	  	   The	  reminder	  of	  this	  discussion	  will	  briefly	  touch	  on	  several	  limitations	  in	  this	  thesis,	  while	  providing	  future	  directions	  for	  new	  questions	  that	  have	  arisen	  from	  this	  work.	  	  	   Future	  research	  should	  investigate	  the	  potential	  role	  that	  acclimation	  and	  adaptation	  may	  play	  in	  determining	  how	  pink	  salmon	  populations	  may	  respond	  to	  climate	  change.	  The	  capacity	  for	  developmental	  and	  transgenerational	  acclimation	  has	  been	  demonstrated	  in	  a	  few	  species	  of	  tropical	  reef	  fish	  (Donselson	  et	  al.,	  2012;	  Miller	  et	  al.,	  2012).	  Similar	  developmental	  and	  transgenerational	  experiments	  could	   64 be	  performed	  on	  pink	  salmon.	  Since	  our	  CO2	  exposures	  started	  at	  the	  eyed	  embryo	  stage,	  CO2	  exposures	  starting	  at	  fertilization	  would	  allow	  us	  to	  thoroughly	  examine	  the	  potential	  for	  developmental	  acclimation.	  Long-­‐term	  selection	  experiments	  selecting	  for	  CO2	  tolerance	  among	  individuals	  could	  also	  look	  into	  the	  role	  that	  adaptation	  may	  play.	  	   Among	  the	  new	  questions	  that	  have	  emerged	  from	  this	  thesis,	  that	  of	  the	  dramatic	  increase	  in	  MO2max	  is	  perhaps	  the	  most	  intriguing.	  As	  discussed	  above,	  one	  explanation	  may	  be	  the	  release	  of	  developmental	  bottlenecks	  in	  the	  oxygen	  transport	  cascade.	  To	  test	  this	  hypothesis,	  one	  could	  investigate	  physiological	  changes	  occurring	  at	  all	  of	  the	  different	  steps	  in	  the	  cascade	  following	  seawater	  transfer.	  Proceeding	  through	  each	  step,	  changes	  in	  buccal	  pump	  capacity,	  gill	  surface	  area,	  relative	  heart	  size,	  capillary	  density	  and	  mitochondrial	  enzyme	  activity	  could	  be	  examined	  in	  pink	  salmon	  alevin	  and	  fry	  to	  elucidate	  the	  underlying	  physiological	  mechanisms	  behind	  the	  rapid	  increase	  in	  aerobic	  capacity.	  Similar	  comparisons	  at	  various	  stages	  of	  the	  oxygen	  transport	  cascade	  could	  be	  made	  between	  control	  and	  high	  CO2-­‐reared	  fish	  prior	  to	  and	  following	  seawater	  transfer	  to	  address	  the	  potential	  physiological	  limitations	  high	  pCO2	  may	  pose	  to	  migrating	  pink	  salmon	  fry.	  	  	   As	  previously	  described,	  pH	  may	  vary	  considerably	  among	  different	  freshwater	  sources	  at	  the	  same	  pCO2,	  whereas,	  pH	  in	  the	  ocean	  is	  relatively	  stable.	  Since	  pCO2	  directly	  affects	  pH	  and	  vice	  versa,	  we	  have	  yet	  to	  determine	  whether	  the	  observed	  negative	  impacts	  on	  growth	  and	  aerobic	  capacity	  are	  a	  result	  of	  CO2,	  pH	  or	  a	  combination	  of	  the	  two.	  Future	  research	  can	  investigate	  this	  by	  manipulating	  the	   65 total	  alkalinity	  of	  the	  water	  to	  increase	  or	  decrease	  the	  magnitude	  of	  pH	  change	  during	  changes	  in	  pCO2.	  	  	  	   This	  thesis	  has	  only	  briefly	  touched	  on	  some	  of	  the	  potential	  physiological	  consequences	  of	  climate	  change-­‐related	  acidification	  on	  pink	  salmon.	  Although	  this	  research	  has	  laid	  important	  groundwork	  for	  determining	  how	  pink	  salmon	  may	  respond	  to	  climate	  change,	  I	  genuinely	  hope	  that	  future	  work	  on	  this	  impressive	  and	  ecologically	  valuable	  species	  will	  continue	  to	  ensure	  its	  persistence	  in	  the	  face	  our	  rapidly	  changing	  climate.	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	  	   66 References	  	  Baker,	  D.	  W.,	  and	  Brauner,	  C.	  J.	  (2012).	  Metabolic	  changes	  associated	  with	  acid–	  base	  regulation	  during	  hypercarbia	  in	  the	  CO2-­‐tolerant	  chondrostean,	  white	  sturgeon	  (Acipenser	  transmontanus).	  Comp.	  Biochem.	  Phys.	  A	  161,	  61-­‐68.	  	  Baumann,	  H.,	  Talmage,	  S.	  C.,	  and	  Gobler,	  C.	  J.	  (2012).	  Reduced	  early	  life	  growth	  	  and	  survival	  in	  a	  fish	  in	  direct	  response	  to	  increased	  carbon	  dioxide.	  Nat.	  Clim.	  Change	  2,	  38-­‐41.	   Beacham,	  T.	  D.,	  Withler,	  R.	  E.,	  and	  Gould,	  A.	  P.	  (1985).	  Biochemical	  genetic	  stock	  	  identification	  of	  pink	  salmon	  (Oncorhynchus	  gorbuscha)	  in	  southern	  British	  Columbia	  and	  Puget	  Sound.	  Can.	  J.	  Fish.	  Aquat.	  Sci.	  42,	  1474-­‐1483.	   Bignami,	  S.,	  Sponaugle,	  S.,	  and	  Cowen,	  R.	  K.	  (2013).	  Response	  to	  ocean	  	  acidification	  in	  larvae	  of	  a	  large	  tropical	  marine	  fish,	  Rachycentron	  canadum.	  Glob.	  change	  Biol.	  19,	  996-­‐1006.	   Boeuf,	  G.	  (1993).	  Salmonid	  smolting:	  A	  pre-­‐adaptation	  to	  the	  oceanic	  environment.	  	  In	  Fish	  Ecophysiology,(ed.	  J.	  C.	  Rankin	  and	  F.	  B.	  Jensen),	  pp.	  105-­‐135.	  London:	  Chapman	  Press.	   Brauner,	  C.	  J.	  (2008).	  Acid-­‐base	  balance.	  In	  Fish	  Larval	  Physiology	  (ed.	  R.	  N.	  Finn	  and	  	  B.	  G.	  Kapoor),	  pp.	  185-­‐200.	  Enfield,	  NH,	  USA:	  Science	  Publisher,	  Inc.	  	  Brauner,	  C.	  J.	  and	  Baker,	  D.	  W.	  (2009).	  Patterns	  of	  acid-­‐base	  regulation	  during	  	  exposure	  to	  hypercarbia	  in	  fishes.	  In	  Cardio-­‐Respiratory	  Control	  in	  Vertebrates:	  Comparative	  and	  Evolutionary	  Aspects	  (ed.	  M.	  Glass	  and	  S.C.	  Wood),	  pp.	  43-­‐63.	  Berlin:	  Springer.	  	  Brauner,	  C.	  J.	  and	  Wood,	  C.	  M.	  (2002).	  Ionoregulatory	  development	  and	  the	  effect	  	  	  of	  chronic	  silver	  exposure	  on	  growth,	  survival	  and	  sublethal	  indicators	  of	  	  toxicity	  in	  early	  life	  stages	  of	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss).	  J.	  Comp.	  	  Physiol.	  B	  172,	  153-­‐162.	  	  Burggren,	  W.	  W.,	  and	  Reyna,	  K.	  S.	  (2011).	  Developmental	  trajectories,	  critical	  	  windows	  and	  phenotypic	  alteration	  during	  cardio-­‐respiratory	  development.	  Respir.	  Physiol.	  Neurobiol.	  178,	  13-­‐21.	  	  Byrne,	  R.	  H.,	  Mecking,	  S.,	  Feely,	  R.	  A.	  and	  Xuewu,	  L.	  (2010).	  Direct	  observations	  of	  basin-­‐wide	  acidification	  of	  the	  North	  Pacific	  Ocean.	  Geophys.	  Res.	  Lett.	  	  37,	  L02601.	  	  	   67 Cai,	  W.	  J.,	  Hu,	  X.,	  Huang,	  W.	  J.,	  Murrell,	  M.	  C.,	  Lehrter,	  J.	  C.,	  Lohrenz,	  S.	  E.,	  Chou,	  	  W.	  C.,	  Weidong,	  Z.,	  Hollibaugh,	  J.	  T.,	  Wang,	  Y.,	  et	  al.	  (2011).	  Acidification	  of	  subsurface	  coastal	  waters	  enhanced	  by	  eutrophication.	  Nature	  Geosci.	  4,	  766-­‐770.	  	  Caldeira,	  K.,	  and	  Wickett,	  M.	  E.	  (2003).	  Oceanography:	  anthropogenic	  carbon	  and	  	  ocean	  pH.	  Nature	  425,	  365-­‐365.	  	  	  Caldeira,	  K.	  and	  Wickett,	  M.	  E.	  (2005).	  Ocean	  model	  predictions	  of	  chemistry	  	  	   	  	  	  changes	  from	  carbon	  dioxide	  emissions	  to	  the	  atmosphere	  and	  ocean.	  J.	  	  	   	  	  	  Geophys.	  Res.	  Oceans	  110,	  C09S4	  	  Cameron,	  J.	  N.,	  and	  Iwama,	  G.	  K.	  (1989).	  Compromises	  between	  ionic	  regulation	  	  and	  acid-­‐base	  regulation	  in	  aquatic	  animals.	  Can.	  J.	  Zoo.	  67,	  3078-­‐3084.	  	  Cao,	  L.,	  and	  Caldeira,	  K.	  (2008).	  Atmospheric	  CO2	  stabilization	  and	  ocean	  	  acidification.	  Geophys.	  Res.	  Lett.	  35,	  L19609.	  	  Checkley,	  D.	  M.,	  Dickson,	  A.	  G.,	  Takahashi,	  M.,	  Radich,	  J.	  A.,	  Eisenkolb,	  N.,	  and	  	  Asch,	  R.	  (2009).	  Elevated	  CO2	  enhances	  otolith	  growth	  in	  young	  fish.	  Science	  324,	  1683-­‐1683.	  	  Chevin,	  L.	  M.,	  Lande,	  R.,	  and	  Mace,	  G.	  M.	  (2010).	  Adaptation,	  plasticity,	  and	  	  extinction	  in	  a	  changing	  environment:	  towards	  a	  predictive	  theory.	  PLoS	  Biol.	  8,	  e1000357.	  	  Claiborne,	  J.	  B.,	  Edwards,	  S.	  L.,	  and	  Morrison-­‐Shetlar,	  A.	  I.	  (2002).	  Acid–base	  	  regulation	  in	  fishes:	  cellular	  and	  molecular	  mechanisms.	  J.	  Exp.	  Zoo.	  293,	  302-­‐319.	  	  Clark,	  T.	  D.,	  Jeffries,	  K.	  M.,	  Hinch,	  S.	  G.,	  and	  Farrell,	  A.	  P.	  (2011).	  Exceptional	  	  aerobic	  scope	  and	  cardiovascular	  performance	  of	  pink	  salmon	  (Oncorhynchus	  gorbuscha)	  may	  underlie	  resilience	  in	  a	  warming	  climate.	  J.	  Exp.	  Biol.	  214,	  3074-­‐3081.	  	  Clarke,	  W.	  C.	  (1982).	  Evaluation	  of	  the	  seawater	  challenge	  test	  as	  an	  index	  of	  	   	  	  	  marine	  survival.	  Aquaculture	  28,	  177-­‐183.	  	  Conceição,	  L.	  E.	  C.,	  Houlihan	  D.	  F.	  and	  Verreth,	  J.	  A.	  J.	  (1997).	  Fast	  growth,	  protein	  	  turnover	  and	  costs	  of	  protein	  metabolism	  in	  yolk-­‐sac	  larvae	  of	  the	  African	  catfish	  (Clarias	  gariepinus).	  Fish	  Physiol.	  Biochem.	  	  16,	  291–302.	  	  Cripps,	  I.	  L.,	  Munday,	  P.	  L.,	  and	  McCormick,	  M.	  I.	  (2011).	  Ocean	  acidification	  	  affects	  prey	  detection	  by	  a	  predatory	  reef	  fish.	  Plos	  one	  6,	  e22736.	  	   68 Dickson,	  A.	  G.,	  Sabine,	  C.	  L.,	  and	  Christian,	  J.	  R.	  (2007).	  Guide	  to	  best	  practices	  for	  	  ocean	  CO2	  measurements.	  Canada:	  North	  Pacific	  Marine	  Science	  Organization.	  	  Dixson,	  D.	  L.,	  Munday,	  P.	  L.,	  and	  Jones,	  G.	  P.	  (2010).	  Ocean	  acidification	  disrupts	  	  the	  innate	  ability	  of	  fish	  to	  detect	  predator	  olfactory	  cues.	  Ecol.	  Lett.	  13,	  68-­‐75.	  	  Donelson,	  J.	  M.,	  Munday,	  P.	  L.,	  McCormick,	  M.	  I.,	  and	  Pitcher,	  C.	  R.	  (2012).	  Rapid	  	  transgenerational	  acclimation	  of	  a	  tropical	  reef	  fish	  to	  climate	  change.	  Nat.	  Clim.	  Change,	  2,	  30-­‐32.	  	  Doney,	  S.	  C.,	  Fabry,	  V.	  J.,	  Feely,	  R.	  A.	  and	  Kleypas,	  J.	  A.	  (2009).	  Ocean	  acidification:	  	  the	  other	  CO2	  problem.	  Annu.	  Rev.	  Mar.	  Sci.	  1,	  169-­‐92.	  	  Dudgeon,	  D.,	  Arthington,	  A.	  H.,	  Gessner,	  M.	  O.,	  Kawabata,	  Z.	  I.,	  Knowler,	  D.	  J.,	  	  Lévêque,	  C.,	  and	  Sullivan,	  C.	  A.	  (2006).	  Freshwater	  biodiversity:	  importance,	  threats,	  status	  and	  conservation	  challenges.	  Biol.	  Rev.	  81,	  163-­‐182. 	  Durkin,	  J.	  T.	  (1982).	  Migration	  characteristics	  of	  coho	  salmon	  (Oncorhynchus	  	  kisutch)	  smolts	  in	  the	  Columbia	  River	  and	  its	  estuary.	  In	  Estuarine	  comparisons	  (ed.	  V.	  S.	  Kennedy),	  pp.	  343-­‐364.	  New	  York:	  Academic	  Press.	  	  Eliason,	  E.	  J.,	  Clark,	  T.	  D.,	  Hague	  M.	  J.,	  Hanson,	  L.	  M.,	  Gallagher,	  Z.	  S.,	  Jeffries,	  K.	  	  M.,	  Gale,	  M.	  K.,	  Patterson,	  D.	  A.,	  Hinch,	  S.	  G.	  and	  Farrell,	  A.	  P.	  (2011).	  Differences	  in	  thermal	  tolerance	  among	  sockeye	  salmon	  populations.	  Science,	  332,	  109–112.	  	  Endler,	  J.	  A.	  (1986).	  Natural	  selection	  in	  the	  wild	  (No.	  21).	  Princeton,	  New	  Jersey:	  	  Princeton	  University	  Press.	  	  Evans,	  W.,	  Hales,	  B.,	  and	  Strutton,	  P.	  G.	  (2011).	  Seasonal	  cycle	  of	  surface	  ocean	  	  pCO2	  on	  the	  Oregon	  shelf.	  J.	  Geophys.	  Res.	  116,	  C05012.	  	  Evans,	  D.	  H.,	  Piermarini,	  P.	  M.	  and	  Choe,	  K.	  P.	  (2005).	  The	  multifunctional	  fish	  	  gill:	  dominant	  site	  of	  gas	  exchange,	  osmoregulation,	  acid-­‐base	  regulation,	  and	  excretion	  of	  nitrogenous	  waste.	  Physiol.	  Rev.	  85,	  97-­‐177.	  	  Farrell,	  A.	  P.	  (2009).	  Environment,	  antecedents	  and	  climate	  change:	  lessons	  from	  	  the	  study	  of	  temperature	  physiology	  and	  river	  migration	  of	  salmonids.	  	  J.	  Exp.	  Biol.	  212,	  3771–3780.	  	  Feely,	  R.	  A.,	  Sabine,	  C.	  L.,	  Hernandez-­‐Ayon,	  J.	  M.,	  Ianson,	  D.	  and	  Hales,	  B.	  (2008).	  	  	   	  	  	  Evidence	  for	  upwelling	  of	  corrosive	  “acidified”	  water	  onto	  the	  continental	  	  	   	  	  	  shelf.	  Science	  320,1490–92.	   69 Finn,	  R.	  N.	  and	  Fyhn,	  H.	  J.	  (2010).	  Requirements	  for	  amino	  acids	  in	  the	  ontogeny	  of	  fish.	  Aquacult.	  Res.	  41,	  684–716.	  	  Fivelstad,	  S.,	  Olsen,	  A.	  B.,	  Åsgård,	  T.,	  Baeverfjord,	  G.,	  Rasmussen,	  T.,	  Vindheim,	  	  T.	  and	  Stefansson,	  S.	  (2003).	  Long-­‐term	  sublethal	  effects	  of	  carbon	  dioxide	  on	  Atlantic	  salmon	  smolts	  (Salmo	  salar):	  ion	  regulation,	  haematology,	  element	  composition,	  nephrocalcinosis	  and	  growth	  parameters.	  Aquaculture,	  215,	  301–319.	  	  Folmar,	  L.	  C.	  and	  Dickhoff,	  W.	  W.	  (1980).	  The	  parr-­‐smolt	  transformation	  	  (smoltification)	  and	  seawater	  adaptation	  in	  salmonids:	  A	  review	  of	  selected	  literature.	  Aquaculture	  21,	  1-­‐37.	  	  Frieder,	  C.	  A.,	  Nam,	  S.	  H.,	  Martz,	  T.	  R.,	  and	  Levin,	  L.	  A.	  (2012).	  High	  temporal	  and	  	  spatial	  variability	  of	  dissolved	  oxygen	  and	  pH	  in	  a	  nearshore	  California	  kelp	  forest.	  Biogeosciences	  9,	  3917-­‐3930.	  	  Fry,	  F.	  E.	  F.	  (1947).	  Effects	  of	  the	  environment	  on	  animal	  activity.	  Publ.	  Ont.	  Fish.	  Res.	  	  Lab.	  68,	  62.	  	  Gallagher,	  Z.	  S.,	  Bystriansky,	  J.	  S.,	  Farrell,	  A.	  P.,	  and	  Brauner,	  C.	  J.	  (2012).	  A	  novel	  	  pattern	  of	  smoltification	  in	  the	  most	  anadromous	  salmonid:	  pink	  salmon	  (Oncorhynchus	  gorbuscha).	  Can.	  J.	  Fish.	  Aquat.	  Sci.	  70,	  349-­‐357.	  	  Grant,	  A.,	  Gardner,	  M.,	  Nendick,	  L.,	  Sackville,	  M.,	  Farrell,	  A.	  P.	  and	  Brauner,	  C.	  J.	  	  (2009).	  Growth	  and	  ionoregulatory	  ontogeny	  of	  wild	  and	  hatchery-­‐raised	  juvenile	  pink	  salmon	  (Oncorhynchus	  gorbuscha).	  Can.	  J.	  Zool.	  87,	  221-­‐228.	   Hamilton,	  S.	  L.,	  Regetz,	  J.,	  and	  Warner,	  R.	  R.	  (2008).	  Postsettlement	  survival	  	  linked	  to	  larval	  life	  in	  a	  marine	  fish.	  Proc.	  Natl.	  Acad.	  Sci.	  105,	  1561-­‐1566.	  	  Hamilton,	  T.	  J.,	  Holcombe,	  A.,	  and	  Tresguerres,	  M.	  (2014).	  CO2-­‐induced	  ocean	  	  acidification	  increases	  anxiety	  in	  Rockfish	  via	  alteration	  of	  GABAA	  receptor	  functioning.	  Proc.	  R.	  Soc.	  B	  281,	  20132509. 	  Healey,	  M.	  C.	  (1982).	  Timing	  and	  relative	  intensity	  of	  size-­‐selective	  mortality	  of	  	  juvenile	  chum	  salmon	  (Oncorhynchus	  keta)	  during	  early	  sea	  life.	  Can.	  J.	  Fish.	  Aquat.	  Sci.	  39,	  952-­‐957.	  	  Healy,	  T.	  M.,	  and	  Schulte,	  P.	  M.	  (2012).	  Thermal	  acclimation	  is	  not	  necessary	  to	  	  maintain	  a	  wide	  thermal	  breadth	  of	  aerobic	  scope	  in	  the	  common	  killifish	  (Fundulus	  heteroclitus).	  Physiol.	  Biochem.	  Zoo.	  85,	  107-­‐119. 	  Heard,	  W.	  R.	  (1991).	  Life	  history	  of	  pink	  salmon	  (Oncorhynchus	  gorbuscha).	  In	  	  Pacific	  Salmon	  Life	  Histories	  (ed.	  C.	  Groot	  and	  L.	  Margolis),	  pp.	  319-­‐377.	  Vancouver:	  UBC	  Press.	   70 Heisler,	  N	  .	  (1984)	  Acid-­‐base	  regulation	  in	  fishes.	  In	  Fish	  Physiology	  Vol.	  10	  (ed.	  W.S.	  	  	   	  	  	  Hoar,	  and	  D.J.	  Randall),	  pp.	  315-­‐401.	  San	  Diego:	  Academic.	  	  Hendry,	  A.	  P.,	  Day,	  T.	  and	  Cooper,	  A.	  B.	  (2001).	  Optimal	  size	  and	  number	  of	  	  propagules:	  allowance	  for	  discrete	  stages	  and	  effects	  of	  maternal	  size	  on	  reproductive	  output	  and	  offspring	  fitness.	  Am.	  Nat.	  157,	  387–407.	  	  Ho,	  D.	  H.,	  &	  Burggren,	  W.	  W.	  (2010).	  Epigenetics	  and	  transgenerational	  transfer:	  a	  	  physiological	  perspective.	  J.	  Exp.	  Biol.	  213,	  3-­‐16.	  	  Hoar,	  W.	  S.	  (1976).	  Smolt	  transformation:	  evolution,	  behavior,	  and	  physiology.	  	  	   	  	  	  J.	  Fish.	  Res.	  Board	  Can.	  33,	  1234–1252.	  	  Hoar,	  W.	  S.	  (1988).	  The	  physiology	  of	  smolting	  salmonids.	  In	  Fish	  Physiology,	  Vol.	  11	  	  (ed.	  W.	  S.	  Hoar	  and	  D.	  J.	  Randall),	  pp.	  275-­‐343:	  Academic	  Press.	  	  Hu,	  M.	  Y.,	  Tseng,	  Y.	  C.,	  Stumpp,	  M.,	  Gutowska,	  M.	  A.,	  Kiko,	  R.,	  Lucassen,	  M.,	  and	  	  Melzner,	  F.	  (2011).	  Elevated	  seawater	  pCO2	  differentially	  affects	  branchial	  acid-­‐base	  transporters	  over	  the	  course	  of	  development	  in	  the	  cephalopod	  Sepia	  officinalis.	  Am.	  J.	  Physiol.	  Regul.	  Integr.	  Comp.	  Phys.	  300,	  R1100-­‐R1114.	  	  Hwang,	  P.	  (1989).	  Distribution	  of	  chloride	  cells	  in	  teleost	  larvae.	  J.	  Morphol.	  200,	  1-­‐8.	  	  Ishimatsu,	  A.,	  Hayashi,	  M.,	  Lee,	  K.	  S.,	  Kikkawa,	  T.,	  and	  Kita,	  J.	  (2005).	  	  Physiological	  effects	  on	  fishes	  in	  a	  high-­‐CO2	  world.	  J.	  Geophys.	  Res.	  110,	  C09S09.	  	  Iwama,	  G.	  K.,	  &	  Heisler,	  N.	  (1991).	  Effect	  of	  environmental	  water	  salinity	  on	  acid-­‐	  base	  regulation	  during	  environmental	  hypercapnia	  in	  the	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss).	  J.	  Exp.	  Biol.	  158,	  1-­‐18.	  	  Jobling,	  M.	  (1995).	  Development	  of	  eggs	  and	  larvae.	  In	  Environmental	  Biology	  of	  	  Fishes,	  Fish	  and	  Fisheries	  Series,	  pp.	  357-­‐390.	  London;	  New	  York:	  Chapman	  &	  Hall.	  	  Jutfelt,	  F.,	  de	  Souza,	  K.	  B.,	  Vuylsteke,	  A.,	  and	  Sturve,	  J.	  (2013).	  Behavioural	  	  disturbances	  in	  a	  temperate	  fish	  exposed	  to	  sustained	  high-­‐CO2	  levels.	  PloS	  one	  8,	  e65825.	  	  Kaneko,	  T.,	  Hasegawa,	  S.,	  Takagi,	  Y.,	  Tagawa,	  M.	  and	  Hirano,	  T.	  (1995).	  	   	  	  	  Hypoosmoregulatory	  ability	  of	  eyed-­‐stage	  embryos	  of	  chum	  salmon.	  Mar.	  	  	   	  	  	  Biol.	  122,	  165-­‐170.	  	  	  	  	   71 Kaneko,	  T.,	  Shiraishi,	  K.,	  Katoh,	  F.,	  Hasegawa,	  S.	  and	  Hiroi,	  J.	  (2002).	  Chloride	  	  cells	  during	  early	  life	  stages	  of	  fish	  and	  their	  functional	  differentiation.	  Fisheries	  Sci.	  68,	  1-­‐9.	  	  	  Killen,	  S.	  S.,	  Costa,	  I.,	  Brown,	  J.	  A.	  and	  Gamperl,	  A.K.	  (2007).	  Little	  left	  in	  the	  tank:	  	  metabolic	  scaling	  in	  marine	  teleosts	  and	  its	  implications	  for	  aerobic	  scope.	  Proc.	  R.	  Soc.,	  	  274B,	  431–438.	  	  Kunz,	  Y.	  W.	  (2004).	  Developmental	  biology	  of	  teleost	  fishes.	  In	  Environmental	  	  Biology	  of	  Fishes,	  Fish	  and	  Fisheries	  Series	  (ed.	  D.	  L.	  G.	  Noakes).	  Dordrecht:	  Springer.	  	  Kurihara,	  H.	  (2008).	  Effects	  of	  CO2-­‐driven	  ocean	  acidification	  on	  the	  early	  	  developmental	  stages	  of	  invertebrates.	  Mar.	  Ecol.	  Prog.	  Ser.	  373,	  275–284.	  	  Larsen,	  B.	  K.	  and	  Jensen,	  F.B.	  (1997).	  Influence	  of	  ionic	  composition	  on	  acid-­‐base	  	   	  	  regulation	  in	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  exposed	  to	  	  	   	  	  environmental	  hypercapnia.	  Fish	  Physio.	  Biochem.	  16,	  157–170.	  	  Lindstedt,	  S.	  L.,	  and	  Conley,	  K.	  E.	  (2001).	  Human	  aerobic	  performance:	  too	  much	  	  ado	  about	  limits	  to	  VO2.	  J.	  Exp.	  Biol.	  204,	  3195-­‐3199.	  	  Lundberg,	  J.	  G.,	  Kottelat,	  M.,	  Smith,	  G.	  R.,	  Stiassny,	  M.	  L.,	  and	  Gill,	  A.	  C.	  (2000).	  So	  	  many	  fishes,	  so	  little	  time:	  an	  overview	  of	  recent	  ichthyological	  discovery	  in	  continental	  waters.	  Ann.	  Missouri	  Bot.	  Gard.	  26-­‐62.	  	  Marliave,	  J.	  B.,	  Gibbs,	  C.	  J.,	  Gibbs,	  D.	  M.,	  Lamb,	  A.	  O.,	  and	  Young,	  S.	  J.	  (2011).	  	  Biodiversity	  stability	  of	  shallow	  marine	  benthos	  in	  Strait	  of	  Georgia,	  British	  Columbia,	  Canada	  through	  climate	  regimes,	  overfishing	  and	  ocean	  acidification.	  In	  Biodiversity	  Loss	  in	  a	  Changing	  Planet	  (ed.	  O.	  Grillo	  and	  G.	  Venora),	  pp.	  49-­‐73.	  Rijeka,	  Croatia:	  In	  Tech.	  	  McCormick,	  S.	  D.	  (1994).	  Ontogeny	  and	  evolution	  of	  salinity	  tolerance	  in	  	  anadromous	  salmonids:	  Hormones	  and	  heterochrony.	  Estuar.	  Coast.	  17,	  26-­‐33.	  	  McCormick,	  S.	  D.	  and	  Saunders,	  R.	  L.	  (1987).	  Preparatory	  physiological	  	  adaptations	  for	  marine	  life	  of	  salmonids:	  osmoregulation,	  growth,	  and	  metabolism.	  Am.	  Fish.	  Soc.	  Symp.	  1,	  211-­‐299.	  	  Melzner,	  F.,	  Thomsen,	  J.,	  Koeve,	  W.,	  Oschlies,	  A.,	  Gutowska,	  M.	  A.,	  Bange,	  H.	  W.,	  	  Hansen,	  H.	  P.	  and	  Körtzinger,	  A.	  (2013).	  Future	  ocean	  acidification	  will	  be	  amplified	  by	  hypoxia	  in	  coastal	  habitats.	  Mar.	  Biol.	  160,	  1875-­‐1888.	  	  	  	   72 Miller,	  G.	  M.,	  Watson,	  S.	  A.,	  Donelson,	  J.	  M.,	  McCormick,	  M.	  I.,	  and	  Munday,	  P.	  L.	  	  (2012).	  Parental	  environment	  mediates	  impacts	  of	  increased	  carbon	  dioxide	  on	  a	  coral	  reef	  fish.	  Nat.	  Clim.	  Change,	  2,	  858-­‐861. 	  Misiaszek,	  C.M.	  (1996).	  The	  development	  if	  ion	  regulation	  in	  larval	  rainbow	  trout	  	  (Oncorhynchus	  mykiss).	  MSc	  thesis,	  Department	  of	  Biology,	  McMaster	  University,	  Hamilton,	  Ontario,	  Canada.	  	  Mölich,	  A.	  and	  Heisler,	  N.	  (2005).	  Determination	  of	  pH	  by	  microfluorometry:	  	  intracellular	  and	  interstitial	  pH	  regulation	  in	  developing	  early-­‐stage	  fish	  embryos	  (Danio	  rerio).	  J.	  Exp.	  Biol.	  208,	  4137–4149.	  	  Munday,	  P.	  L.,	  Crawley,	  N.	  E.,	  and	  Nilsson,	  G.	  E.	  (2009).	  Interacting	  effects	  of	  	  elevated	  temperature	  and	  ocean	  acidification	  on	  the	  aerobic	  performance	  of	  coral	  reef	  fishes.	  Mar.	  Ecol-­‐Prog	  Ser.	  388,	  235-­‐242.	  	  Munday,	  P.	  L.,	  Donelson,	  J.	  M.,	  Dixson,	  D.	  L.,	  and	  Endo,	  G.	  G.	  K.	  (2009).	  Effects	  of	  	  ocean	  acidification	  on	  the	  early	  life	  history	  of	  a	  tropical	  marine	  fish.	  Proc.	  R.	  Soc.	  B	  276,	  3275–3283.	  	  Munday,	  P.	  L.,	  Warner,	  R.	  R.,	  Monro,	  K.,	  Pandolfi,	  J.	  M.,	  and	  Marshall,	  D.	  J.	  	  (2013).	  Predicting	  evolutionary	  responses	  to	  climate	  change	  in	  the	  sea.	  Ecol.	  Lett.	  16,	  1488-­‐1500.	  	  Neave,	  F.,	  Ishida,	  and	  S.	  Murai.	  (1967).	  Salmon	  of	  the	  North	  Pacific	  Ocean.	  Part	  VI.	  	  Pink	  salmon	  in	  offshore	  waters.	  Int.	  North	  Pac.	  Fish.	  Comm.	  Bull.	  22,	  33.	  	  Nendick,	  L.,	  Sackville,	  M.,	  Tang,	  S.,	  Brauner,	  C.J.	  and	  Farrell	  A.P.	  (2011).	  Sea	  lice	  	  infection	  of	  juvenile	  pink	  salmon	  (Oncorhynchus	  gorbuscha):	  effects	  on	  swimming	  performance	  and	  postexercise	  ion	  balance.	  Can.	  J.	  Fish.	  Aquat.	  Sci.	  68,	  241-­‐249.	  	  Nilsson,	  G.	  E.,	  Dixson,	  D.	  L.,	  Domenici,	  P.,	  McCormick,	  M.	  I.,	  Sørensen,	  C.,	  	  Watson,	  S.	  A.,	  and	  Munday,	  P.	  L.	  (2012).	  Near-­‐future	  carbon	  dioxide	  levels	  alter	  fish	  behaviour	  by	  interfering	  with	  neurotransmitter	  function.	  Nat.	  Clim.	  Change,	  2,	  201-­‐204.	  	  Ninness,	  M.	  M.,	  Stevens,	  E.	  D.	  and	  Wright,	  P.	  A.	  (2006).	  Energy	  expenditure	  during	  	  hatching	  in	  rainbow	  trout	  (Oncorhynchus	  mykiss)	  embryos.	  Can.	  J.	  Fish.	  Aquat.	  Sci.	  63,	  1405–1413.	  	  Pandolfi,	  J.	  M.,	  Connolly,	  S.	  R.,	  Marshall,	  D.	  J.,	  and	  Cohen,	  A.	  L.	  (2011).	  Projecting	  	  coral	  reef	  futures	  under	  global	  warming	  and	  ocean	  acidification.	  Science	  333,	  418-­‐422.	  	  	   73 Parker,	  R.	  R.	  (1962).	  Estimations	  of	  ocean	  mortality	  rates	  for	  Pacific	  salmon	  	  (Oncorhynchus).	  J.	  Fish.	  Res.	  Board	  Can.	  19,	  561-­‐589.	  	  Pepin,	  P.	  (1991).	  Effect	  of	  temperature	  and	  size	  on	  development,	  mortality	  and	  sur-­‐	  	  vival	  rates	  of	  the	  pelagic	  early	  life	  history	  stages	  of	  marine	  fish.	  Can.	  J.	  Fish.	  Aquat.	  Sci.	  58,	  503–518.	  	  Perry,	  S.	  F.	  (1982).	  The	  regulation	  of	  hypercapnic	  acidosis	  in	  two	  salmonids,	  the	  	  freshwater	  trout	  (Salmo	  gairdneri)	  and	  the	  seawater	  salmon	  (Onchorynchus	  kisutch).	  Mar.	  Freshw.	  Behav.	  Phy.	  9,	  73-­‐79.	  	  Perry,	  S.	  F.	  and	  Gilmour,	  K.	  M.	  (2006).	  Acid-­‐base	  balance	  and	  CO2	  excretion	  in	  fish:	  	  unanswered	  questions	  and	  emerging	  models.	  Respir.	  Physiol.	  Neurobiol.	  154,	  199–215.	  	  Plaut,	  I.	  (2001).	  Critical	  swimming	  speed:	  its	  ecological	  relevance.	  Comp.	  Biochem.	  	  Phys.	  A	  131,	  41–50.	  	  Pörtner,	  H.	  O.,	  and	  Farrell,	  A.	  P.	  (2008).	  Physiology	  and	  climate	  change.	  Science	  	  322,	  690-­‐692.	   Post,	  J.	  R.,	  and	  Lee,	  J.	  A.	  (1996).	  Metabolic	  ontogeny	  of	  teleost	  fishes.	  Can.	  J.	  Fish.	  	  Aquat.	  Sci.	  53,	  910-­‐923.	  	  Putnam,	  R.	  W.	  and	  Roos,	  A.	  (1997).	  Intracellular	  pH.	  In	  Handbook	  of	  Physiology.	  	  Cell	  Physiology	  (ed.	  J.	  Hoffman	  and	  J.	  Jamieson),	  pp.	  389–440.	  Oxford:	  Oxford	  University	  Press.	  	  Randall,	  D.	  and	  Brauner,	  C.	  J.	  (1991).	  Effects	  of	  environmental	  factors	  on	  exercise	  	  in	  fish.	  J.	  Exp.	  Biol.,	  160,	  113–126.	  	  Raven,	  J.,	  Caldeira,	  K.,	  Elderfield,	  H.,	  Hoegh-­‐Guldberg,	  O.,	  Liss,	  P.,	  Riebesell,	  U.,	  	  Shepherd,	  J.,	  Turley,	  C.,	  and	  Watoson,	  A.	  (2005).	  Ocean	  acidification	  due	  to	  increasing	  atmospheric	  carbon	  dioxide.	  p.	  60.	  London:	  The	  Royal	  Society.	  	  Reidy,	  S.	  P.,	  Nelson,	  J.	  A.,	  Tang,	  Y.,	  and	  Kerr,	  S.	  R.	  (1995).	  Post-­‐exercise	  metabolic	  	  rate	  in	  Atlantic	  cod	  and	  its	  dependence	  upon	  the	  method	  of	  exhaustion.	  J.	  Fish	  Biol.	  47,	  377-­‐386.	  	  Reum,	  J.	  C.,	  Alin,	  S.	  R.,	  Feely,	  R.	  A.,	  Newton,	  J.,	  Warner,	  M.,	  and	  McElhany,	  P.	  	  (2014).	  Seasonal	  carbonate	  chemistry	  covariation	  with	  temperature,	  oxygen,	  and	  salinity	  in	  a	  fjord	  estuary:	  implications	  for	  the	  design	  of	  ocean	  acidification	  experiments.	  PloS	  one	  9,	  e89619.	  	  	  	   74 Riebesell,	  U.,	  Zondervan,	  I.,	  Rost,	  B.,	  Tortell,	  P.	  D.,	  Zeebe,	  R.	  E.,	  and	  Morel,	  F.	  M.	  	  (2000).	  Reduced	  calcification	  of	  marine	  plankton	  in	  response	  to	  increased	  atmospheric	  CO2.	  Nature	  407,	  364-­‐367.	  	  Rombough,	  P.	  J.	  (2011).	  The	  energetics	  of	  embryonic	  growth.	  Respir.	  Physiol.	  	  Neurobiol.	  178,	  22-­‐29.	  	  Rombough,	  P.	  J.	  (1988).	  Respiratory	  gas	  exchange,	  aerobic	  metabolism	  and	  effects	  	  of	  hypoxia	  during	  early	  life.	  In	  Fish	  Physiology	  XIA	  (ed.	  W.S.	  Hoar	  and	  D.J.	  Randall),	  pp.	  59-­‐161.	  New	  York:	  Academic	  Press.	  	  Rounsefell,	  G.	  A.	  (1958).	  Anadromy	  in	  North	  American	  salmonidae.	  US	  Fish	  and	  	  Wildlife	  Fishery	  Bulletin	  58,	  171-­‐185.	  	  Sabine	  C.	  L,	  Feely	  R.	  A.	  (2007).	  The	  oceanic	  sink	  for	  carbon	  dioxide.	  In	  Greenhouse	  	  Gas	  Sinks	  (ed.	  D.	  Reay,	  N.	  Hewitt,	  J.	  Grace	  and	  K.	  Smith),	  pp.	  31–49.	  Oxfordshire:	  CABI	  Publishing.	  	  Schlichting,	  C.	  D.,	  and	  Smith,	  H.	  (2002).	  Phenotypic	  plasticity:	  linking	  molecular	  	  mechanisms	  with	  evolutionary	  outcomes.	  Evol.	  Ecol.	  16,	  189-­‐211.	  	  Schulte,	  P.	  M.,	  Healy,	  T.	  M.,	  and	  Fangue,	  N.	  A.	  (2011).	  Thermal	  performance	  	  curves,	  phenotypic	  plasticity,	  and	  the	  time	  scales	  of	  temperature	  exposure.	  Integr.	  Comp.	  Biol.	  51,	  691-­‐702.	  	  Shen,	  A.	  C.	  Y.	  and	  Leatherland,	  J.	  F.	  (1978).	  Structure	  of	  the	  yolksac	  epithelium	  and	  	  gills	  in	  the	  early	  developmental	  stages	  of	  rainbow	  trout	  (Salmo	  gairdneri)	  maintained	  in	  different	  ambient	  salinities.	  Environ.	  Biol.	  Fishes	  3,	  345–354.	  	  Smith,	  R.	  W.	  and	  Ottema,	  C.	  (2006).	  Growth,	  oxygen	  consumption,	  and	  protein	  and	  	  RNA	  synthesis	  rates	  in	  the	  yolk	  sac	  larvae	  of	  the	  African	  catfish	  (Clarias	  gariepinus).	  Comp.	  Biochem.	  Physiol.	  143A,	  315–325.	  	  Solomon,	  S.,	  Qin,	  D.,	  Manning,	  M.,	  Chen,	  Z.,	  Marquis,	  M.,	  Averyt,	  K.,	  Tignor,	  M.	  M.	  	  	   	  	  	  B.,	  Miller,	  H.	  L.	  and	  Chen,	  Z.	  (2007).	  Climate	  change	  2007:	  The	  physical	  	  	   	  	  	  science	  basis:	  contribution	  of	  working	  group	  I	  to	  the	  fourth	  assessment	  	  	   	  	  	  report	  of	  the	  Intergovernmental	  Panel	  on	  Climate	  Change.	  New	  York:	  	  	   	  	  	  Cambridge	  University	  Press.	  	  Stefansson,	  S.,	  Björnsson,	  B.	  T.,	  Hansen,	  T.,	  Haux,	  C.,	  Taranger,	  G.	  L.	  and	  	  Saunders,	  R.	  L.	  (1991).	  Growth,	  parr–smolt	  transformation,	  and	  changes	  in	  growth	  hormone	  of	  Atlantic	  salmon	  (Salmo	  salar)	  reared	  under	  different	  photoperiods.	  Can.	  J.	  Fish.	  Aquat.	  Sci.,	  48,	  2100–2108.	  	  	  	   75 Stumpp,	  M.,	  Wren,	  J.,	  Melzner,	  F.,	  Thorndyke,	  M.	  C.,	  and	  Dupont,	  S.	  T.	  (2011).	  	  CO2	  induced	  seawater	  acidification	  impacts	  sea	  urchin	  larval	  development	  I:	  elevated	  metabolic	  rates	  decrease	  scope	  for	  growth	  and	  induce	  developmental	  delay.	  Comp.	  Biochem.	  A	  160,	  331-­‐340.	  	  Stefansson,	  S.	  O.,	  Björnsson,	  B.	  T.,	  Ebbesson,	  L.	  O.	  E.,	  and	  McCormick	  S.	  D.	  	  (2008).	  Smoltification.	  In	  Fish	  Larval	  Physiology	  (ed.	  R.	  N.	  Finn	  and	  B.	  G.	  Kapoor),	  pp.	  639-­‐681.	  New	  Delhi:	  Science	  publishers	  inc.	  Enfield	  (NH)	  &	  IBH	  Publishing	  Co.	  Pvt.	  Ltd.	  	  Sylvestre,	  E.	  L.,	  Lapointe,	  D.,	  Dutil,	  J.	  D.,	  and	  Guderley,	  H.	  (2007).	  Thermal	  	  sensitivity	  of	  metabolic	  rates	  and	  swimming	  performance	  in	  two	  latitudinally	  separated	  populations	  of	  cod,	  Gadus	  morhua	  L.	  J.	  Comp.	  Physiol.	  B	  177,	  447-­‐460.	  	  Toews,	  D.	  P.,	  Holeton,	  G.	  F.	  and	  Heisler,	  N.	  (1983)	  Regulation	  of	  the	  acid-­‐base	  	  	   	  	  	  status	  during	  environmental	  hypercapnia	  in	  the	  marine	  teleost	  fish	  Conger	  	  	   	  	  	  conger.	  J.	  Exp.	  Biol.	  107,	  9–20.	  	  Tseng,	  Y.,	  Hu,	  M.	  Y.,	  Stumpp,	  M.,	  Lin,	  L.,	  Melzner,	  F.	  and	  Hwang,	  P.	  (2013).	  CO2-­‐	  	  	  	  driven	  seawater	  acidification	  differentially	  affects	  development	  and	  	  	  	  	  	  	  molecular	  plasticity	  along	  life	  history	  of	  fish	  (Oryzias	  latipes).	  Comp.	  Biochem.	  	  	  	  	  Physiol.	  A	  165,	  119-­‐130.	  	  Walther,	  K.,	  Anger,	  K.,	  and	  Pörtner,	  H.	  O.	  (2010).	  Effects	  of	  ocean	  acidification	  and	  	  warming	  on	  the	  larval	  development	  of	  the	  spider	  crab	  Hyas	  araneus	  from	  different	  latitudes	  (54	  vs.	  79	  N).	  Mar.	  Ecol.	  Prog.	  Ser.	  417,	  159-­‐170.	  	  Wieser,	  W.	  (1989).	  Energy	  allocation	  by	  addition	  and	  by	  compensation:	  an	  old	  	  	   	  	  	  principle	  revisited.	  In	  Energy	  Transformations	  in	  Cells	  and	  Animals	  (ed.	  W.	  	   	  	  	  Wieser	  and	  E.	  Gnaiger),	  pp.	  98-­‐105.	  Thieme	  Verlag,	  Stuttgart	  	  Quinn,	  T.	  P.	  (2005).	  The	  Behavior	  and	  Ecology	  of	  Pacific	  Salmon	  and	  Trout:	  	  University	  of	  Washington	  Press.	  	  Weibel,	  E.	  R.	  (1984).	  The	  Pathway	  for	  Oxygen.	  Cambridge,	  MA,	  USA:	  Harvard	  	  University	  Press.	  	  Weibel,	  E.	  R.,	  Taylor,	  C.	  R.	  and	  Hoppeler,	  H.	  (1991).	  The	  concept	  of	  	  symmorphosis:	  a	  testable	  hypothesis	  of	  structure-­‐function	  relationship.	  Proc.	  Natl.	  Acad.	  Sci.	  USA	  88,	  10357-­‐10361.	  	  Wieser,	  W.	  (1985).	  Developmental	  and	  metabolic	  constraints	  of	  the	  scope	  for	  	  activity	  in	  young	  rainbow	  trout	  (Salmo	  gairdneri).	  J.	  Exp.	  Biol.	  118,	  133-­‐142.	  	  	   76 Willson,	  M.	  F.,	  and	  Halupka,	  K.	  C.	  (1995).	  Anadromous	  fish	  as	  keystone	  species	  in	  	  vertebrate	  communities.	  Conserv.	  Biol.	  9,	  489-­‐497.	  	  Wootton,	  J.	  T.,	  Pfister,	  C.	  A.	  and	  Forester,	  J.	  D.	  (2008).	  Dynamic	  patterns	  and	  	  ecological	  impacts	  of	  declining	  ocean	  pH	  in	  a	  high-­‐resolution	  multi-­‐year	  dataset.	  Proc.	  Natl.	  Acad.	  Sci.	  USA	  105,	  18848-­‐18853.	  	  Yufera,	  M.,	  Parra,	  G.,	  Santiago,	  R.	  and	  Carrascosa,	  M.	  (1999).	  Growth,	  carbon,	  	  nitrogen	  and	  caloric	  content	  of	  Solea	  senegalensis	  (Pisces:	  Soleidae)	  from	  egg	  fertilization	  to	  metamorphosis.	  Mar.	  Biol.	  134,	  43–49.	  	  	  


Citation Scheme:


Citations by CSL (citeproc-js)

Usage Statistics



Customize your widget with the following options, then copy and paste the code below into the HTML of your page to embed this item in your website.
                            <div id="ubcOpenCollectionsWidgetDisplay">
                            <script id="ubcOpenCollectionsWidget"
                            async >
IIIF logo Our image viewer uses the IIIF 2.0 standard. To load this item in other compatible viewers, use this url:


Related Items