The  effect  of  climate  change-­‐related  environmental  acidification  on  the  growth,  development  and    energetics  of  the  early  life  stages  of  pink  salmon  (Oncorhynchus  gorbuscha)     by      Michelle  Ou      B.Sc.,  The  University  of  British  Columbia,  2011            A  THESIS  SUMBMITTED  IN  PARTIAL  FULFILLMENT  OF  THE  REQUIREMENTS  FOR  THE  DEGREE  OF    MASTER  OF  SCIENCE    in    THE  FACULTY  OF  GRADUATE  AND  POSTDOCTORAL  STUDIES    (Zoology)                   The  University  of  British  Columbia  (Vancouver)    July  2014       ©Michelle  Ou  2014   ii Abstract  As  a  consequence  of  increasing  atmospheric  CO2,  the  partial  pressure  of  CO2  (pCO2)  in  the  oceans  is  rising,  causing  a  decrease  in  pH  and  carbonate  ions  known  as  ocean  acidification  (OA).  Since  freshwater  systems  have  the  same  potential  for  atmospheric  equilibrium  with  CO2,  similar  scenarios  of  acidification  will  occur  in  freshwater,  yet  little  is  known  about  the  potential  impacts  of  climate  change-­‐related  acidification  on  freshwater  species  and  ecosystems.  Moreover,  virtually  no  research  has  investigated  the  effect  of  oscillating  pCO2  tensions  on  fish,  which  are  more  likely  to  reflect  natural  coastal  conditions.  The  goal  of  this  thesis  is  to  address  some  of  these  knowledge  gaps  by  studying  the  potential  effects  of  climate  change-­‐related  acidification  on  pink  salmon  (Oncorhynchus  gorbuscha)  at  a  sensitive  and  critical  life-­‐stage  during  development  in  both  freshwater  and  seawater  under  future  elevated  and  fluctuating  pCO2  tensions  (freshwater:  400  μatm,  1000  μatm,  2000  μatm,  400-­‐2000  μatm  (over  24hr);  seawater:  400  μatm,  1600  μatm,  400-­‐1600  μatm).  Growth,  production  efficiencies  and  aerobic  scope  were  measured  starting  2  weeks  pre-­‐hatch  in  freshwater  up  until  2  weeks  post-­‐seawater  transfer.  Growth  was  reduced  during  freshwater  rearing  and  following  seawater  transfer.  Specifically,  size,  production  efficiencies  and  absolute  growth  rates  were  reduced  at  freshwater  tensions  of  1000  and  2000  μatm  and  seawater  tensions  of  1600  μatm.  However,  no  significant  effects  on  growth  were  seen  in  response  to  oscillating  pCO2  tensions.  Similarly,  aerobic  scope  was  reduced  at  high  pCO2  following  seawater  transfer  through  a  reduction  in  maximal  oxygen  consumption  rate  (MO2max)  (but  not  routine  (MO2routine)),  indicating  that  exercise  in  pink  salmon  fry  may  be  particularly  affected   iii by  climate  change-­‐related  acidification.  Given  that  control  fish  exhibit  a  dramatic  increase  in  MO2max  7  days  post-­‐seawater  transfer,  which  is  likely  associated  with  a  change  in  life  history  from  a  sedentary  to  a  migratory  stage,  elevations  in  seawater  pCO2  may  have  implications  for  their  seaward  migration  success.  Overall,  this  thesis  demonstrates  that  pink  salmon,  under  predicted  future  increases  in  pCO2,  may  be  faced  with  sublethal  impacts  of  acidification  on  various  aspects  of  their  physiology  at  a  very  critical  time  in  their  life  history.                                     iv Preface     Chapter  2  of  this  thesis  is  co-­‐authored  by  Michelle  Ou,  Emily  Lyall,  and  Colin  J.  Brauner.  I  conducted  all  of  the  research  in  chapter  2  (research  questions,  experimental  design,  experimentation  and  data  analysis)  under  the  supervision  of  Dr.  Colin  J.  Brauner.  Emily  Lyall,  an  undergraduate  student  (UBC),  assisted  with  the  experimental  design  and  experimentation  for  chapter  2.  I  wrote  all  3  chapters  of  this  thesis  and  received  editorial  feedback  from  my  committee  members,  Drs.  Colin  J.  Brauner,  Patricia  M.  Schulte,  and  William  K.  Milsom.     All  experimental  animals  were  treated  according  to  the  University  of  British  Columbia  Animal  protocol  #  A11-­‐0235.                                   v Table  of  contents    Abstract……………………………………………………………………………………………………………….ii  Preface…………………………………………………………………………………………………………..……iv  Table  of  contents……………………………………………………………………………….…………………v  List  of  tables..……..………………………………………………………………………………………………vii  List  of  figures..…..………………………………………………………………………………………………viii  List  of  abbreviations……..………………………………………………………………………………..……x  Acknowledgements….……..………………………………………………………………………………..…xi  Dedication…………….….……..……………………………………………………………………………….…xii  [1]   General  introduction…………………………………………………………………………………1     1.1  Ocean  acidification……………………………………...………………………………………1     1.2  Acid-­‐base  regulation  in  teleost  fish…..…………………………………………………5     1.3  Acid-­‐base  regulation  in  larval  fish…..……………….…………………………………7     1.4  The  energetics  of  growth  in  developing  fish…..……………………………………8     1.5  The  early  life  stages  of  salmonids…..……………….………..………………………10     1.6  Model  species:  pink  salmon  (Oncorhynchus  gorbuscha)…....……………12     1.7  Thesis  objectives  and  hypotheses…..……………….………..………………………14  [2]    The  effect  of  climate  change-­‐related  environmental  acidification  on  the  growth,  development  and  energetics  of  the  early  life  stages  of  pink  salmon  (Oncorhynchus  gorbuscha)……..……………….………..………………………16       2.1  Introduction…..……………………………………….…………………………………………16     2.2  Materials  and  methods…..…………………………………………………………………21     2.21  Experimental  animals…..………………………………………………………………………21     2.22  Experimental  design  and  CO2  manipulation  in  freshwater….…………………21   vi   2.23  Seawater  transfer  and  CO2  manipulation  in  seawater….………………..………23     2.24  Growth  and  yolk  consumption….………………………………………..……………….…25     2.25  Respirometry….……………………………………………………………………………………..25     2.26  Statistical  analysis….……………………………………………….……………………………27  2.3  Results……….…………………………….…………….………………………………………….28     2.31  Growth  and  development….…………………………………….………………………….…28     2.32  Metabolic  rates……………………….….………………..…………………………………….…29  2.4  Discussion…..…………………………………....…….…………………………………………31     2.41  Growth  and  development….……………………….…………………………………….……31     2.42  Aerobic  scope….………………………………………...………………………………………….34     2.43  Temporal  fluctuations  in  pCO2…………..………………………………………………….35     2.44  Current  and  future  implications  on  pink  salmon…………..……………………….36     2.45  Summary….…………………………………….…………………………………………………….38  [3]  General  discussion  and  conclusions……….………………….….……….…………………….57  3.1  Thesis  summary…..…………………………….………..…………………………………….57  3.2  Potential  for  acclimation  and  adaptation…..…………………………………….57  3.3  Increase  in  𝑴O2max  following  seawater  entry…..………………………………..61  3.4  Freshwater  acidification……………………………..…………………………………….62  3.5  Research  limitations  and  future  directions…..………………….……………….63  References……….…..…………………………….………………………...……………………………………66           vii List  of  tables       Table  2.1   Time  in  weeks  post  CO2  exposure  in  freshwater  and  following  seawater  transfer  with  corresponding  age  of  pink  salmon  embryos/alevin/fry  in  accumulated  thermal  units  (ATU)  from  2  weeks  pre-­‐hatch  up  until  2  weeks  following  seawater  transfer……………………………………………………………………………55     Table  2.2   Fork  lengths  of  pink  salmon  fry  2  weeks  post-­‐seawater  transfer  (week  13  of  CO2  exposure).  Fish  were  reared  at  different  pCO2  tensions  in  freshwater  for  11  weeks  prior  to  seawater  transfer……………………………………………………………………………56                                                                     viii List  of  figures       Figure  2.1   Total  alevin  pink  salmon  wet  mass  (yolk  included)  during  development  in  freshwater  from  2  weeks  pre-­‐hatch  (time  0  of  CO2  exposure)  up  until  1  week  before  seawater  transfer  (week  10  of  CO2  exposure)  at  different  pCO2  tensions……………….…....39    Figure  2.2   Pink  salmon  tissue  wet  mass  (yolk  excluded)  during  development  in  freshwater  from  2  weeks  post-­‐hatch  (week  4  of  CO2  exposure)  up  until  1  week  before  seawater  transfer  (week  10  of  CO2  exposure)  at  different  pCO2  tensions…………..40    Figure  2.3   Pink  salmon  tissue  dry  mass  (yolk  excluded)  at  week  10  (1  week  before  seawater  transfer)……..………….….……………..……...41    Figure  2.4   Pink  salmon  fork  lengths  during  development  in  freshwater  from  3  weeks  post-­‐hatch  (week  5  of  CO2  exposure)  up  until  1  week  before  seawater  transfer  (week  10  of  CO2  exposure)  at  different  pCO2  tensions……………………………………………………….42    Figure  2.5   Pink  salmon  yolk  wet  mass  during  development  in  freshwater  from  2  weeks  post-­‐hatch  (week  4  of  CO2  exposure)  up  until  1  week  before  seawater  transfer  (week  10  of  CO2  exposure)  at  different  pCO2  tensions……………………………………………………….43    Figure  2.6   Pink  salmon  yolk  wet  mass  at  week  10  (1  week  before  seawater  transfer)……………………………………………………………...44    Figure  2.7   Pink  salmon  yolk  dry  mass  at  week  10  (1  week  before  seawater  transfer)……………………………………………………………...45    Figure  2.8   Production  efficiencies  at  week  10  (1  week  before  seawater  transfer)…………………………………………………………………..………...46    Figure  2.9   Absolute  growth  rates  after  2  weeks  following  seawater  transfer  into  different  pCO2  tensions….....…………………….………47    Figure  2.10   Routine  MO2  during  development  in  freshwater  from  2  weeks  pre-­‐hatch  (time  0  of  CO2  exposure)  up  until  1  week  before  seawater  transfer  (week  10  of  CO2  exposure)  at  different  pCO2  tensions…………………………………………………………………………..…48     Figure  2.11   Routine  MO2  at  day  1,  7  and  14  post-­‐seawater  transfer  into  different  pCO2  tensions……………………………………………………….49   ix  Figure  2.12   Maximum  MO2  at  day  1,  7  and  14  post-­‐seawater  transfer  into  different  pCO2  tensions……………………………………………………….50    Figure  2.13   Aerobic  scope  at  day  1,  7  and  14  post-­‐seawater  transfer  into  different  pCO2  tensions……………………………………………………….51    Figure  2.14   Routine  and  maximum  MO2  during  development  in  freshwater  and  following  seawater  transfer  at  control  (400→400  μatm)  or  high  CO2  (2000→1600  μatm)………………………………………………52    Figure  2.15   Aerobic  scope  3  weeks  before  and  3  weeks  following  seawater  transfer  at  control  (400→400  μatm)  or  high  CO2  (2000→1600  μatm)…………………………………………………………………………………53    Figure  2.16   Factorial  scope  3  weeks  before  and  3  weeks  following  seawater  transfer  at  control  (400→400  μatm)  or  high  CO2  (2000→1600  μatm)…………………………………………………………………………………54                                                         x List  of  abbreviations    AT     Total  alkalinity  DIC     Dissolved  inorganic  carbon  E     Energy  allocated  for  excretion  IPCC     Intergovernmental  panel  on  climate  change  MO2 Oxygen consumption rate MO2max Maximum oxygen consumption rate MO2routine Routine oxygen consumption rate MRC     Mitochondria-­‐rich  cells  NKA     Na+/K+  ATPase  OA     Ocean  acidification  P     Energy  allocated  for  growth  pCO2     Partial  pressure  of  CO2  pHe     extracellular  pH  pHi     intracellular  pH  R     Respiration/metabolism  Ra     Respiration  for  activity  Rg     Respiration  for  growth  Rm     Respiration  for  maintenance  SRM     Seawater  reference  materials  Ucrit     Critical  swimming  speed  wtm     wet  mass   xi YSA     Yolk  sac  absorption                                                   xii Acknowledgements     First  and  foremost,  I  wish  to  thank  my  awesome  supervisor,  Dr.  Colin  Brauner,  for  his  support  and  mentorship  during  my  time  here  at  the  University.  Colin,  I  thank  you  for  your  encouragement,  your  words  of  wisdom  and  your  willingness  and  trust  in  allowing  me  to  pursue  my  own  research  interests  and  goals.       To  my  fellow  Braunerites  (past  and  present),  Emily  Lyall,  Katelyn  Tovey,  Emily  Gallagher,  Mike  Sackville,  Till  Harter,  Jonathon  Wong,  Phil  Morrison,  Ryan  Shartau,  Tara  McBryan  and  Josh  Emerman,  thank  you  for  all  your  help  and  support.  I  couldn’t  have  done  it  without  you  lot.  You  guys  were  there  through  the  good  and  the  bad,  making  even  the  most  stressful  times  fun  and  enjoyable  (the  occasional  drink  definitely  helped).       My  experience  in  the  Zoology  department  has  been  nothing  short  of  awesome.  I  have  had  the  pleasure  of  getting  to  know  numerous  wonderful  individuals,  many  of  whom  I  consider  good  friends.  Special  thanks  to  Pat  Tamkee  for  your  fish  expertise,  for  the  many  hours  you  have  spent  helping  me  with  my  project,  and  most  importantly,  for  your  kindness  and  friendship.  To  Ann  Daziel,  Tim  Healy,  Milica  Mandic  and  Georgie  Cox,  thanks  for  being  great  mentors  and  allowing  me  to  harass  you  with  my  many  science  questions.  I  also  want  to  thank  my  committee  members,  Trish  Schulte  and  Bill  Milsom,  for  their  guidance  and  kind  words  of  encouragement  throughout  my  degree.  To  all  the  “Comphy”  peeps,  I  will  cherish  all  the  fun  and  ridiculous  memories  we  have  shared.  It  has  been  a  blast.         Finally,  I  wish  to  thank  Geoff  for  his  patience  and  support,  and  for  always  being  there  for  me.  Words  cannot  express  how  grateful  I  am  to  have  you  in  my  life.     xiii                               For  Duffy  Fonan                                                     1 [1]  General  introduction        General  overview  As  a  result  of  increasing  aerial  CO2  emissions,  the  partial  pressure  of  CO2  (pCO2)  in  the  oceans  is  rising,  causing  a  decrease  in  pH  and  carbonate  ion  concentrations  (Calderia  and  Wickett,  2003).  Little  is  known  about  the  potential  impacts  of  oceanic  acidification  (OA)  on  fish,  especially  at  early  life-­‐stages.  In  addition,  virtually  no  work  has  investigated  the  effect  of  climate  change-­‐related  acidification  in  freshwater  systems  and  the  effect  of  oscillating  pCO2  tensions  on  fish.  This  thesis  aims  to  address  the  effects  of  climate  change  relevant  increases  in  pCO2  on  the  energetics  of  growth  and  development  in  the  early  life-­‐stages  of  pink  salmon,  in  freshwater  and  following  initial  seawater  entry.  By  using  environmentally  realistic  levels  of  CO2  consistent  with  those  predicted  by  climate  change  models  and  those  already  occurring  in  coastal  systems,  this  thesis  will  shed  light  on  the  potential  effects  of  climate  change  on  a  commercially  and  ecologically  valuable  species.  The  remainder  of  this  introduction  will  summarize  the  current  knowledge  of  ocean  acidification,  acid-­‐base  regulation  in  both  adult  and  larval  fish  and  the  energetics  of  development,  with  a  specific  focus  on  salmonid  species.      1.1  Ocean  acidification  Atmospheric  CO2  has  risen  almost  40%  from  pre-­‐industrial  levels  of  280  μatm  to  current  levels  of  390  μatm  (Solomon  et  al.,  2007),  and  continues  to  increase  at  unprecedented  rates.  The  increase  in  atmospheric  CO2  levels  is  buffered  by  the   2 oceanic  uptake  of  CO2  (Sabine  and  Feely,  2007)  and  as  a  consequence,  pCO2  in  the  oceans  is  rising,  causing  a  decrease  in  pH  and  carbonate  ion  (CO32-­‐)  concentrations.    This  is  known  as  ocean  acidification.  Atmospheric  CO2  is  expected  to  rise  above  800-­‐1000  μatm  in  the  next  100  years  (IPCC,  Solomon  et  al.,  2007),  which  has  been  predicted  to  reduce  ocean  pH  by  0.3-­‐0.4  units  (Calderia  and  Wickett,  2005).  By  2300,  predicted  values  of  1600  μatm  will  cause  a  corresponding  0.6-­‐0.8  unit  decrease  in  ocean  pH  (IPCC,  Solomon  et  al.,  2007).    Although  numerous  models  for  predicting  future  CO2  scenarios  exist  (Calderia  and  Wickett,  2005;  Wotton  et  al.,  2008),  there  are  few  large-­‐scale  measurements  and  long-­‐term  historical  records  of  oceanic  pH  and  pCO2,  especially  on  the  West  Coast  of  British  Columbia.  Based  on  one  of  the  first  basin-­‐wide  studies  of  pH  in  the  North  Pacific,  there  appears  to  be  significant  variation  in  pH  within  the  water  column,  with  the  largest  changes  in  pH  occurring  in  the  first  500  m  of  the  ocean  (Byrne  et  al.,  2010).  This,  in  addition  to  seasonal  upwelling  of  acidic  water  from  the  deep  (Feely  et  al.,  2008),  and  the  continued  rise  in  atmospheric  CO2  may  contribute  to  large  temporal  fluctuations  in  ocean  pH.  Through  recent  modeling,  Melzner  et  al.  (2013)  showed  that  OA  could  be  further  compounded  by  seasonal  hypoxia  in  coastal  habitats.  In  combination  with  acidic  upwelling,  seasonal  hypoxia  may  result  in  peak  pCO2  values  of  1700-­‐3200  μatm  under  current  conditions  (Melzner  et  al.,  2013).  More  recently,  work  characterizing  the  variability  of  dissolved  oxygen  and  pH  on  the  California  coast  estimated  that  pCO2  could  peak  as  high  as  1016  μatm  at  depths  of  17  m  and  persist  for  5-­‐7  days  (Frieder  et  al.,  2012).  Similar  fluctuations  from  200-­‐1000  μatm  have  also  been  recorded  at  surface  waters   3 on  the  Oregon  shelf  (Evans  et  al.,  2011),  suggesting  that  the  West  Coast  of  British  Columbia  may  also  be  subjected  to  comparable  fluctuations.  In  Puget  Sound,  a  large  estuary  on  the  West  Coast  of  North  America,  carbonate  chemistry  data  indicate  that  pCO2  values  may  exceed  2500  μatm  during  autumn  near  surface  waters  (Reum  et  al.,  2014).  Furthermore,  records  of  pH  in  the  Strait  of  Georgia  from  the  year  2001  and  onward  show  that  pH  can  periodically  drop  as  low  as  7.5  (Marliave  et  al.,  2011).  Taken  together,  it  is  possible  that  our  coastal  communities  along  the  West  Coast  of  British  Columbia  are  already  experiencing  projected  end-­‐of-­‐century  levels  of  pCO2.    Natural  variations  in  pCO2  are  quite  prevalent  in  coastal  ecosystems  (Frieder  et  al.,  2012;  Evans  et  al.,  2011;  Reum  et  al.,  2014);  however,  the  majority  of  research  investigating  the  effects  of  OA  on  marine  organisms  has  been  conducted  under  constant  pCO2  tensions  projected  by  the  IPCC.  These  elevated  levels  only  represent  average  global  conditions  and  do  not  necessarily  take  into  account  local  conditions,  making  it  difficult  to  infer  how  species  and  communities  will  respond  to  climate  change  (Reum  et  al.,  2014).  Given  that  temporal  pCO2  fluctuations  normally  occur  in  our  oceans,  studies  considering  these  more  realistic  conditions  should  be  explored.      Although  the  negative  effects  of  OA  have  been  well  documented  in  various  marine  invertebrates  (Kurihara,  2008;  Raven  et  al.,  2005;  Doney  et  al.,  2009  for  a  review),  fish  were  generally  thought  to  be  unaffected  by  these  changes  (Doney  et  al.,  2009).  However,  a  growing  body  of  work  has  shown  a  range  of  sublethal  effects  of  OA  on  a  variety  of  fish  species.  Effects  include  changes  in  olfactory  responses  to  predator,  prey  and  substrate  cues  (Dixson  et  al.,  2010;  Cripps  et  al.,  2011;  Munday  et  al.,  2009),  interference  with  neurotransmitter  function  (Nilsson  et  al.,  2012),   4 alterations  in  behavioral  lateralization  (Jutfelt  et  al.,  2013),  heightened  anxiety  (Hamilton  et  al.,  2014),  and  higher  otolith  growth  rates  (Checkley  et  al.,  2009;  Bignami  et  al.,  2013).    Despite  comprising  only  0.8%  of  the  Earth’s  surface,  freshwater  ecosystems  support  over  10,000  fish  species,  representing  approximately  40%  of  total  fish  diversity  (Lundberg  et  al.,  2000).    Yet,  little  is  known  about  the  effects  of  climate  change-­‐related  acidification  in  these  systems.  Streams  and  rivers  have  the  same  potential  for  atmospheric  CO2  uptake  and  thus  similar  scenarios  of  acidification  will  occur  in  freshwater.  However,  the  majority  of  freshwater  research  investigating  the  physiological  effects  of  CO2-­‐mediated  acidification  in  fish  was  originally  geared  towards  understanding  the  mechanisms  associated  with  acid-­‐base  regulation,  which  involved  pCO2  values  that  far  exceed  levels  relevant  to  climate  change  (ie.  10,000  μatm  and  greater;  Ishimatsu  et  al.,  2005).  Since  freshwater  and  seawater  differ  greatly  in  ion  composition,  which  can  have  large  effects  on  buffering  capacity,  osmotic  balance  and  various  other  physiological  processes  in  fish  (Evans  et  al.,  2005),  the  physiological  impacts  of  climate  change-­‐related  acidification  in  freshwater  might  be  quite  different  from  those  in  seawater.  Compared  to  seawater,  freshwater  buffer  values  are  generally  lower  (Perry,  1982),  and  as  a  result,  larger  pH  changes  would  occur  in  freshwater  for  a  given  pCO2  tension.  Furthermore,  compensation  for  an  acid-­‐base  disturbance  tends  to  occur  faster  and  to  a  greater  degree  in  seawater,  as  opposed  to  freshwater  (Iwama  and  Heisler,  1991).  This,  along  with  larger  pH  changes  at  a  given  pCO2  tension,  may  make  compensation  during  an   5 acid-­‐base  disturbance  in  freshwater  more  challenging;  however,  this  has  not  previously  been  investigated  and  is  a  focus  of  my  thesis.    1.2  Acid-­‐base  regulation  in  teleost  fish     In  most  vertebrates,  acid-­‐base  regulation  is  essential  for  life  and  its  processes.  Changes  in  intracellular  and  extracellular  pH  affect  physiological  processes,  such  as  cell  signaling,  gene  expression,  muscle  contraction,  regulation  of  cell-­‐volume  and  metabolism  by  altering  the  charges  and  molecular  shapes  of  proteins  (Putnam  and  Roos,  1997).  Although  the  relative  ability  for  pH  regulation  differs  among  species,  most  teleosts  respond  to  hypercarbia  (exposure  to  elevated  environmental  CO2)  in  a  general  way.  During  hypercarbia,  CO2  from  the  water  readily  diffuses  across  the  gills  and  equilibrates  with  arterial  blood  (reviewed  by  Brauner  and  Baker,  2009).  This  results  in  a  corresponding  drop  in  extracellular  and  intracellular  pH  (pHe  and  pHi,  respectively),  referred  to  as  a  respiratory  acidosis  (Brauner  and  Baker,  2009).  Fish  are  able  to  compensate  in  three  ways:  1)  physiochemical  buffering  with  bicarbonate  (HCO3-­‐)  and  non-­‐bicarbonate  buffers,  2)  net  transport  of  acid-­‐base  related  ions  between  the  animal  and  the  surrounding  water,  and  3)  alteration  of  ventilation  to  change  pCO2  (Evans  et  al.,  2005).  Unlike  terrestrial  vertebrates,  fish  mainly  utilize  the  first  two  compensatory  mechanisms  noted  above  (Evans  et  al.,  2005).  In  general,  90%  of  net  acid-­‐base  transport  is  thought  to  occur  at  the  gill,  with  the  kidney  and  intestine  playing  minor  roles  (Heisler  1984;  1993;  Evans  et  al.  2005).  When  exposed  to  elevated  water  pCO2,  adult  and  juvenile  fish  are  able  to  compensate  for  reductions  in  blood  pH  through  increases  in  plasma  HCO3-­‐  (Evans  et   6 al.,  2005).  This  net  increase  in  plasma  HCO3-­‐  is  matched  by  an  equivalent  net  decrease  in  plasma  Cl¯ˉ  implicating  that  net  HCO3¯ˉ/Cl¯ˉ  exchange  at  the  gills  may  be  involved  (Toews  et  al.,  1983;  Cameron  and  Iwama,  1989;  Larsen  and  Jensen,  1997).  Following  a  respiratory  acidosis  in  rainbow  trout  (Oncorhynchus  mykiss),  recovery  of  pHe  is  accompanied  by  net  branchial  HCO3¯ˉ/Cl¯ˉ  exchange  (Larsen  and  Jensen,  1997).  Generally,  fish  tend  to  fully  compensate  for  acid-­‐base  disturbances  faster  and  to  a  greater  degree  in  seawater,  as  opposed  to  freshwater  (Iwama  and  Heisler,  1991).  The  lower  ion  composition  in  freshwater  may  result  in  lower  HCO3¯ˉ  availability,  which  is  essential  in  buffering  changes  in  blood  pH  (Brauner  and  Baker,  2009).  Water  hardness  also  plays  a  role,  with  faster  and  more  complete  compensation  occurring  in  hard  water  (higher  [Ca2+])  (Larsen  and  Jensen,  1997).  The  main  site  for  acid-­‐base  transport  is  thought  to  be  in  mitochondrion-­‐rich  cells  (MRC)  of  the  gills  in  both  freshwater  and  marine  fish  (Evans  et  al.,  2005;  Brauner,  2008).  H+  secretion  via  apical  V-­‐type  ATPases  is  proposed  to  be  the  dominant  mechanism  for  acid  excretion  in  freshwater  teleosts,  while  NHEs  are  proposed  to  primarily  carry  out  this  function  in  marine  teleosts  (Claiborne  et  al.,  2002;  Evans  et  al.,  2005).  Base  excretion  in  both  freshwater  and  marine  teleosts  is  thought  to  occur  via  an  apical  Cl¯ˉ/  HCO3¯ˉ  anion  exchanger  (Claiborne  et  al.,  2002;  Evans  et  al.,  2005).  Although  numerous  studies  have  investigated  the  role  of  different  transporters  in  various  species  of  fish,  at  this  time  the  exact  molecular  mechanisms  and  transporters  involved  in  acid-­‐base  compensation  have  yet  to  be  elucidated  (Evans  et  al.,  2005;  Perry  and  Gilmour,  2006;  Brauner  and  Baker,  2009).       7 1.3  Acid-­‐base  regulation  in  larval  fish  The  majority  of  our  knowledge  of  acid-­‐base  regulation  is  based  on  adult  and  juvenile  fish,  while  little  is  known  about  this  process  in  developing  fish  (Brauner,  2008).  During  short-­‐term  exposure  to  hypercarbia  (10,000  μatm),  zebrafish  (Danio  rerio)  embryos  are  able  to  compensate  for  pH  within  a  couple  of  hours  (Molich  and  Heisler,  2005).  This  recovery  is  associated  with  a  net  increase  in  HCO3¯ˉ  in  both  the  intracellular  and  extracellular  compartments  (Molich  and  Heisler,  2005).  Embryonic  and  larval  fish  do  appear  to  have  acid-­‐base  regulatory  ability  but  nothing  is  known  about  the  associated  mechanisms  (Brauner,  2008).  The  molecular  mechanisms  of  acid-­‐base  regulation  and  osmoregulation  are  tightly  linked,  since  these  processes  utilize  similar  transporters  and  enzymes  in  MRCs.  Most  of  the  work  on  larval  MRCs  relates  to  osmoregulation  (Brauner,  2008).  In  chum  salmon,  before  the  gills  become  functional,  a  large  number  of  MRCs  are  found  on  the  yolk  sac  epithelium  (Kaneko  et  al.,  1995)  and  appear  to  function  much  like  the  MRCs  in  the  developed  gill  (Kaneko  et  al.,  2002).  In  addition  to  the  yolk  sac,  MRCs  are  also  found  in  the  skin  of  embryos  and  larvae  of  various  fish  species  (Shen  and  Leatherland,  1978;  Hwang,  1989).  Following  hatch,  active  uptake  of  Na+  increases  exponentially  in  salmonid  embryos  (Brauner  &  Wood  2002).  However,  this  is  not  the  case  for  Cl¯ˉ  uptake,  which  remains  low  and  stays  constant  from  hatch  through  emergence  (Misiaszek,  1996).  This  suggests  that  a  compensatory  mechanism  other  than  net  HCO3¯ˉ/Cl¯ˉ  exchange  may  be  present  in  larval  fish.  At  this  stage,  acid-­‐base  compensation  may  primarily  be  associated  with  Na+/H+  exchange  (Brauner,  2008).   8 1.4  The  energetics  of  growth  in  developing  fish     Unlike  adults  and  juveniles,  developing  fish  have  very  different  metabolic  constraints  placed  upon  them,  and  as  a  result,  are  under  tight  energy  budgets,  which  has  profound  effects  on  their  physiology.  Most  species  of  fish  lay  cleidoic  eggs,  which  allow  water,  gases,  and  waste  products  to  be  exchanged  with  the  environment  while  retaining  the  nutrients  contained  within  (Rombough,  2011).  Larval  fish  that  feed  endogenously,  such  as  salmonids,  rely  primarily  on  resources  in  the  yolk  sac  (Kunz,  2004).  The  yolk  contains  proteins  and  free  amino  acids  for  building  new  tissue,  lipids  as  the  main  fuel  for  metabolism,  and  some  carbohydrates  (Rombough,  2011).  Given  that  energy  budgets  balance,  the  total  amount  of  available  yolk  resources  (Y)  is  equal  to  the  sum  of  the  building  materials  required  for  the  production  of  new  tissue  (P),  and  the  energy  allocated  for  metabolism/respiration  (R),  and  excretion  (E)  (Rombough,  2011).  R  can  be  subdivided  into  respiration  for  growth  (Rg),  respiration  for  maintenance  of  homeostasis  (Rm)  and  respiration  for  activity  (Ra)  (Rombough,  2011).  Any  increases  in  Rm  for  maintenance  activities,  such  as  acid-­‐base  regulation,  will  ultimately  reduce  the  energy  available  for  growth  (Rg).     Developing  fish  have  extremely  high  growth  rates  compared  to  mature  fish  with  values  exceeding  150%/day  (Conceição  et  al.,  1997;  Smith  and  Ottema,  2006).  Moreover,  they  have  high  production  efficiencies  (calculated  as  tissue  production  divided  by  yolk  assimilation)  that  exceed  85%  (Rombough,  1998;  Yufera  et  al.,  1999),  This  may  be  possible  given  that  tissue  maintenance  during  the  early  stages  of  development  is  low  (Rombough,  2011),  and  that  there  appear  to  be  maternal  stocks  of  mRNA,  organic  molecules  and  growth  factors  in  the  yolk  (Finn  and  Fyhn,  2010).   9 Approximately  80%  of  the  yolk  is  thought  to  go  towards  growth,  of  which  60%  goes  towards  tissue  production  and  the  other  20%  towards  the  energy  needed  to  build  tissue  (Rombough,  2011).  Of  the  remaining  20%,  5%  is  lost  to  metabolic  waste,  leaving  only  15%  for  non-­‐growth  related  activities,  such  as  movement,  stress  responses  and  maintenance  activities,  such  as  acid-­‐base  regulation  and  osmoregulation  (Rombough,  2011).    In  developing  fish,  the  excess  energy  for  non-­‐growth  related  activities  could  be  quantified  as  aerobic  scope.  Aerobic  scope  is  the  difference  between  resting  and  maximal  oxygen  consumption  (MO2),  and  in  adult  fish,  represents  the  available  energy  left  over  for  processes  such  as  reproduction  and  exercise  (Fry,  1947;  Farrell,  2009).  Since  the  capacity  for  exercise  is  crucial  for  evading  predators,  prey  capture  and  thus  survival,  aerobic  scope  is  commonly  used  as  a  performance  indicator  (eg.  Eliason  et  al.  2011).  In  addition,  exercise  pushes  cellular,  respiratory,  and  cardiovascular  systems  to  their  limit,  revealing  physiological  limitations  in  the  form  of  ionic  perturbations  and  premature  fatigue  (Randall  and  Brauner,  1991).  Therefore,  aerobic  scope  may  be  correlated  to  an  individual’s  ecological  fitness  (Plaut,  2001;  Nendick  et  al.,  2011).    As  a  result  of  high  routine  metabolic  rates  and  a  limited  ability  to  increase  aerobic  metabolism  above  routine  levels,  larval  fish  have  small  aerobic  scopes  (Rombough,  1988;  Killen  et  al.,  2007).  Since  larger  hatchlings  are  subject  to  lower  predation  rates  (Hendry  et  al.,  2001;  Pepin,  1991),  rapid  and  efficient  growth  tends  to  be  selected  for  (Rombough,  2011).  This,  however,  leaves  little  energy  available  for  other  activities.  Rainbow  trout  alevin  have  limited  ability  to  increase  their   10 metabolism  above  routine  levels  during  high  bouts  of  activity  (Ninness  et  al.,  2006).  Conversely,  adults  and  juveniles  can  increase  their  metabolism  in  an  additive  way,  such  that  the  metabolic  demands  of  increased  activity  are  matched  by  increases  in  metabolism  (Wieser,  1989).  Unlike  mature  fish,  larvae  have  limited  ability  to  increase  their  metabolism  as  activity  increases,  suggesting  that  they  follow  a  compensatory  partitioning  model,  whereby  energy  from  elsewhere,  such  as  growth,  is  diverted  to  heightened  activity  (Rombough,  2011).    If  environmental  stress,  such  as  OA,  increases  the  energy  expenditure  for  acid-­‐base  regulation,  then  growth  would  likely  be  compromised.  For  example,  initial  exposure  to  elevated  CO2  reduces  aerobic  scope  in  adult  sturgeon,  suggesting  that  pH  compensation  may  be  metabolically  costly  (Baker  and  Brauner,  2012).  Given  this,  the  potential  effects  of  long-­‐term  hypercarbia  on  growth  and  development  may  be  great.    1.5  The  early  life  stages  of  salmonids     Salmon  have  a  unique  life  history,  making  them  an  excellent  model  to  study  the  effects  of  environmental  stressors,  such  as  climate  change,  on  an  anadromous  species.  Salmonid  eggs  are  deposited  in  gravel  redds  of  freshwater  streambeds,  where  they  are  then  fertilized  (Kunz,  2004).  At  hatch,  the  fish  are  referred  to  as  alevin,  and  remain  in  the  gravel,  feeding  endogenously  on  their  yolk  sac  (Jobling,  1995;  Kunz,  2004).  Near  the  end  of  yolk  sac  absorption,  the  fish  emerge  from  the  gravel  as  fry.  Anadromous  salmonids,  including  most  species  of  salmon,  will  eventually  head  out  to  sea  where  they  spend  the  majority  of  their  juvenile  and  adult   11 lives  before  returning  to  their  native  streams  to  spawn  (Stefansson  et  al.,  2008).  The  duration  of  freshwater  residency  prior  to  their  seaward  migration  varies  among  species.  Some  salmon  may  reside  in  streams  for  a  year  or  more,  whereas  others,  such  as  pink  salmon,  migrate  to  sea  soon  after  emergence  (Stefansson  et  al.  2008).     Prior  to  migration,  salmonids  undergo  smoltification.  Smoltification  is  an  environmentally  elicited  process  that  involves  major  changes  in  the  physiology,  morphology,  and  behavior  of  a  fish  in  preparation  for  seawater  entry  (reviewed  in  Stefansson  et  al.,  2008).  These  changes  transform  a  fish  from  its  freshwater-­‐adapted  form  to  its  seawater-­‐adapted  form  while  it  is  still  in  freshwater  (Stefansson  et  al.,  2008).  Modifications  include  changes  in  osmoregulation,  body  shape  and  coloring,  metabolism,  growth,  rheotaxis,  buoyancy,  and  schooling  behavior  (Stefansson  et  al.,  2008).  Since  these  alterations  are  suited  for  a  marine  existence  and  not  a  freshwater  one,  a  window  of  salinity  tolerance,  termed  the  “smolt-­‐window”,  may  exist  whereby,  following  seawater  entry,  smolts  can  quickly  acclimate  to  the  changing  salinity  with  minor  detriments  to  survival  (Stefansson  et  al.,  2008;  Gallagher  et  al.,  2012).    Among  this  host  of  changes,  acquiring  the  ability  for  hypo-­‐osmoregulation  is  arguably  most  essential  for  the  transition  from  freshwater  to  seawater.    Compared  to  smolts,  parr  have  relatively  poor  seawater  tolerance  and  exhibit  increased  mortality,  higher  ionic  disturbances,  and  stunted  growth  during  direct  transfer  to  seawater  (McCormick  et  al.,  1987;  Stefansson  et  al.,  1991;  2007).  The  biochemical  and  cellular  basis  for  salinity  tolerance  can  be  linked  to  changes  in  the  expression  patterns,  protein  levels,  and  activity  of  relevant  transport  proteins,  along  with  increases  in  the  number  and  size  of  MRCs  in  which  these  proteins  are  located   12 (reviewed  in  Stefansson  et  al.,  2008).  Given  the  multitude  of  physiological  changes  required  for  smoltification,  the  transition  from  freshwater  to  seawater  is  a  time  of  heightened  mortality  for  most  salmonids  (Parker,  1962;  Durkin,  1982;  Healy,  1982),  and  thus  additional  stressors,  such  as  OA,  may  exacerbate  the  challenge  of  seawater  entry.    1.6  Model  species:  pink  salmon  (Oncorhynchus  gorbuscha)     Pink  salmon  exhibit  arguably  one  of  the  most  impressive  and  extreme  forms  of  anadromy  in  the  family  Salmonidae.  Unlike  other  salmon,  pinks  migrate  to  sea  soon  after  gravel  emergence  (Heard  et  al.,  1991),  and  are  the  smallest  (0.2  g)  of  all  salmon  species  at  the  time  of  seawater  entry  (Heard  1991;  Grant  et  al.,  2009).  In  addition  to  their  impressive  life  history,  pinks  also  have  great  ecological  and  economic  value.  Compared  to  other  Pacific  salmon,  they  are  the  most  abundant  and  widely  distributed  (Heard  et  al.,  1991).  Of  all  the  commercially  caught  salmon  in  British  Columbia  and  Alaska,  pink  salmon  represent  40%  by  weight  and  60%  by  numbers  of  the  total  estimate  (Neave  et  al.,  1967).  Furthermore,  their  sheer  biomass  along  with  their  vital  roles  in  both  marine  and  freshwater  food  webs  makes  pinks  an  excellent  indicator  of  ecosystem  health.  Therefore,  using  pink  salmon  as  a  model  species  may  shed  insight  into  the  potential  effects  of  OA  on  a  commercially  and  ecologically  valuable  species.     Since  pink  salmon  migrate  to  sea  at  a  small  size  of  0.2  g,  their  high  surface  area-­‐to-­‐volume  ratios  may  make  them  more  vulnerable  to  environmental  stressors,  such  as  sea  lice  (Nendick  et  al.,  2011)  and  OA.  Recent  work  suggests  that  pinks  do   13 undergo  some  degree  of  smoltification  but  appear  to  enter  seawater  somewhat  precociously  (Gallagher  et  al.,  2012;  Grant  et  al.,  2009).  Prior  to  seawater  entry,  smolts  increase  whole-­‐body  Na+  levels  5-­‐fold  and  appear  to  have  a  window  of  salinity  tolerance  near  the  time  of  emergence  (Gallagher  et  al.,  2012).  Changes  in  the  relative  expression  of  specific  isoforms  of  Na+/K+  ATPase  (NKA)  have  been  used  as  indicators  of  seawater  readiness,  and  thus  smoltification  (Gallagher  et  al.,  2012).  During  this  window  of  salinity  tolerance,  the  ratio  of  the  NKA  seawater  isoform,  α1b,  to  the  freshwater  isoform,  α1a,  increases  in  pink  salmon,  suggesting  that  some  seawater  preparatory  mechanisms  are  present  (Gallagher  et  al.,  2012).  However,  NKA  activity  remains  relatively  low  and  increases  following  seawater  entry  (Grant  et  al.,  2009;  Gallagher  et  al.,  2012).  Seawater  entry  is  a  time  of  heightened  mortality  for  all  species  of  salmon  (Parker,  1962;  Durkin,  1982;  Healy,  1982).  Even  Atlantic  salmon  smolts,  which  are  much  larger  than  pinks,  appear  to  be  more  sensitive  to  additional  stressors,  such  as  elevated  CO2,  when  held  in  freshwater  (Fivelstad  et  al.,  2003).  Pink  salmon  smolts  may  be  more  vulnerable  than  other  teleosts  at  this  stage,  making  them  a  good  model  species  to  study  the  effects  of  OA  on  a  critical  life-­‐stage  in  salmonids.  Furthermore,  their  anadromous  life  history  can  provide  the  first  look  into  the  effects  of  climate  change-­‐related  acidification  in  both  freshwater  and  seawater  on  a  migrating  species  of  fish.    1.7  Thesis  objectives  and  hypotheses  The  general  objective  of  this  thesis  is  to  determine  the  potential  effects  of  climate  change-­‐related  acidification  on  the  physiology  of  fish  at  a  sensitive  and   14 critical  life-­‐stage  under  forecasted  increases  in  pCO2.  This  thesis  incorporates  a  novel  oscillating  pCO2  treatment,  which  reflects  naturally  occurring  temporal  fluctuations.  Specifically,  I  assessed  the  growth,  development  and  energetics  of  pink  salmon  during  their  early  life-­‐stages.  This  thesis  consists  of  three  main  objectives:  Objective  1:  To  assess  the  effects  of  freshwater  and  marine  acidification  on  the  growth  and  development  of  pink  salmon  alevin  and  fry.    Since  acid-­‐base  compensation  may  need  to  occur  constantly  during  temporal  fluctuations  in  pCO2,  the  latter  may  be  more  metabolically  costly  over  time.  Therefore,  I  hypothesized  that  growth  under  oscillating  CO2  conditions  would  decrease  while  little  or  no  effect  on  growth  would  be  seen  at  constantly  elevated  conditions.  Objective  2:  To  assess  the  metabolic  cost  of  development  under  future  elevated  and  fluctuating  pCO2  tensions.    Metabolic  costs  were  assessed  by  measuring  routine  oxygen  consumption  (MO2routine)  and  production  efficiencies  under  the  different  CO2  scenarios  at  various  time  points  during  development.  Larval  fish  are  under  tight  energy  constraints  and  have  lower  aerobic  scope  than  adults  (Rombough,  2011);  therefore,  the  extra  energy  needed  for  acid-­‐base  compensation  during  hypercarbia  may  reduce  the  energy  allotted  to  growth.  I  hypothesized  that  acid-­‐base  regulation  would  be  metabolically  costly  early  in  development,  with  larger  consequences  to  growth  under  fluctuating  pCO2  conditions.  I  predicted  that  routine  MO2  would  increase  and  that  production  efficiencies  would  decrease  at  higher  and  oscillating  pCO2  tensions.   15 Objective  3:  To  assess  the  performance  capacity  of  pink  salmon  prior  to  and  following  seawater  entry  under  future  elevated  and  fluctuating  pCO2  tensions.    Aerobic  scope  was  used  to  assess  performance  capacity.  Since  seawater  entry  is  a  time  of  heightened  stress  and  mortality  for  salmonids,  I  hypothesized  that  elevated  CO2  levels  would  reduce  aerobic  scope  following  seawater  transfer.                     16 [2]  The  effect  of  climate  change-­‐related  environmental  acidification  on  the  growth,  development  and  energetics  of  the  early  life  stages  of  pink  salmon  (Oncorhynchus  gorbuscha)    2.1  Introduction  As  a  consequence  of  increasing  atmospheric  CO2,  the  partial  pressure  of  CO2  in  the  oceans  is  rising,  causing  a  decrease  in  pH  and  carbonate  ions  (Calderia  and  Wickett,  2003).  This  change  in  ocean  chemistry  resulting  from  rising  atmospheric  CO2  is  known  as  ocean  acidification.  Atmospheric  CO2  has  risen  from  pre-­‐industrial  levels  of  280  μatm  to  current  levels  of  390  μatm  (Solomon  et  al.,  2007),  and  is  predicted  to  increase  to  800-­‐1000  μatm  by  the  end  of  the  century  (IPCC,  Climate  change,  2007),  which  will  further  decrease  ocean  pH  by  0.3-­‐0.4  units  (Calderia  and  Wickett,  2005).  However,  many  coastal  ecosystems  are  already  routinely  experiencing  this  elevated  pCO2  (Feely  et  al.,  2008;  Cai  et  al.,  2011).  Upwelling  of  acidic  waters  from  the  deep,  along  with  significant  pH  variation  within  the  water  column,  may  contribute  to  large  temporal  pCO2  fluctuations  (Feely  et  al.,  2008;  Byrne  et  al.,  2010).  This  is  further  compounded  by  the  higher  incidence  of  hypoxic  “dead  zones”  as  a  result  of  eutrophication  (Melzner  et  al.,  2013).  Given  current  conditions,  seasonal  hypoxia  in  combination  with  acidic  upwelling  may  result  in  peak  pCO2  values  in  coastal  ocean  areas  of  1700-­‐3200  μatm  (Melzner  et  al.,  2012).  Long-­‐term  records  of  pH  on  Tatoosh  Island  off  of  the  Washington  coast  show  large  seasonal  and  diurnal  fluctuations  in  pH  (Wotton  et  al.,  2008).  Recent  work  characterizing  the  variability  of  dissolved  oxygen  and  pH  on  the  California  coast   17 estimated  that  pCO2  could  peak  as  high  as  1016  μatm  at  depths  of  17  m  and  persist  for  5-­‐7  days  (Frieder  et  al.,  2012).  Furthermore,  similar  fluctuations  from  200-­‐1000  μatm  have  been  recorded  at  surface  waters  on  the  Oregon  shelf  (Evans  et  al.,  2011),  suggesting  that  the  West  Coast  of  North  America  is  presently  experiencing  the  100-­‐year  predicted  levels.    To  date,  the  majority  of  work  on  the  effect  of  OA  on  marine  organisms  has  focused  mainly  on  calcifying  marine  invertebrates  and  phytoplankton  (Kurihara,  2008;  Raven  et  al.,  2005;  Riebesell  et  al.,  2000),  and  until  recently,  fish  were  generally  thought  to  be  unaffected  by  OA  (Doney  et  al.,  2009).  However,  recent  work  indicates  that  sub-­‐lethal  effects  such  as  altered  olfactory  responses  to  cues  (Dixson  et  al.,  2010;  Munday  et  al.,  2010;  Munday  et  al.  2009;  Cripps  et  al.,  2011),  interference  with  neurotransmitter  function  (Nilsson  et  al.,  2012),  heightened  anxiety  (Hamilton  et  al.,  2014),  changes  in  behavioral  lateralization  (Nilsson  et  al.,  2012;  Jutfelt  et  al.,  2013),  and  increased  otolith  growth  rates  (Checkley  et  al.,  2009;  Bignami  et  al.,  2013)  may  occur  at  pCO2  tensions  projected  by  the  end  of  the  century.  Although  there  is  a  growing  body  of  work  on  the  effects  of  OA  on  fish,  no  work  has  investigated  the  effect  of  fluctuating  pCO2  tensions  on  fish  (Reum  et  al.,  2014),  which  are  more  likely  to  reflect  natural  conditions.  Moreover,  the  current  research  on  climate  change-­‐related  acidification  has  been  on  marine  environments;  virtually  none  has  investigated  the  effects  in  freshwater  environments.    As  with  the  marine  environment,  streams  and  rivers  will  equilibrate  with  atmospheric  CO2,  and  thus,  climate  change  related  acidification  would  also  take  place  in  freshwater  systems.  Compared  to  seawater,  freshwater  contains  a  lower  ion   18 composition  and  buffer  capacity,  which  may  make  processes  such  as  acid-­‐base  regulation  more  challenging  (Larsen  and  Jensen,  1997).  Although  freshwater  only  comprises  0.8%  of  the  water  on  the  Earth’s  surface,  freshwater  ecosystems  support  almost  6%  of  the  world’s  biodiversity  (Dudgeon  et  al.,  2006).  For  example,  freshwater  ecosystems  support  approximately  40%  of  all  fish  species  and  are  vital  nurseries  for  anadromous  fish  (Lundberg  et  al.,  2000).  Therefore,  investigating  the  effects  of  CO2-­‐mediated  acidification  in  both  marine  and  freshwater  systems  may  provide  a  more  extensive  and  global  insight  into  how  species  and  communities  respond  to  climate  change.     Pink  salmon  (Oncorhynchus  gorbuscha)  are  anadromous  salmonids  and  spend  the  majority  of  their  juvenile  and  adult  lives  in  seawater,  before  returning  to  their  freshwater  natal  streams  to  spawn  (Stefansson  et  al.,  2008).  In  comparison  to  all  other  Pacific  salmon,  they  are  the  most  abundant  and  widely  distributed,  making  them  an  excellent  indicator  of  ecosystem  health  (Neave  et  al.,  1967).  Salmon  are  often  considered  a  keystone  species  in  marine,  freshwater  and  terrestrial  ecosystems  because  of  their  role  in  supporting  food  webs  (Wilson  and  Halupka,  1995;  Quinn,  2005)  and  as  such,  may  help  link  distinct  and  relatively  isolated  systems.    The  study  of  pink  salmon,  therefore,  may  provide  insight  into  the  effects  of  environmental  stressors  in  multiple  ecosystems  and  the  interaction  between  those  systems.    Developing  pink  salmon  are  under  tight  energy  constraints,  which  have  profound  impacts  on  their  growth  and  development  (Rombough  2012).  At  hatch,  pink  salmon  remain  in  the  gravel  while  feeding  endogenously  from  their  yolk   19 (Jobling,  1995;  Kunz,  2004).  During  this  early  life-­‐stage,  larval  fish  have  exceptionally  high  routine  metabolic  rates  with  little  ability  to  increase  metabolism  beyond  that  required  for  growth  (Rombough,  2012;  Killen  et  al.,  2007).    The  latter  is  often  quantified  through  the  measurement  of  aerobic  scope,  which  is  calculated  as  the  difference  between  routine  and  maximum  oxygen  consumption  (MO2).  Aerobic  scope  thus  represents  the  energy  available  beyond  that  for  maintenance,  such  as  exercise  (Fry,  1947;  Farrell,  2009),  and  in  larval  fishes,  this  is  thought  to  be  quite  limited  (Rombough  2012;  Killen  et  al.,  2007).  An  increase  in  water  pCO2  (hypercarbia)  may  have  energetic  costs  associated  with  acid-­‐base  regulation  (see  Chapter  1),  and  thus  implications  on  the  aerobic  scope  of  larval  pink  salmon.  Since  compensation  for  an  acid-­‐base  disturbance  occurs  over  a  span  of  24-­‐96  h  in  fish  studied  to  date  (reviewed  in  Brauner  and  Baker,  2009),  exposure  to  oscillating  pCO2  tensions  may  be  even  more  energetically  costly;  however,  this  has  not  previously  been  investigated  and  is  a  focus  of  this  thesis.  Unlike  most  other  anadromous  salmonids,  pink  salmon  migrate  to  sea  soon  after  emergence,  and,  at  0.2  g,  are  the  smallest  at  the  time  of  seawater  entry  (Grant  et  al.,  2009;  Heard  1991).  By  contrast,  most  Pacific  salmon  reside  in  their  natal  streams  for  up  to  a  year  or  more,  and  enter  seawater  between  2-­‐30  g  (Clarke,  1982;  Rounsefell,  1958).  Prior  to  seawater  migration,  many  salmonids  undergo  a  host  of  complex  physiological,  morphological,  and  behavioral  changes  in  preparation  for  the  transition  to  seawater  known  as  smoltification  (reviewed  in  Boeuf,  1993;  Folmar  and  Dickhoff,  1980;  Hoar,  1976;  Hoar,  1988;  McCormick,  1994;  McCormick  and  Saunders,  1987).  Recent  work  suggests  that  pinks  do  undergo  some  degree  of   20 smoltification,  but  appear  to  enter  seawater  somewhat  precociously  (Gallagher  et  al.,  2012;  Grant  et  al.  2009).  Since  seawater  entry  is  a  time  of  heightened  mortality  for  all  species  of  salmon  (Parker,  1962;  Durkin,  1982;  Healy,  1982),  their  small  size  and  high  surface  area-­‐to-­‐volume  ratio  may  make  pink  salmon  more  vulnerable  to  environmental  stressors  such  as  OA.  At  this  stage,  pink  salmon  may  be  more  vulnerable  than  other  salmonids,  making  them  a  good  model  species  to  investigate  the  effects  of  OA  on  a  critical  life-­‐stage  in  fish.  In  addition,  their  anadromous  life  history  can  also  provide  insight  into  the  effects  of  climate  change-­‐related  acidification  in  both  freshwater  and  marine  environments.    This  insight  may,  in  turn,  facilitate  the  creation  of  models  that  will  predict  the  wider-­‐spread  impact  of  climate  change  on  marine  and  freshwater  communities  and  ecosystems.  This  thesis  aims  to  address  some  of  the  current  knowledge  gaps  in  the  OA  literature  by  incorporating  pCO2  fluctuations  and  by  investigating  the  effects  of  climate  change-­‐related  acidification  on  an  anadromous  salmonid  during  growth  in  freshwater  and  seawater.  This  thesis  consists  of  three  main  objectives:  1)  To  assess  the  effects  of  marine  and  freshwater  acidification  on  the  growth  and  development  of  pink  salmon  from  hatch  up  to  seawater  entry,  2)  to  assess  the  metabolic  cost  of  development  under  future  elevated  and  fluctuating  pCO2  tensions,  and  3)  to  assess  the  effects  of  climate  change-­‐related  acidification  on  the  aerobic  scope  of  pink  salmon  prior  to  and  following  seawater  entry.         21 2.2  Materials  and  methods    2.21  Experimental  animals     Pink  salmon  eyed  embryos  were  transported  from  Quinsam  River  Hatchery  to  the  University  of  British  Columbia  (UBC)  on  November  8th  2012.  Embryos  were  incubated  in  total  darkness  at  4.0  ±  1.0  °C  in  small  containers  filled  with  dechlorinated  Vancouver  City  tap  water  ([Na+],  0.17  mM;  [Cl¯ˉ],  0.21mM;  hardness,  30mgL–1  CaCO3;  pH,  6.8  ±  0.2).  Water  changes  were  conducted  daily  to  ensure  good  water  quality.  At  470  accumulated  thermal  units  (ATU’s;  days  x  temperature  in  °C),  embryos  were  pooled,  sorted  based  on  size  and  uniform  sized  embryos  (weight  of  169  ±  14  mg  and  a  diameter  of  7.0  ±  0.7  mm)  were  transferred  into  their  respective  CO2  treatments  in  freshwater  (approximately  2  weeks  pre-­‐hatch).  At  9  weeks  post-­‐hatch,  fish  nearing  yolk-­‐sac  absorption  were  transferred  to  seawater  and  remained  in  seawater  treatments  for  2  weeks.  In  freshwater,  embryos  and  alevin  were  reared  in  darkness  to  mimic  gravel  conditions,  whereas,  in  seawater,  fry  were  exposed  to  natural  photoperiod  (12L:12D).  Throughout  the  experiment,  mortality  was  negligible  in  all  treatments  and  thus  was  not  reported  in  the  results.  Experimental  animals  were  treated  according  to  the  UBC  animal  protocol  #A11-­‐0235.    2.22  Experimental  design  and  CO2  manipulation  in  freshwater     Eyed  embryos  were  transferred  into  1  of  4  different  systems  with  constantly  flowing  dechlorinated  tap  water.  The  4  systems  consisted  of  a  control  treatment  (477  ±  20  μatm),  a  constant  medium  CO2  treatment  (1036  ±  47  μatm),  a  constant   22 high  CO2  treatment  (2031  ±  93  μatm),  and  a  24h  oscillating  CO2  treatment  (400-­‐2000  μatm).  All  systems  were  housed  in  a  temperature-­‐controlled  environmental  chamber.  In  each  system,  oxygenated  tap  water  flowed  through  a  reservoir  tank  where  water  was  equilibrated  with  the  respective  CO2  tension  prior  to  being  distributed  to  3  independent  flow-­‐through  replicate  tanks  (100L).  Dissolved  oxygen  in  all  tanks  always  exceeded  93%  saturation.  Desired  pCO2  tensions  were  set  and  maintained  by  mass  flow  controllers  (Sierra  Instruments,  Model  SmartTrak100  C100L)  that  bubbled  either  air,  which  had  been  partially  stripped  of  CO2,  or  a  mixture  of  compressed  CO2  (5-­‐30%  CO2  balanced  with  air)  into  the  reservoir  tank.  Once  target  tensions  were  achieved,  mass  flow  controller  rates  and  water  flow  rates  through  the  replicate  tanks  (0.3Lmin-­‐1)  were  held  constant  throughout  the  entire  10-­‐week  experiment.  For  the  oscillating  treatment,  the  CO2  mass  flow  controller  was  controlled  by  an  Ardunio  Uno  circuit  board,  which  varied  the  voltage  output  supplying  the  mass  flow  controller.  The  voltage  was  varied  according  to  a  sine  function  with  a  period  of  24  hrs.  Water  pH  and  temperature  in  each  treatment  system  was  monitored  continuously  in  one  of  the  replicate  tanks  with  a  glass  electrode  (Thermo  Scientific,  Orion  Ross  Ultra  Triode)  in  conjunction  with  the  Orion  Star  A211  pH  meter  (Thermo  Scientific).  Water  pH  values  were  stable  over  the  10  week  exposure  period  with  average  values  for  the  treatments  at:  control,  7.25  ±  0.02;  medium,  6.94  ±  0.03;  high,  6.65  ±  0.03;  oscillating,  6.66  ±  0.03  (high),  7.19  ±  0.04  (low).  Total  dissolved  inorganic  carbon  (DIC)  was  determined  with  a  DIC  analyzer  (Apollo  SciTech,  Model  AS-­‐C3)  using  Andrew  Dickson’s  Seawater  Reference  Materials  (SRM;  batch  #117)  over  the  duration  of  the  experiment  to  verify  that   23 target  pCO2  values  were  achieved  (control,  191  ±  7  μmol/kgSW;  medium,  233  ±  3  μmol/kgSW;  high,  292  ±  11  μmol/kgSW).  In  the  weeks  without  DIC  analysis,  water  directly  from  each  system  was  bubbled  with  a  known  tension  of  pCO2  (410,1025  and  2050  μatm)  and  the  corresponding  pH  was  measured  and  compared  with  replicate  tank  values.  This  was  used  as  a  secondary  method  of  water  analysis  to  validate  our  measurements  and  ensure  accuracy  of  our  pH  electrodes.  Freshwater  pCO2  was  calculated  from  pH  and  DIC  with  CO2SYS  (Lewis  and  Wallace,  1998)  using  freshwater  constants  from  Millero,  1979.  Water  temperature  was  also  measured  continuously  at  3  hour  intervals  in  each  replicate  tank  using  iButtons  (Thermochron,  DS19212-­‐F5#)  and  was  on  average  6.75  ±  1.1  °C  throughout  the  entire  10  week  exposure.    2.23  Seawater  transfer  and  CO2  manipulation  in  seawater     At  995  ATU’s  (Table  2.1;  week  9  post-­‐hatch;  week  11  post  CO2  exposure),  fry  were  transferred  from  their  freshwater  treatments  into  100L  static  aquaria  containing  seawater  from  the  Vancouver  Aquarium  (salinity,  29.1  ±  0.6;  temperature,  7.0  ±  0.4,  Total  Alkalinity:  2015  ±  72  μmol/kgSW).  At  this  age,  fry  were  actively  swimming  and  were  at  the  yolk  sac  absorption  stage,  which  typically  corresponds  to  gravel  emergence  and  seaward  migration.  Time  to  yolk  sac  absorption  was  consistent  with  the  age  at  which  pink  salmon  fry  start  to  emerge  at  the  hatchery  and  yolk  sac  absorption  times  from  previous  studies  (Gallagher  et  al.  2012).  Since  migrating  fry  still  possess  an  internal  supply  of  yolk  reserves,  fish  were  not  fed  during  the  entire  2-­‐week  seawater  exposure.  Fry  reared  in  control   24 freshwater  conditions,  were  randomly  transferred  into  1  of  3  different  seawater  treatments:  a  control  CO2  treatment  (448  ±  11  μatm),  a  high  CO2  treatment  (1593  ±  30  μatm),  or  a  24hr  oscillating  CO2  treatment  (400-­‐1600  μatm).  Fry  reared  in  high  CO2  freshwater  conditions  were  randomly  transferred  to  a  high  CO2  seawater  treatment  (1593  ±  30  μatm).  To  mimic  seawater  transfer  conditions  from  the  previous  year’s  experiment,  a  high  pCO2  tension  of  1600  μatm  and  not  2000  μatm  was  used.  Each  treatment  consisted  of  3  independent  and  static  replicate  tanks,  which  were  all  housed  in  a  temperature-­‐controlled  environmental  chamber.  For  each  treatment,  desired  pCO2  tensions  were  set  and  maintained  by  Sierra  mass  flow  controllers  that  bubbled  either  air,  partially  stripped  of  CO2,  or  a  mixture  of  compressed  CO2  (5-­‐15%  CO2  balanced  with  air)  through  3  separate  lines  into  each  of  the  static  replicate  tanks.  Once  target  tensions  were  achieved,  mass  flow  controller  rates  were  held  constant  throughout  the  entire  2-­‐week  exposure.  CO2  oscillations  were  achieved  using  the  same  method  as  noted  above.  Seawater  pH  and  temperature  in  each  treatment  was  monitored  continuously  in  one  of  the  replicate  tanks  with  a  glass  electrode  (Thermo  Scientific,  Orion  Ross  Ultra  Triode)  and  averaged  8.05  ±  0.01  (control),  7.54  ±  0.01  (high)  and  7.57  ±  0.02  to  8.04  ±  0.02  (oscillating).  Analysis  of  seawater  samples  for  DIC  was  conducted  in  a  manner  similar  to  that  of  freshwater  samples.  DIC  was  measured  at  the  beginning  and  at  the  end  of  the  seawater  exposure  (control,  1884  ±  30  μmol/kgSW;  high,  2058  ±  32  μmol/kgSW).  Seawater  samples  were  taken  for  total  alkalinity  (AT)  at  day  14  post-­‐transfer  and  were  analyzed  according  to  Dickson  et  al.,  2007  at  The  Ocean  Acidification  Lab  in  Friday  Harbor  Labs,  Washington.  Similar  to  freshwater  analysis,   25 seawater  from  one  of  the  replicate  tanks  per  treatment  was  sampled  and  bubbled  with  a  known  tension  of  pCO2  (410  and1640  μatm)  and  the  corresponding  pH  was  measured  and  compared  with  replicate  tank  values  to  ensure  consistency.  The  dissociation  constants  from  GEOSECS  (NBS  scale)  were  used  to  calculate  pCO2  in  CO2SYS.      2.24  Growth  and  yolk  consumption     Measurements  of  alevin  wet  mass  (wtm)  and  length  (n=8  for  wet  mass;  n=8  for  length)  were  taken  weekly  from  2  weeks  pre-­‐hatch  up  until  2  weeks  post-­‐seawater  transfer  (11  weeks  post-­‐hatch).  Alevin  were  then  fixed  in  5%  neutral  buffered  formalin  for  up  to  21  days  before  the  yolk  was  dissected  from  the  fish  to  obtain  yolk  wtm  and  tissue  wtm  measurements.  These  samples  were  then  dried  in  an  oven  at  58ºC  for  at  least  5  days  to  obtain  dry  weights  for  alevin  tissue  and  yolk.  Gross  production  efficiencies  at  week  10  were  calculated  as  the  increase  in  tissue  dry  mass  divided  by  the  loss  in  yolk  dry-­‐mass  multiplied  by  100.  Growth  rates  in  seawater  were  calculated  as  the  difference  in  alevin  wtm  at  day  14  and  at  day  0  post-­‐seawater  transfer.      2.25  Respirometry     To  accommodate  the  growing  size  of  developing  fish,  3  different-­‐sized  closed  respirometers  were  used:    3.41  ±  0.1  ml  for  week  1-­‐  4;  7.43  ±  0.3  ml  for  week  5-­‐  10;  and  10.60  ±  0.4  ml  for  day  1-­‐14  post-­‐seawater  transfer.  Chambers  were  rinsed  in  VIRCON  at  the  end  of  each  day  to  reduce  background  bacterial  respiration,  which   26 was  determined  to  be  negligible  from  blank  experiments.  To  ensure  adequate  water  mixing,  a  mini  stir  bar  was  placed  beneath  a  false  bottom  mesh  in  all  the  chambers.  A  total  of  8  fish  per  treatment  (4  treatments)  per  time  point  (weekly)  were  used  for  measurement  of  routine  and  maximum  MO2  in  the  water  from  the  respective  pCO2  treatment  in  which  the  fish  were  reared.    Routine  MO2  (MO2routine)  was  measured  weekly  throughout  development  in  freshwater  up  until  14  days  post-­‐seawater  transfer.  Fish  were  placed  in  the  chambers,  where  they  were  acclimated  in  darkness  at  an  appropriate  acclimation  time  (2  h  for  eggs,  3  h  for  alevin,  4  h  for  fry)  in  flow-­‐through  water  of  their  respective  pCO2  treatments.  Acclimation  times  were  determined  by  preliminary  testing,  which  indicated  that  longer  periods  (8  h)  did  not  significantly  reduce  MO2routine.  After  the  acclimation  period,  the  chamber  was  sealed  and  the  decline  in  oxygen  was  monitored  over  time,  using  a  fiber  optic  oxygen  sensor  (PreSens,  Model  NFSL)  to  calculate  mass-­‐specific  MO2routine.  Once  O2  levels  reached  60%  saturation,  the  measurement  was  terminated  and  the  chamber  was  re-­‐supplied  with  flow  through  water.  The  sensor  was  connected  to  a  4-­‐channel  oxygen  meter  (PreSens,  OYY-­‐4  Micro),  allowing  the  simultaneous  recording  of  4  chambers.  Data  was  obtained  using  the  accompanying  software  (OXY-­‐4v2_11TX),  with  temperature  compensation.       Maximum  MO2  (MO2max)  was  measured  weekly  from  week  8-­‐10  in  freshwater  and  from  day  1-­‐14  post-­‐seawater  transfer,  using  a  chase  protocol  similar  to  the  one  outlined  in  Healy  and  Schulte,  2012.  Briefly  following  the  determination  of  MO2routine,  the  fish  was  removed  from  the  chamber,  placed  in  a  container  filled  with  the   27 respective  pCO2  water  and  then  chased  to  exhaustion  with  a  plastic  pipette  for  a  minimum  of  4  minutes.  The  inability  to  right  itself  within  3  seconds  following  inversion  was  defined  as  complete  exhaustion.  At  this  point  the  fish  was  immediately  returned  to  the  chamber  and  MO2max  was  measured  (all  within  30s).  MO2max  was  calculated  from  the  initial  decrease  in  oxygen  following  closure  of  the  chamber  (within  5  min  of  initial  decrease).  Although  maximum  sustained  swimming  speed  (Ucrit)  is  typically  used  to  obtain  MO2max  in  fish,  previous  studies  have  shown  that  chase  protocols  can  yield  similar  or  higher  values  of  MO2max  in  some  species  of  fish  (Reidy  et  al.,  1995;  Sylvestre  et  al.,  2007;  Killen  et  al.  2007).    2.26  Statistical  analysis     Data  are  expressed  as  means  ±  SEM,  and  were  log-­‐transformed  when  necessary  to  meet  the  assumptions  of  normality  and  equal  variance.  Two-­‐way  analyses  of  variance  (ANOVA)  were  used  to  analyze  all  the  wet  mass,  length,  production  efficiency,  and  growth  data,  using  the  software  SigmaPlot  (version  12,  Systat  Software  Inc.,  San  Jose,  CA,  USA).  Pairwise  comparisons  among  treatments  and  comparisons  to  the  control  were  made  using  the  Holm-­‐Sidak  post-­‐hoc  test  when  significance  was  found.    Multiway  ANOVAs  with  treatment  and  time  as  factors  were  used  to  analyze  log-­‐transformed  mass-­‐specific  MO2routine,  mass-­‐specific  MO2max,  and  aerobic  scope  data  using  the  program  RStudio  (version  3,  RStudio  Inc.).  Preliminary  multiway  ANOVAs  including  log-­‐transformed  mass  as  a  factor  showed  no  significant  effects  of  mass  on  mass-­‐specific  MO2routine/max  and  aerobic  scope,  and  as  a  result,  mass  was   28 dropped  from  our  models.  This  is  consistent  with  the  finding  that  early  in  development,  MO2routine  and  MO2max  scales  isometrically  with  body  mass  (Killen  et  al.,  2007,  Rombough,  2011).  Scaling  exponents  during  early  life-­‐stages  for  MO2routine  and  MO2max  have  been  shown  to  be  >0.96  and  >1.0,  respectively,  for  athletic  salmonid  species  (Wieser,  1985;  Post  and  Lee,  1996).  All  MO2  data  are  expressed  as  mass-­‐specific  metabolic  rates.  TukeyHSD  pairwise  comparisons  among  treatments  were  made  when  significance  was  detected.  For  all  tests,  a  significance  level  of  p<0.05  was  used.    2.3  Results    2.31  Growth  and  development     Total  alevin  wet  mass  (wtm)  increased  significantly  throughout  freshwater  development  (Fig.  2.1;  F  =  2.768,  df  =  10,  p<0.001),  and  was  significantly  different  among  the  different  CO2  treatments  (F  =  3.342,  df  =  3,  p  =  0.019).  At  10  weeks  following  CO2  exposure,  total  alevin  wtm  in  the  control  group  was  12-­‐15%  higher  than  the  medium  and  high  CO2  groups  (p  =  0.027  and  p<0.001,  respectively).  Similarly,  tissue  wtm  (without  yolk)  was  also  significantly  different  throughout  freshwater  development  (Fig.  2.2;  F  =  273.86,  df  =  6,  p<0.001),  and  among  treatments  (F  =  8.081,  df  =  3,  p<0.001).  At  10  weeks  following  CO2  exposure,  tissue  wtm  in  the  high  CO2  group  was  reduced  by  13-­‐15%  relative  to  the  fluctuating  CO2  and  control  group  (p  =  0.048  and  p  =  0.013,  respectively).  Consistent  with  tissue  wtm,  tissue  dry  mass  at  week  10  was  significantly  different  among  groups  (Fig.  2.3;   29 F  =  3.737,  df  =  3,  p  =  0.022).  Fork  lengths  also  revealed  similar  trends,  with  significant  differences  occurring  throughout  development  (Fig.  2.4;  F  =  175.178,  df  =  6,  p<0.001)  and  among  treatments  (F  =  8.355,  df  =  3,  p<0.001).  At  week  10,  control  fish  were  significantly  longer  than  all  other  groups  (p≤0.001).    Yolk  wtm,  on  the  other  hand,  decreased  throughout  freshwater  development  (Fig.  2.5)  and  was  not  significantly  different  among  the  different  treatments  at  week  10  (Fig.  2.6;  F  =  2.723,  df  =  3,  p  =  0.063).  Similarly,  yolk  dry  mass  was  also  not  significantly  different  among  treatments  at  week  10  (Fig.  2.7;  F  =  2.415,  df  =  3,  p  =  0.088),  indicating  that  yolk  stores  were  consumed  at  similar  rates.  Production  efficiencies  near  yolk  sac  absorption  (week  10)  were  significantly  different  among  the  groups  (Fig.  2.8;  F  =  4.715,  df  =  3,  p  =  0.009),  with  the  control  group  having  a  25%  higher  production  efficiency  than  the  high  CO2  group  (p  =  0.007).       In  seawater,  growth  rates  were  significantly  different  among  the  different  CO2  seawater  treatments  (Fig.  2.9;  F  =  4.63,  df  =  3,  p  =  0.009).  At  day  14,  growth  rates  were  almost  4  times  higher  in  control  fish  reared  in  control  freshwater  and  transferred  into  control  seawater  (low→low)  than  fish  reared  in  control  freshwater  and  transferred  into  high  CO2  seawater  (low→high)  (p  =  0.007).  Fork  lengths  of  control  seawater  fish  were  also  greater  compared  to  all  other  groups  (Table  2.2).      2.32  Metabolic  rates     During  development  in  freshwater,  MO2routine  increased  significantly  after  hatch  and  plateaued  around  week  9-­‐10.  There  was  a  significant  effect  of  time  (Fig.  2.10;  F  =  287.183,  df  =  10,  p<0.001)  but  no  effect  of  treatment  (F  =  0.816,  df  =  3,  p  =   30 0.486)  on  MO2routine  with  a  significant  interaction  between  factors  (F  =  1.708,  df  =  30,  p  =  0.0146).  From  week  8-­‐10,  MO2max  did  not  change  during  development  (F  =  0.361,  df  =  2,  p  =  0.699)  but  there  was  a  significant  effect  of  treatment  (F  =  4.943,  df  =  3,  p  =  0.003)  with  no  interaction  effects  between  factors  (F  =  1.053,  df  =  6,  p  =  0.398).       At  day1,  7  and  14  post-­‐seawater  transfer,  there  were  no  significant  effects  of  time  (Fig.  2.11;  F  =  2.319,  df  =  2,  p  =  0.105),  treatment  (F  =  0.646,  df  =  3,  p  =  0.588),  and  interaction  between  factors  (F  =  2.657,  df  =  6,  p  =  0.068)  on  MO2routine.  Conversely,  MO2max  increased  significantly  during  exposure  in  seawater  (Fig.  2.12;  F  =  23.895,  df  =  2,  p<0.001)  with  significant  differences  among  treatments  (F  =  10.363,  df  =  3,  p<0.001);  however,  no  significant  interaction  effects  were  detected  between  factors  (F  =  0.963,  df  =  6,  p  =  0.456).  At  day  7,  the  control  low→low  group  had  significantly  higher  MO2max  than  the  low→high  group  (p  =  0.026).  Similar  to  MO2max,  aerobic  scope  increased  throughout  seawater  exposure  (Fig.  2.13;  F  =  23.014,  df  =  2,  p<0.001)  and  was  significantly  different  among  the  groups  (F  =  8.341,  df  =  3,  p<0.001)  with  no  interaction  effects  between  factors  (F  =  0.301,  df  =  6,  p  =  0.936).     Throughout  development  in  freshwater  and  transfer  into  seawater,  MO2routine  of  fish  reared  in  control  conditions  and  then  transferred  into  control  seawater  (low→low),  and  fish  reared  in  high  CO2  and  then  transferred  into  high  CO2  seawater  (high→high)  were  not  significantly  different  (Fig.  2.14;  F  =  0.576,  df  =  1,  p  =  0.4488).  MO2max  and  aerobic  scope  increased  in  both  groups  following  seawater  transfer  (Fig.  2.14;  Fig.  2.15).  At  7  days  post-­‐transfer,  aerobic  scope  increased  by  60%  in  the  control  group  and  43%  in  the  high→high  group.  The  high→high  group  however,  had   31 a  significantly  lower  MO2max  (F  =  17.021,  df  =  1,  p<0.001),  and  a  smaller  aerobic  scope  (F  =  17.209,  df  =  1,  p<0.001)  than  the  control  group.      2.4  Discussion       This  study  demonstrates  that  pink  salmon,  under  predicted  future  increases  in  pCO2,  may  be  faced  with  sublethal  impacts  of  acidification  on  various  aspects  of  their  physiology  at  a  very  critical  time  in  their  life  history.  Growth  in  both  freshwater  and  seawater  was  significantly  reduced  at  high  pCO2  with  a  25%  reduction  in  production  efficiency  occurring  at  2000  μatm.  However,  no  effect  on  growth  was  seen  at  oscillating  tensions.  Similarly,  MO2max  and  aerobic  scope  were  reduced  at  high  pCO2  following  seawater  transfer  with  no  change  in  MO2routine.      2.41  Growth  and  development     According  to  our  findings,  growth  during  the  early  life-­‐stages  of  pink  salmon  may  be  affected  at  pCO2  levels  predicted  to  occur  within  the  next  century.  Total  alevin  wtm  and  tissue  wtm  were  lower  in  fish  reared  at  medium  and  high  pCO2  compared  to  those  reared  in  control  conditions  near  the  end  of  yolk  absorption.  Since  pink  salmon  begin  their  seawater  migration  around  this  period,  their  smaller  size  relative  to  other  smolts,  may  have  a  large  impact  on  their  survival  at  this  crucial  life-­‐stage.  Smaller  individuals  may  be  more  susceptible  to  predation  and  have  lower  foraging  success  at  a  time  when  yolk  reserves  become  limiting.  Previous  work  looking  at  growth  in  fish  at  OA-­‐relevant  levels  shows  varying  responses  (Tseng  et   32 al.,  2013;  Baumann  et  al.,  2011;  Munday  et  al.,  2009),  indicating  that  OA  impacts  on  growth  may  be  species  specific.  Ocean  acidification  appears  to  reduce  growth  and  survival  in  the  inland  silverside,  Menidia  beryllina  (Baumann  et  al.,  2011),  whereas  it  appears  to  be  enhanced  in  the  clown  fish,  Amphiprion  percula  (Munday  et  al.,  2009).  Early  in  development  (3-­‐5  dph),  Japanese  medaka  show  stunted  growth  under  constant  elevated  pCO2  (1200  and  4200  μatm)  but  were  able  to  catch  up  to  the  control  group  before  hatch  (Tseng  et  al.,  2013).  This  developmental  delay  has  also  been  documented  in  various  marine  invertebrates  at  early  developmental  stages  (Walther  et  al.,  2010;  Stumpp  et  al.,  2011,  Hu  et  al.,  2011).  In  the  case  of  pink  salmon,  a  shift  in  developmental  time  does  not  appear  to  be  occurring.  Near  yolk  absorption  (week  10),  yolk  wtm  is  not  significantly  different  among  the  different  CO2  groups,  suggesting  that  yolk  consumption  rates  were  similar.  Given  that  gravel  emergence  in  pink  salmon  occurs  at  yolk  sac  absorption,  these  data  indicate  that  elevated  CO2  in  freshwater  would  likely  lead  to  comparable  times  of  gravel  emergence  but  in  fish  that  are  smaller,  which  may  have  implications  for  survival.  Following  seawater  entry,  growth  rates  were  negative  in  groups  transferred  into  high  CO2,  whereas  control  fish  continued  to  grow  throughout  the  full  2  weeks  in  seawater.  Fish  were  not  fed  during  seawater  exposure;  however,  internal  yolk  stores  were  still  present,  which  were  presumably  the  basis  for  growth.  Growth  is  indicated  by  changes  in  weight  and  length,  and  consistent  with  the  growth  data,  lengths  were  also  reduced  during  development  in  high  CO2  seawater.  This  suggests  that  tissue  production  may  be  impaired  at  high  CO2.  However,  since  growth  rates  are  based  on  total  wtm,  the  inability  to  hypo-­‐osmoregulate  efficiently  at  high  pCO2  could   33 have  also  contributed  to  the  apparent  negative  growth  rate  estimates  (due  to  water  loss)  during  the  transition  to  seawater.  In  seawater,  fish  continuously  lose  water  to  their  hyperosmotic  environment  and  to  compensate,  marine  fish  actively  drink  seawater  and  excrete  ions  to  maintain  osmotic  balance  (Evans  et  al.,  2005).  Near  the  time  of  seawater  entry,  pink  salmon  appear  to  undergo  some  degree  of  smoltification  as  indicated  by  a  large  increase  in  the  ratio  of  gill  NKA  isoform  α1b/  α1a  in  fish  maintained  in  freshwater  (Gallagher  et  al.,  2012).  These  changes,  among  others,  may  help  maintain  water  balance,  which  is  key  to  seawater  survival.  If  the  lower  growth  rates  at  high  pCO2  are  associated  with  impaired  hypo-­‐osmoregulatory  ability,  then  the  osmoregulatory  challenge  of  seawater  entry  may  be  further  compounded  by  OA.     Lower  yolk-­‐to-­‐tissue  conversion  efficiencies  in  pink  salmon  alevin  may  indicate  that  development  at  pCO2  levels  projected  by  the  end  of  the  century  may  be  more  energetically  costly.  In  the  gravel,  alevin  feed  exclusively  on  their  yolk  reserves,  which  proves  convenient  in  creating  energy  budgets  and  estimating  the  relative  cost  of  growth.  Assuming  100%  yolk  assimilation,  the  total  amount  of  available  yolk  stores  (Y)  is  equal  to  the  sum  of  the  materials  from  the  yolk  that  are  required  for  tissue  production  (P),  and  the  energy  that  is  allocated  towards  total  metabolism/respiration  (R)  and  excretion  (E)  of  waste  (Rombough,  2011).  Respiration  can  be  further  broken  into  respiration  for  growth  (Rg),  respiration  for  maintenance  of  tissues  (Rm)  and  respiration  for  activity  (Ra)  (Rombough,  2011).  Given  that  energy  budgets  balance,  if  development  in  OA-­‐relevant  tensions  is  more  energetically  costly,  then  one  would  expect  a  decrease  in  overall  tissue  production.   34 Consistent  with  our  predictions,  there  was  a  substantial  decrease  in  gross  production  efficiencies  at  high  pCO2.    2.42  Aerobic  scope     Following  seawater  transfer,  an  increase  in  CO2  reduced  aerobic  scope  in  pink  salmon  fry  through  a  decrease  in  MO2max.  These  results  indicate  that  pink  salmon  fry  may  be  particularly  sensitive  to  climate  change-­‐related  acidification  during  exercise,  which  may  have  implications  on  the  success  of  their  seaward  migration.  Similarly,  Munday  et  al.  (2009)  found  reductions  in  MO2max  and  aerobic  scope  in  2  species  of  coral  reef  fish,  Ostorhinchus  doederleini  and  O.  cyanosoma,  at  pCO2  levels  of  1000  μatm.  MO2routine  in  both  O.  doederleini  and  O.  cyanosoma  were  slightly  elevated  at  high  CO2,  suggesting  that  there  may  be  energetic  costs  associated  with  OA-­‐relevant  levels  of  acidification  (Munday  et  al.,  2009).  In  contrast,  hypercarbia  at  much  higher  levels  (7,500-­‐92,000  μatm)  did  not  significantly  change  MO2routine  in  various  species  of  fish  (Ishimatsu  et  al.,  2005).  However,  most  of  these  studies  involved  short-­‐term  exposure  of  CO2  on  adult  and  juvenile  fish  and  thus,  may  not  be  representative  of  what  is  happening  in  larval  fish  in  the  long  term.       Factorial  scope,  which  is  the  ratio  of  MO2max  to  MO2routine,  is  extremely  small  in  larval  fish  and  tends  to  increase  throughout  development.  Near  the  end  of  yolk-­‐sac  absorption,  factorial  scopes  average  around  1.5  to  2.0  (Rombough,  2011;  Post  and  Lee,  1996;  Killen  et  al.,  2007).  Our  findings  show  factorial  scopes  of  2.5  –  3.5  in  developing  pink  salmon  alevin,  with  scopes  as  high  as  5.5  following  seawater  transfer  (Fig.  2.16).  By  contrast,  factorial  scopes  of  rainbow  trout  (Oncorhynchus   35 mykiss)  at  the  same  development  stage  were  only  slightly  higher  than  1.0  (Wieser,  1985),  suggesting  that  pink  salmon  fry  may  have  unusually  high  factorial  scopes  compared  to  other  active  species  of  salmonids.  This  is  not  surprising  given  their  unique  life  history.  Since  pinks  migrate  to  sea  soon  after  emergence,  their  heightened  capacity  for  activity  may  be  crucial  to  their  survival  in  a  predator-­‐dense  environment.  Compared  to  other  anadromous  salmonids,  adult  pink  salmon  show  an  unrivaled  capacity  for  exercise  (Clark  et  al.,  2011).  They  have  exceptionally  high  aerobic  scopes  over  a  broad  range  of  temperatures  (Clark  et  al.,  2011).    This  enhanced  capacity  for  performance  at  different  life-­‐stages  may  contribute  to  their  impressive  ecological  success.  However,  there  is  clearly  an  effect  of  OA  on  the  factorial  and  aerobic  scope  at  a  critical  and  sensitive  life-­‐stage  of  pink  salmon,  which  in  turn,  may  have  large  implications  on  their  survival  and  thus  future  pink  salmon  populations.      2.43  Temporal  fluctuations  in  pCO2     Currently,  large  temporal  fluctuations  in  pCO2,  reaching  projected  end-­‐of-­‐century  levels,  are  occurring  in  many  coastal  ecosystems.  Since  acid-­‐base  compensation  in  fish  involves  the  accumulation  of  HCO3¯ˉ  in  exchange  for  Cl¯ˉ  to  reach  a  new  steady  state,  we  predicted  that  compensation  would  be  more  costly  under  oscillating  pCO2  tensions.  Contrary  to  our  predictions,  daily  fluctuations  from  400–2000  μatm  had  no  effect  on  growth  and  MO2routine  in  freshwater.  Therefore,  either  compensation  for  hypercarbia  was  not  metabolically  costly  as  we  had  predicted  or  the  time  course  of  oscillation  in  this  study  was  insufficient  to  resolve  the  metabolic   36 cost.  Complete  compensation  for  acid-­‐base  disturbances  occurs  over  a  period  of  24-­‐96  h  in  most  teleosts  (reviewed  in  Brauner  and  Baker,  2009).  Given  that  our  oscillation  was  over  24  hrs,  the  fish  may  not  have  had  sufficient  time  or  real  need  to  fully  compensate.  Since  our  changes  in  pCO2  were  extremely  gradual  with  short  exposure  times  at  the  pCO2  extremes,  the  fish  would  have  been  exposed  to  medium  pCO2  tensions  for  the  majority  of  the  day.  Broader  periods  of  oscillating  and  more  dramatic  changes  in  pCO2  during  oscillations  should  be  investigated  in  the  future  to  provide  a  more  in-­‐depth  look  into  the  impacts  of  temporal  pCO2  fluctuations  on  fish,  which  are  more  likely  to  reflect  natural  coastal  conditions.    2.44  Current  and  future  implications  on  pink  salmon     From  our  findings,  future  increases  in  pCO2  may  have  negative  impacts  on  the  physiology  of  pink  salmon.  Development  at  elevated  pCO2  tensions  reduces  growth  in  alevin,  resulting  in  smaller-­‐sized  fry  at  the  time  of  seaward  migration.  Since  predation,  in  most  cases,  is  strongly  size-­‐selective  (Pepin,  1991),  larger  hatchlings  will  generally  fare  better  than  smaller  ones  (Hendry  et  al.,  2001).  This  has  large  implications  on  the  survival  of  pink  salmon  in  the  ocean  as  they  make  the  transition  from  a  predator-­‐sparse  environment  in  freshwater  to  a  predator-­‐rich  marine  environment.  In  addition,  their  larger  surface  area-­‐to-­‐volume  ratios  may  heighten  the  osmoregulatory  challenges  associated  with  the  transition  to  seawater.  At  this  pivotal  time,  the  aerobic  capacity  of  migrating  fry  may  also  be  reduced  under  elevated  pCO2.  Since  aerobic  scope  represents  the  energy  available  for  processes  such  as  growth  and  activity,  pinks  may  be  more  susceptible  to  predation  and  have   37 lower  foraging  success.  The  reduction  of  aerobic  scope  at  high  temperatures  is  thought  to  be  a  key  factor  in  limiting  the  distribution  and  abundance  of  species  (Pörtner  and  Farrell,  2008).  Additional  environmental  stressors,  such  as  OA,  are  hypothesized  to  further  compound  the  effects  of  temperature  on  the  narrowing  of  thermal  windows  (Pörtner  and  Farrell,  2008).  Since  the  sustainability  of  fish  populations  is  highly  dependent  on  survival  during  early  life-­‐stages  (Hamilton  et  al.,  2008),  future  increases  in  CO2  may  have  large  implications  on  the  health  of  future  pink  salmon  populations  and  thus,  the  health  of  our  freshwater  and  coastal  ecosystems.     Recent  oceanic  surveys  of  the  West  Coast  of  North  America  suggest  that  our  coastal  ecosystems  may  already  be  experiencing  the  future  projected  increases  in  pCO2.  The  Oregon  coast,  which  is  contiguous  with  the  waters  of  Vancouver  Island,  may  be  subject  to  high  variations  in  pCO2,  ranging  from  <200  μatm  to  >1000  μatm  (Evans  et  al.,  2011).  In  fact,  elevated  surface  water  pCO2  of  about  1000  μatm  has  been  repeatedly  measured  over  a  2-­‐month  period  in  that  region  (Evans  et  al.,  2011).  Near-­‐shore  environments,  such  as  estuaries,  which  provide  refuge  to  schools  of  pink  salmon  before  they  double  in  size  and  begin  their  offshore  migration  (Heard,  1991),  may  also  be  subjected  to  large  variations  in  pCO2.  Carbonate  chemistry  data  from  Puget  Sound,  a  large  estuary  on  the  West  Coast  of  North  America,  indicate  that  pCO2  may  exceed  2500  μatm  during  autumn  near  surface  waters  (Reum  et  al.,  2014).  In  addition,  long-­‐term  records  of  pH  in  the  Georgia  Strait  show  pH  regularly  dropping  to  as  low  as  7.5  from  the  year  2001  and  onward  (Marliave  et  al.,  2011).  This  pH  drop  corresponds  to  a  pCO2  estimate  of  1600  μatm,  at  which  level  our  study  found   38 detriments  to  growth  and  aerobic  performance  in  pink  salmon.  Taken  together,  pink  salmon  fry  may  currently  be  exposed  to  prolonged  detrimental  levels  of  pCO2  during  their  seaward  migration.    2.45  Summary     This  study  provides  the  first  investigation  into  the  impacts  of  climate  change-­‐related  acidification  on  an  anadromous  fish  species  during  development  in  both  freshwater  and  seawater.  We  show  that  the  growth  and  performance  capacity  of  pink  salmon  are  substantially  reduced  at  an  extremely  critical  and  sensitive  life-­‐stage  under  future  projected  increases  in  pCO2.  Based  on  recent  oceanic  surveys,  the  pCO2  levels  we  investigated  may  already  be  occurring  on  our  coasts.  If  this  is  the  case,  then  our  current  pink  salmon  populations  may  already  be  vulnerable,  which  could  have  large  implications  on  the  future  health  of  our  coastal  ecosystems.                                           39   Figure  2.1.  Total  alevin  pink  salmon  wet  mass  (yolk  included)  during  development  in  freshwater  from  2  weeks  pre-­‐hatch  (time  0  of  CO2  exposure)  up  until  1  week  before  seawater  transfer  (weeks  10  of  CO2  exposure)  at  different  pCO2  tensions  (indicated  in  the  figure  where  400-­‐2000  μatm  represents  a  diurnal  cycle  and  other  tensions  are  constant  throughout).  Dashed  line  represents  time  of  hatch.  Arrow  indicates  yolk  sac  absorption  (YSA).  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  8).  There  was  a  significant  effect  of  CO2  treatment  throughout  freshwater  development.  Letters  that  differ  indicate  statistically  significant  differences  among  groups  at  YSA  (p<0.05).   2 4 6 8 100.140.160.180.200.22Time (weeks)Total Alevin Wet Mass (g)!""#$%&'("""#$%&')"""#$%&'!""*)"""#$%&'%%+%++,-. 40 Figure  2.2.  Pink  salmon  tissue  wet  mass  (yolk  excluded)  during  development  in  freshwater  from  2  weeks  post-­‐hatch  (week  4  of  CO2  exposure)  up  until  1  week  before  seawater  transfer  (week  10  of  CO2  exposure)  at  different  pCO2  tensions  (indicated  in  the  figure  where  400-­‐2000  μatm  represents  a  diurnal  cycle  and  other  tensions  are  constant  throughout).  Arrow  indicates  yolk  sac  absorption  (YSA).  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  8).  There  was  significant  effect  of  CO2  treatment  throughout  freshwater  development.  Letters  that  differ  indicate  statistically  significant  differences  among  groups  at  YSA  (p<0.05).       ! " # $ % & '(()(%()'(()'*()'!()'#()'%()*(()**Time (weeks)Tissue Wet Mass (g)1000 μatm400-2000 μatm400 μatm2000 μatm++,,--./0 41 Figure  2.3.  Pink  salmon  tissue  dry  mass  (yolk  excluded)  at  week  10  (1  week  before  seawater  transfer).  Values  below  bars  represent  the  pCO2  levels  in  μatm  (400-­‐2000  μatm  represents  a  diurnal  cycle  and  other  tensions  are  constant  throughout).  Dashed  line  represents  mean  value  of  the  control  group  (400  μatm).  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  8).  Asterisks  indicate  statistically  significant  difference  from  the  control  group  (p<0.05).   400 1000 2000 400-20005101520253035Tissue Dry Mass (mg)! 42 Figure  2.4.  Pink  salmon  fork  lengths  during  development  in  freshwater  from  3  weeks  post-­‐hatch  (week  5  of  CO2  exposure)  up  until  1  week  before  seawater  transfer  (week  10  of  CO2  exposure)  at  different  pCO2  tensions  (indicated  in  the  figure  where  400-­‐2000  μatm  represents  a  diurnal  cycle  and  other  tensions  are  constant  throughout).  Arrow  indicates  yolk  sac  absorption  (YSA).  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  8).  There  was  significant  effect  of  CO2  treatment  throughout  freshwater  development.  Letters  that  differ  indicate  statistically  significant  differences  among  groups  at  YSA  (p<0.05)   5 6 7 8 9 1028303234Time (weeks)Length (mm)!""#$%&'("""#$%&')"""#$%&'!""*)"""#$%&'%++,,-./ 43 Figure  2.5.  Pink  salmon  yolk  wet  mass  during  development  in  freshwater  from  2  weeks  post-­‐hatch  (week  4  of  CO2  exposure)  up  until  1  week  before  seawater  transfer  (week  10  of  CO2  exposure)  at  different  pCO2  tensions  (indicated  in  the  figure  where  400-­‐2000  μatm  represents  a  diurnal  cycle  and  other  tensions  are  constant  throughout).  Arrow  indicates  yolk  sac  absorption  (YSA).  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  8).  There  was  no  significant  effect  of  CO2  treatment  throughout  freshwater  development.   ! " # $ % & '(()(*()(!()(#()(%()'(Time (weeks)Yolk Wet Mass (g)1000 μatm400-2000 μatm400 μatm2000 μatm+,- 44 Figure  2.6.  Pink  salmon  yolk  wet  mass  at  week  10  (1  week  before  seawater  transfer).  Values  below  bars  represent  the  pCO2  levels  in  μatm  (400-­‐2000  μatm  represents  a  diurnal  cycle  and  other  tensions  are  constant  throughout).  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  8).  No  significant  differences  among  groups.     400 1000 2000 400-2000481216202428Yolk Wet Mass (mg) 45 Figure  2.7.  Pink  salmon  yolk  dry  mass  at  week  10  (1  week  before  seawater  transfer).  Values  below  bars  represent  the  pCO2  levels  in  μatm  (400-­‐2000  μatm  represents  a  diurnal  cycle  and  other  tensions  are  constant  throughout).  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  8).  No  significant  differences  among  groups.     400 1000 2000 400-20002468101214Yolk Dry Mass (mg) 46 Figure  2.8.  Production  efficiencies  (net  tissue  produced/net  yolk  consumption  x  100)  at  week  10  (1  week  before  seawater  transfer).  Values  below  bars  represent  the  pCO2  levels  in  μatm  (400-­‐2000  μatm  represents  a  diurnal  cycle  and  other  tensions  are  constant  throughout).  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  8).  Asterisks  indicate  statistically  significant  difference  from  the  control  group  (p<0.05).   400 1000 2000 400-2000020406080Production Efficency! 47 Figure  2.9.  Absolute  growth  rates  after  2  weeks  following  seawater  transfer.  *High  CO2  group  represent  fish  reared  in  high  CO2  in  freshwater  (2000  μatm)  and  transferred  into  high  CO2  in  seawater  (1600  μatm).  The  remaining  3  groups  were  all  reared  in  control  freshwater  (400  μatm)  and  transferred  into  different  seawater  CO2  treatments  (high,  1600  μatm;  fluctuating,  400-­‐1600  μatm;  control,  400  μatm).  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  8).  Asterisks  indicate  significant  difference  from  the  control  group  (p<0.05).       !"#$%"&'&()$(*+#,-!./01,2-!./301,2-!./-2-10123!"#$%&'()%*'+,-./)01! 48 Figure  2.10.  Routine  MO2  during  development  in  freshwater  from  2  weeks  pre-­‐hatch  (time  0  of  CO2  exposure)  up  until  1  week  before  seawater  transfer  (week  10  of  CO2  exposure)  at  different  pCO2  tensions  (indicated  in  the  figure  where  400-­‐2000  μatm  represents  a  diurnal  cycle  and  other  tensions  are  constant  throughout).  Dashed  line  represents  time  of  hatch.  Arrow  indicates  yolk  sac  absorption  (YSA).  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  6-­‐8).  There  was  no  significant  effect  of  CO2  treatment  throughout  freshwater  development.   ! " # $ %&!"#$%&Time (weeks)Routine MO2 (umol/g/h)1000 μatm400-2000 μatm400 μatm2000 μatmYSA 49 Figure  2.11.  Routine  MO2  at  day  1,  7  and  14  post-­‐seawater  transfer.  Fish  were  reared  at  different  pCO2  tensions  in  freshwater  for  11  weeks  prior  to  seawater  transfer.  Fish  reared  in  control  freshwater  conditions  were  transferred  into  1  of  3  different  seawater  treatments:  a  control  CO2  treatment  (400→400  μatm),  a  high  CO2  treatment  (400→1600  μatm),  or  a  24hr  oscillating  CO2  treatment  (400→400-­‐1600  μatm).  Fish  reared  in  high  CO2  freshwater  conditions  were  transferred  to  a  high  CO2  seawater  treatment  (2000→1600  μatm).  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  6-­‐8).  No  significant  differences  among  groups.   ! " # $ %& %! %"#'$(%&%%%!Time (days)Routine MO2 (umol/g/h)!&&&)*+,-! %#&&)*+,"&&)*+,-! %#&&)*+,"&&)*+,-! "&&.%#&&)*+,"&&)*+,-! "&&)*+, 50 Figure  2.12.  Maximum  MO2  at  day  1,  7  and  14  post-­‐seawater  transfer.  Fish  were  reared  at  different  pCO2  tensions  in  freshwater  for  11  weeks  prior  to  seawater  transfer.  Fish  reared  in  control  freshwater  conditions  were  transferred  into  1  of  3  different  seawater  treatments:  a  control  CO2  treatment  (400→400  μatm),  a  high  CO2  treatment  (400→1600  μatm),  or  a  24hr  oscillating  CO2  treatment  (400→400-­‐1600  μatm).  Fish  reared  in  high  CO2  freshwater  conditions  were  transferred  to  a  high  CO2  seawater  treatment  (2000→1600  μatm).  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  6-­‐8).  There  was  a  significant  effect  of  CO2  treatment  throughout  seawater  exposure.  Asterisks  indicate  statistically  significant  differences  among  groups  (p<0.05).   ! " # $ %& %! %"!&!"!$'!'#"&Time (days)Max MO2 (umol/g/h)!&&&()*+,! %#&&()*+"&&()*+,! %#&&()*+"&&()*+,! "&&-%#&&()*+"&&()*+,! "&&()*+! 51 Figure  2.13.  Aerobic  scope  at  day  1,  7  and  14  post-­‐seawater  transfer.  Fish  were  reared  at  different  pCO2  tensions  in  freshwater  for  11  weeks  prior  to  seawater  transfer.  Fish  reared  in  control  freshwater  conditions  were  transferred  into  1  of  3  different  seawater  treatments:  a  control  CO2  treatment  (400→400  μatm),  a  high  CO2  treatment  (400→1600  μatm),  or  a  24hr  oscillating  CO2  treatment  (400→400-­‐1600  μatm).  Fish  reared  in  high  CO2  freshwater  conditions  were  transferred  to  a  high  CO2  seawater  treatment  (2000→1600  μatm).  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  6-­‐8).  There  was  a  significant  effect  of  CO2  treatment  throughout  seawater  exposure  (p<0.05).   ! " # $ %& %! %"%&%"%$!!!#'&'"Time (days)Aerobic Scope (umol/g/h)!&&&()*+,! %#&&()*+"&&()*+,! %#&&()*+"&&()*+,! "&&-%#&&()*+"&&()*+,! "&&()*+ 52 Figure  2.14.  Routine  and  maximum  MO2  during  development  in  freshwater  and  following  seawater  transfer  at  control  (400→400  μatm)  or  high  CO2  (2000→1600  μatm).  Dashed  line  indicates  time  of  seawater  transfer.  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  6-­‐8).  No  significant  differences  in  routine  MO2  between  the  control  and  high  CO2  group  during  freshwater  development  and  following  seawater  transfer.  There  was  a  significant  effect  of  CO2  treatment  on  maximum  MO2  3  weeks  prior  to  and  following  seawater  transfer  (p<0.05).   ! " # $ %& %! %"'%&%'!&!'(&('"&Time (weeks)MO2 (umol/g/h)Control RoutineHigh CO2 RoutineControl MaxHigh CO2 Max 53 Figure  2.15.  Aerobic  scope  3  weeks  before  and  3  weeks  following  seawater  transfer  at  control  (400→400  μatm)  or  high  CO2  (2000→1600  μatm).  Dashed  line  indicates  time  of  seawater  transfer.  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  6-­‐8).  There  was  a  significant  effect  of  CO2  treatment  3  weeks  prior  to  and  following  seawater  transfer  (p<0.05).    (p<0.05).   ! " #$ ## #% #&#$#'%$%'&$&'Time (weeks)Aerobic Scope (umol/g/h)ControlHigh CO2 54 Figure  2.16.  Factorial  scope  3  before  and  3  weeks  following  seawater  transfer  at  control  (400→400  μatm)  or  high  CO2  (2000→1600  μatm).  Dashed  line  indicates  time  of  seawater  transfer.  Values  are  means  ±  SEM  (n  =  6-­‐8).  There  was  a  significant  effect  of  CO2  treatment  3  weeks  prior  to  and  following  seawater  transfer  (p<0.05).   ! " #$ ## #% #&%&'()Time (weeks)Factorial ScopeControlHigh CO2 55 Table  2.1.  Time  in  weeks  post  CO2  exposure  in  freshwater  and  following  seawater  transfer  with  corresponding  age  of  pink  salmon  embryos/alevin/fry  in  accumulated  thermal  units  (ATU).  CO2  exposure  was  initiated  in  this  experiment  at  2  weeks  pre-­‐hatch  (week  0)  up  until  2  weeks  following  seawater  transfer  (week  13).  YSA  indicates  yolk-­‐sac  absorption.   Time  (weeks)   Age  (ATU)   Notes  0   470.1   transfer  into  of  CO2  treatments  1   529.8    2   586.6   hatch  3   641.1      4   692.3      5   741.4      6   785.4      7   825.9      8   868.4      9   910.5      10   952.6    11   994.7   seawater  transfer/  YSA  12   1037.5      13   1072.4   end  of  CO2  exposure   56 Table  2.2.  Fork  lengths  of  pink  salmon  fry  2  weeks  post-­‐seawater  transfer  (week  13  of  CO2  exposure).  Fish  were  reared  at  different  pCO2  tensions  in  freshwater  for  11  weeks  prior  to  seawater  transfer.  Fish  reared  in  control  freshwater  conditions  were  transferred  into  1  of  3  different  seawater  treatments:  a  control  CO2  treatment  (400→400  μatm),  a  high  CO2  treatment  (400→1600  μatm),  or  a  24hr  oscillating  CO2  treatment  (400→400-­‐1600  μatm).  Fish  reared  in  high  CO2  freshwater  conditions  were  transferred  to  a  high  CO2  seawater  treatment  (2000→1600  μatm).  Data  are  means  ±  SEM  (n=8).     CO2  Treatment   Fork  Length  (mm)  400→400  μatm   33.1  ±  0.2  400→1600  μatm   32.0  ±  0.2  400→400-­‐1600  μatm   32.4  ±  0.4  2000→1600  μatm   32.2  ±  0.5                                                     57 [3]  General  Discussion  and  conclusions    3.1  Thesis  Summary     This  study  provides  some  of  the  first  work  on  the  effects  of  climate  change-­‐related  acidification  in  an  anadromous  fish  species  during  development  in  both  freshwater  and  seawater.  According  to  my  study,  pink  salmon  exhibit  reduced  growth  at  multiple  development  stages  under  elevated  pCO2.  Growth  was  reduced  during  freshwater  development  as  alevin  and  also  following  seawater  transfer  as  fry.  Specifically,  size,  production  efficiencies  and  absolute  growth  rates  were  reduced  at  freshwater  tensions  of  1000  and  2000  μatm  and  seawater  tensions  of  1600  μatm.  In  terms  of  performance  capacity,  aerobic  scope  was  reduced  at  high  pCO2  following  seawater  transfer,  through  a  reduction  in  MO2max  and  not  MO2routine.  MO2max  dramatically  increased  7  days  post-­‐seawater  transfer  in  the  control  and  oscillating  pCO2  groups.  By  contrast,  fish  transferred  into  high  CO2,  regardless  of  their  rearing  conditions,  showed  a  significantly  reduced  increase  in  MO2max.      3.2  Potential  for  acclimation  and  adaptation      The  results  from  my  thesis  indicate  substantial  negative  impacts  of  elevated  pCO2  on  pink  salmon.  While  this  information  informs  upon  the  impact  of  developing  pink  salmon  migrating  into  high  pCO2  tensions  currently  seen  in  coastal  marine  environments  (see  Chapter  2),  it  is  more  difficult  to  predict  how  these  changes  may  impact  future  pink  salmon  populations  without  studying  their  capacity  for  adaptation.  In  order  to  make  insightful  predictions  about  how  species  will  respond   58 to  climate  change,  an  evolutionary  perspective  is  required  (Ho  and  Burggren,  2009;  Pandolfi  et  al.,  2011;  Munday  et  al.,  2013).  While  there  are  many  examples  of  a  negative  effect  of  OA  on  marine  invertebrates  and  fish,  few  have  taken  into  account  the  potential  for  acclimation  and  adaptation.  Since  species  have  the  capacity  to  acclimate  and  adapt  to  changing  environmental  conditions,  climate  change  models  that  do  not  account  for  this  possibility  may  misrepresent  the  severity  of  ecological  consequences  (Pandolfi  et  al.,  2011).    In  the  face  of  rapid  environmental  change,  phenotypic  plasticity  may  help  mitigate  the  adverse  effects  of  climate  change,  allowing  time  for  genetic  adaptation  (Chevin,  2010).  Acclimation  is  a  type  of  phenotypic  plasticity,  which  results  in  reversible  changes  in  an  individual’s  phenotype  in  response  to  environmental  change  (Schulte  et  al.,  2011).  Acclimation  can  occur  within  the  lifetime  of  an  individual  or  trans-­‐generationally  through  parental  epigenetic  effects  (Ho  and  Burggren,  2009;  Donselson  et  al.,  2012).  Under  future  climate  change  conditions,  the  capacity  for  developmental  and  transgenerational  acclimation  has  been  documented  in  two  species  of  tropical  reef  fish  (Donselson  et  al.,  2012;  Miller  et  al.,  2012).  During  exposure  to  elevated  temperature,  the  damselfish,  Acanthochromis  polyacanthus,  showed  a  reduction  in  aerobic  scope;  however,  development  at  high  temperatures  resulted  in  the  partial  recovery  of  scope  (Donselson  et  al.,  2012).  Furthermore,  offspring  from  parents  reared  at  high  temperatures  were  able  to  compensate  for  the  reduction  in  scope  with  complete  recovery  occurring  over  3  generations  (Donselson  et  al.,  2012).  Similarly,  elevated  temperature  and  CO2  resulted  in  increases  in  MO2routine  and  decreases  in  the  growth  of  the  juvenile  anemone  fish,  A.  melanopus,   59 with  reversal  of  effects  occurring  in  offspring  from  parents  exposed  to  high  temperature  and  CO2  (Miller  et  al.,  2012).    By  comparison,  our  work  is  unable  to  shed  light  on  the  potential  for  transgenerational  acclimation  in  pink  salmon  in  response  to  climate  change.  However,  development  in  high  CO2  in  freshwater  does  not  appear  to  mitigate  the  effects  of  high  CO2  following  seawater  transfer.  Regardless  of  CO2  rearing  conditions  in  freshwater,  transfer  to  high  CO2  seawater  reduced  growth  rates  and  aerobic  capacity  in  pink  salmon.  Since  embryos  were  transferred  into  their  CO2  freshwater  treatments  at  the  eyed  egg  stage,  the  potential  for  developmental  acclimation  may  be  restricted  to  early  stages  after  fertilization;  therefore,  our  study  is  unable  to  fully  address  whether  pink  salmon  have  the  potential  for  acclimation  during  development.  For  adaptation  to  occur,  there  must  be  genetic  variation  in  heritable  traits  that  are  subject  to  differential  selection.  Research  investigating  thermal  tolerance  among  distinct  populations  of  Fraser  River  sockeye  salmon  suggests  that  these  salmon  populations  may  possess  the  genetic  potential  to  adapt  to  elevated  river  temperatures  (Eliason  et  al.,  2011).  Although  we  show  considerable  detriments  to  the  early  life-­‐stages  of  pink  salmon  at  pCO2  levels  projected  by  the  end  of  the  century,  we  cannot  predict  how  wild  populations  of  pink  salmon  may  respond  to  the  acidifying  effects  of  climate  change.  It  appears,  however,  that  pink  salmon  possess  an  unrivaled  capacity  for  aerobic  performance  within  a  broad  range  of  environmental  temperatures  (Clark  et  al.,  2011).  While  this  does  not  suggest  that  they  will  be  resilient  to  acidification,  their  ability  to  withstand  higher  temperatures   60 will  undoubtedly  ease  the  combined  stress  of  acidification  and  temperature.  In  addition,  pink  salmon  have  high  fecundity  and  relatively  short  generation  times  with  adults  returning  to  spawn  after  only  2  years  of  ocean  residency  (Heard,  1991),  which  could  allow  ample  time  for  adaptation  over  the  next  century  or  two;  the  time  over  which  the  projected  increases  in  pCO2  are  proposed.  However,  more  recent  research  suggests  that  coastal  ecosystems  are  currently  experiencing  large  seasonal  variations  in  pCO2  at  levels  that  far  surpass  future  climate  change-­‐related  estimates  (Reum  et  al.  2014;  Frieder  et  al.,  2012;  Evans  et  al.,  2011).  Interestingly,  the  evolution  of  plasticity  is  favored  when  environmental  variation  is  frequent  and  temporally  defined  (Schlichting  and  Smith  2002).  Although  detriments  to  growth  and  aerobic  performance  may  occur  during  short-­‐term  exposure  to  high  pCO2,  natural  coastal  variations  in  pCO2  may  help  drive  the  evolution  of  plasticity  in  pink  salmon,  which  has  large  implications  on  their  capacity  to  adapt  to  climate  change.  The  potential  for  adaptation  also  requires  that  there  be  adequate  standing  genetic  variation  within  a  population  (Endler,  1986).  Microsatellite  data  on  various  pink  salmon  populations  show  substantial  heterogeneity  of  allelic  frequencies  at  multiple  loci  between  odd  and  even-­‐year  broodlines  as  well  as  within  odd-­‐year  broodlines  (Beacham  et  al.,  1985).  Populations  of  Fraser  River,  Canadian  non-­‐Fraser  River  and  Puget  Sound  pink  salmon  appear  to  be  fairly  distinct  (Beacham  et  al.,  1985).  The  Fraser  River  population,  however,  showed  the  least  genetic  variability  (Beacham  et  al.,  1985).  Despite  this,  pink  salmon  populations  may  have  greater  potential  for  gene  flow  relative  to  other  Pacific  salmon,  since  they  display  low  site  fidelity  and  thus  are  often  considered  colonizers  (Clark  et  al.,  2011).       61 3.3  Increase  in  MO2max  following  seawater  entry     The  dramatic  increase  in  MO2max  following  seawater  transfer  is  arguably  one  of  the  most  interesting  findings  in  this  thesis.  Naturally,  this  leads  to  the  formulation  of  two  new  questions:  1)  what  are  the  physiological  mechanisms  underlying  this  rapid  increase  in  MO2max  following  seawater  transfer,  and  2)  what  is  limiting  MO2max  at  elevated  tensions  of  pCO2?     The  inability  to  match  oxygen  supply  with  oxygen  demand  is  thought  to  be  key  in  limiting  MO2  (Lindstedt  and  Conely,  2001).  The  transport  of  oxygen  from  the  environment  to  the  mitochondria  consists  of  the  5  following  steps:  1)  ventilation,  which  brings  oxygen  in  contact  with  respiratory  surfaces,  2)  the  diffusion  of  oxygen  across  the  respiratory  surface  into  the  blood,  3)  the  delivery  of  oxygen  throughout  the  body  via  circulation,  4)  tissue  diffusion  from  the  capillaries  to  the  mitochondria,  and  5)  oxygen  consumption  at  the  mitochondria  (Weibel,  1984).  If  the  transport  of  oxygen  is  limiting  aerobic  capacity,  then  natural  selection  should  work  to  maximize  oxygen  flux.  A  theory  known  as  symmorphosis  suggests  that  every  step  in  the  transport  pathway  must  be  matched  in  oxygen  flux  in  order  to  enhance  overall  capacity  (Weibel,  1984;  Weibel  et  al.,  1991).  By  this  theory,  the  release  of  developmental  bottlenecks  at  one  or  multiple  steps  of  the  transport  cascade  could  explain  the  dramatic  and  rapid  increase  in  MO2max  of  pink  salmon  following  seawater  transfer.  In  developing  embryos,  the  developmental  trajectory  of  different  organ  systems  may  vary,  with  certain  organs  functioning  well  before  others  (Burggren  and  Reyna,  2011).  If  organs  or  tissues  from  one  or  multiple  steps  in  the  transport  cascade  are  no  longer  rate-­‐limiting,  then  significant  increases  in  MO2  are   62 possible.  Perhaps  pink  salmon  are  developing  as  fast  as  possible  with  systems  becoming  optimal  near  the  end  of  yolk  absorption.  In  the  context  of  their  remarkable  life  history,  the  capability  of  quickly  elevating  performance  capacity  is  highly  advantageous  as  their  life  history  transitions  from  a  sedentary  (within  gravel)  to  migratory  strategy,  and  they  move  into  a  high  predator  environment  at  a  vulnerable  size.    Reductions  in  MO2max  under  elevated  tensions  suggest  that  migrating  pink  salmon  fry  may  be  particularly  sensitive  to  acidification;  however,  what  are  the  specific  physiological  determinants  underlying  this  reduction?  Since  fry  exhibit  negative  growth  rates  post-­‐seawater  transfer,  indicating  water  loss  and/or  tissue  catabolism,  the  combined  stress  of  acidification  and  salinity  may  impair  hypo-­‐osmoregulatory  capabilities,  thus  reducing  overall  performance  capacity.  Alternatively,  development  at  high  pCO2  may  be  impaired  or  delayed.  In  this  case,  developmental  bottlenecks  in  the  oxygen  transport  cascade,  such  as  a  smaller  relative  heart  size  or  lower  gill  surface,  may  result  in  a  reduced  capacity  for  oxygen  flux  and  thus  a  reduced  capacity  for  performance.  Clearly,  there  are  many  areas  for  further  investigation  into  what  I  consider  to  be  one  of  the  most  interesting  findings  of  my  thesis,  which  I  expand  upon  below.    3.4  Freshwater  acidification       Climate  change-­‐related  acidification  is  occurring  in  our  freshwater  environments,  yet  little  is  known  about  its  potential  impacts  on  freshwater  communities  and  ecosystems.  One  large  contributor  to  our  lack  of  knowledge  is  the   63 difficulty  of  characterizing  and  monitoring  large  numbers  of  freshwater  streams  and  rivers,  which  may  vary  greatly  in  their  water  chemistry.  By  contrast,  the  ocean  is  generally  more  homogenous  with  large  coastal  regions  showing  very  similar  characteristics  and  patterns.  As  a  result,  it  may  be  hard  to  generalize  and  apply  our  results  to  most  freshwater  systems.  Since  pH  is  dependent  on  factors  other  than  just  pCO2,  streams  varying  in  ion  composition  may  differ  considerably  in  total  alkalinity  and  thus  pH  at  a  given  pCO2.  If  the  observed  effects  are  pH-­‐induced  and  not  CO2-­‐induced,  then  it  may  be  difficult  to  make  general  inferences  on  the  ecological  implications  of  climate  change-­‐related  acidification  in  freshwater  systems.  Therefore,  to  address  CO2-­‐induced  acidification  in  freshwater,  research  investigating  both  pCO2  and  pH  effects  in  varying  types  of  freshwater  sources  is  required  to  better  understand  the  mechanistic  basis  for  impaired  growth  and  development  observed  in  this  thesis  as  discussed  below.        3.5  Research  limitations  and  future  directions     The  reminder  of  this  discussion  will  briefly  touch  on  several  limitations  in  this  thesis,  while  providing  future  directions  for  new  questions  that  have  arisen  from  this  work.       Future  research  should  investigate  the  potential  role  that  acclimation  and  adaptation  may  play  in  determining  how  pink  salmon  populations  may  respond  to  climate  change.  The  capacity  for  developmental  and  transgenerational  acclimation  has  been  demonstrated  in  a  few  species  of  tropical  reef  fish  (Donselson  et  al.,  2012;  Miller  et  al.,  2012).  Similar  developmental  and  transgenerational  experiments  could   64 be  performed  on  pink  salmon.  Since  our  CO2  exposures  started  at  the  eyed  embryo  stage,  CO2  exposures  starting  at  fertilization  would  allow  us  to  thoroughly  examine  the  potential  for  developmental  acclimation.  Long-­‐term  selection  experiments  selecting  for  CO2  tolerance  among  individuals  could  also  look  into  the  role  that  adaptation  may  play.     Among  the  new  questions  that  have  emerged  from  this  thesis,  that  of  the  dramatic  increase  in  MO2max  is  perhaps  the  most  intriguing.  As  discussed  above,  one  explanation  may  be  the  release  of  developmental  bottlenecks  in  the  oxygen  transport  cascade.  To  test  this  hypothesis,  one  could  investigate  physiological  changes  occurring  at  all  of  the  different  steps  in  the  cascade  following  seawater  transfer.  Proceeding  through  each  step,  changes  in  buccal  pump  capacity,  gill  surface  area,  relative  heart  size,  capillary  density  and  mitochondrial  enzyme  activity  could  be  examined  in  pink  salmon  alevin  and  fry  to  elucidate  the  underlying  physiological  mechanisms  behind  the  rapid  increase  in  aerobic  capacity.  Similar  comparisons  at  various  stages  of  the  oxygen  transport  cascade  could  be  made  between  control  and  high  CO2-­‐reared  fish  prior  to  and  following  seawater  transfer  to  address  the  potential  physiological  limitations  high  pCO2  may  pose  to  migrating  pink  salmon  fry.       As  previously  described,  pH  may  vary  considerably  among  different  freshwater  sources  at  the  same  pCO2,  whereas,  pH  in  the  ocean  is  relatively  stable.  Since  pCO2  directly  affects  pH  and  vice  versa,  we  have  yet  to  determine  whether  the  observed  negative  impacts  on  growth  and  aerobic  capacity  are  a  result  of  CO2,  pH  or  a  combination  of  the  two.  Future  research  can  investigate  this  by  manipulating  the   65 total  alkalinity  of  the  water  to  increase  or  decrease  the  magnitude  of  pH  change  during  changes  in  pCO2.         This  thesis  has  only  briefly  touched  on  some  of  the  potential  physiological  consequences  of  climate  change-­‐related  acidification  on  pink  salmon.  Although  this  research  has  laid  important  groundwork  for  determining  how  pink  salmon  may  respond  to  climate  change,  I  genuinely  hope  that  future  work  on  this  impressive  and  ecologically  valuable  species  will  continue  to  ensure  its  persistence  in  the  face  our  rapidly  changing  climate.                                                               66 References    Baker,  D.  W.,  and  Brauner,  C.  J.  (2012).  Metabolic  changes  associated  with  acid–  base  regulation  during  hypercarbia  in  the  CO2-­‐tolerant  chondrostean,  white  sturgeon  (Acipenser  transmontanus).  Comp.  Biochem.  Phys.  A  161,  61-­‐68.    Baumann,  H.,  Talmage,  S.  C.,  and  Gobler,  C.  J.  (2012).  Reduced  early  life  growth    and  survival  in  a  fish  in  direct  response  to  increased  carbon  dioxide.  Nat.  Clim.  Change  2,  38-­‐41.   Beacham,  T.  D.,  Withler,  R.  E.,  and  Gould,  A.  P.  (1985).  Biochemical  genetic  stock    identification  of  pink  salmon  (Oncorhynchus  gorbuscha)  in  southern  British  Columbia  and  Puget  Sound.  Can.  J.  Fish.  Aquat.  Sci.  42,  1474-­‐1483.   Bignami,  S.,  Sponaugle,  S.,  and  Cowen,  R.  K.  (2013).  Response  to  ocean    acidification  in  larvae  of  a  large  tropical  marine  fish,  Rachycentron  canadum.  Glob.  change  Biol.  19,  996-­‐1006.   Boeuf,  G.  (1993).  Salmonid  smolting:  A  pre-­‐adaptation  to  the  oceanic  environment.    In  Fish  Ecophysiology,(ed.  J.  C.  Rankin  and  F.  B.  Jensen),  pp.  105-­‐135.  London:  Chapman  Press.   Brauner,  C.  J.  (2008).  Acid-­‐base  balance.  In  Fish  Larval  Physiology  (ed.  R.  N.  Finn  and    B.  G.  Kapoor),  pp.  185-­‐200.  Enfield,  NH,  USA:  Science  Publisher,  Inc.    Brauner,  C.  J.  and  Baker,  D.  W.  (2009).  Patterns  of  acid-­‐base  regulation  during    exposure  to  hypercarbia  in  fishes.  In  Cardio-­‐Respiratory  Control  in  Vertebrates:  Comparative  and  Evolutionary  Aspects  (ed.  M.  Glass  and  S.C.  Wood),  pp.  43-­‐63.  Berlin:  Springer.    Brauner,  C.  J.  and  Wood,  C.  M.  (2002).  Ionoregulatory  development  and  the  effect      of  chronic  silver  exposure  on  growth,  survival  and  sublethal  indicators  of    toxicity  in  early  life  stages  of  rainbow  trout  (Oncorhynchus  mykiss).  J.  Comp.    Physiol.  B  172,  153-­‐162.    Burggren,  W.  W.,  and  Reyna,  K.  S.  (2011).  Developmental  trajectories,  critical    windows  and  phenotypic  alteration  during  cardio-­‐respiratory  development.  Respir.  Physiol.  Neurobiol.  178,  13-­‐21.    Byrne,  R.  H.,  Mecking,  S.,  Feely,  R.  A.  and  Xuewu,  L.  (2010).  Direct  observations  of  basin-­‐wide  acidification  of  the  North  Pacific  Ocean.  Geophys.  Res.  Lett.    37,  L02601.       67 Cai,  W.  J.,  Hu,  X.,  Huang,  W.  J.,  Murrell,  M.  C.,  Lehrter,  J.  C.,  Lohrenz,  S.  E.,  Chou,    W.  C.,  Weidong,  Z.,  Hollibaugh,  J.  T.,  Wang,  Y.,  et  al.  (2011).  Acidification  of  subsurface  coastal  waters  enhanced  by  eutrophication.  Nature  Geosci.  4,  766-­‐770.    Caldeira,  K.,  and  Wickett,  M.  E.  (2003).  Oceanography:  anthropogenic  carbon  and    ocean  pH.  Nature  425,  365-­‐365.      Caldeira,  K.  and  Wickett,  M.  E.  (2005).  Ocean  model  predictions  of  chemistry            changes  from  carbon  dioxide  emissions  to  the  atmosphere  and  ocean.  J.            Geophys.  Res.  Oceans  110,  C09S4    Cameron,  J.  N.,  and  Iwama,  G.  K.  (1989).  Compromises  between  ionic  regulation    and  acid-­‐base  regulation  in  aquatic  animals.  Can.  J.  Zoo.  67,  3078-­‐3084.    Cao,  L.,  and  Caldeira,  K.  (2008).  Atmospheric  CO2  stabilization  and  ocean    acidification.  Geophys.  Res.  Lett.  35,  L19609.    Checkley,  D.  M.,  Dickson,  A.  G.,  Takahashi,  M.,  Radich,  J.  A.,  Eisenkolb,  N.,  and    Asch,  R.  (2009).  Elevated  CO2  enhances  otolith  growth  in  young  fish.  Science  324,  1683-­‐1683.    Chevin,  L.  M.,  Lande,  R.,  and  Mace,  G.  M.  (2010).  Adaptation,  plasticity,  and    extinction  in  a  changing  environment:  towards  a  predictive  theory.  PLoS  Biol.  8,  e1000357.    Claiborne,  J.  B.,  Edwards,  S.  L.,  and  Morrison-­‐Shetlar,  A.  I.  (2002).  Acid–base    regulation  in  fishes:  cellular  and  molecular  mechanisms.  J.  Exp.  Zoo.  293,  302-­‐319.    Clark,  T.  D.,  Jeffries,  K.  M.,  Hinch,  S.  G.,  and  Farrell,  A.  P.  (2011).  Exceptional    aerobic  scope  and  cardiovascular  performance  of  pink  salmon  (Oncorhynchus  gorbuscha)  may  underlie  resilience  in  a  warming  climate.  J.  Exp.  Biol.  214,  3074-­‐3081.    Clarke,  W.  C.  (1982).  Evaluation  of  the  seawater  challenge  test  as  an  index  of          marine  survival.  Aquaculture  28,  177-­‐183.    Conceição,  L.  E.  C.,  Houlihan  D.  F.  and  Verreth,  J.  A.  J.  (1997).  Fast  growth,  protein    turnover  and  costs  of  protein  metabolism  in  yolk-­‐sac  larvae  of  the  African  catfish  (Clarias  gariepinus).  Fish  Physiol.  Biochem.    16,  291–302.    Cripps,  I.  L.,  Munday,  P.  L.,  and  McCormick,  M.  I.  (2011).  Ocean  acidification    affects  prey  detection  by  a  predatory  reef  fish.  Plos  one  6,  e22736.     68 Dickson,  A.  G.,  Sabine,  C.  L.,  and  Christian,  J.  R.  (2007).  Guide  to  best  practices  for    ocean  CO2  measurements.  Canada:  North  Pacific  Marine  Science  Organization.    Dixson,  D.  L.,  Munday,  P.  L.,  and  Jones,  G.  P.  (2010).  Ocean  acidification  disrupts    the  innate  ability  of  fish  to  detect  predator  olfactory  cues.  Ecol.  Lett.  13,  68-­‐75.    Donelson,  J.  M.,  Munday,  P.  L.,  McCormick,  M.  I.,  and  Pitcher,  C.  R.  (2012).  Rapid    transgenerational  acclimation  of  a  tropical  reef  fish  to  climate  change.  Nat.  Clim.  Change,  2,  30-­‐32.    Doney,  S.  C.,  Fabry,  V.  J.,  Feely,  R.  A.  and  Kleypas,  J.  A.  (2009).  Ocean  acidification:    the  other  CO2  problem.  Annu.  Rev.  Mar.  Sci.  1,  169-­‐92.    Dudgeon,  D.,  Arthington,  A.  H.,  Gessner,  M.  O.,  Kawabata,  Z.  I.,  Knowler,  D.  J.,    Lévêque,  C.,  and  Sullivan,  C.  A.  (2006).  Freshwater  biodiversity:  importance,  threats,  status  and  conservation  challenges.  Biol.  Rev.  81,  163-­‐182.  Durkin,  J.  T.  (1982).  Migration  characteristics  of  coho  salmon  (Oncorhynchus    kisutch)  smolts  in  the  Columbia  River  and  its  estuary.  In  Estuarine  comparisons  (ed.  V.  S.  Kennedy),  pp.  343-­‐364.  New  York:  Academic  Press.    Eliason,  E.  J.,  Clark,  T.  D.,  Hague  M.  J.,  Hanson,  L.  M.,  Gallagher,  Z.  S.,  Jeffries,  K.    M.,  Gale,  M.  K.,  Patterson,  D.  A.,  Hinch,  S.  G.  and  Farrell,  A.  P.  (2011).  Differences  in  thermal  tolerance  among  sockeye  salmon  populations.  Science,  332,  109–112.    Endler,  J.  A.  (1986).  Natural  selection  in  the  wild  (No.  21).  Princeton,  New  Jersey:    Princeton  University  Press.    Evans,  W.,  Hales,  B.,  and  Strutton,  P.  G.  (2011).  Seasonal  cycle  of  surface  ocean    pCO2  on  the  Oregon  shelf.  J.  Geophys.  Res.  116,  C05012.    Evans,  D.  H.,  Piermarini,  P.  M.  and  Choe,  K.  P.  (2005).  The  multifunctional  fish    gill:  dominant  site  of  gas  exchange,  osmoregulation,  acid-­‐base  regulation,  and  excretion  of  nitrogenous  waste.  Physiol.  Rev.  85,  97-­‐177.    Farrell,  A.  P.  (2009).  Environment,  antecedents  and  climate  change:  lessons  from    the  study  of  temperature  physiology  and  river  migration  of  salmonids.    J.  Exp.  Biol.  212,  3771–3780.    Feely,  R.  A.,  Sabine,  C.  L.,  Hernandez-­‐Ayon,  J.  M.,  Ianson,  D.  and  Hales,  B.  (2008).            Evidence  for  upwelling  of  corrosive  “acidified”  water  onto  the  continental            shelf.  Science  320,1490–92.   69 Finn,  R.  N.  and  Fyhn,  H.  J.  (2010).  Requirements  for  amino  acids  in  the  ontogeny  of  fish.  Aquacult.  Res.  41,  684–716.    Fivelstad,  S.,  Olsen,  A.  B.,  Åsgård,  T.,  Baeverfjord,  G.,  Rasmussen,  T.,  Vindheim,    T.  and  Stefansson,  S.  (2003).  Long-­‐term  sublethal  effects  of  carbon  dioxide  on  Atlantic  salmon  smolts  (Salmo  salar):  ion  regulation,  haematology,  element  composition,  nephrocalcinosis  and  growth  parameters.  Aquaculture,  215,  301–319.    Folmar,  L.  C.  and  Dickhoff,  W.  W.  (1980).  The  parr-­‐smolt  transformation    (smoltification)  and  seawater  adaptation  in  salmonids:  A  review  of  selected  literature.  Aquaculture  21,  1-­‐37.    Frieder,  C.  A.,  Nam,  S.  H.,  Martz,  T.  R.,  and  Levin,  L.  A.  (2012).  High  temporal  and    spatial  variability  of  dissolved  oxygen  and  pH  in  a  nearshore  California  kelp  forest.  Biogeosciences  9,  3917-­‐3930.    Fry,  F.  E.  F.  (1947).  Effects  of  the  environment  on  animal  activity.  Publ.  Ont.  Fish.  Res.    Lab.  68,  62.    Gallagher,  Z.  S.,  Bystriansky,  J.  S.,  Farrell,  A.  P.,  and  Brauner,  C.  J.  (2012).  A  novel    pattern  of  smoltification  in  the  most  anadromous  salmonid:  pink  salmon  (Oncorhynchus  gorbuscha).  Can.  J.  Fish.  Aquat.  Sci.  70,  349-­‐357.    Grant,  A.,  Gardner,  M.,  Nendick,  L.,  Sackville,  M.,  Farrell,  A.  P.  and  Brauner,  C.  J.    (2009).  Growth  and  ionoregulatory  ontogeny  of  wild  and  hatchery-­‐raised  juvenile  pink  salmon  (Oncorhynchus  gorbuscha).  Can.  J.  Zool.  87,  221-­‐228.   Hamilton,  S.  L.,  Regetz,  J.,  and  Warner,  R.  R.  (2008).  Postsettlement  survival    linked  to  larval  life  in  a  marine  fish.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  105,  1561-­‐1566.    Hamilton,  T.  J.,  Holcombe,  A.,  and  Tresguerres,  M.  (2014).  CO2-­‐induced  ocean    acidification  increases  anxiety  in  Rockfish  via  alteration  of  GABAA  receptor  functioning.  Proc.  R.  Soc.  B  281,  20132509.  Healey,  M.  C.  (1982).  Timing  and  relative  intensity  of  size-­‐selective  mortality  of    juvenile  chum  salmon  (Oncorhynchus  keta)  during  early  sea  life.  Can.  J.  Fish.  Aquat.  Sci.  39,  952-­‐957.    Healy,  T.  M.,  and  Schulte,  P.  M.  (2012).  Thermal  acclimation  is  not  necessary  to    maintain  a  wide  thermal  breadth  of  aerobic  scope  in  the  common  killifish  (Fundulus  heteroclitus).  Physiol.  Biochem.  Zoo.  85,  107-­‐119.  Heard,  W.  R.  (1991).  Life  history  of  pink  salmon  (Oncorhynchus  gorbuscha).  In    Pacific  Salmon  Life  Histories  (ed.  C.  Groot  and  L.  Margolis),  pp.  319-­‐377.  Vancouver:  UBC  Press.   70 Heisler,  N  .  (1984)  Acid-­‐base  regulation  in  fishes.  In  Fish  Physiology  Vol.  10  (ed.  W.S.            Hoar,  and  D.J.  Randall),  pp.  315-­‐401.  San  Diego:  Academic.    Hendry,  A.  P.,  Day,  T.  and  Cooper,  A.  B.  (2001).  Optimal  size  and  number  of    propagules:  allowance  for  discrete  stages  and  effects  of  maternal  size  on  reproductive  output  and  offspring  fitness.  Am.  Nat.  157,  387–407.    Ho,  D.  H.,  &  Burggren,  W.  W.  (2010).  Epigenetics  and  transgenerational  transfer:  a    physiological  perspective.  J.  Exp.  Biol.  213,  3-­‐16.    Hoar,  W.  S.  (1976).  Smolt  transformation:  evolution,  behavior,  and  physiology.            J.  Fish.  Res.  Board  Can.  33,  1234–1252.    Hoar,  W.  S.  (1988).  The  physiology  of  smolting  salmonids.  In  Fish  Physiology,  Vol.  11    (ed.  W.  S.  Hoar  and  D.  J.  Randall),  pp.  275-­‐343:  Academic  Press.    Hu,  M.  Y.,  Tseng,  Y.  C.,  Stumpp,  M.,  Gutowska,  M.  A.,  Kiko,  R.,  Lucassen,  M.,  and    Melzner,  F.  (2011).  Elevated  seawater  pCO2  differentially  affects  branchial  acid-­‐base  transporters  over  the  course  of  development  in  the  cephalopod  Sepia  officinalis.  Am.  J.  Physiol.  Regul.  Integr.  Comp.  Phys.  300,  R1100-­‐R1114.    Hwang,  P.  (1989).  Distribution  of  chloride  cells  in  teleost  larvae.  J.  Morphol.  200,  1-­‐8.    Ishimatsu,  A.,  Hayashi,  M.,  Lee,  K.  S.,  Kikkawa,  T.,  and  Kita,  J.  (2005).    Physiological  effects  on  fishes  in  a  high-­‐CO2  world.  J.  Geophys.  Res.  110,  C09S09.    Iwama,  G.  K.,  &  Heisler,  N.  (1991).  Effect  of  environmental  water  salinity  on  acid-­‐  base  regulation  during  environmental  hypercapnia  in  the  rainbow  trout  (Oncorhynchus  mykiss).  J.  Exp.  Biol.  158,  1-­‐18.    Jobling,  M.  (1995).  Development  of  eggs  and  larvae.  In  Environmental  Biology  of    Fishes,  Fish  and  Fisheries  Series,  pp.  357-­‐390.  London;  New  York:  Chapman  &  Hall.    Jutfelt,  F.,  de  Souza,  K.  B.,  Vuylsteke,  A.,  and  Sturve,  J.  (2013).  Behavioural    disturbances  in  a  temperate  fish  exposed  to  sustained  high-­‐CO2  levels.  PloS  one  8,  e65825.    Kaneko,  T.,  Hasegawa,  S.,  Takagi,  Y.,  Tagawa,  M.  and  Hirano,  T.  (1995).          Hypoosmoregulatory  ability  of  eyed-­‐stage  embryos  of  chum  salmon.  Mar.            Biol.  122,  165-­‐170.           71 Kaneko,  T.,  Shiraishi,  K.,  Katoh,  F.,  Hasegawa,  S.  and  Hiroi,  J.  (2002).  Chloride    cells  during  early  life  stages  of  fish  and  their  functional  differentiation.  Fisheries  Sci.  68,  1-­‐9.      Killen,  S.  S.,  Costa,  I.,  Brown,  J.  A.  and  Gamperl,  A.K.  (2007).  Little  left  in  the  tank:    metabolic  scaling  in  marine  teleosts  and  its  implications  for  aerobic  scope.  Proc.  R.  Soc.,    274B,  431–438.    Kunz,  Y.  W.  (2004).  Developmental  biology  of  teleost  fishes.  In  Environmental    Biology  of  Fishes,  Fish  and  Fisheries  Series  (ed.  D.  L.  G.  Noakes).  Dordrecht:  Springer.    Kurihara,  H.  (2008).  Effects  of  CO2-­‐driven  ocean  acidification  on  the  early    developmental  stages  of  invertebrates.  Mar.  Ecol.  Prog.  Ser.  373,  275–284.    Larsen,  B.  K.  and  Jensen,  F.B.  (1997).  Influence  of  ionic  composition  on  acid-­‐base        regulation  in  rainbow  trout  (Oncorhynchus  mykiss)  exposed  to          environmental  hypercapnia.  Fish  Physio.  Biochem.  16,  157–170.    Lindstedt,  S.  L.,  and  Conley,  K.  E.  (2001).  Human  aerobic  performance:  too  much    ado  about  limits  to  VO2.  J.  Exp.  Biol.  204,  3195-­‐3199.    Lundberg,  J.  G.,  Kottelat,  M.,  Smith,  G.  R.,  Stiassny,  M.  L.,  and  Gill,  A.  C.  (2000).  So    many  fishes,  so  little  time:  an  overview  of  recent  ichthyological  discovery  in  continental  waters.  Ann.  Missouri  Bot.  Gard.  26-­‐62.    Marliave,  J.  B.,  Gibbs,  C.  J.,  Gibbs,  D.  M.,  Lamb,  A.  O.,  and  Young,  S.  J.  (2011).    Biodiversity  stability  of  shallow  marine  benthos  in  Strait  of  Georgia,  British  Columbia,  Canada  through  climate  regimes,  overfishing  and  ocean  acidification.  In  Biodiversity  Loss  in  a  Changing  Planet  (ed.  O.  Grillo  and  G.  Venora),  pp.  49-­‐73.  Rijeka,  Croatia:  In  Tech.    McCormick,  S.  D.  (1994).  Ontogeny  and  evolution  of  salinity  tolerance  in    anadromous  salmonids:  Hormones  and  heterochrony.  Estuar.  Coast.  17,  26-­‐33.    McCormick,  S.  D.  and  Saunders,  R.  L.  (1987).  Preparatory  physiological    adaptations  for  marine  life  of  salmonids:  osmoregulation,  growth,  and  metabolism.  Am.  Fish.  Soc.  Symp.  1,  211-­‐299.    Melzner,  F.,  Thomsen,  J.,  Koeve,  W.,  Oschlies,  A.,  Gutowska,  M.  A.,  Bange,  H.  W.,    Hansen,  H.  P.  and  Körtzinger,  A.  (2013).  Future  ocean  acidification  will  be  amplified  by  hypoxia  in  coastal  habitats.  Mar.  Biol.  160,  1875-­‐1888.         72 Miller,  G.  M.,  Watson,  S.  A.,  Donelson,  J.  M.,  McCormick,  M.  I.,  and  Munday,  P.  L.    (2012).  Parental  environment  mediates  impacts  of  increased  carbon  dioxide  on  a  coral  reef  fish.  Nat.  Clim.  Change,  2,  858-­‐861.  Misiaszek,  C.M.  (1996).  The  development  if  ion  regulation  in  larval  rainbow  trout    (Oncorhynchus  mykiss).  MSc  thesis,  Department  of  Biology,  McMaster  University,  Hamilton,  Ontario,  Canada.    Mölich,  A.  and  Heisler,  N.  (2005).  Determination  of  pH  by  microfluorometry:    intracellular  and  interstitial  pH  regulation  in  developing  early-­‐stage  fish  embryos  (Danio  rerio).  J.  Exp.  Biol.  208,  4137–4149.    Munday,  P.  L.,  Crawley,  N.  E.,  and  Nilsson,  G.  E.  (2009).  Interacting  effects  of    elevated  temperature  and  ocean  acidification  on  the  aerobic  performance  of  coral  reef  fishes.  Mar.  Ecol-­‐Prog  Ser.  388,  235-­‐242.    Munday,  P.  L.,  Donelson,  J.  M.,  Dixson,  D.  L.,  and  Endo,  G.  G.  K.  (2009).  Effects  of    ocean  acidification  on  the  early  life  history  of  a  tropical  marine  fish.  Proc.  R.  Soc.  B  276,  3275–3283.    Munday,  P.  L.,  Warner,  R.  R.,  Monro,  K.,  Pandolfi,  J.  M.,  and  Marshall,  D.  J.    (2013).  Predicting  evolutionary  responses  to  climate  change  in  the  sea.  Ecol.  Lett.  16,  1488-­‐1500.    Neave,  F.,  Ishida,  and  S.  Murai.  (1967).  Salmon  of  the  North  Pacific  Ocean.  Part  VI.    Pink  salmon  in  offshore  waters.  Int.  North  Pac.  Fish.  Comm.  Bull.  22,  33.    Nendick,  L.,  Sackville,  M.,  Tang,  S.,  Brauner,  C.J.  and  Farrell  A.P.  (2011).  Sea  lice    infection  of  juvenile  pink  salmon  (Oncorhynchus  gorbuscha):  effects  on  swimming  performance  and  postexercise  ion  balance.  Can.  J.  Fish.  Aquat.  Sci.  68,  241-­‐249.    Nilsson,  G.  E.,  Dixson,  D.  L.,  Domenici,  P.,  McCormick,  M.  I.,  Sørensen,  C.,    Watson,  S.  A.,  and  Munday,  P.  L.  (2012).  Near-­‐future  carbon  dioxide  levels  alter  fish  behaviour  by  interfering  with  neurotransmitter  function.  Nat.  Clim.  Change,  2,  201-­‐204.    Ninness,  M.  M.,  Stevens,  E.  D.  and  Wright,  P.  A.  (2006).  Energy  expenditure  during    hatching  in  rainbow  trout  (Oncorhynchus  mykiss)  embryos.  Can.  J.  Fish.  Aquat.  Sci.  63,  1405–1413.    Pandolfi,  J.  M.,  Connolly,  S.  R.,  Marshall,  D.  J.,  and  Cohen,  A.  L.  (2011).  Projecting    coral  reef  futures  under  global  warming  and  ocean  acidification.  Science  333,  418-­‐422.       73 Parker,  R.  R.  (1962).  Estimations  of  ocean  mortality  rates  for  Pacific  salmon    (Oncorhynchus).  J.  Fish.  Res.  Board  Can.  19,  561-­‐589.    Pepin,  P.  (1991).  Effect  of  temperature  and  size  on  development,  mortality  and  sur-­‐    vival  rates  of  the  pelagic  early  life  history  stages  of  marine  fish.  Can.  J.  Fish.  Aquat.  Sci.  58,  503–518.    Perry,  S.  F.  (1982).  The  regulation  of  hypercapnic  acidosis  in  two  salmonids,  the    freshwater  trout  (Salmo  gairdneri)  and  the  seawater  salmon  (Onchorynchus  kisutch).  Mar.  Freshw.  Behav.  Phy.  9,  73-­‐79.    Perry,  S.  F.  and  Gilmour,  K.  M.  (2006).  Acid-­‐base  balance  and  CO2  excretion  in  fish:    unanswered  questions  and  emerging  models.  Respir.  Physiol.  Neurobiol.  154,  199–215.    Plaut,  I.  (2001).  Critical  swimming  speed:  its  ecological  relevance.  Comp.  Biochem.    Phys.  A  131,  41–50.    Pörtner,  H.  O.,  and  Farrell,  A.  P.  (2008).  Physiology  and  climate  change.  Science    322,  690-­‐692.   Post,  J.  R.,  and  Lee,  J.  A.  (1996).  Metabolic  ontogeny  of  teleost  fishes.  Can.  J.  Fish.    Aquat.  Sci.  53,  910-­‐923.    Putnam,  R.  W.  and  Roos,  A.  (1997).  Intracellular  pH.  In  Handbook  of  Physiology.    Cell  Physiology  (ed.  J.  Hoffman  and  J.  Jamieson),  pp.  389–440.  Oxford:  Oxford  University  Press.    Randall,  D.  and  Brauner,  C.  J.  (1991).  Effects  of  environmental  factors  on  exercise    in  fish.  J.  Exp.  Biol.,  160,  113–126.    Raven,  J.,  Caldeira,  K.,  Elderfield,  H.,  Hoegh-­‐Guldberg,  O.,  Liss,  P.,  Riebesell,  U.,    Shepherd,  J.,  Turley,  C.,  and  Watoson,  A.  (2005).  Ocean  acidification  due  to  increasing  atmospheric  carbon  dioxide.  p.  60.  London:  The  Royal  Society.    Reidy,  S.  P.,  Nelson,  J.  A.,  Tang,  Y.,  and  Kerr,  S.  R.  (1995).  Post-­‐exercise  metabolic    rate  in  Atlantic  cod  and  its  dependence  upon  the  method  of  exhaustion.  J.  Fish  Biol.  47,  377-­‐386.    Reum,  J.  C.,  Alin,  S.  R.,  Feely,  R.  A.,  Newton,  J.,  Warner,  M.,  and  McElhany,  P.    (2014).  Seasonal  carbonate  chemistry  covariation  with  temperature,  oxygen,  and  salinity  in  a  fjord  estuary:  implications  for  the  design  of  ocean  acidification  experiments.  PloS  one  9,  e89619.         74 Riebesell,  U.,  Zondervan,  I.,  Rost,  B.,  Tortell,  P.  D.,  Zeebe,  R.  E.,  and  Morel,  F.  M.    (2000).  Reduced  calcification  of  marine  plankton  in  response  to  increased  atmospheric  CO2.  Nature  407,  364-­‐367.    Rombough,  P.  J.  (2011).  The  energetics  of  embryonic  growth.  Respir.  Physiol.    Neurobiol.  178,  22-­‐29.    Rombough,  P.  J.  (1988).  Respiratory  gas  exchange,  aerobic  metabolism  and  effects    of  hypoxia  during  early  life.  In  Fish  Physiology  XIA  (ed.  W.S.  Hoar  and  D.J.  Randall),  pp.  59-­‐161.  New  York:  Academic  Press.    Rounsefell,  G.  A.  (1958).  Anadromy  in  North  American  salmonidae.  US  Fish  and    Wildlife  Fishery  Bulletin  58,  171-­‐185.    Sabine  C.  L,  Feely  R.  A.  (2007).  The  oceanic  sink  for  carbon  dioxide.  In  Greenhouse    Gas  Sinks  (ed.  D.  Reay,  N.  Hewitt,  J.  Grace  and  K.  Smith),  pp.  31–49.  Oxfordshire:  CABI  Publishing.    Schlichting,  C.  D.,  and  Smith,  H.  (2002).  Phenotypic  plasticity:  linking  molecular    mechanisms  with  evolutionary  outcomes.  Evol.  Ecol.  16,  189-­‐211.    Schulte,  P.  M.,  Healy,  T.  M.,  and  Fangue,  N.  A.  (2011).  Thermal  performance    curves,  phenotypic  plasticity,  and  the  time  scales  of  temperature  exposure.  Integr.  Comp.  Biol.  51,  691-­‐702.    Shen,  A.  C.  Y.  and  Leatherland,  J.  F.  (1978).  Structure  of  the  yolksac  epithelium  and    gills  in  the  early  developmental  stages  of  rainbow  trout  (Salmo  gairdneri)  maintained  in  different  ambient  salinities.  Environ.  Biol.  Fishes  3,  345–354.    Smith,  R.  W.  and  Ottema,  C.  (2006).  Growth,  oxygen  consumption,  and  protein  and    RNA  synthesis  rates  in  the  yolk  sac  larvae  of  the  African  catfish  (Clarias  gariepinus).  Comp.  Biochem.  Physiol.  143A,  315–325.    Solomon,  S.,  Qin,  D.,  Manning,  M.,  Chen,  Z.,  Marquis,  M.,  Averyt,  K.,  Tignor,  M.  M.            B.,  Miller,  H.  L.  and  Chen,  Z.  (2007).  Climate  change  2007:  The  physical            science  basis:  contribution  of  working  group  I  to  the  fourth  assessment            report  of  the  Intergovernmental  Panel  on  Climate  Change.  New  York:            Cambridge  University  Press.    Stefansson,  S.,  Björnsson,  B.  T.,  Hansen,  T.,  Haux,  C.,  Taranger,  G.  L.  and    Saunders,  R.  L.  (1991).  Growth,  parr–smolt  transformation,  and  changes  in  growth  hormone  of  Atlantic  salmon  (Salmo  salar)  reared  under  different  photoperiods.  Can.  J.  Fish.  Aquat.  Sci.,  48,  2100–2108.         75 Stumpp,  M.,  Wren,  J.,  Melzner,  F.,  Thorndyke,  M.  C.,  and  Dupont,  S.  T.  (2011).    CO2  induced  seawater  acidification  impacts  sea  urchin  larval  development  I:  elevated  metabolic  rates  decrease  scope  for  growth  and  induce  developmental  delay.  Comp.  Biochem.  A  160,  331-­‐340.    Stefansson,  S.  O.,  Björnsson,  B.  T.,  Ebbesson,  L.  O.  E.,  and  McCormick  S.  D.    (2008).  Smoltification.  In  Fish  Larval  Physiology  (ed.  R.  N.  Finn  and  B.  G.  Kapoor),  pp.  639-­‐681.  New  Delhi:  Science  publishers  inc.  Enfield  (NH)  &  IBH  Publishing  Co.  Pvt.  Ltd.    Sylvestre,  E.  L.,  Lapointe,  D.,  Dutil,  J.  D.,  and  Guderley,  H.  (2007).  Thermal    sensitivity  of  metabolic  rates  and  swimming  performance  in  two  latitudinally  separated  populations  of  cod,  Gadus  morhua  L.  J.  Comp.  Physiol.  B  177,  447-­‐460.    Toews,  D.  P.,  Holeton,  G.  F.  and  Heisler,  N.  (1983)  Regulation  of  the  acid-­‐base            status  during  environmental  hypercapnia  in  the  marine  teleost  fish  Conger            conger.  J.  Exp.  Biol.  107,  9–20.    Tseng,  Y.,  Hu,  M.  Y.,  Stumpp,  M.,  Lin,  L.,  Melzner,  F.  and  Hwang,  P.  (2013).  CO2-­‐        driven  seawater  acidification  differentially  affects  development  and              molecular  plasticity  along  life  history  of  fish  (Oryzias  latipes).  Comp.  Biochem.          Physiol.  A  165,  119-­‐130.    Walther,  K.,  Anger,  K.,  and  Pörtner,  H.  O.  (2010).  Effects  of  ocean  acidification  and    warming  on  the  larval  development  of  the  spider  crab  Hyas  araneus  from  different  latitudes  (54  vs.  79  N).  Mar.  Ecol.  Prog.  Ser.  417,  159-­‐170.    Wieser,  W.  (1989).  Energy  allocation  by  addition  and  by  compensation:  an  old            principle  revisited.  In  Energy  Transformations  in  Cells  and  Animals  (ed.  W.          Wieser  and  E.  Gnaiger),  pp.  98-­‐105.  Thieme  Verlag,  Stuttgart    Quinn,  T.  P.  (2005).  The  Behavior  and  Ecology  of  Pacific  Salmon  and  Trout:    University  of  Washington  Press.    Weibel,  E.  R.  (1984).  The  Pathway  for  Oxygen.  Cambridge,  MA,  USA:  Harvard    University  Press.    Weibel,  E.  R.,  Taylor,  C.  R.  and  Hoppeler,  H.  (1991).  The  concept  of    symmorphosis:  a  testable  hypothesis  of  structure-­‐function  relationship.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  88,  10357-­‐10361.    Wieser,  W.  (1985).  Developmental  and  metabolic  constraints  of  the  scope  for    activity  in  young  rainbow  trout  (Salmo  gairdneri).  J.  Exp.  Biol.  118,  133-­‐142.       76 Willson,  M.  F.,  and  Halupka,  K.  C.  (1995).  Anadromous  fish  as  keystone  species  in    vertebrate  communities.  Conserv.  Biol.  9,  489-­‐497.    Wootton,  J.  T.,  Pfister,  C.  A.  and  Forester,  J.  D.  (2008).  Dynamic  patterns  and    ecological  impacts  of  declining  ocean  pH  in  a  high-­‐resolution  multi-­‐year  dataset.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  105,  18848-­‐18853.    Yufera,  M.,  Parra,  G.,  Santiago,  R.  and  Carrascosa,  M.  (1999).  Growth,  carbon,    nitrogen  and  caloric  content  of  Solea  senegalensis  (Pisces:  Soleidae)  from  egg  fertilization  to  metamorphosis.  Mar.  Biol.  134,  43–49.