@prefix vivo: . @prefix edm: . @prefix ns0: . @prefix dcterms: . @prefix skos: . vivo:departmentOrSchool "Medicine, Faculty of"@en ; edm:dataProvider "DSpace"@en ; ns0:degreeCampus "UBCV"@en ; dcterms:creator "Popov, Jesse"@en ; dcterms:issued "2012-03-27T16:59:00Z"@en, "2012"@en ; vivo:relatedDegree "Doctor of Philosophy - PhD"@en ; ns0:degreeGrantor "University of British Columbia"@en ; dcterms:description """This body of work describes a novel methodology for discovering and developing new cancer drugs based on therapeutic monoclonal antibodies. Such antibodies generally contain two sites where they bind to their target, but interesting improvements are often observed when the valence (number of target-binding sites) is increased above two. The methodology outlined in this dissertation involves using liposomes to prepare multivalent antibody-lipid nanoparticle formulations of different valence that can be utilized for preclinical drug development. As a proof-of-concept, we applied the methodology to rituximab, a therapeutic antibody used to treat lymphomas and leukemias. For the same dose of rituximab, multivalent rituximab-lipid nanoparticles with valences up to ~250 showed significantly elevated anticancer activity from enhanced complement-dependent cytotoxicity, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, and direct induction of apoptosis. A valence-dependent improvement in apoptosis in lymphoma cells was observed up to levels that were 21-fold higher than those observed after treatment with bivalent rituximab. We subsequently employed the different valences of multivalent rituximab to investigate its poorly defined direct mechanism of action. We uncovered a novel mechanism consisting of upregulation and activation of CD120a which led to ensuing apoptosis. Effector cells of the immune system were capable of hypercrosslinking rituximab on lymphoma cells and reproducing this mechanism, suggesting that it contributes to the in vivo cytotoxicity of regular bivalent rituximab therapy. The methodology described in this dissertation can therefore serve to identify antibodies that are more active as multivalent rather than bivalent molecules, define the optimal valence of such antibodies, and elucidate the mechanism of action of the new multivalent drugs. Furthermore, we illustrate that this information applies to other types of constructs with similar valences, enabling use of the methodology for advancing both liposomal and non-liposomal multivalent antibody formulations to preclinical maturity. Finally, this work suggests that every therapeutic antibody may have a different valence where it shows optimal therapeutic activity. For example, antibodies directed against targets that exert therapeutic effects upon clustering may show maximum activity at valences above two. This methodology can easily be applied to other antibodies in an effort to develop superior therapies against nearly any type of cancer."""@en ; edm:aggregatedCHO "https://circle.library.ubc.ca/rest/handle/2429/41804?expand=metadata"@en ; skos:note "MULTIVALENT MONOCLONAL ANTIBODIES AS IMPROVED CANCER THERAPIES:  PROOF‐OF‐CONCEPT AND MECHANISTIC STUDIES USING RITUXIMAB‐LIPID NANOPARTICLES  by    Jesse Popov    B.Sc., B.Mus., The University of Western Ontario, 2004      A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF  THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF    DOCTOR OF PHILOSOPHY    in    THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES  (Interdisciplinary Oncology)        THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA  (Vancouver)        March 2012          © Jesse Popov, 2012  • ii   Abstract  This  body  of  work  describes  a  novel  methodology  for  discovering  and  developing  new  cancer drugs based on  therapeutic monoclonal antibodies.   Such antibodies generally contain  two  sites where  they bind  to  their  target, but  interesting  improvements are often observed when  the  valence (number of target‐binding sites)  is  increased above two.   The methodology outlined  in this  dissertation  involves  using  liposomes  to  prepare  multivalent  antibody‐lipid  nanoparticle  formulations of different valence that can be utilized for preclinical drug development.    As  a proof‐of‐concept, we  applied  the methodology  to  rituximab,  a  therapeutic  antibody  used  to  treat  lymphomas and  leukemias.   For  the  same dose of  rituximab, multivalent  rituximab‐ lipid nanoparticles with valences up to ~250 showed significantly elevated anticancer activity from  enhanced complement‐dependent cytotoxicity, antibody‐dependent cell‐mediated cytotoxicity, and  direct  induction of apoptosis.   A valence‐dependent  improvement  in apoptosis  in  lymphoma cells  was  observed  up  to  levels  that  were  21‐fold  higher  than  those  observed  after  treatment  with  bivalent rituximab.  We subsequently employed the different valences of multivalent rituximab to investigate its  poorly  defined  direct  mechanism  of  action.    We  uncovered  a  novel  mechanism  consisting  of  upregulation and activation of CD120a which led to ensuing apoptosis.  Effector cells of the immune  system  were  capable  of  hypercrosslinking  rituximab  on  lymphoma  cells  and  reproducing  this  mechanism,  suggesting  that  it  contributes  to  the  in vivo  cytotoxicity of  regular bivalent  rituximab  therapy.  The methodology described  in  this dissertation  can  therefore  serve  to  identify antibodies  that are more active as multivalent  rather  than bivalent molecules, define  the optimal valence of  such antibodies, and elucidate the mechanism of action of the new multivalent drugs.  Furthermore,  we illustrate that this information applies to other types of constructs with similar valences, enabling  use  of  the  methodology  for  advancing  both  liposomal  and  non‐liposomal  multivalent  antibody  formulations to preclinical maturity.    Finally,  this work  suggests  that  every  therapeutic  antibody may  have  a  different  valence  where  it shows optimal therapeutic activity.   For example, antibodies directed against targets that  exert therapeutic effects upon clustering may show maximum activity at valences above two. This  methodology  can easily be applied  to other antibodies  in an effort  to develop  superior  therapies  against nearly any type of cancer.       • iii   Preface    A version of Chapter 2 has been published [Popov J, Kapanen AI, Turner C, Ng R, Tucker C,  Chiu G, Klasa R, Bally MB, Chikh G. Multivalent rituximab lipid nanoparticles as improved lymphoma  therapies: Indirect mechanisms of action and in vivo activity. Nanomedicine 2011 Nov;6(9):1575‐91].   I collaborated primarily with Dr. Ghania Chikh for collection of data  in this article, and  I wrote the  manuscript  based  on  a  preliminary  draft  by  Dr.  Chikh.    I  obtained  the  content  in  Chapters  3–6  independently; I planned and carried out all experiments, performed data analysis, prepared figures,  and wrote manuscripts for future publication.  A  separate  article  resulting  from  collaboration with  the  laboratory  of  Dr.  Ruth  Signorell  (Department of Chemistry, University of British Columbia) was also published and referenced in this  dissertation  [Weiss A, Preston TC, Popov  J,  Li Q, Wu  S, Chou KC, Burt HM, Bally MB,  Signorell R.  Selective recognition of rituximab‐functionalized gold nanoparticles by lymphoma cells studied with  3D imaging. J Phys Chem C 2009 Oct 21;113(47):20252‐8].  All experiments involving the use of animals were completed in accordance with the current  guidelines of the Canadian Council of Animal Care.   The University of British Columbia Animal Care  Committee  reviewed  and  approved  certificate  numbers  A05‐1582  and  A06‐1537  for  the  animal  studies carried out in Chapter 2 (in vivo efficacy of rituximab and rituximab‐lipid nanoparticles, and  pharmacokinetics of rituximab‐lipid nanoparticles).      This document is written using United States English spelling.    • iv   Table of Contents    Abstract ......................................................................................................................................... ii  Preface .......................................................................................................................................... iii  Table of Contents .......................................................................................................................... iv  List of Tables ................................................................................................................................ xii  List of Figures .............................................................................................................................. xiii  List of Abbreviations ..................................................................................................................... xv  Acknowledgements .................................................................................................................... xvii  Dedication ................................................................................................................................. xviii  1    Introduction: Developing novel therapies for treating cancer ................................................. 1    1.1    Overview ................................................................................................................................. 1    1.2    Liposomal formulations .......................................................................................................... 2        1.2.1    Liposomes in cancer treatment .................................................................................... 2        1.2.2    What are Ab‐LNPs? ....................................................................................................... 3    1.3    Therapeutic monoclonal Abs .................................................................................................. 6        1.3.1    Rituximab and CD20 ..................................................................................................... 8    1.4    The mechanisms of action of therapeutic monoclonal Abs ................................................... 9        1.4.1    Complement‐dependent cytotoxicity ........................................................................ 10        1.4.2    Ab‐dependent cell‐mediated cytotoxicity .................................................................. 10        1.4.3    Direct mechanisms of action of Rtx and other therapeutic Abs ................................ 12    1.5    Apoptosis as a target in cancer therapy ............................................................................... 14    1.6    Multivalent Abs as improved therapies ................................................................................ 15        1.6.1    Characteristics of multivalent Ab constructs and a definition of valence .................. 15        1.6.2    Examples of multivalent interactions in biology and their physical basis .................. 17  • v         1.6.3    Descriptions of multivalent Abs that exhibit superior efficacies ............................... 19    1.7    Multivalent Ab‐LNPs and the content of this dissertation ................................................... 20  2    Indirect mechanisms and in vivo activity of multivalent rituximab‐lipid nanoparticles ...........22    2.1    Synopsis ................................................................................................................................ 22    2.2    Background ........................................................................................................................... 22        2.2.1    Complement‐dependent cytotoxicity of Rtx .............................................................. 22        2.2.2    Ab‐dependent cell‐mediated cytotoxicity of Rtx ....................................................... 23        2.2.3    Does  the  creation  of  Rtx‐LNPs  affect  the  indirect  mechanisms  and  in  vivo  properties of Rtx? ....................................................................................................... 24    2.3     Materials and methods ......................................................................................................... 24        2.3.1    Reagents and cell lines ............................................................................................... 24        2.3.2    Preparation of multivalent Ab‐LNPs ........................................................................... 26        2.3.3    Measurement of cell‐surface protein expression levels ............................................ 28        2.3.4    In vivo xenograft models to assess Rtx efficacy ......................................................... 28        2.3.5    Quantification of Ab‐LNPs bound to cells .................................................................. 28        2.3.6    Annexin‐V/PI flow cytometry‐based apoptosis assay ................................................ 29        2.3.7    Assay for measuring levels of complement‐dependent cytotoxicity ......................... 30        2.3.8    Assay for the quantification of Ab‐dependent cell‐mediated cytotoxicity ................ 30        2.3.9    Quantification of activated natural killer cells ........................................................... 31        2.3.10   In vivo xenograft models for Rtx‐LNP efficacy studies ............................................... 31        2.3.11   In vivo studies on the pharmacokinetics of Rtx‐LNP .................................................. 32    2.4    Results ................................................................................................................................... 33        2.4.1    Characterization of Z138 and  JVM2 cell  lines: surface protein expression  levels  and in vivo response to Rtx treatment ....................................................................... 33        2.4.2    Rtx‐LNPs bind specifically to JVM2 and Z138 cells and induce apoptosis .................. 35  • vi         2.4.3    Multivalent Rtx‐LNPs elicit superior complement‐dependent cytotoxicity and Ab‐ dependent cell‐mediated cytotoxicity compared with Rtx ........................................ 38        2.4.4    Rtx‐LNP induces the activation of natural killer cells ................................................. 40        2.4.5    In vivo efficacy of multivalent Rtx‐LNP ....................................................................... 41        2.4.6    Pharmacokinetics of Rtx and Rtx‐LNP ........................................................................ 44    2.5     Discussion and conclusions ................................................................................................... 45        2.5.1    Discussion ................................................................................................................... 45        2.5.2    Conclusions ................................................................................................................. 48  3    Improved methodology for preparing multivalent antibody‐lipid nanoparticles ....................50    3.1    Synopsis ................................................................................................................................ 50    3.2     Background ........................................................................................................................... 50        3.2.1    The need to produce a new method for creating many valences of Ab‐LNPs ........... 50        3.2.2    How the new methodology overcomes previous limitations .................................... 51    3.3    Materials and methods ......................................................................................................... 52        3.3.1    Materials ..................................................................................................................... 52        3.3.2    Preparation of Neut‐micelles ..................................................................................... 53        3.3.3    Preparation of Neut‐LNP ............................................................................................ 53        3.3.4    CBQCA  assay  for  measuring  protein  concentration  in  solution  or  Ab‐LNP  suspension .................................................................................................................. 54        3.3.5    Ammonium ferrothiocyanate assay for measuring polyethylene glycol content in  LNPs ............................................................................................................................ 54        3.3.6    Ab biotinylation on a nickel immobilized metal affinity chromatography column .... 55        3.3.7    Ab biotinylation in solution ........................................................................................ 56        3.3.8    HABA/avidin assay for measuring the extent of Ab biotinylation .............................. 56        3.3.9     Coupling of Rtx‐biotin to Neut‐LNP to create Rtx‐LNP ............................................... 57  • vii     3.4    Results ................................................................................................................................... 57        3.4.1    Overview of the improved methodology for creating Ab‐LNPs of different valence  57        3.4.2    Preparation of Neut‐LNP and measurement of protein content ............................... 59        3.4.3    Direct measurement of levels of post‐inserted polyethylene glycol in Neut‐LNP ..... 61        3.4.4    Ab biotinylation on a nickel immobilized metal affinity chromatography support ... 62        3.4.5    Different  Ab‐LNP  valences  are  achieved  by  taking  advantage  of  the  slow  association dynamics between Ab‐biotin and Neut‐LNP ........................................... 65    3.5    Discussion and conclusions ................................................................................................... 67        3.5.1    Discussion ................................................................................................................... 67        3.5.2    Conclusions ................................................................................................................. 69  4    Unique biological properties of rituximab‐lipid nanoparticles ................................................71    4.1    Synopsis ................................................................................................................................ 71    4.2    Background ........................................................................................................................... 71        4.2.1    Properties of different types of multivalent anti‐CD20 Abs ....................................... 71        4.2.2    Hypotheses concerning the observed increases in apoptosis induced by Rtx‐LNP ... 73    4.3     Materials and methods ......................................................................................................... 74        4.3.1    Materials ..................................................................................................................... 74        4.3.2    Cell lines ...................................................................................................................... 74        4.3.3    Preparation of Rtx‐LNPs ............................................................................................. 75        4.3.4    Measurement of levels of bound Rtx and free CD20 after treatment with Rtx or  Rtx‐LNP ....................................................................................................................... 75        4.3.5    Confocal laser‐scanning fluorescence microscopy of treated cells ............................ 76        4.3.6     Measurement of total CD20 levels in treated cells .................................................... 76        4.3.7    Measurement of mitochondrial activity using AlamarBlue ....................................... 77        4.3.8    Annexin‐V/PI apoptosis assay using flow cytometry ................................................. 77  • viii     4.4     Results ................................................................................................................................... 78        4.4.1    Rtx‐LNPs exhibit unique binding properties to CD20+ target lymphoma cells ........... 78        4.4.2    Rtx‐enriched domains are found on cells treated with Rtx‐LNP but not on those  treated with bivalent Rtx ............................................................................................ 82        4.4.3    Expression of CD20 does not change substantially after treatment with Rtx‐LNP .... 83        4.4.4    Cytotoxicity of Rtx‐LNPs in two lymphoma cell lines ................................................. 85        4.4.5    Time dependence of apoptosis induced in lymphoma cells by Rtx‐LNP .................... 86        4.4.6    Levels of apoptosis in lymphoma cells depend on the valence of Rtx‐LNP ............... 89    4.5     Discussion and conclusions ................................................................................................... 90        4.5.1    Discussion ................................................................................................................... 90        4.5.2    Conclusions ................................................................................................................. 93  5    A novel direct mechanism of action of multivalent rituximab ................................................94    5.1    Synopsis ................................................................................................................................ 94    5.2    Background ........................................................................................................................... 94        5.2.1    Extrinsic and intrinsic apoptosis pathways ................................................................. 94        5.2.2    The  death‐inducing  signaling  complex  and  the  tumor  necrosis  factor  receptor  superfamily ................................................................................................................. 95        5.2.3    Death receptors .......................................................................................................... 96        5.2.4    Deciphering the direct mechanism of action of multivalent Rtx ............................... 97    5.3    Materials and methods ......................................................................................................... 98        5.3.1    Materials and cell lines ............................................................................................... 98        5.3.2    Preparation of Rtx‐LNPs ............................................................................................. 98        5.3.3    Assay for quantifying caspase‐8 levels in treated cells .............................................. 99        5.3.4    Profiling of caspases and inhibition of caspase‐8 ..................................................... 100        5.3.5    Measurement of levels of death receptors using flow cytometry ........................... 100  • ix         5.3.6    Annexin‐V/PI  apoptosis  assay  and  measurement  of  CD120a  levels  within  apoptotic subpopulations......................................................................................... 101        5.3.7    Confocal laser‐scanning fluorescence microscopy ................................................... 102        5.3.8    Preparation of Rtx‐MS .............................................................................................. 103    5.4    Results ................................................................................................................................. 103        5.4.1    Caspase dependence of Rtx‐LNP‐induced apoptosis ............................................... 103        5.4.2    Dependence of tumor necrosis factor receptor superfamily member expression  on apoptosis induced by Rtx‐LNP ............................................................................. 106        5.4.3    CD120a is equally upregulated in viable and early apoptotic cells after treatment  with Rtx‐LNP ............................................................................................................. 109        5.4.4    Time course and valence dependence of CD120a upregulation .............................. 111        5.4.5    Colocalization of caspase‐8 and CD120a .................................................................. 113        5.4.6    CD120a  upregulation  and  direct  induction  of  apoptosis  result  from  Rtx  multivalency and not the liposomal component of Rtx‐LNP .................................... 115    5.5    Discussion and conclusions ................................................................................................. 118        5.5.1    Discussion ................................................................................................................. 118        5.5.2    Conclusions ............................................................................................................... 121  6    In vivo relevance of a CD120a‐dependent mechanism of action of rituximab ...................... 122    6.1    Synopsis .............................................................................................................................. 122    6.2    Background ......................................................................................................................... 122        6.2.1    The biology and function of CD120a ........................................................................ 122        6.2.2    Plasma membrane rafts ........................................................................................... 124        6.2.3    Studying plasma membrane rafts ............................................................................ 126            6.2.3.1    Detergent‐resistant membranes ...................................................................... 126            6.2.3.2  Manipulation of plasma membrane cholesterol content ................................. 127  • x         6.2.4    Can the direct mechanism of action of bivalent Rtx involve CD120a in vivo? ......... 128    6.3    Materials and methods ....................................................................................................... 129        6.3.1    Materials and cell lines ............................................................................................. 129        6.3.2    Preparation of Rtx‐LNP and Rtx‐MS ......................................................................... 130        6.3.3    Depletion and augmentation of plasma membrane cholesterol levels ................... 130        6.3.4    Use of  flow cytometry  to determine  levels of apoptosis or expression  levels of  cell‐surface proteins ................................................................................................. 131        6.3.5    Assay for quantifying the detergent resistance of plasma membrane‐associated  proteins .................................................................................................................... 131        6.3.6    Confocal laser‐scanning fluorescence microscopy ................................................... 132        6.3.7    Experiments  using  Ramos  cells  pretreated  with  Rtx  or  A568‐Rtx  followed  by  addition of 2oAb or 2oAb‐MS .................................................................................... 132        6.3.8    Coculture of treated Ramos cells and human peripheral blood mononuclear cells.133    6.4     Results ................................................................................................................................. 135        6.4.1    Apoptosis induced by multivalent Rtx is cholesterol‐dependent ............................ 135        6.4.2    Inhibition of cholesterol synthesis using simvastatin sensitizes cells  to Rtx‐LNP‐ induced apoptosis .................................................................................................... 140        6.4.3    A model of Rtx hypercrosslinking that occurs in vivo after normal Rtx therapy ...... 142        6.4.4    CD120a  that  is  excluded  from  plasma  membrane  rafts  is  colocalized  with  hypercrosslinked Rtx‐enriched patches ................................................................... 145        6.4.5    Effector  cells  induce  elevated  apoptosis  and  CD120a  expression  only  in  lymphoma cells treated with Rtx .............................................................................. 149    6.5    Discussion and conclusions ................................................................................................. 151        6.5.1    Discussion ................................................................................................................. 151        6.5.2    Conclusions ............................................................................................................... 155  • xi   7    Discussion  and  conclusions:  Antibody‐lipid  nanoparticles  as  a  promising  tool  in  cancer  drug development ............................................................................................................... 156    7.1    Recapitulation ..................................................................................................................... 156    7.2    Discussion concerning Ab‐LNPs and other multivalent Ab constructs ............................... 157        7.2.1    Strengths and weaknesses of Ab‐LNPs as a tool for developing new drugs ............ 157        7.2.2    The use of whole Abs in Ab‐LNPs versus Ab fragments ........................................... 158        7.2.3    Relevance of the direct mechanism of action of therapeutic Abs studied in vitro  in the absence of hypercrosslinking ......................................................................... 160        7.2.4    The nature of the interaction between Ab‐LNPs and the surface of target cells .... 162    7.3    Discussion on the mechanism of action of Rtx ................................................................... 163        7.3.1    The issue of rapid clearance of multivalent Rtx remains unresolved ...................... 163        7.3.2    Local concentrations of CD20  in the plasma membrane, and not the number of  Rtx‐CD20  interactions, determine the  level of apoptosis  induced by multivalent  Rtx ............................................................................................................................. 165        7.3.3    The direct mechanism of action of Rtx may not exclusively  involve CD120a, but  also other death receptors and signaling molecules ................................................ 166        7.3.4    CD120a  expression  levels  or  mutation  status  as  predictive  markers  for  Rtx  response ................................................................................................................... 167        7.3.5    Statins in combination with Rtx therapy .................................................................. 169    7.4    Future work ........................................................................................................................ 171    7.5    Conclusions ......................................................................................................................... 172  References ................................................................................................................................. 174  • xii   List of Tables    Table 1.1    Pharmacokinetic variables and tumor localization of Trz‐LNP .......................................... 6  Table 1.2    Selected therapeutic monoclonal Abs approved or under development in oncology ..... 7  Table 3.1    Comparison  of  Ab  yields  between  current  and  previous  methods  of  Ab‐LNP  production ....................................................................................................................... 58  Table 3.2    PEG content of 0.5 mL fractions during purification of Neut‐SUV .................................. 62        • xiii   List of Figures    Figure 1.1  Ab‐LNPs exhibit enhanced therapeutic responses  in vitro compared to equal doses  of Ab .................................................................................................................................. 4  Figure 1.2    Trz‐LNP  exhibits  improved  in  vivo  efficacy  in  an  LCC6ErbB2  breast  cancer  model  compared to Trz................................................................................................................. 5  Figure 2.1    Phenotypic characterization of JVM2 and Z138 cell lines and in vivo response to Rtx  treatment ......................................................................................................................... 34  Figure 2.2    Binding of Rtx‐LNPs to target cells and direct induction of apoptosis ............................ 36    Figure 2.3    In vitro levels of Rtx‐mediated CDC and ADCC are augmented when Rtx is presented  to cells as multivalent Rtx‐LNP  ....................................................................................... 39  Figure 2.4    NK cell activation upon treatment of Z138 cells with different forms of Rtx  ................. 41  Figure 2.5    Efficacy study for Rtx‐LNP ................................................................................................ 43  Figure 2.6    Pharmacokinetics of Rtx‐LNP in two mouse models ....................................................... 45  Figure 3.1    Overview of the improved methodology for preparing multivalent Ab‐LNPs ................ 59  Figure 3.2    Control over Neut and PEG content during the preparation of Neut‐LNPs .................... 61  Figure 3.3    Ab biotinylation on a NIMAC column allows for easy purification, high recovery, and  precise degree of biotinylation  ....................................................................................... 64  Figure 3.4    Control over the valence of Rtx‐LNP when coupling Rtx‐biotin to Neut‐LNP ................. 66  Figure 4.1    Levels of bound Rtx and unbound CD20 show an inverse correlation when cells are  treated with bivalent Rtx but not with Rtx‐LNP .............................................................. 79  Figure 4.2    Representative  confocal  fluorescence  microscopy  images  of  Rtx  distribution  on  Ramos cells treated with Rtx or Rtx‐LNP ......................................................................... 83  Figure 4.3    Time course of plasma‐membrane CD20 expression in Ramos cells treated with Rtx  or Rtx‐LNP ........................................................................................................................ 85  Figure 4.4    Particularly  at  higher  doses,  Rtx‐LNPs  are  significantly  more  cytotoxic  than  equivalent doses of free Rtx ............................................................................................ 86  Figure 4.5    Rtx‐LNPs  directly  induce  apoptosis  in  lymphoma  cells  while  the  individual  precursors to Rtx‐LNP do not .......................................................................................... 88  Figure 4.6    A  valence‐dependent  increase  in  the  level  of  apoptosis  is  observed  in  Rtx‐LNP‐ treated lymphoma cells even though all cells are given equal doses of Rtx ................... 89  • xiv   Figure 5.1    Rtx‐LNP‐induced apoptosis is dependent on the activation of caspase‐8 .................... 104  Figure 5.2    CD120a expression is dramatically elevated in lymphoma cells after treatment with  Rtx‐LNP  ......................................................................................................................... 107  Figure 5.3    CD120a levels are elevated in the viable and apoptotic fractions of Rtx‐LNP‐treated  cells 8 h after treatment  ............................................................................................... 109  Figure 5.4    CD120a  expression  levels  in  the  plasma  membrane  are  highest  at  8  h  post‐ treatment and are valence‐dependent ......................................................................... 112  Figure 5.5    Two  slices  of  the  same  representative  non‐necrotic  Ramos  cells  24  h  after  treatment with different valences of Rtx‐LNP  .............................................................. 114  Figure 5.6    Apoptosis via upregulation of CD120a  is not an effect of the  liposomal component  of the formulation of Rtx‐LNP ....................................................................................... 117  Figure 6.1  The manipulation of plasma membrane Chol  content using MBCD or MBCD/Chol  significantly impacts the ability of multivalent Rtx to induce apoptosis ....................... 136  Figure 6.2    Cells  that  are  rescued  from  apoptosis  by  increasing  the  plasma membrane  Chol  content show elevated levels of raft‐associated CD120a ............................................. 139  Figure 6.3    Simvastatin decreases  the DR of CD120a and sensitizes cells  to apoptosis  induced  by Rtx‐LNP ...................................................................................................................... 141  Figure 6.4    A model for the hypercrosslinking of Rtx that occurs in vivo by FcγR‐bearing effector  cells ................................................................................................................................ 143  Figure 6.5    Membrane  raft‐associated  CD120a  is  excluded  from  regions  enriched  in  hypercrosslinked  Rtx/CD20,  and  non‐raft  CD120a  is  colocalized  with  hypercrosslinked Rtx/CD20 ........................................................................................... 146  Figure 6.6    Human  PBMCs  induce  significantly  higher  levels  of  apoptosis  and  plasma‐ membrane CD120a expression in lymphoma cells pretreated with Rtx compared to  non‐pretreated cells ...................................................................................................... 150          • xv   List of Abbreviations    2oAb  secondary antibody  [3H]CHE  [3H]cholesteryl hexadecyl ether  A###‐τ  Alexa Fluor ###‐labeled antibody against antigen τ        e.g. A647‐CD120a = Alexa Fluor 647 labeled anti‐CD120a antibody  Ab  antibody  ADCC  antibody‐dependent cell‐mediated cytotoxicity  AF  ammonium ferrothiocyanate  AFC   7‐amino‐4‐trifluoromethyl coumarin  BB  binding buffer  BCA  bicinchoninic acid  CBQCA  3‐(4‐carboxybenzoyl)quinoline‐2‐carboxaldehyde  CDC  complement‐dependent cytotoxicity  CFSE  carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester  Chol  cholesterol  CLL  chronic lymphocytic leukemia  CTX  cholera toxin B subunit  D649  DyLight 649  DISC  death‐inducing signaling complex  DLBCL   diffuse large B‐cell lymphoma  DMSO  dimethyl sulfoxide  DR  detergent resistance  DSPC  1,2‐distearoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphocholine  DSPE‐PEG  1,2‐distearoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphoethanolamine‐N‐[methoxy(polyethylene   glycol)‐2000]  DSPE‐PEG‐biotin  1,2‐distearoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphoethanolamine‐N‐[biotinyl(polyethylene glycol)‐  2000]  DSPE‐PEG‐Mal  1,2‐distearoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphoethanolamine‐N‐[maleimide(polyethylene   glycol)‐2000]  DTT  dithiothreitol  EB  elution buffer  EDTA  ethylene diamine tetraacetic acid  ELISA  enzyme‐linked immunosorbent assay  FAM  carboxyfluorescein  FcγR  IgG Fc receptor  FcεRI   IgE Fc receptor I  FITC  fluorescein isothiocyanate  FL  follicular lymphoma  FLICA  fluorescent inhibitor of caspase  FMK  fluoromethyl ketone  FSC  forward scatter  HABA  4‐hydroxyazobenzene‐2‐carboxylic acid  HEPES  2‐[4‐(2‐hydroxyethyl)piperazin‐1‐yl]ethanesulfonic acid  HBS  HEPES buffered saline  HMG‐CoA   3‐hydroxy‐3‐methylglutaryl coenzyme A  IgE/IgG  immunoglobulin E/immunoglobulin G  IL  interleukin  IP  intraperitoneally  • xvi   IV  intravenous/intravenously  LNP  lipid nanoparticle  Luc  luciferase  LV  lentivirus  Mal  maleimide  MCL  mantle cell lymphoma  MS  microsphere  Neut  NeutrAvidin  NHL  non‐Hodgkin’s lymphoma  NHS‐PEG‐biotin  N‐Hydroxysuccinimide ester‐dPEG4‐biotin  NIMAC  nickel immobilized metal affinity chromatography  NK  natural killer  NP  nanoparticle  PBMC  peripheral blood mononuclear cell  PBS  phosphate buffered saline  PE  phycoerythrin  PEG  polyethylene glycol  PI  propidium iodide  Prz  pertuzumab  QLS  quasi‐elastic light scattering    Rtx  rituximab  Rtx‐LNP(α)  rituximab‐lipid nanoparticle of valence α  ROI  region of interest  SB  stripping buffer  SC  subcutaneous/subcutaneously  SCID  severe combined immunodeficiency  SD  standard deviation  SPDP  N‐Succinimidyl 3‐(2‐pyridyldithio)propionate  SSC  side scatter  SUV  small unilamellar vesicle  TNFα  tumor necrosis factor α  TNFR  tumor necrosis factor receptor  TRAPS  TNFR‐associated periodic syndrome  Trz  trastuzumab  TX100  Triton X‐100  wrt  with respect to        • xvii   Acknowledgements    I would  like  to offer my gratitude  to my  supervisor, Dr. Marcel Bally,  for his  support and  guidance in my graduate studies, and for encouraging my growth as a scientist.  I would also like to  acknowledge  the other members of my  supervisory committee, Dr. Pieter Cullis and Dr.  I. Robert  Nabi for their scientific direction.    I would  like  to  give  special  thanks  to  the members  of  the  Department  of  Experimental  Therapeutics  at  the  British  Columbia  Cancer  Research  Centre,  both  the  laboratory  and  administrative groups, who provided assistance and encouragement with my work.  I would also like  to thank the Interdisciplinary Oncology Program (College for Interdisciplinary Studies), who provided  support as well as financial assistance in the form of travel awards.    I would also like to thank Dr. Gert Storm, my supervisor during a six‐month work term at the  Utrecht  Institute  for Pharmaceutical Sciences at Utrecht University, The Netherlands.   Some data  found  in Chapter 4 was obtained during  this  time,  including  confocal  laser‐scanning  fluorescence  microscopy  images  which  were  obtained  at  the  Center  for  Cellular  Imaging  in  the  Faculty  of  Veterinary Medicine, and I would like to thank Dr. Richard Wubboltz and Esther van ‘t Veld for help  and technical advice.    I would also like to acknowledge the generous financial support from the following sources:   Canadian Institutes of Health Research   Michael Smith Foundation for Health Research   British Columbia Innovation Council   Natural Sciences and Engineering Research Council    Finally,  a  heartfelt  thank  you  to my  friends,  family,  and  partner  Sébastien  for  their  love,  encouragement, and enduring support.    • xviii     Dedication      To my father      • 1   1  Introduction: Developing novel therapies for treating cancer  1.1  Overview  The goal of the work presented in this dissertation is to create new drug technologies for the  treatment  of  cancer.    It  involves  a  novel  methodology  for  discovering  and  developing  new  treatments  based  on  therapeutic monoclonal  antibodies  (Abs),  a  class  of  drugs  that  hold  great  promise  in  cancer  treatment1,  2.    The methodology makes  use  of  a  drug  formulation  based  on  liposomes,  a  type of  lipid nanoparticle  (LNP)  that normally  serves  to  enhance  the delivery of  an  encapsulated chemotherapeutic drug to the site of disease and therefore increase its efficacy3.  One  common  way  to  further  improve  this  favorable  targeting  effect  is  by  attaching  tumor‐specific  proteins or peptides to the liposome surface4‐6.  We generated such Ab‐LNP constructs by attaching  several copies of the therapeutic Abs rituximab (Rtx) or trastuzumab (Trz) to the exterior surface of  the liposome, with the exception that the liposome interior was devoid of chemotherapy.  Strikingly,  these Ab‐LNPs exhibited much higher efficacy in vitro and in vivo than Ab or bare liposomes alone7.  Given  the  absence  of  encapsulated  drug,  the mechanism  by  which  Ab‐LNPs  exert  their  effects is distinct from the changes in drug pharmacokinetics and biodistribution normally attributed  to  liposomal formulations3, 8.   Because of this entirely abnormal behavior, the mechanism of action  of  these  promising Ab‐LNP  constructs was  completely  elusive,  but  the mechanism  of  action  is  a  critical element for further preclinical and clinical development of such drug technologies.  The work  presented  in  this  dissertation  began with  efforts  to  uncover  the  unique mechanism  of  action  of  these  constructs.    The  outcomes were  not  only  the  uncovering  of  a  novel mechanism  of  action  explaining  the  enhanced  efficacy  of  Rtx‐LNPs  and  Rtx  itself,  but  also  the  creation  of  a  novel  methodology  with  clear  potential  in  the  pharmaceutical  industry  for  discovering,  studying,  and  developing new cancer treatments based on therapeutic monoclonal Abs.    • 2   1.2  Liposomal formulations  1.2.1  Liposomes in cancer treatment  Liposomes are nanometer‐scale particles made up of one or more hydrophobic lipid bilayers  that  enclose  an  internal  aqueous  compartment.    There  are  currently  four  approved  liposomal  formulations for the treatment of cancer, and at  least 14  in Phase  I clinical trials or  later stages of  development9.    In  cancer  treatment,  liposomes  are  traditionally  used  as  drug  delivery  vehicles,  where  a  chemotherapeutic  agent  is  encapsulated  within  the  liposome  and  the  drug‐liposome  complex accumulates at the tumor site8.  The main mechanism by which this occurs is the enhanced  permeability and retention effect, also referred to as passive targeting.  It results from the passage  of  liposomes  through  tumor  vasculature,  which  unlike  normal  vasculature,  is  permeable  to  liposomes  and  macromolecules.    Because  tumors  exhibit  poor  lymphatic  drainage,  liposomes  subsequently accumulate at the site of the tumor10.  Compared to administration of the same dose  of  free drug,  concentrations of drug at  the  tumor  site  can be 10‐fold or higher3.   Such enhanced  delivery to target cell populations at the site of disease, without an associated increase in toxicity, is  instrumental in achieving therapeutic improvement of the encapsulated drug8.  As a method to further refine the specificity of targeting, the attachment of target‐specific  proteins or peptides to the drug carrier surface has received considerable attention4‐6.   This results  in active targeting of the liposome and its contents to the tumor site.  The targeting protein is most  commonly a  tumor‐specific Ab, and such constructs are therefore termed  immunoliposomes.   Abs  are selected on the basis of their ability to bind to target molecules at the disease site; when these  Abs are coupled to  liposomes containing chemotherapy,  liposome targeting  is regularly enhanced6,  11,  12.    It  has  been  shown,  however,  that  the  chemical modification  of  the  protein  required  for  conjugation  to  liposomes  impairs  the  function of  the Ab13‐15.   With  the advent of monoclonal Abs  such  as  Rtx  and  Trz  (Section  1.3),  the  targeting  Ab  itself  can  exhibit  a  therapeutic  response  in  • 3   addition to encapsulated drug (Section 1.3).   Surprisingly, previous work from our  laboratory using  “empty immunoliposomes” containing a therapeutic Ab (rather than simply a targeting Ab) indicated  that  coupling  the  Ab  to  the  liposome  actually  benefited  its  therapeutic  activity7.    These  special  constructs have been termed Ab‐LNPs.   1.2.2  What are Ab­LNPs?  Ab‐LNPs consist of many therapeutic Ab molecules tethered to the outer surface of a small  unilamellar vesicle (SUV), creating a construct with a diameter of approximately 130 nm.  An SUV is a  type of liposome that contains one lipid bilayer surrounding an aqueous interior, and in the current  application,  the bilayer  contains  a mixture of phospholipids,  cholesterol  (Chol),  and polyethylene  glycol  (PEG)  (see Section 2.3.2 and Chapter 3  for more detail)16, 17.   The PEG  serves  specifically  to  block the binding of plasma proteins to the Ab‐LNPs; in the absence of PEG, such binding results in  uptake by the reticuloendothelial system and results in significantly decreased circulation lifetime of  the formulation18, 19.        Ab‐LNPs employ liposomes strictly as scaffolds to bridge many Ab molecules together, which  is distinct from the traditional use of  liposomes, which actively or passively target an encapsulated  drug.    In  fact,  due  to  the  lack  of  encapsulated  drug,  the  advantages  normally  associated  with  liposomal  formulations  discussed  in  Section  1.2.1  (improvements  in  pharmacokinetics  and  biodistribution of an encapsulated drug) are not applicable to Ab‐LNPs3, 8.  In order to emphasize this  distinction  in  liposome  function and mechanism of action,  the  term  “Ab‐LNP”  is employed  rather  than other terms such as “liposomal antibody” or “empty immunoliposome.”    Previous  studies  from  our  laboratory made  use  of  Ab‐LNPs  prepared with  two  different  therapeutic Abs, Rtx and Trz7.  As shown in Figure 1.1, these studies demonstrated that even though  cells were given the same dose of Rtx or Trz, the Abs exhibited significantly higher activities against  different cancer cell lines when the Abs were attached to the liposome as Ab‐LNPs.   • 4       Figure 1.1  Ab‐LNPs exhibit enhanced therapeutic responses in vitro compared to equal doses of Ab†.  (A & B) Two different  lymphoma cell  lines  (Ramos and Z138) were treated  for 3 days with Rtx  (white columns), Rtx‐LNP  (gray columns), or Rtx and a crosslinking secondary Ab  (2oAb)  (black columns).    (C & D) Two different breast cancer cell  lines (LCC6ErbB2 and MCF7ErbB2) were treated for 5 days with Trz (white columns) or Trz‐LNP (gray columns) in the presence  of heregulin.    “Fraction affected” was  calculated by determining  the  fraction of  remaining viable  cells using  the 3‐(4,5‐ dimethylthiazol‐2‐yl)‐2,5‐diphenyltetrazolium bromide assay, and subtracting this value from 1.   Columns: mean of three  independent experiments; bars: standard error; *p < 0.05, #p < 0.05, compared with the free Ab treatment.    The  in vivo efficacy and pharmacokinetics of Trz‐LNPs were also examined  to determine  if  these favorable effects were observed in vivo.  As shown in Figure 1.2, the in vivo efficacy of Trz‐LNP  was shown to be significantly higher  than that of Trz.   The pharmacokinetics of Trz‐LNP were also  studied and compared to those of Trz; as shown in Table 1.1, Trz‐LNP exhibited significantly elevated  Trz plasma  levels after 24 h  compared  to  free Trz, as well as enhanced  tumor  localization of Trz,  explaining the increased efficacy that was observed7.                                                               †Adapted and reprinted by permission from the American Association for Cancer Research: Chiu, G.N.C. et  al.,  Modulation  of  Cancer  Cell  Survival  Pathways  Using  Multivalent  Liposomal  Therapeutic  Antibody  Constructs, Molecular Cancer Therapeutics, 2007, vol. 6(3), 844–55.   A                 Ramos                           B                   Z138    C                LCC6ErbB2                         D                 MCF7ErbB2   • 5        Figure 1.2  Trz‐LNP exhibits improved in vivo efficacy in an LCC6ErbB2 breast cancer model compared to Trz†.  (A) In vivo efficacy of Trz‐LNP in the LCC6ErbB2 breast cancer model.  Trz‐LNP was administered at 0.25 mg/kg (), 0.5 mg/kg  (), and 1 mg/kg () IV twice weekly for 5 weeks starting on day 18 after inoculation of tumor cells.  Ab‐LNP containing  an irrelevant Ab () was administered at 1 mg/kg according to the same dosing schedule, and saline () was used as the  vehicle control.  (B) Fold‐change in tumor volume after 5 weeks of various treatments (controls and Trz‐LNP) according to  the same dosing schedule.  Controls: a, saline; b, irrelevant Ab; c, Trz (1.0 mg/kg); d, irrelevant Ab‐LNP; e, bare liposomes.   *p < 0.05 compared with Trz.   Data represent means obtained  from using six mice  in each study group.   Bars: standard  error.        This was  the  first  report describing enhanced activity of drugs attached  to  the outside of  liposomes, where the liposomes serve a purely structural role.  These studies therefore established  that Ab‐LNPs exhibited novel  therapeutic activity  that could not be explained by passive or active  targeting of an encapsulated drug, so  the  improvements  in Ab efficacy resulted  from an unknown  mechanism of action  that  remained elusive.   The complications  in understanding  this mechanistic  puzzle  were  due,  wholly  or  in  part,  to  the  fact  that  the  mechanisms  of  the  therapeutic  Abs  themselves are not clearly delineated.      A B Controls         Trz‐LNP dose  (mg/kg) 0. 25 0. 50 1. 0a b c d e • 6   Table 1.1  Pharmacokinetic variables and tumor localization of Trz‐LNP†.  Pharmacokinetic comparisona:    Trz  Trz‐LNP  Plasma levels at 24 h (μg/mL)  2.91 ± 0.13  27.7 ± 1.3  AUC0‐24 h (μg ∙ h ∙ mL−1)b  88.7  883  Total body clearance (mL ∙ h‐1)  4.04  0.386  Volume of distribution at steady state (mL)  277  29.7  MRTlast (h)  9.64  10.3  Tumor localizationa:    Control liposome  Trz‐LNP  % Injected dose/g tumor at 24 h 3.84 ± 2.4  13.9 ± 3.4      Abbreviations:  AUC0‐24 h: Area under the curve from time of dosing (t = 0 h) up to the last measured plasma concentration  (t = 24 h); MRTlast: Mean residence time, calculated using values up to the last measured plasma concentration (t = 24 h).  a For plasma elimination studies, 12 animals were used for each study group, with four animals used for each time point of  blood collection (at 1, 4, and 24 h). For tumor localization study, four animals were used for each study group, and tumors  were harvested at 24 h.   b Noncompartmental analysis based on the  linear trapezoidal rule was done using the software WinNonlin version 1.5 to  estimate the values of various pharmacokinetic variables.    1.3  Therapeutic monoclonal Abs  Therapeutic monoclonal Abs are a class of drugs that hold great promise in cancer treatment  due to their ability to target and kill cancer cells while leaving healthy cells in the body unaffected.   This  concept  of  using  “magic  bullets”  to  treat  disease  was  proposed  as  early  as  1897  by  Paul  Ehrlich20.  It was not until 1975, however, that the development of therapeutic Abs as targeted drugs  became  possible  with  the  invention  of  hybridoma  technology,  allowing  for  the  production  of  monoclonal  Abs  of  predefined  antigen  specificity21.   Monoclonal  Abs  were  thought  to  be  ideal  candidates  for  administration  in  humans  because  of  their  specificity  to  a  single  epitope  on  their  corresponding antigen, but early therapeutic Abs were antigenic  in humans due  to their origins  in  mice, limiting their clinical potential22, 23.    Starting  in  the  early  1980s,  protein  engineering  techniques  allowed  for  replacement  of  mouse  regions  of  the  Ab molecules  with  corresponding  regions  of  human  origin,  reducing  the  • 7   mouse‐specific  immunogenic  response when administered  in humans.   Chimeric Abs  refer  to Abs  with  antigen‐binding  regions  coded  by  genes  of mouse  origin  and  constant  regions  from  human  genes.  Humanized Abs refer to a genetically engineered mouse Ab where the protein sequence has  been modified  to  increase  the  similarity of  the Ab  to human Abs22, 23.    Subsequent  technological  advances have allowed fully human therapeutic Abs to also be produced24‐26.    The first monoclonal Ab to be approved for use  in oncology was Rtx  in 199727, 28, and over  the past decade, the market for therapeutic monoclonal Abs has grown exponentially29‐31.  Over 30  Abs  and  their  derivatives  have  been  approved  for  use  in  various  indications,  including  10  in  oncology, and there are hundreds in the late stages of preclinical and clinical development31.  Table  1.2 shows a selection of therapeutic monoclonal Abs that are currently approved for use in treating  cancer, or at late stages of clinical trials.      Table 1.2  Selected therapeutic monoclonal Abs approved or under development in oncology.    Generic name  Trade name  Target  Ab format  Cancer indication  Status  Refs.  Rituximab (Rtx)  Rituxan/Mabthera  CD20  Chimeric IgG1  NHL  Approved  27, 28  Trastuzumab (Trz)  Herceptin  ErbB2  Humanized IgG1  Breast  Approved  32, 33  Alemtuzumab  Campath/MabCampath CD52  Humanized IgG1  CLL  Approved  34  Cetuximab  Erbitux  EGFR  Chimeric IgG1  Colorectal  Approved  35  Bevacizumab  Avastin  VEGFA Humanized IgG1  Colorectal, breast, lung  Approved  36  Panitumumab  Vectibix  EGFR  Human IgG2  Colorectal  Approved  24  Ofatumumab  Arzerra  CD20  Human IgG1  CLL  Approved  25, 37  Pertuzumab (Prz)  Omnitarg  ErbB2  Humanized IgG1  Breast, ovarian  Phase III  38, 39  Veltuzumab  N/A   CD20  Humanized IgG1  NHL, CLL  Phase III  40, 41    Abbreviations:  CLL: Chronic lymphocytic leukemia; N/A: Not applicable; NHL: Non‐Hodgkin lymphoma.    Even though in humans there are five classes of immunoglobulin (IgM, IgD, IgG, IgA, and IgE)  as well as four  IgG subclasses  (IgG1,  IgG2,  IgG3, and  IgG4), by far most therapeutic Abs are of the  IgG1  subtype  (Table 1.2).   This  is because  IgG1 exhibits a  long half‐life  in blood  (~21 days) and  it  elicits more  favorable  indirect mechanisms of action  (see Sections 1.4.1 & 1.4.2) compared  to  the  • 8   other  Ig  classes and  subclasses42.   Cancer patients  treated with  therapeutic Abs  typically need  to  receive weekly doses of  several hundred milligrams over  several months  to maintain an effective  serum concentration of over 10 μg/mL43.   The 150 kDa Y‐shaped structure of  IgGs can be divided  into two distinct functional units: the fragment of antigen binding (Fab; the v‐shaped upper part of  the molecule) and the constant fragment (Fc), which are connected at a site called the hinge region.   The Fab region contains two identical sites where the Ab (drug) binds its antigen (target), while the  Fc region interacts with specific effector cells of the immune system1.  The Fab and Fc regions each  are responsible for different mechanisms of action of therapeutic Abs, as described in Section 1.4.   1.3.1  Rituximab and CD20  Rtx  is  often  heralded  as  a  “blockbuster”  Ab  given  its widespread  success  in  significantly  improving  the  survival  statistics  for  B‐cell  non‐Hodgkin  lymphomas  (NHLs),  as  well  as  other  malignancies  such  as  chronic  lymphocytic  leukemia  (CLL)  and  autoimmune  disorders  such  as  rheumatoid arthritis31, 44.   As opposed to more recently developed Abs, which are often humanized  or  fully human molecules, Rtx  is a  chimeric Ab  containing a murine variable  region attached  to a  human IgG1 constant region.    The target of Rtx is CD20, a 33 to 37 kD membrane‐associated phosphoprotein that is highly  expressed on all normal and most malignant B cells, but not other cells  in  the body, making  it an  attractive target for B cell‐based therapy.   CD20  is not detected on embryonic stem or pro‐B cells,  but is expressed on the surface of mature B cells; expression ceases upon differentiation into plasma  cells.   The protein spans the plasma membrane four times and there  is some evidence that  it may  function in calcium entry45, 46.  It has been shown to form tetramers which associate with the B cell  antigen receptor in unstimulated cells, and upon antigen binding, CD20 is released and it associates  transiently with phosphoproteins and calmodulin‐binding proteins, which regulate calcium entry47.   • 9   Most  anti‐CD20  therapeutic  Abs  do  not  internalize  upon  binding  to  CD2040.    Despite  its  proven  success as a target for Ab therapy, the precise function of CD20 is still elusive.   1.4  The mechanisms of action of therapeutic monoclonal Abs  In general,  the precise mechanisms of action of  therapeutic Abs are not completely clear,  and they vary from Ab to Ab.  The activity of a given therapeutic Ab is commonly viewed as resulting  from a combination of  indirect and direct effects that occur after the Ab binds to  its target44.   The  indirect  and  direct  mechanisms  are  mediated  by  the  Fc  and  Fab  regions  of  the  Ab  molecule,  respectively.    The indirect mechanisms are related to the action of the immune system on target cells that  are  coated with  therapeutic  Ab.    They  involve  the  interaction  of  specific  cell‐surface  or  plasma  proteins with the Fc region of the therapeutic Ab molecule; since the Fc region is common to most  therapeutic Abs, it is not surprising that the indirect mechanisms are common to all therapeutic Abs.   Specifically,  the  two  indirect mechanisms are known as complement‐dependent cytotoxicity  (CDC;  Section 1.4.1)  and Ab‐dependent  cell‐mediated  cytotoxicity  (ADCC;  Section  1.4.2).    The  Fc  region  possesses  interaction  sites  for  ligands  which  can  induce  effector  functions,  including  three  structurally  homologous  cellular  IgG  Fc  receptor  types  (FcγRI,  FcγRII,  FcγRIII)  as well  as  the  C1q  component  of  the  complement48.    Even  though  every  therapeutic  Ab  elicits  CDC  and  ADCC,  the  relative contributions of the two mechanisms vary from one Ab to the next44, 49, 50.    As opposed to the Fc region‐mediated indirect mechanisms, the direct mechanism of action  of a  therapeutic Ab  results  from  the physical  interaction of  its  two  identical Fab  regions with  the  target on the cell surface48 (Section 1.4.3).  The direct mechanism is therefore Ab‐specific, and highly  variable  between  different  Abs;  for  example,  the  direct  mechanism  of  action  can  result  in  therapeutic effects such as growth inhibition, chemosensitization, or induction of apoptosis51.   • 10   1.4.1  Complement­dependent cytotoxicity  As part of the  innate  immune system, complement  is one of the main mechanisms of Ab‐ mediated immunity and is responsible for protecting the host from attack by intruding pathogens.  It  was first identified as a serum component that “complemented” Abs in order to kill bacteria, but we  now know today that it consists of more than 30 proteins found in the plasma and on the surfaces of  cells52,  53.    Activation  of  complement  occurs  after  distinct  events  that  trigger  different  protease  cascades known as  the classical, mannose‐binding  lectin, and alternative pathways.   For example,  the classical pathway is activated by the binding of the complement protein C1q to the Fc region of  the Ab on the surface of an invading pathogen or on a cancer cell coated with therapeutic Ab.  The  final result of all  three complement pathways  is  the assembly of a 5–10 nm diameter membrane‐ attack complex on the foreign cell, which causes cell death by disrupting the plasma membrane53, 54.   Complement  is  finely regulated so  that  it  is activated on  foreign Ab‐coated cells  (resulting  in their  elimination) but not on normal cells52.  For  the  induction  of  strong  CDC  activity  during  monoclonal  Ab  therapy,  relatively  high  expression of target antigen is required in order to attain sufficiently high Ab levels on the tumor‐cell  surface to initiate CDC.  It is also clear that higher amounts of bound C1q to the Fc region of the Ab  correlate with elevated levels of CDC43, 54.  Moreover, given the importance of CDC in the mechanism  of action of  therapeutic Abs,  several  strategies have been employed  to enhance CDC  in new Abs  under  development,  such  as  amino  acid  mutations  that  enhance  CDC  through  improved  C1q  binding55, 56.    Another  strategy  involves  shuffling  IgG1  and  IgG3  sequences within  a  heavy  chain  constant  region, since  IgG3 exhibits superior CDC compared  to  the other  IgG  isotypes, while  IgG1  exhibits  higher  ADCC,  the  other  principal  indirect mechanism  of  action57.    A  discussion  of  CDC  relating specifically to Rtx is provided in Section 2.2.1.    • 11   1.4.2  Ab­dependent cell­mediated cytotoxicity  ADCC  results  from  the  interaction  between  effector  cells  of  the  immune  system  and  a  foreign cell coated with Ab.  Effector cells contain IgG Fc receptors (FcγRs) that bind to the Fc region  of IgG molecules, and they consist of macrophages, natural killer (NK) cells, granulocytes, and other  types  of  leukocytes43, 58.    FcγRs  can  be  classified  as  activating  or  inhibitory;  for  example,  FcγRIa,  FcγRIIa,  FcγRIIc and  FcγRIIIa, are activating  receptors, while  FcγRIIb  is an  inhibitory  receptor.   NK  cells  and  granulocytes  contain  only  activating  FcγRs,  and  are  therefore  better  inducers  of  ADCC  compared to macrophages, which contain both activating and  inhibitory FcγRs54.   When activating  FcγRs  on  effector  cells  are  crosslinked  by  IgG  bound  to  its  target,  activation  of  the  effector  cell  occurs  and  results  in phagocytosis of  the  target  cell or  cell  lysis  through  the  release of  cytotoxic  granules by the effector cell43, 54, 58.  When studied in vitro, ADCC resulting from therapeutic Ab treatment can be achieved at Ab  concentrations below 10 ng/mL, which  is  several orders of magnitude  lower  than  the  required  in  vivo  serum  concentrations  mentioned  in  Section  1.3  (ref.  43).    This  discrepancy  results  from  competition between endogenous human serum  IgG and therapeutic Abs for binding to activating  FcγR on effector cells (such as FcγRIIIa on NK cells), which leads to the requirement of a significant  amount of drug, contributing to the very high costs associated with such therapies58.    Different Abs against the same target show variable  levels of ADCC, and the magnitude of  induced ADCC does not correlate with the density of the target on the cell surface, underscoring the  complexity of  this mechanism of action59.   Since  increased ADCC has been shown  to enhance  the  efficacy of therapeutic Abs, strategies for  improving ADCC activity occupy an  important role  in the  development of the next generation of therapeutic Abs58.   Some approaches  include modifications  of glycosylation of the Ab that result in enhanced ADCC58, 60, 61 as well as amino acid mutations that  result in enhanced binding to FcγRIIIa62‐64.    Properties relating to the ability of Rtx to induce ADCC  are described in further detail in Section 2.2.2.     • 12   1.4.3  Direct mechanisms of action of Rtx and other therapeutic Abs  Because  the  direct mechanism  of  a  therapeutic Ab  is  highly Ab‐specific,  it  depends  on  a  multitude of factors.  These include the molecular biology of the target, the nature of the interaction  between Ab and target, and the specific characteristics of the target cell, such as mutation status,  target  expression  levels,  and  expression of proteins  that  regulate  activation of  the  target51.    The  direct mechanisms of therapeutic Abs are therefore far less well‐defined and more variable than the  indirect ones, even when  looking at direct mechanisms of different Abs directed against the same  target.    One such example  is  two  therapeutic Abs used  in  the  treatment of breast cancer, Trz and  pertuzumab (Prz)32, 65.  Both of these Abs are directed against ErbB2 (also known as Her2 or EGFR2),  which  is overexpressed  in 15‐30% of  invasive breast  carcinomas,  and which  is predictive of poor  prognosis66.   The ErbB  family  includes  four  receptor  tyrosine kinases with a common extracellular  ligand‐binding  domain.   Upon  ligand  binding,  various  homodimers  and  heterodimers  are  formed  among  the  four  family members,  resulting  in  the activation of  intracellular pathways  that control  survival and cell cycle progression.   Dysregulation of  this kinase pathway,  resulting  in constitutive  activation, has been shown to regulate tumor growth in a variety of cancers67.    Trz  acts  by  binding  to  the  extracellular  juxtamembrane  domain  of  ErbB2.    This  causes  dimerization of ErbB2 and  subsequent  internalization and downmodulation of  the protein on  the  tumor  surface.    Downstream  signaling  from  ErbB2  overexpression  therefore  ceases,  resulting  disruption of cell‐cycle progression and inhibition of the growth of metastases68‐70.  Prz, on the other  hand, binds to an epitope on the extracellular domain of ErbB2 that sterically inhibits the ability of  ErbB2 to form ligand‐activated dimer complexes.  This does not result in downmodulation like with  Trz, but instead it causes inhibition of ErbB signaling by disrupting the vast array of different ligand‐ dependent receptor combinations that exist in the ErbB kinase pathway71.  • 13   Because of  the differences  in direct mechanisms of action, Trz  requires overexpression of  ErbB2 on the cell surface in order to have therapeutic activity, and it shows low activity when ErbB2  is not overexpressed.   Prz, however,  is highly effective at  inhibiting  tumor growth when ErbB2  is  overexpressed or when ErbB2 expression is low71.  Moreover, the two Abs together have also been  shown  to  show  synergistic effects  against breast  cancer  cells  in  vitro72  and  against  in  vivo breast  cancer  xenografts73, and  the  combination exhibited  favorable  response  rates  in patients who had  progressed following previous Trz therapy38.  The direct mechanism of action of Rtx involves a different mechanism: it is known to consist  of  induction of apoptosis  in  target cells.   Generally,  in  the absence of ADCC and CDC  in vitro, Rtx  exhibits low levels of cytotoxicity in neoplastic cells unless it is crosslinked with a reagent such as an  anti‐human‐IgG secondary Ab (2oAb).   This has been demonstrated with established cell  lines7, 74, 75  as well as primary cells76.  This direct effect is generally thought to result from clustering of CD20 in  the plasma membrane, and since  it has been shown to occur  in the absence of ADCC or CDC, the  direct mechanism also plays a role in the overall mechanism of action of Rtx.    It has been postulated that in vivo, such a direct mechanism may occur as a result of FcγR‐ mediated hypercrosslinking of Rtx by NK cells and other effector cells, since it is known that Rtx and  other therapeutic Abs mediate FcγR crosslinking in the induction of ADCC43, 54, 58.  Such direct effects  may be responsible for a substantial proportion of the cytotoxic effects of Rtx therapy, although this  has not been definitively shown77.  Moreover, a direct mechanistic link between Rtx crosslinking and  apoptosis has not been established, so it is not understood how crosslinking can result in apoptosis.   The crosslinking of therapeutic Abs is further discussed in Section 1.6.  Taken together, the complex nature of the mechanism of action of therapeutic Abs makes it  difficult  to define  features of  specific Abs  that, upon modulation, would  increase or decrease  the  efficacy of the Ab.  Several strategies for improving the activity of therapeutic Abs by increasing CDC  • 14   or ADCC were mentioned above, and equivalent strategies can also be employed for enhancing the  Ab‐specific direct mechanisms of action.    In  the case of Abs  such as Rtx whose direct mechanism  consists of induction of apoptosis, methods to enhance levels of apoptosis would have clear benefit  in improving these drugs.    1.5  Apoptosis as a target in cancer therapy  Evasion of apoptosis is one of the hallmarks of cancer78, and a large and promising focus in  cancer  research  involves  inducing apoptosis  specifically  in cancer cells but not  in normal cells79‐82.   Apoptosis  is  the  process  of  programmed  cell  death,  and  is  conserved  across  all metazoans;  it  is  necessary  under  normal  physiological  conditions  at  all  stages  of  life.    During  embryonic  development,  apoptosis  is  essential  for organogenesis  and  the  formation of multicellular  tissues,  where  it  ensures  the  proper  balance  of  each  differentiated  cell  lineage,  and  in  adult  organisms,  apoptosis maintains normal cellular homeostasis83.    In multicellular organisms, the total number of cells is a balance between new cells created  through  mitosis  and  cells  that  die  through  apoptosis80.    Different  studies  have  shown  that  disruptions  in  this  balance  due  to  altered  apoptotic  signaling  can  be  primary  pathogenic  events  resulting  in disease. Accelerated  cell death  is evident  in acute and chronic degenerative diseases,  immunodeficiency,  and  infertility,  while  insufficient  apoptosis  can manifest  as  autoimmunity  or  cancer80, 83.    Apoptosis  can  be  contrasted  to  necrosis,  which  is  traumatic  cell  death  following  acute  cellular  injury  such as  rupture of  the plasma membrane, and which may  lead  to an  inflammatory  response.  Apoptosis, on the other hand, is a controlled process that leads to characteristic changes  in biochemistry and morphology before death.  Morphological changes include condensation of the  chromatin and DNA  fragmentation,  reduction of  cell  volume,  cytoskeletal  rearrangement, plasma  membrane blebbing, and eventual  formation of  small vesicles known as apoptotic bodies.   These  • 15   apoptotic bodies are rapidly phagocytosed by macrophages so the dead cell is removed without any  inflammatory response81.    One early biochemical change in apoptosis is the loss of plasma membrane lipid asymmetry.   This  results  in  the  exposure of  phosphatidylserine  in  the outer  leaflet of  the plasma membrane,  which under normal conditions is present almost exclusively in the inner leaflet84.  The appearance  of phosphatidylserine in the extracellular leaflet can be used to identify cells in early apoptosis using  fluorescently‐labeled conjugates of Annexin‐V, a protein that interacts strongly and specifically with  phosphatidylserine.  Using appropriate protocols, labeled Annexin‐V conjugates can be employed in  applications such as flow cytometry and fluorescence microscopy85.    Apoptosis signaling most often results from activation of the caspases, a family of cysteine  proteases that also plays a role in inflammation.  To date, 12 human caspases have been discovered,  and each is activated by cleavage of its procaspase precursor.  Cleavage is often performed by other  activated caspases, resulting in different proteolytic cascades82, 86, 87.  When a cell receives a stimulus  to die,  caspase  signaling begins with  the  cleavage of one or more  specific  initiator  caspases;  this  early  event  corresponds  to  the  loss  of  plasma  membrane  asymmetry  and  appearance  of  phosphatidylserine  in  the  outer  leaflet  of  the  plasma  membrane84,  85.    Specific  molecular  mechanisms related to the direct induction of apoptosis by Rtx and Rtx‐LNP are discussed in greater  detail in Sections 5.2 and 6.2.    1.6  Multivalent Abs as improved therapies   1.6.1  Characteristics of multivalent Ab constructs and a definition of valence  As mentioned in Section 1.4.3, Rtx induces low levels of apoptosis in target cells unless it is  crosslinked with a 2oAb7, 74‐76.   The  importance of  this mechanism  in vivo was provided by studies  showing  that cross‐linked Rtx  induced apoptosis  in a dose‐ and  time‐dependent manner  in  freshly  • 16   isolated clinical samples of B‐CLL cells, in the absence of ADCC and CDC76.  To make use of this effect  in vivo  is a challenge because clearly, administration of a 2oAb  is not feasible.     A different method  that has been shown  to  result  in  induction of apoptosis  is  the use of multivalent Rtx constructs75,        88‐90.  The  valence  of  a multivalent  ligand  is  defined  as  the  number  of  target‐binding  sites  it  contains.  For example, normal therapeutic Abs are bivalent molecules because they are IgGs (Table  1.2), which contain  two  identical sites where  they bind  to  their  target.   Multivalent Ab constructs  possess valences of three or higher, and consist of two or more Ab molecules and/or Fab fragments  bound together in a stable configuration.  In general, the valence of a multivalent Ab prepared using  whole  IgG will be equal  to  twice  the number of  IgG molecules per construct;  for example, an  IgG  dimer produced by chemically crosslinking two IgG molecules has a valence of four.  Rtx, as well as a  variety of other Abs, have been shown  in some cases to be more efficacious as multivalent rather  than bivalent constructs (see Section 1.6.3).    Multivalent Abs of  low valence  (<10) can be Ab or Ab‐like molecules produced by protein  engineering and/or recombination techniques89, 91, or can involve coupling Ab or fragments together  using crosslinking chemistry with or without molecular scaffolds92.  Higher valences can achieved by  coupling  Abs  to  nanostructures  consisting  of  different  types  of  polymers93,  dendrimers94,  95,  rotaxanes92, or gold nanoparticles96.  Regardless of the type of construct, multivalent Abs are able to  crosslink their target in the plasma membrane without the need for a crosslinking 2oAb.  When the  crosslinking  involves  more  than  two  proteins  being  bridged,  creating  an  extensive  network  of  crosslinked  target  due  to  the  numerous  binding  sites  on  the  multivalent  Ab,  the  term  “hypercrosslinking” is employed.    The  increased  efficacy  of many multivalent  Abs  is  related  to  the  fact  that  they  exhibit  different properties  compared  to  their bivalent  counterparts.   Conversion of Abs  into multivalent  formats  has  been  shown  to  result  in  increased  functional  affinity  toward  the  cell‐surface  target,  • 17   decreased  dissociation  rates,  enhanced  biodistribution,  and  longer  in  vivo  half‐life97,  98.    These  characteristics provide  the basis  for mechanisms  of  enhancements  (or  inhibitions) of  therapeutic  activity that are fundamentally different in the multivalent case compared to the bivalent one99.    1.6.2  Examples of multivalent interactions in biology and their physical basis  Multivalent interactions are found throughout biology and are necessary for processes such  as adhesion of viruses or bacteria to the surface of cells, binding of transcription factors to multiple  sites on DNA, and Abs interacting with macrophages and other immune effector cells through their  Fc  regions99.    In  nature,  examples  of  biological molecules with  clustered  and  repeated  epitopes  include  biopolymers  such  as  polysaccharides,  proteoglycans,  filamentous  proteins,  and  DNA100.  Besides  Abs,  other  types  of  multivalent  ligands  include  carbohydrates,  peptides,  and  small  molecules, all of which demonstrate enhanced binding affinity to targeted tissue15.  A multivalent  interaction  consists,  in  theory, of  a  complex  created by  an  initial univalent  interaction  where  the  local  concentrations  of  the  remaining  free  binding  sites  on  both  species  become greatly enhanced due to their close proximity15.  Due to this increase in effective ligand and  target  concentrations,  there  is  a  significantly  higher  probability  that  subsequent  ligand‐target  interactions will result after the first univalent interaction.  This increased probability translates into  a higher avidity of the multivalent ligand.  Avidity refers to the association constant of a polyvalent  interaction,  as  opposed  to  affinity,  which  refers  to  the  association  constant  of  a  univalent  interaction; avidity is usually greater than the sum of constituent affinities for a multivalent ligand99,  100.  Kinetic  studies  have  shown  that  enhanced  avidity  results  from  decreases  in  the  rate  of  dissociation of the multivalent ligand from its target, rather than increases in the rate of association;  a greater number of univalent interactions must be broken99.  While some are being broken, others  continue to  form, resulting  in recapture of the  ligand before the  ligand‐target complex dissociates  • 18   completely100.  From a molecular point of view, the avidity of a multivalent interaction results from  the  length  and  flexibility  of  the  linker(s),  the  strength  of  the  noncovalent  forces  involved,  the  number of binding elements, and the conformational freedom of the multivalent construct101.   On  top of an enormous diversity of constructs in terms of the materials employed, significant work has  also been described on the configuration, architecture, and spacing of the target‐binding sites102, 103.    The  effects  of  multivalency  can  result  in  many  biological  consequences;  for  example,  multivalent  ligands can be strong  inhibitors, particularly  if they bind to a receptor whose agonistic  ligand is monovalent; there is significant therapeutic interest in creating such multivalent ligands104.   Multivalent interactions can also serve to induce specific geometric shapes in the plasma membrane  such as clathrin‐coated pits99.   They may also play a role  in the grading of biological responses; for  example, macrophages cannot ingest a pathogen based on recognizing a single Ab Fc region with its  FcγRs,  but  more  Fc‐FcγR  associations  strengthen  the  interaction  between  pathogen  and  macrophage, increasing the likelihood that the pathogen will be cleared99.    Interactions between Fc  regions on antibody‐coated cells with FcγRs  in general constitute  multivalent interactions; FcγR crosslinking, a multivalent interaction, is required for the initiation of  ADCC  by  NK  cells  and  other  types  of  effector  cells  (Section  1.4.2).   Moreover,  initiation  of  the  classical  complement  cascade  requires  a multivalent  interaction;  C1q  is  a  hexavalent  ligand  and  requires binding to many Fc regions of Ab molecules on the surface of a pathogen or cancer cell in  order  for  CDC  to  result105, 106  (Section  1.4.1).    In  cell  signaling  processes,  there  are  innumerable  examples of multivalent ligands that cause receptor activation due to oligomerization.  Clustering of  the  receptor  results  in  signal amplification because many  receptors become activated by a  single  ligand, which creates high local concentrations of activated receptor and which also causes exclusion  of negative modulators107, 108.   For example, tumor necrosis factor α  (TNF‐α), the  ligand to CD120a  (Tumor  necrosis  factor  receptor  1  (TNFR1)),  is  a  trivalent  ligand  that  is  capable  of  binding  and  crosslinking  three CD120a molecules;  receptor  clustering  is  required  for  the activation of CD120a  • 19   and the subsequent initiation of diverse signaling processes ranging from proliferation to apoptosis  (see Section 6.2.1).    Taken together, these descriptions highlight that multivalent  interactions are ubiquitous  in  nature.  They also illustrate that even though a univalent and multivalent ligand may share the same  target‐binding site, they exhibit distinct physiochemical and biochemical properties that can result in  remarkably different biological responses.  1.6.3  Descriptions of multivalent Abs that exhibit superior efficacies  Although  all  therapeutic Abs differ  in  terms of  their direct mechanism of  action  (Section  1.4.3),  the  multimerization  of  many  bivalent  therapeutic  Abs  that  are  approved  or  under  development  has  been  shown  to  enhance  their  associated  biological  responses7, 74, 89, 109‐113.    For  example, using two different breast cancer cell  lines, one that responds to Trz and one that  is Trz‐ resistant,  it  was  shown  that  creating  multivalent  Trz  by  coupling  it  to  magnetic  microspheres  resulted in therapeutic effects in both cell lines including the Trz‐resistant one110.  Another example  illustrated that multivalent Trz constructs with valences up to four showed significantly higher levels  of growth  inhibition compared to Trz, and similarly constructed multivalent therapeutic anti‐death  receptor 5 (DR5) Abs showed equivalent levels of apoptosis to bivalent Ab at doses that were ~100‐ fold lower89.  Consistent with  the  requirement of crosslinking of Rtx  in order  to  induce apoptosis, many  many multivalent anti‐CD20 designs have been described,  including  tetravalent Rtx dimers88, Rtx‐ dextran polymers  (valence ~10) and nanoparticles  (NPs) prepared by coupling Rtx to Dynabeads75,  trivalent and tetravalent Rtx constructs obtained through protein engineering89, Rtx coupled to gold  nanoparticles96, anti‐CD20 multivalent branched copolymer‐Fab conjugates15, and hexavalent anti‐ CD20 created using  the Dock‐and‐Lock method90.    In general,  the multivalent constructs exhibited  • 20   superior binding to target cells along with elevated responses  in vitro and  in vivo; these responses  are described in greater detail in Section 4.2.  One  type of multivalent Ab not  listed  above  is Ab‐LNPs.    In  fact, before  the experiments  described in Section 1.2.2 (ref. 7) were carried out, the use of a liposome as a nanoscale scaffold for  creating a multivalent therapeutic Ab had not been considered.  This may be surprising in light of the  interest  surrounding  immunoliposomes,  but  the  focus  of  such  work  had  always  been  to  target  encapsulated  chemotherapy;  the Abs employed  therefore possessed  targeting properties and not  necessarily  therapeutic activity  (Section 1.2).   Since  the work  in  this dissertation began, only one  report describing a  similar application of  liposomes has been published; Oliveira et al. describe a  situation where anti‐EGFR nanobodies coupled to empty liposomes resulted in enhanced anticancer  activity through downregulation of EGFR114.  The work presented herein shows that Ab‐LNPs provide  a  convenient,  useful,  and  promising  means  for  the  preclinical  discovery  and  development  of  liposomal and non‐liposomal therapeutic Abs.    1.7  Multivalent Ab­LNPs and the content of this dissertation    The work  in  this dissertation makes use of  the  therapeutic Ab Rtx  in order  to prove  the  concept that Ab‐LNPs are multivalent therapeutic Ab constructs with enhanced activity compared to  bivalent Ab.  It also sets the groundwork for developing improved multivalent drugs based on other  therapeutic Abs.   Section 1.2.2  illustrated that the direct mechanism of action of Rtx  (induction of  apoptosis) is enhanced when cells are treated with equal doses of Rtx‐LNP instead of Rtx.  Chapter 2  serves to examine how the coupling of Ab to Ab‐LNP affects the indirect mechanisms of action (CDC  and ADCC), since the improved direct mechanism should not occur at the cost of decreased indirect  mechanisms.    This  chapter  also  examines  the  in  vivo  efficacy  and  pharmacokinetics  of  Rtx‐LNP.   Next,  to  study  the  direct  mechanism  of  action  of  Rtx‐LNP,  it  was  necessary  to  prepare  many  different valences of Rtx‐LNP, but the available methods for coupling Abs to liposomes were found  • 21   to  be  unsuitable.    Chapter  3  describes  a  superior methodology  that was  developed  for  creating  numerous  Ab‐LNP  constructs  of  different  valence  from  the  same  Ab.    This methodology  shows  significant improvements in terms of yield of coupled Ab, time required to produce many valences,  and reproducibility.      Chapter 4 makes use of the new methodology to prepare many different Rtx‐LNP valences in  order  to  examine  their  novel  physiochemical  and  biological  properties.    These  include  binding  characteristics as well as  improvements  in their therapeutic activity  in CD20+  lymphoma cells.   This  chapter establishes a  relationship between  the valence of a multivalent Rtx‐LNP construct and  its  ability  to  induce apoptosis.   The work  in Chapter 5 employs  the different  valences of Rtx‐LNP  to  uncover  a  novel  molecular  mechanism  of  action  of  Rtx‐LNP  that  explains  its  ability  to  induce  apoptosis.    This  is  extended  into  Chapter  6,  where  it  is  shown  that  conditions  involving  the  interaction of  immune effector cells with  lymphoma cells coated with bivalent Rtx give rise to the  same mechanism,  suggesting  that  it  is  also  a mechanism  of  action  of  bivalent  Rtx  under  in  vivo  conditions.  This provides compelling evidence of a defined direct mechanism of action of Rtx, which  so far has not been described.    Overall,  this  proof‐of‐concept  serves  to  illustrate  that  the methodology  described  in  this  dissertation  would  be  invaluable  in  the  development  of  multivalent  therapeutic  Abs.    Because  multivalent Abs show enhanced efficacies over bivalent ones,  it  is possible  that some “discarded”  Abs under development (due to  low activity as bivalent molecules) may actually show significantly  improved activity as multivalent Abs.  This methodology can therefore be employed in the context of  drug discovery to progress promising multivalent therapeutic Ab formulations to an advanced stage  of preclinical development.         • 22   2  Indirect  mechanisms  and  in  vivo  activity  of  multivalent  rituximab­lipid nanoparticles‡  2.1  Synopsis    Although creating multivalent Ab‐LNPs has been shown to enhance the direct mechanism of  action  (Section 1.2.2),  the effects on  the  indirect mechanisms of action are unclear.   The  indirect  mechanisms of therapeutic Abs consist of complement‐dependent cytotoxicity (CDC; Section 1.4.1)  and  antibody‐dependent  cell‐mediated  cytotoxicity  (ADCC;  Section 1.4.2).   This  chapter examines  how the  indirect mechanisms of Rtx are affected by creating Rtx‐LNPs, and  it also examines the  in  vivo efficacy and pharmacokinetics of Rtx‐LNP. 2.2  Background 2.2.1  Complement­dependent cytotoxicity of Rtx  Rtx activates the classical complement pathway by binding C1q115,  leading to generation of  the membrane attack complex and ensuing tumor cell lysis116.  Rtx has been shown to induce CDC in  many different  lymphoma cell  lines  in vitro115, 117 and Rtx has been shown to be effective only  in a  mouse model expressing a  full complement system, while  its activity was ablated  in C1q‐deficient  mice118.    Infusion of Rtx  in CLL patients has also been shown  to deplete complement, and pre‐Rtx  complement  levels  do  not  return  until  several  weeks  after  completion  of  therapy119.    The  complement cascade leading to CDC is regulated by proteins on the lymphoma cell surface such as  CD55 and CD59.   Blocking CD55 and/or CD59 has been shown to  increase  levels of CDC  in NHL cell                                                               ‡ A  version  of  Chapter  2  has  been  published16.    Adapted  and  reprinted  by  permission  from  Future  Medicine Ltd.  • 23   lines  and  primary  cells  treated  with  Rtx,  indicating  that  these  two  proteins  function  in  the  mechanism of action of Rtx as important regulators of CDC46, 120.  2.2.2  Ab­dependent cell­mediated cytotoxicity of Rtx  ADCC  is also an established contributor to the mechanism of action of Rtx and therapeutic  Abs  in  general.   On Ab‐coated  tumor  cells,  it occurs upon  binding of  the  Fc  region of  the Ab  to  activating Fc receptors  (FcR) such as FcRIIIa which are present on effector cells such as natural  killer  (NK)  cells,  granulocytes,  and macrophages.    Rtx  has  been  shown  to  induce  ADCC  in many  human lymphoma cell lines117 and ADCC was abolished in nude mice deficient in activating FcR yet  present in the wild‐type mice121, establishing a central role of ADCC in the therapeutic activity of Rtx.    The  importance  of  Rtx‐induced  ADCC  in  humans was  illustrated  in  studies  on  a  FcRIIIa  dimorphism  that  influences  the  binding  affinity  of  the  receptor  to  Rtx, where  enhanced  binding  corresponds  to  elevated  ADCC.    Patients  homozygous  for  the  high‐affinity  dimorphism  showed  enhanced clinical and molecular responses compared to the other patients122, 123.  In terms of ADCC‐ regulating molecules on the tumor cells themselves, expression levels of ligands to NKG2D, a NK cell  receptor,  influence  the  susceptibility of  the  tumor  cell  to Rtx‐induced ADCC124.   Other molecules  present on B cells which trigger NK cell activation include CD40125, CD80, and CD86126, but in general,  the molecular determinants of whether a tumor cell will elicit ADCC upon Rtx binding are not well  understood.  Moreover, the relative contributions of CDC and ADCC that occur after Rtx treatment,  as well as  the  relative contribution of  the direct mechanism  (Section 1.4.3), are unclear and have  been shown to depend on the origin of the target cell44, 49, 50.      • 24   2.2.3  Does  the creation of Rtx­LNPs affect  the  indirect mechanisms and  in vivo  properties of Rtx?  We examined how the known indirect mechanisms of action of Rtx are affected by creating  Rtx‐LNPs.   We  have  previously  shown  that  cells  treated with  Rtx‐LNP  exhibit  increased  levels  of  apoptosis compared  to  those  treated with equal doses of  free Rtx  (Section 1.2.2)7.   These studies  established  that Rtx‐LNP exhibits an  improved direct mechanism of action  compared  to Rtx.   The  objective of the current study was to establish whether levels of ADCC and CDC are preserved, since  under  in  vivo  conditions,  the  favorable  direct  effects  of  Rtx‐LNP  should  not  occur  at  the  cost  of  decreased indirect contributions to the efficacy.      To examine differences between Rtx and Rtx‐LNPs in terms of their indirect mechanisms of  action, we employed two mantle cell lymphoma cell lines, Z138 and JVM2, which exhibited different  in vivo sensitivities to Rtx along with variable expression levels of cell‐surface proteins that regulate  ADCC  and  CDC.    Rtx‐LNPs  were  prepared  which  showed  enhanced  binding  and  which  induced  apoptosis in both cell lines.  We demonstrate that multivalent Rtx‐LNPs exhibited increased levels of  CDC and ADCC compared to Rtx, alongside an increase in NK cell activation levels.  Finally, in order to  understand the manifestations of these mechanisms of action in vivo, we examined the efficacy and  pharmacokinetics of Rtx and Rtx‐LNP.  2.3   Materials and methods  2.3.1  Reagents and cell lines  The  following  lipids  were  obtained  from  Avanti  Polar  Lipids  (Alabaster  AL,  USA):  1,2‐ distearoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphocholine  (DSPC),  1,2‐distearoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphoethanolamine‐ N‐[methoxy(polyethylene  glycol)‐2000]  (DSPE‐PEG),  and  1,2‐distearoyl‐sn‐glycero‐3‐ phosphoethanolamine‐N‐[maleimide(polyethylene  glycol)‐2000]  (DSPE‐PEG‐Mal).    [3H]cholesteryl  • 25   hexadecyl  ether  ([3H]CHE)  was  from  Perkin‐Elmer  Life  Sciences  (Woodbridge  ON,  Canada).   Cholesterol (Chol) was purchased from Sigma‐Aldrich (St. Louis MO, USA).   Pico‐Fluor 15 and Pico‐ Fluor 40 scintillation cocktails were bought from PerkinElmer BioSignal (Montreal QC, Canada).   N‐ Succinimidyl  3‐(2‐pyridyldithio)propionate  (SPDP)  and  dithiothreitol  (DTT)  were  obtained  from  Pierce/Thermo  Fisher  Scientific  (Rockford  IL,  USA).    Rituximab  (Rtx)  and  trastuzumab  (Trz) were  obtained  from  the BC Cancer Agency pharmacy  (Vancouver BC, Canada).   Matrigel was purchased  from  Collaborative  Biomedical  Products  Inc.  (Chicago  IL,  USA).    Carboxyfluorescein  diacetate  succinimidyl ester (CFSE) was obtained from Molecular Probes (Eugene OR, USA).  Anti‐human CD3‐ FITC,  CD56‐PE,  CD54‐APC,  and  FcγRIII/II  (CD16/32)  Abs  were  obtained  from  BD  Biosciences  (Mississauga ON, Canada).  Anti‐Rtx‐FITC Ab was purchased from Serotec (Oxford, UK).  Rabbit anti‐ human IgG Fc fragment was purchased from MP Biomedicals (Irvine CA, USA).  Lympholyte‐Mammal  was obtained from Cedarlane (Burlington ON, Canada).  Unless otherwise noted, all other reagents  were from Sigma‐Aldrich (St. Louis MO, USA).    Mantle cell lymphoma (MCL) cell lines Z138 and JVM2 were generously provided by Dr. Zeev  Estrov  (University of Texas) and previously  characterized127.   Cells were maintained  in RPMI 1640  medium  (Stem  Cell  Technologies)  supplemented  with  2  mM  L‐glutamine,  10%  FBS,  and  1%  penicillin/streptomycin.   All cells were maintained at 37  °C  in a humidified atmosphere containing  5% CO2.   For  in  vivo  imaging  studies,  Z138  cells  were  transfected  to  express  luciferase  (Luc).  Constructs for the lentivirus (LV) vector containing the Luc genes were obtained from Dr. Alice Mui  (Jack Bell Research Centre, Vancouver General Hospital, Vancouver BC, Canada) who also assisted in  the transfection of the cell line.  Briefly, the Luc coding sequence was isolated from the pGL‐3 vector  (Promega, Madison, WI, USA) and cloned  into the  lentiviral vector FG9 behind the CMV – LTR and  UBiC promoters.  To generate Luc‐expressing lentivirus (LV‐Luc), this vector was cotransfected using  calcium  phosphate with  packaging  constructs  pRSVREV,  pMDLg/pRRE,  and  the  VSV‐G  expression  • 26   plasmid  pHCMVG  into HEK‐293T  cells.    Five million  293T HEK  cells were  plated  on  poly‐L‐lysine‐ coated  tissue  culture plates  allowed  to  adhere  for  24  hours.    The  following  day,  10  µg of  the  transducing vector, 7.5 µg of the packaging vector, and 2.5 µg of the VSV envelope pMD.G were co‐ transfected  by  LipofectAMINE  2000  (Invitrogen,  Burlington  ON,  Canada),  according  to  the  manufacturer's  instructions.  After 24 h, fresh medium was applied to cells, and cells were cultured  for  another  24  h.    Conditioned medium was  then  collected  and cleared  of  debris  by  low  speed  centrifugation, filtered, and stored at ‐70 °C.  Supernatant was collected daily for 4 days, pooled and  ultracentrifuged.  The pellet was re‐suspended in 500 µL of medium, and aliquots were stored at ‐70  °C.  The Z138 cells were then infected with LV‐Luc (25 µL viral supernatant/mL medium).  Briefly, one  million cells were add to each well of a 12‐well plate in 500 µL of complete medium and these were  then cultured for 24 h.  Subsequently, LV‐vector or LV‐Luc constructs were added to the medium in  the presence of Polybrene (8 µg/mL medium).  After approximately 5 h of incubation, the cells were  washed with phosphate‐buffered  saline  (PBS, pH 7.4),  fresh  culture medium was added and  cells  were incubated for up to 6 days. To enrich for Luc‐positive cells, cells were sorted by FACS for GFP  expression (cells were cotransfected with LV‐GFP constructs). GFP‐positive cells were considered to  be positive for Luc and this was confirmed by culturing the sorted cells in low concentrations in the  wells of a 96‐well plate.   Luciferin was added to each well and plates were  imaged using  IVIS  (see  below)  to  confirm  Luc expression.   These Z138‐Luc  cells were expanded and used  for  the  in  vivo  studies described below.    2.3.2  Preparation of multivalent Ab­LNPs  Small  unilamellar  vesicles  composed  of  DSPC/Chol/DSPE‐PEG/DSPE‐PEG‐Mal  (mole  ratio  48:45:5:2) were prepared by the extrusion procedure128, 129.  A total of 200 µmol lipid were dissolved  in CHCl3  and  an  aliquot of  [3H]CHE  (0.009 µCi/µmol  liposomal  lipid) was  added.   A  lipid  film was  formed by drying  the solution  first with a stream of N2  then under vacuum  for 3 h.   The  film was  • 27   hydrated in 2.0 mL HEPES‐buffered saline (HBS) at 65 oC for 1 h with stirring, then was subjected to  five freeze‐thaw cycles each consisting of five‐minute treatments in liquid N2 and a 65 oC water bath,  respectively.    The  suspension was  then  extruded  ten  times  through  two  stacked  polycarbonate  filters (100 nm and 80 nm pore size) using a Lipex extruder (Northern Lipids, Burnaby BC, Canada).   The resulting mean vesicle diameter was 95–110 nm as determined by quasielastic  light scattering  (QLS)  using  a Nicomp  submicron  particle  sizer  (model  370/270).    Liposomal  lipid  concentrations  were measured by liquid scintillation counting with a Packard scintillation counter (model 1900 TR)  using aliquots mixed with 5.0 mL Pico‐Fluor 15 scintillation fluid.    Rtx was coupled to  liposomes according to an established procedure130.   Briefly, 80 µL of a  12.5 mM solution of SPDP in ethanol were diluted with 920 µL HBS (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH  7.4)  to give a  final concentration of 1.0 nmol/µL.   The Ab  (8 – 9 mg) was  reacted with a  five‐fold  molar  excess  of  SPDP  for  25 min  at  room  temperature,  and was  subsequently  eluted  by  gravity  through a Sephadex G‐50 column equilibrated with sodium acetate buffer (100 mM sodium acetate,  150 mM NaCl, pH 4.5).  Fractions containing the Ab were determined by diluting aliquots 50‐fold in  HBS and by measuring the absorbance at 280 nm.  Ab‐containing fractions were pooled and added  to  solid DTT  to  give  a  final  concentration  of  25 mM DTT.    This  solution was  incubated  at  room  temperature  for 25 min with  stirring.   The  thiolated Ab was  then  isolated using a Sephadex G‐50  column  equilibrated with HBS,  and was  immediately  added  to  liposomes  (10 mM  final  liposomal  lipid concentration).   The mixture was incubated at room temperature for 18 h with gentle mixing.   At the end of the reaction, the mixture was eluted through a Sepharose CL‐4B column equilibrated  with HBS to separate the unreacted Ab from the Ab‐LNPs.   The diameter of the Ab‐LNPs was ~130  nm, as determined using QLS.  The amount of Ab conjugated to liposomes was determined using the  Pierce Micro bicinchoninic acid (BCA) protein assay kit.  This quantitation was carried out according  to the manufacturer’s  instructions with 0.5% Triton X‐100 added to the reagent solution and using  • 28   Ab solutions of known concentration as standards.  The number of Ab molecules per liposome was  calculated as described previously7 and was found to be between 38 and 47.    2.3.3  Measurement of cell­surface protein expression levels  A total of 1 × 106 Z138 or  JVM2 MCL cells  in    the exponential growth phase were washed  with cold PBS containing 1% FBS, then incubated at 4 oC  for 10 min with anti‐FcγRIII/II Ab followed  by 20 min with saturating amounts of FITC‐labeled anti‐human CD20, CD40, CD80, CD86, CD95 (Fas  receptor), CD54, CD55 or CD59 Abs.  Samples were then washed and analyzed on a FACSCalibur flow  cytometer  (Becton Dickinson,  San  Jose, CA)  collecting  10,000  events  for  each  sample.   Data was  analyzed  using  BD  CellQuest  software.    In  this  and  all  subsequent  experiments,  data  values  are  reported  as mean  ±  standard  deviation  (SD)  unless  indicated  otherwise.    In  all  cases,  two‐tailed  unpaired Student’s t‐tests were applied with a level of significance of 0.05.    2.3.4  In vivo xenograft models to assess Rtx efficacy  All in vivo studies were completed using protocols approved by the Animal Care Committee  at  the University of British Columbia,  and were  in  accordance with  the  current  guidelines of  the  Canadian Council of Animal Care.  To assess response to Rtx treatment, 5 × 106 Z138 or JVM2 cells in  the exponential growth phase were mixed with Matrigel to a final volume of 100 µL, then  injected  subcutaneously (SC) into the flank of male Rag‐2M mice.  Treatments with Rtx or control (PBS) were  initiated  when  tumors  were  palpable  (0.5  ×  0.5  ×  0.5  mm),  typically  25  to  28  days  after  cell  inoculation.   Groups of 6 mice were treated with Rtx (2.5 or 10 mg/kg) given  intraperitoneally (IP)  every 3 days  for a  total of 6  treatments  (Q3D × 6).   Tumor  size was measured using a calibrated  caliper every 2–3 days.    • 29   2.3.5  Quantification of Ab­LNPs bound to cells  Z138 or JVM2 cells (1 × 106) were  incubated for 4 h at 4 °C with Rtx, Rtx‐LNP or Trz‐LNP at  different doses as  indicated.   All treatments were done  in triplicate.   At the end of the  incubation  time, cells were washed with cold PBS containing 1% FBS and labeled with anti‐Rtx‐FITC for 30 min  at  4  °C,  then  analyzed  on  a  FACSCalibur  flow  cytometer  as  described  above  (10,000  events  per  sample).   A parallel study was performed to measure Ab‐LNP binding to cells through quantification of  [3H]CHE present in liposomes bound to cells.  After the incubation, cells were centrifuged at 300g for  5 min at 4 C, then washed three times with 1 mL of PBS to eliminate unbound Ab‐LNP.   Washed  cells were resuspended and solubilized with 1 mL of 0.9% Triton‐X 100 in PBS, and concentrations of  [3H]CHE were measured by liquid scintillation counting using Pico‐Fluor 40 scintillation cocktail and a  Canberra‐Packard Scintillation β counter (1900 TR Tri Carb).  2.3.6  Annexin­V/PI flow cytometry­based apoptosis assay  Cells were seeded  in 96‐well plates  (20,000 cells/well) and  treatments were added on  the  same day  the cells were  seeded.   Control  treatments consisted of HBS and uncoupled  liposomes,  negative controls employed Trz  instead of Rtx, and positive controls  included campothecin‐treated  samples.   For analysis 72 h  later, samples were transferred to 1.5 mL Eppendorf tubes and spun at  7000 rpm for 15 s.   Supernatants were removed and pellets were washed with 500 µL cold Hanks’  balanced  salt  solution.    Samples  were  spun  again  at  7000  rpm  /  15  s  and  supernatants  were  removed.    Positive  control  samples  were  unstained,  stained  with  Annexin‐V‐FITC,  stained  with  propidium  iodide  (PI),  or  double‐stained with  both;  all  other  samples were  double‐stained.    For  Annexin‐V‐FITC  staining, pellets were  resuspended  in a mixture of 5 µL Annexin‐V‐FITC and 40 µL  Annexin‐V binding buffer and incubated at room temperature for 20 min.  For PI staining, 500 µL of a  cold 0.5 µg/mL solution of PI  in Hanks’ were added to the samples.   Analysis was performed on a  • 30   Becton Dickinson FACSCalibur flow cytometer.  Compensation values were set with positive controls  and  quadrant  placement  in  a  plot  of  PI  fluorescence  intensity  (FL3)  versus  Annexin‐V‐FITC  fluorescence  intensity  (FL1)  in  each  case  was  decided  on  the  basis  of  data  obtained  with  the  negative  controls.   Early apoptotic  cells were defined as PI negative and Annexin‐V‐FITC positive,  necrotic cells were positive for both fluorophores, and viable cells were negative for both.  2.3.7  Assay for measuring levels of complement­dependent cytotoxicity  MCL target cells  (1 × 106 cells/mL) were  incubated with Rtx, Rtx‐LNP or controls  (including  HBS, uncoupled liposomes, and Trz‐NP) for 15 min at 37 °C, then a 25% volume of human serum (50  µL) was added and the sample was further incubated for 4 h.  Informed consent was obtained from  volunteers who provided the serum.  Cells were washed and stained with PI, then analyzed by flow  cytometry as described above.  Cell lysis due to CDC was expressed as a percentage according to the  following: %  cell  lysis = [1 − (fraction  of  viable  treated  cells  in  the  presence  of  human  serum)  /  (fraction of viable treated cells in the absence of human serum)] × 100%.  2.3.8  Assay for the quantification of Ab­dependent cell­mediated cytotoxicity  A fluorometric method described by Gomez‐Roman et al. was used131.  Briefly, 1 × 106 Z138  or JVM2 target cells were double‐stained with 2.5 µM PKH26 (a membrane dye) and 2.5 µM CFSE (a  viability dye).   Cells were  then  treated with  controls  (as described  in  the CDC assay above) or 10  µg/mL of Rtx  (either as  free Rtx or Rtx‐LNP)  for 30 min.   Next,  cells were  incubated with mouse  splenocytes (at 5:1, 50:1, and 100:1 ratios of effector to target cells) previously stimulated overnight  with  25  ng/mL of  interleukin‐12  (IL‐12).   After  a  24 h  incubation,  cells were washed  in  cold  PBS  containing 1% FBS and resuspended in the same buffer before analysis by flow cytometry, acquiring  10,000 nongated events.   Flow  cytometry data was acquired by  setting FL1 as  the CFSE emission  channel and FL2 as the PKH26 emission channel. Percent cell kill was obtained by back‐gating on the  • 31   PKH26bright population of targets and is reported as the percentage of membrane‐labeled target cells  having  lost the viability dye,  i.e. % CFSE– within PKH26bright.   Non‐stained and single‐stained targets  were included in every experiment to compensate for single‐stained CFSE and PKH26 emissions, and  double‐stained  targets  incubated with Ab without effectors were used  to define spontaneous cell  death  to  exposure  to  the media  and  Ab  alone.    The  percentage  of  cells  undergoing  ADCC was  quantified  as  follows: %  undergoing  ADCC = [1 − (fraction  of  viable  double‐stained  target  cells)  /  (fraction of double‐stained untreated control cells)] × 100%.   2.3.9  Quantification of activated natural killer cells  Fresh  peripheral  blood  mononuclear  cells  (PBMCs;  effector  cells)  were  obtained  from  volunteers who provided  informed consent.   PBMCs were treated with Lympholyte‐Mammal, then  incubated with Z138 target cells  in a 1:1 ratio, at a final concentration of 1 × 106 effector cells/mL  and 1 × 106 target cells/mL.  Cultures were treated with 10 µg/mL of Rtx either as: free Rtx, Rtx‐LNP,  a mixture of free Rtx and unconjugated liposomes, or Trz‐LNP (negative control).  Treated cells were  incubated  for  20  h  at  37  C  in  RPMI  1640  complete  medium  supplemented  with  50  µM‐ mercaptoethanol.  Several control samples containing effector cells only (without target cells) were  also included.  After incubation, cells were washed and labeled with anti‐human CD3‐FITC, CD56‐PE  and CD54‐APC Abs  for 30 min at 4  °C before analysis by  flow cytometry.   Natural killer  (NK) cells  were identified as the CD3–/CD56+ population, and the percentage of CD54bright cells was determined  within this population.  A total of 50,000 events were collected per sample.   2.3.10   In vivo xenograft models for Rtx­LNP efficacy studies  For  in  vivo  efficacy  studies,  female C.B‐17 mice with  severe  combined  immunodeficiency  (SCID) weighing 20‐25 g were  inoculated  intravenously (IV) with 5 × 106 Z138‐Luc cells (see Section  2.3.1).   On day 7 after cell  inoculation, the presence of tumors was assessed using the  IVIS optical  • 32   imaging  system  200  Series  (Xenogen)  prior  to  treatment.   At  10 min  before  imaging, mice were  injected  IP with 200 µl of 15 mg/mL  firefly D‐luciferin potassium salt, which emits photons  in  the  presence  of  oxygen,  adenosine  triphosphate,  and  Luc.    The  animals were  imaged  and  the  total  photon  counts  from  captured  images were  quantified  using  the  Living  Image  software  package  (version  2.50;  Xenogen).    A  photograph  was  first  obtained  in  the  imaging  chamber  under  dim  illumination,  then  a  luminescence  image was  acquired.    The overlay of  the pseudocolour  images  represents the spatial distribution of photon counts produced by active Luc, with red representing  the most  intense  (saturated)  luminescence and blue  representing  the  least  intense  luminescence.   Captured  images were then quantified using Living Image. Bioluminescent signals from the regions  of  interest  (ROI)  expressed  in  pseudocolour  are  presented  as  the  cumulative  photon  counts  collected within each ROI.  Uninfected animals were imaged to detect background signals.  Starting  on  day  7  after  Z138  cell  inoculation,  treatments  consisting  of  either  free  Rtx  or  Rtx‐LNP  were  administered Q3D × 6.  Tumor measurements with the IVIS optical imaging system were made twice  (early  in the study) or once per week.   Mice were monitored daily for extended time frames using  both qualitative and quantitative health status indicators.  When the health status of the animal was  considered poor based on a predefined  scale,  the animals were killed and  the  following day was  recorded as the time of death in order to generate Kaplan‐Meier survival curves.  2.3.11   In vivo studies on the pharmacokinetics of Rtx­LNP  For studies of liposome and Rtx clearance from the plasma, BALB/c mice (17‐19 g) and C.B‐ 17 SCID mice (19‐22 g) were injected IV with 5 mg/kg (in 200 µL) free Rtx or Rtx‐LNP.  At various time  points  post‐injection,  blood  was  collected  by  cardiac  puncture  and  placed  into  EDTA‐coated  microtainer tubes.  Plasma was isolated from blood samples by centrifugation at 1000g for 15 min.   Aliquots  of  the  plasma  were  used  to  determine  Rtx  levels  by  a  colorimetric  enzyme‐linked  immunosorbent assay (ELISA).  Briefly, a rabbit anti‐human IgG Fc fragment was used for coating and  • 33   capturing  Rtx.    A  horseradish  peroxidase‐conjugated  rabbit  anti‐human whole  IgG was  used  for  detection,  with  orthophenylenediamine  added  as  substrate.    To  determine  the  levels  of  Rtx  in  plasma,  absorbance  at  405  nm  was measured  and  compared  to  values  from  a  standard  curve  constructed  from  known  amounts  of  Rtx.    For  liposomal  lipid  concentrations,  aliquots  of  plasma  were counted in 5 mL of Pico‐Fluor 40 scintillation fluid.  2.4  Results  2.4.1  Characterization of Z138  and  JVM2  cell  lines:  surface protein  expression  levels and in vivo response to Rtx treatment  Two  human  MCL  cell  lines,  JVM2  and  Z138,  were  used  in  our  studies  on  the  indirect  mechanisms of action of Rtx and Rtx‐LNPs.  These cell lines were selected based on previous studies  that characterized several MCL cell lines in terms of their expression of the classic features of MCL,  namely  the  t(11;14)(q13;q32)  translocation and overexpression of cyclin D1127.   The Z138  line was  found to possess both traits of classic MCL, and while the JVM2 cells retained the translocation, they  expressed cyclin D2 and did not overexpress cyclin D1, therefore representing a variant form of the  disease132, 133.  Given  these phenotypic differences,  the  two  cell  lines were  further  characterized  in  terms of  select cell‐surface proteins  involved  in the direct and  indirect mechanisms of action of Rtx.   These  molecules consist of the target of Rtx, CD20, as well as a number of proteins known to regulate CDC  and ADCC.  Figure 2.1A shows that while CD20 expression is similar in both cell lines, the JVM2 line  expresses  significantly  higher  levels  of  tumor  necrosis  factor  receptor  (TNFR)  receptor  family  receptors  (CD95  and  CD40),  as  well  as  the  costimulatory molecules  CD80  and  CD86  which  are  necessary  for  T‐cell  activation  and  survival.    NK  cells  are  also  activated  by  CD40125,  CD80,  and  CD86126.  Levels of CD55 are elevated in Z138 cells, whereas CD59 expression is relatively the same in  • 34   both  lines;  these  proteins  have  been  shown  to  inhibit  Rtx‐induced  CDC46,  120.    The  intercellular  adhesion molecule CD54 also shows similar expression in both cell lines.  Overall, the differences in  phenotype observed suggest  that  levels of ADCC and CDC may vary between  the  two cell  lines  in  response to treatment with Rtx and Rtx‐LNP46, 49.        Figure 2.1  Phenotypic characterization of JVM2 and Z138 cell lines and in vivo response to Rtx treatment.  (A)  Cell‐surface  marker  expression  on  JVM2  and  Z138  cells,  assessed  by  flow  cytometry.    *p  <  0.05.    MFI:  mean  fluorescence intensity.  (B & C) To assess in vivo responses to treatment with Rtx, 5 × 106 JVM2 (B) or Z138 (C) cells were  injected SC  into Rag‐2M mice.   Once  the  tumors  reached ~200 mm3, mice were  treated  twice weekly  for 3 weeks with  either 2.5 mg/kg () or 10 mg/kg () Rtx. Control mice () were injected with PBS.  Treatments are indicated by arrows.   Data correspond to the average metastasis from 6 mice for each time point ± SD and are representative of two separate  experiments.  0 0.3 0.6 0.9 1.2 25 30 35 40 45 50 Tu m or vo lu m e /  m m 3 Days postinoculation JVM2B 0 0.3 0.6 0.9 1.2 10 20 30 40 50 Tu m or vo lu m e /  m m 3 Days postinoculation Z138C • 35     The responses to Rtx treatment of Rag‐2M mice inoculated subcutaneously (SC) with JVM2  and Z138 cells were also determined.   As shown  in Figure 2.1B, JVM2 tumors  in mice treated with  Rtx  exhibited  an  initial  growth  delay  (after  day  35  postinoculation),  but  eventually  the  tumors  progressed in a manner that was comparable to controls.  On day 45 after JVM2 cell inoculation, the  control animals possessed tumors that were approximately 600 mg in size.  The animals treated with  2.5 or 10 mg/kg Rtx exhibited  slightly  smaller  tumors, albeit  the differences were not  significant.   Figure 2.1C shows that mice bearing established Z138 tumors were sensitive to treatment with Rtx.   Control animals exhibited  tumors  that were approximately 500 mg  in  size 40 days after Z138 cell  inoculation, while the tumors in mice treated with Rtx (2.5 or 10 mg/kg) were 50% smaller then the  tumors measured  prior  to  initiation  of  treatment.    Based  on  these  data,  the  JVM2  tumors were  considered to be Rtx‐insensitive and the Z138 tumors were considered Rtx‐sensitive.  2.4.2  Rtx­LNPs bind specifically to JVM2 and Z138 cells and induce apoptosis  Multivalent  Rtx‐LNPs were  prepared  from  bivalent  Rtx  as  described  in  Section  2.3.2.    To  examine  the behavior of  these constructs when  tested against  the Z138 and  JVM2 cell  lines, cells  were  treated  with  Rtx  and  Rtx‐LNP  and  the  levels  of  bound  Rtx  were  determined  using  flow  cytometry.   The results, summarized  in Figure 2.2A & B,  indicate  that 4.9 and 3.2  times more Rtx  became bound to JVM2 and Z138 cells, respectively, when added as multivalent Rtx‐LNP compared  with free Rtx at a dose of 100 µg/mL.  Comparable increases in binding were also observed at lower  Rtx doses, and  these data agree with  the  general observation  that multivalent  constructs exhibit  increased functional affinity and decreased dissociation rates when bound to cell‐surface antigens97.   Surprisingly, even though both cell  lines had similar  levels of CD20 expression  (Figure 2.1A),  JVM2  cells had  the ability  to bind more Rtx and Rtx‐LNP.   At doses of 25 µg/mL and above,  the mean  fluorescence intensities for both Rtx and Rtx‐LNP in Figure 2.2A are between 1.8‐ and 2.5‐fold higher  than  those  of  Figure  2.2B  (p  <  0.05  for  all  equivalent  treatments).    Using  non‐exchangeable  • 36   [3H]cholesteryl hexadecyl ether ([3H]CHE)  incorporated in the liposomes as an alternative means to  assess cell binding, the amount of bound lipid following addition of Rtx‐LNP was approximately two‐ fold greater for JVM2 cells compared to Z138 cells (p < 0.05; data not shown).  JVM2‐derived tumors  were less sensitive to Rtx treatment although they bound more Ab than Z138 cells, again suggesting  that the JVM2 cells are more resistant to Rtx therapy.        Figure 2.2  Binding of Rtx‐LNPs to target cells and direct induction of apoptosis.    (A & B) Rtx binding to JVM2 (A) and Z138 (B) MCL cells when incubated with Rtx‐LNP (), free Rtx (), or Trz‐LNP (×), as  assessed  by  flow  cytometry.    Error  bars  are within  the  size  of  the  data  points.    Data  are  the means  of  experiments  performed  in  triplicate.    MFI:  mean  fluorescence  intensity.  (C  &  D)  Fraction  of  viable  cells  remaining  after  in  vitro  0 100 200 300 400 0 25 50 75 100 M FI [Rtx]  /  μg/mL JVM2A 0 100 200 300 400 0 25 50 75 100 M FI [Rtx]  /  μg/mL Z138B • 37   treatment of JVM2 (C) or Z138 (D) cells with Rtx or Rtx‐LNP at 37 oC for 72 h, as assessed by flow cytometry after Annexin‐ V‐FITC and PI staining.  Double‐negatively stained cells were considered viable.  The different treatments are indicated in  the legend.  Data correspond to means of triplicates, and are representative of three separate experiments.     The in vitro responses to treatment of JVM2 and Z138 cells with Rtx and Rtx‐LNP were also  assessed.  Previous work has demonstrated that Rtx, on its own, has little therapeutic effect in vitro  unless a crosslinking Ab  is added7, 74‐76.   Using  the AlamarBlue assay, we have previously observed  that  both  crosslinked  Rtx  and multivalent  Rtx‐LNP  decrease  Z138  cell  proliferation  in  vitro  to  an  equivalent  extent7.    In  this  study,  flow  cytometry  was  used  to  measure  the  fraction  of  viable  (nonapoptotic)  JVM2 and Z138 cells  remaining after  treatment with  free Rtx, crosslinked Rtx, and  Rtx‐LNP. The results, summarized  in Figure 2.2C & D, suggest that when using Annexin‐V and PI to  identify nonviable  cells,  free Rtx was  the  least  effective of  the  treatments  (dark  gray  bars), with  minimum cell viabilities of 80% in JVM2 cells (at 1.5 µg/mL) and 69% in Z138 cells (0.15 µg/mL). The  percentages of viable cells were measured relative to untreated control cell populations in all cases.   Compared to free Rtx, the multivalent Rtx‐LNP (white bars) engenders significant therapeutic effects  on both JVM2 and Z138 cells.   At a treatment dose of 15 µg/mL of Rtx‐LNP, 42% and 62% of JVM2  and Z138 cells,  respectively, were considered non‐viable  (Figure 2.2C & D).   These  results  suggest  that  Z138  cells  are more  sensitive  to  Rtx‐LNP  than  JVM2  cells  in  vitro.    The  effects  on  the  cell  populations after Rtx treatment were equal in the absence or presence of bare uncoupled liposomes  (hatched  bars),  indicating  that  the  enhanced  effects  observed  for  Rtx‐LNP  result  from  Rtx  being  bound to the LNPs.   As an additional control, LNPs formulated with Trz (an anti‐ErbB2 therapeutic  monoclonal  Ab)  instead  of  Rtx  showed  minimal  activity  (light  gray  bars),  indicating  that  the  therapeutic effects are specific to Rtx.  The effects of Rtx‐LNPs were comparable (p > 0.05) to 2oAb‐ crosslinked Rtx (black bars) when the dose of Rtx used was 15 µg/mL.      • 38   2.4.3  Multivalent  Rtx­LNPs  elicit  superior  complement­dependent  cytotoxicity  and Ab­dependent cell­mediated cytotoxicity compared with Rtx  Taken together, the data summarized above  indicate that the multivalent Rtx‐LNPs exhibit  enhanced activity in vitro when compared to the effects achieved with equal doses of free Rtx, and  these data are consistent with previous results7.  The therapeutic activity of Rtx‐LNP shown in Figure  2.2 occurred as a result of direct effects on the cells, yet it is understood that the in vivo activity of  Rtx is largely dependent on indirect mechanisms of action involving CDC and ADCC115‐119, 121, 123.  Thus  it was  important  to  assess how  the CDC  and ADCC  responses  are  affected when  tumor  cells  are  treated with Rtx‐LNPs.  To measure levels of CDC, JVM2 and Z138 cells were given equivalent doses of Rtx and Rtx‐ LNP, then human serum was added and cell lysis was measured 4 h later using flow cytometry (see  Section 2.3.7).  These data have been summarized in Figure 2.3A & B.  Rtx‐LNP treatment resulted in  more significant cell  lysis  than Rtx  treatment  in both cell  lines,  indicating  that Rtx‐LNP  is better at  inducing CDC than free Rtx.  When comparing results obtained in the two cell lines, CDC activity was  higher in JVM2 cells, where treatment with a 1 µg/mL dose of Rtx‐LNP induced a 3.4‐fold increase in  CDC activity  (relative  to control), compared with a 2.0‐fold  increase  in Z138 cells.   This effect was  even more pronounced when the dose  increased to 10 µg/mL, where the values  increased to 5.3‐ fold (JVM2) and 3.9‐fold (Z138).   The  level of CDC observed following treatment with free Rtx was  comparable  to  controls, which  included  Trz‐LNP  as well  as  a mixture  of  free  Rtx  and  uncoupled  liposomes  (Rtx  +  lip)  (Figure  2.3A &  B).    The  level  of  cell  lysis  obtained  for  Rtx  plus  crosslinking  secondary Ab (2oAb) was identical to that obtained with Rtx alone (data not shown).   These results  suggest that indirect CDC‐based mechanisms of activity would be enhanced in vivo when using Rtx‐ LNP, even when compared to situations where Rtx crosslinking is achieved by an anti‐Rtx 2oAb.      • 39     Figure 2.3   In vitro  levels of Rtx‐mediated CDC and ADCC are augmented when Rtx  is presented to cells as multivalent  Rtx‐LNP.    (A & B)  For measuring  levels of CDC,  JVM2 or  Z138  cells were untreated  (U) or  treated with  Trz‐LNP, Rtx, Rtx  + bare  liposomes (Rtx + lip), or Rtx‐LNP.  All treatments consisted of 10 µg Ab except for Rtx‐LNP(lo), which consisted of 1 µg.  (C &  D) For ADCC experiments, JVM2 or Z138 target cells were  incubated for 30 min with 10 µg of Ab  in the form of free Rtx  (), Rtx + bare liposomes (ᇞ), Rtx + crosslinking 2oAb (), Trz‐LNP (◇), or Rtx‐LNP ().  Stimulated effector cells (mouse  splenocytes) were then added in excess of target cells at effector‐to‐target cell ratios of 5:1, 50:1, and 100:1. After a 24 h  incubation,  ADCC  was  measured  as  described  in  Section  2.3.8.    Data  represent  the  means  of  triplicates,  and  are  representative of three separate experiments.     To assess ADCC, a fluorometric method described by Gomez‐Roman et al. was used131.  Cells  were  first  dual‐labeled  with  PKH26,  a  membrane‐associating  lipid  dye,  and  carboxyfluorescein  diacetate succinimidyl ester (CFSE), which stains viable cells.  Cells were then incubated with Rtx‐LNP  or other treatments for 30 min, followed by the addition of mouse splenocytes (effector cells).  After  24 h, the JVM2 and Z138 target cells that were lysed as a result of ADCC retained the PKH26 signal  but lost that of CFSE.  The percentage of lysed cells was therefore determined using flow cytometry  • 40   as the fraction of CFSE‐negative cells within the PKH26bright population.  The results, shown in Figure  2.3C & D,  indicate  that  free Rtx  (filled  triangles) elicits an ADCC  response at  levels comparable  to  those observed when using secondary‐antibody crosslinked Rtx (filled diamonds) or a mixture of Rtx  and uncoupled  liposomes  (open  triangles).   The extent of ADCC  resulting  from Rtx‐LNP  treatment  (filled  squares) was  significantly enhanced  in both  cell  lines, but  it was particularly notable when  using Z138 cells, where at a 100‐fold excess of effector cells, 81% of cells were undergoing ADCC  after treatment with Rtx‐LNP, compared to 26% for free Rtx (p < 0.05 at all target/effector cell ratios  tested).  Overall levels of ADCC were significantly lower in JVM2 cells, where at the same excess of  effector  cells,  Rtx‐LNP  treatment  resulted  in  an  ADCC  response  of  14%,  compared  to  5%  after  treatment with Rtx (p < 0.05 only at this target cell/effector cell ratio).  2.4.4  Rtx­LNP induces the activation of natural killer cells  In order to corroborate the results suggesting that Rtx‐LNP elicits a superior ADCC response  compared with free Rtx, the extent to which NK cells were activated after exposure to Rtx or Rtx‐ LNP was determined.   Bowles and Weiner demonstrated a correlation between ADCC activity after  treatment with  Rtx  and  CD54  upregulation  on  NK  cells134,  and  therefore  the  activation  state  of  human NK cells was quantified here in terms of their CD54 expression levels.  The NK cells used were  a  subpopulation within  a  sample  of  human  peripheral  blood mononuclear  cells  (PBMCs).    These  effector  cells were mixed with Z138  cells as  the  target  cells; only Z138  cells were used  since  the  ADCC response was most robust with these cells, as shown in Figure 2.3D.  Samples of effector cells  or combined effector and target cells were treated with Rtx, Rtx‐LNP, and controls (U or T‐NP).  The  results, shown in Figure 2.4, compare the activation state of the NK cells in terms of the fraction of  CD54bright  cells  contained within  the NK  cell population  (CD3–/CD56+).   Open bars  indicate  control  samples that contained only effector cells, while black bars correspond to samples containing both  effector  and  target  (Z138)  cells.    In  general,  a  greater  fraction  of  NK  cells  are  activated  in  the  • 41   presence  of  Z138  target  cells,  as  illustrated  by  the  elevated  CD54  expression  levels  (black  bars  compared  to  the white  ones).   NK  cell  activation was  greatest when  the  target  Z138  cells were  treated with Rtx or Rtx‐LNP, with the highest  level of CD54 expression found after treatment with  Rtx‐LNP (rightmost black bar).   Among the samples containing both effector and target cells (black  bars), the only significant difference (p < 0.05) occurred between the untreated (34% activated) and  Rtx‐LNP treated (62%) samples.  This study confirms that the elevated levels of ADCC resulting from  Rtx‐LNP treatment are associated with enhanced NK cell activation.         Figure 2.4  NK cell activation upon treatment of Z138 cells with different forms of Rtx.    Human  PBMCs  (effector  cells) were  incubated  overnight with  or without  Z138  target  cells  that were  untreated  (U)  or  treated with Trz‐LNP, Rtx, or Rtx‐LNP.   Cells were then  labeled with anti‐human‐CD3, CD56 and CD54 Abs conjugated to  different  fluorophores.    Flow  cytometric  analysis  was  performed  and  NK  cells  were  identified  as  the  CD3–/CD56+  population.   Within  this population,  the percentage of CD54bright cells was determined, corresponding  to  the  fraction of  activated NK cells.  *p < 0.05.    2.4.5  In vivo efficacy of multivalent Rtx­LNP  The ability of Rtx‐LNP  to  induce ADCC and CDC  is enhanced compared  to  that of  free Rtx,  and when this is considered alongside the increased direct activity leading to cell death, one would  • 42   expect that Rtx‐LNP would exhibit significantly improved therapeutic effects compared with free Rtx  when used in vivo.  We therefore completed in vivo efficacy studies on Rtx‐LNP in C.B‐17 SCID mice.   Although these mice lack functional B and T cells (similar to the Rag‐2M mice used to generate the  data in Figure 2.1), they have a well‐defined NK cell population and should therefore be capable of  eliciting ADCC  responses135.   The  Z138  cell  line was used  for  these  studies  since  it was  the most  responsive  to  Rtx  treatment,  and  a  systemic  tumor model was  employed, where  the  cells were  inoculated  IV.    This model  is  considered  to  be more  aggressive  and  less  sensitive  to  treatment  compared to the SC model.    In  order  to  follow  disease  development  non‐invasively,  Z138  cells  were  transfected  to  express Luc, and tumor‐bearing mice  (as confirmed by bioluminescent  imaging) were treated with  HBS, Rtx, or Rtx‐LNP.  At specified time points after the start of treatment, the animals were imaged  and representative images are provided in Figure 2.5A.  Mice treated with Rtx and Rtx‐LNP exhibited  a significantly  lower  tumor burden compared  to control animals and  this was  readily apparent 14  days after  initiation of  treatment.   The  imaging data also highlighted  that  following  IV  injection of  Z138‐Luc  cells,  disease  development  was  throughout  the  body.    Notably,  there  was  significant  disease burden in the brain, which would partially explain why this model may be considered more  aggressive. As highlighted  in  the Rtx‐treated examples, disease development within  the brain was  unaffected by treatment with Rtx or Rtx‐LNP.  Tumor burden was quantified by measuring the total  number of emitted photons from each mouse, and the average photon counts determined for each  treatment are summarized in Figure 2.5B.  These data show that the tumor burden in mice treated  with  Rtx  and  Rtx‐LNP  are  not  significantly  different,  but  both  treatment  groups  exhibited  significantly lower tumor burden when compared with control (HBS‐treated) mice.      • 43     Figure 2.5  Efficacy study for Rtx‐LNP.   C.B‐17 SCID mice were injected with Z138‐Luc cells and were monitored for tumor growth with the IVIS 200 optical imaging  system.  A total of 10 days after visible tumor growth appeared, mice were treated twice per week for 3 weeks with either  HBS or 1 mg/kg of free Rtx or multivalent Rtx‐LNP (R‐NP). Tumors were scanned once or twice per week.   (A)  Images of  three out of five mice are presented.  Red and blue regions represent the highest and lowest luminescence, respectively.  (B) Assessment of tumor growth, as measured by the total amount of light emitted by Luc‐expressing tumor cells from the  entire body of control mice (), and mice treated with Rtx  () or Rtx‐LNP ().   (C) Kaplan‐Meier survival curve for the  mice in this study; symbols are the same as in (B).  Inset: Increase in lifespan with respect to control.  Data is representative  of two separate studies.     Kaplan‐Meier  survival  curves were also generated as described  in Section 2.3.10, and are  provided in Figure 2.5C.  They are consistent with the imaging data and indicate that treatment with  Rtx and Rtx‐LNP provided equivalent survival benefits.  The median survival time for the Rtx and Rtx‐ LNP  treated animals was 56 and 61 days,  respectively, while  the median  survival  time  for control  animals was 35 days.  These data were somewhat surprising given that the in vitro studies suggested  that the Rtx‐LNP would exhibit improved treatment effects when compared with Rtx.  In an effort to  • 44   understand why these expectations were not realized, pharmacokinetic studies were completed to  compare  the Rtx  levels  in  the plasma compartment over  time  following  IV  injection of Rtx or Rtx‐ LNP.    2.4.6  Pharmacokinetics of Rtx and Rtx­LNP  Pharmacokinetic  studies were  completed  in  immunocompromised mice  (C.B‐17  SCID)  as  well as immunocompetent BALB/c mice, and the data obtained are summarized in Figure 2.6.  The  black symbols in Figure 2.6A (C.B‐17 SCID mice) and Figure 2.6C (BALB/c mice) represent the plasma  concentration of Rtx  in the different mouse strains, and  in general, the elimination rate of Rtx was  comparable in both strains.  The percentage of the initial Rtx dose remaining after 72 h was 27% for  C.B‐17  SCID  mice  and  24%  for  BALB/c  mice.    These  values  are  comparable  to  those  reported  elsewhere136  and  highlight  that  Rtx  is  slowly  eliminated  from  the  circulation  following  IV  administration in mice.  The open symbols in Figure 2.6A & C represent plasma concentrations of Rtx  following  IV  injection of Rtx‐LNP, and  it  is obvious  that  these values are considerably reduced.    In  both mouse strains,  the  injected dose was  reduced by as much as 80% within  the  first hour after  administration, and at 72 h postinjection, the remaining percentages of the  initial dose were 0.3%  (C.B‐17 SCID) and 2.8% (BALB/c).  The plasma concentration of liposomal lipids was also monitored after administration of Rtx‐ LNP.  As highlighted in Figure 2.6B & D, the time‐dependent LNP concentration curves mirror those  of Rtx for the same treatments; after 72 h, 0.7% of the initial dose remained in the C.B‐17 SCID mice,  while 0.5% remained in the BALB/c animals.  The observation that the plasma concentrations of Rtx  and LNPs decrease at approximately the same rate suggests that Rtx does not dissociate from LNPs  in  the  circulation  and  that  both  are  cleared  together.    Since  the  detected  levels  of  Rtx‐LNP  are  similar in both mouse strains, the data also indicate that Rtx‐LNP is not cleared via an immunogenic  • 45   mechanism.  Nevertheless, the plasma levels of Rtx‐LNP are so low compared to free Rtx that its full  therapeutic potential, as illustrated in vitro in Figures 2‐4, is compromised in mice as a result.      Figure 2.6  Pharmacokinetics of Rtx‐LNP in two mouse models.   C.B‐17 SCID mice (A & B) and BALB/c mice (C & D) were injected IV with 5 mg/kg of Rtx in free form (black symbols) or in  Rtx‐LNP (open symbols).  At time points of 0.5, 4, 24 and 72 h after the injection, circulating Rtx (A & C) and lipid (B & D)  were  quantified  by  ELISA  and  liquid  scintillation  counting,  respectively.    Data  is  representative  of  two  separate  experiments.    2.5   Discussion and conclusions  2.5.1  Discussion  In  spite of  the  fact  that nearly all  therapeutic Abs are bivalent  IgG molecules,  it has been  demonstrated  in numerous cases  that equivalent doses of multivalent Abs have more  therapeutic  • 46   potency.   A number of multivalent anti‐CD20 designs have been reported which exhibit enhanced  binding  to  target  cells15, 96  and/or elevated  levels of  cell  kill  in  vitro7, 75, 88‐90  and enhanced  in  vivo  efficacy75, 90.   The Rtx‐LNPs studied here represent  the only  liposomal  formulation of a multivalent  therapeutic IgG that has been described137.  These constructs have a valence of ~90, which is much  higher  than  the other  types of  reported multivalent  constructs, whose  valences  generally do not  exceed 10.    The  favorable effects  related  to  the direct mechanism of action  following  treatment with  Rtx‐LNPs7 were confirmed in the experiments described above.  Figure 2.2 shows that the Z138 cell  line was substantially more sensitive to Rtx‐LNP‐induced apoptosis in spite of the fact that it bound  only half as much Rtx‐LNP,  indicating  that higher  levels of apoptosis do not  result  from more Rtx  being bound to the cells.  These results may be explained, in part, by the fact that the JVM2 line (and  not the Z138  line)  is Epstein‐Barr virus positive, and  latently  infected Epstein‐Barr virus‐positive B‐ cell  lymphomas are often protected from death‐receptor  induced apoptosis such as that triggered  by CD95 (Fas receptor)138.   This may  justify why the high  levels of CD95 observed  in the JVM2  line  (Figure 2.1) did not correlate with lower cell viability levels following treatment with crosslinked Rtx  or Rtx‐LNP (Figure 2.2C & D).    There has been a lack of studies on the indirect mechanisms of multivalent therapeutic Abs  (ADCC  and CDC),  even  though  the  indirect mechanisms  are  known  to be  essential  to  the  in  vivo  efficacy of Rtx118, 119, 121, 123 and this  information would be critical for developing such constructs for  clinical use.    In  the current study,  the  JVM2 cell  line was expected  to  induce higher  levels of CDC  than  the  Z138  line  since,  as  shown  in  Figure  2.1,  it  exhibited  lower  expression  of  CD55,  a  CDC  inhibitor46.    It  was  also  expected  that  the  JVM2  line  would  exhibit  enhanced  ADCC  since  its  expression levels of CD40, CD80, and CD86 were elevated, and these proteins activate NK cells125, 126.   As  expected,  the  JVM2  cell  line  induced  a  more  robust  CDC  response,  but  Z138  cells  were  substantially better at  inducing ADCC  (Figure 2.3).   This  illustrates  the poor understanding of how  • 47   different  types of  lymphoma cells  induce ADCC  to various extents49.   Together with  the apoptosis  data from Figure 2.2C & D, however, the observations in Figure 2.3 support the results in Figure 2.1B  &  C, which  show  that  animals  bearing  established  Z138  tumors  are  Rtx‐sensitive whereas  those  bearing  JVM2  tumors  are  not.    This  is  of  particular  interest  since  these models may  provide  a  framework  for  the  future elucidation of molecular markers of Rtx  resistance or  response  in MCL,  which are currently poorly defined139, 140.  Figure  2.3  also  demonstrates  that  multivalent  Rtx‐LNP  elicits  superior  CDC  and  ADCC  responses compared with bivalent Rtx.    In  fact, bivalent Rtx did not  induce specific CDC activity  in  vitro.    A multivalent  interaction  consists,  in  theory,  of  a  complex  created  by  an  initial  univalent  interaction where the  local concentrations of the remaining  free binding sites on both species are  greatly enhanced15.  This may help explain the increased CDC and ADCC observed in Rtx‐LNP‐treated  cells.  The elevated CDC may result from the fact that C1q is itself a hexavalent ligand that requires  binding  to  several  IgG  Fc  regions  in order  to activate a CDC  response105, 106.   Multivalent Rtx‐LNP  provides significantly higher local concentrations of exposed Fc available to bind C1q after the initial  univalent Fc – C1q  interaction.   Similarly, ADCC requires binding of the Fc region of Rtx to FcγR on  effector cells such as NK cells.  Following the initial interaction between an Fc region on Rtx‐LNP and  a FcγR on a NK cell, the remaining Fc and FcγR are at significantly elevated local concentrations with  respect to one another.  This facilitates subsequent Fc – FcγR interactions leading to ADCC, and this  effect is absent with bivalent Rtx.  Despite  the  fact  that  Rtx‐LNPs  appear  to  be  therapeutically  superior  in  vitro,  we  unexpectedly found that Rtx and Rtx‐LNP exhibited equivalent activity when used to treat a systemic  Z138  tumor  model  (Figure  2.5).    This  could  be  explained  by  the  rapid  elimination  of  Rtx‐LNP  following  IV  injection  (Figure  2.6).    The  observed  removal  of  Rtx‐LNP  from  the  circulation  was  surprising  in  light  of  previous  studies  from  our  laboratory  on  Trz‐LNP  (Section  1.2.2),  which  is  identical  to  Rtx‐LNP  in  every way  except  for  the  Ab  employed.    These  studies  showed  that  the  • 48   pharmacokinetics (plasma concentrations and area under the curve) and efficacy (decrease in tumor  volume)  of  Trz‐LNP  were  both  significantly  enhanced  with  respect  to  free  Trz  in  breast  tumor  xenograft mouse models7.  Thus, the rapid clearance of Rtx‐LNP does not appear to result from the  binding of plasma proteins such as albumin or lipoproteins to the LNPs, which would result in uptake  by the reticuloendothelial system18, 19.  This is expected since Rtx‐LNP contains PEG for this purpose,  and Trz did not interfere with PEG function in Trz‐LNP7.  As shown in Figure 2.6, the rapid elimination  of Rtx‐LNP  involved neither dissociation of Rtx  from  the  liposomes nor an  immunogenic  reaction,  but when compared with Trz‐LNP, the pharmacokinetic behavior of Rtx‐LNP appears to arise  from  the Ab used and not from the liposomal component of the formulation.  The issue of rapid clearance  is discussed further in Section 7.3.1.    2.5.2  Conclusions  The studies  in  this chapter demonstrate  that multivalency can be an effective strategy  for  improving  the efficacy of  therapeutic Abs.   The greatest barrier  to developing multivalent Abs  for  clinical use is their poorly understood mechanism of action, but we have shown that both the direct  and indirect modes of action of multivalent Rtx‐LNPs are significantly improved compared with Rtx.   This chapter focused on the enhanced indirect mechanisms (CDC and ADCC), and we further showed  that elevated ADCC occurred alongside higher levels of activated NK cells.  In spite of more favorable  direct  and  indirect  cytotoxicity,  we  found  that  the  in  vivo  efficacy  of  Rtx  and  Rtx‐LNP  were  equivalent, and pharmacokinetic  studies  revealed  that Rtx‐LNP was very  rapidly  cleared  from  the  circulation compared to Rtx.   This not only  indicates the need to create multivalent Rtx constructs  with more extended circulation lifetimes (using a different type of NP formulation and/or a different  anti‐CD20  Ab)  if  they  are  to  be  developed  for  clinical  use,  but  it  also  highlights  the  therapeutic  potency of Rtx‐LNP compared to Rtx.    • 49   Part of this potency results from the direct mechanism of action, which in the case of Rtx, is  undefined from a molecular point of view.  The next chapter describes an alternative, more versatile  methodology that we developed for producing Ab‐LNPs of differing valence for use in studies on the  direct mechanisms of action of therapeutic Abs51.  Applying this methodology to Rtx‐LNPs will add to  the current results on the indirect factors and will help to delineate the overall mechanism of action  of multivalent Rtx.  This understanding will further define cases where it might be more efficacious  to employ a multivalent Ab rather than a bivalent IgG in order to treat cancer.          • 50   3  Improved methodology for preparing multivalent antibody­lipid  nanoparticles  3.1  Synopsis  Previous methods of coupling Abs to liposomes were unsuitable for creating many different  valences of  (Ab‐LNPs).   An  improved methodology developed  for  this purpose  is described  in  this  chapter.    It  exhibits  significant  improvements  over  previous methods  in  terms  of  reproducibility,  length of time required to produce many valences, and yields of coupled Ab.    3.2   Background  3.2.1  The need to produce a new method for creating many valences of Ab­LNPs  An  updated  methodology  was  required  to  produce  many  different  valences  of  Ab‐LNP  because previous methods, which have been described  largely  in  light of  immunoliposomes, were  inadequate  in  terms  of  reproducibility,  time  required,  and  overall  yields  of  coupled  Ab.    These  problems stem from the method of chemical coupling, which normally involves thiolation of the Ab  followed  by  reaction with maleimide  (Mal)‐containing  liposomes  or micelles3, 5, 141, 142.    Between  three and seven  thiol groups are required per Ab molecule7, 143, resulting  in a very heterogeneous  reaction product  that  varies  from preparation  to preparation.    Such heavy  chemical modification  may  also  pose  a  problem  particularly  for  therapeutic  Abs,  which  after  thiolation  have  shown  decreased binding to target144 and whose indirect mechanisms depend on a native Fc fragment44.    One common coupling strategy, described in Section 2.3.2, involves the preparation of small  unilamellar  vesicles  (SUVs)  containing  surface  Mal  moieties,  followed  by  the  addition  of  thiol‐ modified  Ab7,  144.    In  the  current  application,  where  smaller  amounts  of  several  different  • 51   formulations are required, this method is impractical since a different SUV composition would need  to be prepared, by extrusion or other means, for every desired valence.    A more recent variation  is the coupling of Abs to DSPE‐PEG micelles using thiol‐maleimide  chemistry, followed by heating in the presence of SUVs, enabling the “post‐insertion” of the micellar  lipids and Ab  into  the preformed SUVs142, 145.     Although  this method may be useful  for preparing  immunoliposomes,  it  is unsuitable for preparing many precise valences of Ab‐LNPs because the Ab  undergoes  substantial  heterogeneous  chemical modification  as  described  above.    This  results  in  variable  valences  from  one  preparation  to  the  next  as  well  as  potentially  reduced  therapeutic  activity of the Ab.  Moreover, low yields of Ab in the final product are obtained (59%) compared to  the amount of Ab that was initially modified.  This is particularly a problem when using therapeutic  Abs  since  they  are  generally  available  in  limited  quantities,  especially  novel  drugs  under  development.  3.2.2  How the new methodology overcomes previous limitations  The  improved methodology described  in  this  chapter overcomes  the above  limitations by  drawing on desirable  features  from earlier methods,  including  the post‐insertion  technique142, 145,  while  replacing  thiol‐maleimide  chemistry  with  high‐affinity  biotin‐NeutrAvidin  (Neut)  interactions146, 147.  In doing so, a novel feature concerning the kinetics of biotin‐Neut interactions on  liposomes was discovered and incorporated in the methodology.  Specifically, it involves surprisingly  slow kinetics of association between biotinylated protein and Neut on the surface of PEG‐containing  liposomes, attributed  to a  steric blocking effect by PEG148.   Since Ab addition  is  slow  (coupled Ab  levels continued to increase over 72 h), to make a series of different valences, it was only necessary  to stop fractions of the same coupling reaction at different times.  To improve yields, a solid‐support  Ab  biotinylation  technique was  employed149  that  provides  high  recovery  (96%),  and  to  aid with  reproducibility,  relevant  analytical  assays were developed  for  the  characterization of preparation  • 52   intermediates, including fluorescence‐based protein quantitation150 and an assay for PEG content in  liposomes151.  This chapter details this new methodology and the significant improvements it brings  to the preparation of multivalent Ab‐LNPs of different valence.    3.3  Materials and methods  3.3.1  Materials  The  following  lipids  were  obtained  from  Avanti  Polar  Lipids  (Alabaster  AL,  USA):  1,2‐ distearoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphocholine  (DSPC),  1,2‐distearoyl‐sn‐glycero‐3‐phosphoethanolamine‐ N‐[methoxy(polyethylene  glycol)‐2000]  (DSPE‐PEG),  and  1,2‐distearoyl‐sn‐glycero‐3‐ phosphoethanolamine‐N‐[biotinyl(polyethylene  glycol)‐2000]  (DSPE‐PEG‐biotin).    [3H]cholesteryl  hexadecyl ether ([3H]CHE) and Pico‐Fluor 15 scintillation fluid were from Perkin‐Elmer Life Sciences  (Woodbridge  ON,  Canada).    NeutrAvidin  (Neut)  and  immobilized  iminodiacetic  acid  gel  were  obtained from Pierce/Thermo Fisher Scientific (Rockford IL, USA).  Rituximab (Rtx) and trastuzumab  (Trz)  were  obtained  from  the  BC  Cancer  Agency  pharmacy  (Vancouver  BC,  Canada).    N‐ Hydroxysuccinimide ester‐dPEG4‐biotin  (NHS‐PEG‐biotin) was purchased  from TimTec  (Newark DE,  USA).   Disposable PD‐10 columns  (which contain Sephadex G‐25 medium) were obtained  from GE  Healthcare  Life  Sciences  (Piscataway  NJ,  USA).    4‐Hydroxyazobenzene‐2‐carboxylic  acid  (HABA)/avidin  reagent  was  purchased  from  Sigma‐Aldrich  (St.  Louis  MO,  USA)  as  a  lyophilized  powder.   ATTO‐TAG 3‐(4‐carboxybenzoyl)quinoline‐2‐carboxaldehyde (CBQCA) was from  Invitrogen  (Burlington ON, Canada).   Unless noted otherwise, all other  reagents were obtained  from Sigma‐ Aldrich and were of the highest quality available.        • 53   3.3.2  Preparation of Neut­micelles  Separate micellar  suspensions of DSPE‐PEG and DSPE‐PEG‐biotin were prepared by gently  dissolving the lipids in HBS (25 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.4).  The two suspensions were then  mixed  in different mole  ratios of DSPE‐PEG  to DSPE‐PEG‐biotin corresponding  to different desired  Neut‐LNP formulations.   Separately, with vortexing, the micellar suspension was slowly added to a  threefold mole excess of Neut over DSPE‐PEG‐biotin.   Suspensions were vortexed  for 30 s  longer,  then incubated for 30 min at room temperature with stirring.  3.3.3  Preparation of Neut­LNP  Using  the  same  procedure  as  described  in  Section  2.3.2,  SUVs  composed  of  DSPC  and  cholesterol  (Chol)  in a mole ratio of 2:1 and  labeled with [3H]CHE  (0.009 µCi/µmol  liposomal  lipid)  were prepared by extrusion.    In all  cases when producing Neut‐LNPs,  the  total number of added  moles of DSPE‐PEG + DSPE‐PEG‐biotin (in Neut‐micelles) was 4 % of the number of moles of DSPC (in  SUV).  SUV and Neut‐micelles were heated separately in a 65 oC water bath for 10 min with stirring,  then were combined with vortexing and incubated for 60 min with stirring.  After being allowed to  return to room temperature (with stirring), Neut‐LNP preparations were purified on Sepharose CL‐ 4B  columns  pre‐equilibrated  with  HBS.    Lipid  concentrations  were  determined  with  liquid  scintillation counting, and Neut concentrations were determined using CBQCA (see below).    The  number  of Neut molecules  per  SUV was  calculated  by  dividing  the  number  of Neut  molecules per liter by the number of SUV per liter.  This latter quantity was calculated assuming that  each DSPC molecule occupies 0.815 nm2 of surface area in the bilayer of DSPC/Chol (mole ratio 2:1)  SUV144 and  that  the bilayer  thickness  in  these SUV  is 4.9 nm152.   For a 100‐nm diameter SUV,  this  corresponds to 6.98 × 104 DSPC molecules per SUV.  The number of SUV per liter was calculated by  dividing the number of DSPC molecules per liter by the number of DSPC molecules per SUV.      • 54   3.3.4  CBQCA  assay  for measuring protein  concentration  in  solution  or Ab­LNP  suspension    Solutions of borate  (100 mM Na2B4O7•10H2O, pH 9.3) and KCN (20 mM) were prepared  in  ultrapure water.   A KCN/borate solution was then prepared by mixing 25 volumes of borate and 1  volume of KCN.   A 96‐well plate  layout was prepared  for each assay, which  included separate Rtx  and Neut standards over appropriate concentration ranges, as well as triplicates of unknowns.   To  each sample‐containing well, 130 µL of KCN/borate were added,  followed by 10 µL of standard or  unknown sample.  Finally, a 40 mM stock solution of ATTO‐TAG CBQCA in dimethyl sulfoxide (DMSO)  was diluted tenfold in borate, and 10 µL of the resulting solution were added to the wells.  The plate  was  covered  with  aluminum  foil  and  incubated  for  1  h  at  room  temperature  with  shaking.   Fluorescence  emission  intensities were  then measured  in  triplicate  at 550 nm with  an  excitation  wavelength  of  465  nm  using  a  BMG  Labtechnologies  Fluorstar  plate  reader.    Unknown  concentrations of Rtx and Neut were calculated from their respective standard curves.      3.3.5  Ammonium  ferrothiocyanate  assay  for  measuring  polyethylene  glycol  content in LNPs   Ammonium ferrothiocyanate (AF) was prepared by dissolving 30.4 g of NH4SCN and 27.0 g of  FeCl3•6H2O in ultrapure water to a final volume of 1.0 L.  Standard solutions of DSPE‐PEG (0 to 500  µM) and DSPC (0 to 4.5 mM) were prepared from DSPE‐PEG micelles and DSPC/Chol (2:1) SUV.   In  1.5 mL  Eppendorf  tubes,  500  µL  of  CHCl3 were  added,  followed  by  500  µL  of  AF  and  50  µL  of  standard or unknown solution (assayed in triplicate).  Tubes were closed and mixed vigorously on a  plate shaker for 30 min, then tubes were spun in a microcentrifuge at 13000 rpm for 2 min, and the  lower CHCl3 layers (495 µL) were pipetted into separate Eppendorf tubes.  The absorbances of these  CHCl3 solutions were measured at 530 nm.   The expected absorbances of the unknown samples  in  the  absence  of  DSPE‐PEG  were  calculated  based  on  their  known  DSPC  concentrations  from  • 55   scintillation  counting,  and  excess  absorbances  at  530  nm  in  each  case  were  attributed  to  the  presence of PEG.  PEG concentrations of the unknowns were calculated from the excess absorbance  values.   3.3.6  Ab  biotinylation  on  a  nickel  immobilized metal  affinity  chromatography  column  Immobilized iminodiacetic acid gel was transferred into a 1.5 mL polypropylene column to a  final  gel  bed  volume  of  500  µL  then  rinsed with  5.0 mL  of  ultrapure water.    The  gel was  then  chelated with nickel by adding 5.0 mL of 50 mM ammonium nickel(II) sulfate and washed with an  additional 5.0 mL of water.  If not used immediately, the resultant nickel immobilized metal affinity  chromatography (NIMAC) columns were stored at 4 oC in 0.02 % sodium azide.  Otherwise, columns  were equilibrated with 5.0 mL binding buffer  (BB; 25 mM HEPES, 1 M NaCl, pH 7.4).   Separately,  500µL of 10 mg/mL Rtx were added to 1250 µL of 2x BB and 750 µL of ultrapure water.  For future  analysis, 100 µL of  this solution were set aside, and  the  remaining 2400 µL were  loaded onto  the  column by eluting the solution through the gel bed twice.   The column was then washed with 4 x  500 µL BB.   For biotinylation,  the desired mole excess of NHS‐PEG‐biotin with  respect  to Ab was  measured from a stock DMSO solution and was diluted to 1.0 mL in cold BB.  The concentration of  NHS‐PEG‐biotin was equilibrated across the column by adding 500 µL of the solution to the column,  allowing the eluent to drain into the NHS‐PEG‐biotin solution, vortexing briefly, then another 500 µL  aliquot was added to the column.  After five such aliquots, the entire 1.0 mL was added and allowed  to drain from the column by gravity for 45 min, with the column being refilled as necessary with the  drained solution.  Next, the column was washed with 5 x 500 µL BB to remove NHS‐PEG‐biotin.  Rtx  was either eluted with imidazole or ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA).  For imidazole elution,  the  column was  treated with  3  x  500  µL  elution  buffer  (EB;  25 mM HEPES,  1 M NaCl,  200 mM  imidazole, pH 7.4).  A final 500 µL aliquot of EB was passed through the column three times, and the  • 56   four resulting fractions were pooled.  For elution with EDTA, the column was treated with 4 x 500 µL  stripping buffer  (SB; 25 mM HEPES, 1 M NaCl, 50 mM  EDTA, pH 7.4)  and  all  four  fractions were  pooled.   The concentration of Rtx was measured using the CBQCA assay and the number of biotin  groups  per  Rtx molecule was  calculated  using  HABA/avidin  (see  below)  and  CBQCA  assay  data.   Columns were stripped of Ni2+ by treating with a total volume of 5.0 mL SB, then re‐chelated with  nickel and stored as described above.    3.3.7  Ab biotinylation in solution  As in the NIMAC procedure above, 500µL of 10 mg/mL Rtx were added to 1250 µL of 2x BB  and  750  µL  of  ultrapure  water.    Depending  on  the  mole  excess  of  NHS‐PEG‐biotin  to  Ab,  the  appropriate volume of a stock solution of NHS‐PEG‐biotin in DMSO was measured and diluted to 1.0  mL  in  cold  BB.    The  Rtx  and  NHS‐PEG‐biotin  solutions  were  combined  and  incubated  at  room  temperature for 1 h with stirring.  Biotinylated Rtx was purified on a PD‐10 column pre‐equilibrated  with  BB.    Fractions  (500  µL)  were  obtained  and  Rtx‐containing  fractions  (as  determined  by  measuring absorbances at 280 nm) were pooled.  The number of biotin groups per Rtx molecule was  calculated as per the NIMAC method.  3.3.8  HABA/avidin assay for measuring the extent of Ab biotinylation  HABA/avidin reagent was reconstituted with ultrapure water according to the instructions of  the manufacturer.    Biotin  standards  ranging  from  0  to  150  µM were  prepared  in  BB,  EB,  or  SB  depending on  the method of biotinylation and elution  (see above).    In a 96‐well plate, 140 µL of  HABA/avidin solution were added to wells as required, and the absorbances of all wells were read at  500 nm  in  triplicate using a Thermo Scientific absorbance microplate reader.   Next, 10 µL of each  standard or unknown sample (assayed in triplicate) were added to the wells.  The plate was shaken  on  a  plate  shaker  for  3 min  and  the  absorbances were  read  again  at  500  nm  in  triplicate.    The  • 57   average absorbance of each well after sample addition was subtracted from the absorbance before  to obtain A, which was plotted against biotin  concentration  to generate a  standard  curve.   The  number of biotin groups per Rtx molecule was obtained by dividing the biotin concentration by the  Rtx concentration obtained from the CBQCA assay.    3.3.9    Coupling of Rtx­biotin to Neut­LNP to create Rtx­LNP    Based on the desired mole ratio of Rtx‐biotin to Neut (in Neut‐LNP), the necessary volume of  Neut‐LNP was added dropwise with vortexing to a solution of Rtx‐biotin prepared using the NIMAC  procedure above.  The coupling reaction was allowed to proceed at 4 oC with stirring for 1 to 72 h.   The resulting Rtx‐LNPs were purified over Sepharose CL‐4B columns pre‐equilibrated with HBS.  The  mean  vesicle  diameter  of  Rtx‐LNP was  between  125  and  140  nm  as  determined  by QLS.    Lipid  concentrations  in  Rtx‐LNPs  were  determined  with  respect  to  Neut‐LNP  by  liquid  scintillation  counting, and protein concentrations were measured using CBQCA.   The concentration of Neut  in  Rtx‐LNP was calculated from lipid concentrations by assuming no change in the Neut‐to‐DSPC ratio  as a  result of  coupling.   The expected  contribution  to  the CBQCA  signal by Neut was determined  based on the Neut standard curve, and the excess signal was attributed to Rtx, whose concentration  was calculated from this excess signal.   The number of Rtx molecules per Rtx‐LNP was determined  using the same assumptions as for Neut‐LNP above (Section 3.3.3).    3.4  Results  3.4.1  Overview of  the  improved methodology  for creating Ab­LNPs of different  valence  Given  the  considerations  outlined  in  Section  3.2,  we  have  developed  and  optimized  an  improved methodology  for  producing  smaller  amounts  of  several  different Ab‐LNP  valences  in  a  • 58   manner that is time‐efficient, reproducible, and that results in high yields of coupled Ab.  Table 3.1  shows  that  the new methodology provides  yields of  coupled Ab  as high  as  80% with  far  less Ab  modification compared to the previous post‐insertion method, which produces overall yields of 59%.    Table 3.1  Comparison of Ab yields between current and previous methods of Ab‐LNP productiona.  Improved biotin‐Neut  methodology (Figure 3.1)  Recovered Ab / %  Cumulative yield / %  Notes  Ab biotinylation (NIMAC)  96 ± 6  96 ± 6  1‐2 biotin groups per Ab  Coupling to Neut‐LNPb  84 ± 6  80 ± 7  Ab loss from purification  only  Previous thiol‐Mal  post‐insertion method  Recovered Ab / %  Cumulative yield / %  Notes  Ab thiolationc  80 ± 4  80 ± 4  3‐7 thiol groups per Ab  Coupling to micelles  and post‐insertion of Abd  74 ± 6  59 ± 6  Ab loss from incomplete  coupling, post‐insertion,  and purification  aAll values are averaged over three experiments and are ± SD.  bMole ratio of Rtx‐biotin to Neut = 0.5; coupling time = 72 h.  cUsing Traut’s reagent  followed by purification over a PD‐10 column;  information  from the manufacturer states that 70‐ 95% recovery is typical.  dAb‐to‐DSPC  ratio  after  purification  was  ~88%  of  the  input  amount,  consistent  with  Ishida  et  al.142,  representing  incomplete  coupling and post‐insertion.   Ab  (coupled  to  liposomes) was also  subsequently  lost during purification on a  Sepharose CL‐4B column.     Figure  3.1  summarizes  the  five  major  steps  of  methodology,  and  the  ensuing  sections  describe  them  in  greater  detail.    First,  [1]  DSPE‐PEG  and  DSPE‐PEG‐biotin  are  dissolved  in  HBS,  producing a suspension of micelles.  [2] Biotin present on the micelles is saturated with an excess of  Neut, a deglycosylated analog of streptavidin with  low nonspecific binding.    [3] Micellar  lipids and  Neut‐lipid  complexes  become  post‐inserted  into  the  outer  leaflet  of  SUVs  to  produce Neut‐LNP.   SUVs are composed of DSPC/Chol (mole ratio 2:1; Chol not shown), and Neut is post‐inserted rather  than Ab, which eliminates Ab wastage during post‐insertion.  [4] Separately, Ab is biotinylated on a  NIMAC support to produce Ab‐biotin, resulting in well‐controlled and reproducible Ab modification  with  very  high  Ab  recovery.    [5]  Ab‐biotin  and  Neut‐LNP  are  combined,  producing  Ab‐LNPs  of  defined valence.  • 59       Figure 3.1  Overview of the improved methodology for preparing multivalent Ab‐LNPs.  Please see text for details.    3.4.2  Preparation of Neut­LNP and measurement of protein content  Initially, a mixture of DSPE‐PEG and DSPE‐PEG‐biotin was post‐inserted  into SUVs to create  biotin‐LNPs with different numbers of biotin groups per LNP.   Separately, Ab was biotinylated and  SUV Neut‐LNP Ab‐LNP Ab‐biotinAb Biotin‐Micelles Neut‐Micelles DSPE‐PEG‐biotin DSPE‐PEG [1] [3] [2] [4] [5] HBS excess  Neut NHS‐PEG‐biotin / NIMAC • 60   saturated with Neut to make Ab‐Neut, which was then coupled to the various biotin‐LNPs to create  Ab‐LNPs of different valence.   This approach was problematic, however, since each Neut molecule  contains  four biotin‐binding  sites, and adding Neut  to Ab‐biotin  resulted  in a mixture of Ab‐Neut  species  containing between 0 and 4 Ab molecules per Neut.   Yields were  reduced because  (Ab)4‐ Neut  could not bind  to biotin‐LNP,  and  separation of  (Ab)4‐Neut  and  free Neut  from  the desired  species was  inefficient.   Moreover, some Ab molecules contained more than one biotin group and  thus  bound more  than  one Neut molecule,  resulting  in  a  complex mixture  of  adducts  (data  not  shown).  It was  therefore more efficient  to couple Neut  to DSPE‐PEG‐biotin.   Before post‐insertion,  biotin‐micelles were saturated with a threefold excess of Neut, forming Neut‐micelles (reaction [2]  in Figure 3.1).  For post‐insertion, a total of 4 mol % PEGylated lipid was added with respect to DSPC;  this percentage was selected on the basis that higher amounts of DSPE‐PEG (above ~7 %) are known  to result in unwanted effects such as dissociation back to DSPE‐PEG micelles153.  The number of Neut  molecules added per SUV was controlled by preparing Neut‐micelles containing different  fractions  of DSPE‐PEG‐Neut with respect to DSPE‐PEG (reaction [3]  in Figure 3.1) and several different post‐ insertion reactions were carried out simultaneously.  Using this strategy, Figure 3.2A shows that the  number of added Neut molecules per SUV can be controlled  in a precise manner.   The number of  Neut molecules per Neut‐LNP depended on  the  initial mole percent of DSPE‐PEG‐biotin used; 11  Neut per Neut‐LNP were obtained using 0.5 mole % DSPE‐PEG‐biotin, while the number of Neut per  Neut‐LNP increased to 130 when 20 mole % DSPE‐PEG‐biotin was used (p < 0.05 between all pairs of  shown conditions).      • 61     Figure 3.2  Control over Neut and PEG content during the preparation of Neut‐LNPs.  (A) The number of Neut molecules per Neut‐LNP (product of step [3] in Figure 3.1) can be controlled by varying the mole  percent  of  DSPE‐PEG‐biotin  present  in  biotin‐micelles  (step  [1]).    (B)  The  Neut  content  of  Neut‐micelles  does  not  significantly  influence  the  total  amount  of  post‐inserted  PEGylated  lipid  in  Neut‐LNP;  in  all  cases,  approximately  4 %  PEGylated lipid was added with respect to DSPC.  Values for mole % DSPE‐PEG‐biotin in (A) and (B) are with respect to the  total number of moles of PEGylated lipid (DSPE‐PEG + DSPE‐PEG‐biotin).    Protein content in Neut‐LNP and in all other cases was measured with the CBQCA assay (see  Section 3.3.5).   The direct advantage of employing this fluorescence‐based assay is that there is no  interference  from  liposomes  or micelles.      To  verify  the  lack  of  interference, mixtures  of  known  amounts of DSPC/Chol SUV, DSPE‐PEG, and Ab were  created  in various  combinations, and  it was  found  that Ab concentrations obtained were equivalent  regardless of  the presence of  lipids  (data  not shown).   This  is  in contrast  to other protein assays such as  the bicinchoninic acid  (BCA) assay  (see Section 2.3.2), an absorbance‐based assay which  is  commonly employed  to measure protein  content  in  liposomes154,  155,  although  variable  levels  of  interference  from  lipids  are  commonly  observed, even in the presence of detergents156, 157.  3.4.3  Direct measurement of levels of post­inserted polyethylene glycol in Neut­ LNP  To enhance the reproducibility of the procedure by thoroughly characterizing  intermediate  products,  the PEG content of Neut‐LNP was also quantified  following post‐insertion.   For  this, we  developed an assay for the direct measurement of PEG content  in Neut‐LNP or Ab‐LNP based on a  0 50 100 150 0.5 5 10 20 N N eu t pe r N eu t‐L N P  Mole % DSPE‐PEG‐biotin  A 2 3 4 5 0.5 5 10 20 M ol e %  PE G w it h r es pe ct  to  DS PC   Mole % DSPE‐PEG‐biotin B • 62   method originally described for quantifying PEG  in PEGylated proteins151 (see Section 3.3.6).   Table  3.2 shows the PEG content during a sample purification of Neut‐LNP, and as expected, the fractions  with  the  largest  mean  diameter  (those  containing  the  most  PEG)  were  eluted  first  from  the  Sepharose CL‐4B column.  The pooled fraction contained close to the amount of PEGylated lipid that  was input (4 % with respect to DSPC).  As shown in Figure 3.2B, analysis of other samples indicated  that  the PEG  content was  consistently  in  this  range  (3.5–4.1 mole % PEG with  respect  to DSPC),  regardless of the mole % of DSPE‐PEG‐biotin initially used (p > 0.05 for all pairs of shown conditions  in Figure 3.2B, except between 0.5 and 5 mole % DSPE‐PEG‐biotin, where p < 0.05).  This assay was  also verified by mixing different known quantities of DSPC/Chol SUV and DSPE‐PEG micelles, and  excellent  agreement  (within  5 %) was  found  between  the measured  and  known  values  for  PEG  concentrations with respect to DSPC (data not shown).    Table 3.2  PEG content of 0.5 mL fractions during purification of Neut‐SUVa.  Column  fraction  [DSPC]  / mM  Mole % PEG wrt DSPCb  Column  fraction  [DSPC]  / mM  Mole % PEG wrt DSPCb  1  3.5 ± 0.3  4.4 ± 0.4  5  5.0 ± 0.4  3.7 ± 0.4  2  9.0 ± 0.7  4.4 ± 0.4  6  3.2 ± 0.3  3.7 ± 0.4  3  9.8 ± 0.7  3.9 ± 0.4  pooled  6.7 ± 0.4  3.8 ± 0.4  4  6.2 ± 0.5  3.8 ± 0.4  aAll values are ± SD.  bwrt: with respect to.    3.4.4  Ab  biotinylation  on  a  nickel  immobilized metal  affinity  chromatography  support  A major drawback of thiol‐maleimide chemistry is the need to extensively thiolate the Ab, as  outlined above.   To minimally biotinylate the Ab  in a well‐controlled manner before coupling  it to  Neut‐LNP,  the water‐soluble  compound  NHS‐PEG‐biotin was  employed.   When  the  biotinylation  reaction was carried out in solution, variable results were obtained in terms of the number of biotin  • 63   groups  per  Ab  molecule,  so  to  enhance  yields  and  reproducibility,  an  alternative  strategy  was  employed which made use of a NIMAC support149 (reaction [4] in Figure 3.1).    A schematic of the biotinylation process using the NIMAC column is shown in Figure 3.3A &  B.  Loading takes place by eluting the Ab solution through the NIMAC support, and the Ab contains a  highly  conserved  cluster  of  histidine  residues  that  binds  specifically  to Ni2+  on  the  column158, 159.   Biotinylation of the  immobilized Ab then occurs by eluting an NHS‐PEG‐biotin solution through the  column,  and  purification  consists  of  simply  washing  the  column.    Ab  can  be  eluted  either  by  treatment with a solution containing imidazole (the side chain of histidine), which competes with Ab  binding to Ni2+, or through treatment with EDTA, which removes Ni2+ along with the bound Ab.  No  differences were found between imidazole and EDTA elution in terms of yield of recovered Ab‐biotin  or in terms of the ability of Ab‐biotin to bind to Neut‐LNP (data not shown).  Imidazole elution was  therefore employed to avoid contamination with Ni2+, whose toxicity is well documented160.  It was  also  found  that  imidazole  does  not  interfere  with  the  CBQCA  or  HABA/avidin  assays  (data  not  shown).   Overall,  imidazole elution  resulted  in very high  recovery of Ab  (96 %; Table 3.1) and  the  entire  biotinylation  scheme  takes  place  under  very mild  conditions  (room  temperature,  pH  7.4),  important for the conservation of Ab structure and function.    Figure 3.3C compares the number of biotin groups added per Rtx molecule under conditions  of different excesses of NHS‐PEG‐biotin, using either the NIMAC support (black bars) or by carrying  out  the  reaction  in  solution  (white  bars).    In  general,  the  degree  of Rtx  biotinylation  in  solution  increased  substantially with  the  excess  of  NHS‐PEG‐biotin, whereas  biotinylation  on  the  NIMAC  column resulted in more mild increases.  When biotinylation was carried out in solution, the number  of biotin groups per Rtx increased from 0.23 to 16 (~70‐fold) from a 5‐fold molar excess of NHS‐PEG‐ biotin to a 50‐fold excess  (p < 0.05 between all pairs of conditions  in solution).   When the NIMAC  column was employed instead over the same range of NHS‐PEG‐biotin concentrations, the number  of biotin groups per Rtx molecule increased from 0.90 to 3.8 (~4‐fold; p > 0.05 between 5‐ and 10‐ • 64   fold excesses,  and p < 0.05 between  the 10‐fold  and higher excesses).   Greater  control over  the  biotinylation  process was  therefore  achieved  using  the  NIMAC  column  compared  to  reaction  in  solution,  since  small  unavoidable  variations  in  reagent  concentrations  do  not  produce  large  fluctuations in the degree of biotinylation using NIMAC, resulting in a more reproducible procedure.        Figure  3.3    Ab  biotinylation  on  a NIMAC  column  allows  for  easy  purification,  high  recovery,  and  precise  degree  of  biotinylation.    (A) Schematic representation of biotin concentration in the eluent and (B) mass of immobilized Rtx on the NIMAC column  as a function of the total volume eluted through the column during biotinylation.  During loading, Rtx in solution binds to  immobilized Ni2+ on the column.  Reaction with Rtx takes place by allowing a solution of NHS‐PEG‐biotin to flow through  the column, then it is washed away.  Finally, Rtx elution is performed with a solution containing imidazole, which releases  biotinylated Rtx from the column.   (C) The number of biotin groups added per Rtx molecule is shown for different excesses  of NHS‐PEG‐biotin.  Black bars: NIMAC column; white bars: biotinylation in solution.    0 2 4 6 8 10 12m as s of im m ob iliz ed ri tu x / m g 0 1 2 3 4 5 6 0 2 4 6 8 10 12 [ ] 0 20 40 60 80 100 Volume eluted / mL [b io ti n] el ue nt  / μ M m R tx on  co lu m n  /  mg Load React Elute A B 0 4 8 12 16 20 5 10 25 50 N bi ot in pe r R tx ‐bi ot in  m ol ec ul e Mole ratio of NHS‐PEG‐biotin to Rtx  0 1 2 3 4 5 10 C • 65     In order to minimize the overall modification of Rtx and to obtain the most homogeneous  Rtx‐biotin preparation, biotinylation on  the NIMAC  support was henceforth performed with a 10‐ fold molar excess of NHS‐PEG‐biotin with respect to Rtx.   This resulted  in high yields of samples of  Rtx‐biotin containing, on average, between 1 and 2 biotin groups per Rtx molecule (Figure 3.3C).  3.4.5  Different Ab­LNP  valences  are  achieved  by  taking  advantage  of  the  slow  association dynamics between Ab­biotin and Neut­LNP  The final step in creating Ab‐LNPs involved coupling Ab‐biotin to Neut‐LNP.  In carrying out  this coupling reaction, it was uncovered that the association of Rtx‐biotin and Neut‐LNP is actually a  relatively slow process; the amount of bound Rtx‐biotin continued to  increase up to 72 h after the  start of coupling.   This was surprising since  the  interaction between biotin and Neut  is one of  the  strongest noncovalent  interactions known (KD = 10‐15 M)161, and mixing Rtx‐biotin and free Neut  in  solution often causes the immediate formation of a precipitate, indicating very rapid association.    This  significant  reduction  in  coupling  dynamics  has  not  been  previously  described  in  a  parallel application, and it is a key feature of the methodology described here.  It provides a practical  way  of  obtaining  different  valences  of  Ab‐LNPs:  fractions  of  the  same  coupling  reaction  can  be  stopped at  consecutively  longer  time points,  resulting  in  successively higher valences.   Figure 3.4  shows three different sets of reaction conditions (mole ratios of added Rtx‐biotin to Neut), and in all  cases, the number of moles of Rtx‐biotin associated to Neut‐LNP increased from an incubation time  of 1 h to 72 h.  For example, when the added mole ratio of Rtx‐biotin to Neut (in Neut‐LNP) was 0.5,  the mole ratio of coupled Rtx to Neut (in Rtx‐LNP) was 0.25 after 1 h and 0.47 after 72 h (p < 0.05);  when the added Rtx‐biotin to Neut mole ratio was increased to 2.0, the coupled mole ratio of Rtx to  Neut was 0.28 after 1 h and 1.4 after 72 h  (p < 0.005).   The slow kinetic of association  therefore  provide great versatility to the methodology since many different Ab‐LNP valences can be prepared  from one or two Neut‐LNP preparations and one sample of Ab‐biotin.  • 66       Figure 3.4  Control over the valence of Rtx‐LNP when coupling Rtx‐biotin to Neut‐LNP.  The final valence of Rtx‐LNP can be controlled by both the added mole ratio of Rtx‐biotin with respect to Neut (in Neut‐ LNP) and the length of time that the coupling reaction is allowed to proceed.  Note that for each value on the horizontal  axis, a 100 % coupling efficiency  is represented by  the same value on  the vertical axis.   Reaction  times: black bars: 1 h;  white bars: 24 h; hatched bars: 48 h; dotted bars: 72 h.     Figure  3.4  indicates  that  in  general,  for  equivalent  reaction  times  of  24  h  or  longer,  the  amount of associated Rtx‐biotin increases when higher excesses of Rtx‐biotin (with respect to Neut)  are added.   Using  these higher mole excesses, however, had  the disadvantage of  lower yields;  in  general,  the  coupling  efficiency  increased  as  less  Rtx‐biotin  was  added  with  respect  to  Neut.   Importantly, coupling efficiencies close to 100% (represented by equal values on the horizontal and  vertical axes) were obtained at a mole ratio of Rtx‐biotin to Neut of 0.5 and by allowing the reaction  to proceed for 72 h.  (A 100% coupling efficiency does not represent a 100% yield since Ab, coupled  to Ab‐LNP, will invariably be lost during ensuing purification.)    Figure 3.4 also  shows  that although Neut has  four biotin‐binding  sites  (three available  to  bind to Rtx‐biotin), Neut‐LNP bound a maximum of 1.4 Rtx‐biotin molecules per Neut.  Although this  stoichiometry likely resulted from PEG blocking the biotin‐binding sites on Neut148, one concern was  Co up le d m ol e r at io  of  Rt x t o N eu t (in  Rt x‐L N P) Added mole ratio of Rtx‐biotin to Neut (in Neut‐LNP) 2.0 1.5 1.0 0.5 0 0.5                     1.0                    2.0 • 67   that aggregation might occur over time from unbound biotin groups on Rtx‐biotin and free biotin‐ binding sites on Neut.   Thus  in an effort  to reduce  the available biotin‐biding sites, some samples  were prepared where  excess  free biotin was  added  at  the end of  coupling  and  incubated  for 1h  before purification.  Over the course of one month, the sizes of Rtx‐LNPs prepared with or without  addition of biotin were measured at regular  intervals and were  found  to remain constant at ~130  nm  (data not shown).   The ability of both  types of preparations  to  induce apoptosis  in  lymphoma  cells was also found to be similar and we therefore concluded that Rtx‐LNPs were stable without the  addition of excess biotin.    3.5  Discussion and conclusions  3.5.1  Discussion  The  work  described  in  this  chapter  has  uncovered  that  the  kinetics  of  the  association  between biotinylated protein and PEGylated  liposomes containing an avidin analog are surprisingly  slow.   The  slow association kinetics  comprise a  central  feature of  the  improved methodology  for  preparing  Ab‐LNPs  described  here.    The  use  of  avidin‐biotin  interactions  to  couple  proteins  to  liposomes  is not a new  concept, but one  reason why  the  slow kinetics have not been previously  described may  be  that,  by  and  large,  this  type  of  coupling  has  been  performed  using  liposomes  lacking PEG147, 162, 163.    In aqueous  solution, however, a  similar phenomenon  involving biotinylated  PEG  and  avidin has been  attributed  to  a  steric effect where  the PEG  chains effectively block  the  biotin‐binding sites on  the avidin molecules148.   One unanswered question  is how  the presence of  PEG on  the  liposome affects  the kinetics of other  types of  coupling  reactions,  such as  those  that  employ thiol‐maleimide chemistry.  • 68   The  effect of PEG blocking  lends  significant  efficiency  to  the methodology because many  different valences can be produced from single batches of Neut‐LNP and Ab‐biotin; the two reagents  need only be mixed in different proportions and incubated for different times between 1 h and 72 h  to produce different valences (Figure 3.4).  This is in contrast to having to prepare a different Neut‐ LNP for every desired valence, which would be significantly more cumbersome and time‐consuming.   It should be noted that one case where this more time‐consuming strategy would be desirable is a  situation of severely  limited Ab availability; this  is because the reaction conditions  leading to 100%  coupling efficiencies could be employed  for every valence  (mole  ratio of Ab‐biotin  to Neut = 0.5;  Figure  3.4).    Overall,  the  methodology  is  therefore  versatile  and  easily  adaptable  to  different  circumstances of time and Ab availability.    Two other  features of  the methodology  also  served  to  improve  the  yields of  coupled Ab  (Table 3.1) and the reproducibility of the procedure: elimination of thiol‐maleimide chemistry, and  use of  the NIMAC support  to biotinylate  the Ab.   The NIMAC column enabled a very high yield of  recovered biotinylated Ab (96 %) as well as a more homogeneous product with only 1 to 2 modified  amine groups per Ab  (using a 10‐fold excess of NHS‐PEG‐biotin; Figure 3.3) compared  to 3‐7  thiol  groups per Ab using thiol‐maleimide coupling.   The NIMAC method also has the advantage of very  mild reaction and elution conditions; unlike the thiol‐maleimide method, all steps take place at pH  7.4 at room temperature, which may aid in the conservation of native Ab structure.    As shown in Table 3.1, thiol‐maleimide coupling followed by post‐insertion of Ab may exhibit  a  high  coupling  efficiency,  but  the  start‐to‐finish  yield  of  Ab  is  much  lower.    Replacing  thiol‐ maleimide chemistry also improved reproducibility due to the inherent problem that only one DSPE‐ PEG‐maleimide molecule  is  required  per Ab,  but  higher‐order  adducts  inevitably  result  since  the  reaction must be carried out under an excess of DSPE‐PEG‐maleimide142.   Exposed thiol groups on  the Ab are also known  to undergo oxidation  into disulfide bonds164, which along with  the higher‐ order  adducts,  not  only  affect  Ab  structure  and  function  but  also  constitute  mechanisms  of  • 69   interliposomal crosslinking.   A  further problem  is  that maleimide groups are particularly prone  to  hydrolysis at elevated temperatures (such as 65 oC, used for extrusion) and at pH levels above 7 (ref.  165).    With  the  improved  methodology,  the  issues  of  nonhomogeneous  thiolation  and  adduct  stoichiometry,  disulfide  bond  formation,  and  maleimide  hydrolysis  have  been  eliminated  and  reproducibility has been improved.  The  improved Ab‐LNP preparation methodology may serve to  identify therapeutic Abs that  are more efficacious in a multivalent configuration and to identify the optimal valence of such Abs; it  has been estimated that valences up to ~400 (200 IgG) can theoretically be achieved on a 100 nm‐ diameter  liposome141  although  the  highest  valence  achieved  in  sufficient  yield with  the  current  improved methodology was 250.  Optimal valence information can be translated into non‐liposomal  multivalent Ab constructs where it might otherwise be more difficult or time‐consuming to produce  many different valences.  These alternative multivalent Ab constructs may include Ab‐coupled gold  nanoshells96,  Ab‐dendrimer  conjugates95,  polymeric  nanoparticles166,  or  different  types  of  multifunctional  nanoparticles167.    Using  liposomes  to  create  multivalent  Abs  also  does  not  necessarily  exclude  the  possibility  of  their  application  to  immunoliposomes  that  contain  encapsulated drug.    Indeed,  it should be noted  that  the methodology would be very useful  in  the  development of  targeted  liposomal  formulations where  the effects of varying  the protein‐to‐lipid  ratio are being studied.        3.5.2  Conclusions  The  methodology  described  above  provides  a  means  of  studying  therapeutic  Ab  multivalency  in order  to determine whether Abs under development may be more efficacious as  multivalent  rather  than  bivalent  molecules.    Compared  to  previous  methods,  the  improved  methodology  described  here  is more  time‐efficient  and  reproducible,  and  also  results  in  higher  yields of coupled Ab.  With this optimized methodology, studies which examine how the valence of a  • 70   therapeutic Ab affects its efficacy can now be carried out.  For example, the different valences of Ab‐ LNP  can be  employed  to  identify  the optimal  valence of  the Ab  and  to probe  the mechanism of  action  of  the  multivalent  drug.    The  resulting  information  could  potentially  be  applied  to  the  development of different liposomal and non‐liposomal multivalent therapeutic Abs.                     • 71   4  Unique biological properties of rituximab­lipid nanoparticles  4.1  Synopsis  This chapter examines the properties of different valences of Rtx‐LNPs prepared using  the  improved methodology described  in Chapter 3.   These properties  include binding characteristics to  CD20+ lymphoma cells, distribution of Rtx‐LNPs on the cell surface, modulation of CD20 expression,  cytotoxicity of the constructs, and ability of the different valences to directly induce apoptosis.   4.2  Background  4.2.1  Properties of different types of multivalent anti­CD20 Abs  Various designs of multivalent  anti‐CD20 Abs have been described,  and  in  general,  these  constructs exhibit superior binding to target cells as well as elevated therapeutic activity in vitro and  in some cases in vivo.  Evidence of superior binding to CD20+ lymphoma cells has been provided by  multivalent  Rtx  constructs  such  as  multivalent  Rtx‐gold  nanoshells96  and  anti‐CD20  multivalent  branched copolymer‐Fab conjugates15.  Enhanced binding is consistent with the increased avidity of  multivalent ligands that is usually observed, as described in Section 1.6.  In spite of observations of  improved binding,  studies are  scarce  regarding  the  specific  interaction of  the multivalent Ab with  the target on the cell surface.   For example, when the multivalent Ab  is bound to the cell,  it  is not  known whether all Ab molecules  in  the construct are bound  to CD20, or  if  there  is a  fraction  that  remains unbound.  Several  studies  have  described  therapeutic  improvements  in  multivalent  Rtx  constructs  compared to bivalent Rtx, and  it  is generally understood that this results from hypercrosslinking of  CD20 in the plasma membrane.  Ghetie et al. created tetravalent Rtx and F(ab′)2 homodimers, which   • 72   inhibited  the  growth of  several different B‐lymphoma  cell  lines  in  vitro  through  the  induction of  apoptosis, while monomeric Rtx had no such effect.  Apoptosis did not depend on the presence of Fc  receptors nor on the density of cell‐surface CD20 on the target cells, and Rtx homodimers sensitized  drug‐resistant  CD20+  B‐lymphoma  cells  to  chemotherapy88.    Zhang  and  colleagues  prepared  Rtx‐ dextran polymers (valence ~10) which induced significantly elevated apoptosis in several CD20+ cell  lines but not in CD20– lymphoma cell lines.  This polymer also showed an extended circulation half‐ life  compared  to  bivalent  Rtx  as  well  as  producing  a  marked  regression  in  CD20+  lymphoma  xenografts, while Rtx dimer and monomer showed  little effect  in vivo75.   Trivalent and  tetravalent  Rtx  constructs  obtained  through  protein  engineering  were  prepared  by  Miller  et  al.;  many  configurations of constructs were prepared with tandem Fab repeats (with or without Fc regions) in  order  to mimic  crosslinked Rtx.   Bivalent  Rtx  induced  low  levels  of  apoptosis while many  of  the  multivalent  constructs  induced  elevated  apoptosis without  crosslinking89.    A  final  example  from  Rossi  and  colleagues  involves  the  use  of  a  technique  known  as  the  Dock‐and‐Lock method  for  creating  hexavalent  anti‐CD20  constructs  that  comprise  six  Fab  fragments  and  one  Fc  fragment.   These constructs inhibited proliferation in CD20+ lymphoma cells without a crosslinking Ab, and they  induced ADCC although CDC was completely abolished90.    These  studies  demonstrate  clear  benefits  to  employing  multivalent  Rtx  constructs  as  opposed  to  bivalent  Rtx.    Importantly,  nearly  all  reports  on  multivalent  Rtx  have  employed  constructs  with  valences  that  generally  do  not  exceed  10.    Higher  valences  are  occasionally  employed when different types of nanoparticle formulations are saturated with Ab, but the valences  of such constructs are undefined and/or quite heterogeneous.   Multivalent Rtx‐LNPs, on the other  hand, represent constructs of defined valence, and valences as high as 250 have been obtained  in  sufficient quantities for in vitro experiments.    • 73   4.2.2  Hypotheses  concerning  the  observed  increases  in  apoptosis  induced  by  Rtx­LNP   Previous work has shown that Rtx‐LNPs of valence ~90 induce significantly elevated levels of  apoptosis  in  target  lymphoma  cells  compared  to  bivalent  Rtx  (Fig.  2.2C &  D)7, 16.  There  are  two  possible scenarios with respect to this observed enhancement of the direct mechanism of action: (1)  the chemical modification imparted on the Ab and coupling to liposomes induces an increase in the  apoptotic potency of the Ab itself, or (2) the multivalent Ab, through hypercrosslinking of its target  in  the  plasma  membrane,  is  responsible  for  the  enhanced  apoptosis  through  an  undefined  mechanism.   For equivalent doses of Rtx, scenario  (1) would result  in equal amounts of apoptosis  induced by Rtx‐LNPs of different valence because the effect is due specifically to the Ab; this would  result  in  valence‐independent  levels  of  apoptosis.   On  the  other  hand,  scenario  (2) would  show  valence‐dependent  apoptosis  levels  because  the  valence  is  correlated  with  the  degree  of  crosslinking that the Ab is able to impart; higher valences can hypercrosslink more appreciably than  lower valences.    These  scenarios  can  be  tested  by  creating  Rtx‐LNPs  of  different  valence  using  the  methodology  described  in  Chapter  3  and  adding  them  to  CD20+  lymphoma  cells  to  determine  whether the resulting  levels of apoptosis are valence‐independent or ‐dependent.   With the ability  to reproducibly prepare specific valences over a wide range (2 to 250), we are able to carry out one  of  the  first  studies  that  systematically  examines  the  effects  of  increasing  degrees  of  target  hypercrosslinking brought about by different valences of multivalent Abs.          • 74   4.3   Materials and methods  4.3.1  Materials  Rituximab (Rtx) and trastuzumab (Trz) were obtained from the BC Cancer Agency pharmacy  (Vancouver  BC,  Canada).    Hanks’  balanced  salt  solution  (modified,  without  phenol  red)  was  purchased  from  Stemcell  Technologies  (Vancouver  BC,  Canada).    AlamarBlue,  Annexin‐V  binding  buffer,  recombinant  human  Annexin‐V  labelled with  fluorescein  isothiocyanate  (Annexin‐V‐FITC),  and an Alexa Fluor 647  (A647) monoclonal antibody  labeling kit were  from  Invitrogen  (Burlington  ON,  Canada).    FITC‐labeled  anti‐Rtx  Ab  (FITC‐anti‐Rtx),  A647‐labeled  monoclonal  anti‐CD20  Ab  (A647‐mCD20),  and  A647‐labeled mouse  IgG2a  negative  control  Ab  (A647‐neg)  were  from  AbD  Serotec  (Kidlington, UK).   Glass  cover  slips  (8 mm)  and  paraformaldehyde were  purchased  from  Electron  Microscopy  Sciences.    Phycoerythrin‐conjugated  anti‐human‐IgG  Ab  (PE‐anti‐IgG)  and  polyclonal  anti‐CD20  Ab  were  purchased  from  Santa  Cruz  Biotechnology  (Santa  Cruz  CA,  USA).   FluorSave  reagent was obtained  from Calbiochem  (Billerica MA, USA). Unless noted otherwise, all  other reagents were obtained from Sigma‐Aldrich and were of the highest quality available.    4.3.2  Cell lines  Ramos cells (a Burkitt’s lymphoma cell line) were a kind gift from Dr. Robert Kay (Terry Fox  Laboratory, Vancouver BC, Canada), and Z138 mantle cell lymphoma cells were generously provided  by  Dr.  Zeev  Estrov  (University  of  Texas)  and  previously  characterized127.    Both  cell  lines  were  maintained  in  RPMI  1640  medium  from  Stemcell  Technologies  (Vancouver  BC,  Canada)  supplemented with 10 % (v/v) fetal bovine serum and 2 mM L‐glutamine from Invitrogen, as well as  penicillin‐streptomysin from Stemcell Technologies.  Cells were maintained at 37 °C in a humidified  atmosphere containing 5% CO2.  • 75   4.3.3  Preparation of Rtx­LNPs     Rtx‐LNPs were prepared using the methodology described  in Chapter 3 and summarized  in  Figure  3.1.      Three  separate  batches  of  four  valences  each  were  prepared  over  the  course  of  approximately six weeks and  the resulting valences ranged  from 13 to 165.   The valences and Rtx  concentrations in each preparation were quantified as described in the previous chapter.  4.3.4  Measurement of levels of bound Rtx and free CD20 after treatment with Rtx  or Rtx­LNP    To examine the relationship between the amount of Rtx bound to CD20+ B‐cell  lymphoma  cells and the levels of CD20 on the cell surface that are free from Rtx, 1.25 × 105 Ramos or Z138 cells  in 250  μL medium were  treated with doses of Rtx or Rtx‐LNP  ranging  from 0–30  μg.   After a 1 h  incubation  at  37  oC,  the  cells  were  transferred  to  Eppendorf  tubes,  washed  with  cold  PBSB  (phosphate‐buffered saline (PBS) + 0.1% bovine serum albumin, pH 7.4), resuspended in 20 µL PBSB,  and stained with 1 µL each of FITC‐anti‐Rtx and A647‐mCD20.  The latter Ab is blocked from binding  to CD20 if Rtx is already bound, and the former one measures levels of Rtx.  After staining for 1 h on  ice,  cells  were  washed  with  PBSB,  then  resuspended  in  300  µL  PBSB,  filtered  through  35  µm  strainers, and analyzed on a FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) collecting  10,000 events for each sample.   Fluorescence  intensities were obtained from analysis using FlowJo  software, and  triplicates were averaged  to obtain mean  fluorescence  intensities  (MFIs).   For each  dose, the MFI from the appropriate negative control was subtracted from each measured MFI value  before being scaled relative to the maximum value  for each stain.   Data values are reported  in all  cases as mean ± standard deviation (SD).        • 76   4.3.5    Confocal laser­scanning fluorescence microscopy of treated cells  Ramos and Z138 cells were divided  in 48‐well plates with 2.5 × 105 cells  in 500 µL medium  per well.  Rtx‐LNPs and free Rtx were diluted to obtain equal Rtx concentrations across all samples,  and  the  required volume of Rtx‐LNP or  free Rtx was calculated.   Generally,  the  treatment volume  was between 100 and 200 µL for a 10 µg dose of Rtx.  After treatment times of up to 48 h, cells were  spun  in a microcentrifuge at 7000  rpm  for 15  s, washed with  serum‐free medium  (also  free of L‐ glutamine and penicillin‐streptomysin), then resuspended in 500 µL of cold serum‐free medium.  In  a cold room, a 50 µL volume of this suspension (5 × 104 cells) was transferred to an Eppendorf tube  and 1 µL of PE‐anti‐IgG was added.  The suspension was mixed and transferred onto an 8 mm poly‐L‐ lysine  glass  cover  slip onto which  cells were  allowed  to  adhere  for  1 h on  ice.    Liquid was  then  removed from the cover slip, it was gently washed with HBS, then cells were fixed by applying a 75  µL drop of 4% paraformaldehyde for 20 min at room temperature.   After fixing, the cover slip was  washed with  HBS  before mounting  onto  a  glass  slide  using  10  µL  of  FluorSave.    Samples were  allowed  to dry overnight  in closed Petri dishes protected  from  light, and were  imaged within  two  days  on  a  Bio‐Rad  2100MP  confocal  and  multiphoton  microscope  controlled  by  Zeiss/Biorad  Lasersharp  2000  software.    Negligible  staining  was  observed  in  fluorescence  images  of  control  samples consisting of Ramos cells not treated with Rtx (data not shown).  4.3.6    Measurement of total CD20 levels in treated cells  A polyclonal anti‐CD20 Ab was labeled with A647 using an antibody labeling kit according to  the manufacturer’s instructions.  Unlike the monoclonal A647‐mCD20 described in Section 4.3.4, the  resulting A647‐labeled polyclonal anti‐CD20 Ab (A647‐pCD20) exhibited equivalent staining of CD20  in the presence and absence of Rtx (data not shown).  Ramos and Z138 cells were divided in 48‐well  plates with 2.5 × 105 cells in 500 μL medium per well, and were treated with a 10 μg dose of Rtx or  Rtx‐LNP.   After an  incubation of up to 48 h, cells were stained with PI and A647‐pCD20, and were  • 77   analyzed  using  flow  cytometry,  as  described  in  Section  4.3.4.    Before  analysis,  cells  were  resuspended in PBSB containing 0.5 µg/mL propidium iodide (PI), and A647‐pCD20 MFI values in all  cases were calculated based on data from the viable (PI–) populations.   Here and  in all subsequent  cases, two‐tailed unpaired Student’s t‐tests were applied with a level of significance of 0.05.  4.3.7  Measurement of mitochondrial activity using AlamarBlue     To  evaluate  the  cytotoxicity  of  Rtx  and  Rtx‐LNPs,  AlamarBlue was  employed  to measure  mitochondrial activity in samples of treated cells.  In a 96‐well plate, 5  103 Ramos or Z138 cells in  100 µL medium were added to the wells, followed by 50 µL/well of Rtx or Rtx‐LNP at doses ranging  from 0.2 to 2000 ng/well.   After a 96 h  incubation, 10 μL of AlamarBlue were added per well, and  plates were  incubated  for  a  further  6  h  before  fluorescence measurements were  obtained  in  a  Fluorstar  plate  reader  with  excitation  and  emission  wavelengths  of  544  nm  and  590  nm,  respectively.  Larger emission intensities corresponded to higher mitochondrial activities and greater  fractions of viable cells.  4.3.8  Annexin­V/PI apoptosis assay using flow cytometry  This assay was also described in Section 2.3.6, but the modifications described here apply to  this and all subsequent chapters.  A total of 2.5 × 105 cells in 500 µL medium were treated with a 10  µg dose of Rtx.   For  time‐course experiments, cells were  incubated at 37  oC  for 4  to 72 h, and all  other experiments involved a 24 h incubation at 37 oC.  Cells treated with an equivalent mass of Trz  were  used  as  negative  controls,  and  for  positive  controls,  cells  were  treated  with  4.0  µM  camptothecin at 37 oC  for 4 h.   For analysis, samples were transferred to 1.5 mL Eppendorf tubes  and spun  in a microcentrifuge at 7000 rpm for 15 s.   Pellets were washed with 500 µL cold Hanks’  balanced salt solution.  Different positive control samples were unstained, single‐stained, or double‐ stained with Annexin‐V‐FITC and/or propidium  iodide  (PI); all other  samples were double‐stained.  • 78   Double staining consisted of resuspending the pellets in Annexin‐V‐FITC (5 µL) and binding buffer (40  µL), incubating at room temperature for 20 min, then adding 500 µL of a cold 0.5 µg/mL solution of  PI in Hanks’.   Samples were strained through 50 µM strainers, kept on ice, and analyzed within 1 h  on a Becton Dickinson  FACSCalibur  flow  cytometer.   Compensation  values were  set with positive  controls  and  at  least  10,000  events were  recorded  for  each  sample.    Early  apoptotic  cells were  defined  as  PI  negative  and  Annexin‐V‐FITC  positive,  necrotic  cells  were  positive  for  both  fluorophores, and viable cells were negative for both.        4.4   Results  4.4.1  Rtx­LNPs  exhibit  unique  binding  properties  to  CD20+  target  lymphoma  cells  In order  to  assess differences  in binding  properties of multivalent Rtx‐LNPs  compared  to  bivalent Rtx,  two different CD20+ cell  lines were employed: Ramos, a Burkitt’s  lymphoma cell  line,  and Z138, a mantle cell  lymphoma cell  line.   Two values were measured using flow cytometry: the  amount of Rtx that became bound to the cells, using a FITC‐anti‐Rtx Ab, and the amount of CD20 on  the cell surface free from bound Rtx, using the A647‐mCD20 Ab (see Section 4.3.4).  The binding of  Rtx  to CD20 completely  inhibits  the binding of A647‐mCD20,  thereby providing a practical way of  measuring unbound CD20.   A  titration of bivalent Rtx was  first performed across a 0–30 µg dose  range  given  to 1.25  × 105 Ramos  cells.   As  shown  in  Figure  4.1A,  the  amount of unbound CD20  (white bars) began to decrease at doses of 0.03 µg and above (p < 0.05 between the 0.01 and 0.03  µg doses), and at doses above 0.3 µg, essentially all cell‐surface CD20 molecules were saturated with  Rtx as reflected by the relative MFI values of zero (within error), which represent MFI values roughly  equal to those of negative isotype controls.  In terms of the amount of bound Rtx (black bars),   • 79         Figure 4.1  Levels of bound Rtx and unbound CD20 show an inverse correlation when cells are treated with bivalent Rtx  but not with Rtx‐LNP.  In all cases, 1.25 × 105 Ramos cells in 250 µL medium were treated with Rtx or Rtx‐LNP, then analyzed for levels of bound  Rtx (black bars) and unbound CD20 (white bars).  (A) The indicated doses of bivalent Rtx were given, and the results show  an inverse correlation between the amount of bound Rtx and the level of unbound CD20.  (B) Cells were treated with Rtx‐ LNP(158), and although the same relationship was observed compared to cells treated with Rtx, there was still a significant  proportion of unbound CD20 at the highest dose.   (C) Rtx‐LNPs of different valence were administered to Ramos cells at  the 3 µg dose.  Lower valences showed similar levels of bound Rtx to bivalent Rtx, but as the valence was increased at the  same dose, the amount of unbound CD20 also increased.  Higher valences also showed more elevated levels of bound Rtx.   Black bars: FITC‐anti‐Rtx staining; white bars: A647‐mCD20 staining.  MFI: mean fluorescence intensity.    ‐20 0 20 40 60 80 100 120 0 0.01 0.03 0.1 0.3 1 3 10 30 Re la ti ve  M FI Dose of Rtx / μg A ‐20 0 20 40 60 80 100 120 0 1 3 10 30 Re la ti ve  M FI Dose of Rtx (in Rtx‐LNP) / μg B ‐20 0 20 40 60 80 100 120 0 2 19 32 75 113 158 Re la ti ve  M FI Valence of Rtx‐LNP C • 80   measurable amounts appeared at doses of 0.03 µg and above, and the cells were saturated with Rtx  at doses of 3 µg and above (p < 0.005 between 1 and 3 μg doses; p > 0.05 for the 3, 10, and 30 μg  doses).  At doses between 0.1–0.3 µg, there were measurable amounts of both bound Rtx and free  CD20,  indicated that the cells were only partially saturated at these doses, and suggesting that the  point where the cells were half‐saturated (equal values of white and black bars) lied between these  two  doses.    Apart  from  Rtx  saturation  data  in  Ramos  cells,  this  figure  illustrates  that  the  Abs  employed  in  this  assay  function  as  expected,  given  the  excellent  inverse  correlation  observed  between  the data reported  from  the  two Abs.   Similar data was observed using  the Z138 cell  line  (data not shown).    A similar titration was next carried out using Rtx‐LNP of valence 158 (Rtx‐LNP(158)), and the  data  that was  obtained  is  shown  in  Figure  4.1B.    As with  the  data  shown  for  bivalent  Rtx,  the  measured amount of bound Rtx detected using FITC‐anti‐Rtx increased as the dose of Rtx‐LNP(158)  increased, but the dose at which Rtx‐LNP(158) saturated the cells was found to be 10 µg, which  is  higher than that of Rtx.  Moreover, the unscaled MFI measured when cells were saturated with Rtx‐ LNP(158)  (10 µg dose) was 984 after subtracting negative  isotype control;  this value  is 10.0  times  higher  than  the  same  value  for bound bivalent Rtx  at  the  same dose  in  Figure 4.1A  (98.7).    This  shows  that  the Ramos  cells  are  able  to bind  significantly more multivalent Rtx‐LNP  compared  to  bivalent Rtx.    In spite of the higher levels of bound Rtx, Figure 4.1B shows a significant fraction of CD20 on  the cell surface that does not have Rtx bound to it at doses of 3 µg and above (p > 0.05 for 3, 10, and  30 µg doses), which includes saturating doses.  For example, at the 30 µg dose of Rtx‐LNP(158), 41%  of the CD20 on the cell surface is free of Rtx.   Therefore, at saturating doses, although significantly  higher levels of Rtx are bound to cells after treatment with Rtx‐LNP compared to bivalent Rtx, only a  fraction of the Rtx in Rtx‐LNP physically binds to CD20, since under one half of the CD20 molecules  on the cell surface are free of Rtx when cells are saturated with Rtx‐LNP.   Note that the scaling of  • 81   black bars is different between Figures 4.1A–C, but the scaling of white bars is roughly the same; the  white bars are scaled according to cells in the absence of Rtx, but the black bars are scaled according  to the maximum measured levels of bound Rtx.  Finally,  Ramos  cells  were  treated  with  equivalent  doses  (3  µg)  of  Rtx‐LNPs  of  different  valence, and the binding properties were examined  in the same way.   The 3 µg dose was selected  because as shown  in Figure 4.1B,  the cells were not saturated with Rtx‐LNP(158) at this dose, but  cells  treated  with  bivalent  Rtx  were  just  saturated,  as  indicated  in  Figure  4.1A.    Figure  4.1C  summarizes the data for the treatment with the different valences.  The first feature worth noting is  that at the same dose of Rtx‐LNP, the lower valences (19 and 32) show equal levels of bound Rtx (p >  0.05) that are roughly equivalent to those measured for bivalent Rtx (albeit p < 0.05 between these  valences and valence 2).  Valences 2, 19, and 32, however, show increasing levels of unbound CD20  as the valence  increases (p < 0.05 for all pairs of valences).   As with the Rtx‐LNP titration  in Figure  4.1B, this suggests that not all Rtx in Rtx‐LNP is bound to CD20 on the cell surface at the same time,  but that at any given time there is a fraction of Rtx associated to the LNP that is not bound to CD20.    At  this  same  dose,  as  the  valence  increased  above  32, more  and more  bound  Rtx was  measured; for example, the unscaled MFI for Rtx‐LNP(32) was 133, while that for Rtx‐LNP(113) was  343, representing a 2.6‐fold increase in the Rtx signal (p < 0.0001) even though cells were given the  same dose of Rtx.   Because the dose that was employed  is below saturating  levels, this suggests a  greater avidity of  the Rtx‐LNPs of higher  valence.    Finally, even  though  the measured amount of  bound Rtx increased with the valence, so did the measured amount of unbound CD20, which was as  high  as  58%  unbound  CD20  at  the  highest  valence  of  158.    Valences  of  113  and  158  showed  equivalent  levels  of  bound Rtx  and  unbound  CD20  (p  >  0.05  for  both  parameters).    This  further  suggests that as opposed to bivalent Rtx, which is spread evenly across the cell surface, the binding  of Rtx‐LNP  causes  some plasma‐membrane CD20  to be present  in very high  local  concentrations,  while  some  CD20  is  not  bound  to Rtx.    In  other words,  this  supports  the  existence  of  Rtx/CD20  • 82   clusters that form between a fraction of Rtx in Rtx‐LNP and a fraction of CD20 present in the plasma  membrane.    4.4.2  Rtx­enriched domains are  found on cells  treated with Rtx­LNP but not on  those treated with bivalent Rtx  To examine the organization of Rtx/CD20  in the plasma membrane, the distribution of Rtx  on  the  cell  surface was  investigated using  confocal  laser‐scanning  fluorescence microscopy.   Cells  were treated with Rtx or Rtx‐LNP for different times then stained with an anti‐Rtx Ab to label Rtx on  the cell surface.  The images that were obtained, as shown in Figure 4.2, indicate that Rtx and Rtx‐ LNP became bound to Ramos cells as soon as 15 min after treatment, and remained associated 24 h  later.   Rtx  remained  associated up  to  48 h post‐treatment,  and  no  staining was observed  in  the  absence  of  Rtx  (not  shown).    Cells  that were  treated with  free  Rtx  showed  a  relatively  uniform  distribution of Rtx over the surface of the cell, but cells treated with Rtx‐LNP exhibited Rtx‐enriched  domains with significantly elevated fluorescence intensities on the cell surface (arrows in Figure 4.2).   The size of the domains was < 500 nm and they were visible at all time points between 15 min and  24 h after  treatment with Rtx‐LNP, although  they were most prevalent after 45 min.   At  this  time  point, there were between 0 and ~15 domains per cell, as found by counting the domains observed  in z‐stacked images (on average, 10 slices per cell).  No domains were present on Rtx‐treated cells at  any  time,  but  a  qualitative  rise  in  the  number  of  domains  per  cell was  observed  as  the  valence  increased:  on  average,  valence  53  showed  ~5  domains/cell  and  valence  121  showed  ~15  domains/cell.   Overall, these  images support the binding data  in Figure 4.1 which showed that for  equivalent doses, cells treated with the higher valences of Rtx‐LNP bound more Rtx but had more  unbound  CD20.    The  result  is  the  formation  of  Rtx‐enriched  domains  on  the  cell  surface  after  treatment with Rtx‐LNP, with a greater number of domains being formed as the valence increases.  • 83        Figure 4.2  Representative confocal fluorescence microscopy images of Rtx distribution on Ramos cells treated with Rtx  or Rtx‐LNP.  The distribution of Rtx on the cell surface  is shown at the  indicated time points after treatment with Rtx or Rtx‐LNP.   As  early as 15 min after treatment, and more pronouncedly at 45 min, Rtx‐enriched domains appeared on the surface of the  cells treated with Rtx‐LNP (arrows) but not those treated with Rtx.  Bar: 5 µm.    4.4.3  Expression of CD20 does not change substantially after treatment with Rtx­ LNP  The  previous  two  sections  showed  that  at  the  same  dose  of  Rtx,  CD20+  lymphoma  cells  bound more Rtx as the valence of Rtx‐LNP  increased.   The  increased  levels of bound Rtx occurred  although a significant fraction of CD20 on the cell surface was free from any bound Rtx, resulting in  the  formation of Rtx/CD20‐enriched  clusters  in  the plasma membrane.   One  important possibility  that could be responsible for this effect is that Rtx‐LNPs may cause an upregulation of CD20 to the  cell surface after binding, which would not only help explain the  increased binding capacity of Rtx  Valence: 2 (Rtx) 53 121 15 min                          45 min                           24 h • 84   but  also  the  large  fraction  of  unbound  CD20.    Note,  however,  that  the  data  in  Figure  4.1 was  obtained at a time point of 1 h post‐treatment.     The  total  expression  of  CD20  in  the  plasma  membrane  was  therefore  measured  after  treatment with Rtx and Rtx‐LNP at time points up to 48 h after treatment.  This was done using an  A647‐labeled  polyclonal  anti‐CD20  Ab  (A647‐pCD20;  see  Section  4.3.6).    Unlike  the monoclonal  A647‐mCD20 used  in Section 4.4.1, no measurable  interference was observed  in  the A647‐pCD20  signal when cells were pretreated with Rtx or Rtx‐LNP (data not shown).   The time course of CD20  expression  in the plasma membrane after treatment with Rtx or Rtx‐LNPs  is summarized  in Figure  4.3.  At all time points, levels of CD20  in the plasma membrane of cells treated with Rtx (light gray  bars) were  roughly equivalent  to  those  in cells  treated with HBS, as  indicated by  the  relative MFI  values of ~1.  At the 8 h time point, CD20 expression after Rtx‐LNP(52) and Rtx‐LNP(170) treatment  was maximal; measured MFI values were 1.7 and 1.9  times  those measured  in HBS‐treated  cells,  respectively.   These elevated  levels of CD20  in PI– cells were sustained up to 48 h post‐treatment.   Between all treatments up to and including 8 h, there was no significant difference between any of  the treatments (p > 0.05 between all possible pairs of treatments).  With the exception of the 16 h  time point,  there was no  significant difference between  the measured CD20 expression after Rtx‐ LNP(52)  and  Rtx‐LNP(170)  treatment  (p  <  0.05  only  at  16  h).   At  16  h  and  longer,  however,  the  differences between Rtx and either Rtx‐LNP treatment were significant  (p < 0.05 between Rtx and  Rtx‐LNP(52) and p < 0.01 between Rtx and Rtx‐LNP(170) in all cases).    It is unlikely, however, that the increases in CD20 expression after Rtx‐LNP treatment (~1.5  times those measured  in cells treated with Rtx) explain the data  in Figure 4.1 showing up to 10.0‐ fold higher levels of bound Rtx‐LNP compared to bivalent Rtx.  Moreover, such a modest increase in  CD20 expression cannot account  for  the high  levels of unbound CD20  (up  to 58%)  that were also  measured after treatment with Rtx‐LNP.   These data therefore do not support the hypothesis that  the results shown  in Figures 4.1 & 4.2 were an effect of CD20 upregulation.   They suggest  instead  • 85   that  a  reorganization  of  CD20  in  the  plasma membrane  occurred  following  Rtx‐LNP  treatment,  forming CD20/Rtx‐enriched microdomains that may play a role  in the therapeutic activity of these  constructs.         Figure 4.3  Time course of plasma‐membrane CD20 expression in Ramos cells treated with Rtx or Rtx‐LNP.  Using  a  polyclonal  anti‐CD20  Ab  (A647‐pCD20),  the  total  CD20  expression  in  the  plasma membrane  of  PI–  cells was  measured at different times after treatment with Rtx or Rtx‐LNP.  MFI: mean fluorescence intensity.    4.4.4  Cytotoxicity of Rtx­LNPs in two lymphoma cell lines  To assess  the cytotoxicity of Rtx‐LNP, a range of valences were added  to Ramos and Z138  lymphoma  cells.    Five doses of Rtx were  selected  (0.2–2000 ng;  see  Section  4.3.7) based on  the  binding data  in  Figure 4.1  as well  as on doses  employed  in previous  studies74, 168, 169.   Cells were  incubated for 96 h with the various Rtx‐LNP preparations or with free Rtx (valence 2) at each dose.   Figure  4.4  shows  that  in  both  cell  lines  at  the  highest  dose  (2.0  µg),  all  Rtx‐LNP  valences were  significantly more cytotoxic than free Rtx (p < 0.0005 for all valences).  At this dose, 39% of Ramos  cells were viable after treatment with Rtx with respect to control cells, compared to ≤ 1% viable cells  for all Rtx‐LNPs.  At the same dose, Z138 cells showed 86% viability with respect to control after Rtx  treatment, compared to 25–42% viability after treatment with Rtx‐LNPs.    0 1 2 3 1 4 8 16 24 36 48 M FI  (A 64 7‐p CD 20 ) re la ti ve  to  HB S Time / h 2 52 170 Valence: • 86     Figure 4.4  Particularly at higher doses, Rtx‐LNPs are significantly more cytotoxic than equivalent doses of free Rtx.    To each well of a 96‐well plate, 5  103 cells in 100 µL medium were added followed by 50 µL medium containing the dose  of Rtx  indicated  above.    The  control  consisted  of medium only.   Plates were  incubated  for  96 h  and  cell  viability was  measured using AlamarBlue.    Overall, Ramos cells were more sensitive to the cytotoxic effects of Rtx‐LNP, and for doses of  2.0 ng and above, all Rtx‐LNP valences were significantly more cytotoxic than free Rtx (p < 0.025 for  all valences).  At the 200 ng dose, there were 49% viable cells after Rtx treatment, compared to ≤ 5%  for Rtx‐LNPs (p < 0.0005 for all valences).  In Z138 cells, significant differences between Rtx and Rtx‐ LNP treatment began to appear at 20 ng for the valence of 121: 89% for Rtx, 74% for Rtx‐LNP(121) (p  < 0.005).   At the 200 ng dose, all valences showed significant difference compared to free Rtx (p <  0.05).    These  data  demonstrate  that  regardless  of  the  fact  that  equal  doses  of  Rtx  were  administered, Rtx‐LNPs are significantly more cytotoxic than Rtx.  4.4.5  Time dependence of apoptosis induced in lymphoma cells by Rtx­LNP  It  is  well‐documented  that  Rtx  induces  direct  apoptosis  in  lymphoma  cells  when  it  is  crosslinked on the cell surface using a reagent such as an anti‐human‐IgG secondary antibody7, 74‐76.   To  determine  if  the  cytotoxicity  observed  above  could  be  due  to  Rtx‐LNPs  directly  inducing  0.0 0.4 0.8 1.2 0.1 10 1000 M FI  (re la ti ve  to  co nt ro l) Dose of Rtx / ng A Ramos 0.0 0.4 0.8 1.2 0.1 10 1000 M FI  (re la ti ve  to  co nt ro l) Dose of Rtx / ng B 2 19 53 72 121 Z138 Valence: • 87   apoptosis  on  their  own  without  hypercrosslinking,  the  ability  of  Rtx  and  Rtx‐LNPs  to  induce  apoptosis  in  the  same  two  cell  lines was  examined.    Figure  4.5A  illustrates  the  flow  cytometric  Annexin‐V‐FITC/PI assay that was employed.  This figure shows that levels of apoptosis after treating  Ramos  cells with Rtx were  similar  to  those after  treatment with HBS,  confirming  that Rtx,  in  the  absence of crosslinking, does not elicit apoptosis  in vitro.   Figure 4.5A also demonstrates  that  the  precursors to Rtx‐LNP (Rtx‐biotin and Neut‐LNP) did not induce apoptosis on their own, and neither  did a mixture of unbiotinylated Rtx and Neut‐LNP.   On the other hand,  treating cells with Rtx‐LNP  resulted  in the onset of significant  levels of apoptosis (bottom rightmost plot  in Figure 4.5A).   This  indicates that as opposed to bivalent Rtx, Rtx‐LNP  induces apoptosis on  its own  in target cells, and  the  induction  of  apoptosis  depends  on  many  Rtx  molecules  being  associated  together  in  a  multivalent Rtx construct.  The time course of the induction of apoptosis was also measured by analyzing cells treated  with Rtx or two different valences of Rtx‐LNP at time points up to 48 h after treatment.  As shown in  Figure 4.5B, the percentage of Ramos cells in early apoptosis (Annexin‐V‐FITC+ / PI–) after treatment  with Rtx‐LNP(63) and Rtx‐LNP(158) increased sharply up to 16 h after treatment, and after 24 h, the  levels of early apoptosis subsequently decreased (p > 0.05 between the 16 and 24 h time points for  both  treatments).   The decrease after 24 h was associated with an  increased  fraction of necrotic  cells (Annexin‐V‐FITC+ / PI+; not shown).  Cells treated with HBS (valence 0) and bivalent Rtx did not  show peak levels at 24 h post‐treatment; the levels of apoptosis for both HBS and Rtx at 16 h were  equivalent to those at 0 h (p > 0.05 in both cases), but slight increases in apoptosis after treatment  with HBS or Rtx were observed at time points of 24 h and longer (from 2.9% at 0 h to 8.2% at 48 h).   However, at all  time points, HBS and Rtx  treatment resulted  in equivalent  levels of apoptosis  (p >  0.05).  A separate experiment revealed that Z138 cells also exhibited maximum levels of apoptosis at  a time point 24 h after treatment (data not shown).  Based on these data, the 24 h time point was  • 88   considered to be the time point when early apoptosis was considered maximal after treatment with  Rtx‐LNPs.      Figure 4.5  Rtx‐LNPs directly induce apoptosis in lymphoma cells while the individual precursors to Rtx‐LNP do not.  (A) To measure apoptosis levels, cells were stained with Annexin‐V‐FITC and PI and analyzed using flow cytometry.  Viable  cells were negative  for both dyes  (lower  left quadrant), early apoptotic  cells were Annexin‐V‐FITC+ and PI–  (lower  right  quadrant), and necrotic cells were positive for both dyes (upper right quadrant).  In this example, 5 × 105 Ramos cells were  treated with a 20 µg Rtx dose (or amount of Neut‐LNP equivalent to that given in the Rtx‐LNP treatment) for 24 h.  The Rtx‐ LNP treatment exhibited a significant  increase  in the  fraction of early apoptotic and necrotic cells compared to all other  treatments.    (B) Ramos  cells were  treated with HBS, Rtx, or Rtx‐LNP  (10 µg Rtx dose given  to 2.5 × 105  cells  in 500 µL  medium) and percentages of early apoptotic cells were measured at different times post‐treatment.   Maximum  levels of  A 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 100 101 102 103 104 104 103 102 101 100 104 103 102 101 100 90.1%90.6%91.0% 61.5%90.5%89.3% 8.4% 2.0% 2.4% 11.6%F lu or es ce nc e i nt en si ty   (P I) Fluorescence intensity   (Annexin‐V‐FITC) 7.4% Neut‐LNP HBS Rtx Rtx‐biotin Rtx +  Neut‐LNP Rtx‐LNP (val. 121) 5.3% 6.9% 26.7%6.5% 2.5%3.9%1.4% 0 25 50 75 0 8 16 24 36 48 %  of  ea rl y a po pt ot ic  ce lls Time / h 0 2 63 158 Valence: RamosB • 89   apoptosis occurred approximately 24 h after  treatment with Rtx‐LNP,  regardless of valence, while  free Rtx  showed  low  levels of apoptosis at all time points.  4.4.6  Levels of apoptosis in lymphoma cells depend on the valence of Rtx­LNP  At the time point where maximum apoptosis occurred (24 h), the apoptotic potency of the  various Rtx‐LNP valences was measured.  A total of 2.5 × 105 Ramos or Z138 cells were treated with  a 10 µg dose of Rtx, either in its bivalent form or in the different Rtx‐LNP valences.  Cells were also  treated with HBS (valence 0).   After an  incubation of 24 h, the viable and early apoptotic fractions  were measured as in the previous section, and are shown in Figure 4.6.  This figure clearly illustrates  that  higher  valences  of  Rtx‐LNPs  have  a  much  stronger  ability  to  directly  induce  apoptosis  in  lymphoma cells, even though the same dose of Rtx  is given  in all cases.   The  figure also shows an  inverse correlation between the viable and apoptotic populations (black and white symbols) in both  cell  lines,  indicating  a  shift  from  the  viable  population  to  the  early  apoptotic  population  due  to  exposure to Rtx‐LNP.    Figure 4.6  A valence‐dependent increase in the level of apoptosis is observed in Rtx‐LNP‐treated lymphoma cells even  though all cells are given equal doses of Rtx.    A total of 2.5 × 105 Ramos (A) or Z138 (B) cells were treated with a 10 µg dose of free Rtx (valence 2) or different valences  of Rtx‐LNP.  Valence 0 refers to treatment with HBS.  Percentages of early apoptotic and viable cells were measured as in  Figure 4.5.   At 24 h post‐treatment,  the higher valences of Rtx‐LNP  induced elevated apoptosis compared  to  the  lower  valences,  indicating  that  induction  of  apoptosis  by  Rtx‐LNP  is  valence‐dependent.    In  Ramos  cells, maximum  levels  of  apoptosis occurred at valences of approximately 100 and higher.  0 25 50 75 100 0 50 100 150 200 %  of  to ta l ce ll p op ul at io n Valence Ramos 0 25 50 75 100 0 100 200 %  of  to ta l ce ll p op ul at io n Valence Z138 viable early  apoptotic • 90   The Ramos cell line (Figure 4.6A) was more sensitive to direct induction of apoptosis by Rtx‐ LNPs  than  the Z138  line  (Figure 4.6B).    In Ramos cells,  treatment with Rtx  (valence 2)  resulted  in  4.5% early apoptotic cells after 24 h, and  this value  increased  to 21%  for Rtx‐LNP(19)  (p < 0.001),  while  in the Z138  line,  low equivalent  levels of apoptosis were observed up to a valence of 75 (p >  0.05 for all valences up to and including 75), and it was not until a valence of 113 when higher levels  of  apoptosis were observed  (18%,  compared  to 6.5%  for Rtx‐LNP(75); p < 0.05).    In Ramos  cells,  maximum levels of apoptosis (65%) occurred at valences of 100 and above (p > 0.05 for all pairs of  these valences), but it is unclear whether such a plateau was also observed in Z138 cells, although p  > 0.05 between valences of 113, 152, and 165.   These valences  show  levels of early apoptosis of  22%, which is significantly lower than those observed in Ramos cells, further indicating that the Z138  cell line is less sensitive to the direct induction of apoptosis compared to the Ramos line.  Overall,  these data  confirm  that  the apoptotic activity of Rtx‐LNP  is  significantly elevated  compared  to  bivalent  Rtx,  and  the  levels  of  apoptosis  are  valence‐dependent  in  two  different  lymphoma  cell  lines.    Increasing  the  valence  is  therefore  a method of  improving  the  therapeutic  activity of Rtx by enhancing  its direct mechanism of action.   The data  in  the Ramos  cell  line also  show that the optimal valence of Rtx‐LNP is 100, since no further increase in apoptosis occurred at  higher valences.   This  implies that,  in terms of the direct mechanism of action, there would be no  additional therapeutic benefit of using valences higher than 100.   4.5   Discussion and conclusions  4.5.1  Discussion  This  chapter  has  demonstrated  that  the  methodology  described  in  Chapter  3  can  be  employed to create multivalent Ab‐LNP constructs that possess unique biological properties (Figures  4.1–4.3) and significantly  improved therapeutic activity (Figures 4.4–4.6).   This chapter also proves  • 91   the concept that the methodology can be employed to identify Abs that show enhanced responses  when they are multivalent, such as Rtx, and also to identify the optimal valence of such multivalent  constructs (valence of 100 for multivalent Rtx; Figure 4.6A).  These constructs warrant further study  due to their potential in improving therapeutic antibody‐based cancer treatments.    The nature of the interaction between Rtx‐LNPs and CD20+ lymphoma cells uncovered here  provides interesting clues regarding the direct induction of apoptosis by Rtx‐LNP.  Figure 4.1A shows  that  increased doses of bivalent Rtx  correlated with decreased  levels of unbound CD20,  until  all  CD20  became  saturated  with  Rtx.    Saturating  cells  with  Rtx‐LNP(158)  in  Figure  4.1B,  however,  showed  that  10‐fold more  Rtx was  bound  to  the  cells  although  41%  of  CD20 was  unoccupied,  indicating that a significant proportion of Rtx bound to the cells was not associated with CD20.  This  could be due to the spherical structure of Rtx‐LNP interacting with CD20 in the plasma membrane.   When Rtx‐LNP is bound to the cell, the Rtx molecules closest to the cell surface are more accessible  to CD20 compared to those on the opposite side of the Rtx‐LNP.  The Rtx molecules on the opposite  side may therefore not bind directly to CD20 although they remain associated to the cell through the  Rtx‐LNP construct.        Moreover, Figure 4.1C showed that at the same dose of Rtx‐LNP, treatment with the higher  valences results  in elevated  levels of both bound Rtx and unbound CD20.   Although this may seem  counterintuitive,  it  can  be  explained  by  the  fact  that  for  Rtx‐LNPs,  equal  doses  of  Rtx  do  not  represent the same number of Rtx‐LNPs given to the cells.  Because the higher valences have more  Rtx molecules per Rtx‐LNP, the number of Rtx‐LNPs administered deceases as the valence increases,  when the dose of Rtx is held constant.    The  data  in  Figure  4.1C,  when  compared  to  that  in  Figure  4.6,  show  that  bivalent  Rtx  saturates all CD20 on the cell surface and induces low levels of apoptosis, while multivalent Rtx‐LNP  engages only a fraction of available CD20 and induces significantly higher apoptosis.  It is therefore  not  simply  the  number  of  Rtx/CD20  interactions  that  provides  the  stimulus  for  induction  of  • 92   apoptosis.    These  data  imply  that  instead,  high  local  concentrations  of  Rtx/CD20  in  the  plasma  membrane, such as in the microdomains shown in Figure 4.2, elicit the apoptotic signal.  Higher local  concentrations  of  Rtx/CD20  are  provided  by more  extensive  hypercrosslinking  of  CD20, which  is  facilitated by higher valences of Rtx‐LNP.  The Rtx‐LNP valences of 113 and 158 exhibited equivalent levels of bound Rtx and unbound  CD20 (Figure 4.1C), and in Figure 4.6A & B, they were shown to induce equivalent levels of apoptosis  in lymphoma cells (p > 0.05 for all parameters).  This suggests that the maximum levels of apoptosis  observed above the optimal valence of 100  in Figure 4.6 are related to equivalent  levels of bound  Rtx  and  unengaged  CD20;  in  other words,  it  suggests  that maximum  hypercrosslinking  of  CD20  achievable by Rtx‐LNP is correlated with maximum apoptosis observed in lymphoma cells.     We  showed  specifically  that multivalent  Rtx‐LNPs  are  considerably more  cytotoxic  than  bivalent Rtx  in  two  lymphoma cell  lines  (Figure 4.4) and  that  they  induce apoptosis  in  these cells  while  none  of  their  individual  constituents  do  (Figure  4.5A).   Moreover,  at  24  h  post‐treatment,  when levels of apoptosis were maximal (Figure 4.5B), the level of apoptosis induced in both cell lines  was directly related to the valence of Rtx‐LNP even though all cells were given equivalent doses of  Rtx  (Figure 4.6).   This clearly  shows  that by  increasing  the valence of Rtx,  its efficacy  is  improved  through  an  augmentation  of  the  direct  mechanism  of  action.    This  has  not  been  previously  demonstrated  for  Rtx,  likely  because  until  now  there  has  not  been  a  precise methodology  for  creating defined valences of multivalent Abs as high as those employed here.    The observation of valence‐dependent levels of apoptosis supports hypothesis (2) in Section  4.2.2, where different levels of hypercrosslinking resulting from multivalency are responsible for the  induction of apoptosis.  The different valences can therefore be used to study the direct mechanism  of action since one would also expect concomitant valence‐dependent signaling events that precede  apoptosis.  The direct mechanism of action of Rtx‐LNP is further explored in Chapters 5 and 6.  • 93   4.5.2  Conclusions  The methodology in Chapter 3 can be successfully used to create many Ab‐LNPs that differ in  terms  of  valence.   Multivalent  Rtx‐LNPs  prepared with  this methodology  exhibit  unique  binding  properties  to  CD20+  lymphoma  cells,  where  more  Rtx  is  associated  to  cells  as  the  valence  is  increased  although  there  is  a  significant  fraction  of  CD20  on  the  cell  surface  that  remains  unassociated  with  Rtx.    This  is  consistent  with  the  formation  of  Rtx/CD20‐enriched  domains  observed on cells treated with Rtx‐LNP.  Bivalent Rtx saturates all CD20 on the cell and results in low  cytotoxicity and  low  levels of apoptosis, while multivalent Rtx‐LNPs do not  saturate all CD20 and  result in higher cytotoxicity and high levels of apoptosis.  This indicates that the number of Rtx/CD20  interactions does not determine the therapeutic efficacy of multivalent Rtx; the clustering of CD20 in  the plasma membrane does  instead, which  is  facilitated by multivalent Rtx.   These results suggest  that it may be beneficial to apply the methodology in Chapter 3 to other therapeutic Abs such as Trz,  which has also shown benefits associated with multivalency7, 89, 109, 110.  Moreover,  the  Rtx‐LNP  constructs  of  higher  valence  are  capable  of  greater  hypercrosslinking, and levels of apoptosis were observed to depend on the valence even though all  cells were  given  the  same  dose  of  Rtx.    This  valence‐dependent  relationship  opens  the  door  to  studies  on  the  poorly  defined  direct mechanism  of  action  of  Rtx  because  signaling  events  that  precede and cause apoptosis would also be expected to be valence‐dependent.   The methodology  therefore provides a framework for probing the direct mechanism of action from a molecular point  of view.  • 94   5  A novel direct mechanism of action of multivalent rituximab  5.1  Synopsis  The previous  chapter  showed  that even  though  lymphoma  cells  can be given Rtx‐LNPs at  equivalent doses of Rtx, higher  level of apoptosis are  induced by the constructs of higher valence.   This  chapter  describes  studies  undertaken  to  understand  the mechanism  of  action  of  the  direct  induction of apoptosis by Rtx‐LNP.  5.2  Background  5.2.1  Extrinsic and intrinsic apoptosis pathways  Apoptosis occurs primarily through two distinct pathways, the intrinsic pathway (also known  as the mitochondrial or Bcl‐2 family regulated pathway) and the extrinsic pathway82, 86, 87.   The two  pathways  involve  distinct  initiator  caspases  that  set  each  pathway  in  motion,  while  they  both  converge on the activation of effector caspases such as caspase‐3, ‐6, and ‐7.  The intrinsic pathway  depends on  the  activation of  caspase‐9, which occurs  after perturbation of mitochondria due  to  cellular stress, growth factor withdrawal, or cytotoxic stimuli.   Death stimuli activate pro‐apoptotic  Bcl‐2  family members,  leading  to disruption of  the outer mitochondrial membrane and  release of  cytochrome c and other apoptosis‐inducing proteins into the cytosol.  Cytochrome c, along with the  adaptor protein APAF1, forms a complex termed the apoptosome, which activates caspase‐9, which  in  turn  leads  to  activation  of  effector  caspases.    Additional  caspase‐independent  cell  death  processes regulated by the Bcl‐2 family have also been described86.    In cancer treatment, apoptosis  is usually triggered  in oncogenic cells by chemotherapy and  irradiation through the  intrinsic pathway, since these agents cause cellular damage.   This pathway  • 95   usually  involves  requires p53  function, but mutations or  inhibiting proteins  impair p53  function  in  many human cancers.  In  this way,  tumour cells evade apoptosis and continue  to proliferate even  though  the  treatment  caused  genetic  instabilities82.    This  has  been  demonstrated  in  lymphoma  specifically; for example, the inhibition of the intrinsic apoptosis pathway downstream of caspase‐9  activation has been shown to cause resistance to chemotherapy in diffuse large B‐cell lymphomas170.     In the extrinsic apoptosis pathway, caspase‐8 is the critical initiator caspase.  The cleavage of  procaspase‐8 occurs in the death‐inducing signaling complex (DISC), a plasma membrane‐associated  complex  of  specific  proteins  that  is  responsible  for  initiating  the  extrinsic  pathway.    Activated  caspase‐8 is released into the cytosol from the DISC and goes on to activate the effector caspases87,  171.   Crosstalk between  the  two  apoptosis pathways  is  also well‐documented,  such  as  caspase‐8‐ mediated activation of proapoptotic Bcl‐2 family members, resulting in cytochrome c release.  Such  amplification of the extrinsic pathway through the  intrinsic pathway  is required  in some cell types  but not  in others82.   This highlights  that  the  intrinsic and extrinsic pathways are not distinct, but  interdependent.    5.2.2  The  death­inducing  signaling  complex  and  the  tumor  necrosis  factor  receptor superfamily  Besides procaspase‐8,  there are  two other essential  components of  the DISC: an adaptor  protein  (either  Fas‐associated  death  domain  (FADD)  or  TNFR‐associated  death  domain  (TRADD)),  and  a  death  receptor171, 172.   Death  receptors  constitute  specific members  of  the  tumor  necrosis  factor  receptor  (TNFR)  superfamily.    Discovery  of  the  TNFR  superfamily  was made  possible  by  observations  in 1868 where  tumors  in  some patients  showed  regression  following acute bacterial  infection, but it was not until 1975 that the term “tumor‐necrosis factor” (TNF) was coined82, 173.    The members of the TNFR superfamily are critically involved in maintenance of homeostasis  of the immune system.  They are type‐I transmembrane proteins with a C‐terminal intracellular tail,  • 96   a membrane‐spanning region, and an extracellular ligand‐binding N‐terminal domain.  The hallmark  of TNFR superfamily members is the presence of cysteine‐rich extracellular domains, the number of  which can vary from one to six, and which define ligand specificity.  Over 40 members of the TNFR  superfamily have been identified to date172, 174.  5.2.3  Death receptors  Death receptors are members of the TNFR superfamily characterized by an ~80 amino‐acid  cytoplasmic  “death  domain”  which  is  essential  for  the  induction  of  apoptosis.    When  the  cell  receives a proapoptotic signal, the death domain is responsible for recruiting FADD or TRADD, which  in turn recruits procaspase‐8, forming the DISC which leads to caspase‐8 activation175.  There are six  death  receptors  that have been  identified  to date;  the  four most extensively  studied are CD120a  (also  known  as  TNFR1  or  TNFRSF1A),  CD95  (Fas  receptor,  APO‐1,  or  TNFRSF6), DR4  (TRAILR1  or  TNFRSF10A),  and  DR5  (TRAILR2,  APO‐2,  or  TNFRSF10B)174,  176.    The  ligands  to  these  receptors,  respectively, are TNF‐α, Fas  ligand (FasL), and Apo2L/TRAIL (for both DR4 and DR5).   These  ligands  comprise  a  group  of  complementary  cytokines  that  are mainly  type‐II  transmembrane  proteins,  although some can be released as soluble cytokines upon proteolytic cleavage174, 176.    Almost all of the TNF ligands are expressed only by cells of the immune system, including B  cells, T cells, NK cells, monocytes and dendritic cells, but the TNFRs are expressed by a wide variety  of cells.  For example, no cell type in the body has yet been found that does not express CD120a177.   There  is also another subset of TNFR superfamily members known as decoy  receptors, which  lack  the death domain and  therefore have a nonsignaling role;  they compete with death receptors  for  ligand binding, thereby inhibiting death receptor function172.  Finally, the other two death receptors  that have not been mentioned, which in general are not as effective at inducing apoptosis, are DR3  (TNFRSF12) and DR6 (TNFRSF21)174, 178.    • 97   A common  requirement  to  form  the DISC  is  the oligomerization of death  receptors  in  the  plasma  membrane,  which  is  facilitated  with  ligand  binding  and  which  results  in  receptor  trimerization172,  174.    Although  ligand  binding  was  originally  thought  to  be  required  for  DISC  formation,  there  is  substantial  evidence  showing  the  formation  of  preassembled  death  receptor  complexes  (such  as  ones  containing  CD95  and  CD120a)  on  the  cell  surface  in  the  absence  of  ligand179.    This has been  shown  to occur due  to  interaction of  the membrane‐distal  extracellular  cysteine‐rich domain termed the preligand assembly domain180.   The ligand‐independent activation  of death receptors resulting in apoptosis is well‐documented in a variety of cases181‐186.  5.2.4  Deciphering the direct mechanism of action of multivalent Rtx  Rtx‐LNP was  shown  to  induce  apoptosis  in  target  lymphoma  cells  in  Figure  2.2,  and  the  levels  of  apoptosis  were  also  shown  to  be  valence‐dependent  in  Figure  4.6.    The  aims  of  the  experiments outlined  in  this chapter were to  first determine whether the observed apoptosis was  caspase‐dependent, and  if  so,  to determine  the pattern of  caspase activation  to discern whether  Rtx‐LNP was  inducing apoptosis through the intrinsic or extrinsic apoptosis pathway.   Based on the  known mechanisms of apoptosis described, further experiments were performed to determine the  specific  proteins  involved  in  the  mechanism  of  action  of  this  apoptosis.    Because  the  level  of  apoptosis  was  valence‐dependent,  signaling  events  directly  preceding  apoptosis  (such  as  concentrations of activated proteins that  induce apoptosis) were also valence‐dependent.   Finally,  the role of the  liposomal component  in the  induction of apoptosis by multivalent Rtx‐LNP was also  examined.        • 98   5.3  Materials and methods  5.3.1  Materials and cell lines    The  Vybrant  FAM  Caspase‐8  Assay  Kit,  Alexa  Fluor  488‐labeled  cholera  toxin  subunit  B  (A488‐CTX),  Annexin‐V  binding  buffer,  recombinant  human  Annexin‐V  labelled  with  fluorescein  isothiocyanate  (Annexin‐V‐FITC), and  the Alexa Fluor 647  (A647) monoclonal Ab  labeling  kit were  obtained  from  Invitrogen  (Burlington ON, Canada).   The SensoLyte AFC  (7‐amino‐4‐trifluoromethyl  coumarin) Caspase Profiling Kit was purchased  from AnaSpec  (Fremont CA, USA).      The  caspse‐8  inhibitor Z‐IETD‐FMK was obtained from R&D Systems (Minneapolis MN, USA).  The negative control  peptide Z‐FA‐FMK was obtained  from Santa Cruz Biotechnology  (Santa Cruz CA, USA).   The death  domain receptor antibody detection set was purchased from ProSci (Poway CA, USA).  A647‐labeled  Abs against CD120a (A647‐CD120a) and CD95 (A647‐CD95) as well as an A488‐labeled anti‐DR4 Ab  (A488‐DR4), an A488‐labeled mouse  IgG1 negative control, an A647‐labeled mouse  IgG2a negative  control, and a FITC‐labeled anti‐Rtx Ab (FITC‐anti‐Rtx) were obtained from AbD Serotec (Kidlington,  UK).    Streptavidin‐coated polystyrene microspheres with  a diameter of 100 nm  (streptavidin‐MS)  were purchased from Bangs Laboratories (Fishers IN, USA).  DyLight 649‐conjugated goat anti‐rabbit‐ IgG  F(ab’)2  fragment  (D649‐anti‐rabbit‐IgG) was  purchased  from  Jackson  ImmunoResearch  (West  Grove PA, USA).  Disposable PD‐10 columns (which contain Sephadex G‐25 medium) were obtained  from GE Healthcare Life Sciences (Piscataway NJ, USA).   Unless noted otherwise, all other reagents  were obtained from Sigma‐Aldrich and were of the highest quality available.    Ramos and Z138 cell lines were acquired and maintained as described in Section 4.3.2.  5.3.2  Preparation of Rtx­LNPs    The methodology described in Chapter 3 and summarized in Figure 3.1 was used to prepare  and characterize two separate batches (four valences each) of Rtx‐LNPs with valences up to 204.    • 99   5.3.3  Assay for quantifying caspase­8 levels in treated cells    The  Vybrant  FAM  Caspase‐8  Assay  Kit  was  employed  to  quantify  levels  of  caspase‐8  in  treated cells.  The kit contains the cell‐permeable and noncytotoxic peptide reagent FAM‐LETD‐FMK,  which contains an affinity peptide sequence specific  to activated caspase‐8  (leucine‐glutamic acid‐ threonine‐aspartic acid (LETD)).  Upon association with the peptide sequence, the probe covalently  binds  to  cleaved  caspase‐8  through  the  fluoromethyl  ketone  (FMK)  moiety,  while  the  FAM  (carboxyfluorescein) reporter has excitation and emission wavelengths of approximately 488 nm and  530  nm,  respectively.    Bound  FAM‐LETD‐FMK  remains  within  the  cell,  while  unbound  reagent  diffuses out and  is washed away.    In each well of a 48‐well plate, 2.5 × 105 Ramos cells  in 250 μL  medium were added and treated with HBS, Rtx, or Rtx‐LNP (10 μg dose).  For the time‐course study,  Rtx‐LNP(165)  was  employed  and  incubation  was  allowed  to  proceed  for  different  times  at  6  h  intervals up to 48 h after treatment.   For the valence‐dependence study, different valences of Rtx‐ LNP were employed and analysis was performed 24 h post‐treatment.  After the treatment time, 8.3  μL of a 30x FAM‐LETD‐FMK solution (prepared according to kit instructions) was added to each well  and the plate was gently shaken on a plate shaker for 3 min.  The plate was then incubated at 37 oC  and 5 % CO2  for 60 min, and the plate was mixed every 20 min during the  incubation.   Cells were  resuspended and transferred to Eppendorf tubes, spun  in a microcentrifuge at 7000 rpm  for 15 s,  washed  twice with wash  buffer  (500  μL  and  300  μL),  then  resuspended  in  350  μL wash  buffer  containing 0.2 μg/mL propidium iodide (PI) before analysis on a FACSCalibur flow cytometer (Becton  Dickinson,  San  Jose,  CA).    FAM  fluorescence was measured  in  the  FL1  channel.   Using  a  sample  where caspase‐8 was irreversibly inhibited using Z‐IETD‐FMK (cells were treated with 200 μM for 4 h  at 37 oC), a fluorescence intensity threshold in the FL1 channel was defined above which cells were  considered caspase‐8 positive.   Treatments were performed  in  triplicate, and data here and  in all  subsequent figures is shown as mean ± standard deviation (SD) unless noted otherwise.  Two‐tailed  unpaired Student’s t‐tests were performed in all cases with a level of significance of 0.05.  • 100   5.3.4  Profiling of caspases and inhibition of caspase­8    The  SensoLyte  AFC  Caspase  Profiling  Kit  was  used  according  to  the  manufacturer’s  instructions  to measure  levels of  cleaved  caspases 1, 2, 3 and 7  (3/7), 6, 8, and 9  in  response  to  different  treatments.   The kit contains a  substrates  specific  to each caspase  that contains an AFC  that when cleaved from the substrate by the caspase, has emission and excitation wavelengths of  approximately 380 nm and 500 nm, respectively.    A total of 2 × 106 Ramos cells in 2.0 mL medium were treated with HBS or an 80 μg dose of  Rtx or Rtx‐LNP(150) for 24 h.  For experiments involving inhibition of caspase‐8 using Z‐IETD‐FMK or  Z‐FA‐FMK (negative control), 200 μL of a 2.0 mM solution in cell culture medium were added to the  cells which were then  incubated for 4 h at 37 oC before treatment with Rtx‐LNP(150) as described  above.   A  positive  control  consisted  of  treatment with  4.0  μM  camptothecin  for  4  h.   After  the  incubation, cells were collected by centrifugation at 500g for 5 min, and the pellet was resuspended  in 1.3 mL of lysis buffer (provided with the kit).  The suspension was rotated on a rotating apparatus  for 30 min at 4 oC, then centrifuged at 2500g for 10 min at 4 oC.   A total of 50 μL of the resulting  caspase‐containing supernatant were added  to  the wells of a 96‐well plate containing  the various  substrates dissolved  in assay buffer and dithiothreitol  (DTT).   Samples were  in  triplicate  for every  caspase  for each  treatment.   Plates were  shaken and  read every 30 min  for up  to 3 h.   Average  fluorescence  intensities  were  calculated  after  subtracting  averages  of  blanks,  and  were  scaled  relative to HBS for each caspase.      The  Fluorstar  fluorescence  plate  reader was  calibrated  using  free  AFC,  and  fluorescence  readings were obtained in the linear range of an emission intensity versus AFC concentration plot.    5.3.5  Measurement of levels of death receptors using flow cytometry    To quantify levels of death receptors in treated cells, 2.5 × 105 Ramos or Z138 cells in 500 µL  medium were  treated with  a  10  μg  dose  of  Rtx,  Rtx‐LNP,  or  an  equivalent  volume  of HBS,  and  • 101   analyzed  at  different  times  after  treatment.    For  analysis  using  flow  cytometry,  cells  were  transferred to 1.5 mL Eppendorf tubes and spun in a microcentrifuge at 7000 rpm for 15 s.  Pellets  were washed with  cold PBSB  (phosphate‐buffered  saline  (PBS) + 0.1% bovine  serum albumin, pH  7.4) and resuspended in 20 µL PBSB.  An appropriate volume of each Ab was added and cells were  stained  for 1 h on  ice.   A  titration was performed on each Ab to determine  levels of saturation  in  each cell line and appropriate volumes of Ab required to be added (generally between 0.5 – 3.0 µL).   Primary labeled Abs consisted of A647‐CD95, A488‐DR4, and A647‐CD120a, and nonlabeled primary  Abs  included anti‐DR3, DR4, DR5, and DR6 Abs  from  the death domain  receptor Ab detection set  (see Section 5.3.1).    After  staining  for  1  h  on  ice,  cells  were  washed  with  cold  PBSB.    For  staining  with  a  secondary Ab (if required), pellets were resuspended in 20 µL cold PBSB containing 0.5 µL D649‐anti‐ rabbit‐IgG, incubated for an additional 1 h on ice, then washed again with cold PBSB.  Pellets were  then  resuspended  in 300 µL PBSB containing 0.5 µg/mL propidium  iodide  (PI),  filtered  through 35  µm  strainers,  and  analyzed  on  a  FACSCalibur  flow  cytometer  (Becton  Dickinson,  San  Jose,  CA)  collecting 10,000 events for each sample.   Appropriate single‐stained controls were run in all cases  to set compensation.   Fluorescence  intensities were obtained  from analysis with FlowJo software,  and  triplicates were averaged  to obtain mean  fluorescence  intensities  (MFIs).   For each dose,  the  MFI  from  the appropriate negative control was subtracted  from each measured MFI value before  being scaled to obtain relative MFIs.    5.3.6  Annexin­V/PI apoptosis assay and measurement of CD120a  levels within  apoptotic subpopulations    The Annexin‐V‐FITC apoptosis assay was performed as described in Section 4.3.8 using 2.5 ×  105  Ramos  cells  in  500  µL medium  and  a  10  µg  Rtx  dose,  and  cells were  co‐stained with A647‐ CD120a  (2  μL  /  sample) during Annexin‐V‐FITC  staining.   Quadrants were  set as described on  the  • 102   plots of PI  versus Annexin‐V‐FITC  fluorescence  intensity, and  the quadrants were  set as  separate  gates in order to measure the expression of CD120a within the early apoptotic (PI–/Annexin‐V‐FITC+),  necrotic  (PI+/Annexin‐V‐FITC+),  and  viable  (PI–/Annexin‐V‐FITC–)  populations.    Appropriate  single‐ stained and double‐stained positive controls (cells treated with 4.0 µM camptothecin at 37 oC for 4  h) were run to set compensation, and A647‐labeled IgG2a negative control was used to set the FL4  detector voltage (for A647 emission detection) such that the negative signal occurred within the first  decade.   Analysis of percentages within each population  and mean  fluorescence  intensities were  performed using FlowJo software.      5.3.7  Confocal laser­scanning fluorescence microscopy    Samples were prepared using  the  same procedure as described  in Section 4.3.5, with  the  exception of staining and the microscope used.  For staining of caspase‐8 using FAM‐LETD‐FMK, the  same procedure as described  in Section 5.3.4 was used;  for CD120a staining  (either on  its own or  after  caspase‐8  staining),  cells were  resuspended  in  20  µL  cold  PBSB  containing  an  appropriate  volume (determined by titration – Section 5.3.6) of A647‐CD120a and  incubated on  ice for 30 min,  then 5 × 104 cells were suspended  in a  total of 50 µL of cold serum‐free medium and allowed  to  adhere on each 8 mm poly‐L‐lysine glass cover slip for 1 h on ice before washing the cover slips with  HBS and fixing with paraformaldehyde as described in Section 4.3.5.  Sample preparation proceeded  as described in Section 4.3.5.        Samples  were  imaged  on  a  confocal  Eclipse  TE2000‐E  microscope  (Nikon  Instruments,  Melville NY, USA) controlled with EZ‐C1 software.   Acquired  images were converted to TIFF format  for presentation.        • 103   5.3.8  Preparation of Rtx­MS    To  prepare  Rtx‐MS,  Rtx  was  biotinylated  using  the  nickel  immobilized  metal  affinity  chromatography  (NIMAC) method described  in Section 3.3.6 with a 10‐fold molar excess of NHS‐ PEG‐biotin  with  respect  to  Rtx,  yielding  between  1  and  2  biotin  groups  per  Rtx  molecule.   Streptavidin‐MS were exchanged into HBS using a PD‐10 column in order to remove surfactants and  EDTA.  Based on the certificate of analysis provided by the manufacturer, a fivefold molar excess of  Rtx‐biotin was added with respect to streptavidin present in the streptavidin‐MS suspension in order  to produce Rtx‐MS.   The suspension was  incubated with stirring at room  temperature  for 30 min,  then at 4 oC for 12 h.  Unbound Rtx‐biotin was purified from Rtx‐MS using Sepharose CL‐4B columns  pre‐equilibrated with HBS.      5.4  Results  5.4.1  Caspase dependence of Rtx­LNP­induced apoptosis  To  determine  whether  Rtx‐LNP‐induced  apoptosis  proceeds  via  a  caspase‐dependent  mechanism,  the caspase‐8‐specific peptide  reagent FAM‐LETD‐FMK was employed  (Section 5.3.3).   Time‐course  experiments  were  performed  to  determine  the  activation  state  of  this  caspase  in  treated Ramos cells at different points after treatment.  As shown in Figure 5.1A, caspase‐8 was not  activated  in Ramos cells after treatment with HBS or Rtx, but  it was activated after treatment with  Rtx‐LNP(165).   The  fraction of  caspase‐8 positive  cells  increased until 30 h  after  treatment,  after  which point levels of caspase‐8 began to drop.  At the 30 h time point, 83 % of cells were found to  be caspase‐8‐positive compared to 19 % and 18 % for HBS and Rtx, respectively (p < 0.005 between  both Rtx‐LNP(165) and HBS/Rtx).  These data correlate with the apoptosis data in Figure 4.5B, which  shows a similar time course to the one observed here.  Moreover, the percentage of caspase‐8‐    • 104         Figure  5.1    Rtx‐LNP‐induced  apoptosis  is  dependent  on  the  activation of caspase‐8.  (A) Levels of cleaved caspase‐8 are shown with respect to time  in Ramos cells after different treatments.  (B) Expression levels  of  each  activated  caspase  are  shown  for  the  various  treatments  as  the  measured  fluorescence  values  after  subtracting  blanks  and  normalizing  to  HBS‐treated  samples.   By treating cells with a peptide inhibitor specific for caspase‐8  (Casp‐8  inh.)  for  4  h  and  then  treating  the  cells  with  Rtx‐ LNP(150), levels of nearly all activated caspases were reduced  to  levels  similar  to  blanks.  (C)  Levels  of  cleaved  caspase‐8  measured after treating Ramos cells with different valences of  Rtx‐LNP for 24 h.   0 25 50 75 100 0 20 40 60 %  Ca sp as e‐8  po si ti ve  ce lls Time / h 0 2 165 Valence: A ‐0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 1 2 3/7 6 8 9 Re la ti ve  ex pr es si on Caspase 0 2 150 150 +Casp‐8 inh. Valence: B 0 20 40 60 80 0 2 32 75 113 158 %  ca sp as e‐8  po si ti ve  ce lls Valence C • 105   positive cells  in Figure 5.1A  is roughly equal  to the sum of the percentages of early apoptotic and  necrotic cells in Figure 4.6A.  The elevated levels of caspase‐8 suggest that apoptosis occurred via the extrinsic apoptosis  pathway, which  involves  formation of  the DISC.   Next,  to determine  the pattern of  activation of  other  caspases,  the  levels  of  activated  caspases  1,  2,  3,  6,  7,  8,  and  9 were  profiled  24  h  after  treatment.     These data are shown  in Figure 5.1B and they  indicate that treatment of Ramos cells  with  Rtx  resulted  in  similar  levels  of  caspase  activation  as  treatment  with  HBS  (no  drug),  but  treatment with Rtx‐LNP(150) resulted in an approximately two‐fold higher level of detected cleaved  caspase levels for all caspases tested (p < 0.005 for every caspase between valences 0 or 2 and 150).   A positive control was also carried out by treating cells with 4.0 μM camptothecin for 4 h, and these  samples showed elevated levels of all caspases compared to HBS, particularly the reading from the  caspase 3/7 substrate, which was at  least 10‐fold higher than all other caspases (data not shown).   This  is expected since camptothecin  inhibits  topoisomerase  I, causing DNA damage  that  results  in  apoptosis  through  the  intrinsic pathway, which does not  involve caspase‐8‐dependent  initiation82,  187.    To determine whether caspase‐8 is responsible for the activation of the other caspases, cells  were  treated  for 4 h with  Z‐IETD‐FMK,  a  cell‐permeable,  irreversible peptide  inhibitor  specific  to  caspase‐8, followed with a 24 h treatment with Rtx‐LNP(150).  Figure 5.1B shows that the inhibition  of caspase‐8 resulted in a dramatic reduction in the levels of activated caspases down to levels that  were  roughly  one‐tenth  of  those  in  HBS‐treated  cells  (caspases  3/7  and  6)  or  similar  to  blanks  (caspases 1, 2, and 9).   The caspase with the highest  level of activation was caspase‐8  itself, which  was 0.33 with respect to HBS (p < 0.005 for every caspase between valences 0 or 2 and 150(Casp‐8  inh.)).    Ramos cells that were pretreated with equivalent amounts of Z‐FA‐FMK, a negative control  peptide that does not inhibit caspases, showed levels of cleaved caspases after treatment with Rtx‐ • 106   LNP(150)  that were  similar  to  those  after  treatment with  Rtx‐LNP(150)  alone  (data  not  shown).   Apoptosis was also significantly  reduced by  inhibiting caspase‐8;  treatment of Ramos cells with Z‐ IETD‐FMK followed by Rtx‐LNP(165) resulted in 11% of cells in early apoptosis, compared to 61% for  cells treated only with Rtx‐LNP(165)  (p < 0.001), as measured using  flow cytometry  (Section 5.3.6;  data not shown).  These data therefore indicate that the direct induction of apoptosis by Rtx‐LNP is  caspase‐dependent, and they are consistent with the role of caspase‐8 as the initiating caspase.    Since apoptosis induced by Rtx‐LNP is valence‐dependent as shown in Figure 4.6, one would  also expect that levels of activated caspase‐8 would show a valence‐dependent relationship.  Ramos  cells were therefore treated with different valences of Rtx‐LNP and caspase‐8 levels were measured.   Figure  5.1C  confirms  that  the  levels  of  activated  caspase‐8  are  valence‐dependent, with  higher  valences producing elevated  levels compared to  lower valences.     Ramos cells treated with HBS or  Rtx  showed  16  %  caspase‐8‐positive  cells,  while  treatment  with  Rtx‐LNP(158)  resulted  in  65  %  caspase‐8‐positive cells (p < 0.001).   These data, when taken together, reveal that Rtx‐LNP  induces  apoptosis in lymphoma cells via the caspase‐8‐dependent extrinsic apoptosis pathway.  5.4.2  Dependence  of  tumor  necrosis  factor  receptor  superfamily  member  expression on apoptosis induced by Rtx­LNP  As described in Section 5.2, the extrinsic apoptosis pathway involves formation of the DISC,  which normally contains specific members of  the TNFR superfamily.    In order  to determine which  receptor(s),  if  any,  initiate  the  extrinsic  apoptosis  pathway  after  treatment  with  Rtx‐LNP,  the  expression  levels  of  death  domain‐containing  death  receptors were measured  at  different  times  following treatment with HBS, Rtx, or Rtx‐LNP.  The data summarized in Figure 5.2 show the results  for  three key death  receptors: CD95  (Fas  receptor), death  receptor 4  (DR4), and CD120a  (TNFR‐I).   Figure 5.2A  summarizes  the  fluorescence  intensities measured  in  the  total Ramos  cell population  after staining with  fluorescently  labeled primary Abs against  the shown antigens.    In  the  total cell  • 107   population, DR4 showed very low staining over all treatments, and the labeling of CD95 was also low  and  constant  except  at  24  h  after  treatment with  Rtx‐LNP(165), where  the  relative MFI was  5.7  compared to 0.96 for HBS at the same time point (p < 0.05).  The most significant change was with  CD120a, where the relative MFI after treatment with Rtx‐LNP(165) was 9.2 after 4 h compared to 21  after 24 h  (p < 0.005  in both cases compared  to HBS at  the  same  time point).   The  total  staining  levels of CD95, DR4, and CD120a were similar in Z138 cells (data not shown).      Figure 5.2  CD120a expression is dramatically elevated in lymphoma cells after treatment with Rtx‐LNP.    Using  flow  cytometry,  the  relative  expression  levels  of  the  indicated  death  receptors were measured  in  the  total  cell  population  of  treated  Ramos  cells  (A)  as well  as  in  the  plasma membrane  of  Ramos  (B)  and  Z138  (C)  cells.    Plasma  membrane expression was obtained by measuring fluorescence intensities in the PI‐ population.  MFI, mean fluorescence  intensity.     0 4 8 12 16 20 24 0 4 24 0 4 24 0 4 24Re la ti ve  M FI  (to ta l ce ll p op ul at io n) Time / h CD95 Ramos DR4 CD120a A ‐1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 4 24 0 4 24 0 4 24 Re la ti ve  M FI  (P I– po pu la ti on ) Time / h 0 2 165 Valence: Ramos CD95 DR4 CD120a B 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 4 24 0 4 24 0 4 24 Re la ti ve  M FI  (P I– po pu la ti on ) Time / h 0 2 152 Valence: Z138 CD95 DR4 CD120a C • 108   Figure 5.2B & C show the  levels of each death receptor  in the plasma membrane after the  same  treatments, obtained by gating  for  the cells  that exclude PI.   The  same overall  trends were  observed in the PI– populations as in the total cell populations, with the levels of CD120a being the  highest of all the death receptors that were tested.  In general, levels of all death receptors did not  change after the start of treatment (0 h) in cells treated with HBS or Rtx.  Comparing Figure 5.2A to  Figure 5.2B, one notable observation was that most of the detected CD120a in Figure 5.2A after 4 h  was associated with the plasma membrane (relative MFI of 9.2 in Figure 5.2A and 6.4 in Figure 5.2B,  representing  70%  of  the  signal), while  the majority  after  24  h was  associated with  intracellular  staining (relative MFI of 21 in Figure 5.2A and 4.8 in Figure 5.2B; 23% of the signal).  Also, levels of  CD120a  in Ramos cells at 4 h after  treatment with Rtx‐LNP(165)  (relative MFI of 6.4) were higher  than those at 24 h (relative MFI 4.8) (p < 0.05), but the other death receptors showed highest levels  in the plasma membrane at 24 h (0.78 for DR4 (p < 0.005), 1.6 for CD95 (p < 0.0005; both compared  to HBS)).  Observations in Z138 cells (Figure 5.2C) paralleled those in Ramos cells, with the exception  that the average CD120a levels in the plasma membrane at 24 h after treatment with Rtx‐LNP(152)  were higher than those after 4 h (5.5 compared to 3.6), albeit the difference  is not significant (p >  0.05).    Levels of DR3, DR5,  and DR6  in Ramos  cells were  also  tested using  fluorescently  labeled  secondary Ab detection after staining with primary Abs (not shown); at 4 h and 24 h post‐treatment,  DR3 and DR6 showed similar expression as DR4 (total and PI– populations), and the expression levels  of DR5  lied  between  those  of DR3/DR4/DR6  and  CD95,  i.e.   DR3  ≈ DR4  ≈ DR6  < DR5  <  CD95  <  CD120a.    These data  indicate  a  global upregulation of death  receptors  in  the plasma membrane  following treatment with Rtx‐LNP but not Rtx, with CD120a undergoing by far the most significant  upregulation.  This indicates that CD120a may play a key role in the direct induction of apoptosis by  Rtx‐LNP.     • 109   5.4.3  CD120a  is  equally  upregulated  in  viable  and  early  apoptotic  cells  after  treatment with Rtx­LNP  With CD120a being the member of  the TNFR superfamily that  is most upregulated  in cells  treated with Rtx‐LNP, we further  investigated which subpopulations (viable, apoptotic, or necrotic)  expressed elevated  levels of CD120a.   As described  in Section 5.3.6, analysis was performed using  flow cytometry on HBS‐, Rtx‐, or Rtx‐LNP‐treated cells that were triple‐stained with Annexin‐V‐FITC,  PI, and Alexa Fluor 647  labeled anti‐CD120a Ab (A647‐CD120a).   As shown  in the  leftmost plots  in  Figure 5.3, cell populations were gated according to whether they were viable (V), early apoptotic  (A),  or  necrotic  (N),  and  within  each  subpopulation,  the  expression  of  CD120a  is  shown  in  the  corresponding dot plots.       Figure 5.3  CD120a levels are elevated in the viable and apoptotic fractions of Rtx‐LNP‐treated cells 8 h after treatment.    Ramos cells were treated with Rtx (A) or Rtx‐LNP(165) (B) for 8 h, then triple‐stained with Annexin‐V‐FITC, PI, and A647‐ CD120a.  Gates were set for each quadrant on a plot of PI versus Annexin‐V‐FITC fluorescence intensities (shown at the left  of the figure) using HBS‐treated cells as a negative control (not shown).  A647‐CD120a expression within each of the three  relevant quadrants is shown (V, viable; A, early apoptotic; N, necrotic).  Mean fluorescence intensities and percentages of  cells  in each population  are  indicated on  the dot plots.    The  fluorescence  intensities  in  viable  and apoptotic  cells  (PI–)  V  FSC FI  (A 64 7‐C D 12 0a ) FSCFSCFI (Annexin‐V‐FITC)  FI  (PI ) V A  N Rtx A N 2.2 %91.1 % 6.6 % 28.6 30.3 1598 V A  N Rtx‐LNP(165) FI (Annexin‐V‐FITC)  FI  (PI ) V  A N FI  (A 64 7‐C D 12 0a ) FSC FSCFSC 40.9 %40.0 % 18.8 % 157 166 1354 A B • 110   represent  the  expression  of  plasma membrane‐bound  CD120a, while  CD120a  in  necrotic  cells  is  significantly  elevated,  presumably  from  intracellular,  extracellular,  and  nonspecific  staining.    These  data  correlate  with  the  confocal  laser‐ scanning fluorescence microscopy images shown at the right of the figure, where elevated staining of A647‐CD120a (red) is  visible in Rtx‐LNP(165)‐treated cells, and necrotic cells are visible in both samples.  FI, fluorescence intensity.  Scale bars, 20  μm.     This experiment revealed that the expression of CD120a in viable and early apoptotic cells is  low in cells treated with Rtx but higher in cells treated with Rtx‐LNP(165).  In both cases, the viable  and early apoptotic fractions showed relatively equal levels of CD120a expression (shown directly on  the dot plots).   Since these fractions both constituted cells which excluded PI, these CD120a  levels  represent plasma membrane‐bound (extracellular) CD120a.  The mean fluorescence intensity (MFI)  of an A647‐labeled negative  isotype control under the same conditions was 14.4 (not shown), and  when this value is subtracted from the MFIs shown in Figure 5.3, the level of CD120a in the plasma  membrane of viable and early apoptotic cells after treatment with Rtx‐LNP(165) (Figure 5.3B) is 10‐ fold  higher  than  that  in  Rtx‐treated  cells  (Figure  5.3A).    The  data  for HBS‐treated  cells was  very  similar to that  for Rtx‐treated cells and  is therefore not shown.   Regardless of treatment, necrotic  cells  showed much  higher  CD120a  staining,  possibly  due  to  an  internal  pool  of  CD120a  and/or  nonspecific intracellular staining.   Confocal  laser‐scanning  fluorescence microscopy  images  seen  at  the  right  of  Figure  5.3  confirm the flow cytometry data since they show significantly higher levels of CD120a in the plasma  membrane of cells treated with Rtx‐LNP(165) compared to Rtx, and a few necrotic cells are visible in  both cases with high staining throughout the cells.  These data suggest that the direct mechanism of  action of Rtx‐LNP  involves upregulation and activation of CD120a  in  the plasma membrane.   This  CD120a would subsequently form DISCs with caspase‐8,  leading to apoptosis.   The upregulation of  CD120a in the plasma membrane can only be responsible for apoptosis if it precedes apoptosis, and  the observation that CD120a levels are equal in the viable and early apoptotic fractions of Rtx‐LNP‐ treated cells does initially suggest that CD120a upregulation occurs before the onset of apoptosis.    • 111   5.4.4  Time course and valence dependence of CD120a upregulation  Having established  that CD120a shows higher expression  in  the plasma membrane of Rtx‐ LNP‐treated lymphoma cells, we next determined the time course of CD120a upregulation.  At time  points  between  0  h  and  48  h,  plasma‐membrane  levels  of  CD120a  were measured  using  flow  cytometry by measuring  the  intensity of A647‐CD120a  staining within  the PI–  cell population.   As  shown in Figure 5.4A, these experiments revealed that CD120a expression increased in the plasma  membrane up to approximately 8 h post‐treatment, then decreased to relatively stable levels by 24  h  after  treatment.    This  is  contrasted  to  the A647‐CD120a  signal  from  the  total  cell  population,  which continued to  increase up to 48 h post‐treatment, consistent with Figure 5.2A & B  (data not  shown).  The maximum observed values were an 18‐fold higher CD120a expression (relative to HBS) 8  h after  treatment with Rtx‐LNP(158)  (p < 0.001 between  this and other  time points  for  the  same  treatment), and an 8.1‐fold higher expression at 16 h after treatment with Rtx‐LNP(63) (p > 0.05 for  the 8 h time point, and p < 0.05 for the other time points).   By 24 h post‐treatment, these relative  expression values decreased  to 5.2  (valence 158) and 3.8  (valence 63) with  respect  to HBS at  the  same time point.   Increases in plasma‐membrane CD120a levels were not observed in cells treated  with Rtx, which showed levels equal to HBS‐treated cells (relative MFI = 1 in Figure 5.4A) at all time  points  (p  >  0.05).    A  comparison  of  Figure  5.4A  to  Figure  4.5B  shows  that maximum  apoptosis  occurred  approximately  16  h  after  peak  plasma membrane  CD120a  levels  (peak  CD120a  at  8h,  apoptosis  at  24  h  post‐treatment).    This  time  course  is  consistent with  the  notion  that  Rtx‐LNP  treatment results in CD120a upregulation and activation leading to subsequent apoptosis.        • 112     Figure  5.4    CD120a  expression  levels  in  the  plasma membrane  are  highest  at  8  h  post‐treatment  and  are  valence‐ dependent.   (A) The expression of plasma membrane‐bound CD120a in non‐necrotic Ramos cells was significantly higher in cells treated  with Rtx‐LNP, suggesting that Rtx‐LNP causes upregulation of CD120a in the plasma membrane.  Peak CD120a levels in the  plasma membrane were observed approximately 8 h post‐treatment.   (B & C) The treatment of Ramos (B) and Z138 (C)  cells with Rtx‐LNPs of higher valence resulted in enhanced upregulation of CD120a in the plasma membrane.  This valence‐ dependent process mirrors the valence‐dependent levels of apoptosis induced by Rtx‐LNP shown in Figure 4.6.  MFI values  are shown on the histograms.      0 5 10 15 20 0 4 8 16 24 36 48 M FI  (A 64 7‐C D 12 0a ) re la ti ve  to  HB S Time / h 2 63 158 Valence: A Valence 2 19 32 100 113 158 165 MFI 75.0 80.1 141 214 213 620 636 A647‐CD120a  fluorescence intensity Co un ts Ramos A647‐CD120a  fluorescence intensity Valence 2 32 63 75 113 152 165 MFI 16.2 17.0 23.7 16.7 41.7 96.6 73.5 Co un ts Z138B C • 113     To  determine  if  CD120a  upregulation  corresponds  to  the  valence‐dependent  levels  of  apoptosis shown  in Figure 4.6,  the plasma membrane  levels of CD120a were next measured after  treating Ramos and Z138 cells with the various Rtx‐LNP valences.   Figure 5.4B & C illustrate that in  all  cases,  treatment  with  the  higher  valences  of  Rtx‐LNP  resulted  in  more  elevated  CD120a  expression, even though all cells were given the same dose of Rtx.  Measured levels of CD120a also  correlated with  the percentages of apoptotic  cells  in Figure 4.6  insofar as different valences  that  induced relatively the same amount of apoptosis also resulted in equal expression of CD120a in the  plasma membrane.  Moreover, the Z138 lymphoma cell line was less sensitive to apoptosis induced  by Rtx‐LNP, and  increases  in  the  levels of CD120a  in  this  cell  line were more modest  than  in  the  Ramos cell line.  Together, these data confirm that upregulation and activation of CD120a appears to  play a central role in the direct mechanism of action of Rtx‐LNP.   5.4.5  Colocalization of caspase­8 and CD120a  Next, confocal laser‐scanning fluorescence microscopy images were obtained of Ramos cells  treated with different valences of Rtx‐LNP and dual‐labeled with A647‐CD120a and FAM‐LETD‐FMK,  the  latter of which  labels cleaved caspsase‐8 (Section 5.3.3).   FAM‐LETD‐FMK  is plasma‐membrane  permeable,  but  cells were  not  permeabilized  prior  to A647‐CD120a  staining  in  order  to  visualize  CD120a only  in  the plasma membrane.   Representative  images  are  shown  in  Figure  5.5  for  cells  treated with Rtx‐LNP with valences of 32, 75, and 113.      • 114     Figure 5.5  Two slices of the same representative non‐necrotic Ramos cells 24 h after treatment with different valences  of Rtx‐LNP.    Activated caspase‐8‐rich regions (green; FAM‐LETD‐FMK emission) can be seen inside the cell colocalized with and directly  adjacent to CD120a‐enriched domains in the plasma membrane (red; A647‐CD120a emission), suggesting that CD120a and  Valence 32 75 113 • 115   caspase‐8  are  both  DISC  constituents.    As  the  valence  increased,  CD120a  expression  became  higher,  and  caspase‐8  activation became increasingly associated with plasma membrane CD120a.  Scale bars, 5 μm.      These  images visually confirm  that greater CD120a upregulation occurred after  treatment  with Rtx‐LNPs of higher valence, since  levels of CD120a (red) became more  intense as the valence  increased.    The  images  also  show  specific  colocalization  of  CD120a  and  caspase‐8,  as  well  as  caspase‐8  staining  in  the  intracellular  region directly adjacent  to CD120a‐enriched domains  in  the  plasma membrane;  this  is particularly  the case at  the higher valences.   Procaspase‐8  is cleaved  to  caspase‐8 while  it  is  bound  to  the  plasma membrane‐associated DISC;  after  cleavage,  caspase‐8  leaves the inner leaflet of the plasma membrane and enters the cytoplasm87, 171.  This is illustrated in  the images, which show an increasing degree of colocalized and adjacent caspase‐8 and CD120a as  the  valence  increased  from 32  to 113.   These  experiments  visually  imply  that Rtx‐LNP  treatment  results in CD120a upregulation and DISC formation with procaspase‐8, which is ultimately cleaved to  caspase‐8, resulting in the initiation of apoptosis.    5.4.6  CD120a  upregulation  and  direct  induction  of  apoptosis  result  from  Rtx  multivalency and not the liposomal component of Rtx­LNP  To  more  fully  understand  why  multivalent  Rtx‐LNP  induces  CD120a  upregulation,  CD120a/procaspase‐8 DISC formation, and significantly higher levels of apoptosis compared to equal  doses of Rtx,  it was  important  to  examine  the  role of  the  liposome  in Rtx‐LNP.   As described  in  Section 1.2.2,  the  liposome  serves  as  a  scaffold  for bridging many Rtx molecules  together  into  a  multivalent configuration, which  is distinct from traditional applications of  liposome technology.   If  the liposome serves only a structural role without contributing to CD120a upregulation or induction  of apoptosis, then the same effects should also be present when cells are treated with multivalent  Rtx constructs that are not based on liposomes.    • 116   As an alternative  to Rtx‐LNPs, polystyrene microspheres  (MS) with a diameter of 100 nm  were employed  to  create multivalent Rtx;  these MS have  the  same diameter as  the SUV used  to  prepare  Rtx‐LNPs.    To  mirror  the  preparation  of  Rtx‐LNPs  employed  in  Chapter  3,  Rtx  was  biotinylated on a NIMAC column under identical conditions (Section 3.3.6), and streptavidin‐coupled  MS  (streptavidin‐MS) were  saturated with Rtx‐biotin, as described  in Section 5.3.8.   The  resulting  Rtx‐MS were added to Ramos cells, and a dose‐response curve is shown in Figure 5.6A.  This figure  illustrates that Rtx‐MS induced significantly elevated levels of apoptosis compared to equal doses of  Rtx, which mirrors the behavior of Rtx‐LNP.   At a dose of 4.1 µg Rtx (in Rtx‐MS), 43% of cells were  undergoing  early  apoptosis  after  24  h,  while  for  doses  of  20.6  µg  and  higher,  equal  levels  of  apoptosis were observed for all doses (~60%); this is in contrast to 3–4% early apoptosis induced by  bivalent  Rtx  at  all  doses  tested  (not  shown).   Maximum  levels  of  early  apoptosis  observed  after  treatment with Rtx‐MS were similar to those measured after treatment with Rtx‐LNP, as shown  in  Figure 4.6A.  Another parallel between the two figures is the inverse relationship between the viable  and  apoptotic  cell  fractions,  indicating  that  in both  cases  cells were dying  via  apoptosis  and not  another  mechanism  of  cell  death  that  would  result  in  viable  cells  directly  becoming  necrotic.   Treatment of cells with Rtx‐biotin or  streptavidin‐MS  resulted  in  levels of apoptosis equivalent  to  treatment with HBS (not shown).      • 117     Figure 5.6  Apoptosis via upregulation of CD120a is not an effect of the liposomal component of the formulation of Rtx‐ LNP.   (A) Dose‐response curve for the treatment of 1.25  105 Ramos cells in 250 μL medium with Rtx‐MS for 24 h.  (B) Similar to  treatment with  Rtx‐LNP,  Ramos  cells  treated with  different  doses  of  Rtx‐MS  exhibited  increased  apoptosis  alongside  elevated plasma membrane CD120a  levels.   Both CD120a expression and apoptosis were measured 12h after treatment  (compared  to  24h  in  (A))  in  order  to  simultaneously  measure  CD120a  expression  and  early  apoptosis,  which  show  maximum values at 8h and 24h, respectively.        Cells were next treated with amounts of Rtx‐MS in the region where dose‐dependent levels  of apoptosis were observed (below a 25 µg Rtx dose).   Levels of CD120a  in the plasma membrane  and  apoptosis  were  measured  simultaneously  with  flow  cytometry  12  h  after  treatment.    The  resulting  data,  shown  in  Figure  5.6B,  show  that  the  dose‐dependent  increases  in  apoptosis  correspond  to elevated  levels of CD120a  in  the plasma membrane.   The  fraction of  cells  in early  apoptosis increased from 6.9 % to 16 % (2.3‐fold; p < 0.005) from 0 to 13.2 µg Rtx (in Rtx‐MS) while  the MFI  from A647‐CD120a  increased  from 43.7  to 402  (9.2‐fold; p < 0.0001)  for  the  same dose  difference.    Each  successively  higher  dose  in  this  figure  shows  an  elevated  CD120a  expression  compared  to  the  next  lowest  dose  (p  <  0.05  between  all A647‐CD120a MFIs).   However,  not  all  measured levels of apoptosis show differences that are statistically significant; p > 0.05 for doses of  0–3.3 µg  and 6.6–13.2 µg, but p  < 0.05  for pairs of doses when one dose  is  from each of  these  0 25 50 75 100 0 25 50 75 100 %  of  to ta l ce ll p op ul at io n Dose of Rtx (in Rtx‐MS) / µg Viable E. apoptotic A 0 1 2 3 4 0 1.7 3.3 6.6 13.2 Re la ti ve  va lu es Dose of Rtx (in Rtx‐MS) / µg CD120a exp. E. apoptotic B • 118   groups.  Note that apoptosis values in Figure 5.6B were measured at 12 h post‐treatment compared  to 24 h post‐treatment in Figure 5.6A; this was necessary to simultaneously measure CD120a levels  and apoptosis in the same cells, which show maximum values at 8 h and 24 h, respectively.  Overall,  these results demonstrate  that a  liposome specifically  is not required  to achieve beneficial effects  from multivalent Rtx because the same mechanism of action and maximum levels of apoptosis were  reproduced using a non‐liposomal formulation.    5.5  Discussion and conclusions  5.5.1  Discussion  The molecular basis of the direct mechanism of action of Rtx is poorly defined, but the work  in this chapter provides some of the first evidence explaining the direct induction of apoptosis that is  observed when Rtx is hypercrosslinked but not when it is bivalent (Sections 1.4.3 and 1.6.1).   After  cells  are  treated with Rtx‐LNP,  the direct mechanism uncovered here  consists of upregulation of  CD120a  in  the  plasma  membrane  followed  by  activation  of  caspase‐8  (consistent  with  CD120a/procaspase‐8 DISC formation) and subsequent apoptosis.    This mechanism  of  action  is  supported  by  the  observation  that  of  all  the  known  death  receptors, CD120a  showed  the highest upregulation after  treatment with Rtx‐LNP  (Figure 5.2).    It  was upregulated equally  in  the plasma membrane of both viable and early apoptotic cells  (Figure  5.3),  suggesting  that  upregulation  preceded  apoptosis.    This  was  confirmed  with  time‐course  experiments in Figure 5.4A which showed that peak plasma‐membrane CD120a levels occurred 8 h  after  treatment with  Rtx‐LNP, while maximum  apoptosis was  observed  24  h  after  treatment,  as  indicated in Figure 4.5B.  The time course of apoptosis was also consistent with the measured levels  of activated caspase‐8 over time shown in Figure 5.1A.  • 119    Moreover,  the  valence‐dependent  levels of CD120a  expression  in  the plasma membrane  (Figure 5.4B & C) corresponded to the valence‐dependent levels of activated caspase‐8 (Figure 5.1C)  as well  as  the  valence‐dependent  levels  of  apoptosis  in  Figure  4.6.    Finally,  the  same  CD120a‐ dependent mechanism was observed in two lymphoma cell lines (Ramos and Z138), and it was also  the  same  regardless  of  the  type  of multivalent  construct  used  (Rtx‐LNP  or  Rtx‐MS;  Figure  5.6).    Overall, this data supports a role of CD120a upregulation and activation in the direct mechanism of  action of multivalent Rtx.  Given  that  CD120a  is  expressed  in  all  human  cell  types  (Section  5.2.3),  there  are  innumerable  reported  instances of CD120a upregulation  in  the pathogenesis of a wide  variety of  diseases.  For example, its upregulation has been associated with cardiovascular diseases in diabetic  rats188, ocular allergic inflammation189, and response to treatment for chronic hepatitis C190.  Various  viruses, bacteria, and parasites also act by modulating the expression of CD120a, which may result in  caspase‐dependent  apoptosis  or  NF‐κB‐induced  expression  of  inflammatory  or  antiapoptotic  genes191.  In oncology specifically, CD120a has been shown to be upregulated by estrogen in human  breast adipose fibroblasts, serving as a mechanism that supports breast tumor growth192.  It was also  upregulated on endothelial cells in vitro and in vivo by endothelial monocyte activating polypeptide‐ II, a  tumor‐derived  inflammatory cytokine193.   Finally, CD120a was  shown  to be upregulated after  treating chronic lymphocytic leukemia (CLL) B‐cells with fludarabine, resulting in apoptosis194.    The molecular basis of CD120a upregulation in the plasma membrane has been described as  a method of sensitizing cells to its ligand, TNF‐α (refs. 172, 189, 193).  To test whether cells showed  increased sensitivity to TNF‐α following treatment with Rtx‐LNP, cells were treated with soluble TNF‐ α in the presence and absence of different valences of Rtx‐LNP.  In all cases, regardless of whether  Rtx‐LNP was added, the addition of TNF‐α to cells from 0.01 ng/mL to 1 μg/mL resulted in levels of  apoptosis equivalent to treatments in the absence of TNF‐α (data not shown).    • 120   This  strongly  suggests  that  Rtx‐LNP‐induced  apoptosis  through  CD120a  is  ligand‐ independent,  consistent with other  reports of  ligand‐independent death  receptor activation181‐186.   Although  previous  reports  have  indicated  that  soluble  TNF‐α  associates  with  CD120a  while  membrane‐bound  TNF‐α  associates  with  CD120b  (which  does  not  contain  a  death  domain)195,  ultimately  the  levels  of  soluble  and  plasma  membrane‐bound  TNF‐α  in  treated  and  untreated  samples  of  cells  should  be  measured  in  order  to  firmly  establish  ligand  independence  of  this  signaling process.    Together, this chapter provides a proof‐of‐concept that the methodology  in Chapter 3 can  be used to prepare many valences for use  in studying the mechanism of action of multivalent Ab‐ LNPs.    It also shows that non‐liposomal  formulations exhibit equivalent therapeutic activity  to Ab‐ LNPs  through  the same mechanism of action.   This  indicates  that  information obtained using Rtx‐ LNP in terms of the therapeutic activity of an Ab (for example, the valence at which optimal activity  is observed) can be employed  in  the development of  formulations of multivalent Abs  that do not  utilize  liposomes.   This may be useful  in cases where preparing many different valences of specific  non‐liposomal multivalent Abs is difficult or not feasible.    The  fact  that multivalent  therapeutic Abs  can  show enhanced efficacies  regardless of  the  specific formulation (Figure 5.6) further supports the conclusions of Chapter 4 where the improved  therapeutic effects were driven by hypercrosslinking of the target by the multivalent Ab.   It can be  envisioned that another method of hypercrosslinking would entail treatment with Ab followed by a  reagent  that hypercrosslinks  the Ab.   For example, as described  in Section 1.4.3, Rtx elicits higher  levels  of  apoptosis  when  bivalent  crosslinking  is  achieved  using  a  2oAb.    Another  conceivable  mechanism of hypercrosslinking may occur in vivo when the Fc region of Rtx present on lymphoma  cells  interacts with  FcγR  on  effector  cells  of  the  immune  system.    This  constitutes  a multivalent  interaction that is known to play a role in ADCC (Sections 1.4.2 & 2.2.2), but it has not been shown  to contribute to the direct mechanism of action of therapeutic Abs.   The results from this chapter  • 121   suggest  that  if  effector  cells  can  induce  apoptosis  in  Rtx‐treated  cells  by  a  CD120a‐dependent  mechanism, then they are capable of hypercrosslinking Rtx sufficiently to directly  induce apoptosis  in vivo.   This would  imply that a CD120a‐dependent mechanism of action  is not only applicable to  Rtx‐LNP,  but  also  to  regular  bivalent  Rtx  therapy,  shedding  light  on  the  poorly  defined  direct  mechanism of action of this drug.      5.5.2  Conclusions  The direct mechanism of action of multivalent Rtx constructs, including Rtx‐LNP and Rtx‐MS,  involves  the  induction of apoptosis  resulting  from CD120a upregulation  in  the plasma membrane  and  resultant activation of caspase‐8.    Inhibition of caspase‐8 significantly decreased  the  levels of  other activated caspases as well as Rtx‐LNP‐induced apoptosis.  This is consistent with the formation  of DISCs that include both CD120a and procaspase‐8, and confocal fluorescence microscopy images  showed  CD120a/caspase‐8  colocalization  as  well  as  caspase‐8  present  in  intracellular  regions  adjacent  to  CD120a‐enriched  domains  on  the  cell  surface.    Higher  valences  of  Rtx‐LNP,  which  induced greater levels of apoptosis, also caused more significant CD120a upregulation and caspase‐8  activation, supporting earlier conclusions that more extensive hypercrosslinking of CD20 drives this  direct mechanism of action.  Overall, this work provides a proof‐of‐concept that the methodology in  Chapter  3  can  be  used  to  prepare many  valences  of multivalent Ab‐LNPs  for  use  in mechanistic  studies, and  the results of such studies can be applied  to  the development of both  liposomal and  non‐liposomal multivalent formulations.        • 122   6  In vivo relevance of a CD120a­dependent mechanism of action of  rituximab  6.1  Synopsis  The previous chapter identified a novel mechanism of action of multivalent Rtx in vitro that  involves the upregulation of CD120a and ensuing apoptosis.  By considering recent work concerning  the molecular biology of CD120a, this chapter examines whether such a mechanism  is plausible  in  vivo  after  normal  bivalent  Rtx  therapy.    The  results  suggest  a  possible  treatment  strategy  for  improving the sensitivity of lymphoma cells to Rtx.  6.2  Background  6.2.1  The biology and function of CD120a  Unlike other death  receptors  (discussed  in  Section 5.2.3), CD120a  is primarily  involved  in  mediating  inflammation and not cell death174.    It  is often activated by  its  ligand, TNF‐α, which  is a  trivalent ligand found in two forms, a soluble form and a plasma membrane‐bound form.   TNF‐α is  also specific to another TNFR superfamily member, CD120b (also known as TNFR2), which  is not a  death receptor since it does not possess an intracellular death domain172.  It has been suggested that  the soluble form primarily activates CD120a while the membrane‐bound form activates CD120b195,  but CD120a appears to dominate TNF‐α signaling in most cell types174, 175.  TNF‐α  plays  a  key  role  in  inflammation  and  immunity,  as  well  as  the  proliferation  and  differentiation of many different cell types177.  Like almost all of the TNFR ligands, it is expressed by  cells of the  immune system,  including B cells, T cells, NK cells, and macrophages.   CD120a, on the  other hand, is expressed by every cell type in the body (Section 5.2.3), and although the other TNFR  family members are expressed by a wide variety of cells,  they are not done  so as ubiquitously as  • 123   CD120a177.    It  is  almost  exclusively  expressed  at  constitutively  low  levels  and  is  controlled  by  a  noninducible promoter174.   CD120a  and other TNFRs  contain  cysteine‐rich  repeats  in  their  extracellular domains  that  mediate homophilic  interactions  in  the absence of  ligand.   The preligand assembly domain  is  the  membrane‐distal first cysteine‐rich domain, and  it enables TNFRs to form homotrimers180.   Binding  of the trivalent ligand to the preformed complexes induces intracellular signal transduction.  Ligand  binding  is not always required for activation of the receptor, however, since signal transduction of  CD120a and other death receptors has been reported in the absence of ligand181‐186.   Once activated, CD120a is capable of  inducing both proapoptotic and antiapoptotic signals.   As  described  in  further  detail  below,  the  signal  that  is  transmitted  is  ultimately  dictated  by  the  compartmentalization  of  CD120a  in  the  plasma  membrane175.    Within  minutes  of  CD120a  engagement  in response to TNF‐α or  independent of  ligand, one of two complexes can be formed:  Complex  I, which  regulates  the expression of antiapoptotic proteins, or Complex  II, which  triggers  cell death196, 197.    Activation of CD120a induces the recruitment of specific proteins to the plasma membrane  (TRADD, RIP1, TRAF2, and c‐IAP1/2), resulting  in the formation of Complex  I.   These proteins then  undergo post‐translational modifications that lead to the translocation of NF‐κB to the nucleus and  transcription of antiapoptotic  target genes  such as  cFLIP,  cIAP‐1,  cIAP‐2, TRAF1, and TRAF2174, 177.   Alternatively,  Complex  II  can  form,  which  contains  the  DISC  as  described  in  Section  5.2.2.    It  therefore  contains  procaspase‐8,  which  upon  cleavage  to  caspase‐8,  induces  apoptosis  by  the  extrinsic pathway.  Complex II forms under conditions where Complex I activates JNK in a sustained  manner.   JNK  inhibits cFLIP, which  itself  inhibits the cleavage of procaspase‐8  in the DISC/Complex  II174, 177.    It has been  shown  that Complex  I  remains associated with  the plasma membrane while  clathrin‐dependent  endocytosis  of  Complex  II  is  required  for  proapoptotic  signaling,  although  endocytosis may be cell‐type dependent175.    • 124   Many  reports  have  demonstrated  that  Complex  I  efficiently  activates  NF‐κB  only  when  present  in plasma membrane  rafts  (see below).    This  is because  the necessary post‐translational  modifications required for NF‐κB activation can only take place  in the raft microenvironment174, 177.   Outside of  rafts, Complex  I  therefore  activates NF‐κB poorly,  and  the proapoptotic Complex  II  is  formed instead198.   6.2.2  Plasma membrane rafts    The  plasma membrane  is  an  extremely  heterogeneous  environment.    In  contrast  to  the  familiar “fluid mosaic” model of the plasma membrane199, the  local concentrations of proteins and  other  molecular  constituents  vary  considerably  across  the  membrane  surface200.    Normal  cell  signaling events depend on  these variations  in  local protein concentrations, and disruption of  this  regulation  is  a  factor  in  the  pathogenesis  of many  diseases  including  cancer201‐204.    These  non‐ random  arrangements  are  maintained  by  the  complex  interplay  that  separates  the  plasma  membrane  into  various  types  of  domains  such  as  clathrin‐coated  pits,  caveolae,  and membrane  rafts205.    Plasma membrane rafts are small (10–200 nm) domains, enriched in cholesterol (Chol) and  sphingolipids, that compartmentalize cellular processes206.  They are unstable and transient on their  own, but if stabilizing interactions arise, they aggregate into larger platforms207, and these platforms  play significant roles in cell signaling108, 208.    For example,  rafts and platforms  confine  specific proteins  to  small  regions of  the plasma  membrane, and only proteins within the same raft or platform may  interact with each other.   This  limits the number of other proteins with which a raft‐associated protein may interact209.  In addition,  membrane rafts are slightly thicker and more tightly packed than the contiguous fluid phase, which  may  impact protein conformation and thus function210.   Such spatial and temporal modulations of  local protein concentrations in the plasma membrane play key roles in signal transduction, including,  • 125   for  example,  those  of  IgE  Fc  receptor  I  (FcεRI)  and  the  T‐cell  antigen  receptor211‐213,  as well  as  Rtx/CD20  (see below).   Because  the plasma membrane  localization of a protein often dictates  the  signals it transmits, it is surprising that such information is usually not specified in traditional linear  signaling pathways.     The protein  composition of  rafts and  signaling platforms  is highly dynamic214‐217.   The  raft  affinity of  a  given membrane protein  is  affected by  (and  affects)  the  formation of  stabilized  raft  platforms as a result of lipid‐lipid, protein‐protein, and lipid‐protein interactions207.   One  important  example  is  that when  a moderately  raft‐associating  protein  becomes  oligomerized  as  a  result  of  crosslinking,  its raft affinity usually  increases or decreases108, 218‐220.   This has been shown  in model  membrane systems221, 222 as well as live cells223, 224.  Clearly this has implications with multivalent Ab  constructs, which hypercrosslink  their  target  in  the plasma membrane;  it would be expected  that  hypercrosslinking would modulate the raft affinity of the target.  In terms of Rtx, many studies have documented that the raft affinity of CD20  increases as  early as 15 min following Rtx treatment74, 168, 169.  Rtx induces apoptosis in CD20+ lymphoma cell lines  in culture only when  it  is crosslinked with  reagents such as a 2oAb  (Sections 1.4.3 and 1.6.1), and  crosslinking may be related to the modulation of CD20 raft affinity; some reports have shown that  apoptosis does not occur after Rtx/2oAb  treatment  if membrane  rafts are disrupted  through Chol  depletion74.   With  respect  to  the  relationship between  rafts  and CD120a, disrupting  rafts by depleting  cells  of  Chol  has  been  shown  in  numerous  instances  to  switch  antiapoptotic  CD120a  signaling  (Complex  I)  to proapoptotic  signaling  (Complex  II).   The Chol content of  the plasma membrane  is  therefore  one  factor  that  influences  the  dual  nature  of  CD120a  signaling174,  175,  177,  196‐198.    The  signaling of CD95  (Fas) has also been shown to depend on rafts, but unlike CD120a, CD95 triggers  apoptosis when  it  translocates  into  (rather  than  out  of)  rafts186.    The  interplay  between  CD20,  • 126   CD120a, and rafts after treatment with multivalent Rtx may therefore give clues to the mechanism  of action of the direct induction of apoptosis.  6.2.3  Studying plasma membrane rafts  6.2.3.1  Detergent­resistant membranes  The predominant biochemical means to assess the potential affinity of a protein to plasma  membrane rafts is through the analysis of detergent‐resistant membranes (DRMs).  It was originally  observed  that  raft  constituents were  insoluble  in  cold  nonionic  detergents  such  as  Triton  X‐100  (TX100), and that the resulting DRM fractions could be isolated by flotation using equilibrium density  gradient centrifugation225.  It was found that detergent resistance of proteins in DRMs was related to  Chol content226, so it was hypothesized that DRMs were equivalent to membrane rafts.    It became clear, however, that DRMs are in fact the result of an aggregation process that is  not  fully  understood227‐229.   Model membrane  studies have  shown  that  although  raft  lipids  resist  solubilization by detergent230, 231, the detergent can also artificially  induce the formation of rafts232.   DRM analysis has also been shown to be highly cell type‐dependent233.  Although useful as a tool to  initially  assess  raft  affinity,  DRMs  do  not  reflect  membrane  organization  under  physiological  conditions and therefore cannot be equated with rafts228.    Although  detergent  solubility  and  insolubility  are  not  strict  criteria  in  themselves,  the  usefulness of DRM analysis  lies  in observations of  changes  in DRM association upon  induction of  physiologically  relevant  stimuli234.    One  of  the  first  such  demonstrations  was  in  studies  on  the  allergic  immune  response, where  the multivalent  ligand  IgE  crosslinked  the FcεRI  receptor, which  became detergent  insoluble  along with  its downstream  effectors235.    The use of DRMs  therefore  represents a preliminary means of assessing raft affinity; differences  in detergent solubility before  and after biological stimuli can be used as a basis for raft affinity234.  • 127   Alternative  approaches  to  study  rafts have been described  including detergent  resistance  analysis on intact cells rather than cell lysate after ultracentrifugation236 as well as the preparation of  fractions enriched in raft constituents without the use of detergents237.  A common way to support  DRM data  is with confocal  laser‐scanning  fluorescence microscopy by observing  the colocalization  between  a  protein  of  interest  and  a  constituent  known  to  associate  constitutively with  rafts.   A  frequently  employed  raft marker  is  ganglioside  GM1, which  can  be  detected with  fluorescently  labeled cholera toxin B subunit (CTX)224.  To further study the raft affinity of a protein, data obtained  using DRMs and/or microscopy can be examined under conditions of modulated Chol content in the  plasma membrane.  Addition of Chol results in the formation of new rafts, while decreasing the Chol  content disrupts raft integrity238.    6.2.3.2    Manipulation of plasma membrane cholesterol content  MBCD is a reagent commonly used to remove Chol from the plasma membrane201, 238.  It is a  cyclic  oligosaccharide  with  hydrophilic  external  faces  and  a  hydrophobic  internal  cavity.    The  mechanism by which it efficiently removes Chol is related to its ability to lower the activation energy  for  Chol  efflux;  this  is  done  by  allowing  the  Chol  molecule  to  incorporate  directly  into  the  hydrophobic cavity without having to pass through an  intermediate aqueous phase.    It  is also this  property that allows MBCD to be an efficient donor of Chol, so by employing MBCD complexed with  Chol  (MBCD/Chol), cellular Chol content  can be enriched239.    It  is understood  that MBCD disrupts  plasma membrane  rafts  by  removal  of  Chol,  but  some  caution must  be  observed  because  other  cellular effects have been observed due  to MBCD  treatment  that are unrelated  to raft disruption,  such as disruption of exocytosis, blockage of clathrin‐coated endocytic vesicles, and disruption of the  actin cytoskeleton210.   It  is therefore  important to use more than one method of Chol depletion to  verify results obtained with MBCD.  • 128   Other methods of disrupting  rafts by Chol  interference  include  sequestration using  filipin,  nystatin or amphotericin, or inhibition of Chol synthesis using 3‐hydroxy‐3‐methylglutaryl coenzyme  A  (HMG‐CoA)  reductase  inhibitors,  also  known  as  statins240.    For  example,  simvastatin  is  a  drug  prescribed  for  lowering  total Chol  levels  in order  to  control hypercholesterolemia and  to prevent  atherosclerosis.    It  was  originally  marketed  under  the  trade  name  Zocor  but  is  now  available  generically  in most countries241.   Simvastatin  is also used  to  inhibit Chol synthesis  in cells  in vitro.   This results in the disruption of plasma membrane rafts by decreasing total plasma‐membrane Chol  levels240, 242, 243.  6.2.4  Can the direct mechanism of action of bivalent Rtx involve CD120a in vivo?  Chapter 5  illustrated  that  the mechanism of action of Rtx‐LNP  involves apoptosis resulting  from  the upregulation of CD120a.   This mechanism of action was observed  for different  types of  multivalent  Rtx  constructs  (Rtx‐LNP  and  Rtx‐MS),  suggesting  that  CD20  hypercrosslinking  was  responsible for the enhanced therapeutic effects as opposed to the liposomal or MS component of  the  formulation.   This chapter extends  these  findings  to  investigate whether a CD120a‐dependent  mechanism  could occur  in vivo after normal Rtx  therapy due  to hypercrosslinking of Rtx by FcγR‐ expressing effector cells of the  immune system.   Such a mechanism has not been demonstrated  in  vivo,  and  it  is  not  clear whether  FcγR  on  effector  cells would  be  capable  of  producing  sufficient  hypercrosslinking  to  induce  direct  therapeutic  effects.    It  is  known,  however,  that  adequate  hypercrosslinking of FcγR is achieved by Rtx in vivo to induce ADCC (Sections 1.4.2 & 2.2.2).    Based on the known function and biology of CD120a (Section 6.2.1), the experiments in this  chapter  also examine how modulation of  the plasma‐membrane Chol  content of  lymphoma  cells  influences the therapeutic efficacy of multivalent Rtx.  Under conditions of increased and decreased  plasma‐membrane Chol concentrations,  levels of apoptosis as well as CD120a detergent resistance  and membrane  raft  localization  are  characterized  after  treatment  with  multivalent  Rtx.    These  • 129   experiments  help  define  cases  where  lymphoma  cells  may  be  more  or  less  sensitive  to  Rtx  treatment, which is of particular interest because clinical resistance to Rtx is not well understood139,  140.    6.3  Materials and methods  6.3.1  Materials and cell lines    Alexa  Fluor 488‐labeled  cholera  toxin  subunit B  (A488‐CTX), Texas Red‐labeled phalloidin,  Annexin‐V binding buffer,  recombinant human Annexin‐V  labelled with  fluorescein  isothiocyanate  (Annexin‐V‐FITC),  an  Alexa  Fluor  568  (A568)  protein  labeling  kit,  and  an  Alexa  Fluor  647  (A647)  monoclonal Ab labeling kit were obtained from Invitrogen (Burlington ON, Canada).  Alexa Fluor 647  (A647)‐labeled  Abs  against  CD120a  (A647‐CD120a)  and  an  A647‐labeled  mouse  IgG2a  negative  control  were  obtained  from  AbD  Serotec  (Kidlington,  UK).    Streptavidin‐coated  polystyrene  microspheres with a diameter of 100 nm (streptavidin‐MS) were purchased from Bangs Laboratories  (Fishers  IN, USA).   A goat anti‐human‐Fcγ‐fragment secondary Ab  (2oAb) with no reactivity toward  the Fab region and minimal reactivity toward Fc regions of IgG of other species was purchased from  Jackson  ImmunoResearch  (West  Grove  PA,  USA).    Human  peripheral  blood  mononuclear  cells  (PBMCs)  from healthy donors, CTL‐Anti‐Aggregate‐Wash  supplement,  and CTL‐Test medium were  purchased  from Cellular  Technology  Ltd.  (Cleveland OH, USA).   Unless noted otherwise,  all other  reagents were obtained from Sigma‐Aldrich and were of the highest quality available.    Ramos and Z138 cell lines were acquired and maintained as described in Section 4.3.2.        • 130   6.3.2  Preparation of Rtx­LNP and Rtx­MS    The methodology described in Chapter 3 was used to prepare and characterize of Rtx‐LNPs  with valences up to 204.     Two separate batches of four valences each were prepared.   Please see  Section 5.3.8 for the procedure used to prepare Rtx‐MS.  6.3.3  Depletion and augmentation of plasma membrane cholesterol levels    To  deplete  the  plasma membrane  of  cells  of  Chol  using MBCD,  cells were  treated with  different concentrations of MBCD for times up to 16 h to determine the toxicity of MBCD in each cell  line used.  In Ramos cells, a final concentration of 0.2% MBCD (w/v) was not toxic but concentrations  of 0.3% and higher were.  MBCD treatment at concentrations up to 0.3% was performed at the same  time  as  treatment  with  Rtx,  Rtx‐LNP,  or  controls.    To  insert  additional  Chol  into  the  plasma  membrane, cells were treated with complexes consisting of Chol‐loaded MBCD (MBCD/Chol).  These  complexes were prepared as previously described239 using a stock solution containing 3.5 mM Chol  and 3.4% MBCD, representing a 25:1 mass ratio of MBCD to Chol.  MBCD/Chol was added to cells in  the  same  way  as  MBCD.    Reported  values  of  MBCD/Chol  added  are  with  respect  to  the  concentration of MBCD.      To  reduce  plasma  membrane  levels  of  Chol  through  inhibition  of  Chol  synthesis  using  simvastatin, a titration of simvastatin was performed in each cell line used in order to determine its  toxicity.  In Ramos cells, simvastatin was not toxic up to doses of 10 µM, but at doses of 30 µM and  above,  it was  found  to be cytotoxic after a 16 h  incubation  time.    In  the same way as MBCD and  MBCD/Chol,  simvastatin was added with Rtx, Rtx‐LNP, or  controls, and  incubated  for up  to 16 h.   Analyses were performed as described in previous sections.    • 131   6.3.4  Use of flow cytometry to determine levels of apoptosis or expression levels  of cell­surface proteins    Please see Sections 5.3.5–5.3.6; the same procedures were used.  6.3.5  Assay  for  quantifying  the  detergent  resistance  of  plasma  membrane­ associated proteins    A previously described method was used to quantify the degree to which plasma membrane  proteins  are  resistant  to  solubilization  by  the  nonionic  surfactant  TX100236.    Briefly,  cells  were  treated with HBS, Rtx, or Rtx‐LNP,  and  stained with  a  fluorescently  tagged Ab directed  against  a  plasma membrane  constituent  for which  the detergent  solubility was being measured  (treatment  and  staining were performed as described  in previous  sections).   Cells were  resuspended  in  cold  PBSB, and mean fluorescence  intensities (MFIs) of  labeled cells were measured  in triplicate before  (MFIlab)  and  after  (MFIlab+TX100)  treatment with  cold  TX100  at  a  concentration  of  0.2%  for  5 min.   Autofluorescence  of  unlabeled  cells  was  also measured  before  (MFIauto)  and  after  (MFIauto+TX100)  TX100 treatment.  The quantity defined as detergent resistance (DR) was then calculated as follows:   DR   =   (MFIlab+TX100 – MFIauto+TX100) / (MFIlab – MFIauto)  The method was verified using GM1 as a positive control  (using A488‐CTX) and CD95 as a  negative control  (using A647‐CD95).   GM1  is generally regarded as constitutively raft‐associated201  while CD95 is non‐raft‐associated in unstimulated cells198, 244.  The positive control showed DR values  approximately equal  to 1 while  for  the negative  control, DR < 0.35  (data not  shown).   The  same  measurements were performed after Chol depletion using 0.2% MBCD for 16 h, and the DR of the  positive control dropped to 0.54 or lower while the DR of the negative control was unaffected (not  shown).  These experiments verified that DR values close to 1 represent plasma membrane proteins  (or  lipids)  that  are  detergent‐resistant,  while  the  detergent  solubility  increases  as  DR  values  decrease.    • 132   6.3.6  Confocal laser­scanning fluorescence microscopy    Samples were prepared and imaged using the same procedure as described in Section 5.3.7.  The  labeling of GM1/plasma membrane  rafts with A488‐CTX was  carried out  in  the  same way as  A647‐CD120a  staining,  but  the  staining  of  F‐actin  staining  using  Texas  Red  phalloidin,  required  additional steps.  F‐actin labeling was carried out immediately after the step where cells were fixed  with paraformaldehyde.  Cover slips were washed with HBS and cells were permeabilized with 75 µL  of 0.5% Triton X‐100 (TX100)  in HBS for 5 min; samples were washed again with HBS, then a 25 µL  drop of PBSB containing 0.25 µL of a 0.2 U/µL Texas Red phalloidin was added for 20 min in order to  stain F‐actin, then washed with HBS.  Sample preparation, image acquisition, and analysis proceeded  as described in Section 5.3.7.  6.3.7  Experiments using Ramos cells pretreated with Rtx or A568­Rtx  followed  by addition of 2oAb or 2oAb­MS    Samples of 2oAb‐MS were prepared in the same way as Rtx‐MS as described in Section 5.3.8,  with Rtx being replaced with 2oAb.   A568‐labeled Rtx  (A568‐Rtx) was prepared using an A568 protein  labeling kit according  to  the manufacturer’s  instructions.   For experiments  involving 2oAb‐MS, Ramos cells were pretreated  with saturating levels (see Figure 4.1) of Rtx or A568‐Rtx (20 µg per 2.5 × 105 cells in 500 µL medium)  for 1 h at 37 oC.   Cells were washed with medium to remove unbound Rtx or A568‐Rtx, and were  subsequently treated with different amounts of 2oAb or 2oAb‐MS for different times, depending on  the experiment.         • 133    6.3.8  Coculture  of  treated  Ramos  cells  and  human  peripheral  blood  mononuclear cells    A sample of Rtx was labeled with A647 using an A647 monoclonal Ab labeling kit according  to the manufacturer’s  instructions to produce A647‐Rtx.   A647‐Rtx  induced apoptosis and elevated  CD120a expression upon hypercrosslinking with 2oAb‐MS  to an equivalent extent as unlabeled Rtx  (data not shown).   Ramos cells at 5.0 × 105 cells/mL were  treated with 20 µg/mL Rtx or A647‐Rtx  (see below)  or  an  equivalent  volume  of HBS  for  1 h  at  37  oC.   Cells were washed with CTL‐Test  medium to remove unbound Rtx or A647‐Rtx, and were resuspended  in CTL‐Test medium at 2.0 ×  106  cells/mL.    Cryopreserved  human  PBMCs  were  thawed  using  CTL‐Anti‐Aggregate‐Wash  supplement according to the provider’s  instructions, and were resuspended  in CTL‐Test medium at  4.0 × 106 cells/mL.  Viability was >98% as assessed by trypan blue exclusion.    Appropriate volumes of cells were combined to obtain different ratios of Ramos:PBMC cells  from 1:0 to 1:8, and CTL‐Test medium was added to bring the final cell concentration to 1.0 × 106  cells/mL.   Co‐incubation at 37 oC was allowed to proceed  for 16 h  for measurement of CD120a or  apoptosis levels.  Previous experiments showed that there were no differences between Ramos cells  grown  in  complete  culture medium  (Section  4.3.2)  or  in  CTL‐Test Medium  in  terms  of  CD120a  expression or apoptosis after 16 h (data not shown).    Different  triple‐staining  strategies were  employed  for  analysis,  and  in  all  cases,  positive  controls  consisted  of  Ramos  cells  treated  with  Rtx‐LNP(158)  and  single‐stained  with  each  fluorophore  and dual‐stained  in  every  combination  (to  set  compensation)  and  triple‐stained.   An  additional positive control for apoptosis consisting of treatment of cells with 4.0 µM camptothecin  for 4 h was also employed.   Negative controls consisted of PBMCs only  (no Rtx), Ramos cells only  (with and without Rtx), and a  combination  stained with an A647‐labeled negative  isotype control  (for A647‐CD120a measurements).    • 134   To identify Ramos cells from the PBMCs, the following preliminary experiments were carried  out.   For apoptosis measurements, Ramos cells were pretreated with A647‐Rtx, and after the 16 h  co‐incubation, cells were stained with Annexin‐V‐FITC and PI as described  in Section 4.3.8.   Ramos  cells were  identified  as  the A647‐Rtx+  population,  and  levels  of  apoptosis within  this  population  were measured.   On  the basis of  this population  identified on  the SSC versus FSC plot, apoptosis  levels were measured  in cells  treated with Rtx  instead of A647‐Rtx, and excellent agreement was  obtained between  the  two  values  (within 3%; data not  shown).   A negative  control  consisting of  PBMCs only revealed that 97% of PBMCs were excluded from this area.  For  levels  of  plasma membrane  CD120a,  cells were  stained with  FITC‐anti‐Rtx  and A647‐ CD120a before being  resuspended  in PBSB containing PI  (using  the  same procedure as  in Section  5.3.6).   Rtx‐treated Ramos cells were  identified as FITC‐anti‐Rtx+, and within this population, A647‐ CD120a  fluorescence  intensity was measured  in the PI– population to quantify  levels of CD120a  in  the plasma membrane.   Using  the  same  strategy as  in  the apoptosis measurements, a  sample of  cells  stained  only  with  PI  and  A647‐CD120a  showed  very  similar  levels  of  mean  fluorescence  intensities of A647‐CD120a as the cells stained with FITC‐anti‐Rtx (within 5%; data not shown).  These experiments  revealed  that gating on  the basis of a defined  region on a side scatter  (SSC) versus forward scatter (FSC) plot was an effective method of identifying Ramos cells from the  mixture of  cells.   Ramos  cells were  therefore pretreated with Rtx  and  cocultured with PBMCs  as  described above for 16 h, then stained with Annexin‐V‐FITC, PI, and A647‐CD120a.  As before, 97%  of  PBMCs were  excluded  from  the  defined  area.    Apoptosis  and  CD120a  levels were measured  simultaneously  in the same cells (similar to Section 5.3.7) that were either pretreated with HBS or  with Rtx.  Triplicates were prepared for every cocultured sample.      • 135   6.4   Results  6.4.1  Apoptosis induced by multivalent Rtx is cholesterol­dependent  The biology of CD120a is interesting in the sense that this receptor can serve either an anti‐ apoptotic  role  or  a  pro‐apoptotic  one,  depending  on  whether  it  is  localized  in  Chol‐dependent  plasma membrane  rafts  (Sections 6.2.1 & 6.2.2).   Since CD120a was  shown  to be  involved  in  the  mechanism of action of multivalent Rtx, the ability of multivalent Rtx to induce apoptosis in cells was  examined  under  conditions  of  decreased  or  increased  concentrations  of  Chol  in  the  plasma  membrane.   This  is because a CD120a‐dependent mechanism of action, such as that of Rtx‐LNP as  illustrated in the previous chapter, would be expected to be amplified or attenuated in response to  decreased or increased concentrations of Chol in the plasma membrane.  Using an established procedure (Section 6.3.5), we measured the detergent resistance (DR)  of CD120a and the  levels of apoptosis after different treatments under conditions of decreased or  increased  Chol  concentrations.    Controls  to  verify  the  DR  measurements  were  performed  as  described  in Section 6.3.5.   Ramos cells were  incubated  for 12 h with different concentrations of  MBCD or MBCD/Chol along with HBS, Rtx, Rtx‐LNP(152), or Rtx‐MS, and these data are illustrated in  Figure 6.1.  In general, the DR data support the Chol manipulation that occurred; the DR of CD120a  (gray bars) decreased as more Chol was removed  from  the membrane with MBCD, and  the DR of  CD120a increased or stayed the same when Chol was added.    • 136           Figure 6.1   The manipulation of plasma membrane Chol content using MBCD or MBCD/Chol significantly  impacts  the  ability of multivalent Rtx to induce apoptosis.   To modulate the Chol content of Ramos cells, the indicated doses of MBCD or MBCD/Chol were added simultaneously with  HBS or Rtx (A), or Rtx‐LNP(152) or Rtx‐MS (B).  In all cases, a 10 µg Rtx dose was given to 2.5 × 105 cells in 500 µL medium,  and  the  levels of early apoptosis and CD120a detergent  resistance  (DR) were measured after 12 h  in samples obtained  from the same population of treated cells.  In samples treated with Rtx‐LNP(152) and Rtx‐MS, elevated plasma membrane  Chol  levels  from  added  Chol/MBCD  inhibited  the multivalent  Rtx‐induced  apoptosis  that  occurred  under  normal  Chol  levels.  The same relative scales are used in (A) and (B).     0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 – – + – + – – + – + Re la ti ve  va lu es [MBCD] / %    DR (CD120a) Early apop. HBS Rtx 0         0.2                0.3            0         0.2           0.3 A Chol 0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 – – + – + – – + – + Re la ti ve  va lu es [MBCD] / %    DR (CD120a) Early apop. Rtx‐LNP(152) Rtx‐MS 0         0.2                0.3            0         0.2           0.3 B Chol • 137   Figure  6.1A  shows  that  after  treatment with HBS  or  Rtx,  a  concentration  of  0.2% MBCD  reduced  the DR of CD120a  to 65%  (HBS) or 72%  (Rtx) of  the value measured under normal Chol  concentrations  (p  <  0.05  in  both  cases).    Note  that  the  total  levels  of  CD120a  in  the  plasma  membrane of HBS‐ and Rtx‐treated cells are quite  low, particularly when compared to multivalent  Rtx‐treated cells (Figure 5.2).  Figure 6.1A also demonstrates that both HBS and bivalent Rtx showed  similar profiles  in  terms of  the  relationship between  levels of apoptosis and DR of CD120a under  different  Chol  concentrations;  specifically,  that  increased  apoptosis  occurred  under  conditions  of  decreased CD120a DR.    Importantly,  these data  illustrate  that a concentration of 0.3% MBCD was  toxic to cells under the conditions of these experiments, as shown by the large increase in apoptosis  observed  from 0.2%  to 0.3% MBCD  in HBS‐treated  cells  (6.8%  to 33%; p < 0.0001).    Insertion of  additional Chol into the membrane, however, was not toxic under the conditions tested, since levels  of apoptosis remained low (or were reduced) after all MBCD/Chol treatments.  Under equivalent conditions of Chol manipulation, Figure 6.1B shows the levels of apoptosis  and  CD120a  DR measured  after  cells were  treated with  Rtx‐LNP(152)  and  Rtx‐MS.    These  data  illustrate, like Figure 6.1A, that apoptosis was generally higher when the DR of CD120a was reduced.   One exception involves the Rtx‐LNP(152) treatment in Figure 6.1B.  When comparing the data in the  absence and presence of MBCD, the 0% and 0.2% MBCD treatments produced equivalent data (p >  0.05) but both the amount of apoptosis and the DR of CD120a were significantly reduced in the 0.3%  MBCD  sample  compared  to  the  0%  sample  (p  <  0.05  for  both  values).    Separate  experiments  revealed that a pretreatment of Rtx‐LNP with 0.3% MBCD resulted in an abolishment of the ability of  the construct to  induce apoptosis, most  likely due to disruption of the structure of the LNP, which  contains Chol.   Pretreatment with 0.3% MBCD/Chol did not affect the apoptotic activity of Rtx‐LNP  (data not shown).    Equivalent experiments were therefore performed with Rtx‐MS, a multivalent Rtx construct  that does not contain Chol, and as opposed to Rtx‐LNP(152) treatment, the data on the right‐hand  • 138   side of Figure 6.1B show that 0%, 0.2%, and 0.3% MBCD treatment resulted  in equivalent  levels of  apoptosis and DR of CD120a  (p > 0.05  for all pairs of the same parameter).   This shows that even  though  0.3% MBCD was  toxic  to  cells  in  the  absence  of multivalent  Rtx,  no  further  increase  in  apoptosis (or decrease in CD120a DR) was observed compared to treatment with the multivalent Rtx  constructs tested.    The most important observation from Figure 6.1B is that under conditions of increased Chol  content  in  the plasma membrane,  the apoptotic activity of multivalent Rtx was strikingly reduced.   For the Rtx‐LNP(152) treatment, a comparison of the 0% and 0.3% MBCD/Chol concentrations shows  that  apoptosis  was  reduced  from  34%  to  7.9%  (p  <  0.0001)  while  the  relative  DR  of  CD120a  increased from 0.61 to 0.79 (p < 0.05).  The same MBCD/Choltreatments in the presence of Rtx‐MS  reduced apoptosis from 22% to 7.5% (p < 0.0005) and  increased relative DR from 0.73 to 0.92 (p <  0.05).    In both cases, the  level of apoptosis after treatment with multivalent Rtx and 0.2% or 0.3%  MBCD/Chol was equivalent to that which was measured in cells treated with HBS in the absence of  MBCD (p > 0.05 in all cases).  To  further  investigate  the  phenomenon  where  increased  Chol  content  in  the  plasma  membrane  rescues  cells  from  the  apoptosis  induced  by multivalent  Rtx,  confocal  laser‐scanning  fluorescence microscopy images were obtained of cells treated with Rtx‐LNP(165) under conditions  of normal or increased plasma membrane Chol content.  Figure 6.2 shows representative images of  Ramos cells obtained 12 h after treatment; cells were stained as described in Section 6.3.6.  The blue  signal represents staining by A488‐CTX, which stains the plasma membrane raft marker ganglioside  GM1, while the red signal represents A647‐CD120a staining.   These two signals are shown on their  own  (first and  second panels on  the  left) and merged  (third panels).   Colocalization between  the  blue and red signals indicates CD120a that is associated with plasma membrane rafts.       • 139     Figure 6.2  Cells that are rescued from apoptosis by increasing the plasma membrane Chol content show elevated levels  of raft‐associated CD120a.   Representative  images of Ramos  cells  are  shown  that have been  treated with either Rtx‐LNP(165)  (A) or Rtx‐LNP(165)  +0.2% MBCD/Chol (B) under the same conditions as in Figure 6.1.  As described in Section 6.3.6, cells were stained before  permeabilization with A488‐CTX (blue; stains ganglioside GM1, a membrane raft marker) and A647‐CD120a (red), and after  permeabilization with Texas Red‐labeled phalloidin (green; stains the actin cytoskeleton).   Panels, from  left to right, are:  ganglioside GM1 staining only, CD120a staining only, a merge of the ganglioside GM1 and CD120a signals, and a merge of  all three signals.    When comparing the membrane raft association of CD120a between Figure 6.2A and 6.2B, it  is  evident  that  CD120a  was  almost  exclusively  found  in  membrane  rafts  under  conditions  of  increased Chol  (Figure 6.2B), while a greater  fraction of CD120a was  found outside of membrane  rafts under normal Chol concentrations (Figure 6.2A).  The same result was observed across a large  number  of  images.    Evidence  of  higher  plasma‐membrane  Chol  concentrations  in  Figure  6.2B  is  provided by the greater fraction of the plasma membrane covered by rafts (blue signal) compared to  Figure 6.2A.    The  rightmost panels  in  Figure  6.2  show  the A488‐CTX  and A647‐CD120a  signals merged  with  the  signal  from  Texas  Red  phalloidin, which  stains  F‐actin.    The  illustrated  F‐actin  staining  Rtx‐LNP(165)  +0.2% MBCD/Chol A B Rtx‐LNP(165) • 140   pattern consisting of wavy ring‐like structures on  the outer rim of  the cells  is characteristic of  the  cortical actin cytoskeleton and  is consistent with other reports245.   F‐actin staining was  less  intense  and  less uniform on  the  surface of  cells  treated with Rtx‐LNP(165)  in  the absence of MBCD/Chol  compared to in its presence.  F‐actin staining was also completely absent in necrotic cells, which only  showed high  intracellular  staining of A488‐CTX and A647‐CD120a,  consistent with Figure 5.3  (not  shown).  The F‐actin staining in Figure 6.2 confirms that the observed CD120a and rafts are present  on the cell surface, and that these cells would be considered either viable or early apoptotic using  the Annexin‐V/PI apoptosis assay.     6.4.2  Inhibition of cholesterol synthesis using simvastatin sensitizes cells to Rtx­ LNP­induced apoptosis     MBCD is widely used to deplete Chol from the plasma membrane, resulting in the disruption  of  plasma membrane  rafts,  but MBCD  is  known  to  induce  secondary  effects  on  some  cells,  as  described  in Section 6.2.3.   As an alternative means of reducing plasma membrane Chol levels, the  HMG‐CoA reductase  inhibitor simvastatin was employed, which has been shown to disrupt plasma  membrane  rafts240, 242, 243.   Unlike MBCD, which  removes Chol  from  lipid bilayers, simvastatin  is an  inhibitor  of  Chol  synthesis.    As  opposed  to  MBCD,  therefore,  pretreatment  of  Rtx‐LNP  with  simvastatin in the absence of cells (30 μM for 16 h) had no effect on its apoptotic potency (data not  shown).    The  behavior  of  Ramos  cells  treated  with  simvastatin  along  with  Rtx  or  Rtx‐LNP  was  therefore examined, and the resulting data  is summarized  in Figure 6.3.   As was the case  in Figure  6.1,  the  data  obtained  for HBS  and  Rtx  treatment were  very  similar.    Both  of  these  treatments  indicate that under the conditions of these experiments, a 10 μM dose of simvastatin was not toxic,  while a dose of 30 μM resulted in the  induction of apoptosis on  its own.   For example,  in the HBS‐ treated  samples, 5.3% early apoptosis was observed at  the 10  μM dose of  simvastatin, while  this  percentage increased to 12% at the 30 μM dose (p < 0.05).  The DR of CD120a was also observed to  • 141   decrease from the 10 μM to the 30 μM dose of simvastatin, but as described above, the significance  of this decrease is unclear given the very low levels of CD120a in the plasma membrane in HBS‐ and  Rtx‐treated cells (Figure 5.2).        Figure 6.3  Simvastatin decreases the DR of CD120a and sensitizes cells to apoptosis induced by Rtx‐LNP.   Ramos  cells underwent  incubation with  simvastatin at different doses  in order  to  study  the effects of  reduced plasma  membrane Chol content on the ability of Rtx‐LNP to  induce apoptosis.   The DR of CD120a (gray bars) and  levels of early  apoptosis (black bars) were measured after 12 h and are shown for each treatment.    When  cells were  treated with  Rtx‐LNP(150)  in  the  presence  of  simvastatin  at  doses  that  were not toxic to Ramos cells, the right‐hand side of Figure 6.3 shows a dose‐dependent increase in  early apoptosis alongside a decrease  in  the DR of CD120a  (now present at elevated  levels due  to  upregulation by Rtx‐LNP(150)).  At a dose of 3 μM simvastatin, early apoptosis was observed in 28%  of  cells,  compared  to  21%  at  0  μM  (p  <  0.05);  the  CD120a DR  values  at  these  two  doses were  equivalent, however  (p  > 0.05).   A  significant decrease  in DR of CD120a was observed  at 10  μM  simvastatin;  the DR  at 10  μM was 0.55,  compared  to 0.73  at 3  μM  (p < 0.001),  and  the  level of  apoptosis at 10 μM simvastatin increased to 47% (p < 0.0001 compared to the 3 μM dose).  In terms  of both parameters, the 10 μM and 30 μM doses of simvastatin produced equivalent results in Rtx‐ LNP(150)‐treated cells (p > 0.05).  Overall, the simvastatin experiments corroborate the MBCD data  0 1 2 3 0 3 10 30 0 3 10 30 0 3 10 30 Re la ti ve  va lu es [Simvastatin] / μM DR (CD120a) Early apop. Rtx‐LNP(150)RtxHBS • 142   which  indicate  that  increases  in plasma membrane Chol  inhibit  apoptosis  induced by multivalent  Rtx,  and  decreases  in  plasma  membrane  Chol  sensitize  the  cells  to  multivalent  Rtx‐induced  apoptosis.    6.4.3  A  model  of  Rtx  hypercrosslinking  that  occurs  in  vivo  after  normal  Rtx  therapy  The data  in Chapter 5 and  in Sections 6.4.1 & 6.4.2 establish that the direct mechanism of  action of multivalent Rtx  involves CD120a upregulation and that Chol  levels  influence the ability of  multivalent Rtx to induce apoptosis.  These in vitro experiments would have more clinical relevance  if evidence could be provided for this mechanism occurring in vivo upon hypercrosslinking of Rtx by  FcγR‐expressing effector cells (Section 6.2.4).    To first model the interaction between FcγR on effector cells and Rtx on lymphoma cells, a  2oAb specific to the Fc region of human IgGs was employed.   The specificity of this 2oAb paralleled  that of FcγR.  To enable hypercrosslinking, the 2oAb was coupled to the surface of polystyrene MS to  create 2oAb‐MS  (Section 6.3.7).    Lymphoma  cells were  saturated with Rtx, and after washing  the  cells,  the 2oAb was either added on  its own, producing a  low degree of  crosslinking, or added as  2oAb‐MS, enabling hypercrosslinking.    The ability of 2oAb‐MS to induce apoptosis in Rtx‐pretreated Ramos cells was first assessed  in terms of the amount of 2oAb‐MS added.  This data is summarized in Figure 6.4A; Rtx‐treated cells  in the absence of 2oAb‐MS showed low  levels of early apoptosis (3.3%) 24 h after treatment, while  maximum  levels of early apoptosis (39%) occurred when masses of 8 µg of 2oAb (in 2oAb‐MS) and  above were given  (p < 0.0001).   From 8 µg to 16 µg 2oAb (in 2oAb‐MS), the fraction of viable cells  dropped from 39% to 14% (p < 0.001).  The decreased viable fraction corresponded to an increase in  the percentage of necrotic cells, and at doses above 16 µg, the necrotic fraction was so dominant  that very few viable or early apoptotic cells were observed (not shown).  These data parallel earlier  • 143   results  from  Rtx‐LNP  and  Rtx‐MS  which  showed  low  levels  of  apoptosis  in  the  absence  of  Rtx  hypercrosslinking,  and  significantly  higher  levels  of  apoptosis  upon  hypercrosslinking  via  a  multivalent interaction.        Figure 6.4  A model for the hypercrosslinking of Rtx that occurs in vivo by FcγR‐bearing effector cells.   (A) The percentages of viable and early apoptotic cells were measured 24 h after subjecting 1.25  105 Rtx‐presaturated  Ramos cells in 250 μL medium to the indicated masses of 2oAb (in 2oAb‐MS).  (B) Samples were presaturated with Rtx as in  (A), followed by the treatments shown.  At 12 h post‐treatment, the levels of CD120a in the plasma membrane (white bars)  and early apoptosis (black bars) were measured in each case on cells obtained from the same treated sample.  +1 refers to  the addition of Rtx‐biotin  instead of Rtx, and +2  indicates that streptavidin‐MS were added together with unbiotinylated  Rtx.    0 25 50 75 100 0 4 8 12 16 20 %  of  to ta l ce ll p op ul at io n Mass of added 2oAb  (in 2oAb‐MS) / μg viable e. apoptotic A 0 4 8 12 53 57 + +¹ +² – + – + – + – + – + Re la ti ve  va lu es Mass of added 2oAb / μg CD120a exp. E. apoptotic Rtx 0    16 32           1            4    16 2oAb                             2oAb‐MSB • 144   Experiments  were  next  carried  out  to  determine  whether  the  apoptosis  observed  after  hypercrosslinking Rtx on Ramos cells occurs alongside upregulated CD120a  levels, as was the case  with Rtx‐LNP and Rtx‐MS.  A total of 12 h after the addition of different amounts of 2oAb or 2oAb‐MS  to  Rtx‐presaturated  cells,  the  levels  of  early  apoptosis  and  plasma‐membrane  CD120a  were  measured.  The resulting data is summarized in Figure 6.4B, which shows that in the absence of Rtx  pretreatment,  the addition of 2oAb or 2oAb‐MS on  their own at  the concentrations  tested did not  induce apoptosis after 12 h.  In contrast, mild increases in apoptosis occurred when 2oAb was added  to Rtx‐pretreated  cells  compared  to  cells not  treated with Rtx;  for example, when 32 µg of 2oAb  were added, there was a 1.6‐fold increase in CD120a expression in the plasma membrane (MFI after  subtracting negative  isotype control  increased from 20 to 33; p < 0.005) and a 1.7‐fold  increase  in  early apoptosis (6.9% to 12%; p < 0.001) in the presence of Rtx compared to in its absence.    When  significantly  lower doses of 2oAb were added as 2oAb‐MS, however, a considerable  upregulation  of  CD120a  in  the  plasma membrane was  observed  alongside  significantly  elevated  levels of apoptosis, only in the presence of Rtx.  For example, when 16 µg of 2oAb (in 2oAb‐MS) were  added,  levels of early apoptosis  increased 13‐fold (3.1% to 39%; p < 0.0005) and the MFI observed  for CD120a  increased by a factor of 46 (from 46 to 2130; p < 0.0001)  in cells that were pretreated  with Rtx compared to cells that were not pretreated.  In terms of CD120a upregulation, treatment of  presaturated  cells with 2oAb‐MS  resulted  in  the highest measured upregulation  compared  to  the  other methods of hypercrosslinking studied (Rtx‐LNP and Rtx‐MS).  In the presence of Rtx, apoptosis  was 4.9‐fold higher (8.0% to 39%; p < 0.0005) at 16 µg of added 2oAb (in 2oAb‐MS) compared to 1  µg,  and  the MFI  corresponding  to  CD120a  expression  in  the  plasma membrane was  higher  by  a  factor  of  25  (from  84  to  2130;  p  <  0.0001).    The  controls  in  Figure  6.4B  (+1 Rtx‐biotin  and  +2  streptavidin‐MS  +Rtx)  indicate  that  neither  Rtx‐biotin  nor  streptavidin‐MS  on  their  own  were  responsible for any observed effects since all measured values were equal to those observed in cells  treated only with Rtx  (p  > 0.05  in  all  cases).   These data  further  support  the CD120a‐dependent  • 145   direct mechanism observed after  treatment with Rtx‐LNP and Rtx‐MS, and  they also  indicate  that  the  hypercrosslinking  of  CD20  drives  this  mechanism  of  action  since  different  methods  of  hypercrosslinking produced the same result.     6.4.4  CD120a  that  is excluded  from plasma membrane rafts  is colocalized with  hypercrosslinked Rtx­enriched patches  To  further  study  the  relationship  between  Rtx/CD20  hypercrosslinking  and  CD120a  upregulation,  confocal  laser‐scanning  fluorescence microscopy  was  employed  to  investigate  the  plasma  membrane  organization  of  hypercrosslinked  Rtx  with  respect  to  CD120a  and  plasma  membrane rafts.  To visualize Rtx on the cell surface, the Ab was labeled with A568 (Section 6.3.7).   It was first verified that A568‐Rtx, when hypercrosslinked using 2oAb‐MS,  induced apoptosis  in the  same way as unlabeled Rtx.  Figure 6.5A shows that after a 24 h incubation, 20 μg of added 2oAb (in  2oAb‐MS) on  its own was not  toxic  to  the cells  (top  left panel), while a mass of 50 μg  resulted  in  cytotoxic effects  in Ramos  cells  (top  right).   Treatment with A568‐Rtx on  its own  resulted  in  low  levels of apoptosis (bottom  left), while cells presaturated with A568‐Rtx and treated with 20 μg of  2oAb  (in 2oAb‐MS)  (bottom right) underwent apoptosis at  levels consistent with  those when using  unlabeled Rtx in Figure 6.4A.   The data in Figure 6.5A therefore indicate that A568 labeling did not  significantly affect the function of Rtx, and they also confirm that 20 μg of 2oAb (in 2oAb‐MS) is not  toxic to Ramos cells under the conditions of these experiments.  To  obtain  confocal  laser‐scanning  fluorescence  microscopy  images,  Ramos  cells  were  presaturated as in Section 6.4.3 with A568‐Rtx instead of Rtx, followed by treatment with 2oAb‐MS  or an equivalent volume of HBS.   At a  time point 12 h after  the addition of 2oAb‐MS,  cells were  stained without permeabilization with A488‐CTX (to  label plasma membrane rafts) and with A647‐ CD120a.  Representative images are exhibited in Figure 6.5B & C.  The top two panels in each case  show the staining of A647‐CD120a (red) and A488‐CTX (blue) on their own before being merged  in  • 146   the  third  panels  from  the  top.    The  fourth  panel  shows  staining  of  A568‐Rtx  (green) while  the  bottommost panel contains a merge of all  three signals.   When comparing cells  in  the absence of  2oAb‐MS (Figure 6.5B) to those that have been treated with 2oAb‐MS (Figure 6.5C), it is clear that in  the  absence of 2oAb‐MS,  the  expression of CD120a  is  significantly  lower  and  the distributions of  A568‐Rtx and membrane rafts are more uniform across the surface of the cells.          Figure 6.5  Membrane raft‐associated CD120a is excluded from regions enriched in hypercrosslinked Rtx/CD20, and non‐ raft CD120a is colocalized with hypercrosslinked Rtx/CD20.   (A)  Verification  that  labeling  of  Rtx with  A568  did  not  affect  its  ability  to  induce  apoptosis  in  lymphoma  cells  upon  hypercrosslinking with 2oAb‐MS.  (Continued on next page.)    92.6% 3.7% 3.7% 66.3% 17.2% 16.4% 91.0% 4.9% 4.0% 13.1% 57.2% 29.6% 20 μg 2oAb‐MS only 50 μg  2oAb‐MS only A568‐Rtx only A568‐Rtx +20 μg 2oAb‐MS 100 101 102 103 104 104 103 102 101 100 Fl uo re sc en ce  int en si ty   (P I) Fluorescence intensity   (Annexin‐V‐FITC) 100 101 102 103 104 104 103 102 101 100 A • 147     Figure  6.5    (Continued  from  previous  page.)  (B &  C)  Confocal  laser‐scanning  fluorescence microscopy  images  of  cells  treated with A568‐Rtx only (B) or A568‐Rtx followed by 20 μg of 2oAb (in 2oAb‐MS) (C) for 12 h.   A568‐Rtx  localization  is  represented by the green signal; cells were also stained with A488‐CTX to  label membrane rafts (blue) and A647‐CD120a  (red).    In  (C),  CD120a  that  is  raft‐associated  (purple  regions  in  the  third  panel  from  the  top)  is  excluded  from  hypercrosslinked Rtx‐enriched regions (green), while non‐raft associated CD120a is colocalized with Rtx‐enriched regions.  B A568‐Rtx only C A568‐Rtx  +20 μg 2oAb‐MS • 148   The  third panels  from  the  top specifically show  the regions of CD120a  that are associated  with  plasma membrane  rafts  (purple)  and  the  regions  that  are  non‐raft‐associated  (red).   When  examining the distribution of the purple signal compared to that of the green one (A568‐Rtx),  it  is  clear  in  Figure 6.5C  that  there  is  low  colocalization between  the purple  and  green  regions.   This  implies  that  raft‐associated  CD120  does  not  colocalize with  hypercrosslinked  Rtx.   On  the  other  hand,  non‐raft  CD120a  (red  signal  in  the  third  panel)  is  almost  exclusively  colocalized  with  hypercrosslinked A568‐Rtx  (green)  in Figure 6.5C.    In  fact,  the green and blue  signals  show a  low  degree  of  colocalization,  indicating  that  hypercrosslinked  A568‐Rtx  is  excluded  from  plasma  membrane  rafts.    These  same  trends were observed  across  a  large number of  samples obtained  under a variety of conditions.    Together, these data imply that Rtx/CD20, when hypercrosslinked on the cell surface, forms  large patches that are excluded from plasma membrane rafts.  They also show that CD120a present  in  the  plasma  membrane  (after  upregulation  resulting  from  hypercrosslinked  Rtx/CD20)  forms  different domains, some of which are  raft‐associated and some of which are not.   Raft‐associated  CD120a is almost exclusively excluded from Rtx‐enriched patches, while non‐raft‐associated CD120a  is  largely associated with hypercrosslinked Rtx.   This suggests  that Rtx hypercrosslinking  results  in  the formation of non‐raft patches where the proapoptotic form of CD120a is localized following its  upregulation.      Figures  6.4  &  6.5,  taken  together,  show  that  hypercrosslinking  Rtx/CD20  using  2oAb‐MS  results  in significant apoptosis and upregulation of CD120a.   Since the use of 2oAb‐MS served as a  model  for  the  interaction of effector cells and Rtx‐coated  lymphoma cells,  these data support  the  hypothesis  that  this  direct  mechanism  of  action  occurs  in  vivo  after  administration  of  regular  bivalent Rtx due to hypercrosslinking of Rtx/CD20 by FcγR‐expressing cells.  • 149   6.4.5  Effector  cells  induce  elevated  apoptosis  and  CD120a  expression  only  in  lymphoma cells treated with Rtx   To  determine  if  effector  cells  themselves  are  capable  of  directly  inducing  apoptosis  in  lymphoma  cells  through  a mechanism  that  depends  on  CD120a,  experiments  were  carried  out  where  Ramos  cells  pretreated with  either  Rtx  or HBS were  co‐incubated with  human  peripheral  blood mononuclear cells (PBMCs) obtained from healthy donors.  PBMCs are rich in FcγR‐expressing  effector cells such as NK cells and monocytes246 and a subpopulation of these cells would therefore  be expected to hypercrosslink Rtx on the surface of treated  lymphoma cells  in a manner similar to  2oAb‐MS in Sections 6.4.3 and 6.4.4.  A  detailed  description  of  the  strategies  employed  to  detect  expression  of  CD120a  and  apoptosis  in Ramos cells  is provided  in Section 6.3.8.   After pretreatment with Rtx or HBS, PBMCs  were added in different excesses of Ramos cells and coincubation was allowed to proceed for 16 h.   Levels of apoptosis and plasma‐membrane CD120a were then measured only in the Ramos cells, and  the resulting data is shown in Figure 6.6.  This figure shows that in the absence of Rtx, PBMCs were  capable of inducing apoptosis in Ramos cells and the amount of apoptosis depended on the ratio of  PBMCs that were added with respect to Rtx.   While 8.9% of Ramos cells were  in early apoptosis at  the 1:1 Ramos:PBMC ratio, this value increased to 43% at the 1:8 ratio (p < 0.0001).  The data in the  absence of Rtx, however, suggest that PBMC‐induced apoptosis occurred via a mechanism that was  CD120a‐independent because as  the  levels of apoptosis  increased at  ratios of 1:1 and above,  the  expression of CD120a  in  the plasma membrane  remained  constant  (p > 0.05 between all pairs of  treatments).  • 150     Figure 6.6   Human PBMCs  induce significantly higher  levels of apoptosis and plasma‐membrane CD120a expression  in  lymphoma cells pretreated with Rtx compared to non‐pretreated cells.   PBMCs from healthy donors were coincubated with Ramos cells that were pretreated with either HBS or saturating levels  of  Rtx.    In  Ramos  cells,  both  the  CD120a  expression  in  the  plasma membrane  and  the  level  of  early  apoptosis were  measured 16 h after addition of PBMCs.        The  most  important  result  in  Figure  6.6  is  that  every  ratio  tested  showed  significantly  elevated  levels of  early  apoptosis  in  samples  containing Rtx‐pretreated Ramos  cells  compared  to  cells  that were not  treated with Rtx.    These  elevated  apoptosis  levels were  accompanied by  yet  more pronounced increases in plasma‐membrane CD120a expression.  For example, at the 1:1 ratio,  there was a 2.0‐fold increase in early apoptosis (8.9% to 18%; p < 0.0001) and a 1.3‐fold increase in  the MFI of plasma membrane‐associated A647‐CD120a (203 to 269; p < 0.01)  in cells treated with  Rtx compared to HBS.  At the 1:8 ratio, early apoptosis was 1.3‐fold higher (43% to 58%; p < 0.001)  while CD120a levels were 3.4‐fold higher (increase in MFI from 202 to 694; p < 0.0001).   These experiments  therefore confirm  that circulating FcγR‐expressing effector cells  in vivo  are capable of inducing upregulation of CD120a in the plasma membrane of target lymphoma cells  containing bound Rtx, resulting in the direct induction of apoptosis in these cells.  These data imply  that a direct mechanism of action involving CD120a upregulation occurs in vivo after treatment with  bivalent Rtx.  Others have postulated that a direct mechanism of action may actually be responsible  0 10 20 30 – + – + – + – + Re la ti ve  va lu es Ramos:PBMC CD120a exp. E. apoptotic Rtx 1:0         1:1     1:4         1:8 • 151   for a significant fraction of the in vivo therapeutic activity observed from Rtx77, but until now, such a  mechanism has been undefined.    6.5  Discussion and conclusions  6.5.1  Discussion  The  results  from  this  chapter  suggest  that  a  direct mechanism  involving  upregulation  of  CD120a followed by apoptosis occurs in vivo after normal bivalent Rtx therapy.  As stated in Section  5.4.1,  the direct mechanism of  action of Rtx has not been definitively  shown, but here we have  demonstrated  that Rtx‐treated  lymphoma  cells  expressed dramatically  elevated  levels  of CD120a  and apoptosis when  the Rtx on  the cell surface was hypercrosslinked with 2oAb‐MS, compared  to  only modest  increases  at  higher  doses  of  2oAb  (Figure  6.4).    This  hypercrosslinking modeled  the  multivalent  interaction  that  occurs when  Rtx‐coated  cells  interact with  FcγR‐expressing  immune  effector cells in vivo, lending support to a direct mechanism of action of Rtx  involving upregulation  of CD120a.  We subsequently showed that the same direct mechanism also occurred in vitro in Rtx‐ coated  lymphoma  cells when  they were  allowed  to  interact with  human  effector  cells  in  PBMC  samples from healthy donors (Figure 6.6).  This strongly suggests that CD120a‐mediated apoptosis is  capable of occurring in vivo after treatment with bivalent Rtx.  These  studies  also  demonstrate  that  increasing  the  concentration  of  Chol  in  the  plasma  membrane of  lymphoma cells  rescues  the cells  from apoptosis  induced by multivalent Rtx  (Figure  6.1).   Insertion of Chol resulted  in an  increase of the DR of CD120a and  increased colocalization of  CD120a  in GM1‐positive plasma membrane  rafts  (Figures 6.1 & 6.2).   Depletion of Chol  from  the  plasma membrane  resulted  in  increased  detergent  solubility  of  CD120a  (Figures  6.1 &  6.3)  and  sensitized cells to apoptosis induced by multivalent Rtx (Figure 6.3).  The level of apoptosis induced  by multivalent Rtx  is  therefore dependent on the concentration of Chol  in  the plasma membrane.   • 152   This  is  consistent  with  a  CD120a‐dependent  direct  mechanism  of  action  since  raft‐associated  CD120a  elicits  antiapoptotic  signals,  as  opposed  to  the  non‐raft‐associated  form,  which  is  proapoptotic (Sections 6.2.1 & 6.2.2).    In  order  to measure  the  resistance  of  proteins  to  solubilization  in  detergent,  a method  making  use  of  flow  cytometry was  employed which  allowed  for  the  quantification  of DR  values  (Section  6.3.5).    This  method  is  less  commonly  employed  than  equilibrium  density  gradient  ultracentrifugation followed by western blotting of fractions along the gradient (described in Section  6.2.3.1).    In  these  experiments, however,  employing  the  traditional ultracentrifugation  technique  was not possible because of  the  very  large number of  cells  required  for each  sample  (1–5  108  cells/sample)47, 247, 248.   Cells were  typically given 40 μg Rtx/106 cells  to achieve valence‐dependent  levels of apoptosis (Figure 4.6) and CD120a expression (Figure 5.4); this dose corresponds to at least  4 mg of Rtx (in Rtx‐LNP) per ultracentrifugation sample.   This  is an extremely  large amount of Rtx‐ LNP;  it  is approximately equal  to  the  total mass of Rtx present  in all samples of Rtx‐LNP prepared  using one  iteration of the methodology  in Chapter 3.   Producing the minimum amount of material  necessary  for  ultracentrifugation  experiments  using  this  methodology  (or  the  previous  method  employed  in Section 2.3.2) was  therefore not possible  in practical  terms.   Developing a scaled up  procedure  for preparing precise valences, or an altogether different procedure, would have been  required.    The  flow  cytometry‐based method used  in  this  chapter provides  a  suitable  alternative  to  density  gradient  ultracentrifugation,  and  the  data  was  corroborated  by  confocal  laser‐scanning  fluorescence microscopy  images  (Figures  6.2 &  6.5).   Others  have  used  an  identical  approach  to  determine membrane raft affinity when ultracentrifugation  is  impractical or  impossible249, 250, or to  verify western blots obtained from fractions after ultracentrifugation251.   Simons  et  al.  have  pointed  out  that  a  common  feature  of  density  gradient  ultracentrifugation  DR  analyses  is  variation  in  results,  even  between  replicates  of  the  same  • 153   experiment, and this is a major weakness of the technique234.  They also point out that DR is only a  starting point for studying raft association, and that changes  in DR  in response to biological stimuli  are the most useful indicators of membrane raft involvement in the response.  For example, strong  DR of a protein  in  itself does not provide much  information pertaining  to raft association, but  if a  stimulus  causes  the protein  to undergo a decrease  in DR, a movement out of plasma membrane  rafts due to the stimulus could be assigned234.  The data in Figures 6.1 & 6.3 employ this differential  approach to the treatment of DR data, and the changes in DR measured in response to the different  treatments are supported by the confocal fluorescence microscopy images in Figures 6.2 and 6.5.  The results in this chapter deviate from those reported by many other groups that show that  CD20  is  found  outside  of  plasma  membrane  rafts  in  different  lymphoma  cell  lines,  but  upon  treatment with  Rtx,  CD20  translocates  to membrane  rafts74, 168, 169.   Using  the  same  approach  to  quantify DR as in Figures 6.1 & 6.3, we employed A647‐pCD20 (Section 4.3.6) to measure the DR of  CD20, and we found no changes  in DR values for CD20 (~0.6) before and after treatment with Rtx  and Rtx‐LNP  (data not shown).   Confocal  fluorescence microscopy  images such as  those shown  in  Figures 6.5 also indicate that the majority of Rtx (and therefore CD20) does not colocalize with GM1,  a membrane raft marker.  Most of the studies indicating increased raft association of CD20 after Rtx  treatment employed density gradient ultracentrifugation and western blotting, which may explain  the difference  in part due the variability of such results, as described above.   The differences may  also be due to the fact that most previous studies have employed a 2oAb, which results in moderate  crosslinking  of  Rtx/CD20,  as  opposed  to  the more  substantial  hypercrosslinking  provided  by  the  multivalent  constructs  used  here.    Different  degrees  of  hypercrosslinking would  be  expected  to  modulate raft behavior to different extents (Section 6.2.2).    One study in particular showed that by depleting Chol using MBCD concentrations similar to  those  employed  in  this  chapter,  levels of  apoptosis  induced by Rtx  and  a 2oAb decreased  as  the  MBCD  concentration  was  increased74.    Our  results,  on  the  other  hand,  show  that  insertion  of  • 154   additional  Chol  into  the  plasma  membrane  using  MBCD/Chol  abolishes  apoptosis,  while  Chol  depletion  using  MBCD,  and  particularly  simvastatin,  sensitize  cells  to  apoptosis  induced  by  multivalent  Rtx.   One  possibility  for  the  different  results may  be  that MBCD  interfered with  the  ability of  the 2oAb  to hypercrosslink Rtx  in  the  study of  Janas et al., an event  that  is  required  for  apoptosis (Sections 1.4.3 and 1.6.1).    One  other way  that  the  results  here  differ  from  those  in  other  reports  is  that  apoptotic  CD120a signaling  is generally considered  to  require  internalization of activated CD120a‐containing  Complex II by clathrin‐dependent endocytosis (see Section 6.2.1).  Our results show no evidence of  CD120a internalization preceding apoptosis, including confocal fluorescence microscopy images that  were  obtained where  CD120a  staining  occurred  after  permeabilization  of  the  plasma membrane  (not shown).  Moreover, we employed chlorpromazine treatment, which inhibits clathrin‐dependent  apoptosis, at subcytotoxic doses in conjunction with Rtx and Rtx‐LNP, and we found no differences  in the levels of apoptosis that were induced in the absence of chlorpromazine (data not shown).  The  requirement  for endocytosis may not be universal  to all cell  types175,  so apoptosis via Complex  II  may not be required in Ramos cells.   Other death receptors, such as DR4 and DR5, have also been  shown to not require endocytosis before initiating apoptosis87.    The  results  in  this  chapter  have  demonstrated  that  a  CD120a‐dependent mechanism  of  action is capable of occurring in vivo after normal Rtx therapy as a result of hypercrosslinking of Rtx  by  FcγR‐expressing  cells.    They  also  showed  that  increased  cellular  Chol  content  abolished  multivalent Rtx‐induced apoptosis, while lower levels sensitized cells to apoptosis.  The synthesis of  these two results suggests that improvements in the in vivo efficacy of bivalent Rtx therapy may be  achieved with concurrent Chol‐lowering therapies such as simvastatin or other statins.  The utility of  such an approach can be investigated using in vivo lymphoma xenograft models to study the efficacy  of such treatment strategies and to further investigate the role of CD120a in the direct mechanism  of action of Rtx, as described in Section 7.4.  • 155   6.5.2  Conclusions  Our  results  have  shown  that multivalent  Rtx  serves  to  upregulate  CD120a  to  the  plasma  membrane, where it elicits proapoptotic signaling when localized outside of plasma membrane rafts.   Insertion of additional Chol  into the plasma membrane resulted  in  the translocation of CD120a to  rafts and abolishment of multivalent Rtx‐induced apoptosis, while depletion of Chol sensitized cells  to apoptosis, indicating that apoptosis induced by multivalent Rtx is Chol‐dependent.    To model  the  interaction of  FcγR‐expressing effector  cells with Ab‐coated  tumor  cells,  Fc  region‐specific 2oAb‐MS  induced  significantly elevated apoptosis and upregulation of CD120a only  when  the cells were pretreated with Rtx.   The  same effect was observed when Ramos cells were  cocultured with samples of PBMCs, which contain effector cells  that express FcγRs.   This suggests  that FcγR‐expressing effector cells are capable of hypercrosslinking Rtx on the surface of lymphoma  cells  in  vivo,  and  that  increased  apoptosis  resulting  from  CD120a  upregulation may  constitute  a  novel direct mechanism of action of Rtx that occurs upon regular Rtx therapy.   Together, this data  suggests  that  Rtx  efficacy  could  be  improved  through  concurrent  treatment with  Chol‐lowering  agents such as statins.    • 156   7  Discussion  and  conclusions:  Antibody­lipid  nanoparticles  as  a  promising tool in cancer drug development  7.1  Recapitulation    The work described in this dissertation outlines a complete methodology that can be used to  discover  new  drugs  based  on  therapeutic  monoclonal  Abs  and  develop  such  therapies  to  an  advanced preclinical stage, including an elucidation of their mechanism of action.  The methodology  makes use of Ab‐LNPs, a type of multivalent therapeutic Ab construct that employs a liposome as a  nanoscale scaffold  for bridging many Ab molecules  together.   Therapeutic Abs  that show minimal  activity  as  bivalent molecules may  show  enhanced  therapeutic  activity  as multivalent  constructs,  enabling  their  further  development  as multivalent  Abs  of  defined  (optimal)  valence,  rather  than  bivalent Abs.  The proof of this concept was illustrated using the therapeutic Ab Rtx.    As is the case with other types of multivalent Abs directed against different targets, Rtx‐LNPs  exhibited  enhanced  activity  compared  to  bivalent  Rtx;  as  shown  in  Chapter  2,  Rtx‐LNPs  induced  higher  levels of apoptosis, ADCC, and CDC  compared  to equal doses of bivalent Rtx.    In order  to  further  understand  the  direct  mechanism  of  action  of  Ab‐LNPs,  a  new  Ab‐LNP  preparation  methodology was developed  in Chapter 3 which allowed for the creation of many valences of Ab‐ LNP from the same Ab.  Using Rtx‐LNPs prepared with this methodology, Chapter 4 showed that the  levels of  apoptosis  induced by Rtx‐LNPs depended  on  their  valence,  and  that Rtx‐LNPs  exhibited  unique biological properties consistent with the notion that the higher valences can hypercrosslink  CD20 in the plasma membrane more appreciably and form Rtx/CD20 clusters that may play a role in  apoptosis.    The improved methodology was used to study the direct mechanism of action of Rtx‐LNPs in  Chapter  5, which  uncovered  a mechanism  of  action  of  Rtx‐LNP  involving  the  valence‐dependent  upregulation of CD120a and subsequent activation of caspase‐8, resulting  in apoptosis.   Moreover,  this chapter showed that Rtx‐MS, which do not contain liposomes, also induce apoptosis through a  • 157   CD120a‐dependent mechanism of action,  illustrating  that  the  liposome  is not  responsible  for  the  apoptosis induced by Rtx‐LNP.  Chapter 6 showed that the induction of apoptosis of multivalent Rtx  was  Chol‐dependent,  with  lower  levels  promoting  apoptosis  and  higher  levels  inhibiting  it,  consistent with  the known Chol dependence of CD120a  signaling.   This  final chapter also  showed  that  hypercrosslinking  of  Rtx  on  lymphoma  cells  by  FcγR‐expressing  immune  effector  cells  is  sufficient to upregulate CD120a and  induce apoptosis, suggesting that a CD120a‐dependent direct  mechanism of action occurs in vivo after normal bivalent Rtx therapy.  This constitutes a novel direct  mechanism of action of Rtx, which so far has been undefined.      7.2  Discussion concerning Ab­LNPs and other multivalent Ab constructs   7.2.1  Strengths and weaknesses of Ab­LNPs as a tool for developing new drugs  The use of Ab‐LNPs as  liposomal multivalent Ab constructs  is a unique approach to using a  liposome to enhance the activity of a drug that is present on the outside, rather than the inside, of  the liposome.  This is one feature that distinguishes Ab‐LNPs from immunoliposomes, as discussed in  Section 1.2.  However, the most important difference between Ab‐LNPs and immunoliposomes, the  evidence for which is provided in this dissertation, is that while immunoliposomes are the final drug  product  themselves, Ab‐LNPs are not;  instead, Ab‐LNPs are a  tool  for optimizing and studying  the  mechanism of action of multivalent therapeutic Abs.  Their use would be particularly advantageous  when it is not straightforward to prepare many valences using other types of formulations, as is the  case with gold nanoparticles  for example96, or when  the multivalent Ab  is  to be  included  in more  complex systems such as multifunctional therapeutic nanoparticles167, where  it would be desirable  to study Ab multivalency separately from the rest of the system.    Another  strength  of  Ab‐LNPs  is  that  valences  as  high  as  250  have  been  reproducibly  prepared  using  the methodology  in  Chapter  3.   Although  other  studies  have  probably  employed  • 158   valences  in this range as described  in Section 1.6, the actual valences were never defined, possibly  because the valence was heterogeneous, suitable assays were not available, or it was not necessary  to measure  the  valence.    In  studies  where  the  valence  has  been  defined  for  a multivalent  Ab  construct,  it generally has not exceeded 10 (Section 1.6.3).   A range of specific valences up to 250  can now be reproducibly prepared with high start‐to‐finish yields of coupled Ab (80%).  The principal weakness of Ab‐LNPs is that the constructs resulting from the methodology in  Chapter 3 are likely not suitable for in vivo studies.  This is because the Neut molecules used in the  coupling process are proteins and there therefore potentially antigenic.   The  information obtained  using these Ab‐LNPs (optimal valence and mechanism of action), however, can be translated into a  variety of other types of constructs92‐96, 167.  If it should be desirable to study a liposomal multivalent  Ab construct in vivo, an alternative method of preparing Ab‐LNPs would have to be employed, such  as that used  in Chapter 2 which uses covalent coupling.   Section 3.2.1 described the difficulties  in  terms of yield, reproducibility, and control over the valence of such methods, so they would not be  suitable for studies on multivalency from the outset, but they may potentially be used to prepare a  single valence for in vivo studies.    7.2.2  The use of whole Abs in Ab­LNPs versus Ab fragments  If  hypercrosslinking  of  the  target  on  the  surface  of  the  cancer  cell  is  responsible  for  the  improved  therapeutic effects,  then  it may appear advantageous  to employ Ab  fragments  (such as  Fab regions) rather than the whole IgG.  In this way, defined chemical species could more easily be  prepared which could  then be coupled  to  liposomes;  this  is  the approach used by Nellis et al.  for  preparing anti‐ErbB2  immunoliposomes252, 253.   Using Fab  fragments  for preparing multivalent Abs,  however, would completely eliminate the indirect mechanisms of action of the Abs (ADCC and CDC),  which are important in the overall efficacy of therapeutic Abs (Section 1.4).  Chapter 2 showed that  the indirect mechanisms were not only preserved in Rtx‐LNP, but enhanced.  This was explained by  • 159   the  fact  that  the  processes  of  ADCC  and  CDC  themselves  result  from  multivalent  interactions  involving the Fc region; these interactions are facilitated when the Ab is multivalent.  ADCC and CDC  are common mechanisms to all therapeutic Abs (Sections 1.4.1 & 1.4.2), so the augmentation of the  indirect mechanisms would be expected to be observed using other Abs.    The methodology  in  Chapter  3  utilizes  biotinylation  on  a NIMAC  column,  and  under  the  conditions that were employed, between one and two biotin groups were added per Ab.  The site of  biotinylation on the Ab, however,  is not homogeneous.   On some Ab molecules,  it may be present  on  the  Fab  region,  which  may  negatively  affect  binding  to  target  and  therefore  the  direct  mechanism; on other molecules, a site on the Fc region may be biotinylated, which may affect the  indirect mechanisms.  The nonhomogeneous biotinylation constitutes a significant advantage when  considering  that  the overall mechanism of action  consists of a combination of direct and  indirect  factors; one could  imagine that a single biotinylation site on either the Fab or Fc would reduce or  eliminate one of the contributing mechanisms.    This  appears  to  have  occurred,  for  example,  with  a multivalent  Ab  that  uses  a  specific  configuration of six Fab regions and one Fc region.  This configuration resulted in complete abolition  of all CDC activity, possibly due  to  the point of attachment on  the Fc  region  interfering with CDC  processes such as C1q binding90.  By having many different biotinylation sites in the Ab molecules in  Ab‐LNP,  some  individual molecules may  show  decreased  binding  to  target  (biotinylation  in  Fab  region)  or  decreases  ADCC  or  CDC  (Fc  region);  these  processes,  however,  rely  on  multivalent  interactions  that  can  be  facilitated  by  the  neighboring  Abs  in  Ab‐LNP,  resulting  not  only  in  compensation but improvement in therapeutic responses.    For example, Section 1.4.1 described how C1q is a hexavalent ligand requiring the binding of  several Fc regions in order to initiate CDC; if the Fc region of one Ab in Ab‐LNP is unable to bind C1q  due to  interference from a specific biotinylation site, a significant number of other unaffected Abs  would be expected to be close by for binding, allowing CDC to progress.   It therefore appears that  • 160   having many sites of biotinylation  in Rtx‐LNP  is advantageous  to preserving all  the mechanisms of  action of therapeutic Abs in the multivalent construct.    7.2.3  Relevance of the direct mechanism of action of therapeutic Abs studied in  vitro in the absence of hypercrosslinking  Different strategies for creating multivalent Rtx were employed in this dissertation, including  the use of Rtx‐LNP, Rtx‐MS, Rtx + 2oAb, and Rtx + 2oAb‐MS.  The treatment that provided maximum  therapeutic efficacy (levels of plasma‐membrane CD120a and apoptosis) was hypercrosslinking with  2oAb‐MS following Rtx treatment (Figure 6.4B).  These levels were higher than those observed after  treatment with Rtx‐LNP of high  valence  (above 100;  Figure 4.6) or Rtx‐MS  (Figure 5.6),  and  they  were especially higher than cells treated with Rtx followed by 2oAb (Figure 6.4B).  Note that in Figure  6.4A (24 h time point), a significant fraction of cells had become necrotic; Figure 6.4B provides data  at 12 h post‐treatment, when the necrotic fraction was much lower.    2oAb‐MS  acted  on  cells  that were  already  saturated with  Rtx,  but  Figure  4.1  shows  that  saturating cells with Rtx‐LNP still resulted in significant unbound CD20 as well as a large fraction of  Rtx  that was not bound  to CD20.   The  lack of  saturation of CD20  could be due  to a  steric effect  where  the  liposomal  component  of  Rtx‐LNP  takes  up  too much  space  to  allow  sufficient  Rtx  to  saturate  all  CD20  on  the  cell  surface.   However,  because  2oAb‐MS  acted  on  Rtx‐saturated  cells,  higher  levels  of  hypercrosslinked  CD20  could  be  achieved  in  the  plasma membrane,  resulting  in  more  significant  CD120a  upregulation  and  apoptosis  compared  to  Rtx‐LNP  treatment.    The  saturation  of  cells with  Rtx, which  allows  for  high  levels  of  clustered  CD20,  can  also  be  used  to  explain why  the hypercrosslinking  induced by effector cells can produce a  strong apoptotic  signal  (Figure 6.6).    Importantly,  although  use  of  a  2oAb  is  a  common  method  to  assess  the  effects  of  crosslinking a therapeutic Ab in vitro7, 74‐76, Figure 6.4B showed that 2oAb‐MS but not 2oAb alone was  • 161   able  to  provide  a multivalent  interaction  that  resulted  in  sufficient  hypercrosslinking  to  induce  elevated  levels of apoptosis.   This  suggests  that when  testing  the crosslinking of  therapeutic Abs,  using a 2oAb may not provide the necessary degree of crosslinking to induce meaningful therapeutic  effects, and a multivalent 2oAb construct may be more appropriate.    It  is  known  that  ADCC  occurs  as  a  result  of  the  binding  of  therapeutic  Abs  like  Rtx  to  activating FcγRs on effector cells of the immune system.  This binding of the therapeutic Ab causes  hypercrosslinking  of  the  activating  FcγR  on  the  effector  cell,  which  triggers  the  ADCC  response  (Section 1.4.2).  With the results in Chapter 6, it can be argued that it is not necessarily the Ab which  causes hypercrosslinking of FcγR, but that the Ab and the FcγR mutually hypercrosslink each other,  which in terms of Rtx would result not only in ADCC but also in the direct induction of apoptosis in  vivo.    Moreover, as discussed  in Section 1.4.2, NK cells and granulocytes express only activating  FcγRs, while other effector cells  including macrophages also express  inhibitory FcγRs, which upon  hypercrosslinking,  negatively  regulate  ADCC.   We  demonstrated  in  Chapter  6  that  2oAb‐MS  and  effector cells had similar effects on Rtx‐treated  lymphoma cells  in terms of a CD120a upregulation  and  induction of apoptosis,  indicating that the method of Rtx hypercrosslinking does not  influence  the therapeutic response.  This implies that in vivo, the direct induction of apoptosis resulting from  hypercrosslinking should not depend on whether the particular FcγR that  is hypercrosslinked  is an  activating or inhibitory receptor, because Rtx would be hypercrosslinked as a result.  Inhibitory FcγRs  could therefore be responsible  for  inducing direct apoptosis as well as activating FcγRs.      It  is also  conceivable that responses of bivalent Rtx and possibly other Abs that were thought to be entirely  the result of ADCC (such as those in Figure 2.3C & D) could have actually been due, at least in part,  to the direct mechanism of action.      • 162   7.2.4  The nature of  the  interaction between Ab­LNPs and  the  surface of  target  cells   In  Ab‐LNPs,  as  in  immunoliposomes,  the  Ab molecules  are  not  rigidly  held  in  place,  but  diffuse around the liposome254.  This property may be particularly advantageous to the therapeutic  efficacy  of Ab‐LNPs  because  it  has  been  shown  that  rigid multivalent  constructs  exhibit  variable  activation or inhibition against targets depending on the spacing between the different binding sites  on the multivalent  ligand102.   This suggests that by being allowed to diffuse, the Ab molecules can  arrange in lowest‐energy (most stable) configuration of the multivalent Ab/target complex.    On the other hand, since Figure 4.1 showed that not all Ab  is bound to the target  in these  multivalent  complexes,  an  even more  efficient  use  of Ab may  be  a  near‐planar  nanometer‐scale  configuration with Ab only on one side of the plane.  After treatment of target cells, no unbound Ab  would  be  present,  allowing  all  Ab  to  be  engaged  in  hypercrosslinking.    It would  be  possible  to  synthesize  different  sizes  and  intermolecular  spacings  of  such  constructs102,  or  possibly  create  constructs where the Ab is not rigidly held in place using PEG linkers such as those used in Rtx‐LNPs.   Although the direct mechanism of action of such a construct would be expected to be enhanced, it is  unclear  how  this would  affect  the  indirect mechanisms.    To  preserve  all mechanisms  of  action,  whole IgG would be required (not fragments) and variation in the point of attachment of the linker  would also be necessary, as discussed in the previous section.      In  terms  of  the  dynamics  of  the  association  of  Rtx‐LNP with  target  cells,  there may  be  parallels between with other types of multivalent ligands in nature such as carbohydrates and DNA.   As  outlined  in  Section  1.6, multivalent  ligands  show  decreased  dissociation  rates  from  receptors  compared  to  univalent  ones  due  to  recapture  of  the  ligand  before  complete  dissociation  of  the  ligand‐receptor  complex.    Evidence  suggests  that  some DNA  regulatory  proteins  bind  to DNA  at  nonspecific base pair sites and then through Brownian motion diffuse along the backbone until they  • 163   reach a high‐affinity site.  This “bind and slide” mechanism has also been observed in the interaction  between multivalent carbohydrates and lectins100.    It can be hypothesized that after the initial univalent interaction between an Ab molecule in  Ab‐LNP  and  the  surface  of  the  target  cell,  the  cell  “recaptures”  another Ab molecule  before  (or  during) dissociation of the first molecule.  This constant association and dissociation allows the Ab‐ LNP to essentially roll across the surface of the cell until a higher‐affinity interaction is formed, such  as a cluster of target  in the plasma membrane on a  length scale similar to the diameter of the Ab‐ LNP.   These more stable multivalent  interactions may be  responsible  for  inducing  the  therapeutic  effects  of  multivalent  Abs,  such  as  those  illustrated  in  Figure  6.5  where  hypercrosslinked  Rtx  colocalized with CD120a outside of plasma membrane rafts.    7.3  Discussion on the mechanism of action of Rtx  7.3.1  The issue of rapid clearance of multivalent Rtx remains unresolved  In Chapter 2,  it was shown  that even  though Rtx‐LNPs showed significantly higher  in vitro  apoptosis, ADCC, and CDC, the in vivo efficacy of Rtx and Rtx‐LNP were equivalent (Figure 2.5).  This  was explained by pharmacokinetic studies in Figure 2.6 that showed rapid clearance of Rtx‐LNP from  the  circulation.    Efficacy  and  pharmacokinetics  studies  have  been  performed  on  other  types  of  multivalent  anti‐CD20  Abs,  including  a  hexavalent  construct  based  on  veltuzumab  (a  humanized  anti‐CD20 Ab)90.  Compared to veltuzumab, the hexavalent Ab induced higher apoptosis and similar  levels of ADCC, but the CDC of the hexavalent Ab was completely abolished.  This contrasts to Rtx‐ LNP, which showed enhanced CDC compared with Rtx, and which may have resulted from the intact  Fc regions in Rtx‐LNP enabling multivalent C1q binding.  This highlights the advantage of using entire  IgG molecules in multivalent therapeutic Ab constructs in order to preserve the favorable effects of  the  indirect mechanisms of action  in vivo.   The efficacy of the hexavalent Ab was not  found to be  • 164   superior to that of veltuzumab except at very high doses, and this effect was attributed to the fact  that  it was cleared  from the circulation at  least 4.5 times  faster  than  the bivalent Ab.   These data  mirror  those  in  the  current  study, where  in  both  cases  the  enhanced  effects  from multivalency  observed in vitro are countered by decreases in circulation lifetime.  On the other hand, Zhang et al. have demonstrated more favorable pharmacokinetics and  efficacy of a Rtx polymer with a valence of ~10 (ref. 75).   Although they did not examine ADCC or  CDC, they found that decavalent Rtx  induced apoptosis more effectively  in ten different CD20+ cell  lines, and also exhibited a half‐life if 144 h, compared to 96 h for free Rtx.  The decavalent construct  also exhibited  superior efficacy  in Raji  tumor‐bearing nude mice.   The  reasons  for  the  increase  in  circulation  lifetime of decavalent Rtx versus  the decrease  for Rtx‐LNP are unclear, but one reason  may be  that  the coupling method used may affect pharmacokinetic characteristics and, obviously,  the size of the multivalent constructs are remarkably different.  This study, however, suggests that if  the  pharmacokinetics  of  Rtx‐LNP  can  be  improved,  the  enhanced  effects  from  both  indirect  and  direct  factors could be manifested  in vivo.  Importantly, the  fact  that Rtx‐LNP exhibits such a short  residence  time  in  the  circulation yet exhibit an efficacy  that  is equivalent  to  free Rtx  reflects  the  enhanced potency of Rtx‐LNP.    The rapid clearance of Rtx‐LNP was surprising because previous studies on Trz‐LNP showed  improvements in circulation lifetime and other pharmacokinetic parameters (Table 1.1).  The results  using Rtx‐LNP imply that the rapid clearance may be due to the Ab employed rather than the size of  the constructs or the liposomal component of the formulation.  It may still be possible, however, to  improve  the  pharmacokinetics  of  multivalent  Rtx‐LNP  by  employing  a  non‐liposomal  construct.   Chapters 5 & 6 showed that the enhanced efficacy of Rtx‐LNP is not due to a contribution from the  liposome, because other means of achieving multivalency (Rtx‐MS, 2oAb‐MS) resulted in therapeutic  effects  through  the  same CD120a‐dependent mechanism of action.   Different  types of  constructs  that  could  be  explored  include  polymeric  nanoparticles93,  rotaxanes92,  gold  nanoparticles96,  • 165   dendrimers94,  95,  or  multifunctional  nanoparticles167.    The  issue  of  rapid  clearance  may  also  be  resolved through the selection of an alternative anti‐CD20 Ab such as those  listed  in Table 1.2, but  an alternative Ab would be expected to possess a different direct mechanism of action and different  relative  contributions  of  the  direct  and  indirect  mechanisms,  as  discussed  in  Section  1.4.    An  alternative anti‐CD20 Ab would therefore require re‐initiation of mechanistic studies.   7.3.2  Local  concentrations  of  CD20  in  the  plasma  membrane,  and  not  the  number  of Rtx­CD20  interactions,  determine  the  level  of  apoptosis  induced  by  multivalent Rtx    Section  7.2.3  described  how  the  various  types  of  multivalent  Rtx  employed  in  this  dissertation  resulted  in different  levels of CD120a upregulation and apoptosis  in  lymphoma  cells.   Bivalent Rtx showed the lowest efficacy in vitro although it saturated all CD20 molecules on the cell  surface, while Rtx‐LNP bound only to a fraction of surface CD20, formed domains, and showed much  higher  efficacy  (Figures  4.1,  4.2,  &  4.6).      Rtx‐LNP  treatment  also  resulted  in  a  fraction  of  Rtx  molecules  that were  not  bound  to CD20, but  remained  associated  to  the  cell because other Rtx  molecules  in the same Rtx‐LNP were bound to CD20 (Figure 4.1).   Together, this  indicates that  it  is  not  the direct binding of Rtx  to CD20  that  causes apoptosis; otherwise Rtx would have exhibited  higher efficacy than Rtx‐LNP.   Rather, high  local CD20 densities  in the plasma membrane,  induced  through hypercrosslinking by the multivalent construct, appear to be responsible for the  increased  efficacies.    This  is  supported by  the valence‐dependent  levels of apoptosis  shown  in Figure 4.6.   The  higher  valences of Rtx‐LNP  are  capable of more  substantial hypercrosslinking of CD20 within  the  same  area  of  the  plasma membrane,  resulting  in  greater  local  CD20  concentrations.    This  also  explains why CD20 expression has been observed to be independent of sensitivity to Rtx therapy255;  higher levels of bound Rtx are not necessarily related to greater Rtx sensitivity.  A better indicator of  • 166   sensitivity  to  Rtx  treatment  may  be  an  assessment  of  the  ability  of  Rtx/CD20  to  undergo  hypercrosslinking  (discussed  further  in Section 7.3.4).   By applying  the methodology  to other Abs,  particularly those against targets known to function through hypercrosslinking, it will become clear  whether this same phenomenon occurs with other Abs (Section 7.4).      It should be noted that one potential weakness in Figure 4.1 may be with respect to the Abs  that were employed.   Based on the discussion  in Section 7.2.4,  if the  interaction between Rtx‐LNP  and the cell surface  is highly dynamic with Rtx‐LNP translocating across the surface of the cell, the  binding of A647‐mCD20 on unoccupied CD20 molecules at any instant could cause those molecules  to be unavailable for further interactions with Rtx‐LNP.  This may eventually cause more staining of  unbound CD20 then was actually present at any  instantaneous  time point.   The results would still  indicate  that Rtx‐LNP does not occupy  all  available CD20 on  the  cell  surface,  consistent with  the  current interpretation of this data, but the levels of unoccupied CD20 would be overestimated.       7.3.3  The direct mechanism of action of Rtx may not exclusively involve CD120a,  but also other death receptors and signaling molecules    Cell signaling, in a general sense, encompasses greater complexities than linear transduction  pathways with clearly defined endpoints256.  Rather, a cell contains a network of signaling cascades  that can be envisaged as a spider web, where plucking one fiber results  in small reverberations at  distant sites which determine different biological outcomes256, 257.      In this sense,  it  is  important to  note that CD120a upregulation and activation of the extrinsic apoptosis pathway (Figure 5.1)  likely  cannot explain the direct mechanism of action of Rtx in itself.  This may be particularly true in light  of the fact that essentially all death receptors showed elevated expression after Rtx‐LNP treatment,  particularly CD95 and DR5  in addition to CD120a (Section 5.4.2).   The direct  induction of apoptosis  by  hypercrosslinked  Rtx  therefore  appears  to  involve  a  coordinated  network  of  many  death  receptors that ultimately induce apoptosis in target cells, and from the experiments described in this  • 167   dissertation, CD120a appears to be the major player in this network.  It remains to be seen if this is  the case in cell lines other than those employed here, or in primary cells from xenograft models or  from humans.     In  spite  of  the  strong  evidence  in  support  of  a  CD120a‐dependent  mechanism  at  the  beginning of Section 5.5.1, a knockdown approach or a CD120a‐specific antagonistic antibody258 may  further yield  results on  the overall dependence of CD120a on apoptosis.   CD120a  is nearly always  expressed at  very  low  levels174,  so  strategies aimed at  inhibiting  its upregulation by Rtx‐LNP may  yield  important  information on whether CD120a  is necessary  in the direct mechanism of action of  Rtx, and also whether the other death receptors can compensate for CD120a in its absence.  7.3.4  CD120a expression levels or mutation status as predictive markers for Rtx  response   There is significant interest in identifying molecular markers that are predictive of response  to Rtx because resistance to Rtx therapy is not well understood139, 140.  As mentioned in the previous  section, CD120a  is normally expressed at constitutively  low  levels  in all cells  in the human body174,  177.    In  the  direct mechanism  of  action  of  Rtx,  it  appears  that  the  ability  of multivalent  Rtx  to  upregulate CD120a is responsible for the enhanced therapeutic effects.  Specifically, as illustrated in  Figures 6.1, 6.2, & 6.5, the majority of upregulated CD120a is localized outside of plasma membrane  rafts.    This  constitutes  the  apoptosis‐inducing  form  of  CD120a,  as  opposed  to  the  antiapoptotic  form, which involves association of CD120a with rafts (Section 6.2.1).    It  would  be  expected  that  oncogenic  cells,  in  order  to  survive,  would  express  the  raft‐ associated, NF‐κB‐activating form of CD120a.   In this sense, measuring CD120a expression may not  be a good predictive marker for Rtx response because our results suggest that the upregulation of  non‐raft‐associated  CD120a  drives  the  direct  induction  of  apoptosis.    The  results  in  Chapter  6  (particularly  Figure  6.3),  however,  suggest  that  if  lymphoma  cells  express  high  levels  of  CD120a,  • 168   which  would  be  expected  to  be  raft‐associated,  that  the  patient  may  show  response  to  Chol  depletion  therapy  such  as  statin  treatment.    Such  a  strategy  may  lower  the  levels  of  plasma‐ membrane Chol  in  lymphoma cells and cause CD120a to translocate outside of plasma membrane  rafts, which would be expected  to  induce apoptosis  in  these  cells.    Section 7.3.5 discusses  statin  treatment in conjunction with Rtx therapy.      Since  total CD120a  levels do not appear to be a good marker  for response to Rtx, there  is  also the possibility of assessing the mutation status of CD120a.  Mutations may influence the ability  of  CD120a  to  induce  apoptosis,  affecting  the  response  to  Rtx  treatment.    The  most  common  mutations  in  the  gene  encoding  CD120a  occur  in  a  group  of  autoinflammatory  disorders  called  TNFR‐associated  periodic  syndrome  (TRAPS)259,  260.    Symptoms  of  TRAPS  consist  of  seemingly  unprovoked  inflammatory  attacks  due  to  impaired  control  of  the  innate  immune  system,  but  autoantibodies or antigen‐specific T‐cells (the usual markers of autoimmune disease) are absent261.   Mutations in CD120a that cause TRAPS occur in the extracellular domain, and it has been shown that  these mutations do not cause constitutive or enhanced CD120a activation, but  they may  result  in  defective apoptosis, allowing increased survival of proinflammatory cells262.    Apart from those that are associated with TRAPS, however, CD120a mutations are relatively  rare,  including  in cancer263; this  is  in contrast to CD95, DR4, and DR5, where mutations have been  identified  in many cancer types  including different  lymphomas262, 264.    In an effort to  identify novel  lymphoma‐associated  mutations  in  CD120a,  its  mutation  status  was  queried  in  a  database  of  hundreds of diffuse  large B‐cell  lymphoma  (DLBCL) biopsies which underwent genome sequencing  (Dr.  Randy Gascoyne,  personal  communication).    This  analysis  yielded  the  result  that  no  specific  mutations in CD120a were found across a statistically significant number of samples, confirming the  lack  of  CD120a mutations  observed  in  cancer  and  in  diseases  other  than  TRAPS.    Like  CD120a  expression  levels,  therefore, CD120a expression  status does not  appear  to be  a  good marker  for  clinical Rtx response.    • 169   It may be more promising to look beyond CD120a to other proteins that interact with it; for  example,  mutations  in  proteins  that  associate  with  CD120a  and  which  may  contribute  to  oncogenesis  have  been  identified,  such  as  mutations  in  TRADD,  which  forms  the  DISC  with  CD120a265, 266.  Another possibility would be to assess the ability of healthy FcγR‐expressing effector  cells  in  a  patient  to  engage  in  hypercrosslinking,  because  hypercrosslinking  was  shown  to  be  important in the direct mechanism of action of Rtx (Figures 6.4–6.6).  This can be assessed not only  by  the expression  levels of FcγRs on effector cells, but also by  the  total counts of FcγR‐expressing  cells; both higher average expression and higher  total  cell  counts would be expected  to produce  enhanced Rtx hypercrosslinking.   Another possibility may be  to develop an assay  to measure  the  affinity of FcγRs to the Fc region of therapeutic Abs.  This is in light of studies that have shown that  certain FcγR dimorphisms result in greater affinity interaction between FcγR and the Fc region of IgG  (Section 2.2.2); greater‐affinity  FcγR–Fc  interactions would  result  in more  stable hypercrosslinked  Rtx/CD20  clusters  and  may  result  in  enhanced  efficacy  due  to  the  CD120a‐dependent  direct  mechanism of action described in Chapters 5 & 6 (refs. 122, 123).     7.3.5  Statins in combination with Rtx therapy  Chapter 6 shows that the hypercrosslinking provided by immune effector cells is sufficient to  induce  CD120a  upregulation  and  apoptosis.    This  is  strong  evidence  that  CD120a‐mediated  cell  death  occurs  as  a  direct mechanism  of  action  of  regular  bivalent  Rtx  therapy  in  vivo.    The  final  chapter also examines the Chol dependence of Rtx‐LNP induced apoptosis in light of this mechanism  since CD120a has been shown to produce proapoptotic signals under conditions of reduced plasma  membrane Chol (Sections 6.2.1 & 6.2.2).   It was shown  in Figures 6.1 & 6.2 that Rtx‐LNP  increased  the detergent solubility of CD120a, but when Chol was  reinserted  in  the plasma membrane using  MBCD/Chol,  the  DR  and  raft  association  of  CD120a  increased,  and  cells  were  rescued  from  apoptosis.   Simvastatin treatment also decreased the DR of CD120a and sensitized  lymphoma cells  • 170   to Rtx‐LNP‐induced apoptosis  (Figure 6.3).   Along with  the PBMC experiments  in Figure 6.6 which  supported  an  in  vivo  CD120a‐dependent mechanism,  these  data  suggest  that  concurrent  statin  treatment with Rtx therapy may increase the efficacy of Rtx due to the dual raft‐dependent nature  of CD120a signaling.  Statins  have  shown  anticancer  activity  in  leukemia,  lymphoma,  colorectal  cancer,  breast  cancer,  lung  cancer,  prostate  cancer,  and  pancreatic  cancer267.    Many  mechanisms  of  action  responsible for the therapeutic effects have been described, including the ability of statins to inhibit  antiapoptotic NF‐κB signaling.  Reduced activation of NF‐κB resulting from simvastatin treatment has  been  demonstrated  in  Epstein‐Barr  virus‐associated  lymphomas268  and  cancer‐associated  osteoclastogenesis269,  and  it  occurred  alongside  increased  apoptosis  in  human myeloid  leukemia  cells270 and breast cancer cells, where  the apoptosis was  induced  in response  to TNF‐α271.   Statins  have  also  been  shown  to  induce  apoptosis  in  ovarian  cancer  cells272,  to  inhibit  the  cell  growth,  migration, and  invasion of melanoma  cells273, and  to help overcome drug  resistance  in  refractory  multiple myeloma in a Phase II trial274.  Finally, many studies have associated statin use with reduced  risk of cancer.  For example, a European case‐control study across 22 centers demonstrated an odds  ratio of 0.61  for regular statin use with respect to non‐use, representing a significant reduction  in  overall lymphoma risk associated with statin treatment275.    There  is  some  evidence  that  statin  use  may  directly  inhibit  Rtx  binding  to  CD20  and,  therefore, the efficacy of Rtx.  Inhibition was shown to be related to conformational changes in the  CD20 molecule during statin treatment, and B cells obtained from patients on Rtx therapy showed  lower  levels of Rtx binding276.   Although these studies raised concerns on the use of statins during  Rtx treatment, there is no consensus on whether or not to stop statin treatment at the initiation of  lymphoma  therapy  containing Rtx277.   One  study  that  addressed  this  issue  examined Rtx  efficacy  with respect to statin use on the outcome of a cohort of prospectively observed patients with newly  diagnosed DLBCL and follicular  lymphoma (FL).   It was shown that statin use had no  impact on the  • 171   overall response rate, overall survival, or event‐free survival in patients with DLBCL, but statin use at  diagnosis was associated with improved event‐free survival in patients with FL, including subgroups  treated with a Rtx‐containing regimen.  Statins therefore did not adversely affect outcome in DLBCL  and FL, and the apparent benefit of statin therapy on FL outcome requires further studies277.      At least in some cases, the anticancer effect of statins is related to lowering the area of the  plasma membrane covered with plasma membrane rafts267.   For example, Chol targeting has been  shown to alter lipid raft composition and cell survival in prostate cancer cells and xenografts.  Both  in vitro and in vivo experiments showed that simvastatin induced apoptosis in prostate cancer cells  by  inhibiting  Akt  pathway  signaling,  and  replenishing  cell membranes with  Chol  reversed  these  inhibitory  and  apoptotic  effects243.    This  large  body  of  evidence  concerning  statin  use  in  cancer  treatment  lends  credibility  to  future  studies  on  the  ability  of  statins  to  improve  the  in  vivo  therapeutic efficacy of Rtx through a mechanism that involves CD120a.  7.4  Future work  In an effort  to  further understand  the direct mechanism of action of Rtx,  the results  from  Chapter 6 suggest that an in vivo study in lymphoma xenograft models should be carried out in order  to determine whether changes  in CD120a expression  levels  in  lymphoma cells are observed before  and after treatment with Rtx.  The same two models as used in Figure 2.1B & C could be employed;  the JVM2 model was Rtx‐insensitive while the Z138 model was Rtx‐sensitive.  Based on the results in  Chapter 6, it should be established that the animals have functioning FcγR‐expressing effector cells  in order for hypercrosslinking to occur.   These experiments could be carried out alongside a study  which examines the efficacy of Rtx in conjunction with statin therapy, and if possible, differences in  efficacy  could  be  examined  alongside  CD120a  expression  to  support  or  discredit  the  hypothesis  regarding a CD120a‐dependent direct mechanism of action of Rtx.  • 172   In  terms  of  the  Ab‐LNP methodology  presented  in  this  dissertation,  the most  important  future work involves its application to other therapeutic Abs in an effort to discover new multivalent  drugs.  In industrial settings, a large number of potential therapeutic Ab candidates do not progress  past initial stages of development due to their marginal activity as bivalent molecules.  It is possible,  however,  that  creating multivalent  constructs  from  these Abs  could  lead  to  the discovery of new  responses  that were not observed when  the Ab was bivalent, as was  the case with Rtx.   The new  drugs could then be developed as multivalent, rather than bivalent, Abs.    To work toward a system for applying the methodology in this dissertation to other Abs, the  creation  of  a  business  plan  has  been  underway with  two  partners,  Joel  Jaffe  and Meir Deutsch,  under  the  auspices  of  the  British  Columbia  Innovation  Council.    The  process  would  involve  partnering with academic laboratories or companies engaged in therapeutic antibody development,  who would provide “discarded” Abs for testing.  Besides showing low bivalent activity, the Abs to be  studied  should be at an early  stage of development and  they  should  ideally have a  target  that  is  known  to  produce  therapeutic  responses  through  clustering.    Such  a  strategy would  expand  the  proof‐of‐concept provided using Rtx‐LNPs and may lead to the generation of new cancer medicines.  7.5  Conclusions  This proof‐of‐concept has established that the methodology outlined in this dissertation, in  its application to other Abs in the context of drug development, can serve to:   (1) Identify  therapeutic  Abs  that  show  enhanced  activities  when  multivalent  rather  than  bivalent (Chapter 2);  (2) Determine the optimal valence of Abs that benefit from multivalency (Chapter 4);  (3) Decipher the mechanism of action of the new multivalent drug (Chapters 2, 4, 5, & 6);  (4) Use the above  information to develop non‐liposomal formulations of the multivalent Ab,  if  required (Chapters 5 & 6).  • 173     Although the valence of all approved therapeutic Abs is currently two, the results in this dissertation  suggest that every therapeutic Ab may have a different valence where  it shows  its highest activity.   This new concept should be included in the toolbox for creating therapeutic Abs for treating cancer.        • 174    References    1.  Weiner  LM,  Surana  R,  Wang  S.  Monoclonal  antibodies:  Versatile  platforms  for  cancer  immunotherapy. Nat Rev Immunol 2010 May;10(5):317‐27.    2.  Harris  M.  Monoclonal  antibodies  as  therapeutic  agents  for  cancer.  Lancet  Oncol  2004  May;5(5):292‐302.    3.  Allen  TM,  Cullis  PR.  Drug  delivery  systems:  Entering  the  mainstream.  Science  2004  Mar  19;303(5665):1818‐22.    4. Heath TD, Fraley RT, Papahdjopoulos D. Antibody targeting of liposomes: Cell specificity obtained  by conjugation of F(ab')2 to vesicle surface. Science 1980 Oct 31;210(4469):539‐41.    5.  Zhang  L,  Gu  FX,  Chan  JM,  Wang  AZ,  Langer  RS,  Farokhzad  OC.  Nanoparticles  in  medicine:  Therapeutic applications and developments. Clin Pharmacol Ther 2008 May;83(5):761‐9.    6. Park JW, Benz CC, Martin FJ. Future directions of  liposome‐ and  immunoliposome‐based cancer  therapeutics. Semin Oncol 2004 Dec;31(6 Suppl 13):196‐205.    7. Chiu GN, Edwards LA, Kapanen AI, Malinen MM, Dragowska WH, Warburton C, Chikh GG, Fang KY,  Tan  S,  Sy  J,  et  al. Modulation  of  cancer  cell  survival  pathways  using multivalent  liposomal  therapeutic antibody constructs. Mol Cancer Ther 2007 Mar;6(3):844‐55.    8. Drummond DC, Noble CO, Hayes ME, Park  JW, Kirpotin DB. Pharmacokinetics and  in vivo drug  release rates in liposomal nanocarrier development. J Pharm Sci 2008 Nov;97(11):4696‐740.    9.  Slingerland M, Guchelaar H, Gelderblom H.  Liposomal drug  formulations  in  cancer  therapy: 15  years along the road. Drug Discov Today 2012 Feb;17(3‐4):160‐6.    10. Heidel  JD, Davis ME. Clinical developments  in nanotechnology  for  cancer  therapy. Pharm Res  2011 Feb;28(2):187‐99.    11. Park  JW, Hong K, Kirpotin DB, Colbern G, Shalaby R, Baselga  J, Shao Y, Nielsen UB, Marks  JD,  Moore  D,  et  al.  Anti‐HER2  immunoliposomes:  Enhanced  efficacy  attributable  to  targeted  delivery. Clin Cancer Res 2002 Apr;8(4):1172‐81.    12. Mamot C, Drummond DC, Noble CO, Kallab V, Guo Z, Hong K, Kirpotin DB, Park JW. Epidermal  growth  factor  receptor‐targeted  immunoliposomes  significantly  enhance  the  efficacy  of  multiple anticancer drugs in vivo. Cancer Res 2005 Dec 15;65(24):11631‐8.    13. Kirpotin D, Park JW, Hong K, Zalipsky S, Li WL, Carter P, Benz CC, Papahadjopoulos D. Sterically  stabilized anti‐HER2  immunoliposomes: Design and  targeting  to human breast cancer  cells  in  vitro. Biochemistry 1997 Jan 7;36(1):66‐75.    14. Omelyanenko V, Kopeckova P, Gentry C, Shiah JG, Kopecek J. HPMA copolymer‐anticancer drug‐ OV‐TL16 antibody conjugates. 1. Influence of the method of synthesis on the binding affinity to  OVCAR‐3 ovarian carcinoma cells in vitro. J Drug Target 1996;3(5):357‐73.  • 175   15.  Johnson RN, Kopeckova P, Kopecek  J. Synthesis and evaluation of multivalent branched HPMA  copolymer‐fab'  conjugates  targeted  to  the  B‐cell  antigen  CD20.  Bioconjug  Chem  2009  Jan;20(1):129‐37.    16. Popov J, Kapanen AI, Turner C, Ng R, Tucker C, Chiu G, Klasa R, Bally MB, Chikh G. Multivalent  rituximab  lipid nanoparticles as  improved  lymphoma therapies:  Indirect mechanisms of action  and in vivo activity. Nanomedicine 2011 Nov;6(9):1575‐91.    17. Mufamadi MS, Pillay V, Choonara YE, Du Toit LC, Modi G, Naidoo D, Ndesendo VMK. A review on  composite  liposomal  technologies  for  specialized  drug  delivery.  J  Drug  Deliv  2011  Feb  8;2011(Article ID 939851):19 pgs.    18.  Lian T, Ho RJ. Trends and developments  in  liposome drug delivery  systems.  J Pharm Sci 2001  Jun;90(6):667‐80.    19. Chonn A, Semple SC, Cullis PR. Association of blood proteins with large unilamellar liposomes in  vivo. Relation to circulation lifetimes. J Biol Chem 1992 Sep 15;267(26):18759‐65.    20. Strebhardt K, Ullrich A. Paul ehrlich's magic bullet concept: 100 years of progress. Nat Rev Cancer  2008 Jun;8(6):473‐80.    21.  Kohler  G,  Milstein  C.  Continuous  cultures  of  fused  cells  secreting  antibody  of  predefined  specificity. Nature 1975 Aug 7;256(5517):495‐7.    22.  Boulianne  GL,  Hozumi  N,  Shulman  MJ.  Production  of  functional  chimaeric  mouse/human  antibody. Nature 1984 Dec 13‐19;312(5995):643‐6.    23. Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G. Reshaping human antibodies for therapy. Nature  1988 Mar 24;332(6162):323‐7.    24. Weiner LM, Belldegrun AS, Crawford  J, Tolcher AW, Lockbaum P, Arends RH, Navale L, Amado  RG, Schwab G, Figlin RA. Dose and schedule study of panitumumab monotherapy  in patients  with advanced solid malignancies. Clin Cancer Res 2008 Jan 15;14(2):502‐8.    25. Hagenbeek A, Gadeberg O,  Johnson  P, Møller  Pedersen  L, Walewski  J, Hellmann A,  Link  BK,  Robak T, Wojtukiewicz M, Pfreundschuh M, et al. First clinical use of ofatumumab, a novel fully  human anti‐CD20 monoclonal antibody in relapsed or refractory follicular lymphoma: Results of  a phase 1/2 trial. Blood 2008 June 15;111(12):5486‐95.    26. Burtrum D, Zhu Z, Lu D, Anderson DM, Prewett M, Pereira DS, Bassi R, Abdullah R, Hooper AT,  Koo H, et al. A  fully human monoclonal antibody  to  the  insulin‐like growth  factor  I  receptor  blocks  ligand‐dependent signaling and  inhibits human tumor growth  in vivo. Cancer Res 2003  Dec 15;63(24):8912‐21.    27. Coiffier B,  Lepage E, Briere  J, Herbrecht R, Tilly H, Bouabdallah R, Morel P, Van Den Neste E,  Salles G, Gaulard P, et al. CHOP chemotherapy plus  rituximab compared with CHOP alone  in  elderly patients with diffuse large‐B‐cell lymphoma. N Engl J Med 2002 Jan 24;346(4):235‐42.    28. McLaughlin P, Grillo‐Lopez AJ, Link BK, Levy R, Czuczman MS, Williams ME, Heyman MR, Bence‐ Bruckler  I, White  CA,  Cabanillas  F,  et  al. Rituximab  chimeric  anti‐CD20 monoclonal  antibody  • 176   therapy  for  relapsed  indolent  lymphoma: Half of patients  respond  to  a  four‐dose  treatment  program. J Clin Oncol 1998 Aug;16(8):2825‐33.    29.  Leavy  O.  Therapeutic  antibodies:  Past,  present  and  future.  Nat  Rev  Immunol  2010  May;10(5):297.    30.  Aggarwal S. What's fueling the biotech engine‐‐2008. Nat Biotechnol 2009 Nov;27(11):987‐93.    31.  Beck  A, Wurch  T,  Bailly  C,  Corvaia  N.  Strategies  and  challenges  for  the  next  generation  of  therapeutic antibodies. Nat Rev Immunol 2010 May;10(5):345‐52.    32. Cobleigh MA, Vogel CL, Tripathy D, Robert NJ, Scholl S, Fehrenbacher L, Wolter JM, Paton V, Shak  S, Lieberman G, et al. Multinational  study of  the efficacy and  safety of humanized anti‐HER2  monoclonal antibody  in women who have HER2‐overexpressing metastatic breast cancer that  has progressed after chemotherapy  for metastatic disease.  J Clin Oncol 1999 Sep;17(9):2639‐ 48.    33. Slamon DJ, Leyland‐Jones B, Shak S, Fuchs H, Paton V, Bajamonde A, Fleming T, Eiermann W,  Wolter J, Pegram M, et al. Use of chemotherapy plus a monoclonal antibody against HER2 for  metastatic breast cancer that overexpresses HER2. N Engl J Med 2001 Mar 15;344(11):783‐92.    34. Lundin J, Kimby E, Bjorkholm M, Broliden PA, Celsing F, Hjalmar V, Mollgard L, Rebello P, Hale G,  Waldmann H, et al. Phase II trial of subcutaneous anti‐CD52 monoclonal antibody alemtuzumab  (campath‐1H) as  first‐line  treatment  for patients with B‐cell chronic  lymphocytic  leukemia  (B‐ CLL). Blood 2002 Aug 1;100(3):768‐73.    35. Van Cutsem E, Kohne CH, Hitre E, Zaluski J, Chang Chien CR, Makhson A, D'Haens G, Pinter T, Lim  R, Bodoky G, et al. Cetuximab and chemotherapy as  initial treatment for metastatic colorectal  cancer. N Engl J Med 2009 Apr 2;360(14):1408‐17.    36. Hurwitz H, Fehrenbacher L, Novotny W, Cartwright T, Hainsworth J, Heim W, Berlin J, Baron A,  Griffing  S,  Holmgren  E,  et  al.  Bevacizumab  plus  irinotecan,  fluorouracil,  and  leucovorin  for  metastatic colorectal cancer. N Engl J Med 2004 Jun 3;350(23):2335‐42.    37. Wierda WG, Kipps TJ, Mayer  J, Stilgenbauer S, Williams CD, Hellmann A, Robak T, Furman RR,  Hillmen P, Trneny M, et al. Ofatumumab as single‐agent CD20  immunotherapy  in fludarabine‐ refractory chronic lymphocytic leukemia. J Clin Oncol 2010 Apr 1;28(10):1749‐55.    38. Baselga  J, Gelmon KA, Verma S, Wardley A, Conte P, Miles D, Bianchi G, Cortes  J, McNally VA,  Ross GA, et al. Phase II trial of pertuzumab and trastuzumab in patients with human epidermal  growth  factor  receptor  2–Positive  metastatic  breast  cancer  that  progressed  during  prior  trastuzumab therapy. J Clin Oncol 2010 Mar 1;28(7):1138‐44.    39. Baselga  J,  Swain  SM. CLEOPATRA: A phase  III  evaluation of pertuzumab  and  trastuzumab  for  HER2‐positive metastatic breast cancer. Clin Breast Cancer 2010 Dec 1;10(6):489‐91.    40. Goldenberg DM, Morschhauser F, Wegener WA. Veltuzumab (humanized anti‐CD20 monoclonal  antibody): Characterization, current clinical results, and future prospects. Leuk Lymphoma 2010  May;51(5):747‐55.    • 177   41. Morschhauser F, Leonard JP, Fayad L, Coiffier B, Petillon MO, Coleman M, Schuster SJ, Dyer MJ,  Horne H,  Teoh N,  et  al. Humanized  anti‐CD20  antibody,  veltuzumab,  in  refractory/recurrent  non‐hodgkin's lymphoma: Phase I/II results. J Clin Oncol 2009 Jul 10;27(20):3346‐53.    42. Clark MR. IgG effector mechanisms. Chem Immunol 1997;65:88‐110.    43. Natsume A, Niwa R, Satoh M.  Improving effector functions of antibodies for cancer treatment:  Enhancing ADCC and CDC. Drug Des Devel Ther 2009 Sep 21;3:7‐16.    44.  Lim  SH,  Beers  SA,  French  RR,  Johnson  PW,  Glennie  MJ,  Cragg  MS.  Anti‐CD20  monoclonal  antibodies: Historical and future perspectives. Haematologica 2010 Jan;95(1):135‐43.    45. Deans JP, Li H, Polyak MJ. CD20‐mediated apoptosis: Signalling through  lipid rafts. Immunology  2002 Oct;107(2):176‐82.    46. Golay  J,  Zaffaroni  L,  Vaccari  T,  Lazzari M,  Borleri GM,  Bernasconi  S,  Tedesco  F,  Rambaldi  A,  Introna M. Biologic response of B lymphoma cells to anti‐CD20 monoclonal antibody rituximab  in  vitro:  CD55  and  CD59  regulate  complement‐mediated  cell  lysis.  Blood  2000  Jun  15;95(12):3900‐8.    47. Polyak MJ, Li H, Shariat N, Deans  JP. CD20 homo‐oligomers physically associate with the B cell  antigen receptor: Dissociation upon receptor engagement and recruitment of phosphoproteins  and calmodulin‐binding proteins. J Biol Chem 2008 Jul 4;283(27):18545‐52.    48. Jefferis R, Lund J. Interaction sites on human IgG‐fc for FcγR: Current models. Immunol Lett 2002  Jun 3;82(1‐2):57‐65.    49.  Jazirehi  AR,  Bonavida  B.  Cellular  and molecular  signal  transduction  pathways modulated  by  rituximab  (rituxan,  anti‐CD20  mAb)  in  non‐hodgkin's  lymphoma:  Implications  in  chemosensitization and therapeutic intervention. Oncogene 2005 Mar 24;24(13):2121‐43.    50. Cartron G, Watier H, Golay J, Solal‐Celigny P. From the bench to the bedside: Ways to  improve  rituximab efficacy. Blood 2004 Nov 1;104(9):2635‐42.    51.  Stolz  C,  Schuler  M.  Molecular  mechanisms  of  resistance  to  rituximab  and  pharmacologic  strategies for its circumvention. Leuk Lymphoma 2009 Jun;50(6):873‐85.    52. Walport MJ. Complement. N Engl J Med 2001 Apr 5;344(14):1058‐66.    53. Zhou X, Hu W, Qin X. The role of complement in the mechanism of action of rituximab for B‐cell  lymphoma: Implications for therapy. The Oncologist 2008 September 01;13(9):954‐66.    54. Wang SY, Weiner G. Complement and cellular cytotoxicity in antibody therapy of cancer. Expert  Opin Biol Ther 2008 Jun;8(6):759‐68.    55.  Dall'Acqua WF,  Cook  KE,  Damschroder MM, Woods  RM, Wu  H. Modulation  of  the  effector  functions  of  a  human  IgG1  through  engineering  of  its  hinge  region.  J  Immunol  2006  Jul  15;177(2):1129‐38.    • 178   56.  Idusogie  EE,  Wong  PY,  Presta  LG,  Gazzano‐Santoro  H,  Totpal  K,  Ultsch  M,  Mulkerrin  MG.  Engineered  antibodies  with  increased  activity  to  recruit  complement.  J  Immunol  2001  Feb  15;166(4):2571‐5.    57. Natsume A, In M, Takamura H, Nakagawa T, Shimizu Y, Kitajima K, Wakitani M, Ohta S, Satoh M,  Shitara  K,  et  al.  Engineered  antibodies  of  IgG1/IgG3 mixed  isotype with  enhanced  cytotoxic  activities. Cancer Res 2008 May 15;68(10):3863‐72.    58.  Satoh  M,  Iida  S,  Shitara  K.  Non‐fucosylated  therapeutic  antibodies  as  next‐generation  therapeutic antibodies. Expert Opin Biol Ther 2006 Nov;6(11):1161‐73.    59. Weitzman J, Betancur M, Boissel L, Rabinowitz AP, Klein A, Klingemann H. Variable contribution  of  monoclonal  antibodies  to  ADCC  in  patients  with  chronic  lymphocytic  leukemia.  Leuk  Lymphoma 2009 Aug;50(8):1361‐8.    60. Shields RL, Lai J, Keck R, O'Connell LY, Hong K, Meng YG, Weikert SHA, Presta LG. Lack of fucose  on  human  IgG1  N‐linked  oligosaccharide  improves  binding  to  human  FcγRIII  and  antibody‐ dependent cellular toxicity. J Biol Chem 2002 July 26;277(30):26733‐40.    61. Kanda Y, Yamada T, Mori K, Okazaki A, Inoue M, Kitajima‐Miyama K, Kuni‐Kamochi R, Nakano R,  Yano K, Kakita S, et al. Comparison of biological activity among nonfucosylated therapeutic IgG1  antibodies with  three  different N‐linked  fc  oligosaccharides:  The  high‐mannose,  hybrid,  and  complex types. Glycobiology 2007 Jan 1;17(1):104‐18.    62. Oganesyan V, Damschroder MM, Leach W, Wu H, Dall’Acqua WF. Structural characterization of a  mutated, ADCC‐enhanced human fc fragment. Mol Immunol 2008 4;45(7):1872‐82.    63. Shields RL, Namenuk AK, Hong K, Meng YG, Rae J, Briggs J, Xie D, Lai J, Stadlen A, Li B, et al. High  resolution mapping of the binding site on human  IgG1 for FcγRI, FcγRII, FcγRIII, and FcRn and  design of IgG1 variants with improved binding to the FcγR. J Biol Chem 2001 Mar 2;276(9):6591‐ 604.    64. Lazar GA, Dang W, Karki S, Vafa O, Peng JS, Hyun L, Chan C, Chung HS, Eivazi A, Yoder SC, et al.  Engineered antibody fc variants with enhanced effector function. P Natl Acad Sci USA 2006 Mar  14;103(11):4005‐10.    65.  Agus  DB,  Gordon MS,  Taylor  C,  Natale  RB,  Karlan  B, Mendelson  DS,  Press MF,  Allison  DE,  Sliwkowski  MX,  Lieberman  G,  et  al.  Phase  I  clinical  study  of  pertuzumab,  a  novel  HER  dimerization inhibitor, in patients with advanced cancer. J Clin Oncol 2005 Apr 10;23(11):2534‐ 43.    66. Hall PS, Cameron DA. Current perspective – trastuzumab. Eur J Cancer 2009 1;45(1):12‐8.    67. Yarden Y, Sliwkowski MX. Untangling  the ErbB  signalling network. Nat Rev Mol Cell Biol 2001  Feb;2(2):127‐37.    68.  Sliwkowski  MX,  Lofgren  JA,  Lewis  GD,  Hotaling  TE,  Fendly  BM,  Fox  JA.  Nonclinical  studies  addressing  the mechanism of action of  trastuzumab  (herceptin). Semin Oncol 1999 Aug;26(4  Suppl 12):60‐70.    • 179   69.  Valabrega G, Montemurro  F,  Aglietta M.  Trastuzumab: Mechanism  of  action,  resistance  and  future perspectives in HER2‐overexpressing breast cancer. Ann Oncol 2007 Jun 1;18(6):977‐84.    70. Hudis CA. Trastuzumab — mechanism of action and use in clinical practice. N Engl J Med 2007 Jul  5;357(1):39‐51.    71. DeGrendele H,  Jain VK.  The  anti‐HER2 monoclonal  antibody  pertuzumab may  be  effective  in  androgen‐independent prostate cancer. Clin Genitourin Canc 2003;2(3):143‐5.    72.  Nahta  R,  Hung  M,  Esteva  FJ.  The  HER‐2‐targeting  antibodies  trastuzumab  and  pertuzumab  synergistically inhibit the survival of breast cancer cells. Cancer Res 2004 Apr 1;64(7):2343‐6.    73.  Scheuer  W,  Friess  T,  Burtscher  H,  Bossenmaier  B,  Endl  J,  Hasmann  M.  Strongly  enhanced  antitumor  activity  of  trastuzumab  and  pertuzumab  combination  treatment  on HER2‐positive  human xenograft tumor models. Cancer Res 2009 Dec 15;69(24):9330‐6.    74.  Janas  E,  Priest  R,  Wilde  JI,  White  JH,  Malhotra  R.  Rituxan  (anti‐CD20  antibody)‐induced  translocation  of  CD20  into  lipid  rafts  is  crucial  for  calcium  influx  and  apoptosis.  Clin  Exp  Immunol 2005 Mar;139(3):439‐46.    75. Zhang N, Khawli LA, Hu P, Epstein AL. Generation of rituximab polymer may cause hyper‐cross‐ linking‐induced  apoptosis  in  non‐hodgkin's  lymphomas.  Clin  Cancer  Res  2005  Aug  15;11(16):5971‐80.    76.  Pedersen  IM,  Buhl  AM,  Klausen  P, Geisler  CH,  Jurlander  J.  The  chimeric  anti‐CD20  antibody  rituximab induces apoptosis in B‐cell chronic lymphocytic leukemia cells through a p38 mitogen  activated protein‐kinase‐dependent mechanism. Blood 2002 Feb 15;99(4):1314‐9.    77. Shan D, Ledbetter JA, Press OW. Apoptosis of malignant human B cells by ligation of CD20 with  monoclonal antibodies. Blood 1998 Mar 1;91(5):1644‐52.    78. Hanahan D, Weinberg RA. The hallmarks of cancer. Cell 2000 Jan 7;100(1):57‐70.    79. Pennarun B, Meijer A, de Vries EG, Kleibeuker JH, Kruyt F, de Jong S. Playing the DISC: Turning on  TRAIL  death  receptor‐mediated  apoptosis  in  cancer.  Biochim  Biophys  Acta  2010  Apr;1805(2):123‐40.    80.  Cotter  TG.  Apoptosis  and  cancer:  The  genesis  of  a  research  field.  Nat  Rev  Cancer  2009  Jul;9(7):501‐7.    81. Ghavami S, Hashemi M, Ande SR, Yeganeh B, Xiao W, Eshraghi M, Bus CJ, Kadkhoda K, Wiechec  E, Halayko AJ, et al. Apoptosis and cancer: Mutations within caspase genes. J Med Genet 2009  Aug;46(8):497‐510.    82. Ashkenazi A. Targeting death and decoy  receptors of  the  tumour‐necrosis  factor  superfamily.  Nat Rev Cancer 2002 Jun;2(6):420‐30.    83. Danial NN, Korsmeyer SJ. Cell death: Critical control points. Cell 2004 Jan 23;116(2):205‐19.    • 180   84. Vermes  I, Haanen C, Steffens‐Nakken H, Reutellingsperger C. A novel assay  for apoptosis  flow  cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein  labelled annexin V. J Immunol Methods 1995 Jul 17;184(1):39‐51.    85. Koopman G, Reutelingsperger C, Kuijten G, Keehnen R, Pals S, van Oers M. Annexin V for flow  cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood  1994 Sept 1;84(5):1415‐20.    86.  Strasser  A.  The  role  of  BH3‐only  proteins  in  the  immune  system.  Nat  Rev  Immunol  2005  Mar;5(3):189‐200.    87. Kohlhaas SL, Craxton A, Sun XM, Pinkoski MJ, Cohen GM. Receptor‐mediated endocytosis is not  required for tumor necrosis factor‐related apoptosis‐inducing ligand (TRAIL)‐induced apoptosis.  J Biol Chem 2007 Apr 27;282(17):12831‐41.    88. Ghetie MA, Bright H, Vitetta ES. Homodimers but not monomers of rituxan (chimeric anti‐CD20)  induce apoptosis in human B‐lymphoma cells and synergize with a chemotherapeutic agent and  an immunotoxin. Blood 2001 Mar 1;97(5):1392‐8.    89. Miller K, Meng G, Liu J, Hurst A, Hsei V, Wong WL, Ekert R, Lawrence D, Sherwood S, DeForge L,  et al. Design, construction, and in vitro analyses of multivalent antibodies. J Immunol 2003 May  1;170(9):4854‐61.    90. Rossi EA, Goldenberg DM, Cardillo TM, Stein R, Wang Y, Chang CH. Novel designs of multivalent  anti‐CD20  humanized  antibodies  as  improved  lymphoma  therapeutics.  Cancer  Res  2008 Oct  15;68(20):8384‐92.    91. Deyev  SM,  Lebedenko  EN. Multivalency:  The  hallmark of  antibodies  used  for optimization  of  tumor targeting by design. Bioessays 2008 Sep;30(9):904‐18.    92. Martos V, Castreño P, Valero  J, de Mendoza  J. Binding  to protein  surfaces by  supramolecular  multivalent scaffolds. Curr Opin Chem Biol 2008 12;12(6):698‐706.    93. Kitov PI, Mulvey GL, Griener TP, Lipinski T, Solomon D, Paszkiewicz E, Jacobson JM, Sadowska JM,  Suzuki  M,  Yamamura  K,  et  al.  In  vivo  supramolecular  templating  enhances  the  activity  of  multivalent ligands: A potential therapeutic against the escherichia coli O157 AB5 toxins. P Natl  Acad Sci USA 2008 Nov 4;105(44):16837‐42.    94. Patri AK, Majoros IJ, Baker JR. Dendritic polymer macromolecular carriers for drug delivery. Curr  Opin Chem Biol 2002 Aug;6(4):466‐71.    95. Patri AK, Myc A, Beals J, Thomas TP, Bander NH, Baker JR. Synthesis and in vitro testing of J591  antibody‐dendrimer  conjugates  for  targeted  prostate  cancer  therapy.  Bioconjug  Chem  2004  Nov;15(6):1174‐81.    96. Weiss A, Preston TC, Popov  J,  Li Q, Wu S, Chou KC, Burt HM, Bally MB, Signorell R. Selective  recognition of rituximab‐functionalized gold nanoparticles by  lymphoma cells studied with 3D  imaging. J Phys Chem C 2009 Oct 21;113(47):20252‐8.    • 181   97.  Cuesta AM,  Sainz‐Pastor N,  Bonet  J, Oliva  B, Alvarez‐Vallina  L. Multivalent  antibodies: When  design surpasses evolution. Trends Biotechnol 2010 Jul;28(7):355‐62.    98. Coloma MJ, Clift A, Wims L, Morrison SL. The role of carbohydrate in the assembly and function  of polymeric IgG. Mol Immunol 2000 Dec;37(18):1081‐90.    99. Mammen M, Choi SK, Whitesides GM. Polyvalent interactions in biological systems: Implications  for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Edit 1998;37:2754‐94.    100. Dam TK, Brewer CF. Effects of clustered epitopes  in multivalent  ligand‐receptor  interactions.  Biochemistry 2008 Aug 19;47(33):8470‐6.    101. Martos V, Castreno P, Valero  J, de Mendoza  J. Binding  to protein surfaces by supramolecular  multivalent scaffolds. Curr Opin Chem Biol 2008 Dec;12(6):698‐706.    102. Gestwicki JE, Cairo CW, Strong LE, Oetjen KA, Kiessling LL.  Influencing receptor‐ligand binding  mechanisms with multivalent  ligand architecture. J Am Chem Soc 2002 Dec 18;124(50):14922‐ 33.    103.  Rinker  S,  Ke  Y,  Liu  Y,  Chhabra  R,  Yan  H.  Self‐assembled  DNA  nanostructures  for  distance‐ dependent multivalent ligand‐protein binding. Nat Nanotechnol 2008 Jul;3(7):418‐22.    104. Diestler DJ, Knapp EW. Statistical thermodynamics of the stability of multivalent ligand‐receptor  complexes. Phys Rev Lett 2008 May 2;100(17):178101.    105. Feng  JQ, Mozdzanowska K, Gerhard W. Complement component C1q enhances the biological  activity  of  influenza  virus  hemagglutinin‐specific  antibodies  depending  on  their  fine  antigen  specificity and heavy‐chain isotype. J Virol 2002 Feb;76(3):1369‐78.    106. Schumaker VN, Zavodszky P, Poon PH. Activation of the first component of complement. Annu  Rev Immunol 1987;5:21‐42.    107. George SR, O'Dowd BF, Lee SP. G‐protein‐coupled receptor oligomerization and its potential for  drug discovery. Nat Rev Drug Discov 2002 Oct;1(10):808‐20.    108. Simons K, Toomre D. Lipid rafts and signal transduction. Nat Rev Mol Cell Biol 2000 Oct;1(1):31‐ 9.    109. Hommelgaard AM,  Lerdrup M,  van Deurs B. Association with membrane protrusions makes  ErbB2 an internalization‐resistant receptor. Mol Biol Cell 2004 Apr;15(4):1557‐67.    110. Friedlander E, Arndt‐Jovin DJ, Nagy P, Jovin TM, Szollosi J, Vereb G. Signal transduction of erbB  receptors  in  trastuzumab  (herceptin) sensitive and  resistant cell  lines: Local  stimulation using  magnetic microspheres  as  assessed  by  quantitative  digital microscopy.  Cytom  Part  A  2005  Oct;67(2):161‐71.    111. Nagy P, Vereb G, Sebestyen Z, Horvath G, Lockett SJ, Damjanovich S, Park JW, Jovin TM, Szollosi  J. Lipid rafts and the  local density of ErbB proteins  influence the biological role of homo‐ and  heteroassociations of ErbB2. J Cell Sci 2002 Nov 15;115(Pt 22):4251‐62.    • 182   112. Ghatak  S, Misra S, Toole BP. Hyaluronan  constitutively  regulates ErbB2 phosphorylation and  signaling complex formation in carcinoma cells. J Biol Chem 2005 Mar 11;280(10):8875‐83.    113. Misra S, Ghatak S, Toole BP. Regulation of MDR1 expression and drug resistance by a positive  feedback  loop  involving hyaluronan, phosphoinositide 3‐kinase, and ErbB2.  J Biol Chem 2005  May 27;280(21):20310‐5.    114. Oliveira S, Schiffelers RM, van der Veeken  J, van der Meel R, Vongpromek R, van Bergen En  Henegouwen  PM,  Storm  G,  Roovers  RC.  Downregulation  of  EGFR  by  a  novel  multivalent  nanobody‐liposome platform. J Control Release 2010 Jul 14;145(2):165‐75.    115.  Reff  ME,  Carner  K,  Chambers  KS,  Chinn  PC,  Leonard  JE,  Raab  R,  Newman  RA,  Hanna  N,  Anderson DR. Depletion of B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to  CD20. Blood 1994 Jan 15;83(2):435‐45.    116. Gancz D, Fishelson Z. Cancer resistance to complement‐dependent cytotoxicity (CDC): Problem‐ oriented research and development. Mol Immunol 2009 Sep;46(14):2794‐800.    117. Flieger D, Renoth S, Beier  I, Sauerbruch T, Schmidt‐Wolf  I. Mechanism of cytotoxicity  induced  by chimeric mouse human monoclonal antibody IDEC‐C2B8  in CD20‐expressing  lymphoma cell  lines. Cell Immunol 2000 Aug 25;204(1):55‐63.    118. Di Gaetano N, Cittera E, Nota R, Vecchi A, Grieco V, Scanziani E, Botto M,  Introna M, Golay J.  Complement  activation  determines  the  therapeutic  activity  of  rituximab  in  vivo.  J  Immunol  2003 Aug 1;171(3):1581‐7.    119. Kennedy AD, Beum PV, Solga MD, DiLillo DJ, Lindorfer MA, Hess CE, Densmore JJ, Williams ME,  Taylor RP. Rituximab  infusion promotes  rapid  complement depletion and acute CD20  loss  in  chronic lymphocytic leukemia. J Immunol 2004 Mar 1;172(5):3280‐8.    120. Guo B, Ma ZW, Li H, Xu GL, Zheng P, Zhu B, Wu YZ, Zou Q. Mapping of binding epitopes of a  human  decay‐accelerating  factor  monoclonal  antibody  capable  of  enhancing  rituximab‐ mediated complement‐dependent cytotoxicity. Clin Immunol 2008 Aug;128(2):155‐63.    121. Clynes RA, Towers TL, Presta LG, Ravetch JV. Inhibitory fc receptors modulate in vivo cytoxicity  against tumor targets. Nat Med 2000 Apr;6(4):443‐6.    122. Koene HR, Kleijer M, Algra  J, Roos D, von dem Borne AE, de Haas M. Fc gammaRIIIa‐158V/F  polymorphism influences the binding of IgG by natural killer cell fc gammaRIIIa, independently  of the fc gammaRIIIa‐48L/R/H phenotype. Blood 1997 Aug 1;90(3):1109‐14.    123. Cartron G, Dacheux L, Salles G, Solal‐Celigny P, Bardos P, Colombat P, Watier H. Therapeutic  activity  of  humanized  anti‐CD20 monoclonal  antibody  and  polymorphism  in  IgG  fc  receptor  FcgammaRIIIa gene. Blood 2002 Feb 1;99(3):754‐8.    124.  Inagaki A,  Ishida T, Yano H,  Ishii T, Kusumoto S,  Ito A, Ri M, Mori F, Ding J, Komatsu H, et al.  Expression of the ULBP ligands for NKG2D by B‐NHL cells plays an important role in determining  their susceptibility to rituximab‐induced ADCC. Int J Cancer 2009 Jul 1;125(1):212‐21.    • 183   125.  Carbone  E,  Ruggiero  G,  Terrazzano  G,  Palomba  C,  Manzo  C,  Fontana  S,  Spits  H,  Karre  K,  Zappacosta  S.  A  new  mechanism  of  NK  cell  cytotoxicity  activation:  The  CD40‐CD40  ligand  interaction. J Exp Med 1997 Jun 16;185(12):2053‐60.    126. Wilson  JL,  Charo  J, Martin‐Fontecha  A,  Dellabona  P,  Casorati  G,  Chambers  BJ,  Kiessling  R,  Bejarano MT, Ljunggren HG. NK cell triggering by the human costimulatory molecules CD80 and  CD86. J Immunol 1999 Oct 15;163(8):4207‐12.    127. Tucker CA, Bebb G, Klasa RJ, Chhanabhai M, Lestou V, Horsman DE, Gascoyne RD, Wiestner A,  Masin D, Bally M, et al. Four human  t(11;14)(q13;q32)‐containing cell  lines having classic and  variant features of mantle cell lymphoma. Leuk Res 2006 Apr;30(4):449‐57.    128.  Hope MJ,  Bally MB, Webb  G,  Cullis  PR.  Production  of  large  unilamellar  vesicles  by  a  rapid  extrusion  procedure.  Characterization  of  size  distribution,  trapped  volume  and  ability  to  maintain a membrane potential. BBA‐Biomembranes 1985;812(1):55‐65.    129.  Mayer  LD,  Hope  MJ,  Cullis  PR.  Vesicles  of  variable  sizes  produced  by  a  rapid  extrusion  procedure. Biochim Biophys Acta 1986 Jun 13;858(1):161‐8.    130. Chiu GN, Bally MB, Mayer LD. Targeting of antibody conjugated, phosphatidylserine‐containing  liposomes to vascular cell adhesion molecule 1 for controlled thrombogenesis. Biochim Biophys  Acta 2003 Jun 27;1613(1‐2):115‐21.    131. Gomez‐Roman VR, Florese RH, Patterson LJ, Peng B, Venzon D, Aldrich K, Robert‐Guroff M. A  simplified method for the rapid fluorometric assessment of antibody‐dependent cell‐mediated  cytotoxicity. J Immunol Methods 2006 Jan 20;308(1‐2):53‐67.    132. Estrov Z, Talpaz M, Ku S, Harris D, Van Q, Beran M, Hirsch‐Ginsberg C, Huh Y, Yee G, Kurzrock R.  Z‐138:  A  new  mature  B‐cell  acute  lymphoblastic  leukemia  cell  line  from  a  patient  with  transformed chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res 1998 Apr;22(4):341‐53.    133. Melo  JV,  Foroni  L, Brito‐Babapulle V,  Luzzatto  L, Catovsky D. The establishment of  cell  lines  from chronic B cell leukaemias: Evidence of leukaemic origin by karyotypic abnormalities and ig  gene rearrangement. Clin Exp Immunol 1988 Jul;73(1):23‐8.    134.  Bowles  JA,  Weiner  GJ.  CD16  polymorphisms  and  NK  activation  induced  by  monoclonal  antibody‐coated target cells. J Immunol Methods 2005 Sep;304(1‐2):88‐99.    135. Welsh RM, Brubaker  JO, Vargas‐Cortes M, O'Donnell CL. Natural  killer  (NK)  cell  response  to  virus  infections  in mice with  severe  combined  immunodeficiency.  the  stimulation of NK  cells  and  the  NK  cell‐dependent  control  of  virus  infections  occur  independently  of  T  and  B  cell  function. J Exp Med 1991 May 1;173(5):1053‐63.    136. Dayde D, Ternant D, Ohresser M, Lerondel S, Pesnel S, Watier H, Le Pape A, Bardos P, Paintaud  G, Cartron G. Tumor burden influences exposure and response to rituximab: Pharmacokinetic‐ pharmacodynamic modeling using a syngeneic bioluminescent murine model expressing human  CD20. Blood 2009 Apr 16;113(16):3765‐72.    137.  Sofou  S.  Surface‐active  liposomes  for  targeted  cancer  therapy.  Nanomedicine  2007  Oct;2(5):711‐24.  • 184     138. Young LS, Rickinson AB. Epstein‐barr virus: 40 years on. Nat Rev Cancer 2004 Oct;4(10):757‐68.    139. Howard OM, Gribben JG, Neuberg DS, Grossbard M, Poor C, Janicek MJ, Shipp MA. Rituximab  and CHOP  induction therapy  for newly diagnosed mantle‐cell  lymphoma: Molecular complete  responses are not predictive of progression‐free survival. J Clin Oncol 2002 Mar 1;20(5):1288‐ 94.    140. Cheson BD,  Leonard  JP. Monoclonal antibody  therapy  for B‐cell non‐hodgkin's  lymphoma. N  Engl J Med 2008 Aug 7;359(6):613‐26.    141.  Allen  TM,  Brandeis  E,  Hansen  CB,  Kao  GY,  Zalipsky  S.  A  new  strategy  for  attachment  of  antibodies  to  sterically  stabilized  liposomes  resulting  in  efficient  targeting  to  cancer  cells.  Biochim Biophys Acta 1995 Jul 26;1237(2):99‐108.    142. Ishida T, Iden DL, Allen TM. A combinatorial approach to producing sterically stabilized (stealth)  immunoliposomal drugs. FEBS Lett 1999 Oct 22;460(1):129‐33.    143. Karve S, Alaouie A, Zhou Y, Rotolo J, Sofou S. The use of pH‐triggered leaky heterogeneities on  rigid  lipid  bilayers  to  improve  intracellular  trafficking  and  therapeutic  potential  of  targeted  liposomal immunochemotherapy. Biomaterials 2009 10;30(30):6055‐64.    144. Hansen CB,  Kao GY, Moase  EH,  Zalipsky  S, Allen  TM. Attachment of  antibodies  to  sterically  stabilized  liposomes:  Evaluation,  comparison  and  optimization  of  coupling  procedures.  BBA‐ Biomembranes 1995;1239(2):133‐44.    145. Moreira JN, Ishida T, Gaspar R, Allen TM. Use of the post‐insertion technique to insert peptide  ligands  into pre‐formed  stealth  liposomes with  retention of binding activity and  cytotoxicity.  Pharm Res 2002 Mar;19(3):265‐9.    146. Loughrey HC, Choi LS, Wong KF, Cullis PR, Bally MB. Preparation of streptavidin‐liposomes for  use  in  ligand‐specific  targeting  applications.  In:  Gregory  Gregoriadis,  editor.  Liposome  technology: Vol. 3:  Interactions of  liposomes with  the biological milieu. 2nd ed. Boca Raton,  Fla.: CRC Press; 1993.    147.  Wen  H,  DeCory  TR,  Borejsza‐Wysocki  W,  Durst  RA.  Investigation  of  NeutrAvidin‐tagged  liposomal nanovesicles as universal detection  reagents  for bioanalytical assays. Talanta, 2006  Feb 15;68(4):1264‐72.    148. Ke S, Wright JC, Kwon GS. Intermolecular interaction of avidin and PEGylated biotin. Bioconjug  Chem 2007;18(6):2109‐14.    149. Strachan E, Mallia AK, Cox  JM, Antharavally B, Desai S, Sykaluk L, O'Sullivan V, Bell PA. Solid‐ phase biotinylation of antibodies. J Mol Recognit 2004 May‐Jun;17(3):268‐76.    150.  You  WW,  Haugland  RP,  Ryan  DK,  Haugland  RP.  3‐(4‐carboxybenzoyl)quinoline‐2‐ carboxaldehyde, a reagent with broad dynamic range for the assay of proteins and lipoproteins  in solution. Anal Biochem 1997 Jan 15;244(2):277‐82.    • 185   151.  Nag  A, Mitra  G,  Ghosh  PC.  A  colorimetric  assay  for  estimation  of  polyethylene  glycol  and  polyethylene  glycolated  protein  using  ammonium  ferrothiocyanate.  Anal  Biochem  1996  Jun  1;237(2):224‐31.    152. Lawrence MJ, Barlow DJ, Harvey RD, Heenan RK. Development of non‐ionic surfactant vesicles  as drug delivery vehicles. In: B. H. Robinson, editor. Self‐assembly. Amsterdam: IOS Press; 2003.    153. Moghimi SM, Hunter AC, Murray JC. Long‐circulating and target‐specific nanoparticles: Theory  to practice. Pharmacol Rev 2001 Jun 1;53(2):283‐318.    154. Ying X, Wen H, Lu W, Du J, Guo J, Tian W, Men Y, Zhang Y, Li R, Yang T, et al. Dual‐targeting  daunorubicin  liposomes  improve the therapeutic efficacy of brain glioma  in animals. J Control  Release 2010 Jan 25;141(2):183‐92.    155. Yang T, Choi MK, Cui FD, Kim  JS, Chung SJ, Shim CK, Kim DD. Preparation and evaluation of  paclitaxel‐loaded PEGylated immunoliposome. J Control Release 2007 Jul 31;120(3):169‐77.    156. Epstein H, Gutman D, Cohen‐Sela E, Haber E, Elmalak O, Koroukhov N, Danenberg HD, Golomb  G. Preparation of alendronate  liposomes for enhanced stability and bioactivity:  In vitro and  in  vivo characterization. AAPS J 2008 Dec;10(4):505‐15.    157. Morton RE, Evans TA. Modification of  the bicinchoninic acid protein assay  to eliminate  lipid  interference in determining lipoprotein protein content. Anal Biochem 1992;204(2):332‐4.    158. Hale JE, Beidler DE. Purification of humanized murine and murine monoclonal antibodies using  immobilized metal‐affinity chromatography. Anal Biochem 1994 10;222(1):29‐33.    159.  Gaberc‐Porekar  V, Menart  V.  Perspectives  of  immobilized‐metal  affinity  chromatography.  J  Biochem Biophys Methods 2001 Oct 30;49(1‐3):335‐60.    160. Denkhaus E, Salnikow K. Nickel essentiality,  toxicity, and carcinogenicity. Crit Rev Oncol 2002  4;42(1):35‐56.    161. Hiller Y, Gershoni JM, Bayer EA, Wilchek M. Biotin binding to avidin. Oligosaccharide side chain  not required for ligand association. Biochem J 1987 Nov 15;248(1):167‐71.    162. Loughrey H, Bally MB, Cullis PR. A non‐covalent method of attaching antibodies to  liposomes.  Biochim Biophys Acta 1987 Jul 10;901(1):157‐60.    163. Loughrey HC, Choi LS, Cullis PR, Bally MB. Optimized procedures for the coupling of proteins to  liposomes. J Immunol Methods 1990 Aug 28;132(1):25‐35.    164.  Jue  R,  Lambert  JM,  Pierce  LR,  Traut  RR.  Addition  of  sulfhydryl  groups  of  escherichia  coli  ribosomes  by  protein  modification  with  2‐iminothiolane  (methyl  4‐mercaptobutyrimidate).  Biochemistry 1978;17(25):5399‐406.    165. Wong SS. Chemistry of protein conjugation and cross‐linking. Boca Raton, Fla.: CRC Press; 1991.    166.  Wang  X,  Yang  L,  Chen  Z,  Shin  DM.  Application  of  nanotechnology  in  cancer  therapy  and  imaging. CA‐Cancer J Clin 2008 Mar 1;58(2):97‐110.  • 186   167. Sanvicens N, Marco MP. Multifunctional nanoparticles – properties and prospects for their use  in human medicine. Trends Biotechnol 2008 8;26(8):425‐33.    168. Bezombes C, Grazide S, Garret C, Fabre C, Quillet‐Mary A, Muller S,  Jaffrezou  JP,  Laurent G.  Rituximab antiproliferative effect in B‐lymphoma cells is associated with acid‐sphingomyelinase  activation in raft microdomains. Blood 2004 Aug 15;104(4):1166‐73.    169. Semac I, Palomba C, Kulangara K, Klages N, van Echten‐Deckert G, Borisch B, Hoessli DC. Anti‐ CD20  therapeutic  antibody  rituximab  modifies  the  functional  organization  of  rafts/microdomains of B lymphoma cells. Cancer Res 2003 Jan 15;63(2):534‐40.    170. Cillessen SA, Hess CJ, Hooijberg E, Castricum KC, Kortman P, Denkers F, Vos W, van de Wiel MA,  Schuurhuis  GJ,  Ossenkoppele  GJ,  et  al.  Inhibition  of  the  intrinsic  apoptosis  pathway  downstream  of  caspase‐9  activation  causes  chemotherapy  resistance  in  diffuse  large  B‐cell  lymphoma. Clin Cancer Res 2007 Dec 1;13(23):7012‐21.    171.  Peter  ME,  Krammer  PH.  The  CD95(APO‐1/Fas)  DISC  and  beyond.  Cell  Death  Differ  2003  Jan;10(1):26‐35.    172. Hehlgans  T,  Pfeffer  K.  The  intriguing biology of  the  tumour  necrosis  factor/tumour necrosis  factor receptor superfamily: Players, rules and the games. Immunology 2005 May;115(1):1‐20.    173. Carswell EA, Old  LJ, Kassel RL, Green S,  Fiore N, Williamson B. An endotoxin‐induced  serum  factor that causes necrosis of tumors. P Natl Acad Sci USA 1975 Sep;72(9):3666‐70.    174. Guicciardi ME, Gores GJ. Life and death by death receptors. FASEB J 2009 Jun;23(6):1625‐37.    175.  Schutze  S,  Tchikov  V,  Schneider‐Brachert  W.  Regulation  of  TNFR1  and  CD95  signalling  by  receptor compartmentalization. Nat Rev Mol Cell Biol 2008 Aug;9(8):655‐62.    176. Gonzalvez  F, Ashkenazi A. New  insights  into  apoptosis  signaling  by Apo2L/TRAIL. Oncogene  2010 Aug 26;29(34):4752‐65.    177.  Aggarwal  BB.  Signalling  pathways  of  the  TNF  superfamily:  A  double‐edged  sword.  Nat  Rev  Immunol 2003 Sep;3(9):745‐56.    178. Wajant H. Death receptors. Essays Biochem 2003;39:53‐71.    179.  Chan  KF,  Siegel  MR,  Lenardo  JM.  Signaling  by  the  TNF  receptor  superfamily  and  T  cell  homeostasis. Immunity 2000 Oct;13(4):419‐22.    180. Chan FK, Chun HJ, Zheng  L,  Siegel RM, Bui KL,  Lenardo MJ. A domain  in TNF  receptors  that  mediates  ligand‐independent  receptor  assembly  and  signaling.  Science  2000  Jun  30;288(5475):2351‐4.    181. Beltinger C, Fulda S, Kammertoens T, Meyer E, Uckert W, Debatin KM. Herpes  simplex virus  thymidine  kinase/ganciclovir‐induced  apoptosis  involves  ligand‐independent  death  receptor  aggregation and activation of caspases. P Natl Acad Sci USA 1999 Jul 20;96(15):8699‐704.    • 187   182. Ozsoy HZ,  Sivasubramanian N, Wieder  ED, Pedersen  S, Mann DL. Oxidative  stress promotes  ligand‐independent and enhanced ligand‐dependent tumor necrosis factor receptor signaling. J  Biol Chem 2008 Aug 22;283(34):23419‐28.    183. Yi  JS, Choo HJ, Cho BR, Kim HM, Kim YN, Ham YM, Ko YG. Ginsenoside Rh2  induces  ligand‐ independent  fas  activation  via  lipid  raft  disruption.  Biochem  Biophys  Res  Commun  2009  Jul  24;385(2):154‐9.    184.  Day  TW,  Huang  S,  Safa  AR.  c‐FLIP  knockdown  induces  ligand‐independent  DR5‐,  FADD‐,  caspase‐8‐,  and  caspase‐9‐dependent  apoptosis  in  breast  cancer  cells.  Biochem  Pharmacol  2008 Dec 15;76(12):1694‐704.    185.  Sheikh MS, Antinore MJ, Huang  Y,  Fornace AJ,Jr. Ultraviolet‐irradiation‐induced  apoptosis  is  mediated  via  ligand  independent  activation  of  tumor  necrosis  factor  receptor  1.  Oncogene  1998 Nov 19;17(20):2555‐63.    186. Muppidi JR, Siegel RM. Ligand‐independent redistribution of fas (CD95) into lipid rafts mediates  clonotypic T cell death. Nat Immunol 2004 Feb;5(2):182‐9.    187. Hsiang Y, Lihou MG, Liu LF. Arrest of replication forks by drug‐stabilized topoisomerase  I‐DNA  cleavable  complexes  as  a mechanism  of  cell  killing  by  camptothecin.  Cancer  Res  1989  Sep  15;49(18):5077‐82.    188. Gao X, Picchi A, Zhang C. Upregulation of TNF‐alpha and  receptors contribute  to endothelial  dysfunction in zucker diabetic rats. Am J Biomed Sci 2010;2(1):1‐12.    189. Cook EB, Stahl JL, Graziano FM, Barney NP. Regulation of the receptor for TNFalpha, TNFR1, in  human conjunctival epithelial cells. Invest Ophthalmol Vis Sci 2008 Sep;49(9):3992‐8.    190.  Cubillas  R,  Kintner  K,  Phillips  F,  Karandikar NJ,  Thiele DL,  Brown GR.  Tumor  necrosis  factor  receptor  1  expression  is  upregulated  in  dendritic  cells  in  patients  with  chronic  HCV  who  respond to therapy. Hepat Res Treat 2010;2010:429243.    191. Rahman MM, McFadden G. Modulation of tumor necrosis factor by microbial pathogens. PLoS  Pathog 2006 Feb;2(2):e4.    192. Deb S, Amin S, Imir AG, Yilmaz MB, Suzuki T, Sasano H, Bulun SE. Estrogen regulates expression  of tumor necrosis factor receptors  in breast adipose fibroblasts. J Clin Endocrinol Metab 2004  Aug;89(8):4018‐24.    193. Berger AC, Alexander HR, Wu PC, Tang G, Gnant MF, Mixon A, Turner ES, Libutti SK. Tumour  necrosis factor receptor I (p55) is upregulated on endothelial cells by exposure to the tumour‐ derived  cytokine  endothelial  monocyte‐  activating  polypeptide  II  (EMAP‐II).  Cytokine  2000  Jul;12(7):992‐1000.    194. de Totero D, Tazzari PL, Capaia M, Montera MP, Clavio M, Balleari E, Foa R, Gobbi M. CD40  triggering  enhances  fludarabine‐induced  apoptosis  of  chronic  lymphocytic  leukemia  B‐cells  through  autocrine  release  of  tumor  necrosis  factor‐alpha  and  interferon‐gama  and  tumor  necrosis factor receptor‐I‐II upregulation. Haematologica 2003 Feb;88(2):148‐58.    • 188   195. Grell M, Douni E, Wajant H, Löhden M, Clauss M, Maxeiner B, Georgopoulos S, Lesslauer W,  Kollias G, Pfizenmaier K, et al. The transmembrane form of tumor necrosis factor  is the prime  activating ligand of the 80 kDa tumor necrosis factor receptor. Cell 1995;83(5):793‐802.    196. Muppidi JR, Tschopp J, Siegel RM. Life and death decisions: Secondary complexes and lipid rafts  in TNF receptor family signal transduction. Immunity 2004 Oct;21(4):461‐5.    197. Micheau  O,  Tschopp  J.  Induction  of  TNF  receptor  I‐mediated  apoptosis  via  two  sequential  signaling complexes. Cell 2003 Jul 25;114(2):181‐90.    198. Legler DF, Micheau O, Doucey MA, Tschopp J, Bron C. Recruitment of TNF receptor 1 to  lipid  rafts  is essential for TNFalpha‐mediated NF‐kappaB activation.  Immunity 2003 May;18(5):655‐ 64.    199. Singer SJ, Nicolson GL. The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science 1972  Feb 18;175(23):720‐31.    200. Vereb G, Szollosi J, Matko J, Nagy P, Farkas T, Vigh L, Matyus L, Waldmann TA, Damjanovich S.  Dynamic, yet structured: The cell membrane three decades after the singer‐nicolson model. P  Natl Acad Sci USA 2003 Jul 8;100(14):8053‐8.    201. Simons K, Ehehalt R. Cholesterol, lipid rafts, and disease. J Clin Invest 2002 Sep;110(5):597‐603.    202.  Carver  LA,  Schnitzer  JE,  Anderson  RG, Mohla  S.  Role  of  caveolae  and  lipid  rafts  in  cancer:  Workshop summary and future needs. Cancer Res 2003 Oct 15;63(20):6571‐4.    203. Li YC, Park MJ, Ye SK, Kim CW, Kim YN. Elevated  levels of cholesterol‐rich  lipid rafts  in cancer  cells  are  correlated with  apoptosis  sensitivity  induced  by  cholesterol‐depleting  agents. Am  J  Pathol 2006 Apr;168(4):1107‐18.    204.  Zhuang  L,  Lin  J,  Lu ML,  Solomon  KR,  Freeman MR.  Cholesterol‐rich  lipid  rafts mediate  akt‐ regulated survival in prostate cancer cells. Cancer Res 2002 Apr 15;62(8):2227‐31.    205.  Lajoie  P,  Partridge  EA, Guay G, Goetz  JG,  Pawling  J,  Lagana A,  Joshi B, Dennis  JW, Nabi  IR.  Plasma membrane domain organization regulates EGFR signaling in tumor cells. J Cell Biol 2007  Oct 22;179(2):341‐56.    206. Pike LJ. Rafts defined: A report on  the keystone symposium on  lipid rafts and cell  function.  J  Lipid Res 2006 Jul;47(7):1597‐8.    207. Hancock JF. Lipid rafts: Contentious only from simplistic standpoints. Nat Rev Mol Cell Biol 2006  Jun;7(6):456‐62.    208. Simons K, Ikonen E. Functional rafts in cell membranes. Nature 1997 Jun 5;387(6633):569‐72.    209. Brown DA, London E. Structure and  function of sphingolipid‐ and cholesterol‐rich membrane  rafts. J Biol Chem 2000 Jun 9;275(23):17221‐4.    210. Edidin M. The state of  lipid rafts: From model membranes to cells. Annu Rev Biophys Biomol  Struct 2003;32:257‐83.  • 189   211. Brown DA, London E. Functions of  lipid rafts  in biological membranes. Annu Rev Cell Dev Biol  1998;14:111‐36.    212. Stauffer TP, Meyer T. Compartmentalized  IgE  receptor‐mediated  signal  transduction  in  living  cells. J Cell Biol 1997 Dec 15;139(6):1447‐54.    213. Matko J, Szollosi J. Landing of immune receptors and signal proteins on lipid rafts: A safe way to  be spatio‐temporally coordinated? Immunol Lett 2002 Jun 3;82(1‐2):3‐15.    214.  Kenworthy  AK,  Nichols  BJ,  Remmert  CL,  Hendrix  GM,  Kumar M,  Zimmerberg  J,  Lippincott‐ Schwartz J. Dynamics of putative raft‐associated proteins at the cell surface. J Cell Biol 2004 Jun  7;165(5):735‐46.    215. Foster LJ, De Hoog CL, Mann M. Unbiased quantitative proteomics of  lipid  rafts  reveals high  specificity for signaling factors. P Natl Acad Sci USA 2003 May 13;100(10):5813‐8.    216. Magee  AI,  Parmryd  I.  Detergent‐resistant membranes  and  the  protein  composition  of  lipid  rafts. Genome Biol 2003;4(11):234.    217.  Rajendran  L,  Simons  K.  Lipid  rafts  and membrane  dynamics.  J  Cell  Sci  2005 Mar  15;118(Pt  6):1099‐102.    218.  Silvius  JR. Partitioning of membrane molecules between  raft  and non‐raft domains:  Insights  from model‐membrane studies. Biochim Biophys Acta 2005 Dec 30;1746(3):193‐202.    219. Simons K, Vaz WL. Model systems,  lipid rafts, and cell membranes. Annu Rev Biophys Biomol  Struct 2004;33:269‐95.    220. London E. How principles of domain formation  in model membranes may explain ambiguities  concerning lipid raft formation in cells. Biochim Biophys Acta 2005 Dec 30;1746(3):203‐20.    221. Dietrich C, Volovyk ZN, Levi M, Thompson NL, Jacobson K. Partitioning of thy‐1, GM1, and cross‐ linked  phospholipid  analogs  into  lipid  rafts  reconstituted  in  supported  model  membrane  monolayers. P Natl Acad Sci USA 2001 Sep 11;98(19):10642‐7.    222. Kahya N, Brown DA,  Schwille P. Raft partitioning  and dynamic behavior of human placental  alkaline phosphatase in giant unilamellar vesicles. Biochemistry 2005 May 24;44(20):7479‐89.    223.  Harder  T,  Engelhardt  KR. Membrane  domains  in  lymphocytes  ‐  from  lipid  rafts  to  protein  scaffolds. Traffic 2004 Apr;5(4):265‐75.    224. Harder T, Scheiffele P, Verkade P, Simons K. Lipid domain structure of the plasma membrane  revealed by patching of membrane components. J Cell Biol 1998 May 18;141(4):929‐42.    225.  Brown  DA,  Rose  JK.  Sorting  of  GPI‐anchored  proteins  to  glycolipid‐enriched  membrane  subdomains during transport to the apical cell surface. Cell 1992 Feb 7;68(3):533‐44.    226. Schroeder R, London E, Brown D. Interactions between saturated acyl chains confer detergent  resistance  on  lipids  and  glycosylphosphatidylinositol  (GPI)‐anchored  proteins:  GPI‐anchored  • 190   proteins  in  liposomes  and  cells  show  similar  behavior.  P  Natl  Acad  Sci  USA  1994  Dec  6;91(25):12130‐4.    227.  Kurzchalia  TV,  Hartmann  E,  Dupree  P.  Guilty  by  insolubility‐‐does  a  protein's  detergent  insolubility reflect a caveolar location? Trends Cell Biol 1995 May;5(5):187‐9.    228. Lichtenberg D, Goni FM, Heerklotz H. Detergent‐resistant membranes should not be identified  with membrane rafts. Trends Biochem Sci 2005 Aug;30(8):430‐6.    229. Brown DA.  Lipid  rafts, detergent‐resistant membranes, and  raft  targeting  signals. Physiology  2006 Dec;21:430‐9.    230.  Ahmed  SN,  Brown  DA,  London  E.  On  the  origin  of  sphingolipid/cholesterol‐rich  detergent‐ insoluble cell membranes: Physiological concentrations of cholesterol and sphingolipid  induce  formation  of  a  detergent‐insoluble,  liquid‐ordered  lipid  phase  in  model  membranes.  Biochemistry 1997 Sep 9;36(36):10944‐53.    231. Dietrich C, Bagatolli LA, Volovyk ZN, Thompson NL, Levi M,  Jacobson K, Gratton E. Lipid rafts  reconstituted in model membranes. Biophys J 2001 3;80(3):1417‐28.    232. H. H. Triton promotes domain  formation  in  lipid raft mixtures. Biophys  J 2002 11;83(5):2693‐ 701.    233.  Schuck  S,  Honsho M,  Ekroos  K,  Shevchenko  A,  Simons  K.  Resistance  of  cell membranes  to  different detergents. P Natl Acad Sci USA 2003 May 13;100(10):5795‐800.    234.  Lingwood  D,  Simons  K.  Detergent  resistance  as  a  tool  in membrane  research.  Nat  Protoc  2007;2(9):2159‐65.    235. Field KA, Holowka D, Baird B. Fc epsilon RI‐mediated  recruitment of p53/56lyn  to detergent‐ resistant membrane  domains  accompanies  cellular  signaling.  P Natl  Acad  Sci USA  1995  Sep  26;92(20):9201‐5.    236. Gombos  I, Bacso Z, Detre C, Nagy H, Goda K, Andrasfalvy M,  Szabo G, Matko  J. Cholesterol  sensitivity of detergent  resistance: A  rapid  flow  cytometric  test  for detecting  constitutive or  induced raft association of membrane proteins. Cytom Part A 2004 Oct;61(2):117‐26.    237. Macdonald  JL, Pike LJ. A simplified method  for the preparation of detergent‐free  lipid rafts.  J  Lipid Res 2005 May 01;46(5):1061‐7.    238. Simons K, Ikonen E. How cells handle cholesterol. Science 2000 December 01;290(5497):1721‐ 6.    239.  Christian  AE,  Haynes MP,  Phillips MC,  Rothblat  GH.  Use  of  cyclodextrins  for manipulating  cellular cholesterol content. J Lipid Res 1997 Nov;38(11):2264‐72.    240. Drake DR, Braciale  TJ. Cutting  edge:  Lipid  raft  integrity  affects  the  efficiency of MHC  class  I  tetramer  binding  and  cell  surface  TCR  arrangement  on  CD8+  T  cells.  J  Immunol  2001  Jun  15;166(12):7009‐13.    • 191   241. Pyörälä K, Pedersen TR, Kjekshus J, Faergeman O, Olsson AG, Thorgeirsson G, The Scandinavian  Simvastatin  Survival  Study  (4S)  Group.  Cholesterol  lowering  with  simvastatin  improves  prognosis  of  diabetic  patients  with  coronary  heart  disease:  A  subgroup  analysis  of  the  scandinavian simvastatin survival study (4S). Diabetes Care 1997 April 01;20(4):614‐20.    242.  Ponce  J,  de  la Ossa NP, Hurtado O, Millan M, Arenillas  JF, Dávalos A, Gasull  T.  Simvastatin  reduces the association of NMDA receptors to lipid rafts. Stroke 2008 April 01;39(4):1269‐75.    243. Zhuang  L, Kim  J, Adam RM, Solomon KR, Freeman MR. Cholesterol  targeting alters  lipid  raft  composition  and  cell  survival  in  prostate  cancer  cells  and  xenografts.  J  Clin  Invest  2005  Apr;115(4):959‐68.    244. Algeciras‐Schimnich A, Shen L, Barnhart BC, Murmann AE, Burkhardt  JK, Peter ME. Molecular  ordering of the initial signaling events of CD95. Mol Cell Biol 2002 Jan;22(1):207‐20.    245. Brown BK, Song W. The actin cytoskeleton  is required for the trafficking of the B cell antigen  receptor to the late endosomes. Traffic 2001 Jun;2(6):414‐27.    246.  Beum  PV,  Lindorfer  MA,  Taylor  RP.  Within  peripheral  blood  mononuclear  cells,  antibody‐ dependent cellular cytotoxicity of rituximab‐opsonized daudi cells is promoted by NK cells and  inhibited by monocytes due to shaving. J Immunol 2008 Aug 15;181(4):2916‐24.    247. Radeva G, Sharom FJ. Isolation and characterization of lipid rafts with different properties from  RBL‐2H3 (rat basophilic leukaemia) cells. Biochem J 2004 May 15;380(Pt 1):219‐30.    248. Mitchell  JS, Kanca O, McIntyre BW.  Lipid microdomain  clustering  induces a  redistribution of  antigen  recognition and  adhesion molecules on human T  lymphocytes.  J  Immunol 2002 Mar  15;168(6):2737‐44.    249. Im JS, Arora P, Bricard G, Molano A, Venkataswamy MM, Baine I, Jerud ES, Goldberg MF, Baena  A, Yu KO, et al. Kinetics and cellular site of glycolipid  loading control  the outcome of natural  killer T cell activation. Immunity 2009 Jun 19;30(6):888‐98.    250.  Wolf  Z,  Orso  E,  Werner  T,  Klunemann  HH,  Schmitz  G.  Monocyte  cholesterol  homeostasis  correlates with  the presence of detergent  resistant membrane microdomains. Cytom  Part A  2007 Jul;71(7):486‐94.    251. Calzolari A, Raggi C, Deaglio S, Sposi NM, Stafsnes M, Fecchi K, Parolini I, Malavasi F, Peschle C,  Sargiacomo M, et al. TfR2 localizes in lipid raft domains and is released in exosomes to activate  signal transduction along the MAPK pathway. J Cell Sci 2006 Nov 1;119(Pt 21):4486‐98.    252. Nellis DF,  Ekstrom DL, Kirpotin DB,  Zhu  J, Andersson R, Broadt  TL, Ouellette  TF, Perkins  SC,  Roach  JM,  Drummond  DC,  et  al.  Preclinical  manufacture  of  an  anti‐HER2  scFv‐PEG‐DSPE,  liposome‐inserting conjugate. 1. Gram‐scale production and purification. Biotechnol Prog 2005  Jan‐Feb;21(1):205‐20.    253. Nellis DF, Giardina SL, Janini GM, Shenoy SR, Marks JD, Tsai R, Drummond DC, Hong K, Park JW,  Ouellette  TF,  et  al.  Preclinical  manufacture  of  anti‐HER2  liposome‐inserting,  scFv‐PEG‐lipid  conjugate. 2. Conjugate micelle identity, purity, stability, and potency analysis. Biotechnol Prog  2005 Jan‐Feb;21(1):221‐32.  • 192   254.  Smith  LM, Parce  JW,  Smith BA, McConnell HM. Antibodies bound  to  lipid haptens  in model  membranes  diffuse  as  rapidly  as  the  lipids  themselves.  P  Natl  Acad  Sci  USA  1979  Sep;76(9):4177‐9.    255. Smith MR. Rituximab (monoclonal anti‐CD20 antibody): Mechanisms of action and resistance.  Oncogene 2003 Oct 20;22(47):7359‐68.    256. Kolch W, Calder M, Gilbert D. When kinases meet mathematics: The systems biology of MAPK  signalling. FEBS Lett 2005 Mar 21;579(8):1891‐5.    257.  Kholodenko  BN.  Cell‐signalling  dynamics  in  time  and  space.  Nat  Rev  Mol  Cell  Biol  2006  Mar;7(3):165‐76.    258. Kontermann RE, Munkel S, Neumeyer J, Muller D, Branschadel M, Scheurich P, Pfizenmaier K. A  humanized tumor necrosis factor receptor 1 (TNFR1)‐specific antagonistic antibody for selective  inhibition of tumor necrosis factor (TNF) action. J Immunother 2008 Apr;31(3):225‐34.    259.  McDermott  MF,  Aksentijevich  I,  Galon  J,  McDermott  EM,  Ogunkolade  BW,  Centola  M,  Mansfield E, Gadina M, Karenko L, Pettersson T, et al. Germline mutations  in the extracellular  domains  of  the  55  kDa  TNF  receptor,  TNFR1,  define  a  family  of  dominantly  inherited  autoinflammatory syndromes. Cell 1999 Apr 2;97(1):133‐44.    260. Ryan JG, Aksentijevich I. Tumor necrosis factor receptor‐associated periodic syndrome: Toward  a molecular understanding of  the  systemic autoinflammatory diseases. Arthritis Rheum 2009  Jan;60(1):8‐11.    261. Kimberley FC, Lobito AA, Siegel RM, Screaton GR. Falling into TRAPS‐‐receptor misfolding in the  TNF receptor 1‐associated periodic fever syndrome. Arthritis Res Ther 2007;9(4):217.    262.  Lobito AA, Gabriel TL, Medema  JP, Kimberley  FC. Disease  causing mutations  in  the TNF and  TNFR  superfamilies:  Focus  on molecular mechanisms  driving  disease.  Trends Mol Med  2011  Sep;17(9):494‐505.    263.  Vogelstein  B,  Kinzler  KW.  Cancer  genes  and  the  pathways  they  control.  Nat  Med  2004  Aug;10(8):789‐99.    264. Dechant MJ, Fellenberg J, Scheuerpflug CG, Ewerbeck V, Debatin KM. Mutation analysis of the  apoptotic  \"death‐receptors\"  and  the  adaptors  TRADD  and  FADD/MORT‐1  in  osteosarcoma  tumor samples and osteosarcoma cell lines. Int J Cancer 2004 May 1;109(5):661‐7.    265. Park A, Baichwal VR. Systematic mutational analysis of the death domain of the tumor necrosis  factor receptor 1‐associated protein TRADD. J Biol Chem 1996 Apr 19;271(16):9858‐62.    266. Dechant MJ, Scheuerpflug CG, Pauly E, van der Werff Ten Bosch,J., Debatin KM, Fellenberg  J.  Screening,  identification,  and  functional  analysis  of  three  novel missense  mutations  in  the  TRADD gene in children with ALL and ALPS. Pediatr Blood Cancer 2008 Nov;51(5):616‐20.    267. Sassano A, Platanias LC. Statins in tumor suppression. Cancer Lett 2008 Feb 18;260(1‐2):11‐9.    • 193   268.  Katano  H,  Pesnicak  L,  Cohen  JI.  Simvastatin  induces  apoptosis  of  epstein‐barr  virus  (EBV)‐ transformed lymphoblastoid cell lines and delays development of EBV lymphomas. P Natl Acad  Sci USA 2004 Apr 6;101(14):4960‐5.    269.  Ahn  KS,  Sethi  G,  Chaturvedi  MM,  Aggarwal  BB.  Simvastatin,  3‐hydroxy‐3‐methylglutaryl  coenzyme A  reductase  inhibitor, suppresses osteoclastogenesis  induced by  receptor activator  of nuclear factor‐kappaB  ligand through modulation of NF‐kappaB pathway.  Int J Cancer 2008  Oct 15;123(8):1733‐40.    270. Ahn KS, Sethi G, Aggarwal BB. Reversal of chemoresistance and enhancement of apoptosis by  statins  through  down‐regulation  of  the  NF‐kappaB  pathway.  Biochem  Pharmacol  2008  Feb  15;75(4):907‐13.    271. Aberg M, Wickstrom M, Siegbahn A. Simvastatin induces apoptosis in human breast cancer cells  in a NFkappaB‐dependent manner and abolishes  the anti‐apoptotic  signaling of TF/FVIIa and  TF/FVIIa/FXa. Thromb Res 2008;122(2):191‐202.    272. Martirosyan A, Clendening J, Goard C, Penn L. Lovastatin  induces apoptosis of ovarian cancer  cells  and  synergizes  with  doxorubicin:  Potential  therapeutic  relevance.  BMC  Cancer  2010;10(1):103.    273. Glynn SA, O'Sullivan D, Eustace AJ, Clynes M, O'Donovan N. The 3‐hydroxy‐3‐methylglutaryl‐ coenzyme A  reductase  inhibitors,  simvastatin,  lovastatin  and mevastatin  inhibit  proliferation  and invasion of melanoma cells. BMC Cancer 2008 Jan 16;8:9.    274.  Schmidmaier  R,  Baumann  P,  Bumeder  I, Meinhardt  G,  Straka  C,  Emmerich  B.  First  clinical  experience with simvastatin to overcome drug resistance in refractory multiple myeloma. Eur J  Haematol 2007 Sep;79(3):240‐3.    275. Fortuny J, de Sanjose S, Becker N, Maynadie M, Cocco PL, Staines A, Foretova L, Vornanen M,  Brennan  P,  Nieters  A,  et  al.  Statin  use  and  risk  of  lymphoid  neoplasms:  Results  from  the  european  case‐control  study  EPILYMPH.  Cancer  Epidemiol  Biomarkers  Prev  2006  May;15(5):921‐5.    276. Winiarska M, Bil  J, Wilczek E, Wilczynski GM,  Lekka M, Engelberts PJ, Mackus WJ, Gorska E,  Bojarski  L,  Stoklosa  T,  et  al.  Statins  impair  antitumor  effects  of  rituximab  by  inducing  conformational changes of CD20. PLoS Med 2008 Mar 25;5(3):e64.    277. Nowakowski GS, Maurer MJ, Habermann  TM, Ansell  SM, Macon WR,  Ristow  KM, Allmer  C,  Slager SL, Witzig TE, Cerhan  JR. Statin use and prognosis  in patients with diffuse  large B‐cell  lymphoma and follicular lymphoma in the rituximab era. J Clin Oncol 2010 Jan 20;28(3):412‐7.       "@en ; edm:hasType "Thesis/Dissertation"@en ; vivo:dateIssued "2012-05"@en ; edm:isShownAt "10.14288/1.0072637"@en ; dcterms:language "eng"@en ; ns0:degreeDiscipline "Interdisciplinary Oncology"@en ; edm:provider "Vancouver : University of British Columbia Library"@en ; dcterms:publisher "University of British Columbia"@en ; dcterms:rights "Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International"@en ; ns0:rightsURI "http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/"@en ; ns0:scholarLevel "Graduate"@en ; dcterms:title "Multivalent monoclonal antibodies as improved cancer therapies : proof-of-concept and mechanistic studies using rituximab-lipid nanoparticles"@en ; dcterms:type "Text"@en ; ns0:identifierURI "http://hdl.handle.net/2429/41804"@en .