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Pathogenesis of neurofibromatosis 1 associated neurofibromas Tucker, Tracy 2006

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Pathogenesis of Neurofibromatosis 1 Associated Neurofibromas by Tracy Tucker B.Sc. Honours Science, Biology Option, University of Waterloo, Canada, 2000 A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILMENT OF THE REQUIREMENTSFOR THE D E G R E E OF DOCTOR OF PHILOSOPHY IN THE FACULTY OF G R A D U A T E STUDIES (Medical Genetics) THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA December 2006 © Tracy Tucker, 2006 ABSTRACT Neurofibromatosis 1 (NF1) is an autosomal dominant disease. Neurofibromas, benign tumours that develop from peripheral nerves, are a hallmark feature of NF1. Malignant peripheral nerve sheath tumours (MPNSTs) are one of the leading causes of death in people with NF1. Clinical evidence suggests that most MPNSTs develop from pre-existing plexiform neurofibromas. Most studies treat all NF1-associated neurofibromas as a single entity, ignoring important differences between pathological details, clinical presentation and natural history. I analysed clinical information on 476 probands with NF1 from the Henri Mondor database and found that individuals with subcutaneous neurofibromas were 3 times more likely to have internal plexiform neurofibromas and that individuals with internal plexiform neurofibromas were 20 times more likely to have MPNSTs than individuals without such tumours. These findings suggest that pathogenic differences in some neurofibromas may lead to different risks of progressing to malignancy. I collected formalin-fixed paraffin-embedded samples from NF1 patients and classified them histologically as nodular or diffuse neurofibromas. By using histochemistry, I found that mast cells were absent in MPNSTs and significantly more abundant in diffuse neurofibromas than in nodular neurofibromas. Mast cells were located at the periphery of nodular neurofibromas but were evenly distributed throughout diffuse neurofibromas. Double immunofluorescent staining of S100 (a marker of Schwann cells, the presumed tumour progenitor cell type) and neurofibromin (the protein product of NF1 gene) (Nf) showed that diffuse neurofibromas had significantly more S100+/Nf+ cells and fewer S100-/Nf- cells than nodular neurofibromas. Using laser microdissection of immunofluorescently stained slides, I found that some neurofibromas show evidence of clonal (presumably neoplastic) proliferation of S100+/Nf- cells while other neurofibromas appear to be neurofibromin haploinsufficient and polyclonal, and thus may be hyperplastic rather than neoplastic lesions. The results presented in this thesis support the hypothesis that neurofibromas in people with NF1 are pathogenically heterogeneous and that some kinds of neurofibromas are associated with the development of MPNSTs. These findings have important implications for the surveillance and treatment of people with NF1. I TABLE OF CONTENTS A B S T R A C T II TABLE OF C O N T E N T S Ill LIST OF T A B L E S VI LIST OF F IGURES VII LIST OF ABBREVIATIONS VIII A C K N O W L E D G E M E N T S IX CO-AUTHORSHIP STATEMENT X 1. INTRODUCTION 1 B A C K G R O U N D ON NEUROFIBROMATOSIS 1 T Y P E S OF NEUROFIBROMAS IN NF1 3 THE "TWO-HIT HYPOTHESIS" 7 Loss of Heterozygosity 8 Clonality in Neoplastic Cells 9 M O U S E M O D E L S OF NF1 13 M O L E C U L A R ANALYSIS IN NF1 ASSOCIATED NEUROFIBROMAS 13 MAST C E L L S WITHIN NEUROFIBROMAS 18 MALIGNANT P E R I P H E R A L N E R V E SHEATH T U M O U R S 19 R E S E A R C H OBJECTIVES 19 H Y P O T H E S E S : 20 Risk of developing MPNSTs 20 Mast cell distribution in neurofibromas 20 Histologically-defined diffuse neurofibromas 20 Histologically-defined nodular neurofibromas 22 R E L E V A N C E 23 R E F E R E N C E S 25 2. ASSOCIATION BETWEEN BENIGN AND MALIGNANT PERIPHERAL NERVE SHEATH TUMOURS IN NF1 31 INTRODUCTION 31 METHODS 32 Subjects and Data Description 32 Statistical Analysis 33 R E S U L T S 34 Prevalence of Neurofibromas 34 Logistic Regression 38 Survival Analysis 41 DISCUSSION 42 R E F E R E N C E S 47 3. HETEROGENETITY OF MAST CELL DISTRIBUTION IN NF1 NEUROFIBROMAS 50 INTRODUCTION 50 MATERIALS & METHODS 51 Sample Collection 51 Histopathological Classification of Neurofibromas 52 Identification of Granulated Mast Cells 52 Identification of Mast Cells and Schwann Cells 53 Tumour Characteristics 53 Statistical Analysis 54 R E S U L T S 54 Cellularity 55 Vascularity 57 Mast Cell Distribution Within Neurofibromas and MPNSTs 57 Distribution of Granulated and Non-granulated Mast Cells 59 DISCUSSION 60 R E F E R E N C E S 66 4. PATHOGENETIC HETEROGENEITY OF NF1 ASSOCIATED NEUROFIBROMAS 68 INTRODUCTION 68 METHODS 70 Sample Collection .....70 Histopathological Classification of Neurofibromas 70 Tumour Characteristics 71 Immunofluorescent Staining for S100 and Neurofibromin 71 Image Acquisition 72 Image Analysis 72 Statistical Analysis 73 Method Development for Immunofluorescently Labeled-formalin Fixed Samples for Laser Microdissection 73 Tissue Preparation for Laser Microdissection 74 iv Sample Collection by Laser Microdissection 74 DNA Purification 74 XCI Clonality Assay 75 R E S U L T S 75 Cellularity 78 Lymphocytic Infiltration 78 Vascularity 78 Neurofibromin & S100 Staining within Benign Neurofibromas 80 Correlations 82 Clonality of S100+/Nf+, S100+/Nf- and S100-/Nf+ Cells 83 DISCUSSION 89 R E F E R E N C E S 97 5. GENERAL DISCUSSION 101 S U M M A R Y 101 Risk of MPNST Development 101 Benign Neurofibroma Development 103 HOW THIS STUDY FITS INTO C U R R E N T NF1 R E S E A R C H 105 FUTURE DIRECTIONS 106 R E F E R E N C E S 108 APPENDIX A 110 R E S E A R C H ETHICS BOARD CERTIFICATES OF A P P R O V A L 110 v LIST OF TABLES Table 1.1 National Institutes of Health diagnostic criteria for NF1 1 Table 1.2 Summary of loss of heterozygosity analysis, clonality studies and "second hit" somatic mutations in NF1-associated neurofibromas 15 Table 2.1 Summary of Patient Data for those with MPNSTs 37 Table 2.2 Summary of odds ratios and 95% confidence intervals for logistic regression models 39 Table 3.1 Examples of different classifications for NF1-associated neurofibromas 50 Table 4.1 Summary of Kendall's tau correlations for pathological features in histologically-defined nodular and diffuse neurofibromas from patients with NF1 80 Table 4.2 Summary of Kendall's tau correlations for S100 and neurofibromin staining in histologically-defined nodular and diffuse neurofibromas from patients with NF1 83 Table 4.3 Summary of clonality results from histologically-defined nodular and diffuse neurofibromas and the proportion of each cell type within the neurofibromas 87 vi LIST OF FIGURES Figure 1.1 Schematic drawing showing a normal nerve and a neurofibroma 4 Figure 1.2 Examples of histologically defined types of neurofibromas that develop as part of NF1 5 Figure 1.3 Examples of clinically defined types of neurofibromas that develop as part of NF1 6 Figure 1.4 Cartoon depicting neoplasia as a clonal expansion of one cell that underwent a stochastic somatic mutation 10 Figure 1.5 Schematic of X-Chromosome inactivation (XCI) assay with Androgen Receptor 11 Figure 1.6 Haploinsufficient model of tumour development in histologically-defined diffuse neurofibromas in NF1 22 Figure 1.7 "Second hit" model of development for histologically-defined nodular neurofibromas in NF1 23 Figure 2.1 Kaplan Meier Survival of 25 NF1 patients with MPNSTs 42 Figure 3.1 Images of typical neurofibromas in the current study that represent the majority of the tumour 55 Figure 3.2 Distribution of pathological features of neurofibromas classified histopathologically 56 Figure 3.3 Mast cell distribution within neurofibromas 58 Figure 3.4 Mast cell distribution in MPNSTs 59 Figure 3.5 Confocal image of a diffuse neurofibroma stained with S100 and c-Kit 60 Figure 4.1 Images of typical neurofibromas in the current study that represent the majority of the tumour 76 Figure 4.2 Distribution of pathological features of neurofibromas classified histopathologically .79 Figure 4.3 Boxplot summarizing S100 and neurofibromin staining in nodular and diffuse neurofibromas 81 Figure 4.4 Images showing selective capture of single cell microdissection of S100+/Nf-negative cells from heterogeneous tissue 84 Figure 4.5 Images of Blood Vessel Microdissection 86 vii LIST OF ABBREVIATIONS 4 ' 6 - d i a m i d i n o - 2 - p h e n y l i n d o l e - 2 H C I ( D A P I - j A p p l i e d b i o s y s t e m s ( A B I ) C o m p u t e d t o m o g r a p h y ( C T ) C o n f i d e n c e i n t e r v a l s ( C I ) D e o x y r i b o n u c l e i c a c i d ( D N A ) E t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e ( E D T A ) F l u o r e s c e n c e i n - s i t u h y b r i d i z a t i o n ( F I S H ) G u a n o s i n e d i p h o s p h a t e ( G D P ) G u a n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e - a c t i v a t i n g p r o t e i n ( G A P ) G u a n o s i n e t r i p h o s p h a t e ( G T P ) H e m o t o x y l i n a n d e o s i n ( H & E ) H y d r o c h l o r i c a c i d ( H C I ) K i l o b a s e ( K b ) L o s s o f h e t e r o z y g o s i t y ( L O H ) M a g n e t i c r e s o n a n c e i m a g i n g ( M R I ) M a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o u r ( M P N S T ) M a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P ) M e s s e n g e r r i b o n u c l e i c a c i d ( m R N A ) N e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 ( N F 1 ) O d d s r a t i o ( O R ) P o l y e t h y l e n e n a p h t h o l a t e ( P E N ) P o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n ( P C R ) S o d i u m a c e t a t e ( N a O A c ) T r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) m e t h y l a m i n e ( T r i s ) T u b e r o u s s c l e r o s i s c o m p l e x ( T S C ) U l t r a v i o l e t ( U V ) V a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r ( V E G F ) X - c h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o n ( X C I ) v i i i ACKNOWLEDGEMENTS I w o u l d l i k e t o t h a n k m y r e s e a r c h s u p e r v i s o r a n d m e n t o r , J a n F r i e d m a n , a n d m y f r i e n d a n d c o w o r k e r , P a t r i c i a B i r c h , f o r t h e i r u n w a v e r i n g e n c o u r a g e m e n t a n d g u i d a n c e . T h a n k y o u t o D r C a r o l y n B r o w n a n d D r P i e r r e W o l k e n s t e i n , w i t h o u t y o u t h i s t h e s i s w o u l d n o t b e p o s s i b l e , I o f f e r m y s i n c e r e a p p r e c i a t i o n . T h a n k y o u t o m y s u p e r v i s o r y c o m m i t t e e , D r C a r o l y n B r o w n , D r C o n n i e E a v e s , a n d D r K e i t h H u m p h r i e s f o r t h e i r c o n t i n u a l f e e d b a c k a n d s u p p o r t . T o m e m b e r s o f t h e B r i t i s h C o l u m b i a N e u r o f i b r o m a t o s i s F o u n d a t i o n , t h a n k y o u f o r r e m i n d i n g m e t h a t w e , a s r e s e a r c h e r s , c a n m a k e a d i f f e r e n c e a n d f o r a c o n s t a n t r e m i n d e r o f w h y w e n e e d t o p e r f o r m s u c h r e s e a r c h . T h a n k y o u t o m y f a m i l y f o r t h e i r f a i t h a n d e n c o u r a g e m e n t . F i n a l l y , a n d m o s t i m p o r t a n t l y , t o m y h u s b a n d , J o r d a n H o o d , f o r h i s c o m p a n i o n s h i p a n d h e l p a n d w i t h o u t w h o s e s u p p o r t I c o u l d n o t h a v e c o m p l e t e d m y t h e s i s , y o u h a v e m y u n d y i n g g r a t i t u d e . i x CO-AUTHORSHIP STATEMENT I n C h a p t e r 2 , " A s s o c i a t i o n b e t w e e n b e n i g n a n d m a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o r s i n N F 1 " , I w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e d e s i g n a n d d a t a a n a l y s i s o f t h e r e s e a r c h p r e s e n t e d . I w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e p r e p a r a t i o n o f t h e m a n u s c r i p t w i t h i n p u t f r o m a l l c o n t r i b u t i n g a u t h o r s . P W o l k e n s t e i n w a s t h e p h y s i c i a n w h o c o l l e c t e d t h e d a t a o n t h e p a t i e n t s a n d J R e v u z a n d J Z e l l e r d e s i g n e d t h e d a t a b a s e t h a t s t o r e s t h e p a t i e n t i n f o r m a t i o n . I n C h a p t e r 3 , " H e t e r o g e n e i t y o f m a s t c e l l d i s t r i b u t i o n i n N F 1 n e u r o f i b r o m a s " , I w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e d e s i g n o f t h e r e s e a r c h . I n a d d i t i o n I p e r f o r m e d a l l t h e i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , d a t a c o l l e c t i o n a n d d a t a a n a l y s i s . V M R i c c a r d i a n d J W e c h s l e r r e v i e w e d t i s s u e s e c t i o n s f o r t h i s s t u d y t o c h a r a c t e r i z e t h e m h i s t o l o g i c a l l y . T o g e t h e r , M S u t c l i f f a n d I r e v i e w e d t i s s u e s e c t i o n s t o a s s e s s t u m o u r c h a r a c t e r i s t i c s . J V i e l k i n d f i n a n c i a l l y s u p p o r t e d t h e p a t h o l o g i c a l s e r v i c e s n e c e s s a r y f o r t h i s p r o j e c t . P W o l k e n s t e i n c o n t r i b u t e d s o m e o f t h e s a m p l e s u s e d i n t h i s s t u d y . I w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e p r e p a r a t i o n o f t h e m a n u s c r i p t w i t h i n p u t f r o m a l l c o n t r i b u t i n g a u t h o r s . I n C h a p t e r 4 , " P a t h o g e n e t i c h e t e r o g e n e i t y o f N F 1 - a s s o c i a t e d n e u r o f i b r o m a s " , I w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e d e s i g n o f t h e r e s e a r c h . I n a d d i t i o n , I p e r f o r m e d a l l h i s t o c h e m i s t r y , d a t a c o l l e c t i o n a n d d a t a a n a l y s i s . T h e m a j o r i t y o f t h e m o l e c u l a r w o r k w a s p e r f o r m e d i n t h e l a b o f , a n d w i t h p a r t i a l f i n a n c i a l s u p p o r t b y , C B r o w n . J F e e a s s i s t e d i n t r o u b l e -s h o o t i n g l a s e r m i c r o d i s s e c t i o n . V M R i c c a r d i a n d J W e c h s l e r r e v i e w e d t i s s u e s e c t i o n s f o r t h i s s t u d y t o c h a r a c t e r i z e t h e m h i s t o l o g i c a l l y . T o g e t h e r , M S u t c l i f f a n d I r e v i e w e d t i s s u e s e c t i o n s t o a s s e s s t u m o u r c h a r a c t e r i s t i c s . P W o l k e n s t e i n c o n t r i b u t e d s o m e o f t h e s a m p l e s u s e d i n t h i s s t u d y . I w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e p r e p a r a t i o n o f t h e m a n u s c r i p t w i t h i n p u t f r o m a l l c o n t r i b u t i n g a u t h o r s . x 1. INTRODUCTION Background on Neurofibromatosis N e u r o f i b r o m a t o s i s 1 ( N F 1 ) i s o n e o f t h e m o s t c o m m o n d o m i n a n t l y i n h e r i t e d d i s e a s e s , w i t h a b i r t h i n c i d e n c e o f 1 i n 3 5 0 0 p e o p l e ( 1 ) . N F 1 w a s f i r s t c l i n i c a l l y r e c o g n i z e d b y v o n R e c k l i n g h a u s e n i n 1 8 8 2 ( 2 ) , b u t i t t o o k m o r e t h a n 1 0 0 y e a r s f o r c r i t e r i a f o r d i a g n o s i n g N F 1 t o b e e s t a b l i s h e d ( 3 ) ( T a b l e 1 . 1 ) . T h e d i s e a s e i s c h a r a c t e r i s e d b y m u l t i p l e c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s , p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s , m a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o u r s , a n d o p t i c a n d o t h e r c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m g l i o m a s , a s w e l l a s b y c a f e - a u - l a i t s p o t s a n d a b n o r m a l i t i e s o f t h e s k e l e t a l , c a r d i o v a s c u l a r a n d c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m s . Table 1.1 National Institutes of Health diagnostic criteria for NF1. Cardinal Clinical Features ( A n y t w o o r m o r e a r e r e q u i r e d f o r d i a g n o s i s ) S i x o r m o r e c a f e - a u - l a i t s p o t s o v e r 5 m m i n g r e a t e s t d i a m e t e r i n p r e p u b e r t a l i n d i v i d u a l s o r o v e r 1 5 m m i n g r e a t e s t d i a m e t e r i n p o s t p u b e r t a l i n d i v i d u a l s T w o o r m o r e n e u r o f i b r o m a s o f a n y t y p e , o r o n e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a F r e c k l i n g i n t h e a x i l l a r y o r i n g u i n a l r e g i o n s O p t i c g l i o m a T w o o r m o r e L i s c h n o d u l e s ( i r i s h a m a r t o m a s ) A d i s t i n c t i v e o s s e o u s l e s i o n s u c h a s s p h e n o i d d y s p l a s i a o r t h i n n i n g o f t h e l o n g b o n e c o r t e x w i t h o r w i t h o u t p s e u d a r t h r o s i s A f i r s t d e g r e e r e l a t i v e ( p a r e n t , s i b l i n g , o r o f f s p r i n g ) w i t h N F 1 b y t h e a b o v e c r i t e r i a T h e NF1 g e n e i s l o c a t e d i n t h e p e r i c e n t r i c r e g i o n o f t h e l o n g a r m o f c h r o m o s o m e 1 7 a n d w a s i d e n t i f i e d i n 1 9 9 0 (4, 5 ) . T h e g e n e h a s 6 0 e x o n s a n d e n c o m p a s s e s 3 5 0 k b o f g e n o m i c D N A . T h e l a r g e g e n e s i z e m a y a c c o u n t f o r t h e h i g h e s t i m a t e d m u t a t i o n r a t e o f 1 x 1 0 " 4 p e r g e n e r a t i o n ( 6 ) , w i t h 5 0 % o f N F 1 c a s e s d u e t o n e w m u t a t i o n s . T h e r e a r e 3 o t h e r g e n e s e m b e d d e d w i t h i n i n t r o n 2 7 b t h a t a r e t r a n s c r i b e d i n t h e o p p o s i t e d i r e c t i o n o f t h e NF1 g e n e ; t w o e c t o p i c v i r a l i n t e g r a t i o n s i t e l o c i (EV12A, EV12B) a n d t h e l o c u s f o r 1 o l i g o d e n d r o c y t e - m y e l i n g l y g o p r o t e i n (OMGP). EV12A i s e x p r e s s e d i n t h e b r a i n a n d b o n e m a r r o w , a n d E V 1 2 B i s e x p r e s s e d e x c l u s i v e l y i n t h e b o n e m a r r o w ( 7 ) , w h i l e OMGP i s e x p r e s s e d o n t h e s u r f a c e o f o l i g o d e n d r o c y t e s ( 8 ) . M u t a t i o n s w i t h i n N F 1 m a y i n a c t i v a t e o n e o r a l l o f t h e s e g e n e s , b u t t h e i r r o l e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f d i s e a s e i s n o t k n o w n . U n p r o c e s s e d p s e u d o g e n e s t h a t s h a r e m o s t o f t h e N F 1 s e q u e n c e h a v e b e e n i d e n t i f i e d a t 2 q 2 1 , 1 2 q 1 2 , 1 4 q 1 1 , 1 5 q 1 1 , 1 8 p 1 1 , 2 1 q 1 1 , a n d 2 2 q 1 1 . S i x o f t h e s e r e g i o n s a r e c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h c e n t r o m e r e s , c o n s i s t e n t w i t h t h e i r e m e r g e n c e b y p e r i c e n t r i c i n t e r c h r o m o s o m a l t r a n s p o s i t i o n ( 9 ) . 2 4 e x o n s ( e x o n s 7 - 9 , 1 0 b , 1 1 - 2 3 a n d 2 4 - 2 7 b ) o f t h e f u n c t i o n a l N F 1 g e n e h a v e h o m o l o g o u s c o u n t e r p a r t s i n t h e p s e u d o g e n e s . O n l y t h e p s e u d o g e n e o n c h r o m o s o m e 2 1 h a s a n u n i n t e r r u p t e d r e a d i n g f r a m e , a l t h o u g h p s e u d o g e n e s o n c h r o m o s o m e 2 , 1 5 a n d 2 1 h a v e s h o w n s o m e t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y ( 1 0 ) . N e u r o f i b r o m i n , t h e p r o t e i n p r o d u c t o f t h e N F 1 g e n e , i s o v e r 2 2 0 k D i n s i z e ( 1 1 ) a n d i s a u b i q u i t o u s l y e x p r e s s e d p r o t e i n . T h e b e s t c h a r a c t e r i s e d f u n c t i o n o f N F 1 w a s d e d u c e d f r o m a d o m a i n e n c o d e d b y e x o n s 2 1 - 2 7 a t h a t i s h o m o l o g o u s t o t h e G T P a s e - a c t i v a t i n g ( G A P ) d o m a i n o f h u m a n p 1 2 0 G A P a n d y e a s t IRA1 a n d IRA2 ( 1 2 ) . T h e G A P d o m a i n f u n c t i o n s a s a n e g a t i v e r e g u l a t o r o f R a s b y a c c e l e r a t i n g t h e c o n v e r s i o n o f a c t i v e R a s -G T P t o i n a c t i v e R a s - G D P . R a s f u n c t i o n s a s p a r t o f a s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y i n v o l v i n g e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r , n e r v e g r o w t h f a c t o r a n d p l a t e l e t - d e r i v e d g r o w t h f a c t o r . R a s c a n s t i m u l a t e c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n t h r o u g h t h e R a f - M A K ( m i t o g e n a c t i v a t e d k i n a s e ) p a t h w a y ( 1 3 ) a n d c a n a l s o i n h i b i t a p o p t o s i s t h r o u g h t h e p h o s p h o i n o s i t o l 3 ' k i n a s e ( P I 3 k i n a s e ) p a t h w a y ( 1 4 ) . T h r e e m a j o r a l t e r n a t i v e l y s p l i c e d a n d d i f f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d i s o f o r m s o f N F 1 m R N A h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n h u m a n s . T h e m o s t c o m m o n i s o f o r m i n c l u d e s e x o n 2 3 a w i t h i n t h e G A P - r e l a t e d f u n c t i o n a l d o m a i n ( 1 5 ) a n d r e s u l t s i n a d e c r e a s e i n G A P a c t i v i t y ( 1 6 ) i n d i f f e r e n t i a t e d c e l l s ( 1 7 ) . A n o t h e r i s o f o r m c o n t a i n s e x o n 4 8 a a n d i s p r e f e r e n t i a l l y e x p r e s s e d i n m u s c l e ( 1 8 ) , a n d a t h i r d i s o f o r m t h a t i n c l u d e s e x o n 9 a i s f o u n d e x c l u s i v e l y i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m d u r i n g e m b r y o g e n e s i s ( 1 9 ) . A s e c o n d d o m a i n u p s t r e a m o f t h e N F 1 G A P - r e l a t e d d o m a i n h a s a r o l e i n c A M P s i g n a l i n g a s i t c o n t a i n s c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e A ( P K A ) b i n d i n g s i t e s ( 1 5 ) . T h e NF1 h o m o l o g u e i n Drosphila melangaster a c t s a s a n a c t i v a t o r o f t h e c A M P p a t h w a y a s 2 w e l l a s a n e g a t i v e r e g u l a t o r o f R a s ( 2 0 ) ; m o r e o v e r , N F 1 m u t a n t f l i e s c a n b e r e s c u e d b y a n N F 1 t r a n s g e n e a n d e x p r e s s i o n o f a c t i v a t e d P K A ( 2 1 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t P K A f u n c t i o n s d o w n s t r e a m o f o r p a r a l l e l t o n e u r o f i b r o m i n i n D r o s o p h i l a . I n r a t s , i t w a s f o u n d t h a t n e u r o f i b r o m i n G A P a c t i v i t y w a s d e c r e a s e d u p o n b i n d i n g a n d p h o s p h o r y l a t i o n b y P K A a n d s u b s e q u e n t i n t e r a c t i o n w i t h 1 4 - 3 - 3 , a p r o t e i n k n o w n t o m o d u l a t e v a r i o u s t a r g e t p r o t e i n s ( 2 2 ) . Types of Neurofibromas in NF1 I n t h i s t h e s i s , I u s e t h e w o r d s " t u m o u r " a n d " n e u r o f i b r o m a " i n t e r c h a n g e a b l y a s a m a t t e r o f c o n v e n i e n c e . T h e q u e s t i o n o f w h e t h e r n e u r o f i b r o m a s a r e t r u e n e o p l a s m s i s a f o c u s o f m y r e s e a r c h , a n d m y u s e o f " t u m o u r " i n t h i s c o n t e x t i s n o t i n t e n d e d t o i m p l y a n y t h i n g a b o u t t h e n a t u r e o f t h e p r o c e s s t h a t p r o d u c e s t h e s e l e s i o n s . N e u r o f i b r o m a s a r e a l w a y s b e n i g n ; t h e m a l i g n a n t c o u n t e r p a r t i s t h e m a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o u r ( M P N S T ) . I n t h i s t h e s i s a n y r e f e r e n c e t o m a l i g n a n c y w i l l b e e x p l i c i t . N e u r o f i b r o m a s a r e t u m o u r s t h a t d e v e l o p w i t h i n a p e r i p h e r a l n e r v e , a n d s o m e t i m e s i n d i v i d u a l a x o n s a r e v i s i b l e w i t h i n t h e t u m o u r . W i t h i n t h e p e r i p h e r a l n e r v o u s s y s t e m , e a c h a x o n i s s u r r o u n d e d b y a S c h w a n n c e l l t o f o r m a n e r v e f i b r e . S e v e r a l n e r v e f i b r e s b e c o m e e n c a s e d w i t h i n t h e p e r i n e u r i u m , a t u b u l a r s t r u c t u r e m a d e u p o f p e r i n e u r i a l c e l l s a n d c o l l a g e n , t o f o r m a n e r v e f a s c i c l e . T h e s p a c e b e t w e e n t h e S c h w a n n c e l l s t h a t s u r r o u n d t h e i n d i v i d u a l a x o n s a n d t h e p e r i n e u r i u m i s t h e e n d o n e u r i u m . I n l a r g e r n e r v e s , s e v e r a l n e r v e f a s c i c l e s a r e b u n d l e d t o g e t h e r a n d a r e e n c a s e d b y a d e n s e f i b r o u s s h e a t h , t h e e p i n e u r i u m ( F i g u r e 1 . 1 ) . T h e d e v e l o p m e n t o f a n e u r o f i b r o m a r e s u l t s i n a n i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f S c h w a n n c e l l s a n d d i s o r g a n i z e d n e r v e s t r u c t u r e w i t h p o s s i b l e b r e a k d o w n o f s o m e s t r u c t u r e s ( F i g u r e 1 . 1 ) . 3 Figure 1.1 Schematic drawing showing a normal nerve and a neurofibroma. I l l u s t r a t i o n c o u r t e s y o f D r G o t t f r i e d . I m a g e s p u b l i s h e d i n N e u r o s u r g e r y . 5 8 ( 1 ) , 1 - 1 6 , 2 0 0 6 . N e u r o f i b r o m a s v a r y i n t e r m s o f t h e i r a g e o f a p p e a r a n c e , n a t u r a l h i s t o r y , a n d m a l i g n a n t p o t e n t i a l . C o n s e q u e n t l y , s e v e r a l d i f f e r e n t c l a s s i f i c a t i o n s o f n e u r o f i b r o m a s h a v e b e e n p r o p o s e d ( T a b l e 3 . 1 ) . N o n e o f t h e s e c l a s s i f i c a t i o n s h a s a c h i e v e d u n i v e r s a l a c c e p t a n c e , a n d t h e l i t e r a t u r e c o n t a i n s m a n y e x a m p l e s o f i n c o n s i s t e n t u s e a n d c o n f u s i o n o f v a r i o u s c l i n i c a l a n d p a t h o l o g i c a l d e s c r i p t i v e t e r m s . A l l n e u r o f i b r o m a s c o n t a i n S c h w a n n c e l l s ( t h e s u s p e c t e d p r o g e n i t o r c e l l t y p e ) , b u t f i b r o b l a s t s , m a s t c e l l s , l y m p h o c y t e s , p e r i n e u r i a l c e l l s , e n d o n e u r i a l f i b r o b l a s t s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s a l s o o c c u r i n v a r y i n g n u m b e r s ( 2 3 ) . D e s p i t e t h e s i m i l a r c e l l t y p e s , n e u r o f i b r o m a s c a n b e c l a s s i f i e d h i s t o p a t h o l o g i c a l l y i n t o t w o c a t e g o r i e s o f d i f f u s e a n d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s . D i f f u s e n e u r o f i b r o m a s a r e p r e d o m i n a n t l y l o c a t e d i n t h e d e r m i s a n d i n v o l v e t h e t h i n t e r m i n a l b r a n c h e s o f p e r i p h e r a l n e r v e s ( F i g u r e 1 . 2 A ) . D i f f u s e n e u r o f i b r o m a s a r e c h a r a c t e r i z e d b y p r o l i f e r a t i o n o f c e l l s t h a t a r e n o t l i m i t e d b y t h e p e r i n e u r i u m a n d c a n e n c i r c l e n o r m a l s t r u c t u r e s ( e x o c r i n e g l a n d s , h a i r f o l l i c l e s a n d 4 v e s s e l s ) w i t h o u t d e s t r o y i n g t h e m . T h e p r o l i f e r a t i n g c e l l s a r e i r r e g u l a r l y d i s p e r s e d w i t h i n a f i b r o u s a n d / o r m y x o i d b a c k g r o u n d . M y e l i n f i b r i l s a r e r a r e o r a b s e n t . N o d u l a r n e u r o f i b r o m a s u s u a l l y i n v o l v e d e e p e r t i s s u e s , a n d t h e c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n i s i n t r a n e u r a l a n d e n c l o s e d w i t h i n l a r g e h y p e r t r o p h i c n e r v e s c i r c u m s c r i b e d b y t h e p e r i n e u r i u m ( F i g u r e 1 . 2 B ) . N o d u l a r t u m o u r s i n c l u d e b o t h s i n g l e a n d p l e x i f o r m t y p e s . S i n g l e n o d u l a r t u m o u r s i n v o l v e j u s t o n e f a s c i c l e , w h i l e n o d u l a r p l e x i f o r m t u m o u r s m a y i n v o l v e s e v e r a l f a s c i c l e s , n e r v e b r a n c h e s o r a n e r v e p l e x u s . D i s p e r s e d o r f a s c i c u l a r m y e l i n f i b r i l s a r e u s u a l l y f o u n d i n t h e c e n t r a l a r e a o f t h e n o d u l e s . O n t r a n s v e r s e s e c t i o n , t h e c e n t r a l a r e a i s l o o s e w i t h a m y x o i d b a c k g r o u n d s u b s t a n c e , w h i l e t h e p e r i p h e r a l a r e a i s u s u a l l y m o r e c e l l u l a r . S o m e n e u r o f i b r o m a s c o n t a i n b o t h d i f f u s e a n d n o d u l a r c o m p o n e n t s ; s u c h t u m o u r s a r e u s u a l l y f o u n d i n t h e d e e p d e r m i s a n d s u b c u t a n e o u s t i s s u e . T h e n o d u l a r c o m p o n e n t i s s u r r o u n d e d b y d i f f u s e e x t r a n e u r a l c e l l p r o l i f e r a t i o n , i n f i l t r a t i n g t h e f a t t i s s u e a n d o t h e r n o r m a l p r e - e x i s t i n g s t r u c t u r e s . Figure 1.2 Examples of histologically defined types of neurofibromas that develop as part of NF1. A . H & E s e c t i o n a t 1 0 . 2 5 x m a g n i f i c a t i o n o f a h i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d d i f f u s e n e u r o f i b r o m a w i t h a n a r r o w p o i n t i n g t o t h e s k i n t h a t o v e r l a y s t h e n e u r o f i b r o m a . B . H & E s e c t i o n a t 1 0 . 2 5 x m a g n i f i c a t i o n o f a h i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s w i t h a n a r r o w p o i n t i n g t o p e r i n e u r i u m t h a t c i r c u m s c r i b e s t h e n e u r o f i b r o m a . R i c c a r d i ( 2 4 ) h a s d i s t i n g u i s h e d 4 t y p e s o f n e u r o f i b r o m a s c l i n i c a l l y t h a t d i f f e r w i t h r e s p e c t t o t h e i r a g e o f a p p e a r a n c e , n a t u r a l h i s t o r y , a n d m a l i g n a n t p o t e n t i a l . T h i s c l i n i c a l c l a s s i f i c a t i o n d o e s n o t c o r r e l a t e c o m p l e t e l y w i t h t h e p a t h o l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o n g i v e n a b o v e . R i c c a r d i ' s c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s o c c u r i n t h e s k i n s u r f a c e a n d d e v e l o p f r o m 5 t h e t e r m i n a l b r a n c h e s o f p e r i p h e r a l n e r v e s ( F i g u r e 1.3A). S u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s a r e f i r m a n d l i e d e e p e r i n t h e s u b c u t a n e o u s l a y e r o f t h e s k i n ( F i g u r e 1.3B). T h e y h a v e d i s c r e t e m a r g i n s b u t m a y e x t e n d a l o n g a n e r v e . N o d u l a r p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a r i s e w i t h i n m a j o r p e r i p h e r a l n e r v e s a n d m a y l i e j u s t b e n e a t h t h e d e r m i s o r m u c h d e e p e r i n t h e b o d y ( F i g u r e 1.3C). T h e y c a n b e l o c a l i z e d o r e x t e n d t h e l e n g t h o f t h e n e r v e , i n v o l v e a n e n t i r e n e r v e p l e x u s , o r s p i n a l n e r v e r o o t s a t m u l t i p l e l a y e r s . T h e l a s t t y p e i s d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s , w h i c h a r e s o m e t i m e s r e f e r r e d t o a s c o n g e n i t a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s b e c a u s e t h e y a r e u s u a l l y a p p a r e n t a t b i r t h o r w i t h i n t h e f i r s t f e w y e a r s o f l i f e ( F i g u r e 1.3D). T h e s e n e u r o f i b r o m a s c a n b e s u p e r f i c i a l , i n v o l v i n g t h e s k i n a n d s u b c u t a n e o u s t i s s u e , o r i n v o l v e d e e p e r t i s s u e . T h e t u m o u r s d o n o t h a v e d i s c r e t e b o r d e r s b u t i n v a d e a d j a c e n t n o r m a l t i s s u e s . S u b c u t a n e o u s , n o d u l a r p l e x i f o r m a n d d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s c a n p r o g r e s s t o m a l i g n a n c y , r e s u l t i n g i n M P N S T s . Figure 1 . 3 Examples of clinically defined types of neurofibromas that develop as part of NF1. C i s a n M R I i m a g e o f t h e p e l v i s i n f r o n t a l s e c t i o n . T h e h i s t o l o g i c a l a n d c l i n i c a l a p p r o a c h e s d o n o t c l a s s i f y i n d i v i d u a l t u m o u r s i n t o t h e s a m e g r o u p s . B o t h c l i n i c a l l y d e f i n e d c u t a n e o u s a n d d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s u s u a l l y a r e d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s h i s t o l o g i c a l l y , a l t h o u g h s o m e d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a r e h i s t o l o g i c a l l y - m i x e d d i f f u s e a n d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s . T u m o u r s t h a t a r e c l a s s i f i e d 6 c l i n i c a l l y a s s u b c u t a n e o u s o r n o d u l a r p l e x i f o r m a r e u s u a l l y n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s o n h i s t o p a t h o l o g i c a l e x a m . M o s t s t u d i e s o f n e u r o f i b r o m a p a t h o g e n e s i s t r e a t a l l n e u r o f i b r o m a s a s a s i n g l e c l a s s d e s p i t e t h e i r c l i n i c a l a n d p a t h o g e n i c h e t e r o g e n e i t y . T h i s h e t e r o g e n e i t y i s i m p o r t a n t b e c a u s e s o m e k i n d s o f n e u r o f i b r o m a s h a v e l i t t l e , i f a n y , m a l i g n a n t p o t e n t i a l , w h i l e o t h e r k i n d s m a y p r o g r e s s t o m a l i g n a n c y . M P N S T s a r e o n e o f t h e l e a d i n g c a u s e s o f d e a t h i n N F 1 p a t i e n t s ( 2 5 ) . T h e r e i s c u r r e n t l y n o e f f e c t i v e t r e a t m e n t k n o w n f o r b e n i g n n e u r o f i b r o m a s o r M P N S T s e x c e p t s u r g i c a l r e m o v a l i n f a v o u r a b l e c a s e s . The "two-hit hypothesis" I n t h e e a r l y 1 9 7 0 ' s A l f r e d K n u d s o n s u g g e s t e d t h a t t w o m u t a t i o n s o r " h i t s " w e r e r e q u i r e d f o r t h e d e v e l o p m e n t o f a r e t i n o b l a s t o m a a n d t h a t t h e i n h e r i t a n c e o f o n e o f t h e s e m u t a t i o n s c o u l d a c c o u n t f o r t h e e a r l i e r o n s e t a n d f r e q u e n t b i l a t e r a l o c c u r r e n c e o f t h e h e r e d i t a r y f o r m o f t h i s t u m o u r ( 2 6 ) . S u b s e q u e n t m o l e c u l a r s t u d i e s s u p p o r t e d K n u d s o n ' s h y p o t h e s i s i n b o t h h e r e d i t a r y a n d s p o r a d i c r e t i n o b l a s t o m a s b y d e m o n s t r a t i n g m u t a t i o n s o f b o t h a l l e l e s o f a g e n e t h a t w a s n a m e d " R B 1 " i n b o t h h e r e d i t a r y a n d s p o r a d i c r e t i n o b l a s t o m a s ( 2 7 ) . I n h e r e d i t a r y r e t i n o b l a s t o m a , i n d i v i d u a l s b e g i n l i f e w i t h a c o n s t i t u t i o n a l m u t a t i o n t h a t i n a c t i v a t e s o n e a l l e l e o f t h e R B 1 g e n e . T h e " s e c o n d h i t " o c c u r s s o m a t i c a l l y a n d u s u a l l y i n v o l v e s a l l o r p a r t o f t h e c h r o m o s o m e c o n t a i n i n g t h e n o r m a l R B 1 a l l e l e , p o t e n t i a l l y a f f e c t i n g o t h e r g e n e s a n d g e n e t i c m a r k e r s i n t h e r e g i o n o f t h e n o r m a l R B 1 a l l e l e . I f s o m e o f t h e s e g e n e t i c m a r k e r s h a p p e n t o b e h e t e r o z y g o u s i n a n i n d i v i d u a l , l o s s o f o n e a l l e l e o n t h e s a m e c h r o m o s o m e a s t h e n o r m a l R B 1 a l l e l e p r o d u c e s l o s s o f h e t e r o z y g o s i t y ( L O H ) , a c e l l - s p e c i f i c p h e n o t y p e t h a t i s r e l a t i v e l y e a s y t o t e s t i n t u m o u r t i s s u e . T h e " t w o - h i t " h y p o t h e s i s h a s s u b s e q u e n t l y b e e n s h o w n t o a p p l y t o m a n y o t h e r g e n e s i n v o l v e d i n m a n y o t h e r i n h e r i t e d a n d s p o r a d i c t u m o u r s , a n d f u n c t i o n a l l o s s o f b o t h a l l e l e s o f s u c h g e n e s i s c o n s i d e r e d t o b e a p r i n c i p a l m e c h a n i s m o f t u m o u r i g e n e s i s ( 2 8 , 2 9 ) . A s a c o n s e q u e n c e , L O H f o r a p a r t i c u l a r g e n e w i t h i n a s p e c i f i c t u m o u r t y p e h a s b e c o m e a m a j o r c r i t e r i a f o r t h e i n v o l v e m e n t o f t h a t g e n e i n t u m o u r p a t h o g e n e s i s ( 3 0 ) . G e n e s t h a t p e r m i t t u m o u r d e v e l o p m e n t w h e n b o t h a l l e l e s a r e i n a c t i v a t e d o r l o s t a r e k n o w n a s " t u m o u r s u p p r e s s o r g e n e s " ( 2 9 ) . N F 1 i s a c o n f i r m e d t u m o u r s u p p r e s s o r g e n e a s m o s t c o n s t i t u t i o n a l m u t a t i o n s i n N F 1 r e s u l t i n l o s s o f f u n c t i o n o f t h e p r o t e i n , a n d L O H 7 h a s b e e n o b s e r v e d i n p h e o c h r o m o c y t o m a s ( 3 1 ) , m y e l o i d l e u k e m i a ( 3 2 ) a n d M P N S T s ( 3 3 , 3 4 ) i n N F 1 p a t i e n t s . Loss of Heterozygosity L O H a n a l y s i s i s p e r f o r m e d b y s c r e e n i n g p a i r e d b l o o d a n d t u m o u r s a m p l e s w i t h p o l y m o r p h i c g e n e t i c m a r k e r s i n t h e r e g i o n o f a n e s t a b l i s h e d o r s u s p e c t e d t u m o u r s u p p r e s s o r g e n e . T h e d e t e c t i o n o f L O H e x p l o i t s t h e p r e s e n c e o f D N A p o l y m o r p h i s m s t h r o u g h o u t t h e g e n o m e t o d i s c r i m i n a t e b e t w e e n t h e p a t e r n a l a n d m a t e r n a l a l l e l e s a t a t u m o u r s u p p r e s s o r l o c u s . I n p r a c t i c e , i d e n t i f i c a t i o n o f L O H i s s o m e w h a t a r b i t r a r y b e c a u s e a d e c r e a s e i n t h e r e l a t i v e i n t e n s i t y , r a t h e r t h a n a t o t a l l o s s o f o n e a l l e l e , i s u s u a l l y o b s e r v e d i n t u m o u r s . T h i s i s r e f e r r e d t o a s " a l l e l i c i m b a l a n c e " , a n d d i f f e r e n t s t u d i e s h a v e u s e d d i f f e r e n t c u t o f f s t o d i a g n o s e L O H . A l t h o u g h a l l e l i c i m b a l a n c e i s u s u a l l y c o n s i d e r e d t o b e e v i d e n c e o f L O H , t h e r a t i o o f a l l e l e s i n n e o p l a s t i c t i s s u e c a n a l s o b e d i s t u r b e d b y o t h e r m e c h a n i s m s , i n c l u d i n g t r i s o m y a n d l o c a l D N A a m p l i f i c a t i o n ( 2 9 ) . I n s o m e i n s t a n c e s , h o w e v e r , i n a c t i v a t i o n o f b o t h a l l e l e s o f a t u m o u r s u p p r e s s o r g e n e m a y o c c u r b u t L O H m a y n o t b e d e t e c t e d . F a i l u r e t o o b s e r v e L O H m a y r e s u l t f r o m t e c h n i c a l l i m i t a t i o n s o f t h e a s s a y , s u c h a s i n a c t i v a t i o n o f t h e n o r m a l a l l e l e o f t h e t u m o u r s u p p r e s s o r g e n e b y p o i n t m u t a t i o n s , s m a l l d e l e t i o n s o r e p i g e n e t i c m e c h a n i s m s t h a t d o n o t p r o d u c e l o s s o f c l o s e l y l i n k e d p o l y m o r p h i c m a r k e r s . I n o t h e r c i r c u m s t a n c e s , L O H w o u l d n o t b e e x p e c t e d b e c a u s e t h e n e o p l a s m a r i s e s b y a m e c h a n i s m s u c h a s a c t i v a t i n g m u t a t i o n s o f o n e o r m o r e o n c o g e n e s r a t h e r t h a n i n a c t i v a t i o n o f b o t h a l l e l e s o f a t u m o u r s u p p r e s s o r g e n e . V o g e l s t e i n e t a l . ( 3 5 ) e x p l a i n e d t h e i n c r e a s i n g i n c i d e n c e o f c a n c e r i n t h e g e n e r a l p o p u l a t i o n w i t h a g e b y m e a n s o f a m o r e c o m p l e x m u l t i s t e p t u m o r i g e n e s i s m o d e l . T h i s m o d e l d e s c r i b e s n e o p l a s t i c d e v e l o p m e n t a s t h e e x p a n s i o n o f a c l o n e o f c e l l s t h a t h a s a c c u m u l a t e d s e v e r a l s o m a t i c m u t a t i o n s . T h e n e o p l a s m m a y b e e i t h e r b e n i g n o r m a l i g n a n t , d e p e n d i n g o n w h e t h e r i t s c e l l s p o s s e s s t h e a b i l i t y t o m e t a s t a s i z e . T h e p r o c e s s i s s e e n a s o n e o f p r o g r e s s i v e s e l e c t i o n f o r c e l l s w i t h a n i n c r e a s i n g p r o l i f e r a t i v e a d v a n t a g e . T h e f i r s t m u t a t i o n i n a s o m a t i c c e l l p r o v i d e s a s l i g h t g r o w t h a d v a n t a g e t o i t s p r o g e n y . O n e o f t h e s e c e l l s a c q u i r e s a f u r t h e r p r o l i f e r a t i v e a d v a n t a g e t h r o u g h a s e c o n d m u t a t i o n , a n d o n e o f i t s c e l l u l a r p r o g e n y a c q u i r e s a t h i r d m u t a t i o n , p o s s i b l y f o r m i n g a b e n i g n t u m o u r . S u b s e q u e n t m u t a t i o n s i n t h e d e s c e n d a n t s o f t h e s e c e l l s m a y p e r m i t 8 t h e m t o e s c a p e a p o p t o s i s , c e l l c y c l e c h e c k p o i n t s , o r o t h e r g r o w t h c o n t r o l m e c h a n i s m s o r t o b e c o m e g e n e t i c a l l y u n s t a b l e , i n c r e a s i n g t h e l i k e l i h o o d f o r a t u m o u r t o p r o g r e s s . C o l o r e c t a l c a n c e r i s a w e l l c h a r a c t e r i z e d c a n c e r t h a t f o l l o w s t h e m u l t i s t e p m o d e l o f t u m o u r i g e n e s i s ( 3 5 ) . T u m o u r i n i t i a t i o n o c c u r s w i t h a m u t a t i o n i n t h e t u m o u r s u p p r e s s o r g e n e , A P C ( a d e n o m a t o s i s p o l y p o s i s c o l i ) , w h i c h c a u s e s a h y p e r p r o l i f e r a t i o n o f t h e n o r m a l e p i t h e l i u m r e s u l t i n g i n a b e n i g n c o l o n a d e n o m a . M u t a t i o n s o f t h e A P C g e n e c a n o c c u r s o m a t i c a l l y , c a u s i n g a s i n g l e t u m o u r , o r i n t h e g e r m l i n e , r e s u l t i n g i n a p r e d i s p o s i t i o n t h a t m a y c a u s e t h e d e v e l o p m e n t o f t h o u s a n d s o f a d e n o m a s . A s u b s e q u e n t m u t a t i o n i n t h e RAS g e n e o c c u r s , l e a d i n g t o a f u r t h e r e x p a n s i o n o f t h e c e l l s a n d a n i n c r e a s e i n t h e s i z e o f t h e b e n i g n a d e n o m a . A d d i t i o n a l m u t a t i o n s i n t h e D C C ( d e l e t e d i n c o l o r e c t a l c a r c i n o m a ) a n d P 5 3 g e n e s r e s u l t i n a n i n c r e a s e i n t h e c l o n a l e x p a n s i o n a n d p r o g r e s s i o n f r o m b e n i g n a d e n o m a t o m a l i g n a n t c a r c i n o m a . O t h e r a l t e r a t i o n s o c c u r t h a t p e r m i t m e t a s t a s i s . Clonality in Neoplastic Cells N e o p l a s i a a l m o s t a l w a y s a r i s e s t h r o u g h m u t a t i o n , a l t h o u g h e x a m p l e s o f a b n o r m a l e p i g e n e t i c c h a n g e s h a v e a l s o b e e n d o c u m e n t e d a s l i k e l y c o n t r i b u t i n g e v e n t s ( 3 6 , 3 7 ) . A a c q u i r e d m u t a t i o n a l e v e n t i n s o m a t i c c e l l s a r i s e r a n d o m l y , g i v i n g t h e a f f e c t e d c e l l a g r o w t h a d v a n t a g e c o m p a r e d t o t h e s u r r o u n d i n g c e l l s . T h e c e l l t h e n g i v e s r i s e t o a g e n e t i c a l l y i d e n t i c a l c l o n e o f c e l l s t h a t , o v e r t i m e , c a n f o r m a t u m o u r . A l l o f t h e c e l l s o f t h e r e s u l t i n g t u m o u r a r e c l o n a l d e r i v a t i v e s o f t h e o n e c o m m o n a n c e s t o r c e l l t h a t u n d e r w e n t t h e m u t a t i o n . S u c h t u m o u r s a r e s a i d t o b e " c l o n a l " ( F i g u r e 1 . 4 ) . 9 Figure 1.4 Cartoon depicting neoplasia as a clonal expansion of one cell that underwent a stochastic somatic mutation. E a c h d a r k b l u e c i r c l e r e p r e s e n t s a n o r m a l c e l l i n a n y t i s s u e . O n e c e l l ( l i g h t b l u e ) h a s a s o m a t i c m u t a t i o n t h a t g i v e s i t a p r o l i f e r a t i v e a d v a n t a g e o v e r a l l o t h e r s u r r o u n d i n g c e l l s . T h e l i g h t b l u e c e l l e x p a n d s c l o n a l l y t o f o r m a t u m o u r . Tumour Normal ° n e c e " Mutated cell has a Tissue undergoes growth advantage a mutation a n c j forms a tumour M o s t n o r m a l t i s s u e s a r e s a i d t o b e " p o l y c l o n a l " , i . e . , c o m p o s e d o f a m i x t u r e o f c e l l s t h a t a r o s e f r o m m a n y d i f f e r e n t p r e c u r s o r s , n o n e o f w h i c h h a d a s i g n i f i c a n t g r o w t h a d v a n t a g e o v e r t h e o t h e r s . C l o n a l i t y m a y b e o b s e r v e d a m o n g a d j a c e n t c e l l s i n n o r m a l s o l i d t i s s u e s b e c a u s e t h e t w o d a u g h t e r c e l l s p r o d u c e d b y m i t o t i c d i v i s i o n t e n d t o r e m a i n c l o s e t o e a c h o t h e r i n s o l i d t i s s u e s . H o w e v e r , t h e " p a t c h e s " o f c l o n a l i t y t h a t o c c u r i n n o r m a l t i s s u e s a r e u s u a l l y s m a l l . T h e f i n d i n g o f a l a r g e r e g i o n o f c l o n a l i t y w i t h i n a t i s s u e s u g g e s t s t h e p r e s e n c e o f a n e o p l a s t i c p r o c e s s . T h e r e a r e s o m e e x c e p t i o n s t o t h i s r u l e , f o r e x a m p l e s o m e n e o p l a s m s a r e v i r a l l y i n d u c e d ( 3 8 , 3 9 ) , a r i s i n g f r o m t h e i n f e c t i o n o f a p o l y c l o n a l s e t o f c e l l s . T h e r e a r e a l s o e x a m p l e s o f b e n i g n t u m o u r s t h a t d o n o t d i s p l a y c l o n a l i t y , s u c h a s t h e c o r t i c a l t u b e r s t h a t o c c u r a s p a r t o f t u b e r o u s s c l e r o s i s c o m p l e x ( T S C ) , a d o m i n a n t l y - i n h e r i t e d d i s e a s e ( 4 0 - 4 2 ) . H o w e v e r , t u b e r s a r e c o n s i d e r e d t o b e h a m a r t o m a s t h a t a r i s e t h r o u g h a p r o c e s s o f d y s p l a s i a r a t h e r t h a n t r u e n e o p l a s m s . T h e m o s t f r e q u e n t l y - u s e d a s s a y o f t i s s u e c l o n a l i t y i n h u m a n s i s b a s e d o n t h e f a c t t h a t n o r m a l t i s s u e s i n f e m a l e s a r e m o s a i c , b e i n g c o m p r i s e d o f a m i x t u r e o f c e l l s , s o m e o f w h i c h h a v e a n a c t i v e X - c h r o m o s o m e i n h e r i t e d f r o m t h e m o t h e r , a n d o t h e r s o f w h i c h h a v e a n a c t i v e X - c h r o m o s o m e i n h e r i t e d f r o m t h e f a t h e r . M a r y L y o n f i r s t h y p o t h e s i z e d t h a t o n e X - c h r o m o s o m e i n e a c h f e m a l e c e l l i s r a n d o m l y i n a c t i v a t e d ( 4 3 ) , a n d t h i s i s t r u e i n a l m o s t a l l c e l l s o f h u m a n f e m a l e s . X - i n a c t i v a t i o n o c c u r s i n e a r l y e m b r y o g e n e s i s , a n d 1 0 o n c e o n e o f t h e t w o X - c h r o m o s o m e s i n a n e m b r y o n i c c e l l i s i n a c t i v a t e d , t h e s a m e X -c h r o m o s o m e ( m a t e r n a l o r p a t e r n a l ) r e m a i n s i n a c t i v a t e d i n a l l o f t h e c l o n a l p r o g e n y o f t h a t c e l l . X - i n a c t i v a t i o n i s a r a n d o m p r o c e s s , a n d o n a v e r a g e h a l f o f t h e c e l l s i n a n y w o m a n w o u l d b e e x p e c t e d t o h a v e a n i n a c t i v e p a t e r n a l X - c h r o m o s o m e , a n d t h e o t h e r h a l f t o h a v e a n i n a c t i v e m a t e r n a l X - c h r o m o s o m e . H o w e v e r , t h e a c t u a l r a t i o o f t h e t w o c e l l t y p e s i n a n y n o r m a l t i s s u e f o l l o w s a G a u s s i a n d i s t r i b u t i o n w i t h a m e a n o f 5 0 : 5 0 . S u b s t a n t i a l v a r i a t i o n o c c u r s a r o u n d t h i s m e a n a s a r e s u l t o f t h e r e l a t i v e l y s m a l l s i z e o f t h e c e l l p o o l p r e s e n t a t t h e t i m e o f X - i n a c t i v a t i o n ( 4 3 ) . I t i s t h e r e f o r e n o t s u r p r i s i n g t h a t n o r m a l f e m a l e t i s s u e s o f t e n h a v e a m o r e o r l e s s u n e q u a l p r o p o r t i o n o f c e l l s w i t h t h e m a t e r n a l o r p a t e r n a l X - c h r o m o s o m e i n a c t i v e . T h e p a t t e r n o f X - i n a c t i v a t i o n i n a t i s s u e c a n b e e s t i m a t e d b y a n a l y s i s o f p o l y m o r p h i c X -l i n k e d m a r k e r g e n e s ( e . g . , AR, a n d r o g e n r e c e p t o r ) t h a t c o n t a i n r e s t r i c t i o n s i t e s t h a t a r e m e t h y l a t e d o n t h e i n a c t i v e X - c h r o m o s o m e b u t n o t o n t h e a c t i v e X - c h r o m o s o m e ( 4 4 ) . T h e m a r k e r i s a m p l i f i e d b y P C R w i t h a n d w i t h o u t p r e c e d i n g d i g e s t i o n b y a m e t h y l a t i o n -s e n s i t i v e r e s t r i c t i o n e n z y m e . F o l l o w i n g d i g e s t i o n , o n l y t h e a l l e l e o n t h e m e t h y l a t e d i n a c t i v e X c h r o m o s o m e p e r s i s t s a s a n i n t a c t f r a g m e n t t h a t c a n b e a m p l i f i e d b y P C R ( F i g u r e 1 . 5 ) . Figure 1.5 Schematic of X-Chromosome Inactivation (XCI) assay with Androgen Receptor. A . B l u e b o x r e p r e s e n t s t h e AR l o c u s p o l y m o r p h i c C A G r e p e a t o f a l l e l e A ; r e d b o x r e p r e s e n t s a l l e l e B . T h e v e r t i c a l l i n e s r e p r e s e n t Hpall r e s t r i c t i o n s i t e s a n d b l a c k f i l e d a r r o w s r e p r e s e n t t h e P C R p r i m e r s . A l l e l e s A a n d B r e p r e s e n t t w o a l l e l e s i n a n i n d i v i d u a l h e t e r o z y g o u s a t t h e AR l o c u s . B . A f t e r g e n o m i c d i g e s t i o n w i t h Hpall, t h e r e a r e t w o d i f f e r e n t s c e n a r i o s : r a n d o m X C I a n d s k e w e d X C I . Hpall s i t e s t h a t a r e n o t m e t h y l a t e d w i l l b e c u t ( i n d i c a t e d b y a n o p e n s p a c e b e t w e e n t h e r e s t r i c t i o n s i t e s ) . M e t h y l a t e d s i t e s w i l l r e m a i n i n t a c t . I n r a n d o m X C I , a l l e l e A i s c u t h a l f t h e t i m e , a s i s a l l e l e B . I n c o m p l e t e l y s k e w e d X C I , o n l y o n e a l l e l e i s c u t ( a l l e l e B i n t h e f i g u r e ) . C . U p o n P C R o f t h e d i g e s t e d s a m p l e s , a m p l i f i c a t i o n f r o m t h e AR l o c u s w i l l o n l y o c c u r i f t h e a l l e l e h a s n o t b e e n c u t w i t h Hpall. D . T h e a l l e l e s c a n t h e n b e s e p a r a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s . 11 Hpall Sites (CAG)n A l l e l e A A l l e l e B B Hpall Digest ion Random XCI Skewed XCI OR Amplification D V Electrophoresis A l l e l e A A l l e l e B 12 N o r m a l p o l y c l o n a l t i s s u e s i n a h e t e r o z y g o u s f e m a l e h a v e a m i x t u r e o f c e l l s e x p r e s s i n g t h e m a t e r n a l a n d p a t e r n a l a l l e l e s o n t h e a c t i v e X - c h r o m o s o m e . S u c h t i s s u e s u s u a l l y e x h i b i t a p p r o x i m a t e l y e q u a l e x p r e s s i o n o f e a c h a l l e l e o f t h e m a j o r i t y o f X - l i n k e d g e n e s . T h e p r e s e n c e o f t h e s a m e i n a c t i v e a l l e l e i n a l l c e l l s o f a t u m o u r f r o m a w o m a n w h o s e n o r m a l t i s s u e s e x h i b i t b o t h i n a c t i v e a l l e l e s i n a p p r o x i m a t e l y e q u a l a m o u n t s c o n f i r m s t h e m o n o c l o n a l o r i g i n o f t h e n e o p l a s m . D e m o n s t r a t i n g c l o n a l i t y w i t h i n a t i s s u e i s c o n s i s t e n t w i t h i t b e i n g n e o p l a s t i c , b u t c l o n a l i t y a n a l y s i s d o e s n o t p r o v i d e i n f o r m a t i o n o n t h e s p e c i f i c m o l e c u l a r e v e n t s t h a t l e a d t o t u m o u r i n i t i a t i o n o r p r o g r e s s i o n . C l o n a l i t y o n l y m e a n s t h a t o n e o r m o r e r a r e e v e n t s ( u s u a l l y p r e s u m e d t o b e m u t a t i o n s ) h a v e o c c u r r e d d u r i n g t h e p r o c e s s o f t u m o u r d e v e l o p m e n t . A t u m o u r t h a t i s o f c l o n a l o r i g i n m a y c o n t a i n s e v e r a l d i s t i n c t s u b c l o n e s a s a r e s u l t o f s u b s e q u e n t m u t a t i o n s . I n a d d i t i o n , a t u m o u r s a m p l e m a y c o n t a i n e n o u g h n o n - m a l i g n a n t c e l l s t h a t i t a p p e a r s t o r e p r e s e n t a p o l y c l o n a l p o p u l a t i o n . Mouse Models of NF1 M o u s e m o d e l s o f N F 1 h a v e b e e n d e v e l o p e d , b u t t h e s e m o d e l s o n l y p a r t i a l l y r e c a p i t u l a t e t h e h u m a n d i s e a s e . M i c e h e t e r o z y g o u s f o r N f 1 a r e v i a b l e b u t d o n o t d e v e l o p n e u r o f i b r o m a s o f a n y k i n d , a n d h o m o z y g o u s Nf1 n u l l m i c e d i e in utero o f h e a r t d e f e c t s , p o i n t i n g t o a c r i t i c a l f u n c t i o n o f n e u r o f i b r o m i n i n m o u s e e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t ( 4 5 ) . M i c e w i t h a c o n d i t i o n a l d e l e t i o n o f b o t h N f 1 a l l e l e s r e s t r i c t e d t o S c h w a n n c e l l s s u r v i v e w i t h e n l a r g e d p e r i p h e r a l n e r v e s , d e m o n s t r a t i n g t h a t c o m p l e t e d e f i c i e n c y o f N f 1 i n S c h w a n n c e l l s i s s u f f i c i e n t t o i n i t i a t e a p r o l i f e r a t i v e a b n o r m a l i t y o f t h e S c h w a n n c e l l ( 4 6 ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e s e m i c e d e v e l o p n e u r o f i b r o m a s o f t h e d o r s a l r o o t g a n g l i a o n l y i f o t h e r c e l l s i n t h e m i c e a r e h e t e r o z y g o u s f o r N f 1 - a n N f 1 h a p l o i n s u f f i c i e n t t u m o u r e n v i r o n m e n t a p p e a r s n e c e s s a r y f o r t h e p a t h o g e n e s i s o f t h e s e h i s t o l o g i c a l l y - m i x e d t u m o u r s ( 4 6 ) . T h e n e u r o f i b r o m a s t h a t a r i s e i n t h i s m o u s e m o d e l a r e h i s t o l o g i c a l l y s i m i l a r t o n o d u l a r p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s t h a t o c c u r i n p e o p l e w i t h N F 1 . Molecular Analysis in NF1 Associated Neurofibromas I t i s w i d e l y a s s u m e d t h a t a l l b e n i g n N F 1 n e u r o f i b r o m a s d e v e l o p w h e n a " s e c o n d h i t " o c c u r s s o m a t i c a l l y i n t h e n o r m a l N F 1 a l l e l e . S c h w a n n c e l l s a r e t h e s u s p e c t e d p r o g e n i t o r i n n e u r o f i b r o m a s b e c a u s e t h e y c o n s t i t u t e a l a r g e p r o p o r t i o n o f t h e t u m o u r , 4 0 - 8 0 % , a n d s o m e c u l t u r e s d e r i v e d f r o m N F 1 p a t i e n t n e u r o f i b r o m a s d i s p l a y l o s s o f t h e n o r m a l N F 1 a l l e l e i n S c h w a n n c e l l s b u t n o t i n f i b r o b l a s t s ( 4 7 - 4 9 ) . 1 3 S t u d i e s h a v e f o c u s e d o n u n c o v e r i n g s o m a t i c m u t a t i o n s o r " s e c o n d h i t s " i n N F 1 -a s s o c i a t e d n e u r o f i b r o m a s . E v i d e n c e o f c l o n a l i t y o r L O H h a s b e e n o b s e r v e d i n 2 6 % o f d i s c r e t e d e r m a l n e u r o f i b r o m a s ( T a b l e 1 . 2 ) . A d e r m a l n e u r o f i b r o m a r e p o r t e d b y S a w a d a e t a l . ( 5 0 ) w a s e s p e c i a l l y i n f o r m a t i v e b e c a u s e t h e s o m a t i c m u t a t i o n i n t h e s e c o n d N F 1 a l l e l e w a s i d e n t i f i e d . H o w e v e r , b o t h t h e m u t a n t a n d n o n - m u t a n t v e r s i o n o f t h e s e c o n d N F 1 a l l e l e w e r e f o u n d i n a h o m o g e n o u s - a p p e a r i n g a r e a o f t u m o u r c e l l s , s u g g e s t i n g t h a t t h e s e c e l l s w e r e n o t a l l c l o n a l d e r i v a t i v e s o f t h e c e l l t h a t h a d s u s t a i n e d t h e s e c o n d p a t h o g e n i c m u t a t i o n . T h i s i n t e r p r e t a t i o n i s s t r o n g l y s u p p o r t e d b y s t u d i e s o f c u l t u r e d S c h w a n n c e l l s f r o m 1 0 n e u r o f i b r o m a s o b t a i n e d f r o m 6 N F 1 p a t i e n t s ( 5 1 ) w h o s e g e r m -l i n e N F 1 m u t a t i o n s h a d b e e n i d e n t i f i e d . T w o d i f f e r e n t p o p u l a t i o n s o f S c h w a n n c e l l s w e r e d e m o n s t r a t e d i n c u l t u r e s f r o m 7 o f t h e s e 1 0 t u m o u r s ; o n e p o p u l a t i o n h a d a " s e c o n d h i t " s o m a t i c N F 1 m u t a t i o n , a n d t h e o t h e r d i d n o t . T h i s f i n d i n g r a i s e s t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e " s e c o n d h i t " m u t a t i o n o c c u r r e d a s a s e c o n d a r y e v e n t w i t h i n a n e u r o f i b r o m a t h a t h a d a l r e a d y d e v e l o p e d t h r o u g h s o m e p o l y c l o n a l p r o c e s s . A l t e r n a t i v e l y , t h e s e t u m o u r s m a y h a v e a r i s e n t h r o u g h a " t w o - h i t " m e c h a n i s m , b u t t h e p r o l i f e r a t i n g n e o p l a s t i c c l o n e ( p r e s u m a b l y S c h w a n n c e l l s ) s t i m u l a t e d i n v a s i o n o f t h e t u m o u r b y n o n - n e o p l a s t i c S c h w a n n c e l l s , p e r i n e u r a l c e l l s , m a s t c e l l s a n d f i b r o b l a s t s . 1 4 Table 1.2 Summary of loss of heterozygosity analysis, clonality studies and "second hit" somatic mutations in NF1-associated neurofibromas. Study NF1 Patients Studied Dermal NF1 Patients Studied Plexiform LOH Analysis Tumours Tumours Markers Studied With "2-hit" or Clonality Studied With "2-hit" or Clonality Method Intragenic Extragenic Primary Tumor Fialkow et al. (51a) Clonality 14 14 0 PCR G-6-PD Skuse et a/.(52) "2-hit" 19 19 0 Southern 7 Clonality 8 8 8 PCR PGR Colman et a/.|(53) "2-hit" 5 22 8 PCR .. 12 12 Sawada ef al.(50) "2-hit" 1 1 1 PCR 4 Daschner ef al.(54) "2-hit" 20 31 0 7 7 1 PCR 4 1 Clonality 8 8 3 5 5 1 PCR AR Kluwe era/.(47) LOH 10 14 8 PCR 4 Eisenbarth ef al. (55) "2-hit" 3 6 3 1 1 1 PCR 9 2 John ef a/.(56) Study NF1 Patients Studied Dermal NF1 Patients Studied Plexiform LOH Analysis Tumours Tumours Markers Studied With "2-hit" or Clonality Studied With "2-hit" or Clonality Method Intragenic Extragenic "2-hit" 42 74 10 3 3 1 PCR 8 5 Luijten ef a/.(57) LOH 5 5 2 9 9 3 PCR 3 3 "2-hit" 8 15 2 10 10 4 PCR 10 10 Weist ef al.(58) "2-hit" 2 33 13 PCR 7 4 Upadhyaya ef a/.(59) "2-hit" 17 80 . 13 3 3 1 PCR 9 4 DeLuca ef a/.(60) "2-hit" 4 4 0. 10 11 1 FISH DeRaedt ef a/.(61) "2-hit" 6 28 6 PCR 6 11 "2-hit" in Cultures* Kluwe ef a/.(62)f 1 1 1 PCR 4 Serraef a/.(63) t 17 60 15 PCR 5 6 Serra ef a/. (64) t 12 27 19 PCR 5 16 Maertens ef a/.(65) 9 38 29 PCR 4 2 Total LOH 186 459 121 (26%) 54 59 21 (36%) Total Clonality 16 16 3(19%) 5 5 1 (20%) f A u t h o r c l a s s i f i e d n e u r o f i b r o m a s a s b e n i g n , n o d i s t i n c t i o n b e t w e e n d e r m a l o r p l e x i f o r m t A u t h o r f o u n d L O H i n S c h w a n n c e l l s b u t n o t i n f i b r o b l a s t c u l t u r e s f r o m p a t i e n t n e u r o f i b r o m a s a m p l e s P l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s o c c u r i n a b o u t h a l f o f N F 1 p a t i e n t s a n d m a y b e e i t h e r d i f f u s e o r n o d u l a r . A l t h o u g h t h e s e t w o t y p e s o f p l e x i f o r m t u m o u r s a r e c l i n i c a l l y d i s t i n c t , r e p o r t e d s t u d i e s o f L O H a n d c l o n a l i t y d o n o t d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e m . T h e m a j o r i t y o f p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s h a v e n o t s h o w n e v i d e n c e o f c l o n a l i t y o r L O H i n t h e N F 1 r e g i o n ( T a b l e 1 . 2 ) . H o w e v e r , S c h w a n n c e l l c u l t u r e s d e r i v e d f r o m 4 o f 6 p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s s h o w e d k a r y o t y p i c a b n o r m a l i t i e s , w h i l e c u l t u r e s o f d e r m a l n e u r o f i b r o m a s d i d n o t d i s p l a y a n y c h r o m o s o m a l a b n o r m a l i t i e s ( 6 6 ) . K a r y o t y p i c h e t e r o g e n e i t y w a s o b s e r v e d i n t h e c u l t u r e s f r o m 3 o f t h e s e p l e x i f o r m t u m o u r s . T h e o b s e r v a t i o n o f k a r y o t y p i c a b n o r m a l i t i e s i n p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s m a y i n d i c a t e t h a t s u c h c h a n g e s a r e f r e q u e n t i n t h e s e t u m o u r s o r a t l e a s t i n t h o s e t h a t r e q u i r e s u r g i c a l r e m o v a l . A l t e r n a t i v e l y , c h r o m o s o m a l a b n o r m a l i t i e s m a y n o t h a v e b e e n p r e s e n t i n t h e t u m o u r s b u t m a y h a v e a r i s e n i n c u l t u r e . T h e l o w p e r c e n t a g e o f o b s e r v e d N F 1 L O H i n b e n i g n n e u r o f i b r o m a s i s o f t e n a t t r i b u t e d t o t e c h n i c a l l i m i t a t i o n s o f t h e a s s a y s , s u c h a s t h e i r i n a b i l i t y t o i d e n t i f y p o i n t m u t a t i o n s o r e p i g e n e t i c m e c h a n i s m s ( e . g . p r o m o t e r m e t h y l a t i o n ) t h a t m a y i n a c t i v a t e t h e n o r m a l N F 1 a l l e l e . T o d a t e , t h e r e i s n o e v i d e n c e t h a t m e t h y l a t i o n p l a y s a r o l e i n i n a c t i v a t i n g t h e r e m a i n i n g n o r m a l N F 1 a l l e l e ( 5 7 , 6 7 , 6 8 ) . M o r e o v e r , i t i s t h o u g h t t h a t L O H a n d , h e n c e , c l o n a l i t y i n S c h w a n n c e l l s o f t e n r e m a i n u n d e t e c t e d b e c a u s e o f t h e a b u n d a n c e o f n o n -n e o p l a s t i c s t r o m a l c e l l s p r e s e n t i n t h e s e h e t e r o g e n e o u s t u m o u r s . A t h i r d p o s s i b i l i t y t h a t i s r a r e l y c o n s i d e r e d i s t h a t L O H i s n o t o b s e r v e d b e c a u s e s o m e n e u r o f i b r o m a s d o n o t d e v e l o p a s a r e s u l t o f " t w o h i t s " b u t r a t h e r a s n o n - n e o p l a s t i c p r o l i f e r a t i o n s o f t h e i n v o l v e d t i s s u e . E v i d e n c e o f L O H o r s e c o n d s o m a t i c m u t a t i o n s d o e s n o t p r e c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t m u t a n t n e u r o f i b r o m i n p r o t e i n e x p r e s s e d f r o m t h e N F 1 g e n e c o u l d h a v e r e s i d u a l f u n c t i o n . T h e r e a r e s e v e r a l e x a m p l e s o f e x p r e s s i o n o f N F 1 t r a n s c r i p t s t h a t a r e n o t f u l l -l e n g t h n e u r o f i b r o m i n b u t a p p e a r t o b e s t a b l e . T h e N - i s o f o r m o f n e u r o f i b r o m i n l a c k s t h e G A P - r e l a t e d d o m a i n a n d i s e x p r e s s e d i n n o r m a l b r a i n a n d b r a i n t u m o u r s , b u t i t i s n o t k n o w n w h a t f u n c t i o n o r r o l e t h i s i s o f o r m h a s ( 6 9 ) . N F 1 m R N A i s s u b j e c t t o m R N A e d i t i n g , a n d o n e s u c h e d i t p r o d u c e s a s t o p c o d o n i n t h e 5 ' p o r t i o n o f t h e N F 1 G A P -r e l a t e d d o m a i n , w h i c h c a n r e s u l t i n a n i n c o m p l e t e t r a n s c r i p t ( 7 0 ) . M o r e o v e r , a n N F 1 p a t i e n t h a s b e e n r e p o r t e d w h o h a d a n o n s e n s e m u t a t i o n t h a t w a s e x p r e s s e d a t t h e s a m e l e v e l a s t h e n o r m a l N F 1 a l l e l e , s u g g e s t i n g t h a t t h e m u t a t e d t r a n s c r i p t w a s s t a b l e 1 7 ( 7 0 ) . T h e f u n c t i o n o f t h e t r a n s c r i p t i s n o t k n o w n , b u t i f i t i s n o t d e g r a d e d b y n o n - s e n s e m e d i a t e d d e c a y i t m a y f u n c t i o n t o s o m e e x t e n t ( 7 0 ) . Mast Cells within Neurofibromas L o c a l t r a u m a m a y p l a y a r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f s o m e t y p e s o f n e u r o f i b r o m a s ( 7 1 ) , e s p e c i a l l y c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s , a s t h e s k i n i s p r o n e t o b u m p s a n d b r u i s i n g . L o c a l t r a u m a r e s u l t s i n a n i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e , a p r o c e s s t h a t i n v o l v e s m a s t c e l l s . S e v e r a l s t u d i e s h a v e n o t e d t h e p r e s e n c e o f m a s t c e l l s w i t h i n n e u r o f i b r o m a s ( 7 2 , 7 3 ) , b u t i t i s n o t c l e a r w h a t t y p e o f n e u r o f i b r o m a s w e r e a n a l y s e d o r h o w m a n y o f t h e m w e r e f r o m i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 . M a s t c e l l s h a v e l o n g b e e n t h o u g h t t o p l a y a r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f n e u r o f i b r o m a s , a s n e u r o f i b r o m a s o f t e n i t c h o r b u r n a s t h e y d e v e l o p , a n d i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 h a v e d e s c r i b e d i n s t a n c e s i n w h i c h f o r c e f u l t r a u m a t o t h e s k i n w a s f o l l o w e d b y i n t e n s e i t c h i n g a n d t h e s u b s e q u e n t d e v e l o p m e n t o f a n e u r o f i b r o m a ( 7 1 ) . I n a d d i t i o n , t h e c o n d i t i o n a l N f 1 k n o c k - o u t m o u s e m o d e l h a s s h o w n t h e i m p o r t a n c e o f t h e m a s t c e l l s i n t h e n e u r o f i b r o m a m i c r o e n v i r o n m e n t . M a s t c e l l i n f i l t r a t i o n i n t h e t h i c k e n e d n e r v e s a n d n e u r o f i b r o m a s o f t h e d o r s a l r o o t i s m o r e s u b s t a n t i a l w h e n t h e N f 1 n u l l S c h w a n n c e l l s p r o l i f e r a t e i n a n N f 1 h e t e r o z y g o u s b a c k g r o u n d t h a n i n t h e w i l d t y p e b a c k g r o u n d ( 4 6 ) , a n d c u t a n e o u s m a s t c e l l s o u t s i d e o f t h e t u m o u r s a r e a l s o m o d e r a t e l y i n c r e a s e d a n d d e m o n s t r a t e e n h a n c e d g r o w t h in vitro i n Nf1 h e t e r o z y g o u s m i c e c o m p a r e d t o w i l d t y p e m i c e ( 7 4 ) . M a s t c e l l s s y n t h e s i z e a n d s t o r e s e v e r a l f a c t o r s t h a t a r e i n v o l v e d i n a n g i o g e n e s i s a n d c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n . W h e n s t i m u l a t e d t o d e g r a n u l a t e , m a s t c e l l s c a n s e c r e t e a l l o f t h e s e p r o d u c t s o r a s e l e c t i o n o f t h e m . M a s t c e l l s s y n t h e s i z e a n d e x p r e s s c - K i t , a t y r o s i n e k i n a s e r e c e p t o r t h a t i s t h e p r o d u c t o f t h e c-Kit p r o t o - o n c o g e n e . T h e l i g a n d f o r c - K i t , w h i c h i s c a l l e d S C F o r K i t L , p r o m o t e s p r o l i f e r a t i o n , m i g r a t i o n a n d s u r v i v a l o f m a s t c e l l s . K i t L i s a l s o e x p r e s s e d f r o m n o r m a l S c h w a n n c e l l s a n d M P N S T c e l l l i n e s d e r i v e d f r o m i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 , w h i l e c - K i t i s n o t e x p r e s s e d i n S c h w a n n c e l l s f r o m n o r m a l i n d i v i d u a l s ( 7 5 ) . T h e e x p r e s s i o n o f K i t L b y S c h w a n n c e l l s c o u l d r e c r u i t m a s t c e l l s t o t h e a r e a , a n d , i f s t i m u l a t e d t o d e g r a n u l a t e b y l o c a l t r a u m a o r o t h e r m e a n s , c o u l d p r o m o t e t h e f o r m a t i o n o r s u b s e q u e n t g r o w t h o f n e u r o f i b r o m a s . T h e e x p r e s s i o n o f c - K i t b y a b n o r m a l S c h w a n n c e l l s r a i s e s t h e p o s s i b i l i t y o f a u t o c r i n e - s t i m u l a t e d g r o w t h o f S c h w a n n c e l l s . 1 8 I f t h e y a r e i n v o l v e d i n t h e p a t h o g e n e s i s o f n e u r o f i b r o m a s , i t i s n o t k n o w n w h e t h e r m a s t c e l l s a c t d u r i n g t u m o u r i n i t i a t i o n o r p r o g r e s s i o n o r i f t h e i r i n v o l v e m e n t d i f f e r s a m o n g d i f f e r e n t t y p e s o f n e u r o f i b r o m a s . Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumours P e o p l e w i t h N F 1 h a v e a n a v e r a g e d e c r e a s e i n l i f e e x p e c t a n c y o f 1 5 y e a r s ( 2 5 ) . M P N S T s a r e o n e o f t h e m o s t f r e q u e n t c a u s e s o f d e a t h a m o n g p e o p l e w i t h N F 1 ( 2 5 ) . M P N S T s h a v e a p o o r p r o g n o s i s b e c a u s e m e t a s t a s e s t o t h e l u n g , l i v e r , b r a i n , s o f t t i s s u e , b o n e , r e g i o n a l l y m p h n o d e s , s k i n o r r e t r o p e r i t o n e u m a r e c o m m o n ( 7 6 ) . T h e l i f e t i m e r i s k f o r a n M P N S T i s 8 t o 1 3 % i n N F 1 p a t i e n t s ( 7 7 ) . T h e r i s k i s e v e n h i g h e r ( 1 6 -2 5 % ) f o r i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 w h o s e p a t h o g e n i c m u t a t i o n i s a d e l e t i o n o f t h e w h o l e NF1 g e n e ( 7 8 ) . M P N S T s a r e t r u e n e o p l a s m s , r e s u l t i n g f r o m t h e c l o n a l e x p a n s i o n o f a c e l l p o p u l a t i o n t h a t h a s s u s t a i n e d m u t a t i o n s o f b o t h NF1 a l l e l e s a n d l i k e l y a d d i t i o n a l m u t a t i o n ( s ) a t o t h e r l o c i t o a l l o w f o r m a l i g n a n t p r o g r e s s i o n . S t u d i e s p e r f o r m e d o n b o t h f r e s h M P N S T s a m p l e s a n d c e l l l i n e s d e r i v e d f r o m M P N S T s h a v e d e m o n s t r a t e d c l o n a l i t y a n d l o s s o f N F 1 e x p r e s s i o n , a s w e l l a s a n i n c r e a s e i n r a s a c t i v i t y ( 7 9 - 8 1 ) . M o s t , i f n o t a l l , M P N S T s i n N F 1 p a t i e n t s a p p e a r t o d e v e l o p f r o m p r e - e x i s t i n g p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s ( 8 2 , 8 3 ) . I n c o n t r a s t , c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s r a r e l y , i f e v e r , p r o g r e s s t o m a l i g n a n c y . G i v e n t h e f a c t t h a t m a n y N F 1 p a t i e n t s d e v e l o p h u n d r e d s o r t h o u s a n d s o f t i m e s m o r e c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s t h a n p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s , t h i s d i f f e r e n c e i n m a l i g n a n t p o t e n t i a l i s s t r i k i n g . T h e n u m b e r , s i z e , a n d t y p e o f b e n i g n n e u r o f i b r o m a s v a r y g r e a t l y a m o n g N F 1 p a t i e n t s , b u t i t i s n o t k n o w n i f a n i n d i v i d u a l ' s r i s k f o r d e v e l o p i n g a n M P N S T b e a r s a n y r e l a t i o n s h i p t o t h e b u r d e n o f b e n i g n n e u r o f i b r o m a s o r i f h a v i n g o n e p a r t i c u l a r t y p e o f n e u r o f i b r o m a i n c r e a s e s t h i s r i s k . Research Objectives 1 . D e t e r m i n e i f a n i n d i v i d u a l ' s r i s k f o r a n M P N S T i s d e p e n d e n t o n t u m o u r b u r d e n o r b u r d e n o f o n e p a r t i c u l a r t u m o u r t y p e . . 2 . D e t e r m i n e t h e p r o p o r t i o n o f S c h w a n n c e l l s a n d m a s t c e l l s i n h i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d d i f f u s e a n d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s . 1 9 3 . Determine the presence or absence of the neurofibromin protein in Schwann cells and non-Schwann cells within histologically-defined diffuse and nodular neurofibromas. 4. Determine if Schwann cells expressing or not expressing neurofibromin and non-Schwann cells expressing neurofibromin are clonal in histologically-defined diffuse and nodular neurofibromas. Hypotheses: Risk of developing MPNSTs As the number of neurofibromas that an individual has increases, the probability that one of them may become malignant may also increase. Since subcutaneous, nodular and diffuse plexiform neurofibromas can progress to malignancy, I hypothesize that individuals who have these types of neurofibromas have a higher risk of developing MPNSTs compared to individuals without these types of neurofibromas. Mast cell distribution in neurofibromas Individuals with NF1 complain of intense "itchiness" in areas before cutaneous neurofibromas develop and the improper tissue formation and invasiveness of diffuse plexiform neurofibromas are likely to trigger mast cell infiltration. Therefore, I hypothesize that histologically-defined diffuse neurofibromas will have a high proportion of mast cells present. The observation that mice null for Nf1 exhibit enlarged peripheral nerves and nodular plexiform neurofibromas with a higher density of mast cells on an Nf1 heterozygous background compared to a wild type background suggests that mast cells are involved in this type of neurofibroma development. Therefore, I hypothesize that the number of mast cells will be high in nodular neurofibromas because they will be drawn into the tumour by the NFTA Schwann cells. Histologically-defined diffuse neurofibromas I hypothesize that histologically-defined diffuse neurofibromas develop as a result of excessive proliferation of haploinsufficient NF1 progenitor cells (Figure 1.6). Therefore, neurofibromin expression should be observed in all cell types, including Schwann cells, in these tumours, and all cells should exhibit a polyclonal phenotype. The hypothesis that histologically-defined diffuse neurofibromas develop from non-neoplastic cellular proliferation is supported by knockout mouse studies in which Nf1+/~Schwann cells 20 s h o w i n c r e a s e d i n v a s i v e n e s s a n d a n g i o g e n e s i s c o m p a r e d t o S c h w a n n c e l l s f r o m w i l d t y p e l i t t e r - m a t e s ( 8 4 ) a n d s k i n f i b r o b l a s t s p r o l i f e r a t e b e y o n d t h e n o r m a l t i m e o f m a t u r a t i o n i n w o u n d h e a l i n g ( 8 5 ) . H i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s i n c l u d e b o t h c l i n i c a l l y - d e f i n e d c u t a n e o u s a n d m o s t d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . T h e a n e c d o t a l e v i d e n c e c i t e d a b o v e t h a t l o c a l t r a u m a m a y b e a f a c t o r i n t h e d e v e l o p m e n t o f c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s i s c o n s i s t e n t w i t h t h e i r b e i n g p r o l i f e r a t i v e r a t h e r t h a n n e o p l a s t i c l e s i o n s . I n a d d i t i o n , f i b r o b l a s t s o b t a i n e d f r o m s c a r s o f n o r m a l . h u m a n s d i s p l a y a n i n c r e a s e i n n e u r o f i b r o m i n s i g n a l i n t e n s i t y b y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , s u g g e s t i n g t h a t i n c r e a s e d n e u r o f i b r o m i n a c t i v i t y m a y p l a y a r o l e i n t h e n o r m a l r e s p o n s e o f f i b r o b l a s t s t o t i s s u e i n j u r y ( 8 6 ) a n d t h a t t h i s r e s p o n s e m a y b e a b n o r m a l i n p e o p l e w i t h N F 1 . C l i n i c a l l y - d e f i n e d d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a l m o s t a l w a y s d e v e l o p e a r l y i n l i f e . A t l e a s t s o m e d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a r e p r e s e n t b e f o r e t h e 1 6 t h w e e k o f g e s t a t i o n b e c a u s e t h e h a i r a n d p i g m e n t a t i o n p a t t e r n s i n s k i n o v e r l y i n g t h e t u m o u r s i s a l t e r e d i n a m a n n e r t h a t c a n n o t o c c u r l a t e r i n f e t a l d e v e l o p m e n t ( 8 7 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t h a p l o i n s u f f i c i e n c y f o r N F 1 c o u l d d i s r u p t t h e c h e c k s a n d b a l a n c e s t h a t n o r m a l l y r e g u l a t e t h e g r o w t h o f f e t a l t i s s u e s . N o r m a l f e t a l d e v e l o p m e n t e n t a i l s s e q u e n t i a l e v e n t s d e p e n d e n t o n t h e p r o p e r r e g u l a t i o n o f c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n , m i g r a t i o n , d i f f e r e n t i a t i o n a n d d e a t h . I n m o s t c a s e s t h e s e p r o c e s s e s r e q u i r e c o o r d i n a t e d r e g u l a t i o n o f s e v e r a l f a c t o r s w i t h i n a n d b e t w e e n c e l l t y p e s . I f t h e l e v e l o f o n e o r m o r e o f t h e s e f a c t o r s i s n o t o p t i m a l , a p a r t i c u l a r p a t h w a y m a y b e d i s r u p t e d . 2 1 Figure 1.6 Haploinsufficient model of tumour development in histologically-defined diffuse neurofibromas in NF1. S c h w a n n c e l l s a r e r e p r e s e n t e d b y c i r c l e s a n d a l l o t h e r c e l l s a r e r e p r e s e n t e d b y s q u a r e s . T h e b l u e c o l o u r r e p r e s e n t s a l l e l e A a t t h e AR l o c u s a n d r e d r e p r e s e n t s a l l e l e B . A . A n o r m a l t i s s u e i n a n o n - N F 1 i n d i v i d u a l h a s t w o f u n c t i o n a l c o p i e s o f t h e NF1 g e n e ( + / + ) i n a l l c e l l s . W h e n t h e r e i s a s t i m u l u s t o p r o l i f e r a t e t h e c e l l s a r e k e p t i n c h e c k b y t h e t w o f u n c t i o n a l c o p i e s o f NF1. B . I n i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 , a l l c e l l s a r e h e t e r o z y g o u s f o r N F 1 ( + / - ) . W h e n t h e r e i s a s t i m u l u s t o p r o l i f e r a t e , a l l c e l l s w i l l e x p a n d i n n u m b e r b e c a u s e h a l f t h e a m o u n t o f n e u r o f i b r o m i n i s n o t s u f f i c i e n t t o k e e p t h e c e l l s i n c h e c k , r e s u l t i n g i n a t u m o u r f r o m t h i s a b n o r m a l p r o l i f e r a t i o n . T h e t u m o u r w i l l b e p o l y c l o n a l b e c a u s e t h e r e i s a m i x t u r e o f a l l e l e A a n d a l l e l e B a t t h e AR l o c u s i n t h e c e l l s t h a t p r o l i f e r a t e d . S t i m u l u s t o p r o l i f e r a t i o n A N o r m a l t i s s u e Tumour B N F 1 + / - t i s s u e J Non Schwann cell e.g. fibroblasts, mast cells, lymphocytes (~^) Schwann cell Allele A Allele B Histologically-defined nodular neurofibromas I h y p o t h e s i z e t h a t h i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s d e v e l o p b y a " s e c o n d h i t " m u t a t i o n o f t h e NF1 g e n e i n S c h w a n n c e l l s ( F i g u r e 1 . 7 ) . T h e r e f o r e , n e u r o f i b r o m i n e x p r e s s i o n s h o u l d n o t b e o b s e r v e d i n t h e m a j o r i t y o f S c h w a n n c e l l s b u t w i l l b e o b s e r v e d i n a l l o t h e r c e l l s i n t h i s t u m o u r . S o m e S c h w a n n c e l l s m a y d e m o n s t r a t e n e u r o f i b r o m i n e x p r e s s i o n i f t h e y a r e d r a w n i n t o t h e t u m o u r , a l o n g w i t h o t h e r c e l l t y p e s , b y t h e n e o p l a s t i c S c h w a n n c e l l s . S c h w a n n c e l l s t h a t d o n o t e x p r e s s n e u r o f i b r o m i n s h o u l d 22 e x h i b i t a c l o n a l p h e n o t y p e , w h i l e S c h w a n n c e l l s e x p r e s s i n g n e u r o f i b r o m i n a n d a l l o t h e r c e l l t y p e s s h o u l d e x h i b i t a p o l y c l o n a l p h e n o t y p e . Figure 1.7 "Second hit" model of development for histologically-defined nodular neurofibromas in NF1. S c h w a n n c e l l s a r e r e p r e s e n t e d b y c i r c l e s a n d a l l o t h e r c e l l s a r e r e p r e s e n t e d b y s q u a r e s . A l l e l e s A a n d B a r e r e p r e s e n t e d b y b l u e a n d r e d , r e s p e c t i v e l y . I n a n N F 1 i n d i v i d u a l , a l l c e l l s a r e h e t e r o z y g o u s f o r NF1 ( + / - ) . I n t h i s m o d e l t h e r e i s a m i x t u r e o f a l l e l e A a n d a l l e l e B i n S c h w a n n c e l l s a n d a l l o t h e r c e l l t y p e s . A s e c o n d s o m a t i c m u t a t i o n a t t h e NF1 l o c u s o c c u r s i n o n e S c h w a n n c e l l ( - / - ) t h a t p r o v i d e s a g r o w t h a d v a n t a g e t o t h a t c e l l , w h i c h a l l o w s i t t o e x p a n d c l o n a l l y t o f o r m a t u m o u r . A s a l l N F 1 ~ S c h w a n n c e l l s w e r e a l l d e r i v e d f r o m t h e o n e p r o g e n i t o r , t h e s e c e l l s w i l l d i s p l a y a c l o n a l p h e n o t y p e , w h i l e NF1+I~ S c h w a n n c e l l s a n d a l l o t h e r c e l l s w i l l b e p o l y c l o n a l b e c a u s e t h e r e w a s a m i x t u r e o f b o t h a l l e l e A a n d a l l e l e B i n t h e t i s s u e t o b e g i n w i t h . NF1 + /- C e l l s 2 n d " h i t " a t NF1 NF1-'- S c h w a n n c e l l s u n d e r g o P o l y c l o n a l l o c u s i n S c h w a n n c l o n a l p r o l i f e r a t i o n t o f o r m a c e l l s t u m o u r J Non Schwann cell e.g. fibroblasts, mast cells, lymphocytes ( ^ ) Schwann cell Allele A Allele B Relevance T h e r e i s c u r r e n t l y n o w a y o f p r e d i c t i n g w h i c h i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 w i l l d e v e l o p n e u r o f i b r o m a s o r M P N S T s . M P N S T s a r e o n e o f t h e l e a d i n g c a u s e s o f d e a t h a m o n g p e o p l e w i t h N F 1 , a n d t h i s i s o f t e n b e c a u s e t h e M P N S T h a s a l r e a d y m e t a s t a s i z e d w i d e l y b y t h e t i m e i t i s d e t e c t e d . I t w o u l d b e h e l p f u l t o b e a b l e t o p r e d i c t w h i c h i n d i v i d u a l s a r e a t h i g h r i s k f o r d e v e l o p i n g M P N S T i n o r d e r t o m o n i t o r t h e m c l o s e l y f o r e a r l y s i g n s o f m a l i g n a n c y , a s t r a t e g y t h a t m a y i m p r o v e t h e c h a n c e s o f s u r v i v a l . S i n c e m o s t M P N S T s d e v e l o p f r o m p r e - e x i s t i n g n e u r o f i b r o m a s , u n d e r s t a n d i n g h o w d i f f e r e n t t y p e s o f n e u r o f i b r o m a s d e v e l o p c o u l d h e l p t r e a t t h e m a n d p r e v e n t s o m e f r o m p r o g r e s s i n g t o m a l i g n a n c y . T h e NF1 g e n e i s k n o w n t o h a v e a h i g h m u t a t i o n r a t e . L O H 2 3 a n d s u b t l e " s e c o n d h i t " m u t a t i o n s h a v e b e e n o b s e r v e d i n t h e N F 1 g e n e , b u t t h i s a l o n e d o e s n o t p r o v e t h a t a n e u r o f i b r o m i n - l i k e p r o t e i n i s n o t e x p r e s s e d . L o o k i n g a t n e u r o f i b r o m i n e x p r e s s i o n r a t h e r t h a n L O H w i l l p r o v i d e i n f o r m a t i o n o n t h e p r o p o r t i o n o f S c h w a n n c e l l s t h a t e x p r e s s n e u r o f i b r o m i n , a n d a s s e s s i n g c l o n a l i t y w i l l s h o w h o w t h e c e l l s p r o l i f e r a t e d t o f o r m t h e t u m o u r . T h i s i n f o r m a t i o n c o u l d h e l p i n t h e d e v e l o p m e n t o f t r e a t m e n t s , s i n c e t r e a t i n g a t u m o u r t h a t h a s S c h w a n n c e l l s t h a t d o n o t e x p r e s s n e u r o f i b r o m i n m a y i n v o l v e d i f f e r e n t a p p r o a c h e s t h a n i f t h e S c h w a n n c e l l s a r e h a p l o i n s u f f i c i e n t , r e t a i n i n g s o m e n e u r o f i b r o m i n e x p r e s s i o n . M o s t s t u d i e s t r e a t a l l n e u r o f i b r o m a s a s a s i n g l e g r o u p , f a i l i n g t o t a k e i n t o c o n s i d e r a t i o n h i s t o l o g i c a l a n d c l i n i c a l d i f f e r e n c e s t h a t m a y b e i n d i c a t i v e o f d i f f e r e n t p a t h o g e n i c m e c h a n i s m s . T h e i n c o n s i s t e n c y i n L O H a n d c l o n a l i t y r e s u l t s t h a t h a v e p r e v i o u s l y b e e n r e p o r t e d i n N F 1 m i g h t b e e x p l a i n e d b y p o o l i n g t h e r e s u l t s o f t u m o u r s w i t h d i f f e r e n t p a t h o g e n e s i s . C o n s i d e r a t i o n o f d i f f e r e n c e s i n h i s t o l o g i c a l a p p e a r a n c e , c l i n i c a l f e a t u r e s a n d n a t u r a l h i s t o r y m a y h e l p t o i l l u m i n a t e a n a n a l y s i s o f t h e m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n n e u r o f i b r o m a d e v e l o p m e n t . 24 References 1 . R a s m u s s e n S A , F r i e d m a n J M . N F 1 g e n e a n d n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 . A J E p i d e m i o l 2 0 0 0 ; 1 5 1 : 3 3 - 4 0 . 2 . C r u m p T . T r a n s l a t i o n o f c a s e r e p o r t s i n U e b e r d i e m u l t i p l e n F i b r o m e d e r H a u t u n d i h r e B e z i e h u n g z u d e n m u l t i p l e n N e u r o m e n b y F . v . R e c k l i n g h a u s e n . A d v N e u r o l 1 9 8 1 ; 2 9 : 2 5 9 - 7 5 . 3 . N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h C o n s e n s u s D e v e l o p m e n t C o n f e r e n c e S t a t e m e n t : n e u r o f i b r o m a t o s i s . B e t h e s d a , M d . , U S A , J u l y 1 3 - 1 5 , 1 9 8 7 . N e u r o f i b r o m a t o s i s 1 9 8 8 ; 1 : 1 7 2 - 8 . 4 . V i s k o c h i l D , B u c h b e r g A M , X u G , e f a l . D e l e t i o n s a n d a t r a n s l o c a t i o n i n t e r r u p t a c l o n e d g e n e a t t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 l o c u s . C e l l 1 9 9 0 ; 6 2 : 1 8 7 - 9 2 . 5 . W a l l a c e M R , M a r c h u k D A , A n d e r s e n L B , e t a l . T y p e 1 n e u r o f i b r o m a t o s i s g e n e : i d e n t i f i c a t i o n o f a l a r g e t r a n s c r i p t d i s r u p t e d i n t h r e e N F 1 p a t i e n t s . S c i e n c e 1 9 9 0 ; 2 4 9 : 1 8 1 - 6 . 6 . H u s o n S M , H a r p e r P S , C o m p s t o n D A . V o n R e c k l i n g h a u s e n n e u r o f i b r o m a t o s i s . A c l i n i c a l a n d p o p u l a t i o n s t u d y i n s o u t h - e a s t W a l e s . B r a i n 1 9 8 8 ; 1 1 1 : 1 3 5 5 - 8 1 . 7 . C a w t h o n R M , W e i s s R , X u G F , e t a l . A m a j o r s e g m e n t o f t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 g e n e : c D N A s e q u e n c e , g e n o m i c s t r u c t u r e , a n d p o i n t m u t a t i o n s . C e l l 1 9 9 0 ; 6 2 : 1 9 3 - 2 0 1 . 8 . M i k o l D D , G u l c h e r J R , S t e f a n s s o n K . T h e o l i g o d e n d r o c y t e - m y e l i n g l y c o p r o t e i n b e l o n g s t o a d i s t i n c t f a m i l y o f p r o t e i n s a n d c o n t a i n s t h e H N K - 1 c a r b o h y d r a t e . J C e l l B i o l 1 9 9 0 ; 1 1 0 : 4 7 1 - 9 . 9 . R e g n i e r V , M e d d e b M , L e c o i n t r e G , e f a l . E m e r g e n c e a n d s c a t t e r i n g o f m u l t i p l e n e u r o f i b r o m a t o s i s ( N F I ) - r e l a t e d s e q u e n c e s d u r i n g h o m i n o i d e v o l u t i o n s u g g e s t a p r o c e s s o f p e r i c e n t r o m e r i c i n t e r c h r o m o s o m a l t r a n s p o s i t i o n . H u m M o l G e n e t 1 9 9 7 ; 6 : 9 - 1 6 . 1 0 . Y u H , Z h a o X , S u B , e t a l . E x p r e s s i o n o f N F 1 p s e u d o g e n e s . H u m M u t a t 2 0 0 5 ; 2 6 : 4 8 7 - 8 . 1 1 . D e C l u e J E , C o h e n B D , L o w y D R . I d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 p r o t e i n p r o d u c t . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 9 9 1 ; 8 8 : 9 9 1 4 - 8 . 1 2 . H u s o n S M . N e u r o f i b r o m a t o s i s 1 : a c l i n i c a l a n d g e n e t i c o v e r v i e w . I n : H u s o n S M , H u g h e s R A C , e d i t o r s . T h e n e u r o f i b r o m a t o s e s : a p a t h o g e n e t i c a n d c l i n i c a l o v e r v i e w . 1 s t e d . L o n d o n : C h a p m a n a n d H a l l M e d i c a l ; 1 9 9 4 . p . 1 6 0 - 2 0 3 . 1 3 . S t e r n b e r g P W , A l b e r o l a - l l a J . C o n s p i r a c y t h e o r y : R A S a n d R A F d o n o t a c t a l o n e . C e l l 1 9 9 8 ; 9 5 : 4 4 7 - 5 0 . 1 4 . K h w a j a A , R o d r i g u e z - V i c i a n a P , W e n n s t r o m S , W a r n e P H , D o w n w a r d J . M a t r i x a d h e s i o n a n d R a s t r a n s f o r m a t i o n b o t h a c t i v a t e a p h o s p h o i n o s i t i d e 3 - O H k i n a s e a n d p r o t e i n k i n a s e B / A k t c e l l u l a r s u r v i v a l p a t h w a y . E m b o J 1 9 9 7 ; 1 6 : 2 7 8 3 - 9 3 . 1 5 . M a r c h u k D A , S a u l i n o A M , T a v a k k o l R , e t a l . c D N A c l o n i n g o f t h e t y p e 1 n e u r o f i b r o m a t o s i s g e n e : c o m p l e t e s e q u e n c e o f t h e N F 1 g e n e p r o d u c t . G e n o m i c s 1 9 9 1 ; 1 1 : 9 3 1 - 4 0 . 2 5 1 6 . A n d e r s e n L B , B a l l e s t e r R , M a r c h u k D A , e r a / . A c o n s e r v e d a l t e r n a t i v e s p l i c e i n t h e v o n R e c k l i n g h a u s e n n e u r o f i b r o m a t o s i s ( N F 1 ) g e n e p r o d u c e s t w o n e u r o f i b r o m i n i s o f o r m s , b o t h o f w h i c h h a v e G T P a s e - a c t i v a t i n g p r o t e i n a c t i v i t y . M o l C e l l B i o l 1 9 9 3 ; 1 3 : 4 8 7 - 9 5 . 1 7 . V i s k o c h i l D . T h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f t h e N F 1 g e n e : M o l e c u l a r p a t h o p h y s i o l o g y . I n : M . M . G u t m a h n D H , R i c c a r d i V M , e d i t o r s . N e u r o f i b r o m a t o s i s : p h e n o t y p e , n a t u r a l h i s t o r y , a n d p a t h o g e n e s i s . 3 r d e d . B a l t i m o r e : J o h n H o p k i n s U n i v e r s i t y P r e s s ; 1 9 9 9 . p . 1 1 9 - 4 1 . 1 8 . G u t m a n D H , A n d e r s e n L B , C o l e J L , S w a r o o p M , C o l l i n s F S . A n a l t e r n a t i v e l y -s p l i c e d m R N A i n t h e c a r b o x y t e r m i n u s o f t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 ( N F 1 ) g e n e i s e x p r e s s e d i n m u s c l e . H u m M o l G e n e t 1 9 9 3 ; 2 : 9 8 9 - 9 2 . 1 9 . D a n g l o t G , R e g n i e r V , F a u v e t D , etal. N e u r o f i b r o m a t o s i s 1 ( N F 1 ) m R N A s e x p r e s s e d i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m a r e d i f f e r e n t i a l l y s p l i c e d i n t h e 5 ' p a r t o f t h e g e n e . H u m M o l G e n e t 1 9 9 5 ; 4 : 9 1 5 - 2 0 . 2 0 . G u o H F , T h e I , H a n n a n F , B e r n a r d s A , Z h o n g Y . R e q u i r e m e n t o f D r o s o p h i l a N F 1 f o r a c t i v a t i o n o f a d e n y l y l c y c l a s e b y P A C A P 3 8 - l i k e n e u r o p e p t i d e s . S c i e n c e 1 9 9 7 ; 2 7 6 : 7 9 5 - 8 . 2 1 . T h e I , H a n n i g a n G E , C o w l e y G S , etal. R e s c u e o f a D r o s o p h i l a N F 1 m u t a n t p h e n o t y p e b y p r o t e i n k i n a s e A . S c i e n c e 1 9 9 7 ; 2 7 6 : 7 9 1 - 4 . 2 2 . F e n g L , Y u n o u e S , T o k u o H , e t a / . . P K A p h o s p h o r y l a t i o n a n d 1 4 - 3 - 3 i n t e r a c t i o n r e g u l a t e t h e f u n c t i o n o f n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e I t u m o r s u p p r e s s o r , n e u r o f i b r o m i n . F E B S L e t t 2 0 0 4 ; 5 5 7 : 2 7 5 - 8 2 . 2 3 . F r i e d m a n J M , R i c c a r d i V M . C l i n i c a l a n d e p i d e m i o l o g i c a l f e a t u r e s . I n : G u t m a n n D H , M a c C o l l i n M , R i c c a r d i V M , e d i t o r s . N e u r o f i b r o m a t o s i s : p h e n o t y p e , n a t u r a l h i s t o r y , a n d p a t h o g e n e s i s . 3 r d e d . B a l t i m o r e : J o h n H o p k i n s U n i v e r s i t y P r e s s ; 1 9 9 9 . p . 2 6 - 8 6 . 2 4 . R i c c a r d i V M . A n O v e r v i e w o f N F - 1 : D y s p l a s i a a n d N e o p l a s i a . I n : R i c c a r d i V M , e d i t o r s . N e u r o f i b r o m a t o s i s : P h e n o t y p e , N a t u r a l H i s t o r y a n d P a t h o g e n e s i s . 2 n d e d . B a l t i m o r e : T h e J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y P r e s s ; 1 9 9 2 . p . 1 8 - 3 9 . 2 5 . R a s m u s s e n S A , Y a n g Q , F r i e d m a n J M . M o r t a l i t y i n n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 : a n a n a l y s i s u s i n g U . S . d e a t h c e r t i f i c a t e s . A m J o f H u m G e n e t 2 0 0 1 ; 6 8 : 1 1 1 0 - 8 . 2 6 . K n u d s o n A G , J r . M u t a t i o n a n d c a n c e r : s t a t i s t i c a l s t u d y o f r e t i n o b l a s t o m a . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 9 7 1 ; 6 8 : 8 2 0 - 3 . 2 7 . C a v e n e e W K , D r y j a T P , P h i l l i p s R A , etal. E x p r e s s i o n o f r e c e s s i v e a l l e l e s b y c h r o m o s o m a l m e c h a n i s m s i n r e t i n o b l a s t o m a . N a t u r e 1 9 8 3 ; 3 0 5 : 7 7 9 - 8 4 . 2 8 . K n u d s o n A G . C h a s i n g t h e c a n c e r d e m o n . A n n u R e v G e n e t 2 0 0 0 ; 3 4 : 1 - 1 9 . 2 9 . D e v i l e e P , C l e t o n - J a n s e n A M , C o r n e l i s s e C J . E v e r s i n c e K n u d s o n . T r e n d s G e n e t 2 0 0 1 ; 1 7 : 5 6 9 - 7 3 . 3 0 . H a b e r D , H a r l o w E . T u m o u r - s u p p r e s s o r g e n e s : e v o l v i n g d e f i n i t i o n s i n t h e g e n o m i c a g e . N a t G e n e t 1 9 9 7 ; 1 6 : 3 2 0 - 2 . 3 1 . X u W , M u l l i g a n L M , P o n d e r M A , e t a l . L o s s o f N F 1 a l l e l e s i n p h a e o c h r o m o c y t o m a s f r o m p a t i e n t s w i t h t y p e I n e u r o f i b r o m a t o s i s . G e n e s C h r o m o s o m e s C a n c e r 1 9 9 2 ; 4 : 3 3 7 - 4 2 . 2 6 3 2 . S i d e L , T a y l o r B , C a y o u e t t e M , e t a l . H o m o z y g o u s i n a c t i v a t i o n o f t h e N F 1 g e n e i n b o n e m a r r o w c e l l s f r o m c h i l d r e n w i t h n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 a n d m a l i g n a n t m y e l o i d d i s o r d e r s . N E n g l J M e d 1 9 9 7 ; 3 3 6 : 1 7 1 3 - 2 0 . 3 3 . L e g i u s E , M a r c h u k D A , C o l l i n s F S , G l o v e r T W . S o m a t i c d e l e t i o n o f t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 g e n e i n a n e u r o f i b r o s a r c o m a s u p p o r t s a t u m o u r s u p p r e s s o r g e n e h y p o t h e s i s . N a t G e n e t 1 9 9 3 ; 3 : 1 2 2 - 6 . 3 4 . M e n o n A G , A n d e r s o n K M , R i c c a r d i V M , e t a l . C h r o m o s o m e 1 7 p d e l e t i o n s a n d p 5 3 g e n e m u t a t i o n s a s s o c i a t e d w i t h t h e f o r m a t i o n o f m a l i g n a n t n e u r o f i b r o s a r c o m a s i n v o n R e c k l i n g h a u s e n n e u r o f i b r o m a t o s i s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 9 9 0 ; 8 7 : 5 4 3 5 - 9 . 3 5 . V o g e l s t e i n B , K i n z l e r K W . T h e m u l t i s t e p n a t u r e o f c a n c e r . T r e n d s G e n e t 1 9 9 3 ; 9 : 1 3 8 - 4 1 . 3 6 . H e r m a n J G , L a t i f F , W e n g Y , e t a l . S i l e n c i n g o f t h e V H L t u m o r - s u p p r e s s o r g e n e b y D N A m e t h y l a t i o n i n r e n a l c a r c i n o m a . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 1 9 9 4 ; 9 1 : 9 7 0 0 -4 . 3 7 . G r a d y W M , W i l l i s J , G u i l f o r d P J , e f a l . M e t h y l a t i o n o f t h e C D H 1 p r o m o t e r a s t h e s e c o n d g e n e t i c h i t i n h e r e d i t a r y d i f f u s e g a s t r i c c a n c e r . N a t G e n e t 2 0 0 0 ; 2 6 : 1 6 - 7 . 3 8 . H u X , P a n g T , A s p l u n d A , P o n t e n J , N i s t e r M . C l o n a l i t y a n a l y s i s o f s y n c h r o n o u s l e s i o n s o f c e r v i c a l c a r c i n o m a b a s e d o n X c h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o n p o l y m o r p h i s m , h u m a n p a p i l l o m a v i r u s t y p e 1 6 g e n o m e m u t a t i o n s , a n d l o s s o f h e t e r o z y g o s i t y . J E x p M e d 2 0 0 2 ; 1 9 5 : 8 4 5 - 5 4 . 3 9 . D u M Q , L i u H , D i s s T C , e t a l . K a p o s i s a r c o m a - a s s o c i a t e d h e r p e s v i r u s i n f e c t s m o n o t y p i c ( I g M l a m b d a ) b u t p o l y c l o n a l n a i v e B c e l l s i n C a s t l e m a n d i s e a s e a n d a s s o c i a t e d l y m p h o p r o l i f e r a t i v e d i s o r d e r s . B l o o d 2 0 0 1 ; 9 7 : 2 1 3 0 - 6 . 4 0 . H e n s k e E P , S c h e i t h a u e r B W , S h o r t M P , e f a l . A l l e l i c l o s s i s f r e q u e n t i n t u b e r o u s s c l e r o s i s k i d n e y l e s i o n s b u t r a r e i n b r a i n l e s i o n s . A m J H u m G e n e t 1 9 9 6 ; 5 9 : 4 0 0 -6 . 4 1 . A u K S , H e b e r t A A , R o a c h E S , N o r t h r u p H . C o m p l e t e i n a c t i v a t i o n o f t h e T S C 2 g e n e l e a d s t o f o r m a t i o n o f h a m a r t o m a s . A m J H u m G e n e t 1 9 9 9 ; 6 5 : 1 7 9 0 - 5 . 4 2 . N i i d a Y , S t e m m e r - R a c h a m i m o v A O , L o g r i p M , e f a l . S u r v e y o f s o m a t i c m u t a t i o n s i n t u b e r o u s s c l e r o s i s c o m p l e x ( T S C ) h a m a r t o m a s s u g g e s t s d i f f e r e n t g e n e t i c m e c h a n i s m s f o r p a t h o g e n e s i s o f T S C l e s i o n s . A m J H u m G e n e t 2 0 0 1 ; 6 9 : 4 9 3 -5 0 3 . 4 3 . L y o n M F . X - c h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o n a n d d e v e l o p m e n t a l p a t t e r n s i n m a m m a l s . B i o l R e v C a m b P h i l o s S o c 1 9 7 2 ; 4 7 : 1 - 3 5 . 4 4 . A l l e n R C , Z o g h b i H Y , M o s e l e y A B , R o s e n b l a t t H M , B e l m o n t J W . M e t h y l a t i o n o f H p a l l a n d H h a l s i t e s n e a r t h e p o l y m o r p h i c C A G r e p e a t i n t h e h u m a n a n d r o g e n -r e c e p t o r g e n e c o r r e l a t e s w i t h X c h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o n . A m J H u m G e n e t 1 9 9 2 ; 5 1 : 1 2 2 9 - 3 9 . 4 5 . B r a n n a n C I , P e r k i n s A S , V o g e l K S , e f a l . T a r g e t e d d i s r u p t i o n o f t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e - 1 g e n e l e a d s t o d e v e l o p m e n t a l a b n o r m a l i t i e s i n h e a r t a n d v a r i o u s n e u r a l c r e s t - d e r i v e d t i s s u e s . G e n e s D e v 1 9 9 4 ; 8 : 1 0 1 9 - 2 9 . 2 7 4 6 . Z h u Y , G h o s h P , C h a r n a y P , B u r n s D K , P a r a d a L F . N e u r o f i b r o m a s i n N F 1 : S c h w a n n c e l l o r i g i n a n d r o l e o f t u m o r e n v i r o n m e n t . S c i e n c e 2 0 0 2 ; 2 9 6 : 9 2 0 - 2 . 4 7 . K l u w e L , F r i e d r i c h R E , M a u t n e r V F . A l l e l i c l o s s o f t h e N F 1 g e n e i n N F 1 -a s s o c i a t e d p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . C a n c e r G e n e t C y t o g e n e t 1 9 9 9 ; 1 1 3 : 6 5 - 9 . 4 8 . R u t k o w s k i J L , W u K , G u t m a n n D H , B o y e r P J , L e g i u s E . G e n e t i c a n d c e l l u l a r d e f e c t s c o n t r i b u t i n g t o b e n i g n t u m o r f o r m a t i o n i n n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 . H u m M o l G e n e t 2 0 0 0 ; 9 : 1 0 5 9 - 6 6 . 4 9 . S h e r m a n L S , A t i t R , R o s e n b a u m T , C o x A D , R a t n e r N . S i n g l e c e l l R a s - G T P a n a l y s i s r e v e a l s a l t e r e d R a s a c t i v i t y i n a s u b p o p u l a t i o n o f n e u r o f i b r o m a S c h w a n n c e l l s b u t n o t f i b r o b l a s t s . J B i o l C h e m 2 0 0 0 ; 2 7 5 : 3 0 7 4 0 - 5 . 5 0 . S a w a d a S , F l o r e l l S , P u r a n d a r e S M , e t a l . I d e n t i f i c a t i o n o f N F 1 m u t a t i o n s i n b o t h a l l e l e s o f a d e r m a l n e u r o f i b r o m a . N a t G e n e t 1 9 9 6 ; 1 4 : 1 1 0 - 2 . 5 1 . S e r r a E , R o s e n b a u m T , W i n n e r U , e t a l . S c h w a n n c e l l s h a r b o r t h e s o m a t i c N F 1 m u t a t i o n i n n e u r o f i b r o m a s : e v i d e n c e o f t w o d i f f e r e n t S c h w a n n c e l l s u b p o p u l a t i o n s . H u m M o l G e n e t 2 0 0 0 ; 9 : 3 0 5 5 - 6 4 . 5 1 a . F i a l k o w P J , S a g e b i e l R W , G a r t l e r S M , R i m o i n D L . M u l t i p l e c e l l o r i g i n o f h e r e d i t a r y n e u r o f i b r o m a s . N E n g l J M e d 1 9 7 1 ; 2 8 4 : 2 9 8 - 3 0 0 . 5 2 . S k u s e G R , K o s c i o l e k B A , R o w l e y P T . T h e n e u r o f i b r o m a i n v o n R e c k l i n g h a u s e n n e u r o f i b r o m a t o s i s h a s a u n i c e l l u l a r o r i g i n . A m J H u m G e n e t 1 9 9 1 ; 4 9 : 6 0 0 - 7 . 5 3 . C o l m a n S D , W i l l i a m s C A , W a l l a c e M R . B e n i g n n e u r o f i b r o m a s i n t y p e 1 n e u r o f i b r o m a t o s i s ( N F 1 ) s h o w s o m a t i c d e l e t i o n s o f t h e N F 1 g e n e . N a t G e n e t 1 9 9 5 ; 1 1 : 9 0 - 2 . 5 4 . D a s c h n e r K , A s s u m G , E i s e n b a r t h I , e t a l . C l o n a l o r i g i n o f t u m o r c e l l s i n a p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a w i t h L O H i n N F 1 i n t r o n 3 8 a n d i n d e r m a l n e u r o f i b r o m a s w i t h o u t L O H o f t h e N F 1 g e n e . B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n 1 9 9 7 ; 2 3 4 : 3 4 6 - 5 0 . 5 5 . E i s e n b a r t h I , B e y e r K , K r o n e W , A s s u m G . T o w a r d a s u r v e y o f s o m a t i c m u t a t i o n o f t h e N F 1 g e n e i n b e n i g n n e u r o f i b r o m a s o f p a t i e n t s w i t h n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 . A m J H u m G e n e t 2 0 0 0 ; 6 6 : 3 9 3 - 4 0 1 . 5 6 . J o h n A M , R u g g i e r i M , F e r n e r R , U p a d h y a y a M . A s e a r c h f o r e v i d e n c e o f s o m a t i c m u t a t i o n s i n t h e N F 1 g e n e . J M e d G e n e t 2 0 0 0 ; 3 7 : 4 4 - 9 . 5 7 . L u i j t e n M , R e d e k e r S , v a n N o e s e l M M , e t a l . M i c r o s a t e l l i t e i n s t a b i l i t y a n d p r o m o t e r m e t h y l a t i o n a s p o s s i b l e c a u s e s o f N F 1 g e n e i n a c t i v a t i o n i n n e u r o f i b r o m a s . E u r J H u m G e n e t 2 0 0 0 ; 8 : 9 3 9 - 4 5 . 5 8 . W i e s t V , E i s e n b a r t h I , S c h m e g n e r C , K r o n e W , A s s u m G . S o m a t i c N F 1 m u t a t i o n s p e c t r a i n a f a m i l y w i t h n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 : t o w a r d a t h e o r y o f g e n e t i c m o d i f i e r s . H u m M u t a t 2 0 0 3 ; 2 2 : 4 2 3 - 7 . 5 9 . U p a d h y a y a M , H a n S , C o n s o l i C , etal. C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e s o m a t i c m u t a t i o n a l s p e c t r u m o f t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 ( N F 1 ) g e n e i n n e u r o f i b r o m a t o s i s p a t i e n t s w i t h b e n i g n a n d m a l i g n a n t t u m o r s . H u m M u t a t 2 0 0 4 ; 2 3 : 1 3 4 - 4 6 . 6 0 . D e L u c a A B L , C e c c a r i n i C , S i n i b a l d i L , N o v e l l i A , G i u s t i n i S , D a n i e l e I , C a l v i e r i S , M i n g a r e l l i R . F l u o r e s c e n c e i n s i t u h y b r i d i z a t i o n a n a l y s i s o f a l l e l i c l o s s e s 2 8 i n v o l v i n g t h e l o n g a r m o f c h r o m o s q m e 1 7 i n N F 1 - a s s o c i a t e d n e u r o f i b r o m a s . C a n c e r G e n e t C y t o g e n e t 2 0 0 4 ; 1 5 0 : 1 6 8 - 7 2 . 6 1 . D e R a e d t T , M a e r t e n s O , C h m a r a M , e t a l . S o m a t i c l o s s o f w i l d t y p e N F 1 a l l e l e i n n e u r o f i b r o m a s : C o m p a r i s o n o f N F 1 m i c r o d e l e t i o n a n d n o n - m i c r o d e l e t i o n p a t i e n t s . G e n e s C h r o m o s o m e s C a n c e r 2 0 0 6 ; 6 2 . K l u w e L , F r i e d r i c h R E , K o r f B , F a h s o l d R , M a u t n e r V F . N F 1 m u t a t i o n s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 p a t i e n t s w i t h p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . H u m M u t a t 2 0 0 2 ; 1 9 : 3 0 9 - 1 4 . 6 3 . S e r r a E , P u i g S , O t e r o D , e f a l . C o n f i r m a t i o n o f a d o u b l e - h i t m o d e l f o r t h e N F 1 g e n e i n b e n i g n n e u r o f i b r o m a s . A m J H u m G e n e t 1 9 9 7 ; 6 1 : 5 1 2 - 9 . 6 4 . S e r r a E , A r s E , R a v e l l a A , e f a l . S o m a t i c N F 1 m u t a t i o n a l s p e c t r u m i n b e n i g n n e u r o f i b r o m a s : m R N A s p l i c e d e f e c t s a r e c o m m o n a m o n g p o i n t m u t a t i o n s . H u m G e n e t 2 0 0 1 ; 1 0 8 : 4 1 6 - 2 9 . 6 5 . M a e r t e n s O , B r e m s H , V a n d e s o m p e l e J , etal. C o m p r e h e n s i v e N F 1 s c r e e n i n g o n c u l t u r e d S c h w a n n c e l l s f r o m n e u r o f i b r o m a s . H u m M u t a t 2 0 0 6 ; 2 7 : 1 0 3 0 - 4 0 . 6 6 . W a l l a c e M R , R a s m u s s e n S A , L i m I T , etal. C u l t u r e o f c y t o g e n e t i c a l l y a b n o r m a l Schwann c e l l s f r o m b e n i g n a n d m a l i g n a n t N F 1 t u m o r s . G e n e s C h r o m o s o m e s C a n c e r 2 0 0 0 ; 2 7 : 1 1 7 - 2 3 . 6 7 . H a r d e r A , R o s c h e M , R e u s s D E ; e t a l . M e t h y l a t i o n a n a l y s i s o f t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 ( N F 1 ) p r o m o t e r i n p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o u r s . E u r J C a n c e r 2 0 0 4 ; 4 0 : 2 8 2 0 - 8 . 6 8 . H o r a n M P , C o o p e r D N , U p a d h y a y a M . H y p e r m e t h y l a t i o n o f t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 ( N F 1 ) g e n e p r o m o t e r i s n o t a c o m m o n e v e n t i n t h e i n a c t i v a t i o n o f t h e N F 1 g e n e i n N F 1 - s p e c i f i c t u m o u r s . H u m G e n e t 2 0 0 0 ; 1 0 7 : 3 3 - 9 . 6 9 . T a k a h a s h i K , S u z u k i H , K a y a m a T , e t a l . M u l t i p l e t r a n s c r i p t s o f t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 g e n e i n h u m a n b r a i n a n d i n b r a i n t u m o u r s . C l i n S c i ( L o n d ) 1 9 9 4 ; 8 7 : 4 8 1 - 5 . 7 0 . S k u s e G R , C a p p i o n e A J . R N A p r o c e s s i n g a n d c l i n i c a l v a r i a b i l i t y i n n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e I ( N F 1 ) . H u m M o l G e n e t 1 9 9 7 ; 6 : 1 7 0 7 - 1 2 . 7 1 . R i c c a r d i V M . C u t a n e o u s m a n i f e s t a t i o n o f n e u r o f i b r o m a t o s i s : c e l l u l a r i n t e r a c t i o n , p i g m e n t a t i o n , a n d m a s t c e l l s . B i r t h D e f e c t s O r i g A r t i e S e r 1 9 8 1 ; 1 7 : 1 2 9 - 4 7 . 7 2 . I s a a c s o n P . M a s t c e l l s i n b e n i g n n e r v e s h e a t h t u m o u r s . J P a t h o l 1 9 7 6 ; 1 1 9 : 1 9 3 - 6 . 7 3 . J o h n s o n M D , K a m s o - P r a t t J , F e d e r s p i e l C F , W h e t s e l l W O , J r . M a s t c e l l a n d l y m p h o r e t i c u l a r i n f i l t r a t e s i n n e u r o f i b r o m a s . C o m p a r i s o n w i t h n e r v e s h e a t h t u m o r s . A r c h P a t h o l L a b M e d 1 9 8 9 ; 1 1 3 : 1 2 6 3 - 7 0 . 7 4 . Y a n g F C , I n g r a m D A , C h e n S , e f a l . N e u r o f i b r o m i n - d e f i c i e n t S c h w a n n c e l l s s e c r e t e a p o t e n t m i g r a t o r y s t i m u l u s f o r N f 1 + / - m a s t c e l l s . J C l i n I n v e s t 2 0 0 3 ; 1 1 2 : 1 8 5 1 - 6 1 . 7 5 . R y a n J J , K l e i n K A , N e u b e r g e r T J , e t a l . R o l e f o r t h e s t e m c e l l f a c t o r / K I T c o m p l e x i n S c h w a n n c e l l n e o p l a s i a a n d m a s t c e l l p r o l i f e r a t i o n a s s o c i a t e d w i t h n e u r o f i b r o m a t o s i s . J N e u r o s c i R e s 1 9 9 4 ; 3 7 : 4 1 5 - 3 2 . 2 9 7 6 . D u c a t m a n B S , S c h e i t h a u e r B W , P i e p g r a s D G , R e i m a n H M , l l s t r u p D M . M a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o r s . A c l i n i c o p a t h o l o g i c s t u d y o f 1 2 0 c a s e s . C a n c e r 1 9 8 6 ; 5 7 : 2 0 0 6 - 2 1 . 7 7 . E v a n s D G , B a s e r M E , M c G a u g h r a n J , e t a l . M a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o u r s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 . J M e d G e n e t 2 0 0 2 ; 3 9 : 3 1 1 - 4 . 7 8 . D e R a e d t T , B r e m s H , W o l k e n s t e i n P , e f a l . E l e v a t e d r i s k f o r M P N S T i n N F 1 m i c r o d e l e t i o n p a t i e n t s . A m J H u m G e n e t 2 0 0 3 ; 7 2 : 1 2 8 8 - 9 2 . 7 9 . B a s u T N , G u t m a n n D H , F l e t c h e r J A , e f a l . A b e r r a n t r e g u l a t i o n o f r a s p r o t e i n s i n m a l i g n a n t t u m o u r c e l l s f r o m t y p e 1 n e u r o f i b r o m a t o s i s p a t i e n t s . N a t u r e 1 9 9 2 ; 3 5 6 : 7 1 3 - 5 . 8 0 . D e C l u e J E P A , F l e t c h e r J A , D i e h l S R , R a t n e r N , V a s s W C , L o w y D R . A b n o r m a l r e g u l a t i o n o f m a m m a l i a n p 2 1 r a s c o n t r i b u t e s t o m a l i g n a n t t u m o r g r o w t h i n v o n R e c k l i n g h a u s e n ( t y p e 1 ) n e u r o f i b r o m a t o s i s . C e l l 1 9 9 2 ; 6 9 : 2 6 5 - 7 3 . 8 1 . G u h a A , L a u N , H u v a r I , e t a l . R a s - G T P l e v e l s a r e e l e v a t e d i n h u m a n N F 1 p e r i p h e r a l n e r v e t u m o r s . O n c o g e n e 1 9 9 6 ; 1 2 : 5 0 7 - 1 3 . 8 2 . K o r f B R . M a l i g n a n c y i n n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 . O n c o l o g i s t 2 0 0 0 ; 5 : 4 7 7 - 8 5 . 8 3 . W o o d r u f f J M . P a t h o l o g y o f t u m o r s o f t h e p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h i n t y p e 1 n e u r o f i b r o m a t o s i s . A m J M e d G e n e t 1 9 9 9 ; 8 9 : 2 3 - 3 0 . 8 4 . K i m H A , L i n g B , R a t n e r N . N f 1 - d e f i c i e n t m o u s e S c h w a n n c e l l s a r e a n g i o g e n i c a n d i n v a s i v e a n d c a n b e i n d u c e d t o h y p e r p r o l i f e r a t e : r e v e r s i o n o f s o m e p h e n o t y p e s b y a n i n h i b i t o r o f f a r n e s y l p r o t e i n t r a n s f e r a s e . M o l C e l l B i o l 1 9 9 7 ; 1 7 : 8 6 2 - 7 2 . 8 5 . A t i t R P , C r o w e M J , G r e e n h a l g h D G , W e n s t r u p R J , R a t n e r N . T h e N f 1 t u m o r s u p p r e s s o r r e g u l a t e s m o u s e s k i n w o u n d h e a l i n g , f i b r o b l a s t p r o l i f e r a t i o n , a n d c o l l a g e n d e p o s i t e d b y f i b r o b l a s t s . J I n v e s t D e r m a t o l 1 9 9 9 ; 1 1 2 : 8 3 5 - 4 2 . 8 6 . Y l a - O u t i n e n H , A a l t o n e n V , B j o r k s t r a n d A S , e t a l . U p r e g u l a t i o n o f t u m o r s u p p r e s s o r p r o t e i n n e u r o f i b r o m i n i n n o r m a l h u m a n w o u n d h e a l i n g a n d i n v i t r o e v i d e n c e f o r p l a t e l e t d e r i v e d g r o w t h f a c t o r ( P D G F ) a n d t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r - b e t a l ( T G F - b e t a 1 ) e l i c i t e d i n c r e a s e i n n e u r o f i b r o m i n m R N A s t e a d y - s t a t e l e v e l s i n d e r m a l f i b r o b l a s t s . J I n v e s t D e r m a t o l 1 9 9 8 ; 1 1 0 : 2 3 2 - 7 . 8 7 . R i c c a r d i V M . H i s t o g e n e s i s c o n t r o l g e n e s a n d n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 . E u r J P e d i a t r 2 0 0 0 ; 1 5 9 : 4 7 5 - 6 . 3 0 2. ASSOCIATION B E T W E E N BENIGN A N D MALIGNANT PERIPHERAL N E R V E S H E A T H T U M O U R S IN NF1 1 INTRODUCTION N e u r o f i b r o m a t o s i s 1 ( N F 1 ) i s a n a u t o s o m a l d o m i n a n t d i s e a s e a f f e c t i n g 1 i n 3 0 0 0 t o 1 i n 4 0 0 0 p e o p l e . N F 1 i s c h a r a c t e r i z e d b y m u l t i p l e d e r m a l n e u r o f i b r o m a s , p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s , m a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o u r s ( M P N S T s ) , a n d o p t i c a n d o t h e r C N S g l i o m a s , a s w e l l a s b y c a f e - a u - l a i t s p o t s a n d a b n o r m a l i t i e s o f t h e s k e l e t a l , c a r d i o v a s c u l a r a n d c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m s . T h e N F 1 g e n e i s l o c a t e d o n c h r o m o s o m e 1 7 q 1 1 . 2 , a n d i t s p r o t e i n , n e u r o f i b r o m i n , f u n c t i o n s a s a t u m o u r s u p p r e s s o r . P e o p l e w i t h N F 1 h a v e a d e c r e a s e i n l i f e e x p e c t a n c y o f 1 5 y e a r s , w i t h M P N S T s a s a l e a d i n g c a u s e o f d e a t h i n y o u n g a d u l t s ( 1 , 2 ) . M P N S T s h a v e a p o o r p r o g n o s i s b e c a u s e m e t a s t a s e s t o t h e l u n g , l i v e r , b r a i n , s o f t t i s s u e , b o n e , r e g i o n a l l y m p h n o d e s , s k i n o r r e t r o p e r i t o n e u m a r e c o m m o n ( 3 ) . T h e f r e q u e n c y o f M P N S T s i n t h e g e n e r a l p o p u l a t i o n i s 0 . 0 0 1 % , c o m p a r e d t o 2 - 5 % i n p e o p l e w i t h N F 1 ( 4 ) . T h e l i f e t i m e r i s k f o r M P N S T i s 8 t o 1 3 % i n N F 1 p a t i e n t s ( 5 ) . M o s t s t u d i e s s h o w t h a t t h e p e a k i n c i d e n c e o f M P N S T s i s i n t h e 7 t h d e c a d e o f l i f e i n t h e g e n e r a l p o p u l a t i o n b u t i n t h e 3 r d o r 4 t h d e c a d e i n p e o p l e w i t h N F 1 ( 5 ) , a l t h o u g h t h e s e t u m o u r s m a y o c c u r a t a m u c h y o u n g e r a g e i n e i t h e r p o p u l a t i o n ( 3 ) . S o m e p a t i e n t s w i t h N F 1 a p p e a r a t g r e a t e r r i s k t h a n o t h e r s o f d e v e l o p i n g M P N S T s . F o r e x a m p l e , p e o p l e w i t h N F 1 w h o s e p a t h o g e n i c m u t a t i o n i s a d e l e t i o n o f t h e w h o l e N F 1 g e n e a r e t h o u g h t t o h a v e a l i f e t i m e r i s k o f 1 6 t o 2 5 % f o r d e v e l o p i n g a n M P N S T ( 6 ) . T h e r e a r e s e v e r a l r e p o r t s o f M P N S T s d e v e l o p i n g i n t h e f i e l d a f t e r r a d i a t i o n t r e a t m e n t f o r a n o t h e r t u m o u r , a s m i g h t b e e x p e c t e d f o r i n d i v i d u a l s w h o c a r r y o n e c o n s t i t u t i o n a l m u t a t i o n o f t h e N F 1 t u m o u r s u p p r e s s o r g e n e ( 3 , 7 ) . M o s t , i f n o t a l l , M P N S T s i n N F 1 p a t i e n t s a p p e a r t o d e v e l o p f r o m p r e - e x i s t i n g p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s ( 8 , 9 ) . T h e n u m b e r , s i z e , a n d t y p e o f b e n i g n n e u r o f i b r o m a s v a r y g r e a t l y a m o n g N F 1 p a t i e n t s , b u t i t i s n o t k n o w n w h e t h e r a n i n d i v i d u a l ' s r i s k f o r d e v e l o p i n g a n M P N S T b e a r s a n y r e l a t i o n s h i p t o t h e b u r d e n o f b e n i g n n e u r o f i b r o m a s . 1 A v e r s i o n of t h i s c h a p t e r ha s b e e n p u b l i s h e d . T u c k e r T, W o l k e n s t e i n P, R e v u z J , Z e l l e r J , F r i e d m a n JM A s s o c i a t i o n b e t w e e n b e n i g n a n d m a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o r s in N F 1 . N e u r o l o g y . 2 0 0 5 Ju l 2 6 ; 6 5 ( 2 ) : 2 0 5 - l l . 3 1 O n e s t u d y f o u n d t h a t t h e g r e a t e s t r i s k f a c t o r s a s s o c i a t e d w i t h M P N S T s i n N F 1 p a t i e n t s w e r e p a i n r e l a t e d t o a m a s s a n d t h e p r e s e n c e o f s u b c u t a n e o u s a n d c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s ( 1 0 ) . I n t h i s s t u d y , t h e m e d i a n a g e s o f t h e N F 1 p a t i e n t s w i t h M P N S T s w a s 2 6 . 4 y e a r s a n d w i t h o u t M P N S T s w a s 1 4 . 7 y e a r s , b u t t h i s d i f f e r e n c e w a s n o t c o n s i d e r e d i n t h e a n a l y s i s . T h e p r e s e n c e o f b o t h s u b c u t a n e o u s a n d c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s i s d e p e n d e n t o n a g e , w i t h t h e m a j o r i t y o f p e o p l e a b o v e t h e a g e o f 1 6 h a v i n g a t l e a s t o n e o f t h e s e t u m o u r s ( 1 1 ) . T h e r e f o r e , m a n y p e o p l e i n t h e g r o u p o f p a t i e n t s w i t h N F 1 w i t h o u t M P N S T s w o u l d n o t b e o l d e n o u g h t o e x h i b i t s u b c u t a n e o u s o r c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s , w h e r e a s a l m o s t a l l o f t h o s e w i t h M P N S T s w o u l d b e e x p e c t e d t o h a v e d e r m a l t u m o u r s j u s t o n t h e b a s i s o f t h e i r a g e . W e u s e d l o g i s t i c r e g r e s s i o n t o d e t e r m i n e i f a s s o c i a t i o n s e x i s t b e t w e e n M P N S T a n d c u t a n e o u s , s u b c u t a n e o u s , s u p e r f i c i a l p l e x i f o r m o r i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a m o n g p a t i e n t s w i t h N F 1 . METHODS Subjects and Data Description A l l p a t i e n t s i n c l u d e d i n t h i s a n a l y s i s w e r e d i a g n o s e d w i t h N F 1 a c c o r d i n g t o e s t a b l i s h e d c l i n i c a l c r i t e r i a ( 1 2 , 1 3 ) . D a t a w e r e o b t a i n e d o n a l l N F 1 p a t i e n t s s e e n i n t h e N F c l i n i c a t t h e H e n r i - M o n d o r H o s p i t a l ( R e s e a u N F - M o n d o r ) b e t w e e n J u n e 1 9 8 8 a n d M a y 2 0 0 4 . A t t h e t i m e o f t h e a n a l y s i s , t h i s d a t a b a s e h a d e x t e n s i v e d e m o g r a p h i c a n d c l i n i c a l d a t a o n 4 7 6 N F 1 p r o b a n d s , 3 1 o f t h e i r a f f e c t e d p a r e n t s a n d 1 6 a f f e c t e d c h i l d r e n . O n l y p r o b a n d s w e r e i n c l u d e d i n t h e p r e s e n t a n a l y s i s . T h e s t u d y p r o t o c o l w a s a p p r o v e d b y t h e h o s p i t a l E t h i c s C o m m i t t e e . W e a n a l y z e d c r o s s - s e c t i o n a l d a t a o n c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s , s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s , a n d i n t e r n a l a n d s u p e r f i c i a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s r e c o r d e d a t t h e m o s t r e c e n t c o m p l e t e c l i n i c a l a s s e s s m e n t . A l l c l i n i c a l l y - a p p a r e n t n e u r o f i b r o m a s w e r e i n c l u d e d , r e g a r d l e s s o f s i z e . D i s c r e t e d e r m a l t u m o u r s s e e n o n p h y s i c a l e x a m w e r e c o n s i d e r e d t o b e c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s i f t h e y m o v e d w i t h t h e s k i n a n d s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s i f t h e s k i n m o v e d o v e r t h e l e s i o n ( 1 4 ) . S u p e r f i c i a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a r e m o r e d i f f u s e t h a n t h e d i s c r e t e t u m o u r s a n d i n v o l v e t h e s k i n o r s u b c u t a n e o u s t i s s u e , w h i c h i s t h i c k e n e d o r r a i s e d , a n d t h e o v e r l y i n g s k i n i s o f t e n h y p e r p i g m e n t e d o r h y p e r t r i c h o t i c ( 1 4 ) . I n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w e r e n o t o b s e r v e d o n p h y s i c a l e x a m i n a t i o n b u t w e r e i d e n t i f i e d b y i m a g i n g s t u d i e s . 3 2 D a t a w e r e o b t a i n e d d u r i n g r o u t i n e c l i n i c a l a s s e s s m e n t o f t h e s e p a t i e n t s i n t h e N F C l i n i c . T h e s t a n d a r d p r o t o c o l w a s t o p e r f o r m a p h y s i c a l e x a m i n a t i o n a n d c l i n i c a l h i s t o r y o n e a c h p a t i e n t y e a r l y . B e t w e e n 1 9 8 8 a n d 1 9 9 5 , p a t i e n t s a l s o r e c e i v e d a s c r e e n i n g o p h t h a l m o l o g i c e x a m u s i n g a s l i t l a m p , c h e s t x - r a y , a b d o m i n a l u l t r a s o u n d e x a m , c e r e b r a l C T o r M R I , a n d 2 4 - h o u r u r i n a r y c a t e c h o l a m i n e a n a l y s i s e v e r y f i v e y e a r s t o l o o k f o r c o m m o n p r o b l e m s a s s o c i a t e d w i t h N F 1 . A d d i t i o n a l s t u d i e s w e r e d o n e t o i n v e s t i g a t e a n y s y m p t o m s o f i n t e r n a l n e u r o f i b r o m a s o r M P N S T t h a t o c c u r r e d . A f t e r 1 9 9 5 , t h e s c r e e n i n g w a s d i s c o n t i n u e d a n d i m a g i n g s t u d i e s w e r e o n l y d o n e t o i n v e s t i g a t e p a t i e n t s y m p t o m s . A l l i n f o r m a t i o n w a s r e c o r d e d u s i n g t h e s t a n d a r d f o r m a t a n d c o n s i s t e n t d e f i n i t i o n s o f c l i n i c a l f e a t u r e s d e v e l o p e d f o r t h e N a t i o n a l N e u r o f i b r o m a t o s i s F o u n d a t i o n I n t e r n a t i o n a l D a t a b a s e ( 1 5 ) . T h e n u m b e r o f c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s p r e s e n t i n a p a t i e n t w a s c o u n t e d o r e s t i m a t e d o n p h y s i c a l e x a m a n d r e c o r d e d s e m i - q u a n t i t a t i v e l y a s n o n e , 1 - 9 , 1 0 - 1 0 0 o r g r e a t e r t h a n 1 0 0 . S u b c u t a n e o u s a n d s u p e r f i c i a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w e r e r e c o r d e d a s p r e s e n t o r a b s e n t . T h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w a s d e t e r m i n e d b y r o u t i n e a b d o m i n a l u l t r a s o u n d a n d c h e s t x - r a y e x a m i n a t i o n s . M R I o r C T e x a m i n a t i o n s w e r e p e r f o r m e d w h e n e v i d e n c e o f a n i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a w a s s e e n o n t h e u l t r a s o u n d e x a m o r c h e s t r a d i o g r a p h o r w h e n t h e p a t i e n t h a d s y m p t o m s s u c h a s p a i n o r n e u r o l o g i c a l d e f i c i t s s u g g e s t i v e o f a n i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a . P a t i e n t s c o d e d a s ' u n k n o w n ' f o r a p a r t i c u l a r f e a t u r e w e r e n o t c o n s i d e r e d i n m o d e l s i n v o l v i n g t h a t f e a t u r e . M P N S T s w e r e s u s p e c t e d b y c l i n i c a l e x a m i n a t i o n o r b y i m a g i n g s t u d i e s a n d w e r e c o n f i r m e d b y b i o p s y . P r o b a n d s w i t h M P N S T s w e r e f o l l o w e d l o n g i t u d i n a l l y e v e r y t h r e e m o n t h s . I f a p a t i e n t d i d n o t a t t e n d t h e f o l l o w - u p a p p o i n t m e n t , t h e s t a t u s o f t h e p a t i e n t w a s d e t e r m i n e d b y a t e l e p h o n e c a l l t o t h e i n d i v i d u a l o r f a m i l y . Statistical Analysis N o n - p a r a m e t r i c K r u s k a l - W a l l i s a n d M a n n - W h i t n e y U t e s t s w e r e c a l c u l a t e d u s i n g S P S S ( S P S S , I n c . , C h i c a g o , I l l i n o i s , 1 9 9 8 ) t o a s s e s s t h e r e l a t i o n s h i p o f a g e t o e a c h t y p e o f n e u r o f i b r o m a . A p - v a l u e l e s s t h a n o r e q u a l t o 0 . 0 5 w a s c o n s i d e r e d t o b e s i g n i f i c a n t . L o g i s t i c r e g r e s s i o n m o d e l s w e r e d e v e l o p e d u s i n g S P S S s o f t w a r e ( S P S S , I n c . , C h i c a g o , I l l i n o i s , 1 9 9 8 ) . M a n y N F 1 f e a t u r e s h a v e a h i g h e r p r e v a l e n c e i n o l d e r p a t i e n t s , s o a g e 3 3 ( c o d e d t o t h e n e a r e s t y e a r ) a t e x a m w a s t r e a t e d a s a c o v a r i a t e i n a l l a n a l y s e s . T h e f i r s t s e t o f m o d e l s h a d t h e p r e s e n c e o f i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a s t h e r e s p o n s e v a r i a b l e a n d e i t h e r c u t a n e o u s , s u b c u t a n e o u s o r s u p e r f i c i a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a s t h e e x p l a n a t o r y v a r i a b l e . T h e s e c o n d s e t o f m o d e l s h a d t h e p r e s e n c e o f a n M P N S T a s t h e r e s p o n s e v a r i a b l e a n d c u t a n e o u s , s u b c u t a n e o u s , s u p e r f i c i a l p l e x i f o r m o r i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a s t h e e x p l a n a t o r y v a r i a b l e . A s s o c i a t i o n s w i t h e x p l a n a t o r y v a r i a b l e s w e r e c o n s i d e r e d t o b e s i g n i f i c a n t i f t h e 9 5 % C I o f t h e o d d s r a t i o e x c l u d e d 1 . 0 . S u r v i v a l r a t e s f r o m t h e t i m e o f M P N S T d i a g n o s i s w e r e c a l c u l a t e d f o r a l l p r o b a n d s w i t h M P N S T s w h o h a d d i e d o r w e r e s t i l l l i v i n g a t t h e t i m e o f t h e a n a l y s i s ( M a y 2 0 0 4 ) . F i v e -y e a r s u r v i v a l b y g e n d e r w a s d e t e r m i n e d u s i n g K a p l a n - M e i e r c u r v e s , a n d t h e s i g n i f i c a n c e o f g e n d e r o n s u r v i v a l w a s d e t e r m i n e d u s i n g a l o g r a n k t e s t ( S P S S , I n c . , C h i c a g o , I l l i n o i s , 1 9 9 8 ) . RESULTS Prevalence of Neurofibromas W e s t u d i e d 4 7 6 p r o b a n d s . 9 3 % o f t h e s e N F 1 p a t i e n t s a r e f r o m F r a n c e . S u b j e c t a g e a t e x a m i n a t i o n r a n g e d f r o m 1 t o 7 7 y e a r s , w i t h a n a v e r a g e o f 3 3 y e a r s ( m e d i a n = 3 1 y e a r s ) . S e m i - q u a n t i t a t i v e d a t a o n c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s w e r e a v a i l a b l e f o r 4 4 3 N F 1 p r o b a n d s . C u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s w e r e r e c o r d e d a s a b s e n t i n 6 6 ( 1 5 % ) o f t h e i n d i v i d u a l s a n d p r e s e n t i n t h e r e s t . S i x t y - e i g h t ( 1 5 % ) o f t h e p a t i e n t s h a d 1 - 9 c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s , 1 7 0 ( 3 8 % ) h a d 1 0 - 1 0 0 c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s a n d 1 3 9 ( 3 1 % ) h a d m o r e t h a n 1 0 0 c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s : T h e a v e r a g e a g e ( ± 1 s t a n d a r d d e v i a t i o n ) f o r i n d i v i d u a l s w i t h o u t c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s w a s 2 1 ± 1 0 y e a r s , f o r i n d i v i d u a l s w i t h 1 - 9 n e u r o f i b r o m a s w a s 2 7 ± 1 1 y e a r s , f o r i n d i v i d u a l s w i t h 1 0 - 1 0 0 n e u r o f i b r o m a s w a s 3 3 ± 1 2 y e a r s a n d f o r i n d i v i d u a l s w i t h m o r e t h a n 1 0 0 c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s w a s 4 2 + 1 2 y e a r s . T h e s e v a l u e s w e r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m e a c h o t h e r ( p < 0 . 0 0 1 ) . O f t h e 4 4 3 p r o b a n d s w i t h i n f o r m a t i o n o n c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s , 2 4 8 ( 5 6 % ) w e r e f e m a l e . 8 8 % o f t h e f e m a l e s h a d o n e o r m o r e c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s c o m p a r e d t o 6 7 % o f m a l e s . T h e a v e r a g e a g e o f f e m a l e s f o r e a c h o f t h e c a t e g o r i e s o f c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s w a s h i g h e r t h a n t h a t o f t h e m a l e s , b u t t h e d i f f e r e n c e s a r e n o t s i g n i f i c a n t . 3 4 S u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s w e r e p r e s e n t i n 2 2 4 ( 4 8 % ) o f t h e 4 6 8 i n d i v i d u a l s o n w h o m i n f o r m a t i o n w a s a v a i l a b l e . T h e m e a n a g e o f p a t i e n t s w i t h ( 3 4 ± 1 4 y e a r s ) a n d w i t h o u t ( 3 3 + 1 3 y e a r s ) s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s w a s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t . S u p e r f i c i a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w e r e p r e s e n t i n 1 9 4 ( 4 1 % ) o f t h e 4 7 1 i n d i v i d u a l s o n w h o m i n f o r m a t i o n w a s a v a i l a b l e . T h e m e a n a g e o f p a t i e n t s w i t h a n d w i t h o u t s u p e r f i c i a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w a s t h e s a m e ( 3 3 ± 1 4 y e a r s ) . T h e r e w e r e 1 4 5 N F 1 p r o b a n d s w h o r e c e i v e d a t l e a s t a r o u t i n e a b d o m i n a l u l t r a s o u n d e x a m a n d c h e s t r a d i o g r a p h t o i d e n t i f y i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . E i g h t y - s i x o f t h e s e i n d i v i d u a l s u n d e r w e n t i m a g i n g s t u d i e s a s p a r t o f a r o u t i n e s c r e e n i n g p r o t o c o l , a n d t h e o t h e r 5 9 p e o p l e h a d i m a g i n g s t u d i e s t o i n v e s t i g a t e s y m p t o m s s u g g e s t i v e o f a n i n t e r n a l t u m o u r . T h e r e w e r e 5 4 i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s i d e n t i f i e d i n 4 9 ( 3 4 % ) p r o b a n d s . T w e n t y - e i g h t p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s p r e s e n t e d w i t h p a i n , a n d 2 6 w e r e a s y m p t o m a t i c . F o r t y - f o u r o f t h e 4 9 p e o p l e w h o w e r e f o u n d t o h a v e i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s u n d e r w e n t C T o r M R I e x a m s . T h e C T o r M R I w a s d o n e b e c a u s e o f s y m p t o m s o f a n i n t e r n a l t u m o u r i n 3 0 p a t i e n t s a n d f o r c o n f i r m a t i o n a f t e r a n a b n o r m a l a b d o m i n a l u l t r a s o u n d o r c h e s t x - r a y e x a m i n t h e o t h e r 1 4 i n d i v i d u a l s . T h e a v e r a g e a g e o f p a t i e n t s w i t h i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w a s 3 6 ± 1 4 y e a r s , c o m p a r e d t o 3 4 ± 1 4 y e a r s f o r i n d i v i d u a l s w i t h o u t i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s ( p = 0 . 4 8 ) . O f t h e i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s t h a t w e r e i d e n t i f i e d , 4 3 ( 8 0 % ) w e r e o f t h e s p i n a l n e r v e r o o t s o r g a n g l i a , n i n e ( 1 7 % ) w e r e n o n - s p i n a l i n t h e a b d o m e n o r p e l v i s a n d t w o ( 4 % ) w e r e n o n - s p i n a l i n t h e c h e s t . T h e r e w e r e 1 9 s p i n a l n e u r o f i b r o m a s t h a t d i d n o t p r e s e n t w i t h s y m p t o m s t o t h e 1 8 i n d i v i d u a l s a f f e c t e d . T w e n t y - f o u r s p i n a l t u m o u r s w e r e s y m p t o m a t i c i n 2 1 i n d i v i d u a l s -e i g h t c o m p l a i n e d o f p a i n , n i n e h a d n e u r o l o g i c a l s y m p t o m s o f s p i n a l c o r d c o m p r e s s i o n , f i v e h a d b o t h p a i n a n d s y m p t o m s o f s p i n a l c o r d c o m p r e s s i o n , o n e c o m p l a i n e d o f p a i n a n d h a d b o n e d e s t r u c t i o n , a n d a n o t h e r c o m p l a i n e d o f s y m p t o m s o f c o m p r e s s i o n o f t h e d u o d e n u m . O n e i n d i v i d u a l w h o h a d c o m p r e s s i o n o f t h e s p i n a l c o r d e x p e r i e n c e d p a r a l y s i s i n v o l v i n g t h e r e g i o n b e l o w t h e a r e a o f c o m p r e s s i o n , a n d t w o o t h e r i n d i v i d u a l s h a d r e s p i r a t o r y d i s t r e s s a n d s u b s e q u e n t l y d i e d a s a c o n s e q u e n c e o f t h e i r s p i n a l c o r d c o m p r e s s i o n . 3 5 T w o i n d i v i d u a l s h a d n o n - s p i n a l c h e s t n e u r o f i b r o m a s ; b o t h w e r e a s y m p t o m a t i c . N i n e n o n - s p i n a l t u m o u r s o f t h e a b d o m e n o r p e l v i c r e g i o n w e r e i d e n t i f i e d i n e i g h t i n d i v i d u a l s , f i v e o f w h o m w e r e a s y m p t o m a t i c . O n e p a t i e n t w h o h a d a n e u r o f i b r o m a i n t h e r e g i o n o f t h e p a n c r e a s d e v e l o p e d c h o l e s t a s i s , a n o t h e r i n d i v i d u a l w i t h i n t r a - a b d o m i n a l n e u r o f i b r o m a s h a d g a s t r o i n t e s t i n a l b l e e d i n g , a n d a n o t h e r h a d a b d o m i n a l p a i n a n d w a s f o u n d t o h a v e a n e u r o f i b r o m a o f t h e p e l v i s . O f t h e 4 6 9 i n d i v i d u a l s w i t h i n f o r m a t i o n o n M P N S T s t a t u s , 2 5 ( 5 % ) h a d M P N S T s . T w e n t y - f o u r o f t h e s e 2 5 p a t i e n t s w e r e s y m p t o m a t i c , w i t h t h e m a j o r i t y o f i n d i v i d u a l s c o m p l a i n i n g o f p a i n i n t h e a r e a a n d e n l a r g e m e n t o f a p r e v i o u s l y - r e c o g n i z e d t u m o u r ( T a b l e 2 . 1 ) . T h e i n d i v i d u a l w h o d i d n o t p r e s e n t w i t h s y m p t o m s h a d a n M P N S T o f a l o w e r l i m b t h a t w a s d i s c o v e r e d d u r i n g a n o p e r a t i o n f o r p s e u d a r t h r o s i s [ P a t i e n t 2 4 ] . T h e a v e r a g e a g e o f t h o s e w i t h M P N S T s ( 3 1 ± 1 2 y e a r s ) d i d n o t d i f f e r ( p = 0 . 3 5 ) f r o m t h e a v e r a g e a g e o f i n d i v i d u a l s w i t h o u t M P N S T s ( 3 3 ± 1 2 y e a r s ) . A l l 2 5 o f t h e s e M P N S T s w e r e s h o w n p a t h o l o g i c a l l y t o c o n t a i n e l e m e n t s o f b e n i g n p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a a n d , t h e r e f o r e , a r e l i k e l y t o h a v e a r i s e n f r o m a p r e - e x i s t i n g b e n i g n t u m o u r . T h e M P N S T a r o s e i n o n e o f t h e i n t e r n a l b e n i g n p l e x i f o r m t u m o u r s t h a t h a d p r e v i o u s l y b e e n i m a g e d i n e i g h t o f t h e 2 0 c a s e s i n w h i c h i m a g i n g s t u d i e s h a s b e e n p e r f o r m e d . S e v e n m o r e o f t h e s e 2 0 M P N S T s m a y h a v e a r i s e n i n r e l a t i o n s h i p t o a t u m o u r t h a t w a s i m a g e d b u t c a n n o t b e c o n f i r m e d t o h a v e d o n e s o . T h e r e m a i n i n g f i v e M P N S T s a r o s e i n t u m o u r s t h a t w e r e a p p a r e n t l y u n r e l a t e d t o t h e o n e s i d e n t i f i e d b y i m a g i n g . T h e d e t a i l s o f e a c h a r e g i v e n i n T a b l e 2 . 1 a n d s u m m a r i z e d b e l o w . 3 6 } Table 2.1 Summary of Patient Data for those with MPNSTs. Patient Number Sex Age at MPNST Diagnosis Location of MPNST Internal Plexiform Neurofibromas Seen on Imaging Studies Survival (Months) Status 1 M 2 2 F a c e N D 3 0 D e a d 2 M 2 9 F a c e N o n e 8 4 A l i v e 3 M 3 2 F a c e L 3 - S 1 3 D e a d 4 F 3 9 C e r v i c a l N D 1 0 8 A l i v e 5 F 4 9 C 2 C 2 - C 7 1 5 D e a d 6 F 4 9 C 2 - C 3 C 2 - C 6 6 0 A l i v e 7 F 1 7 T r u n k . N D 1 2 D e a d 8 F 1 8 T r u n k T h o r a c i c 1 2 D e a d 9 M 2 7 T 1 T 1 - T 3 4 A l i v e 1 0 M 3 0 A b d o m i n a l N D 2 9 D e a d 1 1 F 2 0 L u m b a r S p i n e N D 2 9 A l i v e 1 2 M 2 4 L 2 L 1 - L 2 0 D e a d 1 3 F 2 5 S a c r u m T 5 - S 1 4 8 A l i v e 1 4 M 3 1 L 4 - L 5 L 4 6 0 A l i v e 1 5 F 3 1 P e l v i s L u m b a r & S a c r a l 1 9 D e a d 1 6 F 3 3 S c i a t i c N e r v e L 5 - S 2 2 3 D e a d 1 7 M 3 4 L 2 - L 3 L 2 - L 3 1 4 D e a d 1 8 F 3 7 U p p e r L i m b C e r v i c a l 3 6 A l i v e 1 9 M 5 3 U p p e r L i m b S 1 - S 2 1 2 D e a d 2 0 M 5 6 U p p e r L i m b N o n e 8 4 A l i v e 2 1 F 1 5 L o w e r L i m b L 5 - S 1 5 2 D e a d 2 2 F 1 9 L o w e r L i m b L 2 - L 3 & T 9 - T 1 0 3 D e a d 2 3 F 2 1 L o w e r L i m b N o n e 5 5 A l i v e 2 4 M 2 1 L o w e r L i m b L u m b a r & S a c r a l 1 0 8 A l i v e 2 5 M 3 6 L o w e r L i m b L u m b a r 1 6 D e a d N D = I m a g i n g s t u d i e s f o r i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s n o t d o n e M = M a l e ; F = F e m a l e 3 7 T h r e e i n d i v i d u a l s [ P a t i e n t s 1 , 2 , a n d 3 ] h a d M P N S T s o f t h e f a c e t h a t d e v e l o p e d f r o m p r e v i o u s l y - i d e n t i f i e d p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . P a t i e n t 3 a l s o h a d a s p i n a l n e u r o f i b r o m a a t L 3 - S 1 . P a t i e n t 2 r e c e i v e d a b o d y C T s c a n o n l y a f t e r h i s r e f e r r a l t o t h e H e n r i M o n d o r H o s p i t a l f o r s u s p i c i o n o f a n M P N S T , a n d n o i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w e r e f o u n d . P a t i e n t 1 d i d n o t h a v e i m a g i n g s t u d i e s p e r f o r m e d t o l o o k f o r i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . E i g h t i n t e r n a l M P N S T s w e r e c o n f i r m e d p a t h o l o g i c a l l y t o o r i g i n a t e f r o m a p r e v i o u s l y -i d e n t i f i e d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a ; a l l w e r e t u m o u r s o f t h e s p i n a l n e r v e s [ P a t i e n t s 5 , 6 , 9 , 1 2 , 1 3 , 1 4 , 1 6 a n d 1 7 ] . A p e l v i c M P N S T w a s i d e n t i f i e d i n a n i n d i v i d u a l w h o h a d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s o f t h e l u m b a r a n d s a c r a l s p i n e [ P a t i e n t 1 5 ] . A n o t h e r i n d i v i d u a l w a s f o u n d t o h a v e a n i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a o f t h e t h o r a c i c s p i n e a n d d e v e l o p e d a n M P N S T o f t h e t r u n k [ P a t i e n t 8 ] . B o t h o f t h e s e m a l i g n a n c i e s w e r e s u s p e c t e d t o h a v e o r i g i n a t e d f r o m p r e v i o u s l y - u n i d e n t i f i e d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s , a n d p a t h o l o g y r e p o r t s d e m o n s t r a t e d b e n i g n c o m p o n e n t s i n t h e M P N S T . T h r e e M P N S T s o f t h e u p p e r l i m b [ P a t i e n t s 1 8 , 1 9 a n d 2 0 ] a n d 5 o f t h e l o w e r l i m b [ 2 1 , 2 2 , 2 3 , 2 4 , a n d 2 5 ] d e v e l o p e d f r o m p r e v i o u s l y - i d e n t i f i e d p l e x i f o r m t u m o u r s o u t s i d e o f t h e a r e a i m a g e d . S i x o f t h e s e i n d i v i d u a l s [ P a t i e n t s 1 8 , 1 9 , 2 1 , 2 2 , 2 4 a n d 2 5 ] a l s o h a d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s o f t h e s p i n e . B o t h i n d i v i d u a l s w h o d i d n o t h a v e i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s [ P a t i e n t s 2 0 a n d 2 3 ] h a d n o r m a l a b d o m i n a l u l t r a s o u n d a n d c h e s t x - r a y e x a m t h r e e y e a r s b e f o r e d i a g n o s i s o f t h e M P N S T . M P N S T s o f t h e c e r v i c a l s p i n e , l u m b a r s p i n e , a b d o m e n a n d t r u n k w e r e i d e n t i f i e d i n f o u r i n d i v i d u a l s [ P a t i e n t s 4 , 7 , 1 0 a n d 1 1 ] w h o h a d n o p r e v i o u s i m a g i n g p e r f o r m e d t o i d e n t i f y i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . P a t h o l o g y r e p o r t s c o n f i r m e d t h a t t h e r e w e r e b e n i g n c o m p o n e n t s i n e a c h o f t h e s e m a l i g n a n t t u m o u r s . Logistic Regression T h e l o g i s t i c r e g r e s s i o n a n a l y s i s o f c u t a n e o u s a n d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w a s l i m i t e d t o 1 3 9 N F 1 p r o b a n d s w h o h a d i n f o r m a t i o n o n t h e p r e s e n c e o f i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a s w e l l a s s e m i - q u a n t i t a t i v e d a t a o n c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s . T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t a s s o c i a t i o n b e t w e e n c u t a n e o u s a n d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s ( T a b l e 2 . 2 ) . 3 8 Table 2.2 Summary of odds ratios and 95% confidence intervals for logistic regression models. R e s p o n s e V a r i a b l e E x p l a n a t o r y V a r i a b l e * O d d s R a t i o ( 9 5 % C o n f i d e n c e I n t e r v a l ) C u t a n e o u s N e u r o f i b r o m a s 1 - 9 1 . 7 0 ( 0 . 4 9 , 5 . 9 1 ) 1 0 - 1 0 0 0 . 5 5 ( 0 . 1 4 , 2 . 1 4 ) I n t e r n a l P l e x i f o r m N e u r o f i b r o m a s > 1 0 0 0 . 8 8 ( 0 . 3 6 , 2 . 1 3 ) A g e ( p e r y e a r ) 1 . 0 0 ( 0 . 9 7 , 1 . 0 3 ) S u b c u t a n e o u s N e u r o f i b r o m a s 3 . 5 8 ( 1 . 6 8 , 7 . 6 4 ) A g e ( p e r y e a r ) 1 . 0 0 ( 0 . 9 8 , 1 . 0 3 ) S u p e r f i c i a l P l e x i f o r m N e u r o f i b r o m a s 0 . 7 4 ( 0 . 3 6 , 1 . 5 4 ) A g e ( p e r y e a r ) 1 . 0 0 ( 0 . 9 8 , 1 . 0 0 ) C u t a n e o u s N e u r o f i b r o m a s 1 - 9 1 0 - 1 0 0 0 . 7 9 ( 0 . 1 5 , 4 . 0 8 ) 1 . 2 0 ( 0 . 2 8 , 5 . 1 3 ) > 1 0 0 1 . 5 6 ( 0 . 5 1 , 4 . 8 0 ) A g e ( p e r y e a r ) 0 . 9 8 ( 0 . 9 4 , 1 . 0 2 ) M P N S T S u p e r f i c i a l P l e x i f o r m N e u r o f i b r o m a s 0 . 9 0 ( 0 . 6 2 , 1 . 3 2 ) A g e ( p e r y e a r ) 1 . 0 2 ( 1 . 0 1 - 1 . 0 4 ) S u b c u t a n e o u s N e u r o f i b r o m a s 2 . 8 1 ( 1 . 1 4 , 6 . 9 4 ) A g e ( p e r y e a r ) 0 . 9 9 ( 0 . 9 5 , 1 . 0 1 ) I n t e r n a l P l e x i f o r m N e u r o f i b r o m a s 2 0 . 5 2 ( 5 . 3 , 7 9 . 5 ) A g e ( p e r y e a r ) 0 . 9 4 ( 0 . 9 0 , 0 . 9 9 ) I n t e r n a l P l e x i f o r m N e u r o f i b r o m a 1 8 . 0 6 ( 4 . 5 5 , 7 3 . 4 ) M P N S T S u b c u t a n e o u s N e u r o f i b r o m a 2 . 0 8 ( 0 . 6 0 , 7 . 2 4 ) A g e ( p e r y e a r ) 0 . 9 4 ( 0 . 8 9 , 0 . 9 8 ) * C o m p a r i s o n s w e r e m a d e w i t h f e a t u r e s t h a t w e r e a b s e n t i n a n i n d i v i d u a l . 3 9 T h e a s s o c i a t i o n b e t w e e n c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s a n d M P N S T s w a s t e s t e d o n 4 3 9 i n d i v i d u a l s w h o h a d s e m i - q u a n t i t a t i v e d a t a o n n u m b e r s o f c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s a s w e l l a s i n f o r m a t i o n o n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f M P N S T s . T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e n u m b e r o f c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s m e a s u r e d o n a s e m i -q u a n t i t a t i v e s c a l e a n d t h e p r e s e n c e o f M P N S T s ( T a b l e 2 . 2 ) . T h e l o g i s t i c r e g r e s s i o n a n a l y s i s o f s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s a n d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w a s l i m i t e d t o 1 4 4 i n d i v i d u a l s w h o h a d i n f o r m a t i o n o n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f b o t h i n t e r n a l p l e x i f o r m a n d s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s . S e v e n t y - s i x o f t h e s e p a t i e n t s h a d s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s , 3 5 ( 4 6 % ) o f w h o m a l s o h a d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . I n c o n t r a s t , o f t h e 6 8 p a t i e n t s w h o d i d n o t h a v e s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s , o n l y 1 3 ( 2 0 % ) h a d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . T h e r e w a s a s i g n i f i c a n t a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e p r e s e n c e o f s u b c u t a n e o u s a n d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s , w i t h i n d i v i d u a l s h a v i n g s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s b e i n g 3 . 5 8 t i m e s m o r e l i k e l y t o h a v e i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s t h a n i n d i v i d u a l s w i t h o u t s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s ( T a b l e 2 . 2 ) . T h e r e w e r e 4 6 4 i n d i v i d u a l s w h o h a d i n f o r m a t i o n o n p r e s e n c e o r a b s e n c e o f b o t h s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s a n d M P N S T s . S e v e n t e e n ( 8 % ) o f t h e 2 2 2 p a t i e n t s w i t h s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s a l s o h a d M P N S T s , c o m p a r e d t o s e v e n ( 3 % ) o f t h e 2 4 2 N F 1 i n d i v i d u a l s w i t h o u t s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s . T h e r e w a s a s i g n i f i c a n t a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e p r e s e n c e o f s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s a n d M P N S T s ( T a b l e 2 . 2 ) . I n d i v i d u a l s w i t h s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s w e r e a l m o s t t h r e e t i m e s m o r e l i k e l y t o h a v e a n M P N S T a s i n d i v i d u a l s w h o d i d n o t h a v e s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s . T h e a s s o c i a t i o n b e t w e e n s u p e r f i c i a l a n d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w a s t e s t e d o n 1 4 3 i n d i v i d u a l s w h o h a d i n f o r m a t i o n o n p r e s e n c e o r a b s e n c e o f b o t h k i n d s o f p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e p r e s e n c e o f s u p e r f i c i a l a n d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s ( T a b l e 2 . 2 ) . T h e r e w e r e 4 6 5 i n d i v i d u a l s w h o h a d i n f o r m a t i o n o n p r e s e n c e o r a b s e n c e o f b o t h s u p e r f i c i a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a n d M P N S T s . T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t a s s o c i a t i o n b e t w e e n s u p e r f i c i a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a n d M P N S T s ( T a b l e 2 . 2 ) . T h e a n a l y s i s o f i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a n d M P N S T s w a s l i m i t e d t o 1 4 1 N F 1 p r o b a n d s w h o h a d i n f o r m a t i o n o n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f b o t h i n t e r n a l p l e x i f o r m 4 0 n e u r o f i b r o m a s a n d M P N S T s . F o r t y - n i n e i n d i v i d u a l s h a d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s , 1 7 ( 3 5 % ) o f w h o m a l s o h a d M P N S T s . I n c o n t r a s t , o n l y t h r e e ( 3 % ) o f t h e 9 2 i n d i v i d u a l s w i t h o u t i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s h a d M P N S T s . T h e a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e p r e s e n c e o f i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a n d M P N S T s w a s v e r y s t r o n g , w i t h i n d i v i d u a l s w h o h a v e i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s b e i n g o v e r 2 0 t i m e s m o r e l i k e l y t o h a v e a n M P N S T t h a n i n d i v i d u a l s w i t h o u t i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . A g e w a s a l s o n e g a t i v e l y a s s o c i a t e d w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f M P N S T s i n t h i s a n a l y s i s , t h e r a t e d e c r e a s i n g a b o u t 6 % p e r y e a r ( T a b l e 2 . 2 ) . W h e n l o g i s t i c r e g r e s s i o n w a s d o n e w i t h b o t h s u b c u t a n e o u s a n d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a s e x p l a n a t o r y v a r i a b l e s , t h e a s s o c i a t i o n o f s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s w i t h M P N S T s w a s n o l o n g e r s i g n i f i c a n t , b u t t h e a s s o c i a t i o n w i t h i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s r e m a i n e d v e r y s t r o n g ( T a b l e 2 . 2 ) . A f t e r a d j u s t m e n t f o r a g e a n d t h e p r e s e n c e o f s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s , N F 1 p r o b a n d s w i t h i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w e r e o v e r 1 8 t i m e s m o r e l i k e l y t o h a v e M P N S T s a s p r o b a n d s w i t h o u t i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . Survival Analysis S u r v i v a l a n a l y s i s i n N F 1 p a t i e n t s w i t h M P N S T s w a s l i m i t e d t o t h e 2 5 s u b j e c t s w h o h a d M P N S T s . F o u r t e e n i n d i v i d u a l s d i e d a s a r e s u l t o f t h e i r M P N S T s . T h e m e a n s u r v i v a l a f t e r d i a g n o s i s f o r i n d i v i d u a l s w h o d i e d w a s 1 . 4 ± 1 . 1 y e a r s . T h e a v e r a g e l e n g t h o f f o l l o w - u p f o r i n d i v i d u a l s s t i l l a l i v e a t t h e t i m e o f a n a l y s i s w a s 5 . 3 ± 2 . 5 y e a r s . T h e f i v e -y e a r s u r v i v a l w a s 4 1 % ( 9 5 % C l = 2 1 % - 6 2 % ) ( F i g u r e 2 . 1 ) f o r t h e 2 5 p a t i e n t s w i t h M P N S T s a n d w a s s i m i l a r f o r m a l e s a n d f e m a l e s ( p = 0 . 7 9 ) . 4 1 Figure 2.1 Kaplan Meier Survival of 25 NF1 patients with MPNSTs. 1.0 0.9 0.8 f 0.7 'E J? 0G C 0.4 1 0.3' 0 2 0.1 0.0 Follow-up (Months) DISCUSSION W e s o u g h t t o i d e n t i f y f e a t u r e s o f N F 1 t h a t c h a r a c t e r i z e p a t i e n t s w h o a r e a t t h e h i g h e s t r i s k f o r d e v e l o p i n g M P N S T s . W e f o u n d t h a t i n d i v i d u a l s w i t h i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w e r e 1 8 t i m e s m o r e l i k e l y t o d e v e l o p M P N S T s t h a n p a t i e n t s w i t h o u t i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s , a f t e r a d j u s t m e n t f o r a g e a n d t h e o c c u r r e n c e o f s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s . I n a d d i t i o n , i n d i v i d u a l s w i t h s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s w e r e m o r e t h a n t h r e e t i m e s a s l i k e l y t o h a v e i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a s p a t i e n t s w i t h o u t s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s . T h e a s s o c i a t i o n o b s e r v e d b e t w e e n s u b c u t a n e o u s a n d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s m a y r e f l e c t s h a r e d p a t h o g e n i c m e c h a n i s m s a n d i s c o n s i s t e n t w i t h t h e h i s t o p a t h o l o g i c a l s i m i l a r i t i e s a m o n g c u t a n e o u s , s u b c u t a n e o u s a n d p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . I n a d d i t i o n , l o s s o f t h e n o r m a l N F 1 a l l e l e h a s b e e n o b s e r v e d i n a t l e a s t s o m e c a s e s i n a l l t h r e e t y p e s o f n e u r o f i b r o m a s ( 1 6 - 2 3 ) . I t i s s o m e w h a t s u r p r i s i n g , g i v e n t h e h i s t o p a t h o l o g i c a l s i m i l a r i t i e s b e t w e e n t h e s e t h r e e t y p e s o f b e n i g n t u m o u r s , t h a t c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s a r e n o t a s s o c i a t e d w i t h i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . H o w e v e r , c u t a n e o u s t u m o u r s h a v e a d i f f e r e n t n a t u r a l h i s t o r y t h a n p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s b e c a u s e p l e x i f o r m t u m o u r s m a y u n d e r g o m a l i g n a n t t r a n s f o r m a t i o n w h i l e c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s a l m o s t n e v e r d o . T h i s d i f f e r e n c e i n c l i n i c a l b e h a v i o r m a y r e f l e c t a d i f f e r e n c e i n p a t h o g e n e s i s ( 2 4 ) . A w e a k a s s o c i a t i o n b e t w e e n c u t a n e o u s , s u b c u t a n e o u s a n d p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s h a s b e e n o b s e r v e d i n o n e o t h e r s t u d y ( 2 5 ) . H o w e v e r , t h e m a j o r i t y o f p l e x i f o r m t u m o u r s e x a m i n e d i n t h a t s t u d y w e r e s u p e r f i c i a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s ( 2 5 ) . W e d i d n o t o b s e r v e a n y 4 2 a s s o c i a t i o n o f s u p e r f i c i a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w i t h e i t h e r i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s o r M P N S T s i n t h e p r e s e n t s t u d y , w h i c h i n c l u d e d a s u b s e t o f t h e d a t a a n a l y z e d i n t h e p r e v i o u s s t u d y ( 2 5 ) . M P N S T s i n p e o p l e w i t h N F 1 u s u a l l y a r i s e w i t h i n a p r e e x i s t i n g p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a ( 2 6 ) . O u r f i n d i n g t h a t a l l 2 5 o f t h e M P N S T s i n c l u d e d i n t h i s s t u d y c o n t a i n e d e l e m e n t s o f b e n i g n p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a o n h i s t o p a t h o l o g i c a l e x a m i n a t i o n i s c o n s i s t e n t w i t h t h i s i n t e r p r e t a t i o n . W e f o u n d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s i n 3 4 % o f t h e p a t i e n t s w h o h a d u n d e r g o n e i m a g i n g s t u d i e s . W e o b s e r v e d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s m o s t f r e q u e n t l y i n t h e s p i n a l n e r v e s , f o l l o w e d b y o t h e r l o c a t i o n s i n t h e a b d o m e n / p e l v i s , a n d t h e n b y o t h e r l o c a t i o n s i n t h e c h e s t . O n l y f i v e i n d i v i d u a l s h a d t w o c l e a r l y d i s t i n c t i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s , w h i c h i s a l o w e r p r o p o r t i o n o f m u l t i p l i c i t y t h a n f o u n d i n s t u d i e s o f p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s t h a t w e r e a p p a r e n t o n c l i n i c a l e x a m ( 1 2 . 5 - 2 1 % ) ( 2 7 , 2 8 ) . T h e p r e v a l e n c e o f v a r i o u s c l i n i c a l f e a t u r e s a m o n g t h e N F 1 p a t i e n t s i n t h i s d a t a s e t m a y n o t r e f l e c t t h e p r e v a l e n c e a m o n g i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 i n g e n e r a l b e c a u s e o u r d a t a w e r e o b t a i n e d f r o m p a t i e n t s s e e n a t a s p e c i a l i z e d c l i n i c , a n d t h e a n a l y s i s w a s r e s t r i c t e d t o p r o b a n d s . T h e p a t i e n t s i n c l u d e d m a y , t h e r e f o r e , b e m o r e s e v e r e l y a f f e c t e d t h a n t h e N F 1 p o p u l a t i o n i n g e n e r a l . I t i s u n l i k e l y t h a t p a t i e n t s e l e c t i o n f o r i m a g i n g s t u d i e s b i a s e s t h e r e s u l t s , a s a n e q u a l p r o p o r t i o n o f i n d i v i d u a l s w i t h n e u r o f i b r o m a s w a s i d e n t i f i e d a m o n g t h o s e s e l e c t e d b y r o u t i n e e x a m i n a t i o n ( 3 3 % ) c o m p a r e d t o t h o s e i d e n t i f i e d b y s y m p t o m s ( 3 5 % ) . M o r e o v e r , t h e p r e v a l e n c e a n d d i s t r i b u t i o n o f i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s o b s e r v e d i n t h i s s t u d y i s s i m i l a r t o t h a t f o u n d i n a s t u d y t h a t p e r f o r m e d C T s o n 9 1 N F 1 p a t i e n t s o v e r 1 6 y e a r s o l d ( m e a n a g e = 3 5 y e a r s ) . A m o n g t h e s e 9 1 N F 1 p a t i e n t s , 2 0 % h a d i n t e r n a l n e u r o f i b r o m a s o n c h e s t C T , a n d 4 0 % h a d i n t e r n a l n e u r o f i b r o m a s o n a b d o m i n a l / p e l v i c C T . F o r t y p a r a s p i n a l t u m o u r s w e r e i d e n t i f i e d , 1 7 o n c h e s t a n d 2 3 o n a b d o m i n a l / p e l v i c s c a n , c o n s t i t u t i n g 7 2 % o f a l l a b n o r m a l s c a n s ( 2 9 ) . T h i s r e p o r t d i d n o t s t a t e h o w m a n y t u m o u r s e a c h p a t i e n t h a d o r h o w m a n y o f t h e p a t i e n t s h a d a s i n g l e t u m o u r t h a t w a s s e e n o n b o t h t h e a b d o m i n a l a n d c h e s t s c a n . A s t u d y t h a t p e r f o r m e d s p i n a l M R I s o n 5 4 N F 1 p a t i e n t s a g e d 5 t o 5 6 y e a r s o b s e r v e d s p i n a l n e u r o f i b r o m a s i n 6 4 % o f a l l i n d i v i d u a l s e x a m i n e d , w i t h m o r e t h a n f i v e t u m o u r m a s s e s i n 7 9 % . A m o n g 2 4 i n d i v i d u a l s w h o c o m p l a i n e d o f s e n s o r y i m p a i r m e n t o r p a r a l y s i s , s p i n a l t u m o u r s w e r e i d e n t i f i e d i n 2 3 ( 9 3 % ) . S p i n a l t u m o u r s w e r e a l s o i d e n t i f i e d i n 1 2 ( 4 0 % ) o f t h e 3 0 i n d i v i d u a l s w h o d i d n o t h a v e s y m p t o m s o f s u c h a 4 3 t u m o u r . S p i n a l t u m o u r s w e r e s e e n i n a l m o s t h a l f o f t h e a s y m p t o m a t i c i n d i v i d u a l s o v e r t h e a g e o f 1 5 b u t i n o n l y 2 5 % o f a s y m p t o m a t i c i n d i v i d u a l s u n d e r a g e 1 5 ( 3 0 ) . W i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e i n f o r m a t i o n o n s u r v i v a l a f t e r d i a g n o s i s o f M P N S T , t h e d a t a a n a l y z e d f r o m t h e H e n r i M o n d o r D a t a b a s e a r e c r o s s - s e c t i o n a l a n d , t h e r e f o r e , c a n n o t b e u s e d t o a s s e s s t e m p o r a l r e l a t i o n s h i p s . T h i s m e a n s t h a t t h e a s s o c i a t i o n s w e o b s e r v e d c a n n o t b e u s e d t o p r e d i c t t h e r i s k o f a n i n d i v i d u a l N F 1 p a t i e n t t o d e v e l o p a n M P N S T . A l a r g e - s c a l e l o n g i t u d i n a l s t u d y o f t h e n a t u r a l h i s t o r y o f i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s i s n e c e s s a r y t o d e v e l o p p r e d i c t i v e m o d e l s . A r e c e n t s t u d y e x a m i n e d M R I f r o m 5 0 N F 1 p a t i e n t s w h o h a d p r e v i o u s l y - i d e n t i f i e d p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . T e n p a t i e n t s h a d i n h o m o g e n e o u s - a p p e a r i n g t u m o u r s o n M R I , a n d s e v e n o f t h e s e p r e s e n t e d w i t h p a i n o r s w e l l i n g . A l l 1 0 w e r e d i a g n o s e d p a t h o l o g i c a l l y a s M P N S T s . T h e a g e s o f t h e s e 1 0 p a t i e n t s r a n g e d f r o m 1 3 t o 5 6 y e a r s , w i t h a m e a n a g e o f 2 8 y e a r s . A h i g h i n t e r n a l t u m o u r b u r d e n w a s o b s e r v e d i n f i v e o f t h e p a t i e n t s , t w o h a d a p a r e n t w i t h N F 1 w h o d i e d f r o m a n M P N S T a n d t w o o t h e r s h a d h a d a p r e v i o u s M P N S T ( 3 1 ) . M P N S T s h a v e a p o o r p r o g n o s i s , a n d i n m o s t s t u d i e s t h e p r o g n o s i s a p p e a r s t o b e w o r s e i n N F 1 p a t i e n t s t h a n i n t h o s e w h o d o n o t h a v e N F 1 ( 3 , 3 2 ) . A r e c e n t i n v e s t i g a t i o n f o u n d a f i v e - y e a r s u r v i v a l o f o n l y 2 1 % i n p e o p l e w i t h N F 1 w h o h a d a n M P N S T ( 5 ) . I n t h e c u r r e n t s t u d y , t h e f i v e - y e a r s u r v i v a l w a s 4 1 % i n b o t h m a l e s a n d f e m a l e s . T h i s i s n o t i n a g r e e m e n t w i t h t h e s u g g e s t i o n t h a t t h e p r o g n o s i s o f M P N S T i s w o r s e i n m a l e s t h a n f e m a l e s w i t h N F 1 ( 5 , 7 ) . A s t u d y u s i n g t h e N e u r o f i b r o m a t o s i s I n s t i t u t e D a t a b a s e t o i d e n t i f y c l i n i c a l f e a t u r e s t h a t m a y b e a s s o c i a t e d w i t h m o r t a l i t y i n p a t i e n t s w i t h N F 1 l o o k e d a t 7 0 3 p a t i e n t s w i t h a m e a n f o l l o w - u p t i m e o f 2 . 4 y e a r s . F o r t y i n d i v i d u a l s d i e d d u r i n g t h e f o l l o w - u p , 2 7 o f w h o m w h e r e a d u l t s . O f t h e 4 0 i n d i v i d u a l s w h o d i e d , 1 6 ( 4 0 % ) h a d a n M P N S T . U s i n g a g e - a d j u s t e d l o g i s t i c r e g r e s s i o n , t h e s t u d y f o u n d t h a t s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s ( O R = 3 . 6 , 9 5 % C l = 1 . 2 , 1 1 . 3 ) a n d m a l e g e n d e r ( O R = 5 . 6 , 9 5 % C l = 1 . 5 , 2 0 . 9 ) w e r e i n d e p e n d e n t p r e d i c t o r s o f m o r t a l i t y i n a d u l t s w i t h N F 1 ( 3 3 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e f i n d i n g t h a t i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 w h o h a v e s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s a r e a t i n c r e a s e d r i s k o f d e v e l o p i n g a n M P N S T , o n e o f t h e l e a d i n g c a u s e s o f d e a t h a m o n g N F 1 p a t i e n t s ( 3 4 ) , s u p p o r t s t h e p r e v i o u s f i n d i n g t h a t s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s a r e a s s o c i a t e d w i t h m o r t a l i t y ( 3 3 ) . 4 4 T h e 1 9 9 7 c o n s e n s u s g u i d e l i n e s f o r m a n a g e m e n t o f N F 1 p a t i e n t s s t a t e t h a t i m a g i n g s t u d i e s s h o u l d n o t b e d o n e u n l e s s t h e c l i n i c a l e x a m i d e n t i f i e s p r o b l e m s t h a t r e q u i r e s u c h s t u d i e s ( 1 3 ) . H o w e v e r , p a t i e n t s w i t h N F 1 w h o h a v e s y m p t o m s o f a n u n d e r l y i n g t u m o u r a r e n o t t h e o n l y o n e s a t r i s k f o r d e v e l o p i n g i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s , a n d i d e n t i f y i n g a n M P N S T a f t e r i t b e c o m e s s y m p t o m a t i c i s o f t e n t o o l a t e t o p r o v i d e a s u r g i c a l c u r e . W e f o u n d t h a t N F 1 p a t i e n t s w i t h i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w e r e m u c h m o r e l i k e l y t o d e v e l o p M P N S T s t h a n N F 1 p a t i e n t s w i t h o u t i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s , a n d o v e r h a l f o f p a t i e n t s w i t h i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w e r e n o t s y m p t o m a t i c . T h i s r a i s e s t h e q u e s t i o n o f w h e t h e r a d u l t s w i t h N F 1 s h o u l d h a v e r o u t i n e i m a g i n g f o r i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s t o i d e n t i f y t h o s e a t h i g h r i s k o f d e v e l o p i n g M P N S T s . T h e a s s o c i a t i o n b e t w e e n i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a n d s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s i s n o t s t r o n g e n o u g h t o b e c l i n i c a l l y u s e f u l t o i d e n t i f y i n d i v i d u a l s w h o h a v e a g r e a t e r r i s k o f i n t e r n a l n e u r o f i b r o m a s . E l e v e n o f t h e 2 5 i n d i v i d u a l s w i t h M P N S T s i n t h i s s t u d y [ P a t i e n t s 1 , 5 , 7 , 8 , 1 4 , 1 5 , 1 7 , 2 0 , 2 1 , 2 2 a n d 2 4 ] h a v e b e e n t e s t e d f o r a c o n s t i t u t i o n a l N F 1 m i c r o d e l e t i o n b y e i t h e r m a r k e r a n a l y s i s , s p e c i f i c b r e a k - p o i n t P C R , s e m i - q u a n t i t a t i v e P C R o r F I S H ( 6 ) . T h r e e o f t h e e l e v e n w e r e f o u n d t o c a r r y d e l e t i o n s o f t h e w h o l e N F 1 g e n e [ P a t i e n t s 8 , 2 1 , a n d 2 2 ] . I n t h e c u r r e n t s t u d y , i t w a s n o t p o s s i b l e t o d e t e r m i n e w h e t h e r i n d i v i d u a l s w i t h m i c r o d e l e t i o n s a n d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a r e a t a n e v e n g r e a t e r r i s k o f d e v e l o p i n g M P N S T s c o m p a r e d t o t h o s e w i t h o t h e r p a t h o g e n i c m u t a t i o n s a n d i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . I f r o u t i n e i m a g i n g s t u d i e s o f a d u l t s w i t h N F 1 w e r e a d v o c a t e d t o l o o k f o r i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s o r M P N S T s , i t i s n o t c l e a r h o w s u c h s c r e e n i n g s h o u l d b e d o n e . W e d o n o t k n o w w h i c h t y p e o f i m a g i n g s t u d y w o u l d b e m o s t a p p r o p r i a t e f o r r o u t i n e s c r e e n i n g , h o w o f t e n s u c h s c r e e n i n g s h o u l d b e p e r f o r m e d , o r w h e t h e r a l l N F 1 p a t i e n t s o r o n l y a s u b s e t d e f i n e d b y a g e o r o t h e r c l i n i c a l f e a t u r e s s h o u l d b e s c r e e n e d . S e v e r a l i m a g i n g m e t h o d s a r e a v a i l a b l e , i n c l u d i n g u l t r a s o u n d e x a m i n a t i o n , X - r a y e x a m i n a t i o n , C T , a n d M R I , e a c h o f w h i c h w a s u s e d o n a t l e a s t s o m e o f t h e p a t i e n t s i n t h e p r e s e n t s t u d y . E a c h o f t h e s e t e c h n i q u e s h a s a d v a n t a g e s a n d d i s a d v a n t a g e s . U l t r a s o u n d e x a m i n a t i o n i s a s a f e a n d r e l a t i v e l y i n e x p e n s i v e i m a g i n g p r o c e d u r e , b u t i t h a s b o t h l o w s p a t i a l r e s o l u t i o n a n d p o o r s o f t t i s s u e c o n t r a s t c o m p a r e d t o o t h e r i m a g i n g t e c h n i q u e s . 4 5 C o n v e n t i o n a l r a d i o g r a p h i c e x a m i n a t i o n i s a l s o i n e x p e n s i v e a n d u n d e r o p t i m a l c o n d i t i o n s h a s g o o d s p a t i a l r e s o l u t i o n , b u t s o f t t i s s u e c o n t r a s t a n d t h u s d e t e c t i o n o f i n t e r n a l p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s i s v e r y p o o r . C T p r o v i d e s b e t t e r v i s u a l i z a t i o n o f s o f t t i s s u e s a n d b e t t e r s p a t i a l r e s o l u t i o n b u t i s m o r e e x p e n s i v e . I n a d d i t i o n , C T i n v o l v e s g r e a t e r e x p o s u r e t o i o n i z i n g r a d i a t i o n , w h i c h i s a p a r t i c u l a r c o n c e r n i n p a t i e n t s w h o c a r r y a c o n s t i t u t i o n a l m u t a t i o n o f a t u m o u r s u p p r e s s o r g e n e . M R I p r o v i d e s h i g h s p a t i a l r e s o l u t i o n a n d e x c e l l e n t s o f t t i s s u e c o n t r a s t w i t h o u t e x p o s u r e t o i o n i z i n g r a d i a t i o n b u t i s e x p e n s i v e a n d m o r e t i m e c o n s u m i n g f o r t h e p a t i e n t . H o w e v e r , i t i s p r o b a b l y t h e b e s t a p p r o a c h t o r o u t i n e s c r e e n i n g i f t h e c o s t - b e n e f i t r a t i o c a n b e s h o w n t o j u s t i f y i t . T h e r e i s a n u r g e n t n e e d t o a d d r e s s t h e e x c e s s m o r t a l i t y a n d m o r b i d i t y a s s o c i a t e d w i t h N F 1 m o r e e f f e c t i v e l y , a n d r i g o r o u s p r o s p e c t i v e s t u d i e s w i t h d e t a i l e d p h e n o t y p i c a n a l y s i s a n d i m a g i n g s t u d i e s a r e n e c e s s a r y t o d e t e r m i n e t h e c l i n i c a l u t i l i t y o f r o u t i n e b o d y M R I i n a f f e c t e d a d u l t s . 4 6 REFERENCES 1 . R a s m u s s e n S A , Y a n g Q , F r i e d m a n J M . M o r t a l i t y i n n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 : a n a n a l y s i s u s i n g U . S . d e a t h c e r t i f i c a t e s . A m J H u m G e n e t 2 0 0 1 ; 6 8 : 1 1 1 0 - 8 . 2 . Z o l l e r M , R e m b e c k B , A k e s s o n H O , A n g e r v a l l L . L i f e e x p e c t a n c y , m o r t a l i t y a n d p r o g n o s t i c f a c t o r s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 . A t w e l v e - y e a r f o l l o w - u p o f a n e p i d e m i o l o g i c a l s t u d y i n G o t e b o r g , S w e d e n . A c t a D e r m V e n e r e o l 1 9 9 5 ; 7 5 : 1 3 6 -4 0 . 3 . D u c a t m a n B S , S c h e i t h a u e r B W , P i e p g r a s D G , R e i m a n H M , l l s t r u p D M . M a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o r s . A c l i n i c o p a t h o l o g i c s t u d y o f 1 2 0 c a s e s . C a n c e r 1 9 8 6 ; 5 7 : 2 0 0 6 - 2 1 . 4 . F e r n e r R E , G u t m a n n D H . I n t e r n a t i o n a l c o n s e n s u s s t a t e m e n t o n m a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o r s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s . C a n c e r R e s 2 0 0 2 ; 6 2 : 1 5 7 3 -7 . 5 . E v a n s D G , B a s e r M E , M c G a u g h r a n J , e t a l . M a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o u r s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 . J M e d G e n e t 2 0 0 2 ; 3 9 : 3 1 1 - 4 . 6 . D e R a e d t T , B r e m s H , W o l k e n s t e i n P , e t a l . E l e v a t e d r i s k f o r M P N S T i n N F 1 m i c r o d e l e t i o n p a t i e n t s . A m J H u m G e n e t 2 0 0 3 ; 7 2 : 1 2 8 8 - 9 2 . 7 . L o r e e T R , N o r t h J H J r , W e r n e s s B A , e t a l . M a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o r s o f t h e h e a d a n d n e c k : a n a l y s i s o f p r o g n o s t i c f a c t o r s . O t o l a r y n g o l H e a d N e c k S u r g 2 0 0 0 ; 1 2 2 : 6 6 7 - 7 2 . 8 . W o o d r u f f J M . P a t h o l o g y o f t u m o r s o f t h e p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h i n t y p e 1 n e u r o f i b r o m a t o s i s . A m J M e d G e n e t 1 9 9 9 ; 8 9 : 2 3 - 3 0 . 9 . K o r f B R . M a l i g n a n c y i n n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 . O n c o l o g i s t 2 0 0 0 ; 5 : 4 7 7 - 8 5 . 1 0 . K i n g A A , D e b a u n M R , R i c c a r d i V M , G u t m a n n D H . M a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o r s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 . A m J M e d G e n e t 2 0 0 0 ; 9 3 : 3 8 8 - 9 2 . 1 1 . H u s o n S M . N e u r o f i b r o m a t o s i s 1 : a c l i n i c a l a n d g e n e t i c o v e r v i e w . I n : H u s o n S M , H u g h e s R A C , e d i t o r s . T h e n e u r o f i b r o m a t o s e s : a p a t h o g e n e t i c a n d c l i n i c a l o v e r v i e w . 1 s t e d . L o n d o n : C h a p m a n a n d H a l l M e d i c a l ; 1 9 9 4 . p . 1 6 0 - 2 0 3 . 1 2 . N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h C o n s e n s u s D e v e l o p m e n t C o n f e r e n c e S t a t e m e n t : n e u r o f i b r o m a t o s i s . B e t h e s d a , M d . , U S A , J u l y 1 3 - 1 5 , 1 9 8 7 . N e u r o f i b r o m a t o s i s 1 9 8 8 ; 1 : 1 7 2 - 8 . 1 3 . G u t m a n n D H , A y l s w o r t h A , C a r e y J C , e t a l . T h e d i a g n o s t i c e v a l u a t i o n a n d m u l t i d i s c i p l i n a r y m a n a g e m e n t o f n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 a n d n e u r o f i b r o m a t o s i s 2 . J A M A 1 9 9 7 ; 2 7 8 : 5 1 - 7 . 1 4 . F r i e d m a n J M . E p i d e m i o l o g y o f n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 . A m J M e d G e n e t 1 9 9 9 ; 8 9 : 1 - 6 . 1 5 . F r i e d m a n J M , B i r c h P , G r e e n e C . N a t i o n a l N e u r o f i b r o m a t o s i s F o u n d a t i o n I n t e r n a t i o n a l D a t a b a s e . A m J M e d G e n e t 1 9 9 3 ; 4 5 : 8 8 - 9 1 . 1 6 . D a s c h n e r K , A s s u m G , E i s e n b a r t h I , e f a l . C l o n a l o r i g i n o f t u m o r c e l l s i n a p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a w i t h L O H i n N F 1 i n t r o n 3 8 a n d i n d e r m a l n e u r o f i b r o m a s w i t h o u t L O H o f t h e N F 1 g e n e . B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n 1 9 9 7 ; 2 3 4 : 3 4 6 - 5 0 . 4 7 1 7 . C o l m a n S D , W i l l i a m s C A , W a l l a c e M R . B e n i g n n e u r o f i b r o m a s i n t y p e 1 n e u r o f i b r o m a t o s i s ( N F 1 ) s h o w s o m a t i c d e l e t i o n s o f t h e N F 1 g e n e . N a t G e n e t 1 9 9 5 ; 1 1 : 9 0 - 2 . 1 8 . K l u w e L , F r i e d r i c h R , M a u t n e r V F . L o s s o f N F 1 a l l e l e i n S c h w a n n c e l l s b u t n o t i n f i b r o b l a s t s d e r i v e d f r o m a n N F 1 - a s s o c i a t e d n e u r o f i b r o m a . G e n e s C h r o m o s o m e s C a n c e r 1 9 9 9 ; 2 4 : 2 8 3 - 5 . 1 9 . K l u w e L , F r i e d r i c h R E , M a u t n e r V F . A l l e l i c l o s s o f t h e N F 1 g e n e i n N F 1 -a s s o c i a t e d p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . C a n c e r G e n e t C y t o g e n e t 1 9 9 9 ; 1 1 3 : 6 5 - 9 . 2 0 . R a s m u s s e n S A , O v e r m a n J , T h o m s o n S A , etal. C h r o m o s o m e 1 7 l o s s - o f -h e t e r o z y g o s i t y s t u d i e s i n b e n i g n a n d m a l i g n a n t t u m o r s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 . G e n e s C h r o m o s o m e s C a n c e r 2 0 0 0 ; 2 8 : 4 2 5 - 3 1 . 2 1 . S e r r a E , P u i g S , O t e r o D , e t a l . C o n f i r m a t i o n o f a d o u b l e - h i t m o d e l f o r t h e N F 1 g e n e i n b e n i g n n e u r o f i b r o m a s . A m J H u m G e n e t 1 9 9 7 ; 6 1 : 5 1 2 - 9 . 2 2 . S e r r a E , A r s E , R a v e l l a A , e t a l . S o m a t i c N F 1 m u t a t i o n a l s p e c t r u m i n b e n i g n n e u r o f i b r o m a s : m R N A s p l i c e d e f e c t s a r e c o m m o n a m o n g p o i n t m u t a t i o n s . H u m G e n e t 2 0 0 1 ; 1 0 8 : 4 1 6 - 2 9 . 2 3 . S k u s e G R , K o s c i o l e k B A , R o w l e y P T . T h e n e u r o f i b r o m a i n v o n R e c k l i n g h a u s e n n e u r o f i b r o m a t o s i s h a s a u n i c e l l u l a r o r i g i n . A m J H u m G e n e t 1 9 9 1 ; 4 9 : 6 0 0 - 7 . 2 4 . T u c k e r T , F r i e d m a n J M . P a t h o g e n e s i s o f h e r e d i t a r y t u m o r s : b e y o n d t h e " t w o - h i t " h y p o t h e s i s . C l i n G e n e t 2 0 0 2 ; 6 2 : 3 4 5 - 5 7 . 2 5 . S z u d e k J , B i r c h P , R i c c a r d i V M , E v a n s D G , F r i e d m a n J M . A s s o c i a t i o n s o f c l i n i c a l f e a t u r e s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 ( N F 1 ) . G e n e t E p i d e m i o l 2 0 0 0 ; 1 9 : 4 2 9 - 3 9 . 2 6 . M c G a u g h r a n J M , H a r r i s D l , D o n n a i D , e t a l . A c l i n i c a l s t u d y o f t y p e 1 n e u r o f i b r o m a t o s i s i n n o r t h w e s t E n g l a n d . J M e d G e n e t 1 9 9 9 ; 3 6 : 1 9 7 - 2 0 3 . 2 7 . H u s o n S M , H a r p e r P S , C o m p s t o n D A . V o n R e c k l i n g h a u s e n n e u r o f i b r o m a t o s i s . A c l i n i c a l a n d p o p u l a t i o n s t u d y i n s o u t h - e a s t W a l e s . B r a i n 1 9 8 8 ; 1 1 1 : 1 3 5 5 - 8 1 . 2 8 . F r i e d m a n J M , B i r c h P H . T y p e 1 n e u r o f i b r o m a t o s i s : a d e s c r i p t i v e a n a l y s i s o f t h e d i s o r d e r i n 1 , 7 2 8 p a t i e n t s . A m J M e d G e n e t 1 9 9 7 ; 7 0 : 1 3 8 - 4 3 . 2 9 . T o n s g a r d J H , K w a k S M , S h o r t M P , D a c h m a n A H . C T i m a g i n g i n a d u l t s w i t h n e u r o f i b r o m a t o s i s - ! " f r e q u e n t a s y m p t o m a t i c p l e x i f o r m l e s i o n s . N e u r o l o g y 1 9 9 8 ; 5 0 : 1 7 8 8 - 6 0 . 3 0 . T h a k k a r S D , F e i g e n U , M a u t n e r V F . S p i n a l t u m o u r s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 : a n M R I s t u d y o f f r e q u e n c y , m u l t i p l i c i t y a n d v a r i e t y . N e u r o r a d i o l o g y 1 9 9 9 ; 4 1 : 6 2 5 -9 . 3 1 . M a u t n e r V F , F r i e d r i c h R E , v o n D e i m l i n g A , e t a l . M a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o u r s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 : M R I s u p p o r t s t h e d i a g n o s i s o f m a l i g n a n t p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a . N e u r o r a d i o l o g y 2 0 0 3 ; 4 5 : 6 1 8 - 2 5 . 3 2 . L o r e e T R , N o r t h J H J r , W e r n e s s B A , e t a l . M a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o r s o f t h e h e a d a n d n e c k : a n a l y s i s o f p r o g n o s t i c f a c t o r s . O t o l a r y n g o l H e a d N e c k S u r g 2 0 0 0 ; 1 2 2 : 6 6 7 - 7 2 . 4 8 3 3 . K h o s r o t e h r a n i K , B a s t u j i - G a r i n S , R i c c a r d i V M , e t a l . S u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s a r e a s s o c i a t e d w i t h m o r t a l i t y i n n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 : A c o h o r t s t u d y o f 7 0 3 p a t i e n t s . A m J M e d G e n e t 2 0 0 5 ; 1 3 2 : 4 9 - 5 3 . 3 4 . R a s m u s s e n S A , F r i e d m a n J M . N F 1 g e n e a n d n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 . A J E p i d e m i o l 2 0 0 0 ; 1 5 1 : 3 3 - 4 0 . 4 9 3. H E T E R O G E N E T I T Y O F M A S T C E L L DISTRIBUTION IN NF1 N E U R O F I B R O M A S 2 INTRODUCTION N e u r o f i b r o m a t o s i s 1 ( N F 1 ) i s a n a u t o s o m a l d o m i n a n t d i s o r d e r w i t h a n i n c i d e n c e o f 1 : 3 5 0 0 ( 1 ) . B e n i g n n e u r o f i b r o m a s a r e t h e h a l l m a r k f e a t u r e o f N F 1 . A l l n e u r o f i b r o m a s c o n t a i n S c h w a n n c e l l s ( t h e s u s p e c t e d p r o g e n i t o r c e l l t y p e ) , b u t f i b r o b l a s t s , m a s t c e l l s , l y m p h o c y t e s , p e r i n e u r i a l c e l l s , e n d o n e u r i a l f i b r o b l a s t s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s a l s o o c c u r i n v a r y i n g n u m b e r s ( 2 ) . N e u r o f i b r o m a s a l s o v a r y i n t e r m s o f t h e i r a g e o f a p p e a r a n c e , n a t u r a l h i s t o r y , a n d m a l i g n a n t p o t e n t i a l . C o n s e q u e n t l y , s e v e r a l d i f f e r e n t c l a s s i f i c a t i o n s o f n e u r o f i b r o m a s h a v e b e e n p r o p o s e d ( T a b l e 3 . 1 ) . Table 3.1 Examples of different classifications for NF1-associated neurofibromas. Source Types of Neurofibromas Clinical C r o w e , S c h u l l & N e e l ( 3 ) C u t a n e o u s S u b c u t a n e o u s P l e x i f o r m R i c c a r d i ( 4 ) C u t a n e o u s S u b c u t a n e o u s N o d u l a r p l e x i f o r m D i f f u s e p l e x i f o r m H u s o n & H u g h e s ( 5 ) D e r m a l N o d u l a r P l e x i f o r m K o r f & R u b e n s t e i n ( 6 ) D e r m a l P l e x i f o r m Histopathological H a r k i n a n d R e e d ( 7 ) P l e x i f o r m N o n - p l e x i f o r m M a s s o n ( 8 ) E n c a p s u l a t e d D i f f u s e W o o d r u f f ( 9 ) L o c a l i z e d c u t a n e o u s L o c a l i z e d s u b c u t a n e o u s P l e x i f o r m D i f f u s e ( s k i n o r s u b c u t a n e o u s l a y e r ) M a s s i v e s o f t t i s s u e 2 A v e r s i o n o f t h i s c h a p t e r h a s b e e n s u b m i t t e d for p u b l i c a t i o n . T u c k e r T, R i c c a r d i V M , Su t c l i f f M , V i e l k i n d J , W e c h s l e r J , W o l k e n s t e i n P, F r i e d m a n J M . H e t e r o g e n e i t y o f m a s t ce l l d i s t r i b u t i o n i n N F l n e u r o f i b r o m a s . 5 0 N o n e o f t h e s e c l a s s i f i c a t i o n s h a s a c h i e v e d u n i v e r s a l a c c e p t a n c e , a n d t h e l i t e r a t u r e c o n t a i n s m a n y e x a m p l e s o f i n c o n s i s t e n t u s e a n d c o n f u s i o n o f v a r i o u s c l i n i c a l a n d p a t h o l o g i c a l d e s c r i p t i v e t e r m s . M o s t s t u d i e s o f n e u r o f i b r o m a p a t h o g e n e s i s t r e a t a l l n e u r o f i b r o m a s a s a s i n g l e c l a s s d e s p i t e t h e i r c l i n i c a l a n d p a t h o g e n i c h e t e r o g e n e i t y . T h i s h e t e r o g e n e i t y i s i m p o r t a n t b e c a u s e s o m e k i n d s o f n e u r o f i b r o m a s h a v e l i t t l e , i f a n y , m a l i g n a n t p o t e n t i a l , w h i l e o t h e r k i n d s m a y p r o g r e s s t o m a l i g n a n c y . T h e r e s u l t i n g n e o p l a s m s , m a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o u r s ( M P N S T s ) , a r e o n e o f t h e l e a d i n g c a u s e s o f d e a t h i n N F 1 p a t i e n t s ( 1 0 ) . T h e r e i s c u r r e n t l y n o e f f e c t i v e t r e a t m e n t k n o w n f o r b e n i g n n e u r o f i b r o m a s o r M P N S T s e x c e p t s u r g i c a l r e m o v a l i n f a v o u r a b l e c a s e s . A l t h o u g h t h e S c h w a n n c e l l i s t h e p r o m i n e n t c e l l t y p e i n n e u r o f i b r o m a s , m a s t c e l l s m a y p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n n e u r o f i b r o m a d e v e l o p m e n t ( 1 1 ) , a n d m a s t c e l l i n f i l t r a t i o n i s a p r o m i n e n t f e a t u r e o f s o m e n e u r o f i b r o m a s ( 1 2 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , w e u s e d h i s t o l o g i c a l a n d i m m u n o h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e s t o s t u d y t h e o c c u r r e n c e a n d d i s t r i b u t i o n o f m a s t c e l l s i n n e u r o f i b r o m a s f r o m i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 . N e u r o f i b r o m a s w e r e c l a s s i f i e d h i s t o p a t h o l o g i c a l l y a s d i f f u s e o r n o d u l a r ( s i n g l e o r p l e x i f o r m ) . N o d u l a r n e u r o f i b r o m a s a r e c i r c u m s c r i b e d b y t h e p e r i n e u r i u m w h i l e d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s a r e n o t . W e f o u n d t h a t d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s h a d a h i g h e r p r o p o r t i o n a n d m o r e u n i f o r m d i s t r i b u t i o n o f m a s t c e l l s t h a n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s . M a s t c e l l s t h a t w e r e p r e s e n t w i t h i n a t u m o u r r e g i o n s h o w e d n o o b v i o u s c l u s t e r i n g a r o u n d b l o o d v e s s e l s a n d w e r e n o t s e e n i n t h e s u r r o u n d i n g n o r m a l t i s s u e . M a s t c e l l s w e r e r a r e l y s e e n i n N F 1 -a s s o c i a t e d M P N S T s . MATERIALS & METHODS Sample Collection W e c o l l e c t e d f o r m a l i n f i x e d - p a r a f f i n e m b e d d e d s a m p l e s f r o m C r e t e i l H o s p i t a l ( P a r i s , F r a n c e ) , T h e N e u r o f i b r o m a t o s i s I n s t i t u t e ( L a C r e s c e n t a , C a l i f o r n i a ) , V a n c o u v e r G e n e r a l H o s p i t a l ( V a n c o u v e r , C a n a d a ) a n d C h i l d r e n ' s a n d W o m e n ' s H o s p i t a l ( V a n c o u v e r , C a n a d a ) . A l l i n d i v i d u a l s h a d a c o n f i r m e d d i a g n o s i s o f N F 1 a c c o r d i n g t o e s t a b l i s h e d c r i t e r i a ( 1 3 ) . I n t o t a l w e s t u d i e d 4 9 b e n i g n n e u r o f i b r o m a s f r o m 3 7 i n d i v i d u a l s a n d 4 M P N S T s f r o m 4 i n d i v i d u a l s . T h e s t u d y p r o t o c o l w a s a p p r o v e d b y t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a R e s e a r c h E t h i c s C o m m i t t e e . 5 1 Histopathological Classification of Neurofibromas E a c h n e u r o f i b r o m a w a s c l a s s i f i e d h i s t o p a t h o l o g i c a l l y o n t h e b a s i s o f i t s a p p e a r a n c e i n h e m o t o x y l i n a n d e o s i n ( H & E ) s t a i n e d s e c t i o n s a s d i f f u s e o r n o d u l a r a c c o r d i n g t o t h e d e f i n i t i o n s u s e d b y o n e o f t h e a u t h o r s ( J . W . ) . T h e d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s w e r e p r e d o m i n a n t l y l o c a t e d i n t h e d e r m i s a n d i n v o l v e d t h e t h i n t e r m i n a l b r a n c h e s o f p e r i p h e r a l n e r v e s . D i f f u s e n e u r o f i b r o m a s w e r e c h a r a c t e r i z e d b y p r o l i f e r a t i o n o f c e l l s t h a t a r e n o t l i m i t e d b y t h e p e r i n e u r i u m a n d c a n e n c i r c l e n o r m a l s t r u c t u r e s ( e x o c r i n e g l a n d s , h a i r f o l l i c l e s a n d v e s s e l s ) w i t h o u t d e s t r o y i n g t h e m . T h e p r o l i f e r a t i n g c e l l s w e r e i r r e g u l a r l y d i s p e r s e d w i t h i n a f i b r o u s a n d / o r m y x o i d b a c k g r o u n d . M y e l i n f i b r i l s w e r e r a r e o r a b s e n t . N o d u l a r n e u r o f i b r o m a s u s u a l l y i n v o l v e d d e e p e r t i s s u e s , a n d t h e c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n i s i n t r a n e u r a l , e n c l o s e d w i t h i n l a r g e h y p e r t r o p h i c n e r v e s c i r c u m s c r i b e d b y t h e p e r i n e u r i u m . T h e n o d u l a r t u m o u r s i n c l u d e d b o t h s i n g l e a n d p l e x i f o r m t y p e s . S i n g l e n o d u l a r t u m o u r s i n v o l v e j u s t o n e f a s c i c l e , w h i l e n o d u l a r p l e x i f o r m t u m o u r s m a y i n v o l v e s e v e r a l f a s c i c l e s , n e r v e b r a n c h e s o r a n e r v e p l e x u s . D i s p e r s e d o r f a s c i c u l a r m y e l i n f i b r i l s a r e u s u a l l y f o u n d i n t h e c e n t r a l a r e a o f t h e n o d u l e s . O n t r a n s v e r s e s e c t i o n , t h e c e n t r a l a r e a i s l o o s e w i t h a m y x o i d b a c k g r o u n d s u b s t a n c e , w h i l e t h e p e r i p h e r a l a r e a i s u s u a l l y m o r e c e l l u l a r . S o m e n e u r o f i b r o m a s c o n t a i n b o t h d i f f u s e a n d n o d u l a r c o m p o n e n t s ; s u c h t u m o u r s a r e u s u a l l y f o u n d i n t h e d e e p d e r m i s a n d s u b c u t a n e o u s t i s s u e . T h e n o d u l a r c o m p o n e n t i s s u r r o u n d e d b y d i f f u s e e x t r a n e u r a l c e l l p r o l i f e r a t i o n , i n f i l t r a t i n g t h e f a t t i s s u e a n d o t h e r n o r m a l p r e - e x i s t i n g s t r u c t u r e s . T h e d i a g n o s i s o f a l l 4 M P N S T s w a s o b t a i n e d f r o m t h e h i s t o p a t h o l o g y r e p o r t s . Identification of Granulated Mast Cells S e r i a l s e c t i o n s w e r e c u t f r o m e a c h n e u r o f i b r o m a . O n e s e c t i o n w a s s t a i n e d w i t h H & E , a n d a s e c o n d s e c t i o n w a s s t a i n e d w i t h 0 . 1 % t o l u i d i n e b l u e , a m e t a c h r o m a t i c d y e t h a t u n i q u e l y i d e n t i f i e s n o r m a l g r a n u l a t e d m a s t c e l l s . S e c t i o n s w e r e d e p a r a f f i n i z e d i n x y l e n e , h y d r a t e d t h r o u g h g r a d e d a l c o h o l s ( 1 0 0 % , 9 5 % , a n d 7 0 % ) a n d s t a i n e d w i t h t o l u i d i n e b l u e f o r 3 0 s e c o n d s a n d r i n s e d i n w a t e r . T h e s l i d e s w e r e t h e n d e h y d r a t e d t h r o u g h g r a d e d a l c o h o l ( 7 0 % , 9 5 % , 1 0 0 % ) a n d c l e a r e d i n x y l e n e . 5 2 Identification of Mast Cells and Schwann Cells I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y u s i n g a c - K i t a n t i b o d y w a s p e r f o r m e d t o i d e n t i f y a l l m a s t c e l l s , r e g a r d l e s s o f w h e t h e r t h e y c o n t a i n t o l u i d i n e b l u e - p o s i t i v e g r a n u l e s . S e r i a l s e c t i o n s w e r e c u t f r o m 9 b e n i g n n e u r o f i b r o m a s ( 5 d i f f u s e a n d 4 n o d u l a r ) a n d f r o m 3 M P N S T s . O n e s e c t i o n o f e a c h f o r c - K i t , a n d o n e w a s d u a l l a b e l e d f o r c - K i t a n d S 1 0 0 ( a S c h w a n n c e l l m a r k e r ) . A f t e r d e p a r a f f i n i z a t i o n , h e a t a n t i g e n r e t r i e v a l w a s p e r f o r m e d a t 7 0 ° C i n E D T A b u f f e r p H 6 . 0 . E n d o g e n o u s p e r o x i d a s e a c t i v i t y w a s b l o c k e d w i t h 3 % h y d r o g e n p e r o x i d a s e s o l u t i o n . T h e t i s s u e s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 : 4 0 0 m o u s e a n t i - h u m a n c - K i t a n t i b o d y ( Z y m e d , S a n F r a n c i s c o , C A ) o v e r - n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e . T h e s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d w i t h a b i o t i n - l a b e l e d g o a t a n t i - m o u s e I g G s e c o n d a r y a n t i b o d y a n d v i s u a l i z e d u s i n g A B C E l i t e a n d N o v a R e d ( V e c t o r L a b o r a t o r i e s , C a n a d a I n c , B u r l i n g t o n , O N ) . N u c l e i w e r e i d e n t i f i e d u s i n g h e m o t o x y l i n . D u a l i m m u n o h i s t o c h e m i s t y w a s p e r f o r m e d a s a b o v e w i t h t h e a d d i t i o n o f 1 : 4 0 0 r a b b i t a n t i - h u m a n S 1 0 0 a n t i b o d y ( D a k o C y t o m a t i o n , M i s s i s s a u g a , O N ) a n d m o u s e a n t i - h u m a n c - K i t a n t i b o d y . S e c o n d a r y a n t i b o d i e s w e r e c o n j u g a t e d w i t h A l e x a 4 8 8 o r A l e x a 5 6 8 ( I n v i t r o g e n C a n a d a I n c . , B u r l i n g t o n , O N ) Tumour Characteristics H & E a n d t o l u i d i n e b l u e - s t a i n e d t u m o u r s w e r e i n d e p e n d e n t l y r e v i e w e d b y t w o o f t h e a u t h o r s ( M . S . a n d T . T . ) . E a c h t u m o u r w a s g r a d e d a s a w h o l e o n a 3 - p o i n t L i k e r t s c a l e f o r c e l l u l a r i t y a n d v a s c u l a r i t y a n d o n a 4 - p o i n t L i k e r t s c a l e f o r m a s t c e l l d e n s i t y a n d l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n . F o r c e l l u l a r i t y a n d v a s c u l a r i t y , s c a l i n g w a s d e t e r m i n e d a t 2 0 0 x m a g n i f i c a t i o n o n t h e H & E s e c t i o n . M a s t c e l l d e n s i t y w a s d e t e r m i n e d a t 4 0 0 x m a g n i f i c a t i o n o n t o l u i d i n e b l u e - s t a i n e d s l i d e s a n d r a t e d a s 0 , 1 - 5 , 6 - 1 0 a n d > 1 0 m a s t c e l l s p e r f i e l d . L y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d a t 4 0 0 x m a g n i f i c a t i o n a s a p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l c e l l s . F i v e t o e i g h t f i e l d s c h o s e n a t r a n d o m w e r e t a k e n t o r e p r e s e n t t h e t u m o u r a s a w h o l e . I n a d d i t i o n , t h e t o t a l n u m b e r o f m a s t c e l l s p e r s e c t i o n w a s d e t e r m i n e d b y m a n u a l c o u n t i n g o f o n e s e c t i o n o n b o t h t h e t o l u i d i n e b l u e a n d c - K i t s t a i n e d s e c t i o n s . T h e s a m p l e s w e r e s c a n n e d t o d e t e r m i n e i f t h e r e w a s a n y c l u s t e r i n g o f m a s t c e l l s i n p a r t i c u l a r r e g i o n s o r a r o u n d p a r t i c u l a r t u m o u r f e a t u r e s , a n d t h e a d j a c e n t n o r m a l t i s s u e , w h e n p r e s e n t , w a s c o m p a r e d t o t h e t u m o u r t i s s u e t o d e t e r m i n e i f t h e r e w e r e d i f f e r e n c e s i n c e l l u l a r i t y , v a s c u l a r i t y o r m a s t c e l l d e n s i t y . 5 3 Statistical Analysis K e n d a l l ' s c o r r e l a t i o n w a s c a l c u l a t e d u s i n g S P S S ( S P S S , I n c . C h i c a g o , I l l i n o i s , 2 0 0 1 ) t o d e t e r m i n e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n v a s c u l a r i t y , c e l l u l a r i t y a n d m a s t c e l l d e n s i t y . T h e M a n n - W h i t n e y U r a n k t e s t w a s p e r f o r m e d u s i n g S P S S ( S P S S , I n c . C h i c a g o , I l l i n o i s , 2 0 0 1 ) t o d e t e r m i n e i f t h e r e w a s a s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e m a s t c e l l d e n s i t y b e t w e e n t h e t w o t y p e s o f n e u r o f i b r o m a s . A p - v a l u e l e s s t h a n o r e q u a l t o 0 . 0 5 w a s c o n s i d e r e d t o b e s i g n i f i c a n t . RESULTS M a s t c e l l s a r e p r e s e n t i n m a n y n e u r o f i b r o m a s , b u t i t i s n o t k n o w n i f t h e q u a n t i t y o r d i s t r i b u t i o n o f m a s t c e l l s d i f f e r s b e t w e e n d i f f e r e n t t y p e s o f n e u r o f i b r o m a s . W e s t u d i e d t h e c e l l u l a r i t y , v a s c u l a r i t y , a n d d e n s i t y a n d d i s t r i b u t i o n o f m a s t c e l l s i n 4 9 b e n i g n n e u r o f i b r o m a s f r o m 3 7 N F 1 p a t i e n t s a n d i n 4 M P N S T s f r o m 4 N F 1 p a t i e n t s . E a c h o f t h e b e n i g n t u m o u r s w a s c l a s s i f i e d h i s t o l o p a t h o l o g i c a l l y a s a d i f f u s e o r n o d u l a r n e u r o f i b r o m a . 3 2 o f t h e n e u r o f i b r o m a s w e s t u d i e d ( f r o m 2 7 i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 ) w e r e c l a s s i f i e d h i s t o p a t h o l o g i c a l l y a s d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . 1 5 o f t h e n e u r o f i b r o m a s ( f r o m 9 i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 ) w e r e c l a s s i f i e d a s n o d u l a r t u m o u r s . T w o n e u r o f i b r o m a s ( f r o m 2 i n d i v i d u a l s ) w e r e a m i x o f b o t h d i f f u s e a n d n o d u l a r c o m p o n e n t s a n d w e r e n o t i n c l u d e d i n t h e s t a t i s t i c a l a n a l y s i s d u e t o t h e s m a l l n u m b e r . F i g u r e 3 . 1 s h o w s e x a m p l e s o f d i f f u s e a n d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s w i t h t y p i c a l p a t t e r n s o f c e l l u l a r i t y , v a s c u l a r i t y , a n d l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n o n H & E s t a i n i n g . T h e m a s t c e l l d i s t r i b u t i o n i n e a c h o f t h e s e s a m e n e u r o f i b r o m a s a s d e t e r m i n e d b y t o l u i d i n e b l u e s t a i n i n g i s a l s o s h o w n . 5 4 F i g u r e 3 . 1 I m a g e s o f t y p i c a l n e u r o f i b r o m a s i n t h e c u r r e n t s t u d y t h a t r e p r e s e n t t h e m a j o r i t y o f t h e t u m o u r . A . H & E s e c t i o n o f a d i f f u s e n e u r o f i b r o m a a t 1 0 0 x m a g n i f i c a t i o n . B . S e r i a l s e c t i o n t o ( A ) s t a i n e d w i t h t o l u i d i n e b l u e t o i d e n t i f y m a s t c e l l s ( * ) a t 1 0 0 x m a g n i f i c a t i o n t a k e n a t t h e p e r i p h e r y o f t h e t u m o u r . C . H & E s e c t i o n o f a n o d u l a r n e u r o f i b r o m a a t 1 0 0 x m a g n i f i c a t i o n . D . S e r i a l s e c t i o n t o ( C ) s t a i n e d w i t h t o l u i d i n e b l u e t o i d e n t i f y m a s t c e l l s a t 1 0 0 x m a g n i f i c a t i o n . N o t e t h e h i g h e r c e l l u l a r i t y a n d a b u n d a n c e o f s m a l l e r b l o o d v e s s e l s ( a r r o w ) i n A c o m p a r e d t o C a n d t h e l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n ( L ) i n C , s o m e o f w h i c h i s i n d i c a t e d . A l s o n o t e t h e p r e s e n c e o f t h e r e d d i s h - p u r p l e m a s t c e l l s ( * ) i n t h e d i f f u s e n e u r o f i b r o m a ( B ) a n d t h e a b s e n c e o f m a s t c e l l s i n t h e n o d u l a r n e u r o f i b r o m a ( D ) . Cellularity N o d u l a r n e u r o f i b r o m a s t e n d t o b e l e s s c e l l u l a r t h a n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s ( F i g u r e 3 . 1 ) , w i t h a l m o s t 8 0 % o f n o d u l a r t u m o u r s f a l l i n g i n t o c a t e g o r y 1 f o r c e l l u l a r i t y ( F i g u r e 3 . 2 ) . T h e s e t u m o u r s d i s p l a y e d m o r e d e n s e f i b r o t i c t i s s u e a n d a r e a s o f d e g e n e r a t i o n i n t h e c e n t r a l p o r t i o n o f t h e n e u r o f i b r o m a b u t n o t a t t h e p e r i p h e r y . I n c o n t r a s t , t h e d i f f u s e t u m o u r s h a d h i g h e r c e l l u l a r i t y w i t h a m o r e u n i f o r m d i s t r i b u t i o n o f c e l l s t h r o u g h o u t t h e t u m o u r . T h e r e w a s a s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n b e t w e e n c e l l u l a r i t y a n d h i s t o p a t h o l o g i c a l t u m o u r t y p e ( K e n d a l l ' s t a u = - 0 . 3 8 4 , p = 0 . 0 0 7 ) . 5 5 Figure 3.2 Distribution of pathological features of neurofibromas classified histopathologically. A . C e l l u l a r i t y e s t i m a t e d o n a 3 - p o i n t L i k e r t s c a l e w i t h 3 b e i n g t h e h i g h e s t c e l l u l a r i t y ; B . V a s c u l a r i t y e s t i m a t e d o n a 3 - p o i n t L i k e r t s c a l e w i t h 3 b e i n g t h e h i g h e s t v a s c u l a r i t y ; a n d C . M a s t c e l l d e n s i t y e s t i m a t e d o n a 4 - p o i n t L i k e r t s c a l e w i t h 4 b e i n g t h e h i g h e s t m a s t c e l l d e n s i t y . • D i f f u s e n e u r o f i b r o m a s • N o d u l a r n e u r o f i b r o m a s Cellularity B 1.0000 £: 0.2000 0.0000 2 Vascular i ty T h e r e w a s o f t e n a h i g h e r p r o p o r t i o n o f l y m p h o c y t e s w i t h i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s t h a n w i t h i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . L y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n w a s g e n e r a l l y d i s t r i b u t e d e v e n l y w i t h i n t h e n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s ( F i g u r e 3 . 1 ) , w h i l e l y m p h o c y t e s w e r e m o r e l o c a l i z e d w h e n t h e y w e r e o b s e r v e d i n d i f f u s e t u m o u r s . 56 Vascularity N o d u l a r n e u r o f i b r o m a s t y p i c a l l y h a d f e w e r l a r g e v e s s e l s t h a n d i f f u s e t u m o u r s , w h i c h h a d m o r e s m a l l e r v e s s e l s ( F i g u r e 3 . 1 ) . V e s s e l s w e r e e v e n l y d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t t h e t u m o u r i n d i f f u s e a n d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s . O v e r a l l , v a s c u l a r i t y w a s n o t s i g n i f i c a n t l y c o r r e l a t e d w i t h t u m o u r t y p e ( K e n d a l l ' s t a u = - 0 . 2 4 3 , p = 0 . 0 8 5 ) . H o w e v e r , v a s c u l a r i t y w a s s i g n i f i c a n t l y c o r r e l a t e d w i t h c e l l u l a r i t y ( K e n d a l l ' s t a u = 0 . 5 1 0 , p < 0 . 0 0 1 , ) , a s m o r e c e l l u l a r n e u r o f i b r o m a s h a d a h i g h e r n u m b e r o f b l o o d v e s s e l s . Mast Cell Distribution Within Neurofibromas and MPNSTs T h e m a j o r i t y o f m a s t c e l l s w e r e l o c a t e d w i t h i n t h e t u m o u r c o m p o n e n t , w i t h o n l y a f e w l o c a t e d i n t h e s u r r o u n d i n g n o r m a l t i s s u e . N o d u l a r n e u r o f i b r o m a s h a d s i g n i f i c a n t l y f e w e r m a s t c e l l s t h a n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s ( p = 0 . 0 2 1 ) ( F i g u r e s 3 . 1 & 3 . 2 ) . T h e f e w m a s t c e l l s s e e n w i t h i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s w e r e l o c a t e d a t t h e p e r i p h e r y o f t h e t u m o u r s ( F i g u r e 3 . 3 A & 3 . 3 B ) . T h e m a s t c e l l s w e r e e v e n l y d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s , w i t h n o o b v i o u s m a s t c e l l c l u s t e r s f o r m i n g a r o u n d p a r t i c u l a r s t r u c t u r e s ( F i g u r e 3 . 1 ) . A r e a s o f n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s s e e n w i t h i n a m i x e d n o d u l a r a n d d i f f u s e t u m o u r c o n t a i n e d v e r y f e w m a s t c e l l s , a l t h o u g h t h e s u r r o u n d i n g d i f f u s e t u m o u r t i s s u e c o n t a i n e d m a n y m a s t c e l l s ( F i g u r e 3 . 3 C & 3 . 3 D ) . 5 7 F i g u r e 3 . 3 M a s t c e l l d i s t r i b u t i o n w i t h i n n e u r o f i b r o m a s . A . H & E s t a i n i n g o f a n o d u l a r n e u r o f i b r o m a a n d a d j a c e n t p e r i n e u r i u m a t 2 0 0 x m a g n i f i c a t i o n . B . T o l u i d i n e b l u e s t a i n i n g o f a s e r i a l s e c t i o n o f t h e s a m e n o d u l a r n e u r o f i b r o m a a t 2 0 0 x m a g n i f i c a t i o n s h o w i n g c l u s t e r i n g o f m a s t c e l l s ( * ) i n t h e p e r i n e u r i u m a t t h e p e r i p h e r y o f t h e n e u r o f i b r o m a . C . H & E s t a i n i n g a t 5 0 x m a g n i f i c a t i o n o f a n e u r o f i b r o m a t h a t h a s b o t h d i f f u s e ( D ) a n d n o d u l a r c o m p o n e n t s ( N ) . D . T o l u i d i n e b l u e s t a i n i n g o f a s e r i a l s e c t i o n o f t h e s a m e n e u r o f i b r o m a i n ( D ) s h o w i n g m a s t c e l l s ( * ) w i t h i n t h e d i f f u s e c o m p o n e n t ( D ) , b u t f e w a r e o b s e r v e d w i t h i n t h e n o d u l a r c o m p o n e n t ( N ) . M a s t c e l l s d i d n o t a p p e a r t o c l u s t e r a r o u n d b l o o d v e s s e l s o r w i t h i n a r e a s o f l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n , b u t m a s t c e l l d e n s i t y w a s c o r r e l a t e d w i t h o v e r a l l t u m o u r v a s c u l a r i t y ( K e n d a l l ' s t a u = 0 . 5 1 3 , p < 0 . 0 0 1 ) a n d c e l l u l a r i t y ( K e n d a l l ' s t a u = 0 . 4 5 6 , p = 0 . 0 0 1 ) . F o u r M P N S T s w e r e a l s o s t a i n e d w i t h t o l u i d i n e b l u e . T w o h a d n o o b s e r v a b l e m a s t c e l l s , a n d a n o t h e r h a d v e r y f e w m a s t c e l l s . T h e f o u r t h M P N S T i n c l u d e d a b e n i g n - a p p e a r i n g c o m p o n e n t f r o m w h i c h t h e m a l i g n a n c y m a y h a v e a r i s e n . I n t h i s s a m p l e , m a s t c e l l s w e r e f r e q u e n t i n t h e b e n i g n r e g i o n b u t a b s e n t f r o m t h e m a l i g n a n t p o r t i o n ( F i g u r e 3 . 4 ) . 5 8 F i g u r e 3 . 4 M a s t c e l l d i s t r i b u t i o n i n M P N S T s . A . H & E s e c t i o n o f a h i s t o l o g i c a l l y b e n i g n n e u r o f i b r o m a c o m p o n e n t a d j a c e n t t o a M P N S T a t 5 0 x m a g n i f i c a t i o n . B . S e r i a l s e c t i o n o f a h i s t o l o g i c a l l y b e n i g n n e u r o f i b r o m a a d j a c e n t t o a n M P N S T s t a i n e d f o r t o l u i d i n e b l u e s h o w i n g m a s t c e l l s ( * ) a t 5 0 x m a g n i f i c a t i o n . C . H & E s e c t i o n o f a m a l i g n a n t c o m p o n e n t o f t h e s a m e M P N S T s h o w i n g h i g h c e l l u l a r i t y a n d m i t o s e s a t 1 0 0 x m a g n i f i c a t i o n . D . S e r i a l s e c t i o n o f t h e m a l i g n a n t c o m p o n e n t s t a i n e d f o r t o l u i d i n e b l u e s h o w i n g t h e a b s e n c e o f m a s t c e l l s a t 1 0 0 x m a g n i f i c a t i o n . Distribution of Granulated and Non-granulated Mast Cells T o e n s u r e t h a t t h e d i f f e r e n c e s w e f o u n d i n m a s t c e l l d e n s i t y w e r e n o t b i a s e d b y o b s e r v i n g o n l y t h e g r a n u l a t e d m a s t c e l l s s h o w n w i t h t o l u i d i n e b l u e , w e u s e d c - K i t i m m u n o s t a i n i n g t o i d e n t i f y a l l m a s t c e l l s , b o t h g r a n u l a t e d a n d d e g r a n u l a t e d . T h e n u m b e r o f c - K i t p o s i t i v e c e l l s w a s h i g h e r t h a n t h e n u m b e r o f t o l u i d i n e b l u e p o s i t i v e c e l l s i n e a c h o f t h e t u m o u r s s t u d i e d . T o e n s u r e t h a t t h i s i n c r e a s e w a s n o t d u e t o n e o p l a s t i c S c h w a n n c e l l s a s w e l l a s m a s t c e l l s e x p r e s s i n g c - K i t , w e d u a l i m m u n o l a b e l e d a n a d j a c e n t s e c t i o n o f e a c h t u m o u r w i t h a n t i b o d i e s t o c - K i t a n d S 1 0 0 . N o c o l o c a l i z a t i o n o f t h e c - K i t a n d S 1 0 0 s i g n a l s w a s s e e n w i t h c o n f o c a l i m a g i n g ( F i g u r e 3 . 5 ) . W e c o n c l u d e t h a t t h e g r e a t e r f r e q u e n c y o f c - K i t - p o s i t i v e t h a n t o l u i d i n e b l u e - p o s i t i v e c e l l s i n t h e s e 5 9 t u m o u r s p r o b a b l y i n d i c a t e s t h a t s o m e m a s t c e l l d e g r a n u l a t i o n o c c u r s i n b o t h t y p e s o f n e u r o f i b r o m a s . Figure 3.5 Confocal image of a diffuse neurofibroma stained with S100 and c-Kit. C o n f o c a l i m a g e o f a d i f f u s e n e u r o f i b r o m a a t 4 0 0 x m a g n i f i c a t i o n s h o w i n g s t a i n i n g f o r b o t h S 1 0 0 + ( r e d ) S c h w a n n c e l l s a n d c - K i t + ( g r e e n ) m a s t c e l l s . T h e S c h w a n n c e l l s d o n o t e x p r e s s c - K i t . T h e r e w a s n o r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f c - K i t p o s i t i v e - c e l l s i n c o m p a r i s o n t o t h e n u m b e r o f t o l u i d i n e b l u e - p o s i t i v e c e l l s a n d n e u r o f i b r o m a t y p e ; h o w e v e r , t h e r e w a s a s t r o n g c o r r e l a t i o n b e t w e e n t o l u d i n e b l u e c o u n t s a n d c - K i t s t a i n i n g ( K e n d a l l ' s t a u = 0 . 8 9 4 , p < 0 . 0 0 1 ) . A s e x p e c t e d f r o m t h e t o l u i d i n e b l u e r e s u l t s , t h e t o t a l n u m b e r o f c - K i t - p o s i t i v e c e l l s w a s s i g n i f i c a n t l y l o w e r i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s t h a n i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s ( p = 0 . 0 1 4 ) . DISCUSSION M a s t c e l l s a r e a c o n s i s t e n t f i n d i n g i n n e u r o f i b r o m a s i n p e o p l e w i t h N F 1 . H o w e v e r , t h e r o l e o f t h e m a s t c e l l i n t h e d e v e l o p m e n t o f n e u r o f i b r o m a s i n N F 1 i n d i v i d u a l s i s p o o r l y u n d e r s t o o d . T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o d e t e r m i n e i f t h e d e n s i t y a n d d i s t r i b u t i o n o f m a s t c e l l s d i f f e r s b e t w e e n n e u r o f i b r o m a s c l a s s i f i e d b y t h e i r h i s t o p a t h o l o g i c a l a p p e a r a n c e a n d i f m a s t c e l l i n f i l t r a t i o n i s r e l a t e d t o o t h e r h i s t o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s e t u m o u r s , w h i c h m a y i n d i c a t e d i f f e r e n t p a t h o g e n e s i s f o r e a c h t y p e o f n e u r o f i b r o m a . W e f o u n d t h a t n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s h a v e s i g n i f i c a n t l y f e w e r m a s t c e l l s t h a n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s a n d t h a t M P N S T s s h o w l i t t l e o r n o m a s t c e l l i n f i l t r a t i o n . M a s t c e l l s a r e f o r m e d i n t h e b o n e m a r r o w . T h e y a r e r e l e a s e d i n t o t h e b l o o d a s u n d i f f e r e n t i a t e d p r e c u r s o r s a n d d o n o t d i f f e r e n t i a t e u n t i l t h e y l e a v e t h e v a s c u l a t u r e a n d 6 0 e n t e r t h e t a r g e t t i s s u e . M a s t c e l l s c a n b e f o u n d i n e n d o n e u r i a l a n d p e r i n e u r i a l s p a c e s o f p e r i p h e r a l n e r v e s ( 1 4 ) , p a r t i c u l a r l y w h e n t h e n e r v e i s d a m a g e d a n d i n n e e d o f r e p a i r . P r e v i o u s s t u d i e s t h a t h a v e i n v e s t i g a t e d m a s t c e l l s w i t h i n n e u r o f i b r o m a s f o u n d r e s u l t s t h a t a r e g e n e r a l l y s i m i l a r t o t h o s e o f o u r s t u d y . S o m e , b u t n o t a l l , n e u r o f i b r o m a s w e r e f o u n d t o h a v e a h i g h d e n s i t y o f m a s t c e l l s ( 1 2 , 1 5 , 1 6 ) , b u t i t w a s n o t c l e a r w h a t t y p e s o f n e u r o f i b r o m a s w e r e e x a m i n e d i n t h o s e s t u d i e s o r h o w m a n y o f t h e t u m o u r s c a m e f r o m i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 . I s a a c s o n ( 1 2 ) d e s c r i b e d 4 n e u r o f i b r o m a s t h a t w e r e d e n s e l y h y a l i n i s e d w i t h a n a p p e a r a n c e s i m i l a r t o s o m e o f t h e d e n s e f i b r o u s n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s i n t h e c u r r e n t s t u d y . F e w e r t h a n 5 m a s t c e l l s p e r 4 0 0 x f i e l d w e r e o b s e r v e d i n t h e s e t u m o u r s ; t h i s i s s i m i l a r t o o u r f i n d i n g s i n t h e c u r r e n t s t u d y . I n a d d i t i o n , I s a a c s o n n o t e d t h a t a n e n t r a p p e d t h i c k e n e d n e r v e w i t h i n w h a t w a s c a l l e d a " p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a " d i s p l a y e d f e w e r m a s t c e l l s t h a n t h e t u m o u r t i s s u e ; t h i s w a s a l s o o b s e r v e d i n t h e p r e s e n t s t u d y i n 2 n e u r o f i b r o m a s t h a t w e r e a m i x o f b o t h n o d u l a r a n d d i f f u s e t i s s u e ( F i g u r e 3 . 3 ) . J o h n s o n a n d c o w o r k e r s n o t e d t h e a b u n d a n c e a n d e v e n d i s t r i b u t i o n o f m a s t c e l l s t h r o u g h o u t a l a r g e n u m b e r o f n e u r o f i b r o m a s b u t d i d n o t o b s e r v e m a s t c e l l s i n t h e m a j o r i t y o f M P N S T s e x a m i n e d ( 1 5 ) . O n e n e u r o f i b r o m a w a s c l a s s i f i e d a s s u b c u t a n e o u s , a n d i t h a d a g r e a t e r c o n c e n t r a t i o n o f m a s t c e l l s a t t h e p e r i p h e r y o f t h e t u m o u r ( 1 5 ) , a s o b s e r v e d i n s o m e o f t h e n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s i n t h e p r e s e n t s t u d y . P a t i e n t s w i t h N F 1 n e u r o p a t h y a l s o h a v e e n l a r g e d n e r v e s , b u t s u r a l n e r v e b i o p s i e s f r o m s u c h i n d i v i d u a l s s h o w e d a d i s o r g a n i z e d p e r i n e u r i u m a n d h y p e r c e l l u l a r e p i n e u r i u m w i t h m a s t c e l l s p r i m a r i l y l o c a t e d c l o s e t o b l o o d v e s s e l s w i t h i n t h e e p i n e u r i u m a n d e n d o n e u r i u m ( 1 7 ) . T h e l o c a t i o n o f m a s t c e l l s w i t h i n t h e s e t h i c k e n e d n e r v e s c o n t r a s t s t o t h e l o c a t i o n o b s e r v e d i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s i n t h e p r e s e n t s t u d y , w h e r e m a s t c e l l s w e r e f o u n d p r i m a r i l y a t t h e p e r i n e u r i u m a n d / o r e p i n e u r i u m b o r d e r . T h e r e s t r i c t i o n o f m a s t c e l l s t o t h e e n d o n e u r i u m o r p e r i n e u r i u m m a y d i s t i n g u i s h n e u r o p a t h y a n d f r a n k n e u r o f i b r o m a d e v e l o p m e n t . Z h u e t a l u s e d a u n i q u e s y s t e m t o s t u d y n e u r o f i b r o m a d e v e l o p m e n t i n a m o u s e m o d e l . U s i n g a C r e t r a n s g e n e u n d e r t h e c o n t r o l o f t h e S c h w a n n c e l l K r o x 2 0 p r o m o t e r , t h e s e i n v e s t i g a t o r s p r o d u c e d a h o m o z y g o u s k n o c k o u t o f N f 1 i n S c h w a n n c e l l s w h i l e m a i n t a i n i n g a n N f 1 h e t e r o z y g o u s s t a t e i n a l l o t h e r c e l l s ( 1 1 ) . T h e p e r i p h e r a l n e r v e s o f t h e s e m i c e a r e e n l a r g e d , a n d s o m e o f t h e a n i m a l s d e v e l o p d o r s a l r o o t n e u r o f i b r o m a s 6 1 t h a t r e s e m b l e n o d u l a r p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s i n N F 1 p a t i e n t s . I n t e r e s t i n g l y , f o r m a t i o n o f n e u r o f i b r o m a s o c c u r s o n l y i f o t h e r c e l l s i n t h e s e m i c e a r e h e t e r o z y g o u s f o r N f 1 - a n N f 1 h a p l o i n s u f f i c i e n t t u m o u r e n v i r o n m e n t a p p e a r s n e c e s s a r y f o r t h e p a t h o g e n e s i s o f t h e s e h i s t o l o g i c a l l y - m i x e d t u m o u r s ( 1 1 ) . T h e t h i c k e n e d n e r v e s i n t h e s e m i c e s h o w i n f i l t r a t i o n o f m a s t c e l l s , a n d t h i s i n f i l t r a t i o n i s m o r e s u b s t a n t i a l w h e n t h e N f 1 n u l l S c h w a n n c e l l s p r o l i f e r a t e i n a n N f 1 h e t e r o z y g o u s b a c k g r o u n d t h a n i n t h e w i l d t y p e b a c k g r o u n d . H o w e v e r , i t i s n o t c l e a r w h e r e t h e m a s t c e l l s w e r e f o u n d w i t h i n t h e t h i c k e n e d n e r v e s . M a s t c e l l s a r e n o r m a l l y f o u n d i n c l o s e p r o x i m i t y t o t h e S c h w a n n c e l l s t h a t m y e l i n a t e t h e s e n e r v e s ( 7 ) . M o r e o v e r , c u t a n e o u s m a s t c e l l s o u t s i d e o f t h e s e t u m o u r s a r e a l s o m o d e r a t e l y i n c r e a s e d a n d d e m o n s t r a t e e n h a n c e d g r o w t h i n v i t r o i n N f 1 h e t e r o z y g o u s m i c e c o m p a r e d t o w i l d t y p e m i c e ( 1 8 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t m a s t c e l l s a r e i n v o l v e d i n n e u r o f i b r o m a f o r m a t i o n i n t h i s m o u s e m o d e l , b u t t h e p a t h o g e n i c p r o c e s s m a y d i f f e r s o m e w h a t f r o m t h a t w h i c h o c c u r s n a t u r a l l y i n h u m a n s w i t h N F 1 . R i c c a r d i ( 4 ) h a s d i s t i n g u i s h e d 4 t y p e s o f n e u r o f i b r o m a s c l i n i c a l l y t h a t d i f f e r w i t h r e s p e c t t o t h e i r a g e o f a p p e a r a n c e , n a t u r a l h i s t o r y , a n d m a l i g n a n t p o t e n t i a l ( T a b l e 3 . 1 ) . T h i s c l i n i c a l c l a s s i f i c a t i o n d o e s n o t c o r r e l a t e w i t h t h e p a t h o l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o n u s e d i n t h e p r e s e n t s t u d y . R i c c a r d i ' s " c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s " o c c u r i n t h e s k i n s u r f a c e a n d d e v e l o p f r o m t h e t e r m i n a l b r a n c h e s o f p e r i p h e r a l n e r v e s . " S u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s " a r e d e s c r i b e d a s f i r m a n d l y i n g d e e p e r i n t h e s u b c u t a n e o u s l a y e r o f t h e s k i n . T h e y h a v e d i s c r e t e m a r g i n s b u t m a y e x t e n d a l o n g a n e r v e . " N o d u l a r p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s " ( w h i c h m a y o r m a y n o t e x h i b i t t h e p a t h o l o g i c a l f e a t u r e s u s e d t o m a k e t h i s d i a g n o s i s i n t h e p r e s e n t s t u d y ) a r i s e w i t h i n m a j o r p e r i p h e r a l n e r v e s a n d m a y l i e j u s t b e n e a t h t h e d e r m i s o r m u c h d e e p e r i n t h e b o d y . T h e y a r e o f t e n f o u n d i n t h e s p i n a l n e r v e s , n e r v e r o o t s o r g a n g l i a . R i c c a r d i a l s o d e s c r i b e s " d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s " t h a t d o n o t c o r r e s p o n d t o t h e p a t h o l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o n u s e d i n t h e p r e s e n t s t u d y . R i c c a r d i ' s " d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s " u s u a l l y a r e a p p a r e n t a t b i r t h o r w i t h i n t h e f i r s t f e w y e a r s o f l i f e . T h e s e n e u r o f i b r o m a s c a n b e s u p e r f i c i a l , i n v o l v i n g t h e s k i n a n d s u b c u t a n e o u s t i s s u e , o r i n v o l v e d e e p e r t i s s u e . T h e t u m o u r s d o n o t h a v e d i s c r e t e b o r d e r s b u t i n v a d e a d j a c e n t n o r m a l t i s s u e s . M o s t o f t h e t u m o u r s i n o u r s t u d y w e r e n o t c h a r a c t e r i z e d u s i n g t h i s c l i n i c a l c l a s s i f i c a t i o n , a n d t h e h i s t o l o g i c a l a n d c l i n i c a l a p p r o a c h e s d o n o t c l a s s i f y i n d i v i d u a l t u m o u r s i n t o t h e s a m e g r o u p s . B o t h c u t a n e o u s a n d " d i f f u s e p l e x i f o r m " t u m o u r s u s u a l l y a r e d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s h i s t o l o g i c a l l y , 6 2 a l t h o u g h s o m e c o n g e n i t a l o r e a r l y o n s e t t u m o u r s a r e m i x e d d i f f u s e a n d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s . T u m o u r s t h a t a r e c l a s s i f i e d c l i n i c a l l y a s s u b c u t a n e o u s o r n o d u l a r p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a r e u s u a l l y n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s o n h i s t o p a t h o l o g i c a l e x a m . H o w e v e r , t h e o n l y w a y t o d e t e r m i n e t h e h i s t o l o g i c a l t y p e o f a n e u r o f i b r o m a i s t o e x a m i n e i t h i s t o l o g i c a l l y . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e n u m b e r o f m a s t c e l l s w a s l o w e r i n h i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s t h a n i n h i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . N o d u l a r n e u r o f i b r o m a s d i f f e r f r o m d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s i n t h a t n o d u l a r t u m o u r s a r e s u r r o u n d e d b y a n i n t a c t e p i n e u r i u m a n d p e r i n e u r i u m , a l t h o u g h t h e o r g a n i z a t i o n o f t h e e n d o n e u r i m i s d i s r u p t e d w i t h a b n o r m a l a c c u m u l a t i o n o f c e l l s ( 8 ) . I t i s t e m p t i n g t o s p e c u l a t e t h a t t h e e p i n e u r i u m a n d / o r p e r i n e u r i u m a c t s a s a n a n a t o m i c a l b a r r i e r t h a t e x c l u d e s m a s t c e l l s f r o m n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s . I n c o n t r a s t , m a s t c e l l s m i g h t h a v e d i r e c t a c c e s s t o t h e t u m o u r t i s s u e i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s , w h i c h d e v e l o p d i s t a l t o t h e e n d o f t h e e p i n e u r i u m a n d p e r i n e u r i u m o r i n w h i c h t h e e p i n e u r i u m a n d p e r i n e u r i u m a r e b r o k e n d o w n ( 8 ) . T h e s t r i k i n g d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e n u m b e r o f m a s t c e l l s i n n e u r o f i b r o m a s o f d i f f e r e n t t y p e s m a y i n d i c a t e t h a t s o m e w h a t d i f f e r e n t m e c h a n i s m s u n d e r l i e t h e d e v e l o p m e n t o f t h e s e d i f f e r e n t k i n d s o f n e u r o f i b r o m a s . H o w e v e r , w e c a n n o t e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e d i f f e r e n c e i n m a s t c e l l n u m b e r a n d d i s t r i b u t i o n w e o b s e r v e d a r e l a r g e l y a r e s u l t o f t h e d i f f e r e n c e s i n o v e r a l l t u m o u r c e l l n u m b e r a n d d i s t r i b u t i o n s e e n i n n o d u l a r a n d d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . M a s t c e l l s h a v e b e e n o b s e r v e d i n a n u m b e r o f m a l i g n a n t n e o p l a s m s i n c l u d i n g b r e a s t c a n c e r ( 1 9 ) , s q u a m o u s e p i t h e l i a l c a r c i n o m a ( 2 0 ) , c o l o r e c t a l c a n c e r ( 2 1 ) , a n d u t e r i n e c a n c e r ( 2 2 ) . I n m e l a n o m a , m a s t c e l l s a r e l o c a t e d a t t h e m a r g i n o f t u m o u r a n d n o r m a l t i s s u e ( 2 3 ) , a n d m a s t c e l l c o u n t s w i t h i n t h e t u m o u r c o r r e l a t e s t r o n g l y w i t h m i c r o v a s c u l a r d e n s i t y a n d s h o r t e r p a t i e n t s u r v i v a l ( 2 4 ) . I n o u r s t u d y w e f o u n d a n a b u n d a n c e o f m a s t c e l l s i n t h e h i s t o p a t h o l o g i c a l l y - d e f i n e d d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s , w h i c h i n c l u d e c l i n i c a l l y -d e f i n e d c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s t h a t a l m o s t n e v e r p r o g r e s s t o m a l i g n a n c y , a n d w e f o u n d f e w e r m a s t c e l l s i n M P N S T s a n d h i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s , w h i c h c a n p r o g r e s s t o m a l i g n a n c y . H o w e v e r , w e c a n n o t r u l e o u t t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s w e e x a m i n e d m i g h t s u b s e q u e n t l y h a v e p r o g r e s s e d t o m a l i g n a n c y o r t h a t t h e M P N S T s d e v e l o p e d f r o m n e u r o f i b r o m a s t h a t w e r e i n f i l t r a t e d b y m a s t c e l l s a t a n e a r l i e r p o i n t i n t h e t u m o r i g e n i c p r o c e s s . I n f a c t , t h e c o n j u n c t i o n o f m a s t 6 3 c e l l - i n f i l t r a t e d h i s t o l o g i c a l l y - b e n i g n n e u r o f i b r o m a t i s s u e a n d m a s t c e l l - f r e e M P N S T i n o n e N F 1 p a t i e n t ( F i g u r e 3 . 4 ) i s c o m p a t i b l e w i t h t h e m a l i g n a n c y d e v e l o p i n g f r o m a b e n i g n n e u r o f i b r o m a t h a t i s h e a v i l y i n f i l t r a t e d w i t h m a s t c e l l s . W e f o u n d m a s t c e l l s t o b e e v e n l y d i s t r i b u t e d i n t h e t u m o u r c o m p o n e n t o f d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s b u t n o t i n t h e s u r r o u n d i n g n o r m a l t i s s u e . W h i l e t h e r e w a s n o c l u s t e r i n g o f m a s t c e l l s a r o u n d b l o o d v e s s e l s , t h e r e w a s a s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e d e n s i t y o f m a s t c e l l s a n d v a s c u l a r i t y w i t h i n a t u m o u r ( p < 0 . 0 0 1 ) . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h m a s t c e l l s p r o m o t i n g a n g i o g e n e s i s b y r e l e a s i n g f a c t o r s s u c h a s v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r ( V E G F ) , m a t r i x m e t a l l o p r o t e i n a s e s ( M M P 2 , M M P 9 ) a n d c h y m a s e . S i m i l a r l y , t h e r e w a s a c o r r e l a t i o n b e t w e e n m a s t c e l l d e n s i t y a n d c e l l u l a r i t y , s u g g e s t i n g t h a t m a s t c e l l s r e l e a s e f a c t o r s t h a t e i t h e r d i r e c t l y o r i n d i r e c t l y ( e . g . , b y p r o m o t i n g a n g i o g e n e s i s ) l e a d t o i n c r e a s e d c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n . A l s o o f i n t e r e s t i s t h e a b u n d a n c e o f l y m p h o c y t e s w e o b s e r v e d i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s c o m p a r e d t o d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . J o h n s o n a n d c o w o r k e r s s t u d i e d l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n i n a v a r i e t y o f S c h w a n n c e l l t u m o u r s a n d f o u n d t h a t t h e n u m b e r o f B -l y m p h o c y t e s v a r i e d g r e a t l y w i t h i n n e u r o f i b r o m a s ( 1 5 ) . 1 8 / 3 2 n e u r o f i b r o m a s s t u d i e d b y J o h n s o n e t a l . s h o w e d f e w e r t h a n 5 0 B - l y m p h o c y t e s p e r s e c t i o n , a n d a n o t h e r 5 t u m o u r s h a d m o r e t h a n 1 5 0 B - l y m p h o c y t e s . O n l y t w o o f t h e n i n e M P N S T s s t u d i e d s h o w e d B -l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n . I t i s n o t c l e a r w h a t t y p e s o f n e u r o f i b r o m a s w e r e e x a m i n e d i n t h e J o h n s o n s t u d y o r i f t h e M P N S T s w e r e f r o m i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 . T h e a b u n d a n c e o f l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n i n t h e n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s w e s t u d i e d s u g g e s t s t h a t t h e s e t u m o u r s m a y b e t r i g g e r i n g a n i m m u n e r e s p o n s e . M a s t c e l l s s y n t h e s i z e a n d e x p r e s s c - K i t , a t y r o s i n e k i n a s e r e c e p t o r t h a t i s t h e p r o d u c t o f t h e c-Kit p r o t o - o n c o g e n e . T h e l i g a n d f o r c - K i t , w h i c h i s c a l l e d S C F o r K i t L , p r o m o t e s p r o l i f e r a t i o n , m i g r a t i o n a n d s u r v i v a l o f m a s t c e l l s . N e u r o f i b r o m i n a n d c - K i t a r e i n v o l v e d i n o v e r l a p p i n g c e l l s i g n a l i n g p a t h w a y s . N e u r o f i b r o m i n a c t s a s a n e g a t i v e r e g u l a t o r o f t h e R a s p a t h w a y , c o n v e r t i n g a c t i v e R a s - G T P t o i n a c t i v e R a s - G D P , w h i l e c - K i t a c t i v a t i o n b y K i t L i n d u c e s t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f A k t v i a t h e P I - 3 K p a t h w a y ( 2 5 ) . I n c u l t u r e , i t h a s b e e n s h o w n t h a t S c h w a n n c e l l s e x p r e s s m e m b r a n e - b o u n d K i t L ( 2 6 ) a n d s e c r e t e K i t L ( 2 7 ) , b o t h o f w h i c h w o u l d a t t r a c t m a s t c e l l s . C u l t u r e d S c h w a n n c e l l s f r o m Nf1'A m i c e s e c r e t e f i v e t o s i x t i m e s m o r e K i t L t h a n Nf1+/~ o r w i l d t y p e S c h w a n n c e l l s . T h i s i n c r e a s e d K i t L s e c r e t i o n i n c r e a s e s m i g r a t i o n o f Nf1+/~ 6 4 m a s t c e l l s t o w a r d s N f 1 S c h w a n n c e l l s ( 2 7 ) . I n a d d i t i o n , N f 1 m a s t c e l l s e x h i b i t e d a 2 -f o l d i n c r e a s e i n m i g r a t i o n a n d a 2 - f o l d i n c r e a s e i n p r o l i f e r a t i o n c o m p a r e d w i t h w i l d t y p e c e l l s i n r e s p o n s e t o a g i v e n d o s e o f K i t L ( 2 7 ) . T h e m i g r a t i o n o f t h e Nf1+/' m a s t c e l l w a s r e d u c e d t o w i l d t y p e l e v e l s w h e n Nf1+/~ m a s t c e l l s w e r e t r a n s d u c e d w i t h a r e t r o v i r u s c a r r y i n g N f 1 , b u t l i t t l e e f f e c t w a s o b s e r v e d w h e n a N f 1 t r a n s g e n e h a r b o u r i n g a p a t h o g e n i c m u t a t i o n w a s i n t r o d u c e d ( 2 7 ) . G r e a t e r a c c u m u l a t i o n o f m a s t c e l l s o c c u r r e d a t t h e s i t e o f K i t L c u t a n e o u s i n f u s i o n i n Nf1+/~ m i c e t h a n i n w i l d t y p e m i c e ( 2 8 ) . N o r m a l a d u l t S c h w a n n c e l l s d o n o t e x p r e s s c - K i t ( 2 5 ) , b u t B a d a c h e a n d c o w o r k e r s d e m o n s t r a t e d a c o r r e l a t i o n b e t w e e n a n i n c r e a s e i n t h e l e v e l o f c - K i t s y n t h e s i s a n d a d e c r e a s e i n n e u r o f i b r o m i n s y n t h e s i s i n S c h w a n n c e l l l i n e s d e r i v e d f r o m 3 M P N S T s f r o m N F 1 i n d i v i d u a l s ( 2 9 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , w e d i d n o t o b s e r v e c - K i t s t a i n i n g o f S c h w a n n c e l l s i n a n y o f t h e t h r e e M P N S T s e x a m i n e d , a n d w e o n l y f o u n d m a s t c e l l s i n l o w n u m b e r s i n o n e M P N S T . N o n e o f t h e s e M P N S T s e x p r e s s e d n e u r o f i b r o m i n ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e d i f f e r e n c e i n r e s u l t s c o u l d b e b e c a u s e w e a s s e s s e d c - K i t e x p r e s s i o n i n p r i m a r y t u m o u r s w h i l e B a d a c h e a n d c o w o r k e r s u s e d c e l l l i n e s d e r i v e d f r o m N F 1 M P N S T s . A d d i t i o n a l l y , w e a s s e s s e d c - K i t e x p r e s s i o n u s i n g i m m u n o h i s t o c h e m i s t y w h i l e B a d a c h e u s e d a d i f f e r e n t m e t h o d o f d e t e c t i o n , W e s t e r n b l o t t i n g . T h e b e n i g n n e u r o f i b r o m a s w e s t u d i e d d i d n o t s h o w a n y e v i d e n c e o f S 1 0 0 + S c h w a n n c e l l s e x p r e s s i n g c - K i t w h e n s l i d e s w e r e d u a l l a b e l e d w i t h a n t i b o d i e s f o r b o t h S 1 0 0 a n d c - K i t a n t i g e n s ( F i g u r e 3 . 5 ) . T h e s a m p l e s u s e d i n t h i s s t u d y w e r e a r c h i v a l m a t e r i a l f r o m s u r g i c a l s p e c i m e n s t h a t h a d b e e n s u b m i t t e d f o r c l i n i c a l p a t h o l o g y . T h e r e f o r e , i t w a s a s s u m e d t h a t t h e s a m p l e w a s r e p r e s e n t a t i v e o f t h e w h o l e t u m o u r a n d t h a t t h e s e c t i o n s u s e d t o s t u d y t u m o u r c h a r a c t e r i s t i c s a n d m a s t c e l l d e n s i t y a n d d i s t r i b u t i o n r e p r e s e n t t h e t u m o u r a s a w h o l e , a l t h o u g h s o m e v a r i a b i l i t y a m o n g d i f f e r e n t p o r t i o n s w o u l d b e e x p e c t e d b e c a u s e o f t h e h e t e r o g e n e o u s n a t u r e o f n e u r o f i b r o m a s . I n s u m m a r y , w e f o u n d t h a t m a s t c e l l s a r e s i g n i f i c a n t l y l e s s f r e q u e n t i n h i s t o l o g i c a l l y -n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s t h a n i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . T h i s d i f f e r e n c e i s c o n s i s t e n t w i t h c l i n i c a l o b s e r v a t i o n s t h a t d i f f e r e n t k i n d s o f n e u r o f i b r o m a s h a v e d i f f e r e n t n a t u r a l h i s t o r i e s a n d d i f f e r e n t r i s k s o f m a l i g n a n t d e g e n e r a t i o n . T h e d i f f e r e n c e i n m a s t c e l l i n f i l t r a t i o n a n d d i s t r i b u t i o n s u g g e s t s t h a t m a s t c e l l s m a y p l a y d i f f e r e n t r o l e s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f d i f f e r e n t k i n d s o f n e u r o f i b r o m a s . 6 5 REFERENCES 1 . F r i e d m a n J M . E p i d e m i o l o g y o f n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 . A m J M e d G e n e t 1 9 9 9 ; 8 9 : 1 - 6 . 2 . F r i e d m a n J M , R i c c a r d i V M . C l i n i c a l a n d e p i d e m i o l o g i c a l f e a t u r e s . I n : G u t m a n n D H , M a c C o l l i n M , R i c c a r d i V M , e d i t o r s . N e u r o f i b r o m a t o s i s : p h e n o t y p e , n a t u r a l h i s t o r y , a n d p a t h o g e n e s i s . 3 r d e d . B a l t i m o r e : J o h n H o p k i n s U n i v e r s i t y P r e s s ; 1 9 9 9 . p . 2 6 - 8 6 . 3 . C r o w e F , S c h u l l W , N e e l J . M u l t i p l e N e u r o f i b r o m a t o s i s . S p r i n g f i e l d : C h a r l e s C T h o m a s ; 1 9 5 6 . 4 . R i c c a r d i V M . A n O v e r v i e w o f N F - 1 : D y s p l a s i a a n d N e o p l a s i a . I n : R i c c a r d i V M , e d i t o r s . N e u r o f i b r o m a t o s i s : P h e n o t y p e , N a t u r a l H i s t o r y a n d P a t h o g e n e s i s . 2 n d e d . B a l t i m o r e : T h e J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y P r e s s ; 1 9 9 2 . p . 1 8 - 3 9 . 5 . W i e s t e l e r O , R a d n e r H . P a t h o l o g y o f n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 a n d 2 . I n : S . H u s o n , R . H u g h e s , e d i t o r s . T h e n e u r o f i b r o m a t o s e s : A p a t h o g e n e t i c a n d c l i n i c a l o v e r v i e w , e d . L o n d o n : C h a p m a n a n d H a l l M e d i c a l ; 1 9 9 4 . p . 1 3 5 - 5 9 . 6 . K o r f B , R u b e n s t e i n A . N e u r o f i b r o m a t o s i s : A h a n d b o o k f o r p a t i e n t s , f a m i l i e s a n d h e a l t h c a r e p r o f e s s i o n a l s . 2 n d e d i t i o n , N e w Y o r k : T h i e m e M e d i c a l ; 2 0 0 5 . 7 . H a r k i n J , R e e d R . A t l a s o f t u m o r p a t h o l o g y . W a s h i n g t o n : A r m e d F o r c e s I n s t i t u t e o f P a t h o l o g y ; 1 9 6 8 . 8 . M a s s o n P . H u m a n T u m o r s : H i s t o l o g y , D i a g n o s i s a n d T e c h n i q u e . 2 n d e d i t i o n , D e t r o i t : W a y n e S t a t e U n i v e r s i t y P r e s s ; 1 9 7 0 . 9 . W o o d r u f f J M . P a t h o l o g y o f t u m o r s o f t h e p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h i n t y p e 1 n e u r o f i b r o m a t o s i s . A m J M e d G e n e t 1 9 9 9 ; 8 9 : 2 3 - 3 0 . 1 0 . R a s m u s s e n S A , Y a n g Q , F r i e d m a n J M . M o r t a l i t y i n n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 : a n a n a l y s i s u s i n g U . S . d e a t h c e r t i f i c a t e s . A m J o f H u m G e n e t 2 0 0 1 ; 6 8 : 1 1 1 0 - 8 . 1 1 . Z h u Y , G h o s h P , C h a r n a y P , B u r n s D K , P a r a d a L F . N e u r o f i b r o m a s i n N F 1 : S c h w a n n c e l l o r i g i n a n d r o l e o f t u m o r e n v i r o n m e n t . S c i e n c e 2 0 0 2 ; 2 9 6 : 9 2 0 - 2 . 1 2 . I s a a c s o n P . M a s t c e l l s i n b e n i g n n e r v e s h e a t h t u m o u r s . J P a t h o l 1 9 7 6 ; 1 1 9 : 1 9 3 - 6 . 1 3 . N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h C o n s e n s u s D e v e l o p m e n t C o n f e r e n c e S t a t e m e n t : n e u r o f i b r o m a t o s i s . B e t h e s d a , M d . , U S A , J u l y 1 3 - 1 5 , 1 9 8 7 . N e u r o f i b r o m a t o s i s 1 9 8 8 ; 1 : 1 7 2 - 8 . 1 4 . B i e n e n s t o c k J , M a c Q u e e n G , S e s t i n i P , e t a l . M a s t c e l l / n e r v e i n t e r a c t i o n s i n v i t r o a n d i n v i v o . A m R e v R e s p i r D i s 1 9 9 1 ; 1 4 3 : S 5 5 - 8 . 1 5 . J o h n s o n M D , K a m s o - P r a t t J , F e d e r s p i e l C F , W h e t s e l l W O , J r . M a s t c e l l a n d l y m p h o r e t i c u l a r i n f i l t r a t e s i n n e u r o f i b r o m a s . C o m p a r i s o n w i t h n e r v e s h e a t h t u m o r s . A r c h P a t h o l L a b M e d 1 9 8 9 ; 1 1 3 : 1 2 6 3 - 7 0 . 1 6 . N u r n b e r g e r M , M o l l I . S e m i q u a n t i t a t i v e a s p e c t s o f m a s t c e l l s i n n o r m a l s k i n a n d i n n e u r o f i b r o m a s o f n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e s 1 a n d 5 . D e r m a t o l o g y 1 9 9 4 ; 1 8 8 : 2 9 6 - 9 . 1 7 . F e r n e r R E , H u g h e s R A , H a l l S M , U p a d h y a y a M , J o h n s o n M R . N e u r o f i b r o m a t o u s n e u r o p a t h y i n n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 ( N F 1 ) . J M e d G e n e t 2 0 0 4 ; 4 1 : 8 3 7 - 4 1 . 6 6 1 8 . I n g r a m D A , Y a n g F C , T r a v e r s J B , e t a l . G e n e t i c a n d b i o c h e m i c a l e v i d e n c e t h a t h a p l o i n s u f f i c i e n c y o f t h e N f 1 t u m o r s u p p r e s s o r g e n e m o d u l a t e s m e l a n o c y t e a n d m a s t c e l l f a t e s i n v i v o . J E x p M e d 2 0 0 0 ; 1 9 1 : 1 8 1 - 8 . 1 9 . B o w r e y P F , K i n g J , M a g a r e y C , e t a l . H i s t a m i n e , m a s t c e l l s a n d t u m o u r c e l l p r o l i f e r a t i o n i n b r e a s t c a n c e r : d o e s p r e o p e r a t i v e c i m e t i d i n e a d m i n i s t r a t i o n h a v e a n e f f e c t ? B r J C a n c e r 2 0 0 0 ; 8 2 : 1 6 7 - 7 0 . 2 0 . C o u s s e n s L M , R a y m o n d W W , B e r g e r s G , e t a l . I n f l a m m a t o r y m a s t c e l l s u p -r e g u l a t e a n g i o g e n e s i s d u r i n g s q u a m o u s e p i t h e l i a l c a r c i n o g e n e s i s . G e n e s D e v 1 9 9 9 ; 1 3 : 1 3 8 2 - 9 7 . 2 1 . L a c h t e r J , S t e i n M , L i c h t i g C , E i d e l m a n S , M u n i c h o r M . M a s t c e l l s i n c o l o r e c t a l n e o p l a s i a s a n d p r e m a l i g n a n t d i s o r d e r s . D i s C o l o n R e c t u m 1 9 9 5 ; 3 8 : 2 9 0 - 3 . 2 2 . G r a h a m R M , G r a h a m J B . M a s t c e l l s a n d c a n c e r o f t h e c e r v i x . S u r g G y n e c o l O b s t e t 1 9 6 6 ; 1 2 3 : 3 - 9 . 2 3 . T o t h - J a k a t i c s R , J i m i S , T a k e b a y a s h i S , K a w a m o t o N . C u t a n e o u s m a l i g n a n t m e l a n o m a : c o r r e l a t i o n b e t w e e n n e o v a s c u l a r i z a t i o n a n d p e r i t u m o r a c c u m u l a t i o n o f m a s t c e l l s o v e r e x p r e s s i n g v a s c u l a r e n d o t h e l i a l g r o w t h f a c t o r . H u m P a t h o l 2 0 0 0 ; 3 1 : 9 5 5 - 6 0 . 2 4 . R i b a t t i D , E n n a s M G , V a c c a A , e t a l . T u m o r v a s c u l a r i t y a n d t r y p t a s e - p o s i t i v e m a s t c e l l s c o r r e l a t e w i t h a p o o r p r o g n o s i s i n m e l a n o m a . E u r J C l i n I n v e s t 2 0 0 3 ; 3 3 : 4 2 0 - 5 . 2 5 . D a n g I , N e l s o n J K , D e V r i e s G H . c - K i t r e c e p t o r e x p r e s s i o n i n n o r m a l h u m a n S c h w a n n c e l l s a n d S c h w a n n c e l l l i n e s d e r i v e d f r o m n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 t u m o r s . J N e u r o s c i R e s 2 0 0 5 ; 8 2 : 4 6 5 - 7 1 . 2 6 . R y a n J J , K l e i n K A , N e u b e r g e r T J , e t a l . R o l e f o r t h e s t e m c e l l f a c t o r / K I T c o m p l e x i n S c h w a n n c e l l n e o p l a s i a a n d m a s t c e l l p r o l i f e r a t i o n a s s o c i a t e d w i t h n e u r o f i b r o m a t o s i s . J N e u r o s c i R e s 1 9 9 4 ; 3 7 : 4 1 5 - 3 2 . 2 7 . Y a n g F C , I n g r a m D A , C h e n S , e t a l . N e u r o f i b r o m i n - d e f i c i e n t S c h w a n n c e l l s s e c r e t e a p o t e n t m i g r a t o r y s t i m u l u s f o r N f 1 + / - m a s t c e l l s . J C l i n I n v e s t 2 0 0 3 ; 1 1 2 : 1 8 5 1 - 6 1 . 2 8 . I n g r a m D A , H i a t t K , K i n g A J , e t a l . H y p e r a c t i v a t i o n o f p 2 1 ( r a s ) a n d t h e h e m a t o p o i e t i c - s p e c i f i c R h o G T P a s e , R a c 2 , c o o p e r a t e t o a l t e r t h e p r o l i f e r a t i o n o f n e u r o f i b r o m i n - d e f i c i e n t m a s t c e l l s i n v i v o a n d i n v i t r o . J E x p M e d 2 0 0 1 ; 1 9 4 : 5 7 -6 9 . 2 9 . B a d a c h e A , M u j a N , D e V r i e s G H . E x p r e s s i o n o f K i t i n n e u r o f i b r o m i n - d e f i c i e n t h u m a n S c h w a n n c e l l s : r o l e i n S c h w a n n c e l l h y p e r p l a s i a a s s o c i a t e d w i t h t y p e 1 n e u r o f i b r o m a t o s i s . O n c o g e n e 1 9 9 3 ; 1 7 : 7 9 5 - 8 0 0 . 6 7 4. P A T H O G E N E T I C H E T E R O G E N E I T Y O F NF1 A S S O C I A T E D N E U R O F I B R O M A S 3 INTRODUCTION N e u r o f i b r o m a t o s i s 1 ( N F 1 ) i s a c o m m o n d o m i n a n t l y i n h e r i t e d a u t o s o m a l d i s e a s e w i t h a n i n c i d e n c e o f 1 i n 3 5 0 0 ( 1 ) . N F 1 i s c a u s e d b y m u t a t i o n s i n t h e NF1 g e n e t h a t e n c o d e s n e u r o f i b r o m i n , a u b i q u i t o u s l y e x p r e s s e d p r o t e i n . M o s t c o n s t i t u t i o n a l m u t a t i o n s i n NF1 r e s u l t i n a l o s s o f f u n c t i o n o f t h e p r o t e i n . L o s s o f t h e n o r m a l NF1 a l l e l e ( L o s s o f H e t e r o z y g o s i t y o r L O H ) h a s b e e n o b s e r v e d i n p h e o c h r o m o c y t o m a s ( 2 ) , j u v e n i l e m y e l o i d l e u k e m i a ( 3 ) a n d m a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o u r s ( M P N S T s ) ( 4 ) i n N F 1 p a t i e n t s , c o n f i r m i n g NF1 a s a t u m o u r s u p p r e s s o r g e n e . T h e h a l l m a r k f e a t u r e o f N F 1 i s t h e n e u r o f i b r o m a , a b e n i g n t u m o u r c o m p o s e d o f S c h w a n n c e l l s , f i b r o b l a s t s , p e r i n e u r a l c e l l s , m a s t c e l l s a n d e n d o t h e l i a l c e l l s . S c h w a n n c e l l s c o n s t i t u t e a l a r g e p r o p o r t i o n ( 4 0 - 8 0 % ) o f n e u r o f i b r o m a s a n d a r e t h o u g h t t o b e t h e p r o g e n i t o r c e l l t y p e b e c a u s e c u l t u r e s d e r i v e d f r o m s o m e N F 1 p a t i e n t n e u r o f i b r o m a s d i s p l a y l o s s o f t h e n o r m a l NF1 a l l e l e i n S c h w a n n c e l l s b u t n o t i n f i b r o b l a s t s ( 5 - 7 ) . N e u r o f i b r o m a s a r e t h o u g h t t o a r i s e a c c o r d i n g t o t h e " t w o - h i t " h y p o t h e s i s , w i t h a n i n a c t i v a t i n g s o m a t i c m u t a t i o n i n t h e n o r m a l NF1 a l l e l e a s t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p . L O H o r s e c o n d s o m a t i c m u t a t i o n s o f t h e NF1 l o c u s h a v e b e e n o b s e r v e d i n 2 6 % o f d e r m a l n e u r o f i b r o m a s a n d 3 6 % o f p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s s t u d i e d ( 8 - 2 4 ) . T h e l o w p e r c e n t a g e o f o b s e r v e d L O H i s u s u a l l y a t t r i b u t e d t o t e c h n i c a l l i m i t a t i o n s o f t h e a s s a y o r t o " c o n t a m i n a t i o n " o f t h e n e o p l a s t i c S c h w a n n c e l l c l o n e b y a n a b u n d a n c e o f n o n -n e o p l a s t i c s t r o m a l c e l l s p r e s e n t i n t h e s e h e t e r o g e n e o u s t u m o u r s . T h e r e i s a l s o e v i d e n c e t h a t S c h w a n n c e l l s c o m p r i s i n g a n N F 1 - a s s o c i a t e d n e u r o f i b r o m a a r e t h e m s e l v e s h e t e r o g e n e o u s . I m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s e s o f s o m e d e r m a l a n d p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s h a v e s h o w n b o t h n e u r o f i b r o m i n - n e g a t i v e a n d n e u r o f i b r o m i n -p o s i t i v e S c h w a n n c e l l s ( 2 5 ) . T h e f o r m e r a r e u s u a l l y i n t e r p r e t e d a s t h e n e o p l a s t i c c l o n e t h a t h a s l o s t b o t h f u n c t i o n a l c o p i e s o f t h e NF1 g e n e , a n d t h e l a t t e r a s n o r m a l " c o n t a m i n a n t s " o f t h e t u m o u r t h a t h a v e p r o l i f e r a t e d i n r e s p o n s e t o t h e n e o p l a s t i c 3 A v e r s i o n o f t h i s c h a p t e r h a s b e e n s u b m i t t e d for p u b l i c a t i o n . T r a c y T u c k e r , C a r o l y n B r o w n , J o h n Fee , V i n c e n t M. R i c c a r d i , M a r g a r e t Su t c l i f f e , J a n i n e W e c h s l e r , P i e r r e W o l k e n s t e i n J a n M. F r i e d m a n . P a t h o g e n e t i c h e t e r o g e n e i t y of N F l - a s s o c i a t e d n e u r o f i b r o m a s 6 8 p r o c e s s . A s i m i l a r i n t e r p r e t a t i o n h a s b e e n m a d e o f o b s e r v a t i o n s t h a t S 1 0 0 - p o s i t i v e ( p r e s u m a b l y S c h w a n n c e l l ) l i n e s g r o w n f r o m N F 1 - a s s o c i a t e d n e u r o f i b r o m a s m a y c o n t a i n a m i x t u r e o f n e u r o f i b r o m i n - p o s i t i v e a n d n e u r o f i b r o m i n - n e g a t i v e c e l l s o r a m i x t u r e o f c e l l s w i t h a n d w i t h o u t N F 1 L O H ( 6 , 2 5 , 2 6 ) T h e " t w o h i t " h y p o t h e s i s e x p l a i n s t h e d e v e l o p m e n t o f s o m e n e u r o f i b r o m a s , b u t d o e s n o t r e a d i l y e x p l a i n a l l o f t h e c l i n i c a l d a t a r e g a r d i n g n e u r o f i b r o m a d e v e l o p m e n t . F o r e x a m p l e , t h e f o l l o w i n g o b s e r v a t i o n s i n N F 1 p a t i e n t s a r e n o t e a s i l y e x p l a i n e d w i t h o u t i n v o k i n g a d h o c m o d i f i c a t i o n s o f t h e " t w o h i t " h y p o t h e s i s : • T h e a p p a r e n t a s s o c i a t i o n o f t r a u m a w i t h t h e s u b s e q u e n t d e v e l o p m e n t o f a n e u r o f i b r o m a a t t h e s a m e s i t e ( 2 7 ) . • E r u p t i v e n e u r o f i b r o m a t o s i s , i n w h i c h i n n u m e r a b l e d e r m a l n e u r o f i b r o m a s d e v e l o p o v e r a p e r i o d o f a f e w m o n t h s i n a p e r s o n w i t h N F 1 ( 2 8 ) . • R a p i d i n c r e a s e i n t h e d e v e l o p m e n t o f n e u r o f i b r o m a s d u r i n g p r e g n a n c y , a n d s u b s e q u e n t r e g r e s s i o n o f s o m e t u m o u r s a f t e r d e l i v e r y ( 2 9 ) . • T h e f a i l u r e t o f i n d e v i d e n c e o f L O H o r a " s e c o n d h i t " N F 1 m u t a t i o n i n m a n y n e u r o f i b r o m a s , d e s p i t e e x t e n s i v e m o l e c u l a r g e n e t i c s s t u d i e s ( 8 - 2 4 ) . W e h a v e p r o p o s e d a n a l t e r n a t i v e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e s e d a t a : t h a t N F 1 - a s s o c i a t e d n e u r o f i b r o m a s , w h i c h a r e c l i n i c a l l y h e t e r o g e n e o u s i n a p p e a r a n c e , n a t u r a l h i s t o r y , a n d p r o p e n s i t y t o p r o g r e s s t o M P N S T s , ( 3 0 ) a r e a l s o p a t h o g e n i c a l l y h e t e r o g e n o u s ( 3 1 ) . W e s u g g e s t t h a t i n p e o p l e w i t h N F 1 s o m e n e u r o f i b r o m a s a r i s e t h r o u g h i n a c t i v a t i o n o f t h e s e c o n d ( n o r m a l ) N F 1 a l l e l e i n a S c h w a n n c e l l a n d e x p a n s i o n o f t h e r e s u l t i n g n e o p l a s t i c c l o n e , w h i l e o t h e r n e u r o f i b r o m a s a r i s e a s p o l y c l o n a l p r o l i f e r a t i o n s o f N F 1 h a p l o i n s u f f i c i e n t c e l l s . W e u s e d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t o d e t e r m i n e t h e e x p r e s s i o n o f n e u r o f i b r o m i n ( t h e p r o t e i n p r o d u c t o f t h e N F 1 l o c u s ) i n S c h w a n n c e l l s a n d n o n - S c h w a n n c e l l s o f N F 1 -a s s o c i a t e d n e u r o f i b r o m a s c l a s s i f i e d h i s t o p a t h o l o g i c a l l y a s d i f f u s e o r n o d u l a r . W e o b s e r v e d a s i g n i f i c a n t l y l o w e r p r o p o r t i o n o f S 1 0 0 + / N f + c e l l s a n d a s i g n i f i c a n t l y h i g h e r p r o p o r t i o n o f S 1 0 0 - / N f - i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s t h a n i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . W e t h e n u s e d l a s e r m i c r o d i s s e c t i o n t o i s o l a t e S 1 0 0 + / N f + , S 1 0 0 + / N f - a n d S 1 0 0 - / N f + c e l l s f r o m t u m o u r s t h a t h a d b e e n r e m o v e d f r o m f e m a l e s w i t h N F 1 . W e t e s t e d f o r 6 9 c l o n a l i t y i n e a c h c e l l t y p e u s i n g X - l i n k e d AR p o l y m o r p h i s m s . W e f o u n d c l e a r e v i d e n c e o f c l o n a l i t y a m o n g t h e S 1 0 0 + / N f - c e l l s i n s o m e t u m o u r s , a s w o u l d b e e x p e c t e d i f t h e n e u r o f i b r o m a s a r o s e t h r o u g h c l o n a l e x p a n s i o n o f n e o p l a s t i c S c h w a n n c e l l s a f t e r a " s e c o n d h i t " e l i m i n a t e d a l l n e u r o f i b r o m i n e x p r e s s i o n . I n c o n t r a s t , o t h e r t u m o u r s s h o w e d n o e v i d e n c e o f c l o n a l i t y i n a n y o f t h e c e l l t y p e s e x a m i n e d , a s w o u l d b e e x p e c t e d i f t h e s e n e u r o f i b r o m a s a r o s e a s p o l y c l o n a l p r o l i f e r a t i o n s o f N F 1 h a p l o i n s u f f i c i e n t c e l l s . METHODS Sample Collection W e c o l l e c t e d f o r m a l i n f i x e d - p a r a f f i n e m b e d d e d s a m p l e s f r o m C r e t e i l H o s p i t a l ( P a r i s , F r a n c e ) , T h e N e u r o f i b r o m a t o s i s I n s t i t u t e ( L a C r e s c e n t a , C a l i f o r n i a ) , V a n c o u v e r G e n e r a l H o s p i t a l ( V a n c o u v e r , C a n a d a ) , a n d C h i l d r e n ' s a n d W o m e n ' s H o s p i t a l ( V a n c o u v e r , C a n a d a ) . W e s t u d i e d a t o t a l o f 3 8 b e n i g n - n e u r o f i b r o m a s f r o m 2 9 p e o p l e w h o a l l h a d a c o n f i r m e d d i a g n o s i s o f N F 1 a c c o r d i n g t o e s t a b l i s h e d c r i t e r i a ( 3 2 ) . T h e t u m o u r s u s e d i n t h i s s t u d y a r e a s u b s e t o f t h o s e u s e d i n C h a p t e r 3 . T h e s t u d y p r o t o c o l w a s a p p r o v e d b y t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a R e s e a r c h E t h i c s C o m m i t t e e . Histopathological Classification of Neurofibromas E a c h n e u r o f i b r o m a w a s c l a s s i f i e d h i s t o p a t h o l o g i c a l l y o n t h e b a s i s o f i t s a p p e a r a n c e i n h e m o t o x y l i n - a n d e o s i n - ( H & E ) s t a i n e d s e c t i o n s a s d i f f u s e o r n o d u l a r a c c o r d i n g t o d e f i n i t i o n s u s e d b y o n e o f t h e a u t h o r s ( J . W . ) . D i f f u s e n e u r o f i b r o m a s w e r e p r e d o m i n a n t l y l o c a t e d i n t h e d e r m i s . T h e y i n v o l v e d t h e t h i n t e r m i n a l b r a n c h e s o f p e r i p h e r a l n e r v e s a n d w e r e c h a r a c t e r i z e d b y p r o l i f e r a t i o n o f c e l l s t h a t w e r e n o t l i m i t e d b y t h e p e r i n e u r i u m . T h e p r o l i f e r a t i n g c e l l s w e r e i r r e g u l a r l y d i s p e r s e d w i t h i n a f i b r o u s a n d / o r m y x o i d b a c k g r o u n d a n d s o m e t i m e s e n c i r c l e d n o r m a l s t r u c t u r e s ( e x o c r i n e g l a n d s , h a i r f o l l i c l e s a n d v e s s e l s ) w i t h o u t d e s t r o y i n g t h e m . M y e l i n f i b r i l s w e r e r a r e o r a b s e n t . N o d u l a r n e u r o f i b r o m a s u s u a l l y i n v o l v e d d e e p e r t i s s u e s . T h e c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n i n t h e s e t u m o u r s w a s i n t r a n e u r a l , e n c l o s e d w i t h i n l a r g e h y p e r t r o p h i c n e r v e s c i r c u m s c r i b e d b y t h e p e r i n e u r i u m . S i n g l e n o d u l a r t u m o u r s i n v o l v e d j u s t o n e f a s c i c l e , w h i l e n o d u l a r p l e x i f o r m t u m o u r s i n v o l v e d s e v e r a l f a s c i c l e s , n e r v e b r a n c h e s o r a n e r v e p l e x u s . O n t r a n s v e r s e s e c t i o n , t h e c e n t r a l a r e a o f n o d u l a r t u m o u r s w a s l o o s e , w i t h a m y x o i d b a c k g r o u n d s u b s t a n c e , u s u a l l y c o n t a i n i n g d i s p e r s e d o r f a s c i c u l a r m y e l i n f i b r i l s . T h e p e r i p h e r a l a r e a o f t h e s e t u m o u r s w a s u s u a l l y m o r e c e l l u l a r . 7 0 S o m e n e u r o f i b r o m a s c o n t a i n e d b o t h d i f f u s e a n d n o d u l a r c o m p o n e n t s ; s u c h t u m o u r s w e r e u s u a l l y f o u n d i n t h e d e e p d e r m i s a n d s u b c u t a n e o u s t i s s u e . T h e n o d u l a r c o m p o n e n t w a s s u r r o u n d e d b y a d i f f u s e e x t r a n e u r a l c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n t h a t i n f i l t r a t e d t h e f a t t i s s u e a n d o t h e r n o r m a l s t r u c t u r e s . Tumour Characteristics H & E s e c t i o n s o f e a c h n e u r o f i b r o m a w e r e i n d e p e n d e n t l y r e v i e w e d b y t w o o f u s ( M . S . a n d T . T . ) E a c h t u m o u r w a s g r a d e d a t 2 0 0 x m a g n i f i c a t i o n o n a 3 - p o i n t L i k e r t s c a l e f o r c e l l u l a r i t y a n d v a s c u l a r i t y . L y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d a t 4 0 0 x m a g n i f i c a t i o n a s a p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l c e l l s . O n l y n e u r o f i b r o m a s w i t h < 3 0 % l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n w e r e s e l e c t e d f o r t h i s s t u d y . L y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n w a s t h e n r a t e d o n a 3 - p o i n t L i k e r t s c a l e o f < 5 % , 6 - 2 0 % , 2 1 - 3 0 % . F i v e t o e i g h t f i e l d s c h o s e n a t r a n d o m w e r e t a k e n t o r e p r e s e n t t h e t u m o u r a s a w h o l e . T h e s e c t i o n w a s t h e n s c a n n e d t o i d e n t i f y r e g i o n s t h a t r e p r e s e n t e d t h e f u l l r a n g e o f c e l l u l a r i t y w i t h i n t h e s p e c i m e n . T h e s e r e g i o n s w e r e m a r k e d f o r s u b s e q u e n t i m a g i n g a n d a n a l y s i s a f t e r s t a i n i n g f o r S 1 0 0 ( a S c h w a n n c e l l s m a r k e r ) a n d n e u r o f i b r o m i n . Immunofluorescent Staining for S100 and Neurofibromin F o u r s e r i a l 5 p m s e c t i o n s w e r e c u t a f t e r t h e H & E s e c t i o n f r o m e a c h o f t h e n e u r o f i b r o m a s a n d s t a i n e d r e s p e c t i v e l y f o r S 1 0 0 o n l y , n e u r o f i b r o m i n ( N f ) o n l y , S 1 0 0 a n d n e u r o f i b r o m i n t o g e t h e r o r w i t h n o p r i m a r y a n t i b o d y a s a n e g a t i v e c o n t r o l . S e c t i o n s o f a t r a u m a t i c n e u r o m a f r o m a p e r s o n w h o d o e s n o t h a v e N F 1 w e r e u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l , a n d s e c t i o n s o f a n M P N S T f r o m a p e r s o n w i t h N F 1 w e r e u s e d a s a n e g a t i v e c o n t r o l f o r t h e s p e c i f i c i t y o f n e u r o f i b r o m i n s t a i n i n g . T r a u m a t i c n e u r o m a s a r e c o m p o s e d o f s i m i l a r c e l l t y p e s a s n e u r o f i b r o m a s , m a i n l y S c h w a n n c e l l s a n d f i b r o b l a s t s , b o t h o f w h i c h e x p r e s s n e u r o f i b r o m i n . A n a v e r a g e o f 9 2 % o f c e l l s i n t h e t r a u m a t i c n e u r o m a w e r e n e u r o f i b r o m i n p o s i t i v e . T h e r e w a s n o e v i d e n c e o f S 1 0 0 o r n e u r o f i b r o m i n e x p r e s s i o n i n t h e M P N S T , a l t h o u g h S c h w a n n c e l l s i n a n a d j a c e n t h i s t o l o g i c a l l y b e n i g n c o m p o n e n t w e r e S 1 0 0 a n d n e u r o f i b r o m i n p o s i t i v e . A l l s e c t i o n s w e r e d e p a r a f f i n i z e d i n x y l e n e , h y d r a t e d t h r o u g h g r a d e d a l c o h o l s ( 1 0 0 % , 9 5 % , a n d 7 0 % ) a n d e q u i l i b r a t e d i n p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e . H e a t a n t i g e n r e t r i e v a l w a s p e r f o r m e d i n 1 0 m M s o d i u m c i t r a t e p H 6 . 0 a t 7 0 ° C f o r 1 0 m i n u t e s . S a m p l e s w e r e t r e a t e d w i t h f r e s h 1 m g / m l s o d i u m b o r o h y d r i d e f o r 2 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e t o 7 1 r e d u c e a u t o f l u o r e s c e n c e a n d t h e n b l o c k e d w i t h 5 % n o r m a l g o a t s e r u m f o r 3 0 m i n u t e s . P r i m a r y a n t i b o d y t o S 1 0 0 ( p o l y c l o n a l r a b b i t a n t i - c o w ; D A K O C a n a d a I n c . ; M i s s i s s a u g a O N , C a n a d a ) w a s a d d e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 : 4 0 0 a n d n e u r o f i b r o m i n ( m o n o c l o n a l m o u s e a n t i - h u m a n ; M c N F N 2 7 ; N o v u s B i o l o g i c a l s I n c . ; L i t t l e t o n , C O ) a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 : 1 0 0 . T h e s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d i n a n t i b o d y s o l u t i o n o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e . G o a t a n t i - m o u s e a n d a n t i - r a b b i t I g G a n t i b o d i e s l a b e l e d w i t h A l e x a 4 8 8 a n d 5 6 8 f l u o r o c h r o m e s , r e s p e c t i v e l y , w e r e t h e n a d d e d , a n d t h e s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d f o r 9 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . N u c l e i w e r e i d e n t i f i e d b y s t a i n i n g w i t h D A P I . S l i d e s w e r e c o v e r - s l i p p e d w i t h V E C T A S H I E L D © m o u n t i n g m e d i u m ( V e c t o r L a b o r a t o r i e s C a n a d a I n c . ; B u r l i n g t o n , O N , C a n a d a ) . Image Acquisition S l i d e s s t a i n e d f o r S 1 0 0 o n l y o r f o r n e u r o f i b r o m i n o n l y w e r e s c a n n e d t o e n s u r e t h a t t h e s t a i n i n g w o r k e d . B l o o d v e s s e l s w i t h i n t h e t u m o u r s e r v e d a s a n i n t e r n a l p o s i t i v e c o n t r o l f o r n e u r o f i b r o m i n s t a i n i n g . O n t h e s e c t i o n t h a t h a d b e e n d u a l l a b e l e d f o r b o t h S 1 0 0 a n d n e u r o f i b r o m i n , t w o i m a g e s w e r e t a k e n u s i n g e a c h o f t h r e e f i l t e r s ( D A P I , F I T C , R H O D ) w i t h i n e a c h r e g i o n t h a t h a d b e e n s e l e c t e d f o r e x a m i n a t i o n o n t h e H & E s t a i n e d s l i d e . A r e a s t h a t h a d f e w b l o o d v e s s e l s w e r e c h o s e n t o a v o i d i n c l u d i n g S 1 0 0 - / N f + e n d o t h e l i a l c e l l s i n t h e c o u n t s . A d d i t i o n a l i m a g e s w e r e t a k e n i n a r e a s w h e r e t h e r e w a s a c h a n g e i n t h e s t a i n i n g p a t t e r n s f o r S 1 0 0 a n d n e u r o f i b r o m i n . A l l s a m p l e s w e r e i m a g e d o n a Z e i s s A x i o P l a n 2 m i c r o s c o p e e q u i p p e d w i t h a 1 4 b i t A x i o C a m H R m c a m e r a a t 4 0 0 x m a g n i f i c a t i o n . I m a g e r e s o l u t i o n w a s 1 3 8 8 X 1 0 4 0 p i x e l s , a r i d i m a g e s w e r e s a v e d i n T I F f o r m a t . Image Analysis C e l l o m i c s ( C e l l o m i c s I n c , P i t t s b u r g P A ) b i o i m a g i n g s o f t w a r e w a s u s e d t o q u a n t i f y t h e t o t a l n u m b e r o f c e l l s w i t h i n a n i m a g e a n d t h e n u m b e r o f c e l l s t h a t w e r e S 1 0 0 + / N f + , S 1 0 0 + / N f - , S 1 0 0 - / N f + a n d S 1 0 0 - / N f - . T h e b a c k g r o u n d p i x e l i n t e n s i t y w a s m e a s u r e d f r o m f i v e r a n d o m a r e a s f o r e a c h o f t h e i m a g e s o n e a c h f l u o r e s c e n t c h a n n e l . A c e l l w a s c o n s i d e r e d t o b e p o s i t i v e w h e n i t s p i x e l i n t e n s i t y w a s t w o s t a n d a r d d e v i a t i o n s a b o v e t h e m e a n b a c k g r o u n d p i x e l i n t e n s i t y . T h i s a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d o n e a c h o f t h e i m a g e s , a n d a v e r a g e s w e r e c a l c u l a t e d f o r e a c h t u m o u r . 7 2 Statistical Analysis K e n d a l l ' s c o r r e l a t i o n w a s c a l c u l a t e d u s i n g S P S S ( S P S S , I n c . C h i c a g o , I l l i n o i s , 2 0 0 1 ) t o d e t e r m i n e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n v a s c u l a r i t y , c e l l u l a r i t y , l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n , t u m o u r t y p e a n d s t a i n i n g p a t t e r n s . T h e M a n n - W h i t n e y U t e s t w a s p e r f o r m e d u s i n g S P S S ( S P S S , I n c . C h i c a g o , I l l i n o i s , 2 0 0 1 ) t o d e t e r m i n e i f t h e r e w e r e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e S 1 0 0 + / N f + , S 1 0 0 + / N f - , S 1 0 0 - / N f + , a n d S 1 0 0 - / N f - c e l l s a s p e r c e n t a g e s o f t h e t o t a l n u m b e r o f c e l l s w i t h i n n o d u l a r a n d d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . A p -v a l u e l e s s t h a n o r e q u a l t o 0 . 0 5 w a s c o n s i d e r e d t o b e s i g n i f i c a n t . Method Development for Immunofluorescently Labeled-formalin Fixed Samples for Laser Microdissection M e t a l c a s s e t t e s a n d n o r m a l g l a s s s l i d e s w e r e f o u n d t o b e i n c o m p a t i b l e w i t h t h e s t a i n i n g p r o c e d u r e d e s c r i b e d a b o v e . G l a s s s l i d e s w i t h p o l y e t h y l e n e n a p h t h o l a t e ( P E N ) m e m b r a n e m o u n t e d o n t o p w e r e , t h e r e f o r e , u s e d f o r t h i s s t u d y . L a s e r m i c r o d i s s e c t i o n r e q u i r e s a d r y s a m p l e , b o t h f o r c u t t i n g a n d c a p t u r i n g . F o r m a l i n -f i x e d s a m p l e s h a v e h i g h o v e r a l l l e v e l s o f t i s s u e a u t o f l u o r e s c e n c e , w h i c h i s f u r t h e r h e i g h t e n e d w h e n t h e s a m p l e s a r e v i s u a l i z e d d r y . X y l e n e , 1 0 0 % e t h a n o l , a n d 9 5 % e t h a n o l w e r e t e s t e d t o d e t e r m i n e i f t h e y c o u l d b e u s e d t o w e t t h e s a m p l e f o r v i s u a l i z a t i o n b u t w o u l d d r y q u i c k l y e n o u g h t o a l l o w m i c r o d i s s e c t i o n o f t h e d e s i r e d c e l l s . X y l e n e p r o v i d e d t h e b e s t v i s u a l p i c t u r e o f t h e t i s s u e a n d e v a p o r a t e d q u i c k l y . H o w e v e r , x y l e n e c o u l d o n l y b e a p p l i e d t o t h e t i s s u e t h r e e t i m e s b e c a u s e i t d e g r a d e d t h e P E N m e m b r a n e t o w h i c h t h e t i s s u e w a s a t t a c h e d . A f t e r a p p l y i n g x y l e n e t o t h e t i s s u e , t i l e d i m a g e s o f 1 2 0 - 1 4 0 f i e l d s a t 6 0 0 x w e r e t a k e n . S e l e c t e d c e l l s w e r e m i c r o d i s s e c t e d o n a V e r i t a s m i c r o d i s s e c t o r u s i n g t h e u l t r a v i o l e t ( U V ) l a s e r a n d c o l l e c t e d u s i n g t h e i n f r a r e d ( I R ) l a s e r . T h e r e a r e s e v e r a l p a r a m e t e r s w i t h i n t h e U V c u t t i n g t h a t c a n b e a d j u s t e d . T h e s e i n c l u d e t h e s t r e n g t h o f t h e l a s e r , t h e n u m b e r o f t i m e s t h e s e l e c t i o n i s c u t , a n d t h e " t a b s " , w h i c h a r e s p a c e s o n t h e s p e c i m e n t h a t a r e l e f t u n c u t t o h e l p p r e v e n t t i s s u e c u r l i n g . M a n y e x p e r i m e n t s w e r e r e q u i r e d t o d e v e l o p c o n d i t i o n s t h a t p r o v i d e d s a t i s f a c t o r y r e c o v e r y o f t h e s e f o r m a l i n - f i x e d t i s s u e s w i t h s i n g l e c e l l m i c r o d i s s e c t i o n w h e n h u n d r e d s o f c e l l s w e r e b e i n g s e l e c t e d i n a s m a l l a r e a . I t w a s d e t e r m i n e d t h a t t h e b e s t o p t i o n w a s t o e l i m i n a t e t h e " t a b s " f o r c u t t i n g , w h i c h p e r m i t t e d g o o d c o l l e c t i o n w i t h a s i n g l e c u t . 7 3 T h e l a s t p a r a m e t e r t e s t e d w a s t h e n u m b e r o f s e l e c t i o n s t h a t c o u l d b e c o l l e c t e d w i t h i n a g i v e n t i l e d i m a g e . T h i s v a r i e d b e t w e e n s a m p l e s . A g r e a t e r n u m b e r o f s a m p l e s c o u l d b e c o l l e c t e d f r o m t i s s u e t h a t w a s m o r e c e l l u l a r t h a n f r o m t i s s u e t h a t w a s m o r e f i b r o u s . A s s e s s m e n t o f t h e t i s s u e w a s , t h e r e f o r e , r e q u i r e d b e f o r e b e g i n n i n g t h e m i c r o d i s s e c t i o n . Tissue Preparation for Laser Microdissection S e r i a l s e c t i o n s w e r e c u t f r o m 3 d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s f r o m 3 f e m a l e s w i t h N F 1 a n d 3 n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s f r o m 1 f e m a l e w i t h N F 1 . T h e f i r s t s e c t i o n w a s c u t a t 5 p m , s t a i n e d w i t h H & E , a n d u s e d a s a r e f e r e n c e s l i d e . A l l o t h e r s e c t i o n s w e r e c u t a t 8 p m a n d m o u n t e d o n P E N g l a s s m e m b r a n e s l i d e s ( M o l e c u l a r D e v i c e s , S u n n y v a l e , C A ) . O n e s e c t i o n w a s i m m u n o f l u o r e s c e n t l y s t a i n e d ( a s d e s c r i b e d a b o v e ) w i t h r a b b i t a n t i - h u m a n s m o o t h m u s c l e a c t i n ( S M A ) ( A n a S p e c , I n c . , S a n J o s e , C a l i f o r n i a ) a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 : 4 0 0 t o i d e n t i f y b l o o d v e s s e l s w i t h i n t h e n e u r o f i b r o m a s . T h e D N A p u r i f i e d f r o m t h e b l o o d v e s s e l s w i t h i n t h e n e u r o f i b r o m a s s e r v e d a s a c o n t r o l f o r m o l e c u l a r a n a l y s i s b e c a u s e p e r i p h e r a l b l o o d w a s n o t a v a i l a b l e . S u b s e q u e n t s e c t i o n s w e r e s t a i n e d f o r b o t h n e u r o f i b r o m i n a n d S 1 0 0 a s d e s c r i b e d a b o v e , w i t h t h e e x c e p t i o n t h a t A l e x a 5 9 4 w a s u s e d i n s t e a d o f A l e x a 5 6 8 a s t h e l a b e l o n t h e s e c o n d a r y a n t i b o d y . Sample Collection by Laser Microdissection T i l e d i m a g e s w e r e t a k e n u s i n g t w o f i l t e r s ( F I T C , R H O D ) o n t h e V e r i t a s m i c r o d i s s e c t o r . T h e i m a g e s w e r e c o m p a r e d t o i d e n t i f y c e l l s t h a t w e r e S 1 0 0 + / N f + , S 1 0 0 + / N f - a n d S 1 0 0 -/ N f + . C e l l s o f e a c h c l a s s w e r e s e l e c t i v e l y c u t w i t h a U V l a s e r a n d a t t a c h e d t o a c o l l e c t i o n c a p u s i n g a n i n f r a r e d l a s e r . B a s e d o n t h e i n i t i a l D N A a s s e s s m e n t o f t h e w h o l e t u m o u r , e n o u g h c e l l s w e r e m i c r o d i s s e c t e d t o y i e l d 2 0 n g o f D N A f o r e a c h c e l l t y p e . DNA Purification D N A w a s e x t r a c t e d f r o m m i c r o d i s s e c t e d s a m p l e s b y o v e r n i g h t i n c u b a t i o n a t 4 2 ° C i n 5 0 p l o f D N A e x t r a c t i o n b u f f e r p e r m i c r o d i s s e c t i o n c a p . T h e b u f f e r c o n t a i n e d 1 0 m M T r i s -H C I p H 8 . 0 , 1 m M E D T A , 1 % T w e e n 2 0 a n d 0 . 1 % P r o t e i n a s e K . P h e n o l / C h l o r o f o r m e x t r a c t i o n w a s p e r f o r m e d f o l l o w e d b y e t h a n o l p r e c i p i t a t i o n w i t h 4 p g / u l o f g l y c o g e n a d d e d t o e a c h 5 0 u l d i g e s t i o n a s a c a r r i e r . E t h a n o l p r e c i p i t a t i o n w a s c a r r i e d o u t a t - 2 0 ° C f o r a m i n i m u m o f 2 h o u r s i n 0 . 1 M s o d i u m a c e t a t e a n d 9 5 % e t h a n o l p H 5 . 2 s o l u t i o n . S a m p l e s w e r e r e s u s p e n d e d i n 1 0 u l o f w a t e r . 7 4 XCI Clonality Assay S k e w i n g o f X - c h r o m o s o m e - i n a c t i v a t i o n ( X C I ) w a s u s e d t o a s s e s s c l o n a l i t y i n e a c h o f t h e m i c r o d i s s e c t e d s a m p l e s b y m e a n s o f a D N A m e t h y l a t i o n - s e n s i t i y e a s s a y u s i n g p o l y m o r p h i c v a r i a n t s o f t h e a n d r o g e n r e c e p t o r ( A R ) g e n e . 5 u l o f p u r i f i e d g e n o m i c D N A w a s d i g e s t e d w i t h Hpall a n d Rsal, a n d a n u n d i g e s t e d c o n t r o l w i t h 5 u l o f g e n o m i c D N A w a s d i g e s t e d w i t h Rsal a l o n e . B o t h d i g e s t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n a t o t a l v o l u m e o f 1 0 u l . N e s t e d P C R w a s p e r f o r m e d o n t h e D N A d i g e s t s w i t h t h e f o l l o w i n g p r i m e r s f o r 3 5 c y c l e s i n e a c h r o u n d : F i r s t r o u n d - A R N 1 F ( 5 ' C T G C A G C G A C T A C C G C A T C 3 ' ) , A R N 2 R ( 5 ' G C T C T G G G A C G C A A C C T C 3 ' ) ; s e c o n d r o u n d : A R F ( 5 ' T C C A G A A T C T G T T C C A G A G C G T G C 3 ' ) , A R R ( 5 ' G C T G T G A A G G T T G C T G T T C C T C A T 3 ' ) . T h e s e c o n d r o u n d o f P C R w a s p e r f o r m e d w i t h a f o r w a r d p r i m e r l a b e l e d w i t h t h e H E X A B I P r i s m D y e , a n d p r o d u c t s w e r e s i z e d u s i n g c a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s o n a n A B I P r i s m 3 1 0 g e n e t i c a n a l y z e r ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A ) . F l u o r e s c e n c e w a s d e t e c t e d b y A B I P r i s m d a t a - c o l l e c t i o n s o f t w a r e a n d a n a l y s e d w i t h G e n e S c a n s o f t w a r e . T h e p e a k a r e a f o r e a c h a l l e l e w a s u s e d t o d e t e r m i n e X C I s k e w i n g . T o a c c o u n t f o r p r e f e r e n t i a l a m p l i f i c a t i o n , t h e a r e a s o f t h e p e a k s o f t h e d i g e s t e d s a m p l e w e r e n o r m a l i z e d i n r e l a t i o n t o m e a s u r e m e n t s f r o m t h e u n d i g e s t e d s a m p l e . T h e d e g r e e o f s k e w i n g w a s c a l c u l a t e d a s ( d 1 / u 1 ) / ( d 1 / u 1 + d 2 / u 2 ) , w h e r e d 1 a n d d 2 r e p r e s e n t t h e p e a k a r e a s o f t h e t w o a l l e l e s f r o m t h e d i g e s t e d s a m p l e s , a n d u 1 a n d u 2 r e p r e s e n t t h e p e a k a r e a s o f t h e t w o a l l e l e s f r o m t h e u n d i g e s t e d s a m p l e s . S a m p l e s w i t h > 9 0 % s k e w i n g w e r e c o n s i d e r e d t o b e c l o n a l . RESULTS W e s t u d i e d t h e e x p r e s s i o n o f n e u r o f i b r o m i n a n d S 1 0 0 , a S c h w a n n c e l l m a r k e r , i n 3 8 b e n i g n n e u r o f i b r o m a s f r o m 2 9 N F 1 p a t i e n t s . 2 8 o f t h e t u m o u r s ( f r o m 2 3 p a t i e n t s ) w e r e c l a s s i f i e d h i s t o p a t h o l o g i c a l l y a s d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s , 8 t u m o u r s ( f r o m 5 i n d i v i d u a l s ) w e r e c l a s s i f i e d a s n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s , a n d t w o t u m o u r s ( f r o m 2 i n d i v i d u a l s ) h a d a m i x o f b o t h d i f f u s e a n d n o d u l a r c o m p o n e n t s . T h e m i x e d t u m o u r s w e r e n o t i n c l u d e d i n t h e s t a t i s t i c a l a n a l y s i s . F i g u r e 4 . 1 s h o w s e x a m p l e s o f e a c h t y p e o f n e u r o f i b r o m a w i t h c h a r a c t e r i s t i c p a t t e r n s o f c e l l u l a r i t y , v a s c u l a r i t y , a n d l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n . 7 5 Figure 4.1 Images of typical neurofibromas in the current study that represent the majority of the tumour. A . H & E s e c t i o n o f a n o d u l a r n e u r o f i b r o m a a t 4 0 0 x m a g n i f i c a t i o n . B . S e r i a l s e c t i o n t o ( A ) s t a i n e d f o r n e u r o f i b r o m i n a n d c o u n t e r s t a i n e d w i t h D A P I a t 4 0 0 x m a g n i f i c a t i o n . C . S e r i a l s e c t i o n t o ( A ) s t a i n e d f o r S 1 0 0 a n d c o u n t e r s t a i n e d w i t h D A P I a t 4 0 0 x . D . M e r g e d i m a g e o f ( B ) a n d ( C ) . E . H & E s e c t i o n o f a d i f f u s e n e u r o f i b r o m a a t 4 0 0 x m a g n i f i c a t i o n . F . S e r i a l s e c t i o n t o ( E ) s t a i n e d f o r n e u r o f i b r o m i n a n d c o u n t e r s t a i n e d w i t h D A P I a t 4 0 0 x m a g n i f i c a t i o n . G . S e r i a l s e c t i o n t o ( E ) s t a i n e d f o r S 1 0 0 a n d c o u n t e r s t a i n e d w i t h D A P I a t 4 0 0 x . H . M e r g e d i m a g e o f ( F ) a n d ( G ) . N o t e t h e h i g h e r c e l l u l a r i t y i n E c o m p a r e d t o A a n d t h e l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n ( L ) i n A . A l s o n o t e t h e p r e s e n c e o f b l o o d v e s s e l s m a r k e d w i t h a n a r r o w a n d s t a i n e d p o s i t i v e i n ( B ) a n d ( F ) f o r n e u r o f i b r o m i n . 7 6 7 7 Cellularity N o d u l a r n e u r o f i b r o m a s t e n d e d t o b e l e s s c e l l u l a r t h a n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s ( F i g u r e 4 . 1 , F i g u r e 4 . 2 ) , w i t h a l m o s t 7 5 % o f n o d u l a r t u m o u r s f a l l i n g i n t o t h e l o w e s t c e l l u l a r i t y c a t e g o r y . I n c o m p a r i s o n t o d i f f u s e t u m o u r s , n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s d i s p l a y e d m o r e d e n s e f i b r o t i c t i s s u e a n d a r e a s o f d e g e n e r a t i o n i n t h e c e n t r a l p o r t i o n , b u t n o t a t t h e p e r i p h e r y . I n c o n t r a s t , t h e d i f f u s e t u m o u r s h a d h i g h e r o v e r a l l c e l l u l a r i t y w i t h a m o r e u n i f o r m d i s t r i b u t i o n o f c e l l s t h r o u g h o u t t h e t u m o u r . T h e r e w a s a s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n b e t w e e n c e l l u l a r i t y a n d h i s t o p a t h o l o g i c a l t u m o u r t y p e ( K e n d a l l ' s t a u = - 0 . 4 7 4 , p = 0 . 0 0 3 ) ( T a b l e 4 . 1 ) . Lymphocytic Infiltration O n l y n e u r o f i b r o m a s w i t h l e s s t h a n 3 0 % l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n w e r e c h o s e n f o r t h i s s t u d y , a s l y m p h o c y t e s w o u l d c o n t r i b u t e t o t h e o v e r a l l c e l l u l a r i t y a s d e t e r m i n e d b y D A P I s t a i n i n g a n d c a u s e a n o v e r - e s t i m a t i o n o f t h e p e r c e n t a g e o f c e l l s w i t h i n a n e u r o f i b r o m a t h a t w e r e n e u r o f i b r o m i n p o s i t i v e a n d a n u n d e r - e s t i m a t i o n o f t h o s e t h a t w e r e S 1 0 0 -p o s i t i v e . A l l n e u r o f i b r o m a s t h a t w e r e e x c l u d e d f r o m t h i s s t u d y w e r e n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s . F o r t h e 3 8 t u m o u r s i n c l u d e d i n t h e s t u d y , t h e a v e r a g e l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n f o r n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s w a s 1 3 % c o m p a r e d t o 9 % i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . T h e c o r r e l a t i o n o f l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n a n d t u m o u r t y p e c o u l d n o t b e t e s t e d s t a t i s t i c a l l y b e c a u s e t h e m o s t e x t r e m e c a s e s w e r e e l i m i n a t e d i n t h e t u m o u r s e l e c t i o n p r o c e s s . L y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n w a s g e n e r a l l y d i s t r i b u t e d e v e n l y w i t h i n t h e n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s , w h i l e l y m p h o c y t e s w e r e m o r e l o c a l i z e d i n s m a l l c l u s t e r s w h e n t h e y w e r e o b s e r v e d i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . T h e r e w a s a s i g n i f i c a n t i n v e r s e c o r r e l a t i o n b e t w e e n l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n w i t h b o t h c e l l u l a r i t y ( K e n d a l l ' s t a u = - 0 . 3 5 3 , p = 0 . 0 2 2 ) a n d v a s c u l a r i t y ( K e n d a l l ' s t a u = - 0 . 5 1 0 , p = 0 . 0 0 1 ) ( T a b l e 4 . 1 ) . Vascularity N o d u l a r n e u r o f i b r o m a s t y p i c a l l y h a d f e w e r l a r g e v e s s e l s t h a n d i f f u s e t u m o u r s , w h i c h h a d m o r e s m a l l e r v e s s e l s ( F i g u r e 4 . 1 , F i g u r e 4 . 2 ) . V e s s e l s w e r e e v e n l y d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t b o t h d i f f u s e a n d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s . V a s c u l a r i t y w a s n o t s i g n i f i c a n t l y c o r r e l a t e d w i t h t u m o u r t y p e ( K e n d a l l ' s t a u = - 0 . 1 8 7 , p = 0 . 2 5 4 ) b u t w a s s i g n i f i c a n t l y 7 8 correlated with cellularity (Kendall's tau =0.479, p=0.002), as more cellular neurofibromas had a higher number of blood vessels (Table 4.1). Figure 4.2 Distribution of pathological features of neurofibromas classified histopathologically. A. Cellularity estimated on a 3-point Likert scale with 3 being the highest cellularity; B. Vascularity estimated on a 3-point Likert scale with 3 being the highest vascularity; and C. Lymphocytic infiltration estimated on a 3-point Likert scale with 3 being the highest lymphocytic infiltration. I Diffuse neurofibromas • Nodular neurofibromas 79 Table 4.1 Summary of Kendall's tau correlations for pathological features in histologically-defined nodular and diffuse neurofibromas from patients with NF1. T u m o u r T y p e C e l l u l a r i t y V a s c u l a r i t y L y m p h o c y t e s T u m o u r T y p e C o e f f i c i e n t S i g n i f i c a n c e 1 . 0 C e l l u l a r i t y C o e f f i c i e n t S i g n i f i c a n c e - 0 . 4 7 4 P = 0 . 0 0 3 1 . 0 V a s c u l a r i t y C o e f f i c i e n t S i g n i f i c a n c e - 0 . 1 8 7 P = 0 . 2 5 4 0 . 4 7 9 P = 0 . 0 0 2 1 . 0 L y m p h o c y t e s C o e f f i c i e n t S i g n i f i c a n c e 0 . 2 0 4 P = 0 . 2 0 9 - 0 . 3 5 3 P = 0 . 0 2 2 - 0 . 5 1 0 P = 0 . 0 0 1 1 . 0 Neurofibromin & S100 Staining within Benign Neurofibromas F i g u r e 4 . 1 s h o w s e x a m p l e s o f t y p i c a l s t a i n i n g p a t t e r n s f o r S 1 0 0 a n d n e u r o f i b r o m i n i n h i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d d i f f u s e a n d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s . S 1 0 0 - p o s i t i v e ( S c h w a n n ) c e l l s w e r e s c a t t e r e d t h r o u g h o u t a l l n e u r o f i b r o m a s , o f t e n s e p a r a t e d b y S 1 0 0 - n e g a t i v e c e l l s . T h e r e w e r e a r e a s t h a t s h o w e d c o m p a c t S 1 0 0 - p o s i t i v e c e l l s , i n d i c a t i n g t r a p p e d a x o n s o r n e r v e f i b e r s . W h e n s l i d e s w e r e d u a l l a b e l e d f o r S 1 0 0 a n d n e u r o f i b r o m i n , 2 5 . 4 ± 9 . 6 % ( m e a n ± 1 S D ) o f c e l l s w i t h i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s a n d 4 1 . 9 ± 1 4 . 2 % o f c e l l s w i t h i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s s t a i n e d p o s i t i v e l y f o r b o t h S 1 0 0 a n d n e u r o f i b r o m i n ( t h e p h e n o t y p e e x p e c t e d f o r n o r m a l S c h w a n n c e l l s ) ( F i g u r e 4 . 3 ) . T h i s d i f f e r e n c e w a s h i g h l y s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t ( p = 0 . 0 0 5 ) . T h e p r o p o r t i o n o f S 1 0 0 - p o s i t i v e c e l l s t h a t w e r e a l s o n e u r o f i b r o m i n - p o s i t i v e w a s s o m e w h a t l o w e r i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s ( 6 1 . 1 ± 2 0 . 0 % ) t h a n i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s ( 7 4 . 4 ± 1 2 . 7 % ) , b u t t h i s d i f f e r e n c e d i d n o t r e a c h s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e ( p = 0 . 0 7 1 ) . F i f t e e n o f t h e 3 8 t u m o u r s s h o w e d n e u r o f i b r o m i n e x p r e s s i o n i n m o r e t h a n 7 5 % o f S 1 0 0 - p o s i t i v e c e l l s . T h r e e t u m o u r s , o n e n o d u l a r a n d t w o d i f f u s e , s h o w e d n e u r o f i b r o m i n s t a i n i n g i n m o r e t h a n 9 0 % o f S 1 0 0 - p o s i t i v e c e l l s . I n o n e o f t h e s e d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s , 1 0 0 % o f S 1 0 0 - p o s i t i v e c e l l s a l s o e x p r e s s e d n e u r o f i b r o m i n . 8 0 Figure 4 . 3 Boxplot summarizing S 1 0 0 and neurofibromin staining in nodular and diffuse neurofibromas. T h e b o x e s r e p r e s e n t t h e i n t e r q u a r t i l e r a n g e , w i t h t h e t o p o f t h e b o x r e p r e s e n t i n g t h e 7 5 t h p e r c e n t i l e a n d t h e b o t t o m t h e 2 5 t h p e r c e n t i l e f o r t h e d a t a . T h e l i n e w i t h i n t h e b o x r e p r e s e n t s t h e m e d i a n . T h e w h i s k e r s o n t h e b o x e s d i s p l a y t h e s p r e a d o f t h e d a t a . T h e c i r c l e s r e p r e s e n t o u t l i e r s t h a t a r e b e t w e e n 1 . 5 a n d 3 b o x l e n g t h s f r o m t h e u p p e r o r l o w e r e d g e o f t h e b o x . T h e s t a r s r e p r e s e n t o u t l i e r s t h a t a r e g r e a t e r t h a n 3 b o x l e n g t h s f r o m t h e u p p e r e d g e o f t h e b o x . [ | D i f f u s e n e u r o f i b r o m a s I N o d u l a r n e u r o f i b r o m a s S 1 0 0 + M + S 1 0 0 + M - S 1 0 0 - M + S 1 0 0 - / N f -O v e r a l l , t h e r e d i d n o t a p p e a r t o b e l a r g e a g g r e g a t i o n s o f S 1 0 0 + / N f - S c h w a n n c e l l s i n a n y o f t h e t u m o u r s . R a t h e r , S 1 0 0 + / N f - c e l l s a n d S 1 0 0 + / N f + c e l l s w e r e b o t h f o u n d t h r o u g h o u t t h e t u m o u r s . T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n n o d u l a r a n d d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s i n t h e m e a n p e r c e n t a g e o f c e l l s t h a t w a s S 1 0 0 - p o s i t i v e a n d n e u r o f i b r o m i n - n e g a t i v e ( t h e p h e n o t y p e p r e d i c t e d f o r a S c h w a n n c e l l n e o p l a s m t h a t a r i s e s b y c o m p l e t e i n a c t i v a t i o n o f t h e NF1 l o c u s ) ( F i g u r e 3 ) . C e l l s n e g a t i v e f o r b o t h S 1 0 0 a n d n e u r o f i b r o m i n w e r e s c a t t e r e d t h r o u g h o u t b o t h t y p e s o f n e u r o f i b r o m a s . T h e m e a n p e r c e n t a g e o f t h e s e d o u b l e n e g a t i v e c e l l s w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s ( 3 1 . 3 ± 9 . 9 % ) t h a n i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s ( 1 5 . 7 ± 1 0 . 4 % ) ( p = 0 . 0 0 3 , F i g u r e 4 . 3 ) . F i v e n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s a n d t w o d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s h a d m o r e t h a n 3 5 % o f c e l l s n e g a t i v e f o r b o t h S 1 0 0 a n d n e u r o f i b r o m i n . N o d u l a r n e u r o f i b r o m a s u s u a l l y 8 1 h a v e c e n t r a l a r e a s o f d e g e n e r a t i o n o r n e c r o s i s t h a t t e n d t o b e n e g a t i v e f o r b o t h S100 a n d n e u r o f i b r o m i n , b u t p a r t i c u l a r c a r e w a s t a k e n t o a v o i d t h e s e a r e a s f o r i m a g i n g b e c a u s e t h e y m a y n o t r e p r e s e n t t h e t u m o u r a s a w h o l e . T h e r e w a s n o d i f f e r e n c e b e t w e e n n o d u l a r a n d d i f f u s e t u m o u r s i n t h e p e r c e n t a g e o f c e l l s t h a t w a s S 1 0 0 - n e g a t i v e a n d n e u r o f i b r o m i n - p o s i t i v e ( t h e p h e n o t y p e e x p e c t e d f o r n o r m a l s t r o m a l c e l l s ) ( F i g u r e 4 . 3 ) . T h e s e c e l l s w e r e a l s o d i s t r i b u t e d a m o n g t h e S 1 0 0 - p o s i t i v e c e l l s . N i n e n e u r o f i b r o m a s , . 7 d i f f u s e a n d 2 n o d u l a r , s h o w e d a r e a s o f n o n - u n i f o r m s t a i n i n g f o r e i t h e r S 1 0 0 o r n e u r o f i b r o m i n . S i x o f t h e d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s s h o w e d l i t t l e v a r i a b i l i t y i n t h e p e r c e n t a g e o f a n y o f t h e c e l l t y p e s t h r o u g h o u t t h e s p e c i m e n , b u t o n e d i f f u s e t u m o u r s h o w e d a d r o p i n p e r c e n t a g e o f a l l c e l l t y p e s w i t h o n e a r e a t h a t w a s c o m p l e t e l y n e g a t i v e f o r b o t h S 1 0 0 a n d n e u r o f i b r o m i n . O f t h e t w o n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s t h a t s h o w e d v a r i a t i o n i n s t a i n i n g , o n e s h o w e d a d r o p i n t h e p e r c e n t o f a l l c e l l t y p e s a n d t h e o t h e r s h o w e d a d r o p i n t h e p e r c e n t S 1 0 0 + / N f + c e l l s i n o n e p a r t i c u l a r a r e a o f t h e s l i d e . F o u r n e u r o f i b r o m a s , a l l d i f f u s e , s h o w e d v a r i a t i o n s i n t u m o u r a p p e a r a n c e a c c o r d i n g t o t h e H & E , a n d m o r e i m a g e s w e r e t a k e n i n t h e s e d i f f e r i n g a r e a s . T h r e e o f t h e s e n e u r o f i b r o m a s d i d n o t s h o w a n y d i f f e r e n c e i n t h e p e r c e n t a g e o f e a c h o f t h e c e l l t y p e s i n c o m p a r i s o n t o t h e o t h e r a r e a s o f t h e t u m o u r , w h i l e o n e n e u r o f i b r o m a s h o w e d s o m e v a r i a t i o n i n t h e n u m b e r o f c e l l s t h a t w e r e p o s i t i v e f o r b o t h n e u r o f i b r o m i n a n d S 1 0 0 . Correlations T h e r e w a s a s i g n i f i c a n t i n v e r s e c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e n u m b e r o f S 1 0 0 + / N f + c e l l s a n d t h e n u m b e r o f S 1 0 0 - / N f - c e l l s i n a t u m o u r ( p < 0 . 0 0 1 ) ( T a b l e 4 . 2 ) . S 1 0 0 + / N f + c e l l s w e r e a l s o i n v e r s e l y c o r r e l a t e d w i t h S 1 0 0 - / N f + c e l l s ( p = 0 . 0 1 8 ) b u t n o t w i t h S 1 0 0 + / N f - c e l l s ( T a b l e 4 . 2 ) . S 1 0 0 - / N f + a n d S 1 0 0 + / N f - c e l l s w e r e n e g a t i v e l y c o r r e l a t e d w i t h e a c h o t h e r ( p < 0 . 0 0 1 ) . T h e n u m b e r o f l y m p h o c y t e s i n a n e u r o f i b r o m a w a s d i r e c t l y c o r r e l a t e d w i t h t h e n u m b e r o f S 1 0 0 - / N f - c e l l s ( p = 0 . 0 3 4 ) a n d i n v e r s e l y c o r r e l a t e d w i t h t h e n u m b e r o f S 1 0 0 + / N f + c e l l s ( p = 0 . 0 1 ) ( T a b l e 4 . 2 ) . 8 2 Table 4.2 Summary of Kendall's tau correlations for S100 and neurofibromin staining in histologically-defined noduiar and diffuse neurofibromas from patients with NF1. S 1 0 0 + / N f + S 1 0 0 + / N f - S 1 0 0 - / N f + S 1 0 0 - / N f -S 1 0 0 + / N f + C o e f f i c i e n t S i g n i f i c a n c e 1 . 0 S 1 0 0 + / N f -C o e f f i c i e n t S i g n i f i c a n c e 0 . 0 0 7 P = 0 . 9 5 6 1 . 0 S 1 0 0 - / N f + C o e f f i c i e n t S i g n i f i c a n c e - 0 . 2 8 5 P = 0 . 0 1 8 - 0 . 5 4 4 P O . 0 0 1 1 . 0 S 1 0 0 - / N f -C o e f f i c i e n t S i g n i f i c a n c e - 0 . 5 9 5 P O . 0 0 1 - 0 . 1 2 4 P = 0 . 2 9 9 0 . 1 4 2 P = 0 . 2 3 8 1 . 0 Clonality ofS100+/Nf+, S100+/Nf- and S100-/Nf+ Cells I f a n e u r o f i b r o m a d e v e l o p s f r o m a n S 1 0 0 - p o s i t i v e ( S c h w a n n ) c e l l t h a t s u s t a i n s a " s e c o n d h i t " m u t a t i o n o f t h e NF1 l o c u s , t h e n e o p l a s t i c c e l l s s h o u l d b e c l o n a l l y r e l a t e d t o e a c h o t h e r a n d s h o u l d n o t e x p r e s s n e u r o f i b r o m i n . O t h e r c e l l s w i t h i n t h e t u m o u r t h a t a r e n o t p a r t o f t h e n e o p l a s t i c c l o n e w o u l d b e e x p e c t e d t o c o n t i n u e t o e x p r e s s n e u r o f i b r o m i n a n d t o b e p o l y c l o n a l . I n c o n t r a s t , i f n e u r o f i b r o m a s a r i s e b y p r o l i f e r a t i o n o f NF1 h a p l o i n s u f f i c i e n t c e l l s , a l l c e l l t y p e s , i n c l u d i n g S c h w a n n c e l l s , s h o u l d b e p o l y c l o n a l a n d s h o u l d c o n t i n u e t o e x p r e s s n e u r o f i b r o m i n . S i x n e u r o f i b r o m a s , 3 d i f f u s e a n d 3 n o d u l a r , t h a t h a d b e e n r e m o v e d f r o m f e m a l e N F 1 p a t i e n t s w e r e s e l e c t e d f o r m i c r o d i s s e c t i o n b a s e d o n D N A q u a l i t y . A f t e r s e c t i o n s o f e a c h t u m o u r w e r e d o u b l e s t a i n e d f o r S 1 0 0 a n d n e u r o f i b r o m i n , a n d S 1 0 0 + / N f + c e l l s ( p u t a t i v e l y n o r m a l S c h w a n n c e l l s ) , S 1 0 0 + / N f - c e l l s ( p u t a t i v e l y n e o p l a s t i c S c h w a n n c e l l s t h a t h a d s u s t a i n e d a " s e c o n d h i t " NF1 m u t a t i o n ) , a n d S 1 0 0 - / N f + c e l l s ( p u t a t i v e l y n o r m a l n o n - S c h w a n n c e l l s ) w e r e i s o l a t e d b y l a s e r c a p t u r e m i c r o d i s s e c t i o n ( F i g u r e 4 . 4 ) . 8 3 Figure 4.4 Images showing selective capture of single cell microdissection of S100+/Nf-negative cells from heterogeneous tissue. A . D i f f u s e n e u r o f i b r o m a s t a i n e d f o r n e u r o f i b r o m i n . R e d c i r c l e s i n d i c a t e c e l l s t h a t a r e S 1 0 0 - / N f + w h e n c o m p a r e d s i d e - b y - s i d e t o i m a g e s o f S 1 0 0 s t a i n i n g a t 6 0 0 x m a g n i f i c a t i o n . B . S a m e t i s s u e i n ( A ) s t a i n e d f o r S 1 0 0 . G r e e n c i r c l e s i n d i c a t e c e l l s t h a t a r e S 1 0 0 + / N f - a n d b l u e c i r c l e s i n d i c a t e c e l l s t h a t a r e S 1 0 0 + / N f + w h e n c o m p a r e d s i d e -b y - s i d e t o i m a g e s o f n e u r o f i b r o m i n s t a i n i n g a t 6 0 0 x m a g n i f i c a t i o n . C . I m a g e o f t i s s u e a f t e r c u t t i n g a l l o f t h e s e l e c t e d c e l l s t y p e s . R e d a r r o w s i n d i c a t e S 1 0 0 - / N f + c e l l s c u t w i t h a U V l a s e r , g r e e n a r r o w s i n d i c a t e S 1 0 0 + / N f - c e l l s c u t w i t h a U V l a s e r , a n d t h e b l u e a r r o w s i n d i c a t e S 1 0 0 + / N f + c e l l s c u t w i t h a U V l a s e r a t 6 0 0 x m a g n i f i c a t i o n . A f t e r c u t t i n g , o n l y t h e S 1 0 0 + / N f - c e l l s w e r e c a p t u r e d u s i n g t h e i n f r a r e d l a s e r o n t o t h e c o l l e c t i o n c a p . D . I m a g e s o f c o l l e c t i o n c a p s h o w i n g s p e c i f i c r e m o v a l o f o n l y S 1 0 0 + / N f - c e l l s f r o m h e t e r o g e n e o u s t i s s u e a t 4 0 0 x m a g n i f i c a t i o n . 8 4 8 5 T h e X - c h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o n ( X C I ) r a t i o o f D N A i s o l a t e d f r o m e a c h g r o u p o f c e l l s w a s t h e n m e a s u r e d t o d e t e r m i n e c l o n a l i t y . B l o o d v e s s e l s w e r e a l s o m i c r o d i s s e c t e d f r o m e a c h t u m o u r a n d t e s t e d t o d e t e r m i n e t h e X C I r a t i o i n n o r m a l t i s s u e b e c a u s e b l o o d s a m p l e s f r o m t h e s e p a t i e n t s w e r e n o t a v a i l a b l e ( F i g u r e 4 . 5 ) . T h e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 4 . 3 . Figure 4.5 Images of Blood Vessel Microdissection. A . T i s s u e s e c t i o n s t a i n e d w i t h s m o o t h m u s c l e a c t i n ( S M A ) t o i d e n t i f y b l o o d v e s s e l s w i t h i n a d i f f u s e n e u r o f i b r o m a a t 200x m a g n i f i c a t i o n . B . T i s s u e f o l l o w i n g t i s s u e c u t t i n g w i t h a U V l a s e r . A r r o w s i n d i c a t e v e s s e l s t h a t h a v e b e e n c u t a t 200x m a g n i f i c a t i o n . C . T i s s u e f o l l o w i n g s e l e c t i v e c o l l e c t i o n o f s a m p l e s o n t o a c o l l e c t i o n c a p u s i n g a n i n f r a r e d l a s e r a t 200x m a g n i f i c a t i o n . D . I m a g e o f c o l l e c t i o n c a p s h o w i n g s p e c i f i c r e m o v a l o f b l o o d v e s s e l s a t 200x m a g n i f i c a t i o n . A • 86 Table 4.3 Summary of clonality results from histologically-defined nodular and diffuse neurofibromas and the proportion of each cell type within the neurofibromas. T u m o u r S t a i n i n g P a t t e r n ( % ) S 1 0 0 + / N f + S 1 0 0 + / N f - S 1 0 0 - / N f + S 1 0 0 - / N f -X C I R a t i o s W h o l e B l o o d T u m o u r V e s s e l s S 1 0 0 + / N f + S 1 0 0 + / N f - S 1 0 0 - / N f + D 1 3 8 3 0 3 0 3 5 4 : 4 4 6 8 : 3 2 6 2 : 3 8 9 0 : 1 0 5 5 : 4 5 D 2 3 8 2 5 2 4 1 4 4 5 : 5 5 8 0 : 2 0 4 3 : 5 7 2 1 : 7 9 4 2 : 5 8 D 3 5 7 1 4 1 9 1 0 6 6 : 3 4 4 4 : 5 6 5 3 : 4 7 4 4 : 5 6 5 1 : 4 9 N 1 2 5 1 3 3 0 3 2 5 6 : 4 4 9 1 : 9 7 7 : 2 3 7 : 9 3 9 6 : 4 N 2 2 1 2 2 1 9 3 8 4 6 : 5 4 9 5 : 5 5 4 : 4 6 2 3 : 7 7 5 8 : 4 2 N 3 2 0 1 8 2 8 3 4 5 5 : 4 5 8 7 : 1 3 4 1 : 5 9 4 6 : 5 4 8 4 : 1 6 D = D i f f u s e n e u r o f i b r o m a N = N o d u l a r n e u r o f i b r o m a + = p o s i t i v e s t a i n i n g - = n e g a t i v e s t a i n i n g N f = n e u r o f i b r o m i n T u m o u r D 1 i s a d i f f u s e n e u r o f i b r o m a w i t h 3 0 % S 1 0 0 + / N f - c e l l s . N o r m a l b l o o d v e s s e l s f r o m t h i s p a t i e n t s h o w e d a n X C I r a t i o c l o s e t o t h e e x p e c t e d 5 0 : 5 0 ( 5 6 : 4 4 ) . I n c o n t r a s t , t h e S 1 0 0 + / N f - c e l l s d e m o n s t r a t e d c l o n a l i t y w i t h a n X C I r a t i o o f 9 0 : 1 0 ( T a b l e 4 . 3 ) . A s e x p e c t e d , t h e X C I r a t i o s o f S 1 0 0 + / N f + a n d S 1 0 0 - / N f + c e l l s w e r e s i m i l a r t o t h a t o f t h e b l o o d v e s s e l s . T h e p r o p o r t i o n o f S 1 0 0 - / N f - c e l l s i s t h i s t u m o u r w a s v e r y l o w ( 3 % ) . T h e s e f i n d i n g s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h i s n e u r o f i b r o m a a r i s i n g t h r o u g h c l o n a l p r o l i f e r a t i o n o f a S c h w a n n c e l l p r e c u r s o r t h a t s u s t a i n e d a " s e c o n d h i t " N F 1 m u t a t i o n t h a t a b r o g a t e d n e u r o f i b r o m i n e x p r e s s i o n . D 2 w a s t h e s e c o n d d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s t u d i e d . T h i s n e u r o f i b r o m a h a d 2 5 % S 1 0 0 + / N f - c e l l s . T h e X C I r a t i o o f t h i s c e l l p o p u l a t i o n w a s o p p o s i t e ( 2 1 : 7 9 ) t h a t o f t h e b l o o d v e s s e l s ( 8 0 : 2 0 ) . S 1 0 0 + / N f + a n d S 1 0 0 - / N f + c e l l s b o t h h a d X C I r a t i o s c l o s e t o t h e 5 0 : 5 0 e x p e c t e d f o r r a n d o m X C I , a l t h o u g h t h i s w a s s o m e w h a t d i f f e r e n t f r o m t h e r a t i o f o u n d i n t h e b l o o d v e s s e l s ( T a b l e 4 . 3 ) . A l t h o u g h t h e X C I r a t i o i n t h e S 1 0 0 + / N f - c e l l s d i d n o t m e e t o u r d e f i n i t i o n o f c l o n a l i t y ( 9 0 : 1 0 ) , i t s e e m s l i k e l y t h a t t h i s n e u r o f i b r o m a a l s o a r o s e t h r o u g h c l o n a l p r o l i f e r a t i o n o f a S c h w a n n c e l l p r e c u r s o r t h a t s u s t a i n e d a " s e c o n d h i t " N F 1 m u t a t i o n . T h e t h i r d d i f f u s e n e u r o f i b r o m a a n a l y s e d ( D 3 ) h a d 1 4 % S 1 0 0 + / N f - c e l l s , a n d t h e s e c e l l s d i d n o t s h o w a n y e v i d e n c e o f c l o n a l i t y . T h e X C I r a t i o w a s t h e s a m e a s i n t h e b l o o d v e s s e l s ( 4 4 : 5 6 ) ( T a b l e 4 . 3 ) . T h i s t u m o u r s h o w e d a h i g h p r o p o r t i o n ( 5 7 % ) o f S 1 0 0 + / N f + c e l l s , w h i c h a l s o h a d a n X C I r a t i o c l o s e t o t h a t o f t h e b l o o d v e s s e l s . T h e f i n d i n g s i n t h i s n e u r o f i b r o m a a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e t u m o u r a r i s i n g a s a p o l y c l o n a l p r o l i f e r a t i o n o f N F 1 h a p l o i n s u f f i c i e n t c e l l s . T h e t h r e e n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s ( N 1 , N 2 a n d N 3 ) e x a m i n e d f o r c l o n a l i t y w e r e a l l s p i n a l t u m o u r s r e m o v e d f r o m t h e s a m e p a t i e n t . T h e n o r m a l b l o o d v e s s e l s i n a l l t h r e e o f t h e s e n e u r o f i b r o m a s s h o w e d s i m i l a r X C I s k e w i n g ( 9 1 : 9 , 9 5 : 5 a n d 8 7 : 1 3 , r e s p e c t i v e l y ) ( T a b l e 4 . 3 ) . A l l t h r e e o f t h e s e t u m o u r s a l s o s h o w e d h i g h p r o p o r t i o n s o f S 1 0 0 - / N f - c e l l s ( 3 2 -3 8 % ) . O n l y 1 3 % o f t h e c e l l s i n N 1 s t a i n e d p o s i t i v e l y f o r S 1 0 0 b u t n e g a t i v e l y f o r n e u r o f i b r o m i n . T h e X C I r a t i o f o r t h i s c e l l t y p e w a s h i g h l y s k e w e d ( 7 : 9 3 ) t o t h e o p p o s i t e a l l e l e t h a n i n t h e b l o o d v e s s e l s . S 1 0 0 + / N f + c e l l s a n d S 1 0 0 - / N f + c e l l s b o t h h a d X C I r a t i o s s i m i l a r t o t h a t o f t h e n o r m a l b l o o d v e s s e l s . T h e f i n d i n g s i n t h i s n e u r o f i b r o m a a r e c o n s i s t e n t w i t h 8 8 c l o n a l p r o l i f e r a t i o n o f a S c h w a n n c e l l p r e c u r s o r t h a t s u s t a i n e d a " s e c o n d h i t " N F 1 m u t a t i o n . N o d u l a r n e u r o f i b r o m a N 2 h a d 2 2 % S 1 0 0 + / N f - c e l l s . T h i s c e l l t y p e w a s n o t c l o n a l ( 2 3 : 7 7 ) b u t t h e X C I r a t i o d i f f e r e d g r e a t l y f r o m t h a t o f t h e b l o o d v e s s e l s , w h i c h w a s h i g h l y s k e w e d i n t h e o p p o s i t e d i r e c t i o n ( 9 5 : 5 ) ( T a b l e 4 . 3 ) . T h e S 1 0 0 + / N f + c e l l s a n d S 1 0 0 - / N f + c e l l s i n t h i s s a m p l e b o t h h a d X C I r a t i o s c l o s e t o t h a t e x p e c t e d f o r r a n d o m X - i n a c t i v a t i o n a n d t h u s d i f f e r e n t f r o m t h e s k e w e d X C I r a t i o o b s e r v e d i n t h e b l o o d v e s s e l s . T h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h i s c a s e i s l e s s c l e a r , b u t t h e n e u r o f i b r o m a m a y a l s o h a v e a r i s e n t h r o u g h c l o n a l p r o l i f e r a t i o n o f a S c h w a n n c e l l p r e c u r s o r t h a t s u s t a i n e d a " s e c o n d h i t " N F 1 m u t a t i o n . T h e t h i r d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a t e s t e d ( N 3 ) h a d 2 0 % o f c e l l s t h a t w e r e S 1 0 0 + / N f - . T h e X C I r a t i o o f t h e s e c e l l s i s c o m p a t i b l e w i t h r a n d o m X - i n a c t i v a t i o n ( 4 6 : 5 4 ) b u t s o m e w h a t d i f f e r e n t f r o m t h a t o f t h e n o r m a l b l o o d v e s s e l s ( 8 7 : 1 3 ) ( T a b l e 4 . 3 ) . T h e S 1 0 0 - / N f + c e l l s i n t h i s t u m o u r h a d a n X C I r a t i o s i m i l a r t o t h a t o f t h e b l o o d v e s s e l s , b u t t h e X C I r a t i o o f t h e S 1 0 0 + / N f + c e l l s r e s e m b l e d t h a t o f t h e S 1 0 0 + / N f - c e l l s a n d n o t t h a t o f t h e n o r m a l b l o o d v e s s e l s . T h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e s e d a t a w i t h r e s p e c t t o c l o n a l i t y i s u n c l e a r . DISCUSSION N F 1 n e u r o f i b r o m a s a r e t h o u g h t t o d e v e l o p a c c o r d i n g t o K n u d s o n ' s " t w o - h i t " h y p o t h e s i s , a s a r e s u l t o f i n a c t i v a t i o n o f b o t h a l l e l e s o f t h e N F 1 l o c u s ( 3 3 - 3 5 ) . P e o p l e w i t h n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 h a v e a c o n s t i t u t i o n a l m u t a t i o n o f N F 1 i n e v e r y c e l l o f t h e i r b o d i e s , a n d s o m a t i c m u t a t i o n o f t h e s e c o n d ( n o r m a l ) a l l e l e i n a S c h w a n n c e l l i s a s s u m e d t o b e t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p i n n e u r o f i b r o m a f o r m a t i o n . A l t h o u g h t h e " t w o - h i t " m e c h a n i s m i s w i d e l y a c c e p t e d a s t h e b a s i s o f n e u r o f i b r o m a f o r m a t i o n i n N F 1 , t h e d e v e l o p m e n t o f a l l n e u r o f i b r o m a s a s a r e s u l t o f " s e c o n d h i t " m u t a t i o n s d o e s n o t r e a d i l y e x p l a i n a l l o f t h e a v a i l a b l e d a t a . W e h a v e s u g g e s t e d t h a t s o m e n e u r o f i b r o m a s a r i s e t h r o u g h i n a c t i v a t i o n o f t h e s e c o n d ( n o r m a l ) N F 1 a l l e l e i n a S c h w a n n c e l l a n d s u b s e q u e n t c l o n a l e x p a n s i o n t o f o r m a n e o p l a s m , b u t o t h e r n e u r o f i b r o m a s a r i s e a s p o l y c l o n a l p r o l i f e r a t i o n s o f N F 1 h a p l o i n s u f f i c i e n t c e l l s . T h e d e v e l o p m e n t o f s o m e n e u r o f i b r o m a s a s p o l y c l o n a l p r o l i f e r a t i o n s o f N F 1 h a p l o i n s u f f i c i e n t c e l l s c o u l d e x p l a i n t h e e x c e p t i o n a l o b s e r v a t i o n s l i s t e d a b o v e a n d o t h e r s t h a t a r e n o t e a s i l y r e c o n c i l e d w i t h t h e " t w o - h i t " m o d e l o f t u m o u r d e v e l o p m e n t . T h e r e i s i n c r e a s i n g e v i d e n c e t h a t h a p l o i n s u f f i c i e n c y o f o t h e r t u m o u r 8 9 s u p p r e s s o r g e n e s s u c h a s T S C 1 , TSC2, a n d P 5 7 c a n a l s o l e a d t o t h e f o r m a t i o n o f t u m o u r s w i t h o u t a " s e c o n d h i t " ( 3 6 - 3 9 ) . T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o q u a n t i f y t h e p e r c e n t a g e o f c e l l s w i t h i m m u n o h i s t o l o g i c a l f e a t u r e s o f n o r m a l S c h w a n n c e l l s ( S 1 0 0 + / N f + c e l l s ) , n e o p l a s t i c S c h w a n n c e l l s t h a t h a v e s u s t a i n e d a " s e c o n d h i t " N F 1 m u t a t i o n ( S 1 0 0 + / N f - c e l l s ) , a n d n o r m a l n o n - S c h w a n n c e l l s ( S 1 0 0 - / N f + c e l l s ) a n d t o d e t e r m i n e i f t h e p r o p o r t i o n s o f t h e s e c e l l t y p e s d i f f e r i n h i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d n o d u l a r a n d d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . W e a l s o w a n t e d t o d e t e r m i n e i f S c h w a n n c e l l s t h a t n o l o n g e r e x p r e s s n e u r o f i b r o m i n w e r e c l o n a l , a s w o u l d b e e x p e c t e d f o r a n e o p l a s m t h a t a r o s e a s t h e r e s u l t o f a " s e c o n d h i t " N F 1 m u t a t i o n . W e f o u n d a s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e m e a n p e r c e n t a g e s o f S 1 0 0 + / N f + c e l l s a n d o f S 1 0 0 - / N f - c e l l s i n n o d u l a r a n d d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . T h e f i n d i n g s o f o u r c l o n a l i t y s t u d i e s s u p p o r t t h e i n t e r p r e t a t i o n t h a t s o m e n e u r o f i b r o m a s a r e c l o n a l S c h w a n n c e l l n e o p l a s m s w h i l e o t h e r n e u r o f i b r o m a s a r e p o l y c l o n a l p r o l i f e r a t i o n s o f N F 1 h a p l o i n s u f f i c i e n t c e l l s . H a p l o i n s u f f i c i e n c y a n d l o s s o f N F 1 a r e t h o u g h t t o l e a d t o t u m o u r f o r m a t i o n b e c a u s e n e u r o f i b r o m i n , t h e p r o t e i n p r o d u c t o f t h e N F 1 g e n e , f u n c t i o n s t o d o w n - r e g u l a t e R a s , a k e y c e l l c y c l e c o n t r o l p r o t e i n . N e u r o f i b r o m i n e n h a n c e s t h e c o n v e r s i o n o f a c t i v e R a s -G T P t o i n a c t i v e R a s - G D P . R a s m o d u l a t e s s e v e r a l i m p o r t a n t s i g n a l t r a n s d u c t i o n p a t h w a y s , o n e o f w h i c h i s t h e M A P - k i n a s e p a t h w a y . I n a c t i v a t i n g m u t a t i o n s i n o n e o r b o t h c o p i e s o f N F 1 l e a d t o h i g h e r R a s c o n c e n t r a t i o n s a n d a n i n c r e a s e i n c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n ( 4 0 - 4 2 ) . T h e r e i s s u b s t a n t i a l e v i d e n c e t h a t N F 1 f u n c t i o n s a s a t u m o u r s u p p r e s s o r g e n e , a n d L O H o r s e c o n d s o m a t i c m u t a t i o n s f o r N F 1 h a v e b e e n o b s e r v e d i n s o m e n e u r o f i b r o m a s , i n a c c o r d a n c e w i t h t h e " t w o - " h i t " h y p o t h e s i s . O v e r a l l , L O H o r s e c o n d s o m a t i c m u t a t i o n s h a v e b e e n o b s e r v e d i n 2 6 % o f d e r m a l n e u r o f i b r o m a s a n d 3 6 % o f p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s s t u d i e d t o d a t e ( 8 - 2 4 ) . T h e l o w p e r c e n t a g e o f L O H o r s e c o n d s o m a t i c m u t a t i o n s o b s e r v e d i n N F 1 n e u r o f i b r o m a s h a s b e e n a t t r i b u t e d t o d e t e c t i o n m e t h o d s t h a t c a n n o t i d e n t i f y a l l m u t a t i o n s , m u t a t i o n s o u t s i d e o f t h e r e g i o n o f t h e N F 1 g e n e t h a t w a s t e s t e d , o r t h e f r e q u e n t i n a c t i v a t i o n o f t h e s e c o n d ( n o r m a l ) N F 1 a l l e l e b y a n e p i g e n e t i c m e c h a n i s m . H o w e v e r , n o e v i d e n c e o f e p i g e n e t i c i n a c t i v a t i o n o f t h e N F 1 g e n e h a s b e e n o b s e r v e d ( 1 4 , 4 3 , 4 4 ) . 9 0 T o b e t t e r u n d e r s t a n d N F 1 n e u r o f i b r o m a d e v e l o p m e n t , Z h u a n d c o w o r k e r s ( 4 5 ) u s e d a c r e / l o x s y s t e m t o d e l e t e N f 1 i n S c h w a n n c e l l s w h i l e m a i n t a i n i n g N f 1 h e t e r o z y g o s i t y i n a o t h e r c e l l t y p e s i n m i c e . T h e s e a n i m a l s s h o w e d t h i c k e n e d p e r i p h e r a l n e r v e s a n d d e v e l o p e d b o t h c r a n i a l a n d s p i n a l n e r v e n e u r o f i b r o m a s . I n t e r e s t i n g l y , t h e s e f e a t u r e s w e r e o n l y o b s e r v e d w h e n o t h e r c e l l s w e r e h e t e r o z y g o u s f o r N f 1 , p o i n t i n g t o t h e i m p o r t a n c e o f t h e A / 7 7 h a p l o i n s u f f i c i e n t b a c k g r o u n d i n n e u r o f i b r o m a d e v e l o p m e n t i n m i c e . S i m i l a r i l y , e m b r y o n i c d a y 1 2 . 5 Nf1~'~ S c h w a n n c e l l s i m p l a n t e d i n t o t h e s c i a t i c n e r v e o f Nf1+I~ m i c e d e v e l o p i n t o t u m o u r s t h a t r e s e m b l e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s ( 4 6 ) . H u m a n NF1~'~ S c h w a n n c e l l s d e r i v e d f r o m n e u r o f i b r o m a s o f N F 1 p a t i e n t s e x h i b i t a g r o w t h a d v a n t a g e i n c u l t u r e a n d p r o d u c e t u m o u r s t h a t r e s e m b l e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s w h e n t r a n s p l a n t e d i n t o t h e p e r i p h e r a l n e r v e s o f s c i d m i c e ( 2 5 ) . T h e t u m o u r s p r o d u c e d i n t h e s e e x p e r i m e n t a l s y s t e m s a r e m o d e l s o f n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s t h a t d e v e l o p i n p e o p l e w i t h N F 1 , b u t t h e r e l e v a n c e o f t h e s e m o d e l s t o o t h e r t y p e s o f n e u r o f i b r o m a s t h a t o c c u r a s p a r t o f N F 1 i s u n k n o w n . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t m u l t i p l c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s , t h e f e a t u r e t h a t g i v e s N F 1 i t s n a m e , a n d c o n g e n i t a l d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s d o n o t d e v e l o p i n a n y o f t h e N F 1 m o u s e m o d e l s d e s c r i b e d t o d a t e ( 4 7 -5 0 ) . M o r e o v e r , t h e r e a r e i m p o r t a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n h u m a n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s , w h i c h a r e p r e s u m e d t o a r i s e a s c l o n a l o u t g r o w t h s f r o m a s i n g l e m u t a n t p r e c u r s o r t h a t h a s s u s t a i n e d a " s e c o n d h i t " a t t h e N F 1 l o c u s , a n d t h e s e m o u s e m o d e l s , i n w h i c h t u m o u r s d e v e l o p f r o m a l a r g e n u m b e r o f n e u r o f i b r o m i n - d e f i c i e n t S c h w a n n c e l l s . M u i r e t a l ( 2 5 ) a l s o s t a i n e d b e n i g n n e u r o f i b r o m a s f r o m p e o p l e w i t h N F 1 f o r n e u r o f i b r o m i n a n d S 1 0 0 . T h e y f o u n d f o u r b a s i c p a t t e r n s o f n e u r o f i b r o m i n s t a i n i n g i n S 1 0 0 - p o s i t i v e r e g i o n s : n e u r o f i b r o m i n - n e g a t i v e , p r e d o m i n a n t l y n e u r o f i b r o m i n - n e g a t i v e w i t h f o c a l a r e a s o f d i s t i n c t p o s i t i v e s t a i n i n g , p r e d o m i n a n t l y n e u r o f i b r o m i n - p o s i t i v e w i t h f o c a l a r e a s o f d i s t i n c t n e g a t i v e s t a i n i n g , a n d n e u r o f i b r o m i n - p o s i t i v e . W e a l s o o b s e r v e d t w o d i f f e r e n t p o p u l a t i o n s o f S c h w a n n c e l l s - t h o s e t h a t e x p r e s s e d n e u r o f i b r o m i n a n d t h o s e t h a t d i d n o t - b u t w e r a r e l y s a w l a r g e a g g r e g a t e s o f S 1 0 0 - p o s i t i v e c e l l s t h a t d i d n o t e x p r e s s n e u r o f i b r o m i n . O u r t u m o u r s a l m o s t a l w a y s s h o w e d m i n g l i n g o f n e u r o f i b r o m i n - n e g a t i v e a n d n e u r o f i b r o m i n - p o s i t i v e S c h w a n n c e l l s . O u r f i n d i n g s a r e s i m i l a r t o t h o s e o b t a i n e d b y m o l e c u l a r a n a l y s i s o f a d e r m a l n e u r o f i b r o m a i n w h i c h t h e " s e c o n d h i t " s o m a t i c m u t a t i o n o f t h e N F 1 l o c u s w a s i d e n t i f i e d ( 1 0 ) . I n t h i s t u m o u r , b o t h t h e m u t a n t a n d n o n - m u t a n t v e r s i o n o f t h e s e c o n d N F 1 a l l e l e w e r e f o u n d i n a h o m o g e n o u s - a p p e a r i n g a r e a o f t u m o u r c e l l s . 9 1 S 1 0 0 - p o s i t i v e ( p r e s u m a b l y S c h w a n n ) c e l l c u l t u r e s g r o w n f r o m n e u r o f i b r o m a s r e m o v e d f r o m N F 1 p a t i e n t s c o n t a i n b o t h n e u r o f i b r o m i n - p o s i t i v e a n d n e u r o f i b r o m i n - n e g a t i v e c e l l p o p u l a t i o n s ( 6 , 2 5 , 2 6 ) . I t i s n o t k n o w n h o w t h e h e t e r o g e n e i t y o f n e u r o f i b r o m i n e x p r e s s i o n s e e n i n t h e s e c u l t u r e s r e l a t e s t o t h e t u m o u r s f r o m w h i c h t h e c u l t u r e s w e r e g r o w n . I n t h e p r e s e n t s t u d y , w e f o u n d t h a t S 1 0 0 + / N f - c e l l s ( i . e . , c e l l s w i t h t h e p h e n o t y p e e x p e c t e d f o r S c h w a n n c e l l s t h a t h a v e s u s t a i n e d a n i n a c t i v a t i n g m u t a t i o n o f t h e i r n o r m a l N F 1 a l l e l e ) m a d e u p o n l y 1 8 % o f t h e n e u r o f i b r o m a s s t u d i e d , a n d t h e p r o p o r t i o n w a s s i m i l a r i n d i f f u s e a n d n o d u l a r t u m o u r s . H o w e v e r , t h e p r o p o r t i o n o f S 1 0 0 + / N f + c e l l s ( t h e p h e n o t y p e e x p e c t e d f o r n o r m a l S c h w a n n c e l l s ) w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r ( 4 2 % ) i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s t h a n i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s ( 2 4 % ) . T h e p e r c e n t a g e o f S 1 0 0 - p o s i t i v e ( p r e s u m a b l y S c h w a n n ) c e l l s t h a t e x p r e s s e d n e u r o f i b r o m i n a v e r a g e d 6 1 % ( r a n g e , 2 5 -1 0 0 % ) i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s a n d 7 4 % ( r a n g e , 3 9 - 1 0 0 % ) i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . T h e s e v a l u e s a r e c o n s i s t e n t w i t h t w o o t h e r s t u d i e s t h a t e s t i m a t e d t h e p r o p o r t i o n o f S c h w a n n c e l l s w i t h a n i n a c t i v e N F 1 g e n e , i . e . , t h e r e c i p r o c a l f r a c t i o n , a s 1 6 - 6 2 % i n c u l t u r e s d e r i v e d f r o m N F 1 n e u r o f i b r o m a s ( 8 ) a n d a s 3 0 - 6 0 % a s e s t i m a t e d f r o m L O H o n s e q u e n c e a n a l y s i s o f a w h o l e t u m o u r ( 1 9 ) . O n e p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o r t h e d i f f e r e n c e o b s e r v e d i n t h e p r o p o r t i o n o f S 1 0 0 + / N f + c e l l s b e t w e e n d i f f u s e a n d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s i s t h a t t h e d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s w e r e m u c h m o r e l i k e l y t o h a v e b e e n o b t a i n e d f r o m i n d i v i d u a l s w i t h c o n s t i t u t i o n a l w h o l e N F 1 g e n e d e l e t i o n s w h i l e t h e n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s w e r e m o r e l i k e l y t o h a v e b e e n o b t a i n e d f r o m i n d i v i d u a l s w i t h c o n s t i t u t i o n a l i n t r a g e n i c m u t a t i o n s . T h e " s e c o n d h i t s " i n n e u r o f i b r o m a s f r o m i n d i v i d u a l s w i t h c o n s t i t u t i o n a l w h o l e g e n e d e l e t i o n s a r e u s u a l l y s u b t l e m u t a t i o n s t h a t m i g h t n o t c o m p l e t e l y a b r o g a t e n e u r o f i b r o m i n e x p r e s s i o n ( 5 1 ) , w h i l e " s e c o n d h i t s " i n n e u r o f i b r o m a s f r o m i n d i v i d u a l s w i t h o t h e r c o n s t i t u t i o n a l m u t a t i o n s a r e m o r e l i k e l y t o c a u s e L O H a n d t h u s l a c k n e u r o f i b r o m i n e x p r e s s i o n ( 1 9 , 2 3 ) . T h i s e x p l a n a t i o n i s u n l i k e l y t o a c c o u n t f o r t h e d i f f e r e n c e i n f r e q u e n c y o f S 1 0 0 + / N f + c e l l s t h a t w e o b s e r v e d b e t w e e n n o d u l a r a n d d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s b e c a u s e w h o l e g e n e d e l e t i o n s a c c o u n t f o r o n l y a b o u t 5 % o f c o n s t i t u t i o n a l m u t a t i o n s i n p e o p l e w i t h N F 1 ( 5 2 - 5 4 ) . W e f o u n d t h a t a b o u t 3 1 % o f t h e c e l l s i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s a n d a b o u t 1 5 % o f c e l l s i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s d i d n o t e x p r e s s e i t h e r S 1 0 0 o r n e u r o f i b r o m i n . W e c a n n o t r u l e o u t t h e p o s s i b i l i t y t h a t m a n y o f t h e S 1 0 0 - / N f - c e l l s m a y a c t u a l l y b e n e u r o f i b r o m i n -p o s i t i v e c e l l s t h a t d i d n o t s t a i n f o r n e u r o f i b r o m i n . H o w e v e r , t h e s e n s i t i v i t y o f t h e 9 2 a n t i b o d y s h o u l d b e e q u a l i n b o t h d i f f u s e a n d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s , a n d a n a v e r a g e o f 9 2 % o f c e l l s i n t r a u m a t i c n e u r o m a , w h i c h w e r e u s e d a s a p o s i t i v e c o n t r o l i n o u r s t u d y , w e r e n e u r o f i b r o m i n - p o s i t i v e . W e d o n o t k n o w w h a t k i n d o f c e l l s t h e S 1 0 0 - / N f - p o p u l a t i o n r e p r e s e n t s , a n d M u i r e t a l . ( 2 5 ) d i d n o t c o m m e n t o n t h i s c e l l p o p u l a t i o n i n t h e i r s t u d y . O n e i n t r i g u i n g p o s s i b i l i t y i s t h a t t h e S 1 0 0 - / N f - c e l l s a r e d e d i f f e r e n t i a t e d S c h w a n n c e l l s o r , a l t e r n a t i v e l y , i m m a t u r e S c h w a n n s t e m c e l l s t h a t a r e p a r t o f a n e o p l a s t i c c l o n e t h a t h a s s u f f e r e d a " s e c o n d h i t " N F 1 m u t a t i o n . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h s t u d i e s s h o w i n g t h a t i n c r e a s e d s i g n a l i n g t h r o u g h t h e R a s / R a f / E r k p a t h w a y c a n d r i v e S c h w a n n c e l l s t o a d e d i f f e r e n t i a t e d s t a t e ( 5 5 ) . I t i s n o t c l e a r w h y s u c h c e l l s s h o u l d b e m o r e c o m m o n i n n o d u l a r t h a n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s w h e n S 1 0 0 + / N f - c e l l s a r e o b s e r v e d i n a s i m i l a r p r o p o r t i o n i n b o t h k i n d s o f t u m o u r . c A M P h a s b e e n s h o w n t o i n d u c e ^ d i f f e r e n t i a t i o n o f S c h w a n n c e l l s ( 5 5 ) a n d c o u l d b e p r e s e n t i n h i g h e r l e v e l s i n d i f f u s e t h a n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s . S 1 0 0 - / N f - c e l l s a r e o f t e n o b s e r v e d i n M P N S T s ( 5 6 ) , a n d t h e h i g h e r p r o p o r t i o n S 1 0 0 - / N f - c e l l s i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s r a i s e s c o n c e r n a b o u t t h e r i s k o f t h i s t u m o u r t y p e p r o g r e s s i n g t o m a l i g n a n c y . I t i s i m p o r t a n t t o d e f i n e t h e n a t u r e o f t h e S 1 0 0 - / N f - c e l l s a n d t o d e t e r m i n e i f t h e y a r e m o r e t u m o r i g e n i c t h a n o t h e r c e l l t y p e s w i t h i n n e u r o f i b r o m a s . T h e c o r r e l a t i o n w e o b s e r v e d b e t w e e n l y m p h o c y t i c i n f i l t r a t i o n a n d t h e p r o p o r t i o n o f S 1 0 0 - / N f - c e l l s m i g h t i n d i c a t e t h a t t h i s c e l l t y p e i s t r i g g e r i n g a n i m m u n e r e s p o n s e , b u t i t i s a l s o p o s s i b l e t h a t t h e p r e v a l e n c e o f b o t h l y m p h o c y t e s a n d S 1 0 0 - / N f - c e l l s b o t h r e f l e c t s o m e o t h e r u n d e r l y i n g f e a t u r e . I n a n y c a s e , w e m a y n o t h a v e c o m p l e t e l y d e f i n e d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e s e t w o c e l l t y p e s b e c a u s e o u r s t u d y w a s r e s t r i c t e d t o n e u r o f i b r o m a s i n w h i c h l y m p h o c y t e s c o n s t i t u t e d l e s s t h a n 3 0 % o f t h e t o t a l c e l l p o p u l a t i o n . R i c c a r d i ( 3 0 ) h a s d i s t i n g u i s h e d f o u r t y p e s o f n e u r o f i b r o m a s - c u t a n e o u s , s u b c u t a n e o u s , n o d u l a r p l e x i f o r m a n d d i f f u s e p l e x i f o r m - o n t h e b a s i s o f t h e i r c l i n i c a l f e a t u r e s . A m a j o r b e n e f i t o f R i c c a r d i ' s c l a s s i f i c a t i o n i s t h a t t u m o u r s w i t h d i f f e r e n t n a t u r a l h i s t o r i e s a r e p l a c e d i n t o d i f f e r e n t g r o u p s , a n d n e u r o f i b r o m a s w i t h a h i g h p o t e n t i a l f o r m a l i g n a n t d e g e n e r a t i o n ( n o d u l a r p l e x i f o r m a n d d i f f u s e p l e x i f o r m t u m o u r s ) a r e d i s t i n g u i s h e d f r o m t h o s e w i t h a m u c h l o w e r r i s k o f m a l i g n a n c y ( c u t a n e o u s a n d s u b c u t a n e o u s t u m o u r s ) . T h e t u m o u r s i n o u r s t u d y w e r e n o t a l l c l a s s i f i e d b y t h i s c l i n i c a l m e t h o d , a n d t h e h i s t o l o g i c a l a n d c l i n i c a l a p p r o a c h e s d o n o t p l a c e a l l t u m o u r s i n t o t h e s a m e g r o u p s . B o t h 9 3 c u t a n e o u s a n d d i f f u s e p l e x i f o r m t u m o u r s u s u a l l y a r e d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s h i s t o l o g i c a l l y , b u t s o m e d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a r e m i x e d d i f f u s e a n d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s . T u m o u r s t h a t a r e c l a s s i f i e d c l i n i c a l l y a s s u b c u t a n e o u s o r n o d u l a r p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a r e u s u a l l y n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s o n h i s t o p a t h o l o g i c a l e x a m . H o w e v e r , t h e o n l y w a y t o d e t e r m i n e t h e h i s t o l o g i c a l t y p e o f a n e u r o f i b r o m a i s t o e x a m i n e i t h i s t o l o g i c a l l y . T h r e e p r e v i o u s s t u d i e s h a v e a s s e s s e d c l o n a l i t y i n N F 1 n e u r o f i b r o m a s . A l l o f t h e s e s t u d i e s t e s t e d t h e X C I r a t i o o f w h o l e t u m o u r s , w h i c h a r e m a d e u p o f s e v e r a l d i f f e r e n t c e l l p o p u l a t i o n s , r a t h e r t h a n l o o k i n g a t e a c h p a r t i c u l a r c e l l t y p e s e p a r a t e l y . I n t o t a l , 3 5 n e u r o f i b r o m a s , 3 0 d e r m a l a n d 5 p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s , w e r e p r e v i o u s l y a s s e s s e d ( 8 , 1 1 , 5 7 ) . O n e s t u d y d i d n o t f i n d c l o n a l i t y i n a n y o f t h e 1 4 n e u r o f i b r o m a s t e s t e d ( 5 7 ) . I n a n o t h e r s t u d y , e i g h t d e r m a l n e u r o f i b r o m a s w e r e f o u n d t o h a v e a m o n o c l o n a l o r i g i n , a l t h o u g h n o n e o f t h e s e t u m o u r s d i s p l a y e d L O H f o r N F 1 ( 8 ) . T h e l a s t s t u d y f o u n d c l o n a l i t y i n 3 d e r m a l n e u r o f i b r o m a s a n d 1 p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a ( 1 1 ) . T h e w h o l e t u m o u r X C I r a t i o s i n t h e c u r r e n t s t u d y a r e c o n s i s t e n t w i t h a p o l y c l o n a l p h e n o t y p e . U s i n g l a s e r m i c r o d i s s e c t i o n , w e a s s e s s e d t h e X C I r a t i o i n t h r e e d i f f e r e n t c e l l u l a r p o p u l a t i o n s d e f i n e d b y S 1 0 0 a n d n e u r o f i b r o m i n s t a i n i n g , a s w e l l a s i n b l o o d v e s s e l s ( a s n o r m a l t i s s u e c o n t r o l s ) , f r o m s i x N F 1 - a s s o c i a t e d n e u r o f i b r o m a s . O u r f i n d i n g s a r e c o m p a t i b l e w i t h a h e t e r o g e n o u s o r i g i n o f n e u r o f i b r o m a s , w i t h s o m e t u m o u r s d e v e l o p i n g t h r o u g h c l o n a l p r o l i f e r a t i o n o f S 1 0 0 + / N f - c e l l s , a n d o t h e r n e u r o f i b r o m a s d e v e l o p i n g t h r o u g h a p o l y c l o n a l p r o c e s s . T h e r e w a s e v i d e n c e f o r b o t h m e c h a n i s m s i n b o t h h i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d d i f f u s e a n d h i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s . C l e a r e v i d e n c e f o r c l o n a l i t y w a s s e e n i n o n e n o d u l a r ( N 1 ) a n d o n e d i f f u s e ( D 1 ) n e u r o f i b r o m a . N 1 w a s d e f i n e d c l i n i c a l l y a s a n o d u l a r p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a , a n d D 1 w a s d e f i n e d c l i n i c a l l y a s a c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a . I n b o t h o f t h e s e c a s e s , i t i s l i k e l y t h a t t h e S 1 0 0 + / N f - c e l l s r e p r e s e n t a n e o p l a s t i c c l o n e o f S c h w a n n c e l l s t h a t s u s t a i n e d a " s e c o n d -h i t " m u t a t i o n o f t h e N F 1 l o c u s . I t i s i n t e r e s t i n g t h a t t h i s p o p u l a t i o n m a d e u p o n l y 3 0 % o f t h e c e l l s i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a D 1 a n d o n l y 1 3 % i n t h e c e l l s i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a N 1 . C e l l s n e g a t i v e f o r b o t h S 1 0 0 a n d n e u r o f i b r o m i n m a d e u p t h e g r e a t e s t p r o p o r t i o n o f c e l l s i n n e u r o f i b r o m a N 1 . U n f o r t u n a t e l y , w e c o u l d n o t i s o l a t e t h e s e c e l l s b y m i c r o d i s s e c t i o n w i t h o u t a s p e c i f i c m a r k e r , a n d w e d o n o t k n o w i f t h e y w e r e c l o n a l o r 9 4 n o t . I t i s i n t e r e s t i n g t o s p e c u l a t e t h a t t h e y m i g h t b e d e d i f f e r e n t i a t e d ( o r j u s t m o r e p r i m i t i v e ) S c h w a n n c e l l p r e c u r s o r s t h a t a r e p a r t o f t h e n e o p l a s t i c c l o n e . T w o o t h e r n e u r o f i b r o m a s ( N 2 a n d D 2 ) , w h i c h w e r e c l a s s i f i e d c l i n i c a l l y a s a n o d u l a r p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a a n d a c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a , r e s p e c t i v e l y , p r o b a b l y a l s o a r o s e t h r o u g h c l o n a l p r o l i f e r a t i o n o f a S c h w a n n c e l l ( o r S c h w a n n c e l l p r e c u r s o r ) t h a t s u s t a i n e d a " s e c o n d h i t " i n a c t i v a t i n g m u t a t i o n a t t h e N F 1 l o c u s . T h e X C I r a t i o i n S 1 0 0 + / N f - c e l l s i n t h e s e t w o t u m o u r s d i d n o t m e e t o u r f o r m a l d e f i n i t i o n o f s k e w i n g ( 9 0 : 1 0 o r g r e a t e r ) , b u t b o t h s h o w e d a p r e d o m i n a n c e o f t h e N F 1 a l l e l e t h a t w a s l e s s f r e q u e n t a m o n g c e l l s i n t h e n o r m a l b l o o d v e s s e l s . T h e m o s t p a r s i m o n i o u s e x p l a n a t i o n i s t h a t t h e s e t u m o u r s w e r e c l o n a l b u t t h e S 1 0 0 + / N f - c e l l s t e s t e d w e r e " c o n t a m i n a t e d " b y n o n - c l o n a l t i s s u e o f s o m e t y p e . T h e r e w a s n o e v i d e n c e f o r c l o n a l i t y a m o n g t h e S 1 0 0 + / N f - c e l l s i n o n e d i f f u s e n e u r o f i b r o m a ( D 3 ) . T h i s t u m o u r w a s c l a s s i f i e d c l i n i c a l l y a s a d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a . A l l c e l l t y p e s w i t h i n t h i s t u m o u r h a d a n X C I r a t i o s i m i l a r t o t h e b l o o d v e s s e l s . S 1 0 0 + / N f - c e l l s m a d e u p o n l y 1 4 % o f t h e t o t a l i n t h i s t u m o u r , a n d S 1 0 0 - / N f -c e l l s o n l y 1 0 % . W e c a n n o t r u l e o u t t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e d o u b l e n e g a t i v e p o p u l a t i o n w a s c l o n a l i n t h i s t u m o u r , b u t i f i t w a s i t r e p r e s e n t s a n u n u s u a l l y s m a l l p r o p o r t i o n o f t h e t o t a l c e l l p o p u l a t i o n , a n d i t d o e s n o t s e e m t o h a v e c o n t r i b u t e d s u b s t a n t i a l l y t o t h e S 1 0 0 -p o s i t i v e p o p u l a t i o n . I n t e r p r e t a t i o n o f t h e c l o n a l i t y d a t a i n n e u r o f i b r o m a N 3 , w h i c h w a s c l a s s i f i e d c l i n i c a l l y a s a n o d u l a r p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a , i s l e s s c l e a r . A p o l y c l o n a l o r i g i n m a y b e m o s t l i k e l y . A l a r g e r f r a c t i o n ( 3 4 % ) o f t h e c e l l s i n t h i s t u m o u r w e r e n e g a t i v e f o r b o t h S 1 0 0 a n d n e u r o f i b r o m i n , a n d t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h i s p o p u l a t i o n r e p r e s e n t s d e d i f f e r e n t i a t e d o r m o r e p r i m i t i v e S c h w a n n c e l l p r e c u r s o r s t h a t h a v e s u s t a i n e d a " s e c o n d - h i t " i n a c t i v a t i n g m u t a t i o n o f t h e N F 1 l o c u s c a n n o t b e r u l e d o u t . T h e r e a r e s e v e r a l p o s s i b l e e x p l a n a t i o n s f o r t h e s k e w i n g o b s e r v e d i n b l o o d v e s s e l s f r o m t h e i n d i v i d u a l f r o m w h o m a l l t h r e e n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s e x a m i n e d f o r c l o n a l i t y w e r e o b t a i n e d . T h e f i r s t p o s s i b i l i t y i s t h a t t h e i n d i v i d u a l h e r s e l f h a s s k e w e d X i n a c t i v a t i o n t h r o u g h o u t h e r b o d y . 1 0 % o f w o m e n h a v e a g r e a t e r t h a n 9 0 % e x p r e s s i o n o f o n e X c h r o m o s o m e b y c h a n c e i n b l o o d ( 5 8 ) . A s e c o n d p o s s i b i l i t y i s t h a t t h e m e s o d e r m a l s t e m c e l l p o o l f r o m w h i c h t h e b l o o d v e s s e l s a r o s e w a s s m a l l a n d t h a t s k e w e d X c h r o m o s o m e i n a c t i v a t i o n o c c u r r e d i n d e r i v a t i v e s o f t h i s p o o l b y c h a n c e a s a r e s u l t o f s a m p l i n g . A t h i r d , 9 5 p o s s i b i l i t y i s t h a t t h e t u m o u r a r o s e f o c a l l y w i t h i n a s m a l l m i x e d p o p u l a t i o n o f c e l l s a n d t h e c e l l s t h a t p r o d u c e d n e o v a s c u l a t u r e o f t h e t u m o u r a l l a r o s e f r o m a t i n y i n i t i a l p o o l w i t h i n t h e f o c u s o f i n v o l v e m e n t . G r o w t h o f t h e t u m o u r v a s c u l a t u r e f r o m a s m a l l p o p u l a t i o n o f c e l l s c o u l d r e s u l t i n s k e w e d X C I w h i c h , b y c h a n c e , h a p p e n e d t o b e i n t h e s a m e d i r e c t i o n i n a l l t h r e e t u m o u r s . W i t h o u t t e s t i n g o t h e r t i s s u e s f r o m t h i s i n d i v i d u a l , w e c a n n o t d i s t i n g u i s h w h i c h o f t h e s e p o s s i b i l i t i e s i s c o r r e c t . A n o t h e r p o s s i b i l i t y i s t h a t t h e s k e w i n g o b s e r v e d i n n o r m a l t i s s u e s s u c h a s b l o o d v e s s e l s m a y b e d u e t o N F 1 h a p l o i n s u f f i c i e n c y . T h e r e f o r e , a s t u d y a s s e s s i n g X C I r a t i o s i n n o r m a l t i s s u e s o f f e m a l e s w i t h N F 1 s h o u l d b e e x p l o r e d t o s e e i f t h e p r o p o r t i o n o f e x t r e m e ( > 9 0 % ) X C I s k e w i n g i s g r e a t e r t h a n t h e p r o p o r t i o n ( 1 0 % ) o b s e r v e d i n t h e g e n e r a l p o p u l a t i o n . I n s u m m a r y , w e f o u n d t h a t a h i g h p r o p o r t i o n o f S 1 0 0 - p o s i t i v e ( p r e s u m a b l y S c h w a n n ) c e l l s i n N F 1 - a s s o c i a t e d n e u r o f i b r o m a s e x p r e s s n e u r o f i b r o m i n . A l t h o u g h s o m e n e u r o f i b r o m a s a p p e a r t o d e v e l o p a s c l o n a l n e o p l a s m s a s a r e s u l t o f " s e c o n d h i t " m u t a t i o n s o f t h e n o r m a l N F 1 a l l e l e i n a S c h w a n n c e l l , t h e o r i g i n o f s o m e o t h e r n e u r o f i b r o m a s a p p e a r s t o b e d i f f e r e n t . W e f a v o u r t h e p o s s i b i l i t y t h a t s o m e n e u r o f i b r o m a s a r i s e a s p o l y c l o n a l p r o l i f e r a t i o n s o f N F 1 h a l p l o i n s u f f i c i e n t c e l l s , b u t i t i s a l s o p o s s i b l e s o m e n e u r o f i b r o m a s a r i s e f r o m m o r e p r i m i t i v e o r d e - d i f f e r e n t i a t e d c e l l s o f t h e S c h w a n n c e l l l i n e a g e , r a t h e r t h a n f r o m m a t u r e S c h w a n n c e l l s . T h e s e o b s e r v a t i o n s n e e d t o b e c o n f i r m e d i n a l a r g e r s a m p l e s e t t o e n s u r e t h e y a r e n o t u n i q u e t o t h e f e w t u m o u r s e x a m i n e d . F u r t h e r s t u d i e s a r e n e e d e d t o c l a r i f y t h e n a t u r e o f t h e S 1 0 0 - / N f -c e l l s t h a t o f t e n m a k e u p a s u b s t a n t i a l f r a c t i o n o f t h e t o t a l c e l l p o p u l a t i o n w i t h i n n e u r o f i b r o m a s a n d t o d e t e r m i n e t h e r e l a t i o n s h i p o f t h e s e a n d o t h e r c e l l u l a r c o m p o n e n t s t o t h e d e v e l o p m e n t o f M P N S T i n p e o p l e w i t h N F 1 . 96 REFERENCES 1 . F r i e d m a n J M . E p i d e m i o l o g y o f n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 . A m J M e d G e n e t 1 9 9 9 ; 8 9 : 1 - 6 . 2 . X u W , M u l l i g a n L M , P o n d e r M A , e t a l . L o s s o f N F 1 a l l e l e s i n p h a e o c h r o m o c y t o m a s f r o m p a t i e n t s w i t h t y p e I n e u r o f i b r o m a t o s i s . G e n e s C h r o m o s o m e s C a n c e r 1 9 9 2 ; 4 : 3 3 7 - 4 2 . 3 . S i d e L , T a y l o r B , C a y o u e t t e M , e t a l . H o m o z y g o u s i n a c t i v a t i o n o f t h e N F 1 g e n e i n b o n e m a r r o w c e l l s f r o m c h i l d r e n w i t h n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 a n d m a l i g n a n t m y e l o i d d i s o r d e r s . N E n g l J M e d 1 9 9 7 ; 3 3 6 : 1 7 1 3 - 2 0 . 4 . L e g i u s E , M a r c h u k D A , C o l l i n s F S , G l o v e r T W . S o m a t i c d e l e t i o n o f t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 g e n e i n a n e u r o f i b r o s a r c o m a s u p p o r t s a t u m o u r s u p p r e s s o r g e n e h y p o t h e s i s . N a t G e n e t 1 9 9 3 ; 3 : 1 2 2 - 6 . 5 . K l u w e L , F r i e d r i c h R , M a u t n e r V F . L o s s o f N F 1 a l l e l e i n S c h w a n n c e l l s b u t n o t i n f i b r o b l a s t s d e r i v e d f r o m a n N F 1 - a s s o c i a t e d n e u r o f i b r o m a . G e n e s C h r o m o s o m e s C a n c e r 1 9 9 9 ; 2 4 : 2 8 3 - 5 . 6 . R u t k o w s k i J L , W u K , G u t m a n n D H , B o y e r P J , L e g i u s E . G e n e t i c a n d c e l l u l a r d e f e c t s c o n t r i b u t i n g t o b e n i g n t u m o r f o r m a t i o n i n n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 . H u m M o l G e n e t 2 0 0 0 ; 9 : 1 0 5 9 - 6 6 . 7 . S h e r m a n L S , A t i t R , R o s e n b a u m T , C o x A D , R a t n e r N . S i n g l e c e l l R a s - G T P a n a l y s i s r e v e a l s a l t e r e d R a s a c t i v i t y i n a s u b p o p u l a t i o n o f n e u r o f i b r o m a S c h w a n n c e l l s b u t n o t f i b r o b l a s t s . J B i o l C h e m 2 0 0 0 ; 2 7 5 : 3 0 7 4 0 - 5 . 8 . S k u s e G R , K o s c i o l e k B A , R o w l e y P T . T h e n e u r o f i b r o m a i n v o n R e c k l i n g h a u s e n n e u r o f i b r o m a t o s i s h a s a u n i c e l l u l a r o r i g i n . A m J H u m G e n e t 1 9 9 1 ; 4 9 : 6 0 0 - 7 . 9 . C o l m a n S D , W i l l i a m s C A , W a l l a c e M R . B e n i g n n e u r o f i b r o m a s i n t y p e 1 n e u r o f i b r o m a t o s i s ( N F 1 ) s h o w s o m a t i c d e l e t i o n s o f t h e N F 1 g e n e . N a t G e n e t 1 9 9 5 ; 1 1 : 9 0 - 2 . 1 0 . S a w a d a S , F l o r e l l S , P u r a n d a r e S M , e t a l . I d e n t i f i c a t i o n o f N F 1 m u t a t i o n s i n b o t h a l l e l e s o f a d e r m a l n e u r o f i b r o m a . N a t G e n e t 1 9 9 6 ; 1 4 : 1 1 0 - 2 . 1 1 . D a s c h n e r K , A s s u m G , E i s e n b a r t h I , e t a l . C l o n a l o r i g i n o f t u m o r c e l l s i n a p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a w i t h L O H i n N F 1 i n t r o n 3 8 a n d i n d e r m a l n e u r o f i b r o m a s w i t h o u t L O H o f t h e N F 1 g e n e . B i o c h e m B i o p h y s R e s C o m m u n 1 9 9 7 ; 2 3 4 : 3 4 6 - 5 0 . 1 2 . K l u w e L , F r i e d r i c h R E , M a u t n e r V F . A l l e l i c l o s s o f t h e N F 1 g e n e i n N F 1 -a s s o c i a t e d p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . C a n c e r G e n e t C y t o g e n e t 1 9 9 9 ; 1 1 3 : 6 5 - 9 . 1 3 . J o h n A M , R u g g i e r i M , F e r n e r R , U p a d h y a y a M . A s e a r c h f o r e v i d e n c e o f s o m a t i c m u t a t i o n s i n t h e N F 1 g e n e . J M e d G e n e t 2 0 0 0 ; 3 7 : 4 4 - 9 . 1 4 . L u i j t e n M , R e d e k e r S , v a n N o e s e l M M , e t a l . M i c r o s a t e l l i t e i n s t a b i l i t y a n d p r o m o t e r m e t h y l a t i o n a s p o s s i b l e c a u s e s o f N F 1 g e n e i n a c t i v a t i o n i n n e u r o f i b r o m a s . E u r J H u m G e n e t 2 0 0 0 ; 8 : 9 3 9 - 4 5 . 1 5 . R a s m u s s e n S A , O v e r m a n J , T h o m s o n S A , e t a l . C h r o m o s o m e 1 7 l o s s - o f -h e t e r o z y g o s i t y s t u d i e s i n b e n i g n a n d m a l i g n a n t t u m o r s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 . G e n e s C h r o m o s o m e s C a n c e r 2 0 0 0 ; 2 8 : 4 2 5 - 3 1 . 9 7 1 6 . W i e s t V , E i s e n b a r t h I , S c h m e g n e r C , K r o n e W , A s s u m G . S o m a t i c N F 1 m u t a t i o n s p e c t r a i n a f a m i l y w i t h n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 : t o w a r d a t h e o r y o f g e n e t i c m o d i f i e r s . H u m M u t a t 2 0 0 3 ; 2 2 : 4 2 3 - 7 . 1 7 . U p a d h y a y a M , H a n S , C o n s o l i C , e t a l . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e s o m a t i c m u t a t i o n a l s p e c t r u m o f t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 ( N F 1 ) g e n e i n n e u r o f i b r o m a t o s i s p a t i e n t s w i t h b e n i g n a n d m a l i g n a n t t u m o r s . H u m M u t a t 2 0 0 4 ; 2 3 : 1 3 4 - 4 6 . 1 8 . D e L u c a A B L , C e c c a r i n i C , S i n i b a l d i L , N o v e l l i A , G i u s t i n i S , D a n i e l e I , C a l v i e r i S , M i n g a r e l l i R . F l u o r e s c e n c e i n s i t u h y b r i d i z a t i o n a n a l y s i s o f a l l e l i c l o s s e s i n v o l v i n g t h e l o n g a r m o f c h r o m o s o m e 1 7 i n N F 1 - a s s o c i a t e d n e u r o f i b r o m a s . C a n c e r G e n e t C y t o g e n e t 2 0 0 4 ; 1 5 0 : 1 6 8 - 7 2 . 1 9 . D e R a e d t T , M a e r t e n s O , C h m a r a M , e t a l . S o m a t i c l o s s o f w i l d t y p e N F 1 a l l e l e i n n e u r o f i b r o m a s : C o m p a r i s o n o f N F 1 m i c r o d e l e t i o n a n d n o n - m i c r o d e l e t i o n p a t i e n t s . G e n e s C h r o m o s o m e s C a n c e r 2 0 0 6 ; 2 0 . K l u w e L , F r i e d r i c h R E , K o r f B , F a h s o l d R , M a u t n e r V F . N F 1 m u t a t i o n s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 p a t i e n t s w i t h p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . H u m M u t a t 2 0 0 2 ; 1 9 : 3 0 9 - 1 4 . 2 1 . S e r r a E , P u i g S , O t e r o D , e t a l . C o n f i r m a t i o n o f a d o u b l e - h i t m o d e l f o r t h e N F 1 g e n e i n b e n i g n n e u r o f i b r o m a s . A m J H u m G e n e t 1 9 9 7 ; 6 1 : 5 1 2 - 9 . 2 2 . S e r r a E , A r s E , R a v e l l a A , e t a l . S o m a t i c N F 1 m u t a t i o n a l s p e c t r u m i n b e n i g n n e u r o f i b r o m a s : m R N A s p l i c e d e f e c t s a r e c o m m o n a m o n g p o i n t m u t a t i o n s . H u m G e n e t 2 0 0 1 ; 1 0 8 : 4 1 6 - 2 9 . 2 3 . M a e r t e n s O , B r e m s H , V a n d e s o m p e l e J , e t a l . C o m p r e h e n s i v e N F 1 s c r e e n i n g o n c u l t u r e d S c h w a n n c e l l s f r o m n e u r o f i b r o m a s . H u m M u t a t 2 0 0 6 ; 2 7 : 1 0 3 0 - 4 0 . 2 4 . E i s e n b a r t h I , B e y e r K , K r o n e W , A s s u m G . T o w a r d a s u r v e y o f s o m a t i c m u t a t i o n o f t h e N F 1 g e n e i n b e n i g n n e u r o f i b r o m a s o f p a t i e n t s w i t h n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 . A m J H u m G e n e t 2 0 0 0 ; 6 6 : 3 9 3 - 4 0 1 . 2 5 . M u i r D , N e u b a u e r D , L i m I T , Y a c h n i s A T , W a l l a c e M R . T u m o r i g e n i c p r o p e r t i e s o f n e u r o f i b r o m i n - d e f i c i e n t n e u r o f i b r o m a S c h w a n n c e l l s . A m J P a t h o l 2 0 0 1 ; 1 5 8 : 5 0 1 -1 3 . 2 6 . S e r r a E , R o s e n b a u m T , W i n n e r U , e t a l . S c h w a n n c e l l s h a r b o r t h e s o m a t i c N F 1 m u t a t i o n i n n e u r o f i b r o m a s : e v i d e n c e o f t w o d i f f e r e n t S c h w a n n c e l l s u b p o p u l a t i o n s . H u m M o l G e n e t 2 0 0 0 ; 9 : 3 0 5 5 - 6 4 . 2 7 . R i c c a r d i V M . P a t h o g e n e s i s : C e l l B i o l o g y . I n : R i c c a r d i V M , e d i t o r s . N e u r o f i b r o m a t o s i s : P h e n o t y p e , N a t u r a l H i s t o r y a n d P a t h o g e n e s i s . 2 n d e d . B a l t i m o r e : T h e J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y P r e s s ; 1 9 9 2 . p . 2 5 8 - 7 9 . 2 8 . F i t z p a t r i c k J E , M c D e r m o t t M , M a y D , H o f e l d t F D . E r u p t i v e n e u r o f i b r o m a t o s i s a s s o c i a t e d w i t h a n o r e x i a n e r v o s a . A r c h D e r m a t o l 1 9 8 3 ; 1 1 9 : 1 0 1 9 - 2 1 . 2 9 . F r i e d m a n J M , R i c c a r d i V M . V a s c u l a r a n d E n d o c r i n e A b n o r m a l i t i e s . I n : G u t m a n n D H , M a c C o l l i n M , R i c c a r d i V M , e d i t o r s . N e u r o f i b r o m a t o s i s : p h e n o t y p e , n a t u r a l h i s t o r y , a n d p a t h o g e n e s i s . 3 r d e d . B a l t i m o r e : J o h n H o p k i n s U n i v e r s i t y P r e s s ; 1 9 9 9 . p . 2 7 4 - 9 6 . 9 8 3 0 . R i c c a r d i V M . A n O v e r v i e w o f N F - 1 : D y s p l a s i a a n d N e o p l a s i a . I n : R i c c a r d i V M , e d i t o r s . N e u r o f i b r o m a t o s i s : P h e n o t y p e , N a t u r a l H i s t o r y a n d P a t h o g e n e s i s . 2 n d e d . B a l t i m o r e : T h e J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y P r e s s ; 1 9 9 2 . p . 1 8 - 3 9 . 3 1 . T u c k e r T , F r i e d m a n J M . P a t h o g e n e s i s o f h e r e d i t a r y t u m o r s : b e y o n d t h e " t w o - h i t " h y p o t h e s i s , C l i n G e n e t 2 0 0 2 ; 6 2 : 3 4 5 - 5 7 . 3 2 . N a t i o n a l I n s t i t u t e s o f H e a l t h C o n s e n s u s D e v e l o p m e n t C o n f e r e n c e S t a t e m e n t : n e u r o f i b r o m a t o s i s . B e t h e s d a , M d . , U S A , J u l y 1 3 - 1 5 , 1 9 8 7 . N e u r o f i b r o m a t o s i s 1 9 8 8 ; 1 : 1 7 2 - 8 . 3 3 . G o t t f r i e d O N , V i s k o c h i l D H , F u l t s D W , C o u l d w e l l W T . M o l e c u l a r , g e n e t i c , a n d c e l l u l a r p a t h o g e n e s i s o f n e u r o f i b r o m a s a n d s u r g i c a l i m p l i c a t i o n s . N e u r o s u r g e r y 2 0 0 6 ; 5 8 : 1 - 1 6 . 3 4 . R e e d N , G u t m a n n D H . T u m o r i g e n e s i s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s : n e w i n s i g h t s a n d p o t e n t i a l t h e r a p i e s . T r e n d s M o l M e d 2 0 0 1 ; 7 : 1 5 7 - 6 2 . 3 5 . A r u n D , G u t m a n n D H . R e c e n t a d v a n c e s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 . C u r r O p i n N e u r o l 2 0 0 4 ; 1 7 : 1 0 1 - 5 . 3 6 . H e n s k e E P , S c h e i t h a u e r B W , S h o r t M P , e t a l . A l l e l i c l o s s i s f r e q u e n t i n t u b e r o u s s c l e r o s i s k i d n e y l e s i o n s b u t r a r e i n b r a i n l e s i o n s . A m J H u m G e n e t 1 9 9 6 ; 5 9 : 4 0 0 - 6 . 3 7 . N i i d a Y , S t e m m e r - R a c h a m i m o v A O , L o g r i p M , e t a l . S u r v e y o f s o m a t i c m u t a t i o n s i n t u b e r o u s s c l e r o s i s c o m p l e x ( T S C ) h a m a r t o m a s s u g g e s t s d i f f e r e n t g e n e t i c m e c h a n i s m s f o r p a t h o g e n e s i s o f T S C l e s i o n s . A m J H u m G e n e t 2 0 0 1 ; 6 9 : 4 9 3 -5 0 3 . 3 8 . M a L , T e r u y a - F e l d s t e i n J , B e h r e n d t N , e t a l . G e n e t i c a n a l y s i s o f P t e n a n d T s c 2 f u n c t i o n a l i n t e r a c t i o n s i n t h e m o u s e r e v e a l s a s y m m e t r i c a l h a p l o i n s u f f i c i e n c y i n t u m o r s u p p r e s s i o n . G e n e s D e v 2 0 0 5 ; 1 9 : 1 7 7 9 - 8 6 . 3 9 . T r k o v a M , F o r e t o v a L , K o d e t R , H e d v i c a k o v a P , S e d l a c e k Z . A L i - F r a u m e n i s y n d r o m e f a m i l y w i t h r e t a i n e d h e t e r o z y g o s i t y f o r a g e r m l i n e T P 5 3 m u t a t i o n i n t w o t u m o r s . C a n c e r G e n e t C y t o g e n e t 2 0 0 3 ; 1 4 5 : 6 0 - 4 . 4 0 . B e r n a r d s A . N e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 a n d R a s - m e d i a t e d s i g n a l i n g : f i l l i n g i n t h e G A P s . B i o c h i m i c a B i o p h y s i c a A c t a 1 9 9 5 ; 1 2 4 2 : 4 3 - 5 9 . 4 1 . F e l d k a m p M M , A n g e l o v L , G u h a A . N e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 p e r i p h e r a l n e r v e t u m o r s : a b e r r a n t a c t i v a t i o n o f t h e R a s p a t h w a y . S u r g N e u r o l 1 9 9 9 ; 5 1 : 2 1 1 - 8 . 4 2 . H a r r i s i n g h M C , L l o y d A C . R a s / R a f / E R K s i g n a l l i n g a n d N F 1 . C e l l C y c l e 2 0 0 4 ; 3 : 1 2 5 5 - 8 . 4 3 . H o r a n M P , C o o p e r D N , U p a d h y a y a M . H y p e r m e t h y l a t i o n o f t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 ( N F 1 ) g e n e p r o m o t e r i s n o t a c o m m o n e v e n t i n t h e i n a c t i v a t i o n o f t h e N F 1 g e n e i n N F 1 - s p e c i f i c t u m o u r s . H u m G e n e t 2 0 0 0 ; 1 0 7 : 3 3 - 9 . 4 4 . H a r d e r A , R o s c h e M , R e u s s D E , e t a l . M e t h y l a t i o n a n a l y s i s o f t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 ( N F 1 ) p r o m o t e r i n p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o u r s . E u r J C a n c e r 2 0 0 4 ; 4 0 : 2 8 2 0 - 8 . 4 5 . Z h u Y , G h o s h P , C h a r n a y P , B u r n s D K , P a r a d a L F . N e u r o f i b r o m a s i n N F 1 : S c h w a n n c e l l o r i g i n a n d r o l e o f t u m o r e n v i r o n m e n t . S c i e n c e 2 0 0 2 ; 2 9 6 : 9 2 0 - 2 . 9 9 4 6 . W u M , W a l l a c e M R , M u i r D . T u m o r i g e n i c p r o p e r t i e s o f n e u r o f i b r o m i n - d e f i c i e n t S c h w a n n c e l l s i n c u l t u r e a n d a s s y n g r a f t s i n N f 1 k n o c k o u t m i c e . J N e u r o s c i R e s 2 0 0 5 ; 8 2 : 3 5 7 - 6 7 . 4 7 . J a c k s T , S h i h T S , S c h m i t t E M , e t a l . T u m o u r p r e d i s p o s i t i o n i n m i c e h e t e r o z y g o u s f o r a t a r g e t e d m u t a t i o n i n N f 1 . N a t G e n e t 1 9 9 4 ; 7 : 3 5 3 - 6 1 . 4 8 . M c C l a t c h e y A l , C i c h o w s k i K . M o u s e m o d e l s o f n e u r o f i b r o m a t o s i s . B i o c h i m i c a e t B i o p h y s i c a A c t a 2 0 0 1 ; 1 4 7 1 : M 7 3 - m 8 0 . 4 9 . G u t m a n n D H , G i o v a n n i n i M . M o u s e m o d e l s o f n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 a n d 2 . N e o p l a s i a 2 0 0 2 ; 4 : 2 7 9 - 9 0 . 5 0 . C i c h o w s k i K S T , S c h m i t t E , S a n t i a g o S , R e i l l y K , M c L a u g h l i n M E , B r o n s o n R T , J a c k s T . M o u s e m o d e l s o f t u m o r d e v e l o p m e n t i n n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 . S c i e n c e 1 9 9 9 ; 2 8 6 : 2 1 7 2 - 6 . 5 1 . S k u s e G R , C a p p i o n e A J . R N A p r o c e s s i n g a n d c l i n i c a l v a r i a b i l i t y i n n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e I ( N F 1 ) . H u m M o l G e n e t 1 9 9 7 ; 6 : 1 7 0 7 - 1 2 . 5 2 . T o n s g a r d J H , Y e l a v a r t h i K K , C u s h n e r S , S h o r t M P , L i n d g r e n V . D o N F 1 g e n e d e l e t i o n s r e s u l t i n a c h a r a c t e r i s t i c p h e n o t y p e ? A m J M e d G e n e t 1 9 9 7 ; 7 3 : 8 0 - 6 . 5 3 . U p a d h y a y a M , R u g g i e r i M , M a y n a r d J , e t a l . G r o s s d e l e t i o n s o f t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 ( N F 1 ) g e n e a r e p r e d o m i n a n t l y o f m a t e r n a l o r i g i n a n d c o m m o n l y a s s o c i a t e d w i t h a l e a r n i n g d i s a b i l i t y , d y s m o r p h i c f e a t u r e s a n d d e v e l o p m e n t a l d e l a y . H u m G e n e t 1 9 9 8 ; 1 0 2 : 5 9 1 - 7 . 5 4 . L e p p i g K A , K a p l a n P , V i s k o c h i l D , e t a l . F a m i l i a l n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 m i c r o d e l e t i o n s : c o s e g r e g a t i o n w i t h d i s t i n c t f a c i a l p h e n o t y p e a n d e a r l y o n s e t o f c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a t a . A m J M e d G e n e t 1 9 9 7 ; 7 3 : 1 9 7 - 2 0 4 . 5 5 . H a r r i s i n g h M C , P e r e z - N a d a l e s E , P a r k i n s o n D B , e t a l . T h e R a s / R a f / E R K s i g n a l l i n g p a t h w a y d r i v e s S c h w a n n c e l l d e d i f f e r e n t i a t i o n . E m b o J 2 0 0 4 ; 2 3 : 3 0 6 1 -7 1 . 5 6 . F r a h m S , M a u t n e r V F , B r e m s H , e t a l . G e n e t i c a n d p h e n o t y p i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f t u m o r c e l l s d e r i v e d f r o m m a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o r s o f n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e 1 p a t i e n t s . N e u r o b i o l D i s 2 0 0 4 ; 1 6 : 8 5 - 9 1 . 5 7 . F i a l k o w P J , S a g e b i e l R W , G a r t l e r S M , R i m o i n D L . M u l t i p l e c e l l o r i g i n o f h e r e d i t a r y n e u r o f i b r o m a s . N E n g l J M e d 1 9 7 1 ; 2 8 4 : 2 9 8 - 3 0 0 . 5 8 . B u s q u e L , M i o R , M a t t i o l i J , e t a l . N o n r a n d o m X - i n a c t i v a t i o n p a t t e r n s i n n o r m a l f e m a l e s : l y o n i z a t i o n r a t i o s v a r y w i t h a g e . B l o o d 1 9 9 6 ; 8 8 : 5 9 - 6 5 . 1 0 0 5. G E N E R A L DISCUSSION Summary N e u r o f i b r o m a s a r e t h e h a l l m a r k f e a t u r e o f N F 1 . A l m o s t a l l i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 d e v e l o p n e u r o f i b r o m a s i n t h e i r l i f e t i m e , a n d s o m e i n d i v i d u a l s d e v e l o p h u n d r e d s o r t h o u s a n d s o f t h e s e t u m o u r s . C u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s c a n h a v e a g r e a t e f f e c t o n q u a l i t y o f l i f e , a n d o t h e r k i n d s o f n e u r o f i b r o m a s m a y c a u s e p a i n , d e f o r m i t y , f u n c t i o n a l i m p a i r m e n t , o r b l e e d i n g b e c a u s e o f e r o s i o n i n t o a d j a c e n t s t r u c t u r e s . C o n g e n i t a l d i f f u s e a n d n o d u l a r p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s m a y g i v e r i s e t o M P N S T s , w h i c h a r e a m a j o r c a u s e o f p r e m a t u r e d e a t h i n p e o p l e w i t h N F 1 ( 1 ) . M o u s e m o d e l s o f b e n i g n n e u r o f i b r o m a s a n d M P N S T h a v e p r o v i d e d v a l u a b l e i n s i g h t s i n t o t u m o u r d e v e l o p m e n t , b u t t h e s e m o d e l s d o n o t f u l l y r e c a p i t u l a t e t h e h u m a n s i t u a t i o n . C u l t u r e s d e r i v e d f r o m N F 1 n e u r o f i b r o m a s a l s o p r o v i d e v a l u a b l e i n f o r m a t i o n b u t c a n n o t b e u s e d t o s t u d y s o m e c r i t i c a l h o s t f a c t o r s o r t h e r o l e o f t h e t u m o u r e n v i r o n m e n t . I n o r d e r t o u n d e r s t a n d t u m o u r d e v e l o p m e n t i n p e o p l e w i t h N F 1 f u l l y , i t i s n e c e s s a r y t o s t u d y h o w n e u r o f i b r o m a s a r i s e in vivo a n d t o t a k e i n t o c o n s i d e r a t i o n t h e d i f f e r e n t c l i n i c a l f e a t u r e s a n d n a t u r a l h i s t o r i e s o f e a c h t y p e o f n e u r o f i b r o m a . I u s e d h i s t o l o g y a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t o d e t e r m i n e t h e c e l l u l a r c o m p o s i t i o n a n d e x p r e s s i o n o f n e u r o f i b r o m i n i n d i f f u s e a n d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s a n d a s s e s s e d c l o n a l i t y t o d e f i n e t h e c e l l p o p u l a t i o n s t h a t g i v e r i s e t o t h e s e t u m o u r s . I a l s o i n v e s t i g a t e d a s s o c i a t i o n s o f b e n i g n a n d m a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o u r s i n a l a r g e s e r i e s o f N F 1 p a t i e n t s i n o r d e r t o i d e n t i f y a g r o u p o f p a t i e n t s w h o a r e a t h i g h e s t r i s k f o r d e v e l o p i n g M P N S T s . Risk of MPNST Development T h e s t r o n g a s s o c i a t i o n I o b s e r v e d b e t w e e n t h e o c c u r r e n c e o f i n t e r n a l n e u r o f i b r o m a s a n d M P N S T s i n p e o p l e w i t h N F 1 ( C h a p t e r 2 ) s u g g e s t s t h a t s u c h i n d i v i d u a l s a r e a t h i g h e r r i s k o f d e v e l o p i n g M P N S T s t h a n N F 1 p a t i e n t s w i t h o u t i n t e r n a l n e u r o f i b r o m a s . T h e l a r g e s i z e a n d o l d e r a g e o f s u b j e c t s i n t h e c l i n i c a l d a t a b a s e I u s e d i n t h i s s t u d y a r e u n i q u e i n N F 1 r e s e a r c h a n d a l l o w e d m e t o a s s e s s t h i s a s s o c i a t i o n f o r t h e f i r s t t i m e . M y i n v e s t i g a t i o n w a s l a r g e l y c r o s s - s e c t i o n a l , b u t i f t h e a s s o c i a t i o n I f o u n d w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f m a l i g n a n c y c a n b e c o n f i r m e d i n l o n g i t u d i n a l s t u d i e s o f N F 1 p a t i e n t s 1 0 1 w i t h i n t e r n a l n e u r o f i b r o m a s , s u c h i n d i v i d u a l s m a y b e n e f i t f r o m c l o s e r m o n i t o r i n g f o r s i g n s a n d s y m p t o m s o f m a l i g n a n t p r o g r e s s i o n . C l o s e r m o n i t o r i n g m a y p e r m i t e a r l i e r d i a g n o s i s a n d m o r e e f f e c t i v e t r e a t m e n t o f M P N S T s , w h i c h c u r r e n t l y a c c o u n t f o r t h e d e a t h o f a b o u t 1 0 % o f p e o p l e w i t h N F 1 ( 1 ) . T h e o p t i m a l a p p r o a c h t o c l i n i c a l m o n i t o r i n g o f N F 1 p a t i e n t s f o r M P N S T d e v e l o p m e n t i s u n k n o w n . S c r e e n i n g f o r s y m p t o m s i s p r o b a b l y i n a d e q u a t e b e c a u s e m o s t M P N S T s a r e m e t a s t a t i c a t t h e t i m e o f c l i n i c a l d i a g n o s i s ( 2 ) . R o u t i n e w h o l e - b o d y i m a g i n g s t u d i e s u s i n g C T o r M R I w o u l d p e r m i t r e c o g n i t i o n o f m o s t i n t e r n a l n e u r o f i b r o m a s a n d M P N S T s b u t c a n n o t r e l i a b l y d i s t i n g u i s h b e n i g n a n d m a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o u r s . P E T s c a n n i n g c a n d i s t i n g u i s h b e n i g n n e u r o f i b r o m a s f r o m M P N S T i n m o s t c a s e s ( 3 ) , b u t P E T a n d M R I s c a n s a r e e x p e n s i v e , a n d P E T o r C T i m a g i n g w o u l d r e q u i r e e x p o s i n g N F 1 p a t i e n t s t o i o n i z i n g r a d i a t i o n , w h i c h i t s e l f m a y i n c r e a s e t h e i r r i s k o f d e v e l o p i n g a n M P N S T ( 2 , 4 ) . A t h o r o u g h c o s t - b e n e f i t a n a l y s i s i s n e e d e d t o d e t e r m i n e t h e c l i n i c a l v a l u e o f a n d o p t i m a l p r o t o c o l f o r s c r e e n i n g s e l e c t e d N F 1 p a t i e n t s f o r m a l i g n a n c y . M y o b s e r v a t i o n t h a t c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s w e r e n o t a s s o c i a t e d w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f M P N S T d i f f e r s f r o m t h e f i n d i n g s i n o n e s t u d y t h a t f o u n d a w e a k a s s o c i a t i o n w i t h c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s . H o w e v e r , t h e m e d i a n a g e o f i n d i v i d u a l s w i t h o u t M P N S T s w a s l o w e r t h a n t h o s e w i t h M P N S T s i n t h a t s t u d y ( 5 ) , a n d t h e p a t i e n t s w i t h M P N S T s w e r e o f t h e a p p r o x i m a t e a g e w h e n c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s b e g i n t o a p p e a r . T h e r e f o r e , t h e m a j o r i t y o f i n d i v i d u a l s w i t h o u t M P N S T s w o u l d b e e x p e c t e d t o h a v e f e w i f a n y c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s b a s e d o n a g e a l o n e . O u r o b s e r v a t i o n i s c o n s i s t e n t w i t h t h e c l i n i c a l o b s e r v a t i o n t h a t c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s h a v e n o t b e e n r e p o r t e d t o p r o g r e s s t o m a l i g n a n c y , e v e n t h o u g h i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 m a y h a v e t h o u s a n d s o f t h e s e b e n i g n t u m o u r s ( 6 ) . T h e a s s o c i a t i o n I o b s e r v e d b e t w e e n i n t e r n a l a n d s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s c o u l d p o i n t t o a c o m m o n m e c h a n i s m o f t u m o u r d e v e l o p m e n t . I n c o n t r a s t , t h e l a c k o f a s s o c i a t i o n b e t w e e n c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s a n d e i t h e r i n t e r n a l o r s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s s u g g e s t s t h a t m o r e t h a n o n e m e c h a n i s m o f n e u r o f i b r o m a p a t h o g e n e s i s m a y e x i s t i n p e o p l e w i t h N F 1 . T h e r e s u l t s f r o m C h a p t e r s 3 a n d 4 a r e c o n s i s t e n t w i t h t h i s i n t e r p r e t a t i o n . 1 0 2 Benign Neurofibroma Development T h e c l a s s i f i c a t i o n o f b e n i g n n e u r o f i b r o m a s u s e d f o r C h a p t e r s 3 a n d 4 d i f f e r s f r o m t h a t u s e d i n C h a p t e r 2 . C h a p t e r 2 c l a s s i f i e d e x t e r n a l l y - v i s i b l e n e u r o f i b r o m a s a c c o r d i n g t o t h e i r c l i n i c a l f e a t u r e s , w h i l e C h a p t e r s 3 a n d 4 u s e d a h i s t o p a t h l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o n . C l i n i c a l l y - d e f i n e d c u t a n e o u s a n d d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a r e g e n e r a l l y c l a s s i f i e d a s d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s h i s t o p a t h o l o g i c a l l y , a n d c l i n i c a l l y - d e f i n e d s u b c u t a n e o u s a n d n o d u l a r p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a r e u s u a l l y c l a s s i f i e d a s n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s h i s t o p a t h o l o g i c a l l y . H o w e v e r , e x c e p t i o n s d o o c c u r , a n d t h e c l i n i c a l c l a s s i f i c a t i o n o f a n e u r o f i b r o m a c a n n o t a l w a y s b e d e t e r m i n e d f r o m i t s h i s t o p a t h o l o g i c a l a p p e a r a n c e o r t h e h i s t o p a t h o l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o n f r o m t h e c l i n i c a l a p p e a r a n c e . T h e i n t e r n a l n e u r o f i b r o m a s d i a g n o s e d b y M R I o r C T s c a n i n C h a p t e r 2 w e r e n o t c l a s s i f i e d c l i n i c a l l y , b u t m o s t a r e p r o b a b l y n o d u l a r p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s i n R i c c a r d i ' s c l i n i c a l c l a s s i f i c a t i o n ( 7 ) o r n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s i n t h e h i s t o p a t h o l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o n u s e d i n C h a p t e r s 3 a n d 4 . T h u s , t h e l a c k o f a s s o c i a t i o n b e t w e e n i n t e r n a l ( p r e d o m i n a n t l y n o d u l a r ) n e u r o f i b r o m a s a n d c u t a n e o u s ( g e n e r a l l y d i f f u s e ) n e u r o f i b r o m a s f o u n d i n C h a p t e r 2 i s c o n s i s t e n t w i t h t h e h i s t o l o g i c a l f i n d i n g s p r e s e n t e d i n C h a p t e r s 3 a n d 4 , w h i c h a r e s u g g e s t i v e o f p a t h o g e n e t i c d i f f e r e n c e s b e t w e e n n o d u l a r a n d d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . I n C h a p t e r 4 , I f o u n d t h a t S 1 0 0 - / N f - c e l l s w e r e a b u n d a n t i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s b u t m u c h l e s s c o m m o n i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . I d o n o t k n o w w h a t c e l l p o p u l a t i o n t h e S 1 0 0 - / N f - c e l l s r e p r e s e n t . I t i s u n l i k e l y t h a t t h e s e c e l l s a r e r e a l l y S 1 0 0 - / N f + c e l l s ( n o r m a l s t r o m a l c e l l s ) t h a t d i d n o t s t a i n f o r n e u r o f i b r o m i n b e c a u s e t h e s e n s i t i v i t y o f t h e a n t i -n e u r o f i b r o m i n a n t i b o d y w a s 9 2 % i n t h e c o n t r o l a n d s h o u l d b e e q u a l i n n o d u l a r a n d d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . T w o i n t e r e s t i n g p o s s i b i l i t i e s a r e t h a t t h e S 1 0 0 - / N f - c e l l s a r e 1 . n e o p l a s t i c S c h w a n n c e l l s t h a t h a v e s u s t a i n e d a " s e c o n d - h i t " o f t h e N F 1 l o c u s a n d l o s t S 1 0 0 e x p r e s s i o n t h r o u g h d e d i f f e r e n t i a t i o n o r 2 . n e o p l a s t i c p r i m i t i v e S c h w a n n c e l l p r e c u r s o r s ( s t e m c e l l s ) t h a t s u s t a i n e d a " s e c o n d h i t " N F 1 m u t a t i o n . E i t h e r p o s s i b i l i t y c o u l d p r o v i d e a p o p u l a t i o n o f n e o p l a s t i c c e l l s t h a t d r i v e s t u m o u r f o r m a t i o n a n d l e a d s t o a h i g h r i s k o f m a l i g n a n t d e g e n e r a t i o n , a c c o u n t i n g f o r t h e a s s o c i a t i o n o b s e r v e d i n C h a p t e r 2 . W e w e r e n o t a b l e t o a s s e s s c l o n a l i t y i n t h e S 1 0 0 - / N f - p o p u l a t i o n b e c a u s e w e d i d n o t h a v e a c e l l m a r k e r o r n u c l e a r s t a i n t o i d e n t i f y t h e s e c e l l s . T h e u s e o f n u c l e a r s t a i n s l o w e r e d t h e q u a l i t y o f D N A i n t h e s a m p l e s t h a t w e r e a l r e a d y c o m p r o m i s e d f r o m 1 0 3 t h e f o r m a l i n - f i x a t i o n p r o c e s s . H o w e v e r , t h e a b u n d a n c e o f S 1 0 0 - / N f - c e l l s i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s s u g g e s t s t h a t t h e s e c e l l s h a v e a n i m p o r t a n t r o l e i n t h e d e v e l o p m e n t o f t h i s t u m o u r t y p e . I t i s i m p o r t a n t t o a s s e s s t h e c l o n a l i t y o f t h e s e c e l l s t o d e t e r m i n e i f t h e y a r e t h e n e o p l a s t i c c l o n e t h a t g a v e r i s e t o t h e t u m o u r . I f o u n d f e w e r m a s t c e l l s i n h i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d n o d u l a r t h a n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s ( C h a p t e r 3 ) . T h e l o w n u m b e r s o f m a s t c e l l s o b s e r v e d i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s c o u l d s i m p l y r e f l e c t a n a t o m i c a l d i f f e r e n c e s t h a t e x i s t b e t w e e n n o d u l a r a n d d i f f u s e t u m o u r s . D i f f u s e t u m o u r s a r e i n d i r e c t c o n t a c t w i t h a d j a c e n t t i s s u e s , w h i l e n o d u l a r t u m o u r s a r e s u r r o u n d e d b y t h e p e r i n e u r i u m , w h i c h m a y s e r v e a s a n a n a t o m i c a l b a r r i e r t o i n v a s i o n b y m a s t c e l l s . A l t e r n a t i v e l y , t h e r e l a t i v e a b u n d a n c e o f S 1 0 0 - / N f - c e l l s a n d t h e r e l a t i v e p a u c i t y o f S 1 0 0 + / N f + c e l l s i n n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s m a y p r o v i d e l e s s s t i m u l u s t o m a s t c e l l i n v a s i o n t h a n i n d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s . M o s t o f t h e h i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s t h a t I s t u d i e d w e r e c l a s s i f i e d c l i n i c a l l y a s n o d u l a r p l e x i f o r m t u m o u r s . T h e h i s t o l o g i c a l a n d c l i n i c a l s i m i l a r i t i e s b e t w e e n t h e s e n e u r o f i b r o m a s a n d s u b c u t a n e o u s t u m o u r s s u g g e s t t h a t t h e y s h a r e a c o m m o n p a t h o g e n e s i s , b u t m o r e s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s n e e d t o b e s t u d i e d t o a s s e s s t h i s p o s s i b i l i t y . A l t h o u g h c l i n i c a l l y - d e f i n e d c u t a n e o u s a n d d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s h a v e s i m i l a r h i s t o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s , t h e p a t h o g e n e s i s o f t h e s e t w o k i n d s o f t u m o u r s i s l i k e l y t o d i f f e r b e c a u s e t h e y a r i s e a t d i f f e r e n t t i m e s o f l i f e a n d h a v e v e r y d i f f e r e n t n a t u r a l h i s t o r i e s . T w o o f t h e d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s I s t u d i e d f o r c l o n a l i t y w e r e c l a s s i f i e d c l i n i c a l l y a s c u t a n e o u s t u m o u r s ( C h a p t e r 4 ) . O n e s h o w e d d e f i n i t e c l o n a l i t y , a n d t h e o t h e r , p o s s i b l e c l o n a l i t y o f S 1 0 0 + / N f - c e l l s . T h e s e t u m o u r s h a d f e w S 1 0 0 - / N f - c e l l s , i n c o n t r a s t t o n o d u l a r p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . M y o b s e r v a t i o n t h a t c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s o f t e n s h o w a b u n d a n t m a s t c e l l i n f i l t r a t i o n m a y r e f l e c t s t r o n g a t t r a c t i o n o r s t i m u l a t i o n o f m a s t c e l l s b y S 1 0 0 + / N f - S c h w a n n c e l l s , a s h a s b e e n o b s e r v e d i n t h e m o u s e m o d e l ( 8 ) . O n l y o n e o f t h e d i f f u s e n e u r o f i b r o m a s e x a m i n e d f o r c l o n a l i t y i n t h i s s t u d y w a s c l a s s i f i e d c l i n i c a l l y a s a c o n g e n i t a l d i f f u s e p l e x i f o r m t u m o u r ( C h a p t e r 4 ) . I t h a d f e w n e u r o f i b r o m i n -n e g a t i v e c e l l s ( e i t h e r S 1 0 0 - p o s i t i v e o r S 1 0 0 - n e g a t i v e ) a n d d e m o n s t r a t e d p o l y c l o n a l i t y i n a l l c e l l t y p e s . T h i s o b s e r v a t i o n i s c o n s i s t e n t w i t h t h e h y p o t h e s i s t h a t d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s a r i s e d u r i n g f e t a l d e v e l o p m e n t t h r o u g h e x c e s s i v e p r o l i f e r a t i o n o f p o o r l y -r e g u l a t e d N F 1 h a p l o i n s u f f i c i e n t c e l l s r a t h e r t h a n t h r o u g h e x p a n s i o n o f a n e o p l a s t i c 1 0 4 S c h w a n n c e l l c l o n e t h a t h a s s u s t a i n e d a s e c o n d - h i t " t h a t a n n u l s n e u r o f i b r o m i n e x p r e s s i o n . T h e a b u n d a n c e o f m a s t c e l l s i n t h i s t u m o u r m i g h t b e e x p l a i n e d b y r e c r u i t m e n t o r p r o l i f e r a t i o n o f m a s t c e l l s i n r e s p o n s e t o e x c e s s i v e c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n . H o w e v e r , t h i s n e u r o f i b r o m a w a s l o c a t e d s u p e r f i c i a l l y , a n d t h e p r e s e n c e o f m a n y m a s t c e l l s m i g h t s i m p l y r e f l e c t i t s p r o x i m i t y t o t h e s k i n , w h e r e m a n y m a s t c e l l s n o r m a l l y r e s i d e . M o r e d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s f r o m b o t h d e e p a n d s u p e r f i c i a l l o c a t i o n s n e e d t o b e e x a m i n e d t o c o n f i r m m y f i n d i n g s r e g a r d i n g t h e n u m b e r s , d i s t r i b u t i o n a n d c l o n a l i t y o f v a r i o u s c e l l t y p e s . How this Study fits into current NF1 research T h e f u n c t i o n o f t h e N F 1 g e n e h a s n o t y e t b e e n f u l l y e l u c i d a t e d . T h e b e s t c h a r a c t e r i z e d f u n c t i o n o f n e u r o f i b r o m i n i s a s a n e g a t i v e r e g u l a t o r o f t h e R a s s i g n a l i n g p a t h w a y ( 9 ) , b u t N F 1 i s a l s o i n v o l v e d i n o t h e r s i g n a l i n g p a t h w a y s , i n c l u d i n g c A M P ( 1 0 ) . H a p l o i n s u f f i c i e n c y o r c o m p l e t e a b s e n c e o f n e u r o f i b r o m i n h a s b e e n s h o w n t o a f f e c t t h e p r o l i f e r a t i o n o f a v a r i e t y o f c e l l t y p e s ( 1 1 - 1 3 ) , b u t r e s e a r c h i n t o t h e r e s p o n s i b l e m e c h a n i s m s i s o n g o i n g . T h e u b i q u i t o u s e x p r e s s i o n o f n e u r o f i b r o m i n , i t s i n t e r a c t i o n s w i t h n u m e r o u s o t h e r c e l l u l a r p a t h w a y s , a n d t h e v a r i e t y a n d v a r i a b i l i t y o f p h e n o t y p e s o b s e r v e d i n p e o p l e w i t h N F 1 s h o w t h a t N F 1 i s a c o m p l e x d i s e a s e . I t i s , t h e r e f o r e , n o t s u r p r i s i n g t h a t m o r e t h a n o n e p a t h o g e n i c m e c h a n i s m m a y l e a d t o t h e d e v e l o p m e n t o f n e u r o f i b r o m a s , a n d t r y i n g t o c u t t o o d e e p l y w i t h O c c a m ' s r a z o r m a y n o t b e t h e b e s t w a y t o u n d e r s t a n d t h e d i s e a s e . T h e r e i s n o c u r e f o r n e u r o f i b r o m a s e x c e p t s u r g i c a l r e m o v a l i n f a v o u r a b l e c a s e s . S m a l l d i s c r e t e t u m o u r s c a n u s u a l l y b e r e m o v e d s u c c e s s f u l l y , b u t p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s , e s p e c i a l l y d i f f u s e p l e x i f o r m t u m o u r s , u s u a l l y c a n n o t b e r e m o v e d i n t h e i r e n t i r e t y w i t h o u t s u b s t a n t i a l n e u r o l o g i c a l c o m p r o m i s e c a u s e d b y s u r g i c a l d a m a g e t o n e r v e s t h a t t r a v e r s e t h e t u m o u r . I n c o m p l e t e l y r e m o v e d n e u r o f i b r o m a s u s u a l l y g r o w b a c k . M o s t s t u d i e s o f n e u r o f i b r o m a s e i t h e r l u m p a l l o f t h e s e t u m o u r s t o g e t h e r a s a s i n g l e b e n i g n g r o u p o r c a t e g o r i z e t h e m a s " d e r m a l " o r " p l e x i f o r m " , w i t h t h e " d e r m a l " g r o u p c o n t a i n i n g b o t h c u t a n e o u s a n d s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s , a s d e f i n e d b y R i c c a r d i ' s c l i n i c a l c l a s s i f i c a t i o n , a n d t h e " p l e x i f o r m " g r o u p c o n t a i n i n g b o t h n o d u l a r a n d d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . T h e r e s u l t s o f m y w o r k s h o w t h a t t h e s e g r o u p i n g s a r e i n s u f f i c i e n t . A t t h e v e r y l e a s t , c l i n i c a l l y - d e f i n e d c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s s h o u l d b e a n a l y s e d s e p a r a t e l y f r o m s u b c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a s , a n d c l i n i c a l l y - d e f i n e d n o d u l a r 1 0 5 a n d d i f f u s e p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s s h o u l d b e a n a l y s e d s e p a r a t e l y b e c a u s e t h e i r h i s t o l o g i c a l a p p e a r a n c e , c e l l u l a r c o m p o s i t i o n , a n d n a t u r a l h i s t o r y a r e d i f f e r e n t . T h e d i f f e r e n c e s I o b s e r v e d b e t w e e n h i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d d i f f u s e a n d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s h e l p c l a r i f y h o w d i f f e r e n t k i n d s o f n e u r o f i b r o m a s d e v e l o p a n d m a y p r o v i d e i n s i g h t i n t o w h y s o m e n e u r o f i b r o m a s p r o g r e s s t o m a l i g n a n c y , w h i l e m o s t d o n o t . M y r e s u l t s s u p p o r t t h e c u r r e n t t h e o r y t h a t n e u r o f i b r o m a s c a n d e v e l o p b y c l o n a l e x p a n s i o n o f n e o p l a s t i c S c h w a n n c e l l s t h a t h a v e s u s t a i n e d a " s e c o n d - h i t " N F 1 m u t a t i o n . H o w e v e r , I a l s o f o u n d e v i d e n c e t h a t o t h e r n e u r o f i b r o m a s d e v e l o p b y a d i f f e r e n t m e c h a n i s m - p o l y c l o n a l p r o l i f e r a t i o n o f N F 1 h a p l o i n s u f f i c i e n t c e l l s . I t i s a l s o p o s s i b l e t h a t s o m e n e u r o f i b r o m a s , p a r t i c u l a r l y n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s , d e v e l o p f r o m a S c h w a n n c e l l p r e c u r s o r r a t h e r t h a n f r o m m a t u r e S c h w a n n c e l l s . F u r t h e r c l i n i c a l , p a t h o l o g y , c e l l b i o l o g y , a n d m o l e c u l a r g e n e t i c s t u d i e s o f n e u r o f i b r o m a s a r e n e c e s s a r y t o d e t e r m i n e w h y i n d i v i d u a l s w i t h N F 1 a n d c e r t a i n k i n d s o f n e u r o f i b r o m a s a r e m o r e l i k e l y t o d e v e l o p M P N S T s t h a n N F 1 p a t i e n t s w i t h o u t s u c h t u m o u r s . Future Directions T h e t e c h n i q u e t h a t I d e v e l o p e d f o r l a s e r m i c r o d i s s e c t i o n o f i m m u n o f l u o r e s c e n t l y - l a b e l e d c e l l s i n f o r m a l i n - f i x e d p a r a f f i n - e m b e d d e d s a m p l e s i s n o v e l a n d h a s n o t p r e v i o u s l y b e e n d e s c r i b e d . F i x e d t i s s u e o f t h i s k i n d i s r e a d i l y a v a i l a b l e , a n d t h e a b i l i t y t o p e r f o r m m o l e c u l a r g e n e t i c s t u d i e s o n c e l l s i s o l a t e d f r o m s u c h t i s s u e o n t h e b a s i s o f i m m u n o f l u o r e s c e n t f e a t u r e s s h o u l d f a c i l i t a t e m o l e c u l a r g e n e t i c s t u d i e s o f a v a r i e t y o f t u m o u r s w i t h o u t t h e n e e d f o r a d d i t i o n a l s a m p l e c o l l e c t i o n . T h i s t e c h n i q u e c a n a l s o b e a p p l i e d t o o t h e r k i n d s o f t u m o u r s a s s o c i a t e d w i t h N F 1 a s w e l l a s t o b o n y a n d v a s c u l a r l e s i o n s t h a t o c c u r i n s o m e p a t i e n t s w i t h t h i s c o n d i t i o n . T h e a s s o c i a t i o n I f o u n d b e t w e e n i n t e r n a l n e u r o f i b r o m a s a n d M P N S T s i s s t r i k i n g , b u t b e c a u s e t h i s s t u d y w a s b a s e d o n c r o s s - s e c t i o n a l d a t a , t h e r e s u l t s c a n n o t b e u s e d t o a s s e s s i n d i v i d u a l r i s k . N e v e r t h e l e s s , m y f i n d i n g s s h o w t h e n e e d f o r a l o n g i t u d i n a l s t u d y o f n e u r o f i b r o m a g r o w t h a n d M P N S T d e v e l o p m e n t i n y o u n g a d u l t s w i t h N F 1 . C u r r e n t c l i n i c a l s t a n d a r d s f o r c a r e o f N F 1 p a t i e n t s r e c o m m e n d i m a g i n g s t u d i e s f o r i n t e r n a l n e u r o f i b r o m a s o n l y i f t h e y a r e s y m p t o m a t i c . M y d a t a s h o w t h a t i n d i v i d u a l s w i t h a s y m p t o m a t i c i n t e r n a l n e u r o f i b r o m a s m a y a l s o b e a t r i s k f o r d e v e l o p i n g M P N S T s . T h e s e f i n d i n g s r a i s e i m p o r t a n t q u e s t i o n s a b o u t w h e t h e r r o u t i n e w h o l e - b o d y i m a g i n g s h o u l d b e c o n s i d e r e d f o r a l l N F 1 p a t i e n t s a n d w h e t h e r t h o s e f o u n d t o h a v e i n t e r n a l 1 0 6 p l e x i f o r m t u m o u r s s h o u l d b e f o l l o w e d m o r e c l o s e l y f o r t h e d e v e l o p m e n t o f a n M P N S T . C l i n i c a l r e s e a r c h a n d c o s t - b e n e f i t s t u d i e s o f a v a i l a b l e i m a g i n g t e c h n i q u e s f o r p e o p l e w i t h N F 1 a r e c l e a r l y n e e d e d . M o s t i n t e r n a l n e u r o f i b r o m a s i n c l u d e d i n m y a s s o c i a t i o n s t u d y o f M P N S T r i s k w o u l d b e c l a s s i f i e d c l i n i c a l l y a s n o d u l a r p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . T h e r e l a t i v e l y h i g h p r o p o r t i o n o f S 1 0 0 - / N f - c e l l s I o b s e r v e d i n h i s t o l o g i c a l l y - d e f i n e d n o d u l a r n e u r o f i b r o m a s m a y b e e v i d e n c e o f a p r e v i o u s l y - u n a p p r e c i a t e d d e d i f f e r e n t i a t e d o r p r e c u r s o r S c h w a n n c e l l p o p u l a t i o n t h a t i s o f p a r t i c u l a r i m p o r t a n c e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f t h e s e t u m o u r s a n d i n t h e i r m a l i g n a n t p r o g r e s s i o n . T h e t e c h n i q u e s u s e d i n t h e c u r r e n t s t u d y p r e c l u d e d f u r t h e r m o l e c u l a r a n a l y s i s o f t h i s c e l l t y p e , b u t f u t u r e s t u d i e s o f t h e o r i g i n , c l o n a l n a t u r e , a n d g e n e t i c s t a b i l i t y o f t h e S 1 0 0 - / N f - c e l l s m a y p r o v i d e c r i t i c a l i n s i g h t i n t o p r o c e s s e s t h a t l e a d t o t h e f o r m a t i o n a n d m a l i g n a n t p r o g r e s s i o n o f n o d u l a r p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s . M y o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t c e l l u l a r i n t e r a c t i o n s p l a y a k e y r o l e i n n e u r o f i b r o m a d e v e l o p m e n t a n d i m p l y t h a t m o d i f y i n g g e n e s m a y b e o f i m p o r t a n c e . I n d i v i d u a l s w i t h N F 1 w h o s e c o n s t i t u t i o n a l m u t a t i o n i s a m i c o d e l e t i o n o f t h e e n t i r e N F 1 l o c u s a n d i t s a d j a c e n t g e n o m i c r e g i o n a r e c h a r a c t e r i s e d b y u n u s u a l f a c i a l f e a t u r e s , a h i g h t u m o u r b u r d e n a n d a n u n u s u a l l y h i g h r i s k o f d e v e l o p i n g M P N S T ( 1 4 , 1 5 ) . T h e r e a r e 1 7 g e n e s c o n t a i n e d w i t h i n t h e 1 . 4 M b r e g i o n t h a t i s u s u a l l y d e l e t e d i n t h e s e p a t i e n t s . T h e p r o d u c t s o f t h e s e o t h e r g e n e s m a y i n t e r a c t w i t h t h e N F 1 g e n e , w i t h n e u r o f i b r o m i n , o r w i t h o t h e r f a c t o r s i n t h e s i g n a l i n g p a t h w a y s t h a t n e u r o f i b r o m i n r e g u l a t e s . P r o t e i n s p r o d u c e d b y g e n e s e l s e w h e r e i n t h e g e n o m e a l s o a p p e a r t o i n t e r a c t w i t h n e u r o f i b r o m i n ( 1 6 , 1 7 ) . S t u d i e s o f f a c t o r s t h a t i n f l u e n c e n e u r o f i b r o m i n a c t i v i t y a n d f u n c t i o n a r e a m a j o r a r e a o f s t u d y a t N F r e s e a r c h l a b o r a t o r i e s t h r o u g h o u t t h e w o r l d . N F 1 i s a v e r y c o m p l e x d i s e a s e , a n d m y s t u d i e s s h o w t h a t n e u r o f i b r o m a d e v e l o p m e n t i s n o t s i m p l y a m a t t e r o f a S c h w a n n c e l l s u s t a i n i n g a " s e c o n d h i t " o f t h e N F 1 g e n e . I n a d d i t i o n t o h a v i n g d i f f e r e n t c l i n i c a l c h a r a c t e r i s t i c s , d i f f e r e n t k i n d s o f n e u r o f i b r o m a s e x h i b i t c l e a r d i f f e r e n c e s i n c e l l u l a r c o m p o s i t i o n a n d g e n e e x p r e s s i o n . M y r e s u l t s p r o v e t h a t t h e c l i n i c a l a n d p a t h o l o g i c a l h e t e r o g e n e i t y o f n e u r o f i b r o m a s n e e d s t o b e t a k e n i n t o a c c o u n t b y r e s e a r c h e r s w h o a r e t r y i n g t o u n d e r s t a n d h o w t h e s e t u m o u r s d e v e l o p a n d , i n s o m e i n s t a n c e s , p r o g r e s s t o m a l i g n a n c y . 1 0 7 References 1 . R a s m u s s e n S A , Y a n g Q , F r i e d m a n J M . M o r t a l i t y i n n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 : a n a n a l y s i s u s i n g U . S . d e a t h c e r t i f i c a t e s . A m J o f H u m G e n e t 2 0 0 1 ; 6 8 : 1 1 1 0 - 8 . 2 . D u c a t m a n B S , S c h e i t h a u e r B W , P i e p g r a s D G , R e i m a n H M , l l s t r u p D M . M a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o r s . A c l i n i c o p a t h o l o g i c s t u d y o f 1 2 0 c a s e s . C a n c e r 1 9 8 6 ; 5 7 : 2 0 0 6 - 2 1 . 3 . F e r n e r R E , L u c a s J D , O ' D o h e r t y M J , e t a l . E v a l u a t i o n o f ( 1 8 ) f l u o r o d e o x y g l u c o s e p o s i t r o n e m i s s i o n t o m o g r a p h y ( ( 1 8 ) F D G P E T ) i n t h e d e t e c t i o n o f m a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o u r s a r i s i n g f r o m w i t h i n p l e x i f o r m n e u r o f i b r o m a s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 . J N e u r o l N e u r o s u r g P s y c h i a t r y 2 0 0 0 ; 6 8 : 3 5 3 - 7 . 4 . L o r e e T R , N o r t h J H J r , W e r n e s s B A , etal. M a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o r s o f t h e h e a d a n d n e c k : a n a l y s i s o f p r o g n o s t i c f a c t o r s . O t o l a r y n g o l H e a d N e c k S u r g 2 0 0 0 ; 1 2 2 : 6 6 7 - 7 2 . 5 . K i n g A A , D e b a u n M R , R i c c a r d i V M , G u t m a n n D H . M a l i g n a n t p e r i p h e r a l n e r v e s h e a t h t u m o r s i n n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 . A m J M e d G e n e t 2 0 0 0 ; 9 3 : 3 8 8 - 9 2 . 6 . F r i e d m a n J M , R i c c a r d i V M . C l i n i c a l a n d e p i d e m i o l o g i c a l f e a t u r e s . I n : G u t m a n n D H , M a c C o l l i n M , R i c c a r d i V M , e d i t o r s . N e u r o f i b r o m a t o s i s : p h e n o t y p e , n a t u r a l h i s t o r y , a n d p a t h o g e n e s i s . 3 r d e d . B a l t i m o r e : J o h n H o p k i n s U n i v e r s i t y P r e s s ; 1 9 9 9 . p . 2 6 - 8 6 . 7 . R i c c a r d i V M . A n O v e r v i e w o f N F - 1 : D y s p l a s i a a n d N e o p l a s i a . I n : R i c c a r d i V M , e d i t o r s . N e u r o f i b r o m a t o s i s : P h e n o t y p e , N a t u r a l H i s t o r y a n d P a t h o g e n e s i s . 2 n d e d . B a l t i m o r e : T h e J o h n s H o p k i n s U n i v e r s i t y P r e s s ; 1 9 9 2 . p . 1 8 - 3 9 . 8 . Z h u Y , G h o s h P , C h a r n a y P , B u r n s D K , P a r a d a L F . N e u r o f i b r o m a s i n N F 1 : S c h w a n n c e l l o r i g i n a n d r o l e o f t u m o r e n v i r o n m e n t . S c i e n c e 2 0 0 2 ; 2 9 6 : 9 2 0 - 2 . 9 . H a r r i s i n g h M C , L l o y d A C . R a s / R a f / E R K s i g n a l l i n g a n d N F 1 . C e l l C y c l e 2 0 0 4 ; 3 : 1 2 5 5 - 8 . 1 0 . M a r c h u k D A , S a u l i n o A M , T a v a k k o l R , e t a l . c D N A c l o n i n g o f t h e t y p e 1 n e u r o f i b r o m a t o s i s g e n e : c o m p l e t e s e q u e n c e o f t h e N F 1 g e n e p r o d u c t . G e n o m i c s 1 9 9 1 ; 1 1 : 9 3 1 - 4 0 . 1 1 . I n g r a m D A , Y a n g F C , T r a v e r s J B , e t a l . G e n e t i c a n d b i o c h e m i c a l e v i d e n c e t h a t h a p l o i n s u f f i c i e n c y o f t h e N f 1 t u m o r s u p p r e s s o r g e n e m o d u l a t e s m e l a n o c y t e a n d m a s t c e l l f a t e s i n v i v o . J E x p M e d 2 0 0 0 ; 1 9 1 : 1 8 1 - 8 . 1 2 . G u t m a n n D H , L o e h r A , Z h a n g Y , etal. H a p l o i n s u f f i c i e n c y f o r t h e n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 ( N F 1 ) t u m o r s u p p r e s s o r r e s u l t s i n i n c r e a s e d a s t r o c y t e p r o l i f e r a t i o n . O n c o g e n e 1 9 9 9 ; 1 8 : 4 4 5 0 - 9 . 1 . 3 . K i m H A , R o s e n b a u m T , M a r c h i o n n i M A , R a t n e r N , D e C l u e J E . S c h w a n n c e l l s f r o m n e u r o f i b r o m i n d e f i c i e n t m i c e e x h i b i t a c t i v a t i o n o f p 2 1 r a s , i n h i b i t i o n o f c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s . O n c o g e n e 1 9 9 5 ; 1 1 : 3 2 5 - 3 5 . 1 4 . T o n s g a r d J H , Y e l a v a r t h i K K , C u s h n e r S , S h o r t M P , L i n d g r e n V . D o N F 1 g e n e d e l e t i o n s r e s u l t i n a c h a r a c t e r i s t i c p h e n o t y p e ? A m J M e d G e n e t 1 9 9 7 ; 7 3 : 8 0 - 6 . 1 0 8 1 5 . L e p p i g K A , K a p l a n P , V i s k o c h i l D , etal. F a m i l i a l n e u r o f i b r o m a t o s i s 1 m i c r o d e l e t i o n s : c o s e g r e g a t i o n w i t h d i s t i n c t f a c i a l p h e n o t y p e a n d e a r l y o n s e t o f c u t a n e o u s n e u r o f i b r o m a t a . A m J M e d G e n e t 1 9 9 7 ; 7 3 : 1 9 7 - 2 0 4 . 1 6 . J o h a n n e s s e n C M , R e c z e k E E , J a m e s M F , etal. T h e N F 1 t u m o r s u p p r e s s o r c r i t i c a l l y r e g u l a t e s T S C 2 a n d m T O R . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 2 0 0 5 ; 1 0 2 : 8 5 7 3 - 8 1 7 . F e n g L , Y u n o u e S , T o k u o H , e f a l . P K A p h o s p h o r y l a t i o n a n d 1 4 - 3 - 3 i n t e r a c t i o n r e g u l a t e t h e f u n c t i o n o f n e u r o f i b r o m a t o s i s t y p e I t u m o r s u p p r e s s o r , n e u r o f i b r o m i n . F E B S L e t t 2 0 0 4 ; 5 5 7 : 2 7 5 - 8 2 . 1 0 9 

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