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Studies on the synthesis of estrogen glucosiduronates Roy, Joan Elaine 1964

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S T U D I E S ON THE S Y N T H E S I S OP ESTROGEN GLUCOSIDURONATES b y J o a n E l a i n e R o y B . S c , The U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1962 A T H E S I S SUBMITTED I N P A R T I A L F U L F I L M E N T OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF M a s t e r o f S c i e n c e i n t h e D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H COLUMBIA M a y , 1964 In p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t of the requirements f o r an advanced degree at the U n i v e r s i t y of • B r i t i s h Columbia, I agree that the L i b r a r y s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e , f o r r e f e r e n c e and study.. I, f u r t h e r agree that per-m i s s i o n f o r extensive copying of. t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y purposes may be granted by the Head of my Department or by • h i s r e p r e s e n t a t i v e s . I t i s understood t h a t ; c o p y i n g or p u b l i -c a t i o n .of t h i s t h e s i s . f o r f i n a n c i a l gain s h a l l not be allowed without my w r i t t e n permission. Department of B i o c h e m i s t r y • - , The U n i v e r s i t y of B r i t i s h Columbia, Vancouver 8, Canada D a - t e May 6 f 1964 i ABSTRACT A n i n v e s t i g a t i o n o f t h e r e a c t i o n s i n v o l v e d i n t h e c h e m i c a l s y n t h e s i s o f e s t r o g e n g l u c o s i d u r o n a t e s was u n d e r t a k e n t o e s t a b l i s h c o n d i t i o n s f o r ' t h e s y n t h e s i s o f t h e d o u b l y l a b e l -l e d c o n j u g a t e s . The a- a n d (3-anomers o f m e t h y l 1 , 2 , 3 , 4 - i e t r a -O - a c e t y l - D - g l u c u r o n a t e were p r e p a r e d f r o m g l u c u r o n o l a c t o n e b y b a s e a n d a c i d c a t a l y z e d a c e t y l a t i o n s r e s p e c t i v e l y . B r o m i n a t i o n o f e i t h e r o f t h e s e compounds y i e l d e d m e t h y l 2 , 3 , 4 - t r i - 0 - a c e t y l - 1 - b r o m o - l - d e o x y - a - D - g l u c u r o n a t e . E s t r o n e was c o n v e r t e d b y a s e r i e s o f r e a c t i o n s t o 3 , 1 6 a - d i a c e t o x y - 1 7 - k e t o - e s t r a - l , 3 , 5 ( 1 0 ) - t r i e n e . A t t e m p t e d r e d u c t i o n o f t h e 1 7 - k e t o g r o u p was u n s u c c e s s -f u l , a n d f o r t h i s r e a s o n e s t r i o l - 1 7 8 - g l u c o s i d u r o n a t e c o u l d n o t be p r e p a r e d . E s t r a d i o l g l u c o s i d u r o n a t e s c o u l d n o t be o b t a i n e d i n c r y s t a l l i n e f o r m i n s i g n i f i c a n t y i e l d s . E s t r o n e was s u c -c e s s f u l l y c o n j u g a t e d w i t h m e t h y l 2 , 3 , 4 - t r i - 0 - a c e t y l - l - b r o m o - l -d e o x y - a - D - g l u c u r o n a t e . D e a c e t y l a t i o n u n d e r a l k a l i n e c o n d i t i o n s g a v e a s o l i d compound p r e s u m e d t o be e s t r o n e g l u c o s i d u r o n a t e . ACKNOWLEDGEMENT S I w o u l d - l i k e t o e x p r e s s my t h a n k s t o D r . V . J . O ' D o n -n e l l f o r h i s - a d v i c e a n d d i r e c t i o n t h r o u g h o u t t h i s w o r k . I w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k my h u s b a n d f o r h i s c o n -s t r u c t i v e c r i t i c i s m a n d i n s p i r a t i o n . The f i n a n c i a l a s s i s t a n c e o f t h e N a t i o n a l R e s e a r c h C o u n c i l i s g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . i i T A B L E OF CONTENTS P a g e I n t r o d u c t i o n 1 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 16 E x p e r i m e n t a l a n d R e s u l t s 20 P r e p a r a t i o n o f M e t h y l T e t r a a c e t y l G l u c o p y r a n u r o n a t e b y A c i d C a t a l y z e d A c e t y l a t i o n 20 P r e p a r a t i o n o f M e t h y l T e t r a - O - a c e t y l - c c - D - g l u c u r o n a t e b y B a s e C a t a l y z e d A c e t y l a t i o n a n d I s o m e r i z a t i o n . . 23 P r e p a r a t i o n o f M e t h y l ( t r i - O - a c e t y l - c i - D - g l u c o p y r a n -o s y l B r o m i d e ) - u r o n a t e 25 14 P r e p a r a t i o n o f C - l a b e l l e d S u g a r D e r i v a t i v e s . . . 28 C o n v e r s i o n o f G l u c u r o n i c A c i d t o G l u c u r o n o l a c t o n e . 29 A t t e m p t e d S y n t h e s i s o f E s t r i o l - 1 7 p - g l u c o s i d u r o n a t e 29 A t t e m p t e d S y n t h e s i s o f E s t r a d i o l G l u c o s i d u r o n a t e s . 35 A t t e m p t e d S y n t h e s i s o f E s t r o n e G l u c o s i d u r o n a t e . . 37 D i s c u s s i o n 45 Summary 54 B i b l i o g r a p h y 55 1 INTRODUCTION R e l a t i v e l y l i t t l e i s k n o w n o f t h e m e t a b o l i s m a n d f u n c t i o n o f e s t r o g e n c o n j u g a t e s i n t h e b o d y . The o b j e c t i v e s o f t h i s t h e s i s w e r e t o e s t a b l i s h c o n d i t i o n s f o r t h e e f f i c i e n t s y n t h e s i s o f e s t r o g e n s c o n j u g a t e d w i t h g l u c u r o n i c a c i d a n d t o u s e t h e s e m e t h o d s f o r t h e p r e p a r a t i o n o f s u c h compounds d o u b l y l a b e l l e d . C o n c u r r e n t w i t h t h e d i s c o v e r y o f e s t r o n e a n d e s t r i o l i n 1 9 2 9 - 1 9 3 0 , i t was r e p o r t e d ( l ) t h a t e s t r o g e n s w e r e e x c r e t e d i n a w a t e r s o l u b l e f o r m . I n 1 9 3 6 , C o h e n a n d M a r r i a n ( 2 ) i s o -l a t e d s u c h a w a t e r s o l u b l e e s t r o g e n f r o m human p r e g n a n c y u r i n e . T h e i r c h e m i c a l s t u d i e s i n d i c a t e d i t was e s t r i o l c o n j u g a t e d t o one g l u c u r o n i c a c i d r e s i d u e p e r m o l e c u l e ( 3 , 4 ) . W h i l e t h e y s h o w e d t h e p h e n o l i c h y d r o x y l was f r e e , i t r e m a i n e d f o r more r e c e n t i n v e s t i g a t i o n s t o d e t e r m i n e t h e p o i n t s o f a t t a c h m e n t . E x a m i n a t i o n o f t h i s p r o b l e m b y C a r p e n t e r a n d K e l l i e ( 5 ) l e d t o t h e i r d i s c o v e r y t h a t e s t r i o l o c c u r e d i n human p r e g -n a n c y u r i n e c o n j u g a t e d a t t h e 1 6 a - a n d 1 7 8 - p o s i t i o n s i n r i n g D . B y s y n t h e s i s o f t h e two i s o m e r i c s t r u c t u r e s and' c o m p a r i s o n o f t h e s e w i t h d e r i v a t i v e s o f i s o l a t e d u r i n a r y c o m p o u n d s , t h e y f o u n d t h a t b o t h w e r e p r e s e n t , b u t t h a t e s t r i o l - 1 6 a - g l u c o s i d -u r o n a t e o c c u r e d i n t h r e e t i m e s t h e q u a n t i t y o f e s t r i o l - 1 7 8 -g l u c o s i d u r o n a t e . T h i s u n e q u a l d i s t r i b u t i o n was a t t r i b u t e d ( 5 ) t o s t e r i c h i n d r a n c e o f t h e 1 7 8 - h y d r o x y l g r o u p b y t h e a n g u l a r C - 1 3 m e t h y l g r o u p d u r i n g g l u c o s i d u r o n a t e f o r m a t i o n . Neeman a n d H a s h i m o t o ( 6 ) a t t h e same t i m e i s o l a t e d 2 e s t r i o l - l 6 a - g l u c o s i d u r o n a t e from human p regnancy u r i n e , and c o n f i r m e d t h i s s t r u c t u r e by a c i d h y d r o l y s i s o f d e r i v a t i v e s o f t h e con juga t e and by n u c l e a r magne t i c resonance s p e c t r o s c o p y . F e l g e r and Katzman (7) i s o l a t e d an e s t r i o l d i g l u c o -s i d u r o n a t e from the same source as w e l l as a mono-conjugate b u t the p o s i t i o n s c o n j u g a t e d were n o t d e t e r m i n e d . W h i l e q u a n t i t a t i v e l y e s t r i o l g l u c o s i d u r o n a t e s a re t h e most i m p o r t a n t con juga t e s e x c r e t e d i n p regnancy u r i n e , o t h e r c o n j u g a t e d e s t r o g e n s do o c c u r . W i t h the advent o f g e l f i l t r a t i o n and chromatography on Sephadex , B e l i n g (8) was a b l e t o i s o l a t e , p u r i f y and c o n c e n t r a t e u r i n a r y c o n j u g a t e d e s t r o -gens . . I n a d d i t i o n t o t h a t i s o l a t e d by Cohen and M a r r i a n , he i d e n t i f i e d e s t r o n e and e s t r i o l - 3 - g l u c o s i d u r o n a t e , e s t r a d i o l ! - 3 , 1 7 - d i g l u c o s i d u r o n a t e and e s t r i o l - and e s t r o n e - 3 - s u l f a t e , t h e l a s t two o n l y t e n t a t i v e l y . E x t e n s i v e work by D i c z f a l u s y w i t h human f e t u s e s has shown t h a t most o f t h e i r organs a re c a p a b l e o f c o n j u g a t i n g e s -t r o g e n s . T h i s can o c c u r a t any o f the h y d r o x y l a t e d p o s i t i o n s o f t he e s t r o g e n m o l e c u l e , and w h i l e m o n o g l u c o s i d u r o n a t e s and m o n o s u l f a t e s a re formed p r e d o m i n a n t l y , d i g l u c o s i d u r o n a t e s and m i x e d s u l f a t e s and g l u c o s i d u r o n a t e s have been r e p o r t e d ( 9 ) . C o n j u g a t i o n i s a common r e a c t i o n o c c u r i n g i n the body and n e a r l y t h i r t y y e a r s o f r e s e a r c h have i n d i c a t e d t h a t the m a j o r i t y o f s t e r o i d s a re a f f e c t e d : and rogens , e s t r o g e n s , p r o g e s t i n s , a d r e n o . l c o r t i c o i d s , and t h e i r m e t a b o l i t e s . The b i o c h e m i c a l p r o c e s s o f c o n j u g a t i o n i n v o l v e s the 3 c o m b i n a t i o n o f a s u i t a b l e a c c e p t o r w i t h a c i d s s u c h as g l u c u r -o n i c a c i d , s u l f u r i c a c i d , a c e t i c a c i d , m e r c a p t u r i c a c i d a n d a m i n o a c i d s . T h i s r e s u l t s i n t h e p r o d u c t i o n o f compounds more w a t e r s o l u b l e t h a n t h e p a r e n t . E x a m i n a t i o n o f t h e g l u c u r o n i c a c i d c o n j u g a t e s r e v e a l s t h e r e a r e two k i n d s : one i n w h i c h t h e C - l o f g l u c u r o n i c a c i d i s j o i n e d t o t h e h y d r o x y l g r o u p o f a n a g l y c o n e b y a s t a b l e g l y c o s i d i c b o n d , t o f o r m a g l u c o s i d u r o n -a t e ; a n d t h e o t h e r w h i c h p o s s e s s e s a n e s t e r t y p e b o n d w h e r e t h e C - l i s l i n k e d w i t h t h e c a r b o x y l g r o u p o f t h e a g l y c o n e . t h r o u g h a much l e s s s t a b l e a c y l a l b o n d t o f o r m a g l u c u r o n i d e . The a g l y c o n e may be a l i p h a t i c , a l - i c y c l i c , a r o m a t i c o r h e t e r o -c y c l i c . •' RO H R - C - 0 / H C-I H - C - O H H - C „ - O H I 2 H O - C „ - H 0 H O - C H 0 I 3 H - C . - O H H - C H - C O H r 5 H-0 — C 6 O O H COOH G L U C O S I D U R O N A T E - GLUCURONIDE I n t h e b i o c h e m i c a l p r o c e s s o f c o n j u g a t i o n w i t h g l u -c u r o n i c a c i d , u r i d i n e d i p h o s p h a t e g l u c u r o n i c a c i d (UDPGA) w h i c h was i s o l a t e d f r o m t h e l i v e r , was shown t o be t h e g l u c u r o n y l d o n o r ( 1 0 ) . I t was l a t e r d e m o n s t r a t e d b y S t r o m i n g e r ( l l ) t h a t u r i d i n e d i p h o s p h a t e g l u c o s e (UDPG) was o x i d i z e d t o UDPGA i n t h e s o l u b l e f r a c t i o n o f t h e c e l l i n t h e p r e s e n c e o f a n NAD l i n k e d d e h y d r o g e n a s e . The t r a n s f e r o c c u r s i n t h e m i c r o s o m a l f r a c t i o n o f t h e c e l l u n d e r t h e i n f l u e n c e o f u r i d i n e d i p h o s p h a t e 4 ( U D P ) g l u c u r o n y l t r a n s f e r a s e ( 1 1 , 1 2 ) . T h i s c o n j u g a t i o n o c c u r s i n t h e l i v e r ( 1 3 ) , k i d n e y ( 1 3 ) , i n t e s t i n a l m u c o s a ( 1 4 ) , a d r e n -• > . i • a l s ( 1 5 ) , a n d human f e t a l o r g a n s ( 1 6 , 1 7 , 1 8 , 1 9 ) . The f o l l o w i n g s e q u e n c e o f r e a c t i o n s dbs.> i n v o l v e d . UDPG p y r o p h o s p h o r y l a s e g l u c o s e - l - P 0 4 + U T P , ^ UDPG + P P UDPG d e h y d r o g e n a s e UDPG + 2NAD - — ^ UDPGA + 2NADH + 2 H + — - ' i i ' UDP g l u c u r o n y l t r a n s f e r a s e UDPGA- + a g l y e o n e _ • 1 1 1 1 ' g l u c o s i d u r o n a t e + UDP S u l f a t e c o n j u g a t i o n a l s o o c c u r s i n t h e b o d y a n d t h e m e c h a n i s m i s how w e l l e s t a b l i s h e d ( l ) . A T P s u l f u r y l a s e , i n o r g a n i c s u l f a t e + A T P •—- a d e n o s i n e - 5 - p h o s p h o -Mg"*"** ( s u l f a t e + P P A P S A P S p h o s p h o k i n a s e , , A P S + A T P — ^ ADP + 3 - p h o s p h o a d e n o s i n e - 5 - p h o s -Mg , , ( p h o s u l f a t e 3 - p A d - 5 p s u l f a t e , , s u l f © k i n a s e ft , , ROH + 3 - p A d - 5 p s u l f a t e - R - 0 - S r O ~ + 3 - p A d - 5 - P 0 4 S u l f u r y l a t i o n o f t h e e s t r o g e n s o c c u r s v i a t h i s p a t h w a y i n m i -c r o s o m e - f r e e s u p e r n a t e s ( 2 1 ) . The d e s c r i p t i o n o f t h e f o l l o w i n g c h e m i c a l s y n t h e s e s h a s b e e n c o n d e n s e d p r i m a r i l y f r o m t h e f o l l o w i n g c o m p r e h e n s i v e r e v i e w s ( 2 2 , 2 7 , 2 8 ) . The f o r m a t i o n o f c o n j u g a t e s , c h e m i c a l l y , i s a c h i e y e d b y t h e c o n d e n s a t i o n o f a l c o h o l s a n d p h e n o l s w i t h s u g a r s a n d s u g a r d e r i v a t i v e s . T h e r e a r e t h r e e g e n e r a l m e t h o d s f o r t h e s e s y n t h e s e s . The f i r s t , w h i c h h a s b e e n v e r y u s e f u l i n 5 t h e p r e p a r a t i o n o f s t e r o i d g l u c o s i d u r o n a t e s , i s t h e K o e n i g s -K n o r r r e a c t i o n . T h i s i n v o l v e s t h e u s e o f O - a c y l g l y c o s y l h a l -i d e s w h i c h c o m b i n e w i t h a l c o h o l s a n d p h e n o l s i n t h e p r e s e n c e o f a h e a v y ' m e t a l o r o r g a n i c b a s e . I t i s c u s t o m a r y t o a d d a n " a c i d a c c e p t o r " t o s p e e d t h e r e a c t i o n a n d t o p r e v e n t d e a c e t y -l a t i o n o f t h e p r o d u c t . S i l v e r o x i d e a n d s i l v e r c a r b o n a t e a r e t h e m o s t common a c c e p t o r s . 6 \ cT H - C - B r I H C - O A c H - C - o A c 2 ROH + A g 2 C 0 3 . + 2 A c 0 _ c _ H 0 * 2 A g B r + H 2 | C r ° 3 * 2K:Ac01-:CH H - C - o A c H - C H , 0 + C O , H - ? ' 0 A c ^ ^ H - C 1 C 0 0 C H 3 i o O C H 3 W a l d e n i n v e r s i o n a t C - l i s a l m o s t i n v a r i a b l e i n r e a c t i o n s c a r -r i e d o u t i n t h e p r e s e n c e o f s i l v e r i o n . The K o e n i g s - K n o r r r e a c t i o n i s a l s o p e r f o r m e d w i t h p h e n o l s a ) i n t h e p r e s e n c e o f a l k a l i i n a q u e o u s a c e t o n e w i t h W a l d e n i n v e r s i o n o c c u r i n g b ) i n t h e p r e s e n c e o f o r g a n i c b a s e t o y i e l d b o t h a n o m e r s a n d c ) w i t h m e r c u r i c s a l t s w i t h e i t h e r anomer p r o d u c e d , d e p e n d i n g on e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s . S p e -c i f i c c o n j u g a t e d i s o m e r s c a n o n l y be o b t a i n e d b y t h e u s e o f t h e K o e n i g s - K n o r r r e a c t i o n a n d t h e a p p r o p r i a t e c o n d i t i o n s . C o n d e n s a t i o n o f a g l y c o n e s w i t h c o m p l e t e l y a c e t y l a t e d , n o n h a l o g e n a t e d s u g a r s i s c o n f i n e d t o p h e n o l i c g l y c o s i d e s y n -t h e s i s . I n t h e p r e s e n c e o f a c a t a l y s t s u c h as a n h y d r o u s z i n c c h l o r i d e , t h e f o r m a t i o n o f t h e a - a n o m e r i s f a v o u r e d w h i l e g o o d y i e l d s o f 6 - g l y c o s i d e s a r e o b t a i n e d w i t h p - t o l u e n e s u l f o n i c C o n j u g a t i o n o f a l c o h o l s w i t h f r e e s u g a r s i n t h e p r e -s e n c e , o f a h y d r o g e n i o n , k n o w n a s t h e F i s c h e r r e a c t i o n , g i v e s a m i x t u r e o f a n o m e r s . G l y c o s i d e s a r e a l s o s y n t h e s i z e d b y t r a n s f o r m i n g one p r e f o r m e d g l y c o s i d e i n t o a n o t h e r b y a ) a n o m e r i z a t i o n o r c o n -v e r s i o n o f one anomer i n t o a n o t h e r w i t h t h e a p p r o p r i a t e c a t a -l y s t b ) s u b s t i t u t i o n o f one a g l y c o n e f o r a n o t h e r a n d c ) a l -t e r a t i o n o f t h e s u g a r ( e . g . o x i d a t i o n t o g l y c o s i d u r o n i c a c i d s ) . The p r e p a r a t i o n o f t h e common s u g a r d e r i v a t i v e s em-p l o y e d i n t h e K o e n i g s - K n o r r c o n j u g a t i o n r e a c t i o n i s g e n e r a l l y d o n e i n t h r e e s t e p s — a c e t y l a t i o n , a n o m e r i z a t i o n a n d h a l o g e n a -t i o n . F o r m a t i o n o f p o l y - O - a c e t y l a t e d s u g a r s i n v o l v e s , i n a l l c a s e s , a c e t i c a n h y d r i d e a n d a c a t a l y s t , t h e c h o i c e o f w h i c h d e t e r m i n e s t h e anomer o b t a i n e d . Z i n c c h l o r i d e , p e r c h l o r i c a c i d a n d s u l f u r i c a c i d m a i n l y y i e l d a - a n o m e r s , w h i l e s o d i u m a c e t a t e y i e l d s P - a c e t y l d e r i v a t i v e s a n d p y r i d i n e a m i x t u r e o f b o t h . T h e s e r e a c t i o n s g e n e r a l l y r e s u l t i n c r y s t a l l i n e c o m p o u n d s . To make a compound s u c h as t e t r a - O - a c e t y l m e t h y l g l u c o s i d u r o -n a t e , t h e one u s e d i n t h i s p r o j e c t , m e t h y l a t i o n o f t h e c a r b o x y l g r o u p a t C - 6 i s p e r f o r m e d f i r s t a n d t h e n one o f t h e p r e c e d i n g a c e t y l a t i o n r e a c t i o n s a p p l i e d . M e t h y l g l u c u r o n a t e c a n be p r e p a r e d i n a v a r i e t y o f w a y s . G o e b e l a n d B a b e r s r e a c t e d s i l v e r g l u c u r o n a t e w i t h m e t h y l i o d i d e ( 2 3 ) o r r e f l u x e d g l u c u r o n o l a c t o n e w i t h m e t h a n o l ( 2 4 ) t o 7 o b t a i n t h e m e t h y l e s t e r . The a c i d c a t a l y z e d r e a c t i o n o f g l u -c u r o n i c a c i d o r g l u c u r o n o l a c t o n e w i t h m e t h a n o l l e d t o g l y c o s i -d a t i o n a n d l a c t o n i z a t i o n , as w e l l as f o r m a t i o n o f m e t h y l g l u -c u r o n a t e . The b e s t p r e p a r a t i v e m e t h o d was f o u n d t o be e s t e r -i f i c a t i o n w i t h m e t h a n o l i n t h e p r e s e n c e o f b a s e c a t a l y s t s (25, 26). To c o n v e r t a m i x t u r e o f a -and 8 -anomers t o a s p e c i -f i c s p e c i e s i n o r d e r t o a l l o w b e t t e r y i e l d s on r e c r y s t a l l i z a -t i o n , a n a n o m e r i z a t i o n i s p e r f o r m e d (27). F o r a c y l s u g a r s , a m i x t u r e o f a c e t i c a n h y d r i d e , a c e t i c a c i d a n d s u l f u r i c a c i d i s g e n e r a l l y u s e d . The p o l y - O - a c y l d e r i v a t i v e s o f g l y c o s y l h a l i d e s a r e among t h e m o s t u s e f u l i n t e r m e d i a t e s i n s y n t h e t i c c a r b o h y d r a t e c h e m i s t r y . W i t h h a l i d e s , t h e a - anomer i s u s u a l l y more s t a b l e t h a n t h e B-, a n d p r e p a r a t i v e m e t h o d s g e n e r a l l y y i e l d t h e more s t a b l e f o r m , i r r e s p e c t i v e o f t h e a n o m e r i c c o n f i g u r a t i o n o f t h e s t a r t i n g m a t e r i a l . The b r o m i d e i s more r e a c t i v e t h a n t h e c h l o -r i d e b u t l e s s r e a c t i v e t h a n t h e i o d i d e . S i n c e t h e i o d i d e i s l e s s s t a b l e t h a n t h e b r o m i d e , t h e l a t t e r i s ( m o r e c o m m o n l y u s e d . The n u m e r o u s ways o f p r e p a r i n g a g l y c o s y l h a l i d e i n -c l u d e t h e r e p l a c e m e n t o f t h e C - l a c e t o x y l g r o u p , r e p l a c e m e n t o f a h y d r o x y l g r o u p a t t h e r e d u c i n g c a r b o n a t o m a n d e x c h a n g e w i t h a d i f f e r e n t h a l o g e n a t C - l (28). The f i r s t m e t h o d i s t h e m o s t u s e f u l . R e p l a c e m e n t o f t h e C - l a c e t o x y l g r o u p i s a c h i e v e d b y t r e a t m e n t w i t h l i q u i d o r g a s e o u s h y d r o g e n h a l i d e s , p h o s p h o r o u s h a l i d e s , t i t a n i u m t e t r a c h l o r i d e , o r h y d r o g e n h a l -8 i d e i n g l a c i a l a c e t i c a c i d . The l a s t i s m o s t w i d e l y u s e d f o r g l y c o s y l b r o m i d e p r e p a r a t i o n . P r o l o n g e d t r e a t m e n t b y a n y me-t h o d w i l l r e s u l t i n r e p l a c e m e n t o f a s e c o n d a c e t o x y l g r o u p . C l o s e r e x a m i n a t i o n o f t h e c o n j u g a t i o n r e a c t i o n i n -v o l v i n g g l y c o s y l h a l i d e s r e v e a l s t h a t a n a c i d a c c e p t o r , e . g . s i l v e r c a r b o n a t e , a s s u m e s t h e r o l e o f c a t a l y s t b y f a c i l i t a t i n g d i s s o c i a t i o n o f t h e C - l h a l i d e b o n d a n d c r e a t i n g a " p u l l " e f -f e c t . L o s s o f t h e h a l i d e i o n f r o m 1 , 2 - c i s - 0 - a c e t y l g l y c o s y l h a l i d e s i s o n t h e same s i d e as t h e n e i g h b o u r i n g a c e t y l g r o u p . T h i s a c e t y l g r o u p p r o t e c t s t h e G-hl c a t i o n (due t o s t e r i c h i n -d r a n c e ) a n d l e a v e s t h e o p p o s i t e s i d e o p e n f o r a t t a c k b y r e a c t -i n g m o l e c u l e s , so i n v e r s i o n i s c o m p l e t e . W i t h t r a n s a c e t o -h a l o g e n o s u g a r s , d e p a r t u r e o f t h e h a l o g e n i s f o l l o w e d b y a c o m p e t i t i v e n u c l e o p h i l i c a t t a c k f r o m t h e r e a r b y t h e a l c o h o l m o l e c u l e s a n d a l s o b y t h e o x y g e n o f t h e p o l a r i z a b l e c a r b o n y l o f t h e C - 2 a c e t o x y g r o u p , r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f a c i s g l y c o s i d e o r a n a c i d - l a b i l e o r t h o a c e t a t e , r e s p e c t i v e l y . D e a c e t y l a t i o n i s r e q u i r e d t o o b t a i n a c o n j u g a t e p r e -s u m a b l y i d e n t i c a l w i t h t h e n a t u r a l l y o c c u r i n g o n e . A c e t y l g r o u p s may be r e m o v e d u n d e r m i l d l y a l k a l i n e c o n d i t i o n s , t o w h i c h t h e g l y c o s i d i c b o n d i s s t a b l e , u n l e s s t h e b o n d i s o f t h e e s t e r t y p e . I t was d i s c o v e r e d t h a t i n a n h y d r o u s m e d i a l l e s s t h a n t h e t h e o r e t i c a l amount o f a l k a l i was r e q u i r e d a n d now t h i s r e a c t i o n i s a c h i e v e d w i t h c a t a l y t i c q u a n t i t i e s o f b a s e t o g i v e a g a i n i n e f f i c i e n c y a n d c o n v e n i e n c e . E f f e c t i v e d e a c e t y l a t i n g r e a g e n t s i n c l u d e s o d i u m , p o t a s s i u m a n d b a r i u m h y d r o x i d e as 9 w e l l a s m i l d e r a g e n t s s u c h as s o d i u m , p o t a s s i u m o r b a r i u m m e -t h o x i d e . The c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d e s t r o g e n c o n j u g a t e s h a v e a n i m p o r t a n t a p p l i c a t i o n t o m e t a b o l i c e x p e r i m e n t s as w e l l a s s e r v i n g as s t a n d a r d s f o r i d e n t i f i c a t i o n o f c o n j u g a t e s o b t a i n e d f r o m o t h e r s o u r c e s . A s t h e m e t h o d s i n v o l v e d i n t h e d e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f e s t r o g e n c o n j u g a t e s i n u r i n e a r e s i m i l a r t o t h o s e u s e d i n i n v e s t i g a t i o n s o f o t h e r b i o l o g i c a l f l u i d s o r t i s s u e s , t h e y w i l l be c o n s i d e r e d h e r e . M o s t o f t h e s e m e t h o d s a r e a p p l i c a b l e t o s t e r o i d c o n j u g a t e s i n g e n e r a l . B e c a u s e t h e d i s c o v e r y t h a t e s t r o g e n s o c c u r i n u r i n e m a i n l y as c o n j u g a t e s ( 2 ) was f o l l o w e d b y a t t e m p t s t o e x p l a i n t h i s f a c t , e m p h a s i s was p l a c e d on d i r e c t l y e s t i m a t i n g t h e c o n j u g a t e s . L i t t l e p r o -g r e s s was made u n t i l r e c e n t l y when g r e a t e r a v a i l a b i l i t y o f t h e p u r e s t a n d a r d c o n j u g a t e s l e d t o more s e n s i t i v e m e t h o d s . The p h y s i c a l c o n s t a n t s w h i c h a c c u m u l a t e d c a n a l s o be u s e d t o i d e n -t i f y c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d c o n j u g a t e s . T h e r e a r e no g o o d g e n e r a l m e t h o d s f o r t h e e s t i m a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f s t e r o i d c o n j u g a t e s . T h o s e m e t h o d s w h i c h h a v e b e e n u s e d g e n e r a l l y i n v o l v e s e v e r a l s t e p s . Among t h e s e a r e s o l v e n t p a r t i t i o n , a c i d a n d e n z y m a t i c h y d r o l y s i s , c h r o m a t o -g r a p h i c t e c h n i q u e s a n d c o l o r i m e t r i c t e s t s . I t s h o u l d be em-p h a s i z e d t h a t " n o n e o f t h e s e a r e c o m p l e t e l y g e n e r a l a n d t h e me-t h o d s w h i c h may be s u c c e s s f u l l y a p p l i e d v a r y w i t h t h e c o n j u -g a t e s s t u d i e d . S o l v e n t p a r t i t i o n h a s b e e n u s e d t o s e p a r a t e f r e e e s -10 t r o g e n s f r o m t h e i r c o n j u g a t e s . S e v e r a l p r o c e d u r e s may t h e n b e a p p l i e d t o i d e n t i f y t h e c o n j u g a t e d f r a c t i o n . A common one i s d i f f e r e n t i a l h y d r o l y s i s , e i t h e r c h e m i c a l o r e n z y m a t i c . T h i s n o t o n l y c a n s e p a r a t e t h e s u l f a t e s a n d g l u c o s i d u r o n a t e s b u t r e l e a s e s f r e e s t e r o i d s w h i c h c a n be e s t i m a t e d . C h e m i c a l l y , s u l f a t e s a r e h y d r o l y z e d b y m i l d e r c o n d i t i o n s t h a n g l u c o s i d -u r o n a t e s . E x t r a c t i o n o f a n a q u e o u s s o l u t i o n w i t h s o l v e n t s s u c h as c h l o r o f o r m , e t h e r o r e t h y l a c e t a t e e f f e c t s a q u a n t i -t a t i v e s o l v o l y s i s o f s u l f a t e s . G l u c o s i d u r o n a t e s r e q u i r e more d r a s t i c t r e a t m e n t , t h a t i s , h e a t i n g w i t h a c i d . H o w e v e r , a c i d h y d r o l y s i s may be a c c o m p a n i e d b y d e s t r u c t i o n o f u p t o 1 5 - 2 0 $ o f t h e e s t r o g e n s ( 2 0 ) . A m e t h o d h a v i n g t h e a d v a n t a g e o f no s i g n i f i c a n t l o s s o f e s t r o g e n s i s t h e u s e o f e n z y m e s . T h i s i s p a r t i c u l a r l y u s e -f u l f o r many o f t h e n e w e r e s t r o g e n s w h i c h a r e u n s t a b l e t o a c i d h y d r o l y s i s . Enzyme h y d r o l y s i s d i f f e r e n t i a t e s g l u c o s i d u r o n a t e s f r o m s u l f a t e s t h r o u g h t h e a c t i o n o f s p e c i f i c enzymes s u c h as B - g l u c u r o n i d a s e a n d p h e n o l s u l f a t a s e r e s p e c t i v e l y . The h y d r o l y t i c a c t i o n o f ^ - g l u c u r o n i d a s e was f i r s t n o t i c e d b y M a r r i a n i n 1933 ( 2 9 ) when he o b s e r v e d t h a t b a c t e r i a l g r o w t h a n d c l e a v a g e o f e s t r o g e n c o n j u g a t e s o c c u r e d i n two d a y o l d u r i n e s a m p l e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e enzyme f o l l o w e d t h e i s o l a t i o n o f e s t r i o l - 1 6 ( 1 7 ) - g l u c o s i d u r o -n a t e f r o m p r e g n a n c y u r i n e . P r e p a r a t i o n s o f ^ - g l u c u r o n i d a s e a r e now o b t a i n e d f r o m b e e f l i v e r , b a c t e r i a l e x t r a c t s a n d m a r i n e m o l l u s c s . 11 I t was 1 9 4 9 b e f o r e C o h e n a n d B a t e s ( 3 0 ) f o u n d t h a t t h e p h e n o l s u l f a t a s e , M y l a s e P, w o u l d c l e a v e e s t r o g e n s u l f a t e s . T h i s enzyme a c t i v i t y was a l s o f o u n d i n m a r i n e m o l l u s c s . I n d i c a t i o n s h a v e b e e n o b t a i n e d t h a t c o m p l e t e e n z y m a -t i c h y d r o l y s i s d o e s n o t o c c u r ( 3 1 , 3 2 ) a n d w h i l e i t . i s k n o w n t h a t i n h i b i t o r s o f b o t h o f t h e s e e n z y m e s e x i s t i n u r i n e a s i m -i l a r i n c o m p l e t e n e s s h a s b e e n o b t a i n e d w i t h a c i d h y d r o l y s i s . I n t h e s e c a s e s t h e r e m a i n i n g w a t e r s o l u b l e m a t e r i a l m i g h t be d i f f e r e n t e s t r o g e n c o n j u g a t e s , h i g h l y o x y g e n a t e d s t e r o i d s o r n o n - s t e r o i d a l m e t a b o l i t e s ( l ) . D e s p i t e t h e d r a w b a c k o f s p e -c i f i c enzyme i n h i b i t o r s , t h i s m e t h o d o f h y d r o l y s i s h a s t h e a d v a n t a g e o f n o t d e s t r o y i n g e s t r o g e n s p r e s e n t . The i s o l a t e d c o n j u g a t e s , o b t a i n e d b y s o l v e n t p a r t i -t i o n , may be t e n t a t i v e l y i d e n t i f i e d b y c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a -t i o n r a t h e r t h a n d e t e r m i n a t i o n o f t h e p r o d u c t s o f h y d r o l y s i s . S c h n e i d e r a n d L e w b a r t ( 3 3 ) a n d B u s h ( 3 4 ) h a v e e s t a b l i s h e d s o l v e n t p a r t i t i o n s y s t e m s w h i c h a r e a p p l i c a b l e t o p a p e r o r c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( 3 5 , 3 6 ) . I s o l a t e d a t t e m p t s fait' p r e l i m -i n a r y p u r i f i c a t i o n o f b u l k y e x t r a c t s o f u r i n a r y c o n j u g a t e s h a v e b e e n made w i t h i o n e x c h a n g e r e s i n s a n d a d s o r p t i o n c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y . S e p a r a t i o n o f s u l f a t e s a n d g l u c o s i d u r o n a t e s h a s b e e n a c h i e v e d b y C r e p y on a l u m i n a c o l u m n s a n d b y B u s h ( 3 7 ) a n d H a h n e l ( 3 8 ) on a n i o n e x c h a n g e r e s i n s . L a t e l y K u s h i n s k y ( 3 9 , 4 0 ) h a s e m p l o y e d t h e u s e o f a l i q u i d a n i o n e x c h a n g e r a n d G e l i t e c o l u m n s t o e x t r a c t a n d f r a c t i o n a t e c o n j u g a t e d e s t r o g e n s i n u r i n e . T h i s may become a u s e f u l m e t h o d o f i d e n t i f i c a t i o n . 12 B e l i n g ( 8 ) o b t a i n e d s i m i l a r r e s u l t s b y t h e a p p l i c a t i o n o f g e l f i l t r a t i o n on S e p h a d e x . C h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n o f i n d i v i d u a l c o n j u g a t e s h a s now b e e n e s t a b l i s h e d , m a i n l y b y D i c z f a l u s y a n d a l s o b y B e l i n g . U s i n g t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y , D i c z f a l u s y ( 4 1 ) h a s e s t a b l i s h e d c o l o u r r e a c t i o n s a n d v a l u e s f o r n u m e r o u s e s t r o -g e n c o n j u g a t e s . B e l i n g h a s a l s o p r o v i d e d some p h y s i c a l c o n -s t a n t s b y a p p l y i n g g e l c h r o m a t o g r a p h y on S e p h a d e x . S t e r o i d s u l f a t e s a n d g l u c o s i d u r o n a t e s c a n be d e t e r -m i n e d b y c o l o r i m e t r i c m e t h o d s ; t h e r h o d i - z o n i c a c i d t e s t f o r s u l f a t e s ( 3 3 ) a n d t h e n a p h t h o r e s o r c i n o l t e s t f o r g l u c o s i d u r -o n a t e s ( 4 2 ) . M e t h o d s f o r d e t e r m i n a t i o n o f t h e p a r e n t s t e r o i d a r e n o t a f f e c t e d b y t h e p r e s e n c e o f c o n j u g a t i n g a c i d r a d i c a l s . M o d i f i e d K o b e r r e a c t i o n s a n d s u l f u r i c a c i d f l u o r e s c e n c e , b o t h e s t a b l i s h e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f f r e e e s t r o g e n s , h a v e b e e n a p p l i e d s u c c e s s f u l l y . V a l u a b l e i n f o r m a t i o n o n t h e b e h a v i o u r o f c o n j u g a t e s c a n a l s o be o b t a i n e d b y e l e c t r o p h o r e s i s a n d c o u n t e r c u r r e n t d i s t r i b u t i o n . H o w e v e r , t h e s e two m e t h o d s , a s w e l l a s t h e <other c h r o m a t o g r a p h i c p r o c e d u r e s m e n t i o n e d , r e -q u i r e , : , t h e u s e o f s t a n d a r d c o n j u g a t e s f o r c o m p a r i s o n . When t h e f i r s t s t e r o i d g l u c o s i d u r o n a t e was d e m o n s t r a -t e d i n 1 9 3 6 , t h e t h e o r y o f c o n j u g a t i o n was d e t o x i c a t i o n , i n t h i s c a s e a l i m i t i n g o f t h e e s t r o g e n i c e f f e c t . C o n s e q u e n t i s o l a t i o n o f c o n j u g a t e s o f s t e r o i d s w i t h no b i o l o g i c a l a c t i -v i t y s u g g e s t e d o t h e r r o l e s . Q u i c k ( 6 8 ) s u g g e s t e d t h e c o n j u g a -t i o n m e c h a n i s m f a c i l i t a t e d t h e e x c r e t i o n o f compounds b y t h e 13 k i d n e y s , a s t h e y -would be more w a t e r s o l u b l e , a n d h i s i d e a h a s b e e n g e n e r a l l y a c c e p t e d . O v e r a d e c a d e ago F i s h m a n e x a m i n e d a n u m b e r o f s t e r -o i d c o n j u g a t e s f o r b i o l o g i c a l a c t i v i t y a n d f o u n d t h a t w h i l e some d i d p o s s e s s a c t i v i t y i t was g e n e r a l l y lowC"). H o w e v e r , e s -t r o n e s u l f a t e e x h i b i t e d a c t i v i t y g r e a t e r t h a n o r e q u a l t o t h e f r e e h o r m o n e . B u t as r e s u l t s v a r i e d a n d r e m a i n e d u n c o n f i r m e d t h e i d e a o f f u n c t i o n a l ho rmone c o n j u g a t e s l a y d o r m a n t u n t i l r e c e n t l y . A number o f r e c e n t r e p o r t s e m p l o y i n g l a b e l l e d c o n -j u g a t e s i n d i c a t e t h a t t h e s e compounds c a n s e r v e as s u b s t r a t e s i n b i o s y n t h e t i c p r o c e s s e s . The f i n d i n g t h a t d e h y d r o i s o a n d r o s t e r o n e s u l f a t e i s s e c r e t e d b y a n e n d o c r i n e g l a n d s u c h as t h e human a d r e n a l ( 7 0 ) a n d t h a t i t may be c l e a v e d i n v i v o ( 4 3 ) l e d t o t h e s u g g e s t i o n t h a t s u l f a t e c o n j u g a t e s may h a v e some f u n c t i o n o t h e r t h a n t h a t o f . f a c i l i t a t i n g e x c r e t i o n . T h i s was s u p p o r t e d b y t h e d e m o n -s t r a t i o n o f C a l v i n ( 4 4 ) t h a t p r e g n e n o l o n e s u l f a t e c a n s e r v e a s a d i r e c t i n v i v o p r e c u r s o r o f d e h y d r o i s o a n d r o s t e r o n e s u l -f a t e . A r e c e n t c o m m u n i c a t i o n b y R o b e r t s _et a l . ( 6 4 ) h a s r e -p o r t e d t h e c o n v e r s i o n o f c h o l e s t e r o l s u l f a t e t o d e h y d r o i s o a n -d r o s t e r o n e s u l f a t e i n v i v o a n d h a s s u g g e s t e d t h a t s u l f a t e d i n t e r m e d i a t e s a r e i n v o l v e d i n t h e b i o s y n t h e s i s o f s t e r o i d h o r -m o n e s . A l s o , m o s t b i o s y n t h e t i c i n t e r m e d i a t e s a r e i o n i c , w i t h t h e e x c e p t i o n o f s t e r o i d s . S u l f a t e s may s e r v e a s n i o h i c . : a n d p e r h a p s more e f f i c i e n t s u b s t r a t e s t h a n t h e f r e e h o r m o n e s . The p o s s i b i l i t y a l s o e x i s t s t h a t t h e y may be a r e s e r v o i r f o r 14 u n c o n j u g a t e d i n t e r m e d i a t e s w i t h t h e s u l f u r y l a t i o n a n d c l e a v a g e b e i n g a n i m p o r t a n t s t e p i n t h e r e g u l a t i o n o f t h e r a t e o f s y n -t h e s i s o f s t e r o i d h o r m o n e s . On t h e o t h e r h a n d , one s h o u l d c o n s i d e r t h a t s u l f a t e s may be t h e a c t i v e f o r m o f s t e r o i d h o r -mones . A l t h o u g h no r e p o r t on t h e d i r e c t m e t a b o l i s m o f g l u -c o s i d u r o n a t e s h a s y e t b e e n made , t h e s e compounds a r e i n v o l v e d i n t h e a c t i v e t r a n s p o r t o f h o r m o n e s . F i s h m a n h a s s u g g e s t e d (7Z) t h a t t h e s y n t h e s i z e d c o n j u g a t e t r a v e l s t o t h e t a r g e t o r g a n w h e r e u p o n r e m o v a l o f t h e g l u c u r o n y l r a d i c a l d e p o s i t s t h e f r e e h o r m o n e i n s i t u . R a d i o a c t i v e e s t r a d i o l ( 4 5 ) a n d t e s t o s t e r o n e a n d a n d r o s t e n e d i o n e ( 4 6 ) h a v e b e e n shown t o be c o n v e r t e d t o e s t r o n e g l u c o s i d u r o n a t e a n d a n d r o s t e n e d i o l g l u c o s i d u r o n a t e r e s p e c t i v e l y i n t h e i n t e s t i n a l m u c o s a a n d t h e n t r a n s f e r r e d t o t h e s e r o s a w h e r e t h e y a c c u m u l a t e d . T h e s e i n v i t r o s t u d i e s i n -d i c a t e t h e a b i l i t y o f g l u c o s i d u r o n a t e s t o a c t i n a t r a n s p o r t f u n c t i o n . - - ---i The u n c e r t a i n t y w h i c h e x i s t s a t p r e s e n t as t o t h e b i o l o g i c a l r o l e o f t h e v a r i o u s s t e r o i d c o n j u g a t e s makes o b -v i o u s t h e d e s i r a b i l i t y o f e x p e r i m e n t i n g w i t h d o u b l y l a b e l l e d c o n j u g a t e s . U s e o f s u c h compounds m i g h t be e x p e c t e d t o g i v e c o n s i d e r a b l e i n s i g h t i n t o t h e f a t e o f c o n j u g a t e d s t e r o i d s i n  v i v o . M e a s u r e m e n t s o f r e n a l c l e a r a n c e r a t e s w o u l d be i n f o r m a -t i v e i n d e t e r m i n i n g w h e t h e r e x c r e t i o n was t h e p r i m a r y f a t e o f t h e s e c o m p o u n d s . A h i g h r a t e , o f e x c r e t i o n o f u n c h a n g e d c o n -j u g a t e w o u l d p r o b a b l y i n d i c a t e t h a t i t s i n v i v o f u n c t i o n was 15 t h a t o f a n e x c r e t o r y p r o d u c t . H y d r o l y s i s o f t h e c o n j u g a t e s w o u l d be e a s i l y r e c o g n i z e d b y t h e r e s u l t a n t c h a n g e i n l a b e l -l i n g r a t i o s . A l s o , t h e e x c r e t i o n o f d i f f e r e n t r a d i o a c t i v e compounds t h a n t h o s e a d m i n i s t e r e d m i g h t i n d i c a t e t h e e x i s t e n c e o f a s y e t u n d i s c o v e r e d m e t a b o l i c p a t h w a y s . The p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n was a s t u d y o f t h e r e a c -t i o n s l e a d i n g t o t h e c h e m i c a l s y n t h e s i s o f d o u b l y l a b e l l e d e s t r o g e n g l u c o s i d u r o n a t e s a t t h e s e m i m i c r o l e v e l . O f t h e c l a s s i c a l e s t r o g e n s , o n l y e s t r o n e was s u c c e s s f u l l y c o n j u g a t e d a n d t h a t i n t h e u n l a b e l l e d s t a t e . 16 M A T E R I A L S AND METHODS A l l s o l v e n t s u s e d w e r e r e a g e n t : g r a d e a n d d i s t i l l e d b e f o r e u s e . P r e p a r a t i o n s o f more h i g h l y p u r i f i e d s o l v e n t s a r e m e n t i o n e d b e l o w . C h l o r o f o r m - s h a k e n w i t h c o n c e n t r a t e d s u l f u r i c a c i d t o r e m o v e a l c o h o l s , w a s h e d w i t h a s o l u t i o n o f s a t u r a t e d s o d i u m b i c a r -b o n a t e a n d t h e n . w i t h w a t e r , d r i e d o v e r c a l c i u m c h l o r i d e , f i l -t e r e d a n d d i s t i l l e d . The d i s t i l l a t e was s t o r e d i n a t i g h t b o t t l e i n t h e d a r k . A b s o l u t e m e t h a n o l - r e f l u x e d w i t h m a g n e s i u m t u r n i n g s f o r two h o u r s , t h e n d i s t i l l e d . A b s o l u t e a l c o h o l - r e f l u x e d o v e r z i n c a n d p o t a s s i u m h y d r o x i d e a n d d o u b l y d i s t i l l e d . D r y e t h y l a c e t a t e - d r i e d o v e r p o t a s s i u m c a r b o n a t e f o r 24 h o u r s , t h e n f i l t e r e d a n d d i s t i l l e d . D r y b e n z e n e - d i s t i l l e d f r o m c a l c i u m h y d r i d e . P e r o x i d e - f r e e d i e t h y l e t h e r - s h a k e n w i t h a s o l u t i o n o f s l i g h t l y a c i d i c f e r r o u s ' - s u l f a t e , w a s h e d w i t h w a t e r a n d d i s -t i l l e d . A n h y d r o u s c o n d i t i o n s c a n be o b t a i n e d b y d i s t i l l i n g o v e r c a l c i u m h y d r i d e . P e t r o l e u m e t h e r - s h a k e n w i t h c o n c e n t r a t e d s u l f u r i c a c i d u n t i l l a t t e r l a y e r was c o l o u r l e s s . The e t h e r was t h e n w a s h e d t o n e u t r a l i t y w i t h a s o l u t i o n o f s o d i u m b i c a r b o n a t e a n d w a t e r a n d d i s t i l l e d . G l a c i a l a c e t i c a c i d - r e f l u x e d w i t h p o t a s s i u m p e r m a n g a n a t e f o r one h o u r a n d d i s t i l l e d . 17 A c e t i c a n h y d r i d e - r e f l u x e d o v e r f u s e d s o d i u m a c e t a t e t o r e -move a n y c o n t a m i n a t i n g a c e t i c a c i d . D i s t i l l e d . A c e t o n e - r e f l u x e d w i t h p o t a s s i u m p e r m a n g a n a t e a n d d o u b l y d i s -t i l l e d . C a r b o n t e t r a c h l o r i d e - w a s h e d w i t h w a t e r , d r i e d o v e r c a l c i u m c h l o r i d e , f i l t e r e d a n d d i s t i l l e d . P y r i d i n e - r e f l u x e d o v e r b a r i u m o x i d e u n d e r d r y c o n d i t i o n s a n d d i s t i l l e d . S t o r e d o v e r p o t a s s i u m h y d r o x i d e p e l l e t s . B r o m i n a t i o n s w e r e p e r f o r m e d w i t h 3 0 - 3 5 % h y d r o b r o m i c a c i d i n a c e t i c a c i d ( E a s t m a n K o d a k # 1 1 6 1 ) . 14 D - g l u c u r o n o l a c t o n e - 6 - C was o b t a i n e d f r o m t h e Chem. T r a c . C o r p o r a t i o n , C a m b r i d g e , M a s s . R a d i o a c t i v i t y was d e t e r m i n e d i n t h e N u c l e a r C h i c a g o w i n d o w l e s s Gas P l o w C o u n t e r o p e r a t i n g i n t h e G e i g e r r e g i o n . S a m p l e s w e r e p l a t e d i n d u p l i c a t e o r t r i p l i c a t e o n t o c o p p e r p l a n c h e t s . M e l t i n g p o i n t d e t e r m i n a t i o n s w e r e made on s a m p l e s p r e v i o u s l y d r i e d i n v a c u o o v e r p h o s p h o r o u s p e n t o x i d e a t 8 0 ° C . u n l e s s o t h e r w i s e i n d i c a t e d . The K o f l e r m e l t i n g b l o c k was u s e d e x c e p t f o r one d e t e r m i n a t i o n w h i c h was made i n a s e a l e d c a p i l -l a r y t u b e h e a t e d i n p a r a f f i n . " • . B e i l s t e i n t e s t f o r h a l o g e n s - A c o p p e r w i r e was h e a t -e d t o r e d n e s s i n t h e o x i d i z i n g f l a m e o f a b u r n e r u n t i l t h e f l a m e was no l o n g e r c o l o u r e d . The c o o l e d w i r e was t o u c h e d t o t h e s o l i d o r l i q u i d s a m p l e a n d t h e n r e h e a t e d . A v o l a t i l e c o p -p e r h a l i d e g i v e s t h e f l a m e a g r e e n c o l o u r . 18 O p t i c a l r o t a t i o n s w e r e p e r f o r m e d on a p o l a r i m e t e r ( B e l l i n g h a m a n d S t a n l e y L t d . , L o n d o n , E n g l a n d ) . I n f r a r e d s p e c t r a w e r e done on a B e c k m a n I R - 5 d o u b l e beam r e c o r d i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r e q u i p p e d w i t h a c c e s s o r i e s f o r m i c r o - p o t a s s i u m b r o m i d e p e l l e t s a n d a beam c o n d e n s o r . U l t r a v i o l e t s p e c t r a w e r e o b t a i n e d on a B e c k m a n DU S p e c t r o p h o t o m e t e r a n d t h e C a r y 11 r e c o r d i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r . M a t e r i a l s f o r a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y : S i l i c a g e l D a v i s o n 923 M e s h s i z e 1 0 0 - 2 0 0 A l u m i n u m o x i d e WOELM - n e u t r a l , a c t i v i t y G r a d e 1 T h e s e w e r e d r i e d o v e r n i g h t a t 8 0 ° i m m e d i a t e l y b e f o r e u s e . S t e p w i s e e l u t i o n was u s e d p r e d o m i n a n t l y , w i t h l i n e a r s o l v e n t g r a d i e n t s b e i n g e m p l o y e d i n some e x p e r i m e n t s . A p p l i c a t i o n o f a n o i l y s a m p l e n o t s o l u b l e i n t h e s t a r t i n g e l u a n t was a c h i e v e d b y d i s s o l v i n g t h e s a m p l e i n a n o r g a n i c s o l v e n t s u c h as a c e t o n e , a d d i n g a s m a l l amount o f s i l i c a g e l a n d a l l o w i n g t h e s o l v e n t t o e v a p o r a t e . The d r i e d s i l i c a g e l w i t h t h e a d s o r b e d s a m p l e was c a r e f u l l y a p p l i e d t o t h e t o p o f t h e c o l u m n . C o l o u r t e s t s u s e d f o r t h e d e t e c t i o n o f e s t r o g e n s a n d t h e i r c o n j u g a t e d d e r i v a t i v e s : P o l i n - C i o c a l t e u r e a g e n t - c h r o m a t o g r a p h s w e r e s p r a y e d a n d t h e n s u b j e c t e d t o a n ammonia a t m o s p h e r e . F e r r i c c h l o r i d e - F e r r i c y a n i d e R e a g e n t - a Vfo s o l u t i o n o f e a c h , m i x e d t o g e t h e r i n w a t e r , was a p p l i e d as a s p r a y . Z i m m e r m a n r a r e a c t i o n - A p o r t i o n o f t h e p a p e r c h r o m a t o g r a m was 19 d r a w n t h r o u g h a 2% s o l u t i o n o f m - d i n i t r o b e n z e n e i n k e t o n e - f r e e a b s o l u t e e t h a n o l , b l o t t e d a n d s u b s e q u e n t l y d r a w n t h r o u g h a 14% s o l u t i o n o f p o t a s s i u m h y d r o x i d e i n 95% e t h a n o l . P r e p a r a t i o n o f P e r b e n z o i c A c i d P e r b e n z o i c a c i d was p r e p a r e d f r o m s o d i u m m e t h o x i d e a n d d i b e n z o y l p e r o x i d e ( 5 0 , 5 1 ) , a n d s t o r e d i n b e n z e n e . The amount o f p e r a c i d p r e s e n t was a n a l y z e d i o d o m e t r i c a l l y . The b e n z e n e s o l u t i o n was s t o r e d i n t h e c o l d i n t h e a b s e n c e o f l i g h t . No p e r b e n z o i c a c i d was u s e d more t h a n two w e e k s a f t e r p r e p a r a -t i o n . 20 E X P E R I M E N T A L AND R E S U L T S C o n j u g a t i o n i n v o l v e s t h e r e a c t i o n o f t h e a p p r o p r i a t e s t e r o i d m o i e t y w i t h t h e s u g a r , m e t h y l ( t r i - O - a c e t y l - a - D - g l u c o -p y r a n o s y l b r o m i d e ) - u r o n a t e . The l a t t e r compound i s t h e p r o d u c t o f t h e f o l l o w i n g s e r i e s o f r e a c t i o n s . I CHOH I H - C - O H I i C - H 0 H - C I I CHOH I H - C - O H 0 m e t h y l a t i o n i T T | > H O - C - H Q J H - C - O H a c e t y l a t i o n I CHoAc I H ^ C - O A c H - C - O H I — C = 0 H - C -I i s o m e r i z a t i o n A c O - C - H I H - C - o A c I H - C COOCH, COOCH, g l u c u r o n o l a c t o n e m e t h y l g l u c u r o n a t e m e t h y l 1 , 2 , 3 , 4 - t e t r a -0 - a c e t y l - a - ( a n d B ) - D -g l u c u r o n a t e H - C - B r H - C - o A c A c O - C - H " H - C - o A c I H - C 0 b r o m i n a t i o n C 0 0 C H 3 m e t h y l 2 , 3 , 4 - t r i - O - a c e t y l - l - b r o m o - l - d e o x y - a - D - g l u c u r o n a t e , P r e p a r a t i o n o f m e t h y l t e t r a a c e t y l g l u c o p y r a n u r o n a t e by_ A c i d  C a t a l y z e d A c e t y l a t i o n The g e n e r a l p r o c e d u r e s o f B o l l e n b a c k ( 2 6 ) a n d G o e b e l a n d B a b e r s ( 2 3 ) w e r e f o l l o w e d . G l u c u r o n o l a c t o n e ( 1 7 . 6 g , . 1 m o l e ) was a d d e d t o a s o l u t i o n o f . 0O3M d r y c o m m e r c i a l s o d i u m m e t h o x i d e i n 100 m l m e t h a n o l . The r e s u l t i n g m i x t u r e was s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 45 m i n u t e s u n t i l t h e l a c t o n e d i s s o l v e d . A f t e r a n o t h e r h a l f h o u r s t a n d i n g a t room t e m p e r a -t u r e t h e m e t h a n o l was e v a p o r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a t 4 0 C t o y i e l d t h e s y r u p , m e t h y l g l u c u r o n a t e . A s t h i s i s 21 n o t c r y s t a l l i z a b l e t h e a c e t y l a t i o n f o l l o w e d d i r e c t l y . A d d i -~f t i o n o f a c e t i c a n h y d r i d e ( 6 8 m l ) t o t h e y e l l o w s y r u p was f o l -l o w e d b y d r o p w i s e a d d i t i o n o f t h e c a t a l y z i n g s o l u t i o n ( . 3 m l o f p e r c h l o r i c a c i d i n 10 m l a c e t i c , a n h y d r i d e ) a t s u c h a r a t e t h a t t h e r e a c t i o n t e m p e r a t u r e n e v e r e x c e e d e d 4 0 ° C . The r e a c -t i o n m i x t u r e r e m a i n e d o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e . A f t e r a d d i t i o n o f . 1 m l p e r c h l o r i c a c i d , t h e s o l u t i o n was r e f r i g e r -a t e d f o r two d a y s a t w h i c h t i m e c r y s t a l s a p p e a r e d . T h e s e w e r e c o l l e c t e d b y f i l t r a t i o n a n d w a s h e d w i t h p e r o x i d e - f r e e d i e t h y l e t h e r t o g i v e a 19% y i e l d ( 7 . 1 5 g ) o f c r u d e m e t h y l t e t r a - 0 -a c e t y l - 8 - B - g l u c u r o n a t e . The m o t h e r l i q u o r was s e t a s i d e f o r c r y s t a l l i z a t i o n . The c r u d e 8 - a n o m e r , r e c r y s t a l l i z e d s e v e r a l t i m e s f r o m h o t e t h a n o l h a d a mp o f 1 7 6 . 5 ° - 1 7 8 ° ; [ a ] p 3 + 6 . 4 ° ( G 2 , G H G 1 3 ) . L i t e r a t u r e v a l u e s ( 2 6 ) : mp 1 7 6 . 5 ° - 1 7 8 ° ; + 7 . 4 ( 0 2 , C H C 1 3 ) . * A n e f f o r t t o o b t a i n t h e a - a n o m e r p r o c e e d e d b y p o u r -i n g t h e o r i g i n a l f i l t r a t e o f t h e c r y s t a l l i z e d r e a c t i o n p r o d u c t o n t o c r u s h e d i c e a n d n e u t r a l i z i n g i t w i t h a l a r g e q u a n t i t y o f s o l i d s o d i u m b i c a r b o n a t e . U n d i s s o l v e d s o d i u m b i c a r b o n a t e was r e m o v e d b y f i l t r a t i o n a n d w a s h e d w i t h c h l o r o f o r m . The f i l t r a t e was a l s o e x t r a c t e d w i t h c h l o r o f o r m a n d t h e c o m b i n e d e x t r a c t s - d r i e d o v e r a n h y d r o u s s o d i u m s u l f a t e a n d c o n c e n t r a t e d t o a s y -r u p . T h i s was s u b s e q u e n t l y d i s s o l v e d i n a m i n i m a l amoun t o f h o t , i s o p r o p y l a l c o h o l . R e f r i g e r a t i o n y i e l d e d a c r o p : •xv:.. > o f c r u d e c r y s t a l s (33%, 1 2 . 4 g ) w h i c h , a f t e r two c r y s t a l l i z a -o 22 t i o n s f r o m b e n z e n e - h e x a n e h a d a mp 1 9 0 - 1 9 2 , [ a j r . + 6 1 . 2 ( C 2 , 22 CHCl^). Literature values (23) of the a-anomer: [ a ] p 4 + 98° (C2, CHCl^), mp 111°-112°. Upon r e c r y s t a l l i z a t i o n of these cr y s t a l s from hot, absolute alcohol, a compound was obtained with a mp (177°) i d e n t i c a l to that of the 8-anomer indicating a mixture of anomers may have been .present. The overall y i e l d from this methylation and acetylation was 52% from D-glucuro-nolactone. An investigation into the identity of the high melting compound followed. Glucuronolactone i s readily acetylated to form t r i -acetylglucuronolactone (47)', the B-form of which melts at 194°-195° with an op t i c a l rotation o f +84.1" i n chlorof orm. In order to check on the completeness of methyl glucuronate f o r -mation ( f a i l u r e of which might lead to formation of t r i a c e t y l -glucuronolactone) the methylation and acetylation of glucuro-nolactone was repeated. Conditions were es s e n t i a l l y the same as previous. The a l k a l i n i t y of the i n i t i a l glucuronolactone-sodium methoxide mixture was checked with the use of univer-sal pH paper i n case any contaminating glucuronic acid was present i n the commercial preparation. Before addition of the acetylating solvents, the syrup was dissolved i n absolute a l -cohol and refrigerated so that any unreacted glucuronolactone would c r y s t a l l i z e out. Some s o l i d was removed which was iden-t i f i e d as glucuronolactone but the experiment yielded the same results as before, with a similar y i e l d . In a further attempt to i d e n t i f y the high melting compound, carbon-hydrogen analyses were performed on both this 23 a n d t h e B - a n o m e r . The r e s u l t s f r o m t h e B e r n h a r d t l a b o r a t o r y i n G e r m a n y w e r e i n c o n c l u s i v e . T A B L E 1 P e r c e n t a g e C 0 C a l c u l a t e d f o r a a n d 8 m e t h y l t e t r a - 4 7 . 8 7 4 6 . 8 1 O - a c e t y l g l u c o p y r a n u r o n a t e P o u n d a - a n o m e r 4 8 . 5 4 6 . 6 7 6 - a n o m e r 4 8 . 1 0 4 5 . 6 3 C a l c u l a t e d f o r t r i a c e t y l g l u c u r o n o l - 4 7 . 2 0 4 7 . 2 0 a c t o n e The r e s u l t s f o u n d a g r e e w i t h n o n e o f t h e c a l c u l a t e d v a l u e s w i t h i n t h e a c c e p t e d v a l u e o f . 3 . A n i d e n t i c a l s a m p l e o f t h e h i g h m e l t i n g compound was s e n t t o S w i t z e r l a n d f o r c a r -b o n - h y d r o g e n a n a l y s i s . T h e s e r e s u l t s , C - 4 7 . 6 4 % , 0 - 4 7 . 0 4 % , H -5 .32% a g r e e d w i t h t h e c a l c u l a t e d v a l u e s f o r m e t h y l t e t r a - 0 — a c e t y l g l u c u r o n a t e . The c o n c l u s i o n was d r a w n t h a t t h e d e s i r e d compound h a d b e e n s y n t h e s i z e d b u t i t was n o t k n o w n w h i c h a n o -mer p r e d o m i n a t e d . A s s e v e r a l b r o m i n a t i o n s w e r e p e r f o r m e d on t h e s e a c e -t y l a t e d compounds a n d no c r y s t a l l i n e m a t e r i a l o b t a i n e d , a c h a n g e was made f r o m t h e p r o c e d u r e p r e v i o u s l y d e s c r i b e d f o r t h e p r e p a r a t i o n o f t h e a c e t y l a t e d m e t h y l g l u c u r o n a t e d e r i v a -t i v e s . A c e t y l a t i o n a n d i s o m e r i z a t i o n b y t h e m e t h o d o f B o w e r -i n g ~ a n d T i m e l l ( 4 8 ) was u n d e r t a k e n . P r e p a r a t i o n o f M e t h y l r t e t r a - Q - a c e t y l - a - D - g l u c u r o n a t e b y B a s e  C a t a l y z e d - A c e t y l a t i o n a n d I s o m e r i z a t i o n The s y r u p , m e t h y l g l u c u r o n a t e , was p r e p a r e d i n t h e - H 5 . 3 2 4 . 8 8 5 . 5 6 5 . 6 0 24 same manne r as b e f o r e w i t h s o d i u m m e t h o x i d e a s c a t a l y s t . S o -d i u m h y d r o x i d e ( . 0 0 2 m o l e ) w o r k e d e q u a l l y w e l l . The a c e t y l a -t i o n was c a t a l y z e d b y p y r i d i n e i n s t e a d o f p e r c h l o r i c a c i d . S o l u t i o n o f m e t h y l g l u c u r o n a t e (6 gm) i n a 50% m i x t u r e o f a c e -t i c a n h y d r i d e a n d a n h y d r o u s p y r i d i n e (66 m l ) p r e v i o u s l y c o o l e d t o - 1 7 ° C r e s u l t e d i n a d a r k r e d s o l u t i o n . The r e a c t i o n m i x -t u r e was r e f r i g e r a t e d o v e r n i g h t a n d t h e n a l l o w e d t o r e m a i n a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h o c c a s i o n a l s h a k i n g f o r a n a d d i t i o n a l s e v e n t y - t w o h o u r s . T h i s s o l u t i o n was p o u r e d o n t o i c e - w a t e r a n d a l l o w e d t o r e m a i n f o r f i v e h o u r s i n o r d e r t o c o n v e r t a c e -t i c a n h y d r i d e t o a c e t i c a c i d , t h e n e x t r a c t e d w i t h c h l o r o f o r m (3 x e q u a l v o l u m e , 3 x o n e - h a l f v o l u m e ) . T h i s c h l o r o f o r m e x -t r a c t was w a s h e d o n c e w i t h w a t e r , t h r e e t i m e s w i t h I 1 0 % h y d r o -c h l o r i c a c i d , f o u r t i m e s w i t h a s a t u r a t e d s o l u t i o n o f s o d i u m b i c a r b o n a t e , a n d o n c e w i t h w a t e r . A f t e r d r y i n g t h e c h l o r o -f o r m e x t r a c t o v e r a n h y d r o u s s o d i u m s u l f a t e , i t was f i l t e r e d a n d e v a p o r a t e d t o y i e l d a d a r k s y r u p c o n t a i n i n g a m i x t u r e o f a n o m e r s o f m e t h y l t e t r a a c e t y l g l u c u r o n a t e . T h e s e a - a n d B - a n o m e r s w e r e d i s s o l v e d ^ i n a n i s o m e r i -z i n g s o l u t i o n o f a c e t i c a n h y d r i d e (46 m l ) , a c e t i c a c i d ( 2 0 m l ) a n d s u l f u r i c a c i d ( 1 . 2 m l ) . A f t e r t w e n t y - f o u r h o u r s a t room t e m p e r a t u r e t h e s o l u t i o n was p o u r e d o n t o i c e w a t e r , a n d a l a y e r o f o i l s e p a r a t e d . A f t e r 6 h o u r s t h e m i x t u r e was e x t r a c t e d t h r e e t i m e s w i t h e q u a l v o l u m e s o f c h l o r o f o r m , a n d t h e e x t r a c t w a s h e d o n c e w i t h w a t e r , f o u r t i m e s w i t h a s a t u r a t e d s o l u t i o n o f s o d i u m b i c a r b o n a t e a n d once w i t h w a t e r . A f t e r d r y i n g o v e r 25 s o d i u m s u l f a t e a n d r e m o v a l o f c h l o r o f o r m , t h e r e s i d u a l s y r u p was d i s s o l v e d i n e t h a n o l t o g i v e c r y s t a l s , mp 1 1 2 - 1 1 3 ° , t h a t o f m e t h y l 1 , 2 , 3 , 4 - t e t r a - O - a c e t y l - a - D - g l u c u r o n a t e ( 4 8 ) . The m i x t u r e o f a-and 6 - a n o m e r s o b t a i n e d f r o m t h e a c i d c a t a l y z e d a c e t y l a t i o n w e r e a l s o e f f e c t i v e l y i s o m e r i z e d i n t h e manne r d e s c r i b e d . T h e s e m e t h y l a t i o n , a c e t y l a t i o n a n d i s o m e r i z a t i o n r e -a c t i o n s w e r e s c a l e d down t o t h e s e m i m i c r o l e v e l o f q u a n t i t i e s t o be u s e d i n t h e c o n j u g a t i o n r e a c t i o n . The f o l l o w i n g p r e c a u -t i o n s w e r e o b s e r v e d a n d c h a n g e s m a d e . D r y m e t h a n o l was u s e d d u r i n g t h e p r e p a r a t i o n o f m e t h y l g l u c u r o n a t e . A l s o d u r i n g t h i s r e a c t i o n t h e pH was- c o n t r o l l e d w i t h s o d i u m m e t h o x i d e a t pH 8 as e x c e s s a l k a l i n i t y a p p e a r e d t o r e d u c e t h e o v e r a l l y i e l d . A l l s y r u p s o b t a i n e d u p o n e v a p o r a t i o n o f s o l v e n t s w e r e d e s s i c a -t e d i n v a c u o o v e r c a l c i u m c h l o r i d e b e f o r e f u r t h e r r e a c t i o n t o r e m o v e a n y t r a p p e d s o l v e n t . The o v e r a l l y i e l d o f t h e s e r e a c t i o n s f r o m g l u c u r o n o l -a c t o n e t o m e t h y l t e t r a - O - a c e t y l - a - D - g l u c u r o n a t e i n c r e a s e d w i t h t h e u s e o f s e m i m i c r o q u a n t i t i e s t o g i v e a n o p t i m a l y i e l d o f 6 0 - 6 5 % p u r e m e t h y l 1 , 2 , 3 , 4 - t e t r a - O - a c e t y l - a - D g l u c u r o n a t e . P r e p a r a t i o n o f M e t h y l ( t r i - O - a c e t y l - a - D - g l u c o p y r a n o s y l B r o m i d e ) - u r o n a t e a-and 6 - a c e t y l a t e d m e t h y l g l u c u r o n a t e s a r e e q u a l l y a b l e t o f o r m t h e d e r i v a t i v e b r o m i n a t e d a t C - l . The m e t h o d o f B o l l e n b a c k ( 2 6 ) was f i r s t a t t e m p t e d . M e t h y l t e t r a - 0 - a c e t y l - 8 - D - g l u c o p y r a n u r o n a t e ( l g ) was d i s s o l v e d 26 i n a m i n i m a l amount o f . 3 0 - 3 2 % H B r i n a c e t i c a c i d a t r o o m t e m -p e r a t u r e . O v e r n i g h t r e f r i g e r a t i o n was f o l l o w e d b y e v a p o r a -t i o n o f t h e s o l v e n t u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a t l e s s t h a n 4 0 ° C a n d s o l u t i o n o f t h e r e s i d u a l s y r u p i n 20 m l c h l o r o f o r m . The c h l o r o f o r m was w a s h e d w i t h a c o l d , s a t u r a t e d a q u e o u s s o l u t i o n o f s o d i u m b i c a r b o n a t e , f o l l o w e d b y w a t e r , a n d s u b s e q u e n t l y d r i e d o v e r s o d i u m s u l f a t e . R e m o v a l o f t h e s o l v e n t y i e l d e d a s y r u p w h i c h was d i s s o l v e d i n a b s o l u t e e t h a n o l a n d t r e a t e d w i t h N o r i t , w h i c h o n l y p a r t i a l l y r e m o v e d t h e c o l o u r . R e f r i g -e r a t i o n d i d n o t r e s u l t i n c r y s t a l f o r m a t i o n . S i l i c a g e l c h r o -m a t o g r a p h y was n o t e f f e c t i v e i n : , r e m o v i n g a n y i m p u r i t y a n d a l -l o w i n g c r y s t a l l i z a t i o n . D e c o m p o s i t i o n t o a b l a c k t a r o c c u r e d i n t w e n t y - f o u r h o u r s a t room t e m p e r a t u r e . R e p e t i t i o n s o f t h i s e x p e r i m e n t , v a r y i n g t h e r e f r i g e r a t i o n t i m e s a n d q u a n t i t i e s o f H B r i n i a c e t i c a c i d u s e d , w e r e a l s o u n s u c c e s s f u l . The b r o m i n a t i o n p r o c e d u r e o f B o w e r i n g a n d T i m e l l ( 4 8 ) was n e x t a t t e m p t e d . The B - a n o m e r was s h a k e n 2 l / 2 h o u r s a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h H B r i n a c e t i c a c i d . E v a p o r a t i o n o f t h e s o l v e n t was f o l l o w e d b y d i s s o l v i n g t h e s y r u p i n c h l o r o f o r m . A f t e r c o o l i n g t o 0 ° , t h i s s o l u t i o n was e x t r a c t e d w i t h i c e w a t e r , d r i e d o v e r s o d i u m s u l f a t e a n d t h e c h l o r o f o r m r e m o v e d . C r y s -t a l l i z a t i o n o f t h e s y r u p f r o m a b s o l u t e e t h a n o l y i e l d e d s t a r t i n g m a t e r i a l . A t t h i s s t a g e t h e t e t r a - O - a c e t y l - a - D - g l u c o p y r a n u r o -n a t e f o r m e d b y t h e b a s e - c a t a l y z e d a c e t y l a t i o n a n d i s o m e r i z a -t i o n o f m e t h y l g l u c u r o n a t e was o b t a i n e d a n d b r o m i n a t e d a c c o r d -27 i n g t o t h e m e t h o d o f B o l l e n b a c k ( 2 6 ) . The r e a c t i o n m i x t u r e was p r o c e s s e d b y t h e m e t h o d o f P e l z e r ( 4 9 ) . T h i s i n c l u d e d a d -d i t i o n o f c h l o r o f o r m t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e b e f o r e r e m o v a l o f t h e H B r a n d a c e t i c a c i d . R e m o v a l o f a c i d f r o m t h e c h l o r o f o r m e x t r a c t was a c h i e -v e d b y w a s h i n g t w i c e w i t h w a t e r , t w i c e w i t h a s o l u t i o n o f s o -d i u m b i c a r b o n a t e a n d once w i t h w a t e r . The d r i e d c h l o r o f o r m e x t r a c t was e v a p o r a t e d a t 3 0 ° C t o a t h i c k , a l m o s t c o l o r l e s s s y r u p a n d d e s s i c a t e d i n v a c u o o v e r c a l c i u m c h l o r i d e . The d r i e d s y r u p was d i s s o l v e d i n a b s o l u t e a l c o h o l a n d r e f r i g e r a t i o n r e -s u l t e d i n f o r m a t i o n o f c r y s t a l s w i t h a mp 8 2 ° - 8 3 ° , [ a j j p + 1 9 5 ° ( C . 5 , C H C 1 3 ) . L i t e r a t u r e v a l u e s ( 2 6 ) mp 1 0 4 ° - 1 0 5 ° , M^4 + 1 9 8 ° ( C . 5 , C H C 1 3 ) . A mp o f 1 0 3 . 5 ° - 1 0 4 . 5 ° was o b t a i n e d i n a s e a l e d c a p i l l a r y t u b e . T h i s componnd a l s o g a v e a p o s i t i v e B e i l s t e i n . t e s t . R e p e a t e d b r o m i n a t i o n s u n d e r i d e n t i c a l c o n d i -t i o n s g a v e t h e l o w m e l t i n g b r o m i n a t e d c o m p o u n d , a s d e t e r m i n e d on t h e K o f l e r m e l t i n g b l o c k , i n a b o u t 50% o f t h e c a s e s . The r e s t o f t h e t i m e a compound m e l t i n g a t 1 0 4 ° - 1 0 5 ° was o b t a i n e d . R e a c t i o n s c a r r i e d o u t a t t h e s e m i m i c r o l e v e l ( w i t h one g r a m o r l e s s o f m e t h y l t e t r a - O - a c e t y l - a - D g l u c u r o n a t e ) g a v e t h e b e s t y i e l d s o f t h e b r o m i n a t e d compound ( 8 0 - 8 5 % ) . O p t i m a l c o n d i t i o n s f o r t h e s t o r a g e o f t h e b r o m i n a t e d d e r i v a t i v e w e r e i n v a c u o o v e r c a l c i u m c h l o r i d e a t 0 ° C . R e p r o d u c i b l e r e s u l t s c o u l d n o t b e o b t a i n e d w i t h d i f f e r e n t l o t s o f H B r i n a c e t i c a c i d , e v e n u p o n v a r y i n g r e a c t i o n c o n d i t i o n s . 28 14 P r e p a r a t i o n o f C - l a b e l l e d S u g a r D e r i v a t i v e s 14 D - g l u c u r o n d l a c t o n e - 6 - C ( . 1 mc i n 6 mg) was d i l u -t e d w i t h r a d i o i n e r t c a r r i e r g l u c u r o n o l a c t o n e (385 mg) i n a m e t h a n o l s o l u t i o n a n d t h e r a d i o a c t i v i t y d e t e r m i n e d as 1 1 5 . 2 6 x 10 c p m . A l t h o u g h i n t h e p r e p a r a t i o n o f t h i s \ s a m p l e f o r c o u n t i n g c r y s t a l s s e p a r a t e d f r o m s o l u t i o n s e v e r a l t i m e s , r e -c o v e r y o f a s i g n i f i c a n t amount o f s o l i d m a t e r i a l a f t e r r e d u c -t i o n o f t h e s o l v e n t v o l u m e was u n s u c c e s s f u l . T h e r e f o r e t h e o i l was r e d i s s o l v e d a n d o n e - t e n t h o f t h e o r i g i n a l r a d i o a c t i v -i t y , i . e . 1 1 . 5 x 1 0 ^ cpm,was d i l u t e d w i t h more c a r r i e r g l u c u r o -n o l a c t o n e ( 3 5 1 m g ) . T h i s m i x t u r e ( 3 9 0 mg) was d i r e c t l y me-t h y l a t e d a n d a c e t y l a t e d w i t h o u t c r y s t a l l i z a t i o n i n t h e manne r p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . C r u d e s o l i d was o b t a i n e d i n 44% y i e l d b u t c r y s t a l l i z a t i o n d i d n o t y i e l d g o o d c r y s t a l s o r i n t h e e x -p e c t e d a m o u n t . D e t e r m i n a t i o n o f t h e r a d i o a c t i v i t y o f t h e c r y s t a l s a n d m o t h e r l i q u o r g a v e t h e f o l l o w i n g r e s u l t s . T o t a l A c t i v i t y S p e c i f i c A c t i v i t y 6 3 C r y s t a l s 3 . 1 6 x 10 cpm 8 . 4 5 x 10 cpm/mg 6 3 M o t h e r L i q u o r 1 . 0 5 8 x 10 cpm 7 . 3 8 x 10 cpm/mg The r a d i o c h e m i c a l y i e l d was 3 6 . 2 % . No p r o o f o f t h e f o r m a t i o n o f m e t h y l t e t r a - O - a c e t y l - a - D - g l u c u r o n a t e was o b t a i n e d as c r y s -t a l s w e r e n o t p u r e e n o u g h t o r e l y o n a mp d e t e r m i n a t i o n . U p o n r e f r i g e r a t i o n a n d d e s s i c a t i o n o f t h e o r i g i n a l 14 o i l y C - g l u c u r o n o l a c t o n e f o r s i x m o n t h s , c r y s t a l s g r a d u a l l y f o r m e d . S i m i l a r l y w i t h t h e r e a c t e d p r o d u c t , r e f r i g e r a t i o n f o r a l o n g p e r i o d o f t i m e i n e t h a n o l r e s u l t e d i n a n i n c r e a s e i n 29 c r y s t a l f o r m a t i o n when t r a n s f e r r e d f r o m one t u b e t o a n o t h e r . C o n v e r s i o n o f G l u c u r o n i c a c i d t o G l u c u r o n o l a c t o n e A t t e m p t s w e r e made t o p r e p a r e g l u c u r o n o l a c t o n e f r o m g l u c u r o n i c a c i d b y a n e f f i c i e n t m e t h o d as r a d i o a c t i v e g l u c u r -o n i c a c i d i s more e a s i l y o b t a i n e d a n d c h e a p e r t h a n t h e l a c t o n e . D e t a i l e d e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e s f o r s u c h a c o n v e r s i o n a r e m e a g r e , a l t h o u g h t h e r e a c t i o n i s o f t e n r e f e r r e d t o , a n d a s u c -c e s s f u l m e t h o d was f o u n d o n l y a f t e r t h e r a d i o a c t i v e r u n was p e r f o r m e d . H e a t , s t r o n g m i n e r a l a c i d a n d b o i l i n g w i t h a n a q u e o u s s o l u t i o n o f a c i d h a v e a l l b e e n r e p o r t e d a s s u c c e s s f u l a g e n t s when t h e s t a r t i n g m a t e r i a l i s a m i x t u r e o f g l u c u r o n i c a c i d a n d g l u c u r o n o l a c t o n e . V a r y i n g c o n d i t i o n s o f t h e s e m e t h o d s u s i n g s o d i u m g l u c u r o n a t e r e s u l t e d i n a n o i l f o r m a t i o n o r r e t u r n o f t h e s t a r t i n g - m a t e r i a l . C o n v e r s i o n o f s o d i u m g l u c u r o n a t e t o t h e f r e e a c i d a n d r e m o v a l o f t h e c o n t a m i n a t i n g s a l t was a c h i e v -e d b y p a s s i n g i t t h r o u g h a Dowex 50 c a t i o n e x c h a n g e c o l u m n i n w a t e r . E v a p o r a t i o n o f t h e w a t e r a n d ' a d d i t i o n o f a l c o h o l t o t h e " r e m a i n i n g s y r u p r e s u l t e d i n c r y s t a l f o r m a t i o n o f f r e e g l u -c u r o n i c a c i d (mp 1 6 5 ° ) ( 6 6 ) . A c i d i f i c a t i o n c q f a n a q e u o u s s o l u -t i o n o f t h i s f r e e a c i d t o pH 1 w i t h h y d r o c h l o r i c a c i d was f o l -l o w e d b y c o n c e n t r a t i o n t o a s y r u p a t 3 0 ° C ( 5 2 ) . The r e s i d u a l h y d r o c h l o r i c a c i d was r e m o v e d w i t h w a t e r w a s h i n g s . C r y s t a l -l i z a t i o n o f t h e o i l f r o m e t h a n o l y i e l d e d g l u c u r o n o l a c t o n e (mp 1 7 7 ° - 1 7 8 ° ) . A t t e m p t e d S y n t h e s i s o f E s t r i o l - 1 7 B - g l u c o s i d u r o n a t e The s y n t h e s i s o f e s t r i o l - 1 7 - g l u c o s i d u r o n a t e was a t -30 t e m p t e d b y t h e f o l l o w i n g s e q u e n c e o f r e a c t i o n s , c a r r i e d out* u n d e r c o n d i t i o n s s i m i l a r t o t h o s e o f L e e d s a n d G a l l a g h e r ( 5 3 ) b u t m o d i f i e d f o r s e m i m i c r o q u a n t i t i e s . _ 3 , 1 7 B - d i a c e t o x y - e s t r a - l , 3 , 5 ( l O ) , 1 6 - t e t r a e n e ( I ) —a> 3 , 1 7 6 -d i a c e t o x y - 1 6 a , 1 7 a - e p o x y - e s t r a - l , 3 , 5 ( l 0 ) - t r i e n e ( I I ) —s* 3 , 1 6 a - d i a c e t o x y - 1 7 - k e t o - e s t r a - l , 3 , 5 ( 1 0 ) - t r i e n e ( I I I ) . R e d u c t i o n o f t h e 1 7 - k e t o g r o u p o f I I I t o a h y d r o x y l w o u l d y i e l d a compound w h i c h c o u l d r e a c t w i t h m e t h y l 2 , 3 , 4 - t r i - O -a c e t y l - l - b r o m o - l - d e o x y - a - D r - g l u c u r o n a t e t o . f o r m a c e t y l a t e d e s -t r i o l - 1 7 8 - g l u c o s i d u r o n a t e . E p o x i d a t i o n o f 3 , 1 7 B - d i a c e t o x y - e s t r a - l , 3 , 5 ( 1 0 ) , 1 6 - t e t r a e n e (l) t o f o r m 3 , 1 7 B - d i a c e t o x y - 1 6 a , 1 7 a - e p o x y - e s t r a - l , 3,-5 ( 1 0 ) - t r i e n e ( I I ) I n i t i a l l y t h e e s t r o n e e n o l d i a c e t a t e ( I ) s u p p l i e d (mp 1 5 3 ° - 1 5 4 ° , l i t . v a l u e ( 5 3 ) 1 4 9 ° - 1 5 0 ° ) was e p o x i d i z e d w i t h f r e s h l y p r e p a r e d p e r b e n z o i c a c i d , 1 . 6 m - m d l e s (565 mg) o f t h e s t e r o i d w e r e t r e a t e d w i t h 8mM o f p e r b e n z o i c a c i d i n b e n z e n e s o l u t i o n a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r .18 hour s . ' , The r e a c t i o n mix-^ t u r e , a f t e r d i l u t i o n w i t h b e n z e n e , was w a s h e d w i t h a c o l d s o -l u t i o n o f I N s o d i u m h y d r o x i d e a n d t h e n w i t h w a t e r . A f t e r d r y i n g o v e r s o d i u m s u l f a t e , t h e b e n z e n e was r e m o v e d on t h e r o t a r y e v a p o r a t o r t o y i e l d a c o l o r l e s s o i l . T h i s c r y s t a l l i z e d w i t h d i f f i c u l t y b u t a 40% y i e l d ( 2 3 6 mg) o f c r y s t a l l i n e m a -t e r i a l was o b t a i n e d f r o m a c e t o n e - p e t r o l e u m e t h e r - m e t h a n o l w h i c h c o r r e s p o n d e d i n mp d e t e r m i n a t i o n s t o 3 , 1 7 B - d i a c e t o x y - 1 6 c c , 1 7 o c - e p o x y - e s t r a - l , 3 , 5 ( l 0 ) - t r i e n e (mp 1 5 5 ° - 1 5 6 ° - L i t . v a l u e s 31 ( 5 3 ) 1 5 0 - 1 5 2 ). T h e - s t a r t i n g m a t e r i a l a l s o m e l t e d 4 ° h i g h . S i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y o f t h e r e m a i n d e r ' o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e . r e s u l t e d i n no s i g n i f i c a n t p u r i f i c a t i o n . R e a r r a n g e m e n t o f 3 , 1 7 B - d i a c e t o x y - 1 6 a , 1 7 a - e p o x y - e s t r a - l , 3 . 5 ( 1 0 ) - t r i e n e ( I I ) t o 3 , 1 6 a - d i a c e t o x y - 1 7 - k e : t o - e s t r a ^ l , 3 , 5 ( l O ) - t r i e n e  ( I I I ) A n a t t e m p t was made t o r e a r r a n g e 3 , 1 7 P - d i a c e t o x y - 1 6 a , 1 7 a - e p o x y - e s t r a - l , 3 , 5 ( l O ) - t r i e n e t o 3 , 1 6 a - d i a c e t o x y - 1 7 - k e t o -e s t r a - l , 3 , 5 ( l O ) - t r i e n e b y c h r o m a t o g r a p h y ( 5 3 ) . The e p o x y d e -r i v a t i v e ("*84 m - m o l e s ) was d i s s o l v e d a n d a p p l i e d t o a s i l i c a g e l c o l u m n i n d r y b e n z e n e (9 m l ) a n d s t e p w i s e e l u t i o n p e r f o r m -e d w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f d r y , p e r o x i d e - f r e e d i e t h y l e t h e r . S o l i d m a t e r i a l was e l u t e d w h i c h c r y s t a l l i z e d i n t h e same manne r as t h e e p o x i d e a n d h a d a mp i d e n t i c a l w i t h t h e a p -p l i e d s a m p l e , so i t was c o n c l u d e d t h e r e a r r a n g e m e n t was u n s u c -c e s s f u l . A t t h i s p o i n t t h e s y n t h e t i c p r o c e d u r e o f C a r p e n t e r a n d K e l l i e ( 5 ) f o r f o r m i n g e s t r i o l g l u c o s i d u r o n a t e s f r o m 3 -m e t h o x y e s t r o n e was a t t e m p t e d . E s t r o n e ( . 0 1 2 m o l e ) was m e t h y -l a t e d b y t h e a d d i t i o n o f d i m e t h y l s u l f a t e ( 1 9 m l ) , o v e r f i f -t e e n m i n u t e s , t o a b o i l i n g s o l u t i o n o f t h e e s t r o n e i n m e t h a n o l ( 5 6 m l ) a n d a 10% a q u e o u s s o l u t i o n o f s o d i u m h y d r o x i d e (112 m l ) . A f t e r r e f l u x i n g 1 l / 2 h o u r s , f u r t h e r a d d i t i o n o f d i -m e t h y l s u l f a t e ( 1 9 m l ) a n d 10% a q u e o u s s o d i u m h y d r o x i d e (38 m l ) was f o l l o w e d b y one more h o u r r e f l u x i n g , a n d t h e s o l u t i o n was t h e n c o o l e d a n d d i l u t e d w i t h w a t e r . E x t r a c t i o n w i t h e t h e r 32 a n d e v a p o r a t i o n o f t h e s o l v e n t g a v e a 91% y i e l d o f 3 - m e t h o x y -e s t r o n e (mp 1 7 0 . 5 - 1 7 1 . 5 , l i t e r a t u r e v a l u e ( 5 ) 1 6 9 . 5 ° - 1 7 0 ° ) . M n o l i z a t i o n a n d a c e t y l a t i o n w i t h i s o p r o p e n y l a c e t a t e , f o l l o w e d b y s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y t o i p u r i f y t h e r e a c t i o n p r o d u c t 1 ; , y i e l d e d 69% o f 3 - m e t h o x y - 1 7 - a c e t o x y - e s t r a - l , 3 , 5 ( 1 0 ) , 1 6 - t e t r a -ene (mp 1 1 3 ° - 1 1 4 ° , l i t . v a l u e ( 5 ) 1 1 4 0 - 1 1 5 ° ) . E p o x i d a t i o n w i t h p e r b e n z o i c a c i d g a v e o n l y 16-24% y i e l d s o f 1 7 8 - a c e t o x y - 1 6 a , 1 7 a - e p o x y - 3 - m e t h o x y - e s t r o n e . T h i s was n o t i n c r e a s e d b y a t -t e m p t e d p u r i f i c a t i o n s on s e v e r a l a l u m i n a c o l u m n s . A t t h i s t i m e t h e m e t h o d o f p r e p a r a t i o n o f p e r b e n z o i c a c i d was m o d i f i e d , r e s u l t i n g i n g r e a t e r t h a n t w i c e t h e o r i g i -n a l l y o b t a i n e d y i e l d . ; T h i s was a c h i e v e d b y a d d i t i o n o f d i b e n -z o y l p e r o x i d e t o s o d i u m m e t h o x i d e a t - 3 0 ° C o r l e s s i n a d r y i c e - e t h a n o l b a t h , r a t h e r t h a n a t 0 ° C . A l s o t h e s o d i u m b e n z o y l p e r o x i d e f o r m e d was r e m o v e d f r o m t h e m e t h a n o l - c h l o r o f o r m r e a c -t i o n m i x t u r e w i t h w a t e r a t a t e m p e r a t u r e no h i g h e r t h a n 3 0 - 4 ° C . I n a l l s u b s e q u e n t e p o x i d a t i o n s o f e s t r o n e e n o l d i a c e t a t e , u s e o f p e r b e n z o i c a c i d . p r e p a r e d i n t h i s i m p r o v e d manne r r e s u l t e d i n a two f o l d i n c r e a s e i n t h e y i e l d o f e p o x i d e . I t h a d no e f -f e c t on t h e c o r r e s p o n d i n g 3 - m e t h o x y d e r i v a t i v e h o w e v e r . To c o n v e r t t h e 3 - m e t h o x y - 1 7 - a c e t o x y - l , 3 , 5 ( 1 0 ) , 1 6 -t e t r a e n e on h a n d t o t h e 3 , 1 7 r d i a c e t o x y d e r i v a t i v e , d e m e t h y l a -t i o n f o l l o w e d b y a c e t y l a t i o n was p e r f o r m e d . D e m e t h y l a t i o n ( 5 5 ) c o n s i s t e d o f s o l u t i o n o f t h e s t e r o i d ( 3 . 7 9 m - m o l e s ) i n a c e t i c a c i d ( 41 m l ) , a d d i t i o n o f a n e q u a l v o l u m e o f h y d r i o d i c a c i d a n d r e f l u x i n g f o r 5 m i n u t e s . A c o l d 5% a q u e o u s s o l u t i o n 3 3 . o f s o d i u m h y d r o g e n s u l f i t e ( 8 3 0 m l ) was a d d e d a n d t h e w h i t e s o l i d f o r m e d was e x t r a c t e d w i t h d i e t h y l e t h e r . T h i s was t h e n w a s h e d t o n e u t r a l i t y w i t h a s o l u t i o n of.sodium.: b i c a r b o n a t e a n d w i t h w a t e r . A f t e r d r y i n g , - t h e s o l i d was a c e t y l a t e d i m m e d i a t e l y b y t r e a t m e n t w i t h a c e t i c a n h y d r i d e (8 m l ) a n d p y r i d i n e (11 m l ) a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 26 h o u r s . T h i s r e a c t i o n m i x t u r e was d i l u t e d w i t h w a t e r , e x t r a c t e d w i t h e t h e r a n d w a s h e d w i t h I N h y d r o c h l o r i c a c i d a n d a s o l u t i o n o f s o d i u m b i c a r b o n a t e . The o n l y c r y s t a l s o b t a i n e d f r o m t h i s a c e t y l a t i o n w e r e a 5% y i e l d o f a n u n i d e n t i f i e d compound m e l t i n g a t 1 1 5 ° - 1 2 0 ° , a n d a n e v e n l e s s e r q u a n t i t y o f 3 - m e t h o x y e s t r o n e . The r e m a i n d e r was r e -c o v e r e d i n a n o i l f o r m w h i c h c o u l d n o t be p u r i f i e d b y s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y . The more p r a c t i c a l s y n t h e s i s o f e s t r i o l g l u c o s i d u r o -n a t e s f r o m e s t r o n e a c e t y l a t e d a t t h e C - 3 p o s i t i o n a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d a n d i l l u s t r a t e d was a g a i n c o n s i d e r e d . A s t h e y i e l d o f c r y s t a l l i z a b l e m a t e r i a l was l o w d u r -i n g a l l o f t h e r e a c t i o n s a n d p u r i f i c a t i o n s i n v o l v e d , t h e y w e r e r e p e a t e d , s u b s e q u e n t t o t h e p r e p a r a t i o n o f f r e s h e s t r o n e e n o l d i a c e t a t e f r o m e s t r o n e . T h i s l a t t e r s t e p i n v o l v e s a c e t y l a t i o n a n d e n o l i z a t i o n . T h i s was p e r f o r m e d b y d i s s o l v i n g d r y e s t r o n e ( 3 . 7 m - m o l e s , 1 gm) i n i s o p r o p e n y l a c e t a t e (35 m l ) , a d d i n g c a t -a l y t i c a m o u n t s o f s u l f u r i c a c i d ( 1 . 4 m l o f a s o l u t i o n o f 5 m l Ji s k > p r o p e n y l a c e t a t e a n d . 1 m l c o n c e n t r a t e d s u l f u r i c a c i d ) a n d i s l o w l y d i s t i l l i n g f o r e i g h t h o u r s . A f t e r r e f r i g e r a t i o n o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e , p e r o x i d e - f r e e d i e t h y l e t h e r was a d d e d a n d 34 t h e m i x t u r e w a s h e d w i t h a s a t u r a t e d s o l u t i o n o f s o d i u m b i c a r -b o n a t e a n d w a t e r a n d d r i e d o v e r s o d i u m s u l f a t e . E v a p o r a t i o n o f t h e s o l v e n t y i e l d e d a d a r k r e d r e s i d u e w h i c h was d i s s o l v e d i n h e x a n e - b e n z e n e ( l : l ) , a p p l i e d t o a s i l i c a g e l c o l u m n a n d e l u t e d w i t h t h e same s o l v e n t s y s t e m . A n e a s i l y c r y s t a l l i z e d w h i t e s o l i d was s e p a r a t e d i n t h i s way f r o m t h e c o l o r e d c o m -p o n e n t s a n d o b t a i n e d i n p u r e f o r m i n 6 6 . 5 % y i e l d . I t s mp c o r -r e s p o n d e d t o e s t r o n e e n d d i a c e t a t e ( 1 5 3 . 5 ° - 1 5 5 ° ) . E p o x i d a t i o n o f t h i s compound as p r e v i o u s l y d e s c r i b e d w i t h f r e s h l y p r e p a r e d p e r b e n z o i c a c i d - u s u a l l y g a v e a n 8 0 - 8 5 % y i e l d o f t h e p r o d u c t , 3 , 1 7 8 - d i a c e t o x y - l 6 a , 1 7 c t - e p o x y - e s t r a - l , 3 , 5 ( l O ) - t r i e n e . R e a r r a n g e m e n t o f t h e e p o x i d e on a s i l i c a g e l c o l u m n y i e l d e d a maximum r e c o v e r y o f 5 0 $ o f 3 , 1 6 a - d i a c e t o x y - 1 7 - k e t o -e s t r a - l , 3 , 5 ( l O ) - t r i e n e . E l u t i o n o f t h e p r o d u c t o c c u r e d b e -t w e e n 5-10% d i e t h y l e t h e r i n b e n z e n e . The mp v a r i e d w i t h d i f -f e r e n t e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d i n t h e same manne r f r o m 1 7 7 - 1 7 8 . 5 ° t o 1 7 3 . 5 - 1 7 5 ° . L i t e r a t u r e v a l u e s ( 5 3 ) mp 1 7 9 ° - 1 8 0 ° . B o t h t h e e p o x i d e a n d t h e r e a r r a n g e d p r o d u c t d i s p l a y e d t h e p e c u l i a r i t y o f a d e c r e a s e i n mp w i t h s u c c e s s i v e r e c r y s t a l l i z a t i o n s . R e d u c t i o n o f t h e 17 k e t o - g r o u p o f 3 , 1 6 c c - d i a c e t o x y -1 7 - k e t o - e s t r a - l , 3 , 5 ( l O ) - t r i e n e t o t h e 1 7 - h y d r o x y l was a t t e m p t e d b y a m e t h o d s i m i l a r t o t h a t o f C a r p e n t e r a n d K e l l i e ( 5 ) . A s o l u t i o n o f t h e s a m p l e ( 4 0 mg) i n d r y m e t h a n o l (6 m l ) was c o o l e d t o 2 ° a n d t r e a t e d w i t h a c o l d m e t h a n o l i c s u s p e n s i o n o f s o d i u m b o r o h y d r i d e ( . 0 2 g i n . 6 6 m l m e t h a n o l ) . A f t e r 15 m i n -35 u t e s ' a t 2 ° C t h e r e a c t i o n was s t o p p e d w i t h a f e w d r o p s o f a c e -t i c a c i d , d i l u t e d w i t h w a t e r (175 m l ) a n d n e u t r a l i z e d w i t h s o -d i u m h y d r o x i d e . E x t r a c t i o n w i t h e t h e r , w a s h i n g o f t h e e x t r a c t w i t h w a t e r a n d e v a p o r a t i o n o f t h e s o l v e n t y i e l d e d a n u n i d e n t i -f i e d s o l i d w h i c h m e l t e d b e l o w 1 0 0 ° . L i t e r a t u r e mp o f 3 , 1 6 a -d i a c e t o x y - 1 7 - h y d r o x y - e s t r a - l , 3 , 5 ( l 0 ) - t r i e n e i s 1 5 8 ° - 1 6 0 ° ( 6 7 ) . S u b s e q u e n t a t t e m p t e d r e c r y s t a l l i z a t i o n o f t h e i m p u r e p r o d u c t g a v e a n o i l . I t h a s b e e n r e p o r t e d ( 5 2 ) t h a t h y d r o l y s i s o f e n o l a c e t a t e s c a n o c c u r d u r i n g s o d i u m b o r o h y d r i d e r e d u c t i o n s . I t i s b e l i e v e d t h a t t h e 3 - a c e t o x y g r o u p was r e m o v e d i n t h i s w a y , t h e r e b y r e n d e r i n g t h e s y n t h e s i s o f e s t r i o l g l u c o s i d u r o n a t e s p e -c i f i c a l l y a t t h e C - 1 7 p o s i t i o n i m p o s s i b l e . A t t e m p t e d S y n t h e s i s o f E s t r a d i o l G l u c o s i d u r o n a t e s A s t h e s y n t h e s i s o f e s t r a d i o l - 1 7 B - g l u c o s i d u r o n a t e h a s b e e n r e p o r t e d ( 5 6 ) , a n a t t e m p t was made t o p r e p a r e t h i s compound i n s u f f i c i e n t y i e l d t o a l l o w a r a d i o a c t i v e s y n t h e s i s . The~ p r o c e d u r e o f M e y s t r e a n d M i e s c h e r ( 5 7 ) as r e p o r t e d b y W o -t i z e t E i l . ( 5 6 ) was f o l l o w e d f o r t h i s c o n j u g a t i o n . D r i e d e s -t r a d i o l ( 3 5 2 mg , 1 . 2 9 m - m o l e s ) a n d s i l v e r c a r b o n a t e ( 6 6 0 mg, 2 . 4 m - m o l e s ) w e r d a d d e d t o d r y b e n z e n e (25 m l ) a n d r e f l u x e d . A s o l u t i o n o f m e t h y l 2 , 3 , 4 - t r i - O - a c e t y l - l - b r o m o - l - d e o x y - a - D -g l u c u r o n a t e ( 7 0 2 mg , 1 . 7 7 m - m o l e s ) was d i s s o l v e d i n a m i n i m a l q u a n t i t y o f b e n z e n e (3 m l ) a n d a d d e d d r o p w i s e w h i l e t h e s o l u -t i o n was d i s t i l l e d . A f t e r r e d u c t i o n o f t h e s o l v e n t t o o n e -h a l f i t s o r i g i n a l v o l u m e , t h e r e a c t i o n f l a s k was c o o l e d a n d t h e s u p e r n a t a n t r e m o v e d f r o m t h e s i l v e r b r o m i d e s a l t s . The 36 b e n z e n e was e v a p o r a t e d a n d t h e r e s i d u a l o i l d i s s o l v e d i n e t h -a n o l . U n r e a c t e d e s t r a d i o l ( 5 0 $ o f t h e s t a r t i n g a m o u n t ) was r e c o v e r e d a n d r e m o v e d . F u r t h e r c r y s t a l l i z a t i o n was d i f f i c u l t a n d t h e o n l y s o l i d o b t a i n e d was 1$ o f w h a t a p p e a r e d t o be e s -t r a d i o l c o n j u g a t e d a t t h e 1 7 8 - p o s i t i o n (mp 1 2 1 ° - 1 2 4 ° ; l i t e r -a t u r e v a l u e s ( 5 6 ) 1 2 2 ° - 1 2 4 ° ) . A d d i t i o n a l c o n j u g a t i o n s w e r e a t t e m p t e d w i t h v a r y i n g t i m e s o f h e a t i n g a n d d i s t i l l a t i o n b u t n o c h a n g e i n t h e r e s u l t s w e r e o b t a i n e d . The r e a c t i o n was r e p e a t e d a n d i n t h i s c a s e t h e s u g a r was a d d e d d r o p w i s e t o t h e d i s t i l l i n g r e a c t i o n m i x t u r e a t at s l o w e r r a t e a n d i n o n e - t e n t h t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e p r e v i o u s e x p e r i m e n t . A n i m p u r e s o l i d p r o d u c t was i s o l a t e d w h i c h was i d e n t i f i e d a s e s t r a d i o l after t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( T . L . C . ) on s i l i c a g e l i n a s o l v e n t s y s t e m o f 4 0 $ e t h y l a c e t a t e i n . b e n -z e n e . The r e m a i n i n g o i l c o u l d n o t be i d e n t i f i e d i n t h i s m a n -n e r b e c a u s e a s many as e i g h t s p o t s c o u l d be d e t e c t e d f r o m a ^ g i v e n a p p l i c a t i o n . T h e s e w e r e t h o u g h t t o be some f o r m o f s u -g a r d e r i v a t i v e as b o t h m e t h y l 1 , 2 , 3 , 4 - t e t r a - O - a c e t y l - a - D - g l u -c u r o n a t e a n d i t s b r o m i n a t e d d e r i v a t i v e g a v e p o s i t i v e r e s u l t s w i t h t h i s s y s t e m a n d p h e n o l s p r a y s . A n y c o n j u g a t e s f o r m e d w o u l d a l s o a p p e a r as d i s t i n c t s p o t s . G r a d i e n t e l u t i o n o f t h i s o i l on a s i l i c a g e l c o l u m n f r o m 1 0 0 $ b e n z e n e t o 1 0 0 $ e t h y l a c e t a t e a n d a p p l i c a t i o n o f r a n d o m s a m p l e s on T . L . C . i n -d i c a t e d a n e f f e c t i v e s e p a r a t i o n o f some o f t h e s e s p o t s b u t n o t h i n g c o u l d be c r y s t a l l i z e d . A n o t h e r c o n j u g a t i o n r e a c t i o n was e q u a l l y u n s u c c e s s f u l i n t e r m s o f s o l i d p r o d u c t o b t a i n e d 37 w i t h t h e e x c e p t i o n o f a n i n s i g n i f i c a n t amount o f c r y s t a l s m e l t i n g a t 2 1 2 ° C . T h i s c o r r e s p o n d s t o t h e 3 , 1 7 8 - d i g l u c o s i -d u r o n a t e o f e s t r a d i o l , mp 2 1 5 ° - 2 1 6 . ' 5 ° C , w h i c h h a s b e e n r e p o r t -e d b y W o t i z e t _ a l _ . ( 5 6 ) t o h a v e z e r o y i e l d b y t h e m e t h o d o f M e y s t r e a n d M i e s c h e r . A t t e m p t e d S y n t h e s i s o f E s t r o n e G l u c o s i d u r o n a t e The c o n j u g a t i o n m e t h o d o f S h a p i r o ( 5 8 ) f o r e s t r o n e was f o l l o w e d . E s t r o n e ( 1 . 3 4 m - m o l e ) , m e t h y l - 2 , 3 , 4 - t r i - 0 - a c e -t y l - l - b r o m o - l - d e o x y - o c - D - g l u c u r o n a t e ( 2 . 4 m - m o l e s ) a n d d r y s i l -v e r c a r b o n a t e ( 2 . 6 m - m o l e s ) w e r e a d d e d t o 60 m l o f d r y b e n z e n e . C a l c i u m h y d r i d e (3 m - m o l e s ) was i n c l u d e d a s a n i n t e r n a l d e s -s i c a n t . The r e s u l t a n t m i x t u r e was s h a k e n a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 20 h o u r s w i t h i t s c o l o u r c h a n g i n g f r o m g r e e n t o d a r k r e d t o b l a c k . The s i l v e r s a l t s a n d c a l c i u m h y d r i d e w e r e r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d t h e s u p e r n a t e a n d w a s h i n g s p a s s e d t h r o u g h c o t t o n w o o l t o r e m o v e a n y f i n e p a r t i c l e s . The s o l u t i o n was t a k e n t o d r y n e s s on t h e r o t a r y e v a p o r a t o r a t 4 0 ° C a n d t h e r e -s i d u e d i s s o l v e d i n a b s o l u t e a l c o h o l . A g o o d y i e l d o f c r y s t a l s was o b t a i n e d b u t on r e c r y s t a l l i z a t i o n a m i x t u r e , t h a t i s t w o d i f f e r e n t c r y s t a l l i n e s t r u c t u r e s , o c c u r e d . The c r y s t a l s a p -p e a r i n g f i r s t were , r e m o v e d a n d i d e n t i f i e d as e s t r o n e b y mp— d e t e r m i n a t i o n s . H o w e v e r , on s u b s e q u e n t r e c r y s t a l l i z a t i o n s of t h e r e m a i n i n g s o l u t i o n a d d i t i o n a l c r o p s o f e s t r o n e w e r e a l w a y s o b t a i n e d a n d i t was s u s p e c t e d t h e c o n j u g a t e was b e i n g h y d r o l -y z e d b y h e a t t o y i e l d t h e f r e e s t e r o i d . A t t e m p t e d c r y s t a l l i -z a t i o n s a t r o o m t e m p e r a t u r e w e r e u n s u c c e s s f u l . The s o l i d o b -38 t a i n e d f r o m t h e r e m a i n i n g s o l u t i o n g a v e a . ^ ' b r o a d " m e l t ( 2 0 0 ° -2 3 5 ° ) w h i c h c o u l d n o t be i m p r o v e d . To d e t e r m i n e w h e t h e r e s t r o n e - 3 - g l u c o s i d u r o n a t e was p r e s e n t a s a m p l e o f t h e s o l i d (mp 2 0 0 ° - 2 3 5 ° ) was s p o t t e d o n a s i l i c a g e l t h i n l a y e r c h r o m a t o p l a t e , d e v e l o p e d i n 40% e t h y l a c e t a t e i n b e n z e n e a n d t h e Z immerman r e a c t i o n a p p l i e d b y means o f a s p r a y d e s c r i b e d b y L i s b o a e t a l . ( 3 8 ) . I n t h i s p r o c e d u r e t h e p o t a s s i u m h y d r o x i d e a n d m - d i n i t r o b e n z e n e a r e a p p l i e d s i m -u l t a n e o u s l y . The r e s u l t s r e p o r t e d b y t h i s g r o u p c o u l d n o t be d u p l i c a t e d . D e v e l o p m e n t o f t h e same s a m p l e on p a p e r i n a t o l -u e n e - p r o p y l e n e g l y c o l s y s t e m a n d a p p l i c a t i o n o f t h e o r d i n a r y Z i m m e r m a n n r e a c t i o n i n two s t a g e s i n d i c a t e d a compound w i t h a l o w e r t h a n e s t r o n e . T h i s r e s u l t p r o v e d i n c o n c l u s i v e as i t c o u l d n o t be r e p e a t e d . F u r t h e r a t t e m p t s t o e s t a b l i s h t h e p r e -s e n c e o f a c o n j u g a t e d p r o d u c t i n c l u d e d d e a c e t y l a t i o n a c c o r d -i n g t o D i c z f a l u s y e t a l . ( 1 7 ) . The s o l i d (15 mg) was d i s s o l v e d i n 2 m l o f f r e s h l y p r e p a r e d s o d i u m m e t h o x i d e a n d h e a t e d f o r 2 l / 4 h o u r s a t 6 0 ° C i n a w a t e r b a t h . The s o l u t i o n was c o o l e d t o r o o m t e m p e r a t u r e a n d t h e m e t h a n o l e v a p o r a t e d . S o l u t i o n o f t h e r e s i d u e i n w a t e r was f o l l o w e d b y n e u t r a l i z a t i o n t o pH 6 . 6 w i t h a c e t i c a c i d , e x t r a c t i o n w i t h e t h e r t o r emove f r e e e s t r o n e , a n d e x t r a c t i o n w i t h b e n z e n e t o r e m o v e a n y u n c h a n g e d , a c e t y l a t e d c o n j u g a t i o n p r o d u c t . 90% o f t h e s t a r t i n g m a t e r i a l r e m a i n e d i n t h e e t h e r f r a c t i o n . The w a t e r f r a c t i o n c o n t a i n e d 500 mg o f s o l i d m a t e r i a l w h i c h was p r o b a b l y s o d i u m a c e t a t e . E s t r o n e g l u c o s i d u r o n a t e c o u l d n o t be d e t e c t e d on a t h i n l a y e r c h r o m a t -39 lOgram d e v e l o p e d i n a w a t e r s a t u r a t e d n - b u t a n o l s y s t e m o r on 1 p a p e r i n a s y s t e m f o r s i m p l e g l u c u r o n i d e s d e s c r i b e d b y S c h -n e i d e r and L e w b a r t ( 5 9 ) c o n s i s t i n g o f e t h e l a c e t a t e , 6 0 : t o l u e n e , 7 5 : h e x a n e , 4 0 : t - b u t a n o l , 2 5 : a c e t i c a c i d , - 6 0 : w a t e r , 1 4 0 . B o t h w e r e s p r a y e d w i t h a n i s a l d e h y d e - s u l p h u r i c a c i d ( 6 0 ) a n d no p o s -i t i v e o l i v e g r e y s p o t s o c c u r e d i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f a n e s t r o n e c o n j u g a t e . R e p e t i t i o n o f t h e c o n j u g a t i o n r e a c t i o n w i t h a f i v e f o l d e x c e s s o f t h e b r o m i n a t e d s u g a r ( l m-mo le e s t r o n e , 5 . 0 5 m - m o l e s m e t h y l 2 , 3 , 4 - t r i - O - a c e t y l - l - b r o m o - l - d e o x y - a - D - g l u c u r -o n a t e ) g a v e i d e n t i c a l r e s u l t s , a compound h a v i n g a b r o a d m e l t -i n g r a n g e ( 2 0 5 ° - 2 3 0 ° ) w h i c h r e m a i n e d u n i d e n t i f i e d . A t t h i s t i m e a r e p o r t was f o u n d ( 2 2 ) w h i c h i n d i c a t e d t h a t f o r some u n k n o w n r e a s o n i n t e r n a l d e s s i c a n t s s l o w down c o n j u g a t i o n r e a c t i o n s . A l s o , o n l y f r e s h l y p r e p a r e d s i l v e r c a r b o n a t e s h o u l d be u s e d i n r e a c t i o n s o f t h i s n a t u r e . Thus s i l v e r c a r b o n a t e was p r e p a r e d i m m e d i a t e l y b e f o r e u s e b y a d d i n g 4 0 $ a q u e o u s s i l v e r n i t r a t e t o 21% a q u e o u s s o d i u m c a r b o n a t e . A d d i t i o n o f s o d i u m b i c a r b o n a t e ( a n 8fo a q u e o u s s o l u t i o n ) was f o l l o w e d b y f i l t r a t i o n o f t h e s o l i d f o r m e d a n d r e p e a t e d w a s h -i n g s w i t h w a t e r . The p r o d u c t was y e l l o w b u t t u r n e d g r e e n on e x p o s u r e t o a i r . The c o n j u g a t i o n r e a c t i o n was a g a i n p e r f o r m e d , t h i s t i m e w i t h o u t c a l c i u m h y d r i d e a n d w i t h f r e s h s i l v e r c a r b o n a t e . The m i x t u r e was s h a k e n f o r 44 h o u r s a t r o o m t e m p e r a t u r e t o i n -s u r e c o m p l e t e r e a c t i o n . A compound h e h a v i n g as b e f o r e was o b -4 0 t a i n e d . A w a t e r - e t h e r p a r t i t i o n o f t h e s o l i d was u n s u c c e s s f u l b e c a u s e t h e compound ( t h e s u s p e c t e d c o n j u g a t e ) was w a t e r i n -s o l u b l e . A s s u m i n g t h e r e f o r e t h a t a n y a c e t y l a t e d e s t r o n e g l u -c o s i d u r o n a t e w o u l d be q u i t e s o l u b l e i n o r g a n i c s o l v e n t s , a p a r t i t i o n was made b e t w e e n a c o l d s o d i u m h y d r o x i d e s o l u t i o n (pH 1 0 . 5 ) a n d b e n z e n e . The b a s i c e x t r a c t was n e u t r a l i z e d a n d e x t r a c t e d w i t h e t h e r t o r emove a n y e s t r o n e . O v e r 95% o f t h e s o l i d r e m a i n e d i n t h e b e n z e n e f r a c t i o n a n d h a d a mp o f 2 1 5 ° -2 1 7 . 5 ° , l i t e r a t u r e v a l u e s f o r a c e t y l a t e d e s t r o n e g l u c o s i d u r o -n a t e ( 5 6 ) 2 1 2 . 5 ° - 2 1 5 ° o r 2 2 5 . 5 ° - 2 2 8 ° . The e t h e r f r a c t i o n was i d e n t i f i e d a s e s t r o n e b y i t s m e l t i n g p o i n t . To c h e c k i f a n y e s t r o n e r e m a i n e d i n t h e b e n z e n e p h a s e a s i m i l a r p a r t i t i o n was c a r r i e d o u t b e t w e e n t o l u e n e a n d a s o l u t i o n o f s o d i u m h y d r o x i d e ( p H U 2 V 2 ) . 98% o f t h e s o l i d r e m a i n e d i n t h e t o l u e n e l a y e r . The y i e l d o f t h i s s o l i d , w h i c h was p r o v e n b y mp, U V , I R a n d a c i d h y d r o l y s i s t o be m e t h y l ( l 7 - o x o - e s t r a - l , 3 , 5 ( l O ) , - t r i e n - 3 8 y l - 2 , 3 , 4 - t r i - 0 - a c e t y l - 8 - D - g l u c o s i d ) - u r o n a t e , a f t e r i n i t i a l c r y s t a l l i z a t i o n a t t e m p t s a n d p a r t i t i o n b e t w e e n a l k a l i a n d b e n -z e n e was 15%. C o m p a r i s o n o f t h e u l t r a v i o l e t s p e c t r a o f e s t r o n e a n d 3 - m e t h o x y e s t r o n e i n d i c a t e d t h a t s u b s t i t u t i o n o f t h e p h e n o l i c h y d r o x y l c a u s e s a s i g n i f i c a n t c h a n g e i n t h e s p e c t r u m . A max e s t r o n e - 2 8 0 mu., A max 3 - m e t h o x y - e s t r o n e 2 7 8 , 2 8 7 m u . The l a t t e r h a s a s p l i t p e a k a n d a h y p s o c h r o m i c s h i f t 1 . o c c u r e d . S p e c t r a s i m i l a r t o t h e l a t t e r w e r e o b t a i n e d w i t h b o t h t h e s t a n d a r d s a m p l e o f a c e t y l a t e d e s t r o n e g l u c o s i d u r o n a t e f r o m W o t i z a n d t h e p r e p a r e d c o m p o u n d . S t d . A max 282 m | i , 2 7 5 - 2 7 7 m | i . P r e -p a r e d A max 282 m(i, 2 7 4 - 2 7 5 m | i . The s t a n d a r d a p p e a r e d t o be s l i g h t l y i m p u r e as i t h a d h i g h e r m i n i m a , b r o a d e r p e a k s a n d a l e s s o b v i o u s h y p s o c h r o m i c s h i f t . The i n f r a r e d s p e c t r a o f t h e s t a n d a r d a n d t h e ' p r e p a r e d a c e t y l a t e d e s t r o n e g l u c o s i d u r o n a t e w e r e i d e n t i c a l . ( P i g . I.) F u r t h e r p r o o f o f t h e s u c c e s s f u l p r e p a r a t i o n o f t h e a c e t y l a t e d e s t r o n e g l u c o s i d u r o n a t e was o b t a i n e d b y a c i d h y d r o l -y s i s a n d i d e n t i f i c a t i o n o f t h e l i b e r a t e d g l u c u r o n i c a c i d a n d e s t r o n e . The s t e r o i d a n d s u g a r w e r e c l e a v e d b y h e a t i n g a t 1 0 0 ° C w i t h 15% v / v c o n c e n t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i d f o r 1 l / 4 h o u r s . E x t r a c t i o n o f t h e r e a c t i o n , m i x t u r e w i t h b e n z e n e s e p a -r a t e d t h e e s t r o n e a n d g l u c u r o n i c a c i d . E s t r o n e was d e t e c t e d b y i t s UV s p e c t r u m . F r e e g l u c u r o n i c a c i d was d e t e r m i n e d c o l o r -i m e t r i c a l l y b y t h e m e t h o d o f M e j b a u m i m p r o v e d b y C h a r l a l a m p o u s ( 5 2 ) . A n o r c i n o l r e a g e n t (2 m l ) , c o n s i s t i n g o f o r c i n o l ( . 1 gm) a n d F e C l ^ ^ R ^ O ( 2 2 mg) i n c o n c e n t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i d ( 2 0 m l ) , was a d d e d t o 1 m l o f t h e s a m p l e a n d t h e m i x t u r e s h e a t e d f o r 30 m i n i n b o i l i n g w a t e r . TV S p e c t r a w e r e t a k e n o f t h e c o o l -e d s o l u t i o n s a n d t h a t o f t h e h y d r o l y z e d compound was i d e n t i c a l t o s t a n d a r d g l u c u r o n i c a c i d , p e a k s o c c u r i n g a t 6 6 8 . 5 - 6 6 9 mp.. T h e r e f o r e b o t h e s t r o n e a n d g l u c u r o n i c a c i d w e r e p r e s e n t i n t h e c o n j u g a t e d c o m p o u n d , as i n d i c a t e d b y t h e s e s p e c t r a l r e s u l t s . D e a c e t y l a t i o n o f t h i s a c e t y l a t e d e s t r o n e g l u c o s i d -u r o n a t e was p e r f o r m e d i n i a manne r s i m i l a r t o t h a t u s e d f o r a c e t y l a t e d m e t h y l g l y c o s i d e s ( 2 2 ) . The c o n j u g a t e ( 1 6 . 5 mg) 42 Figure 1. Comparison of infrared spectra of: A. Standard sample of methyl (17-oxo-estra-l,3,5(10)-trien-3-yl-2,3,4,-tri-0-acetyl-8-D-gluc6sid)-uronate , supplied by H. H. Wotiz. B. As above, prepared as described in Experimental. 43 was d i s s o l v e d i n a b s o l u t e m e t h a n o l ( 7 . 5 m l ) b y h e a t i n g . A c a t a l y t i c amount o f s o d i u m m e t h o x i d e ( t h e c o m m e r c i a l s o l i d d i s s o l v e d i n m e t h a n o l ) was a d d e d t o make a . 0 0 2 M s o l u t i o n . T h i s r e a c t i o n m i x t u r e was h e a t e d two m i n u t e s i n a b o i l i n g w a t e r b a t h , c o o l e d , t h e m e t h a n o l e v a p o r a t e d a n d w a t e r a d d e d . ' The b a s i c s o l u t i o n was n e u t r a l i z e d ( p H 6 ) w i t h a c e t i c a c i d a n d e x -t r a c t e d w i t h e t h e r a n d b e n z e n e . A n i n s i g n i f i c a n t amount o f m a t e r i a l was r e m o v e d . N - b u t a n o l h a s b e e n r e p o r t e d t o e x t r a c t e s t r o g e n c o n j u g a t e s f r o m a c i d i c s o l u t i o n s ( 6 l ) so t h e pH o f t h e n e u t r a l i z e d s o l u t i o n was l o w e r e d t o 2 a n d e x t r a c t e d w i t h b u t a n o l . The d r i e d e x t r a c t was c r y s t a l l i z e d t o y i e l d 9 7 $ o f t h e d e a c e t y l a t e d m a t e r i a l e x p e c t e d . The mp ( 1 4 0 ° - 1 4 2 . 5 ° ) was d i s t i n c t f r o m t h e c o r r e s p o n d i n g a c e t y l a t e d c o n j u g a t e ( 2 1 5 ° -2 1 7 . 5 ° ) b u t no k n o w n mp d a t a a r e a v a i l a b l e f o r c o m p a r i s o n . I t s UV s p e c t r u m h a d t h e s p l i t p e a k c h a r a c t e r i s t i c o f e s t r o n e w i t h a s u b s t i t u t e d h y d r o x y l A max 2 7 3 , 2 8 0 - 2 8 1 m u . The a b s e n c e o f a c e t y l g r o u p s was d e t e r m i n e d b y a s p o t t e s t f o r e s t e r s o f c a r b o x y l i c a c i d s ( 6 2 ) . C o n v e r s i o n o f t h e e s t e r s t o s o d i u m s a l t s o f h y d r o x a m i c a c i d s o c c u r s on t r e a t -men t w i t h h y d r o x y l amine' h y d r o c h l o r i d e i n t h e p r e s e n c e o f s o d i u m h y d r o x i d e . RCOOR* + N H 2 0 H + NaOH — > RCO(NHONa) + .R'OH + H 2 0 . The f r e e h y d r o x a m i c a c i d f o r m e d b y a c i d i f i c a t i o n c a n be i d e n -t i f i e d b y a c o l o u r r e a c t i o n w i t h f e r r i c c h l o r i d e . H NHOH N - O x R - C = 0 + 1/3 F e + 3 — > R - C = 0 " " F e / 3 + H + 44 A positive reaction gave a red to purple colour. The test was performed on ethyl acetate and acetylated estrone gluco-siduronate as standards and on the deacetylated material. TABLE 2 Compound Colour ethyl acetate intensespurple acetylated estrone glucosiduronate purple deacetylated estrone glucosiduronate negative 45 D I S C U S S I O N The m e t h o d s p r o p o s e d b y G o e b e l a n d - B a b e r s ( 1 9 3 3 - 3 5 ) f o r t h e s y n t h e s i s o f m e t h y l 2 , 3 , 4 - t r i - 0 - a c e t y l - l - b r o m o - l - d e o x y - a - D - g l u c u r o n a t e f r o m g l u c u r o n o l a c t o n e , a n d t h e c o n j u g a t i o n o f t h i s compound w i t h a h y d r o x y l - c o n t a i n i n g r e a c t a n t ( i n t h e p r e -s e n c e o f s i l v e r c a r b o n a t e ) c o m p r i s e t h e f i r s t c o m p r e h e n s i v e r e p o r t s made on a l l t h e r e a c t i o n s i n v o l v e d i n t h e s y n t h e s i s o f g l u c o s i d u r o n a t e s . B o l l e n b a c k ( 2 6 ) h a s i m p r o v e d t h e s e p r o c e d u r e s a n d h i s m e t h o d s h a v e b e e n i n c o r p o r a t e d i n t o t h e m e t h y l a t i o n a n d b r o m i n a t i o n r e a c t i o n s r e p o r t e d i n t h i s t h e s i s . The a c e t y l a t i o n a n d i s o m e r i z a t i o n c o n d i t i o n s o f B o w e r i n g a n d T i m e l l ( 4 8 ) w e r e f o l l o w e d a n d t h e b r o m i n a t i o n r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e p r o c e s s e d a c c o r d i n g t o P e l z e r ( 4 9 ) . T h i s c o m b i n a t i o n g a v e t h e b e s t r e -s u l t s — a n o v e r a l l y i e l d f r o m g l u c u r o n o l a c t o n e t o m e t h y l 2 , 3 , 4 -t r i - O - a c e t y l - l - b r o m o - l - d e o x y - a - D - g l u c u r o n a t e o f 50%; a g e n e r a l y i e l d o f 6 0 - 6 5 % on t h e m e t h y l a t i o n , a c e t y l a t i o n a n d i s o m e r i z a -t i o n r e a c t i o n s a n d 8 0 - 8 5 % on t h e b r o m i n a t i o n r e a c t i o n s . D i f f i c u l t y i n o b t a i n i n g t h e m i x t u r e o f u n l a b e l l e d and r a d i o a c t i v e g l u c u r o n o l a c t o n e i n c r y s t a l l i n e f o r m a f t e r s o l u t i o n i n m e t h a n o l f o r c o u n t i n g was s u r p r i s i n g . G l u c u r o n o l a c t o n e . c r y s -t a l l i z e d r e a d i l y f r o m m e t h a n o l , a b s o l u t e and 95% e t h a n o l a n d r e c r y s t a l l i z a t i o n h a d p o s e d no d i f f i c u l t y b e f o r e . S e v e r a l p o s -s i b i l i t i e s f o r t h i s u n u s u a l b e h a v i o u r e x i s t . G l u c u r o n i c a c i d may h a v e b e e n f o r m e d f r o m g l u c u r o n o l a c t o n e . A n a q u e o u s s o l u -t i o n o f t h e l a c t o n e r e a c h e s a n e q u i l i b r i u m o f 20% l a c t o n e a n d 80% a c i d i n a b o u t two m o n t h s a t r o o m t e m p e r a t u r e , w h i l e a t 1 0 0 ° C 46 a n e q u i l i b r i u m o f 60% l a c t o n e a n d 40% f r e e a c i d i s r e a c h e d i n t w o h o u r s ( 7 1 ) . I n t h i s e x p e r i m e n t t h e r e were , . , f pu r d r o p s o f w a t e r i n 15 m l o f m e t h a n o l a n d t h e s o l u t i o n was h e a t e d f o r 5 m i n u t e s a t 64 °C . T h e r e f o r e t h e f o r m a t i o n o f g l u c u r o n i c a c i d i n amoun t s s u f f i c i e n t t o i n h i b i t c r y s t a l l i z a t i o n seems u n l i k e l y . The p o s s i b i l i t y o f e x t e n s i v e l y p o l y m e r i z e d d e g r a d a t i o n p r o d u c t s o c c u r i n g f r o m h e a t i s e v e n more i m p r o b a b l e as p r e p a r a t i o n s o f g l u c u r o n o l a c t o n e f r o m g l u c u r o n i c a c i d i n v o l v e b o i l i n g a q u e o u s s o l u t i o n s . R e f l u x i n g g l u c u r o n o l a c t o n e w i t h m e t h a n o l f o r s e v e r a l d a y s i s k n o w n t o y i e l d m e t h y l g l u c u r o n a t e , a compound w h i c h h a s n e v e r b e e n c r y s t a l l i z e d (26). T h i s w o u l d be a d e s i r a b l e p r o -d u c t b u t f o r m a t i o n i n t h i s c a s e w o u l d o c c u r o n l y i f t h e r a d i o -a c t i v e m a t e r i a l w e r e b a s i c a n d a c t i n g as a c a t a l y s t . The l o w r e c o v e r y o f m e t h y l t e t r a - O - a c e t y l - a - D - g l u c u r o -n a t e ; . a f t e r m e t h y l a t i o n a n d a c e t y l a t i o n d u r i n g t h e r a d i o a c t i v e p r e p a r a t i o n c o m p a r e d w i t h n o n - r a d i o a c t i v e e x p e r i m e n t s was m o s t p r o b a b l y t h e r e s u l t o f a n i m p u r i t y p r e s e n t i n t h a t p o r t i o n o f t h e o r i g i n a l r a d i o a c t i v e g l u c u r o n o l a c t o n e s o l u t i o n u s e d . A c e t y l a t i o n b y t h e m e t h o d o f B o w e r i n g a n d T i m e l l (48) g a v e h i g h e r y i e l d s t h a n t h a t o f B o l l e n b a c k (26). D e s p i t e t h e f a c t t h e f o r m e r i s l o n g e r a n d h a s a n a d d e d i s o m e r i z a t i o n s t e p , i t h a s t h e a d v a n t a g e , o f p r o d u c i n g o n l y one i s o m e r so o n l y one c r y s t a l l i z a t i o n i s r e q u i r e d . W h i l e t h e a c i d c a t a l y z e d a c e t y l a -t i o n o f B o l l e n b a c k s h o u l d y i e l d p r e d o m i n a n t l y t h e a - f o r m o f t h e a c e t y l a t e d s u g a r , t h e c r u d e m a t e r i a l o b t a i n e d , a f t e r p r o c e s s i n g t h e m o t h e r l i q u i o r r e m o v e d f r o m t h e 8 - a n o m e r , was d i f f i c u l t t o 47 c r y s t a l l i z e a n d a p p e a r e d t o be a m i x t u r e o f a c e t a t e s . M e t h y l t e t r a - O - a c e t y l - a - D - g l u c u r o n a t e h a s b e e n r e p o r t e d t o be d i f f i -c u l t t o i s o l a t e b y t h e m e t h o d o f B o l l e n b a c k ( 2 6 ) . H o w e v e r , t h e p r o d u c t o b t a i n e d a f t e r i s o m e r i z a t i o n was e a s i l y c r y s t a l l i z e d f r o m a l c o h o l . The b r o m i n a t i o n r e a c t i o n was t h e m o s t d i f f i c u l t s t e p i n t h e s y n t h e s i s o f m e t h y l 2 , 3 , 4 - t r i - 0 - a c e t y l - l - b r o m o - l - d e o x y -g l u c u r o n a t e , f r o m g l u c u r o n o l a c t o n e . I t i s h a m p e r e d b y t h e b r o -m i n a t e d compound b e i n g q u i t e u u n s t a b l e , e s p e c i a l l y a t r o o m t e m -p e r a t u r e . The c r i t i c a l s t e p i n o b t a i n i n g s u c h a r e a c t i v e m o l e -c u l e a p p e a r s t o be t h e t r e a t m e n t o f t h e r e a c t i o n m i x t u r e a f t e r b r o m i n a t i o n . The m e t h o d s o f B o l l e n b a c k a n d B o w e r i n g a n d T i m e l l b o t h i n v o l v e r e m o v a l o f H B r i n - a c e t i c a c i d b y e v a p o r a t i o n p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f c h l o r o f o r m t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e . A c c o r d -i n g " t o P e l z e r ( 4 9 ) t h e c h l o r o f o r m s h o u l d be a d d e d d i r e c t l y t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e a n d t h e n w a s h e d t o r emove as much a c i d as p o s s i b l e . I t h a s b e e n o b s e r v e d t h a t i n t h o s e c a s e s w h e r e r e a c -t i o n s o l v e n t s w e r e r e m o v e d d i r e c t l y some h y d r o b r o m i c a c i d became t r a p p e d i n t h e r e s i d u a l s y r u p a n d was more d i f f i c u l t t o r emove b y w a s h i n g t h e c h l o r o f o r m t h a n i f no p r i o r e v a p o r a t i o n was p e r -f o r m e d . A s a r e s u l t h y d r o b r o m i c a c i d r e m a i n e d d i s s o l v e d i n t h e s y r u p a n d o n ; r e m o v a l o f t h e c h l o r o f o r m seemed t o h i n d e r c r y s t a l -l i z a t i o n . Once t h e c r y s t a l s o f t h e b r o m i n a t e d s u g a r a r e o b t a i n e d t h e y m u s t be k e p t a n h y d r o u s . D r y i n g a n d s t o r a g e a r e e f f e c t e d i n t h e same m a n n e r , b y d e s s i c a t i o n o v e r c a l c i u m c h l o r i d e a t 0 ° C . 48 D e c o m p o s i t i o n o c c u r s a t room t e m p e r a t u r e i n l e s s t h a n 24 h o u r s . P u r i f i c a t i o n o f a n y u n d e g r a d e d m a t e r i a l f r o m a p a r t i a l l y d e -c o m p o s e d s a m p l e was a c h i e v e d b y s o l u t i o n o f t h e compound i n c h l o r o f o r m , w a s h i n g w i t h a s o d i u m b i c a r b o n a t e s o l u t i o n a n d w a t e r a n d c r y s t a l l i z a t i o n o f t h e o i l o b t a i n e d on r e m o v a l o f t h e c h l o -r o f o r m . The s u c c e s s a n d y i e l d o f t h e b r o m i n a t i o n r e a c t i o n was q u i t e v a r i a b l e a n d a p p e a r e d t o be d i r e c t l y r e l a t e d t o d i f f e r -e n c e s i n t h e l o t s o f H B r i n a c e t i c a c i d . T h e s e d i f f e r e n c e s may p o s s i b l y h a v e b e e n i n t h e q u a n t i t i e s o f H B r d i s s o l v e d i n t h e a c e t i c a c i d . I n t h e a c i d - c a t a l y z e d c o n v e r s i o n o f g l u c u r o n i c a c i d t o g l u c u r o n o l a c t o n e , c r y s t a l l i n e m a t e r i a l was o b t a i n e d o n l y w h e n f r e e g l u c u r o n i c a c i d a n d n o t t h e s o d i u m s a l t was u s e d . T h e r e f o r e t h e p r e s e n c e o f s o d i u m a c e t a t e o r s o d i u m c h l o r i d e , d e p e n d i n g on w h i c h a c i d was u s e d , may h a v e h i n d e r e d c r y s t a l l i -z a t i o n . A l s o t h e s u c c e s s f u l m e t h o d was t h e o n l y one n o t i n v o l v -i n g h e a t , so p o l y m e r i z a t i o n p r o d u c t s may h a v e p r e v e n t e d c r y s t a l f o r m a t i o n . I t was o b s e r v e d t h a t s o d i u m h y d r o x i d e a n d s o d i u m me-t h o x i d e m u s t be u s e d i n c a t a l y t i c a m o u n t s ( . 0 0 2 m o l e ) a n d a t t e m p e r a t u r e s l e s s t h a n 4 0 ° C d u r i n g t h e m e t h y l a t i o n o f g l u c u r o -n o l a c t o n e o r t h e f o r m a t i o n o f s o d i u m g l u c u r o n a t e w i l l o c c u r . A two f o l d i n c r e a s e i n t h e y i e l d o f 3 , 1 7 8 - d i a c e t o x y -1 6 c c , 1 7 c x - e p o x y - e s t r a - l , 3 , 5 ( l O ) - t r i e n e a n d i t s s u c c e s s f u l r e a r -r a n g e m e n t to_ 3 , 1 6 a - d i a c e t o x y - 1 7 - k e t o - e s t r a - l , 3 , 5 ( 1 0 ) - t r i e n e o c -c u r e d d u r i n g t h e s e c o n d a t t e m p t t o s y n t h e s i z e e s t r i o l - 1 7 8 - g l u -49 c o s i d u r o n a t e . The r e a s o n f o r t h i s i s u n c l e a r . The o n l y d i f -f e r e n c e s i n t h e two p r e p a r a t i o n s w e r e d i f f e r e n t s a m p l e s o f e s -t r o n e e n o l d i a c e t a t e a n d t h e d i f f e r e n t . p r e p a r a t i o n s o f p e r b e n -z o i c a c i d u s e d . The p e r b e n z o i c a c i d u s e d i n t h e s e c o n d e p o x i -d a t i o n was p r e p a r e d i n s u c h a manne r ( i n a d r y i c e - e t h a n o l b a t h a t l e s s t h a n - 3 0 ° C i n s t e a d o f a n i c e b a t h ) t h a t t h e y i e l d was d o u b l e d . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t a r e q u i r e m e n t f o r a more h i g h l y c o n c e n t r a t e d s o l u t i o n o f p e r b e n z o i c a c i d f o r e f f i c i e n t e p o x i d a t i o n . I t h a s b e e n e m p h a s i z e d b y L e e d s ejt a l . ( 5 3 ) t h a t r e -a r r a n g e m e n t o f t h e e p o x i d e o c c u r s b y s i l i c a g e l c h r o m a t o g r a p h y o n l y i f t h e s a m p l e i s p u r e . W h i l e mp d e t e r m i n a t i o n s i n d i c a t e d t h e m a t e r i a l u s e d i n b o t h a t t e m p t s was o f e q u a l p u r i t y , t h e 3 , 1 7 f 3 - d i a c e t o x y - 1 6 a , 1 7 a - e p o x y - e s t r a - l , 3 ,5 ( l O ) - t r i e n e o b t a i n e d i n h i g h e r y i e l d was more r e a d i l y c r y s t a l l i z e d a n d h a d a d i s t i n c t l y d i f f e r e n t a p p e a r a n c e f r o m t h e f i r s t l o t . T h u s t h e f o r m e r may h a v e b e e n i n a p u r e r s t a t e w h i c h a l l o w e d r e a r r a n g e m e n t t o 3 , 1 6 a - d i a e e t p x y - 1 7 - k e t o - e s t r a - l , 3 , 5 ( l O ) - t r i e n e t o o c c u r . Two d i f f e r e n t m e c h a n i s m s h a v e b e e n p r o p o s e d f o r t h i s r e a c t i o n w h i c h i n v o l v e r e a r r a n g e m e n t o f t h e a c e t o x y l g r o u p f r o m t h e 1 7 6 - t o t h e 1 6 a - p o s i t i o n . W o o d w a r d ( 5 3 ) p r o p o s e d t h a t i f m i g r a t i o n w i t h i n v e r s i o n o c c u r e d , t h e r e t e n t i o n o f c o n f i g u r a t i o n w o u l d be e x p l a i n e d b y a s s u m i n g t h e 1 6 8 - p o s i t i o n o f t h e a c e t o x y l g r o u p ( w h i c h f o r m s f i r s t ) i s u n f a v o u r e d a n d w o u l d r e a r r a n g e t o t h e more s t a b l e 1 6 a - c o n f i g u r a t i o n v i a a n e n o l i n t e r m e d i a t e . W i t h o u t i n v e r s i o n t h e a c e t o x y l m i g r a t i o n w o u l d be d i r e c t l y t o 50 t h e 1 6 a - p o s i t i o n . T h i s seems more l i k e l y a s t h e b o n d s a t C - 1 6 a r e b i s e c t i o n a l and t h e 1 6 a - a n d l 6 B - p o s i t i o n s s h o u l d be n e a r l y e q u a l l y f a v o u r e d . D u r i n g r e d u c t i o n s w i t h s o d i u m b o r o h y d r i d e a t 5 °C v i s -i b l e h y d r o g e n e v o l u t i o n o c c u r e d as t h e r e a c t i o n was c a r r i e d o u t i n a m e t h a n o l i c medium a n d s o d i u m b o r o t e t r a m e t h o x i d e f o r m e d r e l e a s i n g h y d r o g e n ( 6 6 ) . A c e t a t e h y d r o l y s i s a t t h e C - 3 p o s i -t i o n p r o b a b l y o c c u r e d b e c a u s e o f t h e p h e n o l i c r i n g " a c t i v a t i n g " t h e a c e t o x y l g r o u p t o w a r d h e m i a c e t a l f o r m a t i o n . The l a t t e r i s r e a d i l y h y d r o l y z e d t o y i e l d t h e h y d r o x y l . F o r t h i s r e a s o n t h e s y n t h e s i s o f e s t r i o l s p e c i f i c a l l y a t t h e C - 1 7 p o s i t i o n w o u l d n o t be f e a s i b l e . The s y n t h e s i s o f t h e a c e t y l a t e d 3 - m e t h o x y e s t r i o l - 1 6 a -a n d 1 7 B - g l u c o s i d u r o n a t e s h a s b e e n r e p o r t e d b y C a r p e n t e r a n d K e l l i e . H o w e v e r , t h e i r m e t h o d s w o u l d be a p p l i e d o n l y w i t h d i f -f i c u l t y t o t h e s y n t h e s i s o f u n s u b s t i t u t e d c o n j u g a t e s b e c a u s e o f t h e e x t r e m e - s t a b i l i t y o f t h e m e t h y l g r o u p i n t h e C - 3 p o s i t i o n . C o n d i t i o n s w h i c h w o u l d q u a n t i t a t i v e l y r emove t h i s m e t h y l g r o u p w o u l d p r o b a b l y be s u f f i c i e n t t o c l e a v e t h e g l y c o s i d i c b o n d . The d i f f i c u l t y . i n o b t a i n i n g c r y s t a l l i n e m a t e r i a l f r o m t h e c o n j u g a t i o n o f e s t r a d i o l w i t h m e t h y l 2 , 3 , 4 - t r i - 0 - a c e t y l - l -b r o m o - l - d e o x y - a - D - g l u c u r o n a t e was a t t r i b u t e d t o t h e v a r i e t y o f r e a c t i o n p r o d u c t s p r e s e n t . B e c a u s e o f t h e f o r m a t i o n o f w a t e r f r o m t h e i o n i z a t i o n o f c a r b o n i c a c i d r e l e a s e d d u r i n g t h e a c t u a l c o n j u g a t i o n , u n w a n t e d d i s s a c h a r i d e s o r h i g h e r s u g a r s a r e f o r m e d f r o m t h e b r o m i n a t e d s u g a r w h i c h h i n d e r c r y s t a l l i z a t i o n o f t h e 5 1 p r o d u c t s . I n a d d i t i o n , c o n j u g a t i o n o f e s t r a d i o l c a n o c c u r a t e i t h e r o r b o t h o f t h e two h y d r o x y l s a n d t h e p r o d u c t s , a l o n g w i t h t h e s t a r t i n g m a t e r i a l , p r e s e n t i n s e m i m i c r o q u a n t i t i e s made f r a c t i o n a l c r y s t a l l i z a t i o n v e r y d i f f i c u l t . E x a m i n a t i o n o f t h e d a t a W o t i z o b t a i n e d f r o m c o n j u g a t i n g e s t r a d i o l w i t h g l u -c u r o n i c a c i d on a l a r g e r s c a l e i n d i c a t e s t h a t t h e . C - 1 7 h y d r o x y l i s a more f a v o u r a b l e p o s i t i o n f o r c o n j u g a t i o n t h a n t h e p h e n o l i c h y d r o x y l . A c e t y l a t e d e s t r a d i o l - 1 7 8 - g l u c o s i d u r o n a t e i s f o r m e d i n t w e n t y - f i v e t i m e s t h e y i e l d of "the 3 , 1 7 - d i g l u c o s i d u r o n a t e a n d no m e n t i o n i s made o f a ' c o n j u g a t i o n • p r o d u c t a t t h e 3 - p o s i t i o n o n l y . The m i n u t e amoun t o f m a t e r i a l c o r r e s p o n d i n g t o a c e t y l a t e d e s t r a d i o l — 3 , 1 7 - d i g l u c o s i d u r o n a t e o b t a i n e d i n t h i s e x p e r i m e n t b y t h e m e t h o d o f M e y s t r e a n d M i e s c h e r i n w h i c h W o t i z r e p o r t s n o y i e l d i s p r o b a b l y due t o c o n t i n u i n g t h e r e a c t i o n f o r a g r e a t e r l e n g t h o f t i m e a n d u n d e r d i f f e r e n t r e a c t i o n c o n d i t i o n s . The d e t e c t i o n . o f t h e a c e t y l a t e d s u g a r s b y t h e F o l i n -C i o c a l t e u P h e n o l s p r a y a n d f e r r i c c h l o r i d e - p o t a s s i u m f e r r i c y a -n i d e s p r a y i s s u r p r i s i n g a n d c a n o n l y be due t o t h e a c e t y l g r o u p s . I t i n d i c a t e s t h e n o n - s p e c i f i c i t y o f t h e s e c o l o u r r e -a g e n t s . The c o n j u g a t i o n o f e s t r o n e was more s u c c e s s f u l t h a n e s t r a d i o l a n d h a d s e v e r a l p o i n t s i n i t s f a v o u r . The m e t h o d o f S h a p i r o ( 5 8 ) i s much m i l d e r t h a n t h a t o f M e y s t r e ( 5 7 ) a n d r e l a -t i v e l y e a s i e r , t o p e r f o r m . A l s o t h e p o s s i b i l i t y o f a m i x t u r e o f p r o d u c t s . h i n d e r i n g c r y s t a l l i z a t i o n i s r e m o v e d as e s t r o n e h a s o n l y one h y d r o x y l a v a i l a b l e f o r c o n j u g a t i o n . A s a r e p o r t b y 52 C o n c h i e ( 2 2 ) i n d i c a t e d t h a t f r e s h l y p r e p a r e d s i l v e r c a r b o n a t e s h o u l d be u s e d f o r c o n j u g a t i o n a n d t h a t i n t e r n a l d e s s i c a n t s s l o w d o w r i ' t h e r e a c t i o n , no d r y i n g a g e n t was i n c o r p o r a t e d i n t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e a n d f r e s h s i l v e r c a r b o n a t e was u s e d . C o m -p a r i s o n o f t h e y i e l d o f c o n j u g a t e b e f o r e a n d a f t e r o b s e r v i n g t h e s e p r e c a u t i o n s was r e n d e r e d i m p o s s i b l e b y t h e i n a b i l i t y t o s e p a r a t e e s t r o n e f r o m a c e t y l a t e d e s t r o n e - 3 - g l u c o s i d u r o n a t e b y c r y s t a l l i z a t i o n w i t h o u t b r e a k d o w n o f t h e l a t t e r . O b s e r v a t i o n o f t h e d i f f e r e n t c r y s t a l l i n e s t r u c t u r e s , h o w e v e r , i n d i c a t e d t h a t a n i n c r e a s e o f c o n j u g a t e d i d o c c u r w h i l e t a k i n g t h e a f o r e -m e n t i o n e d p r e c a u t i o n s . I t was l a t e r d i s c o v e r e d t h a t t h e a c e -t y l a t e d e s t r o n e g l u c o s i d u r o n a t e c o u l d be s e p a r a t e d f r o m e s t r o n e b y a p a r t i t i o n b e t w e e n a c o l d s o l u t i o n o f s o d i u m h y d r o x i d e (pH 1 0 . 5 ) a n d b e n z e n e o r t o l u e n e . The a l k a l i e x t r a c t o n l y r e m o v e d e s t r o n e ar id t h e c o n d i t i o n s w e r e n o t d r a s t i c e n o u g h t o c l e a v e t h e a c e t y l g r o u p s . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e a c e t y l a t e d c o n j u g a t e was made b y c o m p a r i s o n o f t h e I R s p e c t r a ( F i g . l ) a n d UV s p e c t r u m w i i h l t h a t of a s t a n d a r d ( s t d . ^ max 282 m\x, 2 7 5 - 2 7 7 mu: p r e p a r e d A max 282 m u , 2 7 4 - 2 7 5 mu)". The s h a r p e r a n d more c l e a r l y d e f i n e d p e a k s o f t h e p r e p a r e d compound c o m p a r e d w i t h t h e s t a n d a r d was a t t r i b -u t e d t o some i m p u r i t y i n t h e s t a n d a r d . A n i n d i c a t i o n t h a t t h e r e a c t i o n p r o d u c t was t h e c o n j u g a t e was made b y c o m p a r i s o n o f i t s UV s p e c t r u m w i t h t h a t o f e s t r o n e . S u b s t i t u t i o n a t t h e p h e -n o l i c h y d r o x y l , a s d e t e r m i n e d w i t h 3 - m e t h o x y e s t r o n e , i s r e -f l e c t e d i n a s p l i t p e a k , w h e r e a s t h e f r e e e s t r o n e o r a s a l t o f 53 e s t r o n e h a s a s i n g l e p e a k . The I R s p e c t r u m o f a c e t y l a t e d e s -t r o n e g l u c o s i d u r o n a t e s h o w e d t h e p e a k s c h a r a c t e r i s t i c o f t h e 8 - g l y c o s i d i c l i n k , t h e a c e t y l g r o u p s a n d t h e a r o m a t i c r i n g o f t h e s t e r o i d ( 6 3 ) . A c i d h y d r o l y s i s o f t h e a c e t y l a t e d c o n j u g a t e n o t o n l y c l e a v e d t h e g l y c o s i d i c b o n d b u t a l s o r e m o v e d t h e m e t h y l a n d - a c e t y l g r o u p s . D e t e c t i o n o f t h e f r e e g l u c u r o n i c a c i d a n d e s -t r o n e a d d e d f u r t h e r e v i d e n c e t h a t t h e c o n j u g a t e was p r e s e n t . T r e a t m e n t o f t h e a c e t y l a t e d e s t r o n e g l u c o s i d u r o n a t e w i t h a k n o w n c a t a l y t i c q u a n t i t y o f s o d i u m m e t h o x i d e f o l l o w e d b y b r i e f h e a t i n g i n b o i l i n g w a t e r p r o v e d more e f f e c t i v e t h a n t h e s i m i l a r m e t h o d o f W o t i z f o r r e m o v a l o f a c e t y l g r o u p s . The d e a c e t y l a t e d e s t r o n e g l u c o s i d u r o n a t e was s u c c e s s f u l l y e x t r a c t e d f r o m a n a c i d -i c s o l u t i o n w i t h n - b u t a n o l a n d i n t h i s way s e p a r a t e d 1 f r o m o t h e r r e a c t i o n p r o d u c t s . The s p o t t e s t f o r c a r b o x y l i c e s t e r s b y t h e i r c o n v e r s i o n t o h y d r o x a m i c a c i d s a n d s u b s e q u e n t d e t e c t i o n b y a c o l o u r r e a c t i o n w i t h f e r r i c c h l o r i d e p r o v e d t o be a n e f f i c i e n t m i c r o t e c h n i q u e f o r d e t e r m i n i n g t h e p r e s e n c e o f a c e t y l g r o u p s . I t i n d i c a t e d t h a t t h e d e a c e t y l a t i o h r e a c t i o n h a d be.en s u c c e s s f u l ( T a b l e 2 ) . D e v e l o p m e n t o f c h r o m a t o g r a p h i c a n d p a r t i t i o n s y s t e m s f o r t h e s e p a r a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f i n t e r m e d i a t e s a n d p r o -d u c t s w o u l d p r o b a b l y be r e q u i r e d f o r i m p r o v e m e n t o f t h e e x i s t -i n g s y n t h e s e s . W i t h e s t a b l i s h m e n t o f t h e s e / s y s t e m s , t h e p r e -p a r a t i o n o f d o u b l y l a b e l l e d c o n j u g a t e s w o u l d be more f e a s i b l e . 54 SUMMARY -1 . M e t h y l 1 , 2 , 3 , 4 - t e t r a - O - a c e t y l - a - D - g l u c u r o n a t e was p r e p a r e d i n 6 0 - 6 5 $ y i e l d f r o m g l u c u r o n o l a c t o n e b y a b a s e c a t a l y z e d ace ty l - a - , . t i o n a n d a n i s o m e r i z a t i o n r e a c t i o n . M e t h y l 1 , 2 , 3 , 4 , - t e t r a - O -a c e t y l - B - D - g l u c u r o n a t e was p r e p a r e d i n l o w e r y i e l d s f r o m a n a c i d c a t a l y z e d a c e t y l a t i o n . 2 . M e t h y l 2 , 3 , 4 - t r i - » 0 - a c e t y l - l - b r o m o - l - d e o x y - a - D - g l u c u r o n a t e was p r e p a r e d i n 8 0 - 8 5 $ y i e l d f r o m m e t h y l t e t r a - O - a c e t y l - c t - a n d B - D -g l u c u r o n a t e . 3 . E s t r o n e e n o l d i a c e t a t e was p r e p a r e d f r o m e s t r o n e i n 6 6 $ y i e l d . I t s c o n v e r s i o n in t h e e p o x y d e r i v a t i v e was a c c o m p l i s h e d i n 8 0 -8 5 $ y i e l d , a n d r e a r r a n g e m e n t o f t h e l a t t e r on a s i l i c a g e l c o l -umn g a v e a 5 0 $ r e c o v e r y o f 3 , 1 6 a - d i a c e t ; p x y - 1 7 - k e t o - e s t r a - l , 3 , 5 ( l O ) - t r i e n e . I s o l a t i o n o f t h i s c o m p o u n d , s p e c i f i c a l l y r e d u c e d t o "the 1 7 - h y d r o x y l w i t h s o d i u m b o r o h y d r i d e , was u n s u c c e s s f u l . T h u s t h e s y n t h e s i s o f e s t r i o l - 1 7 B - g l u c o s i d u r o n a t e was n o t f e a s -i b l e b y t h i s m e t h o d . 4 . A c e t y l a t e d e s t r o n e - 3 - g l u c o s i d u r o n a t e was p r e p a r e d i n a p p r o x i -m a t e l y 1 5 $ y i e l d . A s m a l l p o r t i o n o f t h i s was p u r i f i e d f o r i d e n t i f i c a t i o n . D e a c e t y l a t i o n g a v e a s o l i d compound p r e s u m e d t o be e s t r o n e g l u c o s i d u r o n a t e . 55 B I B L I O G R A P H Y ( 1 ) B r e u e r , H . V i t a m i n s a n d H o r m o n e s 2 0 , 317 ( 1 9 6 2 ) . ( 2 ) C o h e n , S . a n d M a r r i a n , G . F . B i o c h e m . J . 3 0 , 57 ( 1 9 3 6 ) . ( 3 ) C o h e n , S . a n d M a r r i a n , G . F . B i o c h e m . J . 3 0 , 2250 ( 1 9 3 6 ) . ( 4 ) G r a n t , J . K . a n d M a r r i a n , G . F . B i o c h e m . J . 4 7 , 1 ( 1 9 5 0 ) . ( 5 ) C a r p e n t e r , J . G . a n d K e l l i e , A . E . B i o c h e m . J? 8 4 , 303 ( 1 9 6 2 ) . ( 6 ) N e e m a n , M . a n d H a s h i m o t o , Y . J . A m . Chem. S o c . 8 4 , 2972 ( 1 9 6 2 ) . ( 7 ) F e l g e r , C . B . a n d K a t z m a n , P . A. F e d . P r o c . 2 0 , 199 ( 1 9 6 1 ) . ( 8 ) B e l i n g , C . G . A c t a E n d o c r i n o l . , s u p p l . 79 ( 1 9 6 3 ) . ( 9 ) T r o e n , P . , N i l s s o n , B . , W i g j v i s t , N . a n d D i c z f a l u s y , E . A c t a E n d o c r i n o l . 3 8 , 361 ( 1 9 6 1 ) . • ( 1 0 ) S m i t h , E . E . B . a n d M i l l s , G . T . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 3 , 389 ( 1 9 5 4 ) . ( 1 1 ) S t r o m i n g e r , T . L . , M a x w e l l , E . S . , A x e l r o d , J . a n d K a l c k a r , H. M . J . B i o l . Chem. 2 2 4 , 79 ( 1 9 5 7 ) . ( 1 2 ) S m i t h , E . R . a n d B r e u e r , H . B i o c h e m . J . 8 8 , 168 ( 1 9 6 2 ) . ( 1 3 ) S t e v e n s , ¥ . , B e r l i n e r , D . a n d D o u g h e r t y , T . E n d o c r i n o l . 6 8 , 875 ( 1 9 6 1 ) . ( 1 4 ) D i c z f a l u s y , E . , F r a n k s s o n , C , L i s b o a , B . P . and" M a r t i n s e n , B . A c t a E n d o c r i n o l . 4 0 , 537 ( 1 9 6 2 ) . ( 1 5 ) D o r f m a n , R . a n d H a d d , H . J . B i o l . Chem. £ 3 8 , 907 ( 1 9 6 3 ) . ( 1 6 ) D i c z f a l u s y , E . a n d M a g n u s s o n , A. M . A c t a E n d o c r i n o l . 2 8 , 69 ( 1 9 5 8 ) . ( 1 7 ) D i c z f a l u s y , E . , C a s s m e r , 0 . , A l o n s o , C , de M i g u e l , M . a n d 56 W e s t i n , B . A c t a E n d o c r i n o l . 3 7 , 516 ( 1 9 6 1 ) . ( 1 8 ) D i c z f a l u s y , E . , C a s s m e r , 0 . , A l o n s o , C . A c t a E n d o c r i n o l . 3 7 , 353 ( 1 9 6 1 ) . ( 1 9 ) M i k h a i l , G . , W i g v i s t , N . a n d D i c z f a l u s y , E . A c t a E n d o c r i n -o l , s u p p l . 6 7 , 108 ( 1 9 6 2 ) . ( 2 0 ) B r o w n , J . B . a n d B l a i r , H . A . J . E n d o c r i n o l 1 7 , 411 ( 1 9 5 8 ) . ( 2 1 ) De M e i o , R . H . , L e w y c k a , C h . , W i z e r k a n u i k , M . a n d S a l c i u -n a s , 0 . B i o c h e m . J . 6 8 , 1 ( 1 9 5 8 ) . ( 2 2 ) C o n c h i e , J . , L e v v y , G . a n d M a r s h , C . A . , A d v . C a r b o h y d r a t e C h e m . 1 2 , 157 ( 1 9 5 7 ) . ( 2 3 ) G o e b e l , W. H . a n d B a b e r s , P . H . J . B i o l . Chem. 1 0 6 , 63 ( 1 9 3 4 ) . ( 2 4 ) G o e b e l , V . H . a n d B a b e r s , J . H . J . B i o l " . C h e m . I l l , 347 ( 1 9 3 5 ) . ( 2 5 ) T o u s t e r , 0 . a n d R e y n o l d s , V . H . J . B i o l . Chem. JL97, 863 ( 1 9 5 2 ) . . ( 2 6 ) B o l l e n b a c k , G . N . , L o n g , J . ¥ . , B e n j a m i n , D . G . a n d L i n d -q u i s t , " J . A . J . A m . Chem. S o c . 7 7 , 3310 ( 1 9 5 5 ) . ( 2 7 ) L e m i e u x , R . 'TJ. A d v . C a r b o h y d r a t e Chem. 9 , 1 ( 1 9 5 4 ) . ( 2 8 ) H a y n e s , L . J . A d v . C a r b o h y d r a t e Chem. 1 0 , ' 2 0 7 ( 1 9 5 5 ) . ( 2 9 ) M a r r i a n , G . F . P h y s i o l . R e v s . 1 3 , 185 ( 1 9 3 3 ) . ( 3 0 ) C o h e n , H . a n d B a t e s , R . ¥ . E n d o c r i n o l . 4 5 , 86 ( 1 9 4 9 ) . ( 3 1 ) V a l c o u r t , A . J . , T h a y e r , S . A . , D o i s y , E . A . , E l l i o t t , ¥ . H . a n d D G i s y , E . A . E n d o c r i n o l . . 5 7 , 692 ( 1 9 5 5 ) . (3.2) B e e r , C . T . a n d G a l l a g h e r , T . F . J . B i o l . C h e m . 2 1 4 , 335 ( 1 9 5 5 ) . 57 ( 3 3 ) S c h n e i d e r , J . a n d L e w b a r t , M . L . R e c e n t P r o g r e s s i n H o r -mone R e s e a r c h x l 5 , 201 ( 1 9 5 9 ) . ( 3 4 ) B u s h , I . E . B i o c h e m . J . 6 7 , 23P ( 1 9 5 7 ) . ( 3 5 ) M e n i n i , E . a n d D i c z f a l u s y , E . E n d o c r i n o l . 6 7 , 500 ( i 9 6 0 ) . ( 3 6 ) P r e e d y , J . R . K . a n d A i t k e n , E . H . J . B i o l . Chem. 2 3 6 , 1297 & 1 3 0 0 ( 1 9 6 1 ) . ( 3 7 ) B u s h , I . E . a n d G a l e , M . B i o c h e m . J . 6 7 , 29P ( 1 9 5 7 ) . ( 3 8 ) H a h n e l , R . C l i n . Chem. A c t a 8 , 305 ( 1 9 6 3 ) . ( 3 9 ) K u s h i n s k y , S . a n d T a n g , J . A c t a E n d o c r i n o l . 4 3 , 361 ( 1 9 6 3 ) . ( 4 0 ) K u s h i n s k y , S . a n d T a n g , T . A c t a E n d o c r i n o l . 4 3 , 345 ( 1 9 6 3 ) . ( 4 1 ) L i s b o a , B . a n d D i c z f a l u s y , E . A c t a E n d o c r i n o l . 4 3 , 545 ( 1 9 6 3 ) . ( 4 2 ) F i s h m a n , ¥ . H . a n d G r e e n , S . J . B i o l . Chem. 2 1 5 , 527 ( 1 9 5 5 ) . ( 4 3 ) R o b e r t s , K . D . , V a n de W i e l e , R . L . a n d L i e b e r m a n , S . J . B i o l . C h e m . 2 3 6 , 2213 ( 1 9 6 3 ) . ( 4 4 ) C a l v i n , H . B . , V a n de W i e l e , R . L . a n d L i e b e r m a n , S . B i o -c h e m i s t r y 2 , 648 ( 1 9 6 3 ) . ( 4 5 ) K r e e k , M . , G r i g g e n h e i m , P . , R o s s , J . a n d T a p l e y , D . B i o -c h i m . B i o p h y s . A c t a 7 4 , 418 ( 1 9 6 3 ) . ( 4 6 ) S m i t h , F . , T a p l e y , D . a n d R o s s , J . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 6 9 , 68 ( 1 9 6 3 ) . ( 4 7 ) G o e b e l , V . H . a n d B a b e r s , F . H . J . B i o l . Chem. 1 0 0 , 743 ( 1 9 3 3 ) . ( 4 8 ) B o w e r i n g , ¥ . D . S . a n d T i m e l l , T . E . J . A m . Chem. S o c . 8 2 , 2827 ( 1 9 6 0 ) . ( 4 9 ) P e l z e r , H . H o p p e - S e y l . 3 1 4 , 234 ( 1 9 5 9 ) . ( 5 0 ) O r g a n i c S y n t h e s e s c o l l . v o l . 1, 437 ( 1 9 4 7 ) . 58 ) O r g a n i c R e a c t i o n s 7 , 393 ( 1 9 5 3 ) . ) C h a r a l a m p o u ' s ; , , F . C . a n d L y r a s , C . J . B i o l . C h e m . 2 2 8 , 1 ( 1 9 5 7 ) . , I L e e d s , N . S . , F u k u s h i m a , D . K . a n d G a l l a g h e r , T . F . J . A m . Chem. S o c . 7 6 , 2943 ( 1 9 5 4 ) . I S o d i u m a n d P o t a s s i u m B o r o h y d r i d e s , M e t a l H y d r i d e s I n c o r -p o r a t e d ( 1 9 5 8 ) . I H o f f m a n , M . N . J . B i o l . C h e m . .169 , 167 ( 1 9 5 7 ) . I W o t i z , H . H . , S m a k u l a , E . E i c h t i n , N . N . a n d L e f t i n , I . - H . J . A m . C h e m . S o c . 8 1 , 1704 ( 1 9 5 8 ) . I M e y s t r e , C . a n d M i e s c h e r , K. , H e l v . C h i m . A c t a 29,, 33 ( 1 9 4 6 ) . i S h a p i r o , E . B i o c h e m . J . 3 3 , 385 ( 1 9 3 9 ) . i S c h n e i d e r , J . a n d L e w b a r t , M . L . R e c e n t P r o g r e s s i n H o r -mone R e s e a r c h 1 5 , 201 ( 1 9 5 9 ) . ' i - N e h e r , R . a n d W e t t s t e i n , A . H e l v . C h i m . A c t a 3 4 , 2278 ( 1 9 5 1 ) . \< P r e e d y , J . R . K . M e t h o d s i n Hormone R e s e a r c h : E s t r o g e n s e d i t e d b y R . I . D o r f m a n New Y o r k ( 1 9 6 2 ) I . !• F e i g l , F . S p o t T e s t s I I - O r g a n i c A p p l i c a t i o n s 1 9 5 4 . I W o t i z , H . H . , S m a k u l a , E . L i c h t i n , N . N . a n d L e f t i n , . J . H . J . A m . C h e m . S o c . 8 1 , 1708 ( 1 9 5 8 ) . I R o b e r t s , K . D . , B a n d i , L . , C a l v i n , H . , D r u c k e r , W. D . a n d L i e b e r m a n , S . J . A m . Chem. S o c . 8 6 , 959 ( 1 9 6 4 ) . I H a c h , W. a n d B e n j a m i n , D . G . J . , A m . C h e m . S o c . 7 6 , 917 ( 1 9 5 4 ) . I G o e b e l , W. a n d B a b e r s , F . J . B i o l . Chem. 1 0 0 , 573 ( 1 9 3 3 ) . 5 9 ( 6 7 ) F i s h m a n , J . J . A m . C h e m . S o c . 8 2 , 6143 ( i 9 6 0 ) . ( 6 8 ) D u t t o n , G . J . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 6 , 65 ( 1 9 6 1 ) . ( 7 0 ) W a l l a c e , E . a n d L i e b e r m a n , S . J . C l i n . E n d o c r i n o l . & Me*. 2 3 , 90 ( 1 9 6 3 ) . ( 7 1 ) M e r c k I n d e x o f . C h e m i c a l s a n d D r u g s . M e r c k & C o . I n c . N . J . , U . S . A . 7 t h e d i t i o n ( i 9 6 0 ) . ( 7 2 ) F i s h m a n , W. H . The C h e m i s t r y o f D r u g M e t a b o l i s m , Thomas C o . , S p r i n g f i e l d , 1 1 1 . 1 9 6 1 . 

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