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An immunofluorescent demonstration of nuclear proteins David, Lyle Anacletus 1968

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831-UBC_1969_A1 D38.pdf [ 10.63MB ]
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A N I M M U N O F L U O R E S C E N T D E M O N S T R A T I O N O F N U C L E A R P R O T E I N S b y L Y L E A N A C L E T U S D A V I D B . S c , U n i v e r s i t y o f A l b e r t a , 1 9 6 2 M . S c , U n i v e r s i t y o f A l b e r t a , 1 9 6 5 A T H E S I S S U B M I T T E D I N P A R T I A L , F U L F I L M E N T O F T H E R E Q U I R E M E N T S F O R T H E D E G R E E O F D O C T O R O F P H I L O S O P H Y I N G E N E T I C S i n t h e D i v i s i o n of M e d i c a l G e n e t i c s W e a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d T H E U N I V E R S I T Y O F B R I T I S H C O L U M B I A N O V E M B E R 1968 In p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t o f the r e q u i r e m e n t s f o r an advanced degree a t the U n i v e r s i t y of B r i t i s h C olumbia, I a g r e e t h a t the L i b r a r y s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e and Study. I f u r t h e r agree t h a t p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e c o p y i n g o f t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y purposes may be g r a n t e d by the Head o f my Department or by h i s r e p r e s e n t a t i v e s . I t i s u n d e r s t o o d t h a t c o p y i n g o r p u b l i c a t i o n of t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l not be a l l o w e d w i t h o u t my w r i t t e n p e r m i s s i o n . Department of The U n i v e r s i t y o f B r i t i s h Columbia Vancouver 8, Canada i A B S T R A C T T h i s t h e s i s d e s c r i b e s t h e d e v e l o p m e n t o f a n i m m u n o -f l u o r e s c e n t t e c h n i q u e a n d i t s a p p l i c a t i o n t o a c y t o c h e m i c a l s t u d y o f t h e i n t r a c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f a b a s i c p r o t e i n c o m p o n e n t w h i c h s a t i s f i e s s e v e r a l c r i t e r i a u s e d t o i d e n t i f y h i s t o n e . T h e t e c h n i q u e w a s d e v e l o p e d i n t h r e e s t e p s : 1. P r o d u c t i o n o f A n t i b o d y T h e m e t h o d o f n u c l e a r p r o t e i n e x t r a c t i o n , , t h e p r e p -a r a t i o n o f t h e i n o c u l u m , t h e i m m u n i s a t i o n p r o c e d u r e a n d the s p e c i e s o f a n t i g e n d o n o r a n d r e c i p i e n t w e r e a l l c o n s i d e r e d c o n t r i b u t o r y o f t h e s u c c e s s f u l p r o d u c t i o n o f a n t i b o d y . 2 . A n a l y s e s o f A n t i g e n a n d A n t i b o d y E l e c t r o p h o r e t i c a n d c h r o m a t o g r a p h i c t e c h n i q u e s w e r e e m p l o y e d t o c h a r a c t e r i s e t he n u c l e a r p r o t e i n a n t i g e n s . T h e a n t i s e r u m w a s p u r i f i e d b y i m m u n o l o g i c a l a b s o r p t i o n a n d c h r o m a t o -g r a p h y . T h e a n t i g e n - a n t i b o d y r e s p o n s e s w e r e s t u d i e d u s i n g e l e c t r o p h o r e t i c a n d i m m u n o d i f f u s i o n t e c h n i q u e s , b o t h s i n g l y a n d i n c o m b i n a t i o n . 3 . A p p l i c a t i o n t o C e l l P r e p a r a t i o n s F l u o r e s c e n t a n t i b o d y p r o v i d e d a p r o t e i n t r a c e r w i t h w h i c h i i t o d e m o n s t r a t e t h e p r e c i s e c y t o l o g i c a l l o c a t i o n o f a n a l y t i c a l l y d e f i n e d n u c l e a r p r o t e i n s . T h e a n t i b o d y w a s p r o d u c e d i n t h e c h i c k e n a g a i n s t b a s i c p r o t e i n f r o m c a l f t h y m u s n u c l e i . I t w a s s p e c i f i c f o r n u c l e i a n d c h r o m o s o m e s b u t w a s n e i t h e r o r g a n n o r s p e c i e s s p e c i f i c . i i i A C K N O W L E D G E M E N T S T h e a u t h o r g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e s t h e s u p p o r t a n d d i r e c t i o n p r o v i d e d b y h i s c o m m i t t e e c h a i r m e n , D r . J . R . M i l l e r , o f t h e F a c u l t y o f M e d i c i n e , , a n d D r . C . P e r s o n , o f t h e B o t a n y D e p a r t m e n t . S p e c i a l t h a n k s a r e g i v e n t o D r . M . C o r e y f o r h e r c o n t i n u e d e n t h u s i a s m a n d i n t e r e s t i n d i r e c t i n g t h e r e s e a r c h p r o j e c t a n d a s s i s t i n g i n p r e p a r a t i o n o f t h e t h e s i s . T h e m e m b e r s o f t h e a d v i s o r y c o m m i t t e e g a v e f r e e l y o f t h e i r t i m e t o p r o v i d e a s s i s t a n c e . A p p r e c i a t i o n i s e x p r e s s e d t o D r . J . G e r w i n g f o r p r o v i d i n g t h e a m i n o a c i d a n a l y s e s . D r . C . F i n n e g a n w a s a l s o e s p e c i a l l y h e l p f u l w i t h h i s k n o w l e d g e of h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e s . T e c h n i c a l a s s i s t a n c e w a s r e c e i v e d f r o m s e v e r a l p e o p l e i n t h e Z o o l o g y D e p a r t m e n t , T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , a n d t h e D e p a r t m e n t o f P a e d i a t r i c s , V a n c o u v e r G e n e r a l H o s p i t a l . H e l p w i t h s e v e r a l p h a s e s o f t h e p r o j e c t w a s g i v e n b y M i s s A n n e W r i g h t t o w h o m I a m e s p e c i a l l y g r a t e f u l . T h a n k s a l s o g o t o C a n a d a P a c k e r s L t d . f o r p r o v i d i n g the b o v i n e t i s s u e s , t o t h e P a t h o l o g y D e p a r t m e n t o f t he V a n c o u v e r G e n e r a l H o s p i t a l f o r a u t o p s y s p e c i m e n s a n d t h e D e p a r t m e n t o f P o u l t r y S c i e n c e , T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , f o r t he i v c h i c k e n s . A l s o t o D r . R . B . L o w r y f o r a r r a n g i n g t h e c o l l e c t i o n o f l u p u s s e r u m . D r . R . F . R u t h , D e p a r t m e n t o f Z o o l o g y , U n i v e r s i t y o f A l b e r t a , E d m o n t o n , p r o v i d e d v a l u a b l e a d v i c e o n s e v e r a l o c c a s i o n s . T h i s w o r k w a s d o n e u n d e r a g r a n t p r o v i d e d b y t h e M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l o f C a n a d a . V. T A B L E O F C O N T E N T S P a g e A B S T R A C T i A C K N O W L E D G E M E N T S i i i I N T R O D U C T I O N 1 L I T E R A T U R E R E V I E W 3 I C h a r a c t e r i z a t i o n o f H i s t o r i e s 3 I I E a r l y S t u d i e s o f N u c l e a r P r o t e i n s 4 I I I P r e p a r a t i v e a n d A n a l y t i c a l P r o c e d u r e s 6 I V H i s t o n e s a s S t r u c t u r a l P r o t e i n s 10 V A c i d i c N u c l e a r P r o t e i n s 13 V I H i s t o c h e m i c a l C h a r a c t e r i z a t i o n o f H i s t o n e s 15 V I I A n t i g e n i c i t y o f N u c l e i c A c i d s a n d N u c l e a r P r o t e i n s 17 M E T H O D S A N D M A T E R I A L S 21 I I m m u n i s a t i o n P r o c e d u r e 2 1 1. I s o l a t i o n o f C a l f T h y m u s N u c l e i 2 1 2 . N u c l e a r P r o t e i n 21 3. P r e p a r a t i o n o f I n o c u l u m 22 4 . I m m u n i s a t i o n 2 2 II P r o t e i n A n a l y s i s 2 3 1. C h r o m a t o g r a p h y 23 A . D e s c r i p t i o n o f C h r o m a t o g r a p h i c C o l u m n s 2 3 B . C o l u m n P a c k i n g 2 4 v i C . P r o t e i n F r a c t i o n a t i o n 2 6 D . P r o t e i n C o n c e n t r a t i o n 2 6 2 . D i s c E l e c t r o p h o r e s i s 28 A . A c i d i c P r o t e i n s .28 B . B a s i c P r o t e i n s 28 3. A m i n o A c i d A n a l y s i s 30 4 . I m m u n o d i f f u s i o n 30 A . S e r u m P r o t e i n s 30 B . N u c l e a r P r o t e i n s 31 C . I m m u n o l o g i c a l A n a l y s i s o f . E l e c t r o p h o r e t i c F r a c t i o n s 32 5. P r e c i p i t i n T e s t s 33 I I I A b s o r p t i o n 34 I V N o n - I m m u n e S e r u m 34 V L u p u s E r y t h e m a t o s i s S e r u m 34 V I F l u o r e s c e n t D y e - P r o t e i n C o n j u g a t i o n 35 V I I H i s t o l o g i c a l T e c h n i q u e s 35 1. M a m m a l i a n C e l l s 35 A . P e r i p h e r a l B l o o d C u l t u r e s 35 B . B u c c a l S m e a r s 36 C . B l o o d S m e a r s 36 D . O r g a n I m p r i n t s 36 v i i 2 . I n s e c t M a t e r i a l 37 A . P o l y t e n e C h r o m o s o m e s 37 B . P r o t o z o a n C e l l s 37 3. P l a n t M a t e r i a l s 38 4 . A n t i b o d y A p p l i c a t i o n 39 5. A c r i d i n e O r a n g e S t a i n i n g 4 0 6. B i e b r i c h S c a r l e t S t a i n i n g 4 0 V I I I M i c r o s c o p y 4 0 I X P h o t o g r a p h y 4 1 R E S U L T S 4 3 I E x t r a c t i o n o f N u c l e a r P r o t e i n s 4 5 I I P r o d u c t i o n o f A n t i s e r u m 4 8 1. S c h e d u l e o f I m m u n i s a t i o n s a n d P r e c i p i t i n T e s t s 4 8 2 . I m m u n o d i f f u s i o n T e s t s 52 A . M i c r o - i m m u n o d i f f u s i o n 52 B . M a c r o - i m m u n o d i f f u s i o n 5 6 3. A b s o r p t i o n o f A n t i s e r u m 62 I I I A n a l y s i s o f N u c l e a r P r o t e i n E x t r a c t 65 1. D i s c E l e c t r o p h o r e s i s 65 2 . I m m u n o D i s c E l e c t r o p h o r e s i s 68 3. B i e b r i c h S c a r l e t S t a i n i n g 71 4 . A b s o r p t i o n o f A n t i g e n 71 v i i i I V C h r o m a t o g r a p h i c S e p a r a t i o n o f N u c l e a r P r o t e i n 7 6 V A n a l y s i s o f C h r o m a t o g r a p h i c F r a c t i o n s 84 1. D i s c E l e c t r o p h o r e s i s 8 4 2 . A m i n o A c i d C o m p o s i t i o n 87 3. I m m u n o d i f f u s i o n T e s t 89 V I P r e p a r a t i o n o f F l u o r e s c e n t S e r u m F r a c t i o n s 9 2 V I I A n a l y s i s o f F l u o r e s c e n t S e r u m F r a c t i o n s 9 7 1. D i s c E l e c t r o p h o r e s i s 97 2 . I m m u n o d i f f u s i o n T e s t 101 3. P r e c i p i t i n T e s t s 104 V I I I I m m u n o f l u o r e s c e n t T e s t s o f the C e l l u l a r L o c a l i s a t i o n a n d D i s t r i b u t i o n o f N u c l e a r 104 P r o t e i n A n t i g e n 1. B o v i n e C e l l s 105 A . C a l f T h y m u s I m p r i n t s 105 B . L i v e r C e l l s 110 C . S p l e e n C e l l s 110 D . T e s t i s C e l l s 113 E . C h r o m o s o m e s o f C u l t u r e d L e u k o c y t e s 116 2. H u m a n C e l l s 119 A . B u c c a l C e l l s 1.19 B . T h y m u s C e l l s 119 C . T e s t i s C e l l s 120 D . C h r o m o s o m e s o f C u l t u r e d L e u k o c y t e s 12 3 i x 3. I n s e c t C h r o m o s o m e s 126 4 . P l a n t C e l l s 129 5. P r o t o z o a n C e l l s 132 6. C h i c k e n B l o o d C e l l s 132 I X H u m a n L u p u s E r y t h e m a t o s i s A n t i b o d y A c t i v i t y A g a i n s t C a l f T h y m u s N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n s 138 S U M M A R Y 141 D I S C U S S I O N 145 B I B L I O G R A P H Y 15 6 A P P E N D I X 162 I . C h r o m o s o m a l P r e p a r a t i o n 162 I I . B u c c a l ( S m e a r s 165 I I I . A c r i d i n e O r a n g e S t a i n i n g 167 X L I S T O F T A B L E S T a b l e I I M M U N O C H E M I C A L P R O C E D U R E F O R T H E D E M O N S T R A T I O N O F N U C L E A R P R O T E I N A N T I G E N A T T H E C E L L U L A R L E V E L . 4 4 T a b l e I I A M I N O A C I D C O M P O S T I O N O F N U C L E A R . P R O T E I N P R E P A R A T I O N ( B A T C H 3)' 4 7 T a b l e I I I A M I N O A C I D C O M P O S I T I O N O F T H R E E F R A C T I O N S O F C H R O M A T O G R A P H E D N U C L E A R P R O T E I N 88 L I S T O F F I G U R E S F i g u r e 1 P r e c i p i t i n T e s t o f A n t i s e r a 3 3 3 a n d 312 51 F i g u r e 2 M i c r o - i m m u n o d i f f u s i o n T e s t s o f A n t i b o d y -A c t i v i t y o f C h i c k e n S e r u m A g a i n s t N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n 55 F i g u r e 3 M a c r o - i m m u n o d i f f u s i o n T e s t o f A n t i b o d y A c t i v i t y o f C h i c k e n S e r u m A g a i n s t N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n 58 F i g u r e 4 I m m u n o d i f f u s i o n T e s t o f A n t i s e r a 3 3 3 , 312 A g a i n s t C y t o p l a s m , H i s t o n e a n d N u c l e a r P r o t e i n 61 XI F i g u r e 5 I m m u n o d i f f u s i o n T e s t o f A n t i s e r u m 3 1 2 , A b s o r b e d w i t h C y t o p l a s m , A g a i n s t N u c l e a r P r o t e i n a n d C y t o p l a s m 64 F i g u r e 6 C o m p a r a t i v e D i s c E l e c t r o p h o r e s i s 67 F i g u r e 7 I m m u n o d i f f u s i o n T e s t o f T w o C h i c k e n A n t i s e r a A g a i n s t C a l f T h y m u s B a s i c N u c l e a r P r o t e i n s , F r a c t i o n e d b y D i s c E l e c t r o p h o r e s i s 7 0 F i g u r e 8 D i s c E l e c t r o p h o r e s i s o f N u c l e a r P r o t e i n S t a i n e d f o r P r o t e i n a n d H i s t o n e 74 F i g u r e 9 N u c l e a r P r o t e i n C h r o m a t o g r a p h y 8 0 F i g u r e 10 C h r o m a t o g r a p h y o f a M o l e c u l a r W e i g h t M i x t u r e 80 F i g u r e 11 N u c l e a r P r o t e i n C h r o m a t o g r a p h y 8 3 F i g u r e 12 D i s c E l e c t r o p h o r e t i c A n a l y s i s o f C h r o m a t o g r a p h e d N u c l e a r P r o t e i n s 86 F i g u r e 13 I m m u n o d i f f u s i o n T e s t o f U n f r a c d o n a t e d a n d C h r o m a t o g r a p h i c F r a c t i o n s o f N u c l e a r P r o t e i n 91 F i g u r e 14 S e p h a d e x C h r o m a t o g r a p h y o f a S a m p l e o f A b s o r b e d , I m m u n e , F l u o r e s c e n t C h i c k e n S e r u m 9 6 X l l F i g u r e 15 D i s c E l e c t r o p h o r e s i s o f A b s o r b e d , F l u o r e s c e n t , I m m u n e S e r u m 3 1 2 . B e f o r e a n d A f t e r C h r o m a t o g r a p h y 1 0 0 F i g u r e 16 M i c r o - i m m u n o d i f f u s i o n T e s t o f A b s o r b e d , F l u o r e s c e n t I m m u n e C h i c k e n S e r u m 312 103 F i g u r e 17 C a l f T h y m u s I m p r i n t s S h o w i n g P r e s e n c e o f D N A , H i s t o n e a n d B a s i c N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n i n N u c l e i 109 F i g u r e 18 B o v i n e L i v e r a n d S p l e e n I m p r i n t s S h o w i n g P r e s e n c e o f B a s i c N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n a n d H i s t o n e i n N u c l e i 112 F i g u r e 19 B o v i n e T e s t i s I m p r i n t s S h o w i n g t h e P r e s e n c e o f D N A , H i s t o n e a n d B a s i c N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n i n M e i o t i c N u c l e i a n d S p e r m H e a d s 115 F i g u r e 2 0 B o v i n e A c i d A l c o h o l F i x e d C h r o m o s o m e s S h o w i n g t h e P r e s e n c e o f B a s i c N u c l e a r P r o t e i n a n d N u c l e i c A c i d i n the S a m e S i t e s 118 F i g u r e 21 H u m a n C e l l s ( U n f i x e d ) S h o w i n g the P r e s e n c e o f B a s i c N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n i n N u c l e i 122 F i g u r e 22 H u m a n C h r o m o s o m e s S h o w i n g the P r e s e n c e o f B a s i c N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n 12 5 F i g u r e 2 3 C h r o m o s o m e s o f C h i r o n o m u s t e n t a n s S h o w i n g the P r e s e n c e o f B a s i c N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n 128 X1X1 F i g u r e 2 4 P l a n t C e l l s S h o w i n g t h e P r e s e n c e o f B a s i c N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n i n S o m e N u c l e i 131 F i g u r e 2-5 A n I n s e c t P a r a s i t e ( H o l o m a s t i g o t o i d e s) L a b e l l e d W i t h F l u o r e s c e n t A n t i b o d y 134 F i g u r e 2 6 C h i c k e n B l o o d ' C e l l s L a b e l l e d W i t h F l u o r e s c e n t A n t i b o d y 137 F i g u r e 27 I m m u n o d i f f u s i o n T e s t o f A n t i b o d y A c t i v i t y o f L . E . P l a s m a A g a i n s t B a s i c N u c l e a r P r o t e i n 140 1 I N T R O D U C T I O N P r o t e i n s m a k e u p a p p r o x i m a t e l y 7 0 % o f t h e c h r o m a t i n n e t w o r k o f i n t e r p h a s e n u c l e i ( B u s c h , 1 9 6 5 , p . 5) a n d a r e a n i n t e g r a l c o m p o n e n t o f c h r o m o s o m e s ( M i r s k y a n d R i s , 1 9 4 7 ) . H i s t o n e s , t h e D N A - a s s o c i a t e d b a s i c n u c l e a r p r o t e i n s , c o m p r i s e a b o u t 3 5 % o f the t o t a l p r o t e i n i n n u c l e i . T h e r e m a i n d e r i s m a d e u p o f h i g h l y i n s o l u b l e a c i d i c p r o t e i n s w h i c h a r e a l s o p r e s e n t i n c y t o p l a s m . B o t h t h e s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l r o l e s o f n u c l e a r p r o t e i n s a r e u n r e s o l v e d b u t i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t h i s t o n e s a r e i n v o l v e d i n the c o n t r o l o f D N A a c t i v i t y ( S t e d m a n a n d S t e d m a n , 1 9 5 0 ) . B o t h a c i d i c n u c l e a r p r o t e i n s ( M i r s k y a n d R i s , 1 9 4 7 ) a n d h i s t o n e s ( Z u b a y a n d D o t y , 1959) h a v e b e e n p r o p o s e d t o be i n v o l v e d i n t he m a i n t e n a n c e o f c h r o m o s o m e s t r u c t u r e . S e v e r a l e x t r a c t i o n a n d s e p a r a t i o n t e c h n i q u e s a r e a v a i l a b l e f o r t h e s t u d y o f h i s t o n e s , b u t t h e c y t o c h e m i c a l t e c h n i q u e s n o w i n u s e a r e i n a d e q u a t e f o r d i s t i n g u i s h i n g b e t w e e n t h e d i f f e r e n t h i s t o n e f r a c t i o n s i n c e l l s a n d c h r o m o s o m e s . T h e i m m u n o f l u o r e s c e n t t e c h n i q u e ( C o o n s , 1 9 5 1 ) i s h i g h l y s p e c i f i c a n d s e n s i t i v e . I t h a s n o t b e e n w i d e l y a p p l i e d t o s t u d i e s o f n u c l e a r p r o t e i n s b e c a u s e o f t h e d i f f i c u l t i e s i n v o l v e d i n the p r o d u c t i o n o f f l u o r e s c e n t a n t i b o d y a g a i n s t n u c l e a r p r o t e i n s , w h i c h h a v e l o n g b e e n c o n s i d e r e d n o n - a n t i g e n i c ( W i l s o n e t a l . , 1 9 6 6 ) . T h i s p r o j e c t w a s d e s i g n e d t o a t t e m p t t h e a p p l i c a t i o n o f 2 a n i m m u n o f l u o r e s c e n t t e c h n i q u e t o a s t u d y o f n u c l e a r p r o t e i n s i n c e l l u l a r a n d c h r o m o s o m a l p r e p a r a t i o n s . S i n c e t e c h n i q u e s f o r t h e p r e p a r a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n of a c i d i c n u c l e a r p r o t e i n s h a v e r e c e i v e d s c a n t a t t e n t i o n , b a s i c n u c l e a r p r o t e i n s w e r e c h o s e n a s t he a n t i g e n i c m a t e r i a l . 3 L I T E R A T U R E R E V I E W I . C H A R A C T E R I Z A T I O N O F H I S T O N E S H i s t o n e s a r e d e f i n e d a s b a s i c p r o t e i n s t h a t a t s o m e t i m e a r e a s s o c i a t e d w i t h D N A ( M u r r a y , 1 9 6 4 ) . T h i s d e f i n i t i o n i n c l u d e s p r o t a m i n e s w h i c h a r e c o n s i d e r e d t o be a n a l o g o u s » p r o t e i n s . T h e n o m e n c l a t u r e u s e d f o r v a r i o u s h i s t o n e f r a c t i o n s b y d i f f e r e n t l a b o r a t o r i e s d e p e n d s o n t h e m e t h o d o f a n a l y s i s o r p r e p a r a t i o n . T h i s h a s l e d t o s e v e r a l s y s t e m s o f c l a s s i f i c a t i o n , b a s e d o n a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n , N H £ - t e r m i n a l a m i n o a c i d , p r e c i p i t a t i o n b e h a v i o u r , e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y , c h r o m a t o g r a p h y a n d s e d i m e n t a t i o n r a t e ( B u s c h , 1 9 6 5 , p . 4 0 ) . M u r r a y ( 1 9 6 4 ) l i s t s t w e n t y - s e v e n f r a c t i o n s t h a t h a v e b e e n d e s c r i b e d i n t h e l i t e r a t u r e u s i n g a v a r i e t y of s y m b o l s t h a t s h o w a l m o s t n o c o r r e l a t i o n w i t h e a c h o t h e r . T h e m o l a r r a t i o s o f l y s i n e t o a r g i n i n e f o r t h e s e f r a c t i o n s f o r m a c o n t i n u o u s r a n g e o f v a l u e s f r o m 0 . 09 t o 1. 3 5 . H e s u g g e s t s t h a t t h i s r a t i o be a d a p t e d a s a n i n i t i a l d e s c r i p t i o n o f a h i s t o n e f r a c t i o n f o l l o w e d b y a s c o m p l e t e a d e s c r i p t i o n a s p o s s i b l e . T h i s s y s t e m c o u l d be u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e m o r e g e n e r a l a n d w i d e l y u s e d c l a s s i f i c a t i o n s , v e r y l y s i n e - r i c h , l y s i n e - r i c h , s l i g h t l y l y s i n e - r i c h a n d a r g i n i n e - r i c h . S i n c e n o s i n g l e h i s t o n e c o m p o n e n t h a s b e e n i s o l a t e d i n a p u r e f o r m , c h a r a c t e r i z a t i o n o f h i s t o n e f r a c t i o n s a r e d e s c r i p t i o n s o f m i x t u r e s o f p r o t e i n s . T h i s 4 h a s l e d t o m u c h c o n f u s i o n i n t h e l i t e r a t u r e . I I . E A R L Y S T U D I E S O F N U C L E A R P R O T E I N S S t u d i e s i n v o l v i n g p r o t e i n s a s e s s e n t i a l c o m p o n e n t s o f t h e c e l l n u c l e u s b e g a n one h u n d r e d y e a r s a g o i n t h e l a b o r a t o r i e s o f D r . E r n s t H o p p e - S e y l e r a t t h e U n i v e r s i t y o f S t r a s b o u r g ( B o n n e r a n d T S ' O , 1 9 6 4 ) . T h e e a r l i e s t w o r k w a s p e r f o r m e d i n 1 8 6 9 b y o n e of h i s s t u d e n t s , J o h a n F r i e d r i c h M e i s c h e r , w h o i s o l a t e d a c r u d e p r e p a r a t i o n , w h i c h h e c a l l e d " n u c l e i n " , f r o m p u s c e l l n u c l e i ( M e i s c h e r , 1 8 9 7 ) . T h i s m a t e r i a l w a s f o u n d t o b e r i c h i n p h o s -p h o r o u s a n d w a s p r e s e n t i n a l l t h e n u c l e i he e x a m i n e d . I n 1872 M e i s c h e r a g a i n i s o l a t e d a D N A l i k e s u b s t a n c e , t h i s t i m e f r o m s a l m o n s p e r m a t o z o a , a l o n g w i t h a n i t r o g e n r i c h b a s i c p r o t e i n w h i c h h e c a l l e d " p r o t a m i n e " . T h i s w o r k w a s c o n t i n u e d b y a n o t h e r o f H o p p e - S e y l e r ' s a s s i s t a n t s , A l b r e c h t K o s s e l . D u r i n g t h e p e r i o d f r o m 1872 t o 1 9 1 0 K o s s e l p u b l i s h e d a s e r i e s o f p a p e r s o n t h e c h e m i s t r y o f t h e c e l l n u c l e u s w h i c h c u l m i n a t e d i n h i s r e c e i v i n g t h e N o b e l P r i z e i n m e d i c i n e . H e s h o w e d t h a t t h e p r o t a m i n e s w e r e u n i q u e t o g e r m c e l l s a n d w e r e n o t p r e s e n t i n u n r i p e s a l m o n t e s t e s , b u t a n o t h e r b a s i c p r o t e i n s u b s t a n c e w h i c h h e c a l l e d " h i s t o n e " w a s p r e s e n t i n n u c l e i f r o m s o m a t i c c e l l s . H e w a s a b l e t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e s e n u c l e o p r o t e i n s o n t h e b a s i s o f a r g i n i n e c o n t e n t , t h e p r o t a m i n e s c o n t a i n i n g h i g h a m o u n t s o f a r g i n i n e , the h i s t o n e s m u c h l e s s . I n 1884 h e i s o l a t e d h i s t o n e s f r o m g o o s e e r y t h r o c y t e n u c l e i b y u s i n g w a t e r to d i s r u p t the c e l l m e m b r a n e s a n d c e n t r i f u g a t i o n to s e p a r a t e o u t t he n u c l e a r m a s s . B y 1910 K o s s e l h a d s h o w n t h a t h i s c l a s s i c p r e p a r a t i o n s w e r e a c t u a l l y a c o m p l e x o f p r o t e i n s w i t h d i f f e r e n t s o l u b i l i t i e s a n d a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n s . A l l p r o t e i n s i n t h i s c l a s s h a d s o m e c o m m o n f e a t u r e s , h o w e v e r . T h e y w e r e s i m i l a r to p r o t a m i n e s i n h a v i n g a h i g h i s o e l e c t r i c p o i n t a n d the a b i l i t y to c o m b i n e w i t h a c i d s i n f a c t t h e y w e r e a l w a y s f o u n d i n a s s o c i a t i o n w i t h n u c l e i c a c i d s . T h e y w e r e t h o u g h t to c o n t a i n 1 7 - 3 0 % a r g i n i n e i n c o m p a r i s o n to 8 0 % a r g i n i n e f o r p r o t a m i n e . K o s s e l h y p o t h e s i z e d t h a t h i s t o n e s w e r e l a r g e r , m o r e c o m p l e x , m o l e c u l e s t h a n p r o t a m i n e s , a n d t h a t t h e y w e r e d e g r a d e d d u r i n g s p e r m a t o g e n e s i s to f o r m p r o t a m i n e s b y the l o s s o f n o n - b a s i c a m i n o a c i d s . A n o t h e r i m p o r t a n t a d v a n c e i n e a r l y h i s t o n e c h e m i s t r y w a s the i s o l a t i o n o f m a m m a l i a n h i s t o n e s f r o m c a l f t h y m u s c e l l s . T h i s w a s d o n e b y L i l i e n f i e l d w h o w a s a s t u d e n t o f K o s s e l i n 1894 . T h i s p r o c e d u r e m a d e p o s s i b l e t he p r e p a r a t i o n o f l a r g e a m o u n t s o f n u c l e a r p r o t e i n f r o m a n e a s i l y o b t a i n a b l e s o u r c e . T h i s m a t e r i a l w a s c h o s e n b e c a u s e the t h y m u s i s c o m p o s e d a l m o s t e n t i r e l y o f l o o s e l y p a c k e d c e l l s , s i m i l a r to s m a l l l y m p h o c y t e s , w h i c h h a v e a p r e d o m i n a n t n u c l e u s s u r r o u n d e d b y a t h i n l a y e r o f c y t o p l a s m . 6 ( B u s c h , 1 9 6 5 , p . 12) . T h e s t u d y o f n u c l e a r p r o t e i n s r e m a i n e d d o r m a n t f o r m a n y y e a r s a f t e r the i n i t i a l w o r k b y E u r o p e a n b i o l o g i s t s a n d w a s n o t t a k e n u p a g a i n u n t i l m o r e r e c e n t t i m e s . T h e p r e s e n t w a v e o f i n t e r e s t i n h i s t o n e s s t e m s f r o m a s h o r t c o m m u n i c a t i o n o f N a t u r e b y S t e d m a n l a n d S t e d m a n i n 1950 . T h e y s t u d i e d h i s t o n e s f r o m d i f f e r e n t t i s s u e s o f the o x , f o w l , c o d , s a l m o n a n d h u m a n a n d u s e d a r g i n i n e c o n t e n t a s t h e i r m e a s u r e o f s p e c i f i c i t y . A l t h o u g h t h e y c o u l d f i n d n o d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e i r m a i n f r a c t i o n s t h e y d i d f i n d s o m e m i n o r i n t e r s p e c i e s d i f f e r e n c e s . T h i s l e d t h e m to s u g g e s t t h a t h i s t o n e s m i g h t a c t a s g e n e s u p p r e s s o r s , s i n c e t h e y k n e w t h a t a l t h o u g h c e l l s w i t h i n a n o r g a n i s m c o n t a i n e d i d e n t i c a l s e t s o f g e n e s , t h e y w e r e c a p a b l e o f p r e f o r m i n g d i f f e r e n t f u n c t i o n s . I I L P R E P A R A T I V E A N D A N A L Y T I C A L P R O C E D U R E S I n 19 54 D a l y a n d M i r s k y d e v i s e d a p r o c e d u r e , i n w h i c h s t r o n g a c i d s w e r e a v o i d e d , f o r r e m o v i n g h i s t o n e s f r o m i s o l a t e d c a l f t h y m u s n u c l e i . T h e c y t o p l a s m i c c o n s t i t u e n t s w e r e r e m o v e d f r o m t h y m o c y t e s b y h o m o g e n i z i n g the t h y m u s t i s s u e i n c i t r i c a c i d . T h e h i s t o n e s w e r e e x t r a c t e d b y a d d i n g s o d i u m c h l o r i d e to the n u c l e a r s u s p e n s i o n a t v a r i o u s m o l a r i t i e s . A t l o w s a l t c o n c e n t r a t i o n s a h i s t o n e f r a c t i o n w a s e x t r a c t e d t h a t h a d a l y s i n e - a r g i n i n e r a t i o o f a p p r o x i m a t e l y 9 : 1 a n d c o n t a i n e d 3 5 . 9% l y s i n e . T h i s r a t i o d e c r e a s e d to 1 : 1 a s t he s a l t c o n c e n t r a t i o n w a s i n c r e a s e d . T h e y 7 o b t a i n e d l y s i n e - r i c h h i s t o n e s f r o m c a l f l i v e r a n d t u r t l e r e d - c e l l s a s w e l l , a n d c o n c l u d e d t h a t the l y s i n e - r i c h h i s t o n e s w e r e a c o n s t a n t n u c l e a r c o m o n e n t t h a t w a s m o r e r e a d i l y d i s s o c i a b l e f r o m n u c l e i c a c i d t h a n w a s the a r g i n i n e - r i c h h i s t o n e s . T h i s n e w h i s t o n e , b e i n g s o l u b l e a t p H 10 . 6 ( the i s o e l e c t r i c r e g i o n a t w h i c h a r g i n i n e -r i c h h i s t o n e s p r e c i p i t a t e ) , h a d p r e v i o u s l y b e e n d i s c a r d e d i n the s u p e r n a t e n t . T h i s s t u d y e m p h a s i s e d t h a t h i s t o n e s w e r e a c o m p l e x o f b a s i c p r o t e i n s t h a t w o u l d r e q u i r e s p e c i a l m e t h o d s f o r s e p a r a t i o n a n d a n a l y s i s . D u r i n g the e a r l y 1 9 5 0 ' s t w o n e w t e c h n i q u e s w e r e a p p l i e d to the s t u d y o f h i s t o n e s : c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y a n d e l e c t r o p h o -r e s i s . C r u f t a n d h i s c o l l e a g u e s ( C r u f t e t aL . 1957) u s e d m o v i n g b o u n d a r y e l e c t r o p h o r e s i s to s e p a r a t e h i s t o n e s f r o m s e v e r a l s o u r c e s o n t h e b a s i s o f t h e i r e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y , a n d d e s i g n a t e d the t h r e e f r a c t i o n s t h e y o b t a i n e d a s a l p h a , b e t a a n d g a m m a . A m i n o a c i d a n a l y s i s s h o w e d t h a t t h e s e f r a c t i o n s c o u l d a l s o b e d e s i g n a t e d a s l y s i n e - r i c h , a r g i n e - r i c h , a n d s l i g h t l y l y s i n e - r i c h ( C r u f t e t a L 1 9 5 8 ) . T h e y a l s o o b s e r v e d t h a t h i s t o n e s t e n d to f o r m m o l e c u l a r a g g r e g a t e s a t p H ' s a b o v e 4 . T h i s p l a c e d a l i m i t a t i o n o n t h o s e c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d s t h a t r e q u i r e d r a s t i c c h a n g e s i n p H f o r e l u t i o n a n d s e p a r a t i o n o f h i s t o n e s . H o w e v e r , i n 1 9 5 5 C r a m p t o n e t a l , a c h i e v e d f r a c t i o n -a t i o n o f the l e s s b a s i c c a l f t h y m u s h i s t o n e s o n c o l u m n s o f t he 8 c a r b o x y l i c a c i d r e s i n 1 RC - 50 u s i n g b a r i u m a c e t a t e b u f f e r o f c o n t i n u o u s l y i n c r e a s i n g i o n i c s t r e n g t h . They o b t a i n e d t h r e e p r o t e i n f r a c t i o n s w h i c h were c h a r a c t e r i z e d as h i s t o n e s on t h e b a s i s o f amino a c i d c o n t e n t . Improved r e s u l t s were o b t a i n e d w i t h g u a n a d i n i u m c h l o r i d e b u f f e r ( B u s c h , 1 9 6 5 , p . 7 8 ) . The use o f c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e co lumns was p i o n e e r e d by D a v i s o n (1957) who used i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f N a C l t o s e p a r a t e a l y s i n e - r i c h f r a c t i o n f rom t h e r e m a i n d e r o f t he h i s t o n e s . He was a b l e t o a c h i e v e 90% r e c o v e r y o f t h e h i s t o n e s c h r o m a t o g r a p h e d by t h i s me thod . One o f t h e ma jo r t e c h n i c a l p r o b l e m s a t t h i s t i m e was the need f o r a method o f a n a l y s i s o f h i s t o n e f r a c t i o n s w h i c h w o u l d d i s t i n g u i s h be tween m i x t u r e s o f p r o t e i n s and f r a c t i o n s c o n t a i n i n g a s i n g l e component . To t h i s end N e e l i n and C o n n e l l (1959) a p p l i e d t h e method o f e l e c t r o p h o r e s i s i n a s t a r c h g e l i n t r o d u c e d by S m i t h i e s ( 1 9 5 5 ) . They r e p o r t e d t h e f r a c t i o n a t i o n o f c h i c k e n e r y t h r o c y t e h i s t o n e i n t o s i x t e e n bands a t pH 4 . 1 , I n 1960 N e e l i n and N e e l i n a c h i e v e d e l e c t r o p h o r e s i s o f c a l f thymus i n t o 18 bands a t pH 4 . 9 , a g a i n s u b s t a n t i a t i n g t h a t h i s t o n e s were c o m p l e x . C o r r e l a t i o n o f c h r o m a t o g r a p h i c f r a c t i o n s , e l e c t r o -p h o r e t i c p a t t e r n s and amino a c i d a n a l y s i s was b r o u g h t about by J o h n s e t a l . , i n 1 9 6 1 . They c h r o m a t o g r a p h e d c a l f thymus h i s t o n e 9 o n c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e u s i n g s o d i u m a c e t a t e b u f f e r a t p H 4 . 2 a n d N a C l t o e l u t e t h r e e p e a k s . T h e s e p e a k s , c a l l e d F l , F 2 a n d F 3 , w e r e c h a r a c t e r i s e d a s l y s i n e - r i c h , s l i g h t l y l y s i n e - r i c h a n d a r g i n i n e - r i c h . F u r t h e r , e a c h f r a c t i o n p r o d u c e d a c h a r a c t e r i s t i c e l e c t r o p h o r e t i c b a n d i n g p a t t e r n w h i c h , w h e n r e c o m b i n e d , r e p r o d u c e d t h e o r i g i n a l p a t t e r n o f w h o l e h i s t o n e . I n o r d e r t o s e p a r a t e h i s t o n e o n t h e b a s i s o f m o l e c u l a r s i z e a n d a v o i d a g g r e g a t i o n o f h i s t o n e m o l e c u l e s , c o l u m n s o f S e p h a d e x G - 7 5 w e r e f i r s t u s e d b y C r u f t ( 1961) a n d a m o r e d e t a i l e d a n a l y s i s o f t h i s m e t h o d m a d e b y J o h n s o n e t a l . ( 1 9 6 4 ) . C r u f t a c h i e v e d 1 0 0 % r e c o v e r y o f h i s t o n e u s i n g 0 . 02 N H C 1 a s t h e e l u t i n g s o l u t i o n . H e w a s a b l e t o r e c o v e r 3 p e a k s c o n t a i n i n g f r a c t i o n s t h a t c o r r e s p o n d e d t o 3 b a n d i n g g r o u p s o n s t a r c h g e l e l e c t r o p h o r e s i s . J o h n s o n a n d h i s c o - w o r k e r s f o u n d t h a t s a t i s f a c t o r y s e p a r a t i o n s c o u l d b e a c h i e v e d o n S e p h a d e x u s i n g s o d i u m c i t r a t e b u f f e r a t p H 7 . 0 . A s l o n g a s t h e s o d i u m c o n c e n t r a t i o n w a s k e p t a t o r a b o v e 0 . 0 2 M t h e p r e s e n c e o f s o d i u m i o n s p r e v e n t e d a d s o r p t i o n o f h i s t o n e o n t h e S e p h a d e x g r a n u l e s a n d d i d n o t a l l o w a g g r e g a t e f o r m a t i o n . T h e y c o n c l u d e d t h a t S e p h a d e x r e s o l v e d h i s t o n e s i n t o f o u r o r f i v e i n c o m p l e t e l y r e s o l v e d , h e t e r o g e n e o u s f r a c t i o n s . A n o t h e r r e c e n t a d v a n c e i n h i s t o n e c h a r a c t e r i s a t i o n i s t h e u s e o f p o l y a c r y l a m i d e g e l s a s a n e l e c t r o p h o r e t i c m e d i u m . T h i s m e t h o d h a s t h e a d v a n t a g e o f a l l o w i n g g e l p o l y m e r i z a t i o n a t 10 p H v a l u e s a s l o w a s 2 . 3 t h e r e b y d e c r e a s i n g t h e p o s s i b i l i t y o f h i s t o n e a g g r e g a t i o n . A l s o t h e u s e o f g e l s h a v i n g v a r i a b l e p o r e s i z e s a n d v e r y t h i n s t a r t i n g z o n e s r e s u l t s i n h i g h r e s o l u t i o n d u r i n g r e l a t i v e l y s h o r t r u n s . M c A l l i s t e r , W a n a n d I r v i n ( 1 9 6 3 ) a n d S h e p h e r d a n d G u r l e y ( 1 9 6 5 ) m o d i f i e d t h e o r i g i n a l p r o c e d u r e s a n d a d a p t e d a s i n g l e l o w p H g e l w i t h a p o r o s i t y a p p r o p r i a t e f o r e l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n o f h i s t o n e s . S h e p h e r d a n d G u r l e y e x p e r i m e n t e d w i t h a c i d e x t r a c t e d c a l f t h y m u s h i s t o n e w h i c h p r o d u c e d h i g h l y c o m p l e x b a n d i n g p a t t e r n s . T h e n u m b e r o f b a n d s a n d t h e i r m o b i l i t i e s v a r i e d c o n s i d e r a b l y w h e n d i f f e r e n t a m o u n t s o f s a m p l e s w e r e u s e d . N e v e r t h e l e s s , t h e y c o n c l u d e d t h a t i t w a s a s i m p l e , s e n s i t i v e , a n d h i g h l y r e p r o d u c e a b l e > t e c h n i q u e . M c A l l i s t e r , W a n a n d I r v i n u s e d a s l i g h t l y d i f f e r e n t b u f f e r s y s t e m a n d c o m p a r e d t h e b a n d i n g p a t t e r n s p r e s e n t w h e n s e v e r a l d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s o f c a l f t h y m u s h i s t o n e s w e r e t e s t e d . T h e y a l s o a c h i e v e d h i g h r e s o l u t i o n a n d r e p r o d u c e a b i l i t y , w h i c h t h e y f e l t w a s s u p e r i o r t o t h a t o f s t a r c h g e l e l e c t r o p h o r e s i s ; I V . H I S T O N E S A S S T R U C T U R A L P R O T E I N S C h r o m o s o m e s o f h i g h e r o r g a n i s m s c o n t a i n a p p r o x i m a t e l y e q u a l a m o u n t s o f D N A a n d h i s t o n e h e l d t o g e t h e r b y e l e c t r o s t a t i c b o n d s . T h e y c a n b e s e p a r a t e d b y e x p o s u r e t o h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f s a l t s o r a c i d s . O n r e m o v a l o f t h e s a l t s o r a c i d s b y d i a l y s i s t h e 11 DNA and h i s t o n e r e - f o r m a n u c l e o h i s t o n e c o m p l e x w h i c h behaves as a g e l i n c o n c e n t r a t e d s o l u t i o n s , s u g g e s t i n g t h a t h i s t o n e a c t s as a m o l e c u l a r b r i d g e l i n k i n g n u c l e o p r o t e i n m o l e c u l e s t o g e t h e r as w e l l as f o r m i n g more i n t i m a t e a s s o c i a t i o n s w i t h DNA. X - r a y d i f f r a c t i o n p a t t e r n s s u g g e s t t h a t h i s t o n e i s bound more o r l e s s r e g u l a r l y a l o n g t h e l a r g e g r o o v e o f t h e DNA h e l i x . H i s t o n e b r i d g e s be tween DNA m o l e c u l e s a r e a l s o p r o p o s e d t o l i e p a r a l l e l t o the l a r g e g r o o v e o f DNA w i t h t h e i r l o n g a x i s a t an a n g l e o f s i x t y d e g r e e s t o t h e l o n g a x i s o f DNA ( Z u b a y , 1 9 6 4 ) . T h i s c o n c e p t i n v o l v e s h i s t o n e s i n the m a i n t e n a n c e o f chromosome s t r u c t u r e d u r i n g c e l l d i v i s i o n and i n t h e o r g a n i z a t i o n o f c h r o m a t i n d u r i n g i n t e r p h a s e . T h i s i s a t v a r i a n c e w i t h t he f i n d i n g o f S o m e r s , C o l e and H s u (1963) t h a t a c i d e x t r a c t i o n o f h i s t o n e s d i d n o t a f f e c t t h e s t r u c t u r e o f metaphase chromosomes . T h a t p r o t e i n o f some n a t u r e i s n e c e s s a r y as a s t r u c t u r a l component has been shown by the c o m p l e t e d i s r u p t i o n o f chromosomes f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h t r y p s i n ( B u s c h , 1 9 6 5 , p . 9 2 ) . I n a r e c e n t a r t i c l e L i t t a u e t a l . (1965) showed c o n v i n c i n g e v i d e n c e t h a t one h i s t o n e component , t h e l y s i n e - r i c h f r a c t i o n , i s i n v o l v e d i n h o l d i n g c h r o m a t i n t o g e t h e r i n c lumps i n i n t e r p h a s e n u c l e i . They s e l e c t i v e l y removed s i n e - r i c h and a r g i n i n e - r i c h h i s t o n e s f r o m c a l f thymus n u c l e i , u s i n g s a l t and a c i d e x t r a c t i o n p r o c e d u r e s . The n u c l e i we re examined by e l e c t r o n m i c r o s c o p y f o r d e p l e t i o n o f c h r o m a t i n a g g r e g a t e s on r e m o v a l o f h i s t o n e s a n d r e a g g r e g a t i o n w h e n h i s t o n e s w e r e a d d e d b a c k t o t h e n u c l e i . T h e y r e p o r t t h a t t h e d e n s e c h r o m a t i n o f t h y m o c y t e n u c l e i i s i n a c t i v e i n R N A s y n t h e s i s a n d i s h e l d i n a c o n d e n s e d s t a t e b y c r o s s - l i n k a g e o f l y s i n e - r i c h h i s t o n e . A r g i n i n e - r i c h h i s t o n e a l s o c o m b i n e s w i t h c h r o m a t i n f i b r i l s b u t d o e s n o t c r o s s l i n k t h e m . S i n c e h i s t o n e s a r e a t t a c h e d t o D N A t h r o u g h s a l t l i n k a g e , i t i s o f p a r t i c u l a r i n t e r e s t t h a t s e v e r a l h i s t o n e f r a c t i o n s t h a t h a v e b e e n s t u d i e d c o n t a i n e d s u f f i c i e n t b a s i c a m i n o a c i d s t o s a t u r a t e the p h o s p h a t e g r o u p s o f D N A , p r e s e n t i n t he n u c l e i f r o m w h i c h t h e h i s t o n e s w e r e e x t r a c t e d ( V e n d r e l y e t a l . , I 9 6 0 ) . S i n c e t h e p h o s p h a t e g r o u p s o f D N A a r e r e g u l a r l y s p a c e d a n d h i s t o n e s w e r e p r o p o s e d t o l i e a l o n g t h e m a j o r g r o o v e i n the D N A h e l i x , i t w a s e x p e c t e d t h a t t h e b a s i c a m i n o a c i d s o f h i s t o n e s m i g h t s h o w a c o m p l e m e n t a r y s p a c i n g . P h i l l i p s a n d S i m p s o n ( 1 9 6 2 ) i n v e s t i g a t e d t h e n u m b e r o f n o n - b a s i c a m i n o a c i d s t h a t w e r e p r e s e n t b e t w e e n l y s i n e a n d a r g i n i n e r e s i d u e s , u s i n g a t r y p t i c d i g e s t o f c a l f t h y m u s h i s t o n e . S i n c e a p p r o x i m a t e l y o n e q u a r t e r o f t h e a m i n o a c i d s p r e s e n t w e r e b a s i c t h e y l o o k e d f o r e v e n s p a c i n g o f l y s i n e a n d a r g i n i n e s e p a r a t e d b y t h r e e n o n - b a s i c a m i n o a c i d s . T h e y f o u n d t h a t t h e b a s i c a m i n o a c i d s w e r e i r r e g u l a r l y s p a c e d a n d v a r i e d f r o m b e i n g i n j u x t a p o s i t i o n t o b e i n g s e p a r a t e d b y s e v e n n o n - b a s i c a m i n o a c i d s . I t a p p e a r s t h a t m o s t h i s t o n e - D N A i n t e r a c t i o n s d o n o t f i t a s i m p l e m o d e l o f p h o s p h a t e n e u t r a l i s a t i o n b y r e g u l a r l y 13 s p a c e d b a s i c a m i n o a c i d s l y i n g i n p a r a l l e l ( B u s c h , 1 9 6 5 , p . 1 0 8 ) . V . A C I D I C N U C L E O P R O T E I N S H i s t o n e s h a v e b e e n e x t e n s i v e l y s t u d i e d i n t h e p a s t b e c a u s e o f t h e i r c l o s e a s s o c i a t i o n w i t h n u c l e i c a c i d a n d t h e r e l a t i v e e a s e w i t h w h i c h t h e y c a n be e x t r a c t e d f r o m n u c l e i i n a s o l u b l e f o r m . H o w e v e r , t h e y m a k e up o n l y a b o u t o n e t h i r d o f t h e t o t a l p r o t e i n o f t h e n u c l e u s . T h e r e m a i n d e r o f t h e n u c l e o p r o t e i n s a r e i n s o l u b l e i n a c i d s o l u t i o n s a n d m a k e u p 4 5 t o 50 % of t h e d r y w e i g h t o f t h e n u c l e u s . T h e s e a c i d i c n u c l e o p r o t e i n s h a v e n o t b e e n c h a r a c t e r i s e d , e i t h e r b i o c h e m i c a l l y o r f u n c t i o n a l l y , b e c a u s e o f t h e i r p e c u l i a r s o l u b i l i t y c h a r a c t e r i s t i c s . T h e y a r e i n s o l u b l e i n m o s t a q u e o u s r e a g e n t s u s e d f o r c o n v e n t i o n a l s t u d i e s o n p r o t e i n s , b e i n g s o l u b l e o n l y i n s a l t s o l u t i o n s o f h i g h m o l a r i t y o r d i l u t e a l k a l i ( 0 . 0 5 N N a O H ) . T h i s g r o u p o f p r o t e i n s i s t h o u g h t t o c o m p r i s e a v a r i e t y o f m o l e c u l a r s p e c i e s c o m i n g f r o m d i f f e r e n t n u c l e a r s t r u c t u r e s , h a v i n g d i f f e r e n t f u n c t i o n s , b u t a r e g r o u p e d t o g e t h e r b e c a u s e o f t h e i r h i g h c o n c e n t r a t i o n i n t h e n u c l e u s , c o m m o n s o l u b i l i t y c h a r a c t e r i s t i c s , t h e p r e s e n c e o f h i g h a m o u n t s o f a s p a r t i c a n d g l u t a m i c a m i n o a c i d s , a n d t h e h i g h r a t e a t w h i c h t h e y i n c o r p o r a t e l a b e l l e d a m i n o a c i d s i n v i v o ( B u s c h , 1 9 6 5 , p . p . 197 - 3 2 6 ) . S t e e l e a n d B u s c h ( 1 9 6 3 ) p r e p a r e d s a l t a n d a l k a l i n e e x t r a c t s o f a c i d i c n u c l e o p r o t e i n s f r o m n u c l e i o f n o r m a l l i v e r a n d a W a l k e r t u m o u r i n a r a t . T h e y c o m p a r e d t h e s e p r o t e i n s f o r a m i n o 14 a c i d c o n t e n t , N H ^ - t e r m i n a l a m i n o a c i d s a n d s y n t h e t i c a c t i v i t y ( i n c o r p o r a t i o n o f l a b e l l e d l y s i n e ) i n v i v o . T h e a m i n o a c i d c o n -t e n t s o f t h e i r f r a c t i o n s w e r e s i m i l a r , b e i n g n o t a b l y h i g h (23%) i n a s p a r t i c a n d g l u t a m i c a c i d s . E n d g r o u p a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t t h e r e w e r e at l e a s t f i v e d i f f e r e n t p r o t e i n s i n e a c h o f t h e i r s u b f r a c t i o n s . 14 T h e d a t a o n i n c o r p o r a t i o n o f l y s i n e - C s h o w e d t h a t a c i d i c n u c l e o -p r o t e i n s t u r n o v e r a t d i f f e r e n t r a t e s i n n u c l e i o f l i v e r a n d W a l k e r t u m o u r . " I n t h e t u m o r , a p p r o x i m a t e l y t w o - t h i r d s o f t h e l a b e l e n t e r e d t h e h i s t o n e f r a c t i o n a n d o n e - t h i r d w a s i n c o r p o r a t e d i n t o t h e a c i d i n s o l u b l e p r o t e i n s . I n t h e l i v e r , t h e r e v e r s e w a s t r u e " ( S t e e l e a n d B u s c h , 1 9 6 3 ) . M i r s k y a n d R i s ( 1 9 4 7 ) d e v e l o p e d a p r o c e d u r e f o r i s o l a t i n g c h r o m o s o m e s a n d s t u d y i n g t h e i r c h e m i c a l c o m p o s i t i o n . A f t e r r e m o v i n g h i s t o n e s f r o m c h r o m o s o m e s w i t h h i g h m o l a r s a l t a n d l o w p H t h e y d e s c r i b e d " r e s i d u a l c h r o m o s o m e s " t h a t c o n t a i n e d D N A a n d p r o t e i n . A n e a r l i e r s t u d y o n t h e n a t u r e o f t h e r e s i d u a l p r o t e i n h a d s h o w n t h a t i t w a s a n a c i d i c p r o t e i n a s i t w a s s o l u b l e i n I M N a C l a t p H 10 ( M i r s k y a n d P o l l i s t e r , 1946) a n d c o n t a i n e d a b o u t 1% t r y p t o p h a n e . T h i s r e s i d u a l p r o t e i n m a d e u p 8 - 1 0 % of t h e c h r o m o s o m e ( M i r s k y a n d R i s , 1 9 4 7 ) . I f h i s t o n e a n d D N A w e r e r e m o v e d w i t h H C 1 a n d D N A - a s e t h e r e m a i n i n g r e s i d u a l p r o t e i n f o r m e d c o i l e d f i l a m e n t s t h a t c o u l d b e s e e n i n t h e e l e c t r o n m i c r o -s c o p e . R e m o v a l o f h i s t o n e d i d n o t a f f e c t c h r o m o s o m e s t r u c t u r e . T h e s e o b s e r v a t i o n s w e r e t h e b a s i s f o r a m o d e l o f c h r o m o s o m e 15 s t r u c t u r e i n w h i c h r e s i d u a l o r a c i d i c p r o t e i n s f o r m a c e n t r a l c o r e a b o u t w h i c h D N A i s c o i l e d . H i s t o n e s a r e t h o u g h t t o f o r m s a l t l i n k a g e w i t h D N A p h o s p h a t e g r o u p s o n t h e o u t e r s u r f a c e . T h e n a t u r e o f t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n a c i d i c p r o t e i n s a n d D N A i s u n k n o w n , b u t t h e p r e s e n c e o f s u b s t a n t i a l a m o u n t s o f s e r i n e i n a c i d i c p r o t e i n h a s l e d t o t h e s u g g e s t i o n t h a t t h e f o r m a t i o n o f p h o s p h o - s e r i n e e s t e r s i s o n e p o s s i b i l i t y ( B u s c h , 1 9 6 5 , p . p . 91 - 1 1 9 ) . V I . H I S T O C H E M I C A L C H A R A C T E R I S A T I O N O F H I S T O N E S I n t h e f i e l d o f h i s t o c h e m i s t r y c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t i n d i f f e r e n t i a l h i s t o n e s t a i n i n g h a s b e e n e v i d e n t . U n t i l r e c e n t l y t h e u s u a l m e t h o d f o r s t a i n i n g h i s t o n e s w a s t h e a c i d f a s t g r e e n s e q u e n c e w h i c h d e p e n d s o n t h e e x t r e m e l y b a s i c n a t u r e o f h i s t o n e s a n d t h e i r o c c u r r e n c e i n a c o n c e n t r a t e d f o r m i n c e l l n u c l e i . T h i s m e t h o d , h o w e v e r , l a c k s s p e c i f i c i t y a s i t w i l l s t a i n o t h e r b a s i c p r o t e i n - c o n t a i n i n g s t r u c t u r e s s u c h a s r i b o s o m e s a n d m u c o p o l y s a c c h a r i d e i n c l u s i o n s ( C o w d e n , 1 9 6 6 ) . R e c e n t l y B l a c k a n d A n s l e y ( 1 9 6 5 , 1 9 6 6 ) h a v e d e v e l o p e d a m e t h o d f o r t h e s e l e c t i v e s t a i n i n g o f h i s t o n e c a l l e d t h e p o s t -f o r m a l i n a m m o n i a c a l s t a i n i n g t e c h n i q u e . T h i s m e t h o d r e s u l t s i n l y s i n e - r i c h h i s t o n e b e i n g s t a i n e d y e l l o w a n d a r g i n i n e - r i c h h i s t o n e b e i n g s t a i n e d b l a c k . T h i s d i f f e r e n t i a l c o l o u r r e a c t i o n s t a i n s c a l f t h y m u s n u c l e i y e l l o w a n d l i v e r n u c l e i b r o w n i s h - b l a c k , i n d i c a t i n g t h a t d i f f e r e n t h i s t o n e s a r e p r e s e n t i n d i f f e r e n t c e l l t y p e s . 16 T h e y a l s o r e p o r t e d t h a t t h y m o c y t e s f r o m m i c e i n j e c t e d w i t h a n t i g e n s t a i n e d b l a c k i n c o m p a r i s o n t o u n t r e a t e d m o u s e t h y m o c y t e s w h i c h s t a i n e d y e l l o w a n d s u g g e s t e d t h a t t h i s r e p r e s e n t e d a c e l l u l a r r e s p o n s e t o a n t i g e n , t h a t i s a ' d i s c h a r g e o f h i s t o n e , r e f l e c t i n g a c h a n g e i n c e l l f u n c t i o n . S p i c e r ( 1 9 6 2 ) d e v e l o p e d a n o t h e r s t a i n i n g t e c h n i q u e , s p e c i f i c f o r b a s i c p r o t e i n s , w h i c h s e l e c t i v e l y s t a i n s h i s t o n e s a n d p r o t a m i n e s i n c e l l n u c l e i . T h i s m e t h o d r e q u i r e s s t r i c t a d h e r e n c e t o t h e f i x a t i o n p r o c e d u r e s d e s c r i b e d a n d i s h i g h l y s e n s i t i v e t o c h a n g e s i n p H o f t h e s t a i n i n g s o l u t i o n (0 . 0 4 % B i e b r i c h s c a r l e t ) . T h i s m e t h o d h a s b e e n u s e d t o s t u d y t h e b a s i c p r o t e i n c o n t e n t of c e l l c o m p o n e n t s b y D o u g l a s , S p i c e r a n d B a r t e l s ( 1 9 6 6 ) . A t t h e c h r o m o s o m e l e v e l , S w i f t ( 1 9 6 4 ) u s e d a c i d f a s t g r e e n t o s t a i n b a s i c p r o t e i n b a n d s i n D r o s o p h i l a s a l i v a r y g l a n d c h r o m o s o m e s . T h e a m o u n t o f s t a i n i n g d u r i n g f o u r s t a g e s o f p u f f f o r m a t i o n a t t h e e n d o f c h r o m o s o m e 2 w a s m e a s u r e d w i t h a m i c r o d e n s i t o m e t e r . T h e y c o u l d f i n d n o m e a s u r a b l e d i f f e r e n c e i n t h e a m o u n t o f s t a i n a b l e b a s i c p r o t e i n p e r b a n d d u r i n g t h e p u f f i n g p r o c e s s . H o w e v e r , i t h a s b e e n s h o w n t h a t D N A a n d h i s t o n e s o c c u p y a c l o s e s p a t i a l r e l a t i o n s h i p i n t h e c h r o m a t i n o f D r o s o p h i l a p o l y t e n e c h r o m o s o m e s . H o r n a n d W a r d ( 1 9 5 7 ) s t a i n e d c h r o m o s o m e p r e p a r a t i o n s f o r D N A ( F e u l g e n r e a c t i o n ) a n d f o r b a s i c p r o t e i n ( a c i d f a s t g r e e n ) . T h e y f o u n d t h a t e a c h b a n d o r c h r o m o m e r e t h a t s t a i n e d f o r D N A a l s o h a d a h i g h c o n c e n t r a t i o n of b a s i c p r o t e i n . T h e i n t e r c h r o m e r i c r e g i o n s s t a i n e d t o a m u c h l e s s e r e x t e n t . V I I . A N T I G E N I C I T Y O F N U C L E I C A C I D S A N D N U C L E A R P R O T E I N S I m m u n o l o g i c a l t e c h n i q u e s f o r t h e c h a r a c t e r i s a t i o n o f p r o t e i n s h a v e b e e n a p p l i e d t o t h e s t u d y o f n u c l e a r c o n s t i t u e n t s i n s c a t t e r e d i n s t a n c e s . T h i s h a s m a i n l y b e e n i n r e f e r e n c e t o a n a u t o i m m u n e d i s e a s e i n h u m a n s ; s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s i s ( S . L . E . ) . I n t h i s d i s e a s e the s e r u m c o n t a i n s a g a m m a g l o b u l i n w h i c h h a s a n t i b o d y a c t i v i t y a g a i n s t t h e p a t i e n t ' s D N A , h i s t o n e a n d a D N A - h i s t o n e c o m p l e x ( K u n k e l e t a l . , I 9 6 0 ) . A l t e r a t i o n of n u c l e i o f m e s e n c h y m a l c e l l s b y a u t o a n t i b o d y i n the p a t i e n t ' s s e r u m w a s f i r s t d e m o n s t r a t e d c y t o c h e m i c a l l y ( K l e m p e r e r e t a l . , 1 9 5 0 ) . T h e s u b s e q u e n t u s e o f t h e f l u o r e s c e n t a n t i b o d y t e c h n i q u e s h o w e d c l e a r l y t h a t c e l l i n j u r y w a s c a u s e d b y a n i n t e r a c t i o n b e t w e e n S . L . E . s e r u m a n d n u c l e a r c o m p o n e n t s . I f c e l l s s u s p e n s i o n s w e r e e x p o s e d t o S . L . E . s e r u m a n d t h e n t r e a t e d w i t h f l u o r e s c e n t a n t i - h u m a n g l o b u l i n t h e n u c l e i s h o w e d m a r k e d f l u o r e s c e n c e . T h i s f l u o r e s c e n c e i s n o w k n o w n t o be d u e to the p r e s e n c e o f s e v e r a l a n t i - n u c l e a r f a c t o r s p r e s e n t i n S . L . E . g l o b u l i n w h i c h a r e c o u n t e r s t a i n e d b y f l u o r e s c e n t a n t i - h u m a n g l o b u l i n , p r o d u c e d i n t h e h o r s e o r r a b b i t . T h e p r e d o m i n a n t f a c t o r 18 a p p e a r s t o b e a n t i b o d y t o w h o l e n u c l e o p r o t e i n ( K u n k e l e t a l . , I 9 6 0 ) . T h e a n t i - n u c l e a r a c t i v i t y i n S. L . E . s e r u m h a s b e e n f o u n d a t t i t e r s i n e x c e s s o f 1 : 4 , 0 0 0 . I t r e a c t s w i t h t h e p a t i e n t ' s o w n c e l l s , c e l l s f r o m o t h e r d o n o r s a n d o t h e r m a m m a l i a n c e l l s , a n d a p p e a r s t o b e r e s t r i c t e d t o t h e 6 . 6S f r a c t i o n of g a m m a g l o b u l i n ( G o o d m a n et a l . , I 9 6 0 ) . T h a t t h e a n t i - n u c l e a r a c t i v i t y i n S . L . E . s e r u m i s a l s o d i r e c t e d a g a i n s t a n t i g e n p r e s e n t i n m e t a p h a s e c h r o m o s o m e s h a s b e e n d e m o n s t r a t e d b y K r o o t h , T o b i e , T j i o a n d G o o d m a n . ( 1 9 6 1 ) . T h e y u s e d t h e f l u o r e s c e n t a n t i b o d y t e c h n i q u e t o s h o w a t t a c h m e n t o f S . L . E . f a c t o r t o a l l t h e c h r o m o s o m e s o f h u m a n f i b r o b l a s t s a n d l e u k o c y t e s , a s w e l l a s c h r o m o s o m e s f r o m C h i n e s e h a m s t e r f i b r o b l a s t s . A l t h o u g h t h e h i s t o n e s a r e c o n s i d e r e d t o b e w e a k a n t i g e n s a n d D N A n o n - a n t i g e n i c , i t h a s b e e n p o s s i b l e , i n s o m e c a s e s , t o p r o d u c e a n t i - h i s t o n e a n t i b o d i e s i n e x p e r i m e n t a l a n i m a l s . W i l s o n e t a l . ( 1 9 6 6 ) r e p o r t e d t h a t D N A - h i s t o n e f r o m c a l f t h y m u s w a s n e i t h e r a n t i g e n i c n o r h a p t e n i c i n r a b b i t s a f t e r p r o l o n g e d i m m u n i s a t i o n . H o w e v e r , a D N A - h i s t o n e c o m p l e x f r o m a c a n i n e t u m o u r i n j e c t e d i n t o r a b b i t s g a v e p o s i t i v e c o m p l e m e n t f i x a t i o n t e s t s a l t h o u g h o t h e r s e r o l o g i c a l t e s t s w e r e n e g a t i v e . T h e a u t h o r s i n t e r p r e t e d t h e i r r e s u l t s t o m e a n t h a t s o m e c o m p o n e n t s o f D N A - p r o t e i n s a r e s u f f i c i e n t l y a n t i g e n i c t o e l i c i t a r e s p o n s e , b u t a r e p r e s e n t i n v e r y s m a l l q u a n t i t i e s . I n a n e a r l i e r s t u d y M e i s c h e r et a l . ( I 9 6 0 ) u s e d c a l f t h y m u s n u c l e i a n d n u c l e o p r o t e i n t o i m m u n i s e g u i n e a p i g s a n d r a b b i t s . A b o u t h a l f t he a n i m a l s r e a c t e d p o s i t i v e l y t o p r o d u c e a n t i b o d i e s d e t e c t a b l e b y c o m p l e m e n t f i x a t i o n , p a s s i v e c u t a n e o u s a n a p h y l a x i s a n d t h e f l u o r e s c e n t a n t i b o d y t e c h n i q u e . N u c l e o -p r o t e i n s w e r e f o u n d t o be w e a k l y a n t i g e n i c a n d the s e r a p r o d u c e d s h o w e d c r o s s r e a c t i v i t y b e t w e e n r a b b i t a n d g u i n e a p i g c e l l s . T h e y a l s o e x a m i n e d t i s s u e s o f i m m u n i s e d a n i m a l s f o r e v i d e n c e o f a u t o i m m u n i t y a g a i n s t t he a n i m a l s o w n n u c l e i b u t c o u l d f i n d n o n e . I n a s h o r t c o m m u n i c a t i o n R u m k e a n d S l u y s e r ( 1 9 6 6 ) r e p o r t e d a m e t h o d o f p r e p a r a t i o n i n w h i c h h i s t o n e s f r o m r a t l i v e r a r e s t r o n g l y a n t i g e n i c t o r a b b i t s . B r i e f h e a t t r e a t m e n t (5 m i n u t e s a t 8 0 ° C ) o f t h e t i s s u e b e f o r e h i s t o n e e x t r a c t i o n w a s c a r r i e d o u t t o i n a c t i v a t e p r o t e o l y t i c e n z y m e s a n d p r e v e n t h i s t o n e b r e a k d o w n . T h e h i s t o n e s w e r e e x t r a c t e d w i t h N a C l , p e r c h l o r i c a c i d , H C 1 a n d e t h a n o l ( S l u y s e r e t a l . , 1 9 6 5 ) . A l y s i n e - r i c h f r a c t i o n w a s f o u n d t o be m o s t a n t i g e n i c a n d p r o d u c e d a s i n g l e p r e c i p i t a t i o n l i n e i n the O u c h t e r l o n y t e s t w h i c h d i d n o t c r o s s -r e a c t w i t h o t h e r h i s t o n e f r a c t i o n s o r w i t h r a t s e r u m . F l u o r e s c e n t a n t i b o d y s t u d i e s r e v e a l e d t h a t t h i s a n t i s e r u m r e a c t e d w i t h t h e c o n t e n t s o f n u c l e i o f r a t l i v e r s e c t i o n s a n d c e l l s u s p e n s i o n s . A n o t h e r l y s i n e - p o o r h i s t o n e f r a c t i o n w a s l e s s a n t i g e n i c . T h e a n t i s e r u m d i d n o t r e a c t w i t h t h e l y s i n e - r i c h h i s t o n e , b u t r e a c t e d w e a k l y w i t h r a t s e r u m . I t p r o d u c e d t w o d i s t i n c t l i n e s o f 2 0 p r e c i p i t a t e a g a i n s t t h e i n o c u l u m . T h e a u t h o r s c o n c l u d e t h a t r a t l i v e r h i s t o n e s a r e a n t i g e n i c t o t h e r a b b i t a n d c a n be s e p a r a t e d i n t o i m m u n o c h e m i c a l l y d i s t i n c t f r a c t i o n s . 21 METHODS AND MATERIALS I . IMMUNISATION PROCEDURE 1. I s o l a t i o n o f C a l f Thymus N u c l e i F o l l o w i n g t h e p r o c e d u r e o f D a l y and M i r s k y ( 1 9 5 5 ) , f r e s h thymus t i s s u e was o b t a i n e d , 1 to 3 h o u r s a f t e r s l a u g h t e r , and p l a c e d i n the c o l d . The t i s s u e was c l e a r e d o f f a t , m i n c e d , and as much c o n n e c t i v e t i s s u e as p o s s i b l e r emoved . A p p r o x i -m a t e l y 150 gm o f t i s s u e i*as combined w i t h an e q u a l vo lume o f c r u s h e d i c e and 400 ml 0 . 0 0 5 M c i t r i c a c i d , s t r a i n e d t h r o u g h gauze and c e n t r i f u g e d i n 250 m l t u b e s i n a r e f r i g e r a t e d c e n t r i f u g e a t l o w speed f o r 20 m i n u t e s . The s u p e r n a t a n t , c o n t a i n i n g c y t o p l a s m i c and t i s s u e p r o t e i n s , was d e c a n t e d and p l a c e d i n a f r o z e n s t o r a g e a t - 2 0 ° C . The n u c l e a r s e d i m e n t was washed i n 0 . 0 1 M c i t r i c a c i d u n t i l t h e s u p e r n a t a n t was f r e e o f p r o t e i n . N u c l e a r p r o t e i n s xvere e x t r a c t e d f r o m t h e n u c l e a r p r e p a r a t i o n u s i n g a m o d i f i c a t i o n o f one o f s e v e r a l 2 . N u c l e a r P r o t e i n 22 p r o c e d u r e s ( p r e p a r a t i o n 8) d e s c r i b e d b y D a l y a n d M i r s k y ( 1 9 5 5 ) . A n e q u a l a m o u n t o f 0 . 2 M c i t r i c a c i d , 1. 25 M N a C l ( p H 2 . 0) w a s a d d e d t o t h e n u c l e a r p r e p a r a t i o n a n d s t i r r e d f o r o n e h o u r i n a n i c e b a t h . T h e p r e p a r a t i o n w a s c e n t r i f u g e d at 1, 5 0 0 R P M t o p e l l e t t h e n u c l e a r m a s s a n d s e p a r a t e l i p i d m a t e r i a l . T h e l i p i d w a s c a r e f u l l y s k i m m e d o f f a n d t h e s u p e r n a t a n t d e c a n t e d . P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d w i t h t h e r e f r a c t o m e t e r a n d t h e s o l u t i o n w a s s e p a r a t e d i n t o 5 m l a l i q u o t s a n d p l a c e d i n f r o z e n s t o r a g e a t - 2 0 ° C . 3 . P r e p a r a t i o n o f I n o c u l u m T h e w h o l e n u c l e a r p r o t e i n s o l u t i o n w a s p r e p a r e d f o r i n j e c t i o n b y d i a l y s i s o f 5 m l s a m p l e s e n c l o s e d i n 2 7 / 3 2 " d i a l y s i s t u b i n g w i t h a w a l l t h i c k n e s s o f 0 . 001 i n c h e s ( V i s k i n g C o r p . , C h i c a g o , 111. ) a n d p l a c e d i n a l i t r e b e a k e r o f d i s t i l l e d w a t e r i n t h e r e f r i g e r a t o r . T h e d i a l y s a t e w a s c h a n g e d e v e r y 2 4 h o u r s f o r t h r e e d a y s a f t e r w h i c h t h e p H of t h e d i a l y s a t e w a s at n e u t r a l i t y a n d t h e p r o t e i n s w i t h i n t h e d i a l y s i s b a g h a d f o r m e d a w h i t e p r e c i p i t a t e . T h e p r e c i p i t a t e a n d s u p e r n a t a n t w e r e d i l u t e d i n p h o s p h a t e b u f f e r e d i s o t o n i c s a l i n e t o a c o n c e n t r a t i o n o f a p p r o x i -m a t e l y 4 m g / m l . 4 . I m m u n i s a t i o n M a t u r e L e g h o r n h e n s w e r e o b t a i n e d f r o m t h e D e p a r t -2 3 m e r i t o f P o u l t r y S c i e n c e , T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a . T h e y w e r e h o u s e d s i n g l y i n w i r e c a g e s a n d i d e n t i f i e d b y m e t a l w i n g t a g s . T h e c h i c k e n s w e r e i n o c u l a t e d w i t h 5 m l o f t h e n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n a s f o l l o w s : 1 m l i n t r a m u s c u l a r l y i n t h e b r e a s t , 1 m l i n t r a m u s c u l a r l y i n t h e r i g h t l e g a n d 3 m l i n t r a -v e n o u s l y t h r o u g h t h e b r a c h i a l v e i n o n t h e u n d e r s i d e o f t h e w i n g . T h i s p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d 3 t i m e s at 14 d a y i n t e r v a l s . D u r i n g t h e 8 t h w e e k 10 m l o f b l o o d w e r e d r a w n f r o m t h e b r a c h i a l v e i n s a n d p l a c e d i n t u b e s i n a w a t e r b a t h a t 4 0 ° C f o r 12 h o u r s t o a l l o w c l o t f o r m a t i o n w i t h o u t h e m o l y s i s t o o c c u r . A f t e r c l o t r e t r a c t i o n t h e s e r a w e r e r e m o v e d f r o m t h e t u b e s w i t h a c a t h e t e r a t t a c h e d t o a 10 m l s y r i n g e , p l a c e d i n 2 m l s t o r a g e b o t t l e d a n d s t o r e d f r o z e n . T h e c h i c k e n s w e r e r o u t i n e l y t a k e n o f f f o o d f o r 2 4 h o u r s p r i o r t o b l e e d i n g t o l o w e r s e r u m l i p i d c o n t e n t . I n s o m e c a s e s b l o o d w a s o b t a i n e d b y c a r d i a c p u n c t u r e , w h e n w i n g v e i n s w e r e a b s e n t o r s c a r r e d b e y o n d u s e . I I . P R O T E I N A N A L Y S I S 1. C h r o m a t o g r a p h y A . D e s c r i p t i o n o f C h r o m a t o g r a p h i c C o l u m n s C h r o m a t o g r a p h i c c o l u m n s w e r e p r e p a r e d i n t h e f o l l o w -i n g m a n n e r . A #4 T e f l o n s t o p c o c k a n d a # 2 4 / 4 0 P y r e x g l a s s 24 j o i n t w e r e f i t t e d t o e i t h e r e n d o f a 2 . 5 c m g l a s s t u b e , 3 4 c m i n l e n g t h . A p o r o u s g l a s s d i s c w a s f i t t e d i n t h e b o t t o m o f t h e t u b e t o s u p p o r t t h e g e l b e d . T w o s u c h c o l u m n s w e r e f a b r i c a t e d b y V a n c o u v e r S c i e n t i f i c G l a s s b l o w i n g L t d . , V a n c o u v e r , B . C . T h e y c o u l d b e u s e d s i n g l y o r c o n n e c t e d i n t a n d e m . E a c h c o l u m n h a d 3 a b e d v o l u m e o f 1 9 5 . 0 c m . W h e n l a r g e r c o l u m n s w e r e r e q u i r e d , t w o 1 l i t r e g r a d u a t e d d i s p e n s i n g c y l i n d e r s h a v i n g a n i n s i d e d i a m e t e r o f 2 . 5 c m a n d 7 0 . 0 c m i n l e n g t h w e r e u s e d . T h e s e a r e e q u i p p e d w i t h s t o p c o c k s a n d c a n b e s e a l e d a t t h e t o p w i t h a d r i l l e d r u b b e r s t o p p e r . A s m a l l a m o u n t o f g l a s s w o o l o n t o p o f a p o r o u s p l a s t i c d i s c w a s p l a c e d i n t h e b o t t o m of t h e c o l u m n s t o s u p p o r t t h e g e l b e d . B . C o l u m n P a c k i n g S e p h a d e x G - 7 5 a n d G - 2 0 0 w e r e o b t a i n e d f r o m P h a r m a c i a F i n e C h e m i c a l s , I n c . , i n t h e b e a d f o r m . T h e S e p h a d e x w a s s u s -p e n d e d i n a l a r g e e x c e s s o f e l u t i n g b u f f e r a n d a l l o w e d t o h y d r a t e c o m p l e t e l y a n d s e t t l e . T h e e x c e s s b u f f e r w a s F"siphom@'<i o f f t o r e m o v e f i n e p a r t i c l e s , t h e S e p h a d e x w a s s u s p e n d e d i n b u f f e r a n d s t o r e d at r o o m t e m p e r a t u r e . T w o m e t h o d s o f p a c k i n g t h e c o l u m n s w e r e e m p l o y e d . I n t h e f i r s t m e t h o d a 1 l i t r e s e p a r a t o r y f u n n e l w a s a t t a c h e d t o t h e 25 c o l u m n t o p r o v i d e a r e s e r v o i r o f S e p h a d e x s u s p e n s i o n , k e p t h o m o g e n e o u s b y a n e l e c t r i c s t i r r e r . T h e c o l u m n w a s f i l l e d w i t h b u f f e r a n d a f e w m l o f S e p h a d e x a l l o w e d t o s e t t l e u n d e r g r a v i t y t o p r o v i d e a b a s e f o r t h e g e l b e d . T h e c o l u m n w a s t h e n a l l o w e d t o r u n f r e e l y a n d a s t e a d i l y r i s i n g l e v e l b e d w a s m a i n t a i n e d , w i t h -o u t s t o p p i n g u n t i l t h e d e s i r e d h e i g h t w a s r e a c h e d . F i n a l l y , a f i l t e r - p a p e r d i s c w a s a l l o w e d t o s e t t l e o n t o p o f t h e b e d t o p r o t e c t i t w h e n a p p l y i n g s a m p l e s . S i n c e t h i s m e t h o d r e s u l t s i n a t i g h t l y p a c k e d c o l u m n w h i c h s o o n c e a s e s t o f l o w a t a s u f f i c i e n t r a t e , a s e c o n d m e t h o d w a s e m p l o y e d w h i c h d o e s n o t b i n d t h e h y d r a t e d g e l b e a d s s o t i g h t l y t o g e t h e r . A g l a s s c y l i n d e r s l i g h t l y l a r g e r i n d i a m e t e r t h a n t h e c o l u m n w a s f i t t e d t o t h e t o p o f t h e c o l u m n u s i n g a r u b b e r s e a l . T h e c o l u m n , a n d t h e r e s e r v o i r t h u s p r o v i d e d , w e r e f i l l e d w i t h a s u s p e n s i o n o f e q u a l v o l u m e s o f h y d r a t e d S e p h a d e x a n d b u f f e r . T h e S e p h a d e x w a s a l l o w e d t o s e t t l e u n d e r g r a v i t y w i t h -ou t b u f f e r e l u t i o n . W h e n i t h a d c o m p l e t e l y s e t t l e d t h e b u f f e r w a s a l l o w e d t o f l o w s l o w l y , c a u s i n g t h e b e d t o p a c k e v e n l y . T h e r e s e r v o i r a n d e x c e s s g e l w e r e r e m o v e d , a s m a l l a m o u n t o f b u f f e r a d d e d , a n d t h e t o p o f t h e b e d s t i r r e d t o a d e p t h o f a b o u t 2 i n c h e s a n d a l l o w e d t o r e s e t t l e . T h e c o l u m n s w e r e t e s t e d f o r e v e n p a c k i n g b y e l u t i n g a s a m p l e o f 0 . 1% d e x t r a n b l u e , a h i g h m o l e c u l a r w e i g h t i n d i c a t o r 2 6 w h i c h p a s s e s t h r o u g h t h e c o l u m n i n a s i n g l e b a n d w i t h o u t h i n -d r a n c e . C . P r o t e i n F r a c t i o n a t i o n T o i n t r o d u c e s e r u m o r n u c l e a r p r o t e i n s a m p l e s f o r f r a c t i o n a t i o n t h e b u f f e r l e v e l w a s l o w e r e d i n t h e c o l u m n t o t h e t o p o f t h e g e l b e d . T h e s a m p l e w a s l a y e r e d o n c a r e f u l l y a n d a l l o w e d t o s i n k i n t o t h e g e l u n t i l t h e l i q u i d l e v e l w a s a g a i n e v e n w i t h t h e t o p o f t h e b e d . T h e c o l u m n w a s t h e n f i l l e d w i t h b u f f e r a n d a 2 0 l i t r e b u f f e r t a n k i n s t a l l e d 12 i n c h e s a b o v e t h e c o l u m n a n d c o n n e c t e d w i t h p l a s t i c t u b i n g . T h e c o l u m n o u t l e t w a s c o n -n e c t e d t o a p e r i s t a l t i c p u m p ( S i g m a m o t o r I n c . , M i d d l e p o r t , N . Y . ) w h i c h p r o v i d e d a c o n s t a n t f l o w r a t e . E f f l u e n t f r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d i n 10 m l t u b e s i n a n I s c o m o d e l 2 7 0 f r a c t i o n c o l l e c t o r ( I n s t r u m e n t a t i o n S p e c i a l t i e s C o . , L i n c o l n , N e b r . ) a t 5 m i n u t e i n t e r v a l s , t h e a m o u n t i n e a c h t u b e d e p e n d i n g o n t h e f l o w r a t e s e l e c t e d . T h e o p t i c a l d e n s i t y o f t h e d i l u t e f r a c t i o n s w a s r e a d , a t t h e a p p r o p r i a t e w a v e l e n g t h , o n a U n i c a m S p - 5 0 0 s p e c t r o p h o t o m e t e r ( U n i c a m I n s t r u m e n t s L t d . , C a m b r i d g e , E n -g l a n d ) a n d p l o t t e d a g a i n s t t u b e n u m b e r . D . . P r o t e i n C o n c e n t r a t i o n P r o t e i n f r a c t i o n s c o m p r i s i n g s e v e r a l t u b e s ( 5 0 - 2 0 0 m l ) 2 7 w e r e r e c o n c e n t r a t e d b y t w o m e t h o d s . I n i t i a l l y , s e r u m p r o t e i n s w e r e r e c o n c e n t r a t e d u s i n g a v a c u u m d i a l y s i s a p p a r a t u s p u r c h a s e d f r o m S c h l e i c h e r a n d S c h u e l l C o . , K e e n e , N . H . A c o l l o d i o n b a g , c o n t a i n i n g t h e d i l u t e p r o t e i n , i s s u s p e n d e d i n d i s t i l l e d w a t e r w i t h a n a i r t i g h t s e a l b e t w e e n t h e i n n e r a n d o u t e r c h a m b e r s . W h e n a v a c u u m p u m p i s c o n n e c t e d t o t h e o u t e r c h a m b e r a t m o s p h e r i c p r e s s u r e f o r c e s w a t e r a n d s a l t s t h r o u g h t h e w a l l s o f t h e d i a l y s i s b a g . A t a v a c u u m p r e s s u r e o f 2 0 c m m e r c u r y t h e c o n c e n t r a t i o n r a t e d e c r e a s e d f r o m 4 - 6 m l p e r h o u r t o 0 . 25 - 0 . 5 m l p e r h o u r a s c o n c e n t r a t i o n p r o c e e d e d . A l t h o u g h t h i s m e t h o d w a s s u i t a b l e f o r t h e c o n c e n t r a t i o n o f s e r u m p r o t e i n f r a c t i o n s , s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s , p r e s e n t i n t h e n u c l e a r p r o t e i n f r a c t i o n s , p a s s e d t h r o u g h t h e w a l l s o f t h e d i a l y s i s b a g . A m o r e e f f i c i e n t c o n c e n t r a t o r w a s p u r c h a s e d f r o m T h e A m i c o n C o r p o r a t i o n ( C a m b r i d g e , M a s s . ) , D i a f l o m o d e l 5 0 . T h i s c o n c e n t r a t o r h a s a 50 m l c a p a c i t y a n d m a k e s u s e - o f g e l m e m b r a n e s U M - 1 a n d U M - 2 w h i c h w i l l a l l o w p a s s a g e o f m o l e c u l e s h a v i n g a " M W l a r g e r t h a n 1, 0 0 0 a n d 1 0 , 0 0 0 r e s p e c t i v e l y . U n d e r a p r e s s u r e o f 50 P S I p r o v i d e d b y a n i t r o g e n c y l i n d e r t h e c o n c e n -t r a t i o n r a t e v a r i e d f r o m a p p r o x i m a t e l y 2 0 m l p e r h o u r t o 5 m l p e r h o u r w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n . T h i s c o n c e n t r a t i o n h a s t h e a d d e d a d v a n t a g e t h a t t h e m e m b r a n e s w i l l n o t p l u g w i t h r e p e a t e d u s e . 28 2 . D i s c E l e c t r o p h o r e s i s A . . A c i d i c P r o t e i n s A m o d e l 6 d i s c e l e c t r o p h o r e s i s a p p a r a t u s a n d c h e m i c a l s w e r e p u r c h a s e d f r o m C a n a l c o C o r p o r a t i o n , B e t h e s d a , M d . T h e s t a n d a r d a c r y l a m i d e g e l s a n d b u f f e r (7%, p H 8 . 9 - 9 . 5) w e r e u s e d f o r t h e a n a l y s i s o f s e r u m p r o t e i n f r a c t i o n s ( O r n s t e i n , 1 9 6 5 ) w i t h t h e f o l l o w i n g m o d i f i c a t i o n s . S e r u m p r o t e i n s a m p l e s w e r e m i x e d w i t h a s a m p l e g e l a s i n s t r u c t e d i n t h e C a n a l c o m a n u a l . F o r a n a l y s i s o f a c i d i c p r o t e i n s i n n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n s t h e s a m p l e s w e r e d i l u t e d i n 0 . 1 m l , I ' M s u c r o s e a n d l a y e r e d o n t o p o f t h e s t a c k i n g g e l i n t h e e l e c t r o p h o r e s i s c o l u m n s . T h i s r e q u i r e d t h a t t h e s t a n d a r d o r d e r o f p o l y m e r i z i n g t h e g e l s b e r e v e r s e d . T h e c o l u m n s w e r e t h e n f i l l e d b y l a y e r i n g b u f f e r o n t o p o f t h e s u c r o s e -p r o t e i n s o l u t i o n . T h i s m e t h o d h a s t h e a d v a n t a g e o f r e d u c i n g t h e t i m e f o r a n a n a l y s i s a n d a l l o w i n g t h e e l e c t r o p h o r e s i s o f l a r g e r s a m p l e s o f m o r e d i l u t e s o l u t i o n s . T h e u s e o f f l u o r e s c e n t s e r u m p r o t e i n s m a d e i t p o s s i b l e t o o b s e r v e t h e p r o g r e s s o f e l e c t r o -p h o r e t i c s e p a r a t i o n u s i n g t h e u l t r a v i o l e t l a m p a n d o n c o m p l e t i o n o f a r u n t h e t u b e s c o u l d b e p h o t o g r a p h e d d i r e c t l y w i t h o u t f u r t h e r f i x a t i o n , s t a i n i n g a n d d e s t a i n i n g . B . B a s i c P r o t e i n s T h e e l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n o f b a s i c n u c l e a r p r o t e i n s r e q u i r e s the u s e o f l o w p H g e l s o f s m a l l e r p o r e s i z e ( M c A l l i s t e r , W a n a n d I r v i n , 1 9 6 3 ; S h e p h a r d a n d G u r l e y , 1965) . I t w a s n o t p o s s i b l e to a c h i e v e s e p a r a t i o n o f n u c l e a r p r o t e i n u s i n g the m e t h o d d e s c r i b e d i n t h e C a n a l c o m a n u a l f o r l o w p H g e l s (15%, p H 5. 0 - 4 . 3) u n t i l g l y c i n e w a s s u b s t i t u t e d f o r b e t a a l a n i n e i n the r u n n i n g b u f f e r a s d e s c r i b e d b y M c A l l i s t e r , W a n a n d I r v i n (19 6 3 ) . I t w a s a l s o f o u n d t h a t b a s i c n u c l e a r p r o t e i n s w o u l d n o t m i g r a t e i f a p p l i e d i n a s a m p l e g e l , b u t t h a t t h e y m u s t b e a p p l i e d i n a 1 M s u c r o s e m e d i u m . S i n c e the n u c l e a r p r o t e i n s w e r e n o t l a b e l l e d w i t h f l u o r e s c e n t d y e the g e l s w e r e f i x e d i n 7% a c e t i c a c i d a n d s t a i n e d o v e r n i g h t i n 0. 1% A m i d o B l a c k 1 0 B , i n 7% a c e t i c a c i d s o l u t i o n . A n o t h e r u s e f u l m o d i f i c a t i o n w a s f o u n d to be r e v e r s a l o f t he e l e c t r o d e s d u r i n g the d e s t a i n i n g p r o c e d u r e so t h a t u n b o u n d d y e w a s m o v e d u p w a r d t h o u g h the c o l u m n s a n d i n t o t h e u p p e r b u f f e r c h a m b e r . T h i s a v o i d s c o n t a m i n a t i o n o f the d e s t a i n i n g s o l u t i o n w i t h d y e d u r i n g the i n i t i a l p e r i o d o f d e s t a i n i n g . S h e r i d a n a n d S t e r n (1967) a n a l y s e d the h i s t o n e o f p l a n t c e l l s u s i n g a f u r t h e r m o d i f i c a t i o n o f t he t e c h n i q u e o f M c A l l i s t e r , W a n a n d I r v i n , w h i c h p r o v i d e s e v e n s m a l l e r g e l p o r e s s i z e s (18% a c r y l a m i d e , 10% c a t a l y s t ) . T h i s m e t h o d d i d n o t s e p a r a t e b a s i c n u c l e a r p r o t e i n s a s e f f i c i e n t l y a s the m e t h o d o f M c A l l i s t e r , W a n a n d I r v i n , b u t p r o v i d e d w i d e r b a n d s w h i c h s e p a r a t e d b y a g r e a t e r d i s t a n c e . 30 B a s i c n u c l e a r p r o t e i n s , e l e c t r o p h o r e s e d u s i n g t h e m o d -i f i c a t i o n o f S h e r i d a n a n d S t e r n ( 1 9 6 7 ) , w e r e s t a i n e d f o r t h e p r e s e n c e of h i s t o n e u s i n g a m o d i f i c a t i o n o f a h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e d e v e l -o p e d b y D o u g l a s , S p i c e r a n d B a r t e l s ( 1 9 6 6 ) . T h e a c r y l a m i d e c y l i n d e r s w e r e f i x e d i n C a r n o y ' s f l u i d f o r 6 h o u r s a n d s t a i n e d o v e r -n i g h t i n a 0 . 0 4 % s o l u t i o n of B i e b r i c h s c a r l e t i n I N g l y c i n e b u f f e r , a d j u s t e d t o p H 9 . 5 w i t h I N N a O H . D e s t a i n i n g w a s a c c o m p l i s h e d , u s i n g 7% a c e t i c a c i d , i n 90 m i n u t e s . T h e s t a i n e d d i s c s o f p r o t e i n w e r e p h o t o g r a p h e d i m m e d i a t e l y a f t e r d e s t a i n i n g , s i n c e t h e y p a r t i a l l y d i f f u s e d o u t of t h e a c r y l a m i d e i n a b o u t 2 4 h o u r s . 3 . A m i n o A c i d A n a l y s i s T h e w h o l e n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n , u s e d f o r c h i c k e n i m m u n i s a t i o n s a n d f r a c t i o n s p r e p a r e d b y S e p h a d e x - 7 5 c h r o m a t o g r a p h y , w e r e a n a l y s e d f o r a m i n o a c i d c o n t e n t i n t h e D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y , T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , V a n c o u v e r , B . C . , u s i n g a B e c k m a n , m o d e l 1 2 0 C a u t o m a t i c a m i n o a c i d a n a l y s e r . 4 . I m m u n o d i f f u s i o n A . S e r u m P r o t e i n s T h e c o n t e n t s o f s e r u m f r a c t i o n s , p r e p a r e d b y c h r o m a -t o g r a p h y , w e r e a l s o a n a l y s e d i m m u n o l o g i c a l l y o n M i l l i p o r e 31 c e l l u l o s e a c e t a t e m e m b r a n e s u s i n g a M R P - 2 , N I L - S a r a v i s I m m u n o d i f f u s i o n K i t ( N a t i o n a l I n s t r u m e n t s L a b o r a t o r i e s , I n c . , R o c k v i l l e , M d . ). B r i e f l y , t h e m e t h o d c o n s i s t s of r e a c t i n g l a m b d a a m o u n t s o f a n t i b o d y ( a n t i - c h i c k e n s e r u m o r a n t i - c h i c k e n g l o b u l i n ) i n a c e n t r a l w e l l a g a i n s t a n t i g e n ( c h i c k e n s e r u m p r o t e i n s , i n 4 s u r r o u n d i n g w e l l s , o v e r a d i s t a n c e o f 8 m m . T h e r e a c t i o n s t a k e p l a c e i n a s a l i n e - s a t u r a t e d c e l l u l o s e a c e t a t e m e m b r a n e , s a n d -w i c h e d b e t w e e n a r e s i l i e n t b a s e a n d a n o v e r l y i n g p l a s t i c t e m p l a t e i n t o w h i c h t h e w e l l s h a v e b e e n m a c h i n e d . U n d e r s t a n d a r d c o n d i t i o n s t h e p r e c i p i t i n l i n e s r e q u i r e 4 8 h o u r s t o d e v e l o p a f t e r w h i c h t i m e t h e y w e r e s t a i n e d a n d f i x e d , u s i n g a P o n c e a u - S d y e , t r i c h l o r e c e t i c - s u l f o s a l y c y l i c a c i d p r e p a r a t i o n , s u p p l i e d b y t h e m a n u f a c t u r e r . T h e m e m b r a n e w a s t h e n m o u n t e d o n a g l a s s s l i d e a n d c l e a r e d i n a n a c i d - a l c o h o l b a t h . I t c o u l d t h e n b e p h o t o g r a p h e d , p r i n t e d d i r e c t l y o n t o p h o t o g r a p h i c p a p e r i n t h e e n l a r g e r o r s t o r e d a s a p e r m a n e n t r e c o r d . B . N u c l e a r P r o t e i n s A l t h o u g h p r e c i p i t i n l i n e s c o u l d b e o b t a i n e d w i t h t h e m i l l i p o r e m e t h o d u s i n g a n t i b o d y p r o d u c e d i n t h e c h i c k e n a g a i n s t c a l f t h y m u s n u c l e a r p r o t e i n s a n d a c o m m e r c i a l h i s t o n e p r e p a r a t i o n ( N u t r i t i o n a l B i o c h e m i c a l C o . , C l e v e l a n d , O h i o ) t h e l i n e s o f p r e c i p i t a t e w e r e d i f f u s e a n d c o u l d n o t a l w a y s b e r e p r o d u c e d i n t h e 32 s a m e p a t t e r n . A s a n a l t e r n a t i v e , i m m u n o d i f f u s i o n t e s t s w e r e c a r r i e d o u t u s i n g t h e O u c h t e r l o n y t e c h n i q u e ( 1 9 4 8 ) . A s o l u t i o n o f 1% a g a r ( I o n a g a r N o . 2 , B a l t i m o r e B i o l o g i c a l L a b o r a t o r i e s , B a l t i m o r e , M d . ) w a s b u f f e r e d at p H 5 . 0 u s i n g W a l p o l e ' s a c e t i c a c i d - s o d i u m a c e t a t e b u f f e r ( C u l l i n g , 1 9 6 3 , p . 159) i n i s o t o n i c s a l i n e . T h e p o w d e r e d a g a r w a s s t i r r e d i n t o t h e b o i l i n g s o l v e n t a n d k e p t b o i l i n g u n t i l t h e a g a r h a d d i s s o l v e d . I t w a s r e m o v e d f r o m t h e h e a t a n d a s t o c k s o l u t i o n o f 1% m e r t h i o l a t e w a s a d d e d t o g i v e a f i n a l c o n -c e n t r a t i o n o f 1 :10 , 0 0 0 . T h e a g a r s o l u t i o n (10 m l ) w a s p i p e t t e d i n t o P e t r i d i s h e s a n d a l l o w e d t o s o l i d i f y . S m a l l h o l l o w p o r o u s c y l i n d e r s ( 1 / 4 " d i a m e t e r ) w e r e p o s i t i o n e d o n t h e a g a r t o f o r m t h e s a m p l e w e l l s . A f u r t h e r 10 m l o f a g a r s o l u t i o n w a s t h e n p o u r e d a r o u n d t h e c y l i n d e r s . E x c e s s w a t e r w a s r e m o v e d f r o m t h e p l a t e s b y d r y i n g f o r 1 h o u r a t 3 7 ° C . T h e s e r u m a n d h i s t o n e s a m p l e s w e r e a p p l i e d t o t h e w e l l s w i t h a s y r i n g e a n d t h e r e a c t i o n s a l l o w e d t o p r o c e e d at r o o m t e m p e r a t u r e . C . I m m u n o l o g i c a l A n a l y s i s o f E l e c t r o p h o r e t i c F r a c t i o n s A c r y l a m i d e c y l i n d e r s , c o n t a i n i n g d i s c s o f b a s i c n u c l e a r p r o t e i n s w e r e r e m o v e d f r o m t h e e l e c t r o p h o r e s i s c o l u m n s a n d i m b e d d e d i n 1% I o n a g a r b u f f e r e d a t p H 5 . 0 . A n t i s e r u m t r o u g h s w e r e f o r m e d , p a r a l l e l t o t h e a c r y l a m i d e c y l i n d e r , b y i m b e d d i n g 3 / 1 6 " d i a m e t e r g l a s s r o d s o f t h e s a m e l e n g t h a n d r e m o v i n g t h e m a f t e r t h e g e l h a d s o l i d i f i e d . T h e p l a t e s w e r e d r i e d f o r 1 h o u r a t o 37 C a n d c h i c k e n a n t i n u c l e a r p r o t e i n s e r u m a d d e d t o t h e t r o u g h s . A c o n t r o l c y l i n d e r , p r e p a r e d a t t h e s a m e t i m e , w a s f i x e d a n d s t a i n e d b y t h e u s u a l m e t h o d . T h e p r e c i p i t i n l i n e s c o u l d t h e n b e c o r r e l a t e d w i t h t h e s t a i n e d d i s c s . 5 . P r e c i p i t i n T e s t s T h e p r e s e n c e o f p r e c i p i t a t i n g a n t i b o d y i n t h e s e r u m o f i m m u n i s e d c h i c k e n s w a s d e t e r m i n e d b y a m i c r o m e t h o d c a r r i e d o u t i n h e m a t o c r i t t u b e s . N u c l e a r p r o t e i n s o l u t i o n , b u f f e r e d t o p H 7 . 0 , w a s d r a w n i n t o t h e t u b e s f o r a d i s t a n c e o f a b o u t 1 i n c h b y c a p i l l a r y a c t i o n . T h i s w a s f o l l o w e d b y a n e q u a l a m o u n t o f t h e a n t i s e r u m t o b e t e s t e d . T h e e n d o f t h e t u b e w a s p l u g g e d w i t h P l a s t i c e n e a n d t h e t u b e i n v e r t e d a n d s t o o d u p r i g h t i n a P l a s t i c e n e b l o c k . T h i s p r o v i d e d a n a i r - l i q u i d m e n i s c u s n e a r t h e b o t t o m o f t h e t u b e o n w h i c h p r e c i p i t a t e s c o u l d s e t t l e . I t a l s o c a u s e d m i x i n g o f t h e s e r u m a n d n u c l e a r p r o t e i n a s t h e m o r e d e n s e s e r u m s e t t l e d t o t h e b o t t o m . A m e a s u r e o f t h e s t r e n g t h o f t h e a n t i s e r a s e l e c t e d w a s p r o v i d e d b y t i t r a t i n g i t a g a i n s t d o u b l i n g d i l u t i o n s o f t h e n u c l e a r p r o t e i n s o l u t i o n . 34 I I I . A B S O R P T I O N U n w a n t e d r e a c t i o n s a g a i n s t c y t o p l a s m i c p r o t e i n s w e r e r e m o v e d f r o m t h e a n t i s e r u m b y m i x i n g 5 m l a l i q u o t s o f s e r u m w i t h 1 m l o f c y t o p l a s m i c s o l u t i o n o b t a i n e d f r o m t h e c i t r i c a c i d w a s h o f c a l f t h y m o c y t e s . T h e c y t o p l a s m w a s p r e p a r e d f o r a b -s o r p t i o n b y d i a l y s i s w i t h p h o s p h a t e b u f f e r e d i s o t o n i c s a l i n e ( p H 7 . 0 ) . T h e c y t o p l a s m - s e r u m s o l u t i o n w a s a g i t a t e d s l o w l y o n a F i s h e r C l i n i c a l R o t a t o r ( F i s h e r S c i e n t i f i c C o . ) f o r 1 h o u r i n a n i c e b a t h , t h e n c e n t r i f u g e d at a m o d e r a t e s p e e d t o r e m o v e p r e c i p i t a t e s . T h e r e a c t i o n w a s r e p e a t e d a s m a n y a s 3 t i m e s t o r e m o v e a l l p r e c i p i t i n a c t i v i t y . I V . N O N - I M M U N E S E R U M T w o c h i c k e n s w e r e m a i n t a i n e d t h r o u g h o u t t h e c o u r s e o f t h e e x p e r i m e n t s t o p r o v i d e a s u p p l y o f s e r u m w h i c h d i d n o t h a v e a c t i v i t y a g a i n s t c a l f t h y m u s c e l l c o n s t i t u e n t s . T h i s s e r u m w a s l a b e l l e d w i t h f l u o r e s c e n t d y e , c h r o m a t o g r a p h e d a n d c o n c e n t r a t e d i n t h e s a m e m a n n e r a s i m m u n e s e r u m . T h i s p r o v i d e d s a m p l e s o f w h o l e s e r u m a n d f l u o r e s c e n t g l o b u l i n f r a c t i o n s t o b e u s e d a s c o n t r o l s f o r i m m u n e r e a c t i o n s . V . L U P U S E R Y T H E M A T O S I S S E R U M H u m a n L . E . s e r u m w a s o b t a i n e d f r o m p a t i e n t s a t t h e 35 V a n c o u v e r G e n e r a l H o s p i t a l . I t w a s t e s t e d f o r a n t i - c a l f t h y m u s h i s t o n e a c t i v i t y b y p r e c i p i t i n t e s t s a n d i m m u n o d i f f u s i o n i n 1% I o n a g a r . V I . F L U O R E S C E N T D Y E - P R O T E I N C O N J U G A T I O N T h e c o n j u g a t i o n p r o c e d u r e f o l l o w e d w a s e s s e n t i a l l y t h a t o f R i g g s et a l . , ( 1 9 5 8 ) , e x c e p t t h a t a c e t o n e w a s n o t a d d e d t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e s ( C o h e n e t a l . , I 9 6 0 ) . F l u o r e s c e i n i s o -t h i o c y a n a t e ( F I T C ) w a s p u r c h a s e d f r o m H y l a n d L a b o r a t o r i e s , L o s A n g e l e s , C a l i f o r n i a , i n a s t a b l e p o w d e r e d f o r m w h i c h c o u l d b e s t o r e d f o r l o n g p e r i o d s a t r o o m t e m p e r a t u r e . A r e f r a c t o m e t e r r e a d i n g w a s t a k e n t o d e t e r m i n e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n a n d t h e s e r u m b u f f e r e d at p H 9 . 0 w i t h 0 . 1 M c a r b o n a t e b u f f e r , 0 . 3 m l p e r m l o f s e r u m . F o r e a c h m g o f p r o t e i n 0 . 05 m g o f F I T C w a s a d d e d t o t h e s u r f a c e o f t h e s e r u m t o p r o v i d e a 1 : 2 0 d y e - p r o t e i n r a t i o . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s a g i t a t e d s l o w l y i n a n i c e b a t h o n t h e c l i n i c a l r o t a t o r , a t s p e e d s n o t e x c e e d i n g 7 0 R P M i n o r d e r t o a v o i d f o a m i n g , f o r 6 - 8 h o u r s . V I I . H I S T O L O G I C A L T E C H N I Q U E S 1. M a m m a l i a n C e l l s A . P e r i p h e r a l B l o o d C u l t u r e s B o v i n e a n d h u m a n c h r o m o s o m e p r e p a r a t i o n s w e r e 36 o b t a i n e d f r o m l e u k o c y t e c u l t u r e s u s i n g a m o d i f i c a t i o n o f H i r s c h h o r n s m i c r o t e c h n i q u e ( M o n t a g u , 1 9 6 1 , p p 46 - 4 7 , S e e A p p e n d i x I ) . B . B u c c a l S m e a r s H u m a n e p i t h e l i a l c e l l s w e r e p r e p a r e d f o r f l u o r e s c e n t m i c r o s c o p y b y a m o d i f i c a t i o n o f a s t a n d a r d t e c h n i q u e r o u t i n e l y u s e d f o r s e x c h r o m a t i n d e t e r m i n a t i o n ( B a r r , 1 9 5 9 , S e e A p p e n d i x I D . C . B l o o d S m e a r s U n c u l t u r e d l e u k o c y t e s w e r e p r e p a r e d b y m a k i n g s m e a r s o f f r e s h w h o l e b l o o d a n d a l l o w i n g t h e m t o d r y at r o o m t e m p e r a t u r e . E r y t h r o c y t e s w e r e r e m o v e d b y i m m e r s i n g t h e s l i d e s b r i e f l y i n 1% a c e t i c a c i d a n d t h e n c e i n t o i s o t o n i c b u f f e r e d s a l i n e , p H 7 . 0 . D . O r g a n I m p r i n t s O r g a n s w e r e p r e p a r e d f o r i m p r i n t i n g b y s l i c i n g t h e t i s s u e w i t h a r a z o r b l a d e t o p r o v i d e a f l a t s u r f a c e . I m p r i n t s w e r e m a d e b y p r e s s i n g t h e s u r f a c e g e n t l y a g a i n s t a g l a s s s l i d e a n d a i r d r y i n g o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e t o ^ s t i c k t h e c e l l s t o t h e s l i d e . B o v i n e o r g a n s w e r e o b t a i n e d , 1 - 2 h o u r s a f t e r s l a u g h t e r , 37 f r o m C a n a d a P a c k e r s L t d . , V a n c o u v e r , B . C . S l i d e s w e r e p r e p a r e d i m m e d i a t e l y f r o m t h e f r e s h t i s s u e a n d t h e r e m a i n d e r o s t o r e d f r o z e n a t - 2 0 C . H u m a n o r g a n s w e r e m a d e a v a i l a b l e b y T h e A u t o p s y L a b o r a t o r y , V a n c o u v e r G e n e r a l H o s p i t a l , 2 - 3 d a y s a f t e r d e a t h , w h e n t h e y w e r e i m p r i n t e d a n d t h e o r g a n s s t o r e d f r o z e n . 2 . I n s e c t M a t e r i a l A . P o l y t e n e C h r o m o s o m e s S a l i v a r y g l a n d s w e r e d i s s e c t e d f r o m l i v e C h i r o n o m u s  t e n t a n s l a r v a e b y a m p u t a t i n g t h e h e a d w i t h a p o i n t e d s c a l p e l a n d s q u e e z i n g o u t t h e c o n t e n t s o f t h e s e c o n d s e g m e n t w i t h a d i s s e c t i n g n e e d l e . T h e g l a n d s w e r e f i x e d b r i e f l y i n a d r o p o f I N H C 1 a n d s q u a s h e d b y t h e w e i g h t of t h e c o v e r g l a s s . T h e s l i d e w a s p l a c e d o n t h e m i c r o s c o p e u n d e r l o w p o w e r (3 . 5 X ) a n d t h e c o v e r g l a s s r o t a t e d g e n t l y t o b r e a k u p t h e c e l l m e m b r a n e s a n d e x p o s e t h e c h r o m o s o m e s , u s u a l l y l y i n g o n t o p o f a m e m b r a n e s e g m e n t . T h e c e l l u l a r m a t e r i a l w a s t h e n q u i c k f r o z e n b y p l a c i n g t h e s l i d e o n a b l o c k o f d r y i c e . T h i s a l s o c a u s e d t h e c o v e r g l a s s t o d i s l o d g e . T h e p r e p a r a t i o n w a s a l l o w e d t o t h a w a n d a i r d r y a t r o o m t e m p e r -a t u r e i n p r e p a r a t i o n f o r a p p l i c a t i o n o f f l u o r e s c e n t a n t i b o d y . A f t e r f i x a t i o n w i t h H C 1 t h e c h r o m o s o m e s c o u l d b e e x a m i n e d d i r e c t l y w i t h t h e p h a s e m i c r o s c o p e o r s t a i n e d w i t h 0 . 5% a c e t o - o r c e i n . 38 A n o t h e r a l t e r n a t i v e , i n p r e p a r a t i o n f o r p h a s e m i c r o -s c o p y , w a s t o p l a c e t h e g l a n d i n 1 / 1 5 M p h o s p h a t e b u f f e r , w i t h o u t f i x a t i v e , t o s w e l l t h e c e l l s o s m o t i c a l l y . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s t h e w e i g h t o f t h e c o v e r g l a s s w a s s u f f i c i e n t t o s p r e a d t h e c h r o m o -s o m e s w h i l e k e e p i n g t h e n u c l e a r m e m b r a n e i n t a c t . M o r e h y p o t o n i c s o l u t i o n s w e r e f o u n d t o c a u s e c o m p l e t e d i s i n t e g r a t i o n of t h e c e l l s , i n c l u d i n g t h e c h r o m o s o m e s . B . P r o t o z o a n C e l l s P r e p a r a t i o n s o f t h e i n t e s t i n a l p a r a s i t e H o l o m a s t i g o t o i d e s w e r e m a d e b y s q u e e z i n g t h e i n t e s t i n a l c o n t e n t s o f t h e t e r m i t e H e t e r o t e r m e s o n t o a g l a s s s l i d e a n d a l l o w i n g t h e m t o a i r d r y . T o i n s u r e t h a t f l u o r e s c e n t a n t i b o d y m a d e c o n t a c t w i t h t h e n u c l e u s a d r o p o f 1 / 1 5 M p h o s p h a t e b u f f e r w a s a d d e d t o r u p t u r e t h e o u t e r m e m b r a n e s . F l u o r e s c e n t a n t i b o d y w a s a d d e d d i r e c t l y t o t h e w e t p r e p a r a t i o n . 3 . P l a n t M a t e r i a l s M i t o t i c p l a n t c e l l s o f L i l l i u m a n d A l l i u m w e r e p r e p a r e d b y r e m o v i n g t h e r o o t t i p s a n d i n c u b a t i n g t h e m f o r 3 0 m i n u t e s a t 3 7 ° C i n a 2 . 0% s o l u t i o n o f p e c t i n a s e ( N u t r i t i o n a l B i o c h e m i c a l C o m p a n y , C l e v e l a n d , O h i o ) t o s o f t e n a n d s e p a r a t e t h e c e l l s ( S h a r m a a n d S h a r m a , 1 9 6 5 , p . 1 0 6 ) . T h e r o o t t i p s w e r e m a c e r a t e d , 39 s p r e a d o n g l a s s s l i d e s a n d a i r d r i e d . 4 . A n t i b o d y A p p l i c a t i o n M a t e r i a l s t h a t h a d b e e n p r e p a r e d w i t h o r g a n i c f i x a t i v e s w e r e b r o u g h t t o a n a q u e o u s m e d i u m b y p a s s a g e t h r o u g h i n c r e a s i n g d i l u t i o n s o f t h e f i x a t i v e u s e d a n d f i n a l l y i n t o 0 . 02 M p h o s p h a t e b u f f e r e d i s o t o n i c s a l i n e . M a t e r i a l s t h a t w e r e f i x e d b y d r y i n g w e r e p l a c e d d i r e c t l y i n t h e b u f f e r f o r s e v e r a l m i n u t e s . I n b o t h c a s e s t h e s l i d e s w e r e k e p t w e t t h r o u g h o u t t h e r e s t o f t h e p r o c e d u r e . E x c e s s b u f f e r w a s r e m o v e d f r o m t h e s l i d e s , s u r r o u n d i n g t h e t i s s u e s , w i t h a b s o r b e n t p a p e r a n d a d r o p o f f l u o r e s c e n t a n t i b o d y s p r e a d o v e r t h e s u r f a c e o f t h e t e s t m a t e r i a l s . T h e s l i d e s w e r e p l a c e d i n a P e t r i d i s h c o n t a i n i n g a w e t p i e c e o f f i l t e r p a p e r t o p r o v i d e a s a t u r a t e d a t m o s p h e r e . T h e s l i d e s w e r e r o t a t e d g e n t l y o n t h e c l i n i c a l r o t a t o r f o r 30 m i n u t e s , r e m o v e d a n d r i n s e d i n b u f f e r , t h e n w a s h e d f o r 30 m i n u t e s i n 3 c h a n g e s o f b u f f e r , o n t h e r o t a t o r . A c o v e r g l a s s w a s a p p l i e d u s i n g t h e b u f f e r a s m o u n t i n g m e d i u m . T h e s l i d e s c o u l d b e v i e w e d d i r e c t l y o r s e a l e d w i t h m e l t e d p a r a f f i n a n d s t o r e d i n t h e w e t P e t r i d i s h e s . I n e i t h e r c a s e t h e y w e r e p h o t o -g r a p h e d a t t h e e a r l i e s t c o n v e n i e n c e a n d d i s p o s e d o f . S e v e r a l s l i d e s o f e a c h t y p e o f m a t e r i a l w e r e r o u t i n e l y c o n j u g a t e d w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y . A t l e a s t o n e s l i d e o f e a c h s e r i e s w a s t r e a t e d w i t h f l u o r e s c e n t n o n - i m m u n e g l o b u l i n t o s e r v e 4 0 a s a c o n t r o l a n d s h o w t h e k i n d s a n d a m o u n t o f n o n - s p e c i f i c f l u o r e s c e n c e p r e s e n t . 5 . A c r i d i n e O r a n g e S t a i n i n g B l o o d s m e a r s , u n f i x e d c h r o m o s o m a l p r e p a r a t i o n s a n d o r g a n i m p r i n t s w e r e s t a i n e d w i t h A c r i d i n e , o r a n g e ( A O ) a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f V o n B e r t a l a n f f y ( 1 9 6 1 ) . T h i s i s a l i m i t e d p u b l i -c a t i o n , (See A p p e n d i x I I I ) . 6 . B i e b r i c h S c a r l e t S t a i n i n g F r e s h t i s s u e i m p r i n t s w e r e s t a i n e d w i t h B i e b r i c h s c a r l e t a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f D o u g l a s , S p i c e r a n d B a r t e l s ( 1 9 6 6 ) . T h e i m p r i n t s w e r e f i x e d f o r 2 4 h o u r s i n C a r n o y ' s f l u i d ( 1 : 1 : 1 , V / V , a b s o l u t e e t h a n o l - c h l o r o f o r m - g l a c i a l a c e t i c a c i d ) . A f t e r f i x a t i o n t h e s l i d e s w e r e h y d r a t e d t h r o u g h g r a d e d a l c o h o l s a n d s t a i n e d f o r 60 m i n u t e s i n a 0 . 0 4 % s o l u t i o n o f B i e b r i c h . s c a r l e t i n I N g l y c i n e b u f f e r a d j u s t e d t o p H 9 . 5 w i t h I N N a O H . T h e i m p r i n t s w e r e t h e n d e h y d r a t e d w i t h t w o r a p i d i m m e r s i o n s i n a b s o l u t e a l c o h o l a n d c l e a r e d r a p i d l y i n 1:1 a l c o h o l - x y l o l f o l l o w e d b y x y l o l . F i n a l l y t h e y w e r e m o u n t e d i n P e r m o u n t . V I I I . M I C R O S C O P Y A Z e i s s - P h o t o m i c r o s c o p e w a s u s e d t h r o u g h o u t t h e c o u r s e 41 o f t h e s e i n v e s t i g a t i o n s . I t w a s e q u i p p e d f o r p h a s e c o n t r a s t a n d f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y . T h i s p e r m i t s t h e o b s e r v a t i o n o f f l u o r e s c e n t c e l l s w h i c h c a n t h e n b e v i e w e d b y p h a s e c o n t r a s t w i t h o u t m o v i n g t h e s l i d e o r c h a n g i n g o b j e c t i v e s . F o r f l u o r e s c e n c e m i c r o -s c o p y B G / 3 a n d B G 38 w h i c h m a k e u p e x c i t e r f i l t e r I I w e r e u s e d t o l i m i t e x c i t e r l i g h t t r a n s m i s s i o n t o t h e 3 0 0 0 - 4 0 0 0 A ° r a n g e . B a r r i e r f i l t e r 5 3 / 4 4 w h i c h t r a n s m i t s a b o v e 5 2 5 0 A ° w a s u s e d i n c o m b i n a t i o n . I t w a s f o u n d t h a t t h e b e s t r e s u l t s w e r e o b t a i n e d u s i n g t h e 4 5 X o b -j e c t i v e w i t h t h e c o n d e n s e r s e t a t t h e " J " p o s i t i o n . I X . P H O T O G R A P H Y F l u o r e s c e n t c e l l s w e r e p h o t o g r a p h e d b y d i r e c t i n g a l l t h e l i g h t u p t h e c a m e r a t u b e , d i r e c t l y o n t o t h e f i l m . K o d a k H i g h S p e e d E k t a c h r o m e ( A S A 120, d a y l i g h t t y p e ) w a s u s e d t h r o u g h o u t a n d d e v e l -o p e d c o m m e r c i a l l y t o p r o v i d e c o l o u r s l i d e s . E x p o s u r e t i m e s w e r e d e t e r m i n e d b y t a k i n g t e s t e x p o s u r e s t o p r o v i d e t h e e x p o s u r e r a n g e i n w h i c h t h e d i f f e r e n t m a t e r i a l s c o u l d b e p h o t o g r a p h e d . T h r e e p h o t o g r a p h s , o v e r t h i s r a n g e , w e r e r o u t i n e l y t a k e n . E x p o s u r e t i m e s , w h i c h v a r i e d f r o m 5 t o 2 4 0 s e c o n d s , p r o v i d e d a m e a s u r e o f t h e s t r e n g t h o f f l u o r e s c e n c e . T h e c o l o u r p h o t o g r a p h s w e r e m a c h i n e p r i n t e d b y s t a n d a r d m e t h o d s i n m o s t c a s e s , d i r e c t l y f r o m t h e c o l o u r s l i d e s . W h e r e e n l a r g e m e n t s o f p o r t i o n s o f a s l i d e o r s p e c i a l m e t h o d s t o c o m b a t 4 2 o v e r - e x p o s u r e w e r e r e q u i r e d , t h e p r i n t s w e r e h a n d d e v e l o p e d M r . J . D e i t r i c h , H e a d , D e p a r t m e n t o f P h o t o S e r v i c e , U n i v e r s o f A l b e r t a , E d m o n t o n . 4 3 R E S U L T S T h e s o u r c e o± i m m u n o g e n i c m a t e r i a l u s e d i n t h i s s t u d y w a s n u c l e a r p r o t e i n e x t r a c t e d f r o m c a l f t h y m u s ( D a l y a n d M i r s k y , 1955). T h i s p r o t e i n p r e p a r a t i o n w a s i n j e c t e d i n t o c h i c k e n s a n d t h e i r i m m u n o l o g i c a l r e s p o n s e s t u d i e d . T h e r e s u l t a n t a n t i s e r u m w a s u s e d t o s t u d y t h e n u c l e a r p r o t e i n e x t r a c t i m m u n o l o g i c a l l y ( O u c h t e r l o n y , 1 9 4 8 ) . T h e e x t r a c t w a s a l s o a n a l y s e d c h r o m a t o -g r a p h i c a l l y ( J o h n s o n e t a l . , 1 9 6 4 ) , e l e c t r o p h o r e c t i c a l l y ( M c A l l i s t e r , W a n a n d I r v i n , 1 9 6 3 ) , b y a m m o a c i d a n a l y s i s a n d b y a d i f f e r e n t i a l s t a i n i n g t e c h n i q u e ( D o u g l a s , S p i c e r a n d B a r t e l l s , 1 9 6 6 ) . T h e a n t i s e r u m w a s a b s o r b e d t o r e m o v e u n w a n t e d i m m u n o -l o g i c a l a c t i v i t y . I t w a s p r e p a r e d a s a p r o t e i n t r a c e r b y l a b e l l i n g w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y , w a s a p p l i e d t o a v a r i e t y o f c e l l s t o d e m o n s t r a t e t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e n u c l e a r p r o t e i n a n t i g e n a n d t h e r e s u l t s p h o t o g r a p h e d . T a b l e 1 s h o w s t h e s e q u e n c e o f p r e p a r a t i v e p r o c e d u r e s a n d a n a l y t i c a l t e s t s e m p l o y e d . TABLE I IMMUNOCHEMICAL PROCEDURE FOR THE FLUORESCENT DEMONSTRATION  OF NUCLEAR PROTEIN ANTIGEN AT THE CELLULAR L E V E L CALF THYMUS TISSUE ANALYSES •< amino a c i d c o m p o s i t i o n d i s c e l e c t r o p h o r e s i s c h r o m a t o g r a p h y d i f f e r e n t i a l s t a i n i n g p r e c i p i t i n t e s t s - , _ i m m u n o d i f f u s i o n t e s t s p r e c i p i t i n t e s t i m m u n o d i f f u s i o n t e s t c a l f thymus c e l l s ' b o v i n e l i v e r c e l l s b o v i n e s p l e e n c e l l s b o v i n e t e s t i s c e l l s b o v i n e chromosomes N a C l . / n u c l e a r p r o t e i n p r e c i p i t a t e \ c h i c k e n a n t i s e r u m v s . n u c l e a r p r o t e i n & ~* i m p u r i t i e s a n t i s e r u m v s . n u c l e a r p r o t e i n 1 l a b e l w i t h F I T C and c h r o m a t o g r a p h f l u o r e s c e n t ^ a n t i b o d y — i m m u n o f l u o r e s c e n t t e s t s human thymus c e l l s human b u c c a l c e l l s human t e s t i s c e l l s human chromosomes C i t r i c a c i d \ c y t o p l a s m •ANALYSES d i s c e l e c t r o p h o r e s i s i m m u n o d i f f u s i o n t e s t s a b s o r p t i o n J " i n s e c t c e l l s p l a n t c e l l s c h i c k e n c e l l s s p e c t r o p h o t o m e t r y i m m u n o d i f f u s i o n t e s t s d i s c e l e c t r o p h o r e s i s p r e c i p i t i n t e s t s 4 5 I . E X T R A C T I O N O F N U C L E A R P R O T E I N S N u c l e a r p r o t e i n s w e r e p r e p a r e d o n t h r e e o c c a s i o n s u s i n g 150 g m of c a l f t h y m u s e a c h t i m e . B a t c h e s 1 a n d 2 w e r e p r e p a r e d d u r i n g t h e e a r l y s t a g e s o f t h e s e e x p e r i m e n t s , i T h e s e p r e p a r a t i o n s w e r e u s e d i n the i n i t i a l i m m u n i -s a t i o n s a n d w e r e n o t a n a l y s e d . T h e t h i r d e x t r a c t i o n w a s c o n s i d e r e d m o s t s a t i s f a c t o r y a s m o r e e x t e n s i v e w a s h i n g w a s p o s s i b l e . I n t h i s c a s e t h e c y t o p l a s m i c f r a c t i o n w a s s t o r e d f o r l a t e r a n a l y s i s a n d t h e n u c l e i w a s h e d t h r e e t i m e s i n 6 , 2 5 0 m l c e n t r i f u g e t u b e s . T h i s p r o c e d u r e r e s u l t e d i n c o m p l e t e r e m o v a l of c y t o p l a s m i c p r o t e i n a s d e t e r m i n e d b y a r e f r a c t o m e t e r t e s t f o r p r o t e i n , s t a n d a r d i s e d a g a i n s t t h e w a s h s o l u t i o n . T h e f i n a l y i e l d o f B a t c h 3 w a s 16 0 m l o f n u c l e a r p r o t e i n s o l u t i o n a t a c o n c e n t r a t i o n o f 4 . 3 g m % a n d 120 n i l o f c y t o p l a s m i c p r o t e i n ( 1 . 5 g m % ) . M i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f t h e n u c l e i a f t e r r e m o v a l o f c y t o p l a s m w a s c o m p l i c a t e d b y t h e p r e s e n c e o f t i s s u e d e b r i s a n d t h e h i g h d e n s i t y o f t h e n u c l e a r p e l l e t . H o w e v e r , a n i m p r i n t o f c a l f t h y m o c y t e s w a s e x a m i n e d m i c r o s c o p i c a l l y a f t e r b e i n g t r e a t e d w i t h 0 . 005 M c i t r i c a c i d f o r 3 0 m i n u t e s a n d r i n s e d i n b u f f e r e d s a l i n e . T h i s s h o w e d t h e c o m p l e t e r e m o v a l o f c y t o p l a s m l e a v i n g b a r e n u c l e i , a s r e p o r t e d b y L i t t a u e t a l . , ( 1 9 6 5 ) . 4 6 A m i n o a c i d a n a l y s i s o f B a t c h 3 w a s c a r r i e d o u t . T h e r e s u l t s a r e s h o w n i n T a b l e II a l o n g w i t h s t a n d a r d v a l u e s f o r c o m -p a r i s o n . T h e s l i g h t d i f f e r e n c e s i n p e r c e n t a g e s o f b a s i c a m i n o a c i d s a r e a t t r i b u t a b l e to d i f f e r e n c e s i n e x t r a c t i o n m e t h o d s . C r a m p t o n e t a l . , u s e d 2 . 6 M N a C l to e x t r a c t a n a r g i n i n e - r i c h f r a c t i o n . A 1. 25 M N a C l s o l u t i o n w a s u s e d i n t h i s p r o j e c t to e x t r a c t a l y s i n e - r i c h f r a c t i o n . A l t h o u g h the t o t a l m o l e s o f b a s i c a m i n o a c i d s i n B a t c h 3 a r e 2 . 1% l e s s t h a n the s t a n d a r d v a l u e the r a t i o o f l y s i n e to a r g i n i n e i s h i g h e r . 4 7 T A B L E I I A M I N O A C I D C O M P O S I T I O N O F N U C L E A R P R O T E I N  P R E P A R A T I O N ( B A T C H 3) T h e v a l u e s a r e p e r c e n t a g e s o f t o t a l m o l e s o f a m i n o a c i d s . T h e s t a n d a r d v a l u e s a r e t h o s e o f C r a m p t o n e t a l . , ( l 9 5 5 ) . a c c e p t e d a s s t a n d a r d f o r c a l f t h y m u s h i s t o n e s p r i o r t o f r a c t i o n a t i o n ( B u s c h , 1 9 6 5 p . 4 3 ) . S t a n d a r d N u c l e a r A m i n o A c i d V a l u e s P r o t e i n L y s i n e 1 4 . 7 1 5 . 5 H i s t i d i n e 2. 0 1. 6 A r g i n i n e 8. 3 5 . 4 A s p a r t i c A c i d 4 . 8 6. 1 T h r e o n i n e a n d S e r i n e 1 1 . 6 1 1 . 5 G l u t a m i c A c i d 8. 2 9 . 7 P r o l i n e 4 . 9 4 . 6 G l y c i n e 8. 3 1 0 . 8 A l a n i n e 1 3 . 5 1 5 . 3 V a l i n e 6 . 2 5 . 4 M e t h i o n i n e 0 . 9 0 . 8 I s o l e u c i n e 4 . 3 2 . 9 L e u c i n e 7 . 7 6 . 4 T y r o s i n e 2 . 5 1 . 7 P h e n y l a l a n i n e 2 . 2 2 . 1 L y s i n e a n d A r g i n i n e 2 3 . 0 2 0 . 9 A s p a r t i c a n d G l u t a m i c 1 3 . 0 1 5 . 8 L y s i n e / A r g i n i n e 1 . 8 2 . 8 4 8 I I . P R O D U C T I O N O F A N T I S E R U M B e f o r e t h e n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n c o u l d b e a n a l y s e d i n g r e a t e r d e t a i l i t w a s n e c e s s a r y t o d e t e r m i n e w h e t h e r i t w a s i m r n u n o g e n i c t o t h e c h i c k e n . I m m u n i s a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a n d t h e c h i c k e n s e r a t e s t e d f o r a n t i b o d y a c t i v i t y b y p r e c i p i t i n t e s t s , i m m u n o d i f f u s i o n t e s t s o n m i l l i p o r e m e m b r a n e s , a n d i m m u n o -d i f f u s i o n t e s t s i n 1% a g a r . 1. S c h e d u l e o f I m m u n i s a t i o n s a n d P r e c i p i t i n T e s t s C a l f , t h y m u s n u c l e a r p r o t e i n ( B a t c h e s 1 a n d 2 ) w a s p r e c i p i t a t e d a n d i n j e c t e d i n t o 2 2 L e g h o r n h e n s . A f t e r 14 d a y s t h e c h i c k e n s w e r e s t a r v e d o v e r n i g h t , 5 m l s e r u m s a m p l e s t a k e n , a n d t h e c h i c k e n s r e i n j e c t e d w i t h t h e i n o c u l u m . T h e s e r a o f 7 b i r d s g a v e w e a k l y p o s i t i v e p r e c i p i t i n t e s t s a g a i n s t t h e n u c l e a r p r o t e i n s o l u t i o n . A f t e r a f u r t h e r 14 d a y s , 2 0 m l s e r u m s a m p l e s w e r e t a k e n f r o m t h e b i r d s w h i c h h a d p r o d u c e d p r e c i p i t i n s a n d 6 b i r d s a g a i n i n j e c t e d , o n e h a v i n g d i e d i n t h e i n t e r v a l . A f i n a l b l e e d i n g o f 2 0 m l p e r b i r d w a s p e r f o r m e d a f t e r t h e s i x t h w e e k . T h e s e r a f r o m 4 o f t h e s e l e c t e d b i r d s s t i l l c o n t a i n e d w e a k p r e c i p i t i n a c t i v i t y w h i c h w a s n o t e v i d e n t i n d i l u t i o n s g r e a t e r t h a n 1 :1 . C o n t r o l s e r a f r o m n o n i m m u n i s e d c h i c k e n s g a v e a n e g a t i v e r e s u l t . T w o c h i c k e n s ( n u m b e r e d 3 1 2 a n d 333) : p r o d u c e d l i t r e s o f 1:32 a n d 1:16 a s s h o w n i n F i g u r e 1. T h e s e b i r d s w e r e r e i n j e c t e d w i t h 49 n u c l e a r p r o t e i n ( B a t c h 3) a n d b l e d a f t e r a 28 d a y i n t e r v a l o n t w o s u c c e s s i v e o c c a s i o n s a t 8 a n d 10 m o n t h s . T h e s e p r o c e d u r e s p r o v i d e d a s t o c k o f 120 m l o f a n t i s e r u m . 50 F i g u r e 1 P r e c i p i t i n T e s t o f A n t i s e r a 3 3 3 a n d 3 1 2 - T u b e 1 c o n t a i n s a n t i s e r u m a n d n u c l e a r p r o t e i n a n t i g e n 1 :1 . S u c c e s s i v e t u b e s r e p r e s e n t d o u b l i n g d i l u t i o n s o f a n t i s e r u m . . P r e c i p i t a t e s c a n b e s e e n r e s t i n g o n m e n i s c u s a t a i r - l i q u i d i n t e r f a c e . A - A n t i s e r u m 3 3 3 , t u b e 6 i s n e g a t i v e . T i t r e 1 :16 . B - A n t i s e r u m 3 1 2 , t u b e 6 w e a k l y p o s i t i v e . T i t r e 1:32 • 5 52 2 . I m m u n o d i f f u s i o n T e s t s A . M i c r o - i m m u n o d i f f u s i o n I n a n e f f o r t t o q u a n t i t a t e the i m m u n e r e s p o n s e e l i c i t e d b y the i m m u n i s a t i o n p r o c e d u r e two m e t h o d s o f i m m u n o d i f f u s i o n w e r e e m p l o y e d u s i n g u n f r a c t i o n a t e d a n t i s e r u m a n d the n u c l e a r p r o t e i n s o l u t i o n . T h e f i r s t m e t h o d c h o s e n w a s m i c r o - i m m u n o d i f f u s i o n o n m i l l i p o r e m e m b r a n e s . T h i s m e t h o d i s r e p o r t e d to h a v e the a d v a n t a g e s o f r e q u i r i n g o n l y l a m b d a a m o u n t s o f r e a g e n t s , h a v i n g h i g h r e s o l v i n g p o w e r , p r o v i d i n g s h a r p p r e c i p i t i n l i n e s w h i c h c a n b e s t a i n e d to p r o v i d e a p e r m a n e n t s l i d e , a n d b e i n g r e l a t i v e l y e a s y to p r e p a r e . T h i s w a s f o u n d to be the c a s e w h e n a n a l y s i n g s e r u m p r o t e i n s . H o w e v e r , the m e t h o d d o e s n o t a p p e a r to b e w e l l s u i t e d to the i m m u n o l o g i c a l a n a l y s e s o f s m a l i ' m o l e c u l a r w e i g h t , b a s i c p r o t e i n s . T w e l v e p l a t e s w e r e p r e p a r e d . T h e s t r o n g e s t r e a c t i o n s a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 2 w h e r e z o n e s o f p r e c i p i t a t e w e r e o b t a i n e d r a t h e r t h a n s h a r p l i n e s . T h e p o s i t i o n o f t he p r e c i p i t i n z o n e s , i n c l o s e p r o x i m i t y to the a n t i s e r u m w e l l s p r o v i d e d the f i r s t e v i d e n c e t h a t the a n t i g e n i c c o m p o n e n t s m i g r a t e a t a f a s t e r r a t e t h a n the a n t i b o d y . T h i s i s a s s u m e d to b e d u e to the a n t i g e n i c m o l e c u l e s h a v i n g s m a l l e r m o l e c u l a r d i m e n s i o n s t h a n the a n t i b o d y m o l e c u l e s . F i g u r e 2 A s e r v e s to d e m o n s t r a t e , b y a n o t h e r m e t h o d , the i m m u n o l o g i c a l a c t i v i t y o f d i l u t e d a n t i s e r u m , f i r s t o b s e r v e d i n t h e p r e c i p i t i n t e s t s . F i g u r e 2 B i n d i c a t e s t h a t t h i s a n t i b o d y a c t i v i t y i s d i r e c t e d a g a i n s t a n a n t i g e n t h a t i s p r e s e n t i n c o m m e r c i a l h i s t o n e a s w e l l a s t h e 3 n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n s . T h i s i s i n d i c a t e d b y t h e c o n t i n u i t y o f t h e r i n g o f p r e c i p i t a t e a r o u n d t h e c e n t r a l w e l l . T h e i n c r e a s e d d e n s i t y o f t h e p r e c i p i t a t e s o p p o s i t e w e l l 4 i n d i c a t e s t h a t m o r e o f t he a n t i g e n w a s p r e s e n t i n B a t c h 3 t h a n i n t h e o t h e r s a m p l e s . 54 F i g u r e 2 M i c r o - i r n r n u n o d i f f u s i o n T e s t s o f A n t i b o d y A c t i v i t y o f C h i c k e n S e r u m A g a i n s t N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n . A - T h e c i r c u l a r w e l l s c o n t a i n e d d o u b l i n g d i l u t i o n s o f 2 a n t i s e r a w h i l e t h e a n t i g e n w a s p r e s e n t i n t h e c e n t r a l t r o u g h . P r e c i p i t a t e s f a i n t e r w i t h i n c r e a s i n g d i l u t i o n . B - T h e c e n t r a l w e l l c o n t a i n e d t h e a n t i s e r u m . O u t e r w e l l s c o n t a i n e d 4 n u c l e a r p r o t e i n p r e p -a r a t i o n s . P r e c i p i t a t e s f o r m a c o n t i n u o u s r i n g a r o u n d w e l l 5 , c o n c e n t r a t e d o p p o s i t e w e l l 4 . Z o n e s o f p r e c i p i t a t e o c c u r r e d a f t e r 72 h o u r s , n e a r e s t t h e a n t i s e r u m w e l l s i n a l l e a s e s . T h e m e m b r a n e s w e r e s t a i n e d , c l e a r e d a n d m o u n t e d o n g l a s s . T h e m e m b r a n e i t s e l f w a s u s e d a s a n e g a t i v e i n t h e e n l a r g e r t o p r o v i d e t h e p h o t o -g r a p h s i n w h i c h t h e s t a i n e d p r e c i p i t a t e s a p p e a r w h i t e . E n l a r g e d 6 X . 55 A . B . W e l l N o . Reagen t W e l l N o , Reagen t 1 A n t i s e r u m 3 1 2 , 1 :1 1 C o m m e r c i a l H i s t o n e 2 A n t i s e r u m 3 1 2 , 1:2 2 N u c l e a r P r o t e i n , B a t c h 1 3 A n t i s e r u m 3 1 2 , 1 :4 3 N u c l e a r P r o t e i n , B a t c h 2 4 A n t i s e r u m 3 3 3 , 1 :1 4 N u c l e a r P r o t e i n , B a t c h 3 5 A n t i s e r u m 3 3 3 , 1:2 5 A n t i s e r u m 312 6 A n t i s e r u m 3 3 3 , 1 :4 7 N u c l e a r P r o t e i n 56 B . M a c r o - i m m u n o d i f f u s i o n T h e s e c o n d m e t h o d o f a n a l y s i n g t h e c h i c k e n a n t i s e r u m f o r r e a c t i v i t y a g a i n s t n u c l e a r p r o t e i n a n t i g e n w a s m a c r o -i m m u n o d i f f u s i o n i n 1% a g a r , i n P e t r i d i s h e s . T h i s m e t h o d r e q u i r e s m o r e o f e a c h r e a g e n t ( a p p r o x i m a t e l y 0 . 5 m l ) b u t p r o v i d e d d e f i n i t e l i n e s o f p r e c i p i t a t e . T h e m e t h o d w a s u s e d t o t e s t t h e s e r a f r o m s e v e r a l c h i c k e n s , t h a t h a d g i v e n p o s i t i v e r e s u l t s i n t h e p r e c i p i t i n t e s t , - f o r a n t i b o d y a c t i v i t y a g a i n s t n u c l e a r p r o t e i n a n t i g e n s . T h e s e r a f r o m c h i c k e n s 3 1 2 a n d 3 3 3 g a v e t h e m o s t s t r o n g l y p o s i t i v e r e s u l t s . T h e s e s e r a w e r e t e s t e d a g a i n s t n u c l e a r p r o t e i n s , c o m m e r c i a l h i s t o n e , a n d c y t o p l a s m i c p r o t e i n s t o w h i c h t h e y r e a c t e d p o s i t i v e l y . A n t i b o d i e s a g a i n s t c y t o p l a s m i c a n t i g e n s w e r e a b s o r b e d o u t o f t h e s e 2 a n t i s e r a a n d t h e y w e r e a g a i n t e s t e d f o r a n t i b o d y a c t i v i t y a g a i n s t n u c l e a r p r o t e i n a n t i g e n s . F i g u r e 3 A s h o w s t h e r e s u l t s o f a n i n i t i a l a t t e m p t i n w h i c h a n t i s e r a f r o m c h i c k e n s 3 1 2 a n d 3 3 3 b o t h p r o v i d e d 2 l i n e s o f p r e c i p i t a t e a g a i n s t t h e n u c l e a r p r o t e i n a n t i g e n s , a f t e r d e v e l o p i n g f o r 5 d a y s . I n o r d e r t o a s c e r t a i n w h e t h e r b o t h c h i c k e n s w e r e p r o d u c i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t t h e s a m e a n t i g e n s t h e o u t e r w e l l s w e r e m o v e d c l o s e r t o e a c h o t h e r a n d t h e c e n t r a l w e l l ( F i g u r e 3 B ) . T h e c o n t i n u o u s l i n e s o f p r e c i p i t a t e s u r r o u n d i n g t h e c e n t r a l w e l l s h o w t h a t t h e a n t i g e n s i n v o l v e d a r e i d e n t i c a l . T h r e e s u c h p l a t e s w e r e p r e p a r e d , i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e o p t i m u m d i s t a n c e b e t w e e n w e l l s . 57 F i g u r e 3 M a c r o - i m m u n o d i f f u s i o n T e s t o f A n t i b o d y A c t i v i t y o f C h i c k e n S e r u m A g a i n s t N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n . A - T w o a n t i s e r a , p r e s e n t i n o u t e r w e l l s , h a v e d i f f u s e d a s h o r t d i s t a n c e t o c o m b i n e w i t h 2 a n t i g e n s f r o m t h e c e n t r a l w e l l t o p r o d u c e 2 l i n e s o f p r e c i p i t a t e o p p o s i t e e a c h w e l l . B - A n t i s e r a 3 1 2 a n d 3 3 3 h a v e r e a c t e d w i t h n u c l e a r p r o t e i n a n t i g e n a n d p r o d u c e d 2 p r e c i p i t i n l i n e s w h i c h a r e j o i n e d . A n t i -s e r u m 3 5 7 d i d n o t p r o d u c e l i n e s o f p r e c i p i t a t e . I t w a s w e a k l y p o s i t i v e i n t h e p r e c i p i t i n t e s t . B y m o v i n g t h e a n t i s e r u m w e l l s c l o s e r t o g e t h e r t h e p r e c i p i t i n l i n e s p r e s e n t i n A c a n b e s e e n i n B t o b e c o n t i n u o u s , i n d i c a t i n g t h a t a n t i s e r a 3 3 3 a n d 3 1 2 c o n t a i n a n t i b o d i e s a g a i n s t 2 i d e n t i c a l a n t i g e n s . T h e l i n e s a r e c l o s e s t t o t h e a n t i s e r u m w e l l s i n b o t h c a s e s . ' So 1U A . W e l l N o . 1 2 3 4 5 Feagent Antiserum 312 A n t i s e r u m 312 Antiserum 333 Antiserum 333 Nuclear n rote in Batch #3 B. Wel l No. 1 2 3 4 5 6 7 p eaqent A n t i s e r u m 312 Antiserum 312 Antiserum 333 Antiserum 333 Antiserum 357 Antiserum 357 "Tuclear Drotein Batch #3 I n o r d e r t o f u r t h e r d e f i n e t h e i m m u n o l o g i c a l r e a c t i o n s o f t h e s e a n t i s e r a t h e y w e r e t e s t e d a g a i n s t a c o m m e r c i a l h i s t o n e p r e p a r a t i o n , t h e n u c l e a r p r o t e i n f r a c t i o n a n d t h e c y t o p l a s m i c f r a c t i o n o b t a i n e d f r o m t h e p r e p a r a t i v e p r o c e d u r e . B o t h a n t i s e r a g a v e s i m i l a r p o s i t i v e r e a c t i o n s a g a i n s t a l l 3 a n t i g e n s , , a s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 4 . T w o s t r a i g h t i m m u n o d i f f u s i o n l i n e s a r e p r e s e n t b e t w e e n t h e a n t i s e r u m a n d t h e n u c l e a r p r o t e i n f r a c t i o n , o n e w i d e a n d o n e n a r r o w . T h i s i s m o s t c l e a r l y e v i d e n t i n F i g u r e 4 A , w e l l 6 . T w o s i m i l a r b u t w e a k e r l i n e s a r e p r e s e n t b e t w e e n t h e a n t i s e r u m a n d t h e c o m m e r c i a l h i s t o n e ( F i g u r e 4 B , w e l l 5 ) . T h e a n t i s e r u m r e a c t e d w i t h t h e c y t o p l a s m i c p r o t e i n t o p r o d u c e a l i n e o f i d e n t i t y w i t h t h e o t h e r t w o s y s t e m s a n d a c r e s c e n t s h a p e d l i n e s u p e r -i m p o s e d o n i t ( F i g u r e 4 A , w e l l 4 ) . O n t h e b a s i s o f t h e r e s u l t s s h o w n i n F i g u r e 4 a n d b y s t u d y i n g f o u r o t h e r p l a t e s w h i c h p r o d u c e d s i m i l a r p a t t e r n s i t w a s c o n c l u d e d t h a t a l l 3 a n t i g e n i c p r e p a r a t i o n s c o n t a i n e d a c o m m o n c o m p o n e n t i n v a r y i n g a m o u n t s ( the c o m m o n w i d e l i n e ) . T h e n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n c o n t a i n e d a u n i q u e a n t i g e n i c c o m p o n e n t o f s m a l l e r w e i g h t t h a n t h e c o m m o n c o m p o n e n t ( the n a r r o w l i n e c l o s e s t t o t h e a n t i g e n w e l l ) . A n o t h e r d i f f e r e n t a n t i g e n i c s p e c i e s w a s p r e s e n t i n t h e c y t o p l a s m ( the c u r v e d l i n e ) . 60 F i g u r e 4 I m m u n o d i f f u s i o n T e s t s o f A n t i s e r a 3 3 3 , 3 1 2 A g a i n s t C y t o p l a s m , H i s t o n e a n d N u c l e a r P r o t e i n . A n t i s e r a w e r e a l l o w e d t o d i f f u s e 2 4 h o u r s b e f o r e a d d i n g a n t i g e n s . C e n t r a l l i n e l i n k i n g a l l a n t i g e n s a p p e a r e d a f t e r 5 d a y s . A f t e r a f u r t h e r 4 d a y s t h e c u r v e d l i n e ( w e l l s 1 a n d 4) a p p e a r e d , f o l l o w e d b y t h e s i n g l e l i n e c l o s e t o w e l l s 3 , 6 . L i n e s a r e h e a v i e r i n B i n d i c a t i n g m o r e a n t i b o d y p r e s e n t i n a n t i s e r u m 3 1 2 t h a n 3 3 3 . s 61 A . Wel l No. 3 6 7 Reagent Cytoplasmic F r a c t i o n Cytoplasmic F r a c t i o n Commercial Histone Commercial Histone Nuclear p r o t e i n Batch #3 Nuclear p r o t e i n Batch #3 Antiserum 333 B. " e l l No. 4 2 3 6 7 rc.ea^ent Cy top lasmic F r a c t i o n Cytoplasmic F r a c t i o n Commercial Kis tone Commercial Histone Nuclear n r o t e i n Batch #3 v u c l e a r p r o t e i n Batch #3 Ant i serur 312 62 3 . A b s o r p t i o n o f A n t i s e r u m I n o r d e r t o r e m o v e t h e a n t i b o d i e s t h a t w e r e r e a c t i n g w i t h c y t o p l a s m i c a n t i g e n s t h e a n t i s e r a w e r e m i x e d w i t h s m a l l a m o u n t s o f c y t o p l a s m a n d a l l o w e d t o r e a c t u n t i l p r e c i p i t a t e s n o l o n g e r a p p e a r e d . F i g u r e 5 s h o w s t h e r e s u l t of t e s t i n g a n t i s e r u m 3 1 2 a g a i n s t t he n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c p r o t e i n f r a c t i o n s a f t e r a b s o r p t i o n w i t h c y t o p l a s m . T h e s t r a i g h t l i n e s o f p r e c i p i t a t e b e t w e e n w e l l s 5 a n d 1, 5 a n d 2 i n d i c a t e t h e p r e s e n c e i n s e r u m 3 1 2 o f a n t i b o d y a g a i n s t a s i n g l e a n t i g e n i c c o m p o n e n t i n t he n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n . T h e a n t i g e n s w e r e a p p l i e d 2 4 h o u r s a f t e r t h e a n t i s e r u m a n d t h e l i n e s a r e e q u i d i s t a n t b e t w e e n t h e w e l l s . T h e a b s e n c e o f p r e c i p i t i n l i n e s a n d f r e e d i f f u s i o n o f t h e a n t i s e r u m t o w a r d s w e l l s 3 a n d 4 i n d i c a t e t h e a b s e n c e o f a n t i b o d y a g a i n s t c y t o p l a s m i c p r o t e i n s i n s e r u m 3 1 2 , w h i c h h a s b e e n a b s o r b e d w i t h c y t o p l a s m . 63 F i g u r e 5 I m m u n o d i f f u s i o n T e s t o f A n t i s e r u m 3 1 2 , A b s o r b e d w i t h C y t o p l a s m , A g a i n s t N u c l e a r P r o t e i n a n d C y t o p l a s m . L i n e s o f p r e c i p i t a t e a r e e q u i d i s t a n t b e t w e e n w e l l s 5 a n d 1,. 5 a n d 2 . A n t i g e n s i n t r o d u c e d 2 4 h o u r s a f t e r a n t i s e r u m . 64 Reagent v u c l e a r p r o t e i n Batch #3 Nuclear p r o t e i n Batch #3 Cytoplasmic nro te in Batch #3 Cytoplasmic p r o t e i n Batch #3 Absorbed Antiserum 312 65 I I I . A N A L Y S I S O F N U C L E A R P R O T E I N E X T R A C T 1. D i s c E l e c t r o p h o r e s i s T h e n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n w a s s e p a r a t e d i n t o s e v e r a l f r a c t i o n s , b y d i s c e l e c t r o p h o r e s i s . T h e n u c l e a r p r o t e i n , e x t r a c t c o u l d b e d i v i d e d i n t o 8 m a j o r c o m p o n e n t s . F i g u r e 6 B s h o w s the 3 m a j o r d i s c s p r e s e n t w h i c h m i g r a t e t o w a r d s the c a t h o d e a t a r a t e s i m i l a r to t h a t o f a c i d i c s e r u m p r o t e i n s u n d e r the s a m e c o n d i t i o n s . F i g u r e 6 C i l l u s t r a t e s the 5 m o r e d i f f u s e b a n d s p r e s e n t u n d e r c o n d i t i o n s o f l o w p H , s m a l l e r p o r e s i z e a n d r e v e r s e d p o l a r i t y . T h e s e c o n d i t i o n s h a v e b e e n . d e v i s e d f o r the s e p a r a t i o n o f s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t , b a s i c p r o t e i n s . F i g u r e 6 D s h o w s the e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n o b t a i n e d w h e n a s a m p l e o f c o m m e r c i a l h i s t o n e ( a c i d e x t r a c t e d ) w a s t e s t e d f o r b a s i c p r o t e i n s . T h i s p r e p a r a t i o n c o n t a i n e d 3 d i s c s ( A , B a n d C ) n o t p r e s e n t i n o u r e x t r a c t . D i s c s 2 a n d 3 a p p e a r to be c o m m o n to b o t h p r e p a r a t i o n s w h i l e d i s c s 1, 4 a n d 5 a r e u n i q u e to the n u c l e a r p r o t e i n s e x t r a c t e d i n o u r l a b o r a t o r y . 66 F i g u r e 6 C o m p a r a t i v e D i s c E l e c t r o p h o r e s i s A - 3 u l (150 u g ) s a m p l e , 90 m i n u t e s r u n n i n g t i m e , 5 M A p e r t u b e B - 7 u l (90 u g ) s a m p l e , 90 m i n u t e s r u n n i n g t i m e , 5 M A p e r t u b e C - 0 . 1 m l s a m p l e , B a t c h 3 , 2 h o u r s r u n n i n g t i m e , 5 M A p e r t u b e D - 0 . 1 m l s a m p l e , (90 u g ) , 2 h o u r s r u n n i n g t i m e , 5 M A p e r t u b e T u b e A i s i n c l u d e d t o s h o w t h e r e l a t i v e p o s i t i o n s o f d i s c s o f s e r u m p r o t e i n a n d a c i d i c n u c l e a r p r o t e i n . D i s c s 2 a n d 3 i n t u b e s C a n d D a r e a s s u m e d t o b e i d e n t i c a l b e c a u s e o f t h e i r c o r r e s p o n d i n g p o s i t i o n s a n d a p p e a r a n c e . A l l t u b e s s t a i n e d w i t h A m i d o B l a c k 1 0 B . A . B . c » D . Serum A c i d i c B a s i c C o m m e r c i a l P r o t e i n N u c l e a r N u c l e a r H i s t o n e P r o t e i n P r o t e i n S t a n d a r d G e l , pH 8.5 15^ G e l , pH 5.0 68 2 . I m m u n o D i s c E l e c t r o p h o r e s i s I n a n a t t e m p t t o d e t e r m i n e w h i c h c o m p o n e n t o r c o m p o n e n t s o f t h e b a s i c n u c l e a r p r o t e i n f r a c t i o n w e r e a n t i g e n i c t o t h e c h i c k e n t h e t e c h n i q u e s o f i m m u n o d i f f u s i o n a n d d i s c e l e c t r o -p h o r e s i s w e r e c o m b i n e d . I m m e d i a t e l y a f t e r e l e c t r o p h o r e s i s a n u n s t a i n e d , u n f i x e d , a c r y l a m i d e c y l i n d e r w a s i m b e d d e d i n a g a r . A c o n t r o l c y l i n d e r , r u n a t t h e s a m e t i m e , w a s f i x e d a n d s t a i n e d t o d e t e r m i n e t h e p o s i t i o n s o f t h e d i s c s . T h e s i n g l e p r e c i p i t i n l i n e p r o d u c e d ( F i g u r e 7) i s a s s o -c i a t e d w i t h t h e s l o w e s t m o v i n g c o m p o n e n t o f t h e n u c l e a r p r o t e i n f r a c t i o n ( d i s c 1 ) . T h i s l i n e w a s f a i n t l y v i s i b l e a f t e r 72 h o u r s a n d c o n t i n u e d t o d e v e l o p f o r 10 d a y s , a t w h i c h p o i n t i t w a s p h o t o g r a p h e d . T h i s l e n g t h y t i m e i n t e r v a l a n d t h e p o s i t i o n o f t h e l i n e c l o s e t o t h e a c r y l a m i d e . c y l i n d e r i s t h o u g h t t o r e f l e c t t h e s l o w e r r a t e o f d i f f u s i o n f r o m t h e a c r y l a m i d e , d u e t o i t s h a v i n g a s m a l l e r p o r e s i z e t h a n t h e s u r r o u n d i n g g e l m a t r i x . T h e c o n c e n t r i c l i n e s s u r r o u n d i n g t h e a n t i s e r u m t r o u g h s a r e d u e t o s e p a r a t i o n o f a n t i -s e r u m c o m p o n e n t s , w h i c h h a v e d i f f e r e n t r a t e s o f d i f f u s i o n . A n t i -s e r a w e r e a d d e d t o t h e t r o u g h s d a i l y , d u r i n g t h e d e v e l o p m e n t p e r i o d , t o a t o t a l o f T . 5 m l e a c h . T h i s r e s u l t w a s r e p e a t e d s u c c e s s f u l l y o n o n e o t h e r o c c a s i o n . 69 F i g u r e 7 I r r r m u n o d i f f u s i o n T e s t o f T w o C h i c k e n A n t i s e r a A g a i n s t C a l f T h y m u s , B a s i c N u c l e a r P r o t e i n s , F r a c t i o n a t e d b y D i s c E l e c t r o p h o r e s i s . T h e u n s t a i n e d c y l i n d e r h a s b e e n r e m o v e d t o f a c i l i t a t e p h o t o g r a p h y . A s t a i n e d c o n t r o l c y l i n d e r i s o n t h e r i g h t . T h e s i n g l e l i n e o f p r e c i p i t a t e ( a r r o w ) i s a s s o c i a t e d w i t h d i s c 1. B o t h a n t i s e r a h a v e p r o d u c e d a s i m i l a r p r e c i -p i t i n l i n e , w h i c h i s m o r e p r o n o u n c e d w i t h s e r u m 3 1 2 . 71 3 . B i e b r i c h S c a r l e t S t a i n i n g T h e n u c l e a r p r o t e i n s w e r e a l s o e l e c t r o p h o r e s e d u s i n g a m o d i f i e d t e c h n i q u e d e v e l o p e d b y S h e r i d a n a n d S t e r n ( 1 9 6 6 ) f o r t h e s t u d y o f p l a n t h i s t o n e s . T h i s m e t h o d m a k e s u s e o f p o l y a c r y l a m i d e g e l s h a v i n g a s m a l l e r p o r e s i z e (18% g e l , 1 0 % c a t a l y s t ) . T h i s t e c h n i q u e s e p a r a t e d t h e d i s c s m o r e w i d e l y b u t r e s u l t e d i n a m o r e d i f f u s e p a t t e r n . D i s c s 2 a n d 3 c o u l d n o t b e s e p a r a t e d u s i n g t h i s m e t h o d . T u b e A , . F i g u r e 8, w a s s t a i n e d w i t h A m i d o B l a c k 1 0 B i n t h e u s u a l f a s h i o n . T h e a c r y l a m i d e c y l i n d e r i n t u b e B w a s s t a i n e d f o r t h e p r e s e n c e o f h i s t o n e w i t h B i e b r i c h s c a r l e t u s i n g a m o d i f i c a t i o n o f t h e c y t o c h e m i c a l t e c h n i q u e d e s c r i b e d b y D o u g l a s , S p i c e r a n d B a r t e l s ( 1 9 6 6 ) . D i s c 1 s t a i n e d f a i n t l y . D i s c s 2 a n d 3 s t a i n e d m o r e d e e p l y w h i l e d i s c s 4 a n d 5 d i d n o t a c c e p t t h e s t a i n . 4 . A b s o r p t i o n o f A n t i g e n A f u r t h e r t e s t o f a n t i s e r u m s p e c i f i c i t y f o r e l e c t r o p h o r e t i c d i s c s o f b a s i c n u c l e a r p r o t e i n w a s p e r f o r m e d . T h i s t e s t , t h e c o r o l l a r y o f t h e o n e j u s t d e s c r i b e d , i n v o l v e d r e a c t i n g a s m a l l a m o u n t o f a n t i s e r u m w i t h t h e n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n t o r e m o v e a n t i g e n i c p r o t e i n s b e f o r e e l e c t r o p h o r e s i s . A f t e r f i v e d r o p s o f a b s o r b e d a n t i s e r u m w e r e a d d e d t o 0 . 5 m l o f t h e n u c l e a r p r o t e i n f r a c t i o n n o m o r e p r e c i p i t a t e s 7 2 o c c u r r e d . A 0 . 2 m l s a m p l e o f t h i s a b s o r b e d n u c l e a r p r o t e i n w a s e l e c t r o p h o r e s e d t o d e t e r m i n e w h i c h b a s i c p r o t e i n c o m p o n e n t s h a d b e e n r e m o v e d b y t h e a n t i b o d y . T h e r e s u l t a n t d i s c s w e r e v e r y f a i n t d u e t o d i l u t i o n o f t h e n u c l e a r p r o t e i n s d u r i n g t h e a b s o r p t i o n p r o c e s s . H o w e v e r , d i s c 1 w a s c o m p l e t e l y a b s e n t w h i l e d i s c s 2 a n d 3 w e r e p r e s e n t i n t r a c e a m o u n t s . D i s c s 4 a n d 5 w e r e s h a r p l y v i s i b l e . 7 3 F i g u r e 8 D i s c E l e c t r o p h o r e s i s o f N u c l e a r P r o t e i n S t a i n e d f o r P r o t e i n a n d H i s t o n e . B o t h t u b e s c o n t a i n 0 . 1 m l (90 u g ) s a m p l e s o f n u c l e a r p r o t e i n , B a t c h 3 , r u n a t t h e s a m e t i m e 5 M A p e r t u b e . R u n n i n g t i m e - 4 h o u r s . T u b e A s t a i n e d w i t h A m i d o B l a c k 1 0 B . T u b e B s t a i n e d w i t h B i e b r i c h s c a r l e t a t )(_ p H 9 . 5 a f t e r f i x a t i o n i n C a r n o y s f l u i d . D i s c 1 h a s s t a i n e d f a i n t l y w i t h 1 3 i e b r i c h s c a r l e t , \f d i s c s 2 a n d 3 s t a i n e d m o r e d e e p l y . N o s t a i n i n g o f d i s c s 4 a n d 5 . 75 On the bas is of r e s u l t s obtained from amino ac id a n a l y s i s , p r e c i p i t i n t e s t s , immunodiffusion and d i s c e l e c t r o p h o r e s i s , several observations could be made. Nuclear p r o t e i n s , s a l t extracted from c a l f thymus, were immunogenic to some, but not to a l l , chickens when i n j e c t e d as a p r e c i p i t a t e . The r e s u l t a n t antiserum contained at l eas t three types of p r e c i p i t a t i n g antibody demonstrable by immunodiffusion. One type was d i rec t ed against an antigen shared by the s a l t - e x t r a c t e d nuclear p r o t e i n , a commercial a c i d extracted histone prepara t ion , and the cytoplasmic f r a c t i o n . Another antibody was d i r e c t e d against an ant igen ic component unique to the cytoplasm. A t h i r d antibody reacted with an antigen demonstrable only i n the nuclear p r o t e i n prepara t ion . The ant ibodies against the shared antigen and the cytoplasmic antigen could be removed from the antiserum by absorbing i t with cytoplasm. The antiserum continued to react with the nuclear p r o t e i n antigen a f t er absorpt ion . This antigen had several unique c h a r a c t e r i s t i c s : 1. I t was present i n s a l t - e x t r a c t e d nuclear p r o t e i n , but not i n the cytoplasmic f r a c t i o n . 2 . I t migrated more s lowly than the shared antigen i n 1% agar, i n d i c a t i n g that i t had larger molecular dimensions. 3. I t was present i n the slowest moving of 5 d iscs of p r o t e i n produced i n polyacrylamide d i sc e lec trophores i s under condit ions designed for demonstraztion of the presence of h i s tones . 7 6 T h i s i n d i c a t e d t h a t i t h a d a r e l a t i v e l y l a r g e m o l e c u l a r w e i g h t o r i s i n t h e l e a s t p o s i t i v e l y c h a r g e d g r o u p o f p r o t e i n s , o r b o t h . T h e p r e s e n c e o f t h e a n t i g e n i n d i s c 1 w a s d e m o n s t r a b l e b y p r o d u c t i o n o f a p r e c i p i t i n l i n e a s s o c i a t e d w i t h t h e p o s i t i o n o f t h i s d i s c a n d b y t h e a b i l i t y o f t h e a b s o r b e d a n t i b o d y t o r e m o v e t h i s d i s c p r i o r t o e l e c t r o p h o r e s i s . 4 . I t s t a i n e d f a i n t l y w i t h B i e b r i c h s c a r l e t , a d y e w h i c h s e l e c t i v e l y s t a i n s h i s t o n e s u n d e r s p e c i f i c c o n d i t i o n s . I V . C H R O M A T O G R A P H I C S E P A R A T I O N O F N U C L E A R P R O T E I N A l t h o u g h s e v e r a l c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d s a r e a v a i l a b l e f o r t h e f r a c t i o n a t i o n o f n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n s , S e p h a d e x w a s u s e d b e c a u s e i t r e s u l t s i n t h e l e a s t d e n a t u r a t i o n o f a n t i g e n i c p r o t e i n s . S e p h a d e x c h r o m a t o g r a p h y w a s s t u d i e d (17 r u n s ) u s i n g f i r s t a s m a l l c o l u m n (9 r u n s ) a n d t h e n a l a r g e r o n e (8 r u n s ) u n d e r v a r y i n g c h r o m a t o g r a p h i c c o n d i t i o n s . F r a c t i o n s , f r o m r u n s g i v i n g b e s t s e p a r a t i o n , w e r e p o o l e d a n d r e c o n c e n t r a t e d . T h e y w e r e a n a l y s e d f o r p r o t e i n c o n t e n t a n d a n t i g e n i c i t y b y d i s c e l e c t r o p h o r e s i s , a m i n o a c i d a n a l y s i s a n d i m m u n o d i f f u s i o n . T h e p r e p a r a t i v e s e p a r a t i o n o f n u c l e a r p r o t e i n s i n S e p h a d e x G - 7 5 w a s i n v e s t i g a t e d u s i n g t e c h n i q u e s d e s c r i b e d b y C r u f t ( 1 9 6 1 ) a n d J o h n s o n , D r i e d g e r a n d M a r k o , ( 1 9 6 4 ) . 77 3 T h e i n i t i a l a t t e m p t s w e r e m a d e w i t h 2 , 195 c m c o l u m n s c o n n e c t e d i n t a n d e m . T h e y w e r e p a c k e d w i t h h y d r a t e d S e p h a d e x G - 7 5 u s i n g a s t i r r e r a n d r e s e r v o i r a n d e q u i l i b r a t e d w i t h p o t a s s i u m c i t r a t e b u f f e r p H 3 . 14 a n d (K+) = 0 . 05 M . T h e v o i d v o l u m e w a s 90 m l a n d t h e u n m e t e r e d c o l u m n h a d a f l o w r a t e o f 1. 6 m l p e r m i n u t e , A 1 m l s a m p l e o f n u c l e a r p r o t e i n ( B a t c h 2) w a s c h r o m a t o -g r a p h e d a n d t h e e f f l u e n t c o l l e c t e d i n 2 . 5 m l a l i q u o t s . O p t i c a l 2 d e n s i t y w a s r e a d a t 2 7 6 m u u s i n g 1 c m q u a r t z c u v e t t e s . T h e t u b e s w e r e t h e n p o o l e d i n t o t h r e e l o t s , c o r r e s p o n d i n g t o p e a k s , a n d a n a t t e m p t w a s m a d e t o c o n c e n t r a t e t h e m u s i n g v a c u u m d i a l y s i s . T h i s p r o v e d u n s u c c e s s f u l , h o w e v e r , a s s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s , p r e s e n t i n a l l t h r e e f r a c t i o n s , p a s s e d t h r o u g h t h e c o l l o d i o n b a g s a n d w e r e l o s t . A t t h i s p o i n t a p r e s s u r e d i a l y s i s u n i t w a s p u r c h a s e d h a v i n g g e l m e m b r a n e s o f v a r y i n g p o r o s i t y . F i g u r e 9 s h o w s t h e r a t h e r p o o r s e p a r a t i o n o b t a i n e d i n a t y p i c a l r u n ( N o . 8) u s i n g t h i s m e t h o d . S i n c e r e d u c t i o n o f t h e s a m p l e s i z e d i d n o t i m p r o v e r e s o l u t i o n i t w a s c o n c l u d e d t h a t t h e c o l u m n w a s t o o l o n g i n r e l a t i o n t o i t s d i a m e t e r a n d h a d t o o f a s t a f l o w r a t e . B e f o r e a b a n d o n i n g t h i s c o l u m n i t w a s u s e d t o o b t a i n a r e l a t i v e e s t i m a t e o f t h e m o l e c u l a r s i z e s o f t h e n u c l e a r p r o t e i n s i n v o l v e d , A m i x t u r e o f 1 m l o f 1% b l u e d e x t r a n , 1 m l o f f l u o -r e s c e n t c h i c k e n a l b u m i n , 1 m l o f n u c l e a r p r o t e i n ( B a t c h 2) a n d 1 m g F I T C w a s c h r o m a t o g r a p h e d . T h e p o s i t i o n s o f d e x t r a n b l u e a n d F I T C c o u l d b e s e e n a s b a n d s o f c o l o u r i n t h e c o l u m n a n d 78 t h e i r v o l u m e s m e a s u r e d a s t h e y w e r e e l u t e d . T h e o p t i c a l d e n s i t y o f the p r o t e i n s o l u t i o n s w e r e r e a d a t 2 7 6 m u . T h e r e s u l t i s s h o w n i n F i g u r e 10 . B l u e d e x t r a n , w h i c h i s a p o l y s a c c h a r i d e p o l y m e r h a v i n g a m o l e c u l a r w e i g h t o f a p p r o x i m a t e l y 2 m i l l i o n , w a s e l u t e d f i r s t . T h i s w a s f o l l o w e d i m m e d i a t e l y b y f l u o r e s c e n t a l b u m i n i n a s h a r p b a n d ( M W 68 , 0 0 0 ) . A l m o s t a l l the a l b u m i n w a s e l u t e d b e f o r e t h e f i r s t n u c l e a r p r o t e i n a p p e a r e d . T h i s w a s e l u t e d i n t h r e e p e a k s f o l l o w e d b y f r e e d y e ( M W 3 8 9 ) . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t the n u c l e a r p r o t e i n s e x t r a c t e d w e r e s m a l l , r a n g i n g i n m o l e c u l a r w e i g h t f r o m o v e r 1, 0 0 0 to a b o u t 6 0 , 0 0 0 , a n d f a l l i n g i n t o t h r e e o v e r l a p p i n g s u b g r o u p s . F u r t h e r , the m a j o r i t y o f t he n u c l e a r p r o t e i n s w e r e i n t e r m e d i a t e i n s i z e , a s e v i d e n c e d b y the l a r g e c e n t r a l p e a k . 79 F i g u r e 9 N u c l e a r P r o t e i n C h r o m a t o g r a p h y . A 1 m l s a m p l e o f n u c l e a r p r o t e i n . B a t c h 2 . C o l u m n v o l u m e 3 9 0 m l . F l o w r a t e 1. 6 m l p e r m i n u t e . T h e s h a l l o w t r o u g h s b e t w e e n t h e p e a k s i n d i c a t e d a h i g h d e g r e e o f o v e r l a p b e t w e e n t h e c h r o m a t o -g r a p h i c f r a c t i o n s a n d i n c o m p l e t e s e p a r a t i o n . P e a k 1 c o n t a i n e d t h e l a r g e s t m o l e c u l a r s i z e s o f n u c l e a r p r o t e i n . P e a k 2 w a s i n t e r m e d i a t e a n d p e a k 3 c o n t a i n e d s m a l l e r p r o t e i n s . F i g u r e 10 C h r o m a t o g r a p h y o f a M o l e c u l a r W e i g h t M i x t u r e . . P e a k s 2 , 3 a n d 4 c o r r e s p o n d t o t h e 3 p e a k s p r e s e n t i n F i g u r e 3 a n d s h o w t h e s a m e k i n d o f i n c o m p l e t e s e p a r a t i o n o f n u c l e a r p r o t e i n . T h e s h a r p n e s s o f t h e f i r s t p e a k , c o n t a i n i n g a l b u m i n , i n d i c a t e s t h e r e l a t i v e h o m o g e n e i t y o f t h i s , s u b -s t a n c e a s c o m p a r e d t o n u c l e a r p r o t e i n w h i c h h a s a g a i n b e e n s e p a r a t e d i n t o 3 o v e r l a p p i n g f r a c t i o n s a s i n F i g u r e 9. 80 81 T h e n e x t s e r i e s o f 9 c h r o m a t o g r a p h i c e x p e r i m e n t s w e r e m a d e u s i n g a 1 l i t r e c o l u m n , p a c k e d w i t h S e p h a d e x G - 7 5 b y t h e g r a v i t y m e t h o d . A p e r i s t a l t i c p u m p w a s u s e d t o c o n t r o l f l o w r a t e a n d t h e f r a c t i o n s c o l l e c t e d i n 10 m l t u b e s . O t h e r w i s e c o n d i t i o n s w e r e t h e s a m e a s w i t h t h e s m a l l e r c o l u m n s . D u r i n g t h e c o u r s e o f t h e s e t r i a l s t h e f l o w r a t e w a s v a r i e d , w i t h i n t h e l i m i t s o f o u r t i m e d c o l l e c t o r s y s t e m , b y u s i n g a v a r i a b l e s p e e d p e r i s t a l t i c p u m p p l a c e d b e t w e e n t h e c o l u m n o u t l e t a n d t h e c o l l e c t o r . T h e p r o t e i n s a m p l e s i z e w a s a l s o v a r i e d f r o m 1 t o 5 m l i n o r d e r t o a s c e r t a i n t h e p r o p e r c o l u m n l o a d . It w a s f o u n d t h a t a 3 m l s a m p l e (130 m g ) o f p r o t e i n w a s t h e l a r g e s t , l o a d t h e c o l u m n c o u l d a c c o m m o d a t e . A f l o w r a t e o f 9 m l p e r h o u r w a s f o u n d t o b e o p t i m a l f o r o u r c o l l e c t o r s y s t e m . T h e c o l u m n h a d a v o i d v o l u m e o f 3 5 0 m l . F i g u r e 11 i l l u s t r a t e s t h e i m p r o v e d s e p a r a t i o n p o s s i b l e w i t h t h i s c o l u m n , a l t h o u g h t h e r e i s s t i l l c o n s i d e r a b l e o v e r l a p b e t w e e n t h e t h r e e p e a k s o f p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n . T h e f r a c t i o n s c o n t a i n e d i n e a c h p e a k w e r e p o o l e d a s s h o w n i n t h e f i g u r e a n d c o n c e n t r a t e d i n t h e p r e s s u r e d i a l y s e r t o v o l u m n s o f 3 , 5 a n d 2 m l r e s p e c t i v e l y . 82 F i g u r e 11 N u c l e a r P r o t e i n C h r o m a t o g r a p h y . A 3 m l s a m p l e o f B a t c h 3 . C o l u m n v o l u m e 1, 0 0 0 m l . F l o w r a t e 9 m l p e r h o u r . T h e d e e p e r t r o u g h s i n d i c a t e m o r e c o m p l e t e s e p a r a t i o n o f t h e t h r e e m a i n m o l e c u l a r s p e c i e s o f n u c l e a r p r o t e i n . 84 V . A N A L Y S I S O F C H R O M A T O G R A P H I C F R A C T I O N S 1. D i s c E l e c t r o p h o r e s i s T h e t h r e e f r a c t i o n s o f c h r o m a t o g r a p h e d c o n c e n t r a t e d n u c l e a r p r o t e i n w e r e a n a l y s e d f o r b a s i c p r o t e i n u s i n g 1 5 % g e l a t p H 5 . 0 . E i g h t e l e c t r o p h o r e t i c r u n s w e r e m a d e o f t h e s e f r a c t i o n s w h i l e v a r y i n g t h e s a m p l e l o a d , b u f f e r s y s t e m s a n d g e l p o r o s i t y . T h e m o s t s a t i s f a c t o r y r e s u l t i s s h o w n i n F i g u r e 1 2 . T h e s e c o n d c h r o m a t o g r a p h i c p e a k c o n t a i n e d a l l t h e d i s c s p r e s e n t i n t h e o r i g i n a l s a m p l e . P e a k 1 c o n t a i n e d a t r a c e o f d i s c s 1 a n d 2 w h i c h s u g g e s t s t h a t t h e s e a r e c o m p o s e d o f s o m e l a r g e r m o l e c u l e s i n t h a t t h e y a r e e l u t e d f i r s t f r o m t h e S e p h a d e x c o l u m n a n d t r a v e l s l o w e s t i n t h e a c r y l a m i d e g e l . T h a t t h e s e d i s c s a r e h e t e r o -g e n e o u s w a s e v i d e n c e d b y t h e i r p r e s e n c e i n p e a k s 2 a n d 3 . D i s c s 4 a n d 5 a p p e a r t o b e o f s m a l l e r t h a n a v e r a g e m o l e c u l a r d i m e n s i o n s a s t h e y w e r e e l u t e d i n t h e s e c o n d a n d t h i r d c h r o m a t o g r a p h i c p e a k s a n d t r a v e l e d f a s t e s t i n t h e a c r y l a m i d e g e l . D i s c 3 w h i c h i s p r e s e n t o n l y i n p e a k 2 a p p e a r s t o be a l e s s h e t e r o g e n e o u s f r a c t i o n h a v i n g m o l e c u l a r d i m e n s i o n s w h i c h l i e b e t w e e n t h e o t h e r t w o g r o u p s . 85 F i g u r e 12 D i s c E l e c t r o p h o r e t i c A n a l y s i s o f C h r o m a t o g r a p h e d N u c l e a r P r o t e i n s . 0 . 1 m l (90 u g ) s a m p l e s . R u n n i n g t i m e 2 h o u r s . 5 M A p e r t u b e . 1 5 % g e l s ( p H 5 . 0 ) . A m i d o B l a c k 1 0 B s t a i n . . P e a k 2 s h o w s a p a t t e r n v e r y s i m i l a r t o t h e s t a r t i n g s a m p l e . Unfract ionated Peak 1 Pe*k 2 Peak 3 Nuclear P r o t e i n 87 2 . A m i n o A c i d C o m p o s i t i o n R e s u l t s o f t h e a m i n o a c i d a n a l y s i s o f t h e 3 f r a c t i o n s o f c h r o m a t o g r a p h e d n u c l e a r p r o t e i n a r e s h o w n i n T a b l e 3 . T h e o b s e r v a t i o n , f r o m d i s c e l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s , t h a t t h e b a s i c p r o t e i n s h a v e n o t b e e n f r a c t i o n a t e d t o a n y g r e a t d e g r e e b y c h r o m a t o -g r a p h y , i s c o n f i r m e d b y t h e a m i n o a c i d a n a l y s e s . F r a c t i o n 2 i s s i m i l a r i n a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n t o t h e o r i g i n a l u n f r a c t i o n a t e d s a m p l e ( T a b l e 2 ) . C h r o m a t o g r a p h y d o e s , h o w e v e r , r e s u l t i n s o m e s e p a r a t i o n o f a c i d i c p r o t e i n s f r o m b a s i c p r o t e i n s a s e v i d e n c e d b y t h e h i g h e r p e r c e n t a g e s o f a s p a r t i c a n d g l u t a m i c a c i d s i n f r a c t i o n s 1 a n d 3 . 88 T A B L E I I I A M M O A C I D C O M P O S I T I O N O F T H R E E F R A C T I O N S O F C H R O M A T O G R A P H E D N U C L E A R P R O T E I N . V a l u e s a r e p e r c e n t a g e s o f t o t a l m o l e s o f a m i n o a c i d s p r e s e n t . F r a c t i o n s 1 a n d 3 c o n t a i n h i g h v a l u e s f o r a c i d i c a m i n o a c i d s . F r a c t i o n 2 h a s v a l u e s c l o s e to t h a t o f t h e u n f r a c t i o n a t e d n u c l e a r p r o t e i n . A m i n o A c i d F r a c t i o n 1 F r a c t i o n 2 F r a c t i o n 3 L y s i n e 5 . 6 1 5 . 2 8 . 7 H i s t i d i n e 2 . 5 1 . 8 1 . 5 A r g i n i n e 4 . 4 5. 2 5 . 8 A s p a r t i c A c i d 9 - 9 6 . 2 1 1 . 7 T h r e o n i n e + S e r i n e 9 . 5 1 3 . 3 1 0 . 2 G l u t a m i c A c i d 1 2 . 6 6 . 0 1 2 . 6 P r o l i n e 6 . 7 5 . 3 2 . 4 G l y c i n e 1 0 . 7 1 3 . 8 1 1 . 2 A l a n i n e 1 0 . 8 1 5 . 1 1 2 . 6 V a l i n e 8 . 6 5 . 0 5 . 8 M e t h i o n i n e 1 . 7 0 . 8 0 . 0 I s o l e u c i n e 4 . 5 2 . 8 5 . 3 L e u c i n e 7 . 7 6. 2 8 . 3 T y r o s i n e 2 . 3 1 . 5 1 . 0 P h e n y l a l a n i n e 2 . 0 1 . 7 2 . 4 L y s i n e + A r g i n e 9 . 9 2 0 . 4 1 4 . 6 A s p a r t i c + G l u t a m i c 2 2 . 5 1 2 . 2 2 4 . 3 L y s i n e / A r g i n i n e 1 . 3 2 . 9 1 . 5 89 3 . I m m u n o d i f f u s i o n T e s t T h e t h r e e c h r o m a t o g r a p h e d , r e c o n c e n t r a t e d f r a c t i o n s w e r e t e s t e d f o r a n t i g e n i c i t y a s s h o w n i n F i g u r e 1 3 . T h e a n t i s e r u m f o r m e d s i n g l e l i n e s o f p r e c i p i t a t e w i t h t h e u n f r a c t i o n a t e d p r o t e i n a n d w i t h f r a c t i o n 2 b u t n o t w i t h f r a c t i o n s 1 a n d 3 , i n d i c a t i n g t h a t t h e a n t i g e n i c c o m p o n e n t i s i n f r a c t i o n 2 . 9 0 F i g u r e 13 I m m u n o d i f f u s i o n T e s t o f U n f r a c t i o n a t e d a n d C h r o m a t o g r a p h i c F r a c t i o n s o f N u c l e a r P r o t e i n 1% a g a r m a t r i x . R e a c t i o n s d e v e l o p e d a f t e r 5 d a y s . S i n g l e p r e c i p i t a t i o n l i n e s b e t w e e n 4 a n d 5, 2 a n d 5 . 11 N o . 1 2 3 4 5 Reagent F r a c t i o n 1 F r a c t i o n 2 F r a c t i o n 3 U n f r a c t i o n a t e d N u c l e a r P r o t e i n A b s o r b e d A n t i s e r u m 312 92 T h e c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s i s o f n u c l e a r p r o t e i n d i d n o t s e p a r a t e t h e a n t i g e n i c c o m p o n e n t a s d e s i r e d . It d i d p r o v i d e a d d i -t i o n a l i n f o r m a t i o n a b o u t t h e c o m p o s i t i o n o f t h e n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n a n d t h e e f f i c i e n c y o f t h e t e c h n i q u e s . 1. T h e n u c l e a r p r o t e i n s h a v e m o l e c u l a r w e i g h t s i n t e r m e d i a t e b e t w e e n f r e e d y e a n d a l b u m i n a n d a r e s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s . 2 . T h e n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n c a n b e c h a r a c t e r -i s e d a s h a v i n g 3 b r o a d m o l e c u l a r s i z e s u b g r o u p s . F r a c t i o n 1 - l a r g e r m o l e c u l a r w e i g h t , a c i d i c p r o t e i n s . F r a c t i o n 2 - i n t e r m e d i a t e m o l e c u l a r w e i g h t , b a s i c p r o t e i n s . F r a c t i o n 3 - s m a l l e r m o l e c u l a r w e i g h t , a c i d i c p r o t e i n s . 3 . T h e a n t i g e n i c c o m p o n e n t , p r e s e n t i n f r a c t i o n 2 , i s n o t d e s t r o y e d d u r i n g t h e p r o c e s s o f c h r o m a t o g r a p h y a n d r e c o n c e n -t r a t i o n . 4 . S e p h a d e x G - 7 5 d o e s n o t p r o v i d e s u f f i c i e n t r e s o l u t i o n f o r f i n e s e p a r a t i o n of n u c l e a r p r o t e i n s . V I . P R E P A R A T I O N O F F L U O R E S C E N T S E R U M F R A C T I O N S T h e a b s o r b e d a n t i s e r a f r o m c h i c k e n s 3 3 3 a n d 312 a n d t w o s a m p l e s o f n o n - i m m u n e c h i c k e n s e r u m w e r e p r e p a r e d f o r u s e a s 93 f l u o r e s c e n t p r o t e i n t r a c e r s t o s t u d y t h e c e l l u l a r l o c a l i s a t i o n of b a s i c n u c l e a r p r o t e i n . T h e p r o c e d u r e w a s b a s e d o n t e c h n i q u e s u s e d b y t h e a u t h o r i n a p r e v i o u s s t u d y ( D a v i d , R u t h a n d L a w , 1 9 6 6 ) i n v o l v i n g f l u o r e s c e n t c h i c k e n i s o a n t i b o d y . T h e s e r a w e r e l a b e l l e d w i t h f l u o r e s c e n t d y e a n d c h r o m a -t o g r a p h e d o n S e p h a d e x G - 2 0 0 t o r e m o v e n o n - g l o b u l i n p r o t e i n s a n d f r e e d y e . T h i s p r o c e d u r e s e p a r a t e s t h e s e r u m i n t o 3 m a i n f r a c t i o n s : h i g h m o l e c u l a r w e i g h t (19S) g l o b u l i n s , s m a l l e r (7S) g l o b u l i n s a n d a n o n - g l o b u l i n f r a c t i o n , m o s t l y a l b u m i n ( F a h e y et, a l . , 1 9 6 4 ) . T h e f r a c t i o n s w e r e r e c o n c e n t r a t e d a n d a n a l y s e d e l e c t r o p h o r e t i c a l l y a n d i m m u n o l o g i c a l l y u s i n g t h e f r a c t i o n s a s a n t i g e n s . T h e g l o b u l i n f r a c t i o n s o f a n t i s e r u m , w h i c h c o n t a i n a n t i b o d y , w e r e t e s t e d f o r i m m u n o l o g i c a l a c t i v i t y a n d u s e d a s p r o t e i n t r a c e r s . S i m i l a r g l o b u l i n f r a c t i o n s o f n o n - i m m u n e s e r a w e r e p r e p a r e d i n t h e s a m e w a y f o r u s e a s a c o n t r o l . N o n - i m m u n e s e r u m w a s f r a c t i o n a t e d t w i c e , a n t i s e r u m 3 3 3 w a s f r a c t i o n a t e d o n c e a n d a n t i s e r u m 3 1 2 , w h i c h h a d t h e h i g h e s t t i t e r s w a s f r a c -t i o n a t e d f o u r t i m e s . T h e f o u r p e a k s o b t a i n e d a r e s h o w n i n F i g u r e 1 4 . T h e f i r s t p e a k t o b e e l u t e d f r o m t h e c o l u m n c o n t a i n e d t h e l a r g e s t m o l e c u l e s , m o s t l y l i p o p r o t e i n s . T h e s e c o n d p e a k i s t h e 19S g l o b u l i n f r a c t i o n a n d t h e t h i r d i s t h e 7 S . T h e f o u r t h a n d l a r g e s t p e a k i s t h e a l b u m i n f r a c t i o n . 9 4 T h e t u b e s c o n t a i n i n g e a c h p e a k w e r e p o o l e d a n d c o n c e n -t r a t e d b y v a c u u m d i a l y s i s t o a f i n a l v o l u m e o f 1 m l . T h e c o n c e n -t r a t e d p r o t e i n w a s r e m o v e d f r o m t h e d i a l y s i s t u b e s w i t h a l e n g t h o f c a t h e t e r t u b i n g a t t a c h e d t o a s y r i n g e . T h e t u b e s w e r e t h e n w a s h e d b y p l a c i n g 0 . 5 m l i s o t o n i c s a l i n e i n t h e m a n d a g i t a t i n g f o r t h i r t y m i n u t e s o n t h e c l i n i c a l r o t a t o r . T h i s w a s h w a s r e m o v e d a n d a d d e d t o t h e p r o t e i n f r a c t i o n s . 9 5 F i g u r e 14 S e p h a d e x C h r o m a t o g r a p h y o f a S a m p l e o f A b s o r b e d , I m m u n e , F l u o r e s c e n t C h i c k e n S e r u m . A 5 m l s a m p l e o f a n t i s e r u m 3 1 2 . C o l u m n v o l u m e 1 l i t e r . F l o w r a t e 6 m l p e r h o u r . A n t i b o d y a c t i v i t y w a s f o u n d t o b e a s s o c i a t e d w i t h p e a k 3 w h i c h c o n t a i n t h e 75 g l o b u l i n c o m p o n e n t . TUBE RTTBKB Tool 1 Tool 2 ' f o o l 3 " Tool U 97 V I I . A N A L Y S I S O F F L U O R E S C E N T S E R U M F R A C T I O N S T h e f r a c t i o n s w e r e a n a l y s e d f o r p u r i t y a n d t h e t y p e o f p r o t e i n s p r e s e n t b y d i s c e l e c t r o p h o r e s i s a n d m i c r o - i m m u n o d i f f u s i o n o n M i l l i p o r e m e m b r a n e s . T h e y w e r e t e s t e d f o r a n t i - n u c l e a r p r o t e i n a c t i v i t y b y t h e p r e c i p i t i n t e s t a n d b y t h e i r a b i l i t y t o c o m b i n e s p e c i f i c a l l y w i t h n u c l e a r c o m p o n e n t s a c c o r d i n g t o t h e i m m u n o -f l u o r e s c e n t t e c h n i q u e o f C o o n s ( 1 9 5 1 ) . 1. D i s c E l e c t r o p h o r e s i s F i g u r e 15 s h o w s t h e r e s u l t s o f d i s c e l e c t r o p h o r e s i s o f f l u o r e s c e n t l a b e l l e d w h o l e s e r u m a n d f r a c t i o n s 2 , 3 a n d 4 , o b t a i n e d b y S e p h a d e x c h r o m a t o g r a p h y . F r a c t i o n 1 c o n t a i n i n g l i p o p r o t e i n s i s n o t i n c l u d e d . T h i s p h o t o g r a p h w a s m a d e b y p l a c i n g t h e e l e c t r o -p h o r e s i s t u b e s d i r e c t l y o n t h e u l t r a - v i o l e t l a m p i m m e d i a t e l y a f t e r e l e c t r o p h o r e s i s . T h i s e l i m i n a t e s t h e n e e d t o f i x , s t a i n a n d d e s t a i n t h e g e l s . T u b e 2 c o n t a i n s s o m e l i p o p r o t e i n , 19S g l o b u l i n s a n d a s m a l l a m o u n t o f 7S g l o b u l i n , s l i g h t l y m o r e t h a n i n w h o l e s e r u m . T u b e 3 c o n t a i n s a t r a c e o f 19S a n d a h i g h c o n c e n t r a t i o n o f 7S g l o b u l i n . I t i s f r e e o f n o n - g l o b u l i n p r o t e i n s . T u b e 4 c o n t a i n s m o s t l y a l b u m i n . T h e o t h e r d i s c s i n T u b e 4 a r e a s s u m e d t o b e s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s a s t h e y w e r e e l u t e d f r o m t h e S e p h a d e x c o l u m n a f t e r 7S g l o b u l i n s , w i t h t h e a l b u m i n f r a c t i o n . L a r g e m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s t h a t w e r e e l u t e d f r o m t h e c o l u m n f i r s t ( l i p o p r o t e i n s , 19S g l o b u l i n s ) , h a v e m i g r a t e d t h e s h o r t e s t d i s t a n c e 98 i n t h e g e l . T h e 7S g l o b u l i n s ( M W 1 0 0 , 000 ) h a v e t r a v e l l e d f u r t h e r . A l b u m i n ( M . W.._ 6 8 , 0 0 0 ) w h i c h w a s e l u t e d f r o m t h e c o l u m n l a s t , h a s t h e s m a l l e s t m o l e c u l a r w e i g h t , a n d i s t h e m o s t n e g a t i v e l y c h a r g e d o f t h e m a j o r s e r u m p r o t e i n s . It h a s m i g r a t e d f u r t h e s t i n t h e g e l . 99 F i g u r e 15 D i s c E l e c t r o p h o r e s i s o f A b s o r b e d , F l u o r e s c e n t , I m m u n e S e r u m 3 1 2 . B e f o r e a n d A f t e r C h r o m a t o g r a p h y . 5 u l s a m p l e s , r u n n i n g t i m e 90 m i n u t e s , s t a n d a r d g e l s . P h o t o g r a p h e d w i t h H . S . E k t a c h r o m e , 1 m i n u t e e x p o s u r e , f . 5 . 6 . T u b e s 2 , 3 a n d 4 c o n t a i n s a m p l e s f r o m f r a c t i o n s 2 , 3 a n d 4 , F i g u r e 14 . M o s t o f t h e 7S g l o b u l i n i s i n F r a c t i o n 3 . T u b e s 2 a n d 3 a r e c o m p l e t e l y f r e e o f a l b u m i n . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e d i s c s b y r e f e r e n c e t o a n a n a l y s i s m a d e b y O r n s t e i n ( 1 9 6 4 ) . 100 l i p o p r o t e i n 19S g l o b u l i n 7S g l o b u l i n t r a n s f e r r i n a l b u m i n Whole 2 3 serum 101 2 . I m m u n o d i f f u s i o n T e s t S a m p l e s o f t he c h i c k e n s e r u m w e r e a l s o a n a l y s e d b y m i c r o - i m m u n o d i f f u s i o n ( F i g u r e 16) . T h i s w a s d o n e b y u s i n g the f o u r f r a c t i o n s o f c h i c k e n a n t i s e r u m a s a n t i g e n s a n d r e a c t i n g t h e m w i t h r a b b i t a n t i - c h i c k e n s e r u m . T h e d i f f e r e n t m o l e c u l a r s i z e s o f 1 9 S a n d 7 S g l o b u l i n s a n d a l b u m i n c a u s e d i f f e r e n t r a t e s o f d i f f u s i o n o f t h e s e m o l e c u l e s i n t he m i l l i p o r e m e m b r a n e . T h i s i s r e f l e c t e d i n the p o s i t i o n s o f t h e p r e c i p i t i n l i n e s . A l b u m i n h a s m i g r a t e d f u r t h e s t a n d i s c l o s e s t to t he c e n t r a l w e l l . T h e 7 S g l o b u l i n i s i n t e r m e d i a t e a n d the 19S g l o b u l i n , b e i n g the l a r g e s t , h a s m i g r a t e d the s h o r t e s t d i s t a n c e . T h e c o n t i n u i t y o f t h e 7 S a n d 19S l i n e s b e t w e e n w e l l s 2 a n d 3 s h o w s t h a t t h e s e c o m p o n e n t s a r e i n b o t h f r a c t i o n s . T h e 1 9 S l i n e i s h e a v i e s t o p p o s i t e w e l l 2 , w h e r e i t i s i n t he g r e a t e s t c o n c e n t r a t i o n . T h e 7 S l i n e i s h e a v i e s t o p p o s i t e w e l l 3 w h e r e i t i s c o n c e n t r a t e d . T h e a l b u m i n l i n e i s a s s o c i a t e d o n l y w i t h w e l l 4 a n d c r o s s e s the 7 S l i n e s h o w i n g t h a t t h e s e a r e d i f f e r e n t a n t i g e n s . T h e r e i s no a l b u m i n i n f r a c t i o n s 2 a n d 3. T h e r e a r e no g l o b u l i n s o r a l b u m i n i n f r a c t i o n 1. 102 F i g u r e 16 M i c r o - i m m u n o d i f f u s i o n T e s t o f 4 F r a c t i o n s o f A b s o r b e d , F l u o r e s c e n t , C h r o m a t o g r a p h e d , I m m u n e C h i c k e n S e r u m 3 1 2 . T h e l i n e s a r e i d e n t i f i e d b y r e f e r e n c e t o J o h n s o n , W e s t w o o d a n d B e a u l i e u ( 1 9 6 4 ) . . P h o t o g r a p h p r o d u c e d b y p l a c i n g t h e m o u n t e d m e m b r a n e d i r e c t l y i n t h e e n l a r g e r a n d p r i n t i n g . E n l a r g e d 4 X . 103 Well No. Reagent 1 Fraction 1 2 f ract ion 2 3 Fraction 3 4 Fraction 4 Rabbit a n t i -chicken serum 104 3. P r e c i p i t i n T e s t s W h e n the f r a c t i o n s w e r e t e s t e d f o r a n t i b o d y a c t i v i t y b y the p r e c i p i t i n t e s t o n l y the 7 S f r a c t i o n , o b t a i n e d b y . S e p h a d e x c h r o m a t o g r a p h y , g a v e p o s i t i v e r e a c t i o n s a g a i n s t the n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n . S o m e a c t i v i t y a p p e a r e d to h a v e b e e n l o s t d u r i n g the p r o c e s s e s o f c y t o p l a s m i c a b s o r p t i o n , l a b e l l i n g , c h r o m a -t o g r a p h y a n d r e c o n c e n t r a t i o n f o r , a l t h o u g h the p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s s e v e r a l t i m e s h i g h e r i n t h e s e f r a c t i o n s t h e n i n t h e o r i g i n a l s e r u m , the t i t r e s h a d d r o p p e d to 1:16 a n d 1:8 f o r c h i c k e n s 312 a n d 3 3 3 r e s p e c t i v e l y . V I I L I M M U N O F L U O R E S C E N T T E S T S O F T H E C E L L U L A R L O C A L I S A T I O N A N D D I S T R I B U T I O N O F N U C L E A R P R O T E I N A N T I G E N . T h e f o r e g o i n g p r o c e d u r e s r e s u l t e d i n the p r o d u c t i o n o f 5 m l o f a b s o r b e d a n d p u r i f i e d f l u o r e s c e n t g l o b u l i n k n o w n to c o n t a i n a n t i b o d y a g a i n s t a b a s i c n u c l e a r p r o t e i n a n t i g e n . F o u r m l o f t h i s , f r o m c h i c k e n 3 1 2 , w e r e u s e d e x c l u s i v e l y i n the i m m u n o f l u o r e s c e n t t e s t s to f o l l o w . T w o m l o f f l u o r e s c e n t n o n -i m m u n e g l o b u l i n w e r e a l s o p r e p a r e d b y the s a m e m e t h o d . T h e s e r e a g e n t s w e r e s t o r e d f r o z e n i n s m a l l a l i q u o t s . F l u o r e s c e n t m i c r o s c o p y w a s e m p l o y e d to s t u d y the c e l l u l a r l o c a l i s a t i o n , o r g a n d i s t r i b u t i o n a n d s p e c i e s s p e c i f i c i t y o f c a l f t h y m u s b a s i c n u c l e a r p r o t e i n a n t i g e n u s i n g f l u o r e s c e n t a n t i -b o d y a s a p r o t e i n t r a c e r ( C o o n s , 1 9 5 1 ) . B i e b r i c h s c a r l e t , a 105 h i s t o n e s t a i n ( D o u g l a s , S p i c e r a n d B a r t e l s , 1 9 6 6 ) w a s u s e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r h i s t o n e s a n d t h e n u c l e a r p r o t e i n a n t i g e n o c c u p i e d t h e s a m e s i t e s . C o m p a r i s o n o f t h e f l u o r e s c e n c e o b s e r v e d w i t h t h e p r e s e n c e o f D N A a n d R N A w a s m a d e b y s t a i n i n g s i m i l a r c e l l s w i t h A c r i d i n e o r a n g e ( V o n B e r t a l a n f f y , 1 9 6 1 ) . P h a s e - c o n t r a s t m i c r o s c o p y w a s u s e d a s a n a l t e r n a t i v e m e t h o d o f v i e w i n g f l u o r e s c e n t c e l l s . T h e i m m u n o l o g i c a l s p e c i f i c i t y o f f l u o r e s c e n t r e a c t i o n s w a s t e s t e d , i n a l l c a s e s , b y a p p l y i n g f l u o r e s -c e n t n o n - i m m u n e g l o b u l i n t o c o n t r o l s l i d e s . C o n t r o l g l o b u l i n w a s p r e p a r e d f r o m n o n - i m m u n e c h i c k e n s u s i n g t h e s a m e m e t h o d s a s f o r i m m u n e g l o b u l i n s . C e l l u l a r l o c a l i s a t i o n a n d o r g a n s p e c i f i c i t y w e r e s t u d i e d b y a p p l y i n g t h e s e m e t h o d s t o c a l f t h y m u s c e l l s , b o v i n e l i v e r , s p l e e n a n d t e s t i s c e l l s a n d b o v i n e c h r o m o s o m e s . S p e c i e s s p e c i f i c i t y w a s s t u d i e d u s i n g b o v i n e c e l l s , h u m a n c e l l s , , p l a n t c e l l s , i n s e c t c e l l s a n d p r o t o z o a n c e l l s . 1. B o v i n e C e l l s A . C a l f T h y m u s I m p r i n t s C o m p a r a t i v e s t u d i e s o n c a l f t h y m o c y t e s a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 1 7 . F i g u r e 1 7 A s h o w s t h e y e l l o w f l u o r e s c e n c e , a s s o c i a t e d w i t h D N A , . o f t h y m o c y t e n u c l e i . T h e r e d f l u o r e s c e n c e o f R N A c a n b e s e e n i n t h e c y t o p l a s m o f s o m e c e l l s . W h e r e s u f f i c i e n t a m o u n t s o f R N A o v e r - l a y t h e n u c l e u s , t h e n u c l e i a p p e a r m o r e g r e e n . 106 S u c h A c r i d i n e o r a n g e s t a i n e d m a t e r i a l s a l s o p r o v i d e d a m e t h o d o f v i e w i n g c e l l p r e p a r a t i o n s u n d e r u l t r a - v i o l e t i l l u m i n a t i o n p r e l i m i n a r y t o l a b e l l i n g t h e s a m e t y p e o f m a t e r i a l s w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d i e s . G e n e r a l m o r p h o l o g y , o p t i m u m c o n d i t i o n s f o r f l u o r e s -c e n t m i c r o s c o p y a n d t h e r a n g e s o f e x p o s u r e t i m e s f o r c o l o u r p h o t o g r a p h y w e r e s t u d i e d u s i n g A c r i d i n e o r a n g e . B i e b r i c h s c a r l e t w a s a l s o u s e d t o s t a i n c e l l i m p r i n t s . T h i s p r o v i d e d a c y t o c h e m i c a l m e a n s of s h o w i n g t h e l o c a t i o n of b a s i c p r o t e i n i n c e l l n u c l e i , a s a c o m p a r i s o n t o t h e o b s e r v a t i o n m a d e w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y . T h e p r e s e n c e of b a s i c p r o t e i n i n t h y m o c y t e n u c l e i i s i n d i c a t e d b y t h e b r o w n t o g r e y c o l o u r s h o w n i n F i g u r e 1 7 B . T h e d a r k b r o w n c y t o p l a s m i c i n c l u s i o n s a r e p r e s e n t i n g r a n u l o c y t e s . F i g u r e 1 7 C s h o w s t h e r e s u l t s o f a p p l y i n g f l u o r e s c e n t a n t i b o d y t o a n i m p r i n t o f u n f i x e d c a l f t h y m o c y t e s . T h e f l u o r e s c e n c e i s a s s o c i a t e d w i t h n u c l e i a n d d o e s n o t h a v e t h e s a m e d e n s i t y t h r o u g h o u t . T r e a t m e n t o f c a l f t h y m o c y t e s w i t h 0 . 0 0 5 M c i t r i c a c i d ( i m m e r s i o n a n d g e n t l e w a s h i n g f o r 15 m i n u t e s ) b e f o r e l a b e l l i n g w i t h F I T C i m m u n e g l o b u l i n r e s u l t e d i n t h e n u c l e i b e i n g c o n d e n s e d * a n d m u c h b r i g h t e r f l u o r e s c e n c e , p e r h a p s d u e t o i n c r e a s e d p e r m e -a b i l i t y o f t h e n u c l e a r m e m b r a n e s a n d r e m o v a l o f c y t o p l a s m ( F i g u r e 1 7 D ) . A f u r t h e r t r e a t m e n t w i t h 0 . 01 M c i t r i c a c i d - 1 . 2 5 M N a C l 107 f o r t h r e e m i n u t e s , w h i c h i s k n o w n t o r e l e a s e n u c l e a r p r o t e i n s , w a s a l s o c a r r i e d o u t . S u b s e q u e n t a i r d r y i n g a n d l a b e l l i n g w i t h f l u o r e s -c e n t i m m u n e g l o b u l i n s h o w s t h e p r e s e n c e o f t h e r e l e a s e d n u c l e a r p r o t e i n s a s h a l o s o f f l u o r e s c e n c e s u r r o u n d i n g t h e n u c l e i ( F i g u r e 1 7 E , ) . F i g u r e 1 7 F i s o f a c o n t r o l s l i d e s h o w i n g t h e r e s u l t s o f l a b e l l i n g u n f i x e d t h y m o c y t e s w i t h n o n - i m m u n e f l u o r e s c e n t g l o b u l i n s . T h e f l u o r e s c e n t s p o t i s a c e l l f r a g m e n t . T h a t c e l l s a r e p r e s e n t o n t h e s l i d e c a n be s e e n i n t h e p h a s e - c o n t r a s t i m a g e o f t h e s a m e m a t e r i a l ( F i g u r e 1 7 G ) . 108 F i g u r e 17 C a l f T h y m u s I m p r i n t s S h o w i n g P r e s e n c e o f D N A , H i s t o n e a n d B a s i c N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n i n N u c l e i . A - A c r i d i n e o r a n g e s t a i n . D N A i s y e l l o w ; R N A w h i c h i s r e d a n d p r e s e n t i n c y t o p l a s m s h o w s t h e a m o u n t o f c y t o p l a s m i n t h e s e c e l l s . E x p o s u r e t i m e 15 s e c o n d s . B - B i e b r i c h s c a r l e t s t a i n . B r o w n c o l o u r i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f h i s t o n e i n n u c l e i . D a r k b r o w n i n c l u s i o n s a r e g r a n u l o c y t e s . A u t o m a t i c e x p o s u r e . C - F l u o r e s c e n t l a b e l l i n g o f u n f i x e d c e l l s . N u c l e a r f l u o r e s c e n c e s h o w i n g u n e v e n d i s t r i b u t i o n o f b a s i c n u c l e a r p r o t e i n a n t i g e n . E x p o s u r e t i m e 60 s e c o n d s . D - F l u o r e s c e n t l a b e l l i n g o f c i t r i c a c i d t r e a t e d c e l l s . N u c l e i a r e c o n d e n s e d a n d s h o w m u c h b r i g h t e r f l u o r e s c e n c e . E x p o s u r e t i m e 45 s e c o n d s . E - F l u o r e s c e n t l a b e l l i n g o f s a l t t r e a t e d c e l l s . N u c l e a r p r o t e i n h a s b e e n r e l e a s e d f r o m n u c l e i , i n s o m e c a s e s c o m p l e t e l y ( d a r k n u c l e i ) , a n d i s s e e n a s a h a l o o f d i f f u s e f l u o r e s c e n c e s u r r o u n d i n g c e l l s . E x p o s u r e t i m e 60 s e c o n d s . F - F l u o r e s c e n t l a b e l l i n g o f u n f i x e d c e l l s w i t h n o n - i m m u n e g l o b u l i n . C e l l s c a n be s e e n f a i n t l y . A c e l l f r a g m e n t i s s e e n f l u o r e s c i n g b r i g h t l y . E x p o s u r e t i m e 60 s e c o n d s . G - P h a s e c o n t r a s t p h o t o g r a p h y o f s a m e f i e l d a s i n F , s h o w i n g c e l l s p r e s e n t . 109 5Q WVM, 110 B . L i v e r C e l l s T h e p r e s e n c e o f b a s i c p r o t e i n i n l i v e r c e l l s i s i n d i c a t e d b y t h e p i n k c o l o u r a s s o c i a t e d w i t h n u c l e i i n F i g u r e 1 8 B , t a k e n f r o m a n i m p r i n t s t a i n e d w i t h B i e b r i c h s c a r l e t . F i g u r e 1 8 A , C s h o w s t h e r e s u l t s o f l a b e l l i n g a s i m i l a r , u n f i x e d i m p r i n t , w i t h f l u o r e s c e n t i m m u n e g l o b u l i n . L i v e r c e l l n u c l e i h a v e d i s t i n c t i v e n u c l e o l i w h i c h w e r e o b s e r v e d t o f l u o r e s c e m o r e b r i g h t l y t h a n t h e s u r r o u n d i n g n u c l e a r c o m p o n e n t s . T h i s p h o t o g r a p h s e r v e s t o d e m o n s t r a t e the i n c r e a s e d r e s o l u t i o n p o s s i b l e w i t h t h e i m m u n o f l u o r e s c e n t t e c h n i q u e . C . S p l e e n C e l l s F i g u r e 1 8 E a n d F i g u r e 1 8 F a r e o f s p l e e n i m p r i n t s p r e p a r e d b y t h e s a m e m e t h o d s a s w e r e t h e l i v e r c e l l s . T h e n u c l e a r f l u o r e s c e n c e p r e s e n t a g a i n d e m o n s t r a t e s t h e p r e s e n c e o f b a s i c n u c l e a r p r o t e i n s i n i n t e r p h a s e n u c l e i w i t h o u t t h e i n c l u s i o n o f b a c k g r o u n d m a t e r i a l . I l l F i g u r e 18 B o v i n e L i v e r a n d S p l e e n I m p r i n t s S h o w i n g P r e s e n c e of B a s i c N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n a n d H i s t o n e i n N u c l e i . A , C - F l u o r e s c e n t l a b e l l i n g o f u n f i x e d l i v e r c e l l s . B r i g h t f l u o r e s c e n c e o f n u c l e o l i . E x p o s u r e t i m e 45 s e c o n d s . B - B i e b r i c h s c a r l e t s t a i n . P i n k c o l o u r o f n u c l e i i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e of h i s t o n e . D - P h a s e c o n t r a s t i m a g e o f t h e s a m e c e l l s a s i n C , s h o w i n g n u c l e o l i . E - F l u o r e s c e n t l a b e l l i n g o f u n f i x e d s p l e e n c e l l s . S o m e n u c l e i f l u o r e s c e m o r e b r i g h t l y t h a n o t h e r s . E x p o s u r e t i m e 3 0 s e c o n d s . F - B i e b r i c h s c a r l e t s t a i n . P i n k c o l o u r o f n u c l e i s h o w s t h e p r e s e n c e o f h i s t o n e i n v a r y i n g d e g r e e s o f i n t e n s i t y . 112 5 0 wyi 4 D . T e s t i s C e l l s T e s t i s i m p r i n t s p r o v i d e d e x c e l l e n t c y t o l o g i c a l m a t e r i a l a n d w e r e s t u d i e d m o r e e x t e n s i v e l y . S t a i n i n g w i t h B e i b r i c h S c a r l e t s h o w e d t h e p r e s e n c e o f b a s i c p r o t e i n i n i n t e r p h a s e n u c l e i , c e l l s u n d e r g o i n g m e i o t i c d i v i s i o n a n d s p e r m h e a d s , b u t a b s e n t f r o m e r y t h r o c y t e s . T h e s a m e p a t t e r n s o f s t a i n i n g a n d i n t e n s i t y w e r e p r e s e n t w h e n u s i n g t h e f l u o r e s c e n t a n t i b o d y t e c h n i q u e ( F i g u r e 1 9 ) . F i g u r e 1 9 F , a p h a s e c o n t r a s t p h o t o g r a p h o f a n u n s t a i n e d i m p r i n t , i s i n c l u d e d t o s h o w t h e p r e s e n c e o f s p e r m f l a g e l l a w h i c h w e r e n o t v i s i b l e u s i n g o t h e r t e c h n i q u e s . T h e p r e s e n c e o f D N A i n p o s i t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h a t o f b a s i c n u c l e a r p r o t e i n i n n u c l e i i s d e m o n s t r a t e d i n 1 9 B , s t a i n e d w i t h A c r i d i n e o r a n g e . T w o s p e r m h e a d s a r e l a b e l l e d S a n d s h o w D N A f l u o r e s c e n c e . N u c l e o l i c a n be s e e n i n s e v e r a l c e l l s , w h i c h u n l i k e l i v e r n u c l e o l i , d i d n o t s h o w i n c r e a s e d f l u o r e s c e n c e w h e n l a b e l l e d w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y . 114 F i g u r e 19 B o v i n e T e s t i s I m p r i n t s S h o w i n g the P r e s e n c e o f , D N A , H i s t o n e a n d B a s i c N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n i n M e i o t i c N u c l e i a n d S p e r m H e a d s . A - B i e b r i c h s c a r l e t s t a i n . M - n u c l e u s i n m e i o t i c d i v i s i o n S - s p e r m h e a d E - e r y t h r o c y t e T h e p i n k s t a i n i n g o f n u c l e i i n d i c a t e s h i s t o n e p r e s e n t . S p e r m h e a d s s t a i n m o r e d a r k l y . B - A c r i d i n e l o r a n g e s t a i n . R e d f l u o r e s c e n c e i n d i c a t e s h i g h a m o u n t o f R N A p r e s e n t . S - s p e r m h e a d s h o w i n g y e l l o w f l u o r e s -c e n c e o f D N A . C , E - F l u o r e s c e n t l a b e l l i n g . S p e r m h e a d s f l u o r e s c e m o r e b r i g h t l y t h a n n u c l e i . E x p o s u r e t i m e 60 s e c o n d s . D - P h a s e c o n t r a s t i m a g e o f t h e s a m e f i e l d a s C . S t a i n e d f o r n u c l e i w i t h a c e t o -o r c e i n a f t e r f l u o r e s c e n c e p h o t o g r a p h y . F - P h a s e c o n t r a s t i m a g e o f u n s t a i n e d c e l l s . S p e r m f l a g e l l a p r e s e n t w h i c h d o n o t s t a i n f o r b a s i c n u c l e a r p r o t e i n a n d d o n o t f l u o r e s c e w h e n l a b e l l e d w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y . 115 1 1 6 E . C h r o m o s o m e s o f C u l t u r e d L e u k o c y t e s T h e a n t i g e n i c i t y o f b a s i c p r o t e i n s s u r v i v e d t h e t e c h n i q u e s o f p r e p a r a t i o n o f m e t a p h a s e c h r o m o s o m e s o f c u l t u r e d l y m p h o c y t e s . F i g u r e 2 0 i l l u s t r a t e s t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e c h r o m o -s o m e s d i d n o t f l u o r e s c e e v e n l y b u t s h o w e d a s t i p p l e d p a t t e r n . T h e c h r o m o s o m e s f l u o r e s c e d w i t h e q u a l i n t e n s i t y a n d t h e p h a s e c o n t r a s t p h o t o g r a p h i s i n c l u d e d t o s h o w t h a t a l l c h r o m o s o m e s s h o w f l u o r e s -c e n c e i n c l u d i n g t h e s e x c h r o m o s o m e s . C o n t r o l s l i d e s , l a b e l l e d w i t h n o n - i m m u n e f l u o r e s c e n t g l o b u l i n , w e r e r o u t i n e l y p r e p a r e d w i t h e a c h f l u o r e s c e n t t e s t a n d w e r e n e g a t i v e . I t w a s f o u n d t h a t B i e b r i c h ' s c a r l e t d i d n o t s t a i n c h r o m o -s o m e s p r e p a r e d i n t h i s m a n n e r a s t h e r e a c t i o n d e p e n d s t o a l a r g e e x t e n t o n t h e u s e o f s p e c i f i c f i x a t i v e s w h i c h a r e n o t u s e d i n c h r o m o s o m a l p r e p a r a t i o n . 117 F i g u r e 2 0 B o v i n e , A c i d - A l c o h o l F i x e d , C h r o m o s o m e s S h o w i n g t h e P r e s e n c e o f B a s i c N u c l e a r P r o t e i n a n d N u c l e i c A c i d i n t h e S a m e S i t e s . A - F l u o r e s c e n t l a b e l l i n g . N o t e s t i p p l e d a p p e a r a n c e o f c h r o m o s o m e s i n d i c a t i n g u n e v e n d i s t r i b u t i o n o f b a s i c n u c l e a r p r o t e i n a n t i g e n . A l l c h r o m o s o m e s s h o w f l u o r e s c e n c e . A r r o w i n d i c a t e s s u b m e t a c e n t r i c s e x c h r o m o s o m e s . E x p o s u r e t i m e 90 s e c o n d s . B - T h e s a m e f i e l d s t a i n e d f o r n u c l e i c a c i d w i t h a c e t o - o r c e i n a f t e r f l u o r e s c e n c e p h o t o g r a p h y . 118 2 . H u m a n C e l l s F l u o r e s c e n t a n t i b o d y w a s a l s o a p p l i e d t o t h r e e t y p e s o f h u m a n c e l l s a n d t i s s u e s a n d h u m a n c h r o m o s o m e s . A . B u c c a l C e l l s E p i t h e l i a l c e l l s f r o m t h e l i n i n g o f t he m o u t h w e r e p r e p a r e d a n d s t a i n e d f o r t h e d e m o n s t r a t i o n o f B a r r b o d i e s w i t h i n t h e n u c l e u s . S i m i l a r c e l l s t r e a t e d w i t h f l u o r e s c e n t i m m u n e g l o b u l i n s h o w e d b r i g h t n u c l e a r f l u o r e s c e n c e a n d s o m e c y t o p l a s m i c f l u o r e s c e n c e ( w h i c h w a s a l s o p r e s e n t i n c o n t r o l s l i d e s ) . T h e f l u o r e s c e n t l a b e l l i n g o f B a r r b o d i e s c o u l d n o t b e a s c e r t a i n e d a s t h e w h o l e n u c l e u s f l u o r e s c e d b r i g h t l y a n d e v e n l y ( F i g u r e 2 1 A ) . B . T h y m u s C e l l s A s a m p l e o f h u m a n t h y m u s w a s o b t a i n e d , t h r e e d a y s a f t e r d e a t h , f r o m t h e c a d a v e r o f a 13 y e a r o l d g i r l . T h i s t i s s u e h a d d e t e r i o r a t e d b a d l y , p r o b a b l y d u e t o t h e n o r m a l r e g r e s s i o n o f t h i s o r g a n a n d a u t o l y s i s . W h e n i m p r i n t s w e r e m a d e a n d t r e a t e d w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y s o m e n u c l e a r f l u o r e s c e n c e w a s e v i d e n t b u t s u i t a b l e p h o t o g r a p h s c o u l d n o t be o b t a i n e d . T h e s p l e e n f r o m t h i s p a t i e n t w a s i n b e t t e r c o n d i t i o n . T h e d e m o n s t r a t i o n o f f l u o r e s c e n t n u c l e i w a s a c h i e v e d u s i n g t h e u s u a l t e c h n i q u e s ( F i g u r e 2 1 C ) . 120 C . T e s t i s C e l l s A s a m p l e o f h u m a n t e s t i s w a s o b t a i n e d f r o m a 45 y e a r o l d p a t i e n t s h o r t l y a f t e r d e a t h a n d p r o v i d e d m a t e r i a l f o r t h e d e m o n s t r a t i o n o f f l u o r e s c e n t n u c l e a r p r o t e i n s ( F i g u r e 2 I E ) . V e r y f e w m a t u r e s p e r m w e r e p r e s e n t i n t h i s t i s s u e . H o w e v e r , t w o s p e r m h e a d s , a s w e l l a s n u c l e i i n v a r i o u s s t a g e s o f d i v i s i o n , c a n be s e e n t o f l u o r e s c e . 121 F i g u r e 2 1 H u m a n C e l l s ( U n f i x e d ) S h o w i n g t h e P r e s e n c e o f B a s i c N u c l e a r ' P r o t e i n A n t i g e n i n N u c l e i . A - F l u o r e s c e n t l a b e l l i n g o f b u c c a l s m e a r . B r i l l i a n t n u c l e a r f l u o r e s c e n c e , s l i g h t l y -o v e r - e x p o s e d . S o m e c y t o p l a s m i c f l u o r e s c e n c e p r e s e n t . B - P h a s e c o n t r a s t i m a g e o f t h e s a m e f i e l d a s A . C - F l u o r e s c e n t l a b e l l i n g o f s p l e e n i m p r i n t . E x p o s u r e t i m e 6 0 s e c o n d s . D - P h a s e c o n t r a s t i m a g e o f a n o t h e r f i e l d o n t h e s a m e s l i d e a s C . E - F l u o r e s c e n t l a b e l l i n g o f t e s t i s i m p r i n t . F l u o r e s c e n c e o f m e i o t i c n u c l e i a n d t w o s p e r m h e a d s . E x p o s u r e t i m e 60 s e c o n d s . F - P h a s e c o n t r a s t i m a g e o f t h e s a m e f i e l d a s E . N o t e p r e s e n c e o f f l a g e l l a . 122 5Q mu. 123 D . C h r o m o s o m e s o f C u l t u r e d L e u k o c y t e s F i g u r e 2 2 A w a s t a k e n f r o m a s l i d e o f h u m a n c h r o m o s o m e s p r e p a r e d b y t h e s t a n d a r d t e c h n i q u e , i n c l u d i n g m e t h a n o l - a c e t i c a c i d f i x a t i o n , a n d l a b e l l e d w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y . B y o v e r - e x p o s i n g the f i l m p h o t o g r a p h s c o u l d be o b t a i n e d , w i t h o u t t h e u s e o f a d d i t i o n a l f l u o r e s c e n t a n t i - c h i c k e n g l o b u l i n s . S p e c i a l c o l o u r p r i n t i n g t e c h -n i q u e s d e s c r i b e d i n t h e l e g e n d w e r e n e c e s s a r y t o p r o d u c e F i g u r e 2 2 C . T h a t s u c h c h r o m o s o m a l f l u o r e s c e n c e i s n o t a n a r t i f a c t o f f i x a t i o n w a s d e t e r m i n e d b y t h e n e g a t i v e r e s u l t s o b t a i n e d w i t h c o n t r o l n o n - i m m u n e g l o b u l i n a n d b y l a b e l l i n g u n f i x e d c h r o m o s o m e s w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y a s i n F i g u r e 2 2 D . 124 F i g u r e 22 H u m a n C h r o m o s o m e s S h o w i n g t h e P r e s e n c e o f B a s i c N u c l e a r ' P r o t e i n A n t i g e n . A - P r e p a r e d u s i n g f i x a t i v e s a n d l a b e l l e d w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y . T h e c o l o u r o f t w o l y m p h o c y t e n u c l e i i n d i c a t e s o v e r -e x p o s u r e , w h i c h w a s n e c e s s a r y t o m a k e t h e p h o t o g r a p h . B y c o m p a r i s o n w i t h B a l l c h r o m o s o m e s a r e s e e n t o be f l u o r -e s c i n g t h r o u g h o u t . E x p o s u r e t i m e 120 s e c o n d s . I n c o m p l e t e m e t a p h a s e . B - P h a s e - c o n t r a s t . S t a i n e d w i t h a c e t o -o r c e i n a f t e r f l u o r e s c e n t l a b e l l i n g a n d c o l o u r p h o t o g r a p h y . C - P r e p a r e d u s i n g f i x a t i v e a n d l a b e l l e d w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y . T h i s p h o t o -g r a p h w a s m a d e b y o v e r - e x p o s i n g t h e c o l o u r s l i d e , m a k i n g a n e g a t i v e u s i n g a y e l l o w f i l t e r a n d p r i n t i n g t h e g r e e n f l u o r e s c e n c e . E x p o s u r e t i m e 120 s e c o n d s . C o m p l e t e m e t a p h a s e . D - P r e p a r e d w i t h o u t f i x a t i v e a n d l a b e l l e d w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y . T h i s p h o t o -g r a p h p r e p a r e d i n t h e s a m e m a n n e r a s F i g u r e 2 2 C . T h e c h r o m o s o m e s a r e i n d i s t i n c t u s i n g t h i s m e t h o d b u t s h o w f l u o r e s c e n c e o f t h e s a m e i n t e n s i t y a s t h o s e i n C . E x p o s u r e t i m e 120 s e c o n d s . 125 1 0 & * J|»* * f A • 1 1 B r t ** + T C > J " • D 3 . I n s e c t C h r o m o s o m e s I n F i g u r e 2 3 A t h e p o l y t e n e s a l i v a r y g l a n d c h r o m o s o m e s f r o m t h e l a r v a o f t h e d i p t e r a n C h i r o n o m u s t e n t a n s a r e s h o w n a s t h e y a p p e a r a f t e r b e i n g s t a i n e d w i t h 0 . 5% a c e t o - o r c e i n f o r D N A a n d v i e w e d u n d e r p h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p y . A s i m i l a r n u c l e u s , s p r e a d b y m o d e r a t e o s m o t i c s w e l l i n g a n d f l a t t e n e d b y a c o v e r g l a s s i s s h o w n i n F i g u r e 2 3 B . T h i s i s a n u n s t a i n e d p r e p a r a t i o n v i e w e d b y p h a s e c o n t r a s t . I n F i g u r e 2 3 F c h r o m o s o m e s c a n be s e e n a d h e r i n g t o a p o r t i o n o f a c e l l m e m b r a n e . T h i s m a t e r i a l w a s p r e p a r e d b y m e c h a n i c a l l y r u p t u r i n g t h e c e l l a f t e r b r i e f f i x a t i o n i n 1 N H C 1 . A f t e r p h a s e c o n t r a s t p h o t o g r a p h y t h e s a m e m a t e r i a l w a s t r e a t e d w i t h f l u o r e s c e n t n o n - i m m u n e g l o b u l i n a s a c o n t r o l . T h e r e s u l t i n g n o n - s p e c i f i c f l u o r e s c e n c e ( F i g u r e 2 3 E ) i s a s s o c i a t e d e q u a l l y w i t h t h e c e l l m e m b r a n e a n d t h e c h r o m o s o m a l m a t e r i a l . T h e r a t h e r h i g h a f f i n i t y o f s e r u m g l o b u l i n s f o r t h e s e m e m b r a n e s w a s a c o n s t a n t f i n d i n g . F i g u r e s 2 3 C a n d 2 3 D w e r e p r e p a r e d i n t h e s a m e m a n n e r e x c e p t t h a t f l u o r e s c e n t i m m u n e g l o b u l i n w a s u s e d t o l a b e l t h e c h r o m o s o m e s i n C . T h i s i s a s p e c i f i c r e a c t i o n t h o u g h t t o b e d u e t o t h e p r e s e n c e o f b a s i c p r o t e i n , a s s o c i a t e d w i t h D N A , i n t h e c h r o m o s o m e s . T h e r e i s s o m e n o n - s p e c i f i c b i n d i n g t o t h e m e m b r a n e o n t h e u p p e r p o r t i o n o f t h e f i g u r e . 127 F i g u r e 23 C h r o m o s o m e s o f C h i r o n o m u s t e n t a n s S h o w i n g t h e P r e s e n c e o f B a s i c N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n . A - A c e t o - o r c e i n s t a i n i n g . P h a s e c o n t r a s t p h o t o g r a p h y . 1 0 0 X o b j e c t i v e l e n s . S q u a s h p r e p a r a t i o n . F o u r c h r o m o s o m e s p r e s e n t s h o w i n g p a t t e r n s o f b a n d i n g a n d c h r o m o s o m a l p u f f s . B - U n s t a i n e d . P h a s e c o n t r a s t p h o t o g r a p h y . 1 0 0 X o b j e c t i v e l e n s . N u c l e u s h a s b e e n s w e l l e d a n d f l a t t e n e d u n d e r c o v e r g l a s s . S h a r p b a n d i n g p a t t e r n s a r e v i s i b l e . C - L a b e l l e d w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y . C h r o m o s o m e s h a v e b e e n e x p o s e d , p r i o r t o l a b e l l i n g , b y r u p t u r i n g t h e c e l l m e m -b r a n e . F l u o r e s c e n c e i s 1 /4 t h e i n t e n s i t y o f t h a t o f b o v i n e c h r o m o s o m e s . E x p o s u r e t i m e 2 4 0 s e c o n d s . D - T h e s a m e f i e l d a s i n C p h o t o g r a p h e d b y p h a s e c o n t r a s t . E - L a b e l l e d w i t h n o n - i m m u n e f l u o r e s c e n t g l o b u l i n . T h e f l u o r e s c e n c e p r e s e n t i s n o n - s p e c i f i c f l u o r e s c e n c e o f t h e c e l l m e m b r a n e . T h a t c h r o m o s o m e s a r e p r e s e n t c a n be s e e n , i n F . E x p o s u r e t i m e 2 4 0 s e c o n d s , F - P h a s e c o n t r a s t i m a g e o f t h e s a m e f i e l d a s i n E . 128 129 4. P lant C e l l s The immunofluorescent study of p lant c e l l s provided some s p e c i a l problems. The l i g n i f i e d mater ia l i n c e l l wal ls had a high a f f i n i t y f o r serum g lobul ins and f luoresced n o n - s p e c i f i c a l l y . I t also provided a b a r r i e r to the entry of f luorescent antibody in to the c e l l . Pect inase served to soften the c e l l wal l s and separate the c e l l s , but o lder c e l l s were s t i l l impermeable to f luorescent g l o b u l i n . Younger c e l l s , which had not developed a th i ck w a l l , were permeable and showed d e f i n i t e nuclear f luorescence . Both types of c e l l s are presented i n Figure 24B, prepared from root t ip s of L i l y and treated with f luorescent immune g l o b u l i n . Onion root t i p c e l l s , prepared i n the same manner, gave comparable r e s u l t s , as shown i n Figure 24A of a s ing l e c e l l . The high l e v e l of n o n - s p e c i f i c f luorescence associated with such plant mater ia l i s shown i n Figure 24D. This was taken from a s l i d e of L i l y (LiHum) root t i p mater ia l treated with f luorescent non-immune g l o b u l i n . Some f luorescence i s associated with c e l l u l a r components and the strong a f f i n i t y of a s p i r a l vessel element for serum g l o b u l i n i s ev ident . The reddish f luorescence at lower centre is due to autofluorescence at lower centre i s due to autofluorescence of dust p a r t i c l e s . No nuclear f luorescence was present i n such contro l s l i d e s . F igure 24C, also of Onion root t i p (Al ium). treated with f luorescent immune g l o b u l i n , i s presented to support the observat ion that n u c l e o l i i n plant c e l l s d i d not f luoresce . 130 F i g u r e 2 4 P l a n t C e l l s S h o w i n g t h e P r e s e n c e o f B a s i c N u c l e a r P r o t e i n A n t i g e n i n S o m e N u c l e i . A - O n i o n r o o t t i p c e l l l a b e l l e d w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y . P l a n t c e l l s s h o w s o m e c y t o p l a s m i c f l u o r e s c e n c e . N u c l e o l i a r e n o t f l u o r e s c e n t . T h i s i s a y o u n g c e l l w h i c h h a s n o t d e v e l o p e d a t h i c k w a l l . E x p o s u r e t i m e 180 s e c o n d s . B - L i l l y r o o t t i p c e l l s l a b e l l e d w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y . T h e y o u n g c e l l i n c e n t r e w h i c h d o e s n o t h a v e a t h i c k w a l l s h o w s n u c l e a r f l u o r e s c e n c e ^ s a n t i b o d y c o u l d p e n e t r a t e . T h e o t h e r t w o c e l l s s h o w o n l y n o n - s p e c i f i c f l u o r e s c e n c e o f c e l l w a l l m a t e r i a l . E x p o s u r e t i m e 180 s e c o n d s . C - O n i o n r o o t t i p c e l l s l a b e l l e d w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y . T h e n u c l e o l i i n t h e s e c e l l s a r e m o r e e v i d e n t a n d doi n o t f l u o r e s c e . E x p o s u r e t i m e 180 s e c o n d s . D - L i l l y r o o t t i p c e l l s l a b e l l e d w i t h f l u o r e s c e n t n o n - i m m u n e g l o b u l i n . T h e r e i s s o m e n o n -s p e c i f i c f l u o r e s c e n c e , a s s o c i a t e d w i t h c e l l w a l l m a t e r i a l , p r e s e n t . T h e s p i r a l s t r u c -t u r e i s a v e s s e l e l e m e n t w h i c h h a s s t r o n g a f f i n i t y f o r s e r u m g l o b u l i n . E x p o s u r e t i m e 180 s e c o n d s . 131 132 5 . P r o t o z o a n C e l l s T h i s u n i c e l l u l a r p a r a s i t e ( H o l o m a s t i g o t o i d e s ) w a s t e s t e d f o r t h e p r e s c e n c e o f b a s i c p r o t e i n i n t h e n u c l e u s b y r u p t u r i n g t h e p e l l i c l e o s m o t i c a l l y a n d l a b e l l i n g w i t h f l u o r e s c e n t g l o b u l i n i n t h e u s u a l m a n n e r . T h e n u c l e u s , w h i c h i s F e u l g e n p o s i t i v e f o r D N A , i s l a b e l l e d (N); i n F i g u r e 2 5 B t a k e n w i t h p h a s e c o n t r a s t b e f o r e f l u o r e s c e n t l a b e l l i n g . A s c a n b e s e e n i n F i g u r e 2 5 A t h e p e l l i c l e a n d s e v e r a l c e l l i n c l u s i o n s , a s w e l l a s t h e n u c l e u s , a r e v i s i b l e a f t e r f l u o r e s -c e n t l a b e l l i n g . T h i s i s a n o n - s p e c i f i c e f f e c t a s t h e s a m e r e s u l t w a s o b t a i n e d w i t h f l u o r e s c e n t n o n - i m m u n e g l o b u l i n . 133 F i g u r e 2 5 A n I n s e c t P a r a s i t e ( H o l o m a s t i g o t o i d e s ) L a b e l l e d w i t h F l u o r e s c e n t A n t i b o d y . A - C e l l h a s b e e n r u p t u r e d o s m o t i c a l l y t o a l l o w a n t i b o d y t o p e n e t r a t e . T h e o u t e r p e l l i c l e , s o m e c e l l u l a r i n c l u s i o n s a n d t h e n u c l e u s a l l s h o w n o n - s p e c i f i c a f f i n i t y f o r s e r u m g l o b u l i n s . S i m i l a r r e s u l t o b t a i n e d w i t h n o n - i m m u n e g l o b u l i n . E x p o s u r e t i m e 2 4 0 s e c o n d s . B - P h a s e c o n t r a s t i m a g e o f t h e s a m e c e l l . N = n u c l e u s . 134 135 6 . C h i c k e n B l o o d C e l l s A s a f i n a l t e s t o f t h e i m m u n o f l u o r e s c e n t s p e c i f i c i t y o f t h e f l u o r e s c e n t , c h r o m a t o g r a p h e d , a b s o r b e d , i m m u n e c h i c k e n g l o b u l i n i t w a s t e s t e d a g a i n s t c h i c k e n b l o o d c e l l s o b t a i n e d f r o m t h e s a m e i m m u n i s e d c h i c k e n . F i g u r e 2 6 A s h o w s t h e n e g a t i v e r e s u l t s o b t a i n e d a f t e r f l u o r e s c e n t l a b e l l i n g . T h e c o m p a n i o n p h o t o g r a p h ( F i g u r e 2 6 B ) s h o w s t h a t t h e r e w e r e c e l l s p r e s e n t i n t h i s f i e l d . 136 F i g u r e 2 6 C h i c k e n B l o o d C e l l s L a b e l l e d w i t h F l u o r e s c e n t A n t i b o d y . A - F l u o r e s c e n t s p o t i s n o n - s p e c i f i c a t t a c h m e n t t o d i r t p a r t i c l e a s s o c i a t e d w i t h t h e r u p t u r e d c e l l ( a r r o w i n B ) . E x p o s u r e t i m e 6 0 s e c o n d s . B - P h a s e c o n t r a s t i m a g e o f s a m e f i e l d . M o s t o f t h e c e l l s a r e n u c l e a t e d e r y t h r o c y t e s . A t l e a s t o n e l y m p h o c y t e ( L ) ; i s p r e s e n t . 138 I X . H U M A N L U P U S E R Y T H E M A T O S A A N T I B O D Y A C T I V I T Y A G A I N S T C A L F T H Y M U S N U C L E A R P R O T E I N A N T I G E N S . L u p u s E r y t h e m a t o s i s i s a n a u t o i m m u n e d i s e a s e w h i c h i s k n o w n t o c a u s e t h e p r o d u c t i o n o f a n t i b o d i e s a g a i n s t t h e p a t i e n t ' s o w n n u c l e a r p r o t e i n ( K r o o t h e t a l . , 1 9 6 1 ) . T h e p l a s m a f r o m 5 p a t i e n t s d i a g n o s e d a s h a v i n g L u p u s E r y t h e m a t o s i s w a s t e s t e d f o r i t s i m m u n o l o g i c a l a c t i v i t y a g a i n s t c a l f t h y m u s n u c l e a r p r o t e i n b y a p r e c i p i t i n t e s t a n d i m m u n o d i f f u s i o n . W h i l e t h e r e s u l t s o f t h e s e t e s t s c a n b e c o m p a r e d t o t h e a n t i b o d y a c t i v i t y , p r o d u c e d e x p e r i -m e n t a l l y i n t h e c h i c k e n a g a i n s t t h e s a m e a n t i g e n s , f u r t h e r c o n c l u s i o n s m u s t a w a i t a m o r e d e t a i l e d s t u d y . T h e r e s u l t s o f t h e s e t e s t s a r e , t h e r e f o r e , p r e s e n t e d a s o b s e r v a t i o n s o n l y . P l a s m a N ( w e l l 3 , F i g u r e 2 7 ) ; w a s t h e o n l y o n e t o r e a c t p o s i t i v e l y i n t h e p r e c i p i t i n t e s t . T h e l i n e s o f p r e c i p i t a t e i n F i g u r e 2 7 i n d i c a t e t h a t t h e p l a s m a s r e a c t e d a g a i n s t o n e o r b o t h o f t w o a n t i g e n s p r e s e n t i n t h e n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n . P l a s m a s B a n d L r e a c t e d w i t h a f a s t m o v i n g c o m p o n e n t t o p r o d u c e l i n e s n e a r t h e p l a s m a w e l l s . P l a s m a B a l s o r e a c t e d w i t h a s l o w e r m o v i n g c o m p o n e n t t o p r o d u c e a n o t h e r l i n e n e a r t h e c e n t r a l w e l l . T h i s l i n e i s c o n t i n u o u s o p p o s i t e w e l l s 2 a n d 4 c o n t a i n i n g p l a s m a s N a n d C . T h e s e l i n e s d o n o t a p p e a r t o c o i n c i d e w i t h t h e p r e c i p i t i n l i n e o p p o s i t e w e l l 5 c o n t a i n i n g a b s o r b e d c h i c k e n a n t i - n u c l e a r p r o t e i n s e r u m . S i n c e o n l y o n e p l a t e w a s p r e p a r e d t h i s i s a p r e l i m i n a r y o b s e r v a t i o n o n l y . 139 F i g u r e 2 7 I m m u n o d i f f u s i o n T e s t o f A n t i b o d y A c t i v i t y o f L . E . P l a s m a A g a i n s t B a s i c N u c l e a r P r o t e i n . — P l a s m a , c h i c k e n a n t i s e r u m a n d a n t i g e n a l l a d d e d a t t h e s a m e t i m e . L i n e s c l o s e s t t o w e l l s 1 a n d 3 i n d i c a t e a n i m m u n e r e a c t i o n b e t w e e n p l a s m a s B a n d L a g a i n s t a s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t n u c l e a r p r o t e i n a n t i g e n . L i n e c l o s e t o w e l l 6 o p p o s i t e w e l l s 1, 2 a n d 4 i n d i c a t e s p l a s m a s B , N a n d C a r e r e a c t i n g w i t h a d i f f e r e n t l a r g e r m o l e c u l a r w e i g h t a n t i g e n . T T e l l N o . Reagen t 1 P l a s m a B 2 P l a s m a N 3 P l a s m a L 4 P l a s m a C 5 C h i c k e n serum 312 6 B a s i c N u c l e a r P r o t e i n , B a t c h #3 141 S U M M A R Y T h e p r o t e i n s f r o m c a l f t h y m u s c e l l s w e r e s e p a r a t e d i n t o a c y t o p l a s m i c a n d n u c l e a r f r a c t i o n u s i n g a c i t r i c a c i d a n d w e a k s a l t e x t r a c t i o n p r o c e d u r e . A n a l y s i s o f the n u c l e a r p r o t e i n r e v e a l e d a n a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n c h a r a c t e r i s t i c o f a c r u d e , l y s i n e - r i c h , h i s t o n e p r e p a r a t i o n . T h e h e t e r o g e n e i t y o f t he e x t r a c t w a s d e m o n s t r a t e d b y s e p a r a t i o n i n t o 3 a c i d i c a n d 5 b a s i c f r a c t i o n s b y d i s c e l e c t r o p h o r e s i s o n p o l y a c r y l a m i d e g e l s . T h e s e f r a c t i o n s c o u l d n o t b e s e p a r a t e d o n S e p h a d e x G - 7 5 c o l u m n s , i n d i c a t i n g t h a t a l l 8 f r a c t i o n s w e r e o f a s i m i l a r , s m a l l m o l e c u l a r s i z e . N u c l e a r p r o t e i n w a s p r e c i p i t a t e d b y s a l t r e m o v a l t h r o u g h d i a l y s i s a g a i n s t d i s t i l l e d w a t e r a n d i n j e c t e d i n t o c h i c k e n s . F i v e o f 22 c h i c k e n s p r o d u c e d a n t i b o d i e s d e t e c t a b l e b y p r e c i p i t a t i o n a n d i m m u n o d i f f u s i o n . T w o c h i c k e n s , s e l e c t e d a s t h e b e s t a n t i b o d y p r o d u c e r s , w e r e h y p e r i m m u n i s e d b y r e p e a t e d i n j e c t i o n s o f the p r e c i p i t a t e d n u c l e a r p r o t e i n e x t r a c t . T h e s e r u m o b t a i n e d f r o m t h e s e c h i c k e n s c o n t a i n e d p r e c i p i t a t i n g a n t i b o d i e s a g a i n s t 3 a n t i g e n i c c o m p o n e n t s o f t h e i n o c u l u m , 2 o f w h i c h w e r e a l s o p r e s e n t i n t he c y t o p l a s m . A n t i b o d i e s a g a i n s t 2 c y t o p l a s m i c a n t i g e n s w e r e r e m o v e d f r o m the s e r a b y a b s o r p t i o n w i t h the c y t o p l a s m i c f r a c t i o n o f c a l f t h y m u s c e l l s . T h e a b s o r b e d a n t i s e r a r e a c t e d w i t h a s i n g l e e l e c t r o p h o r e t i c f r a c t i o n o f t h e b a s i c n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n . 142 T h e a n t i s e r a w e r e c o n j u g a t e d w i t h f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e a n d t h e a n t i b o d y c o n t a i n i n g g l o b u l i n f r a c t i o n w a s i s o l a t e d b y S e p h a d e x G - 2 0 0 c h r o m a t o g r a p h y . D i s c e l e c t r o p h o r e s i s , i m m u n o d i f f u s i o n a n d p r e c i p i t i n t e s t s i n d i c a t e d t h a t the a n t i b o d y a c t i v i t y w a s p r e s e n t i n a 7 S g l o b u l i n f r a c t i o n , f r e e o f n o n - g l o b u l i n p r o t e i n . S e r a o b t a i n e d f r o m c h i c k e n s t h a t h a d n o t b e e n i n j e c t e d w i t h n u c l e a r p r o t e i n s w a s p r e p a r e d i n the s a m e m a n n e r a s t t h e i m m u n e g l o b u l i n f r a c t i o n a n d u s e d a s a c o n t r o l i n i m m u n o f l u o r e s c e n t t e s t s . T h e f l u o r e s c e n t a n t i b o d y r e a c t e d s p e c i f i c a l l y w i t h n u c l e i o f i m p r i n t s o f a n u m b e r o f b o v i n e t i s s u e s : t h y m u s , l i v e r , s p l e e n , t e s t i s , e p i t h e l i u m : h u m a n t i s s u e s ; t h y m u s , l i v e r , s p l e e n , t e s t i s : p l a n t s m e a r s o f r o o t t i p c e l l s ; l i l y , o n i o n : a l l c h r o m o s o m e s i n f i x e d a n d u n f i x e d h u m a n l y m p h o c y t e c u l t u r e s ; f i x e d b o v i n e l y m p h o c y t e c u l t u r e s a n d i n s e c t s a l i v a r y g l a n d c e l l s , T h e a n t i b o d y d i d n o t r e a c t w i t h c h i c k e n c e l l s . C o n t r o l p r e p a r a t i o n s , ' l a b e l l e d w i t h n o n - i m m u n e g l o b u l i n w e r e n e g a t i v e i n a l l c a s e s . E x p o s u r e t i m e s , n e c e s s a r y to p h o t o g r a p h t h e f l u o r e s c e n c e i n d i c a t e d a d e c r e a s i n g a f f i n i t y b e t w e e n a n t i b o d y a n d t e s t m a t e r i a l s i n t he f o l l o w i n g o r d e r : b o v i n e c e l l s , h u m a n c e l l s , p l a n t c e l l s , a n d i n s e c t c e l l s . If t he a m o u n t o f f l u o r e s c e n c e i s c o m p a r a b l e to i n t e r s p e c i f i c s e r o l o g i c a l c r o s s -r e a c t i v i t y i t i n d i c a t e s a n a n t i g e n i c s i m i l a r i t y w h i c h e x i s t s o v e r a w i d e p h y l o g e n e t i c r a n g e b u t d e c r e a s e s w i t h p h y l o g e n e t i c s e p a r a t i o n . 143 This common ant igen ic component was t e n t a t i v e l y i d e n t i f i e d as a histone according to the fo l lowing c r i t e r i a : a. It was i s o l a t e d from a preparat ion having amino ac id values consistent with standard his tone preparat ions . This preparat ion was, however, a mixture of p r o t e i n s , any one of which could be the antigen i n quest ion . b . I t migrated i n polyacrylamide gels under condit ions designed for the electrophoresis of h i s tones , i n d i c a t i n g that i t i s a small molecular weight, bas i c p r o t e i n . c. It s t a i n e d , i n polyacrylamide ge l s , with B i e b r i c h s c a r l e t , a dye known to s e l e c t i v e l y s t a i n histones under appropriate cond i t i ons . d. I t occurred s o l e l y i n the n u c l e i of c e l l s , as seen by immunofluorescence. e. I t was found to be i n c lose a s soc ia t ion with DNA i n chromosomes, as seen by comparison of ace to-orce in s ta ined chromosomes and immunofluorescence. f. I t occupied s i m i l a r s i t e s to h is tone i n c e l l n u c l e i and to protamines i n sperm heads, as seen by comparison of B i e b r i c h s c a r l e t s t a i n i n g and immunofluorescence. 144 Immunodiffusion tests showed a p r e c i p i t i n l i n e continuous between the b a s i c nuclear p r o t e i n extract and a commercial h is tone preparat ion , i n d i c a t i n g the same antigen was present i n both samples. The p o s s i b i l i t y remains that both preparations could have contained a common ant igen ic contaminant. The author wishes to point out that these are i n d i r e c t pieces of evidence and do not prove that the antigen i s a histone although they do i n d i c a t e that th i s i s a strong p o s s i b i l i t y . 145 D I S C U S S I O N T h e p r i m a r y o b j e c t i v e o f t h i s s t u d y w a s to d e v e l o p a n i m m u n o f l u o r e s c e n t t e c h n i q u e w h i c h c o u l d b e a p p l i e d to s t u d i e s o f the l o c a t i o n a n d d i s t r i b u t i o n o f s p e c i f i c n u c l e a r p r o t e i n s . H o w e v e r , s i n c e o n l y the h i s t o n e s a r e u n i q u e to the n u c l e u s t h e y w e r e s e l e c t e d a s t h e m o s t a p p r o p r i a t e a n t i g e n i c m a t e r i a l f o r t h i s s t u d y . H i s t o n e s h a v e the f u r t h e r a d v a n t a g e t h a t t h e y h a v e b e e n the o b j e c t o f i n t e n s e s t u d y d u r i n g the p a s t f i f t e e n y e a r s ( B u t l e r , 1965) a n d c o n s e q u e n t l y e x t r a c t i o n p r o c e d u r e s a n d a n a l y t i c a l t e c h n i q u e s f o r c a l f t h y m u s h i s t o n e p r e p a r a t i o n a r e w e l l d e v e l o p e d ( B u s c h , 1 9 6 5 , p . p . 5 8 - 9 0 ) . I n c o n t r a s t , a c i d i c n u c l e a r p r o t e i n s a r e d i f f i c u l t to i s o l a t e a n d h a v e r e c e i v e d l i t t l e a t t e n t i o n ( B u s c h , p . p . 1 9 7 - 2 2 6). T h e m a j o r d i s a d v a n t a g e o f u s i n g h i s t o n e s i n i m m u n o l o g i c a l s t u d i e s i s t h a t t h e y a r e g e n e r a l l y c o n s i d e r e d to b e p o o r a n t i g e n s ( W i l s o n e t a l . , 19 66) . H o w e v e r , s t r o n g i m m u n e r e a c t i o n s a g a i n s t h i s t o n e s a r e p r o d u c e d i n the a u t o i m m u n e d i s e a s e s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s i s ( K u n k e l , I9 60) a n d i t h a s b e e n p o s s i b l e , i n s o m e c a s e s , to p r o d u c e h i s t o n e a n t i b o d i e s i n e x p e r i m e n t a l a n i m a l s . M e i s c h e r e t a L , ( 1 9 6 0 ) i m m u n i s e d g u i n e a p i g s a n d r a b b i t s w i t h c a l f t h y m u s n u c l e o p r o t e i n s a n d f o u n d t h e m to b e w e a k l y a n t i g e n i c . M o r e 146 r e c e n t l y , W i l s o n e t a l . , ( 1 9 6 6 ) r e p o r t e d t h a t h i s t o n e s e x t r a c t e d f r o m c a l f t h y m u s w e r e n o t a n t i g e n i c i n r a b b i t s a f t e r p r o l o n g e d i m m u n i s a t i o n . O n e a p p a r e n t d i f f e r e n c e b e t w e e n the s u c c e s s f u l e x p e r i m e n t s r e p o r t e d b y M e i s c h e r ( I 9 60) a n d i n t h i s s t u d y a n d the u n s u c c e s s f u l a t t e m p t s o f W i l s o n ( 1 9 6 6 ) i s i n t he m e t h o d s o f h i s t o n e e x t r a c t i o n a n d p r e p a r a t i o n o f the a n t i g e n s . W h e r e a s W i l s o n u s e d a n a c i d e x t r a c t e d p r e p a r a t i o n , s a l t e x t r a c t e d n u c l e a r p r o t e i n s w e r e u s e d b y M e i s c h e r a n d t h i s a u t h o r . C h a r g a f f ( 1 9 5 5 ) s u g g e s t e d t h a t a c i d e x t r a c t e d h i s t o n e s a r e s h o r t - c h a i n c l e a v a g e p r o d u c t s o f t h e n a t i v e h i s t o n e m o l e c u l e . T h i s h a s b e e n s u p p o r t e d b y H u a n g a n d B o n n e r (19 66) w h o f o u n d t h a t a c i d e x t r a c t e d h i s t o n e s f r o m p e a b u d n u c l e i h a d m o l e c u l a r w e i g h t s o f a p p r o x i m a t e l y 2 0, 0 0 0 ; o n e - t e n t h t h a t o f t he n a t i v e h i s t o n e m o l e c u l e . If a c i d e x t r a c t i o n c l e a v e s h i s t o n e m o l e c u l e s i n t o f r a g m e n t s , t he g e n t l e r m e t h o d o f w e a k s a l t e x t r a c t i o n u s e d i n the p r e s e n t e x p e r i m e n t , a n d b y M e i s c h e r , s h o u l d l i m i t d e n a t u r a t i o n a n d r e s u l t i n t h e i s o l a t i o n o f a l a r g e r m o l e c u l e . A s t h e m i n i m u m s i z e f o r a p r o t e i n to b e i m m u n o g e n i c i s c o n s i d e r e d to b e 2 0 , 0 0 0 ( C a r p e n t e r 1 9 6 5 , p . 4 1 ) i t s e e m s r e a s o n a b l e to e x p e c t t h a t t he s a l t e x t r a c t e d h i s t o n e s w o u l d b e m o r e i m m u n o g e n i c . I n the p r e s e n t e x p e r i m e n t s i m m u n o g e n i e i t y m a y h a v e b e e n f u r t h e r e n h a n c e d b y t h e u s e o f a r e l a t i v e l y c r u d e n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n i n j e c t e d a s a p r e c i p i t a t e s i n c e a n t i g e n s i n t r o d u c e d i n a p a r t i c u l a t e f o r m a r e u s u a l l y m o r e i m m u n o g e n i c t h a n i f 147 i n j e c t e d a s s o l u t e s ( F i s c h e r , 19 64 ) . R u m k e a n d S l u y s e r (19 66) h a v e r e p o r t e d a m e t h o d o f p r e p a r a t i o n i n w h i c h s a l t e x t r a c t e d h i s t o n e s f r o m r a t l i v e r w e r e s t r o n g l y a n t i g e n i c to r a b b i t s a n d a c i d e x t r a c t e d h i s t o n e s w e r e w e a k l y a n t i g e n i c . T h e y a t t r i b u t e d t h e i r s u c c e s s to a b r i e f h e a t t r e a t m e n t ( 5 m i n u t e s a t 8 0 * C ) o f t he t i s s u e b e f o r e h i s t o n e e x t r a c t i o n to i n a c t i v a t e p r o t e o l y t i c e n z y m e s a n d p r e v e n t h i s t o n e b r e a k d o w n . T h i s p r o c e d u r e m a y b e m o r e e f f e c t i v e t h a n the u s u a l m e t h o d o f i n a c t i v a t i n g e n z y m e s b y e x t r a c t i n g h i s t o n e s a t 4 C ( D a l y a n d M i r s k y ^ 1 9 5 5 ) . A l t h o u g h i n p r e v i o u s e x p e r i m e n t s c a l f t h y m u s n u c l e o p r o t e i n s w e r e i n j e c t e d i n t o o t h e r fflammals ( M e i s c h e r e t a l . > 1 9 5 9 ; B l a c k , A n s l e y a n d M a n d l ; 1 9 6 4 f W i l s o n e t a l . , 1 9 6 5 ) the c h i c k e n w a s u s e d a s t h e r e c i p i e n t i n t h i s p r o j e c t . T h e i m p o r t a n c e o f t h e c h o i c e o f a n t i b o d y p r o d u c e r s w a s i n d i c a t e d , a s t he o b s e r v a t i o n s o f o t h e r s h a d s h o w n t h a t h i s t o n e s f r o m d i f f e r e n t s p e c i e s s h o w r e m a r k a b l e s i m i l a r i t y ( S t e d m a n a n d S t e d m a n , 1 9 5 1 ; N e e l i n a n d B u t l e r , 1 9 6 1 ) . I f i n s p i t e o f t h i s i n t e r s p e c i f i c s i m i l a r i t y , s l i g h t a n t i g e n i c d i f f e r e n c e s do e x i s t , t h e c h a n c e o f f i n d i n g v a r i a t i o n s h o u l d i n c r e a s e i n v e r s e l y w i t h t h e d e g r e e o f b i o l o g i c a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e a n t i g e n d o n o r a n d r e c i p i e n t ( C a r p e n t e r , 19 65 , p . 65) . T h e u s e o f t he b o v i n e a n d a v i a n s p e c i e s m a y h a v e 148 c o n t i r b u t e d to s u c c e s s f u l a n t i b o d y p r o d u c t i o n b y p r o v i d i n g a w i d e s p e c i e s s e p a r a t i o n . T o d a t e , e x p e r i m e n t s u s i n g n u c l e a r c o m p o n e n t s a s a n t i g e n i c m a t e r i a l h a v e b e e n p r i m a r i l y c o n c e r n e d w i t h the p o s s i b i l i t y o f p r o d u c i n g a n i m m u n e r e s p o n s e a n d l i t t l e e m p h a s i s h a s b e e n p l a c e d o n c h a r a c t e r i s a t i o n o f t he a n t i g e n s . I n i t i a l a t t e m p t s to a n a l y s e the a n t i g e n - a n t i b o d y r e s p o n s e s m a d e u s e o f I m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s ( W i l s o n e t _ a l , , 1 9 6 6 ; R u m k e a n d S l u y s e r , 1 9 6 6 ) . W i l s o n c o m p a r e d i m m u n e r e s p o n s e s to D N A , D N A - p r o t e i n a n d h i s t o n e , c o n c l u d i n g t h a t o n l y D N A -p r o t e i n c o n t a i n e d t r a c e a m o u n t s o f a n t i g e n i c m a t e r i a l s . R u m k e a n d S l u y s e r w e r e a b l e to d e m o n s t r a t e t h e p r e s e n c e o f t h r e e i m m u n o c h e m i c a l ^ d i s t i n c t h i s t o n e e x t r a c t s . T h e i r s t r o n g e s t r e a c t i o n p r o d u c e d a s i n g l e p r e c i p i t i n l i n e a g a i n s t a s a l t -e x t r a c t e d , l y s i n e - r i c h p r e p a r a t i o n . T h e a n t i b o d y o b t a i n e d i n t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t s a l s o p r o d u c e d a s i n g l e p r e c i p i t i n l i n e a g a i n s t t h e l y s i n e - r i c h p r e p a r a t i o n . A f u r t h e r f r a c t i o n -a t i o n o f t h i s e x t r a c t w a s a c h i e v e d b y d i s c e l e c t r o p h o r e s i s a n d a n a n t i b o d y w a s s h o w n to b e d i r e c t e d a g a i n s t o n e o f t he f i v e s u b t r a c t i o n s . R u m k e a n d S l u y s e r d i d n o t r e p o r t a n a l y s i s o f t he a n t i g e n i c c o m p o n e n t s o f t h e i r h i s t o n e e x t r a c t s , b u t a t t e m p t e d to d e m o n s t r a t e h e t e r o g e n e i t y o f t h e b a s i c n u c l e a r p r o t e i n s b y u s i n g f r a c t i o n s , o b t a i n e d b y d i f f e r e n t e x t r a c t i o n 149 p r o c e d u r e s , a s a n t i g e n s . T h e i r e v i d e n c e f o r i m m u n o -c h e m i c a l l y d i s t i n c t f r a c t i o n s w a s b a s e d o n p r e c i p i t i n l i n e s a g a i n s t l y s i n e - r i c h a n d l y s i n e - p o o r p r e p a r a t i o n s . T h e p o s s i b i l i t y o f c h a r a c t e r i s i n g the b a s i c n u c l e a r p r o t e i n s a n d c y t o p l a s m i c c o n t a m i n a n t s p r e s e n t i n the l y s i n e - r i c h p r e p a r a t i o n u s e d i n t h i s s t u d y w a s e x p l o r e d u s i n g i m m u n o -l o g i c a l , e l e c t r o p h o r e t i c a n d c h r o m a t o g r a p h i c t e c h n i q u e s . S e p h a d e x c h r o m a t o g r a p h y h a s the a d v a n t a g e t h a t n u c l e a r p r o t e i n s c a n b e s e p a r a t e d u n d e r c o n d i t i o n s o f p H a n d s a l t c o n c e n t r a t i o n t h a t l i m i t d e n a t u r a t i o n ( J o h n s o n e t a l . , 1 9 6 4 ) . H o w e v e r , the r e s u l t s o f d i s c e l e c t r o p h o r e s i s o f t h e c h r o m a t o g r a p h i c f r a c t i o n s i n d i c a t e d t h a t S e p h a d e x f r a c t i o n -a t i o n n e i t h e r s e p a r a t e d t h e n u c l e a r p r o t e i n s i n t o d i s c r e t e f r a c t i o n s n o r r e m o v e d the c y t o p l a s m i c c o n t a m i n a n t s . S i n c e the b a s i c n u c l e a r p r o t e i n r e t a i n e d i t s a n t i g e n i c i t y a f t e r a n a l y t i c a l d i s c e l e c t r o p h o r e s i s , o u r r e s u l t s i n d i c a t e t h a t p r e p a r a t i v e e l e c t r o p h o r e s i s o n p o l y a c r y l a m i d e g e l s c o u l d b e e m p l o y e d to s e p a r a t e n u c l e a r p r o t e i n s i n t o s e p a r a t e f r a c t i o n s i n a m o u n t s s u f f i c i e n t f o r a m i n o a c i d a n a l y s e s a n d i m m u n o -l o g i c a l t e s t s . T h e f l u o r e s c e n t a n t i b o d y o b t a i n e d w a s s p e c i f i c f o r n u c l e i a n d c h r o m o s o m e s b u t w a s n e i t h e r o r g a n n o r s p e c i e s 150 s p e c i f i c . T h e a n t i b o d y r e a c t e d w i t h n u c l e i f r o m c a l f t h y m u s a n d o t h e r b o v i n e o r g a n s a n d w i t h b o v i n e s p e r m h e a d s a n d l e u k o c y t e c h r o m o s o m e s . I t a l s o r e a c t e d w i t h n u c l e i f r o m s e v e r a l h u m a n t i s s u e s , p l a n t n u c l e i a n d i n s e c t p o l y t e n e c h r o m o s o m e s . H o w e v e r , a d e c r e a s e i n the i n t e n s i t y o f f l u o r e s c e n c e , r o u g h l y p r o p o r t i o n a l to t he i n c r e a s e i n s p e c i e s d i v e r s i t y w a s o b s e r v e d . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t a n a n t i g e n i c a l l y s i m i l a r p r o t e i n w a s p r e s e n t i n t h e n u c l e i f r o m a l l t h e s e s p e c i e s . T h e p r e s e n c e o f a n t i g e n i c a l l y s i m i l a r p r o t e i n s i n d i f f e r e n t s p e c i e s i s n o t u n c o m m o n . C l a s s i c a l l y , t h e s e h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d b y s e r o l o g i c a l t e s t s f o r c r o s s -r e a c t i o n s i n w h i c h the d e g r e e o f i n t e r s p e c i f i c p r o t e i n s i m i l a r i t y i s m e a s u r e d b y t h e s t r e n g t h o f t he r e a c t i o n . I n 19 34 H o o k e r a n d B o y d p r o p o s e d t h a t s u c h c r o s s - r e a c t i o n s w e r e d u e to the p r e s e n c e o f a t l e a s t t w o t y p e s o f a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s a s a n i n t e g r a l p a r t o f t h e c o m p o s i t i o n a n d s t r u c t u r a l c o n f i g u r a t i o n o f p r o t e i n m o l e c u l e s . O n e t y p e o f d e t e r m i n a n t i s s p e c i f i c f o r t he p a r t i c u l a r p r o t e i n i n q u e s t i o n a n d the o t h e r t y p e i s c o m m o n to a g r o u p o f r e l a t e d p r o t e i n s . A n t i b o d i e s p r o d u c e d a g a i n s t s u c h a p r o t e i n c l a s s c o u l d r e a c t m o s t s t r o n g l y w i t h t he o r i g i n a l a n t i g e n , f o r m i n g i m m u n e c o m p l e x e s w i t h b o t h t y p e s o f d e t e r m i n a n t s . T h e 151 s a m e a n t i b o d y w o u l d c r o s s - r e a c t w i t h a v a r i e t y o f r e l a t e d p r o t e i n s t h a t s h a r e the s a m e o r s i m i l a r d e t e r m i n a n t s , c o m m o n to the p r o t e i n s a s a g r o u p . T h i s t h e o r y i s s u p p o r t e d b y n u m e r o u s r e p o r t s o f i n t e r s p e c i f i c s e r o l o g i c a l c r o s s -r e a c t i v i t y b e t w e e n s o l u b l e p r o t e i n a n t i g e n s ( s e e L a n d s t e i n e r , 1 9 4 5 , f o r r e v i e w ) a n d the e x i s t e n c e o f a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s h a s b e e n d e m o n s t r a t e d b y W e i g l e (19 61) w h o s h o w e d t h a t c r o s s - r e a c t i o n s o f e l e v e n h e t e r o l o g o u s m a m m a l i a n s e r u m a l b u m i n s w e r e d u e to the p r e s e n c e o f f r o m t w o to f i v e a n t i -g e n i c d e t e r m i n a n t s s h a r e d b y t h e d i f f e r e n t s p e c i e s . T h e o b s e r v a t i o n t h a t f l u o r e s c e n t a n t i b o d y r e a c t e d w i t h b o v i n e n u c l e i a n d n u c l e i f r o m o t h e r s p e c i e s , w i t h v a r y i n g d e g r e e s o f i n t e n s i t y , i n d i c a t e s t h a t t h e r e a r e a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s o n b o v i n e h i s t o n e m o l e c u l e s t h a t a r e f o r e i g n to the c h i c k e n . A n t i b o d i e s p r o d u c e d a g a i n s t t h e s e f o r e i g n d e t e r m i n a n t s w i l l r e a c t w i t h b o v i n e h i s t o n e s a n d c r o s s - r e a c t w i t h h i s t o n e s f r o m o t h e r s p e c i e s t h a t h a v e the s a m e o r s i m i l a r d e t e r m i n a n t s . C o m p a r i s o n s o f the i n t e n s i t y o f f l u o r e s c e n c e c a n t h u s b e c o n s i d e r e d a s a m e a s u r e o f t he n u m b e r o f s h a r e d d e t e r m i n a n t s . T h i s e x p l a n a t i o n p r e s u m e s t h a t t h e a n t i b o d y i s d i r e c t e d a g a i n s t a s i n g l e h i s t o n e m o l e c u l e w h i c h v a r i e s f r o m s p e c i e s to s p e c i e s . T h e e v i d e n c e f o r t h i s i s b a s e d o n the d e m o n s t r a t i o n t h a t the a n t i b o d y r e a c t s w i t h a s i n g l e e l e c t r o p h o r e t i c f r a c t i o n o f t h e 152 b a s i c n u c l e a r p r o t e i n p r e p a r a t i o n . H i s t o n e s f r o m a s i n g l e c e l l t y p e a r e h e t e r o g e n e o u s , t h e n u m b e r o f f r a c t i o n s o b t a i n e d v a r y i n g w i t h t he p r o c e d u r e . T h e r e i s no m e a n s o f d e t e r m i n i n g w h e t h e r o r n o t t he f r a c t i o n s a r e h o m o g e n e o u s . I f t he s i n g l e a n t i g e n i c f r a c t i o n d o e s c o n t a i n d i f f e r e n t m o l e c u l e s , c r o s s -r e a c t i v i t y m i g h t b e d u e to t h e n u m b e r o f c o m m o n m o l e c u l e s o f h i s t o n e a n d n o t the n u m b e r o f s h a r e d d e t e r m i n a n t s o n a s i n g l e m o l e c u l e . E i t h e r o f t h e s e s y s t e m s o f i n t e r s p e c i f i c v a r i a t i o n c o u l d a c c o u n t f o r t h e f a c t t h a t t he a n t i b o d y d i d n o t r e a c t w i t h c h i c k e n c e l l s . If t h e c h i c k e n l a c k s a n a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t o r m o l e c u l a r t y p e , c o m m o n to a l l t he o t h e r s p e c i e s , i t w o u l d p r o d u c e a n a n t i b o d y to t h i s f o r e i g n e n t i t y . It m a y b e p o s s i b l e , h o w e v e r , t h a t i m m u n i s a t i o n w i t h n u c l e a r p r o t e i n c a u s e d the c h i c k e n to l o s e i t s t o l e r a n c e to s o m e o f i t s o w n p r o t e i n s a n d t h a t a u t o a n t i b o d i e s w e r e p r o d u c e d w h i c h c o m b i n e d w i t h a n t i g e n a n d w e r e c a t a b o l i s e d , l e a v i n g o n l y a n t i b o d i e s to f o r e i g n p r o t e i n s i n t h e s e r u m . I n g e n e r a l , a u t o - i m m u n i t y i s d e t e c t e d b y i t s a s s o c i a t i o n w i t h d i s e a s e s t a t e s b u t t he d e t e c t i o n o f t h e a c t u a l a u t o a n t i b o d y p r o b a b l y d e p e n d s o n t h e r e l a t i v e a m o u n t s o f a n t i g e n a n d a n t i b o d y p r e s e n t i n t he s e r u m ( W e i g l e , 1 9 6 5 ) . A s t h e n u c l e a r p r o t e i n s p r o b a b l y m a k e u p a c o n s i d e r a b l e p o r t i o n o f the 1 5 3 o f t he p r o t e i n s r e l e a s e d i n t o the b o d y f l u i d s d u r i n g the n o r m a l p r o c e s s e s o f a u t o l y s i s , a u t o - a n t i b o d i e s p r o d u c e d i n s m a l l q u a n t i t i e s w o u l d b e a b s o r b e d b y e x c e s s a n t i g e n s a n d r e m o v e d f r o m the s e r u m . S u c h a u t o - a n t i b o d i e s w o u l d n e i t h e r c a u s e a u t o - i m m u n e s y m p t o m s n o r b e d e t e c t a b l e b y a n y s e r o l o g i c a l t e s t s . A s t h e c h i c k e n s s h o w e d no i l l e f f e c t s f r o m i m m u n i s a t i o n a n d a u t o - a n t i b o d y w a s n o t d e t e c t a b l e b y f l u o r e s c e n t t e s t s i t i s i m p o s s i b l e to d e t e r m i n e w h e t h e r o r n o t a u t o - a n t i b o d i e s w e r e p r o d u c e d . L a r g e a m o u n t s o f a u t o - a n t i b o d i e s a g a i n s t n u c l e a r c o m p o n e n t s a r e d e t e c t a b l e b o t h s y m p t o m a t i c a l l y a n d s e r o -l o g i c a l l y i n l u p u s e r y t h e m a t o s i s . K r o o t h e t a L , (19 61) o b t a i n e d l u p u s s e r a h a v i n g t i t r e s a s h i g h a s 1:4, 0 0 0 . T h e s e a n t i s e r a w e r e u n f r a c t i o n a t e d a n d p r o b a b l y c o n t a i n e d a n t i -b o d i e s a g a i n s t s e v e r a l n u c l e a r a n t i g e n s i n c l u d i n g h i s t o n e s . T h e a n t i s e r a w e r e s i m i l a r to t h e c h i c k e n a n t i b o d y f r a c t i o n s u s e d i n t h i s p r o j e c t i n t h a t t h e y s p e c i f i c a l l y l a b e l l e d n u c l e i a n d c h r o m o s o m e s w i t h f l u o r e s c e n c e , r e a c t i n g w i t h t he f u l l c h r o m o s o m e s c o m p l e m e n t . T h i s i n d i c a t e s t h a t t he a n t i g e n s p r e s e n t i n l u p u s h a v e a s i m i l a r d i s t r i b u t i o n to the s i n g l e a n t i g e n i c c o m p o n e n t o f b a s i c n u c l e a r p r o t e i n u s e d i n t h i s s t u d y . 154 N e i t h e r the l u p u s s e r a n o r t h e c h i c k e n a n t i s e r a w a s s p e c i e s s p e c i f i c . K r o o t h d e m o n s t r a t e d t h a t the l u p u s s e r a r e a c t e d w i t h n u c l e i a n d c h r o m o s o m e s f r o m t h r e e m a m m a l i a n s p e c i e s ( h u m a n , h a m s t e r , m o u s e ) . T h e c h i c k e n a n t i b o d y r e a c t e d w i t h n u c l e i , n o t o n l y f r o m d i f f e r e n t s p e c i e s , b u t e v e n d i f f e r e n t p h y l a . T h e s e e x p e r i m e n t s p r o v i d e a u n i q u e i m m u n o l o g i c a l v e r i f i c a t i o n o f the r e p o r t s o f o t h e r s u s i n g e l e c t r o p h o r e t i c a n d c h r o m a t o g r a p h i c t e c h n i q u e s , a m i n o a c i d a n a l y s e s a n d D N A - h i s t o n e a n n e a l i n g s t u d i e s ( B u s c h , 1 9 6 5 , p . p . 3 9 - 9 0 ) t h a t h i s t o n e f r o m a n i m a l , p l a n t a n d i n s e c t n u c l e i h a v e a b a s i c s i m i l a r i t y . S i m i l a r i t i e s o f a n t i g e n i c i t y a d d a f u r t h e r d i m e n s i o n to the r e p o r t s o f o t h e r s i n t h a t t h e y i m p l y t h a t t h e p r o t e i n s i n q u e s t i o n h a v e s i m i l a r i t i e s o f a m i n o a c i d s e q u e n c e s a n d t e r t i a r y s t r u c t u r e ( F i s c h e r , 1 9 6 4 ) . T h e e x t e n s i v e c r o s s - r e a c t i v i t y o f b a s i c n u c l e a r p r o t e i n a n t i g e n h a s n o t b e e n r e p o r t e d f o r a n y o t h e r c l a s s o f p r o t e i n s o v e r s u c h a w i d e p h y l o g e n e t i c r a n g e . I n t h i s r e s p e c t h i s t o n e s c o u l d b e c o m p a r e d to the n u c l e i c a c i d s w i t h w h i c h t h e y a r e i n v a r i a b l y a s s o c i a t e d . T h e p r e s e n c e o f s u c h a c o m m o n b a s i c s t r u c t u r e o v e r a w i d e p h y l o g e n e t i c r a n g e s u g g e s t s t h a t d u r i n g t h e p r o c e s s o f e v o l u t i o n the i n t e g r i t y o f h i s t o n e m o l e c u l e s h a s b e e n r i g i d l y m a i n t a i n e d . 155 T h e r e s u l t s a n d o b s e r v a t i o n s i n t h i s t h e s i s a r e b a s e d o n the p r o d u c t i o n o f a n t i b o d y to o n l y o n e o f s e v e r a l f r a c t i o n s o f n u c l e a r p r o t e i n s E x t e n s i o n o f the a n a l y t i c a l t e c h n i q u e s d e v e l o p e d h e r e s h o u l d v m a k e i t p o s s i b l e to c h a r a c t e r i s e o t h e r a n t i g e n i c f r a c t i o n s o f t h e n u c l e u s a n d c y t o p l a s m . T h e s e n s i t i v i t y a n d p r e c i s i o n o f i m m u n o c h e m i c a l a n a l y s e s w o u l d b e o f g r e a t a d v a n t a g e i n the s t u d y o f c e l l u l a r p r o t e i n s s i n c e t h e m e t h o d s i n c u r r e n t u s e l a c k t h e n e c e s s a r y r e s o l u t i o n . T h e u s e o f f l u o r e s c e n t a n t i b o d y p r o v i d e s a n o t h e r s e n s i t i v e m e t h o d , f o r c y t o l o g i c a l s t u d i e s . A l t h o u g h t h i s t e c h n i q u e i s t i m e c o n s u m i n g i t a d d s n e w p r e c i s i o n to o b s e r v a t i o n s o f t h e l o c a t i o n a n d d i s t r i b u t i o n o f c e l l u l a r p r o t e i n s . 156 B I B L I O G R A P H Y B a r r , M . L . , (19 59) S e x c h r o m a t i n a n d p h e n o t y p e i n m a n . S c i . 1 3 0 : 6 7 9 - 6 8 5 . B l a c k , M . M , , A n s l e y , H . R . , a n d M a n d l , R . , ( 1 9 6 4 ) : O n c e l l s p e c i f i c i t y o f h i s t o n e s . A r c h . P a t h . 78_: 3 5 0 - 3 6 8 . B l a c k , M , M , , a n d A n s l e y , H . R . , (19 6 5 ) : A n t i g e n c h a n g e s i n l y m p h o i d c e l l h i s t o n e s . J . C e l l B i o l . 2j>: 2 0 1 - 2 0 8 B l a c k , M . M , , a n d A n s l e y , H . R . ( 1 9 6 6 ) : H i s t o n e s p e c i f i c i t y r e v e a l e d b y a m m o n i a c a l s i l v e r s t a i n i n g . J . H i s t o c h e m . C y t o c h e m 14_3 1 7 7 - 1 8 1 . B o n n e r , J . , a n d T s ' o , P . , (19 6 4 ) : " T h e N u c l e o h i s t o n e s " , H o l d e n - D a y I n c . , S a n F r a n c i s c o , L o n d o n , A m s t e r d a m . B u s c h , H . , ( 1 9 6 5 ) : " H i s t o n e s a n d o t h e r N u c l e a r P r o t e i n s " , A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k , L o n d o n . B u t l e r , J . A V . , ( 1 9 6 5 ) : R o l e o f h i s t o n e s a n d o t h e r p r o t e i n s i n . g e n e c o n t r o l . N a t u r e 2 0 7 : 1 0 4 1 - 1 0 4 2 C a r p e n t e r , P . , ( 1 9 6 5 ) : " I m m u n o l o g y a n d S e r o l o g y " , 2 n d E d . , W . B . S a u n d e r s C o . , P h i l a d e l p h i a a n d L o n d o n . C h a r g a f f , E . , ( 1 9 5 5 ) : I n " T h e N u c l e i A c i d s " , p . 3 1 3 , C h a r g a f f a n d D a v i d s o n , E d s . , V o l . 1, A c a d e m i c P r e s s I n c . , N e w Y o r k , N . Y . C o h e n , F . , Z u e l z e r , W . W . , a n d E v a n s , M . M . , (19 6 0 ) : I d e n t i f i c a t i o n o f b l o o d g r o u p a n t i g e n s a n d m i n o r c e l l p o p u l a t i o n s b y t h e f l u o r e s c e n t a n t i b o d y m e t h o d . B l o o d 1_5: 8 8 4 - 9 0 0 . C o o n s . , A. H . , ( 1 9 5 1 ) : F l u o r e s c e n t a n t i b o d i e s a s h i s t o c h e m i c a l t o o l s . . . F e d . P r o c . 10_: 5 5 8 - 5 5 9 . C o w d e n , R . R . , ( 1 9 6 6 ) : C y t o c h e m i c a l s t u d i e s o n c y t o p l a s m i c R N A - a s s o c i a t e d b a s i c p r o t e i n s i n o o c y t e s , s o m a t i c c e l l s , a n d r i b o s o m e s . H i s t o c h e m i e 6: 2 2 6 - 2 4 2 . C r o m p t o n , C . F . , M o o r e , S. , a n d S t e i n , W . H . , ( 1 9 5 5 ) : C h r o m a t o g r a p h i c f r a c t i o n a t i o n o f c a l f t h y m u s h i s t o n e . J . B i o l . C h e m 2 1 5 t 7 8 7 - 8 0 1 . 157 C r u f t , H . J . , M a u r i t z e n , C . M . , a n d S t e d m a n , E . , ( 1 9 5 7 ) : T h e n a t u r e a n d p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f h i s t o n e s . P h i l . T r a n s . R o y . S b c . L o n d o n B 2 4 1 : 9 3 - 1 4 6 . C r u f t , H . J . , M a u r i t z e n , C . M , , a n d S t e d m a n , E . , ( 1 9 5 8 ) : T h e i s o l a t i o n o f b e t a - h i s t o n e f r o m c a l f t h y m o c y t e s a n d t h e f a c t o r s a f f e c t i n g i t s a g g r e g a t i o n . P r o c . R o y . S o c . B 1 4 9 : 2 1 - 2 9 . C r u f t , H . J . , (19 6 1 ) : T h e f r a c t i o n a t i o n o f h i s t o n e s o n S e p h a d e x G - 7 5 . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a 54_: 6 1 1 -6 1 3 . C u l l i n g , C . F . A . , ( 1 9 6 3 ) : " H a n d b o o k o f H i s t o p a t h o l o g i c a l T e c h n i q u e s . " 2 n d E d . , B u t t e r w o r t h a n d C o . , ( C a n a d a ) L t d . , T o r o n t o . D a l y , M , , a n d M i r s k y , A . , ( 1 9 5 4 - 5 5 ) : H i s t o n e s w i t h h i g h l y s i n e c o n t e n t . J . G e n . P h y s i o l . 3 8 : 4 0 5 - 4 0 9 . D a v i d , L . A . , R u t h , R . F . , a n d L a w , G . R . J . , ( 1 9 6 6 ) : S p e c i f i c d e t e c t i o n o f c e l l u l a r t r a n s p l a n t a t i o n a n t i g e n . A n n a l s o f t he N . Y . A c a d . S c i . 1 2 9 ! 4 6 - 7 5 . D o u g l a s , S. D . , S p i c e r , S. S. , a n d B a r t e l s , P . H . ( 1 9 6 6 ) : M i c r o s p e c t r o p h o t o m e t r i c a n a l y s i s o f b a s i c p r o t e i n r i c h s i t e s s t a i n e d w i t h B i e b r i c h s c a r l e t . J . H i s t o c h e m . C y t o c h e m . 14: 3 5 2 - 3 6 0 . F i s c h e r , D . S, , ( 1 9 6 4 ) : T h e o r i e s o f a n t i b o d y f o r m a t i o n : a r e v i e w . Y a l e J . B i o l . M e d . 37_: 1 - 3 0 . G o o d m a n , H . C . , F a h e y , J . L . , a n d M a l g r e m , R . A . , ( I 9 6 0 ) : S e r u m f a c t o r s i n l u p u s e r y t h e m a t o s i s a n d o t h e r d i s e a s e s r e a c t i n g w i t h c e l l n u c l e i a n d n u c l e o p r o t e i n e x t r a c t s : e l e c t r o p h o r e t i c , u l t r a c e n t r i f u g a l a n d c h r o m a t o g r a p h i c s t u d i e s . J . C l i n . I n v e s t . 3 9 : 1 5 9 5 - 1 6 0 5 . H o o k e r , S. B . , a n d B o y d , W . C . , ( 1 9 3 4 ) : T h e e x i s t e n c e o f a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s o f d i v e r s e s p e c i f i c i t y i n a s i n g l e p r o t e i n . II I n t w o n a t u r a l p r o t e i n s : c r y s t a l l i n e d u c k a l b u m i n a n d c r y s t a l l i n e h e n e g g a l b u m i n . J . I m m . ' 2 7 : 4 6 9 - 4 7 8 . 158 H o r n , E . C . , a n d W a r d , C . L . , ( 1 9 5 7 ) : T h e l o c a l i s a t i o n o f b a s i c p r o t e i n s i n the n u c l e i o f l a r v a l D r o s o p h i l i a s a l i v a r y g l a n d s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S. 4 3 : 7 7 6 - 7 7 9 . H u a n g , R . C . a n d B o n n e r , J . , (19 6 6 ) : H i s t o n e - b o u n d R N A , a c o m p o n e n t o f n a t i v e n u c l e o h i s t o n e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 5 4 : 9 6 0 - 9 6 7 . J o h n s , E . W . , P h i l l i p s , D . M , P . , S i m s o n , P . , a n d B u t l e r , J . A V . , ( 1 9 6 1 ) : T h e e l e c t r o p h o r e s i s o f h i s t o n e s a n d h i s t o n e f r a c t i o n s o n s t a r c h g e l . B i o c h e m . J . 8 0 : 1 8 9 - 1 9 3 . J o h n s o n , C . M , , W e s t w o o d , J . C . N . , a n d B e a u l i e u , M . , ( 1 9 6 4 ) : A c o n t i n u o u s f l o w m i c r o d o u b l e d i f f u s i o n t e c h n i q u e w i t h c e l l u l o s e a c e t - a t e . ' N a t u r e 2 0 4 : 1 3 2 1 - 1 3 2 2 . J o h n s o n , L . D . , D r i e d g e r , A . , a n d M a r k o , A , M , , ( 1 9 6 4 ) : C h r o m a t o g r a p h i c b e h a v i o u s o f h i s t o n e s o n S e p h a d e x a n d c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e . C a n . J . B i o c h e m . 4 2 : 7 9 5 - 8 1 1 . K l e m p e r e r , P . , G u e f t , B . , L e e , S. L . , L e u c h t e n b u r g e r , C . , a n d P o l l i s t e r , A , W . , ( 1 9 5 0) : C y t o c h e m i c a l c h a n g e s o f a c u t e l u p u s e r y t h e m a t o s i s . A r c h P a t h . 4 9 : 5 0 3 - 5 1 6 . K r ' o o t h , S. R . , T o b i e , J . E . , T j i o , J . H . a n d G o o d m a n , H . C . , ( 1 9 6 1 ) : R e a c t i o n o f h u m a n s e r a w i t h m a m m a l i a n c h r o m o s o m e s s h o w n b y f l u o r e s c e n t a n t i b o d y t e c h n i q u e . S c i e n c e 134 : 2 8 4 - 2 8 5 . v K u n k e l , H . G . , ( I 9 6 0 ) : M u l t i p l e a u t o - a n t i b o d i e s to c e l l c o n s t i t u e n t s i n s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s i s I n " C e l l u l a r A s p e c t s o f I m m u n i t y " . , p . p . 4 2 9 - 4 3 6 . K u n k e l , H a l l m a n a n d D e i c h e r , E d s . , L i t t l e , B r o w n a n d C o . , B o s t o n , M a s s . L i t t a u , V . C . , B u r d i c k , C . J . , A l l f r e y , V . G . , a n d M i r s k y , A . E . , ( 1 9 6 5 ) : T h e r o l e o f h i s t o n e s i n the m a i n t e n a n c e o f c h r o m o s o m e s t r u c t u r e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S. 54_: 1 2 0 4 - 1 2 1 2 . M c A l l i s t e r , J . R . , W a n , Y . C . , a n d I r v i n , J . L . , ( 1 9 6 3 ) : E l e c t r o p h o r e s i s o f h i s t o n e s a n d h i s t o n e f r a c t i o n s o n p o l y a c r y l a m i d e g e l s . A n a l y t i c a l B i o c h e m 5_: 3 2 1 - 3 2 9 . 159 M e i s c h e r , F . , ( 1 8 9 7 ) : " D i e H i s t o c h e m i s c h e n u n d p h y s i o l o g i s c h e n A r b e i t e n " , V o g e l , L e i p z i g . M i e s c h e r , P . , C o o p e r , N . S. , a n d B e n a c e r r a f , B . , ( I 9 6 0 ) : E x p e r i m e n t a l p r o d u c t i o n o f a n t i n u c l e a r a n t i b o d i e s . J . I m m . 8 5 : 2 7 - 3 6 . M i r s k y , A, E , , a n d P o l l i s t e r , A.W., ( ( 1 9 4 6 ) : C h r o m o s o m i n , a d e s o x y r i b o s e n u c l e o p r o t e i n c o m p l e x o f t he c e l l n u c l e u s . J . G e n . P h y s . 30: 1 1 7 - 1 4 7 . M i r s k y , A. E . , a n d R i s , H . , ( 1 9 4 7 ) : T h e c h e m i c a l c o m p s i t i o n o f i s o l a t e d c h r o m o s o m e s . J . G e n . P h y s . 3 1 : 7 - 1 5 . M u r r a y , K . , ( 1 9 6 4 ) : H i s t o n e n o m e n c l a t u r e I n " T h e N u c l e o -h i s t o n e " , p . 15 , B o n n e r a n d T s ' o , E d s . , H o l d e n -D a y I n c . , S a n F r a n c i s c o , C a l i f o r n i a . N e e l i n , J . M . , a n d N e e l i n , E . M . , ( I 9 6 0 ) : Z o n e e l e c t r o p h o r e s i s o f c a l f t h y m u s h i s t o n e i n s t a r c h g e l . C a n . J . B i o c h e m . P h y s i o l . 3 8 : 3 5 5 - 3 6 3 . N e e l i n , J , M , a n d B u t l e r , G . C . , ( 1 9 6 1 ) : A c o m p a r i s o n o f h i s t o n e s f r o m c h i c k e n t i s s u e s b y z o n e e l e c t r o p h o r e s i s i n s t a r c h g e l . C a n . J . B i o c h e m . P h y s i o l . 39j 4 8 5 - 4 9 1 . O u c h t e r l o n y , O . , ( 1 9 4 8 ) : I n v i t r o m e t h o d f o r t e s t i n g t o x i n p r o d u c i n g c a p a c i t y o f d i p t h e r i a b a c t e r i a . A c t a . P a t h , e t M i c r o b i o l . S c a n d i n a v . 25_: 1 8 6 - 1 9 1 . O r n s t e i n , L . , ( 1 9 6 5 ) : D i s c e l e c t r o p h o r e s i s - I. B a c k g r o u n d a n d T h e o r y . A n n a l s o f N . Y . A c a d . S c i . 1 2 1 : 3 2 1 - 3 4 9 . P h i l l i p s , D . M . P . , a n d S i m p s o n , P . , ( 1 9 6 2 ) : I d e n t i f i c a t i o n o f s o m e p e p t i d e s f r o m a n a r g i n i n e - r i c h h i s t o n e a n d t h e i r b e a r i n g o n the s t r u c t u r e o f d e o x y r i b o n u -c l e o h i s t o n e . B i o c h e m . J . 8 2 : 2 3 6 - 2 4 1 . R i g g s , J . L . , S e w a l d , R . J . , B u r k h a l t e r , J . H . , D o w n s , C . H . , a n d M e t c a l f , T . G . , ( 1 9 5 8 ) : I s o t h i o c y a n a t e c o m p o u n d s a s f l u o r e s c e n t l a b e l l i n g a g e n t s f o r i m m u n e s e r u m . A m e r . J . P a t h . 34 : 1 0 8 1 - 1 0 9 7 . R u m k e , P . a n d S l y s e r , M . , (19 6 6 ) : A n t i g e n i c i t y o f h i s t o n e . B i o c h e m . J . 1 0 1 : 1 c . 160 S h a r m a , A . K . , a n d S h a r m a , A . , ( 1 9 6 5 ) : " C h r o m o s o m e T e c h n i q u e s , T h e o r y a n d P r a c t i c e " . , B u t t e r w o r t h a n d C o . , ( C a n a d a ) L t d . , T o r o n t o . S h e p h e r d , G . R . , a n d G u r l e y , L . R . , ( 1 9 6 6 ) : H i g h r e s o l u t i o n d i s c e l e c t r o p h o r e s i s < ; o f h i s t o n e s : A n i m p r o v e d m e t h o d . A n a l y t i c a l B i o c h e m . 14: 35 6 - 3 6 3 . S h e r i d a n , W . F . , a n d S t e r n , H . , ( 1 9 6 7 ) : H i s t o n e o f m e i o s i s . E x p . C e l l R e s . 4 5 : 32 3 - 3 3 5 . S l u y s e r , M . , T h u n g , P . T . , a n d E m m e l o t , P . , ( 1 9 6 5 ) : I n h i b i t i o n o f D N A s y n t h e s i s i n r e g e n e r a t i n g r a t l i v e r b y the a d m i n i s t r a t i o n o f h i s t o n e s i n v i v o . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a 1 0 8 : 2 4 9 - 2 6 5 . ~ S m i t h i e s , O . , ( 1 9 5 5 ) : Z o n e e l e c t r o p h o r e s i s i n s t a r c h g e l s : g r o u p v a r i a t i o n s i n the s e r u m p r o t e i n s o f n o r m a l h u m a n a d u l t s . B i o c h e m . J . 6 1 : 6 2 9 - 6 4 1 . S o m e r s , C . A , C o l e , A . , a n d H s u , T . C . , (19 63 ) : I s o l a t i o n o f c h r o m o s o m e s . E x p t l . C e l l R e s . S u p p l . 9 : 2 2 0 - 2 3 4 . S p i c e r , S. S. , ( 1 9 6 2 ) : B a s i c p r o t e i n v i s u a l i s e d h i s t o c h e m i c a l l y i n m u c i n o u s s e c r e t i o n s . E x p . C e l l R e s . 2 8 : 4 8 0 . S t e d m a n , E . , a n d S t e d m a n , E . , ( 1 9 5 0 ) : C e l l s p e c i f i c i t y o f h i s t o n e s . N a t u r e 1 6 6 : 7 8 0 - 7 8 1 . S t e e l e , J . S. , a n d B u s c h , H . , ( 1 9 6 3 ) : S t u d i e s o n a c i d i c n u c l e a r p r o t e i n s o f t he W a l k e r t u m o r a n d l i v e r . C a n c e r R e s . 2 3 : 1 1 5 3 - 1 1 6 3 . S w i f t , H . , ( 1 9 6 4 ) : I n " T h e N u c l e o h i s t o n e s " , p . p . 1 6 9 - 1 9 2 , J . B o n n e r a n d P . T s ' o , E d s . , H o l d e n - D a y I n c . , S a n F r a n c i s c o , L o n d o n , A m s t e r d a m . V e n d r e l y , R . , K n o b l o c h - M a z e n , A . , a n d V e n d r e l y , C . , ( 1 9 6 0 ) : D o n n e e s b i o c h e m i q u e s r e c e n t e s s u r l a r e l a t i o n e n t r e a c i d d e s o x y r i b o n u c l e i q u e et p r o t e i n e s b a s i q u e s d a n s l e n o y e a u . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 4_: 1 9 - 2 7 . V o n B e r t a l a n f f y , E . , ( 1 9 6 1 ) : A c r i d i n e o r a n g e f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e p r o c e d u r e f o r the d i a g n o s i s o f m a l i g n a n t c e l l s b y e x f o l i a t i v e c y t o l o g y . D e p t . o f A n a t o m y , M e d i c a l C o l l e g e , U n i v e r s i t y o f M a n i t o b a . 161 W e i g l e , W . O . , (19 6 1 ) : I m m u n o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f the c r o s s - r e a c t i o n s b e t w e e n a n t i - B S A a n d h e t e r o l o g o u s a l b u m i n s . J . I m m . 8 7 : 5 9 9 - 6 0 7 . W e i g l e , W . O . . , ( 1 9 6 5 ) : T h e i n d u c t i o n o f a u t o i m m u n i t y i n r a b b i t s f o l l o w i n g i n j e c t i o n o f h e t e r o l o g o u s o r a l t e r e d h o m o l o g o u s t h y r o g l o b u l i n . J . E x p . M e d . 1 2 0 : 2 8 9 - 3 0 8 . W i l s o n , R . H , , J u r e v i c s , V . , D e l a n e y , R . , R i t t e r , T . , R e n c z , K . , a n d S c h r a m , A . , ( 1 9 6 6 ) : C o m p a r a t i v e i m m u n o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f n u c l e o p r o t e i n s : a n t i g e n i c c h a r a c t e r i s t i c s o f d e o x r i b o n u c l e i c a c i d p r o t e i n f r o m a c a n i n e h a e m a n g i o p e r i c y t o m a . N a t u r e 2 0 9 : 1 1 0 2 - 1 1 0 5 . Z u b a y , G . , ( 1 9 6 4 ) : N u c l e o h i s t o n e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n I n " T h e N u c l e o h i s t o n e s " , p . p . 9 5 - 1 0 6 . , B o n n e r a n d T s ' o , E d s . , H o l d e n - D a y I n c . , S a n F r a n c i s c o , C a l i f o r n i a . Z u b a y , G . , a n d D o t y , P . , ( 1 9 5 9 ) : I s o l a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f d e o x y r i b o n u c l e o p r o t e i n p a r t i c l e s c o n t a i n i n g s i n g l e n u c l e i c a c i d m o l e c u l e s . J . M o l . B i o l . 1: 1 - 2 0 . 162 A P P E N D I X I . C H R O M O S O M A L P R E P A R A T I O N M i c r o c u l t u r e s o f b o v i n e a n d h u m a n b l o o d , f o r c h r o -m o s o m e s t u d i e s , w e r e p r e p a r e d u s i n g t h e f o l l o w i n g p r o c e d u r e , r e p r o d u c e d h e r e f r o m T h e G i b c o P r i c e a n d R e f e r e n c e M a n u a l , G r a n d I s l a n d B i o l o g i c a l C o m p a n y , O a k l a n d , C a l i f o r n i a ( 1 9 6 7 ) p . 7 7 . C h r o m o s o m e M e d i u m 1 A P r o c e d u r e - M i c r o - c u l t u r e f o r C h r o m o s o m e S t u d i e s : 1. F r o m f r e e - f l o w i n g p u n c t u r e o f c l e a n s e d a n d d r y s k i n (70% e t h y l a l c o h o l , t h e n a c e t o n e o r e t h e r a n d l e t d r y ) a s p i r a t e 0 . 1 -0 . 2 m l o f b l o o d w i t h s t e r i l e d i s p o s a b l e t u b e r c u l i n s y r i n g e a n d n e e d l e , p l a c e 2 s m a l l d r o p s o f b l o o d i n t o c u l t u r e t u b e o f G I B C O C h r o m o s o m e M e d i u m 1 A , a n d m i x w e l l . 2 . K e e p a t 3 7 ° C f o r t h r e e d a y s . 3 . A t 6 6 - 7 0 h o u r s , a d d 0 . 1 c c o f V e l b a n , E l i L i l l y ( v i n c a l e u c o b l a s t i n e ) m a d e u p a s a s t o c k s o l u t i o n o f 0 . 5 u g / c c a n d k e e p a t 3 7 ° C f o r 2 h o u r s . I f p r e f e r r e d , C o l c e m i d S o l u t i o n , C a t . N o . 5 2 1 , c a n b e s u b s t i t u t e d . U s e 0 . 2 5 m l / 5 m l m e d i u m . 4 . T o h a r v e s t s p i n c u l t u r e s a t 8 0 0 R P M f o r 5 m i n u t e s . 163 5 . D i s c a r d s u p e r n a t e , a n d s u s p e n d s l o w l y d r o p b y d r o p i n a p p r o x i m a t e l y 5 c c o f 1:5 F e t a l C a l f S e r u m i n d i s t i l l e d w a t e r . 6 . P l a c e s u s p e n s i o n a t 3 7 ° f o r 15 m i n u t e s . 7 . A d d 1 d r o p o f f r e s h l y p r e p a r e d f i x a t i v e (3:1 a b s o l u t e a l c o h o l : g l a c i a l a c e t i c a c i d ) , a n d s p i n a t 4 0 0 R P M f o r 2 m i n u t e s . ( A b s o l u t e a l c o h o l = m e t h a n o l o r e t h a n o l . ) 8 . D i s c a r d s u p e r n a t e a n d l e a v e o n e l a r g e d r o p o v e r t h e c e l l s . M i x t h e d r o p a n d c e l l s a n d t h e n s l o w l y a d d 1. 5 c c f i x a t i v e d r o p b y d r o p w i t h c o n s t a n t m i l d a g i t a t i o n . 9 . P l a c e t u b e s a t 4 ° C i n r e f r i g e r a t o r f o r 2 0 m i n u t e s . ( T u b e s s h o u l d b e s t o p p e r e d w h e n i n r e f r i g e r a t o r . ) 1 0 . S p i n a t 4 0 0 R P M f o r 5 m i n u t e s . 1 1 . D i s c a r d s u p e r n a t e a n d s a v e a l a r g e d r o p o v e r c e l l s : D O N O T M I X . 1 2 . L a y e r 0 . 5 c c o f f i x a t i v e ( 0 . 5 c c = 1 /2 P a s t e u r p i p e t t e ) o v e r c e l l s , b e i n g c a r e f u l n o t t o d i s r u p t c e l l s . D O N O T M I X . W a i t 2 m i n u t e s a n d r e p e a t 1 - 2 t i m e s . R e m o v e e x c e s s f i x a t i v e , m i x , a n d t h e n a d d d r o p b y d r o p t o o b t a i n p r o p e r c o n c e n t r a t i o n o f c e l l s . (If c e l l b u t t o n i s d i s r u p t e d , a d d f i x a t i v e t o 1. 5 c c , r e c e n t r i f u g e , a n d w a s h a s a b o v e o n e t i m e o r p u t d i r e c t l y o n c o v e r s l i p . ) 164 13. Prepare c lean cover s l i p s , and place t i n y drops of suspension on i t . Spread evenly by blowing. 14. When dry , s t a i n as below. 15. S ta in ing Procedure for Phas Microscopy: When dry , i n v e r t in to a drop of 0.5C a c e t i c orce in JJ.0.5 gm o r c e i n i n 45 ml g l a c i a l a c e t i c a c i d , r e f l u x 1/2 hour, add 55 ml d i s t i l l e d water whi le warm, r e f l u x 1/2 hour, l e t stand 24 hours , f i l t e r (and f i l t e r fresh before us ing)_ / on a clean s l i d e , suck out excess s t a i n xri.th f i l t e r paper and seal with Kroenig ' s cement. I f permanent s l i d e s are d e s i r e d , t r ea t dry cover s l i p preparat ion i n fo l lowing sequence: 0.5% a c e t i c orce in (30 minutes) , 45% ace t i c ac id (dip u n t i l free of excess s t a i n ) , t e r t i a r y b u t y l a l coho l (15 seconds), 1:1 t e r t i a r y b u t y l a l c o h o l , xylene (1 minute) , x y l i n e (1 minute) , xylene (1 minute) , and i n v e r t wet into Permount (thinned with xylene) on c lean s l i d e . ( I f b r i g h t f i e l d microscopy i s to be used, use 1% a c e t i c o r c e i n , made as above, but with 1.0 gm o r c e i n . For permanent s t a i n s , 2% a c t i c o r c e i n i s recommended.) This method was used in the Cytogenetics Laboratory , D i v i s i o n of Medical Genet ics , Department of P a e d i a t r i c s , Vancouver General H o s p i t a l , Vancouver, B . C . , inhere consis tent r e s u l t s were achieved using Gibco Chromosome Medium 1A #167, 165 C o l c e m i d S o l u t i o n # 5 2 1 , A c e t o O r c e i n S t a i n 2 . 0% # 5 3 9 . U n f i x e d c h r o m o s o m a l p r e p a r a t i o n s w e r e a l s o p r e p a r e d f r o m h u m a n b l o o d b y t e r m i n a t i n g t h e c u l t u r e p r o c e d u r e at s t e p 6 a n d m a k i n g s m e a r s o f t h e c u l t u r e d c e l l s . A f t e r a i r d r y i n g a b r i e f p a s s a g e t h r o u g h 1. 0% a c e t i c a c i d r e m o v e d r e d c e l l s f r o m t h e s l i d e s . T h e y w e r e t h e n b u f f e r e d a t p H 7 . 0 f o r 10 m i n u t e s a n d c o n j u g a t e d w i t h f l u o r e s c e n t a n t i b o d y a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n V I I , 4 . W h e n f i x e d p r e p a r a t i o n s w e r e t e s t e d f o r f l u o r e s c e n c e t h e s l i d e s w e r e b r o u g h t t o w a t e r a n d l e f t i n t h e b u f f e r s o l u t i o n f o r 1 h o u r b e f o r e a n t i b o d y a p p l i c a t i o n . I I . B U C C A L S M E A R S H u m a n e p i t h e l i a l c e l l s w e r e p r e p a r e d b y t h e f o l l o w i n g m e t h o d , r o u t i n e l y u s e d f o r s e x c h r o m a t i n d e t e r m i n a t i o n : 1. S c r a p e t h e i n s i d e o f t h e c h e e k w i t h t h e e d g e o f a s t a i n l e s s s t e e l s p a t u l a . 2 . S m e a r t h e m u c o s a l c e l l s o n a c l e a n s l i d e . 3 . I m m e r s e i n 9 5 % E t h y l a l c o h o l f o r a t l e a s t 30 m i n u t e s ( m a y b e l e f t f o r a d a y o r t w o ) . A . T e m p o r a r y S l i d e s 4 . R e m o v e f r o m a l c o h o l a n d a l l o w e x c e s s a l c o h o l t o d r y . 166 5 . P u t a g e n e r o u s d r o p o f s t a i n ( a c e t o - o r c e i n ) d i r e c t l y o n t h e s l i d e a n d c o v e r w i t h a c o v e r s l i p . 6 . A f t e r a l l o w i n g t h e s t a i n t o p e n e t r a t e f o r a m i n u t e o r t w o , p u t t h e s l i d e b e t w e e n s e v e r a l l a y e r s o f p a p e r t o w e l s a n d p r e s s h a r d . 7 . S e a l t h e c o v e r s l i p w i t h m e l t e d p a r a f f i n o r v a s e l i n e . B . . P e r m a n e n t S l i d e s 4 . T r a n s f e r t o 7 0 % a l c o h o l f o r 2 m i n u t e s . 5 . T r a n s f e r t o t a p w a t e r f o r 2 m i n u t e s . 6 . S t a i n w i t h e a r b o l - f u c h s i n f o r 90 s e c o n d s . 7 . R i n s e o f f e x c e s s s t a i n i n a b s o l u t e a l c o h o l (5 o r 6 q u i c k d i p s ) . 8 . D i f f e r e n t i a t e i n a b s o l u t e a l c o h o l f o r o n e m i n u t e . 9 . C l e a r i n t w o c h a n g e s o f x y l o l , 2 m i n u t e s e a c h . 1 0 . M o u n t i n n e u t r a l b a l s a m o r D P X m o u n t a n t . S t a i n s 1. C a r b o l f u c h s i n ( d y e s o u r c e : B a s i c f u c h s i n f r o m G . T . G u r r , L o n d o n ) . 167 Stock S o l u t i o n a. 3% b a s i c fuchs in i n 70% ETOH. b . 5% c a r b o l i c ac id i n water. S t a i n i n g S o l u t i o n (keeps for 4 - 5 months) -45 ml of s o l u t i o n of a. and b. (5% a. and 95% b . ) . - 6 ml of g l a c i a l a c e t i c a c i d . -6 ml of formaldehyde (37%). - Allow to stand for one day before use. - Store i n a dark conta iner . 2. A c e t o - o r c e i n : 2% orce in i n 60% ace t i c ac id (dye source: Natura l orce in from G . T . Gurr , London). Heat 60 ml of g l a c i a l ace t i c ac id to b o i l i n g p o i n t . Add 2 gm o r c e i n . Warm and shake gently for 2 minutes and allow to c o o l . D i l u t e to 100 c c . with d i s t i l l e d water and f i l t e r . The s t a i n w i l l p r e c i p i t a t e and requ ire frequent r e f i l t e r i n g . I I I . ACRIDINE ORANGE STAINING Preparat ion of the A c r i d i n e Orange (AO) s o l u t i o n s : 1. A stock s o l u t i o n of 0.1% AO i s prepared i n d i s t i l l e d 168 w a t e r . T h i s k e e p s i n d e f i n i t e l y , e s p e c i a l l y i f s t o r e d i n t h e r e f r i g -e r a t o r . 2 . F o r s t a i n i n g a p o r t i o n o f a b o v e s o l u t i o n i s d i l u t e d w i t h 1 / 1 5 M p h o s p h a t e b u f f e r t o o b t a i n a 0 . 0 1 % s t a i n i n g s o l u t i o n o f A O . A l s o t h i s s o l u t i o n k e e p s f o r a l o n g t i m e . P h o s p h a t e b u f f e r : T h i s i s a c o m b i n a t i o n o f 1 / 1 5 M d i s o d i u m a c i d p h o s p h a t e a n d 1 / 1 5 M p o t a s s i u m d i h y d r o p h o s p h a t e m a d e u p i n d i s t i l l e d w a t e r , a n d m i x e d i n p r o p o r t i o n s t o p H 6 . T h e s o l u t i o n s a r e p r e p a r e d a s f o l l o w s : 1. 9 . 4 6 5 g m N a 2 H P 0 4 a r e d i s s o l v e d i n 1, 0 0 0 m l d i s t i l l e d w a t e r . 2 . 9. 072 g m K H 2 P 0 4 a r e d i s s o l v e d i n 1, 0 0 0 m l d i s t i l l e d w a t e r . T o o b t a i n 1 / 1 5 M p o t a s s i u m - s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r a t p H 6 , 4 0 m l N a ^ P O ^ s o l u t i o n a r e m i x e d w i t h 2 3 0 m l K H 2 P O 4 . S o l u t i o n s k e e p i n d e f i n i t e l y e v e n at r o o m t e m p e r a t u r e . C a l c i u m c h l o r i d e s o l u t i o n : T h i s i s n e c e s s a r y t o p r o d u c e d i f f e r e n t i a t i o n b e t w e e n R N A a n d D N A f l u o r e s c e n c e . I t i s a n a q u e o u s 0 . 10 M c a l c i u m c h l o r i d e s o l u t i o n p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g 1 1 . 099 g m o f C a C l 2 i n 1, 0 0 0 m l d i s t i l l e d w a t e r . T h e s o l u t i o n k e e p s i n d e f i n i t e l y . 169 T h e s t e p s i n t h e p r o c e s s i n g o f s m e a r s f o r f l u o r e s c e n c e c y t o -d i a g n o s i s : T h e s m e a r s a r e r a p i d l y p a s s e d t h r o u g h o n e c h a n g e e a c h o f 1. 8 0 % a l c o h o l 2 . 7 0 % a l c o h o l 3 . 5 0 % a l c o h o l 4 . d i s t i l l e d w a t e r 5 . 1% a c e t i c a c i d (to p r e v e n t f a d i n g o f f l u o r e s c e n c e ) 6 . d i s t i l l e d w a t e r T h e s e s t e p s r e q u i r e i n a l l a b o u t a m i n u t e : i t i s u n n e c e s s a r y t o c o u n t " d i p s " . 7 . T h e s m e a r s a r e s t a i n e d i n t h e A c r i d i n e O r a n g e s o l u t i o n f o r 3 m i n u t e s . 8 . T h e y a r e p a s s e d i n t o p h o s p h a t e b u f f e r f o r a t l e a s t 1 m i n u t e t o r e m o v e e x c e s s d y e . I n t h e b u f f e r , s m e a r s m a y r e m a i n f o r s e v e r a l h o u r s i f p r o c e s s e d i n b a t c h e s a n d s c r e e n e d s u c c e s s i v e l y , o r i f r e - e x a m i n a t i o n o f s m e a r s o n t h e s a m e d a y i s d e s i r e d . ) 170 9 . T h e s m e a r s a r e d i f f e r e n t i a t e d f o r 1 t o 2 m i n u t e s i n t h e c a l c i u m c h l o r i d e s o l u t i o n , u n t i l m o s t t y p e s o f n u c l e i ( a n d e s p e c i a l l y t h o s e o f g r a n u l o c y t e s ) a p p e a r i n a c l e a r , t r a n s l u c e n t g r e e n c o l o u r . T h e t i m e f o r d i f f e r e n t i a t i o n d e p e n d s p r i m a r i l y o n t h e p r e p a r a t i o n o f A O , a n d a f t e r a f e w t r i a l s c a n b e e a s i l y s t a n d a r d i s e d . 1 0 . W i t h t h e a i d o f a p o l y e t h y l e n e d i s p e n s i n g b o t t l e t h e s m e a r s a r e r i n s e d w i t h p h o s p h a t e b u f f e r , s t i l l w e t a r e m o u n t e d w i t h a c o v e r g l a s s a n d a r e n o w , 6 t o 7 m i n u t e s a f t e r b e i n g r e m o v e d f r o m t h e f i x a t i v e , r e a d y f o r s c r e e n i n g w i t h t h e f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e . It w a s f o u n d t h a t t h e s t a i n i n g t i m e s i n 0 . 0 1 % A O s o l u t i o n h a d t o b e a d j u s t e d f o r e a c h t i s s u e e x a m i n e d . A c o n s t a n t p r o b l e m w a s o v e r s t a i n i n g w h i c h c a u s e d t h e r e d f l u o r e s c e n c e , a s s o c i a t e d w i t h R N A , t o a p p e a r t h r o u g h o u t . T h e t e c h n i q u e p r o v i d e d a s o u r c e o f b r i g h t l y f l u o r e s c i n g m a t e r i a l w i t h w h i c h t o a d j u s t t h e f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e a s w e l l a s p r o v i d i n g a n i n d i r e c t m e t h o d o f c o m p a r i n g i m m u n o l o g i c a l f l u o -r e s c e n c e w i t h t h e l o c a l i s a t i o n o f D N A a n d R N A i n c e l l s a n d c h r o m o s o m e s . 

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