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Immunology of lungworm (Protostrongylus) infections of the Rocky Mountain bighorn sheep Hudson, Robert John 1970

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IMMUNOLOGY OF LUNGWORM (PROTOSTRONGYLUS) INFECTIONS OF THE ROCKY MOUNTAIN BIGHORN SHEEP by ROBERT JOHN HUDSON B.S.A., U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1967 A T H E S I S SUBMITTED IN PAR T I A L FULFILMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY i n t h e D e p a r t m e n t o f ANIMAL S C I E N C E We a c c e p t t h i s t h e s i s as c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE U NIVERSITY OF B R I T I S H COLUMBIA D e c e m b e r , 19 70 In present ing th is thes is in p a r t i a l f u l f i l m e n t o f the requirements fo r an advanced degree at the Un ive rs i t y of B r i t i s h Columbia, I agree that the L i b r a r y s h a l l make it f r e e l y a v a i l a b l e for reference and study. I fu r ther agree that permission for extensive copying o f th is thes is fo r s c h o l a r l y purposes may be granted by the Head of my Department or by h is representa t ives . It is understood that copying or p u b l i c a t i o n o f t h i s thes is fo r f i n a n c i a l gain sha l l not be allowed without my wr i t ten permiss ion . Department of Animal Science The Un ive rs i t y of B r i t i s h Columbia Vancouver 8, Canada Date December 30, 1970 11 "1 .Chairman: P r o f . W. D. K i t t s ABSTRACT Protostrongylus s t i l e s i , t h e p a r e n c h y m a l l u n g w o r m , has be e n a t t r i b u t e d an i m p o r t a n t r o l e i n t h e w i d e s p r e a d r e s p i r a -t o r y d i s e a s e s o f t h e R o c k y M o u n t a i n b i g h o r n s h e e p (Ovis cana-densis canadensis). T h i s s t u d y was c o n d u c t e d t o d e l i n e a t e some o f t h e i m m u n o l o g i c and n o n - s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s be-tween p a r a s i t e and h o s t . A p r o c e d u r e was d e v e l o p e d f o r - t h e i m m u n o c h e m i c a l q u a n -t i t a t i o n o f t h e o v i n e i m m u n o g l o b u l i n s IgG-j, • I g G 2 and IgM and f o r t h e s e m i - q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f I g A . T h i s t e c h n i q u e o b v i a t e d , t h e p r e p a r a t i o n o f h i g h l y s p e c i f i c a n t i s e r a r e q u i r e d f o r s i n g l e r a d i a l i m m u n o d i f f u s i o n . The l u n g w o r m d i d n o t a p p e a r t o be a s i g n i f i c a n t p a r t o f t h e t o t a l a n t i g e n i c e n v i r o n m e n t o f i n f e c t e d a n i m a l s s i n c e no r e l a t i o n s h i p b e t w e e n i m m u n o g l o b u l i n l e v e l s a nd p a r a s i t e a c t i v i t y was d e t e c t e d . G e n e t i c i n f l u e n c e s w e r e s u g g e s t e d i n t h e l e v e l s o f I g G 2 w h i c h r e m a i n e d a t a r e l a -t i v e l y c o n s t a n t l e v e l c f i a r a c t e r f s t i c o f i n d i v i d u a l a n i m a l s . The s e r o m u c o l d s w e r e e v a l u a t e d as c o r r e l a t e s o f t h e i n f l a m m a t o r y r e a c t i o n t o p a r a s i t i s m . T h e s e p r o t e i n s w e r e u s e f u l i n d e t e c t i n g c h a n g e s i n p a r a s i t e a c t i v i t y and b a c t e r i a l i n f e c t i o n . . G a s t r o i n t e s t i n a l d i s o r d e r s a s s o c i a t e d w i t h s e v e r e s c o u r i n g were a c c o m p a n i e d by t h e d i s a p p e a r a n c e o f c i r c u l a t i n g o r o s o m u c o i d Ca-1 a c i d g l y c o p r o t e i n ] . The l o s s o f t h i s low m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n a p p e a r e d t o be r e l a t e d t o v a s c u l a r l e a k a g e . Lungworm i n f e c t i o n s i n d u c e d t h e a p p e a r a n c e o f homo-c y t o t r o p i c a n t i b o d i e s w h i c h c o u l d be d e t e c t e d in v i t r o by t h e i r a b i l i t y t o s e n s i t i z e p e r i p h e r a l p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u c o c y t e s f o r a d h e r e n c e t o t h e l a r v a l c u t i c l e . The e l u t i o n o f t h i s a n t i b o d y f r o m s e n s i t i z e d c e l l s and t h e i n h i b i t i o n o f t h e a d h e r e n c e r e a c t i o n w i t h s p e c i f i c a n t i s e r u m s u g g e s t e d t h a t t h e r e a c t i o n was m e d i a t e d a t l e a s t p a r t l y by IgG-j. The a d h e r e n c e r e a c t i o n was u s e d t o a s s a y h o m o c y t o -t r o p i c a c t i v i t y o f se r u m f r o m i n f e c t e d a n i m a l s ( w a s h e d - c e l l t e s t ) . T h i s t e s t was c o r r e l a t e d w i t h t h e a b i l i t y o f s e r a t o s e n s i t i z e s k i n f o r a n a p h y l a x i s . The e f f e c t i v e h y p e r s e n -s i t i v e r e s p o n s e , a c c o u n t i n g f o r b o t h s e n s i t i z i n g and b l o c k i n g a c t i v i t y , was d e t e r m i n e d by e x p o s i n g n o r m a l c e l l s t o l a r v a e i n a medium c o n t a i n i n g s e r u m ( d e c o m p l e m e n t e d - s e r u m t e s t ) . The r e s u l t s o f t h i s t e s t p a r a l l e l e d i n f l a m m a t o r y c h a n g e s i n p a r a s i t i z e d a n i m a l s , m o n i t o r e d by t h e l e v e l s o f s e r u m o r o s o -mucoid... U s i n g t h i s m e t h o d , l e v e l s o f h . o m o c y t o t r o p t c and b l o c k s i n g a n t i b o d i e s were m e a s u r e d t h r o u g h o u t t h e a n n u a l p a r a s i t e c y c l e . P r e l i m i n a r y o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e d t h a t Immunogenic i n f l a m m a t i o n , a s s o c i a t e d w i t h t h e " s p r i n g r i s e " a nd " s e l f c u r e , " r e s u l t e d f r o m a s h i f t i n a d y n a m i c b a l a n c e b e t w e e n c o m p e t i n g a n t i b o d i e s r a t h e r t h a n a p r o p o r t i o n a t e i n c r e a s e i n f i o m o c y t o t r o p i c a c t i v i t y . The r e s p o n s e o f p e r i p h e r a l l y m p h o c y t e s t o t h e p r e s e n c e o f l a r v a e o r l a r v a l e x t r a c t s was c u r s o r i l y e x a m i n e d . A l -t h o u g h o v i n e l y m p h o c y t e s d i d n o t r e s p o n d w e l l e n o u g h i n c u l t u r e t o draw d e f i n i t i v e c o n c l u s i o n s , t h e p r e s e n c e o f l a r v a l e x t r a c t s a p p e a r e d t o h a v e a d e t r i m e n t a l e f f e c t on c e l l s u r v i v a l and t r a n s f o r m a t i o n . E v e n i n t h e p r e s e n c e o f EDTA, m i n u t e amounts o f a n t i -b o d y s e n s i t i z e d l y m p h o c y t e s f o r a d h e r e n c e t o t h e l a r v a l c u t i c l e . S e r a f r o m a w i d e v a r i e t y o f s o u r c e s h a d an i n h i b -i t o r y e f f e c t on t h i s r e a c t i o n . T r e a t m e n t o f l a r v a e w i t h n e u r a m i n i d a s e and h i g h c o n -c e n t r a t i o n s o f N a C l e n g e n d e r e d i m p r o v e d a d h e r e n c e . T h i s s u g g e s t e d t h a t Protostrongylus h a d a d o p t e d m e c h a n i s m s s i m i l a r t o t h e t r o p h o b l a s t o r t h e n e o p l a s t i c c e l l w h i c h a l l e g e d l y e v a d e i m m u n o l o g i c r e c o g n i t i o n w i t h a s t r o n g l y a n i o n i c c o a t . T h e s e a s p e c t s a r e d i s c u s s e d i n t e r m s o f t h e p o s s i b l e r o l e o f Protostrongylus i n r e s p i r a t o r y d i s e a s e s o f t h e b i g -h o r n s h e e p , and t h e e x p l o i t a t i o n o f m o l e c u l a r m e c h a n i s m s i n t h e c o n t r o l o f p a r a s i t i c d i s e a s e s . v i TABLE OF CONTENTS Page T i t i e Page i A'bs t r a c t ' i i i T a b l e o f C o n t e n t s . . ... . v i L i s t o f T a b l e s x i i i L i s t o f F i g u r e s x i v A c k n o w l e d g e m e n t s . . . . x v i i A b b r e v i a t i o n s x i x INTRODUCTION 1 H i s t o r y o f t h e R o c k y M o u n t a i n b i g h o r n s h e e p . . 1 D i s e a s e o u t b r e a k s i n B r i t i s h C o l u m b i a . . . . 3 P r o t o s t r o n g y 1 i n e l ungworms o f t h e b i g h o r n s h e e p . 4 I m m u n o l o g i c r e s p o n s e t o p a r a s i t i s m 6 P r i n c i p l e s o f i m m u n i t y 6 T y p e I . I m m e d i a t e - t y p e h y p e r s e n s i t i v i t y . 7 T y p e 11. D e l a y e d - t y p e h y p e r s e n s i t i v i t y . . 8 M e c h a n i s m o f i m m u n i t y t o p a r a s i t e s . . . . 10 G l y c o p r o t e i n r e s p o n s e s t o t i s s u e i n j u r y . . . . 12 Ob j e c t i v e s 13 GENERAL MATERIALS AND METHODS . . . 14 A n i m a l s . . . . . . 14 EXPERIMENTS 17 S e a s o n a l C y c l e o f p a r a s i t e a c t i v i t y 17 I n t r o d u c t i on 17 E x p e r i m e n t a l 17 R e s u l t s and d i s c u s s i o n 18 v i i Page L o c a l r e s p o n s e s ... . . . . . 2 0 I n t r o d u c t i o n . . . . 2 0 E x p e r i m e n t a l 20 R e s u l t s and d i s c u s s i o n 21 C u t a n e o u s h y p e r s e n s i t i v i t y 21 L u n g l e s i o n s . . . . . 2 2 I m m u n o g l o b u l i n s . . . . . 2 6 I m m u n o g l o b u l i n q u a n t i t a t i o n . . . . . . . . 26 * I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . . 26 E x p e r i m e n t a l . . 27 P r e p a r a t i o n o f a n t i s e r a 27 P u r i f i c a t i o n o f i m m u n o g l o b u l i n c l a s s s t a n d a r d s . . . . 28 I m m u n o e l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s 30 I m m u n o g l o b u l i n . q u a n t i t a t i o n 30 R e s u l t s and d i s c u s s i o n 31 . P u r i f i c a t i o n o f i m m u n o g l o b u l i n s t a n d a r d s 31 Q u a n t i t a t i v e i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s . . . 37 R e l a t i o n s h i p o f t h e i m m u n o g l o b u l i n s o f d o m e s t i c and R o c k y Mtn. b i g h o r n s h e e p . . 4 3 I m m u n o g l o b u l i n r e s p o n s e 44 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . . . . 44 E x p e r i m e n t a l 44 R e s u l t s and d i s c u s s t o n E n v i r o n m e n t a l e f f e c t s . . . . ... G e n e t i c e f f e c t s M o n i t o r i n g i n f l a m m a t i o n E l e c t r o p h o r e s i s o f t h e s e r o m u c o i d s I n t r o d u c t i o n . . . . E x p e r i m e n t a l I d e n t i f i c a t i o n o f o r o s o m u c o i d E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o f t h e s e r o m u c o i ds . R e s u l t s and d i s c u s s i o n I m m e d i a t e - t y p e h y p e r s e n s i t i v i t y In v i t r o d e t e c t i o n o f h o m o c y t o t r o p i c and b l o c k i n g . a n t i b o d y . . . I n t r o d u c t i o n . . . E x p e r i m e n t a l . P r e p a r a t i o n o f l a r v a l s u s p e n s i o n s . P r e p a r a t i o n o f l e u c o c y t e s u s p e n s i o n s . H i s t a m i n e - r e l e a s e e x p e r i m e n t s . P a s s i v e t r a n s f e r o f c u t a n e o u s h y p e r s e n s i t i v i t y t P - K r e a c t i o n ) . In v i t r o s e n s i t i z a t i o n . . . . . W a s h e d - c e l l t e s t i x Page D e c o m p l e m e n t e d - s e r u m t e s t . . • . . . . . 6 4 E l u t i o n o f h o m o c y t o t r o p i c. a n t i b o d y f r o m s e n s i t i z e d leucocytes . , 64 R e s u l t s and d i s c u s s i o n . . . . . . . . 05 • H i s t a m i n e - r e l e a s e 65 C e l l a d h e r e n c e a s s a y . 65 C h a r a c t e r i z a t i o n o f o v i n e , h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d y 70 E f f e c t o f a n t i s e r a 70 P h y s i c o - c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s . . . 73 H e a t s e n s i t i v i t y 78 S k i n p e r s i s t e n c e 78 P h y s i c a l f a c t o r s i n c e l l s e n s i t i z a t i o n . . . . 80 I n t r o d u c t i on 80 E x p e r i m e n t a l 81 R e s u l t s and d i s c u s s i o n 82 E f f e c t o f a n i o n i c compounds and p o l a r m o l e c u l e s on d e s e n s i t i z a t i o n . . . 82 F o r m u l a t i o n o f t h e " e l e c t r o s t a t i c " h y p o t h e s i s . 84 -H y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e t o p a r a s i t e a c t i v i t y . . 90 I n t r o d u c t i o n . . . . 90 E x p e r i m e n t a l . . . . . . . . . . . . 90 X Page G e n e r a l p r o c e d u r e . . . . . . . 'JO S t a t i s t i c a l t r e a t m e n t . . , . . . . . :Jl R e s u l t s and d i s c u s s i o n <)2 Dy n a m i c s o f c e l l a d h e r e n c e r e a c t i o n s oZ M o d e l o f i m m u n o g e n i c i n f l a m m a t i o n . . . . 100 L y m p h o c y t e r e s p o n s e 101 O v i n e l y m p h o c y t e s i n s h o r t - t e r m c u l t u r e . . . . 102 I n t r o d u c t i o n 102 E x p e r i m e n t a l . . . 103 L y m p h o c y t e c u l t u r e 103 E v a l u a t i o n o f l y m p h o c y t e a c t i v a t i o n . . . 104 M o r p h o l o g i c a l a n a l y s i s 104 C h e m i c a l a n a l y s i s 104 D i s c e l e c t r o p h o r e s i s o f c e l l u l a r p r o t e i n s . . . . . . . 105 R e s u l t s and d i s c u s s i o n 105 M o r p h o l o g i c a l a n a l y s i s o f a c t i v a t i o n . . . 105 C h e m i c a l a n a l y s i s o f a c t i v a t i o n . . . . 106 .Ly m p h o c y t e a d h e r e n c e . . . 106 I n t r o d u c t i o n 106 E x p e r i m e n t a l . . . . . . . . . . . . . . 107 R e s u l t s and d i s c u s s i o n . . 1 0 7 x i P age T y p e I a d h e r e n c e 108 T y p e I I a d h e r e n c e I l l P h y s i c o - c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e l a r v a l c u t i c l e . . . . . . . . 1 1 2 C h e m i c a l and e n z y m a t i c t r e a t m e n t , of t h e l a r v a l c u t i c l e . . 1 1 2 I n t r o d u c t i o n . . . . . . . . . ; . . 1 1 2 E x p e r i m e n t a l "i 12 P a p a i n . . . . . . 1 1 3 2 - M - r c a p t o e t h a n o T 113 P e r i o d a t e 113 N e u r a m i ni.dase 113 R e s u l t s and d i s c u s s i o n 114 M o d e r a t i o n o f h o s t d e f e n s e m e c h a n i s m s 119 B l o c k i n g o f a n t i g e n i c e x p r e s s i o n 119 I n t r o d u c t i o n " . . . 1 1 9 E x p e r i m e n t a l 121 R e s u l t s a n d d i s c u s s i o n 121 B l o c k i n g a c t i v i t y i n i m m e d i a t e h y p e r s e n s i t i v i t y 121 B l o c k i n g a c t i v i t y i n l y m p h o c y t e a d h e r e n c e . . . 125 A d s o r p t i o n phenomena 129 x i i Page GENERAL DISCUSSION - '132 Protostrongylus i n f e c t i o n s o f t h e b% c Jv-'rn s h e e p , . 132 I m m u n o l o g i c m e c h a n i s m s o p e r a t i n g •  r; i n f e c t i o n ' . . . . 132 I n t e r a c t i o n o f i n f e c t i o n and e n v i r o n m e n t . . . . "133 R o l e o f i m m u n o l o g i c u n r e s p o n s i v e n e s s . . . . . 134 I n d u c t i o n o f t o l e r a n c e . . . . . . . . 13G I m m u n o s u p p r e s s i o n . , . . 138 « S e q u e s t r a t i o n o f a n t i g e n s . . . . . . . 138 M o n i t o r i n g d i s e a s e 139 E x p l o i t a b l e m o l e c u l a r m e c h a n i s m s i n t h e c o n t r o l o f p a r a s . i t i c d i s e a s e . . . . . . . . 141 Immunoprophy 1 a x i s . 141 C h e m o t h e r a p y 142 M o d e r a t i o n o f h y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e s . . . . 143 SUMMARY AND CONCLUSIONS . . . 1 4 4 LITER A T U R E CITED . ... . . 148 APPENDIX . . . . . . . 171 x i i i L I S T OF TABLES T a b l e , ' Page I . A b s o r p t i o n o f p o l y v a l e n t a n t i s e r a . . . . '.10 I I . C o m p a r i s o n o f mean i m m u n o g l o b u l i n l e v e l s o f c a p t i v e b i g h o r n s h e e p w i t h o t h e r r u m i n a n t s and man 50 III... E f f e c t o f a n t i s e r a on c e l l a d h e r e n c e t o Protostrongylus l a r v a e m e a s u r e d by t h e w a s h e d - c e l l t e s t 72 I V . C e l l - s e n s i t i z i n g ' a c t i v i t y o f s e r u m f r a c t i o n s o b t a i n e d by a n i o n e x c h a n g e on DEAE-S e p h a d e x • 77 V. E f f e c t o f a n i o n i c compounds on t h e de-s e n s i t i z a t i on o f c e l l s u s p e n s i o n s 83 V I . E f f e c t o f h i g h l y p o l a r compounds on t h e d e s e n s i t i z a t i o n o f c e l l s u s p e n s i o n s . . . . 85 V I I . E f f e c t o f b u f f e r e l u t i o n and r e - e x p o s u r e t o immune ser u m on l y m p h o c y t e a d h e r e n c e . . . 109 V I I I . E f f e c t o f c h e m i c a l and e n z y m a t i c t r e a t m e n t o f Protostrongylus l a r v a e on c e l l a d h e r e n c e 116 I X . B l o c k i n g a c t i v i t y o f e l e c t r o p h o r e t i c f r a c t i o n s o f immune s e r u m . 127 X. I n h i b i t o r y e f f e c t on c e l l a d h e r e n c e o f s e r a f r o m d i f f e r e n t s p e c i e s 128 X I . E f f e c t o f N a C l and b o r a t e on t h e e x p r e s s i o n o f c u t i c u l a r a n t i -g e n i c i t y . . . . . . . . . '. . . . 1 3 0 X I V L I S T CF FIGURES F i g u r e Page 1. S e a s o n a l c y c l e s o f Protostrongylus i n c a p t i v e b i g h o r n s r e f l e c t e d i n f e c a l l a r v a l c o u n t s . 1 9 2. I m p r i n t o f l u n g w o r m l e s i o n s t a i n e d w i t h Lei.shman's s t a i n . . . . . . . . . . . . . 23 3. I m p r i n t o f l u n g w o r m l e s i o n s t a i n e d w i t h m e t h y l g r e e n - p y r o n i ne . . . 23 4. U l t r a v i o l e t spectrum of an e x t r a c t of Protostrongylus lung 2 5 l e s i o n s 5. I m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s o f t h e f o u r m a j o r o v i n e i m m u n o g l o b u l i n s 32 6. S c h e m a t i c p r o c e d u r e f o r t h e f r a c t i o n a t i o n o f the immunoglobulins . 32 7. A b s o r p t i o n o f m u 1 t i s p e c i f i c a n t i s e r u m w i t h e t h a c r i d i n e s o l u b l e p r o t e i n s 34 8. P u r i f i c a t i o n o f l g M . .35 9. D e t e c t i o n o f I g G 2 s u b c l a s s d e t e r m i n a n t s . . . . 38 10. D e t e c t i o n o f IgM s u b c l a s s d e t e r m i n a n t s . . . . 38 11. I d e n t i f i c a t i o n o f p r e c i p i t a t e s 40 12. " The e f f e c t o f p r e d i f f u s i o n and i n c r e a s e d e l e c t r o l y t e c o n c e n t r a t i o n on rthe - c l a r i t y o f p r e c i p i t a t e s 41 13. S a m p l e d o s e ^ r e s p o n s e c u r v e s f o r e a c h o f t h e s e r u m i m m u n o g l o b u l i n s . ... . . . . . 41 14". I m m u n o g l o b u l i n l e v e l s o f c a p t i v e .bi g h o r n s . . . 46 X V F i g u r e Page 15. Q u a n t i t a t i v e immunoel e c t r o p h o r e s i s- o f I g G 2 i n t h e b i g h o r n c o m p a r i n g normal l e v e l s w i t h h y p e r g a m m a g l o b u l i n e m i a 52 16. D i s c e l e c t r o p h o r e s i s of. a c i d - s o l u b l e series p r o t e i n s . . . 56 1-?. D i s c e l e c t r o p h o r e s i s o f o v i n e g l y c o p r o t e i n p r e p a r e d by a n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y . . . 56 18. The s e r o m u c o i d r e s p o n s e t o p a r a s i t e a c t i v i t y . . 57 19. C h a n g e s i n t h e s e r o m u c o i d p r o f i l e w i t h a c u t e b a c t e r i a l s c o u r s . 5 9 20. S e r o m u c o i d i n d e x o f f r e e - r a n g i n g b i g h o r n s . . . 60 21. P e r i p h e r a l l e u c o c y t e s s e n s i t i z e d w i t h o v i n e h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d y a d h e r i n g t o Protostrongylus l a r v a e in v i t r o 66 22. C o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e w a s h e d - c e l l t e s t and t h e d i a m e t e r o f t h e s k i n r e a c t i o n 66 23. The e f f e c t i v e h y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e t o s e a s o n a l c h a n g e s i n p a r a s i t e a c t i v i t y . . . . 68 24. I m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s o f I g G e l u t e d f r o m s e n s i t i z e d p e r i p h e r a l l e u c o c y t e s . . . . . ... . 71 25. M o d e l o f t h e o r i e n t a t i o n o f h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d i e s a t t h e c e l l s u r f a c e 74 26. The d i s t r i b u t i o n o f h o m o c y t o t r o p i c a c t i v i t y . on g e l f i l t r a t i o n 76 27. E f f e c t o f p r i o r d i l u t i o n on h e a t s e n s i t i v i t y - o f o v i n e h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d y 79 28. C e l l a d h e r e n c e a s s a y s d u r i n g t h e s e a s o n a l c y c l e o f p a r a s i t e a c t i v i t y 93 29. E f f e c t on c e l l a d h e r e n c e o f d i l u t i o n o f a l I e r g i c s e r u m 122 x v i F i g u r e Page 30. E f f e c t of IgC-i-j c o n c e n t r a t i o n on adherence of p e r i p h e r a l g r a n u l o c y t e s . . . . . . 124 3 1 . I n h i b i t i o n of l ymphocy te adherence by the a dd i ti on > f se rum 126 32. D i s t r i b u t i o n of the ma jor bands o f b i g -horn sheep i n the Ease Koo tenay Reg ion of B r i t i s h Co lumb ia . . . . . . . . . . . . 172 33. R e l a t i o n s h i p between the w a s h e d - c e l l ' and' decomplemented-serum t e s t s . 1 7 3 34. E f f e c t o f Protostrongylus a n t i g e n o n . c e l l s u r v i v a l 174 » 35. E f f e c t of Protostrongylus a n t i g e n on the d i s t r i b u t i o n of c e l l d i a m e t e r s i n l ymphocy te c u l t u r e s 175 x v i i ACKNOWLEDGEMENTS T h r o u g h o u t t n i s p r o j e c t I h a v e b e e n i n d e b t e d t o a number o f p e o p l e and i n s t i t u t i o n s . D r . P. J . B a n d y , B r i t i s h C o l u m b i a F i s h and W i l d l i f e B r a n c h , and D r . W. D. K i t t s , D e p a r t m e n t o f A n i m a l S c i e n c e , d i r e c t e d t h e s t u d y and c o n t r o l l e d f i n a n c e s . D r . R. M. T a i t , D e p a r t m e n t o f A n i m a l S c i e n c e , k i n d l y p r o v i d e d d o m e s t i c s h e e p . A c t i v e c o o p e r a t i o n was p r o v i d e d by Mr. D. E a s t m a n and o t h e r p e r s o n n e l o f t h e B r i t i s h C o l u m b i a F i s h and W i l d l i f e B r a n c h i n t h e f i e l d p h a s e s o f t h e p r o j e c t . M i s s V. C u r y l o o f f e r e d e x p e r t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e t h r o u g h o u t t h e e n t i r e s t u d y . The f e c a l l a r v a l c o u n t s w e r e c o n -d u c t e d by M i s s A. Thomas and Mr. D. K i t t s . D r . J . E . H u d s o n , H a m i o t a D i s t r i c t H o s p i t a l , o f f e r e d h e l p f u l s u g g e s t i o n s d u r i n g t h e c o l l e c t i o n and a n a l -y s i s o f d a t a . D r . P. S t o v e l l , C a n a d a D e p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r e V e t e r i n a r y P a t h o l o g y L a b o r a t o r y , and D r . K. M a c D o n a l d , B r i t i s h C o l u m b i a V e t e r i n a r y P a t h o l o g y L a b o r a t o r y , eu-1 t u r e d and- i d e n t i f i e d b a c -t e r i a l i s o l a t e s f r o m d i s e a s e d b i g h o r n s h e e p . D r . x v i i i S h e i k h S a i f - u r - R a h m a n p r o v i d e d h e l p i n many ways p a r t i c u l a r l y w i t h r e s p e c t to p r o t e i n s e p a r a t i o n t e c h n i q u e s . Dr . C. R. K r i s h n a m u r t i o f f e r e d h e l p -f u l s u g g e s t i o n s d u r i n g the p r e p a r a t i o n of the m a n u s c r i p t . To t h e s e peop le and many mor^ I'e x -tend my s i n c e r e t h a n k s . F i n a n c i a l s u p p o r t f o r r e s e a r c h was r e c e i v e d f rom the N a t i o n a l Resea rch C o u n c i l of Canada . The U n i v e r s i t y of B r i t i s h Co lumb ia p r o v i d e d a s t u d e n t s c h o l a r s h i p f o r 1 9 6 7 - 1 9 6 9 and the N a t i o n a l R e s e a r c h C o u n c i l f o r 1969 -1970 . x i x A B B R E V I A T I O N S . U S E D IN THE TEXT BSA - b o v i n e s e r u m a l b u m i n C' - c o m p l e m e n t DH - d e l a y e d h y p e r s e n s i t i v i t y ( c e l l -m e d i a t e d i m m u n i t y ) EDTA - E t h y l e n e d i a m i n e t e t r a - a c e t i c a c i d Ig - i m m u n o g l o b u l i n MEM - E a g l e ' s minimum e s s e n t i a l medium ( t i s s u e c u l t u r e medium) PBS - p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e PHA - p h y t o h e m a g g l u t i n i n P-K - P r a u s n i t z - K u s t n e r r e a c t i o n (immed-i a t e s k i n r e a c t i o n c a u s e d by t h e i n j e c t i o n o f a l l e r g e n d i r e c t l y i n t o p a s s i v e l y s e n s i t i z e d s k i n t e s t s i t e s ) IMMUNOLOGY OF LUNGWORM CP ROTO ST ROE GY LUS ) INFECTIONS OF THE ROCKY MOUNTAIN BIGHORN SHEEP 1 A. INTRODUCTION The l u n g w o r m , Protostrongylus s t i l e s i D i k m a n s , has bee n i n c r i m i n a t e d i n t h e e t i o l o g y o f w i d e s p r e a d r e s p i r a t o r y d i s e a s e s w h i c h h a v e p e r i o d i c a l l y ' d e c i m a t e d p o p u l a t i o n s o f t h e R o c k y M o u n t a i n b i g h o r n (Ovis cana&e;.f.i& canadensis Shaw). Th i s - p a r a s i t e , w h i c h i n f e c t s most N o r t h A m e r i c a n w i l d s h e e p , a p p e a r s t o a c t as a p r e d i s p o s i n g a g e n t w o r k i n g s y n e r g i s t i c -a l l y w i t h o t h e r e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s t o e x a c e r b a t e s e c o n -d a r y b . a c t e r i a l . i n f e c t i o n s . The i m p a c t o f t h i s , d i s e . a s e s y n d r o m e on d i s a p p e a r i n g p o p u l a t i o n s o f t h e b i g h o r n , as w e l l as t h e w i d e s p r e a d i m p o r t a n c e o f p a r a s i t i s m i n human h e a l t h and a n i m a l p r o d u c t i o n , p r o m p t e d t h i s s t u d y o f t h e i m m u n o l o g i c a s p e c t s o f lun g w o r m i n f e c t i o n s . 1. H i s t o r y o f t h e R o c k y M o u n t a i n b i g h o r n s h e e p  S e t o n ( 1 9 2 9 ) s u g g e s t e d t h a t b i g h o r n s h e e p numbered 2,000,000 i n N o r t h A m e r i c a b e f o r e w h i t e s e t t l e m e n t . F o r m e r -l y , w i l d s h e e p were d i s t r i b u t e d w i d e l y b u t now o c c u p y o n l y s m a l l , r e l a t i v e l y i n a c c e s s i b l e p o r t i o n s o f t h e i r p r i s t i n e r a n g e . G r i n n e l ( 1 9 2 8 ) s u g g e s t e d t h a t s h e e p were n o t f o r m e r l y c o n f i n e d t o m o u n t a i n s b u t i n p a r t s o f t h e i r r a n g e l i v e d i n h a b i t a t s i m i l a r t o t h a t p r e s e n t l y o c c u p i e d by t h e mule d e e r . He r e p o r t e d t h a t , i n 1875 , b i g h o r n s were o f t e n found, f o r a g -i n g on t h e p r a i r i e s o f N o r t h e r n M o n t a n a a t c o n s i d e r a b l e d i s -t a n c e s f r o m e s c a p e t e r r a i n . The p l a i n s b i g h o r n (o.o. audu-boni M e r r i a m ) , e x t i n c t s i n c e a b o u t 1905,. was b e l i e v e d t o h a v e o c c u p i e d t h e b a d l a n d s a d j o i n i n g t h e M i s s o u r i R i v e r i n N o r t h and S o u t h D a k o t a , an e c o l o g i c a l n i c h e p r o b a b l y o n c e i n h a b i t e d by o t h e r r a c e s i n o t h e r p a r t s o f N o r t h A m e r i c a (Cowan, 1 9 4 0 ) . The i n i t i a l d e c l i n e a p p e a r s t o h a v e o c c u r r e d p r i o r t o t h e t u r n o f t h e c e n t u r y . The o n l y s e r i o u s d i s e a s e a t t h a t t i m e was s c a b i e s o r mang.e p r e s u m a b l y c o n t r a c t e d f r o m domes-t i c s h e e p . B r o o k s . ( 1 9 2 3 ) - s u g g e s t e d t h a t h e a v y i n f e s t a t i o n s may h a v e b e e n p r e s e n t i n t h e r e g i o n e a s t o f t h e F r a s e r R i v e r i n B r i t i s h C o l u m b i a a b o u t 1870. M a j o r d e c l i n e s o f b i g h o r n s o c c u r r e d i n I d a h o b e t w e e n 1870 and 1880 ( S m i t h , 1954) and i n t h e T a r r y l M o u n t a i n s , C o l o r a d o , a b o u t 1885 ( S p e n c e r , 1 9 4 3 ) . C o m p e t i t i o n f r o m d o m e s t i c s t o c k on w i n t e r r a n g e s , and u n c o n -t r o l l e d h u n t i n g a l s o a p p e a r e d t o p l a y a r o l e i n t h i s i n i t i a l d e c l i n e . U n t i l t h e 1 9 2 0 ' s , a r e s u r g e n c e o f m o u n t a i n s h e e p p o p u -l a t i o n s was e x p e r i e n c e d . H o w e v e r , a g a i n w i l d s h e e p b e g a n t o d i s a p p e a r . A number o f s t u d i e s w e r e l a u n c h e d t o d e t e r m i n e t h e f a c t o r s l i m i t i n g b a n d s and t o e x p l a i n low lamb p r o d u c t i o n B r o o k s ( 1 9 2 3 ) s u g g e s t e d t h a t p r e d a t i o n c o u l d a c c o u n t f o r s e v e n t y - f i v e p e r cent, o f t h e a n n u a l lamb c r o p . M i l l s ( 1937) 3 and Marsh (1938) s t r e s s e d summer d i s e a s e l o s s e s , whereas Dav i s (1938) i d e n t i f i e d the f i r s t w i n t e r as the b o t t l e n e c k of p r o d u c t i v i t y . One of the e a r l i e s t comprehens i ve r e p o r t s of resp-'! r a -t o r y d i s e a s e was based on an e p i z o o t i c i n G l a c i e r f ' a t i cnzl Park i n 1924-1925 ( M a r s h , 1 9 3 8 ) . F u r t h e r o u t b r e a k s o c c u r r e d i n Y e l l o w s t o n e and Rocky Moun ta in N a t i o n a l P a r k s ' i n the m id -1 9 3 0 ' s . The d i s e a s e was i d e n t i f i e d as verminous pneumonia caused by Protostrongylus s p p . w i t h seconda ry b a c t e r i a l i n -v a s i o n w i t h P a s t e u r e l l a o v i s e p t i c a (multocida) and Coryne-bacteriurn pyogenes ( M i l l s , 1937 ; P o t t s , 1938 ; P a c k a r d , 1 9 4 6 ) . In a more r e c e n t d i e - o f f i n C o l o r a d o , the lungworm was i n -c r i m i n a t e d as the pr ime e t i o l o g i c agent (Moser and P i l l m o r e , 1 9 5 4 ) . 2 . D i s e a s e o u t b r e a k s i n B r i t i s h Co lumb ia The w i l d sheep of the Rocky Moun ta in Trench ( A p p . , p .172) p r o b a b l y were not numerous i n e a r l y t i m e s . L o g g i n g a t the t u r n ' of ..the c e n t u r y , f o l l o w e d by e x t e n s i v e f i r e s about 1930 , c r e a t e d the major w i n t e r ranges and p e r m i t t e d a r a p i d i n -c r e a s e of b i g h o r n p o p u l a t i o n s . W idesp read m o r t a l i t i e s have been e x p e r i e n c e d t w i c e on these r a n g e s . The f i r s t ma jo r de -c l i n e o c c u r r e d about 1942. The second ou tb reak was f i r s t n o t i c e d i n 1965 on the B u l l R i v e r range where m o r t a l i t y was e s t i m a t e d to be n i n e t y per cen t of p r e v i o u s numbers (Bandy , 1 9 6 6 ) . The f o l l o w i n g y e a r a n i m a l s a t P r e m i e r R i c l g e and E s t e l l a M o u n t a i n showed s i g n s o f d i s e a s e . The S t o d d a r t C r e e k R a d i um b a n d was s t i l l a p p a r e n t l y u n a f f e c t e d . H o w e v e r , i n 1 9 6 6 - 1 9 6 7 , m o r t a l i t i e s were a l s o r e p o r t e d i n t h i s a r e a . A l t h o u g h t h e d i s e a s e showed a d e f i n i t e p r o g r e s s i o n up t h e T r e n c h , t h e c a u s a t i v e a g e n t and r o u t e o f t r a n s m i s s i o n w ere n o t c o n c l u s i v e l y d e t e r m i n e d . A u t o p s i e s c o n d u c t e d by t h e B r i t i s h C o l u m b i a F i s h and W i l d l i f e B r a n c h r e v e a l e d h e a v y i n f e c t i o n s o f Protostrongylus s t i l e s i j t h e p a r e n c h y m a l l u n g -worm, a c c o m p a n i e d by a p n e u m o n i c c o n d i t i o n a t t r i b u t e d t o s e c o n d a r y b a c t e r i a l i n v a s i o n w i t h Pasteurella multooida and Corynebaoterium pyrogenes. Clostridium s o r d e l l i was a l s o i s o l a t e d f r o m s e v e r a l a n i m a l s f r o m B u l l R i v e r w h e r e a p u l p y k i d n e y c o n d i t i o n was t r i g g e r e d by a d i g e s t i v e u p s e t c a u s e d by t h e s u d d e n a v a i l a b i l i t y o f h i g h q u a l i t y f o r a g e ( B a n d y , 1966) . R e c e n t y e a r s h a v e n o t b r o u g h t s a t i s f a c t o r y r e c o v e r y o f w i l d b a n d s i n t h e a r e a . In J a s p e r N a t i o n a l P a r k , b i g h o r n s on o v e r p o p u 1 a t e d r a n g e s p r e s e n t l y show d a n g e r o u s l y h i g h p a r a -s i t e l o a d s ( S t e l f o x and M c G i l l i s , 1 9 7 0 ) . W i t h o u t r e m e d i a l management t h e s e b a n d s may a l s o be s e v e r e l y d e c i m a t e d . 3.. P r o t o s t r o n g y 1 i ne lungworms o f t h e b i g h o r n s h e e p  S e v e r a l s p e c i e s o f t h e genus Protostrongylus (P. rushi, P. s t i l e s i and P. f r o s t i ) h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n i n f e c t i o n s o f t h e R o c k y M o u n t a i n b i g h o r n s h e e p ( D i k m a n s , 1943; M a r q u a r d t and S e n g e r , 1 9 5 6 ) . In r e c e n t d i s e a s e o u t b r e a k s i n B r i t i s h C o l u m b i a . P. s t i l e s i was i d e n t i f i e d as t h e m a j o r p a r a s i t i c n e m a t o d e ( B a n d y , 1 9 6 6 ) . The l i f e c y c l e o f t h i s s p e c i e s has b e e n i n f e r r e d f r o m c o m p a r i s o n s w i t h r e l a t e d l ungworms s u c h as p. rufesoens w h i c h i n f e c t d o m e s t i c s h e e p . I f t h i s c o m p a r i s o n i s v a l i d , l u n g w o r m l a r v a e p r e s u m a b l y w o u l d be p a s s e d i n f e c e s p e n e t r a t e l a n d s n a i l s and d e v e l o p i n t o i n f e c t i v e t h i r d s t a g e l a r v a e . S h e e p w o u l d t h e n be p a r a s i t i z e d by i n g e s t i n g t h e s e i n f e c t e d s n a i l s ( O l s e n , 1 9 6 2 ) . H u n t e r and P i l l m o r e ( 1 9 5 4 ) and P i l l m o r e ( 1 9 5 8 ) f o u n d s n a i l s on b i g h o r n w i n t e r i n g r a n g e s h a r b o u r i n g i n f e c t i v e l u n g w o r m l a r v a e o f s e v e r a l s p e c i e s . H o w e v e r , s e v e r a l a t t e m p t s t o i n f e c t b i g h o r n s h e e p e x p e r i m e n -t a l l y h a v e b e e n u n s u c c e s s f u l (Howe, 1966) a n d , f r o m an e c o l -o g i c a l s t u d y o f l a n d s n a i l s on t h e E a s t K o o t e n a y w i n t e r ranges., R e i d ( 1969 ) c o n c l u d e d t h a t they, p r o b a b l y w e r e n o t i m p o r t a n t i n t h e e p i d e m i o l o g y o f p a r a s i t i s m on t h e s t u d y a r e a . E v i d e n c e has b e e n p r e s e n t e d f o r t r a n s p l a c e n t a l t r a n s -m i s s i o n o f lungworms b u t i t s s i g n i f i c a n c e i s n o t known ( F o r r e s t e r and S e n g e r , 1 9 6 4 a ; Howe, 1 9 6 6 ) . I t i s c l e a r t h a t many more s t u d i e s on t h e b a s i c b i o l o g y and e p i d e m i o l o g y o f l u n g w o r m s o f w i l d s h e e p a r e r e q u i r e d b e f o r e t h e i r r o l e i n r e s p i r a t o r y d i s e a s e s can be e v a l u a t e d . 6 4. I m m u n o l o g i c r esponse t o p a r a s i t i s m I n c r e a s i n g i n t e r e s t i n h e l m i n t h d i s e a s e s has been s t i m -u l a t e d by t h e W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i on- whi ch has e m p h a s i z e d t h e n e e d f o r i m p r o v e d d i a g n o s t i c and t h e r a p e u t i c a n t i g e n p r e -p a r a t i o n s ( W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n , 1 9 6 5 ) . A l t h o u g h t h e i m m u n o l o g i c r e s p o n s e t o p a r a s i t i s m has b e e n t h e s u b j e c t o f a c t i v e r e s e a r c h ( S i n c l a i r , 1 9 7 0 ) , t h i s d i s c i p l i n e has n o t a c h i e v e d t h e s o p h i s t i c a t i o n o f o t h e r a r e a s o f i m m u n o l o g y . The r e a s o n f o r t h e r e l a t i v e l y s l o w p r o g r e s s p r o b a b l y s t e m s f r o m t h e g r e a t c o m p l e x i t y o f p a r a s i t i c s y s t e m s . M e t a z o a n p . a r a s i t e s e x p r e s s s e v e r a l l i f e s t a g e s i n t h e t i s . s u e s o f t h e h o s t , e a c h a s s o c i a t e d w i t h s t r u c t u r a l and p h y s i o l o g i c a l c h a n g e s . The h o s t , t h e r e f o r e , i s e x p o s e d t o a c o m p l e x a r r a y o f a n t i g e n s d i f f e r i n g n o t o n l y i n c h e m i c a l c h a r a c t e r b u t a l s o i n mode o f p r e s e n t a t i o n t o t h e l y m p h o - r e t i c u l a r t i s s u e s . I t i s n o t s u r p r i s i n g t h a t t h i s a n t i g e n i c m o s a i c s t i m u l a t e s an a l l e r g i c r e s p o n s e o f c o m p a r a b l e c o m p l e x i t y . a) P r i n c i p l e s o f i m m u n i t y Coombs and G e l ! ( 1 9 6 8 ) i n t r o d u c e d a c l a s s i f i c a t i o n o f th e e f f e r e n t l i m b o f t h e immune r e s p o n s e w h i c h d e l i n e a t e d t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f f o u r t y p e s o f a l l e r g i c r e a c t i o n s : T y p e I . Immedi a t e - t y p e h y p e r s ens i t i v i t y , T y p e I I . C y t o t o x i c r e a c t i o n s , T y p e I I I . A r t h u s r e a c t i o n s , T y p e I V . D e 1 a y e d - t y p e h y p e r s e n s i t i v i t y . Of t h e s e r e s p o n s e s , T y p e s I and IV h a v e r e c e i v e d m o s t a t t e n t i o n i n p a r a s i t o l o g y . T h e y a l s o , r e p r e s e n t t h e most ob-v i o u s r e a c t i o n s i n Protostrongylus i n f e c t i o n s o f t h e b i g h o r n and a r e t r e a t e d most e x t e n s i v e l y i n t h i s r e p o r t . ( 1 ) T y p e I . I m m e d i a t e - t y p e h y p e r s ens i t i v i t y The r e a c t i o n o f a n t i g e n w i t h s p e c i f i c c e l l s p a s s i v e l y s e n s i t i z e d w i t h a n t i b o d i e s may l e a d t o t h e r e l e a s e o f v a s o -a c t i v e a m i n e s . T h e s e r e a c t i o n s h a v e b e e n t e r m e d " i m m e d i a t e " s i n c e t h e a n a p h y l a c t i c m a n i f e s t a t i o n s a r e u s u a l l y a p p a r e n t s o o n a f t e r c h a l l e n g e w i t h t h e o f f e n d i n g a l l e r g e n . In man, t h e s e n s i t i z i n g a n t i b o d y has be e n i d e n t i f i e d as b e l o n g i n g t o a d i s t i n c t i m m u n o g l o b u l i n c l a s s c a l l e d I g E , a l t h o u g h r e c e n t s t u d i e s h a v e i n d i c a t e d t h a t h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d y may be more h e t e r o g e n e o u s t h a n p r e v i o u s l y e x p e c t e d . T h i s a n t i b o d y ( r e a g i n o r h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d y ) i s r e s p o n -s i b l e f o r a l l e r g i e s t o f o o d s , d r u g s and p o l l e n s ( J o h a n s s o n , B e n n i c h and W i d e , 1968) b u t may a l s o be e l e v a t e d i n a v a r i e t y o f n o n - a t o p i c d i s o r d e r s ( H e i n e r and R o s e , 1 9 7 0 ) . A n a l o g o u s a n t i b o d i e s h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n c e r t a i n a n i m a l s p e c i e s ( F r e e m a n et al., 1969; P a t t e r s o n , R o b e r t s and P r u z a n s k y , 1969) b u t a g a i n , c e l l s e n s i t i z i n g a c t i v i t y has b e e n d e t e c t e d 8 i n more t h a n one i m m u n o g l o b u l i n c l a s s ( S t a n w o r t h , 1 9 7 0 ) . (2) T y p e I V . D e 1 a y e d - t y p e h y p e r -s e n s i t i v i t y (DH, c e l l -m e d i a t e d i m m u n i t y ) The d e l a y e d h y p e r s e n s i t i v i t y s t a t e i s m a n i f e s t by a s p e c i f i c i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e t o t h e i n t r a d e r m a l i n j e c t i o n o f a n t i g e n w h i c h r e a c h e s a maximum i n t w e n t y - f o u r t o f o r t y -e i g h t h o u r s . P a s s i v e t r a n s f e r o f t h i s r e a c t i v i t y t o n o r m a l a n i m a l s c a n u s u a l l y be a c h i e v e d w i t h v i a b l e l y m p h o i d c e l l s b u t n o t n o r m a l l y w i t h s e r u m ( M o h r et-al.3 1 9 6 9 ) . A l t h o u g h c e l l u l a r and h u m o r a l i m m u n i t y h-ave b e e n t r a d i t i o n a l l y d i s -t i n g u i s h e d by s u c h p a s s i v e t r a n s f e r ' e x p e r i m e n t s , H a l l ( 1 9 7 0 ) has p o i n t e d o u t t h a t t h e s e c r i t e r i a may n o t be u n e q u i v o c a l . W hereas b l o o d c o n t a i n s h i g h l e v e l s o f a n t i b o d y p r o d u c e d by p l a s m a c e l l s i n t h e lymph n o d e s and s p l e e n , t h e e x t r a -v a s c u l a r t i s s u e s p a c e s a r e n o t s i m i l a r l y b a t h e d i n h i g h c o n -c e n t r a t i o n s . I m m u n o b l a s t s , t h e e f f e c t o r s o f e e l 1 - m e d i a t e d i m m u n i t y , a r e r a p i d l y r e m o v e d f r o m t h e b l o o d , h o m i n g t o v a r i o u s t i s s u e s , p a r t i c u l a r l y t h e g u t ( H a l l and S m i t h , 1 9 7 0 ) . A c c o r d i n g t o H a l l ' s c o n c e p t , t h e s e c e l l s e n t e r s o l i d t i s s u e g r a f t s - o r f o c i o f i n f e c t i o n w h e r e a t l e a s t some t r a n s f o r m i n t o a n t i b o d y - p r o d u c i n g p l a s m a c e l l s . S i n c e n e m a t o d e p a r a -s i t e s a r e p r e d o m i n a n t l y e x t r a v a s c u l a r , f a i l u r e t o t r a n s f e r i m m u n i t y w i t h s e r u m may be due t o i n s u f f i c i e n t l o c a l concen t -r a t i o n o f a n t i b o d y . On t h e o t h e r h a n d , c e l l u l a r t r a n s f e r may be e f f e c t i v e by p r o d u c i n g h i g h l e v e l s o f a n t i b o d y in- t h e p a r a s i t e l e s i o n . L y m p h o c y t e s f r o m s e n s i t i z e d a n i m a l s o r n o r m a l l y m p h o -c y t e s i n t h e p r e s e n c e o f a n t i b o d y o r a g g l u t i n a t i n g f a c t o r s a r e c y t o t o x i c t o t a r g e t c e l l s ( P e r l m a n n and Holm, 1 9 6 9 a ) . I n i t i a l r e c o g n i t i o n o f s e n s i t i z e d l y m p h o c y t e s f o r t h e i r c o r -r e s p o n d i n g a n t i g e n may be due t o s p e c i f i c i m m u n o g l o b u l i n -l i k e r e c e p t o r s on t h e c e l l membrane (Coombs et al.3 1970; D a g u i l l a r d and R i c h t e r , 1 9 7 0 ) . C o m p l e x e s o f h u m o r a l a n t i -b o d y and a n t i g e n a r e a l s o c a p a b l e o f a c t i v a t i n g n o n - s e n s i -t i z e d T*ymphocytes ( O p p e n h e i m , 1969 ) . In a d d i t i o n , l y m p h o -c y t e s a r e c y t o t o x i c f o r a l l o g e n e i c c e l l s ( a l l o g e n e i c i n h i b i t i o n ) , a r e a c t i o n w h i c h i s a p p a r e n t l y n o n - a l l e r g i c i n n a t u r e , t h a t i s , d o es n o t d e p e n d upon p r i o r a n t i g e n i c e x p o s -u r e ( M o l ' l e r , L a p p and L i n d h o l m , 1969 ) . I t has b e e n s u g g e s t e d t h a t DH e v o l v e d as a m e c h a n i s m t o c o n t r o l t i s s u e g r o w t h , a c t i n g as a s u r v e i l l a n c e s y s t e m p r e v e n t i n g n e o p l a s t i c m e t a s t a s i s ( B u r n e t , 1 9 7 0 a , b ) . P r e s u m -a b l y , h i s t o c o m p a t i b i l i t y and h o m o g r a f t r e j e c t i o n a r e e x p r e s s -i o n s o f a m e c h a n i s m d e s i g n e d t o d e t e c t c e l l s w h i c h h a v e a c q u i r e d u n i q u e a n t i g e n i c s t r u c t u r e s . B u r n e t ( 1 9 6 9 ) has p r o p o s e d t h a t t h e e s s e n t i a l f e a t u r e o f DH i s t h a t t h e a n t i -gen must be i n c o r p o r a t e d i n t o t h e s u r f a c e o f a m o b i l e c e l l p r o d u c i n g c h a n g e s t h a t m i m i c g e n e t i c a l l y d e t e r m i n e d h i s t o -c o m p a t i b i l i t y a n t i g e n s . T h e s e m o d i f i e d c e l l s t h e n p a s s t o 10 the' p a r a c o r t i c a l ( t h y m u s - d e p e n d e n t . ) r e g i o n o f t h e r e g i o n a l lymph n o d e s and s t i m u l a t e t h e p r o l i f e r a t i o n o f s p e c i f i c i m m u n o c y t e s . b) M e c h a n i s m s o f i m m u n i t y t o p a r a s i t e s The r o l e o f h u m o r a l a n t i b o d y i n p a r a s i t i c i m m u n i t y has be e n d i f f i c u l t t o e s t a b l i s h e i t h e r in v i t r o o r in vivo. P r e -c i p i t a t e f o r m a t i o n a t t h e o r a l and s e c r e t o r y a p e r t u r e s ( T h o r s o n , 1953) o r b i n d i n g o f f 1 u o r e s c e i n - 1 a b e T l e d a n t i -g l o b u l i n ( T a f f s and V o l l e r , , 19,63) h a v e b e e n o b s e r v e d when c e r t a i n n e m a t o d e s were i n c u b a t e d w i t h s e r u m f r o m i n f e c t e d a n i m a l s . P a r t i a l i n h i b i t i o n o f o x y g e n u p t a k e was o b t a i n e d w i t h Nippostrongylus b r a s i l i e n s i s i n t h e p r e s e n c e o f immune s e r u m ( M u l l i g a n et al.3 1 9 6 5 ) . H o w e v e r , o t h e r w o r k e r s h a v e n o t f o u n d e v i d e n c e o f a d v e r s e e f f e c t s o f p r e c i p i t a t i n g o r c u t i c l e - b i n d i n g a n t i b o d i e s on l a r v a l d e v e l o p m e n t ( S i n g h a , 1 9 6 7 ) . A n t i b o d y may n o t e x e r t a d i r e c t e f f e c t b u t r a t h e r o p e r a t e by s e n s i t i z i n g c e l l s f o r p a r t i c i p a t i o n i n t h e immune r e s p o n s e . The i m p o r t a n c e o f f i x e d c o m p l e m e n t and c y t o p h i l i c a n t i b o d y i n c e 1 1 - m e d i a t e d i m m u n o l o g i c phenomena has b e e n r e v i e w e d f o r n e u t r o p h i l s ( C o c h r a n e , 1968) and m o n o n u c l e a r e e l ( P e a r s a l l and W e i s e r , 1 9 7 0 ) . Mo.rseth and S o u l s b y ( 1 9 6 9 a , b ) h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t a d h e r i n g n e u t r o p h i l s , b u t n o t p y r o n i n o p h i l s , r e l e a s e enzymes t h a t damage t h e p a r a s i t e c u t i c l e . P a s s i v e t r a n s f e r o f i m m u n i t y e i t h e r t r a n s p l a c e n t a l l y , 11 w i t h s e r u m , o r r u m i n a n t c o l o s t r u m has n o t b e e n c o n s i s t e n t l y a c h i e v e d ( L e e s and J o r d a n , 1968; Gemmel , B l u n d . e l l - H a s e l 1 and MacNamara, 1 9 6 9 ) . A l t h o u g h many s e r o l o g i c a l r e a c t i o n s h a v e b e e n u s e d i n i m m u n e - d i a g n o s i s i t has b e e n d i f f i c u l t t o demon-s t r a t e a r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c i r c u l a t i n g a n t i b o d y t i t r e and r e s i s t a n c e . P a r a s i t i c i n f e c t i o n s a r e p a r t i c u l a r l y e f f e c t i v e i n i n -d u c i n g t h e a p p e a r a n c e o f a n t i b o d i e s w i t h t h e a b i l i t y t o s e n s i -t i z e h o m o l g o u s t i s s u e s f o r a n a p h y l a x i s ( M c A n i n c h and P a t t e r s o n , 1 9 7 0 ) . S t e w a r t ( 1 9 5 0 ) d e s c r i b e d a l o c a l a n a p h y -l a c t i c r e a c t i o n o f t h e g u t membranes a s s o c i a t e d w i t h e x p u l -s i o n o f g a s t r o i n t e s t i n a l n e m a t o d e s ( " s e l f - c u r e " r e a c t i o n ) . S e v e r a l w o r k e r s h a v e d i s c u s s e d t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e i m p o r t a n c e o f a n t i b o d y may n o t be i t s d i r e c t a n t i - w o r m a c t i v -i t y b u t r a t h e r i t s i n d u c t i o n o f i n f l a m m a t i o n w h i c h p r o d u c e d an u n f a v o r a b l e l o c a l e n v i r o n m e n t f o r t h e p a r a s i t e ( M u l l i g a n et al., 1965; U r q u h a r t et al., 1 9 6 5 ) . S h a r p and J a r r e t t ( 1 9 6 8 ) w e r e a b l e t o d e l a y worm e x p u l s i o n w i t h r e s e r p i n e , a compound w h i c h d e p l e t e s m a s t c e l l s o f b i o g e n i c a m i n e s . . I f i n f 1 a m m a t o r y c h a n g e s a r e s o l e l y r e s p o n s i b l e f o r t h e r e s t r i c t i o n o f p a r a s i t e a c t i v i t y , a n a p h y l a x i s p r o d u c e d by h e t e r o l o g o u s a n t i g e n - a n t i b o d y s y s t e m s o r mast c e l l l y t i c com-p o u n d s ( K e l l e r , 1970) s h o u l d be e q u a l l y e f f e c t i v e . B a r t h . , J a r r e t t and U r q u h a r t ( 1 9 6 6 ) f o u n d t h a t o v a l b u m i n - i n d u c e d a n a p h y l a x i s was e f f e c t i v e i n r e d u c i n g Nippostrongylus b u r d e n s 12 o n l y when r a t s were p a s s i v e l y a d m i n i s t e r e d immune s e r u m . T h e y s u g g e s t e d t h a t a n a p h y l a c t i c a n t i b o d i e s , by i n c r e a s i n g v a s c u l a r p e r m e a b i l i t y , may p o t e n t i a t e t h e e x t r a v a s a t i o n o f c i r c u l a t i n g a n t i b o d i e s w h i c h t h e n a c t d i r e c t l y a g a i n s t t h e p a r a s i t e . R e c e n t work w i t h t h e p a s s i v e t r a n s f e r o f l y m p h o i d c e l l s ( s u b j e c t t o t h e r e s e r v a t i o n s s t a t e d i n s e c t i o n ( 2 ) , page- 8) i n d i c a t e s t h a t T y p e IV r e a c t i o n s may be i m p o r t a n t i n h o s t r e s i s t a n c e t o s e v e r a l h e l m i n t h s ( L a r s h , 1 967; D i n e e n , R o n a i and W a g l a n d , 1 9 6 8 ) . T h i s may p r o v e t o be a f e r t i l e a r e a o f s t u d y s i n c e r a p i d a d v a n c e s i n c e l l u l a r i m m u n o l o g y h a v e b e e n made i n t r a n s p l a n t a t i o n and c a n c e r r e s e a r c h . T h e r e a p p e a r t o be many a n a l o g i e s b e t w e e n t h e i m m u n o l o g i c p r o b l e m s p o s e d by p a r a s i t i c h e l m i n t h s and s o l i d t i s s u e g r a f t s . 5. G l y c o p r o t e i n r e s p o n s e t o t i s s u e i n j u r y Trauma,- i n f e c t i o n and i n f l a m m a t i o n p r o d u c e an e l e v a t i o n o f s e r u m g l y c o p r o t e i n s ( W o l l h e i m et al.} 1 9 6 9 ) . A number o f s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d i n c r e a s e s o f g l y -c o p r o t e i n s i n m a l i g n a n t and p a t h o l o g i c a l t i s s u e s ( S y l v e n , 1 9 6 6 ) . A p r o t e i n s i m i l a r t o o r i d e n t i c a l w i t h s e r u m a-1 a c i d g l y c o p r o t e i n ( o r o s o m u c o i d ) has been s e p a r a t e d f r o m p l e u r a l e f f u s i o n s ( B o u r r i l l o n et a L , 1963) and Y o s h i d a a s c i t e s t u m o r c e l l s ( M a r c a n t e , 1 9 6 3 ) . A l t h o u g h l o c a l s y n t h e s i s o f t h e s e m u c o p r o t e i n s has b e e n r e p o r t e d , numer-ous s t u d i e s i n d i c a t e t h a t m o s t g l y c o p r o t e i n i s s y n t h e s i z e d 13 h e p a t i c a l l y ( L i , L i and S h e t l a r , 1 9 6 8 ) . The s i g n i f i c a n c e o f t h e g l y c o p r o t e i n r e s p o n s e i s l a r g e l y unknown, p a r t i c u l a r l y i n p a r a s i t i c i n f e c t i o n s . 6. O b j e c t i v e s L i k e most b i o l o g i c a l s y s t e m s , t h e c o m p o n e n t p a r t s o f t h e h o s t - p a r a s i t e " i n t e r a c t i o n a r e n o t e a s i l y a n a l y s e d . W h i t -l o c k and R o b s o n ( 1 9 6 9 ) h a v e d e s c r i b e d a s t a t i s t i c a l a p p r o a c h w h i c h t h e y c a l l e d " e x p e r i m e n t a l e n d e m i o l o g y " i n w h i c h b o t h h o s t an.d p a t h o g e n a l l e g e d l y d e m o n s t r a t e m u t u a l a d a p t a t i o n . R a t c l i f f e et al. ( 1 9 6 9 ) h a v e a l s o a p p l i e d c y b e r n e t i c s o r s y s t e m s a n a l y s i s t o t h e s t u d y o f p a r a s i t i s m . R e f i n e m e n t o f c y b e r n e t i c m o d e l s , u s e d f o r p r e d i c t i o n o f t h e o u t c o m e o f p a r a s i t e - h o s t i n t e r a c t i o n s , r e q u i r e s de-t a i l e d and m e a n i n g f u l i n p u t . T h i s i n p u t i s l i m i t e d by t h e a b i l i t y t o d e l i n e a t e i n t e r a c t i n g c o m p o n e n t s s a t i s f a c t o r i l y . T h i s s t u d y was c o n d u c t e d t o p r o v i d e m ethods t o a s s e s s v a r i o u s a s p e c t s o f immune r e a c t i v i t y and t o d e v e l o p in v i t r o s y s t e m s w h i c h may s i m u l a t e immune r e a c t i o n s o c c u r r i n g in vivo. Ex-p e r i m e n t a l work was s t i m u l a t e d by t h e n e e d f o r methods t o a n a l y s e t h e h e t e r o g e n e i t y o f t h e i m m u n o g l o b u l i n r e s p o n s e . The s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s o f a n t i b o d y w i t h c e l l s i n v o l v e d i n h o s t d e f e n s e w e r e e x a m i n e d t o g a i n i n s i g h t i n t o t h e i r r o l e i n t h e e x p r e s s i o n o f i m m u n i t y . F i n a l l y , t h e p a r a s i t e was s t u d i e d t o r e v e a l i t s p o s s i b l e a d a p t a t i o n s t o e v a d e t h e a d -v e r s e e f f e c t s o f t h e s e i m m u n o l o g i c m e c h a n i s m s . 14 B. GENERAL MATERIALS AND METHODS 1 . An i ma 1s Two R o c k y M o u n t a i n b i g h o r n ewes were a v a i l a b l e a t t h e i n i t i a t i o n o f t h e s t u d y . They were c a p t u r e d i n 1965 on t h e S t o d d a r t C r e e k Range s o u t h o f B a n f f as p a r t o f a d i s e a s e r e -s e a r c h p r o g r a m i n i t i a t e d by t h e B r i t i s h C o l u m b i a F i s h and W i l d l i f e B r a n c h . T h e s e two a n i m a l s (M and R) were m a i n t a i n e d a t t h e U n i v e r s i t y w i l d l i f e u n i t u n d e r c o n d i t i o n s m i n i m i z i n g i n f e c t i o n f r o m p a r a s i t e s w i t h i n d i r e c t l i f e c y c l e s . T h e y w e r e f e d a b a l a n c e d p e l l e t e d , r a t i o n (UBC 36.-57),. a<2 libitum,. w i t h o u t f o r a g e s u p p l e m e n t a t i o n . In J a n u a r y , 1 970, R d i e d o f b a c t e r i a l p n e u m o n i a . A h e a v y g r o w t h o f Escherichia f r e u n d i i . was c u l t u r e d f r o m t h e i n f e c t e d l u n g t i s s u e . In M a r c h , 1969, an a d d i t i o n a l t w e l v e ewes were c a p t u r e d on t h e M o r r i s e y - W i g w a m r a n g e n e a r C r a n b r o o k . By A p r i l s e v -e r a l c a p t i v e a n i m a l s d e v e l o p e d b a c t e r i a l s c o u r s - and- l o s t c o n -d i t i o n r a p i d l y . T r e a t m e n t w i t h p e n i c i l l i n - s t r e p t o m y c i n p r e -1 2 p a r a t i o n s and s u l f a m e t h a z i n e f a i l e d t o c u r b t h e i n f e c t i o n . 3 N i t r o f u r a z o n e c o n t r o l l e d p a t h o g e n m u l t i p l i c a t i o n i n t h e i n -t e s t i n a l t r a c t b u t , b e i n g i n e f f i c i e n t l y a b s o r b e d , d i d n o t ^ D e r a f o r t , A y e r s t , M o n t r e a l . 2 S u l m e t , C y a n a m i d , M o n t r e a l . 3 NFZ, B i o v i n , M o n t r e a l . 15 p r e v e n t t h e d e v e l o p m e n t o f s e p t i c e m i a . S i x ewes c a r r i e d s i n g l e lambs and one c a r r i e d t w i n s . O n l y one lamb was b o r n a l i v e b u t d i e d t h r e e d a y s l a t e r o f b a c t e r i a l p n e u m o n i a . A b o r t e d f e t i showed m i c r o s c o p i c t i s s u e d e g e n e r a t i o n . A l l ewes, e x c e p t t h e one g i v i n g l i v e b i r t h , d e v e l o p e d e n d o m e t r i t i s and d i e d w i t h i n t w e n t y - f o u r h o u r s . The m a j o r c u l t u r e f r o m i n f l a m m e d t i s s u e s was a h i g h l y d r u g r e s i s t a n t s t r a i n o f E. c o l i . M o s t o f t h e s t u d y was b a s e d , t h e r e f o r e , on s a m p l e s f r o m f o u r b i g h o r n s ; two s u r v i v i n g f r o m t h e g r o u p c a p t u r e d i n 1969 (780 and 781) and t h e o r i g i n a l two a n i m a l s (M and R) c a p t u r e d b e f o r e t h e i n i t i a t i o n o f t h e p r o j e c t . S i n c e many t r a n q u i l i z e r s and i m m o b i l i z i n g a g e n t s a f f e c t i n f l a m m a t o r y p r o c e s s e s ( F e i n b e r g , F e i n b e r g and L e e , 1 9 6 9 ) , m e c h a n i c a l r e s t r a i n t was c h o s e n t o a v o i d un-d e t e r m i n e d s i d e - e f f e c t s . D u r i n g most o f t h e s t u d y , a n i m a l s 780 and 781 w e r e c a u g h t i n a h a n d l i n g n e t . The o t h e r p a i r M and R, w e r e c a p t u r e d by h a n d and s a m p l e d w i t h a minimum o f e x c i t e m e n t and p h y s i c a l a c t i v i t y b e c a u s e t h e y became a c c u s -tomed t o f r e q u e n t h a n d l i n g and w e r e more c l o s e l y c o n f i n e d t h a n t h e o t h e r two. F o r t y t o s i x t y ml o f b l o o d were drawn a t two t o t h r e e week i n t e r v a l s f r o m e a c h a n i m a l . A number o f b l o o d s a m p l e s w e r e o b t a i n e d f r o m b i g h o r n s h e e p t r a p p e d on t h e M o r r i s e y - W i g w a m , S t o d d a r t C r e e k and W a t e r t o n L a k e s w i n t e r r a n g e s . U n f o r t u n a t e l y , t h i s p r o g r a m 16 was no t e x t e n s i v e enough to e s t a b l i s h s e a s o n a l p a t t e r n s i n w i l d bands . Only a few broad compar i sons were a t t emp ted be tween these a n i m a l s and c a p t i v e b i g h o r n s . A group o f s i x mixed b reed d o m e s t i c sheep CO. aries) were used f o r s k i n t e s t e x p e r i m e n t s and p r o v i s i o n o f l e u c o -c y t e s u s p e n s i o n s f o r the in v i t r o models o f immedia te hype r s e n s i t i v i t y and s e v e r a l e x p e r i m e n t s w i t h l ymphocy te a d h e r e n c e . 17 C. EXPERIMENTS 1. S e a s o n a l c y c l e o f p a r a s i t e a c t i v i t y a) I n t r o d u c t i o n M a r k e d v e r n a l i n c r e a s e s i n p a r a s i t e f e c u n d i t y h a v e b e e n r e p o r t e d f o r a w i d e v a r i e t y o f g a s t r o i n t e s t i n a l nema-t o d e s ( B r u n s d o n , 1964; D u n s m o r e , 1965) p a r t i c u l a r l y i n p o s t -p a r t u r i e n t dams ( C r o f t e n , 1958 ; C o n n a n , 1969 ) . R e m i t t e n t c y c l e s i n i n f e c t i o n s o f Bictyoeaulus viviparus, t h e c a t t l e l u n g w o r m , h a v e a l s o b e e n d o c u m e n t e d ( G u p t a and G i b b s , 1 9 7 0 ) . The s e a s o n a l e x p r e s s i o n o f a c t i v i t y i n Protostrongylus i n f e c -t i o n s o f c a p t i v e b i g h o r n s i s d e s c r i b e d i n t h i s s e c t i o n . b) E x p e r i m e n t a l F e c a l l a r v a l c o u n t s were made a t i r r e g u l a r i n t e r v a l s ( t w o t o f o u r w e e k s ) f r o m s i n g l e f e c a l s a m p l e s . A l t h o u g h B a e r m a n n ' s t e c h n i q u e i s c u s t o m a r i l y u s e d f o r l a r v a l c o u n t s , a m o d i f i e d z i n c s u l f a t e f l o t a t i o n m e t h o d ( F a u s t et al. 3 1939) was c h o s e n t o d e r i v e c o m p a r a t i v e v a l u e s f o r s e v e r a l p a r a s i t e s . The l u n g w o r m c o u n t s w e r e t h e c e n t e r o f i n t e r e s t i n t h i s s t u d y b u t o t h e r p a r a s i t e s were m o n i t o r e d t o e v a l u a t e t h e i r p o s s i b l e r o l e i n t h e o b s e r v e d r e s p o n s e . R e s u l t s w e r e e x p r e s s e d as t h e number o f l a r v a e - per- gram o f a i r - d r i e d -f e c e s . c) R e s u l t s and d i s c u s s i o n 18 F l u c t u a t i o n s o f f e c a l c o u n t s o f Protostrongylus l a r v a e w e r e d e t e c t e d i n t h e e x p e r i m e n t a l anima.ls ( F i g . 1 ) . I n f e c -t i o n a p p e a r e d t o i n v o l v e a m i n o r autumn and a m a j o r v e r n a l r e s u r g e n c e o f l a r v a l o u t p u t , a p a t t e r n p r e v i o u s l y o b s e r v e d i n c a p t i v e ( T h o m a s , u n d a t e d ) and f r e e - r a n g i n g b i g h o r n s h e e p ( F o r r e s t e r and S e n g e r , 1 9 6 4 b ) . A n i m a l s M and R showed h i g h l a r v a l c o u n t s d u r i n g t h e f i r s t y e a r o f t h e s t u d y ( 1 9 6 8 - 1 9 6 9 ) b u t t h e mean l e v e l and a m p l i t u d e o f f l u c t u a t i o n s w e r e c o n s i d e r a b l y r e d u c e d t h e f o l -Towi-ng-*year. I f Protostrongylus c o n f o r m s t o an i n d i r e c t l i f e c y c l e e m p l o y i n g t h e p r e s e n t l y s u g g e s t e d h o s t s ( P i l l m o r e , 1 9 5 8 ) , r e i n f e c t i o n s h o u l d n o t h a v e o c c u r r e d . B a s e d on t h i s p r e m i s e , c o n t i n u e d l a r v a l p r o d u c t i o n may be a t t r i b u t e d t o a l o n g - l i v e d p o p u l a t i o n o f a d u l t worms. The r e g r e s s i o n o f p a r a s i t e a c t i v i t y i n t h e f i n a l y e a r o f t h e s t u d y may r e f l e c t t h e l o s s o f p a r t o f t h i s a d u l t p o p u l a t i o n . C o u n t s r e m a i n e d low i n a n i m a l s 780 and 781. The d i f -f e r e n c e b e t w e e n t h e s e a n i m a l s and R and M may r e f l e c t t h e i n f e c t i v i t y o f t h e r a n g e s p r i o r t o c a p t u r e . The i n i t i a l two a n i m a l s w e r e c a p t u r e d a t S t o d d a r t C r e e k i n 1965 when m o r t a l -i t i e s due t o t h e l u n g w o r m p n e u m o n i a c o m p l e x w e r e h i g h i n t h e E a s t K o o t e n a y r e g i o n . The o t h e r s ( 780 and 781) w e r e c a p t u r e d on t h ' e ' M o r r i s e y - W i gwam r a n g e f r o m a p o p u l a t i o n w h i c h had n o t 5000 4000 3000 2000 1000 ° 1968-69 o 1969-70 • 1968-69 I o 1969-70 / leo • \ o o " o e e 0 S 0 N D J F M A M J J A S 0 N D J F M A M J J A 5000 r 4000 3000 2000 1000 780 o 1969-70 O Q Q CP Q O O Q  S O N D J F M A M J J A Months 781 o 1969-70 e © o S O N D J F M A M J J A Months F i g . 1 Seasonal c y c l e s of Protostrongylus i n c a p t i v e bighorns r e -f l e c t e d i n f e c a l l a r v a l counts. 20 r e c e n t l y e x p e r i e n c e d a s i g n i f i c a n t d i s e a s e o u t b r e a k . A t o t a l o f f i v e s e a s o n a l c y c l e s w e r e a v a i l a b l e f o r s t u d y . Of t h e s e , o n l y two c y c l e s showed c o n s i d e r a b l e a m p l i -t u d e (R and M i n 1 9 6 8 - 1 9 6 9 ) . The o t h e r t h r e e c y c l e s s e r v e d as c o n t r o l s t o d e m o n s t r a t e t h a t c h a n g e s i n i m m u n o l o g i c p a r a -m e t e r s w e r e r e l a t e d t o p a r a s i t i s m r a t h e r t h a n t o s e a s o n a l f a c t o r s . 2. L o c a l r e s p o n s e s a) I n t r o d u c t i o n Any. a t t e m p t t.o d e t e r m i n e t h e mode o f t h e a l l e r g i c r e s -p o n s e m e d i a t i n g a c q u i r e d i m m u n i t y i s s u b j e c t t o c e r t a i n d i f -f i c u l t i e s . The d e m o n s t r a t i o n o f an a l l e r g i c r e a c t i o n u s i n g s e r u m and c e l l s f r o m a p a r a s i t i z e d h o s t does n o t i n f e r t h a t i t i s a n y t h i n g more t h a n a c o i n c i d e n t a l e x p r e s s i o n o f i n f e c -t i o n s i n c e i t may n o t be r e l e v a n t t o t h e r e a c t i o n o p e r a t i n g a t t h e s i t e o f i n f e c t i o n . To g a i n a d d i t i o n a l i n f e r e n c e s a b o u t t h e immune r e s p o n s e in vivo, b o t h t h e l u n g l e s i o n and t h e l o c a l c u t a n e o u s r e s p o n s e t o t h e p r e s e n c e o f p a r a s i t e a n t i g e n w e r e e x a m i n e d . b) E x p e r i m e n t a l A l t h o u g h no d e t a i l e d a t t e m p t was made i n t h i s s t u d y t o e s t a b l i s h s e a s o n a l r e a c t i v i t i e s t o p a r a s i t i s m , two a n i m a l s (M and R) we r e c h a l l e n g e d i n t r a d e r m a l l y w i t h l a r v a l a n t i g e n s 21 d u r i n g t h e r e s t r i c t i o n o f p a r a s i t e a c t i v i t y f o l l o w i n g t h e " s p r i n g r i s e " ( s e c . ( d ) , page 6 3 ) . The r e s p o n s e was e v a l -u a t e d s u b j e c t i v e l y a t i n t e r v a l s up t o s e v e n t y - t w o h o u r s t o s e r v e as a p r e l i m i n a r y c r i t e r i o n f o r f u r t h e r e x p e r i m e n t a t i o n . The r e s p o n s e t o a c t u a l i n f e c t i o n was e x a m i n e d by p r e -p a r i n g i m p r e s s i o n s m e a r s o f l e s i o n s e x c i s e d f r o m t h e l u n g s o f w i l d b i g h o r n s . T h e s e i m p r e s s i o n s were t h e n s t a i n e d w i t h L e i s h m a n ' s and m e t h y l g r e e n - p y r o n i n e . L e s i o n s were a l s o ex-t r a c t e d w i t h an i s o t o n i c s u c r o s e s o l u t i o n and s u b j e c t e d t o 4 u l t r a v i o l e t s p e c t r o p h o t o m e t r i c s c a n n i n g , c ) * R e s u l t s and d i s c u s s i o n ( 1 ) C u t a n e o u s h y p e r s e n s i t i v i t y S k i n r e a c t i o n s were q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r i n b o t h a n i -m a l s b u t more i n t e n s e i n M. The i m m e d i a t e r e a c t i o n ( o n e h a l f h o u r f o l l o w i n g c h a l l e n g e ) was s l i g h t . S i n c e r e a c t i v i t y a t f o u r t o s i x h o u r s was n o t m a r k e d , t h e A r t h u s c o m p o n e n t a p p a r e n t l y p l a y e d o n l y a m i n o r r o l e . From t w e n t y - f o u r t o s e v e n t y - t w o h o u r s , t h e c h a l l e n g e d s i t e became i n d u r a t e d p r e -s u m a b l y as a r e s u l t o f a e e l 1 - m e d i a t e d r e s p o n s e ( d e l a y e d ' h y p e r s e n s i t i v i t y ) . T h i s e x p e r i m e n t s u g g e s t e d t h a t any o f t h e a l l e r g i c m e c h a n i s m s may o p e r a t e i n t h e r e s p o n s e t o l u n g -worm i n f e c t i o n s . 4 S p e c t r o n i c 8 0 0 , U n i c a m , C a m b r i d g e . 22 S k i n t e s t i n g w i t h a l l e r g e n s i s a c l a s s i c a l t e c h n i q u e f o r d e m o n s t r a t i n g and c l a s s i f y i n g a l l e r g i c r e a c t i v i t y . How-e v e r , t h i s m e t h od was u n s a t i s f a c t o r y f o r e x a m i n i n g h y p e r s e n -s i t i v i t y i n Protostrongylus i n f e c t i o n s . In a d d i t i o n t o t h e t e c h n i c a l d i f f i c u l t i e s o f r e s t r a i n i n g t h e a n i m a l s f o r p r o -l o n g e d p e r i o d s , p r e p a r i n g s a t i s f a c t o r y t e s t s i t e s and v i s u a l -i z i n g t h e f i n a l r e a c t i o n , s e v e r a l b i o l o g i c a l p r o b l e m s w e r e p r e s e n t . Q u a n t i t a t i v e e v a l u a t i o n o f r e a c t i v i t y was d i f f i -c u l t s i n c e more t h a n one immune m e c h a n i s m was o p e r a t i n g . F o r e x a m p l e , U h r ( 1 9 6 6 ) r e p o r t e d t h a t an i m m e d i a t e - t y p e s k i n r e a c -t i o n may p r e - e m p t t h e s k i n t e s t s i t e and p r e v e n t t h e s u b s e -q u e n t d e v e l o p m e n t o f a d e l a y e d r e a c t i o n . In a d d i t i o n , t h e d a n g e r e x i s t e d t h a t r e p e a t e d c h a l l e n g e w i t h a n t i g e n may a l t e r h o s t s e n s i t i v i t y and t h a t t h e a n i o n i c dye u s e d i n t h i s t e s t may a f f e c t i n f l a m m a t o r y p r o c e s s e s ( R e g e l s o n , 1 9 6 8 ) . ( 2 ) L u n g l e s i o n s A c h r o n i c p a t h o l o g y c h a r a c t e r i z e d by l o c a l i z e d i n d u r a t e d n o d u l e s was n o t e d i n t h e l u n g s e x a m i n e d f r o m a number o f p a r -a s i t i z e d b i g h o r n s . I m p r i n t s o f t h e l e s i o n s , s t a i n e d w i t h L e i s h m a n ' s showed a m a r k e d a c c u m u l a t i o n o f m o n o n u c l e a r c e l l s ( F i g . 2 ) . The l e s i o n s f r o m one h e a v i l y p a r a s i t i z e d ewe r e -v e a l e d a c o n s i d e r a b l e i n f i l t r a t i o n o f e o s i n o p h i l s a n d , when s t a i n e d w i t h m e t h y l g r e e n - p y r o n i n e , showed t h e p r e s e n c e o f a s t r o n g l y p y r o n i n o p h i 1 i c s u b s t a n c e ( F i g . 3 ) . T h i s m a t e r i a l , F i g . 3 Lungworm l e s i o n s t a i n e d with methyl green-pyronine r e v e a l i n g the presence of a p y r o n i n o p h i l i c substance ( s t a i n e d red) (approx. 200x). when e x t r a c t e d , s h o w e d a m e t a c h r o m a t i c r e a c t i o n w i t h a c r i d i n ' e o r a n g e a n d a s t r o n g r e a c t i o n w i t h n i n h y d r i n a n d b i u r e t . T h e u 1 t r a v i o l e t s p e c t r u m o f t h e u n f r a c t i o n a t e d l e s i o n e x t r a c t s u g g e s t e d t h e p r e s e n c e o f b o t h n u c l e i c a c i d s a n d p r o t e i n s ( F i g . 4 ) . T h e s i g n i f i c a n c e o f f r e e n u c l e i c a c i d i n t h e a c t i v e l e s i o n s o f t h i s a n i m a l i s u n k n o w n ( s e c t i o n ( b ) , page 1 1 1 ) . S e v e r a l o t h e r b i g h o r n s w i t h l i g h t p a r a s i t e i n f e c t i o n s d i d n o t show t h e p r e s e n c e o f t h i s m ' a t e r i a l . Two d i s t i n c t r e s p o n s e s t o l u n g w o r m i n f e c t i o n s h a v e b e e n d e s c r i b e d ( H o n e s s , 1 9 4 2 ) . T h e f i r s t , u s u a l l y f o u n d i n y o u n g a n i m a l s i s m a n i f e s t .by i n t e n s e i n f l a m m a -t i o n i n t h e l o w e r h a l v e s o f t h e d i a p h r a g m a t i c l o b e s p r o -d u c i n g c o n s o l i d a t i o n a n d f i b r o u s a d h e s i o n s . P u l m o n a r y o e d e m a i s c o m m o n l y n o t e d . T h e c h r o n i c r e s p o n s e f o u n d i n o l d e r a n i m a l s i s c h a r a c t e r i z e d b y a r e a s o f i n d u r a t i o n g e n e r a l l y r e s t r i c t e d t o t h e d o r s a l b o r d e r s . T h e s e a r e a s o f i n d u r a t i o n a r e m a n i f e s t a t i o n s o f g r a n u l o m a f o r m a t i o n . G r a n u l o m a t a , w h i c h a r e c i r c u m -s c r i b e d i n f l a m m a t o r y r e a c t i o n s , c a n be c l a s s i f i e d i n t o h y p e r s e n s i t i v e a n d f o r e i g n b o d y t y p e s . T h e p r o t o t y p e o f t h e h y p e r s e n s i t i v e t y p e i s t h e t u b e r c u l i n l e s i o n . T h e f o r e i g n b o d y r e s p o n s e i s i n i t i a t e d b y c e r t a i n p a r t i c u l a t e s u b s t a n c e s s u c h as s i l i c a , 25 225 250 275 300 Wavelength (nm) F i g . 4 U l t r a v i o l e t spectrum of an e x t r a c t of- Protostrongylus lung l e s i o n s which s t a i n e d intensely...with pyronine. 26 k a o l i n o r b e r y l l i u m o x i d e ( P r e s e n t , L i n d n e r and O a n o w i t z , 1966} which, a c t i v a t e v a r i o u s f a c t o r s p r o m o t i n g c e l l u l a r a c c u m u l a t i o n ( K e l 1 e r r n e y e r and W a r r e n , 1 9 7 0 ) . The c e l l u l a r i n f i l t r a t e i n p a r a s i t e l e s i o n s i s c o m p r i s -ed p r i m a r i l y o f l y m p h o c y t e s , m o n o c y t e s and o c c a s i o n a l l y e o s -i n o p h i l s ( H o n e s s , 1 9 4 2 ) , T h i s may p r o g r e s s t o assume t h e ap-p e a r a n c e o f l y m p h o i d t i s s u e e v e n w i t h w e l l d e v e l o p e d g e r m i n a l c e n t e r s ( P o y n t e r , 1 9 6 6 ) . S o u T s b y ( p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) s u g g e s t e d t h a t t h i s i s an e x p r e s s i o n o f d e l a y e d - t y p e h y p e r -s e n s i t i v i t y . 3. Immunoglobu1 i n s a) I m m u n o g l o b u l i n q u a r i t i t a t i on ( 1 ) I n t r o d u c t i o n In man, f i v e h e a v y c h a i n c l a s s e s ( I g A , IgM, I g G , I g D , and I g E ) h a v e b e e n d e s c r i b e d . In r u m i n a n t s , o n l y f o u r h a v e b e e n c o n c l u s i v e l y i d e n t i f i e d ( B u t l e r , 1 9 6 9 ) . By a n a l o g y t o human i m m u n o g l o b u l i n s ( C o h e n , 1 9 6 5 ) , t h e y h a v e b e e n named I g A , IgM, IgG-j and IgG,,. P r e r e q u i s i t e t o an u n d e r s t a n d i n g o f immune p r o c e s s e s i s t h e k n o w l e d g e o f t h e b e h a v i o r o f t h e s e . c l a s s e s in v i t r o . W i t h t h i s i n f o r m a t i o n t h e y c a n be q u a n t i -f i e d ( s e c . b ) , page 44) and t h e i r r o l e i n a l l e r g i c r e a c t i o n s c a n be s t u d i e d ( s e c . 5, page 6 1 ; s e c . b ) , page 1 0 6 ) . To e x a m i n e t h e d y n a m i c s o f t h e i m m u n o g l o b u l i n r e s p o n s e t o p a r a s i t i s m , t h e p r e p a r a t i o n o f H - c h a i n s p e c i f i c a n t i s e r a 27 was a t t e m p t e d . P r o l o n g e d i m m u n i z a t i o n w i t h e a c h o f t h e im-m u n o g l o b u l i n i s o t y p e s i n a d j u v a n t was r e q u i r e d f o r t h e r e c o g -n i t i o n o f c l a s s - s p e c i f i c d e t e r m i n a n t s . S u c h i m m u n i z a t i o n s c h e d u l e s r e s u l t e d i n t h e d e t e c t i o n o f t r a c e c o n t a m i n a n t s i n a d m i n i s t e r e d a n t i g e n s w h i c h r e n d e r e d t h e a n t i s e r a u n s u i t a b l e f o r s i n g l e r a d i a l i m m u n o d i f f u s i o n . In t h i s s e c t i o n an a l t e r -n a t i v e p r o c e d u r e i s d e s c r i b e d f o r t h e c l i n i c a l q u a n t i t a t i o n o f o v i n e • immuno.gl o b u l i ns . (2) E x p e r i m e n t a l ( a ) P r e p a r a t i o n o f a n t i s e r a The y - g 1 o b u l i n - e n r i c h e d a n t i g e n was p r e p a r e d by t h e p r e c i p i t a t i o n o f w h o l e s h e e p s e r u m w i t h t h i r t y - t h r e e p e r c e n t • s a t u r a t e d ammonium s u l f a t e , pH 8.2 ( S t e l o s , 1 9 6 7 ) . The p r e -c i p i t a t e was s u s p e n d e d i n d i s t i l l e d w a t e r and d i a l y s e d a g a i n s t r e p e a t e d c h a n g e s o f b u f f e r e d ( 0.01 M p h o s p h a t e , pH 7.5) s a l i n e ( P B S ) t o remove t h e ammonium s a l t . W h i t e r a b b i t s w e r e i n j e c t e d s u b c u t a n e o u s l y w i t h 0.5 ml o f a two p e r c e n t s o l u t i o n o f a n t i g e n e m u l s i f i e d w i t h an e q u a l v o l u m e o f 5 F r e u n d ' s c o m p l e t e a d j u v a n t . The a n i m a l s w e r e i n j e c t e d a t f i v e week i n t e r v a l s a n d b l o o d was drawn two weeks a f t e r e a c h i n j e c t i o n . A b s o r p t i o n s o f p o l y s p e c i f i c a n t i s e r a w e r e D i f c o , D e t r o i t , M i c h . 28 c o n d u c t e d as shown i n T a b l e I . The c h o i c e o f an a b s o r b i n g . a n t i g e n d e p e n d e d on t h e s p e c i f i c i t y o f e a c h a n t i s e r u m . ( b ) P u r i f i c a t i o n o f i m m u n o g l o b u l i n c l a s s s t a n d a r d s The f r a c t i o n a t i o n o f o v i n e s e r u m i m m u n o g l o b u l i n s was b a s e d cn t h e i r s i z e , i o n i c c h a r g e and c h e m i c a l p r o p e r t i e s . P u r i f i c a t i o n o f IgG-j and I g G 2 was e f f e c t e d by t h e i n i t i a l r e a c t i o n o f w h o l e s e r u m w i t h an e q u a l v o l u m e o f T.5 p e r c e n t e t h a c r i d i n e l a c t a t e ^ a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e o f S a g a n ( 1 9 6 8 ) . A f t e r g e n t l e m i x i n g t h e s o l u t i o n was i n c u b a t e d a t 2 2 ° C f o r two h o u r s . E t h a c r i d i n e was f i l t e r e d f r o m t h e s u p e r -n a t a n t f o l l o w i n g p r e c i p i t a t i o n w i t h f i v e p e r c e n t (w/v) s o d i u m c h l o r i d e . The c l e a r e d s o l u t i o n was t h e n d i a l y s e d a g a i n s t 0.0175 M s o d i u m p h o s p h a t e (pH 6.3) and a p p l i e d t o a c o l u m n o f D E A E - S e p h a d e x A - 5 0 ^ e q u i l i b r a t e d w i t h t h e same b u f f e r . S l o w IgG ( I g ) was e l u t e d as a b r e a k t h r o u g h p e a k . A f t e r w a s h i n g t h e c o l u m n w i t h t h e i n i t i a l b u f f e r , f a s t IgG (IgG-j) was e l u t e d w i t h 0.1 M s o d i u m p h o s p h a t e , pH 5.8. F o r t h e i s o l a t i o n o f IgM, e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y on S e p h a d e x G-200 was c o n d u c t e d a c c o r d i n g t o P o r a t h and F l o d i n ( 1 9 6 2 ) u s i n g 0.1 M t r i s 8 - H C l b u f f e r (pH 8.0) c o n t a i n i n g 1 M 6 R i v a n o l ; 6 , 9 - d i a m i n o - 2 - e t h o x y a c r i d i n e l a c t a t e , K. & K. L a b o r a t o r i e s , P l a i n v i e w , N.Y. ^ P h a r m a c i a , U p p s a l a . o T r i s ( h y d r o x y m e t h y 1 ) a m i n o m e t h a n e , F i s h e r , F a i r l a w n , N . J . 29 TABLE I ABSORPTION OF POLYSPECIFIC ANTTSERA Antiserum s p e c i f i c i t y Absorbing antigen P r e p a r a t i o n of a n t i g e n 3 IgG 1, IgA, IgM IgG 2 . IgA, IgM i g G 2 IgG,, IgA & IgM I g G 1 , I g G 2 t r a n s f e r r i n Serum a o p l i e d to DEAE-Sephadex; 0.0175 M P G 4 , pH 6.3 DEAE-Sephadex; 0.4 M, pH 5.8 b Supernatant from treatment of serum with 0.75% e t h a c r i d i n e l a c t a t e a A l l antigen p r e p a r a t i o n s were concentrated by pressure d i a l y s i s . ^The column must be thoroughly washed with 0.0175 M P04 a f t e r serum a p p l i c a t i o n to remove IgG 9. 30 s o d i u m c h l o r i d e . A 5 cm x 100 cm c o l u m n w i t h u p w a r d f l o w e l u t i o n was u s e d . Serum was d i a l y s e d a g a i n s t one p e r c e n t b o r i c a c i d o r 0.01 M p h o s p h a t e b u f f e r (pH 6 . 3 ) . The r e s u l t -i n g . w h i t e p r e c i p i t a t e was d i s s o l v e d i n e l u t i n g b u f f e r and a p p l i e d t o t h e c o l u m n . The i n i t i a l peak was c o l l e c t e d , e q u i -q i i b r a t e d 8 w i t h PBS and c o n c e n t r a t e d by p r e s s u r e d i a l y s i s . S i n c e t h e p r e p a r a t i o n was n o t p a r t i c u l a r l y s t a b l e , b o t h -Immunol og-i-c a n d pro-te-in d e t e r m i n a t i o n s were- c o n d u c t e d immed-i a t e l y upon p u r i f i c a t i o n . ( c ) I m m u n o e l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s A m o d i f i c a t i o n o f mi cro-immun.oel e c t r o p h o r e s i s a c c o r d i n g t o S c h e i d e g g e r ( 1 9 5 5 ) was s e l e c t e d u s i n g two p e r c e n t a g a r ^ c o n t a i n i n g 0.1 p e r c e n t s o d i u m a z i d e i n s o d i u m b a r b i t a l - H C l b u f f e r , pH 8.3, 1=0.033. C o m p a r a t i v e t e c h n i q u e s o f W a d s w o r t h and H a n s o n ( 1 9 6 0 ) w e r e u s e d t o c o n f i r m t h e i d e n t i t y o f c e r -t a i n f r a c t i o n s . ( d ) I m m u n o g l o b u l i n q u a n t i t a t i o n Q u a n t i t a t i v e m i c r o - i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s was m o d i f i e d f r o m t h e m e t h o d o f A f o n s o and P r o e n c a ( 1 9 6 8 ) . A g a r g e l e l e c -t r o p h o r e s i s was c o n d u c t e d as b e f o r e w i t h a c u r r e n t o f 2.5 ma q D i a f l o , Ami c o n , L e x i n g t o n , M a s s . ^ N o b l e , S p e c i a l a g a r , D i f c o , D e t r o i t . '31 p e r m i c r o s 1 i d e . E l e c t r o p h o r e t i c d i s p e r s i o n was t e r m i n a t e d when t h e a l b u m i n - b o u n d t r a c k i n g d y e , b r o m p h e n o l b l u e , had m i g r a t e d 1.5 cm f r o m t h e o r i g i n . F o l l o w i n g e l e c t r o p h o r e s i s , a t r i m m e d f i l t e r paper''"' e x a c t l y o n e - h a l f t h e l e n g t h o f t h e m i c r o s l i d e was 'dipped i n t o a s o l u t i o n - o f 1M N a C l and 0.01 M s o d i u m a z i d e , b l o t t e d and p l a c e d o v e r t h e g-2 and y r e g i o n o f t h e s l i d e . F o l l o w i n g f i v e h o u r s o f p r e - d i f f u s i o n , 0.15 ml o f a p p r o p r i a t e l y a b s o r b e d and d i l u t e d a n t i s e r u m was e v e n l y a p p l i e d t o t h e f i l t e r p a p e r . The s l i d e s w e r e t h e n i n c u b a t e d i n a h u m i d box f o r s i x d a y s . A f t e r t h i s t h e y w e r e d r i e d , w a s h e d i n s a l i n e f o r t w e n t y - f o u r h o u r s , s t a i n e d w i t h a mido b l a c k and f i n a l l y d e s t a i n e d i n s e v e n p e r c e n t a c e t i c a c i d . The a r e a s o f p r e c i p i t a t e r i n g s were d e t e r m i n e d u s i n g 1 2 a p h o t o - e n 1 a r g e r . M a g n i f i e d i m a g e s were p r o j e c t e d o n t o c h r o m a t o g r a p h i c p a p e r and e x p r e s s e d as p a p e r w e i g h t o f t h e t r a n s c r i b e d d i s c s . T h i s m e t h od has b e e n shown t o be one o f c h o i c e f o r i m m u n o d i f f u s i o n s t u d i e s ( S c h m i d , 1 9 6 9 ) . ( 3 ) R e s u l t s and d i s c u s s i o n ( a ) P u r i f i c a t i o n o f immuno-g l o b u l i n s t a n d a r d s S e p a r a t i o n o f t h e m a j o r i m m u n o g l o b u l i n s CFig. 5) was b a s e d on b o t h i o n i c c h a r g e and c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s ^ W h a t m a n #1, W. and R. B a l s t o n L t d . , E n g l a n d . 12 M o d e l I I , M i n o x GMBH, G i e s s e n , Germany. 32 F i g . 5 I m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s o f the 4 major o v i n e i m m u n o g l o b u l i n s . D i s t i n c t d e t e r m i n a n t s on I g G 9 can be seen as a r e v e r s e s p u r ( a ) . Serum D i a l y s i s - 1% b o r i c a c i d I P r e c i p i t a t e Peak I Sephadex G-200 IgM 0.75% e t h a c r i d i n e l a c t a t e I DEAE-Sephadex 0.0175 Ms' pH 6.3 \ 0.1 M, pH 5.8 I IgG, IgG 1 F i g . 6 S c h e m a t i c p r o c e d u r e f o r t h e f r a c t i o n a t i o n o f t h e immuno-g l o b u l i n s . 33 ( F i g . 6 ) . S t r i c t p u r i f i c a t i o n c o u l d n o t be o b t a i n e d w i t h i o n e x c h a n g e r s o r . p r e p a r a t i v e e l e c t r o p h o r e s i s b e c a u s e o f t h e g r e a t c h a r g e h e t e r o g e n e i t y o f t h e i m m u n o g l o b u l i n s . A l l c l a s s e s were e l u t e d o v e r w i d e r a n g e s o f pH and i o n i c c o n c e n -t r a t i o n f r o m b o t h DEAE- and CM- S e p h a d e x . E t h a c r i d i n e l a c -t a t e was f o u n d t o p r e c i p i t a t e most s e r u m p r o t e i n s l e a v i n g t r a n s f e r r i n , IgG-j and I g G 2 i n t h e s u p e r n a t a n t . By d i s s o l v i n g t h e p r e c i p i t a t e i n 0.2 M a c e t a t e b u f f e r (p.H 5.0) and s u b -j e c t i n g t h e p r e p a r a t i o n t o i m m u n o e - l e c t r o p h o r e s i s , an IgG-j p o p u l a t i o n was d e t e c t e d . H o w e v e r , i t was n o t r e c o g n i z e d as b e i n g a n t i g e n i c a l l y d i s t i n c t s i n c e a b s o r p t i o n w i t h t h e e t h a -c r i d i n e s u p e r n a t a n t f r a c t i o n c o m p l e t e l y e l i m i n a t e d IgG-j and I g G 2 r e a c t i v i t y ( F i g . 7 ) . H i g h l y p u r i f i e d IgG f r a c t i o n s w ere o b t a i n e d by s u b s e q u e n t a n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f t h e p r o t e i n s r e m a i n i n g i n t h e s u p e r n a t a n t . On t h e b a s i s o f i t s g r e a t e r m o l e c u l a r s i z e , IgM c o u l d be i s o l a t e d by e x c l u s i o n c h r o m a t o g r a p h y on S e p h a d e x G-200 o f t h e e u g l o b u l i n o r b o r i c a c i d p r e c i p i t a t e f r o m w h o l e s e r u m . The i n i t i a l d i a l y s i s s t e p ( F i g . 8) m i n i m i z e d c o n t a m i n a t i o n o f t h e s t a n d a r d w i t h a - 2 m a c r o g l o b u l i n . P r e s s u r e d i a l y s i s r e d u c e d d e n a t u r a t i o n d u r i n g c o n c e n t r a t i o n o f t h e IgM p r e -p a r a t i o n . I m m u n o g l o b u l i n A, f r e e o f IgG-j - c o u l d n o t be o b t a i n e d by DEAE- o r CM- i o n exchange.. A l s o , t r e a t m e n t o f d e . l i p . i -d i z e d s e r u m w i t h r e a c t i v e z i n c ( B a d i n , T r e n s z and R o u s s e l e t , F i g . 7 A b s o r p t i o n o f m u l t i s p e c i f i c a n t i s e r u m w i t h e t h a c r i d i n e s o l u b l e p r o t e i n s . The lower t r o u g h c o n t a i n e d unabsorbed a n t i s e r u m . The upper c o n t a i n e d the same a n t i s e r u m f o l l o w -i n g a b s o r p t i o n . 35 F i g . 8 P u r i f i c a t i o n o f IgM s h o w i n g t h e e n r i c h m e n t o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n a c h i e v e d by p r e -c i p i t a t i o n i n low i o n i c s t r e n g t h s o l u t i o n s . a) C h r o m a t o g r a m o f w h o l e s e r u m on S e p h a d e x G-200. b) E u g l o b u l i n p r e c i p i t a t e . c ) P s e u d o g l o b u l i n s u p e r n a t a n t . ' — — 1 • • 1 • , I _ • . I 4 1 i I _ 2 4 6 8 10 1 2 14 16 18 20 22 24 26 • . - Tu b e number 37 1968) d i d n o t a l l o w p u r i f i c a t i o n . W i t h o u t a s a t i s f a c t o r y s t a n d a r d o n l y s e m i - q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f IgA c o u l d be a c h i e v e d . ( b ) Q u a n t i t a t i v e I m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s I n t e r e s t i n t h i s s t u d y c e n t e r e d on t h e f o u r m a j o r rum-i n a n t i m m u n o g l o b u l i n s ( A a l u n d , O s e b o l d and M u r p h y , 1 9 6 5 ) . H o w e v e r , s e v e r a l a n t i s e r a w i t h p o s s i b l e s u b c l a s s s p e c i f i c -i t i e s w ere o b t a i n e d a f t e r p r o l o n g e d i m m u n i z a t i o n ( t e n m o n t h s ) . An I g G 2 s u b c l a s s w h i c h may r e p r e s e n t t h e m i n o r d e l t a and e p s i l o n s u b g r o u p s o f Pan et al. ( 1 9 6 8 ) was d e t e c t e d ( F i g . 9 ) . A n o t h e r a n t i s e r u m c o n s i s t e n t l y p r o d u c e d a d o u b l e p r e c i p i t i n a r c w i t h IgM ( F i g . 1 0 ) . S i n c e a b s o r p t i o n w i t h IgG-j and I g G 2 d i d n o t a b s o r b t h i s a c t i v i t y , i t d i d n o t a p p e a r t o be a n a l -o g o u s t o 19S IgG r e p o r t e d i n t h e s e r u m o f p i g l e t s ( K i m , B r a d l e y and W a t s o n , 1968) o r t o be a r e s u l t o f t h e d e t e c t i o n o f < and x l i g h t c h a i n s ( B l a k e , 1 9 6 8 ) . S u b c l a s s e s o f IgM h a v e a l s o b e e n r e p o r t e d i n man ( M a c K e n z i e et al., 1969) and i n c a t t l e ( R a p a c z , K o r d a and S t o n e , 1968) a l t h o u g h t h e v a l -i d i t y o f t h e l a t t e r has b e e n q u e s t i o n e d ( B l a k e s l e e , 1 9 6 9 ) , O t h e r r e p o r t e d u n i q u e i m m u n o g l o b u l i n s u b c l a s s e s ( C u r t a i n , 1969; H e i m e r , C l a r k and M a u r e r , 1969) w e r e n o t d e t e c t e d . U n i q u e a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s on I g G 2 were m a n i f e s t by a r e v e r s e d s p u r b e t w e e n f a s t and s l o w IgG ( F i g . 5, page 3 2 ) . T h i s p e r m i t t e d t h e p r e p a r a t i o n o f a n t i s e r a w i t h n a r r o w e d F i g . 9 Detection of IgGp subclass determinants shown by the double p r e c i p i t a t e with whole sheep serum. F i g . 10 Detection of IgM subclass determinants with a polyvalent antiserum. Compare with the s i n g l e IgM arc i n F i g . 5 . 39 s p e c i f i c i t y by a b s o r p t i o n w i t h a f r a c t i o n c o n t a i n i n g . IgG-] and IgA e l u t e d f r o m D E A E - S e p h a d e x w i t h 0.25 M p h o s p h a t e (pH 5.8) ( F i g . l i b ) . P r o t e i n s s o l u b l e i n e t h a c r i d i n e l a c t a t e were u s e f u l f o r a b s o r p t i o n , r e n d e r i n g p o l y s p e c i f i c a n t i s e r a p r e d o m i n a n t l y r e a c t i v e t o IgA and IgM ( F i g . 1 1 c ) . T h i s a b s o r p t i o n a s sumed p a r t i c u l a r i m p o r t a n c e s i n c e IgG-j o f t e n masked t h e IgA p r e -c i p i t a t e . C r o s s - r e a c t i v i t y , due t o common d e t e r m i n a n t s on f a s t and s l o w I g G , was r e m o v e d w i t h t h e r e a d i l y p r e p a r e d IgG- f r a c t i o n . T h i s p r o d u c e d a n t i s e r a w h i c h f o r m e d c l e a r un-c o m p l i c a t e d p r e c i p i t a t e s w i t h IgG-j ( F i g . l i d ) . . A c o n s i d e r a b l e i m p r o v e m e n t i n b o t h t h e r a t e o f d e v e l o p -ment and t h e c l a r i t y o f p r e c i p i t a t e s was o b t a i n e d by p r e -d i f f u s i o n f o r f i v e h o u r s u s i n g 1 M s o d i u m c h l o r i d e w i t h s o d i u m a z i d e as a p r e s e r v a t i v e ( F i g . 1 2 ) . I n c r e a s i n g t h e e l e c t r o l y t e c o n c e n t r a t i o n , f r o m t h e low i o n i c s t r e n g t h u s e d i n e l e c t r o p h o r e s i s , a i d e d t h e r e - d i s s o l u t i o n and r e - f o r m a t i o n o f t h e p r e c i p i t a t e f r o n t as t h e s a m p l e a n t i g e n d i f f u s e d o u t w a r d . W i t h l a r g e a n t i g e n e x c e s s e s , s u c h as may o c c u r i n t h e s e r u m o f a n i m a l s i n c e r t a i n p a t h o l o g i c c o n d i t i o n s , t h e a r e a " o f t h e p r e c i p i t a t e d e p a r t e d f r o m a l i n e a r r e l a t i o n s h i p w i t h c o n c e n t r a t i o n . T h i s was c o r r e c t e d by p r o l o n g i n g i n c u b a t i o n o r by d i l u t i n g t h e s e r u m s a m p l e . E a c h a n t i s e r u m s y s t e m must be c a l i b r a t e d t o d e t e r m i n e w h a t r a n g e o f i m m u n o g l o b u l i n 40 b. d. F i g . 11 The i d e n t i f i c a t i o n o f p r e c i p i t a t e s d e v e l o p e d by absorbed a n t i s e r a : a) S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f superimposed p r e c i p i t a t e s ; b) I g G 2 • The f a i n t p r e c i p i t a t e o f p a r t i a l l y a b s o r b e d IgG, i s v i s i b l e ; c) IgA and IgM f o l l o w i n g com-p l e t e a b s o r p t i o n o f f a s t and slow IgG; d) I g G l . The sample a n t i g e n i n each c a s e was whole serum. 4 1 F i g . 12 The e f f e c t o f p r e d i f f u s i o n and i n c r e a s e d e l e c t r o l y t e c o n -c e n t r a t i o n on t h e c l a r i t y o f p r e c i p i t a t e s , a) Not p r e -d i f f u s e d , showing b r o a d p r e c i p i t a t e z o n e s , b) P r e -d i f f u s e d . F i g . 13 Sample d o s e - r e s p o n s e c u r v e s f o r each o f t h e serum immuno-g l o b u l i n s . 42 c o n c e n t r a t i o n s c a n be a c c u r a t e l y q u a n t i f i e d . U s u a l l y , 2 ml o f t e s t s e r u m ( d i l u t e d one t o f o u r w i t h b a r b i t a l - H C l b u f f e r ) and 0.15 ml o f a p p r o p r i a t e l y a b s o r b e d a n t i s e r u m , i n c u b a t e d f o r s i x d a y s , r e p r e s e n t e d s u i t a b l e c o n d i t i o n s f o r d e t e r m i n i n g I g G i and I g G ? v a l u e s i n s e r u m f r o m n o r m a l and most d i s e a s e d a n i m a l s . F o r d e t e r m i n i n g IgM and I g A , somewhat l a r g e r s a m p l e s and d i l u t e d a n t i s e r a were u s e d . W i t h a b a l a n c e d r a t i o o f a n t i g e n t o a n t i b o d y and a d e -q u a t e d i f f u s i o n t i m e , t h e o r d i n a t e i n t e r c e p t d i d n o t d e v i a t e g r e a t l y f r o m z e r o ( F i g . 1 3 ) . The mean i n t e r c e p t f o r e i g h t s t a n d a r d c u r v e s , c a l c u l a t e d f o r l i n e s f i t t e d by t h e m e t h od o f t h e l e a s t s q u a r e s , was 0.04 ± 0.055 f o r p r e c i p i t a t e v a l u e s f r o m 0 t o 0.66 u n i t s . W i t h l a r g e a n t i g e n t o a n t i b o d y r a t i o s , r e s u l t i n g i n v e r y l a r g e p r e c i p i t a t e s , n o n - l i n e a r i t y l e d t o e r r o n e o u s l y h i g h v a l u e s f o r t h e c a l c u l a t e d i n t e r c e p t . G e n e r a l l y , t h e m a g n i t u d e o f t h i s d e v i a t i o n was l e s s t h a n t h a t r e p o r t e d by M a n c i n i , C a r b o n a r a and Heremans ( 1 9 6 5 ) . F o u r e l e c t r o p h o r e t i c d i s t a n c e s ( 1 . 5 , 1.65, 2.09 and 2.29 cm) o f t h e y - g l o b u l i n r e g i o n w e r e a n a l y s e d t o d e t e r m i n e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e l e n g t h o f t h e e l e c t r o p h o r e t i c r u n and t h e f i n a l p r e c i p i t a t e a r e a . A h i g h l y s i g n i f i c a n t (p < 0.01) d i r e c t r e l a t i o n s h i p was o b t a i n e d . B e c a u s e o f t h e i n s t a b i l i t y o f p u r i f i e d p r e p a r a t i o n s , i m m u n o g l o b u l i n l e v e l s were d e t e r m i n e d f o r a c o n t r o l s e r u m . To a c c o u n t f o r t h e i n t e r - r u n v a r i a t i o n , d u p l i c a t e s o f t h i s s e r u m w e r e r o u t i n e l y i n c l u d e d . 43 N i n e t y s e p a r a t e d e t e r m i n a t i o n s were u s e d t o s t u d y r e -p r o d u c i b i l i t y and i n t e r - r u n v a r i a b i l i t y . When s l i d e s were p r e p a r e d f r o m t h e same b a t c h o f a g a r and e l e c t r o p h o r e t i c and d i f f u s i o n i n t e r v a l s were c a r e f u l l y s t a n d a r d i z e d , r u n e f f e c t s were f o u n d t o be n o n - s i g n i f i c a n t . The s t a n d a r d e r r o r o f i n d i v i d u a l d e t e r m i n a t i o n s r e p r e s e n t e d 6.3 p e r c e n t o f t h e mean. A c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n o f 7.8 p e r c e n t ( l O O s / x ) f o r t h e p r e s e n t p r o c e d u r e , was c o m p a r a b l e t o 7.5 p e r c e n t f o r s i n g l e r a d i a l i m m u n o d i f f u s i o n on c e l l u l o s e a c e t a t e s t r i p s ( V e r g a n i , S t a b i l i n i and A g o s t o n i , 1967) and s e v e n t o t e n p e r c e n t r e p o r t e d f o r a n t i b o d y - a g a r p l a t e s ( F a h e y and M c K e l v e y , 1 9 6 5 ) . ( c ) R e l a t i o n s h i p o f t h e immuno-g l o b u l i n s o f d o m e s t i c and R o c k y M o u n t a i n b i g h o r n s h e e p S erum p r o t e i n s o f b o t h b i g h o r n and d o m e s t i c s h e e p w e r e f o u n d t o be i n d i s t i n g u i s h a b l e on t h e b a s i s o f p h y s i c o -c h e m i c a l p r o p e r t i e s . A n t i s e r a p r e p a r e d i n r a b b i t s r e a c t e d s i m i l a r l y w i t h e i t h e r s p e c i e s . • . To e x a m i n e t h i s s e r o l o g i c a l r e l a t i o n s h i p more c l o s e l y , t h r e e d o m e s t i c s h e e p were i n j e c t e d s u b c u t a n e o u s l y i n t o t h e d r a i n a g e a r e a o f t h e s u p e r f i c i a l c e r v i c a l lymph node w i t h p o o l e d b i g h o r n s e r u m e m u l s i f i e d i n an e q u a l v o l u m e o f com^-p l e t e F r e u n d ' s a d j u v a n t . A t o t a l o f t h r e e 5 ml i n j e c t i o n s w e r e made a t t e n day i n t e r v a l s . Two weeks f o l l o w i n g t h e 44 f i n a l i n j e c t i o n , s e r a were o b t a i n e d and t e s t e d a g a i n s t p o o l e d b i g h o r n s h e e p s e r u m . In e a c h c a s e no r e a c t i o n was o b s e r v e d e x c e p t f o r a s l i g h t p r e c i p i t a t e w i t h 3 - 1 i p o p r o t e i n p r o d u c e d by one a n t i s e r u m . The s e r u m p r o t e i n s o f d o m e s t i c and b i g h o r n s h e e p a r e a p p a r e n t l y v e r y c l o s e l y r e l a t e d s e r o l o g i c a l l y a l -t h o u g h more r i g o r o u s i m m u n i z a t i o n s c h e d u l e s w o u l d u n d o u b t e d l y r e s u l t i n t h e d e t e c t i o n o f a l l o t y p e s o f v a r i o u s s e r u m p r o -t e i n s ( H i l d e m a n n , 1 9 7 0 ) . b) I m m u n o g l o b u l i n r e s p o n s e ( 1 ) I n t r o d u c t i o n A l t h o u g h t h e s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f r u m i n a n t i m m u n o g l o b u l i n s h a v e b e e n i n t e n s i v e l y s t u d i e d , l e s s i s known a b o u t t h e i r r e s p o n s e i n d i s e a s e s t a t e s ( B u t l e r , 1 9 6 9 ) . T h i s p a r t o f t h e s t u d y was c o n d u c t e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e i m m u n o g l o b u l i n s c o u l d be u s e d t o m o n i t o r p a r a s i t e a c t i v i t y i n w i l d s h e e p and t o e x a m i n e w h e t h e r c h a n g e s i n a n t i b o d y a c t i v i t y w e r e p a r a l l e l e d by c h a n g e s i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f s p e c i f i c i m m u n o g l o b u l i n s . ( 2 ) E x p e r i m e n t a l I m m u n o g l o b u l i n l e v e l s w e r e d e t e r m i n e d f o r t h e e x p e r i -m e n t a l a n i m a l s , t h r o u g h o u t t h e s e a s o n a l c y c l e o f p a r a s i t e a c t i v i t y , u s i n g t h e t e c h n i q u e d e s c r i b e d i n s e c . 3.a, p g . 26. 45 R e s u l t s o f q u a n t i t a t i v e s t u d i e s o f t h e i m m u n o g l o b u l i n s a r e d i f f i c u l t t o c o m p a r e s i n c e t h e m e t h o d s u s e d f o r c a l i b r a -t i o n a r e o f t e n n o t a d e q u a t e l y d e s c r i b e d . In t h i s s t u d y , p u r i f i e d i m m u n o g l o b u l i n s t a n d a r d s w e r e m e a s u r e d by a s s u m i n g t h e f o l l o w i n g a b s o r p t i o n c h a r a c t e r i s t i c s u s e d by C h a m b e r l a i n , S h a p l a n d and R o i t t ( 1 9 7 0 ) : r0. . 5.. cm 280 nm ° - ] = 1 3 9 ( 3 ) R e s u l t s and d i s c u s s i o n 9 ( a ) E n v i r o n m e n t a l e f f e c t s A c l e a r a s s o c i a t i o n b e t w e e n i m m u n o g l o b u l i n l e v e l s and p a r a s i t i s m was n o t e v i d e n t i n t h e e x p e r i m e n t a l b i g h o r n s h e e p ( F i g . 1 4 a - d ) . D u r i n g t h e more m a r k e d p a r a s i t e c y c l e o f 1968-1969, M and R e v e n t e n d e d t o e x h i b i t a d e p r e s s i o n d u r i n g t h e s p r i n g r i s e . Mean l e v e l s f r o m s a m p l e d e t e r m i n a t i o n s , d i s -t r i b u t e d e v e n l y t h r o u g h o u t t h e y e a r ( o n e e a c h m o n t h ) , d i d . n o t d i s c l o s e m a r k e d d i f f e r e n c e s b e t w e e n y e a r s i n t h e one ewe (M) w h e r e t h i s c o m p a r i s o n c o u l d be made ( T a b l e I I ) . S i m i l a r - r l y , c o m p a r i s o n s among a n i m a l s d i d n o t r e v e a l d i f f e r e n c e s t h a t c o u l d be r e l a t e d t o p a r a s i t i s m . A p p a r e n t l y Protostron-gylus c o n s t i t u t e d o n l y a m i n o r p a r t o f t h e t o t a l " a n t i g e n i c e n v i r o n m e n t " o f t h e a n i m a l s u s e d i n t h i s s t u d y . Serum immuno-g l o b u l i n s do n o t a p p e a r t o be s u f f i c i e n t l y s e n s i t i v e t o m o n i -t o r s u b c l i n i c a l i n f e c t i o n s o f t h i s p a r a s i t e i n w i l d s h e e p . 46 F i g . 1 4 a - d I m m u n o g l o b u l i n l e v e l s o f c a p t i v e b i g h o r n s h e e p s h o w i n g no a p p a r e n t a s s o c i a t i o n t o p a r a s i t e a c t i v i t y r e f l e c t e d i n t h e f e c a l l a r v a l c o u n t . R e l a t i v e {% of c o n c e n t r a t i o n c o n t r o l ) R e l a t i v e c o n c e n t r a t i o n {% of c o n t r o l ) Larvae per gram S -C n S~ CU O-cu 03 > 4000 3000 2000 1000 °o°o-o o A o / V o (O .—-S- r— -M O _ S_ CL) +J o _ c o o C J o <4-CD O > +-> ~— ta a> c_ 280 240 200 160 120 80 -40 -I g G ^ o •V A . i V ° ° 0-*o _ — o — c o * I — +-> ro ^ S- i — -t-> o _ i-CU -t-> CJ E C O o o o t-OJ o > _ 400 360 320 280 240 200 160 120 80 IgA o IgM © S O N D J F M A M J J A S O N D J F M A M J J A Months 50 TABLE I I COMPARISON OF MEAN IMMUNOGLOBULIN LE V E L S OF C A P T I V E BIGHORN SHEEP WITH OTHER RUMINANTS AND MAN S o u r c e IgM T o t a l I g G 5 i g G 1 IgG 2 • Bo-vine^ 260 -r. 80 2-640 ± 126 B o v i n e 0 280 + 10 1290 ± 60 — M a n d 102 + 3 1142 ± 23 — B i g h o r n s h e e p ( t h i s s t u d y ) M 68-69 69-70 62 84 + + 5 8 2047 1834 1551 + 239 1347 ± 16 495 ± 487 ± 38 41 R 68-69 67 + 11 2421 1906 ± 128 515 ± 20 780 69-70 99 + 12 1717 1529 ± 251 189 ± 7 781 69-70 & 19 2 488^) 1901 ± 74 587 ± 38 D o m e s t i c s h e e p ( t h i s s t u d y ) 163 172 ± ± 7 5 ; 496 ± 506 ± 18 40 a T o t a l IgG f o r b i g h o r n s h e e p was sum o f mean IgG-j and I g G 2 v a l u e s c a l c u l a t e d as t h e ^ K l a u s , B e n n e t t and J o n e s , 1 9 6 9 . 0 P e n h a 1 e and C h r i s t i e , 1969. d U f f e l m a n , E n g e l h a r d and J o l l i f f , 1 970. 51 ( b ) G e n e t i c e f f e c t s The l e v e l s o f IgM i n b i g h o r n s h e e p were c o n s i d e r a b l y l o w e r t h a n v a l u e s r e p o r t e d f o r b o t h c a t t l e and man. Two d o m e s t i c s h e e p e x a m i n e d i n t h i s s t u d y showed i n t e r m e d i a t e c o n c e n t r a t i o n s . T o t a l IgG l e v e l s i n t h e e x p e r i m e n t a l b i g h o r n s h e e p w e r e b r a c k e t e d by two s e e m i n g l y d i s c r e p a n t v a l u e s r e p o r t e d f o r c a t t l e . T h e s e v a l u e s were c o n s i d e r a b l y h i g h e r t h a n i n man. IgG-j l e v e l s were r e l a t i v e l y u n i f o r m w i t h o n l y s l i g h t i n d i v i d -u a l d i f f e r e n c e s . H o w e v e r , a m a r k e d e f f e c t ( p e r h a p s g e n e t i c ) was n o t i c e d i n t h e I g G 2 l e v e l s o f a n i m a l 780 w h i c h were a p p r o x -i m a t e l y f o r t y p e r c e n t o f t h a t i n t h e o t h e r b i g h o r n s h e e p . An a l m o s t c o m p l e t e a b s e n c e o f t h i s i m m u n o g l o b u l i n was a l s o d e t e c t e d i n t h e s e r u m o f one f r e e - r a n g i n g a n i m a l c a p t u r e d on t h e M o r r i s e y - W i g w a m r a n g e . In c o n t r a s t , h y p e r g a m m a g l o b u -l i n e m i a o f unknown e t i o l o g y was n o t i c e d i n a c a p t i v e b i g h o r n ewe a t Was a, B r i t i s h C o l u m b i a ( F i g . 1 5 ) . Mans a ( 1 963) r e -p o r t e d t h a t I g G ^ was a b s e n t i n t h r e e p e r c e n t and s u b n o r m a l i n f o u r t e e n p e r c e n t o f c a t t l e o f t h e Red D a n i s h m i l k b r e e d . S p e c i f i c h y p o g a m m a g l o b u l i n e m i a has b e e n r e p o r t e d i n o t h e r b r e e d s as w e l l ( N a n s e n , 1 9 6 9 ) . S t o o p e t al. ( 1 9 6 9 ) f o u n d t h a t v e r y low l e v e l s o f t h e m a j o r i m m u n o g l o b u l i n s i n man were, by no means e x c e p t i o n a l and t h e y d i d n o t a p p e a r t o be g e n e r a l l y a s s o c i a t e d w i t h any p a r -t i c u l a r p r e d i s p o s i t i o n t o d i s e a s e . On t h e o t h e r h a n d , 52 ia 15 Quantitative Immunoelectrophoresis of IgG 2 in the bighorn comparing normal levels (above) with markfed hypergamma-globulinemia found in one captive bighorn at Wasa, B r i t i sh Columbia. Anode at the r ight . 53 s e v e r a l w o r k e r s n o t e d t h a t p a t i e n t s w i t h r e p e a t e d u p p e r r e s p i r a t o r y i n f e c t i o n s o f t e n e x h i b i t i s o l a t e d IgA o r I g E d e f i c i e n c i e s ( C o l l i n s - W i l l i a m s , Lemenza and K o k u b a , T 9 6 8 ; C a i n et al.3 1 9 6 9 ) . T h e s e s t u d i e s a r e d i f f i c u l t t o r e c o n -c i l e u n l e s s t h e p o s s i b i l i t y i s c o n s i d e r e d t h a t c e r t a i n i m m u n o g l o b u l i n d e f i c i e n c i e s may r e f l e c t more p r o f o u n d im-m u n o l o g i c d e f e c t s . In a l l a n i m a l s IgM and IgA f l u c t u a t e d w i d e l y w h e r e a s IgG-j and IgG2 were more s t a b l e and l a r g e l y a s s u m e d l e v e l s c h a r a c t e r i s t i c f o r e a c h a n i m a l . S t u d i e s w i t h f r a t e r n a l and i d e n t i c a l t w i n s ( A l l a n s m i t h , M c C l e l l a n and B u t t e r w o r t h , 1969) h a v e shown t h a t m o s t o f t h e m a j o r human I g s ( I g G , I g A , I g D , b u t n o t IgM) a r e i n f l u e n c e d s t r o n g l y by h e r e d i t y . I n t e r e s t i n g l y , a l l b u t IgG a r e i n f l u e n c e d c o n s i d e r a b l y by e n v i r o n m e n t . The f i n a l s e r u m c o n c e n t r a t i o n r e p r e s e n t s t h e b a l a n c e o f a n a b o l i s m and c a t a b o l i s m . T h e r e f o r e a p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o r t h e s t r o n g g e n e t i c i n f l u e n c e on IgG i s t h e more h i g h l y i n t e g r a t e d r e g u l a t i o n o f t h i s i m m u n o g 1 u b u 1 i n , w i t h c a t a b o l i c r a t e s t r o n g l y d e p e n d e n t on c o n c e n t r a t i o n ( A n d e r s e n , 1 9 6 4 ) . I n t h i s c a s e i m m u n o g l o b u l i n c o n c e n t r a -t i o n s w o u l d n o t be e x p e c t e d t o r e f l e c t a n t i b o d y t i t e r . 54 4. M o n i t o r i n g i n f l a m m a t i o n a) E l e c t r o p h o r e s i s o f t h e s e r o m u c o i d s ( 1 ) I n t r o d u c t i on S u b c l i n i c a l d i s e a s e i s d i f f i c u l t t o m o n i t o r , p a r t i c u -l a r l y i n a w i l d p o p u l a t i o n . E x t e n s i v e s t u d i e s i n man and e x p e r i m e n t a l a n i m a l s h a v e shown t h a t p l a s m a g l y c o p r o t e i n s a r e a l t e r e d s i g n i f i c a n t l y i n a number o f p a t h o l o g i c a l and p h y s i o l o g i c a l s t a t e s ( s e c . 5, pg. 1 2 ) . The " a c u t e - p h a s e r e -a . c t a n t s " r e s p o n d r e 1 a t i ve l y n on-s p e c i f i c a l l y t o i n j u r y , w i t h t h e s e r o m u c o i d f r a c t i o n ( p r o t e i n s o l u b l e i n 0.6 M p e r c h l o r i c a c i d ) m o s t a f f e c t e d . T h i s s e c t i o n d e s c r i b e s c h a n g e s i n a c i d -s o l u b l e p r o t e i n s w h i c h c a n be u s e d t o m o n i t o r i n f l a m m a t i o n i n d i s e a s . e d a n i m a l s . ( 2 ) E x p e r i m e n t a l ( a ) I d e n t i f i c a t i o n o f o r o s o m u c o i d The i d e n t i t y o f t h e a-1 g l y c o p r o t e i n r e s p o n d i n g t o t i s -s u e i n j u r y was c o n f i r m e d by c o m p a r i n g i t s b e h a v i o r on i o n ex-c h a n g e r e s i n s w i t h t h a t o f human o r o s o m u c o i d ( W h i t e h e a d and Sammons, 1 9 6 6 ) . A number o f p r o t e i n s were e l u t e d f r o m . D E A E -S e p h a d e x b e t w e e n 0.05 M (pH 4.3) and 0.1 M (pH 4.0) s o d i u m a c e t a t e . F o l l o w i n g p r e c i p i t a t i o n o f c o n t a m i n a t i n g p r o t e i n s , w i t h f i f t y p e r c e n t s a t u r a t e d ammonium s u l f a t e , t h e s u p e r n a -t a n t was c o m p a r e d w i t h o v i n e s e r o m u c o i d u s i n g d i s c e l e c t r o -p h o r e s i s . ( b ) E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o f t h e s e r o m u c o i d s S e r o m u c o i d s were e x t r a c t e d f r o m s e r u m and s u b m i t t e d t o 55 d i s c e l e c t r o p h o r e s i s u s i n g a p r o c e d u r e m o d i f i e d f r o m P r i c e , H a r r i s and M o l e n d a ( 1 9 6 6 ) . The s e r o m u c o i d f r a c t i o n was p r e -p a r e d by d i l u t i n g 2 ml o f p l a s m a w i t h an e q u a l v o l u m e o f d i s -t i l l e d w a t e r . A f t e r s t i r r i n g and e q u i l i b r a t i o n a t 4 ° C . 2 ml o f 1.8 M p e r c h l o r i c a c i d were a d d e d . F o l l o w i n g n e u t r a l i z a -t i o n o f t h e s u p e r n a t a n t w i t h KOH ( i n s o l u b l e c r y s t a l s o f p o t a s s i u m p e r c h l o r a t e a r e f o r m e d ) and d i a l y s i s a g a i n s t d i s -t i l l e d w a t e r , t h e s a m p l e was s u b j e c t e d t o e l e c t r o p h o r e s i s on a s e v e n p e r c e n t s t a n d a r d d i s c , g e l p r e p a r e d f r o m p r e m i x e d 13 s t o c k s o l u t i o n s . The s t a i n e d g e l s ( a m i d o b l a c k ) were 14 s c a n n e d by a m i c r o d e n s i t o m e t e r and t h e r e l a t i v e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s w e r e e s t i m a t e d by p e ak a r e a . ( 3 ) R e s u l t s and d i s c u s s i o n P a t h o l o g i c a l c h a n g e s i n t h e p r o f i l e o f a c i d - s o l u b l e p r o t e i n s a n a l y z e d by d i s c e l e c t r o p h o r e s i s were e x p r e s s e d as a r a t i o o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e e l e c t r o p h o r e t i c a l l y f a s -t e s t p r o t e i n i d e n t i f i e d as o r o s o m u c o i d ( F i g . 1 6 ) , t o t h a t o f an u n i d e n t i f i e d e - g l o b u l i n w h i c h a p p e a r e d r e l a t i v e l y u n a l -t e r e d by t i s s u e i n j u r y ( F i g . 1 7 ) . U s i n g t h i s i n d e x , d e f i n -i t i v e c h a n g e s were n o t e d d u r i n g p e r i o d s o f i n c r e a s e d p a r a s i t e a c t i v i t y ( F i g . 1 8 ) . I n f l a m m a t i o n c o u l d c o n c e i v a b l y r e s u l t f r o m d i r e c t t i s s u e damage i n f l i c t e d 13 C a n a l c o , R o c k v i l l e , Md. 14 J o y c e L o e b e l C h r o m o s c a n . 56 F i g . 16 D i s c e l e c t r o p h o r e s i s o f a c i d s o l u b l e serum p r o t e i n s showing the 2 p r o t e i n s , orosomucoid (Oro) and an u n i d e n t i f i e d p r o t e i n ( B ) , used t o c a l c u l a t e the seromucoid i n d e x . The anode i s l o c a t e d a t the r i g h t s i d e o f the f i g u r e . F i g . 17 D i s c e l e c t r o p h o r e s i s o f o v i n e g l y c o p r o t e i n p r e p a r e d by a n i o n exchange chromatography. L e f t : Serum g l y c o p r o t e i n p r e c i p i -t a t e d w i t h 50% s a t u r a t e d ammonium s u l f a t e . R i g h t : P u r i f i e d o v i n e o r o s o m u c o i d r e m a i n i n g i n the s u p e r n a t a n t f o l l o w i n g t r e a t m e n t . The anode i s l o c a t e d a t the bottom o f the f i g u r e . 57 E CO s-cx s-CL. O) > (0 6000 5000 4000 3000 2000 1000 x cu o o _s E o s-CL) 10 S O N D J F M A M J J Months F i g . 18 The s e r o m u c o i d r e s p o n s e t o p a r a s i t e a c t i v i t y i n a c a p t i v e b i g h o r n ewe ( M ) . P a r a s i t e a c t i v i t y i s r e p r e s e n t e d by t h e f r e q u e n c y p o l y g o n and t h e s e r o m u c o i d i n d e x by t h e b a r g r a p h . 58 . by Protostrongylus a n d / o r h y p e r s e n s i t i v i t y t o p a r a s i t e a l l e r -g e n s . The l a t t e r m e c h a n i s m i s d i s c u s s e d i n s e c t i o n 5, p g. 61 . C h a n g e s i n t h e s e r o m u c o i d p r o f i l e a l s o o c c u r r e d d u r i n g an a c u t e i n f e c t i o n o f E. c o l i i n t w e l v e c a p t i v e b i g h o r n s h e e p . E a r l y i n t h e c o u r s e o f d i s e a s e , t h e s e r o m u c o i d i n d e x was e l e v a t e d , b u t w i t h t h e o n s e t o f s c o u r i n g t h e o r o s o m u c o i d b a n d c o m p l e t e l y d i s a p p e a r e d w i t h a c o n c o m i t a n t i n c r e a s e i n t h e c o m p o n e n t o f s l o w e r m o b i l i t y ( F i g . 1 9 ) . L a r g e amounts o f u n d e g r a d e d o r o s o m u c o i d w e r e r e c o v e r e d f r o m d i a r r h e i c f e c e s . When s c o u r i n g was c o n t r o l l e d by n i t r o f u r a z o n e , o r o -s o m u c o i d r a p i d l y r e g a i n e d e l e v a t e d c o n c e n t r a t i o n s . The s e r u m i m m u n o g l o b u l i n s d i d n o t show a c o m p a r a b l e a s s o c i a t i o n w i t h s c o u r i n g i n t e n s i t y . L o s s o f p l a s m a p r o t e i n i s known t o o c c u r i n s e v e r e d i a r r h e a and o t h e r c o n d i t i o n s a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d v a s -c u l a r p e r m e a b i l i t y (Waldmann, 1 9 6 6 ) . T h i s has b e e n r e p o r t e d f o r IgG i n t h e b o v i n e ( N i e l s e n and N a n s o n , 1967) b u t t h e e f f e c t i s o f t e n g r e a t e r f o r p r o t e i n s o f low m o l e c u l a r w e i g h t s u c h as a l b u m i n o r o r o s o m u c o i d . S i m i l a r s e l e c t i v i t y has be e n d e m o n s t r a t e d i n c e r t a i n n e p h r o t i c s y n d r o m e s ( L i n e s , 1 9 6 9 ) . S e v e r a l b l o o d s a m p l e s f r o m w i l d s h e e p on t h e M o r r i s e y -Wigwam r a n g e w e r e t a k e n b e t w e e n 1968 and 1970 ( F i g . 2 0 ) . The s e r o m u c o i d i n d e x o f a n i m a l s s a m p l e d i n J a n u a r y ( 1 9 6 8 ) was e l e v a t e d a p p r o a c h i n g t w i c e t h e v a l u e commonly a s s o c i a t e d w i t h p a r a s i t i c i n f e c t i o n s o f t h e c a p t i v e a n i m a l s . One month l a t e r , 5 9 F i g . 19 Changes i n the s e r o m u c o i d p r o f i l e w i t h a c u t e b a c t e r i a l s c o u r s a) Phase o f a c u t e i n f l a m m a t i o n , b) Phase o f s e v e r e s c o u r i n g showing t h e e l i m i n a t i o n o f o r o s o m u c o i d and t h e i n c r e a s e o f a p r o t e i n o f n e x t f a s t e s t m o b i l i t y . The anode i s l o c a t e d a t the bottom o f the f i g u r e . 260 240 220 200 180 160 14,0 120 100 80 60 40 20 0 o o o o Jan Feb 1968 ooo o o o Mar 1969 o o Feb 1970 F i g . 20 Seromucoid index o f f r e e - r a n g i n g bighorns from the Morris Wigwam range. 61 t h e i n d e x t e n d e d t o be r e d u c e d . T h i s d a t a , o f c o u r s e , i s l i m i t e d and i t c a n n o t be s t a t e d w i t h c e r t a i n t y t h a t t h e ob-s e r v e d s e r u m c h a n g e s were r e l a t e d t o p a r a s i t i s m . The o r o s o m u c o i d i n d e x a p p e a r s t o r e s p o n d v e r y r a p i d l y t o t i s s u e i n j u r y . H e r z b e r et al. ( 1 9 6 7 ) n o t e d a r e s p o n s e t o bone f r a c t u r e s i n man w i t h i n s e v e r a l d a y s . M i a , C o r n e l i u s and L i n d ( 1 9 6 7 ) h a v e r e p o r t e d r a p i d t u r n o v e r r a t e s o f s e r u m g l y c o p r o t e i n s i n d o m e s t i c s h e e p . N u t r i t i o n a l s t r e s s a p p e a r s t o h a v e o n l y a m i n o r e f f e c t on t h e r e s p o n s e o f a c u t e - p h a s e r e a c t a n t s t o i n f l a m m a t i o n ( W e i m e r and G o d f r e y , 1 9 6 5 ) . T h e s e p r o p e r t i e s and p r e l i m i n a r y o b s e r v a t i o n s f r o m t h i s s t u d y i n d i -c a t e t h a t s e r o m u c o i d s may be o f v a l u e i n e s t a b l i s h i n g s e a s -o n a l i n f e c t i v e p a t t e r n s o f t h e p a r a s i t e s o f w i l d s h e e p . 5. Immedi a t e - t y p e h y p e r s e n s i t i v i t y a) In v i t r o d e t e c t i o n o f h o m o c y t o -t r o p i c and b l o c k i n g a n t i b o d i e s ( 1 ) I n t r o d u c t i o n The c l a s s i c a l m e t h o d f o r a s s a y i n g h y p e r s e n s i t i v i t y i s t h e s k i n t e s t , a p r o c e d u r e a s s o c i a t e d w i t h s e v e r a l t e c h n i c a l a n d b i o l o g i c a l d i f f i c u l t i e s ( s e c . 2, p g . 2 0 ) . The n e e d f o r r a p i d and c o n v e n i e n t t e s t s f o r b o t h h o m o c y t o t r o p i c and b l o c k -i n g a c t i v i t y p r o m p t e d an e x a m i n a t i o n o f in v i t r o m o d e l s w h i c h w o u l d p r o v i d e an a l t e r n a t i v e t o i n t r a d e r m a l c h a l l e n g e . 62 ( 2 ) E x p e r i m e n t a l ( a ) P r e p a r a t i o n o f l a r v a l s u s p e n s i o n s Lungworm l e s i o n s , e x c i s e d f r o m t h e l u n g s o f n a t u r a l l y i n f e c t e d w i l d b i g h o r n s , were t e a s e d a p a r t i n s a l i n e and f i l -t e r e d t h r o u g h c h e e s e c l o t h . A p u r i f i e d s u s p e n s i o n c o n t a i n i n g a p p r o x i m a t e l y t w e n t y p e r c e n t o v a and e i g h t y p e r c e n t l a r v a e was s e p a r a t e d f r o m l i g h t e r t i s s u e d e b r i s by r e p e a t e d s e d i m e n -t a t i o n i n n o r m a l s a l i n e . T h i s s u s p e n s i o n was w a s h e d f i r s t i n 1 M N a C l and t h e n i n n o r m a l s a l i n e b e f o r e s t o r a g e a t - 2 0 ° C , ( b ) P r e p a r a t i o n . o f l e u c o c y t e s u s p e n s i o n s Two v o l u m e s o f h e p a r i n i z e d b l o o d w e r e a d d e d t o one v o l u m e o f f o u r p e r c e n t g e l a t i n d i s s o l v e d - i n PBS. A f t e r g e n t l e m i x i n g , t h e t u b e s were i n c u b a t e d i n a v e r t i c a l p o s i -t i o n a t 3 7 ° C f o r f o r t y m i n u t e s t o p e r m i t s e d i m e n t a t i o n o f e r y t h r o c y t e s . The l e u c o c y t e - r i c h p l a s m a was c o l l e c t e d and t h e c e l l s w e r e w a s h e d w i t h 20 ml PBS c o n t a i n i n g 1.5 p e r c e n t 15 p o l y g l u c o s e ( P B S - F i c o l l ) . H y p o t o n i c l y s i s f o l l o w e d by w a s h i n g was e m p l o y e d f o r t h e p u r i f i c a t i o n o f c e l l s u s p e n s i o n s f r o m d o m e s t i c s h e e p s i n c e t h e i r e r y t h r o c y t e s w o u l d n o t s e d i -ment i n g e l a t i n o r d e x t r a n . F t co11 , P h a r m a c i a , U p p s a l a . 63 ( c ) H i s t a m i n e - r e 1 e a s e e x p e r i m e n t s H i s t a m i n e r e l e a s e d f r o m p e r i p h e r a l l e u c o c y t e s when c h a l l e n g e d w i t h a n t i g e n was a s s a y e d as t h e 0 - p h t h a l a l d e h y d e f l u o r o p h o r e u s i n g a p r o c e d u r e d e v e l o p e d by S h o r e , B u r k h a l t e r and Cohn ( 1 9 5 9 ) and m o d i f i e d by L i c h t e n s t e i n and O s i e r ( 1 9 6 4 ) . ( d ) P a s s i v e t r a n s f e r o f c u t a n e o u s h y p e r s e n s i t i v i t y ( P -K r e a c t i o n ) S k i n s e n s i t i z a t i o n was c o n d u c t e d a c c o r d i n g t o H o g a r t h -S c o t t ( 1 9 6 9 ) . A l a r v a l s u s p e n s i o n , p r e p a r e d as d e s c r i b e d i n s e c t i o n ( a ) , page 62, (0.1 ml r e p r e s e n t i n g a p p r o x i m a t e l y e i g h t h u n d r e d l a r v a e ) was i n j e c t e d i nto- t h e s e n s i t i z e d s i t e s a f t e r i n t r a j u g u l a r i n f u s i o n o f 5 ml o f 1.5 p e r c e n t t r y p a n b l u e d y e . The d i a m e t e r o f e x t r a v a s a t e d dye was r e c o r d e d a f t e r t h i r t y mi n u t e s . ' ( e ) In v i t r o s e n s i t i z a t i o n Washed p e r i p h e r a l l e u c o c y t e s (3 x 10^) f r o m d o m e s t i c s h e e p were s u s p e n d e d i n 1 ml o f a l l e r g i c s e r u m o r s e r u m f r a c -t i o n s and i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r t h r e e h o u r s . F o l l o w i n g s e n s i -t i z a t i o n , t h e c e l l s w ere w a s h e d t w i c e w i t h 20 ml o f P B S - F i c o l l and u s e d i n t h e w a s h e d - c e l l t e s t . ( f ) W a s h e d - c e l l t e s t To d e t e r m i n e h o m o c y t o t r o p i c a c t i v i t y , w a s h e d s e n s i t i z e d c e l l s (6 x 10^/ml) w e r e e x a m i n e d f o r a d h e r e n c e t o l a r v a e i n a medium c o n t a i n i n g a g e d d e c o m p l e m e n t e d r a b b i t s e r u m d i l u t e d 64 w i t h an e q u a l v o l u m e o f PBS. P a r a s i t e a l l e r g e n ( a p p r o x i m a t e -l y f o u r h u n d r e d f i f t y l a r v a e ) was a d d e d t o 0.8 ml o f t h e s e n -s i t i z e d c e l l s u s p e n s i o n . F o l l o w i n g i n c u b a t i o n f o r one h o u r a t 2 2 ° C , t h e s e d i m e n t was e x a m i n e d m i c r o s c o p i c a l l y and t h e l e u c o c y t e s a d h e r i n g t o t h e ova and l a r v a e were e n u m e r a t e d . ( g ) D e c o m p l e m e n t e d - s e r u m t e s t E f f e c t i v e h y p e r s e n s i t i v i t y , a c c o u n t i n g f o r t h e i n t e r -a c t i n g i n f l u e n c e s o f a l l s t a b l e s e r u m f a c t o r s , was a s s a y e d by m e a s u r i n g t h e a d h e r e n c e o f n o r m a l o r d e s e n s i t i z e d c e l l s i n a 0.3 ml s u s p e n s i o n , i n c u b a t e d w i t h l a r v a e i n 0.4 ml o f a l l e r g i c t e s t s e r u m . S i n c e n e u t r o p h i l s p o s s e s s r e c e p t o r s f o r t h e t h i r d c o m p o n e n t o f c o m p l e m e n t ( C o c h r a n e , 1 9 6 8 ) , t e s t s e r a were d e c o m p l e m e n t e d by a b s o r p t i o n w i t h z y m o s a n ^ (5 mg/ml) p r i o r t o t h e a d h e r e n c e t e s t ( H e n s o n , 1 9 6 9 ) . ( h ) E l u t i o n o f h o m o c y t o t r o p i c a n t i -body f r o m s e n s i t i z e d l e u c o c y t e s S e n s i t i z e d l e u c o c y t e s were s u s p e n d e d i n PBS c o n t a i n i n g 0.004 M EDTA and i n c u b a t e d f o r s i x t o e i g h t h o u r s a t 3 7 ° C w i t h o c c a s i o n a l c h a n g e s o f t h e s u s p e n d i n g b u f f e r . The s u p e r -n a t a n t s were p o o l e d , c o n c e n t r a t e d by u1 t r a d i a l y s i s , and t e s t e d by m i c r o - i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s ( S h e i d e g g e r , 1 9 5 5 ) . S i g m a , S t . L o u i s , Mo . 65 (3) R e s u l t s and d i s c u s s i o n ( a ) H i s t a m i n e - r e l e a s e E x p e r i m e n t s , i n v o l v i n g t h e r e l e a s e o f h i s t a m i n e s u b s e -q u e n t t o t h e e x p o s u r e o f s e n s i t i z e d c e l l s t o p a r a s i t e a l l e r -g e n s , w e r e a t t e m p t e d u s i n g l e u c o c y t e s o b t a i n e d f r o m c a p t i v e a n i m a l s . The r e s u l t s were n o t s a t i s f a c t o r y s i n c e t h e l e v e l o f h i s t a m i n e was a t t h e l o w e r l i m i t o f s e n s i t i v i t y o f t h e f l u o r o m e t r i c a s s a y . I t was e s t i m a t e d t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n i n s h e e p b l o o d was a p p r o x i m a t e l y t w e n t y p e r c e n t o f t h a t i n t h e r a b b i t o r r a t . (b ) C e 1 1 - a d h e r e n c e a s s a y D i r e c t a d h e r e n c e o f c e l l s t o t h e l a r v a l c u t i c l e was e x a m i n e d as an a l t e r n a t i v e a s s a y o f c e l l s e n s i t i z a t i o n ( F i g . 2 1 ) . H o m o c y t o t r o p i c a c t i v i t y e v a l u a t e d by t h i s p r o c e d u r e was d i r e c t l y r e l a t e d t o s e v e n t y - t w o h o u r s k i n - s e n s i t i z i n g a c t i v i t y ( F i g : 2 2 ) . The s e n s i t i v i t y o f t h e w a s h e d - c e l l t e s t was d i r e c t l y r e l a t e d t o t h e d i e l e c t r i c c o n s t a n t o f t h e s u s p e n d i n g medium. A p p a r e n t l y C o u l o m b i c f o r c e s a r e i m p o r t a n t i n t h e a p p r o a c h o f c e l l s t o t h e l a r v a l c u t i c l e . The a d d i t i o n o f m o l e c u l e s w i t h l a r g e d i p o l e moments ( e . g . , p r o t e i n o r d e x t r a n ) may t e n d t o d i s p e r s e t h e e l e c t r o s t a t i c r e p u l s i v e b a r r i e r due t o t h e n e g a t i v e c h a r g e s on b o t h c e l l s and l a r v a e . When t h e 66 t-F i g . 21 Pe r i p h e r a l leucocytes s e n s i t i z e d with ovine homocytotropic antibody adhering to Protostrongylus l a r v a e in vitro. 20 > o o •o <u 10-O u> * -O O r = 0 - 9 5 0 1 0 - 8 4 6 0 . 9 8 4 ) 4 6 8 10 12 P - K r e a c t i o n ( m m . ) 14 16 ie F i g . 22 C o r r e l a t i o n between the washed-cell t e s t , measured as the number of p a s s i v e l y s e n s i t i z e d c e l l s adhering per l a r v a , and the diameter o f the s k i n r e a c t i o n e l i c i t e d 72 hours a f t e r passive t r a n s f e r of a l l e r g i c serum. 67 d e g r e e o f c e l l s e n s i t i z a t i o n was h i g h , a d h e r e n c e o c c u r r e d e v e n i n s i m p l e e l e c t r o l y t e s o l u t i o n s . P o s s i b l y , t h e a t t a c h -ment o f a n t i b o d y t e n d e d t o p a r t i a l l y c a n c e l t h e c e l l s u r f a c e c h a r g e . E f f e c t i v e a l l e r g i c s t a t u s , a c c o u n t i n g f o r t h e i n t e r -a c t i o n o f s e r u m f a c t o r s was m e a s u r e d by e x a m i n i n g a d h e r e n c e i n t h e p r e s e n c e o f z y m o s a n - d e c o m p l e m e n t e d a l l e r g i c s e r u m ( d e c o m p l e m e n t e d - s e r u m t e s t ) . S e r a w e r e d e c o m p l e m e n t e d p r i o r t o t h e t e s t s i n c e a c t i v a t e d c o m p l e m e n t , i n a d d i t i o n t o homo-c y t o t r o p i c a n t i b o d y , was f o u n d t o m e d i a t e a d h e r e n c e . T h i s r e a c t i o n was q u a l i t a t i v e l y i n d e p e n d e n t o f t h e s p e c i e s o r i g i n o f c e l l s o r c o m p l e m e n t . Z y m o s a n , an i n s o l u b l e m a t e r i a l f r o m t h e c e l l w a l l s o f y e a s t (Saochavomyces c e r e v i s i a e ) , b i n d s C 1 3 w h i c h i s an e s s e n t i a l c o m p o n e n t o f t h e c o m p l e m e n t s e -q u e n c e f o r c e l l a t t a c h m e n t ( C o c h r a n e , 1 9 6 8 ) . A b s o r p t i o n w i t h t h i s m a t e r i a l o b v i a t e d c o n v e n t i o n a l h e a t i n a c t i v-a t i on ( 5 6 ° C , 30 min.) w h i c h a f f e c t e d h o m o c y t o t r o p i c a c t i v i t y . S i n c e t h e a n i m a l s u s e d i n t h i s s t u d y c a r r i e d v e r y l i g h t n a t u r a l i n f e c t i o n s , t h e r e s u l t s o f t h e a d h e r e n c e a s s a y c o u l d n o t be r e l a t e d t o g r o s s c l i n i c a l s ymptoms. O r o s o m u c o i d , a s e n s i t i v e b u t n o n - s p e c i f i c i n d e x o f i n f l a m m a t i o n ( D e a r i n g , M c G u c k i n and E l v e b a c k , 1 969; W e r n e r , 1 9 6 9 ) , e x h i b i t e d a ma r k e d r e s p o n s e t o s e a s o n a l c h a n g e s i n p a r a s i t e a c t i v i t y ( s e c t i o n 4, p g . 5 3 ) . The d e c o m p l e m e n t e d - s e r u m t e s t p a r a l l e d t h e s e i n f l a m m a t o r y c h a n g e s ( F i g . 2 3 ) . 6 8 ISO • • 200 *-' I 5 j _ J F i g . 23 The e f f e c t i v e h y p e r s e n s i t i v e response of a bighorn ewe (M) to seasonal changes i n p a r a s i t e a c t i v i t y . The p o i n t s r e -present the mean number of c e l l s adhering to l a r v a e i n the decomplemented-serum t e s t . The v e r t i c a l l i n e s r e p r e s e n t the standard e r r o r of d e t e r m i n a t i o n . Adherence was e v a l -uated f o r approximately 30 l a r v a e i n each case. The bar graph shows the r e l a t i v e l e v e l of orosomucoid, a measure of inflammation, i n serum from the i n f e c t e d animal. 69 N e u t r o p h i l s and e o s i n o p h i l s , - p a s s i v e l y s e n s i t i z e d w i t h a l l e r g i c s e r u m o r o b t a i n e d f r o m p a r a s i t i z e d a n i m a l s , w e r e t h e p r i n c i p l e c e l l t y p e s o b s e r v e d t o a d h e r e t o p a r a s i t e l a r v a e in vitro.. F t t z p a t r i c k et al. ( 1 9 6 7 ) d e m o n s t r a t e d a s i m i l a r c y t o p h i l i a o f human r e a g i n f o r h o m o l o g o u s p o l y m o r -p h o n u c l e a r l e u c o c y t e s . The r e a c t i o n a p p e a r e d t o be s p e c i f i c and a n t i b o d y d e p e n d e n t . The l a r v a l c u t i c l e e v i d e n t l y r e p r e -s e n t s a r a t h e r p o o r s u b s t r a t e f o r n o n - s p e c i f i c a d h e r e n c e . J e s k a ( 1 9 6 9 ) d i d n o t o b s e r v e t h e a d h e s i o n o f p e r i t o n e a l p o l y -m o r p h o n u c l e a r s t o p a r a s i t i c worms. . S o u l s b y ( 1 9 6 7 b ) and M o r s e t h and S o u l s b y ( 1 9 6 9 b ) n o t e d t h a t a d h e r e n c e t o Ascaris suum l a r v a e was s t r i c t l y d e p e n d e n t on t h e a c t i v a t i o n o f t h e c o m p l e m e n t s e q u e n c e f o l l o w i n g t h e f o r m a t i o n o f a n t i b o d y -a n t i g e n e o m p l e x e s . C e l l a d h e r e n c e a p p e a r e d t o p r o v i d e a r a p i d and c o n v e n -i e n t a s s e s s m e n t o f i m m e d i a t e - t y p e h y p e r s e n s i t i v i t y and o b v i a t e d many o f t h e t e c h n i c a l d i f f i c u l t i e s a s s o c i a t e d w i t h o t h e r in v i t r o m e t h o d s b a s e d on h i s t a m i n e r e l e a s e ( S t a r r and W e i n s t o c k , 1 9 7 0 ) . H o w e v e r , l i k e t h e d o u b l e - l a y e r l e u c o c y t e a g g l u t i n a t i o n t e s t o f F i t z p a t r i c k et al. ( 1 9 6 7 ) , p o s s i b l e i n t e r f e r e n c e by n o n - a n a p h y 1 a c t i c a n t i b o d y c o u l d n o t be e x c l u d e d . A p p a r e n t l y , s u c h a n t i b o d i e s d i d n o t o c c u r i n h i g h c o n c e n t r a t i o n s s i n c e a s a t i s f a c t o r y c o r r e l a t i o n was o b t a i n e d b e t w e e n in v i t r o a d h e r e n c e and s k i n - s e n s i t i z i n g a c t i v i t y . T h i s a s s o c -i a t i o n c o u l d be d e m o n s t r a t e d i n s p i t e o f d i f f i c u l t i e s 70 q u a n t i t a t i n g c u t a n e o u s a n a p h y l a x i s i n o v i n e s k i n ( K a p l a n and F r e e m a n , 1969 ) . ( c ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f o v i n e h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d y i ) E f f e c t o f a n t i s e r a The i m m u n o g l o b u l i n m e d i a t i n g t h e a d h e r e n c e o f w a s h e d p e r i p h e r a l l e u c o c y t e s t o l a r v a e a p p e a r e d t o be IgG-j s i n c e c o n c e n t r a t e d s u p e m a t a n t s f r o m c e l l s d e s e n s i t i z e d by i n c u b a -t i o n i n PBS-EDTA r e v e a l e d t h i s i m m u n o g l o b u l i n when t e s t e d by i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s ( F i g . 2 4 ) . A n t i s e r a t o IgG-j, b u t n o t t o I g A , IgM o r I g G 2 a l s o c a u s e d a r e d u c t i o n i n c e l l a d h e r e n c e ( T a b l e I I I ) . A b s o r p t i o n o f t h e i n h i b i t i n g a n t i s e r u m w i t h c o l o s t r u m w h i c h c o n t a i n s h i g h l e v e l s o f IgG-j ( H e i m e r , J o n e s and M a u r e r , 1969) a b o l i s h e d i t s a c t i v i t y a n d , due t o t h e p r e s e n c e o f s p e c i f i c h o m o c y t o t r o p i c a c t i v i t y , a c t u a l l y e n -h a n c e d a d h e r e n c e . I n h i b i t i o n o f c e l l s e n s i t i z a t i o n w i t h a n t i - I g G - j was n e v e r c o m p l e t e , a f i n d i n g w h i c h c o u l d p o s s i b l y be i n t e r p r e t e d as e v i d e n c e f o r t h e o c c u r r e n c e o f a d d i t i o n a l h o m p c y t o t r o p i c a n t i b o d i e s . H o w e v e r , t h e Fc f r a g m e n t ( H - c h a i n ) o f t h e i m m u n o g l o b u l i n i s r e s p o n s i b l e f o r c y t o p h i l i c p r o p e r t i e s and I s h i z a k a et al. ( 1 9 6 9 ) h a v e shown t h a t h i s t a m i n e r e l e a s e d e p e n d s upon t h e b r i d g i n g o f two i m m u n o g l o b u l i n m o l e c u l e s upon e x p o s u r e t o a n t i g e n . The m o s t r e a s o n a b l e model f o r t h e o r i e n t a t i o n o f h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d y i s , t h e r e f o r e , w i t h F ig . 24 Immunoelectrophoresis of IgG, eluted from sensi t ized peripheral leucocytes (lower w e l l ) . Whole serum as a control was placed in the upper w e l l . The anode is located at the l e f t side of the f igure . 72 TABLE III EFFECT OF ANTISERA ON CELL ADHERENCE TO Protostrongylus LARVAE MEASURED BY THE WASHED-CELL TEST Antiserum s p e c i f i c i t y No. c e l l s a d h e r i n g per l a r v a (x ± SE) Normal r a b b i t serum 43.885 ± 3.951 Anti-IgA, IgM 40.292 ± 3.880 A n t i - I g G 2 47.380 ± 4.200 Anti-TgG^ 22.308 ± 2.727 Anti-IgG-, absorbed with c o l A s t r u m 61.000 ± 3.517 A n t i - L - c h a i n a 8.143 ± 2.132 aAn unabsorbed p o l y s p e c i f i c antiserum. 73 t h e Fc f r a g m e n t p r o x i m a l and t h e Fab ( a n t i g e n - b i n d i n g ) r e g i o n d i s t a l t o t h e c e l l membrane ( F i g . 2 5 ) . A c c o r d i n g t o t h i s m o del a g r e a t e r i n h i b i t o r y e f f i c a c y m i g h t be e x p e c t e d w i t h a n t i s e r a r e a c t i v e a g a i n s t L - c h a i n s . H o g a r t h - S c o t t ( 1 9 6 9 ) was a b l e t o b l o c k p a s s i v e c u t a n -e o u s a n a p h y l a x i s (PCA) w i t h IgG-j^, a n e w l y r e p o r t e d s u b c l a s s o f IgG-j ( C u r t a i n , 1969 ) . S p e c i f i c a n t i s e r a t o t h i s immuno-g l o b u l i n a l s o e l i c i t e d a r e v e r s e d r e a c t i o n ( R P C A ) . On t h e o t h e r h a n d , Pan et al. ( 1 9 6 8 ) and K a p l a n and F r e e m a n ( 1 9 6 9 ) r e p o r t e d t h a t s k i n s e n s i t i z i n g a c t i v i t y i n d o m e s t i c s h e e p d i d n o i p a r a l l e l t h e b i n d i n g o f r a d i o - 1 a b e l 1 e d a n t i g e n by any o f t h e f o u r m a j o r i m m u n o g l o b u l i n s . T h i s was p r e s e n t e d as e v i d e n c e o f t h e e x i s t e n c e o f a f i f t h p r e v i o u s l y u n d e s -c r i b e d i m m u n o g l o b u l i n c l a s s . H o w e v e r , t h e i r a p p r o a c h was i n d i r e c t and e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t IgG-] a n t i b o d i e s w i t h a l o w e r a v i d i t y f o r c e l l r e c e p t o r s may f u n c t i o n as b l o c k i n g a n t i b o d i e s ( s e c t i o n 8.a, page 1 1 9 ) . i i ) P h y s i c o - c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s When t e s t e d b o t h in v i t r o and in vivo, h i g h l e v e l s o f e e l 1 - s e n s i t i z i n g a c t i v i t y w e r e l o c a t e d i n t h e e t h a c r i d i n e s u p e r n a t a n t o f o v i n e s e r u m . H o m o c y t o t r o p i c a c t i v i t y i n t h e w a s h e d - c e l l t e s t e v e n e x c e e d e d t h a t o f s i m i l a r l y d i l u t e d s e r u m . P o s s i b l y low m o l e c u l a r w e i g h t s e r u m p r o t e i n s may i n t e r f e r e w i t h t h e s e n s i t i z a t i o n p r o c e s s ( G o o d f r i e n d , P h i l l s F i g . 2 5 M o d e l o f t h e o r i e n t a t i o n o f h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d i e s a t t h e l e u c o c y t e s u r f a c e . a) I m m u n o g l o b u l i n L - c h a i n s . b) C l a s s - s p e c i f i c H - c h a i n ' d e t e r m i n a n t s . c) C e l l r e c e p t o r . d) C e l l membrane. 75 and P e r e 1 m u t t e r , 1 9 6 9 ) . M e n z e l and Sher m a n ( 1 969) h a v e a l s o u s e d e t h a c r i d i n e t o o b t a i n s e r u m f r a c t i o n s e n r i c h e d w i t h human r e a g i n s ( I g E ) . The s e r u m f r a c t i o n e l u t e d i n t h e c e n t e r o f t h e 7S peak on S e p h a d e x G-200 c a r r i e d t h e maximum c e l l s e n s i t i z i n g a c t i v i t y ( F i g . 2 6 ) . Human I g E and t h e r e a g i n i c a n a l o g u e s o f o t h e r s p e c -i e s e x h i b i t a m o l e c u l a r w e i g h t s l i g h t l y l a r g e r t h a n t h e b u l k o f IgG as e v i d e n c e d by t h e i r e l u t i o n b e t w e e n t h e 19S ( f i r s t ) a nd 7S ( s e c o n d ) p e a k s . P h y s i c o - c h e m i c a l p r o p e r t i e s , t h e r e f o r e , s u p p o r t t h e c o n t e n t i o n t h a t t h e m a j o r h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d y i n 1 u n § w o r m - i n f e c t e d b i g h o r n s i s IgG-j r a t h e r t h a n a f i f t h i m m u n o g l o b u l i n c l a s s a n a l o g u s t o human I g E . Serum f r o m p a r a s i t i z e d b i g h o r n s was s e p a r a t e d on t h e b a s i s o f c h a r g e p r o p e r t i e s by a n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y on D E A E - S e p h a d e x . The r e l a t i v e s e n s i t i z i n g a c t i v i t y o f e a c h IgG-j p o p u l a t i o n was t h e n c a l c u l a t e d by d e t e r m i n i n g t h e a b i l i t y o f f r a c t i o n s t o s e n s i t i z e c e l l s and t h e r e l a t i v e c o n -c e n t r a t i o n o f IgG-j ( T a b l e I V ) . S i n c e f r a c t i o n s e l u t e d a t h i g h e r i o n i c s t r e n g t h s showed maximum a c t i v i t y ( i . e . , t h e m o s t a c i d i c f r a c t i o n s ) , h o m o c y t o t r o p i c a c t i v i t y may h a v e b e e n d i r e c t e d a g a i n s t more b a s i c c o m p o n e n t s o f t h e c u t i c l e . A l t e r n a t i v e l y , i n t e r a c t i n g e f f e c t s o f o t h e r p r o t e i n s may be i n v o l v e d . A number o f s t u d i e s h a v e d i s c l o s e d t h i s a p p a r e n t i n v e r s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e c h a r g e p r o p e r t i e s o f a n t i -b o d i e s and t h e i r c o r r e s p o n d i n g a n t i g e n s ( B e n a c e r r a f et al., 1969; Mozes a n d S e l a , 1 9 6 9 ; Unde r d o w n and G o o d f r i e n d , 1 9 7 0 ) . 76 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 . 24 26 28 Tube number F i g . 26 The d i s t r i b u t i o n o f h o m o c y t o t r o p i c a c t i v i t y on g e l f i l t r a t i o n . The l i n e g r a p h e x p r e s s e s t h e p r o t e i n d i s t r i b u t i o n o f w h o l e s e r u m f r a c t i o n -a t e d on S e p h a d e x G-200. The b a r g r a p h r e p r e -s e n t s t h e mean and one s t a n d a r d e r r o r o f c e l l s e n s i t i z i n g a c t i v i t y o f t h e e l u t e d p r o t e i n f r a c t i o n s . . 77 TABLE IV CELL SENSITIZING ACTIVITY OF SERUM FRACTIONS OBTAINED BY ANION EXCHANGE ON DEAE-SEPHADEX E l u t i n g C e l l R e l a t i v e S e n s i t i z i n g 9 b u f f e r adherence cone. IgG-j a c t i v i t y 0.0175 M, pH 6.4 0.000 0.000 0.000 0.1 M, pH 5.8 4.200 0.360 11.667 0.25 M, pH 5.8 13.125 0.545 24.082 0.40 M, pH 5.8 8.857 0.138 64.368 Calculated by dividing mean cell adherence by the relative concen-tration of IgG-,. 78 i i i ) H e a t s e n s i t i v i t y A l t h o u g h ce11 - s e n s i t i z i n g a c t i v i t y o f b i g h o r n s h e e p s e r u m was m o d e r a t e l y s e n s i t i v e t o h e a t i n g a t 5 6 ° C , t h e e f f e c t was c o n s i d e r a b l y d i m i n i s h e d by p r i o r d i l u t i o n ( F i g . 2 7 ) . C l a u s e n , Munoz and Bergman ( 1 9 7 0 ) , n o t i n g a s i m i l a r phenomenon w i t h r a t a n a p h y l a c t i c a n t i b o d i e s , h y p o t h e s i z e d t h e p r e s e n c e o f a s e r u m c o m p o n e n t t h a t p o t e n t i a t e d h e a t i n a c t i y a t i o n by c o m p l e x i n g w i t h a n t i b o d y . H e a t s e n s i t i v i t y has b e e n u s e d w i d e l y t o e s t a b l i s h a n a l o g i e s among t h e h o m o c y t o t r o p i c a n t i -b o d i e s o f d i f f e r e n t s p e c i e s . R e a g i n s a r e r e c o g n i z e d as b e i n g l a b i l e w h e r e a s t h e IgG-j a n a p h y l a c t i c a n t i b o d i e s o f m o s t s p e c i e s a r e r e l a t i v e l y s t a b l e - ( M o t a et al., 1969; R e v o l t e l l a and O v a r y , 1 9 6 9 ) . i v ) S k i n p e r s i s t e n c e In t h i s s t u d y s e v e n t y - t w o - h o u r s k i n s e n s i t i z i n g a c t i v -i t y was u s e d f o r t h e in vivo a s s a y o f h o m o c y t o t r o p i c a n t i -b o d y . A l t h o u g h i n t r a d e r m a l c h a l l e n g e s i x h o u r s f o l l o w i n g s e n s i t i z a t i o n a p p e a r s o p t i m a l f o r t h e m e a s u r e m e n t o f IgG-j a n a p h y l a c t i c a n t i b o d i e s i n m o s t s p e c i e s , p r e l i m i n a r y s t u d i e s r e v e a l e d i n t e r f e r e n c e f r o m b l o c k i n g a n t i b o d i e s w h i c h had n o t d i f f u s e d f r o m t h e s k i n t e s t s i t e . T h i s was m a n i f e s t i n a p o o r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e w a s h e d - c e l l t e s t and s i x - h o u r c u t a n -e o u s a n a p h y l a x i s ( F i g . 3 3 , pg. 1 7 3 ) . S i m i l a r t o human I g E , t h e o p t i m u m i n t e r v a l b e t w e e n s e n s i t i z a t i o n and c h a l l e n g e was f o u n d by H o g a r t h - S c o t t ( 1 9 6 9 ) t o be b e t w e e n f o r t y - e i g h t 27 E f f e c t of p r i o r d i l u t i o n on heat s e n s i t i v i t y of ovine homocytotropic antibody. 80 and s e v e n t y - t w o h o u r s . H o w e v e r , he a l s o f o u n d t h a t t h e maximum i n t e r v a l t h a t w i l l e l i c i t a r e s -p o n s e i s much s h o r t e r t h a n i n man. In t h i s r e s p e c t , as w e l l as h e a t s e n s i t i v i t y , t h e h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d y o f t h e b i g -h o r n s h e e p w o u l d a p p e a r i n t e r m e d i a t e t o human I g E and t h e IgG-j a n t i b o d i e s o f o t h e r s p e c i e s . H o w e v e r , t h e s e c h a r a c t e r -i s t i c s a r e n o t n e c e s s a r i l y a s s o c i a t e d w i t h t h e i m m u n o g l o b u l i n m o l e c u l e . R e v e r s a l o f s e n s i t i z a t i o n in v i t r o d e p e n d s upon t h e c o n c e n t r a t i o n o f c o m p e t i t i v e n o n - a n t i b o d y i m m u n o g l o b u l i n ( M o n g a r and W i n n e , 1966; B i n a g h i , 1 9 6 8 ) . The p e r s i s t e n c e o f p a s s i v e l y t r a n s f e r r e d a n t i b o d y may w e l l be a f u n c t i o n n o t o n l y o f t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s e n s i t t z i n g a n t i b o d y b u t a l s o t h e c o n c e n t r a t i o n and t u r n o v e r o f n o n - a n t i b o d y immuno^ g l o b u l i n i n t h e s k i n . b) P h y s i c a l f a c t o r s i n c e l l s e n s i t i z a t i o n ( 1 ) I n t r o d u c t i o n S e v e r a l in v i t r o m o d e l s o f i m m e d i a t e - t y p e h y p e r s e n s i -t i v i t y h a v e b e e n u s e d t o e x a m i n e s e n s i t i z a t i o n o f t i s s u e s and d i s s o c i a t e d c e l l s u s p e n s i o n s . H o w e v e r , t h e e x a c t m o l e c u l a r m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n t h i s p r o c e s s r e m a i n p o o r l y u n d e r s t o o d . P r e v i o u s s t u d i e s h a v e d i s c l o s e d t h a t t h e d e g r e e o f p a s s i v e a l l e r g i z a t i o n n e v e r a p p r o a c h e s t h a t o f c e l l s f r o m a l l e r g i c i n d i v i d u a l s ( O s i e r , L i c h t e n s t e i n and L e v y , 1 9 6 8 ) . M o n g a r and Winne ( 1 9 6 6 ) h a v e a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t t h e e a s e 0 f 81 r e v e r s a l o f s e n s i t i z a t i o n v a r i e s i n v e r s e l y w i t h t h e t i m e -i n t e r v a l c e l l s a r e i n c u b a t e d w i t h a n t i b o d y . C o n s e q u e n t l y , p a s s i v e s e n s i t i z a t i o n in v i t r o may n o t r e v e a l a l l f a c t o r s i n v o l v e d i n t h e a s s o c i a t i o n b e t w e e n a n t i b o d i e s and t h e c e l l membrane. F o r t h i s r e a s o n t h e f o l l o w i n g s t u d i e s were b a s e d on f a c t o r s a f f e c t i n g t h e r a t e o f d e s e n s i t i z a t i o n o f c e l l s n a t u r a l l y a l l e r g i z e d in vivo. Two p r i n c i p a l h y p o t h e s e s , t h e " c o m p e t i t i v e " ( M o n g a r and W i n n e , 1 9 6 6 ) and " a s s o c i a t i v e " m o d e l s ( B i n a g h i , 1 9 6 8 ) , h a v e b e e n p r o m u l g a t e d t o e x p - l a i n f e a t u r e s o f s e n s i t i z a t i o n . B e c a u s e t h e y d i d n o t s a t i s f a c t o r i l y a c c o u n t f o r a l l i n f l u -e n c e s o b s e r v e d i n t h i s s t u d y , a new model t e r m e d t h e " e l e c t r o s t a t i c " h y p o t h e s i s was f o r m u l a t e d . ( 2 ) E x p e r i m e n t a l P u r i f i e d s u s p e n s i o n s o f p e r i p h e r a l l e u c o c y t e s f r o m b i g -h o r n s h e e p w e r e i n c u b a t e d a-t 3 7 ° C i n v a r i o u s b u f f e r s f o r 4 h o u r s ( T a b l e V ) , w a s h e d and e v a l u a t e d f o r r e m a i n i n g h o m o c y t o -t r o p i c a c t i v i t y u s i n g t h e w a s h e d - c e l l t e s t . I n t h e f i r s t ex-p e r i m e n t t h e e f f e c t on t h e r a t e o f d e s e n s i t i z a t i o n o f two a n i o n i c c o m p o u n d s , EDTA and h e p a r i n , was e x a m i n e d . I n t h e s e c o n d , d i e l e c t r i c p r o p e r t i e s o f t h e s u s p e n d i n g b u f f e r w e r e a l t e r e d u s i n g d e x t r a n , ^ b o v i n e s e r u m a l b u m i n (BSA) a n d s u c r o s e . The i n t e r a c t i n g e f f e c t o f u r e a was a l s o 1 7 D e x t r a n 200 ( a v . m o l . wt. 2 0 4 , 0 0 0 ) , S i g m a , S t . L o u i s , M o. 82 s t u d i e d . D i e l e c t r i c c o n s t a n t s were c a l c u l a t e d a s s u m i n g a d i e l e c t r i c i n c r e m e n t o f 6.10 f o r b o v i n e s e r u m a l b u m i n (BSA) and 40.45 f o r d e x t r a n ( P o l l a c k et al., 1 9 6 5 ) . ( 3 ) R e s u l t s and d i s c u s s i o n ( a ) E f f e c t o f a n i o n i c compounds and p o l a r m o l e c u l e s on d e s e n s i t i z a t i o n In a d d i t i o n t o i n c r e a s i n g p a s s i v e s e n s i t i z a t i o n o f c e l l s in v i t r o , h e p a r i n and EDTA p r o m o t e d t h e l o s s o f homo-c y t o t r o p i c a n t i b o d y when i n c u b a t e d i n b u f f e r s n o t c o n t a i n i n g a l l e r g i c s e r u m ( T a b l e V ) . T h i s e x p e r i m e n t s u g g e s t e d t h a t , t h e a c t i o n o f t h e s e compounds was t o f a c i l i t a t e t h e a t t a i n -ment o f an e q u i l i b r i u m b e t w e e n f r e e and c e l l - b o u n d a n t i b o d y . L e v y and O s i e r ( 1 9 6 6 ) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e e f f e c t o f EDTA c o u l d be r e v e r s e d by t h e a d d i t i o n o f c a l c i u m . H o w e v e r , t h e y n o t e d t h a t t h e e f f e c t o f h e p a r i n c o u l d n o t be r e l a t e d e n t i r e l y t o i t s r o l e as a c h e l a t i n g a g e n t ( L e v y and O s i e r , 1 9 6 7 ) . B o t h compounds were p o s t u l a t e d t o a c t as m u l t i v a l e n t l i g a n d s b e t w e e n p o s i t i v e l y c h a r g e d r e s i d u e s on b o t h t h e c e l l membrane and t h e i m m u n o g l o b u l i n m o l e c u l e . One p o s s i b l e c r i -t i c i s m o f t h i s h y p o t h e s i s was t h a t v e r y few t i t r a t a b l e c a t i o n i c g r o u p s w e r e p r e s e n t on t h e l e u c o c y t e membrane ( V a s s a r , K e n d a l l and Seaman, 1 9 6 9 ) . The i m p o r t a n c e o f d i e l e c t r i c p r o p e r t i e s was. d e m o n s t r a t e d e x p e r i m e n t a l l y by m e a s u r i n g t h e r a t e o f d e s e n s i t i z a t i o n i n 83 TABLE V EFFECT OF ANIONIC COMPOUNDS (EDTA AND HEPARIN) ON THE DESENSITIZATION OF CELL SUSPENSIONS Suspending medium No. of c e l l s adhering per l a r v a (x ± SE) Sucrose (0.14 M) PBS PBS c o n t a i n i n g EDTA (0.004 M) PBS c o n t a i n i n g heparin (10 yg/ml) 31.545 ± 4.937 .30.625 ± 2.742 11.833 ± 1.724 23.300 ± 2.625 84 b u f f e r s c o n t a i n i n g s t r o n g l y p o l a r s u b s t a n c e s ( T a b l e V I ) . De-s e n s i t i z a t i o n was i n v e r s e l y r e l a t e d t o t h e e s t i m a t e d d i e l e c -t r i c c o n s t a n t f o r m e d i a c o n t a i n i n g s u c r o s e , s u c r o s e - u r e a , b o v i n e s e r u m a l b u m i n - u r e a , and d e x t r a n . A l b u m i n (BSA) r e -t a r d e d t h e d e t a c h m e n t o f h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d y f r o m t h e c e l l membrane t o a d e g r e e t h a t c o u l d n o t be e x p l a i n e d by i t s d i e l e c t r i c p r o p e r t i e s . H o w e v e r , an i m m u n o e l e c t r o p h o r e t i c s t u d y o f t h e p r o t e i n s e l u t e d f r o m t h e c e l l membrane r e v e a l e d t h e p r e s e n c e o f a l b u m i n i n a d d i t i o n t o IgG-j. A l b u m i n , t h e r e -f o r e , may m i n i m i z e e l e c t r o s t a t i c f o r c e s by d i r e c t l y a f f e c t i n g s u r f a c e c h a r g e i n a d d i t i o n t o i m p a r t i n g a d i e l e c t r i c i n c r e -ment. U r e a , w h i c h has o n l y a s l i g h t e f f e c t on t h e d i p o l e moment o f a l b u m i n a t t h e c o n c e n t r a t i o n s u s e d i n t h i s s t u d y ( T a k a s h i m a , 1 9 6 4 ) , may i n t e r f e r e w i t h t h e a s s o c i a t i o n o f a l b u m i n w i t h t h e c e l l membrane. In t h e p r e s e n c e o f u r e a , de-s e n s i t i z a t i o n c o u l d be p r e d i c t e d by t h e d i e l e c t r i c c o n s t a n t . B i n a g h i ( 1 9 6 8 ) a t t r i b u t e d t h e e n h a n c i n g i n f l u e n c e o f u r e a on t i s s u e s e n s i t i z a t i o n t o i t s r o l e i n p r e v e n t i n g a g g r e g a t i o n o f a n t i b o d i e s a c c o r d i n g t o t h e " a s s o c i a t i o n " h y p o t h e s i s . ( b ) F o r m u l a t i o n o f t h e " e l e c t r o -s t a t i c " h y p o t h e s i s The t h e o r y o f l y o p h o b i c c o l l o i d s has b e e n s u c c e s s f u l l y a p p l i e d t o v a r i o u s a s p e c t s o f c e l l c o n t a c t and a d s o r p t i o n o f v i r u s e s t o c e l l m o n o l a y e r s ( W e i s s , 1 9 6 7 ) . M o s t , i f n o t a l l , a n i m a l c e l l s c a r r y n e t n e g a t i v e c h a r g e s . The m a j o r i o n i z a b l e 85 TABLE VI EFFECT OF HIGHLY POLAR COMPOUNDS ON THE DESENTIZATION OF CELL SUSPENSIONS Suspending medium Approximate d i e l e c t r i c c onstant No. o f c e l l s adhering per l a r v a (x ± SE) Sucrose (0.14 M) 69 7.000 ± 1.122 Sucrose (0.14 M), plus urea (0.6 M) 69 7.610 ± 0.790 BSA (330 mg%) plus urea (0.6 M) 80.5 10.600 ± 1.567 Dextran (3.3%) 211.9 14.208 ± 2.046 BSA (330 mg%) 80.5 27.945 ± 3.962 86 g r o u p s c o n t r i b u t i n g t o t h e c h a r g e a t t h e e l e c t r o k i n e t i c s u r -f a c e o f . l e u c o c y t e s and many o t h e r c e l l s a p p e a r s t o be s i a l i c a c i d r e s i d u e s o f . v a r i o u s membrane h e t e r o p o l y s a c c h a r i d e s ( P a t i n k i n , S c h l e s i n g e r and D o l j a n s k i , 1 9 7 0 ) . I t has a l s o b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e s u r f a c e c h a r g e c o u l d be due t o p o l a r -i z a t i o n o f t h e membrane by an i o n - i n d u c e d d i p o l e m e c h a n i s m . H o w e v e r , Seaman and Cook ( 1 9 6 5 ) w e r e a b l e t o c a n c e l t h e n e g -a t i v e c h a r g e o f e r y t h r o c y t e s s o l e l y by b l o c k i n g s u r f a c e c a r b o x y l g r o u p s . T h i s s u g g e s t e d t h a t i o n - i n d u c e d p o l a r i z a ^ -t i o n and p r e f e r e n t i a l a d s o r p t i o n o f a n i o n s w e r e n o t i m p o r t a n t c o n t r i b u t o r s t o t h e t o t a l s u r f a c e c h a r g e . C e l l s s u s p e n d e d i n e l e c t r o l y t e s o l u t i o n s a r e s u r r o u n d e d by an i o n i c c l o u d , t e r m e d t h e " e l e c t r i c a l d o u b l e - l a y e r . " The t h i c k n e s s o f t h i s i o n i c l a y e r can be e s t i m a t e d by t h e D e b y e ^ H u c k e l p a r a m e t e r , 1/k, w h i c h i s g i v e n b y , 1 / k _ CDkT ) 1 / 2 " C D 8e*V* w h e r e , D = d i e l e c t r i c c o n s t a n t T = a b s o l u t e t e m p e r a t u r e e = e l e c t r o n i c c h a r g e V = v a l e n c y k = B o l t z m a n n c o n s t a n t . T h i s t e r m r e p r e s e n t s t h e d i s t a n c e f r o m t h e n e g a t i v e l y c h a r g e d g r o u p s l o c a t e d on t h e c e l l membrane t o a p o i n t ( x ) 87 w h e r e t h e p o t e n t i a l {ty ) i s 1/e o f t h e s u r f a c e p o t e n t i a l O 0 ) ( W e i s s , 1967 ) . E l e c t r o p h o r e s i s has b e e n u s e d t o m e a s u r e t h e s u r f a c e c h a r g e {tyQ) o f a n i m a l c e l l s . S u c h m e a s u r e m e n t s do n o t d i r -e c t l y e s t i m a t e t h i s v a l u e b u t r a t h e r t h e p o t e n t t a T U) a t t h e h y d r o d y n a m i c s l i p p l a n e ( i . e . , t h e s u r f a c e o f t h e l a y e r o f w a t e r and e l e c t r o l y t e w h i c h moves w i t h t h e c e l l o r p a r -t i c l e ) . The r e l a t i o n b e t w e e n e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y ( V ) and t h e ^ - p o t e n t i a l i s g i v e n by t h e H e l m h o l t z - S m o l u c h o w s k i e q u a t i o n ( O v e r b e e k and W i e r s e m a , 1 9 6 7 ) , „ _ C D ( 2 ) w h e r e D = d i e l e c t r i c c o n s t a n t o f t h e s u s p e n d i n g medium and n = v i s c o s i t y o f t h e medium. The ^ - p o t e n t i a l i s r e l a t e d t o t h e t r u e s u r f a c e c h a r g e d e n s i t y b y , c - !V ( 3 ) c D w h e r e d = t h e d i s t a n c e f r o m t h e c h a r g e d s u r f a c e t o t h e s u r -f a c e o f s h e a r ( h y d r o d y n a m i c s l i p p l a n e ) . P o l l a c k et al.3 ( 1 9 6 5 ) h a v e r e l a t e d d t o t h e e l e c t r i c a l d o u b l e - l a y e r and r e -w r i t t e n e q u a t i o n ( 3 ) , 4* .Cl /k + y , ) « 9 D " - C 4 ) 88 w h e r e y-j = r a d i u s o f t h e c o u n t e r i o n . T h i s e q u a t i o n p r e d i c t s t h a t t h e ^ - p o t e n t i a l i s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e s u r f a c e p o t e n t i a l and t h e w i d t h o f t h e i o n i c d o u b l e l a y e r and i n v e r -s e l y p r o p o r t i o n a l t o t h e d i e l e c t r i c c o n s t a n t . P o s i t i v e l y c h a r g e d r e s i d u e s on t h e i m m u n o g l o b u l i n m o l e -c u l e a p p e a r t o r e a c t w i t h a n i o n i c g r o u p s on t h e c e l l s u r f a c e ( O s i e r , 1 9 6 9 ) . I f C o u l o m b i c a t t r a c t i o n i s i m p o r t a n t i n t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m s o f c e l l a t t a c h m e n t , c e l l s e n s i t i z a t i o n s h o u l d be a f f e c t e d by any f a c t o r w h i c h may a l t e r t h e l e u c o r . c y t e £ - p o t e n t i a l . The a c t i o n o f EDTA and h e p a r i n was c o n s i s t e n t w i t h t h e " e l e c t r o s t a t i c " c o n c e p t o f c e l l s e n s i t i z a t i o n . E a r l y work. ++ on t h e e f f e c t o f Ca on a g g r e g a t i o n o f n e o p l a s t i c c e l l s l e a d t o t h e s u g g e s t i o n t h a t Ca may r e d u c e t h e p o t e n t i a l e n e r g y b a r r i e r t o c e l l c o n t a c t by r e d u c i n g t h e e l e c t r i c a l d o u b l e - l a y e r ( W e i s s , 1 9 6 0 ) . The r o l e o f EDTA on t h e r a t e o f e x c h a n g e o f i m m u n o g l o b u l i n s a t t h e c e l l membrane may t h e r e -++ f o r e h a v e b e e n due t o t h e c h e l a t i o n o f Ca . The a d d i t i v e e f f e c t o f h e p a r i n , a s t r o n g l y a n i o n i c h e t e r o p o l y s a c c h a r i d e , may h a v e b e e n r e l a t e d t o a d s o r p t i o n t o t h e c e l l membrane c a u s i n g an i n c r e a s e i n s u r f a c e c h a r g e ( c f . L i p p m a n , 1 9 6 8 ) . P r e v i o u s s t u d i e s h a v e n o t e x p l o r e d d i e l e c t r i c p r o p e r ^ t i e s i n r e l a t i o n t o c e l l s e n s i t i z a t i o n . The d i e l e c t r i c c o n -s t a n t e s s e n t i a l l y r e f e r s t o t h e c h a r g e d i s s i p a t i n g q u a l i t y o f t h e medium and a c c o r d i n g t o t h e " e l e c t r o s t a t i c " c o n c e p t 89 s h o u l d p l a y an i m p o r t a n t r o l e i n t h e a t t a c h m e n t o f h o m o c y t o -t r o p i c a n t i b o d y . The i o n i c d o u b l e - l a y e r i s d i r e c t l y r e l a t e d t o t h e s q u a r e r o o t o f t h e d i e l e c t r i c c o n s t a n t ( E q n . 1) and i s t h e r e f o r e r a t h e r i n s e n s i t i v e t o t h e a d d i t i o n o f l a r g e p o l a r m o l e c u l e s . On t h e o t h e r h a n d , i n c r e a s i n g t h e d i e l e c -t r i c c o n s t a n t c a u s e s a s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n t h e c - p o t e n -t i a l and p r e s u m a b l y i m m u n o g l o b u l i n e x c h a n g e a t t h e c e l l mem-b r a n e ( E q n . 3}. E l e c t r o s t a t i c f a c t o r s a p p e a r t o a c c o u n t f o r many o f t h e f e a t u r e s o f c e l l s e n s i t i z a t i o n r e v e a l e d by o t h e r in v i t r o m o d e l s . C e l l s e n s i t i z a t i o n v/as p r e d i c t e d t o be p r o -p o r t i o n a l t o t e m p e r a t u r e [ E q n . 1 ) . T h i s was i n a g r e e m e n t w i t h e x p e r i m e n t a l o b s e r v a t i o n s w i t h i n a r a n g e c o m p a t i b l e w i t h t i s s u e i n t e g r i t y ( B i n a g h i , ( 1 9 6 8 ) . H e a r d and Seaman ( 1 9 6 0 ) c a l c u l a t e d t h e D e b y e - H u c k e l p a r a m e t e r ( t h e w i d t h o f t h e i o n i c d o u b l e - l a y e r ) f o r e r y t h r o -c y t e s s u s p e n d e d i n u n i v a l e n t e l e c t r o l y t e s a t 2 5 ° C u s i n g t h e r e l a t i o n , 1/k = 3.05 r 1 / 2 ( 5 ) w h e r e I = i o n i c s t r e n g t h . T h i s was i n a c c o r d a n c e w i t h t h e e x p e r i m e n t a l a b s e r v a t i o n t h a t low i o n i c s t r e n g t h e n h a n c e d t h e s e n s i t i z a t i o n o f t i s s u e s ( B i n a g h i et al.3 1 9 6 0 ) . 90 c ) H y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e t o p a r a s i t e a c t i v i t y . (1) I n t r o d u c t i o n P o l y m o r p h o n u c l e a r l e u c o c y t e s a d h e r i n g t o Ascaris suum l a r v a e h a v e b e e n shown t o d i s r u p t t h e c u t i c l e ( M o r s e t h and S o u l s b y , 1969b), a r e a c t i o n w h i c h i s a p p a r e n t l y s t r i c t l y d e -p e n d e n t upon t h e a c t i v a t i o n o f c o m p l e m e n t ( S o u l s b y , 1 9 6 7 a ) . H o w e v e r , i n o t h e r s y s t e m s t h e i m m u n o l o g i c m e d i a t i o n o f c e l l a d h e r e n c e may be more c o m p l e x . H i g a s h i and Chowdhury ( 1 9 7 0 ) h a v e d e s c r i b e d t h e a n t i b o d y - d e p e n d e n t b u t c o m p l e m e n t - i n d e -p e n d e n t a d h e r e n c e o f e o s i n o p h i l s t o i n f e c t i v e Wuehere-ria l a r v a e . The r e s u l t s o f s e c . 5, page 61 , s u g g e s t e d t h a t h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d i e s may c o n t r i b u t e s i g n i f i c a n t l y t o a d h e r e n c e o f p e r i p h e r a l g r a n u l o c y t e s t o Protostrongylus l a r v a e and t h a t o t h e r a n t i b o d i e s l a c k i n g c y t o t r o p i c p r o p e r -t i e s may m o d e r a t e t h e r e a c t i o n by c o m p e t i n g f o r a n t i g e n i c d e-t e r m i n a n t s on t h e c u t i c l e . I n t h i s s e c t i o n , t h e a p p l i c a t i o n o f t h e c e l l a d h e r e n c e a s s a y i s d e s c r i b e d and t h e r e s u l t s a r e c o m p a r e d w i t h s e a s o n a l c h a n g e s i n p a r a s i t e a c t i v i t y and t h e s e r o m u c o i d r e s p o n s e . ( 2 ) E x p e r i m e n t a l ( a ) G e n e r a l p r o c e d u r e P r o c e d u r e s f o r l a r v a l c o u n t s ( s e c . C l , page 17), s e r o -m u c o i d a n a l y s i s ( s e c . 4, page 53) and c e l l a d h e r e n c e t e s t s 91 ( s e c . 5, p a g e 61) h a v e b e e n d e s c r i b e d . ( b ) S t a t i s t i c a l t r e a t m e n t I n f l a m m a t i o n and i t s c o n s e q u e n t e f f e c t on p u l m o n a r y f u n c t i o n were b e l i e v e d t o be r e l a t e d p r i m a r i l y t o two f a c t o r s ; viz., t h e e x t e n t o f c o n t a c t w i t h t h e o f f e n d i n g a l -l e r g e n ( i . e . , t h e b i o m a s s and a c t i v i t y o f t h e p a r a s i t e ) and t h e p r e d i s p o s i t i o n o f t h e h o s t t o a n a p h y l a x i s . The d e t r i -m e n t a l e f f e c t o f l u n g w o r m i n f e c t i o n s ( i . e . , the- d e g r e e o f t i s s u e i n f l a m m a t i o n ) was e v a l u a t e d by t h e s e r o m u c o i d i n d e x s i n c e s e r u m g l y c o p r o t e i n s a p p e a r t o be s e n s i t i v e and non-s p e c i f i c i n d i c e s o f i n f l a m m a t o r y p r o c e s s e s . T h i s i n d e x s e r v e d as t h e d e p e n d e n t v a r i a b l e i n -a l e a s t s q u a r e s model a n a l y z e d a c c o r d i n g t o H a r v e y ( 1 9 6 0 ) . C o n s t a n t s w e r e f i t f o r a n i m a l s , f e c a l l a r v a l c o u n t s and c e l l a d h e r e n c e i n t h e d e c o m p l e m e n t e d - s e r u m t e s t . I n d i -v i d u a l a n i m a l s were t r e a t e d as m a i n e f f e c t s t o a l l o w e a c h a n i m a l t o s e r v e as i t s own c o n t r o l . The f e c a l l a r v a l c o u n t s e r v e d as a c o v a r i a b l e s i n c e i t may r e f l e c t t h e d e g r e e o f a n t i g e n i c c h a l l e n g e . The d e c o m p l e m e n t e d - s e r u m t e s t was a l s o u s e d as a c o v a r i a b l e s i n c e i t a c c o u n t e d f o r t h e n e t r e s u l t o f c o m p e t i t i o n b e t w e e n t h o s e a n t i b o d i e s s e n s i t i z i n g c e l l s and t h o s e p r e v e n t i n g a n a p h y l a x i s by s p e c i f i c a l l e r g e n . 92 ( 3 ) R e s u l t s and d i s c u s s i o n ( a ) D y n a m i c s o f c e l l a d h e r -e n c e r e a c t i o n s The r e s u l t s o f t h e a d h e r e n c e a s s a y s and t h e i r , a s s o c -i a t i o n w i t h s e a s o n a l c h a n g e s i n l a r v a l c o u n t s and s e r o m u c o i d s a r e s u m m a r i z e d i n F i g . 28. H o m o c y t o t r o p i c a c t i v i t y m e a s u r e d by t h e w a s h e d - c e l l t e s t d i d n o t show a. c 1 e a r as s oc i a t i on w i t h 1 arv.a.1 court t s . One e x p e r i m e n t a l a n i m a l (R) e v e n showed a d e f i n i t e d e p r e s s i o n t o l e v e l s b e l o w t h e m i n i m a l l y i n f e c t e d a n i m a l s (780 and 781] •j o d u r i n g t h e s p r i n g r i s e . P o s s i b l y , h y p o s e n s i t i z a t i o n c a n be i n d u c e d n a t u r a l l y u n d e r t h e c o n t i n u e d s t i m u l u s o f i n f e c t i o n i n a manner s i m i l a r t o t h a t s e e n i n i m m u n o t h e r a p y o f p o l l e n a l l e r g i e s . In a d d i t i o n t o t h e i n d u c t i o n o f b l o c k i n g a n t i -b o d i e s , t h i s t r e a t m e n t may r e d u c e t h e l e v e l o f h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d y ( S t r a n n e g a r d and B e l i n , 1 9 7 0 ] , A l t h o u g h t h i s may r e p r e s e n t t h e u t i l i z a t i o n o f e e l 1 - s e n s i t i z i n g a n t i b o d i e s p r e s e n t ( F e l l n e r et al.3 1 9 7 0 ) , i t a l s o may r e f l e c t some d i r e c t e f f e c t on d i f f e r e n t i a t i n g c e l l s w h i c h p r o d u c e t h e s e a n t i b o d i e s . The e f f e c t i v e a l l e r g i c s t a t u s b a s e d on t h e n e t a b i l i t y I o T h e s e r e s u l t s c a n n o t be c o m p a r e d d i r e c t l y w i t h t h e d e c o m p l e m e n t e d - s e r u m t e s t s i n c e b o t h a r e e x p r e s s e d on a r e l a t i v e b a s i s . The w a s h e d - c e l l a s s a y was c o n d u c t e d i n a medium o f a l o w e r d i e l e c t r i c c o n s t a n t t h a n s e r u m t o p e r m i t more a c c u r a t e e n u m e r a t i o n o f a d h e r e n t c e l l s . 93 F i g . 2 8 a -e C e l l a d h e r e n c e a s s a y s d u r i n g t h e s e a s o n a l c y c l e o f p a r a s i t e a c t i v i t y . S e r o m u c o i d r e s p o n s e , l a r v a l c o u n t and c e l l a d h e r e n c e f o r p a r a s i t e c y c l e s f r o m c a p t i v e b i g h o r n s h e e p . R ( 1 9 6 8 - 6 9 ) S e r o m u c o i d J l rn. L a r v a l c o u n t JZL nil C e l 1 a d h e r e n c e 0 W a s h e d - c e l 1 D D e c o m p l e m e n t e d - s e r u m i i S O N D J F M A M J J A Months X CD •o o o _ J E o CO E ro s-S -cu O-<D > s-> <0 cu Q . C n £= * i — S -„ (O cu CJ 180 150 120 90 60 30 4000 3000 2000 1000 180 150 120 90 60 30 M (1968-69) Seromucoid n L a r v a l count C e l l adherence o Washed-cell [] Decomplemented-serum n n S 0 N D J F M A J J A Months 18CV 150 120 90 60 30 4000 3000 2000 M (1969-70) Seromucoid La r v a l count 1000 n rrTlrmn im JOa 180 150 120 90 60 C e l l adherence o Washed-cell [ ] Decomplemented-serum 30 .° o—o. On ffn n II S O N D J F M A . M J J A M o n t h s 180 150 120 90 60-30 781 (1969-70) Seromucoid n 4000 La r v a l count 3000 2000 1000 JZL n 11 n J Z L J Z L 180 150 120 90 60 30 C e l l adherence © Washed-cell C] Decomplemented-serum S O N D J F M A M J J A Months 180 150 120 90 60 30 780 (1969-70) Seromucoid n 4000 3000 1 2000. 1000. L a r v a l Count f t r - , n r f l -x_ tn. 180-150-120" 90. 6 C 30-C e l l adherence o washed-cell []] decompl emented serum ffrhr S O N D J F M A M J J A M o n t h s 99 t o p r o m o t e c e l l a d h e r e n c e showed m a r k e d c h a n g e s w i t h p a r a s i t e , a c t i v i t y . By a n a l o g y t o h i s t a m i n e r e l e a s e a s s a y s o f immed-i a t e - t y p e h y p e r s e n s i t i v i t y , t h i s r e s p o n s e w o u l d be i n t e r p r e -t e d as t h e d e p r e s s i o n o f b l o c k i n g a n t i b o d y s i n c e t h e s e c h a n g e s w e r e n o t a c c o m p a n i e d by a c o n c o m i t a n t i n c r e a s e i n h o m o c y t o t r o p i c a c t i v i t y . A l t h o u g h t h e n e t e f f e c t o f a l l e r g i c s e r u m was t o m o d e r a t e t h e r e a c t i o n as shown by t h e m a r k e d i m p r o v e m e n t i n c e l l a d h e r e n c e upon s e r i a l d i l u t i o n ( s e c . 3 . a , page 1 2 1 ) , f l u c t u a t i o n s i n m o d e r a t i n g e f f i c a c y may n o t h a v e b e e n due e n t i r e l y t o c h a n g e s i n a n t i b o d i e s w h i c h c o m p e t e f o r common a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s . S i n c e t h e s e n s i t i v i t y o f a d h e r e n c e was s t r o n g l y i n f l u -e n c e d by d i e l e c t r i c p r o p e r t i e s , e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s s h o u l d be c o n s i d e r e d i n f u r t h e r s t u d i e s . A number o f non-i m m u n o l o g i c f a c t o r s c o u l d c o n c e i v a b l y h a v e a l t e r e d t h e r e -s p o n s e by n o n - s p e c i f i c a l l y a f f e c t i n g t h e c h a r g e b a r r i e r . G e n e r a l l y , t h i s has n o t b e e n c o n s i d e r e d and i t may e x p l a i n , f o r e x a m p l e , t h e a b i l i t y o f n o r m a l s e r u m t o n o n - s p e c i f i -c a l l y e n h a n c e a d h e r e n c e o f r a g w e e d p o l l e n t o g r a n u l o c y t e s in v i t r o ( S i e g e l and S h e r m a n , 1 9 7 0 ) . I n c r e a s e d a d h e r e n c e i n t h e d e c o m p l e m e n t e d - s e r u m t e s t d u r i n g t h e s p r i n g r i s e may r e f l e c t a phenomenon s i m i l a r t o t h e i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y o f t h e i n d i r e c t t e s t f o r m a c r o -phage c y t o p h i l i c a n t i b o d y ( B e r k e n and B e n a c e r r a f , 1 9 6 6 ) . The i n d i r e c t t e s t has b e e n c r i t i c i z e d s i n c e t h e r e i s some 100 d o u b t w h e t h e r t h i s i s r e a l l y a more s e n s i t i v e t e s t f o r c y t o -p h i l i c a n t i b o d y o r w h e t h e r i t d e t e c t s a n t i b o d i e s w h i c h ex-p o s e c y t o p h i l i c s i t e s o n l y f o l l o w i n g c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n d u c e d , by i n t e r a c t i o n w i t h a n t i g e n ( N e l s o n , 1 9 6 9 ) . The r e -s u l t s o f t h e d e c o m p l e m e n t e d - s e r u m t e s t c o u l d be e x p l a i n e d , t h e r e f o r e , e i t h e r by t h e i n c r e a s e o f s u c h a n t i b o d i e s o r t o an a c t u a l d e p r e s s i o n o f b l o c k i n g a n t i b o d y . A l t h o u g h t h e r e l a t i v e i m p o r t a n c e o f t h e s e two a l t e r n a t i v e s has n o t b e e n d e t e r m i n e d , t h e d e c o m p l e m e n t e d - s e r u m t e s t r e m a i n s a r e l a t i v e l y s e n s i t i v e m e a s u r e o f t h e h o s t - p a r a s i t e i n t e r a c t i o n . The r e s u l t s o f t h i s s t u d y do n o t g i v e i n s i g h t i n t o t h e a c t u a l m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n t h e p r o t e c t i o n o f t h e h o s t . A l t h o u g h g r a n u l o c y t e s a p p a r e n t l y a r e a b l e t o damage t h e c u t i c l e in v i t r o , t h e r e s p o n s e o f s e r u m f a c t o r s p r o m o t i n g c e l l a d h e r e n c e do n o t s u g g e s t t h a t t h i s r e a c t i o n i s i m p o r t a n t i n r e s t r i c t i n g p a r a s i t e a c t i v i t y in vivo. P o s s i b l y o t h e r a n t i g e n i c t a r g e t s , p e r h a p s m e t a b o l i c s e c r e t i o n s , a r e more v i t a l t a r g e t s . A l s o , i t i s p o s s i b l e t h a t a r e a c t i o n o f t h i s t y p e may p r e - e m p t t h e d e v e l o p m e n t o f more e f f e c t i v e im-m u n o l o g i c m e c h a n i s m s s u c h as d e l a y e d h y p e r s e n s i t i v i t y . ( b ) M o d e l o f i m m u n o g e n i c i n f l a m m a t i o n A l t h o u g h a d e f i n i t e t r e n d e x i s t e d ( s e c . ( a ) , p a g e 92) b e t w e e n t h e s e r o m u c o i d i n d e x and t h e c o v a r i a b l e s ( l a r v a l c o u n t and d e c o m p l e m e n t e d - s e r u m t e s t ) s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e l e a s t 101 s q u a r e s c o n s t a n t s were n o t o b t a i n e d . T h e r e a r e s e v e r a l p o s -s i b l e r e a s o n s why t h e s e d i f f e r e n c e s c o u l d n o t be d e t e c t e d : 1. M o n t h l y a v e r a g e s o f p a r a m e t e r s were u s e d i n t h i s a n a l y s i s s i n c e a l l d e t e r m i n a t i o n s were n o t c o n -d u c t e d on t h e same s a m p l e . C h a n g e s i n h o s t - p a r a -s i t e b a l a n c e , r e f l e c t e d i n t h e l a r v a l c o u n t , a p p e a r e d t o be a b r u p t and t h e a s s o c i a t i o n was l o s t when d a t a were p o o l e d . 2. C o n s i d e r a b l e e r r o r was i n v o l v e d i n f e c a l c o u n t s b a s e d on s i n g l e f e c a l c o l l e c t i o n s o f s e v e r a l g r a m s . 3. O t h e r immune m e c h a n i s m s ( e . g . , d e l a y e d h y p e r s e n -s i t i v i t y o r A r t h u s r e a c t i o n s ) may h a v e c o n t r i b u t e d t o i n f l a m m a t i o n . Many more s e a s o n a l c y c l e s s h o u l d be e x a m i n e d t o p r o v i d e s u f f i c i e n t d e g r e e s o f f r e e d o m t o t e s t o t h e r e f f e c t s s u c h as a c t i v i t y o f m i n o r p a r a s i t e s , i m m u n o l o g i c c r o s s - r e a c t i o n s b e -tween p a r a s i t e s p e c i e s and t h e c o n t r i b u t i o n o f o t h e r immuno-l o g i c m e c h a n i sms. 6. L y m p h o c y t e r e s p o n s e A l t h o u g h i m m e d i a t e h y p e r s e n s i t i v i t y has r e c e i v e d c o n -s i d e r a b l e a t t e n t i o n i n p a r a s i t i c i n f e c t i o n s , t h e u l t i m a t e e x p r e s s i o n o f i m m u n i t y u n d o u b t e d l y d e p e n d s on t h e i n t e r p l a y 102 o f o t h e r a l l e r g i c and n o n - s p e c i f i c m e c h a n i s m s . The r e a c t i o n s o f t h e l y m p h o i d c e l l i n t h e i n d u c t i o n and m e d i a t i o n o f i m m u n i t y t o p a r a s i t e s h a v e n o t been e x t e n s i v e l y s t u d i e d . The i d e n t i f i c a t i o n and s e p a r a t i o n o f t h e l y m p h o c y t e s a c c o r d i n g t o t h e i r i m m u n o l o g i c f u n c t i o n p r e s e n t an u n r e s o l v e d c h a l l e n g e . A number o f in v i t r o m o d e l s h a v e b e e n e x a m i n e d as c o r r e l a t e s o f t h e c o r r e s p o n d i n g e f f e c t o r a c t i v i t i e s o f l y m p h o i d c e l l s in vivo. Of t h e s e , t h e most w i d e l y s t u d i e d i s l y m p h o c y t e a c t i v a t i o n i n s h o r t - t e r m c u l t u r e . a ) ^ O v i n e l y m p h o c y t e s i n s h o r t - t e r m c u l t u r e Cl) I n t r o d u c t i o n An a r r a y o f s t i m u l a n t s may i n d u c e t h e p r o l i f e r a t i o n and t r a n s f o r m a t i o n o f p e r i p h e r a l b l o o d l y m p h o c y t e s t o b l a s t -l i k e c e l l s r e s e m b l i n g t h e p y r o n i n o p h i 1 i c c e l l s o f r e g i o n a l lymph n o d e s ( Z a l e s k i , C e r n y and H r a b a , 1 9 6 6 ) , t h o r a c i c d u c t f l u i d ( D e l o r m e et al., 1969) and p e r i p h e r a l b l o o d ( C r o w t h e r , F a i r l e y a nd S e w e l l , 1969) f o l l o w i n g in vivo a n t i g e n i c s t i m -u l a t i o n . The g e n e r a l s t i m u l a n t s i n c l u d e p h y t o h e m a g g l u t i n i n (PHA) ( N o w e l l , 1 9 6 0 ) , b a c t e r i a l c u l t u r e f i l t r a t e s ( M a n d e l s t a m a n d F a u c o n n i e r , 1 9 6 9 ) , a l l o g e n e i c c e l l s ( B a i n and L o w e n s t e i n , 1 9 6 4 ) , s o l u b l e h i s t o c o m p a t i b i l i t y a n t i g e n s ( V i z a et al.} 1968) and a n t i - l y m p h o c y t e s e r a ( W o o d r u f f , R e i d and J a m e s , 1 9 6 7 ) . In a d d i t i o n t o t h e s e n o n - s p e c i f i c r e s p o n s e s , 103 p e r i p h e r a l b l o o d l y m p h o c y t e s o f i m m u n i z e d a n i m a l s i n c l u d e a s m a l l p r o p o r t i o n o f c e l l s w h i c h c a r r y s p e c i f i c i m m u n o l o g i c memory and w h i c h a r e t r i g g e r e d s p e c i f i c a l l y when c u l t u r e d w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g a n t i g e n ( S i m o n s and F i t z g e r a l d , 1 9 6 9 ) . ( 2 ) E x p e r i m e n t a l An a t t e m p t was made t o d e t e c t a n t i g e n - r e a c t i v e l y m p h o -c y t e s by e x a m i n g t h e b l a s t o g e n i c e f f e c t on l y m p h o c y t e c u l t u r e s o f s o l u b l e a n t i g e n f r o m s o n i c a t e d l a r v a e . D i s r u p t i o n was c o n -d u c t e d u s i n g s e v e r a l f i f t e e n s e c o n d c y c l e s on a B i o s o n i c I I I u l t r a s o n i c s y s t e m ( B r o n w i l l S c i . , New Y o r k ) u n t i l m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n r e v e a l e d t h e d i s i n t e g r a t i o n o f many o f t h e l a r v a e , ( a ) L y m p h o c y t e c u l t u r e P e r i p h e r a l l e u c o c y t e s w e r e o b t a i n e d f r o m h e p a r i n i z e d b l o o d by e r y t h r o c y t e s e d i m e n t a t i o n w i t h a u t o c l a v e d f o u r p e r c e n t g e l a t i n . I n some e x p e r i m e n t s , t h i s c e l l s u s p e n s i o n was w a s h e d and c u l t u r e d d i r e c t l y . I n o t h e r s , t h e 1 e u c o c y t e - r i c h p l a s m a was i n c u b a t e d w i t h c o t t o n t o o b t a i n p u r i f i e d l y m p h o -c y t e s u s p e n s i o n s ( L a m v i k , 1 9 6 6 ) . Washed c e l l s w e r e d i l u t e d t o a c o n c e n t r a t i o n o f 2 x 1 0 6 p e r ml w i t h E a g l e s minimum 1 9 / e s s e n t i a l medium ( w i t h p e n i c i l l i n and s t r e p t o m y c i n ) c o n -t a i n i n g t w e n t y p e r c e n t h e a t i n a c t i v a t e d s e r u m , and d i s t r i -b u t e d i n 2.5 ml a l i q u o t s t o 5 ml s h e l l v i a l s . T he c u l t u r e s w ere i n c u b a t e d a t 3 7 ° C , w i t h o u t a g i t a t i o n , f o r i n t e r v a l s up t o one h u n d r e d f o r t y - f o u r h o u r s . 19 MEM ( S p i n n e r m o d i f i e d ) , D i f c o TG medium, D e t r o i t , M i c h . ( b ) E v a l u a t i o n o f l y m p h o -c y t e a c t i v a t i o n i ) M o r p h o l o g i c a l a n a l y s i s The b l a s t o g e n i c r e s p o n s e was d e t e r m i n e d by m o r p h o l o g i c a n a l y s i s . A t t h e t e r m i n a t i o n o f t h e i n c u b a t i o n i n t e r v a l , t h e s u p e r n a t a n t medium was d i s c a r d e d and t h e v o l u m e was r e -s t o r e d w i t h p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e c o n t a i n i n g 0.3 mg/ml b o v i n e s e r u m a l b u m i n o r one p e r c e n t F i c o l l . When t h e c e l l s h a d b e e n e v e n l y d i s p e r s e d , t o t a l c e l l c o u n t s w e r e c o n d u c t e d w i t h a N e b a u e r c o u n t i n g c h a m b e r . C e l l v i a b i l i t y was d e t e r -m i n e d by t h e a b i l i t y o f l i v i n g c e l l s t o e x c l u d e one p e r c e n t E o s i n Y. The c u l t u r e t u b e s w e r e c e n t r l f u g e d a t 800 x g f o r f i v e m i n u t e s and t h e c e l l d e p o s i t was s m e a r e d on s e v e r a l s l i d e s . F o l l o w i n g s t a i n i n g w i t h L e i s h m a n ' s , c e l l u l a r d i m e n s i o n s w e r e r e c o r d e d . i i ) C h e m i c a l a n a l y s i s T o t a l RNA and t o t a l DNA we r e e s t i m a t e d by a b s o r p t i o n a t 257 nm and 260 nm r e s p e c t i v e l y , u s i n g a U n i c a m Sp 800 s c a n n i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r f o l l o w i n g d i f f e r e n t i a l e x t r a c t i o n o f n u c l e i c a c i d s i n t e n p e r c e n t p e r c h l o r i c a c i d (RNA: f o u r h o u r s , 2 2 ° C ; DNA: two h o u r s , 6 5 ° C ) a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f H a n d m a k e r , C o o p e r and L e v e n t h a l ( 1 9 6 7 ) . N u c l e o h i s t o n e s w e r e e x t r a c t e d i n 0.01 M g l y c i n e 105 ( K o n g s v i k and M e s s i n e o , 1970) f o l l o w i n g e x t r a c t i o n o f RNA and c y t o p l a s m i c p r o t e i n s f r o m d i s r u p t e d c e l l s w i t h PBS c o n -t a i n i n g 0.01 M EDTA. An e q u a l v o l u m e o f a c r i d i n e o r a n g e ( 0 . 0 2 M) i n 0.01 M c i t r a t e b u f f e r , pH 3.8, was a d d e d t o t h e g l y c i n e e x t r a c t . The amount r e m o v e d by p r e c i p i t a t i o n w i t h n u c l e o p r o t e i n was d e t e r m i n e d by a d e c r e a s e i n a b s o r p t i o n a t 460 nm. i i i ) D i s c e l e c t r o p h o r e s i s o f c e l l u l a r p r o t e i n s The n u c l e o h i s t o n e e x t r a c t was s u b m i t t e d t o e l e c t r o -p h o r e s i s on a f i f t e e n p e r c e n t a c r y l a m i d e g e l (pH 3.8) c o n -t a i n i n g 1 M u r e a ( F a m b r o u g h and B o n n e r , 1 9 6 6 ) . . ( 3 ) R e s u l t s and d i s c u s s i o n ( a ) M o r p h o l o g i c a l a n a l y s i s o f a c t i v a t i o n A l t h o u g h c e l l s u r v i v a l was s a t i s f a c t o r y i n t h e s e e x p e r -i m e n t s , n u merous a t t e m p t s t o i n d u c e s i g n i f i c a n t t r a n s f o r m a -t i o n , w i t h s e v e r a l c o n c e n t r a t i o n s o f t h i s a n t i g e n , f a i l e d . P r e l i m i n a r y work s u g g e s t e d t h a t i t may h a v e e x e r t e d a n e g a -t i v e e f f e c t on c e l l s u r v i v a l ( F i g . 34, p g . 174) and n e g a t e d t h e s l i g h t s t i m u l a t o r y e f f e c t i n d u c e d by t h e i n c o r p o r a t i o n o f h e t e r o l o g o u s s e r u m i n t h e c u l t u r e medium ( F i g . 35, pg. 1 7 5 ) . T h i s w ork was n o t p u r s u e d f u r t h e r . A w i d e r a n g e o f s u b s t a n c e s , i n c l u d i n g - h i s t o n e s ( L e v i n e et at., 1 9 6 8 ) , p o l y a n i o n s ( R e g e l s o n , 1 9 6 8 ) , and e x o g e n o u s 106 RNA ( R i g b y , 1969) a r e i n h i b i t o r y t o c e l l t r a n s f o r m a t i o n in v i t r o . S o n i c a t e d l a r v a l a n t i g e n u s e d i n t h i s s t u d y e x h i b i t e d s t r o n g a b s o r p t i o n a t 257 nm and 235 nm, t h e c h a r a c t e r i s t i c s p e c t r u m f o r n u c l e i c a c i d s and p r o t e i n s , r e s p e c t i v e l y , and may h a v e c o n t a i n e d some n u c l e o h i s t o n e and RNA. H o w e v e r , t h e d e p r e s s i v e e f f e c t may h a v e b e e n l a r g e l y n o n - s p e c i f i c . E v e n PHA, a p o w e r f u l n o n - s p e c i f i c m i t o g e n , d i d n o t i n d u c e c o n s i s t e n t t r a n s f o r m a t i o n a l t h o u g h r a b b i t l y m p h o c y t e s u n d e r s i m i l a r c u l t u r e c o n d i t i o n s were s t i m u l a t e d . O v i n e l y m p h o -c y t e s a p p e a r t o be f a s t i d i o u s i n t h e i r c u l t u r e r e q u i r e m e n t s ; a p r o b l e m r e c o g n i z e d by L i n g ( 1 9 6 8 ) b u t e v i d e n t l y o v e r c o m e by C u r t a i n ( 1 9 6 9 ) . ( b ) C h e m i c a l a n a l y s i s o f a c t i v a t i o n S i n c e c e l l s a p p a r e n t l y were u n a b l e t o c o m p l e t e a l l c e l l u l a r e v e n t s c u l m i n a t i n g i n b l a s t o g e n e s i s and m . i t o s i s , s e v e r a l a t t e m p t s were made t o d e t e c t t h e e a r l y e v e n t s o f s t i m u l a t i o n u s i n g c o l u m n p u r i f i e d l y m p h o c y t e s . T o t a l DNA and RNA d e t e r m i n a t i o n s , e l e c t r o p h o r e s i s o f e x t r a c t e d n u c -l e o h i ' s t o n e s , and i n t e r a c t i o n s o f n u c l e a r e x t r a c t s w i t h a m i n o a c r i d i n e d y e s f a i l e d t o r e v e a l c e l l c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h a c t i v a t i o n . 107 b) L y m p h o c y t e a d h e r e n c e ( 1 ) I n t r o d u c t i o n The f i r s t v i s u a l e v i d e n c e o f i m m u n o l o g i c r e c o g n i t i o n i n c e l l - m e d i a t e d immune r e a c t i o n s i s t h e a g g r e g a t i o n o f ly m -p h o c y t e s a r o u n d t h e i r c o r r e s p o n d i n g a n t i g e n i c t a r g e t s ( P e r l r n a n n and Holm, 1 9 6 9 a ) . The a d h e r e n c e o f p e r i p h e r a l l y m p h o c y t e s t o Protostrongylus l a r v a e was e x a m i n e d t o e v a l -u a t e t h i s r e s p o n s e i n p a r a s i t i c i n f e c t i o n s . ( 2 ) E x p e r i m e n t a l P e r i p h e r a l l e u c o c y t e s , f r e e d o f e r y t h r o c y t e s by g e l a -t i n s e d i m e n t a t i o n o r h y p o t o n i c l y s i s , were r e s u s p e n d e d i n f r e s h p l a s m a and i n c u b a t e d w i t h n o n - a b s o r b e n t c o t t o n f o r one h a l f h o u r a t 3 7 ° C w i t h o c c a s i o n a l r o t a t i o n ( L a m v i k , 1 9 6 6 ) . T h i s p r o c e d u r e p e r m i t t e d t h e p r e p a r a t i o n o f c e l l s u s p e n s i o n s c o n s i s t i n g o f a p p r o x i m a t e l y n i n e t y - f i v e p e r c e n t l y m p h o c y t e s . C e l l s w e r e w a s h e d i n s e v e r a l c h a n g e s o f PBS and s u s p e n d e d i n E a g l e s s p i n n e r c u l t u r e medium c o n t a i n i n g one p e r c e n t F i c o l l a nd 0.05 M EDTA. One d r o p o f l a r v a l s u s p e n s i o n was a d d e d t o e a c h c u l t u r e b e f o r e i n c u b a t i o n , w i t h o c c a s i o n a l a g i t a t i o n , f o r f i v e h o u r s a t 3 7 ° C . A d h e r e n c e was e v a l u a t e d m i c r o -s c o p i c a l l y . ( 3 ) R e s u l t s and d i s c u s s i o n Two a p p a r e n t l y d i s t i n c t r e a c t i o n s w e r e o b s e r v e d . T y p e I o c c u r r e d o n l y w i t h v e r y low d o s e s o f a n t i b o d y w h e r e a s T y p e I I was n o t i c e d o n l y i n t h e p r e s e n c e o f m i n i m a l l y d i l u t e d a l l e r g i c s e r u m . 108 ( a ) T y p e I a d h e r e n c e V e r s i n e (EDTA) e l i m i n a t e d a d h e r e n c e due t o b o t h homo-c y t o t r o p i c a n t i b o d y and c o m p l e m e n t by a low p e r c e n t a g e o f g r a n u l o c y t e s r e m a i n i n g i n t h e s u s p e n s i o n . S i n c e l y m p h o c y t e a t t a c h m e n t was n o t a f f e c t e d , t h e r e a c t i o n c o u l d be r a p i d l y e v a l u a t e d w i t h o u t t i m e - c o n s u m i n g s t a i n i n g and c e l l c l a s s i -f i c a t i o n . A l t h o u g h e x t r e m e l y e c o n o m i c a l i n i t s r e q u i r e m e n t s , l y m p h o c y t e a d h e r e n c e a p p e a r e d t o be d e p e n d e n t t o a l a r g e e x t e n t upon a n t i b o d y . T h i s c o u l d be m o s t c o n v e n i e n t l y demon-s t r a t e d by s e r i a l l y w a s h i n g c e l l s u s p e n s i o n s . As shown i n T a b l e V I I , a l a r g e d e g r e e o f a d h e r e n c e c o u l d be a t t r i b u t e d t o t h e p r e s e n c e o f m i n u t e amounts o f a n t i b o d y w h i c h c o u l d be w a s h e d f r o m l y m p h o c y t e s ( h e n c e n o t s t r o n g l y c y t o p h i l i c ) . S i m i l a r l y , o t h e r w o r k e r s h a v e n o t f o u n d e v i d e n c e f o r t h e o c c u r r e n c e o f a n t i b o d i e s c y t o p h i l i c f o r l y m p h o c y t e s ( B o s m a n , F e l d m a n and P i c k , 1969) i n c o n t r a s t t o t h e u b i q u i t o u s n e s s o f a n t i b o d i e s w i t h a f f i n i t i e s f o r c e l l s o f t h e m o n o c y t e -m a c r o p h a g e s e r i e s (Hoy and N e l s o n , 1 9 6 9 ) . The b a s e l i n e l e v e l o f a d h e r e n c e r e a c h e d f o l l o w i n g wash-i n g w i t h 40 ml b u f f e r may r e f l e c t t h e p r e s e n c e o f a n t i g e n -r e a c t i v e c e l l s c a r r y i n g s p e c i f i c r e c o g n i t i o n u n i t s s i n c e f u r t h e r m i n o r l o s s e s i n a d h e r e n c e w i t h s u b s e q u e n t w a s h e s c o u l d be r e l a t e d t o t h e l o s s o f c e l l s w i t h e a c h c e n t r i f u g e -d e c a n t c y c l e . H o w e v e r , t h e p o s s i b i l i t y t h a t some a n t i b o d y 109 TABLE VII EFFECT OF BUFFER ELUTION AND RE-EXPOSURE TO IMMUNE SERUM ON LYMPHOCYTE ADHERENCE Treatment o f Lymphocyte adherence lymphocytes (x ± SE) Washed 20 ml PBS 33.771 ± 6.608 Washed 40 ml PBS 9.178 ± 1.947 Washed 60 ml PBS 7.141 ± 1.595 Washed 60 ml PBS, r e - e x p o s e d .. t o immune s e r u m , then washed with 20 ml b u f f e r 21.875 ± 2.613. n o r e m a i n e d on t h e l a r v a e a f t e r s e p a r a t i o n f r o m l u n g l e s i o n s c a n n o t be n e g l e c t e d p a r t i c u l a r l y when l y m p h o c y t e s w e r e r e s -p o n s i v e t o v e r y low c o n c e n t r a t i o n s . Numerous a t t e m p t s were made t o s t u d y t h e p r e s e n c e o f i m m u n o g l o b u l i n - l i k e r e c e p t o r s u s i n g s p e c i f i c a n t i s e r a ; h o w e v e r , t h e p o s s i b i l i t y t h a t immun-o g l o b u l i n f r a c t i o n s u s e d f o r a b s o r p t i o n may i n t e r f e r e r e n -d e r e d t h e r e s u l t s u n i n t e r p r e t a b 1e. P r e s e n t l y , e x c e p t f o r t h e e n i g m a t i c c a p a b i l i t i e s o f human t r a n s f e r f a c t o r [ L a w r e n c e , 19 69}, a n t i b o d y i s t h e o n l y known m o l e c u l e a b l e t o s p e c i f i c a l l y r e c o g n i z e c o r r e s p o n d i n g a n t i g e n s . S i n c e a n t i s e r a t o t h e i m m u n o g l o b u l i n s i n d u c e b1 a s t o g e n e s i s ( D a g u i l l a r d et al., 1969; G r e a v e s , T o r r i g i a n i a n d R o i t t , 1 9 6 9 ) , i t has be e n p o s t u l a t e d t h a t a n t i g e n s s t i m -u l a t e t h e p r o l i f e r a t i o n and d i f f e r e n t i a t i o n o f immuno-c o m p e t e n t c e l l s by a s p e c i f i c r e a c t i o n b e t w e e n t h e e p i t o p e ( a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t ) and a c o m p l e m e n t a r y i m m u n o g l o b u l i n -l i k e s t r u c t u r e on t h e c e l l membrane. A l t h o u g h T y p e IV a l l e r g i c r e a c t i o n s a r e b e l i e v e d t o be i n i t i a t e d by l y m p h o c y t e s c a r r y i n g t h e s e r e c o g n i t i o n u n i t s , t h e r e i s e v i d e n c e t h a t v e r y low d o s e s o f a n t i b o d y p r o d u c e d by t h e s e c e l l s may a m p l i f y t h e c e l l u l a r immune r e s p o n s e ( M a c L e n n a n , L o e w i and H a r d i n g , 19 70} . L y m p h o c y t e s f r o m n o n-i m m u n i z e d d o n o r s h a v e b e e n s t i m u l a t e d |n c u l t u r e w i t h immune c o m p l e x e s C O p p e n h e i m , 1969} and d e s t r u c t i o n o f t a r g e t c e l l s by l y m p h o c y t e s has be e n i n d u c e d w i t h s p e c i f i c a n t i b o d i e s ( P e r l m a n n and Holm., w e r e c o n s i s t e n t w i t h 1969b) . The r e s u l t s o f t h i s scheme o f c e l l u l a r 111 t h i s e x p e r i m e n t r e c r u i t m e n t . ( b ) . T y p e H a d h e r e n c e A s e c o n d p h e nomenon, w i t h u n c e r t a i n r e l a t i o n s h i p t o t h e one j u s t d e s c r i b e d was. o b s e r v e d i n h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f immune s e r u m ( a t d i l u t i o n s l e s s t h a n 1:5 t o 1 : 1 0 ) . T h i s r e a c t i o n , w h i c h o c c u r r e d a l s o i n t h e p r e s e n c e o f EDTA, ap-p e a r e d t o i n v o l v e t h e l a r g e r l y m p h o i d e l e m e n t s and was a n t i -b o d y — b u t n o t compl e m e n t * - - d e p e n d e n t . The most r e m a r k a b l e f e a t u r e was t h e g r e a t f r a g i l i t y o f c e l l s i n v o l v e d i n a d h e r -e n c e . E v e n f o l l o w i n g s h o r t i n c u b a t i o n p e r i o d s C f o r t y-five m i n u t e s ) , o n l y n u c l e a r r e m n a n t s were f o u n d a l o n g t h e c u t i c l e . S e l e c t i v e d e g e n e r a t i o n o f l a r g e l y m p h o c y t e s has b e e n o b s e r -v e d p r e v i o u s l y i n c u l t u r e ( Y o f f e y et al.3 1 9 6 5 ) . The r e -s i s t a n t s m a l l l y m p h o c y t e s a r e b e l i e v e d t o be t h e c a r r i e r s o f i m m u n o l o g i c memory (Gowans and U h r , 1 9 6 6 ) . The f u n c t i o n o f t h e l a r g e r c e l l s i s somewhat u n c e r t a i n a l t h o u g h B a s t e n and B e e s o n ( 1 9 7 0 ) h a v e i n d u c e d e o s i n o p h i l i a by a d o p t i v e t r a n s f e r o f t h i s p o p u l a t i o n . The s i g n i f i c a n c e o f a d h e r e n c e and l y s i s o f t h e s e l a r -g e r l y m p h o i d e l e m e n t s in vivo may p r o v e r a t h e r d i f f i c u l t t o e v a l u a t e . P o s s i b l y i t may be a s s o c i a t e d w i t h t h e p y r o n l n o -p h i l i c s u b s t a n c e d e t e c t e d i n one o f t h e i n f e c t e d l u n g s - e x -a m i n e d i n t h i s s t u d y ( s e c t i o n ( 2 ) , page 2 2 ) . Of 112 c o n s i d e r a b l e i n t e r e s t i s t h e r e c e n t s u g g e s t i o n o f G i l l i s s e n and Bubenzer ( 1 9 7 0 ) , t h a t h i s t o n e s may be one o f t h e m e d i a t o r s o f DH r e a c t i o n s s i n c e h i s t o n e s m i m i c many o f t h e a c t i v i t i e s a s c r i b e d t o lymph node p e r m e a b i l i t y f a c t o r ( L N P F ) . 7. P h y s i c o - c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e l a r v a l c u t i c l e a) C h e m i c a l and e n z y m a t i c t r e a t m e n t o f t h e l a r v a l c u t i c l e  ( 1 ) I n t r o d u c t i o n The c u t i c l e i s a c o m p l e x s t r u c t u r e s i n c e i t must f u n c -t i o n as a r e c e p t o r t o t h e l o c a l e n v i r o n m e n t , an o r g a n f o r n u t r i t i o n and r e s p i r a t i o n , as w e l l as an a r m o u r a g a i n s t t i s -s u e e nzymes and i m m u n o l o g i c a s s a u l t s . The c u t i c l e c o n t a i n s RNA, h a e m o g l o b i n and a number o f e n z y m e s , f i n d i n g s w h i c h e m p h a s i z e t h a t i t i s more t h a n an i n e r t s h e l l (Le'e, 1 9 6 6 ) . One o f t h e p r i n c i p l e c o m p o n e n t s a p p e a r s t o be c o l l a g e n ( S i m m o n d s , 1958) a s s o c i a t e d w i t h h y a l u r o n i c a c i d , s u l f a t e d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s ( A n y a , 1966) and l i p i d s . The c h e m i s t r y and r h e o l o g y o f t h e s e and r e l a t e d compounds i n v e r t e b r a t e s h a v e r e c e i v e d c o n s i d e r a b l e a t t e n t i o n i n c o n n e c t i o n w i t h a g i n g and c o n n e c t i v e ' t i s s u e d i s e a s e s ( E n g e l and L a r s s o n , 1969) . ( 2 ) E x p e r i m e n t a l The c h e m i c a l n a t u r e o f c u t i c u l a r s t r u c t u r e s 113 i n f l u e n c i n g t h e a d h e r e n c e o f g r a n u l o c y t e s o r l y m p h o c y t e s was e x a m i n e d by s u b j e c t i n g l a r v a l s u s p e n s i o n s t o s e v e r a l c h e m i c a l and e n z y m a t i c t r e a t m e n t s a t t h e c o n c e n t r a t i o n s and f o r t h e i n t e r v a l s g i v e n i n T a b l e V I I I . ( a ) P a p a i n The l a r v a l s u s p e n s i o n was i n c u b a t e d a t 3 7 ° w i t h an 20 e q u a l v o l u m e o f a m e r c u r i p a p a i n s o l u t i o n p r e p a r e d a c c o r d -i n g t o Roseman et al., 1969. (b) 2 - M e r c a p t o e t h a n o l (2-ME) 21 t a r v a e w e r e e x p o s e d t o 2 - m e r c a p t o e t h a n o l a t room tem-p e r a t u r e . ( c ) P e r i o d a t e L a r v a e s u s p e n d e d i n 0.25 M a c e t a t e b u f f e r CpH 5.0} we r e m i x e d w i t h an e q u a l v o l u m e o f 0.1 M p e r i o d i c a c i d ( M o r g a n and W a t k i n s , 1951}. A f t e r e x p o s u r e a t room t e m p e r a -t u r e f o r t h i r t y m i n u t e s , t h e s a m p l e was d i l u t e d w i t h g l u c o s e -c i t r a t e s o l u t i o n (30 g s o d i u m c i t r a t e , 25 g g l u c o s e p e r l i t r e } t o p r e v e n t f u r t h e r r e a c t i o n w i t h p e r i o d a t e . The s u s p e n s i o n was t h e n w a s h e d s e v e r a l t i m e s w i t h PBS. (d} N e u r a m i n i d a s e 22 N e u r a m i n i d a s e o b t a i n e d f r o m Clostridium perfringens 20 N u t r i t i o n a l B i o c h e m i c a l s , C l e v e l a n d , O h i o . 2 1 B a k e r , P h i l 1 i p s b u r g , N . J . 22 S i g m a , S t . L o u i s , Mo. 114 was d i s s o l v e d i n 0.25 M p h o s p h a t e b u f f e r (pH 5.0) a t a c o n -c e n t r a t i o n o f 1 mg/ml ( 0 . 0 4 u n i t s ) . L a r v a e w e r e i n c u b a t e d i n t h i s s o l u t i o n f o r t h r e e h o u r s a t 3 7 ° C ( D a v e y and A s h e r s o n , 1 9 6 7 ) . A f t e r e x p o s u r e t o t h e s e t r e a t m e n t s , t h e l a r v a l s u s p e n -s i o n s w e r e r e p e a t e d l y w a s h e d w i t h PBS and u s e d i n t h e c e l l a d h e r e n c e t e s t s . ( 3 ) R e s u l t s and d i s c u s s i o n A n t i g e n s ' r e s p o n s i b l e f o r in v i t r o a d h e r e n c e a p p e a r e d t o be an i n t e g r a l p a r t o f t h e c u t i c u l a r s t r u c t u r e s i n c e R i l l e d l a r v a e r e t a i n e d a n t i g e n i c i t y f o r l o n g i n t e r v a l s o f s t o r a g e a t - 2 0 ° C ( n o d e c r e a s e was d e t e c t e d a f t e r one and a h a l f y e a r s ) and d u r i n g a v a r i e t y o f c h e m i c a l and e n z y m a t i c t r e a t m e n t s (vide i n f r a ) . The a n t i g e n i c i t y o f t h e n e m a t o d e c u t i c l e has b e e n d i s -p u t e d f o r many y e a r s . O f t e n , c u t i c u l a r p r e c i p i t a t e s h a v e b e e n r e p o r t e d b u t u s u a l l y t h e y h a v e b e e n a t t r i b u t e d t o v a r -i o u s s e c r e t o r y p r o d u c t s t h a t h a v e f l o w e d o v e r t h e s u r f a c e r a t h e r t h a n t o a c t u a l c u t i c u l a r s t r u c t u r e s . D e s p o m m i e r , K a j i m a and Wostmann ( 1 9 6 7 ) f o u n d t h a t a n t i b o d i e s a t t a c h i n g t o t h e c u t i c l e o f T r i o U i n e l l a a l s o f o r m e d p r e c i p i t a t e s w i t h s e c r e t o r y p r o d u c t s . H o w e v e r , s t u d i e s w i t h f l u o r e s c e n t a n t i -b o d i e s ( C r a n d a l l , E c h e v a r r i a and A r e a n , 1963) and a d h e r e n t c e l l s ( S o u l s b y , 1967b) s u g g e s t e d t h a t t h e c u t i c l e p e r se was a n t i g e n i c . 115 As a n t i c i p a t e d f o r an o r g a n i s m a d a p t e d t o a p a r a s i t i c e x i s t e n c e , t h e c u t i c l e was r e l a t i v e l y r e s i s t a n t t o a p r o -t e o l y t i c enzyme, p a p a i n . E x p o s u r e o f l a r v a e t o p a p a i n f o r s e v e n h o u r s r e s u l t e d i n o n l y a s l i g h t d e c r e a s e i n a d h e r e n c e o f l y m p h o c y t e s o r p a s s i v e l y - s e n s i t i z e d g r a n u l o c y t e s ( T a b l e V I I I ) . A l t h o u g h t h e i m m u n o g e n i c i t y o f c o l l a g e n h as b e e n e s t a b -l i s h e d ( W o l f f et at., 1 9 7 0 ) , i t i s n o t c e r t a i n i f t h e m a j o r s t r u c t u r a l c o m p o n e n t i s a l s o t h e p r i n c i p a l a l l e r g e n . S t e f f e n et al. ( 1 9 7 0 ) d o c u m e n t e d t h e r a t h e r m a r k e d r e s i s t a n c e o f c o l l a g e n t o many p r o t e a s e s i n c l u d i n g p a p a i n . The r o l e o f c o l l a g e n i n t h e a n t i g e n i c s t r u c t u r e o f t h e c u t i c l e p o s s i b l y c o u l d be d e t e r m i n e d by e x a m i n i n g , t h e I n h i b i t o r y e f f e c t o f c o l l a g e n d i g e s t s on t h e a d h e r e n c e r e a c t i o n . The d i r e c t a c t i o n o f c o l l a g e n a s e w o u l d g i v e o n l y d e l p h i c r e s u l t s s i n c e c o l l -a g e n may a c t as a s u b s t r a t e f o r t h e a t t a c h m e n t o f t h e a l l e r -gen per se. The c u t i c l e o f Protostrongylus was a f f e c t e d by r e l a -t i v e l y h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , a compound d i s r u p t i n g d i s u l f i d e l i n k a g e s ( T a b l e V I I I ) . The i m p o r t a n c e o f s u c h l i n k a g e s i n a n t i g e n i c i t y may be due t o t h e i r r o l e o f m a i n t a i n i n g t h e c o n f o r m a t i o n o f t h e a l l e r g e n o r l i n k i n g t h e a l l e r g e n t o t h e c u t i c u l a r s u r f a c e . A n y a ( 1 9 6 6 ) s u g g e s t e d t h a t d i s u l f i d e l i n k a g e s may c o n t r i b u t e t o s u r f a c e s t a b i l i z a -t i o n . I t i s n o t c e r t a i n w h e t h e r t h i s r e p r e s e n t s c r o s s - l i n k i n g 116 TABLE V I I I EFFECT OF CHEMICAL AND ENZYMATIC TREATMENT OF Protostrongylus LARVAE ON CELL ADHERENCE Treatment Conce n t r a t i o n Time Washed-cell adherence Lymphocyte adherence Control - - 48.167 ± 4.709 10.184 ± 1.710 2-ME 0.1 M 1 hr 42.444 + 5.914 — 2-ME 1 .0 M 8 hr 21.308 ± 2.767 0.400 ± 0,404 Per i o d a t e 0.05 M •30 min 41.557 ± 4.228 10.438 ± 3.495 Neuraminida: ;e 1 mg/ml 3 hr 70.682 ± 3.512 28.176 ± 4.471 Papain 0.5% (v/v) 7 hr 49.545 ± 5.748 8.000 ± 2.594 o f c o l l a g e n f i b r i l s o r o t h e r c u t i c u l a r p r o t e i n s and p e p t i d e s A l t h o u g h c o l l a g e n f r o m i n v e r t e b r a t e s c o n t a i n s c y s t i n e r e s i -d u e s , mammalian c o l l a g e n i s f r e e o f t h i s a m i n o a c i d and must d e p e n d on c r o s s - l i n k i n g b e t w e e n l y s i n e and a l l y s i n e ( P i e z , •19 6 9 ) . N e u t r a l m u c o p o l y s a c c h a r i d e s , c h e m i c a l l y a n d a n t i g e n i c -a l l y s i m i l a r t o human b l o o d g r o u p s u b s t a n c e s , a r e w i d e l y d i s t r i b u t e d i n n a t u r e ( B r i m a c o m b e and Webber, 1 9 6 4 ) . To d e t e r -m i n e i f s i m i l a r a n t i g e n s were p r e s e n t on t h e c u t i c l e o f Protostrongylus l a r v a e , t h e e f f e c t o f t h e p e r i o d a t e i o n , w h i c h i n a c t i v a t e s t h e s e s u b s t a n c e s [ M o r g a n and W a t k i n s , 1 9 5 1 ) , was e x a m i n e d b u t i n h i b i t i o n was n o t o b s e r v e d [ T a b l e V I I I ) . N e u r a m i n i d a s e , an enzyme a t t a c k i n g a - k e t o s i d i c l i n k -a g e s o f n e u r a m i n i c a c i d g l y c o s i d e s , e n g e n d e r e d i n c r e a s e d a d h e r e n c e ( T a b l e V I I I ) . E i t h e r g l y c o s u b s t a n c e s a r e n o t i m p o r t a n t a l l e r g e n s o r t h e c l e a v a g e o f t h e g l y c o s i d e s o f t h e p r o t h e t i c g r o u p does n o t a f f e c t t h e i r a n t i g e n i c c h a r a c -t e r . The s i a l i c a c i d r e s i d u e s c a n be c l e a v e d f r o m s e v e r a l s e r u m g l y c o p r o t e i n s w i t h o u t i n f l u e n c i n g t h e r e m a i n d e r o f t h e m o l e c u l e . I m p r o v e d a d h e r e n c e f o l l o w i n g e n z y m a t i c t r e a t -ment may be e x p l a i n e d by t h e r e d u c t i o n o f s u r f a c e p o t e n t i a l as a r e s u l t o f t h e r e m o v a l o f n e g a t i v e l y c h a r g e d s i a l o -r e s i d u e s f r o m c u t i c u l a r c o m p o n e n t s o r a d s o r b e d a n i o n i c s u b -s t a n c e s . 118 The a p p r o a c h u s e d i n t h i s s t u d y was i n d i r e c t b e c a u s e c e l l a d h e r e n c e was a c o m p l e x phenomenon d e p e n d i n g on more t h a n t h e p r e s e n c e o f c o r r e s p o n d i n g a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s . The r e m o v a l o f p o l a r i z a b l e o r s t r o n g l y i c n o g e n i c g r o u p s w o u l d h a v e a p r o f o u n d e f f e c t on b o t h t h e e l e c t r i c a l d o u b l e - l a y e r and t h e h y d r a t i o n b a r r i e r . In a p r e v i o u s s e c t i o n ( C . 5 . b , page 8 0 ) , C o u l o m b i c i n t e r a c t i o n s were d i s c u s s e d i n r e l a t i o n t o c e l l s e n s i t i z a t i o n a c c o r d i n g t o t h e t h e o r y o f l y o p h o b i c c o l l o i d s . T h i s a p p e a r e d t o p r o v i d e a s a t i s f a c t o r y e x p l a n a -t i o n when o n l y t e m p e r a t u r e , d i e l e c t r i c c o n s t a n t and i o n i c s t r e n g t h w e r e c o n s i d e r e d . H o w e v e r , t h e a l t e r a t i o n o f c h e m i -c a l s t r u c t u r e may e n g e n d e r a number o f a d d i t i o n a l i n f l u e n c e s . Good ( 1 9 6 7 ) and Ap.ffel and P e t e r s ( 1 9 6 9 ) h a v e a r g u e d t h a t t h e e l e c t r o c h e m i c a l b a r r i e r b e t w e e n s i m i l a r l y c h a r g e d c o l l o i d s o r c e l l s i s 1 i k e l y n e g 1 i g i b 1e t o t h a t b e t w e e n c h a r g e d p a r t i -c l e s and s o l v e n t ( i . e . , h y d r a t i o n ) . S p e c i f i c m o l e c u l a r i n t e r -a c t i o n s b e t w e e n s o l v e n t a n d h i g h l y i o n o g e n i c s u b s t a n c e s , w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o c o n n e c t i v e t i s s u e s , h a v e b e e n r e p o r t e d by Schwan ( 1 9 6 5 ) and B e r e n d s e n and M i g c h e l s e n ( 1 9 6 5 ) . C o u l o m b i c f o r c e s a r e e v i d e n t l y v e r y i m p o r t a n t i n t h e a p p r o a c h and a t t a c h m e n t o f c e l l s t o l a r v a e . B o t h m a l i g n a n t and t r o p h o b l a s t i c c e l l s c a r r y h i g h n e t - n e g a t i v e c h a r g e s w h i c h a r e l a r g e l y due t o s i a l i c a c i d m o i e t i e s . T h i s f e a t u r e may be r e s p o n s i b l e f o r t h e r e l a t i v e a n e r g y o f h o s t s t o n e o -p l a s t i c g r o w t h o r p r e g n a n t a n i m a l s t o t h e c o n c e p t u s CKtrby, 119 1968, 1 9 6 9 ) . L y m p h o c y t e s a l s o c a r r y t h i s h i g h e l e c t r o n e g a -t i v e s u r f a c e ' c h a r g e ' -(Hause et al,3 1 970 ) and n o r m a l and l e u k e m i c c e l l s c a n n o t be d i s t i n g u i s h e d on t h i s b a s i s ( P a t i n -k i n , S c h l e s l n g e r and D o l j a n s k i , 1970] u n l e s s t h e c o n t r i b u -t i o n o f RNA t o t h e e 1 e c t r o k i n e t i c s u r f a c e i s e v a l u a t e d ( W e i s s and S i n k s , 1 9 7 0 ] . By a n a l o g y , e i t h e r t h e a p p a r e n t c h a r g e o r h y d r a t i o n b a r r i e r s due t o s i a l o - r e s i d u e s o f t h e l a r v a l c u t i c l e may r e p r e s e n t an a d a p t a t i o n o f Protostrongylus t o m i n i m i z e a n t i g e n i c e x p r e s s i o n . T h i s a p p e a r s t o be an e x a m p l e o f c o n v e r g e n t a d a p t a t i o n o f t h e l u n g w o r m , t h e neo-: p l a s t i c c e l l and t h e t r o p h o b l a s t f o r a " p a r a s i t i c " e x i s t e n c e . 8. M o d e r a t i o n o f h o s t d e f e n s e m e c h a n i s m s a) B l o c k i n g o f a n t i g e n i c e x p r e s s i o n ( 1 ) I n t r o d u c t i o n V e r t e b r a t e s r e s p o n d t o t h e p r e s e n c e o f f o r e i g n t i s s u e s w i t h n u m erous n o n - s p e c i f i c and i m m u n o l o g i c m e c h a n i s m s . C i r ^ c u l a t i n g a n t i b o d i e s t o t u m o r - s p e c i f i c and h e t e r o l o g o u s t i s s u e g r a f t s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d u s i n g many s y s t e m s ( W i n n , 1 9 7 0 ] . The r o l e o f t h e s e h u m o r a l f a c t o r s i s n o t w e l l u n d e r s t o o d ; t h e y h a v e b e e n shown t o e i t h e r s i g n i f i c a n t l y c u r t a i l o r , par-? a d o x i c a l l y , t o g r e a t l y p r o l o n g t h e s u r v i v a l o f t r a n s p l a n t e d n o r m a l o r m a l i g n a n t t i s s u e s . The e v e n t s s u b s e q u e n t t o tf l e u n i o n o f a n t i b o d y and a n t i g e n may d e p e n d on a number o f 120 f a c t o r s i n c l u d i n g n a t u r e o f t h e a n t i b o d y ( V o i s i n et al., 1 9 6 9 ] , c o n c e n t r a t i o n o f a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s on t h e c e l l s u r f a c e ( M o l l e r and M o l l e r , 1962} and v a s c u l a r i z a t i o n o f t h e g r a f t / " 3 The i n c r e a s e o v e r t h e e x p e c t e d r a t e o f t u m o r g r o w t h or l e n g t h o f g r a f t s u r v i v a l c a u s e d by s p e c i f i c a n t i b o d y i s an e x p r e s s i o n o f a phenomenon known as " i m m u n o l o g i c e n h a n c e m e n t " (Amos, Cohen and K l e i n , 1 9 7 0 ) . A number o f m e c h a n i s m s h a v e b e e n p r o p o s e d : 1. A f f e r e n t i n h i b i t i o n : A n t i b o d y i n t e r f e r e s w i t h t h e r e c o g n i t i o n o f f o r e i g n a n t i g e n s CMoller, 1963) . 2. E f f e r e n t i n h i b i t i o n : E f f e c t o r c e l l s a r e b l o c k e d f r o m r e a c t i n g w i t h a n t i b o d y - m a s k e d a n t i g e n i c d e t e r - • m i n a n t s ( M o l l e r , 1 9 6 4 ) . 3. C e n t r a l i n h i b i t i o n : A n t i b o d y a c t s as a f e e d b a c k p r e v e n t i n g t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f i m m u n o c o m p e t e n t c e l l s ( T a k a s u g i and H i l d e m a n n , 1969; Amos, Cohen and K l e i n , 1970) . A l l o f t h e s e m e c h a n i s m s p r e s u m a b l y o p e r a t e i n t h e com^ p l e x r e s p o n s e o f v e r t e b r a t e h o s t s t o f o r e i g n t i s s u e s . In t h e p r e s e n t s t u d y , b l o c k i n g a c t i v i t y o p e r a t i n g a t t h e l e v e l . o f a n t i g e n i c e x p r e s s i o n was c o n s i d e r e d . 23 P r i m a r i l y v a s c u l a r i z e d o r g a n s s u c h as t h e k i d n e y ( N a j a r t a n and f o k e r , 1969} and h e a r t ( L o w e r , 1969 ).. a r e dam^-a g e d by h u m o r a l a n t i b o d y w h e r e a s t h e s u r v i v a l o f s k i n g r a f t s t s u s u a l l y e n h a n c e d ( C o h e n and N e l k e n , 1 9 7 0 ) . 121 (2) E x p e r i m e n t a l The a b i l i t y o f a l l e r g i c s e r a t o b l o c k the adherence o f p e r i p h e r a l g r a n u l o c y t e s was examined by e v a l u a t i n g c e l l a t t a c h m e n t i n s e r i a l l y d i l u -t e d a l l e r g i c serum ( s e c . ( g ) , pg. 64). The b l o c k i n g p r o p e r t i e s o f IgG-j were a l s o s t u d i e d by a d d i n g i n c r e a s i n g amounts o f column p u r i f i e d a n t i b o d y made up t o 0.5 ml w i t h PBS, t o an e q u a l volume o f c e l l s suspended i n PBS-a l b u m i n b u f f e r . L a r v a e were added and c e l l adherence was e v a l u a t e d . B l o c k i n g a c t i v i t y f o r lymphocyte adherence was s t u d i e d by e x p o s i n g l a r -vae t o lymphocytes i n a medium c o n t a i n i n g serum d i l u t e d from 1:10 t o 1:200. Agar b l o c k e l e c t r o p h o r e s i s was used t o o b t a i n f r a c t i o n s f o r t e s t i n g t h e : d i s t r i b u t i o n o f b l o c k i n g a c t i v i t y o f immune serum, The a g a r g e l was p r e p a r e d u s i n g the same b u f f e r and p r o t o c o l as d e s c r i b e d f o r immuno-e l e c t r o p h o r e s i s ( s e c . ( c ) , pg. 3 0 ) . N o n - s p e c i f i c a d s o r p t i o n o f serum p r o t e i n s was s t u d i e d by i n c u b a t i n g l a r v a e i n t r i s (0.1 M ) - b u f f e r e d NaCl (1 M) and b o r a t e b u f f e r (0.45 M, pH 6.0) p r i o r t o w a s h e d - c e l l and lymphocyte adherence t e s t s . (3) R e s u l t s and d i s c u s s i o n (a) B l o c k i n g a c t i v i t y i n immediate h y p e r s e n s i t i v i t y . B l o c k i n g a c t i v i t y was d e m o n s t r a t e d by d i l u t i n g a l l e r g i c serum from p a r a s i t i z e d b i g h o r n sheep w i t h normal r a b b i t serum p r i o r t o the decom-plemented-serum t e s t . T h i s d i l u t i o n p r o d u c e d marked i n c r e a s e s i n c e l l a d herence ( F i g . 2 9 ) . P o s s i b l y , h o m o c y t o t r o p i c and b l o c k i n g a c t i v i t y were n o t e q u a l l y a f f e c t e d because c e l l - s e n s i t i z i n g a n t i b o d y a d s o r b e d t o c e l l s even when e x t e n s i v e l y d i l u t e d . 122 ro > ro CU CL c * I — cu . c -a ro cu CJ 35. 30 25 20 15 10 1:3 1:6 1:9 1:12 1:15 1:18 1:21 1:24 Serum d i l u t i o n F i g . 29 E f f e c t on c e l l adherence of d i l u t i o n of a l l e r g i c serum p r i o r to the decomplemented-serum t e s t . Each p o i n t shows the mean and standard e r r o r f o r c e l l adherence to approx-im a t e l y t h i r t y l a r v a e . The l i n e was f i t s u b j e c t i v e l y . 123 B l o c k i n g a c t i v i t y , on t h e o t h e r h a n d , was e f f e c t i v e l y r e -d u c e d and d i d n o t c o m p e t e as s t r o n g l y f o r a n t i g e n i c s i t e s on l u n g w o r m l a r v a e . P u r i f i e d IgG-], a p p a r e n t l y one c a r r i e r o f c e l l - s e n s i t i z -i n g a c t i v i t y [ s e c t i o n C . 5 . a , page 6 1 ] , e x h i b i t e d a r a t h e r i n t e r e s t i n g c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t e f f e c t on t h e a d h e r e n c e o f p e r i p h e r a l g r a n u l o c y t e s ( F i g . 3 0 ] , P o s s i b l y IgG^ e n h a n c e d c e l l a d h e r e n c e u n t i l a l l membrane r e c e p t o r s had t a k e n up c y t o p h i l i c a n t i b o d y . A f t e r t h i s p o i n t a d d i t i o n a l IgG-j a n t i > b o d i e s c o m p e t e d f o r a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s on t h e l a r v a l c u t i c l e and b l o c k a d h e r e n c e . IgG-j may c o n s i s t o f immuno-g l o b u l i n p o p u l a t i o n s w h i c h e x h i b i t v a r y i n g a f f i n i t i e s f o r c e l l s . S t r o n g l y c y t o p h i l i c a n t i b o d i e s may f u n c t i o n as homor c y t o t r o p i c a n t i b o d i e s w h e r e a s p o p u l a t i o n s w h i c h a r e more w e a k l y c y t o p h i l i c may e x h i b i t b l o c k i n g a c t i v i t y . A l t e r n a -t i v e l y , more t h a n one i m m u n o g l o b u l i n c l a s s may have b e e n p r e s e n t i n t h i s f r a c t i o n a l t h o u g h i t a p p e a r e d t o be immunor c h e m i c a l l y p u r e . R e c e n t l y H e i m e r , C l a r k and M a u r e r [ 1 9 6 9 ] h a v e i s o l a t e d a f i f t h i m m u n o g l o b u l i n c l a s s w h i c h t h e y b e l i e v e d e i t h e r t o be r e l a t e d t o IgG o r a n a l o g o u s t o human IgD. I f t h i s i s t h e c a s e , t h e c u r v e may r e p r e s e n t a c o m p e t i t i v e phen-r omenon i n v o l v i n g two i m m u n o g l o b u l i n s . I n a d d i t i o n t o IgG-j, b l o c k i n g a c t i v i t y was d e t e c t e d i n I g G 2 t n a number o f s e r a t e s t e d . The s i t u a t i o n was u n d o u b t e d l y much more c o m p l e x and may h a v e r e s i d e d i n o t h e r I m m u n o g l o b u l i n 124 70 r CO cu o 30 r i 0 I i • 1 1 : . 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 P u r i f i e d I g G, ( m l ) F i g . 30 E f f e c t o f IgG-, c o n c e n t r a t i o n on c e l l a d h e r e n c e o f p e r i p h e r a l g r a n u l o c y t e s in v i t r o . I n c r e a s -i n g amounts o f p u r i f i e d IgG-, were made up t o a t o t a l v o l u m e o f 0.5 ml w i t h PBS and t h e n a d d e d t o an e q u a l v o l u m e o f p e r i p h e r a l g r a n u l o c y t e s s u s p e n d e d i n a l b u m i n - P B S b u f f e r . E a c h p o i n t r e p r e s e n t s t h e mean and 1 s t a n d a r d e r r o r . 125 c l a s s e s i n t h e p r i m a r y as o p p o s e d t o t h e a n a m n e s t i c r e s p o n s e . A l s o , c e r t a i n a n t i b o d i e s may h a v e e n h a n c e d a d h e r e n c e by m a s k i n g h i g h l y a n i o n i c g r o u p s on t h e l a r v a l c u t i c l e r e s u l t i n g i n d e c r e a s e d e l e c t r o s t a t i c r e p u l s i o n ( s e c t i o n C.5.b, page 8 0 ) . The n e t e f f e c t , h o w e v e r , was t o m o d e r a t e i n f l a m m a t i o n . ( b ) B l o c k i n g a c t I v i t y i n l y m p h o c y t e a d h e r e n c e E v e n when e x t e n s i v e l y d i l u t e d , s e r u m f r o m p a r a s i t i z e d b i g h o r n s h e e p was s t r o n g l y i n h i b i t o r y t o l y m p h o i d c e l l s ( F i g . 3 1 ) . The m a r k e d s e n s i t i v i t y o f l y m p h o c y t e s t o i n h i b i t i o n was i n c o n t r a s t t o t h a t o f p a s s i v e l . y - a l l e r g i z e d g r a n u l o c y t e s . A h i g h d e g r e e o f s p e c i f i c i t y has b e e n n o t e d i n in v i t r o c e l l -m e d i a t e d r e a c t i o n s ( B r u n n e r et al.j 1970) and i n d e l a y e d h y p e r s e n s i t i v i t y ( T u r k , 1 9 6 7 ) . T h e s e e x a c t i n g r e q u i r e m e n t s f o r a n t i g e n i c e x p r e s s i o n may a c c o u n t f o r t h e o b s e r v e d s e n s i - ? t i v i t y t o b l o c k i n g a n t i b o d y . M o s t o f t h e a c t i v i t y r e s i d e d i n t h e y - g l o b u l i n r e g i o n when f r a c t i o n s o b t a i n e d by a g a r g e l e l e c t r o p h o r e s i s were t e s t e d ( T a b l e I X ) . H o w e v e r , o t h e r p r o t e i n s o r h i g h m o l e c u -l a r w e i g h t m a t e r i a l s o f f a s t e r e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y a l s o -a p p e a r e d t o be a d s o r b e d t o t h e c u t i c l e . A m o d e r a t e d e g r e e o f i n h i b i t i o n was n o t e d w i t h s e r a f r o m a v a r i e t y o f s o u r c e s ( T a b l e X ) . I t was d i f f i c u l t t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e s e e f f e c t s w e r e due t o n o n - s p e c i f i c a d s o r p t i o n , h e t e r o p h i l e p h e n o m e n a , o r t o t h e p r e s e n c e o f 126 res > cu s-•a ro o 16 14 12 10 8 0* 200 160 120 80 40 R e c i p r o c a l o f serum d i l u t i o n 10 F i g . 31 I n h i b i t i o n of lymphocyte adherence by the a d d i t i o n of serum from p a r a s i t i z e d bighorn sheep. 0* represents a c o n t r o l c u l t u r e , i . e . , without the a d d i t i o n of serum. The l i n e through values f o r mean c e l l adherence at each serum d i l u t i o n was f i t s u b j e c t i v e l y . 127 TABLE IX BLOCKING ACTIVITY OF ELECTROPHORETIC FRACTIONS OF IMMUNE SERUM E l e c t r o p h o r e t i c a f r a c t i o n Lymphocyte adherence'5 (x ± SE) Control 20.750 + 4.298 a 11.667 + 2.280 3 8.565 + 2.158 Y 5.810 + 1.879 Agar block e l e c t r o p h o r e s i s o f serum obtained from a c a p t i v e b i g -horn sheep. 'Larvae were incubated with these f r a c t i o n s f o r 1 hour, washed with PBS and used i n the lymphocyte adherence t e s t . 128 .. TABLE X INHIBITORY EFFECT ON CELL ADHERENCE OF SERA FROM DIFFERENT SPECIES 9 Source Washed-cell t e s t (x ± SE) Lymphocyte adherence (x ± SE) Con t r o l 17.846 ± 3.115 41.941 ± 3.915 Ovine 37.625 ± 3.655 1.688 ± 0.435 v Human 16.056 ± 3..136 . 22.250 ± 3.455 R a b b i t d 13.750 ± 4.895 6.714 ± 2.012 C h i n c h i l l a d — 7.946 ± 2.981 3 Larvae were incubated with sera f o r 1 hour, washed with PBS and used i n the c e l l adherence t e s t s . ^Serum obtained from a p a r a s i t i z e d bighorn ewe. Normal c o n t r o l serum, Hyland L a b o r a t o r i e s , Los Angeles. dAnimals maintained at the U n i v e r s i t y of B r i t i s h Columbia. 129 a n t i b o d i e s t o c r o s s - r e a c t i n g a n t i g e n s r e s u l t i n g f r o m c h a n c e e x p o s u r e t o o t h e r p a r a s i t i c h e l m i n t h s . S o u l s b y (1967b) and H o g a r t h - S c o t t ( 1 9 6 8 ) h a v e a l s o n o t e d e i t h e r n o n - s p e c i f i c a d s o r p t i o n o f i m m u n o g l o b u l i n s o r t h e o c c u r r e n c e o f n a t u r a l a n t i b o d i e s t o t h e n e m a t o d e c u t t c l e . T h i s q u e s t i o n may p o s s i b l y be r e s o l v e d u s i n g e n z y m a t i c d e g r a -d a t i o n p r o d u c t s o f i m m u n o g l o b u l i n s t o d e t e r m i n e i f t h e a n t i -g e n - b i n d i n g ( F a b ) o r h e a v y - c h a i n f r a g m e n t s ( F c ) a r e r e s p o n -s i b l e f o r a d s o r p t i o n . T h i s a p p r o a c h was u s e d t o s t u d y . a n t i - n u c l e a r a n t i b o d i e s i n l u p u s e r y t h m a t o s i s ( P i n c u s and K a p l a n * 19 70) and a n t i - m u s c l e a c t i v i t y i n m y a s t h e n i a g r a v i s ( A a r l i , 1 9 7 0 ) . ( c ) A d s o r p t i o n phenomena The p h y s i c o - c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e l a r v a l c u t i c l e w e r e s t u d i e d u s i n g l a r v a e o b t a i n e d f r o m l u n g l e s i o n s w h i c h had b e e n r e p e a t e d l y w a s h e d i n PBS ( s e c t i o n C . 7 . a , P a 9 ^ 1 1 2 ) . Much o f t h e a p p a r e n t m a s k i n g e f f e c t may be a t t r i b u t a b l e t o a d s o r b e d s u b s t a n c e s s i n c e t r e a t m e n t o f l a r v a e w i t h 1 M N a C l i n t r i s b u f f e r e n g e n d e r e d i n c r e a s e d a d h e r e n c e ( T a b l e X T ) . B o r a t e has b e e n shown t o i n h i b i t t h e r e a c t i o n o f c a r b o -h y d r a t e s and g l y c o p r o t e i n s w i t h s p e c i f i c a n t i b o d i e s , p r o t e i n s o r . o t h e r s u b s t a n c e s s u c h as c o n c a n a v a l i n A ( S v e n s s o n , H ammarstram and K a b a t , 1 9 7 0 1 . T r e a t m e n t o f l a r v a e w i t h b o r a t e f o l l o w i n g e x p o s u r e t o N a C l d i d n o t c a u s e f u r t h e r 130 TABLE XI EFFECT OF 1 M NaCl AND BORATE ON THE EXPRESSION OF CUTICULAR ANTIGENICITY Treatment ! Lymphocyte adherence (x ± SE) Control 11.630 ± 2.720 1 M NaCl 25.182 ± 4.773 1 M rfaCl f o l l o w e d by borate 19.950 ± 2.495 131 i m p r o v e m e n t o f a d h e r e n c e and may h a v e e v e n c o n t r i b u t e d t o t h e m a s k i n g o f c e r t a i n a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s . S u p e r n a t a n t s o b t a i n e d f r o m N a C l and b o r a t e w a s h e s were c o n c e n t r a t e d and t e s t e d by i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s . Serum p r o -t e i n s w e r e n o t d e t e c t e d b u t t h i s may have beer, due t o t h e l i m i t e d s t o c k o f l a r v a e a v a i l a b l e f o r t h i s e x p e r i m e n t . On th e o t h e r h a n d , g l y c o s a m i n o g l y c a n s o r s u b s t a n c e s o t h e r t h a n p r o t e i n s may h a v e b e e n i n v o l v e d . M u t a t i o n o f t h e s u r f a c e s t r u c t u r e o f tumo r c e l l s , i n -c l u d i n g b o t h g l y c o p r o t e i n ( W i n z l e r and B e k e s l , 1967] and l i p i d «[Rapport and G r a f , 1969) c o m p o n e n t s , h a v e b e e n s u g g e s t e d t o p l a y a s i g n i f i c a n t r o l e i n t h e m e t a s t a s i s and i n v a s i o n o f t u m o r s . A p f f e l and P e t e r s ( 1 9 6 9 ) h a v e p r o p o s e d t h a t t h e i m p o r t a n c e l i e s i n l i p i d membrane r e c e p t o r s w h i c h b i n d s i a l o g l y c o p r o t e i n s o f h o s t o r i g i n t o mask t u m o r - s p e c i f | c a n t i -g e n s . F u r t h e r s t u d i e s s h o u l d be c o n d u c t e d t o d e t e r m i n e i f Protostrongylus has a d o p t e d s i m i l a r m e c h a n i s m s . 132 D. GENERAL DISCUSSION 1. Protostrongylus i n f e c t i o n s o f t h e b i g h o r n s h e e p  a) I m m u n o l o g i c m e c h a n i s m s o p e r a t i n g i n i n f e c t i o n H i s t o l o g i c a l f e a t u r e s o f t h e l u n g l e s i o n and t h e l o c a l r e s p o n s e t o i n t r a d e r m a l c h a l l e n g e s u g g e s t e d t h a t b o t h immed-i a t e and d e l a y e d h y p e r s e n s i t i v i t y may p l a y a r o l e i n t h e immune r e s p o n s e t o Protostrongylus. C h r o n i c i n d u r a t e d l e s i o n s f o u n d i n o l d e r a n i m a l s a p p e a r e d t o r e p r e s e n t w e l l c o n t r o l l e d i n f e c t i o n s and u s u a l l y were n o t a c c o m p a n i e d by t h e e x t e n s i v e n e c r o t i z i n g p r o c e s s e s o f t e n a s s o c i a t e d w i t h c e 1 1 u 1 a r h y p e r s e n s i t i v i t i e s . T h i s may be a t t r i b u t a b l e t o t h e c o n c o m i t a n t i n d u c t i o n o f a h u m o r a l r e s p o n s e , s i n c e l y m p h o c y t e i n v o l v e m e n t was h i g h l y s e n s i t i v e t o i n h i b i t i o n by b l o c k i n g a n t i b o d i e s ( s e c t i o n 8 .a, page 1 1 9 ) . S t u d i e s w i t h c a p t i v e a n i m a l s i n d i c a t e d t h a t i m m e d i a t e h y p e r s e n s i t i v i t y may make an i m p o r t a n t c o n t r i b u t i o n t o t i s s u e i n j u r y d u r i n g t h e s p r i n g r i s e . D u r i n g t h e m i g r a t i o n o f l a r v a e up t h e b r o n c h i a l t r e e , l a r g e p a r t s o f t h e l u n g may be c h a l l e n g e d by a l l e r g e n and may r e s p o n d w i t h a n a p h y l a x i s . M a r k e d i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e s p o s s i b l y o f a l l e r g i c n a t u r e h a v e b e e n r e p o r t e d i n lungworm i n f e c t i o n s o f c a t t l e - a n d y o u n g b i g h o r n s h e e p ( H o n e s s , 1 9 4 2 ) . B l o c k i n g a n t i b o d i e s m o d e r a t e d 133 h y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e s o f t h i s t y p e l e s s e f f i c i e n t l y t h a n r e a c t i o n s i n v o l v i n g l y m p h o i d c e l l s . D i l u t i o n o f a l l e r g i c s e r u m r e s u l t e d i n a m a r k e d i n -c r e a s e i n t h e d e c o m p l e m e n t e d s e r u m t e s t [ s e c t i o n 8, page 1 1 9 ) . T h i s ' s u g g e s t e d t h a t h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d y was' e f f e c t i v e a t much l o w e r c o n c e n t r a t i o n s t h a n B l o c k i n g a c t i v i t y . E n v i r o n -m e n t a l s t r e s s o r s , w h i c h d e p r e s s t h e immune r e s p o n s e non-: s p e c i f i c a l l y [ V i e r e c k , 1 9 6 3 ) , may c o n f e r upon t h e h o s t an u n u s u a l p r e d i s p o s i t i o n t o h y p e r s e n s i t i v e i n f l a m m a t i o n . Young a n i m a l s may a l s o go t h r o u g h p e r i o d s o f m a r k e d h y p e r s e n s i -t i v i t y as t h e y d e v e l o p t h e i r i m m u n o l o g i c a l c a p a c i t i e s . P u l m o n a r y i n v a s i o n by a number o f b a c t e r i a l p a t h o g e n s o c c u r s as an a e r s o l . I f t h e l o w e r l o b e s a r e f u n c t i o n a l l y i m p a i r e d by an a n a p h y l a c t i c r e a c t i o n , t h e s e i n f e c t i o n s may l o c a l i z e i n h y p e r v e n t i l a t e d a r e a s . T h i s may e x p l a i n p a r t l y why p n e u m o n i c l e s i o n s c a u s e d by Pasteurella do n o t u s u a l l y d e v e l o p a r o u n d l u n g w o r m f o c i . H o w e v e r , t i s s u e d e v i t a l i z a ^ t i o n c a u s e d by i n f l a m m a t i o n may p r o v i d e f a v o r a b l e c o n d i t i o n s i n t h e l o w e r p a r a s i t i z e d l o b e s f o r a n a e r o b i c p a t h o g e n s s u c h as Corynebacterium pyogenes. b) I n t e r a c t i o n s o f i n f e c t i o n and e n v i r o n m e n t I n t e r a c t i o n s o f e n v i r o n m e n t a l s t r e s s a n d d i s e a s e h a v e n o t b e e n a d e q u a t e l y s t u d i e d . The a l l e r g i c m a n i f e s t a t i o n s o f p a r a s i t i s m t e m p t a c o m p a r i s o n w i t h c l i m a t i c a l l y i n f l u e n c e d 134 a l l e r g i c d i s o r d e r s o f man. P o l l e n a l l e r g i e s a r e r e l a t e d t o s e a s o n a l f l u c t u a t i o n s i n t h e a l l e r g e n ( t h e p o l l e n s e a s o n s ) b u t b r o n c h i a l a s t h m a h a s no a p p a r e n t r e l a t i o n s h i p w i t h t h e s e a s o n a l p r e v a l e n c e o f e x t r i n s i c a l l e r g e n s . I t i s o f i n t e r -e s t t h a t s h o r t - t e r m v a r i a t i o n s i n s u c h d i s o r d e r s a r e a s s o c -i a t e d w i t h c o l d d r y w e a t h e r ( D e r r i c k , 1 9 6 9 ) . One i n f l u e n c e w e a t h e r may h a v e i s t h r o u g h e n d o c r i n e a d a p t a t i o n f o r t h e r m a l h o m e o s t a s i s , s i n c e h o r m o n e s , p a r t i c u l a r l y t h y r o x i n e , e x h i b i t m a r k e d e f f e c t s on m e d i a t o r s o f a l l e r g i c r e a c t i o n s ( T e l f o r d , 1 9 6 9 ) . The s t r e s s o f c h r o n i c e x p o s u r e t o hi g h , a l t i t u d e may a l s o be s i g n i f i c a n t . C a t t l e g r a z i n g m o u n t a i n r a n g e s a t e l e -v a t i o n s o v e r 7,500 t o 8,000 f e e t o f t e n show " h i g h m o u n t a i n " o r " b r i s k e t " d i s e a s e , a d i s o r d e r d i r e c t l y r e l a t e d t o h y p o x i a ( A l e x a n d e r and W i l l , 1 9 6 3 ) . M o u n t a i n s h e e p u n d e r n o r m a l c i r c u m s t a n c e s a r e o b v i o u s l y w e l l a d a p t e d t o t h i s e n v i r o n m e n t . H o w e v e r , d i s e a s e s o f a l l e r g i c p a t h o g e n e s i s may m a r k e d l y i m p a i r t h i s a d a p t a b i l i t y and may p o s s i b l y l e a d t o a s i m i l a r c o n d i t i o n . c ) R o l e o f I m m u n o l o g i c u n r e s p o n s i v e n e s s A number o f f e a t u r e s o f l u n g w o r m I n f e c t i o n s i n c a p t i v e a n i m a l s s u g g e s t e d t h a t t h e s p r i n g r i s e may be a s s o c i a t e d w | t h d ' i m i n i s h e d i m m u n o l o g i c r e a c t i v i t y . I m m u n o g l o b u l i n l e v e l s w e r e n o t e l e v a t e d i n r e s p o n s e t o i n c r e a s e d l a r v a l o u t p u t and. 135 IgA and IgM e v e n t e n d e d t o be somewhat d e p r e s s e d . L e v e l s o f h o m o c y t o t r o p i c a c t i v i t y f o l l o w e d a s i m i l a r p a t t e r n . A l t h o u g h t h e r e s u l t s o f t h e d e c o m p l e m e n t e d - s e r u m t e s t showed a m a r k e d p o s i t i v e a s s o c i a t i o n w i t h p a r a s i t e a c t i v i t y , i m p r o v e d a d h e r -e n c e a l s o c o u l d be a c h i e v e d by d i l u t i n g t e s t s e r a , T h e s e r e -s u l t s , t h e r e f o r e , c o u l d be i n t e r p r e t e d as a d e p r e s s i o n o f b l o c k i n g a n t i b o d i e s . The e x a c t , c a u s e o f t h i s a p p a r e n t d e p r e s s i o n i s d i f f i -c u l t t o I d e n t i f y . A r e l a t i v e l y m i l d c o a s t a l c l i m a t e a p p e a r e d t o e x c l u d e s e a s o n a l t h e r m a l s t r e s s . H o w e v e r , e n d o c r i n e c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h t h e s e a s o n a l l i g h t reg.imen may h a v e o p e r a t e d e i t h e r d i r e c t l y o r by i n f l u e n c i n g f e e d I n t a k e . A l t h o u g h t h e e x p e r i m e n t a l a n i m a l s were o f f e r e d a u n i f o r m r a t i o n , ad l i b i t u m , f e e d i n t a k e showed s e a s o n a l v a r i a t i o n s i n a l l a n i m a l s w h i c h was i n d e p e n d e n t o f p a r a s i t e l o a d s . In l a t e w i n t e r and e a r l y s p r i n g t h e y were i n n o t i c e a b l y p o o r e r c o n d i t i o n t h a n d u r i n g o t h e r s e a s o n s . C h a n g e s i n immune r e a c t i v i t y a r e n o t n e c e s s a r i l y re - r l a t e d t o e x t r i n s i c i n f 1 u e n c e s . P a r a s i t i c n e m a t o d e s o f t e n show m a r k e d s p e c i e s s p e c i f i c i t y and p r e s u m a b l y h a v e u n d e r g o n e v e r y s p e c i f i c a d a p t a t i o n s t o t h e i r h o s t s . G e n e r a l l y , t h e r e a r e t h r e e p r i n c i p a l m e t h o d s t h a t p a r a s i t e s may h a v e a d o p t e d t o e v a d e t h e i m m u n o l o g i c a l a t t a c k s o f t h e h o s t ; i n d u c t i o n o f t o l e r a n c e , i m m u n o s u p p r e s s i o n , and s e q u e s t r a t i o n o f a n t i g e n s . The f i r s t two may be i n v o l v e d |n s e a s o n a l c h a n g e s In 136 r e s p o n s i v e n e s s w h e r e a s t h e l a t t e r m e c h a n i s m may be i n v o l v e d In t h e g e n e r a l p e r s i s t e n c e o f t h e p a r a s i t e . ( 1 ) I n d u c t i o n o f t o l e r a n c e Owen ( 1 9 4 5 ) d e m o n s t r a t e d t h e p r e s e n c e o f two d i s t i n c t b l o o d g r o u p s i n d i z y g o t i c b o v i n e t w i n s . T h i s e r y t h r o c y t e c h i m a e r i s m was f o u n d t o r e s u l t f r o m v a s c u l a r a n a s t o m o s e s in utero. B a s e d on t h i s o b s e r v a t i o n , B u r n e t and F e n n e r ( 1 9 4 8 ) p r o p o s e d t h a t e x p o s u r e , t o f o r e i g n a n t i g e n s d u r i n g p r e n a t a l l i f e w o u l d r e s u l t i n t h e r e c o g n i t i o n o f t h o s e a n t i g e n s as " s e l f c o m p o n e n t s " and t h a t a s p e c i f i c Immune r e s p o n s e w o u l d n o t be made i n a d u l t l i f e . B i l l i n g h a m , B r e n t and Medawar ( 1 9 5 5 ) e x p e r i m e n t a l l y d e m o n s t r a t e d t h a t t o l e r a n c e t o s k i n g r a f t s i n m i c e c o u l d be i n d u c e d by p r e n a t a l e x p o s u r e t o d o n o r h i s t o c o m p a t i b i l i t y a n t i g e n s . V e r t i c a l t r a n s m i s s i o n o f Protostrongylus f r o m ewe t o lamb has b e e n p r o p o s e d ( s e e s e c t i o n A . 3 , page 4 ) . T o l e r a n c e i n d u c e d by i n f e c t i o n in utero, t h e r e f o r e , may p l a y a r o l e i n r e s i s t a n c e t o p a r a s i t i s m . I m m u n o l o g i c a l u n r e s p o n s i v e n e s s was d e m o n s t r a t e d i n a d u l t r a t s i n f e c t e d w i t h Nippostrongylus brasiliensis e a r l y i n l i f e ( J a r r e t t , J a r r e t t and U r q u h a r t , 1966) and i n " m i c e s i m i l a r l y i n f e c t e d w i t h Schistosoma ( L e w e r t a n d M a n d l o w i t z , 1 9 6 9 ) . H o w e v e r , a number o f s t u d i e s i n d i -c a t e d t h a t t h i s may n o t o c c u r w i t h e q u a l e a s e i n a l l s p e c i e s . F o r e x a m p l e , S l l v e r s t e l n and h i s c o - w o r k e r s ( P r e n d e r g a s t , 137 S i l v e r s t e i n and P a r s h a l l , 1969) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e f e t a l lamb c a n r e j e c t g r a f t s and p r o d u c e h u m o r a l a n t i b o d i e s a t l e a s t t o some a n t i g e n s a b o u t m i d - g e s t a t i o n . T o l e r a n c e i s a d o s a g e - d e p e n d e n t phenomenon ( L e s k o w i t z , 1968; I v a n y i and C e r n y , 1 9 6 9 ) . The a d m i n i s t r a t i o n o f moder-a t e d o s e s o f a n t i g e n s t i m u l a t e s a n t i b o d y f o r m a t i o n b u t b o t h v e r y h i g h and v e r y low d o s e s i n d u c e a s t a t e o f u n r e s p o n s i v e -n e s s . G e n e r a l l y , s o l u b l e a n t i g e n s a d m i n i s t e r e d i n t r a v e n o u s l y i n d u c e t h i s t o l e r a n t s t a t e more e a s i l y t h a n p a r t i c u l a t e a n t i -g e n s i n j e c t e d by some o t h e r r o u t e . T t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t a n t i g e n w h i c h b y - p a s s e s m a c r o p h a g e p r o c e s s i n g w i l l p r e -v e n t t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f i m m u n o c o m p e t e n t c e l l s ( B i r o and A r r o y a v e , 1970) w h e r e a s p r o c e s s e d a n t i g e n w i l l s t i m u l a t e an immune r e s p o n s e ( M i t c h i s o n , 1 9 6 8 ) . H o w e v e r , o n c e a n t i b o d y f o r m a t i o n has b e e n i n d u c e d , t o l e r a n c e c a n n o t be e s t a b l i s h e d e a s i l y . U n r e s p o n s i v e n e s s t o c e r t a i n p a r a s i t e a n t i g e n s may be i n d u c e d by t h i s m e c h a n i s m . C h r o n i c e x p o s u r e t o a c o n s t a n t a n t i g e n i c s t i m u l u s o f t e n l e a d s t o a c e r t a i n d i m i n u t i o n o f r e s p o n s i v e n e s s ( G r a s , 1 9 6 9 ) . D i n e e n and W a g l a n d ( 1 9 6 6 ) and W a g l a n d and D i n e e n ( 1 9 6 7 ) h a v e d e s c r i b e d a phenomenon t h e y c a l l e d " i m m u n o l o g i c e x h a u s t i o n " w h e r e b y i n t e r r u p t i o n o f an i n f e c t i o n o f Haemonchus w i t h a n t h -e l m i n t i c s e n a b l e d a n i m a l s t o r e g a i n t h e i r i m m u n o l o g i c c a p a c -i t i e s . V e r y l i t t l e i s p r e s e n t l y known a b o u t the- m e c h a n i s m i n v o l v e d ( c f . D o n a l d , D i n e e n and Adams, 1 9 6 9 ) . 138 ( 2 ) I m m u n o s u p p r e s s i o n E p i d e m i o l o g i c a l e v i d e n c e i n d i c a t e s t h a t i n f e c t i o n w i t h c e r t a i n p a r a s i t e s m a y v r e s u l t i n i m m u n o s u p p r e s s i o n . G r e e n w o o d , H e r r i c k and V o l l e r ( 1 9 7 0 a ) f o u n d a low i n c i d e n c e o f a u t o -immune d i s o r d e r s i n A f r i c a n s w h i c h t h e y a t t r i b u t e d t o t h e p r e s e n c e o f m u l t i p l e p a r a s i t i c i n f e c t i o n s . P l a s m o d i a w e r e b e l i e v e d t o be p a r t i c u l a r l y e f f e c t i v e ( G r e e n w o o d , H e r r i c k and V o l l e r , 1 9 7 0 b ) . R e c e n t l y , S v e t - M o l d a y s k y et al. C l970] h a v e b e e n a b l e t o d e m o n s t r a t e an i n h i b i t i o n o f s k i n a l l o g r a f t r e -j e c t i o n i n Trichinella^infected m i c e . S y n e r g i s m b e t w e e n h e l m i n t h s and m i c r o b i a l i n f e c t i o n s h a s b e e n f r e q u e n t l y r e p o r t e d ( C a m p b e l l and M a r t i n , 1968; W o o d r u f f , 1968] and i t may p l a y a r o l e i n t h e l u n g w o r m -p n e u m o n i a c o m p l e x o f b i g h o r n s h e e p . The p o s s i b l e r o l e o f p a r a s i t e - i n d u c e d ' i m m u n o s u p p r e s s i o n i n t h i s a s s o c i a t i o n s h o u l d be e x a m i n e d i n more d e t a i l . ( 3 ) S e q u e s t r a t i o n o f a n t i g e n s . N e o p l a s t i c and t r o p h o b l a s t i c c e l l s and p e r h a p s Proto-strongylus l a r v a e mask t h e i r a n t i g e n i c e x p r e s s i o n w i t h a h i g h l y a n i o n i c c o a t . T h i s p r e s u m a b l y a l l o w s them t o e v a d e t h e i m m u n o l o g i c a s s a u l t s o f t h e h o s t . H o w e v e r , s e l e c t i v e p r e s s u r e s may n o t h a v e b e e n e n t i r e l y i n t h e d i r e c t i o n o f e l i m i n a t i o n o f a n t i g e n i c i t y . D i n e e n ( 1 9 6 3 ) e n v i s a g e d t h e 139 p r e s e n c e o f t h r e s h o l d l e v e l s o f a n t i g e n i c s t i m u l a t i o n . Some a n t i g e n d i s p a r i t y was b e l i e v e d t o be f a v o r a b l e b e c a u s e i t p e r m i t t e d t h e c o n t r o l o f v e r y h e a v y i n f e c t i o n s w h i c h w e r e u l t i m a t e l y d e t r i m e n t a l t o t h e p a r a s i t e by d e s t r o y i n g t h e h o s t " r e s o u r c e . " T h i s t y p e o f e v o l u t i o n i m p ! i e s g r o u p , as o p p o s e d t o i n d i v i d u a l , s e l e c t i o n w h i c h f o r m s t h e b a s i s o f s e v e r a l t h e o r i e s o f p o p u l a t i o n r e g u l a t i o n ( W y n n e - E d w a r d s , 1963; B r e r e t o n , 1 9 6 6 ) . The c o n t r o v e r s i a l a s p e c t a r i s e s f r o m t h e i m p l i c a t i o n t h a t a l t r u i s t i c t r a i t s h a v e e v o l v e d w h i c h , a l t h o u g h d i s a d v a n t a g e o u s t o t h e i n d i v i d u a l , e n h a n c e t h e s u c -c e s s o f t h e g r o u p . One d i f f i c u l t y i s t h e p a r t i c u l a r i n s t a - r b i l i t y o f g e n e t i c p o l y m o r p h i s m s f o r t h e s e t r a i t s ( M a y n a r d -S m i t h , 1964, 1 9 6 5 ) . A l t r u i s m c a n n o t a r i s e by m u t a t i o n and s p r e a d by s e l e c t i o n . The e s s e n t i a l c o n d i t i o n f o r t h i s t y p e o f e v o l u t i o n a r y d e v e l o p m e n t a p p e a r s t o be g e n e t i c d r i f t . d) M o n i t o r i n g d i s e a s e I f . t h e p r o p o s e d r o l e o f l u n g w o r m s i s s i g n i f i c a n t i n f r e e - r a n g i n g p o p u l a t i o n s o f w i l d s h e e p , i t may be i m p o r t a n t t o m o n i t o r s u b c l i n i c a l p a r a s i t i s m i n t h e f i e l d . T h e r e a r e c e r t a i n m i n i m a l r e q u i r e m e n t s f o r s a t i s f a c t o r y i n d i c e s o f p a t h o l o g i c a l p r o c e s s e s . Many o f t h e commonly u s e d b a s i c b l o o d p a r a m e t e r s a r e n o t s u f f i c i e n t l y s e n s i t i v e and o f t e n r e f l e c t o n l y s e c o n d a r y e f f e c t s due t o s e v e r e l o s s o f b o d y c o n d i t i o n . If c h a n g e s ca n be m e a s u r e d as e a s i l y by v i s u a l 140 i n s p e c t i o n , b l o o d p a r a m e t e r s become r e d u n d a n t u n l e s s , o f c o u r s e , t h e y l e n d some i n s i g h t i n t o b i o l o g i c a l phenomena. F e c a l l a r v a l c o u n t s h a v e been u s e d e x t e n s i v e l y i n t h e a s s e s s m e n t o f p a r a s i t i s m i n w i l d u n g u l a t e p o p u l a t i o n s . One l i m i t a t i o n i s t h e v a r i a b i l i t y e n c o u n t e r e d b e t w e e n s a m p l e s . By a n a l o g y t o t h e c h r o m i c o x i d e - m a r k e r t e c h n i q u e , t h e l e v e l w o u l d a l s o be i n f l u e n c e d by f e e d i n t a k e and t h e d i g e s t i -b i l i t y o f t h e r a t i o n . In t h i s s t u d y , i m m u n o g l o b u l i n q u a n t i t a t i o n was f o u n d t o be u n s a t i s f a c t o r y f o r m o n i t o r i n g s u b c l i n i c a l p a r a s i t i s m . T h i s was i n a g r e e m e n t w i t h t h e work o f M c G r e g o r et al. ( 1 9 7 0 ) who w e r e u n a b l e t o d e t e c t an i n t e r p r e t a b 1 e i m m u n o g l o b u l i n r e -s p o n s e t o m u l t i p l e p a r a s i t i c i n f e c t i o n s i n n a t i v e G a m b i a n s . As shown i n s e c t i o n c ) , p a g e 9 0 , t h e l e v e l o f h y p e r s e n -s i t i v i t y t e n d e d t o be r e l a t e d t o t h e l e v e l o f a l l e r g e n i c s t i m u l a t i o n and t h e p r e d i s p o s i t i o n t o a l l e r g y w h i c h may r e -p r e s e n t a b a l a n c e b e t w e e n h o m o c y t o t r o p i c and b l o c k i n g a n t i -b o d y . The m o s t c o n v e n i e n t r o u t i n e t e s t e x p r e s s i n g t h e b a l a n c e o f t h e s e f a c t o r s a p p e a r e d t o be t h e s e r o m u c o i d i n d e x as l o n g as o t h e r p a t h o l o g i c p r o c e s s e s c o u l d be e x c l u d e d . C e l l a d h e r e n c e t e c h n i q u e s may p r o v e v a l u a b l e f o r e s t a b -l i s h i n g s e a s o n a l i n f e c t i v e p a t t e r n s o f l u n g w o r m s . H o w e v e r , more d e t a i l e d s t u d i e s o f t h e a n t i g e n i c c h a r a c t e r i z a t i o n o f . l a r v a l s t a g e s a r e r e q u i r e d t o f a c i l i t a t e more d e t a i l e d l i f e c y c l e s t u d i e s . 141 2. E x p l o i t a b l e m o l e c u l a r m e c h a n i s m s i n t h e c o n t r o l o f p a r a s i t i c d i s e a s e s a) I m m u n o p r o p hy T a x i s A t t e m p t s t o a r t i f i c i a l l y i m m u n i z e a n i m a l s a g a i n s t z o o -p a r a s i t i c i n f e c t i o n s h a v e b e e n l a r g e l y u n s u c c e s s f u l . A c t u a l i n f e c t i o n a p p e a r s t o be a p r e r e q u i s i t e f o r t h e i n d u c t i o n o f an i m m u n i t y w h i c h i s u s u a l l y p r e m u n i t i v e , i . e . , r e q u i r e s t h e c o n t i n u e d p r e s e n c e o f t h e p a r a s i t e . M o d e r a t e s u c c e s s h a s " b e e n a c h i e v e d u s i n g i r r a d i a t e d l a r v a l v a c c i n e s ; h o w e v e r t e c h n i c a l p r o b l e m s s u c h as s h e l f - l i f e and s t a n d a r d i z a t i o n a r e i m p o r t a n t d r a w b a c k s . A number o f w o r k e r s h a v e a t t e m p t e d t o i s o l a t e m e t a b o l i c p r o d u c t s f r o m l a r v a e c u l t u r e d in vitro on t h e a s s u m p t i o n t h a t t h e p r e s e n c e o f t h e s e a n t i g e n s e x -p l a i n e d t h e r e q u i r e m e n t f o r 1 i v e i n f e c t t o n s . D e s p i t e t h e i n t u i t i v e a p p e a l o f t h e i r h y p o t h e s i s , r e s u l t s h a v e n o t been g r a t i f y i n g (Denham, 1 9 6 9 ) . V e r y l i t t l e a t t e n t i o n has b e e n g i v e n t o t h e mode o f p r e s e n t a t i o n o f a n t i g e n p r e p a r a t i o n s t o t h e immune s y s t e m . T h i s a s p e c t may be v e r y i m p o r t a n t s i n c e t h e p a r a s i t e - h o s t i n t e r a c t i o n i s v e r y d e l i c a t e l y b a l a n c e d . T h i s s t u d y has d e m o n s t r a t e d t h a t many i m m u n o l o g i c m e c h a n i s m s a r e i n v o l v e d ; some a r e d e t r i m e n t a l w h e r e a s o t h e r s may e v e n p r o v i d e p r o -t e c t i o n f o r t h e p a r a s i t e . ' I m m u n o l o g i c e n h a n c e m e n t has. b e e n r e p o r t e d t o f o l l o w " i m m u n i z a t i o n " 1 w i t h l y o p h t l i z e d t u m o r c e l l s ( A r e n a , 1 9 6 9 ) . T h i s may p r o v i d e an e x p l a n a t i o n f o r 142 numerous u n s u c c e s s f u l a t t e m p t s t o s t i m u l a t e i m m u n i t y u s i n g c r u d e e x t r a c t s o f w h o l e a d u l t o r l a r v a l p a r a s i t i c h e l m i n t h s . More b a s i c i n f o r m a t i o n i s n e e d e d t o p e r m i t t h e r e d i r e c t i o n o f immune r e s p o n s e s t o t h e p r o d u c t i o n o f o n l y e f f e c t i v e s o l u b l e and e e l 1 - a s s o c i a t e d immune s u b s t a n c e s . Read [ 1 9 7 0 ] d i s c u s s e d c y b e r n e t i c p r i n c i p l e s i n a n i m a l s y m b i o s i s i n t r o d u c i n g t h e c o n c e p t o f f e e d b a c k l o o p s i n w h i c h some e x t r i n s i c i n f o r m a t i o n f r o m t h e h o s t i s n e c e s s a r y t o f i l l gaps i n t h e " r e a d o u t " p e r m i t t i n g a c o n t i n u a t i o n o f t h e d e v e l -o p m e n t a l s e q u e n c e o f t h e p a r a s i t e . F u r t h e r r e s e a r c h i s n e e d e d a l o n g t h e s e l i n e s t o d i s c l o s e c r i t i c a l g aps w h i c h c a n be b l o c k e d . E d w a r d s [ 1 9 7 0 ] has d i s c u s s e d a s i m i l a r a p p r o a c h t o t h e i m m u n o l o g i c i n t e r f e r e n c e o f c o n c e p t i o n and p r e g n a n c y . b) C h e m o t h e r a p y A d v a n c e s i n c h e m o t h e r a p y o f many i n f e c t i o n s h a v e de-p e n d e d on d i s r u p t i o n o f c r i t i c a l b i o c h e m i c a l s t e p s w h i c h a r e u n i q u e t o t h e p a t h o g e n . S t u d i e s w i t h c e l l a d h e r e n c e d i s -c l o s e d . t h a t a n t i g e n i c c a m o u f l a g e , a c q u i r e d by t h e a d s o r p t i o n o f - s u b s t a n c e s o f h o s t o r i g i n , may r e p r e s e n t a p r o t e c t i v e a d a p t a t i o n o f Prostrongylus [ s e c t i o n ' 8.a. 3. c , p a g e 1 2 9 ) . I f t h i s phenomenon i s f o u n d t o be w i d e s p r e a d among p a r a s i t e s , c h e m o t h e r a p e u t i c m o d i f i c a t i o n o f c u t i c u l a r r e c e p t o r s f o r t h e s e s u b s t a n c e s may" be; an i m p o r t a n t t a r g e t f o r t h e d e v e l o p -ment o f new a n t h e l m i n t i c s . 143 c) M o d e r a t i o n o f h y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e s ' The d e t r i m e n t a l m a n i f e s t a t i o n s o f p a r a s i t i s m a r e o f t e n l a r g e l y r e l a t e d t o the^ i m m u n o p a t h o l o g i c a l e f f e c t s o f h y p e r -s e n s i t i v i t i e s . I m m u n o s u p p r e s s i v e d r u g s h a v e b e e n u s e d i n a t t e m p t s t o m i n i m i z e i n f l a m m a t i o n and n o d u l e f o r m a t i o n . E x p e r i m e n t s u s i n g c a p t i v e b i g h o r n ewes i n f e r e d t h a t b l o c k i n g a n t i b o d i e s a r e t h e m o s t v a l u a b l e p r o t e c t i o n t h e h o s t may h a v e . I m m u n o s u p p r e s s i o n may a g g r a v a t e r a t h e r t h a n m i t i g a t e a l l e r g i c m a n i f e s t a t i o n s s i n c e t h e e f f i c a c y o f e a c h immune e f f e c t o r may d i f f e r on a p e r u n i t b a s i s . R a t h e r t h a n r e l y i n g on t h i s a p p r o a c h , t h e r a p y i n v o l v i n g r e p e a t e d i n j e c t i o n o f a l l e r g e n s h o u l d be e x p l o r e d as an a l t e r n a t i v e . 144 E. SUMMARY AND CONCLUSIONS H i s t o r i c a l l y , r e s p i r a t o r y d i s e a s e s w i t h v e r y c o m p l e x e t i o l o g i e s h a v e p l a y e d an i m p o r t a n t r o l e i n t h e p o p u l a t i o n d y n a m i c s o f t h e R o c k y M o u n t a i n b i g h o r n s h e e p . S i n c e h e a v y i n f e c t i o n s w i t h t h e l u n g w o r m , Protostrongylus s t i l e s i , o f t e n h a v e b e e n a s s o c i a t e d w i t h o u t b r e a k s o f p n e u m o n i c d i s e a s e , t h i s s t u d y was i n i t i a t e d t o p r o v i d e i n s i g h t i n t o t h e immuno-l o g i c i m p l i c a t i o n s o f i n f e c t i o n s w i t h t h i s p a r a s i t e . The immune r e s p o n s e t o p a r a s i t i s m i s c o m p l e x . H e l -m i n t h s r e l e a s e a b e w i l d e r i n g number o f a n t i g e n i c s u b s t a n c e s t o w h i c h t h e h o s t r e s p o n d s w i t h an e q u a l l y c o m p l e x a r r a y o f i m m u n o l o g i c e f f e c t o r s . A t h i r d d i m e n s i o n i s a d d e d when i t i s c o n s i d e r e d t h a t p a r a s i t e s a r e p r e d o m i n a n t l y e x t r a v a s c u l a r and m e c h a n i s m s w h i c h c a u s e c h a n g e s i n v a c u l a r p e r m e a b i l i t y may be r e q u i r e d t o p e r m i t an a c c u m u l a t i o n o f immune s u b s t a n -c e s a t t h e s i t e o f i n f e c t i o n . S i n c e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p a r a s i t e and h o s t i s r e l a t i v e l y r e f r a c t o r y t o a n a l y s i s u s i n g e x i s t i n g t e c h n i q u e s , t h e p r e s e n t s t u d y was d e v o t e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f in v i t r o m o d e l s w h i c h w o u l d s i m u l a t e i n t e r -a c t i o n s o c c u r i n g i n i n f e c t e d a n i m a l s . In t h e e a r l y p h a s e s o f t h e s t u d y , t h e i m m u n o g l o b u l i n s w e r e e x a m i n e d as n o n - s p e c i f i c m e a s u r e s o f a n t i g e n i c s t i m u l a -t i o n . S i n c e o n l y IgM and t o t a l IgG l e v e l s h a v e b e e n r e p o r t e d f o r r u m i n a n t s , a p r o c e d u r e was d e v e l o p e d w h i c h p e r m i t t e d t h e 145 i m m u n o c h e m i c a l q u a n t i t a t i o n o f IgM, IgG-] and I g G 2 and t h e s e m i - q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f I g A . A l t h o u g h t h e immuno-g l o b u l i n s d i d n o t r e f l e c t p a r a s i t e a c t i v i t y , t h i s p a r t o f t h e s t u d y was i m p o r t a n t f o r t h e a n a l y s i s o f i n t e r a c t i o n s among a n t i b o d i e s , c e l l s and t h e l u n g w o r m . C h a n g e s i n t h e e l e c t r o p h o r e t t c p r o f i l e o f t h e s e r o -m u c o i d s a p p e a r e d t o p r o v i d e a s e n s i t i v e m e a s u r e o f p a r a s i t e a c t i v i t y . T h i s t e c h n i q u e may p r o v e u s e f u l f o r m o n i t o r i n g i n f e c t i o n s i n f r e e - r a n g f n g a n i m a l s . The i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e t o p a r a s i t i s m a p p e a r e d t o be a c o m p l e x phenomenon r e l a t e d t o b o t h b i o m a s s o f t h e p a r a s i t e and p r e d i s p o s i t i o n o f t h e h o s t t o i m m u n o l o g i c h y p e r s e n s i -t i v i t i e s . To d e t e r m i n e t h e c o n t r i b u t i o n o f a l l e r g i c p r o -c e s s e s t o t i s s u e i n j u r y , a w a s h e d - c e l l a d h e r e n c e a s s a y f o r h o m o c y t o t r o p i c a n t i b o d y was d e v e l o p e d . The r e s u l t s o f t h i s t e s t w e r e c o r r e l a t e d w i t h s k i n - s e n s i t i z i n g a c t i v i t y . The a d d i t i o n o f d e c o m p l e m e n t e d s e r u m t o t h i s s y s t e m m o d e r a t e d a d h e r e n c e and p r o d u c e d r e s u l t s w h i c h c l o s e l y p a r a l l e l e d m e a s u r e s o f i n f l a m m a t o r y c h a n g e s o c c u r r i n g in vivo. T h i s s u g g e s t e d t h a t c o m p e t i t i v e i n t e r a c t i o n s among s e v e r a l s e r u m f a c t o r s o r n e g a t i v e f e e d b a c k s by h i g h l e v e l s o f h o m o c y t o -t r o p i c a n t i b o d y [ s e c t i o n 8 . a , page 119} d e t e r m i n e d t h e f i n a l p r e d i s p o s i t i o n o f p a r a s i t i z e d a n i m a l s t o i m m u n o g e n i c i n f l a m -m a t i o n . T h i s p h a s e o f t h e s t u d y i n d i c a t e d ' t h a t t h e r a p e u t i c d e s e n s i t i z a t i o n u s i n g g r a d e d i n j e c t i o n s o f p a r a s i t e a l l e r g e n 146 may be u s e f u l f o r c o n t r o l l i n g t h e d i s f i g u r i n g and d i s a b l i n g m a n i f e s t a t i o n s o f e x a g g e r a t e d t i s s u e r e a c t i o n s w h i c h o c c u r i n many h e l m i n t h , i n f e c t i o n s . S i n c e an e x a m i n a t i o n o f p a r a s i t e l e s i o n s and t h e c u t -a n e o u s r e s p o n s e t o .'antigens i n f e r e d t h e i n v o l v e m e n t o f c e l l -u l a r i m m u n i t y , r e a c t i o n s o f l y m p h o i d e l e m e n t s w e r e e x a m i n e d . P r e l i m i n a r y s t u d i e s i n d i c a t e d t h a t l a r v a l e x t r a c t s had a d e t r i m e n t a l e f f e c t on l y m p h o c y t e s , in vitro, b u t t h e s p e c i -f i c i t y and s i g n i f i c a n c e o f t h e o b s e r v a t i o n were n o t d e t e r -m i n e d . M i n u t e amounts o f a n t i b o d y p r o m o t e d a d h e r e n c e o f l y m p h o e y t e s t o t h e l a r v a l c u t i c l e . T h i s r e a c t i o n was h i g h l y s e n s i t i v e t o t h e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f a n t i b o d y . H o w e v e r , i n m i n i m a l l y d i l u t e d a l l e r g i c s e r u m , l a r g e r l y m p h o i d e l e m e n t s a l s o e x h i b i t e d a d h e r e n c e . T h e s e c e l l s a p p e a r e d t o be p a r t i c u l a r l y f r a g i l e a n d , a f t e r s h o r t i n c u b a t i o n p e r i o d s , u s u a l l y w e r e d i s r u p t e d l e a v i n g o n l y n u c l e a r r e m n a n t s a l o n g t h e c u t i c l e . T h i s p h a s e o f t h e s t u d y d e m o n s t r a t e d t h e c o m p l e x i t y o f t h e h o s t r e s p o n s e and empha-s i z e d t h e i m p o r t a n c e o f i n t e r a c t i o n s among e f f e c t o r s i n t h e f i n a l e x p r e s s i o n o f i m m u n o l o g i c r e a c t i o n s . T h r o u g h o u t t h i s s t u d y t h e l a r v a l c u t i c l e was c h o s e n as t h e a n t i g e n i c t a r g e t f o r d e m o n s t r a t i n g a l l e r g i c r e a c t i v i t y . The m o s t r e m a r k a b l e f e a t u r e o f c u t i c u l a r a n t i g e n s was t h e i r s t a b i l i t y d u r i n g e x p o s u r e t o a v a r i e t y o f e n z y m a t i c and-c h e m i c a l t r e a t m e n t s . N e u r a m i n i d a s e e n g e n d e r e d a m a r k e d 147 I m p r o v e m e n t o f c e l l a d h e r e n c e . T h i s s u g g e s t e d t h a t h i g h l y a n i o n i c s i a l i c a c i d r e s i d u e s on t h e c u t i c l e w h i c h i m p a r t e d s t r o n g C o u l o m b i c r e p u l s i v e f o r c e s r e p r e s e n t e d an i m p o r t a n t c o u n t e r - a d a p t a t i o n o f Protostrongylus t o t h e immune r e a c t i o n s o f i t s h o s t . F u r t h e r s t u d i e s showed t h a t c e l l a d h e r e n c e was im-p r o v e d by w a s h i n g l a r v a e i n 1 M N a C l and t h a t s e r a f r o m o t h e r s p e c i e s w e r e i n h i b i t o r y . A l t h o u g h t h i s may h a v e r e f l e c t e d n o n - s p e c i f i c a d s o r p t i o n o f v a r i o u s s u b s t a n c e s , Protostron-gylus may h a v e a d o p t e d t h i s f e a t u r e f o r a n t i g e n i c c a m o u f l a g e . T h r o u g h o u t t h i s s t u d y , p a r a s i t e a c t i v i t y a p p e a r e d t o be a s s o c i a t e d w i t h r e d u c e d i m m u n o l o g i c a l r e s p o n s i v e n e s s . H o w e v e r , i t was d i f f i c u l t t o d e t e r m i n e t h e c a u s e - e f f e c t n a t u r e o f t h i s r e l a t i o n s h i p . A l t h o u g h i t may r e p r e s e n t ex-t r i n s i c i n f l u e n c e s , t h e p o s s i b i l i t y t h a t p a r a s i t e s m a n i p u -l a t e t h e immune s y s t e m o f t h e i r h o s t s s h o u l d n o t be o v e r l o o k e d . D e t a i l e d e x a m i n a t i o n s o f t h e r o l e o f t o l e r a n c e , a n t i g e n s e -q u e s t r a t i o n and p e r h a p s i m m u n o s u p p r e s s i o n i n t h i s s y s t e m a r e s u g g e s t e d s u b j e c t s f o r f u t u r e r e s e a r c h . 0 L I T E R A T U R E CITED 149 L ITERATURE CITED A a l u n d , 0., J . W. O s e b o l d and F. A. M u r p h y . ( 1 9 6 5 ) I s o l a -t i o n and c h a r a c t e r i z a t i o n o f o v i n e y - g l o b u l i n s . A r c h . B i o c h . B i o p h y s . , 1 0 9 , 1 4 2 - 1 4 9 . A a r l i , J . A. ( 1 9 7 0 ) B i n d i n g o f y - g l o b u l i n f r a g m e n t s t o m u s c l e t i s s u e . C l i n . E x p . Immunol., 7_, 2 3 - 3 0 . A f o n s o , E. and J . S. P r o e n c a . ( 1 9 6 8 ) E l e c t r o p h o r e t i c h e t e r -o g e n e i t y o f I g G . C l i n . C h i m . A c t a , 21_, 143-1 49. A l e x a n d e r , A. F. and D. H. W i l l . ( 1 9 6 3 ) The s t r e s s o f h i g h a l t i t u d e upon c a t t l e . B i o m e t e o r o l ogy , 2_, 1 6 1 - 1 6 7 . A l l a n s m i t h , M., B. M c C l e V l a n and M.' B u t t e r w o r t h . ( 1 9 6 9 ) The i n f l u e n c e o f h e r e d i t y and e n v i r o n m e n t on human immuno-g l o b u l i n l e v e l s . J . Immunol., 1_02^ 1 5 0 4 - 1 5 1 0 . Amos, D. B., I . Cohen and W. J. K l e i n . ( 1 9 7 0 ) M e c h a n i s m s o f i m m u n o l o g i c e n h a n c e m e n t . T r a n s p l a n t a t i o n P r o c , 2_, 6 8 - 7 5 . A n d e r s e n , S. B. ( 1 9 6 4 ) M e t a b o 1 i s m o f Human y - G l o b u l i n. P h i l a d e l p h i a : F. A. D a v i s Co. A n y a , A. 0. ( 1 9 6 6 ) . The s t r u c t u r e and c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e n e m a t o d e c u t i c l e . O b s e r v a t i o n s on some o x y u r i d s and Ascaris. P a r a s i t o l o g y , 5_6 , 179 - 1 9 8 . A p f f e l , C. A. and J. H. P e t e r s . ( 1 9 6 9 ) Tumors and s e r u m . g l y c o p r o t e i n s . P r o g r . E x p . Tumor R e s . , 1_2, 1-54. A r e n a , S. ( 1 9 6 9 ) P r e s e n t c o n c e p t s i n c a n c e r and i m m u n o l o g i c r e s p o n s e s . L a r y n g o s c o p e , 79^, 1400-1 404. B a d i n , J., F. T r e n s z . and F. R o u s s e l e t . ( 1 9 6 8 ) I n d i v i d u a l i t e d'une f r a c t i o n de A - g l o b u l i n e s non p r e c i p i t a b l e s p a r l e z i n c a pH 7.3. C l i n . C h i m . A c t a , 1_9_, 1 1-18. B a i n , B. a n d L. L o w e n s t e i n . ( 1 9 6 4 ) G e n e t i c s t u d i e s on t h e m i x e d l e u c o c y t e r e a c t i o n . S c i e n c e , 145, 1 3 1 5 - 1 3 1 6 . B a n d y , P. J. ( 1 9 6 6 ) B i g h o r n s h e e p d i e - o f f i n B r i t i s h Columbia': a c o m p l e x o f e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s . P a p e r p r e -s e n t e d t o t h e A n n u a l M e e t i n g o f t h e C a n a d i a n S o c i e t y o f W i l d l i f e and F i s h e r i e s B i o l o g i s t s , O t t a w a . 150 B a r t h , E . E. E . , W. F. H. J a r r e t t and.G. M. U r q u h a r t . ( 1 9 6 6 ) S t u d i e s on t h e m e c h a n i s m o f t h e s e l f - c u r e r e a c t i o n i n r a t s i n f e c t e d w i t h Nippostrongylus b r a s i l i e n s i s . Immun-o l o g y , 1_0 , 4 5 9 - 4 6 4 . B a s t e n , A. and P. B. B e e s o n . ( 1 9 7 0 ) M e c h a n i s m o f e o s i n o -p h i l i a . I I . R o l e o f t h e l y m p h o c y t e . J . E x p . Med., 131 , 1 2 8 8 - 1 3 0 5 . B e n a c e r r a f , B., V. N u s s e n z w e i g , P. H. M a u r e r and W. S t y l o s . ( 1 9 6 9 ) R e l a t i o n b e t w e e n t h e n e t e l e c t r i c a l c h a r g e o f a n t i g e n s and s p e c i f i c a n t i b o d i e s . T o p i c s i n B a s i c Immun-o l ogy ( E d . by M. S e l a and M. P r y w e s ) . New Y o r k and L o n d o n : A c a d e m i c P r e s s . B e r e n d s e n , H. J . C. and C. M i g c h e T s e n . ( 1 9 6 5 ) H y d r a t i o n s t r u c t u r e o f f i b r o u s m a c r o m o l e c u l e s . A n n . N.Y. A c a d . S c i . , 125 , 365-379 . B e r k e n , A. and B. B e n a c e r r a f . ( 1 9 6 6 ) P r o p e r t i e s o f a n t i -b o d i e s c y t o p h i l i c f o r m a c r o p h a g e s . J . E x p . 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( 1 9 6 8 ) I s o l a t i o n o f g l y c o p e p t i d e s f r o m r a t l i v e r m i c r o s o m e s i n v o l v e d i n t h e b i o s y n t h e s i s o f p l a s m a g l y c o p r o t e i n . J . B i o l . Chem., 2 4 3 , 6 5 6 - 6 6 5 . L i c h t e n s t e i n , L. M. and A. G. O s i e r . ( 1 9 6 4 ) S t u d i e s on t h e m e c h a n i s m o f h y p e r s e n s i t i v i t y p henomena. I X. H i s t a m i n e r e l e a s e f r o m human l e u k o c y t e s by r a g w e e d p o l l e n a n t i g e n . J . E x p . Med., 2 2 0 , 5 0 7 - 5 3 0 . L i n e s , D. R. ( 1 9 6 9 ) S e l e c t i v e p r o t e i n u r i a i n c h i l d h o o d n e p h r o t i c s y n d r o m e . A r c h . D i s . C h i l d h . , 44, 4 6 1 - 4 6 4 . L i n g , N. R. ( 1 9 6 8 ) L y m p h o c y t e S t i m u l a t i o n . A m s t e r d a m : N o r t h H o l l a n d P u b l . C o . L i p p m a n , M. ( 1 9 6 8 ) T r a n s p l a n t a t i o n and t o x i c i t y c h a n g e s i n -d u c e d by a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s . N a t u r e ( L o n d . ) , 2 1 9 , 3 3 - 3 6 . L o w e r , R. R. ( 1 9 6 9 ) R e j e c t i o n o f t h e t r a n s p l a n t e d h e a r t . T r a n s p l a n t a t i o n P r o c , 7 3 3 -737 . M a c k e n z i e , M. R., N. L. W a r n e r , W. D. L i n s c o t t and H. H. F u d e n b e r g . ( 1 9 6 9 ) D i f f e r e n t i a t i o n o f human IgM s u b -c l a s s e s by t h e a b i l i t y t o i n t e r a c t w i t h a f a c t o r r e s e m -b l i n g t h e f i r s t c o m p o n e n t o f c o m p l e m e n t . J . Immunol., 103 , 6 0 7 - 6 1 2 . 160 M a c L e n n a n , I . C. M., G. L o e w i and B. H a r d i n g . ( 1 9 7 0 ) The r o l e o f i m m u n o g l o b u l i n s i n l y m p h o c y t e - m e d i a t e d c e l l dam-age in v i t r o . Immunology, JJ3 , 3 9 7 - 4 0 4 . M a n c i n i , G., A. 0. C a r b o n a r a and J . F. 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( 1 9 6 3 ) S t u d i e s on t h e m e c h a n i s m s o f i m m u n o l o g i -c a l e n h a n c e m e n t o f tu.mor h o m o g r a f t s . I . S p e c i f i c i t y o f t h e i m m u n o l o g i c a l e n h a n c e m e n t . J . N a t . C a n c e r I n s t . , 30, 1 1 5 3 - 1 1 7 5 . . ( 1 9 6 4 ) A n t i b o d y i n d u c e d d e p r e s s i o n o f t h e immune r e s p o n s e : a s t u d y o f t h e m e c h a n i s m i n v a r i o u s i m m u n o l o g -i c a l s y s t e m s . T r a n s p l a n t a t i o n , 2^ , 4 0 5 - 4 1 2 . , W. Lapp and L. L i n d h o l m . (1969 ) A l l o g e n e i c i n h i -b i t i o n i n t o l e r a n t a n i m a l s . T r a n s p l a n t a t i o n P r o c , 1_, 5 4 3 - 5 4 7 . M o n g a r , J . L. and D. W i n n e . ( 1 9 6 6 ) F u r t h e r s t u d i e s on t h e m e c h a n i s m o f p a s s i v e s e n s i t i z a t i o n . J . P h y s i o l . , 182, 79-91 . M o r g a n , W. T. J . and W. M. W a t k i n s . 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( u n d a t e d ) P a r a s i t e s ' o f t h e Ro c k y M o u n t a i n b i g h o r n s h e e p COvis canadensis} o f S o u t h E a s t e r n B r i t i s h C o l u m b i a . U n p u b l i s h e d r e p o r t , B r i t i s h C o l u m b i a F i s h and W i l d l i f e B r a n c h R e s e a r c h D i v i s i o n . T h o r s o n , R. E. ( 1 9 5 3 ) F o r m a t i o n i n t h e r a b b i t o f a n t i b o d i e s a g a i n s t Nippostrongylus rnuris. J . P a r a s i t o ! ., 3_9, 574. T u r k , J . L. ( 1 9 6 7 ) D e l a y e d H y p e r s e n s i t i v i t y . A m s t e r d a m arid L o n d o n : N o r t h - H o l l a n d P u b l . Co. U f f e l m a n , J . A., W. E. E n g e l h a r d and C. R. J o l l i f f . ( 1 9 7 0 ) Q u a n t i t a t i o n o f i m m u n o g l o b u l i n s i n n o r m a l c h i l d r e n . C l i n . C h i m . A c t a , 28,' 1 8 5 - 1 9 2 . U h r , J . W. ( 1 9 6 6 ) D e l a y e d h y p e r s e n s i t i v i t y . P h y s i o l . R e v . , 46, 3 6 0 - 3 8 5 . U n d e r d o w n , B. J . and L. G o o d f r i e n d . ( 1 9 7 0 ) C o r r e l a t i o n o f c h a r g e p r o p e r t i e s o f human r e a g i n i c a n t i b o d i e s w i t h c h a r g e o f t h e c o r r e s p o n d i n g a l l e r g e n s . J . rmmunol., 104, 5 3 0 - 5 3 3 . U r q u h a r t , G. M., W. M u l l i g a n , R. M. E a d i e and F. W. J e n n i n g s . ( 1 9 6 5 ) I m m u n o l o g i c a l s t u d i e s on Nippostrongylus b r a s i l -i e n s i s i n f e c t i o n i n t h e r a t : t h e r o l e o f l o c a l a n a p h y -l a x i s . E x p . P a r a s i t o l . , 1_7, 2 1 0 - 2 1 7 . V a s s a r , P. S., M. J . K e n d a l l and G. V. F. Seaman. ( 1 9 6 9 ) E l e c t r o p h o r e s i s o f human l e u k o c y t e s . A r c h . B i o c h . B i o p h y s . , 135_, 3 5 0 - 3 5 5 . V e r g a n i , C , R. S t a b i l i n i and A. A g o s t o n i . ( 1 9 6 7 ) Q u a n t i -t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f s e r u m i m m u n o g l o b u l i n s by s i n g l e r a d i a l i m m u n o d i f f u s i o n on c e l l u l o s e a c e t a t e . Immuno-c h e m i s t r y , 4, 2 3 3 - 2 3 7 . V i e r e c k , E . G. ( 1 9 6 3 ) I n f l u e n c e o f c o l d on h o s t - p a r a s i t e i n t e r a c t i o n s . P r o c . Symp. A r c t i c B i o l . Med. I I I . U.S. D e p t . Commerce, W a s h i n g t o n . V i z a , D. C , 0. D e g a n i , J . D a u s s e t and D. A. L. D a v i e s . ( 1 9 6 8 ) L y m p h o c y t e s t i m u l a t i o n by s o l u b l e human HL-A t r a n s p l a n t a t i o n a n t i g e n s . N a t u r e ( L o n d . ) , 2 1 9 , 7 0 4 - 7 0 5 . V o i s i n , G. A., R. K i n s k y , F. J a n s e n and C. B e r n a r d . ( 1 9 6 9 ) B i o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f a n t i b o d y c l a s s e s i n t r a n s p l a n -t a t i o n immune s e r a . T r a n s p l a n t a t i o n , 8, 6 1 8 - 6 3 1 . 169 W a d s w o r t h , C. and L. A. H a n s o n , ( 1 9 6 0 ) C o m p a r a t i v e a n a l y s i s , o f immune e l e c t r o p h o r e t i c p r e c i p i t a t e s e m p l o y i n g a m o d i -f i e d immune e l e c t r o p h o r e t i c t e c h n i q u e . I n t . A r c h . A l l e r g y , J7_> 1 65-1 77. W a g l a n d , B. M. and J . K. D i n e e n . ( 1 9 6 7 ) The d y n a m i c s o f t h e h o s t - p a r a s i t e r e l a t i o n s h i p . V I . R e g e n e r a t i o n o f t h e immune r e s p o n s e i n s h e e p i n f e c t e d w i t h Haemonchus contortus. P a r a s i t o l o g y , 5_7, 5 9 - 6 5 . Waldmann, T. A. ( 1 9 6 6 ) P r o t e i n - l o s i n g e n t e r o p a t h y . G a s t r o -e n t e r o l o g y , 50_, 4 2 2 - 4 4 3 . W e i m e r , H. E. and J . F. G o d f r e y . ( 1 9 6 5 ) N u t r i t i o n a l s t r e s s and t h e a c u t e - p h a s e r e a c t a n t s o f r a t s e r u m In e x p e r i -m e n t a l i n f l a m m a t i o n . C a n . J . P h y s i o l . P h a r m a c o l . , 42, 9 2 5 - 9 3 5 . W e i s s , L. ( 1 9 6 0 ) The a d h e s i o n o f c e l l s . I n t . Rev. C y t o l . , 9 ,. 1 8 7 - 2 2 5 . . ( 1 9 6 7 ) The Ce11 P e r i p h e r y . M e t a s t a s i s and O t h e r C o n t a c t Phenomena. A m s t e r d a m and L o n d o n : N o r t h - H o i 1 and P u b l . Co. and L. F. S i n k s . ( 1 9 7 0 ) The e l e c t r o k i n e t i c s u r f a c e o f human c e l l s o f l y m p h o i d o r i g i n and t h e i r r i b o n u c l e a s e s u s c e p t i b i l i t y . C a n c e r Res.,' 30., 9 0 - 9 4 . W e r n e r , M. ( 1 9 6 9 ) Serum p r o t e i n c h a n g e s d u r i n g t h e a c u t e -p h a s e r e a c t i o n . C l i n , C h i m . A c t a , 25_, 2 9 9 - 3 0 5 . W h i t e h e a d , P. H. and H. G. Sammons. ( 1 9 6 6 ) A s i m p l e t e c h -n i q u e f o r t h e i s o l a t i o n o f o r o s o m u c o i d f r o m n o r m a l and p a t h o l o g i c a l s e r a . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 124, 209-21 1. W h i t l o c k , J . H. and D. S. R o b s o n . ( 1 9 6 9 ) The a n a l y s i s o f p o p u l a t i o n and e n v i r o n m e n t a l d i s e a s e m e c h a n i s m s . C o r n e l l V e t . , 5 9 , 4 5 4 - 4 6 5 . W i n n , H. J . ( 1 9 7 0 ) H u m o r a l a n t i b o d y i n a l l o g r a f t r e a c t i o n s . T r a n s p l a n t a t i o n P r o c , 2^, 8 3 - 9 1 . W i n z l e r , R. J . and J . G. B e k e s i . ( 1 9 6 7 ) G l y c o p r o t e i n s i n r e l a t i o n t o c a n c e r . M e t h o d s i n C a n c e r R e s . , 2_, 1 5 9 - 2 0 2 . W o l f f , I . , G. W i c k , H. F u r t h m a y r , R. T i m p l and C. S t e f f e n . ( 1 9 7 0 ) I m m u n o g e n i c t y and s p e c i f i c i t y o f c o l l a g e n . V I I I . S t u d i e s on t h e a n t i g e n i c s t r u c t u r e o f s o l u b l e f i s h c o l l a g e n . I m m u n o l o g y , 18, 843-847.. 170 W o l l h e i m , E. A., B. P i h l , G. E k e l u n d and K. F. A r o n s e n . ( 1 9 6 9 ) I m m u n o g l o b u l i n s and a c u t e - p h a s e r e a c t a n t s i n man a f t e r m a j o r h e p a t i c r e s e c t i o n . S c a n d . J . G a s t r o e n t . , 4, 2 4 9 - 2 5 5 . W o o d r u f f , Z. W. (1968} H e l m i n t h s as v e h i c l e s and s y n e r g i s t s o f m i c r o b i a l i n f e c t i o n s . T r a n s . Roy. S o c . T r o p . Med. Hyg. , 62, 4 4 6 - 4 5 2 . W o o d r u f f , M. F. A., B. R e i d and K. J a m e s . ( 1 9 6 7 ) E f f e c t o f a n t i l y m p h o c y t i c a n t i b o d y and a n t i b o d y f r a g m e n t s on human l y m p h o c y t e s in vitro. M a t u r e ( L o n d . ) , 2 1 5 , 5 9 1 - 5 9 4 . W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n . ( 1 9 6 5 ) Immunology and P a r a s i t i c D i s e a s e s . W l d . H l t h . T e c h . . R e p . S e r . , No. 315. W y n n e - E d w a r d s , V. C. ( 1 9 6 3 ) I n t e r g r o u p s e l e c t i o n i n t h e e v o l u t i o n o f s o c i a l s y s t e m s . N a t u r e ( L o n d . ) , 200 , 6 2 3 - 6 2 6 . Y o f f e y * J . M., G. C. B. W i n t e r , D. Osmond and E . S. Meek. ( 1 9 6 5 ) M o r p h o l o g i c a l s t u d i e s i n t h e c u l t u r e o f human l e u c o c y t e s w i t h p h y t o h e m a g g l u t i n i n . B r i t . J . H a e m a t o l . , J _ l , 4 8 8 - 4 9 7 . Z a l e s k i , M., J . C e r n y and T. H r a b a . ( 1 9 6 6 ) C y t o l o g i c a l c h a n g e s i n t h e r e g i o n a l lymph n o d e s o f r a b b i t s a f t e r l o c a l a d m i n i s t r a t i o n o f human s e r u m a l b u m i n . F o l i a B i o l . , 1 2 , 22 - 2 8 . APPENDIX F i g . 32. D i s t r i b u t i o n o f t h e m a j o r b a n d s o f b i g h o r n s h e e p i n t h e E a s t K o o t e n a y R e g i o n o f B r i t i s h . C o l u m b i a . A d o p t e d f r o m D e m a r c h i and. D e m a r c h i , 1967 , W i l d -L i f e R e v i e w , 10, 10-13. 40 35 30 2 5 173 W a s h e d - c e l l t e s t ro > S-ro S -CU CL CP. • I — S -cu sz •o rO cu o 20 15 10 5. 80 70 60 50 40 30 20 10 8 D e c o m p l e m e n t e d - s e r u m t e s t 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 12 13 1 4 1 5 D i a m e t e r o f s k i n r e a c t i o n (mm) F i g . : 33 R e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e w a s h e d - c e l l and d e c o m p l e m e n t e d - s e r u m t e s t s w i t h t h e d i a m e t e r o f t h e s k i n r e a c t i o n f o l l o w i n g c h a l l e n g e w i t h p a r a s i t e a l l e r g e n s i x h o u r s a f t e r p a s s i v e s k i n s e n s i t i z a t i o n ( r e f e r t o s e c . i v ) , page 7 8 ) . 174 o C o n t r o l Protostrongylus a n t i g e n 48 72 96 H o u r s i n c u l t u r e 120 144 34 E f f e c t o f Protostrongylus a n t i g e n on c e l l s u r -v i v a l . The number o f v i a b l e c e l l s p e r ml o f c u l t u r e i s shown a f t e r v a r i o u s i n t e r v a l s o f i n c u b a t i o n . Number o f v i a b l e c e l l s r e p r e s e n t s t h e t o t a l c e l l c o u n t m u l t i p l i e d by t h e p e r -- c e n t a g e o f c e l l s e x c l u d i n g e o s i n Y ( r e f e r t o page 1 0 5 ) . 175 35 o C o n t r o l Protostrongylus a n t i g e n 4 5 6 7 8 9 10 1 1 R e l a t i v e c e l l d i a m e t e r g. 35 E f f e c t o f Protostrongylus a n t i g e n on t h e d i s t r i b u -t i o n o f c e l l d i a m e t e r s i n l y m p h o c y t e c u l t u r e s a f t e r 72 h o u r s i n c u b a t i o n a t 3 7 ° C e n t i g r a d e ( r e f e r t o p a g e 1 0 5 ) . 

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