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Histochemical localization of choline acetyltransferase in the deep cerebellar nuclei of the rat Petrali, Elena Harriet 1972

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831-UBC_1972_A6_7 P48.pdf [ 10.14MB ]
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The H i s t o c h e m i c a l L o c a l i z a t i o n o f C h o l i n e A c e t y l t r a n s f e r a s e i n t h e Deep C e r e b e l l a r N u c l e i o f t h e R a t by E l e n a H a r r i e t P e t r a l i B . Sc. ( H o n . ) , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1969 A T h e s i s s u b m i t t e d i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f M a s t e r o f S c i e n c e i n t h e ; D e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g y We a c c e p t t h i s t h e s i s as c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d The U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a S e p t e m b e r , 1972 In present ing th i s thes is in pa r t i a l f u l f i lmen t o f the requirements fo r an advanced degree at the Un ive rs i t y of B r i t i s h Columbia, I agree that the L ibrary sha l l make i t f r ee l y ava i l ab le for reference and study. I fu r ther agree that permission for extensive copying of th i s thes i s for s cho la r l y purposes may be granted by the Head of my Department or by h is representat ives . It is understood that copying or pub l i c a t i on of th is thes i s f o r f i nanc i a l gain sha l l not be allowed without my wr i t ten permiss ion. Department of 1*H VX/aLoCY The Univers i ty o f B r i t i s h Columbia Vancouver 8, Canada ABSTRACT A h i s t o c h e m i c a l method f o r t h e l o c a l i z a t i o n o f c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e , t h e s y n t h e s i z i n g enzyme of a c e t y l c h o l i n e has been r e c e n t l y d e v e l o p e d . C o n d i t i o n s o f t h e method were f i r s t i n v e s t i g a t e d and o p t i m i z e d i n the s p i n a l c o r d o f t h e r a t where c h o l i n e r g i c neurones a r e known t o be p r e s e n t . F o l l o w i n g s t a n d a r d i z a t i o n o f t h e method t h e l o c a l i z a t i o n o f the enzyme was s t u d i e d i n t h e deep c e r e b e l l a r n u c l e i . A s e r i e s o f t r a n s v e r s e s e c t i o n s were s t a i n e d t o f a c i l i t a t e , a l l o c a t i o n o f c e l l s d e m o n s t r a t i n g enzyme a c t i v i t y t o t h e i r r e s p e c t i v e n u c l e i as d e s c r i b e d i n t h e l i t e r a t u r e . The p r e s e n c e o f c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e was used as a d i r e c t i n d i c a t i o n o f a c h o l i n e r g i c neurone, and was found p r e d o m i n a n t l y i n t h e c e l l s i n t h e v e n t r a l p o r t i o n o f t h e l a t e r a l n u c l e u s , on t h e b o r d e r o f t h e i n t e r p o s i t u s and l a t e r a l n u c l e i and i n t h e c a u d a l p o r t i o n o f t h e m e d i a l n u c l e u s . The r e s u l t s o b t a i n e d a r e c o n s i s t e n t w i t h o t h e r s t u d i e s i n d i c a t i n g t h a t a p o r t i o n of: t h e c e r e b e l l o - t h a l a m i c pathway i s c h o l i n e r g i c . tm TABLE OP CONTENTS A b s t r a c t i i L i s t o f F i g u r e s v L i s t o f A b b r e v i a t i o n s v i i A c k n o w l e d g e m e n t s • ix I n t r o d u c t i o n A. G e n e r a l Comment 1 B. M o r p h o l o g y o f t h e C e r e b e l l a r N u c l e i 6 I . N u c l e u s m e d i a l i s 7 I I . N u c l e u s i n t e r p o s i t u s 9 I I I . N u c l e u s l a t e r a l i s 10 C. F i b r e C o n n e c t i o n s 12 I . G e n e r a l comment 12 I I . C o r t i c o - n u c l e a r p r o j e c t i o n s 13 I I I . B r a c h i u m c o n j u n c t i v u m 16 1. N u c l e u s m e d i a l i s 17 2. N u c l e u s i n t e r p o s i t u s a n d l a t e r a l i s 21 I V . Summary 23 M e t h o d s A. P r e p a r a t i o n 25 B. C h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e 25 C. A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e 27 D. H i s t o l o g i c a l S t a i n i n g 28 / T a b l e o f Contents. (IV) - c o n t i n u e d R e s u l t s 29 A. S p i n a l C o r d 30 I . S e c t i o n i n g 30 I I . I n c u b a t i o n 30 1. P r e c i p i t a t i o n o f CoA-SH and a c e t y l ^ CoA w i t h l e a d 31 2. C o n t r o l s a n d i n h i b i t o r s 35 I I I . S o d i u m S u l p h i d e 38 I V . H i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f AChE 40 B. C e r e b e l l u m 43 I . N u c l e u s m e d i a l i s 43 I I . N u c l e i i n t e r p o s i t u s and l a t e r a l i s 49 D i s c u s s i o n A. E v a l u a t i o n o f t h e M e t h o d 55 I . H i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n 55 I I . S u b s t r a t e s 56 I I I . M e c h a n i s m o f h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n 58 I V . The enzyme-ChAc 60 B. The C e r e b e l l o - T h a l a m i c P a t h w a y 64 C. Summary and C o n c l u s i o n s 71 B i b l i o g r a p h y 72 A p p e n d i x I C h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e 80 I I A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e 82 I I I P a r a f f i n S e c t i o n s 84 I V C r e s y l V i o l e t 86 V H a e m a t o x y l i n - D a r r o w Red 88 (V) L I S T OF FIGURES F i g u r e 1 F i g u r e 2 F i g u r e F i g u r e F i g u r e F i g u r e 3 4 5 6 F i g u r e 7 F i g u r e 8 F i g u r e 9 F i g u r e 10 F i g u r e 11 F i g u r e 12 F i g u r e 13 F i g u r e 14 F i g u r e 15 F i g u r e 16 S u b d i v i s i o n o f t h e c e r e b e l l a r n u c l e i . R e l a t i v e d i s t r i b u t i o n o f c e l l t y p e s f o u n d i n c e r e b e l l a r n u c l e i . P h y l o g e n e t i c d e v e l o p m e n t o f c e r e b e l l a r n u c l e i C o m p a r i s o n o f c e l l s i z e s o f c e r e b e l l a r n u c l e i M o r p h o l o g y o f r a t c e r e b e l l a r n u c l e i . L o n g i t u d i n a l a n a t o m i c a l z o n e s o f c o r t i c o -n u c l e a r p r o j e c t i o n s o f t h e c a t . M o d i f i c a t i o n o f B r o d a l ' s l o n g i t u d i n a l c o r t i c o n u c l e a r p r o j e c t i o n z o n e s o f t h e c a t a c c o r d i n g t o V o o g d . F i b r e c o m p o s i t i o n o f b r a c h i u m c o n j u n c t i v u m . P a t h o l o g i c a l c h a n g e s i n t h e c e r e b e l l a r n u c l e i t h e c a t f o l l o w i n g u n i l a t e r a l t r a n s e c t i o n o f b r a c h i u m c o n j u n c t i v u m . E f f e c t o f t i m e . E f f e c t o f d o u b l i n g t h e c oenzyme c o n c e n t r a t i o n E f f e c t o f o l d c o e n z y m e . a) E f f e c t o f p r e - i n c u b a t i o n . b) C o n t r o l r e s u l t . E f f e c t o f f o r m a l i n f i x a t i o n . T y p i c a l r e s u l t . A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e r e s u l t . F i g u r e 17 F i g u r e 18 F i g u r e 19 F i g u r e 20 F i g u r e 21 F i g u r e 22 F i g u r e 23 F i g u r e 24 F i g u r e 25 F i g u r e 26 F i g u r e 27 M i d d l e 1/3 o f r o s t r o - c a u d a l e x t e n t o f t h e c e r e b e l l a r n u c l e i o f t h e r a t . C r e s y l V i o l e t . 44 C a u d a l 2/3 o f r o s t r o - c a u d a l e x t e n t o f t h e c e r e b e l l a r n u c l e i o f t h e r a t . C r e s y l V i o l e t . 45 C o m p a r i s o n o f c e l l s s t a i n i n g f o r ChAc i n v a g a l a n d m e d i a l n u c l e i . 46 C r e s y l V i o l e t and AChE s t a i n i n g i n t h e c a u d a l m e d i a l n u c l e u s . 47 C o m p a r i s o n o f ChAc s t a i n i n g s e c t i o n and i t s c o r r e s p o n d i n g c o n t r o l i n t h e m e d i a l n u c l e u s . 48 R e p r e s e n t a t i v e s e c t i o n s h o w i n g d i s t r i -b u t i o n o f c e l l s e x h i b i t i n g ChAc a c t i v i t y . 50 C r e s y l V i o l e t a n d AChE s t a i n i n g i n s m a l l c e l l e d v e n t r a l p o r t i o n o f t h e l a t e r a l n u c l e u s . 51 ChAc and AChE s t a i n i n g i n s m a l l c e l l e d v e n t r o l a t e r a l p o r t i o n o f t h e l a t e r a l n u c l e u s . 52 I n t e r p o s i t u s c e l l s s t a i n i n g f o r ChAc and AChE 53 ChAc i n t h e c e r e b e l l u m . 66 AChE i n t h e c e r e b e l l u m . 67 tv\\) L I S T OJF ABBREVIATIONS A c e t y l - C o A a c e t y l - C o e n z y m e A ACh . a c e t y l c h o l i n e AChE a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e ANS 1 a n s i f o r m l o b e ANSU ; a n s u l a ( B o l k ) ANT a n t e r i o r l o b e BC b r a c h i u m c o n j u n c t i v u m C c y t o p l a s m ChAc A v., v c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e CV c r e s y l v i o l e t DFP » d i - i s o p r o p y l f l u o r o p h o s p h a t e F N u c l e u s f a s t i g i u s FLO ' ..'. ' f l o c c u l u s F r f r a g m e n t a t i o n o f t i s s u e HEPES N - 2 - H y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - N - 2 -e t h a n e s u l f o n i c a c i d HDR H a e m a t o x y l i n - D a r r o w Red A HSR ,. , H a r l e c o S y n t h e t i c R e s i n I N u c l e u s i n t e r p o s i t u s I A N u c l e u s i n t e r p o s i t u s a n t e r i o r I P N u c l e u s i n t e r p o s i t u s p o s t e r i o r L : N u c l e u s l a t e r a l i s L c p a r s c o n v e x a o f N u c l e u s l a t e r a l L r . ' • •" p a r s r o t u n d a o f N u c l e u s l a t e r a l M N u c l e u s m e d i a l i s (viii) L i s t o f A b b r e v i a t i o n s - c o n t i n u e d m i s m i l l i l i t r e s Mo m o t o n e u r o n e N n e u r o n e Nc n u c l e u s NP n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n P F L p a r a f l o c c u l u s PMD v p a r a m e d i a m l o b e RN r e d n u c l e u s SIM . l o b u l u s s i m p l e x ( B o l k ) SLP s u b n u c l e u s l a t e r a l i s p a r v i c e l l u l a r i s SMP V s u b n u c l e u s m e d i a l i s p a r v i c e l l u l a r i s u l • •; m i c r o l i t r e V - v e s t i b u l a r n u c l e a r c o m p l e x VL n u c l e u s v e n t r a l i s l a t e r a l i s o f t h e < .. , •'."•: •, .. t h a l a m u s WM w h i t e m a t t e r . . (ix) ACKNOWLEDGEMENTS 'V The a u t h o r w i s h e s t o t h a n k D r . H. M c L e n n a n f o r s u g g e s t i n g t h e p r o j e c t a n d f o r h i s c o n s t r u c t i v e a d v i c e a n d c r i t i c i s m t h r o u g h b u t ! t h e d e v e l o p m e n t o f t h i s t h e s i s . Many t h a n k s a l s o t o Mr. Ron W a l k e r f o r h i s e x c e l l e n t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e and v e r y h e l p f u l i n s t r u c t i o n i n p r a c t i c a l h i s t o l o g i c a l t e c h n i q u e . The c o n t r i b u t i o n s o f Mr. K u r t H enze f o r p r i n t i n g t h e p h o t o g r a p h s a n d M r s . Y v o n n e . Heap f o r h e r c o n t i n u e d i n t e r e s t i n a l l p h a s e s o f t h e p r o j e c t a r e g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . A s p e c i a l t h a n k s t o D i a n e Cumming f o r c h e e r f u l l y t y p i n g . t h e r o u g h c o p y a n d d r a w i n g F i g . 22 and t o M i s s P a t t i M i l l e r f o r h e r c o n s c i e n t i o u s t y p i n g o f t h e f i n a l m a n u s c r i p t . . INTRODUCTION A. G e n e r a l Comment I t i s now g e n e r a l l y a g r e e d on t h e b a s i s o f t h e i r m o r p h o l o g y ( c y t o - a n d m y e l o a r c h i t e c t u r e ) , a n d d e v e l o p m e n t ( p h y l o g e n e t i c a nd o n t o g e n e t i c ) , t h a t t h e c e r e b e l l a r n u c l e i c a n be s u b d i v i d e d i n b o t h r o s t r o - c a u d a l (WEIDENREICH, 1 8 9 9 ) , a n d m e d i o - l a t e r a l d i r e c t i o n s (BRUNNER, 1 9 1 9 ) . The f o u r n u c l e i d i s t i n g u i s h a b l e . i n mammals c a n be f o u n d i n two g r o u p s o f . t w o (VOOGD, 1 9 6 4 ) ; a r o s t r o - l a t e r a l a n d a c a u d o - m e d i a l p a i r ( F i g . 1 ) . The c a u d o -m e d i a l p a i r c o n s i s t s o f t h e m e d i a l o r r o o f n u c l e u s ( n . f a s t i g i u s o f man) m e d i a l l y , a n d t h e n u c l e u s i n t e r p o s i t u s p o s t e r i o r ., ( n . g l o b o s u s o f man) m e r g i n g l a t e r a l l y w i t h i t . The r o s t r o -l a t e r a l p a i r c o n s i s t s o f t h e l a t e r a l n u c l e u s ( n . d e n t a t u s o f man) l a t e r a l l y , a n d t h e n u c l e u s i n t e r p o s i t u s a n t e r i o r ( n . e m b o l i f o r m u s o f man) m e r g i n g m e d i a l l y w i t h i t (FLOOD a n d JANSEN, 1 9 6 1 ; MASSION, 1967; NIEWENHUYS, 1 9 6 7 ) . I n a d d i t i o n t o t h e s e f o u r m a i n d i v i s i o n s FLOOD a n d JANSEN ( 1 9 6 1 ; F i g . 2 ) , d e s c r i b e d i n t h e c a t a s u b n u c l e u s m e d i a l i s p a r v i -c e l l u l a r i s (SMP) i n t h e c a u d o - m e d i a l p o r t i o n o f t h e m e d i a l n u c l e u s ; a n d a s u b n u c l e u s l a t e r a l i s p a r v i c e l l u l a r i s (SLP) i n t h e v e n t r o l a t e r a l p o r t i o n o f t h e l a t e r a l n u c l e u s . VOOGD (1964) d o e s n o t m e n t i o n a s u b d i v i s i o n o f t h e m e d i a l n u c l e u s a l t h o u g h he d o e s s u b d i v i d e t h e l a t e r a l n u c l e u s i n t o two p a r t s ; a d o r s o -c a u d a l p a r s c o n v e x a ( L c ) m e r g i n g w i t h i n t e r p o s i t u s a n t e r i o r ( I A ) a n d a v e n t r o - l a t e r a l p a r s r o t u n d a (L ) r o s t r a l l y ( F i g . 1 & 2 ) . -2-BRUNNER M E D WEIDENREICH OGAWA t i g . 23. H o r i z o n t a l s e c t i o n o f the c e r e b e l l u m o f the c a t . i l l u s t r a t i n g the m e d i o l a t c r a l s u b d i v i s i o n o f B r u n n e r a n d the r o s t r o c a u d a l s u b d i v i s i o n o f the c e n t r a l c e r e b e l l a r n u c l e i o f W e i d e n r e i c h - O g a w a . H a t c h e d : f a s t i g i a l n u c l e u s ( F ) . S m a l l d o t s : p o s t e r i o r i n t e r p o s e d nucleus (IP). F i l l e d c i r c l e s : a n t e r i o r i n t e r p o s e d nucleus (IA) pars c o n v e x a o f the l a t e r a l nucleus (Ix) a n d pars r o t u n d a of the lat e r a l n u c leus ( L r ) . F o r a b b r e v i a t i o n s see p. 131. FIGURE 1. S u b d i v i s i o n o f t h e c e r e b e l l a r n u c l e i (VOOGD, 1967) MED - n. m e d i a l i s INT - n. i n t e r p o s i t u s LAT - n. l a t e r a l i s -3-i i . , <Z2&> . ;'..;<'.7 12 -v- V ^ V , nuc. - f-20 •• . —<&r— s u p nuc. rnr 28 Fig. 1 A series of sections through the cerebellar nuclei of a kitten. The numbers (4, 12, 20 etc.) refer to the number of the section in the series used for the drawings, number 1 being the section through the rostral bonier of the nuclear complex. On the right side the relative size of the nerve cells and their distribution within the nuclear subdivisions are indicated. The left half shows the boundaries of the nuclei as defined in the present investigation. Nuc. i., nucleus interpositus; nuc. 1., nucleus lateralis; nuc. m., nucleus niedialis or faatigii. This diagram is used in figures 3 to 7 to illustrate the pathological changes observed in tho experiments. C> 11 FIGURE 2. R e l a t i v e d i s t r i b u t i o n o f c e l l t y p e s f o u n d i n c e r e b e l l a r  n u c l e i ( M o d i f i c a t i o n o f J a n s e n and J a n s e n . ( 1 9 5 5 ) ; t o i n c l u d e i n f o r m a t i o n f r o m F l o o d a n d J a n s e n ( 1 9 6 1 ) . DP - d o r s o l a t e r a l p r o t u b e r a n c e o f Goodman. L a r g e c e l l s s i t u a t e d b e t w e e n f a s t i g i a l a n d i n t e r p o s i t u s n u c l e i . SLP - s u b n u c l e u s p a r v i c e l l u l a r i s l a t e r a l i s SMP - s u b n u c l e u s p a r v i c e l l u l a r i s m e d i a l i s < H o w e v e r , FLOOD a n d JANSEN (1961) do n o t c o n s i d e r t h e i r v e n t r o -l a t e r a l s m a l l c e l l e d p o r t i o n o f t h e l a t e r a l n u c l e u s t o be e q u i v a l e n t t o VOOGD's h^. I n c o m p a r a t i v e s t u d i e s o f t h e c e r e b e l l u m i t h a s b e e n f o u n d (DOW, 1 9 4 2 ; ARIENS e t a l . , 1 9 3 6; CROSBY e t a l . , 1962) t h a t t h o s e p o r t i o n s o f i t s h e m i s p h e r e s c o n s i d e r e d p h y l o g e n e t i c a l l y o l d e r , i . e . , t h e v e r m a l z o n e ( F i g . 5 ) , a r e a s s o c i a t e d w i t h t h e more m e d i a l l y p l a c e d c e r e b e l l a r n u c l e u s . The g r a d u a l i n c r e a s e i n t h e s i z e o f t h e l a t e r a l z o n e ( F i g . 5) o f t h e c e r e b e l l a r h e m i s p h e r e s f r o m l o w e r mammals t h r o u g h t o man i s p a r t i c u l a r l y r e f l e c t e d i n t h e i n c r e a s i n g s i z e o f t h e l a t e r a l p a r t o f t h e l a t e r a l n u c l e u s ( F i g . 3 ) . S i m i l a r l y t h e l a t e r a l n u c l e u s shows much g r e a t e r v a r i a t i o n t h r o u g h o u t t h e mammalian s p e c i e s t h a n d o e s t h e m e d i a l n u c l e u s . DOW (1942) a l s o r e f e r s t o t h e two p a r t s o f t h e d e n t a t e o f man, s t a t i n g t h a t t h e d o r s o - m e d i a l p o r t i o n a p p e a r s t o be h o m o l o g o u s w i t h t h e l a t e r a l n u c l e u s o f p h y l o g e n e t i c a l l y o l d e r f o r m s a n d t h e l a t e r a l l y e x p a n d e d new p a r t , w h i c h c o m p r i s e s t h e b u l k o f t h e n u c l e u s i n man, i s s i t u a t e d v e n t r o l a t e r a l l y . The i n c r e a s e i n t h e s i z e o f t h e p a r v o c e l l u l a r l a t e r a l n u c l e u s ( v e n t r o -l a t e r a l p o r t i o n ) i n t h e a s c e n d i n g p h y l o g e n e t i c s c a l e i s p a r a l l e l -e d b y an i n c r e a s e i n t h e s i z e o f t h e p a r v o c e l l u l a r r e d n u c l e u s a n d t h e c e r e b e l l o - t h a l a m i c s y s t e m i n man. Homology o f t h e c e r e b e l l a r n u c l e i i n t h e p a s t h a s b e e n p r i n c i p a l l y b a s e d on t h e i r m o r p h o l o g y a n d t h e i r o n t o g e n e t i c a n d p h y l o g e n e t i c d e v e l o p m e n t . Few s t u d i e s w e r e a v a i l a b l e t o a l l o w c o m p a r i s o n o f t h e i r f i b r e c o n n e c t i o n s a n d p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s . More r e c e n t l y h o w e v e r , v a r i o u s e x t e n s i v e s t u d i e s h a v e b e e n done -s-I ' "• I C A T PHAL ANGER MONKEY m e d . v a . 1 rostral<— -» caudal FIGURE 3. P h y l o g e n e t i c d e v e l o p m e n t o f c e r e b e l l a r n u c l e i ( V o ogd, 1967) : : T r e n d shows d i m i n i t i o n i n t h e r e l a t i v e s i z e o f t h e m e d i a l n u c l e u s , a n d t h e i n c r e a s e d s e p a r a t i o n b e t w e e n I A + I P and L c + I P . A l s o t h e d e v e l o p m e n t a nd d i f f e r e n t i a t i o n o f L c i n t o a r o s t r a l m a g n o c e l l u l a r a n d c a u d a l p a r v o c e l l u l a r p a r t c o r r e s p o n d i n g t o t h e human d e n t a t e n u c l e u s . F - f a s t i g i a l ( m e d i a l n u c l e u s ) . I A + I P a n t e r i o r + p o s t e r i o r i n t e r p o s i t u s , L c + L r p a r s c o n v e x a and r o t u n d a o f l a t e r a l n. i n t h e c a t (FLOOD a n d JANSEN., 1966) , a n d monkey (RAND, 1954) on t h e e f f e r e n t c o n n e c t i o n s ; a n d i n t h e c a t (VOOGD, 1964; EAGER, 1963) , a n d monkey (EAGER, 1966) on c o r t i c o - n u c l e a r p r o j e c t i o n s w h i c h t h e r e b y p r o v i d e f u r t h e r c r i t e r i a f o r t h e e s t a b l i s h m e n t o f t r u e h o m o l o g i e s . I n t h e r a t , d e t a i l e d s t u d i e s have b e e n done on t h e m o r p h o g e n e s i s o f t h e l o b e s a n d f i s s u r e s o f t h e c e r e b e l l a r h e m i s p h e r e s ( L A R S E L L , 1 9 5 2 ; KORNELIUSSEN,1968b) and on t h e c o r t i c o - n u c l e a r p r o j e c t i o n s t o t h e c e r e b e l l a r n u c l e i (GOODMAN e t a l . , 1963) b u t t h e r e i s s t i l l o n l y s c a n t y i n f o r m a t i o n a v a i l a b l e on t h e e f f e r e n t c o n n e c t i o n s o f t h e n u c l e i . I n t h i s s t u d y t h e r e f o r e t h e n o m e n c l a t u r e o f t h e d i v i s i o n s o f t h e c e r e b e l l a r n u c l e i o f t h e r a t w i l l be b a s e d p r i m a r i l y on t h e i r m o r p h o l o g y a n d c o r t i c o - n u c l e a r p r o j e c t i o n s a s d e s c r i b e d b y GOODMAN e t , a l . | 1963) a n d KORNELIUSSEN (1968a) a n d w i t h r e f e r -e n c e t o s i m i l a r s t u d i e s done on t h e c a t w h e r e t h e e f f e r e n t c o n n e c t i o n s h a v e b e e n e s t a b l i s h e d . I n o u t l i n i n g t h e e f f e r e n t p r o j e c t i o n s y s t e m s p a r t i c u l a r a t t e n t i o n w i l l be f o c u s e d on t h e p r o p o r t i o n a l c o n t r i b u t i o n t h a t e a c h o f t h e c e r e b e l l a r n u c l e i makes t o t h e b r a c h i u m c o n j u n c t i v u m ( B C ) , h e r e d e f i n e d as t h e a s c e n d i n g t r a c t a r i s i n g f r o m t h e i p s i -l a t e r a l c e r e b e l l a r n u c l e i a n d i n c l u d i n g t h e c o n t r a l a t e r a l f a s t i g i a l c omponent known a s t h e a s c e n d i n g b r a n c h o f t h e u n c i n a t e f a s c i c u l u s . B. M o r p h o l o g y o f t h e C e r e b e l l a r N u c l e i The c e r e b e l l a r n u c l e i h a v e b e e n c l e a r l y d e f i n e d i n t r a n s v e r s e , h o r i z o n t a l a n d s a g g i t a l s e c t i o n s w i t h N i s s l a n d m y e l i n s t a i n s i n t h e c a t (VOOGD, 1964; FLOOD a n d JANSEN, 1 9 6 1 , 1966) a n d i n t h e -7-w h i t e r a t (GOODMAN e t a l . , 1 9 6 3 ; KORNELIUSSEN, 1 9 6 8 a ) . The g e n e r a l c y t o - a r c h i t e c t u r e i n d i c a t e s t h a t t h e r e a r e t h r e e t y p e s o f c e l l s f o u n d i n a l l n u c l e i , . l a r g e p o l y g o n a l c e l l s , medium c e l l s s i m i l a r i n s h a p e t o t h e l a r g e c e l l s , a n d s m a l l c e l l s s o m e t i m e s a p p e a r i n g f l a t t e n e d . The l a r g e c e l l s a r e commonly f o u n d i n t h e d o r s a l p o r t i o n s o f t h e n u c l e i , t h e medium c e l l s i n t h e c e n t r a l p o r t i o n s , a n d t h e s m a l l c e l l s p a r t i c u l a r l y i n . t h e v e n t r o - l a t e r a l p a r t o f t h e l a t e r a l n u c l e u s b u t s c a t t e r e d a l s o t h r o u g h o u t t h e v e n t r a l p o r t i o n s o f t h e o t h e r n u c l e i (FLOOD a n d JANSEN, 1 9 6 1 ) . F i g u r e 4 shows t h e r e l a t i v e s i z e s o f t h e c e l l s f o u n d i n t h e c e r e b e l l a r n u c l e i o f t h e k i t t e n . G o l g i s i l v e r s t u d i e s done on t h e c e l l s i n t h e m e d i a l n u c l e u s (MATSUSHITA e t a l . , 1971) o f t h e c a t a n d r a t showed i t t o be composed o f c e l l s o f t h e f o l l o w i n g d i m e n s i o n s : l a r g e c e l l s 35-40^ X 4 0 ^ medium c e l l s 2 0 - 3 0 A . X 30^ s m a l l c e l l s 1 2 . 5 - 2 0 A X 2 0 4 C e l l s o f s i m i l a r d i m e n s i o n s h a v e a l s o b e e n f o u n d i n a l l n u c l e i o f t h e c e r e b e l l u m o f t h e c a t (EAGER, 1968) and monkey(COURVILLE e t a l . , 1 9 7 0 ) . . . \ ' ' . I . M e d i a l n u c l e u s T h i s n u c l e u s i s s i t u a t e d j u s t a b o v e t h e r o o f o f t h e f o u r t h v e n t r i c l e a n d t a p e r s o f f c a u d a l l y . I t i s composed p r e -d o m i n a n t l y o f m i d d l e s i z e d c e l l s . The r o s t r a l t h i r d o f t h e n u c l e u s i n t h e r a t h a s a d o r s o l a t e r a l p r o t u b e r a n c e ( F i g . 5) c o n s i s t i n g o f c e l l s t e n d i n g t o be. l a r g e r (GOODMAN e t a l . , 1 9 6 3 ) . T h e r e i s no s p e c i f i c r e f e r e n c e t o t h e a b o v e m e n t i o n e d g r o u p o f c e l l s i n t h e c a t b u t t h e s e seem t o c o r r e s p o n d t o t h e g r o u p o f Nuc. f 4 r . - i N u c . i V N u c . 1 Figure 2 Fig. 2 Types of normnl nerve cells from the cerebellar nuclei (to the left) and cells displaying retrograde reactions (to the right). Nuc. f., nucleus fastigii; nuc. i., nucleus interpositus; nuc. 1., nucleus lateralis, Camera lueida drawing. Leitz oil imm. 1/12. Oc. 5, reduced to X 530. FIGURE 4. C o m p a r i s o n o f c e l l s i z e s o f c e r e b e l l a r n u c l e i ( J a n s e n a nd J a n s e n , 1955) 7-n e u r o n e s l y i n g b e t w e e n t h e m e d i a l a n d i n t e r p o s i t u s n u c l e i ( F i g . 2 ) t h a t JANSEN-and JANSEN J R . (1955) h a v e n o t e d . T h i s g r o u p w i l l be r e f e r r e d t o l a t e r i n c o n s i d e r i n g t h e e f f e r e n t c o n n e c t i o n s . I n t h e c a u d a l t w o - t h i r d s o f t h e m e d i a l n u c l e u s t h e r e i s a s c a t t e r i n g o f l a r g e c e l l s d o r s o - m e d i a l l y , t h e medium a n d s m a l l s i z e d c e l l s become more c l o s e l y p a c k e d , a n d v e n t o - m e d i a l l y t h e r e i s a g r o u p o f s m a l l c e l l s (FLOOD a n d J A N S E N 1 s 1SMP', 1966) e x t e n d i n g a p p r o x i m a t e l y o n e - f i f t h t o o n e - s i x t h o f t h e t o t a l l e n g t h o f t h e n u c l e u s . I n t h e G o l g i s i l v e r s t u d y done by MATSUSHITA e t a l . (1971) , i t . w a s f o u n d t h a t t h e a x o n s o f t h e c e l l s o f t h e c a u d a l m e d i a l n u c l e u s c r o s s i n t h e c e r e b e l l u m t o j o i n t h e c o n t r a l a t e r a l u n c i n a t e f a s c i c u l u s . Thus on t h e b a s i s o f c y t o - a r c h i t e c t u r e t h e r e i s l i t t l e j u s t i f i c a t i o n f o r s u b d i v i d i n g t h e n u c l e u s b u t t h e a x o n a l p a t t e r n seems t o i n d i c a t e a d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e c a u d a l a n d r o s t r a l p o r t i o n s . I I . N u c l e u s i n t e r p o s i t u s The a n t e r i o r p o r t i o n o f t h e i n t e r p o s i t u s c o m p l e x ( I A ) i s c y l i n d r i c a l i n s h a p e a n d t a k e s up t h e r o s t r a l t w o - t h i r d s , w h i l e t h e p o s t e r i o r p o r t i o n ( I P ) i s o v o i d a n d o c c u p i e s t h e c a u d a l o n e -t h i r d . The d i v i s i o n b e t w e e n I A a n d I P i s b e s t v i s i b l e i n h o r i z o n t a l s e c t i o n s (VOOGD, 1964) b u t i n t r a n s v e r s e s e c t i o n s i t i s d i f f i c u l t t o d e f i n e . F o r t h e p u r p o s e s o f t h i s i n v e s t i g a t i o n t h e n t h e i n t e r p o s i t u s w i l l be c o n s i d e r e d a s a u n i t . The r o s t r a l p o l e o f t h e i n t e r p o s i t u s c o m p l e x c o n s i s t s o f medium a n d s m a l l s i z e d c e l l s . Medium c e l l s p r e d o m i n a t e i n t h e m i d d l e t h i r d , a n d l a r g e s i z e d c e l l s i n t h e c a u d a l t h i r d . V e n t r a l l y i n t h e c a u d a l o n e - t h i r d s m a l l c e l l s a r e f o u n d (FLOOD -10-and JANSEN, 1 9 6 1 ) . I n t h e r a t a n d c a t t h e d i v i s i o n b e t w e e n t h e n u c l e u s l a t e r a l i s a n d i n t e r p o s i t u s h a s b e e n v a r i o u s l y p l a c e d . GOODMAN e t a l . (1963), d e s c r i b e s a d o r s o l a t e r a l 'hump' a r e a ( F i g . 5) s i t u a t e d on t h e b o r d e r , o f t h e i n t e r p o s i t u s a n d l a t e r a l n u c l e i t h a t h a s c e l l s t h a t a p p e a r t o be s i m i l a r t o t h e c e l l s o f t h e a d j a c e n t l a t e r a l n u c l e u s ( i . e . , f l a t t e n e d a n d o r i e n t e d t o w a r d t h e h i l u s o f BC) h o w e v e r , s t u d i e s on e f f e r e n t p r o j e c t i o n s by t h e same a u t h o r i n d i c a t e d t h a t t h i s p o r t i o n b e l o n g e d t o t h e i n t e r p o s i t u s c o m p l e x . FLOOD and, JANSEN ( l 9 6 6 ) h o w e v e r , i n s t u d i e s o n t h e c a t , i n c l u d e t h i s p o r t i o n w i t h t h e l a t e r a l n u c l e u s a n d KORNELIUSSEN (1968a) s u g g e s t s t h a t i t c o u l d be c o n s i d e r e d a s an e n t i t y i n i t s e l f a n d t h e r e b y n o t b e l o n g t o e i t h e r o f t h e a d j a c e n t n u c l e i . I n t h i s t h e s t u d y t h e d i v i s i o n o f GOODMAN e t a l . (196 3) w i l l be o b s e r v e d a n d t a k e n l a t e r a l t o the'hump' a s i n d i c a t e d i n F i g . 5 . I l l . N u c l e u s l a t e r a l i s I n i t s r o s t r a l t w o - t h i r d s t h i s n u c l e u s i s co m p o s e d c h i e f l y o f l a r g e c e l l s d o r s a l l y w i t h medium a n d s m a l l c e l l s f o u n d c e n t r a l l y . The v e n t r a l h a l f i s composed c h i e f l y o f medium c h i e f l y o f medium s i z e d c e l l s . I n t h e c a u d a l t h i r d t h e medium a n d s m a l l s i z e d c e l l s p r e d o m i n a t e w i t h few l a r g e c e l l s . The medium a n d l a r g e s i z e d c e l l s a r e o f t e n o r i e n t e d w i t h t h e i r l o n g a x e s p o i n t i n g t o w a r d t h e o r i g i n o f t h e b r a c h i u m c o n j u n c t i v u m and t h e m o s t v e n t r a l l y , . s i t u a t e d ' c e l l s a r e f l a t t e n e d i n a p p e a r a n c e . -n-PARAVERMAL! NUCLEUS VERMAL NUCLEUS DENTATUS FASTIGII ZONE LATERAL ZONE | ZONE I ,,_J |,C[Nllf»T, / ^ • C t N U A L ' l ' CULMENI r PARAROCCULUS FLOCCULONODUIAR'LOBE 9 h NUCLEUS INTERPOSITUS B F i g . 1 A , Schematic representation of surface topography of rat cerebellum (modified after Larse l l , "52). Funct ional cortical zones are indicated. B , Serial diagrams of every eighth transverse section through the ipsi lateral cerebellar nuclear complex. Oblique lines i n nucleus fastigi i , levels c through e, indicate region of dorsolateral protuberance; st ippl ing i n medial aspect of nucleus interpositus, levels b through e, identify the crest region; and vertical lines i n lateral aspect of nucleus interpositus indicate the dorsolateral " h u m p " region. FIGURE 5. M o r p h o l o g y o f R a t c e r e b e l l a r n u c l e i (Goodman et al y : : -\%-VOOGD's (1964) d i v i s i o n o f t h e l a t e r a l n u c l e u s i n t o a p a r s c o n v e x a (L ) a n d p a r s r o t u n d a (L ) i s n o t b a s e d s o l e l y on c y t o a r c h i t e c t o n i c c o n s i d e r a t i o n s b u t a l s o o n f i b r e c o n n e c t i o n s . FLOOD a n d JANSEN's (1961) s u b n u c l e u s p a r v i -c e l l u l a r i s l a t e r a l i s a p p e a r s t o c o i n c i d e w i t h t h e c a u d a l L c o f VOOGD d e s c r i b e d as c o n t a i n i n g s m a l l d a r k l y s t a i n i n g c e l l s . C. The F i b r e C o n n e c t i o n s I . G e n e r a l comment The c e r e b e l l u m h a s t h r e e m a i n p a i r s o f f i b r e b u n d l e s t h a t c a r r y a f f e r e n t a n d / o r e f f e r e n t n e r v e s . / t e r m e d t h e c e r e b e l l a r p e d u n c l e s . The p r i m a r y component o f t h e s u p e r i o r c e r e b e l l a r p e d u n c l e i s t h e b r a c h i u m c o n j u n c t i v u m , w h i c h c o n t a i n s e f f e r e n t c e r e b e l l o f u g a l f i b r e s t o s t r u c t u r e s i n t h e mes- a n d d i e n c e p h a l o n v i a i t s a s c e n d i n g . b r a n c h , t o g e t h e r w i t h t h e a s c e n d i n g b r a n c h o f t h e u n c i n a t e f a s c i c u l u s w h i c h j o i n s i t (VOOGD, 1 9 6 4 , 1 9 6 7 ; FLOOD a n d JANSEN, 1 9 6 6 ) . I t a l s o h a s a d e s c e n d i n g c o m p o n e n t , o r i g i n a t i n g p r i m a r i l y f r o m t h e l a t e r a l a n d i n t e r p o s i t u s n u c l e i and t e r m i n a t i n g p r i n c i p a l l y i n t h e c o n t r a l a t e r a l n u c l e u s r e t i c u l a r i s t e g m e n t i p o n t i s (BRODAL e t a l . , 1 9 7 2 ) . The a f f e r e n t c o m p o n e n t - o f t h e s u p e r i o r c e r e b e l l a r p e d u n c l e c o n s i s t s o f t h e p o s t e r i o r s p i n o c e r e b e l l a r t r a c t , t e c t o c e r e b e l l a r a n d r u b r o c e r e b e l l a r f i b r e s (BRODAL e t a l . , 1 9 5 4 ) , a n d f i b r e s o f t h e m e s e n c e p h a l i c r o o t o f t h e f i f t h c r a n i a l n e r v e (FLOOD a n d JANSEN, 1966; VOOGD, 1 9 6 4 ) . The m i d d l e c e r e b e l l a r p e d u n c l e i s a w e l l d e f i n e d b u n d l e o f f i b r e s c o n t a i n i n g p r o b a b l y p u r e l y c e r e b e l l o p e t a l a f f e r e n t f i b r e s . The i n f e r i o r c e r e b e l l a r p e d u n c l e i s composed o f t h e r e s t i f o r m a n d j u x t a r e s t i f o r m b o d i e s . The m a i n c o m p o n e n t s o f t h e i n f e r i o r p e d u n c l e t h a t c o n c e r n : - t h i s i n v e s t i g a t i o n a r e t h e d i r e c t a n d c r o s s e d f a s t i g i o - b u l b a r f i b r e s t h a t t o g e t h e r f o r m t h e u n c i n a t e f a s c i c u l u s . The d i r e c t f a s t i g i o - b u l b a r t r a c t a n d t h e d e s c e n d i n g b r a n c h o f t h e u n c i n a t e f a s c i c u l u s p a s s t h r o u g h t h e j u x t a - r e s t i f o r m b o d y (VOOGD, 1 9 6 4 ) . I I . C o r t i c o - n u c l e a r p r o j e c t i o n s An i n v e s t i g a t i o n o f t h e c e r e b e l l a r c o r t e x u s i n g t h e M a r c h i t e c h n i q u e i n t h e r a b b i t , c a t a n d monkey was u n d e r t a k e n by JANSEN a n d BRODAL (1940) t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e r e was a n a n a t o m i c a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e e n t h e c o r t e x a n d t h e d e e p n u c l e i i n - t h e w h i t e m a t t e r b e l o w i t . The f o l l o w i n g two p r i n c i p l e s r e s u l t e d f r o m t h i s i n v e s t i g a t i o n ( F i g . 6 ) : (1) e a c h h a l f o f t h e c o r p u s c e r e b e l l i i s a r r a n g e d i n t h r e e l o n g i t u d i n a l c o r t i c a l z o n e s ; a v e r m a l zone r e l a t e d t o t h e m e d i a l n u c l e u s , a p a r a -v e r m a l zone c o n n e c t e d w i t h t h e i n t e r p o s i t u s n u c l e u s a n d a l a t e r a l zone p r o j e c t i n g t o t h e l a t e r a l n u c l e u s . T h e s e d i v i s i o n s w e r e p r o p o s e d t o be b i l a t e r a l l y s y m m e t r i c a l a n d n o n - o v e r l a p p i n g ; (2) r o s t r o - c a u d a l l y t h e r e i s a p o i n t - t o - p o i n t . l o c a l i z a t i o n o f c o r t i c a l p r o j e c t i o n s t o t h e c e r e b e l l a r n u c l e i . F u n c t i o n a l l o n g i t u d i n a l l o c a l i z a t i o n b a s e d on s t i m u l a t i o n e x p e r i m e n t s was a l s o f o u n d t o c o r r e s p o n d t o t h e s e a n a t o m i c a l o b s e r v a t i o n s o f JANSEN e t a l . (1940),(CHAMBERS a n d SPRAGUE, 1 9 5 5 ) . T h e s e p r o p o s i t i o n s w e r e q u e s t i o n e d by EAGER ( 1 9 6 3 , 1966) i n t h e c a t a n d monkey a n d by GOODMAN e t a l . (1963) i n t h e r a t . T h e s e -m-N. ve*tib. Fig. 4. Diagram of the main principles in the corticonuclear projection in the cerebellum of the cat as established in Marchi studies. The mutually interconnected divisions of the cerebellar cortex and the intracerebellar nuclei are marked with identical symbols. The drawings of the transversely sectioned nuclei are arranged from rostral (above) to caudal (below). Note longitudinal zonal pattern. Cf. text. From Jansen and Brodal (1940). FIGURE 6. L o n g i t u d i n a l a n a t o m i c a l z o n e s o f c o r t i c o - n u c l e a r p r o j e c t i o n s o f t h e c a t . ( B r o d a l , 1967) ! ' FLO j|| zone A and caudal vermis zoneB zoneB' zone C and C' O, zone D and Cf FIGURE 7. M o d i f i c a t i o n o f B r o d a l ' s l o n g i t u d i n a l c o r t i c o n u c l e a r  p r o j e c t i o n z o n e s o f t h e c a t a c c o r d i n g t o VOOGD. (Voogd, 1964) ~~ ' ' ~ O n l y n a r r o w d i v i s i o n s o f c o r t e x p r o j e c t s p e c i f i c a l l y t o one n u c l e u s as i n d i c a t e d a b o v e . D i v i s i o n o f c e r e b e l l a r n u c l e i a s i n F i g . 1. ANT - a n t e r i o r l o b e SIM - l o b u l u s s i m p l e x ( B o l k ) PMD - p a r a m e d i a n l o b e PFL - p a r a f l o c c u l u s ANS - a n s i f o r m l o b e ANSU - a n s u l a ( B o l k ) a u t h o r s c o n c l u d e d t h a t a l t h o u g h t h e l o n g i t u d i n a l z o n e s do e x i s t t h e y a r e n o t a s s t r i c t l y d e f i n e d a s JANSEN a n d BRODAL (1940) h a d c l a i m e d . VOOGD (1964) a l s o f o u n d t h a t - t h e z o n e s w e r e n o t d i s t i n c t , a n d F i g . 7 i l l u s t r a t e s h i s r e s u l t s as t h e y r e l a t e t o t h e s u b d i v i s i o n o f t h e c e r e b e l l a r n u c l e i b a s e d on t h a t o f WEIDENREICH a n d OGAWA ( F i g . 1 ) . The d i a g r a m i s b a s e d o n t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e e f f e r e n t f i b r e s o f t h e l o n g i t u d i n a l z o n e s a r e c o l l e c t e d i n t o s h a r p l y , c i r c u m s c r i b e d b u n d l e s , t e r m e d r a p h e s . T h e s e i n v e s t i g a t i o n s h a v e b e e n c r i t i c a l l y r e v i e w ed.-by BRODAL ( 1 9 6 7 ) . S u f f i c e i t h e r e t o s a y t h a t t h e c o r t i c o - n u c l e a r p r o j e c t i o n p a t t e r n l e n d s more s u p p o r t t o VOOGD"s c o n c e p t i o n o f t h e d i v i s i o n s o f t h e c e r e b e l l a r n u c l e i . I I I . B r a c h i u m c o n j u n c t i v u m T h e r e r e m a i n s t o be c o n s i d e r e d t h e o r i g i n a n d t e r m -i n a t i o n o f t h e component p a r t s o f BC. O n l y m a j o r a r e a s o f t e r m i n a t i o n a n d a r e a s p a r t i c u l a r l y p e r t i n e n t t o t h i s i n v e s t i g a -t i o n w i l l be m e n t i o n e d . The f i b r e s o f t h e b r a c h i u m c o n j u n c t i v u m i n t h e r a t a r e d e s c r i b e d a s f o l l o w s b y VERHAART ( 1 9 7 0 ) : ' BC i s m o d e r a t e l y l a r g e a n d c o m p a c t . I t s d i v i s i o n i n t o a m e d i a l a n d l a t e r a l p a r t , t h e l a t t e r a b o u t t w i c e a s l a r g e i s d i s t i n c t a l r e a d y i n t h e c e r e b e l l u m , w h e r e t h e two p a r t s o r i g i n a t e f r o m t h e c e n t r a l n u c l e i . The m e d i a l p a r t c o n s i s t s o f a c e n t r e r i c h l y p r o v i d e d w i t h c o a r s e f i b r e s s u r r o u n d e d by an a r e a i n w h i c h t h e y d o m i n a t e l e s s . I n t h e l a t e r a l p a r t s , c o a r s e f i b r e s a r e more e v e n l y s p r e a d e x c e p t v e r y l a t e r a l l y w h e r e f i n e f i b r e s a r e n u m e r o u s . ' T h e s e d i v i s i o n s a r e d i s t i n c t - a n d o b v i o u s i n t h e c a t a s w e l l ( F i g . 8 ) . I n t h e same F i g u r e ' t h e c o u r s e o f t h e BC i s i n d i c a t e d a n d shown t o d e c u s s a t e i n t h e m e s e n c e p h a l o n f o l l o w e d b y a p a r t i a l ' t e r m i n a t i o n i n t h e r e d n u c l e u s . B e y o n d t h e r e d n u c l e u s t h e m a i n a r e a o f t e r m i n a t i o n i s t h e n u c l e u s v e n t r a l i s l a t e r a l i s o f t h e t h a l a m u s (VL) ( A L L E N , 1924; VOOGD,1964; CARREA a n d METTLER, 1954 ) . 1. N u c l e u s m e d i a l i s The m e d i a l n u c l e u s g i v e s r i s e t o two f a s t i g i o - b u l b a r t r a c t s ; t h e f i r s t , a r i s i n g f r o m t h e c a u d a l t w o - t h i r d s o f t h e n u c l e u s , i s composed o f s m a l l a n d medium s i z e d f i b r e s a nd c r o s s e s r o s t r a l l y i n t h e a n t e r i o r c o m m i s s u r e o f t h e c e r e b e l l u m t o f o r m t h e u n c i n a t e f a s c i c u l u s ; t h e s e c o n d a r i s e s f r o m t h e r o s t r a l o n e - t h i r d o r o n e - h a l f o f t h e n u c l e u s , i s composed o f c o a r s e f i b r e s , a n d d o e s n o t c r o s s b u t g i v e s r i s e t o t h e d i r e c t f a s t i g i o - b u l b a r f i b r e s t h a t j o i n t h e u n c i n a t e f a s c i c l e a n d e n t e r t h e j u x t a - r e s t i f o r m b ody (FLOOD a n d JANSEN, 1966; VOOGD, 1 9 6 4 ) . The u n c i n a t e f a s c i c u l u s h o o k s o v e r and t r a v e r s e s t h r o u g h t h e BC a n d a t t h e i r p o i n t o f s e p a r a t i o n s p l i t s i n t o a n a s c e n d i n g a n d a d e s c e n d i n g b r a n c h . The a s c e n d i n g b r a n c h t a k e s two p o s i t i o n s i n t h e b r a c h i u m , i n t h e d o r s o m e d i a l p o l e c o u r s e t h e t h i n a n d medium f i b r e s a r i s i n g f r o m t h e c a u d a l t w o - t h i r d s o f t h e m e d i a l n u c l e u s , a n d i n t h e e x t r e m e v e n t r o m e d i a l c o r n e r a r e f o u n d t h e c o a r s e f i b r e s a r i s i n g f r o m t h e r o s t r a l h a l f o f t h e n. m e d i a l , ( V O O G D , 1 9 6 4 ) . . JANSENand JANSEN J R . (1955) i n a n e x p e r i m e n t i n w h i c h a l e s i o n i n t h e b r a c h i u m was made w h i c h Fig. 6. Diagram of the fibre composition of the brachium conjunctivum and its termination in the contralateral red nucleus. A. origin, localization in the brachium conjunctivum at the level of the isthmus and termination in the contralateral red nucleus of the fibres arising from the subdivisions of the central cerebellar nuclei (Voogd, 1964). B, somatotopically arranged origin of the fibres of the rubrospinal tract from the red nucleus (Pompeiano and Brodal, 1957b). L FIGURE 8. F i b r e c o m p o s i t i o n o f B r a c h i u m C o n j u n c t i v u m ( P o m p e i a h o , 1967) Shows d i v i s i o n o f BC i n t o m e d i a l 1/3 a n d l a t e r a l 2/3 c e r e b e l l a r n u c l e i as i n F i g . 1. s p a r e d t h e v e n t r o m e d i a l c o r n e r , f o u n d a g r o u p o f l a r g e i n t a c t c e l l s r e m a i n i n g b e t w e e n t h e m e d i a l a n d i n t e r p o s i t u s n u c l e i ( F i g . 9 ) , VOOGD (1964) s u g g e s t e d t h a t t h i s g r o u p i s t h e o r i g i n o f t h e c o a r s e f i b r e s f o u n d i n t h e v e n t r o m e d i a l b r a c h i u m c o n j u n c t i v u m . P e r h a p s t h i s a l s o c o r r e s p o n d s t o t h e d o r s o l a t e r a l p r o t u b e r a n c e o f GOODMAN e t a l . (1963) m e n t i o n e d p r e v i o u s l y . The c o a r s e f i b r e s t e r m i n a t e p a r t i a l l y i n t h e r e d n u c l e u s b u t more r o s t r a l t e r m i n a t i o n s h a v e n o t b e e n i d e n t i f i e d . The s e c o n d c r o s s e d p o r t i o n o f t h e a s c e n d i n g u n c i n a t e f a s c i c u l u s l e a v e s t h e BC j u s t c a u d a l t o i t s d e c u s s a t i o n , p a s s e s p a r a l l e l t o i t a n d may be t h e e q u i v a l e n t o f t h e u n c r o s s e d component o f BC o f CARREA a n d METTLER ( 1 9 5 4 ) . The t e r m i n a t i o n s o f t h e a s c e n d i n g u n c i n a t e t r a c t a r e d i s t i n g u i s h a b l e f r o m t h o s e o f " t h e BC i n t h a t t h e y a r e n o t f o u n d i n t h e r e d n u c l e u s a n d a r e s c a r c e i n t h e . n u c l e u s o f D a r k s c h e w i i s c h a n d o t h e r r e g i o n s w h i c h r e c e i v e many f i b r e s f r o m BC. The t r a c t i t s e l f c r o s s e s a t a l l l e v e l s o f t h e m e s e n c e p h a l o n b e f o r e many t e r m i n a t i o n s a p p e a r i n t h e i n t r a l a m i n a r t h a l a m i c n u c l e i , t h e most v e n t r o m e d i a l p a r t s o f t h e n u c l e i v e h t r a l i s l a t e r a l i s , v e n t r a l i s p o s t e r o m e d i a l i s , v e n t r a l i s p o s t e r o l a t e r a l i s a n d v e n t r a l i s a n t e r i o r . A n o t h e r m a j o r d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e a s c e n d i n g u n c i n a t e a n d t h e a s c e n d i n g b r a c h i u m i s t h a t t h e f o r m e r p r o j e c t s b i l a t e r a l l y w h i l e t h e l a t t e r p r o j e c t s c o n t r a l a t e r a l l y . T h e r e h a s b e e n some c o n t r o v e r s y o v e r t h e e x i s t e n c e o f f i b r e s o r i g i n a t i n g i n t h e m e d i a l n u c l e u s a n d e n d i n g i n t h e t h a l a m u s . APPELBERG (1961) i n an e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d y s t i m u l a t e d t h e - c e r e b e l l a r n u c l e i o f a c a t ~ u n d e r N e m b u t a l -10-L R F i g . 5 .1 J N . Transsection of brachium conjunctivum iloxtruni. Patho-logical changes in the cerebellar nuclei, no pathological cells observe.!. Where no symbols FIGURE 9. P a t h o l o g i c a l c h a n g e s i n c e r e b e l l a r n u c l e i o f cat- f o l l o w i n g t r a n s a c t i o n of. BC. ( J a n s e n a nd J a n s e n , 1955) IC - l a r g e c e l l s b e t w e e n "•• i n t e r p o s i t u s + m e d i a l n u c l e u s l e f t i n t a c t + r e p r e s e n t s n o r m a l c e l l s • r e p r e s e n t s p a t h o l o g i c a l c e l l s - Z l -a n a e s t h e s i a a n d f a i l e d t o f i n d ' a r e s p o n s e i n t h e VL o f t h e t h a l a m u s when s t i m u l a t i o n o f t h e m e d i a l n u c l e u s was p e r f o r m e d . ANGAUT e t a l . (1968) f s u g g e s t e d t h a t f a i l u r e t o f i n d a r e s p o n s e J was due t o d e p r e s s i o n o f t h e s y s t e m u n d e r b a r b i t u r a t e a e n e s -t h e s i a . U n d e r c h l o r a l o s e i t was f o u n d t h a t s t i m u l a t i o n o f t h e ' c a u d a l m e d i a l n u c l e u s r e s u l t e d i n a r e s p o n s e - w i t h a l o n g l a t e n c y b i l a t e r a l l y i n V L , a n d t h e s u g g e s t i o n was made e i t h e r t h a t t h e f i b r e s i n v o l v e d a r e o f a f i n e d i a m e t e r o r t h a t t h e \ p a t h w a y i s a p o l y s y n a p t i c o n e . I n an a n a t o m i c a l s t u d y u s i n g t h e N a u t a t e c h n i q u e f o r t e r m i n a l d e g e n e r a t i o n , COHEN e t a l . (1958), w e r e a b l e t o d e m o n s t r a t e a h i g h r a t i o o f t h i n f i b r e s w i t h i n t h e m e d i a l - t h a l a m i c , p r o j e c t i o n . 2. N u c l e i i n t e r p o s i t u s a n d l a t e r a l i s F i b r e s e m e r g i n g f r o m t h e i n t e r p o s i t u s a n d l a t e r a l n u c l e i ! make up t h e m a j o r p o r t i o n o f t h e l a t e r a l t w o - t h i r d s o f t h e BC a s d e s c r i b e d by VERHAART ( 1 9 7 0 ) . R e f e r e n c e t o F i g u r e 8 shows t h a t t h e r e i s a s t r o n g p r o j e c t i o n f r o m i n t e r p o s i t u s t o t h e r e d n u c l e u s ( R N ) (COURVILLE, 1 9 6 6 ) . POMPEIANO (1967) s t a t e s t h a t t h e ; t e r m i n a t i o n o f t h e i n t e r p o s i t u s i s l o c a t e d c h i e f l y i n t h e p o s t e r i o r m a g n o c e l l u l a r p a r t o f RN. S i m i l a r l y i t h a s b e e n shown t h a t t h e r e i s a s t r o n g r e c i p r o c a l p r o j e c t i o n b a c k t o t h e i n t e r p o s i t u s f r o m RN (BRODAL e t a l . , 1954; COURVILLE e t a l . , 1966).. A p p r o x i m a t e l y 1 0 - 1 5 % o f t h e i n t e r p o s i t u s f i b r e s a r e t h o u g h t t o c o n t i n u e r o s t r a l l y f r o m t h e r e d n u c l e u s (JANSEN a n d JANSEN JR.,1955;FLOOD' and JANSEN, 1 9 6 6 ) . E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s a l s o c o n f i r m t h e t e r m i n a t i o n o f i n t e r p o s i t u s f i b r e s i n t h e c o n t r a l a t e r a l VL o f t h e t h a l a m u s (ANGAUT e t a l . , 1968; TOYAMA e t a l . , 1 9 7 0 ) . - 2 2 -I n t h e r a t (GOODMAN e t a l . , 1963) t h e p r e v i o u s l y m e n t i o n e d 'hump' a r e a - a t t h e b o r d e r o f t h e i n t e r p o s i t u s a n d l a t e r a l n u c l e i i s c o n s i d e r e d p a r t o f t h e i n t e r p o s i t u s b e c a u s e c e l l s f o u n d i n t h i s a r e a s e n d f i b r e s i n t h e m i d d l e t h i r d o f BC a n d s e n d e f f e r e n t s t o t h e same r e g i o n o f t h e i p s i l a t e r a l p o n s a n d m e d u l l a , w h e r e a s t h e a d j a c e n t d o r s a l l a t e r a l n u c l e u s s e n d s f i b r e s t o o c c u p y t h e l a t e r a l t h i r d o f BC a n d s e n d o n l y a s m a l l p r o j e c -t i o n i n t o t h e i p s i l a t e r a l p o n s . The b r a c h i u m c o n j u n c t i v u m h a s a d e s c e n d i n g b r a n c h w h i c h s p l i t s o f f f r o m t h e m a i n t r a c t j u s t r o s t r a l t o t h e d e c u s s a t i o n . I t i s made up p r i m a r i l y o f medium a n d s m a l l f i b r e s o r i g i n a t i n g f r o m b o t h i n t e r p o s i t u s a n d l a t e r a l n u c l e i (VOOGD, 19 6 4 ) . The p a r s r o t u n d a s e n d s a s t r o n g p r o j e c t i o n i n t h i s d e s c e n d i n g BC, w h i c h t e r m i n a t e s l a r g e l y i n t h e n u c l e u s r e t i c u l a r i s t e g m e n t i p o n t i s (BRODAL e t a l . , 1 9 7 2 ) . I n a n e x t e n s i v e r e v i e w b y MASSION ( 1 9 6 7 ) , i t was n o t e d t h a t t h e a n t e r i o r RN i s f u n c t i o n a l l y s e p a r a t e f r o m t h e p o s t e r i o r p o r t i o n . I t was a l s o n o t e d t h a t t h e s m a l l c e l l e d a n t e r i o r RN i n c r e a s e s i n s i z e c o n s i d e r a b l y f r o m l o w e r s p e c i e s t o man w h i l e t h e m a g n o c e l l u l a r p o r t i o n v i r t u a l l y d i s a p p e a r s . I t i s o f n o t e t h a t t h e r u b r o s p i n a l t r a c t o r i g i n a t i n g i n t h e m a g n o c e l l u l a r p o r t i o n o f RN i s a l s o n o n - e x i s t e n t i n man. F u r t h e r s t u d i e s showed t h a t t h e l a t e r a l n u c l e u s p r o j e c t s t o t h e a n t e r i o r o n e - t h i r d o f t h e RN ( C O U R V I L L E , 1 9 6 6 ) . R e t r o g r a d e d e g e n e r a t i o n s t u d i e s showed t h a t l e s i o n s i n ' VL c a u s e d p a t h o l -o g i c a l c h a n g e s t o o c c u r i n t h e s m a l l c e l l s o f t h e i p s i l a t e r a l RN a n d t h e c o n t r a l a t e r a l l a t e r a l n u c l e u s . L a r g e c e l l s i n t h e -23-l a t e r a l n u c l e u s r e m a i n e d i n t a c t . L e s i o n o f t h e s u p e r i o r c e r e b e l l a r p e d u n c l e c a u s e d d e g e n e r a t i o n i n t h e s m a l l a n d l a r g e c e l l s o f t h e l a t e r a l n u c l e u s . I t w o u l d seem f r o m t h i s t h a t t h e r e i s a d i r e c t l a t e r a l - t h a l a m i c p a t h w a y a r i s i n g f r o m t h e s m a l l " a n d : 5 m i d d l e s i z e d c e l l s of: t h e l a t e r a l n u c l e u s a n d an i n d i r e c t p a t h w a y t h a t - a r i s e s i n l a r g e c e l l s a n d r e l a y s i n t h e p a r v o c e l l u l a r p o r t i o n o f RN on i t s way t o VL o f t h e t h a l a m u s (GEREBTZOFF, 1941) a l t h o u g h t h e e x p e r i m e n t d o e s n o t e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e l a r g e c e l l s do: n o t r e l a y v i a RN b u t s i m p l y t e r m i n a t e t h e r e . H o w e v e r , e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d l o n g a n d s h o r t l a t e n c y r e s p o n s e s i n VL i n r e s p o n s e t o c e r e b e l l a r ^ s t i m u l a t i o n i n d i c a t i n g t h a t t h e r e p r o b a b l y i s a d i - s y n a p t i e p a t h w a y a s w e l l as a., m o n o s y n a p t i c one (O'BRIEN e t a l . , 1970,-CONDE e t a l . , 1 9 7 0 ; . YOSHIDA e t a l . , 1 9 6 6 ) . I V . Summary Thus i n summary we c a n c o n c l u d e t h e f o l l o w i n g a b o u t t h e c e r e b e l l u m i n t h e c a t (COHEN e t a l . , 1958) a n d r a t (JANSEN, 1 9 5 6 ) : a) A l l c e r e b e l l a r n u c l e i s e n d f i b r e s t o VL. b) A l l c e r e b e l l a r n u c l e i c o n t r i b u t e t o BC. c) F i b r e s f r o m a l l p a r t s o f BC c o n t r i b u t e t o i t s a s c e n d i n g a n d d e s c e n d i n g b r a n c h e s . d) F i b r e s o r i g i n a t i n g i n t h e c a u d a l p o r t i o n o f t h e m e d i a l n u c l e u s c r o s s i n t h e r o s t r a l c e r e b e l l u m a n d p r o j e c t b i l a t e r a l l y t o s t r u c t u r e s i n t h e mes- a n d d i e n c e p h a l o n . e) F i b r e s . o r i g i n a t i n g . m a i n l y i n t h e - . r o s t r a l p o r t i o n o f t h e m e d i a l n u c l e u s p r o j e c t t o t h e v e s t i b u l a r n u c l e a r c o m p l e x an d b r a i n s t e m b y way o f c r o s s e d a n d u n c r o s s e d f a s t i g i o - b u l b a r t r a c t s . f ) F i b r e s f r o m t h e i n t e r p o s e d a n d l a t e r a l n u c l e i c r o s s i n t h e BC d e c u s s a t i o n a n d p r o j e c t c o n t r a l a t e r a l l y t o t h e mes-and d i e n c e p h a l o n . g) I n t e r p o s i t u s a n d l a t e r a l n u c l e i p r o j e c t t o t h e n u c l e u s r e t i c u l a r i s t e g m e n t i p o n t i s b y way o f t h e d e s c e n d i n g l i m b o f BC. h) M o s t o f t h e i n t e r p o s i t u s f i b r e s e n d i n t h e m a g n o c e l l u l a r RN a n d 1 0 - 1 5 % c o n t i n u e o n t o t h e VL o f t h e t h a l a m u s . i ) F i b r e s o r i g i n a t i n g i n t h e v e n t r o l a t e r a l a n d c a u d a l p o r t i o n s o f L c o f VOOGD ( 1 9 6 4 ) , 1 S L P 1 o f FLOOD a n d JANSEN ( 1 9 6 1 ) , a n d l a t e r a l i n t e r p o s i t u s t r a v e l i n t h e l a t e r a l t w o - t h i r d s o f t h e BC and many o f t h e s e a r e t h o u g h t t o c o n t i n u e r o s t r a l t o RN b u t more d e t a i l e d a n a t o m i c a l s t u d i e s a r e r e q u i r e d t o c o n f i r m t h i s . ' j ) H a l f o f t h e l a t e r a l n u c l e u s f i b r e s b y - p a s s RN a n d t e r m i n a t e i n VL o f t h a l a m u s a nd t h e o t h e r h a l f t e r m i n a t e l a r g e l y i n t h e p a r v o c e l l u l a r RN. The p u r p o s e o f t h i s s t u d y i s t o d e t e r m i n e i f a p o r t i o n o f t h e c e r e b e l l o - t h a l a m i c e f f e r e n t p r o j e c t i o n s y s t e m i s c h o l i n e r g i c . To t h i s e n d t h e c e r e b e l l a r n u c l e i w e r e e x a m i n e d u s i n g a r e c e n t l y d e v e l o p e d h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e f o r t h e l o c a l i z a t i o n o f c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e ( C h A c ) . The p r e s e n c e o f t h e enzyme was t a k e n as a d i r e c t i n d i c a t i o n o f a c h o l i n e r g i c n e u r o n e as w i l l be f u r t h e r d i s c u s s e d . The h i s t o c h e m i c a l m e t h o d was f i r s t s t u d i e d i n t h e s p i n a l c o r d on known c h o l i n e r g i c n e u r o n e s t o o p t i m i z e c o n d i t i o n s a n d s u b s e q u e n t l y i n t h e deep c e r e b e l l a r n u c l e i t o d e t e r m i n e t h e p r o p o r t i o n a n d l o c a t i o n o f c h o l i n e r g i c n e u r o n e s p r e s e n t . - 2 5 -METHODS A . P r e p a r a t i o n The s p i n a l c o r d s a nd c e r e b e l l a o f a d u l t (150-200g) m a l e r a t s o f t h e L o n g - E v a n s and W i s t a r s t r a i n s w e r e u s e d t h r o u g h o u t t h i s s t u d y . U n d e r e t h e r a n a e s t h e s i a , t h e c e r e b e l l a w e r e r e m o v e d i n t a c t and t h e s p i n a l c o r d s e g m e n t s w e r e e x c i s e d a t t h e l e v e l s o f T 1 0 - L 2 . The p o s i t i o n o f t h e T i 0 s e g m e n t c o r r e s p o n d e d t o t h e v e r t e b r a l l e v e l o f t h e s e c o n d l a s t r i b , a s - d e s c r i b e d b y GREENE (19 3 5 ) . F r e s h t i s s u e was e m p l o y e d f o r t h e d e m o n s t r a t i o n o f c h o l i n e a c e t y l t r a n s -f e r a s e (ChAc) a n d f i x e d t i s s u e f o r t h e a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e (AChE) and d y e s t a i n i n g t e c h n i q u e s . ~B C h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e Upon r e m o v a l t h e t i s s u e s w e r e i m m e d i a t e l y w a s h e d i n 0.15 M N a C l a t 0°C, and t h e d u r a m a t e r was c a r e f u l l y d i s -s e c t e d away. The b l o c k s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d t o a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 10% s u c r o s e a nd 25 mM HEPES b u f f e r e d t o pH 7.0 a l s o a t 0°C. F r e s h f r o z e n s e c t i o n s ( u ) + w e r e c u t i n a c r y o s t a t , ( I n t e r n a t i o n a l E q u i p m e n t Company M o d e l C T D ) , and t h a w e d o n c o v e r s l i p s . Optimum c u t t i n g t e m p e r a t u r e s + A l l v a r i a b l e s l e f t b l a n k i n t h e f o l l o w i n g d e s c r i p t i o n w e r e a d j u s t e d i n t h e c o u r s e o f t h i s s t u d y i n o r d e r t o a r r i v e a t optimum c o n d i t i o n s f o r t h e d e m o n s t r a t i o n o f t h e enzyme C h A c , a s d e s c r i b e d u n d e r R e s u l t s . The com-p o s i t i o n o f t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e f i n a l l y d e t e r m i n e d i s g i v e n i n A p p e n d i x I . -1L-w e r e -16°C and -11°C f o r t h e s p i n a l c o r d and c e r e b e l l u m r e s p e c t i v e l y . F o l l o w i n g a i r d r y i n g a t room t e m p e r a t u r e , t h e c o v e r s l i p s w e r e p l a c e d i n C o l u m b i a j a r s and d e p o s i t e d g e n t l y i n a Dewar f l a s k c o n t a i n i n g d r y i c e . S e l e c t e d p a i r s o f s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d c o n c o m i t a n t l y i n m e d i a m o d i f i e d f r o m t h o s e e m p l o y e d b y BURT (1970) and HEBB ( 1 9 7 0 ) . C o n t r o l and t e s t s e c t i o n s f r o m c o r r e s p o n d i n g l e v e l s w e r e p a i r e d t o f a c i l i t a t e a c c u r a t e c o m p a r i s o n o f r e s u l t s . The c o m p l e t e medium was f r e s h l y p r e p a r e d i n b a t c h e s o f 25 m i s . and f i l t e r e d p r i o r t o u s e . The i n g r e d i e n t s w e r e a d d e d i n t h e f o l l o w i n g o r d e r t o m i n i m i z e p r e c i p i t a t i o n ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n s ) : 25 mM HEPES* a t pH 6.0 ( f r o m N u t r i t i o n a l B i o c h e m i c a l s ) mM C h o l i n e C h l o r i d e ( f r o m F i s h e r S c i e n t i f i c Co.) 10"^M. D F P + ( f r o m C a l b i o c h e m ) 1.8 mM L e a d N i t r a t e ( f r o m C a n l a b ) mM A c e t y l - C o A * ( f r o m N u t r i t i o n a l B i o c h e m i c a l s ) S t o c k s o l u t i o n s w e r e k:ept u n d e r r e f r i g e r a t i o n and r e p l a c e d e v e r y t h r e e t o f o u r w e e k s . I n c u b a t i o n was p e r f o r m e d i n a c o n s t a n t t e m p e r a t u r e w a t e r b a t h a t 37°C'for h o u r s . C o n t r o l s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d e i t h e r i n a medium l a c k i n g c h o l i n e and a c e t y l - C o A o r i n one c o n t a i n i n g 10 - 1*M C U S C M a s an i n h i b i t o r o f ChAc (BURT, 1 9 7 0 ) . * N - 2 - H y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - N - 2 - e t h a n e s u l f o n i c a c i d , a n o r g a n i c b u f f e r . + D i - i s o p r o p y l f l u o r o p h o s p h a t e , an i r r e v e r s i b l e a c e t y l c h o l i n -e s t e r a s e i n h i b i t o r . # A c e t y l - C o e n z y m e A, w e i g h e d o u t d r y . A l l o t h e r c h e m i c a l s made up f r o m s t o c k s o l u t i o n s . - 2 ? -The c o v e r s l i p s w e r e t h e n w a s h e d r e p e a t e d l y i n d i s t i l l e d w a t e r , t r e a t e d w i t h a c e t a t e - b u f f e r e d Na2S (pH ) f o r s e c o n d s , r i n s e d i n d i s t i l l e d w a t e r a nd m o u n t e d i n K a i s e r g l y c e r o l j e l l y , d r i e d , a n d e x a m i n e d u n d e r t h e l i g h t m i c r o -s c o p e . I n some i n s t a n c e s t h e s e c t i o n s w e r e p l a c e d i n a s o l u t i o n c o n t a i n i n g , 25 mM HEPES (pH 7 . 0 ) , 10% s u c r o s e a nd 1% f o r m a l d e h y d e f o r 5 m i n u t e s , w a s h e d w e l l i n b u f f e r e d s u c r o s e s o l u t i o n ; t h e n t r a n s f e r r e d t o t h e i n c u b a t i o n medium -as d e s c r i b e d a b o v e . C. A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e To p r e p a r e t i s s u e s f o r t h e d e m o n s t r a t i o n o f a c e t y l -c h o l i n e s t e r a s e a c t i v i t y , r a t s w e r e k i l l e d u n d e r e t h e r by e x s a n g u i n a t i o n . When t h e h e a r t c e a s e d t o b e a t , a g l a s s c a n n u l a was i n s e r t e d i n t o t h e a r c h o f t h e a o r t a b y way o f t h e v e n t r i c l e a n d t h e a n i m a l was p e r f u s e d w i t h 0.9% s a l i n e , f o l l o w e d b y c o l d 10% f o r m a l i n c o n t a i n i n g 1.0% C a C l 2 . The t i s s u e was d i s s e c t e d o u t , f i x e d o v e r n i g h t i n t h e same f o r m o l -c a l c i u m s o l u t i o n , a n d t h e n i m m e r s e d i n c o l d 0.88 M s u c r o s e -1% gum a r a b i c (HOLT e t . a l . , 1960) u n t i l s a t u r a t e d . The b l o c k s o f t i s s u e w e r e t h e n w a s h e d f o r f i v e m i n u t e s i n d i s t i l l e d w a t e r , b l o t t e d d r y , and f r o z e n on a CO 2 f r e e z i n g m i c r o t o m e . S e c t i o n s w e r e c u t a t 20u and f r e e f l o a t e d i n t h e i n c u b a t i o n medium made up a c c o r d i n g t o KARNOVSKY and ROOTS (1964) (Appen-d i x I I ) . A v e r a g e i n c u b a t i o n t i m e was 2 1/4 h o u r s . F o l l o w i n g i n c u b a t i o n , t h e s e c t i o n s w e r e w a s h e d i n d i s t i l l e d w a t e r , m o u n t e d on s l i d e s , r a p i d l y d e h y d r a t e d i n a l c o h o l , c l e a r e d i n x y l e n e , -2f-m o u n t e d i n H a r l e c o S y n t h e t i c R e s i n ( H . S . R . ) * a n d e x a m i n e d u n d e r t h e l i g h t ' m i c r o s c o p e . D . H i s t o l o g i c a l S t a i n i n g 4 -Two h i s t o l o g i c a l s t a i n s w e r e u s e d f o r o r i e n t a t i o n p u r p o s e s . S e c t i o n s a d j a c e n t t o t h o s e i n w h i c h ChAc was. d e m o n s t r a t e d w e r e s t a i n e d b y t h e C r e s y l V i o l e t t e c h n i q u e . The s e c t i o n s w e r e c u t f r o m f r e s h f r o z e n t i s s u e , f i x e d , s t a i n e d a n d m o u n t e d i n H.S.R. The H a e m o t o x y l i n - D a r r o w Red p r o c e d u r e was u s e d on t i s s u e p e r f u s e d w i t h p h y s i o l o g i c a l s a l i n e f o l l o w e d b y f o r m a l i n f i x a t i o n . A f t e r d e h y d r a t i n g , c l e a r i n g a n d em-b e d d i n g i n p a r a f f i n , s e r i a l f r o n t a l s e c t i o n s w e r e c u t a t 10y a n d e v e r y 2 0 t h s e c t i o n was s t a i n e d a n d m o u n t e d a c c o r d i n g t o AUGULIS e t a l . , ( 1 9 6 9 ) . T h i s p r o v i d e d a means t o v i s u a l i z e t h e c o n f i g u r a t i o n and t h e c e l l u l a r c o m p o s i t i o n o f t h e d e e p c e r e b e l l a r n u c l e i o f t h e r a t . * H.S.R. f r o m t h e H a r t m a n - L e d d o n C o . , P h i l a d e p h i a . C o n t a i n s 60% d r i e d (H.S.R.) r e s i n i n x y l e n e . U s e d t o mount f r o m x y l e n e m e d i a . + P r o c e d u r e s w i t h r e f e r e n c e t o L I L L I E (1965) a n d R. W a l k e r ( p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . S t e p - b y - s t e p d e t a i l s a r e g i v e n i n t h e A p p e n d i c e s I I I , I V , a n d V. RESULTS The h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e was u s e d as a t o o l t o s t u d y t h e l o c a l i z a t i o n o f c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e (ChAc) w i t h t h e a i m o f a n s w e r i n g q u e s t i o n s r a i s e d f r o m e a r l i e r p h y s i o l o g i c a l and a n a t o m i c a l i n v e s t i g a t i o n s . B e c a u s e i m p o r t a n c e was g i v e n t o t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e r e g i o n a l d i s t r i b u t i o n o f ChAc i n t h e d e e p c e r e b e l l a r n u c l e i , p r e c i s e c y t o l o g i c a l l o c a l i z a t i o n o f t h e enzyme was n o t c o n s i d e r e d t o be o f p r i m e i m p o r t a n c e . I n t e n s i t y o f s t a i n i n g was t a k e n o n l y as i n d i c a t i v e o f t h e p r e s e n c e o f t h e enzyme r a t h e r t h a n i t s l e v e l o f a c t i v i t y . To t h a t e n d t h e c o n d i t i o n s o f i n c u b a t i o n w e r e a d j u s t e d t o o b t a i n t h e s h a r p e s t p o s s i b l e c o n t r a s t s u i t a b l e f o r o b s e r v a t i o n . The m e t h o d was f i r s t t e s t e d i n t h e l u m b a r s p i n a l c o r d o f t h e r a t w h e r e l a r g e m o t o n e u r o n e s a r e known t o be p r e s e n t (ZEMAN and INNES, 1963) and t h e e v i d e n c e i s a b u n d a n t t h a t t h e s e c e l l s a r e c h o l i n e r g i c , i e . c o n t a i n ACh, ChAc and AChE (FELDBERG, 19 4 5 , r e v i e w ) . The e f f e c t o f v a r y i n g t h e c o n d i t i o n s o f t h e h i s t o c h e m i c a l r e a c t i o n was t h u s b a s e d on t h e maximum i n t e r c i t y ' o f s t a i n i n g o b t a i n e d w i t h m i n i m a l n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n o c c u r r i n g . F o l l o w i n g s t a n d a r d i z a t i o n o f t h e p r o c e d u r e t h e same m e t h o d was a p p l i e d t o t h e c e r e b e l l a r t i s s u e . -30-A. S p i n a l C o r d I . S e c t i o n i n g D i f f i c u l t y was e n c o u n t e r e d i n c u t t i n g s e r i a l s e c t i o n s f r o m f r e s h f r o z e n t i s s u e a t t h e t h i c k n e s s o f 8u recommended by BURT ( 1 9 7 0 ) . I t was f o u n d t h a t d u r i n g t h e t i m e r e q u i r e d t o t e a s e t h e s e c t i o n o f f t h e m i c r o t o m e k n i f e and mount i t on a c o v e r s l i p , t h e t i s s u e on t h e b l o c k h a d t h a w e d and r e c e d e d . S e c t i o n i n g a t a h i g h e r s e t t i n g (20u) i m p r o v e d c o n d i t i o n s c o n s i d e r a b l y and a l s o r e s u l t e d i n d a r k e r c e l l u l a r s t a i n i n g , b u t t h i c k e r s e c t i o n s t o o k l o n g e r t o a i r d r y a n d w e r e more e a s i l y f r a g m e n t e d d u r i n g i n c u b a t i o n . Thus i t was f o u n d t h a t w h e r e a s 8u s e c t i o n s w e r e t o o t h i n t o be p r a c t i c a b l e t h e d i s -a d v a n t a g e s i n c u r r e d by c u t t i n g 20y s e c t i o n s o u t w e i g h e d t h e a d v a n t a g e s , s o i n t e r m e d i a t e t h i c k n e s s o f 14-16u was f o u n d t o be s u i t a b l e . I I . I n c u b a t i o n The f o l l o w i n g medium (BURT, 1970) was u s e d i n i t i a l l y i n t h i s s t u d y : 4 mM c h o l i n e c h l o r i d e 0.2 mM a c e t y l - C o e n z y m e 1.8 mM l e a d n i t r a t e i n 25 mM N - 2 - H y d r o x y e t h y l p i p e r a z i n e - N - 2 - e t h a n e s u l f o n i c a c i d (HEPES.) b u f f e r a d j u s t e d t o pH 6.0, p l u s 10 - 1* M DFP a s s u g g e s t e d b y r K A S A e t a l . (1970aX I n t h e f o l l o w i n g r e p o r t t h e i n d i v i d u a l c o n t r i -b u t i o n o f e a c h component o f t h e i n c u b a t i o n medium t o t h e -31-p r e c i p i t a t i o n r e a c t i o n w i l l be c o n s i d e r e d . I n g e n e r a l i n c r e a s i n g t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e i n d i v i d u a l s o l u t i o n s t e n d e d t o c a u s e n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n a n d t h e c o n c e n t r a t i o n s e m p l o y e d by BURT (197fij) w e r e f o u n d t o be o p t i m a l . 1. P r e c i p i t a t i o n o f CoA-SH a c e t y l - C o A w i t h l e a d S t u d i e s b y BURT (1970) showed t h a t t h e r e was- no p r e c i p i -t a t i o n o f a c e t y l - C o A w i t h l e a d i n a s o l u t i o n o f 25 mM HEPES, pH 6.0, c o n t a i n i n g 1.8 mM l e a d n i t r a t e a n d 0.2 mM a c e t y l - C o A a t room t e m p e r a t u r e . However a f t e r 60-90 m i n u t e s i n c u b a t i o n a t 37°C, a s l i g h t p r e c i p i t a t i o n was o b s e r v e d . T h e s e o b s e r v a t i o n s i n g e n e r a l w e r e c o n f i r m e d i n t h i s s t u d y , a l t h o u g h when t h e i n c u b a t i o n medium was made up e m p l o y i n g t h e a b o v e c o n c e n t r a t i o n s a s l i g h t c l o u d i n e s s was s o m e t i m e s o b s e r v e d . As o u t l i n e d i n t h e d i s c u s s i o n , l e a d r e a c t s w i t h t h e f r e e SH g r o u p o f t h e CoA m o l e c u l e . I t f o l l o w s t h e n t h a t any l e a d - C o A f o r m e d i n d e p e n d e n t l y o f t h a t a t t r i b u t a b l e t o ChAc o r o t h e r h y d r o l y t i c a c t i v i t y w i l l r e s u l t i n a n o n - s p e c i f i c b r o w n p r e c i p i t a t e a p p e a r i n g o n t h e s e c t i o n o f t h e t i s s u e . R e g a r d l e s s o f t h e c a u s e o f h y d r o l y s i s o f a c e t y l - C o A t h e d e g r e e o f p r e c i p i t a t i o n p r e s e n t w i l l be d e p e n d e n t on t h e amount o f f r e e CoA-SH a v a i l a b l e i n t h e medium. A s t r o n g e r i n i t i a l p r e c i p i t a t i o n o c c u r r e d when m a k i n g up t h e medium b o t h when t h e coenzyme c o n c e n t r a t i o n was i n c r e a s e d , and when o l d e r m a t e r i a l was u s e d . I t i s s u g g e s t e d t h a t t h e a b o v e m e n t i o n e d p r e c i p i t a t i o n o c c u r r i n g on a d d i t i o n o f a c e t y l -CoA t o t h e s o l u t i o n c o n t a i n i n g l e a d a n d HEPES i s a t t r i b u t a b l e t o t h e amount o f f r e e CoA-SH p r e s e n t due t o t h e i n s t a b i l i t y o f a c e t y l - C o A . -32-The i n c r e a s e i n p r e c i p i t a t i o n i n t h e s o l u t i o n c o n t a i n i n g l e a d , a c e t y l - C o A a nd HEPES o v e r t i m e a t 37°C as n o t e d b y BURT (1970) , s u g g e s t s t h a t t h e l o n g e r t h e i n c u b a t i o n p e r i o d t h e g r e a t e r w i l l be t h e n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n i n t h e n e u r o p i l , w h i l e t h e i n t e n s i t y o f s t a i n i n g due t o t h e i n s o l u b l e p r e c i p i t a t e i n t h e c e l l s h o u l d r e m a i n r e l a t i v e l y c o n s t a n t . T h i s was i n f a c t n o t e d i n F i g . 1 0 , w h e r e t h e e x t e n t o f n o n -s p e c i f i c s t a i n i n g i s c o n s i d e r a b l y g r e a t e r a f t e r a 3 h o u r i n c u -b a t i o n p e r i o d t h a n a f t e r lh h o u r s . I t c a n b e s e e n t h a t t h e optimum i n c u b a t i o n t i m e d e t e r m i n e d s h o u l d be l o n g e n o u g h t o d e v e l o p s u f f i c i e n t i n t e n s i t y f o r a d e q u a t e v i s u a l i z a t i o n a n d s h o r t e nough t o m i n i m i z e n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n due t o i n s t a b i l i t y o f t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e . E x p e r i m e n t s done i n w h i c h t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e c o -enzyme was d o u b l e d ( f r o m 0.2 mM t o 0.4 mM) showed s i m i l a r d e g r e e s o f c e l l u l a r s t a i n i n g i n t e n s i t y b u t d a r k e r - a nd more c o n c e n t r a t e d n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n w i t h t h e h i g h e r c o n c e n -t r a t i o n ( F i g . 1 1 ) . S t o r i n g t h e a c e t y l - C o A a t 4°C c a u s e d i t t o become l e s s e f f e c t i v e o v e r t i m e . I n t h e l a t e r e x p e r i m e n t s g r e a t e r p r e c i p i -t a t i o n was n o t e d when t h e coenzyme was a d d e d t o t h e i n c u b a t i o n medium. F i l t e r i n g r e m o v e d t h e p r e c i p i t a t e p r i o r t o i n c u b a t i o n b u t a l s o r e d u c e d t h e a b s o l u t e q u a n t i t y o f t h e enzyme. T h i s r e s u l t e d i n a d e c r e a s e d i n t e n s i t y o f c e l l u l a r s t a i n i n g a nd was e v i d e n t i n t h e c e r e b e l l a r s t u d i e s w h i c h w e r e done s u b s e q u e n t t o i n v e s t i g a t i o n o f t h e t e c h n i q u e i n t h e s p i n a l c o r d . A f u r t h e r s t u d y d one o n t h e s p i n a l c o r d showed t h a t i n d e n t i c a l c o n d i t i o n s -33 b) 3 h o u r i n c u b a t i o n . N o t f i l t e r e d , h i g h N a 2 S pH. FIGURE 1 0 . E f f e c t o f t i m e . N o t e t h a t i n b n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t e i s s u p e r i m p o s e d o n s e c t i o n . Mo- M o t o n e u r o n e , NP - N o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n -34-b) 0.4 mM a c e t y l - C o A , 1*2 h o u r i n c u b a t i o n , n o t f i l t e r e d , h i g h Na2S pH. FIGURE 1 1 . E f f e c t o f d o u b l i n g t h e coenzyme c o n c e n t r a t i o n . N o t e t h a t t h e n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t e i n b i s d a r k e r and more p r e v a l e n t t h a n i n a. H o l e s i n t h e t i s s u e c a n be s e e n c a u s e d by f r a g m e n t a t i o n o f t i s s u e a t h i g h pH o f N a 2 S . Mo- m o t o n e u r o n e , NP - n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n WM - w h i t e m a t t e r t o t h o s e e m p l o y e d p r e v i o u s l y g a v e a much p a l e r r e s u l t . ( F i g . 12) The a b o v e r e s u l t s c a n b e i n t e r p r e t e d t o mean t h a t t h e amount o f n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n i s d e p e n d e n t , t o a c e r t a i n e x t e n t , on t h e amount o f f r e e CoA-SH r e s u l t i n g f r o m u n s t a b l e a c e t y l - C o A a n d t h e i n t e n s i t y o f c e l l u l a r s t a i n i n g i s d e p e n d e n t on t h e amount o f i n t a c t a c e t y l - C o A a v a i l a b l e t o C hAc. Thus w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n and age o f t h e coenzyme e m p l o y e d and w i t h i n c r e a s i n g t i m e s o f i n c u b a t i o n , t h e n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n becomes, g r e a t e r . F o r t h e a b o v e r e a s o n s 0.2 mM o f f r e s h c o e n z y m e , f i l t r a t i o n o f t h e c o m p l e t e medium j u s t p r i o r t o u s e and a n i n c u b a t i o n p e r i o d o f lh h o u r s w e r e c o n s i d e r e d o p t i m a l c o n d i t i o n s . P r e i n c u b a t i o n o f t h e t i s s u e w i t h DFP showed no a p p r e c i a b l e i m p r o v e m e n t i n t h e c l a r i t y o f t h e r e s u l t (compare F i g . 13a w i t h F i g . 10b) and t h e r e f o r e was n o t d one r o u t i n e l y . T h e r e was a l s o no d i f f e r e n c e i n t h e r e s u l t s o b t a i n e d when t h e i n c u b a t i o n m e d i a c o n t a i n e d 1 0 - 3M. r a t h e r t h a n 10" 4M DFP. 2. C o n t r o l s a n d i n h i b i t o r s O m i s s i o n o f c h o l i n e o n l y f r o m t h e medium e l i m i n a t e d c e l l u l a r s t a i n i n g , and a s i m i l a r r e s u l t was o b t a i n e d when b o t h c h o l i n e and a c e t y l - C o A w e r e o m i t t e d ( F i g . 1 3 b ) . I t m i g h t be e x p e c t e d t h a t t h e c e l l s h o u l d c o n t a i n a c e r t a i n e n d o g e n o u s amount o f t h e t w o s u b s t r a t e s w h i c h a r e n e c e s s a r y t o r e s u l t i n p r e c i p i t a t i o n o f t h e r e a c t i o n e n d p r o d u c t i n s p i t e o f t h e i r o m i s s i o n f r o m t h e i n c u b a t i o n medium. Ho w e v e r , i t was f o u n d t h a t t h e c o n t r o l s e c t i o n s w e r e n e v e r s e e n t o e x h i b i t a c e l l u l a r r e a c t i o n . -36-b) O l d enzyme, f i l t e r e d , l o w N a 2 S pH. FIGURE 12. E f f e c t o f o l d c o e n z y m e . I n b: n o t e t h a t o l d enzyme r e s u l t s i n p a l e r c e l l u l a r s t a i n i n g ; f i l t r a t i o n c o n s i d e r a b l y r e d u c e s n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n a n d l o w e r pH o f N a 2 S r e d u c e s f r a g -m e n t a t i o n o f t i s s u e . A l s o n o t e p r e c i p i t a t i o n p a t t e r n i n w h i t e m a t t e r . M«- m o t o n e u r o n e NP - n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n E> - f r a g m e n t a t i o n WM - w h i t e m a t t e r b) C o n t r o l - o m i s s i o n o f c h o l i n e + a c e t y l CoA, 1*5 h o u r i n c u b a t i o n , f i l t e r e d , l o w N a 2 S pH FIGURE 13. a) E f f e c t o f p r e - i n c u b a t i o n . b) C o n t r o l r e s u l t . N o t e homogeneous n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n f o r m i n g t h e b a c k g r o u n d a g a i n s t w h i c h t h e o u t l i n e o f t h e m o t o n e u r o n e c a n be s e e n (b) c y t o p l a s m i s f r e e o f r e a c t i o n end p r o d u c t . Mo - m o t o n e u r o n e - 3 S -N o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n was p r e s e n t o n l y to- t h e d e g r e e t h a t i t a p p e a r e d as w i d e s p r e a d f i n e b l a c k g r a n u l e s on a l i g h t b r o w n b a c k g r o u n d ; a g a i n s t w h i c h t h e o u t l i n e o f t h e c o n t r o l c e l l c o u l d be f a i n t l y d i s t i n g u i s h e d ( F i g . 1 3 b ) . On o c c a s i o n f o r m a l i n f i x a t i o n was a t t e m p t e d as d e s c r i b e d i n t h e m e t h o d s ( F i g . 1 4 b ) . I t c a n be n o t e d t h a t b o t h t h e b a c k -g r o u n d and t h e c e l l a r e p a l e r . T h i s c o n f i r m e d t h a t f o r m a l i n f i x a t i o n r e d u c e d t h e a c t i v i t y o f ChAc and n o n - s p e c i f i c a d s o r p t i o n o f l e a d as n o t e d a l s o b y BURT ( 1 9 7 0 ) . I n c l u s i o n o f CuSOi* i n t h e medium a s an i n h i b i t o r o f ChAc g a v e a s i m i l a r r e s u l t t o t h e f o r m a l i n f i x a t i o n . The s e c t i o n s w e r e v e r y p a l e a n d c e l l s w e r e d i f f i c u l t t o d i s t i n g u i s h . The w h i t e m a t t e r was n e g a t i v e t o s t a i n e x c e p t f o r a p e c u l i a r p a t t e r n o f p r e c i p i t a t i o n s c a t t e r e d i n i t ( F i g . 12b, 1 4 a ) . I t was t h o u g h t t o b e due t o v a r i a b l e n o n - s p e c i f i c a d s o r p t i o n o f l e a d (BURT, 1 9 7 0 ) . I I I . S o d i u m s u l p h i d e A l k a l i n i t y o f s o d i u m s u l p h i d e s o l u t i o n s i s known t o c a u s e m a r k e d d i s t o r t i o n a n d f r a g i l i t y o f t i s s u e s e c t i o n s (LEWIS, 1 9 6 1 ) . I t was f o u n d t h a t s e c t i o n s t r e a t e d w i t h y e l l o w s o d i u m s u l p h i d e (pH a b o v e 8.0) became v e r y f r a g i l e and t h e t i s s u e t e n d e d t o come o f f t h e c o v e r s l i p s . The pH was t h e r e f o r e a d j u s t e d . t o pH 6.5 a t t h e b e g i n n i n g o f e a c h i n c u b a t i o n ; m e a s u r e m e n t s t a k e n a t t h e c o n c l u s i o n o f t h e e x p e r i m e n t s showed t h e pH t o be a p p r o x i m a t e l y 6.6-6.7. O n l y two s e c t i o n s w e r e d e v e l o p e d i n e a c h 100 m l b e a k e r a t N a 2 S ; t h i s p r o c e d u r e a l l o w e d b) O l d e r enzyme 1*5 h o u r 1% f o r m a l i n i n 25mM HEPES 5 m i n . w a s h ed i n 10% s u s c r o s e 25mM HEPES pH 6.0, f i l t e r e d l o w N a 2 S pH ±h h o u r i n c u b a t i o n . FIGURE 14. E f f e c t o f f o r m a l i n f i x a t i o n . N o t e t h a t b o t h n o n - s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n a n d c e l l u l a r p r e c i p i t a t i o n i s r e d u c e d . Mo - m o t o n e u r o n e s WM - w h i t e m a t t e r much n o n - s p e c i f i c e n d p r o d u c t t o f a l l away- i n t o a l a r g e v o l u m e and t h u s i m p r o v e d t h e q u a l i t y o f s t a i n i n g . D e v e l o p i n g t i m e i n t h e N a 2 S s o l u t i o n was e s t a b l i s h e d a t 45 s e c . The s h o r t e s t t i m e p o s s i b l e was e m p l o y e d t o l i m i t d e s t r u c t i o n o f t h e i n t e g r i t y o f t h e t i s s u e . F r a g m e n t a t i o n was n o t a p r o b l e m i n t h e s p i n a l c o r d r e s u l t s s i n c e o r i e n t a t i o n o f a n t e r i o r a n d p o s t e r i o r h o r n s was r e l a t i v e l y s i m p l e . H owever, c e r e b e l l a r s e c t i o n s w e r e d i f f i c u l t t o mount w h o l e and o f t e n o n l y t h e p o r t i o n c o n t a i n i n g t h e d e e p n u c l e i was m o u n t e d . I t was i m p o r t a n t t h e r e f o r e t h a t f r a g m e n t a t i o n be l i m i t e d t o p e r m i t an a c c u r a t e a l l o c a t i o n o f c e l l s t o t h e i r r e s p e c t i v e n u c l e i . I V . H i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f AChE A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e d e t e r m i n a t i o n s b y t h e d i r e c t t h i o c h o l i n e m e thod o f KARNOVSKY and ROOTS (1964) w e r e a l s o d one o n t h e s p i n a l c o r d . The c e l l s t h a t s t a i n e d w e r e l a r g e m oto-n e u r o n e s ( F i g . 16) s i m i l a r i n s i z e a n d s h a p e t o t h e o n e s s t a i n i n g f o r ChAc ( F i g . 15) a l t h o u g h t h e c o r r e s p o n d e n c e i s n o t i m m e d i a t e l y o b v i o u s b e c a u s e F i g . 15 was t a k e n a t a h i g h e r m a g n i f i c a t i o n . b) 3 h o u r i n c u b a t i o n FIGURE 15. T y p i c a l r e s u l t . N o t e n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c s t a i n i n g a n d s m a l l e r c e l l s a d j a c e n t t o m o t o n e u r o n e s t h a t a p p e a r r e f r a c t o r y t o e n d - p r o d u c t p r e c i p i t a t i o n ( b o t h a & b ) . N c- n u c l e u s C - c y t o p l a s m NS - n e g a t i v e t o s t a i n - I l l -FIGURE 16. A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e r e s u l t . NS - n e g a t i v e t o s t a i n Mo - m o t o n e u r o n e N c- n u c l e u s N o t e s i m i l a r s m a l l c e l l s a d j a c e n t t o l a r g e m o t o n e u r o n e s n e g a t i v e t o s t a i n a s i n F i g . 15b. - 4 3 -B. C e r e b e l l u m The c o n d i t i o n s o f t h e i n c u b a t i o n e m p l o y e d i n t h e c e r e b e l l a r s t u d i e s w e r e i d e n t i c a l t o t h o s e d e s c r i b e d a s o p t i m a l f o r t h e s p i n a l c o r d , e x c e p t t h a t t h e enzyme h a d a g e d and t h e r e f o r e t h e s t a i n i n g a p p e a r e d p a l e r . The d i s t r i b u t i o n o f ChAc was s t u d i e d m a i n l y i n t h e m i d d l e t h i r d o f t h e r o s t r o c a u d a l e x t e n t o f t h e c e r e b e l l a r n u c l e i ( F i g . 1 7 ) , a l t h o u g h some c e l l s c o n t a i n i n g ChAc w e r e a l s o f o u n d i n t h e m e d i a l n u c l e u s more c a u d a l l y ( F i g . 1 8 ) . ' The m i d d l e 1/3 was t a k e n t o c o r r e s p o n d t o l e v e l s c & d o f F i g . 5 w h e r e t h e n u c l e u s i n t e r p o s i t u s a nd m e d i a l i s merge v e n t r a l l y w i t h t h e v e s t i b u l a r c o m p l e x and t h e g e n u o f t h e f a c i a l n e r v e i s . v i s i b l e i n t h e b r a i n s t e m . A s e t o f t r a n s v e r s e s e r i a l s e c t i o n s o f t h e r a t c e r e b e l l a r n u c l e i w e r e s t a i n e d w i t h H a e m a t o x y l i n - D a r r o w Red and showed a s i m i l a r c y t o a r c h i t e c t n i c p a t t e r n t o t h a t r e p o r t e d i n t h e l i t -e r a t u r e . I . N u c l e u s M e d i a l i s The n e u r o n e s - t h a t showed ChAc a c t i v i t y i n t h e m e d i a l n u c l e u s w e r e s m a l l , and l o c a t e d i n t h e c a u d a l 2/3 o f t h e n u c l e u s m e d i a l l y a nd v e n t r a l l y n e x t t o t h e r o o f o f t h e I V v e n t r i c l e ( F i g . 1 8 ) . , I n F i g . 19 i s i l l u s t r a t e d f o r c o m p a r i s o n a known c h o l i n e r g i c c e l l l y i n g i n t h e m o t o r n u c l e u s o f t h e v a g u s ( F R I Z E L L e t a l . , 1 9 7 0 ) . C e l l s o f c o r r e s p o n d i n g d i m e n s i o n s w e r e f o u n d t o be p r e s e n t i n s e c t i o n s s t a i n e d s e p a r a t e l y b y C r e s y l V i o l e t a n d AChE t a k e n a d j a c e n t t o t h o s e w h i c h showed ChAc a c t i v i t y ( F i g . 20 & 2 1 ) . FIGURE 17. M i d d l e 1/3 o f r o s t r o - c a u d a l e x t e n t o f c e r e b e l l a r n u c l e i o f t h e r a t . C r e s y l V i o l e t . T r « . K s y « r * e s e c t i o n . C o r r e s p o n d s t o l e v e l c and d o f F i g . 5. D o r s o l a t e r a l p r o t u b e r a n c e o f Goodman (1963) e v i d e n t . L - l a t e r a l n u c l e u s I - i n t e r p o s i t u s n u c l e u s M - m e d i a l n u c l e u s I P - i n f e r i o r p e d u n c l e V - v e s t i b u l a r n u c l e a r c o m p l e x FIGURE 18. C a u d a l 2/3 o f r o s t r o - c a u d a l e x t e n t o f t h e c e r e b e l l a r n u c l e i o f t h e r a t . S e c t i o n i s c u t o b l i q u e l y s o t h a t m e d i a l s t r u c t u r e s r e p r e s e n t more c a u d a l l e v e l s . M e d i a l n u c l e u s t h e r e -f o r e c o r r e s p o n d s t o l e v e l f and g o f F i g . 5 w h i l e l a t e r a l n u c l e u s c o r r e s p o n d s t o l e v e l c and d. N o t e t h a t d o r s o l a t e r a l p r o t u b e r a n c e i s m i s s i n g . L - l a t e r a l n u c l e u s I - i n t e r p o s i t u s n u c l e u s M - m e d i a l n u c l e u s I P - i n f e r i o r p e d u n c l e V - v e s t i b u l a r n u c l e a r c o m p l e x I V - f o u r t h v e n t r i c l e a) V a g a l C e l l s b) C e l l s f r o m m e d i a l n u c l e u s FIGURE 19. C o m p a r i s o n o f c e l l s s t a i n i n g f o r ChAc i n v a g a l a nd m e d i a l n u c l e i . N o t e s i m i l a r i t y o f i n t e n s i t y o f s t a i n i n g i n a a n d b. C e l l s f r o m m e d i a l n u c l e u s shown i n b a r e s m a l l . N - n e u r o n e -4? b) Same as a b o v e , a c e t y l c h o l i n e s t e r a s e . FIGURE 20. C r e s y l V i o l e t a n d AChE s t a i n i n g i n t h e c a u d a l m e d i a l n u c l e u s . C e l l c o r r e s p o n d i n g i n s i z e t o t h o s e s t a i n e d b y ChAc i n F i g . 19b and AChE i n F i g . 20b a r e f o u n d i n l o w e r l e f t c o r n e r o f a b o v e , o t h e r l a r g e r c e l l s o f m e d i a l n u c l e u s c a n a l s o be s e e n i n a. N - n e u r o n e a) ChAc s t a i n i n g m e d i a l n u c l e u s b) C o n t r o l - o m i s s i o n o f b o t h c h o l i n e and a c e t y l - C o A f r o m i n c u b a t i o n medium. C o r n e r o f w h i t e m a t t e r i n c l u d e d ( l e f t u p p e r ) . FIGURE 21. C o m p a r i s o n o f ChAc s t a i n i n g s e c t i o n a n d i t s c o r r e s p o n d i n g c o n t r o l i n t h e m e d i a l n u c l e u s . N o t e p a l e o u t l i n e o f s m a l l a n d l a r g e r c e l l s i n t h e c o n t r o l s e c t i o n b. N - n e u r o n e WM - w h i t e m a t t e r - M -I t was- n o t p o s s i b l e t o d e t e r m i n e i f t h e c e l l s w h i c h s t a i n e d f o r ChAc w e r e i d e n t i c a l t o t h o s e b e l o n g i n g t o SMP o f FLOOD e t a l . ( 1 9 6 1 ) , a l t h o u g h t h e y w e r e o f t h e same m a g n i t u d e a s t h e s m a l l c e l l s o f t h e m e d i a l n u c l e u s a s d e s c r i b e d b y MATSUSHITA e t a l . ( 1 9 7 1 ) . I I . N u c l e u s I n t e r p o s i t u s a n d L a t e r a l i s A s shown i n F i g . 22 t h e b o r d e r b e t w e e n t h e l a t e r a l a n d i n t e r p o s i t u s n u c l e i was t a k e n l a t e r a l t o t h e "hump" a s d e s c r i b e d b y GOODMAN ( 1 9 6 3 ) . The CV s e c t i o n t h a t i s r e p r e s e n t e d i n F i g . 17 when e x a m i n e d m i c r o s c o p i c a l l y shows b o t h r o u n d a n d s p i n d l e s h a p e d s m a l l c e l l s v e n t r o l a t e r a l l y i n t h e l a t e r a l n u c l e u s ( F i g . 2 3 ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e s e s p i n d l e s h a p e d a n d r o u n d s m a l l c e l l s a r e i d e n t i c a l a n d a p p e a r r o u n d o r f l a t t e n e d d e p e n d i n g on t h e a n g l e a t w h i c h t h e y a r e c u t (COUR-V I L L E , 1 9 7 0 ) . The v e n t r o l a t e r a l p o r t i o n o f t h e l a t e r a l n u c l e u s was t h o u g h t t o c o r r e s p o n d t o SLP o f FLOOD and JANSEN (1961) a n d t h e s a m l l c e l l e d p o r t i o n o f t h e p a r s c o n v e x a ( L c ) o f VOOGD ( 1 9 6 4 ) . The c e l l s t h a t r e a c t e d p o s i t i v e l y f o r ChAc w e r e f o u n d p r e d o m i n a n t l y i n t h e v e n t r o l a t e r a l p o r t i o n o f t h e l a t e r a l n u c l e u s and c o r r e s p o n d e d i n s i z e t o t h o s e d e s c r i b e d a b o v e as s e e n i n t h e CV s e c t i o n s ( F i g . 2 4 ) . O t h e r s l i g h t l y l a r g e r c e l l s s t a i n i n g f o r ChAc w e r e f o u n d s c a t t e r e d i n t h e d o r s a l p a r t o f t h e l a t e r a l n u c l e u s a n d on t h e b o r d e r o f t h e i n t e r p o s i t u s a n d l a t e r a l n u c l e i . ' T h o s e c e l l s t h a t w e r e s i t u a t e d o n t h e b o r d e r o f t h e two n u c l e i w e r e o f t e n f l a t t e n e d i n a p p e a r a n c e w i t h t h e i r l o n g a x e s p o i n t i n g t o w a r d t h e o r i g i n o f t h e b r a c h i u m c o n j u n c t i v u m ( F i g . 2 5 ) . - S o -FIGURE 22. R e p r e s e n t a t i v e s e c t i o n s h o w i n g d i s t r i b u t i o n o f  c e l l s e x h i b i t i n g ChAc a c t i v i t y . N o t e a g g r e g a t i o n s o f c e l l s i n SLP and on b o r d e r o f i n t e r p o s i t u s and l a t e r a l n u c l e i . L - n u c l e u s l a t e r a l i s I - n u c l e u s i n t e r p o s i t u s M - n u c l e u s m e d i a l i s I P - i n f e r i o r p e d u n c l e I V - f o u r t h v e n t r i c l e V - v e s t i b u l a r n u c l e a r c o m p l e x SLP - s u b n u c l e u s p a r v i c e l l u l a r i s l a t e r a l i s . £3? - w h i t e m a t t e r p a t t e r n o f s t a i n i n g o b s c u r i n g c e l l u l a r s t a i n i n g . i 5 7 -a) CV - s m a l l s p i n d l e s h a p e d and r o u n d c e l l s f o u n d i n t h e v e n t r a l p o r t i o n o f l a t e r a l n u c l e u s . 50^ b) AChE same a r e a as above FIGURE 2 3 . C r e s y l V i o l e t a n d AChE s t a i n i n g i n s m a l l c e l l e d v e n t r a l  p o r t i o n o f t h e l a t e r a l n u c l e u s . N o t e t h a t many o f t h e c e l l s a r e c u t t o a p p e a r s p i n d l e s h a p e d b u t some a p p e a r r o u n d . N - n e u r o n e s b) AChE - v e n t r o l a t e r a l p o r t i o n o f l a t e r a l n u c l e u s FIGURE 24. ChAc and AChE s t a i n i n g i n s m a l l c e l l e d v e n t r o l a t e r a l p o r t i o n o f t h e l a t e r a l n u c l e u s . N o t e t h a t more o f t h e c e l l s a p p e a r r o u n d i n t h i s f i g u r e as o p p o s e d t o F i g . 2 3 . N - n e u r o n e NS - n e u r o n e s n e g a t i v e t o t h e ChAc s t a i n . a) ChAc - f l a t t e n e d c e l l o n b o r d e r o f i n t e r p o s i t u s w i t h l o n g a x i s o r i e n t e d t o w a r d o r i g i n o f BC. 2 o ^ b) AChE s t a i n i n g more m e d i a l l y s i t u a t e d i n t e r p o s i t u s c e l l . FIGURE 25. I n t e r p o s i t u s c e l l s s t a i n i n g f o r ChAc and AChE. I n b n o t e t h e d i f f e r e n c e i n s t a i n i n g i n t e n s i t y f o r AChE b e t w e e n c e l l s . I n t h i s s t u d y c e l l s w e r e s a i d t o s t a i n f o r AChE when t h e i r i n t e n s i t y o f s t a i n i n g c o r r e s p o n d e d t o t h a t o f t h e s p i n d l e s h a p e d c e l l i n b. WM - w h i t e m a t t e r N - n e u r o n e B - b o r d e r o f i n t e r p o s i t u s anrl "I a 1 - v a 1 n u c l e i A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e s t u d i e s done o n t h e c e r e b e l l a r n u c l e i showed a s i m i l a r d i s t r i b u t i o n o f i n t e n s e l y s t a i n e d c e l l s a s t h a t d e s c r i b e d a b o v e f o r ChAc ( F i g . 2 2 ) . - 5 5 -DISCUSSION A. E v a l u a t i o n o f t h e M e t h o d I . . H i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n H i s t o c h e m i s t r y i s b a s e d on a c o m b i n a t i o n o f h i s t o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l p r i n c i p l e s * . A l t h o u g h p a r t i c u l a r h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e s a r e d e s i g n e d t o d e a l w i t h a s i n g l e enzyme s y s t e m , one m u s t n o t l o s e s i g h t o f t h e f a c t t h a t a l l t h e o t h e r enzyme s y s t e m s i n t h e t i s s u e a r e a l s o p r e s e n t and a c t i v e . The b i o -c h e m i s t c a n i s o l a t e a n d c h a r a c t e r i z e an enzyme s y s t e m i n t h e t e s t t u b e b u t t h e h i s t o c h e m i s t m u s t a l w a y s / be aware o f t h e p o s s i b i l i t y o f i n t e r f e r i n g r e a c t i o n s . I n a d d i t i o n l o c a l i z a t i o n o f t h e s i t e o f enzyme a c t i v i t y , p a r t i c u l a r l y a t t h e i n t r a c e l l u l a r l e v e l , i s c o m p l i c a t e d b y t h e f a c t t h a t t i s s u e s e c t i o n i n g e x p o s e s t h e c y t o p l a s m t o e x t e r n a l e n v i r o n m e n t a l i n f l u e n c e s a n d a c e r t a i n amount o f enzyme a c t i v i t y may be l o s t f r o m t h e c e l l t o d i f f u s e f r e e l y i n t o t h e i n c u b a t i o n medium. C a r e must be t a k e n t o c a r r y o u t t h e p r o p e r b i o c h e m i c a l c o n t r o l s f o r a n y m o d i f i c a t i o n s o f t h e h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e t h a t may i m p r o v e l o c a l i z a t i o n b u t a t t h e same t i m e may a l t e r t h e c h a r a c t e r i s t i c s o r a c t i v i t y o f t h e enzyme u n d e r c o n s i d e r a t i o n . A n a l y s i s o f t h e m e c h a n i s m s o f h i s t o c h e m i c a l r e a c t i o n s h a s shown t h a t v a r i o u s f a c t o r s c a n a f f e c t l o c a l i z a t i o n a n d c h a r a c -t e r i z a t i o n o f t h e enzyme o f i n t e r e s t . H i s t o c h e m i c a l m e t h o d s b a s e d on s u b s t r a t e h y d r o l y s i s c a n b e d i v i d e d i n t o f o u r m a i n t y p e s o f s y s t e m s a s f o l l o w s : * • H i s t o c h e m i c a l p r i n c i p l e s o b t a i n e d f r o m C.W.M. ADAMS (1965) and G.G-. GLENNER ( 1 9 6 5 ) . -SL-i ) M u l t i p l e s e q u e n c e i i ) N o n - c p u p l i n g i i i ) s i m u l t a n e o u s c o u p l i n g i v ) p o s t - i n c u b a t i o n c o u p l i n g The c h o l i n e a c e t y l a s e s y s t e m m o s t c l o s e l y r e s e m b l e s a s i m u l -t a n e o u s c o u p l i n g s y s t e m , s c h e m a t i c a l l y r e p r e s e n t e d a s f o l l o w s : , . . G> e n z y m i c v . . . . , . . , ®capture S u b s t r a t e J L~.—> i n i t i a l r e a c t i o n p r o d u c t ^ " •—-4 r e a c t i o n * r e a c t i o n f i n a l r e a c t i o n p r o d u c t T ^ 2 i £ H £ — * v i s i b l e p r e c i p i t a t e ^ d e v e l o p e r r * A . ,' ® ChAc _ _ c u © P b (N0 3) 2 ., . „ @Na 2S A c e t y l - C o A » CoA-SH 1——tL$ l e a d - C p A i - * PbS T h i s s y s t e m w i l l be c o n s i d e r e d i n t e r m s o f b i o c h e m i c a l e x p e r i m e n t s done b y BURT (1969,1970) a n d HEBB e t a l . ( 1 9 7 0 ) , KASA e t a l . (1970 a & b , 1 9 7 2 ) . I I . S u b s t r a t e s T h e r e a r e two s u b s t r a t e s f o r ; t h e s y n t h e s i z i n g r e a c t i o n o f a c e t y l c h o l i n e , A c e t y l - C o A a s t h e d o n o r o f t h e a c e t y l g r o u p an d c h o l i n e a s t h e a c c e p t o r . The- c o m p r e h e n s i v e a r t i c l e o f HEBB (1957) o u t l i n e s and r e v i e w s t h e s u b j e c t o f c h o l i n e a c e t y l a t i o n . I t was e s t a b l i s h e d i n 1954 b y L i p m a n t h a t t h e coenzyme a c e t y l - C o A was r e s p o n s i b l e f o r v a r i o u s b i o l o g i c a l a c e t y l a t i o n s a n d t h a t i t was t h e c e n t r e o f an a c e t y l d i s t r i b u -t i o n p o o l i n c e l l u l a r m e t a b o l i s m . I t f o l l o w s t h e n t h a t s e v e r a l s u b s t a n c e s c a n d o n a t e an a c e t y l g r o u p t o f o r m a c e t y l - C o A a n d t h a t i t c a n i n t u r n become t h e common s o u r c e o f a c e t y l g r o u p s . ' The h i s t o c h e m i c a l m e t h o d u n d e r c o n s i d e r a t i o n i s b a s e d on t h e f o r m a t i o n o f f r e e CoA-SH f r o m h y d r o l y s i s o f a c e t y l - C o A b y ChAc and i t s s u b s e q u e n t p r e c i p i t a t i o n b y l e a d . F o r m o s t a c c u r a t e l o c a l i z a t i o n i t i s e s s e n t i a l t h a t f o r m a t i o n o f f r e e CoA be l i m i t e d t o t h a t - p r o d u c e d b y t h e a c t i o n o f C h A c . The d e p e n d e n c e o f t h e r a t e o f r e a c t i o n o n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f c h o l i n e i s u s e d a s a m e a s u r e o f s p e c i f i c i t y . BURT (1969,1970) f o u n d t h a t i n t h e a b s e n c e o f c h o l i n e t h e ChAc r e a c t i o n was 45-50% t h a t o b s e r v e d i n t h e c o m p l e t e medium and a c e t a t e f o r m a t i o n m e a s u r e d r a d i o m e t r i c a l l y was more t h a n d o u b l e d . The e x p l a n a t i o n g i v e n f o r t h i s phenomena was t h a t c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e o p e r a t e s a s a t w o - s t e p m e c h a n i s m . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t a n a c e t y l - e n z y m e c o m p l e x i n t e r m e d i a t e i s f o r m e d p r i o r t o t r a n s f e r o f t h e a c e t y l g r o u p t o c h o l i n e a n d w h i c h i n t h e a b s e n c e o f t h e a c c e p t o r c h o l i n e i s h y d r o l y z e d t o l i b e r a t e a c e t a t e , BURT s u p p o r t s t h i s e x p l a n a t i o n w i t h t h e e v i d e n c e t h a t 0.IM C u + + , w h i c h i s known t o i n h i b i t t h e a c t i v i t y o f C h A c , a l s o i n h i b i t s t h e f o r m a t i o n o f a c e t a t e i n t h e a b s e n c e o f c h o l i n e . An a l t e r n a t i v e e x p l a n a t i o n i s t h a t n o n - s p e c i f i c h y d r o l y s i s o c c u r s a t a f a s t e r r a t e i n t h e a b s e n c e o f c h o l i n e . HEBB (1970) f a v o u r s t h e l a t t e r v i e w and m e n t i o n s t h e f o l l o w i n g , p o s s i b i l i t i e s : (1) n o n - e n z y m a t i c h y d r o l y s i s o f a c e t y l - C o A , (2) a c t i o n o f e s t e r a s e s , (3) a c t i o n o f a c e t o - a c e t y l - C o A t h i o l a s e . T h e r e a r e o t h e r enzymes t h a t c o u l d l e a d t o r e l e a s e o f f r e e CoA-SH b u t t h e y w o u l d r e q u i r e t h e a d d i t i o n o f a n o t h e r s e c o n d s u b s t r a t e . A d d i t i o n o f an AChE i n h i b i t o r ( 1 0 - l t M e s e r i n e ) t o t h e i n c u b a t i o n medium i n t h e a b s e n c e o f c h o l i n e d i d n o t r e d u c e t h e n o n - s p e c i f i c h y d r o l y s i s b y more t h a n 2%. N o r . d i d i n c r e a s i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f e s e r i n e s u f f i c i e n t l y t o i n h i b i t n o n - s p e c i f i c c h o l i n e s t e r a s e s f u r t h e r r e d u c e t h e f o r m a t i o n o f f r e e a c e t a t e i n t h e a b s e n c e o f c h o l i n e . H o w e v e r , DFP a t a h i g h e r c o n c e n t r a t i o n •'(ioViPFPV^than t h a t r e q u i r e d , t o i n h i b i t a l l e s t e r a s e s d i d i n h i b i t t h e n o n - s p e c i f i c h y d r o l y s i s o f a c e t y l - C o A t o 1 1 % t h a t o f c o n t r o l . T h i s c o n c e n t r a t i o n o f DFP was shown n o t t o i n h i b i t ChAc a c t i v i t y . BURT'S r e s u l t s w i t h C u + + c o u l d be e x p l a i n e d b y p o s t u l a t i n g t h a t t h e enzyme o r enzymes c a u s i n g n o n - s p e c i f i c h y d r o l y s i s a r e a l s o s e n s i t i v e t o i n h i b i t i o n b y C u + + . T h e r e f o r e we c a n c o n c l u d e t h a t p a r t o f t h e c h o l i n e i n d e p e n d e n t h y d r o l y s i s may be due t o e s t e r a s e s a n d p a r t t o n o n - s p e c i f i c h y d r o l y s i s o f a n u n i d e n t i f i e d a c e t y l -CoA h y d r o l a s e . T h u s , i n . m e d i a c o n t a i n i n g DFP t h e h i s t o c h e m i c a l r e a c t i o n becaomes c h o l i n e d e p e n d e n t . C h o l i n e d e p e n d e n c e was c o n f i r m e d i n t h e p r e s e n t s u t d y a n d i t was f o u n d t h a t t h e r e d i d n o t a p p e a r t o be a s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n s e c t i o n s i n c u b a t e d i n t h e c o m p l e t e m e d i a c o n t a i n i n g 10" 3M DFP o r t h o s e c o n t a i n i n g 10 - l tM DFP i n t h e s p i n a l c o r d . H o w e v e r , i n t h e c e r e -b e l l a r s t u d i e s r e s u l t s o b t a i n e d w e r e more v a r i a b l e when e m p l o y i n g t h e l o w e r c o n c e n t r a t i o n o f DFP. I I I . - M echanism o f H i s t o c h e m i c a l L o c a l i z a t i o n A h i s t o c h e m i c a l m e t h o d m u s t n o t o n l y i n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f t h e enzyme o f i n t e r e s t b u t i t m u s t a l s o i n d i c a t e i t s c o r r e c t a n a t o m i c a l l o c a t i o n . V a r i o u s s t e p s i n t h e s i m u l t a n e o u s c o u p l i n g r e a c t i o n t h a t a f f e c t a c c u r a t e l o c a l i z a t i o n o f t h e enzyme w i l l be c o n s i d e r e d i n t u r n . - 5 1 -I n o r d e r t o r e f l e c t e n z y m i c a c t i v i t y a c c u r a t e l y one m u s t a s s u r e t h a t z e r o o r d e r k i n e t i c s a r e o p e r a n t , i e . , t h a t t h e r a t e o f s u b s t r a t e b r e a k d o w n d e p e n d s o n l y o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f enzyme. T h e s e c o n d i t i o n s a p p l y when t h e s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n i s s u f f i c i e n t l y h i g h s u c h t h a t i t i s n o t r a t e l i m i t i n g a n d t h i s c a n be a c h i e v e d i f t h e s u b s t r a t e i s p r e s e n t i n l a r g e e x c e s s o v e r t h a t o f t h e i n i t i a l r e a c t i o n p r o d u c t . E q u a l l y i m p o r t a n t i s t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e c a p t u r e r e a g e n t be i n l a r g e e x c e s s t o t h a t o f t h e p r o d u c t o f t h e enzyme r e a c t i o n s o t h a t t h e i n i t i a l s p e e d o f f o r m a t i o n o f t h e f i n a l r e a c t i o n p r o d u c t i s a f i r s t o r d e r r e a c t i o n , i e . i t w i l l d e p e n d b o t h on t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e i n i t i a l r e a c t i o n p r o d u c t and on i t s c o u p l i n g c h a r a c t e r i s t i c s . The c a p t u r e r e a g e n t m u s t n o t i n t e r f e r e w i t h t h e enzyme a c t i v i t y a nd i t m u s t f o r m a s t a b l e i n s o l u b l e p r e c i p i t a t e . I n t h i s i n v e s t i g a t i o n l e a d n i t r a t e h a s b e e n c h o s e n as t h e c a p t u r e r e a -g e n t . BURT (1970) n o t e d t h a t t h e p r e c i p i t a t i o n o f l e a d CoA was m a x i m a l f r o m pH 4-5 and t h a t o p t i m a l t r a p p i n g e f f i c i e n c y o c c u r r e d a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1.8 mM. C h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e i s known t o be s e n s i t i v e t o h e a v y m e t a l i o n s ( K A S A e t a l v '1972), b u t BURT (1970) r e p o r t e d t h a t i n a r a d i o m e t r i c a s s a y o f a c e t y l c h o l i n e s y n t h e s i s , l e a d n i t r a t e i n a c o n c e n t r a t i o n o f 2mM r e d u c e d t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f a p a r t i a l l y p u r i f i e d p r e p a r a t i o n o f ChAc t o o n l y 92% o f t h e c o n t r o l v a l u e . KASA e t a l , ( 1 9 7 2 ) s t a t e d m e r e l y t h a t o v e r 60% o f t h e c o n t r o l a c t i v i t y was o b t a i n e d i n t h e p r e s e n c e o f 0.1 mM l e a d n i t r a t e s o l u t i o n . I n t h e . p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n t h e ' s t r o n g e r c o n c e n t r a t i o n was u s e d ' b e c a u s e i t o f f e r e d t h e a d V a n t a g e ' o f a p p r o x i m a t i n g t h e c o n d i t i o n s f o r f i r s t o r d e r k i n e t i c s and t h e r e f o r e i n c r e a s e d t h e p r o b a b i l i t y of- a c c u r a t e l o c a l i z a t i o n . A n o t h e r s o u r c e o f h i s t o c h e m i c a l m i s i n t e r p r e t a t i o n c a n be c a u s e d b y n o n - s p e c i f i c a d s o r p t i o n o f t h e c a p t u r e a g e n t t o t h e t i s s u e (ADAMS, 1965). T h i s o c c u r s t o a m i n i m a l e x t e n t and i s p a r t l y r e s p o n s i b l e f o r b a c k g r o u n d s t a i n i n g i n t h e p r e s e n t c a s e , b u t g e n e r a l l y i s n o t t h e c a u s e f o r f a l s e l o c a l i z a t i o n o f ChAc e s p e c i a l l y i f t h e i n t r a c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f a c t i v i t y i s n o t o f c o n c e r n . I n summary, i t c a n be s e e n t h a t i t i s i m p o r t a n t t o h a v e a h i g h c o n c e n t r a i t o n o f s u b s t r a t e a n d o f c a p t u r e r e a g e n t s o t h a t t h e enzyme s y s t e m w i l l be s a t u r a t e d and a t any g i v e n t i m e t h e r e w i l l be a m i n i m a l amount o f i n i t i a l r e a c t i o n p r o d u c t and a m a x i m a l c o n c e n t r a t i o n o f f i n a l r e a c t i o n p r o d u c t . I V . The Enzyme-ChAc I t i s o f p a r a m o u n t i m p o r t a n c e i n a b i o c h e m i c a l s y s t e m : t o a p p r o x i m a t e p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s a s c l o s e l y as p o s s i b l e when c h a r a c t e r i z i n g an enzyme. I n a h i s t o c h e m i c a l p r e p a r a t i o n h o w e v e r optimum a c t i v i t y i s o f t e n s a c r i f i c e d i n o r d e r t o f a c i l i t a t e l o c a l i z a t i o n . The ChAc s y s t e m i s no e x c e p t i o n . O p t i m a l c o n d i t i o n s f o r ChAc a r e t h e f o l l o w i n g : pH 7.5, i n a p h o s p h a t e b u f f e r e d s o l u t i o n , i n t h e a b s e n c e o f h e a v y m e t a l i o n s . H o w e v e r , a pH o f 6.0 was u s e d ((KASA e t a l . , 1972) b e c a u s e t h i s r e d u c e s n o n - s p e c i f i c s t a i n i n g and i s a l s o more a d v a n t a g e o u s i n t e r m s o f t h e c a p t u r e r e a c t i o n as a l r e a d y m e n t i o n e d (BURT, 19 70) P h o s p h a t e B u f f e r i s n o t s u i t a b l e b e c a u s e l e a d i n t e r a c t s w i t h p h o s p h a t e and s o o r g a n i c b u f f e r s a r e u s e d , c a c o d y l a t e by HEBB e t a l . (1970) and HEPES b y BURT ( 1 9 7 0 ) . I n c r e a s i n g p r o p o r t i o n o f d i s p l a c e m e n t o f t h e enzyme f r o m i t s b i n d i n g s i t e s w i t h i n c r e a s i n g s a l t c o n c e n t r a t i o n s h a s b e e n shown by FONNUM (1967) and t h e r e f o r e a h y p o t o n i c i n c u b a t i o n medium i s u s e d . The g r e a t e r t h e s o l u b i l i t y o f t h e enzyme t h e l e s s p r e c i s e t h e l o c a l i z a t i o n s o a g a i n b i o c h e m i c a l o p t i m a a r e s a c r i f i c e d f o r h i s t o c h e m i c a l o p t i m a . The i n h i b i t i o n o f ChAc b y h e a v y m e t a l s a l t s h a s b e e n d i s c u s s e d i n t e r m s o f t h e c a p t u r e r e a g e n t s . P r o o f t h a t t h e enzyme s t u d i e d i n t h e h i s t o c h e m i c a l s y s t e m i s t h e same as t h a t s t u d i e d i n t h e b i o c h e m i c a l s y s t e m d e p e n d s on i t s c h a r a c t e r i z a t i o n . I n t h i s c a s e t h e two m a i n l i n e s o f e v i d e n c e t h a t s u p p o r t t h e s p e c i f i c i t y o f t h e enzyme a r e i t s d e p e n d e n c e on c h o l i n e ( a l r e a d y m e n t i o n e d ) , a n d i t s r e s p o n s e t o i n h i b i t o r s . KASA e t a l . (1972) h a s s t u d i e d t h e e f f e c t s o f t h r e e i n h i b i t o r s o n ChAc a c t i v i t y i n h o m o g e n a t e s o f n e r v o u s t i s s u e as w e l l as on h i s t o c h e m i c a l s e c t i o n s . C M - o r o a c e t y l c h o l i n e was f o u n d t o i n h i b i t ACh s y n t h e s i s t o 80% t h a t o f c o n t r o l i n t h e h o m o g e n a t e s , and i n t h e h i s t o c h e m i c a l s y s t e m c h l o r o a c e t y l c h o l i n e e l i m i n a t e d t h e a p p e a r a n c e o f e n d p r o d u c t o b t a i n e d i n DFP t r e a t e d r a t s p i n a l c o r d . I m m o b i l i z a t i o n o f t h e enzyme t o p r e v e n t d i f f u s i o n and f a l s e l o c a l i z a t i o n i s d e s i r a b l e . The u s u a l m e t h o d o f f o r m a l i n f i x a t i o n h o w e v e r was f o u n d t o r e d u c e t h e amount o f h i s t o c h e m i c a l end p r o d u c t i n t h i s i n v e s t i g a t i o n , and o t h e r s h a v e r e p o r t e d . t h a t t h e enzyme, a c t i v i t y i s c o n s i d e r a b l y r e d u c e d KASA e t a l . ( 1 9 7 0 b ) . T h e r e f o r e , f o r m a l i n f i x a t i o n was n o t e m p l o y e d and s l i g h t d i f f u s i o n was a c c e p t e d a s a s o u r c e o f e r r o r . I n t h e AChE s y s t e m s n u c l e a r s t a i n i n g i s c o n s i d e r e d t o be e v i d e n c e o f d i f f u s e s t a i n i n g s i n c e AChE i s n o t f o u n d on t h e n u c l e a r membrane (KOELLE, 1 9 5 1 ) . I n t h e ChAc s y s t e m n u c l e a r s t a i n i n g h a s n o t b e e n e v a l u a t e d . The i n t r a c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f ChAc i n d i c a t e s t h a t i t i s b o u n d t o tke e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m (FONNUM, 1967) r a t h e r t h a n . t o t h e n u c l e a r membrane, t h e r e f o r e t h e n u c l e a r s t a i n i n g s o m e t i m e s o b s e r v e d may be an i n d i c a t i o n o f d i f f u s i o n b u t t h i s h a s n o t b e e n p r o v e n . The p o s t - m o r t e m t i s s u e p r e p a r a t i o n may a l s o c o n c e i v a b l y a f f e c t enzyme c h a r a c t e r i s t i c s and l o c a l i z a t i o n . F r e s h f r o z e n s e c t i o n s w e r e e m p l o y e d i n o r d e r t o r e d u c e h a n d l i n g o f t i s s u e t o a minimum. T h e r e i s no i m m e d i a t e p o s t - m o r t e m l o s s o f a c t i v i t y i n t h e n e r v o u s t i s s u e (HEBB, 1957) and G r e e n e t a l . (1970) showed t h a t t h e r e was no a p p a r e n t d e c r e a s e i n ChAc a c t i v i t y w i t h r e p e a t e d f r e e z i n g and t h a w i n g o f t h e t i s s u e . The m o s t r i g o r o u s c r i t e r i a f o r t h e h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f enzyme a r e t h e f o l l o w i n g , a c c o r d i n g t o G l e n n e r ( 1 9 6 5 ) : ( i ) a s u b s t r a t e i s s p e c i f i c f o r a s p e c i f i c e n z y m e ^ g r o u p o f e n z y m e s . ( i i ) a h i s t o c h e m i c a l s u b s t r a t e i d e n t i f i e s t h e same a c t i v i t i e s a s i t s n a t u r a l l y o c c u r r i n g a n a l o g u e . ( i i i ) a n a t u r a l l y - i n s o l u b l e ( u n d e n a t u r e d ) enzyme h a s a s o l u b l e c o m p o n e n t and v i c e - v e r s a . ( i v ) t h e r e a g e n t s a d d e d t o t h e h i s t o c h e m i c a l i n c u b a t i n g medium h a v e no e f f e c t on t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f e n z y m i c - L l -a c t i v i t y d e m o n s t r a t e d . (v) t h e s t e p s o f h i s t o c h e m i c a l t i s s u e p r e p a r a t i o n h a v e no e f f e c t o n t h e l o c a l i z a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f enzyme a c t i v i t y . ( v i ) a b s e n c e o f e n z y m i c a c t i v i t y t o w a r d a s u b s t r a t e i n a t i s s u e i n d i c a t e s t h e a b s e n c e e i t h e r i n v i v o o r i n v i t r o o f an enzyme c a p a b l e o f h y d r o l y z i n g t h e s u b s t r a t e a t t h a t s i t e . I t c a n be c o n c l u d e d f r o m t h e p r e c e d i n g d i s c u s s i o n t h a t a s s u m p t i o n s ( i ) , ( i i ) and ( i i i ) h a v e b e e n p r o v e n a n d t h a t t h e l i m i t a t i o n s o f t h e s y s t e m w i t h r e s p e c t t o ( i v ) , (v) a n d ( v i ) h a v e b e e n d e s c r i b e d . B. The C e r e b e l l o - t h a l a m i c P a t h w a y P h a r m a c o l o g i c a l i n v e s t i g a t i o n s s u g g e s t t h a t t h e c e r e b e l l o -t h a l a m i c p a t h w a y may be i n p a r t c h o l i n e r g i c . MARSHALL (1971) o b s e r v e d t h a t t h e s h o r t l a t e n c y BC e v o k e d s p i k e a n d f i e l d r e s p o n s e i n t h e n u c l e u s v e n t r a l i s l a t e r a l i s o f t h e t h a l a m u s c a n be a b o l i s h e d o r r e d u c e d b y a t r o p i n e a d m i n i s t e r e d i n t r a v e n o u s l y b u t n o t i o n t o p h o r e t i c a l l y . P r e v i o u s i n v e s t i g a t i o n s ( F R I G Y E S I e t a l . , 1966) a l s o showed t h a t t h e BC e v o k e d f i e l d r e s p o n s e was m a r k e d l y a f f e c t e d b y t h e i n t r a c a r o t i d a d m i n i s t r a t i o n o f ACh o r a t r o p i n e . I n a d d i t i o n McCANCE e t a l . , (1968 a & b) n o t e d an a u g m e n t a t i o n o f t h e BC e v o k e d f i e l d r e s p o n s e b y i o n t o p h o r e t i c a p p l i c a t i o n o f ACh. I d e n t i f i c a t i o n o f a s y s t e m a s c h o l i n e r g i c h o w e v e r i s n o t c o n c l u s i v e s o l e l y on t h e b a s i s o f ' i d e n t i t y o f a c t i o n ' o r ' p h a r m a c o l o g i c a l i d e n t i t y ' a l t h o u g h t h e s e a r e s t r e s s e d b y WERMAN (1966) a s b e i n g t h e m o s t i m p o r t a n t c r i t e r i a f o r t h e e s t a b l i s h m e n t o f t r a n s m i t t e r f u n c t i o n . O t h e r c r i t e r i a a s l i s t e d b y McLENNAN (1963,1970) i n c l u d e t h e f o l l o w i n g : (1) t h e s u b s t a n c e m u s t be p r e s e n t i n n e u r o n e s f r o m w h i c h i t i s r e l e a s e d . (2) t h e n e u r o n e m u s t p o s s e s s t h e n e c e s s a r y e n z y m i c m e c h a n i s m s f o r m a n u f a c t u r e o f t r a n s m i t t e r . (3) T h e r e m u s t be a s y s t e m f o r i n a c t i v a t i o n o f t h e l i b e r a t e d t r a n s m i t t e r w h i c h may o r may n o t be e n z y m i c (4) d u r i n g s t i m u l a t i o n i t may be p o s s i b l e ^ t o c o l l e c t t h e p r o p o s e d ; t r a n s m i t t e r s u b s t a n c e i n t h e r e g i o n o f t e r m i n a t i o n o f s y n a p s e s . The m a i n t h r u s t o f t h i s i n v e s t i g a t i o n was s u b s t a n t i a t i o n o f t h e s e c o n d c r i t e r i o n i . e . p r e s e n c e o f t h e s y n t h e s i z i n g enzyme. The two enzymes t h a t a r e ' k e y t o a c h o l i n e r g i c s y s t e m a r e t h e s y n t h e s i z i n g enzyme ChAc and t h e i n a c t i v a t i n g enzyme AChE. B o t h o f t h e s e h a v e b e e n m e a s u r e d b i o c h e m i c a l l y b u t u n t i l 1970 t h e r e was no h i s t o c h e m i c a l m e t h o d a v a i l a b l e f o r t h e d e m o n s t r a t i o n o f ChAc as t h e r e was f o r AChE (KOELLE, e t a a l . 1 9 4 9 ) . S t u d i e s d o ne on t h e d i s t r i b u t i o n o f b o t h t h e s e enzymes i n v a r i o u s a n i m a l s ( i n t h e d o g , FELDBERG e t a l . , 1948; BURGEN e t a l . , 1 9 5 1 ; i n t h e r a t , KOELLE, 1954*, SHUTE e t a l . ; 1963,' F R I E D E . e t a a l . , 1964) s u g g e s t s t h a t t h e i r a c t i v i t i e s a r e f a i r l y c l o s e l y c o r r e l a t e d i n m o s t a r e a s o f t h e b r a i n w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e c e r e b e l l u m ( c e r e b e l l a r c o r t e x i n p a r t i c u l a r ) . I n t h e c e r e b e l l u m t h e r e a p p e a r t o be h i g h q u a n t i t i e s o f AChE p r e s e n t w i t h l i t t l e o r no ChAc a c c o m p a n y i n g i t (GOLDBERG, 1967 F i g . 26 & 2 7 ) . I n a d d i t i o n t h e r e i s c o n s i d e r a b l e v a r i a t i o n o f AChE a c t i v i t y b e t w e e n c e r e b e l l a r f o l i a a n d b e t w e e n s p e c i e s . I n a c o m p a r a t i v e s t u d y o f t h e g u i n e a p i g , r a t , p i g e o n a n d c a t (FRIEDE e t a l . , 1 9 6 4 ) , c o n s i d e r a b l e v a r i a t i o n i n t h e a p p e a r a n c e o f t h e c e r e b e l l a r c o r t e x s t a i n e d f o r AChE a l t h o u g h s t a i n i n g o f t h e l a t e r a l n u c l e u s a p p e a r e d t o be u n i f o r m . T h e s e d i s c r e p a n c i e s i n a c t i v i t y o f AChE, p l u s t h e f a c t t h a t AChE c a n be f o u n d i n n o n -n e r v o u s s t r u c t u r e s s u c h as e r y t h r o c y t e s i n t h e a b s e n c e o f ACh o r C h A c , i n d i c a t e s t h a t t h e p r e s e n c e o f AChE a l o n e c a n n o t be t a k e n a s c o n c l u s i v e e v i d e n c e o f a c h o l i n e r g i c s y s t e m . The' p r e s e n c e o f ChAc h o w e v e r i s c o n s i d e r e d t o be more r e l i a b l e as i n d i c a t i v e o f a c h o l i n e r g i c s y s t e m (HEBB, 1957, 1 9 6 1 ; P H I L L I S , 1 9 6 5 b ) . b e c a u s e T A B L E I Act i v i t y * of Choline Acetyltransferase in the Cerebellum Rat Pigeon Guinea-pig R a b b i t + Cat Molecular 0. 98±0 27 1. 55±0.30 0. 62±0.15 <0. 1 0. 71±0.19 layer (8) (9) (11) (8) (6) Granular 1. 92±0 37 1. 36±0.19 1. 60±0.22 1.52±0. 14 1. 23±0.18 layer (5) (9) (13) (8) (6) White 2 75±0 48 1 38±0.22 2. 60±0.08 1.23±0. 10 0. 44±0.10 (.4) (8) (5) (7) (4) Nuclei 6. 90±0 51 10 5±1. 5 10. 6±1. 5 3 78±1.08 (6) (7) (5) (4) FIGURE 26. ChAc i n t h e c e r e b e l l u m ( f r o m G o l d b e r g , 1967) * t h e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s u m o l e s o f a c e t y l -c h o l i n e s y n t h e s i z e d / g d r y w e i g h t / h r . E a c h v a l u e r e p r e s e n t s t h e ± s t a n d a r d e r r o r (number o f s e c t i o n s ) + f r o m d a t a o f McCaman & Hun t ( 1 9 6 5 ) . -LI-T A B L E n A c t i v i t y * of Cholinesterase in the Cerebellum Rat Pigeon Guinea-pig Rabbit Cat Molecular layer Granular layer White Nuclei 1000±123 (4) 1472±89 (5) 1620±223 (4) 152 5±232 (5) 4293±316 (6) 2399±190 (8) 775±132 (7) 610±58 (4) 3757±285 (7) 2390±131 (6) 1192±69 (7) 1354±189 (5) 2087±216 (6) 3702±643 (6) 1270±126 (5) 2330±288 (7) 3694±282 (5) 1193±211 (6) 1790±276 (9) FIGURE 27. AChE i n t h e c e r e b e l l u m ( f r o m G o l d b e r g ] 1 9 6 7 ) . * The a c t i v i t y e x p r e s s e d a s y m o l e s o f a c e t y l c h o l i n e h y d r o l y z e d / g d r y w e i g h t 1 h r . E a c h " v a l u e r e p r e s e n t s t h e ± s t a n d a r d e r r o r (number o f s e c t i o n s ) . i t s ' a c t i v i t y i s a l w a y s p a r a l l e l e d b y t h e p r e s e n c e o f ACh and AChE. I t i s d e s i r a b l e t h e n t o d e m o n s t r a t e t h e p r e s e n c e o f ChAc i n c o n j u n c t i o n w i t h t h a t o f AChE b e f o r e a p a r t i c u l a r n e r v o u s p a t h w a y i s c o n s i d e r e d t o be c h o l i n e r g i c . The c o n c e n t r a t i o n o f AChE i n t h e c e r e b e l l a r n u c l e i a n d p e d u n c l e s i n t h e c a t ( S N E L L , 1 9 6 1 ; P H I L L I S , 1 9 6 5 a , 1968) and t h e r a t (S P E R T I , 1959 a ,&,~b; KOELLE, 1954) a p p e a r s t o be h e a v i e s t i n t h e l a t e r a l n u c l e i , a n d t h e m i d d l e p e d u n c l e ( c o n t a i n i n g a f f e r e n t - f i b r e s ) shows a l m o s t t h e same amount o f a c t i v i t y a s t h e s u p e r i o r p e d u n c l e ( c o n t a i n i n g t h e B C ) . A s u g g e s t i o n h a s b e e n made (ARVY,1966; ODUTOLA.1970) t h a t t h e a c t i v i t y f o u n d i n t h e m i d d l e p e d u n c l e o f t h e r a t i s r e l a t e d t o a c h o l i n e r g i c c e r e b e l l a r i n p u t f r o m t h e a u d i o - v i s u a l c e n t r e s . The a c t i v i t y i n t h e s u p e r i o r c e r e b e l l a r p e d u n c l e o n t h e o t h e r h a n d h a s b e e n a t t r i b u t e d t o a c h o l i n e r g i c c o m p o nent o f t h e B.C. ( P H I L L I S , 1 9 6 5 a ) . T h i s i s s u p p o r t e d b y t h e o b s e r v a t i o n i n t h e c a t ( P H I L L I S , 1 9 6 8 ) t h a t some n e u r o n e s i n t h e l a t e r a l p o r t i o n o f t h e i n t e r p o s i t u s n u c l e u s a n d i n t h e l a t e r a l n u c l e u s o f t h e c e r e b e l l u m t h a t s t a i n i n t r a c e l l u l a r l y f o r AChE, a r e t h e same c e l l s t h a t e v i d e n c e r e t r o g r a d e d e g e n e r a t i o n a nd a c c u m u l a t i o n o f AChE on s e c t i o n o f t h e p e d u n c l e . I t was c o n f i r m e d i n t h i s s t u d y t h a t c e l l s f o u n d i n t h e l a t e r a l n u c l e u s a nd on t h e b o r d e r o f t h e i n t e r p o s i t u s s t a i n e d f o r b o t h AChE and ChAc. BURT (1970) a l s o n o t e d ChAc a c t i v i t y i n t h e d e e p c e r e b e l l a r n u c l e i o f t h e r a t b u t d i d n o t s p e c i f y w h i c h n u c l e i c o n t a i n e d i t . On c l o s e r e x a m i n a t i o n i t was a l s o o b s e r v e d i n t h U s t u d y t h a t t h e c e l l s s t a i n i n g f o r AChE and ChAc w e r e p r e d o m i n a n t l y s m a l l (10-15y) a nd m i d d l e ( 20-25y) s i z e d c e l l s . I n t h e c a t and monkey (EAGER;1968; C O U R V I L L E . e t a l . , 1970) s c a t t e r e d s m a l l c e l l s w e r e f o u n d t h r o u g h o u t a l l c e r e b e l l a r n u c l e i and t h e s u g g e s t i o n was made t h a t t h e y p o s s e s s s h o r t a x o n s and may n o t c o n t r i b u t e t o e f f e r e n t p r o j e c t i o n s y s t e m s . T h i s was c o n f i r m e d by M a t s u s h i t a e t a l . (1971) i n t h e c a t and r a t . H o w e v e r , t h e s e s m a l l c e l l s w e r e c o n s i s t e n t l y d e s c r i b e d as b e i n g i n c l o s e j u x -t a p o s i t i o n t o l a r g e c e l l s , a n d no m e n t i o n was made o f t h e e x c l u s i v e l y s m a l l c e l l e d p o r t i o n o f t h e l a t e r a l n u c l e u s w h i c h p r o b a b l y d o e s p r o j e c t s v i a t h e BC (VOOGD 1 9 6 4 ) . I t i s s u g g e s t e d t h a t t h e s m a l l c e l l s f o u n d i n t h e p r e s e n t s t u d y b e l o n g t o t h e g r o u p t h a t j o i n s t h e e f f e r e n t p r o j e c t i o n s y s t e m . H a v i n g i n d i c a t e d t h a t t h e r e may b e a c h o l i n e r g i c s y s t e m o r i g i n -a t i n g i n t h e c e r e b e l l a r n u c l e i t h e c o u r s e a n d t e r m i n a t i o n o f t h e f i b r e s r e m a i n s t o be r e s o l v e d . S t u d y o f c h o l i n e r g i c m e c h a n i s m s i n t h e t h a l a m u s o f t h e c a t show t h a t a h i g h p r o p o r t i o n (87%) o f t h a l a m i c n e u r o n e s r e s p o n d t o A c h and t h a t t h e l i m i t s o f t h e n u c l e u s v e n t r a l i s o r a l i s p o s t e r i o r o f HASSLER (1959) a r e s h a r p l y d e f i n e d b y t h e o n s e t a n d d i s a p p e a r a n c e o f m a r k e d ACh s e n s i t i v i t y o f t h e c e l l s (McLENNAN e t a l . , 1 9 6 8 ) . B i o c h e m i c a l and h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s o f AChE and ChAc (KOELLE, 1954"; FELDBERG, 1948; BURGEN and CHIPMAN,1951, FRIEDE,1966) show t h a t t h e i r d i s t r i b u t i o n i n t h e t h a l a m i c n u c l e i i s o f medium i n t e n s i t y . The d i s t r i b u t i o n o f enzymes- a s a l s o c o r r o b o r a t e d b y t h i s s t u d y w o u l d i n d i c a t e t h a t t h e c h o l i n e r g i c p o r t i o n o f t h e f i b r e s y s t e m a f f e r e n t - t o t h e t h a l a m u s i s n o t s t r o n g . The o t h e r p o s s i b l e t e r m i n a t i o n s i t e o f t h e c h o l i n e r g i c p o r t i o n o f BC i s t h e r e d n u c l e u s . E v i d e n c e h a s b e e n f o u n d t h a t b o t h l a r g e a n d s m a l l c e l l s i n t h e r e d n u c l e u s s t a i n i n t e n s e l y f o r AChE (WALDRON e t a l . , 1969) McLENNAN,1969). A n a t o m i c a l s t u d i e s c o n f i r m a s t r o n g c e r e b e l l o - r u b r a l p r o j e c t i o n (COURVILLE, 1966; VOOGD,1964) f r o m n u c l e u s i n t e r p o s i t u s t o m a g n o c e l l u l a r r e d n u c l e u s a n d f r o m l a t e r a l n u c l e u s t o p a r v o c e l l u l a r RN. Some c e l l s i n t h e r e d n u c l e u s h a v e a l s o b e e n f o u n d t o be e x c i t e d b y ACh (McLENNAN,1970). P o s s i b l e f u t u r e i n v e s t i g a t i o n s t o s u b s t a n t i a t e f u r t h e r t h e p r e s e n c e o f a c h o l i n e r g i c c o m p o nent i n BC c o u l d c o n s i s t o f t h e f o l l o w i n g : (1) E x t e n d t h e i n v e s t i g a t i o n o f t h e h i s t o c h e m i c a l d i s t r i -b u t i o n o f ChAc i n t h e d e e p c e r e b e l l a r n u c l e i t o o t h e r a n i m a l s s u c h as t h e c a t and monkey. (2) N o t e t h e e f f e c t o f t r a n s e c t i o n o f t h e p e d u n c l e on t h e d i s t r i b u t i o n o f ChAc i n t h e c e r e b e l l a r n u c l e i . T r a n s e c t i o n c a u d a l a n d r o s t r a l t o r e d n u c l e u s c o u l d g i v e an i n d i c a t i o n o f t h e p r o p o r t i o n o f c h o l i n e r g i c n e u r o n e s t h a t p r o j e c t t o t h e t h a l a m u s . -71-C. Summary and C o n c l u s i o n s (1) The method d e v e l o p e d f o r h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f ChAc b y BURT (1970) and HEBB e t a l . (1970) i s s p e c i f i c a n d c a n be u s e d a s a n i n d i c a t i o n o f t h e p r e s e n c e o f ChAc i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m . I N THE RAT: (2) ChAc d i s t r i b u t i o n p a r a l l e l s AChE d i s t r i b u t i o n i n t h e d e e p c e r e b e l l a r n u c l e i . (3) Medium and s m a l l s i z e d ChAc s t a i n i n g c e l l s w e r e f o u n d m o s t a b u n d a n t l y i n t h e v e n t r a l " p o r t i o n o f t h e l a t e r a l n u c l e u s and l a t e r a l p o r t i o n o f i n t e r p o s i t u s . T h e r e w e r e a l s o a f e w c e l l s s c a t t e r e d t h r o u g h o u t t h e n u c l e u s i n t e r p o s i t u s . (4) The c a u d a l p a r t o f t h e m e d i a l n u c l e u s c o n t a i n e d a g r o u p o f s m a l l c e l l s t h a t s t a i n e d d a r k l y f o r ChAc. (5) The c e l l s o f a l l t h r e e n u c l e i h a v e b e e n shown t o t e r m i n a t e i n t h e VL o f t h e t h a l a m u s v i a t h e b r a c h i u m c o n j u n c t i v u m . (6) The r e s u l t s o b t a i n e d a r e c o n s i s t e n t w i t h o t h e r s t u d i e s i n d i c a t i n g t h a t a p o r t i o n o f t h e c e r e b e l l o - t h a l a m i c p a t h w a y i s c h o l i n e r g i c . - > 2 -BIBLIOGRAPHY Adams, C.W.M. (1965) H i s t o c h e m i s t r y o f t h e c e l l s i n t h e n e r v o u s s y s t e m , p.253 i n : N e u r o c h e m i s t r y e d . by C.W.M. Adams. E l s e v i e r P u b l . Co. New Y o r k , p p . 7 5 3 . A l l e n , W.F. (1924) D i s t r i b u t i o n o f f i b r e s o r i g i n a t i n g f r o m t h e d i f f e r e n t b a s a l c e r e b e l l a r n u c l e i . J . Comp. 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(1970) The t o p o g r a p h i c a l l o c a l i z a t i o n o f a c e t y l -c h o l i n e s t e r a s e i n t h e a d u l t r a t c e r e b e l l u m : A r e - a p p r a i s a l . H i s t b c h e m i e .23., 9 8 - 1 0 6 . P h i l l i s , J.W. (1965a) C h o l i n e s t e r a s e i n t h e c a t c e r e b e l l a r c o r t e x , d e e p n u c l e i a n d p e d u n c l e s . E x p e r i e n t i a 2 1 , 266 - 2 6 8 . P h i l l i s , J.W. (1965b) C h o l i n e r g i c m e c h a n i s m s i n t h e c e r e b e l l u m . B r i t . Med. B u l l . 2 1 , 2 6 - 2 8 . P h i l l i s , J.W. (1968) A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e i n t h e f e l i n e c e r e b e l l u m . J . Neur o c h e m . 1 5 , 6 9 1 - 6 9 8 . P o m p e i a n o , 0. (1967) F u n c t i o n a l o r g a n i z a t i o n o f t h e c e r e b e l l a r p r o j e c t i o n s t o t h e s p i n a l c o r d . P r o g r e s s i n B r a i n R e s . 25, 282-321 e d . by C A . F o x a n d R.S. S n i d e r . E l s e v i e r P u b l i s h i n g Co., New Y o r k . P o m p e i a n o , 0.; A. B r o d a l (1957) E x p e r i m e n t a l d e m o n s t r a t i o n o f a s o m a t o t o p i c a l o r i g i n o f r u b r o s p i n a l f i b r e s i n t h e c a t . J . Comp. N e u r o l . 1 0 8 , 2 2 5 - 2 5 2 . R a n d , R.W. (1954) A n a t o m i c a l a n d e x p e r i m e n t a l s t u d y o f t h e c e r e b e l l a r n u c l e i a n d t h e i r e f f e r e n t p a t h w a y s i n t h e monkey. J . Comp.. N e u r o l . 1 0 1 , 167-224 . S h u t e , C C D . ; P.R. L e w i s (1963) C h o l i n e s t e r a s e c o n t a i n i n g s y s t e m s o f t h e b r a i n o f t h e r a t . N a t u r e 1 9 9 , 1160-1164 S n e l l , R.S. (1961) The h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f c h o l i n e s t e r -a s e i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m . B i b l . A n a t . 2_, 5 0 - 5 8 . S p e r t i , L.; S. S p e r t i (1959a) E f f e c t s o£chronic l e s i o n s o f t h e c e r e b e l l a r p e d u n c l e s on c e r e b e l l u m c h o l i n e s t e r a s e a c t i v i t y i n t h e a l b i n o r a t . E x p e r i e n t i a 15_, 4 4 1 - 4 4 2 . S p e r t i , L.; S. S p e r t i (1959b) E f f e c t s o f m i d l i n e c e r e b e l l a r s p l i t t i n g a n d o f l e s i o n s i n c e r e b r a l c o r t e x on c e r e b e l l u m c h o l i n e s t e r a s e a c t i v i t y , i n t h e a l b i n o r a t . E x p e r i e n t i a 15_, 442. Toyama, K.; N. T s u k a h a r a , K. K o s a k a , K. M a t s u n a m i (1970) S y n a p t i c e x c i t a t i o n o f r e d n u c l e u s n e u r o n e s by f i b r e s f r o m i n t e r p o s i t u s n u c l e u s . E x p t l . B r a i n R e s . 11^, 187 - 1 9 8 . V e r h a a r t , W.J.C..(1970) ' C o m p a r a t i v e A n a t o m i c a l A s p e c t s o f Mammalian B r a i n Stem a n d S p i n a l C o r d ' . V o l I I . I l l u s t r a t i o n s a n d T a b l e s . P r o e f s c h r . V a n Gorcum a n d Co. N.V., A s s e n . V o o g d , J . (1964) 'The C e r e b e l l u m o f t h e C a t . S t r u c t u r e a n d F i b e r C o n n e c t i o n s ' T h e s i s . P r o e f s c h r . V a n Gorcum a n d Co. N.V., A s s e n . V o o g d , J . (196 7) C o m p a r a t i v e a s p e c t s o f t h e s t r u c t u r e a n d f i b e r c o n n e c t i o n s o f t h e mammalian c e r e b e l l u m i n : P r o g r e s s i n B r a i n Res..25_, 9 4 - 1 3 4 f e d . by C A . F o x a n d R.S. S n i d e r . E l s e v i e r P u b l i s h i n g C o ., New Y o r k . W a l d r o n , H.A.; D.G. Gwyn (1969) A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e a c t i v i t y i n t h e r e d n u c l e u s o f t h e r a t a n d i t s r e s p o n s e t o ax o t o m y . B r a i n R e s . 1_3, 146-154. W e i d e n r e i c h , F. (1899) Z u r A n a t o m i e d e r z e n t r a l e n K l e i n h i r n -k e r n e d e r S a u g e r . Z t s c h r . M o r p h o l . u . A n t h r o p o l . 1_, 25 9 - 3 1 2 . ( q u o t e d b y V o o g d , 1 9 6 4 ) . Werman, R. (1966) A r e v i e w - c r i t e r i a f o r i d e n t i f i c a t i o n o f a c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m t r a n s m i t t e r . Comp. B i o c h e m . and P h y s i o l . 1 8 , 7 4 5 - 7 6 6 . Y o s h i d a , . M . ; K. Y a j i m a , M. Uno (1966) D i f f e r e n t a c t i v a t i o n o f t h e two t y p e s o f t h e p y r a m i d a l t r a c t n e u r o n e s t h r o u g h t h e c e r e b e l l o - t h a l a m o c o r t i c a l p a t h w a y . E x p e r i e n t i a 22 ,331-33 APPENDIX I C h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e S t o c k S o l u t i o n s 1. 25 mM HEPES pH 7.0 10% s u c r o s e 2. 25 mM HEPES pH 6.0 m.w. 238.3 238.3 s o l u t e 1.4893 g 10 g 1.4893 g or 2.9786 g s o l v e n t " 250 m i s H 2 0 250 m i s H 2 0 500 m i s H 2 0 3. 10 mM C h o l i n e C h l o r i d e 139.63 139.63 mg 100 m i s o f 25 mM 4 . 4.5 mM L e a d N i t r a t e 5. c a . 0.054M DFP HEPES pH 6.0 331.20 149.04 mg 100 m i s H 2 0 184.1 1 g 10 m i s i s o p e n t a n e + 90 m i s H 2 0 I I . Optimum I n c u b a t i o n Medium 1. C o n t r o l Amount 10 m i s 50 y l 59.57mg 'make up t o 10 m i s ' S o l u t i o n 25 mM HEPES pH 6.0 DFP d r y HEPES 15 m i s w i t h 25 mM HEPES pH6.0 4.5mM, L e a d N i t r a t e F i n a l C o n c e n t r a t i o n s 25 mM HEPES pH 610 10 - if M DFP 1.8 mM P b ( N O 3 ) 2 2. T e s t 10 m i s 50 u l . 59.57 mg make up t o 10 m i s 4mM C h o l i n e C h l o r i d e - h DFP 10 mM C h o l i n e C h l o r i d e DFP 10 d r y HEPES 15 m i s w i t h 25 mM HEPES 25 mM HEPES pH 6.0 pH 6.0 4.5 mM L e a d N i t r a t e 1.8 mM P b ( N 0 3 ) 2 4.405 mg A c e t y l - C o A 0.2 mM A c e t y l CoA A p p e n d i x I c o n t i n u e d 3. I n h i b i t o r a d d 0 . 6 2 mg CuSOi* t o T e s t b a t c h I X 10 ^M CuSCK I I I . N a 2 S s o l u t i o n 2.5 c c s a t u r a t e d 2 0 % a q u e o u s s o d i u m s u l p h i d e 0 . 5 6 c c g l a c i a l a c e t i c a c i d 9 7 . 0 0 c c d i s t i l l e d w a t e r pH b e t w e e n 6 . 8 - 7 . 5 d e t e r m i n e d b y a d j u s t i n g t h e amount o f a c e t i c a c i d a d d e d . I V . K a i s e r g l y c e r o l j e l l y . ( R e f r . i n d e x 1.47) G e l a t i n 10 g D i s t i l l e d W a t e r 60 m l G l y c e r i n 70 m l P h e n o l 0 . 2 5 g V. DFP 1 g o f DFP was d i s s o l v e d i n 1 0 m l o f i s o p e n t a n e a n d t h e n d i l u t e d t o 1 0 0 m l w i t h d i s t i l l e d w a t e r . T h e n 50 u l o f t h i s s o l u t i o n p l a c e d i n 25 m i s o f i n c u b a t i o n medium r e s u l t s i n a c o n c e n t r a t i o n o f c a . 10~k M . 1.0 N NaOH i s - k e p t o n h a n d t o i n a c t i v a t e any DFP s p i l l e d i n t h e p r o c e s s . T h i s p r o c e d u r e m u s t be done i n t h e fume h o o d . - S 2 -APPENDIX I I A c e t y l c h o l i n e s t e r a s e 1. F i x e d f r o z e n s e c t i o n s , p r e p a r e d as d e s c r i b e d i n t h e t e x t u n d e r m e t h o d s , w e r e f r e e f l o a t e d i n t h e i n c u b a t i o n medium f o r 2\ h o u r s . I n c u b a t i o n medium as f o l l o w s : 5 mg a c e t y l t h i o c h o l i n e i o d i d e ( f r o m N u t r i t i o n a l B i o c h e m i c a l s ) d i s s o l v e d i n 6.5 m l o f 0.1 M s o d i u m a c e t a t e b u f f e r a t pH 5.5 The f o l l o w i n g a r e t h e n a d d e d i n o r d e r w i t h s t i r r i n g b e t w e e n e a c h a d d i t i o n : 0.5 m l o f 0.2 M s o d i u m c i t r a t e ' 1 m l o f 30 mM CuSO^ 1 m l w a t e r 1 m l o f 5 mM p o t a s s i u m f e r r i c y a n i d e S t o c k s o l u t i o n s k e e p i n t h e c o l d f o r s e v e r a l w e e k s . The f i n a l i n c u b a t i o n medium i s c l e a r , g r e e n i s h i n c o l o u r and i s s t a b l e f o r h o u r s . I f an i n h i b i t o r i s u s e d i t i s a d d e d i n p l a c e o f t h e 1 m l o f w a t e r . 2. F l o a t & wash i n d i s t i l l e d w a t e r . 3. F l o a t & wash i n 0.5% g e l a t i n 40% a l c o h o l s o l u t i o n . 4. M ount on s l i d e . B l o t w i t h f i l t e r p a p e r s o a k e d i n 7.0%, a l c o h o l . - « 3 -A p p e n d i x I I c o n t i n u e d 5. D e h y d r a t e a) 70% a l c o h o l 10 s e c . b) a b s o l u t e a l c o h o l 1-5 s e c . 6. C l e a r i n x y l e n e 5 m i n u t e s . 7. Mount i n H.S.R. APPENDIX I I I P a r a f f i n S e c t i o n s P r e p a r a t i o n o f b l o c k f o r c u t t i n g p a r a f f i n s e c t i o n s A f t e r p e r f u s i o n o f t i s s u e i n s i t u w i t h 10% f o r m a l i n i t i s e x c i s e d a n d p l a c e d i n t h e same f i x a t i v e f o r 3-4 d a y s , w a s h e d i n t a p w a t e r a nd t a k e n t h r o u g h t h e f o l l o w i n g p r o c e d u r e : 1. D e h y d r a t e a) .7 0;% a l c o h o l b) 95% a l c o h o l i ) f i r s t c h a n g e i i ) s e c o n d c h a n g e c) M e t h y l B e n z o a t e i ) f i r s t c h a n g e , i i ) s e c o n d c h a n g e 2. C l e a r a) B e n z e n e i ) f i r s t c h a n g e i i ) s e c o n d c h a n g e 3. Impregnate i ) f i r s t c h a n g e i i ) s e c o n d c h a n g e i i i ) t h i r d c h a n g e o v e r n i g h t 4 h o u r s 4 h o u r s o v e r n i g h t o r u n t i l s a t u r a t e d 3-4 h o u r s 3-4 h o u r s 3-4 h o u r s o v e r n i g h t 2-3 h o u r s 2-3 h o u r s 4. Embed ' i n p a r a f f i n B. P r e p a r i n g s e c t i o n s t o be s t a i n e d . 1. Cut. s e c t i o n s , a t d e s i r e d t h i c k n e s s on t h e c l i n i c a l m i c r o t o m e . - i s -A p p e n d i x I I I c o n t i n u e d 2. B r i n g s e c t i o n s t o w a t e r , h y d r a t i o n . 5 m i n u t e s e a c h a) X y l e n e - two c h a n g e s b) A b s o l u t e a l c o h o l c ) 70% a l c o h o l c ) w a t e r 3. T a k e t h r o u g h s t a i n i n g p r o c e d u r e d e s i r e d . APPENDIX I V C r e s y l V i o l e t 1. F rom f r e s h t i s s u e , i t i s d e s i r a b l e t o go t h r o u g h t h e f o l l o w i n g p r o c e d u r e p r i o r t o s t a n d a r d p r o c e d u r e . 5 m i n u t e s e a c h . a) w a t e r b) 70% a l c o h o l c) a b s o l u t e a l c o h o l d) x y l e n e - t w o . c h a n g e s e) a b s o l u t e a l c o h o l f ) 70% a l c o h o l g) w a t e r , 2. S t a n d a r d p r o c e d u r e f o r p a r a f f i n s e c t i o n s . a) B r i n g s e c t i o n t o w a t e r a s d e s c r i b e d i n A p p e n d i x I I I B 2. b) P l a c e i n w a t e r - 5 m i n u t e s . c) C r e s y l V i o l e t s t a i n - a p p r o x . 5 m i n u t e s . ( C r e s y l B i o l e t A c e t a t e 0.25% a q u e o u s s o l u t i o n . A l l i e d C h e m i c a l s ) . d) Wash i n t a p w a t e r . e) 70% a l c o h o l . f ) CV d i f f e r e n t i a t o r u n t i l a d e q u a t e l y d i f f e r e n t i a t e d . A p p e n d i x I V c o n t i n u e d 1-2 m i n . w i t h a g i t a t i o n . (90ml o f 95% a l c o h o l , 10ml o f C h l o r o f o r m , 3 d r o p s g l a c i a l a c e t i c a c i d ) i ) 9 5 % a l c o h o l j ) a b s o l u t e a l c o h o l - two c h a n g e s k) x y l e n e - two c h a n g e s 1) mount i n H.S.R. 3. R e s u l t s N i s s l s u b s t a n c e - p u r p l e . i APPENDIX V-H a e m a t o x y l i n a nd D a r r o w Red 1. S t a n d a r d p r o c e d u r e f r o m p a r a f f i n s e c t i o n s . a) B r i n g s e c t i o n t o w a t e r as d e s c r i b e d i n A p p e n d i x I I I B 2. b) M o r d a n t i n 1% a q u e o u s I r o n A l u m f o r 30-60 m i n u t e s . c) Wash t h o r o u g h l y i n d i s t i l l e d w a t e r f o r 10 m i n u t e s , c h a n g i n g t h e w a t e r b a t h f o u r o r f i v e t i m e s . d) S t a i n i n L i t h i u m H a e m a t o x y l i n f o r 3 h o u r s , (5mls 10% h a e m a t o x y l i n i n 9 5 % a l c o h o l a d d e d t o 95 m i s 0.15% L i t h i u m C a r b o n a t e + 25g N a I 0 3 ) . e) Wash w e l l - 10 m i n u t e s , i n r u n n i n g t a p w a t e r ; f o l l o w e d b y a f i n a l b a t h o f d i s t i l l e d w a t e r . f ) S t a i n i n D a r r o w Red f o r 10 m i n u t e s . Red S t a i n A c e t a t e B u f f e r pH 3.8 100 m i s D a r r o w Red 25 mg. M i x t u r e b r o u g h t j u s t t o a b o i l , s i m m e r e d f o r 1-2 m i n u t e s , c o o l e d t o room t e m p e r a -t u r e , •„ s h a k e n o c c a s i o n a l l y a n d f i l t e r e d . M i x t u r e ^ s t a b l e f o r 1 month and c a n b e u s e d r e p e a t e d l y . g) Wash i n d i s t i l l e d w a t e r f o r 1 m i n u t e . h) D e h y d r a t e f o r 5 m i n u t e s e a c h i n two c h a n g e s o f 95% a l c o h o l a n d two c h a n g e s o f a b s o l u t e a l c o h o l . i ) C l e a r i n x y l e n e , a nd mount i n H.S.R. A p p e n d i x V c o n t i n u e d 2. R e s u l t s H a e m a t o x y l i n D a r r o w Red s t a i n s m y e l i n s h e a t h s , n u c l e o l i and e r y t h r o c y t e s - b l u e b l a c k , s t a i n s n e u r o n a l n u c l e i l i g h t r e d w i t h d a r k r e d g r a n u l e s o f c h r o m a t i n , c y t o p l a s m - r e d - w i t h d a r k r e d N i s s l g r a n u l e s . 

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