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Thermal elution of oligonucleotides on cellulose columns containing oligodeoxyribonucleotides of defined… Astell, Caroline Ruth 1970

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831-UBC_1971_A1 A88.pdf [ 7.95MB ]
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\ THERMAL E L U T I O N OF O L I G O N U C L E O T I D E S ON C E L L U L O S E COLUMNS C O N T A I N I N G O L I G O D E O X Y R I B O N U C L E O T I D E S OF D E F I N E D LENGTH AND SEQUENCE b y C a r o l i n e R. A s t e l 1 B . S c , T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1 9 6 4 . M . S c , T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1 9 6 6 . A T H E S I S SUBM ITTED IN P A R T I A L F U L F I L M E N T OF THE REQUIREMENT FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF P H I L O S O P H Y i n t h e D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H COLUMB IA D e c e m b e r , 1 9 7 0 . I n p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r a n a d v a n c e d d e g r e e a t t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , I a g r e e t h a t t h e L i b r a r y s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e a n d s t u d y . I f u r t h e r a g r e e t h a t p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e c o p y i n g o f t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y p u r p o s e s may be g r a n t e d by t h e H e a d o f my D e p a r t m e n t o r by h i s r e p r e s e n t a t i v e s . I t i s u n d e r s t o o d t h a t c o p y i n g o r p u b l i c a t i o n o f t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l n o t be a l l o w e d w i t h o u t my w r i t t e n p e r m i s s i o n . D e p a r t m e n t o f T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a V a n c o u v e r 8 , C a n a d a A B S T R A C T T h e h i g h d e g r e e o f s p e c i f i c i t y o f b a s e i n t e r a c t i o n s o f c o m p l e m e n t a r y p o l y n u c l e o t i d e s i s a f u n d a m e n t a l p r o p e r t y o f b i o l o g i c a l s y s t e m s . T h r o u g h i n t e r a c t i o n s o f t h i s t y p e , g e n e t i c i n f o r m a t i o n i s a b l e t o f l o w , t o s u c c e e d i n g g e n e r a t i o n s b y r e p l i c a t i o n o f t h e g e n o m e , a n d f r o m d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d a n d r i b o n u c l e i c a c i d s t o p r o t e i n s , b y t h e s t e p s o f t r a n s c r i p t i o n a n d t r a n s l a t i o n . T h e e x p e r i m e n t s r e p o r t e d i n t h i s t h e s i s a r e c o n c e r n e d w i t h a s t u d y o f t h e f e a s i b i l i t y o f d e v e l o p i n g a m e t h o d s u i t a b l e f o r t h e i s o l a t i o n o f n a t u r a l l y o c c u r r i n g p o l y n u c l e o t i d e s b y h y b r i d i z a t i o n o f t h e p o l y n u c l e o t i d e w i t h a c o m p l e m e n t a r y o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e . H o m o - o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s ( l e n g t h s u p t o t h e d o d e c a n u c l e o t i d e s ) o f t h y m i d y l i c a n d d e o x y -a d e n y l i c a c i d s h a v e b e e n p r e p a r e d b y c h e m i c a l p r o c e d u r e s , a s h a v e o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s o f t h e r e p e a t i n g , c o m p l e m e n t a r y t r i n u c l e o t i d e b a s e s e q u e n c e s , d ( p T p T p C ) n > d ( p C p T p T ) n > a n d d ( p A p A p G ) n , ( n = 1 t o h). V a r i o u s o l i g o n u c l e o t i d e s h a v e b e e n l i n k e d c o v a l e n t l y t o c e l l u l o s e , a n i n s o l u b l e , i n e r t m a t r i x , v i a t h e 5 ' p h o s p h o r y l g r o u p o n t h e o l i g o d e o x y r i b o n u c 1 e o t i d e s , u s i n g t h e w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e , N - c y c l o h e x y l - N ' 3 ( 4 -m e t h y l m o r p h o l i n i u m ) e t h y l c a r b o d i i m i d e p - t o l u e n e s u l f o n a t e . T h e r e s u l t a n t o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s , i n t h e f o r m o f s m a l l c o l u m n s , w e r e e x a m i n e d f o r t h e i r a b i l i t y t o r e t a i n c o m p l e m e n t a r y o l i g o m e r s . T h e r e t a i n e d o l i g o n u c l e o t i d e s c a n be e l u t e d c o n v e n i e n t l y w i t h a l i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t . T h e d a t a i n d i c a t e t h a t a t l e a s t a l l b u t . . o n e n u c l e o t i d e , a n d p o s s i b l y t h e e n t i r e o l i g o n u c l e o t i d e a t t a c h e d t o t h e c e l l u l o s e i s c a p a b l e o f h y d r o g e n b o n d i n g w i t h i t s c o m p l e m e n t a r y s e q u e n c e . T h e r e s o l u t i o n o b t a i n e d w i t h t h e s e c o l u m n s i s s u c h t h a t o l i g o -n u c l e o t i d e s , d i f f e r i n g i n l e n g t h b y o n e n u c l e o t i d e r e s i d u e may b e f r a c t i o n a t e d . T h e c a p a c i t y i s 1/3 t o \/k o f t h e t h e o r e t i c a l a m o u n t . P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s s u g g e s t t h a t t h e s e o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e s a r e c a p a b l e o f s e l e c t i v e l y r e m o v i n g a c o m p l e m e n t a r y s e q u e n c e o f n u c l e i c a c i d f r o m a m i x t u r e o f n u c l e i c a c i d s . T A B L E OF CONTENTS P a g e A B S T R A C T } T A B L E OF CONTENTS i n L I S T OF T A B L E S xF i L I S T OF F I G U R E S x ; v ACKNOWLEDGEMENTS . x v i i A B B R E V I A T I O N S U S E D . . . . . . . . x v i i i GENERAL INTRODUCTION . 1 P a r t I: C h e m i c a l S y n t h e s i s o f 0 1 i g o d e o x y r i b o -n u c l e o t i d e s o f D e f i n e d L e n g t h a n d S e q u e n c e « INTRODUCT ION 19 M A T E R I A L S AND METHODS . 27 N u c l e o t i d e s a n d C h e m i c a l s . . . . . . . . . . 27 M e t h o d s 29 1) C o n v e r s i o n o f n u c l e o t i d e s t o p y r i d i n i u m s a l t s 2 9 2 ) A n h y d r o u s c o n d i t i o n s 3 0 3 ) S t o p p i n g r e a c t i o n s 3 0 k) C o n d e n s a t i o n r e a c t i o n w o r k u p 30 a ) DCC r e a c t i o n s 30 b ) s u l f o n y l c h l o r i d e r e a c t i o n s 31 c ) r e m o v a l o f t e r m i n a l p r o t e c t i n g g r o u p s . . . . 31 i v T a b l e o f C o n t e n t s ( C o n t i n u e d ) P a g e 5 ) A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e c t e d n u c l e o t i d e s 31 6) C o n c e n t r a t i o n o f p r o t e c t e d n u c l e o t i d e s f o l l o w i n g a n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y 3 2 7 ) R e m o v a l o f a l l p r o t e c t i n g g r o u p s . . . . . . . 3 2 8 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o t e c t e d d i -a n d t r i n u c l e o t i d e s 3 2 9 ) P u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f l o n g e r o l i g o n u c l e o t i d e s f r o m t h e p o l y m e r i z a t i o n o f p r o t e c t e d t r i -n u c l e o t i d e s . 33 10) P a p e r c h r o m a t o g r a p h y 3^ E X P E R I M E N T A L AND R E S U L T S . . . 3 5 1) S y n t h e s i s o f o l i g o d e o x y t h y m i d y l a t e p o l y m e r s t e r m i n a t e d w i t h a 5 ' ~ p h o s p h a t e a n d 3 ' ~ h y d r o x y l ( d ( p T ) n n = 2 t o 12 ) 3 5 a ) P o l y m e r i z a t i o n o f d - p T 3 5 b ) P o l y m e r i z a t i o n o f t h e t r i -n u c l e o t i d e , d - p T p T p T 38 ( i ) S t e p w i s e s y n t h e s i s o f d ( p T ) ^ 3 8 ( i i ) P o l y m e r i z a t i o n o f t h e t r i -n u c l e o t i d e d - p T p T p T l\2 V T a b l e o f C o n t e n t s ( C o n t i n u e d ) P a 9 e 2) S y n t h e s i s o f o l i g o n u c l e o t i d e s o f r e p e a t i n g s e q u e n c e d ( p T p T p C ) n (n = 1 t o 4) *t7 a ) S y n t h e s i s o f t h e p r o t e c t e d t r i -n u c l e o t i d e , d - p T p T p C ^ n  b) P o l y m e r i z a t i o n o f t h e t r i n u c l e o t i d e , d - p T P T p C A n . . . . . . 51 3 ) S y n t h e s i s o f o l i g o n u c l e o t i d e s o f t h e s e q u e n c e d ( p C p T p T ) n (n = 1 t o h). . . . . . . . 54 a ) S y n t h e s i s o f d-pC p T p T . . 51 b) P o l y m e r i z a t i o n o f d - p C A n p T p T . . . . . . . . 56 k) S y n t h e s i s o f o l i g o d e o x y a d e n y l a t e p o l y m e r s , d ( p A ) n (n = 2 t o 12 ) . 5 3 5) S y n t h e s i s o f o 1 i g o d e o x y r i b o n u c 1 e o t i d e s o f r e p e a t i n g s e q u e n c e d ( p A p A p 6 ) n ( n = 1 t o k) . . . . . . 58 a ) S y n t h e s i s o f t h e p r o t e c t e d t r i -B z B z B z n u c l e o t i d e d-pA pA pG 5 8 b ) P o l y m e r i z a t i o n o f t h e p r o t e c t e d 1 . • 1 J n B z . B z „ Bz t r i n u c l e o t i d e , d pA pA pG 6 7 D I S C U S S I O N . 7 1 v i T a b l e o f C o n t e n t s ( C o n t i n u e d ) P a r t I I : T h e r m a l E l u t i o n o f O l i g o n u c l e o t i d e s On C e l l u l o s e C o l u m n s C o n t a i n i n g O l i g o n u c l e o t i d e s o f D e f i n e d L e n g t h A n d S e q u e n c e INTRODUCTION Jk M A T E R I A L S AND METHODS 8 7 A . I n t e r a c t i o n o f C o m p l e m e n t a r y O l i g o -n u c l e o t i d e s i n S o l u t i o n . . . . . . . . • . . 87 1) E s t i m a t i o n o f a v e r a g e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t p e r b a s e a t 2 5 ° f o r o l i g o n u c l e o t i d e s o f m i x e d b a s e s e q u e n c e 8 7 2 ) T h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e s f o r c o m p l e m e n t a r y i n t e r a c t i o n s o f t h e t y p e d ( p T ) n > d ( p A ) n a n d d ( p T ) n . p o l y A . 8 9 3 ) Tm a n d % h y p o c h r o m i c ! t y . . . . . . . . • . 91 B. S y n t h e s i s a n d P r o p e r t i e s o f 0 1 i g o -n u c l e o t i d e - C e l 1 u 1 o s e s 9 3 1) S y n t h e s i s o f o l i g o n u c 1 e o t i d e - c e l 1 u 1 o s e s . , R e a c t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s o n c e l l u l o s e p a p e r w i t h a w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e 9 3 T a b l e o f C o n t e n t s ( C o n t i n u e d ) P a g e 2 ) P o s s i b l e s i d e r e a c t i o n s i n t h e r e a c t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s w i t h t h e c a r b o d i i m i d e . . . . 9 5 3) P r e p a r a t i o n o f c o l u m n m a t r i x a n d p r o c e d u r e f o r p a c k i n g c o l u m n - 9 6 h) P r o c e d u r e f o r r u n n i n g o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e c o l u m n s . 9 7 a ) T h e r m a l e l u t i o n o f o l i g o -n u c l e o t i d e s 9 7 b ) O t h e r m e t h o d s o f e l u t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s 100 5 ) P r e p a r a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s o f t h e s e r i e s d ( A ) a n d r ( A ) . . . . . . . . 1 0 0 n n 6) I s o l a t i o n o f S a l m o n L i v e r RNA 101 R E S U L T S AND D I S C U S S I O N . . ]0k A . I n t e r a c t i o n o f C o m p l e m e n t a r y O l i g o -n u c l e o t i d e s i n S o l u t i o n 104 1) E s t i m a t i o n o f t h e a v e r a g e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t p e r b a s e a t 2 5 ° f o r o l i g o n u c l e o t i d e s o f m i x e d b a s e s e q u e n c e 1 0 ^ v i i i T a b l e o f C o n t e n t s ( C o n t i n u e d ) P a g e 2 ) T h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e s f o r c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e i n t e r -a c t i o n s a n d p o l y A . d ( p T ) n i n t e r a c t i o n s . . . . . ^ 7 . a ) T y p i c a l t h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e 107 b ) W i d t h o f t h e t h e r m a l t r a n s i t i o n 109 c ) % H y p o c h r o m i c ! t y . 110 d ) Summary o f d a t a o n Tm c u r v e s f o r v a r i o u s i n t e r a c t i o n s o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s a n d p o l y n u c l e o t i d e s . . . . 110 e ) T h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e s f o r l o n g e r o l i g o n u c l e o t i d e s . . . . . . . . . no f ) T h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e s f o r o l i g o n u c l e o t i d e s o f m i x e d , r e p e a t i n g b a s e s e q u e n c e 1 1 5 g ) Summary o f d a t a f r o m t h e t h e r m a l d e n a t u r a t i o n s t u d i e s o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s 1 1 8 B. S y n t h e s i s a n d P r o p e r t i e s o f O l i g o -n u c l e o t i d e - C e l l u l o s e s 119 1) S y n t h e s i s o f o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e s . . . . 119 a ) I n c o r p o r a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e b y t h e w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e m e t h o d . . . . 1 1 9 i x T a b l e o f C o n t e n t s ( C o n t i n u e d ) P a j e b ) E x a m i n a t i o n o f t h e CMC-OTs r e a c t i o n 120 c ) Summary o f t h e s y n t h e s i s o f o l i g o -n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s 129 2) 0 1 i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n s ' 130 a ) T h e r m a l e l u t i o n o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s . . . . . . • . . . . . 1 3 0 ( i ) S t e p w i s e t h e r m a l e l u t i o n 1 3 0 ( i i ) L i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t e l u t i o n 131 ( i i i ) T y p i c a l e l u t i o n p r o f i l e 1 3 3 b ) A l t e r n a t e m e t h o d s f o r t h e e l u t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s f r o m o l i g o -n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n s 137 ( i ) R e v e r s e s a l t g r a d i e n t 1 3 8 ( i i ) F o r m a m i d e I 3 8 ( i i i ) N , N ' - d i m e t h y l f o r m a m i d e 1 i+0 ( i v ) D i m e t h y l s u l f o x i d e 1^0 ( v ) S o d i u m p e r c h l o r a t e 1^0 c ) C a p a c i t y o f o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e c o l u m n s 1*»1 T a b l e o f C o n t e n t s ( C o n t i n u e d ) p a 9 e d ) R e s o l u t i o n o f o l i g o d e o x y a d e n y 1 a t e s o n c e l l - d ( p T ) g , c e l l - d ( p T ) , a n d c e l l - d ( p T ) 1 2 . . 147 e ) E l u t i o n o f d ( p A ) , d ( A ) a n d r ( A ) r n n n o n e e l 1 u l o s e - d ( p T ) ^ 156 f ) C h a r a c t e r i s t i c s o f d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s o f o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e . . . 159 g ) 0 1 i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e o f m i x e d r e p e a t i n g b a s e s e q u e n c e s a n d t h e e l u t i o n o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o m e r s 164 ( i ) C e l 1 u l o s e s - d ( p T p T p C ) ^ a n d - d ( p C p T P T ) 2 . . . 164 ( i i ) C e l 1 u l o s e s - d ( p T p T p C ) a n d - d ( p C P T p T ) 3 • . . 169 a ) E l u t i o n o f t h e h e x a n u c 1 e o t i d e , d ( p A p A p G ) 2 169 b) E l u t i o n o f t h e n o n a n u c l e o t i d e , d ( p A p A p G ) 3 . . ' 171 h) E f f e c t o f GC b a s e p a i r s o n t h e s t a b i l i t y o f o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e : c o m p l e m e n t a r y o l i g o m e r i n t e r a c t i o n s x i T a b l e o f C o n t e n t s ( C o n t i n u e d ) P a g e i ) E l u t i o n o f n o n - c o m p l e m e n t a r y o l i g o -n u c l e o t i d e s o n o l i g o n u c 1 e o t i d e -c e l l u l o s e s . 1 7 5 j ) P u r i f i c a t i o n o f c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d o l i g o n u c l e o t i d e s o n o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e c o l u m n s 1 7 6 k ) E l u t i o n o f RNA f r o m a n o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e c o l u m n , a n d t h e s e l e c t i v e r e t e n t i o n o f a c o m p l e m e n t a r y o l i g o -n u c l e o t i d e 177 CONCLUS IONS . . . . . 1 8 3 L I T E R A T U R E C I T E D 188 L I S T OF T A B L E S P a g e T a b l e I. M i n i m u m l e n g t h n o n - r e p e a t i n g b a s e s e q u e n c e s i n g e n o m e s o f 3 x 1 0 ^ t o 3 x 109 n u c l e o t i d e b a s e ^ p a i r s 13 T a b l e I I . C h a r a c t e r i z a t i o n o f d e p h o s p h o r y l a t e d o l i g o n u c l e o t i d e s b y v e n o m p h o s p h o d i e s t e r a s e d i g e s t i o n a n d e s t i m a t i o n o f m o l a r r a t i o s - 3 6 T a b l e I I I . Y i e l d o f o l i g o n u c l e o t i d e s d ( p T ) n f r o m t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T 37 T a b l e I V . Summary o f R f v a l u e s o f n o n - p r o t e c t e d a n d p r o t e c t e d n u c l e o t i d e s Z J O T a b l e V . Y i e l d o f o l i g o n u c l e o t i d e o b t a i n e d b y p o l y m e r i z a t i o n o f s u i t a b l y p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e s i j6 T a b l e V I . A v e r a g e m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t p e r b a s e a t 3 5 ° f o r o l i g o n u c l e o t i d e s o f m i x e d b a s e s e q u e n c e 1 0 6 T a b l e V I I . Tm v a l u e s ( ° C ) a n d p e r c e n t h y p o c h r o m i c i t y f o r d ( p T ) n : d ( p A ) n a n d d ( p T ) n : p o l y A i n t e r a c t i o n s . 111 T a b l e V I I I . T h e r m a l s t a b i l i t y o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s o f m i x e d b a s e s e q u e n c e . . T a b l e I X . . S y n t h e s i s o f o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e b y t h e w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e m e t h o d 121 T a b l e X . C h a r a c t e r i z a t i o n o f b y p r o d u c t s p r o d u c e d o n r e a c t i o n o f d - p T w i t h CMC-OTs a t pH 6 . 0 1 2 6 T a b l e X I . C a p a c i t y o f c e l l - d ( p T ) g c o l u m n I^lf T a b l e X I I . E l u t i o n o f d e o x y a d e n y l a t e s , d ( p A ) ^ t o d ( p A ) ^ , o n c e l l - d ( p T ) 8 » c e l l -d ( p T ) g a n d c e l l - d ( p T ) 1 2 1^8 X I I I L i s t o f T a b l e s ( C o n t i n u e d ) P a g e T a b l e X I I I . E l u t i o n o f d ( p A ) n o n c e l l - d ( p T ) 9 c o l u m n s 154 T a b l e X I V . E l u t i o n o f o l i g o r i b o - a n d o l i g o -d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s o n c e l l - d ( p T ) q . . . 1 5 8 T a b l e X V . E l u t i o n o f d ( p A ) q a n d d ( p A ) y o n d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s o f c e l l -d ( p T ) 9 161 T a b l e X V I . E l u t i o n o f d ( p A p A p G ) n (n = 2 , 3 ) o n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s o f m i x e d , r e p e a t i n g b a s e s e q u e n c e s . . . . 165 T a b l e X V I I . T h e r m a l e l u t i o n o f RNA a n d d ( p A p A p G ) o o n c e l l u l o s e -d ( p C p T p T ) 3 181 L I S T OF F I G U R E S P a g e F i g u r e 1 . N - a c y l p r o t e c t i n g g r o u p s f o r n u c l e o s i d e 5 ' m o n o p h o s p h a t e s 2 2 F i g u r e 2 . G e n e r a l m e t h o d f o r t h e s y n t h e s i s o f p r o t e c t e d d e o x y r i b o t r i n u c l e o t i d e s . . . 2 5 F i g u r e 3 . A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f d - p T p T 41 F i g u r e 4 . A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f d - p T p T p T . 4 3 F i g u r e 5 . A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y . s e p a r a t i o n o f p r o d u c t s f r o m t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T p T p T 4 5 F i g u r e 6 . A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f p r o d u c t s f r o m t h e s y n t h e s i s o f d - p T p T p C A n . 5 0 F i g u r e 7- A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f p r o d u c t s f r o m t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T p T P C A n 5 2 F i g u r e 8 . A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y p u r i f i c a t i o n o f d-pC pTpT 55 F i g u r e 9- A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f p r o d u c t s f r o m t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d - p C A n p T p T 5 7 F i g u r e 1 0 . A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y p u r i f i c a t i o n o f d - p A B z p A B z 6 3 F i g u r e 1 1 . A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f d - p A B z p A B z p G B z , a t pH 8 . 5 . . . . ( . • 66 F i g u r e 1 2 . A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f d - p A B z p A B z p G B z , a t pH 5 . 5 • • . . ' . • 6 8 F i g u r e 1 3 . A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f p r o d u c t s f r o m t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d - p A B z p A B z p G B z 7 0 XV L i s t o f F i g u r e s ( C o n t i n u e d ) P a g e F i g u r e 1 4 . D e f i n i t i o n o f t e r m s r e l a t e d t o t h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e s . 9 2 F i g u r e 1 5 - D i m e n s i o n s ( i n c e n t i m e t e r s ) o f j a c k e t e d c o l u m n u s e d f o r t e m p e r a t u r e c o n t r o l l e d e l u t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s f r o m c o l u m n s o f o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e 9 8 F i g u r e 1 6 . Venom p h o s p h o d i e s t e r a s e d i g e s t i o n o f d ( p A p A p G ) 2 a n d d ( p A p A p G ) ^ 1 0 5 F i g u r e 1 7 . T h e r m a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e s f o r t h e i n t e r a c t i o n s d ( p T ) o « p o l y A (A ) a n d d ( p T ) g . d ( p A ) 8 (B ) . . . . . . . . 1 0 8 F i g u r e 1 8 . T h e r m a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e s f o r t h e i n t e r a c t i o n s d ( p A ) ^ . d ( p T ) a n d d ( p A ) n . d ( p T ) F i g u r e 19- R e a c t i o n o f d - p T w i t h CMC-OTs 124 F i g u r e 2 0 . S p e c t r u m o f p e a k b ( C M C d - p T ) 127 F i g u r e 2 1 . R e a c t i o n o f d - p T , d - p C , a n d d - p A w i t h 100 mg ( t o t a l ) o f CMC-OTs a t ! pH 6 . 0 . 128 F i g u r e 2 2 . E l u t i o n o f d ( p A ) g o n c e l l u l o s e -d ( p T ) g 132 F i g u r e 2 3 . T y p i c a l e l u t i o n p r o f i l e s f o r o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e s . . . . . . 1 3 ^ F i g u r e 2 4 . A l t e r n a t e m e t h o d s f o r t h e e l u t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s o n o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e c o l u m n s . . . 139 F i g u r e 2 5 . T h e c a p a c i t y o f a c e l l - d ( p T ) g c o l u m n 143 F i g u r e 2 6 . % A . I I . d ( p A ) g n o t r e t a i n e d b y a c e l l - d ( p T ) „ c o l umn v s A . U . d ( pA ) g l o a d e d 1 ^5 L i s t o f F i g u r e s ( C o n t i n u e d ) XV I F i g u r e 27-F i g u r e 2 8 . F i g u r e 23. F i g u r e 3 0 . F i g u r e 3 1 • F i g u r e 3 2 . F i g u r e 3 3 . F i g u r e 3 4 . F i g u r e 3 5 . P a g e C o m p o s i t e g r a p h e l u t i o n p r o f i l e s f o r e l u t i o n o f d ( p A ) n o n c e l l -d ( p T ) 8 > A ; c e l l - d ( p T ) q , B; a n d e e l l - d ( p T ) 1 2 , C . . . . . . . . 149 T m c o f d ( p A ) n o n c e l l u l o s e -d ( p T ) s , - d ( p T ) q , a n d - d ( p T ) 1 2 v s o l i g o m e r l e n g t h n 152 C o m p o s i t e e l u t i o n p r o f i l e f o r d ( p A ) n ( n = 6 t o 9) o n c e l l -d ( p T ) q ( 0 . 9 cm x. 15 c m , 150 A . U . d ( p T ) g ) . . . . . . . . . . . . 1 5 5 T m c ( ° C ) v e r s u s o l i g o m e r l e n g t h f o r t h e e l u t i o n o f t h e s e r i e s d ( p A ) n , d ( A ) n , a n d r ( A ) n o n c e l l - d ( p T ) q . . . . 160 E l u t i o n o f d ( p A p A p G ) 2 3 o n c e l l u l o s e s -d ( p T p T p C ) 2 a n d - d ( p C p f p T ) 2 1 6 6 E l u t i o n o f d ( p A p A p G ) 2 3 o n c e l l u l o s e s -d ( p T p T p C ) 3 a n d - d ( p C p f p T ) - j 170 T h e r m a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e s o f t h e i n t e r a c t i o n s d ( p A p A p G ) 3 w i t h d ( p T p T p C ) ^ a n d d ( p C p T p T ) 3 , p r i o r t o a n d a f t e r p u r i f i c a t i o n o f t h e d ( p A p A p G ) 3 o n a n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n . . . . 173 E l u t i o n o f RNA o n e e l 1 - d ( p C p T p T ) 3 . . . 179 E l u t i o n o f d ( p A p A p G ) 3 a n d RNA , s e p a r a t e l y , a n d a s a m i x t u r e o n e e l l - d ( p C p T p T ) 3 1 8 0 ACKNOWLEDGEMENTS D u r i n g t h e c o u r s e o f t h e s e e x p e r i m e n t s I h a v e h a d t h e p l e a s u r e o f w o r k i n g w i t h a n u m b e r o f p e o p l e w h o s e d i s c u s s i o n s h a v e b e e n m o s t h e l p f u l a n d t o whom I am g r a t e f u l . T o V i v i a n , D e e n a , N a d i n e , G r a n t , R i c h a r d , R o n , J e r r y , Y a s u k o , B i l l , P a u l , P a t , D a v i d , a n d A l b e r t I e x p r e s s my a p p r e c i a t i o n . I w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k D r . I a n G i l l a m w h o h a s o f f e r e d h i s a d v i c e o n a n u m b e r o f p r o b l e m s w h i c h a r o s e . M r . W. M o r r i s o n o f t h e D e p a r t m e n t o f P h y s i c s , T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , d e s i g n e d a n d b u i l t t h e g e a r b o x f o r t h e g e a r s y s t e m n e c e s s a r y t o r u n t h e l i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t . F i n a l l y , m o s t o f a l l , t h e s u p e r v i s i o n o f D r . M i c h a e l S m i t h i s g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . H i s s i n c e r e i n t e r e s t i n s t u d e n t s , a n d h i s g u i d a n c e o f t h e i r r e s e a r c h w i l l b e r e m e m b e r e d . I was t h e r e c i p i e n t o f a N a t i o n a l R e s e a r c h C o u n c i l o f C a n a d a S c h o l a r s h i p ( 1 9 6 6 - 1 9 6 7 ) a n d a K i l l a m P r e d o c t o r a l F e l l o w s h i p ( 1 9 6 7 - 1 9 7 0 ) . x v i i i A B B R E V I A T I O N S USED T h e a b b r e v i a t i o n s u s e d f o r t h e n u c l e o t i d e s a r e t h o s e s u g g e s t e d b y t h e I U P A C - I U B C o m b i n e d C o m m i s s i o n o n B i o c h e m i c a l N o m e n c l a t u r e ( R e v i s e d T e n t a t i v e R u l e s , 1 9 6 5 ) (1 ) a n d u s e d e x t e n s i v e l y i n t h e p a p e r s o n p o l y n u c l e o t i d e s y n t h e s i s p u b l i s h e d b y D r . H . G . K h o r a n a a n d h i s a s s o c i a t e s ( s e e S c h a l l e r a n d K h o r a n a , r e f . 2 , f o o t n o t e 7 ) . T h e s e a b b r e v i a t i o n s a r e s u m m a r i z e d b e l o w : t h e d e o x y r i b o n u c l e o s l d e s o f t h e f o u r b a s e s ; t h y m i n e , c y t o s i n e , a d e n i n e , a n d g u a n i n e , t h e 5 1 d e o x y r i b o n u c l e o s i d e m o n o p h o s p h a t e s . N - b e n z o y 1 d - p A N - a n i s o y l d-pC N - b e n z o y l d-pG t h e 3 ~ c y a n o e t h y 1 d e r i v a t i v e o f d - p T . t h e 3 i _ 0 - a c e t y ! d e r i v a t i v e o f d - p T . t h e p r o t e c t e d d e o x y t r i n u c l e o t i d e , 5 I _ 0 -p h o s p h o r y l - N - b e n z o y I d e o x y a d e n y l y l -(3 ' "*"5 1 ) - N - b e n z o y 1 d e o x y a d e n y 1 y 1 -( 3 ' - * 5 l ) - N - b e n z o y l d e o x y g u a n o s i n e . o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e o f N , n n u c l e o t i d e s l o n g , w i t h a 5 ' p h o s p h a t e g r o u p a n d 3 ' h y d r o x y l . d T , d C , d A , dG d - p T , d - p C , d - p A , d-pG d - p A B z d - p C A n d - P G B z C E d - p T d - p T - O A c d - p A B z p A B z p A B z d ( p N ) n A b b r e v i a t i o n s U s e d ( C o n t i n u e d ) d ( N ) n d ( p N ) n w h i c h h a s b e e n d e p h o s p h o r y l a t e d , r ( N ) n t h e o l i g o r i b o n u c l e o t i d e o f N , n n u c l e o t i d e s l o n g , w i t h 5 ' a n d 3 ' h y d r o x y 1 t e r m i n i i . d ( p T p T p C ) n t h e o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e o f r e p e a t i n g s e q u e n c e , d - p T p T p C , 3n n u c l e o t i d e s l o n g . DNA d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d . RNA r i b o n u c l e i c a c i d . t R N A t r a n s f e r r i b o n u c l e i c a c i d . mRNA m e s s e n g e r r i b o n u c l e i c a c i d . rRNA r i b o s o m a l r i b o n u c l e i c a c i d . P o l y G p o l y r i b o g u a n y l i c a c i d . P o l y ( U , G) p o l y r i b o n u c l e o t i d e w i t h r a n d o m s e q u e n c e o f u r i d y l a t e a n d g u a n y l a t e r e s i d u e s . P o l y ( A , G) a n d p o l y ( I , G) a r e a n a l o g o u s s t r u c t u r e s . d A T P d e o x y a d e n o s i n e 5 ' t r i p h o s p h a t e . d C T P d e o x y c y t o s i n e 5 ' t r i p h o s p h a t e . d I T P d e o x y i n o s i n e 5 ' t r i p h o s p h a t e . UDP u r i d i n e 5" d i p h o s p h a t e . O t h e r a b b r e v i a t i o n s a n d d e f i n i t i o n s u s e d a r e : p o l y n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c e l l u l o s e c o n t a i n i n g c o v a l e n t l y l i n k e d h o m o - o l i g o n u c 1 e o t i d e s o f r a n d o m l e n g t h . XX A b b r e v i a t i o n s U s e d ( C o n t i n u e d ) o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c e l l u l o s e c o n t a i n i n g c o v a l e n t l y l i n k e d o l i g o n u c l e o t i d e s o f d e f i n e d l e n g t h a n d s e q u e n c e . c e l l - d ( p T ) n c e l l u l o s e t o w h i c h h a s b e e n c o v a l e n t l y a t t a c h e d t h e o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e , d ( p T ) n > v i a a p h o s p h o d i e s t e r l i n k b e t w e e n t h e 5 ' t e r m i n a l n u c l e o t i d e a n d a n h y d r o x y l g r o u p o n t h e c e l l u l o s e . R^ m o b i l i t y r e l a t i v e t o t h e s o l v e n t f r o n t . ^ d - p T m o b i l i t y r e l a t i v e t o d - p T ^ d - p T p T m o b i l i t y r e l a t i v e t o d - p T p T . nm n a n o m e t e r ( 1 0 ^ m e t e r , 1 m i l l i m i c r o n ) . A 2 6 0 nm a b s o r b a n c e a t 2 6 0 nm. A . U . o n e a b s o r b a n c e u n i t , i s t h a t a m o u n t o f s u b s t a n c e , w h i c h w h e n d i s s o l v e d i n 1 ml o f s o l v e n t h a s a n a b s o r b a n c e o f 1 .0 i n a c e l l w i t h a 1 cm l i g h t p a t h . ( T h e a b s o r b a n c e v a l u e i s r e a d a t t h e X m a x . ) Amax ( A m i n ) w a v e l e n g t h a t a b s o r b a n c e m a x i m u m ( m i n i m u m ) . E t h e m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t , e q u a l t o t h e a b s o r b a n c e o f a 1 m o l a r s o l u t i o n i n a 1 cm l i g h t p a t h . u DCC M s S 0 2 C l T E A T E A B TBA THA N a + M e s CMC-OTs MBS D E A E - c e l l u l o s e SDS Tm T m c A b b r e v i a t i o n s U s e d ( C o n t i n u e d ) u n i t o f e n z y m e a c t i v i t y . N , N 1 - d i e y e l o h e x y l c a r b o d i i m i d e . 2 - m e s i t y l e n e s u l f o n y l c h l o r i d e . n - t r i e t h y l a m i n e . t r i e t h y l a m m o n i u r n b i c a r b o n a t e . n - t r i b u t y l a m i n e . n - t r i h e x y l a m i n e . s o d i u m s a l t o f 2 - ( N - m o r p h o l i n o ) -e t h a n e - s u l f o n i c a c i d . N - c y c l o h e x y l - N 1 3 ( 4 - m e t h y l m o r p h o l i n u m ) -e t h y l c a r b o d i i m i d e p - t o l u e n e s u l f o n a t e . m o l a r b u f f e r e d s a l i n e ; 0 . 0 1 M N a h ^ P O i , , pH 7 - 0 , 1 M i n N a C l . 0 - ( d i e t h y l am i n o e t h y 1 ) e e l 1 u l o s e . s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e . t e m p e r a t u r e a t o n e h a l f t h e i n c r e a s e i n a b s o r b a n c e o f a t h e r m a l d i s s o c i a t i o n p r o f i l e . t e m p e r a t u r e o f e l u t i o n o f a n o l i g o -n u c l e o t i d e f r o m a n o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e c o l u m n ( d e f i n e d a s t h e t e m p e r a t u r e a t t h e p e a k t u b e ) . A b b r e v i a t i o n s U s e d ( C o n t i n u e d ) ATm ( A T m c ) d i f f e r e n c e b e t w e e n t w o Tm ( T m c ) v a l u e s . L i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t a l i n e a r i n c r e a s e i n t e m p e r a t u r e o f t h e e l u t i n g b u f f e r i n a c o l u m n . 1 GENERAL INTRODUCTION T h e d i s c o v e r y o f n u c l e i c a c i d s h a s b e e n a t t r i b u t e d t o F r i e d r i c h M e i s c h e r , i n 1871 ( 3 ) , who i s o l a t e d " n u c l e i n " b o t h f r o m p u s c e l l s a n d f r o m s p e r m h e a d s o f t h e A t l a n t i c s a l m o n S a l mo  s a 1 a r ( 4 , 5 ) . A l t h o u g h t h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n a n d w i d e d i s t r i b u t i o n o f n u c l e i c a c i d s b e c a m e k n o w n l a r g e l y i n t h e n e x t 30 t o 4 0 y e a r s ( 4 ) , t h e b i o l o g i c a l f u n c t i o n o f d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d was n o t a p p r e c i a t e d u n t i l t h e w o r k o f A v e r y , M c L e o d a n d M c C a r t y , i n 1 9 4 4 ( 6 ) , w h o d e m o n s t r a t e d t h a t DNA was t h e f a c t o r r e s p o n s i b l e f o r b a c t e r i a l t r a n s f o r m a t i o n . A f e w y e a r s l a t e r , i n 1 9 5 2 , H e r s h e y a n d C h a s e (7 ) d e m o n s t r a t e d t h a t d u r i n g T 2 i n f e c t i o n o f E s c h e r i c h i a c o l i , t h e n u c l e i c a c i d o f t h e b a c t e r i o -p h a g e ( a n d n o t t h e p r o t e i n c o a t ) e n t e r e d t h e h o s t b a c t e r i u m , a n d t h e r e f o r e t h e n u c l e i c a c i d m u s t c a r r y t h e g e n e t i c i n f o r m a t i o n . T h e s e t w o o b s e r v a t i o n s p l u s c o r r o b o r a t i v e w o r k o f o t h e r s l e d t o t h e c o n c l u s i o n t h a t DNA i s t h e s t o r e h o u s e o f g e n e t i c i n f o r m a t i o n . M o r e r e c e n t w o r k h a s d e m o n s t r a t e d t h a t RNA may a l s o e n c o d e i n f o r m a t i o n f r o m o n e g e n e r a t i o n t o a n o t h e r ( i n RNA v i r u s e s ) . H o w e v e r , f o r t h e m o s t p a r t RNA i s i d e n t i f i e d w i t h s t r u c t u r a l 1 ( r R N A ) , i n f o r m a t i o n a l (mRNA) a n d a d a p t o r ( t R N A ) f u n c t i o n s w i t h i n t h e c e l l . A l l t h r e e c l a s s e s o f RNA a r e i n t i m a t e l y i n v o l v e d * T h e u s e o f " s t r u c t u r a l " d o e s n o t i m p l y a n i n a c t i v e r o l e . i n t h e p r o c e s s o f p r o t e i n s y n t h e s i s ( 8 ) . T h e s i g n i f i c a n c e o f n u c l e i c a c i d s h a s l e d t o a n a l m o s t p h e n o m e n a l a s s a u l t o n t h e p r o b l e m s o f d e t a i l e d s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n . F o r e x a m p l e , m e t h o d s h a v e b e e n d e v e l o p e d f o r t h e s e q u e n c i n g o f r i b o n u c l e i c a c i d s (9 — 11 ) a n d a n u m b e r o f c o m p l e t e s e q u e n c e s f o r t r a n s f e r RNAs h a v e b e e n r e p o r t e d ( s e e 10 f o r a r e c e n t s u m m a r y ) . P a r t i a l s e q u e n c e s f o r s e v e r a l v i r a l RNAs a r e a l s o known ( 1 0 ) a s w e l l a s f o r t h e t w o r i b o s o m a l RNAs f r o m E_. c o l i ( 1 2 , 1 3 ) . L a c k o f e x t e n s i v e c h e m i c a l o r s p e c i f i c e n z y m a t i c m e t h o d s h a v e s e v e r e l y r e s t r i c t e d s e q u e n c e s t u d i e s i n a l l b u t s i m p l e DNA m o l e c u l e s t o s e q u e n c e s a s l o n g a s 10 t o 15 b a s e s ( 1 4 , . 1 5 ) . H o w e v e r , r e c e n t r e p o r t s ( 1 6 - 1 8 ) h a v e i n d i c a t e d t h a t t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e s e q u e n c e o f a DNA m o l e c u l e may b e p o s s i b l e w i t h i n t h e n e x t f e w y e a r s . W i t h t h i s i n t e r e s t i n s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f n u c l e i c a c i d s i t i s n o t s u r p r i s i n g , t h e n , t h a t a g r e a t d e a l o f e f f o r t h a s b e e n d i r e c t e d t o w a r d i s o l a t i o n p r o c e d u r e s f o r n u c l e i c a c i d s . T h e f r a c t i o n a t i o n o f n u c l e i c a c i d s h a d i t s b e g i n n i n g b o t h i n c y t o c h e m i c a l s t u d i e s ( 1 9 ) a n d c h e m i c a l c o m p o s i t i o n s t u d i e s o f c e l l f r a c t i o n s ( 2 0 - 2 3 ) . T h u s , i n e u c a r y o t i c c e l l s , t h e n u c l e u s w a s s h o w n t o be t h e p r i m a r y s o u r c e o f DNA, w h i l e t h e c y t o p l a s m w a s r e l a t i v e l y r i c h i n RNA . Many n u c l e i c a c i d e x t r a c t i o n p r o c e d u r e s t a k e a d v a n t a g e o f t h i s d i f f e r e n t i a l l o c a t i o n o f t h e m o l e c u l e s , a n d c o n s e q u e n t l y n u m e r o u s m e t h o d s h a v e b e e n d e v e l o p e d f o r t h e i s o l a t i o n o f n u c l e i a s w e l l a s o t h e r c e l l o r g a n e l l e s (2h). R i b o s o m a l RNA ( i n c l u d i n g 5s RNA) i s r e a d i l y e x t r a c t e d f r o m r i b o s o m e s o r p o l y s o m e f r a c t i o n s . T r a n s f e r RNA may b e o b t a i n e d f r o m t h e h i g h s p e e d s u p e r n a t a n t f r a c t i o n d u r i n g c e n t r i f u g a t i o n o f f r a g m e n t e d c e l l p r e p a r a t i o n s , o r i s o f t e n o b t a i n e d f r o m t h e a q u e o u s l a y e r o f p h e n o l e x t r a c t e d c y t o p l a s m , a n d i s s e p a r a t e d f r o m o t h e r RNAs b y v a r i o u s c h r o m a t o g r a p h i c p r o c e d u r e s ( 2 5 ) . M o r e r e f i n e d f r a c t i o n a t i o n m e t h o d s ( f o r e x a m p l e , c o u n t e r c u r r e n t s e p a r a t i o n , D E A E - S e p h a d e x c h r o m a t o g r a p h y , i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y , r e v e r s e d - p h a s e p a r t i t i o n c h r o m a -t o g r a p h y , a n d b e n z o y l a t e d D E A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y , 10 ) h a v e b e e n u s e d t o s e p a r a t e d i f f e r e n t t R N A m o l e c u l e s f o r s e q u e n c e a n a l y s e s . H o w e v e r , w h i l e t h e s e c l a s s e s o f n u c l e i c a c i d s ( r R N A s a n d t R N A s ) a r e r e a d i l y f r a c t i o n a t e d , DNA a n d m e s s e n g e r RNAs a r e s t i l l p r e p a r e d l a r g e l y a s h e t e r o g e n o u s f r a c t i o n s . T h e i s o l a t i o n o f a h o m o g e n e o u s p o p u l a t i o n o f DNA m o l e c u l e s ( w i t h t h e e x c e p t i o n o f s p e c i a l c a s e s s u c h a s v i r a l , b a c t e r i a l o r m i t o c h o n d r i a l D N A s , e t c . ) h a s n o t b e e n a c c o m p l i s h e d . T h e d i f f i c u l t y i s o b v i o u s f r o m t h e k n o w n c o n t e n t a n d c o m p l e x i t y o f c e l l u l a r DNA i n e u c a r y o t i c o r g a n i s m s . F o r e x a m p l e , i n t h e g c a l f g e n o m e , t h e r e a r e 3-2 x 10 n u c l e o t i d e b a s e p a i r s p e r h a p l o i d s e t ( 2 6 ) . A l t h o u g h kS% o f t h e c a l f g e n o m e b e l o n g s t o t h e c l a s s o f r e p e t i t i o u s DNA m o l e c u l e s ( 2 7 ) , t h e r e a r e s t i l l 9 some 1 . 8 x 10 b a s e p a i r s c o m p r i s i n g u n i q u e DNA s e q u e n c e s . W i t h t h e k n o w l e d g e t h a t a t l e a s t s e v e r a l g e n e s a r e l o c a t e d o n d i f f e r e n t c h r o m o s o m e s ( 2 6 ) , i t m u s t b e c o n c l u d e d t h a t i n h i g h e r o r g a n i s m s t h e g e n o m e c o n s i s t s o f a l a r g e p o p u l a t i o n o f d i f f e r e n t DNA m o l e c u l e s . I f o n e w e r e a t t e m p t i n g t o i s o l a t e a p a r t i c u l a r r e g i o n o f t h e g e n o m e , f o r e x a m p l e , a c i s t r o n , o c c u r r i n g i n t h e n o n - r e p e t i t i o u s p o r t i o n o f t h e g e n o m e , o n e w o u l d be a t t e m p t i n g t o i s o l a t e a p p r o x i m a t e l y 10 % o f t h e g e n o m e ! P o s s i b l y a m o r e f e a s i b l e a p p r o a c h t o t h e i s o l a t i o n o f s p e c i f i c s e q u e n c e s o f i n f o r m a t i o n a l n u c l e i c a c i d w o u l d b e t h e i s o l a t i o n o f a s p e c i f i c m e s s e n g e r R N A . T h i s i s t h e o r e t i c a l l y a s i m p l e r p r o b l e m . i n t h a t i n a d i f f e r e n t i a t e d c e l l e x p r e s s i n g a p a r t i c u l a r g e n e , many c o p i e s o f t h a t m e s s e n g e r c o u l d b e e x p e c t e d 3 t o b e p r e s e n t , a n d o n l y a f r a c t i o n , p o s s i b l y a s f e w a s 10 g e n e s o c c u r r i n g i n t h e g e n o m e may b e t r a n s c r i b e d ( 2 8 ) . 3 A l s o , i n t h e i s o l a t i o n o f a mRNA t h e r e i s t h e p o s s i b i l i t y o f a n i n v i t r o a s s a y , i n w h i c h t h e RNA may b e i d e n t i f i e d b y i t s a b i l i t y t o p r o m o t e t h e s y n t h e s i s o f a s p e c i f i c p r o t e i n ( 3 1 , 3 2 ) , a l t h o u g h c o u p l e d DNA-RNA p r o t e i n s y n t h e s i z i n g c o m p l e x e s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d ( 3 3 " 3 5 ) • T e c h n i q u e s h a v e b e e n d e v e l o p e d r e c e n t l y i n w h i c h RNA ( t R N A s f r o m E_. c o l i ) h a s b e e n h y b r i d i z e d w i t h i t s h o m o l o g o u s r e g i o n o f t h e g e n o m e ( 3 6 , 3 7 ) . When s h e a r e d DNA (mo l e c u 1 a r w e i g h t 2 I h a v e a s s u m e d t h a t a c i s t r o n i s t h e l e n g t h o f DNA c o d i n g f o r a s i n g l e p r o t e i n , a b o u t 5 0 0 a m i n o a c i d s l o n g a n d t h e r e f o r e e q u a l t o 1 5 0 0 b a s e p a i r s . I f t h e n u m b e r o f p a i r s p e r h a p l o i d s e t i s 1 . 8 x 1 0 ^ ( t h e n o n -r e p e t i t i o u s p o r t i o n o f t h e g e n o m e ) ( 2 7 ) , t h e n a c i s t r o n w h i c h o c c u r s o n c e r e p r e s e n t s a b o u t 1 0 " % o f t h e g e n o m e . 3 In f a c t , t h e r e i s no g o o d e v i d e n c e y e t t o s u g g e s t how much o f t h e DNA i n a e u c a r y o t e c o d e s f o r p r o t e i n s ( 2 9 , 3 0 ) . 1 . 2 5 x 10 d a l t o n s ) w a s u s e d , a r e g i o n o f t h e DNA c o d i n g f o r h t o 5 tRNA m o l e c u l e s was o b t a i n e d , s u g g e s t i n g a c o n t i g u o u s a r r a n g e m e n t o f t R N A c i s t r o n s i n t h e E_. c o l i g e n o m e ( 3 6 ) . In o t h e r w o r k , a n e n d o n u c l e a s e s p e c i f i c f o r s i n g l e s t r a n d e d DNA was u s e d t o d i g e s t a w a y n o n - h y b r i d i z e d r e g i o n s o f t h e DNA. T h e s i z e o f t h e DNA f r a g m e n t o b t a i n e d w a s e q u i v a l e n t t o t h e l e n g t h o f a s i n g l e t R N A m o l e c u l e , i n d i c a t i n g t h a t t h e D N A - t R N A h y b r i d s f o r m e d m u s t h a v e a t l e a s t a s h o r t g a p , b e t w e e n t w o a d j a c e n t c i s t r o n s , w h i c h t h e e n d o n u c l e a s e i s a b l e t o r e c o g n i z e ( 3 7 ) . I t i s c o n c e i v a b l y p o s s i b l e t h a t t h e d e o x y p o l y m e r i s o l a t e d i n t h i s w a y c o u l d t h e n b e c o p i e d u s i n g DNA p o l y m e r a s e . A p r e l i m i n a r y r e p o r t u s i n g a s i m i l a r h y b r i d i z a t i o n t e c h n i q u e h a s s h o w n t h a t t h i s m e t h o d i s a l s o f e a s i b l e f o r u s e w i t h a m e s s e n g e r RNA ( 3 8 ) . H o w e v e r , t h e r a p i d r a t e a n d e x t e n t o f h y b r i d i z a t i o n o f m o u s e g l o b i n mRNA w i t h i t s h o m o l o g o u s DNA s u g g e s t s t h a t t h e g l o b i n m e s s e n g e r h y b r i d i z e d w i t h a p o r t i o n o f t h e r e p e t i t i o u s DNA s e q u e n c e s i n t h e g e n o m e . T h i s i s f u r t h e r s u b s t a n t i a t e d b y t h e r e l a t i v e l y l o w Tm o f t h e g l o b i n mRNA:DNA h y b r i d s a s w e l l a s t h e e x t r e m e s e n s i t i v i t y o f t h e h y b r i d t o r i b o n u c l e a s e d i g e s t i o n . I t may a l s o be p o s s i b l e t o o b t a i n t h e d e o x y r i b o - s t r a n d c o m p l e m e n t a r y t o a n mRNA m o l e c u l e u s i n g o n e o f t h e r e c e n t l y d i s c o v e r e d RNA d e p e n d e n t DNA p o l y m e r a s e s a s s o c i a t e d w i t h RNA t u m o r v i r u s e s ( 3 9 ~ 4 1 ) . F r o m t h e c o n s i d e r a t i o n d i s c u s s e d a b o v e ( l e s s h e t e r o g e n e i t y , p o t e n t i a l i n v i t r o a s s a y o f t h e p r o d u c t , a n d t h e a v a i l a b i l i t y o f a m e t h o d t o o b t a i n t h e c o m p l e m e n t a r y DNA s e q u e n c e b y i s o l a t i o n o r e n z y m a t i c s y n t h e s i s ) , i t w o u l d s e e m l o g i c a l t o c o n c e n t r a t e o n a . . l e s s f o r m i d a b l e p r o b l e m t h a n t h e o n e o f i s o l a t i o n o f a g e n e , t h e i s o l a t i o n o f a s p e c i f i c mRNA. T h e f i r s t o b s e r v a t i o n o f a n i n f o r m a t i o n a l t y p e RNA was made i n 1 9 5 6 b y V o l k i n a n d A s t r a c h a n ( 4 2 ) who o b s e r v e d a r a p i d 32 i n c o r p o r a t i o n o f P. i n t o RNA a f t e r i n f e c t i o n o f E_. c o l i w i t h b a c t e r i o p h a g e T 2 . T h e name o f m e s s e n g e r RNA w a s p u t f o r t h b y J a c o b a n d Monod ( 4 3 ) i n a n h y p o t h e s i s t o e x p l a i n t h e r a p i d s y n t h e s i s - o f RNA a f t e r p h a g e i n f e c t i o n , a s w e l l a s t h e k i n e t i c s o f e n z y m e i n d u c t i o n a n d r e p r e s s i o n . In t h e n e x t 10 y e a r s a f t e r V o l k i n a n d A s t r a c h a n ' s o b s e r v a t i o n , a n u m b e r o f p r o p e r t i e s o f mRNA w e r e d e f i n e d . F o r e x a m p l e , i t w a s b e l i e v e d t h a t m e s s e n g e r RNA h a d a b a s e c o m p o s i t i o n a n d s e q u e n c e s i m i l a r t o t o t a l DNA , i t w a s h e t e r o g e n e o u s i n s i z e , i t s t i m u l a t e d a m i n o a c i d i n c o r p o r a t i o n , i t was r a p i d l y l a b e l l e d i n p u l s e e x p e r i m e n t s a n d h a d a s h o r t h a l f - l i f e , a n d i t w a s p r e s e n t i n p o l y s o m e s . U n f o r t u n a t e l y , t h e s e p r o p e r t i e s a r e n o t n e c e s s a r i l y u n i q u e t o m e s s e n g e r RNA . S i n g e r a n d L e d e r ( 4 4 ) s u g g e s t e d t h a t e x p e r i m e n t s w i t h c e l l - f r e e s y s t e m s p r o v i d e t h e m o s t c o n v i n c i n g e v i d e n c e i n s u p p o r t o f t h e c o n c e p t o f mRNA. In t h e e x p e r i m e n t s F o r a d i s c u s s i o n o n t h e e v a l u a t i o n o f mRNA, s e e r e f e r e n c e 4 4 . t h a t t h e s e w o r k e r s h a v e r e f e r r e d t o , a n RNA ( o f t e n a v i r a l RNA) w a s u s e d t o p r o g r a m t h e i n v i t r o t r a n s l a t i o n o f a p r o t e i n . A p a r t i a l p r o t e o l y t i c d i g e s t o f t h e p r o t e i n w a s t h e n c o m p a r e d w i t h t h e i n v i v o p r o d u c t , n o r m a l l y b y t w o d i m e n s i o n a l t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y (hS-kS). S i n c e t h e n a t l e a s t t h r e e r e p o r t s o f t h e i n v i t r o t r a n s l a t i o n o f mRNA i n t o a c t i v e e n z y m e m o l e c u l e s ( p h a g e Ik l y s o z y m e , 3 1 ; p h a g e Jk g l u c o s y l t r a n s f e r a s e , 3 2 ; a n d E_. c o l i a 1 k a 1 i ne p h o s p h a t a s e , 50 ) h a v e a p p e a r e d i n t h e l i t e r a t u r e , i n d i c a t i n g a r e m a r k a b l e f i d e l i t y o f t h e i n v i t r o t r a n s l a t i o n p r o c e s s . I s o l a t i o n p r o c e d u r e s f o r m e s s e n g e r RNAs a r e p o o r l y d e v e l o p e d c o m p a r e d w i t h t h o s e f o r o t h e r R N A s , p o s s i b l y b e c a u s e o f t h e s i z e h e t e r o g e n e i t y , t h e s m a l l a m o u n t n o r m a l l y p r e s e n t i n a c e l l , 5 a s w e l l a s t h e e x t r e m e s e n s i t i v i t y o f t h e s e m o l e c u l e s t o r i b o n u c l e a s e ( 5 2 ) . H o w e v e r , t w o g e n e r a l p r o c e d u r e s f o r t h e i s o l a t i o n o f m e s s e n g e r RNAs h a v e b e e n u s e d . T h e f i r s t o f t h e s e m e t h o d s i n v o l v e d t h e h y b r i d i z a t i o n o f RNA t o h o m o l o g o u s DNA. B a u t z a n d H a l l ( 53 ) r e p o r t e d t h e u s e o f a b a c t e r i o p h a g e Jh D N A - p h o s p h o c e l 1 u l o s e m a t r i x t o i s o l a t e T4 s p e c i f i c mRNA, p r e s u m a b l y by h y b r i d i z a t i o n o f t h e h o m o l o g o u s RNA a n d DNA. T h e i r p r o c e d u r e a l s o p e r m i t t e d t h e m t o e f f e c t a p u r i f i c a t i o n o f a s p e c i f i c p o r t i o n o f t h e Tk m e s s e n g e r b y 5 T h e m e s s e n g e r RNA a c c o u n t s f o r a t m o s t 5 " 1 0 % o f t h e RNA i n a c e l l , w h i l e r i b o s o m a l (80%) a n d t R N A ( 1 0 t o 15%) m a k e u p t h e r e m a i n d e r ( 5 1 ) . e l u t i o n o f t h i s m a t e r i a l o n a T 4 d e l e t i o n D N A - p h o s p h o c e l 1 u l o s e m a t r i x . T h e m e t h o d i s a p o t e n t i a l l y p r o m i s i n g o n e , a n d i s t h e o r e t i c a l l y a p p l i c a b l e t o t h e i s o l a t i o n o f a n y m e s s e n g e r RNA . DNA c e l l u l o s e h a s n o t b e e n u s e d e x t e n s i v e l y f o r t h i s p u r p o s e , a 1 t h o u g h " a 1 t e r n a t e m e t h o d s w i t h DNA i m m o b i l i z e d i n a g a r o r o n n i t r o c e l l u l o s e ( 5 4 , 5 5 ) h a v e b e e n u s e d . R e c e n t l y a 0X 174 DNA c e l l u l o s e c o l u m n h a s b e e n u s e d t o p r e p a r e m i n u s s t r a n d s f r o m t h e RF f o r m o f t h e v i r u s ( 5 6 ) . DNA c e l l u l o s e s h a v e a l s o b e e n u s e d t o i s o l a t e e n z y m e s w i t h DNA a s s o c i a t e d f u n c t i o n s ( 5 7 , 5 8 ) . A n o t h e r m e t h o d t h a t h a s b e e n u s e d t o p u r i f y m e s s e n g e r RNA i s b a s e d o n t h e c o n c e p t t h a t mRNA i n t h e p r o c e s s o f t r a n s l a t i o n i s a s s o c i a t e d w i t h p o l y s o m e f r a c t i o n s . A c c o r d i n g l y , a n u m b e r o f a t t e m p t s h a v e b e e n made t o i s o l a t e a n d c h a r a c t e r i z e t h e mRNA f o r h a e m o g l o b i n . 6 T h e w o r k r e l a t e d t o t h e i s o l a t i o n o f h a e m o g l o b i n m e s s e n g e r up t o 1 9 6 7 h a s b e e n s u m m a r i z e d b y C h a n t r e n n e e t a 1. ( 5 2 ) . S e v e r a l m o r e r e c e n t r e p o r t s h a v e a p p e a r e d . L a y c o c k a n d H u n t ( 60 ) h a v e r e p o r t e d a s a l t f r a c t i o n a t i o n p r o c e d u r e f o r r e t i c u l o c y t e RNA . One f r a c t i o n t h e y o b t a i n e d c o n t a i n e d a n 8S a n d 14S RNA s p e c i e s , a n d t h e s e w o r k e r s w e r e 6 M a n y w o r k e r s h a v e c h o s e n g l o b i n m e s s e n g e r a s a m o d e l s y s t e m . T h e i r c h o i c e i s p r o b a b l y r e l a t e d t o t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e s o l u b l e r i b o s o m e s o f t h e r e t i c u l o c y t e a r e c o n c e r n e d a l m o s t e x c l u s i v e l y w i t h t h e s y n t h e s i s o f t h e a a n d g c h a i n s o f t h e g l o b i n m o l e c u l e ( 5 9 ) . A l s o , r e t i c u l o c y t e s a r e r e a d i l y l y s e d by c o n t r o l l e d o s m o t i c s h o c k , m a k i n g i t p o s s i b l e t o o b t a i n i n t a c t p o l y s o m e s ( 5 1 ) . a b l e t o d e m o n s t r a t e t h a t t h e 8S s p e c i e s s t i m u l a t e d i n c o r p o r a t i o n o f r a d i o a c t i v e a m i n o a c i d s i n t o a g l o b i n t y p e m o l e c u l e , u s i n g a n E_. c o l i e e l 1 - f r e e p r o t e i n s y n t h e s i z i n g s y s t e m a n d t h e " i n i t i a t o r " N - a c e t y l - v a l y l - t R N A . H o w e v e r , r e c e n t w o r k o f H o u s m a n e_t_ a j _ . (61 ) . . .has d e m o n s t r a t e d t h a t b o t h g l o b i n c h a i n s a r e i n i t i a t e d a s N H 2 ~ m e t - v a 1 i n a r e t i c u l o c y t e c e l l - f r e e s y s t e m s u p p l e m e n t e d w i t h y e a s t ( e u c a r y o t i c ) m e t h i o n i n e t R N A s , a n d t h e m e t h i o n i n e i s s u b s e q u e n t l y r e m o v e d f r o m t h e a m i n o t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n s . T h u s , t h e g l o b i n s y n t h e s i s o b s e r v e d b y L a y c o c k a n d H u n t (60) w o u l d a p p e a r t o . h a v e b e e n i n i t i a t e d a b n o r m a l l y . H o w e v e r , t h i s d o e s n o t mean t h a t t h e 8S RNA i s n o t t h e g l o b i n m e s s e n g e r . L a b r i e ( 62 ) h a s r e p o r t e d a m e t h o d f o r i s o l a t i o n o f r a b b i t g l o b i n mRNA o b t a i n e d f r o m p o l y s o m e s a n d p u r i f i e d b y e l e c t r o -p h o r e s i s . T h e RNA ( 1 0 S ) was i d e n t i f i e d a s p u t a t i v e g l o b i n m e s s e n g e r b y i t s s i z e , k i n e t i c s o f l a b e l l i n g , s e n s i t i v i t y t o r i b o n u c l e a s e a n d i t s a p p a r e n t l a c k o f h o m o l o g y w i t h e i t h e r r i b o s o m a l RNA s p e c i e s , d e t e r m i n e d f r o m f i n g e r p r i n t p a t t e r n s o f r i b o n u c l e a s e T^ d i g e s t i o n o f t h e RNAs ( 6 2 ) . A n u m b e r o f o t h e r t R N A s h a v e b e e n p r e p a r e d by t h e p o l y s o m e p r o c e d u r e . F o r e x a m p l e , mRNA f o r m y o s i n h a s b e e n i s o l a t e d f r o m e m b r y o n i c c h i c k e n s k e l e t a l m u s c l e p o l y s o m e s a n d p u r i f i e d by s u c r o s e g r a d i e n t s e d i m e n t a t i o n (63). T h e i s o l a t i o n o f h i s t o n e m e s s e n g e r s h a s a l s o b e e n r e p o r t e d ( 64-66 ) . A n i n t e r e s t i n g a n d p o t e n t i a l l y . h i g h l y d i s c r i m i n a t i n g m o d i f i c a t i o n o f t h e p o l y s o m e m e t h o d w a s t h a t r e p o r t e d b y W i l l i a m s a n d A s k o n a s ( 6 7 ) . T h e s e w o r k e r s i s o l a t e d t h e p o l y s o m e s w h i c h w e r e i n t h e p r o c e s s o f m a k i n g t h e h e a v y a n d l i g h t c h a i n s o f i m m u n o g 1 o b i n s , by p r e c i p i t a t i o n w i t h _ a n t i s e r a p r e p a r e d a g a i n s t t h e t w o c h a i n s . T h e y o b s e r v e d a h i g h l y s p e c i f i c p r e c i p i t a t i o n o f t h e 300S p o l y s o m e s w i t h a n t i s e r u m a g a i n s t t h e h e a v y c h a i n s , w h i l e a l e s s d i s c r e t e r e g i o n c e n t e r e d o n 1 2 0 - 1 8 0 S p o l y s o m e s w a s p r e c i p i t a t e d w i t h a n t i s e r u m a g a i n s t l i g h t c h a i n s . I t w o u l d s eem t h a t t h e a p p l i c a t i o n o f t h e s e m e t h o d s ( s a l t f r a c t i o n a t i o n , p o l y s o m e e x t r a c t i o n , s e d i m e n t a t i o n a n a l y s i s a n d e l e c t r o p h o r e s i s ) t o m e s s e n g e r RNA i s o l a t i o n , a l t h o u g h r e a s o n a b l y s u c c e s s f u l i n s e v e r a l c a s e s , owe m u c h o f t h e i r s u c c e s s t o t h e u s e o f c e l l s w h i c h a r e h i g h l y s p e c i a l i z e d a n d m a k i n g v e r y f e w p r o t e i n s . In l o o k i n g f o r a m e t h o d f o r t h e i s o l a t i o n o f s p e c i f i c p o l y n u c l e o t i d e s , p o s s i b l y e i t h e r m o d i f i c a t i o n s o f h y b r i d i z a t i o n p r o c e d u r e s u s e d b y B a u t z a n d H a l l (53) o r i s o l a t i o n o f s p e c i f i c p o l y s o m e c l a s s e s b y a n i m m u n o l o g i c a l p r e c i p i t a t i o n s t e p (67) w o u l d b e m o r e g e n e r a l l y u s e f u l . G i l h a m h a s r e p o r t e d t h e s y n t h e s i s o f p h o s p h o d i e s t e r - 1 i n k e d p o l y n u c 1 e o t i d e - c e l 1 u 1 o s e c o l u m n s t o i s o l a t e c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s ( 6 8 , 6 9 ) . T h u s , d e o x y t h y m i d i n e p o l y n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e h a s b e e n d e m o n s t r a t e d t o f r a c t i o n a t e d e o x y a d e n y l a t e s ( t r i - t h r o u g h h e p t a n u c l e o t i d e s , 69) , a n d t h i s p r o c e d u r e h a s b e e n u s e d t o f r a c t i o n a t e a n e n z y m i c d i g e s t o f v i r a l RNA (70). Edmonds a n d A b r a m s (71) h a v e r e p o r t e d t h e u s e o f d e o x y t h y m i d i n e p o l y n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e t o i s o l a t e a n a t u r a l l y o c c u r r i n g p o l y a d e n y l a t e f r o m c a l f t h y m u s n u c l e i , w h i l e t h e s ame p r o c e d u r e h a s b e e n u s e d t o i s o l a t e a n a d e n i n e - r i c h p o l y m e r f r o m E h r l i c h a s c i t e s c e l l s (72). T h e e x t e n s i o n o f t h e p r i n c i p l e o f p o l y -n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n s , c o n t a i n i n g h o m o - o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s o f r a n d o m l e n g t h , t o c e l l u l o s e s c o n t a i n i n g p h o s p h o d i e s t e r - 1 i n k e d o l i g o n u c l e o t i d e s o f d e f i n e d l e n g t h a n d s e q u e n c e m i g h t o f f e r a f e a s i b l e t e c h n i q u e b y w h i c h p o l y n u c l e o t i d e s s u c h a s mRNA m o l e c u l e s may b e i s o l a t e d . T h e o b j e c t i v e o f t h e w o r k d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s i s t o e x a m i n e t h e p o s s i b i l i t y o f t h i s e x t e n s i o n . T h e p r o c e d u r e p r o p o s e d w o u l d i n v o l v e t h e i s o l a t i o n o f a p o l y -n u c l e o t i d e c o n t a i n i n g a n o l i g o n u c l e o t i d e s e q u e n c e c o m p l e m e n t a r y t o a c h e m i c a l l y - s y n t h e s i z e d o l i g o m e r w h i c h i s c o v a l e n t l y a t t a c h e d t o a n i n s o l u b l e m a t r i x ( s e e b e l o w ) . > 3 cellulose-pTpTpA PCpTpC In s u c h a p r o c e d u r e , i t i s n e c e s s a r y t o d e c i d e w h a t i s t h e l e n g t h o f t h e b a s e s e q u e n c e r e q u i r e d i n o r d e r f o r t h e s e q u e n c e t o b e u n i q u e f o r a p a r t i c u l a r p o l y n u c l e o t i d e . O b v i o u s l y , i t m u s t b e l o n g e n o u g h t o p r o v i d e a s t a b l e . ( h y d r o g e n b o n d e d ) i n t e r a c t i o n , a n d a t t h e s ame t i m e , be l o n g e n o u g h s u c h t h a t o n a r a n d o m p r o b a b i l i t y b a s i s , t h a t s e q u e n c e o c c u r s o n l y o n c e i n t h e g e n o m e o f t h e o r g a n i s m . T h e p r o b a b i l i t y o f o b s e r v i n g a p a r t i c u l a r s e q u e n c e o f n n u c l e o t i d e s l o n g i s p i . A s s u m i n g a r a n d o m d i s t r i b u t i o n o f b a s e s , f o r a g e n o m e w h i c h c o n t a i n s X n u c l e o t i d e b a s e p a i r s , a u n i q u e s e q u e n c e o f b a s e s i s p r e s e n t i n a n o l i g o m e r n n u c l e o t i d e s l o n g , w h e r e 4 n = X . 7 V a r i o u s g r o u p s ( 2 6 , 2 7 , 74) h a v e s u m m a r i z e d d a t a o n t h e m i n i m u m n u m b e r o f n u c l e o t i d e b a s e p a i r s p e r h a p l o i d s e t i n d i f f e r e n t o r g a n i s m s . T h e d a t a a r e c o m b i n e d a n d l i s t e d i n T a b l e I. T h e o r g a n i s m s a r e l i s t e d i n o r d e r o f i n c r e a s i n g n u m b e r o f b a s e p a i r s p e r h a p l o i d s e t ( g i v e n i n t h e b r a c k e t s , c o l u m n A ) , a n d a r e a l i g n e d i n p o s i t i o n w i t h t h e c o r r e s p o n d i n g v a l u e o f t h e e x p a n s i o n 4 n ( c o l u m n B ) . C o l u m n C i s t h e c o r r e s p o n d i n g T h o m a s (73) h a s p r e s e n t e d a m o r e c o m p l i c a t e d c a l c u l a t i o n o f t h e m i n i m u m , n o n - r e p e a t i n g l e n g t h i n a g e n o m e . He c o n c l u d e s t h a t t h e l e n g t h i s >, f w h e r e t h e n u m b e r o f n u c l e o t i d e s i n t h e g e n o m e i s a p p r o x i m a t e l y 1/2.4 . T h e t w o c a l c u l a t i o n s a c t u a l l y d i f f e r by a f a c t o r o f 4. T h o m a s ' s c a l c u l a t i o n i s b a s e d o n t h e t o t a l n u m b e r o f n u c l e o t i d e s , w h i l e t h e o n e d e s c r i b e d a b o v e i s f o r t h e t o t a l n u m b e r o f n u c l e o t i d e b a s e p a i r s . ( i . e . 1/2 t h e t o t a l n u m b e r o f n u c l e o t i d e s ) . T h o m a s a l s o e x c l u d e d i n v e r t e d r e p e a t i n g s e q u e n c e s . I f o n e u s e s T h o m a s ' s r e l a t i o n s h i p t o d e t e r m i n e t h e m i n i m u m u n i q u e c h a i n l e n g t h , t h e l e n g t h o b t a i n e d i s o n e b a s e l o n g e r t h a n t h a t o b t a i n e d b y t h e r e l a t i o n s h i p d e r i v e d a b o v e . T a b l e I. M i n i m u m l e n g t h n o n - r e p e a t i n g b a s e s e q u e n c e s i n g e n o m e s 3 9 o f 3 x 10 t o 3 x 10 n u c l e o t i d e b a s e p a i r s . A B C O r g a n i s m ( n u c l e o t i d e b a s e pa i r s ) 4 n n 4 1 16 2 6 4 3 2 5 6 4 1 , 0 2 4 5 R17 ( 3 3 0 0 ) a ; MS-2 ( 4 0 0 0 ) a ; 0X 174 ( 5 , 1 0 0 ) a ; S V 4 0 ( 7 , 0 0 0 ) 4 , 0 9 6 6 1 6 , 3 8 4 7 1 7 ( 4 0 , 0 0 0 ) ; A ( 50 , 000 ) 6 5 , 5 3 6 8 T 2 , T 4 (2 x 1 0 5 ) 2 6 2 , 1 4 4 9 1 , 0 4 8 , 5 7 6 10 > 4 , 1 9 4 , 3 0 4 11 E. c o l i (4.5 x 1 0 6 ) 1 6 , 7 7 7 , 2 1 6 12 Y e a s t (2 x 10 7) 6 7 , 1 0 8 , 8 6 4 13 T e l e o s t s (4 x 10 8) 2 6 8 , 4 3 5 , 4 5 6 14 1 , 0 7 3 , 7 4 1 , 8 2 4 1 5 A m p h i b i a n s (1 x 10^ ) R e p t i l e s (1.5 x 1Q9) M a m m a l s ( 3 - 2 x 1 0 9 ) 4 , 2 9 4 , 9 6 7 , 2 9 6 16 N u m b e r o f b a s e p a i r s i n t h e d o u b l e - s t r a n d e d r e p l i c a t i v e f o r m . v a l u e o f n, o r t h e minimum, u n i q u e sequence. From t h e t a b l e i t can be seen t h a t a number o f v i r a l and b a c t e r i a l p o l y n u c l e o t i d e s s h o u l d c o n t a i n u n i q u e o l i g o - . n u c l e o t i d e sequences o f r e m a r k a b l y s h o r t l e n g t h (6 t o 12 n u c l e o t i d e s ) , w i t h i n t h e range t h a t i s c o n v e n i e n t t o p r e p a r e s y n t h e t i c a l l y by e x i s t i n g c h e m i c a l methods ( 7 5 ) . Mushynski and Spencer (14, 15) have l o o k e d a t t h e f r e q u e n c y o f o c c u r r e n c e o f p y r i m i d i n e t r a c t s i n two b a c t e r i a l DNA v i r u s e s , T7 and A. They found t h a t i n T7, t h e r e a r e two t r a c t s o f o l i g o d e o x y -t h y m i d y l a t e s , d ( p T ) ^ , per m o l e c u l e o f T7 DNA ( b o t h on t h e l e f t s t r a n d ) . In A, t h e r e a r e f i v e t r a c t s o f d ( p T ) ^ per m o l e c u l e (two on t h e r i g h t s t r a n d and t h r e e on the l e f t s t r a n d ) . M i n Jou and F i e r s (76) have r e p o r t e d t h a t t h e r e a r e a t l e a s t e i g h t u n i q u e o c t a n u c l e o t i d e s i n t h e MS-2 genome, w h i l e T h i r i o n and K a e s b e r g (77) have a l s o r e p o r t e d s i m i l a r r e s u l t s f o r t h e R17 and M12 genomes. The u n i q u e l e n g t h i n a e u c a r y o t i c genome i s l o n g e r (14 t o 16 n u c l e o t i d e s ) t h a t one c o u l d c o n v e n i e n t l y s y n t h e s i z e by e x i s t i n g methods. However, the i s o l a t i o n o f mammalian p o l y -n u c l e o t i d e s i s s t i l l t h e o r e t i c a l l y p o s s i b l e u s i n g two o l i g o -n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e columns, each e i g h t n u c l e o t i d e s l o n g . 8 The p r o b a b i l i t y o f t h e o c c u r r e n c e o f two sequences each y n u c l e o t i d e s long i s e q u a l t o t h e p r o b a b i l i t y o f o c c u r r e n c e ^ o f one sequence n n u c l e o t i d e s l o n g ( i . e . x ^ = -^n). T h e i s o l a t i o n o f r a n d o m s e q u e n c e p o l y n u c l e o t i d e s b y h y b r i d i z a t i o n t o a r e l a t i v e l y s h o r t c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e w o u l d t h e r e f o r e s e e m t o be a f e a s i b l e a p p r o a c h t o t h e i s o l a t i o n o f s p e c i f i c p o l y n u c l e o t i d e s , p r o v i d i n g i n t e r a c t i o n s b e t w e e n s u c h s h o r t t r a c t s o f o l i g o n u c l e o t i d e s a r e s u f f i c i e n t l y s t a b l e . T h e f i n a l p r o b l e m i s t h a t o f how o n e d e t e r m i n e s a s h o r t s e q u e n c e o f n u c l e o t i d e s w i t h i n a p o l y n u c l e o t i d e s u c h a s a m e s s e n g e r RNA . T h e r e a r e s e v e r a l a p p r o a c h e s a v a i l a b l e a t t h e p r e s e n t t i m e . S t r e i s i n g e r ' s g r o u p h a s d e m o n s t r a t e d t h e o c c u r r e n c e o f p s e u d o - w i l d l y s o z y m e p h e n o t y p e s i n a c r i d i n e - i n d u c e d d o u b l e f r a m e s h i f t m u t a n t s o f b a c t e r i o p h a g e Jk (78-82). By c o m p a r i n g t h e c o d o n s ( 8 2 , 83) f o r t h e a m i n o a c i d s w i t h i n t h e d o u b l e f r a m e -s h i f t r e g i o n o f t h e m u t a n t a n d t h e c o r r e s p o n d i n g r e g i o n o f t h e w i l d t y p e p r o t e i n s , o n e i s a b l e t o o b t a i n a n a l m o s t u n a m b i g u o u s s e q u e n c e u p t o 10 n u c l e o t i d e s l o n g . M i s s e n s e m u t a t i o n s h a v e a l s o b e e n u s e d t o d e r i v e t h e s e q u e n c e o f n u c l e o t i d e s w i t h i n a s h o r t t r a c t . F o r e x a m p l e , S h e r m a n et_ a j _ . ( 8 4 ) h a v e s t u d i e d , t h e r e l a t i o n s h i p o f g e n e s t r u c t u r e a n d p r o t e i n s t r u c t u r e o f i s o - 1 - c y t o c h r o m e C f r o m y e a s t . F r o m a n u m b e r o f a m i n o a c i d r e p l a c e m e n t m u t a n t s a s h o r t s e q u e n c e o f t h e m e s s e n g e r a t t h e 5' e n d o f t h e m o l e c u l e c a n be d e r i v e d . A l s o , t h e c o d o n s f o r m e t h i o n i n e a n d t r y p t o p h a n r e s i d u e s may b e d e d u c e d u n a m b i g u o u s l y (85). C o n s e q u e n t l y , i f a n y t w o o f t h e s e o c c u r c o n s e c u t i v e l y i n a p r o t e i n , a s e q u e n c e i n t h e c o r r e s p o n d i n g mRNA 8 n u c l e o t i d e s l o n g , c a n b e d e t e r m i n e d . I t may b e p o s s i b l e t o d e r i v e ( n o t e n t i r e l y u n a m b i g u o u s l y ) t h e c o d o n s f o r a s h o r t s e q u e n c e o f a m i n o a c i d s w i t h i n a p r o t e i n b y d e d u c t i o n f r o m r i b o s o m a l b i n d i n g s t u d i e s (82) o f f r a c t i o n a t e d t R N A m o l e c u l e s . H o w e v e r , t h i s m e t h o d c a n o n l y a n s w e r q u e s t i o n s c o n c e r n i n g d e g e n e r a c y i n t h e f i r s t l e t t e r o f c o d e w o r d s . F i n a l l y , r e c e n t r e p o r t s f r o m s e v e r a l l a b o r a t o r i e s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t i t i s p o s s i b l e t o d e t e r m i n e s h o r t s e q u e n c e s w i t h i n v i r a l RNA m o l e c u l e s , f o r e x a m p l e r i b o s o m a l b i n d i n g s i t e s , b y v i r t u e o f t h e p r o t e c t i o n b y t h e r i b o s o m e o f a s h o r t o l i g o -n u c l e o t i d e f r o m n u c l e a s e d i g e s t i o n (86, 8 7 ) . I t i s c o n c e i v a b l y p o s s i b l e t h a t t h i s m e t h o d c o u l d b e a d a p t e d t o d e t e r m i n a t i o n o f a s h o r t s e q u e n c e w i t h i n a n y m e s s e n g e r R N A . F o r e x a m p l e , t h e t r a n s l a t i o n o f a m e s s e n g e r c o u l d b e s t o p p e d a t a s p e c i f i c p o i n t b y o m i s s i o n o f a r a r e a m i n o a c i d f r o m t h e s y n t h e s i z i n g p r e p a r a t i o n . T h e s p e c i f i c p o l y s o m e c l a s s c o u l d b e i s o l a t e d b y s e d i m e n t a t i o n o r p r e c i p i t a t i o n ( 6 7 ) . A s e q u e n c e o f o l i g o n u c l e o t i d e s may t h e n be o b t a i n e d b y m i l d n u c l e a s e d i g e s t i o n o f t h e p o l y s o m e s f o l l o w e d b y i s o l a t i o n o f t h e " p r o t e c t e d " s e q u e n c e . T h e s t r u c t u r e o f t h e s e q u e n c e c o u l d t h e n be d e t e r m i n e d b y e x i s t i n g m e t h o d s ( 1 0 ) . In s u m m a r y , t h e m e t h o d s p r e s e n t l y a v a i l a b l e f o r t h e i s o l a t i o n o f n u c l e i c a c i d s a r e i n a d e q u a t e f o r t h e p r e p a r a t i o n o f h o m o g e n e o u s p o p u l a t i o n s o f b o t h d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d s a n d m e s s e n g e r r i b o n u c l e i c a c i d s . P o s s i b l y t h e m a i n d i f f i c u l t y i n t h e i s o l a t i o n o f t h e s e m o l e c u l e s r e s t s i n t h e i r h e t e r o g e n e i t y ( b o t h s i z e a n d s e q u e n c e ) . B e c a u s e o f t h e h i g h d e g r e e o f s p e c i f i c i t y o f . b a s e i n t e r a c t i o n s o f c o m p l e m e n t a r y n u c l e i c a c i d s e q u e n c e s , i t i s l i k e l y t h a t a m e t h o d w h i c h t o o k a d v a n t a g e o f t h i s . p r o p e r t y , w o u l d b e o f g e n e r a l u s e i n t h e i s o l a t i o n o f s p e c i f i c p o l y n u c l e o t i d e s . In t h i s I n t r o d u c t i o n , i t i s p r o p o s e d t h a t p o l y n u c l e o t i d e s s u c h a s m e s s e n g e r r i b o n u c l e i c a c i d s may b e i s o l a t e d b y h y b r i d i z a t i o n t o a c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d o l i g o -d e o x y r i b o n u c 1 e o t i d e w h i c h i s c o m p l e m e n t a r y t o a s h o r t t r a c t w i t h i n t h e p o l y n u c l e o t i d e . T h e e x p e r i m e n t s r e p o r t e d h e r e , c a r r i e d o u t i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e p r a c t i c a b i l i t y o f s u c h a m e t h o d , i n v o l v e d a s t u d y w i t h c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d m o d e l c o m p o u n d s . T h i s t h e s i s i s d i v i d e d i n t o t w o p a r t s . P a r t I d e s c r i b e s t h e c h e m i c a l s y n t h e s i s o f o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s o f d e f i n e d l e n g t h a n d s e q u e n c e . T h e m e t h o d s u s e d w e r e s i m i l a r t o t h o s e d e v e l o p e d b y K h o r a n a a n d h i s a s s o c i a t e s (75). T h e p r e p a r a t i o n o f some o f t h e s e q u e n c e s h a s n o t b e d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . A c c o r d i n g l y , t h e s e o l i g o n u c l e o t i d e s h a v e b e e n t h o r o u g h l y c h a r a c t e r i z e d . F o r t h e s t u d i e s d e s c r i b e d i n P a r t I I , m i c r o m o l e a m o u n t s o f o l i g o n u c l e o t i d e s w e r e r e q u i r e d , c o n s i d e r a b l y m o r e t h a n t h e n a n o m o l e a m o u n t s o f t h e i n t e r m e d i a t e o l i g o m e r s w h i c h w e r e r e q u i r e d i n t h e c h e m i c a l s y n t h e s i s o f t h e y e a s t a l a n i n e t R N A g e n e (88). P a r t II i s d i v i d e d i n t o t w o s e c t i o n s . S e c t i o n A i s a s t u d y o f t h e t h e r m a 1 s t a b i 1 i t y o f i n t e r a c t i o n s b e t w e e n c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s i n s o l u t i o n . In S e c t i o n B, t h e m e t h o d u s e d t o c o v a l e n t l y l i n k o l i g o n u c l e o t i d e s t o c e l l u l o s e a n d t h e p r e p a r a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e s i n a f o r m s u i t a b l e f o r c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y , i s d e s c r i b e d . O p t i m a l c o n d i t i o n s f o r t h e t h e r m a l e l u t i o n o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o -n u c l e o t i d e s h a v e b e e n d e t e r m i n e d . T h e o l i g o n u c 1 e o t i d e - c e l 1 u 1 o s e s w e r e c h a r a c t e r i z e d w i t h r e g a r d t o t h e i r a b i l i t y t o b i n d c o m p l e m e n t a r y d e o x y r i b o - a n d r i b o - o l i g o n u c l e o t i d e s . T h e c a p a c i t y , r e s o l v i n g p o w e r , a n d r e p r o d u c i b i l i t y o f t h e s e c o l u m n s h a v e b e e n s t u d i e d . T h e a b i l i t y o f a n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n t o s e l e c t i v e l y r e t a i n a c o m p l e m e n t a r y ( s y n t h e t i c ) o l i g o m e r i n a m i x t u r e w i t h c e l l u l a r r i b o n u c l e i c a c i d s h a s b e e n e x a m i n e d . T h e r e s u l t s o f t h e s e e x p e r i m e n t s p r o v i d e a v e r y e n c o u r a g i n g b a s i s f o r a n a t t e m p t e d e x t e n s i o n o f t h e u s e o f o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e s t o t h e i s o l a t i o n o f s p e c i f i c , n a t u r a l l y o c c u r r i n g p o l y n u c l e o t i d e s . PART I C H E M I C A L S Y N T H E S I S OF O L I G O D E O X Y R I B O N U C L E O T I D E S OF D E F I N E D LENGTH AND SEQUENCE INTRODUCTION M e t h o d s f o r t h e s y n t h e s i s o f o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s o f d e f i n e d s e q u e n c e h a v e b e e n d e v e l o p e d i n t h e l a b o r a t o r y o f D r . H . G . K h o r a n a , o v e r t h e p a s t 15 y e a r s ( f o r g e n e r a l r e v i e w , s e e 75) . T h e s e m e t h o d s , i n v o l v i n g r e a c t i o n i n a n h y d r o u s s o l v e n t , u s e e i t h e r a c a r b o d i i m i d e ( e . g . d i c y c l o h e x y 1 c a r b o d i i m i d e , DCC) o r a s u l f o n y l c h l o r i d e ( e . g . 2 - m e s i t y 1 e n e s u 1 f o n y 1 c h l o r i d e o r 2 ,4,6 t r i i s o p r o p y 1 b e n z e n e s u 1 f o n y 1 . ch1 o r i d e ) a s c o n d e n s i n g a g e n t . T h e s e p r o c e d u r e s a r e l e n g t h y , r e q u i r i n g much t i m e b o t h t o m a k e t h e s u i t a b l y p r o t e c t e d r e a c t a n t s , a s w e l 1 a s t o s e p a r a t e t h e d e s i r e d p r o d u c t s i n p u r e f o r m b y a n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y . H o w e v e r , t h e y h a v e b e e n u s e d t o g r e a t a d v a n t a g e , r e s u l t i n g i n t h e s y n t h e s i s o f a l l s i x t y - f o u r r i b o n u c l e o t i d e c o d o n s (89) a n d o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s w i t h r e p e a t i n g d i - (90), t r i - (91) a n d t e t r a n u c l e o t i d e (92 _94) s e q u e n c e s . T h e o l i g o d e o x y r i b o n u c 1 e o t i d e s w e r e u s e d a s t e m p l a t e p r i m e r s f o r E s c h e r i c h i a c o l i DNA p o l y m e r a s e (95). 0 1 i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s a n d d e r i v e d p o l y d e o x y r i b o -n u c l e o t i d e s h a v e b e e n t r a n s c r i b e d w i t h E_. c o l ? RNA p o l y m e r a s e i n t o h i g h m o l e c u l a r w e i g h t r i b o p o l y m e r s 8 u s e d i n c e l l - f r e e p r o t e i n 8 T h e p r e f e r r e d m e t h o d t o o b t a i n h i g h m o l e c u l a r w e i g h t r i b o p o l y m e r s i s t o u s e t h e s h o r t o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s w i t h E_. c o l i DNA p o l y m e r a s e t o p r e p a r e D N A - l i k e p o l y m e r s . T h e s e a r e t h e n t r a n s c r i b e d i n t o R N A - l i k e p o l y m e r s (95, 75). s y n t h e s i z i n g s y s t e m s t o d e t e r m i n e a n d c o n f i r m c o d o n a s s i g n m e n t s ( s e e r e v i e w , 95)- R e c e n t l y , t h e g o a l o f t h e s e s y n t h e t i c m e t h o d s , t h e c o m p l e t e s y n t h e s i s o f t h e g e n e f o r y e a s t a l a n i n e t R N A , h a s b e e n a c h i e v e d (88). T h e m e t h o d u s e d i n v o l v e d t h e c h e m i c a l s y n t h e s i s o f o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s ( u p t o a n i c o s a n u c l e o t i d e i n l e n g t h ) o f o v e r l a p p i n g c o m p l e m e n t a r y s e g m e n t s o f t h e d e r i v e d s t r u c t u r e f o r t h i s t RNA g e n e . T h e s e g m e n t s w e r e j o i n e d u s i n g t h e e n z y m e p o l y n u c l e o t i d e 1 i g a s e (96, 97). T h e c h e m i c a l s y n t h e s i s o f o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s r e q u i r e s t w o g e n e r a l t y p e s o f p r o t e c t i o n i n i n t e r m e d i a t e s : 1) p r o t e c t i o n o f t h e h e t e r o c y c l i c a m i n o g r o u p s o f c y t o s i n e , a d e n i n e a n d g u a n i n e , a n d 2) p r o t e c t i o n o f e i t h e r t h e 5' p h o s p h o r y l g r o u p o r t h e 3' h y d r o x y l g r o u p o f t h e n u c l e o t i d e s . T h e h e t e r o c y c l i c a m i n o g r o u p s r e q u i r e p r o t e c t i n g g r o u p s i n o r d e r t o p r e v e n t s i d e r e a c t i o n s . (One a d v a n t a g e t o u s i n g N - a c y l p r o t e c t i n g g r o u p s i s t h a t t h e p r o t e c t e d n u c l e o t i d e s a r e m o r e s o l u b l e i n a n h y d r o u s p y r i d i n e , t h e r e f e r r e d r e a c t i o n s o l v e n t . ) In e a r l y e x p e r i m e n t s , r e a c t i o n b e t w e e n d - p T - O A c a n d 5 ' " 0 - t r i t y l d r i n t h e p r e s e n c e o f DCC r e s u l t e d i n p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e 6 - a m i n o g r o u p o f d-pC b y t h e a c t i v a t e d c o m p o n e n t s , f o r m i n g t h e p h o s p h o -r a m i d a t e (98). A s i m i l a r p r o b l e m w h e r e t h e a m i n o g r o u p o f d e o x y a d e n o s i n e was p h o s p h o r y l a t e d was e n c o u n t e r e d i n t h e A n a t t e m p t e d s y n t h e s i s o f d - T p A p C b y r e a c t i n g d - T p A a n d d-pC -OAc i n t h e p r e s e n c e o f DCC (99)-T h e c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s f o r g r o u p s t o p r o t e c t h e t e r o c y c l i c a m i n e s a r e t h a t t h e y m u s t b e s p e c i f i c , t h e y m u s t b e s t a b l e t o t h e c o n d i t i o n s o f t h e p h o s p h o d i e s t e r s y n t h e s i s a n d t h e w o r k u p , ar id t h e y m u s t p r o d u c e no a d v e r s e s i d e B z e f f e c t s ( e . g . s e e d i s c u s s i o n o f d-pG b e l o w ) . A l s o , t h e p r o t e c t i n g g r o u p s m u s t be r e a d i l y r e m o v e d u n d e r c o n d i t i o n s w h i c h d o n o t d e g r a d e p h o s p h o d i e s t e r o r g l y c o s i d i c l i n k a g e s . I t h a s b e e n d e t e r m i n e d t h a t d - p A may b e a d e q u a t e l y p r o t e c t e d w i t h t h e b e n z o y l g r o u p ( 1 0 0 ) , w h i l e d-pC may b e p r o t e c t e d w i t h t h e p - m e t h o x y b e n z o y 1 ( a n i s o y l ) g r o u p ( 1 0 1 ) ( s e e F i g u r e 1 ) . D e o x y g u a n o s i n e 5' p h o s p h a t e w a s o r i g i n a l l y p r o t e c t e d w i t h t h e a c e t y l g r o u p ( 1 0 2 ) , h o w e v e r t h i s w a s n o t q u i t e s t a b l e e n o u g h ( 1 0 3 ) ( l o s s o f a b o u t 10% d u r i n g n o r m a l w o r k u p o f a c o n d e n s a t i o n r e a c t i o n ) ; ' t h u s t h e b e n z o y l d e r i v a t i v e w a s p r e f e r r e d . S u b -s e q u e n t l y , t h e N - b e n z o y l g r o u p . w a s f o u n d t o i n t e r f e r e w i t h t h e a n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y p u r i f i c a t i o n s t e p b y l o w e r i n g t h e pK o f t h e h y d r o x y l a t p o s i t i o n 6, r e s u l t i n g i n p a r t i a l i o n i z a t i o n a t pH 8.5 ( 1 0 4 ) . T h e c o n s e q u e n c e i s p o o r r e s o l u t i o n o f t h e r e a c t a n t s a n d p r o d u c t s . T h e p r e f e r r e d p r o t e c t i n g g r o u p f o r d-pG now i s t h e i s o b u t y r y l g r o u p (75) ( s e e F i g u r e 1 ) . In t h e c h e m i c a l s y n t h e s i s w o r k d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s , d-pG r e s i d u e s w e r e p r o t e c t e d w i t h t h e b e n z o y l g r o u p . OH N-benzoyl d-pA OH OH N-acyl d-pG ,. benzoyl C H 3 I R = HC—CH 3 isobutyryl c=o I g u r e l . N - a c y l p r o t e c t i n g g r o u p s f o r n u c l e o s i d e 5 ' m o n o p h o s p h a t e s . 2 3 A l l t h r e e N - a c y l p r o t e c t i n g g r o u p s a r e r e m o v e d b y c o n c e n t r a t e d NH^OH ( 1 0 5 ) . T h e y a r e a l l s t a b l e t o s t r o n g a l k a l i ( pH 12) f o r s h o r t p e r i o d s a t l o w t e m p e r a t u r e , b y v i r t u e o f t h e f a c t t h e a c y l g r o u p s e n o l i z e a b o v e pH 1 2 , m a k i n g t h e m r e s i s t a n t t o a t t a c k b y h y d r o x y l i o n ( 1 0 0 ) . T h e s e c o n d t y p e o f p r o t e c t i n g g r o u p s i n v o l v e p r o t e c t i o n o f t h e 5 ' p h o s p h o r y l g r o u p a n d . t h e 3 ' h y d r o x y l g r o u p . I t h a s b e e n f o u n d t h a t t h e c y a n o e t h y l g r o u p i s s u i t a b l e f o r p r o t e c t i n g t h e 5 ' p h o s p h o r y l g r o u p , w h i l e t h e a c e t y l g r o u p i s s a t i s f a c t o r y f o r t h e 3 ' h y d r o x y l ( 7 5 ) . B o t h o f t h e s e g r o u p s may b e r e m o v e d i n s t e p w i s e s y n t h e s i s , w i t h s t r o n g a l k a l i (pH 1 2 , 20 m i n , 0 ° C ) , c o n d i t i o n s i n w h i c h t h e N - a c y l g r o u p s a r e s t a b l e ( s e e a b o v e ) . H o w e v e r , o n e d i s a d v a n t a g e i s t h a t b o t h g r o u p s a r e a l k a l i l a b i l e ; t h u s i n s t e p w i s e s y n t h e s i s , o n e c a n n o t b e s e l e c t i v e l y r e m o v e d . Two o t h e r g r o u p s w h i c h h a v e b e e n p r o p o s e d f o r t h e 5 ' p h o s p h o r y l g r o u p a r e t h e t r i c h l o r o e t h y 1 e s t e r ( 1 0 6 ) a n d t h e S - e t h y 1 p h o s p h o r o -t h i o a t e s ( 1 0 7 ) . B o t h o f t h e s e g r o u p s a r e s t a b l e t o a l k a l i ; . T h e t r i c h l o r o e t h y 1 g r o u p i s r e a d i l y r e m o v e d b y r e d u c t i o n ( 1 0 6 ) , w h i l e t h e t h i o e t h y l g r o u p i s r e m o v e d b y m i l d o x i d a t i o n ( 1 0 7 ) . R e c e n t l y , O h t s u k a et_ a j _ . ( 1 0 8 ) h a v e r e p o r t e d t h e u s e o f t h e a n i l i d a t e g r o u p t o p r o t e c t a 5 ' t e r m i n a l p h o s p h a t e i n s t e p w i s e s y n t h e s i s . T h i s g r o u p i s s t a b l e t o t h e a l k a l i n e c o n d i t i o n s r e q u i r e d t o r e m o v e t h e 3 ' " 0 - a c e t y l g r o u p s , a n d i s r e m o v e d r e a d i l y b y b r i e f t r e a t m e n t w i t h i s o a m y l n i t r i t e . ; In t h e c h e m i c a l s y n t h e s i s o f t h e y e a s t a l a n i n e t R N A g e n e , b l o c k p o l y m e r s w e r e p r e p a r e d w i t h a 5 ' t e r m i n a l n u c l e o s i d e ( p r o t e c t e d w i t h a n a c i d l a b i l e , a l k a l i s t a b i l e , t r i t y l g r o u p ) . In t h e f i n a l j o i n i n g s t a g e s t h e 5 ' p h o s p h o r y l g r o u p w a s i n t r o d u c e d b y t h e e n z y m e p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e ( 1 0 9 ) . P h o s p h a t e - t e r m i n a t e d o l i g o n u c l e o t i d e s a r e r e q u i r e d f o r t h e s y n t h e s i s o f p h o s p h o d i e s t e r - 1 i n k e d o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e s . In t h e p r e s e n t w o r k , i t w a s d e c i d e d t o s y n t h e s i z e t h e 5 ' - p h o s p h o r y l a t e d o l i g o n u c l e o t i d e s d i r e c t l y . T h e g e n e r a l m e t h o d f o r s t e p w i s e s y n t h e s i s o f o l i g o d e o x y -r i b o n u c l e o t i d e s b e a r i n g a 5 ' p h o s p h o r y l g r o u p i n v o l v e s : 1) c o n d e n s a t i o n o f t w o s u i t a b l y p r o t e c t e d n u c l e o t i d e s , a l k a l i n e t r e a t m e n t , a n d w o r k u p t o g i v e t h e p r o t e c t e d d i n u c 1 e o t i d e , a n d 2 ) r e - p r o t e c t i o n o f t h e 5 ' p h o s p h o r y l g r o u p o f t h e d i n u c l e o t i d e w i t h t h e c y a n o e t h y l g r o u p a n d c o n d e n s a t i o n o f t h i s w i t h a n o t h e r s u i t a b l y p r o t e c t e d m o n o n u c l e o t i d e ( s e e F i g u r e 2 ) . In t h e p r e s e n t s e r i e s o f e x p e r i m e n t s , c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s o f r e p e a t i n g s e q u e n c e o f d ( p A p A p G ) n > d ( p T p T p C ) n a n d d ( p C p T p T ) n ( n = 2 , 3 , 4 ) h a v e b e e n p r e p a r e d , a s w e l l a s t h e h o m o d e o x y r i b o o l i g o m e r s , d ( p T ) ^ a n d d ( p A ) ^ . T h e h o m o - o l i g o d e o x y -r i b o n u c 1 e o t i d e s - w e r e made b y p o l y m e r i z a t i o n o f t h e s u i t a b l y p r o t e c t e d m o n o m e r u n i t s ( d - p T , f o r t h e o l i g o d e o x y t h y m i d y l a t e s ; o N C C H 2 C H a O - P O C H IV IV N C C H 2 C H 2 0 - P O C H O H O _ L 1 P C C ^ " O - P ^ O 'O-POCH NCCH2CH2OH, DCC O - P O C H w ^ R I I K a l . MsSO,CI OAc + "OH I I , R3 , thymine, N-benzoyladenine N-benzoylguanine, N-anisoylcytosine O II 1C "O -0- ;P=0 -o-p=o "O—P=O F i g u r e 2 . G e n e r a l m e t h o d f o r t h e s y n t h e s i s o f p r o t e c t e d d e o x y r i b o t r i n u c l e o t i d e s , a n d d - p A , f o r t h e o l i g o d e o x y a d e n y l a t e s ) . H o m o d e o x y t h y m i d y l a t e s o f l e n g t h 3 , 6 , 9 a n d 12 w e r e a l s o p r e p a r e d b y s t e p w i s e s y n t h e s i s o f d - p T p T p T , a n d c h e m i c a l p o l y m e r i z a t i o n o f t h i s t r i n u c l e o t i d e . T h e o l i g o n u c l e d t i d e s o f r e p e a t i n g s e q u e n c e w e r e s y n t h e s i z e d b y t h e c h e m i c a l p o l y m e r i z a t i o n o f s u i t a b l y p r o t e c t e d t r i -n u c l e o t i d e s ( d - p A ^ Z p A ^ Z p G ^ Z , d - p T p T p C ^ n a n d d - p C ^ P p T p T ) . T h e f i r s t t w o p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e s w e r e p r e p a r e d b y s t e p w i s e s y n t h e s i s , a c c o r d i n g t o t h e s c h e m e o u t l i n e d i n F i g u r e 2 . A n T h e t r i n u c l e o t i d e d-pC p T p T w a s p r e p a r e d b y a s l i g h t l y d i f f e r e n t s t e p w i s e p r o c e d u r e . In t h e E x p e r i m e n t a l a n d R e s u l t s s e c t i o n , P a r t I, p r o c e d u r e s w h i c h f o l l o w d i r e c t l y f r o m p u b l i s h e d r e p o r t s h a v e n o t b e e n r e p e a t e d , b u t r a t h e r t h e r e f e r e n c e s h a v e b e e n l i s t e d a n d t h e y i e l d s a n d c h r o m a t o g r a p h i c , a n d s p e c t r a l d a t a o n t h e c o m p o u n d s s y n t h e s i z e d , a r e d i s c u s s e d . M A T E R I A L S AND METHODS N u c l e o t i d e s a n d C h e m i c a l s . T h e o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s s y n t h e s i z e d w e r e a l l p r e p a r e d f r o m t h e f o u r d e o x y r i b o n u c l e o s i d e 5 ' m o n o p h o s p h a t e s . T h e s e f o u r n u c l e o t i d e s , d - p A , d - p G , d-pC a n d d - p T , w e r e p u r c h a s e d f r o m P - L B i o c h e m i c a 1 s , I n c . , M i l w a u k e e , W i s c o n s i n , a n d R a y l o C h e m i c a l s , L t d . , E d m o n t o n , A l b e r t a . T h e p u r i t y o f t h e s e n u c l e o t i d e s w a s c h e c k e d ( a t l e a s t 2 y m o l e s o f e a c h n u c l e o t i d e ) b y p a p e r c h r o m a t o g r a p h y i n s y s t e m s A , B a n d C ( s e e p a g e 3 4 ) , a n d f o u n d t o b e 38% o r b e t t e r . T h e n u c l e o t i d e s w e r e u s e d w i t h o u t f u r t h e r p u r i f i c a t i o n . T h e f o l l o w i n g l i s t o f c h e m i c a l s a n d o t h e r m a t e r i a l s , a n d t h e i r p u r i f i c a t i o n m e t h o d s , w e r e u s e d . F o r t h e p u r i f i c a t i o n o f c h e m i c a l s by d i s t i l l a t i o n , t h e c h e m i c a l s w e r e d j s t i l l e d t h r o u g h a 5 0 cm f r a c t i o n a t i n g c o l u m n c o n t a i n i n g g l a s s t u b i n g c h i p s , e x c e p t w h e r e n o t e d o t h e r w i s e . D i s t i l l a t i o n s a t r e d u c e d p r e s s u r e w e r e c a r r i e d o u t u s i n g a n o i l v a c u u m pump w h i c h g a v e a p r e s s u r e o f a b o u t 0 . 1 mm. P y r i d i n e (B & A , p u r i f i e d g r a d e ) w a s d i s t i l l e d ( b p 1 1 4 ° ) a t s t a n d a r d p r e s s u r e f r o m t o l u e n e s u 1 f o n y 1 c h l o r i d e ( E a s t m a n O r g a n i c s , R o c h e s t e r , N . Y . ) ( 2 5 g / l i t r e ) . T h e d i s t i l l a t e w a s s t o r e d a t l e a s t t w o w e e k s o v e r c a l c i u m h y d r i d e c h i p s ( A l p h a I n o r g a n i c s , I n c . , B e v e r l e y , M a s s . ) p r i o r t o u s e . B e n z o y l c h l o r i d e ( E a s t m a n O r g a n i c s , R o c h e s t e r N . Y . ) was d i s t i l l e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a n d s t o r e d i n a d a r k b o t t l e . p - A n i s o y l c h l o r i d e ( p - m e t h o x y b e n z o y 1 c h l o r i d e ) ( A l d r i c h C h e m i c a l C o . , I n c . , M i l w a u k e e , W i s c o n s i n ) was d i s t i l l e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e ( b p 8 7 ° ) . T h e c l e a r d i s t i l l a t e w a s s t o r e d i n a d a r k b o t t l e . A c e t i c a n h y d r i d e (B & A ) w a s p u r i f i e d b y d i s t i l l a t i o n a t r e d u c e d p r e s s u r e , a n d s t o r e d i n a d a r k b o t t l e . H y d r a c r y l o n i t r i l e ( $ - c y a n o e t h a n d l ) ( E a s t m a n O r g a n i c s , R o c h e s t e r , N . Y . ) w a s u s e d a s s u p p l i e d . D i c y c l o h e x y c a r b o d i i m i d e (DCC) ( A l d r i c h C h e m i c a l C o . , I n c . , M i l w a u k e e , W i s c o n s i n ) w a s u s e d a s s u p p l i e d . 2 - M e s i t y l e n e s u l f o n y l c h l o r i d e (2,k,6-trimethy1 b e n z e n e s u I f o n y I c h l o r i d e ) ( A l d r i c h C h e m i c a l C o . , I n c . , M i l w a u k e e , W i s c o n s i n ) w a s p u r i f i e d b y . c h a r c o a l f i l t r a t i o n (2 t o 3 X ) a n d r e c r y s t a l 1 i z a t i o n f r o m w a r m c y c l o h e x a n e ( 3 X ) . T h e w h i t e c r y s t a l s w e r e d r i e d o v e r ^2^5' ' n v a c u o , a n d s t o r e d , i n v a c u o , o v e r ^2^5' T r i e t h y l a m i n e ( E a s t m a n O r g a n i c s , R o c h e s t e r , N . Y . ) w a s d i s t i l l e d a t s t a n d a r d p r e s s u r e ( b p 87 ° ) f r o m t o l u e n e s u 1 f o n y l c h l o r i d e (25 g / 1 i t r e ) . T r i b u t y l a m i n e ( E a s t m a n O r g a n i c s , R o c h e s t e r , N . Y . ) was d i s t i l l e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e ( b p 4 5 ° ) . T r i h e x y l a m i ne (K&K L a b o r a t o r i e s , I n c . , P l a i n v i e w , N . Y . ) w a s d i s t i l l e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e w i t h o u t t h e u s e o f a f r a c t i o n a t i n g c o l u m n . R P h o s p h o r u s p e n t o x i d e ( G r a n u s i c ) was t h e p r o d u c t o f J . T . B a k e r C h e m i c a l C o . , P h i 1 1 i p s b u r g , N . J . B i o - R a d AG 50W-X2 ( B i o - R a d L a b o r a t o r i e s , R i c h m o n d , C a l i f o r n i a ) 2 0 0 - 4 0 0 m e s h , c a p a c i t y 0 . 7 m e q / m l r e s i n b e d , w a s r e g e n e r a t e d b y w a s h i n g w i t h a t l e a s t f i v e v o l u m e s 2 N N a O H , 2 v o l u m e s 1 N NaOH (50% e t h a n o l ) , w a t e r , 5 v o l u m e s 2 N H C l , a n d w a t e r t o n e u t r a l i t y . 0 - ( d i e t h y l am i n o e t h y 1 ) e e l 1 u l o s e , s t a n d a r d g r a d e ( S c h l e i c h e r 6 S c h u e l l , I n c . , K e e n e , New H a m p s h i r e ) , w a s p r e c y c l e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d i n t h e Wha tman T e c h n i c a l B u l l e t i n ( 1 1 6 ) . V a r i o u s p r e p a r a t i o n s r a n g e d f r o m 0 . 9 t o O .98 m e q / g d r y c e l l u l o s e . A l l . o t h e r c h e m i c a l s u s e d w e r e s t a n d a r d l a b o r a t o r y c h e m i c a l s ' o f r e a g e n t g r a d e . M e t h o d s In t h e s y n t h e s i s o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e s d e s c r i b e d i n t h e E x p e r i m e n t a l a n d R e s u l t s s e c t i o n , a n u m b e r o f p r o c e d u r e s a r e s i m i l a r f o r t h e d i f f e r e n t n u c l e o t i d e s . F o r b r e v i t y , t h e s e h a v e b e e n s u m m a r i z e d b e l o w . 1. C o n v e r s i o n o f n u c l e o t i d e s t o p y r i d i n i u m s a l t s . T h e s a l t o r f r e e a c i d f o r m o f t h e n u c l e o t i d e w a s d i s s o l v e d i n w a t e r ( 1 0 m l / 5 m m o l e s ) a n d p a s s e d t h r o u g h a B i o - R a d AG 50W-X2 c o l u m n , 2 . 5 x 10 cm ( p y r i d i n i u m f o r m , f r e s h l y p r e p a r e d ) . T h e n u c l e o t i d e was e l u t e d i n 100 t o 2 0 0 ml d i l u t e a q u e o u s p y r i d i n e (5% ) a n d c o n c e n t r a t e d e i t h e r by r o t a r y e v a p o r a t i o n o r f r e e z e -d r y i n g . 2 . A n h y d r o u s c o n d i t i o n s . N u c l e o t i d e s w e r e r e n d e r e d a n h y d r o u s b y r e p e a t e d e v a p o r a t i o n ( a t l e a s t 3X ) o f d r y p y r i d i n e o n a n o i l v a c u u m pump e q u i p p e d w i t h a d r y i c e , m e t h a n o l c o l d t r a p . T h e n u c l e o t i d e s t h e n w e r e s u s p e n d e d i n t h e d e s i r e d v o l u m e o f a n h y d r o u s p y r i d i n e f o r t h e r e a c t i o n . A l l s y n t h e t i c s t e p s , w h e t h e r i t b e a p r o t e c t i o n s t e p , o r o n e i n v o l v i n g t h e s y n t h e s i s o f a n i n t e r - d e o x y r i b o n u c l e o t i d e b o n d w e r e c a r r i e d o u t i n d r y p y r i d i n e , i n t h e d a r k , a t r o o m t e m p e r a t u r e , a n d a l l r e a c t i o n f l a s k s w e r e s h a k e n v i g o r o u s l y o n a m e c h a n i c a l w r i s t a c t i o n s h a k e r . 3 . S t o p p i n g r e a c t i o n s . When s u l f o n y l c h l o r i d e c o n d e n s a t i o n r e a c t i o n s a r e s t o p p e d b y t h e a d d i t i o n o f w a t e r , h e a t i s p r o d u c e d . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s t h e r e f o r e f i r s t c o o l e d i n a n i c e - w a t e r b a t h p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f w a t e r , s o t h a t t h e f l a s k d i d n o t b e c o m e w a r m . T h i s w a s d o n e t o m i n i m i z e l o s s o f p r o t e c t i n g g r o u p s . k. C o n d e n s a t i o n r e a c t i o n w o r k u p . a . DCC R e a c t i o n s . F o r w o r k i n g up DCC r e a c t i o n s , a n e q u a l v o l u m e o f w a t e r was a d d e d , a n d t h e d i c y c l o h e x y l u r e a f i l t e r e d o f f a n d w a s h e d w i t h d i l u t e a q u e o u s p y r i d i n e . T h e f i l t r a t e w a s e x t r a c t e d 3X w i t h a n e q u a l v o l u m e o f e i t h e r c y c l o h e x a n e o r d i e t h y l e t h e r t o r e m o v e u n r e a c t e d c a r b o d i i m i d e , a n d t h e n u c l e o t i d e s o l u t i o n l e f t o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e . b . S u l f o n y l c h l o r i d e r e a c t i o n s . A n e q u a l v o l u m e o f . w a t e r a n d o f t r i a l k y l a m i n e was a d d e d t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e w h i c h w a s l e f t f o r h t o 16 h o u r s a t r o o m t e m p e r a t u r e . c . R e m o v a l o f t e r m i n a l p r o t e c t i n g g r o u p s . T h e g e n e r a l p r o c e d u r e f o r t h e r e m o v a l o f t h e c y a n o e t h y l g r o u p f r o m t h e 5'~ p h o s p h o m o n o e s t e r a n d t h e a c e t y l g r o u p f r o m t h e 3 ' h y d r o x y l o f t h e n u c l e o t i d e s w i t h o u t r e m o v i n g t h e a c y l p r o t e c t i n g g r o u p o n t h e h e t e r o c y c l i c a m i n o r e s i d u e s w a s t o c o o l t h e a q u e o u s p y r i d i n e m i x t u r e t o 0 ° , a d d a n e q u a l v o l u m e o f 2 N NaOH ( 0 ° ) , s t i r f o r 2 0 m i n u t e s a t 0 ° , a n d t h e n r a p i d l y n e u t r a l i z e w i t h B i o - R a d AG 50W r e s i n ( h y d r o g e n f o r m ) . T h e n u c l e o t i d e s w e r e r e c o v e r e d b y f i l t e r i n g o f f t h e r e s i n a n d w a s h i n g i t e x t e n s i v e l y w i t h d i l u t e a q u e o u s p y r i d i n e . 5. A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e c t e d n u c l e o t i d e s . T h e p r o d u c t s o f a c o n d e n s a t i o n r e a c t i o n w e r e p u r i f i e d b y c h r o m a t o g r a p h y o n D E A E - c e l l u l o s e c o l u m n s . T h e p r o t e c t e d n u c l e o t i d e s w e r e c h r o m a t o g r a p h e d u s i n g e i t h e r T E A B (pH 8 . 5 ) o r T E A A (pH 5-5) b u f f e r s , n o r m a l l y i n a c o l d r o o m a t 8 ° i n a n e f f o r t t o m i n i m i z e l o s s o f p r o t e c t i n g g r o u p s . N i n e t y - f i v e p e r c e n t e t h a n o l ( 1 0 t o 35% b y v o l u m e ) was i n c l u d e d i n t h e e l u t i o n ^ b u f f e r s . 3 2 6. C o n c e n t r a t i o n o f p r o t e c t e d n u c l e o t i d e s f o l l o w i n g a n i o n  e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y . I t w a s f o u n d , m o s t c o n v e n i e n t t o c o n c e n t r a t e t h e p r o t e c t e d n u c l e o t i d e s by f i r s t r e m o v i n g t h e t r i e t h y l a m m o n i u m i o n s by a d d i n g B i o - R a d AG 50W r e s i n ( h y d r o g e n f o r m ) u n t i l t h e pH d r o p p e d t o b e l o w 5- T h e r e s i n w a s t h e n f i l t e r e d o f f a n d t h e n u c l e o t i d e s r e c o v e r e d b y e x t e n s i v e l y w a s h i n g t h e r e s i n w i t h d i l u t e a q u e o u s p y r i d i n e . T h e n u c l e o t i d e s w e r e t h e n c o n c e n t r a t e d o n ; a B u c h i R o t a v a p o r R e v a p o r a t o r u s i n g t h e v a c u u m o f a n o i l p u m p . T h e c o n d e n s o r w a s c o o l e d t o - 2 ° ( H a a k e m o d e l KT41 c i r c u l a t i n g b a t h ) s u c h t h a t a r e a s o n a b l e t e m p e r a t u r e g r a d i e n t b e t w e e n c o n d e n s o r a n d e v a p o r a t i o n f l a s k c o u l d b e m a i n t a i n e d w h i l e k e e p i n g t h e e v a p o r a t i o n f l a s k a t l e s s t h a n 2 0 ° . T h e n u c l e o t i d e s w e r e r e n d e r e d a n h y d r o u s , d i s s o l v e d i n a s m a l l v o l u m e o f d r y p y r i d i n e a n d a d d e d d r o p w i s e t o a n h y d r o u s e t h e r . T h e w h i t e p r e c i p i t a t e s w e r e c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n . 7 . R e m o v a l o f a l l p r o t e c t i n g g r o u p s . When a l l p r o t e c t i n g g r o u p s ( C E , O A c , N - B z , N-An) w e r e t o be r e m o v e d , t h e n u c l e o t i d e s , i n a s m a l l v o l u m e o f a q u e o u s p y r i d i n e , w e r e i n c u b a t e d w i t h 3 v o l u m e s o f c o n c e n t r a t e d NH^OH f o r e i t h e r a ) 4 8 h o u r s a t room t e m p e r a t u r e (91); o r b) 3 h o u r s a t 60 ° ( 1 0 5 ) - T h e NH^OH was r e m o v e d b y r o t a r y . e v a p o r a t i o n a t 35 ° . 8 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o t e c t e d d i - a n d t r i n u c l e o t i d e s . T h e n u c l e o t i d e s w e r e c h a r a c t e r i z e d b y p a p e r c h r o m a t o g r a p h y p r i o r t o a n d a f t e r r e m o v a l o f p r o t e c t i n g g r o u p s . T h e d e p r o t e c t e d n u c l e o t i d e s w e r e t h e n t r e a t e d . w i t h a n a l i q u o t o f E s c h e r i c h i a c o l i a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( W o r t h i n g t o n o r M i l e s ) a n d a g a i n c h e c k e d f o r h o m o g e n e i t y o n p a p e r . T h e d e p h o s p h o r y l a t e d n u c l e o t i d e w a s t h e n d e g r a d e d w i t h a n a l i q u o t o f s n a k e v e n o m p h o s p h o d i e s t e r a s e ( W o r t h i n g t o n ) a n d t h e p r o d u c t s s e p a r a t e d o n p a p e r ( n o r m a l l y s y s t e m A o r D) ( s e e 10 b e l o w ) . T h e s e w e r e e l u t e d ( 1 1 0 ) a n d t h e a b s o r b a n c e o f e a c h a c c u r a t e l y m e a s u r e d i n o r d e r t o o b t a i n m o l a r r a t i o s a s a c o n f i r m a t i o n o f s t r u c t u r e . 9 . T h e p u r i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f l o n g e r o l i g o - n u c l e o t i d e s f r o m t h e p o l y m e r i z a t i o n o f p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e s . A f t e r t h e p o l y m e r i z a t i o n r e a c t i o n , t h e n u c l e o t i d e s w e r e d e p r o t e c t e d ( s e e 7 a b o v e ) a n d s e p a r a t e d b y a n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y ( D E A E - c e 1 1 u 1 o s e , C 0 ~ o r C I f o r m ) , i n t h e p r e s e n c e o f 7 M u r e a , f o l l o w e d b y e x t e n d e d p a p e r c h r o m a t o g r a p h y o f a p p r o p r i a t e p e a k s i n s y s t e m C ( s e e 10 b e l o w ) . T h e m a j o r b a n d s w e r e e l u t e d w i t h 0 . 1 % N H ^ O H , a n d t h e p u r i t y o f t h e s e l o n g e r o l i g o n u c l e o t i d e s c h e c k e d b y a l k a l i n e p h o s p h a t a s e d i g e s t i o n o f a s a m p l e o f t h e n u c l e o t i d e a n d c h r o m a t o g r a p h y i n s y s t e m C . T h e a s s u m p t i o n i s t h a t m a j o r c o n t a m i n a n t s w i l l b e p y r o p h o s p h a t e s a n d c y c l i c o l i g o -n u c l e o t i d e s , r e s i s t a n t t o a l k a l i n e p h s o p h a t a s e ( r e f . 1 0 1 , f o o t n o t e 23). T h u s , i f a l l t h e a l k a l i n e p h o s p h a t a s e t r e a t e d o l i g o n u c l e o t i d e m o v e s a h e a d o f n o n - t r e a t e d n u c l e o t i d e , t h e n t h e o l i g o m e r c o n t a i n s a t e r m i n a l 5 l - p h o s p h a t e g r o u p a n d i s t h e d e s i r e d , l i n e a r m o l e c u l e . 34 10 . P a p e r c h r o m a t o g r a p h y . A l l p a p e r c h r o m a t o g r a p h y w a s d o n e o n Wha tman #40 ( d o u b l e a c i d w a s h e d ) p a p e r , u s i n g t h e d e s c e n d i n g t e c h n i q u e . F o u r s y s t e m s h a v e b e e n u s e d : A 35% e t h a n o l : M ammon ium a c e t a t e , pH 7 .5 ( 7 :3 ) B i s o b u t y r i c a c i d : M ammon ium h y d r o x i d e ( 5 : 3 ) C n - p r b p a n o l c o n c e n t r a t e d a m m o n i a : w a t e r ( 5 5 : 1 0 : 3 5 ) D i s o p r o p a n o l c o n c e n t r a t e d a m m o n i a : w a t e r ( 7 : 1 : 2 ) I n c h e c k i n g t h e p u r i t y o f n u c l e o t i d e s a t l e a s t 2 y m o l e s (20 a b s o r b a n c e u n i t s o f n o n - p r o t e c t e d n u c l e o t i d e , a n d a s much a s 40 a b s o r b a n c e u n i t s o f p r o t e c t e d n u c l e o t i d e ) w e r e u s e d . N u c l e o t i d e s w e r e d e t e c t e d u n d e r ' s h o r t u l t r a v i o l e t l i g h t u s i n g a C h r o m a t o v u e f r o m U l t r a v i o l e t P r o d u c t s I n c o r p o r a t e d . E X P E R I M E N T A L AND RESULTS 1 . S y n t h e s i s o f 0 1 i g o d e o x y t h y m i d y l a t e P o l y m e r s T e r m i n a t e d  w i t h a 5 ' - P h o s p h a t e a n d 3 ' - H y d r o x y 1 ( d ( p T ) n = 2 t o 1 2 ) . T h e s y n t h e s i s o f o l i g o d e o x y t h y m i d y l a t e p o l y m e r s w a s a c h i e v e d b y t w o s e p a r a t e p r o c e d u r e s : a ) t h e p o l y m e r i z a t i o n o f t h e m o n o n u c l e o t i d e , d - p T , a n d b ) t h e p o l y m e r i z a t i o n o f t h e t r i n u c l e o t i d e , d - p T p T p T . a ) P o l y m e r i z a t i o n o f d - p T . T h e p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T w a s c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o K h o r a n a a n d C o n n e r s ( 1 1 1 ) , w i t h t h e e x c e p t i o n t h a t no d - p T - O A c w a s u s e d . T h e r e s u l t a n t n u c l e o -t i d e s w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a D E A E - c e l 1 u l o s e c o l u m n (CO^ f o r m ) a n d e l u t e d w i t h a 1 i n e a r g r a d i e n t o f N H ^ H C O ^ . N u c l e o t i d e s u p t o t h e d e c a m e r , d ( p T ) ^ , w e r e o b t a i n e d p l u s a p e a k o f h i g h e r o l i g o n u c l e o t i d e s e l u t e d w i t h M NH^HCO^ . ( R e c h r o m a t o g r a p h y o f t h e h i g h e r o l i g o m e r s o n a s m a l l e r D E A E - c e l 1 u l o s e c o l u m n r e s u l t e d i n r e s o l u t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s a s l o n g a s d ( p T ) ^ . ) T h e p e a k s c o r r e s p o n d i n g t o d(pl)^, d ( p T ) ^ , d ( p T ) , . a n d d ( p T ) ^ w e r e i d e n t i f i e d b y a l k a l i n e p h o s p h a t a s e d . i g e s t i o n f o l l o w e d b y v e n o m p h o s p h o d i -e s t e r a s e d i g e s t i o n t o o b t a i n t h e m o l a r r a t i o o f dT t o d - p T ( s e e T a b l e I I ) . T a b l e I I I l i s t s t h e y i e l d s o f t h e v a r i o u s o l i g o m e r s a s w e l l a s t h e y i e l d s r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e ( 1 1 1 ) . C o m p a r i s o n w i t h t h e r e p o r t e d y i e l d s i n d i c a t e s t h a t t h i s p o l y m -e r i z a t i o n d i d n o t go a s w e l l , h o w e v e r , a d e q u a t e y i e l d s o f t h e T a b l e I I . C h a r a c t e r i z a t i o n o f d e p h o s p h o r y 1 a t e d o l i g o n u c l e o t i d e s d i g e s t i o n a n d e s t i m a t i o n o f m o l a r r a t i o s . b y v e n o m p h o s p h o d i e s t e r a s e N u c l e o t i d e A . U . d e g r a d e d dT dC dA dG d - p T d-pC d - p A d-pG T h e o r e t i c a 1 ^ m o l a r r a t i o s 1 a d - T p T 15 1 .00 - 1.07 - - 1 :1 2 a d - T p T p T p T 16 1.00 _ 3 .04 - - - 1 :3 3 a d - T p T p T p T p T 1 3 1 .00 - 3.98 - - - 1 :4 4 a d - T p T p T p T p T p T p T 7 1.00 _ 5.70 - - - 1:6 5 d - T p T 16 1 .09 • - ' 1.00 - - - 1:1 6 d - T p T p T 7 1 .00 - 1.80 - - - 1:2 7 d - T p T p C 5 1.03 • _ 1.00 1 .00 - - 1:1:1 8 d - C p T p T • 12 - 1.00 - - 1.88 - - - 1 :2 9 d - A p A 2 - - 1 .04 - - - 1 .00 - 1:1 10 d - A p A p G 12 - 0.93 . - - - 1 .16 1 .00 1:1:1 O l i g o n u c l e o t i d e s o b t a i n e d b y p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T . A l l o t h e r s w e r e f r o m s t e p w i s e c o n d e n s a t i o n r e a c t i o n s . 3 T h e o r e t i c a l m o l a r r a t i o s o f t h e e x p e c t e d n u c l e o s i d e s a n d n u c l e o t i d e s r e a d i n g i n o r d e r f r o m l e f t t o r i g h t a c r o s s t h e t a b l e . ON T a b l e I I I . Y i e l d o f o l i g o n u c l e o t i d e s d ( p T ) n f r o m t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T . 0 1 i g o - A . U . Y i e l d L i t e r a t u r e n u c l e o t i d e (267 nm) (%) y i e l d % a d i 9900 17.0 12.82 t r i 9600 16.5 14 .77 t e t r a 6500 11.2 12.19 p e n t a 4090 7.0 7-29 h e x a 2215 3-8 7.29 h e p t a 1200 2.1 4.39 o c t a 680 1 .2 2.7 n o n a 410 0.7 1.37 d e c a a n d h i g h e r 643 1.1 2 .63 a Y i e l d r e p o r t e d b y K h o r a n a a n d C o n n e r s (111). o l i g o m e r s up t o t h e n o n a n u c l e o t i d e w e r e o b t a i n e d , a n d a s j u d g e d b y c h r o m a t o g r a p h y i n s y s t e m C , t h e p e n t a - t h r o u g h n o n a n u c l e o t i d e s w e r e f r e e f r o m c o n t a m i n a n t s a n d s u i t a b l e f o r u s e i n e x p e r i m e n t s w i t h o u t f u r t h e r p u r i f i c a t i o n . b ) P o l y m e r i z a t i o n o f t h e t r i n u c l e o t i d e , d - p T p T p T . ( i ) S t e p w i s e s y n t h e s i s o f d ( p T ) ^ . T h e l a r g e s c a l e s y n t h e s i s o f d ( p T ) ^ w a s c a r r i e d o u t b y t h e s t e p w i s e c o n d e n s a t i o n o f s u i t a b l y p r o t e c t e d d e o x y t h y m i d y l a t e u n i t s a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g s c h e m e . C E d - p T + d - p T - O A c 1) D C C , p y r i d i n e ; Sf. 2) N N a O H , 20 m i n , 0 ° . d - p T p T D C C , h y d r a c r y l o n i t r i l e , p y r i d i n e C E d - p T p T + d - p T - O A c 1) M s S 0 2 C l , p y r i d i n e , THA 2) N N a O H , 20 m i n , 0 ° . u d - p f p T p T T h e p r o c e d u r e f o r t h e s y n t h e s i s o f t h e $ - c y a n o e t h y l d e r i v a t i v e o f d - p T h a s b e e n d e s c r i b e d ( 1 1 2 , 113). In a s i m i l a r p r o c e d u r e , s t a r t i n g w i t h k m m o l e s o f p y r i d i n i u m d - p T , a y i e l d o f 3.56 m m o l e s {&3%) o f t h e m o n o c y a n o e t h y 1 a t e d p r o d u c t was o b t a i n e d . T h e p r o d u c t was h o m o g e n e o u s i n s y s t e m A w i t h R^ . = 0 .75, R , _ = 1 .61 ( T a b l e I V ) . d - p l T h e 3 ' ~ 0 - a c e t y l d e r i v a t i v e o f d-pT w a s p r e p a r e d a c c o r d i n g t o K h o r a n a a n d V i z s o l y i ( 1 0 1 ) . T h e p r o d u c t , o b t a i n e d i n q u a n t i t a t i v e y i e l d , w a s h o m o g e n e o u s i n s y s t e m s A a n d B, w i t h R f i n s y s t e m A o f 0 .49, R d _ p T = 1.21, a n d R f i n s y s t e m B o f 0 .73, R d - p T = 1 - ^ 0 , T n e s P e c t r a o f b o t n d - p T - O A c a n d C E d - p T w e r e i d e n t i c a l t o d - p T . T h e s y n t h e s i s o f t h e d i n u c l e o t i d e d - p T p T w a s c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o t h e g e n e r a l p r o c e d u r e r e p o r t e d b y N a r a n g e_t^  a_l_. ( 1 0 3 ) . T h e p y r i d i n i u m s a l t s o f C E d - p T a n d d - p T - 0 A c (0.8 m m o l e e a c h ) w e r e c o m b i n e d , r e n d e r e d a n h y d r o u s , a n d d i s s o l v e d i n 3 ml d r y p y r i d i n e . DCC (1.6 g m , 8 m m o l e s ) w a s a d d e d a n d t h e r e a c t i o n s e a l e d a n d s h a k e n f o r hi d a y s . A f t e r t h e n o r m a l w o r k u p f o r a ' DCC c o n d e n s a t i o n r e a c t i o n ( s e e M e t h o d s ) , t h e p r o d u c t s w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a D E A E - c e l l u l o s e c o l u m n ( F i g . 3 ) . T u b e s 95 t o 1 5 0 c o n t a i n e d t h e d e s i r e d p r o d u c t . T h e y i e l d w a s 0 . 4 2 m m o l e (52.5%). T h e d i n u c l e o t i d e was c o n c e n t r a t e d b y r o t a r y e v a p o r a t i o n a n d c h a r a c t e r i z e d b y p a p e r c h r o m a t o g r a p h y a n d e n z y m a t i c d e g r a d a t i o n . T h e d - p T p T w a s h o m o g e n e o u s i n s y s t e m B, w i t h R^ . = 0 . 4 2 . E n z y m a t i c r e m o v a l o f t h e 5 l _ p h o s p h a t e g a v e d - T p T , R^ . ( s y s t e m B) = 0 .59. T h e m o l a r r a t i o o f dT t o d - p T a f t e r v e n o m p h o s p h o d i e s t e r a s e d i g e s t i o n w a s 1.09 t o 1.00 ( T a b l e I I ) . 4o T a b l e I V . Summary o f R^ . v a l u e s o f n o n - p r o t e c t e d a n d p r o t e c t e d n u c l e o t i d e s . S o l v e n t S y s t e m S o l v e n t S y s t e m A B CPD_ C o l o u r R f d - p T R f R d - p T C E d - p T P 0.75 1 .61 d - p T - O A c P 0 . 49 1 .21 0 .73 1 . 5 0 d - p T p T P 0 . 36 - 0 . 4 2 -d - T p T P - s 0 .59 -C E d - p T p T P 0 .63 - - -d - p T p T p T P - - 0 . 2 8 -d - T p T p T P - - 0 . 4 6 -• r A n d-pC B f 0 .47 1 . 2 7 - • -A n d - p C -OAc B f 0 . 6 0 1 . 6 2 - - , d - p T p T p C A n B f 0 . 2 7 0 .68 - -d - p T p T p C P 0 . 1 5 0 .38 - -d - T p T p C P 0 .47 1 . 1 0 - -d - p T p T - O A c P 0 . 4 0 0 .99 - -C E d - p C A n B f 0 . 60 2 .34 - -d i C E d - p C A n B f 0 .63 4 .60 - -d - p C A n p T p T B f 0 . 2 4 0 .63 - -d - p C p T p T P 0 . 1 2 0 . 2 8 - -d - C p T p T P 0 ,38 1 . 0 4 - -• rtBz d - pA P B f 0 . 5 0 1 . 3 0 - -: . n B z n B z ' d - A p-pA f P B r 0 . 7 0 1 . 8 0 - -c d - A p - p A P 0 .29 0 . 75 -C E d - p A B z P B f 0 .74 1 .88 - -d - p A B z - 0 A c P B f 0 . 6 4 1.60 - -A A B Z A B Z d - p A pA f P B T 0 .44 1 . 2 6 - -4o ( c o n t i n u e d ) T a b l e I V . Summary o f R^ . v a l u e s o f n o n - p r o t e c t e d a n d p r o t e c t e d n u c l e o t i d e s - C o n t i n u e d . CPD C o l o u r S o l v e n t S y s t e m S o l v e n t S y s t e m A B R f R d - p T R f R d - p T d - p A p A P 0 . 1 4 0.37 - -d - A p A P 0.45 1.21 -C E d - p A B z p A B z P B f O.85 1.73. - -d - P G B z Y f 0 . 4 1 • . _ -* d - G B z p - p G B z ( ? ) Y f 0.78 - -d - p G B z - 0 A c Y f 0 . 4 1 - -. . B z . B z _ B z d - p A pA pG Y f 0.43 1 . 0 0 -d - p A p A p G P 0.12 0.23 -d - A p A p G P 0.32 0.68 - -A b b r e v i a t i o n s : R, _ - R,, r e l a t i v e t o dTMP d - p T f , P - p u r p l e PB^ - p u r p l e - b l u e f l u o r e s c e n t B^ - b l u e f l u o r e s c e n t Y^ - y e l l o w f l u o r e s c e n t . T h e s e s t r u c t u r e s a r e t h e 5 1 l i n k e d p y r o p h o s p h a t e s , d - N 5 ' p -p 5 ' N . T h e y a r e a l s o a b b r e v i a t e d a s < " Bz ' < * ' a n d < ? B z \ p A B z \ P A \ P G B z . 41 50 100 150 200 TUBE NUMBER F i g u r e 3 . A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y d - p T p T . T h e s a m p l e (500 m l ) w a s a p p l i e d t o a D E A E - c e l l u l o s e c o l u m n i n t h e c a r b o n a t e f o r m (2.5 x 40 c m ) , p r e -e q u i l i b r a t e d w i t h 0.05 M NH/jHCO^, pH 8 .0. A f t e r w a s h i n g t o r e m o v e t h e p y r i d i n e , t h e n u c l e o t i d e s w e r e e l u t e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o f NH/jHCO., (0.05 M t o 0.15 M , 4 1 t o t a l ) , a t a f l o w r a t e o f 2.5 ml p e r m i n . • T h e d i n u c l e o t i d e d - p T p T was c o n v e r t e d t o t h e c y a n o e t h y l a t e d d e r i v a t i v e u s i n g DCC a n d h y d r a c r y 1 o n i t r i 1 e ( 1 0 3 ) - S t a r t i n g w i t h 1.9 m m o l e s o f t h e p y r i d i n i u m s a l t o f d - p T p T , a y i e l d o f 1 .3 m m o l e s (68%) o f t h e d e s i r e d p r o d u c t was o b t a i n e d . T h e C E d - p T p T h a d a R^ . o f 0 . 6 3 , a n d R d _ o f 1.75 i n s y s t e m A . T h e t r i n u c l e o t i d e d - p T p T p T was p r e p a r e d by c o n d e n s i n g C E d - p T p T w i t h a f i v e - f o l d e x c e s s o f t h e p r o t e c t e d m o n o n u c l e o t i d e , d - p T - O A c . T h e t r i h e x y l a m m o n i u m s a l t s o f C E d - p T p T ( 1 . 1 m m o l e s ) a n d d - p T - O A c (5.1 m m o l e s ) w e r e r e n d e r e d a n h y d r o u s a n d d i s s o l v e d i n 10 ml d r y p y r i d i n e . M s S O ^ C l (3-24 g , 1 4 . 6 m m o l e s ) was a d d e d a n d t h e r e a c t i o n a l l o w e d t o p r o c e e d f o r 4 h o u r . A f t e r t h e u s u a l w o r k u p f o r a s u l f o n y l c h l o r i d e c o n d e n s a t i o n r e a c t i o n ( s e e M e t h o d s ) , t h e p r o d u c t s w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a D E A E - c e l 1 u l o s e c o l u m n ( c a r b o n a t e f o r m ( F i g . 4 ) . T h e d e s i r e d t r i n u c l e o t i d e (39% y i e l d ) was l o c a t e d i n t u b e s 3 2 5 t o 4 4 0 . T h e p r o d u c t was p u r e a s j u d g e d b y c h r o m a -t o g r a p h y i n s y s t e m B (R = 0 . 2 8 ) . A l k a l i n e p h o s p h a t a s e d i g e s t i o n o f a s a m p l e o f t h e t r i -n u c l e o t i d e r e s u l t e d i n c o m p l e t e c o n v e r s i o n t o d - T p T p T (R^. = 0 . 4 6 i n s y s t e m B ) . A m o l a r r a t i o o f dT t o d-pT o f 1 . 0 0 t o 1.80 was o b t a i n e d a f t e r v e n o m , p h o s p h o d i e s t e r a s e d i g e s t i o n . . ( Tab 1 e l l ) . ( i i ) P o l y m e r i z a t i o n o f . t h e t r i n u c l e o t i d e d - p T p T p T (91). T h e t r i n u c l e o t i d e d - p T p T p T was p o l y m e r i z e d u s i n g t h e c o n d e n s i n g a g e n t , M s S 0 2 C l . 0 . 1 6 mmo le o f t r i n u c l e o t i d e ( 4 6 0 0 A . U . 266 nm) w e r e c o n v e r t e d t o t h e p y r i d i n i u m s a l t o n a B i o - R a d AG 50W c o l u m n , 43 e C O H * H N W wu on V F i g u r e 4 . A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f d - p T p T p T . T h e _ s a m p l e (2 1) was c h r o m a t o g r a p h e d o n . a D E A E - c e l 1 u l o s e (COo ) c o l u m n (5 x 30 c m ) , p r e - e q u i 1 i b r a t e d w i t h 0 . 0 5 M NH^HCOo . T h e n u c l e o t i d e s w e r e e l u t e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o f NH^HCOo ( 0 . 0 5 M t o 0 . 2 7 5 M, 14 1 t o t a l ) a t a f l o w r a t e o f 5 ml p e r m i n u t e . a n d a p p r o x i m a t e l y 25% o f t h i s was a c e t y l a t e d i n 1 ml d r y p y r i d i n e a n d 0 . 3 ml a c e t i c a n h y d r i d e ( o v e r n i g h t ) . A f t e r a w o r k u p s i m i l a r t o t h a t f o r t h e s y n t h e s i s o f d - p T - O A c , t h e p r o d u c t , d - p T p T p T - O A c , w a s r e n d e r e d a n h y d r o u s a n d p r e c i p i t a t e d w i t h d i e t h y l e t h e r . T h i s a c e t y l a t e d d e r i v a t i v e was c o m b i n e d w i t h t h e r e m a i n d e r o f t h e t r i n u c l e o t i d e a n d d i s s o l v e d i n 2 ml d r y p y r i d i n e . S u f f i c i e n t t r i h e x y l a m i n e ( 1 6 0 u l , 0 . 4 6 mmo le ) was i n c l u d e d t o s o l u b i l i z e t h e n u c l e o t i d e . M s S O ^ C l (425 m g , 1.91 mmo les ) w a s a d d e d a n d t h e r e a c t i o n m i x t u r e i m m e d i a t e l y c o n c e n t r a t e d t o a g u m . A f t e r 3 h o u r , t h e r e a c t i o n was s t o p p e d b y t h e a d d i t i o n o f 2 ml e a c h o f p y r i d i n e , w a t e r a n d t r i e t h y l a m i n e , a n d t h e f l a s k was s t o r e d o v e r n i g h t ( 1 6 h o u r ) . T h e a c e t a t e g r o u p w a s r e m o v e d by a m m o n o l y s i s ( s e e M e t h o d s ) , a n d t h e n u c l e o t i d e s w e r e c o n c e n t r a t e d f o r c h r o m a t o g r a p h y o n D E A E - c e l 1 u l o s e ( F i g . 5) . T h e p e a k s c o n t a i n i n g t h e v a r i o u s o l i g o m e r s , d ( p T ) ^ , d ( p T ) ^ , d ( p T ) Q a n d d ( p T ) . „ ( i n d i c a t e d i n F i g . 5 ) , w e r e p o o l e d a n d y I z c o n c e n t r a t e d t o r e m o v e NH^HCO^ . T h e s e s a m p l e s w e r e p u r i f i e d b y e x t e n d e d c h r o m a t o g r a p h y o n Wha tman #40 p a p e r i n s y s t e m C . T h e m a j o r b a n d s w e r e e l u t e d w i t h 0 . 1 % NH^OH, a n d t h e p u r i t y o f t h e c o m p o u n d c h e c k e d by a l k a l i n e p h o s p h a t a s e d i g e s t i o n o f a n a l i q u o t ( 10 A . U . ) a n d r e c h r o m a t o g r a p h y . A l t h o u g h t h e y i e l d o f t h e o l i g o m e r s ( T a b l e V) was r e l a t i v e l y h i g h j u d g e d o n t h i s f i n a l p o l y m e r i z a t i o n s t e p , t h e o v e r a l l y i e l d s 9 9 T h e o v e r a l 1 y i e l d i s t h a t y i e l d b a s e d o n t h e a m o u n t o f s t a r t i n g p r o t e c t e d m o n o n u c l e o t i d e . T h e o v e r a l l y i e l d f o r t h e h e x a n u c l e o t i d e , d ( p T ) , , i s t h e p r o d u c t o f t h e % y i e l d s i n t h e s y n t h e s e s o f d - p T p T (52.5%), C E d - p T p T ( 6 8 % ) , d - p T p T p T ( 3 9 % ) , a n d t h e h e x a n u c l e o t i d e , d ( p T ) , ( 1 8 . 5 % , T a b l e V ) . F i g u r e 5. A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y s e p a r a t i o n o f p r o d u c t s f r o m t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T p T p T . T h e s a m p l e (100 m l ) was a p p l i e d t o a D E A E - c e l l u l o s e (CO^) c o l u m n (2.5 cm x 45 c m ) , p r e - e q u i 1 i b r a t e d w i t h 0.075 M NH^HCO^. T h e n u c l e o t i d e s w e r e e l u t e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o f NH^HCO^ (0.075 M t o 1.0 M , 6 1 t o t a l ) a t a f l o w r a t e o f 3 m l p e r m i n ( n o t e t h a t t h e a b s o r b a n c e 270 nm s c a l e c h a n g e s a t t u b e n u m b e r 143). .c-T a b l e V , Y i e l d o f o l i g o n u c 1 e o t i d e o b t a i n e d by p o l y m e r i z a t i o n o f s u i t a b l y p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e s . A B C D E F G H 0 1 i g o -n u c l e o t i d e L e n g t h o f c h r o m a t o g r a p h y ( h o u r s ) D i s t a n c e m o v e d (cm) A . U . S t r e a k e d o n p a p e r A . U . r e c o v e r e d % Y i e l d 3 O v e r a l l y i e l d ( % ) b Y i e l d i n p o l y m e r i z a t i o n o f m o n o n u c l e o t i d e (%) d ( P T ) 6 24 17 1 ,008 848 18.5 2.6 7.29 d ( P T ) 9 48 15 620 527 11.5 1.6 1 .37 d ( P T ) 1 2 k8 8 300 118 2.6 0.36 n o t g i v e n ; p r o b a b l y 0.4 d ( p T p T p C ) 2 k8 28.5 1,750 1,130 9-75 1-55 -d ( p T p T p C ) 3 k8 16.8 378 208 1.8 0.29 -d C p T p T p C ) ^ k8 6.5 355 184 1.58 0.25 -d ( p C p T p T ) 2 2k 15 921 745 16.9 -d ( p C p T p T ) ^ k8 12 1,755 1,264 6.1 1.56 -d ( p A p A p G ) 2 12 19-0 461 127 4.5 0.11 -d ( p A p A p G ) 3 120 8.8 307 56 1 -97 0 . 048 -d ( p A p A p G ) ^ 168 5.3 140 39 1.37 0.034 -a - % o f t o t a l n u c l e o t i d e p o l y m e r i z e d ; - o v e r a l l y i e l d i s b a s e d o n t h e y i e l d s o f a l l i n t e r m e d i a t e s f r o m t h e p r o t e c t e d m o n o n u c l e o t i d e s t i m e s t h e f i n a l y i e l d a t t h e p o l y m e r i z a t i o n s t e p . F o r d ( p T ) n t h i s i s t h e p r o d u c t o f y i e l d s o f d - p T p T (52 .5% ) , C E d - p T p T ( 6 8 % ) , a n d d - p T p T p T (39%) t i m e s c o l u m n F. F o r d ( p T p T p C ) n t h i s i s t h e p r o d u c t o f y i e l d s o f d - p T p T (52 .5%) , C E d - p T p T ( 68% ) , a n d d - p T p T p C A n ( 4 4 . 5 % ) , t i m e s c o l u m n F. F o r d ( p C p T p T ) n t h i s i s t h e p r o d u c t o f y i e l d s o f d - p T p T (52 .5%) , d - p T p T - O A c (100%), a n d d - p C p T p T ( 4 6 % ) , t i m e s c o l u m n F. F o r d ( p A p A P G ) n t h i s i s t h e p r o d u c t o f y i e l d s o f d - p A B z p A B z ( 4 5 - 5 % ) , C E d - p A B z p A B z (69%), a n d d - p A B z p A B z p G B z ( 7 . 8 % ) . - y i e l d i n p o l y m e r i z a t i o n o f m o n o n u c l e o t i d e i s t h e y i e l d o f t h e c o r r e s p o n d i n g o l i g o n u c l e o t i d e o b t a i n e d f r o m t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T (111). w e r e n o t h i g h . C o n s i d e r i n g t h o s e y i e l d s o b t a i n a b l e f r o m a d i r e c t p o l y m e r i z a t i o n o f d-pT ( T a b l e V ) , t h e a m o u n t o f e x t r a w o r k i n v o l v e d i n t h e s t e p w i s e s y n t h e s i s o f a t r i n u c l e o t i d e a n d p o l y m e r i z a t i o n o f t h i s , a s w e l l a s t h e l a c k o f i n t e r m e d i a t e o l i g o m e r s ( d ( p T ) n > n = 4, 5, 7, 8, 1 0 , 11 ) t h a t c o u l d be u s e f u l i n f u r t h e r b l o c k s y n t h e s i s , i t i s o b v i o u s l y p r e f e r a b l e t o p r e p a r e t h e h o m o - o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s b y a p o l y m e r i z a t i o n o f s u i t a b l y p r o t e c t e d m o n o n u c l e o t i d e s . 2 . S y n t h e s i s o f o l i g o n u c l e o t i d e s o f r e p e a t i n g s e q u e n c e d ( p T p T P C ) n ( n = 1 t o k). T h e s y n t h e s i s o f t h e o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s o f r e p e a t i n g s e q u e n c e d - p T p T p C w a s a c h i e v e d b y t h e p o l y m e r i z a t i o n o f t h e A n p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e d - p T p T p C . ' a ) S y n t h e s i s o f t h e p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e , d - p T p T p C A n . A n T h e t r i n u c l e o t i d e d - p T p T p C w a s p r e p a r e d b y s t e p w i s e s y n t h e s i s o f a p p r o p r i a t e l y p r o t e c t e d m o n o - a n d d i n u c l e o t i d e s a c c o r d i n g t o t h e g e n e r a l p r o c e d u r e r e p o r t e d b y N a r a n g et_ a j _ . ( 1 0 3 ) . T h e p r o c e d u r e i s o u t l i n e d b e l o w . C E d - p T + d - p T - O A c . 1) D C C , p y r i d i n e ; 2 ) N N a O H , 20 m i n , 0 ° . d - p T p T D C C , h y d r a c r y l o n i t r i l e , p y r i d i n e An . C E d - p T p T + d-pC -OAc 1) M s S 0 2 C l , p y r i d i n e , T H A ; * 2) N N a O H , 20 m i n , 0 ° . d - p T p T P C A n T h e s t e p s u p t o a n d i n c l u d i n g t h e s y n t h e s i s o f C E d - p T p T h a v e b e e n d e s c r i b e d a b o v e . T h e p r o c e d u r e u s e d t o p r e p a r e t h e N - a n i s o y 1 a t e d d e r i v a t i v e o f d-pC h a s b e e n d e s c r i b e d i n t h e l i t e r a t u r e ( 1 1 4 ) . T h e w o r k u p u s e d was t h a t d e s c r i b e d w i t h t h e e x c e p t i o n t h a t t h e A n d-pC w a s e l u t e d . f r o m t h e B i o - R a d AG 50W c o l u m n w i t h 25% a q u e o u s p y r i d i n e r a t h e r t h a n t h e r e p o r t e d 5%- ( T h i s h i g h e r a m o u n t o f p y r i d i n e was u s e d b e c a u s e o f t h e l o w s o l u b i l i t y o f t h e p r o t e c t e d d e r i v a t i v e i n d i l u t e a q u e o u s p y r i d i n e . ) T h e y i e l d o f t h e d - p C ^ n w a s q u a n t i t a t i v e . T h e p r o d u c t ( b l u e f l u o r e s c e n t (B^) u n d e r s h o r t UV) h a d a n R f o f 0 .47 a n d R d _ p J o f 1 .27 i n s y s t e m A . A l l p r e p a r a t i o n s c o n t a i n e d t w o m i n o r c o n t a m i n a n t s . One w a s p r e s e n t i n v e r y s m a l l a m o u n t s ( < 1 % ) , was b l u e f l u o r e s c e n t a n d h a d a n R^ . o f 0 .79- T h e o t h e r h a d a n R f o f 0 . 8 3 a n d was i d e n t i f i e d b y i t s s p e c t r u m a s a n i s i c a c i d . T h e p r e p a r a t i o n w a s u s e d a s s u c h . T h e s p e c t r a l d a t a o n t h e m a j o r s p o t (R^. 0 .47) a g r e e d w i t h t h a t r e p o r t e d f o r d-pC ( 1 1 4 ) ; Amax 3 0 2 ; A m i n 2 3 5 , i n f l e c t i o n 2 5 5 -T h e a c e t y l a t i o n o f d - p C ^ n was d o n e a s r e p o r t e d b y S c h a l l e r a n d K h o r a n a ( 1 1 5 ) . T h e p r o d u c t o b t a i n e d a f t e r 1 y o p h i 1 i z a t i o n was a f l u f f y w h i t e p o w d e r w h i c h was i n s o l u b l e i n d r y p y r i d i n e . T h e y i e l d w a s q u a n t i t a t i v e a n d t h e s p e c t r a l c h a r a c t e r i s t i c s t h e s ame a s f o r d - p C ^ n . T h e p r o d u c t h a d a n R^ . = 0 .60 i n s y s t e m A , w i t h a t r a c e c o n t a m i n a n t (B^) a t R^ . = 0 . 7 3 . A n T h e s y n t h e s i s o f t h e p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e , d - p T p T p C w a s c a r r i e d o u t by t h e g e n e r a l p r o c e d u r e o f N a r a n g e t a l . ( 1 0 3 ) . A n C E d - p T p T (1 m m o l e ) a n d d-pC -OAc (3 mmo les ) w e r e c o m b i n e d ( w i t h 1 7 5 y l , 0 . 5 1 m m o l e THA ) a n d r e n d e r e d a n h y d r o u s . 1 0 T h e s a m p l e w a s s u s p e n d e d i n 10 ml d r y p y r i d i n e a n d M s S 0 2 C l (2 g , 9 m m o l e s ) was a d d e d . T h e n u c l e o t i d e s u s p e n s i o n b e c a m e h o m o g e n e o u s w i t h i n 1 t o 2 m i n . T h e r e a c t i o n w a s l e f t 6 h o u r a n d t h e n w o r k e d u p a c c o r d i n g t o t h e g e n e r a l p r o c e d u r e f o r a s u l f o n y l c h l o r i d e c o n d e n s a t i o n r e a c t i o n ( s e e M e t h o d s ) . T h e p r o d u c t s w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a D E A E - c e l 1 u l o s e c o l u m n ( a c e t a t e f o r m ) ( F i g . 6 ) . T h e d e s i r e d t r i n u c l e o t i d e was o b t a i n e d f r o m t u b e s 5 0 0 t o 7 0 0 . T h e y i e l d w a s 0 .445 m m o l e (44.5%) b a s e d o n a c a l c u l a t e d E ^ q o f 3 4 , 2 0 0 A n f o r d - p T p T p C . T h e p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e w a s h o m o g e n e o u s i n . s y s t e m A w i t h = 0 . 2 7 , R j - p j = 0-68. T h e s p e c t r a l p r o p e r t i e s o f d - p T p T p C A n w e r e A m a x 1 1 . 86 , A m a x 2 3 0 3 , A m i n 1 2 3 7 a n d A m i n , , , 2 9 6 a t pH 7 . 0 . A n In t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f d - p T p T p C , a m m o n o l y s i s g a v e d - p T p T p C ( R f = 0 . 1 5 , R d _ p T = 0-38, s y s t e m A ) . D e p h o s p h o r y l a t i o n o f d - p T p T p C g a v e d - T p T p C ( R f = 0 . 4 7 , R d _ p T = 1 - 1 , s y s t e m A ) . T h e m o l a r r a t i o o f d T : d - p T : d - p C o b t a i n e d a f t e r v e n o m p h o s p h o d i e s t e r a s e d i g e s t i o n was 1 . 0 3 : 1 • 0 0 : 1 . 0 0 ( T a b 1e l l ) . 1 0 I t was f o u n d t h a t t h e m o n o t r i h e x y 1 a m m o n i u r n s a l t o f t h e p r o t e c t e d c y t i d i n e n u c l e o t i d e w a s v e r y i n s o l u b l e i n d r y p y r i d i n e , a n d a t c o n c e n t r a t i o n s g r e a t e r t h a t 1 m m o l e / 1 0 ml c o n s i s t e n t l y c ame o u t o f s o l u t i o n . H o w e v e r , w h e n t h e m i x t u r e was made a n h y d r o u s a n d t h e n u c l e o t i d e s s u s p e n d e d i n t h e r e a c t i o n v o l u m e o f d r y p y r i d i n e , f o r t u n a t e l y , o n t h e a d d i t i o n o f t h e c o n d e n s i n g a g e n t , M s S 0 2 C l , . - t h e p r o t e c t e d d - p C A n g o e s i n t o s o l u t i o n f o r t h e d u r a t i o n o f t h e r e a c t i o n . 50 F i g u r e 6. A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f p r o d u c t s f r o m t h e A n s y n t h e s i s o f d - p T p T p C T h e s a m p l e (2 1) w a s l o a d e d o n t o a D E A E - c e l l u l o s e ( O A c ) c o l u m n (5 x 35 c m ) , p r e - e q u i 1 i b r a t e d w i t h 0.1 M T E A A , pH 6.5 (35% e t h a n o l ) . T h e s a m p l e w a s w a s h e d i n w i t h s t a r t i n g b u f f e r a n d e l u t e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o f T E A A (16 1), pH 6 .5 , 35% e t h a n o l (0.1 M t o 0.2 M) a t a f l o w r a t e o f 3 ml p e r m i n . T h e h o m o g e n e i t y o f t h e t r i n u c l e o t i d e p e a k w a s e x a m i n e d b y l o o k i n g a t t h e r a t i o o f a b s o r b a n c e a t 303/270 nm. b) P o l y m e r i z a t i o n o f t h e t r i n u c l e o t i d e , d - p T p T p C A n (91). A n T h e p y r i d i n i u m s a l t o f d - p T p T p C ( 0 . 4 4 5 m m o l e , 1 4 , 5 0 0 A . U . „ ^ ) r 2 7 0 nm w a s p o l y m e r i z e d b y a p r o c e d u r e s i m i l a r t o t h a t d e s c r i b e d f o r t h e A n p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T p T p T . T h e t r i n u c l e o t i d e (25% a s d - p T p T p C - O A c ) w a s r e n d e r e d a n h y d r o u s a n d d i s s o l v e d i n 2 ml d r y p y r i d i n e a n d 2 0 0 u l (O .58 m m o l e ) t r i h e x y 1 a m i n e . M s S 0 2 C l ( 2 . 7 m m o l e s , 0 . 6 g ) w a s a d d e d a n d t h e m i x t u r e c o n c e n t r a t e d t o a g u m . T h e r e a c t i o n w a s l e f t f o r 2 h o u r a n d t h e n w o r k e d up a s d e s c r i b e d f o r t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T p T p T . T h e p r o d u c t s w e r e ' c h r o m a t o g r a p h e d o n a D E A E - c e l 1 u l o s e c o l u m n ( F i g . 7 ) . T h e t r i - , h e x a - , n o n a -a n d d o d e c a n u c l e o t i d e p e a k s w e r e c o n c e n t r a t e d t o r e m o v e ammon ium b i c a r b o n a t e a n d c h r o m a t o g r a p h e d i n s y s t e m C . T h e m a j o r b a n d s c o r r e s p o n d i n g t o t h e h e x a - , n o n a - a n d d o d e c a n u c 1 e o t i d e s w e r e e l u t e d w i t h 0 . 1 % NH^OH a n d c h e c k e d f o r p u r i t y b y a l k a l i n e p h o s p h a t a s e t r e a t m e n t o f a s a m p l e ( 10 A . U . ) a n d r e c h r o m a t o g r a p h y i n s y s t e m C . T h e y i e l d s o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e s a r e g i v e n i n T a b l e V . 3 . S y n t h e s i s o f o l i g o n u c l e o t i d e s o f t h e s e q u e n c e d ( p C p T p T ) n (n = 1 t o 4) . O l i g o n u c l e o t i d e s o f t h e s e q u e n c e d ( p C p T p T ) ^ w e r e p r e p a r e d A n b y t h e p o l y m e r i z a t i o n o f t h e p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e d-pC p T p T . a ) S y n t h e s i s o f d-pC p T p T . T h e s y n t h e s i s o f t h e p r o t e c t e d A n t r i n u c l e o t i d e d-pC pTpT w a s a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e o u t l i n e d . F i g u r e 7- A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f p r o d u c t s f r o m t h e A n p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T p T p C . T h e s a m p l e (210 m l ) w a s l o a d e d o n t o a D E A E - c e l 1 u 1 o s e ( C0~ ) c o l u m n (2.5 x 36 c m ) , p r e - e q u i 1 i b r a t e d w i t h 0.075 M NH^HCO^ . T h e n u c l e o t i d e s w e r e e l u t e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o f NH^HCOj (0.075 M t o 0.65 H , k 1 t o t a l ) , a t a f l o w r a t e o f 2.5 ml p e r m i n . ( N o t e t h a t t h e a b s o r b a n c e 270 nm s c a l e c h a n g e s a t t u b e n u m b e r 165.) C E d - p T + d - p T - O A c 1) D C C , p y r i d i n e ; 2) N N a O H , 0 ° , 20 m i n . d - p T p T a c e t i c a n h y d r i d e , p y r i d i n e C E d - p C A n V + d - p T p T - O A c 1) MsSO C l , p y r i d i n e ; T H A ; 2) N N a O H , 0 ° , 20 m i n . d-pC p T p T . T h e p r e p a r a t i o n o f t h e d i n u c l e o t i d e d - p T p T a n d t h e p r o t e c t e d A n m o n o n u c l e o t i d e d-pC h a s b e e n d e s c r i b e d e a r l i e r . T h e d i n u c l e o t i d e w a s a c e t y l a t e d b y r e a c t i n g 1 . 7 5 m m o l e s o f t h e p y r i d i n i u m s a l t o f d - p T p T i n d r y p y r i d i n e ( 2 0 m l ) w i t h 8 . 2 ml ( 8 7 - 5 m m o l e s ) o f a c e t i c a n h y d r i d e . T h e r e a c t i o n w a s l e f t f o r 5 i h o u r a n d t h e n w o r k e d up i n a s i m i l a r p r o c e d u r e f o r t h e a c e t y l a t i o n o f d - p T ( 1 0 1 ) . T h e y i e l d o f d - p T p T - O A c w a s q u a n t i t a t i v e , a n d t h e p r o d u c t h a d a n i n s y s t e m A o f 0 . 4 0 ( R d _ p T = 0 . 9 9 ) . T h e c y a n o e t h y l a t e d d e r i v a t i v e o f d - p C A n ( 5 - 5 m m o l e s ) w a s p r e p a r e d b y r e a c t i o n i n 2 5 ml d r y p y r i d i n e w i t h 2 5 ml h y d r a c y l -o n i t r i l e ( 2 8 0 m m o l e s ) a n d 4 . 5 g ( 2 1 . 6 m m o l e s ) D C C , f o r 2k h r . T h e w o r k up was s i m i l a r t o t h a t f o r t h e p r e p a r a t i o n o f C E d - p T ( 1 0 1 ) w i t h t h e e x c e p t i o n t h a t t h e p r o d u c t w a s i n c u b a t e d f o r k h o u r a t r o o m t e m p e r a t u r e a t a pH o f 8 . 5 ( a d j u s t e d w i t h M T E A B , r a t h e r t h a n NH^OH) i n o r d e r t o c o n v e r t a n y d i c y a n o e t h y l a t e d d e r i v a t i v e t o t h e m o n o - s u b s t i t u t e d p r o d u c t . T h e p r o d u c t o b t a i n e d a f t e r p r e c i p i t a t i o n f r o m d r y p y r i d i n e b y e t h e r w a s a w h i t e p o w d e r . T h e y i e l d w a s 4.15 m m o l e s (75%)- T h e s p e c t r u m w a s i d e n t i c a l t o d - p C ^ n . T h e R^ i n s y s t e m A o f t h e m a j o r s p o t w a s 0.60 ( R d _ p J = 2.34). M i n o r s p o t s a t R f = 0.49 (M o f t o t a l A . U . p u t o n p a p e r ) a n d R^ . = O.63 {&% o f t o t a l A . U . p u t o n p a p e r ) w e r e a l s o e v i d e n t . ( T h i s l a t t e r , m a j o r c o n t a m i n a n t w a s p r o b a b l y r e s i d u e l d i c y a n o e t h y l d e r i v a t i v e , a s i n a s u b s e q u e n t p r e p a r a t i o n , i n c u b a t i o n a t pH 8 . 5 f o r 8 h o u r e l i m i n a t e d t h i s s p o t . ) T h e p r e p a r a t i o n w a s u s e d a s s u c h . A n T h e t r i n u c l e o t i d e d - p C pTpT w a s p r e p a r e d u s i n g t h e c o n d e n s i n g a g e n t M s S O ^ C l . T h e t w o r e a c t i o n s , C E d - p C ^ P (4.15 m m o l e s ) a n d d - p T p T - O A c (1.75 m m o l e s ) w e r e c o m b i n e d a n d s u s p e n d e d i n 30 ml p y r i d i n e w i t h 200 u l (0.58 m m o l e ) t r i h e x y l a m i n e . T h e n u c l e o t i d e s w e r e r e n d e r e d a n h y d r o u s a n d s u s p e n d e d i n 15 m l d r y p y r i d i n e . 1 1 M s S O ^ C l (2 g , 9 m m o l e s ) , w a s a d d e d a n d t h e r e a c t i o n a l l o w e d t o p r o c e e d f o r Si h o u r . T h e w o r k u p w a s t h a t n o r m a l l y f o l l o w e d f o r a s u l f o n y l c h l o r i d e c o n d e n s a t i o n ( s e e M e t h o d s ) . T h e p r o d u c t s w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a D E A E - c e l 1 u l o s e c o l u m n ( F i g . 8 ) . T h e p r o t e c t e d c y t i d i n e m o n o n u c l e o t i d e w a s i n s o l u b l e i n d r y p y r i d i n e . H o w e v e r , a s s o o n a s t h e s u l f o n y l c h l o r i d e w a s a d d e d , t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s h o m o g e n e o u s w i t h i n 1 t o 2 m i n . T h i s i s s i m i l a r t o t h e o b s e r v a t i o n made d u r i n g t h e s y n t h e s i s o f d - p T p T p C A n . F i g u r e 8 . A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y p u r i f i c a t i o n o f d - p C p T p T . T h e s a m p l e was l o a d e d o n t o a D E A E - c e l 1 u 1 o s e ( a c e t a t e f o r m ) c o l u m n (5 x hO c m ) , p r e - e q u i 1 i b r a t e d w i t h 0.12 M T E A A , pH 5-5< T h e n u c l e o t i d e s w e r e e l u t e d w i t h a 1 i n e a r g r a d i e n t 0.12 M t o 0.22 M T E A A , pH 5-5, 25% e t h a n o l ( 1 4 1 t o t a l ) , a t a f l o w r a t e o f 3 ml p e r m i n . T u b e s 4 4 0 t o 6 6 0 c o n t a i n e d t h e d e s i r e d p r o d u c t , d - p C A n p T p T . T h e y i e l d w a s 2 7 , 3 0 0 A . U . , ^ n m ( 4 6 % ) ( a c a l c u l a t e d e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t E 2 7 0 = 3 4 , 2 0 0 w a s u s e d ) . T h i s p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e w a s p u r e a s j u d g e d b y c h r o m a t o g r a p h y i n s y s t e m A (R^. = 0 . 2 4 , R d - p T = ° - 6 3 ) ' ' ' A f t e r a m m o n o l y s i s , t h e d - p C p T p T h a d a n R f 0 . 1 2 i n s y s t e m A ^ R d - p T = 0 - 2 8 ) . R e m o v a l o f t h e 5 l - p h o s p h a t e w i t h a l k a l i n e p h o s p h a t a s e r e s u l t e d i n c o m p l e t e c o n v e r s i o n t o t h e t r i n u c l e o t i d e d - C p T p T (R^. = O . 3 8 , s y s t e m A ) . T h e m o l a r r a t i o o f dC t o d - p T a f t e r v e n o m p h o s p h o d i e s t e r a s e d i g e s t i o n w a s . 1 . 0 0 t o 1 . 8 8 ( T a b l e I I ) c o n f i r m i n g t h e s t r u c t u r e . b) P o l y m e r i z a t i o n o f d - p C A n p T p T ( 9 1 ) . T h e p r o t e c t e d t r i -A n u c l e o t i d e d-pC pTpT ( 0 . 7 7 m m o l e , 2 6 , 4 0 0 A . U . , , . , - ) w a s r ^ r 2 7 2 nm p o l y m e r i z e d i n a s i m i l a r m a n n e r t o t h a t d e s c r i b e d f o r d ( p T ) ^ A n a n d d - p T p T p C . T h u s , 2 0 % o f t h e t r i n u c l e o t i d e w a s c o n v e r t e d A n t o d-pC p T p T - O A c a n d c o m b i n e d w i t h t h e r e m a i n i n g n u c l e o t i d e . T h e s a m p l e was d i s s o l v e d i n p y r i d i n e a n d a m i n i m u m a m o u n t o f t r i h e x y 1 a m i n e a d d e d t o s o l u b i l i z e t h e n u c l e o t i d e s ( 3 0 0 y l , 0 . 8 7 m m o l e ) . T h e s a m p l e w a s r e n d e r e d a n h y d r o u s , d i s s o l v e d i n 5 ml d r y p y r i d i n e a n d M s S O ^ C l ( 2 . 0 4 g , 9-2 mmoles ) w a s a d d e d . T h e s o l u t i o n w a s i m m e d i a t e l y c o n c e n t r a t e d t o a gum a n d l e f t 2 h o u r . T h e r e a c t i o n w a s w o r k e d up a c c o r d i n g t o t h a t d e s c r i b e d f o r t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d ( p T ) ^ . T h e p r o d u c t s w e r e s e p a r a t e d o n a p E A E - c e l l u l o s e ( c a r b o n a t e f o r m ) c o l u m n ( F i g . 9 ) - T h e p e a k s A n F i g u r e 9- A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f p r o d u c t s f r o m t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d-pC p T p T . T h e s a m p l e was a p p l i e d t o a D E A E - c e l l u l o s e (C0~ ) c o l u m n ( 2 . 5 x 50 c m ) , p r e -e q u i l i b r a t e d w i t h 0 . 0 7 5 M NH^HCO^. T h e n u c l e o t i d e s w e r e e l u t e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o f NH^HCO . (7 1 t o t a l ) , 0 . 0 1 5 M t o 0 . 8 M . T h e f l o w r a t e w a s 20 ml p e r 9 m i n . ( N o t e t h a t t h e A„-, „ s c a l e c h a n g e s a t t u b e n u m b e r 2 0 0 . ) 270 nm 3 V I 100 200 300 TUBE NUMBER c o n t a i n i n g t h e h e x a - a n d n o n a n u c 1 e o t i d e s w e r e c o n c e n t r a t e d a n d p u r i f i e d b y e x t e n d e d c h r o m a t o g r a p h y i n s y s t e m C . T h e p u r i t y o f t h e s e n u c l e o t i d e s was c h e c k e d b y d i g e s t i o n w i t h a l k a l i n e p h o s p h a t a s e , a n d r e c h r o m a t o g r a p h y i n s y s t e m C . T a b l e V l i s t s t h e y i e l d s o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e s a t t h e f i n a l p o l y m e r i z a t i o n s t e p a n d t h e o v e r a l l y i e l d s . 4 . S y n t h e s i s o f o l i g o d e o x y a d e n y l a t e p o l y m e r s , d ( p A ) (n = 2 t o 1 2 ) • T h e o l i g o d e o x y a d e n y l a t e s u s e d i n t h i s s t u d y w e r e p r e p a r e d b y D r . M i c h a e l S m i t h . T h e m e t h o d u s e d i n t h e i r p r e p a r a t i o n B z w a s t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d - p A w i t h DCC i n a n h y d r o u s p y r i d i n e . ( 1 0 0 ) . 5 . S y n t h e s i s o f o l i g o d e o x y r i b o n u c 1 e o t i d e s o f r e p e a t i n g  s e q u e n c e , d ( p A p A p G ) (n = 1 t o k). T h e s y n t h e s i s o f d e o x y r i b o - o 1 i g o m e r s o f r e p e a t i n g s e q u e n c e d - ( p A p A p G ) n w a s a c h i e v e d b y t h e p o l y m e r i z a t i o n o f t h e p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e , d - p A ^ Z p A ^ Z p G ^ Z . B z Bz B z a ) S y n t h e s i s o f t h e p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e , d - p A pA pG Bz B z Bz T h e t r i n u c l e o t i d e d - p A pA pG w a s p r e p a r e d b y a s t e p w i s e c o n d e n s a t i o n o f s u i t a b l y p r o t e c t e d m o n o - a n d d i n u c 1 e o t i d e s a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g s c h e m e . C E d - p A B z + d - p A B z - O A c 1) D C C , p y r i d i n e ; ^ 2 ) . N. N a O H , 0 ° , 20 m i n . A A 8 * A B Z d - p A pA r c , . B z . B z C E d - p A pA D C C , h y d r a c r y l o n i t r i l e , p y r i d i n e + d - p G B z - 0 A c 1) M s S 0 2 C l , p y r i d i n e , T H A ; 2) N N a O H , 0 ° , 20 m i n . , . B z . B z . B z d - p A pA pG T h e s y n t h e s i s o f d - p A w a s c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e o f R a l p h a n d K h o r a n a ( 1 0 0 ) . I t w a s f o u n d t h a t , b y i n c r e a s i n g s l i g h t l y t h e v o l u m e s o f p y r i d i n e a n d b e n z o y l c h l o r i d e r e l a t i v e t o t h e n u c l e o t i d e ( 3 0 ml p y r i d i n e , 3 n i l b e n z o y l c h l o r i d e p e r m m o l e n u c l e o t i d e i n s t e a d o f 20 ml p y r i d i n e , 2 . 5 ml b e n z o y l c h l o r i d e ( 1 0 0 ) ) a n d b y k e e p i n g t h e r e a c t i o n t i m e t o a m i n i m u m , t h e d e s i r e d p r o d u c t c o u l d b e o b t a i n e d i n q u a n t i t a t i v e y i e l d w i t h a m i n i m u m o f i m p u r i t i e s . T h e p r o d u c t o b t a i n e d b y l y o p h i 1 i z a t i o n w a s a f l u f f y w h i t e p o w d e r . I t h a s a n R^ . i n s y s t e m A o f 0 . 5 5 ( R , t = I . 3 6 ) . H o w e v e r , i n a l l p r e p a r a t i o n s t h e r e w a s a s e c o n d , f a s t e r m i g r a t i n g s p o t (R -^ = 0 . 7 , ^ - p T = 1 - 9 1 ) - 1 2 T h e s e c o n d B z 13 pA s p o t i s p r o b a b l y t h e d i n u c l e o s i d e p y r o p h o s p h a t e / ^ p A a n d , a s j u d g e d b y t h e a b s o r b a n c e a t 2 8 2 n m , was p r e s e n t , c o n s i s t e n t l y , i n s e v e r a l p r e p a r a t i o n s , a t 10 t o 1 1 % o f t h e t o t a l n u c l e o t i d e . ' I t was f o u n d t h a t t h i s m a j o r c o n t a m i n a n t c o u l d be r e m o v e d b y c h r o m a t o g r a p h y o n a D E A E - c e l l u l o s e (CO^) c o l u m n , e l u t i n g w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o f TEAB t o 0 . 1 2 M 1 2 B e n z o y l a t e d a d e n o s i n e r e s i d u e s a r e d i f f i c u l t t o d e t e c t u n d e r UV l i g h t , a n d i n o r d e r t o s e e t h e i m p u r i t y , a t l e a s t 25 t o 30 A . U . 2 3 Q n m m u s t b e s p o t t e d o n t h e p a p e r . T o d i s t i n g u i s h t h e s e b e n z o y l a t e d a d e n o s i n e r e s i d u e s f r o m a n i s o y l a t e d c y t o s i n e r e s i d u e s , I h a v e d e s c r i b e d t h e f o r m e r a s p u r p l e b l u e f l u o r e s c e n t ( P B f ) a n d t h e l a t t e r a s b l u e f l u o r e s c e n t ( B f ) , u n d e r s h o r t U V . 1 3 T h e f a s t e r m o v i n g s p o t w a s c h a r a c t e r i z e d b y c h r o m a t o g r a p h y p r i o r t o a n d a f t e r r e m o v a l o f t h e b e n z o y l g r o u p . A s i d e f r o m t h e R f v a l u e s i n s y s t e m s A a n d B ( T a b l e I V ) , t h e c o m p o u n d h a d a n R f = 0 . 5 * * ( s y s t e m C) a n d 0 . 1 7 ( s y s t e m D) . In a l l o f t h e s e s y s t e m s t h i s ( d e b e n z o y l a t e d ) c o m p o u n d was n o t c o m p l e t e l y r e s o l v e d f r o m d - p A . H o w e v e r , i n a f i f t h c h r o m a t o g r a p h y s y s t e m ( 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r , pH 6 . 8 ( 1 0 0 m l : ( N H i ^ S O ^ (60 g ) : n - p r o p a n o l (2 m l ) ) , t h e t w o a r e r e s o l v e d . T h e c o m p o u n d w a s s t a b l e t o a l k a l i n e p h o s p h a t a s e , w h i l e d i g e s t i o n w i t h v e n o m p h o s p h o d i e s t e r a s e c o n v e r t e d i t q u a n t i t a t i v e l y t o t h e m o n o n u c l e o t i d e d - p A . T h e s e d a t a a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e s t r u c t u r e o f t h e c o n t a m i n a n t b e i n g t h e N , N 1 - d i b e n z o y l d i n u c l e o s i d e p y r o p h o s p h a t e , fiBz <pA P A B Z T h e s p e c t r u m o f t h i s c o m p o u n d w a s s l i g h t l y . B z d i f f e r e n t f r o m t h a t o f d - p A B z (Xmax d - p A B z 2 8 2 nm, Amax < / P _ \ p A B z 2 8 3 n m ) . (25% in e thanol ) at 8 ° . Under these c o n d i t i o n s the contaminant was e lu t ed in a t r a i l i n g shoulder of the main peak of UV absorb ing m a t e r i a l . La te r i t was found by Dr. M. Smith that chromatography of the nuc l eo t i des on a s i m i l a r column in the absence of ethanol in the e l u t i o n g rad i en t gave an improved s e p a r a t i o n . Under these c o n d i t i o n s , the pyrophosphate e l u t e s as a smal l peak not comple te l y reso lved from the main peak. Bz CEd-pA was prepared acco rd ing to Ohtsuka e_t a_l_. (113) . Bz S t a r t i n g w i t h 7 mmoles of d-pA ( p u r i f i e d ) the des i r ed product 6.8 mmoles (37%) was ob t a i ned . The product had an R^ . in system A of 0 .74 , R . _ = 1.88. d-p I Bz The 3 l - 0 - a c e t y l p ro tec ted d e r i v a t i v e of d-pA was prepared " Ac acco rd ing to a method desc r ibed f o r the p r epa r a t i on of d-pA -OAc Bz (100 ) . . S t a r t i n g w i th 1.4 mmoles of d-pA , a y i e l d of 0.98 mmole Bz (70%) o f d-pA -OAc was ob t a i ned . ( i n o ther p r e p a r a t i o n s , the y i e l d s were normal ly h i g h e r ; 90. to 100%..) The product obta ined . by p r e c i p i t a t i o n from p y r i d i n e w i th anhydrous e ther was a wh i te powder. It was homogeneous in system A (R .^ = 0 .64 , R d _ p j = 1.60) . The spec t r a of the CE- and 3 ' " 0 - a c e t y l d e r i v a t i v e s of d - p A B z were s i m i l a r to that of d-pA^ Z . Bz Bz The d i n u c l e o t i d e d-pA pA was prepared by condensat ion Bz Bz of equimolar amounts of CEd-pA and d-pA -OAc (103)• 2.9 mmoles of CEd-pA B z and 3-1 mmoles of d-pA -OAc were condensed i n 15 ml d r y p y r i d i n e w i t h 4.2 m m o l e s D C C a n d 1.2 g B i o - R a d AG 50W r e s i n i n t h e p y r i d i n i u m f o r m . A f t e r 6 d a y s t h e r e a c t i o n w a s w o r k e d u p a s f o r a DCC c o n d e n s a t i o n ( s e e M e t h o d s ) . T h e p r o d u c t s w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a D E A E - c e l 1 u 1 o s e c o l u m n ( F i g . T O ) . T u b e s 2 6 0 t o 3 6 0 c o n t a i n e d t h e d i n u c l e o t i d e , w h i c h w a s c o n c e n t r a t e d b y t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d i n M e t h o d s . T h e p r o d u c t w a s o b t a i n e d a s a w h i t e p o w d e r by p r e c i p i t a t i o n f r o m d r y p y r i d i n e w i t h e t h e r . T h e y i e l d was 48 ,000 A . U . 282 nm ( 1 . 3 2 m m o l e s , 45.5% b a s e d o n a c a l c u l a t e d E^g2 ° f 3 6 , 4 0 0 ) . T h e p r o t e c t e d d i n u c l e o t i d e w a s h o m o g e n e o u s i n s y s t e m A (R^. = 0.44, R ^ . p j = 1 . 2 6 ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p r o d u c t , a f t e r a m m o n o l y s i s , s h o w e d t h a t d - p A p A h a d a n R^ . = 0 . 1 4 i n s y s t e m A . A l k a l i n e p h o s p h a t a s e d i g e s t i o n r e s u l t e d i n c o m p l e t e c o n v e r s i o n t o d - A p A (R^. i n s y s t e m A = 0.45). T h e m o l a r r a t i o o f dA t o d - p A a f t e r v e n o m p h o s p h o -d i e s t e r a s e d i g e s t i o n was 1 . 00 t o 1 . 0 4 , c o n f i r m i n g t h e s t r u c t u r e d - p A p A . B z Bz C E d - p A pA w a s p r e p a r e d a c c o r d i n g t o t h e g e n e r a l p r o c e d u r e r e p o r t e d b y N a r a n g et_ a j _ . ( 1 0 3 ) . A y i e l d o f 0 . 9 m m o l e (69%) o f B z Bz t h e C E d - p A pA w a s o b t a i n e d . T h e p r o d u c t was h o m o g e n e o u s i n s y s t e m A w i t h Rf = 0.85 ( R d_ p T = 1-73). B z T h e p r o t e c t e d n u c l e o t i d e d-pG w a s p r e p a r e d b y r e a c t i n g t h e p y r i d i n i u m s a l t o f d-pG w i t h b e n z o y l c h l o r i d e i n d r y p y r i d i n e ( 1 0 2 ) . T h e v o l u m e s o f p y r i d i n e a n d b e n z o y l c h l o r i d e w e r e i n c r e a s e d f r o m t h a t r e p o r t e d b y R a l p h e t a l . ( 1 0 2 ) , t o F i g u r e 10. A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y p u r i f i c a t i o n o f d - p A pA T h e s a m p l e (1800 m l ) w a s l o a d e d o n t o a D E A E - c e l l u l o s e (C0~ ) c o l u m n (5 x 25 c m ) , p r e - e q u i 1 i b r a t e d w i t h 0.05 M TEAB (25% e t h a n o l b y v o l u m e ) a t 8 ° . T h e n u c l e o t i d e s w e r e e l u t e d w i t h a n 8 1 g r a d i e n t i n T E A B (25% e t h a n o l ) , f r o m 0.05 M t o 0.175 M , a t a f l o w r a t e o f 5 ml p e r m i n . O A 30 ml p y r i d i n e , 3 ml b e n z o y l c h l o r i d e p e r m m o l e m o n o n u c l e o t i d e , a n d t h e r e a c t i o n w a s a l l o w e d t o p r o c e e d f o r 2 h o u r . A f t e r a w o r k u p s i m i l a r t o t h a t d e s c r i b e d i n t h e l i t e r a t u r e (102), t h e p r o d u c t w a s c h r o m a t o g r a p h e d t o c h e c k i t s p u r i t y . T h e m a j o r . s p o t ( y e l l o w f l u o r e s c e n t , Y^) h a d a n R^ = 0 . 4 8 , R ^ . p j = 1.87 i n s y s t e m A . A s e c o n d , m i n o r s p o t ( a l s o Y^) h a d a n R f = 0.78. d G B Z ( T h i s w a s p r o b a b l y t h e p y r o p h o s p h a t e / p D . T h e p r o d u c t was V u s u a l l y o b t a i n e d a s a l i g h t b r o w n p o w d e r a n d w a s r o u t i n e l y p u r i f i e d b y c h r o m a t o g r a p h y o n a D E A E - c e l l u l o s e ( a c e t a t e ) c o l u m n a t r o o m t e m p e r a t u r e , e l u t i n g w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o f T E A A pH 5>5, t o 0.3 M (25% i n e t h a n o l ) . 1 1 * 1 5 T h e m a j o r p e a k a t 290 n m , e l u t e d b e t w e e n 0.15 M a n d 0.175 M T E A A , w a s r e c o v e r e d a s a f l u f f y w h i t e B z p o w d e r a f t e r l y o p h i 1 i z a t i o n . T h e d-pG w a s h o m o g e n e o u s i n s y s t e m A 1 4 B z — A n e a r l y a t t e m p t t o p u r i f y d-pG o n a D E A E - c e l 1 u l o s e (CO ) e l u t i n g w i t h a g r a d i e n t o f T E A B pH 8.5 (25% e t h a n o l ) r e s u l t e d i n v e r y p o o r r e s o l u t i o n o f t h e UV a b s o r b i n g m a t e r i a l . T h e n u c l e o t i d e e l u t e d o v e r a r a n g e o f 0.05 M t o 0.2 M T E A B . A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o r t h i s p o o r r e s o l u t i o n may b e t h a t , a s m e n t i o n e d i n t h e I n t r o d u c t i o n , b e n z o y l a t i o n o f t h e h e t e r o c y c l i c a m i n o g r o u p o f d-pG l o w e r s t h e pK o f t h e r i n g h y d r o x y l . I f t h e r e w a s a c h a n g e i n pH o f t h e g r a d i e n t ( d u e t o l o s s o f C O 2 o v e r t h e 48 h o u r c h r o m a t o g r a p h y p e r i o d , o r d u e t o u s i n g o l d e r , h i g h e r p H , T E A B b u f f e r t o m a k e u p t h e 0.3 M r e s e r v o i r ) t h e n a s t h e c o n c e n t r a t i o n o f e l u t i n g i o n i n c r e a s e d , s o w o u l d t h e n e t c h a r g e o n t h e p r o t e c t e d n u c l e o t i d e . A g g r e g a t i o n o f t h e n u c l e o t i d e s may a l s o be c o n t r i b u t i n g t o ' t h e p o o r r e s o l u t i o n o b s e r v e d . ( 1 1 6 ) . 1 5 A l t h o u g h t h i s c o l u m n r e m o v e d o n l y 5% o f t h e UV a b s o r b i n g m a t e r i a l ( p r o b a b l y t h e p y r o p h o s p h a t e . p G B z , i t a l s o r e m o v e d a l l t h e v i s i b l e ( b r o w n ) c o l o u r f r o m t h e \ „ B z s a m p l e . A t t h e e n d o f t h e g r a d i e n t a t l e a s t 4 d i s t i n c t - c o l o u r e d b a n d s a r e v i s i b l e o n t h e c o l u m n . 65 w i t h R f = 0 . 4 8 . A s e c o n d UV a b s o r b i n g p e a k (5% o f t h e A . U . a t 290 nm) e l u t e d b e t w e e n 0 .225 M t o 0 .275 M T E A A . T h i s p e a k c o r r e s p o n d e d t o t h e y e l 1 o w f 1 u o r e s c e n t s p o t a t R f 0 . 7 8 a n d was p G B z ' Bz p r o b a b l y t h e p y r o p h o s p h a t e < ^ ^ B z . T h e s p e c t r u m o f d-pG w a s i d e n t i c a l t o t h a t r e p o r t e d b y R a l p h et_ a j _ . ( 1 0 2 ) ; Amax 2 9 1 , 2 6 2 , s h o u l d e r 2 4 1 , A m i n 2 7 6 a n d 223. T h e y i e l d s r a n g e d f r o m 50 t o 80%. T h e a c e t y l a t i o n o f d-pG w a s c a r r i e d o u t b y t h e m e t h o d u s e d Bz f o r t h e a c e t y l a t i o n o f d - p A . T h e p r o d u c t , o b t a i n e d b y p r e c i p i t a t i o n o f t h e n u c l e o t i d e f r o m p y r i d i n e w i t h a n h y d r o u s e t h e r , w a s a w h i t e p o w d e r . T h e y i e l d w a s q u a n t i t a t i v e . T h e D — d-pG -OAc h a d a n R f = 0 . 5 3 , R d _ p G = 2 . 5 , a n d t h e s p e c t r a l B z p r o p e r t i e s w e r e s i m i l a r t o t h o s e o f d-pG Bz Bz Bz T h e t r i n u c l e o t i d e d - p A pA pG -OAc w a s p r e p a r e d b y c o n d e n s a t i o n o f C E d - p A B z p A B z ( 0 . 8 7 m m o l e ) a n d d - p G B z - 0 A c ( 4 . 3 5 m m o l e s ) i n 10 ml d r y p y r i d i n e ( 1 0 3 ) . T h e n u c l e o t i d e s w e r e s o l u b i l i z e d b y t h e a d d i t i o n o f 2 0 0 y l ( 0 . 5 8 m m o l e ) t r i h e x y 1 a m i n e , a n d t h e c o n d e n s i n g a g e n t M s S O ^ C l ( 2 . 4 5 9 , 11 m m o l e s ) a d d e d . T h e r e a c t i o n was l e f t 6 h o u r , a n d t h e n w o r k e d u p i n t h e u s u a l way f o r a s u l f o n y l c h l o r i d e c o n d e n s a t i o n ( s e e M e t h o d s ) . T h e n u c l e o t i d e s w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a D E A E - c e l 1 u l o s e ( C0^ ) c o l u m n ( F i g . 1 1 ) . T r i n u c l e o t i d e was e l u t e d b e t w e e n 0 . 1 8 5 M t o 0 .225 M T E A B . H o w e v e r , t h e p r o d u c t was i m p u r e , 1 6 a n d w a s r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a s e c o n d D E A E - c e 1 1 u 1 o s e ( C0^ ) 1 6 T h e m a j o r c o n t a m i n a n t w a s n o t c l e a r l y r e s o l v e d f r o m d - p A B z p A B z p G B z by p a p e r c h r o m a t o g r a p h y i n s y s t e m A ; h o w e v e r , r e m o v a l o f t h e b e n z o y l g r o u p b y a m m o n o l y s i s a n d r e c h r o m a t o g r a p h y g a v e t w o n u c l e o t i d e s p o t s . -• ( R f = 0 . 1 2 , Amax 2 5 6 , t h e t r i n u c l e o t i d e d - p A p A p G , a n d R f = 0 . 2 0 , Amax 2 5 2 w i t h t h e s p e c t r u m o f a G c o m p o u n d ) . T h e m i n o r s p o t was s t a b l e t o a l k a l i n e p h o s p h a t a s e d i g e s t i o n a n d a t t e m p t s t o d i g e s t t h i s n u c l e o t i d e w i t h v e n o m p h o s p h o d i e s t e r a s e w e r e u n s u c c e s s f u l , r e s u l t i n g i n t r a c e a m o u n t s o f a p r o d u c t w i t h a n R^ s i m i l a r t o d G . T h e r e m a i n d e r o f t h e n u c l e o t i d e was u n d e g r a d e d . F i g u r e 11. A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f d-pA pA pG a t pH 8.5-T h e s a m p l e (2 1) was a p p l i e d t o a D E A E - c e l 1 u 1 o s e (CO^) c o l u m n , 5 x 35 c m , p r e - e q u i 1 i b r a t e d w i t h 0.125 M T E A B , pH 8.5. T h e c o l u m n w a s w a s h e d w i t h 0.175 M TEAB pH 8.5, a n d t h e n e l u t e d w i t h a g r a d i e n t o f T E A B , 0.175 M t o 0.275 M (16 1 t o t a l ) a t a f l o w r a t e o f 3 ml p e r m i n . A l l s o l u t i o n s w e r e 25% e t h a n o l , b y v o l u m e . O N O N c o l u m n , e l u t i n g w i t h T E A B , pH 8 . 5 . T h e p r o d u c t a f t e r t h i s s e c o n d c h r o m a t o g r a p h y a t pH 8 . 5 was s t i l l c o n t a m i n a t e d . S i n c e t h e Bz b e n z o y l a t e d d e r i v a t i v e , d-pG was e l u t e d a s a s h a r p p e a k f r o m a D E A E - c e l l u l o s e ( a c e t a t e ) c o l u m n a t pH 5 - 5 , i t was d e c i d e d t o B z B z B z t r y t o p u r i f y t h e t r i n u c l e o t i d e d - p A pA pG u n d e r s i m i l a r c o n d i t i o n s ( F i g . 1 2 ) . T h e UV a b s o r b i n g m a t e r i a l e l u t e d b e t w e e n 0 . 1 5 M a n d 0 . 2 M T E A A h a d a " b e n z o y l a t e d G " s p e c t r u m , w h i l e B z B z B z t u b e s n u m b e r s 50 t o 82 c o n t a i n e d t h e t r i n u c l e o t i d e d - p A pA pG T h e y i e l d a t t h i s p o i n t was 3 . 9 8 0 A . U . ( B a s e d o n a c a l c u l a t e d ^ 2 8 0 t ' 1 6 P r o t e c t e c ' t r i n u c l e o t i d e o f 5 0 , 5 0 0 t h e y i e l d w a s 7 . 8 % . ) T h e p r o d u c t was h o m o g e n e o u s i n s y s t e m A w i t h = 0 . 4 2 . A f t e r a m m o n o l y s i s , t h e t r i n u c l e o t i d e h a d a n R^ . = 0 . 1 2 a n d R ^ . p j = 0 . 2 3 i n s y s t e m A . T h e t r i n u c l e o t i d e was d e p h o s p h o r y 1 a t e d b y a l k a l i n e p h o s p h a t a s e t o d - A p A p G ,(R^. = 0 . 3 2 i n s y s t e m A ) , a n d t h e m o l a r r a t i o o f dA t o d - p A t o d-pG a f t e r v e n o m p h o s p h o d i e s t e r a s e d i g e s t i o n was 0 . 9 3 : 1 - 1 6 : 1 . 0 0 , c o n s i s t e n t w i t h t h e s t r u c t u r e d - A p A p G . B z B z B z b ) P o l y m e r i z a t i o n o f t h e p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e , d - p A pA pG B z B z Bz T h e t r i n u c l e o t i d e d - p A pA pG w a s p o l y m e r i z e d a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d b y N a r a n g e t a l . ( 9 1 ) • A p p r o x i m a t e l y 20% o f t h e 4 4 0 0 A . U . ( 0 . 0 8 7 m m o l e ) was a c e t y l a t e d a n d c o m b i n e d w i t h t h e r e m a i n i n g t r i n u c l e o t i d e . T h e n u c l e o t i d e s w e r e s u s p e n d e d i n 3 ml d r y p y r i d i n e a n d 50 u l t r i h e x y l a m i n e ( 0 . 1 5 m m o l e ) . T h e c o n d e n s a t i o n w a s c a r r i e d o u t by a d d i n g 2 3 0 mg ( 1 . 3 5 m m o l e s ) o f M S S O 2 C I a n d c o n c e n t r a t i n g t h e m i x t u r e t o a g u m . A f t e r 2 h o u r , t h e r e a c t i o n w a s w o r k e d up i n a s i m i l a r w a y t o t h a t d e s c r i b e d 68 TUBE NUMBER • B z Bz B z F i g u r e 12. A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f d - p A pA pG a t pH 5. T h e s a m p l e (2 1, 7400 A . U . 2 g Q ) was a p p l i e d t o a DEAE-c e l l u l o s e ( a c e t a t e ) c o l u m n (1.2 x 40 c m ) , p r e -e q u i l i b r a t e d w i t h 0 .175 M T E A A , pH 5-5 (30% e t h a n o l , b y v o l u m e ) . T h e n u c l e o t i d e s w e r e e l u t e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o f T E A A (2.5 1), pH 5.5 (0 .175 M t o 0 . 4 M, 30% e t h a n o l ) a t a f l o w r a t e o f 2 ml p e r m i n . e a r l i e r f o r t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T p T p T . T h e n u c l e o t i d e s w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a D E A E - c e l l u l o s e ( c h l o r i d e ) c o l u m n ( F i g . 13). T h e t u b e s c o n t a i n i n g t h e h e x a - , n o n a - a n d d o d e c a -n u c l e o t i d e s w e r e p o o l e d , d i l u t e d f i v e - f o l d w i t h d i s t i l l e d w a t e r a n d d e s a l t e d o n a s m a l l D E A E - c e 1 1 u 1 o s e (CO^) c o l u m n , 1.2 x 15 c m . T h e n u c l e o t i d e s w e r e e l u t e d w i t h M NH^HCO^ a n d c o n c e n t r a t e d b y r o t a r y e v a p o r a t i o n p r i o r t o c h r o m a t o g r a p h y o n Wha tman #40 p a p e r i n s y s t e m C ( s e e T a b l e V ) . T h e o v e r a l l y i e l d s o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e s a r e v e r y l o w ; h o w e v e r , t h i s i s n o t p r i m a r i l y d u e t o a l o w y i e l d a t t h e f i n a l p o l y m e r i z a t i o n s t e p , b u t r a t h e r , d u e t o t h e l o w y i e l d o f t h e t r i n u c l e o t i d e . B z B z B z F i g u r e 13- A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f t h e p r o d u c t s f r o m t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d - p A pA pG ; T h e s a m p l e ( 1 0 0 m l ) was a p p l i e d t o a D E A E - c e l 1 u 1 o s e (CI ) c o l u m n ( 1 . 2 x 50 c m ) , p r e -e q u i l i b r a t e d w i t h 0 . 1 M s o d i u m a c e t a t e , pH 5 . 5 , 0 . 0 2 M i n N a C l , 7 M i n u r e a . T h e n u c l e o t i d e s w e r e e l u t e d w i t h t h i s b u f f e r u s i n g a n i n c r e a s i n g g r a d i e n t o f N a C l . o 40 80 120 160 TUBE NUMBER §? D I S C U S S I O N 01 i g o d e o x y r i b o n u c l e o t : i d e s o f t h e s e r i e s d ( p T ) n a n d d ( p A ) n h a v e b e e n p r e p a r e d , a s w e l l a s o l i g o n u c l e o t i d e s c o n t a i n i n g t h e r e p e a t i n g s e q u e n c e s , d ( p T p T p C ) n > d C p C p T p T ) ^ , a n d d ( p A p A p G ) n (n = 1 t o k) . T h e h o m o - o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s w e r e p r e p a r e d b e c a u s e o f t h e i r r e l a t i v e e a s e o f s y n t h e s i s ( p a r t i c u l a r l y o l i g o d e o x y -t h y m i d y l a t e s ) , c o m p a r e d w i t h t h e s y n t h e s i s o f o l i g o n u c l e o t i d e s c o n t a i n i n g s p e c i f i c , m i x e d n u c l e o t i d e s e q u e n c e s . T h e s e o l i g o -n u c l e o t i d e s w e r e s u i t a b l e f o r t h e s t u d y o f a n u m b e r o f t h e p r o p e r t i e s o f i n t e r a c t i o n s b e t w e e n c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s , b o t h i n s o l u t i o n a n d o n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e . T h e t h r e e c o m p l e m e n t a r y r e p e a t i n g s e q u e n c e s w e r e p r e p a r e d i n o r d e r t h a t o n e m i g h t be a b l e t o e v a l u a t e t h e e f f e c t o f m i x e d b a s e s e q u e n c e s ( i n c l u d i n g GC b a s e p a i r s ) o n t h e s t a b i l i t y o f o l i g o n u c l e o t i d e i n t e r a c t i o n s . T h e d e c i s i o n t o s y n t h e s i z e r e p e a t i n g t r i n u c l e o t i d e s e q u e n c e s was g o v e r n e d b y t h e a v a i l a b i l i t y o f g e n e r a l m e t h o d s f o r t h e s y n t h e s i s o f p r o t e c t e d d e o x y r i b o t r i -n u c l e o t i d e s ( 1 0 3 ) . T h e s e c o u l d t h e n b e p o l y m e r i z e d , i n o n e s t e p , t o d e f i n e d , r e p e a t i n g s e q u e n c e s , 6 , 9» a n d 12 n u c l e o t i d e s l o n g ( 9 1 ) . T h e y i e l d s o f d i n u c 1 e o t i d e s (hS t o 55%) a n d t r i n u c l e o t i d e s (AO t o k5%) w e r e s o m e w h a t l o w e r t h a n t h o s e r e p o r t e d b y N a r a n g e_t a j _ . (103) f o r t h e s y n t h e s i s o f s i m i l a r c o m p o u n d s (60 t o 70% a n d 50 t o 60%). H o w e v e r , a l l i n t e r m e d i a t e s w e r e h o m o g e n e o u s a n d d e m o n s t r a t e d t o c o n t a i n t h e a p p r o p r i a t e n u c l e o s i d e a n d n u c l e o t i d e ( s ) . Y i e l d s o f f r o m 2 t o 10 u m o l e s o f o l i g o -n u c l e o t i d e s ( p r e p a r e d by t h e p o l y m e r i z a t i o n o f s u i t a b l y p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e s ) w e r e p r a c t i c a b l e , a n d t h e s e a m o u n t s a r e m o r e t h a n a d e q u a t e f o r t h e s y n t h e s i s o f o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e s . F u r t h e r d e t a i l s o n t h e s y n t h e s i s o f p a r t i c u l a r s e q u e n c e s a r e g i v e n b e l o w . J a c o b a n d K h o r a n a (117) h a v e r e p o r t e d t h e s y n t h e s i s o f t h e o l i g o m e r s d ( T p T p C ) by s t e p w i s e c o n d e n s a t i o n o f s u i t a b l y p r o t e c t e d m o n o n u c 1 e o t i d e s t o t h e 3' h y d r o x y l e n d o f a g r o w i n g c h a i n . T h e 5' n u c l e o t i d e was 5 ' ~ 0 - t r i t y l d T . In t h e p r e s e n t A n e x p e r i m e n t s , t h e p r o t e c t e d d e o x y r i b o t r i n u c l e o t i d e , d - p T p T p C , was p r e p a r e d , a n d t h i s was p o l y m e r i z e d t o o b t a i n t h e h e x a - , n o n a - , a n d d o d e c a n u c l e o t i d e s . T h e s y n t h e s i s o f t h e o l i g o n u c 1 e o t i d e s d ( p C p T p T ) . ( n = 1 t o h) h a s n o t b e e n r e p o r t e d . T h e s e w e r e p r e p a r e d b y a m o d i f i c a t i o n o f t h e g e n e r a l p r o c e d u r e d e s c r i b e d b y N a r a n g e t a 1. (103, 91) ( s e e F i g u r e 2 ) . T h e p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e d-pC pTpT was p r e p a r e d b y c o n d e n s a t i o n o f t h e m o n o n u c l e o t i d e C E d - p C ^ n w i t h t h e d i -A n n u c l e o t i d e , d - p T p T - O A c . T h e p r o d u c t , d-pC p T p T , w a s t h e n p o l y m e r i z e d t o g i v e t h e h e x a - , n o n a - , a n d d o d e c a n u c l e o t i d e s . T h e s y n t h e s i s o f o l i g o m e r s o f r e p e a t i n g s e q u e n c e , d ( p A p A p G ) h a s b e e n r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e ( S H ) . In t h e p r e s e n t B z B z B z e x p e r i m e n t s t h e p r o t e c t e d t r i n u c l e o t i d e , d - p A pA pG was Bz Bz A c p r e p a r e d r a t h e r t h a n d - p A pA pG , a s r e p o r t e d by N a r a n g et_ a j _ . ( 1 0 3 ) - T h i s t r i n u c l e o t i d e w a s t h e n p o l y m e r i z e d t o o b t a i n h i g h e r o l i g o m e r s . T h e s y n t h e s i s o f t h e t h r e e p r o t e c t e d d e o x y r i b o t r i n u c l e o t i d e s , d - p T p T p C A n , d - p C A n p T p T , a n d d - p A B z p A B z p G B z , h a s , s o f a r , n o t b e e n r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e . T h e s e t r i n u c l e o t i d e s w e r e t h e r e f o r e c a r e f u l l y c h a r a c t e r i z e d by c h r o m a t o g r a p h y , p r i o r t o a n d a f t e r t h e r e m o v a l o f t h e N - a c y l p r o t e c t i n g g r o u p s a n d a l s o a f t e r t r e a t m e n t w i t h a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( T a b l e I V ) . T h e r e s u l t a n t t r i n u c l e o s i d e d i p h o s p h a t e s w e r e d e g r a d e d w i t h v e n o m p h o s p h o d i e s t e r a s e a n d t h e m o l a r r a t i o s o f t h e n u c l e o s i d e a n d n u c l e o t i d e s d e t e r m i n e d a s a c o n f i r m a t i o n o f t h e s t r u c t u r e ( T a b l e I I ) . -S t u d i e s w i t h t h e i s o m e r i c r e p e a t i n g s e q u e n c e s , d ( p T p T p C ) ^ a n d d ( p C p T p T ) ^ w i t h d ( p A p A p G ) ^ s e q u e n c e s r e s u l t e d i n a n u m b e r o f i n t e r e s t i n g o b s e r v a t i o n s , d u e t o t h e s l i g h t l y d i f f e r e n t h y b r i d s t r u c t u r e s t h a t c a n f o r m a s a r e s u l t o f a " s h i f t i n t h e p a i r i n g f r a m e " ( s e e b e l o w ) i n d ( p T p T p C ) n > d ( p A p A p G ) i n t e r a c t i o n s . * ' 3 ' 5 ' 3 ' pTpTpCpTpTpC pCpTpTpCpTpT GpApApGpApAp G P ApApGpApAp < . « 11 3 ' 5 ' 3 ' 5 ' shifted pairing frame PART I I THERMAL E L U T I O N OF O L I G O N U C L E O T I D E S ON C E L L U L O S E COLUMNS C O N T A I N I N G O L I G O N U C L E O T I D E S OF D E F I N E D LENGTH AND SEQUENCE Ik INTRODUCTION I t w a s d e c i d e d t o e x a m i n e t h e i n t e r a c t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s i n s o l u t i o n p r i o r t o s t u d y i n g t h e e l u t i o n o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o m e r s f r o m o l i g o n u c 1 e o t i d e - c e l 1 u l o s e s . A s t u d y o f t h e t h e r m a l d i s s o c i a t i o n c u r v e s o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o m e r s w o u l d p r o v i d e a g u i d e t o t h e p r o p e r t i e s o f t h e v a r i o u s o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e : o l i g o n u c l e o t i d e i n t e r a c t i o n s . A n u m b e r o f s t u d i e s o n h o m o p o l y m e r : o l i g o n u c 1 e o t i d e i n t e r a c t i o n s h a v e b e e n . r e p o r t e d ( s e e 1 1 8 - 1 2 3 ) . In t h e s e e x p e r i m e n t s , t h e h y b r i d f o r m a t i o n o r d e s t r u c t i o n h a s b e e n f o l l o w e d b y o n e o r m o r e o f t h e f o l l o w i n g : t h e d e c r e a s e i n a b s o r b a n c e o b s e r v e d o n m i x i n g a c o m p l e m e n t a r y o l i g o m e r a n d p o l y m e r , t h e r m a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e s , s e d i m e n t a t i o n s t u d i e s i n t h e a n a l y t i c a l u 1 t r a c e n t r i f u g e , g e l f i l t r a t i o n o n S e p h a d e x c o l u m n s , e q u i l i b r i u m d i a l y s i s , o r t h e c h a n g e i n s p e c i f i c r o t a t i o n o f t h e m i x t u r e s . In t h e s e s t u d i e s , t h e s t r u c t u r e s i n v o l v e d e i t h e r 2 - s t r a n d e d o r 3 -s t r a n d e d c o m p l e x e s ( d e p e n d i n g o n t h e i o n i c s t r e n g t h a n d t e m p e r a t u r e o f t h e m i x t u r e ) , a n d i n m o s t c a s e s , t h e i n t e r a c t i o n s a r e g r e a t l y s t a b i l i z e d b y c o o p e r a t i v e b i n d i n g o f t h e c o m p l e m e n t a r y o l i g o -n u c l e o t i d e . 1 7 In s t u d i e s a p p l i c a b l e t o t h e p r o b l e m s d i s c u s s e d i n t h i s C o o p e r a t i v e b i n d i n g r e f e r s t o t h e r e d u c t i o n o f f r e e e n e r g y o r s t a b i l i z a t i o n t h a t r e s u l t s d u e t o v e r t i c a l s t a c k i n g o f t h e c o n s e c u t i v e b a s e s o f a d j a c e n t o l i g o m e r s . t h e s i s , i t w a s f e l t t h a t o l i g o n u c l e o t i d e : o l i g o n u c l e o t i d e i n t e r -a c t i o n s w o u l d p r o v i d e a m o r e u s e f u l s t u d y f o r t h e e x t r a p o l a t i o n o f d a t a t o e x p e r i m e n t s c o n c e r n i n g t h e i s o l a t i o n o f n u c l e i c a c i d s ( i . e . o 1 i g o n u c 1 e o t i d e : r a n d o m s e q u e n c e p o l y m e r i n t e r a c t i o n s ) . T h e r e a s o n f o r t h i s i s t h a t , a s m e n t i o n e d a b o v e , t h e r e i s a c o n s i d e r a b l e s t a b i l i z a t i o n a s s o c i a t e d w i t h c o o p e r a t i v e b i n d i n g o f s m a l l o l i g o m e r s t o a c o m p l e m e n t a r y h o m o p o l y m e r . F o r e x a m p l e , P i t h a a n d T s ' o ( 1 1 8 ) r e p o r t e d t h a t a d e n o s i n e b i n d s t o p o l y U i n t h e p r e s e n c e o f t h e a d e n o s i n e h e p t a n u c l e o s i d e h e x a p h o s p h a t e ( A ( p A ) ^ ) . T h e s e w o r k e r s f e e l t h e i n t e r a c t i o n o f a d e n o s i n e i s s t a b i l i z e d b y c o o p e r a t i v e b i n d i n g o f t h i s n u c l e o s i d e b e t w e e n t w o A ( p A ) ^ r e s i d u e s . L i p s e t t e t a j _ . ( 1 2 1 ) w e r e a b l e t o o b s e r v e a n i n t e r a c t i o n b e t w e e n p o l y U a n d o l i g o m e r s a s s m a l l a s t h e t r i n u c l e o t i d e , A p A p A . In o t h e r w o r k , L i p s e t t ( 1 2 2 ) o b s e r v e d a Tm o f 2 5 - 5 ° f o r t h e i n t e r -a c t i o n o f GpG w i t h p o l y C . H o w e v e r , f o r t h e i n t e r a c t i o n o f a s h o r t s e q u e n c e w i t h i t s c o m p l e m e n t w i t h i n a r a n d o m s e q u e n c e p o l y m e r ( s e e i l l u s t r a t i o n b e l o w ) , e n d t o e n d b i n d i n g ( i . e . v e r t i c a l s t a c k i n g o f t h e o l i g o n u c 1 e o t i d e u n i t s ) i s n o t p o s s i b l e . N a y l o r a n d G i l h a m (124) h a v e r e p o r t e d t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s o f t h e s e r i e s , d ( p T ) ^ a n d d ( p A ) ^ . In t h e i r i n v e s t i g a t i o n , t h e i n t e r a c t i o n s w e r e s t u d i e d b y m e a s u r i n g t h e % h y p o c h r o m i c i t y o b s e r v e d o n m i x i n g t h e t w o c o m p o n e n t s a n d r e d u c i n g t h e t e m p e r a t u r e t o 0 ° . One c r i t i c i s m o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e : o l i g o n u c l e o t i d e i n t e r -a c t i o n m o d e l s y s t e m i s t h a t i n o l i g o m e r : r a n d o m s e q u e n c e p o l y m e r i n t e r a c t i o n s , t h e e f f e c t o f t h e l o n g " t a i l s " o n t h e p o l y m e r s may b e t o g r e a t l y r e d u c e t h e s t a b i l i t y o f t h e i n t e r a c t i o n . S t u d i e s c o n c e r n e d w i t h a n o n - c o m p l e m e n t a r y s e q u e n c e ( o r b a s e ) , a t t a c h e d t o a c o m p l e m e n t a r y s e q u e n c e h a v e b e e n r e p o r t e d b y L i p s e t t a n d c o w o r k e r s (121) a r id B a u t z a n d B a u t z (125). F o r e x a m p l e , t h e s t a b i l i t y o f p o l y U . A p A p A p A p U a n d p o l y U . A p A p A p U c o m p l e x e s h a v e b e e n s t u d i e d . I t was f o u n d t h a t t h e t e r m i n a l u r i d i n e r e s i d u e r e d u c e s t h e s t a b i l i t y o f t h e i n t e r a c t i o n , a l t h o u g h . t h e s t o i c h i o -m e t r y o f t h e r e a c t i o n i n d i c a t e d t h e " t a i l s " w e r e b e n t o u t f r o m t h e h e l i x , t o p e r m i t t h e n e x t o l i g o n u c l e o t i d e t o b i n d i n a c o o p e r a t i v e w a y . T h e s e e x t r a u r i d i n e r e s i d u e s a l s o p r e v e n t e d t h e f o r m a t i o n o f t r i p l e - s t r a n d e d s t r u c t u r e s (121), h o w e v e r t h r e e - s t r a n d e d s t r u c t u r e s w i t h A p A p A p A p U . p o l y U d o f o r m (125). I t i s d i f f i c u l t t o e x t r a p o l a t e t h e s e o b s e r v a t i o n s t o o l i g o m e r : r a n d o m s e q u e n c e i n t e r -a c t i o n s , a s a g a i n , e n d t o e n d b i n d i n g o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e i s n o t t h e c a s e , a n d t h e r e d u c t i o n i n s t a b i l i t y o f t h e h y b r i d i n t h e e x p e r i m e n t s r e p o r t e d may b e d u e t o p a r t i a l i n t e r f e r e n c e o f v e r t i c a l s t a c k i n g . E x p e r i m e n t s o f S z y b a l s k i a n d h i s c o w o r k e r s (126-130), i n w h i c h d i f f e r e n t i a l h y b r i d i z a t i o n o f t h e t w o s t r a n d s o f a DNA d u p l e x w i t h p o l y G , p o l y ( l , G) o r p o l y ( U , G) h a s b e e n u s e d t o f a c i 1 i t a t e t h e s e p a r a t i o n o f t h e t w o s t r a n d s b y u l t r a -c e n t r i f u g a t i o n i n c e s i u m c h l o r i d e ; s u g g e s t t h a t i t s h o u l d b e p o s s i b l e t o i s o l a t e a s h o r t h y b r i d r e g i o n w i t h l o n g u n b o u n d " t a i l s " . H o w e v e r , t h e s e w o r k e r s f e e l t h a t t h e r e g i o n o f h y b r i d s t r u c t u r e e x t e n d s f o r 15 t o 4 0 n u c l e o t i d e s ( 129 ) . 1 8 T h e i n c r e a s e d l e n g t h o f t h e h y b r i d r e g i o n , p l u s t h e f a c t t h a t t h e i n t e r a c t i o n s a r e a l l GC i n t e r a c t i o n s , w o u l d c o n t r i b u t e g r e a t e r s t a b i l i t y t o t h e s e t y p e s o f s t r u c t u r e s c o m p a r e d t o t h a t a n t i c i p a t e d i n t h e i s o l a t i o n o f n u c l e i c a c i d s b y o l i g o m e r : r a n d o m s e q u e n c e p o l y m e r i n t e r a c t i o n s . N i y o g i a n d T h o m a s (131» 132) h a v e r e p o r t e d t h e f o r m a t i o n o f s p e c i f i c , s t a b l e o l i g o r i b o n u c 1 e o t i d e : D N A h y b r i d s w i t h o l i g o m e r s a s s h o r t a s t h e d e c a n u c l e o t i d e f o r b o t h T 4 a n d T 7 v i r a l D N A : o l i g o m e r i n t e r a c t i o n s . M c C o n a u g h y a n d M c C a r t h y (133) h a v e r e p o r t e d s t a b l e o l i g o n u c l e o t i d e : D N A c o m p l e x e s w i t h o l i g o d e o x y r i b o -n u c l e o t i d e c h a i n l e n g t h s a p p r o x i m a t e l y 11-14 r e s i d u e s . C l e a r l y , t h e m i n i m u m s t a b l e l e n g t h o f a n o l i g o n u c 1 e o t i d e : D N A c o m p l e x m u s t b e a f u n c t i o n o f s o l v e n t , t e m p e r a t u r e , a n d b a s e c o m p o s i t i o n . G i l l e s p i e a n d S p i e g e l m a n (134) r e p o r t e d t h a t t h e m i n i m u m c h a i n R e c e n t e v i d e n c e w o u l d s u g g e s t t h a t t h e i n t e r a c t i o n o f c o n s e c u t i v e c y t i d y l a t e t r a c t s w i t h g u a n y l a t e r e s i d u e s may b e much s h o r t e r ( 1 4 , 1 5 ) . 78 l e n g t h o l i g o r i b o n u c l e o t i d e ( f r o m r R N A ) t h a t h y b r i d i z e d w i t h h o m o l o g o u s DNA was 50 a t 6 7 ° , 32 a t 5 5 ° , 17 a t hh° a n d g r e a t e r t h a n 6 a t 23 ° a n d 37° ( i n 2 x S C C ) . 1 9 In t h e s e e x p e r i m e n t s o f T h o m a s , M c C a r t h y a n d S p i e g e l m a n , a n d t h e i r a s s o c i a t e s , t h e r o l i g o n u c l e o t i d e f r a c t i o n s w e r e o b t a i n e d b y l i m i t e d d e g r a d a t i o n o f t h e n u c l e i c a c i d ( w i t h a n u c l e a s e , b y p a r t i a l d e p u r i n a t i o n o r a l k a l i ) , a n d t h e r e s u l t a n t o l i g o m e r s s e p a r a t e d a c c o r d i n g t o c h a i n l e n g t h . T h e o b s e r v a t i o n s b y t h e s e w o r k e r s t h a t s t a b l e s p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e : r a n d o m s e q u e n c e p o l y m e r h y b r i d s c a n b e f o r m e d p r o v i d e e n c o u r a g e m e n t f o r t h e . s u c c e s s o f t e c h n i q u e s d e s i g n e d t o i s o l a t e a p a r t i c u l a r n u c l e i c a c i d by h y b r i d i z a t i o n w i t h a s m a l l , c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e o f d e f i n e d s e q u e n c e . T h e p o s s i b i l i t y o f s u c c e s s i s f u r t h e r e n c o u r a g e d b y a r e p o r t b y J o v i n a n d K o r n b e r g (135), i n w h i c h a d e o x y t h y m i d i n e p o l y n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e 2 0 w a s s h o w n t o r e t a i n , s p e c i f i c a l l y , s i n g l e - s t r a n d e d DNA ( m o l e c u l a r w e i g h t 2.5 x 10 d a l t o n s ) w h e n t h e DNA was e x t e n d e d by t e r m i n a l n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e (136) i n t h e p r e s e n c e o f d A T P . In a n o t h e r e x p e r i m e n t , t h e d e o x y t h y m i d i n e p o l y n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e w a s e x t e n d e d w i t h d C T P . T h i s m i x e d p o l y n u c 1 e o t i d e - c e l 1 u l o s e t h e n r e t a i n e d s i n g l e - s t r a n d e d DNA w h i c h h a d b e e n e x t e n d e d w i t h d I T P . T h e b u f f e r u s e d b y G i l l e s p i e a n d S p i e g e l m a n w a s n o t r e p o r t e d i n t h e i r a b s t r a c t (13^). H o w e v e r , i t i s r e p o r t e d t o be 2 x S S C , a s a p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n i n (131)• 2 0 S e e f o o t n o t e 22. T h e t w o c o m p l e x e s a r e i l l u s t r a t e d , s c h e m a t i c a l l y , b e l o w , t h e m a x i m u m i n t e r a c t i o n In I , cell - pTpTpTpT . . . . . I APApApAp-DNA cell-pTpTpTpTpCpCpCpC II i P i p l P l p-DNA i s p r o b a b l y d ( p T ) ^ ^ • d ( p A ) ^ 2 > a l t h o u g h t h e m a j o r i t y o f t h e o l i g o -t h y m i d y l a t e s w o u l d b e s h o r t e r . In I I , t h e l e n g t h o f c y t i d y l i c a c i d r e s i d u e s may be c o n s i d e r a b l y g r e a t e r ( up t o 2 0 0 r e s i d u e s ( 1 3 5 ) ) • A s h o r t , r e m a r k a b l y s t a b l e h y b r i d r e g i o n (6 GC a n d 1 A U ; . b a s e p a i r s ) h a s b e e n i s o l a t e d f r o m , t h e s t e m p o r t i o n o f E_. c o l i t y r o s i n e t R N A (137). T h e r e i s a l s o a s h o r t h y b r i d r e g i o n i n t h e a n t i c o d o n l o o p o f E_. c o l i m e t h i o n i n e tRNA^. (h G C , 1 AU. b a s e p a i r s ) (138) a s w e l l a s a r e g i o n i n y e a s t a s p a r t i c t R N A (5 GC b a s e p a i r s ) (139)• +2 By s u i t a b l e c h o i c e o f t e m p e r a t u r e a n d Mg c o n c e n t r a t i o n , i t h a s b e e n p o s s i b l e t o f o r m s h o r t h y b r i d r e g i o n s b e t w e e n o v e r l a p p i n g c o m p l e m e n t a r y s y n t h e t i c o 1 i g o d e o x y r i b o n u c 1 e o t i d e s . T h e s e o l i g o m e r s w e r e s u b s e q u e n t l y j o i n e d , e n z y m a t i c a l l y , d u r i n g t h e s y n t h e s i s o f 1 t h e y e a s t a l a n i n e t R N A g e n e (88). 80 P o s s i b l y t h e b e s t m o d e l s y s t e m t o u s e i n s t u d y i n g o l i g o m e r : r a n d o m s e q u e n c e p o l y m e r i n t e r a c t i o n s w o u l d b e p o l y m e r s w h i c h c o n t a i n e d a s h o r t s e q u e n c e c o m p l e m e n t a r y t o a s y n t h e t i c o l i g o -n u c l e o t i d e . 2 1 In t h e s t u d i e s r e p o r t e d i n t h i s t h e s i s , o l i g o n u c l e o t i d e : o l i g o n u c l e o t i d e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e s e r i e s d ( p A ) ^ a n d d ( p T ) ^ w e r e i n v e s t i g a t e d b y s t u d y i n g t h e t h e r m a l d i s s o c i a t i o n c u r v e s f o r a n u m b e r o f m i x t u r e s . Some i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s o f m i x e d , r e p e a t i n g b a s e s e q u e n c e h a v e a l s o b e e n s t u d i e d . T h e s y n t h e s i s o f p o l y n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s 2 2 w a s f i r s t r e p o r t e d T h e s y n t h e s i s o f s u c h p o l y m e r s c o u l d b e d o n e e n z y m a t i c a l l y . A s a m p l e o f s y n t h e t i c o l i g o n u c l e o t i d e c o u l d a c t a s a p r i m e r f o r t h e t e r m i n a l d e o x y n u c 1 e o t i d y 1 t r a n s f e r a s e , d e s c r i b e d by B o l l u m (136). T h e o l i g o -n u c l e o t i d e , e x t e n d e d i n t h e 3 ' " h y d r o x y l d i r e c t i o n (50 t o 100 n u c l e o t i d e u n i t s ) , c o u l d t h e n be c o p i e d s p e c i f i c a l l y b y E_. c o l i DNA p o l y m e r a s e , u s i n g s u c h c o n d i t i o n s a s t h o s e d e s c r i b e d . b y Wu a n d K a i s e r (16) a n d Wu (17). (A s m a l l p r i m e r may be n e e d e d t o i n i t i a t e t h e r e p a i r r e a c t i o n . ) T h e c o m p l e m e n t a r y p o l y m e r c o u l d t h e n be e x t e n d e d f u r t h e r i n t h e 3' d i r e c t i o n , u s i n g t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e t o p r o v i d e " a s e c o n d " t a i l " . T h e s t r a n d s e p a r a t i o n w o u l d b e g r e a t l y f a c i l i t a t e d b y s t a r t i n g w i t h t h e c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d o l i g o n u c l e o t i d e a t t a c h e d t o a n i n s o l u b l e s u p p o r t s u c h a s c e l l u l o s e (135)-4 T h e t e r m " p o l y n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e " r e f e r s t o c e l l u l o s e c o n t a i n i n g r a n d o m l e n g t h o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s . T h i s t e r m w a s f i r s t u s e d b y G i l h a m (68), a n d i s r e t a i n e d h e r e a s a means o f e a s i l y d i s t i n g u i s h i n g b e t w e e n a c e l l u l o s e c o n t a i n i n g o l i g o n u c 1 e o t i d e s o f r a n d o m l e n g t h , a n d o n e c o n t a i n i n g o l i g o n u c l e o t i d e s o f d e f i n e d l e n g t h ( a n d s e q u e n c e ) . T h e s e l a t t e r c e l l u l o s e s a r e r e f e r r e d t o a s " o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e s " . b y G i l h a m (68). R andom l e n g t h h o m o - o l i g o d e o x y r I b o n u c 1 e o t i d e s o f T , A a n d C w e r e p r e p a r e d by p o l y m e r i z a t i o n o f t h e c o r r e s p o n d i n g m o n o n u c l e o t i d e i n a n h y d r o u s p y r i d i n e u s i n g t h e c o n d e n s i n g a g e n t , D C C . A f t e r t h e p o l y m e r i z a t i o n w a s c o m p l e t e , d r y c e l l u l o s e p o w d e r a n d m o r e DCC w a s a d d e d t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e t o l i n k t h e l i n e a r o l i g o m e r s t o t h e c e l l u l o s e (68, 69). T h e r e s u l t i n g p o l y n u c l e o t i d e - c e l 1 u 1 o s e s w e r e d e m o n s t r a t e d . t o r e t a i n c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s . T h u s , d e o x y t h y m i d i n e p o l y n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e r e t a i n e d a m i x t u r e o f d e o x a d e n y l a t e o l i g o m e r s ( t r i - t h r o u g h h e p t a n u c l e o t i d e s ) . T h e v a r i o u s o l i g o m e r s c o u l d b e s e p a r a t e d b y s t e p w i s e t h e r m a l e l u t i o n . S i m i l a r l y , d e o x y a d e n o s i n e p o l y -n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e w a s a b l e t o r e t a i n a n d r e s o l v e a s e r i e s o f u r i d i n e o l i g o n u c l e o t i d e s (69). G i l h a m a n d R o b i n s o n (70) h a v e r e p o r t e d t h e u s e o f d e o x y -t h y m i d i n e p o l y n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e i n f r a c t i o n a t i n g a n e n z y m i c d i g e s t o f v i r a l RNA . B r o m e g r a s s v i r u s RNA w a s d i g e s t e d w i t h p a n c r e a t i c r i b o n u c l e a s e a n d t h e r e s u l t a n t o l i g o n u c l e o t i d e s s e p a r a t e d a c c o r d i n g t o l e n g t h by a n i o n - e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y . O l i g o n u c l e o t i d e s o f t h e s ame c h a i n l e n g t h w e r e t h e n c h r o m a t o g r a p h e d o n a d e o x y t h y m i d i n e p o l y n u c 1 e o t i d e - c e l 1 u 1 o s e c o l u m n u s i n g s t e p -w i s e t e m p e r a t u r e e l u t i o n . T h e c o l u m n s w e r e a b l e t o s e p a r a t e o l i g o m e r s b a s e d o n t h e i r c o n t e n t o f c o n s e c u t i v e a d e n o s i n e s e q u e n c e s . . H o w e v e r , t h e c o l u m n s a p p a r e n t l y d i d n o t r e s o l v e s u c h o l i g o m e r s a s t h o s e c o n t a i n i n g t e t r a - a d e n o s i n e s e q u e n c e s f r o m t h o s e c o n t a i n i n g t h e s e q u e n c e s - A p G p A p A p A p - o r - A p A p G p A p A p -( i . e . i n t e r r u p t e d t e t r a - a d e n o s i n e s e q u e n c e s ) . T h i s o b s e r v a t i o n may b e e x p l a i n e d b y e x p e r i m e n t s r e p o r t e d b y B a u t z a n d B a u t z (125). T h e s e w o r k e r s s t u d i e d t h e d i f f e r e n c e s i n s t a c k i n g e n e r g y b e t w e e n d i f f e r e n t d i n u c l e o t i d e s a n d c o n c l u d e d t h a t g u a n i n e i n t e r a c t s ( s t a c k s ) r e l a t i v e l y s t r o n g l y w i t h a n a d j a c e n t a d e n i n e , a n d w i t h i n a t r a c t o f a d e n y l i c a c i d r e s i d u e s d o e s n o t g r e a t l y d e s t a b i l i z e t h e o v e r a l l i n t e r a c t i o n . H o w e v e r , i n a n a t t e m p t t o q u a n t i t a t e t h e e f f e c t o f m i s m a t c h i n g o f b a s e p a i r s , a s t u d y b y B a u t z a n d B a u t z (125) o f p o l y U . p o l y ( A , G i n t e r a c t i o n s w i t h v a r y i n g a m o u n t s o f g u a n y l a t e d e m o n s t r a t e d a l i n e a r r e l a t i o n s h i p i n w h i c h 1% m i s m a t c h i n g o f b a s e s r e d u c e d t h e Tm b y a b o u t 0 . 7 ° . T h i s o b s e r v a t i o n i s i n a g r e e m e n t w i t h t h a t o f K o t a k a a n d . B a l d w i n ( 1 4 0 ) a n d L a i r d e_t a_k (29). A c c o r d i n g t o L a i r d et_ a J L , t h e r e l a t i o n s h i p i s v a l i d f o r h y b r i d s i n w h i c h t h e r e i s <30% m i s m a t c h i n g o f b a s e s a n d t h e p o l y m e r s a r e l a r g e r t h a n 50 n u c l e o t i d e s l o n g . I f t h i s r e l a t i o n s h i p c a n b e e x t r a p o l a t e d t o much s h o r t e r n u c l e o t i d e s , i t i s d i f f i c u l t t o u n d e r s t a n d why t h e i n t e r r u p t e d t e t r a - a d e n o s i n e s e q u e n c e c o n t a i n i n g o l i g o n u c l e o t i d e s w e r e r e t a i n e d b y t h e d e o x t h y m i d i n e p o l y n u c 1 e o t i d e - c e l 1 u 1 o s e c o l u m n . Edmonds a n d A b r a m s (71) h a v e r e p o r t e d t h e u s e o f d e o x y -t h y m i d i n e p o l y n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e t o i s o l a t e a p o l y a d e n y 1 a t e a s s o c i a t e d w i t h a n a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e p o l y m e r a s e i n c a l f t h y m u s n u c l e i , w h i l e Edmonds a n d C a r a m e l a (72) h a v e u s e d t h e same t e c h n i q u e t o r e c o v e r f r o m E h r 1 i c h a s c i t e s n u c l e i t h e 1% f r a c t i o n o f RNA w h i c h i s r i c h i n a d e n o s i n e . R e c e n t l y , G i l h a m (144) h a s r e p o r t e d a n a l t e r n a t e m e t h o d f o r t h e c o v a l e n t a t t a c h m e n t o f o l i g o n u c l e o t i d e s t o c e l l u l o s e . T h i s i n v o l v e s i n c o r p o r a t i o n o f n u c l e o t i d e s o n t o c e l l u l o s e p a p e r s t r i p s b y s p e c i f i c a c t i v a t i o n i n a q u e o u s s o l u t i o n o f a t e r m i n a l p h o s p h a t e g r o u p u s i n g t h e w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e , N-c y c l o h e x y l - N 1 - 3 ( 4 - m e t h y l m o r p h o l i n i u r n ) e t h y l c a r b o d i i m i d e p - t o l u e n e -s u l f o n a t e . A t pH 6 . 0 , i t h a s b e e n s h o w n t h a t t h i s r e a g e n t i s a s p e c i f i c p h o s p h a t e a c t i v a t i n g a g e n t t h a t c a n e f f e c t t h e e f f i c i e n t f o r m a t i o n o f p h o s p h o d i e s t e r b o n d s , i n t h e p r e s e n c e o f a h i g h c o n c e n t r a t i o n o f h y d r o x y l g r o u p ( 1 2 4 ) . One n o v e l a s p e c t o f t h i s r e a c t i o n i s t h a t , i n s o l u t i o n , i n t h e p r e s e n c e o f c e l l u l o s e , t h e r e i s no i n c o r p o r a t i o n o f n u c l e o t i d e o n t o t h e c e l l u l o s e , p r e s u m a b l y d u e t o a l o w c o n c e n t r a t i o n o f a v a i l a b l e h y d r o x y l g r o u p . H o w e v e r , w h e n t h e r e a c t i o n m i x t u r e i s s t r e a k e d o n p a p e r , a n d s l o w l y a i r d r i e d , t h e r e a c t i o n i s c o n c e n t r a t e d o n t h e c e l l u l o s e f i b r e s . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , 71% i n c o r p o r a t i o n o f d - p G , 67% i n c o r p o r a t i o n o f d - p C , 64% i n c o r p o r a t i o n o f U D P , e t c . h a v e b e e n r e p o r t e d ( 1 4 1 ) . One p r o b l e m a s s o c i a t e d w i t h t h e w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e m e t h o d i s t h a t t h e y i e l d o f t h e n u c l e o t i d e i n c o r p o r a t e d d e c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g l e n g t h o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e ( 1 4 1 ) . ( F o r e x a m p l e d ( p T ) , w a s i n c o r p o r a t e d a t a l e v e l o f 47% ( 1 4 1 ) , w h i l e d ( p T ) . . was i n c o r p o r a t e d a t a l e v e l o f o n l y . 1 1 . 8 % a n d 1 6 . 7 % ( t w o e x p e r i m e n t s ) ( 1 4 2 ) . In t h e e x p e r i m e n t s r e p o r t e d i n t h i s t h e s i s , o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e s c o n t a i n i n g o l i g o m e r s o f d e f i n e d . 1 e n g t h a n d s e q u e n c e w e r e p r e p a r e d u s i n g t h e w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e m e t h o d . 2 3 T h e m e t h o d , a s r e p o r t e d b y G i l h a m ( 1 4 1 ) , w a s a l t e r e d b y u s i n g m o r e c a r b o d i i m i d e ( i n t w o a p p l i c a t i o n s ) , a n d b y l e a v i n g t h e r e a c t i o n f o r a much l o n g e r t i m e . O t h e r m i n o r a l t e r a t i o n s i n b u f f e r c o n c e n t r a t i o n a r e d e s c r i b e d i n M e t h o d s . T h e r e a s o n f o r u s i n g m o r e c a r b o d i i m i d e , a n d s t r e a k i n g i t o n t h e r e a c t i o n p a p e r i n t w o a p p l i c a t i o n s t e p s w a s b a s e d o n d a t a c o n c e r n i n g t h e h a l f -l i f e o f t h i s r e a g e n t . M e t z a n d B r o w n ( 1 4 4 ) s t u d i e d t h e s t a b i l i t y o f t h e w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e b y i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y , f o l l o w i n g t h e d e c r e a s e i n t h e 2 1 0 0 cm ^ p e a k d u e t o t h e N=C=N s t r e t c h i n g m o d e . In w a t e r (pH n o t s p e c i f i e d ) , t h e s e w o r k e r s o b s e r v e d a h a l f - l i f e o f 2 4 0 h r . H o w e v e r , i n 0 .1 M s o d i u m c a c o d y l a t e b u f f e r , pH 6 . 0 , t h e t i w a s o n l y 1 h o u r . U s i n g a d i f f e r e n t a s s a y , N a y l o r a n d G i l h a m ( 1 2 4 ) r e p o r t e d a t i o f 6 h o u r , 2 3 A l t e r n a t e m e t h o d s w e r e t r i e d t o l i n k t h e o l i g o n u c l e o t i d e s t o c e l l u l o s e . F o r e x a m p l e , t h e i m i d a z o l a t e o f d - p T ( 1 4 3 ) was r e a c t e d w i t h d r i e d c e l l u l o s e p o w d e r o r c e l l u l o s e p a p e r s t r i p s u n d e r a n h y d r o u s c o n d i t i o n s . T h e i m i d a z o l a t e o f d - p T was a l s o r e a c t e d w i t h d r y p h o s p h o c e l l u l o s e p o w d e r . H o w e v e r , n o n e o f t h e c o n d i t i o n s u s e d r e s u l t e d i n i n c o r p o r a t i o n o f n u c l e o t i d e , a n d b e c a u s e i t w a s d i s c o v e r e d b y a l t e r i n g t h e c o n d i t i o n s f o r t h e w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e r e a c t i o n , t h e y i e l d s o f n u c l e o t i d e i n c o r p o r a t e d w e r e c o n s i s t e n t l y g r e a t e r t h a n 60%, f u r t h e r e f f o r t s t o f i n d a n o t h e r m e t h o d f o r i n c o r p o r a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e w e r e a b a n d o n e d . i n w a t e r , a t pH 6 . 0 . F r o m t h e s e d a t a i t s e e m e d p o s s i b l e t h a t t h e s t a b i l i t y o f t h e c a r b o d i i m i d e may b e a f f e c t i n g t h e i n c o r p o r a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e , w h i c h p r o c e e d s m u c h s l o w e r t h a n t h e i n c o r p o r a t i o n o f m o n o m e r u n i t s . S i n c e a c o n s i d e r a b l y g r e a t e r a m o u n t o f c a r b o d i i m i d e w a s u s e d t o e f f e c t t h e l i n k a g e o f t h e o l i g o m e r t o t h e c e l l u l o s e , t h e p o s s i b i l i t y o f s i d e r e a c t i o n s o c c u r r i n g w a s i n v e s t i g a t e d , i n t h a t t h e i n t e g r i t y o f t h e f u n c t i o n a l g r o u p s o n t h e b a s e s i s e s s e n t i a l f o r h y b r i d f o r m a t i o n t o o c c u r . U s i n g t h e m o d i f i e d w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e p r o c e d u r e , o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e c o n t a i n i ng t h e o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s , d ( p T ) ^ , d ( p T ) g , d ( p T ) g a n d d ( p T ) ^ 2 w e r e p r e p a r e d . T h e s e o l i g o -n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s , i n t h e f o r m o f s m a l l c o l u m n s , w e r e e x a m i n e d f o r t h e i r a b i l i t y t o r e t a i n c o m p l e m e n t a r y o l i g o m e r s . T h e r e t a i n e d o l i g o n u c l e o t i d e s c o u l d b e e l u t e d c o n v e n i e n t l y w i t h a l i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t . T h e c a p a c i t y o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e , t h e r e s o l u t i o n t h a t may b e o b t a i n e d b e t w e e n c o n s e c u t i v e d e o x y r i b o -o l i g o m e r s , a n d t h e e l u t i o n o f r i b o - o l i g o m e r s w e r e s t u d i e d . S e v e r a l d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s o f t h e s ame o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u 1 o s e ( e e l 1 - d ( p T ) n ) w e r e e x a m i n e d i n o r d e r t o l e a r n s o m e t h i n g o f t h e r e p r o d u c i b i l i t y o f r e t e n t i o n p r o p e r t i e s o f o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e s . C e l l u l o s e s o f m i x e d , r e p e a t i n g b a s e s e q u e n c e s ( e e l 1 - d ( p T p T p C ) 2 - a n d e e l 1 - d ( p C p T p T ) 2 ^) w e r e t e s t e d f o r t h e i r 8 6 a b i l i t y t o r e t a i n t h e c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s d ( p A p A P G ) 2 y P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s , c o n c e r n i n g t h e a b i l i t y o f a n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n t o s e l e c t a c o m p l e m e n t a r y s e q u e n c e f r o m a m i x t u r e o f n u c l e i c - a c i d s , w e r e a l s o c a r r i e d o u t . M A T E R I A L S AND METHODS T h e c o m p l e m e n t a r y o l l g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s d(pT)^, d ( p A ) n , d ( p T P T p C ) 2 d ( p C p T p T ) 2 ^ ^ a n d d ( p A p A p G ) 2 ^ ^ w e r e p r e p a r e d b y c h e m i c a l s y n t h e t i c m e t h o d s ( s e e P a r t I o f t h i s t h e s i s ) T h e d e p h o s p h o r y l a t e d o l i g o n u c l e o t i d e s d ( A ) ^ w e r e p r e p a r e d b y a l k a l i n e p h o s p h a t a s e d i g e s t i o n o f t h e s e r i e s d ( p A ) n > T h e o l i g o -r i b o n u c l e o t i d e s r ( A ) „ a n d r ( A ) / w e r e p u r c h a s e d f r o m M i l e s 9 o L a b o r a t o r i e s . ( E l k h a r t , I n d i a n a ) . P o l y a d e n y l i c a c i d ( S 2 Q 7-0 -11 . 5 ) w a s a l s o t h e p r o d u c t o f M i l e s L a b o r a t o r i e s . A . I n t e r a c t i o n o f C o m p l e m e n t a r y O l i g o n u c l e o t i d e s i n S o l u t i o n 1) E s t i m a t i o n o f a v e r a g e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t p e r b a s e a t 25° f o r o l i g o n u c l e o t i d e s o f m i x e d b a s e s e q u e n c e . In o r d e r t o p r e p a r e e q u i m o l a r m i x t u r e s ( b a s e d o n m o n o n u c l e o t i d e c o n c e n t r a t i o n ) o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s , i t i s n e c e s s a r y t o be a b l e t o e s t i m a t e t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e s e n u c l e o t i d e s . One c o n v e n i e n t m e t h o d i s t o a s s a y f o r t o t a l p h o s p h a t e a n d o b t a i n a n E z h v a l u e . A l t e r n a t i v e l y , a n e s t i m a t e o f t h e e x t i n c t i o n P c o e f f i c i e n t may b e o b t a i n e d b y d e g r a d i n g t h e o l i g o m e r w i t h a n u c l e a s e t o t h e l e v e l o f m o n o n u c l e o t i d e s ( 1 2 4 ) , t h u s e l i m i n a t i n g t h e r e s i d u a l h y p o c h r o m i s m . By f o l l o w i n g t h e i n c r e a s e i n a b s o r b a n c e a t t h e w a v e l e n g t h o f max imum a b s o r b a n c e , o n e c a n E i s t h e m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t p e r p h o s p h a t e r e s i d u e . P e s t i m a t e t h e r e s i d u a l h y p o c h r o m i c i t y a n d s u b t r a c t t h i s v a l u e f r o m t h e a v e r a g e t h e o r e t i c a l e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t (E t h e o r T h i s c a l c u l a t e d . v a l u e i s d e f i n e d a s t h e a v e r a g e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t p e r b a s e (E c a I c ) . In t h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s , t h e c o n c e n t r a t i o n o f m i x e d b a s e s e q u e n c e o l i g o -n u c l e o t i d e s w a s d e t e r m i n e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y f r o m E c a l c v a l u e s f o r t h e o l i g o m e r s d e t e r m i n e d b y d e g r a d a t i o n o f a s a m p l e o f e a c h o l i g o n u c l e o t i d e w i t h v e n o m p h o s p h o d i e s t e r a s e . A s a m p l e o f e a c h o l i g o m e r ( a b o u t . 0 . 7 A . U . f o r p u r i n e o l i g o -n u c l e o t i d e s a n d a b o u t 2 A . U . f o r p y r i m i d i n e o l i g o n u c l e o t i d e s ) i n a 1 ml c u v e t t e p l a c e d i n a w a t e r - j a c k e t e d s a m p l e h o l d e r o f a r e c o r d i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r . A n a l i q u o t o f v e n o m p h o s p h o d i e s t e r a s e ( W o r t h i n g t o n , 7-5 m g / m l ) w a s a d d e d t o t h e s a m p l e c u v e t t e a n d t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e a t t h e max imum w a v e l e n g t h r e c o r d e d . T h e a m o u n t o f e n z y m e a d d e d was d e t e r m i n e d e x p e r i m e n t a l l y s u c h t h a t d e g r a d a t i o n o f t h e o l i g o m e r w a s c o m p l e t e w i t h i n 1 t o 2 h o u r . T h e % h y p o c h r o m i c i t y w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e f o r m u l a : w a s p r e - i n c u b a t e d a t 3 5 ° i n 1 ml o f 0 .1 M t r i s a c e t a t e , pH 8 . 0 , % H y p o c h r o m i c i t y = A A . U . Amax X 1 0 0 % i n i t i a l A . U . Amax + A A . U . Amax 2 5 E ^ Q _ i s t h e a v e r a g e m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t p e r b a s e c a l c u l a t e d f r o m t h e m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s o f t h e i n d i v i d u a l n u c l e o t i d e s a t t h e Amax o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e . T h e E , w a s c a l c u l a t e d a s d e s c r i b e d a b o v e . I t s h o u l d b e n o t e d c a l c 3 5 ° t h a t t h i s v a l u e i s a c t u a l l y E , a n d b e c a u s e m o s t o f t e n t h e c a l c e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t a t 25° i s m o r e u s e f u l , t h e h y p o c h r o m i c i t y r e s u l t i n g f r o m a c h a n g e i n t e m p e r a t u r e f r o m 35 ° t o 25 ° w a s 35° 2 5 ° e s t i m a t e d a n d t h i s v a l u e u s e d t o c o r r e c t t h e E . t o t h e E , -. . c a l c c a l c 2) T h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e d f o r c o m p l e m e n t a r y i n t e r - a c t i o n s o f t h e t y p e d ( p T ) n ' d ( p A ) ^ a n d d ( p T ) ^ ' p o l y A . T h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n o l i g o n u c l e o t i d e s w a s s t u d i e d b y f o l l o w i n g t h e i n c r e a s e i n a b s o r b a n c e a t 260 nm o f a m i x t u r e o f t w o c o m p l e m e n t a r y s e q u e n c e s . T h e m e t h o d u s e d w a s s i m i l a r t o t h a t d e s c r i b e d b y G i l h a m (68) a n d N a y l o r a n d G i l h a m ( 1 2 4 ) . A p p r o x i m a t e l y 0.025 m m o l e o f o l i g o n u c l e o t i d e ( b a s e d o n t h e m o n o n u c l e o t i d e u n i t ) w e r e m i x e d w i t h 0.025 m m o l e o f a c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e o r p o l y n u c l e o t i d e ( t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f n u c l e o t i d e = 0.05 m M ) . T h e s a m p l e w a s made u p t o 1 ml w i t h m o l a r b u f f e r e d s a l i n e , MBS (0.01 M N a H ^ P O ^ , pH 7-0, 1 M i n N a C l ) a n d s t o r e d a t 4 ° f o r 16 t o 18 h o u r . T h e s a m p l e w a s t h e n t r a n s f e r r e d t o a p r e - c h i l l e d ( 0 ° ) 1 m l , 1 cm l i g h t p a t h , q u a r t z c u v e t t e i n t h e s a m p l e h o l d e r o f a d o u b l e beam r e c o r d i n g s p e c t r o -p h o t o m e t e r ( U n i c a m Sp .800 w i t h Sp .825 p r o g r a m m e c o n t r o l l e r Sp .850 s c a l e e x p a n s i o n a c c e s s o r y , a n d S P . 2 1 r e c o r d e r ) . 2 6 T h e t e m p e r a t u r e ' i n t h e c u v e t t e w a s r e d u c e d f u r t h e r t o a p p r o x i m a t e l y - 7 ° a n d t h e s a m p l e i n c u b a t e d a t t h i s t e m p e r a t u r e f o r a t l e a s t 1 h o u r . T h e t h e r m a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e w a s t h e n o b s e r v e d b y s l o w l y r a i s i n g t h e t e m p e r a t u r e o f t h e s a m p l e . T h i s w a s a c c o m p l i s h e d b y c o n n e c t i n g t h e m a g n e t o n t h e t h e r m o r e g u l a t o r o f t h e H a a k e c i r c u l a t i n g b a t h t o t h e s l o w s h a f t o f a v a r i a b l e s p e e d m o t o r ( G e r a l d K. H e l l e r , m o d e l 2 T 6 0 - 1 1 1 0 v a r i a b l e s p e e d m o t o r w i t h S - 1 0 m o t o r c o n t r o l l e r ) . T h e m o t o r w a s s e t t o t u r n t h e m a g n e t a t a r a t e w h i c h c a u s e d a r i s e i n t e m p e r a t u r e o f n o g r e a t e r t h a n 1 . 5 ° p e r 3 m i n . T h e s p e c t r o p h o t o m e t e r w a s p r o g r a m m e d t o r e c o r d t h e a b s o r b a n c e o f t h e s a m p l e f o r a f i v e s e c o n d d u r a t i o n e v e r y 3 m i n , a n d t h e r e c o r d w a s p l o t t e d o u t o n t h e r e c o r d e r . T h e S P . 2 1 r e c o r d e r w a s s e t a t a f u l l s c a l e e x p a n s i o n o f 0 . 2 0 A . U . T h e t e m p e r a t u r e i n c r e a s e w a s c o n t i n u e d u n t i l a n u p p e r " b r e a k " i n t h e t h e r m a l p r o f i l e w a s o b s e r v e d . T h e j a c k e t e d c u v e t t e h o l d e r o f t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r was p r e -c h i l l e d t o 0 ° u s i n g a c i r c u l a t i n g r e f r i g e r a t e d b a t h ( H a a k e M o d e l K T 4 1 ) f i l l e d w i t h e i t h e r 35% e t h a n o l o r 50% e t h y l e n e g l y c o l . T h e b l a n k c u v e t t e c o n t a i n e d 1 ml M B S . A t e m p e r a t u r e p r o b e c o n n e c t e d t o a t e l e - t h e r m o m e t e r (YS I t e 1 e - t h e r m o m e t e r m o d e l hi SC w i t h r a n g e -h0° t o 1 5 0 ° ) w a s p l a c e d i n a t h i r d c u v e t t e f i l l e d w i t h M B S . T h i s " t e m p e r a t u r e e e l 1 " was p l a c e d i n s a m p l e s l o t 2 , a d j a c e n t t o t h e s a m p l e c u v e t t e . (A c h e c k s h o w e d t h a t t h e t e m p e r a t u r e o f t h e s a m p l e c u v e t t e w a s i d e n t i c a l t o t h a t r e c o r d e d i n t h e " t e m p e r a t u r e c e l l " . ) C o n d e n s a t i o n o f w a t e r v a p o u r o n t h e o p t i c a l s u r f a c e s a t l e s s t h a n 1 0 ° was a p r o b l e m . H o w e v e r , i t w a s f o u n d t h a t p a s s i n g a s t r e a m o f d r y n i t r o g e n i n t o t h e c u v e t t e h o l d e r a r e a e l i m i n a t e d t h i s p r o b l e m , p r o v i d e d t h e c e l l c o m p a r t m e n t d o o r w a s n o t o p e n e d b e l o w 0 ° . B e c a u s e o f t h e s t a c k i n g o f l i n e a r l y a r r a n g e d p u r i n e b a s e s , s i n g l e s t r a n d e d p o l y n u c l e o t i d e s a n d o l i g o n u c l e o t i d e s c o n t a i n i n g t r a c t s o f p u r i n e s ( p a r t i c u l a r l y a d e n y l i c a c i d r e s i d u e s ) e x h i b i t a t h e r m a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e ( 1^5 ) . C o n s e q u e n t l y , t h e p u r i n e c o n t a i n i n g o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s a s w e l l a s p o l y A w e r e ' d e n a t u r e d i n d i v i d u a l l y . T h e d e n a t u r a t i o n c u r v e f o r a . 0 2 5 mM s o l u t i o n o f p u r i n e o l i g o n u c l e o t i d e w a s t h e n s u b t r a c t e d f r o m a t h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e f o r a m i x t u r e o f c o m p l e m e n t a r y n u c l e o t i d e s ( . 0 5 0 mM n u c l e o t i d e ) t o o b t a i n t h e t r u e t h e r m a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e ( s e e F i g . 1 4 A ) . 3) f m a n d % h y p o c h r o m i c ! t y . T h e Tm i s d e f i n e d a s t h e t e m p e r a t u r e a t t h e m i d p o i n t o f t h e i n c r e a s e i n a b s o r b a n c e ( a t 260 nm) (1^5) ( s e e F i g . 14B) . T h e % h y p o c h r o m i c ! t y i s d e f i n e d a s t h e p e r c e n t i n c r e a s e i n a b s o r b a n c e r e l a t i v e t o t h e sum o f t h e a b s o r b a n c e o f t h e i n d i v i d u a l o l i g o n u c 1 e o t i d e s a t 25 ° . F o r i n t e r a c t i o n s b e t w e e n s h o r t e r o l i g o n u c l e o t i d e s , e s p e c i a l l y o l i g o n u c l e o t i d e s o f m i x e d r e p e a t i n g b a s e s e q u e n c e , w h i c h a r e i n c o m p l e t e a t - 7 ° , t h e % h y p o c h r o m i c i t y i s c a l c u l a t e d o n t h e max imum d i f f e r e n c e i n a b s o r b a n c e o b s e r v e d . In t h e s e c a s e s t h e Tm was e s t i m a t e d , b a s e d o n a n e x p e c t e d max imum h y p o c h r o m i c i t y o f 1 5 % f o r d ( p A ) n " d ( p T ) n i n t e r a c t i o n s a n d 9% f o r d ( p A p A p G ) n * d ( p C p T p T ) • ' ( o r d ( p T p T p C ) 2 ) i n t e r a c t i o n s . T h i s Tm v a l u e i s r e c o r d e d w i t h a n i n d i c a t i n g i t i s a n e s t i m a t e d v a l u e . 92 F i g u r e ]h. D e f i n i t i o n o f t e r m s r e l a t e d t o t h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e s . A . T h e o r e t i c a l t h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e s f o r i n t e r a c t i o n o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s . C u r v e a i s t h e t h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e o b s e r v e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y f o r t h e i n t e r a c t i o n o f t w o c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s . C u r v e b.| i s t h e d e n a t u r a t i o n p r o f i l e o f t h e p y r i m i d i n e o l i g o n u c l e o t i d e a n d b ^ , t h e p u r i n e o l i g o n u c l e o t i d e . C u r v e c , t h e t r u e d e n a t u r a t i o n p r o f i l e , i s o b t a i n e d b y s u b t r a c t i n g c u r v e s b^ a n d b^ f r o m a . S i n c e t h e i n c r e a s e i n a b s o r b a n c e o f a p y r i m i d i n e o l i g o n u c l e o t i d e o v e r t h e t e m p e r a t u r e r a n g e - 5 ° t o 70 ° i s n e g l i g i b l e , c u r v e c i s r o u t i n e l y o b t a i n e d b y s u b t r a c t i n g c u r v e b^ f r o m a . B. D e t e r m i n a t i o n o f Tm a n d % h y p o c h r o m i c ! t y ( 1 4 5 ) . T h e t h e r m a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e i s e q u i v a l e n t t o c u r v e c i n F i g u r e 1 4 A . T h e Tm i s t h e t e m p e r a t u r e a t o n e h a l f t h e i n c r e a s e i n a b s o r b a n c e . T h e % h y p o c h r o m i c i t y i s c a l c u l a t e d f r o m t h e f o r m u l a : A 2 6 0 ( M ) - A 2 6 0 ( B ) 0 A 260 i n d i v i d u a l o l i g o m e r s a t 2 5 u 9 2 a B. S y n t h e s i s a n d P r o p e r t i e s o f 0 ) i g o n u c l e o t i d e - C e l 1 u l o s e s . 1) S y n t h e s i s o f o l i g o n u c i e o t i d e - c e 1 1 u l o s e s . R e a c t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s o n c e l l u l o s e p a p e r w i t h a w a t e r - s o l u b l e c a r b o d ? i m i d e . T h e p r o c e d u r e u s e d t o l i n k o l i g o n u c l e o t i d e s t o c e l l u l o s e p a p e r w a s s l i g h t l y m o d i f i e d f r o m t h a t d e s c r i b e d b y G i l h a m (124). A p p r o x i m a t e l y 50 t o 150 A . U . o f o l i g o n u c l e o t i d e (NH^ s a l t c o n v e r t e d t o Na s a l t o n a s m a l l B i o - R a d AG 50W c o l u m n , 0 . 9 cm x 5 cm) w a s d r i e d o v e r n i g h t , i n v a c u o , o v e r ^2^5" ^ o u r t u b e s w e r e s e t u p a c c o r d i n g t o t h e o u t l i n e b e l o w . T h e c o n t e n t s o f e a c h t u b e w e r e s t r e a k e d o n t o a 5 x 1.2 cm a r e a o f p r e - w a s h e d Wha tman 3 MM p a p e r s t r i p . 2 7 O l i g o B u f f e r W a t e r T u b e n u c l e o t i d e (0.2 M N a + M e s " ) (pH 6.0) C a r b o d i i m i d e A 5 0 - 1 5 0 A . U . 0 . 1 ml 0 . 4 ml 50 mg B 5 0 - 1 5 0 A . U . 0 . 1 ml 0 . 4 ml --C -- 0 .1 ml 0 . 4 ml 50 mg D 0 .1 ml 0 . 4 ml " T h e W h a t m a n 3 MM w a s w a s h e d i n 0 . 0 0 1 M EDTA (pH 7 . 0 ) , d i s t i 1 l e d w a t e r , a n d a i r - d r i e d . T h e p a p e r was t h e n s o a k e d i n m e t h a n o l : H C 1 ( 9 9 : 1 v / v ) f o r 3 d a y s . T h e p a p e r was w a s h e d i n e x c e s s d i s t i l l e d w a t e r u n t i l t h e pH w a s n e u t r a l , a n d s o a k e d b r i e f l y i n 0 . 0 5 M N a + M e s ~ , pH 6 . 0 . T h e p a p e r w a s a g a i n w a s h e d i n d i s t i l l e d w a t e r a n d a i r - d r i e d . I n i t i a l l y , t h e p a p e r w a s m e t h y l a t e d b e c a u s e i t i s k n o w n t h a t c e l l u l o s e c o n t a i n s a n u m b e r o f f r e e c a r b o x y l g r o u p s w h i c h c a n r e a c t w i t h a c a r b o d i i m i d e ( 1 4 6 ) . T h i s c a n r e a r r a n g e t o g i v e a s t a b l e a c y l u r e a , w h i c h i n t h e c a s e o f a w a t e r - s o l u b l e c a r b o -d i i m i d e w i t h a q u a t e r n a r y n i t r o g e n g r o u p w o u l d i n t r o d u c e a n i o n -e x c h a n g e r p r o p e r t i e s t o t h e c e l l u l o s e , a n d may t h e r e f o r e a f f e c t t h e e l u t i o n o f a n i o n i c o l i g o n u c l e o t i d e s ( 1 4 2 ) . A l t h o u g h a t h i g h j s a l t c o n c e n t r a t i o n s ( l M N a C l ) t h e i o n i c i n t e r f e r e n c e o f o l i g o -n u c l e o t i d e e l u t i o n i s u n l i k e l y t h e m e t h y l a t i o n s t e p w a s r e t a i n e d b e c a u s e i t w a s f e l t t h a t t h e p r o p o s e d i n t e r m e d i a t e o f c a r b o d i i m i d e a n d p h o s p h a t e o n t h e o l i g o n u c l e o t i d e c o u l d r e a c t w i t h f r e e c a r b o x y l g r o u p s p r o d u c i n g l i n k a g e s o f t h e t y p e O l i g o n u c l e o t i d e s l i n k e d t o c e l l u l o s e v i a a m i x e d a n h y d r i d e w o u l d be l e s s s t a b l e t h a n t h o s e l i n k e d v i a a p h o s p h o d i e s t e r l i n k a g e , c e | | -ce T h e p a p e r s t r i p s w e r e h u n g u p t o d r y a t r oom t e m p e r a t u r e f o r 2 4 t o 4 8 h o u r . ( T h e p a p e r s w e r e n o t e x p o s e d p e r i o d i c a l l y t o a n a t m o s p h e r e o f w a t e r v a p o u r , a s d e s c r i b e d b y G i l h a m ( 1 2 4 ) . ) In s o m e c a s e s , a s e c o n d 50 mg o f N - c y c l o h e x y 1 - N 1 - 3 ( 4 - m e t h y 1 -m o r p h o l i n i u m ) e t h y l c a r b o d i i m i d e p - t o l u e n e s u 1 f o n a t e was a p p l i e d t o p a p e r s A a n d C . T h i s w a s d o n e b y d i s s o l v i n g t h e r e a g e n t i n 0 .1 ml b u f f e r a n d 0 . 4 ml w a t e r . P a p e r s B a n d C. w e r e s t r e a k e d w i t h t h e b u f f e r a n d w a t e r m i x t u r e m i n u s t h e c a r b o d i i m i d e . I f t w o a p p l i c a t i o n s o f t h e c a r b o d i i m i d e w e r e d o n e , t h e s e c o n d w a s r o u t i n e l y s t r e a k e d o n 48 h o u r a f t e r t h e f i r s t , a n d t h e p a p e r s l e f t a n o t h e r 4 8 h o u r ( i . e . 96 h o u r t o t a l ) . In some e x p e r i m e n t s , t h e a m o u n t o f b u f f e r was i n c r e a s e d t o 0 . 2 ml ( 0 . 2 M N a + M e s ) a n d t h e a m o u n t o f w a t e r r e d u c e d t o 0 . 3 m l . F i n a l l y , i n some e x p e r i m e n t s , b e c a u s e o f t h e l i m i t e d a m o u n t o f o l i g o n u c l e o t i d e a v a i l a b l e , t u b e B w a s o m i t t e d . T h e o m i s s i o n o f t u b e B a l t e r s t h e c a l c u l a t i o n o f t h e % n u c l e o t i d e i n c o r p o r a t i o n ( s e e b e l o w ) , a n d o w i n g t o t h i s c h a n g e , t h e e s t i m a t e o f n u c l e o t i d e i n c o r p o r a t i o n i s p r o b a b l y u p t o 1 0 % h i g h e r t h a n t h e t r u e v a l u e . A f t e r t h e r e a c t i o n h a d p r o c e e d e d ( f o r 2 4 t o 96 h o u r ) t h e p a p e r s t r i p s w e r e s u s p e n d e d i n a t r o u g h i n a s m a l l c h r o m a t o g r a p h y t a n k ( K o n t e s , t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y t a n k ) a n d e l u t e d b y t h e d e s c e n d i n g m e t h o d w i t h a b o u t 10 ml o f 0 . 0 5 M N a h ^ P O ^ , pH 7 - 0 . T h e e l u a t e was c o l l e c t e d a n d made u p t o 25 ml w i t h t h e p h o s p h a t e b u f f e r . T h e s p e c t r a o f t h e f o u r s a m p l e s w e r e r u n a n d t h e a m o u n t 9 5 o f o l i g o n u c l e o t i d e i n c o r p o r a t e d o n t o t h e p a p e r c a l c u l a t e d u s i n g o n e o f t h e f o l l o w i n g t w o f o r m u l a e . . C a l c u l a t i o n o f n u c l e o t i d e i n c o r p o r a t i o n w h e n t u b e B i s i n c l u d e d ( A , B, C a n d D a r e t h e a b s o r b a n c e o f t h e 2 5 ml s o l u t i o n s a t t h e w a v e l e n g t h o f max imum a b s o r p t i o n o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e . ) A . U . O l i g o n u c l e o t i d e i n c o r p o r a t e d C a l c u l a t i o n o f n u c l e o t i d e i n c o r p o r a t i o n w h e n t u b e B i s o m i t t e d . ( A , C a n d D a r e t h e a b s o r b a n c e o f t h e 2 5 ml s o l u t i o n s a t t h e w a v e l e n g t h o f max imum a b s o r p t i o n o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e . B i s t h e a b s o r b a n c e u n i t s o f o l i g o n u c l e o t i d e t h a t was p l a c e d i n t u b e A , i n i t i a l l y . ) A . U . O l i g o n u c l e o t i d e = + i n c o r p o r a t e d II 2) P o s s i b l e s i d e r e a c t i o n s i n t h e r e a c t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s  w i t h t h e c a r b o d i i m i d e . In e x p e r i m e n t s t o c h e c k t h a t t h e o l i g o n u c l e o t i d e s w e r e n o t i n v o l v e d i n s i d e r e a c t i o n s w i t h t h e c a r b o d i i m i d e u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f t h e i n c o r p o r a t i o n e x p e r i m e n t s , t h e m o d e l c o m p o u n d s d - p T , d-pC a n d d - p A ( a p p r o x i m a t e l y 20 u m o l e s o f t h e N a + s a l t s ) , w e r e r e a c t e d i n a q u e o u s s o l u t i o n a n d o n p a p e r , i n t h e p r e s e n c e o f N a + M e s b u f f e r (B-D) A . U . / m l ( C - D ) A . U . / m r ( A ^ D ) A . U . / m , 2 5 m 1 (C-D) A . U . / m l (A-D) A . U . / m l 25 ml 9 6 (pH 6.0) w i t h v a r y i n g a m o u n t s o f c a r b o d i i m i d e r e a g e n t a n d f o r v a r y i n g l e n g t h s o f t i m e . ( T h e d e t a i l s o f t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s a r e g i v e n i n t h e R e s u l t s . ) A t t h e e n d o f t h e i n c u b a t i o n , t h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s d i l u t e d t o 10 ml w i t h w a t e r a n d t h e pH . a d j u s t e d t o 7.1 w i t h a d i l u t e . s o l u t i o n o f t r i e t h y l a m i n e . T h e s a m p l e s w e r e l o a d e d d i r e c t l y o n t o DEAE-c e l l u l o s e ( a c e t a t e ) c o l u m n s (1.2 cm x kO c m ) , p r e - e q u i 1 i b r a t e d w i t h 0.01 M T E A A , pH 7 .1, a n d e l u t e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o f T E A A , pH 7 .1 , 0.01 M t o 0.15 M. In o r d e r t o m o r e c l o s e l y a p p r o x i m a t e r e a c t i o n c o n d i t i o n s f o r t h e n u c l e o t i d e s w i t h t h e c a r b o d i i m i d e d u r i n g a n i n c o r p o r a t i o n e x p e r i m e n t , o n e e x p e r i m e n t w a s d o n e i n w h i c h d - p T a n d c a r b o d i i m i d e w e r e s t r e a k e d o n t o Wha tman 3 MM i n t h e u s u a l m a n n e r ( s e e 1 a b o v e ) . A f t e r 2k h o u r , t h e p a p e r s w e r e e l u t e d w i t h 10 ml p h o s p h a t e b u f f e r (0.01 M , pH 7-0) a n d t h e e l u a t e l o a d e d d i r e c t l y o n t o a D E A E - c e l l u l o s e ( a c e t a t e ) c o l u m n a s d e s c r i b e d a b o v e . 3) P r e p a r a t i o n o f c o l u m n m a t r i x a n d p r o c e d u r e f o r p a c k i n g c o l u m n . T h e o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e p a p e r s t r i p s w e r e p r e p a r e d f o r c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y b y c u t t i n g t h e p a p e r i n t o 1 mm s q u a r e s , s u s p e n d i n g t h e s e i n 20 ml MBS a n d s t i r r i n g v i g o r o u s l y w i t h a m a g n e t i c s t i r r e r f o r 1 t o 2 h o u r . A f t e r t h i s t i m e m o s t o f t h e p a p e r w a s i n f i n e l y d i v i d e d f i b r e s w i t h a v e r y f e w s q u a r e s o f p a p e r r e m a i n i n g . 2 8 ^ A t t e m p t s w e r e made t o o b t a i n a m o r e u n i f o r m p a r t i c l e s i z e o f t h e c e l l u l o s e . T h i s w a s d o n e b y s u s p e n d i n g t h e p a p e r i n 100 ml MBS a n d m i x i n g i n a W a r i n g B l e n d e r . H o w e v e r , w h e n t h e p a p e r j u s t r e a c h e d t h e s t a g e w h e r e a l l s q u a r e s o f p a p e r h a d b e e n f r a g m e n t e d , t h e r e s u l t i n g s l u r r y , w h e n p a c k e d i n t o a c o l u m n g a v e a p r o h i b i t i v e l y s l o w f l o w r a t e , p a r t i c u l a r l y a t t e m p e r a t u r e s l e s s t h a n 5 ° . T h e r e f o r e , t h e m e t h o d d e s c r i b e d a b o v e w a s u s e d . T h e j a c k e t e d c o l u m n s u s e d f o r t h e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y w e r e p r e p a r e d b y V a n c o u v e r S c i e n t i f i c G l a s s b l o w i n g . T h e s e c o l u m n s ( d i m e n s i o n s i n F i g u r e 15) w e r e p r e p a r e d t o a c c o m m o d a t e t h e f i t t i n g s i l l u s t r a t e d i n t h e f i g u r e . ( T h e s e f i t t i n g s w e r e p u r c h a s e d f r o m H o e f f e r S c i e n t i f i c I n s t r u m e n t s , C a l i f o r n i a . ) One a d v a n t a g e o f t h i s c o l u m n i s t h a t t h e t e m p e r a t u r e j a c k e t e x t e n d s w e l l b e y o n d b o t h e n d s o f t h e c o l u m n m a t r i x a n d t h e r e f o r e t h e r e i s no c h a n c e o f t h e r e b e i n g a t e m p e r a t u r e g r a d i e n t w i t h i n t h e c o l u m n . A l s o , t h e d e a d s p a c e i s n e g l i g i b l e (<200 \i), i n c l u d i n g t h e l e a d t o t h e f r a c t i o n c o l l e c t o r ) . T h e c e l l u l o s e s l u r r y w a s p a c k e d i n t o t h e c o l u m n u s i n g a p r e s s u r e b u l b . T h e m a t r i x w a s f u r t h e r p a c k e d b y a p p l y i n g p r e s s u r e w i t h a g l a s s r o d w h i c h j u s t f i t t h e i n s i d e o f t h e c o l u m n . A l t h o u g h a n e s t i m a t e o f t h e a m o u n t o f p r e s s u r e u s e d t o p a c k t h e c o l u m n i s d i f f i c u l t t o g i v e , i t s h o u l d b e s a i d t h a t i t w a s c o n s i d e r a b l y g r e a t e r t h a n w h a t o n e o r d i n a r i l y u s e s t o p a c k s u c h c o l u m n s a s D E A E - c e l 1 u l o s e c o l u m n s (2 t o 5 p s i ) a n d t h a t t h e c e l l u l o s e f r o m a 5 cm x 12 cm p i e c e o f Wha tman 3 MM c o u l d b e p a c k e d i n t o a c o l u m n 0.9 cm x 5 c m . A l t h o u g h t h e c o l u m n w a s p a c k e d v e r y t i g h t l y , f l o w r a t e s i n e x c e s s o f 0.5 m l / m i n c o u l d b e o b t a i n e d , e v e n a t t e m p e r a t u r e s a s l o w a s -5°-4) P r o c e d u r e f o r r u n n i n g o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n s , a ) T h e r m a l e l u t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s . T h e o l i g o -n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n s w e r e r o u t i n e l y p r e p a r e d ( a n d iiliijnnii I 2.5 1 F i g u r e 1 5 . D i m e n s i o n s ( i n c e n t i m e t e r s ) o f j a c k e t e d c o l u m n u s e d f o r t e m p e r a t u r e - c o n t r o l l e d e l u t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s f r o m c o l u m n s o f o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e . T h e f i t t i n g s i l l u s t r a t e d w e r e p u r c h a s e d f r o m H o e f f e r S c i e n t i f i c I n s t r u m e n t s . r e g e n e r a t e d ) b y w a s h i n g t h e m r a p i d l y w i t h a t l e a s t 3 c o l u m n v o l u m e s o f 0 . 1 N N a O H . T h e c e l l u l o s e w a s t h e n e q u i l i b r a t e d w i t h MBS a t t h e t e m p e r a t u r e t h a t t h e n u c l e o t i d e s w e r e t o be l o a d e d ( u s u a l l y - 4 ° t o - 5 ° ) . T h e o l i g o n u c 1 e o t i d e - c e l 1 u l o s e s w e r e s t a b l e t o r e p e a t e d w a s h i n g w i t h t h e d i l u t e a l k a l i , a n d c o u l d b e r e u s e d many t i m e s , w i t h t h e r e s u l t s f o r a p a r t i c u l a r c o l u m n i n v a r i a n t a f t e r s e v e r a l w a s h i n g s a n d a l s o a f t e r s t o r a g e ( a s a s l u r r y i n MBS a t - 2 0 ° ) f o r s e v e r a l m o n t h s . T h e c o l u m n s w e r e l o a d e d w i t h a n o l i g o n u c l e o t i d e s a m p l e ( u s u a l l y a b o u t 5 A . U . i n 1 m l MBS) u n d e r a s l i g h t p r e s s u r e s u c h t h a t a 1 m l s a m p l e w a s l o a d e d i n a p p r o x i m a t e l y 15 m i n . T h e s a m p l e w a s w a s h e d i n w i t h 1 ml MBS a n d t h e c o l u m n w a s h e d w i t h t h i s b u f f e r a t -4 ° t o - 5 ° , a t a f l o w r a t e o f 1.7 ml/11 m i n ( c o n t r o l l e d b y u s i n g a B u c h l e r p e r i s t a l t i c . p u m p ) . T h i s i n i t i a l w a s h i n g w a s c o n t i n u e d u n t i l t h e a b s o r b a n c e o f t h e e f f l u e n t d r o p p e d t o z e r o . T h e b o u n d n u c l e o t i d e w a s t h e n e l u t e d w i t h a s t e p w i s e t e m p e r a t u r e g r a d i e n t o r l i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t . 2 9 T h e c o l u m n t e m p e r a t u r e w a s c o n t r o l l e d b y u s i n g a H a a k e m o d e l KT41 c i r c u l a t i n g b a t h . T h e l i n e a r , i n c r e a s e i n t e m p e r a t u r e w a s o b t a i n e d b y a t t a c h i n g t h e m a g n e t o f t h e t h e r m o - r e g u l a t o r t o t h e s l o w s h a f t o f a v a r i a b l e s p e e d m o t o r ( G . K . H e l l e r , m o d e l 2 T 6 0 - 1 1 1 0 ) . A l t h o u g h t h e s p e c i f i c a t i o n s o f t h e m o t o r s t a t e t h a t s p e e d s o f 0 - 4 0 0 0 RPM a r e o b t a i n a b l e , t h e m o t o r was u n r e l i a b l e a t t h e n e c e s s a r y s l o w s p e e d , a n d f r e q u e n t l y s t a l l e d . T h e p r o b l e m w a s o v e r c o m e b y c o n n e c t i n g t h e s l o w s h a f t o f t h e m o t o r t o a g e a r s y s t e m ( r a t i o 4.6 t o 1) s u p p o r t e d i n a g e a r b o x w h i c h w a s a t t a c h e d t o t h e m o t o r b y a b r a c k e t . T h e m a g n e t w a s t h e n a t t a c h e d t o t h e l a r g e g e a r . In t h i s w a y , t h e m o t o r c o u l d b e s e t a t a s p e e d s u c h t h a t t h e m a g n e t o n t h e t h e r m o - r e g u 1 a t o r t u r n e d a t a s l o w , r e l i a b l e , c o n s t a n t r a t e (1 r e v o l u t i o n p e r 14 m i n ) , c a u s i n g a n i n c r e a s e i n t e m p e r a t u r e o f 1 ° e v e r y 22 mi n . T h e l a t t e r w a s s e t u p t o g i v e a n i n c r e a s e o f 1 p e r 2 2 m i n ( i . e . 0 . 5 ° p e r 1 .7 ml f r a c t i o n ) . T h e c h o i c e o f t h i s f l o w r a t e a n d t e m p e r a t u r e g r a d i e n t w a s s o m e w h a t a r b i t r a r y , a l t h o u g h , i t w a s f e l t t h a t s i n c e t h e b e d v o l u m e o f t h e c o l u m n w a s a p p r o x i m a t e l y 3 m l , a n d t h e f r a c t i o n s i z e 1 .7 m l , t h e n e v e r y t w o f r a c t i o n s a r e e q u i v a l e n t t o a t l e a s t o n e c o l u m n v o l u m e , a n d t h i s a l s o c o r r e s p o n d s t o a c h a n g e o f 1 ° ( i . e . t h i s f l o w r a t e a n d t e m p e r a t u r e g r a d i e n t r e s u l t i n o n e b e d v o l u m e o f e l u a n t t h r o u g h t h e c o l u m n p e r i n c r e a s e o f 1 ° ) . b ) O t h e r m e t h o d s o f e l u t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s . A n u m b e r o f m e t h o d s o t h e r t h a n t h e r m a l e l u t i o n w e r e u s e d t o e f f e c t t h e e l u t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s f r o m b l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n s . T h e s e i n c l u d e r e v e r s e s a l t g r a d i e n t s ( h i g h s a l t t o l o w s a l t ) , o r g a n i c s o l v e n t s ( f o r m a m i d e , d i m e t h y l f o r m a m i d e , d i m e t h y 1 s u 1 f o x i d e ) , a s w e l l a s a g r a d i e n t o f s o d i u m p e r c h l o r a t e . T h e d e t a i l s o f t h e s e e x p e r i m e n t s a r e g i v e n i n t h e R e s u l t s . 5 . P r e p a r a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s o f t h e s e r i e s d ( A ) a n d r ( A ) . — n — n T h e o l i g o n u c l e o t i d e s e r i e s d ( A ) ( n = 6 , 7 , 8 , 9 ) w a s p r e p a r e d b y a l k a l i n e p h o s p h a t a s e d i g e s t i o n o f d ( p A ) ^ . A p p r o x i m a t e l y 1 y m o l e o f n u c l e o t i d e w a s i n c u b a t e d i n 100 y l o f 0 . 1 M N H ^ H C O ^ , pH 8 . 0 w i t h 10 y l a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( M i l e s , 10 m g / m l , 33U/mg ) a t h5° f o r 3 h o u r . T h e n u c l e o t i d e w a s s e p a r a t e d f r o m t h e e n z y m e b y e l u t i o n o n e i t h e r a s m a l l D E A E - c e l 1 u l o s e 101 9 ( C0^ ) c o l u m n , 1 .2 cm x 5 cm ( d ( A ) ^ a n d d ( A ) g p r e p a r a t i o n s ) , w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o f NH^HCO^ , o r o n a S e p h a d e x G50 c o l u m n , 0 . 8 cm x 55 cm ( d ( A ) _ , a n d d ( A ) ^ p r e p a r a t i o n s ) , w i t h 0 . 0 1 M NH^HCO^ . In b o t h c a s e s t h e e n z y m e a c t i v i t y w a s a s s a y e d u s i n g t h e s u b s t r a t e p - n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e , a n d t h e e n z y m e w a s f o u n d t o b e s e p a r a t e d f r o m t h e o l i g o n u c l e o t i d e . 3 0 T h e o l i g o m e r r ( A ) g w a s p r e p a r e d b y p e r i o d a t e o x i d a t i o n o f r ( A ) ( 1 4 7 ) f o l l o w e d b y a l k a l i n e p h o s p h a t a s e d i g e s t i o n . T h e r ( A ) g was s e p a r a t e d f r o m t h e e n z y m e o n a D E A E - c e l l u l o s e (CO^) c o l u m n a s d e s c r i b e d a b o v e . T h i s p r e p a r a t i o n w a s s u b j e c t e d t o a n o t h e r r o u n d o f p e r i o d a t e o x i d a t i o n f o l l o w e d b y p h o s p h a t a s e , a n d t h e r e s u l t a n t r ( A ) ^ was p u r i f i e d o n a S e p h a d e x G50 c o l u m n a s d e s c r i b e d a b o v e . 6. I s o l a t i o n o f S a l m o n L i v e r RNA . T h e p r o c e d u r e f o r t h e i s o l a t i o n o f RNA f r o m t h e l i v e r o f a C h i n o o k s a l m o n ( O n c o r h y n c h u s t s c h a w y t s c h a ) w a s b a s e d o n a m e t h o d u s i n g d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e a s a n i n h i b i t o r o f n u c l e a s e a c t i v i t y ( 1 4 8 ) . T h e l i v e r (4.8 g , s t o r e d f r o z e n a t - 2 0 ° ) w a s b r o k e n i n t o s m a l l p i e c e s a n d h o m o g e n i z e d a t 0 ° i n 12 ml h o m o g e n i z i n g m e d i u m ( 0 . 2 5 M s u c r o s e , 1 . 5 mM M g C l ^ , 2 . 5 mM t r i s H C 1 , pH 7-6; TMS) i n a g l a s s - t e f l o n h o m o g e n i z e r . T h e h o m o g e n a t e w a s c e n t r i f u g e d a t 2 2 0 0 RPM ( S S - 3 4 r o t o r ) a t 4 ° f o r 10 m i n . I t was n o t r e a l l y n e c e s s a r y t o f i r s t r e m o v e t h e e n z y m e f r o m t h e o l i g o n u c l e o t i d e p r i o r t o e l u t i o n o f t h e o l i g o m e r f r o m a n o l i g o -n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e c o l u m n . T h e n u c l e a r p e l l e t w a s w a s h e d w i t h 4 ml TMS a n d r e c e n t r i f u g e d . T h e p o o l e d s u p e r n a t a n t s w e r e c e n t r i f u g e d a g a i n , a t 12 ,500 RPM (SS-34) ( 4 ° ) f o r 15 m i n t o p e l l e t t h e m i t o c h o n d r i a ( 1 4 9 ) . T h e p e l l e t w a s w a s h e d (4 ml TMS) a n d t h e m i t o c h o n d r i a r e -p e l l e t e d . T h e r e d d i s h s u p e r n a t a n t s w e r e p o o l e d t o g i v e a t o t a l o f 2 0 m l . C o n c e n t r a t e d SDS b u f f e r (2 m l , 11% SDS w / v i n . 0 . 5 M t r i s H C 1 , pH 7.6, 50 mM MgC i l^ ) was a d d e d t o t h e 20 ml o f e x t r a c t , a n d t h e t w o w e r e m i x e d t h o r o u g h l y . D i e t h y l -p y r o c a r b o n a t e ( B a y c o v i n ) (0 . 66 m l ) w a s a d d e d t o b r i n g t h e N a C l c o n c e n t r a t i o n t o 1.7 M . T h e s o l u t i o n w a s l e f t a f u r t h e r 15 m i n a t 3 7 ° , a n d t h e h e a v y p r e c i p i t a t e r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( 1 0 , 0 0 0 x £ , S S - 3 4 : r o t o r , 4 ° ) . Some f l o c c u l e n t p r e c i p i t a t e r e m a i n e d a n d w a s r e m o v e d b y p i p e t t i n g t h e s o l u t i o n t h r o u g h a s m a l l p a d o f g l a s s w o o l . T h e f i l t r a t e w a s a d d e d t o 60 ml o f 9 5 % e t h a n o l a n d s t o r e d o v e r n i g h t a t - 2 0 ° . T h e p r e c i p i t a t e w a s d i s s o l v e d i n 8 ml 5 0 mM N a h ^ P O ^ , pH 7 - 0 , 0 . 4 M N a C l a n d d i a l y z e d 3 1 o v e r n i g h t i n t h e c o l d r oom a g a i n s t t h i s b u f f e r ( 2 x 2 l i t r e s ) . S u f f i c i e n t N a C l w a s a d d e d t o b r i n g t h e s o l u t i o n t o 1 m o l a r , a n d t h e RNA w a s a g a i n p r e c i p i t a t e d . w i t h 9 5 % e t h a n o l . T h e p r e c i p i t a t e was r e d i s s o l v e d i n 8 ml 0 . 0 1 M t r i s H C 1 , pH 7.4, 5 mM M g C l 2 . D e o x y r i b o n u c l e a s e ( W o r t h i n g t o n , r i b o n u c l e a s e f r e e , 0 . 5 m g / m l ) ( 2 0 0 u l ) w a s a d d e d a n d t h e s o l u t i o n i n c u b a t e d a t 3 5 ° f o r 30 m i n . 3 1 T h e d i a l y s i s t u b i n g w a s h e a t i n g a t 80° i n 0 . 0 0 1 M E D T A , pH 7-0 , f o r 1 h o u r , t h e n w a s h e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r a n d s t o r e d i n E D T A , pH 7 . 0 , a t 4 ° ( 1 5 0 ) . SDS (0.33 ml o f a 25% s o l u t i o n w / v ) , d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e (0.27 m l ) a n d s o l i d N a C l (0.86 g ) w e r e a d d e d a n d t h e s o l u t i o n i n c u b a t e d a t 37 f o r 5 m i n . T h e p r e c i p i t a t e was r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d t h e RNA p r e c i p i t a t e d w i t h 95% e t h a n o l (2 v o l u m e s ) . T h e RNA was r e d i s s o l v e d i n 10ml o f 0.025-M t r i s H C l (pH 8.0), 0.01 M M g C l a n d d i a l y z e d a t 4 ° a g a i n s t t h i s b u f f e r f o r 36 h o u r . \ 2 T h e y i e l d o f RNA w a s 230 A ^ u n i t s (||^- r a t i o = 0 .48) . H i g h v o l t a g e a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s a c c o r d i n g t o a p r o c e d u r e d e s c r i b e d b y P e a c o c k a n d D i n g m a n (151) s h o w e d t h i s p r e p a r a t i o n c o n t a i n e d m a t e r i a l m i g r a t i n g i n r e g i o n s c o n s i s t e n t w i t h 4S ( a n d 5 S ) R N A , t h e t w o r R N A s , a s w e l l a s two l a r g e r m o l e c u l a r w e i g h t R N A s . R e c e n t l y , d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e h a s b e e n s h o w n t o r e a c t w i t h a t l e a s t o n e c o m p o n e n t o f n u c l e i c a c i d s , a d e n i n e , f o r m i n g t h e 5 ( 4 ) - N - c a r b e t h o x y a m i n o i m i d a z o l e - 4 ( 5 ) ~ N 1 - c a r b e t h o x y c a r b o x a m i d i n e . T h i s f i n d i n g may e x p l a i n t h e e x t r e m e s e n s i t i v i t y o f t h e i n f e c t i v i t y o f t o b a c c o m o s a i c v i r u s RNA t o t h i s r e a g e n t (152). B e c a u s e o f t h i s f i n d i n g , d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e i s no l o n g e r t h e o n e o f c h o i c e i n t h e i s o l a t i o n o f n u c l e i c a c i d s ( a t l e a s t w h e n b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f t h e m o l e c u l e s i s t o b e r e t a i n e d ) . 104 RESULTS AND D I S C U S S I O N A . I n t e r a c t i o n o f C o m p l e m e n t a r y O l i g o n u c l e o t i d e s i n S o l u t i o n . 1) E s t i m a t i o n o f t h e a v e r a g e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t p e r b a s e a t 25° f o r o l i g o n u c l e o t i d e s o f m i x e d b a s e s e q u e n c e . T h e a v e r a g e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t p e r b a s e a t 25° f o r t h e o l i g o n u c l e o t i d e s o f m i x e d b a s e s e q u e n c e was d e t e r m i n e d b y d e g r a d i n g t h e o l i g o n u c l e o t i d e s w i t h v e n o m p h o s p h o d i e s t e r a s e a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . T h e p r o c e d u r e was c h e c k e d b y d e g r a d i n g a s a m p l e , o f d ( p T ) ^ (1.91 A . U . a t 267 nm) . T h e % h y p o c h r o m i c i t y 2 5 o b s e r v e d was 6.0%, f r o m w h i c h a n E , v a l u e o f 9 , 0 2 4 w a s ' c a l c ' c a l c u l a t e d . N a y l o r a n d G i l h a m ( 1 2 4 ) o b t a i n e d a v a l u e o f 9,000. ' T h e d a t a f o r s a m p l e d e g r a d a t i o n s o f d ( p A p A p G ) ^ (0.72 A . U . a t 257 nm) a n d d ( p A p A p G ) ^ (0.725 A . U . a t 257 nm) a r e s h o w n In F i g u r e 16. T h e a m o u n t o f e n z y m e a d d e d i n e a c h c a s e , 2 u l (7-5 u g ) , r e s u l t e d i n c o m p l e t e d e g r a d a t i o n w i t h i n 30 m i n f o r t h e h e x a n u c l e o t i d e a n d w i t h i n 45 m i n f o r t h e n o n a n u c l e o t i d e . T h e d a t a f o r a l l t h e o l i g o n u c l e o t i d e s o f m i x e d b a s e s e q u e n c e 25 i s s u m m a r i z e d i n T a b l e V I . B e c a u s e m o s t o f t e n t h e E , i s a c a 1c m o r e u s e f u l v a l u e , t h e h y p o c h r o m i c i t y f o r t h e p u r i n e c o n t a i n i n g 2 5 35 o l i g o n u c l e o t i d e s (E a n d E f o r p y r i m i d i n e c o n t a i n i n g o l i g o m e r s a r e t h e s ame ) was c a l c u l a t e d by e s t i m a t i n g t h e h y p o c h r o m i c ! t y d u e t o a 10° d e c r e a s e i n t e m p e r a t u r e (35 ° t o 2 5 ° ) . T h i s was 1 0 5 2 jil e n z y m e TIME ( minutes ) F i g u r e 1 6 . Venom p h o s p h o d i e s t e r a s e d i g e s t i o n o f d ( p A p A p G ) 2 a n d d ( p A p A p G ) , . D e t a i l s i n t e x t . 106 T a b l e V I . A v e r a g e m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t p e r b a s e a t 35 f o r o l i g o n u c l e o t i d e s o f m i x e d b a s e s e q u e n c e . 0 1 i g o -n u c l e o t i d e A . U . ( Amax ) A A . U . (Amax ) 9 'a h y p o c h r o m i c ! t y E 3 5 ° t h e o r c a 1 c d ( P T ) 6 1-91 (267) 0.122 (267) 6.0 9,600 9 , 0 2 4 d ( p T p T P C ) 2 1 .42 (267) 0.105 (267) 6.9 9,317 8,670 d ( p T p T p C ) 3 1 .58 (267) 0.111 (267) 6.5 ' 9,317 8,712 d ( p C p T p T ) 2 1-73 (267) 0.125 (267) 6.7 9,317 8,697 d ( p C p T p T ) 3 1.435 (267) 0. 100 (267) 6.5 9,317 8,712 d ( p C p T p T ) 3 a 1 .745 (267) 0.120 (267) 6.5 9,317 8,712 d ( p A p A p G ) 2 1 . 8 4 (257) 0 . 4 8 5 (257) 2 0 . 8 14 ,500 1 1 , 4 8 0 d ( P A p A p G ) 2 a 0.72 (257) 0.212 (257) 22.8 14 ,500 1 1 , 2 0 0 d ( p A p A p G ) 3 0.725 (257) 0.231 (257) 23-0 14 ,500 11,160 d ( p A p A p G ) 3 a O .78 (257) 0.213 (257) 21 .2 14 ,500 1 1 , 4 2 0 T h i s s a m p l e i s a r e p e a t o f t h e o n e i m m e d i a t e l y a b o v e i t i n t h e t a b l e . a p p r o x i m a t e l y 2.1%. A v a l u e o f 8 , 7 0 0 f o r t h e a v e r a g e m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t ( p e r b a s e ) f o r t h e o l i g o n u c l e o t i d e s , d ( p T p T p C ) n a n d d ( p C p T p T ) n (n = 2 , 3 ) , h a s b e e n u s e d . F o r d ( p A p A p G ) n o l i g o m e r s t h e a v e r a g e m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t ( p e r b a s e ) o b t a i n e d a t 35° was 1 1 , 3 1 5 . T h e c o r r e s p o n d i n g v a l u e a t 2 5 ° i s 1 1 , 0 2 0 . F o r s p e c t r o -p h o t o m e t r y d e t e r m i n a t i o n o f n u c l e o t i d e c o n c e n t r a t i o n , a v a l u e o f 1 1 , 0 0 0 w a s u s e d . 2 5 ° T h e E . v a l u e s f o r o l i g o d e o x y t h y m i d y l a t e s ( 9 , 0 0 0 ) C3 I C a n d f o r o l i g o r i b o a d e n y l a t e s ( 1 1 , 0 0 0 ) h a v e b e e n p r e v i o u s l y d e t e r m i n e d ( 1 2 4 , 153). T h e v a l u e f o r o l i g o d e o x y a d e n y 1 a t e s w a s a s s u m e d t o b e 1 1 , 0 0 0 . 2 ) T h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e s f o r c o m p l e m e n t a r y  o l i g o n u c l e o t i d e i n t e r a c t i o n s a n d P o l y A : d ( p T )  i n t e r a c t i o n s . a ) T y p i c a l t h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e s . T y p i c a l t h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e s f o r a n o l i g o n u c l e o t i d e : o l i g o n u c l e o t i d e i n t e r -a c t i o n ( d ( p T ) g ' d ( p A ) g ) i s s h o w n i n F i g u r e 17B. F o r c o m p a r i s o n , F i g u r e 17A s h o w s t h e o l i g o n u c l e o t i d e : p o l y n u c l e o t i d e i n t e r a c t i o n ( d ( p T ) g " p o l y A ) . In e a c h c a s e t h e p u r i n e c o n t a i n i n g c o m p o n e n t h a s b e e n m e l t e d s e p a r a t e l y ( c u r v e b ) a n d s u b t r a c t e d f r o m t h e o b s e r v e d p r o f i l e ( c u r v e a ) t o o b t a i n c u r v e c , t h e t r u e t h e r m a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e . , F o r t h e i n t e r a c t i o n d ( p T ) g " d ( p A ) g i n M B S , t h e Tm i s 1 5 . 0 ° w i t h a % h y p o c h r o m i c ! t y o f \k%. F o r t h e i n t e r a c t i o n d ( p T ) R ' p o l y A i n M B S , t h e Tm i s 2 4 . 0 ° , a n d t h e c a l c u l a t e d F i g u r e 17. T h e r m a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e s f o r t h e i n t e r a c t i o n s d ( p T ) g ' p o l y A (A ) a n d d ( p T ) g - d ( p A ) 8 ( B ) . —• • — o b s e r v e d t h e r m a l d i s s o c i a t i o n p r o f i l e f o r t h e m i x t u r e s . —a—o—observed t h e r m a l d i s s o c i a t i o n p r o f i l e f o r t h e p u r i n e c o m p o n e n t , t r u e t h e r m a l d i s s o c i a t i o n p r o f i l e f o r t h e m i x t u r e . o C O h y p o c h r o m i c ! t y , 22%. b) W i d t h o f t h e t h e r m a l t r a n s i t i o n . T h e o l i g o n u c l e o t i d e i n t e r a c t i o n s ( a s w e l l a s t h e o l i g o n u c l e o t i d e r p o l y n u c l e o t i d e i n t e r a c t i o n s ) a l l m e l t o v e r a w i d e t e m p e r a t u r e r a n g e ( a p p r o x i m a t e l y 3 0 ° ) . T h i s i s much w i d e r t h a n f o r . n a t u r a 1 l y o c c u r r i n g DNA m o l e c u l e s ( r a n g e o f m e l t i n g a p p r o x i m a t e l y 1 0 ° i n SSC ( 1 5 4 ) ) . A c c o r d i n g t o S z y b a l s k i ( 1 4 5 ) , t h e w i d t h o f t h e t h e r m a l t r a n s i t i o n i n t h e s e c a s e s i s a r e s u l t o f t h e " i n h o m o g e n e i t i e s o f t h e l i n e a r s e q u e n c e o f b a s e p a i r s o r c l u s t e r s o f a l t e r n a t i n g b a s e p a i r s " ( i . e . A , T r i c h r e g i o n s m e l t o u t a t l o w e r t e m p e r a t u r e s , t h e b a s i s b e h i n d d e n a t u r a t i o n m a p p i n g (155, 156). T h e b r e a d t h o f t h e d e n a t u r a t i o n c u r v e i s a l s o a f u n c t i o n o f t h e i o n i c s t r e n g t h a n d s o l v e n t . F o r i n t e r a c t i o n s o f t h e t y p e d ( p T ) n ' o l i g o d ( p A ) n , a s w e l l a s d ( p T ) ' p o l y A i n t e r a c t i o n s , t h e r e c a n be no " i n h o m o g e n e i t y n i n l i n e a r s e q u e n c e " , b u t i n t h e s e c a s e s t h e b r e a d t h o f t h e c u r v e s m u s t b e r e l a t e d t o t h e l e n g t h o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e . N a y l o r a n d G i l h a m ( 1 2 4 ) o b s e r v e d a p p r o x i m a t e l y a 3 0 r a n g e o f m e l t i n g f o r t h e i n t e r a c t i o n d ( p T ) ^ ^ ' d ( p A ) ^ , a s w e l l a s f o r d ( p T ) ^ " p o l y A i n M B S . C a s s a n i a n d B o l l u m ( 1 2 3 ) a l s o o b s e r v e d a r e l a t i v e l y w i d e r a n g e o f m e l t i n g 3 3 f o r o l i g o n u c 1 e o t i d e : p o 1 y n u c 1 e o t i d e i n t e r a c t i o n s . ( T h e w i d e r a n g e o f m e l t i n g w a s f o r d u p l e x i n t e r a c t i o n s o n l y . T h e t r i p l e x i n t e r a c t i o n s f o r o l i g o d A : 2 p o l y dT w e r e much s h a r p e r , T h e b u f f e r s u s e d w e r e 1) S S C ; 2) 40 mM p o t a s s i u m p h o s p h a t e , pH 7 . 0 , a n d 3) 40 mM p o t a s s i u m p h o s p h a t e , pH 7 . 0 , c o n t a i n i n g 8 mM M g C l „ . w i t h a t r a n s i t i o n r a n g e o f a p p r o x i m a t e l y 5 t o 10 .) c ) % H y p o c h r o m i c i t y . T h e % h y p o c h r o m i c ! t y o f e a c h i n t e r a c t i o n w a s e s t i m a t e d a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . T h e % h y p o c h r o m i c i t y f o r d ( p T ) ' d ( p A ) ^ i n t e r a c t i o n w h i c h w e r e c o m p l e t e w i t h i n t h e t e m p e r a t u r e r a n g e s t u d i e d was 13 t o 16% ( s e e T a b l e V I I ) . T h e s e v a l u e s a g r e e w i t h t h o s e r e p o r t e d b y N a y l o r a n d G i l h a m ( 1 2 4 ) . T h e o n l y m i n o r d i s c r e p a n c i e s w e r e f o r d ( p T ) g ' d ( p A ) ^ ( 14% ) a n d d ( p T ) ^ ' d ( p A ) ^ (13%), i n d i c a t i n g c o m p l e t e i n t e r a c t i o n . N a y l o r a n d G i l h a m ( 1 2 4 ) r e p o r t e d a n i n c o m p l e t e i n t e r a c t i o n , 3% a n d 5% r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , i n t h e i r p r o c e d u r e , t h e y w e r e s t u d y i n g t h e % h y p o c h r o m i c ! t y o n r e d u c i n g t h e t e m p e r a t u r e t o . 0 ° , w h i l e i n t h e s e e x p e r i m e n t s , t h e t e m p e r a t u r e h a s b e e n r o u t i n e l y d e c r e a s e d t o a b o u t - 7 ° , p e r m i t t i n g m o r e c o m p l e t e i n t e r a c t i o n s f o r t h e l e s s s t a b l e h y b r i d s . d ) Summary o f d a t a o n Tm c u r v e s f o r v a r i o u s i n t e r a c t i o n s  o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s a n d p o l y n u c l e o t i d e s . In T a b l e V I I a s u m m a r y o f t h e d a t a f o r t h e v a r i o u s h o m o - o l i g o -n u c l e o t i d e i n t e r a c t i o n s s t u d i e d , i s g i v e n . T h e Tm a n d % h y p o c h r o m i c i t i e s w e r e o b t a i n e d a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . e ) T h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e s f o r l o n g e r o l i g o n u c l e o t i d e s . In i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e s e r i e s d ( p T ) ^ a n d . d ( p A ) n , a s t h e l e n g t h o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e s i n c r e a s e d , t h e s l o p e o f t h e t r a n s i t i o n . . n o t i c e a b l y d e c r e a s e d , w h i c h i s i n c o n s i s t e n t w i t h w h a t o n e w o u l d e x p e c t f o r l o n g e r , c o m p l e t e l y h o m o g e n e o u s i n t e r a c t i o n s . A l s o , 111 T a b l e V I I . Tm v a l u e s ( ° ) a n d p e r c e n t h y p o c h r o m i c i t y f o r d ( p T ) n : d ( p A ) ^ a n d d ( p T ) n : p o l y A i n t e r a c t i o n s . T h e b r a c k e t e d n u m b e r i s t h e % h y p o c h r o m i c i t y . 4 - '- 0 . 0 ( 1 4 ) 3-5 ( 1 3 ) { 7 . 0 ( 1 2 ) 6 - 4 . 5 ( 1 6 ) 8 . 5 ( 1 4 ) 1 6 . 0 ( 1 4 ) 7 4 . 0 (15) 8 . 5 ( 1 6 ) 1 1 . 5 (15) 19-0 ( 1 4 ) 8 10 .5 (13) 1 5 . 0 ( 1 4 ) 1 7 . 0 ( 1 4 ) 2 1 . 5 ( 1 6 ) 9 13 .5 (13) 1 8 . 0 ( 1 5 ) 2 4 . 5 (15) 2 4 . 0 ( 1 5 ) 10 - - 1 8 . 5 ( 1 5 ) 2 4 . 0 ( 1 4 ) 2 9 . 0 ( 1 4 ) 11 - - 19 .5 (14) 26 . 5 ( 1 5 ) 31 . 0 ( 1 5 ) P o l y A 6 . 5 ( 1 8 ) 1 6 . 0 ( 2 1 ) 2 4 . 0 ( 2 2 ) 28 .5 ( 2 0 ) -i n some o f t h e s e i n t e r a c t i o n s , a t w o - s t e p m e l t i n g c u r v e was o b s e r v e d . B o t h t h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t e d t h a t t h e l o n g e r o l i g o n u c l e o t i d e s w e r e l e s s p u r e t h a n o n e h o p e d ( a l t h o u g h t h e t w o - s t e p m e l t i n g c u r v e c o u l d s u g g e s t t h e p r e s e n c e o f o t h e r t h a n d o u b l e - s t r a n d e d s t r u c t u r e s (123)). I f t h e s e l o n g e r o l i g o n u c l e o t i d e s a r e l e s s p u r e , i n o r d e r t o p u r i f y t h e m , i t i s n e c e s s a r y t o c o n s i d e r t h e n a t u r e o f t h e c o n t a m i n a n t s . In c h e m i c a l p o l y m e r i z a t i o n r e a c t i o n s , t h e m a j o r i m p u r i t i e s a r e c y c l i c p h o s p h a t e s (157) ( up t o t h e c y c l i c p e n t a -n u c l e o t i d e , a t w h i c h p o i n t t h e s e c o m p o n e n t s b e c o m e n e g l i g i b l e ) a n d p y r o p h o s p h a t e s ( 1 1 4 ) . A t t h e e n d o f a DCC p o l y m e r i z a t i o n r e a c t i o n , t h e s a m p l e i s r e n d e r e d a n h y d r o u s a n d t r e a t e d w i t h e x c e s s a c e t i c a n h y d r i d e i n p y r i d i n e t o c o n v e r t t h e p y r o p h o s p h a t e s t o m i x e d a n h y d r i d e s w h i c h w i l l b r e a k down i n a q u e o u s s o l u t i o n . I f p y r o p h o s p h a t e s a r e c o n t a m i n a t i n g t h e l o n g e r o l i g o n u c l e o t i d e s t h e n a p u r i f i c a t i o n s t e p w h i c h w o u l d t a k e a d v a n t a g e o f t h e a b r u p t c h a n g e i n p o l a r i t y o f t h e m o l e c u l e a t t h e p y r o p h o s p h a t e l i n k a g e w o u l d , b e t h e b e s t p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e . A n i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y h a s a l r e a d y n o t r e s o l v e d t h e s e i m p u r i t i e s . T h e c o n t a m i n a t i n g p y r o p h o s p h a t e i n a l i n e a r o l i g o n u c l e o t i d e p e a k i s m o s t l i k e l y t h e n e x t h i g h e s t o l i g o m e r i n l e n g t h , a n d , t h e r e f o r e , w o u l d h a v e a n e t c h a r g e o f m i n u s 12 a t n e u t r a l p H ) . A t t h e d e c a n u c l e o t i d e l e v e l a n d l o n g e r , e x t e n d e d p a p e r c h r o m a t o g r a p h y i n s y s t e m C (91) t h e s a m e n e t c h a r g e ( e . g . d ( p A ) . . a n d b o t h h a v e 113 w o u l d a l s o p r o b a b l y g i v e v e r y p o o r r e s o l u t i o n b e t w e e n t h e l i n e a r o l i g o n u c l e o t i d e s a n d t h e p y r o p h o s p h a t e s . C o n s e q u e n t l y , i t was d e c i d e d t o t r y t o p u r i f y a s a m p l e o f i d ( p A ) ^ o n a n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n c o n t a i n i n g c o v a l e n t l y a t t a c h e d d ( p T ) ( s e e P a r t I I , B ) . T h i s c o l u m n w o u l d - y b e e x p e c t e d , b y c a r e f u l c h o i c e o f t e m p e r a t u r e e l u t i o n s t e p s , t o r e s o l v e a l l p y r o p h o s p h a t e s e x c e p t p o s s i b l y t h e 9 :3 , 1 0 : 2 a n d 1 1 : 1 s t r u c t u r e s . 3 " * T h e n u c l e o t i d e r e t a i n e d a t 29° b u t e l u t e d a t 50° f r o m a c e l l - d ( p T ) . c o l u m n ( s e e i n s e t F i g u r e 18B ) y w a s m i x e d w i t h a n e q u i m o l a r a m o u n t o f d ( p T ) ^ , a n d d(pT) a n d t h e t h e r m a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e s o f t h e s e m i x t u r e s s t u d i e d ( F i g . 18A t o D ) . F i g u r e 18A a n d C a r e t h e Tm c u r v e s f o r t h e t w o i n t e r a c t i o n s , d ( p A ) ^ ' d ( p T ) ^ a n d d ( p A ) ^ * d ( p T ) ^ p r i o r t o t h e p u r i f i c a t i o n o f t h e d ( p A ) ^ . F i g u r e 18B a n d D a r e t h e s a m e i n t e r a c t i o n s a f t e r t h e d ( p A ) 1 1 h a d b e e n p u r i f i e d o n a c e l l - d ( p T ) 1 i y c o l u m n . T h e i n c r e a s e d s l o p e o f t h e t h e r m a l t r a n s i t i o n , c o m p l e t e a b s e n c e o f t h e t w o - s t e p m e l t i n g c u r v e , a n d i n c r e a s e i n T m , a l l s u g g e s t t h a t t h e o r i g i n a l s a m p l e o f d ( p A ) ^ was i m p u r e p r i o r t o i t s c h r o m a t o g r a p h y o n t h e o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n . C o n s i d e r i n g t h e b a s i s f o r t h e p u r i f i c a t i o n o f t h e d ( p A ) 1 1 s a m p l e , T h e 9:3 p y r o p h o s p h a t e i s t h e 1 1 : 1 p y r o p h o s p h a t e i s 10 t h e 1 0 : 2 p y r o p h o s p h a t e i s : p A ( p A ) F i g u r e 1 8 . T h e r m a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e s f o r t h e i n t e r a c t i o n s d ( p A ) ^ ' d ( p T ) ^ a n d d ( p A ^ ^ ' d ( p T ) 1 ^ . A . d ( p A ) ^ ' d ( p T ) g p r i o r t o p u r i f i c a t i o n o f d ( p A ) ^ o n a c e l l - d ( p T ) ^ c o l u m n . B. d ( p A ) ' d ( p T ) a f t e r p u r i f i c a t i o n o f d ( p A ) ' , o n a c e l l - d ( p T ) Q c o l u m n . 11 y i i y C . d p A ^ " d ( p T ) ^ 2 p r i o r t o p u r i f i c a t i o n o f d ( p A ) ^ o n a c e l l - d ( p T ) ^ c o l u m n . D. d ( pA ) ^ " d (pT ) ^ ^ a f t e r p u r i f i c a t i o n o f d ( p A ) ^ o n a c e l l - d ( p T ) ^ c o l u m n . T h e i n s e t i n F i g u r e 18B i s t h e e l u t i o n p r o f i l e f o r t h e s t e p w i s e t h e r m a l e l u t i o n o f d ( p A ) ^ i o n a c e l l - d ( p T ) ^ c o l u m n . o b s e r v e d t h e r m a l d i s s o c i a t i o n p r o f i l e o f t h e m i x t u r e , o b s e r v e d t h e r m a l d i s s o c i a t i o n p r o f i l e o f t h e p u r i n e o l i g o m e r , t r u e t h e r m a l d i s s o c i a t i o n p r o f i l e f o r t h e i n t e r a c t i o n . 1 1 5 i t s e e m s q u i t e l i k e l y t h a t t h e m a j o r i t y o f t h e i m p u r i t i e s w e r e p y r o p h o s p h a t e s . f ) T h e r m a l d e n a t u r a t i o n c u r v e s f o r o l i g o n u c l e o t i d e s  o f m i x e d , r e p e a t i n g b a s e s e q u e n c e ( T a b l e V I l l ) . I n a s t u d y o f t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n some o f t h e c o m p l e m e n t a r y o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s d ( p A p A p G ) n > a n d d ( p T p T p C ) n a n d d ( p C p T p T ) (n = 2 , 3 , 4 ) t h e f o l l o w i n g t w o g e n e r a l i z a t i o n s c a n be m a d e . ( i ) T h e p e r c e n t h y p o c h r o m i c i t y i s s i g n i f i c a n t l y l o w e r (7 t o 9% f o r a c o m p l e t e i n t e r a c t i o n ) t h a n f o r t h e h o m o - o l i g o n u c l e o t i d e i n t e r a c t i o n s ( 1 3 t o 16%) a t t h e same n u c l e o t i d e c o n c e n t r a t i o n s . ( i i ) A l t h o u g h t h e s e m i x e d d e o x y o l i g o m e r s a r e c a p a b l e o f f o r m i n g GC b a s e p a i r s , w h i c h a r e k n o w n t o be m o r e s t a b l e t h a n AT b a s e p a i r s ( 1 4 5 ) , f o r a n a n a l o g o u s l e n g t h o f o l i g o d A ' o l i g o dT i n t e r a c t i o n , t h e Tm v a l u e s a r e n o t a g r e a t d e a l h i g h e r ( e . g . d ( p C p T P T ) , ' d ( p A p A p G ) _ h a d a Tm o f 31 , w h i l e d ( p T ) _ * d ( p A ) 0 • 5 5 y y h a d a Tm o f 2 4 . 5 ° ) , a n d i n some c a s e s a p p a r e n t l y l o w e r ( e . g . d ( p C p T p T ) : d ( p A p A p G ) ^ had a Tm o f b e t w e e n -5 ° t o 0 ° , w h i l e d ( p T ) g " d ( P A ) 6 m e l t e d a t 8 . 5 ° ) . 3 5 T h e v a l u e 3 1 ° d o e s n o t a g r e e w i t h t h e v a l u e ( 25 ° ) i n T a b l e V I I I . T h e e x p l a n a t i o n i s ( a n a l o g o u s t o t h e s i t u a t i o n w i t h t h e l o n g e r o l i g o d e o x y a d e n y l a t e ) t h e d ( p A p A p G ) ^ s a m p l e w a s c o n t a m i n a t e d , p r o b a b l y w i t h t h e p y r o p h o s p h a t e , a n d p o s s i b l y b y a s much a s 3 0 % . When t h e d ( p A p A p G ) ^ w a s p u r i f i e d o n a n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n , a n d t h i s i n t e r a c t i o n r e s t u d i e d , t h e h i g h e r Tm v a l u e o f 31 ° w a s o b t a i n e d ( s e e F i g u r e 3 3 0 ) . T a b l e , V I I I . T h e r m a l s t a b i l i t y o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s o f m i x e d b a s e s e q u e n c e . ; A l l i n t e r a c t i o n s w e r e s t u d i e d i n M B S , u n l e s s o t h e r w i s e n o t e d . P u r i ne ,01 i g o -. N u c l e o t i d e P y r i m i d i ne-^ 0 1 i g o -n u c 1 e o t i d e d ( p A p A p G ) , d ( p A p A p G ) . d C p A p A p G ) ^ d ( p T p T p C ) ! d ( p T p T p C ) . d ( p T p T p C ) ^ d ( p T p T p C ) . i n 1/10 x MBS d ( p C p T p T ) , d ( p C p T p T ) . -no i n t e r a c t i o n -<2% h y p o c h r o m i c i t y i n - 7 ° t o 20° r a n g e - i n c o m p l e t e -Tm* 0 ° t o 5 ° 6 .4% - i n c o m p l e t e -Tm" -5 ° t o 0 ° - h y p o c h r o m i c i t y 6. - i n c o m p l e t e -Tm* <~5° - h y p o c h r o m i c ! t y 4 . 7 % -Tm 20 .5 ° - h y p o c h r o m i c i t y 7.4% 5% - i n c o m p l e t e -Tm* <-5° - h y p o c h r o m i c i t y 4 -Tm 25 .0 ° - h y p o c h r o m i c i t y 8 . 7 % - n o Tm c u r v e , b u t 14% h y p o c h r o m i c i t y o v e r t h e r a n g e -5 ° t o 70° - n o r m a l Tm c u r v e -Tm 14 .5 ° - h y p o c h r o m i c i t y 1 0 . 2 % - i n c o m p l e t e -Tm ^ 5 ° 5% _ h y p o c h r o m i c i t y 6 . 3 % I n d i c a t e s t h a t t h e Tm v a l u e h a s b e e n e s t i m a t e d 117 B e y o n d e x p e c t i n g GC c o n t a i n i n g c o m p l e m e n t a r y d e o x y o l i g o m e r s t o b e m o r e s t a b l e t h a n h o m o - o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s o f A a n d T , i t i s d i f f i c u l t t o p r e d i c t how much m o r e s t a b l e t h e s e b a s e s u b s t i t u t i o n s w o u l d m a k e t h e i n t e r a c t i o n s . F o r h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p o l y d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s , t h e r e i s a 1 ° i n c r e a s e i n Tm p e r 2.5% i n c r e a s e i n GC c o n t e n t (158). I f t h i s r e l a t i o n s h i p i s v a l i d f o r t h e i n t e r a c t i o n s o f t h e d e o x y o l i g o m e r s s t u d i e d h e r e , a 33 1/3% i n c r e a s e i n GC c o n t e n t s h o u l d r e s u l t i n a 13° i n c r e a s e i n t h e T m . F o r a l o n g e r i n t e r a c t i o n (9 b a s e p a i r s ) , d ( p A ) . d ( p T ) Q 9 y h a d a Tm o f 2 4 . 5 ° , w h i l e d ( p A p A p G ) ^ . d ( p C p T p T ) ^ h a d a Tm o f 31 ° ( a d i f f e r e n c e o f 6 . 5 ° ) • T h i s i s a f e w d e g r e e s l e s s t h a n e x p e c t e d . In T a b l e V I M i t i s n o t e d t h a t d ( p T p T p C ) 2 « d ( p A p A p G ) s h o w e d n o i n t e r a c t i o n . H o w e v e r , d ( p T p T p C ) ^ - d ( p A p A p G ) r e s u l t e d i n a p a r t i a l i n t e r a c t i o n w i t h i n t h e t e m p e r a t u r e r a n g e s t u d i e d . T h e d o d e c a n u c l e o t i d e s , d ( p T p T p C ) ^ a n d d ( p A p A p G ) ^ , d i d n o t g i v e a n o r m a l t h e r m a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e ( i n MBS) o v e r t h e r a n g e -5 ° t o 7 0 ° , a l t h o u g h '\k% h y p o c h r o m i c i t y w a s o b s e r v e d . In 1/10 x M B S , a n o r m a l c u r v e w a s o b s e r v e d , w i t h Tm 1 4 . 5 ° . F o r t h e t w o i n t e r a c t i o n s , d ( p T p T p C ) ^ . d ( p A p A p G ) ^ a n d d ( p C p T p T ) ^ • d ( p A p A p G ) t h e Tm v a l u e s w e r e 2 0 . 5 ° a n d 2 5 . 0 ° , r e s p e c t i v e l y . H o w e v e r , a s s h o w n i n F i g u r e 33C a n d D, w h e n t h e p u r i n e o l i g o n u c l e o t i d e w a s p u r i f i e d o n a e e l 1 - d ( p C p T p T ) c o l u m n , a n d t h e s e i n t e r a c t i o n s r e s t u d i e d , t h e Tm o f b o t h i n t e r a c t i o n s i n c r e a s e d b y 6 ° . g ) Summary o f d a t a f r o m t h e t h e r m a l d e n a t u r a t i o n s t u d i e s o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s . F o r i n t e r a c t i o n s b e t w e e n o l i g o d e o x y t h y m i d y l a t e s a n d o l i g o d e o x y -a d e n y l a t e s , t h e d a t a i n T a b l e V I I i n d i c a t e t h a t t h e t h e r m a l s t a b i l i t y o f t h e i n t e r a c t i o n s i s d e p e n d e n t o n t h e l e n g t h o f b o t h o l i g o m e r s . W i t h i n a g i v e n s e r i e s ( f o r e x a m p l e , d ( p T ) " d ( p A ) ) , 1 z n t h e r e i s a n i n c r e a s e o f a p p r o x i m a t e l y 3 ° t o k° f o r e a c h a d d i t i o n a l b a s e p a i r . H o w e v e r , d u e t o t h e p r e s e n c e o f i m p u r i t i e s , p a r t i c u l a r l y i n t h e l o n g e r d e o x y a d e n y l a t e s , w h i c h r e s u l t i n T n r v a l u e s a t l e a s t 1 ° t o 2 ° l o w e r t h a n t h e t r u e v a l u e ( s e e s e c t i o n 2 e a n d F i g u r e 1 8 , a b o v e ) , . i t d o e s n o t s e e m w i s e t o d e r i v e a r e l a t i o n s h i p b e t w e e n o l i g o m e r l e n g t h a n d t h e r m a l d e n a t u r a t i o n t e m p e r a t u r e , u n t i l t h e s e l o n g e r o l i g o m e r s h a v e b e e n p u r i f i e d , o n c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s ( s e e i n s e t , F i g u r e 18) a n d t h e p a r t i c u l a r i n t e r a c t i o n s r e - e x a m i n e d . T h e w i d t h o f t h e t h e r m a l t r a n s i t i o n s ( a b o u t 3 0 ° ) i n d i c a t e s t h a t t h e r e i s c o n s i d e r a b l e o v e r l a p o f t h e m e l t i n g r a n g e s f o r s u c c e s s i v e m e m b e r s o f a s e r i e s . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t o l i g o -n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s may n o t be c a p a b l e o f r e s o l v i n g c o n s e c u t i v e o l i g o m e r s . H o w e v e r , t h i s w a s n o t t h e c a s e ( s e e P a r t B, s e c t i o n 2 , d , b e l o w ) . T h e % h y p o c h r o m i c ! t y f o r o l i g o d e o x y t h y m i d y l a t e : o l i g o d e o x y -a d e n y l a t e i n t e r a c t i o n s i s a b o u t 1 5 % . F o r p o l y A : o l i g o d e o x y -t h y m i d y l a t e i n t e r a c t i o n s i t i s a b o u t 2 2 % . B o t h o f t h e s e v a l u e s a r e i n a g r e e m e n t w i t h t h e d a t a o f N a y l o r a n d G i l h a m ( 1 2 4 ) . F r o m t h e d a t a p r e s e n t e d h e r e o n t h e i n t e r a c t i o n o f d e o x y -o l i g o m e r s o f m i x e d b a s e s e q u e n c e , i t i s n o t p o s s i b l e t o d r a w a s t r o n g c o n c l u s i o n a s t o t h e e f f e c t o f GC b a s e p a i r s o n t h e r m a l s t a b i l i t y . In t h e c a s e o f t h e h e x a n u c l e o t i d e : n o n a n u c l e o t i d e i n t e r a c t i o n s ( T a b l e V I M ) , f o r r e a s o n s t h a t a r e n o t c l e a r , t h e s e i n t e r a c t i o n s w e r e l e s s s t a b l e t h a n t h e c o r r e s p o n d i n g homo-o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e i n t e r a c t i o n s ( T a b l e V l l ) . H o w e v e r , d ( p C p T p T ) 3 . d ( p A p A p G ) ^ (Tm = 3 1 . 0 ° , s e e F i g u r e 33) m e l t s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n d ( p T ) . d ( p A ) Q (Tm = 2 4 . 5 ° ) • A l s o , y y e v e n w h e n o n e o v e r l o o k s t h e p o s s i b l e d e s t a b i 1 i z a t i o n e f f e c t o f a n u n p a i r e d t e r m i n a l n u c l e o t i d e , d ( p T p T p C ) ^ . d ( p A p A p G ) ^ (Tm = 2 6 . 5 ° , s e e F i g u r e 33) m e l t s c o n s i d e r a b l y h i g h e r t h a n d ( p T ) g : d ( p A ) g (Tm = 1 5 - 0 ° ) . B. S y n t h e s i s a n d P r o p e r t i e s o f 0 1 i g o n u c l e o t i d e - C e l 1 u l o s e s . 1) S y n t h e s i s o f o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e s . a ) I n c o r p o r a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e b y t h e w a t e r - s o l u b l e  c a r b o d i i m i d e m e t h o d . T h e i n c o r p o r a t i o n o f o l i g o -n u c l e o t i d e s o n t o c e l l u l o s e p a p e r w a s a c c o m p l i s h e d u s i n g t h e w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e N - c y c l o h e x y 1 - N 1 - 3 ( 4 - m e t h y l m o r p h o l i n i u m ) -e t h y l c a r b o d i i m i d e p - t o 1 u e n e s u 1 f o n a t e ( C M C - O T s ) . T h e p r o d u c t s o f t h i s r e a c t i o n a r e c o n s i d e r e d t o c o n s i s t o f o l i g o n u c l e o t i d e s c o n n e c t e d t o t h e c e l l u l o s e b y e s t e r l i n k a g e s b e t w e e n t h e t e r m i n a l p h o s p h a t e g r o u p o f t h e n u c l e o t i d e c h a i n s a n d t h e s t e r i c a l l y f a v o u r e d h y d r o x y l g r o u p s o f t h e c e l l u l o s e ( 1 4 1 ) . T h e r e s u l t s f o r t h e i n c o r p o r a t i o n o f a n u m b e r o f o l i g o -n u c l e o t i d e s a n d t h e c o n d i t i o n s f o r t h e p a r t i c u l a r r e a c t i o n a r e • g i v e n i n T a b l e I X . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t b y i n c r e a s i n g t h e a m o u n t o f c a r b o d i i m i d e ( i n t w o a p p l i c a t i o n s ) a n d t h e t i m e o f t h e r e a c t i o n , i n c o r p o r a t i o n o f n u c l e o t i d e s was c o n s i s t e n t l y g r e a t e r t h a n 6 0 % 3 6 , . e v e n f o r t h e l o n g e r o l i g o n u c l e o t i d e s ( c f . G i l h a m ( 1 4 1 ) r e p o r t e d a d e c r e a s i n g y i e l d o f i n c o r p o r a t i o n a s t h e l e n g t h o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e i n c r e a s e d . ) A p r o c e d u r e w h i c h g i v e s h i g h l e v e l s o f i n c o r p o r a t i o n i s e x t r e m e l y v a l u a b l e i n t h e s y n t h e s i s o f o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s , p a r t i c u l a r l y f o r t h e l o n g e r , m o r e c o m p l e x o l i g o m e r s , b e c a u s e t h e s e a r e c o n s i d e r a b l y m o r e d i f f i c u l t t o p r e p a r e , a n d t h e y i e l d s o b t a i n e d i n c h e m i c a l s y n t h e s e s a r e l o w . b ) E x a m i n a t i o n o f t h e CMC-OTs r e a c t i o n . B e c a u s e i n t h e i n c o r p o r a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s o n t o c e l l u l o s e p a p e r , m u c h h i g h e r l e v e l s o f c a r b o d i i m i d e a n d l o n g e r t i m e s h a v e b e e n u s e d t h a n t h o s e r e p o r t e d by G i l h a m ( l A l ) , i t w a s c o n s i d e r e d i m p o r t a n t t o r e - e x a m i n e t h i s r e a c t i o n f o r p o s s i b l e b y p r o d u c t s . A t pH 8 . 0 , CMC-OTs h a s b e e n r e p o r t e d t o s u b s t i t u t e u r a c i l , When t h e t u b e B i s o m i t t e d , t h e % i n c o r p o r a t i o n , m a r k e d w i t h a , i s p r o b a b l y a n o v e r - e s t i m a t e b y p o s s i b l y a s much a s 1 0 % ( s e e M e t h o d s ) . T a b l e I X . S y n t h e s i s o f o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s b y t h e w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e m e t h o d . e p 7 01 i g o n u c l e o t i d e C a r b o d i i m i d e a m o u n t 3 (mg) T o t a l i n c o r p . t i m e b ( h r ) C a l c . i n c o r p . A . U . C I n c o r p . ' % 1 d ( P T ) 6 (56.5) 266 nm 50 26 32 56.5 2 d ( p T ) 9 (47) 266 nm 50 26 6.0, 13 3 d ( p T ) g (48) 266 nm 50 48 27.0 56 4 d ( P T ) 9 (78) 266 nm 50 24 39 50 5 d ( p T p T p C ) 2 (90) 267 nm 50 64 ' 24 .5 27 6 d ( p T p T p C ) 2 (124) 267 nm 2 x 50 96 92.5* 75 " " 7 d ( p T p T p C ) 2 (124) 267 nm 2 x 50 96 96 .5 " 78 A 8 d ( p T p T p C ) 2 (124) 267 nm 2 x 50 96 92 .5 " 75 ; " " 9 d ( P T ) 1 2 (47.5) 266 nm 2 x 50 96 30 63 10 d ( p T ) q (49-6) 266 nm 2 x 50 96 4 8 . 4 * 97 : " 11 d ( p T p T p C ) .j (104) 267 nm 2 x 50 96 77.0" 74.5" 12 d ( p C p T p T ) (133) 267 nm 2 x 50 96 ; . 96 .4" 67 * 13 d ( p C p T p T ) ^ (132) 267 nm 2 x 50 96 102.8" 80. 5* 14 d ( p T ) 9 (72) 266 nm 2 x 50 96 . 69-3" 83 " 15 d ( p T ) g " (48) - 266 nm 2 x 50 96 47.0" 92 ^ I n d i c a t e s e x p e r i m e n t s i n w h i c h t u b e B was o m i t t e d . A m o u n t o f c a r b o d i i m i d e - a m o u n t o f CMC-OTs a d d e d / t u b e . 2 x 50 mg means 50 mg w a s a d d e d a t s t a r t , a n d a t 48 h o u r s , a f u r t h e r 50 mg was s t r e a k e d o n t o t h e p a p e r a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d i n M e t h o d s . ^ T o t a l t i m e o f i n c o r p o r a t i o n - t i m e f r o m f i r s t s t r e a k i n g o f p a p e r t i l l t i m e o f e l u t i o n o f n o n -i n c o r p o r a t e d m a t e r i a l . ^ C a l c u l a t e d i n c o r p o r a t i o n - s e e f o r m u l a e I a n d II i n M e t h o d s . I n c o r p o r a t e d - A . U . i n c o r p o r a t e d e x p r e s s e d a s % o f o l i g o n u c l e o t i d e s t r e a k e d o n t o p a p e r . t h y m i n e a n d g u a n i n e n u c l e o t i d e s ( 1 5 9 , 1 6 0 ) , a s w e l l a s p s e u d o -u r i d i n e ( 1 6 1 ) . T h e s t r u c t u r e o f t h e a d d i t i o n p r o d u c t f o r d - p T , C M C d - p T , i s s h o w n b e l o w . A n a n a l o g o u s s t r u c t u r e h a s b e e n s u g g e s t e d f o r t h e u r a c i l a d d i t i o n p r o d u c t , w h i l e t h e p u r i n e r i n g o f t h e g u a n i n e n u c l e o t i d e i s t h o u g h t t o be s u b s t i t u t e d a t t h e N-1 p o s i t i o n ( 1 6 0 ) . T h e s e n u c l e o t i d e s a l l h a v e pK v a l u e s o f a b o u t 9 . a n d b a s e d o n t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e r a t e o f s u b s t i t u t i o n g o e s u p a s t h e pH i n c r e a s e s , a n d a s t h e pK d e c r e a s e s , i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e r e a c t i n g s p e c i e s i s t h e a n i o n o f t h e p y r i m i d i n e o r p u r i n e b a s e ( 1 6 0 ) . < o II " O - P O C H " O C M C d - p T H o w e v e r , b e l o w pH 7 . 0 , t h i s r e a g e n t h a s b e e n r e p o r t e d n o t t o p a r t i c i p a t e i n a b a s e a d d i t i o n r e a c t i o n (Ho a n d G i l h a m ( 1 6 0 ) ) , b u t o n l y t o a c t i v a t e t h e f r e e p h o s p h a t e g r o u p . T h e r e a g e n t h a s b e e n r e p o r t e d t o e f f e c t t h e s y n t h e s i s o f t h e f o u r r i b o n u c l e o s i d e 2 ' , 3 ' c y c l i c p h o s p h a t e s i n w a t e r a t pH 6 . 0 , s t a r t i n g w i t h t h e 2 ' ( 3 ' ) m o n o p h o s p h a t e s ( 1 2 4 ) . N a y l o r a n d G i l h a m ( 1 2 4 ) h a v e a l s o r e p o r t e d t h e u s e o f t h i s r e a g e n t u n d e r a q u e o u s c o n d i t i o n s a t pH 6 . 0 t o l i n k t o g e t h e r t w o d e o x y t h y m i d y l a t e h e x a n u c l e o t i d e s ( h y b r i d i z e d t o p o l y A t o p r o v i d e t h e c o r r e c t o r i e n t a t i o n o f r e a c t i n g g r o u p s ) . T h i s p r o c e d u r e may w e l 1 h a v e b e e n o f c o n s i d e r a b l e i m p o r t a n c e i n t h e s y n t h e s i s o f l a r g e d e o x y r i b o n u c l e o t i d e o l i g o m e r s , h a d n o t t h e e n z y m e p o l y n u c l e o t i d e 1 i g a s e b e e n d i s c o v e r e d ( 1 6 2 - 1 6 6 ) . I f w i t h h i g h e r l e v e l s o f C M C - O T s , t h e r e a g e n t d i d s u b s t i t u t e d e o x y t h y m i d y l a t e r e s i d u e s a t t h e N-3 p o s i t i o n , t h i s w o u l d i n t e r f e r e w i t h t h e a b i l i t y o f t h e t h y m i d y l a t e r e s i d u e t o h y d r o g e n b o n d w i t h a n a d e n y l a t e r e s i d u e (167). C o n s e q u e n t l y , t h e r e a c t i o n o f CMC-OTs w i t h n u c l e o t i d e s h a s . b e e n c a r e f u l l y s t u d i e d . In F i g u r e 1 9 A , B a n d C , t h e r e s u l t s o f t h e r e a c t i o n o f d - p T w i t h C M C - O T s , i n s o l u t i o n , a t pH 8 . 0 ( b o r a t e b u f f e r ) f o r 7 h r ( A ) , pH 6 . 0 ( N a + M e s " b u f f e r ) f o r 7 h r ( B ) , a n d a t pH 6 . 0 ( N a + M e s " b u f f e r ) f o r 24 h r (C) a r e g i v e n . In F i g u r e 19B a n d C , a s m a l l p e a k o f U V - a b s o r b i n g m a t e r i a l ( a b o u t 1 .5% ) e l u t e s a t t h e p o s i t i o n o f ^ C M C d - p T - ( p e a k b i n t h e s e g r a p h s ) . T h i s p e a k f r o m a 2 0 - f o l d , l a r g e s c a l e p r e p a r a t i o n was p o o l e d , c o n c e n t r a t e d a n d c h a r a c t e r i z e d . F i g u r e 19. R e a c t i o n o f d - p T w i t h C M C - O T s . A . 20 y m o l e s o f d - p T i n 2 m l 0.2 M s o d i u m b o r a t e , pH 8.0, 7 h r (68 mg C M C - O T s ) . B. 20 y m o l e s o f d-pT i n 2 ml 0.1 M N a + M e s " , pH 6.0, 7 h r (68 mg C M C - O T s ) . C . 20 y m o l e s o f d-pT i n 2 m l 0.1 M N a + M e s " , pH 6.0, Ik h r (68 mg C M C - O T s ) . D. E l u a t e f r o m r e a c t i o n p a p e r A . E. E l u a t e f r o m r e a c t i o n p a p e r B. F . E l u a t e f r o m r e a c t i o n p a p e r C . In t h i s f i g u r e , t h e p o s i t i o n o f e l u t i o n o f t h e u r e a a n d a n y u n r e a c t e d c a r b o d i i m i d e i s i n d i c a t e d by a , CMCd-pT b y b , p - t o l u e n e s u 1 f o n a t e b y c , a n d u n r e a c t e d d - p T b y d . S h a d e d a r e a i s A _ r . X 10. 254nm C h r o m a t o g r a p h i c , h i g h v o l t a g e p a p e r e l e c t r o p h o r e s i s , a n d s p e c t r a l d a t a a r e i n a g r e e m e n t w i t h t h i s p e a k b e i n g CMCd-pT ( s e e T a b l e X a n d F i g u r e 2 0 ) . I n F i g u r e 1 9 D , E a n d F, t h e e l u a t e s f r o m a t y p i c a l p a p e r i n c o r p o r a t i o n e x p e r i m e n t ( t u b e s / p a p e r s A , B a n d C) h a v e b e e n c h r o m a t o g r a p h e d . T h i s w a s d o n e t o s e e i f s o m e s i d e r e a c t i o n o c c u r r e d u n i q u e t o t h e p a p e r r e a c t i o n , w h i c h d i d n o t o t h e r w i s e o c c u r i n s o l u t i o n , a t pH 6 . 0 . I t i s c l e a r t h a t no s i g n i f i c a n t s i d e r e a c t i o n h a s o c c u r r e d u n i q u e t o t h e p a p e r r e a c t i o n . 3 7 3 8 T h e r e a c t i o n o f d - p T ( F i g . 2 1 A ) , d-pC ( F i g . 2 1 B ) a n d d - p A ( F i g . 2 1 C ) w i t h C M C - O T s , a t pH 6 . 0 , w a s s t u d i e d u s i n g a h i g h e r l e v e l o f c a r b o d i i m i d e ( 1 0 0 mg) a n d i n c u b a t i n g f o r a l o n g e r p e r i o d (96 h r ) . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , C M C d - p T ( p e a k b) w a s p r o d u c e d (2% o f t o t a l n u c l e o t i d e ) w h i l e n o c o r r e s p o n d i n g d e r i v a t i v e s f o r d-pC o r d - p A w e r e o b s e r v e d . H o w e v e r , w h a t was m o s t n o t i c e a b l e w a s t h e a p p e a r a n c e o f a s e c o n d s i d e p r o d u c t ( p e a k x ) . F o r t h e 3 7 T h e d - p T ( p e a k d i n F i g u r e 19D a n d E) a p p e a r s t o c o n t a i n t w o c o m p o n e n t s . H o w e v e r , b y c a r e f u l c h e c k i n g i t was f o u n d t h a t t h i s p l i t p e a k w a s t h e r e s u l t o f l o a d i n g t h e s a m p l e i n a m i x t u r e o f N a + M e s ~ a n d p h o s p h a t e b u f f e r s o n t o t h e D E A E - c e l 1 u l o s e c o l u m n e q u i l i b r a t e d w i t h d i l u t e T E A A b u f f e r ( i . e . some u n e x p l a i n e d " s a l t e f f e c t " ) . 3 8 A 1 t h o u g h n o b y p r o d u c t s h a v e b e e n p r o d u c e d , u n i q u e t o t h e p a p e r r e a c t i o n , t h e s i g n i f i c a n c e o f a 2% l e v e l o f s u b s t i t u t i o n o f d - p T r e s i d u e s i s d i s c u s s e d m o r e f u l l y i n s e c t i o n 2 f , b e l o w . T a b l e X . C h a r a c t e r i z a t i o n o f b y p r o d u c t s p r o d u c e d o n r e a c t i o n o f d - p T w i t h CMC-OTs a t pH 6 .0 . A . . CMC d - p T ( p e a k b) C h r o m a t o g r a p h y s y s t e m R f (b ) R f ( s t a n d a r d C M C d - p T ) R f ( d - p T ) A 0.71 0.72 0.47 B 0.90 0.90 0.47 d i s t a n c e m o v e d (b) d i s t a n c e m o v e d ( s t a n d a r d C M C d - p T ) d i s t a n c e m o v e d ( d - p T ) H i g h v o l t a g e e l e c t r o p h o r e s i s a 3-9 cm 4.2 cm 16.3 cm B. C o m p o u n d x C h r o m a t o g r a p h y s y s t e m R f (x) R f (x) a f t e r a l k a l i n e p h o s p h a t a s e R f ( d - p T ) A 0.82 0.81 0.44 B 0.88 - 0.50 C ( t w o s p o t s ) 0 .30 a n d 0. 86 0.52 D ( t w o s p o t s ) 0 .06 a n d 0. 68 0.12 d i s t a n c e m o v e d (x) d i s t a n c e m o v e d (x) a f t e r a l k a 1 i ne p h o s p h a t a s e d i s t a n c e m o v e d ( d - p T ) H i g h v o l t a g e e l e c t r o p h o r e s i s 11.6 cm 11.7 cm 20.8 cm a H i g h v o l t a g e e l e c t r o p h o r e s i s w a s c a r r i e d o u t i n 0.05 M NH^HCO pH 8.0, u s i n g Wha tman 40 p a p e r . T h e s a m p l e s w e r e r u n f o r 40 t o 60 m i n a t 3000 v o l t s (120 v o l t s / c m ) , 49 m i l l i a m p s . i 1 !— 1 r 200 225 250 275 300 325 WAVELENGTH nm F i g u r e 2 0 . S p e c t r u m o f p e a k b ( C M C d - p T ) . 128 0.8 0.4 -E c m CN 0.8 0.4 0.8 0.4 < < 20 40 60 80 TUBE NUMBER F i g u r e 2 1 . R e a c t i o n o f d - p T , d-pC a n d d - p A w i t h 100 mg ( t o t a l ) o f C M C - O T s , a t pH 6 .0 . 20 y m o l e s o f n u c l e o t i d e i n 2 ml 0 . 1 M Na Mes , pH 6.0 ( p l u s 1 d r o p o f b u t a n o l ) w a s i n c u b a t e d a t 3 0 ° i n t h e p r e s e n c e o f 50 mg C M C - O T s . A f t e r 48 h r , a f u r t h e r 50 mg o f r e a g e n t ( C M C - O T s ) w a s a d d e d , a n d t h e i n c u b a t i o n c o n t i n u e d f o r a n o t h e r 48 h r . T h e n u c l e o t i d e s w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n D E A E - c e l l u l o s e a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . S h a d e d a r e a i s A 2 5 4 nm X 1 0 7 V A , d - p T ; B, d - p C ; C , d - p A . d - p T r e a c t i o n , t h i s c o m p o u n d w a s c o m p l e t e l y r e s o l v e d f r o m t h e p - t o l u e n e s u 1 f o n a t e ( p e a k c ) ( F i g . 2 1 A ) . In t h e c a s e o f d - p C , x i s a v e r y s m a l l p e a k ( 0 . 5 % ) ( F i g . 2 1 B ) , w h i l e f o r t h e d - p A r e a c t i o n , i t i s p r o b a b l y a t l e a s t 2% o f t h e t o t a l n u c l e o t i d e . 1 * 0 P e a k x f r o m t h e d - p T r e a c t i o n w a s c o n c e n t r a t e d a n d c h a r a c t e r i z e d b y c h r o m a t o g r a p h i c a n d e l e c t r o p h o r e t i c d a t a ( T a b l e X ) . T h e s p e c t r u m o f t h i s c o m p o u n d i n w a t e r a t pH 7 - 0 , a n d i n 0 .1 N H C l . a n d 0 .1 N NaOH was s i m i l a r t o d - p T . A l t h o u g h i d e n t i t y o f c o m p o u n d x i s u n k n o w n , i t i s k n o w n t h a t t h e c o m p o u n d i s n o t d e g r a d e d b y a l k a l i n e p h o s p h a t a s e d i g e s t i o n ( T a b l e X) s u g g e s t i n g s u b s t i t u t i o n o f t h e 5 ' - p h o s p h a t e . ( T h e c o m p o u n d w a s n o t c y c l i c d e o x y t h y m i d i n e 3 1 -51-monophosphate.) N a y l o r a n d G i l h a m ( 1 2 4 ) h a v e r e p o r t e d t h a t r e a c t i o n o f 2 5 y m o l e s o f d - p A w i t h 0 .43 y m o l e s e t h a n o l i n 3 0 0 y l w a t e r (pH 6 . 0 , 2 5 ° , 24 h r ) g a v e 2 0 % 5 ' ~ e t h y l p h o s p h a t e . I t i s p o s s i b l e t h a t c o m p o u n d x i s t h e a n a l o g o u s , 5 ' ~ b u t y l p h o s p h a t e ( a d r o p o f b u t a n o l w a s a d d e d t o e a c h t u b e t o p r e v e n t b a c t e r i a l g r o w t h d u r i n g t h e 96 h r - i n c u b a t i o n a t 3 0 ° , s e e F i g u r e 2 1 ) . T h i s i s s u p p o r t e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t x i s c o n v e r t e d , q u a n t i t a t i v e l y , t o a p r o d u c t w i t h R^ . = 0 .49 ( i n s y s t e m A) a f t e r d i g e s t i o n w i t h a n a l i q u o t o f v e n o m p h o s p h o d i e s t e r a s e . c ) Summary o f t h e s y n t h e s i s o f o l i g o n u c 1 e o t i d e -. c e l l u l o s e s . In t h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d i n  1 * ° l h a v e a s s u m e d t h a t t h e p e a k s " x " i n F i g u r e 21A t o C a r e a n a l o g o u s c o m p o u n d s . 130 s e c t i o n 1a a n d b a b o v e , i t i s a p p a r e n t t h a t o l i g o n u c l e o t i d e s b e a r i n g a t e r m i n a l p h o s p h a t e g r o u p may b e l i n k e d , c o n v e n i e n t l y , a n d e f f i c i e n t l y , t o c e l l u l o s e p a p e r u s i n g a p r o c e d u r e m o d i f i e d s l i g h t l y f r o m t h a t r e p o r t e d b y G i l h a m ( 1 4 1 ) . When t h e a m o u n t o f c o n d e n s i n g a g e n t ( w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e ) i s d o u b l e d , a n d s t r e a k e d o n t o t h e p a p e r i n t w o a p p l i c a t i o n s , a t t i m e z e r o a n d a t 4 8 h o u r s , a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 1a a b o v e , t h e i n c o r p o r a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e i s c o n s i s t e n t l y g r e a t e r t h a n 60%. A l s o , a s f a r a s c a n b e d e t e c t e d , o n l y o n e m i n o r b y p r o d u c t , C M C d - p T , i s p r o d u c e d u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f t h e r e a c t i o n . T h e b y p r o d u c t a p p e a r s a t a l e v e l o f 2% o f t h e t o t a l n u c l e o t i d e , w h i c h m e a n s t h a t a p p r o x i m a t e l y 17% (168) o f d ( p T ) o l i g o m e r s , y l i n k e d t o c e l l u l o s e b y t h i s m e t h o d , w i l l b e s u b s t i t u t e d w i t h t h e c a r b o d i i m i d e . H o w e v e r , t h i s i s n o t a s e r i o u s p r o b l e m a s t h e s e d e r i v a t i v e s a r e r e a d i l y b r o k e n down a t a pH g r e a t e r t h a n 10.5 (160). 2) 01 i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n s . a ) T h e r m a l e l u t i o n o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s . ( i ) S t e p w i s e t h e r m a l e l u t i o n . G i l h a m (69) h a s r e p o r t e d t h e e l u t i o n o f o l i g o d e o x y a d e n y l a t e s ( t r i - t h r o u g h h e p t a n u c l e o t i d e s ) f r o m a t h y m i d i n e p o l y n u c 1 e o t i d e - c e l 1 u 1 o s e c o l u m n , 1 + 1 u s i n g s t e p w i s e ** *Th i s e e l 1 u 1 o s e i s p r e p a r e d b y t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T i n a n h y d r o u s p y r i d i n e , u s i n g DCC a s c o n d e n s i n g a g e n t . A f t e r t h e p o l y m e r i z a t i o n i s c o m p l e t e , d r y c e l l u l o s e p o w d e r a n d m o r e DCC i s a d d e d , a n d t h e o l i g o -n u c l e o t i d e s a r e c o v a l e n t l y a t t a c h e d t o t h e c e l l u l o s e . T h e c e l l u l o s e t h e r e f o r e c o n t a i n s o l i g o d e o x y t h y m i d y l a t e s o f r a n d o m l e n g t h . T h e d e o x y t h y m i d i n e p o l y n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s , p r e p a r e d by G i l h a m , c o n t a i n a b o u t 1.2 m m o l e s o f t o t a l n u c l e o t i d e (68, 69). I f o n e e s t i m a t e s t h a t i n a n o r m a l p o l y m e r i z a t i o n r e a c t i o n , 1% o f t h e n u c l e o t i d e i s r e c o v e r e d a s t h e o c t a m e r a n d h i g h e r o l i g o m e r s (111), t h e n t h i s c e l l u l o s e c o n t a i n s a b o u t 80 y m o l e s o f o l i g o n u c l e o t i d e s . 131 t h e r m a l e l u t i o n . A c c o r d i n g t o t h i s r e p o r t , t h e s u c c e s s i v e o l i g o m e r s a r e e l u t e d a t t h e f o l l o w i n g t e m p e r a t u r e s : t r i ( 5 ° ) ; t e t r a ( 1 5 ° ) ; p e n t a ( 2 5 ° ) ; h e x a ( 3 0 ° ) ; a n d h e p t a ( 35 ° ) ( i . e . t h e v a r i o u s o l i g o n u c l e o t i d e s e l u t e w i t h i n a 5 ° t o 10° t e m p e r a t u r e r a n g e . -When a n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e , c e l l - d ( p T ) g (27 A . U . d ( p T ) g , 0 . 37 y m o l e s o f o l i g o n u c l e o t i d e ) w a s l o a d e d a t 0 ° w i t h t h e c o m p l e m e n t a r y o l i g o d e o x y a d e n y l a t e , d ( p A ) g , a n d e l u t e d w i t h a s t e p w i s e t e m p e r a t u r e g r a d i e n t ( F i g . 2 2 A ) , t h e d ( p A ) g a p p e a r e d t o b e s u b - f r a c t i o n a t e d i n t o s e v e r a l c o m p o n e n t s . T h e d ( p A ) g s a m p l e w a s r e - c h e c k e d f o r p u r i t y b y c h r o m a t o g r a p h y i n s y s t e m C , a n d f o u n d t o b e >35% p u r e . T h e r e f o r e , i t w o u l d s e e m t h a t t h i s o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n r e l e a s e s d ( p A ) g o v e r a w i d e t e m p e r a t u r e r a n g e ( 3 0 ° ) , w h i c h , f r o m t h e Tm d a t a i s n o t e n t i r e l y u n e x p e c t e d . I t i s a l s o p o s s i b l e t h a t t h e c o l u m n w a s o v e r l o a d e d , a n d t h a t some o f t h e o l i g o d e o x y a d e n y l a t e e l u t e s a t e a c h t e m p e r a t u r e s t e p b e c a u s e , a s t h e t e m p e r a t u r e i s i n c r e a s e d , t h e r e s t r i c t i o n s o n t h e h y b r i d s t r u c t u r e s b e c o m e m o r e s t r i n g e n t . H o w e v e r , t h i s p o s s i b i l i t y w a s r u l e d b u t ( s e e b e l o w , S t u d i e s o n t h e c a p a c i t y o f b l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s ) . ( i i ) L i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t e l u t i o n . When t h e s a m e o l i g o -d e o x y a d e n y l a t e w a s e l u t e d f r o m c e l l - d ( p T ) g w i t h a c o n t i n u o u s 1 i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t , t h e b o u n d m a t e r i a l w a s e l u t e d o v e r 4 2 a 2k t e m p e r a t u r e r a n g e , w i t h a Tm o f a p p r o x i m a t e l y 2 0 ( F i g . 2 2 B ) . hZlm~ - t e m p e r a t u r e a t t h e m i d p o i n t o f t h e e l u t e d p e a k . F i g u r e 2 2 . E l u t i o n o f d ( p A ) g o n e e l l u l o s e - d ( p T ) g . d ( p A ) g ( 2 . 6 A . U . i n 1 m l MBS) was a p p l i e d t o c e l l - d ( p T ) g c o l u m n ( 2 7 A . U . d ( p T ) 0 . 9 cm x 5 cm) a t 0 ° . T h e c o l u m n was w a s h e d s l o w l y , a t 1 m l p e r 2 2 m i n . In F i g u r e A , t h e b o u n d n u c l e o t i d e w a s e l u t e d b y a s t e p w i s e t h e r m a l e l u t i o n a s i n d i c a t e d i n t h e f i g u r e . In B, t h e b o u n d n u c l e o t i d e w a s e l u t e d b y a l i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t . I n b o t h A a n d B, t h e f r a c t i o n s i z e w a s 1 m l . 0 ° C |5°C |l0 oc|l5°cl20°C |25°C |30°C |35°C Uo°| 50 °C 60 °C TUBE NUMBER (V) 0> T h e e l u t i o n o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o m e r s o n a n o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e i s c h a r a c t e r i z e d b y a r e l a t i v e l y w i d e r a n g e o f e l u t i o n f o r t h e o l i g o m e r , c o m p a r e d w i t h G i l h a m ' s d e o x y t h y m i d i n e p o l y -n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e c o l u m n ( 6 9 ) . T h e m a j o r d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e s e t w o c o l u m n s i s t h a t t h e p o l y n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e c o n t a i n s a t l e a s t 2 0 0 t i m e s m o r e b o u n d o l i g o n u c l e o t i d e ( s e e f o o t n o t e 4 0 ) . A l s o , t h e p o l y n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e may c o n t a i n o l i g o m e r s a s l o n g a s d ( p T ) ^ o r l o n g e r . In e x p e r i m e n t d e s c r i b e d l a t e r ( s e c t i o n 2 , d , b e l o w ) t h e r a n g e o f e l u t i o n o n o l i g o n u c 1 e o t i d e - c e l 1 u l o s e c o l u m n s w a s r e d u c e d t o a p p r o x i m a t e l y 8 ° t o 1 2 ° , b y i n c r e a s i n g t h e a m o u n t o f o l i g o n u c l e o t i d e l i n k e d t o t h e c e l l u l o s e , ( i i i ) T y p i c a l e l u t i o n p r o f i l e . B e c a u s e m o s t o f t h e s t u d i e s o n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n s r e p o r t e d i n t h i s t h e s i s h a v e i n v o l v e d t h e u s e o f l i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t e l u t i o n , i t s e e m s w o r t h w h i l e t o d e s c r i b e i n some d e t a i l a t y p i c a l e l u t i o n p r o f i l e ( s e e F i g . 2 3 ) . F o r a l l c o m p l e m e n t a r y n u c l e o t i d e s l o a d e d o n t o a n o l i g o -n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n , t h e r e w a s a l w a y s a c e r t a i n a m o u n t o f U V - a b s o r b i n g m a t e r i a l n o t r e t a i n e d b y t h e c o l u m n . ( F o r c o n v e n i e n c e t h i s i s r e f e r r e d t o a s p e a k A , t u b e s 2 t o 20 i n e l u t i o n p r o f i l e f i g u r e s . ) P e a k A v a r i e d i n s i z e d e p e n d i n g o n t h e l e n g t h o f t h e o l i g o m e r s ; a s t h e o l i g o m e r l e n g t h d e c r e a s e d , p e a k A i n c r e a s e d . I t i s p o s s i b l e t h a t p e a k A r e p r e s e n t s i m p u r i t i e s s u c h a s c y c l i c o l i g o n u c l e o t i d e s o r p y r o p h o s p h a t e s , 1 3 4 F i g u r e 2 3 . T y p i c a l e l u t i o n p r o f i l e s f o r o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e s . T h e e l u t i o n o f d ( p A ) g (A) a n d d ( p A ) ^ (B ) o n a c e l l - d ( p T ) Q c o l u m n ( 3 9 A . U . d ( p T ) . ( 0 . 9 cm x 5 c m ) . y y T h e o l i g o n u c l e o t i d e s a m p l e ( a p p r o x i m a t e l y 5 A . U . i n 1 ml MBS) w a s s l o w l y a p p l i e d t o t h e c o l u m n a t - 4 ° . T h e c o l u m n w a s w a s h e d a t t h i s t e m p e r a t u r e u n t i l t h e a b s o r b a n c e o f t h e e l u a t e d r o p p e d t o l e s s t h a n 0 . 0 0 3 . T h e b o u n d n u c l e o t i d e w a s t h e n e l u t e d w i t h a l i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t a s i n d i c a t e d . T h e f r a c t i o n s i z e w a s 1 . 7 ml p e r 11 m i n , a n d t h e t e m p e r a t u r e g r a d i e n t a p p r o x i m a t e l y 0 . 5 ° p e r 11 m i n . T h e d o t t e d c u r v e i n F i g . 2 3 B i s t h e e l u t i o n p r o f i l e f o r a s a m p l e o f d ( p A ) j j w h i c h h a s b e e n p u r i f i e d o n a c e l l - d ( p T ) g c o l u m n b y s t e p w i s e t h e r m a l e l u t i o n ( s e e i n s e t F i g u r e 1 8 B ) . 1 3 4 a 30 60 90 120 TUBE NUMBER t h e m a j o r c o n t a m i n a n t s i n t h e c h e m i c a l s y n t h e s i s ( 1 5 1 , 1 1 4 ) . H o w e v e r , o n e w o u l d e x p e c t t h a t t h e l o n g e r t h e o l i g o n u c l e o t i d e s a r e , t h e l e s s p u r e t h e y w o u l d b e , a n d t h u s t h e l o n g e r t h e o l i g o m e r , t h e l a r g e r p e a k A s h o u l d b e . 1 * 3 I t i s p o s s i b l e t h a t p e a k A r e p r e s e n t s m a t e r i a l w h i c h i s c o m p l e m e n t a r y , b u t i n s u f f i c i e n t t i m e w a s a l l o w e d d u r i n g t h e l o a d i n g a n d w a s h i n g f o r i t t o f o r m s t a b l e h y b r i d s t r u c t u r e s . T h i s e x p l a n a t i o n i s u n l i k e l y h o w e v e r , b e c a u s e w h e n t h e c o l u m n was l o a d e d v e r y s l o w l y ( b y g r a v i t y , 2 h r ) , t h e s i z e o f p e a k A was n o t r e d u c e d . D i l u t i n g t h e s a m p l e s e v e r a l f o l d a l s o d i d n o t d e c r e a s e p e a k A . F r o m c a p a c i t y s t u d i e s d e s c r i b e d l a t e r , i t i s k n o w n t h a t t h e c o l u m n w a s n o t o v e r l o a d e d . A n o t h e r c h a r a c t e r i s t i c o f t h e e l u t i o n p r o f i l e was t h e s y m m e t r y o f t h e e l u t i o n o f t h e r e t a i n e d n u c l e o t i d e . A s t h e l e n g t h o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e i n c r e a s e d , a s i g n i f i c a n t a m o u n t e l u t e d i n a l e a d i n g e d g e a s s o c i a t e d w i t h t h e m a i n p e a k ( s e e F i g u r e 2 3 B ) . T h e n a t u r e o f t h i s m a t e r i a l i s n o t k n o w n . H o w e v e r , w h e n t h e d ( p A ) ^ was e l u t e d w i t h a s t e p w i s e g r a d i e n t ( i n s e t F i g u r e 18B ) a n d t h e m a t e r i a l r e l e a s e d b e t w e e n 29° a n d 5 0 ° r e a p p l i e d 3 T h e s t a t e m e n t " t h e l o n g e r t h e o l i g o n u c l e o t i d e s a r e , t h e l e s s p u r e t h e y w o u l d b e " , i s p r o b a b l y t r u e . H o w e v e r , t h e i m p u r i t i e s a r e n o t n e c e s s a r i l y e l u t e d i n p e a k A . T h e y may f o r m s u f f i c i e n t l y s t a b l e i n t e r a c t i o n s a n d be r e t a i n e d b y t h e c o l u m n . T h e n a s t h e t e m p e r a t u r e i n c r e a s e s , t h e y s h o u l d b e e l u t e d a t a l o w e r t e m p e r a t u r e t h a n t h e m a j o r p e a k . t o a c e l l - d ( p T ) g c o l u m n i t e l u t e d a s a s y m m e t r i c a l p e a k w i t h n o s u g g e s t i o n o f a l e a d i n g e d g e ( F i g . 2 3 B , d o t t e d c u r v e ) . T h i s i n d i c a t e d t h a t t h e m a t e r i a l s i n t h e l e a d i n g e d g e w e r e i m p u r i t i e s t h a t f o r m l e s s s t a b l e h y b r i d s t r u c t u r e s t h a n t h e l i n e a r o l i g o d e o x y a d e n y l a t e . T h i s s u g g e s t i o n i s s u p p o r t e d b y Tm d a t a o n t h e p u r i f i e d d e o x y a d e n y l a t e ( s e e F i g u r e 1 8 ) . T h e v o l u m e i n w h i c h t h e s a m p l e i s e l u t e d ( 6 0 t o 70 m l ) a n d t h e Tm v a l u e w e r e i n d e p e n d e n t o f t h e s a m p l e s i z e ( f r o m 1 t o 3 0 m l ) . H o w e v e r , t h e r e w a s some ( r a n d o m ) v a r i a b i l i t y i n t h e s h a r p n e s s o f t h e e l u t i o n c u r v e , a n d r e p r o d u c i b i l i t y o f t h e T m C v a l u e f o r a p a r t i c u l a r o l i g o n u c 1 e o t i d e - c e l 1 u l o s e a n d c o m p l e m e n t a r y o l i g o -n u c l e o t i d e w a s ± 0 . 5 ° . One f i n a l o b s e r v a t i o n o n t h e g e n e r a l e l u t i o n p r o f i l e w a s t h a t a f t e r t h e e l u t i o n o f t h e b o u n d n u c l e o t i d e , i n o r d e r t o e n s u r e t h a t n o n u c l e o t i d e was s t i l l r e t a i n e d o n t h e c o l u m n , * * * * a n d t o " r e g e n e r a t e " t h e c e l l u l o s e , t h e s e c o l u m n s w e r e r o u t i n e l y w a s h e d a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h 0 . 1 N N a O H . In a l l c a s e s a s m a l l p e a k o f U V r a b s o r b i n g m a t e r i a l w a s e l u t e d . S p e c t r a o f t h e f r a c t i o n s s h o w e d t h a t i n t h e f i r s t f r a c t i o n t h e r e w a s , p o s s i b l y , a v e r y s m a l l a m o u n t o f n u c l e o t i d i c m a t e r i a l . ( T h i s a l k a l i w a s h p e a k i s n o t s h o w n i n m o s t , e l u t i o n p r o f i l e s . ) T h e r e c o v e r y o f n u c l e o t i d e was 8 5 t o 1 0 0 % . b ) A l t e r n a t e m e t h o d s f o r t h e e l u t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s  f r o m o l i g o n u c 1 e o t i d e - c e l 1 u l o s e c o l u m n s . A l t h o u g h t h e m a j o r p o r t i o n o f t h e w o r k r e p o r t e d i n t h i s t h e s i s h a s b e e n c o n c e r n e d w i t h t h e r m a l e l u t i o n o f o l i g o -n u c l e o t i d e s , o t h e r e l u t i o n m e t h o d s h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d , b r i e f l y . I f t h e p r i n c i p l e b e h i n d t h e s e o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n s i n v o l v e s r e t e n t i o n o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s b y h y d r o g e n b o n d f o r m a t i o n , t h e n a n y c o n d i t i o n s w h i c h d e s t a b i l i z e h y b r i d s t r u c t u r e s h o u l d b e c a p a b l e o f e f f e c t i n g t h e e l u t i o n o f b o u n d o l i g o n u c l e o t i d e . S z y b a l s k i (145) h a s b r i e f l y r e v i e w e d t h e r e a g e n t s o r c o n d i t i o n s w h i c h c a n r e v e r s i b l y d e s t a b i l i z e h y b r i d s t r u c t u r e . I t i s k n o w n t h a t i n c r e a s i n g t h e i o n i c s t r e n g t h o f t h e s o l v e n t i n c r e a s e s t h e s t a b i l i t y o f DNA t o t h e r m a l d e n a t u r a t i o n (169> 170). T h i s s t a b i l i z a t i o n i s b a s e d o n t h e e l e c t r o s t a t i c n e u t r a l i z a t i o n o f t h e c h a r g e s o n t h e p h o s p h a t e g r o u p s b y t h e c a t i o n s i n t h e s o l v e n t (145) . W a t e r - m i s c i b l e o r g a n i c s o l v e n t s a l s o a f f e c t t h e s t a b i l i t y o f h y b r i d s t r u c t u r e s , r e s u l t i n g i n a d e c r e a s e i n T m . I f t h e d e n a t u r i n g s o l v e n t c o n c e n t r a t i o n i s s u f f i c i e n t l y h i g h , d e n a t u r a t i o n o f t h e DNA c a n b e a c h i e v e d a t t e m p e r a t u r e s a s l o w a s r o o m t e m p e r a t u r e ( 1 4 5 ) . T h e e f f e c t o f t h e s o l v e n t s f o r m a m i d e , N , N 1 - d i m e t h y 1 f o r m a m i d e , a n d d i m e t h y s u l f o x i d e o n t h e s t a b i l i t y o f DNA h a v e b e e n s t u d i e d b y L e v i n e e t a 1. (171), M a r m u r a n d T s ' o (172), H e r s k o v i t s (173, 174) a n d o t h e r s . C e r t a i n s a l t s a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s ( e . g . N a C l O ^ ) a r e a l s o k n o w n t o h a v e a m a r k e d e f f e c t o n h y b r i d s t a b i l i t y (175). T h e Tm o f s e a u r c h i n DNA (37% GC) i s r e d u c e d a p p r o x i m a t e l y h 0 ° i n 6 M N a C l O ^ b u f f e r e d w i t h EDTA a t pH 7-0 (175)'.. In t h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d h e r e , t h e c o n d i t i o n s i n v e s t i g a t e d t o e f f e c t t h e e l u t i o n o f b o u n d n u c l e o t i d e s w e r e r e v e r s e s a l t g r a d i e n t s ( a l i n e a r g r a d i e n t o f d e c r e a s i ng s a l t c o n c e n t r a t i o n ) a n d g r a d i e n t s o f i n c r e a s i n g o r g a n i c s o l v e n t c o n c e n t r a t i o n s ( f o r m a m i d e ; N , N ' - d i m e t h y l f o r m a m i d e , D M F ; a n d d i m e t h y l s u l f o x i d e , D M S O ) . A g r a d i e n t o f i n c r e a s i n g s o d i u m p e r c h l o r a t e c o n c e n t r a t i o n w a s a l s o u s e d . T h e " m o d e l s y s t e m " e m p l o y e d t o s t u d y t h e s e v a r i o u s c o n d i t i o n s w a s t h e e l u t i o n o f d ( p A ) ^ (5 t o 6 A . U . i n 1 ml M B S , l o a d e d a t -k°) o n a p r e p a r a t i o n o f c e l l - d ( p T ) (39 A . U . d ( p T ) , 0.9 cm y y x 5 c m ) . A f t e r t h e s a m p l e w a s l o a d e d , t h e c o l u m n w a s e l u t e d a t -4 ° w i t h MBS u n t i l t h e a b s o r b a n c e a t 260 ( o r 270) nm d r o p p e d . T h e t e m p e r a t u r e was t h e n r a i s e d t o 8 o r 9 ° a n d a s e c o n d p e a k o f n u c l e o t i d e e l u t e d . T h e . c o l u m n s w e r e t h e n e l u t e d a s d e s c r i b e d b e l o w . ( i ) R e v e r s e s a l t g r a d i e n t . A l i n e a r g r a d i e n t o f N a C l (1.0 M t o z e r o ) w a s r u n i n 0.01 M N a l ^ P O ^ , pH 7-0 ( t o t a l 200 m l ) . ( F i g . 2 4 B ) . ( i i ) F o r m a m i d e . A l i n e a r g r a d i e n t o f f o r m a m i d e (0 t o 30%, v / v ) i n 0.01 M NaH P 0 , , pH 7-0 1 M N a C l ( t o t a l 200 m l ) w a s r u n ( F i g . 2 h C ) . 139 F i g u r e 2 4 . A l t e r n a t e m e t h o d s f o r t h e e l u t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s o n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e c o l u m n s . C e l l - d ( p T ) 9 ( 3 9 A . U . d ( p T ) Q , 0 . 9 cm x 5 cm) was l o a d e d w i t h a s a m p l e o f d ( p A ) ^ a t - 4 ° i n M B S . T h e n u c l e o t i d e s w e r e e l u t e d a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . A - l i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t . B - r e v e r s e s a l t g r a d i e n t , 1 M t o 0 . 0 M N a C l . C - l i n e a r g r a d i e n t o f f o r m a m i d e , 0 t o 3 0 % . D - l i n e a r g r a d i e n t o f DMF , 0 t o 3 0 % . E - e x p o n e n t i a l g r a d i e n t o f N a C l 0 ^ , 0 t o 4 . 1 M. In C a n d D, t h e d o t t e d c u r v e i s t h e a b s o r b a n c e a t 2 7 0 nm c o r r e c t e d . f o r t h e a b s o r b a n c e d u e t o f o r m a m i d e (C) o r DMF ( D ) . TUBE NUMBER TUBE NUMBER ( i i i ) N , N ' - d i m e t h y l f o r m a m i d e . A l i n e a r g r a d i e n t o f DMF (0 t o 30%, v / v ) i n 0 . 0 1 M NaH P O ^ , pH 7-0 , 1 M N a C l ( t o t a l 2 0 0 m l ) was r u n ( F i g . 2 4 D ) . ( i v ) D i m e t h y l s u l f o x i d e . A l i n e a r g r a d i e n t o f DMS0 (0 t o 3 0 % , v / v ) i n 0 . 0 1 M N a H 2 P 0 i t , pH 7-0 , 1 M N a C l ( t o t a l 2 0 0 m l ) w a s r u n . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , t h e o l i g o n u c l e o t i d e d ( p A ) ^ w a s n o t e l u t e d . A t t h e e n d o f t h e g r a d i e n t , t h e c o l u m n w a s w a s h e d w i t h M B S . T h e t e m p e r a t u r e was t h e n r a i s e d t o 3 0 ° a n d t h e e l u t i o n c o n t i n u e d . T h e n u c l e o t i d e w a s r e c o v e r e d q u a n t i t a t i v e l y a t t h i s p o i n t . ( v ) S o d i u m p e r c h l o r a t e . A n e x p o n e n t i a l l y i n c r e a s i n g g r a d i e n t * * 5 o f s o d i u m p e r c h l o r a t e c o n s i s t i n g o f 100 ml o f MBS i n t h e m i x i n g c h a m b e r a n d 100 ml o f 7-2 M N a C I O ^ ( b u f f e r e d w i t h s o d i u m E D T A , pH 7-0) (175) i n a s e c o n d f l a s k w a s r u n ( F i g - ; 2 4 E ) . In a l l t h e s e e x p e r i m e n t s , t h e f l o w r a t e w a s 1 .7 ml p e r 11 m i n . E l u t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s w i t h a r e v e r s e s a l t g r a d i e n t r e s u l t e d i n a v e r y b r o a d p e a k o f n u c l e o t i d e ( F i g . 2 4 B ) . S i m i l a r l y , f o r m a m i d e a n d DMF ( F i g . 24C a n d D) d i d n o t g i v e a s s h a r p a n e l u t i o n o f b o u n d n u c l e o t i d e a s d i d t h e 1 i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t ( F i g . 2 4 A ) . F r o m t h e r e l a t i o n s h i p r e p o r t e d b y M c C o n a u g h y e t a 1. (177) ( a 1% i n c r e a s e o f f o r m a m i d e c o n c e n t r a t i o n r e s u l t s i n a d r o p i n t h e T h i s g r a d i e n t w a s s e t up s u c h t h a t t h e r a t e o f r e m o v a l o f l i q u i d f r o m t h e m i x i n g c h a m b e r was e q u a l t o t h e r a t e o f a d d i t i o n o f 7 . 2 M N a C l O ^ t o t h e m i x i n g c h a m b e r . T h e g r a d i e n t t h a t r e s u l t s i s a n e x p o n e n t i a l o n e . T h e c o n c e n t r a t i o n o f NaC 10/, r e a c h e s a m a x i m u m ( a p p r o x i m a t e l y 4 . 1 M) h a l f w a y t h r o u g h t h e g r a d i e n t ( 1 7 6 ) . Tm o f 0 . 7 2 ° , i n e i t h e r 1 x o r 5 x S SC ) , t h e c o n c e n t r a t i o n o f f o r m a m i d e t h a t s h o u l d b e r e q u i r e d t o e l u t e d ( p A ) ^ , a t 8 ° c a n b e c a l c u l a t e d , a s s u m i n g t h i s r e l a t i o n s h i p i s v a l i d f o r t h e b u f f e r u s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s . T h e T m C o f d ( p A ) ^ o n c e l l - d ( p T ) g i n MBS was 19°- T h e r e f o r e , t h e c o n c e n t r a t i o n o f f o r m a m i d e r e q u i r e d t o e l u t e t h e d ( p A ) ^ a t 8 ° c o u l d b e a p p r o x i m a t e l y 14% DMF , v / v . T h e n u c l e o t i d e a c t u a l l y e l u t e d a t a l o w e r c o n c e n t r a t i o n o f f o r m a m i d e ( a b o u t 10%). T h e o l i g o n u c l e o t i d e d ( p A ) ^ w a s e l u t e d m o s t s h a r p l y b y t h e N a C l O ^ g r a d i e n t ( t h e p e a k o f n u c l e o t i d e e l u t e s , a p p r o x i m a t e l y , b e t w e e n 1 t o 2 M N a C l O ^ ) . T h e s h a r p n e s s o f t h e p e a k i s n o t u n e x p e c t e d f r o m t h e d a t a o f H a m a g u c h i a n d G e i d u s c h e k (175)• c ) C a p a c i t y o f o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u 1 o s e c o l u m n s . In e a r l y e x p e r i m e n t s t o a t t a c h o l i g o n u c l e o t i d e s o n t o c e l l u l o s e ( T a b l e I X , p r e p a r a t i o n s 1 t o 5 ) , i n c o r p o r a t i o n o f l e s s t h a n 60% w a s o b t a i n e d , g i v i n g c e l l u l o s e s w i t h l e s s t h a n kO A . U . o f c o v a l e n t l y b o u n d o l i g o n u c l e o t i d e . S i n c e i t w a s f e l t t h a t a t l e a s t 2 A . U . a n d p r e f e r a b l y up t o 5 o r 6 A . U . o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s h o u l d b e l o a d e d t o s t u d y t h e b i n d i n g a n d e l u t i o n o f a p a r t i c u l a r o l i g o m e r , i t w a s n e c e s s a r y t o e x a m i n e t h e c a p a c i t y o f t h e c o l u m n s t o d e t e r m i n e a t w h a t p o i n t t h e c o l u m n w a s o v e r l o a d e d . A c e l l - d ( p T ) g c o l u m n (27 A . U . d ( p T ) g ) s h o u l d b e c a p a b l e o f r e t a i n i n g 33 A . U . o f d ( p A ) g , a n d t h u s a s a m p l e s i z e o f 5 A . U . s h o u l d b e w e l l w i t h i n t h e t h e o r e t i c a l c a p a c i t y o f t h e c o l u m n . T o e x a m i n e t h e c a p a c i t y o f a c e l l - d ( p T ) g c o l u m n (27 A . U . d ( p T ) g , 0.9 cm x 5 c m ) , t h e c o l u m n w a s l o a d e d w i t h s i x d i f f e r e n t a m o u n t s o f d ( p A ) g o l i g o m e r (1.6, 3.4, 6.2, 10.6, 16.4 a n d 25.3 A . U . e a c h i n 1 ml M B S ) . T h e r e t a i n e d n u c l e o t i d e w a s e l u t e d w i t h a l i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t . F i g u r e 25 g i v e s t h e e l u t i o n p r o f i l e s f o r t h r e e s a m p l e s o f d ( p A ) g ( 3 . 4 , 10.6 a n d 25.3 A . U . ) . I t c a n b e s e e n t h a t o n i n c r e a s i n g t h e s a m p l e l o a d , t h e r e i s a n i n c r e a s e i n t h e a m o u n t o f m a t e r i a l n o t r e t a i n e d b y t h e c o l u m n ( p e a k A ) , a n d t h e r e t a i n e d p e a k c h a n g e s f r o m a s y m m e t r i c a l o n e t o a n a s y m m e t r i c a l o n e , w i t h a p r o n o u n c e d l e a d i n g e d g e . D a t a r e l a t e d t o t h e % A . U . n o t r e t a i n e d , a n d t h e Tm f o r e a c h s a m p l e s i z e a r e g i v e n i n T a b l e X I . In d e t e r m i n i n g t h e c a p a c i t y o f t h e c o l u m n , i t i s n e c e s s a r y t o d e f i n e c a p a c i t y . I t s e e m s c o n v e n i e n t t o u s e t h e t w o c r i t e r i a : ( i ) t h e n o n - p r o p o r t i o n a t e i n c r e a s e i n t h e n u c l e o t i d e n o t r e t a i n e d b y t h e c o l u m n , r e l a t i v e t o t h e s i z e o f t h e l o a d ( T a b l e XI a n d F i g u r e 2 6 ) , a n d ( i i ) t h e a s y m m e t r y o f t h e e l u t i o n o f t h e b o u n d o l i g o -n u c l e o t i d e p e a k ( F i g . 2 5 ) . U s i n g t h e f i r s t o f t h e s e c r i t e r i a , t h i s c o l u m n w a s o v e r l o a d e d b e t w e e n 6 t o 10 A . U . ( T a b l e XI a n d F i g u r e 2 6 ) . B a s e d o n t h e a s y m m e t r y o f t h e e l u t e d p e a k , t h e c o l u m n w a s o v e r l o a d e d w i t h 16.4 A . U . d ( p A ) g ( t h e p r o f i l e w a s s i m i l a r t o t h a t i n F i g u r e 2 5 C ) , a n d i s p r o b a b l y l o a d e d t o i t s c a p a c i t y w i t h 10.6 A . U . (When a 143 F i g u r e 25. T h e c a p a c i t y o f a c e l l - d ( p T ) g c o l u m n (27 A . U . d ( p T ) g , 0 . 9 cm x 5 c m ) . V a r i o u s s a m p l e s i z e s o f d ( p A ) g w e r e l o a d e d a n d e l u t e d a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . A - 3 .4 A . U . d ( p A ) g . B - 1 0 . 6 A . U . d ( p A ) g . C - 25.3 A . U . d ( p A ) g . T a b l e X I . C a p a c i t y o f c e l l - d ( p T ) g c o l u m n (0.9 cm x 5 c m ; 27 A . U . d ( p T ) g ) . S a m p l e s o f d ( p A ) g w e r e l o a d e d a n d e l u t e d a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . A . U . A . U . A . U . % A . U . l o a d e d r e c o v e r e d n o t r e t a i n e d n o t r e t a i n e d Tm 1.6 1.6 0.15 9 - h 26 3.4 2.8 0.33 11.8 24 6.2 5.6 0.53 9-5 20 10.6 9 . 9 1-5 15.0 20 16.4 17.2 5-2 30.0 20 25.3 25.6 10.7 4 1 . 9 20 1 4 5 10 20 30 A .U . LOADED F i g u r e 26. % A . U . d ( p A ) g n o t r e t a i n e d b y a c e l l - d ( p T ) g c o l u m n v s A . U . d ( p A ) g l o a d e d . 146 p e r p e n d i c u l a r i s dropped from t h e peak tube i n F i g u r e 25C, and t w i c e t h e a b s o r b a n c e t o the r i g h t o f t h i s p e r p e n d i c u l a r i s e s t i m a t e d , a v a l u e o f 10.4 A.U. i s o b t a i n e d . ) T h e r e f o r e , t h e c a p a c i t y o f t h i s e e l 1-d(pT)g column (27 A.U. d(pT ) g ) i s a p p r o x i m a t e l y 10 A.U. o f d ( p A ) g , w h i c h i s 1/3 to 1/4 o f t h e t h e o r e t i c a l c a p a c i t y o f 33 A.U. The l e a d i n g edge i n F i g u r e 25C i s presumably due t o o l i g o n u c l e o t i d e w h i c h i s o n l y p a r t i a l l y hydrogen bonded. R a i s i n g t h e t e m p e r a t u r e r e s u l t s i n i n c r e a s i n g l y more s t r i n g e n t c o n d i t i o n s f o r s t a b l e h y b r i d f o r m a t i o n and thus r e t e n t i o n o f the n u c l e o t i d e . The o l i g o n u c l e o t i d e s must then r e a r r a n g e t o s t a b l e r s t r u c t u r e s , and t he e x c e s s o l i g o m e r s a r e e l u t e d i n t h i s l e a d i n g edge. T h i s i s i 1 l u s t r a t e d below. 5 ' 3 ' Cell-pTpTpTpTpTpTpTpT „ ^pApApApAp A PApApA P /d stable at low temperatures 5 ' 3 " increase in temperature results in a rearrangement 3 ' cell - pTpTpTpTpTpTpTpT • • • • • • • • ApApAPApApApApAp < 3 ' + 5 ' ApApApApApAPApAp t stable at- higher temperatures eluted early D u r i n g t h i s s t u d y o f c a p a c i t y i t was o b s e r v e d t h a t t h e r e w a s some d e p e n d e n c e o f t h e T m c o n t h e s i z e o f t h e s a m p l e ( s e e T a b l e X I ) . A s t h e s a m p l e s i z e d e c r e a s e d , t h e T m C i n c r e a s e d , s l i g h t l y . T h i s may p a r t i a l l y e x p l a i n t h e Tm d i s c r e p a n c y b e t w e e n t h e e l u t i o n o f d ( p A ) Q o n c e 1 1 - d ( p T ) g a t 20 ° ( T a b l e X I ) d e s c r i b e d a b o v e , a n d t h e o b s e r v a t i o n o f G i l h a m (69) ( u s i n g d e o x y t h y m i d i n e p o l y n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e ) t h a t d ( p A ) ^ i s e l u t e d a t 3 5 V 6 d ) R e s o l u t i o n o f o l i g o d e o x y a d e n y l a t e s o n c e l l - d ( p T ) 8 >  e e l 1 - d ( pT ) , a n d e e l 1-d (pT )^ 2 . T h e e l u t i o n o f t h e o l i g o d e o x y a d e n y l a t e s e r i e s d ( p A ) ^ (n = 6 t o 11) w a s s t u d i e d o n c e l l u l o s e s w i t h c o v a l e n t l y a t t a c h e d d ( p T ) g , d ( p T ) g a n d d ( p T ) ^ 2 - T h e d a t a f o r t h e s e e x p e r i m e n t s i s g i v e n i n T a b l e X I I . A c o m p o s i t e g r a p h o f t h e e l u t i o n p r o f i l e s f o r t h e v a r i o u s a d e n y l a t e o l i g o m e r s o n t h e s e o l i g o d e o x y t h y m i d y l a t e -c e l l u l o s e s i s g i v e n i n F i g u r e 27. T h e d a t a f r o m t h e s e e x p e r i m e n t s may b e s u m m a r i z e d a s f o l l o w s . ( i ) i n c r e a s i n g t h e c h a i n l e n g t h o f t h e o l i g o d e o x y a d e n y 1 a t e r e s u l t e d i n a s t a b l e r i n t e r a c t i o n ( h i g h e r T m C v a l u e ) o n a p a r t i c u l a r o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e . 1 * 6 l t s h o u l d be e m p h a s i z e d t h a t t h e s u b s t i t u t e d c e l l u l o s e t h a t G i l h a m u s e d c o n t a i n e d a t l e a s t 200 f o l d m o r e o l i g o m e r t h a n t h e o l i g o -n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e u s e d h e r e . G i l h a m ' s c e l l u l o s e m u s t a l s o h a v e c o n t a i n e d o l i g o m e r s much l o n g e r t h a n t h e o c t a t h y m i d y l a t e (69). T h e much h i g h e r c a p a c i t y o f t h e p o l y n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e v e r y l i k e l y r e s u l t s i n t h e g r e a t e r r e s o l u t i o n o b s e r v e d . T a b l e X I I . E l u t i o n o f d e o x y a d e n y 1 a t e s d ( p A ) , t o d ( p A ) , , , o n b 11 c e l l - d ( p T ) Q > c e l l - d ( P T ) q , a n d e e l 1 - d ( p T ) 1 9 . A . C e l l - d ( p T ) 8 (27 A . U . d ( p T ) g ) 0 1 i g o -n u c l e o t i d e A . U . l o a d e d T mC ( ° C ) R a n g e o f e l u t i o n ( ° c ) d ( P A ) 6 7.2 3 .5 19 d ( P A ) ? 6.3 13.5 19 d ( p A ) g 6 .2 19.0 1 5 d ( p A ) 9 6 .2 25.5 20 d ( p A ) 1 Q 6 . 0 28.5 1 4 . 5 B. C e l l - d ( p T ) 9 (39 A . U . d ( P T ) g ) 0 1 i g o -n u c l e o t i d e A . U . l o a d e d T mC ( ° C ) R a n g e o f e l u t i o n ( C ) d ( P A ) 6 8 .5 19 d ( p A ) y 5.5 1 8 . 0 16 d ( P A ) g 5.5 2 6 . 0 19 d ( P A ) 9 5.6 3 2 . 0 16 d ( p A ) 1 Q 5-7 3 5 . 0 16 d ( P A ) n 5.6 3 7 . 0 14 C . C e l l - d ( p T ) 12 (30 A . U . d ( P T ) 1 2 ) 0 1 i g o -n u c 1 e o t i d e A . U . l o a d e d T mC ( ° C ) R a n g e o f e l u t i o n ( C) d ( P A ) 6 4 . 0 8 .5 18 d ( P A ) ? 4 . 8 1 4 . 5 17.5 d ( p A ) g 4 .2 2 0 . 5 1 8 . 5 d ( P A ) 9 3-0 27-5 11 .0 d ( p A ) 1 Q 4 . 4 3 4 . 0 1 1 . 0 d ( p A ) n 4 . 8 3 7 . 5 1 4 . 0 149 F i g u r e 27. C o m p o s i t e g r a p h o f e l u t i o n p r o f i l e s f o r e l u t i o n o f d ( p A ) n o n c e l l - d ( p T ) g , A ; c e l l - d ( p T ) g , B; a n d e e l 1 - d ( p T ) ^» . C . T h e s a m p l e s w e r e a l l l o a d e d a t - 4 ° a n d e l u t e d w i t h a l i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t . ( i i ) T h e A T m c i n c r e m e n t w i t h i n c r e a s i n g l e n g t h o f o l i g o -d e o x y a d e n y1 a t e i s a b o u t 6° t o 8° w h e n t h e l e n g t h o f t h e d A o l i g o m e r i s l e s s t h a n o r e q u a l t o t h e l e n g t h o f t h e dT o l i g o m e r , l i n k e d t o t h e c e l l u l o s e . B e y o n d t h i s l e n g t h , t h e r e i s a v e r y n o t i c e a b l e d e c r e a s e i n t h e A T m C i n c r e m e n t ( a p p r o x i m a t e l y 2.5° t o 3 . 0 ° ) f o r e a c h a d d i t i o n a l n u c l e o t i d e . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t a l l t h e n u c l e o t i d e s l i n k e d t o t h e c e l l u l o s e a r e a v a i l a b l e f o r h y b r i d f o r m a t i o n w i t h c o m p l e m e n t a r y n u c l e o t i d e s . I f o n e c o n s i d e r s t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n T m C a n d o l i g o m e r l e n g t h , n , f o r t h e t h e o r e t i c a l c a s e w h e r e c o n s e c u t i v e o l i g o m e r s s h o w a A T m c o f 6° w h e n t h e l e n g t h o f t h e dA o l i g o m e r i s t h e l e n g t h o f t h e c e l l u l o s e - b o u n d dT o l i g o m e r , a n d b e y o n d t h i s l e n g t h t h e A T m c i s 3 ° » t h e n a p l o t o f T m C v e r s u s o l i g o d e o x y -a d e n y l a t e l e n g t h w i l l g i v e t w o s t r a i g h t l i n e s w h i c h i n t e r s e c t w h e r e t h e l e n g t h o f t h e o l i g o d e o x y a d e n y l a t e i s e q u a l t o t h e . . l e n g t h o f t h e o l i g o d e o x y t h y m i d y l a t e . .When t h e Tm d a t a f o r t h e -t h r e e d i f f e r e n t o l i g o d e o x y t h y m i d y l a t e - c e l l u l o s e ( T a b l e X I I ) v e r s u s o l i g o m e r l e n g t h , n , a r e p l o t t e d ( F i g u r e 2 8 ) , a t l e a s t 2 c u r v e s c a n b e d r a w n i n 2 8 A a n d B. T h e d o t t e d l i n e s i n t e r s e c t j u s t b e l o w w h e r e t h e l e n g t h o f t h e d e o x y a d e n y1 a t e i s e q u a l t o t h e l e n g t h o f t h e c e l l u l o s e - b o u n d d e o x y t h y m i d y l a t e , w h i l e t h e s o l i d l i n e s i n t e r s e c t j u s t b e y o n d t h i s p o i n t . I t w o u l d s eem f r o m t h e d a t a t h a t a t l e a s t a l l b u t o n e o f t h e n u c l e o t i d e s , a n d p o s s i b l y t h e e n t i r e o l i g o n u c l e o t i d e a t t a c h e d t o t h e e e l l u l o s e , i s f r e e t o i n t e r a c t w i t h a c o m p l e m e n t a r y o l i g o -n u c l e o t i d e . T h e i n t e r a c t i o n i n v o l v i n g t h e d e o x y t h y m i d y l a t e r e s i d u e a d j a c e n t t o t h e c e l l u l o s e may b e w e a k e r ( d u e t o s t e r i c r e a s o n s ) t h a n t h e i n t e r a c t i o n s i n v o l v i n g t h e r e s t o f t h e c n u c l e o t i d e s . H o w e v e r , t h e ATm i n c r e m e n t s u g g e s t s t h i s n u c l e o t i d e d o e s i n t e r a c t a s s t r o n g l y . D a t a p r e s e n t e d b e l o w i n s e c t i o n 2 , i a l s o s u g g e s t t h a t a l l t h e n u c l e o t i d e s a t t a c h e d t o t h e c e l l u l o s e a r e f r e e t o i n t e r a c t w i t h c o m p l e m e n t a r y n u c l e o t i d e s . F i g u r e 28 i m p l i e s t h a t t h e r e i s a l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n T m c a n d t h e l e n g t h o f u n b o u n d o l i g o m e r s . T h i s r e l a t i o n -s h i p may n o t b e a l i n e a r o n e . ( i i i ) i n c r e a s i n g t h e c h a i n l e n g t h o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e i n c r e a s e s t h e Tm o f t h e c o r r e s p o n d i n g c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e i n t h e c a s e o f c e l l - d ( p T ) g a n d e e l 1 - d ( p T ) g . H o w e v e r , f o r e e l 1 - d ( p T ) ^ > a l t h o u g h t h e T m C v s o l i g o m e r l e n g t h g i v e s a l i n e a r l y i n c r e a s i n g r e l a t i o n s h i p f r o m n = 6 t o n = 11 ( F i g . 2 8 C ) , t h e T m C v a l u e s f o r t h e v a r i o u s o l i g o d e o x y a d e n y l a t e s a r e n o t s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r t h a n f o r c e l l - d ( p T ) . T h i s may b e e x p l a i n e d p a r t i a l l y b y t h e e a r l i e r o b s e r v a t i o n t h a t t h e T m c v a l u e i s s o m e w h a t d e p e n d e n t o n t h e s i z e o f t h e s a m p l e ( s e e c a p a c i t y d i s c u s s i o n a b o v e ) . T h e e e l 1 - d ( p T ) ^ c o n t a i n e d a n e s t i m a t e d 30 A . U . o f c o v a l e n t l y l i n k e d d ( p T ) 1 2 ( T a b l e I X ) . T h i s c o l u m n w o u l d t h e r e f o r e h a v e a s much a v a i l a b l e " e x c h a n g e r u n i t s " a s a c e l l - d ( p T ) c o l u m n w i t h 22 A . U . d ( p T ) Q . T h e c e l l - d ( p T ) 152 F i g u r e 28. Tm° o f d ( p A ) n o n e e l l u l o s e s - d ( p T ) g , d ( p T ) g , a n d d ( p T ) ^ v s o l i g o m e r l e n g t h n . A - e e l 1 - d ( p T ) g . B - c e l l - d ( p T ) . C - e e l l - d ( p T ) 1 2 . LENGTH n c o l u m n u s e d , i n t h e s e s t u d i e s c o n t a i n e d a l m o s t t w i c e t h a t a m o u n t o f o l i g o t h y m i d y l a t e . T h e l o w e r e l u t i o n t e m p e r a t u r e s f o r t h e d e o x y a d e n y 1 a t e s e r i e s o n cell-dCpT)^ may a l s o be p a r t i a l l y e x p l a i n e d b y o b s e r v a t i o n s d e s c r i b e d i n p a r t 2 f , b e l o w . F r o m F i g u r e 27 a n d T a b l e X I I I , i t c a n b e s e e n t h a t c o n s e c u t i v e o l i g o m e r s a r e n o t c o m p l e t e l y r e s o l v e d o n t h e s e s m a l l o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n s ( 0 . 9 cm x 5 c m , ~ 3 5 A . U . o l i g o -t h y m i d y l a t e ) , a l t h o u g h o l i g o m e r s d i f f e r i n g i n l e n g t h b y t w o n u c l e o t i d e s a r e r e s o l v e d . 1 * 7 T h e r e f o r e , a l a r g e r c o l u m n o f c e l l - d ( p T ) ' * 8 o f h i g h e r c a p a c i t y ( 0 . 9 mm x 15 c m , 150 A . U . 9 d ( p T ) g ) w a s u s e d t o s t u d y t h e e l u t i o n o f d ( p A ) ^ (n = 6 t o 9) • T h e r e s u l t s a r e g i v e n i n T a b l e X I I I a n d F i g u r e 2 9 . By i n c r e a s i n g t h e s i z e o f t h e c o l u m n , i t w a s f o u n d t h a t c o n s e c u t i v e o l i g o m e r s w e r e r e s o l v e d , a n d t h e r a n g e o f e l u t i o n w a s r e d u c e d f r o m 15°-"-'' 20 ° t o 8 ° - 1 2 ° . O n e o t h e r o b s e r v a t i o n w a s t h a t t h e o l i g o n u c l e o t i d e s e l u t e d a t 1.5° t o 3 ° h i g h e r f r o m t h e l a r g e r c o l u m n , c o n s i s t e n t w i t h t h e e a r l i e r o b s e r v a t i o n t h a t t h e Tm v a l u e i s d e p e n d e n t t o some d e g r e e o n t h e c a p a c i t y o f t h e c o l u m n . In s u m m a r i z i n g t h e o b s e r v a t i o n s o n t h e r e s o l u t i o n o f 7 1 n a n e x p e r i m e n t t o s e e i f i n c r e a s i n g t h e f l o w r a t e r e l a t i v e t o t h e t e m p e r a t u r e g r a d i e n t w o u l d r e s o l v e c o n s e c u t i v e o l i g o m e r s , i t w a s f o u n d t h a t a p a r t i c u l a r o l i g o m e r w a s e l u t e d o v e r t h e s a m e t e m p e r a t u r e r a n g e . " * 8 F o r t h i s l a r g e r c o l u m n , 4 . 7 ml f r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d p e r 11 min, and t h e t e m p e r a t u r e g r a d i e n t was 1 ° per 22 m i n . T a b l e X I I I . E l u t i o n o f d ( p A ) o n c e l l - d ( p T ) c o l u m n s . A . C e l l - d ( p T ) (0.9 cm x 15 c m , 150 A . U . d ( p T ) ) ° ! i g ° " A . U . l o a d e d T m C ( ° C ) R a n g e ( ° C ) n u c l e o t i d e d ( P A ) 6 8.8 10.0 11 d ( p A ) 7 7-8 21.0 12 d ( p A ) g 6.5 28.0 8.5 d ( P A ) 9 6.8 33.5 9.5 B. C e l l - d ( p T ) (0.9 cm x 15 c m , 39 A . U . d ( p T ) ) ° ! I g ° " A . U . l o a d e d T m c ( ° C ) R a n g e ( ° C ) n u c l e o t i d e ' ' 3 d ( p A ) 6 5.4 8.5 19 d ( p A ) 7 , 5-5 18.0 16 d ( p A ) g 5-5 26.0 19 d ( p A ) 5.6 32.0 16 155 T 1 1 1 1 1 r 6 60 120 180 V O L U M E m l F i g u r e 29. C o m p o s i t e e l u t i o n p r o f i l e f o r d ( p A ) n ( n = 6 t o 9) o n c e l l - d ( p T ) (0.9 cm x 15 c m , 150 A . U . d ( p T ) ) . c o n s e c u t i v e o l i g o m e r s o n s m a l l o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n s , s e v e r a l p o i n t s a r e i m p o r t a n t . T h e ATm f o r c o n s e c u t i v e o l i g o m e r s (when t h e f r e e o l i g o m e r i s s h o r t e r t h a n t h e o l i g o n u c l e o t i d e e x c h a n g e r ) i s s l i g h t l y l a r g e r t h a n t h e ATm f o r t h e s ame s e r i e s i n s o l u t i o n ( c o m p a r e t h e d a t a i n T a b l e X I I w i t h t h o s e i n T a b l e V I I ) . T h i s i s t r u e e v e n f o r a r e l a t i v e l y s m a l l c o l u m n w i t h a p p r o x i m a t e l y 0.5 u r n o l e o f c o v a l e n t l y l i n k e d e x c h a n g e r . T h e r a n g e o f e l u t i o n (15° t o 20°) i s l e s s t h a n t h e w i d t h o f t h e c o r r e s p o n d i n g t h e r m a l d i s s o c i a t i o n c u r v e ( a b o u t 30°). On a c o l u m n w i t h h i g h e r c a p a c i t y ( a b o u t 2 y m o l e s o f b o u n d n u c l e o t i d e ( T a b l e XI I l ) , t h e r a n g e o f e l u t i o n o f 0.1 y m o l e o f f r e e o l i g o m e r i s d e c r e a s e d f u r t h e r . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s c o n s e c u t i v e o l i g o m e r s a r e j u s t r e s o l v e d , w h e r e a s t h e t h e r m a l d e n a t u r a t i o n s t u d i e s , i n s o l u t i o n , h a d s u g g e s t e d t h a t o n e w o u l d g e t o v e r l a p o f f i v e o r m o r e s u c c e s s i v e o l i g o m e r s . A l t h o u g h m o s t o f t h e c o l u m n s s t u d i e d c o n t a i n e d a p p r o x i m a t e l y 0.5 t o 1.0 y m o l e o f b o u n d o l i g o m e r , p r e p a r a t i o n o f c o l u m n s w i t h 2 t o 5 y m o l e s o f b o u n d o l i g o m e r ( o f d e f i n e d l e n g t h a n d s e q u e n c e ) , a r e p r a c t i c a b l e , u s i n g t h e e x i s t i n g c h e m i c a l s y n t h e t i c d e v e l o p e d b y K h o r a n a a n d h i s a s s o c i a t e s ( 7 5 ) • e ) E l u t i o n o f d ( p A ) , d ( A ) , a n d r ( A ) o n c e l l u l o s e -d j £ l ) g . I f d e o x y n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s a r e t o b e u s e d i n t h e i s o l a t i o n o f n a t u r a l l y o c c u r r i n g r i b o n u c l e i c a c i d s , i t i s i m p o r t a n t t o know how o l i g o r i b o n u c 1 e o t i d e s e l u t e f r o m t h e s e c o l u m n s i n c o m p a r i s o n w i t h o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s . C h a m b e r l i n a n d h i s c o w o r k e r s (178, 179) h a v e s t u d i e d a n u m b e r o f p o l y d e o x y r i b o n u c l e o t i d e a n d p o l y r i b o n u c l e o t i d e i n t e r a c t i o n s . T h e y h a v e f o u n d t h a t , d e p e n d i n g o n t h e p a r t i c u l a r b a s e p a i r , t h e r e i s a d i s t i n c t o r d e r o f t h e r m a l s t a b i l i t y . F o r e x a m p l e , t h e o r d e r f o r i n c r e a s i n g Tm v a l u e s f o r t h e f o l l o w i n g h o m o p o l y m e r i n t e r a c t i o n s w a s o b s e r v e d : d l : r C < d I : d C < r l : d C < r l : r C < a n d d G : d C < d G : r C < r G : d C < r G : r C . F r o m t h e s e e x p e r i m e n t s , i t c a n n o t b e p r e d i c t e d w h e t h e r d ( T ) n " r ( A ) i n t e r a c t i o n s w o u l d b e m o r e s t a b l e o r l e s s s t a b l e t h a n d ( T ) : d ( A ) n n i n t e r a c t i o n s . H o w e v e r , R i l e y et_ a j _ . (180) h a v e a l s o s t u d i e d t h e h o m o p o l y m e r i n t e r a c t i o n s d A : d T a n d r A : d T . A t 0.1 M s o d i u m i o n c o n c e n t r a t i o n , t h e d A : d T i n t e r a c t i o n h a d a Tm o f 68° w h i l e t h e r A : d T i n t e r a c t i o n h a d a Tm o f 63°. T h e r e f o r e , o n e w o u l d p r e d i c t t h a t o l i g o r i b o a d e n y l a t e s w o u l d b e e l u t e d f r o m o l i g o -d e o x y t h y m i d y l a t e - c e l l u l o s e s a t l o w e r t e m p e r a t u r e s t h a n t h e c o r r e s p o n d i n g o l i g o d e o x y a d e n y l a t e s . ( i t s h o u l d a l s o be m e n t i o n e d t h a t i n s t u d i e s w i t h n a t u r a l l y o c c u r r i n g p o l y n u c l e o t i d e s , DNA/RNA h y b r i d s . h a v e b e e n f o u n d t o b e l e s s s t a b l e t h a n DNA/DNA h y b r i d s (181).) T o e x a m i n e t h e e l u t i o n o f o l i g o r i b o n u c 1 e o t i d e s , t h e s e r i e s r ( A ) ( n = 6 t o 9) w a s r u n o n a p r e p a r a t i o n o f e e l 1 - d ( p T ) _ n y (0.9 cm x 5 c m , 39 A . U . d ( p T ) g ) . F o r c o m p a r i s o n , t h e d e -p h o s p h o r y 1 a t e d d e o x y r i b o - s e r i e s d ( A ) w a s a l s o r u n . T h e y r e s u l t s o f t h e s e e x p e r i m e n t s a r e l i s t e d i n T a b l e X I V ( s e e a l s o T a b l e X I V . E l u t i o n o f o l i g o r i b o -o n e e l 1 - d ( p T ) Q . a n d o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s 01igo-n u c l e o t i d e A . U . l o a d e d T m C ( ° 0 . r ( A ) 6 5.4 5. 0 r ( A ) 7 6.5 1 4 . 0 r ( A ) 8 4.3 20. 0 r ( A ) g 5.1 25. 5 d ( A ) 6 7.0 9. 0 d ( A ) 7 4.0 19. 5 d ( A ) 8 4.2 26. 5 d ( A ) g 5.2 34. 5 d ( p A ) 6 5.4 8 . 5 d ( p A ) y 5.5 18 . 0 d ( p A ) g 5.5 26. 0 d ( p A ) g 5.6 32. 0 F i g u r e 3 0 ) . I t i s c l e a r t h a t t h e o l i g o r i b o n u c l e o t i d e s e l u t e a t 4 ° t o 9 ° l o w e r t h a n t h e c o r r e s p o n d i n g d e o x y r i b o - o l i g o m e r s . O n e o t h e r i n t e r e s t i n g o b s e r v a t i o n i s t h a t t h e p h o s p h o r y l a t e d d ( p A ) ^ e l u t e s a t a p p r o x i m a t e l y 1 ° t o 2 ° l o w e r t h a n t h e d e p h o s p h o r y l a t e d s e r i e s d ( A ) ^ , s u g g e s t i n g t h a t e v e n a t a v e r y h i g h s a l t c o n c e n t r a t i o n (M N a C l ) , t h e 5 ' p h o s p h a t e g r o u p o n t h e o l i g o n u c l e o t i d e i s c a p a b l e o f r e d u c i n g t h e s t a b i l i t y o f t h e h y b r i d s t r u c t u r e . f ) C h a r a c t e r i s t i c s o f d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s o f  o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e s . I t w a s o f i n t e r e s t , t o c o m p a r e t h e p r o p e r t i e s o f d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s o f t h e s ame o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e i n o r d e r t o s e e i f t h e r e w a s g o o d r e p r o d u c i b i l i t y o f r e t e n t i o n p r o p e r t i e s . T h e t w o p r e p a r a t i o n s t h a t w e r e c o m p a r e d i n i t i a l l y w e r e p r e p a r a t i o n # 4 , c e l l - d ( p T ) g p r e p a r e d a s d e s c r i b e d b y G i l h a m ( 1 4 1 ) , a n d p r e p a r a t i o n # 1 0 , c e l l - d ( p T ) a p r e p a r e d b y a m o d i f i e d p r o c e d u r e ( s e e M e t h o d s , P a r t II a n d T a b l e I X ) , u s i n g a l a r g e r a m o u n t o f c a r b o d i i m i d e . T h e o l i g o a d e n y 1 a t e s d ( p A ) ^ a n d d ( p A ) ^ w e r e e l u t e d a t a s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t e m p e r a t u r e f r o m p r e p a r a t i o n #h t h a n p r e p a r a t i o n #10 ( s e e T a b l e X V ) . T h e d i f f e r e n c e i n Tm v a l u e s o b s e r v e d i s s i g n i f i c a n t i n t h a t i t i s k n o w n t h a t t h e r e p e a t e l u t i o n o f a n o l i g o n u c l e o t i d e f r o m t h e same c o l u m n i s r e p r o d u c i b l e t o w i t h i n ± 0 . 5 ° . T h e r e a r e t h r e e p o s s i b l e e x p l a n a t i o n s f o r t h i s v a r i a b i l i t y T a b l e X V . , E l u t i o n o f d ( p A ) g a n d d ( p A ) ^ o n d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s o f c e l l - d ( p T ) Q . C e l l u l o s e „..... A . U . T m C ( ° C ) T m C ( ° C ) p r e p a r a t i o n ' " ' * I n c o r p o r a t e d o f d ( p A ) ? o f d ( p A ) _ 39 1 8 . 0 (5.5 A . U . ) 3 2 . 0 (5.6 A . U . ) 48.5 1 4 . 0 (5.7 A . U . ) 29.5 (5.3 A . U . ) 4 8 . 5 1 4 . 0 ( 5 - 5 A . U . ) 2 9 . 5 ( 4 . 4 A . U . ) 69 19.0 (5.1 A . U . ) 47 1 6 . 5 ( 5 . 1 A . U . ) a | n e x p e r i m e n t 3, c e l l - d ( p T ) g (#10) w a s i n c u b a t e d a t pH 10.9 ( N a 2 C 0 , b u f f e r ) f o r 20 h r , a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . I t w a s n o t i c e d t h a t a f t e r t h i s t r e a t m e n t , t h e f l o w r a t e w a s n o t i c e a b l y r e d u c e d , a l t h o u g h a r a t e o f 1.7 m l p e r 11 m i n c o u l d s t i l l b e m a i n t a i n e d . F o r p r e p a r a t i o n s #14 a n d # 1 5 , t h e p a p e r s w e r e t r e a t e d a t pH 10.9 p r i o r t o b e i n g c u t u p t o f o r m a c o l u m n m a t r i x . In b o t h t h e s e p r e p a r a t i o n s , t h e f l o w r a t e s w e r e n o r m a l . T h e r e f o r e , t r e a t m e n t o f c e l l u l o s e a t a l k a l i n e pH f o r e x t e n d e d p e r i o d s p r i o r t o c u t t i n g u p t h e p a p e r i s p r e f e r r e d . 1 . c e l l - d ( P T ) Q 4 y 2 . c e l l - d ( p T ) g 10 3. c e l l - d ( p T ) ( t r e a t e d a t pH 1 0 . 9 f o r 2 0 h r ) a 10 4 . e e l 1 - d ( p T ) • ( t r e a t e d a t pH 1 0 . 9 f o r 20 h r ) 14 5 . c e l l - d ( p T ) ( t r e a t e d a t pH 1 0 . 9 f o r 20 h r ) 15 T h e r e a r e t h r e e p o s s i b l e e x p l a n a t i o n s f o r t h i s v a r i a b i l i t y b e t w e e n d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s o f t h e s ame o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e ( i ) T h e i n c o r p o r a t i o n o f d ( p T ) ^ o n t o c e l l u l o s e i n p r e p a r a t i o n #10 u s e d t w i c e a s much c a r b o d i i m i d e a s w a s u s e d i n p r e p a r a t i o n § h . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e r e a g e n t h a s . p r o d u c e d some s i d e p r o d u c t , e . g . CMC-dpT d e r i v a t i v e s w h i c h w o u l d i n t e r f e r e w i t h t h e h y d r o g e n b o n d i n g c a p a b i l i t i e s o f t h e o l i g o d e o x y t h y m i d y l a t e . E x p e r i m e n t s r e p o r t e d a b o v e , s h o w e d t h a t u n d e r t h e s e r e a c t i o n c o n d i t i o n s a p p r o x i m a t e l y 2% o f d - p T i s c o n v e r t e d t o t h e C M C - d p T . ( i f 2% o f t h e t h y m i d y l a t e r e s i d u e s h a v e b e e n s u b s t i t u t e d i n t h e d ( p T ) g p r e p a r a t i o n , t h e n 17% o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e s c o n t a i n o n e o r m o r e s u b s t i t u t e d t h y m i d y l a t e r e s i d u e s ( 1 6 8 ) ) . ( i i ) T h e s e p r e p a r a t i o n s o f d ( p T ) w e r e made b y d i f f e r e n t 9 m e t h o d s . P r e p a r a t i o n #k w a s o b t a i n e d f r o m a p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T , w h i l e #10 w a s f r o m a p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T p T p T ( s e e p a r t I o f t h i s t h e s i s ) . ( i i i ) T h e r e i s i n h e r e n t , u n e x p l a i n e d v a r i a b i l i t y i n d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s o f t h e s ame o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e . I f t h e c a u s e o f t h e v a r i a b l e p r o p e r t i e s o f t h e s ame o l i g o -n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e i s d u e t o s u b s t i t u t i o n o f d e o x y t h y m i d y l a t e r e s i d u e s b y C M C , t h e n i n c u b a t i o n o f p r e p a r a t i o n #10 i n 0 . 2 M N a ^ C O ^ , pH 1 0 . 9 , f o r 20 h r a t r oom t e m p e r a t u r e s h o u l d r e s u l t i n c o m p l e t e c o n v e r s i o n o f t h e CMC s u b s t i t u t e d r e s i d u e s t o f r e e t h y m i d y l a t e s ( 1 6 0 ) . T h e r e f o r e p r e p a r a t i o n #10 w a s i n c u b a t e d a t pH 10.9, a n d t h e e l u t i o n o f d ( p A ) ^ a n d d ( p A ) ^ a g a i n s t u d i e d . T h e d a t a i n T a b l e X V ( e x p e r i m e n t 3) c l e a r l y s h o w t h a t t h i s i n c u b a t i o n h a d n o e f f e c t w h a t s o e v e r o n t h e e l u t i o n t e m p e r a t u r e o f t h e s e t w o o l i g o d e o x y a d e n y l a t e s . A n o t h e r p o s s i b l e e x p l a n a t i o n i s t h a t t h e d ( p T ) ^ u s e d i n t h e p r e p a r a t i o n o f t h e s e t w o c e l l u l o s e s w a s f r o m d i f f e r e n t s y n t h e s e s ( P a r t l ) . T h e d ( p T ) ^ u s e d i n p r e p a r a t i o n #4 w a s i d e n t i f i e d b y i t s p o s i t i o n o f e l u t i o n f r o m a D E A E - c e l 1 u l o s e c o l u m n , a s w e l l a s m o l a r b a s e r a t i o d a t a ( s e e p a r t I, T a b l e I I ) . T h e r e s e e m s l i t t l e d o u b t f r o m t h e s e d a t a t h a t t h i s w a s n o t d ( p T ) . y S i m i l a r l y , t h e i d e n t i f i c a t i o n o f t h e d ( p T ) ^ o b t a i n e d f r o m t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d r p T p T p T s e e m s s o u n d , b a s e d o n i t s e l u t i o n f r o m D E A E - c e l 1 u l o s e a n d c o - c h r o m a t o g r a p h y i n s y s t e m C w i t h t h e e a r l i e r p r e p a r a t i o n o f d ( p T ) ^ , b o t h b e f o r e a n d a f t e r a l k a l i n e p h o s p h a t a s e d i g e s t i o n . One i s t h e r e f o r e l e f t t o c o n c l u d e t h a t t h e v a r i a b i l i t y b e t w e e n d i f f e r e n t o l i g o n u c 1 e o t i d e - c e l 1 u l o s e p r e p a r a t i o n s i s t h e r e s u l t o f u n e x p l a i n e d i n h e r e n t v a r i a b i l i t y . T h i s s u g g e s t i o n i s s u p p o r t e d b y d a t a o n t w o f u r t h e r p r e p a r a t i o n s o f c e l I - d ( p T ) Q (#14 a n d #15, y T a b l e I X ) . T h e s e p r e p a r a t i o n s w e r e b o t h made w i t h d ( p T ) ^ o b t a i n e d b y t h e p o l y m e r i z a t i o n o f d - p T p T p T , a n d b o t h w e r e made u s i n g 100 mg c a r b o d i i m i d e . d ( p A ) ^ e l u t e s f r o m p r e p a r a t i o n #14 a t 19.0°, a n d f r o m p r e p a r a t i o n #15 a t 16.5° ( s e e T a b l e X V ) . I t w o u l d . s e e m t h a t e a c h p r e p a r a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e s h o u l d b e s t a n d a r d i z e d p r i o r t o i t s u s e i n i s o l a t i n g n a t u r a l l y o c c u r r i n g , c o m p l e m e n t a r y s e q u e n c e s . g ) 0 1 i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e o f m i x e d r e p e a t i n g b a s e s e q u e n c e s a n d t h e e l u t i o n o f c o m p l e m e n t a r y o l i g o m e r s . O l i g o n u c l e o t i d e s o f t h e g e n e r a l f o r m d ( p T p T p C ) n a n d d ( p C p T p T ) n ( n = 2 , 3 ) w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d i n p a r t I, a n d t h e n c o v a l e n t l y l i n k e d t o c e l l u l o s e p a p e r u s i n g t h e w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e m e t h o d ( T a b l e I X ) . T h e s e c e l l u l o s e s h a v e b e e n t e s t e d f o r t h e i r a b i l i t y t o r e t a i n c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s o f t h e t y p e d ( p A p A p G ) n ( n = 2 , 3 ) . A s u m m a r y o f t h e T m C d a t a f o r t h e AAG o l i g o m e r s o n t h e d i f f e r e n t c o m p l e m e n t a r y p y r i m i d i n e o l i g o -n u c l e o t i d e s i s l i s t e d i n T a b l e X V I . T h e c o r r e s p o n d i n g p r o f i l e s a r e s h o w n i n F i g u r e 31 a n d 3 2 . ( i ) C e l l u l o s e s - d ( p T p T p C ) , , a n d - d ( p C p T p T ) , , . F r o m T a b l e XV I a n d F i g u r e 3 1 A , i t i s c l e a r t h a t a l t h o u g h e e l 1-d ( p T p T p C ) d o e s n o t r e t a i n d ( p A p A p G ) ^ a t - 5 ° , i t i s d e f i n i t e l y r e t a r d e d o n t h i s c o l u m n . ( T h e d o t t e d c u r v e i n F i g u r e 31A i s t h e e l u t i o n p r o f i l e f o r t h e n o n - c o m p l e m e n t a r y o l i g o m e r d ( p A ) ^ . ) T h e d ( p A p A p G ) ^ p e a k i s d i s p l a c e d a p p r o x i m a t e l y 5 t o 10 t u b e s ( 1 0 t o 20 m l ) . H o w e v e r , o n e e l 1 - d ( p C p T p T ) ^ ( w h e r e o n e m o r e GC b a s e p a i r i s p o s s i b l e ) , t h e h e x a n u c l e o t i d e d ( p A p A p G ) ^ i s r e t a i n e d , a n d e l u t e s a t 1 4 . 0 ° . ( T h i s o b s e r v a t i o n f u r t h e r s u p p o r t s t h e s u g g e s t i o n t h a t a l l t h e n u c l e o t i d e s a t t a c h e d t o t h e c e l l u l o s e a r e f r e e t o h y d r o g e n b o n d w i t h a c o m p l e m e n t a r y s e q u e n c e . ) T a b l e X V I . E l u t i o n o f d ( p A p A p G ) n (n = 2 ,3 ) o n o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e s o f m i x e d , , r e p e a t i n g b a s e s e q u e n c e s . T h e c o l u m n s h a d a p a c k e d d i m e n s i o n o f 9 mm x 5 c m . 0 1 i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e A 2 6 6 u n i t s i n c o r p o r a t e d S a m p l e un i t s ) T mC C e l l - d ( p T p T p C ) 2 92 d ( p A p A p G ) 2 ( 3 . 0 ) n o t r e t a i n e d b u t r e t a r d e d a t -5 ° ... — d ( p A p A p G ) 3 ( 2 . 5 ) 15-5° d ( p A p A P G ) 2 ( 3 .0 ) 14 .0 ° C e l l - d ( p C p T p T ) 2 97 d ( p A p A p G ) 3 ( 2 . 5 ) 19-0° d ( p A p A p G ) 2 ( 3 . 0 ) 4 . 5 ° C e l l - d ( p T p T p C ) 3 77 d ( p A p A p G ) 3 ( 2 . 5 ) 3 3 . 5 ° d ( p A p A p G ) 2 (3-0) 16 .0 ° C e l l - d ( p C p T p T ) 3 103 d ( p A p A p G ) 3 ( 2 .5 ) 4 0 . 5 ° F i g u r e 31- E l u t i o n o f d ( p A p A p G ) 2 ^ o n e e l l u l o s e s - d ( p T p T p C ) 2 a n d - d ( p C p T p T ) A - C e l l - d ( p T p T p C ) 2 - e l u t i o n d ( p A p A p G ) 2 B - C e l l - d ( p C p T p T ) 2 - e l u t i o n d ( p A p A p G ) 2 C - C e l l - d ( p T p T p C ) 2 - e l u t i o n d ( p A p A p G ) ^ D - C e l l - d ( p C p T p T ) - e l u t i o n d ( p A p A p G ) . O N O N e 99l E l u t i o n p r o f i l e s f o r t h e n o n a n u c l e o t i d e d ( p A p A p G ) ^ o n b o t h c e l 1 - d ( p T p T p C ) 2 a n d c e l 1 - d ( p C p T p T ) a r e g i v e n i n F i g u r e 31C a n d D, r e s p e c t i v e l y . I f a l l t h e n u c l e o t i d e s o n t h e c e l l u l o s e c a n h y d r o g e n b o n d , t h e n t h e T m C o f d ( p A p A p G ) ^ o n b o t h h e x a n u c l e o t i d e c o l u m n s s h o u l d b e s i m i l a r . In f a c t , t h e y d i f f e r b y *4.5°- T h i s d i f f e r e n c e c o u l d p o s s i b l y b e e x p l a i n e d b y i n h e r e n t r a n d o m v a r i a t i o n i n c e l l u l o s e p r e p a r a t i o n s a s d i s c u s s e d a b o v e f o r d i f f e r e n t c e l l -d ( p T ) g p r e p a r a t i o n s . H o w e v e r , i t i s a l s o p o s s i b l e t h a t s t e r i c i n t e r f e r e n c e may d e s t a b i l i z e t h e c e l 1-d ( p T p T p C ^ ' d ( p A p A p G ) ^ i n t e r a c t i o n ( s e e s c h e m e b e l o w ) . In t h e c e l 1 - d ( p T p T p C ) ' d ( p A p A p G ) . L 5 i n t e r a c t i o n , f o r t h e s t a b l e s t s t r u c t u r e (A AT b o n d s , 2 GC b o n d s ) , a n e x t r a n u c l e o t i d e ( d e o x y g u a n y l a t e r e s i d u e ) i s a d j a c e n t t o t h e c e l l u l o s e , a n d i t i s p o s s i b l e t h a t t h i s may d e s t a b i 1 i z e t h e h y b r i d s t r u c t u r e . S u c h a n e f f e c t w o u l d b e a s e r i o u s p r o b l e m i n t h e i s o l a t i o n o f n a t u r a l l y o c c u r r i n g n u c l e i c a c i d s b y h y b r i d i z a t i o n a' 5 ' 3 ' cel 1-pTpTpCpTpTp C ce 1 1 - P C P T P T P C P T P T GPApApGpApApGpAPAp GpApApGpApApGpApA <——:—:—: •<-3 ' w i t h a s m a l l , i n t e r n a l s e g m e n t . H o w e v e r , o n e w a y a r o u n d t h i s p r o b l e m m i g h t b e t o c o n s t r u c t a n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e w i t h a n " e x t e n s i o n b l o c k " o f n u c l e o t i d e s ( e . g . t h e t e t r a t h y m i d y l a t e ) , a n d a t t a c h t h e s y n t h e t i c o l i g o n u c l e o t i d e o f d e f i n e d s e q u e n c e t o t h e 3 ' h y d r o x y l e n d o f t h i s t h y m i d y l a t e b l o c k a s i l l u s t r a t e d b e l o w , w h e r e t h e c o m p l e m e n t a r y s e q u e n c e d e s i r e d i s d - p A p C ( p T ) A n o t h e r o b s e r v a t i o n c o n c e r n i n g t h e s e h e x a n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s i s t h a t w h e n d ( p A p A p G ) ^ i s r u n o n c e l 1 - d ( p T p T p C ) ^ , t h e n o n - r e t a i n e d p e a k h a s a t r a i l i n g e d g e ( F i g u r e 3 1 C ) w h i l e t h e r e t a i n e d p e a k o n c e l 1 - d ( p C p T p T ) ^ ( F i g u r e 31D ) h a s a d i s t i n c t l e a d i n g e d g e . I t s e e m s l i k e l y t h a t t h e d ( p A p A p G ) ^ p r e p a r a t i o n , a l t h o u g h p u r i f i e d b y c h r o m a t o g r a p h y o n a D E A E - c e l 1 u 1 o s e c o l u m n i n t h e p r e s e n c e o f 7 M u r e a , f o l l o w e d b y e x t e n d e d p a p e r c h r o m a t o g r a p h y ( s e e p a r t l ) , s t i l l c o n t a i n s a s i g n i f i c a n t a m o u n t o f c o n t a m i n a n t s . I f t h e m a j o r c o n t a m i n a n t i s t h e . 6 : 3 p y r o p h o s p h a t e , 1 * 9 i t s h o u l d e l u t e a t a t e m p e r a t u r e s i m i l a r t o t h e h e x a n u c l e o t i d e . T h e r e f o r e , t h e 6 : 3 p y r o p h o s p h a t e s h o u l d b e r e t a r d e d , b u t n o t r e t a i n e d a t - 5 ° , o n c e l 1 - d ( p T p T p C ) 2 , w h i l e o n c e l 1 - d ( p C p T p T ) 2 , t h e 6 : 3 p y r o p h o s p h a t e s h o u l d e l u t e a t a p p r o x i m a t e l y 1 4 ° . T h e c o r r e s p o n d e n c e b e t w e e n t h e p r e d i c t e d e l u t i o n o f t h i s p y r o p h o s p h a t e o n b o t h h e x a n u c l e o t i d e c e l l u l o s e s , a n d t h e o b s e r v e d e l u t i o n p o s i t i o n o f t h i s " c o n t a m i n a n t " cell-pTpTpTpTp ApCpTpTpTpTp T T h e 6 : 3 p y r o p h o s p h a t e i s pApApG s u p p o r t s t h e s u g g e s t i o n o f t h a t t h i s m a t e r i a l i s t h e p y r o p h o s p h a t e . T h e s t a b l e s t i n t e r a c t i o n s f o r t h e 6 : 3 p y r o p h o s p h a t e o n t h e c e l l u l o s e h e x a n u c l e o t i d e s a r e i l l u s t r a t e d b e l o w : 3 cel 1-pTp TpCpTp TpC GpApApGpApAp : P A 3 ' 5 V ^ A P G 3 ' 4 A T 1 G C 3 ' cel l-pCpT p T p CpT p T G p A P A P G P A P A P - P A P A P G < > 3 ' 5 ' 5 ' i 4 A T 2 G C ( i i ) C e l l u l o s e - d ( p T p T p C ) ^ a n d - d ( p C p T p T ) ^ . a ) E l u t i o n o f t h e h e x a n u c l e o t i d e , d ( p A p A p G ) ^ . C e l 1 - d ( p T p T p C ) 3 e l u t e s d ( p A p A p G ) 2 a t 4 . 5 ° , w h i l e t h e i s o m e r i c o l i g o n u c 1 e o t i d e - c e l 1 u 1 o s e , c e l 1 - d ( p C p T p T ) ^ e l u t e s t h i s h e x a -n u c l e o t i d e a t 1*4.5° ( T a b l e XV I a n d F i g u r e 3 2 A a n d B) . A l t h o u g h i n b o t h c a s e s t h e n u m b e r o f i n t e r a c t i o n s (4 AT a n d 2 GC b a s e p a i r s ) i s t h e s a m e , t h e r e i s a c o n s i d e r a b l e d i f f e r e n c e i n t h e Tm v a l u e s ( 1 0 ° ) . A g a i n , t h i s d i f f e r e n c e may ( a t l e a s t p a r t i a l l y ) b e e x p l a i n e d b y r a n d o m v a r i a b i l i t y o f c e l l u l o s e p r e p a r a t i o n s . H o w e v e r , o t h e r e x p l a n a t i o n s may b e r e s p o n s i b l e . F o r e x a m p l e , t h e s t a b l e s t s t r u c t u r e f o r c e l 1 - d ( p T p T p C ) ^ ( b a s e d o n t h e m a x i m u m n u m b e r o f b a s e p a i r s ) i s i l l u s t r a t e d b e l o w , w h i l e f o r c e l 1 - d ( p C p T p T ) ^ 5 ' 3 ' > ce l l -pTpTpCpTpTpCpTPTpC 170 F i g u r e 3 2 . E l u t i o n o f d ( p A p A p G ) , o n c e l 1 u l o s e s - d ( p T p T p C ) _ ^» J 5 a n d - d ( p C p T p T ) ^ . . A . d ( p A p A p G ) 2 o n c e l 1 - d ( p T p T p C ) 3 . B. d ( p A p A p G ) 2 o n c e l 1 - d ( p C p T p T ) ^ . C . d t p A p A p G ) ^ o n c e l 1 - d ( p T p T p C ) . . D. d ( p A p A p G ) ^ o n c e l 1 - d ( p C p T p T ) . T h e i n s e t i n F i g u r e 31D i s t h e p r o f i l e f o r t h e s t e p w i s e e l u t i o n o f d ( p A p A p G ) ^ o n c e l 1 - d ( p C p T p T ) ^ . T h e t e m p e r a t u r e s t e p s a r e i n d i c a t e d i n t h e f i g u r e . 1 7 0 a 40 80 TUBE NUMBER 1 7 0 b 40 80 120 TUBE NUMBER t h e s t a b l e s t s t r u c t u r e may b e e i t h e r o f t h e f o l l o w i n g ( o r a c o m b i n a t i o n o f b o t h ) . 5 ' 3 ' 5 ' 3 ' . > > c e 11-pCpT pTpCpT pTpCpTpT of cel I- pCpT PT PC pT P T P CpT p T GpApApGpApAp GpApApGpApA p < <r 3 ' 5 ' 3 ' * ' In t h e f i r s t c a s e , t h e r e i s a g a p o f t w o u n p a i r e d b a s e s ( p T p T ) , b e f o r e h y b r i d i z a t i o n b e g i n s , w h i l e f o r t h e o t h e r c a s e , t h e d ( p A p A p G ) 2 c a n h y b r i d i z e i m m e d i a t e l y a d j a c e n t t o t h e c e l l u l o s e . I f t h e r e i s s o m e " s t a b i l i z i n g e f f e c t " a s s o c i a t e d w i t h t h i s l a t t e r c o n f i g u r a t i o n , t h e n t h i s may e x p l a i n t h e d i f f e r e n c e i n T m C v a l u e s ( p a r t i a l l y o r w h o l l y ) f o r t h e s e i n t e r a c t i o n s . A p o s s i b l e " s t a b i l i z i n g e f f e c t " m i g h t r e s u l t f r o m h y d r o g e n b o n d i n g b e t w e e n n u c l e o t i d e s a t t h e 3' e n d o f t h e p u r i n e o l i g o m e r w i t h t h e c e l l u l o s e . S e c o n d a r y b i n d i n g f o r c e s b e t w e e n n u c l e o s i d e s ( p a r t i c u l a r l y p u r i n e d e o x y r i b o s i d e s ) o n c e l l u l o s e h a v e b e e n o b s e r v e d , a n d t h e e l u t i o n o f d i f f e r e n t o l i g o n u c l e o t i d e i s o p l i t h s o n D E A E - c e l l u l o s e i s g r e a t l y i m p r o v e d w h e n t h e c h r o m a t o g r a p h y i s c a r r i e d o u t i n t h e p r e s e n c e o f 7 M u r e a (182). b) E l u t i o n o f t h e n o n a n u c l e o t i d e , d ( p A p A p G ) ( F i g u r e 32C a n d D ) . T h e n o n a n u c l e o t i d e d ( p A p A p G ) ^ was e l u t e d a t 33-5° o n c e l l -d ( p T p T p C ) ^ a n d h O . 5 ° o n c e l 1 - d ( p C p T p T ) ^ . In b o t h c a s e s , a b r o a d p e a k o f U V - a b s o r b i n g m a t e r i a l ( a s much a s 30% o f t h e U V - a b s o r b a n c e a n d w i t h a s p e c t r u m l i k e d ( p A p A p G ) ^ ) w a s e l u t e d p r i o r t o t h e m a j o r , d ^ A p A p G ) ^ , p e a k . T h e e s t i m a t e d Tm v a l u e f o r t h i s p e a k o n c e 1 l - d ( p T p T p C ) 3 i s 1 2 , a n d o n c e l 1 - d ( p C p T p T ) ^ i s 16 . I f t h i s n o n a n u c l e o t i d e i s c o n t a m i n a t e d w i t h t h e 6 : 3 p y r o - ' p h o s p h a t e a s d i s c u s s e d a b o v e , t h e n t h e Tm v a l u e s o f t h e p y r o -p h o s p h a t e o n t h e s e n o n a n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s s h o u l d b e r e l a t e d t o t h e T m C . v a l u e s f o r t h e e l u t i o n o f d ( p A p A p G ) 2 o n t h e n o n a -n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s . T h e s e v a l u e s a r e 4 . 5 ° a n d 1 4 . 5 ° , r e s p e c t i v e f o r c e l 1 - d ( p T p T p C ) ^ a n d c e l 1 - d ( p C p T p T ) ^ . T h e " c o n t a m i n a n t " e l u t e s a t a t e m p e r a t u r e s o m e w h a t h i g h e r t h a n e x p e c t e d i n b o t h c a s e s . S i n c e c o n s i d e r a b l e e v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f a m a j o r c o n t a m i n a n t i n t h e d ( p A p A p G ) ^ p r e p a r a t i o n w a s o b t a i n e d , i t w a s d e c i d e d t o a t t e m p t t o p u r i f y t h i s n o n a n u c l e o t i d e o n a c e l l -d ( p C p T p T ) ^ c o l u m n , u s i n g s t e p w i s e t h e r m a l e l u t i o n ( s e e i n s e t F i g u r e 3 2 D ) . T h e m a t e r i a l e l u t i n g b e t w e e n 3 2 ° a n d 50° w a s c o n c e n t r a t e d , d i a l y z e d a g a i n s t d i s t i l l e d w a t e r , a n d l y o p h i l i z e d . T h e n u c l e o t i d e w a s d i s s o l v e d i n MBS a n d s a m p l e s f o r s o l u t i o n t h e r m a l d e n a t u r a t i o n s t u d i e s p r e p a r e d a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s . T h e t w o i n t e r a c t i o n s , d ( p A p A p G ) ^ . d ( p T p T p C ) ^ a n d d ( p A p A p G ) 3 > d ( p C p T p T ) ^ w e r e s t u d i e d ( F i g u r e 33C a n d D ) . In b o t h c a s e s , t h e t h e r m a l d i s s o c i a t i o n p r o f i l e w i t h t h e o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e p u r i f i e d d ( p A p A p G ) , w a s n o t i c e a b l y s h a r p e r , a n d t h e Tm v a l u e 173 F i g u r e 33. T h e r m a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e s o f t h e i n t e r a c t i o n s d ( p A p A p G ) ^ w i t h d C p T p T p C ) ^ a n d d ( p C p T p T ) ^ p r i o r t o a n d a f t e r p u r i f i c a t i o n o f t h e d ( p A p A p G ) ^ o n a n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n . A . d ( p T p T p C ) 3 < d ( p A p A p G ) 3 . B. d ( p C p T p T ) 3 . d ( p A p A p G ) 3 . C . d ( p T p T p C ) 3 > d ( p A p A p G ) 3 ( p u r i f i e d ) . D. d ( p C p T p T ) 3 . d ( p A p A p G ) 3 ( p u r i f i e d ) . —• •— o b s e r v e d t h e r m a l d i s s o c i a t i o n c u r v e f o r t h e m i x t u r e s . o a— o b s e r v e d t h e r m a l d i s s o c i a t i o n c u r v e f o r t h e p u r i ne o l i g o m e r . t r u e t h e r m a l d e n a t u r a t i o n p r o f i l e . TEMPERATURE ° C i n c r e a s e d b y 6 . 0 ° . T h e s e o b s e r v a t i o n s f u r t h e r s u p p o r t t h e i d e a t h a t t h e d ( p A p A p G ) ^ p r e p a r a t i o n c o n t a i n e d a s i g n i f i c a n t a m o u n t o f i m p u r i t y . h) E f f e c t o f GC b a s e p a i r s o n t h e s t a b i l i t y o f o l i g o - n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e : c o m p 1 e m e n t a r y o l i g o m e r i n t e r - a c t i o n s . T h e d a t a f o r t h e e l u t i o n o f t h e o l i g o m e r s , d ( p A p A p G ) -o n c o m p l e m e n t a r y , i s o m e r i c c e l l u l o s e s ( T a b l e X V I ) i n d i c a t e t h a t t h e d e o x y o l i g o m e r s c o n t a i n i n g GC b a s e p a i r s a r e s i g n i f i c a n t l y m o r e s t a b l e t h a n t h e h o m o - o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e i n t e r -a c t i o n s ( T a b l e XI l ) . N o t e h o w e v e r t h a t f o r t h e m i x e d s e q u e n c e c e l l u l o s e s , a p p r o x i m a t e l y 0 . 0 7 y m o l e o f p u r i n e o l i g o m e r was c h r o m a t o g r a p h e d o n a 1 y m o l e c o l u m n . F o r t h e c e l l - d ( p T ) c o l u m n s , n a p p r o x i m a t e l y 0 . 0 7 y m o l e o f o l i g o d e o x y a d e n y l a t e w a s c h r o m a t o g r a p h e d o n a ce.1 l u l o s e c o n t a i n i n g 0 . 5 y m o l e o f d ( p T ) n > T h i s c o u l d a f f e c t t h e T m c b y 1 ° t o 2 ° ( s e e s e c t i o n 2 d , a b o v e ) . T h e o l i g o m e r d ( p A ) ^ i s r e t a r d e d o n c e l 1 - d ( p T ) ^ ( 6 AT b a s e p a i r s ) a t - 5 ° , a s i s d ( p A p A p G ) 2 o n c e l 1 - d ( p T p T p C ) ( k A T p a i r s , 1 GC p a i r ) . E l u t i o n o f o l i g o m e r s , d ( p A p A p G ) „ , o n m i x e d c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s i n w h i c h k AT a n d 2 GC b a s e p a i r s a r e p o s s i b l e , r e s u l t e d i n Tm° v a l u e s o f a p p r o x i m a t e l y 1 4 ° t o 19°. A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o r t h e o n e e x c e p t i o n ( 4 . 5 ° ) w a s d i s c u s s e d i n s e c t i o n 2 g , a b o v e . On t h e o t h e r h a n d , d ( p A ) , e l u t e d f r o m t h r e e d i f f e r e n t o l i g o t h y m i d y l a t e - c e l 1 u l o s e s a t l o w e r t e m p e r a t u r e s ( T a b l e X I I ) . In t h e o n e p o s s i b l e 6 A T , 2 GC i n t e r a c t i o n , d ( p A p A p G ) ^ o n c e l 1 - d ( p T p T p C ) ^ , t h e Tm° w a s 3 3 . 5 ° . T h e h o m o - o l i g o d e o x y -r i b o n u c l e o t i d e , d ( p A ) g , e l u t e d a t l o w e r t e m p e r a t u r e s f r o m d e o x y t h y m i d y l a t e - c e l l u l o s e s i n w h i c h 8 A T i n t e r a c t i o n s a r e p o s s i b l e ( T a b l e X I I ) . S i m i l a r l y , t h e o n e p o s s i b l e 6 A T , 3 GC i n t e r a c t i o n , d ( p A p A p G ) ^ o n c e l 1 - d ( p C p T p T ) ^ , h a d a T m C o f " 4 0 . 5 ° . I n t e r a c t i o n s i n v o l v i n g 9 AT b a s e p a i r s a r e l e s s s t a b l e ( T a b l e X I I ) . i ) E l u t i o n o f n o n - c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s o n  o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e s . I f t h e r e l a t i o n s h i p d e s c r i b e d b y L a i r d e t a l . (29) (1% m i s m a t c h i n g o s b a s e s d e c r e a s e s t h e Tm b y 0 . 7 ° ) i s v a l i d f o r t h e s e s h o r t o l i g o m e r s , s u b s t i t u t i o n o f 1/3 o f t h e b a s e s s h o u l d r e d u c e t h e Tm b y s o m e 2 4 ° . In e x p e r i m e n t s t o s e e i f n o n - c o m p l e m e n t a r y s e q u e n c e s w o u l d b e e x c l u d e d f r o m o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e s , o l i g o m e r s o f t h e s e r i e s d ( p A ) w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n c e l 1 - d ( p C p T p T ) a n d c e l 1 - d ( p C p T p T ) . n z 5 S i m i l a r l y , d ( p A p A p G ) „ - w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n c e l l - d ( p T ) . In t h e f i r s t c a s e , n o n e o f t h e o l i g o d e o x y a d e n y l a t e w e r e r e t a i n e d b y t h e d ( p C p T p T ) _ , c e l l u l o s e ( f o r e x a m p l e , s e e F i g u r e 31 A ) . L e s s t h a n 1.3% o f t h e d ( p A p A p G ) 2 s a m p l e w a s r e t a i n e d b y a c e l l -d . (pT) c o l u m n a t - 4 ° , w h i l e <5% o f a d ( p A p A p G ) s a m p l e w a s r e t a i n e d i n a s i m i l a r e x p e r i m e n t . I t i s n o t k n o w n w h a t t h e t h e r m a l s t a b i l i t y o f t h e s m a l l a m o u n t o f r e t a i n e d n u c l e o t i d e w a s , a s t h e t e m p e r a t u r e o f t h e c o l u m n w a s r a i s e d , r a p i d l y , t o 30° i n o r d e r t o e l u t e . a n y r e t a i n e d m a t e r i a l a s a s h a r p p e a k . In t h e l a t t e r c a s e , h a d t h e n u c l e o t i d e s b e e n p e r f e c t l y c o m p l e m e n t a r y , ^ ( p A p A p G ) ^ . d ( p C p T p T ) ^ ) , t h e T m C w o u l d h a v e b e e n a b o u t 40 ° t o 4 1 ° , w h i l e t h i s v e r y s m a l l a m o u n t o f n o n - c o m p l e m e n t a r y n u c l e o t i d e t h a t w a s r e t a i n e d , w a s e l u t e d a t 30 ° ( o r l o w e r ) . j ) P u r i f i c a t i o n o f c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d o l i g o - n u c l e o t i d e s o n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n s . T h e o b s e r v a t i o n s made i n t h e p r e v i o u s s e c t i o n s c o n c e r n i n g t h e a p p a r e n t p r e s e n c e o f i m p u r i t i e s b o t h i n t h e s y n t h e t i c o l i g o d e o x y a d e n y l a t e s ( e . g . d ( p A ) ^ ) a n d i n t h e d ( p A p A p G ) ^ o l i g o m e r , s u g g e s t t h a t t h e p u r i f i c a t i o n m e t h o d s u s e d f o r t h e s e p a r a t i o n o f t h e s e o l i g o n u c l e o t i d e s i s n o t e n t i r e l y s a t i s f a c t o r y ( s e e e . g . 91)• In t h e c a s e o f t h e d ( p A p A p G ) ^ B z B z B o l i g o m e r ( p r e p a r e d b y t h e c h e m i c a l p o l y m e r i z a t i o n o f d - p A p A pG i n a n h y d r o u s p y r i d i n e , u s i n g t h e s u l p h o n y l c h l o r i d e , MsSO C I , t h e r e i s s u p p o s e d t o b e l i t t l e p y r o p h o s p h a t e p r o d u c e d ( 1 8 3 ) ) . T h e p u r i f i c a t i o n s t e p s i n v o l v e d c h r o m a t o g r a p h y o n a D E A E -c e l l u l o s e ( c h l o r i d e ) c o l u m n , i n t h e p r e s e n c e o f 7 M u r e a , a l t h o u g h f r o m t h e e l u t i o n p r o f i l e ( F i g u r e 1 3 ) , t h e n o n a n u c l e o t i d e p e a k i s n o t c l e a n l y r e s o l v e d f r o m o t h e r b y - p r o d u c t s . A l s o , e x t e n d e d c h r o m a t o g r a p h y o n Wha tman #40 p a p e r i n s y s t e m C (91), s t i l l d i d n o t r e m o v e a s i g n i f i c a n t a m o u n t o f i m p u r i t y , a l t h o u g h t h e m a j o r b a n d w a s c l e a r l y s e p a r a t e d f r o m a f a s t e r m o v i n g b a n d a n d f r o m a f l u o r e s c e n t b a n d w h i c h r e m a i n e d a t t h e o r i g i n . A c c o r d i n g t o N a r a n g e t a K (91) t h i s p a p e r c h r o m a t o g r a p h y t e c h n i q u e i s c a p a b l e o f s e p a r a t i n g t h e p y r o p h o s p h a t e , w h i c h s h o u l d move f a s t e r t h a n t h e l i n e a r h o m o l o g u e . H o w e v e r , a f t e r t h e s e p u r i f i c a t i o n s t e p s , t h e n o n a n u c l e o t i d e s t i l l c o n t a i n e d a m a j o r c o n t a m i n a n t ( s ) , a n d b a s e d o n t h e r e t e n t i o n p r i n c i p l e o f a n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l 1 u l o s e c o l u m n , t h e s u g g e s t i o n t h a t much o f t h e i m p u r i t y i s t h e p y r o p h o s p h a t e , i s n o t u n r e a s o n a b l e . T h e r e f o r e , i t w o u l d s eem u s e f u l i n t h e c h e m i c a l s y n t h e s i s o f o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s t o i n c l u d e a s a f i n a l p u r i f i c a t i o n s t e p , c h r o m a t o g r a p h y o n a c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n . k ) E l u t i o n o f RNA f r o m a n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n , a n d t h e s e l e c t i v e r e t e n t i o n o f a c o m p l e m e n t a r y  o l ? g o n u c l e o t i d e . A s a p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t r e l a t e d t o t h e a b i l i t y o f a n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e t o s e l e c t a n u c l e i c a c i d w i t h a c o m p l e m e n t a r y b a s e s e q u e n c e , i t w a s d e c i d e d t o c o - c h r o m a t o g r a p h a m i x t u r e o f RNA a n d t h e o l i g o n u c l e o t i d e d ( p A p A p G ) ^ o n c e l l -d ( p C p T p T ) ^ . When a s a m p l e o f R N A 5 0 ( U . A . U . i n 1 ml o f MBS) w a s a p p l i e d T h e RNA u s e d w a s t h a t i s o l a t e d f r o m t h e l i v e r o f c h i n o o k s a l m o n ( O n c h o r y n c h u s t s c h a w y t s c h a ) ( s e e M e t h o d s ) . t o a c e l 1 - d ( p C p T p T ) ^ c o l u m n a t -4 , a l a r g e p e a k o f RNA was e l u t e d a t t h e f r o n t . H o w e v e r , a c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f m a t e r i a l w a s r e t a i n e d , a n d e l u t e d b e t w e e n 0 ° a n d 35° ( F i g u r e 3 4 ) . T h e s e c o n d i t i o n s o f h i g h s a l t (M N a C l ) a n d l o w t e m p e r a t u r e (-4 ° ) a r e k n o w n t o b e i d e a l f o r t h e p r e c i p i t a t i o n o f rRNA ( f o r e x a m p l e , 1 8 4 ) . I f t h e r e t e n t i o n o f t h e RNA b y t h e c o l u m n i s n o n - s p e c i f i c d u e t o p r e c i p i t a t i o n , a s t h e t e m p e r a t u r e i s s l o w l y i n c r e a s e d , t h e RNA s h o u l d g o b a c k i n t o s o l u t i o n a n d b e e l u t e d . T h a t t h i s RNA w a s r e t a i n e d d u e t o a p r e c i p i t a t i o n p h e n o m e n o n i s f u r t h e r s u b s t a n t i a t e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t r e p e a t e d a t t e m p t s t o c h r o m a t o g r a p h t h e RNA r e s u l t e d i n w i d e l y v a r y i n g a m o u n t s o f RNA b e i n g r e t a i n e d , b o t h o n a o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e c o l u m n a s w e l l a s o n a c o n t r o l c e l l u l o s e c o l u m n . I t w a s t h e r e f o r e n e c e s s a r y t o f i n d c o n d i t i o n s f o r l o a d i n g a n d e l u t i n g t h e c o l u m n s , u n d e r w h i c h a m i n i m a l a m o u n t o f RNA was p r e c i p i t a t e d , w h i l e t h e c o n d i t i o n s w o u l d s t i l l p e r m i t t h e b i n d i n g o f d ( p A p A p G ) ^ . T h e c o n d i t i o n s t h a t w e r e f i n a l l y c h o s e n w e r e l o a d i n g t h e s a m p l e i n MBS a t 10 ° . 5 1 T h e p r o f i l e s f o r e l u t i o n o f d ( p A p A p G ) ^ a n d RNA ( l o a d i n g a t 10 ° ) a r e g i v e n i n F i g u r e 3 5 A a n d B. A m i x t u r e o f RNA ( t w o d i f f e r e n t a m o u n t s ) a n d d ( p A p A p G ) ^ i s s h o w n i n F i g u r e 35C a n d D. ( F o r d e t a i l s o f t h e s e e x p e r i m e n t s , s e e T a b l e X V I I . ) I t i s c l e a r 5 1 In t h e i s o l a t i o n o f a n a t u r a l l y o c c u r r i n g RNA s u c h a s mRNA, o n e w o u l d i n c l u d e a s t e p t h a t w o u l d r e m o v e a l a r g e p o r t i o n o f t h e rRNA p r i o r t o c h r o m a t o g r a p h y o n a c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e c o l u m n . 179 30 60 90 120 TUBE NUMBER F i g u r e 3 4 . E l u t i o n o f RNA o n c e l 1 - d ( p C p T p T ) . T h e s a m p l e w a s l o a d e d i n MBS a t - 4 ° . T h e a r r o w i n d i c a t e s w h e r e t h e c o l u m n was w a s h e d w i t h 0.1 N NaOH a t r o o m t e m p e r a t u r e . 180 F i g u r e 35. E l u t i o n o f d v p A p A p G ) ^ a n d R N A , s e p a r a t e l y , a n d . a s a m i x t u r e o n c e l 1 - d ( p C p T p T ) ^ . A . d C p A p A p G ) ^ . ' B. R N A . C . d ( p A p A p G ) 3 + RNA ( 9 - 3 A . U . ) . D. d ( p A p A p G ) 3 + RNA ( 8 4 A . U . ) . T h e a r r o w i n d i c a t e s w h e r e t h e c o l u m n , w a s washed . , w i t h 0 .1 N NaOH a t r o o m t e m p e r a t u r e . . 1 8 0 a TUBE . NUMBER T a b l e X V I I . T h e r m a l e l u t i o n o f RNA a n d d ( p A p A p G ) ^ o n c e l l u l o s e -d C p C p T p T ) ^ . T h e s a m p l e s w e r e l o a d e d o n t o t h e c o l u m n a t 1 0 ° , a n d e l u t e d w i t h a l i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t . A M i I I V o l u m e c . Tm A . U . l o a d e d o f s a m p l e F . g u r e ( d ( p A p A p G ) 3 ) Samp 1e 1. d ( p A p A p G ) 3 3-7 2. RNA 9-3 3. RNA + d ( p A P A p G ) 3 9-3 + 3-7 4. RNA + d ( p A p A p G ) 84 +3-7 1 ml 35A 4 0 . 5 ° 1 ml 3 5 B 1 ml 35C 4 0 . 5 ° 9 ml 35D 4 0 . 5 ° t h a t t h e n o n a n u c l e o t i d e d ( p A p A p G ) ^ ' i s r e t a i n e d w h e n l o a d e d a t 1 0 ° , e v e n i n t h e p r e s e n c e o f a l a r g e l o a d o f R N A . A l s o , t h e d ( p A p A p G ) ^ p e a k i s e l u t e d a t e x a c t l y t h e s ame t e m p e r a t u r e a s w h e n no RNA i s l o a d e d . T h e U V - a b s o r b i n g m a t e r i a l e l u t i n g b e t w e e n 1 0 ° a n d 3 5 ° s e e m s t o b e c o n t r i b u t e d t o b y b o t h t h e o l i g o n u c l e o t i d e s a m p l e a s w e l l a s t h e R N A . C O N C L U S I O N S In t h e G e n e r a l I n t r o d u c t i o n a m e t h o d w a s p r o p o s e d f o r t h e i s o l a t i o n o f s p e c i f i c p o l y n u c l e o t i d e s b y h y b r i d i z a t i o n w i t h a s y n t h e t i c o l i g o n u c l e o t i d e o f d e f i n e d s t r u c t u r e w h i c h i s c o m p l e m e n t a r y t o a s h o r t s e q u e n c e w i t h i n a p o l y n u c l e o t i d e . T o f a c i l i t a t e t h e s e p a r a t i o n , i t w a s p r o p o s e d t h a t t h e o l i g o n u c l e o t i d e b e c o v a l e n t l y l i n k e d t o a n i n s o l u b l e m a t r i x s u c h a s c e l l u l o s e . T h e e x p e r i m e n t s r e p o r t e d h e r e a r e a s t u d y , w i t h c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d m o d e l c o m p o u n d s , o f t h e p r a c t i c a b i 1 i t y o f s u c h a m e t h o d . In p a r t I, t h e s y n t h e s i s a n d p u r i f i c a t i o n o f c o m p l e m e n t a r y h o m o - o l i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s a n d o l i g o n u c l e o t i d e s o f r e p e a t i n g t r i n u c l e o t i d e s e q u e n c e s ( u p t o 12 n u c l e o t i d e s l o n g ) h a v e b e e n d e s c r i b e d . T h e g e n e r a l p r o c e d u r e s u s e d i n t h e s e s y n t h e s e s w e r e t h o s e d e v e l o p e d b y K h o r a n a a n d h i s a s s o c i a t e s ( 7 5 ) . U s i n g t h e s e m e t h o d s i t w a s f o u n d t h a t y i e l d s o f 1 t o 10 y m o l e s o f t h e d e s i r e d o l i g o n u c l e o t i d e s c o u l d r e a d i l y b e o b t a i n e d . T h e s e a m o u n t s a r e s u i t a b l e f o r t h e s y n t h e s i s o f o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s . In e x p e r i m e n t s n o t r e p o r t e d h e r e , t h e b l o c k s y n t h e s i s o f o l i g o -n u c l e o t i d e s o f d e f i n e d s t r u c t u r e h a s a l s o b e e n a c c o m p l i s h e d , a n d a g a i n y i e l d s i n t h e r a n g e o f 1 t o 10 y m o l e s w e r e r e a d i l y o b t a i n a b l e . In p a r t I I , m e t h o d s t o a t t a c h o l i g o n u c l e o t i d e s v i a a t e r m i n a l p h o s p h o d i e s t e r l i n k a g e t o c e l l u l o s e , w e r e i n v e s t i g a t e d . I t w a s f o u n d t h a t a m o d i f i c a t i o n o f t h e w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e m e t h o d r e p o r t e d b y G i l h a m ( 1 4 1 ) c o n s i s t e n t l y r e s u l t e d i n h i g h l e v e l s o f c o u p l i n g o f t h e o l i g o m e r t o c e l l u l o s e p a p e r . U n d e r t h e c o n d i t i o n s o f t h i s r e a c t i o n , o n e m i n o r b y p r o d u c t , t h e c a r b o d i i m i d e s u b s t i t u t e d d e o x y t h y m i d y l a t e , was d e t e c t e d , a t a m a x i m u m l e v e l o f 2% o f t h e t o t a l n u c l e o t i d e . H o w e v e r , c o n d i t i o n s a r e a v a i l a b l e f o r t h e c o n v e n i e n t r e v e r s a l o f t h e s u b s t i t u t i o n ( 1 6 0 ) . C o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e s ( b o t h h o m o - o l i g o n u c l e o t i d e s a n d o l i g o m e r s o f m i x e d b a s e s e q u e n c e ) , f r o m 6 t o 12 n u c l e o t i d e s l o n g , f o r m s t a b l e c o m p l e x e s w i t h t h e a p p r o p r i a t e o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e s , u n d e r c o n d i t i o n s s u i t a b l e f o r h y b r i d f o r m a t i o n ( n e u t r a l p H , 1 M N a C l , l o w t e m p e r a t u r e ) . T h e s t a b i l i t y o f t h e s e c o m p l e x e s i s r e l a t e d t o t h e t o t a l n u m b e r o f b a s e i n t e r a c t i o n s p o s s i b l e . 0 1 i g o d e o x y r i b o n u c l e o t i d e s w h i c h a r e c a p a b l e o f f o r m i n g GC b a s e p a i r s a r e m o r e s t a b l e t h a n t h e s a m e l e n g t h o l i g o m e r s w h i c h c o n t a i n o n l y a d e n y l a t e a n d t h y m i d y l a t e r e s i d u e s . T h e c a p a c i t y o f o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s i s 1/3 t o 1/4 o f t h e t h e o r e t i c a l . B e c a u s e o f t h e d i f f e r e n c e i n t h e r m a l s t a b i l i t y o f t h e d i f f e r e n t o l i g o m e r s , c o n s e c u t i v e o l i g o n u c l e o t i d e s o f a p a r t i c u l a r s e r i e s , d ( p A ) n > may be r e s o l v e d , p a r t i a l l y , o r c o m p l e t e l y , b y c h r o m a t o g r a p h y o n a c o m p l e m e n t a r y o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e , e l u t i n g w i t h a l i n e a r t e m p e r a t u r e g r a d i e n t . When t h e r a t i o o f b o u n d o l i g o m e r ( c e l l u l o s e - b o u n d ) t o f r e e o l i g o m e r i s s u f f i c i e n t l y h i g h (2 y m o l e s b o u n d , t o 0 .1 y m o l e f r e e ) , c o n s e c u t i v e o l i g o m e r s a r e c o m p l e t e l y r e s o l v e d . E v i d e n c e i s p r e s e n t e d w h i c h s u g g e s t s t h a t p r o b a b l y a l l t h e n u c l e o t i d e s o f a p a r t i c u l a r o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e a r e c a p a b l e o f h y d r o g e n b o n d i n g w i t h t h e i r c o m p l e m e n t a r y b a s e s . T h e m i n o r v a r i a b i l i t y i n r e t e n t i o n p r o p e r t i e s o f d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s o f a p a r t i c u l a r o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e h a s n o t b e e n a c c o u n t e d f o r . F i n a l l y , i n a l l t h e i n t e r a c t i o n s s t u d i e d h e r e , c o m p l e m e n t a r y s t r a n d s h a v e c o n s i s t e d o f e i t h e r e n t i r e l y p y r i m i d i n e s o r e n t i r e l y p u r i n e s . S i n c e t h e v e r t i c a l s t a c k i n g o f o l i g o p u r i n e t r a c t s i s k n o w n t o c o n t r i b u t e a d d i t i o n a l s t a b i l i z a t i o n t o h y b r i d i n t e r -a c t i o n s ( 1 4 5 ) , i t w o u l d b e i n t e r e s t i n g t o i n v e s t i g a t e t h e t h e r m a l s t a b i l i t y o f some c o m p l e m e n t a r y s t r a n d s w h i c h e a c h c o n t a i n b o t h p y r i m i d i n e s a n d p u r i n e s . In o r d e r t o d r a w u s e f u l c o m p a r i s o n s w i t h t h e p r e s e n t d a t a , a n o b v i o u s c o m p l e m e n t a r y s e t o f o l i g o n u c l e o t i d e s t h a t s h o u l d b e p r e p a r e d a r e d ( p G p T p T ) n a n d d ( p A p A p C ) n > In t h e a p p l i c a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e s t o t h e i s o l a t i o n o f p o l y n u c l e o t i d e s , a n u m b e r o f e x p e r i m e n t s a r e s u g g e s t e d . F i r s t , i t i s n e c e s s a r y t o o b t a i n some f i r m c o n c l u s i o n s a s t o t h e s t e r i c f a c t o r s i n v o l v e d i n o l i g o n u c l e o t i d e - c e l l u l o s e : p o l y n u c l e o t i d e i n t e r a c t i o n s . I t i s e x p e c t e d t h a t a t l e a s t t h e " t a i l " o n t h e 3 ' e n d o f a p o l y n u c l e o t i d e w i l l d e s t a b i l i z e ( a n d p o s s i b l y p r e v e n t ) i n t e r a c t i o n w i t h t h e c e l l u l o s e - b o u n d , c o m p l e m e n t a r y o l i g o m e r . T h e d e s i g n o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e may h a v e t o b e a l t e r e d t o a c c o m m o d a t e t h i s . In a t e s t o f t h e s t e r i c i n t e r f e r e n c e o f t h e 3' " t a i l " , e i t h e r a s y n t h e t i c p o l y n u c l e o t i d e ( p r e p a r e d e n z y m a t i c a l l y , s e e p a g e 80) o r a n a t u r a l l y o c c u r r i n g p o l y m e r i n w h i c h s h o r t t r a c t s o f n u c l e o t i d e s a r e k n o w n ; may b e u s e d . P y r i m i d i n e t r a c t s , i n c l u d i n g o l i g o t h y m i d y l a t e t r a c t s i n t w o v i r a l DNA m o l e c u l e s (T7 a n d A) h a v e b e e n r e p o r t e d , r e c e n t l y ( 1 4 , 15). T h e f r e q u e n c y a n d s t r a n d d i s t r i b u t i o n o f t h e o l i g o t h y m i d y l a t e t r a c t s i n t h e s e m o l e c u l e s i s d i s c u s s e d i n t h e G e n e r a l I n t r o d u c t i o n . S h o r t t r a c t s o f p y r i m i d i n e s h a v e a l s o b e e n d e t e r m i n e d i n t h e m i n u s s t r a n d o f 0X 1 7 4 ( 1 8 5 ) . O n c e t h e n e c e s s a r y s t e r i c e a s e m e n t o f t h e o l i g o n u c l e o t i d e -c e l l u l o s e h a s b e e n d e f i n e d , t h e i s o l a t i o n o f a n a t u r a l p o l y -n u c l e o t i d e f r o m a h e t e r o g e n e o u s p o p u l a t i o n o f m o l e c u l e s c o u l d b e a t t e m p t e d . A n o b v i o u s f i r s t c h o i c e . w o u l d b e t h e a t t e m p t e d i s o l a t i o n o f p h a g e T 4 l y s o z y m e m e s s e n g e r r i b o n u c l e i c a c i d . T4 l y s o z y m e i s a s m a l l p r o t e i n (164 a m i n o a c i d s ) , w h i c h i s p r o d u c e d l a t e i n t h e i n f e c t i o n c y c l e . T h e a m i n o a c i d s e q u e n c e h a s b e e n d e t e r m i n e d ( 1 8 6 ) . S t r e i s i n g e r a n d h i s g r o u p h a v e d e s c r i b e d t h e i s o l a t i o n o f a c r i d i n e - i n d u c e d d o u b l e f r a m e s h i f t m u t a n t s o f p h a g e T 4 , w h i c h m a k e p s e u d o w i l d l y s o z y m e m o l e c u l e s . F r o m t h e a l t e r e d a m i n o a c i d s e q u e n c e w i t h i n t h e f r a m e s h i f t r e g i o n , s h o r t t r a c t s o f t h e m e s s e n g e r n u c l e o t i d e s e q u e n c e c a n b e d e d u c e d (78-81). F o r e x a m p l e , a s e q u e n c e w i t h i n t h e w i l d t y p e l y s o z y m e m e s s e n g e r h a s b e e n d e d u c e d . T h i s s e q u e n c e w o u l d b e c o m p l e m e n t a r y t o a h e p t a n u c l e o t i d e , d - p A p C p T p T p T p T p T . S i m i l a r l y , t h e m u t a n t e J D 1 0 e J 4 2 e J 1 7 m e s s e n g e r s h o u l d c o n t a i n a t r a c t o f n u c l e o t i d e s c o m p l e m e n t a r y t o t h e o c t a n u c l e o t i d e s e q u e n c e , d - p A p C p A p C p T p T p T p T . T o d a t e , t h e s y n t h e s i s o f b o t h t h e h e p t a -n u c l e o t i d e , d - p A p C p T p T p T p T p T , a n d t h e n o n a n u c l e o t i d e , d - p A p C -p T p T p T p T p T p T p T , h a s b e e n a c c o m p l i s h e d , a n d b o t h h a v e b e e n l i n k e d , e f f i c i e n t l y , t o c e l l u l o s e , u s i n g t h e m o d i f i e d w a t e r - s o l u b l e c a r b o d i i m i d e m e t h o d . D r . M i c h a e l D o e l , o f t h i s l a b o r a t o r y , h a s r e c e n t l y b e g u n t h e s y n t h e s i s o f t h e o c t a n u c l e o t i d e , d - p A p C p A p C p T p T p T p T . P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s r e l a t e d t o t h e i s o l a t i o n o f l y s o z y m e mRNA u s i n g t h e s e o l i g o m e r s , a r e i n p r o g r e s s . One p r o b l e m a s s o c i a t e d w i t h t h e i s o l a t i o n o f a n y g r o u p o f b i o l o g i c a l m o l e c u l e s i s t h a t o f h a v i n g a v a i l a b l e a s p e c i f i c a s s a y f o r t h e m o l e c u l e s . I n t h e c a s e o f p h a g e J h l y s o z y m e , a c o n v e n i e n t , i n v i t r o a s s a y f o r t h e m e s s e n g e r ( i n v o l v i n g t h e s y n t h e s i s , o f a c t i v e e n z y m e m o l e c u l e s ) , h a s b e e n d e v e l o p e d (31). 188 L I T E R A T U R E C I T E D 1. I U P A C - I U B C o m b i n e d C o m m i s s i o n o n B i o c h e m i c a l N o m e n c l a t u r e . A b b r e v i a t i o n s a n d S y m b o l s f o r C h e m i c a l Names o f S p e c i a l I n t e r e s t i n B i o l o g i c a l C h e m i s t r y . R e v i s e d T e n t a t i v e R u l e s (1965), B i o c h e m i s t r y , 5_, 1445 (1966). 2. S c h a l l e r , H . , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . S o c , 85, 3841 (1963). 3- M e i s c h e r , F . , H o p p e - S e y l e r 1 s m e d i z i n i s c h e - c h e m i s c h e U n t e r -s u c h u n g e n , 4_, 441 (1871) , E n g l i s h t r a n s l a t i o n i n M . L . G a b r i e l a n d S . F o g e l ( E d i t o r s ) , G r e a t E x p e r i m e n t s i n B i o l o g y , P r e n t i c e -H a l l , I n c . , E n g l e w o o d C l i f f s , N . J . , 1955, P- 233-4. D a v i d s o n , J . N . , i n J . N . D a v i d s o n a n d W . E . C o h n ( E d i t o r s ) , P r o g . N u c l e i c A c i d R e s . M o l . B i o l . , V o l . 8_, A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , 1968, p . 1. 5. C h a r g a f f , E . , i n J . N . D a v i d s o n a n d W . E . C o h n ( E d i t o r s ) , P r o g . N u c l e i c A c i d R e s . M o l . B i o l . , V o l . 8_, A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , 1968, p . 297-6. A v e r y , O . T . , M a c L e o d , C M . , a n d M c C a r t y , M. , J . E x p t l . M e d . , 79, 137 (1944). 7. H e r s h e y , A . D . , a n d C h a s e , M . , J . G e n . P h y s i o l . , 36., 39 (1952). 8. L e n g y e l , P . , C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . , 3_4, 828 (1969) . 9. R a j B h a n d a r y , U . L . , a n d S t u a r t , A . , A n n . R e v . B i o c h e m . , 35, 759 (1966). 10. G i l h a m , P . T . , A n n . R e v . B i o c h e m . , 39.. 227 (1970). 11. B i l l e t e r , M . A . , D a h l b e r g , J . E . , G o o d m a n , H . M . , H i n d l e y , J . , a n d W e i s s m a n , C , N a t u r e , 224, 1083 (1969). 12. F e l l n e r , P . , E h r e s m a n n , C , a n d E b e l , J . P . , N a t u r e , 225, 26 (1970). 13. F e l l n e r , P . , a n d E b e l , J . P . , N a t u r e , 225, 1131 (1970). 14. M u s h y n s k i , W . E . , a n d S p e n c e r , J . H . , J . M o l . B i o l . , 52, 91 (1970) . 189 15- M u s h y n s k i , W . E . , a n d S p e n c e r , J . H . , J . M o l . B i o l . , j>2_, 107 (1970). • 16. Wu , R. , a n d K a i s e r , A . D . , J . M o l . B i o l . , 35., 523 (1968). 17. Wu , R . , J . M o l . B i o l . , 51, 501 (1970). 18. Wu , R . , D o n e l s o n , J . , a n d P a d m a n a b h a n , F . , V I M I n t e r n a t . C o n g r . B i o c h e m . , S w i t z e r l a n d , 1970, p. 166. 19« S w i f t , H . , i n E. C h a r g a f f . a n d J . N . D a v i d s o n ( E d i t o r s ) , T h e N u c l e i c A c i d s , V o l . I I , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , 1955, p. 51. 20. D o u n c e , A . L . , i n E. C h a r g a f f a n d J . N . D a v i d s o n ( E d i t o r s ) , T h e N u c l e i c A c i d s , V o l . I I , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , 1955, P- 93. 21. V e n d r e l y , R:', i n E. C h a r g a f f a n d J . N . D a v i d s o n ( E d i t o r s ) , T h e N u c l e i c A c i d s , V o l . I I , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , 1955, p. 155. 22. T h o r e l 1 , B . , i n E. C h a r g a f f a n d J . N . D a v i d s o n ( E d i t o r s ) , T h e N u c l e i c A c i d s , V o l . I I , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , 1955, p. 181. 23- H o g e b o o m , G . H . , a n d S c h n e i d e r , W . C . , i n E. C h a r g a f f a n d J . N . D a v i d s o n ( E d i t o r s ) , T h e N u c l e i c A c i d s , V o l . I I , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , 1955, p. 199. 2 k . G r o s s m a n , L . , a n d M o l d a v e , K. ( E d i t o r s ) , M e t h o d s i n E n z y m o l o g y , V o l . X I I A , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , 1967, s e c t i o n I I I , p. k \ 7 . 25. G r o s s m a n , L . , a n d M o l d a v e , K. ( E d i t o r s ) , M e t h o d s i n E n z y m o l o g y , V o l . X I I A , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , 1967, s e c t i o n I V , p. 533-26. B r i t t e n , R . J . , a n d D a v i d s o n , E . H . , S c i e n c e , I 6 5 , 3^9 (1969). 27. B r i t t e n , R . J . , a n d K o h n e , D . E . , S c i e n c e , 161, 529 (1968). 28. W a t s o n , J . D . , T h e M o l e c u l a r B i o l o g y o f t h e G e n e , W . A . B e n j a m i n , I n c . , New Y o r k , 1965-29. L a i r d , C D . , M c C o n a u g h y , B . L . , a n d M c C a r t h y , B . J . , N a t u r e , 22*4, 149 (1969). 30. M c C a r t h y , B . J . , a n d C h u r c h , R . B . , A n n . R e v . B i o c h e m . , 39, 131 (1970). 190 3 1 . S a l s e r , W . , G e s t e l a n d , R . F . , a n d B o l l e , A . , N a t u r e , 2 1 5 , 588 ( 1 9 6 7 ) . 32. Y o u n g , E . T . , J . M o l . B i o l . , 51_, 591 ( 1 9 7 0 ) . 33« L e d e r m a n , M . , a n d Z u b a y , G . , B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . , 32. 710 ( 1 9 6 8 ) . 3 4 . G o l d , L . M . , a n d S c h w e i g e r , M . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 62, 892 ( 1 9 6 9 ) . 3 5 . C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . , 34., 1969 . 3 6 . B r e n n e r , D . J . , F o u r m e r , M . J . , a n d D o c t o r , B . P . , N a t u r e , 227, 448 ( 1 9 7 0 ) . 37- M a r k s , A . , a n d S p e n c e r , J . H . , J . M o l . B i o l . , 5J_, 115 ( 1 9 7 0 ) . 3 8 . W i l l i a m s o n , R . , M o r r i s o n , M . , a n d P a u l , J . , B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . , 40_, 740 ( 1 9 7 0 ) . 3 9 . B a l t i m o r e , D . , N a t u r e , 226, 1209 ( 1 9 7 0 ) . 4 0 . T e m i n , H . M . , a n d M i z u t a n i , S . , N a t u r e , 226, 1211 ( 1 9 7 0 ) . 4 1 . S p i e g e l m a n , S . , B u r n e y , A . , D a s , M . R . , K e y d a r , J . , S c h l o m , , J . , T r a v n i c e k , M . , a n d W a t s o n , K . , N a t u r e , . 227 , 563 ( 1 9 7 0 ) . 4 2 . V o l k i n , E . , a n d A s t r a c h a n , L . , V i r o l o g y , 2_, 149 ( 1 9 5 6 ) . 4 3 . J a c o b , F . , a n d M o n o d , J . , J . M o l . B i o l . , 3., 318 ( 1 9 6 1 ) . 4 4 . S i n g e r , M . F . , a n d L e d e r , P . , A n n . R e v . B i o c h e m . , 3 5 , 195 ( 1 9 6 6 ) . — 4 5 . N a t h a n s , D. , N o t a n i , G . , S c h w a r t z , J . H . , a n d Z i n d e r , N . D . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 4 8 , 1424 ( 1 9 6 2 ) . 4 6 . N a t h a n s , D . , J . M o l . B i o l . , |3_» 5 2 1 (1965) . 4 7 . C a p e c c h i , M . , J . M o l . B i o l . , 2J_, 173 (1966). 4 8 . C a p e c c h i , M . R . , a n d G u s s i n , G . N . , S c i e n c e , 1 4 9 , 417 ( 1 9 6 5 ) . 4 9 . S c h w a r t z , J . H . , E i s e n s t a d t , J . M . , B r a w e r m a n , G . , a n d Z i n d e r , N . D . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 5 3 , 195 ( 1 9 6 5 ) . 5 0 . D o h a n , F . C . , J r . , R u b m a n , R . H . , a n d T o r r i a n i , A . , C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . , 3 4 , 768 (1969). 191 51. I n g r a m , V . M . , T h e B i o s y n t h e s i s o f M a c r o m o l e c u l e s , W . A . B e n j a m i n , I n c . , New Y o r k , 1966. 52. C h a n t r e n n e , H . , B u r n y , A . , a n d M a r b a i x , G . , P r o g . N u c l e i c A c i d R e s . M o l . B i o l . , J_, 173 (1967). 53. B a u t z , E . K . F . , a n d H a l l , B . D . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 48, 400 (1962). 54. B o l t o n , E . J . , a n d M c C a r t h y , B . J . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 48, 1390 (1962). 55- G i l l e s p i e , D . , a n d S p i e g e l m a n , S . , J . M o l . B i o l . , 12, 829 (1965). 56. M e r r i a m , E . V . , D u m a s , L . B . , a n d S i n s h e i m e r , R . L . , A n a l . B i o c h e m . , 36, 389 (1970). 57. L i t m a n , R . , J . B i o l . C h e m . , 243, 6222 (1968). 58. A l b e r t s , B . M . , A m o d i o , F . J . , J e n k i n s , M . , G u t m a n , E . D . , a n d F e r r i s , F . L . , C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . , 33, 289 (1968). 59- B u l o v a , S . l . , a n d B u r k a , E . R . , J . B i o l . C h e m . , 245, 4907 (1970). 60. L a y c o c k , D . G . , a n d H u n t , J . A . , N a t u r e , 221, 1118 (1969). 61. H o u s m a n , D . , J a c o b s - L o r e n a , M . , R a j B h a n d a r y , U . L . , a n d L o d i s h , H . F . , N a t u r e , 227, 913 0 9 7 0 ) . 62. L a b r i e , F. , N a t u r e , 221 , 1217 (1969). 63. H e y w o o d , S . M . , a n d N w a g w u , M. , B i o c h e m i s t r y , 8_, 3839 (1969). 64. B o r u n , T . W . , S c h a r f f , M . D . , a n d R o b b i n s , E . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 58, 1977 (1967). . 65. N e m e r , M . , a n d L i n d s a y , D . T . , B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun . 35, 156 (1969). 66. K e d e s , L . H . , H o g a n , B . , C o g n e t t i , G . , S e l v i g , S . , Y a n o v e r , P . , a n d G r o s s , P . R . , C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . , 34. 717 (1969). 67. W i l l i a m s , A . R . , a n d A s k o n a s , B . A . , J . M o l . B i o l . , 23, 201 (1967). ~ ~ 192 6 8 . G i l h a m , P . T . , J . A m e r . C h e m . S o c , 8 4 , 131 1 ( 1 9 6 2 ) . 69. G i l h a m , P . T . , J . A m e r . C h e m . S o c . , 8 6 , 4982 ( 1 9 6 4 ) . 7 0 . G i l h a m , P . T . , a n d R o b i n s o n , W . E . , J . A m e r . C h e m . S o c , 8 6 , 4985 ( 1 9 6 4 ) . 7 1 . E d m o n d s , M . , a n d A b r a m s , R . , J . B i o l . C h e m . , 2 3 8 , PC 1180 ( 1 9 6 3 ) . 7 2 . E d m o n d s , M . , a n d C a r a m e l a , M . G . , J . B i o l . C h e m . , 2 4 4 , 1314 ( 1 9 6 9 ) . 73- T h o m a s , C . A . , J r . , i n J . N . D a v i d s o n a n d W . E . C o h n ( E d i t o r s ) , P r o g . N u c l e i c A c i d R e s . M o l . B i o l . , V o l . 5., A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , I 9 6 6 , p . 315-7 4 . M a c H a t t i e , L . A . , a n d T h o m a s , C . A . , J r . , i n H . A . S o b e r ( E d i t o r ) , H a n d b o o k o f B i o c h e m i s t r y , s e l e c t e d d a t a f o r m o l e c u l a r b i o l o g y , T h e C h e m i c a l R u b b e r C o . , C l e v e l a n d , 1968 , p . H-3-7 5 . K h o r a n a , H . G . , P u r e a n d A p p l i e d C h e m . , }]_, 349 ( 1 9 6 8 ) . 7 6 . M i n J o u , N . , a n d F i e r s , W. , J . M o l . B i o l . , 40_, 187 ( 1 9 6 9 ) . 77- T h i r i o n , J . P . , a n d K a e s b e r g , P . , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 1 6 1 , 247 ( 1 9 6 8 ) . 7 8 . T e r z a g h i , E . , O k a d a , Y . , S t r e i s i n g e r , G . , E m r i c h , J . , I n o u y e , M . , a n d T s u g i t a , A . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 5 6 , 500 ( 1 9 6 6 ) . 79- O k a d a , Y . , T e r z a g h i , E . , S t r e i s i n g e r , G . , E m r i c h , J . , I n o u y e , J . , a n d T s u g i t a , A . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 5 6 , 1692 ( 1 9 6 6 ) . 8 0 . T s u g i t a , A . , I n o u y e , M . , I m a g a w a , T . , N a k a n i s h i , T . , O k a d a , Y . , E m r i c h , J . , a n d S t r e i s i n g e r , G . , J . M o l . B i o l . , 4 1 , 349 ( 1 9 6 9 ) . 8 1 . S t r e i s i n g e r , G . , O k a d a , Y . , Y o s h i m i , 0 . , E m r i c h , J . , N e w t o n , J . , T s u g i t a , A . , T e r z a g h i , E . , a n d I n o u y e , M . , C o l d S p r i n g H a r b o r d S y m p . Q u a n t . B i o l . , 3J_, 77 (1966) . 8 2 . N i r e n b e r g , M . , L e d e r , P . , B e r n f i e l d , M. , B r i m a c o m b e , R . , T r u p i n , J . , R o t t m a n , F . , a n d O ' N e a l , C , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 5 3 , 1161 ( 1 9 6 5 ) . 193 83. S o i l , D . , O h t s u k a , E . , J o n e s , D . S . , L o h r m a n n , R . , H a y a t s u , A . , N i s h i m u r a , S . , a n d K h o r a n a , H . G . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 5 4 , 1378 ( 1 9 6 5 ) . 8 4 . S h e r m a n , F . , S t e w a r t , J . W . , P a r k e r , J . H . , P u t t e r m a n , G . J . , A g r a w a l , B . B . L . , a n d M a r g o l i a s h , E . , X X I V S y m p . I n t e r n a t . S o c . E x p t l . B i o l . , 1970 , p . 8 5 . 85. C r i c k , F . H . C . , C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . , 3J_, 1 ( 1 9 6 6 ) . 8 6 . A r g e t s i n g e r S t e i t z , J . , C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . , 3 4 , 621 ( 1 9 6 9 ) . 87. G u p t a , S . L . , C h e n , J . , S c h a e f e r , L . , W e i s s m a n , S . M . , a n d L e n g y e l , P . , C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . , 3 4 , 630 ( 1 9 6 9 ) . 8 8 . A g a r w a l , K . L . , B u c h i , H . , C a r u t h e r s , M . H . , G u p t a , N . , K h o r a n a , H . G . , K l e p p e , K . , K u m a r , A . , O h t s u k a , E . , R a j B h a n d a r y , U . L . , V a n d e S a n d e , J . H . , S c a r a m e l l a , V . , W e b e r , H . , Y a m a d a , T . , N a t u r e , 2 2 7 , 27 ( 1 9 7 0 ) . 89. L o h r m a n n , R . , S o i l , D . , H a y a t s u , H . , O h t s u k a , E . , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . S o c , 8£, 819 ( 1 9 6 6 ) . 9 0 . O h t s u k a , E . , M o o n , M.W. , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . S o c , 8 7 , 2956 ( 1 9 6 5 ) . 91. N a r a n g , S . A . , J a c o b , T . M . , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . S o c . , 89., 2167 (1967) • 92. J a c o b , T . M . , N a r a n g , S . A . , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . . S o c , 8 9 , 2177 ( 1 9 6 7 ) . 93- K o s s e l , H . , B u c h i , H . , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . S o c . , 8 9 , 2185 (1967 )• 9 4 . O h t s u k a , E . , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . S o c . , 89, 2195 ( 1 9 6 7 ) . 95- K h o r a n a , H . G . , B u c h i , H . , G h o s h , H . , G u p t a , N . , J a c o b , T . M . , K o s s e l , H . , M o r g a n , R . , N a r a n g , S . A . , O h t s u k a , E . , a n d W e l l s , R . D . , C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p . Q u a n t . B i o l . , 3J_, 39 ( 1 9 6 6 ) . 96. G u p t a , N . K . , O h t s u k a , E . , W e b e r , H . ^ C h a n g , S . H . , a n d K h o r a n a , H . G . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 6 0 , 285 (1968). 194 97- G u p t a , N . K . , O h t s u k a , E . , S c a r a m e l l a , V . , B u c h i , H . , K u m a r , A . , W e b e r , H . , a n d K h o r a n a , H . G . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 60, 1338 ( 1 9 6 8 ) . 9 8 . S c h a l l e r , H . , W e i m a n n . G . , L e r c h , B . , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . S o c , 85, 3821 (1963) -99« G i l h a m , P . T . , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . S o c , 8 1 , 4647 ( 1 9 5 9 ) . 100 . R a l p h , R . K . , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . S o c , 83, 2926 ( 1 9 6 1 ) . 1 0 1 . K h o r a n a , H . G . , a n d V i z s o l y i , J . P . , J . A m e r . C h e m . S o c , 83_» 6 7 5 ( 1 9 6 1 ) . 102 . R a l p h , R . K . , C o n n e r s , W . J . , S c h a l l e r , H . , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . S o c , 85, 1983 ( 1 9 6 3 ) . 1 0 3 . N a r a n g , S . A . , J a c o b , T . M . , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . S o c , 89, 2158 ( 1 9 6 7 ) . 104 . K h o r a n a , H . G . , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n . 105. P _ L B i o c h e m i c a 1 s , I n c . , R e f e r e n c e G u i d e C a t a l o g N o . 1 0 2 , 1970, p . 3 7 . 106 . E c k s t e i n , F. , A n g e w . C h e m . I n t e r n a t . E d i t . , 5., 671 ( 1 9 6 6 ) . 107 . C o o k , A . F . , H o l m a n , M . J . , a n d N u s s b a u m , A . L . , J . A m e r . C h e m . S o c , 91, 6479 ( 1 9 6 9 ) . 108 . O h t s u k a , E . , U b a s a w a , M . , a n d I k e h a r a , M . , J . A m e r . C h e m . S o c , 92, 5507 ( 1 9 7 0 ) . 109 . R i c h a r d s o n , C . C . , P r o c N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 54., 158 ( 1 9 6 5 ) . 110. H e p p e l , L . A . , i n L . G r o s s m a n a n d K. M o l d a v e ( E d i t o r s ) , M e t h o d s i n E n z y m o l o g y , V o l . X I I A , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , 1967 , p . 3 1 6 . 1 1 1 . K h o r a n a , H . G . , a n d C o n n e r s , W . J . , i n A . C . M a e h l y ( E d i t o r ) , B i o c h e m i c a l P r e p a r a t i o n s , V o l . 1 1 , J o h n W i l e y a n d S o n s , I n c . , New Y o r k , 1966, p . 113-112 . W e i m a n n , G . , S c h a l l e r , H . , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . S o c , 8 5 , 3835 ( 1 9 6 3 ) . 195 113- O h t s u k a , E . , M o o n , M . W . , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . S o c , 87, 2956 (1965). 1 1 4 . K h o r a n a , H . G . , T u r n e r , A . F . , a n d V i z s o l y i , J . P . , J . A m e r . C h e m . S o c , 83, 686 (1961). 115- S c h a l l e r , H . , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . S o c , 85, 3828 (1963). 116. T e n e r , G . M . , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n . 117. J a c o b , T . M . , a n d K h o r a n a , H . G . , J . A m e r . C h e m . S o c , 87, 2971 (1965). 118. P i t h a , P . M . , a n d T s ' o , P . O . P . , B i o c h e m i s t r y , S, 5206 (1969). 119. R i c h , A . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 4 6 , 1 0 4 4 (i960). 120. R i c h , A . , a n d T i n o c o , I., J . A m e r . C h e m . S o c , 82_, 6409 ( I 9 6 0 ) . 121. L i p s e t t , M. , H e p p e l , L . A . , a n d B r a d l e y , O . F . , J . B i o l . C h e m . , 236, 857 (1961). 1 2 2 . L i p s e t t , M . , J . B i o l . C h e m . , 239, 1257 (1964). 123. C a s s a n i , G . R . , a n d B o l l u m , F . J . , B i o c h e m i s t r y * 8, 3928 (1969). 1 2 4 . N a y l o r , R. , a n d G i l h a m . P . T . , B i o c h e m i s t r y , 5., 2 7 2 2 (1966) . 125. B a u t z , E . K . F . , a n d B a u t z , F . A . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 52, 1476 (1964). 126. O p a r a - K u b i n s k a , Z . , K u b i n s k i , H . , a n d S z y b a l s k i , W . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 52., 923 0 9 6 5 ) . 127. K u b i n s k i , H . , O p a r a - K u b i n s k a , Z . , a n d S z y b a l s k i , W . , J . M o l . B i o l . , 2 0 , 313 0 9 6 6 ) . 128. S u m m e r s , W . C . , a n d S z y b a l s k i , W . , V i r o l o g y , 3_4, 9 (1968). 129. S u m m e r s , W . C . , a n d S z y b a l s k i , W . , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 1 6 6 , 371 0 9 6 8 ) . 130. S u m m e r s , W . C . , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 182, 269 (1969). 196 131. N i y o g i , S . K . , a n d T h o m a s , C . A . , J r . , B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . , 26_, 51 (1967) • 132. N i y o g i , S . K . , J . B i o l . C h e m . , 2 4 4 , 1576 (1969). 133- M c C o n a u g h y , B . L . , a n d M c C a r t h y , B . J . , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , J_4_9, 180 (1967). 134. G i l l e s p i e , D . , a n d S p i e g e l m a n , S . , B a c t e r i o l o g i c a l P r o c e e d i n g s , G 112 (I966). 135. J o v i n , T . M . , a n d K o r n b e r g , A . , J . B i o l . C h e m . , 2 4 3 , 250 (1968). 136. Bo11 urn, F . J . , i n G . L . C a n t o n i a n d D . R . D a v i e s ( E d i t o r s ) , P r o c e d u r e s i n N u c l e i c A c i d R e s e a r c h , H a r p e r a n d R o w , New Y o r k , 1966, p . 5 7 7 . 137. R a j B h a n d a r y , U . L . , C h a n g , S . H . , G r o s s , H . 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A . , a n d R u s h i z k y , G . W . , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 6j_ , 474 (1962) . 154 . M a r m u r , J . , a n d D o t y , P . , N a t u r e , 1 8 3 , 1427 ( 1 9 5 9 ) . 155- T h o m a s , C . A . , J r . , a n d M a c H a t t i e , L . A . , A n n . R e v . B i o c h e m . , 3 6 , 485 ( 1 9 6 7 ) . 156 . I n m a n , R . B . , J . M o l . B i o l . , j £ , 464 ( 1 9 6 6 ) . 157- T e n e r , G . M . , K h o r a n a , H . G . , M a r k h a m , R . , a n d P o l , E . H . , J . A m e r . C h e m . S o c , 80_, 6223 ( 1 9 5 8 ) . 158 . M a r m u r , J . , a n d D o t y , P . , J . M o l . B i o l . , 5., 109 ( 1 9 6 2 ) . 1 5 9 . G i l h a m , P . T . , J . A m e r . C h e m . S o c , 84_, 687 ( 1 9 6 2 ) . 160 . H o , N . W . Y . , G i l h a m , P . T . , B i o c h e m i s t r y , 6, 3632 ( 1 9 6 7 ) . 1 6 1 . N a y l o r , R . , H o , N . W . Y . , a n d G i l h a m , P . T . , J . A m e r . C h e m . S o c . , 87., 4209 ( 1 9 6 5 ) . 1 6 2 . G e l l e r t , M . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 5 7 , 148 (1967)-163 . Z i m m e r m a n , S . B . , L i t t l e , J . W . , O s h i n s k y , C . K . , a n d G e l l e r t , M . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 5 7 , 1841 ( 1 9 6 7 ) . 164 . O l i v e r a , B . M . , a n d L e h m a n , I . R . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 5 7 , 1426 ( 1 9 6 7 ) . 165 . W e i s s , S . , a n d R i c h a r d s o n , C . C . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 5 7 , 1021 ( 1 9 6 7 ) . 166 . G e f t e r , M . L . , B e c k e r , A . , a n d H u r w i t z , J . , P r o c . N a t . A c a d . S c i . ( U . S . ) , 5 8 , 240 ( 1 9 6 7 ) . 198 167. W a t s o n , J . D . , a n d C r i c k , F . H . C . , N a t u r e , 171 , 737 (1953). 168. S t e e l e , R . G . D . , a n d T o r r i e , J . 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