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Effector mechanisms in the endocrine control of steroidogenesis Rodway, Marie R. 1990

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E F F E C T O R M E C H A N I S M S I N T H E E N D O C R I N E C O N T R O L O F S T E R O I D O G E N E S I S B y M A R I E R O S A L I N D RODWAY B . S c . P h a r m . , T h e U n i v e r s i t y o f A l b e r t a , 1 9 8 1 M . S c , T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1 9 8 6 A T H E S I S S U B M I T T E D I N P A R T I A L F U L F I L L M E N T O F T H E R E Q U I R E M E N T S F O R T H E D E G R E E O F DOCTOR OF P H I L O S O P H Y i n T H E F A C U L T Y O F G R A D U A T E S T U D I E S D e p a r t m e n t o f O b s t e t r i c s a n d G y n a e c o l o g y ( H u m a n R e p r o d u c t i v e B i o l o g y ) We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d T H E U N I V E R S I T Y O F B R I T I S H C O L U M B I A N o v e m b e r , 1 9 9 0 ® M a r i e R o s a l i n d R o d w a y , 1 9 9 0 In presenting this thesis in partial fulfilment of the requirements for an advanced degree at the University of British Columbia, I agree that the Library shall make it freely available for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of this thesis for scholarly purposes may be granted by the head of my department or by his or her representatives. It is understood that copying or publication of this thesis for financial gain shall not be allowed without my written permission. Department of O b s t e t r i c s a n d G y n a e c o l o g y The University of British Columbia Vancouver, Canada D a t e npr.PmhPr 17, IQQn DE-6 (2/88) A B S T R A C T P r o d u c t i o n o f h o r m o n e s i n t h e o v a r y i s c o n t r o l l e d b y e n d o c r i n e , p a r a c r i n e , a u t o c r i n e a n d i n t r a c r i n e i n f l u e n c e s . S i m i l a r c o n t r o l s m a y e x i s t i n t h e p l a c e n t a . I w i s h e d t o i n v e s t i g a t e t h e i n v o l v e m e n t o f s e c o n d m e s s e n g e r s i n t h e a c t i o n o f h o r m o n e s i n c o n t r o l o f h o r m o n o g e n e s i s i n r a t o v a r y a n d h u m a n p l a c e n t a . T h e s e c o n d m e s s e n g e r s i n v o l v e d i n t h e a c t i o n o f g o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e (GnRH ) a n d p r o s t a g l a n d i n ( P G ) F 2 a w e r e i n v e s t i g a t e d i n r a t g r a n u l o s a a n d l u t e a l c e l l s . A s w e l l , t h e e n d o c r i n e r o l e o f G n R H i n t h e p l a c e n t a a n d t h e p o s s i b l e s e c o n d m e s s e n g e r s i n v o l v e d w e r e i n v e s t i g a t e d . M o n o l a y e r c u l t u r e s o f r a t g r a n u l o s a a n d l u t e a l c e l l s a n d h u m a n p l a c e n t a l c e l l s w e r e p r e p a r e d . R a t g r a n u l o s a c e l l s w e r e m e c h a n i c a l l y d i s p e r s e d ; r a t l u t e a l c e l l s w e r e e n z y m a t i c a l l y d i s p e r s e d w i t h c o l l a g e n a s e a n d D N a s e . R a t g r a n u l o s a c e l l s w e r e t r e a t e d d u r i n g t h e f i r s t 2 4 h o u r s i n c u l t u r e ; r a t l u t e a l c e l l s w e r e t r e a t e d u p t o 3 d a y s a f t e r d i s p e r s i o n . R a d i o i m m u n o a s s a y o f m e d i u m w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f t r e a t m e n t s o n h o r m o n e p r o d u c t i o n . S t u d i e s w h i c h e x a m i n e d t h e e f f e c t o f h o r m o n e s o n t h e i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n ( [ C a 2 + ] i ) i n s i n g l e c e l l s u s i n g t h e c a l c i u m s e n s i t i v e f l u o r e s c e n t d y e , F u r a - 2 , w e r e d o n e i n m o n o l a y e r r a t g r a n u l o s a a n d l u t e a l c e l l c u l t u r e s . H u m a n p l a c e n t a l c e l l s , f r o m f i r s t t r i m e s t e r a n d t e r m p l a c e n t a e , w e r e d i s p e r s e d u s i n g t r y p s i n - D N a s e o r c o l l a g e n a s e - D N a s e . C e l l s w e r e c u l t u r e d f o r 2 d a y s p r i o r t o t r e a t m e n t . T h e e f f e c t s o f t r e a t m e n t s o n p r o d u c t i o n o f s t e r o i d ( p r o g e s t e r o n e a n d e s t r o g e n ) , i i i g l y c o p r o t e i n ( h u m a n c h o r i o n i c g o n a d o t r o p i n ; h C G ) a n d p r o t e i n ( h u m a n p l a c e n t a l l a c t o g e n ; h P L ) h o r m o n e s w e r e d e t e r m i n e d b y r a d i o i m m u n o a s s a y o f t h e m e d i u m . I n r a t g r a n u l o s a a n d l u t e a l c e l l c u l t u r e s , I e x a m i n e d t h e e f f e c t o f a n u m b e r o f h o r m o n e s a n d s e c o n d m e s s e n g e r s . E f f e c t s o f f o l l i c l e - s t i m u l a t i n g h o r m o n e ( F S H ) , l u t e i n i z i n g h o r m o n e ( L H ) , c y c l i c a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e ( c A M P ) , G n R H a n d P G F 2 a o n o v a r i a n h o r m o n o g e n e s i s h a v e b e e n p r e v i o u s l y r e p o r t e d . C h a n g e s i n c y t o s o l i c f r e e c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n s ( [ C a 2 + ] i ) i n r e s p o n s e t o P G F 2 a w e r e m e a s u r e d i n s i n g l e r a t g r a n u l o s a a n d l u t e a l c e l l s . I f o u n d t h a t i n 3 4 % o f g r a n u l o s a c e l l s , a n d 5 3 % o f l u t e a l c e l l s , t h e r e w a s a 3 t o 4 f o l d i n c r e a s e i n r e s t i n g [ C a 2 + ] i w i t h i n 3 0 s e c o n d s o f a d m i n i s t r a t i o n o f P G F 2 a . M a n y c e l l s w h i c h r e s p o n d e d t o P G F 2 a a l s o r e s p o n d e d t o G n R H ( 3 9 % o f g r a n u l o s a c e l l s ; 6 7 % o f l u t e a l c e l l s ) . T h e i m m e d i a t e s o u r c e o f t h e i n c r e a s e d [ C a 2 + ] i a p p e a r e d t o b e c o m m o n i n t r a c e l l u l a r s t o r e s . N o c h a n g e i n h o r m o n e p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o G n R H i n p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s w a s s e e n . T r y p s i n d i s p e r s i o n m a y h a v e d a m a g e d c e l l s u r f a c e r e c e p t o r s , t h e r e f o r e t h e e f f e c t o f s e c o n d m e s s e n g e r s o n h o r m o n e p r o d u c t i o n i n t h e s e c u l t u r e s w a s e x a m i n e d . I n t e r m a n d f i r s t t r i m e s t e r t r o p h o b l a s t c u l t u r e s , I o b s e r v e d t h e f o l l o w i n g e f f e c t s w i t h 8 - b r o m o - c y c l i c a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e ( 8 -b r - c A M P ) : i n h i b i t e d e s t r o g e n p r o d u c t i o n f r o m t h e s u p p l i e d a n d r o g e n p r e c u r s o r s ; s t i m u l a t e d h C G p r o d u c t i o n ; s t i m u l a t e d h P L p r o d u c t i o n i n f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s ( h P L w a s n o t m e a s u r e d i n e n o u g h t e r m c u l t u r e s t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f 8 - b r - c A M P ) , a n d s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n . I a l s o i v i n v e s t i g a t e d t h e e f f e c t s o f a c t i v a t o r s a n d i n h i b i t o r s o f t h e p h o s p h o i n o s i t i d e ( P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 ) b r e a k d o w n s e c o n d m e s s e n g e r p a t h w a y ( T P A , A 2 3 1 8 7 , a r a c h i d o n i c a c i d ) ; n o e f f e c t s o f t h e s e a g e n t s w e r e s e e n . O t h e r h o r m o n e s s u s p e c t e d o f h a v i n g e n d o c r i n e , p a r a c r i n e o r a u t o c r i n e e f f e c t s i n t h e p l a c e n t a w e r e t e s t e d w i t h o u t e f f e c t . I c o n c l u d e t h a t G n R H a n d P G F 2 a c a u s e i n c r e a s e s i n [ C a 2 + ] i i n r a t o v a r i a n c e l l s , f r o m c o m m o n i n t r a c e l l u l a r s t o r e s o f c a l c i u m , a n d t h a t t h e p r o d u c t i o n o f h o r m o n e s b y t h e h u m a n p l a c e n t a m a y b e u n d e r r e g u l a t i o n o f a n a g e n t o r a g e n t s w h i c h i n d u c e p r o d u c t i o n o f c A M P . V T A B L E O F C O N T E N T S P a g e A B S T R A C T i i T A B L E O F C O N T E N T S V L I S T O F T A B L E S x i i L I S T O F F I G U R E S x i v L I S T O F A B B R E V I A T I O N S x v i A C K N O W L E D G E M E N T S x v i i i I N T R O D U C T I O N I . I N T R A C E L L U L A R S I G N A L T R A N S D U C T I O N M E C H A N I S M S A . T h e a d e n y l a t e c y c l a s e s y s t e m 1 B . T h e i n o s i t o l p h o s p h a t e s y s t e m 4 1 . S y s t e m c o m p o n e n t s 4 a . R e c e p t o r s a n d G - p r o t e i n s 4 b . P h o s p h o l i p a s e C 6 c . S u b s t r a t e : i n o s i t o l l i p i d s . . . . . 6 d . P r o t e i n k i n a s e C 7 e . I n t r a c e l l u l a r c a l c i u m s t o r a g e 7 2 . S e c o n d m e s s e n g e r s p r o d u c e d 8 a . D i a c y l g l y c e r o l a s a s e c o n d m e s s e n g e r 8 b . I n o s i t o l p h o s p h a t e s a s s e c o n d m e s s e n g e r s 9 1 . I n o s i t o l ( 1 , 4 , 5 ) t r i s p h o s p h a t e 9 2 . I n o s i t o l ( 1 , 3 , 4 , 5 ) t e t r a p h o s p h a t e 1 0 c . C a l c i u m a s a s e c o n d m e s s e n g e r 1 1 o 1 . M e a s u r e m e n t o f t h e c h a n g e s i n [ C a 2 + ] i . . . l 2 2 . T h e i n c r e a s e i n [ C a 2 + ] i i n r e s p o n s e t o i n o s i t o l ( 1 , 4 , 5 ) t r i s p h o s p h a t e o r h o r m o n a l s t i m u l i 1 4 3 . T h e i n v o l v e m e n t o f e x t r a c e l l u l a r s o u r c e s o f c a l c i u m 1 7 4 . T h e i n v o l v e m e n t o f i n t r a c e l l u l a r s o u r c e s o f c a l c i u m 1 7 5 . T h e d e p e n d e n c e o f t h e e f f e c t o n t h e s o u r c e o f c a l c i u m 18 6 . T h e e f f e c t o f i n c r e a s e d [ C a 2 + ] i o n c e l l u l a r p h y s i o l o g y 1 9 C . A r a c h i d o n i c a c i d a s a s e c o n d m e s s e n g e r 2 0 D . S u m m a r y 2 0 v i I I . R E G U L A T I O N A N D T R A N S D U C T I O N O F HORMONE A C T I O N I N T H E O V A R Y A . O v a r i a n a n a t o m y 2 1 B . R a t e s t r o u s c y c l e 2 3 C . O v a r i a n e n d o c r i n o l o g y 2 4 1 . F o l l i c l e - s t i m u l a t i n g h o r m o n e 2 4 2 . L u t e i n i z i n g h o r m o n e 2 6 3 . S t e r o i d h o r m o n e s 2 7 4 . G n R H 3 3 5 . P r o s t a g l a n d i n s 4 4 6 . G r o w t h f a c t o r s 5 4 7 . P r o l a c t i n 5 4 8 . O x y t o c i n 5 5 9 . A n g i o t e n s i n I I 5 5 1 0 . G l u c o c o r t i c o i d s 5 6 1 1 . C a t e c h o l a m i n e s 5 6 D . A c t i v i t y o f s e c o n d m e s s e n g e r p a t h w a y s i n t h e o v a r y . . . . 5 7 1 . A d e n y l a t e c y c l a s e s y s t e m 5 7 2 . I n o s i t o l p h o s p h a t e s y s t e m 5 7 3 . A r a c h i d o n i c a c i d s y s t e m 5 8 E . R a t o v a r i a n c e l l c u l t u r e 5 9 1 . G r a n u l o s a c e l l s 5 9 2 . L u t e a l c e l l s 6 0 F . S u m m a r y 6 1 I I I . R E G U L A T I O N A N D T R A N S D U C T I O N O F HORMONE P R O D U C T I O N I N T H E P L A C E N T A A . P l a c e n t a l a n a t o m y a n d h i s t o l o g y 62 1 . P l a c e n t a l d e v e l o p m e n t a n d a n a t o m y 6 2 2 . H i s t o l o g y o f p l a c e n t a l c e l l s i n c u l t u r e a . T e r m 6 5 b . F i r s t t r i m e s t e r 6 6 B . P l a c e n t a l e n d o c r i n o l o g y 6 8 1 . H o r m o n e s p r o d u c e d b y t h e p l a c e n t a . . 7 0 a . S t e r o i d h o r m o n e p r o d u c t i o n 7 3 b . G l y c o p r o t e i n h o r m o n e p r o d u c t i o n ( h C G ) 7 3 c . P o l y p e p t i d e h o r m o n e p r o d u c t i o n ( h u m a n p l a c e n t a l l a c t o g e n ) 7 7 d . P e p t i d e h o r m o n e p r o d u c t i o n ( G n R H ) 7 8 2 . H o r m o n e s w h i c h a f f e c t p l a c e n t a l h o r m o n o g e n e s i s . . . 7 9 a . S t e r o i d h o r m o n e s 7 9 b . G n R H 8 1 c . P r o s t a g l a n d i n s 8 2 d . A r a c h i d o n i c a c i d 8 2 e . A d r e n o c o r t i c o t r o p i c h o r m o n e 8 3 f . G r o w t h f a c t o r s . , 8 3 v i i g . I n t e r l e u k i n 1 8 4 h . O p i o d s 8 5 i . C a t e c h o l a m i n e s 8 5 j . A n g i o t e n s i n I I 8 6 C . T h e a c t i v i t y o f s e c o n d m e s s e n g e r p a t h w a y s i n t h e p l a c e n t a 8 6 1 . A d e n y l a t e c y c l a s e s y s t e m 8 6 2 . I n o s i t o l p h o s p h a t e s y s t e m 8 9 a . P r o t e i n k i n a s e C 8 9 b . C a l c i u m 9 0 c . A r a c h i d o n i c a c i d 9 2 D . P l a c e n t a l c e l l c u l t u r e 9 2 E . S u m m a r y 9 7 I V . G E N E R A L SUMMARY 9 7 V . O B J E C T I V E S O F T H I S S T U D Y 9 9 METHODS A N D M A T E R I A L S I . C h e m i c a l s 1 0 1 I I . C a r e a n d t r e a t m e n t o f a n i m a l s , 1 0 2 I I I . P r i m a r y c e l l c u l t u r e 1 0 3 A . R a t g r a n u l o s a c e l l s 1 0 3 B . R a t l u t e a l c e l l s 1 0 4 C . H u m a n t r o p h o b l a s t c e l l s 1 0 5 1 . T r y p s i n d i s p e r s i o n 1 0 5 2 . C o l l a g e n a s e d i s p e r s i o n . 1 0 7 I V . R a d i o i m m u n o a s s a y 1 0 9 V . M i c r o s p e c t r o f l u o r i m e t r y 1 0 9 A . P r e p a r a t i o n a n d l o a d i n g o f r a t g r a n u l o s a a n d l u t e a l c e l l s 1 0 9 B . F l u o r e s c e n c e m e a s u r e m e n t s 1 1 0 C . C a l c u l a t i o n o f c y t o s o l i c c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n . . I l l D . C a l i b r a t i o n o f t h e s y s t e m 1 1 4 V I . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s 1 1 4 R E S U L T S I . O v a r i a n c e l l c u l t u r e 1 1 5 V l l H o r m o n e s t u d i e s 1 1 5 1 . R a t g r a n u l o s a c e l l c u l t u r e 1 1 5 T h e e f f e c t o f 8 - b r - c A M P , c a l c i u m , F S H , h C G , P G E 2 , G n R H , P G F 2 a a n d E G F o n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n a n d t h e e f f e c t o f a n g i o t e n s i n I I a n d I I I o n e s t r o g e n a n d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n 2 . R a t l u t e a l c e l l c u l t u r e 1 2 2 T h e e f f e c t o f h C G , P G F 2 0 j G n R H , A 2 3 1 8 7 a n d T P A o n p r o g e s t e r o n e ' p r o d u c t i o n I n t r a c e l l u l a r c a l c i u m s t u d i e s 1 2 6 1 . T h e c h a n g e i n [ C a 2 * ] i i n r e s p o n s e t o G n R H i n s i n g l e r a t g r a n u l o s a a n d l u t e a l c e l l s 1 2 6 2 . T h e e f f e c t o f a c a l c i u m c h a n n e l b l o c k e r s , d i l t i a z e m a n d n i f e d i p i n e , o n G n R H i n d u c e d i n c r e a s e i n [ C a 2 + ] i 1 3 2 3 . T h e c h a n g e i n [ C a 2 + ] i i n r e s p o n s e t o P G F 2 a i n s i n g l e r a t g r a n u l o s a a n d g r a n u l o s a c e l l s 1 3 2 a . S h o r t d u r a t i o n a d m i n i s t r a t i o n 1 3 2 b . P r o l o n g e d a d m i n i s t r a t i o n 1 3 9 4 . A n i n v e s t i g a t i o n o f a d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p a n d t h e m i n i m u m e f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n 1 4 8 5 . T h e r e s p o n s e t o G n R H i n c e l l s r e s p o n s i v e t o P G F 2 a 1 4 8 6 . T h e s o u r c e o f i n c r e a s e d i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m . . . 1 5 6 a . L o w c a l c i u m p e r i f u s i o n e x p e r i m e n t s 1 5 6 b . C o m b i n e d a d m i n i s t r a t i o n o f P G F 2 a a n d G n R H . . . 1 6 1 c . A d m i n i s t r a t i o n o f G n R H o r P G F 2 a d u r i n g p e r i f u s i o n w i t h P G F 2 a 1 6 1 7 . T h e r e s p o n s e o f [ C a 2 + ] i t o a d m i n i s t r a t i o n o f l u t e i n i z i n g h o r m o n e 1 7 3 H u m a n t r o p h o b l a s t c e l l c u l t u r e 1 7 3 T r y p s i n d i s p e r s i o n 1 . T e r m p l a c e n t a a . T h e e f f e c t o f c A M P o n e s t r a d i o l a n d e s t r o n e p r o d u c t i o n 1 7 6 b . T h e e f f e c t o f f e t a l b o v i n e s e r u m o n h u m a n p l a c e n t a l l a c t o g e n , h C G a n d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n 1 7 6 c . T h e e f f e c t o f G n R H o n h C G p r o d u c t i o n 1 8 1 d . T h e e f f e c t o f a n g i o t e n s i n I I o n h o r m o n e p r o d u c t i o n 1 8 7 e . T h e e f f e c t o f p h o r b o l e s t e r s o n h o r m o n e p r o d u c t i o n 1 8 7 f . T h e e f f e c t o f c a l c i u m i o n o p h o r e s o n h o r m o n e / i x p r o d u c t i o n 1 8 7 g . T h e e f f e c t o f s t e r o i d h o r m o n e o n h o r m o n e p r o d u c t i o n 1 8 8 h . T h e e f f e c t o f h C G o n h o r m o n e p r o d u c t i o n . . . . 1 8 8 2 . F i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a a . T h e e f f e c t o f c A M P a n d p r e s e n c e o f 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m o n e s t r o g e n , p r o g e s t e r o n e , h u m a n p l a c e n t a l l a c t o g e n a n d h C G 1 8 8 i . e s t r a d i o l 1 8 9 i i . e s t r o n e 1 8 9 i i i . p r o g e s t e r o n e 2 0 0 i v . h u m a n p l a c e n t a l l a c t o g e n 2 0 0 v . h u m a n c h o r i o n i c g o n a d o t r o p i n 2 0 9 b . T h e d u r a t i o n o f c A M P e f f e c t o n h C G p r o d u c t i o n 2 0 9 c . T h e e f f e c t o f G n R H o n h C G p r o d u c t i o n 2 1 8 d . T h e e f f e c t o f a p h o r b o l e s t e r o n p l a c e n t a l h o r m o n o g e n e s i s 2 1 8 e . T h e e f f e c t o f a r a c h i d o n i c a c i d o n p l a c e n t a l h o r m o n o g e n e s i s 2 1 8 f . T h e e f f e c t o f a l t e r a t i o n s o f c a l c i u m o n p l a c e n t a l h o r m o n o g e n e s i s 2 1 9 g T h e e f f e c t o f s t e r o i d h o r m o n e s o n p l a c e n t a l h o r m o n o g e n e s i s 2 1 9 h . T h e e f f e c t o f h C G o n p l a c e n t a l h o r m o n o g e n e s i s 2 2 0 i . T h e e f f e c t o f i n t e r l e u k i n 1/3 a n d a t r i a l n a t r i u r e t i c p e p t i d e o n p l a c e n t a l h o r m o n o g e n e s i s 2 2 0 B . C o l l a g e n a s e d i s p e r s i o n 2 2 0 C . M e c h a n i c a l d i s p e r s i o n 2 2 1 D . P r e l i m i n a r y r e s u l t s 2 2 1 D I S C U S S I O N I . O v a r i a n c e l l c u l t u r e A . H o r m o n e s t u d i e s i n r a t g r a n u l o s a c e l l c u l t u r e s 2 2 3 1 . T h e e f f e c t o f F S H , h C G , G n R H , P G , 8 - b r - c A M P a n d c a l c i u m o n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n 2 2 4 2 . T h e e f f e c t o f E G F o n X p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n 2 2 5 3 . T h e e f f e c t o f a n g i o t e n s i n I I o n s t e r o i d h o r m o n e p r o d u c t i o n 2 2 5 B . H o r m o n e s t u d i e s i n r a t l u t e a l c e l l c u l t u r e s 1 . T h e e f f e c t o f h C G , P G F 2 a a n d G n R H o n h C G s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n 2 2 6 2 . T h e e f f e c t o f A 2 3 1 8 7 a n d T P A o n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n 2 2 7 C . I n t r a c e l l u l a r c a l c i u m s t u d i e s 1 . T h e e f f e c t o f c a l c i u m c h a n n e l ( L - t y p e ) b l o c k e r s o n G n R H s t i m u l a t e d i n c r e a s e i n [ C a 2 + ] i i n r a t g r a n u l o s a c e l l s 2 2 7 2 . P G F 2 a s t i m u l a t e s a n i n c r e a s e i n [ C a 2 + ] i 2 2 8 3 . N o c h a n g e i n m a g n i t u d e o f r e s p o n s e w i t h i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n o f P G F 2 a 2 3 0 4 . D e p l e t i o n o f c a l c i u m s t o r e s 2 3 1 5 . T h e r e s p o n s e t o G n R H i n c e l l s r e s p o n s i v e t o P G F 2 a 2 3 2 6 . P G F 2 a p e r i f u s i o n . 2 3 3 7 . P G F 2 a p e r i f u s i o n a n d t r e a t m e n t w i t h G n R H a n d P G F 2 a 2 3 4 8 . T h e s o u r c e o f c a l c i u m 2 3 5 9 . T h e e v i d e n c e a g a i n s t P G F 2 a i n d u c e d l u t e o l y s i s . . . . 2 3 8 D . S u m m a r y 2 4 0 I I . H u m a n t r o p h o b l a s t c e l l c u l t u r e 2 4 1 A . T h e e f f e c t o f G n R H h o r m o n o g e n e s i s i n t r o p h o b l a s t 2 4 1 B . T h e e f f e c t o f s e c o n d m e s s e n g e r s o r s y s t e m a c t i v a t o r s o n p l a c e n t a l h o r m o n o g e n e s i s 2 4 3 1 . T h e e f f e c t o f c A M P o n h C G , h u m a n p l a c e n t a l l a c t o g e n , p r o g e s t e r o n e , e s t r a d i o l a n d e s t r o n e p r o d u c t i o n 2 4 3 a . h C G , h u m a n p l a c e n t a l l a c t o g e n a n d p r o g e s t e r o n e 2 4 3 b . E s t r a d i o l a n d e s t r o n e 2 4 9 2 . T h e e f f e c t o f a l t e r a t i o n o f p r o t e i n k i n a s e C x i a c t i v a t i o n o n h o r m o n e p r o d u c t i o n i n c u l t u r e d p l a c e n t a l c e l l s 2 5 3 3 . T h e e f f e c t o f a l t e r a t i o n s o f c a l c i u m o n p l a c e n t a l h o r m o n o g e n e s i s 2 5 4 4 . T h e e f f e c t o f a r a c h i d o n i c a c i d o n p l a c e n t a l h o r m o n o g e n e s i s 2 5 5 C . T h e e f f e c t o f o t h e r h o r m o n e s o n p l a c e n t a l h o r m o n o g e n e s i s 2 5 5 1 . F e t a l b o v i n e s e r u m a n d g r o w t h f a c t o r s 2 5 5 2 . S t e r o i d h o r m o n e s 2 5 7 3 . I n t e r l e u k i n - 1 2 5 7 4 . A t r i a l n a t r i u r e t i c p e p t i d e 2 5 7 5 . A n g i o t e n s i n I I 2 5 8 D . D i f f e r e n c e s b e t w e e n t r o p h o b l a s t e x p l a n t a n d c e l l c u l t u r e s 2 5 8 E . S u m m a r y 2 5 9 F U T U R E E X P E R I M E N T S 2 5 9 C O N C L U S I O N 2 6 3 R E F E R E N C E S 2 6 6 x i i L I S T O F T A B L E S • P a g e I . H o r m o n e s p r o d u c e d i n , a n d h o r m o n e s w h i c h h a v e e n d o c r i n e e f f e c t s i n t h e o v a r y 2 5 I I . H o r m o n e s p r o d u c e d i n , a n d h o r m o n e s a n d s e c o n d m e s s e n g e r s w h i c h h a v e e n d o c r i n e e f f e c t s i n t h e p l a c e n t a 7 1 I I I . T h e e f f e c t o f E G F o n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n b y r a t g r a n u l o s a c e l l s 1 1 9 I V . T h e e f f e c t o f P G F 2 a , G n R H a n d h C G o n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n r a t l u t e a l c e l l s 1 2 4 V . T h e e f f e c t o f G n R H o n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t g r a n u l o s a c e l l s 1 2 9 V I . T h e e f f e c t o f G n R H o n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s p r e v i o u s l y d e m o n s t r a t e d t o b e r e s p o n s i v e t o P G F 2 a 1 3 1 V I I . T h e e f f e c t o f c a l c i u m c h a n n e l b l o c k e r s o n G n R H s t i m u l a t e d i n c r e a s e i n i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m i n r a t g r a n u l o s a 1 3 3 V I I I . T h e e f f e c t o f P G F 2 a o n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t g r a n u l o s a c e l l s 1 3 6 I X . T h e e f f e c t o f P G F 2 a o n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s 1 3 7 X . T h e e f f e c t o f a d e c r e a s e i n t h e t i m e i n t e r v a l b e t w e e n a d m i n i s t r a t i o n s o f P G F 2 a o n a l t e r a t i o n s i n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t g r a n u l o s a c e l l s 1 4 2 X I . T h e e f f e c t o f a d e c r e a s e i n t h e t i m e i n t e r v a l b e t w e e n a d m i n i s t r a t i o n s o f P G F 2 a o n a l t e r a t i o n s i n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s 1 4 4 X I I . T h e e f f e c t o f P G F 2 a p e r i f u s i o n o n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t g r a n u l o s a c e l l s 1 4 6 X I I I . T h e e f f e c t o f P G F 2 a p e r i f u s i o n o n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s 1 4 9 X I V . A n i n v e s t i g a t i o n o f a d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p i n r e s p o n s e t o P G F 2 a i n s i n g l e r a t g r a n u l o s a c e l l s 1 5 1 X V . A n i n v e s t i g a t i o n o f a d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p i n r e s p o n s e t o P G F 2 a i n s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s 1 5 3 X V I . T h e e f f e c t o f l o w c a l c i u m p e r i f u s i o n o n t h e r e s p o n s e o f s i n g l e r a t g r a n u l o s a c e l l s t o P G F 2 a 1 5 9 X V I I . T h e e f f e c t o f l o w c a l c i u m p e r i f u s i o n o n t h e r e s p o n s e o f s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s t o P G F 2 a 1 6 2 X V I I I . T h e e f f e c t o f c o n c u r r e n t a d m i n i s t r a t i o n o f G n R H a n d P G F 2 a o n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t g r a n u l o s a c e l l s 1 6 5 X I X . T h e e f f e c t o f c o n c u r r e n t a d m i n i s t r a t i o n o f G n R H a n d P G F 2 a o n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s 1 6 7 X X . T h e e f f e c t o f a d m i n i s t r a t i o n o f G n R H a n d P G F 2 a a t r e d u c e d t i m e i n t e r v a l s i n s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s . . . . 1 6 9 X X I . T h e e f f e c t o f G n R H a n d P G F 2 a a d m i n i s t r a t i o n d u r i n g P G F ? a p e r i f u s i o n o n a l t e r a t i o n s o f [ C a 2 + ] i i n i n d i v i d u a l r a t g r a n u l o s a a n d l u t e a l c e l l s 1 7 1 X X I I . T h e e f f e c t o f 8 - b r - c A M P o n e s t r a d i o l p r o d u c t i o n f r o m a n d r o s t e n e d i o n e a n d t e s t o s t e r o n e i n t e r m p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s 1 7 7 X X I I I . T h e e f f e c t o f 8 - b r - c A M P o n e s t r o n e p r o d u c t i o n f r o m x i i i P a g e a n d r o s t e n e d i o n e a n d t e s t o s t e r o n e i n t e r m p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s 1 7 9 X X I V . T h e e f f e c t o f 8 - b r - c A M P o n h P L , h C G a n d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m i n t e r m p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s 1 8 2 X X V . T h e e f f e c t o f 8 - b r - c A M P o n h P L , h C G a n d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n t h e a b s e n c e o f f e t a l b o v i n e s e r u m i n t e r m p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s 1 8 5 X X V I . T h e e f f e c t o f 8 - b r - c A M P o n e s t r a d i o l p r o d u c t i o n f r o m a n d r o s t e n e d i o n e , t e s t o s t e r o n e a n d d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e i n f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s w i t h a n d w i t h o u t 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m 1 9 0 X X V I I . T h e e f f e c t o f 8 - b r - c A M P o n e s t r o n e p r o d u c t i o n f r o m a n d r o s t e n e d i o n e , t e s t o s t e r o n e a n d d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e i n f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s w i t h a n d w i t h o u t 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m 1 9 5 X X V I I I . T h e e f f e c t o f 8 - b r - c A M P , a n d r o s t e n e d i o n e a n d t e s t o s t e r o n e a n d d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e o n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s w i t h a n d w i t h o u t 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m . 2 0 2 X X I X . T h e e f f e c t o f 8 - b r - c A M P , a n d r o s t e n e d i o n e a n d t e s t o s t e r o n e a n d d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e o n h P L p r o d u c t i o n i n f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s w i t h a n d w i t h o u t 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m . 2 0 6 X X X . T h e e f f e c t o f 8 - b r - c A M P , a n d r o s t e n e d i o n e , t e s t o s t e r o n e a n d d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e o n h C G p r o d u c t i o n i n f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s w i t h a n d w i t h o u t 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m 2 1 1 X X X I . T h e d u r a t i o n o f 8 - b r - c A M P e f f e c t o n h C G p r o d u c t i o n i n f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s 2 1 5 x i v L I S T O F F I G U R E S , P a g e 1 . T h e a d e n y l a t e c y c l a s e s e c o n d m e s s e n g e r p a t h w a y 2 2 . T h e i n o s i t o l p h o s p h a t e s e c o n d m e s s e n g e r p a t h w a y 5 3 . S t e r o i d b i o s y n t h e t i c p a t h w a y s i n t h e o v a r y , a n d t h e t w o -c e l l t y p e h y p o t h e s i s o f s t e r o i d h o r m o n e p r o d u c t i o n i n t h e o v a r y 2 9 4 . A s c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e i n t e r a c t i o n o f P G F 2 a a n d h C G o r L H i n r a t l u t e a l c e l l s 4 8 5 . A s c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f i n t e r a c t i o n s b e t w e e n G n R H , P G F 2 a a n d L H o r h C G i n r a t l u t e a l c e l l s 5 3 6 . T h e p a t t e r n o f h C G a n d h P L , a n d p r o g e s t e r o n e a n d e s t r o g e n p r o d u c t i o n b y t h e p l a c e n t a t h r o u g h o u t g e s t a t i o n . 6 9 7 . S t e r o i d o g e n e s i s i n t h e f e t a l - p l a c e n t a l u n i t 7 4 8 . A n i l l u s t r a t i o n o f e n d o c r i n e , p a r a c r i n e a n d a u t o c r i n e e f f e c t s d o c u m e n t e d i n t h e h u m a n p l a c e n t a 8 0 9 . T h e a p p a r a t u s u s e d f o r m e a s u r e m e n t o f [ C a 2 + ] i i n i n d i v i d u a l c e l l s 1 1 2 1 0 . T h e e f f e c t o f E G F o n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n b y r a t g r a n u l o s a c e l l s 1 1 8 1 1 . T h e e f f e c t o f P G F 2 a , G n R H a n d h C G o n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n r a t l u t e a l c e l l s 1 2 3 1 2 . T h e e f f e c t o f G n R H o n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t g r a n u l o s a c e l l s 1 2 7 1 3 . T h e e f f e c t o f G n R H o n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s . 1 2 8 1 4 . T h e e f f e c t o f c a l c i u m c h a n n e l b l o c k e r s o n G n R H s t i m u l a t e d i n c r e a s e i n i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m i n r a t g r a n u l o s a c e l l s 1 3 5 1 5 . T h e e f f e c t o f P G F 2 a o n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t g r a n u l o s a c e l l s . . . . V 1 4 0 1 6 . T h e e f f e c t o f P G F 2 a o n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s . 1 4 1 1 7 . T h e e f f e c t o f a d e c r e a s e i n t h e t i m e i n t e r v a l b e t w e e n a d m i n i s t r a t i o n s o f P G F 2 a a g o n i s t o n a l t e r a t i o n s i n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t g r a n u l o s a c e l l s 1 4 3 1 8 . T h e e f f e c t o f a d e c r e a s e i n t h e t i m e i n t e r v a l b e t w e e n a d m i n i s t r a t i o n s o f a g o n i s t o n a l t e r a t i o n s i n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s 1 4 5 1 9 . T h e e f f e c t o f P G F 2 a p e r i f u s i o n o n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t g r a n u l o s a c e l l s 1 4 7 2 0 . T h e e f f e c t o f P G F 2 a p e r i f u s i o n o n [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s 1 5 0 2 1 . A n i n v e s t i g a t i o n o f a d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p i n r e s p o n s e t o P G F 2 a i n s i n g l e r a t g r a n u l o s a c e l l s 1 5 2 2 2 . A n i n v e s t i g a t i o n o f a d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p i n r e s p o n s e t o P G F 2 a i n s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s 1 5 5 2 3 . T h e r e s p o n s e o f s i n g l e r a t g r a n u l o s a c e l l s t o G n R H a n d P G F 2 a 1 5 7 2 4 . T h e r e s p o n s e o f s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s t o G n R H a n d P G F 2 a 1 5 8 2 5 . T h e e f f e c t o f l o w c a l c i u m p e r i f u s i o n o n t h e r e s p o n s e o f s i n g l e r a t g r a n u l o s a c e l l s t o PGF- 1 6 0 2 6 . T h e e f f e c t o f l o w c a l c i u m p e r i f u s i o n o n t h e r e s p o n s e o f X V Page s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s t o PGF ? a 164 27. The e f f e c t o f c o n c u r r e n t a d m i n i s t r a t i o n o f GnRH and PGF 2 a on [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t g r a n u l o s a c e l l s 166 28. The e f f e c t o f c o n c u r r e n t a d m i n i s t r a t i o n o f GnRH and PGF 2 a on [ C a 2 + ] i i n s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s 168 29. The e f f e c t o f a d m i n i s t r a t i o n o f GnRH and PGF 2 a a t re d u c e d t i m e i n t e r v a l s i n s i n g l e r a t l u t e a l c e l l s 170 30. The e f f e c t o f GnRH a d m i n i s t r a t i o n d u r i n g PGF 2 a p e r i f u s i o n on a l t e r a t i o n s o f [ C a 2 + ] i i n i n d i v i d u a l r a t l u t e a l c e l l s 174 31. The e f f e c t o f PGF 2 a a d m i n i s t r a t i o n d u r i n g PGF ? a p e r i f u s i o n on a l t e r a t i o n s o f [ C a 2 + ] i i n i n d i v i d u a l r a t l u t e a l c e l l s 175 32. The e f f e c t o f 8-br-cAMP on e s t r a d i o l p r o d u c t i o n from a n d r o s t e n e d i o n e and t e s t o s t e r o n e i n t e r m p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s 178 33. The e f f e c t o f 8-br-cAMP on e s t r o n e p r o d u c t i o n from a n d r o s t e n e d i o n e and t e s t o s t e r o n e i n term p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s 180 34. The e f f e c t o f 8-br-cAMP on hPL, hCG and p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 10% f e t a l b o v i n e serum i n term p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s 184 35. The e f f e c t o f 8-br-cAMP on hPL, hCG and p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n t h e absence o f f e t a l b o v i n e serum i n term p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s 186 36. The e f f e c t o f 8-br-cAMP on e s t r a d i o l p r o d u c t i o n from a) a n d r o s t e n e d i o n e and t e s t o s t e r o n e and b) d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e i n f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s w i t h and w i t h o u t 10% f e t a l b o v i n e serum 194 37. The e f f e c t o f 8-br-cAMP on e s t r o n e p r o d u c t i o n from a) a n d r o s t e n e d i o n e and t e s t o s t e r o n e and b) d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e i n f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s w i t h and w i t h o u t 10% f e t a l b o v i n e serum 199 38. The e f f e c t o f 8-br-cAMP, a n d r o s t e n e d i o n e and t e s t o s t e r o n e and d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e on p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s w i t h and w i t h o u t 10% f e t a l b o v i n e serum...201 39. The e f f e c t o f 8-br-cAMP, a n d r o s t e n e d i o n e and t e s t o s t e r o n e and d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e on hPL p r o d u c t i o n i n f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s w i t h and w i t h o u t 10% f e t a l b o v i n e serum...205 40. The e f f e c t o f 8-br-cAMP, a n d r o s t e n e d i o n e , t e s t o s t e r o n e and d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e on hCG p r o d u c t i o n i n f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s w i t h and w i t h o u t 10% f e t a l b o v i n e serum 210 41. The d u r a t i o n o f 8-br-cAMP e f f e c t on hCG p r o d u c t i o n i n f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s 217 x v i L I S T O F A B B R E V I A T I O N S A 2 3 1 8 7 A C T H A A A C A D A - K i n a s e A N O V A A T P B A P T A 8 - b r - c A M P C a 2 + / C a m c A M P [ C a 2 + ] i co 2 c C R E DG D H E A D H E A S DMEM D N a s e E l E 2 E B S S E D T A E G F E G T A E R e s t r a d i o l F B S F G F F S H g G - p r o t e i n G s G i G n R H G T P h C G h P L H-7 I G F - 1 C a l i m y c i n a d r e n o c o r t i c o t r o p i c h o r m o n e a r a c h i d o n i c a c i d a d e n y l a t e c y c l a s e a n d r o s t e n e d i o n e c A M P d e p e n d a n t k i n a s e a n a l y s i s o f v a r i a n c e a d e n o s i n e t r i s p h o s p h a t e 1 , 2 - b i s ( 2 - a m i n o p h e n o x y ) e t h a n e N , N , N ' , N * - t e t r a a c e t i c a c i d 8 - b r o m o - c y c l i c a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e c a l c i u m c a l m o d u l i n c y c l i c a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m i o n c o n c e n t r a t i o n c a r b o n d i o x i d e d e g r e e s c e n t i g r a d e c A M P r e s p o n s e e l e m e n t d i a c y l g l y c e r o l d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e D u l b e c c o ' s m o d i f i e d E a g l e ' s m e d i u m d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d - a s e e s t r o n e e s t r a d i o l E a r l e ' s b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n e t h y l e n e d i a m i n e - t e t r a a c e t i c a c i d E p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r e t h y l e n e g l y c o l b i s ( A -a m i n o e t h y l e t h e r ) - N , N ' -t e t r a a c e t i c e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m 1 7 / 3 - e s t r a d i o l f e t a l b o v i n e s e r u m f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r f o l l i c l e s t i m u l a t i n g h o r m o n e g r a v i t a t i o n a l f o r c e u n i t s G T P b i n d i n g p r o t e i n s t i m u l a t o r y G - p r o t e i n i n h i b i t o r y G - p r o t e i n g o n a d o t r o p i n r e l e a s i n g h o r m o n e g u a n o s i n e t r i s p h o s p h a t e h u m a n c h o r i o n i c g o n a d o t r o p i n h u m a n p l a c e n t a l l a c t o g e n o q u i n o l i n e s u l f o n a m i d e k i n a s e i n h i b i t o r i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r 1 x v i i I n s P i n o s i t o l p h o s p h a t e I n s ( l , 4 ) P 2 i n o s i t o l b i s p h o s p h a t e I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 i n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e I n s ( l , 3 , 4 , 5 ) P 4 i n o s i t o l 1 , 3 , 4 , 5 - t e t r a p h o s p h a t e I U i n t e r n a t i o n a l u n i t s L H l u t e i n i z i n g h o r m o n e M 1 9 9 m e d i u m 1 9 9 MEM m i n i m u m e s s e n t i a l m e d i u m M g m i c r o g r a m mg m i l l i g r a m m L m i l l i l i t r e mM m i l l i m o l a r N a H C 0 3 s o d i u m b i c a r b o n a t e n M n a n o m o l a r nm n a n o m e t e r % p e r c e n t P 4 p r o g e s t e r o n e P 5 p r e g n e n o l o n e P A p h o s p h a t i d i c a c i d P D G F p l a t e l e t d e r i v e d g r o w t h f a c t o r P G p r o s t a g l a n d i n P I - P L C p h o s p h o i n o s i t i d e - p h o s p h o l i p a s e n P L A 2 \— p h o s p h o l i p a s e A 2 P K C p r o t e i n k i n a s e C P L C p h o s p h o l i p a s e C P M S G p r e g n a n t m a r e ' s s e r u m g o n a d o t r o p i n s P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 4 , 5 -b i s p h o s p h a t e r p m r e v o l u t i o n s p e r m i n u t e R i i n h i b i t o r y r e c e p t o r R s s t i m u l a t o r y r e c e p t o r T G F t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r T P A p h o r b o l - 1 2 - m y r i s t a t e - 1 3 - a c e t a t e x v i i i A C K N O W L E D G E M E N T S I w o u l d l i k e t o t h a n k D r . P . C . K . L e u n g f o r f i n a n c i a l s u p p o r t a n d f o r s u p e r v i s i n g t h i s p r o j e c t . T h a n k s a r e a l s o d u e t o D r . D . C h i t a y a t , D r . S . H u d s o n a n d S u z a n n e L e u n g w h o h e l p e d me o b t a i n s a m p l e s o f h u m a n t i s s u e . T h a n k s t o D r . J i a n W a n g w h o t a u g h t me g r a n u l o s a c e l l c u l t u r e , R I A a n d m i c r o s p e c t r o f l u o r i m e t r y , a n d D r . J o A n n e B e n o i t w h o t a u g h t me p l a c e n t a c e l l c u l t u r e . T h a n k s a l s o t o D r . K . G . B a i m b r i d g e f o r u s e o f t h e s p e c t r o m i c r o f l u o r i m e t r y e q u i p m e n t a n d f o r v a l u a b l e q u e s t i o n s a n d s u g g e s t i o n s . T h a n k a l s o t o D r . J . F . S t r a u s s , I I I , a n d D r . M . I w a s h i t a a n d M . W a t a n a b e w h o t a u g h t me m o r e a b o u t p l a c e n t a c e l l c u l t u r e . O t h e r s d u e r e c o g n i t i o n i n c l u d e : D r . H u g o B e r g e n , V e r a L e e , a n d my f a m i l y , w h o p r o v i d e d m o r a l a n d a d d i t i o n a l f i n a n c i a l s u p p o r t w i t h o u t w h i c h s o m e o f t h i s w o r k w o u l d n o t h a v e b e e n d o n e . T h a n k y o u t o a l l . T h a n k y o u t o my t h e s i s c o m m i t t e e , D r . A . P e r k s , D r . D . R u r a k , a n d D r . B . H o Y u e n , a n d t o my e x a m i n i n g c o m m i t t e e , e s p e c i a l l y D r . F . L e d w i t z - R i g b y w h o d i r e c t e d t h e f i n a l c o r r e c t i o n s . 1 INTRODUCTION T h i s i n t r o d u c t i o n i n c l u d e s an o v e r v i e w o f i n t r a c e l l u l a r s i g n a l t r a n s d u c t i o n mechanisms w h i c h f u n c t i o n i n o v a r i a n and p l a c e n t a l c e l l s and an o v e r v i e w o f o v a r i a n and p l a c e n t a l e n d o c r i n o l o g y . I . I n t r a c e l l u l a r S i g n a l T r a n s d u c t i o n The m u l t i p l e e n d o c r i n e , p a r a c r i n e , a u t o c r i n e and i n t r a c r i n e r e g u l a t o r s w h i c h c o n t r o l hormonal p r o d u c t i o n and o v u l a t i o n i n t h e o v a r y have t h e i r e f f e c t s t h r o u g h s e v e r a l i n t r a c e l l u l a r s i g n a l t r a n s d u c t i o n mechanisms. A c t i v i t y o f t h e c y c l i c a d e n o s i n e monophosphate (cAMP) system, t h e i n o s i t o l phosphate system, and t h e a r a c h i d o n i c a c i d system has been demonstrated i n t h e o v a r y . A l t h o u g h t h e e n d o c r i n e , p a r a c r i n e , a u t o c r i n e and i n t r a c r i n e c o n t r o l s o f p l a c e n t a l f u n c t i o n have n o t been as e x t e n s i v e l y s t u d i e d , t h e r e i s e v i d e n c e f o r t h e a c t i v i t y o f t h e a d e n y l a t e c y c l a s e , i n o s i t o l phosphate and a r a c h i d o n i c a c i d second messenger systems i n t h e p l a c e n t a . The f o l l o w i n g i s a b r i e f r e v i e w o f t h e s e i n t r a c e l l u l a r s i g n a l t r a n s d u c t i o n mechanisms. A. The a d e n y l a t e c y c l a s e system The a d e n y l a t e c y c l a s e system c o n s i s t s o f c e l l s u r f a c e bound r e c e p t o r s , g u anine t r i s p h o s p h a t e (GTP) b i n d i n g - p r o t e i n s (G-p r o t e i n s ) and a d e n y l a t e c y c l a s e ( f i g u r e 1). R e c e p t o r s a r e 2 F i g u r e 1. The a d e n y l a t e c y c l a s e second messenger pathway. T h i s f i g u r e r e p r e s e n t s t h e a d e n y l a t e c y c l a s e second messenger pathway i n t h e a d r e n e r g i c system. S t i m u l a t o r y and i n h i b i t o r y r e c e p t o r s (Rs and R i , r e s p e c t i v e l y ) and G - p r o t e i n s (Gs and G i ) a r e i n v o l v e d i n s i g n a l t r a n s d u c t i o n . The a g o n i s t b i n d s t o t h e r e c e p t o r s , t h e n i s c o u p l e d t o a d e n y l a t e c y c l a s e (AC) t h r o u g h G - p r o t e i n s . I n h i b i t o r y e f f e c t s a r e i n d i c a t e d by t h e h a t c h e d a r r o w s . G - p r o t e i n s r e q u i r e g u a nine t r i p h o s p h a t e (GTP) t o c o u p l e t h e r e c e p t o r t o AC. AC c l e a v e s a d e n o s i n e t r i s p h o s p h a t e (ATP) t o form c y c l i c a d e n o s i n e monophosphate (cAMP) and cAMP may b i n d t o and a c t i v a t e cAMP-dependant k i n a s e ( A - k i n a s e ) , by i n d u c i n g s e p a r a t i o n o f r e g u l a t o r y (R) and c a t a l y t i c (C) s u b u n i t s . C y c l i c AMP remains bound t o t h e r e g u l a t o r y s u b u n i t . The c a t a l y t i c s u b u n i t p h o s p h o r y l a t e s i n a c t i v e p r o t e i n s ( P r o t e i n i ) c o n v e r t i n g them t o a c t i v e p r o t e i n s ( P r o t e i n a) . No i n h i b i t o r y r e c e p t o r s o r G - p r o t e i n s have been found i n o v a r i a n c e l l s . 3 c o u p l e d t o a d e n y l a t e c y c l a s e b y G - p r o t e i n s . G u a n i n e t r i s p h o s p h a t e ( G T P ) , t h e p h y s i o l o g i c a l r e g u l a t o r o f a d e n y l a t e c y c l a s e , b i n d s t o t h e G - p r o t e i n a n d m o d u l a t e s t h e b i n d i n g a f f i n i t y o f h o r m o n e r e c e p t o r s . A d e n y l a t e c y c l a s e i s a m e m b r a n e b o u n d e n z y m e i n t h e p l a s m a m e m b r a n e ( S t a d e l a n d L e f k o w i t z , 1 9 8 9 ) , w h i c h c l e a v e s c A M P f r o m a d e n o s i n e t r i s p h o s p h a t e ( A T P ) w h e n a g o n i s t s b i n d t o r e c e p t o r s a n d t h e s e r e c e p t o r s a r e c o u p l e d t o a d e n y l a t e c y c l a s e b y t h e G T P - a c t i v a t e d G - p r o t e i n . T h e a c t i v i t y o f t h e g o n a d o t r o p i n s , l u t e i n i z i n g h o r m o n e ( L H ) a n d f o l l i c l e - s t i m u l a t i n g h o r m o n e ( F S H ) i s t r a n s d u c e d t h r o u g h a c t i v a t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e a n d g e n e r a t i o n o f c y c l i c a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e ( c A M P ) ( G o f f a n d A r m s t r o n g , 1 9 7 7 ) . R e c e p t o r s f o r F S H a n d L H h a v e r e c e n t l y b e e n c l o n e d ( M c F a r l a n d e t a l . , 1 9 8 9 a n d S p r e n g e l e t a l . , 1 9 9 0 ) . I n c o n t r a s t t o t h e a d r e n e r g i c s y s t e m , w h i c h h a s s t i m u l a t o r y a n d i n h i b i t o r y r e c e p t o r s a n d G - p r o t e i n s , o n l y s t i m u l a t o r y r e c e p t o r s a n d o n l y o n e G - p r o t e i n ( s t i m u l a t o r y , b u t n o t n e c e s s a r i l y t h e s a m e s t i m u l a t o r y G - p r o t e i n a s s o c i a t e d w i t h t h e a d r e n e r g i c r e c e p t o r s ) a p p e a r t o e x i s t i n t h e o v a r y ( N i s w e n d e r a n d N e t t , 1 9 8 8 ) . O n c e p r o d u c e d , c A M P m a y a c t i v a t e c A M P d e p e n d a n t ( A - ) k i n a s e . A f t e r b i n d i n g t o t h e A - k i n a s e r e g u l a t o r y s u b u n i t , t h e c A M P : r e g u l a t o r y s u b u n i t c o m p l e x m a y i n t e r a c t w i t h DNA a t c A M P r e s p o n s e e l e m e n t s ( C R E ) , o r a c t i v a t e d A - k i n a s e m a y p h o s p h o r y l a t e t r a n s - a c t i n g f a c t o r s w h i c h i n t e r a c t w i t h C R E . C y c l i c A M P ( c A M P r e q u i r e s A - k i n a s e f o r a l l o f i t ' s a c t i o n s ) m a y a l s o h a v e d i r e c t a c t i o n s a t t h e p o s t - t r a n s l a t i o n a l l e v e l ( K u r t e n a n d R i c h a r d s , 1 9 8 9 a n d S t r a u s s e t a l . , 1 9 8 8 ) . 4 B. The i n o s i t o l phosphate system Hormones e f f e c t i v e i n t h e o v a r y a l s o work by p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 4 , 5-bisphosphate ( P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 ) breakdown ( D a v i s e t a l . 1981, 1983a,b, 1984a,b, 1986a,b; Naor and Y a v i n 1982; Leung, 1985; M i n e g i s h i and Leung, 1985a; Ma and Leung, 1985; Leung e t a l . , 1986, and Leung and Wang, 1989a,b), a second messenger system o r i g i n a l l y d e s c r i b e d i n p a n c r e a t i c c e l l s ( H o k i n and H o k i n , 1953). The i n o s i t o l phosphate system i s composed o f r e c e p t o r s , G - p r o t e i n s , p h o s p h o l i p a s e C and p r o t e i n k i n a s e C (PKC) ( f i g u r e 2 ) . A f t e r a g o n i s t b i n d i n g t o c e l l - s u r f a c e r e c e p t o r s , and c o u p l i n g o f r e c e p t o r t o p h o s p h o l i p a s e C t h r o u g h GTP a c t i v a t e d G-p r o t e i n s , p h o s p h o l i p a s e C m e t a b o l i z e s P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 i n t o d i a c y l g l y c e r o l (DG) and i n o s i t o l phosphates ( I n s P ) . D i a c y l g l y c e r o l a c t i v a t e s PKC; t h e I n s P s , i n o s i t o l 1,4,5-t r i s p h o s p h a t e (Ins(1,4,5)P 3) and i n o s i t o l ( 1 , 3 , 4 , 5 ) -t e t r a p h o s p h a t e ( I n s ( l , 3 , 4 , 5 ) P 4 ) , i n c r e a s e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m . A c t i v a t e d PKC p h o s p h o r y l a t e s p r o t e i n s and i n c r e a s e d i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m may a c t i v a t e t h e c a l c i u m / c a l m o d u l i n (Ca 2 +/Cam) dependent k i n a s e . 1. System components: a. R e c e p t o r s and G - p r o t e i n s G u a n i d i n e n u c l e o t i d e analogues s t i m u l a t e t h e m e t a b o l i s m o f P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 t o DG and I n s P . F l u o r i d e i o n s , w h i c h a c t i v a t e g u a n i n e n u c l e o t i d e - b i n d i n g p r o t e i n s ( G - p r o t e i n s ) , a l s o s t i m u l a t e 5 F i g u r e 2 . T h e i n o s i t o l p h o s p h a t e s e c o n d m e s s e n g e r p a t h w a y . T h e a g o n i s t b i n d s t o t h e r e c e p t o r (R ) a n d i s c o u p l e d t o p h o s p h o l i p a s e C ( P L C ) b y a G - p r o t e i n (G) w h i c h i s d e p e n d a n t o n g u a n i n e t r i s p h o s p h a t e ( G T P ) f o r i t s a c t i v i t y . T h e s u b s t r a t e f o r P L C i s p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l 4 , 5 - b i s p h o s p h a t e ( P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 ) . P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 i s b r o k e n d o w n i n t o d i a c y l g l y c e r o l (DG) w h i c h a c t i v a t e s p r o t e i n k i n a s e C ( P K C ) a n d i n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e ( I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 ) , w h i c h c a u s e s t h e r e l e a s e o f c a l c i u m f r o m t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( E R ) . A c t i v a t e d P K C a n d a c t i v a t e d c a l c i u m / c a l m o d u l i n d e p e n d a n t k i n a s e ( C a 2 + / C a m k i n a s e ) a c t i v a t e p r o t e i n s b y p h o s p h o r y l a t i n g t h e m . 6 t h e f o r m a t i o n o f I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 . T h i s s u g g e s t s t h a t i n t h e i n o s i t o l l i p i d t r a n s d u c t i o n s y s t e m , a s i n t h e a d e n y l a t e c y c l a s e t r a n s d u c t i o n s y s t e m , t h e a g o n i s t r e c e p t o r i s c o u p l e d t o t h e a c t i v a t i n g e n z y m e b y a G - p r o t e i n ( B e r r i d g e , 1 9 8 7 ) . I n t h e b o v i n e p i t u i t a r y , a t l e a s t , t h e G n R H r e c e p t o r ' s i n t e r a c t i o n w i t h a G -p r o t e i n h a s b e e n d e m o n s t r a t e d ( P e r r i n e t a l . , 1 9 8 9 ) . b . P h o s p h o l i p a s e C T h e p h o s p h o d i e s t e r a s e w h i c h m e t a b o l i z e s P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 i s a p h o s p h o l i p a s e C ( P L C ) . A t l e a s t 7 p h o s p h o i n o s i t i d e - p h o s p h o l i p a s e C s ( P I - P L C ) i s o e n z y m e s h a v e b e e n p u r i f i e d a n d c h a r a c t e r i z e d . T h e y a p p e a r t o d i f f e r i n t i s s u e d i s t r i b u t i o n a n d i n c a l c i u m s e n s i t i v i t y . I n e a c h t i s s u e s t u d i e d , t h e r e a r e m u l t i p l e P I - P L C i s o e n z y m e s ( C r o o k e a n d B e n n e t t , 1 9 8 9 ) . c . S u b s t r a t e : i n o s i t o l l i p i d s I n o s i t o l l i p i d s m a k e u p l e s s t h a n 1 0 % o f t h e p h o s p h o l i p i d s i n t h e p l a s m a l e m m a ( H o k i n , 1 9 8 5 ) , t h e p e r c e n t a g e c o m p o s i t i o n v a r i e s w i t h t i s s u e a n d s p e c i e s ( V o e l k e r , 1 9 8 5 ) . P h o s p h a t i d y l i n o s i t o l i s u n i q u e a m o n g p h o s p h o l i p i d s b e c a u s e i t c a n u n d e r g o a d d i t i o n a l p h o s p h o r y l a t i o n ( B e r r i d g e , 1 9 8 7 , a n d B e r r i d g e e t a l . , 1 9 8 8 ) . A b o u t 6 0 % o f t h e P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 , i s i n a h o r m o n e s e n s i t i v e p o o l . W h e n a G - p r o t e i n l i n k e d r e c e p t o r i s o c c u p i e d b y a n a g o n i s t , P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 i s b r o k e n d o w n b y a P I - P L C i n t o DG a n d I n s P . A t l e a s t 2 0 i n o s i t o l p h o s p h a t e s e x i s t ( I r v i n e e t a l . , 1 9 8 8 ) h o w e v e r o n l y I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 a n d I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 h a v e d e m o n s t r a t e d s e c o n d m e s s e n g e r a c t i o n s ( s e e b e l o w ) . I n o s i t o l 7 phosphates a r e f i n a l l y m e t a b o l i z e d t o i n o s i t o l , w h i c h , w i t h c y t i d i n e - 5 1 - d i p h o s p h o - 1 . 2 - d i a c y l - s n - g l y c e r o l i s used t o r e f o r m p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l , p h o s p h a t i d y l 4-phosphate and f i n a l l y P t d l n s (4,5) P 2. d. P r o t e i n k i n a s e C P r o t e i n k i n a s e C (PKC) can be a c t i v a t e d by DG o r c a l c i u m , i f c a l c i u m i s i n h i g h enough c o n c e n t r a t i o n , and p h o r b o l e s t e r s ( N i s h i z u k a e t a l . , 1984). The a c t i v a t i o n o f PKC by DG i s dependent on p h o s p h o l i p i d s and on c a l c i u m . The i n a c t i v e form o f PKC i s t i g h t l y a s s o c i a t e d w i t h t h e c y t o s o l ; upon a c t i v a t i o n PKC moves f u r t h e r i n t o t h e plasma membrane ( N i s h i z u k a 1984, 1986). P r o t e i n KC may a l s o be a c t i v a t e d by c a l c i u m w h i c h e n t e r s t h e c e l l v i a v o l t a g e dependent c a l c i u m c h a n n e l s ( B r o c k l e h u r s t e t a l . , 1985). S e v e r a l s u b s p e c i e s o f PKC have been i d e n t i f i e d . They may be d i s t r i b u t e d d i f f e r e n t l y i n p a r t i c u l a r c e l l t y p e s and have l i m i t e d i n t r a c e l l u l a r l o c a t i o n s . P r o t e i n KC p r o t e i n s a r e d e r i v e d from m u l t i p l e genes and a l t e r n a t i v e s p l i c i n g o f s i n g l e RNA t r a n s c r i p t s . They a r e d i f f e r e n t i n modes o f a c t i v a t i o n , i n s e n s i t i v i t y t o c a l c i u m and i n c a t a l y t i c a c t i v i t y towards endogenous s u b s t r a t e s (Kikkawa e t a l . , 1989). P r o t e i n KC has been found i n o v a r i a n ( D a v i s and C l a r k , 1983; S h i n o h a r a e t a l . , 1984; V e l d h u i s and Demers, 1986, and Noland and Dimino, 1986) and p l a c e n t a l ( T e r t r i n - C l a r y , C. e t a l . , 1990) t i s s u e s . e. I n t r a c e l l u l a r c a l c i u m s t o r a g e S t u d i e s have d e t e r m i n e d t h a t t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m i s 8 m o r e l i k e l y t h a n t h e m i t o c h o n d r i a t o b e t h e s i t e o f I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 r e l e a s a b l e c a l c i u m s t o r e s ( A b d e l - L a t i f , 1 9 8 6 ) , h o w e v e r r e c e n t e v i d e n c e s u g g e s t s d i s t i n c t o r g a n e l l e s c a l l e d c a l c i o s o m e s m a y b e t h e s i t e o f I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 r e l e a s a b l e c a l c i u m . C a l c i o s o m e s c o -p u r i f y w i t h I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 r e l e a s a b l e c a l c i u m s t o r e s a n d c o n t a i n c a l s e q u e s t r i n w h i c h i s a c a l c i u m b i n d i n g p r o t e i n . C a l c i u m - A T P a s e h a s a l s o b e e n f o u n d t o b e a s s o c i a t e d w i t h t h e c a l c i o s o m e ( H a s h i m o t o e t a l . , 1 9 8 8 ) . B i o c h e m i c a l , c e l l f r a c t i o n a t i o n , m o r p h o l o g i c a l a n d i m m u n o c h e m i c a l s t u d i e s s u g g e s t t h a t t h e s e o r g a n e l l e s a r e d i s t i n c t f r o m , a n d f r e e f r o m c o n t a c t w i t h , o t h e r i n t r a c e l l u l a r o r g a n e l l e s , h o w e v e r t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e c a l c i o s o m e i s a s p e c i a l i z e d p a r t o f a n o t h e r o r g a n e l l e s u c h a s t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m h a s n o t b e e n e x c l u d e d . S o f a r c a l c i o s o m e s h a v e b e e n s t u d i e d o n l y i n n e u t r o p h i l s a n d a r e l a t e d c e l l l i n e ( H L - 6 0 ) ( r e v i e w e d b y K r a u s e e t a l . , 1 9 8 9 ) . 2 . S e c o n d m e s s e n g e r s p r o d u c e d a . D i a c y l g l y c e r o l a s a s e c o n d m e s s e n g e r D i a c y l g l y c e r o l a c t i v a t e s m e m b r a n e a s s o c i a t e d P K C w h i c h r e s u l t s i n a t r a n s l o c a t i o n o f P K C i n t o t h e c y t o s o l ( N i s h i z u k a 1 9 8 4 , 1 9 8 6 ) . P r o t e i n K C r e q u i r e s c a l c i u m a n d p h o s p h o l i p i d f o r m a x i m a l a c t i v i t y ( K i s h i m o t o e t a l . , 1 9 8 0 ) . A f t e r a c t i v a t i o n , P K C p h o s p h o r y l a t e s a n d a c t i v a t e s p r o t e i n s ( N i s h i z u k a 1 9 8 4 , 1 9 8 6 ) . O n e o f t h e p r o t e i n s p h o s p h o r y l a t e d b y P K C i s S C P 2 w h i c h i s a s t e r o l c a r r i e r r e s p o n s i b l e f o r t r a n s p o r t a t i o n o f c h o l e s t e r o l t o t h e i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e ( S t e i n s c h n e i d e r e t a l . , 1 9 8 9 ) . 9 D i a c y l g l y c e r o l - a c t i v a t e d P K C m a y a l s o f u n c t i o n a s p a r t o f a n e g a t i v e f e e d b a c k m e c h a n i s m i n P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 h y d r o l y s i s . A c c o r d i n g t o t h e m o d e l o f C o b b o l d e t a l . ( 1 9 8 8 ) , n e g a t i v e f e e d b a c k r e s u l t s f r o m P K C p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e r e c e p t o r a n d t h e G - p r o t e i n , d e c r e a s i n g t h e a c t i v i t y o f P L C . P h o r b o l e s t e r s s u c h a s 1 2 - 0 - t e t r a d e c a n o y l p h o r b o l - 1 3 - a c e t a t e ( T P A ) a n d p e r m e a n t d i a c y l g l y c e r o l s , s u c h a s d i o c t a n y l g l y c e r o l a n d l - o l e o y l - 2 - a c e t o y l - s n - 3 - g l y c e r o l , c a n a c t i v a t e P K C d i r e c t l y ( C a s t a g n a e t a l . , 1 9 8 2 ; N i s h i z u k a , 1 9 8 4 ; K a w a i e t a l . , 1 9 8 5 , a n d K r a f t e t a l . , 1 9 8 2 ) . b . I n o s i t o l p h o s p h a t e s a s s e c o n d m e s s e n g e r s T h e r e a r e o v e r 2 0 i n o s i t o l p h o s p h a t e s , h o w e v e r , o n l y I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 h a s a f i r m l y e s t a b l i s h e d r o l e a s a s e c o n d m e s s e n g e r . T h e r e i s e v i d e n c e t h a t I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 a l s o h a s a r o l e a s a s e c o n d m e s s e n g e r ( I r v i n e e t a l . , 1 9 8 8 ) . 1 . I n o s i t o l ( 1 , 4 . 5 ) t r i p h o s p h a t e I n o s i t o l ( 1 , 4 , 5 ) P 3 i s a m e d i a t o r o f i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m m o b i l i z a t i o n ( B u r g e s s e t a l . , 1 9 8 4 ; N i s h i z u k a , 1 9 8 4 ; B e r r i d g e , 1 9 8 4 , a n d B e r r i d g e a n d I r v i n e , 1 9 8 4 ) . I n o s i t o l ( 1 , 4 , 5 ) P 3 b i n d s t o s p e c i f i c r e c e p t o r s a t h o r m o n e r e l e a s a b l e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m s t o r e s , a n d c a u s e s a n i n c r e a s e i n i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m ( [ C a 2 + ] i ) ( r e v i e w e d b y B e r r i d g e , 1 9 8 4 a n d 1 9 8 7 ) . T h e I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 r e c e p t o r i n m i c e a n d r a t s h a s b e e n s e q u e n c e d ( n u c l e o t i d e s a n d t r a n s l a t e d a m i n o a c i d s ) ( F u r u i c h i , e t a l . , 1 9 8 9 ; M i g n e r y , e t a l . , 1 9 9 0 ) . I n o s i t o l ( 1 , 4 , 5 ) P 3 m a y a l s o c a u s e o p e n i n g o f e n d o p l a s m i c 1 0 r e t i c u l u m ( E R ) a s s o c i a t e d c h a n n e l s a t t h e p l a s m a l e m m a ( S p a t e t a l . , 1 9 8 6 ) . P u t n e y ( 1 9 8 6 ) h y p o t h e s i z e s t h a t I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 m a y i n f l u e n c e c a l c i u m e n t r y i n t o t h e c e l l b y e m p t y i n g i n t r a c e l l u l a r s t o r e s o f c a l c i u m . T h e E R w h i c h i s c l o s e t o t h e p l a s m a l e m m a , o n c e d e p l e t e d o f c a l c i u m , m a y b e r e l o a d e d w i t h c a l c i u m e n t e r i n g f r o m t h e e x t r a c e l l u l a r s p a c e , w h i c h P u t n e y s a y s o c c u r s w i t h o u t c h a n g i n g [ C a 2 + ] i l e v e l s . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h t h e E R c h a n g e s t h e p l a s m a l e m m a p e r m e a b i l i t y i s n o t k n o w n ( P u t n e y , 1 9 8 6 ) . 2 . I n o s i t o l ( 1 . 3 . 4 , 5 ) t e t r a p h o s p h a t e I n o s i t o l ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 w a s d i s c o v e r e d b y B a t t y e t a l . , i n 1 9 8 5 . I t i s d e r i v e d d i r e c t l y f r o m I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 ( I r v i n e e t a l . , 1 9 8 8 ) a n d i s r a p i d l y m e t a b o l i z e d i n s t i m u l a t e d t i s s u e s . T h e f u n c t i o n o f I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 m a y b e i n t h e r e l o a d i n g o f i n t r a c e l l u l a r I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 - s e n s i t i v e c a l c i u m p o o l s ( I r v i n e a n d M o o r , 1 9 8 7 ; I r v i n e , 1 9 8 7 ) . T h i s a c t i o n w a s o r i g i n a l l y d e s c r i b e d i n s e a u r c h i n e g g s a n d h a s s i n c e b e e n s e e n i n c e l l s f r o m m o u s e l a c r i m a l g l a n d s , a n d p i t u i t a r y m e m b r a n e p r e p a r a t i o n s ( I r v i n g e t a l . , 1 9 8 8 ) . I n o s i t o l ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 m a y a l s o m o d u l a t e I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 ' s m o b i l i z a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m . I r v i n g e t a l . ( 1 9 8 8 ) s u g g e s t t h a t I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 m a y b e t h e c o n t r o l l i n g f a c t o r f o r t h e p a s s a g e o f c a l c i u m t h r o u g h d i f f e r e n t i n t r a c e l l u l a r c o m p a r t m e n t s ( p o s s i b l y t h e p l a s m a l e m m a a n d t h e E R ) f o r w h i c h G T P i s n e c e s s a r y ( s e e I r v i n e e t a l . , 1 9 8 8 f o r r e v i e w ) . I n o s i t o l ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 m a y a l s o c o n t r o l t h e s i z e o f t h e c a l c i u m p o o l w h i c h i s r e s p o n s i v e t o I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 , t h r o u g h e n t r y o f e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m a t t h e p l a s m a l e m m a a n d t h r o u g h c a l c i u m t r a n s p o r t t h r o u g h o u t t h e c e l l . S e p a r a t i o n o f c a l c i u m p o o l s i n t h e c e l l h a s b e e n d e m o n s t r a t e d ; I n s ( l , 3 , 4 , 5 ) P 4 m a y f u n c t i o n a l l y u n i t e t h e E R , w h i c h i s t h e m a j o r s o u r c e o f c a l c i u m w i t h i n t h e c e l l , t o t h e I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 - s e n s i t i v e c a l c i u m s t o r e s ( I r v i n e , 1 9 8 9 ) . A n o t h e r t h e o r y s u g g e s t s t h a t I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 a c t s a t t h e p l a s m a l e m a t o o p e n m e m b r a n e c a l c i u m c h a n n e l s a n d a l l o w i n f l u x o f e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m i n t o t h e c e l l ( H a n s e n e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e p r e c i s e s i t e o f a c t i o n a n d m e c h a n i s m o f a c t i o n a r e n o t y e t k n o w n . I t i s p o s s i b l e t h a t I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 f u n c t i o n s b o t h a t t h e p l a s m a m e m b r a n e a n d a t i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m s t o r e s ( P e t e r s e n , 1 9 8 9 , a n d I r v i n e , 1 9 8 9 ) . c . C a l c i u m a s a s e c o n d m e s s e n g e r C a l c i u m i s e s s e n t i a l i n c e l l u l a r h o m e o s t a s i s . E n t r y o f c a l c i u m i n t o t h e c e l l i s p r e c i s e l y c o n t r o l l e d a t t h e p l a s m a l e m m a b y g a t e d c a l c i u m c h a n n e l s , t h e s o d i u m - c a l c i u m e x c h a n g e r , w h i c h i s a c t i v e p r i m a r i l y i n e x c i t a b l e t i s s u e , a n d c a l c i u m A T P a s e ( C a r a f o l i , 1 9 8 7 , 1 9 8 8 a , b ) . T h e p r e s e n c e o f v o l t a g e d e p e n d e n t o r r e c e p t o r o p e r a t e d c a l c i u m c h a n n e l s h a s b e e n d o c u m e n t e d i n m a n y c e l l t y p e s ( H o s e y a n d L a z d u n s k i , 1 9 8 8 ) . T h e r e a r e t h r e e m a i n t y p e s o f v o l t a g e d e p e n d e n t c a l c i u m c h a n n e l s : L o r l o n g a c t i n g , N o r i n t e r m e d i a t e a c t i n g a n d T o r t r a n s i e n t a c t i n g a n d t h e r e a r e p r o b a b l y s u b t y p e s o f e a c h c h a n n e l . B l o c k e r s a r e a v a i l a b l e f o r t h e L a n d N c a l c i u m c h a n n e l s ( H o s e y a n d L a z d u n s k i , 1 9 8 8 ) a n d p o s s i b l y T c h a n n e l s ( S h a n e t a l . , 1 9 8 8 ) . A s w e l l , t h e r e a r e r e c e p t o r o p e r a t e d c a l c i u m c h a n n e l s . E x a m p l e s o f h o r m o n e s w h i c h u s e r e c e p t o r o p e r a t e d c a l c i u m c h a n n e l s a r e v a s o p r e s s i n a n d p a r a t h y r o i d h o r m o n e s ( H o s e y a n d L a z d u n s k i 1 9 8 9 ) . I n d i r e c t e v i d e n c e , f r o m t h e u s e o f c a l c i u m c h a n n e l b l o c k e r s a n d m e a s u r e m e n t o f p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e , f o r t h e p r e s e n c e o f v o l t a g e d e p e n d a n t c a l c i u m c h a n n e l s h a s b e e n s e e n i n o v i n e l u t e a l c e l l s ( H i g u c h i e t a l . , 1 9 7 6 ) a n d p o r c i n e g r a n u l o s a c e l l s ( V e l d h u i s a n d K l a s e , 1 9 8 2 a , b ) , b u t n o t i n r a t l u t e a l c e l l s ( G o r e a n d B e h r m a n , 1 9 8 4 ) . S c h w a r t z e t a l . , 1 9 8 9 h a v e b e e n a b l e t o d e t e r m i n e d i r e c t l y , u s i n g t h e p a t c h c l a m p t e c h n i q u e , t h a t t h e r e a r e T a n d L c a l c i u m c h a n n e l s o n c h i c k e n g r a n u l o s a c e l l s . T h e s e c o n d m e s s e n g e r r o l e o f c a l c i u m i s i m p o r t a n t i n m a n y c e l l t y p e s ( R a s s m u s s e n a n d B a r r e t t , 1 9 8 4 ) . I n o r d e r t o s t u d y t h e e f f e c t o f c a l c i u m o n t h e a c t i v i t y o f a g o n i s t s , v a r i o u s a g e n t s h a v e b e e n u s e d t o a l t e r t h e e x t r a c e l l u l a r a n d i n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n s o f c a l c i u m . E x t r a c e l l u l a r c a l c i u m c a n b e a l t e r e d b y u s i n g a l o w c a l c i u m m e d i u m t o c u l t u r e c e l l s , a n d / o r b y a d d i n g a c a l c i u m c h e l a t i n g a g e n t t o t h e m e d i u m . I n t r a c e l l u l a r c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n s m a y b e a l t e r e d u s i n g c a l c i u m i o n o p h o r e s s u c h a s A 2 3 1 8 7 , s t a b l e I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 a n a l o g u e s o r i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m c h e l a t o r s s u c h a s B A P T A ( 1 , 2 - b i s ( 2 - a m i n o p h e n y o x y ) e t h a n e N , N , N ' , N ' - t e t r a a c e t i c a c i d ) . C a l c i u m i o n o p h o r e s a l l o w c a l c i u m m o v e m e n t b y f o r m a t i o n o f s y n t h e t i c c h a n n e l s . T h e s e c h a n n e l s a r e g e n e r a t e d f r o m l i n e a r i o n o p h o r e s w h i c h c y c l i z e i n t h e p r e s e n c e o f a p p r o p r i a t e c a t i o n s , t h a n s t a c k t o f o r m c h a n n e l s i n m e m b r a n e s ( B o w m a n e t a l . , 1 9 7 7 ) . 1 . M e a s u r e m e n t o f c h a n g e s i n [ C a 2 * ] ! T h e r e c e n t d e v e l o p m e n t o f f l u o r e s c e n t c a l c i u m i n d i c a t o r s s u c h a s Q u i n - 2 , I n d o - 1 a n d F u r a - 2 h a s e n a b l e d i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y i n m e a s u r i n g [ C a ] i . T h e s e i n d i c a t o r s a r e d e r i v a t i v e s o f e t h y l e n e g l y c o l b i s ( A - a m i n o e t h y l e t h e r ) - N , N 1 -t e t r a a c e t i c ( E G T A ) w h i c h i s a c a l c i u m c h e l a t o r . I m p o r t a n t i m p r o v e m e n t s o v e r o t h e r c a l c i u m t i t r a t i o n m e t h o d s i n c l u d e h i g h e r • a f f i n i t y f o r c a l c i u m a n d l o w a f f i n i t y f o r m a g n e s i u m a n d h y d r o g e n i o n s , m i n i m a l m e m b r a n e b i n d i n g , l a r g e c h a n g e s i n a b s o r p t i o n a n d e m i s s i o n w a v e l e n g t h s w i t h b i n d i n g o f c a l c i u m , a n d c h e m i c a l d e r i v a t i v e s t h a t a r e e a s i l y l o a d e d i n t o t h e c y t o p l a s m o f c e l l s . C y t o s o l i c e s t e r a s e s c l e a v e t h e a c e t o x y m e t h y l g r o u p f r o m t h e h y d r o p h o b i c i n d i c a t o r , t r a p p i n g t h e h y d r o p h i l l i c f u r a - 2 i n s i d e t h e c e l l . L i t t l e l e a k a g e f r o m t h e c e l l i s s e e n f o r u p t o 4 o r 5 h o u r s . P r o b l e m s e n c o u n t e r e d w h e n u s i n g F u r a - 2 [ C a 2 + ] i i n c l u d e : 1 . i n c o m p l e t e h y d r o l y s i s o f F u r a - 2 a c e t o x y m e t h y l e s t e r b o n d s b y c y t o s o l i c e s t e r a s e s o r e s t e r a s e r e s i s t a n t m e t h y l e s t e r c o m p l e x e s o n t h e F u r a - 2 A M m o l e c u l e ; 2 . h e a v y m e t a l q u e n c h i n g o f F u r a - 2 f l u o r e s c e n c e ; 3 . s e q u e s t r a t i o n o f F u r a - 2 i n t o i n t r a c e l l u l a r o r g a n e l l e s s u c h a s m i t o c h o n d r i a , e n d o s o m e s , l i p o s o m e s , t h e n u c l e u s , a n d e n d o c y t o t i c o r p i n o c y t o t i c v e s i c l e s ; 4 . d y e l o s s t h r o u g h l e a k a g e i n t o t h e e x t r a c e l l u l a r f l u i d ; 5 . p h o t o b l e a c h i n g w h i c h p r o d u c e s f l u o r e s c e n t n o n - c a l c i u m s e n s i t i v e F u r a - 2 s p e c i e s ; 6 . s h i f t s i n t h e a b s o r p t i o n a n d e m i s s i o n s p e c t r u m a n d s h i f t s i n t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t w h i c h r e s u l t s f r o m c h a n g e s i n p o l a r i t y , v i s c o s i t y , o r i o n i c s t r e n g t h o f t h e s o l u t i o n s u s e d , o r t h e t e m p e r a t u r e a t w h i c h t h e e x p e r i m e n t i s r u n , a n d 7 . p r o b l e m s w i t h t h e c a l i b r a t i o n o f t h e F u r a - 2 s i g n a l i n s i d e c e l l s . T e c h n i q u e s h a v e b e e n d e v e l o p e d w h i c h o v e r c o m e s o m e o f t h e s e d i f f i c u l t i e s , s u c h a s l o w t e m p e r a t u r e l o a d i n g t o r e d u c e s e q u e s t r a t i o n o f F u r a - 2 i n t o i n t r a c e l l u l a r o r g a n e l l e s (Roe e t a l . , 1990). Quin-2 and f u r a - 2 have been used t o s t u d y t h e e f f e c t o f a g o n i s t s on [ C a 2 + ] i i n r a t o v a r i a n c e l l s ( D a v i s e t a l . , 1986a, 1987; D a v i s , 1987; P e p p e r e l l e t a l . , 1989; Wang e t a l . , 1989a,b, and Leung e t a l . , 1989). 2. The i n c r e a s e i n [Ca2*]i i n r e s p o n s e t o I n s ( 1 . 4 . 5 ) P 3 o r  hormonal s t i m u l i The p a t t e r n o f change i n [ C a 2 + ] i over time i n i n d i v i d u a l c e l l s has n o t been f i r m l y e s t a b l i s h e d . E x p e r i m e n t s done i n c e l l s u s p e n s i o n s have s u g g e s t e d a two phase phenomenon o f c a l c i u m m o b i l i z a t i o n ( B e r r i d g e , 1987). R e l e a s e o f i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m has been d e s i g n a t e d phase I . Much o f t h e r e l e a s e d i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m i s b e l i e v e d t o be pumped out o f t h e c e l l , r e d u c i n g t h e c a l c i u m c o n t e n t o f t h e c e l l by up t o 50%. Phase I I has been d e s i g n a t e d as c a l c i u m r e p l e n i s h m e n t from e x t r a c e l l u l a r s o u r c e s a c r o s s t h e plasmalemma ( B e r r i d g e , 1987). I n o s i t o l ( 1 , 4 , 5 ) P 3 presumably c o n t r o l s c a l c i u m r e l e a s e from t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m o r t h e c a l c i o s o m e i n phase I , t h e n i s m e t a b o l i z e d t o I n s (1,3,4,5) P 4 w h i c h c o n t r o l s c a l c i u m e n t r y a c r o s s t h e plasmalemma i n phase I I . S t u d i e s done i n c e l l s u s p e n s i o n s o f r a t o v a r i a n c e l l s a l s o show two phases o f i n c r e a s e i n [ C a 2 + ] i d e s c r i b e d by B e r r i d g e e t a l . , (1987), ( D a v i s e t a l . , 1986a; Muallem e t a l . , 1989, and P e p p e r e l l e t a l . , 1989). However, c o n c l u s i o n s about t h e p a t t e r n o f [ C a 2 + ] i i n i n d i v i d u a l c e l l s based on r e c o r d i n g s from s u s p e n s i o n s may be m i s l e a d i n g ( R i n k and H a l l a m , 1989). R e l e a s e o f c a l c i u m f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s b y h o r m o n e s o r I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 m a y b e q u a n t a l i n n a t u r e . C a r b a c h o l a n d c h o l y c y s t e k i n i n a d m i n i s t r a t i o n t o p a n c r e a t i c a c i n i i n v o k e d q u a n t a l c a l c i u m r e l e a s e s t u d i e d i n 4 5 C a e f f l u x a n d f u r a - 2 [ C a 2 + ] i e x p e r i m e n t s ( M u a l l e m e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h a t i s , i n s t e a d o f t h e c a l c i u m b e i n g r e l e a s e d i n p a r a l l e l w i t h t h e a m o u n t o f a g o n i s t a p p l i e d , c a l c i u m w a s r e l e a s e d i n d i s c r e t e e p i s o d e s . T h e s a m e p a t t e r n o f r e l e a s e o f c a l c i u m w a s s e e n w h e n I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 w a s a d m i n i s t e r e d . C a l c i u m i o n o p h o r e s , h o w e v e r , c a u s e a c o n t i n u a l i n c r e a s e i n [ C a 2 + ] i ( M u a l l e m e t a l . 1 9 8 9 ) . T h i s g r o u p b e l i e v e s t h a t e a c h d o s e r e l e a s e s a f r a c t i o n o f t h e s t o r e d c a l c i u m a n d i n c r e a s i n g h o r m o n e c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e s t h e f r a c t i o n o f i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m r e l e a s e d , a s l a r g e r i n c r e a s e s o f [ C a 2 + ] i w e r e s e e n w i t h h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f a g o n i s t . S t u d i e s o n i n d i v i d u a l r a t o v a r i a n c e l l s h a v e a l s o s h o w n q u a n t a l i n c r e a s e s i n [ C a 2 + ] i m e a s u r e d i n f u r a - 2 l a b e l e d c e l l s i n r e s p o n s e t o a g o n i s t s , h o w e v e r , t h e r e w a s n o i n c r e a s e i n m a g n i t u d e o f r e s p o n s e w i t h h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f a g o n i s t , a n d n o s u g g e s t i o n o f a s e c o n d p h a s e o f [ C a 2 + ] i i n c r e a s e . R e c o r d i n g s o f c h a n g e s i n [ C a 2 + ] i w e r e m a d e a t 2 a n d 1 0 s e c o n d i n t e r v a l s ( W a n g e t a l . , 1 9 8 9 a , b , a n d L e u n g e t a l . , 1 9 8 9 ) . S i n g l e r a t h e p a t o c y t e s e x p o s e d t o a n a g o n i s t f o r p r o l o n g e d p e r i o d s , e x h i b i t r e p e t i t i v e t r a n s i e n t i n c r e a s e s i n [ C a 2 + ] i ( W o o d s e t a l . , 1 9 8 7 a , b , a n d C o b b o l d e t a l . , 1 9 8 8 ) . I n c r e a s e d a g o n i s t c o n c e n t r a t i o n r e s u l t e d i n i n c r e a s e d f r e q u e n c y o f [ C a 2 + ] i s p i k e s , b u t d i d n o t c h a n g e t h e s i z e o r s h a p e o f i n d i v i d u a l s p i k e s ( R i n k a n d H a l l a m , 1 9 8 9 ) . A m o d e l t o e x p l a i n t h e d e s c r i b e d t r a n s i e n t s s u g g e s t s t h a t a c t i v a t e d P K C p h o s p h o r y l a t e s t h e r e c e p t o r a n d p o s s i b l y t h e G - p r o t e i n , s t o p p i n g t h e p r o d u c t i o n o f I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 ( W o o d s e t a l . , 1 9 8 7 a ) . T h e p a t t e r n o f e a c h t r a n s i e n t d e p e n d s o n t h e a g o n i s t , t h e r e f o r e , i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e c y t o p l a s m i c c o n c e n t r a t i o n o f I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 i s c o n t r o l l e d b y t h e r e c e p t o r o r b y r e c e p t o r - s p e c i f i c e l e m e n t s s u c h a s G - p r o t e i n s . T h e m o d e l d e s i g n e d b y C o b b o l d e t a l . , 1 9 8 8 , e x p l a i n s d i f f e r e n c e s i n f o r m o f t h e c a l c i u m t r a n s i e n t a s d i f f e r e n c e s i n t h e s p e e d o f t h e n e g a t i v e f e e d b a c k f r o m P K C w h i c h i n a c t i v a t e s t h e r e c e p t o r o r t h e G - p r o t e i n ( s e e a l s o B e r r i d g e a n d G a l i o n e , 1 9 8 8 a n d R i n k a n d H a l l a m , 1 9 8 9 ) . A n o t h e r t h e o r y f o r t h e g e n e r a t i o n o f o s c i l l a t i o n s i n [ C a 2 + ] i i s c a l c i u m i n d u c e d - c a l c i u m r e l e a s e , w h i c h h a s b e e n r e c e n t l y d e s c r i b e d i n s k i n n e d c a r d i a c c e l l s a n d X e n o p u s o o c y t e s . T h i s i s c o n s i d e r e d a s e c o n d m e s s e n g e r - c o n t r o l l e d o s c i l l a t o r a s c a l c i u m i t s e l f c o n t r o l s t h e r e l e a s e o f c a l c i u m f r o m i n t e r n a l s t o r e s ( B e r r i d g e a n d G a l i o n e , 1 9 8 8 ) . T h i s t h e o r y s t a t e s t h a t c a l c i u m h o m e o s t a s i s i s m a i n t a i n e d b y c a l c i u m p u m p s a t t h e c e l l -s u r f a c e w h i c h r e m o v e c a l c i u m t h a t h a s l e a k e d a c r o s s t h e p l a s m a m e m b r a n e . C a l c i u m p u m p s o n i n t e r n a l s t o r e s c o n s t a n t l y s e q u e s t e r c a l c i u m a s t h e y h a v e h i g h e r a f f i n i t y t h a n t h e c a l c i u m p u m p s a t t h e p l a s m a m e m b r a n e . T h e r e s t i n g l e v e l o f c a l c i u m m a y b e a d y n a m i c p r o c e s s , s p o n t a n e o u s r e l e a s e o c c u r r i n g f r o m f u l l i n t e r n a l s t o r e s a t r a n d o m . E x t e r n a l s i g n a l s s y n c h r o n i z e t h e s e r a n d o m r e l e a s e s . D i s c r e t e i n t e r n a l p o o l s m a y a m p l i f y a n d s p r e a d t h e i n i t i a l c a l c i u m s i g n a l t h r o u g h t h e c e l l s . I f t h e i n d i v i d u a l s t o r e s a r e c l o s e l y a s s o c i a t e d , t h e i n c r e a s e d r e l e a s e o f c a l c i u m m a y s p r e a d a s a w a v e ( B e r r i d g e a n d G i a l o n e , 1 9 8 8 ) . T h e p a t t e r n o f t r a n s i e n t i n c r e a s e d [ C a ] i i n r e s p o n s e t o s t i m u l i m a y b e d e p e n d a n t u p o n c e l l t y p e . T h i s p a t t e r n m a y b e o b s c u r e d b y m u l t i p l e s i g n a l s f r o m c e l l s i n s u s p e n s i o n o r b y p r o l o n g e d r e c o r d i n g i n t e r v a l s . 3 . I n v o l v e m e n t o f e x t r a c e l l u l a r s o u r c e s o f c a l c i u m O p e n i n g o f t h e a b o v e d e s c r i b e d c h a n n e l s m a y o c c u r a s a f i r s t s t e p i n s i g n a l t r a n s d u c t i o n , i n t h e c a s e o f a r e c e p t o r o p e r a t e d c h a n n e l , o r a s e c o n d a r y s t e p d u e t o a c h a n g e i n t h e c h a r g e o f t h e p l a s m a l e m m a , t h e p r o d u c t i o n o f p h o s p h a t i d i c a c i d ( P A ) ( K i e s e l a n d C a t t , 1 9 8 4 ) , t h e p r o d u c t i o n o f I n s ( l , 3 , 4 , 5 ) P 4 ( H a n s e n e t a l . , 1 9 8 7 ) , o r t h e a c t i v a t i o n o f P K C ( F u r u k a w a e t a l . , 1 9 8 9 ) . P r o t e i n K C c a n a l s o b e a c t i v a t e d i f a s u f f i c i e n t q u a n t i t y o f c a l c i u m i s p r e s e n t ( N i s h u z u k a , 1 9 8 4 a n d B r o c k l e h u r s t e t a l . , 1 9 8 5 ) s o c a l c i u m m a y h a v e a r o l e a s a s e c o n d m e s s e n g e r w h i c h i s i n d e p e n d e n t o f P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 b r e a k d o w n . 4 . I n v o l v e m e n t o f i n t r a c e l l u l a r s o u r c e s o f c a l c i u m I n o s i t o l ( 1 , 4 , 5 ) P 3 i s a s e c o n d m e s s e n g e r f o r i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m m o b i l i z a t i o n ( B e r r i d g e , 1 9 8 4 ; B e r r i d g e a n d I r v i n e 1 9 8 4 ; B u r g e s s e t a l . , 1 9 8 4 , a n d N i s h i z u k a , 1 9 8 4 ) . T h e l o c a t i o n a n d i d e n t i t y o f t h e I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 r e l e a s a b l e s t o r e o f c a l c i u m i s m o s t l i k e l y t h e E R o r a r e c e n t l y d e s c r i b e d o r g a n e l l e , t h e c a l c i o s o m e ( K r a u s e e t a l . , 1 9 8 9 ) . T a y l o r e t a l . ( 1 9 8 9 ) p r e p a r e d a s t a b l e a n a l o g u e o f I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 i n o r d e r t o m o r e e a s i l y s t u d y I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 i n d u c e d c a l c i u m r e l e a s e f r o m i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m p o o l s . D u r i n g 18 p r o l o n g e d s t i m u l a t i o n w i t h t h e I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 a n a l o g u e a n d I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 , t h e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m s t o r e s r e m a i n e d e m p t y . I n t r a c e l l u l a r s t o r e s m u s t b e r e f i l l e d f r o m e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m s o u r c e s . T h e r o l e o f e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m i n r e p l e n i s h i n g i n t r a c e l l u l a r s t o r e s h a s b e e n i n v e s t i g a t e d i n s u s p e n s i o n s o f p a n c r e a t i c a c i n a r c e l l s ( b y P a n d o l e t a l . , 1 9 8 7 ) . B l o c k i n g u p t a k e o f e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m w i t h l a n t h a n u m e l i m i n a t e s t h e i n c r e a s e i n [ C a 2 + ] i i n r e s p o n s e t o c a r b a c h o l . R i n k a n d H a l l a m , 1 9 8 9 , n o t e d t h a t i n m o s t s t u d i e s i n w h i c h e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m i s r e m o v e d t h e r e i s a f a d i n g a n d s l o w i n g o f r e s p o n s e o v e r s e v e r a l c y c l e s . T h e y c o n c l u d e t h a t t h e o s c i l l a t o r y m e c h a n i s m ( d e s c r i b e d a b o v e ) i s a r e p e t i t i v e d i s c h a r g e a n d r e f i l l i n g o f t h e i n t e r n a l s t o r e s , a n d t h a t e x t e r n a l c a l c i u m i s n e e d e d t o r e f i l l i n t e r n a l s t o r e s , s i n c e c a l c i u m i s p r o b a b l y p u m p e d o u t o f t h e c e l l w h e n [ C a 2 + ] i i s h i g h . 5 . D e p e n d e n c e o f e f f e c t o n s o u r c e o f c a l c i u m T h e u s e o f f l u o r e s c e n t c a l c i u m c h e l a t o r s , s u c h a s q u i n - 2 a n d f u r a - 2 a l l o w t h e s t u d y o f c h a n g e s i n [ C a 2 + ] i . U n f o r t u n a t e l y , d u e t o t h e l i m i t a t i o n s o f a v a i l a b l e c a l c i u m c h a n n e l b l o c k e r s ( H o s e y a n d L a z d u n s k i , 1 9 8 8 ) , a n d t h e l a c k o f s p e c i f i c b l o c k e r s o f i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m r e l e a s e , i t i s s o m e t i m e s d i f f i c u l t t o e s t a b l i s h w h e t h e r t h e s o u r c e o f c a l c i u m i s i n t r a c e l l u l a r o r e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m o r a c o m b i n a t i o n o f b o t h w h e n i n c r e a s e s i n [ l C a 2 + ] i o c c u r . T h e e f f e c t o f i n c r e a s e d [ C a 2 + ] i i s b e l i e v e d t o b e e q u i v a l e n t r e g a r d l e s s o f s o u r c e ( W a n g a n d L e u n g , 1 9 8 9 ) , h o w e v e r , K i m a n d W e s t h e a d , 1 9 8 9 , r e p o r t d i f f e r e n t r e s p o n s e s t o i n c r e a s e d [ C a ] i f r o m i n t r a c e l l u l a r a n d e x t r a c e l l u l a r s o u r c e s . C h a n g e s i n [ C a 2 + ] i i n i n d i v i d u a l c e l l s ( b o v i n e c h r o m a f f i n c e l l s ) , m e a s u r e d u s i n g f u r a - 2 , a n d r e l e a s e o f c a t e c h o l a m i n e f r o m t h e s a m e c e l l s , m e a s u r e d e l e c t r o c h e m i c a l l y , s h o w t h a t c a t e c h o l a m i n e s e c r e t i o n o c c u r e d o n l y w h e n a g e n t s c a u s e d e n t r y o f e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m . B a s e d o n t h e s e r e s u l t s , K i m a n d W e s t h e a d c o n c l u d e d t h a t t h e t w o s o u r c e s o f c a l c i u m a r e e f f e c t i v e l y c o m p a r t m e n t a l i z e d . T h e r e f o r e , i f t h e n o r m a l s o u r c e o f c a l c i u m t h a t r e s u l t s i n i n c r e a s e d [ C a 2 + ] i i s i n t r a c e l l a r stores, calcium i o n o p h o r e s m a y n o t h a v e t h e s a m e e f f e c t s . i 6 . E f f e c t o f i n c r e a s e d [ C a 2 + 1 i o n c e l l u l a r p h y s i o l o g y T h e m e c h a n i s m b y w h i c h c a l c i u m e x e r t s i t s e f f e c t s a f t e r b e i n g r e l e a s e d f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s o r e n t e r i n g t h e c e l l s f r o m t h e e x t r a c e l l u l a r s p a c e i s s t i l l l a r g e l y u n k n o w n . H i g h c a l c i u m m a y a c t i v a t e P K C , c a l m o d u l i n , c a l c i u m - s t i m u l a t e d p h o s p h o l i p a s e s a n d p r o t e a s e s ( C a r a f o l i , 1 9 8 7 ) . C a l c i u m b i n d s t o c a l m o d u l i n , a n d c a l m o d u l i n r e g u l a t e s t h e m e t a b o l i s m o f c y c l i c n u c l e o t i d e s , l i p i d s a n d t h e a c t i v i t y o f s e v e r a l e n z y m e s a n d c y t o s k e l e t a l p r o t e i n s i m p l i c a t e d i n t h e s e c r e t o r y p r o c e s s , a s w e l l a s p h o s p h o r y l a t i n g p r o t e i n s ( M a n a l a n , 1 9 8 4 ) . C a l c i u m h a s m a n y i m p o r t a n t f u n c t i o n s i n t h e c e l l , i n c l u d i n g a n i m p o r t a n t r o l e i n s i g n a l t r a n s d u c t i o n . C h a n g e s i n [ C a 2 + ] i c a n b e m e a s u r e d . T h e s o u r c e a n d t h e p a t t e r n o f i n c r e a s e d [ C a 2 + ] i c a n b e e x a m i n e d a n d t h i s s h o u l d i n c r e a s e o u r u n d e r s t a n d i n g o f c e l l u l a r p h y s i o l o g y . C . A r a c h i d o n i c A c i d a s a s e c o n d m e s s e n g e r 20 A r a c h i d o n i c a c i d i s a c o m m o n s u b s t i t u e n t o n t h e s e c o n d p o s i t i o n o f DG i n e u k a r y o t e s . A r a c h i d o n i c a c i d c a n b e s y n t h e s i z e d f r o m p h o s p h o r y l a t i o n o f DG t o P A , o r f r o m h y d r o l y s i s o f m o n o a c y l g l y c e r o l p r o d u c e d f r o m DG m e t a b o l i s m ( B e r r i d g e , 1 9 8 7 ) . A l t e r n a t e l y , a r a c h i d o n i c a c i d m a y b e p r o d u c e d f r o m t h e d i r e c t a c t i o n o f p h o s p h o l i p a s e A 2 ( P L A 2 ) o n p h o s p h o l i p i d s ( N i s h i z u k a , 1 9 8 4 ) . A r a c h i d o n i c a c i d i s t h e p r e c u r s o r f o r s y n t h e s i s o f e i c o s a n o i d s : t h e . l e u k o t r i e n e s t h r o u g h t h e l i p o x y g e n a s e p a t h w a y , a n d t h e t h r o m b o x a n e s a n d P G s t h r o u g h t h e c y c l o - o x y g e n a s e p a t h w a y . E i c o s a n o i d s h a v e r o l e s a s p a r a c r i n e o r a u t o c r i n e a g e n t s ( B e r r i d g e , 1 9 8 7 ) . I n s o m e c e l l t y p e s , a r a c h i d o n i c a c i d i n c r e a s e s [ C a 2 + ] i ( W o l f e t a l . , 1 9 8 6 ; B e a u m i e r e t a l . , 1 9 8 7 ; M e t z , 1 9 8 8 , a n d S n o w d o w n e t a l . , 1 9 8 9 ) a n d t h e p o o l o f c a l c i u m r e l e a s e d a p p e a r s t o i n c l u d e t h a t r e l e a s e d b y I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 ( B e a u m i e r e t a l . , 1 9 8 7 ) . D . S u m m a r y T h e i n t r a c e l l u l a r s i g n a l t r a n s d u c t i o n m e c h a n i s m s w h i c h a r e o f g r e a t e s t r e l e v a n c e i n t h i s s t u d y a r e t h e a d e n y l a t e c y c l a s e s y s t e m , w h i c h g e n e r a t e s c A M P , a n d t h e p h o s p h o i n o s i t o l s y s t e m , w h i c h g e n e r a t e s DG a n d I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 a n d r e s u l t s i n t h e a c t i v a t i o n o f P K C a n d t h e i n c r e a s e i n [ C a 2 + ] i . T h e a r a c h i d o n i c a c i d s e c o n d m e s s e n g e r p a t h w a y a l s o f u n c t i o n s i n t h e o v a r y . I I . R e g u l a t i o n a n d T r a n s d u c t i o n o f H o r m o n e A c t i o n i n t h e O v a r y A . O v a r i a n a n a t o m y a n d h i s t o l o g y T h e o v a r i e s a r e p a i r e d o r g a n s i n t h e a b d o m e n t h a t a r e c o v e r e d w i t h a l a y e r o f s u r f a c e e p i t h e l i u m w h i c h i s c o n t i n u o u s w i t h t h e l i n i n g o f t h e p e r i t o n e a l c a v i t y . T h e o v a r i e s a r e m a d e u p o f s t r o m a l a n d i n t e r s t i t i a l t i s s u e ; f o l l i c l e s w h i c h i n c l u d e t h e c a i n t e r s t i t i a l , t h e c a i n t e r n a a n d g r a n u l o s a c e l l s , a n d c o n t a i n t h e o o c y t e s ; a n d t h e corpora l u t e a . M a n y d i f f e r e n t s t a g e s o f f o l l i c l e s a r e c o n t a i n e d i n t h e o v a r y a t a n y g i v e n t i m e . F o l l i c u l o g e n e s i s i s t h e d e s c r i p t i o n o f t h e d e v e l o p m e n t o f f o l l i c l e s f o l l o w i n g r e c r u i t m e n t f r o m t h e p o o l o f p r i m o r d i a l f o l l i c l e s w h i c h a r e p r e s e n t f r o m f e t a l l i f e . P r i m o r d i a l f o l l i c l e s a r e f o u n d i n t h e o v a r i a n c o r t e x a n d c o n t a i n p r i m a r y o o c y t e s i n p r o p h a s e o f t h e f i r s t m e i o t i c d i v i s i o n , s u r r o u n d e d b y o n e l a y e r o f s p i n d l e s h a p e d c e l l s . T h e y a r e s e p a r a t e d f r o m t h e s u r r o u n d i n g s t r o m a b y t h e b a s e m e n t m e m b r a n e . P r i m o r d i a l f o l l i c l e s a r e c o n t i n u a l l y e n t e r i n g i n t o a p o o l o f d e v e l o p i n g f o l l i c l e s . P r i m o r d i a l f o l l i c l e s d e v e l o p i n t o p r i m a r y f o l l i c l e s i n w h i c h t h e s i n g l e l a y e r o f s p i n d l e s h a p e d c e l l s s u r r o u n d i n g t h e o o c y t e b e c o m e c u b o i d a l . M u l t i p l e l a y e r s o f t h e s e g r a n u l o s a c e l l s d e v e l o p , t h e o o c y t e p r o d u c e s a m u c o i d , g l y c o p r o t e i n c o n t a i n i n g s u b s t a n c e , c a l l e d t h e z o n a p e l l u c i d a , w h i c h s e p a r a t e s t h e o o c y t e f r o m t h e g r a n u l o s a c e l l s , a n d t h e c a ( i n t e r n a a n d e x t e r n a ) c e l l s d e v e l o p f r o m s u r r o u n d i n g s t r o m a c e l l s o u t s i d e t h e b a s e m e n t m e m b r a n e o f t h e s e c o n d a r y f o l l i c l e . O n c e f l u i d f i l l e d s p a c e s a p p e a r a m o n g t h e g r a n u l o s a c e l l s , t h e f o l l i c l e i s k n o w n a s a n a n t r a l o r t e r t i a r y f o l l i c l e . A l t h o u g h g o n a d o t r o p i c h o r m o n e s a r e m o s t i m p o r t a n t i n f o l l i c u l a r d e v e l o p m e n t b e y o n d t h e t e r t i a r y f o l l i c l e , t h e y a r e a l s o b e l i e v e d t o b e i m p o r t a n t i n e a r l y f o l l i c u l a r d e v e l o p m e n t ( G r e e n w a l d a n d T e r r a n o v a , 1 9 8 8 ) . L a r g e a n t r a l f o l l i c l e s a r e a l s o c a l l e d G r a a f i a n f o l l i c l e s . T h e m a t u r e G r a a f i a n f o l l i c l e i s m a d e u p o f t h e o o c y t e , s u r r o u n d i n g c u m u l u s o o p h o r u s ( g r a n u l o s a c e l l s ) , t h e f l u i d f i l l e d a n t r u m , m u r a l a n d a n t r a l g r a n u l o s a c e l l s , a b a s e m e n t m e m b r a n e s e p a r a t i n g t h e g r a n u l o s a c e l l s f r o m t h e t h e c a l c e l l s ; t h e t h e c a i n t e r n a a n d , i n t h e o u t e r m o s t p o s i t i o n , t h e c a e x t e r n a c e l l s . T h e b a s e m e n t m e m b r a n e p r e v e n t s b l o o d s u p p l y t o t h e g r a n u l o s a c e l l s , b u t t h e t h e c a c e l l s h a v e a r i c h b l o o d s u p p l y . P r i o r t o o v u l a t i o n , t h e f i r s t m e i o t i c d i v i s i o n i s r e s u m e d . A s e c o n d a r y o o c y t e s u r r o u n d e d b y t h e z o n a p e l l u c i d a a n d t h e c u m u l u s o o p h o r u s i s o v u l a t e d . T h e t i m e f o r d e v e l o p m e n t f r o m a p r e a n t r a l f o l l i c l e t o o v u l a t i o n i s a p p r o x i m a t e l y 3 a n d a h a l f m e n s t r u a l o r ( r a t ) e s t r o u s c y c l e s . A h i g h c o n c e n t r a t i o n o f F S H i n c r e a s e s a n d e s t r o g e n f o r m a t i o n a n d a s a c o n s e q u e n c e , m i t o s i s , b y g r a n u l o s a c e l l s . L u t e i n i z i n g h o r m o n e a c t i o n a t t h e t h e c a c e l l s i n c r e a s e s t h e a n d r o g e n s u b s t r a t e f o r g r a n u l o s a c e l l e s t r o g e n f o r m a t i o n . O v u l a t i o n o c c u r s o n l y i n a l i m i t e d n u m b e r o f f o l l i c l e s , w h i l e t h e f a t e o f m o s t f o l l i c l e s i s a t r e s i a . I n t h e h u m a n o v e r 9 9 % o f f o l l i c l e s b e c o m e a t r e t i c . F o l l i c u l a r a t r e s i a o c c u r s a t a n y s t a g e o f f o l l i c u l o g e n e s i s . D e g e n e r a t i o n o f p r i m o r d i a l f o l l i c l e s a l s o o c c u r s ( G r e e n w a l d a n d T e r r a n o v a , 1 9 8 8 ) . I n a t r e t i c f o l l i c l e s t h e a n d r o g e n t o e s t r o g e n r a t i o i s h i g h ; i n h e a l t h y f o l l i c l e s t h e e s t r o g e n t o a n d r o g e n r a t i o i s h i g h . O v u l a t i o n r e s u l t s f r o m c o m p l e x p a r a c r i n e a n d e n d o c r i n e i n t e r a c t i o n s i n t h e p r e o v u l a t o r y f o l l i c l e a n d t h e o v a r y . E s t r o g e n e n h a n c e s t h e a c t i v i t y o f F S H , i n c l u d i n g t h e F S H s t i m u l a t i o n o f L H r e c e p t o r f o r m a t i o n i n g r a n u l o s a c e l l s . F o l l i c l e - s t i m u l a t i n g h o r m o n e a n d L H i n c r e a s e e s t r o g e n f o r m a t i o n . T h e s e l e c t e d f o l l i c l e s ' p r o d u c t i o n o f e s t r o g e n e f f e c t i v e l y r e d u c e s s y s t e m i c F S H b y f e e d b a c k i n h i b i t i o n a t t h e l e v e l o f t h e p i t u i t a r y , i n h i b i t i n g m a t u r a t i o n o f o t h e r f o l l i c l e s . E s t r o g e n s p r o d u c e d b y t h e d o m i n a n t f o l l i c l e h a v e a p o s i t i v e f e e d b a c k e f f e c t a t t h e h y p o t h a l a m u s a n d p i t u i t a r y , a n d r e s u l t i n t h e p r e o v u l a t o r y s u r g e o f g o n a d o t r o p i n s a n d e s t r o g e n s ( H s u e h , 1 9 8 6 ) . T h e c o r p u s l u t e u m i s f o r m e d f r o m g r a n u l o s a a n d t h e c a c e l l s a f t e r o v u l a t i o n , a n d i s r a p i d l y a n d e x t e n s i v e l y v a s c u l a r i z e d ( B a i r d , 1 9 8 4 ) . L u t e o l y s i s o c c u r s i f c o n c e p t i o n d o e s n o t o c c u r . L u t e o l y s i s i s t w o p r o c e s s e s : f i r s t , f u n c t i o n a l l u t e o l y s i s , w h i c h i s a s u s t a i n e d l o s s i n p r o g e s t e r o n e s y n t h e s i s a n d s e c r e t i o n ; a n d s e c o n d , s t r u c t u r a l l u t e o l y s i s , w h i c h i s i n v o l u t i o n a n d d e g e n e r a t i o n o f t h e c o r p u s l u t e u m ( B e h r m a n e t a l . , 1 9 8 7 ) . B . T h e R a t E s t r o u s C y c l e T h e e s t r o u s c y c l e o f t h e r a t i s 4 t o 5 d a y s i n l e n g t h . I t c o n s i s t s o f p r o - e s t r u s , e s t r u s , m e t e s t r u s , d i e s t r u s 1 a n d d i e s t r u s 2 . L a r g e p r e o v u l a t o r y f o l l i c l e s t h a t o v u l a t e i n r e s p o n s e t o t h e L H s u r g e e n t e r t h e g r o w i n g p o o l o f f o l l i c l e s 2 0 d a y s e a r l i e r a n d s o w e r e r e c r u i t e d b y a g o n a d o t r o p i n s u r g e ( F S H ) , t h e n e x p o s e d t o 3 o r 4 s u b s e q u e n t s u r g e s ( L H / F S H ) b e f o r e o v u l a t i n g . I n t h e r a t , c o i t u s i s r e q u i r e d t o p r o d u c e a f u l l y f u n c t i o n a l c o r p u s l u t e u m ; i n t h e a b s e n c e o f c o i t u s , t h e c o r p u s l u t e u m s e c r e t e s p r o g e s t e r o n e f o r 2 o r 3 d a y s o n l y . P s e u d o p r e g n a n c y i s i n d u c e d i n r a t s b y c e r v i c a l s t i m u l a t i o n w h i c h , l i k e c o i t u s c a u s e s a s u r g e o f p r o l a c t i n w h i c h i s n e c e s s a r y f o r t h e d e v e l o p m e n t o f a f u n c t i o n a l c o r p u s l u t e u m i n r a t s . T h i s g e n e r a t e s a c o r p u s l u t e u m w h i c h w i l l f u n c t i o n f o r a b o u t 1 3 d a y s b e f o r e r e g r e s s i n g ( B a i r d , 1 9 8 4 ) . C . O v a r i a n E n d o c r i n o l o g y 1 . F o l l i c l e - s t i m u l a t i n g h o r m o n e S t e r o i d o g e n e s i s a n d f o l l i c u l a r m a t u r a t i o n a r e r e g u l a t e d b y p i t u i t a r y - p r o d u c e d g o n a d o t r o p i n s , L H a n d F S H ( s e e t a b l e I ) . G r a n u l o s a c e l l s r e s p o n d t o F S H b y s t i m u l a t i o n o f s i d e c h a i n c l e a v a g e a n d t h e r e f o r e i n c r e a s e d p r o d u c t i o n o f p r o g e s t e r o n e . F o l l i c l e - s t i m u l a t i n g h o r m o n e a l s o r e g u l a t e s t h e a r o m a t i z a t i o n o f a n d r o g e n s t o e s t r o g e n s i n g r a n u l o s a c e l l s ( G o r e - L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 ) . T h e s t r u c t u r e o f t h e F S H r e c e p t o r i n r a t S e r t o l i c e l l s h a s r e c e n t l y b e e n d e t e r m i n e d a n d t h e r e c e p t o r f u n c t i o n a l l y e x p r e s s e d i n c u l t u r e d m a m m a l i a n c e l l s ( S p r e n g e l e t a l . , 1 9 9 0 ) . 2 5 T a b l e I . H o r m o n e s p r o d u c e d i n a n d h o r m o n e s w h i c h h a v e e n d o c r i n e e f f e c t s i n t h e o v a r y . H o r m o n e s w h i c h  h a v e a n e n d o c r i n e  e f f e c t i n t h e  o v a r y l o c a l p r o d u c t i o n c e l l t y p e i n w h i c h  e f f e c t h a s  b e e n s e e n m e c h a n i s m o f  a c t i o n p r o g e s t i n s e s t r o g e n s a n d r o g e n s g l u c o c o r t i c o i d s Y N g r a n u l o s a t h e c a l u t e a l g r a n u l o s a t h e c a t h e c a g r a n u l o s a s t e r o i d h o r m o n e r e c e p t o r s L H F S H P G E , P G F 2 a p r o l a c t i n G n R H E G F P D G F I G F - 1 i n s u l i n c a t e c h o l a m i n e s N N Y N 7 Y N Y N t h e c a g r a n u l o s a l u t e a l g r a n u l o s a t h e c a g r a n u l o s a i n t e r s t i t i a l g r a n u l o s a t h e c a i n t e r s t i t u a l l u t e a l g r a n u l o s a t h e c a g r a n u l o s a t h e c a g r a n u l o s a g r a n u l o s a g r a n u l o s a g r a n u l o s a a d r e n e r g i c n e r v e s t e r m i n a t e c l o s e t o t h e c a e x t e r n a g r a n u l o s a l u t e a l c A M P c a l c i u m ? c A M P c A M P P t d I n s ( 4 , 5 ) P 2 a r a c h i d o n i c a c i d P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 •7 a u t o p h o s p h o r y l a t i o n o f t y r o s i n e r e s i d u e s o n i n s u l i n a n d I G F - 1 r e c e p t o r s c A M P P r o d u c t i o n o f h o r m o n e i n t h e o v a r y i s i n d i c a t e d b y 1 Y 1 ; l a c k o f p r o d u c t i o n b y ' N ' . • ~ l i n d i c a t e s t h e s a m e p r o c e s s a s a b o v e . • ? ' m e a n s i t i s n o t k n o w n . S e e t e x t f o r r e f e r e n c e s . 2 6 2 . L u t e i n i z i n g h o r m o n e L u t e i n i z i n g h o r m o n e h a s e f f e c t s o n h o r m o n e p r o d u c t i o n i n t h e t h e c a a n d i n t h e m a t u r e g r a n u l o s a c e l l s . T h e c a c e l l s h a v e L H r e c e p t o r s a t a l l f o l l i c u l a r s t a g e s , a n d p r o d u c e s t e r o i d s w h e n s t i m u l a t e d b y L H ( E r i c k s o n , 1 9 8 5 ) . L u t e i n i z i n g h o r m o n e i n c r e a s e s t h e a c t i v i t y o f C 1 7 2 0 - l y a s e a n d t h e c o n v e r s i o n o f c h o l e s t e r o l t o p r o g e s t e r o n e i n t h e c a c e l l s , w h i c h r e s u l t s i n i n c r e a s e d a n d r o g e n p r o d u c t i o n ( B o g o v i c h a n d R i c h a r d s , 1 9 8 2 ) . L u t e i n i z i n g h o r m o n e a l s o i n c r e a s e s t h e p r o d u c t i o n o f p r o g e s t e r o n e i n g r a n u l o s a c e l l s , o n c e r e c e p t o r s h a v e b e e n i n d u c e d b y F S H ( G o r e - L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 ) . T h e s t r u c t u r e o f t h e L H / h G C r e c e p t o r h a s r e c e n t l y b e e n d e t e r m i n e d b y a n a l y s i s o f t h e c D N A ( M c F a r l a n d e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e o v u l a t o r y s u r g e o f L H c a u s e s a l a r g e i n c r e a s e , t h e n f a l l o f a n d r o g e n p r o d u c t i o n i n t h e o v a r y . I t i s b e l i e v e d t h a t t h e L H s u r g e s t i m u l a t e s p r o d u c t i o n o f a n d r o g e n s w h i c h a r e a r o m a t i z e d t o e s t r o g e n s i n g r a n u l o s a c e l l s a n d t h a t t h e e s t r o g e n s i n h i b i t f u r t h e r s y n t h e s i s o f a n d r o g e n s i n t h e t h e c a l c e l l s ( G o r e - L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 ) . I n t h e c o r p u s l u t e u m , L H o r h C G i s t h e m o s t i m p o r t a n t e n d o c r i n e i n f l u e n c e o n t h e r e g u l a t i o n o f s y n t h e s i s o f p r o g e s t e r o n e i n t h e c o r p u s l u t e u m ( N i s w e n d e r a n d N e t t , 1 9 8 8 ) . L u t e i n i z i n g h o r m o n e i s w e l l k n o w n t o u s e c A M P ( M a r s h , 1 9 7 5 , a n d G o f f a n d A r m s t r o n g , 1 9 7 7 ) a s a s e c o n d m e s s e n g e r . H o w e v e r , D a v i s e t a l . f o u n d t h a t L H i n c r e a s e s s y n t h e s i s ( 1 9 8 3 b , 1 9 8 4 b ) a n d d e g r a d a t i o n ( 1 9 8 4 b ) o f P t d l n s i n r a t g r a n u l o s a c e l l s i s o l a t e d f r o m m a t u r e g r a a f i a n f o l l i c l e s , a s w e l l a s f o r m a t i o n o f I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 ( D a v i s e t a l . , 1 9 8 6 a ) . S t i m u l a t e d b r e a k d o w n o f P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 h a s b e e n s e e n i n r e s p o n s e t o L H i n o t h e r s p e c i e s ( a v i a n g r a n u l o s a c e l l s : H e r t e l e n d y e t a l . , 1 9 8 9 , s w i n e g r a n u l o s a c e l l s : S a d i g h i a n , 1 9 8 9 ) . C a l c i u m m a y p l a y a r o l e i n t h e s t e r o i d o g e n i c a c t i o n o f L H . T s a n g a n d C a r n e g i e , 1 9 8 4 u s i n g c a l c i u m c h a n n e l b l o c k e r s , v e r a p a m i l , c o b a l t a n d m a n g a n e s e a n d E G T A , h a v e s e e n m a r k e d d e c r e a s e s i n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o F S H , c h o l e r a t o x i n , P G E , i s o p r o t e r e n o l a n d c A M P . C a l m o d u l i n i n h i b i t o r s i n h i b i t c A M P a n d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n ( T s a n g a n d C a r n e g i e 1 9 8 3 ; C a r n e g i e a n d T s a n g , 1 9 8 3 ) . L u t e i n i z i n g h o r m o n e c a u s e s i n c r e a s e d i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m i n a v i a n g r a n u l o s a c e l l s ( A s e m a n d H e r t e l e n d y , 1 9 8 6 ; A s e m e t a l . , 1 9 8 7 ; H e r t e l e n d y e t a l . , 1 9 8 9 ) , i n b o v i n e l u t e a l c e l l s ( D a v i s , 1 9 8 7 , a n d A l i l a e t a l . , 1 9 8 9 ) , i n s w i n e g r a n u l o s a c e l l s ( V e l d h u i s a n d K l a s e , 1 9 8 2 a ) a n d i n o v i n e l u t e a l c e l l s ( H i g u c h i e t a l . , 1 9 7 6 ) . A l i l a e t a l . , 1 9 8 9 , r e p o r t i n c r e a s e s i n [ C a 2 + ] i i n r e s p o n s e t o 8 - b r - c A M P o r f o r s k o l i n i n l a r g e a n d s m a l l b o v i n e l u t e a l c e l l s ; t h e s o u r c e o f t h e i n c r e a s e d [ C a 2 + ] i i n r e s p o n s e t o 8 - b r - c A M P o r f o r s k o l i n i s p r o b a b l y n o t i d e n t i c a l t o t h e s o u r c e o f i n c r e a s e d [ C a 2 + ] i i n r e s p o n s e t o L H . O t h e r s h a v e n o t s e e n i n c r e a s e d [ C a 2 + ] i i n r e s p o n s e t o L H i n r a t g r a n u l o s a c e l l s ( W a n g e t a l . , 1 9 8 9 b ) . 3 . S t e r o i d h o r m o n e s T h e b e s t c h a r a c t e r i z e d s e c r e t o r y p r o d u c t s o f t h e o v a r y a r e t h e s t e r o i d h o r m o n e s , p r o g e s t i n s , a n d r o g e n s a n d e s t r o g e n s ( s e e 2 8 t a b l e I ) . T h e i n t e r s t i t i a l a n d t h e c a l c e l l s o f t h e o v a r y a r e o r g a n i z e d f o r t h e s y n t h e s i s o f p r o g e s t i n s a n d a n d r o g e n s ; g r a n u l o s a c e l l s a r e o r g a n i z e d p r i m a r i l y f o r t h e a r o m a t i z a t i o n o f t h e c a - p r o d u c e d a n d r o g e n s i n t o e s t r o g e n s ( s e e f i g u r e 3 ) . S i n c e t h e g r a n u l o s a c e l l l a y e r i s a v a s c u l a r , t h e c h o l e s t e r o l f o r s t e r o i d s y n t h e s i s i s b e l i e v e d t o b e f r o m p r e - f o r m e d c h o l e s t e r o l s t o r e d i n t h e c e l l o r s y n t h e s i z e d d e n o v o f r o m a c e t a t e . H o w e v e r t h e r e i s e v i d e n c e t h a t l o w d e n s i t y a n d h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n s m a y b e t h e p r i m a r y s o u r c e o f c h o l e s t e r o l ( V e l d h u i s a n d G w y n n e , 1 9 8 5 a n d S t r a u s s e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e p r o d u c t i o n o f p r o g e s t i n s i n i m m a t u r e g r a n u l o s a c e l l s i s s t i m u l a t e d b y F S H v i a s t i m u l a t i o n o f t h e c h o l e s t e r o l s i d e - c h a i n c l e a v a g e m u l t i - e n z y m e c o m p l e x . F o l l i c l e - s t i m u l a t i n g h o r m o n e s t i m u l a t e s t h e p r o d u c t i o n o f L H r e c e p t o r s i n m a t u r e g r a n u l o s a c e l l s . I n m a t u r e g r a n u l o s a c e l l s L H a l s o s t i m u l a t e s c h o l e s t e r o l s i d e - c h a i n c l e a v a g e a n d t h e r e f o r e t h e p r o d u c t i o n o f p r o g e s t i n s . L u t e i n i z i n g h o r m o n e a n d F S H a l s o s t i m u l a t e t h e a c t i v i t y o f d e l t a 5 - 3 / 3 - h y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e : d e l t a 5 " 4 - i s o m e r a s e , w h i c h c o n v e r t s p r e g n e n o l o n e t o p r o g e s t e r o n e . G r a n u l o s a c e l l s h a v e l i t t l e o r n o 1 7 a - h y d r o x y l a s e o r C 1 7 2 0 - l y a s e n e c e s s a r y f o r t h e m e t a b o l i s m o f p r o g e s t i n s t o a n d r o g e n s , c o n s e q u e n t l y a n d r o g e n s a r e n o t p r o d u c e d . T h e p r o d u c t i o n o f e s t r o g e n s i n g r a n u l o s a c e l l s i s d e p e n d e n t u p o n a s u p p l y o f a n d r o g e n p r e c u r s o r f r o m t h e c a l c e l l s . A r o m a t i z a t i o n i s s t i m u l a t e d b y F S H , a n d o c c u r s p r i m a r i l y i n l a r g e a n t r a l a n d p r e o v u l a t o r y f o l l i c l e s . T h e g r a n u l o s a c e l l s h a v e l a r g e a m o u n t s o f 1 7 / 3 - h y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e w h i c h c o n v e r t s e s t r o n e t o e s t r a d i o l , t h e r e f o r e t h e p r i m a r y e s t r o g e n p r o d u c e d i s 2 9 cholesterol C27 side chain cleavage cytochrome P4S0 1. cholesterol 22-hydroxylase 2. cholesterol 20<£-hydroxylaee 3. C20,22-lyase  £ 5 - 3 A- hydroxys terold dehydrogenase pregnenolone £ 5 . * -isomerase progesterone 17«--hydroxypregnenolone_ I dehydroepiandrosterone' 17W- -hydroxyprogesterone I C21 side-chain cleavage cytochrome P450 ' 1. 17a-hydroxylase = 2l C17,20-lyase 'androstenedione 1 7 ^ - h y d r o x y 8 t e r o l d , dehydrogenase testosterone . estrone estradiol aromatase cytochrome P450 B. T h e c a C e l l Small antral to preovulatory follicles LH lipoproteins cAMP . cholesterol Late preovulatory follicles LH V cholesterol cAMP^. * V DHEA G r a n u l o s a C e l l r FSH cAMP cholesterol P4 Small antral follicle T S H l choleate cAMP / •A . cAMP Large antral to preovulatory follicles On P4 F i g u r e 3 . A . S t e r o i d b i o s y n t h e t i c p a t h w a y s i n t h e o v a r y ( a d a p t e d f r o m G o r e - L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 ) . O u t l i n e d b a r s c o n n e c t e n z y m e s t o s t e p s a t w h i c h t h e y h a v e t h e i r e f f e c t . B . T h e o v a r i a n t w o - c e l l t y p e h y p o t h e s i s o f s t e r o i d p r o d u c t i o n . T h i s i s a d i a g r a m m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f h o r m o n e p r o d u c t i o n i n t h e f o l l i c l e . P o s i t i v e i n f l u e n c e s a r e i n d i c a t e d b y b l a c k a r r o w s ; i n h i b i t o r y i n f l u e n c e s b y o u t l i n e d a r r o w s . S e e t e x t f o r d e t a i l s . 3 0 e s t r a d i o l . T h e t h e c a i n t e r n a b e c o m e s m o r e v a s c u l a r i z e d a s t h e f o l l i c l e d e v e l o p s , a n d h a s a c c e s s t o c h o l e s t e r o l i n t h e f o r m o f l i p o p r o t e i n s f o r s t e r o i d s y n t h e s i s , a s w e l l a s c h o l e s t e r o l s t o r e d i n t h e c e l l a n d s y n t h e s i z e d d e n o v o . T h e f o r m ( i e . l o w o r h i g h d e n s i t y ) o f l i p o p r o t e i n w h i c h i s t h e p r i m a r y s o u r c e o f c h o l e s t e r o l f o r s t e r o i d o g e n e s i s i s d e p e n d e n t u p o n t h e s p e c i e s ; i n r a t s , h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n s a r e t h e p r i m a r y s o u r c e , i n h u m a n s , l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s are the p r i m a r y s o u r c e . P r o d u c t i o n o f p r o g e s t i n s a n d a n d r o g e n s i n t h e c a l c e l l s i s s t i m u l a t e d b y L H i n s m a l l a n t r a l t o p r e o v u l a t o r y f o l l i c l e s . L u t e i n i z i n g h o r m o n e s t i m u l a t e s t h e a c t i v i t y o f c h o l e s t e r o l s i d e -c h a i n c l e a v a g e a n d t h e r e f o r e p r o d u c t i o n o f p r o g e s t i n s a n d s t i m u l a t e s t h e a c t i v i t y o f 1 7 a - h y d r o x y l a s e a n d C 1 7 2 0 - l y a s e a n d t h e r e f o r e t h e p r o d u c t i o n o f a n d r o g e n s i n t h e c a l c e l l s . T h e c a i s d e f i c i e n t i n 1 7 / 3 - h y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e , t h e r e f o r e t h e p r i m a r y a n d r o g e n p r o d u c t i s a n d r o s t e n e d i o n e . I n l a r g e p r e o v u l a t o r y f o l l i c l e s t h e a c t i v i t y o f 1 7 a - h y d r o x y l a s e a n d C 1 7 2 0 -l y a s e , a n d t h e r e f o r e p r o d u c t i o n o f a n d r o g e n s , i s r e s t r i c t e d . A r o m a t i z a t i o n i n t h e t h e c a i n t e r n a d e p e n d s o n t h e s p e c i e s a n d t h e s t a g e o f d e v e l o p m e n t o f t h e f o l l i c l e . A r o m a t i z a t i o n i n t h e t h e c a l c e l l s m a y b e e q u a l t o t h a t i n t h e g r a n u l o s a c e l l s o r i t m a y b e m u c h l e s s . I n t h e p i g a n d s h e e p t h e a r o m a t i z a t i o n o c c u r i n g i n t h e t h e c a l c e l l s i n c r e a s e s w i t h f o l l i c u l a r m a t u r a t i o n a n d i s e q u a l i n m a t u r e f o l l i c l e s . I n t h e r a t , p r o d u c t i o n o f e s t r o g e n i n t h e t h e c a i n t e r n a i s n o t s i g n i f i c a n t . I n t h e h u m a n , r e g a r d l e s s o f f o l l i c l e s t a g e , a r o m a t i z a t i o n o c c u r s a l m o s t e x c l u s i v e l y i n t h e g r a n u l o s a c e l l s . T h e i d e a o f c o - o p e r a t i o n o f t h e c a a n d g r a n u l o s a c e l l s i n p r o d u c t i o n o f e s t r o g e n w a s i n t r o d u c e d b y F a l c k ( 1 9 5 9 ) , w h o d e m o n s t r a t e d t h a t b o t h c e l l t y p e s w e r e n e c e s s a r y f o r e s t r o g e n p r o d u c t i o n . T h e c o n t r o l o f a n d r o g e n b i o s y n t h e s i s b y L H i n t h e t h e c a c e l l , a n d e s t r o g e n b i o s y n t h e s i s b y F S H i n t h e g r a n u l o s a c e l l w a s l a t e r s h o w n ( M o o n e t a l . , 1 9 7 5 , a n d D o r r i n g t o n e t a l . , 1 9 7 5 ) . T h i s i s k n o w n a s t h e " m o d e r n t w o c e l l - t y p e , t w o g o n a d o t r o p i n t h e o r y " o f e s t r o g e n b i o s y n t h e s i s i n t h e o v a r i a n f o l l i c l e ( G o r e - L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 ) . T h e c o r p u s l u t e u m i s f o r m e d f r o m t h e c a i n t e r n a a n d g r a n u l o s a c e l l s f r o m t h e o v u l a t e d f o l l i c l e . T h e c o r p u s l u t e u m i s w e l l v a s c u l a r i z e d ; l u t e a l c e l l s d e r i v e d f r o m b o t h t h e c a l i n t e r n a a n d g r a n u l o s a c e l l s h a v e a c c e s s t o t h e b l o o d b o r n e s u p p l y o f c h o l e s t e r o l . L u t e i n i z i n g h o r m o n e i s t h e m o s t i m p o r t a n t f a c t o r r e g u l a t i n g p r o d u c t i o n o f p r o g e s t e r o n e i n t h e c o r p u s l u t e u m ( N i s w e n d e r a n d N e t t , 1 9 8 8 ) . L u t e i n i z i n g h o r m o n e c o n t i n u e s t o s t i m u l a t e c h o l e s t e r o l s i d e c h a i n c l e a v a g e , a n d i n c r e a s e s t h e a v a i l a b l e c h o l e s t e r o l b y s t i m u l a t i n g 3 - h y d r o x y - 3 - m e t h y l g l u t a r y l c o e n z y m e A r e d u c t a s e , w h i c h i s r a t e l i m i t i n g i n c h o l e s t e r o l b i o s y n t h e s i s . L u t e i n i z i n g h o r m o n e a l s o s t i m u l a t e s c h o l e s t e r o l e s t e r a s e , w h i c h i n c r e a s e s f r e e c h o l e s t e r o l b y r e l e a s i n g i t f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s o f f a t t y a c i d e s t e r s , a n d i n c r e a s e s l i p o p r o t e i n r e c e p t o r s , a n d t h e r e f o r e u p t a k e o f l i p o p r o t e i n s . S i d e c h a i n c l e a v a g e i s a l s o s t i m u l a t e d b y L H i n t h e c o r p u s l u t e u m . 3 / ? - H y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e : d e l t a 5 , d e l t a 4 - i s o m e r a s e i s n o t s t i m u l a t e d b y L H , b u t i s p r e s e n t i n e x c e s s ( N i s w e n d e r a n d N e t t , 1 9 8 8 ) . T h e a b s e n c e o f 1 7 a - h y d r o x y l a s e p r e v e n t s t h e f o r m a t i o n o f a n d r o g e n s , t h e r e f o r e t h e m a j o r s t e r o i d p r o d u c t o f t h e c o r p u s l u t e u m i s p r o g e s t e r o n e i n m o s t s p e c i e s ( G o r e - L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 ) , a l t h o u g h p r i m a t e s a l s o p r o d u c e e s t r o g e n s ( N i s w e n d e r a n d N e t t , 1 9 8 8 ) . I n s o m e s p e c i e s e s t r o g e n i s r e q u i r e d f o r a n o r m a l l u t e a l p h a s e ( K e y e s a n d W i l t b a n k , 1 9 8 8 ) . S t i m u l a t i o n o f p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n b y L H o c c u r s i n s m a l l l u t e a l c e l l s , h o w e v e r t h e m a j o r i t y o f t h e p r o g e s t e r o n e p r o d u c e d b y t h e c o r p u s l u t e u m i s p r o d u c e d b y t h e l a r g e l u t e a l c e l l s ( s e e b e l o w ) . P r o d u c t i o n o f p r o g e s t e r o n e i s a l s o d e p e n d a n t o n p r o l a c t i n i n s o m e s p e c i e s , i n c l u d i n g r a t s ( N i s w e n d e r a n d N e t t , 1 9 8 8 ) . S t e r o i d s p r o d u c e d i n f o l l i c l e s h a v e e f f e c t s o n r e s p o n s e s t o g o n a d o t r o p i n s a n d p r o d u c t i o n o f o t h e r s t e r o i d h o r m o n e s i n t h e f o l l i c l e s . E s t r o g e n s i n h i b i t a n d r o g e n p r o d u c t i o n a t e n z y m a t i c s t e p s b e t w e e n C 2 1 t o C 1 9 c o n v e r s i o n . T h i s i n h i b i t i o n i s n o t o v e r c o m e w i t h i n c r e a s e d g o n a d o t r o p i n . E s t r o g e n s i n c r e a s e t h e i r o w n p r o d u c t i o n b y a d i r e c t a c t i o n a t t h e g r a n u l o s a c e l l . E s t r o g e n s a l s o i n c r e a s e F S H i n d u c e d a r o m a t a s e a c t i v i t y , a n d d e c r e a s e p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n b y g r a n u l o s a c e l l s . E s t r o g e n s a l s o e n h a n c e g o n a d o t r o p i n - s t i m u l a t e d L H r e c e p t o r f o r m a t i o n , a n d t h e r e b y i n c r e a s e r e s p o n s i v e n e s s t o t h e p r e o v u l a t o r y L H s u r g e . A n d r o g e n s i n c r e a s e p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n r a t g r a n u l o s a c e l l s , a n d d e c r e a s e p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n h u m a n g r a n u l o s a c e l l s . A n d r o g e n s a l s o i n c r e a s e F S H - s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n . P r o g e s t e r o n e d e c r e a s e s F S H - s t i m u l a t e d e s t r o g e n p r o d u c t i o n ( G o r e - L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 ) . 4 . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e 3 3 G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e i s a d e c a p e p t i d e h y p o t h a l a m i c h o r m o n e . I t s l i n e a r s e q u e n c e i s : G l u 1 - H i s 2 - T r p 3 - S e r 4 - T y r 5 - G l y 6 -L e u 7 - A r g 8 - P r o 9 - G l y 1 0 - a m i d e . T h e c h e m i s t r y , s h a p e a n d s t r u c t u r e a c t i v i t y r e l a t i o n s o f G n R H a n d i t s r e c e p t o r h a v e b e e n r e v i e w e d ( K a r t e n a n d R i v i e r , 1 9 8 6 ; H a z u m a n d C o n n , 1 9 8 8 ) a s h a s i t s m e c h a n i s m o f a c t i o n ( H u c k l e a n d C o n n , 1 9 8 8 ) . T h e s t r u c t u r e o f t h e p r e c u r s o r p r o t e i n f r o m w h i c h G n R H i s p r o d u c e d w a s d i s c o v e r e d i n 1 9 8 4 ( S e e b u r g a n d A d e l m a n , 1 9 8 4 ) . P r e - p r o - G n R H i s c o m p o s e d o f a 2 3 a m i n o a c i d s i g n a l p e p t i d e , t h e 1 0 a m i n o a c i d G n R H m o l e c u l e , a 3 a m i n o a c i d s e q u e n c e a n d 5 6 a m i n o a c i d s t h a t m a k e u p G n R H a s s o c i a t e d p e p t i d e , G A P ( N i k o l i c s , e t a l . , 1 9 8 5 ) o r p r o l a c t i n r e l e a s e - i n h i b i t i n g f a c t o r ( P I F ) ( A d e l m a n , e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h e G n R H g e n e i s o n t h e s h o r t a r m o f c h r o m o s o m e 8 ( Y a n g - F e n g e t a l . , 1 9 8 6 ) . A l t h o u g h i t i s u n l i k e l y t h a t h y p o t h a l a m i c G n R H r e a c h e s t h e o v a r y b e c a u s e o f d i l u t i o n a n d r a p i d d e g r a d a t i o n ( T s a f r i r i 1 9 8 8 ) , i n t r a g o n a d a l p r o d u c t i o n i s s u s p e c t e d . T h e r e a r e r e p o r t s o f a G n R H - l i k e a c t i v i t y i n p o r c i n e f o l l i c u l a r f l u i d ( W i l l i a m s a n d U l m a n i s , 1 9 8 3 ) a n d r a t o v a r i e s ( Y i n g e t a l . , 1 9 8 1 ; E s c h , 1 9 8 3 a n d A t e n e t a l . , 1 9 8 5 ) . L i e t a l . , 1 9 8 7 , p r e s e n t e d a p a p e r w h i c h c l a i m e d t h a t t h e o v a r y p r o d u c e d a G n R H l i k e p e p t i d e w i t h a 14 a m i n o a c i d s e q u e n c e w h i c h w a s e n t i r e l y d i f f e r e n t f r o m t h e h y p o t h a l a m i c d e c a p e p t i d e , a n d c a u s e d t h e r e l e a s e o f F S H a n d L H . H o w e v e r t h e v a l i d i t y o f t h i s r e p o r t h a s b e e n q u e s t i o n e d . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e r e c e p t o r s ( r e v i e w e d b y H a z u m a n d C o n n , 1 9 8 8 ) a r e f o u n d i n t h e p l a s m a m e m b r a n e o f r a t g r a n u l o s a , l u t e a l a n d t h e c a c e l l s ( C l a y t o n e t a l . , 1 9 7 9 ; H a l l a n d B e h r m a n , 1 9 8 1 ; J o n e s e t a l . , 1 9 8 0 ; H a r w o o d e t a l . , 1 9 8 0 ; R e e v e s , 1 9 8 0 , D a l k i n , 1 9 8 1 ; P i e p e r e t a l . , 1 9 8 1 ; P e l l e t i e r e t a l . , 1 9 8 2 ; S e g u i n e t a l . , 1 9 8 2 ; L a b r i e e t a l . , 1 9 8 2 ; M a r i o n a n d C o n n 1 9 8 3 ; O j e d a , 1 9 8 4 , a n d M a r c h e t t i e t a l . , 1 9 8 5 a , b ) . G o n a d o t r o p i n -r e l e a s i n g h o r m o n e b i n d i n g s i t e s a r e d e c r e a s e d i n p r e g n a n t m a r e ' s s e r u m g o n a d o t r o p i n ( PMSG ) t r e a t e d r a t s a f t e r i n d u c t i o n o f o v u l a t i o n b y L H / h C G ( J o n e s e t a l . , 1 9 8 0 ; H a r w o o d e t a l . , 1 9 8 0 a n d P i e p e r e t a l . , 1 9 8 1 ) . T h e n u m b e r o f G n R H r e c e p t o r s i s r e g u l a t e d b y G n R H ( P i e p e r e t a l . , 1 9 8 1 ) . T h e r e m a y b e t w o t y p e s o f G n R H r e c e p t o r s , o n e w h i c h a c t i v a t e s P L C , u l t i m a t e l y r e s p o n s i b l e f o r I n s P a n d DG p r o d u c t i o n , a n d a n o t h e r w h i c h b i n d s t o P L A 2 , u l t i m a t e l y r e s p o n s i b l e f o r t h e p r o d u c t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d ( W a t a n a b e , 1 9 9 0 ) . T h e i n v o l v e m e n t o f a r a c h i d o n i c a c i d a n d P K C i n G n R H a c t i v i t y h a s a l s o b e e n s t u d i e d i n c u l t u r e d p i t u i t a r y c e l l s ( C h a n g e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h e c l a s s i c r o l e o f G n R H i s a r e g u l a t o r o f L H / F S H r e l e a s e a t t h e p i t u i t a r y ; h o w e v e r s i n c e 1 9 7 9 i t h a s b e e n k n o w n t h a t G n R H a l s o h a s d i r e c t a c t i o n s a t t h e g o n a d a l l e v e l ( H s u e h a n d E r i c k s o n , 1 9 7 9 ; L a b r i e e t a l . 1 9 8 1 ; H s u e h a n d J o n e s 1 9 8 1 ; L e u n g , 1 9 8 5 ; H i l l e n s j o e t a l . , 1 9 8 2 ; K n e c h t e t a l . , 1 9 8 5 , a n d C l a r k , 1 9 8 2 ) . F o l l i c l e - s t i m u l a t i n g h o r m o n e p r o m o t e s s t e r o i d o g e n e s i s a n d m a t u r a t i o n o f t h e g r a n u l o s a c e l l . P r o l a c t i n , i n s u l i n , t e s t o s t e r o n e a n d e s t r o g e n m o d u l a t e t h i s p r o c e s s . G o n a d o t r o p i n -r e l e a s i n g h o r m o n e i n h i b i t s t h i s m a t u r a t i o n b y i n h i b i t i n g F S H -s t i m u l a t e d e s t r o g e n a n d p r o g e s t i n p r o d u c t i o n ( H s u e h a n d E r i c k s o n , 1 9 7 9 ; H s u e h a n d L i n g , 1 9 7 9 ; M a s s i c o t t e e t a l . , 1 9 8 0 ; H i l l i e r e t a l . , 1 9 8 1 ; J o n e s a n d H s u e h , 1 9 8 1 ; M a s s i c o t t e e t a l . , 1 9 8 1 ; T u r e c k e t a l . , 1 9 8 2 ; K n e c h t e t a l . , 1 9 8 1 ; W e l s h e t a l . , 1 9 8 4 ; K n e c h t e t a l . , 1 9 8 5 ; S h i n o h a r a e t a l . , 1 9 8 5 ; K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 6 a , a n d W a n g e t a l . , 1 9 8 9 c ) a p p a r e n t l y t h r o u g h a n e f f e c t o n s t e r o i d o g e n i c e n z y m e s . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e i n h i b i t s F S H - s t i m u l a t e d a r o m a t a s e a c t i v i t y ( H s u e h e t a l . , 1 9 8 0 ; D o r r i n g t o n e t a l . , 1 9 8 2 , a n d G o r e - L a n g t o n e t a l . , 1 9 8 1 ) , 3 / ? - h y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e , p o s s i b l y t h e s i d e c h a i n c l e a v a g e e n z y m e ( J o n e s a n d H s u e h , 1 9 8 2 ) a n d i n c r e a s e s F S H - s t i m u l a t e d 2 0 a - s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y ( J o n e s a n d H s u e h , 1 9 8 1 ) . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e s u p p r e s s e s c A M P f o r m a t i o n a n d s t i m u l a t e s c A M P b r e a k d o w n ( M a s s i c o t t e e t a l . , 1 9 8 0 ; K n e c h t a n d C a t t , 1 9 8 1 , G o r e - L a n g t o n e t a l . , 1 9 8 1 ) a n d i n h i b i t s p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n s t i m u l a t e d b y 8 -b r - c A M P a n d c h o l e r a t o x i n . T h i s i n h i b i t o r y e f f e c t a p p e a r s t o b e t h e r e s u l t o f a n i n c r e a s e i n t h e m e t a b o l i s m o f p r o g e s t e r o n e t o 2 0 a - h y d r o x y - p r o g e s t e r o n e w i t h n o d e c r e a s e i n p r e g n e n o l o n e p r o d u c t i o n ( S h e e l a R a n i e t a l . , 1 9 8 3 , a n d H s u e h e t a l . , 1 9 8 4 ) . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e a l s o i n h i b i t s c A M P p r o d u c t i o n i n d u c e d b y L H , i s o p r o t e r e n o l a n d P G E i f g r a n u l o s a c e l l s h a v e b e e n s t i m u l a t e d f i r s t w i t h F S H ( R a n t a , 1 9 8 3 ) . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e i n h i b i t s F S H - s t i m u l a t e d L H , p r o l a c t i n a n d e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r ( E G F ) r e c e p t o r f o r m a t i o n i n c u l t u r e d g r a n u l o s a c e l l s ( H s u e h a n d L i n g , 1 9 7 9 ; H s u e h e t a l . , 1 9 8 0 ; H s u e h a n d J o n e s , 1 9 8 1 a n d S t . A r n a u d e t a l . , 1 9 8 3 ) a n d d e s e n s i t i z e s t h e l u t e a l L H r e c e p t o r s ( H a l l a n d B e h r m a n , 1 9 8 1 ) . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e s t i m u l a t e s f i b r o n e c t i n p r o d u c t i o n i n t h e r a t g r a n u l o s a c e l l ( D o r r i n g t o n a n d S k i n n e r , 1 9 8 6 ) . I n g r a n u l o s a c e l l s , F S H s u p p r e s s e s f i b r o n e c t i n p r o d u c t i o n , a n d a b o l i s h e s t h e s t i m u l a t i o n o f f i b r o n e c t i n f o r m a t i o n b y G n R H . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e b l o c k s F S H i n h i b i t i o n o f t h e s y n t h e s i s o f a d h e r e n s j u n c t i o n p r o t e i n s , v i n c u l i n , a l p h a - a c t i n i n a n d a c t i n ( B e n - Z e ' e v a n d A m s t e r d a m , 1 9 8 7 ) . A l t h o u g h t h e m a j o r e f f e c t s o f G n R H i n p r i m a r y c u l t u r e s o f g r a n u l o s a c e l l s a r e s u p p r e s s i o n o f F S H - s t i m u l a t e d s t e r o i d o g e n e s i s , a n d m a t u r a t i o n o f t h e g r a n u l o s a c e l l ( H s u e h a n d J o n e s , 1 9 8 1 ) , G n R H w h e n a d m i n i s t e r e d b y i t s e l f t o c e l l s i n c u l t u r e a l s o h a s m u l t i p l e e f f e c t s o n s t e r o i d o g e n e s i s . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e s t i m u l a t e s p r o g e s t e r o n e , p r e g n e n o l o n e , 2 0 a - h y d r o x y - p r o g e s t e r o n e , e s t r a d i o l , P G p r o d u c t i o n , l a c t a t e f o r m a t i o n , a n d p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r a c t i v i t y i n g r a n u l o s a c e l l s ( C l a r k e t a l . , 1 9 8 0 ; G o r e - L a n g t o n e t a l . , 1 9 8 1 ; D o r r i n g t o n e t a l . , 1 9 8 2 ; J o n e s a n d H s u e h , 1 9 8 2 ; C l a r k , 1 9 8 2 ; S h e e l a R a n i e t a l . , 1 9 8 3 ; H s u e h e t a l . , 1 9 8 4 ; D o r r i n g t o n a n d S k i n n e r , 1 9 8 6 ; W a n g a n d L e u n g , 1 9 8 6 ; W a n g a n d L e u n g 1 9 8 7 , a n d W a n g e t a l . , 1 9 8 9 c , d ) . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e i n h i b i t s L H / h C G - s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e s e c r e t i o n b y r a t l u t e a l c e l l s i n v i t r o ( M a s s i c o t t e e t a l . , 1 9 8 1 ; B e h r m a n e t a l . , 1 9 8 0 ; C l a y t o n , 1 9 7 9 ; J o n e s a n d H s u e h , 1 9 8 0 ) o r i n v i v o ( J o n e s a n d H s u e h , 1 9 8 0 ) . I n l u t e a l c e l l s , u n l i k e g r a n u l o s a c e l l s , i n h i b i t i o n o f p r o g e s t e r o n e s e c r e t i o n b y G n R H i s r e v e r s e d b y d i b u t y r y l c A M P ( B e h r m a n e t a l . , 1 9 8 0 , H a r w o o d e t a l . , 1 9 8 0 ) . G o n a d o t r o p i n -r e l e a s i n g h o r m o n e a l s o i n h i b i t s p r o l a c t i n i n d u c t i o n o f L H r e c e p t o r s ( K h a n - D a w o o d a n d D a w o o d , 1 9 8 6 ) . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e i n h i b i t s F S H - , p r o l a c t i n - a n d / 3 2 - a d r e n e r g i c a g o n i s t -s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n b y i n c r e a s i n g 2 0 a -h y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y , b u t i n h i b i t s h C G - a n d F S H -s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n b y i n h i b i t i n g p r e g n e n o l o n e f o r m a t i o n ( J o n e s e t a l . , 1 9 8 3 ; K h a n - D a w o o d a n d D a w o o d , 1 9 8 6 , a n d B r a m l e y , 1 9 8 9 ) . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e a c t i o n i n t h e p i t u i t a r y a n d o v a r y i s b e l i e v e d t o b e m e d i a t e d b y i n c r e a s e d p h o s p h o l i p i d t u r n o v e r ( S n y d e r a n d B l e a s d a l e 1 9 8 2 ; R a y m o n d e t a l . , 1 9 8 4 : L e u n g e t a l . , 1 9 8 3 ; D a v i s e t a l . , 1 9 8 3 a , a n d N a o r a n d Y a v i n , 1 9 8 2 ) . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e e n h a n c e s P A / P t d l n s t u r n o v e r i n c u l t u r e d r a t g r a n u l o s a ( N a o r a n d Y a v i n , 1 9 8 2 ; D a v i s e t a l . 1 9 8 3 a ; M i n e g i s h i a n d L e u n g , 1 9 8 5 a , a n d M a a n d L e u n g , 1 9 8 5 ) , a n d l u t e a l ( L e u n g e t a l . , 1 9 8 3 , a n d L e u n g e t a l . , 1 9 8 6 ) c e l l s . P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 t u r n o v e r p r o d u c e s DG a n d I n s P . G o n a d o t r o p i n -r e l e a s i n g h o r m o n e s t i m u l a t e s p r o d u c t i o n o f DG i n g r a n u l o s a c e l l s ( D a v i s e t a l . , 1 9 8 6 a ) . D i a c y l g l y c e r o l i s t h e p h y s i o l o g i c a l a c t i v a t o r o f P K C . A c t i v a t i o n o f P K C i s b e l i e v e d t o b e a t l e a s t p a r t i a l l y r e s p o n s i b l e f o r t h e a c t i o n s o f G n R H i n o v a r i a n c e l l s ( D a v i s a n d C l a r k , 1 9 8 3 ; N o l a n d a n d D i m i n o , 1 9 8 6 , a n d V e l d h u i s a n d D e m e r s , 1 9 8 6 ) . I n i t i a l r e p o r t s s h o w e d i n c r e a s e d P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 t u r n o v e r a n d s u b s e q u e n t s t u d i e s s h o w e d i n c r e a s e d p r o d u c t i o n o f I n s P , i n c l u d i n g I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 i n r e s p o n s e t o G n R H i n r a t o v a r i a n c e l l s ( M a a n d L e u n g , 1 9 8 5 ; L e u n g e t a l . , 1 9 8 5 , a n d D a v i s e t a l . , 1 9 8 6 a ) . T h e a c c u m u l a t i o n o f I n s P w a s c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t , G n R H w a s e f f e c t i v e f r o m 1 0 " 9 t o 1 0 " 6 M , a n d t h i s a c c u m u l a t i o n o f I n s P w a s p r e v e n t e d b y G n R H a n t a g o n i s t . 38 I n h i b i t o r s o f P K C ( H - 7 ) h a v e a l s o b e e n u s e d t o i n v e s t i g a t e t h e r o l e o f P K C i n G n R H a c t i o n . T h e s t i m u l a t o r y e f f e c t o f G n R H o n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n w a s r e d u c e d b y 6 0 % a f t e r 5 h o u r s o f t r e a t m e n t w i t h H-7 ( W a n g a n d L e u n g , 1 9 8 7 ) . H-7 i s n o t a s p e c i f i c P K C i n h i b i t o r , h o w e v e r , s o r e s u l t s m a y n o t h a v e b e e n d u e t o i n h i b i t i o n o f P K C a c t i v i t y ( R i n g l e r e t a l . , 1 9 8 9 a ) . T h e a c t i v a t i o n o f P K C i n d u c e d b y G n R H i n t h e o v a r y h a s b e e n i n v e s t i g a t e d b y u s i n g p h o r b o l e s t e r s s u c h a s 1 2 - 0 -t e t r a d e c a n o y l p h o r b o l - 1 3 - a c e t a t e ( T P A ) a n d p e r m e a n t d i a c y l g l y c e r o l s , s u c h a s d i o c t a n y l g l y c e r o l , l - o l e o y l - 2 - a c e t o y l -s n - 3 - g l y c e r o l , a n d l - o l e o y l - 2 - a c e t y l g l y c e r o l , w h i c h a c t i v a t e P K C d i r e c t l y ( N i s h i z u k a , 1 9 8 8 ; K o m o r o w s k i a n d T s a n g , 1 9 9 0 ) . T P A , s i m i l a r t o G n R H , i n c r e a s e d p r o g e s t e r o n e a c c u m u l a t i o n b y a p p r o x i m a t e l y 2 . 5 f o l d ; t h e r e w a s n o s y n e r g i s t i c o r a d d i t i v e e f f e c t o f T P A o n G n R H - s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e a c c u m u l a t i o n ( W a n g a n d L e u n g , 1 9 8 7 ; K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 5 ; K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 6 a , a n d W a n g e t a l . , 1 9 8 9 c ) . D u r i n g s h o r t t e r m i n c u b a t i o n s ( 3 0 m i n u t e s ) , n o e f f e c t o f p h o r b o l e s t e r s o r p e r m e a n t d i a c y l g l y c e r o l s w a s s e e n o n p r o g e s t e r o n e s y n t h e s i s s t i m u l a t e d b y g o n a d o t r o p i n s ( S h i n o h a r a e t a l . , 1 9 8 6 ) . I n l o n g e r c u l t u r e s o f r a t g r a n u l o s a c e l l s ( u p t o 2 4 h o u r s ) , G n R H i n h i b i t e d F S H - s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n ( W a n g e t a l . , 1 9 8 9 c ) . T P A i n h i b i t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n s t i m u l a t e d b y L H , F S H , c h o l e r a t o x i n , 8 -b r - c A M P a n d d i b u t y r y l c A M P ( K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 5 ; W a n g e t a l . , 1 9 8 9 c , a n d K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 6 b ) w i t h o r w i t h o u t 1 - m e t h y l -3 - i s o b u t y l x a n t h i n e , w h i c h b l o c k e d p h o s p h o d i e s t e r a s e ( L e u n g e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e a b i l i t y o f T P A t o a t t e n u a t e F S H - s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n a t s h o r t e r t i m e p o i n t s ( 5 h o u r s ) m a y h a v e b e e n d u e t o t h e c o n c e n t r a t i o n o f T P A u s e d ( L e u n g e t a l . , 1 9 8 8 ) . I n o t h e r e x p e r i m e n t s , T P A d i d n o t a f f e c t b a s a l o r L H -s t i m u l a t e d c A M P a c c u m u l a t i o n f o r u p t o 5 h o u r s . T h e s e r e s u l t s w e r e i d e n t i c a l t o t h e r e s u l t s o b t a i n e d u s i n g a G n R H a g o n i s t i n t h e s a m e e x p e r i m e n t s ( K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 5 ) . A f t e r t h e s e c o n d d a y o f c u l t u r e , T P A i n h i b i t e d F S H - i n d u c e d i n c r e a s e i n c A M P ( K n e c h t e t a l . , 1 9 8 1 , a n d S h i n o h a r a e t a l . , 1 9 8 5 ) a s d i d G n R H ( K n e c h t a n d C a t t , 1981; G o r e - L a n g t o n e t a l . , 1981, a n d R a n t a e t a l . , 1 9 8 3 ) . T P A m a y d i r e c t l y a f f e c t s t e r o i d o g e n i c e n z y m e a c t i v i t y . S t i m u l a t i o n ( K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 6 b ) o r i n h i b i t i o n o f 3 / 3 - h y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y h a s b e e n s e e n ( J o n e s a n d H s u e h , 1 9 8 1 , a n d W e l s h e t a l . , 1 9 8 4 ) . T P A - s t i m u l a t e d ( K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 6 b ) , i n h i b i t e d ( J o n e s a n d H s u e h , 1 9 8 1 ) o r h a d n o e f f e c t o n 2 0 a - h y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e a c t i v i t y ( W e l s h e t a l . , 1 9 8 4 ) . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e a n d T P A b o t h i n h i b i t e d m a t u r a t i o n r e s p o n s e s s u c h a s c e l l u l a r a g g r e g a t i o n a n d e x p r e s s i o n o f L H r e c e p t o r s . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e a n d T P A b o t h b l o c k e d F S H i n h i b i t i o n o f t h e s y n t h e s i s o f a d h e r e n s j u n c t i o n p r o t e i n s , v i n c u l i n , a - a c t i n i n a n d a c t i n ( B e n - Z e ' e v a n d A m s t e r d a m , 1 9 8 7 ) . T P A a n d G n R H i n c r e a s e d P G E a c c u m u l a t i o n b u t w e r e n o t a d d i t i v e ( K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 6 a ; a n d W a n g e t a l . , 1 9 8 9 c ) . B o t h i n c r e a s e d P G s y n t h a s e a c t i v i t y ; T P A h a l f a s e f f e c t i v e a s G n R H a g o n i s t ( K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 6 a ) . T h e e f f e c t o f T P A o n P G E 2 p r o d u c t i o n w a s a d d i t i v e w i t h L H o r F S H ( K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 5 , a n d W a n g e t a l . , 1 9 8 9 c ) . B a s e d o n t h e s i m i l a r i t y b e t w e e n t h e e f f e c t s o f T P A a n d G n R H o n g r a n u l o s a c e l l f u n c t i o n , w e c o n c l u d e 4 0 t h a t s o m e o f t h e a c t i o n s o f G n R H r e s u l t f r o m t h e p r o d u c t i o n o f DG a n d i t s a c t i v a t i o n o f P K C . A r e c e n t r e p o r t h a s s h o w n t h a t T P A a n d DG h a v e d i s t i n c t l y d i f f e r e n t e f f e c t s o n p r o g e s t i n f o r m a t i o n ( K o m o r o w s k i a n d T s a n g , 1 9 9 0 ) . I f t h i s i s t h e c a s e , t h e n i n h i b i t i o n o f p r o g e s t i n f o r m a t i o n b y G n R H m a y b e t h e r e s u l t o f t h e a c t i o n o f a n o t h e r s e c o n d m e s s e n g e r , s u c h a s c a l c i u m w h i c h i s k n o w n t o a t t e n u a t e g o n a d o t r o p i n - s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n . C a l c i u m i s a l s o b e l i e v e d t o be important i n G n R H a c t i v i t y ( L e u n g a n d W a n g , 1 9 8 9 c ) . I n o s i t o l ( 1 , 4 , 5 ) P 3 m o b i l i z e s i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m b y b i n d i n g t o s p e c i f i c r e c e p t o r s o n i n t r a c e l l u l a r s t o r e s o f c a l c i u m a n d o p e n i n g c h a n n e l s , r e s u l t i n g i n i n c r e a s e d [ C a 2 + ] i ( N i s h i z u k a , 1 9 8 4 a n d B e r r i d g e , 1 9 8 7 ) . P h o s p h a t i d i c a c i d m a y ( T y s o n , 1 9 7 6 ; P u t n e y e t a l . , 1 9 8 0 ) o r m a y n o t ( H o l m e s a n d Y o s s , 1 9 8 3 ) a c t a s a c a l c i u m i o n o p h o r e i n a r t i f i c i a l m e m b r a n e s a n d c e l l s a n d p l a y a r o l e i n [ C a 2 + ] i f o l l o w i n g a d m i n i s t r a t i o n o f G n R H t o o v a r i a n c e l l s . I n t r a c e l l u l a r c a l c i u m h a s b e e n m e a s u r e d b y Q u i n - 2 f l u o r e s c e n c e i n s u s p e n s i o n s o f r a t g r a n u l o s a c e l l s b y D a v i s e t a l . ( 1 9 8 6 a ) . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e c a u s e d a 2 - f o l d i n c r e a s e i n [ C a 2 + ] i a s c o m p a r e d w i t h r e s t i n g c o n c e n t r a t i o n s . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e a l t e r s i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m l e v e l s i n i n d i v i d u a l c u l t u r e d r a t g r a n u l o s a c e l l s ( W a n g e t a l . , 1 9 8 9 b ) . F i v e - f o l d c h a n g e s i n i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m h a v e b e e n m e a s u r e d w i t h i n 2 0 s e c o n d s o f a d m i n i s t r a t i o n o f 1 0 " 9 t o 1 0 " 5 M G n R H u s i n g f u r a - 2 - m i c r o s p e c t r o f l u o r i m e t r y . T h i s a l t e r a t i o n i n i n t r a c e l l u l a r f r e e c a l c i u m w a s t r a n s i e n t ( t h e h o r m o n e w a s w a s h e d a w a y f r o m t h e c e l l s w i t h i n a b o u t 1 5 s e c o n d s ) a n d r e t u r n e d t o b a s e l i n e l e v e l s i n a b o u t 8 0 s e c o n d s . T h e s p e c i f i c i t y o f t h i s i n c r e a s e i n [ C a 2 + ] i h a s b e e n v e r i f i e d b y u s i n g a s p e c i f i c G n R H a n t a g o n i s t ( W a n g e t a l . , 1 9 8 9 b ) . E x p e r i m e n t s w i t h l o w c a l c i u m p e r i f u s i o n m e d i a s u g g e s t e d t h a t t h e i m m e d i a t e s o u r c e o f t h e [ C a 2 + ] i w a s i n t r a c e l l u l a r s t o r e s . C a l c i u m ( L ) c h a n n e l b l o c k e r s v e r a p a m i l , n i f e d i p i n e a n d d i l t i a z e m o n l y r e d u c e d t h e m a g n i t u d e o f t h e r e s p o n s e t o G n R H i n h a l f o f t h e c e l l s t e s t e d a n d o n l y a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s ( l O ' ^ M ) ( W a n g e t a l . , s u b m i t t e d ) . However, a f t e r p r o l o n g e d p e r i f u s i o n w i t h n o a d d e d c a l c i u m b u f f e r , t h e r e s p o n s e t o G n R H w a s e l i m i n a t e d , s u g g e s t i n g t h a t e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m i s a l s o r e q u i r e d f o r t h e c o n t i n u e d r e s p o n s e o f g r a n u l o s a c e l l s t o G n R H . E x t r a c e l l u l a r c a l c i u m m a y b e r e q u i r e d f o r t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f G n R H o n L H - s t i m u l a t e d c A M P p r o d u c t i o n a n d o n P G E 2 p r o d u c t i o n . R e d u c e d e x t r a c e l l u l a r c a l c i u m a l s o d e c r e a s e s i s o p r o t e r e n o l - i n d u c e d c A M P p r o d u c t i o n s u g g e s t i n g t h i s e f f e c t i s n o t s p e c i f i c t o a g e n t s b e l i e v e d t o u s e c a l c i u m a s a s e c o n d m e s s e n g e r ( R a n t a e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e e f f e c t o f i n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n o f [ C a 2 + ] i h a s b e e n i n v e s t i g a t e d u s i n g t h e c a l c i u m i o n o p h o r e , A 2 3 1 8 7 . E i t h e r p h o r b o l e s t e r s o r c a l c i u m i o n o p h o r e s i n c r e a s e b a s a l p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n ( K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 5 ; W a n g a n d L e u n g , 1 9 8 7 a n d L e u n g e t a l . , 1 9 8 8 a n d T s a n g e t a l . , 1 9 8 9 ) . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e o r T P A s t i m u l a t i o n o f p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i s n o t i n c r e a s e d b y t h e p r e s e n c e o f a c a l c i u m i o n o p h o r e ( K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 6 a ; W a n g e t a l . , 1 9 8 9 c ) . F o l l i c l e - s t i m u l a t i n g h o r m o n e -, 8 - b r - c A M P - o r c h o l e r a t o x i n - s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i s a t t e n u a t e d b y A 2 3 1 8 7 w i t h a n d w i t h o u t l - m e t h y l - 3 -i s o b u t y l x a n t h i n e i n r a t g r a n u l o s a c e l l s ( W a n g a n d L e u n g , 1 9 8 7 , L e u n g e t a l . , 1 9 8 8 ) . A 2 3 1 8 7 a l s o d e c r e a s e s p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o g o n a d o t r o p i n s ( W a n g a n d L e u n g , 1 9 8 7 , L e u n g e t a l . 1 9 8 8 ) . T h i s e f f e c t i s s i m i l a r t o t h e e f f e c t o f G n R H o n g o n a d o t r o p i n - s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n ( H s u e h a n d J o n e s , 1 9 8 1 ) . H o w e v e r , A 2 3 1 8 7 h a s n o f u r t h e r e f f e c t o n T P A i n h i b i t i o n o f p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n s t i m u l a t e d b y L H , c h o l e r a t o x i n o r d i b u t y r y l c A M P ( L e u n g e t a l . 1 9 8 8 , a n d K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 6 a ) . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h A 2 3 1 8 7 e x e r t s i t s e f f e c t s o n i n h i b i t i o n o f s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i s n o t c l e a r . H o w e v e r h i g h a m o u n t s o f c a l c i u m c a n a c t i v a t e P K C w i t h o u t DG b e i n g i n v o l v e d ( N i s h i z u k a , 1 9 8 4 , a n d B r o c k l e h u r s t , 1 9 8 4 ) , s o t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f G n R H o n s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n m a y b e d u e e n t i r e l y t o i n c r e a s e d [ C a 2 + ] i . A 2 3 1 8 7 i s s y n e r g i s t i c w i t h T P A o r G n R H o n P G E p r o d u c t i o n , b u t n o t o n t h e s t i m u l a t i o n o f P G s y n t h a s e ( K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 6 a a n d T s a n g e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h e s t i m u l a t o r y e f f e c t o f G n R H o n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n m a y b e m e d i a t e d b y a r a c h i d o n i c a c i d i n t h e r a t o v a r y ( M i n e g i s h i a n d L e u n g , 1 9 8 5 b , W a n g a n d L e u n g , 1 9 8 9 , a n d W a t a n a b e e t a l . , 1 9 9 0 ) . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e i n c r e a s e s a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e f r o m r a t g r a n u l o s a c e l l s ( K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 6 a ) , a n d r a t l u t e a l c e l l s ( W a t a n a b e e t a l . , 1 9 9 0 ) a s d o e s T P A a n d A 2 3 1 8 7 . T P A o r A 2 3 1 8 7 h a v e a d d i t i v e e f f e c t s w i t h G n R H a g o n i s t s o n a r a c h i d o n i c a c i d p r o d u c t i o n ( K a w a i a n d C l a r k , 1 9 8 6 a ) . A d m i n i s t r a t i o n o f e x o g e n o u s a r a c h i d o n i c a c i d i n c r e a s e s 4 3 p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n ( M c P h a i l e t a l . 1 9 8 4 , a n d M u r a k a m i a n d R o u t t e n b e r g , 1 9 8 5 ) . T h e P L A 2 a c t i v a t o r , m e l l i t i n , w h i c h i n c r e a s e s a r a c h i d o n i c a c i d p r o d u c t i o n , s t i m u l a t e s p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n b y r a t g r a n u l o s a c e l l s ( W a n g a n d L e u n g , 1 9 8 9 ) . T h i s s t i m u l a t i o n o f p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i s b l o c k e d b y n o r d i h y d r o g u a i a r e t i c a c i d w h i c h b l o c k s f o r m a t i o n o f l i p o x y g e n a s e m e t a b o l i t e s o f a r a c h i d o n i c a c i d ( l e u k o t r i e n e s ) , b u t i s n o t b l o c k e d b y i n d o m e t h a c i n , a b l o c k e r o f t h e c y c l o - o x y g e n a s e p a t h w a y ( P G a n d thromboxane f o r m a t i o n ) . L i p o x y g e n a s e m e t a b o l i t e s o f a r a c h i d o n i c a c i d h a v e a s t i m u l a t o r y e f f e c t o n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n r a t g r a n u l o s a c e l l s ( W a n g e t a l . , 1 9 8 9 d ) . A r a c h i d o n i c a c i d p a r t i a l l y r e v e r s e s t h e i n h i b i t i o n o f F S H -s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e c a u s e d b y G n R H o r T P A , i n s h o r t b u t n o t l o n g t e r m i n c u b a t i o n s ( W a n g a n d L e u n g , 1 9 8 9 ) . W a n g a n d L e u n g h a v e s u g g e s t e d t h a t t h e s t i m u l a t o r y e f f e c t o f G n R H o n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n s h o r t t e r m c u l t u r e m a y b e d u e t o t h e a c t i v a t i o n o f P L A 2 a n d p r o d u c t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d . W a t a n a b e e t a l . , 1 9 9 0 , s u g g e s t t h a t G n R H s t i m u l a t e s p r o d u c t i o n o f I n s P a n d a r a c h i d o n i c a c i d v i a d i f f e r e n t r e c e p t o r s . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e - s t i m u l a t e d P G E 2 p r o d u c t i o n m a y a l s o b e d e p e n d e n t o n p r o d u c t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d a n d l e u k o t r i e n e m e t a b o l i t e s ( W a n g e t a l . , 1 9 8 9 c , d ) . L i p o x y g e n a s e m e t a b o l i t e s o f a r a c h i d o n i c a c i d s t i m u l a t e d p r o d u c t i o n o f p r o g e s t e r o n e a n d P G E 2 a n d a u g m e n t e d G n R H - s t i m u l a t e d p r o d u c t i o n i n c u l t u r e d r a t g r a n u l o s a c e l l s ; T P A - s t i m u l a t e d p r o d u c t i o n o f P G E 2 w a s s t i m u l a t e d f u r t h e r b y a r a c h i d o n i c a c i d m e t a b o l i t e s ( W a n g a n d L e u n g , 1 9 8 9 ) . I n s u m m a r y , t h e a c t i o n s o f G n R H i n r a t o v a r i a n c e l l s a r e c o m p l e x . S t i m u l a t i o n o f p r o g e s t e r o n e a n d P G E 2 p r o d u c t i o n b y G n R H a p p e a r s t o b e m e d i a t e d t h r o u g h a r a c h i d o n i c a c i d a n d l e u k o t r i e n e p r o d u c t i o n . T h e i n h i b i t i o n o f g o n a d o t r o p i n - s t i m u l a t e d c A M P a n d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n m a y i n v o l v e P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 b r e a k d o w n a n d s u b s e q u e n t i n c r e a s e s i n [ C a 2 + ] i a n d P K C a c t i v a t i o n . T h e m e c h a n i s m ( s ) b y w h i c h G n R H a l t e r s e n z y m e a c t i v i t y a n d r e c e p t o r f o r m a t i o n h a s n o t y e t b e e n e s t a b l i s h e d . 5 . P r o s t a g l a n d i n s P r o s t a g l a n d i n s a r e c o m p o u n d s d e r i v e d f r o m 2 0 c a r b o n p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s , p r i m a r i l y a r a c h i d o n i c a c i d . P r o s t a g l a n d i n s a r e p r o d u c e d i n t h e c a a n d g r a n u l o s a c e l l s o f r a t f o l l i c l e s ( L i n d n e r e t a l . , 1 9 7 4 ; B a u m i n g e r e t a l . , 1 9 7 5 ; B a u m i n g e r a n d L i n d n e r , 1 9 7 5 a n d L i n d n e r e t a l . 1 9 8 0 ) . I n t h e r a t f o l l i c l e , P G f o r m a t i o n i s i n d e p e n d e n t o f s t e r o i d s y n t h e s i s ; i t i s d e p e n d a n t u p o n t h e i n d u c t i o n o f P G - s y n t h e t a s e ( B a u m i n g e r e t a l . , 1 9 7 5 ) . C u r r y e t a l . ( 1 9 8 7 ) h a v e s h o w n t h a t P G s y n t h a s e i m m u n o r e a c t i v i t y i n r a t o v a r y i s f o u n d i n i n t e r s t i t i a l c e l l s , i n t h e c a c e l l s o f l a r g e r f o l l i c l e s a n d i n g r a n u l o s a c e l l s i n l a r g e a n t r a l f o l l i c l e s . P r o s t a g l a n d i n s y n t h a s e s t a i n i n g i n g r a n u l o s a c e l l s i s h e t e r o g e n o u s , c o n s i s t e n t w i t h t h e c o n c e p t o f a h e t e r o g e n o u s g r a n u l o s a c e l l p o p u l a t i o n ( G r e e n w a l d a n d T e r r a n o v a , 1 9 8 8 ) . A l a r g e i n c r e a s e i n t h e a m o u n t o f P G p r o d u c e d i n t h e o v a r y i s s t i m u l a t e d b y t h e p r e o v u l a t o r y s u r g e o f L H o r i n r e s p o n s e t o c A M P ( B a u m i n g e r a n d L i n d n e r , 1 9 7 5 , a n d L e M a i r i e , e t 4 5 i a l . , 1 9 7 9 ) . T h i s i n c r e a s e o c c u r s i n f o l l i c l e s d e s t i n e d t o o v u l a t e ( H a m b e r g e r e t a l . , 1 9 8 6 ) . L u t e i n i z i n g h o r m o n e - s t i m u l a t e d P G E p r o d u c t i o n i s m u c h g r e a t e r t h a n L H - s t i m u l a t e d P G F 2 a p r o d u c t i o n i n t h e r a t ( B a u m i n g e r a n d L i n d n e r , 1 9 7 5 ) . M a x i m a l l e v e l s o f P G F 2 a , P G E 2 a n d 6 - k e t o - P G F 1 a ( w h i c h i s a m e t a b o l i t e o f p r o s t a c y c l i n ) w e r e m e a s u r e d i n c o r p o r a l u t e a o f r a t s o n d a y 1 3 o f p s e u d o p r e g n a n c y , c l o s e t o t h e t i m e o f l u t e o l y s i s ( O l o f s s o n e t a l . , 1 9 9 0 ) . H o w e v e r , i n m a n y s p e c i e s , i n c l u d i n g r a t s a n d m o s t d o m e s t i c s p e c i e s , t h e s o u r c e o f p r o s t a g l a n d i n s i n v o l v e d i n l u t e o l y s i s i s n o t t h e o v a r y , b u t t h e u t e r u s ( N i s w e n d e r a n d N e t t , 1 9 8 8 ) . P r o s t a g l a n d i n F 2 a f r o m t h e u t e r o - o v a r i a n v e i n p a s s e s i n t o t h e o v a r i a n a r t e r y a n d t o t h e o v a r y w h e r e t h e P G F 2 a i n d u c e s l u t e o l y s i s ( H a m b e r g e r e t a l . , 1 9 8 6 ) . B i n d i n g s i t e s f o r P G E a n d P G F 2 a h a v e b e e n f o u n d o n l u t e a l c e l l s ( K i m b a l l a n d L a u d e r d a l e , 1 9 7 3 ; R a o , 1 9 7 3 , a n d O r l i c k y , 1 9 9 0 ) . T w o b i n d i n g s i t e s f o r P G F 2 a , o n e w i t h h i g h ( K d = 4 . 7 n M ; W r i g h t e t a l . , 1 9 7 9 a n d B u s s m a n , 1 9 8 9 ) a n d o n e w i t h l o w e r a f f i n i t y ( K d = 0 . 4 / i M ; W r i g h t e t a l . , 1 9 7 9 ) h a v e b e e n d e s c r i b e d i n r a t c o r p o r a l u t e a . B i n d i n g o f P G F 2 a t o t h e r e c e p t o r a p p e a r s t o p a r a l l e l , i n t e r m s o f t h e i n c r e a s e d K d a n d b i n d i n g c a p a c i t y , t h e l u t e o l y t i c a c t i o n o f P G F 2 a . W r i g h t e t a l . , 1 9 7 9 , s a w i n c r e a s e d i n h i b i t i o n o f L H - s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n b y a P G F 2 a a n a l o g u e ( 1 6 - m - t r i f l u o r o m e t h y l p h e n y l P G F 2 a ) , w h i c h c o r r e s p o n d s t o i t s i n c r e a s e d p o t e n c y a s a c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r o f P G F 2 a b i n d i n g t o l u t e a l c e l l s . P r o s t a g l a n d i n s a r e b e l i e v e d t o b e i n v o l v e d i n e a r l y f o l l i c u l a r g r o w t h , o v u l a t i o n a n d f u n c t i o n a s l u t e o t r o p i c a n d l u t e o l y t i c a g e n t s . P r o s t a g l a n d i n s r e g u l a t e e a r l y f o l l i c u l a r g r o w t h b y i n c r e a s i n g b l o o d s u p p l y t o t h e f o l l i c l e a n d / o r i n c r e a s i n g F S H r e c e p t o r s o n g r a n u l o s a c e l l s ( H a m b e r g e r e t a l . , 1 9 8 6 ) . P r o s t a g l a n d i n s c a n a l s o r e g u l a t e t h e s e c r e t o r y c a p a b i l i t y o f g r a n u l o s a c e l l s ( A r m s t r o n g , 1 9 8 1 , a n d H s u e h e t a l . , 1 9 8 4 ) , a n d a r e i n v o l v e d i n o v u l a t i o n . I n h i b i t o r s o f P G s y n t h e s i s ( a c e t y l s a l i c y l i c a c i d a n d i n d o m e t h a c i n ) b l o c k o v u l a t i o n i n r a t s ( A r m s t r o n g a n d G r i n w i c h , 1 9 7 2 a n d O r c z y k a n d B e h r m a n , 1 9 7 2 ) . T h i s b l o c k c a n b e o v e r c o m e w i t h t h e i n j e c t i o n o f e x o g e n o u s P G s ( H a m b e r g e r e t a l . , 1 9 8 6 , a n d P r i d d y a n d K i l l i c k , 1 9 8 8 ) . P r o d u c t i o n o f p r o s t a g l a n d i n o f t h e E a n d F s e r i e s a r e g r e a t l y i n c r e a s e d i n s o m e s p e c i e s p r i o r t o o v u l a t i o n ; i n d o m e t h a c i n h a s b e e n s h o w n t o b l o c k t h e s e i n c r e a s e s a t d o s e s w h i c h p r e v e n t e d o v u l a t i o n ( Z o r e t a l . , 1 9 7 7 ) . A n t i s e r u m t o P G E o r P G F 2 a b l o c k e d L H i n d u c e d o v u l a t i o n w h e n a d m i n i s t e r e d s y s t e m i c a l l y ( L a u e t a l . , 1 9 7 4 ) i n m i c e , o r i n t r a f o l l i c u l a r l y ( A r m s t r o n g e t a l . , 1 9 7 4 ) i n e s t r o u s r a b b i t s . A n t i s e r u m t o P G F 2 a w a s m o r e e f f e c t i v e t h a n P G E 2 a n t i s e r u m i n b l o c k i n g o v u l a t i o n i n r a b b i t s ( A r m s t r o n g e t a l . , 1 9 7 4 ) . P r o s t a g l a n d i n E 2 i s a l u t e o t r o p i c a g e n t i n t h e e a r l y l u t e a l p h a s e ; P G E 2 s t i m u l a t e s p r o d u c t i o n o f c A M P a n d p r o g e s t e r o n e ( E r i c k s o n , 1 9 8 5 , a n d s e e G o r e - L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 ) . P r o s t a g l a n d i n F 2 a m a y b e r e s p o n s i b l e f o r l u t e o l y s i s i n m a n y s u b p r i m a t e s p e c i e s ( H o r t o n a n d P o y s e r , 1 9 7 6 ; Z o r a n d L a m p e r t 1 9 7 7 ) . M u l t i p l e c h a n g e s i n l u t e a l f u n c t i o n a r e i n d u c e d b y P G F 2 a . P h a r r i s s a n d W y n g a r d e n , 1 9 6 9 , w e r e t h e f i r s t t o s h o w d e c r e a s e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n f o l l o w i n g i n j e c t i o n o f P G F 2 a i n t o p s e u d o p r e g n a n t r a t s . A l t h o u g h P G F 2 m a y d e c r e a s e b l o o d f l o w t o t h e o v a r y ( B e h r m a n e t a l . 1 9 7 1 , a n d P h a r r i s s e t a l . 1 9 7 2 ) , P G F 2 a w h i c h i s i n j e c t e d i n a d o s e h i g h e n o u g h t o i n d u c e l u t e o l y s i s d o e s n o t d e c r e a s e o v a r i a n b l o o d f l o w , b u t d o e s d e c r e a s e p r o g e s t e r o n e s e c r e t i o n i n r a t s ( B e h r m a n , 1 9 7 9 ) . P r o s t a g l a n d i n F 2 a a l s o d e c r e a s e s L H r e c e p t o r s o n t h e c o r p u s l u t e u m , ( G r i n w i c h e t a l . , 1 9 7 6 a ) d u e t o i n h i b i t i o n o f p r o l a c t i n a c t i o n s ( B e h r m a n , 1 9 7 9 ) . H o w e v e r r e d u c t i o n i n b l o o d f l o w t o t h e c o r p u s l u t e u m a n d d e c r e a s e d L H r e c e p t o r n u m b e r , a s L i n d n e r e t a l . ( 1 9 8 0 ) h a v e p o i n t e d o u t , o c c u r t o o l a t e t o a c c o u n t f o r d e c l i n e i n p r o g e s t e r o n e s e c r e t i o n f r o m t h e c o r p u s l u t e u m ( B e h r m a n a n d H i t c h e n s , 1 9 7 6 ) , w h i c h o c c u r s w i t h i n 1 5 m i n u t e s o f P G F 2 a a d m i n i s t r a t i o n ( L i n d n e r e t a l . , 1 9 8 0 ) . P r o s t a g l a n d i n F 2 a m a y c a u s e l u t e o l y s i s o f l u t e a l c e l l s b y i n h i b i t i n g L H i n d u c e d c A M P a n d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n ( s e e f i g u r e 4 ) ( L a h a v e t a l . , 1 9 7 6 , G r i n w i c h e t a l . , 1 9 7 6 a , b , T h o m a s e t a l . , 1 9 7 8 , B e h r m a n e t a l . , 1 9 8 0 ) . P r o s t a g l a n d i n F 2 a i n h i b i t s t h e p r o d u c t i o n , r a t h e r t h a n s t i m u l a t i n g t h e d e g r a d a t i o n o f c A M P ( B e h r m a n , 1 9 7 9 ; K h a n e t a l . , 1 9 7 9 , a n d D o r f l i n g e r e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e e f f e c t o f P G F 2 a i s n o t a t t h e l e v e l o f t h e L H r e c e p t o r , b e c a u s e P G F 2 a h a s s i m i l a r e f f e c t s o n c A M P g e n e r a t i o n s t i m u l a t e d b y t r e a t m e n t w i t h i s o p r o t e r e n o l a n d s o d i u m f l u o r i d e ( K h a n a n d R o s b e r g , 1 9 7 9 , a n d L i n d n e r e t a l . , 1 9 8 0 ) . P r o s t a g l a n d i n F 2 a d o e s n o t d i r e c t l y i n h i b i t a d e n y l a t e c y c l a s e a c t i v i t y i n m e m b r a n e s o r h o m o g e n a t e s p r e p a r e d f r o m c o r p u s l u t e u m o f r a t s ( A a k v a a g a n d T o r j e s e n , 1 9 8 1 , a n d B e r h m a n e t a l . , 1 9 8 5 ) , b u t m a y w o r k t h r o u g h a r e v e r s i b l e f u n c t i o n a l i m p a i r m e n t i n G p r o t e i n s o f t h e a d e n y l a t e c y c l a s e s y s t e m ( N o r j a v a a r a a n d R o s b e r g , 1 9 8 6 ) . I n h i b i t i o n o f p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n 4 8 F i g u r e 4 . A s c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e i n t e r a c t i o n o f P G F 2 a a n d h C G o r L H i n r a t l u t e a l c e l l s . P G F ^ a a n < ^ L H b i n d t o c e l l s u r f a c e r e c e p t o r s a n d a c t i v a t e p h o s p h o l i p a s e C ( P L C ) a n d a d e n y l c y c l a s e ( A C ) , r e s p e c t i v e l y . T h i s b i n d i n g i s c o u p l e d t h r o u g h G -p r o t e i n s . L H m a y a l s o a c t i v a t e P L C . A c t i v a t i o n o f a d e n y l c y c l a s e i n c r e a s e s c A M P p r o d u c t i o n . A c t i v a t i o n o f P L C c a u s e s i n c r e a s e d P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 b r e a k d o w n a n d D G - I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 p r o d u c t i o n . P G F 2 a - r e c e p t o r i n t e r a c t i o n a l s o a c t i v a t e s a p r o t e i n k i n a s e i n t h e c e l l m e m b r a n e w h i c h a c t i v a t e s a s y e t u n i d e n t i f i e d p r o t e i n s . A c t i v a t o r s o f P L C i n d u c e f o r m a t i o n o f DG a n d I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 . DG a c t i v a t e s p r o t e i n k i n a s e C ( P K C ) w h i c h p h o s p h o r y l a t e s a n d t h e r e b y a c t i v a t e s p r o t e i n s . A c t i v a t e d P K C m a y p h o s p h o r y l a t e r e c e p t o r s a n d P L C a n d i n h i b i t f u r t h e r p r o d u c t i o n o f DG a n d I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 . I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 b i n d s t o r e c e p t o r s a n d r e l e a s e s c a l c i u m f r o m i n t r a c e l l u l a r s t o r e s c a l l e d c a l c i o s o m e s w h i c h m a y b e a s p e c i a l p a r t o f t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . I n c r e a s e d [ C a ] i a c t i v a t e s c a l c i u m - c a l m o d u l i n ( C a 2 + / C a m ) d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e , w h i c h a l s o p h o s p h o r y l a t e s a n d a c t i v a t e s p r o t e i n s . I n c r e a s e d p r o g e s t e r o n e ( P 4 ) p r o d u c t i o n m a y r e s u l t f r o m m u l t i p l e e f f e c t s o f c A M P . I n h i b i t o r y i n t e r a c t i o n s a r e i n d i c a t e d b y r e s p o n s e t o c A M P i n t h e p r e s e n c e o f P G F 2 a h a s b e e n r e p o r t e d ( G r i n w i c h e t a l . , 1 9 7 6 b ; D o r f l i n g e r e t a l . , 1 9 8 3 , a n d R a j k u m a r e t a l . , 1 9 8 8 ) . P r o g e s t e r o n e c o n t e n t o f t h e c o r p u s l u t e u m i s d e c r e a s e d b y a r e d u c t i o n i n t h e s u p p l y o f p r e c u r s o r s a n d s t i m u l a t i o n o f m e t a b o l i s m . D e c r e a s e d c h o l e s t e r o l e s t e r s y n t h e s i s a n d d e c r e a s e d t i s s u e c o n t e n t o f c h o l e s t e r o l e s t e r i n o v a r i e s i s s e e n i n i m m a t u r e r a t s t r e a t e d w i t h g o n a d o t r o p i n s f o l l o w e d b y P G F 2 a i n v i v o ( B e h r m a n e t a l . , 1 9 7 1 ) . 2 0 a - H y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e which m e t a b o l i z e s progestins, i s i n c r e a s e d a f t e r t r e a t m e n t w i t h P G F 2 a o n d a y s 9 - 1 2 , b u t n o t o n d a y s 4 - 6 o f p r e g n a n c y ( F u c h s a n d M o l k , 1 9 7 4 ) . L u t e a l c e l l s d i s p e r s e d f r o m p s e u d o p r e g n a n t r a t s 2 4 h o u r s f o l l o w i n g i n j e c t i o n o f P G F 2 a s h o w r e d u c e d m e m b r a n e f l u i d i t y , a s d o d i s p e r s e d l u t e a l c e l l s o n e h o u r a f t e r i n v i t r o a d m i n i s t r a t i o n o f P G F 2 a . M e m b r a n e s p r e p a r e d f r o m w h o l e o v a r y d o n o t h a v e d e c r e a s e d f l u i d i t y ( R i l e y a n d C a r l s o n , 1 9 8 5 ; R i l e y e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h i s s u g g e s t s r e d u c e d m e m b r a n e f l u i d i t y r e s u l t s f r o m t h e a c t i o n o f a s u b s t a n c e p r o d u c e d b y t h e c e l l s . A c h a n g e i n h C G b i n d i n g a n d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n P L A 2 a c t i v i t y i n d i s p e r s e d l u t e a l c e l l s i s a l s o s e e n . L u t e o l y s i s m a y o c c u r i n t w o p h a s e s . R e v e r s i b l e l u t e a l r e g r e s s i o n m a y b e d u e t o i m p a i r m e n t o f t h e G - p r o t e i n w h i c h c o u p l e s t h e L H r e c e p t o r t o a d e n y l a t e c y c l a s e ( N o r j a v a a r a a n d R o s b e r g , 1 9 8 6 ) . S i n c e t h e c o r p o r a l u t e a h a v e h i g h a m o u n t s o f t h e a d e n y l a t e c y c l a s e G - p r o t e i n i n t h e f i r s t d a y s o f l u t e a l l i f e , t h e l a c k o f a l u t e o l y t i c e f f e c t o f P G F 2 a i n t h i s p e r i o d m a y s i m p l y b e d u e t o t h e l a r g e a m o u n t o f G - p r o t e i n , o f w h i c h t h e P G F 2 a c a n i n a c t i v a t e a l i m i t e d a m o u n t ( M c l l r o y a n d B e r g e r t , 1 9 8 4 ; R o s b e r g e t a l . , 1 9 8 6 , a n d K h a n e t a l . , 1 9 7 9 ) . I r r e v e r s i b l e l u t e a l r e g r e s s i o n a p p e a r s t o b e d u e t o d e c r e a s e s i n L H r e c e p t o r s , d e c r e a s e d p r o g e s t e r o n e s y n t h e s i s , a n d i n c r e a s e d 2 0 a -d i h y d r o p r o g e s t e r o n e s y n t h e s i s ( D o r f l i n g e r e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e t r a n s d u c t i o n m e c h a n i s m o f P G F 2 a i n r a t l u t e a l a n d g r a n u l o s a c e l l s h a s n o t b e e n c o n c l u s i v e l y d e t e r m i n e d . H o w e v e r , t h e r e i s e v i d e n c e t h a t P G F 2 a u s e s P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 b r e a k d o w n a s a t r a n s d u c t i o n m e c h a n i s m i n r a t l u t e a l a n d g r a n u l o s a c e l l s ( L e u n g , 1 9 8 5 ; L a h a v e t a l . , 1 9 8 8 , a n d W a t a n a b e , H . e t a l . , 1 9 9 0 ) . Doses o f P G F 2 a t h a t i n h i b i t L H i n d u c e d p r o g e s t e r o n e s e c r e t i o n i n l u t e a l c e l l s m a r k e d l y i n c r e a s e l a b e l i n g o f P t d l n s a n d P A w i t h o r t h o [ 3 2 P ] p h o s p h a t e a s e a r l y a s 2 m i n u t e s a f t e r P G F 2 a a d d i t i o n ( T h o m a s e t a l . , 1 9 7 8 , a n d R a y m o n d e t a l . , 1 9 8 3 ) . I n c r e a s e d f o r m a t i o n o f I n s ( 4 ) P 1 f I n s ( l , 4 ) P 2 a n d I n s ( l , 4 , 5 ) P 3 h a s a l s o b e e n f o u n d i n r e s p o n s e t o P G F 2 a r a t l u t e a l c e l l s ( L e u n g , 1 9 8 5 , a n d L a h a v , 1 9 8 8 ) . A r a c h i d o n i c a c i d i s a l s o p r o d u c e d b y r a t g r a n u l o s a ( M i n e g i s h i e t a l . , 1 9 8 5 b ) a n d l u t e a l ( W a t a n a b e , H . e t a l . , 1 9 9 0 ) c e l l s i n r e s p o n s e t o P G F 2 a a n d m a y b e i n v o l v e d i n t h e p h y s i o l o g i c a l e f f e c t s o f P G F 2 a o n o v a r i a n c e l l f u n c t i o n . T h e l u t e o l y t i c e f f e c t o f P G F 2 a i n r a t l u t e a l c e l l s c a n b e d u p l i c a t e d u s i n g a p h o r b o l e s t e r , T P A , w h i c h a c t i v a t e s P K C . P h o r b o l e s t e r s m i m i c t h e e f f e c t o f P G F 2 a o n L H - s t i m u l a t e d c A M P a n d p r o g e s t e r o n e s e c r e t i o n f r o m l u t e a l c e l l s ( B a u m a n d R o s b e r g , 1 9 8 7 ) . P r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o 8 - b r - c A M P o r d i b u t y r y l c A M P i s a l m o s t e l i m i n a t e d b y t r e a t m e n t o f c e l l s w i t h T P A ( B a u m a n d R o s b e r g , 1 9 8 7 ) . C a l c i u m i o n o p h o r e s ( D o r f l i n g e r e t a l . , 1 9 8 4 , a n d S o o d a k e t 5 1 a l . , 1 9 8 8 ) , 4 5 C a ( L a h a v e t a l . , 1 9 8 3 ) , c a l c i u m c h a n n e l b l o c k e r s ( L a h a v e t a l . , 1 9 8 3 , a n d D o r f l i n g e r e t a l . , 1 9 8 4 ) , c a l m o d u l i n i n h i b i t o r s ( L a h a v e t a l . , 1 9 8 3 a n d 1 9 8 7 ) a n d i n h i b i t o r s o f i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m r e l e a s e ( T M B - 8 ; L a h a v e t a l . , 1 9 8 7 ) , h a v e b e e n u s e d t o i n v e s t i g a t e t h e i m p o r t a n c e o f c a l c i u m a s a s e c o n d m e s s e n g e r o f P G F 2 a . C a l c i u m i o n o p h o r e s h a v e e f f e c t s s i m i l a r t o P G F 2 a o n L H - s t i m u l a t e d c A M P a n d p r o g e s t e r o n e a c c u m u l a t i o n ( D o r f l i n g e r e t a l . , 1 9 8 4 ; B a u m a n d R o s b e r g , 1 9 8 7 , a n d S o o d a k e t a l . , 1 9 8 8 ) , a n d o n 8 - b r - c A M P o r d i b u t y r y l c A M P - s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n ( B a u m a n d R o s b e r g , 1 9 8 7 ) . C a l m o d u l i n i n h i b i t o r s s u c h a s t r i f l u o r o p e r z a i n e ( L a h a v e t a l . , 1 9 8 3 ) , p i m o z i d e ( d i p h e n y l b u t y l p i p e r i d i n e ) a n d N - ( 6 - a m i n o h e x y l ) - 5 - c h l o r o -1 - n a p h t h a l e n e s u l p h o n a m i d e ( W - 7 ) , h a v e n o e f f e c t o n P G F 2 a i n h i b i t i o n o f c A M P f o r m a t i o n ( L a h a v e t a l . , 1 9 8 7 ) . P r o s t a g l a n d i n F 2 a s t i m u l a t e s a c a l c i u m d e p e n d e n t p h o s p h o r y l a t i o n o f a s p e c i f i c p r o t e i n i n l u t e a l m e m b r a n e s o f r a t o v a r y ( B a u m , 1 9 8 9 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t a n e n d o g e n o u s p r o t e i n k i n a s e i s i n v o l v e d i n i t s a c t i o n . P h o s p h o r y l a t i o n o c c u r s w i t h i n 5 m i n u t e s o f h o r m o n e a d m i n i s t r a t i o n , w h i c h i s t h e t i m e a t w h i c h t h e e f f e c t o f P G F 2 a o n P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 b r e a k d o w n a l s o o c c u r s , a n d m a y b e a n o t h e r p a r t o f t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f P G F 2 a . T h e r o l e o f P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 b r e a k d o w n a n d c a l c i u m i n P G F 2 a i n d u c e d i n h i b i t i o n o f L H - s t i m u l a t e d c A M P p r o d u c t i o n h a s b e e n q u e s t i o n e d . M a x i m u m s e n s i t i v i t y o f l u t e a l c e l l s t o P G F 2 a - i n d u c e d P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 t u r n o v e r d o e s n o t c o r r e s p o n d t o m a x i m u m s e n s i t i v i t y o f L H - s t i m u l a t e d c A M P p r o d u c t i o n t o P G F 2 a - i n h i b i t i o n ( K h a n e t a l . , 1 9 7 9 , W r i g h t e t a l . , 1 9 8 0 , L a h a v e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e s e s t u d i e s s u g g e s t e d t h a t I n s P p r o d u c t i o n o n l y o c c u r r e d i n l u t e a l c e l l s h a r v e s t e d s o o n a f t e r f o r m a t i o n o f c o r p o r a l u t e a , b u t n o t a t l a t e r t i m e s , w h e n P G F 2 a w a s m o r e e f f e c t i v e i n i n h i b i t i n g L H -s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n . I n s u m m a r y , p r o s t a g l a n d i n s a r e m a d e i n t h e o v a r y , a n d h a v e e f f e c t s t h r o u g h b i n d i n g t o s p e c i f i c r e c e p t o r s a n d g e n e r a t i o n o f s e c o n d m e s s e n g e r s . P r o s t a g l a n d i n E 2 i n d u c e s p r o d u c t i o n o f c A M P ( E r i c k s o n , 1 9 8 5 , a n d s e e G o r e - L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 ) a n d P G F 2 a i n d u c e s p r o d u c t i o n o f I n s P s a n d a r a c h i d o n i c a c i d . P r o s t a g l a n d i n s h a v e s t e r o i d o g e n i c e f f e c t s i n g r a n u l o s a a n d l u t e a l c e l l s , a n d m a y p l a y a r o l e i n o v u l a t i o n a n d l u t e o l y s i s . C o m p a r i s o n o f t h e e f f e c t s o f G n R H a n d P G F 2 a i n r a t o v a r i a n c e l l s G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e a n d P G F 2 a h a v e s i m i l a r p h y s i o l o g i c a l e f f e c t s i n r a t o v a r i a n c e l l s w i t h r e s p e c t t o i n h i b i t i o n o f g o n a d o t r o p i n - s t i m u l a t e d c A M P a n d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n ( s e e f i g u r e 5 ) ( M a s s i c o t t e e t a l . , 1 9 8 1 , a n d L e u n g e t a l . , 1 9 8 8 ) . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e a n d P G F 2 a a p p e a r t o u s e a r a c h i d o n i c a c i d , a s w e l l a s p r o d u c t s o f P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 b r e a k d o w n a s t r a n s d u c t i o n m e c h a n i s m s ( R a y m o n d e t a l . , 1 9 8 3 ; M i n e g i s h i a n d L e u n g , 1 9 8 5 a ; L e u n g , 1 9 8 5 ; M i n e g i s h i a n d L e u n g , 1 9 8 5 b ; L e u n g e t a l . , 1 9 8 6 ; L a h a v e t a l . , 1 9 8 8 , a n d W a t a n a b e e t a l . 1 9 9 0 ) . A l t h o u g h b o t h G n R H a n d P G F 2 a i n c r e a s e P A / P t d l n s l a b e l i n g i n r a t l u t e a l a n d g r a n u l o s a c e l l s t h e r e a r e d i f f e r e n c e s i n t h e i r a c t i v i t i e s . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e i s m o r e e f f e c t i v e t h a n P G F 2 a i n l a b e l i n g o f P A / P t d l n s i n g r a n u l o s a c e l l s , a n d P G F 2 a i s m o r e e f f e c t i v e t h a n G n R H i n l u t e a l c e l l s ( R a y m o n d e t 5 3 F i g u r e 5 . A s c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f i n t e r a c t i o n s b e t w e e n G n R H , P G F 2 a a n d L H o r h C G i n r a t l u t e a l c e l l s , a s s u m i n g r e c e p t o r s f o r G n R H , P G F 2 a a n d L H a r e f o u n d o n t h e s a m e l u t e a l c e l l t y p e . G n R H a n d P G F 2 a a n d p o s s i b l y L H c a u s e i n c r e a s e d p r o d u c t i o n o f I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 a n d DG b y a c t i v a t i o n o f P L C . DG a c t i v a t e s P K C ; I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 i n c r e a s e s [ C a 2 + ] i . I n s ( 1 , 4 , 5 ) P 3 i s m e t a b o l i z e d t o I n s ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 w h i c h m a y a l s o b e i n v o l v e d i n i n c r e a s i n g [ C a 2 + ] i b y i n t e r a c t i n g a t t h e c e l l m e m b r a n e o r i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m s o u r c e s . A c t i v a t e d P K C p h o s p h o r y l a t e s a n d t h e r e b y a c t i v a t e s p r o t e i n s . O n e o f t h e p r o t e i n s p h o s p h o r y l a t e d b y P K C i s S C P 2 w h i c h i s a s t e r o l c a r r i e r r e s p o n s i b l e f o r t r a n s p o r t a t i o n o f c h o l e s t e r o l t o t h e i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e . DG m a y a l s o b e m e t a b o l i z e d i n t o a r a c h i d o n i c a c i d , t h e n l e u k o t r i e n e s , t h r o m b o x a n e s a n d p r o s t a g l a n d i n s . A s w e l l a c t i v a t i o n o f P L A 2 c a u s e s t h e p r o d u c t i o n o f A A . A c t i v a t i o n o f P1JC a n d P L A 2 m a y o c c u r v i a s e p a r a t e r e c e p t o r s f o r G n R H a n d P G F 2 a . L e u k o t r i e n e s s t i m u l a t e p r o d u c t i o n o f p r o g e s t e r o n e a n d P G E 2 . H i g h c a l c i u m m a y a c t i v a t e P K C , c a l m o d u l i n , c a l c i u m - s t i m u l a t e d p h o s p h o l i p a s e s a n d p r o t e a s e s . C a l c i u m b i n d s t o c a l m o d u l i n a n d a c t i v a t e s t h e c a l c i u m -c a l m o d u l i n d e p e n d a n t p r o t e i n k i n a s e ( C a 2 + / C a m k i n a s e ) . L u t e i n i z i n g h o r m o n e i n c r e a s e s c A M P b y a c t i v a t i o n o f A C . c A M P h a s a m u l t i t u d e o f e f f e c t s i n t h e c e l l . C y c l i c A M P m a y a c t i v a t e A - k i n a s e , a n d , a f t e r b i n d i n g t o t h e A - k i n a s e r e g u l a t o r y s u b u n i t , i n t e r a c t w i t h DNA a t t r a n s c r i p t i o n e n h a n c e r s e q u e n c e s , o r a c t i v a t e d A - k i n a s e m a y p h o s p h o r y l a t e t r a n s - a c t i n g f a c t o r s w h i c h i n t e r a c t w i t h t r a n s c r i p t i o n e n h a n c e r s e q u e n c e s , o r c A M P m a y h a v e d i r e c t a c t i o n s a t t h e p o s t - t r a n s l a t i o n a l l e v e l . S e e t e x t f o r f u r t h e r d e t a i l s . a l . , 1 9 8 3 , a n d L e u n g e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h e s e d i f f e r e n c e s m a y b e d u e t o d i f f e r e n t s e n s i t i v i t i e s o f t h e e f f e c t o r m e c h a n i s m s t o c A M P o r t o s t u d i e s b e i n g d o n e i n a m i x e d p o p u l a t i o n o f l u t e a l c e l l s . 6 . G r o w t h f a c t o r s G r o w t h f a c t o r s h a v e m a n y e f f e c t s o n d i f f e r e n t i a t i o n o f o v a r i a n c e l l s . E f f e c t s o n s t e r o i d o g e n e s i s m a y b e a s a r e s u l t o f e f f e c t s o n d i f f e r e n t i a t i o n ( G o r e - L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 ) . I n t h e c a c e l l s , E G F i n h i b i t s a n d r o g e n p r o d u c t i o n ; i n g r a n u l o s a c e l l s , E G F i n h i b i t s F S H - s t i m u l a t e d a r o m a t a s e a c t i v i t y , a n d a u g m e n t s F S H - s t i m u l a t e d o r b a s a l p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n ( J o n e s e t a l . , 1 9 8 2 , a n d G o r e - L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 ) . P l a t e l e t -d e r i v e d g r o w t h f a c t o r ( P D G F ) i n c r e a s e s F S H - s t i m u l a t e d p r o g e s t i n p r o d u c t i o n i n g r a n u l o s a c e l l s a n d p o s s i b l y i n l u t e a l c e l l s . I n s u l i n a n d i n s u l i n - l i k e g r o w t h f a c t o r - 1 ( I G F - 1 ) i n c r e a s e d F S H -s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n a n d a r o m a t a s e a c t i v i t y i n g r a n u l o s a c e l l s ( G o r e - L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 ) a n d b a s a l a n d h C G - s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n b y l u t e a l c e l l s ( K h a n -D a w o o d a n d D a w o o d , 1 9 8 6 ) . 7 . P r o l a c t i n P r o l a c t i n a l s o i n c r e a s e s p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n g r a n u l o s a c e l l s f r o m p r e o v u l a t o r y f o l l i c l e s a n d i n h i b i t s 55 p r o g e s t e o n e p r o d u c t i o n f r o m i m m a t u r e f o l l i c l e s . I n g r a n u l o s a c e l l s , p r o l a c t i n r e d u c e s F S H - s t i m u l a t e d a r o m a t a s e a c t i v i t y a n d t h e r e f o r e e s t r o g e n p r o d u c t i o n . I n t h e c a c e l l s , p r o l a c t i n c a u s e s a d o s e d e p e n d e n t i n h i b i t o n o f L H - s t i m u l a t e d a n d r o g e n s y n t h e s i s . P r o l a c t i n i s i n v o l v e d i n l u t e i n i z a t i o n o f g r a n u l o s a c e l l s . I n s o m e s p e c i e s , p r o l a c t i n m a i n t a i n s p r o g e s t e r o n e s y n t h e s i s a n d i n h i b i t s c a t a b o l i s m o f p r o g e s t e r o n e i n l u t e a l c e l l s ( G o r e - L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 , a n d K h a n - D a w o o d a n d D a w o o d , 1 9 8 6 ) . 8 . O x y t o c i n O x y t o c i n i s p r o d u c e d i n s m a l l a m o u n t s b y b o v i n e g r a n u l o s a c e l l s ( L u c k , 1 9 8 9 ) . O x y t o c i n i s a l s o p r o d u c e d i n t h e c o r p u s l u t e u m , a n d h a s a l u t e o l y t i c f u n c t i o n b y r e d u c i n g p r o d u c t i o n o f p r o g e s t e r o n e . T h e r e d u c t i o n o f b a s a l o r h C G - s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n r e s u l t f r o m a d i r e c t a c t i o n o f o x y t o c i n o r b y o x y t o c i n s t i m u l a t i o n o f p r o s t a g l a n d i n p r o d u c t i o n ( N i s w e n d e r a n d N e t t , 1 9 8 8 ) . 9 . A n g i o t e n s i n I I A n g i o t e n s i n I I m a y h a v e e f f e c t s o n s t e r o i d o g e n e s i s a n d o v u l a t i o n i n o v a r i a n c e l l s . A n g i o t e n s i n I I i m m u n o r e a c t i v i t y h a s b e e n f o u n d i n h u m a n o v a r i a n f o l l i c u l a r f l u i d ( C u l l e r e t a l . , 1 9 8 6 , a n d L i g h t m a n e t a l . , 1 9 8 7 ) a n d r e c e p t o r s f o r a n g i o t e n s i n I I h a v e b e e n f o u n d i n r a t o v a r i a n f o l l i c l e s ( H u s a i n e t a l . , 1 9 8 7 ) . A n g i o t e n s i n I I a n t a g o n i s t s b l o c k o v u l a t i o n i n r a t s ( P e l l i c e r e t a l . , 1 9 8 8 ) . A n g i o t e n s i n I I h a s n o e f f e c t o n t h e p r o d u c t i o n o f p r o g e s t e r o n e , b u t s t i m u l a t e s e s t r o g e n p r o d u c t i o n i n c u l t u r e d o v a r i a n t i s s u e ( P u c e l l e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e t r a n s d u c t i o n m e c h a n i s m o f a n g i o t e n s i n I I m a y b e P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 b r e a k d o w n . T h e i n v o l v e m e n t o f c a l c i u m i n t h e a c t i o n o f a n g i o t e n s i n I I h a s b e e n s u g g e s t e d i n o t h e r t i s s u e s ( f r o g i n t e r r e n a l g l a n d : L i h r m a n n e t a l . , 1 9 8 7 ) a n d i n t h e o v a r y . F o u r - f o l d i n c r e a s e s i n [ C a 2 + ] i a n d r a p i d r e c o v e r y i n r e s p o n s e t o a n g i o t e n s i n I I b u t n o t a n g i o t e n s i n I o r a n a n g i o t e n s i n I I a n t a g o n i s t h a v e b e e n s e e n i n r a t g r a n u l o s a c e l l s ( W a n g e t a l . , 1 9 8 9 a ) . E i g h t e e n o u t o f 4 4 c h a l l e n g e d c e l l s r e s p o n d e d . T h e i n c r e a s e i n [ C a 2 + ] i m a y s u p p o r t P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 b r e a k d o w n a s t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f a n g i o t e n s i n I I . 1 0 . G l u c o c o r t i c o i d s G l u c o c o r t i c o i d s ( d e x a m e t h a s o n e a n d C o r t i s o l ) i n h i b i t F S H -s t i m u l a t e d a r o m a t a s e a c t i v i t y , a n d i n c r e a s e F S H - s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n g r a n u l o s a c e l l s ( G o r e - L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 ) . 1 1 . C a t e c h o l a m i n e s S y m p a t h e t i c i n n e r v a t i o n o f t h e m a m m a l i a n o v a r y h a s b e e n 5 7 d o c u m e n t e d . A d r e n e r g i c n e r v e t e r m i n a l s a r e a t t h e t h e c a e x t e r n a a n d d o n o t p e n e t r a t e t h e b a s e m e n t m e m b r a n e . f3 r e c e p t o r s f o r c a t e c h o l a m i n e s a r e f o u n d i n l u t e a l a n d g r a n u l o s a c e l l s . T h e i r a c t i v a t i o n i n c r e a s e s t h e p r o d u c t i o n o f p r o g e s t e r o n e , b u t h a s n o e f f e c t o n e s t r o g e n p r o d u c t i o n i n g r a n u l o s a c e l l s . T h e s e e f f e c t s a r e i n c r e a s e d b y F S H p r e - t r e a t m e n t . I n t h e c a l c e l l s t r e a t e d w i t h f3 a d r e n e r g i c s , i n c r e a s e d a n d r o g e n p r o d u c t i o n i n t h e p r e s e n c e o f h C G i s s e e n . I n t h e c o r p u s l u t e u m , a d r e n e r g i c a g e n t s m a y p l a y a r o l e i n t h e a c t i v i t y o f d e l t a 5 - 3 / ? - h y d r o x y s t e r o i d dehydrogenase ( G o r e - L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 ) . D . A c t i v i t y o f s e c o n d m e s s e n g e r p a t h w a y s i n t h e o v a r y 1 . A d e n y l a t e c y c l a s e s y s t e m F o l l i c l e - s t i m u l a t i n g h o r m o n e , L H a n d P G E 2 a r e w e l l k n o w n t o u s e c A M P a s a s e c o n d m e s s e n g e r i n g r a n u l o s a a n d l u t e a l c e l l s ( s e e t a b l e I ; G o f f a n d A r m s t r o n g , 1 9 7 7 , E r i c k s o n , 1 9 8 5 , a n d s e e G o r e -L a n g t o n a n d A r m s t r o n g , 1 9 8 8 ) . 2 . I n o s i t o l p h o s p h a t e s y s t e m S t u d i e s d o n e i n r a t g r a n u l o s a a n d l u t e a l c e l l s , a s w e l l a s o v i n e a n d b o v i n e l u t e a l c e l l s , h a v e d e m o n s t r a t e d i n c r e a s e d 5 8 P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 b r e a k d o w n i n r e s p o n s e t o G n R H a n d P G F 2 a ( M a e t a l . , 1 9 8 5 ; M i n e g i s h i e t a l . , 1 9 8 5 b ; L e u n g , 1 9 8 5 ; L e u n g e t a l . , 1 9 8 6 , a n d D a v i s 1 9 8 4 a , 1 9 8 6 a ) . S o m e e v i d e n c e f r o m b o v i n e l u t e a l c e l l s a n d r a t g r a n u l o s a c e l l s s u g g e s t s t h a t L H m a y a l s o i n d u c e P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 b r e a k d o w n a n d g e n e r a t i o n o f DG a n d I n s P ( D a v i s e t a l . , 1 9 8 3 b , 1 9 8 4 b , 1 9 8 6 b ) . I n o s i t o l ( 1 , 4 , 5 ) P 3 a n d P t d ( 1 , 3 , 4 , 5 ) P 4 c a n i n c r e a s e [ C a 2 + ] i w h i c h i s a l s o i n v o l v e d a s a s e c o n d m e s s e n g e r o f s e v e r a l h o r m o n e s i n t h e o v a r y ( s e e a b o v e ) . R o l e o f c a l c i u m i n o v a r i a n h o r m o n o g e n e s i s O n c e r e l e a s e d , i n c r e a s e d [ C a 2 + ] i m a y h a v e e f f e c t s t h r o u g h a c t i v a t i o n o f P K C , c a l m o d u l i n , c a l c i u m - s t i m u l a t e d p h o s p h o l i p a s e s a n d p r o t e a s e s ( C a r a f o l i , 1 9 8 7 ) . T h e i m p o r t a n c e o f c a l c i u m i n p r o d u c t i o n o f h o r m o n e s b y r a t g r a n u l o s a c e l l s h a s b e e n i n v e s t i g a t e d u s i n g c u l t u r e d r a t g r a n u l o s a c e l l s a n d c a l c i u m c h a n n e l b l o c k e r s ( C a r n e g i e a n d T s a n g , 1 9 8 3 , 1 9 8 4 ; T s a n g a n d C a r n e g i e , 1 9 8 3 , 1 9 8 4 ) . C a l c i u m h a s a p e r m i s s i v e r o l e i n s t e r o i d o g e n e s i s i n r a t g r a n u l o s a c e l l s ( C a r n e g i e a n d T s a n g , 1 9 8 3 ) . 3 . A r a c h i d o n i c a c i d s y s t e m T h e r e i s e v i d e n c e f r o m s e v e r a l l a b o r a t o r i e s t h a t G n R H a n d P G F 2 a s t i m u l a t e t h e p r o d u c t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d i n r a t o v a r i a n c e l l s . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e i n c r e a s e s a r a c h i d o n i c a c i d r e l e a s e f r o m r a t g r a n u l o s a ( M i n e g i s h i a n d L e u n g , 1 9 8 5 a , a n d K a w a i 5 9 a n d C l a r k , 1 9 8 6 a ) a n d l u t e a l ( W a t a n a b e e t a l . , 1 9 9 0 ) c e l l s . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e - s t i m u l a t e d P G E 2 p r o d u c t i o n m a y a l s o b e d e p e n d e n t o n p r o d u c t i o n o f a r a c h i d o n i c a c i d a n d l e u k o t r i e n e m e t a b o l i t e s ( W a n g e t a l . , 1 9 8 9 c , d ) . A r a c h i d o n i c a c i d i s a l s o p r o d u c e d b y r a t l u t e a l c e l l s i n r e s p o n s e t o P G F 2 a a n d m a y b e i n v o l v e d i n t h e p h y s i o l o g i c a l e f f e c t s o f P G F 2 a o n l u t e a l c e l l r e g r e s s i o n ( W a t a n a b e e t a l . , 1 9 9 0 ) . E . R a t o v a r i a n c e l l c u l t u r e T h e p u r p o s e o f t h i s s e c t i o n i s t o a c q u a i n t t h e r e a d e r w i t h t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f PMSG i n t h e p r o d u c t i o n o f l a r g e n u m b e r s o f g r a n u l o s a c e l l s a n d t o p o i n t o u t t h a t t h e c e l l s p r o d u c e d m a y n o t b e e x a c t l y t h e s a m e a s g r a n u l o s a c e l l s f o u n d i n n o r m a l l y c y c l i n g r a t s . 1 . G r a n u l o s a c e l l s G r a n u l o s a c e l l s f o r c e l l c u l t u r e m a y b e p r e p a r e d b y s e v e r a l m e t h o d s . I n t h e s e s t u d i e s , g r a n u l o s a c e l l s w e r e p r e p a r e d b y i n j e c t i n g P M S G i n t o i m m a t u r e r a t s w h i c h r e s u l t s i n s u p e r o v u l a t i o n . P r e g n a n t MSG h a s F S H a n d L H a c t i v i t y i n r a t s . I t a l s o i n c r e a s e s c h o l e s t e r o l s i d e - c h a i n c l e a v a g e , c h o l e s t e r o l e s t e r a s e a c t i v i t y a n d c y t o c h r o m e P 4 5 0 w h e n i n j e c t e d i n t o i m m a t u r e r a t s . T h r e e m e c h a n i s m s o f a c t i o n m a y b e r e s p o n s i b l e f o r t h e e f f e c t o f g o n a d o t r o p i n s ( PMSG ) o n f o l l i c l e d e v e l o p m e n t a n d s u p e r o v u l a t i o n : r e s c u e o f f o l l i c l e s u n d e r g o i n g e a r l y a t r e s i a ; r e c r u i t m e n t o f s m a l l e r f o l l i c l e s , and r e d u c t i o n i n t h e r a t e o f f o l l i c u l a r a t r e s i a . I n j e c t i o n o f PMSG t o immature r a t s i n c r e a s e s t h e m i t o s i s o f g r a n u l o s a c e l l s i n a l l f o l l i c l e s . A l t h o u g h PMSG p r i m i n g i n d u c e s p r o d u c t i o n o f many g r a n u l o s a c e l l s , " P r i m i n g w i t h PMSG may a l t e r t h e s t e r o i d o g e n i c pathways and may n o t r e p r e s e n t t h e s t a t u s o f a d u l t c y c l i c a n i m a l s " (Greenwald and T e r r a n o v a , 1988) . G r a n u l o s a c e l l s from u n t r e a t e d o r from s u p e r o v u l a t e d r a t s a r e n o t homogenous. There a r e s u b p o p u l a t i o n s o f g r a n u l o s a c e l l s , w h i c h d i f f e r i n hormone r e s p o n s i v e n e s s and enzyme o r hormone abundance ( M i d g l e y e t a l . , 1972; Amsterdam e t a l . , 1975; Z o l l e r e t a l . , 1978; Z o l l e r e t a l . , 1979; D u n a i f e t a l . , 1982, and Kasson e t a l . , 1985). 2. L u t e a l c e l l s The p r e s e n c e o f l a r g e and s m a l l l u t e a l c e l l s i n t h e c o r p u s l u t e u m has been known f o r many y e a r s . R e c e n t l y s e p a r a t i o n o f t h e s e c e l l s has been a c h i e v e d f o r sheep and r a t c o r p o r a l u t e a . I n sheep, s t u d i e s have shown t h e p r e s e n c e o f LH r e c e p t o r s o n l y on s m a l l l u t e a l c e l l s , and o f PGF 2 a r e c e p t o r s o n l y on l a r g e l u t e a l c e l l s ( F i t z , 1982). Other s t u d i e s show LH r e c e p t o r s on b o t h l a r g e and s m a l l l u t e a l c e l l s ( H a r r i s o n , 1987). I n sheep, p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i s s t i m u l a t e d by LH o n l y i n s m a l l , n o t l a r g e , l u t e a l c e l l s (Hoyer and Niswender, 1986; H a r r i s o n e t a l . , 1987, and W i l t b a n k e t a l . , 1990) b u t l a r g e l u t e a l c e l l s a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e m a j o r i t y o f t h e p r o g e s t e r o n e produced by t h e c o r p u s luteum ( N i s w e n d e r e t a l . , 1 9 8 5 ) . S m i t h e t a l . , ( 1 9 8 9 ) a n d N e l s o n a n d K h a n ( 1 9 8 7 ) h a v e d e s c r i b e d t w o d i f f e r e n t t y p e s o f s t e r o i d o g e n i c c e l l s i n t h e c o r p u s l u t e u m o f t h e r a t . T h e s e l a r g e ( > 2 2 /im) a n d s m a l l ( 1 2 -21/xm) l u t e a l c e l l s c a n b e s e p a r a t e d b y e l u t r i a t i o n . E l u t r i a t i o n i s s e p a r a t i o n o f c e l l s u s i n g c e n t r i f u g a l f o r c e a n d c o u n t e r f l o w o f a l i q u i d . C e l l s a r e s u s p e n d e d i n a m e d i u m i n t r o d u c e d i n t o a s p i n n i n g r o t o r . S m a l l e r , s l o w e r s e d i m e n t i n g c e l l s a r e c a r r i e d i n t h e d i r e c t i o n o f l i q u i d f l o w a n d e l u t r i a t e d . L a r g e r c e l l s c a n b e e l u t r i a t e d b y i n c r e a s i n g t h e f l o w r a t e o f t h e l i q u i d ( B e c k m a n , 1 9 8 9 ) . S m i t h e t a l . ( 1 9 8 9 ) s h o w e d t h a t t h e l a r g e l u t e a l c e l l s a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e b u l k o f t h e p r o g e s t e r o n e a n d e s t r a d i o l p r o d u c e d d u r i n g p r e g n a n c y . U s e o f t h e r a t o v a r y a s a m o d e l f o r l u t e o l y s i s T h e r a t e s t r o u s c y c l e i s c o n s i d e r e d a f o l l i c u l a r c y c l e , a s w h e n p r e g n a n c y d o e s n o t o c c u r , n o c o r p u s l u t e u m i s e s t a b l i s h e d . P s e u d o p r e g n a n c y , a c h i e v e d b y i n j e c t i o n o f P M S G t h e n h C G 4 8 h o u r s l a t e r , i s u s e d t o g e n e r a t e a f u n c t i o n a l c o r p u s l u t e u m i n t h e r a t f r o m w h i c h l u t e a l c e l l s a r e h a r v e s t e d a n d u s e d f o r c e l l c u l t u r e s . T h e c o r p u s l u t e u m o f p s e u d o p r e g n a n c y u n d e r g o e s l u t e o l y s i s a f t e r a b o u t 1 3 d a y s . F . S u m m a r y R a t g r a n u l o s a c e l l s a r e u s e d e x t e n s i v e l y f o r e n d o c r i n o l o g y s t u d i e s , i n c l u d i n g t h e i n v e s t i g a t i o n o f s e c o n d m e s s e n g e r s y s t e m s . S t i m u l a t i o n o f P t d l n s (4 , 5) P 2 breakdown, i n c r e a s e d [ C a 2 + ] i p r o d u c t i o n and a r a c h i d o n i c a c i d p r o d u c t i o n a r e i m p o r t a n t s i g n a l t r a n s d u c t i o n mechanisms t h a t f u n c t i o n i n t h e o v a r y . T h e i r r o l e a p pears t o be p r i m a r i l y o f a m o d u l a t o r y n a t u r e on t h e e n d o c r i n e f u n c t i o n o f p i t u i t a r y g o n a d o t r o p i n s . I t i s l i k e l y t h a t w i t h t h e advent o f t o o l s t o s t u d y i n d i v i d u a l c e l l s a c l e a r e r u n d e r s t a n d i n g o f t r a n s d u c t i o n mechanisms and p a r a c r i n e and a u t o c r i n e systems w i l l emerge. S p e c i f i c r e c e p t o r s f o r GnRH, PGF 2 a, and LH a r e found on r a t o v a r i a n c e l l s . P r o s t a g l a n d i n F 2 a i s produced i n t h e o v a r y , t h e r e may be i n t r a o v a r i a n p r o d u c t i o n o f GnRH, and LH i s s u p p l i e d by t h e c i r c u l a t i o n . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g hormone, PGF 2 a and perhaps LH use P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 breakdown as a t r a n s d u c i n g mechanism i n t h e r a t o v a r y . I I I . R e g u l a t i o n and t r a n s d u c t i o n o f hormone p r o d u c t i o n i n t h e  p l a c e n t a A. P l a c e n t a l anatomy and h i s t o l o g y 1. P l a c e n t a l development and anatomy i n t h e human The d e v e l o p i n g embryo matures t o t h e b l a s t o c y s t s t a g e w h i l e f r e e i n t h e u t e r i n e lumen. A t t h e b l a s t o c y s t s t a g e , t h e zona p e l l u c i d a i s shed and t h e embryo becomes l o d g e d on t h e u t e r i n e e p i t h e l i u m , where i m p l a n t a t i o n o c c u r s . The f i r s t d e v e l o p m e n t a l s t a g e o f t h e p l a c e n t a i s t h e c h o r i o n i c p l a c e n t a w h i c h i n c l u d e s 63 t h e t r o p h e c t o d e r m ( t r o p h o b l a s t ) and t h e s o m a t i c mesoderm. D u r i n g t h e i n i t i a l s t a g e s o f g e s t a t i o n t h i s a v a s c u l a r s t r u c t u r e may a l l o w t r a n s m i s s i o n o f u t e r i n e - d e r i v e d n u t r i e n t s t o t h e mesodermal d e r i v e d c a v i t y (exocoelom). T h i s c h o r i o n i c p l a c e n t a i s l a t e r r e p l a c e d by t h e c h o r i o a l l a n t o i c p l a c e n t a , w h i c h d e v e l o p s from t h e ectoderm and mesoderm o f t h e 3 germ l a y e r s (endoderm, mesoderm and e c t o d e r m ) . The t r o p h e c t o d e r m forms t h e c y t o t r o p h o b l a s t and s y n c y t i o t r o p h o b l a s t ; t h e s o m a t i c mesoderm forms t h e c a p i l l a r y e n d o t h e l i u m . C h o r i o n i c v i l l i d e v e l o p from t h e t r o p h e c t o d e r m , and i n v a d e and r e p l a c e m a t e r n a l u t e r i n e e p i t h e l i u m . Seven days a f t e r o v u l a t i o n , t h e t r o p h o b l a s t d i f f e r e n t i a t e s i n t o an i n n e r l a y e r o f l a r g e mononuclear c y t o t r o p h o b l a s t i c c e l l s , and an o u t e r l a y e r o f m u l t i n u c l e a t e d s y n c y t i o t r o p h o b l a s t . Only t h e c y t o t r o p h o b l a s t a r e m i t o t i c a l l y a c t i v e , t h e s y n c y t i o t r o p h o b l a s t i s formed by t h e f u s i o n o f c y t o t r o p h o b l a s t c e l l s ( R i c h a r t , 1961 and L i n e t a l . , 1972). A t 10 t o 13 days a f t e r o v u l a t i o n , l a c u n a e , w h i c h a r e i n t e r c o n n e c t i n g s p a c e s , form i n t h e e n l a r g i n g t r o p h o b l a s t i c c e l l mass, become c o n f l u e n t , and form t h e p r e c u r s o r o f i n t e r v i l l u s s p ace. The m a t e r n a l v e s s e l s a r e eroded and t h e l a c u n a e f i l l w i t h m a t e r n a l b l o o d . The p r i m a r y v i l l o u s stem b e g i n s t o d e v e l o p 13 t o 21 days p o s t - o v u l a t i o n , t h e r e a f t e r v i l l o u s s p r o u t s d e v e l o p . V i l l o u s s p r o u t s , w h i c h a r e i n i t i a l l y p u r e l y s y n c y t i o t r o p h o b l a s t , form from p r i m a r y v i l l u s stems. A f t e r t h e s p r o u t has formed, c y t o t r o p h o b l a s t f i l l s t h e i n s i d e and f i n a l l y t h e mesenchyme c o r e d e v e l o p s and v a s c u l a r i z a t i o n t a k e s p l a c e . D u r i n g t h e t h i r d month, p l a c e n t a l s e p t a form from f o l d s o f t h e b a s a l p l a t e , s e p a r a t i n g t h e p l a c e n t a i n t o c o t y l e d o n s o r l o b e s . The f e t a l c i r c u l a t o r y u n i t s ( c o t y l e d o n s , l o b u l e s ) a r e suspended from t h e c h o r i o n i c s u r f a c e o f t h e p l a c e n t a i n t o c i r c u l a t i n g m a t e r n a l b l o o d . F e t a l a r t e r i a l b l o o d moves down t h e c o r e o f t h e v i l l u s stem and a c a p i l l a r y network i s formed a t t h e t e r m i n a l v i l l u s . A f t e r t h e f o u r t h g e s t a t i o n a l month, t h e d i a m e t e r o f t h e p l a c e n t a i n c r e a s e s , t h e s t r u c t u r e o f t h e v i l l i become more complex and t h e i n t e r v i l l u s space d e c r e a s e s (Fox, 1985). The human p l a c e n t a i s a h e m o c h o r i a l p l a c e n t a . T h i s d e s c r i b e s t h e s e p a r a t i o n o f m a t e r n a l and f e t a l b l o o d and i n d i c a t e s t h a t m a t e r n a l b l o o d d i r e c t l y b a t h e s t h e o u t e r m o s t t r o p h o b l a s t l a y e r . The two c i r c u l a t o r y systems a r e s e p a r a t e d by t h e t r o p h o b l a s t , t h e c o n n e c t i v e t i s s u e and t h e e n d o t h e l i u m , a l l o f f e t a l o r i g i n (Faber and Thornburg, 1983). The human p l a c e n t a i s f u r t h e r d e s c r i b e d as d i s c o i d , because t h e c h o r i o n i c v i l l i a r e a r r a n g e d i n a c i r c u l a r p l a t e . The f u l l y d e v e l o p e d p l a c e n t a c o n s i s t s o f t h e c h o r i o n i c p l a t e (amnion and f e t a l v e s s e l s ) , v i l l o u s l a b y r i n t h and t h e d e c i d u a b a s a l p l a t e . The d e c i d u a b a s a l p l a t e i s t h e a t t a c h e d m a t e r n a l endometrium. The d e c i d u a l r e a c t i o n d e s c r i b e s t h e m o d i f i c a t i o n and p r o l i f e r a t i o n o f d e c i d u a l c e l l s and t h e r e s t r u c t u r i n g o f u t e r i n e g l a n d s and b l o o d v e s s e l s . A g e i n g o f t h e p l a c e n t a has been c o n s i d e r e d one o f t h e l i m i t a t i o n s t o t h e d u r a t i o n o f g e s t a t i o n . C e s s a t i o n o f s t r u c t u r a l development, i n terms o f w e i g h t and c e l l u l a r c o n t e n t , o f t h e p l a c e n t a a f t e r t h e m i d - t h i r d t r i m e s t e r has been s u g g e s t e d t o be i n d i c a t i v e o f a g e i n g o f t h e p l a c e n t a (Sands and Dobing, 1985). Most s t u d i e s done have shown d e c e l e r a t i o n o f i n c r e a s e i n p l a c e n t a l w e i g h t i n t h e l a s t f e w w e e k s b e f o r e t e r m . S a n d s a n d D o b i n g , a f t e r s t u d y i n g 2 0 0 p l a c e n t a e f o u n d n o s l o w i n g o f g r o w t h b e f o r e 4 0 w e e k s o f g e s t a t i o n , a n d f o u n d t h a t t h e p l a c e n t a l DNA c o n t e n t i n c r e a s e d l i n e a r l y u n t i l t e r m . O t h e r s h a v e s e e n n o f u r t h e r i n c r e a s e i n DNA c o n t e n t a f t e r 3 5 w e e k s o f g e s t a t i o n ( s e e S a n d s a n d D o b i n g , 1 9 8 5 , f o r r e f e r e n c e s ) . T h e p l a c e n t a a c c u m u l a t e s l e s i o n s w h i c h s e e m p a t h o l o g i c a l a s t e r m a p p r o a c h e s , a n d s o m e p l a c e n t a l f u n c t i o n s d e c r e a s e n e a r t e r m ; t h e s e m a y ( F i s h e r e t a l . , 1 9 7 6 ) o r m a y n o t ( P a r m l e y , 1 9 8 4 ) b e d u e t o a g i n g . 2 . H i s t o l o g y o f p l a c e n t a l c e l l s i n c u l t u r e a . T e r m S e v e r a l s t u d i e s h a v e b e e n d o n e t o i d e n t i f y t h e c e l l t y p e s p r o d u c e d b y d i g e s t i o n o f t e r m t r o p h o b l a s t t i s s u e . K l i m a n e t a l . , 1 9 8 6 , f o u n d 9 5 % p u r e c y t o t r o p h o b l a s t c o u l d b e p r o d u c e d b y d i g e s t i o n w i t h c r u d e t r y p s i n a n d D N a s e f o l l o w e d b y p u r i f i c a t i o n o v e r a P e r c o l l g r a d i e n t . T h e p u r i t y w a s e s t a b l i s h e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y o f f i n e s t r u c t u r a l f e a t u r e s . I n c o n t r a s t t o s y n c y t i a l t r o p h o b l a s t s o f i n t a c t t e r m p l a c e n t a e , t h e c e l l s d i d n o t s t a i n f o r h C G , h P L , p r e g n a n c y - s p e c i f i c 81-glycoprotein o r l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o k e r a t i n s u s i n g i m m u n o p e r o x i d a s e m e t h o d s . N o i m m u n o p e r o x i d a s e s t a i n i n g o c c u r r e d w i t h a n t i b o d i e s a g a i n s t v i m e n t i n o r a l - a n t i c h y m o t r y p s i n . T h e s e c e l l s p r o d u c e d p r o g e s t e r o n e a n d e s t r o g e n , w h e n s u p p l i e d w i t h a n d r o g e n p r e c u r s o r s . I n c u l t u r e , c y t o t r o p h o b l a s t f o r m e d a g g r e g a t e s a n d 6 6 t r a n s f o r m e d i n t o s y n c y t i a w i t h i n 2 4 t o 4 8 h o u r s a f t e r p l a t i n g ( f u s i o n o f c e l l s w a s s e e n u s i n g t i m e - l a p s e c i n e m a t o g r a p h y ) . A p r o g r e s s i v e i n c r e a s e i n c y t o p l a s m i c p r e g n a n c y - s p e c i f i c 61-g l y c o p r o t e i n , h C G a n d h P L w a s s e e n . K l a s s e n e t a l . ( 1 9 8 9 ) a l s o c o n d u c t e d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t o d e t e r m i n e t h e p r e s e n c e o f h u m a n p l a c e n t a l l a c t o g e n ( h P L ) a n d h C G , o n t e r m p l a c e n t a l c e l l s d i g e s t e d i n a m a n n e r a l m o s t i d e n t i c a l t o t h a t u s e d b y K l i m a n e t a l . ( 1 9 8 6 ) a n d t h e i r r e s u l t s w e r e s i m i l a r . B a x e t a l . ( 1 9 8 9 ) a l s o c l a i m t o p r o d u c e 9 5 % p u r e c y t o t r o p h o b l a s t b y s i m p l e t r y p s i n i z a t i o n . T h e s e c e l l s w e r e f o l l o w e d f o r 4 d a y s i n c u l t u r e , u s i n g f l u o r e s c e n c e i m m u n o c y t o c h e m i s t r y a n d s c a n n i n g a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d l i g h t m i c r o s c o p y . T h e i r r e s u l t s a g r e e w i t h t h o s e o f K l i m a n e t a l . ( 1 9 8 6 ) , i n t h a t t h e y f i n d t h e c y t o t r o p h o b l a s t d i f f e r e n t i a t e i n t o s y n c y t i o t r o p h o b l a s t . b . F i r s t t r i m e s t e r L o k e e t a l . , ( 1 9 8 6 ) d i g e s t e d f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l t i s s u e w i t h c r u d e t r y p s i n a n d E D T A a n d f o u n d t h a t f o u r t y p e s o f c o l o n i e s w e r e f o r m e d . O n e t y p e a p p e a r e d t o b e c y t o t r o p h o b l a s t ( s t a i n e d w i t h a n t i b o d y t o c y t o k e r a t i n a n d t r o p h o b l a s t a n t i b o d i e s 1 8 B / A g a n d 1 8 A / C 4 ) ; a n o t h e r , e p i t h e l i a l c e l l s , a n d t h e r e m a i n i n g t w o d e r i v e d f r o m m e s e n c h y m a l e l e m e n t s , e i t h e r m a c r o p h a g e s o r f i b r o b l a s t s . L o k e e t a l . ( 1 9 8 6 ) f o u n d t h a t b y m o d i f y i n g t h e m e d i u m a n d e x t r a c e l l u l a r m a t r i x t h e y c o u l d i n c r e a s e ( u p t o 8 0 -9 0 % ) t h e p e r c e n t a g e o f c y t o t r o p h o b l a s t g r o w n i n c u l t u r e f r o m t h i s d i g e s t i o n p r o d u c t , a s d e t e r m i n e d b y s t a i n i n g w i t h t h e s a m e 6 7 m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a s d e s c r i b e d a b o v e ( L o k e e t a l . , 1 9 8 8 ) . D a n i e l s - M c Q u e e n e t a l . ( 1 9 8 6 ) , h a r v e s t e d c e l l s f r o m t r y p s i n - E D T A , p r o t e a s e - D N a s e , o r t r y p s i n d i g e s t i o n o f f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l t i s s u e , a n d c u l t u r e d t h e s e c e l l s o n f i b r o n e c t i n - c o a t e d p l a t e s i n s e r u m f r e e m e d i u m . M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o c y t o t r o p h o b l a s t a n d s y n c y t i o t r o p h o b l a s t a n t i g e n s s h o w e d t h e c e l l s p r o d u c e d t o b e p r i m a r i l y t r o p h o b l a s t s . C e l l s w e r e f o l l o w e d u s i n g l i g h t m i c r o s c o p y f r o m 1 t o 4 3 d a y s , e l e c t r o n m i c r o s c o p y w a s d o n e a t d a y 5 o n c e l l u l a r i s l a n d s t h a t h a d f o r m e d . I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y i d e n t i f i e d a a n d /3-hCG s u b u n i t s a t 3 a n d 7 d a y s o f c u l t u r e , b u t b y 2 1 d a y s t h e ) 3 - s u b u n i t w a s n o l o n g e r d e t e c t a b l e . T r u m a n e t a l . , 1 9 8 9 , f o u n d t h a t a l k a l i n e p h o s p h a t a s e a c t i v i t y w a s a n u n r e l i a b l e m a r k e r o f t r o p h o b l a s t t i s s u e i n e a r l y p l a c e n t a , b u t t h a t N A D H d i a p h o r a s e a c t i v i t y a n d g e n e r a l m o r p h o l o g y w e r e i d e a l t o d i s t i n g u i s h c y t o t r o p h o b l a s t i n d i g e s t e d m i x t u r e s o f c e l l s . T h e y f o u n d t h a t t h e m a x i m u m y i e l d o f c y t o t r o p h o b l a s t c e l l s w i t h l e a s t c o n t a m i n a t i o n w i t h o t h e r c e l l t y p e s w a s a c h i e v e d b y b r i e f e x p o s u r e t o c r u d e t r y p s i n . C u l t u r e s p r e p a r e d f r o m t e r m p l a c e n t a e w e r e f a i r l y h o m o g e n o u s , h o w e v e r t h o s e p r e p a r e d f r o m p l a c e n t a e o f 6 - 1 2 w e e k g e s t a t i o n p r o d u c e d h e t e r o g e n e o u s c e l l c u l t u r e s w h i c h b e c a m e o v e r - g r o w n w i t h f i b r o b l a s t s a f t e r a b o u t 2 w e e k s . T e r m t r o p h o b l a s t s b e c a m e o v e r g r o w n w i t h f i b r o b l a s t s a f t e r a b o u t 4 w e e k s . Y e g e r e t a l . , 1 9 8 9 , i s o l a t e d t r o p h o b l a s t s f r o m f i r s t t r i m e s t e r a n d t e r m p l a c e n t a e , b y d i g e s t i n g t h e t i s s u e w i t h D i s p a s e ® , w h i c h d i g e s t s c a s e i n . T h e s e c e l l s w e r e c h a r a c t e r i z e d w i t h l i g h t m i c r o s c o p y , s c a n n i n g a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y , a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y . T h i s g r o u p f o u n d t h a t f i b r o b l a s t s over-grew t h e t e rm c u l t u r e s i n 7 days, and t h e f i r s t t r i m e s t e r c u l t u r e s i n 3 weeks. They saw few f i b r o b l a s t s , e n d o t h e l i a l o r o t h e r mesenchymal c e l l t y p e s when c u l t u r e s were seeded on c o l l a g e n g e l . F i r s t t r i m e s t e r c u l t u r e s grown on c o l l a g e n g e l were p r i m a r i l y l a r g e m u l t i n u c l e a t e d s y n c y t i a l s h e e t s , t h e s m a l l mononuclear e p i t h e l i a l c y t o t r o p h o b l a s t g i v i n g r i s e t o p r o l i f e r a t i n g s h e e t s o f s y n c y t i o t r o p h o b l a s t . Term c u l t u r e s had minor mesenchymal c o n t a m i n a t i o n b u t were m a i n l y a u n i f o r m , s y n c y t i a l - l i k e p o p u l a t i o n , w h i c h had i n c r e a s e d immunocytochemical s t a i n i n g f o r /JhCG, hPL and p r e g n a n c y - s p e c i f i c 01 - g l y c o p r o t e i n a f t e r t h r e e days i n c u l t u r e . The p r o d u c t i o n o f 95% pure c y t o t r o p h o b l a s t u s i n g t r y p s i n -DNase d i g e s t i o n o f t e rm p l a c e n t a l t i s s u e has been demonstrated. However t h e r e have been no s t u d i e s u s i n g t h e same d i g e s t i o n -p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e on c e l l s d i g e s t e d from f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l t i s s u e . A l t h o u g h c r u d e t r y p s i n does seem t o produce somewhat p u r e r c u l t u r e s t h a n t h e o t h e r enzymes used, t h e p e r c e n t a g e p u r i t y , e i t h e r w i t h o r w i t h o u t P e r c o l l p u r i f i c a t i o n , has n o t been r e p o r t e d . B. P l a c e n t a l e n d o c r i n o l o g y The p l a c e n t a has l o n g been b e l i e v e d t o s e c r e t e hormones i n a c o n s t i t u t i v e manner. However, d i f f e r e n c e s i n t h e t i m i n g o f peak p r o d u c t i o n o f hCG, hPL, p r o g e s t e r o n e , and o t h e r hormones d u r i n g g e s t a t i o n s u g g e s t s m o d u l a t i o n o f p l a c e n t a l hormone s e c r e t i o n ( f i g u r e 6 ) . E x p l a n t s and monolayer c e l l c u l t u r e s have been used 6 9 SERUM LEVEL | 1 r 1 1 1 1 t I 1 i 1 " '— 1 . r | , , , , , , , , , , , , , , , , 1 r-6 10 14 16 2 2 26 50 54 38 «2 6 10 * 18 22 26 50 54 38 42 WEEKS OF PREGNANCY WEEKS OF PREGNANCY F i g u r e 6 . T h e p a t t e r n o f h C G a n d h P L p r o d u c t i o n ( F r o m S . S . C . Y e n , 1 9 8 6 ) , a n d p r o g e s t e r o n e a n d e s t r o g e n p r o d u c t i o n ( F r o m T u l c h i n s k y , D . , H o b e l , C . J . , Y e a g e r , E . a n d M a r s h a l l , J . R . , 1 9 7 2 ) b y t h e p l a c e n t a t h r o u g h o u t g e s t a t i o n ( p e r m i s s i o n r e q u e s t e d ) . t o s t u d y r e g u l a t i o n o f h o r m o n o g e n e s i s i n t h e h u m a n p l a c e n t a s i n c e t h e m i d 1 9 7 0 ' s . I n t h i s s e c t i o n I w i l l b r i e f l y r e v i e w t h e h o r m o n e s p r o d u c e d i n t h e p l a c e n t a , d i s c u s s b i o s y n t h e s i s o f s t e r o i d , g l y c o p r o t e i n , p o l y p e p t i d e a n d p e p t i d e h o r m o n e p r o d u c t i o n , r e v i e w t h e l i t e r a t u r e o n r e p o r t e d e f f e c t s o f h o r m o n e s i n t h e p l a c e n t a , a n d t h e e v i d e n c e f o r t h e a c t i v i t y o f s e c o n d m e s s e n g e r p a t h w a y s i n t h e p l a c e n t a . 1 . Hormones p r o d u c e d b y t h e p l a c e n t a T h e l i s t o f h o r m o n e s p r o d u c e d b y t h e p l a c e n t a i s e x t e n s i v e ( s e e t a b l e I I ) . C y t o t r o p h o b l a s t p r o d u c e a g o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e - l i k e p e p t i d e ( K h o d r a n d S i l e r - K h o d r , 1 9 7 8 a , b , a n d M i y a k e e t a l . , 1 9 8 2 ) a n d s o m a t o s t a t i n ( S i l e r - K h o d r , 1 9 8 3 ) b u t h a v e s m a l l a m o u n t s o r n o a r o m a t a s e , 11B-hydroxysteroid d e h y d r o g e n a s e , o r 2B-h y d r o x y s t e r o i d d e h y d r o g e n a s e ( F o u r n e t - D u l g u e r o v e t a l . , 1 9 8 7 ) . S y n c y t i o t r o p h o b l a s t p r o d u c e F S H , L H , a d r e n o c o r t i c o t r o p h i c h o r m o n e ( A C T H ) , p r o l a c t i n , h C G , h P L , ( A l - T i m i n i a n d F o x , 1 9 8 6 ) , B-l i p o t r o p h i n , a n d a - m e l a n o c y t e - s t i m u l a t i n g h o r m o n e ( K r i e g e r , 1 9 8 2 ) . I t i s a l s o t h e m a j o r s i t e o f s t e r o i d o g e n e s i s ( K l i m a n e t a l . , 1 9 8 6 ; 1 9 8 7 ) . P r o g e s t e r o n e i s p r o d u c e d b y c y t o t r o p h o b l a s t a n d s y n c y t i o t r o p h o b l a s t ( K l i m a n e t a l . , 1 9 8 7 ) . O t h e r h o r m o n e s p r o d u c e d b y t h e p l a c e n t a i n c l u d e c o r t i c o t r o p h i n - r e l e a s i n g h o r m o n e , t h y r o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e ( S i l e r - K h o d r , 1 9 8 7 , a n d R o b i n s o n a n d M a j z o u b , 1 9 8 7 ) , P G s ( P G E 2 , P G F 2 a a n d p o s s i b l y P G I 2 , O l s o n e t a l . , 1 9 8 3 a , b ; H a r p e r e t a l . , 1 9 8 3 ; J o g e e e t a l . , 1 9 8 3 ; J e r e m y e t a l . , 1 9 8 5 ) a n d g r o w t h f a c t o r s ( I G F - 1 , E G F , P D G F a n d 7 1 T a b l e I I . H o r m o n e s p r o d u c e d i n a n d h o r m o n e s a n d s e c o n d m e s s e n g e r s w h i c h h a v e e n d o c r i n e e f f e c t s i n t h e p l a c e n t a . H o r m o n e s w h i c h h a v e a n e f f e c t o n h o r m o n e p r o d u c t i o n i n t h e p l a c e n t a G n R H s o m a t o s t a t i n F S H L H A C T H p r o l a c t i n h C G h P L / J l i p o t r o p h i n a m e l a n o c y t e s t i m u l a t i n g h o r m o n e C R H T R H P G E , P G F 2 a P G I 2 E G F F G F I G F - 1 P D G F T G F A n g i o t e n s i n I I l o c a l p r o d u c t i o n Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y 7 Y Y Y Y N c e l l t y p e ( p r o d u c t i o n ) c y t o c y t o s y n c y t i o s y n c y t i o s y n c y t i o s y n c y t i o s y n c y t i o s y n c y t i o s y n c y t i o s y n c y t i o 7 7 •3 E f f e c t 7 7 7 t h C G t e s t r a d i o l t p r o g e s t e r o n e t G n R H ** h C G ** h P L t G n R H ** h C G « h P L t h C G t h P L t h P L t h P L e s t r o g e n s a n d r o g e n s p r o g e s t i n s g l u c o c o r t i c o i d c a t e c h o l a m i n e s Y N N s y n c y t i o c y t o s y n c y t i o ** p r o g e s t e r o n e t h P L t e s t r o g e n 4- p r o g e s t e r o n e ** h C G i h C G t h P L t h C G t e s t r a d i o l t p r o g e s t e r o n e ** h C G t A C T H t G n R H I h P L 72 S e c o n d m e s s e n g e r s w h i c h h a v e a n e f f e c t o n h o r m o n e p r o d u c t i o n i n t h e p l a c e n t a c A M P a r a c h i d o n i c a c i d E f f e c t t h C G t h P L t p r o g e s t e r o n e I e s t r o g e n t h P L ** h C G L o c a l p r o d u c t i o n i s i n d i c a t e d b y ' Y ' ; l a c k o f l o c a l p r o d u c t i o n b y 1 N 1 . P r o d u c t i o n i n c y t o t r o p h o b l a s t i s i n d i c a t e d b y 1 c y t o 1 ; p r o d u c t i o n i n s y n c y t i o t r o p h o b l a s t i s i n d i c a t e d b y ' s y n c y t i o 1 . I n c r e a s e d h o r m o n e p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o t h e t e s t s u b s t a n c e i s i n d i c a t e d b y • t • , d e c r e a s e d p r o d u c t i o n b y ' I', a n d u n c h a n g e d h o r m o n e p r o d u c t i o n b y ' * + ' . ' ? ' m e a n s t h e c e l l t y p e i n w h i c h p r o d u c t i o n o c c u r s i s n o t k n o w n . S e e t e x t f o r r e f e r e n c e s . 7 3 t r a n s f o r m i n g g r o w t h f a c t o r { T G F } ( S i m o n i a n e t a l . , 1 9 8 7 ) . T h e p o s s i b i l i t y o f a m u l t i t u d e o f e n d o c r i n e , p a r a c r i n e , a u t o c r i n e a n d i n t r a c r i n e e f f e c t s i n t h e p l a c e n t a i s o b v i o u s . a . S t e r o i d h o r m o n e p r o d u c t i o n T h e p l a c e n t a t a k e s o v e r t h e b u l k o f s t e r o i d h o r m o n e p r o d u c t i o n a t a b o u t t h e 7 o r 8 w e e k o f g e s t a t i o n . T h e p l a c e n t a i s d e f i c i e n t i n C 1 7 2 0 - l y a s e a n d 1 7 a - h y d r o x y l a s e , a n d i s t h e r e f o r e d e p e n d e n t o n a n d r o g e n s y n t h e s i s , p r i m a r i l y i n t h e f e t a l c o m p a r t m e n t , f o r p r e c u r s o r s w h i c h a r e a r o m a t i z e d t o e s t r o g e n s i n t h e p l a c e n t a . T h e m a j o r s t e r o i d h o r m o n e s p r o d u c e d i n t h e p l a c e n t a a r e e s t r o g e n s ( e s t r o n e , e s t r a d i o l , a n d e s t r i o l ) , a n d p r o g e s t e r o n e . S t e r o i d h o r m o n e p r o d u c t i o n b y t h e f e t a l - p l a c e n t a l u n i t h a s b e e n r e v i e w e d f r e q u e n t l y ( B u s t e r a n d S i m o n , 1 9 8 9 , f o r a r e c e n t r e v i e w : f i g u r e 7 ) . T h e m o l e c u l a r b i o l o g y o f s t e r o i d h o r m o n e p r o d u c t i o n h a s b e e n r e c e n t l y r e v i e w e d ( M i l l e r , 1 9 8 8 ) . S t e r o i d h o r m o n e p r o d u c t i o n i s d e p e n d a n t o n s u p p l y o f s u b s t r a t e a n d t h e p r e s e n c e a n d f u n c t i o n o f s t e r o i d o g e n i c e n z y m e s . b . G l y c o p r o t e i n h o r m o n e p r o d u c t i o n ( h C G ) H u m a n c h o r i o n i c g o n a d o t r o p i n i s a g l y c o p r o t e i n p r o d u c e d i n t h e p l a c e n t a w h i c h i s n e c e s s a r y f o r t h e m a i n t e n a n c e o f t h e c o r p u s l u t e u m f o r t h e f i r s t 4 t o 6 w e e k s o f p r e g n a n c y ( H u s s a , 1 9 8 0 ) . H u m a n c h o r i o n i c g o n a d o t r o p i n r e a c h e s p e a k l e v e l s a t a b o u t 1 0 w e e k s o f g e s t a t i o n ( H a y , 1 9 8 8 , a n d s e e H a y f o r e a r l i e r 7 4 M a t e r n a l C o m p a r t m e n t C h o l e s t e r o l ( LDL ) . P l a c e n t a l C o m p a r t m e n t Dehydroepiandrosterone s u l f a t e C h o l e s t e r o l ( LDL ) Pregnenolone P r o g e s t e r o n e -F e t a l C o m p a r t m e n t i n l i v e r a n d a d r e n a l C h o l e s t e r o l ( L D L ) P r e g n e n o l o n e s u l f a t e • 1 7 o r - h y d r o x y p r e g n e n o l o n e s u l f a t e ) iandr< D e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e E s t r o n e — it . E s t r a d i o l < £ -D e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e I D e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e I - A n d r o s t e n e d i o n e T e s t o s t e r o n e 1 6 a - h y d r o x y d e h y d r o -i s o a n d r o s t e r o n e s u l f a t e E s t r i o l - ^ - 5 - A n d r o s t e n - 3 0 , 1 6 o , ^ J . 6 a - h y d r o x y d e h y d r o -1 7 0 - t r i o l - i s o a n d r o s t e r o n e F i g u r e 7 . S t e r o i d o g e n e s i s i n t h e f e t a l - p l a c e n t a l u n i t : T h e p l a c e n t a p r o d u c e s p r e g n e n o l o n e a n d p r o g e s t e r o n e f r o m c h o l e s t e r o l s u p p l i e d b y t h e m o t h e r . A n d r o g e n s a r e n o t p r o d u c e d b y t h e p l a c e n t a d u e t o t h e l a c k o f 1 7 a - h y d r o x y l a s e a n d C 1 7 2 0 - l y a s e . E s t r o g e n s a r e p r o d u c e d f r o m d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e s u p p l i e d b y t h e m o t h e r o r t h e f e t u s w h i c h i s d e s u l f a t e d a n d c o n v e r t e d t o a n d r o s t e n e d i o n e t h e n t e s t o s t e r o n e a n d a r o m a t i z e d t o e s t r o n e a n d e s t r a d i o l , r e s p e c t i v e l y . E s t r i o l , t h e e s t r o g e n p r o d u c e d i n t h e l a r g e s t a m o u n t b y t h e p l a c e n t a , i s f o r m e d f r o m 1 6 a - h y d r o x y d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e w h i c h i s p r o d u c e d i n t h e f e t a l a d r e n a l . r e f e r e n c e s ) . I t c o n t i n u e s t o b e p r o d u c e d i n r e d u c e d , b u t s t i l l d e t e c t a b l e , l e v e l s u n t i l t e r m . H u m a n c o r i o n i c g o n a d o t r o p i n , l i k e L H , F S H a n d t h y r o i d -s t i m u l a t i n g h o r m o n e , i s a 2 8 - 3 8 K m o l e c u l a r w e i g h t h e t e r o d i m e r i c g l y c o p r o t e i n h o r m o n e c o m p o s e d o f a c o m m o n a - s u b u n i t w h i c h i s n o n -c o v a l e n t l y b o u n d t o a j 3 - s u b u n i t . A l t h o u g h g l y c o p r o t e i n ot-s u b u n i t s a r e i d e n t i c a l i n a m i n o a c i d s e q u e n c e , t h e i r c a r b o h y d r a t e m o i e t i e s a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( H u s s a , 1 9 8 0 ) . T h e 8-s u b u n i t s o f t h e s e hormones a r e d i f f e r e n t i n amino a c i d s e q u e n c e a n d i n c a r b o h y d r a t e m o i e t i e s a n d a r e r e s p o n s i b l e f o r r e c e p t o r b i n d i n g s p e c i f i c i t y . E a c h s u b u n i t h a s t w o a s p a r a g i n e - 1 i n k e d , h i g h m a n n o s e c o m p l e x - t y p e o l i g o s a c c h a r i d e s . A f t e r a d d i t i o n o f a s p a r a g i n e - 1 i n k e d o l i g o s a c c h a r i d e s , e x c e s s m a n n o s e a n d g l u c o s e r e s i d u e s a r e c l e a v e d f r o m t h e i n t e r m e d i a t e a n d p e r i p h e r a l m o n o s a c c h a r i d e s ( N - a c e t y l g l u c o s a m i n e , g a l a c t o s e , N -a c e t y l n e u r a m i n i c a c i d ) a r e a t t a c h e d s e q u e n t i a l l y t o c o m p l e t e t h e o l i g o s a c c h a r i d e s t r u c t u r e s ( H u s s a , 1 9 8 0 ) . T h e / 3 - s u b u n i t a l s o h a s f o u r s e r i n e 0 - 1 i n k e d s i m p l e o l i g o s a c c h a r i d e s i n a c l u s t e r c l o s e t o t h e c a r b o x y t e r m i n a l ( H u s s a e t a l . , 1 9 8 0 a n d M a t z u k e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h e s e 0 - l i n k e d o l i g o s a c c h a r i d e s p l a y a m i n o r r o l e i n r e c e p t o r b i n d i n g a n d s i g n a l t r a n s d u c t i o n , b u t a r e c r i t i c a l f o r i n v i v o b i o l o g i c a l r e s p o n s e ( M a t z u k e t a l . 1 9 9 0 ) . T h e i n c r e a s e d p l a s m a h a l f - l i f e a n d b i o l o g i c a l p o t e n c y o f h C G o v e r L H m a y b e d u e t o a 3 1 a m i n o a c i d h y d r o p h i l i c t e r m i n u s , a s c o m p a r e d t o t h e 7 -a m i n o a c i d h y d r o p h o b i c t e r m i n u s o f L H , o r d u e t o t h e 4 0 - l i n k e d o l i g o s a c c h a r i d e s d e s c r i b e d a b o v e , o r b o t h . B o t h a a n d / 3 - s u b u n i t s h a v e l a r g e a m o u n t s o f s i a l i c a c i d i n t h e t e r m i n a l p o s i t i o n s o f 0 0 7 6 t h e i r o l i g o s a c c h a r i d e c h a i n s . R e m o v a l o f t h e s i a l i c a c i d r e s i d u e s i n c r e a s e s a f f i n i t y f o r t h e r e c e p t o r , b u t r e d u c e s c A M P p r o d u c t i o n a n d d e c r e a s e s t h e c l e a r a n c e t i m e f r o m t h e c i r c u l a t i o n ( A m a n o e t a l . , 1 9 8 9 a n d T a l a m a n t e s a n d O g r e n , 1 9 8 8 ) . R e m o v a l o f s u g a r c h a i n s f r o m h C G d o u b l e s t h e b i n d i n g o f h o r m o n e t o r e c e p t o r , b u t e l i m i n a t e s t h e b i o l o g i c a l e f f e c t o f h C G . T h e c a r b o h y d r a t e m o i e t i e s p r o t e c t h C G f r o m r a p i d d e g r a d a t i o n ( s e e M a t z u k e t a l . , 1 9 9 0 a n d H u s s a , 1 9 8 0 f o r r e f e r e n c e s ) . T h e s i t e o f t h e h C G d i m e r p r o d u c t i o n i s t h e s y n c y t i o t r o p h o b l a s t ( A l - T i m i n i a n d F o x , 1 9 8 6 ; B e c k e t a l . , 1 9 8 6 ; W i d e e t a l . , 1 9 8 8 ; F r a u l i a n d L u d w i g , 1 9 8 7 ; H a m a s a k i e t a l . , 1 9 8 7 ) , b u t f r e e a h C G m a y b e p r o d u c e d i n b o t h t h e s y n c y t i a l l a y e r a n d c y t o t r o p h o b l a s t . T h e r e i s s o m e e v i d e n c e t h a t s u g g e s t s t h a t t h e j 3 - s u b u n i t o f h C G a n d t h e d i m e r m a y b e p r o d u c e d i n " m u l t i n u c l e a t e i n t e r m e d i a t e " t r o p h o b l a s t ( G a s p a r d e t a l . , 1 9 8 0 ; H o s h i n a e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e a a n d /3 s u b u n i t s a r e g e n e r a t e d f r o m s e p a r a t e m R N A s ( p r e a a n d p re/3 ) t h e n a r e l i n k e d t o g e t h e r , t h e c a r b o h y d r a t e m o i e t i e s a r e a d d e d d u r i n g t h e l i n k i n g o f t h e a a n d (3 s u b u n i t s . T h e a - s u b u n i t i s e n c o d e d b y a s i n g l e g e n e , h o w e v e r , t h e / 9 - s u b u n i t i s e n c o d e d b y a f a m i l y o f s i x v e r y s i m i l a r g e n e s , o f w h i c h o n l y 2 a r e e x p r e s s e d i n t h e p l a c e n t a ( s e e P o l i c a s t r o e t a l . , 1 9 8 6 f o r r e f e r e n c e s ) . F r e e a a n d f r e e / 3 - s u b u n i t s o f h C G a r e f o u n d . A s s a y s o f h C G d o n e d u r i n g p r e g n a n c i e s r e s u l t i n g f r o m i n v i t r o f e r t i l i z a t i o n , w e r e a b l e t o m e a s u r e r i s i n g l e v e l s o f f r e e / 3 - s u b u n i t h C G a t 6 . 5 d a y s a f t e r o v u m r e t r i e v a l c o m p a r e d t o 8 . 3 d a y s f o r t o t a l /3hCG a n d 9 . 2 d a y s f o r r i s i n g l e v e l s o f t h e h C G d i m e r . T h e p r o p o r t i o n o f f r e e / 3 - s u b u n i t h C G d e c l i n e d f r o m d a y 9 t o d a y 2 2 , a t w h i c h t i m e t h e a m o u n t w a s l e s s t h a n 5% o f t h e o r i g i n a l v a l u e ( H a y , 1 9 8 5 ) . T h e p l a c e n t a p r o d u c e s e x c e s s f r e e a s u b u n i t a n d m o r e f r e e a t h a n f r e e B s u b u n i t ( C h a t t e r j e e a n d M u n r o 1 9 7 7 ; B o o t h b y e t a l . ; 1 9 8 3 ) . F r e e a h C G w a s f i r s t d e t e c t e d f r o m d a y 1 8 ( H a y , 1 9 8 5 ) . T h e p r o d u c t i o n o f f r e e a s u b u n i t i n c r e a s e s t h r o u g h o u t p r e g n a n c y ( H a y , 1 9 8 5 ) . O t h e r s ( F a n e t a l . , 1 9 8 7 ) d e t e c t h i g h e r a m o u n t s o f f r e e j B - s u b u n i t h C G i n t h e s e r u m o f p a t i e n t s w i t h t r o p h o b l a s t i c d i s e a s e ( a n d s e e F a n e t a l . f o r more r e f e r e n c e s ) , a n d t h e p r o p o r t i o n o f f r e e / ? - s u b u n i t t o h C G d i m e r m a y b e d i f f e r e n t d e p e n d i n g u p o n t h e t y p e o f t r o p h o b l a s t i c d i s e a s e ( F a n e t a l . , 1 9 8 7 ) . A l t h o u g h c A M P s t i m u l a t e s p r o d u c t i o n o f b o t h a a n d j 3 - s u b u n i t s o f h C G , t h e t e m p o r a l p a t t e r n i s d i f f e r e n t , t h e p r o d u c t i o n o f a -s u b u n i t i n c r e a s e s s o o n e r t h a n t h e p r o d u c t i o n o f t h e / 3 - s u b u n i t ( M i l s t e d e t a l . , 1 9 8 7 , a n d R i n g l e r e t a l . , 1 9 8 9 a ) . H u m a n c h o r i o n i c g o n a d o t r o p i n i s s t o r e d i n s p e c i f i c s e c r e t o r y g r a n u l e s i n t h e s y n c y t i o t r o p h o b l a s t , h o w e v e r t h e s e s e c r e t o r y g r a n u l e s a r e d i f f e r e n t f r o m t h o s e s e c r e t o r y g r a n u l e s f o u n d i n p i t u i t a r y ( F u j i m o t o e t a l . , 1 9 8 6 ; M o r r i s h e t a l . , 1 9 8 7 ) . c . P o l y p e p t i d e h o r m o n e p r o d u c t i o n ( h u m a n p l a c e n t a l l a c t o g e n ) H u m a n p l a c e n t a l l a c t o g e n ( h P L ) i s a s i n g l e - c h a i n 1 9 1 a m i n o a c i d p o l y p e p t i d e h o r m o n e w i t h 2 d i s u l f i d e b r i d g e s , t h a t i s a m e m b e r o f t h e h u m a n g r o w t h h o r m o n e f a m i l y ( B u s t e r a n d S i m o n , 1 9 8 9 ) . I t s h a r e s 8 5 % h o m o l o g y w i t h g r o w t h h o r m o n e . H u m a n P L f u n c t i o n s a s a r e g u l a t o r o f m a t e r n a l l i p i d , c a r b o h y d r a t e a n d 7 8 p r o t e i n m e t a b o l i s m b u t h a s n o d e m o n s t r a t e d l a c t o g e n i c a c t i v i t y i n h u m a n s ( T a l a m a n t e s a n d O g d e n , 1 9 8 8 , a n d B u s t e r a n d S i m o n , 1 9 8 9 ) . H u m a n P L i s f o r m e d i n t h e s y n c y t i o t r o p h o b l a s t ( M c W i l l i a m s a n d B o i m e , 1 9 8 0 ; F u j i m o t o e t a l . , 1 9 8 6 ) . I t i s f i r s t d e t e c t e d i n m a t e r n a l p l a s m a a t 3 w e e k s o f g e s t a t i o n ( S p e l l a c y e t a l . , 1 9 6 6 ) , a n d i s p r o d u c e d i n i n c r e a s i n g a m o u n t s f o r t h e d u r a t i o n o f g e s t a t i o n . H u m a n P L i s s t o r e d i n s e c r e t o r y g r a n u l e s w h i c h a r e s i m i l a r t o L H a n d F S H s t o r a g e g r a n u l e s f o u n d i n t h e p i t u i t a r y ( F u j i m o t o e t a l . , 1 9 8 6 a n d M o r r i s h e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e h P L / h G H g e n e c l u s t e r i s f o u n d o n c h r o m o s o m e 1 7 . T w o h G H g e n e s a r e i n t e r s p e r s e d w i t h t h r e e h P L g e n e s , t w o o f w h i c h a r e e x p r e s s e d i n h u m a n p l a c e n t a . T h e s e 2 g e n e s ( 1 0 - 2 0 % t r a n s c r i b e d f r o m h P L j , 8 0 - 9 0 % f r o m h P L 4 ) e n c o d e i d e n t i c a l p o l y p e p t i d e s . H u m a n P L mRNA p r o d u c t i o n i n t e r m p l a c e n t a l c u l t u r e s h a s b e e n r e p o r t e d K l a s s e n e t a l . , 1 9 8 9 . I n v e s t i g a t i o n o f h P L t r a n s c r i p t i o n e n h a n c e r s i s o n g o i n g ( s e e K l a s s e n e t a l . , 1 9 8 9 , f o r r e f e r e n c e s ) . d . P e p t i d e h o r m o n e p r o d u c t i o n (GnRH ) F o r a g e n e r a l d e s c r i p t i o n o f G n R H p r o d u c t i o n s e e o v a r i a n e n d o c r i n e s e c t i o n a b o v e . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e mRNA i s c l e a r l y p r o d u c e d i n t h e h u m a n p l a c e n t a . H o w e v e r , t h e a m o u n t o f t h e p e p t i d e t h a t i s p r o d u c e d i s p r o b a b l y q u i t e s m a l l , s i n c e t h e f i r s t i n t r o n o f t h e g e n e i s n o t c l e a v e d i n t r a n s c r i p t i o n f r o m D N A . T h i s r e d u c e s t h e a m o u n t o f p e p t i d e p r o d u c e d b y a b o u t 1 0 0 -f o l d ( A d e l m a n e t a l . , 1 9 8 6 ) . 79 2 . H o r m o n e s w h i c h a f f e c t p l a c e n t a l h o r m o n o g e n e s i s S e e f i g u r e 8 f o r a s u m m a r y o f d o c u m e n t e d e n d o c r i n e , p a r a c r i n e a n d a u t o c r i n e e f f e c t s i n t h e p l a c e n t a . a . S t e r o i d h o r m o n e s A n d r o g e n s a r e t h e r e q u i s i t e p r e c u r s o r f o r p r o d u c t i o n o f e s t r o g e n s i n t h e p l a c e n t a ( s e e f i g u r e 7 ) , t h e r e f o r e p r o v i s i o n o f a n d r o g e n s w o u l d b e e x p e c t e d t o i n c r e a s e p l a c e n t a l e s t r o g e n p r o d u c t i o n . A n d r o g e n s h a v e b e e n s h o w n t o i n c r e a s e e s t r o g e n p r o d u c t i o n i n t e r m e x p l a n t s ( a n d r o s t e n e d i o n e : O g i n o e t a l . , 1 9 8 5 ) a n d i n t e r m c u l t u r e d p l a c e n t a l c e l l s ( d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e , d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e s u l f a t e , 1 6 a h y d r o x y d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e , a n d r o s t e n e d i o n e , t e s t o s t e r o n e : B r a n c h a u d e t a l . , 1 9 8 3 a n d B e n o i t e t a l . , 1 9 8 8 ) . T h e p r e s e n c e o f a n d r o g e n s h a d n o e f f e c t o n p r o g e s t e r o n e o r h C G p r o d u c t i o n i n t e r m e x p l a n t s ( O g i n o e t a l . , 1 9 8 5 ) , b u t d e c r e a s e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n t e r m c e l l c u l t u r e ( W u n s c h , e t a l . , 1 9 8 6 a n d B r a n c h a u d , e t a l . , 1 9 8 3 ) . I n c o n t r a s t t o t h e e f f e c t o f a n d r o g e n o n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n , e s t r o n e a n d e s t r a d i o l c a u s e d n o c h a n g e i n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n t e r m c u l t u r e d c e l l s ( W u n s c h , e t a l . , 1 9 8 6 , a n d B r a n c h a u d , e t a l . , 1 9 8 3 ) . P r o g e s t e r o n e (5-20/xM) d e c r e a s e d h C G p r o d u c t i o n i n f i r s t t r i m e s t e r e x p l a n t s ( M a r u o e t a l . , 1 9 8 6 ) . P r o g e s t e r o n e a n d e s t r a d i o l h a v e b e e n r e p o r t e d t o i n c r e a s e h P L r e l e a s e i n f i r s t t r i m e s t e r a n d t e r m e x p l a n t s ( B e l l e v i l l e e t a l . , 1 9 7 8 ) . E s t r a d i o l 8 0 Cytotrophoblast Syncytiotrophoblast Interleukin 1 anglotentln II F i g u r e 8 . A n i l l u s t r a t i o n o f e n d o c r i n e , p a r a c r i n e a n d a u t o c r i n e e f f e c t s d o c u m e n t e d i n t h e p l a c e n t a . S t i m u l a t o r y i n f l u e n c e s a r e i n d i c a t e d b y b l a c k a r r o w s ; i n h i b i t o r y i n f l u e n c e s a r e i n d i c a t e d b y o u t l i n e d a r r o w s . 8 1 a n d e s t r i o l a u g m e n t e d , a n d p r o g e s t e r o n e d e c r e a s e d , t h e 8 - b r - c A M P s t i m u l a t e d p r o d u c t i o n o f G n R H , b u t w e r e w i t h o u t e f f e c t a l o n e ( P e t r a g l i a , e t a l . , 1 9 9 0 ) . G l u c o c o r t i c o i d s ( C o r t i s o l , c o r t i s o n e , a n d d e x a m e t h a s o n e ) i n c r e a s e h C G p r o d u c t i o n i n o r g a n c u l t u r e ( W i l s o n a n d J a w a d , 1 9 8 2 ) a n d i n t e r m c e l l c u l t u r e ( R i n g l e r e t a l . , 1 9 8 9 b ) . b . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e T h e s y n t h e s i s o f a g o n a d o t r o p i n r e l e a s i n g h o r m o n e - l i k e p e p t i d e ( G n R H ) b y t h e p l a c e n t a h a s b e e n k n o w n s i n c e 1 9 7 5 ( G i b b o n s e t a l . ) . T h e s e q u e n c e o f h u m a n p l a c e n t a l p r o G n R H mRNA h a s r e c e n t l y b e e n e l u c i d a t e d ( M i l l a r e t a l , 1 9 8 6 ) . P e p t i d e s e q u e n c e s c l e a v e d p o s t - t r a n s l a t i o n a l l y w e r e s y n t h e s i z e d a n d s o m e ( 1 - 1 3 , 1 4 -6 9 a n d 1 4 - 2 6 ) h a v e d e m o n s t r a b l e e n d o c r i n e e f f e c t s o n h u m a n p i t u i t a r y c e l l s ( M i l l a r e t a l . , 1 9 8 6 ) . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e - l i k e i m m u n o r e a c t i v e p e p t i d e i s s y n t h e s i z e d i n t h e c y t o t r o p h o b l a s t ( K h o d r a n d S i l e r - K h o d r , 1 9 7 8 b ; a n d M i y a k e e t a l . , 1 9 8 2 ) . D e s p i t e t h e p r o b a b i l i t y t h a t v e r y l o w a m o u n t s o f G n R H a r e m a d e i n t h e p l a c e n t a , t h e p o s s i b i l i t y o f p a r a c r i n e e f f e c t s c a n n o t b e e x c l u d e d . T h e f i r s t d e m o n s t r a t i o n o f a p a r a c r i n e e f f e c t i n p l a c e n t a l t i s s u e w a s p r o v i d e d b y K h o d r a n d S i l e r - K h o d r , 1 9 7 8 a , w h o s a w s t i m u l a t i o n o f t h e p r o d u c t i o n o f h C G i n r e s p o n s e t o G n R H t r e a t m e n t i n e x p l a n t c u l t u r e s o f v a r i o u s g e s t a t i o n a l a g e s . H a n i n g e t a l . , ( 1 9 8 2 ) h a v e a l s o s h o w n t h i s , u s i n g e x p l a n t s f r o m t e r m p l a c e n t a . M a t h i a l a g a n a n d R a o ( 1 9 8 6 ) h a v e r e p o r t e d s i m i l a r f i n d i n g s u s i n g f i r s t t r i m e s t e r p l a c e n t a l m i n c e s . S e v e r a l g r o u p s h a v e r e p o r t e d i n c r e a s e d h C G p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o G n R H t r e a t m e n t o f c u l t u r e d c e l l s ( B e l i s l e e t a l . , 1 9 8 4 , 1 9 8 6 ; I w a s h i t a e t a l . , 1 9 8 6 , 1 9 8 9 , a n d P e t r a g l i a e t a l . , 1 9 8 7 ) . A d e c r e a s e i n h C G p r o d u c t i o n w a s s e e n i n c u l t u r e s t r e a t e d w i t h G n R H a n t a g o n i s t ( S i l e r - K h o d r e t a l . , 1 9 8 3 ) . c . P r o s t a g l a n d i n s P r o s t a g l a n d i n s E 2 , F 2 a , a n d p o s s i b l y I 2 a r e p r o d u c e d i n t h e p l a c e n t a ( O l s o n e t a l . , 1 9 8 3 a , b ; H a r p e r e t a l . , 1 9 8 3 ; J o g e e e t a l . , 1 9 8 3 ; J e r e m y e t a l . , 1 9 8 5 ) . A s t i m u l a t o r y e f f e c t o f P G E 2 a n d F 2 a o n t h e p r o d u c t i o n o f G n R H i n t e r m c e l l s w a s r e p o r t e d b y P e t r a g l i a e t a l . ( 1 9 8 7 ) ; n o e f f e c t o f P G D 2 o r I 2 w a s o b s e r v e d . d . A r a c h i d o n i c a c i d S t u d i e s d o n e w i t h a r a c h i d o n i c a c i d , t h e p r e c u r s o r o f P G ' s , t h r o m b o x a n e s a n d l e u k o t r i e n e s h a v e s h o w n a n a c u t e ( w i t h i n 3 0 m i n u t e s ) i n c r e a s e i n h P L r e l e a s e , w i t h a r e t u r n t o c o n t r o l v a l u e s a t 9 0 m i n u t e s . C a l c i u m i n f l u x a n d p h o s p h a t i d y l i n o s i t i d e b r e a k d o w n a r e a l s o i n c r e a s e d b y a r a c h i d o n i c a c i d ( Z e i t l e r a n d H a n d w e r g e r , 1 9 8 5 ) i n t e r m p e r i f u s e d c e l l s . A r a c h i d o n i c a c i d i n c r e a s e s h P L r e l e a s e f r o m t e r m e x p l a n t s b u t c a u s e s n o c h a n g e i n h C G r e l e a s e ( H a n d w e r g e r e t a l . , 1 9 8 1 a a n d b ) . I n e x p e r i m e n t s i n w h i c h a r a c h i d o n i c a c i d p r o d u c e d a n i n c r e a s e i n h P L r e l e a s e , t h e e f f e c t o f a r a c h i d o n i c a c i d w a s i n d e p e n d e n t o f t h e f u n c t i o n o f c y c l o - o x y g e n a s e a n d l i p o x y g e n a s e , s u g g e s t i n g t h e e f f e c t w a s 8 3 s p e c i f i c t o a r a c h i d o n i c a c i d a n d d i d n o t d e p e n d o n m e t a b o l i s m t o l e u k o t r i e n e s , t h r o m b o x a n e s o r P G ' s . T h i s i s s u p p o r t e d b y w o r k o f o t h e r s w h o h a v e b e e n u n s u c c e s s f u l i n d e m o n s t r a t i n g a n e f f e c t o f P G s o n h P L a n d h C G i n p l a c e n t a l e x p l a n t s ( B e l l e v i l l e e t a l . , 1 9 7 8 ; H a n d w e r g e r e t a l . , 1 9 8 1 a ; Y l i k o r k a l a a n d P e n n a n e n , 1 9 7 3 ) . e . A d r e n o c o r t i c o t r o p i c h o r m o n e A d r e n o c o r t i c o t r o p i n ( A C T H ) , i d e n t i c a l i n s t r u c t u r e t o p i t u i t a r y A C T H , i s p r o d u c e d i n t h e p l a c e n t a ( J a i l e r a n d K n o w l t o n , 1 9 5 0 : A s s a l i a n d H a m m e r m e s z , 1 9 5 4 ; O d a g i r i e t a l . , 1 9 7 9 ; a n d L i o t t a a n d K r i e g e r 1 9 8 0 . M u l d e r e t a l . ( 1 9 8 6 ) d e m o n s t r a t e d s e c r e t i o n o f A C T H b y p l a c e n t a l t i s s u e f r a g m e n t s i n a s u p e r f u s i o n s y s t e m . B a r n e a e t a l . , ( 1 9 8 6 ) d e m o n s t r a t e d a s t i m u l a t o r y e f f e c t o f p o r c i n e A C T H o n e s t r a d i o l a n d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n t e r m p l a c e n t a l f r a g m e n t s . f . G r o w t h f a c t o r s G r o w t h f a c t o r s p r e s e n t i n t h e p l a c e n t a i n c l u d e TGF/3 , f i b r o b l a s t g r o w t h f a c t o r ( F G F ) a n d p l a t e l e t d e r i v e d g r o w t h f a c t o r ( P D G F ) ( S i m o n i a n e t a l . , 1 9 8 7 ) . I n s u l i n g r o w t h f a c t o r - 1 r e c e p t o r s a r e p r e s e n t i n t h e p l a c e n t a a n d I G F - 1 i n c r e a s e s h P L r e l e a s e f r o m t e r m o r g a n c u l t u r e ( B h a u m i c h e t a l . , 1 9 8 7 ) . M o s t e f f o r t h a s b e e n e x p e n d e d o n t h e d e s c r i p t i o n o f E G F e f f e c t s i n t h e p l a c e n t a . E p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r r e c e p t o r s a r e l o c a t e d i n t h e s y n c y t i a ( L a i a n d G u y d a , 1 9 8 4 , a n d M a r u o a n d M o c h i z u k i , 1 9 8 7 ) . 8 4 E p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r i n c r e a s e d h C G p r o d u c t i o n i n f i r s t t r i m e s t e r e x p l a n t s b u t n o t i n t e r m e x p l a n t s ( M a r u o , T . , e t a l . , 1 9 8 7 ) . T r e a t m e n t w i t h E G F h a d n o e f f e c t o n h C G p r o d u c t i o n i n c e l l s a c c o r d i n g t o H u o t e t a l . ( 1 9 8 1 ) a n d W i l s o n e t a l . ( 1 9 8 4 ) , h o w e v e r L a i a n d G u y d a ( 1 9 8 4 ) , a n d M o r r i s h e t a l . ( 1 9 8 6 ) r e p o r t s t i m u l a t i o n o f h C G a n d h P L r e l e a s e i n t e r m a n d f i r s t t r i m e s t e r c e l l s . q . I n t e r l e u k i n - 1 I n t e r l e u k i n - 1 i s a p o l y p e p t i d e p r o d u c e d a f t e r i n f e c t i o n , i n j u r y o r a n t i g e n i c c h a l l e n g e . I t f u n c t i o n s a s a h o r m o n e l o c a l l y o r s y s t e m i c a l l y , a n d s t i m u l a t e s p r o d u c t i o n o f A A m e t a b o l i t e s ( D i n a r e l l o , 1 9 8 8 ) . I n t e r l e u k i n - l a a n d i n t e r l e u k i n - 1 ^ a r e s t r u c t u r a l l y r e l a t e d , b i o c h e m i c a l l y d i s t i n c t m o l e c u l e s , w h i c h a r e c o d e d f o r b y d i s t i n c t g e n e s . M o r e i n t e r l e u k i n - 1 / 9 t h a n - l a i s p r o d u c e d . T h e i n t e r l e u k i n - 1 r e c e p t o r r e c o g n i z e s a a n d (3 f o r m s a n d b o t h h a v e t h e s a m e b i o l o g i c a l e f f e c t s . I n t e r l e u k i n - 1 i s p r o d u c e d b y a w i d e v a r i e t y o f c e l l s ; t h o s e o f m o s t i n t e r e s t i n t h e c a s e o f t h e p l a c e n t a m a y b e v a s c u l a r e n d o t h e l i a l a n d s m o o t h m u s c l e c e l l s a n d m o n o c y t e s / m a c r o p h a g e s . I n t e r l e u k i n - 1 c a n d e c r e a s e c y t o c h r o m e P 4 5 0 , t h e r e f o r e a d e c r e a s e i n p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n a n d d e c r e a s e d a n d r o g e n t o e s t r o g e n c o n v e r s i o n m i g h t b e e x p e c t e d . I n t e r l e u k i n - 1 i n d u c e s r e l e a s e o f h y p o t h a l a m i c a n d p i t u i t a r y p e p t i d e s ( e n d o r p h i n s , c o r t i c o t r o p h i n - r e l e a s i n g f a c t o r , a n d A C T H ) w h i c h a r e k n o w n t o b e p r o d u c e d i n t h e p l a c e n t a . A l t h o u g h I n t e r l e u k i n - 1 a c t s d i r e c t l y t o a u g m e n t s t e r o i d 8 5 s y n t h e s i s i n t h e a d r e n a l , i t i n h i b i t e d b a s a l a n d L H - s t i m u l a t e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n p o r c i n e g r a n u l o s a c e l l s . Y a g e l e t a l . , 1 9 8 9 , s a w i n c r e a s e d h C G p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o i n t e r l e u k i n - 1 i n l o n g t e r m c u l t u r e s o f h u m a n f i r s t t r i m e s t e r t r o p h o b l a s t . h . O p i o d s W h e n m o r p h i n e , m e t h i o n i n e - e n k e p h a l i n e a n d U P 5 0 , 4 8 8 H a r e a d m i n i s t e r e d ( w h i c h b i n d t o /x, <S a n d K o p i o d r e c e p t o r s , r e s p e c t i v e l y ) , t h e y i n h i b i t e d 8 - b r - c A M P s t i m u l a t e d G n R H r e l e a s e i n c u l t u r e d t e r m p l a c e n t a l c e l l s . T h e y h a d n o e f f e c t w h e n a d m i n i s t e r e d o n t h e i r o w n ( P e t r a g l i a e t a l . , 1 9 9 0 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t e n d o r p h i n s m a y b e i n v o l v e d i n p l a c e n t a l h o r m o n e p r o d u c t i o n . O p i o d r e c e p t o r s h a v e b e e n f o u n d i n h u m a n p l a c e n t a e ( B e l i s l e e t a l . , 1 9 8 8 b ) . i . C a t e c h o l a m i n e s N o r e p i n e p h r i n e a n d e p i n e p h r i n e s t i m u l a t e p r o d u c t i o n o f c A M P ( S a t o a n d R y a n , 1 9 7 1 , a n d F e r r e , 1 9 8 6 ) , G n R H ( P e t r a g l i a e t a l . , 1 9 8 7 ) , e s t r a d i o l a n d p r o g e s t e r o n e ( F a k i h e t a l . , 1 9 8 5 ) . P r o d u c t i o n o f h C G w a s u n c h a n g e d b y t r e a t m e n t w i t h n o r e p i n e p h r i n e a n d e p i n e p h r i n e ( B e l l e v i l l e e t a l . , 1 9 7 8 ) , d e s p i t e t h e i n c r e a s e d c A M P p r o d u c t i o n t h a t h a s a l s o b e e n m e a s u r e d . D o p a m i n e , t h e p r e c u r s o r o f n o r e p i n e p h r i n e a n d e p i n e p h r i n e , i s r e p o r t e d t o s t i m u l a t e t h e p r o d u c t i o n o f c A M P a n d d e c r e a s e h P L r e l e a s e ( F e r r e , 1 9 8 6 , a n d M a c a r o n e t a l . , 1 9 7 8 ) . I s o p r o t e r e n o l s t i m u l a t e s 8 6 p r o g e s t e r o n e ( K a s u g a i e t a l . , 1 9 8 7 ) , A C T H ( M u l d e r e t a l . , 1 9 8 6 ) , a n d G n R H ( P e t r a g l i a e t a l . , 1 9 8 7 ) p r o d u c t i o n . T h e s e e f f e c t s a p p e a r t o b e d u e t o i t s a c t i o n a t t h e f3 a d r e n e r g i c r e c e p t o r , w h i c h h a s b e e n i d e n t i f i e d i n t r o p h o b l a s t ( W h i t s e t t e t a l . , 1 9 8 0 ) . E p i n e p h r i n e a n d n o r e p i n e p h r i n e h a v e e f f e c t s a t b o t h a a n d 0 r e c e p t o r s , d o p a m i n e h a s e f f e c t s p r i m a r i l y t h r o u g h t h e /3 r e c e p t o r , a n d i s o p r o t e r e n o l h a s a l m o s t e x c l u s i v e l y f3 r e c e p t o r e f f e c t s . O t h e r s t u d i e s u s i n g f3 a g o n i s t s ( t e r b u t a l i n e : / 3 2 ; d o b u t a m i n e : /?.,) d e m o n s t r a t e d i n c r e a s e d c A M P ( K a s u g a i e t a l . , 1 9 8 7 , a n d F e r r e , 1 9 8 6 ) , a n d p r o g e s t e r o n e ( C a r i t i s e t a l . , 1 9 8 3 , a n d K a s u g a i e t a l . , 1 9 8 7 ) p r o d u c t i o n . T h e i n c r e a s e d p r o d u c t i o n o f e s t r a d i o l a n d p r o g e s t e r o n e s e e n a f t e r t r e a t m e n t w i t h (3 a g o n i s t s w a s n o t s e e n a f t e r t r e a t m e n t w i t h m e t h o x a m i n e , w h i c h i s a n a r e c e p t o r a g o n i s t ( C a r i t i s e t a l . , 1 9 8 3 ) . • j . A n g i o t e n s i n I I P e t i t e t a l . , 1 9 8 9 h a v e r e c e n t l y r e p o r t e d a n g i o t e n s i n I I s t i m u l a t e s p r o d u c t i o n o f h P L b y c u l t u r e d t e r m t r o p h o b l a s t . C . A c t i v i t y o f s e c o n d m e s s e n g e r p a t h w a y s i n t h e p l a c e n t a 1 . A d e n y l a t e c y c l a s e s y s t e m A d e n y l a t e c y c l a s e h a s b e e n i d e n t i f i e d i n h u m a n c y t o t r o p h o b l a s t ( N u l s e n e t a l . , 1 9 8 8 ) . S t i m u l a t o r y a n d i n h i b i t o r y G - p r o t e i n s h a v e b e e n f o u n d i n h u m a n c y t o t r o p h o b l a s t 8 7 ( N u l s e n e t a l . , 1 9 8 8 ) . A l t h o u g h t h e a g e n t r e s p o n s i b l e f o r i n c r e a s e d c A M P p r o d u c t i o n i n p l a c e n t a l c e l l s i s n o t k n o w n , a g e n t s b e l i e v e d t o a c t v i a t h e c A M P s e c o n d m e s s e n g e r p a t h w a y s u c h a s B-a d r e n e r g i c a g e n t s a n d c o r t i c o t r o p h i n r e l e a s i n g h o r m o n e a r e a c t i v e i n t h e p l a c e n t a ( N u l s e n e t a l , 1 9 8 8 ) . H u m a n c h o r i o n i c g o n a d o t r o p i n a l s o s t i m u l a t e s p l a c e n t a l a d e n y l a t e c y c l a s e a c t i v i t y ( M e n o n a n d J a f f e 1 9 7 3 ) . C o r t i c o t r o p i n r e l e a s i n g h o r m o n e a n d h C G a r e b o t h p r o d u c e d i n t h e t r o p h o b l a s t a n d h a v e e n d o c r i n e e f f e c t s i n c u l t u r e d p l a c e n t a l c e l l s ( R o b i n s o n a n d M a j z o u b , 1 9 8 7 ) . Wu e t a l . , ( 1 9 8 8 ) d e m o n s t r a t e d i n c r e a s e d c A M P p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o H D L ( a p o p r o t e i n - A I I ) w h i c h p r e c e d e d a n i n c r e a s e i n h P L r e l e a s e ( J o r g e n s e n e t a l . , 1 9 8 9 ) . A n a l o g u e s o f c A M P w h i c h c r o s s t h e c e l l m e m b r a n e h a v e b e e n u s e d t o a s s e s t h e e f f e c t s o f c A M P i n t h e p l a c e n t a . D i b u t y r y l c A M P a n d 8 - b r o m o - c A M P h a v e b e e n u s e d w i t h o r w i t h o u t p h o s p h o d i e s t e r a s e i n h i b i t o r s ( t h e o p h y l l i n e , a m i n o p h y l l i n e ) t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f c A M P o n h o r m o n e p r o d u c t i o n . C y c l i c A M P a f f e c t s t h e p r o d u c t i o n o f h C G , p r o g e s t e r o n e , h P L a n d e s t r o g e n i n t h e p l a c e n t a . C y c l i c A M P s t i m u l a t e s t h e p r o d u c t i o n o f h C G i n t e r m p l a c e n t a l e x p l a n t s ( H a n d w e r g e r e t a l . , 1 9 7 3 ; H u s s a e t a l . , 1 9 7 4 ; S t o r y e t a l . , 1 9 7 4 ; H u s s a e t a l . , 1 9 7 8 ; H a n i n g e t a l . , 1 9 8 5 ; H a n i n g e t a l . , 1 9 8 8 ) a n d i n c u l t u r e d c e l l s ( L o b o e t a l . , 1 9 8 5 ; Z h o u e t a l . , 1 9 8 7 ; F e i n m a n e t a l . , 1 9 8 6 ; U l l o a - A g u i r r e e t a l . , 1 9 8 7 , a n d B e n o i t e t a l . , 1 9 8 8 ) . D e s p i t e i n c r e a s e d h C G p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o c A M P , a n d d e s p i t e i n c r e a s e d c A M P i n r e s p o n s e t o B a d r e n e r g i c a g e n t s a n d h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n s , t h e r e h a s b e e n n o s t i m u l a t i o n o f h C G p r o d u c t i o n b y t h e s e a g e n t s 8 8 r e p o r t e d . P r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i s a l s o s t i m u l a t e d ( C a r i t i s e t a l . , 1 9 8 3 ) o r u n c h a n g e d ( H a n i n g e t a l . , 1 9 8 2 ) b y t h e p r e s e n c e o f c A M P i n e x p l a n t c u l t u r e s . I n c e l l c u l t u r e s , c A M P h a s b e e n r e p o r t e d t o h a v e a s t i m u l a t o r y e f f e c t o n t h e p r o d u c t i o n o f p r o g e s t e r o n e ( Z h o u e t a l . , 1 9 8 7 ; F e i n m a n e t a l . , 1 9 8 6 ; U l l o a -A g u i r r e e t a l . , 1 9 8 6 ; R i t v o s , 1 9 8 8 , a n d R i t v o s e t a l . , 1 9 8 8 ) . H u m a n p l a c e n t a l l a c t o g e n ( h P L ) h a s b e e n r e p o r t e d t o b e s t i m u l a t e d , i n h i b i t e d o r u n a f f e c t e d b y t h e p r e s e n c e o f c A M P . I n h i b i t i o n o f h P L p r o d u c t i o n b y c A M P w a s r e p o r t e d i n t e r m p l a c e n t a l e x p l a n t c u l t u r e s ( C h o y a n d W a t k i n s , 1 9 7 6 ) a n d i n t e r m p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e s ( H o c h b e r g e t a l . , 1 9 8 3 , 1 9 8 4 , 1 9 8 7 ) . O t h e r s h a v e r e p o r t e d n o a p p a r e n t e f f e c t o f c A M P o n h P L p r o d u c t i o n i n t e r m p l a c e n t a l e x p l a n t ( H a n d w e r g e r e t a l . , 1 9 7 3 ; W i n i k o f f a n d B r a u n s t e i n , 1 9 8 5 ) o r i n c e l l c u l t u r e s ( Z e i t l e r e t a l . , 1 9 8 3 ) . S o m e h a v e r e p o r t e d c A M P - s t i m u l a t e d h P L p r o d u c t i o n i n p l a c e n t a l e x p l a n t s ( H a n d w e r g e r e t a l . , 1 9 7 3 ; B e l l e v i l l e e t a l . , 1 9 7 8 , a n d G o l a n d e r e t a l . , 1 9 7 8 ) a n d i n c e l l s ( H a r m a n e t a l . , 1 9 8 7 ; S a n e e t a l . , 1 9 8 8 a n d Wu e t a l . , 1 9 8 8 ) . I n t e r m e x p l a n t ( H a n i n g e t a l . , 1 9 8 2 ) a n d t r o p h o b l a s t c e l l c u l t u r e , c A M P m a y i n h i b i t ( L o b o e t a l . , 1 9 8 5 ; N e s t l e r , 1 9 8 7 , a n d Z h o u e t a l . , 1 9 8 7 ) o r s t i m u l a t e ( H o c h b e r g e t a l . , 1 9 8 2 , 1 9 8 7 , a n d L o b o a n d B e l l i n o , 1 9 8 9 a ) a r o m a t a s e a c t i v i t y . T h e m e c h a n i s m s b y w h i c h c A M P s t i m u l a t e s t h e p r o d u c t i o n o f s t e r o i d h o r m o n e s i s c u r r e n t l y u n d e r i n v e s t i g a t i o n . T h e g e n e s e n c o d i n g t h e s t e r o i d o g e n i c f o r m s o f c y t o c h r o m e P 4 5 0 r e s p o n d t o c A M P b u t o v e r a m u c h l o n g e r t i m e f r a m e t h a n t h o s e g e n e s w h i c h r e s p o n d t o c A M P v i a c A M P ' s i n t e r a c t i o n w i t h t y p i c a l o r a t y p i c a l 8 9 c A M P - r e s p o n s i v e e l e m e n t s f o u n d i n t h e c h r o m o s o m e ( R o e s l e r e t a l . , 1 9 8 8 ; I m a g a w a e t a l . , 1 9 8 7 ; S i m p s o n e t a l . , 1 9 9 0 ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t e a c h o f t h e s t e r o i d o g e n i c P - 4 5 0 g e n e s m a y i n t e r a c t w i t h d i f f e r e n t m e m b e r s o f t h e c A M P r e s p o n s e e l e m e n t B f a m i l y o f t r a n s c r i p t i o n r e g u l a t i n g f a c t o r s ( S i m p s o n e t a l . , 1 9 9 0 ) . 2 . I n o s i t o l p h o s p h a t e s y s t e m a . P r o t e i n k i n a s e C P h o r b o l e s t e r s o r d i a c y l g l y c e r o l s c a n a c t i v a t e P K C d i r e c t l y . H a r m a n e t a l . , ( 1 9 8 6 ) e x a m i n e d t h e e f f e c t o f P K C a c t i v a t i o n b y a p h o r b o l e s t e r , p h o r b o l - 1 2 - m y r i s t a t e - 1 3 - a c e t a t e ( T P A ) a n d a d i a c y l g l y c e r o l , s n - 1 , 2 - d i o c t a n o l y g l y c e r o l ( d i C 8 ) , o n h o r m o n e p r o d u c t i o n b y c u l t u r e d t e r m p l a c e n t a l c e l l s . T h e y s a w a n a c u t e ( a t 0 . 5 h o u r s ) d o s e d e p e n d e n t i n c r e a s e i n h P L s y n t h e s i s a n d r e l e a s e , b u t n o c h a n g e i n t h e r e l e a s e o f h C G . T h e m a x i m u m e f f e c t w a s s e e n a t 1 0 _ 8 M T P A a n d 3 0 0 / i M d i C 8 . T h e s t i m u l a t i o n o f r e l e a s e a n d s y n t h e s i s o f h P L c o u l d b e b l o c k e d b y c y c l o h e x a m i d e ( a p r o t e i n s y n t h e s i s i n h i b i t o r ) . A c y l g l y c e r o l s ( m o n o p a l m i t i n a n d t r i p a l m i t i n ) a n d a p h o r b o l e s t e r w h i c h d o e s n o t a c t i v a t e P K C ( 4 a -p h o r b o l - 1 2 , 1 3 - d i d e c a n o a t e ) h a d n o e f f e c t o n h P L r e l e a s e . G o n a d o t r o p i n - r e l e a s i n g h o r m o n e a n d c A M P i n c r e a s e h C G p r o d u c t i o n i n t h e p l a c e n t a a n d G n R H i s k n o w n t o s t i m u l a t e P t d l n s ( 4 , 5 ) P 2 i n o t h e r t i s s u e s . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t b o t h a d e n y l a t e c y c l a s e a n d P K C p a t h w a y s m a y b e f u n c t i o n a l i n t h e s t i m u l a t i o n o f h C G p r o d u c t i o n i n t h e p l a c e n t a . R e c e n t l y , R i t v o s e t a l . , ( 1 9 8 8 ) h a v e d e m o n s t r a t e d i n c r e a s e d p r o d u c t i o n o f h C G i n r e s p o n s e t o T P A , a n d a n a d d i t i v e e f f e c t w i t h c h o l e r a t o x i n o n h C G p r o d u c t i o n . T P A t r e a t m e n t a l s o r e s u l t e d i n i n c r e a s e d p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n , s i m i l a r i n c r e a s e s w e r e s e e n i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f c h o l e r a t o x i n . b . C a l c i u m B e l i s l e s ' g r o u p has a l s o d o n e w o r k suggesting c a l c i u m a l o n e a n d n o t p h o s p h a t i d y l i n o s i t i d e b r e a k d o w n i s r e s p o n s i b l e f o r t h e i n c r e a s e d p r o d u c t i o n o f h C G i n r e s p o n s e t o G n R H ( 1 9 8 8 a , 1 9 8 9 ) . E v i d e n c e h a s a c c u m u l a t e d i n t h e p a s t f e w y e a r s t h a t s u g g e s t s c a l c i u m i s a n i m p o r t a n t i n t r a c e l l u l a r s e c o n d m e s s e n g e r i n v o l v e d i n h o r m o n e r e s p o n s e s i n t r o p h o b l a s t c e l l s . I n c r e a s e d c a l c i u m r e p o r t e d l y d e c r e a s e s h P L s e c r e t i o n f r o m p l a c e n t a l e x p l a n t s ( C h o y a n d W a t k i n s , 1 9 7 6 ) a n d t e r m c e l l c u l t u r e ( H o c h b e r g e t a l . , 1 9 8 4 ) . O t h e r s ( H a n d w e r g e r e t a l . , 1 9 8 1 b ) r e p o r t n o e f f e c t o f i n c r e a s e d c a l c i u m o n h P L r e l e a s e f r o m t e r m e x p l a n t s . M a t h i a l a g a n a n d R a o , 1 9 8 9 r e p o r t e d i n c r e a s e d h C G r e l e a s e f r o m f i r s t t r i m e s t e r h u m a n p l a c e n t a l m i n c e s i n r e s p o n s e t o h i g h c a l c i u m . P o l l i o t t i e t a l . , 1 9 9 0 , r e p o r t i n c r e a s e d r e l e a s e o f h C G a n d h P L f r o m t e r m e x p l a n t i n h i g h c a l c i u m . Z e i t l e r e t a l . ( 1 9 8 6 ) s h o w e d i n c r e a s e d r e l e a s e o f h P L f r o m t e r m c c e l l s p e r i f u s e d w i t h m e d i a c o n t a i n i n g i n c r e a s e d c a l c i u m . A 2 3 1 8 7 , a c a l c i u m i o n o p h o r e , h a s b e e n r e p o r t e d t o c a u s e i n c r e a s e s ( Z e i t l e r e t a l . , 1 9 8 6 ) o r d e c r e a s e s ( H o c h b e r g e t a l . , 1 9 8 7 ) i n h P L r e l e a s e i n t e r m t r o p h o b l a s t . A 2 3 1 8 7 i n c r e a s e s p r o g e s t e r o n e p r o d u c t i o n i n t e r m m i n c e s ( K a s u g a i e t a l . , 1 9 8 7 ) . D e c r e a s e d c a l c i u m r e s u l t e d i n i n c r e a s e d h P L r e l e a s e f r o m t e r m c e l l s ( Z e i t l e r e t a l . , 1 9 8 6 ) a n d n o c h a n g e i n h C G r e l e a s e f r o m t e r m e x p l a n t s ( Z e i t l e r e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e u s e o f E D T A a n d E G T A , c a l c i u m c h e l a t o r s , i n t h e m e d i a r e s u l t e d i n i n c r e a s e d h P L r e l e a s e f r o m t e r m e x p l a n t s ( H a n d w e r g e r e t a l . , 1 9 8 1 ) . C a l c i u m c h a n n e l b l o c k e r s r e d u c e i n t r a c e l l u l a r c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n b y r e d u c i n g c a l c i u m i n f l u x . V e r a p a m i l , a b l o c k e r o f t y p e L v o l t a g e d e p e n d e n t c a l c i u m c h a n n e l s , c a u s e d a s l i g h t i n c r e a s e i n h P L r e l e a s e i n c u l t u r e d t r o p h o b l a s t ( H o c h b e r g e t a l . , 1 9 8 7 ) , a n d m e t h o x y v e r a p a m i l ( D 6 0 0 ) i n c r e a s e d h P L r e l e a s e f r o m e x p l a n t c u l t u r e s ( H a n d w e r g e r e t a l . , 1 9 8 1 b ) . I n g e n e r a l , i t s e e m s d e c r e a s e d c a l c i u m i n c r e a s e s h P L r e l e a s e , b u t h a s n o e f f e c t o n h C G r e l e a s e o r o n s t e r o i d p r o d u c t i o n . c . A r a c h i d o n i c a c i d A l t h o u g h a l i m i t e d a m o u n t o f w o r k h a s b e e n d o n e o n t h e i n v o l v e m e n t o f t h e a r a c h i d o n i c a c i d s e c o n d m e s s e n g e r p a t h w a y i n t h e p l a c e n t a , t h e r e i s s o m e e v i d e n c e t h a t t h i s t r a n s d u c t i o n m e c h a n i s m m a y b e a c t i v e i n t h e p l a c e n t a ( H a n d w e r g e r e t a l . , 1 9 8 1 a a n d b , a n d Z e i t l e r a n d H a n d w e r g e r , 1 9 8 5 ) . D . P l a c e n t a l c e l l c u l t u r e D u r i n g g e s t a t i o n t h e p l a c e n t a l c e l l p o p u l a t i o n d i f f e r e n t i a t e s f r o m p r e d o m i n a n t l y m i t o t i c a l l y a c t i v e c y t o t r o p h o b l a s t , a n d p o s s i b l y i n t e r m e d i a t e t r o p h o b l a s t w i t h a t h i n s y n c y t i a l l a y e r d u r i n g t h e f i r s t t r i m e s t e r i n t o p r e d o m i n a n t l y m i t o t i c a l l y i n a c t i v e s y n c y t i o t r o p h o b l a s t a t t e r m ( s e e H o s h i n a , 1 9 8 5 f o r r e f e r e n c e s ) . M a n y s t u d i e s h a v e b e e n d o n e u s i n g p l a c e n t a l e x p l a n t s , s l i c e s o r p e r i f u s e d e x p l a n t s . T h i s m e t h o d o l o g y h a s t h e a d v a n t a g e o f r e t a i n i n g c e l l t o c e l l c o n t a c t a n d r e t a i n i n g a m i x e d p o p u l a t i o n a n d a p p r o p r i a t e p r o p o r t i o n s o f c e l l t y p e s . I n c o n t r a s t , m o n o l a y e r c e l l c u l t u r e h a s t h e a d v a n t a g e o f i s o l a t i n g c e l l s , d e c r e a s i n g c e l l t o c e l l c o n t a c t a n d c o m m u n i c a t i o n . T h i s a l l o w s p r e c i s e d e t e r m i n a t i o n o f t h e e f f e c t o f o n e h o r m o n e o r d r u g o n t h e c e l l t y p e o f i n t e r e s t . M o n o l a y e r s a l s o i n c r e a s e t h e a c c e s s a b i l i t y o f c e l l s t o h o r m o n e o r d r u g t r e a t m e n t . T h e a b i l i t y t o c u l t u r e o n l y c y t o t r o p h o b l a s t o r s y n c y t i o t r o p h o b l a s t m a y b e a d v a n t a g e o u s i n d e t e r m i n i n g w h i c h c e l l t y p e i s r e s p o n s i b l e f o r r e c o r d e d r e s p o n s e s . A d i s a d v a n t a g e o f p l a c e n t a l c e l l c u l t u r e i s t h e n e c e s s i t y o f u s i n g d i g e s t i v e e n z y m e s t o d i s p e r s e c e l l s . T h e s e e n z y m e s o f t e n r e d u c e v i a b i l i t y o f c e l l s a n d d a m a g e c e l l s u r f a c e r e c e p t o r s . E n z y m e s u s e d t o d i s p e r s e t e r m a n d f i r s t t r i m e s t e r t i s s u e f o r c e l l c u l t u r e i n c l u d e t r y p s i n ( B a x e t a l . , 1 9 8 9 , a n d T r u m a n e t a l . , 1 9 8 9 ) , t r y p s i