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Mechanisms of modulation of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors by mutant huntingtin Fan, Mannie Man Yee 2007

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MECHANISMS OF MODULATION OF N-METHYL-D-ASPARTATE (NMDA) RECEPTORS BY MUTANT HUNTINGTIN by M A N N I E M A N Y E E F A N B.Sc, McGill University, 1998 M.Sc, The University of British Columbia, 2001 A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY in THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES (Neuroscience) THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA April 2007 © Mannie Man Yee Fan, 2007 ABSTRACT Evidence supports a role for neuronal damage arising from excessive activation of glutamate receptors (especially the NMDA subtype) in the pathogenesis of Huntington's disease (HD), although clinical trials involving NMDA receptor inhibition have mostly failed. Further understanding of the underlying molecular mechanisms is therefore needed to refine therapeutic approaches. My work has focused on the elucidation of molecular pathways linking huntingtin (htt) to NMDA receptors (NMDARs). I found that NMDAR subunits NR1/NR2B are shifted from internal pools to the plasma membrane, with faster NMDAR insertion to the surface in striatal neurons from YAC72 HD mice. YAC72 striatum shows a relative enrichment of NR1 C2' isoforms in the vesicle/microsome-enriched fraction and preferential association of these isoforms with NR2B subunits, suggesting alternative splicing of NR1 may favour faster forward trafficking of receptors to potentiate NMDAR current and toxicity in this HD mouse model. I demonstrated co-localization and interaction of the htt-interacting protein HIP-1 and actin-crosslinking cc-actinin proteins, together in a complex with NMDARs in mouse striatal neurons and forebrain tissue. In fact, HIP-1 can directly interact with a-actinin, thus providing a physical link between htt and NMDARs. To broaden the search for candidate proteins mediating the effects of mutant htt (mhtt) on NMDAR function, I collaborated with Kinexus Bioinformatics Corp. to examine expression patterns of a variety of protein kinases, phosphatases, and heat shock/stress proteins, in HEK cells over-expressing NR1/NR2B-type NMDARs and wild-type or mutant htt. Multiple proteins involved in the heat shock response pathway, including Hsp-70 and CK2, show altered subcellular distribution with co-expression of mhtt and NR1/NR2B, an i i effect potentiated by NMDAR stimulation. CK2 expression is also elevated in striatal tissue from YAC HD mice, and its activity plays a protective role against NMDAR toxicity. Altered expression of stress response proteins in the presence of mhtt and NR1/NR2B may reflect anattempt to mitigate mhtt-induced sensitivity to excitotoxicity. Findings from this thesis provide additional insight into the molecular mechanisms underlying increased NMDAR-mediated excitotoxicity in the YAC mouse model of HD. Target molecules and pathways identified in this work may contribute to the optimization of strategies for the treatment of HD. iii TABLE OF CONTENTS Abstract .....ii Table of Contents iv List of Tables '. x List of Figures xi List of Abbreviations xv Acknowledgments xxiii Dedication xxiv CHAPTER 1. Introduction 1 1.1. Huntington's Disease 1 1.1.1. Clinical Presentation ...1 1.1.2. Neuropathology 2 1.1.3. Molecular Pathology 3 1.1.3.1. Toxic Effects of Aggregated versus Soluble mHtt 4 1.1.3.2. Other Toxic Actions of mHtt... 6 1.1.4. Normal Functions and Interactions of Htt 8 1.1.4.1. Role of Htt in Vesicular/Mitochondrial Transport and Energy Production ........8 1.1.4.2. Binding Partners of Htt Provide Clues to Its Functions 9 1.1.4.3. Domain Structure of Htt Provides Clues to Its Functions 10 1.1.5. Gains and Losses of Htt Function in HD 11 1.1.6. Selective Neuronal Degeneration 14 1.1.7. Animal Models of HD ...14 1.2. Excitotoxicity Hypothesis 16 iv 1.2.1. What is Excitotoxicity? 16 1.2.2. Classes of Glutamate Receptors 17 1.2.3. Structure and Functional Characteristics of NMDARs 18 1.2.4. Trafficking of NMDARs 21 1.2.5. Striatal Expression of NMDARs in HD-Affected Individuals and Mouse Models 24 1.2.6. Chemical Models of HD 26 1.3. Aberrant NMDAR Activity in HD 29 1.3.1. Synaptic Abnormalities in HD Models 29 1.3.1.1. Alterations in NMDA-LTP and NMDA-LTD in HD Models 30 1.3.2. Enhanced Sensitivity to NMDA in HD Mouse Models 32 1.4. Signaling Downstream of Altered NMDAR Activity 34 1.4.1. Loss of Calcium Homeostasis 34 1.4.2. Mitochondrial Dysfunction in HD and Models of HD 36 1.4.3. Caspase Activation 40 1.4.4. Cellular Toxicity and Involvement of NR1/NR2B-Type NMDARs 41 1.5. Mechanisms Underlying mHtt-lnduced Alterations in NMDAR Signaling 44 1.5.1. Interactions of NMDARs with the Actin CSK and PSD-Associated Proteins 44 1.5.2. Interaction of NMDARs and tnHtt via PSD-95 45 1.5.3. Phosphorylation of NMDARs 47 1.5.4. Other Possible Mechanisms of Modulation of NMDAR Activity by mHtt ..50 1.6. Hypothesis and Rationale 51 CHAPTER 2. Materials and Methods 57 2.1. Transgenic Mice 57 2.1.1. Breeding and Maintenance of Mice 57 2.1.2. Primary Culture of Mouse Striatal MSNs 57 2.1.2.1. Transfection of Cultured Striatal MSNs with Plasmid DNA 58 2.1.2.2. Immunofluorescent Staining and Quantification 59 2.1.2.3. Chymotrypsin Assay 62 2.1.2.4. Biotinylation Assays 63 2.1.2.4.1. To Examine NR1/NR2B Surface Expression 63 2.1.2.4.2. To Examine Loss of NR1/NR2B from the Cell Surface 64 2.1.2.4.2.1. Blocking Degradation by Lysosomal Inhibition 65 2.1.2.4.3. To Examine NR1/NR2B Insertion Using Chlorpromazine to Block Endocytosis and Recycling 65 2.1.2.5. NMDAR-Dependent Toxicity Assay 66 2.1.2.5.1. Induction of Toxicity 66 2.1.2.5.2. Analysis of Apoptotic Death 67 2.1.3. Harvesting Tissue 68 2.1.3.1. Immunoblot Analysis 68 2.1.3.2. Examination of NR1/NR2B Expression in Mice of Different Ages ....68 2.1.3.3. Examination of Protein Expression in Mouse Tissue to Follow Up on Kinetworks™ Results 69 2.1.3.4. Subcellular Fractionation 70 2.1.3.5. Immunoprecipitation 71 2.1.3.5.1. From Mouse Forebrain Tissue 71 2.1.3.5.2. From Mouse Striatal Tissue 72 2. HEK293 Cell Line 73 2.2.1. Passaging and Maintaining Cell Line 73 vi 2.2.2. Transfection of Cell Line with Plasmid DNA 73 2.2.2.1. p-Galactosidase Staining to Determine Transfection Efficiency 74 2.2.3. Immunoprecipitation 75 2.2.4. NMDAR Stimulation of Transfected Cells 76 2.2.5. Harvesting Cells for Kinetworks™ or Immunoblotting Analysis 76 2.3. E. Coli Bacteria 78 2.3.1. Transformation with Plasmid DNA 78 2.3.2. Purification of Plasmid DNA 79 2.3.3. Purification of GST-Fusion Proteins from Bacteria 80 2.4. Plasmid DNA ...81 2.5. Antibodies 82 2.6. Gel Overlay Assay 84 2.7. Materials 85 2.8. Data Analysis 85 CHAPTER 3. Altered NMDAR Trafficking in YAC72 Transgenic HD Mouse Model 90 3.1. No Change in NR1/NR2B Total Expression in Striatal Tissue from YAC46 or YAC72 Mice : 90 3.2. Increased NMDAR Surface Expression in YAC72 MSNs 91 3.2.1. By Immunofluorescent Staining 91 3.2.2. By Chymotrypsin Assay 92 3.2.3. By Biotinylation Assay 93 3.3. Increased Rate of NMDAR Trafficking in YAC72 MSNs 94 3.3.1. Increased Rate of Receptor Loss from the Cell Surface 94 3.3.2. Increased Rate of Receptor Insertion to the Cell Surface 95 3.4. Altered Splicing of NR1 Isoform in YAC72 Striatal Tissue 97 vii 3.5. Differential Interaction of NR1 C2' Splice Isoform with NR2 Subunits in YAC72 Striatal Tissue 99 3.6. Summary 100 CHAPTER 4. HIP-1 and a-Actinins Link Huntingtin with NMDARs 120 4.1. Role for HIP-1 in Receptor Trafficking 120 4.2. Role for Actin-Binding Proteins in Regulating NMDARs 121 4.3. Interaction of HIP-1 and a-Actinin with NMDARs .122 4.3.1. Co-Localization of HIP-1 with a-Actinin 4 in Mouse Striatal MSNs 122 4.3.2. HIP-1 and a-Actinin 4 Interact with NMDARs by Co-lmmunoprecipitation 123 4.3.3. HIP-1, a-Actinin 4, and NMDARs Co-Fractionate .-. 124 4.3.4. Direct Interaction between HIP-1 and a-Actinin 125 4.4. HIP-1 Over-Expression Increases NR1 Surface Expression in Striatal MSNs ". .126 4.5. Summary 127 CHAPTER 5. Kinetworks™ Profiling of Protein Expression Changes in Cells Expressing mHtt 137 5.1. Introduction to Kinetworks™ Screening Technique 137 5.2. Results from KPKS Protein Kinase Screens 139 5.3. Results from KPPS Protein Phosphatase Screens 140 5.4. Results from KHSP Heat Shock Protein Screens 141 5.5. NMDAR Expression- and Activity-Dependent Increase in Cytosolic Hsp70 142 5.6. Analyzing Total Expresson of Selected Protein Targets 144 5.7. Role of Increased CK2 Expression in Membrane Compartments 145 vi i i 5.7.1. Increased CK2 Expression in Particulate Fraction from YAC Mouse Striatum 145 5.7.2 CK2 Activity Protects Against NMDAR-Mediated Apoptotic Death in mHtt-Expressing Cells 146 5.8. Summary 147 CHAPTER 6. Conclusions 166 6.1. Mechanisms of Modulation of NMDAR Activity/Trafficking by mHtt 166 6.1.1. Limitations of Methods Available for Measuring Forward Trafficking 168 6.1.2. Enhanced Trafficking of NMDARs Composed of NR1 C2' and NR2B 171 6.1.3. Implications for YAC128 HD Mice 172 6.2. Physical Link between NMDARs and Htt 176 6.2.1. Modulation of NMDARs by HIP-1 177 6.3. Effect of Htt PolyQ Expansion on Expression and/or Distribution of Signaling Proteins '. 179 6.3.1. Modulation of NMDAR Activity by CK2 in the Context of HD 181 6.4. Selective Vulnerability of Striatal MSNs in HD 183 6.5. Future Directions 185 Bibliography 190 ix LIST OF TABLES Table 1. Summary of Referenced HD Mouse Models 53 Table 2. List of Protein Kinases Examined in Kinetworks™ KPKS Screen 148 Table 3. List of Protein Phosphatases Examined in Kinetworks™ KPPS Screen 149 Table 4. List of Stress/Heat Shock Proteins Examined in Kinetworks™ KHSP Screen 150 Table 5. Expression Levels of Selected Proteins from KPKS, KPPS, and KHSP Screens 151 Table 6. Summary of Changes in Expression Levels of Selected Proteins from KPKS, KPPS, and KHSP Screens 152 Table 7. Quantification of Results from Immunoblot Analysis of Selected Protein Targets as Shown in Figure 39B 153 LIST OF FIGURES Figure 1. Cartoon of Possible Points Along the Corticostriatal Pathway Where Dysfunction May Contribute to Excitotoxicity 54 Figure 2. Cartoon of NR1 Membrane Topology and C-Terminal Splice Variants ...55 Figure 3. Cartoon of Possible Mechanisms Underlying Potentiation of NMDAR Activity by mHtt 56 Figure 4. Schematic of Biotinylation Assay to Examine Loss of Receptors from the Cell Surface 87 Figure 5. Schematic of Biotinylation Assay to Examine Surface Protein Insertion 88 Figure 6. Schematic of Subcellular Fractionation Protocol 89 Figure 7. NR1/NR2B Total Expression is not Different in Striatal Tissue from 2 Month-Old FVB/N WT, YAC46, or YAC72 Mice 102 Figure 8. NR1/NR2B Total Expression is not Different in Striatal Tissue from FVB/N WT orYAC72 Mice at 2, 6, 9, or 12 Months of Age 103 Figure 9. Plots Comparing NR1 and NR2B Expression Levels in Striatal Tissue from WT and YAC72 Mice, Grouped by Age 104 Figure 10. Immunofluorescent Staining Demonstrates Increased Proportion of Surface NR1 in MSNs from YAC72 Mice 105 Figure 11. Representative Immunoblot of NR1/NR2B Levels in 9-10 d.i.v. MSNs from YAC72 versus WT Mice With or Without Chymotrypsin Treatment 106 Figure 12. Biotinylation Assay Demonstrates Increased Proportion of Surface NR1 in MSNs from YAC72 Mice 107 XI Figure 13. Biotinylation Assay Demonstrates Increased Proportion of Surface NR2B in MSNs from YAC72 Mice 108 Figure 14. Biotinylation Assay Demonstrates Unchanged Proportion of Surface GluR1 in MSNs from YAC72 Mice 109 Figure 15. Representative Immunoblots Illustrating Loss of Biotin-Tagged NR1 Over Time in MSNs from WT and YAC72.Mice 110 Figure 16. Enhanced Rate of Loss of Surface-Labeled NR1/NR2B in MSNs from YAC72 Mice 111 Figure 17. Plots Comparing Loss of Surface-Labeled GluR1 in MSNs from WT and YAC72 Mice 112 Figure 18. Representative Immunoblots Illustrating Insertion of NR1 to the Cell Surface Over Time in MSNs from WT and YAC72 Mice 113 Figure 19. Insertion of NR1/NR2B to the Cell Surface Proceeds More Rapidly in MSNs from YAC72 Mice 114 Figure 20. Plots Comparing Insertion of GluR1 in MSNs from WT and YAC72 Mice ..115 Figure 21. NR1 C2 and NR1 C2' Expression is Not Different in Striatal Tissue from 2 Month-Old FVB/N WT orYAC72 Mice ...116 Figure 22. Increased YAC72/WT Ratio of NR1 C2'-to-C2 Expression in Microsome-Enriched Fraction 117 Figure 23. Representative Immunoblots Illustrating Co-lmmunoprecipitation of NR1 or NR1 C2' with NR2 Subunits in Striatal Tissue from 2 Month-Old WT or YAC72 Mice 118 Figure 24. Plots Comparing Fraction of Immunoprecipitated NR1 C2' Normalized to NR1 in Anti-NR2 Precipitates from Striatal Tissue of 2 Month-Old WT or YAC72 Mice 119 Xll F i g u r e 2 5 . S c h e m a t i c o f S e l e c t e d M o d u l a r D o m a i n s i n H I P - 1 a n d a - A c t i n i n P r o t e i n s : , . 1 2 9 F i g u r e 2 6 . H I P - 1 a n d a - A c t i n i n 4 C o - L o c a l i z e b y I m m u n o s t a i n i n g i n M o u s e S t r i a t a l M S N s 1 3 0 F i g u r e 2 7 . H I P - 1 a n d a - A c t i n i n 4 I n t e r a c t w i t h N M D A R s i n T r a n s f e c t e d H E K 2 9 3 C e l l s b y C o - l m m u n o p r e c i p i t a t i o n 1 3 1 F i g u r e 2 8 . H I P - 1 a n d a - A c t i n i n 4 I n t e r a c t w i t h N M D A R s i n M o u s e F o r e b r a i n T i s s u e b y C o - l m m u n o p r e c i p i t a t i o n 1 3 2 F i g u r e 2 9 . H I P - 1 , a - A c t i n i n 4 , a n d N M D A R s C o - F r a c t i o n a t e i n M o u s e S t r i a t a l T i s s u e '.. 1 3 3 F i g u r e 3 0 . H I P - 1 B i n d s D i r e c t l y t o a - A c t i n i n b y G e l O v e r l a y A s s a y 1 3 4 F i g u r e 3 1 . C a r t o o n o f H y p o t h e s i z e d H I P - 1 / a - A c t i n i n I n t e r a c t i o n s i n L i n k i n g H t t t o N M D A R s 1 3 5 F i g u r e 3 2 . I m m u n o f l u o r e s c e n t S t a i n i n g D e m o n s t r a t e s I n c r e a s e d P r o p o r t i o n o f S u r f a c e N R 1 i n M S N s O v e r - E x p r e s s i n g H I P - 1 . 1 3 6 F i g u r e 3 3 . S a m p l e K i n e t w o r k s ™ K P K S S c r e e n R e s u l t s 1 5 4 F i g u r e 3 4 . P l o t s o f Q u a n t i f i e d K i n e t w o r k s ™ K P K S S c r e e n R e s u l t s 1 5 5 F i g u r e 3 5 . S a m p l e K i n e t w o r k s ™ K P P S S c r e e n R e s u l t s 1 5 6 F i g u r e 3 6 . P l o t s o f Q u a n t i f i e d K i n e t w o r k s ™ K P P S S c r e e n R e s u l t s 1 5 7 F i g u r e 3 7 . S a m p l e K i n e t w o r k s ™ K H S P S c r e e n R e s u l t s 1 5 8 F i g u r e 3 8 . P l o t s o f Q u a n t i f i e d K i n e t w o r k s ™ K H S P S c r e e n R e s u l t s 1 5 9 F i g u r e 3 9 . U p - R e g u l a t i o n o f C y t o s o l i c H s p 7 0 E x p r e s s i o n b y m H t t D e p e n d s o n C o - E x p r e s s i o n o f N M D A R s a n d i s E n h a n c e d b y N M D A R A c t i v i t y 1 6 0 F i g u r e 4 0 . I m m u n o b l o t s f o r T o t a l C e l l u l a r E x p r e s s i o n o f S e l e c t e d P r o t e i n s f r o m T r a n s f e c t e d H E K 2 9 3 C e l l s W i t h o r W i t h o u t N M D A R S t i m u l a t i o n 1 6 1 xiii F i g u r e 4 1 . Q u a n t i f i c a t i o n o f T o t a l C e l l u l a r E x p r e s s i o n o f S e l e c t e d P r o t e i n s f r o m T r a n s f e c t e d H E K 2 9 3 C e l l s W i t h o r W i t h o u t N M D A R S t i m u l a t i o n 1 6 2 F i g u r e 4 2 . P a r t i c u l a t e C K 2 E x p r e s s i o n i s U p - R e g u l a t e d i n S t r i a t a l T i s s u e f r o m M i c e E x p r e s s i n g m H t t 1 6 3 F i g u r e 4 3 . N M D A - l n d u c e d A p o p t o s i s i n M S N s f r o m F V B / N W T , Y A C 7 2 , o r Y A C 1 2 8 M i c e i n t h e P r e s e n c e o r A b s e n c e o f C K 2 I n h i b i t i o n 1 6 4 F i g u r e 4 4 . B l o c k a d e o f C K 2 A c t i v i t y i n M o u s e S t r i a t a l M S N s E x a c e r b a t e s N M D A R - M e d i a t e d m H t t - l n d u c e d A p o p t o s i s 1 6 5 F i g u r e 4 5 . F l o w c h a r t I l l u s t r a t i n g C e l l u l a r P r o c e s s e s A f f e c t e d b y E x p r e s s i o n o f m H t t . . . 1 8 8 F i g u r e 4 6 . C a r t o o n o f P o s s i b l e M e c h a n i s m s U n d e r l y i n g P o t e n t i a t i o n o f N M D A R A c t i v i t y b y m H t t a t N o n - S y n a p t i c S i t e s 1 8 9 xiv LIST OF ABBREVIATIONS 3 - N P , 3 - n i t r o p r o p i o n i c a c i d A b , a n t i b o d y A M P A , a - a m i n o - 3 - h y d r o x y - 5 - m e t h y l - 4 - i s o x a z o l e - p r o p i o n i c a c i d A M P A R , A M P A r e c e p t o r A N O V A , a n a l y s i s o f v a r i a n c e A P - 2 , a d a p t o r p r o t e i n - 2 A T P , a d e n o s i n e 5 ' - t r i p h o s p h a t e B C A , b i c i n c h o n i n i c a c i d B D N F , b r a i n - d e r i v e d n e u r o t r o p h i c f a c t o r B E S , N , N - B i s - ( 2 - h y d r o x y e t h y l ) - 2 - a m i n o e t h a n e s u l f o n i c a c i d B i o t E l u a t e , b i o t i n y l a t i o n e l u a t e B S A , b o v i n e s e r u m a l b u m i n B S S , b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n B T K , B r u t o n a g a m m a g l o b u l i n e m i a t y r o s i n e k i n a s e C a l n x n , c a l n e x i n C a M K 1 , c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t k i n a s e 1 C a M K 4 , c a l m o d u l i n - d e p e n d e n t k i n a s e 4 c A M P , c y c l i c a d e n o s i n e 5 ' - m o n o p h o s p h a t e C a P , c a l c i u m p h o s p h a t e C B P , C R E B - b i n d i n g p r o t e i n C D K 2 , c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e 2 C D K 4 , c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e 4 XV C D K 5 , c y c l i n - d e p e n d e n t k i n a s e 5 c D N A , c o m p l e m e n t a r y D N A C K 1 e , c a s e i n k i n a s e 1 e p s i l o n C K 2 , c a s e i n k i n a s e 2 C M V , c y t o m e g a l o v i r u s C N S , c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m C o x - 2 , c y c l o - o x y g e n a s e 2 C R E , c A M P r e s p o n s e e l e m e n t C R E B , C R E - b i n d i n g p r o t e i n C S F , c e r e b r o s p i n a l f l u i d C S K , c y t o s k e l e t o n c y t o , c y t o s o l i c D E D , d e a t h e f f e c t o r d o m a i n D F , d e t e r g e n t - f r e e b u f f e r d . i . v . , d a y s in vitro D M S O , d i m e t h y l s u l f o x i d e D N A , d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d D N A s e , d e o x y r i b o n u c l e a s e D R B , 5 , 6 - d i c h l o r o b e n z i m i d a z o l e r i b o s i d e E C L , e n h a n c e d c h e m i l u m i n e s c e n c e E. coli, Escherichia coli e l F 2 a , e u k a r y o t i c t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n f a c t o r 2 a l p h a E P S C , e x c i t a t o r y p o s t - s y n a p t i c c u r r e n t E R , e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m E R K 1 , e x t r a c e l l u l a r - r e g u l a t e d k i n a s e 1 xvi E R K 2 , e x t r a c e l l u l a r - r e g u l a t e d k i n a s e 2 E R p 5 7 , 5 7 k D a E R p r o t e i n E R p 7 2 , 7 2 k D a E R p r o t e i n E t O H , e t h a n o l F B S , f e t a l b o v i n e s e r u m F V B / N , f r i e n d l e u k e m i a v i r u s s t r a i n B N I H G A B A , y - a m i n o b u t y r i c a c i d G A P D H , g l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e G C K , g e r m i n a l c e n t r e k i n a s e G E B , G l u t a t h i o n e E l u t i o n B u f f e r G F P , g r e e n f l u o r e s c e n t p r o t e i n G P e , e x t e r n a l g l o b u s p a l l i d u s G P i , i n t e r n a l g l o b u s p a l l i d u s G r o E L , c h a p e r o n i n h e a t s h o c k 6 0 k D a p r o t e i n 1 G r p 9 4 , 9 4 k D a g l u c o s e - r e g u l a t e d p r o t e i n G S T , g l u t a t h i o n e - S - t r a n s f e r a s e G T P , g u a n o s i n e 5 ' - t r i p h o s p h a t e H A P - 1 , h u n t i n g t i n - a s s o c i a t e d p r o t e i n 1 H B , H a r v e s t B u f f e r H B S S , H a n k s ' b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n H D , H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e Hdh, H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e h o m o l o g u e H E A T , H t t / E l o n g a t i o n f a c t o r 3 / P P 2 A R e g u l a t o r y A s u b u n i t / T O R 1 H E K , h u m a n e m b r y o n i c k i d n e y H I P - 1 , h u n t i n g t i n - i n t e r a c t i n g p r o t e i n 1 xvii ) H I P P I , H I P - 1 p r o t e i n i n t e r a c t o r h n R N A , h e t e r o n u c l e a r R N A H 0 2 , h e m e o x y g e n a s e 2 H P K 1 , h e m a t o p o i e t i c p r o g e n i t o r k i n a s e 1 H S F 4 , h e a t s h o c k t r a n s c r i p t i o n f a c t o r 4 H s p 6 0 , H e a t s h o c k 6 0 k D a p r o t e i n 1 H s p 7 0 , h e a t s h o c k 7 0 k D a p r o t e i n 1 A H s p 9 0 , h e a t s h o c k 9 0 k D a p r o t e i n H s p 1 0 5 , h e a t s h o c k 1 0 5 k D a p r o t e i n H s p B P I , H s p 7 0 - b i n d i n g p r o t e i n 1 h t t , h u n t i n g t i n I B , i m m u n o b l o t i G l u R , i o n o t r o p i c g l u t a m a t e r e c e p t o r I K K a , i n h i b i t o r N F K B k i n a s e a l p h a I M M , i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e I P , i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ; i m m u n o p r e c i p i t a t e I P 3 , i n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e I P 3 R , I P 3 r e c e p t o r I P T G , i s o p r o p y l t h i o g a l a c t o s i d e J A K 2 , J a n u s k i n a s e 2 J N K , J u n N - t e r m i n a l k i n a s e K H S P , K i n e t w o r k s ™ h e a t s h o c k p r o t e i n s c r e e n K I , k n o c k - i n K O , k n o c k - o u t K P K S , K i n e t w o r k s ™ p r o t e i n k i n a s e s c r e e n xviii K P P S , K i n e t w o r k s ™ p r o t e i n p h o s p h a t a s e s c r e e n L B , L u r i a b r o t h L c k , l y m p h o c y t e - s p e c i f i c p r o t e i n t y r o s i n e k i n a s e l e u p , l e u p e p t i n L T D , l o n g - t e r m d e p r e s s i o n L T P , l o n g - t e r m p o t e n t i a t i o n L y s , l y s a t e M A G U K , m e m b r a n e - a s s o c i a t e d g u a n y l a t e k i n a s e M E M , m i n i m u m e s s e n t i a l m e d i u m M E M + , M E M s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % F B S , 2 m M g l u t a m i n e , 1 m M s o d i u m p y r u v a t e , a n d 1 0 0 u n i t s / m l p e n i c i l l i n - s t r e p t o m y c i n m G l u R , m e t a b o t r o p i c g l u t a m a t e r e c e p t o r m h t t , m u t a n t htt M K K 7 , M A P k i n a s e k i n a s e 7 M n k 2 , M A P k i n a s e - i n t e r a c t i n g k i n a s e 2 m P T , m i t o c h o n d r i a l p e r m e a b i l i t y t r a n s i t i o n m R N A , m e s s e n g e r R N A M S N , m e d i u m - s i z e d s p i n y n e u r o n M W , m o l e c u l a r w e i g h t m y r - D y n , m y r i s t o y l a t e d d y n a m i n - d e r i v e d p e p t i d e N e k 2 , N I M A - r e l a t e d k i n a s e 2 N E S , n u c l e a r e x p o r t s i g n a l N B M , n e u r o b a s a l m e d i u m N G S , n o r m a l g o a t s e r u m N i l , n e u r o n a l i n t r a n u c l e a r i n c l u s i o n xix N M D A , N - m e t h y l - D - a s p a r t a t e N M D A R , N M D A r e c e p t o r N P - 4 0 , N o n i d e t P - 4 0 N . R . , n o t r e p o r t e d N S E , n e u r o n - s p e c i f i c e n o l a s e N S F , N - e t h y l m a l e i m i d e - s e n s i t i v e f u s i o n p r o t e i n O D , o p t i c a l d e n s i t y P A C S I N , P K C a n d C a s e i n K i n a s e S u b s t r a t e i n N e u r o n s P A K 1 , p 2 1 - a c t i v a t e d k i n a s e 1 P A K 3 , p 2 1 - a c t i v a t e d k i n a s e 3 p a r t i c , p a r t i c u l a t e P B S , p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e P D K 1 , 3 - p h o s p h o i n o s i t i d e - d e p e n d e n t p r o t e i n k i n a s e 1 P D L , p o l y - D - l y s i n e P D Z , P S D - 9 5 / D i s c s l a r g e / Z o n a o c c l u d e n s - 1 P F A , p a r a f o r m a l d e h y d e P I , p r o p i d i u m i o d i d e P I 3 K , p h o s p h o i n o s i t i d e 3 - k i n a s e P K A , p r o t e i n k i n a s e A P K B , p r o t e i n k i n a s e B P K C , p r o t e i n k i n a s e C P K C a , p r o t e i n k i n a s e C a l p h a P K C e , p r o t e i n k i n a s e C e p s i l o n P K C y , p r o t e i n k i n a s e C g a m m a P K C A , , p r o t e i n k i n a s e C l a m b d a xx P K C 9 , p r o t e i n k i n a s e C t h e t a P K C ^ , p r o t e i n k i n a s e C z e t a P K R , d s R N A - d e p e n d e n t k i n a s e P M S F , p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l f l u o r i d e P o l y P , p o l y p r o l i n e P o l y Q , p o l y g l u t a m i n e P P 2 A / A a / ( 3 , p r o t e i n p h o s p h a t a s e 2 A - A r e g u l a t o r y s u b u n i t s ( a l p h a / b e t a i s o f o r m s ) P P 5 , p r o t e i n p h o s p h a t a s e 5 P P V / C , p r o t e i n p h o s p h a t a s e 6 c a t a l y t i c s u b u n i t P S B , p r o t e i n s a m p l e b u f f e r P S D , p o s t - s y n a p t i c d e n s i t y P S D - 9 5 , p o s t - s y n a p t i c d e n s i t y p r o t e i n 9 5 k D a P T P - 1 B , p r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h a t a s e 1 B P V D F , p o l y v i n y l i d e n e d i f l u o r i d e P Y K 2 , p r o t e i n t y r o s i n e k i n a s e 2 Q A , q u i n o l i n i c a c i d R I P A , r a d i o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n R N A , r i b o n u c l e i c a c i d R O S , r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s R S K 1 , r i b o s o m a l S 6 k i n a s e 1 R S K 2 , r i b o s o m a l S 6 k i n a s e 2 S A P - 9 7 , s y n a p s e - a s s o c i a t e d p r o t e i n 9 7 k D a S A P - 1 0 2 , s y n a p s e - a s s o c i a t e d p r o t e i n 1 0 2 k D a S A P K b , s t r e s s - a c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e b e t a S B , S o l u b i l i z a t i o n B u f f e r xxi S D S , s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e S D S - P A G E , s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s S E M , s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n S F K , S r c f a m i l y k i n a s e S H 3 , S r c h o m o l o g y r e g i o n 3 S H 3 G L 3 , S H 3 - d o m a i n - c o n t a i n i n g G r b - 2 - l i k e p r o t e i n - 3 S N A R E , s o l u b l e N S F ( N - e t h y l m a l e i m i d e - s e n s i t i v e f u s i o n p r o t e i n ) a t t a c h m e n t p r o t e i n r e c e p t o r S N c , s u b s t a n t i a n i g r a p a r s c o m p a c t a S P N , s u p e r n a t a n t S T N , s u b t h a l a m i c n u c l e u s S y p , s y n a p t o p h y s i n T B S , T r i s - b u f f e r e d s a l i n e T B S - T , T B S 0 . 5 % T w e e n - 2 0 T E , T r i s - E D T A t g , t r a n s g e n i c T r k B , t y r o s i n e r e c e p t o r k i n a s e B T U N E L , t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e ( T d T ) - m e d i a t e d d U T P n i c k e n d l a b e l i n g T W B , T r i s w a s h b u f f e r T X , D F b u f f e r c o n t a i n i n g 1 % T r i t o n X - 1 0 0 U P S , u b i q u i t i n / p r o t e a s o m e s y s t e m U T , u n t r a n s f e c t e d W T , w i l d - t y p e Y A C , y e a s t a r t i f i c i a l c h r o m o s o m e x x i i A C K N O W L E D G M E N T S M a n y t h a n k s g o f i r s t a n d f o r e m o s t t o m y r e s e a r c h s u p e r v i s o r , D r . L y n n R a y m o n d , f o r h e r t i r e l e s s s u p p o r t d u r i n g t h e p a s t s e v e r a l y e a r s . A m a z i n g l y g e n e r o u s w i t h h e r t i m e , L y n n i s a l w a y s t h e r e f o r h e r s t u d e n t s . N o t o n l y d o e s s h e p r o v i d e e x c e p t i o n a l e x p e r i m e n t a l a n d c o n c e p t u a l g u i d a n c e f o r m y r e s e a r c h , b u t s h e i s v e r y m u c h a g o o d f r i e n d a n d m e n t o r a s w e l l . W o r k i n g w i t h L y n n h a s b e e n a t h o r o u g h l y e n j o y a b l e a n d i n t e l l e c t u a l l y s t i m u l a t i n g e x p e r i e n c e ; I t h a n k h e r f o r g i v i n g m e t h e o p p o r t u n i t y t o p u r s u e m y P h . D . s t u d i e s i n h e r l a b . I w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k a l l t h e m e m b e r s o f t h e R a y m o n d l a b , p a s t a n d p r e s e n t , f o r b e i n g g o o d f r i e n d s a n d c o l l e a g u e s : H e r m a n , J a c k i e , M e l i n d a , C a r o l y n , L a v a n , A u s t e n , a n d C r i s t i n a . . . S p e c i a l t h a n k s g o t o E s t h e r a n d L i l y f o r p u t t i n g u p w i t h m y e n d l e s s r e q u e s t s f o r 6 0 m m d i s h e s , J i n g a n d C a t h f o r l i s t e n i n g t o m e c o m p l a i n a b o u t b l o t s t h a t d o n ' t w o r k , a n d T u l i n a n d C h r i s t i n e f o r s h a r i n g a m u s i n g t a l e s o f c h o r a l p r a c t i s e . T a o , l i f e i n t h e R a y m o n d l a b w o u l d ' v e b e e n v e r y d i f f e r e n t f o r m e if y o u h a d n ' t b e e n t h e r e ; a n d B o , t h a n k y o u f o r b e i n g m y g o o d f r i e n d a n d r o l e m o d e l . T h a n k s a l s o t o H e l e n , A n d y , P i n g , K u n , a n d R u j u n , f o r m a k i n g K i n s m e n a n e v e n m o r e i n t e r e s t i n g p l a c e ! L a s t b u t n o t l e a s t , I w o u l d l i k e t o e x t e n d t h a n k s t o m y s u p e r v i s o r y c o m m i t t e e m e m b e r s D r s . A l a a E l - D i n E l - H u s s e i n i , S t e v e n P e l e c h , a n d Y u - T i a n W a n g f o r a l w a y s p r o v i d i n g t h o u g h t f u l s u g g e s t i o n s a t m y c o m m i t t e e m e e t i n g s . T h a n k y o u S t e v e f o r s h a r i n g y o u r i m m e n s e k n o w l e d g e d u r i n g o u r c o l l a b o r a t i v e e f f o r t s , a n d Y u - T i a n f o r c r i t i c a l r e a d i n g o f t h i s t h e s i s o n s u c h s h o r t n o t i c e ! C o l l e c t i v e l y , y o u r g u i d a n c e h a s b e e n i n d i s p e n s a b l e a n d y o u r a d v i c e m o s t i n v a l u a b l e . A b i g " t h a n k y o u " t o y o u a l l ! xxiii D E D I C A T I O N I w o u l d l i k e t o d e d i c a t e t h i s w o r k t o m y m o m a n d d a d , m y s i s t e r s , a n d A l l a n C h a k M a n K w a n . D a d , I k n o w y o u w o u l d ' v e b e e n p r o u d o f t h e f i r s t P h . D . i n t h e f a m i l y . M o m , t h a n k y o u f o r p u t t i n g u p w i t h m y a l w a y s - c h a n g i n g e x p e r i m e n t s c h e d u l e . L i l i a n a n d T a n i a , t h a n k s f o r g e t t i n g o u t o f b e d f o r t h o s e i n s a n e l y e a r l y m o r n i n g c a r p o o l s ! A l l a n , t h a n k y o u s o m u c h f o r b e i n g m y " p i l l a r o f s u p p o r t " i n e v e r y s e n s e o f t h e t e r m f o r t h e p a s t t h r e e y e a r s , e s p e c i a l l y d u r i n g t h e l a s t s e v e r a l m o n t h s a s I i n e v i t a b l y b e c a m e a f i x t u r e i n t h e l a b o r i n f r o n t o f t h e c o m p u t e r s c r e e n i n o r d e r t o f i n i s h w r i t i n g w h a t y o u a r e n o w r e a d i n g . . . xxiv C H A P T E R 1. I N T R O D U C T I O N G i v e n a r e l a t i v e p a u c i t y o f k n o w l e d g e c o n c e r n i n g t h e m o l e c u l a r p a t h w a y s l e a d i n g t o c e l l d e a t h b y o v e r - e x c i t a t i o n o f g l u t a m a t e r e c e p t o r s i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e ( H D ) a n d i n m o d e l s m i m i c k i n g t h e d i s e a s e , m y g o a l w a s t o i n v e s t i g a t e t h e u n d e r l y i n g m e c h a n i s m s u s i n g a v a r i e t y o f b i o c h e m i c a l a n d m o l e c u l a r b i o l o g i c a l t e c h n i q u e s . I m m u n o s t a i n i n g a n d r e c e p t o r - t a g g i n g a s s a y s w e r e p e r f o r m e d t o a s s e s s r e c e p t o r s u r f a c e e x p r e s s i o n a n d t h e k i n e t i c s . o f r e c e p t o r t r a f f i c k i n g , w h i l e c o - l o c a l i z a t i o n o f r e c e p t o r s a n d o t h e r p r o t e i n s o f i n t e r e s t w e r e d e m o n s t r a t e d u s i n g i m m u n o p r e c i p i t a t i o n , s u b c e l l u l a r f r a c t i o n a t i o n , a n d g e l o v e r l a y a s s a y s . M o r e o v e r , a h i g h - t h r o u g h p u t s c r e e n i s d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s w h e r e c a n d i d a t e t a r g e t p r o t e i n s w i t h a l t e r e d e x p r e s s i o n a n d / o r d i s t r i b u t i o n w e r e i n i t i a l l y s u r v e y e d i n a c e l l l i n e m o d e l o f t h e d i s e a s e . T h e s p e c i f i c a i m s o f t h i s t h e s i s a r e d i s c u s s e d i n f u r t h e r d e t a i l i n s e c t i o n 1 . 6 o f t h i s I n t r o d u c t i o n u n d e r " H y p o t h e s i s a n d R a t i o n a l e " , a n d I b e g i n t h i s I n t r o d u c t i o n w i t h a d e s c r i p t i o n o f H D i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n s . 1.1. Huntington's Disease 1 . 1 . 1 . C l i n i c a l P r e s e n t a t i o n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e ( H D ) i s o n e o f e i g h t n e u r o d e g e n e r a t i v e d i s e a s e s i d e n t i f i e d a s r e s u l t i n g f r o m e x p a n s i o n o f t h e C A G r e p e a t i n t h e c o d i n g r e g i o n o f t h e i r r e s p e c t i v e g e n e s l e a d i n g t o p o l y g l u t a m i n e ( p o l y Q ) e x p a n s i o n i n t h e p r o t e i n p r o d u c t s ( r e v i e w e d i n Z o g h b i a n d O r r , 2 0 0 0 ) . A s w i t h a l l d i s e a s e s i n t h i s g r o u p , H D i s p r o g r e s s i v e , w i t h s y m p t o m o n s e t t y p i c a l l y i n m i d - l i f e b u t v a r y i n g i n v e r s e l y w i t h l e n g t h o f t h e p o l y Q r e p e a t 1 s u c h t h a t t h e l a r g e r t h e n u m b e r o f r e p e a t s , t h e e a r l i e r t h e o n s e t o f s y m p t o m s ( B r i n k m a n e t a l . , 1 9 9 7 ; G u s e l l a a n d M a c D o n a l d , 2 0 0 0 ) . T h e s e s y m p t o m s w o r s e n o v e r t i m e , a n d d e a t h o f t h e i n d i v i d u a l i n v a r i a b l y f o l l o w s , g e n e r a l l y s o m e 1 0 - 2 0 y e a r s a f t e r d i s e a s e p r e s e n t a t i o n . H D i s d o m i n a n t l y h e r i t a b l e , a n d p a t i e n t s p r e s e n t w i t h d e f i c i t s i n m o t o r f u n c t i o n a n d m e m o r y a s w e l l a s a n a f f e c t i v e d i s t u r b a n c e ( H a y d e n e t a l . , 1 9 8 1 ; H a r p e r , 1 9 9 1 ; P a u l s e n e t a l . , 2 0 0 1 ) . E v e n t h o u g h s u b t l e c h a n g e s i n p e r s o n a l i t y , m o o d , a n d c o g n i t i o n g e n e r a l l y p r e c e d e d e m e n t i a a n d m o t o r s y m p t o m s , d e v e l o p m e n t o f c h o r e i c , d a n c e - l i k e m o v e m e n t s i s b y f a r t h e m o s t c o m m o n a n d t e l l - t a l e s y m p t o m i n i n d i v i d u a l s c a r r y i n g t h e H D g e n e a t t h e t i m e o f c l i n i c a l p r e s e n t a t i o n . A t l a t e r s t a g e s o f t h e d i s e a s e , c h o r e a i s r e p l a c e d b y p a r k i n s o n i s m a n d a k i n e s i a . In t h e c a s e o f p a t i e n t s c a r r y i n g H D a l l e l e ( s ) w i t h e x t r e m e e x p a n s i o n s o f t h e C A G r e p e a t ( > 7 0 ) , t h e y d e v e l o p t h e j u v e n i l e v e r s i o n o f t h e d i s e a s e p r e s e n t i n g w i t h a m o r e a g g r e s s i v e p h e n o t y p e a n d a d i f f e r e n t s y m p t o m a t i c p r o f i l e i n c l u d i n g b r a d y k i n e s i a , r i g i d i t y , e p i l e p s y , a n d s e v e r e d e m e n t i a ( B i t t e n b e n d e r a n d Q u a d f a s e l , 1 9 6 2 ; V a n D i j k e t a l . , 1 9 8 6 ) . 1 . 1 . 2 . N e u r o p a t h o l o g y T h e n e u r o p s y c h i a t r i c m a n i f e s t a t i o n s o f H D r e s u l t f r o m t h e d y s f u n c t i o n a n d / o r d e m i s e o f s p e c i f i c n e u r o n a l p o p u l a t i o n s a n d r e g i o n s o f t h e b r a i n , w i t h t h e G A B A e r g i c p r o j e c t i o n m e d i u m - s i z e d s p i n y n e u r o n s ( M S N s ) o f t h e n e o s t r i a t u m b e i n g m o s t s e v e r e l y a f f e c t e d l e a d i n g t o s t r i a t a l a t r o p h y a n d / o r n e u r o n a l l o s s ( V o n s a t t e l e t a l . , 1 9 8 5 ; V o n s a t t e l a n d D i F i g l i a , 1 9 9 8 ) . M S N s r e c e i v e g l u t a m a t e r g i c i n p u t f r o m t h e c o r t e x a n d p a r t s o f t h e t h a l a m u s , a s w e l l a s d o p a m i n e r g i c t r a n s m i s s i o n f r o m t h e s u b s t a n t i a n i g r a p a r s c o m p a c t a ( S N c ) . O n e p o p u l a t i o n o f G A B A - c o n t a i n i n g M S N s , t h o s e t h a t a r e e n r i c h e d i n d o p a m i n e 2 D 2 r e c e p t o r a n d e n k e p h a l i n e x p r e s s i o n , p r o j e c t t o t h e i n t e r n a l g l o b u s p a l l i d u s ( G P i ) v i a a n i n d i r e c t p a t h w a y i n v o l v i n g t h e e x t e r n a l g l o b u s p a l l i d u s ( G P e ) a n d t h e s u b t h a l a m i c n u c l e u s ( S T N ) . T h e o t h e r p o p u l a t i o n o f M S N s , w h i c h e x p r e s s t h e d o p a m i n e D 1 r e c e p t o r , d y n o r p h i n , a n d s u b s t a n c e P , p r o j e c t d i r e c t l y t o t h e G P i . In H D , t h o s e M S N s o f t h e i n d i r e c t p a t h w a y a r e l o s t b e f o r e t h o s e p r o j e c t i n g i n t h e d i r e c t p a t h w a y ( R e i n e r e t a l . , 1 9 8 8 ; A l b i n e t a l . , 1 9 9 2 ; R i c h f i e l d e t a l . , 1 9 9 5 ; S a p p e t a l . , 1 9 9 5 ) , t h u s l e a d i n g t o a n e t r e d u c t i o n o f G P i i n h i b i t o r y o u t p u t t o t h e t h a l a m u s , c a u s i n g e n h a n c e d i n i t i a t i o n o f c o r t i c a l m o t o r p r o g r a m s t h a t m a n i f e s t a s c h o r e i c m o v e m e n t s . B e c a u s e b o t h p a t h w a y s a r e l a t e r i m p a i r e d , n e o s t r i a t a l o u t p u t t o t h e G P i i s l o s t ; a s a r e s u l t , i n h i b i t o r y d r i v e f r o m t h e G P i t o t h e t h a l a m u s i s i n c r e a s e d a n d t h e h y p e r k i n e t i c p h e n o t y p e g i v e s w a y t o r i g i d i t y a n d b r a d y k i n e s i a . A s d i s e a s e p r o g r e s s e s , o t h e r p a r t s o f t h e b r a i n i n c l u d i n g p a r t s o f t h e c o r t e x , g l o b u s p a l l i d u s , a n d t h e h i p p o c a m p u s , m a y b e c o m e a f f e c t e d a s w e l l . 1 . 1 . 3 . M o l e c u l a r P a t h o l o g y M u c h r e s e a r c h i n r e c e n t y e a r s h a s b e e n d i r e c t e d t o w a r d s e l u c i d a t i o n o f t h e p a t h o g e n i c m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g d e v e l o p m e n t a n d p r o g r e s s i o n o f H D . W i t h t h e i d e n t i f i c a t i o n o f t h e HD g e n e a n d i t s p r o t e i n p r o d u c t h u n t i n g t i n (htt) i n t h e e a r l y 1 9 9 0 ' s ( H u n t i n g t o n ' s D i s e a s e C o l l a b o r a t i v e R e s e a r c h G r o u p , 1 9 9 3 ) , t h e g e n e t i c m u t a t i o n l e a d i n g t o t h e d e v e l o p m e n t o f H D h a s b e e n d e t e r m i n e d a s t h e e x p a n s i o n o f a p o l y m o r p h i c C A G r e p e a t ( > 3 5 ) i n t h e HD g e n e . M u c h a t t e n t i o n h a s s i n c e f o c u s e d o n t h e c e l l u l a r f u n c t i o n s o f htt i n b o t h i t s n o r m a l a n d m u t a n t f o r m s . 3 1 . 1 . 3 . 1 . T o x i c E f f e c t s o f A g g r e g a t e d v e r s u s S o l u b l e m H t t H t t i s p r e d o m i n a n t l y a c y t o p l a s m i c p r o t e i n ( D i F i g l i a e t a l . , 1 9 9 5 ; S h a r p e t a l . , 1 9 9 5 ; T r o t t i e r e t a l . , 1 9 9 5 ) . It i s a k n o w n s u b s t r a t e f o r a v a r i e t y o f p r o t e a s e s , a n d p r o t e o l y t i c c l e a v a g e o f p o l y Q - e x p a n d e d f o r m s o f htt i s a s s o c i a t e d w i t h l o s s o f t h e C - t e r m i n a l n u c l e a r e x p o r t s i g n a l ( N E S ) ( X i a e t a l . , 2 0 0 3 ) . C o u p l e d w i t h a n i n h i b i t i o n o f i t s o w n n u c l e a r e x p o r t b y p o l y Q e x p a n s i o n w i t h i n t h e m u t a n t htt ( m h t t ) p r o t e i n ( C o r n e t t e t a l . , 2 0 0 5 ) , r e t e n t i o n o f t h e N - t e r m i n a l c l e a v a g e p r o d u c t s i n t h e n u c l e u s i s f a v o u r e d ( D a v i e s e t a l . , 1 9 9 7 ; D i F i g l i a e t a l . , 1 9 9 7 ; B e c h e r e t a l . , 1 9 9 8 ; W h e e l e r e t a l . , 2 0 0 0 ) . In t i s s u e f r o m H D b r a i n s , N - t e r m i n a l f r a g m e n t s o f m h t t w e r e f o u n d a g g r e g a t e d i n n e u r o n a l i n t r a n u c l e a r i n c l u s i o n s ( N i l s ) a n d d y s t r o p h i c n e u r i t e s o f t h e c o r t e x o r s t r i a t u m , w h i l e s u c h f r a g m e n t s w e r e a b s e n t f r o m n u c l e a r e x t r a c t s i n b r a i n t i s s u e f r o m n o r m a l i n d i v i d u a l s ( D i F i g l i a e t a l . , 1 9 9 7 ; S i e r a d z a n e t a l . , 1 9 9 9 ) . F o r m a t i o n o f N i l s w a s p r o p o r t i o n a l t o t h e l e n g t h o f t h e htt p o l y Q r e p e a t ( D i F i g l i a e t a l . , 1 9 9 7 ; B e c h e r e t a l . , 1 9 9 8 ) a n d g e n e r a l l y c o i n c i d e d w i t h t h e o n s e t o f s y m p t o m s i n m o u s e m o d e l s o f H D , s u g g e s t i n g c l e a v a g e p r o d u c t s o f m h t t t h a t u n d e r g o t r a n s l o c a t i o n t o t h e n u c l e u s m a y b e t h e s p e c i e s r e s p o n s i b l e f o r e x e r t i n g t h e t o x i c e f f e c t s o f m h t t e x p r e s s i o n ( D i F i g l i a e t a l . , 1 9 9 7 ; B e c h e r e t a l . , 1 9 9 8 ; S a p p e t a l . , 1 9 9 9 ) . I n d e e d , t a r g e t i n g o f N - t e r m i n a l l y t r u n c a t e d m h t t t o t h e n u c l e u s i n a n e u r o n a l c e l l l i n e w a s f o u n d t o i n c r e a s e t h e e x t e n t o f c e l l l o s s a s w e l l a s t h e n u m b e r o f c e l l s w i t h n u c l e a r a g g r e g a t e s , w h i l e c y t o p l a s m i c t a r g e t i n g o f t h e s e m h t t f r a g m e n t s h a d t h e o p p o s i t e e f f e c t ( S a u d o u e t a l . , 1 9 9 8 ; P e t e r s e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h e r e i s e v i d e n c e t h a t t h e c y t o p l a s m i c p o p u l a t i o n o f a g g r e g a t e d N - t e r m i n a l l y t r u n c a t e d m h t t a l s o c o n t r i b u t e s t o t o x i c i t y ( C o o p e r e t a l . , 1 9 9 8 ; H a c k a m e t a l . , 1 9 9 9 a , 1 9 9 9 b ) . A d d i t i o n a l l y , s o l u b l e a n d p r o t o f i b r i l f o r m s o f m h t t ( a s m o n o m e r s o r s m a l l o l i g o m e r s ) h a v e b e e n s h o w n t o p l a y a r o l e i n c a u s i n g c e l l u l a r t o x i c i t y . N e u r o n s t h a t l a t e r 4 d e g e n e r a t e d f i r s t e x h i b i t e d d i f f u s e n u c l e a r i m m u n o s t a i n i n g f o r h t t , a t a t i m e w h e n s y m p t o m s b e g a n t o d e v e l o p a n d w e l l b e f o r e f o r m a t i o n o f N i l s ( H o d g s o n e t a l . , 1 9 9 9 ; W h e e l e r e t a l . , 2 0 0 0 ; S l o w e t a l . , 2 0 0 3 ; V a n R a a m s d o n k e t a l . , 2 0 0 5 ) . T h e s e n o n - a g g r e g a t e d f o r m s o f m h t t a r e b e l i e v e d t o m e d i a t e t o x i c i t y i n p a r t b y s e q u e s t e r i n g e s s e n t i a l p r o t e i n s s u c h a s n u c l e a r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s a n d c o m p o n e n t s o f t h e u b i q u i t i n / p r o t e a s o m e s y s t e m ( U P S ) a w a y f r o m t h e i r n o r m a l f u n c t i o n s ( S c h a f f a r e t a l . , 2 0 0 4 ) . I n t r i g u i n g l y , a n u m b e r o f m o l e c u l a r c h a p e r o n e s h a v e b e e n s h o w n t o s u c c e s s f u l l y p r o t e c t a g a i n s t N - t e r m i n a l m h t t f r a g m e n t - i n d u c e d t o x i c i t y w i t h o u t r e d u c i n g m h t t a g g r e g a t i o n , s u g g e s t i n g t h e t w o p h e n o m e n a ( t o x i c i t y a n d a g g r e g a t i o n ) c a n b e d i s s o c i a t e d ( Z h o u e t a l . , 2 0 0 1 ) . In f a c t , t h e p r e s e n c e o f a g g r e g a t e s d o e s n o t a l w a y s p r e d i c t c e l l d e a t h , n o r d o e s c e l l d e a t h n e c e s s a r i l y o c c u r i n t h o s e n e u r o n s t h a t c o n t a i n v i s i b l e a g g r e g a t e s ( K u e m m e r l e e t a l . , 1 9 9 9 ; r e v i e w e d i n S i s o d i a , 1 9 9 8 ) . A s f u r t h e r e v i d e n c e a g a i n s t t h e t w o p h e n o m e n a b e i n g n e c e s s a r i l y r e l a t e d b y c a u s e a n d e f f e c t , N i l s w e r e f o u n d g e n e r a l l y n o t t o b e a b u n d a n t i n t h e m o s t v u l n e r a b l e p o p u l a t i o n o f n e u r o n s ( p r o j e c t i o n M S N s ) w i t h i n t h e s t r i a t u m ( K u e m m e r l e e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h e r e l a t i v e p a u c i t y o f n u c l e a r o r n e u r o p i l a g g r e g a t e s i n t h e s t r i a t u m , r e l a t i v e t o o t h e r p a r t s o f t h e b r a i n , a l s o a r g u e s a g a i n s t a d i r e c t r o l e f o r a g g r e g a t e f o r m a t i o n i n p a t h o g e n e s i s ( D i F i g l i a e t a l . , 1 9 9 7 ; G u t e k u n s t e t a l . , 1 9 9 9 ; S i e r a d z a n e t a l . , 1 9 9 9 ) . E v i d e n c e i n d i c a t i n g a p r o t e c t i v e r o l e f o r a g g r e g a t e f o r m a t i o n c a m e f r o m s t u d i e s s h o w i n g e x a c e r b a t i o n o f n e u r o n a l d e a t h b y m a n i p u l a t i o n s o r g e n e t i c m u t a t i o n s t h a t i n h i b i t e d a g g r e g a t e f o r m a t i o n , t h r o u g h e i t h e r a d e c r e a s e i n u b i q u i t i n a t i o n o r a n i n c r e a s e i n S U M O y l a t i o n o f m h t t ( S a u d o u e t a l . , 1 9 9 8 ; S t e f f a n e t a l . , 2 0 0 4 ) . A l s o , n e u r o n s c o n t a i n i n g N i l s w e r e f o u n d t o h a v e l o w e r l e v e l s o f c e l l d e a t h i n c o m p a r i s o n t o t h o s e n e u r o n s t h a t l a c k e d N i l s ( A r r a s a t e e t a l . , 2 0 0 4 ) . In m o u s e m o d e l s o f H D w h e r e t r u n c a t e d 5 N - t e r m i n a l f r a g m e n t s o f m h t t w e r e e x p r e s s e d , N i l s w e r e a l w a y s f o r m e d w h i l e d e v e l o p m e n t o f H D - l i k e s y m p t o m s a n d n e u r o p a t h o l o g y w a s v a r i a b l e d e p e n d i n g o n t h e e x a c t f r a g m e n t t h a t w a s e x p r e s s e d ( S l o w e t a l . , 2 0 0 5 ) , s u g g e s t i n g t h a t n o t a l l N i l s o r N - t e r m i n a l f r a g m e n t s o f m h t t a r e n e c e s s a r i l y e q u a l l y t o x i c . H e n c e it r e m a i n s a n i s s u e o f d e b a t e a s t o w h e t h e r f o r m a t i o n o f a g g r e g a t e s i n t h e h u m a n b r a i n c o n t r i b u t e s t o p a t h o l o g y , p l a y s a p r o t e c t i v e r o l e a g a i n s t m h t t - m e d i a t e d t o x i c i t y , o r i s m e r e l y c o i n c i d e n t a l w i t h n e u r o d e g e n e r a t i o n . 1 . 1 . 3 . 2 . O t h e r T o x i c A c t i o n s o f m H t t A m o n g t h e t o x i c e f f e c t s o f m h t t e x p r e s s i o n a r e r o l e s f o r t h e p r o t e i n i n e x a c e r b a t i n g , o x i d a t i v e s t r e s s , m e t a b o l i c f a i l u r e a n d m i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o n , w h i c h w i l l b e d i s c u s s e d i n a l a t e r s e c t i o n . F r a g m e n t s o f p o l y Q - e x p a n d e d htt a l s o i n t e r a c t w i t h l i p i d m e m b r a n e s t h e r e b y d i s r u p t i n g p h o s p h o l i p i d b i l a y e r s t r u c t u r e ( S u o p a n k i e t a l . , 2 0 0 6 ) . M o r e o v e r , m h t t p e r t u r b s u b i q u i t i n / p r o t e a s o m a l f u n c t i o n a n d l e a d s t o a b e r r a n t a x o n a l t r a n s p o r t a n d e n d o c y t o s i s , a s w e l l a s p a r t i c i p a t e s i n a b n o r m a l i n t e r a c t i o n s w i t h o t h e r p r o t e i n s , s o m e o f w h i c h l e a d t o d y s r e g u l a t i o n o f t h e t r a n s c r i p t i o n a l m a c h i n e r y a n d h e n c e a l t e r e d g e n e e x p r e s s i o n ( r e v i e w e d i n C h a , 2 0 0 0 ; T o b i n a n d S i g n e r , 2 0 0 0 ; D a v i e s a n d R a m s d e n , 2 0 0 1 ; M e n a l l e d a n d C h e s s e l e t , 2 0 0 2 ; R o s s , 2 0 0 2 ; R u b i n s z t e i n , 2 0 0 2 ; H a r j e s a n d W a n k e r , 2 0 0 3 ; S u g a r s a n d R u b i n s z t e i n , 2 0 0 3 ; L i a n d L i , 2 0 0 4 ) . T h e r e i s e v i d e n c e t o i n d i c a t e i n c r e a s e d a s s o c i a t i o n o f m h t t - c o n t a i n i n g a g g r e g a t e s w i t h c o m p o n e n t s o f t h e U P S . H o w e v e r , l o n g e r p o l y Q t r a c t s a p p e a r t o b e a s s o c i a t e d w i t h a s l o w e r r a t e o f p r o t e o l y s i s o f t h e m u t a n t p r o t e i n ( D y e r a n d M c M u r r a y , 2 0 0 1 ; J a n a e t a l . , 2 0 0 1 ) , s u g g e s t i n g a n i m p a i r m e n t o f t h e U P S f u n c t i o n l i k e l y v i a s e q u e s t r a t i o n i n t o a g g r e g a t e s . B e c a u s e t h e f u n c t i o n o f a n u m b e r o f t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s d e p e n d s o n 6 p r o t e o s o m a l p r o c e s s i n g ( r e v i e w e d i n C i e c h a n o v e r , 1 9 9 4 ; P a h l a n d B a e u e r l e , 1 9 9 6 ) , m h t t m a y i m p a i r t h e f u n c t i o n o f t h e s e f a c t o r s i n p a r t b y s e q u e s t r a t i o n o f U P S c o m p o n e n t s . O t h e r t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s c o n t a i n r e g u l a t o r y g l u t a m i n e - r i c h r e g i o n s ( C o u r e y e t a l . , 1 9 8 9 ; G e r b e r e t a l . , 1 9 9 4 ) , a n d b e c a u s e p o l y Q t r a c t s c a n i n t e r a c t n o t o n l y w i t h D N A b u t a l s o w i t h o n e a n o t h e r v i a t r a n s g l u t a m i n a t i o n ( G r e e n , 1 9 9 3 ) a n d / o r p o l a r - z i p p e r f o r m a t i o n ( P e r u t z e t a l . , 1 9 9 4 ; P e r u t z , 1 9 9 6 ) , t h e s e g l u t a m i n e - r i c h r e g i o n s c a n a b e r r a n t l y i n t e r a c t w i t h t h e m h t t p o l y Q s t r e t c h t h e r e b y t r a p p i n g t h e s e t r a n s c r i p t i o n a l f a c t o r s w i t h i n h t t - c o n t a i n i n g a g g r e g a t e s a n d p r e v e n t i n g t h e m f r o m c a r r y i n g o u t t h e i r n o r m a l f u n c t i o n ( H u a n g e t a l . , 1 9 9 8 ) . A l t e r n a t i v e l y , b y b i n d i n g D N A o r t r a n s c r i p t i o n a l f a c t o r s s u c h a s p 5 3 a n d c A M P r e s p o n s e e l e m e n t ( C R E ) - b i n d i n g p r o t e i n ( C R E B ) - b i n d i n g p r o t e i n ( C B P ) , t h e e x p a n d e d p o l y Q t r a c t o f m h t t m a y d i r e c t l y r e p r e s s t r a n s c r i p t i o n b y f o r m i n g i n a c t i v e t r a n s c r i p t i o n a l c o m p l e x e s ( B o u t e l l e t a l . , 1 9 9 9 ; M c C a m p b e l l e t a l . , 2 0 0 0 ; S t e f f a n e t a l . , 2 0 0 0 ; r e v i e w e d i n C h a , 2 0 0 0 ) . A l t e r e d t r a n s c r i p t i o n r e s u l t i n g f r o m e x p r e s s i o n o f N - t e r m i n a l f r a g m e n t s o f m h t t h a s b e e n r e p o r t e d i n b o t h c e l l l i n e a n d m o u s e m o d e l s , i n c l u d i n g d o w n - r e g u l a t i o n o f m R N A s f o r v a r i o u s n e u r o t r a n s m i t t e r r e c e p t o r s ( C h a e t a l . , 1 9 9 8 , 1 9 9 9 ; L i e t a l . , 1 9 9 9 ) . D N A m i c r o a r r a y s t u d i e s i n s t r i a t a l t i s s u e f r o m R 6 / 2 m i c e r e v e a l e d a d d i t i o n a l c l a s s e s o f g e n e s t h a t w e r e d o w n - r e g u l a t e d , s u c h a s t h o s e i n v o l v e d i n r e g u l a t i o n o f C a 2 + h o m e o s t a s i s a n d i n t r a c e l l u l a r s i g n a l i n g ( L u t h i - C a r t e r e t a l , 2 0 0 0 ) . I n t e r e s t i n g l y , i n d u c t i o n a n d m a i n t e n a n c e o f t h e p r o g r e s s i v e H D p h e n o t y p e i s e n t i r e l y d e p e n d e n t o n c o n t i n u e d e x p r e s s i o n o f t h e m u t a n t p r o t e i n p r o d u c t , a s s t u d i e s f r o m a c o n d i t i o n a l t r a n s g e n i c m o u s e m o d e l i n d i c a t e d t h a t s h u t t i n g o f f t r a n s g e n e e x p r e s s i o n a t a t i m e w e l l a f t e r s y m p t o m o n s e t w a s a b l e t o r e v e r s e t h e s y m p t o m s a n d n e u r o p a t h o l o g i c a l c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h H D ( Y a m a m o t o e t a l . , 2 0 0 0 ) . 7 1 . 1 . 4 . N o r m a l F u n c t i o n s a n d I n t e r a c t i o n s o f H t t 1 . 1 . 4 . 1 . R o l e o f H t t i n V e s i c u l a r / M i t o c h o n d r i a l T r a n s p o r t a n d E n e r g y P r o d u c t i o n W h i l e n u m e r o u s n e u r o t o x i c p r o c e s s e s h a v e b e e n r e l a t e d t o htt p o l y Q e x p a n s i o n , t h e p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s o f t h e p r o t e i n i n i t s n o r m a l f o r m a r e f a r f r o m c l e a r l y d e f i n e d . H t t e x p r e s s i o n i s w i d e s p r e a d t h r o u g h o u t t h e b r a i n , w i t h n o p a r t i c u l a r e n r i c h m e n t i n t h e s t r i a t u m ( D i F i g l i a e t a l . , 1 9 9 5 ; T r o t t i e r e t a l . , 1 9 9 5 ) . T h e 3 5 0 k D a p r o t e i n i s p r i m a r i l y c y t o p l a s m i c b u t m a y a l s o b e f o u n d a s s o c i a t e d w i t h c l a t h r i n - c o a t e d v e s i c l e s , m i c r o t u b u l e s , a n d t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( E R ) / G o l g i m e m b r a n e s , i n d i c a t i v e o f p o s s i b l e r o l e s i n t r a f f i c k i n g a n d f a s t a x o n a l t r a n s p o r t o f m e m b r a n o u s o r g a n e l l e s a n d / o r p r o t e i n s t o r e g u l a t e s u c h n e u r o n a l p r o c e s s e s a s n e u r o t r a n s m i t t e r r e l e a s e ( S h a r p e t a l . , 1 9 9 5 ; S t r e h l o w e t a l . , 2 0 0 6 ; r e v i e w e d i n T r u a n t e t a l . , 2 0 0 6 ) . D e m o n s t r a t i o n o f a p h y s i c a l i n t e r a c t i o n b e t w e e n htt a n d t h e o u t e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e ( G u t e k u n s t e t a l . , 1 9 9 8 ; C h o o e t a l . , 2 0 0 4 ) p r o v i d e s s u p p o r t f o r a n o r m a l r o l e o f t h i s p r o t e i n i n m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n s a n d m a y r e p r e s e n t o n e r o u t e t h r o u g h w h i c h p o l y Q - e x p a n d e d h t t c o u l d a c t t o i m p a i r m e t a b o l i c e n e r g y p r o d u c t i o n a n d / o r C a 2 + - b u f f e r i n g a b i l i t y i n v a r i o u s m o d e l s o f H D . T h e n e u r o n a l c a p a c i t y f o r g e n e r a t i n g e n e r g y i n t h e f o r m o f A T P a p p e a r e d t o b e i n v e r s e l y c o r r e l a t e d w i t h p o l y Q r e p e a t l e n g t h , f o r r e p e a t l e n g t h s i n b o t h t h e n o r m a l ( < 3 5 ) a n d p a t h o l o g i c a l ( > 3 5 ) r a n g e s ( S e o n g e t a l . , 2 0 0 5 ) , c o n s i s t e n t w i t h a r o l e f o r htt i n r e g u l a t i n g A T P g e n e r a t i o n i n n o r m a l p h y s i o l o g y a n d i n H D . F u r t h e r e v i d e n c e i m p l i c a t i n g htt i n t h e r e g u l a t i o n o f e n e r g y p r o d u c t i o n c a m e f r o m e x a m i n a t i o n o f p r o t e i n s t h a t i n t e r a c t w i t h h t t , o n e o f w h i c h w a s f o u n d t o b e t h e m e t a b o l i c e n z y m e g l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ( G A P D H ) ( B u r k e e t a l . , 1 9 9 6 ) . A d d i t i o n a l l y , h t t h a s b e e n s h o w n t o b e e s s e n t i a l f o r f a s t a x o n a l t r a f f i c k i n g , b a s e d 8 o n s t u d i e s i n b o t h i n v e r t e b r a t e s ( G u n a w a r d e n a e t a l . , 2 0 0 3 ; S z e b e n y i e t a l . , 2 0 0 3 ) a n d m a m m a l s ( T r u s h i n a e t a l . , 2 0 0 4 ) . R e d u c e d e x p r e s s i o n o r p o I y Q - e x p a n s i o n o f htt l e d t o a x o n a l t r a n s p o r t d e f e c t s ( G u n a w a r d e n a e t a l . , 2 0 0 3 ; S z e b e n y i e t a l . , 2 0 0 3 ) , a n d m h t t - i n d u c e d i m p a i r m e n t s i n v e s i c u l a r a n d m i t o c h o n d r i a l t r a f f i c k i n g w e r e d e m o n s t r a t e d i n m a m m a l i a n n e u r o n s b o t h in vitro a n d in vivo ( T r u s h i n a e t a l . , 2 0 0 4 ) . I m p o r t a n t l y , a g g r e g a t e f o r m a t i o n b y m h t t b l o c k e d t h e t r a f f i c k i n g o f m i t o c h o n d r i a a l o n g n e u r o n a l p r o c e s s e s , c a u s i n g t h e s e o r g a n e l l e s t o b e c o m e i m m o b i l i z e d a n d t o a c c u m u l a t e a t s i t e s c o n t a i n i n g a g g r e g a t e s ( C h a n g e t a l . , 2 0 0 6 ) . M i t o c h o n d r i a l m o t i l i t y i s a l s o d i r e c t l y i m p a i r e d b y g l u t a m a t e ( R i n t o u l e t a l . , 2 0 0 3 ) , a n d p r e s u m a b l y m i t o c h o n d r i a w h i c h a r e u n a b l e t o t r a f f i c k n o r m a l l y t h e n b e c o m e t r a p p e d a n d d a m a g e d w i t h t i m e , a d d i n g t o t h e o t h e r t o x i c e f f e c t s o f g l u t a m a t e r e c e p t o r o v e r - a c t i v a t i o n . A l l o f t h e s e f i n d i n g s p o i n t t o a l i k e l y i n v o l v e m e n t o f a b e r r a n t m i t o c h o n d r i a l m o v e m e n t i n H D p a t h o p h y s i o l o g y , w h e r e t h e HD m u t a t i o n w o u l d c o u p l e w i t h e x c i t o t o x i c p a t h w a y s t o i n h i b i t n o r m a l m i t o c h o n d r i a l t r a f f i c k i n g a n d f u n c t i o n . 1 . 1 . 4 . 2 . B i n d i n g P a r t n e r s o f H t t P r o v i d e C l u e s t o Its F u n c t i o n s I d e n t i f i c a t i o n o f o t h e r i n t e r a c t o r s o f htt p r o v i d e s a d d i t i o n a l c l u e s a s t o i t s n o r m a l f u n c t i o n s u n d e r p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s , a n d t h e d i v e r s e f u n c t i o n s t h e s e p r o t e i n s a s s u m e i m p l i c a t e h t t i n a n u m b e r o f c e l l u l a r p r o c e s s e s r a n g i n g f r o m e n d o c y t o s i s t o v e s i c u l a r t r a n s p o r t t o n o n - r e c e p t o r s i g n a l i n g t o m R N A b i o g e n e s i s ( G o e h l e r e t a l . , 2 0 0 4 ; r e v i e w e d i n H a r j e s a n d W a n k e r , 2 0 0 3 ; L i a n d L i , 2 0 0 4 ; G i o r g i n i a n d M u c h o w s k i , 2 0 0 5 ) . O n e o f t h e s e b i n d i n g p a r t n e r s , h u n t i n g t i n - i n t e r a c t i n g p r o t e i n 1 ( H I P - 1 ) , i s t h e h u m a n h o m o l o g u e o f t h e y e a s t p r o t e i n S l a 2 p w h i c h i s i n v o l v e d i n r e g u l a t i o n o f t h e c y t o s k e l e t o n ( C S K ) ( K a l c h m a n e t a l . , 1 9 9 7 ; W a n k e r e t a l . , 1 9 9 7 ) . A s w i l l b e d i s c u s s e d i n a l a t e r s e c t i o n 9 ( s e e s e c t i o n 4 . 1 ) , H I P - 1 a p p e a r s t o b e i n v o l v e d i n c l a t h r i n - m e d i a t e d e n d o c y t o s i s ( M e t z l e r e t a l . , 2 0 0 1 ) a n d h a s p r o - a p o p t o t i c f u n c t i o n s ( H a c k a m e t a l . , 2 0 0 0 ; G e r v a i s e t a l . , 2 0 0 2 ) . I n t e r e s t i n g l y , H I P - 1 - m e d i a t e d t o x i c i t y w a s a b o l i s h e d b y c o n c u r r e n t e x p r e s s i o n o f w i l d - t y p e ( W T ) h t t ( H a c k a m e t a l . , 2 0 0 0 ) , a n d s t r i a t a l c e l l s e x p r e s s i n g W T htt w e r e p r o t e c t e d f r o m a p o p t o t i c s t i m u l i a n d N - m e t h y l - D - a s p a r t a t e ( N M D A ) r e c e p t o r ( N M D A R ) - m e d i a t e d e x c i t o t o x i c i t y ( R i g a m o n t i e t a l . , 2 0 0 0 ; H o e t a l . , 2 0 0 1 ; L e a v i t t e t a l . , 2 0 0 6 ) , s u g g e s t i n g a n a n t i - a p o p t o t i c r o l e f o r t h e p r o t e i n . H t t a l s o b i n d s p o s t - s y n a p t i c d e n s i t y ( P S D ) p r o t e i n 9 5 k D a ( P S D - 9 5 ) , a n d t h e i m p l i c a t i o n o f t h i s i n t e r a c t i o n i n t h e m o d u l a t i o n o f N M D A R f u n c t i o n w i l l b e a d d r e s s e d i n a s u b s e q u e n t s e c t i o n ( s e e s e c t i o n 1 . 5 . 2 ) , i n t h e c o n t e x t o f d i s c u s s i n g t h e c o n t r i b u t i o n o f P S D - 9 5 f u n c t i o n t o e x c i t o t o x i c c e l l d e a t h i n H D . 1 . 1 . 4 . 3 . D o m a i n S t r u c t u r e o f H t t P r o v i d e s C l u e s t o Its F u n c t i o n s A s i s t r u e f o r m a n y l a r g e p r o t e i n s , htt c o n s i s t s o f a n u m b e r o f r e p e a t e d s t r u c t u r e s a n d m o d u l a r d o m a i n s , t h e a n a l y s i s o f w h i c h p r o v i d e s a d d i t i o n a l i n s i g h t i n t o t h e f u n c t i o n s o f t h e p r o t e i n . T h e N - t e r m i n u s o f t h e htt p r o t e i n i s f o l l o w e d c l o s e l y b y t h e p o l y Q t r a c t a n d t h e n a p o l y p r o l i n e ( p o l y P ) r e g i o n . P r o l i n e - r i c h d o m a i n s m e d i a t e b i n d i n g t o o t h e r p r o t e i n s c o n t a i n i n g t h e S r c h o m o l o g y r e g i o n 3 ( S H 3 ) o r t r y p t o p h a n ( W W ) d o m a i n , a n d htt b i n d s v i a i t s p o l y P r e g i o n t o t h e S H 3 - d o m a i n - c o n t a i n i n g G r b - 2 - l i k e p r o t e i n - 3 ( S H 3 G L 3 ) ( S i t t l e r e t a l . , 1 9 9 8 ) , t h e r e b y l i n k i n g h t t w i t h G r b 2 / S o s a n d t h e d o w n s t r e a m R a s - R a f - M E K - M A P K s i g n a l i n g c a s c a d e . A s w e l l , h t t a p p e a r s t o b e a k e y p l a y e r i n t h e p h o s p h o i n o s i t i d e 3 - k i n a s e ( P I 3 K ) - p r o t e i n k i n a s e B ( P K B / A k t ) s i g n a l i n g p a t h w a y , a s a d i r e c t s u b s t r a t e o f t h e s e r i n e / t h r e o n i n e k i n a s e A k t ( H u m b e r t e t a l . , 2 0 0 2 ) . E n d o g e n o u s l e v e l s o f A k t - m e d i a t e d p h o s p h o r y l a t i o n o n htt S 4 2 1 a p p e a r e d s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d i n t h e p r e s e n c e o f a n 10 e x p a n d e d p o l y Q t r a c t ( W a r b y e t a l . , 2 0 0 5 ) , a n d p h o s p h o r y l a t i o n ( o r i n h i b i t i o n o f d e p h o s p h o r y l a t i o n ) o f htt a t S 4 2 1 w a s f o u n d t o p r o t e c t t h e c e l l a g a i n s t m h t t - m e d i a t e d t o x i c i t y ( H u m b e r t e t a l . , 2 0 0 2 ; R a n g o n e e t a l . , 2 0 0 4 ; P a r d o e t a l . , 2 0 0 6 ) . P a l m i t o y l a t i o n o f htt o n C 2 1 4 w a s l i k e w i s e s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d b y htt p o l y Q e x p a n s i o n , a n d t h e p r o p e n s i t y o f m h t t t o f o r m N i l s a p p e a r e d t o b e i n v e r s e l y c o r r e l a t e d w i t h t h e e x t e n t o f htt p a l m i t o y l a t i o n ( Y a n a i e t a l . , 2 0 0 6 ) . T o g e t h e r , t h e s e f i n d i n g s a r e s u g g e s t i v e o f a r o l e f o r p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s i n t h e r e g u l a t i o n o f W T h t t u n d e r n o r m a l c i r c u m s t a n c e s , a n d o f m h t t i n H D . . ' W i t h i n t h e m o d u l a r s t r u c t u r e o f htt , t h e r e a r e a l s o t e n ~ 4 0 a m i n o a c i d - l o n g H t t / E l o n g a t i o n f a c t o r 3 / P P 2 A R e g u l a t o r y A s u b u n i t V T O R I ( H E A T ) r e p e a t s ( A n d r a d e a n d B o r k , 1 9 9 5 ) , d o m a i n s w h i c h a r e c o m m o n l y f o u n d i n t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s a s w e l l a s p r o t e i n s i n v o l v e d i n c h r o m o s o m a l r e g u l a t i o n , c y t o p l a s m i c a n d n u c l e a r t r a n s p o r t p a t h w a y s ( C i n g o l a n i e t a l . , 1 9 9 9 ; N e u w a l d a n d H i r a n o , 2 0 0 0 ; r e v i e w e d i n A n d r a d e e t a l . , 2 0 0 1 ; T r u a n t e t a l . , 2 0 0 7 ) . T h e p r e s e n c e o f t h e s e m o t i f s i m p l i c a t e s htt i n t h e r e g u l a t i o n o f p r o t e i n a n d / o r n u c l e i c a c i d t r a n s p o r t t o o r f r o m t h e n u c l e u s . I n t e r e s t i n g l y , htt w a s s h o w n t o b i n d a c i d i c p h o s p h o l i p i d s v i a t h e s e H E A T d o m a i n s , p r o v i d i n g f u r t h e r e v i d e n c e i n s u p p o r t o f a p h y s i o l o g i c a l r o l e f o r htt i n t h e r e g u l a t i o n o f v e s i c u l a r t r a f f i c k i n g a n d / o r s t r u c t u r e o f m e m b r a n o u s o r g a n e l l e s ( K e g e l e t a l . , 2 0 0 5 ) . 1 . 1 . 5 . G a i n s a n d L o s s e s o f H t t F u n c t i o n i n H D T h u s f a r t h e d a t a f r o m h u m a n p a t i e n t s a n d f i n d i n g s b a s e d o n s t u d i e s i n a n i m a l m o d e l s o f H D w o u l d s u g g e s t t h a t p o l y Q e x p a n s i o n c o n f e r s a d e l e t e r i o u s g a i n i n p r o t e i n f u n c t i o n , w h e r e m u t a t i o n o f t h e g e n e c a u s e s t h e r e s u l t i n g p r o t e i n t o a s s u m e a n a l t e r e d c o n f o r m a t i o n a n d / o r n o v e l f u n c t i o n s . P o l y Q i s i n i t s e l f t o x i c , a s e c t o p i c e x p r e s s i o n o f a 11 l o n g p o l y Q t r a c t i n t h e c o n t e x t o f a n o t h e r w i s e i n n o c u o u s p r o t e i n l e a d s t o a p r o g r e s s i v e n e u r o l o g i c a l p h e n o t y p e a c c o m p a n i e d b y n e u r o p a t h o l o g i c a l c h a n g e s a n d n e u r o n a l d e a t h ( O r d w a y e t a l . , 1 9 9 7 ) . H D p a t i e n t s h o m o z y g o u s f o r t h e m u t a n t a l l e l e e x h i b i t s i m i l a r d i s e a s e p h e n o t y p e a n d s e v e r i t y a s t h o s e w h o a r e h e t e r o z y g o u s f o r t h e a l l e l e ( W e x l e r e t a l . , 1 9 8 7 ) , a n d m o u s e e m b r y o s l a c k i n g b o t h c o p i e s o f t h e g e n e d o n o t d e v e l o p H D ( D u y a o e t a l . , 1 9 9 5 ; N a s i r e t a l . , 1 9 9 5 ; Z e i t l i n e t a l . , 1 9 9 5 ) . I n s t e a d , t h e s e m i c e d i e i n g e s t a t i o n , i n c o m p l e t e c o n t r a s t w i t h H D m i c e w h i c h d e v e l o p n o r m a l l y s u g g e s t i n g t h a t t h e d e v e l o p m e n t a l r o l e p l a y e d b y n o r m a l htt i s m a i n t a i n e d i n m u t a n t f o r m s o f t h e p r o t e i n c o n t a i n i n g e x p a n d e d p o l y Q t r a c t s . S o - c a l l e d " g a i n s " i n b o t h s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n d u e t o p o l y Q e x p a n s i o n l e a d n o t o n l y t o a n a c q u i r e d r e s i s t a n c e a g a i n s t d e g r a d a t i o n o f t h e m u t a n t p r o t e i n b y n o r m a l p r o t e o l y t i c p r o c e s s i n g ( r e v i e w e d i n C u m m i n g s a n d Z o g h b i , 2 0 0 0 ; S i e r a d z a n a n d M a n n , 2 0 0 1 ) , b u t a l s o n o v e l o r p e r t u r b e d i n t e r a c t i o n s w i t h o t h e r i n t r a c e l l u l a r m o l e c u l e s o r o r g a n e l l e s . In r e c e n t y e a r s , h o w e v e r , i n c r e a s i n g e v i d e n c e i n d i c a t e s t h a t l o s s e s i n c e r t a i n a s p e c t s o f n o r m a l htt f u n c t i o n m a y b e i m p l i c a t e d i n H D a s w e l l ( r e v i e w e d i n C a t t a n e o e t a l . , 2 0 0 1 ; C a t t a n e o , 2 0 0 3 ) . S t r i a t a l M S N s r e l y o n b r a i n - d e r i v e d n e u r o t r o p h i c f a c t o r ( B D N F ) f r o m c o r t i c a l a f f e r e n t s i n o r d e r t o s u r v i v e , s i n c e t h e y t h e m s e l v e s d o n o t e x p r e s s t h i s g r o w t h f a c t o r . W T htt h a s b e e n s h o w n t o p r o m o t e B D N F e x p r e s s i o n v i a s e q u e s t r a t i o n o f a t r a n s c r i p t i o n a l r e p r e s s o r ( Z u c c a t o e t a l . , 2 0 0 1 ) , w h i l e B D N F e x p r e s s i o n l e v e l s w e r e f o u n d t o b e r e d u c e d i n t h e s t r i a t u m o f H D p a t i e n t s ( F e r r e r e t a l . , 2 0 0 0 ) , s u g g e s t i n g l o s s o f h t t - m e d i a t e d t r a n s c r i p t i o n o f B D N F l i k e l y c o n t r i b u t e s t o s t r i a t a l n e u r o n a l d y s f u n c t i o n i n H D . T h e r e g u l a t i o n o f t r o p h i c s u p p o r t f o r s t r i a t a l n e u r o n s b y m h t t i s n o t o n l y l i m i t e d t o r e g u l a t i o n a t t h e t r a n s c r i p t i o n a l l e v e l , b u t a l s o e n c o m p a s s e s d e l i v e r y o f t h i s t r o p h i c f a c t o r t o t h e s t r i a t u m ; s e v e r a l r e c e n t s t u d i e s r e v e a l e d i m p a i r m e n t s i n p o s t - G o l g i t r a f f i c k i n g o f B D N F i n 12 s t r i a t a l k n o c k - i n ( K I ) c e l l s e x p r e s s i n g f u l l - l e n g t h m h t t ( D e l T o r o e t a l . , 2 0 0 6 ) , a s w e l l a s d e f i c i e n c i e s i n B D N F t r a n s p o r t a l o n g c o r t i c a l a x o n s d u e t o d e c r e a s e d b i n d i n g o f t h e h t t - a s s o c i a t e d p r o t e i n H A P - 1 w i t h m i c r o t u b u l e m o l e c u l a r m o t o r s r e s u l t i n g f r o m e n h a n c e d m h t t / H A P - 1 i n t e r a c t i o n s ( G a u t h i e r e t a l . , 2 0 0 4 ) . R e l a t e d t o t h e s e f i n d i n g s , e x p r e s s i o n o f t h e e n d o g e n o u s B D N F r e c e p t o r , T r k B , w a s a l s o s h o w n t o b e d o w n - r e g u l a t e d b y m h t t b o t h i n m o u s e m o d e l s o f H D a n d i n p o s t - m o r t e m b r a i n t i s s u e f r o m h u m a n p a t i e n t s , i n d e p e n d e n t o f c h a n g e s i n B D N F l e v e l s ( G i n e s e t a l . , 2 0 0 6 ) . T o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s i n d i c a t e a r o l e f o r htt i n t h e r e g u l a t i o n a t m a n y s t e p s o f a p a t h w a y t h a t n o r m a l l y s u p p l i e s s t r i a t a l n e u r o n s w i t h a s o u r c e o f t r o p h i c g r o w t h f a c t o r s , s u g g e s t i n g H D p a t h o l o g y m a y r e s u l t i n p a r t f r o m l o s s o f s p e c i f i c W T htt f u n c t i o n s , i n t h i s c a s e r e l a t e d t o t h e p r o v i s i o n o f t r o p h i c s u p p o r t , d u e t o p o l y Q e x p a n s i o n . A d d i n g t o t h e p r o - s u r v i v a l r o l e o f htt i n m e d i a t i n g B D N F t r a n s c r i p t i o n a n d / o r t r a n s p o r t i s i t s a n t i - a p o p t o t i c r o l e a s d i s c u s s e d i n p r e v i o u s s e c t i o n s ( s e e s e c t i o n s 1 . 1 . 4 . 2 a n d 1 . 1 . 4 . 3 ) , w h e r e W T htt p l a y s a p r o t e c t i v e r o l e a g a i n s t t o x i c s t i m u l i ( R i g a m o n t i e t a l . , 2 0 0 0 ; C a t t a n e o e t a l . , 2 0 0 1 ; H o e t a l . , 2 0 0 1 ; L e a v i t t e t a l . , 2 0 0 6 ) , s e q u e s t e r s t o x i c m o l e c u l e s s u c h a s H I P - 1 ( H a c k a m e t a l . , 2 0 0 0 ) , a n d p a r t i c i p a t e s i n t h e P I 3 K / A k t s u r v i v a l s i g n a l i n g p a t h w a y ( H u m b e r t e t a l . , 2 0 0 2 ) . G i v e n t h e s e i m p o r t a n t f u n c t i o n s a s c r i b e d t o n o r m a l W T h t t , r e p l a c e m e n t o f o n e W T HD a l l e l e w i t h t h e m u t a n t f o r m m a y i n c r e a s e c e l l v u l n e r a b i l i t y i n t w o w a y s - f i r s t l y b y g e n e r a t i n g a m o l e c u l e w i t h t o x i c p r o p e r t i e s a n d s e c o n d l y b y a r e d u c t i o n o f c e l l u l a r p r o t e c t i o n o t h e r w i s e a f f o r d e d b y t h e p r o d u c t f r o m t h e W T a l l e l e . N o t o n l y i s e x p r e s s i o n o f W T htt r e d u c e d i n t h i s c a s e , b u t b e c a u s e m h t t - c o n t a i n i n g a g g r e g a t e s a r e c a p a b l e o f r e c r u i t i n g p o l y p e p t i d e s w i t h s h o r t e r p o l y Q r e p e a t s ( C h e n e t a l . , 2 0 0 1 ) , t h e l i t t l e t h a t i s e x p r e s s e d f o r W T h t t m a y w e l l b e d e p l e t e d b y s e q u e s t r a t i o n i n t o t h e s e p r e - f o r m e d a g g r e g a t e s . 13 1 . 1 . 6 . S e l e c t i v e N e u r o n a l D e g e n e r a t i o n B o t h g a i n a n d l o s s o f f u n c t i o n s o f t h e m u t a n t a n d W T f o r m s o f t h e htt p r o t e i n , r e s p e c t i v e l y , h a v e b e e n i d e n t i f i e d a s p o t e n t i a l c o n t r i b u t o r s t o n e u r o n a l d y s f u n c t i o n o r d e a t h i n H D a s o u t l i n e d a b o v e . T h e r e a s o n s f o r s e l e c t i v e n e u r o n a l d e g e n e r a t i o n r e m a i n e l u s i v e h o w e v e r . E x p a n d e d p o l y Q t r a c t s a r e t o x i c t o c e l l s o f b o t h n e u r o n a l a n d n o n - n e u r o n a l o r i g i n s , w h i l e t h e htt p r o t e i n i s w i d e l y e x p r e s s e d i n b o t h t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m ( C N S ) a n d p e r i p h e r a l t i s s u e s ( A r o n i n e t a l . , 1 9 9 5 ; T r o t t i e r e t a l . , 1 9 9 5 ) r e g a r d l e s s o f p o l y Q l e n g t h . N o t o n l y i s t h e r e n o e n r i c h m e n t f o r m h t t e x p r e s s i o n i n t h e s t r i a t u m ( A r o n i n e t a l . , 1 9 9 5 ; S h a r p e t a l . , 1 9 9 5 ) , b u t t h e p r o j e c t i o n M S N s i n f a c t e x p r e s s l o w e r l e v e l s o f m h t t t h a n d o i n t e m e u r o n s w h i c h a r e s p a r e d i n H D ( F u s c o e t a l . , 1 9 9 9 ) . A d d i t i o n a l l y , n o n e o f t h e p r o t e i n s i d e n t i f i e d a s i n t e r a c t o r s o f h t t i s s e l e c t i v e l y e x p r e s s e d o r a l t e r e d i n s t r i a t a l M S N s e x p r e s s i n g m h t t , t h e r e f o r e f a i l i n g t o p r o v i d e a n a d e q u a t e e x p l a n a t i o n a s t o h o w m h t t s e l e c t i v e l y t a r g e t s s t r i a t a l M S N s f o r c e l l u l a r d e m i s e ( G r a v e l a n d e t a l . , 1 9 8 5 ; F e r r a n t e e t a l . , 1 9 8 5 , 1 9 8 7 ) . In t h e r e s t o f t h i s I n t r o d u c t i o n , t h e n , w e r e v i e w e v i d e n c e a c c u m u l a t e d o v e r t h e p a s t t w o d e c a d e s i n s u p p o r t o f a r o l e f o r a l t e r e d N M D A R s i g n a l i n g i n m e d i a t i n g t h e r e g i o n - s e l e c t i v e p a t h o g e n i c e f f e c t s o f m h t t i n t h e c o u r s e o f H D p a t h o g e n e s i s . 1 . 1 . 7 . A n i m a l M o d e l s o f H D I d e n t i f i c a t i o n o f m e c h a n i s m s p r o m o t i n g n e u r o n a l d y s f u n c t i o n a n d d e g e n e r a t i o n i n H D h a s b e e n g r e a t l y a i d e d b y t h e d e v e l o p m e n t o f n u m e r o u s m o u s e m o d e l s o f t h e d i s e a s e . S o m e f e a t u r e s o f t h e s e m o d e l s t h a t a r e r e l e v a n t t o t h e c u r r e n t s t u d y a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 1 . M o u s e m o d e l s e x p r e s s i n g s h o r t , t r u n c a t e d f o r m s o f h u m a n m h t t , 14 s u c h a s t h e R 6 / 1 , R 6 / 2 , a n d N 1 7 1 m i c e , p r e s e n t w i t h a n e a r l y p h e n o t y p e w i t h m o t o r s y m p t o m s c h a r a c t e r i s t i c o f H D a n d p r o g r e s s t o d e a t h b y 4 t o 5 m o n t h s o f a g e ( M a n g i a r i n i e t a l . , 1 9 9 6 ; S c h i l l i n g e t a l . , 1 9 9 9 ) . D i s t r i b u t i o n o f n e u r o n a l a g g r e g a t e s c o n t a i n i n g t r u n c a t e d N - t e r m i n a l m h t t f r a g m e n t s i s w i d e s p r e a d i n d e n s e N i l s ( D a v i e s e t a l . , 1 9 9 7 ) , d e s p i t e s c a n t e v i d e n c e f o r s e l e c t i v e n e u r o n a l l o s s . T h i s a c c e l e r a t e d p h e n o t y p e m a k e s t h e s e a n i m a l s e s p e c i a l l y s u i t a b l e f o r t h e r a p e u t i c t r i a l s t a r g e t i n g t h e p r o x i m a t e c a u s e s o f n e u r o n a l d y s f u n c t i o n i n t h e s y m p t o m a t i c s t a g e s o f d i s e a s e . T r a n s g e n i c m i c e t h a t e x p r e s s f u l l - l e n g t h h u m a n m h t t , i n c l u d i n g Y A C 4 6 a n d Y A C 7 2 m i c e , d e v e l o p p r o g r e s s i v e m o t o r d e f i c i t s c o n s i s t e n t w i t h a d u l t - o n s e t H D a t 3 - 6 m o n t h s o r l a t e r , d e p e n d i n g o n p o l y Q l e n g t h a n d e x p r e s s i o n l e v e l s ( H o d g s o n e t a l . , 1 9 9 9 ) . D e a t h e n s u e s m o r e q u i c k l y o n l y i n a s u b g r o u p o f t h e m o s t e x t r e m e m o d e l , t h e Y A C 1 2 8 m i c e ( S l o w e t a l . , 2 0 0 3 ; V a n R a a m s d o n k e t a l . , 2 0 0 5 ) . T h e s e m i c e e x h i b i t s e l e c t i v e n e u r o n a l d e g e n e r a t i o n a n d t h e r e f o r e r e p r e s e n t a g o o d m o d e l f o r i n v e s t i g a t i n g m e c h a n i s m s t h a t t a r g e t s p e c i f i c n e u r o n a l p o p u l a t i o n s i n H D . A n o t h e r f u l l - l e n g t h H D m o u s e m o d e l , w h i c h e x p r e s s e s t h e HD c D N A w i t h v a r i o u s p o l y Q l e n g t h s u n d e r t h e c o n t r o l o f t h e C M V p r o m o t e r ( R e d d y e t a l . , 1 9 9 8 , 1 9 9 9 ) , a l s o d i s p l a y e d a p r o g r e s s i v e p h e n o t y p e i n c l u d i n g e v e n t u a l h y p o k i n e s i a c o i n c i d e n t w i t h s e l e c t i v e n e u r o n a l l o s s a n d g l i o s i s w i t h i n t h e s t r i a t u m . T h e r e l a t i v e a b s e n c e o f p r o m i n e n t a g g r e g a t e s i n t h e r e g i o n m o s t s e v e r e l y a f f e c t e d b y n e u r o d e g e n e r a t i o n a r g u e s a g a i n s t a r o l e f o r a g g r e g a t e d m h t t i n t h e i n i t i a t i o n o f d i s e a s e p a t h o g e n e s i s . A d d i t i o n a l l y , b e c a u s e s t r i a t a l n e u r o n a l l o s s i s o b s e r v e d i n t h e f u l l - l e n g t h m o d e l s b u t n o t i n t h o s e t h a t e x p r e s s s h o r t e r f r a g m e n t s o f m h t t , t h e c o n t e x t o f t h e f u l l - l e n g t h m h t t p r o t e i n a p p e a r s t o b e i m p l i c a t e d i n m e d i a t i n g t h e s e l e c t i v i t y o f n e u r o n a l d e g e n e r a t i o n s e e n i n H D . K I m o u s e m o d e l s , s u c h a s t h e C A G 8 0 a n d 9 4 ( S h e l b o u r n e e t a l . , 1 9 9 9 ; L e v i n e e t a l . , 1 9 9 9 ) a s w e l l a s t h e HdhQ92 a n d Q 1 1 1 m i c e ( W h e e l e r e t a l . , 2 0 0 0 ) , m a y w e l l b e t h e 15 m o s t a c c u r a t e g e n e t i c m o d e l o f H D s i n c e t h e s e m i c e c a r r y a C A G - e x p a n d e d v e r s i o n o f t h e e n d o g e n o u s m u r i n e Huntington's disease homologue (Hdh) g e n e a n d t h e r e f o r e e x p r e s s n o r m a l l e v e l s o f h t t . T h e s e a n i m a l s d i s p l a y a v e r y m i l d p h e n o t y p e a n d d o n o t d e v e l o p n e u r o d e g e n e r a t i o n , a n d a l l b u t t h e C A G 9 4 m o d e l e x h i b i t e d f o r m a t i o n o f N i l s a n d n e u r i t i c a g g r e g a t e s s i m i l a r t o t h o s e f o u n d i n h u m a n H D b r a i n s ( A l b i n e t a l . , 1 9 9 0 , 1 9 9 2 ; L i e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e s e f e a t u r e s c o u p l e d w i t h t h e g e n e t i c a l l y a c c u r a t e e x p r e s s i o n o f m h t t i n t h e s e m i c e m a k e t h e m e x c e l l e n t m o d e l s w i t h w h i c h t o e x a m i n e t h e m e c h a n i s m s o f n e u r o n a l d y s f u n c t i o n i n H D . 1.2. Excitotoxicity Hypothesis 1 . 2 . 1 . W h a t i s E x c i t o t o x i c i t y ? E x c i t o t o x i c i t y r e f e r s t o a m o d e o f c e l l d e a t h r e s u l t i n g f r o m t h e t o x i c e f f e c t s o f e x c i t a t o r y a m i n o a c i d s ( L u c a s a n d N e w h o u s e , 1 9 5 7 ; R o t h m a n a n d O l n e y , 1 9 9 5 ) . B e c a u s e g l u t a m a t e i s t h e p r i n c i p a l n e u r o t r a n s m i t t e r r e s p o n s i b l e f o r m e d i a t i n g e x c i t a t o r y s y n a p t i c t r a n s m i s s i o n i n t h e m a m m a l i a n C N S ( r e v i e w e d i n H e b b , 1 9 7 0 ; E n g e l s e n , 1 9 8 6 ) , n e u r o n a l e x c i t o t o x i c i t y t y p i c a l l y r e f e r s t o t h e c e l l u l a r d e a t h a r i s i n g f r o m e x p o s u r e t o g l u t a m a t e a t h i g h c o n c e n t r a t i o n s a n d / o r f o r p r o l o n g e d p e r i o d s o f t i m e , w h i c h l e a d s t o m a s s i v e i n f l u x o f i o n s a n d w a t e r t h u s c a u s i n g t h e c e l l t o s w e l l . T h i s i s a c c o m p a n i e d b y a n a c c u m u l a t i o n o f e x c e s s i v e a m o u n t s o f C a 2 + , t r i g g e r i n g s e c o n d a r y m e s s e n g e r p a t h w a y s t h a t a r e t o x i c t o t h e n e u r o n i n c l u d i n g a c t i v a t i o n o f c a t a b o l i c e n z y m e s t o d e g r a d e p r o t e i n s , n u c l e i c a c i d s , a n d o t h e r c e l l u l a r c o m p o n e n t s ( r e v i e w e d i n B e r l i o c c h i e t a l . , 2 0 0 5 ) . O n e m a j o r h y p o t h e s i s t o e x p l a i n t h e e x q u i s i t e s e n s i t i v i t y w i t h w h i c h M S N s i n t h e s t r i a t u m u n d e r g o s e l e c t i v e d e g e n e r a t i o n i n H D i s t h e " e x c i t o t o x i c i t y h y p o t h e s i s " . 16 Excessive activation of glutamate receptors could result from enhanced glutamate release from cortical and thalamic afferents, diminished glial uptake of glutamate, increased sensitivity of post-synaptic glutamate receptors on striatal projection neurons, or a combination of these. In the context of HD, the excitotoxicity hypothesis proposes that over-activation of glutamate receptors by one or more of the aforementioned mechanisms, in combination with impaired mitochondrial function, compromised intracellular C a 2 + homeostasis, and the associated pathological downstream signaling, would activate cytotoxic pathways leading to MSN dysfunction and death (Schwarcz et al., 1977; DiFiglia, 1990) (see Figure 1). Here we present evidence from HD mouse models (summarized in Table 1) and post-mortem brain tissue that incriminates altered glutamate receptor signaling and mitochondrial function in HD pathogenesis. 1.2.2. Classes of Glutamate Receptors Glutamate-binding post-synaptic receptors belong to one of two broad classes: the metabotropic glutamate receptors (mGluRs) (reviewed in Conn and Pin, 1997), which initiate secondary signaling pathways to activate or inhibit effector systems through GTP-binding proteins; and ionotropic glutamate receptors (iGluRs) (reviewed in Dingledine et al., 1999), which form ion channel pores upon ligand binding to facilitate cationic influx. This latter class of glutamate receptors, the iGluRs, includes the a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA) receptors (AMPARs), kainate receptors, and NMDARs. AMPA and kainate receptors mediate fast synaptic transmission with relatively low C a 2 + permeability. The NMDARs are of special importance to our discussion of excitotoxicity because of their high permeability to C a 2 + and slow gating kinetics. NMDARs are also remarkably sensitive to voltage-dependent 17 b l o c k b y M g 2 + i n t h e e x t r a c e l l u l a r m i l i e u ( M a y e r e t a l . , 1 9 8 4 ; N o w a k e t a l . , 1 9 8 4 ; M o n y e r e t a l . , 1 9 9 2 ; r e v i e w e d i n C u l l - C a n d y e t a l . , 2 0 0 1 ) . U n d e r n o r m a l p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s , C a 2 + i n f l u x t h r o u g h N M D A R s i s c r u c i a l n o t o n l y f o r t h e f o r m a t i o n a n d s t a b i l i z a t i o n o f n e w s y n a p s e s b u t a l s o f o r t h e i n d u c t i o n a n d m a i n t e n a n c e o f s y n a p t i c p l a s t i c i t y ( B l i s s a n d C o l l i n g r i d g e , 1 9 9 3 ; M a r e n a n d B a u d r y , 1 9 9 5 ; A s z t e l y a n d G u s t a f s s o n , 1 9 9 6 ) . In c e r t a i n p a t h o l o g i c a l c o n d i t i o n s , a c t i v i t y o f t h e s e s a m e r e c e p t o r s i s a l t e r e d l e a d i n g t o i n c r e a s e d o x i d a t i v e s t r e s s a n d e x c i t o t o x i c i t y ( L u c a s a n d N e w h o u s e , 1 9 5 7 ; R o t h m a n a n d O l n e y , 1 9 9 5 ; M i c h a e l i s , 1 9 9 8 ) . 1 . 2 . 3 . S t r u c t u r e a n d F u n c t i o n a l C h a r a c t e r i s t i c s o f N M D A R s F u n c t i o n a l N M D A R s a r e h e t e r o m e r i c c o m p l e x e s c o m p o s e d o f d i f f e r e n t s u b u n i t s f r o m t h e N R 1 , N R 2 , a n d N R 3 s u b t y p e s ( r e v i e w e d i n C u l l - C a n d y a n d L e s z k i e w i c z , 2 0 0 4 ; P a o l e t t i a n d N e y t o n , 2 0 0 6 ) . ( A c a r t o o n i l l u s t r a t i n g t h e m e m b r a n e t o p o l o g y a n d C - t e r m i n a l s p l i c e c a s s e t t e s o f t h e N R 1 s u b u n i t i s s h o w n i n F i g u r e 2 . ) A l t h o u g h t h e s t o i c h i o m e t r y o f N M D A R s h a s n o t b e e n u n e q u i v o c a l l y d e f i n e d , m o s t f u n c t i o n a l r e c e p t o r s i n n e u r o n s a r e w i d e l y b e l i e v e d t o b e t e t r a m e r i c s t r u c t u r e s ( L a u b e e t a l . , 1 9 9 8 ) c o m p o s e d o f t w o g l y c i n e - b i n d i n g N R 1 s u b u n i t s a n d t w o g l u t a m a t e - b i n d i n g N R 2 s u b u n i t s t h a t a s s e m b l e i n t h e E R ( M o n y e r e t a l . , 1 9 9 4 ; M c l l h i n n e y e t a l . , 1 9 9 8 ; r e v i e w e d i n O z a w a e t a l . , 1 9 9 8 ; D i n g l e d i n e e t a l . , 1 9 9 9 ) . W h i l e t h e r e l a t i v e l y l a r g e C - t e r m i n a l t a i l s o f t h e s e r e c e p t o r s a r e i n t r a c e l l u l a r l y l o c a t e d a n d a r e i n v o l v e d i n b i n d i n g t o c y t o p l a s m i c s i g n a l i n g m o l e c u l e s , s y n a p t i c s c a f f o l d s , a n d s t r u c t u r a l p r o t e i n s , s u b u n i t a s s e m b l y i s t h o u g h t t o b e m e d i a t e d b y t h e e x t r a c e l l u l a r p o r t i o n o f e a c h s u b u n i t ( M e d d o w s e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e r e - e n t r a n t p o r e l o o p s ( M 2 ) f r o m a l l s u b u n i t s d i p i n t o t h e m e m b r a n e f r o m t h e c y t o p l a s m i c s i d e t o f o r m t h e c h a n n e l - l i n i n g r e g i o n ( F i g u r e 2 ) a n d a s s u c h d e f i n e p e r m e a t i o n p r o p e r t i e s o f t h e r e c e p t o r . 18 I m p o r t a n t l y , N M D A R s a r e p e r m e a b l e t o c a t i o n s i n c l u d i n g C a , w h i c h a c t s a s a s e c o n d m e s s e n g e r t o i n i t i a t e n u m e r o u s i n t r a c e l l u l a r s i g n a l i n g p a t h w a y s a n d t o a c t i v a t e a m u l t i t u d e o f p r o t e i n k i n a s e s a n d p h o s p h a t a s e s . T h i s p r o p e r t y o f t h e N M D A R u n d e r s c o r e s i t s i m p o r t a n c e i n t h e i n d u c t i o n o f s y n a p t i c p l a s t i c i t y ( r e v i e w e d i n B l i s s a n d C o l l i n g r i d g e , 1 9 9 3 ) , a s w e l l a s i n m e d i a t i n g e x c i t o t o x i c d a m a g e r e s u l t i n g f r o m r e c e p t o r o v e r - s t i m u l a t i o n ( L u c a s a n d N e w h o u s e , 1 9 5 7 ; R o t h m a n a n d O l n e y , 1 9 9 5 ) . R e c e p t o r s c o m p r i s i n g N R 1 a n d N R 2 s u b u n i t s a r e a c t i v a t e d o n l y w h e n t w o c o n d i t i o n s a r e m e t s i m u l t a n e o u s l y : (1) c o i n c i d e n t b i n d i n g o f g l y c i n e ( o r s e r i n e ) t o e a c h N R 1 s u b u n i t , a n d g l u t a m a t e t o e a c h N R 2 s u b u n i t ; a n d ( 2 ) r e l i e f o f v o l t a g e - d e p e n d e n t b l o c k b y e x t r a c e l l u l a r M g 2 + e i t h e r b y a r t i f i c i a l l y r e m o v i n g M g 2 + f r o m t h e e x t r a c e l l u l a r s o l u t i o n o r b y p o s t - s y n a p t i c d e p o l a r i z a t i o n o f t h e n e u r o n . B e c a u s e o f t h e s e u n i q u e r e q u i r e m e n t s , N M D A R s e s s e n t i a l l y a c t a s c o i n c i d e n c e d e t e c t o r s u n d e r p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s a n d a r e a c t i v a t e d t o p e r m i t i o n f l u x o n l y w h e n b o t h p r e - a n d p o s t - s y n a p t i c n e u r o n s a r e e x c i t e d a t t h e s a m e t i m e . T h e t r a n s c r i p t e n c o d i n g N R 1 c a n u n d e r g o a l t e r n a t i v e s p l i c i n g a t t h r e e i n d e p e n d e n t s i t e s g i v i n g r i s e t o a t o t a l o f e i g h t p o s s i b l e i s o f o r m s o f t h e N R 1 p r o t e i n ( H o l l m a n n e t a l . , 1 9 9 3 ) . O n e s u c h s p l i c e s i t e d e t e r m i n e s t h e i n c l u s i o n o r e x c l u s i o n o f e x o n 5 a t t h e 5 ' - e n d o f t h e m R N A w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e e x t r a c e l l u l a r N - t e r m i n u s o f t h e t r a n s l a t e d p r o t e i n . T h e e x o n 5 p o r t i o n f o r m s a s u r f a c e l o o p s i m i l a r i n s t r u c t u r e t o p o l y a m i n e , w h i c h i s b e l i e v e d t o s h i e l d t h e p r o t o n s e n s o r o f t h e r e c e p t o r . H e n c e e x o n 5 - c o n t a i n i n g N R 1 i s o f o r m s a r e i n s e n s i t i v e t o r e g u l a t i o n b y p r o t o n s , Z n 2 + ( w h i c h a t l o w c o n c e n t r a t i o n s s e l e c t i v e l y i n h i b i t s N R 1 / N R 2 A - s u b t y p e o f N M D A R s ) , a n d p o l y a m i n e s . In c o n t r a s t , t h e m a j o r s p l i c e v a r i a n t o f N R 1 e x p r e s s e d i n m o s t n e u r o n s l a c k s e x o n 5 a n d a s s u c h , m o s t N M D A R s a r e s u b j e c t e d t o i n h i b i t i o n b y Z n 2 + ( f o r N R 1 / N R 2 A ) a n d p r o t o n s , a s w e l l a s p o t e n t i a t i o n b y p o l y a m i n e s ( r e v i e w e d i n M c B a i n a n d M a y e r , 1 9 9 4 ; C u l l - C a n d y e t a l . , 19 2 0 0 1 ; C u l l - C a n d y a n d L e s z k i e w i c z , 2 0 0 4 ) . T h e c h a r a c t e r i s t i c s o f o t h e r N R 1 s p l i c e v a r i a n t s w i l l b e d i s c u s s e d i n s e c t i o n 1 . 2 . 4 i n t h e c o n t e x t o f r e c e p t o r t r a f f i c k i n g . In a d d i t i o n t o t h e r o l e t h a t N R 1 s u b u n i t s p l a y i n i n f l u e n c i n g r e g u l a t i o n o f t h e N M D A R c o m p l e x b y a l l o s t e r i c m o d u l a t o r s , N R 2 s u b u n i t s p l a y a c r i t i c a l r o l e i n c o n f e r r i n g t h e b i o p h y s i c a l a n d p h a r m a c o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f t h e r e c e p t o r . F o u r d i f f e r e n t g e n e s e n c o d e f o r t h e N R 2 s u b u n i t ( N R 2 A , B , C a n d D ) , a n d t h e d i f f e r e n t N R 2 s u b u n i t s a n d N M D A R s u b t y p e s a r e e x p r e s s e d n o t o n l y i n a d e v e l o p m e n t a l l y a n d r e g i o n a l l y r e g u l a t e d m a n n e r ( I s h i i e t a l . , 1 9 9 3 ; A k a z a w a e t a l . , 1 9 9 4 ; M o n y e r e t a l . , 1 9 9 4 ; L a u r i e e t a l . , 1 9 9 7 ) , b u t a l s o i n a n a c t i v i t y - d e p e n d e n t f a s h i o n ( P h i l p o t e t a l . , 2 0 0 1 ; B a r r i a a n d M a l i n o w , 2 0 0 2 ) . D u r i n g d e v e l o p m e n t , s o m e r e g i o n s o f t h e b r a i n a l s o e x p r e s s N R 3 A o r N R 3 B s u b u n i t s . T h e s e g l y c i n e - b i n d i n g s u b u n i t s , w h e n e x p r e s s e d a s a t r i h e t e r o m e r i c r e c e p t o r w i t h N R 1 a n d N R 2 s u b u n i t s , g r e a t l y d e c r e a s e b o t h t h e c u r r e n t f l o w a n d C a 2 + p e r m e a b i l i t y o f t h e r e c e p t o r . W h e n e x p r e s s e d a s N R 1 / N R 3 d i h e t e r o m e r s , o n t h e o t h e r h a n d , it f o r m s a c a t i o n - p e r m e a b l e g l y c i n e r e c e p t o r t h a t i s u n r e s p o n s i v e t o g l u t a m a t e r e c e p t o r a g o n i s t s o r a n t a g o n i s t s , a n d i s n e i t h e r s e n s i t i v e t o v o l t a g e - d e p e n d e n t b l o c k a d e b y M g 2 + n o r p e r m e a b l e t o C a 2 + ( P e r e z - O t a n o e t a l . , 2 0 0 1 ; C h a t t e r t o n e t a l . , 2 0 0 2 ) . T h e m u l t i t u d e o f d i f f e r e n t N R 1 s p l i c e v a r i a n t s a l o n g w i t h t h e m a n y N R 2 a n d N R 3 s u b u n i t c h o i c e s a v a i l a b l e t h e r e f o r e a l l o w t h e f o r m a t i o n ( a t l e a s t i n t h e o r y ) o f a n i m p r e s s i v e r e p e r t o i r e o f N M D A R s , e a c h o f w h i c h d i f f e r s f r o m o t h e r s i n s u c h f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s a s a f f i n i t y f o r r e c e p t o r a g o n i s t s a n d a n t a g o n i s t s , s e n s i t i v i t y t o M g 2 + , s i n g l e c h a n n e l c o n d u c t a n c e , a n d c h a n n e l k i n e t i c s ( I s h i i e t a l . , 1 9 9 3 ; M o n y e r e t a l . , 1 9 9 4 ; C h e n e t a l . , 1 9 9 9 a ; r e v i e w e d i n C u l l - C a n d y e t a l . , 2 0 0 1 ; C u l l - C a n d y a n d L e s z k i e w i c z , 2 0 0 4 ; W a x m a n a n d L y n c h , 2 0 0 5 ) . M o s t N M D A R s i n t h e a d u l t m a m m a l i a n f o r e b r a i n a r e c o m p o s e d o f N R 1 w i t h N R 2 A a n d / o r N R 2 B s u b u n i t s . T h e s e r e c e p t o r s , r e g a r d l e s s o f N R 2 A / N R 2 B c o n t e n t ( i . e . , t w o s u b u n i t s o f N R 2 A , t w o s u b u n i t s o f N R 2 B , o r o n e s u b u n i t e a c h o f N R 2 A a n d N R 2 B f o r m i n g 20 t r i h e t e r o m e r i c r e c e p t o r s ) , d i s p l a y c o m p a r a b l e p e r m e a b i l i t y t o C a , s e n s i t i v i t y t o v o l t a g e - d e p e n d e n t M g 2 + b l o c k , a n d s i m i l a r l y h i g h s i n g l e c h a n n e l c o n d u c t a n c e s i n t h e r a n g e o f ~ 4 0 - 5 0 p S . H o w e v e r , N R 2 A - a n d N R 2 B - c o n t a i n i n g N M D A R s e x h i b i t d i f f e r e n c e s i n c h a n n e l g a t i n g p r o p e r t i e s i n r e s p o n s e t o k n o w n N M D A R a g o n i s t s a n d a n t a g o n i s t s ( V i c i n i e t a l . , 1 9 9 8 ; r e v i e w e d i n D i n g l e d i n e e t a l . , 1 9 9 9 ; K e w a n d K e m p , 2 0 0 5 ; W a x m a n a n d L y n c h , 2 0 0 5 ) . In t h i s w a y , p h a r m a c o l o g i c a l t o o l s a n d d i f f e r e n c e s i n c h a n n e l g a t i n g k i n e t i c s h e l p t o i d e n t i f y t h e s u b u n i t c o m p o s i t i o n w i t h i n a g i v e n p o p u l a t i o n o f f u n c t i o n a l N M D A R s . 1 . 2 . 4 . T r a f f i c k i n g o f N M D A R s In a d d i t i o n t o r o l e s f o r d i f f e r e n t N M D A R s u b u n i t s a n d i s o f o r m s i n c o n f e r r i n g u n i q u e b i o p h y s i c a l a n d p h a r m a c o l o g i c a l p r o p e r t i e s u p o n t h e r e c e p t o r , N M D A R c o m p l e x e s c o n t a i n i n g d i f f e r e n t c o m p l e m e n t s o f r e c e p t o r i s o f o r m s a n d s u b u n i t s a l s o b e h a v e d i f f e r e n t l y w i t h r e s p e c t t o h o w t h e y a r e t r a n s p o r t e d , t a r g e t e d , a n d a n c h o r e d a t t h e c e l l s u r f a c e ( R u m b a u g h a n d V i c i n i , 1 9 9 9 ; T o v a r a n d W e s t b r o o k , 1 9 9 9 ; B a r r i a a n d M a l i n o w , 2 0 0 2 ; P r y b y l o w s k i e t a l . , 2 0 0 5 ; M a u c e r i e t a l . , 2 0 0 7 ; r e v i e w e d i n P r y b y l o w s k i a n d W e n t h o l d , 2 0 0 4 ) . O f t h e t h r e e a l t e r n a t i v e s p l i c e s i t e s i n N R 1 , t w o a r e l o c a t e d i n t r a c e l l u l a r l y c l o s e t o t h e C - t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n ( F i g u r e 2 ) . T h e m o r e m e m b r a n e - p r o x i m a l o n e o f t h e s e , i n v o l v i n g d e l e t i o n o r r e t e n t i o n o f e x o n 2 1 , g i v e s r i s e t o t h e i n c l u s i o n o f a C 1 c a s s e t t e w h e n e x o n 2 1 i s n o t s p l i c e d o u t f r o m t h e h n R N A . W i t h i n t h e C 1 c a s s e t t e e x i s t s a n R X R m o t i f w h i c h a c t s a s a c o n s e n s u s s e q u e n c e m e d i a t i n g r e t e n t i o n o f t h e n e w l y s y n t h e s i z e d p r o t e i n w i t h i n t h e E R . T h e r e f o r e C 1 - c o n t a i n i n g N R 1 i s o f o r m s d o n o t g e t t r a f f i c k e d t o t h e G o l g i a p p a r a t u s u n t i l t h e E R r e t e n t i o n s i g n a l i s m a s k e d , g e n e r a l l y v i a a s s e m b l y w i t h N R 2 21 s u b u n i t s a s w e l l a s p h o s p h o r y l a t i o n o f n e a r b y s e r i n e r e s i d u e s a t a m i n o a c i d p o s i t i o n s 8 9 6 a n d 8 9 7 ( M c l l h i n n e y e t a l . , 1 9 9 6 , 1 9 9 8 ; X i a e t a l . , 2 0 0 1 ; S c o t t e t a l . , 2 0 0 1 , 2 0 0 3 ; r e v i e w e d i n C a r r o l l a n d Z u k i n , 2 0 0 2 ; W e n t h o l d e t a l . , 2 0 0 3 ; P r y b y l o w s k i a n d W e n t h o l d , 2 0 0 4 ) . T h e t h i r d s p l i c e s i t e i n N R 1 i s p o s i t i o n e d c l o s e t o t h e 3 ' - e n d o f t h e h n R N A a n d i n v o l v e s d i f f e r i n g s p l i c e a c c e p t o r s i t e s w i t h i n e x o n 2 2 . W i t h t h e u s e o f t h e n o r m a l s p l i c e a c c e p t o r s i t e , t h e N R 1 i s o f o r m g e n e r a t e d c o n t a i n s w h a t i s r e f e r r e d t o a s t h e C 2 c a s s e t t e . U s e o f t h e a l t e r n a t e s p l i c e a c c e p t o r s i t e g i v e s r i s e t o a t r u n c a t e d v e r s i o n , t h e C 2 ' c a s s e t t e , w h i c h c o n t a i n s a P S D - 9 5 / D i s c s l a r g e / Z o n a o c c l u d e n s - 1 ( P D Z ) l i g a n d m o t i f l o c a t e d a t t h e C - t e r m i n a l e n d . I n t e r e s t i n g l y , C 2 ' - c o n t a i n i n g N R 1 i s o f o r m s a r e a b l e t o e g r e s s f r o m t h e E R a n d r e a c h t h e s u r f a c e i n t h e a b s e n c e o f a s s e m b l y w i t h N R 2 s u b u n i t s , a n d r e g a r d l e s s o f w h e t h e r t h e R X R m o t i f - c o n t a i n i n g C 1 c a s s e t t e i s p r e s e n t o r n o t ( S t a n d l e y e t a l . , 2 0 0 0 ; r e v i e w e d i n C a r r o l l a n d Z u k i n , 2 0 0 2 ; W e n t h o l d e t a l . , 2 0 0 3 ) . t h e p r e s e n c e o f t h e P D Z l i g a n d m o t i f a p p e a r s t o h a v e a d o m i n a n t e f f e c t , a n d f o r w a r d t r a f f i c k i n g o f t h e s e N R 1 C 2 ' i s o f o r m s i s p o s t u l a t e d t o b e m e d i a t e d i n p a r t b y i n t e r a c t i o n s o f t h e C - t e r m i n a l t a i l w i t h P D Z d o m a i n - c o n t a i n i n g p r o t e i n s s u c h a s P S D - 9 5 . A s w i t h N R 2 s u b u n i t e x p r e s s i o n , a l t e r n a t i v e s p l i c i n g o f N R 1 i s o f o r m s a p p e a r s t o b e m o d u l a t e d b y a c t i v i t y ; C 2 s p l i c e i s o f o r m s a r e f a v o u r e d b y h i g h l e v e l s o f n e u r o n a l a c t i v i t y , w h e r e a s C 2 ' v a r i a n t s a r e u p - r e g u l a t e d d u r i n g p e r i o d s o f l o w a c t i v i t y , l e a d i n g t o f o r m a t i o n o f N M D A R c o m p l e x e s w i t h d i s t i n c t E R e x p o r t a n d s u r f a c e d e l i v e r y k i n e t i c s ( M u e t a l . , 2 0 0 3 ) N R 2 s u b u n i t s , u n l i k e N R 1 , d o n o t t r a f f i c k t o t h e c e l l s u r f a c e u n l e s s p r e - a s s e m b l e d i n t h e E R w i t h N R 1 s u b u n i t s i n t o t h e t e t r a m e r i c c o m p l e x ( M c l l h i n n e y e t a l . , 1 9 9 8 ; r e v i e w e d i n W e n t h o l d e t a l . , 2 0 0 3 ) . L i k e t h e N R 1 C 2 ' i s o f o r m s , h o w e v e r , C - t e r m i n a l t a i l s o f N M D A R N R 2 s u b u n i t s c o n t a i n P D Z l i g a n d m o t i f s t h a t p e r m i t i n t e r a c t i o n w i t h s c a f f o l d i n g p r o t e i n s o f t h e m e m b r a n e - a s s o c i a t e d g u a n y l a t e k i n a s e ( M A G U K ) f a m i l y , s u c h a s P S D - 9 5 a n d t h e 1 0 2 k D a s y n a p s e - a s s o c i a t e d p r o t e i n ( S A P - 1 0 2 ) ( K o r n a u e t a l . , 1 9 9 5 ; 22 S a n s e t a l . , 2 0 0 0 ; L i n e t a l . , 2 0 0 4 ; r e v i e w e d i n W e n t h o l d e t a l . , 2 0 0 3 ) . T h e s e i n t e r a c t i o n s s e r v e t o p r o m o t e s u r f a c e d e l i v e r y a n d / o r s t a b i l i z e s u r f a c e e x p r e s s i o n o f t h e N M D A R s , a n d a f f i n i t i e s f o r b i n d i n g d i f f e r e n t M A G U K s a r e r e l a t i v e l y N R 2 s u b u n i t - s p e c i f i c . W h i l e i n t e r a c t i o n o f N R 2 A w i t h t h e M A G U K f a m i l y m e m b e r s y n a p s e - a s s o c i a t e d p r o t e i n 9 7 k D a ( S A P - 9 7 ) c o n t r o l s f o r w a r d t r a f f i c k i n g a n d i n s e r t i o n o f N R 2 A - c o n t a i n i n g N M D A R s ( M a u c e r i e t a l . , 2 0 0 7 ) , N R 2 B s u b u n i t s i n t e r a c t w i t h S A P - 1 0 2 a n d t h e e x o c y s t p r o t e i n S e c 8 t o f a c i l i t a t e t r a f f i c k i n g o f N R 2 B - c o n t a i n i n g r e c e p t o r s t o t h e c e l l s u r f a c e m e m b r a n e ( S a n s e t a l . , 2 0 0 0 , 2 0 0 3 ; r e v i e w e d i n P r y b y l o w s k i a n d W e n t h o l d , 2 0 0 4 ) . T h e p r e s e n c e o f a Y E K L m o t i f n e a r t h e C - t e r m i n u s o f N R 2 B , o n t h e o t h e r h a n d , a l l o w s b i n d i n g t o c o m p o n e n t s o f t h e c l a t h r i n - d e p e n d e n t e n d o c y t i c m a c h i n e r y ( R o c h e e t a l . , 2 0 0 1 ) t o r e g u l a t e i n t e r n a l i z a t i o n o f N R 2 B - c o n t a i n i n g N M D A R s . S i m i l a r l y , a t y r o s i n e - e n r i c h e d " r i n g " o f a m i n o a c i d s i n t h e m e m b r a n e - p r o x i m a l r e g i o n o f t h e N R 2 A C - t e r m i n u s r e g u l a t e s i n t e r n a l i z a t i o n f o r t h i s s u b t y p e o f r e c e p t o r , w h e r e a g o n i s t b i n d i n g t o N R 2 A - c o n t a i n i n g N M D A R s l e a d s t o d e p h o s p h o r y l a t i o n o f t h e s e t y r o s i n e r e s i d u e s a n d s u b s e q u e n t r e c e p t o r i n t e r n a l i z a t i o n , i n d e p e n d e n t o f c u r r e n t f l o w t h r o u g h t h e r e c e p t o r ( V i s s e l e t a l . , 2 0 0 1 ) . R e g u l a t i o n o f N M D A R a c t i v i t y b y p h o s p h o r y l a t i o n , e s p e c i a l l y i n t h e c o n t e x t o f m h t t e x p r e s s i o n , w i l l b e d i s c u s s e d i n a l a t e r s e c t i o n o f t h i s I n t r o d u c t i o n ( s e c t i o n 1 . 5 . 3 ) . A s w i t h o t h e r p r o p e r t i e s o f t h e r e c e p t o r s , t a r g e t i n g o f N M D A R s a l s o a p p e a r s t o b e d i s t i n c t l y r e g u l a t e d i n a n N R 2 s u b u n i t - d e p e n d e n t m a n n e r , w i t h i n c r e a s i n g e v i d e n c e t o s u g g e s t d i f f e r e n t i a l s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f N R 2 A - v e r s u s N R 2 B - c o n t a i n i n g N M D A R s . W h i l e t h e f o r m e r a r e a b u n d a n t l y e x p r e s s e d a t s y n a p t i c m e m b r a n e s , t h e l a t t e r p r e f e r e n t i a l l y t a r g e t t o e x t r a - s y n a p t i c r e g i o n s o f t h e p l a s m a m e m b r a n e ( L i e t a l . , 1 9 9 8 ; S t o c c a a n d V i c i n i , 1 9 9 8 ; f o v a r a n d W e s t b r o o k , 1 9 9 9 ; B a r r i a a n d M a l i n o w , 2 0 0 2 ) a l t h o u g h t h i s d i s t i n c t i o n i s n o t a b s o l u t e ( T h o m a s e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h e r e l a t i v e c o n t r i b u t i o n o f e a c h s u b u n i t t o t h e t o t a l N M D A R p o o l a n d d i f f e r e n c e s i n s u b c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n a r e i m p o r t a n t i n t h e c o n t r o l o f n e u r o n a l s u r v i v a l , a s w e l l a s i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f c e l l u l a r r e s p o n s e s t o p l a s t i c i t y - i n d u c i n g s t i m u l i i n f o r e b r a i n r e g i o n s s u c h a s t h e h i p p o c a m p u s ( H a r d i n g h a m e t a l . , 2 0 0 2 ; H a r d i n g h a m a n d B a d i n g , 2 0 0 3 ; L i u e t a l . , 2 0 0 4 ; M a s s e y e t a l . , 2 0 0 4 ; B e r b e r i c h e t a l . , 2 0 0 5 , 2 0 0 6 ; B a r t l e t t e t a l . , 2 0 0 6 ; M o r i s h i t a e t a l . , 2 0 0 6 , S o r i a n o e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h e h u m a n s t r i a t u m i s n o t a b l e f o r i t s r e m a r k a b l y h i g h l e v e l s o f N M D A R s c o n t a i n i n g t h e N R 2 B s u b u n i t r e l a t i v e t o o t h e r s u b u n i t s , i n c o m p a r i s o n t o o t h e r p a r t s o f t h e f o r e b r a i n . T h i s e n r i c h m e n t a p p e a r s t o b e c o n s e r v e d i n o t h e r m a m m a l i a n s p e c i e s , a s s t r i a t a l t i s s u e s f r o m r o d e n t s s u c h a s r a t a n d m o u s e a l s o d i s p l a y i n c r e a s e d N R 2 B e x p r e s s i o n ( L a n d w e h r m e y e r e t a l . , 1 9 9 5 ; G h a s e m z a d e h e t a l . , 1 9 9 6 ; R i g b y e t a l . , 1 9 9 6 ; S t a n d a e r t e t a l . , 1 9 9 9 ; C h r i s t i e e t a l . , 2 0 0 0 ; K u p p e n b e n d e r e t a l . , 2 0 0 0 ; L i e t a l . , 2 0 0 3 ) . A d d i t i o n a l e v i d e n c e s u p p o r t i n g a r o l e f o r t h e N R 1 / N R 2 B s u b t y p e o f N M D A R s i n H D p a t h o g e n e s i s w i l l b e p r e s e n t e d i n s e c t i o n 1 . 4 . 4 o f t h i s I n t r o d u c t i o n . 1 . 2 . 5 . S t r i a t a l E x p r e s s i o n o f N M D A R s i n H D - A f f e c t e d I n d i v i d u a l s a n d M o u s e M o d e l s E a r l y s t u d i e s i n v o l v i n g r a d i o l i g a n d - b i n d i n g o f N M D A R s i n p o s t - m o r t e m b r a i n t i s s u e f r o m H D p a t i e n t s d e m o n s t r a t e d a d i s p r o p o r t i o n a t e l o s s o f N M D A R s f r o m t h e s t r i a t u m o f p a t i e n t s a t p r e - s y m p t o m a t i c s t a g e s o f t h e d i s e a s e , e v e n t h o u g h t h e s e p a t i e n t s e x h i b i t o n l y r e l a t i v e l y s m a l l a m o u n t s o f n e u r o n a l l o s s a t t h i s p o i n t ( Y o u n g e t a l . , 1 9 8 8 ; A l b i n e t a l . , 1 9 9 0 ) . B e c a u s e t h e a m o u n t o f N M D A R s l o s t g r e a t l y e x c e e d s t h e e x p e c t e d a m o u n t b a s e d o n t h e e x t e n t o f n e u r o n a l l o s s , t h e s e f i n d i n g s s u g g e s t t h a t s t r i a t a l n e u r o n s w i t h h i g h e x p r e s s i o n o f N M D A R s m a y b e p r e f e r e n t i a l l y l o s t e v e n f r o m t h e e a r l i e s t s t a g e s o f d i s e a s e , r e v e a l i n g a n e x q u i s i t e v u l n e r a b i l i t y i n t h e s e c e l l s . M o r e r e c e n t l y , s c r u t i n y o f e x p r e s s i o n o f t h e d i f f e r e n t N M D A R s u b u n i t s i n 24 { t r a n s g e n i c m o u s e m o d e l s o f H D h a v e y i e l d e d s o m e t i m e s c o n f l i c t i n g r e s u l t s , d e p e n d i n g o n t h e m o d e l u s e d a n d w h e t h e r m R N A o r p r o t e i n l e v e l s w e r e e x a m i n e d . A s d i s c u s s e d e a r l i e r , R 6 / 2 m i c e e x p r e s s a n e x o n 1 f r a g m e n t o f m h t t c o n t a i n i n g ~ 1 5 0 Q ( M a n g i a r i n i e t a l . , 1 9 9 6 ) . T h e s e m i c e a t s y m p t o m a t i c a g e s d i s p l a y e d e n h a n c e d s t r i a t a l N R 1 e x p r e s s i o n b u t r e d u c e d N R 2 A a n d N R 2 B e x p r e s s i o n , a s r e v e a l e d b y i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g o f b r a i n s l i c e s ( C e p e d a e t a l . , 2 0 0 1 a ) . In c o n t r a s t , C h a a n d c o l l e a g u e s ( 1 9 9 9 ) r e p o r t e d n o c h a n g e s i n N R 1 p r o t e i n l e v e l s f r o m 1 2 - w e e k o l d s y m p t o m a t i c R 6 / 2 m i c e , e i t h e r i n t h e s t r i a t u m ( a s r e v e a l e d b y r e c e p t o r b i n d i n g a s s a y s ) o r i n w h o l e b r a i n h o m o g e n a t e s ( b y i m m u n o b l o t a n a l y s i s ) . A d i f f e r e n t s t u d y i n v e s t i g a t i n g c h a n g e s a t t h e m R N A l e v e l , u s i n g m i c e o f t h e s a m e m o d e l f r o m b o t h e a r l y ( 6 - w e e k ) a n d l a t e ( 1 2 - w e e k ) s y m p t o m a t i c s t a g e s , f o u n d n o c h a n g e i n s t r i a t a l N R 1 m R N A e x p r e s s i o n r e l a t i v e t o W T l i t t e r m a t e s r e g a r d l e s s o f s t a g e o f d i s e a s e p r o g r e s s i o n ( L u t h i - C a r t e r e t a l . , 2 0 0 0 , 2 0 0 3 ) . T h e s e f i n d i n g s w e r e c o r r o b o r a t e d b y A l i a n d L e v i n e i n a r e c e n t s t u d y ( 2 0 0 6 ) e x a m i n i n g s t r i a t a l M S N s f r o m p r e - s y m p t o m a t i c a n d e a r l y s y m p t o m a t i c R 6 / 2 m i c e , w h i c h o n c e a g a i n c o n f i r m e d u n a l t e r e d N R 1 m R N A l e v e l s . M o r e o v e r , t h e s a m e s t u d y s h o w e d N R 2 B m R N A e x p r e s s i o n t o b e u n c h a n g e d w h i l e N R 2 A m R N A l e v e l s w e r e r e d u c e d . N M D A R s u b u n i t e x p r e s s i o n h a s b e e n i n v e s t i g a t e d i n o t h e r H D m o u s e m o d e l s a s w e l l . In t h e Y A C t r a n s g e n i c m o u s e m o d e l , w h i c h e x p r e s s e s f u l l - l e n g t h h u m a n m h t t u n d e r t h e c o n t r o l o f h u m a n p r o m o t e r a n d r e g u l a t o r y s e q u e n c e s ( H o d g s o n e t a l . , 1 9 9 9 ) , a n a l y s i s o f N R 1 a n d N R 2 B p r o t e i n e x p r e s s i o n r e v e a l e d n o p o l y Q l e n g t h - d e p e n d e n t d i f f e r e n c e s i n s t r i a t a l t i s s u e s o f p r e - s y m p t o m a t i c Y A C 4 6 o r Y A C 7 2 m i c e a t 2 m o n t h s o f a g e , r e l a t i v e t o F V B / N W T l i t t e r m a t e s ( L i e t a l . , 2 0 0 3 ; a l s o s e e F i g u r e 7 ) . T h e Y A C 1 2 8 m i c e , w h i c h e x p r e s s f u l l - l e n g t h m h t t w i t h a m o r e e x t r e m e e x p a n s i o n o f 1 2 8 Q , s h o w e d r e d u c e d s t r i a t a l N R 2 B e x p r e s s i o n a t 1 2 m o n t h s o f a g e ( J . S h e h a d e h a n d L . A . R a y m o n d , u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) , a t i m e w h e n t h e a n i m a l s a r e s y m p t o m a t i c a n d d i s p l a y s i g n i f i c a n t s t r i a t a l 25 d e g e n e r a t i o n ( S l o w e t a l . , 2 0 0 3 ) . S t u d i e s i n t h e N 1 7 1 - 8 2 Q m o u s e m o d e l ( S c h i l l i n g e t a l . , 1 9 9 9 ) r e v e a l e d u n a l t e r e d l e v e l s o f s t r i a t a l N R 1 o r N R 2 B p r o t e i n e x p r e s s i o n r e g a r d l e s s o f d i s e a s e s t a g e ( p r e - s y m p t o m a t i c v e r s u s s y m p t o m a t i c ) , w i t h t h e e x c e p t i o n o f a t r a n s i e n t r e d u c t i o n i n N R 2 A s u b u n i t e x p r e s s i o n i n t h e s t r i a t u m o f p r e - s y m p t o m a t i c a n i m a l s ( J a r a b e k e t a l . , 2 0 0 4 ) . D e s p i t e s o m e n o t a b l e d i f f e r e n c e s i n f i n d i n g s f r o m t h e d i f f e r e n t a n i m a l m o d e l s , m o s t o f t h e m s e e m t o i n d i c a t e d i m i n i s h e d N R 2 A a n d / o r N R 2 B s u b u n i t e x p r e s s i o n w h i l e N R 1 l e v e l s r e m a i n u n a l t e r e d . B e c a u s e N M D A R c o m p l e x e s r e q u i r e b o t h N R 1 a n d N R 2 s u b u n i t s t o f o r m f u n c t i o n a l c h a n n e l s , t h e s e d a t a c o l l e c t i v e l y s u g g e s t t h a t a r e d u c t i o n i n n u m b e r s o f a c t i v e N M D A R s a n d / o r c h a n g e s i n N M D A R s u b u n i t c o m p o s i t i o n m a y o c c u r w i t h d i s e a s e p r o g r e s s i o n i n a n u m b e r o f t h e s e t r a n s g e n i c m o u s e m o d e l s f o r H D . I m p o r t a n t l y , f i n d i n g s f r o m s t u d i e s i n t r a n s g e n i c m i c e i n g e n e r a l a p p e a r c o n s i s t e n t w i t h r e s u l t s f r o m r e c e p t o r l i g a n d - b i n d i n g s t u d i e s i n p o s t - m o r t e m h u m a n H D b r a i n s a s d e s c r i b e d a b o v e , a l t h o u g h d i r e c t c o r r e l a t i o n s b e t w e e n t h e s e s t u d i e s a r e d i f f i c u l t t o d r a w d u e t o d i f f e r e n c e s i n t h e e x p e r i m e n t a l a p p r o a c h e s t h a t w e r e u s e d . 1 . 2 . 6 . C h e m i c a l M o d e l s o f H D B e f o r e t h e a d v e n t o f t r a n s g e n i c m o d e l s , s o m e o f t h e e a r l i e s t s y s t e m s u s e d t o m o d e l H D i n v o l v e d i n j e c t i o n o f a v a r i e t y o f t o x i n s i n t o t h e s t r i a t u m o f a n i m a l s . S p e c i f i c a l l y , i n j e c t i o n o f N M D A R a g o n i s t s s u c h a s q u i n o l i n i c a c i d ( Q A ) i n t o t h e s t r i a t u m o f r o d e n t s o r p r i m a t e s c a u s e d l e s i o n i n g o f t h e s t r i a t u m a n d r e p r o d u c e d s e v e r a l b e h a v i o u r a l a n d n e u r o p a t h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f H D , i n c l u d i n g s e l e c t i v e l o s s o f p r o j e c t i o n M S N s f r o m t h e s t r i a t u m w h i l e i n t e r n e u r o n s w e r e n o t a f f e c t e d ( S c h w a r c z e t a l . , 1 9 8 4 ; B e a l e t a l . , 1 9 8 6 , 1 9 9 1 ; S a n b e r g e t a l . , 1 9 8 9 ; H a n t r a y e e t a l . , 1 9 9 0 ; F e r r a n t e e t a l . , 1 9 9 3 ) . E n d o g e n o u s l y , 26 Q A i s g e n e r a t e d f r o m t h e k y n u r e n i n e p a t h w a y o f t r y p t o p h a n d e g r a d a t i o n , w h i c h w a s s h o w n t o b e p e r t u r b e d i n H D p a t i e n t s a s w e l l a s i n R 6 / 2 a n d Y A C 1 2 8 m i c e . A m o n g t h e m e t a b o l i t e s p r o d u c e d i n t h i s p a t h w a y , t h o s e t h a t l e d t o a n i n c r e a s e i n o x i d a t i v e s t r e s s ( s u c h a s 3 - h y d r o x y k y n u r e n i n e ) o r d i r e c t l y a c t i v a t e d N M D A R s ( s u c h a s Q A ) w e r e f o u n d a t a b n o r m a l l y h i g h l e v e l s i n c o r t i c a l a n d / o r s t r i a t a l t i s s u e i n t h e e a r l y s y m p t o m a t i c s t a g e s ( G u i d e t t i e t a l . , 2 0 0 4 , 2 0 0 6 ) . T h e s e f i n d i n g s w o u l d t h e r e f o r e s u g g e s t t h a t e x c i t o t o x i c d a m a g e a s a . r e s u l t o f e x p o s u r e t o m e t a b o l i t e s o f t h e k y n u r e n i n e p a t h w a y m a y c o n t r i b u t e t o N M D A R - m e d i a t e d t o x i c i t y i n H D . A n o t h e r e x c i t o t o x i n u s e d i n t h o s e e a r l y d a y s w a s t h e n o n - N M D A R a g o n i s t k a i n i c a c i d , w h i c h a l s o c a u s e d d e a t h o f s t r i a t a l n e u r o n e s b u t d i d n o t s e l e c t i v e l y t a r g e t p r o j e c t i o n M S N s ( C o y l e a n d S c h w a r c z , 1 9 7 6 ; M c G e e r a n d M c G e e r , 1 9 7 6 ) . B o t h k a i n a t e - a n d Q A - i n d u c e d n e u r o n a l t o x i c i t y i n t h e s t r i a t u m w e r e a b o l i s h e d w h e n s y n a p t i c i n p u t f r o m t h e c o r t e x v i a c o r t i c o s t r i a t a l g l u t a m a t e r g i c a f f e r e n t s w a s r e m o v e d b y d e c o r t i c a t i o n , i n d i c a t i n g a r o l e f o r c o r t i c a l l y r e l e a s e d g l u t a m a t e i n c o n t r i b u t i n g t o e x c i t o t o x i n - m e d i a t e d s t r i a t a l d a m a g e ( M c G e e r a n d M c G e e r , 1 9 7 8 ; B i z i e r e a n d C o y l e , 1 9 7 9 ; O r l a n d o e t a l . , 2 0 0 1 ) . I n t e r e s t i n g l y , i n j e c t i o n o f g r o u p I m G l u R a g o n i s t s r e s t o r e d N M D A R - d e p e n d e n t e x c i t o t o x i c c e l l d e a t h i n d e c o r t i c a t e d a n i m a l s , w h i l e b l o c k i n g t h e a c t i v a t i o n o f g r o u p I m G l u R s w a s p r o t e c t i v e a g a i n s t Q A - a n d N M D A - i n d u c e d n e u r o n a l t o x i c i t y i n a n i m a l s w i t h i n t a c t c o r t i c o s t r i a t a l a f f e r e n t a t i o n ( O r l a n d o e t a l . , 2 0 0 1 ) , i m p l i c a t i n g a r o l e f o r s t r i a t a l m G l u R a c t i v a t i o n i n c o n t r i b u t i n g t o N M D A R - d e p e n d e n t e x c i t o t o x i c i t y ( s e e F i g u r e 1 ) . N M D A R a g o n i s t s a r e n o t o n l y m o r e s e l e c t i v e i n t a r g e t i n g s t r i a t a l p r o j e c t i o n M S N s f o r n e u r o n a l d e a t h , b u t t h e y a r e a l s o m o r e n e u r o t o x i c t h a n a g o n i s t s f o r o t h e r i G l u R s u b c l a s s e s ( r e v i e w e d i n D i F i g l i a , 1 9 9 0 ) . In t o x i c i t y p a r a d i g m s w h e r e N M D A w a s u s e d a s t h e e x c i t o t o x i n , M S N s i n a c u t e s t r i a t a l s l i c e s f r o m b o t h R 6 / 2 a n d Y A C 7 2 m i c e d e m o n s t r a t e d a s e l e c t i v e e n h a n c e m e n t o f N M D A R - m e d i a t e d c u r r e n t d e n s i t y a n d 27 NMDA-induced swelling, in comparison to large interneurons which are spared in HD (Cepeda et al, 2001 b). In contrast, the current flux and cell swelling evoked by application of kainate were not significantly different between interneurons and projection MSNs (Cepeda et al., 2001b). These findings unmask NMDAR-specific characteristics which confer on these receptors an exquisite selectivity and efficacy in terms of their ability to elicit excitotoxic damage in striatal projection MSNs, once again confirming a likely involvement of these receptors and their altered activity in the pathogenesis of HD. Apart from injection of animals with excitotoxins, other chemical models that recapitulate neuropathological features of HD include those that involve the use of mitochondrial toxins. In particular, striatal or systemic injection in rodents with inhibitors of mitochondrial complex II such as 3-nitropropionic acid (3-NP) or malonic acid resulted in a selective pattern of striatal neurodegeneration reminiscent of that seen in HD (Beal et al., 1993; Greene et al., 1993; Brouillet et al., 1995; Greene and Greenamyre, 1995; Bogdanov et al., 1998). Notably, cell death caused by these toxins appeared to depend on activation of NMDARs. In the rat striatum, injection of 3-NP led to increased NMDAR activation (Wullner et al., 1994), while inhibition of NMDAR function blocked the neurotoxicity resulting from injection of malonate or 3-NP (Greene et al., 1993; Bogdanov et al., 1998). These findings suggest that NMDAR and mitochondrial functions are intimately related and implicate them, in their aberrant functional states resulting from mhtt expression, in rendering striatal projection MSNs especially susceptible to excitotoxic damage in HD. 28 1.3. Aber rant N M D A R Act iv i t y in HD 1 . 3 . 1 . S y n a p t i c A b n o r m a l i t i e s i n H D M o d e l s T h e g e n e r a t i o n o f a l a r g e a r r a y o f H D m o d e l s e x p r e s s i n g p a r t o r a l l o f t h e HD t r a n s g e n e i n c e l l l i n e s o r r o d e n t s ( M a n g i a r i n i e t a l . , 1 9 9 6 ; H o d g s o n e t a l . , 1 9 9 9 ; R e d d y e t a l . , 1 9 9 8 ; S c h i l l i n g e t a l . , 1 9 9 9 ; S h e l b o u r n e e t a l . , 1 9 9 9 ; W h e e l e r e t a l . , 2 0 0 0 ; L i n e t a l . , 2 0 0 1 ; V o n H o r s t e n e t a l . , 2 0 0 3 ) h a s g r e a t l y f a c i l i t a t e d i n - d e p t h a n a l y s e s o f t h e m o l e c u l a r p a t h w a y s i n v o l v e d i n H D p a t h o g e n e s i s . A s d e p i c t e d i n F i g u r e 1 , a l t e r a t i o n s i n a v a r i e t y o f c e l l u l a r p r o c e s s e s h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n t h e r e s u l t i n g a u g m e n t a t i o n o f t h e s e n s i t i v i t y o f s t r i a t a l M S N s t o e x c i t o t o x i c i t y a t c o r t i c o s t r i a t a l s y n a p s e s i n H D . A m o n g t h e s e a r e e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l c h a n g e s i n t h e c o r t i c o s t r i a t a l p a t h w a y a s w e l l a s a l t e r a t i o n s i n g l u t a m a t e r e c e p t o r s e n s i t i v i t y i n M S N s t h a t e x p r e s s m h t t . W h i l e e v i d e n c e f r o m s t u d i e s i n s l i c e s o f 1 m o n t h - o l d Y A C 7 2 m i c e ( a t a n a g e b e f o r e s y m p t o m o n s e t ) d e m o n s t r a t e d u n a l t e r e d p r o b a b i l i t y o f e v o k e d g l u t a m a t e r e l e a s e f r o m c o r t i c a l a f f e r e n t s o n t o s t r i a t a l M S N s r e l a t i v e t o W T c o n t r o l s ( L i e t a l . , 2 0 0 4 ) , e x a m i n a t i o n o f o t h e r m o u s e m o d e l s c l e a r l y r e v e a l e d m h t t - d e p e n d e n t d i f f e r e n c e s i n g l u t a m a t e r e l e a s e a t c o r t i c o s t r i a t a l s y n a p s e s ( F i g u r e 1 , p o i n t 1 ) . In a c u t e c o r t i c o s t r i a t a l s l i c e s f r o m R 6 / 2 m i c e a t t h e t i m e o f s y m p t o m o n s e t , l a r g e - a m p l i t u d e , s p o n t a n e o u s e x c i t a t o r y p o s t - s y n a p t i c c u r r e n t s ( E P S C s ) w e r e r e c o r d e d a t s i g n i f i c a n t l y h i g h e r f r e q u e n c i e s r e l a t i v e t o c o n t r o l ( C e p e d a e t a l . , 2 0 0 3 ) . T h e i m p l i c a t i o n s o f s u c h b u r s t s o f e n h a n c e d c o r t i c a l g l u t a m a t e r e l e a s e r e m a i n u n c l e a r ; h o w e v e r t h e i r o c c u r r e n c e e a r l y i n t h e d i s e a s e p r o c e s s c o u l d c o n c e i v a b l y c o u p l e w i t h m h t t - i n d u c e d d e c r e a s e s i n g l u t a m a t e u p t a k e b y a s t r o c y t e s a n d i m p a i r m e n t s o f g l u t a m a t e c l e a r a n c e f r o m t h e s y n a p t i c c l e f t ( L i e v e n s e t a l . , 2 0 0 1 ; B e h r e n s e t a l . , 2 0 0 2 ; S h i n e t a l . , 2 0 0 5 ; F i g u r e 1 , p o i n t 2 ) , a l o n g w i t h i n c r e a s e s i n Q A a n d o x i d a t i v e m e t a b o l i t e s f r o m a n 29 i m p a i r e d k y n u r e n i n e p a t h w a y a s d e s c r i b e d a b o v e ( G u i d e t t i e t a l . , 2 0 0 4 , 2 0 0 6 ) t o c o n t r i b u t e t o e x c e s s i v e a c t i v a t i o n o f N M D A R s l e a d i n g t o e x c i t o t o x i c d a m a g e i n s t r i a t a l M S N s . T h e s e l a r g e e v e n t s a p p e a r e d t o b e t r a n s i t o r y , h o w e v e r , a s t h e f r e q u e n c y o f a l l s p o n t a n e o u s c u r r e n t s d e c r e a s e d w i t h d i s e a s e p r o g r e s s i o n a n d s y m p t o m a t i c o n s e t i n t h e s e m i c e ( C e p e d a e t a l . , 2 0 0 3 ) . T h i s f u n c t i o n a l c h a n g e a p p e a r s t o c o r r e l a t e s t r u c t u r a l l y w i t h d i m i n i s h e d e x p r e s s i o n o f s y n a p t i c m a r k e r p r o t e i n s a n d a d e c r e a s e i n t h e n u m b e r o f s p i n e s i n s y m p t o m a t i c R 6 / 2 m i c e ( K l a p s t e i n e t a l . , 2 0 0 1 ) , c o n s i s t e n t w i t h a r e d u c t i o n i n g l u t a m a t e r g i c t r a n s m i s s i o n . T h e s e o b s e r v a t i o n s i n d i c a t i n g d e c r e a s e d g l u t a m a t e r e l e a s e f r o m c o r t i c o s t r i a t a l s y n a p s e s a r e i n a g r e e m e n t w i t h c e l l m o d e l s t u d i e s w h i c h r e v e a l e d c o m p r o m i s e d e x o c y t i c f u n c t i o n i n c e l l s e x p r e s s i n g p o l y Q - e x p a n d e d htt e x o n 1 l e a d i n g t o a b n o r m a l i t i e s i n n e u r o t r a n s m i t t e r r e l e a s e ( E d w a r d s o n e t a l . , 2 0 0 3 ) . A p a r t f r o m a d e f e c t i n e x o c y t o s i s , t h e p r o p e r t i e s o f t h e v e s i c l e r e l e a s e a n d r e c o v e r y c y c l e t h a t d e t e r m i n e t h e a m p l i t u d e a n d t i m i n g o f n e u r o t r a n s m i t t e r r e l e a s e a l s o a p p e a r e d t o b e i m p a i r e d b y htt p o l y Q e x p a n s i o n ( r e v i e w e d i n M i l n e r w o o d a n d R a y m o n d , 2 0 0 6 ) . T h e s e r e s u l t s s e e m t o s u g g e s t t h a t , a t l a t e r s t a g e s o f d i s e a s e , t h e i n i t i a l h y p e r s e n s i t i v i t y o f c o r t i c o s t r i a t a l s i g n a l i n g g i v e s w a y t o a r e d u c t i o n i n g l u t a m a t e r g i c s y n a p t i c t r a n s m i s s i o n , w h i c h m a y e f f e c t i v e l y c o n f e r s o m e m e a s u r e o f r e s i s t a n c e a g a i n s t g l u t a m a t e r e c e p t o r - d e p e n d e n t i n s u l t s i n n e u r o n s t h a t h a v e a l r e a d y f a c e d t r e m e n d o u s e x c i t o t o x i c i n j u r y . 1 . 3 . 1 . 1 . A l t e r a t i o n s i n N M D A - L T P a n d N M D A - L T D i n H D M o d e l s A l t e r e d c o g n i t i v e f u n c t i o n ( i n c l u d i n g m e m o r y f o r m a t i o n a n d i n f o r m a t i o n p r o c e s s i n g ) a s w e l l a s c h a n g e s i n e m o t i o n s a n d a f f e c t i v e b e h a v i o u r a r e s y m p t o m s t h a t g e n e r a l l y p r e c e d e m o t o r d y s f u n c t i o n i n p a t i e n t s i n H D , a l t h o u g h t h e s e c h a n g e s c o u l d 30 s o m e t i m e s b e s u b t l e a n d m a y n o t b e n o t e d u n t i l t h e t i m e o f c l i n i c a l p r e s e n t a t i o n ( L a w r e n c e e t a l . , 1 9 9 6 , 1 9 9 8 ; J a s o n e t a l . , 1 9 9 7 ; P a u l s e n e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e m o l e c u l a r s u b s t r a t e s w h i c h u n d e r l i e m e m o r y f o r m a t i o n a s w e l l a s i n f o r m a t i o n a c q u i s i t i o n a n d l o n g - t e r m s t o r a g e a r e w i d e l y b e l i e v e d t o i n v o l v e l o n g - t e r m , a c t i v i t y - d e p e n d e n t c h a n g e s i n s y n a p t i c e f f i c a c y , m a n y f o r m s o f w h i c h r e l y o n N M D A R a c t i v a t i o n . H e n c e s t u d i e s h a v e b e e n c a r r i e d o u t i n v a r i o u s t r a n s g e n i c a n d K I m o u s e m o d e l s o f H D t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t s o f htt p o l y Q e x p a n s i o n o n N M D A R - d e p e n d e n t l o n g - t e r m p o t e n t i a t i o n ( L T P ) a n d d e p r e s s i o n ( L T D ) . S t u d i e s i n a n u m b e r o f H D m o u s e m o d e l s h a v e r e v e a l e d a l t e r a t i o n s i n h i p p o c a m p a l L T P r e l a t e d t o i m p a i r m e n t s o f p r e - a n d / o r p o s t - s y n a p t i c f u n c t i o n ( H o d g s o n e t a l . , 1 9 9 9 ; U s d i n e t a l . , 1 9 9 9 ; M u r p h y e t a l . , 2 0 0 0 ; M i l n e r w o o d e t a l . , 2 0 0 6 ) w h i c h i n s o m e c a s e s a p p e a r e d t r a n s i t o r y a n d c h a n g e d o v e r t i m e ( H o d g s o n e t a l . , 1 9 9 9 ) . In Y A C 7 2 m i c e , h i g h f r e q u e n c y s t i m u l a t i o n ( H F S ) o f C A 1 s y n a p s e s l e d t o p o t e n t i a t i o n o f N M D A R - d e p e n d e n t r e s p o n s e s i n 6 m o n t h - o l d a n i m a l s , w h e r e a s t h e s a m e t r e a t m e n t i n d u c e d d e p r e s s i o n i n 1 0 m o n t h - o l d a n i m a l s ( H o d g s o n e t a l . , 1 9 9 9 ) . T h e C A G 8 0 KI m o u s e e x h i b i t e d d i m i n i s h e d h i p p o c a m p a l L T P r e s p o n s e s , l i k e l y a s a r e s u l t o f p e r t u r b a t i o n s i n t h e p r e - s y n a p t i c r e l e a s e o f n e u r o t r a n s m i t t e r ( U s d i n e t a l . , 1 9 9 9 ) . E v i d e n c e f o r a c o n t r i b u t i o n f r o m p o s t - s y n a p t i c c h a n g e s i n N M D A R s i g n a l i n g c a m e f r o m s t u d i e s i n R 6 m i c e w h i c h e x p r e s s e d r e d u c e d L T P c o m p a r e d t o c o n t r o l s ; i n t e r e s t i n g l y t h e s e m i c e a l s o e x p r e s s e d a f o r m o f L T D t h a t w a s a b s e n t i n c o n t r o l a n i m a l s ( M u r p h y e t a l . , 2 0 0 0 ; M i l n e r w o o d e t a l . , 2 0 0 6 ) . S u c h c h a n g e s i n h i p p o c a m p a l s y n a p t i c p l a s t i c i t y o c c u r e d p r i o r t o t h e a p p e a r a n c e o f m o t o r s y m p t o m s a n d c o i n c i d e d w i t h t h e d e v e l o p m e n t o f c o g n i t i v e d e f e c t s i n t h e R 6 / 2 m o d e l ( M u r p h y e t a l . , 2 0 0 0 ; C y b u l s k a - K l o s o w i c z e t a l . , 2 0 0 4 ; M a z a r a k i s e t a l . , 2 0 0 5 ; M i l n e r w o o d e t a l . , 2 0 0 6 ) . A l t e r e d p l a s t i c i t y , i n t h e f o r m s o f s u p p r e s s i o n o f L T D e x p r e s s i o n a n d i m p a i r m e n t o f p o s t - L T P s y n a p t i c d e p o t e n t i a t i o n , h a s 31 a l s o b e e n r e p o r t e d a t t h e c o r t i c o s t r i a t a l s y n a p s e , b o t h f r o m 3 - N P - t r e a t e d r a t s ( D a l b e m e t a l . , 2 0 0 5 ; P i c c o n i e t a l . , 2 0 0 6 ) a n d R 6 / 2 m i c e ( P i c c o n i e t a l . , 2 0 0 6 ) . A l t o g e t h e r , t h e s e s t u d i e s t o d a t e h a v e y i e l d e d m a n y i m p o r t a n t f i n d i n g s p r o v i d i n g i n v a l u a b l e i n s i g h t i n t o t h e p o s s i b l e m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g m h t t - m e d i a t e d c h a n g e s i n c o g n i t i v e f u n c t i o n e a r l y i n H D p a t h o g e n e s i s . 1 . 3 . 2 . E n h a n c e d S e n s i t i v i t y t o N M D A i n H D M o u s e M o d e l s O n e m e c h a n i s m l e a d i n g t o i n c r e a s e d e x c i t o t o x i c i t y i n v o l v e s e n h a n c e d s e n s i t i v i t y o f p o s t - s y n a p t i c g l u t a m a t e r e c e p t o r s , a n d s t u d i e s i n m o u s e m o d e l s o f H D h a v e p r o v i d e d s t r o n g e v i d e n c e i n s u p p o r t o f o v e r - a c t i v a t i o n o f N M D A R s a s c o n t r i b u t i n g t o e x c i t o t o x i c d a m a g e i n H D ( F i g u r e 1 , p o i n t 3 ) . M e a s u r i n g s w e l l i n g o f c e l l s a s a p a r a m e t e r t o i n d i c a t e t h e l e v e l o f c e l l u l a r s t r e s s , L e v i n e a n d c o l l e a g u e s d e m o n s t r a t e d t h a t e x p o s u r e t o N M D A l e d t o f a s t e r a n d m o r e s u b s t a n t i a l s w e l l i n g r e s p o n s e s f r o m s t r i a t a l M S N s o f b o t h t h e C A G K I m o u s e e x p r e s s i n g h t t - 9 4 Q ( C A G 9 4 ) a n d t h e R 6 / 2 m o u s e m o d e l s ( L e v i n e e t a l . , 1 9 9 9 ) . In R 6 / 2 m i c e , t h e s e m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s w e r e c o r r e l a t e d w i t h a u g m e n t e d p e a k N M D A - e v o k e d c u r r e n t d e n s i t i e s i n s t r i a t a l s l i c e s t h a t a p p e a r e d t o b e s e l e c t i v e f o r N M D A R s b u t n o t o t h e r i G l u R s ( C e p e d a e t a l . , 2 0 0 1 a ) . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d f r o m s t r i a t a l n e u r o n s i n s y m p t o m a t i c a n d p r e - s y m p t o m a t i c a n i m a l s ( C e p e d a e t a l . , 2 0 0 1 a ) w h i l e c o r t i c a l n e u r o n s , i n c o n t r a s t , d i d n o t d i s p l a y e n h a n c e d N M D A R - m e d i a t e d c u r r e n t s ( A n d r e e t a l . , 2 0 0 6 ) i n a g r e e m e n t w i t h t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e s e n e u r o n s d o n o t d e g e n e r a t e u n t i l m u c h l a t e r i n t h e c o u r s e o f d i s e a s e p r o g r e s s i o n ( V o n s a t t e l a n d D i F i g l i a , 1 9 9 8 ) . In a d d i t i o n t o d a t a f r o m s t r i a t a l s l i c e s , m o r e i n - d e p t h e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l a n a l y s e s o f N M D A R a c t i v i t y c h a n g e s h a v e b e e n c a r r i e d o u t i n a c u t e l y d i s s o c i a t e d s t r i a t a l M S N s 32 f r o m R 6 / 2 m i c e , e x a m i n i n g h o w N M D A - e v o k e d c u r r e n t s a n d s e n s i t i v i t y t o M g b l o c k a r e i n f l u e n c e d b y m h t t o v e r a r a n g e o f h o l d i n g p o t e n t i a l s ( S t a r l i n g e t a l . , 2 0 0 5 ) . T h i s s t u d y i n d i c a t e d t h a t , w h i l e o n e p o p u l a t i o n o f n e u r o n s b e h a v e d s i m i l a r l y t o W T c o n t r o l s , t h e o t h e r p o p u l a t i o n e x h i b i t e d s i g n i f i c a n t l y l a r g e r c u r r e n t f l o w t h r o u g h N M D A R s w i t h d i m i n i s h e d s e n s i t i v i t y t o b l o c k b y e x t r a c e l l u l a r M g 2 + . A m o r e r e c e n t s t u d y u s i n g a c u t e l y d i s s o c i a t e d M S N s f r o m p r e - s y m p t o m a t i c R 6 / 2 m i c e a l s o c o n f i r m e d s i g n i f i c a n t l y l a r g e r N M D A R - m e d i a t e d c u r r e n t s , e v e n t h o u g h t h e s e m i c e e x p r e s s e d l o w e r l e v e l s o f N R 2 A m R N A a n d s i m i l a r a m o u n t s o f N R 1 a n d N R 2 B m R N A i n c o m p a r i s o n t o W T l i t t e r m a t e s ( A l i a n d L e v i n e , 2 0 0 6 ) . B e c a u s e a n o m a l o u s N M D A R f u n c t i o n i s o b s e r v e d f r o m s t r i a t a l n e u r o n s a n d s l i c e s o f b o t h p r e - s y m p t o m a t i c a n d s y m p t o m a t i c m i c e , a b e r r a n t N M D A R a c t i v i t y w o u l d t h e r e f o r e a p p e a r t o b e a n e a r l y e f f e c t o f m h t t e x p r e s s i o n t h a t p r e c e d e s t h e d e v e l o p m e n t o f a n y m o t o r d e f i c i t s . A p a r t f r o m t h e R 6 / 2 m o d e l , s e v e r a l o t h e r K I a n d t r a n s g e n i c m o u s e m o d e l s o f H D h a v e p r o v i d e d a d d i t i o n a l e v i d e n c e i n s u p p o r t f o r s e n s i t i z e d N M D A R f u n c t i o n i n c e l l s e x p r e s s i n g m h t t . I n c r e a s e d r e s p o n s e o f N M D A R s f o l l o w i n g e x p o s u r e t o N M D A w a s n o t e d i n i m m o r t a l i z e d s t r i a t a l c e l l s f r o m H c f r ? 0 1 1 1 K I m i c e ( S T H o T ? 0 1 1 1 c e l l s ; T r e t t e l e t a l . , 2 0 0 0 ) . W h o l e - c e l l v o l t a g e - c l a m p r e c o r d i n g s i n a d i f f e r e n t m o u s e m o d e l t h a t e x p r e s s e s a n N - t e r m i n a l f r a g m e n t o f h u m a n htt w i t h 1 0 0 Q ( t g H D 1 0 0 ) r e v e a l e d a u g m e n t e d p e a k N M D A R c u r r e n t i n M S N s f r o m s t r i a t a l s l i c e s o f t h e s e m i c e ( L a f o r e t e t a l . , 2 0 0 1 ) . In t h e Y A C t r a n s g e n i c H D m o u s e m o d e l e x p r e s s i n g f u l l - l e n g t h h u m a n h t t - 7 2 Q , a c u t e l y d i s s o c i a t e d M S N s f r o m p r e - s y m p t o m a t i c m i c e a n d s t r i a t a l M S N s c u l t u r e d f r o m n e o n a t a l m i c e b o t h r e s p o n d e d t o N M D A t r e a t m e n t w i t h s i g n i f i c a n t l y l a r g e r c u r r e n t d e n s i t i e s t h a n d i d W T l i t t e r m a t e s ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 2 , 2 0 0 4 ) , s u g g e s t i n g o n c e a g a i n t h a t t h e e f f e c t o f m h t t o n N M D A R f u n c t i o n i s a n e a r l y e v e n t i n H D p a t h o g e n e s i s , p o s s i b l y o c c u r r i n g a s e a r l y a s a t t h e t i m e o f b i r t h . S u c h e a r l y a l t e r a t i o n s m a y l e a d t o p r o f o u n d 33 c h a n g e s i n i n t r a c e l l u l a r s i g n a l i n g , e s p e c i a l l y t h o s e p a t h w a y s t h a t i n v o l v e c y t o s o l i c C a , t h u s s e t t i n g t h e s t a g e f o r i n c r e a s e d o x i d a t i v e s t r e s s a n d n e u r o n a l d y s f u n c t i o n a s d i s e a s e p r o g r e s s e s . T o d e t e r m i n e w h e t h e r s y n a p t i c N M D A R - m e d i a t e d c u r r e n t s a r e m o d u l a t e d b y m h t t i n a m a n n e r s i m i l a r t o w h o l e - c e l l N M D A R c u r r e n t s , e v o k e d N M D A R c u r r e n t w a s m e a s u r e d f r o m s t r i a t a l M S N s i n a c u t e l y d i s s o c i a t e d c o r t i c o s t r i a t a l s l i c e s f r o m ~1 m o n t h - o l d F V B / N W T o r Y A C 7 2 m i c e . T h e s e s t u d i e s s u g g e s t e d t h a t s t i m u l a t i o n o f c o r t i c a l a f f e r e n t s i n d u c e d s i g n i f i c a n t l y l a r g e r s y n a p t i c N M D A R - m e d i a t e d c u r r e n t s i n Y A C 7 2 m i c e , i n c o m p a r i s o n t o W T ( L i e t a l . , 2 0 0 3 , 2 0 0 4 ) . T h i s e f f e c t w a s N M D A R - s p e c i f i c , a s i l l u s t r a t e d b y a c o n s i s t e n t l y l a r g e r r a t i o o f N M D A R - t o A M P A R - m e d i a t e d E P S C a m p l i t u d e s i n Y A C 7 2 c o r t i c o s t r i a t a l s y n a p s e s ( L i e t a l . , 2 0 Q 3 , 2 0 0 4 ) . A l s o , p r e - s y n a p t i c g l u t a m a t e r e l e a s e w a s n o t f o u n d t o d i f f e r b e t w e e n W T a n d Y A C 7 2 s l i c e p r e p a r a t i o n s ( L i e t a l . , 2 0 0 4 ) , s u g g e s t i n g t h a t a m p l i t u d e o f s y n a p t i c N M D A R c u r r e n t s i n Y A C 7 2 s t r i a t a l n e u r o n s i s a u g m e n t e d p r i m a r i l y a s a r e s u l t o f a s p e c i f i c m h t t - i n d u c e d i n c r e a s e i n p o s t - s y n a p t i c N M D A R a c t i v i t y . 1.4. Signaling Downstream of Altered NMDAR Activity • 1 . 4 . 1 . L o s s o f C a l c i u m H o m e o s t a s i s T h e h i g h p e r m e a b i l i t y o f t h e N M D A R t o C a 2 + m a k e s t h i s c h a n n e l a k e y r e g u l a t o r o f i n t r a c e l l u l a r C a 2 + l e v e l s . In t u r n , C a 2 + p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e a s a s e c o n d m e s s e n g e r i n m a n y d o w n t r e a m s i g n a l i n g p a t h w a y s . T h u s c h a n g e s i n l e v e l s o f i n t r a c e l l u l a r C a 2 + a r e n o r m a l l y t i g h t l y r e g u l a t e d t o e n s u r e s t r i n g e n t c o n t r o l o v e r C a 2 + - d e p e n d e n t s i g n a l i n g p a t h w a y s . U n d e r p a t h o l o g i c a l c o n d i t i o n s w h e r e l e v e l s o f i n t r a c e l l u l a r C a 2 + e x c e e d a 34 c e r t a i n t h r e s h o l d c a u s i n g s a t u r a t i o n o f t h e C a - b u f f e r i n g m a c h i n e r i e s , d e g r a d a t i v e p a t h w a y s a r e a c t i v a t e d , l e a d i n g t o c a t a b o l i c b r e a k d o w n o f p h o s p h o l i p i d s , n u c l e i c a c i d s , a n d p r o t e i n s . M o r e o v e r , c o m p r o m i s e d m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n a s a r e s u l t o f C a 2 + o v e r l o a d p r o m o t e s f r e e r a d i c a l f o r m a t i o n a n d i n d u c t i o n o f t h e m i t o c h o n d r i a l p e r m e a b i l i t y t r a n s i t i o n ( m P T ) ( D u g a n e t a l . , 1 9 9 5 ; R e y n o l d s a n d H a s t i n g s , 1 9 9 5 ; P e n g a n d G r e e n a m y r e , 1 9 9 8 ; r e v i e w e d i n B e r l i o c c h i e t a l . , 2 0 0 5 ) l e a d i n g t o a d d i t i o n a l c e l l u l a r d y s f u n c t i o n e v e n t u a l l y f o l l o w e d b y d e a t h . T h u s , C a 2 + h o m e o s t a s i s i s c r i t i c a l t o t h e w e l l - b e i n g o f a n y c e l l a n d h a s b e e n s h o w n t o b e c o m p r o m i s e d i n c e l l s e x p r e s s i n g p o l y Q - e x p a n d e d m h t t ( F i g u r e 1 , p o i n t 4 ) . S t u d i e s i n t r a n s g e n i c m i c e r e v e a l e d e l e v a t e d l e v e l s o f b a s a l i n t r a c e l l u l a r C a 2 + i n h i p p o c a m p a l n e u r o n s f r o m Y A C H D m i c e ( H o d g s o n e t a l . , 1 9 9 9 ) a s w e l l a s s t r i a t a l n e u r o n s f r o m R 6 / 2 m i c e ( H a n s s o n e t a l . , 2 0 0 1 ) . S i m i l a r f i n d i n g s w e r e m a d e i n a K I m o d e l , i n i m m o r t a l i z e d s t r i a t a l c e l l s f r o m m i c e e x p r e s s i n g t h e m u r i n e htt p r o t e i n w i t h 1 1 1 Q ( S T W c f / 7 Q 1 1 1 ; S e o n g e t a l . , 2 0 0 5 ) . A p a r t f r o m b a s a l l e v e l s , N M D A R - d e p e n d e n t i n c r e a s e s i n i n t r a c e l l u l a r C a 2 + l e v e l s w e r e a l s o a f f e c t e d b y e x p r e s s i o n o f m h t t . F o r e x a m p l e , n e u r o n s f r o m t g H D 1 0 0 m i c e d i s p l a y e d s i g n i f i c a n t l y h i g h e r l e v e l s o f i n t r a c e l l u l a r C a 2 + c o n c e n t r a t i o n s f o l l o w i n g N M D A t r e a t m e n t ( L a f o r e t e t a l . , 2 0 0 1 ) . S i m i l a r l y , b a t h a p p l i c a t i o n o f N M D A l e d t o m u c h l a r g e r i n c r e a s e s o f i n t r a c e l l u l a r C a 2 + i n s t r i a t a l s l i c e s f r o m R 6 / 2 m i c e i n c o m p a r i s o n t o W T c o n t r o l s ( C e p e d a e t a l . , 2 0 0 1 a ) . S t r i a t a l M S N s f r o m Y A C 4 6 a n d Y A C 7 2 m i c e r e s p o n d e d t o N M D A t r e a t m e n t w i t h a u g m e n t e d c y t o s o l i c C a 2 + r e s p o n s e s ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 4 ) , w h i l e c u l t u r e d M S N s f r o m a s i m i l a r m o u s e m o d e l w i t h a n e x t r e m e p o l y Q r e p e a t l e n g t h o f 1 2 8 Q d e m o n s t r a t e d e n h a n c e d i n t r a c e l l u l a r C a 2 + l e v e l s f o l l o w i n g r e p e a t e d a p p l i c a t i o n o f g l u t a m a t e ( T a n g e t a l . , 2 0 0 5 ) . In t h e s a m e Y A C 1 2 8 m o d e l , N M D A t r e a t m e n t f o l l o w i n g b l o c k o f g l y c o l y t i c A T P s y n t h e s i s c a u s e d e i t h e r d e l a y e d r e c o v e r y o f C a 2 + l e v e l s b a c k t o 35 b a s e l i n e o r c o m p l e t e d e - r e g u l a t i o n o f C a 2 + i m m e d i a t e l y u p o n e x p o s u r e t o N M D A ( O l i v e i r a e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h e n u m b e r o f c u l t u r e d s t r i a t a l M S N s u n d e r g o i n g t h e s e N M D A - i n d u c e d c h a n g e s w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r f o r Y A C 1 2 8 m i c e i n c o m p a r i s o n t o W T ( O l i v e i r a e t a l . , 2 0 0 6 ) . A l t h o u g h t h e d i s c u s s i o n s o f a r h a s p e r t a i n e d m o s t l y t o N M D A R s a n d i n c r e a s e d C a 2 + l e v e l s l i k e l y d u e i n p a r t t o a l t e r e d N M D A R a c t i v i t y , i n t r a c e l l u l a r C a 2 + f r o m s o u r c e s o t h e r t h a n N M D A R s w a s a l s o f o u n d t o b e d i f f e r e n t i a l l y r e g u l a t e d b y W T v e r s u s m u t a n t htt . In p a r t i c u l a r , t h e a c t i v a t i o n o f i n o s i t o l 1 , 4 , 5 - t r i s p h o s p h a t e ( I P 3 ) r e c e p t o r s ( I P 3 R s ) o n E R m e m b r a n e s g a t i n g E R C a 2 + s t o r e s w a s h i g h l y s e n s i t i z e d b y m h t t b u t n o t W T htt ( T a n g e t a l . , 2 0 0 3 ) . M u t a n t htt a l s o s i g n i f i c a n t l y p o t e n t i a t e d I P 3 R - m e d i a t e d C a 2 + r e l e a s e f r o m E R s t o r e s i n m o u s e a n d r a t M S N s ( T a n g e t a l . , 2 0 0 3 , 2 0 0 4 ) . A s t h e f i n d i n g s i n c u l t u r e d n e u r o n s d e s c r i b e d a b o v e c l e a r l y i l l u s t r a t e , e f f e c t s o f m h t t o n i n t r a c e l l u l a r C a 2 + h o m e o s t a s i s o c c u r a s e a r l y a s t h e t i m e o f b i r t h ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 4 ; O l i v e i r a e t a l . , 2 0 0 6 ) , a s w i t h m h t t - i n d u c e d c h a n g e s o f N M D A R a c t i v i t y d i s c u s s e d i n p r e v i o u s s e c t i o n s . T o g e t h e r t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t m h t t - m e d i a t e d d y s r e g u l a t i o n o f C a 2 + s i g n a l i n g c o n t r i b u t e s t o e a r l y c e l l u l a r c h a n g e s t h a t r e n d e r s t r i a t a l M S N s e x q u i s i t e l y v u l n e r a b l e i n H D . 1 . 4 . 2 . M i t o c h o n d r i a l D y s f u n c t i o n i n H D a n d M o d e l s o f H D I n t a c t m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n i s a b s o l u t e l y e s s e n t i a l t o t h e c e l l , n o t o n l y b e c a u s e m i t o c h o n d r i a a r e t h e m a i n s o u r c e o f m e t a b o l i c e n e r g y , b u t a l s o b e c a u s e t h e y p l a y a c r i t i c a l r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r C a 2 + h o m e o s t a s i s . A s m e n t i o n e d p r e v i o u s l y i n s e c t i o n s 1 . 2 . 6 a n d 1 . 1 . 4 . 1 , i n h i b i t i o n o f m i t o c h o n d r i a l e l e c t r o n t r a n s p o r t c h a i n f u n c t i o n l e a d s t o N M D A R - d e p e n d e n t s t r i a t a l l e s i o n i n g s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d i n H D ( B e a l e t a l . , 36 1 9 9 3 ; G r e e n e e t a l . , 1 9 9 3 ; B r o u i l l e t e t a l . , 1 9 9 5 ; G r e e n e a n d G r e e n a m y r e , 1 9 9 5 ; B o g d a n o v e t a l . , 1 9 9 8 ) , a n d p o l y Q e x p a n s i o n i n htt h a s b e e n r e p o r t e d t o c o n t r i b u t e t o m i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o n b y b l o c k i n g m o v e m e n t o f m i t o c h o n d r i a a l o n g n e u r o n a l p r o c e s s e s ( T r u s h i n a e t a l . , 2 0 0 4 ; C h a n g e t a l . , 2 0 0 6 ) . A n u m b e r o f c h a n g e s i n m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n , m o s t l y i n t h e d i r e c t i o n o f d e c r e a s e d f u n c t i o n , h a v e b e e n r e p o r t e d i n b r a i n s o f H D p a t i e n t s . T h e s e i n c l u d e a r e d u c t i o n i n m i t o c h o n d r i a l o x y g e n c o n s u m p t i o n a n d d i m i n i s h e d g l u c o s e m e t a b o l i s m ( S t a h l a n d S w a n s o n , 1 9 7 4 ; L e e n d e r s e t a l . , 1 9 8 6 ) , a s w e l l a s d e c r e a s e d c A M P l e v e l s i n t h e c e r e b r o s p i n a l f l u i d ( C S F ) ( C r a m e r e t a l . , 1 9 8 4 ) a n d p o s t - m o r t e m b r a i n s ( G i n e s e t a l . , 2 0 0 3 ) o f H D p a t i e n t s . E n z y m e s t h a t f u n c t i o n i n o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n i n c l u d i n g a c o n i t a s e a n d m i t o c h o n d r i a l c o m p l e x e s II, III, a n d I V , a l s o d i s p l a y e d d e c r e a s e d a c t i v i t y i n s t r i a t a l t i s s u e f r o m H D p a t i e n t s ( B r e n n a n e t a l . , 1 9 8 5 ; B e a l , 1 9 9 5 ; G u e t a l . , 1 9 9 6 ; B r o w n e e t a l . , 1 9 9 7 ; T a b r i z i e t a l . , 1 9 9 9 ) . In a d d i t i o n t o c h a n g e s i n t h e C N S , a b e r r a n t m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n a n d a n o m a l o u s e n e r g y p r o d u c t i o n h a v e a l s o b e e n n o t e d i n p e r i p h e r a l t i s s u e s o f p a t i e n t s s u f f e r i n g f r o m H D , i n c l u d i n g m u s c l e ( K o r o s h e t z e t a l . , 1 9 9 7 ; A r e n a s e t a l . , 1 9 9 8 ; S a f t e t a l . , 2 0 0 5 ) a n d l y m p h o b l a s t s ( P a n o v e t a l . , 2 0 0 2 ; G i n e s e t a l . , 2 0 0 3 ) . L y m p h o b l a s t s f r o m h u m a n H D p a t i e n t s , i n p a r t i c u l a r , a p p e a r e d t o b e e x t r e m e l y s u s c e p t i b l e t o t r e a t m e n t w i t h m i t o c h o n d r i a l t o x i n s , d i s p l a y i n g a r e m a r k a b l e i n c r e a s e i n t h e e x t e n t o f m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e d e p o l a r i z a t i o n a n d a p o p t o t i c c e l l d e a t h i n r e s p o n s e t o c y a n i d e o r s t a u r o s p o r i n e t r e a t m e n t ( S a w a e t a l . , 1 9 9 9 ) . C h a n g e s i n m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n s i n e v i t a b l y a f f e c t c e l l u l a r f u n c t i o n , w i t h o f t e n s e r i o u s c o n s e q u e n c e s i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f c e l l s u r v i v a l v e r s u s c e l l d e a t h . U n d e r p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s o f n e u r o n a l a c t i v a t i o n , w h e r e m o d e r a t e a m o u n t s o f C a 2 + a r e t a k e n u p b y m i t o c h o n d r i a , t h e i n n e r m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e ( I M M ) u n d e r g o e s t r a n s i e n t /37 a n d m o d e r a t e d e p o l a r i z a t i o n t h a t s u b s e q u e n t l y r e t u r n s t o b a s e l i n e l e v e l s f o l l o w i n g r e m o v a l o f t h e C a 2 + - i n d u c i n g s t i m u l u s . T h e e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t a c r o s s t h e I M M d r i v e s u p t a k e o f C a 2 + f r o m t h e c y t o s o l i n t o t h e m i t o c h o n d r i a a n d a s s u c h s u p p o r t s t h e m a j o r C a 2 + - b u f f e r i n g s y s t e m w i t h i n t h e c e l l ( r e v i e w e d i n N i c h o l l s a n d W a r d , 2 0 0 0 ) . H o w e v e r , a p p l i c a t i o n o f t o x i c l e v e l s o f s t i m u l i s u c h a s l a r g e a m o u n t s o f g l u t a m a t e o r N M D A g e n e r a l l y l e a d s t o p a t h o l o g i c a l l y h i g h l e v e l s o f i n t r a c e l l u l a r C a 2 + . W h e n t h e c o n c e n t r a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r C a 2 + e x c e e d s 1 u M , s u c h a s o c c u r s f o l l o w i n g N M D A R o v e r - s t i m u l a t i o n o r r e l e a s e f r o m E R s t o r e s , e x c e s s i v e a m o u n t s o f c y t o s o l i c C a 2 + a r e l o a d e d i n t o m i t o c h o n d r i a t h e r e b y c a u s i n g t h e b u f f e r i n g a b i l i t y o f t h e s e o r g a n e l l e s t o b e o v e r - b u r d e n e d . T h i s i s f o l l o w e d b y a p e r m a n e n t a n d m a s s i v e d e p o l a r i z a t i o n o f t h e I M M , l e a d i n g t o f o r m a t i o n a n d a c t i v a t i o n o f t h e l a r g e c o n d u c t a n c e p o r e , m P T . O n c e t h e m P T i s a c t i v a t e d , t h e e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t a c r o s s t h e I M M t h a t n o r m a l l y m a i n t a i n s a c t i v i t y o f t h e e l e c t r o n t r a n s p o r t c h a i n t o d r i v e A T P p r o d u c t i o n b e c o m e s d i s s i p a t e d . T h i s r e n d e r s m i t o c h o n d r i a u n a b l e t o m a i n t a i n n o r m a l o x i d a t i v e p h o s p h o r y l a t i o n a c t i v i t y o r t o b u f f e r C a 2 + , s o t h a t o x i d a t i v e g e n e r a t i o n o f A T P i s a b o l i s h e d , a n d A T P - d e p e n d e n t p r o c e s s e s s u c h a s m a i n t e n a n c e o f a h y p e r p o l a r i z e d p o t e n t i a l a c r o s s t h e p l a s m a m e m b r a n e b y a c t i v i t y o f t h e N a + / C a 2 + e x c h a n g e r i s c u r t a i l e d . P r o d u c t i o n o f r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s ( R O S ) i s i n c r e a s e d , a n d C a 2 + i s d u m p e d b a c k i n t o t h e c y t o s o l a l o n g w i t h o t h e r p r o - a p o p t o t i c f a c t o r s l e a d i n g t o a c t i v a t i o n o f C a 2 + - d e p e n d e n t a p o p t o t i c a n d e x c i t o t o x i c p a t h w a y s ( r e v i e w e d i n W h i t e a n d R e y n o l d s , 1 9 9 6 ; D u c h e n , 2 0 0 4 ; O r r e n i u s , 2 0 0 4 ; B e a l , 2 0 0 5 ) . B e c a u s e m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n i s i n t i m a t e l y l i n k e d t o c h a n g e s i n l e v e l s o f i n t r a c e l l u l a r C a 2 + , r e a s o n i n g s u g g e s t s t h a t m h t t - i n d u c e d c h a n g e s i n C a 2 + h o m e o s t a s i s m a y a f f e c t m i t o c h o n d r i a f u n c t i o n a n d w e e versa. M i t o c h o n d r i a i s o l a t e d f r o m s t r i a t a l n e u r o n s i n b o t h r a t ( B r u s t o v e t s k y e t a l . , 2 0 0 3 ) a n d m o u s e ( B r u s t o v e t s k y e t a l . , 2 0 0 5 ) 38 a p p e a r e d t o b e m o r e s e n s i t i v e t o c h a n g e s i n i n t r a c e l l u l a r C a l e v e l s , a s t h e y w e r e m o r e p r o n e t o m P T f o r m a t i o n t h a n m i t o c h o n d r i a i s o l a t e d f r o m c o r t i c a l n e u r o n s . T h e s e r e s u l t s a r e o n c e a g a i n i n a g r e e m e n t w i t h t h e o b s e r v a t i o n i n H D p a t i e n t s o f c o r t i c a l p r e s e r v a t i o n u n t i l f a i r l y l a t e s t a g e s o f d i s e a s e ( V o n s a t t e l a n d D i F i g l i a , 1 9 9 8 ) . A p a r t f r o m t h e i n t r i n s i c s u s c e p t i b i l i t y o f s t r i a t a l m i t o c h o n d r i a t o c h a n g e s i n i n t r a c e l l u l a r C a 2 + l e v e l s , m h t t c a n d i r e c t l y m o d u l a t e m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n . L i k e W T h t t , N - t e r m i n a l m h t t f r a g m e n t s a r e c a p a b l e o f d i r e c t l y b i n d i n g m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s , a n i n t e r a c t i o n w h i c h i s b e l i e v e d t o c o n t r i b u t e t o C a 2 + r e t e n t i o n d e f i c i t s a n d / o r f o r m a t i o n o f t h e m P T ( P a n o v e t a l . , 2 0 0 2 ; C h o o e t a l . , 2 0 0 4 ) . I n c r e a s e d t e n d e n c y f o r C a 2 + - i n d u c e d I M M d e p o l a r i z a t i o n a n d m P T f o r m a t i o n w a s d e m o n s t r a t e d i n l i v e r m i t o c h o n d r i a f r o m H a Y ? 0 1 1 1 m i c e ( C h o o e t a l . , 2 0 0 4 ) , a n d s i m i l a r f i n d i n g s w e r e m a d e i n l y m p h o b l a s t m i t o c h o n d r i a f r o m H D p a t i e n t s ( P a n o v e t a l . , 2 0 0 2 ) . M i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e p o t e n t i a l s i n b r a i n s o f Y A C 7 2 m i c e w e r e a l s o m o r e d e p o l a r i z e d a t b a s e l i n e , a n d u n d e r w e n t a d d i t i o n a l d e p o l a r i z a t i o n f o l l o w i n g e x p o s u r e t o s m a l l e r l o a d s o f C a 2 + a s c o m p a r e d w i t h W T c o n t r o l s ( P a n o v e t a l . , 2 0 0 2 ) . O t h e r m e a s u r e s o f m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n s u c h a s A T P a n d c A M P l e v e l s a l s o i n d i c a t e d c o m p r o m i s e d e n e r g y p r o d u c t i o n c a p a c i t y , i n t h e s t r i a t u m o f HdhQ/[ 11 KI m i c e ( G i n e s e t a l . , 2 0 0 3 ) , a n d i n i m m o r t a l i z e d s t r i a t a l c e l l s f r o m t h i s s a m e m o u s e m o d e l ( S T H d r ? 0 1 1 1 ) ( G i n e s e t a l . , 2 0 0 3 ; S e o n g e t a l . , 2 0 0 5 ) . N o t s u r p r i s i n g l y , m h t t - e x p r e s s i n g c e l l s w h i c h e x h i b i t e d i m p a i r e d m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n a l s o d i s p l a y e d i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y t o t r e a t m e n t w i t h m i t o c h o n d r i a l t o x i n s ( S a w a e t a l . , 1 9 9 9 ; G i n e s e t a l . , 2 0 0 3 ; O l i v e i r a e t a l . , 2 0 0 6 ; S h e h a d e h e t a l . , 2 0 0 6 ) . A n o v e r a l l c o m p r o m i s e i n t h e a b i l i t y o f m i t o c h o n d r i a t o m a i n t a i n C a 2 + h o m e o s t a s i s o r t o m e e t t h e m e t a b o l i c d e m a n d s o f t h e c e l l , t h e n , w o u l d l i k e l y a c t s y n e r g i s t i c a l l y w i t h o t h e r m h t t - i n d u c e d , N M D A R - d e p e n d e n t p a t h w a y s t o p r o d u c e a d d i t i o n a l o x i d a t i v e d a m a g e . W i t h a c c u m u l a t i n g e v i d e n c e i n d i c a t i n g i m p a i r m e n t o f m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n f r o m 39 s t u d i e s i n b o t h H D p a t i e n t s a n d r o d e n t m o d e l s , w e d e v e l o p a n i n c r e a s i n g a w a r e n e s s o f t h e n o t i o n t h a t m i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o n g r e a t l y e n h a n c e s s e n s i t i v i t y o f s t r i a t a l n e u r o n s t o e x c i t o t o x i c d a m a g e i n H D . T o g e t h e r w i t h e v i d e n c e i n s u p p o r t o f a r o l e f o r a b e r r a n t N M D A R a c t i v i t y , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t s i g n a l i n g e v e n t s d o w n s t r e a m o f N M D A R a c t i v a t i o n a r e c r i t i c a l l y i m p o r t a n t i n s e l e c t i v e l y t a r g e t i n g s t r i a t a l n e u r o n s f o r d e g e n e r a t i o n i n H D . 1 . 4 . 3 . C a s p a s e A c t i v a t i o n B o t h n o r m a l a n d m u t a n t f o r m s o f htt c o n t a i n c o n s e n s u s c a s p a s e c l e a v a g e s e q u e n c e s ( W e l l i n g t o n e t a l . , 1 9 9 8 , 2 0 0 0 ) , a n d t h e y a r e i n d e e d s u b s t r a t e s f o r c l e a v a g e b y t h e s e e n z y m e s i n t h e h u m a n b r a i n ( W e l l i n g t o n e t a l . , 2 0 0 2 ) ; c e l l s w i t h i n t h e s t r i a t u m o f H D p a t i e n t s c o r r e s p o n d i n g l y s h o w e d s i g n s o f a p o p t o t i c d e a t h ( D r a g u n o w e t a l . , 1 9 9 5 ; S a n c h e z e t a l . , 1 9 9 9 ) . M o u s e m o d e l s o f H D r e v e a l e d s i g n i f i c a n t l y h i g h e r l e v e l s o f a c t i v e c a s p a s e - 3 i n d u c e d b y s t r e s s s t i m u l i ( S a w a e t a l . , 1 9 9 9 ; Z e r o n e t a l . , 2 0 0 2 ) , a n d i n h i b i t i o n o f c a s p a s e - m e d i a t e d c l e a v a g e o f htt e i t h e r b y p h a r m a c o l o g i c a l b l o c k a d e o f t h e e n z y m e o r b y g e n e t i c a b l a t i o n o f a c a s p a s e c l e a v a g e s i t e i n m h t t s u c c e s s f u l l y p r o t e c t e d a g a i n s t m h t t - i n d u c e d a p o p t o t i c d e a t h ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 2 ; G r a h a m e t a l . , 2 0 0 6 ) . T h e a p o p t o t i c c a s c a d e t h a t i s i n t u r n a c t i v a t e d b y m h t t a n d i t s c l e a v a g e p r o d u c t s i s b e l i e v e d t o b e m e d i a t e d a t l e a s t i n p a r t v i a m i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o n a n d / o r a c t i v a t i o n o f t h e i n t r i n s i c m i t o c h o n d r i a - d e p e n d e n t c a s p a s e c a s c a d e ( i n v o l v i n g c a s p a s e - 9 ) , s i n c e N M D A R - d e p e n d e n t a p o p t o s i s w a s r e d u c e d u p o n t r e a t m e n t b y i n h i b i t o r s o f t h e m P T o r o f c a s p a s e - 9 ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 4 ; T a n g e t a l . , 2 0 0 5 ) . 40 1 . 4 . 4 . C e l l u l a r T o x i c i t y a n d I n v o l v e m e n t o f N R 1 / N R 2 B - T y p e N M D A R s W h i l e it r e m a i n s a n i s s u e o f d e b a t e a s t o w h e t h e r t h e e x c i t o t o x i c c e l l d e a t h o b s e r v e d i n H D p a t i e n t s a n d a n i m a l / c e l l l i n e m o d e l s o f H D p r o c e e d s v i a a p o p t o t i c a n d / o r n e c r o t i c p a t h w a y s , a p l e t h o r a o f s t u d i e s h a v e i n v e s t i g a t e d t h e r o l e o f htt p o l y Q e x p a n s i o n i n m e d i a t i n g a n d m o d u l a t i n g N M D A R - d e p e n d e n t e x c i t o t o x i c i t y . A s m e n t i o n e d p r e v i o u s l y , d a t a f r o m m o u s e m o d e l s o f H D s t r o n g l y s u g g e s t e d s e n s i t i z a t i o n o f N M D A R s b y m h t t . O n e o f t h e f i r s t d e m o n s t r a t i o n s o f a f u n c t i o n a l i n t e r a c t i o n b e t w e e n htt p o l y Q e x p a n s i o n a n d c h a n g e s i n N M D A R a c t i v i t y , h o w e v e r , c a m e f r o m s t u d i e s u s i n g a r e l a t i v e l y s i m p l e a n d w e l l - c h a r a c t e r i z e d c e l l l i n e m o d e l , t h e h e t e r o l o g o u s h u m a n e m b r y o n i c k i d n e y ( H E K ) 2 9 3 c e l l s . C e l l s w e r e t r a n s f e c t e d t o c o - e x p r e s s t h e N R 1 / N R 2 B - t y p e N M D A R s w i t h f u l l - l e n g t h h u m a n h t t c o n t a i n i n g e i t h e r a n o r m a l ( 1 5 Q ) o r e x p a n d e d ( 1 3 8 Q ) p o l y Q t r a c t ( C h e n e t a l . , 1 9 9 9 b ) . In t h i s m o d e l , l a r g e r N M D A R - m e d i a t e d c u r r e n t s w e r e o b s e r v e d i n c e l l s t h a t c o - e x p r e s s e d h t t - 1 3 8 Q , r e l a t i v e t o h t t - 1 5 Q . A s p e c i f i c i n v o l v e m e n t o f t h e N R 2 B s u b u n i t w a s s u g g e s t e d d u e t o a l a c k o f e f f e c t o f m h t t e x p r e s s i o n o n c u r r e n t m e d i a t e d b y t h e N R 1 / N R 2 A - s u b t y p e o f N M D A R s i n t h i s s a m e s t u d y ( C h e n e t a l . , 1 9 9 9 b ) . S i m i l a r l y , u s e o f t h e s a m e t r a n s f e c t e d c e l l s y s t e m i n a s u b s e q u e n t s t u d y e x a m i n i n g N M D A R - d e p e n d e n t c e l l d e a t h s u g g e s t e d a n N R 2 B - s e l e c t i v e p a t h w a y ; t h e n u m b e r o f c e l l s s h o w i n g s i g n s o f a p o p t o t i c d e a t h w a s o n l y i n c r e a s e d f o r m h t t - e x p r e s s i n g c e l l s t h a t c o - e x p r e s s e d N R 1 / N R 2 B b u t n o t N R 1 / N R 2 A ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 1 ) . In a d i f f e r e n t s t u d y u s i n g i m m o r t a l i z e d h i p p o c a m p a l H N 3 3 c e l l s , t r a n s i e n t t r a n s f e c t i o n o f t h e c e l l s w i t h h t t - 4 8 Q , b u t n o t h t t - 1 6 Q , l e d t o s i g n i f i c a n t l y h i g h e r l e v e l s o f g l u t a m a t e - i n d u c e d a p o p t o s i s ( S u n e t a l . , 2 0 0 1 ) . T h e s e f i n d i n g s a n d r e s u l t s f r o m t h e H E K 2 9 3 c e l l l i n e w e r e c o r r o b o r a t e d b y f i n d i n g s i n t h e Y A C t r a n s g e n i c m o u s e m o d e l , 41 w h e r e N M D A - e v o k e d c u r r e n t a m p l i t u d e w a s g r e a t l y a u g m e n t e d i n c u l t u r e d s t r i a t a l M S N s f r o m Y A C 7 2 r e l a t i v e t o W T c o n t r o l s a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y i n s e c t i o n 1 . 3 . 2 ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 2 ) . E f f e c t s o f m h t t e x p r e s s i o n o n N M D A - i n d u c e d c e l l d e a t h w e r e a l s o e x a m i n e d i n c u l t u r e d s t r i a t a l M S N s , a n d M S N s f r o m Y A C t r a n s g e n i c m i c e d i s p l a y e d s i g n i f i c a n t l y a u g m e n t e d l e v e l s o f N M D A R - m e d i a t e d c e l l d e a t h i n c o m p a r i s o n t o W T , i n a p o l y Q l e n g t h - d e p e n d e n t m a n n e r ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 2 ; S h e h a d e h e t a l . , 2 0 0 6 ) . I n t e r e s t i n g l y , t h e e x t e n t o f m h t t - p o t e n t i a t e d a p o p t o t i c d e a t h i n Y A C 7 2 M S N s a p p e a r e d t o b e t i g h t l y c o r r e l a t e d w i t h c u r r e n t f l o w t h r o u g h N M D A R s , a s p h a r m a c o l o g i c a l r e d u c t i o n o f N M D A - i n d u c e d C a 2 + i n f l u x i n Y A C 7 2 M S N s t o W T l e v e l s l e d t o a c o r r e s p o n d i n g d e c r e a s e i n N M D A R - d e p e n d e n t a p o p t o s i s , a l s o t o W T l e v e l s ( S h e h a d e h e t a l . , 2 0 0 6 ) . A p o p t o t i c d e a t h w a s f o u n d t o b e e n h a n c e d i n c u l t u r e d M S N s f r o m Y A C 1 2 8 m i c e i n c o m p a r i s o n t o W T c o n t r o l s f o l l o w i n g g l u t a m a t e t r e a t m e n t , i n a N M D A R - a n d m G l u R - d e p e n d e n t m a n n e r ( T a n g e t a l . , 2 0 0 5 ; a l s o s e e F i g u r e 1 , p o i n t 3 ) . In c o n t r a s t , m o d u l a t i o n o f e x c i t o t o x i c c e l l d e a t h b y m h t t a p p e a r e d n o t t o i n v o l v e t h e A M P A R s u b c l a s s o f i G l u R s , s i n c e A M P A t r e a t m e n t o f c u l t u r e d M S N s l e d t o s i m i l a r a m o u n t s o f c e l l d e a t h r e g a r d l e s s o f htt p o l y Q l e n g t h ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 2 ) . A s p e c i f i c i n v o l v e m e n t o f t h e N R 2 B - c o n t a i n i n g N M D A R s w a s f u r t h e r c o n f i r m e d , a s p h a r m a c o l o g i c a l i n h i b i t i o n o f t h e N R 1 / N R 2 B - t y p e o f N M D A R s n o t o n l y r e d u c e d g l u t a m a t e - i n d u c e d d e a t h i n Y A C 1 2 8 M S N s ( T a n g e t a l . , 2 0 0 5 ) , b u t a l s o b l o c k e d m o r e t h a n h a l f o f t h e c u r r e n t a n d i n h i b i t e d t h e m a j o r i t y ( > 8 0 % ) o f N M D A - i n d u c e d c e l l d e a t h i n M S N s f r o m b o t h W T a n d Y A C 7 2 m i c e ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 2 ) . C u l t u r e d c e r e b e l l a r g r a n u l e n e u r o n s , w h i c h d o n o t e x p r e s s t h e N R 2 B s u b u n i t , w e r e e x a m i n e d i n p a r a l l e l a s a c o n t r o l ; s i m i l a r l e v e l s o f N M D A R - d e p e n d e n t c e l l d e a t h w e r e o b s e r v e d i n W T a n d Y A C 7 2 n e u r o n s ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 2 ) , c o n s i s t e n t w i t h a N R 2 B - s e l e c t i v e m e c h a n i s m o f m h t t - e l i c i t e d t o x i c i t y . T h e t o x i c i t y - p o t e n t i a t i n g e f f e c t o f m h t t e x p r e s s i o n , i n a d d i t i o n t o a c t i n g v i a 42 e n h a n c e m e n t o f N M D A R a c t i v i t y , l i k e l y a l s o i n v o l v e s i m p a i r i n g m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y , a n d t h e t w o e v e n t s a r e l i k e l y r e l a t e d . In f a c t , m o u n t i n g e v i d e n c e i m p l i c a t e s d y s f u n c t i o n a l N M D A R s i g n a l i n g t h r o u g h m i t o c h o n d r i a i n r e n d e r i n g M S N s m o r e s u s c e p t i b l e t o e x c i t o t o x i c d a m a g e i n t h e p r e s e n c e o f m h t t e x p r e s s i o n ( F i g u r e 1 , p o i n t 5 ) . A s t u d y b y S t o u t a n d c o - w o r k e r s ( 1 9 9 8 ) f o u n d m i t o c h o n d r i a l u p t a k e o f C a 2 + t o b e c r i t i c a l f o r N M D A R - d e p e n d e n t e x c i t o t o x i c i t y . T r e a t m e n t w i t h N M D A i n d u c e d s i g n i f i c a n t l y l a r g e r d e p o l a r i z a t i o n o f t h e I M M i n s t r i a t a l n e u r o n s f r o m Y A C 4 6 a n d Y A C 7 2 m i c e , i n c o m p a r i s o n t o W T ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 4 ) . S i m i l a r l y , f o r m a t i o n o f t h e m P T f o l l o w i n g g l u t a m a t e t r e a t m e n t , a s d e t e r m i n e d b y r e l e a s e o f c y t o c h r o m e c f r o m t h e i n t r a - m i t o c h o n d r i a l s p a c e i n t o t h e c y t o s o l , w a s m o r e r e a d i l y a p p a r e n t i n Y A C 1 2 8 M S N s r e l a t i v e t o c o n t r o l s ( T a n g e t a l . , 2 0 0 5 ) . C o n v e r s e l y , t r e a t m e n t o f M S N s f r o m Y A C t r a n s g e n i c m i c e w i t h m i t o c h o n d r i a l f u n c t i o n - p r o m o t i n g a g e n t s d r a m a t i c a l l y d e c r e a s e d b o t h t h e a c t i v a t i o n o f c a s p a s e s a n d t h e e x t e n t o f N M D A - e l i c i t e d a p o p t o t i c d e a t h ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 4 ) . T h e s e f i n d i n g s o n c e a g a i n c l e a r l y i m p l i c a t e a b e r r a n t N M D A R a c t i v i t y a n d r e l a t e d m i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o n i n t h e e n h a n c e m e n t o f e x c i t o t o x i c c e l l d e a t h b y m h t t , e v e n f r o m t h e b i r t h o f t h e a n i m a l . M o r e o v e r , s t u d i e s o n t h e r o l e o f m h t t m o d u l a t i o n o f N M D A R - m e d i a t e d t o x i c i t y i n m o u s e a n d c e l l l i n e m o d e l s o f H D , c o u p l e d w i t h t h e o b s e r v a t i o n o f t h e d i s p r o p o r t i o n a t e l o s s o f s t r i a t a l M S N s e x p r e s s i n g h i g h l e v e l s o f N M D A R s i n H D p a t i e n t s ( Y o u n g e t a l . , 1 9 8 8 ; A l b i n e t a l . , 1 9 9 0 ) a s w e l l a s a n e n r i c h m e n t o f N R 2 B - c o n t a i n i n g N M D A R s i n t h e s t r i a t u m v e r s u s o t h e r p a r t s o f t h e f o r e b r a i n ( L a n d w e h r m e y e r e t a l . , 1 9 9 5 ; G h a s e m z a d e h e t a l . , 1 9 9 6 ; R i g b y e t a l . , 1 9 9 6 ; S t a n d a e r t e t a l . , 1 9 9 9 ; C h r i s t i e e t a l . , 2 0 0 0 ; K u p p e n b e n d e r e t a l . , 2 0 0 0 ; L i e t a l . , 2 0 0 3 ) , s t r o n g l y s u g g e s t t h a t t h e N R 2 B s u b u n i t p l a y s a c e n t r a l r o l e i n p r o m o t i n g N M D A R - d e p e n d e n t t o x i c i t y i n H D p a t h o g e n e s i s . 43 1.5. Mechanisms Underlying mHtt-lnduced Alterations in NMDAR Signaling W h i l e m a n y s t u d i e s h a v e f o c u s e d o n c h a r a c t e r i z i n g t h e f u n c t i o n a l l i n k b e t w e e n N M D A R s a n d p o l y Q - e x p a n d e d h t t , t h e u n d e r l y i n g p h y s i c a l m e a n s o f a s s o c i a t i o n a n d t h e a c t u a l m e d i a t o r ( s ) o f m h t t a c t i o n o n N M D A R s r e m a i n l a r g e l y u n k n o w n . A n u m b e r o f t h e s e p o s s i b i l i t i e s a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 3 a n d s u m m a r i z e d i n t h e f o l l o w i n g p a r a g r a p h s . 1 . 5 . 1 . I n t e r a c t i o n s o f N M D A R s w i t h t h e A c t i n C S K a n d P S D - A s s o c i a t e d P r o t e i n s A v a s t n u m b e r o f p a t h w a y s c o n v e r g e o n N M D A R s t o r e g u l a t e t h e i r f u n c t i o n . O n e o f t h e s e p a t h w a y s i n v o l v e s i n t e r a c t i o n s w i t h c o m p o n e n t s o f t h e C S K , w h i c h i s k n o w n t o p l a y a n e s s e n t i a l r o l e i n m a i n t a i n i n g n o r m a l n e u r o n a l f u n c t i o n , a s w e l l a s p r o v i d i n g s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l r e g u l a t i o n t o r e c e p t o r s o n t h e p l a s m a m e m b r a n e ( D i n g l e d i n e e t a l . , 1 9 9 9 ) . P h y s i c a l l y a n d s t r u c t u r a l l y , t h i s r e g u l a t i o n t a k e s t h e f o r m o f m o d u l a t i o n o f r e c e p t o r t a r g e t i n g , a n c h o r i n g / c l u s t e r i n g , a n d r e m o v a l , w h i l e f u n c t i o n a l l y t h e c o m p o n e n t s o f t h e C S K s u c h a s m i c r o t u b u l e s , a c t i n f i l a m e n t s , a n d a s s o c i a t e d p r o t e i n s p a r t i c i p a t e i n t h e m o d u l a t i o n o f r e c e p t o r a c t i v i t y a n d t h e s i g n a l i n g p a t h w a y s d o w n s t r e a m o f r e c e p t o r a c t i v a t i o n ( A l l i s o n e t a l . , 1 9 9 8 , 2 0 0 0 ; r e v i e w e d i n D i n g l e d i n e e t a l . , 1 9 9 9 ) . S p e c i f i c a l l y , r e g u l a t i o n o f N M D A R s b y m i c r o t u b u l e s ( Y u e n e t a l . , 2 0 0 5 ) a n d b y t h e a c t i n C S K ( R o s e n m u n d a n d W e s t b r o o k , 1 9 9 3 ; A l l i s o n e t a l . , 1 9 9 8 ; L e i e t a l . , 2 0 0 1 ) h a s b e e n r e p o r t e d . T h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n N M D A R s a n d t h e a c t i n C S K i s n o t a d i r e c t o n e b u t r a t h e r i s t h o u g h t t o b e m e d i a t e d b y a c t i n - c r o s s l i n k i n g p r o t e i n s s u c h a s a - a c t i n i n s , w h i c h h a v e b e e n s h o w n t o d i r e c t l y b i n d N M D A R s u b u n i t s N R 1 a n d N R 2 B ( W y s z y n s k i e t a l . , 1 9 9 7 , 1 9 9 8 ; A l l i s o n e t a l . , 1 9 9 8 ; D u n a h e t a l . , 2 0 0 0 ; r e v i e w e d i n S h i r a o a n d S e k i n o , 2 0 0 1 ) . P r o p e r p o s t - s y n a p t i c l o c a l i z a t i o n a n d a n c h o r i n g o f t h e s y n a p t i c p o o l o f N M D A R s 44 a r e c r i t i c a l l y d e p e n d e n t o n a n i n t a c t a c t i n C S K , a s d e p o l y m e r i z a t i o n o f F - a c t i n r e s u l t e d i n a l o s s o f N M D A R s f r o m t h e P S D ( A l l i s o n e t a l . , 1 9 9 8 ) . C o n v e r s e l y , N M D A R a c t i v i t y h a s a l s o b e e n s h o w n t o r e g u l a t e t h e a c t i n C S K b y p r o m o t i n g a c t i n d e p o l y m e r i z a t i o n ( S h o r t e , 1 9 9 7 ) ; t h i s t h e n a f f e c t s t h e b i n d i n g o f C S K - a s s o c i a t e d p r o t e i n s t o N M D A R S w h i c h i n t u r n a l t e r s N M D A R f u n c t i o n ( E h l e r s e t a l . , 1 9 9 6 b ; W y s z y n s k i e t a l . , 1 9 9 7 ) . S i n c e a - a c t i n i n s a r e c r u c i a l f o r l i n k i n g N M D A R s t o a c t i n , m o d u l a t o r s o f t h e a - a c t i n i n / N M D A R i n t e r a c t i o n m a y a l s o r e g u l a t e N M D A R f u n c t i o n a n d / o r s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n . It i s t h e r e f o r e i n t e r e s t i n g t h a t o n e o f t h e a - a c t i n i n i s o f o r m s , a - a c t i n i n 4 , h a s b e e n s h o w n t o c o - i m m u n o p r e c i p i t a t e w i t h H I P - 1 i n H E K 2 9 3 c e l l s o v e r - e x p r e s s i n g t h e s e t w o p r o t e i n s ( C D . I c t o n , 2 0 0 1 M . S c . t h e s i s ) In a d d i t i o n t o r e g u l a t i o n b y t h e a c t i n C S K , m e m b e r s o f t h e M A G U K f a m i l y o f P S D - a s s o c i a t e d s c a f f o l d i n g p r o t e i n s h a v e a l s o b e e n i m p l i c a t e d i n t h e r e g u l a t i o n o f N M D A R d i s t r i b u t i o n a s e a r l y a s a d e c a d e a g o ( E h l e r s e t a l . , 1 9 9 6 a ) . S u c h s c a f f o l d i n g p r o t e i n s i n c l u d e P S D - 9 5 a n d S A P - 1 0 2 , a n d t h e s e P D Z - c o n t a i n i n g , C S K - a s s o c i a t e d p r o t e i n s h a v e b e e n r e p o r t e d t o n o t o n l y r e g u l a t e t r a f f i c k i n g , s u r f a c e e x p r e s s i o n a n d s y n a p t i c t a r g e t i n g o f N M D A R s b u t a l s o m o d u l a t e N M D A R f u n c t i o n a n d a c t i v i t y ( S a n s e t a l . , 2 0 0 0 , 2 0 0 3 ; R o c h e e t a l . , 2 0 0 1 ; L i n e t a l . , 2 0 0 4 ; r e v i e w e d i n C a r r o l l a n d Z u k i n , 2 0 0 2 ; W e n t h o l d e t a l . , 2 0 0 3 ) . M o r e o v e r , M A G U K f a m i l y m e m b e r s a r e k n o w n t o s c a f f o l d a w i d e a r r a y o f k i n a s e s / p h o s p h a t a s e s a n d o t h e r s i g n a l i n g m o l e c u l e s i n c l o s e p r o x i m i t y t o t h e N M D A R , a n d a s s u c h p l a y a p i v o t a l r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f c e l l u l a r s i g n a l i n g p a t h w a y s a r i s i n g f r o m N M D A R a c t i v a t i o n ( r e v i e w e d i n K i m a n d S h e n g , 2 0 0 4 ) . 1 . 5 . 2 . I n t e r a c t i o n o f N M D A R s a n d m H t t v i a P S D - 9 5 W h i l e n u m e r o u s p r o t e i n p a r t n e r s o f htt i n i t s n o r m a l a n d m u t a n t f o r m s h a v e b e e n 45 i d e n t i f i e d ( G o e h l e r e t a l . , 2 0 0 4 ; r e v i e w e d i n H a r j e s a n d W a n k e r , 2 0 0 3 ; L i a n d L i , 2 0 0 4 ; G i o r g i n i a n d M u c h o w s k i , 2 0 0 5 ) , t h e s e h t t - c o n t a i n i n g p r o t e i n c o m p l e x e s h a v e n o t b e e n r e p o r t e d t o c o n t a i n N M D A R s . H o w e v e r , o n e o f t h e s e h t t - b i n d i n g p a r t n e r s i s t h e P S D - l o c a l i z e d p r o t e i n P S D - 9 5 , w h i c h a s d e s c r i b e d a b o v e p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n r e g u l a t i n g t h e d i s t r i b u t i o n a n d f u n c t i o n o f N M D A R s . It w a s t h e r e f o r e p r o p o s e d t h a t htt a n d N M D A R s m a y b e p h y s i c a l l y l i n k e d v i a m u t u a l i n t e r a c t i o n s w i t h P S D - 9 5 ( S u n e t a l . , 2 0 0 1 ; S o n g e t a l . , 2 0 0 3 ; F i g u r e 3 , p o i n t 1) . K o r n a u a n d c o l l e a g u e s ( 1 9 9 5 ) f i r s t d e m o n s t r a t e d a d i r e c t i n t e r a c t i o n b e t w e e n P S D - 9 5 a n d t h e C - t e r m i n a l t a i l s o f N R 2 s u b u n i t s . S u b s e q u e n t l y P S D - 9 5 h a s b e e n s h o w n t o m o d u l a t e s u r f a c e N M D A R e x p r e s s i o n b y s t a b i l i z i n g t h e l a t t e r i n c e l l s u r f a c e c l u s t e r s ( R o c h e e t a l . , 2 0 0 1 ) a n d a l s o b y i n c r e a s i n g t h e r a t e o f N M D A R i n s e r t i o n t o t h e s u r f a c e ( L i n e t a l . , 2 0 0 4 ) . S t u d i e s f r o m b o t h t r a n s f e c t e d 2 9 3 T c e l l s a n d h u m a n c o r t i c a l t i s s u e i n d i c a t e d a n i n t e r a c t i o n o f htt w i t h P S D - 9 5 a n d t h e i r a s s o c i a t i o n w i t h N M D A R s u b u n i t s N R 1 , N R 2 A , a n d N R 2 B ( S u n e t a l . , 2 0 0 1 ) , s u g g e s t i n g a p h y s i c a l l i n k b e t w e e n htt a n d N M D A R s v i a i n t e r a c t i o n s w i t h P S D - 9 5 . T h e h t t / P S D - 9 5 i n t e r a c t i o n i s n o t i d e n t i c a l f o r W T a n d m u t a n t f o r m s o f h t t b u t i n s t e a d i s w e a k e n e d b y e x p a n s i o n o f t h e htt p o l y Q t r a c t ( S u n e t a l . , 2 0 0 1 ) . E c t o p i c e x p r e s s i o n o f m h t t l e d t o N M D A R - d e p e n d e n t a p o p t o s i s w h i c h w a s r e d u c e d b y c o - e x p r e s s i o n w i t h W T h t t , a n d f u n c t i o n a l l y , P S D - 9 5 m o d u l a t e s m h t t - t r i g g e r e d N M D A R - m e d i a t e d c e l l d e a t h b y a b o l i s h i n g t h e r e s c u e o f m h t t t o x i c i t y b y W T htt c o - e x p r e s s i o n ( S u n e t a l . , 2 0 0 1 ) . H e n c e e x p a n s i o n o f t h e htt p o l y Q t r a c t , b y r e d u c i n g t h e a s s o c i a t i o n b e t w e e n m h t t a n d P S D - 9 5 , m a y e f f e c t i v e l y i n c r e a s e t h e a m o u n t o f P S D - 9 5 t h a t i s a v a i l a b l e f o r b i n d i n g N M D A R s ( S u n e t a l . , 2 0 0 1 ) . N o t o n l y w o u l d s u c h a n i n c r e a s e r e s u l t i n s t a b i l i z e d e x p r e s s i o n a n d e n h a n c e d f u n c t i o n o f N M D A R s , b u t it c o u l d a l s o s e n s i t i z e m h t t - e x p r e s s i n g c e l l s t o N M D A R - m e d i a t e d t o x i c i t y b y p r o m o t i n g N M D A R a c t i v i t y - d e p e n d e n t n i t r i c o x i d e s y n t h a s e a c t i v a t i o n a n d t h e i n i t i a t i o n o f t o x i c 4 6 d o w n s t r e a m s i g n a l i n g e v e n t s ( S a t t l e r e t a l . , 1 9 9 9 ) . D e s p i t e t h e s e f i n d i n g s , h o w e v e r , it r e m a i n s u n c l e a r a s t o w h e t h e r s e n s i t i z a t i o n o f P S D - 9 5 - o v e r - e x p r e s s i n g c e l l s t o m h t t - i n d u c e d , N M D A R - d e p e n d e n t a p o p t o s i s i n d e e d r e f l e c t s a n a l t e r e d i n t e r a c t i o n b e t w e e n m h t t a n d P S D - 9 5 . D a t a f r o m o u r o w n l a b o r a t o r y f a i l e d t o r e v e a l d i f f e r e n c e s i n t h e a m o u n t o f P S D - 9 5 a s s o c i a t e d w i t h N M D A R s i n c o r t i c a l o r s t r i a t a l t i s s u e f r o m Y A C t r a n s g e n i c H D m i c e v e r s u s F V B / N W T m i c e ( C o w a n e t a l . , 2 0 0 5 ) . M o r e o v e r , l o c a l i z a t i o n o f P S D - 9 5 a t s y n a p s e s p r e c l u d e s t h e i n v o l v e m e n t o f t h i s p r o t e i n i n m e d i a t i n g e f f e c t s o f m h t t o n n o n - s y n a p t i c a l l y l o c a l i z e d N M D A R s . I n s t e a d , a p u t a t i v e r o l e f o r a c t i n - b i n d i n g p r o t e i n s i n r e g u l a t i n g N M D A R s a n d i n m e d i a t i n g t h e e f f e c t s o f m h t t o n N M D A R f u n c t i o n h a s b e e n i n v e s t i g a t e d a s p a r t o f m y r e s e a r c h a n d w i l l b e d i s c u s s e d i n g r e a t e r d e t a i l i n C h a p t e r 4 o f t h i s t h e s i s . 1 . 5 . 3 . P h o s p h o r y l a t i o n o f N M D A R s A p a r t f r o m i n t e r a c t i o n s w i t h b i n d i n g p r o t e i n s a n d t h e C S K , N M D A R a c t i v i t y i s a l s o r e g u l a t e d i n p a r t b y p o s t - t r a n s c r i p t i o n a l a n d p o s t - t r a n s l a t i o n a l e v e n t s . O n e o f t h e m o s t p r o m i n e n t p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s i n v o l v e s p h o s p h o r y l a t i o n , a n d N M D A R s u b u n i t s h a v e b e e n r e p o r t e d t o u n d e r g o p h o s p h o r y l a t i o n o n b o t h t y r o s i n e a n d s e r i n e / t h r e o n i n e r e s i d u e s . G e n e r a l l y s p e a k i n g , p h o s p h o r y l a t i o n o f N M D A R s o n t y r o s i n e s u b u n i t s b y t h e S r c f a m i l y o f n o n - r e c e p t o r p r o t e i n t y r o s i n e k i n a s e s ( S F K s ; s u c h a s S r c a n d F y n ) l e a d s t o i n c r e a s e d N M D A R c u r r e n t a n d s u r f a c e e x p r e s s i o n ( F i g u r e 3 , p o i n t 2 ) , w h i l e s e r i n e / t h r e o n i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f N M D A R s p r o m o t e s f o r w a r d t r a f f i c k i n g o f t h e s e r e c e p t o r s ( F i g u r e 3 , p o i n t 3 ) ( r e v i e w e d i n W a n g a n d S a l t e r , 1 9 9 4 ; S a l t e r a n d K a l i a , 2 0 0 4 ; W e n t h o l d e t a l . , 2 0 0 3 ; P r y b y l o w s k i a n d W e n t h o l d , 2 0 0 4 ) . C o n v e r s e l y , r e m o v a l o f p h o s p h o r y l g r o u p s f r o m N M D A R s u b u n i t s b y p r o t e i n t y r o s i n e p h o s p h a t a s e s c a u s e s a n 47 activity-dependent reduction of surface NMDAR expression as well as decreased NMDAR current (Wang et al., 1996; Li et al., 2002; reviewed in Wang and Salter, 1994; Salter and Kalia, 2004; Prybylowski and Wenthold, 2004). As mentioned earlier in this Introduction (see section 1.2.4), tyrosine-enriched motifs within the C-terminal tails of NR2 subunits play an important role in regulating receptor internalization and therefore the balance of NMDARs that are localized at the surface versus internally. Specifically, phosphorylation of Y837 in NR1 and the homologous residue Y842 in NR2A, as well as Y1472 in NR2B, decreases the binding of NMDARs to the clathrin adapter protein AP-2 (Roche et al., 2001; Vissel et al., 2001; reviewed in Prybylowski and Wenthold, 2004). Because AP-2 binding is necessary for clathrin-dependent endocytosis, reduced AP-2 binding results in stabilized NMDAR expression at the surface. Interestingly, polyQ expansion in htt was shown to alter tyrosine phosphorylation on NR2B in at least one study; levels of tyrosine-phosphorylated NR2B (pY-NR2B) were significantly increased in transfected 293T or HN33 cells expressing htt-48Q, in comparison to htt-16Q-expressing cells (Song et al., 2003). Triply mutating the tyrosine residues on NR2B or treatment with a Src inhibitor had similar effects on htt-48Q-induced apoptotic death as did blocking NMDAR activity by the competitive inhibitor AP-5, suggesting NR2B phosphorylation by Src may play a role in mediating mhtt toxicity by sensitizing cells to excitotoxic stimuli (Song et al., 2003). Whether expression of mhtt in more physiologically relevant systems in fact modulates tyrosine phosphorylation status of NMDARs remains an issue of debate, however, since similar levels of tyrosine-phosphorylated NR2A and NR2B have been found in WT and R6/2 HD mice (Luthi-Carteretal., 2003). Regulation by protein serine/threonine kinases has also been implicated in the 48 m o d u l a t i o n o f N M D A R t r a f f i c k i n g a n d a c t i v i t y . P h o s p h o r y l a t i o n s i t e s f o r t h e p r o t e i n s e r i n e / t h r e o n i n e k i n a s e , p r o t e i n k i n a s e C ( P K C ) , h a v e b e e n i d e n t i f i e d o n N M D A R s u b u n i t s N R 1 , N R 2 A , a n d N R 2 B ( T i n g l e y e t a l . , 1 9 9 7 ; L e o n a r d a n d H e l l , 1 9 9 7 ) . P K C a c t i v a t i o n n o t o n l y i n c r e a s e d t h e a m p l i t u d e o f N M D A R c u r r e n t s , b u t a l s o e n h a n c e d N M D A R c h a n n e l o p e n p r o b a b i l i t y , i n b o t h Xenopus o o c y t e s a n d n e u r o n s ( G e r b e r e t a l . , 1 9 8 9 ; C h e n a n d H u a n g , 1 9 9 2 ; X i o n g e t a l . , 1 9 9 8 ; Z h e n g e t a l . , 1 9 9 9 ; L a n e t a l . , 2 0 0 1 ) . In a d d i t i o n , a c t i v a t i o n o f P K C p r o m o t e d d e l i v e r y o f n e w N M D A R s t o t h e c e l l s u r f a c e v i a a s o l u b l e N - e t h y l m a l e i m i d e - s e n s i t i v e f u s i o n p r o t e i n ( N S F ) a t t a c h m e n t p r o t e i n r e c e p t o r ( S N A R E ) - d e p e n d e n t e x o c y t i c p a t h w a y , a l t h o u g h it w a s u n c l e a r w h e t h e r d i r e c t p h o s p h o r y l a t i o n o f N M D A R s b y P K C w a s i n v o l v e d i n t h i s p r o c e s s ( L a n e t a l . , 2 0 0 1 ) . A p a r t f r o m t h e P K C p h o s p h o r y l a t i o n s i t e s a t S 8 9 0 a n d S 8 9 6 , t h e N R 1 s u b u n i t i s a l s o p h o s p h o r y l a t e d o n S 8 9 7 b y t h e c A M P - d e p e n d e n t p r o t e i n s e r i n e / t h r e o n i n e k i n a s e p r o t e i n k i n a s e A ( P K A ) ( T i n g l e y e t a l . , 1 9 9 7 ) . I n d e e d , P K A a c t i v i t y h a s a l s o b e e n i m p l i c a t e d i n t h e r e g u l a t i o n o f N M D A R f u n c t i o n ( R a m a n e t a l . , 1 9 9 6 ; W e s t p h a l e t a l . , 1 9 9 9 ) . P h o s p h o r y l a t i o n o f N R 1 a t S 8 9 6 b y P K C a n d a t S 8 9 7 b y P K A t o g e t h e r s u p p r e s s e s t h e R X R E R r e t e n t i o n s i g n a l w i t h i n t h e C 1 c a s s e t t e a n d , i n s o d o i n g , f a c i l i t a t e s f o r w a r d t r a f f i c k i n g o f N M D A R s a n d t h e i r e x i t f r o m t h e E R ( S c o t t e t a l . , 2 0 0 1 , 2 0 0 3 ) . S t u d i e s a t t e m p t i n g t o f i n d c o r r e l a t i o n s b e t w e e n P K A a c t i v i t y a n d m h t t p o l y Q l e n g t h h a v e s o f a r y i e l d e d c o n f l i c t i n g r e s u l t s . W h i l e s t r i a t a l M S N s f r o m R 6 / 2 m i c e d i s p l a y e d i n c r e a s e d s t a i n i n g i n t e n s i t y f o r N R 1 - p S 8 9 7 ( A r i a n o e t a l . , 2 0 0 5 ) , s t r i a t a l t i s s u e f r o m N 1 7 1 - 8 2 Q H D m i c e e x p r e s s e d r e d u c e d l e v e l s o f N R 1 - p S 8 9 7 r e l a t i v e t o W T l i t t e r m a t e s ( J a r a b e k e t a l . , 2 0 0 4 ) . I n c r e a s e d p h o s p h o r y l a t i o n a t e i t h e r S 8 9 6 o r b o t h S 8 9 6 a n d S 8 9 7 ( t h r o u g h t h e u s e o f a n a n t i b o d y t h a t d i d n o t d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e s i n g l y o r d u a l l y p h o s p h o r y l a t e d f o r m s ) w a s n o t e d i n s t r i a t a l t i s s u e f r o m Y A C 7 2 a n d Y A C 1 2 8 m i c e ( C . 49 C o w a n a n d L . A . R a y m o n d , u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) , a s w e l l a s i n t r a n s i e n t l y t r a n s f e c t e d H E K 2 9 3 c e l l s o v e r - e x p r e s s i n g N M D A R s a l o n g w i t h h t t - 1 3 8 Q ( C . S u t t o n a n d L . A . R a y m o n d , u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) . H e n c e t h e e f f e c t s o f h t t p o l y Q e x p a n s i o n o n N M D A R p h o s p h o r y l a t i o n b y P K A / P K C r e m a i n i n c o m p l e t e l y u n d e r s t o o d , w i t h f u r t h e r w o r k w a r r a n t e d t o c l a r i f y t h e r o l e t h a t P K A / P K C m a y p l a y i n m e d i a t i n g m h t t - i n d u c e d N M D A R - d e p e n d e n t t o x i c i t y , if a n y . 1 . 5 . 4 : O t h e r P o s s i b l e M e c h a n i s m s o f M o d u l a t i o n o f N M D A R A c t i v i t y b y m H t t W h i l e c h a n g e s i n s i n g l e c h a n n e l p r o p e r t i e s m a y c o n t r i b u t e t o a l t e r e d N M D A R f u n c t i o n , e v i d e n c e f r o m o u r l a b o r a t o r y s u g g e s t e d u n a l t e r e d s i n g l e c h a n n e l c o n d u c t a n c e a n d o p e n p r o b a b i l i t y o f r e c e p t o r s r e g a r d l e s s o f h t t p o l y Q l e n g t h ( C h e n e t a l . , 1 9 9 9 b ) . O u r i n v e s t i g a t i o n h a s t h e r e f o r e f o c u s e d o n o t h e r a s p e c t s o f N M D A R r e g u l a t i o n , s u c h a s c h a n g e s i n n u m b e r s o f f u n c t i o n a l r e c e p t o r s . N M D A R s o n l y b e c o m e p h y s i o l o g i c a l l y a c t i v e o n c e t h e y a r e o n t h e c e l l s u r f a c e , e i t h e r s y n a p t i c a l l y o r e x t r a - s y n a p t i c a l l y . C h a n g e s i n r e c e p t o r a c t i v i t y c a n t h e r e f o r e r e s u l t n o t o n l y f r o m a l t e r e d t o t a l e x p r e s s i o n o f t h e p r o t e i n , b u t a l s o f r o m p e r t u r b e d s u r f a c e e x p r e s s i o n a n d / o r a l t e r e d s u r f a c e - t o - i n t e r n a l r a t i o o f d i s t r i b u t i o n . T o d a t e h o w e v e r m o s t s t u d i e s h a v e r e p o r t e d u n c h a n g e d o r d e c r e a s e d e x p r e s s i o n o f N M D A R s u b u n i t p r o t e i n s a n d m R N A s i n a v a r i e t y o f c e l l l i n e a n d m o u s e m o d e l s o f H D ( C h a e t a l . , 1 9 9 9 ; L u t h i - C a r t e r e t a l . , 2 0 0 0 ; 2 0 0 3 ; L i e t a l . , 2 0 0 3 ; J a r a b e k e t a l . , 2 0 0 4 ; A N a n d L e v i n e , 2 0 0 6 ; t h e p r e s e n t s t u d y , s e e s e c t i o n 3 . 1 ) . T h e r e f o r e , a r o l e f o r a l t e r e d N M D A R s u r f a c e e x p r e s s i o n i n m e d i a t i n g t h e e n h a n c e d N M D A - i n d u c e d c u r r e n t a n d t o x i c i t y r e m a i n s t o b e e x p l o r e d . 50 1.6. Hypothesis and Rationale T h e b u l k o f e v i d e n c e a m a s s e d t o d a t e a n d d i s c u s s e d i n t h e p r e c e d i n g s e c t i o n s s u g g e s t s t h a t , n o t o n l y d o e s e x p r e s s i o n o f f u l l - l e n g t h m h t t r e n d e r s t r i a t a l n e u r o n s m o r e i n t r i n s i c a l l y v u l n e r a b l e t o s t r e s s , it a l s o a u g m e n t s N M D A R a c t i v i t y ( e s p e c i a l l y t h a t o f t h e N R 1 / N R 2 B s u b t y p e ) i n t h e s e c e l l s s u c h t h a t i n t r a c e l l u l a r C a 2 + h o m e o s t a s i s i s a l t e r e d , d e g r a d a t i v e p a t h w a y s i n v o l v i n g c a t a b o l i c e n z y m e s a r e a c t i v a t e d , a n d R O S a r e g e n e r a t e d f r o m d y s f u n c t i o n a l m i t o c h o n d r i a w h i c h u n d e r g o t h e m P T . T o a d d f u r t h e r t o n e u r o n a l d a m a g e a n d d y s f u n c t i o n , p r o t e o l y t i c c l e a v a g e o f m h t t c o m b i n e s w i t h a b e r r a n t n u c l e a r t a r g e t i n g t o d i s r u p t c e l l u l a r t r a n s c r i p t i o n a s w e l l a s a l t e r i n t e r a c t i o n s o f htt w i t h o t h e r p r o t e i n s , m e m b r a n o u s o r g a n e l l e s , a n d c o m p o n e n t s o f t h e U P S . G i v e n t h e a m o u n t o f d a m a g e t h a t p o l y Q - e x p a n d e d htt c a n d o e v e n f r o m t h e t i m e o f b i r t h , it s e e m s s u r p r i s i n g t h a t p a t i e n t s a n d a n i m a l s c a r r y i n g t h e HD g e n e d o n o t s u c c u m b t o d i s e a s e a n y e a r l i e r t h a n t h e y d o . In f a c t , n e u r o n a l l o s s i s m a n i f e s t e d c l o s e t o t h e t i m e o f c l i n i c a l o n s e t , w h i c h u s u a l l y o c c u r s i n m i d d l e a g e . O n t h e b a s i s o f t h e s e a n d o t h e r f i n d i n g s , t h e n , w e p o s t u l a t e t h a t e x p r e s s i o n o f m h t t f r o m t h e d i s e a s e a l l e l e ( s ) l e a d s t o a l t e r e d N M D A R f u n c t i o n a n d c h a n g e s i n o t h e r c e l l u l a r f u n c t i o n s t h a t d e l i v e r a n e x c i t o t o x i c y e t s u b - l e t h a l i n s u l t t o t h e n e u r o n s , e v e n a t b i r t h . T h e s e c h a n g e s , a l t h o u g h i n s u f f i c i e n t o n t h e i r o w n t o c a u s e c e l l u l a r d e m i s e i n y o u n g n e u r o n s , n e v e r t h e l e s s r e n d e r m h t t - e x p r e s s i n g n e u r o n s s e n s i t i z e d t o g l u t a m a t e r g i c i n p u t a n d a s s u c h s u b j e c t t h e m t o c h r o n i c e x c i t o t o x i c d a m a g e . A l t h o u g h c e l l s t h a t e x p r e s s m h t t w i l l a d a p t t o i t s t o x i c a c t i o n s b y t r i g g e r i n g a p r o g r a m o f c o m p e n s a t o r y s e l f - d e f e n s e p a t h w a y s , t h e s e m e c h a n i s m s w i l l b e c o m e l e s s e f f e c t i v e w i t h i n c r e a s i n g a g e . L i k e w i s e t h e U P S s y s t e m , w h i c h n o r m a l l y p e r f o r m s t h e f u n c t i o n o f r e m o v i n g m i s f o l d e d o r o t h e r w i s e t o x i c m o l e c u l e s f r o m t h e c e l l , b e c o m e s 51 i n c r e a s i n g l y p r o n e t o f a i l u r e a s t h e n e u r o n a g e s . E v e n t u a l l y t h e a m o u n t o f d a m a g e d o n e t o t h e c e l l e x c e e d s i t s c a p a c i t y f o r r e p a i r a n d / o r d e f e n s e , a n d t h e c e l l b e c o m e s d y s f u n c t i o n a l a n d d i e s . In t h e f a c e o f t h e m a n y t h e r a p i e s b e i n g t e s t e d i n c l i n i c a l t r i a l s w h i c h g e n e r a l l y d o n o t p r o d u c e t h e s a m e b e n e f i c i a l e f f e c t s i n h u m a n p a t i e n t s a s t h e y d o i n H D m i c e , a m o r e t h o r o u g h u n d e r s t a n d i n g o f t h e p a t h w a y s a c t i v a t e d b y m h t t u n d e r l y i n g a b e r r a n t N M D A R s i g n a l i n g i s a b s o l u t e l y r e q u i r e d . T h e w o r k i n t h i s t h e s i s t e s t s t h e f o l l o w i n g h y p o t h e s e s : (1) p o t e n t i a t i o n o f N M D A - i n d u c e d c u r r e n t a n d t o x i c i t y a s o b s e r v e d i n t h e Y A C H D m o u s e m o d e l ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 2 ; S h e h a d e h e t a l . , 2 0 0 6 ) m a y b e c o r r e l a t e d w i t h c h a n g e s i n s u r f a c e N M D A R e x p r e s s i o n a n d / o r a l t e r e d r e c e p t o r t r a f f i c k i n g t o / f r o m t h e c e l l s u r f a c e ; ( 2 ) t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e C S K - a s s o c i a t e d p r o t e i n a - a c t i n i n 4 a n d H I P - 1 a s d e m o n s t r a t e d i n t r a n s f e c t e d H E K 2 9 3 c e l l s ( C D . I c t o n , 2 0 0 1 M . S c . t h e s i s ) m a y a l s o b e p r e s e n t i n t h e s t r i a t u m in vivo t o f a c i l i t a t e a p h y s i c a l i n t e r a c t i o n b e t w e e n htt a n d N M D A R s ; a n d ( 3 ) c o - e x p r e s s i o n o f m h t t w i t h N R 1 / N R 2 B - t y p e N M D A R s m a y l e a d t o c h a n g e s i n t h e e x p r e s s i o n a n d / o r d i s t r i b u t i o n o f s e v e r a l c l a s s e s o f p r o t e i n s i n c l u d i n g p r o t e i n k i n a s e s , p r o t e i n p h o s p h a t a s e s , a n d h e a t s h o c k / s t r e s s - r e l a t e d p r o t e i n s t h a t i m p a c t c e l l f u n c t i o n a n d v u l n e r a b i l i t y t o a p o p t o s i s . . 52 Transgenic for N-terminal fragment of human mhtt Transgenic for full-length human mhtt Endogenous mouse htt with KI of polyQ sequence R671, R6/2 N171 tgHDIOO YAC4S. YAC72, YAC128 11HD48, flHD89 CAG80 CAG94 HdIiQ?l, HdhQlW References 1 2 3 4,5 6 7 8 9 Promoter Human Prion RatNSE Hiunan CMV Murine Murine Murine Transcript Exon 1 cDNA for N-terminal 171aa cDNA for N-terrninal 3kb All 67 exons All 67 exons CAG knock-in CAG knock-in CAG knock-in » CAG repeats 120.150 82 100 46, 72, 128 48.89 80 94 92, 111 Striatal NMDAR protein expression NR1 unchanged or increased, NR2A'NR2B decreased NR2A transiently decreased N.R. NR1/NR2B unchanged mYAC46 or YAC72 NR. N.R. N.R. N.R. Electrophysiological properties Altered N.R. Altered Altered N.R. N.R. Altered Altered Hippocampal and'or striatal LTP/LTD Altered NR. N.R. Altered NR. Altered N.R. N.R. Striatal NMDAR-current Increased NR. Increased Increased N.R. N.R. NR. N.R. Striatal NMDAR-Ca"* or cell swelling response Increased N.R. Increased Increased N.R. N.R. Increased N.R. Striatal NMDAR-mitochondrial membrane depolarization NR. NR. N.R. Increased NR. N.R. N.R. N.R. Cellular energy metabolism NR. N.R. N.R. NR. Normal N.R. N.R. Impaired Striatal NMDAR toxicity No change early, resistant late Resistant late Not different fromWT Increased; remains susceptible NR. N.R. N.R. N.R. Neuronal loss No No Relatively small loss Yes Yes No N.R. No Aggregate formation Widespread Nils Nils and diffuse, nuclear mhtt accumulation Nns Nils Few Nils Nils form late No Nils ' Table 1. Summary of referenced HD mouse models (adapted from Fan and Raymond, 2006). 1 , M a n g i a r i n i e t a l . , 1 9 9 6 ; 2 , S c h i l l i n g e t a l . , 1 9 9 9 ; 3 , L a f o r e t e t a l . , 2 0 0 1 ; 4 , H o d g s o n e t a l . , 1 9 9 9 ; 5 , S l o w e t a l . , 2 0 0 3 ; 6 , R e d d y e t a l . , 1 9 9 8 ; 7 , S h e l b o u r n e e t a l . , 1 9 9 9 ; 8 , L e v i n e e t a l . , 1 9 9 9 ; 9 , W h e e l e r e t a l . , 2 0 0 0 . C M V , c y t o m e g a l o v i r u s ; N i l , n e u r o n a l i n t r a n u c l e a r i n c l u s i o n ; N . R . , n o t r e p o r t e d ; N S E , n e u r o n - s p e c i f i c e n o l a s e ; W T , w i l d - t y p e . F o r o t h e r m o d e l s , s e e w w w . h d f o u n d a t i o n . o r g / P D F / h d m i c e t a b l e . p d f 53 Figure 1. Car toon of p o s s i b l e points a long the cort icost r iata l pathway where dys funct ion may contr ibute to exc i totox ic i ty (Fan and R a y m o n d , 2006). Excitotoxic neuronal death may result from a combination of: (1) increased glutamate release from cortical afferents; (2) reduced uptake of glutamate by glia; (3) hypersensitivity of post-synaptic NMDARs and/or augmentation of mGluR signaling; (4) altered intracellular calcium homeostasis; (5) mitochondrial dysfunction. 54 Subunit Assembly Agonist Binding extracellular intracellular Pore*** CO C1 co • • CO C1 C2' I CO NR1-1a/b NR1-2a/b NR1-3a/b NR1-4a/b Figure 2. Cartoon of NR1 membrane topology and C-terminal splice variants. The pore-forming M2 re-entrant loop region and extracellular regions mediating subunit assembly and binding of agonist are shown for the NR1 subunit. The different combinations of alternatively spliced cassettes within the NR1 C-terminal tail are also illustrated. 55 Cortical presynaptic terminal Striatal MSN post-synaptic spine F i g u r e 3. C a r t o o n o f p o s s i b l e m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g p o t e n t i a t i o n o f N M D A R a c t i v i t y b y m h t t ( F a n a n d R a y m o n d , 2 0 0 6 ) . M u t a n t htt m a y e n h a n c e N M D A R f u n c t i o n b y : ( 1 ) a c t i n g t h r o u g h P S D - 9 5 t o m o d u l a t e N M D A R f u n c t i o n ; ( 2 ) i n c r e a s i n g t y r o s i n e p h o s p h o r y l a t i o n o f N M D A R s b y n o n - r e c e p t o r t y r o s i n e k i n a s e s , s u c h a s S r c f a m i l y k i n a s e s ( S F K s ) , t o s t a b i l i z e s u r f a c e r e c e p t o r e x p r e s s i o n ; ( 3 ) a l t e r i n g s e r i n e / t h r e o n i n e p h o s p h o r y l a t i o n o n N M D A R s t o m o d u l a t e r e c e p t o r f u n c t i o n a n d / o r p r o m o t e f o r w a r d t r a f f i c k i n g f r o m E R / G o l g i . 56 CHAPTER 2. MATERIALS AND METHODS 2 . 1 . Transgenic Mice 2 . 1 . 1 . B r e e d i n g a n d M a i n t e n a n c e o f M i c e M i c e w e r e b r e d f r o m p a i r s o f F V B / N W T m i c e o r h o m o z y g o u s y e a s t a r t i f i c i a l c h r o m o s o m e ( Y A C ) t r a n s g e n i c m i c e o n a p u r e F V B / N s t r a i n b a c k g r o u n d ( H o d g s o n e t a l . , 1 9 9 9 ; S l o w e t a l . , 2 0 0 3 ; L e a v i t t e t a l . , 2 0 0 6 ) . Y A C 4 6 ( 6 6 8 l i n e ) , Y A C 7 2 ( 2 5 1 1 l i n e ) , a n d Y A C 1 2 8 ( l i n e 5 5 ) m i c e w e r e u s e d a s m o d e l s e x p r e s s i n g f u l l - l e n g t h h u m a n m h t t c o n t a i n i n g 4 6 , 7 2 , o r 1 2 8 p o l y Q r e p e a t s ( 4 6 Q , 7 2 Q , o r 1 2 8 Q ) . T h e s e w e r e c o m p a r e d t o F V B / N W T m i c e , o r t o Y A C 1 8 ( 2 1 2 l i n e ) t h a t e x p r e s s f u l l - l e n g t h h u m a n htt w i t h a n o n - p a t h o g e n i c n u m b e r ( 1 8 Q ) o f p o l y Q r e p e a t s . A l l m i c e w e r e b r e d a n d m a i n t a i n e d i n a n e n r i c h e d e n v i r o n m e n t a n d a c c o r d i n g t o C a n a d i a n C o u n c i l o n A n i m a l C a r e ( C C A C ) g u i d e l i n e s . 2 . 1 . 2 . P r i m a r y C u l t u r e o f M o u s e S t r i a t a l M S N s P r i m a r y c u l t u r e s o f s t r i a t a l M S N s w e r e p r e p a r e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 2 ) . B r i e f l y , s t r i a t a l t i s s u e w a s d i s s e c t e d f r o m p o s t n a t a l d a y 0 - 1 ( P 0 - P 1 ) F V B / N W T , Y A C 1 8 , Y A C 7 2 , o r Y A C 1 2 8 m i c e i n i c e - c o l d d i v a l e n t - f r e e H a n k s ' B a l a n c e d S a l t S o l u t i o n ( H B S S ; I n v i t r o g e n C a n a d a I n c . , B u r l i n g t o n , O N ) . S t r i a t a w e r e m a n u a l l y c u t i n t o s m a l l p i e c e s a n d i n c u b a t e d f o r ~ 1 0 m i n u t e s a t 3 7 ° C i n H B S S c o n t a i n i n g ~ 4 0 u n i t s / m l p a p a i n b e f o r e b e i n g t r a n s f e r r e d t o n e u r o b a s a l m e d i u m ( N B M ; I n v i t r o g e n C a n a d a I n c . , 57 B u r l i n g t o n , O N ) s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 2 5 % ( w / v ) b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) , 0 . 2 5 % ( w / v ) t r y p s i n i n h i b i t o r , a n d 2 0 p g / m l D N A s e . C e l l s w e r e t h e n d i s s o c i a t e d b y r e p e a t e d p a s s a g e t h r o u g h a g r a d e d s e r i e s o f P a s t e u r p i p e t t e s w i t h s u c c e s s i v e l y s m a l l e r b o r e s i z e s , a n d w e r e s u b s e q u e n t l y s e e d e d o n t o 6 0 - m m d i s h e s o r 2 4 - w e l l p l a t e s c o n t a i n i n g f l a m e - s t e r i l i z e d 1 2 - m m r o u n d g l a s s c o v e r s l i p s ( P a u l M a r i e n f e l d G m b H & C o . K G , L a u d a - K o n i g s h o f e n , G e r m a n y ) t h a t w e r e p r e - c o a t e d w i t h 5 0 p g / m l l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t ( M W 3 0 , 0 0 0 - 7 0 , 0 0 0 ) p o l y - D - l y s i n e ( P D L ) . C e l l s w e r e s e e d e d a t a d e n s i t y o f - 0 . 6 t o 1 x 1 0 6 c e l l s / m l a n d m a i n t a i n e d i n p l a t i n g m e d i u m c o n s i s t i n g o f N B M s u p p l e m e n t e d w i t h 2 % (v/v) B 2 7 ( I n v i t r o g e n C a n a d a I n c . , B u r l i n g t o n , O N ) , 2 m M g l u t a m i n e , a n d 1 0 0 u n i t s / m l p e n i c i l l i n - s t r e p t o m y c i n ( I n v i t r o g e n C a n a d a I n c . , B u r l i n g t o n , O N ) i n a h u m i d i f i e d w a t e r - j a c k e t e d i n c u b a t o r a t 3 7 ° C 5 % CO2. H a l f o f t h e e x i s t i n g m e d i u m w a s r e p l a c e d w i t h f r e s h m e d i u m a t ~ 4 t o 5 d a y s in vitro ( d . i . v . ) , a n d c e l l s w e r e u s e d f o r e x p e r i m e n t s a t 9 - 1 0 d . i . v . U n d e r o u r s t r i a t a l c u l t u r e c o n d i t i o n s , ~ 8 5 % o f c e l l s s h o w e d f e a t u r e s c h a r a c t e r i s t i c o f M S N s w h i l e - 9 % w e r e a s t r o c y t e s ( S h e h a d e h e t a l . , 2 0 0 6 ) . 2 . 1 . 2 . 1 . T r a n s f e c t i o n o f C u l t u r e d S t r i a t a l M S N s w i t h P l a s m i d D N A T o i n t r o d u c e p l a s m i d D N A i n t o n e u r o n s , p r i m a r y s t r i a t a l M S N s c u l t u r e d o n P D L - c o a t e d g l a s s c o v e r s l i p s w e r e t r a n s f e c t e d u s i n g t h e c a l c i u m p h o s p h a t e ( C a P ) m e t h o d . T o p r e p a r e f o r t r a n s f e c t i o n , m i n i m u m e s s e n t i a l m e d i u m ( M E M ) s u p p l e m e n t e d w i t h L - g l u t a m i n e ( t o 2 m M ) , s o d i u m p y r u v a t e (to 1 m M ) , p e n i c i l l i n - s t r e p t o m y c i n ( t o 1 0 0 u n i t s / m l ) , f e t a l b o v i n e s e r u m ( F B S ; t o 1 0 % ) a n d B 2 7 ( t o 2 % ) ( B 2 7 / M E M + s o l u t i o n ) w a s e q u i l i b r a t e d a t 3 7 ° C 0 - 0 . 3 % C 0 2 f o r 1 0 m i n u t e s . C o v e r s l i p s o f c u l t u r e d M S N s a t 7 d . i . v . w e r e t h e n t r a n s f e r r e d t o 6 0 - m m d i s h e s c o n t a i n i n g p r e - e q u i l i b r a t e d B 2 7 / M E M + s o l u t i o n a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C 0 - 0 . 3 % CO2 f o r 3 0 m i n u t e s p r i o r t o t r a n s f e c t i o n . F o r a n a l y s i s o f 58 t h e e f f e c t s o f H I P - 1 o v e r - e x p r e s s i o n o n N R 1 s u r f a c e e x p r e s s i o n , c e l l s w e r e c o - t r a n s f e c t e d w i t h p l a s m i d D N A c o n s t r u c t s e n c o d i n g g r e e n f l u o r e s c e n t p r o t e i n ( G F P ) a n d H I P - 1 , a t 1 0 pg t o t a l D N A ( c o m p r i s i n g 5 pg e a c h o f G F P a n d H I P - 1 , o r 1 0 pg o f G F P a l o n e a s c o n t r o l ) p e r 6 0 - m m d i s h . A l i q u o t s o f p l a s m i d D N A w e r e p r e p a r e d b y m i x i n g w i t h 1 / 1 0 t h v o l u m e o f 3 M s o d i u m a c e t a t e a n d t h r e e v o l u m e s o f 1 0 0 % E t O H . A f t e r b r i e f c e n t r i f u g a t i o n , p l a s m i d D N A s a m p l e s w e r e t o p p e d u p t o 1 4 0 0 u l f i n a l v o l u m e w i t h 1 0 0 % E t O H i n a 1 . 5 - m l m i c r o f u g e t u b e a n d c e n t r i f u g e d f o r 2 0 m i n u t e s a t 1 4 , 0 0 0 r p m a t 4 ° C t o p r e c i p i t a t e t h e D N A . T h e n u c l e i c a c i d p e l l e t w a s t h e n r e s u s p e n d e d i n 2 2 5 pl o f 0 . 1 x T r i s - E D T A b u f f e r ( 0 . 1 x T E : 2 . 5 m M T r i s , 0 . 3 2 m M E D T A p H 7 . 4 ) , m i x e d w i t h 2 5 pl o f 2 . 5 M C a C I 2 a n d 2 5 0 pl o f 2 x B E S s o l u t i o n ( c o n t a i n i n g , i n m M : 2 8 0 N a C l , 1 . 5 N a 2 H P 0 4 , 5 0 B E S p H 6 . 9 6 ) . T h e t r a n s f e c t i o n m i x w a s a d d e d t o c o v e r s l i p s o f M S N s i n a 6 0 - m m d i s h i n 5 m l o f B 2 7 / M E M + , a t 5 0 0 pl p e r 6 0 - m m d i s h o f c e l l s . T r a n s f e c t e d c e l l s w e r e i n c u b a t e d f o r 2 t o 3 h o u r s a t 3 7 ° C 0 - 0 . 3 % C 0 2 u n t i l f o r m a t i o n o f c a l c i u m p h o s p h a t e c r y s t a l s b e c a m e e v i d e n t . A t t h e e n d o f t r a n s f e c t i o n , n e u r o n s w e r e w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h p r e - w a r m e d H B S S a n d r e p l e n i s h e d w i t h c o n d i t i o n e d m e d i u m b e f o r e b e i n g t r a n s f e r r e d b a c k t o t h e 3 7 ° C 5 % C 0 2 i n c u b a t o r . T r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y w a s a s s e s s e d b y f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p y t o i d e n t i f y G F P - e x p r e s s i n g n e u r o n s a t 2 4 h o u r s f o l l o w i n g t h e s t a r t o f t r a n s f e c t i o n . 2 . 1 . 2 . 2 . I m m u n o f l u o r e s c e n t S t a i n i n g a n d Q u a n t i f i c a t i o n C o v e r s l i p s o f s t r i a t a l M S N s i s o l a t e d f r o m P 0 o r P 1 m o u s e p u p s a n d c u l t u r e d f o r 9 - 1 0 d . i . v . ( w i t h o r w i t h o u t t r a n s f e c t i o n o f p l a s m i d D N A a t 7 d . i . v . ) w e r e r i n s e d i n p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) a n d f i x e d f o r 1 5 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e i n P B S c o n t a i n i n g 4 % p a r a f o r m a l d e h y d e N(PFA) . F o r s u r f a c e N R 1 e x p r e s s i o n a n a l y s i s , c e l l s w e r e t h e n w a s h e d i n P B S w i t h g e n t l e s h a k i n g p r i o r t o b l o c k i n g i n P B S c o n t a i n i n g 1 0 % 59 n o r m a l g o a t s e r u m ( N G S ) f o r 3 0 m i n u t e s , a g a i n a t r o o m t e m p e r a t u r e . In u n t r a n s f e c t e d M S N s ( t o e x a m i n e e f f e c t s o f htt p o l y Q e x p a n s i o n ) , s u r f a c e N R 1 w a s t h e n l a b e l e d g r e e n b y i n c u b a t i o n w i t h a m o u s e a n t i - N R 1 e x t r a c e l l u l a r M 3 - M 4 l o o p d o m a i n p r i m a r y a n t i b o d y i n P B S s u p p l e m e n t e d w i t h 1 % B S A f o r 1 . 5 h o u r s f o l l o w e d b y P B S w a s h e s a n d i n c u b a t i o n w i t h A l e x a F l u o r 4 8 8 s e c o n d a r y a n t i b o d y f o r 3 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . In G F P -a n d G F P / H I P - 1 - t r a n s f e c t e d M S _ N s ( t o e x a m i n e e f f e c t s o f H I P - 1 o v e r - e x p r e s s i o n ) , s u r f a c e N R 1 w a s l a b e l e d r e d i n s t e a d b y i n c u b a t i o n w i t h t h e s a m e a n t i - N R 1 a n t i b o d y f o l l o w e d b y a C y 3 s e c o n d a r y a n t i b o d y . F o r t h i s a n d a l l s u b s e q u e n t s t e p s , c e l l s w e r e k e p t a w a y f r o m l i g h t . F o l l o w i n g s e c o n d a r y a n t i b o d y i n c u b a t i o n , n e u r o n s w e r e w a s h e d , p e r m e a b i l i z e d w i t h P B S 0 . 5 % T r i t o n X - 1 0 0 f o r 5 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e , a n d b l o c k e d a g a i n i n P B S 1 0 % N G S f o r a n o t h e r 3 0 m i n u t e s . I n t e r n a l N R 1 w a s t h e n l a b e l e d w i t h t h e s a m e p r i m a r y a n t i b o d y a s b e f o r e , b u t f o l l o w e d b y i n c u b a t i o n w i t h C y 3 s e c o n d a r y a n t i b o d y i n u n t r a n s f e c t e d M S N s , o r A l e x a F l u o r 3 5 0 s e c o n d a r y a n t i b o d y i n G F P - a n d G F P / H I P - 1 - e x p r e s s i n g M S N s , t o l a b e l i n t e r n a l r e c e p t o r s r e d o r b l u e , r e s p e c t i v e l y . In a l l o t h e r d o u b l e i m m u n o s t a i n i n g e x p e r i m e n t s , f i x e d n e u r o n s w e r e w a s h e d i n P B S p r i o r t o p e r m e a b i l i z a t i o n i n P B S 0 . 5 % T r i t o n X - 1 0 0 , w a s h e d a g a i n i n P B S w i t h g e n t l e s h a k i n g , a n d t h e n b l o c k e d i n P B S c o n t a i n i n g 5 % B S A f o r 3 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . S u b s e q u e n t l y , c e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h p r i m a r y a n t i b o d i e s d i s s o l v e d i n P B S w i t h 2 % B S A o v e r n i g h t a t 4 ° C , f o l l o w e d b y i n c u b a t i o n w i t h a s e c o n d a r y a n t i b o d y s o l u t i o n o f 1 : 1 0 0 0 A l e x a F l u o r 4 8 8 a n t i - m o u s e a n d 1 : 8 0 0 A l e x a F l u o r 5 9 4 a n t i - r a b b i t i n P B S 2 % B S A i n t h e d a r k a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 1 t o 2 h o u r s ( t o l a b e l p r o t e i n s o f i n t e r e s t g r e e n a n d r e d , r e s p e c t i v e l y ) . A l l i m m u n o s t a i n e d c e l l s w e r e w a s h e d w i t h P B S b e f o r e t h e c o v e r s l i p s w e r e m o u n t e d o n t o g l a s s s l i d e s u s i n g t h e F l u o r o m o u n t r e a g e n t ( S o u t h e r n B i o t e c h n o l o g y A s s o c i a t e s , I n c . , B i r m i n g h a m , A L ) . F l u o r e s c e n t i m a g e s o f c e l l s a t 6 3 0 x m a g n i f i c a t i o n 60 w e r e c a p t u r e d u s i n g a C C D c a m e r a m o u n t e d o n a f l u o r e s c e n c e m i c r o s c o p e ( A x i o p h o t ; C a r l Z e i s s , T h o r n b u r g , N Y ) . F o r s u r f a c e N R 1 e x p r e s s i o n a n a l y s i s i n u n t r a n s f e c t e d M S N s t o e x a m i n e e f f e c t s o f htt p o l y Q e x p a n s i o n , t h e r a t i o o f s u r f a c e - t o - i n t e r n a l N R 1 s i g n a l s w a s c a l c u l a t e d a n d c o m p a r e d a m o n g F V B / N W T , Y A C 1 8 , a n d Y A C 7 2 s a m p l e s . F i v e i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s u s i n g d i f f e r e n t b a t c h e s o f c u l t u r e s w e r e p e r f o r m e d , w i t h s a m p l e s f r o m a l l 3 g e n o t y p e s p r o c e s s e d a n d a n a l y z e d i n p a r a l l e l w i t h i n e a c h e x p e r i m e n t . In e a c h o f t h e 5 e x p e r i m e n t s , d a t a w a s a n a l y z e d f r o m 4 f i e l d s c h o s e n a t r a n d o m i n e a c h o f 5 c o v e r s l i p s f o r e a c h g e n o t y p e . D a t a f r o m a l l 2 0 f i e l d s ( 4 f i e l d s p e r c o v e r s l i p x 5 c o v e r s l i p s p e r g e n o t y p e ) w e r e t h e n p o o l e d f o r e a c h i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t . T o a s s e s s t h e e f f e c t s o f H I P - 1 o v e r - e x p r e s s i o n o n t h e r a t i o o f s u r f a c e - t o - i n t e r n a l N R 1 e x p r e s s i o n , M S N s e c t o p i c a l l y e x p r e s s i n g e i t h e r G F P a l o n e o r b o t h G F P a n d H I P - 1 w e r e e x a m i n e d . In e i t h e r c o n d i t i o n , o n l y g r e e n f l u o r e s c e n t c e l l s ( i n d i c a t i n g s u c c e s s f u l t r a n s f e c t i o n a n d e x p r e s s i o n o f t r a n s g e n e s ) w e r e s e l e c t e d f o r a n a l y s i s . T h r e e i n d e p e n d e n t t r a n s f e c t i o n s a n d e x p e r i m e n t s u s i n g d i f f e r e n t b a t c h e s o f c u l t u r e s w e r e p e r f o r m e d , w i t h s a m p l e s f r o m b o t h c o n d i t i o n s p r o c e s s e d a n d a n a l y z e d i n p a r a l l e l w i t h i n e a c h e x p e r i m e n t . In e a c h o f t h e 3 e x p e r i m e n t s , d a t a w a s a n a l y z e d f r o m 4 G F P - o r G F P / H I P - 1 - t r a n s f e c t e d n e u r o n s . T o q u a n t i f y N R 1 e x p r e s s i o n o n t h e s u r f a c e o r i n s i d e t h e c e l l , w e m e a s u r e d i n t e n s i t y o f N R 1 s t a i n i n g o f M S N s i n b o t h g r e e n a n d r e d c h a n n e l s ( f o r u n t r a n s f e c t e d M S N s ) , o r r e d a n d b l u e c h a n n e l s ( f o r G F P - a n d G F P / H I P - 1 - e x p r e s s i n g M S N s ) , r e s p e c t i v e l y . I m a g e s w e r e e x p o r t e d i n t o N o r t h e r n E c l i p s e ( E m p i x I m a g i n g , I n c . , M i s s i s s a u g a , O N ) , a n d f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y w a s m e a s u r e d u s i n g c u s t o m - w r i t t e n s o f t w a r e I D L 3 . 1 ( T . H . M u r p h y , u n p u b l i s h e d ) f o r 1 2 s e l e c t e d s u b - f i e l d s c o v e r i n g p a r t s o f t h e s o m a t a a n d p r o c e s s e s o f M S N s i n e a c h f i e l d . B a c k g r o u n d I n t e n s i t i e s w e r e 61 s u b t r a c t e d i n e a c h c o l o u r c h a n n e l , a n d s u r f a c e - t o - i n t e r n a l r a t i o o f N R 1 e x p r e s s i o n c a l c u l a t e d b y d i v i d i n g t h e g r e e n c h a n n e l v a l u e s b y t h e r e d c h a n n e l v a l u e s i n t h e c a s e o f u n t r a n s f e c t e d M S N s , o r d i v i d i n g t h e r e d c h a n n e l v a l u e s b y t h e b l u e c h a n n e l v a l u e s f o r G F P - a n d G F P / H I P - 1 - t r a n s f e c t e d M S N s . D a t a f r o m a l l f i e l d s a n a l y z e d w e r e t h e n p o o l e d f o r e a c h i n d i v i d u a l e x p e r i m e n t . 2 . 1 . 2 . 3 . C h y m o t r y p s i n A s s a y S t r i a t a l M S N s i s o l a t e d f r o m P O o r P 1 m o u s e p u p s a n d c u l t u r e d f o r 9 - 1 0 d . i . v . i n 6 0 - m m d i s h e s w e r e w a s h e d w i t h H B S S . S i s t e r d i s h e s o f n e u r o n s w e r e t r e a t e d w i t h H B S S c o n t a i n i n g 1 m g / m l c h y m o t r y p s i n o r H B S S a l o n e f o r 1 0 m i n u t e s a t 3 7 ° C b e f o r e e n z y m a t i c a c t i v i t y w a s t e r m i n a t e d b y w a s h i n g w i t h 2 m M p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l f l u o r i d e ( P M S F ) i n H B S S . N e u r o n s w e r e t h e n h a r v e s t e d i n 0 . 5 m l o f i c e - c o l d P B S a n d c e n t r i f u g e d a t 1 4 , 0 0 0 r p m f o r 3 s e c o n d s . C e l l p e l l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n 1 0 0 u l P B S 1 m M E D T A / 1 m M E G T A c o n t a i n i n g 1 % T r i t o n X - 1 0 0 a n d s u p p l e m e n t e d w i t h p r o t e a s e i n h i b i t o r s a n d p h o s p h a t a s e i n h i b i t o r s . P r o t e i n s w e r e s o l u b i l i z e d b y s o n i c a t i o n w i t h a S o n i c a t o r ™ C e l l D i s r u p t o r m o d e l W - 1 0 ( f r o m f o r m e r l y H e a t S y s t e m s U l t r a s o n i c s , n o w M i s o n i x , I n c . , F a r m i n g d a l e , N Y ) f o r 5 - 1 0 s e c o n d s a t s e t t i n g 3 f o l l o w e d b y e n d - o v e r - e n d r o t a t i o n a t 4 ° C f o r 3 0 m i n u t e s . T h e t o t a l s o l u b l e l y s a t e w a s c o l l e c t e d a n d q u a n t i f i e d f o r p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n u s i n g t h e b i c i n c h o n i n i c a c i d ( B C A ) a s s a y ( P i e r c e B i o t e c h n o l o g y , I n c . , R o c k f o r d , I L ) , a n d e q u i v a l e n t a m o u n t s o f p r o t e i n s f r o m e a c h s a m p l e w e r e r e s o l v e d b y s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S D S - P A G E ) a n d s u b j e c t e d t o i m m u n o b l o t t i n g . S u r f a c e e x p r e s s i o n o f N R 1 o r N R 2 B w a s c a l c u l a t e d b y s u b t r a c t i n g t h e b a n d d e n s i t y o f t h e c h y m o t r y p s i n - t r e a t e d l a n e ( r e p r e s e n t i n g t h e 62 c h y m o t r y p s i n - r e s i s t a n t o r i n t e r n a l p o o l o f N R 1 o r N R 2 B ) f r o m t h a t o f t h e u n t r e a t e d l a n e ( r e p r e s e n t i n g t o t a l N R 1 o r N R 2 B e x p r e s s i o n ) . 2 . 1 . 2 . 4 . B i o t i n y l a t i o n A s s a y s 2 . 1 . 2 . 4 . 1 . T o E x a m i n e N R 1 / N R 2 B S u r f a c e E x p r e s s i o n B i o t i n y l a t i o n w a s c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o a p r o t o c o l m o d i f i e d f r o m E h l e r s , 2 0 0 0 a n d L i n e t a l . , 2 0 0 0 . S t r i a t a l M S N s c u l t u r e d f o r 9 d . i . v . i n 6 0 - m m d i s h e s w e r e g r a d u a l l y p r e - c o o l e d t o 4 - 1 0 ° C t o h a l t b i o l o g i c a l p r o c e s s e s w i t h i n t h e c e l l . C e l l s w e r e w a s h e d t w i c e w i t h i c e - c o l d P B S , a n d s u r f a c e p r o t e i n s w e r e l a b e l e d w i t h b i o t i n b y i n c u b a t i o n i n 1 . 5 m g / m l N H S - S S - B i o t i n ( P i e r c e B i o t e c h n o l o g y , I n c . , R o c k f o r d , IL) i n P B S s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 1 m M C a C I 2 a n d 1 m M M g C I 2 a t 2 m l / d i s h f o r 1 2 m i n u t e s a t 4 - 1 0 ° C . E x c e s s b i o t i n l a b e l w a s s u b s e q u e n t l y r e m o v e d b y t w o w a s h e s o f 0 . 1 % B S A i n P B S c o n t a i n i n g 0 . 1 m M C a C b a n d 1 m M M g C b b e f o r e c e l l s w e r e s c r a p e d i n t o H a r v e s t B u f f e r ( H B : P B S 1 m M E D T A / 1 m M E G T A s u p p l e m e n t e d w i t h p r o t e a s e i n h i b i t o r s ) a t 1 m l / d i s h o f c e l l s . F o l l o w i n g c e n t r i f u g a t i o n a t 1 4 , 0 0 0 r p m f o r 3 s e c o n d s , t h e s u p e r n a n t w a s r e m o v e d a n d t h e c e l l p e l l e t r e s u s p e n d e d i n 1 2 5 p l S o l u b i l i z a t i o n B u f f e r ( S B : H B c o n t a i n i n g 1 % T r i t o n X - 1 0 0 ) . P r o t e i n s w e r e s o l u b i l i z e d b y s o n i c a t i o n f o r 8 s e c o n d s a t s e t t i n g 3 , f o l l o w e d b y e n d - o v e r - e n d r o t a t i o n f o r 3 0 m i n u t e s a t 4 ° C . D u r i n g t h i s t i m e , N e u t r A v i d i n b i o t i n - b i n d i n g r e s i n ( P i e r c e B i o t e c h n o l o g y , I n c . , R o c k f o r d , IL) w a s p r e p a r e d a s 1 0 0 - u l a l i q u o t s o f a 5 0 % - s l u r r y a n d e q u i l i b r a t e d b y r e s u s p e n s i o n i n 2 0 x b e d v o l u m e s (1 m l ) o f S B w i t h e n d - o v e r - e n d r o t a t i o n f o r 3 0 m i n u t e s a t 4 ° C . F o l l o w i n g 2 m i n u t e s o f c e n t r i f u g a t i o n a t 1 4 , 0 0 0 r p m , t h e S B w a s h w a s r e m o v e d l e a v i n g b e h i n d ~ 5 0 p l o f N e u t r A v i d i n r e s i n . F o l l o w i n g s o l u b i l i z a t i o n o f t h e t o t a l l y s a t e , s a m p l e s w e r e c e n t r i f u g e d a t 4 ° C f o r 2 0 63 m i n u t e s a t 1 4 , 0 0 0 r p m . F r o m t h e t o t a l s o l u b l e l y s a t e , 2 0 % ( 2 5 p l ) o f t h e v o l u m e w a s s e t a s i d e a s t h e " l y s a t e " s a m p l e . T h e r e m a i n d e r ( 8 0 % o r 1 0 0 p l ) w a s a d d e d t o 5 0 p l o f p r e - e q u i l i b r a t e d N e u t r A v i d i n b i o t i n - b i n d i n g r e s i n a n d i n c u b a t e d w i t h e n d - o v e r - e n d r o t a t i o n f o r 2 - 3 h o u r s a t 4 ° C . S a m p l e s w e r e t h e n c e n t r i f u g e d a t 4 ° C f o r 2 m i n u t e s a t 1 4 , 0 0 0 r p m . F r o m t h e s u p e r n a t a n t , 2 5 % ( 2 5 p l ) w a s s a v e d f o r S D S - P A G E a n d t h e r e s t w a s r e m o v e d . T h e r e s i n w a s s u b s e q u e n t l y w a s h e d f o u r t i m e s w i t h S B a t 1 m l p e r s a m p l e p e r w a s h , a n d b o u n d b i o t i n - t a g g e d p r o t e i n s w e r e e l u t e d f r o m t h e w a s h e d r e s i n b y e n d - o v e r - e n d r o t a t i o n i n 6 0 p l o f 3 x p r o t e i n s a m p l e b u f f e r ( 3 x P S B ; c o n t a i n s 4 6 5 m M D T T a d d e d f r e s h a t t i m e o f u s e , P y r o n i n Y r e d d y e , 6 % S D S , a n d 3 0 % g l y c e r o l i n 3 8 5 m M T r i s - C I p H 6 . 8 ) f o r 3 0 m i n u t e s a t 4 ° C . S a m p l e s w e r e t h e n h e a t e d f o r 1 m i n u t e a t 9 5 - 1 0 0 ° C b e f o r e b e i n g r e s o l v e d b y S D S - P A G E a n d s u b j e c t e d t o i m m u n o b l o t t i n g . T h e b i o t i n y l a t i o n e l u a t e f r a c t i o n r e p r e s e n t s t h e p o r t i o n o f p r o t e i n s p r e s e n t o n t h e c e l l s u r f a c e d u r i n g t h e b i o t i n l a b e l i n g s t e p w h i c h h a s n o t y e t u n d e r g o n e p r o t e a s o m a l o r l y s o s o m a l d e g r a d a t i o n . 2 . 1 . 2 . 4 . 2 . T o E x a m i n e L o s s o f N R 1 / N R 2 B f r o m t h e C e l l S u r f a c e F i g u r e 4 o u t l i n e s t h e s t e p s i n v o l v e d i n t h i s p r o c e d u r e . S t r i a t a l M S N s c u l t u r e d f o r 9 d . i . v . i n 6 0 - m m d i s h e s w e r e p r o c e s s e d a n d t r e a t e d w i t h b i o t i n y l a t i o n r e a g e n t a s d e s c r i b e d a b o v e f o r e x a m i n i n g N R 1 / N R 2 B s u r f a c e e x p r e s s i o n . F o l l o w i n g r e m o v a l o f e x c e s s b i o t i n l a b e l b y t w o w a s h e s o f 0 . 1 % B S A i n P B S c o n t a i n i n g 0 . 1 m M C a C I 2 a n d 1 m M M g C I 2 , c e l l s w e r e r e p l a c e d i n c o n d i t i o n e d m e d i u m . T o a s s e s s t h e r a t e o f s u r f a c e N R 1 d e g r a d a t i o n , s i s t e r d i s h e s o f c e l l s w e r e t r e a t e d i n p a r a l l e l a n d r e t u r n e d t o t h e 3 7 ° C 5 % C 0 2 i n c u b a t o r f o r 0 , 1 2 o r 2 4 h o u r s b e f o r e t h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d b y s c r a p i n g i n t o H B . P r o t e i n s w e r e 64 t h e n s o l u b i l i z e d a n d b i o t i n - t a g g e d p r o t e i n s i s o l a t e d a s d e s c r i b e d a b o v e . S a m p l e s w e r e t h e n r e s o l v e d b y S D S - P A G E a n d s u b j e c t e d t o i m m u n o b l o t t i n g . 2 . 1 . 2 . 4 . 2 . 1 . B l o c k i n g D e g r a d a t i o n b y L y s o s o m a l I n h i b i t i o n T h e b i o t i n y l a t i o n a s s a y w a s c a r r i e d o u t a s d e s c r i b e d a b o v e f o r t h e d e g r a d a t i o n a s s a y , b u t w i t h t h e a d d i t i o n o f 1 0 0 u g / m l l e u p e p t i n ( l y s o s o m e i n h i b i t o r ; E M D B i o s c i e n c e s , I n c . , S a n D i e g o , C A ) t o t h e c u l t u r e m e d i u m o n e h o u r p r i o r t o b i o t i n - l a b e l i n g . 2 . 1 . 2 . 4 . 3 . T o E x a m i n e N R 1 / N R 2 B I n s e r t i o n U s i n g C h l o r p r o m a z i n e t o B l o c k E n d o c y t o s i s a n d R e c y c l i n g F i g u r e 5 o u t l i n e s t h e s t e p s i n v o l v e d i n t h i s p r o c e d u r e . S i s t e r 6 0 - m m d i s h e s o f c u l t u r e d s t r i a t a l M S N s a t 9 - 1 0 d . i . v . w e r e t r e a t e d w i t h t h e e n d o c y t o s i s a n d r e c y c l i n g i n h i b i t o r c h l o r p r o m a z i n e ( W a n g e t a l . , 1 9 9 3 ; Z h u e t a l . , 2 0 0 5 ; V e y h l e t a l . , 2 0 0 6 ) f o r 0 , 0 . 5 , o r 6 h o u r s a t 3 7 ° C 5 % C 0 2 . A t t h e c o n c e n t r a t i o n u s e d ( 1 0 u M ) , c e l l s r e t a i n e d a h e a l t h y a p p e a r a n c e u p t o 6 h o u r s f o l l o w i n g t r e a t m e n t , w h i l e h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f d r u g w e r e n o t e d i n p i l o t s t u d i e s t o c a u s e s i g n i f i c a n t m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s a n d d e t a c h m e n t o f M S N s f r o m t h e c u l t u r e d i s h o v e r t h e s a m e t i m e p e r i o d . A t e a c h t i m e p o i n t , o n e d i s h o f n e u r o n s w a s g r a d u a l l y p r e - c o o l e d t o 4 - 1 0 ° C t o h a l t b i o l o g i c a l p r o c e s s e s w i t h i n t h e c e l l . C e l l s w e r e w a s h e d t w i c e w i t h 4 - 1 0 ° C P B S b e f o r e s u r f a c e p r o t e i n s w e r e b i o t i n - t a g g e d b y i n c u b a t i o n w i t h 1 . 5 m g / m l N H S - S S - B i o t i n ( P i e r c e B i o t e c h n o l o g y , I n c . , R o c k f o r d , IL) i n P B S s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 1 m M C a C I 2 a n d 1 m M M g C I 2 a t 2 m l / d i s h f o r 1 2 m i n u t e s a t 4 - 1 0 ° C . E x c e s s b i o t i n l a b e l w a s r e m o v e d b y t w o w a s h e s w i t h 0 . 1 % B S A i n P B S c o n t a i n i n g 0 . 1 m M C a C I 2 a n d 1 m M M g C I 2 a n d a t h i r d w a s h i n i c e - c o l d P B S . C e l l s w e r e 65 t h e n h a r v e s t e d a n d s a m p l e s p r o c e s s e d a s f o r t h e s u r f a c e e x p r e s s i o n a n d r e c e p t o r l o s s a s s a y s a s d e s c r i b e d a b o v e , f o l l o w e d b y r e s o l u t i o n b y S D S - P A G E a n d i m m u n o b l o t t i n g . T h e b i o t i n y l a t i o n e l u a t e f r a c t i o n r e p r e s e n t s t h e p o r t i o n o f p r o t e i n s p r e s e n t o n t h e c e l l s u r f a c e d u r i n g t h e b i o t i n l a b e l i n g s t e p . 2 . 1 . 2 . 5 . N M D A R - D e p e n d e n t T o x i c i t y A s s a y 2 . 1 . 2 . 5 . 1 . I n d u c t i o n o f T o x i c i t y S i s t e r c o v e r s l i p s o f s t r i a t a l M S N s f r o m F V B / N W T , Y A C 7 2 , o r Y A C 1 2 8 m i c e w e r e c u l t u r e d i n 2 4 - w e l l p l a t e s . A t 9 d . i . v . , n e u r o n s w e r e e x p o s e d i n p a r a l l e l t o v e h i c l e d i m e t h y l s u l f o x i d e ( D M S O ) o r t h e C K 2 i n h i b i t o r 5 , 6 - d i c h l o r o b e n z i m i d a z o l e r i b o s i d e ( D R B ; f i n a l 1 0 0 p M ) d i s s o l v e d i n D M S O a n d a d d e d t o c u l t u r e m e d i u m f o r 2 h o u r s b e f o r e c o - t r e a t m e n t w i t h e i t h e r b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n ( B S S ; c o n t a i n s , i n m M : 1 3 9 N a C l , 3 . 5 K C I , 2 N a H C 0 3 , 3 N a 2 H P 0 4 , 1 0 H E P E S , 11 D - g l u c o s e , 1 . 8 C a C I 2 , 0 . 0 5 g l y c i n e p H ~ 7 . 3 5 - 7 . 4 0 ) a l o n e ( c o n t r o l s ) o r 1 m M N M D A i n B S S f o r 1 0 m i n u t e s . N e u r o n s w e r e t h e n w a s h e d t w i c e w i t h f r e s h c u l t u r e m e d i a a t 0 . 5 m l / w e l l b e f o r e c o n d i t i o n e d m e d i a w a s a d d e d b a c k , f o r i n c u b a t i o n a t 3 7 ° C 5 % C 0 2 f o r 2 4 h o u r s i n t h e c o n t i n u e d p r e s e n c e o f D R B o r v e h i c l e D M S O . S u b s e q u e n t l y , c e l l s o n c o v e r s l i p s w e r e w a s h e d o n c e i n P B S , f i x e d f o r 1 h o u r i n P B S w i t h 4 % P F A , w a s h e d t h r e e t i m e s 5 m i n u t e s e a c h i n P B S , a n d t h e n s t o r e d t o 4 ° C i n P B S c o n t a i n i n g 0 . 0 2 % a z i d e u n t i l t e r m i n a l d e o x y n u c l e o t i d y l t r a n s f e r a s e ( T d T ) - m e d i a t e d d U T P n i c k e n d l a b e l i n g ( T U N E L ) w a s p e r f o r m e d . 66 2 . 1 . 2 . 5 . 2 . A n a l y s i s o f A p o p t o t i c D e a t h F i x e d M S N s t r e a t e d w i t h N M D A i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f C K 2 i n h i b i t o r s w e r e p e r m e a b i l i z e d b y t r e a t m e n t w i t h P B S c o n t a i n i n g 0 . 2 5 % T r i t o n X - 1 0 0 a n d 0 . 5 % s o d i u m c i t r a t e f o r 2 m i n u t e s o n i c e . B a c k g r o u n d r i b o n u c l e i c a c i d s t a i n i n g w a s m i n i m i z e d b y i n c u b a t i n g w i t h 1 6 p g / m l R N a s e f o r 3 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . F o l l o w i n g t h r e e w a s h e s w i t h P B S a t 0 . 5 m l / w e l l p e r w a s h , n i c k e d D N A i n d i c a t i v e o f a p o p t o t i c p r o c e s s e s w a s s t a i n e d b y i n c u b a t i o n o f t h e n e u r o n s w i t h t h e T U N E L r e a g e n t ( R o c h e D i a g n o s t i c s C o r p o r a t i o n , B a s e l , S w i t z e r l a n d ; 9 p a r t s l a b e l t o 1 p a r t e n z y m e ) a t 1 7 . 5 p l p e r c o v e r s l i p f o r 1 h o u r a t 3 7 ° C i n a p a r a f i l m - a n d f o i l - w r a p p e d 2 4 - w e l l p l a t e . F o l l o w i n g a b r i e f r i n s e i n P B S , n e u r o n a l n u c l e i w e r e c o u n t e r s t a i n e d b y 8 p M p r o p i d i u m i o d i d e ( P I ) i n P B S f o r 1 5 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . C o v e r s l i p s w e r e t h e n w a s h e d t h r e e m o r e t i m e s i n P B S a n d t h e n m o u n t e d o n t o g l a s s s l i d e s u s i n g t h e F l u o r o m o u n t r e a g e n t . F l u o r e s c e n t i m a g e s o f c e l l s w e r e c a p t u r e d u s i n g a C C D c a m e r a m o u n t e d o n a Z e i s s A x i o p h o t m i c r o s c o p e c o n n e c t e d t o a c o m p u t e r w i t h N o r t h e r n E c l i p s e s o f t w a r e . C e l l s w e r e s c o r e d a s a p o p t o t i c o n l y if t h e y a p p e a r e d t o b e p o s i t i v e f o r T U N E L s t a i n i n g a n d d i s p l a y e d s m a l l , c o n d e n s e d a n d b l e b b e d n u c l e i , a s v i s u a l i z e d w i t h P I . In a n y s i n g l e e x p e r i m e n t f o r e a c h o f t h e 3 g e n o t y p e s , o v e r 1 5 0 0 n e u r o n s w e r e c o u n t e d i n e a c h t r e a t m e n t c o n d i t i o n , T h e p e r c e n t a g e o f a p o p t o t i c n u c l e i a f t e r N M D A t r e a t m e n t w a s c a l c u l a t e d b y f i r s t s u b t r a c t i n g t h e p e r c e n t a g e o f a p o p t o t i c c e l l s i n t h e c o r r e s p o n d i n g c o n t r o l c o n d i t i o n ( i . e . , D M S O o r D R B i n t h e a b s e n c e o f N M D A ) . T h r e e i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s — e a c h e m p l o y i n g a d i f f e r e n t b a t c h o f c u l t u r e d n e u r o n s — w e r e p e r f o r m e d f o r e a c h g e n o t y p e . 67 2 . 1 . 3 . H a r v e s t i n g T i s s u e T i s s u e w a s h a r v e s t e d f r o m F V B / N W T a n d t r a n s g e n i c Y A C m i c e f o r a v a r i e t y o f p u r p o s e s i n c l u d i n g a n a l y s i s o f p r o t e i n e x p r e s s i o n , s u b c e l l u l a r f r a c t i o n a t i o n , a n d i m m u n o p r e c i p i t a t i o n . 2 . 1 . 3 . 1 . I m m u n o b l o t A n a l y s i s I m m u n o b l o t t i n g f o r p r o t e i n s o f i n t e r e s t w a s d o n e a c c o r d i n g t o s t a n d a r d p r o t o c o l s . B r i e f l y , p r o t e i n s a m p l e s r e s o l v e d b y S D S - P A G E w e r e t r a n s f e r r e d b y w e t e l e c t r o p h o r e s i s o n t o I m m o b i l o n p o l y v i n y l i d e n e d i f l u o r i d e ( P V D F ) m e m b r a n e s ( M i l l i p o r e , B i l l e r i c a , M A ) . M e m b r a n e s w e r e t h e n w e t t e d i n m e t h a n o l , e q u i l i b r a t e d i n w a t e r a n d T r i s - b u f f e r e d s a l i n e ( T B S ) , a n d t h e n b l o c k e d f o r 2 h o u r s i n T B S c o n t a i n i n g 0 . 5 % T w e e n - 2 0 a n d 3 % ( w / v ) B S A . F o l l o w i n g a b r i e f r i n s e i n T B S 0 . 5 % T w e e n - 2 0 ( T B S - T ) , m e m b r a n e s w e r e i n c u b a t e d w i t h p r i m a r y a n t i b o d y d i s s o l v e d i n t h e b l o c k i n g s o l u t i o n t y p i c a l l y f o r 1 t o 2 h o u r s w i t h s h a k i n g a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d t h e n o v e r n i g h t a t 4 ° C . M e m b r a n e s w e r e t h e n w a s h e d t h r e e t i m e s i n T B S - T , i n c u b a t e d f o r 4 5 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h t h e a p p r o p r i a t e h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e - c o u p l e d s e c o n d a r y a n t i b o d y i n b l o c k i n g s o l u t i o n , w a s h e d a g a i n , a n d v i s u a l i z e d b y t h e a d d i t i o n o f t h e e n h a n c e d c h e m i l u m i n e s c e n c e ( E C L ) r e a g e n t s ( A m e r s h a m B i o s c i e n c e s , P i s c a t a w a y , N J ) a n d e x p o s u r e o n f i l m . 2 . 1 . 3 . 2 . E x a m i n a t i o n o f N R 1 / N R 2 B E x p r e s s i o n i n M i c e o f D i f f e r e n t A g e s F o r a n a l y s i s o f N M D A R p r o t e i n e x p r e s s i o n i n t h e Y A C m o u s e m o d e l , t i s s u e f r o m s t r i a t a o f 2 , 6 , 9 , o r 1 2 m o n t h - o l d F V B / N W T a n d Y A C t r a n s g e n i c m i c e w a s h a r v e s t e d i n 68 1 0 x v o l u m e s o f p r e - c h i l l e d r a d i o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( R I P A ) b u f f e r ( 5 0 m M T r i s p H 7 . 6 / 1 5 0 m M N a C I / 1 m M E D T A / 1 % N o n i d e t P - 4 0 (NP-40)/0.5% d e o x y c h o l a t e / 0 . 1 % S D S ) , h o m o g e n i z e d w i t h 8 s t r o k e s a t 2 0 0 0 r p m u s i n g a C a f r a m o s t i r r e r - t y p e R 2 R 1 - 6 4 h o m o g e n i z e r ( V W R I n t e r n a t i o n a l , M i s s i s s a u g a , O N ) , a n d q u a n t i f i e d f o r p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n u s i n g t h e B C A a s s a y . E q u a l a m o u n t s o f p r o t e i n w e r e t h e n r e s o l v e d b y S D S - P A G E a n d p r o b e d b y i m m u n o b l o t t i n g f o r t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f N R 1 a n d N R 2 B i n s t r i a t a l t i s s u e f r o m F V B / N W T a n d Y A C t r a n s g e n i c m i c e . 2 . 1 . 3 . 3 . E x a m i n a t i o n o f P r o t e i n E x p r e s s i o n i n M o u s e T i s s u e t o F o l l o w U p o n K i n e t w o r k s ™ R e s u l t s F o r a n a l y s i s o f p r o t e i n e x p r e s s i o n i n m o u s e t i s s u e t o c o n f i r m K i n e t w o r k s ™ s c r e e n i n g r e s u l t s , c y t o s o l i c a n d p a r t i c u l a t e f r a c t i o n s w e r e o b t a i n e d f r o m s t r i a t a l t i s s u e s ( p o o l e d f r o m t w o m a l e a n i m a l s i n e a c h N ) o f 2 m o n t h - o l d F V B / N W T , Y A C 7 2 , a n d Y A C 1 2 8 m i c e , a c c o r d i n g t o a m o d i f i e d p r o t o c o l b a s e d o n g u i d e l i n e s f r o m K i n e x u s B i o i n f o r m a t i c s C o r p . ( w w w . k i n e x u s . c a ) . T i s s u e s w e r e m i c r o d i s s e c t e d a n d i s o l a t e d i n t o i c e - c o l d d e t e r g e n t - f r e e b u f f e r s u p p l e m e n t e d w i t h p h o s p h a t a s e i n h i b i t o r s a n d p r o t e a s e i n h i b i t o r s ( D F b u f f e r p H 7 ; c o n t a i n s i n m M : 2 0 M O P S , 2 E G T A , 5 E D T A , 3 0 N a F , - 4 0 p - g l y c e r o p h o s p h a t e , 1 0 s o d i u m p y r o p h o s p h a t e , 2 s o d i u m o r t h o v a n a d a t e , 1 P M S F , 0 . 0 0 5 p e p s t a t i n A , 0 . 0 1 l e u p e p t i n ) a t ~ 4 m l p e r g r a m o f w e t t i s s u e m a s s ( o r ~ 4 0 0 p l f o r s t r i a t a l t i s s u e f r o m 2 m i c e ) . F o l l o w i n g h o m o g e n i z a t i o n f o r 3 0 s e c o n d s a t 2 0 0 0 r p m o n i c e , t h e l y s a t e w a s c e n t r i f u g e d f o r 3 0 m i n u t e s a t 4 ° C a t 1 0 0 , 0 0 0 x g a n d t h e r e s u l t i n g s u p e r n a t a n t c o l l e c t e d a s t h e c y t o s o l i c f r a c t i o n . T h e p e l l e t w a s t h e n r e s u s p e n d e d i n D F b u f f e r s u p p l e m e n t e d w i t h 0 . 5 % T r i t o n X - 1 0 0 ( T X b u f f e r ) , a l s o a t ~ 4 m l p e r g r a m o f i n i t i a l t i s s u e m a s s , b e f o r e b e i n g s o n i c a t e d w i t h t w o 1 5 - s e c o n d p u l s e s a n d c e n t r i f u g e d a t 1 0 0 , 0 0 0 x g 69 f o r 3 0 m i n u t e s t o o b t a i n t h e p a r t i c u l a t e f r a c t i o n ( s u p e r n a t a n t ) . E q u i v a l e n t a m o u n t s o f p r o t e i n f r o m c y t o s o l i c a n d p a r t i c u l a t e f r a c t i o n s o f s t r i a t a l t i s s u e s w e r e r e s o l v e d b y S D S - P A G E a n d c o m p a r e d b e t w e e n F V B / N W T , Y A C 7 2 , a n d Y A C 1 2 8 m i c e f o r t h e e x p r e s s i o n o f t h e s e r i n e / t h r e o n i n e k i n a s e C K 2 . 2 . 1 . 3 . 4 . S u b c e l l u l a r F r a c t i o n a t i o n T i s s u e f r o m m o u s e s t r i a t u m w a s s u b j e c t e d t o b i o c h e m i c a l f r a c t i o n a t i o n b a s e d o n a p r o t o c o l m o d i f i e d f r o m D u n a h a n d S t a n d a e r t ( 2 0 0 1 ) a n d H e l l a n d J a h n ( 1 9 9 4 ) . S t r i a t a l t i s s u e w a s i s o l a t e d a n d p o o l e d f r o m F V B / N W T o r Y A C 7 2 m i c e ( 1 0 a n i m a l s o f e a c h g e n o t y p e w e r e u s e d f o r t w o s e t s o f f r a c t i o n a t i o n s , a n d 3 0 a n i m a l s e a c h w e r e u s e d i n a t h i r d s e t o f f r a c t i o n a t i o n s ) , - i n e a c h c a s e f r o m t w o o r m o r e l i t t e r s , a t 2 m o n t h s o f a g e . T i s s u e w a s h o m o g e n i z e d w i t h 9 s t r o k e s a t 9 0 0 r p m i n i c e - c o l d h o m o g e n i z a t i o n b u f f e r ( H o m o g B ; c o n t a i n i n g , i n m M : 1 E G T A , 3 2 0 s u c r o s e , 4 H E P E S p H 7 . 4 ) s u p p l e m e n t e d w i t h p r o t e a s e i n h i b i t o r s , u s i n g r o u g h l y 1 0 m l H o m o g B p e r g r a m o f w e t b r a i n t i s s u e ( a r o u n d 1 5 m l f o r s t r i a t a l t i s s u e f r o m 3 0 m i c e ) . H o m o g e n a t e w a s t h e n c e n t r i f u g e d f o r 1 0 m i n u t e s a t 1 , 0 0 0 x g t o o b t a i n f r a c t i o n s P 1 a n d S 1 . S 1 w a s f u r t h e r c e n t r i f u g e d f o r 1 5 m i n u t e s a t 1 2 , 0 0 0 x g t o i s o l a t e S 2 a n d P 2 , t h e c r u d e s y n a p t o s o m a l f r a c t i o n . P 2 w a s t h e n r e s u s p e n d e d i n H o m o g B t o t w o - t h i r d s o f t h e i n i t i a l v o l u m e a n d c e n t r i f u g e d f o r 1 5 m i n u t e s a t 1 3 , 0 0 0 x g t o g i v e S 2 ' a n d a w a s h e d c r u d e s y n a p t o s o m a l f r a c t i o n P 2 ' . T h e p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n H o m o g B t o o n e - t e n t h o f t h e i n i t i a l v o l u m e , d i l u t e d w i t h 9 x v o l u m e s o f i c e - c o l d w a t e r , a n d l y s e d h y p o - o s m o t i c a l l y w i t h 3 s t r o k e s a t 2 , 0 0 0 r p m . H E P E S - N a O H p H 7 . 4 w a s t h e n a d d e d t o ~ 8 . 5 m M f i n a l c o n c e n t r a t i o n , a n d t h e l y s e d P 2 ' w a s t h e n c e n t r i f u g e d f o r 2 0 m i n u t e s a t 3 3 , 0 0 0 x g t o g i v e L P 1 ( h e a v y / s y n a p t o s o m a l m e m b r a n e f r a c t i o n ) a n d L S 1 ( c y t o p l a s m o f l y s e d s y n a p t o s o m e s ) . L S 1 a n d S 2 w e r e c e n t r i f u g e d a t 70 1 6 5 , 0 0 0 x g f o r 2 h o u r s t o i s o l a t e L S 2 ( p r e - s y n a p t i c c y t o s o l ) / L P 2 ( s y n a p t i c v e s i c l e - e n r i c h e d f r a c t i o n ) a n d S 3 ( c y t o s o l ) / P 3 ( l i g h t m e m b r a n e / m i c r o s o m e - e n r i c h e d f r a c t i o n ) , r e s p e c t i v e l y . A s c h e m a t i c s u m m a r i z i n g t h e s u b c e l l u l a r f r a c t i o n a t i o n s t e p s i s s h o w n i n F i g u r e 6 . F r a c t i o n s w e r e t h e n q u a n t i f i e d f o r p r o t e i n c o n t e n t , r e s o l v e d b y S D S - P A G E , a n d s u b j e c t e d t o i m m u n o b l o t t i n g t o d e t e r m i n e t h e s u b c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f t h e p r o t e i n s o f i n t e r e s t . 2 . 1 . 3 . 5 . I m m u n o p r e c i p i t a t i o n 2 . 1 . 3 . 5 . 1 . F r o m M o u s e F o r e b r a i n T i s s u e F o r e b r a i n t i s s u e w a s i s o l a t e d f r o m ~ 2 m o n t h - o l d F V B / N W T o r Y A C 7 2 m i c e a n d h o m o g e n i z e d w i t h 8 s t r o k e s a t 2 , 0 0 0 r p m i n l y s i s b u f f e r c o n t a i n i n g 5 0 m M T r i s p H 9 a n d 1 % d e o x y c h o l a t e w i t h 1 m M E D T A a n d 1 m M E G T A , s u p p l e m e n t e d w i t h p h o s p h a t a s e i n h i b i t o r s a n d p r o t e a s e i n h i b i t o r s , a t 7 m l f o r ~ 0 . 4 g w e t b r a i n t i s s u e ( o r ~ 7 m l p e r m o u s e f o r e b r a i n ) . T h e h o m o g e n a t e w a s i n c u b a t e d f o r 1 5 m i n u t e s a t 4 ° C w i t h e n d - o v e r - e n d r o t a t i o n b e f o r e c e n t r i f u g a t i o n a t 5 0 , 0 0 0 x g f o r 1 5 m i n u t e s . T h e r e s u l t i n g s u p e r n a t a n t ( " l y s a t e " ) w a s u s e d f o r i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( I P ) a t 4 0 0 p l p e r s a m p l e . F o r e a c h s a m p l e , 1 0 p g o f p r i m a r y a n t i b o d y w e r e a d d e d t o t h e l y s a t e a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e f o r 1 h o u r a t 4 ° C w i t h s l o w e n d - o v e r - e n d r o t a t i o n . S i x t y m i c r o l i t e r s o f a 5 0 % - s l u r r y c o n t a i n i n g a m i x t u r e o f p r e - e q u i l i b r a t e d P r o t e i n A a n d P r o t e i n G S e p h a r o s e 4 F a s t F l o w r e s i n ( f r o m f o r m e r l y A m e r s h a m P h a r m a c i a B i o t e c h , n o w p a r t o f G E H e a l t h c a r e B i o - S c i e n c e s I n c . , B a i e d ' U r f e , Q C ) w e r e t h e n a d d e d a n d s a m p l e s w e r e i n c u b a t e d f o r a n a d d i t i o n a l h o u r . S u b s e q u e n t l y , s a m p l e s w e r e c e n t r i f u g e d b r i e f l y a t 5 , 0 0 0 r p m a n d t h e p e l l e t e d r e s i n w a s h e d f o u r t i m e s i n 1 x T r i s W a s h B u f f e r ( T W B ; c o n t a i n i n g , i n m M : 1 E D T A , 1 E G T A , 1 5 0 N a C l , 5 0 T r i s p H 7 . 4 71 a n d 1 % T r i t o n X - 1 0 0 ) t o r e d u c e n o n - s p e c i f i c b i n d i n g . T h e w a s h e d r e s i n w a s t h e n r e s u s p e n d e d i n 3 x P S B a n d h e a t e d a t 9 5 - 1 0 0 ° C f o r 3 - 5 m i n u t e s i n p r e p a r a t i o n f o r r e s o l u t i o n b y S D S - P A G E . 2 . 1 . 3 . 5 . 2 . F r o m M o u s e S t r i a t a l T i s s u e S t r i a t a l t i s s u e w a s i s o l a t e d f r o m ~ 2 m o n t h - o l d F V B / N W T o r Y A C 7 2 m i c e . T i s s u e w a s p o o l e d f r o m t w o m a l e m i c e f r o m e a c h g e n o t y p e i n 2 . 4 m l H B s u p p l e m e n t e d w i t h p r o t e a s e i n h i b i t o r s a n d p h o s p h a t a s e i n h i b i t o r s . F o l l o w i n g h o m o g e n i z a t i o n w i t h 8 s t r o k e s a t 2 , 0 0 0 r p m , t i s s u e s a m p l e s w e r e c e n t r i f u g e d f o r 5 m i n u t e s a t 5 , 0 0 0 r p m . S u p e r n a t a n t s w e r e r e m o v e d a n d t h e t i s s u e p e l l e t s s o l u b i l i z e d i n l y s i s b u f f e r c o n t a i n i n g e i t h e r 1 % N P - 4 0 / 1 5 0 m M N a C I / 5 0 m M T r i s p H 8 o r P B S 1 m M E D T A / 1 m M E G T A / 0 . 2 % S D S / 0 . 8 % T r i t o n X - 1 0 0 , s u p p l e m e n t e d w i t h p h o s p h a t a s e i n h i b i t o r s a n d p r o t e a s e i n h i b i t o r s , a t 2 . 4 m l p e r s a m p l e ( p o o l e d f r o m t w o p a i r s o f s t r i a t a ) . D N A s e w a s a d d e d t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 p g / m l , a n d t h e l y s a t e w a s s o n i c a t e d i n t w o 1 0 - s e c o n d b u r s t s a t s e t t i n g 3 . F o r t y m i c r o l i t e r s f r o m t h e s o l u b i l i z e d s a m p l e w a s s a v e d a s " l y s a t e " , a n d I P w a s p e r f o r m e d u s i n g 3 0 0 - 3 6 0 pl p e r s a m p l e . E a c h I P s a m p l e w a s f i r s t p r e - c l e a r e d b y i n c u b a t i o n w i t h 1 0 pl e a c h o f 5 0 % - s l u r r i e s o f p r e - e q u i l i b r a t e d P r o t e i n A a n d P r o t e i n G S e p h a r o s e 4 F a s t F l o w r e s i n f o r 1 h o u r a t 4 ° C w i t h s l o w e n d - o v e r - e n d r o t a t i o n . S a m p l e s w e r e t h e n c e n t r i f u g e d b r i e f l y t o s e d i m e n t t h e r e s i n , a n d p r e - c l e a r e d l y s a t e s w e r e t r a n s f e r r e d t o f r e s h t u b e s c o n t a i n i n g 1 0 pg o f p r i m a r y a n t i b o d y a n d r o t a t e d e n d - o v e r - e n d f o r a n a d d i t i o n a l h o u r . S u b s e q u e n t l y , 1 5 pl e a c h o f P r o t e i n A a n d P r o t e i n G s l u r r i e s w e r e a d d e d t o e a c h I P s a m p l e f o r o v e r n i g h t i n c u b a t i o n w i t h e n d - o v e r - e n d r o t a t i o n a t 4 ° C . S a m p l e s w e r e t h e n c e n t r i f u g e d f o r 1 m i n u t e a t 5 , 0 0 0 r p m , a n d t h e r e s i n s w i t h b o u n d a n t i b o d y a n d p r o t e i n s w e r e w a s h e d f i v e t i m e s i n 1 x T W B a t 5 0 0 pl p e r s a m p l e p e r w a s h . P r o t e i n s a s s o c i a t e d 72 w i t h t h e w a s h e d r e s i n w e r e t h e n e l u t e d b y r e s u s p e n d i n g t h e r e s i n i n 4 5 p l o f 3 x P S B a n d h e a t i n g a t 9 5 - 1 0 0 ° C f o r 3 - 5 m i n u t e s i n p r e p a r a t i o n f o r r e s o l u t i o n b y S D S - P A G E . 2.2. HEK293 Cell Line 2 . 2 . 1 . P a s s a g i n g a n d M a i n t a i n i n g C e l l L i n e H u m a n e m b r y o n i c k i d n e y ( H E K ) 2 9 3 c e l l s w e r e c u l t u r e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( C h e n e t a l . , 1 9 9 7 ) . B r i e f l y , c e l l s w e r e m a i n t a i n e d i n " M E M + " , o r M E M s u p p l e m e n t e d w i t h E a r l e ' s s a l t s , L - g l u t a m i n e ( t o 2 m M ) , s o d i u m p y r u v a t e ( t o 1 m M ) , p e n i c i l l i n - s t r e p t o m y c i n ( t o 1 0 0 u n i t s / m l ) , a n d f e t a l b o v i n e s e r u m ( F B S ; t o 1 0 % ) a t 3 7 ° C 5 % C 0 2 i n a h u m i d i f i e d i n c u b a t o r . H E K c e l l s w e r e g e n e r a l l y p a s s a g e d e v e r y 2 t o 3 d a y s a n d s e e d e d a t ~1 t o 2 x 1 0 6 c e l l s p e r 1 0 - c m c u l t u r e d i s h . 2 . 2 . 2 . T r a n s f e c t i o n o f C e l l L i n e w i t h P l a s m i d D N A F o r t r a n s f e c t i o n o f H E K 2 9 3 c e l l s b y t h e C a P m e t h o d , c e l l s w e r e s e e d e d 9 t o 1 2 h o u r s p r i o r t o t r a n s f e c t i o n a t a d e n s i t y o f ~1 t o 2 x 1 0 6 c e l l s p e r d i s h i n 1 0 - c m c u l t u r e d i s h e s p r e - c o a t e d w i t h 1 0 p g / m l h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t ( M W 7 0 , 0 0 0 - 1 5 0 , 0 0 0 ) P D L . T o p r e p a r e f o r t r a n s f e c t i o n , a l i q u o t s c o n t a i n i n g 1 0 - 1 5 p g o f o n e o r m o r e p l a s m i d D N A s w e r e p r e p a r e d b y m i x i n g w i t h 1 / 1 0 t h v o l u m e o f 3 M s o d i u m a c e t a t e a n d t h r e e v o l u m e s o f , 1 0 0 % E t O H . F o r i m m u n o p r e c i p i t a t i o n s t u d i e s , e a c h 1 0 - c m d i s h o f H E K c e l l s w a s t r a n s f e c t e d w i t h 5 p g e a c h o f c D N A p l a s m i d e n c o d i n g r a t N R 1 a n d N R 2 B s u b u n i t s . F o r a n a l y s i s o f p r o t e i n e x p r e s s i o n i n c e l l s o v e r - e x p r e s s i n g W T v e r s u s m u t a n t h t t , e a c h 1 0 - c m d i s h o f H E K c e l l s w a s t r a n s f e c t e d w i t h 3 p g e a c h o f c D N A p l a s m i d e n c o d i n g r a t N R 1 a n d N R 2 B 73 a l o n g w i t h 6 u g o f p l a s m i d D N A e n c o d i n g f u l l - l e n g t h h u m a n h t t w i t h a p o l y Q r e p e a t l e n g t h o f e i t h e r 1 5 ( h t t - 1 5 Q ; W T ) o r 1 3 8 ( h t t - 1 3 8 Q ; m u t a n t ) r e s i d u e s . A f t e r b r i e f c e n t r i f u g a t i o n , p l a s m i d D N A s a m p l e s w e r e t o p p e d u p t o 1 4 0 0 p l f i n a l v o l u m e w i t h 1 0 0 % E t O H i n a 1 . 5 - m l m i c r o f u g e t u b e a n d c e n t r i f u g e d f o r 2 0 m i n u t e s a t 1 4 , 0 0 0 r p m a t 4 ° C t o p r e c i p i t a t e t h e D N A . T h e n u c l e i c a c i d p e l l e t w a s t h e n r e s u s p e n d e d i n 4 5 0 p l o f 0 . 1 x T E , m i x e d w i t h 5 0 p l o f 2 . 5 M C a C I 2 a n d 5 0 0 p l o f 2 x B E S s o l u t i o n , a n d a l l o w e d t o s i t a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 0 m i n u t e s . C e l l s t o b e t r a n s f e c t e d w e r e t r a n s f e r r e d t o a h u m i d i f i e d 3 7 ° C 3 % C O 2 e n v i r o n m e n t a n d i n c u b a t e d f o r 2 0 m i n u t e s . S u b s e q u e n t l y , t h e t r a n s f e c t i o n m i x w a s a d d e d t o e x i s t i n g m e d i a a t 1 m l p e r 1 0 - c m d i s h o f c e l l s . T r a n s f e c t e d c e l l s w e r e i n c u b a t e d f o r 8 h o u r s a t 3 7 ° C 3 % C 0 2 b e f o r e b e i n g w a s h e d t w i c e w i t h p r e - w a r m e d P B S a n d r e p l e n i s h e d w i t h f r e s h m e d i u m . C e l l s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d b a c k t o t h e 5 % C 0 2 i n c u b a t o r u n t i l t h e y w e r e h a r v e s t e d f o r e x p e r i m e n t s a t 2 4 h o u r s f o l l o w i n g t h e s t a r t o f t r a n s f e c t i o n . T r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y w a s d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g p - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i n a s e p a r a t e 1 0 - c m d i s h t r a n s f e c t e d i n p a r a l l e l w i t h 1 0 p g o f B - g a l p l a s m i d c D N A , a n d f u r t h e r e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d o n l y if t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y e x c e e d e d 5 0 % . 2 . 2 . 2 . 1 . p - G a l a c t o s i d a s e S t a i n i n g t o D e t e r m i n e T r a n s f e c t i o n E f f i c i e n c y C e l l s t r a n s f e c t e d w i t h p l a s m i d D N A e n c o d i n g p - g a l a c t o s i d a s e w e r e e x a m i n e d f o r p - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y a s a m e a s u r e o f t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y . A t 2 4 h o u r s f o l l o w i n g s t a r t o f t r a n s f e c t i o n b y t h e C a P m e t h o d , c e l l s w e r e w a s h e d o n c e w i t h 5 m l o f p r e - w a r m e d P B S b e f o r e b e i n g f i x e d i n P B S c o n t a i n i n g 0 . 4 % g l u t a r a l d e h y d e a n d 2 % f o r m a l d e h y d e f o r 5 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . F o l l o w i n g f i x a t i o n , c e l l s w e r e w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h P B S a n d t h e n s t a i n e d w i t h P B S c o n t a i n i n g 2 m M M g C I 2 , 5 m M K 3 [ F e ( C N ) 6 ] , 5 m M 74 K 4 F e ( C N ) 6 . 3 H 2 0 , a n d 0 . 5 m g / m l X - g a l ( f r o m f o r m e r l y M o l e c u l a r P r o b e s , n o w p a r t o f I n v i t r o g e n C a n a d a I n c . , B u r l i n g t o n , O N ) d i s s o l v e d i n D M S O a n d a d d e d f r e s h i m m e d i a t e l y p r i o r t o u s e . S t a i n e d d i s h e s o f c e l l s w e r e w r a p p e d i n p a r a f i l m a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 1 h o u r b e f o r e c e l l c o u n t s w e r e p e r f o r m e d . A s c e l l s e x p r e s s i n g p - g a l a c t o s i d a s e r e a c t w i t h t h e s u b s t r a t e X - g a l t o g e n e r a t e a b l u e c o l o u r , t h e n u m b e r o f b l u e c e l l s w e r e c o u n t e d a n d c a l c u l a t e d a s a p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l n u m b e r o f c e l l s t o d e t e r m i n e t r a n s f e c t i o n e f f i c i e n c y . 2 . 2 . 3 . I m m u n o p r e c i p i t a t i o n . > . . T e n - c e n t i m e t e r d i s h e s o f H E K 2 9 3 c e l l s t r a n s f e c t e d i n d u p l i c a t e w i t h N R 1 / N R 2 B c D N A w e r e h a r v e s t e d a t 2 4 h o u r s f o l l o w i n g s t a r t o f t r a n s f e c t i o n i n l y s i s b u f f e r c o n t a i n i n g P B S 1 m M E D T A / 1 m M E G T A / 0 . 2 % S D S / 0 . 8 % T r i t o n X - 1 0 0 a n d s u p p l e m e n t e d w i t h p h o s p h a t a s e i n h i b i t o r s a n d p r o t e a s e i n h i b i t o r s , a t 5 0 0 p l p e r 1 0 - c m d i s h o f c e l l s . P r o t e i n s w e r e s o l u b i l i z e d b y s o n i c a t i o n f o r 1 0 s e c o n d s a t s e t t i n g 3 , a n d t h e h o m o g e n a t e w a s i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n u t e s a t 4 ° C w i t h e n d - o v e r - e n d r o t a t i o n b e f o r e b r i e f c e n t r i f u g a t i o n a t 1 4 , 0 0 0 r p m t o p e l l e t c e l l u l a r d e b r i s . T h e r e s u l t i n g s u p e r n a t a n t s ( " l y s a t e s " ) w e r e p o o l e d f r o m d u p l i c a t e d i s h e s a n d u s e d f o r I P a t 3 0 0 - 4 0 0 p l p e r s a m p l e . F o r e a c h s a m p l e , 5 - 1 0 p g o f a n t i - N R 2 B p r i m a r y a n t i b o d y w e r e a d d e d t o t h e l y s a t e a n d a l l o w e d t o i n c u b a t e f o r 1 - 2 h o u r s a t 4 ° C w i t h s l o w e n d - o v e r - e n d r o t a t i o n . S i x t y m i c r o l i t e r s o f a 5 0 % - s l u r r y c o n t a i n i n g a m i x t u r e o f p r e - e q u i l i b r a t e d P r o t e i n A a n d P r o t e i n G S e p h a r o s e 4 F a s t F l o w r e s i n w e r e t h e n a d d e d a n d s a m p l e s w e r e i n c u b a t e d f o r a n a d d i t i o n a l h o u r . S u b s e q u e n t l y , s a m p l e s w e r e c e n t r i f u g e d b r i e f l y a t 5 , 0 0 0 r p m a n d t h e p e l l e t e d r e s i n w a s h e d t h r e e t i m e s i n 1 x T W B t o r e d u c e n o n - s p e c i f i c b i n d i n g . T h e w a s h e d r e s i n w a s t h e n r e s u s p e n d e d i n 3 x P S B a n d h e a t e d a t 9 5 - 1 0 0 ° C f o r 3 - 5 m i n u t e s i n p r e p a r a t i o n f o r r e s o l u t i o n b y S D S - P A G E . 75 2 . 2 . 4 . N M D A R S t i m u l a t i o n o f T r a n s f e c t e d C e l l s In c e r t a i n e x p e r i m e n t s w h e r e c y t o s o l i c a n d p a r t i c u l a t e f r a c t i o n s w e r e t o b e c o l l e c t e d f r o m N R 1 / N R 2 B / h t t - 1 5 Q - o r N R 1 / N R 2 B / h t t - 1 3 8 Q - t r a n s f e c t e d H E K 2 9 3 c e l l s t o e x a m i n e e f f e c t s o f N M D A R a c t i v a t i o n , d i s h e s o f t r a n s f e c t e d c e l l s w e r e s t i m u l a t e d w i t h N M D A R a g o n i s t s p r i o r t o h a r v e s t i n D F b u f f e r . A t 2 4 h o u r s a f t e r t r a n s f e c t i o n , c u l t u r e m e d i u m w a s r e p l a c e d w i t h B S S o r w i t h p h y s i o l o g i c a l s o l u t i o n ( P S ; c o n t a i n i n g , i n m M : 1 . 8 C a C I 2 , 1 4 5 N a C l , 5 . 4 K C I , 11 D - g l u c o s e , 1 0 H E P E S p H 7 . 3 ) , w i t h o r w i t h o u t 1 m M N M D A / 5 0 u M g l y c i n e f o r t h e " p l u s N M D A R s t i m u l a t i o n " o r " m i n u s N M D A R s t i m u l a t i o n " c o n d i t i o n s , r e s p e c t i v e l y . F o l l o w i n g i n c u b a t i o n o f t h e c e l l s a t 3 7 ° C 5 % C 0 2 f o r 3 0 m i n u t e s , c e l l s w e r e w a s h e d a n d h a r v e s t e d i n D F b u f f e r . C y t o s o l i c a n d p a r t i c u l a t e f r a c t i o n s o f p o o l e d c e l l l y s a t e s w e r e t h e n h a r v e s t e d a s d e s c r i b e d i n t h e n e x t s e c t i o n . A l t e r n a t i v e l y , i n e x p e r i m e n t s w h e r e t o t a l c e l l u l a r e x p r e s s i o n w a s m e a s u r e d , t o t a l s o l u b l e l y s a t e s w e r e c o l l e c t e d d i r e c t l y i n T X b u f f e r a n d h a r v e s t e d , a g a i n a s d e s c r i b e d i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n . E q u i v a l e n t a m o u n t s o f p r o t e i n f r o m c y t o s o l i c a n d p a r t i c u l a t e f r a c t i o n s o r t o t a l s o l u b l e l y s a t e s o f e a c h c o n d i t i o n ( e x p r e s s i n g h t t - 1 5 Q o r h t t - 1 3 8 Q ; w i t h o r w i t h o u t N M D A R s t i m u l a t i o n ) w e r e r e s o l v e d b y S D S - P A G E a n d e x a m i n e d f o r t h e p r o t e i n s o f i n t e r e s t b y i m m u n o b l o t t i n g . 2 . 2 . 5 . H a r v e s t i n g C e l l s f o r K i n e t w o r k s ™ o r I m m u n o b l o t t i n g A n a l y s i s D i s h e s o f H E K 2 9 3 c e l l s w e r e t r a n s f e c t e d i n p a r a l l e l f o r t h e W T a n d m u t a n t c o n d i t i o n s ( w i t h 3 / 3 / 6 p g o f N R 1 / N R 2 B / h t t - 1 5 Q o r N R 1 / N R 2 B / h t t - 1 3 8 Q p l a s m i d D N A s , r e s p e c t i v e l y ) u s i n g t h e C a P m e t h o d . In t h e s a m e e x p e r i m e n t , a c o n t r o l d i s h o f c e l l s w a s t r a n s f e c t e d w i t h t h e p - g a l a c t o s i d a s e p l a s m i d D N A a n d s t a i n e d w i t h X - g a l a t 2 4 h o u r s 76 p o s t - t r a n s f e c t i o n t o d e t e r m i n e t h e e f f i c i e n c y o f t r a n s f e c t i o n . E x p e r i m e n t s w e r e c o n t i n u e d o n l y w h e n m o r e t h a n 5 0 % o f t h e c e l l s w e r e t r a n s f e c t e d a n d e x p r e s s i n g t h e t r a n s g e n e s . H a r v e s t o f c y t o s o l i c a n d p a r t i c u l a t e f r a c t i o n s f r o m c e l l l y s a t e s w a s c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o a m o d i f i e d p r o t o c o l b a s e d o n g u i d e l i n e s f r o m K i n e x u s B i o i n f o r m a t i c s C o r p . ( V a n c o u v e r , B C ; w e b s i t e a t w w w . k i n e x u s . c a ) . B r i e f l y , c e l l l y s a t e s w e r e p o o l e d a n d h a r v e s t e d a t 2 4 h o u r s f o l l o w i n g t h e s t a r t o f t r a n s f e c t i o n i n D F b u f f e r a t r o u g h l y 1 0 0 p l p e r 1 0 6 c e l l s ( o r ~ 2 0 0 - 3 0 0 p l p e r 1 0 - c m d i s h o f c e l l s a t m e d i u m d e n s i t y ) . S a m p l e s i n D F b u f f e r w e r e s o n i c a t e d w i t h t w o 1 5 - s e c o n d b u r s t s a t s e t t i n g 3 w i t h a 3 - s e c o n d i n t e r - b u r s t p a u s e o n i c e . L y s a t e s w e r e t h e n s u b j e c t e d t o u l t r a c e n t r i f u g a t i o n f o r 3 0 m i n u t e s a t 4 ° C a t 1 0 0 , 0 0 0 x g . T h e r e s u l t i n g s u p e r n a t a n t w a s s a v e d a s t h e c y t o s o l i c f r a c t i o n a n d t h e p e l l e t r e s u s p e n d e d i n T X b u f f e r a t r o u g h l y h a l f t h e i n i t i a l v o l u m e o f D F b u f f e r u s e d ( ~ 1 0 0 - 1 5 0 p l p e r 1 0 - c m d i s h o f c e l l s ) . T h e p e l l e t f r a c t i o n w a s t h e n m i x e d , s o n i c a t e d , a n d c e n t r i f u g e d f o r 3 0 m i n u t e s a t 1 0 0 , 0 0 0 x g a s d e s c r i b e d a b o v e . T h e s u p e r n a t a n t f r o m t h i s s t e p w a s a l s o s a v e d a n d r e p r e s e n t e d t h e p a r t i c u l a t e f r a c t i o n c o n t a i n i n g d e t e r g e n t - s o l u b l e p r o t e i n s . T o t a l s o l u b l e f r a c t i o n s w e r e h a r v e s t e d d i r e c t l y i n T X b u f f e r ( i n s t e a d o f D F b u f f e r ) b u t w e r e o t h e r w i s e p r o c e s s e d i n t h e s a m e w a y . A l l f r a c t i o n s w e r e q u a n t i f i e d f o r p r o t e i n c o n t e n t u s i n g t h e B C A a s s a y b e f o r e b e i n g d i l u t e d i n 4 x K i n e t w o r k s ™ P S B ( c o n t a i n i n g 5 % B - m e r c a p t o e t h a n o l a d d e d f r e s h a t t i m e o f u s e , 0 . 0 8 % B r o m o p h e n o l b l u e d y e , 4 % S D S , a n d 5 0 % g l y c e r o l i n 1 2 5 m M T r i s - C I p H 6 . 8 ) a n d s u b j e c t e d t o s t a n d a r d i m m u n o b l o t t i n g o r K i n e t w o r k s ™ m u l t i - i m m u n o b l o t t i n g a n a l y s e s . C y t o s o l i c a n d p a r t i c u l a t e f r a c t i o n s f r o m H E K 2 9 3 c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h N R 1 / N R 2 B / h t t - 1 5 Q o r N R 1 / N R 2 B / h t t - 1 3 8 Q ( t h e " h t t 1 5 " a n d " h t t 1 3 8 " c o n d i t i o n s , r e s p e c t i v e l y ) w e r e a n a l y z e d b y K i n e t w o r k s ™ K P K S 1 . 0 P r o t e i n K i n a s e , K P P S 1 . 0 P r o t e i n P h o s p h a t a s e , a n d K H S P 1 . 0 H e a t S h o c k P r o t e i n s c r e e n s . A n a l y s i s i n v o l v e s r e s o l u t i o n o f t h e l y s a t e s a m p l e b y S D S - P A G E a n d s u b s e q u e n t i m m u n o b l o t t i n g w i t h u p t o t h r e e 77 p r i m a r y a n t i b o d i e s p e r c h a n n e l i n a 2 0 - c h a n n e l m u l t i b l o t t e r . M i x t u r e s o f a n t i b o d i e s u s e d i n a g i v e n c h a n n e l w e r e t e s t e d t o r u l e o u t c r o s s - i m m u n o r e a c t i v i t y w i t h o t h e r t a r g e t p r o t e i n s t o b e p r o b e d f o r i n t h e s a m e c h a n n e l . D e t a i l e d i n f o r m a t i o n a n d p r o t o c o l s o f t h e K i n e t w o r k s ™ a n a l y s e s h a v e a l s o b e e n p u b l i s h e d p r e v i o u s l y ( P e l e c h e t a l . 2 0 0 3 ) . 2.3. E. Coli Bacteria 2 . 3 . 1 . T r a n s f o r m a t i o n w i t h P l a s m i d D N A F o r t h e p u r i f i c a t i o n o f p l a s m i d D N A f r o m a p r e - e x i s t i n g D N A s t o c k , S u b c l o n i n g E f f i c i e n c y ™ D H 5 a h e a t - s h o c k c o m p e t e n t £ . coli b a c t e r i a ( I n v i t r o g e n C a n a d a I n c . , B u r l i n g t o n , O N ) w e r e t h a w e d o n i c e - w a t e r . 1 - 2 p l o f p l a s m i d s t o c k w a s a d d e d t o a 5 0 - p l a l i q u o t o f c o m p e t e n t b a c t e r i a a n d i n c u b a t e d o n i c e f o r 3 0 m i n u t e s b e f o r e b e i n g h e a t s h o c k e d f o r 2 0 s e c o n d s a t 3 7 ° C . C e l l s w e r e i m m e d i a t e l y p l a c e d o n i c e f o r 2 m i n u t e s f o l l o w i n g h e a t s h o c k , a n d t h e n d i l u t e d w i t h 9 5 0 p l L u r i a b r o t h ( L B ) b a c t e r i a l m e d i u m ( i n g / L : 1 0 p e p t o n e / t r y p t o n e , 5 y e a s t e x t r a c t , 1 0 N a C l ) p r i o r t o i n c u b a t i o n f o r 1 h o u r a t 3 7 ° C w i t h v i g o r o u s s h a k i n g a t 2 2 5 r p m . C e l l s w e r e s u b s e q u e n t l y c e n t r i f u g e d f o r 5 m i n u t e s a t 4 , 0 0 0 r p m , a n d t h e b a c t e r i a l p e l l e t r e s u s p e n d e d i n 1 0 0 p l o f f r e s h L B m e d i u m . O n e , 1 0 , a n d 9 0 p l o f t h e b a c t e r i a w e r e p l a t e d o n t o L B a g a r p l a t e s s u p p l e m e n t e d w i t h t h e a p p r o p r i a t e a n t i b i o t i c t o s e l e c t f o r b a c t e r i a s u c c e s s f u l l y t r a n s f o r m e d w i t h t h e p l a s m i d D N A . 78 2 . 3 . 2 . P u r i f i c a t i o n o f P l a s m i d D N A B a c t e r i a t r a n s f o r m e d w i t h p l a s m i d D N A o r s m e a r e d f r o m a f r o z e n g l y c e r o l s t o c k w e r e s t r e a k e d o n t o L B a g a r p l a t e s c o n t a i n i n g t h e a p p r o p r i a t e s e l e c t i v e a n t i b i o t i c a n d a l l o w e d t o g r o w o v e r n i g h t a t 3 7 ° C . A s i n g l e c o l o n y o f b a c t e r i a w a s p i c k e d t o i n o c u l a t e a s t a r t e r c u l t u r e o f 2 m l o f a n t i b i o t i c - c o n t a i n i n g f r e s h L B m e d i u m . S t a r t e r c u l t u r e s w e r e g r o w n f o r ~ 8 - 1 2 h o u r s a t 3 7 ° C w i t h v i g o r o u s s h a k i n g a t 2 5 0 - 3 0 0 r p m , a n d t h e n d i l u t e d i n t o 5 0 0 m l o f s e l e c t i v e L B m e d i u m . T h e d i l u t e d c u l t u r e w a s f u r t h e r i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 1 2 - 1 6 h o u r s ( u s u a l l y o v e r n i g h t ) w i t h v i g o r o u s s h a k i n g a n d a e r a t i o n i n a 2 - L f l a s k . T o p r e p a r e f r o z e n g l y c e r o l s t o c k s o f b a c t e r i a c a r r y i n g p l a s m i d D N A , 1 m l o f b a c t e r i a l c u l t u r e i s m i x e d w i t h 2 5 0 p l o f s t e r i l e g l y c e r o l t o g e n e r a t e a 2 0 % g l y c e r o l s t o c k t o b e s t o r e d a t - 8 0 ° C . T h e r e s t o f t h e p l a s m i d - c o n t a i n i n g b a c t e r i a l c u l t u r e g r o w n o v e r n i g h t w a s t h e n h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 6 , 0 0 0 x g f o r 1 5 m i n u t e s a t 4 ° C . P l a s m i d D N A w a s p u r i f i e d u s i n g Q i a g e n ( M i s s i s s a u g a , O N ) P l a s m i d M a x i ™ o r E n d o F r e e P l a s m i d M a x i ™ p u r i f i c a t i o n k i t s a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ' s p r o t o c o l . P u r i f i e d p l a s m i d s p r e c i p i t a t e d w i t h 7 0 % E t O H w e r e t h e n a l l o w e d t o a i r - d r y b e f o r e b e i n g d i s s o l v e d i n s t e r i l e t i s s u e - c u l t u r e g r a d e H2O. C o n c e n t r a t i o n s o f t h e r e s u l t a n t p l a s m i d D N A s w e r e d e t e r m i n e d b y o p t i c a l d e n s i t y ( O D ) m e a s u r e m e n t s a t 2 6 0 n m ( O D 2 6 o ) i n a n U l t r o s p e c 3 0 0 0 U V A / i s i b l e S p e c t r o p h o t o m e t e r ( f r o m f o r m e r l y P h a r m a c i a B i o t e c h , n o w p a r t o f G E H e a l t h c a r e B i o - S c i e n c e s I n c . , B a i e d ' U r f e , Q C ) , a n d D N A p u r i t y w a s a s s e s s e d b y c a l c u l a t i n g t h e r a t i o o f OD260 t o OD280 m e a s u r e m e n t s . 79 2 . 3 . 3 . P u r i f i c a t i o n o f G S T - F u s i o n P r o t e i n s f r o m B a c t e r i a G l u t a t h i o n e - S - t r a n s f e r a s e ( G S T ) a n d G S T - f u s i o n p r o t e i n s w e r e e x p r e s s e d i n D H 5 a o r B L 2 1 E. coli a n d p u r i f i e d a c c o r d i n g t o t h e p G E X v e c t o r m a n u f a c t u r e r ' s p r o t o c o l ( f r o m f o r m e r l y P h a r m a c i a B i o t e c h , n o w p a r t o f G E H e a l t h c a r e B i o - S c i e n c e s I n c . , B a i e d ' U r f e , Q C ) . B r i e f l y , o v e r n i g h t s t a r t e r c u l t u r e s o f b a c t e r i a c a r r y i n g i n d u c i b l e v e c t o r s e n c o d i n g f o r G S T , G S T - H I P 1 ( G S T f u s e d t o f u l l - l e n g t h H I P - 1 ) , o r G S T - H I P 1 - T a l i n ( G S T f u s e d t o t h e H I P - 1 t a l i n d o m a i n ) w e r e e a c h u s e d t o i n o c u l a t e 2 0 0 m l o f 2 x Y T b a c t e r i a l m e d i u m ( i n g / L : 1 6 t r y p t o n e / p e p t o n e , 1 0 y e a s t e x t r a c t , 5 N a C l ) , w h i c h w a s t h e n a l l o w e d t o g r o w a t 3 7 ° C w i t h s h a k i n g a n d a e r a t i o n u n t i l a n O D 6 0 0 o f ~ 0 . 5 w a s r e a c h e d . I s o p r o p y l t h i o g a l a c t o s i d e ( I P T G ) w a s t h e n a d d e d t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 2 m M t o i n d u c e e x p r e s s i o n o f G S T a n d G S T - f u s i o n p r o t e i n s . B a c t e r i a w e r e h a r v e s t e d a t 3 h o u r s a f t e r i n d u c t i o n b y c e n t r i f u g a t i o n a t 7 , 2 0 0 r p m f o r 1 0 m i n u t e s a t 4 ° C . F o l l o w i n g r e m o v a l o f t h e s u p e r n a t a n t , t h e b a c t e r i a l p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n 1 0 m l o f i c e - c o l d P B S c o n t a i n i n g p r o t e a s e i n h i b i t o r s , l y s e d b y t r e a t m e n t w i t h l y s o z y m e a t ~1 m g / m l a n d e n d - o v e r - e n d r o t a t i o n f o r 1 5 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e , s o n i c a t e d w i t h t w o 3 0 - s e c o n d b u r s t s o n i c e , a n d s o l u b i l i z e d w i t h T r i t o n X - 1 0 0 ( a t 1 % f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) . T h e s o l u t i o n w a s t h e n r o t a t e d e n d - o v e r - e n d f o r 3 0 m i n u t e s a t 4 ° C p r i o r t o c e n t r i f u g a t i o n f o r 1 0 m i n u t e s a t 9 , 4 0 0 r p m . T h e s o l u b l e l y s a t e w a s s u b s e q u e n t l y s u p p l e m e n t e d w i t h 2 m M A T P a n d 1 0 m M M g S 0 4 i n a 5 0 m M T r i s - C I p H 8 s o l u t i o n a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 1 0 m i n u t e s w i t h o c c a s i o n a l m i x i n g , i n o r d e r t o r e d u c e t h e p r e s e n c e o f c o n t a m i n a t i n g b a c t e r i a l p r o t e i n s i n t h e f i n a l e l u a t e . G S T a n d G S T - f u s i o n p r o t e i n s w e r e t h e n p u r i f i e d b y i n c u b a t i o n f o r 1 h o u r a t 4 ° C o r 3 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e w i t h 1 0 0 - 2 0 0 p l o f a 5 0 % s l u r r y o f p r e - e q u i l i b r a t e d G l u t a t h i o n e S e p h a r o s e 4 B r e s i n ( f r o m f o r m e r l y A m e r s h a m P h a r m a c i a B i o t e c h , n o w p a r t o f G E H e a l t h c a r e B i o - S c i e n c e s I n c . , B a i e d ' U r f e , Q C ) . R e s i n w a s 80 w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h i c e - c o l d P B S s u p p l e m e n t e d w i t h 5 m M A T P a n d p r o t e a s e i n h i b i t o r s a t 1 m l / s a m p l e p e r w a s h , f o l l o w e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 , 0 0 0 x g f o r 5 m i n u t e s a t 4 ° C a n d r e m o v a l o f t h e w a s h s o l u t i o n . P u r i f i e d r e s i h - b o u n d p r o t e i n s w e r e e l u t e d b y i n c u b a t i n g t h e w a s h e d r e s i n w i t h 5 0 - 1 0 0 p l o f G l u t a t h i o n e E l u t i o n B u f f e r ( G E B ; 1 0 m M r e d u c e d g l u t a t h i o n e , 5 0 m M T r i s - C I p H 8 ) w i t h e n d - o v e r - e n d r o t a t i o n f o r 1 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . R e s i n - p u r i f i e d e l u a t e s w e r e t h e n q u a n t i f i e d f o r p r o t e i n c o n t e n t b y B C A a s s a y a n d u s e d i n i m m u n o b l o t t i n g o r g e l o v e r l a y e x p e r i m e n t s . 2.4. P lasmid D N A p - g a l , e x p r e s s i n g E. coli p - g a l a c t o s i d a s e u n d e r c o n t r o l o f t h e c y t o m e g a l o v i r u s ( C M V ) p r o m o t e r ; p l a s m i d p C M V p a c q u i r e d f r o m C l o n t e c h ( M o u n t a i n V i e w , C A ) G F P , e x p r e s s i n g m a m m a l i a n e n h a n c e d g r e e n f l u o r e s c e n t p r o t e i n ; k i n d g i f t f r o m D r . E l - H u s s e i n i ( C a n a d a ) G S T , e x p r e s s i n g Schistosoma japonicum g l u t a t h i o n e - S - t r a n s f e r a s e u n d e r c o n t r o l o f t h e i n d u c i b l e tac p r o m o t e r ; k i n d g i f t f r o m D r . A s t e l l ( C a n a d a ) G S T - H I P 1 , e x p r e s s i n g G S T - t a g g e d H I P - 1 p r o t e i n ; k i n d g i f t f r o m D r s . M e t z l e r a n d H a y d e n ( C a n a d a ) G S T - H I P 1 - T a l i n , e x p r e s s i n g G S T - t a g g e d H I P - 1 t a l i n d o m a i n ; k i n d g i f t f r o m D r s . M e t z l e r a n d H a y d e n ( C a n a d a ) H I P 1 , e x p r e s s i n g H I P - 1 ( c o n t a i n i n g t h e F 3 9 8 G p o i n t m u t a t i o n t o m i n i m i z e t o x i c i t y f r o m o v e r - e x p r e s s i o n ) f r o m a p C I - d e r i v e d v e c t o r ; k i n d g i f t f r o m D r . H a y d e n ( C a n a d a ) H t t 1 5 , e x p r e s s i n g f u l l - l e n g t h h u m a n htt w i t h 1 5 Q ( W T ) u n d e r c o n t r o l o f t h e C M V p r o m o t e r ( G o l d b e r g e t a l . , 1 9 9 6 ) 81 H t t 1 3 8 , e x p r e s s i n g f u l l - l e n g t h h u m a n htt w i t h 1 3 8 Q ( m u t a n t ) u n d e r c o n t r o l o f t h e C M V p r o m o t e r ( G o l d b e r g e t a l . , 1 9 9 6 ) N R 1 , e x p r e s s i n g r a t N R 1 - 1 a i s o f o r m f r o m a p R K 5 - d e r i v e d v e c t o r u n d e r c o n t r o l o f t h e C M V p r o m o t e r ( R a y m o n d e t a l . , 1 9 9 6 ; C h e n e t a l . , 1 9 9 7 ) N R 2 B , e x p r e s s i n g r a t N R 2 B s u b u n i t f r o m a p R K 5 - d e r i v e d v e c t o r u n d e r c o n t r o l o f t h e C M V p r o m o t e r ( R a y m o n d e t a l . , 1 9 9 6 ; C h e n e t a l . , 1 9 9 7 ) r 2.5. Antibodies A n t i - a - a c t i n i n , m o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( f o r m e r l y U p s t a t e ; n o w p a r t o f M i l l i p o r e , B i l l e r i c a , M A ; c a t a l o g u e # 0 5 - 3 8 4 ) A n t i - a - a c t i n i n , r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y ( S i g m a - A l d r i c h C a n a d a L t d . , O a k v i l l e , O N ; c a t a l o g u e # A - 2 5 4 3 ) A n t i -a - a c t i n i n 4 , r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y ( k i n d g i f t f r o m D r . Y a m a d a , J a p a n ) A n t i - a c t i n , g o a t p o l y c l o n a l a n t i b o d y ( S a n t a C r u z B i o t e c h n o l o g y , I n c . , S a n t a C r u z , C A ; c a t a l o g u e # S C - 1 6 1 6 ) A n t i - c a l n e x i n , r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y ( f o r m e r l y S t r e s s G e n ; n o w N v e n t a B i o p h a r m a c e u t i c a l s C o r p . , S a n D i e g o , C A ; c a t a l o g u e # S P A - 8 6 0 ) A n t i - C K 2 , r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y ( k i n d g i f t f r o m D r . P e l e c h , C a n a d a ; C h a r l t o n e t a l . 1 9 9 2 ) A n t i - G l u R 1 , r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y ( f o r m e r l y U p s t a t e ; n o w p a r t of , M i l l i p o r e , B i l l e r i c a , M A ; c a t a l o g u e # 0 6 - 3 0 6 ) A n t i - G l u R 1 , r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y ( f o r m e r l y C h e m i c o n ; n o w p a r t o f M i l l i p o r e , B i l l e r i c a , M A ; c a t a l o g u e # A B 1 5 0 4 ) 82 A n t i - G r o E L , r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y ( A s s a y D e s i g n s , A n n A r b o r , M l ) A n t i - G S T , m o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( f o r m e r l y S t r e s s G e n ; n o w N v e n t a ; c a t a l o g u e # M S A - 1 0 3 ) A n t i - H I P - 1 , r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y ( k i n d g i f t f r o m D r . H a y d e n , C a n a d a ) A n t i - H I P - 1 # 9 , m o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( k i n d g i f t f r o m D r . H a y d e n , C a n a d a ) A n t i - H s p 7 0 , m o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( A s s a y D e s i g n s , A n n A r b o r , M l ; c a t a l o g u e # S P A - 8 1 0 ) A n t i - H s p 9 0 , m o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( S a n t a C r u z B i o t e c h n o l o g y , I n c . , S a n t a C r u z , C A ) A n t i - h t t , m o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( f o r m e r l y C h e m i c o n ; n o w p a r t o f M i l l i p o r e , B i l l e r i c a , M A ; c a t a l o g u e # M A B 2 1 6 6 ) A n t i - N R 1 e x t r a c e l l u l a r l o o p b e t w e e n M 3 a n d M 4 , m o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( f o r m e r l y C h e m i c o n ; n o w p a r t o f M i l l i p o r e , B i l l e r i c a , M A ; c a t a l o g u e # M A B 3 6 3 ) A n t i - N R 1 A C T , r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y ( f o r m e r l y U p s t a t e ; n o w p a r t o f M i l l i p o r e , B i l l e r i c a , M A ; c a t a l o g u e # 0 6 - 3 1 1 ) A n t i - N R 1 C 2 , r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y ( P h o s p h o S o l u t i o n s , A u r o r a , C O ; c a t a l o g u e # 1 5 0 6 - C 2 ) A n t i - N R 1 C 2 ' , r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y ( P h o s p h o S o l u t i o n s , A u r o r a , C O ; c a t a l o g u e # 1 5 0 7 - C 2 ' ) A n t i - N R 2 A , r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y ( f o r m e r l y U p s t a t e ; n o w p a r t o f M i l l i p o r e , B i l l e r i c a , M A ; c a t a l o g u e * 0 6 - 3 1 3 ) A n t i - N R 2 B , m o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( B D T r a n s d u c t i o n L a b o r a t o r i e s , S a n J o s e , C A ; c a t a l o g u e # 6 1 0 4 1 7 ) A n t i - N R 2 B , m o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( A B R - A f f i n i t y B i o R e a g e n t s , G o l d e n , C O ; c a t a l o g u e * M A 1 - 2 0 1 4 ) 83 A n t i - N R 2 B , r a b b i t p o l y c l o n a l a n t i b o d y ( f o r m e r l y U p s t a t e ; n o w p a r t o f M i l l i p o r e , B i l l e r i c a , M A ; c a t a l o g u e # 0 6 - 6 0 0 ) A n t i - N R 2 B , r a b b i t a n t i - s e r u m ( k i n d g i f t f r o m D r . H u g a n i r , U . S . A . ) A n t i - P S D - 9 5 , m o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( f o r m e r l y C h e m i c o n ; n o w p a r t o f M i l l i p o r e , B i l l e r i c a , M A ; c a t a l o g u e # M A B 1 5 9 6 ) A n t i - s y n a p t o p h y s i n , m o u s e m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( k i n d g i f t f r o m D r . V i n c e n t , C a n a d a ) C y 3 a n t i - m o u s e , s e c o n d a r y a n t i b o d y ( J a c k s o n I m m u n o R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s , I n c . , W e s t G r o v e , P A ) A l e x a F l u o r 3 5 0 a n t i - m o u s e , s e c o n d a r y a n t i b o d y ( f o r m e r l y M o l e c u l a r P r o b e s ; n o w p a r t o f I n v i t r o g e n C a n a d a I n c . , B u r l i n g t o n , O N ) A l e x a F l u o r 4 8 8 a n t i - m o u s e , s e c o n d a r y a n t i b o d y ( f o r m e r l y M o l e c u l a r P r o b e s ; n o w p a r t o f I n v i t r o g e n C a n a d a I n c . , B u r l i n g t o n , O N ) A l e x a F l u o r 5 9 4 a n t i - r a b b i t , s e c o n d a r y a n t i b o d y ( f o r m e r l y M o l e c u l a r P r o b e s ; n o w p a r t o f I n v i t r o g e n C a n a d a I n c . , B u r l i n g t o n , O N ) 2.6. Gel Overlay Assay P u r i f i e d r e c o m b i n a n t G S T , G S T - H I P 1 , a n d G S T - H I P 1 - T a l i n w e r e r e s o l v e d b y S D S - P A G E a n d t r a n s f e r r e d o n t o a P V D F m e m b r a n e a s f o r i m m u n o b l o t t i n g . T h e m e m b r a n e w a s t h e n w e t t e d i n m e t h a n o l , e q u i l i b r a t e d i n H2O a n d T B S , a n d t h e n b l o c k e d f o r 2 h o u r s a t r o o m t e m p e r a t u r e i n T B S - T s u p p l e m e n t e d w i t h 3 % ( w / v ) B S A . F o l l o w i n g a b r i e f r i n s e i n T B S - T , t h e m e m b r a n e w a s i n c u b a t e d w i t h 2 p g / m l r e c o m b i n a n t a - a c t i n i n i n T B S - T 3 % B S A f o r 1 . 5 h o u r s a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d t h e n w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h T B S - T . T h e m e m b r a n e w a s s u b s e q u e n t l y p r o b e d f o r t h e b i n d i n g o f a - a c t i n i n t o G S T o r 84 G S T - f u s i o n p r o t e i n s u s i n g a n a n t i - a - a c t i n i n p r i m a r y a n t i b o d y a n d a p p r o p r i a t e s e c o n d a r y a n t i b o d y a s p e r s t a n d a r d i m m u n o b l o t t i n g p r o t o c o l s . 2.7. Materials C h e m i c a l s a n d r e a g e n t s w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a - A l d r i c h C a n a d a L t d . ( O a k v i l l e , O N ) u n l e s s o t h e r w i s e n o t e d . 2.8. Data Analysis S t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s w e r e d e t e r m i n e d u s i n g s t a n d a r d s t a t i s t i c a l t e s t s . D a t a f r o m e x p e r i m e n t s w i t h t w o c o n d i t i o n s o r g e n o t y p e s c o n d u c t e d i n p a r a l l e l w e r e a n a l y z e d b y p a i r e d t - t e s t s . W h e r e s a m p l e s f o r t h e t w o c o n d i t i o n s w e r e p r o c e s s e d s e p a r a t e l y , d a t a w e r e a n a l y z e d b y u n p a i r e d t - t e s t s . F o r e x p e r i m e n t s w i t h m o r e t h a n t w o c o n d i t i o n s , t y p i c a l l y t h e 1 - w a y A N O V A w o u l d b e u s e d f o l l o w e d b y B o n f e r r o n i ' s p o s t h o c t e s t s f o r p a i r w i s e c o m p a r i s o n s . In e x p e r i m e n t s w h e r e s t r i a t a l t i s s u e w a s c o l l e c t e d f r o m Y A C 7 2 a n d Y A C 1 2 8 m i c e f o r e x a m i n a t i o n o f C K 2 e x p r e s s i o n , d a t a w a s e x p r e s s e d a s f o l d c h a n g e f r o m W T , a n a l y z e d i n d i v i d u a l l y b y 1 - s a m p l e t - t e s t s , a n d c o m p a r e d u s i n g u n p a i r e d t - t e s t b e t w e e n Y A C 7 2 a n d Y A C 1 2 8 v a l u e s t h a t w e r e n o r m a l i z e d t o W T . In t h i s c a s e it w a s n o t v a l i d o r p o s s i b l e t o u s e 1 - w a y A N O V A t e s t i n g b e c a u s e e a c h b a t c h o f t r a n s g e n i c t i s s u e ( e i t h e r Y A C 7 2 o r Y A C 1 2 8 ) w a s c o l l e c t e d i n p a r a l l e l w i t h i t s o w n a g e - m a t c h e d W T c o n t r o l s a m p l e s , a n d t h e v a l u e s f o r W T s a m p l e s p r e s e n t e d i n t r i n s i c v a r i a b i l i t y w h e n p o o l e d . D a t a f r o m i m m u n o s t a i n i n g e x p e r i m e n t s i n t r a n s f e c t e d M S N s w e r e a l s o e x p r e s s e d a s s u r f a c e - t o - i n t e r n a l r a t i o o f N R 1 s u b u n i t s t a i n i n g i n t e n s i t y i n G F P / H I P - 1 t r a n s f e c t e d c e i l s n o r m a l i z e d t o G F P - e x p r e s s i n g c e l l s , a n d a n a l y z e d b y 1 - s a m p l e t - t e s t . 85 F o r e x p e r i m e n t s w i t h t w o v a r i a b l e s , s u c h a s t h e t o x i c i t y i n d u c t i o n / T U N E L l a b e l i n g s t u d i e s , 2 - w a y A N O V A w a s u s e d f o l l o w e d b y B o n f e r r o n i ' s p o s t h o c t e s t s f o r p a i r w i s e c o m p a r i s o n s . 86 F i g u r e 4. S c h e m a t i c o f b i o t i n y l a t i o n a s s a y t o e x a m i n e l o s s o f r e c e p t o r s f r o m t h e c e l l s u r f a c e . S i s t e r d i s h e s o f 9 - 1 0 d . i . v . s t r i a t a l M S N s i n c u l t u r e a r e i n c u b a t e d w i t h N H S - S S - B i o t i n t o l a b e l s u r f a c e p r o t e i n s , w a s h e d t o r e m o v e e x c e s s b i o t i n , a n d r e p l a c e d i n p r e - e x i s t i n g c u l t u r e m e d i a a t 3 7 ° C 5 % C 0 2 . A t 0 , 1 2 , o r 2 4 h o u r s f o l l o w i n g b i o t i n y l a t i o n , t o t a l s o l u b l e l y s a t e s a r e h a r v e s t e d f r o m c e l l s a n d i n c u b a t e d w i t h N e u t r A v i d i n r e s i n t o i s o l a t e b i o t i n - t a g g e d p r o t e i n s . E x p r e s s i o n o f s u r f a c e p r o t e i n s i s t h e n e x a m i n e d b y i m m u n o b l o t a n a l y s i s a n d c o m p a r e d a g a i n s t t h e i n t e r n a l p o r t i o n r e p r e s e n t e d b y t h e p o o l o f n o n b i o t i n - t a g g e d p r o t e i n s t h a t d i d n o t b i n d N e u t r A v i d i n r e s i n a n d r e m a i n e d i n t h e s u p e r n a t a n t . 87 Fiqure 5. Schematic of biotinylation assay to examine surface protein insertion. S i s t e r d i s h e s o f 9 - 1 0 d . i . v . s t r i a t a l M S N s i n c u l t u r e a r e t r e a t e d w i t h t h e e n d o c y t o s i s a n d r e c y c l i n g i n h i b i t o r c h l o r p r o m a z i n e f o r 0 , 0 . 5 , o r 6 h o u r s a t 3 7 ° C 5 % C 0 2 . A t e a c h t i m e p o i n t , o n e d i s h o f n e u r o n s a r e i n c u b a t e d w i t h N H S - S S - B i o t i n t o l a b e l s u r f a c e p r o t e i n s , w a s h e d t o r e m o v e e x c e s s b i o t i n , a n d h a r v e s t e d f o r t o t a l s o l u b l e l y s a t e s . L y s a t e s a r e t h e n i n c u b a t e d w i t h N e u t r A v i d i n r e s i n t o i s o l a t e b i o t i n - t a g g e d p r o t e i n s . A c c u m u l a t i o n o f s u r f a c e p r o t e i n s i s e x a m i n e d b y i m m u n o b l o t a n a l y s i s a n d c o m p a r e d a g a i n s t t h e i n t e r n a l p o r t i o n r e p r e s e n t e d b y t h e p o o l o f n o n b i o t i n - t a g g e d p r o t e i n s t h a t d i d n o t b i n d N e u t r A v i d i n r e s i n a n d r e m a i n e d i n t h e s u p e r n a t a n t . 88 H (Homogenate) 1 .OOOJJ^O min) P1 (Nuclei and large cell fragments) (Crude synaptosomal membranes) 13,00&xg (15 min) S2 165,000 xg (2 hr) P2' (Washed crude synaptosomal membranes) Hypo-osmotic lysis S2' P3 (Light membranes and microsomes) S3 (Cytosol) Lysed P2' 33,000. LP1 (Heavy synaptosomal membranes) LS1 (Cytoplasm of lysed synaptosomes) 7 65,000* g (2 hr) LP2 (Synaptic vesicles) LS2 (Pre-synaptic cytosol) Figure 6. Schematic of subcellular fractionation protocol. S t r i a t a l t i s s u e i s p o o l e d f r o m 2 m o n t h - o l d m i c e , f r a c t i o n a t e d b y c e n t r i f u g a t i o n i n t o v a r i o u s s u b c e l l u l a r c o m p a r t m e n t s , a n d a n a l y z e d b y i m m u n o b l o t t i n g f o r p r o t e i n s o f i n t e r e s t . S e e S e c t i o n 2 . 1 . 3 . 4 u n d e r M a t e r i a l s a n d M e t h o d s f o r m o r e d e t a i l s o n t h e f r a c t i o n a t i o n p r o t o c o l . 89 CHAPTER 3. ALTERED NMDAR TRAFFICKING IN YAC72 TRANSGENIC HD MOUSE MODEL T h e s e l e c t i v e v u l n e r a b i l i t y o f s t r i a t a l n e u r o n s t o e x c i t o t o x i c d a m a g e i s t h o u g h t t o i n v o l v e e x c e s s i v e a c t i v a t i o n o f G l u R s , w i t h t h e N M D A R - s u b c l a s s o f i G l u R s p l a y i n g a m o r e s e l e c t i v e a n d e f f e c t i v e r o l e t h a n o t h e r G l u R s i n t h i s p r o c e s s ( r e v i e w e d i n D i F i g l i a , 1 9 9 0 ) . G i v e n t h e s t r o n g e v i d e n c e i n s u p p o r t o f a r o l e f o r N M D A R s , e s p e c i a l l y t h e N R 1 / N R 2 B s u b t y p e , i n c o n t r i b u t i n g t o t h e e x c i t o t o x i c d e a t h o f n e u r o n s e x p r e s s i n g m h t t ( Z e r o n e t a l . , 2 0 0 2 , 2 0 0 4 ) , w e s o u g h t t o d e t e r m i n e w h e t h e r a l t e r e d N M D A R s u b c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n t o i n c r e a s e s u r f a c e r e c e p t o r n u m b e r s c o r r e l a t e s w i t h t h e p o t e n t i a t i o n o f N M D A - i n d u c e d c u r r e n t a n d t o x i c i t y b y m h t t i n t h e Y A C m o u s e m o d e l o f H D . 3.1. No Change in NR1/NR2B Total Expression in Striatal Tissue from YAC46 or YAC72 Mice W h i l e t h e c u r r e n t a n d t o x i c i t y m e d i a t e d v i a t h e N R 1 / N R 2 B s u b t y p e o f N M D A R s w e r e f o u n d t o b e u p r e g u l a t e d b y p o l y Q - e x p a n d e d htt ( C h e n e t a l . , 1 9 9 9 b ; Z e r o n e t a l . , 2 0 0 1 , 2 0 0 2 ) , it r e m a i n s u n c l e a r a s t o h o w m h t t e x e r t s i t s e f f e c t s o n N M D A R a c t i v i t y . I m m u n o b l o t t i n g a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d t o e x a m i n e w h e t h e r N M D A R e x p r e s s i o n m a y b e a l t e r e d b y m h t t . A n a l y s i s o f s t r i a t a l t i s s u e f r o m 2 m o n t h - o l d F V B / N W T , Y A C 4 6 , a n d Y A C 7 2 m i c e r e v e a l e d t h a t o v e r a l l e x p r e s s i o n l e v e l s o f N R 1 a n d N R 2 B w e r e n o t d i f f e r e n t a n d d i d n o t v a r y w i t h htt p o l y Q l e n g t h ( F i g u r e 7 ) . T h i s f i n d i n g w a s e x t e n d e d i n a t i m e - c o u r s e e x p e r i m e n t i n w h i c h w e c o l l e c t e d s t r i a t a l t i s s u e f r o m W T a n d Y A C 7 2 m i c e a t 2 , 6 , 9 , o r 1 2 m o n t h s o f a g e a n d e x a m i n e d N R 1 / N R 2 B e x p r e s s i o n l e v e l s . I m m u n o b l o t s 9 0 s h o w i n g l e v e l s o f e x p r e s s i o n o f N R 1 , N R 2 B , a n d a c t i n ( a s l o a d i n g c o n t r o l ) a r e s h o w n i n F i g u r e 8 . W e f o u n d t h a t i n s t r i a t a l t i s s u e s f r o m m i c e o f a n y g i v e n a g e g r o u p , N R 1 / N R 2 B e x p r e s s i o n w a s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t b e t w e e n W T a n d Y A C 7 2 m i c e ( F i g u r e 9 ) ( b y 2 - w a y A N O V A : e f f e c t o f g e n o t y p e F ( 1 , 1 6 ) = 0 . 6 7 4 6 , p = 0 . 4 2 3 5 f o r N R 1 ; e f f e c t o f g e n o t y p e F ( 1 , 1 6 ) = 0 . 0 7 9 7 4 , p = 0 . 7 8 1 3 f o r N R 2 B ) , a n d t h a t N R 1 / N R 2 B e x p r e s s i o n l e v e l s d i d n o t v a r y w i t h a g e i n s t r i a t a l t i s s u e f r o m W T m i c e . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t , a p a r t f r o m c e r t a i n t e m p o r a l c h a n g e s i n t h e t o t a l c e l l u l a r e x p r e s s i o n o f N R 1 / N R 2 B i n s t r i a t a l t i s s u e f r o m Y A C 7 2 m i c e o f v a r y i n g a g e s , N M D A R e x p r e s s i o n l e v e l s a r e u n a f f e c t e d b y e x p a n s i o n o f t h e p o l y Q t r a c t i n m h t t . H e n c e t h e m o d u l a t i o n o f N M D A R f u n c t i o n b y m h t t d o e s n o t a p p e a r t o i n v o l v e c h a n g e s i n t h e o v e r a l l e x p r e s s i o n l e v e l s o f t h e N R 1 / N R 2 B r e c e p t o r s u b t y p e . 3.2. Increased NMDAR Surface Expression in YAC72 MSNs N M D A R a c t i v i t y i s d e t e r m i n e d i n l a r g e p a r t b y t h e c o m p l e m e n t o f r e c e p t o r s t h a t a r e e x p r e s s e d o n t h e c e l l s u r f a c e , a n d c h a n g e s i n r e c e p t o r d i s t r i b u t i o n o r t r a f f i c k i n g c o u l d o c c u r w i t h o u t a f f e c t i n g t o t a l p r o t e i n e x p r e s s i o n . W e t h e r e f o r e e x a m i n e d N M D A R s u r f a c e e x p r e s s i o n i n s t r i a t a l n e u r o n s f r o m W T a n d Y A C m i c e i n o r d e r t o a s s e s s t h e e f f e c t s o f m h t t e x p r e s s i o n o n s u r f a c e n u m b e r s o f N M D A R s . 3 . 2 . 1 . B y I m m u n o f l u o r e s c e n t S t a i n i n g C u l t u r e d s t r i a t a l M S N s g r o w n o n P D L - c o a t e d g l a s s c o v e r s l i p s w e r e u s e d f o r e x p e r i m e n t s a t 9 - 1 0 d . i . v . N o n - p e r m e a b i l i z e d c e l l s w e r e f i r s t l a b e l e d w i t h a n a n t i b o d y r e c o g n i z i n g t h e e x t r a c e l l u l a r M 3 - M 4 l o o p o f t h e N R 1 s u b u n i t , f o l l o w e d b y t h e A l e x a F l u o r 91 4 8 8 - c o n j u g a t e d f l u o r e s c e n t g r e e n s e c o n d a r y a n t i b o d y . C e l l s w e r e t h e n p e r m e a b i l i z e d t o f a c i l i t a t e b i n d i n g o f t h e s a m e a n t i - N R I a n t i b o d y t o t h e r e m a i n d e r o f t h e r e c e p t o r s , r e p r e s e n t i n g t h e i n t r a c e l l u l a r p o p u l a t i o n o f N R 1 , w h i c h w e r e t h e n l a b e l e d w i t h t h e s e c o n d a r y C y 3 - c o n j u g a t e d r e d f l u o r o p h o r e a n t i b o d y . A l t h o u g h t h i s m e t h o d w a s n o t d e s i g n e d t o p r o v i d e a b s o l u t e m e a s u r e m e n t s o f t h e n u m b e r s o f r e c e p t o r s o n t h e c e l l s u r f a c e o r i n s i d e t h e c e l l ( d u e t o t h e d i f f e r e n t a f f i n i t i e s a n d i n t e n s i t i e s o f t h e f l u o r e s c e n t s e c o n d a r y a n t i b o d i e s u s e d ) , q u a n t i f i c a t i o n o f t h e g r e e n - t o - r e d s i g n a l s g a v e a n e s t i m a t e o f t h e s u r f a c e - t o - i n t e r n a l N R 1 e x p r e s s i o n l e v e l s . U s i n g t h i s m e t h o d w e w e r e a b l e t o d e m o n s t r a t e t h a t M S N s f r o m Y A C 7 2 m i c e h a d ~ 5 0 % h i g h e r s u r f a c e N R 1 e x p r e s s i o n r e l a t i v e t o W T ( F i g u r e 1 0 ) , a f i n d i n g w h i c h m a y e x p l a i n t h e e n h a n c e d N M D A R - m e d i a t e d c u r r e n t / t o x i c i t y o b s e r v e d i n t h i s s a m e m o u s e m o d e l . M S N s f r o m Y A C 1 8 m i c e , w h i c h e x p r e s s e d h t t w i t h a n o n - p a t h o g e n i c n u m b e r o f g l u t a m i n e r e p e a t s ( 1 8 Q ) , e x h i b i t e d a s i m i l a r p r o p o r t i o n o f s u r f a c e N R 1 a s d i d W T ( F i g u r e 1 0 B ) . H e n c e t h e i n c r e a s e d p r o p o r t i o n o f s u r f a c e N R 1 e x p r e s s i o n a p p e a r s t o b e c a u s e d b y e x p r e s s i o n o f t h e p o l y Q - e x p a n d e d m h t t , i n s t e a d o f b e i n g a n o n - s p e c i f i c e f f e c t r e s u l t i n g f r o m htt o v e r - e x p r e s s i o n o r e x p r e s s i o n o f t h e Y A C i t s e l f . 3 . 2 . 2 . B y C h y m o t r y p s i n A s s a y S i s t e r d i s h e s o f c u l t u r e d M S N s f r o m Y A C 7 2 o r c o n t r o l ( W T o r Y A C 1 8 ) m i c e w e r e s u b j e c t e d t o t r e a t m e n t w i t h e i t h e r H B S S o r w i t h c h y m o t r y p s i n - c o n t a i n i n g s o l u t i o n t o c l e a v e s u r f a c e p r o t e i n s i n l i v e c e l l s . I m m u n o b l o t a n a l y s i s t h e n a l l o w e d c o m p a r i s o n o f t h e u n c l e a v e d p o r t i o n w i t h t o t a l a m o u n t s o f N R 1 t o d e t e r m i n e t h e f r a c t i o n o f i n t r a c e l l u l a r l y l o c a t e d N R 1 ( F i g u r e 1 1 ) . W e f o u n d a g r e a t e r r e d u c t i o n o f N R 2 B a s w e l l a s N R 1 l e v e l s i n Y A C 7 2 M S N s f o l l o w i n g c h y m o t r y p s i n t r e a t m e n t r e l a t i v e t o c o n t r o l s , i m p l y i n g t h e 9 2 p r e s e n c e o f a l a r g e r p o o l o f N M D A R s a t t h e s u r f a c e t h a t w a s a c c e s s i b l e t o t h e t r y p t i c e n z y m e i n t h e s e n e u r o n s . T h e s m a l l e r l o s s e s o f N R 1 / N R 2 B s i g n a l f r o m c h y m o t r y p s i n t r e a t m e n t n o t e d i n M S N s f r o m c o n t r o l m i c e e x p r e s s i n g htt w i t h a n o n - p a t h o g e n i c p o l y Q l e n g t h ( e i t h e r W T o r Y A C 1 8 ) s u g g e s t a s m a l l e r s u r f a c e p o r t i o n a n d a c o r r e s p o n d i n g l y l a r g e r i n t e r n a l p r o p o r t i o n o f N R 1 i n t h e s e c e l l s . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s w a s n o t p e r f o r m e d d u e t o t h e s m a l l s a m p l e s i z e ( N = 2 ) , b u t t h i s f i n d i n g p r o v i d e s a n i n i t i a l c o n f i r m a t i o n o f o u r i m m u n o s t a i n i n g r e s u l t s s h o w i n g i n c r e a s e d s u r f a c e N M D A R e x p r e s s i o n i n M S N s f r o m Y A C 7 2 m i c e e x p r e s s i n g p o l y Q - e x p a n d e d m h t t , b e f o r e w e n e x t m o v e d o n t o f u r t h e r e x a m i n e t h i s p h e n o m e n o n u s i n g a b i o t i n y l a t i o n - b a s e d a p p r o a c h a s d e s c r i b e d i n t h e n e x t s e c t i o n . 3 . 2 . 3 . B y B i o t i n y l a t i o n A s s a y A t h i r d m e t h o d w i t h w h i c h w e p r o b e d f o r r e l a t i v e l e v e l s o f s u r f a c e N M D A R s i n c e l l s f r o m W T o r Y A C 7 2 m i c e i s b a s e d o n b i o t i n - t a g g i n g o f s u r f a c e p r o t e i n s . T h e u s e o f S u l f o - N H S - S S - B i o t i n e n a b l e s b i o t i n - l a b e l i n g o f p r i m a r y a m i n e - c o n t a i n i n g b i o m o l e c u l e s . S i n c e t h i s r e a g e n t i s m e m b r a n e - i m p e r m e a b l e , i n t a c t c e l l s c o u l d b e t r e a t e d t o l a b e l a l l c e l l s u r f a c e p r o t e i n s . S u b s e q u e n t l y s i s o f c e l l s p r o d u c e s t w o p o p u l a t i o n s o f p r o t e i n s : o n e p o p u l a t i o n i s u n l a b e l e d r e p r e s e n t i n g i n t r a c e l l u l a r p r o t e i n s ; t h e s e c o n d , b i o t i n y l a t e d s e t r e p r e s e n t s s u r f a c e p r o t e i n s . B i o t i n - l a b e l e d p r o t e i n s c o u l d t h e n b e c a p t u r e d o n r e s i n c o u p l e d t o s t r e p t a v i d i n ( w i t h u n l a b e l e d p r o t e i n s r e m a i n i n g i n t h e s u p e r n a t a n t ) , a n d t h e n r e l e a s e d b y b o i l i n g i n S D S - b a s e d p r o t e i n s a m p l e b u f f e r . Q u a n t i f i c a t i o n o f t h e a m o u n t o f b i o t i n y l a t e d p r o t e i n c o m p a r e d t o w h a t r e m a i n e d i n t h e s u p e r n a t a n t o f t h e s t r e p t a v i d i n b i n d i n g s t e p a l l o w e d o n e t o d e d u c e t h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n o f t h e p r o t e i n t h a t w a s o n t h e c e l l s u r f a c e i n i t i a l l y . W e f o u n d s u r f a c e N R 1 t o c o m p r i s e ~ 3 9 % a n d ~ 6 1 % o f t o t a l p o o l s 93 ( F i g u r e 1 2 B ) , w h i l e - 5 3 % a n d - 7 1 % o f t o t a l N R 2 B ( F i g u r e 1 3 B ) w e r e d e t e r m i n e d t o b e o n t h e c e l l s u r f a c e o f W T a n d Y A C 7 2 M S N s , r e s p e c t i v e l y . A l o w e r p r o p o r t i o n o f s u r f a c e - l o c a l i z e d N R 1 r e l a t i v e t o N R 2 B i s i n a g r e e m e n t w i t h t h e p r e s e n c e o f a s u b s t a n t i a l i n t r a c e l l u l a r p o o l o f u n a s s e m b l e d N R 1 s u b u n i t s i n n e u r o n s ( r e v i e w e d i n W e n t h o l d e t a l . , 2 0 0 3 ; P r y b y l o w s k i a n d W e n t h o l d , 2 0 0 4 ) . O u r r e s u l t s o n c e a g a i n c o n f i r m e d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n t h e a m o u n t o f s u r f a c e N R 1 ( b y 5 6 % ; F i g u r e 1 2 ) a n d N R 2 B ( b y 3 4 % ; F i g u r e 1 3 ) i n s t r i a t a l M S N s c u l t u r e d f r o m Y A C 7 2 m i c e a s c o m p a r e d w i t h W T , i n a g r e e m e n t w i t h o u r i m m u n o s t a i n i n g a n d c h y m o t r y p s i n d a t a . In c o n t r a s t , t h e A M P A R s u b u n i t G l u R 1 d i d n o t s h o w d i f f e r e n t s u r f a c e e x p r e s s i o n l e v e l s i n M S N s f r o m W T v e r s u s Y A C 7 2 m i c e ( F i g u r e 1 4 ) , s u g g e s t i n g t h e e f f e c t o n s u r f a c e e x p r e s s i o n i n Y A C 7 2 M S N s e x p r e s s i n g m h t t i s s e l e c t i v e f o r N M D A R s b u t n o t o t h e r m e m b e r s o f t h e i G l u R f a m i l y . 3.3. Increased Rate of NMDAR Trafficking in YAC72 MSNs 3 . 3 . 1 . I n c r e a s e d R a t e o f R e c e p t o r L o s s f r o m t h e C e l l S u r f a c e T o p r o b e i n t o m e c h a n i s m s u n d e r l y i n g i n c r e a s e d s t e a d y - s t a t e s u r f a c e e x p r e s s i o n l e v e l s o f N R 1 a n d N R 2 B i n Y A C 7 2 M S N s , w e i n v e s t i g a t e d p o s s i b l e c h a n g e s i n t h e t r a f f i c k i n g r a t e s o f N M D A R s t o / f r o m t h e c e l l s u r f a c e . U s i n g a v a r i a t i o n o f t h e b i o t i n y l a t i o n a s s a y m e n t i o n e d a b o v e ( s h o w n i n F i g u r e 4 ) , w e t r a c k e d d i s a p p e a r a n c e o f b i o t i n - l a b e l e d s u r f a c e N R 1 o v e r t i m e a n d c o m p a r e d M S N s f r o m W T v e r s u s Y A C 7 2 m i c e ( F i g u r e 1 5 A ) . In s p i t e o f a h i g h e r p e r c e n t a g e o f s u r f a c e N R 1 i n i t i a l l y i n Y A C 7 2 M S N s , b y 1 2 a n d 2 4 h o u r s f o l l o w i n g b i o t i n y l a t i o n t h e l e v e l s o f N R 1 r e m a i n i n g b i o t i n y l a t e d h a d d r o p p e d t o l e v e l s s i m i l a r t o t h a t i n W T n e u r o n s ( F i g u r e 1 6 A , l e f t p a n e l ) . T h e p r o p o r t i o n o f b i o t i n y l a t e d N R 1 n o r m a l i z e d t o s t a r t i n g a m o u n t s a t 0 h o u r s a f t e r b i o t i n y l a t i o n i n d i c a t e d a m o r e r a p i d 94 r a t e o f d e g r a d a t i o n i n t h e Y A C 7 2 M S N s ( F i g u r e 1 6 B , l e f t p a n e l ) . S i m i l a r l y , s u r f a c e N R 2 B s u b u n i t s l a b e l e d w i t h b i o t i n s h o w e d a t r e n d t o w a r d s a n a c c e l e r a t e d r a t e o f l o s s i n Y A C 7 2 M S N s a s c o m p a r e d w i t h W T ( F i g u r e s 1 6 A a n d 1 6 B , r i g h t p a n e l s ) , i n c o n t r a s t t o G l u R 1 w h i c h a p p e a r e d t o h a v e s i m i l a r r a t e s o f l o s s f r o m t h e s u r f a c e i n M S N s f r o m e i t h e r g e n o t y p e ( F i g u r e 1 7 ) . T o c o n f i r m t h a t l o s s o f b i o t i n - t a g g e d p r o t e i n s w a s n o t t h e r e s u l t o f n o n - l y s o s o m e - b a s e d c l e a v a g e b y e n z y m e s s u c h a s c a l p a i n s , w e r e p e a t e d e x p e r i m e n t s t o t h e 1 2 - h o u r t i m e p o i n t a n d p r o b e d f o r l e v e l s o f b i o t i n y l a t e d N R 1 i n M S N s t r e a t e d w i t h t h e l y s o s o m a l i n h i b i t o r l e u p e p t i n . T r e a t m e n t w i t h l e u p e p t i n r e s c u e d t h e m a j o r i t y o f N R 1 s i g n a l a t 1 2 h o u r s f o l l o w i n g b i o t i n y l a t i o n ( F i g u r e 1 5 B ) , i n d i c a t i n g t h e r e c e p t o r l o s s w e o b s e r v e d p r e d o m i n a n t l y i n v o l v e d d e g r a d a t i o n b y t h e l y s o s o m e . 3 . 3 . 2 . I n c r e a s e d R a t e o f R e c e p t o r I n s e r t i o n t o t h e C e l l S u r f a c e O u r r e s u l t s s h o w i n g m o r e r a p i d l o s s o f s u r f a c e N M D A R s i n Y A C 7 2 M S N s a r e c o n t r a r y t o w h a t o n e m i g h t e x p e c t , s i n c e t h i s r e s u l t c a n n o t e x p l a i n t h e h i g h e r b a s a l s u r f a c e e x p r e s s i o n l e v e l s o f N M D A R s i n Y A C 7 2 M S N s . B e c a u s e o f t h i s u n e x p e c t e d f i n d i n g , w e e x a m i n e d t h e r a t e i n t h e o t h e r a r m o f t r a f f i c k i n g - t h a t o f i n s e r t i o n . T o g e t h e r , i n s e r t i o n t o , a n d r e m o v a l f r o m , t h e s u r f a c e d i c t a t e t h e s t e a d y - s t a t e a m o u n t s o f N M D A R s t h a t a r e p o s i t i o n e d o n t h e c e l l s u r f a c e t o c a r r y o u t t h e i r p r e s c r i b e d p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s . T r a c k i n g p r o p o r t i o n s o f N M D A R s t h a t a r e l o c a t e d o n t h e c e l l s u r f a c e v i a b i o t i n y l a t i o n a t v a r i o u s t i m e s f o l l o w i n g b l o c k a d e o f e n d o c y t i c a n d r e c y c l i n g p r o c e s s e s a l l o w s d e t e r m i n a t i o n o f c h a n g e s i n c e l l s u r f a c e e x p r e s s i o n d u e t o i n s e r t i o n a l o n e . T o a c c o m p l i s h t h i s , w e e m p l o y e d t h e d r u g c h l o r p r o m a z i n e , w h i c h i s c u r r e n t l y a p p r o v e d f o r u s e i n t h e t r e a t m e n t o f p s y c h o t i c d i s o r d e r s . T h i s c a t i o n i c , a m p h i p h i l i c c o m p o u n d h a s b e e n s h o w n t o b l o c k c l a t h r i n - m e d i a t e d r e c e p t o r e n d o c y t o s i s a n d r e c y c l i n g b y p r e v e n t i n g 95 a s s e m b l y o f c l a t h r i n a d a p t e r p r o t e i n A P - 2 o n c l a t h r i n - c o a t e d p i t s t h e r e b y c a u s i n g m i s - a s s e m b l y o f t h e c l a t h r i n l a t t i c e ( W a n g e t a l . , 1 9 9 3 ) . A t 0 , 0 . 5 , a n d 6 h o u r s f o l l o w i n g t h e b e g i n n i n g o f t r e a t m e n t w i t h t h i s d r u g , i n t a c t c e l l s w e r e b i o t i n y l a t e d t o e x a m i n e s u r f a c e e x p r e s s i o n . In M S N s f r o m W T m i c e , w e f o u n d t h e l e v e l s - o f N R 1 p r o t e i n e x p r e s s e d o n t h e c e l l s u r f a c e t o b e u n c h a n g e d a f t e r 6 h o u r s o f e n d o c y t i c / r e c y c l i n g b l o c k ( F i g u r e s 1 8 , 1 9 A a n d 1 9 B l e f t p a n e l s ) , i n d i c a t i n g a l a c k o f d e novo i n s e r t i o n o f N M D A R s i n t h e a b s e n c e o f r e p l e n i s h m e n t f r o m t h e r e c y c l i n g p o o l . In c o n t r a s t , s u r f a c e N R 1 e x p r e s s i o n w a s u p - r e g u l a t e d i n M S N s c u l t u r e d f r o m Y A C 7 2 m i c e a t 6 h o u r s f o l l o w i n g c h l o r p r o m a z i n e t r e a t m e n t ( F i g u r e s 1 8 , 1 9 A a n d 1 9 B l e f t p a n e l s ) , w i t h s i m i l a r t r e n d s o b s e r v e d f o r t h e N R 2 B s u b u n i t ( F i g u r e s 1 9 A a n d 1 9 B r i g h t p a n e l s ) b u t n o t t h e A M P A R s u b u n i t G l u R 1 ( F i g u r e 2 0 ) . O u r r e s u l t s s u g g e s t t h a t n e w N M D A R s w e r e b e i n g i n s e r t e d i n t o t h e c e l l s u r f a c e o v e r a 6 - h o u r p e r i o d , a t l e a s t f o r Y A C 7 2 M S N s . A t 3 0 m i n u t e s f o l l o w i n g c h l o r p r o m a z i n e t r e a t m e n t , t h o u g h , w e o b s e r v e d a s m a l l d e c r e a s e i n N R 1 s u r f a c e e x p r e s s i o n , w h i c h i s c o n s i s t e n t w i t h a r e c y c l i n g i n h i b i t i o n e f f e c t a s n o t e d p r e v i o u s l y ( W a n g e t a l . , 1 9 9 3 ) ; n e w r e c e p t o r s f r o m t h e de novo s y n t h e s i s p a t h w a y w i l l l i k e l y n o t h a v e h a d t h e c h a n c e t o a p p e a r o n t h e c e l l s u r f a c e b y t h i s t i m e . B e c a u s e m o b i l i z a t i o n o f n e w l y s y n t h e s i z e d , s u r f a c e - t a r g e t e d p r o t e i n s i s n o t e x p e c t e d t o b e a f f e c t e d b y t r e a t m e n t w i t h c h l o r p r o m a z i n e ( W a n g e t a l . , 1 9 9 3 ; V e y h l e t a l . , 2 0 0 6 ) , a c c u m u l a t i o n o f s u r f a c e N M D A R s i n Y A C 7 2 M S N s a t 6 h o u r s f o l l o w i n g e n d o c y t i c / r e c y c l i n g b l o c k b y c h l o r p r o m a z i n e l i k e l y r e p r e s e n t s i n s e r t i o n o f n e w r e c e p t o r s f r o m t h e E R / G o l g i p a t h w a y . T h e r e l a t i v e l y m o d e s t a m o u n t s o f N M D A R s t h a t a c c u m u l a t e d a t t h e s u r f a c e o f Y A C 7 2 M S N s , a l o n g w i t h a l a c k o f i n s e r t i o n o f N M D A R s o v e r t h e s a m e t i m e p e r i o d i n W T n e u r o n s , a r e s u r p r i s i n g f i n d i n g s w h i c h s u g g e s t a d d i t i o n a l , n o n - s p e c i f i c e f f e c t s o f c h l o r p r o m a z i n e t r e a t m e n t o n r e c e p t o r t r a f f i c k i n g t h a t m a y r e s u l t i n a n u n d e r - e s t i m a t i o n o f t h e r a t e o f N M D A R i n s e r t i o n . H o w e v e r b e c a u s e b o t h 9 6 W T a n d Y A C 7 2 M S N s w e r e t r e a t e d a n d p r o c e s s e d i n p a r a l l e l , t h e d i f f e r e n c e s i n f o r w a r d t r a f f i c k i n g k i n e t i c s w e o b s e r v e d r e m a i n v a l i d a n d i n d e e d r e f l e c t a s p e c i f i c e f f e c t o f m h t t e x p r e s s i o n . A l t h o u g h it w a s n o t p o s s i b l e t o d i r e c t l y c o m p a r e r e s u l t s f r o m s u r f a c e r e c e p t o r l o s s a n d i n s e r t i o n e x p e r i m e n t s , r o u g h e s t i m a t e s o f t h e r e l a t i v e r a t e s o f t h e s e p r o c e s s e s i n d i c a t e d t h a t f o r w a r d t r a f f i c k i n g o f N M D A R s m a y d o m i n a t e o v e r t h e r e v e r s e t r a f f i c k i n g / d e g r a d a t i o n p r o c e s s t o i n c r e a s e s t e a d y - s t a t e l e v e l s o f N M D A R s a t t h e s u r f a c e ( s e e C o n c l u s i o n s s e c t i o n 6 . 1 ) . 3 .4. Altered Splicing of NR1 Isoform in YAC72 Striatal Tissue A p a r t f r o m s u b u n i t c o m p o s i t i o n , p h o s p h o r y l a t i o n , a n d i n t e r a c t i o n s w i t h o t h e r p r o t e i n s a n d t h e C S K , N M D A R t r a f f i c k i n g t o a n d f r o m t h e c e l l s u r f a c e i s a l s o d e t e r m i n e d i n p a r t b y a l t e r n a t i v e s p l i c i n g o f t h e N R 1 s u b u n i t ( s e e s e c t i o n 1 . 2 . 4 u n d e r I n t r o d u c t i o n ) . S p e c i f i c a l l y , d i f f e r e n t s p l i c e i s o f o r m s o f N R 1 m R N A r e g u l a t e t h e r a t e o f N M D A R e x p o r t f r o m t h e E R d u r i n g t h e f o r w a r d t r a f f i c k i n g p r o c e s s ( O k a b e e t a l . , 1 9 9 9 ) ; t h e r a t e o f E R e x p o r t i s a c c e l e r a t e d f o r N R 1 i s o f o r m s c o n t a i n i n g t h e C 2 ' d o m a i n ( S c o t t e t a . l . , 2 0 0 1 ; M u e t a l . , 2 0 0 3 ; s e e F i g u r e 2 f o r N R 1 s p l i c e v a r i a t i o n s ) . T o a s s e s s t h e c o n t r i b u t i o n o f a l t e r n a t i v e s p l i c i n g i n p r o m o t i n g f a s t e r f o r w a r d t r a f f i c k i n g a n d i n s e r t i o n o f N M D A R s t o t h e c e l l s u r f a c e i n s t r i a t a l n e u r o n s f r o m Y A C 7 2 m i c e , w e a n a l y z e d t h e e x p r e s s i o n o f C 2 - o r C 2 ' - c o n t a i n i n g N R 1 i s o f o r m s i n s t r i a t a l t i s s u e f r o m 2 m o n t h - o l d W T a n d Y A C 7 2 m i c e . T h e a n t i b o d i e s w e u s e d d i d n o t d i s t i n g u i s h b e t w e e n d i f f e r e n t N R 1 s p l i c e v a r i a n t s c o n t a i n i n g t h e C 2 c a s s e t t e ( i n c l u d i n g N R 1 - 1 a , N R 1 - 1 b , N R 1 - 2 a , a n d N R 1 - 2 b ) , o r t h o s e c o n t a i n i n g t h e C 2 ' c a s s e t t e ( i n c l u d i n g N R 1 - 3 a , N R 1 - 3 b , N R 1 - 4 a , a n d N R 1 - 4 b ) . D u e t o t h e d i f f e r e n t i a l a f f i n i t i e s o f d i f f e r e n t a n t i b o d i e s f o r t h e i r a n t i g e n s , w e w e r e n o t a b l e t o 9 7 d i r e c t l y c o m p a r e a b s o l u t e l e v e l s o f e x p r e s s i o n o f C 2 - a n d C 2 ' - c o n t a i n i n g N R 1 ; it i s h o w e v e r w e l l a c c e p t e d t h a t t h e m o s t a b u n d a n t l y e x p r e s s e d i s o f o r m o f N R 1 b y f a r i n s t r i a t a l M S N s i s N R 1 - 1 a ( K u p p e n b e n d e r e t a l . , 1 9 9 9 ) , w h i c h c o n t a i n s t h e C 2 ( b u t n o t C 2 ' ) c a s s e t t e . S t r i a t a l t i s s u e s f r o m W T a n d Y A C 7 2 m i c e a p p e a r e d t o e x p r e s s c o m p a r a b l e l e v e l s o f t h e C 2 - c o n t a i n i n g N R 1 i s o f o r m s , a n d e x p r e s s i o n o f C 2 ' - c o n t a i n i n g N R 1 w a s a l s o s i m i l a r i n t i s s u e s f r o m e i t h e r g e n o t y p e ( F i g u r e 2 1 ) . H o w e v e r , c h a n g e s a t t h e s u b c e l l u l a r l e v e l c o u l d o c c u r w i t h o u t a f f e c t i n g o v e r a l l e x p r e s s i o n o f d i f f e r e n t N R 1 s p l i c e v a r i a n t s . W e t h e r e f o r e p r e p a r e d s u b c e l l u l a r f r a c t i o n s f r o m s t r i a t a l t i s s u e o f 2 m o n t h - o l d W T o r Y A C 7 2 m i c e a n d a n a l y z e d t h e r e l a t i v e e x p r e s s i o n o f t h e C 2 ' - a n d C 2 - c o n t a i n i n g N R 1 i s o f o r m s . A s c h e m a t i c d e t a i l i n g t h e p r o t o c o l f o r s u b c e l l u l a r f r a c t i o n i s s h o w n i n F i g u r e 6 . S u b c e l l u l a r f r a c t i o n s w e r e f i r s t c h a r a c t e r i z e d t o e n s u r e p r o p e r s e p a r a t i o n o f t h e d i f f e r e n t i n t r a c e l l u l a r c o m p a r t m e n t s : i m m u n o b l o t t i n g f o r s y n a p t o p h y s i n a f f i r m e d L P 2 a s t h e p r e - s y n a p t i c m e m b r a n e f r a c t i o n , c o n c e n t r a t i o n o f c a l n e x i n i n P 3 c o n f i r m e d t h i s a s t h e E R / m i c r o s o m e - c o n t a i n i n g f r a c t i o n , a n d e n r i c h m e n t o f P S D - 9 5 i n L P 1 w a s c o n s i s t e n t w i t h t h i s b e i n g t h e f r a c t i o n c o m p r i s e d o f h e a v y s y n a p t o s o m a l m e m b r a n e s f r o m t h e p o s t - s y n a p t i c c o m p a r t m e n t ( F i g u r e 2 2 A ) : I m p o r t a n t l y , i n Y A C 7 2 s t r i a t u m w e f o u n d a s i g n i f i c a n t e n r i c h m e n t o f t h e C 2 ' - c o n t a i n i n g i s o f o r m s o f N R 1 ( a s c o m p a r e d w i t h C 2 - c o n t a i n i n g N R 1 ) i n a s u b c e l l u l a r f r a c t i o n c o m p o s e d p r i m a r i l y o f l i g h t m i c r o s o m a l c o m p a r t m e n t s s u c h a s E R m e m b r a n e s a n d o t h e r v e s i c u l a r m e m b r a n e s ( F i g u r e s 2 2 B a n d 2 2 C ) , t h o u g h t t o b e a m o b i l e f r a c t i o n i n v o l v e d i n t r a f f i c k i n g o f N M D A R s . T h e s y a p t o s o m a l c o m p a r t m e n t , i n c o n t r a s t , d i d n o t s h o w a n i n c r e a s e i n t h e a m o u n t o f C 2 ' - c o n t a i n i n g N R 1 i s o f o r m s r e l a t i v e t o N R 1 C 2 i n Y A C 7 2 v e r s u s W T s t r i a t a l t i s s u e ( F i g u r e s 2 2 B a n d 2 2 C ) . A n i n c r e a s e i n s y n a p t i c N M D A R c o n t e n t w o u l d r e q u i r e a c o r r e s p o n d i n g i n c r e a s e i n P D Z d o m a i n - c o n t a i n i n g p r o t e i n s t o 98 a n c h o r t h e r e c e p t o r s a t t h e s y n a p s e ( B a r r i a a n d M a l i n o w , 2 0 0 2 ; P r y b y l o w s k i e t a l . , 2 0 0 5 ) , a l t h o u g h w e h a v e f o u n d n o e v i d e n c e t h u s f a r t o s u g g e s t t h a t P D Z p r o t e i n s m a y b e i n c r e a s e d i n e i t h e r t o t a l l y s a t e s o r L P 1 f r a c t i o n s f r o m Y A C 7 2 s t r i a t u m , r e l a t i v e t o W T ( M . M . Y . F a n a n d C M . C o w a n , u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n s ) . It i s t h e r e f o r e p o s s i b l e t h a t t h e e n h a n c e d s u r f a c e d e l i v e r y o f N M D A R s i n Y A C 7 2 s t r i a t a l M S N s a d d s t o t h e p o o l o f n o n - s y n a p t i c a l l y l o c a l i z e d N M D A R s a n d i n s o d o i n g p r o m o t e c e l l d e a t h s i g n a l i n g b y g l u t a m a t e a c t i v a t i o n o f e x t r a - s y n a p t i c N M D A R s ( H a r d i n g h a m a n d B a d i n g , 2 0 0 3 ) . 3.5. Differential Interaction of NR1 C2' Splice Isoform with NR2 Subunits in YAC72 Striatal Tissue P r e v i o u s s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t C 2 ' - c o n t a i n i n g N R 1 i s o f o r m s c a n t r a f f i c t o t h e c e l l s u r f a c e m e m b r a n e w i t h o u t c o m p l e x i n g w i t h N R 2 ( r e v i e w e d i n W e n t h o l d e t a l . , 2 0 0 3 ) . G i v e n o u r o b s e r v a t i o n o f a r e l a t i v e i n c r e a s e i n N R 1 C 2 ' - c o n t a i n i n g i s o f o r m s i n t h e m o b i l e v e s i c u l a r f r a c t i o n , n e x t w e d e t e r m i n e d w h e t h e r t h e p r o p o r t i o n o f N R 1 C 2 ' i s o f o r m s w a s i n c r e a s e d i n N R 2 - c o n t a i n i n g N M D A R c o m p l e x e s i n Y A C 7 2 s t r i a t u m . T o t h i s e n d , w e a s s e s s e d t h e a m o u n t s o f C 2 ' - c o n t a i n i n g N R 1 i s o f o r m s r e l a t i v e t o t o t a l N R 1 t h a t w e r e c o - i m m u n o p r e c i p i t a t e d b y a n t i b o d i e s d i r e c t e d a g a i n s t N R 2 A o r N R 2 B . A s i s e x p e c t e d f o r s u b u n i t s k n o w n t o a s s e m b l e i n t o r e c e p t o r c o m p l e x e s , N R 1 ( i n c l u d i n g t h e C 2 ' - c o n t a i n i n g i s o f o r m s ) w a s f o u n d t o c o - p r e c i p i t a t e w i t h b o t h N R 2 A ( F i g u r e 2 3 A ) a n d N R 2 B ( F i g u r e 2 3 B ) s u b u n i t s i n i m m u n o p r e c i p i t a t i o n e x p e r i m e n t s f r o m W T o r Y A C 7 2 s t r i a t a l t i s s u e . A n t i b o d y - f r e e c o n t r o l s a m p l e s w e r e p r o c e s s e d i n p a r a l l e l a n d c o n f i r m e d l a c k o f n o n - s p e c i f i c b i n d i n g o f p r o t e i n s t o t h e r e s i n ( F i g u r e 2 3 C ) . P o o l e d r e s u l t s ( F i g u r e 2 4 A ) i n d i c a t e d t h a t t h e r a t i o o f c o - i m m u n o p r e c i p i t a t e d N R 1 C 2 ' i s o f o r m s t o N R 1 l e v e l s ( r e p r e s e n t i n g a l l i s o f o r m s ) w a s h i g h e r i n Y A C 7 2 s t r i a t a l t i s s u e t h a n W T f o r 99 b o t h a n t i - N R 2 A a n d a n t i - N R 2 B s a m p l e s ; i m p o r t a n t l y , t h e f o l d - i n c r e a s e w a s s i g n i f i c a n t l y l a r g e r i n a n t i - N R 2 B p r e c i p i t a t e s t h a n i n a n t i - N R 2 A p r e c i p i t a t e s ( 1 . 7 7 ± 0 . 1 3 c o m p a r e d w i t h 1 . 3 2 ± 0 . 0 8 ; F i g u r e 2 4 B ) . T h e s e f i n d i n g s i n d i c a t e a n i n c r e a s e i n t h e n u m b e r s o f N M D A R s a s s e m b l e d f r o m N R 1 i s o f o r m s c o n t a i n i n g t h e C 2 ' c a s s e t t e , p r e f e r e n t i a l l y w i t h N R 2 B , i n Y A C 7 2 s t r i a t a l t i s s u e . O u r d a t a a r e a l s o c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e s i n d i c a t i n g t h a t t h e N R 1 / N R 2 B s u b t y p e o f N M D A R s i s s e l e c t i v e l y i n v o l v e d i n m e d i a t i n g e n h a n c e d c u r r e n t / t o x i c i t y b y m h t t ( C h e n e t a l . , 1 9 9 9 b ; Z e r o n e t a l . , 2 0 0 1 , 2 0 0 2 ; a l s o s e e I n t r o d u c t i o n , s e c t i o n 1 . 4 . 4 ) . T h e i n c r e a s e i n N R 1 C 2 ' - c o n t a i n i n g N M D A R s m a y c o n t r i b u t e t o f a s t e r f o r w a r d t r a f f i c k i n g o f r e c e p t o r s t o a c c o u n t f o r h i g h e r b a s a l e x p r e s s i o n l e v e l s o f N M D A R s a t t h e s u r f a c e a s d e s c r i b e d e a r l i e r i n t h i s t h e s i s . 3.6. Summary E a r l i e r r e s u l t s f r o m o u r l a b o r a t o r y i n d i c a t i n g e n h a n c e d N M D A R - m e d i a t e d c u r r e n t a n d t o x i c i t y i n c u l t u r e d o r a c u t e l y d i s s o c i a t e d s t r i a t a l M S N s e x p r e s s i n g p o l y Q - e x p a n d e d m h t t m a y n o w b e e x p l a i n e d , a t l e a s t i n p a r t , b y a n u p - r e g u l a t i o n o f s t e a d y - s t a t e N M D A R n u m b e r s o n t h e c e l l s u r f a c e . T h i s t h e s i s r e p o r t s w o r k s h o w i n g i n c r e a s e d s u r f a c e - t o - i n t e r n a l r a t i o o f N R 1 a n d N R 2 B s u b u n i t s u s i n g a v a r i e t y o f m e t h o d s , i n c l u d i n g i m m u n o s t a i n i n g , c h y m o t r y p s i n - c l e a v a g e o f s u r f a c e p r o t e i n s , a n d b i o t i n y l a t i o n - b a s e d a s s a y s . F u r t h e r m o r e , m o d i f i e d b i o t i n y l a t i o n e x p e r i m e n t s s h o w e d g e n e r a l l y m o r e r a p i d t r a f f i c k i n g o f t h e N M D A R p r o t e i n s , i n c l u d i n g f a s t e r l o s s o f s u r f a c e p r o t e i n s a s w e l l a s a n a c c e l e r a t e d r a t e o f de novo i n s e r t i o n i n t o t h e c e l l s u r f a c e m e m b r a n e i n t h e a b s e n c e o f e n d o c y t o s i s / r e c y c l i n g a c t i v i t i e s . T h e h i g h e r r a t e o f i n s e r t i o n i n s t r i a t a l n e u r o n s f r o m Y A C 7 2 m i c e e x p r e s s i n g m h t t c o r r e l a t e d w i t h a r e l a t i v e e n h a n c e m e n t o f t h e C 2 ' - c o n t a i n i n g N R 1 i s o f o r m s i n t h e s u b c e l l u l a r f r a c t i o n c o n t a i n i n g v e s i c u l a r c o m p o n e n t s 100 i n v o l v e d i n t r a n s i t o f p r o t e i n s i n c l u d i n g N M D A R s t o / f r o m t h e c e l l s u r f a c e . M o r e o v e r , t h e a s s o c i a t i o n o f C 2 ' - c o n t a i n i n g N R 1 i s o f o r m s w i t h N R 2 B , m o r e t h a n w i t h N R 2 A , w a s e n r i c h e d i n Y A C 7 2 c o m p a r e d w i t h W T s t r i a t a l t i s s u e . T o g e t h e r , o u r f i n d i n g s s u g g e s t t h a t e n h a n c e d s u r f a c e e x p r e s s i o n o f N R 2 B - c o n t a i n i n g N M D A R s i n Y A C 7 2 M S N s r e s u l t s f r o m a m h t t - m e d i a t e d c h a n g e i n t h e b a l a n c e o f N M D A R f o r w a r d t r a f f i c k i n g a n d l o s s f r o m t h e s u r f a c e . 101 ^- Actin 10 20 10 20 10 20 ug protein YAC46 WT YAC72 F i g u r e 7 . N R 1 / N R 2 B t o t a l e x p r e s s i o n i s n o t d i f f e r e n t i n s t r i a t a l t i s s u e f r o m 2 m o n t h - o l d F V B / N W T , Y A C 4 6 , o r Y A C 7 2 m i c e ( L i e t a l . , 2 0 0 3 ) . S t r i a t a l l y s a t e s a r e l o a d e d a t 10-ug a n d 20-ug p e r l a n e , a n d s u b s e q u e n t l y i m m u n o b l o t t e d f o r NR1 a n d NR2B e x p r e s s i o n . A c t i n e x p r e s s i o n i s u s e d a s l o a d i n g c o n t r o l . I m m u n o b l o t s h o w n i s r e p r e s e n t a t i v e o f t h r e e i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s u s i n g t w o d i f f e r e n t t i s s u e b a t c h e s . 102 N# 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 2-mo 6-mo 9-mo 12-mo F i g u r e 8 . N R 1 / N R 2 B t o t a l e x p r e s s i o n i s n o t d i f f e r e n t i n s t r i a t a l t i s s u e f r o m F V B / N W T o r Y A C 7 2 m i c e a t 2 , 6 , 9 , o r 1 2 m o n t h s o f a g e . S t r i a t a l l y s a t e s a r e c o l l e c t e d i n t r i p l i c a t e f r o m m i c e a t e a c h a g e a n d a n a l y z e d i n p a r a l l e l f o r N R 1 / N R 2 B e x p r e s s i o n . A c t i n e x p r e s s i o n i s u s e d a s l o a d i n g c o n t r o l . 103 A 4 r- +3 w o rt 7 i -z o S 3 2 0 H WT 1YAC72 2 - m o 6 - m o 9 - m o A g e o f M i c e 1 2 - m o B 1 . 5 c 5 *5 0 o 1 < 1 . 0 o £ O. "D X 0> UJ .N CQ w 0 . 5 E 2 0 . 0 H WT • Y A C 7 2 2 - m o 6 - m o 9 - m o A g e o f M i c e 1 2 - m o F i g u r e 9 . P l o t s c o m p a r i n g N R 1 a n d N R 2 B e x p r e s s i o n l e v e l s i n s t r i a t a l t i s s u e f r o m W T a n d Y A C 7 2 m i c e , g r o u p e d b y a g e . B a r s r e p r e s e n t m e a n o f ( A ) N R 1 o r ( B ) N R 2 B e x p r e s s i o n n o r m a l i z e d t o a c t i n , ± S E M f r o m N = 3 i n d e p e n d e n t s a m p l e s a t e a c h a g e f o r e v e r y g e n o t y p e , w i t h s t r i a t a l t i s s u e p o o l e d f r o m 2 m i c e p e r s a m p l e . N o s i g n i f i c a n t e f f e c t o f g e n o t y p e i s o b s e r v e d f o r o v e r a l l N R 1 o r N R 2 B e x p r e s s i o n l e v e l s i n s t r i a t a l t i s s u e f r o m m h t t - e x p r e s s i n g Y A C 7 2 m i c e v e r s u s W T m i c e a t a n y a g e e x a m i n e d ( 2 , 6 , 9 , o r 1 2 m o n t h s ) , b y 2 - w a y A N O V A . 104 S u r f a c e NR1 I n t e r n a l NR1 CM O • 4 » * i / 20 Lrtir •1 B • i ** • W T 0 Y A C 1 8 BYAC72 Figure 10. Immunofluorescent staining demonstrates increased proportion of surface NR1 in MSNs from YAC72 mice (contributed by L. Zhang; Fan et al., 2007). (A) Representative pictographs of cultured MSNs fixed at 9-10 d.i.v. and immunostained for surface and internal populations of NR1 are shown for WT and YAC72 mice, with insets depicting an enlarged sample neuron; following initial fixation of the neurons in 4% PFA, all subsequent steps of the immunostaining protocol, fluorescence imaging and image capturing are performed in parallel for both genotypes. (B) Intensity of fluorescent staining is quantified for both surface (green) and internal (red) NR1 in MSNs from WT, YAC18, and YAC72 mice. Proportion of NR1 expressed at the cell surface is determined by taking a ratio of surface-to-internal NR1 staining. Bars represent mean ratio ± SEM from N = 5 independent experiments. Every experiment uses an individual batch of cultured MSNs for each genotype and is performed in parallel for all three genotypes. Subsequent data analysis is also performed in parallel, using 5 coverslips of each genotype per experiment and 4 fields chosen at random from each coverslip (giving a total of 20 measurements). ** Significantly different compared to WT or YAC18, p < 0.01 by 1-way ANOVA, Bonferroni post-test. 105 NR2B NR1 -» Actin WT YAC 72 ~o o TJ O B E Q) £ CO > IS > £ O c c 3 F i g u r e 1 1 . R e p r e s e n t a t i v e i m m u n o b l o t o f N R 1 / N R 2 B l e v e l s i n 9 - 1 0 d . i . v . M S N s f r o m Y A C 7 2 v e r s u s W T m i c e w i t h o r w i t h o u t c h y m o t r y p s i n t r e a t m e n t . S i s t e r d i s h e s o f c u l t u r e d M S N s a r e t r e a t e d w i t h H B S S a l o n e o r H B S S c o n t a i n i n g 1 m g / m l c h y m o t r y p s i n t o c l e a v e c e l l s u r f a c e p r o t e i n s . P r o t e i n l e v e l s r e m a i n i n g f o l l o w i n g t r e a t m e n t a r e e x a m i n e d b y i m m u n o b l o t t i n g t o d e t e r m i n e t h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f s u r f a c e v e r s u s i n t e r n a l N M D A R s . A c t i n i s a l s o s h o w n a s l o a d i n g c o n t r o l . I m m u n o b l o t s h o w n i s r e p r e s e n t a t i v e o f 2 i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s w h e r e Y A C 7 2 s a m p l e s w e r e p r o c e s s e d i n p a r a l l e l w i t h e i t h e r p a i r e d W T o r Y A C 1 8 c u l t u r e s . 106 A CD -*—> CO ZD a Q. .2 D_ D0 CO i n C M <D rn CO co Q) 3 Q . c : o LU z O Q_ bo CO IMMI 5. c CD -*—> CO CO W T <r N R 1 <- Act in YAC72 B •o 8 0 % > , ~ 6 0 % -c S + ; L U .2 co 4 0 % 5 2 0 % z ^ 0 % r *** 3£ 1 6 1 % 3 9 % • W T ( n = 7 ) Y A C 7 2 ( n = 6 ) G e n o t y p e F i g u r e 1 2 . B i o t i n y l a t i o n a s s a y d e m o n s t r a t e s i n c r e a s e d p r o p o r t i o n o f s u r f a c e N R 1 i n M S N s f r o m Y A C 7 2 m i c e . ( A ) R e p r e s e n t a t i v e i m m u n o b l o t d e p i c t s N R 1 l e v e l s p r e s e n t i n t h e " B i o t E l u a t e " f r a c t i o n r e p r e s e n t i n g s u r f a c e N R 1 , a n d t h e " S P N " f r a c t i o n r e p r e s e n t i n g i n t e r n a l , n o n b i o t i n - t a g g e d N R 1 , i n M S N s f r o m F V B / N W T o r Y A C 7 2 m i c e . A c t i n i s s h o w n a s a c o n t r o l t o c o n f i r m s e l e c t i v e l a b e l i n g o f s u r f a c e b u t n o t i n t e r n a l p r o t e i n s b y b i o t i n . ( B ) B a n d d e n s i t i e s a r e m e a s u r e d f o r e a c h o f " B i o t E l u a t e " a n d " S P N " a n d t h e p e r c e n t s u r f a c e N R 1 e x p r e s s i o n c a l c u l a t e d a s ( " B i o t E l u a t e " + " T o t a l " * 1 0 0 % ) w h e r e " T o t a l " i s t h e s u m o f " B i o t E l u a t e " a n d f o u r t i m e s t h e s i g n a l f r o m t h e " S P N " l a n e . B a r s r e p r e s e n t m e a n p e r c e n t s u r f a c e e x p r e s s i o n ± S E M f r o m N = 7 ( W T ) o r 6 ( Y A C 7 2 ) i n d e p e n d e n t e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d w i t h d i f f e r e n t b a t c h e s o f c u l t u r e d n e u r o n s . * * * S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t c o m p a r e d t o W T , p < 0 . 0 0 1 b y u n p a i r e d t - t e s t . 107 N R 2 B <- Actin WT YAC72 B W T ( n = 5 ) Y A C 7 2 ( n = 5 ) G e n o t y p e F i g u r e 1 3 . B i o t i n y l a t i o n a s s a y d e m o n s t r a t e s i n c r e a s e d p r o p o r t i o n o f s u r f a c e N R 2 B i n M S N s f r o m Y A C 7 2 m i c e . ( A ) R e p r e s e n t a t i v e i m m u n o b l o t d e p i c t s N R 2 B l e v e l s p r e s e n t i n t h e " B i o t E l u a t e " f r a c t i o n r e p r e s e n t i n g s u r f a c e N R 2 B , a n d t h e " S P N " f r a c t i o n r e p r e s e n t i n g i n t e r n a l , n o n b i o t i n - t a g g e d N R 2 B , i n M S N s f r o m F V B / N W T o r Y A C 7 2 m i c e . A c t i n i s s h o w n a s a c o n t r o l t o c o n f i r m s e l e c t i v e l a b e l i n g o f s u r f a c e b u t n o t i n t e r n a l p r o t e i n s b y b i o t i n . ( B ) B a n d d e n s i t i e s a r e m e a s u r e d f o r e a c h o f " B i o t E l u a t e " a n d " S P N " a n d t h e p e r c e n t s u r f a c e N R 2 B e x p r e s s i o n c a l c u l a t e d a s ( " B i o t E l u a t e " + " T o t a l " * 1 0 0 % ) w h e r e " T o t a l " i s t h e s u m o f " B i o t E l u a t e " a n d f o u r t i m e s t h e s i g n