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Toxicology of trace metals : metallothionein production and carcinogenesis Brown, David Arthur 1978

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TOXICOLOGY OF TRACE METALS: METALLOTHIONEIN PRODUCTION AND CARCINOGENESIS by DAVID ARTHUR BROWN B . S c , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1970 A T H E S I S SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY i n THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES (The D e p a r t m e n t o f Z o o l o g y and t h e I n s t i t u t e o f O c e a n o g r a p h y ) We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE UNIVERSITY OF B R I T I S H COLUMBIA N o v e m b e r , 1978 © D a v i d A r t h u r B r o w n , 1978 I n p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r a n a d v a n c e d d e g r e e a t t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , I a g r e e t h a t t h e L i b r a r y s h a l l m a k e i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e a n d s t u d y . I f u r t h e r a g r e e t h a t p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e c o p y i n g o f t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y p u r p o s e s may b e g r a n t e d b y t h e H e a d o f my D e p a r t m e n t o r b y h i s r e p r e s e n t a t i v e s . I t i s u n d e r s t o o d t h a t c o p y i n g o r p u b l i c a t i o n o f t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l n o t b e a l 1 o w e d w i t h o u t my w r i t t e n p e r m i s s i o n . D e p a r t m e n t o f Z o o l o g y T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a 2075 Wesbrook Place Vancouver, Canada V6T 1W5 D a t e January 15, 1979 11 A b s t r a c t M a n y r e p o r t s o f t r a c e m e t a l l e v e l s i n o r g a n i s m s f r o m p o l l u t e d a r e a s e x i s t i n t h e l i t e r a t u r e , b u t l i t t l e c a n b e i n f e r r e d f r o m t h e s e d a t a a s t o t h e a c t u a l b i o l o g i c a l s i g n i f i -c a n c e o f t h e s e m e t a l l e v e l s t o t h e e x p o s e d o r g a n i s m . T h i s s t u d y r e p o r t s a b i o c h e m i c a l l y m e a n i n g f u l a s s a y b a s e d u p o n t h e a c t u a l t o x i c o l o g y o f t h e t r a c e m e t a l s : i t m e a s u r e s t h e l e v e l s o f t h o s e m e t a l s t h a t a r e b o u n d b y t h e t r a c e m e t a l d e t o x i f y i n g p r o t e i n , m e t a l 1 o t h i o n e i n , a n d t h o s e w h i c h a r e f r e e t o e x e r t t o x i c e f f e c t s b y b i n d i n g e n z y m e s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . F u r t h e r , a s t u d y w a s m a d e o f t r a c e m e t a l c h a n g e s i n c a r c i n o g e n e s i s i n o r d e r t o e l u c i d a t e t h e r o l e o f t r a c e m e t a l s i n t h e e t i o l o g y o f c a n c e r . O r g a n i s m s w e r e s a m p l e d f r o m a n a r e a k n o w n t o b e p o l l u t e d w i t h t r a c e m e t a l s . T i s s u e s w e r e h o m o g e n i z e d , c e n t r i f u g e d , a n d t h e s u p e r n a t a n t s f r a c t i o n a t e d a c c o r d i n g t o m o l e c u l a r w e i g h t b y p a s s i n g t h r o u g h a . c o l u m n p a c k e d w i t h P h a r m a c i a G - 7 5 g e l . C o p p e r a n d z i n c w e r e p r e s e n t i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l i n r e l a t i v e l y h i g h l e v e l s , a s t h e y a r e c o m p o n e n t s o f m e t a l 1 o e n z y m e s . E x c e s s e s o f C u a n d Zn w e r e s t o r e d o n m e t a l l o t h i o n e i n . I n d u c k l i v e r a n d k i d n e y t i s s u e , c a d m i u m w a s b o u n d t o m e t a l 1 o t h i o n e i n u n l e s s t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w a s Zn d e f i c i e n t . I n t h i s c a s e , h i g h l e v e l s o f C d a p p e a r e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , p r e -s u m a b l y s i n c e C d w a s t h e n m o r e e f f e c t i v e l y a b l e t o c o m p e t e w i t h Zn f o r Z n - b i n d i n g s i t e s i n m e t a l 1 o e n z y m e s . M u s s e l s w e r e e x p o s e d t o C d , C u a n d Zn n e a r a s e w e r o u t -i i i f a l l a n d i n t h e l a b o r a t o r y . R e d u c e d s u r v i v a l d i d n o t o c c u r u n t i l m e t a l 1 o t h i o n e i n w a s a p p a r e n t l y m e t a l s a t u r a t e d , a n d t h e r e w a s a r a p i d i n c r e a s e o f m e t a l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . P h y t o p l a n k t o n , z o o p l a n k t o n a n d f i s h w e r e e x p o s e d t o m e r c u r y . G r o w t h r a t e s w e r e r e d u c e d i n t h o s e e x p o s u r e s w h e r e H g w a s d e t e c t a b l e i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . I n f i s h a n d z o o p l a n k t o n , t h i s o c c u r r e d w h e n t h e c a p a c i t y o f m e t a l -l o t h i o n e i n t o b i n d Hg w a s a p p a r e n t l y s u r p a s s e d . C o p p e r a n d z i n c l e v e l s d e c r e a s e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w i t h i n c r e a s i n g H g e x p o s u r e l e v e l . T o x i c e f f e c t s o f t r a c e m e t a l s a r e a t t r i b u t e d t o t h e i n t e r f e r e n c e o f n o n e s s e n t i a l m e t a l s w i t h e s s e n t i a l m e t a l s i n m e t a l 1 o e n z y m e s . B o t h c a n c e r o u s f i s h a n d h u m a n s h a d i n c r e a s e s o f C d a n d t h e C d : Z n r a t i o i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . I n c o n t r o l o r g a n i s m s , a m u c h h i g h e r p o r t i o n o f C d . w a s b o u n d t o m e t a l 1 o t h i o n e i n . W h e n m i c e w e r e e x p o s e d t o l o w C d d o s e s , m o s t Cd a c c u m u l a t e d o n m e t a l . l o t h i o n e i n . W h e n t h e c a r c i n o g e n d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) w a s a d m i n i s t e r e d w i t h t h i s C d , m o r e C d a c c u m u l a t e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . S i n c e Zn w a s d e c r e a s e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l b y DEN e x p o s u r e , i t i s r e a s o n a b l e t o c o n c l u d e t h a t , a s i n d u c k s w i t h Zn d e f i c i e n t h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l s , C d w a s m o r e e f f e c t i v e l y a b l e t o c o m p e t e f o r m e t a l T o -e n z y m e b i n d i n g s i t e s . I t i s s u g g e s t e d t h a t C d , i n c a n c e r o u s o r g a n i s m s , m i g h t b e i n t e r f e r i n g w i t h t h e Z n - c o n t a i n i n g e n z y m e s i n v o l v e d i n c e l l d i v i s i o n p r o c e s s e s . i v E x p o s u r e t o DEN a l o n e r e s u l t e d i n d e c r e a s e s o f C d , C u a n d Zn i n t h e h i g h a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t p o o l s , a n d o n m e t a l 1 o t h i o n e i n . C o n c u r r e n t a d m i n i s t r a t i o n o f Zn w i t h DEN r e v e r s e d l o s s e s o f C u a n d Zn s l i g h t l y , a n d i n c r e a s e d s u r v i v a l t i m e . W h e n l o w l e v e l s o f C d w e r e a d m i n i s t e r e d w i t h D E N , l o s s e s o f C u a n d Zn w e r e i n c r e a s e d , a n d p r e t u m o r o u s h i s t o -l o g i c a l c h a n g e s w e r e m o r e e v i d e n t . V e r y h i g h C d d o s e s i n -c r e a s e d l e v e l s o f C u a n d Zn i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o v e r c o n t r o l v a l u e s , a n d g r e a t l y i n c r e a s e d t i m e t o d e a t h d u e t o t u m o r s . T a b l e o f C o n t e n t s P a g e A b s t r a c t i i T a b l e o f C o n t e n t s v L i s t o f T a b l e s v i i L i s t o f F i g u r e s x A c k n o w l e d g e m e n t s x i v C H A R T E R " I I n t r o d u c t i o n 1 I I T h e W i l d l i f e C o m m u n i t y o f I o n a I s l a n d J e t t y , V a n c o u v e r , B . C . , a n d H e a v y - m e t a l P o l l u t i o n E f f e c t s 2 4 I I I R e l a t i o n s h i p B e t w e e n S u r v i v a l o f M u s s e l s E x p o s e d t o C d , C u a n d Zn a n d t h e C y t o -p l a s m i c D i s t r i b u t i o n o f t h e s e M e t a l s 4 2 I V I n t e r a c t i o n s B e t w e e n C a d m i u m a n d Z i n c i n C y t o p l a s m o f D u c k L i v e r a n d K i d n e y 5 9 V R e l a t i o n s h i p B e t w e e n C y t o p l a s m i c D i s t r i -b u t i o n o f M l e r c u r y a n d T o x i c E f f e c t s t o Z o o p l a n k t o n a n d . C h u m . . S a l m o n ( O n c o r h y n c h u s  k e t a ) . E x p o s e d t o M e r c u r y i n a C o n t r o l l e d E c o s y s t e m 8 0 V I T h e E f f e c t o f M e r c u r y E x p o s u r e o n t h e C y t o p l a s m i c D i s t r i b u t i o n o f M e r c u r y , C o p p e r , a n d Z i n c i n S k e l e t o n e m a c o s t a t urn 9 7 V I I I n c r e a s e s o f C d a n d t h e C d : Z n R a t i o i n t h e H i g h M o l e c u l a r W e i g h t P r o t e i n P o o l f r o m A p p a r e n t l y N o r m a l L i v e r o f T u m o r - B e a r i n g F l o u n d e r s ( P a r o p h r y s v e t u 1 u s ) 11 3 V I I I I n c r e a s e s o f C d a n d t h e C d : Z n R a t i o i n t h e H i g h M o l e c u l a r W e i g h t P r o t e i n P o o l f r o m A p p a r e n t l y N o r m a l K i d n e y o f T e r m i n a l H u m a n C a n c e r P a t i e n t s ' 3 2 v i C H A P T E R P a g e I X D e c r e a s e s o f , C o p p e r a n d Z i n c i n t h e H i g h M o l e c u l a r W e i g h t P r o t e i n P o o l f r o m L i v e r s o f M i c e E x p o s e d t o D i e t h y l n i t r o s a m i n e , W i t h o r W i t h o u t C a d m i u m o r Z i n c S u p p l e m e n t a t i o n . . 1 4 4 X D e c r e a s e s o f C o p p e r a n d Z i n c i n P r e t u m o r o u s a n d P o s t t u m o r o u s L i v e r s o f M i c e E x p o s e d t o D i e t h y l n i t r o s a m i n e , W i t h a n d W i t h o u t C a d m i u m o r Z i n c S u p p l e m e n t a t i o n ' ' ^ X I T h e E f f e c t o f C a d m i u m E x p o s u r e , W i t h o r W i t h o u t D i e t h y l n i t r o s a m i n e , o n t h e C y t o -p l a s m i c L e v e l s a n d D i s t r i b u t i o n o f C a d m i u m , C o p p e r a n d Z i n c X I I D i s c u s s i o n 2 3 8 X I I I R e f e r e n c e s 2 5 0 X I V A p p e n d i x I : M e t h o d o l o g y S u m m a r y 263 v i i L i s t o f T a b l e s T a b l e P a g e 1 . L e v e l s o f C d , C u a n d Zn a d d e d t o b i o a s s a y w a t e r ( c o l l e c t e d f r o m S t a t i o n E ) f o r t h e l a b o r a t o r y e x p o s u r e o f m u s s e l s f r o m S t a t i o n E , I o n a I s l a n d , V a n c o u v e r , B . C 4 5 2 . T h e d i s t r i b u t i o n o f C d , C u a n d Zn a m o n g c y t o -p l a s m i c p o o l s o f m u s s e l s e x p o s e d t o v a r i o u s l e v e l s o f t h e s e t r a c e e l e m e n t s i n t h e l a b o r a t o r y ( E x p o s u r e s 1 - 5 ) o r n e a r I o n a I s l a n d , V a n c o u v e r , B . C . ( S t a t i o n B - E ) 5 0 3 . T h e d i s t r i b u t i o n o f C d , C u a n d Zn a m o n g s t c y t o p l a s m i c p o o l s f r o m l i v e r a n d k i d n e y o f d u c k s 6 6 4 . D i s t r i b u t i o n o f H g , C u a n d Zn a m o n g s t c y t o -p l a s m i c p o o l s f r o m l i v e r o f c h u m s a l m o n e x -p o s e d t o v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f Hg 8 6 5 . D i s t r i b u t i o n o f H g , C u a n d Zn a m o n g s t c y t o -p l a s m i c p o o l s f r o m t i s s u e o f z o o p l a n k t o n e x -p o s e d t o v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f Hg 9 7 6 . T h e D i s t r i b u t i o n o f Z n , C u a n d Hg a m o n g s t c y t o p l a s m i c p o o l s f r o m p h y t o p i a n k t o n e x p o s e d t o m e r c u r y i n b a t c h c u l t u r e s 1 0 6 7 . P a r o p h r y s v e t u l u s . D i s t r i b u t i o n o f C d , C u • a n d Zn a m o n g s t p r o t e i n p e a k s f r o m l i v e r c y t o -p l a s m o f n o n t u m o r - a n d t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s 1 2 1 8 . P a r o p h r y s v e t u l u s . R a t i o o f C d : Z n i n v a r i o u s p r o t e i n p e a k s f r o m l i v e r c y t o p l a s m o f n o n -t u m o r - a n d t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s 1 2 3 9 . P a r o p h r y s v e t u l u s . P e r c e n t a g e o f t o t a l C d , C u o r Zn o n e a c h o f p r o t e i n p e a k s f r o m l i v e r c y t o p l a s m o f n o n t u m o r - a n d t u m o r -b e a r i n g f l o u n d e r s 1 2 4 1 0 . D i s t r i b u t i o n o f C d , C u a n d Zn a m o n g s t c y t o -p l a s m i c p o o l s f r o m k i d n e y t i s s u e o f c a n c e r a n d n o n c a n c e r p a t i e n t s 1 3 9 v i i i T a b l e P a g e 1 1 . P e r c e n t a g e o f t o t a l C d , C u o r Zn o n v a r i o u s c y t o p l a s m i c p o o l s f r o m k i d n e y t i s s u e o f c a n c e r a n d n o n c a n c e r p a t i e n t s 1 4 0 1 2 . R a t i o o f C d : Z n i n c y t o p l a s m i c p o o l s f r o m k i d n e y t i s s u e o f c a n c e r a n d n o n c a n c e r p a t i e n t s 1 4 2 1 3 . T h e d i s t r i b u t i o n o f C d , C u a n d Zn a m o n g s t p r o t e i n p e a k s f r o m l i v e r o f m i c e e x p o s e d t o DEN ( d i e t h y l n i t r o s a m i n e ) , w i t h a n d w i t h o u t C d o r Zn 1 5 0 1 4 . P e r c e n t a g e d e c r e a s e s o f C u a n d Zn i n t o t a l t i s s u e h o m o g e n a t e s u p e r n a t a n t a n d t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m l i v e r s o f m i c e e x p o s e d t o DEN ( d i e t h y l n i t r o s a m i n e ) , w i t h a n d w i t h o u t C d o r Zn 1 5 2 1 5 . C h a n g e s i n h i s t o l o g y o f l i v e r a f t e r 1 2 . 5 w e e k s e x p o s u r e t o DEN ( d i e t h y l n i t r o s a m i n e ) w i t h a n d w i t h o u t C d a n d Zn 1 ° 4 1 6 . L e v e l s o f C d , C u a n d Zn i n l i v e r t i s s u e h o m o g e n a t e s u p e r n a t a n t o f m i c e e x p o s e d t o d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) , w i t h a n d w i t h o u t s u p p l e m e n t a t i o n w i t h C d o r Zn 1 7 . P e r c e n t a g e c h a n g e s o f C d a n d Zn l e v e l s i n t o t a l t i s s u e h o m o g e n a t e s u p e r n a t a n t f r o m l i v e r s o f m i c e e x p o s e d t o d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) , w i t h a n d w i t h o u t C d o r Zn. s u p p l e -men t a t i o n ' ' 8 1 8 . T h e d i s t r i b u t i o n o f C d , C u a n d Zn a m o n g c y t o p l a s m i c p o o l s f r o m l i v e r s o f m i c e e x -p o s e d t o d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) , w i t h a n d w i t h o u t s u p p l e m e n t a t i o n w i t h C d o r Zn 1 8 3 1 9 . T h e c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f C d w i t h e x -p o s u r e t o a r a n g e o f C d c o n c e n t r a t i o n s , w i t h o r w i t h o u t d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) 2 0 2 2 0 . T h e c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f C u w i t h e x -p o s u r e t o a r a n g e o f C d c o n c e n t r a t i o n s , w i t h o r w i t h o u t d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) i x T a b l e P a g e 2 1 . T h e c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f Zn w i t h e x -p o s u r e t o a r a n g e o f C d c o n c e n t r a t i o n s , w i t h o r w i t h o u t d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) . . . . 2 0 4 2 2 . P e r c e n t a g e d i s t r i b u t i o n . o f t o t a l C d o n e a c h c y t o p l a s m i c p o o l w i t h e x p o s u r e t o a r a n g e o f C d c o n c e n t r a t i o n s , w i t h o r w i t h o u t d i e t h y l - ; - * n i t r o s a m i n e ( D E N ) 2 0 5 2 3 . P e r c e n t a g e d i s t r i b u t i o n , o f t o t a l C u o n e a c h c y t o p l a s m i c p o o l w i t h e x p o s u r e t o a r a n g e o f C d c o n c e n t r a t i o n s , w i t h o r w i t h o u t d i e t h y l -n i t r o s a m i n e ( D E N ) 2 0 6 2 4 . P e r c e n t a g e d i s t r i b u t i o n o f t o t a l Zn o n e a c h c y t o p l a s m i c p o o l w i t h e x p o s u r e t o a r a n g e o f C d c o n c e n t r a t i o n s , w i t h o r w i t h o u t d i e t h y l -n i t r o s a m i n e ( D E N ) 2 0 7 2 5 . R e c o m m e n d e d p r o c e d u r e s f o r v a r i o u s t i s s u e t y p e s 2 6 6 2 6 T h e s p e c i f i c a t i o n s f o r v a r i o u s s i z e s o f P h a r m a c i a c o l u m n s w h e n p a c k e d w i t h s e p h a d e x G - 7 5 g e l 2 6 8 X L i s t o f F i g u r e s F i g u r e P a g e 1 . M e t a l l o t h i o n e i n i s a p r o t e i n o f m o l e c u l a r w e i g h t o f a p p r o x i m a t e l y 1 0 , 0 0 0 . O n e t h i r d o f i t s a m i n o a c i d s a r e c y s t e i n e . T h e r e a r e 2 4 c y s t e i n e r e s i d u e s p e r m e t a l 1 o t h i o n e i n m o l e c u l e . E a c h 3 c y s t e i n e r e s i d u e s b i n d a m e t a l i o n s o t h a t e a c h m o l e c u l e o f m e t a l l o -t h i o n e i n b i n d s 3 m e t a l i o n s . E x p o s u r e t o l o w d o s e s o f Cd r e s u l t s i n m e t a l 1 o t h i o n e i n p r o d u c t i o n w i t h C d a n d Zn e a c h i n a p p r o x i -m a t e l y h a l f o f t h e b i n d i n g s i t e s . S u b -s e q u e n t e x p o s u r e t o a h i g h C d d o s e , r e -s u l t s i n d i s p l a c e m e n t o f Zn f r o m m e t a l l o - k t h i o n e i n b y t h e C d . Zn i s m u c h l e s s t o x i c t h a n C d s i n c e Zn i s a n a t u r a l c o m p o n e n t o f g o v e r 7 0 m e t a l 1 o e n z y m e s 2 . S k e t c h - m a p o f t h e F r a s e r R i v e r e s t u a r y , n e a r V a n c o u v e r , B r i t i s h C o l u m b i a 3 . D i a g r a m o f a s i m p l i f i e d f o o d - w e b o f t h e w i l d -l i f e c o m m u n i t y a r o u n d t h e I o n a I s l a n d j e t t y . 4 . G r a p h o f ( D ) p r o t e i n f r a c t i o n s ( c o m p o s i n g p e a k . I t o V ) a n d c o n c e n t r a t i o n s o f ( A ) c o p p e r , ( B ) z i n c , a n d ( C ) c a d m i u m , f r o m d u c k l i v e r i n e a c h o f t h e s e f r a c t i o n s , 5. T o t a l q u a n t i t y o f m e t a l s ( C d , C u , a n d Z n ) p l o t t e d a g a i n s t t h e r a t i o o f t h e s a m e m e t a l s o n t h e m e t a l 1 o t h i o n e i n t o h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n ( e n z y m e - c o n t a i n i n g ) f r a c t i o n s f o r d i f f e r e n t a n i m a l s 6 . G e l e l u t i o n p r o f i l e , o f m u s s e l s f r o m S t a t i o n B , I o n a I s l a n d , V a n c o u v e r , B . C 4 8 7 . T h e l e v e l s o f t o t a l C d + C u + Zn i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t (HMW) p r o t e i n p o o l a n d m e t a l l o t h i o n e i n 8. G e l e l u t i o n p r o f i l e s o f G r e a t e r S c a u p l i v e r ( A ) a n d k i d n e y ( B ) 6 3 •" x i F i g u r e P a g e 9 . T h e v a r i a t i o n o f C d , C u a n d Z n o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , m e t a l l o r ' t h i o n e i n a n d t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o -p l a s m i c p o o l w i t h i n c r e a s e s o f t h e s e m e t a l s i n l i v e r a n d k i d n e y c y t o p l a s m 6 7 1 0 . T h e v a r i a t i o n o f t h e p o r t i o n o f t o t a l c y t o -p l a s m i c C d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l (HMW) + t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l ( L M W ) w i t h i n -c r e a s e s o f Zn o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l + t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l ' ' 1 1 . T h e v a r i a t i o n o f t h e p o r t i o n o f t o t a l c y t o -p l a s m i c C d o n m e t a l l o t h i o n e i n w i t h l e v e l s o f Zn o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l (HMW) + t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o -p l a s m i c p o o l ( L M W ) 7 3 1 2 . G e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m c o n t r o l c h u m s a l m o n e x p o s e d t o 1 >ig H g / L ( B ) , a n d t h o s e e x p o s e d t o 5 j j g H g / L ( C ) f o r 7 2 d a y s , 1 3 . G e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m c o n t r o l z o o -p l a n k t o n ( A ) , z o o p l a n k t o n e x p o s e d t o 1 j j g H g / L ( B ) , a n d t h o s e e x p o s e d t o 5 j j g H g / L f o r 7 2 d a y s 8 8 9 0 1 4 . I n v i v o f l u o r e s c e n c e o f b a t c h c u l t u r e s o f S k e l e t o n e m a c o s t a t u m e x p o s e d t o H g f o r 1 1 6 h o u r s 101 1 5 . G e l e l u t i o n p r o f i l e o f S k e l e t o n e m a c o s t a t u m . . . e x p o s e d t o 0 . 5 j j g H g / L f o r 1 1 6 h o u r s 1 ° 3 1 6 . P a r o p h r y s ; v e t u l u s . C o m p o s i t e o f g e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m l i v e r o f 3 t u m o r - b e a r i n g f 1 o u n d e r s 11 7 1 7 . P a r o p h r y s v e t u l u s . C o m p o s i t e o f g e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m l i v e r o f n o n t u m o r - b e a r i n g f 1 o u n d e r s 11 ^ 1 8 . C o m p o s i t e o f g e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m k i d n e y s o f 2 t e r m i n a l n o n c a n c e r p a t i e n t s . . . . l 3 ^ 1 9 . C o m p o s i t e o f g e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m k i d n e y s o f 2 t e r m i n a l c a n c e r p a t i e n t s I 3 ' F i g u r e 2 0 . 21 2 2 2 3 . 2 4 , 2 5 2 6 , 2 7 , 2 8 , 2 9 , 3 0 , C o m p o s i t e g e l e 1 u t i o n , p r o f i 1 e s f r o m n o n -c a n c e r o u s 1 i v e r s o f c o n t r o l m i c e a n d m i c e e x p o s e d t o DEN w i t h a n d . w i t h o u t C d o r Zn f o r 1 2 . 5 w e e k s , T h e v a r i a t i o n o f C u l e v e l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m n o n -c a n c e r o u s l i v e r s o f c o n t r o l m i c e a n d m i c e e x p o s e d t o DEN w i t h a n d w i t h o u t C d o r Zn f o r 1 2 . 5 w e e k s T h e v a r i a t i o n o f Zn l e v e l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m n o n -c a n c e r o u s l i v e r s o f c o n t r o l m i c e a n d m i c e e x p o s e d t o DEN w i t h a n d w i t h o u t C d o r Z n f o r 1 2 . 5 w e e k s T h e p e r c e n t a g e d e c r e a s e s o f C u l e v e l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m n o n c a n c e r o u s l i v e r s o f D E N - e x p o s e d m i c e T h e p e r c e n t a g e d e c r e a s e s o f Zn l e v e l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m n o n -c a n c e r o u s l i v e r s o f D E N - e x p o s e d m i c e , T h e v a r i a t i o n o f C u l e v e l s i n c y t o p l a s m f r o m l i v e r s o f m i c e e x p o s e d t o DEN w i t h a n d w i t h o u t C d o r Z n , T h e v a r i a t i o n o f Zn l e v e l s i n c y t o p l a s m f r o m l i v e r s o f m i c e e x p o s e d t o DEN w i t h a n d w i t h -o u t C d o r Zn , T h e t i m e t o d e a t h a f t e r c o m m e n c e m e n t o f e x p o s u r e o f m i c e t o D E N , w i t h a n d w i t h o u t C d o r Zn s u p p l e m e n t a t i o n , T h e i n c r e a s e i n t i m e t o d e a t h w i t h i n c r e a s e s o f C u a n d Zn i n l i v e r , a t t i m e o f d e a t h , o f m i c e e x p o s e d t o D E N , w i t h a n d w i t h o u t C d o r Zn s u p p l e m e n t a t i o n C o m p o s i t e g e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m t h r e e c o n t r o l m i c e C o m p o s i t e g e l e l u t i o n m i c e e x p o s e d t o 2 5 mg w a t e r , a n d f r o m t h r e e C d / L + 2 5 mg D E N / L . . p r o f i l e s f r o m t h r e e C d / L i n t h e i r d r i n k i n g m i c e e x p o s e d t o 2 5 mg x i i P a g e 1 5 3 1 5 5 1 5 7 1 6 0 1 6 2 1 7 9 1 8 1 1 8 5 1 8 8 2 0 8 2 1 0 x i i i F i g u r e 3 1 . 32 3 3 . 3 4 , 3 5 , 3 6 , 3 7 . 3 8 , T h e v a r i a t i o n o f C d l e v e l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m m i c e e x p o s e d t o C d , w i t h o r w i t h o u t DEN , T h e v a r i a t i o n o f C d l e v e l s i n m e t a l l o -t h i o n e i n f r o m m i c e e x p o s e d t o C d , w i t h o r w i t h o u t DEN , T h e v a r i a t i o n o f C u l e v e l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m m i c e e x p o s e d t o C d , w i t h o r w i t h o u t DEN , T h e v a r i a t i o n o f C u l e v e l s . i n m e t a l l o -t h i o n e i n f r o m m i c e e x p o s e d t o C d , w i t h o r w i t h o u t DEN T h e v a r i a t i o n o f Z n l e v e l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m m i c e e x p o s e d t o C d , w i t h o r w i t h o u t DEN T h e v a r i a t i o n o f Zn l e v e l s i n m e t a l l o -t h i o n e i n f r o m m i c e e x p o s e d t o C d , w i t h o r w i t h o u t DEN T h e v a r i a t i o n o f t o t a l t i s s u e h o m o g e n a t e s u p e r n a t a n t C u + Zn l e v e l s i n m i c e e x p o s e d t o C d , w i t h o r w i t h o u t DEN T h e v a r i a t i o n o f l i v e r w e i g h t w i t h e x p o s u r e t o v a r i o u s l e v e l s o f C d , w i t h o r w i t h o u t DEN P a g e 2 1 2 2 1 4 2 1 7 2 1 9 2 2 2 2 2 4 2 2 6 2 2 8 3 9 . A f l o w d i a g r a m o f t h e s t e p s i n v o l v e d i n t h e e x t r a c t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n a n d t h e h i g h a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t p o o l s f r o m t i s s u e . 2 6 4 x i v A c k n o w l e d g e m e n t s S t u d i e s i n t h i s t h e s i s w e r e s u p p o r t e d b y g r a n t s f r o m E n v i r o n m e n t C a n a d a , t h e U . S . N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n , a n d t h e N a t i o n a l R e s e a r c h C o u n c i l o f C a n a d a . T h e a u t h o r w a s s u p p o r t e d b y a s c h o l a r s h i p f r o m t h e N a t i o n a l R e s e a r c h C o u n c i l o f C a n a d a . S p e c i a l t h a n k s t o T i m P a r s o n s a n d J e f f T h o m p s o n f o r i n t r o d u c i n g me t o t h e t o p i c o f m e t a l l o t h i o n e i n . T h a n k s a l s o , t o t h o s e w h o c o l l a b o r a t e d w i t h me i n t h e s e s t u d i e s ; T i m P a r s o n s , K e n C h a t e l , A g n e s C h a n , C a r o l e B a w d e n , L o u i s e C l o u t i e r , a n d B r i a n K n i g h t . D o n M c L e a y o f B . C . R e s e a r c h r e v i e w e d s o m e o f t h e m a n u s c r i p t s i n t h i s t h e s i s , b e f o r e t h e y w e r e s u b m i t t e d f o r p u b l i c a t i o n , a n d p r o v i d e d s t i m u l a -t i n g d i s c u s s i o n s o n t h e t o p i c o f c a r c i n o g e n e s i s . B . C . R e s e a r c h p r o v i d e d t h e u s e o f t h e i r P e r k i n E l m e r f l a m e a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t e r , W h i l e t h e P a c i f i c E n v i r o n m e n t I n s t i t u t e p r o v i d e d t h e u s e o f t h e i r P e r k i n E l m e r g r a p h i t e f u r n a c e a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t e r . 1 C H A P T E R I I n t r o d u c t i o n M e t a l l o t h i o n e i n a n d M e t a l 1 o e n z y m e s M e t a l ! o t h i o n e i n i s a l o w m o l e c u l a r w e i g h t ( 1 0 , 0 0 0 ) p r o t e i n h i g h i n s u l f h y d r y l g r o u p s d u e t o t h e p r e s e n c e o f h i g h l e v e l s o f t h e a m i n o a c i d c y s t e i n e ( M a r g o s h e s a n d V a l l e e , 1 9 5 7 ; K a g i a n d V a l l e e , 1 9 6 0 ) . T h e s u l f h y d r y l g r o u p s c a n b i n d h e a v y m e t a l s t h u s r e n d e r i n g t h e m n o n t o x i c t o t h e e x p o s e d o r g a n i s m ( P i s c a t o r , 1 9 6 4 ) . M e t a l - t h i o n e i n c o m p l e x e s a r e u s u a l l y s t o r e d s o l u b i l i z e d i n l i v e r a n d k i d n e y c y t o p l a s m . H e a v y m e t a l s n o t b o u n d t o m e t a l 1 o t h i o n e i n m a y b e b o u n d t o h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s s u c h a s e n z y m e s . L o w l e v e l s o f c e r t a i n h e a v y m e t a l s ( e . g . , Zn a n d C u ) a r e n e c e s s a r y f o r t h e n o r m a l f u n c t i o n i n g o f m e t a l 1 o e n z y m e s ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 , U n d e r w o o d , 1 9 7 1 ) . W h e n t h e r e i s e x p o s u r e t o h i g h e r l e v e l s o f h e a v y m e t a l s , m e t a l 1 o t h i o n e i n p r o d u c t i o n i s s t i m u l a t e d ( W e b b , 1 9 7 2 a , b ; S q u i b a n d C o u s i n s , 1 9 7 4 ; D a v i e s e t a l . , 1 9 7 3 ; W i n g e e t a l . , 1 9 7 5 ; S u g a w a r a a n d S u g a w a r a , 1 9 7 5 ) . E x c e s s h e a v y m e t a l s a r e t h e n s e q u e s t e r e d b y m e t a l 1 o t h i o n e i n . H o w e v e r i f t h e r e i s a v e r y h i g h i n -f l u x o f h e a v y m e t a l s i n t o l i v e r a n d k i d n e y t i s s u e , t h e n p r o d u c t i o n o f m e t a l ! o t h i o n e i n m a y n o t b e s u f f i c i e n t t o s e q u e s t e r a l l e x c e s s h e a v y m e t a l . I n t h i s c a s e t h e r e m a y b e a " s p i l l o v e r " , i n c e l l c y t o p l a s m , o f h e a v y m e t a l s f r o m m e t a l 1 o t h i o n e i n t o h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s ( W i n g e e t a l . , 1 9 7 3 ) s u c h a s e n z y m e s . E i t h e r a n e x c e s s o f h e a v y 2 m e t a l o r a n i n c o r r e c t h e a v y m e t a l o n a n e n z y m e c a n r e n d e r t h e e n z y m e n o n f u n c t i o n a l ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ; B r e n i n e r , 1 9 7 4 ; W i l l i a m s , 1 9 7 1 ) . T h u s , t h e a p p e a r a n c e o f s p i l l a g e c o i n -c i d e s w i t h t h e a p p e a r a n c e o f p a t h o l o g i c a l c h a n g e s ( W i n g e e t a l . , 1 9 7 3 ) . E n z y m e s a r e r e n d e r e d n o n f u n c t i o n a l b y c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s b r o u g h t a b o u t b y b i n d i n g h e a v y m e t a l s w i t h p r o p e r t i e s d i f f e r e n t f r o m t h e i r r e q u i r e d m e t a l s ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ) . N o n f u n c t i o n i s d u e t o t h e f a c t t h a t a f t e r c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s , s u b s t r a t e m o l e c u l e s n o l o n g e r f i t b i n d i n g s i t e s o n t h e e n z y m e s ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ) . I t m a y b e p o s s i b l e t o q u a n t i t a t i v e l y r e l a t e s u b l e t h a l l e v e l s o f h e a v y m e t a l s b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n o r e n z y m e s t o t h e l e t h a l " s p i l l o v e r " l e v e l . T h i s w o u l d p r o v i d e a b i o c h e m i c a l l y m e a n i n g f u l a s s a y o f t h e d e g r e e o f t h e h e a v y m e t a l t o x i c i t y p r o b l e m i n h i g h l y i n d u s t r i a l i z e d a r e a s . T h e U s e o f M o l a r R a t h e r t h a n W e i g h t U n i t s O n e o f t h e a s s u m p t i o n s o f t h e " s p i l l o v e r " t h e o r y i s t h a t t h e r e i s a l i m i t e d a m o u n t o f m e t a l ! o t h i o n e i n a v a i l a b l e t o d e t o x i f y h e a v y m e t a l s a n d a l i m i t e d r a t e a t w h i c h i t c a n b e i n -d u c e d . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e r e w i l l b e c o m p e t i t i o n b e -t w e e n d i f f e r e n t h e a v y m e t a l s f o r b i n d i n g s i t e s o n m e t a l l o -t h i o n e i n . C o m p e t i t i v e s u c c e s s w i l l d e p e n d n o t o n l y o n t h e r e l a t i v e a f f i n i t y o f e a c h m e t a l f o r s u l f h y d r y l b i n d i n g s i t e s b u t a l s o o n t h e n u m b e r o f i o n s o f e a c h m e t a l t y p e c o m p e t i n g f o r t h e s e b i n d i n g s i t e s . P r o p e r i n t e r p r e t a -t i o n o f c o m p e t i t i o n d a t a w i l l n o t b e p o s s i b l e u s i n g w e i g h t 3 u n i t s a s h e a v y m e t a l s t e n d t o b e o f a w i d e r a n g e o f m o -l e c u l a r w e i g h t . T h e r e f o r e h e a v y m e t a l s w i l l b e e x p r e s s e d i n m o l a r u n i t s w h i c h r e l a t e t o t h e n u m b e r o f m e t a l i o n s p r e s e n t . W h e n m o l a r q u a n t i t i e s o f m e t a l a r e u s e d , t h e n t h e t o t a l q u a n t i t y o f m e t a l o n m e t a l 1 o t h i o n e i n i s d i r e c t l y p r o -p o r t i o n a l t o t h e a m o u n t o f m e t a l 1 o t h i o n e i n p r e s e n t . M e t a l l o -t h i o n e i n h a s 3 s u l f h y d r y l g r o u p s p e r m e t a l i o n ( K a g i a n d V a l l e e , 1 9 6 1 ; P u l i d o e t a l . , 1 9 6 6 ; B u h l e r a n d K a g i , 1 9 7 4 ; B r e m n e r a n d D a v i e s , 1 9 7 5 ) a n d a p p r o x i m a t e l y 2 4 s u l f h y d r y l s p e r m e t a l 1 o t h i o n e i n m o l e c u l e ( N o r d b e r g e t a l . , 1 9 7 2 ; B r e m n e r a n d D a v i e s , 1 9 7 5 ; B u h l e r a n d K a g i , 1 9 7 4 ; W i n g e e t a l . , 1 9 7 5 ) . T h e r e f o r e , i f a l l t h e m e t a l o n m e t a l 1 o t h i o n e i n i s a c c o u n t e d f o r , t h e m e a s u r e m e n t o f m e t a l 1 o t h i o n e i n b y p r o t e i n a s s a y m e t h o d s i s n o t n e c e s s a r y , i . e . , 3 m o l e SH X 1 m o l e m e t a l 1 o t h i o n e i n X m o l e m e t a l 2 4 m o l e SH x m o l e t o t a l m e t a l o n m e t a l 1 o t h i o n e i n = y m o l e m e t a 1 1 o t h i o n e i n M o s t r e p o r t s o n m e t a l l o t h i o n e i n a n d h e a v y m e t a l s u s e w e i g h t u n i t s . I n o r d e r t h a t d a t a f r o m o t h e r s t u d i e s m a y b e r e l a t e d t o t h i s s t u d y , a l l d a t a r e f e r r e d t o h a v e b e e n c o n v e r t e d t o m o l a r q u a n t i t i e s . T h e P r o c e s s o f D e t o x i f i c a t i o n b y M e t a l 1 o t h i o n e i n A s f i r s t p r o p o s e d b y P i s c a t o r ( 1 9 6 4 ) t h e f u n c t i o n o f m e t a l 1 o t h i o n e i n i s t h e d e t o x i f i c a t i o n o f h e a v y m e t a l s . 4 R a b b i t s w e r e i n j e c t e d w i t h C d a n d C d - t h i o n e i n ( m e t a l l o -t h i o n e i n w i t h b o u n d C d ) w a s i s o l a t e d f r o m t h e i r l i v e r s . P r e v i o u s l y m e t a l 1 o t h i o n e i n h a d b e e n i s o l a t e d o n l y f r o m k i d n e y t i s s u e ( K a g i a n d V a l l e e , 1 9 6 0 , 1 9 6 1 ) . W i t h t h e d i s c o v e r y o f m e t a l 1 o t h i o n e i n a l s o i n l i v e r t i s s u e , P i s c a t o r ( 1 9 6 4 ) p r o p o s e d t h a t i t w a s s y n t h e s i z e d i n l i v e r , t h e n b o u n d t o h e a v y m e t a l s a n d t r a n s p o r t e d t o t h e k i d n e y . H e r e i t p a s s e d t h r o u g h t h e g l o m u l a r f i l t r a t i o n a p p a r a t u s a n d w a s r e a b s o r b e d i n t h e r e n a l t u b u l e s . N o r d b e r g . (1 9 7 2 ) f o u n d t h a t a f t e r a s i n g l e i n j e c t i o n o f C d , i t w a s d i s t r i b u t e d t o o r g a n s i n a f e w m i n u t e s a n d w a s r e d i s t r i b u t e d o n l y s l o w l y t h e r e a f t e r . C a d m i u m r e m a i n i n g i n b l o o d w a s t a k e n u p i n t o r e d b l o o d c e l l s w h e r e i t w a s f i r s t b o u n d t o h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s , b u t l a t e r t o m e t a l 1 o t h i o n e i n . I n l i v e r a n d k i d n e y t i s s u e , C d w a s f i r s t b o u n d t o c e l l o r g a n e l l e s a n d p a r t i c l e s . C a d m i u m i n f r e e s u p e r n a t a n t w a s b o u n d t o h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s . A f t e r a f e w d a y s m o s t o f t h e C d w a s b o u n d t o ' m e t a l l o -t h i o n e i n . T h i s s u g g e s t s t h a t C d i s a v a i l a b l e t o b i n d e n z y m e s b e f o r e m e t a l l o t h i o n e i n i s s y n t h e s i z e d . T h e r e f o r e , i n i t i a l l y C d w o u l d b e a b l e t o e x e r t i t s t o x i c e f f e c t s . H o w e v e r , a s s y n t h e s i s o f m e t a l 1 o t h i o n e i n o c c u r r e d , m o r e C d w a s b o u n d t o m e t a l ! o t h i o n e i n , a n d l e s s t o h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o -t e i n s . T h i s s u g g e s t s t h a t a d e c l i n e i n l e v e l s o f C d a b l e t o e x e r t t o x i c e f f e c t s b y b i n d i n g e n z y m e s , i s b a s e d u p o n t h e s y n t h e s i s o f m e t a l 1 o t h i o n e i n . 5 F o r u p t o 1 1 2 d a y s a f t e r i n j e c t i o n , t h e c o n c e n t r a t i o n o f C d - t h i o n e i n i n l i v e r d e c r e a s e d w h i l e t h a t i n k i d n e y r e m a i n e d c o n s t a n t , s u g g e s t i n g a s l o w r e d i s t r i b u t i o n f r o m l i v e r t o k i d n e y , w i t h s o m e c o n c u r r e n t e x c r e t i o n f r o m t h e k i d n e y s . T h i s s t u d y i s t h e r e f o r e i n a c c o r d a n c e w i t h P i s c a t o r ' s ( 1 9 6 4 ) h y p o t h e s i s t h a t C d - t h i o n e i n i s f o r m e d i n t h e l i v e r a n d t r a n s p o r t e d t o t h e k i d n e y w h e r e i t i s r e -a b s o r b e d f r o m k i d n e y t u b u l e s . N o r d b e r g f o u n d t h a t a b o u t 0 . 0 1 % o f t h e b o d y b u r d e n o f C d w a s e x c r e t e d p e r d a y . A s u d d e n i n c r e a s e i n C d e x c r e t i o n w a s o b s e r v e d c o n c o m i t a n t l y w i t h a p p e a r a n c e o f t u b u l a r p r o t e i n u r i a . T h i s C d w a s b o u n d t o a s m a l l p r o t e i n w i t h s i z e i d e n t i c a l t o m e t a 1 1 o t h i o n e i n . N o r d b e r g s u m m a r i z e s b y s a y i n g t h a t m e t a l 1 o t h i o n e i n i s a n i m p o r t a n t c a r r i e r o f C d f r o m t i s s u e s i n t o t h e u r i n e , a t l e a s t a f t e r r e n a l t u b u l a r d a m a g e h a s o c c u r r e d . F u r t h e r , C d - t h i o n e i n r e a c h e s t h e k i d n e y c o r t e x b y g l o m u l a r f i l t r a -t i o n a n d s u b s e q u e n t t u b u l a r r e a b s o r p t i o n . W h e n t h e t u b u l e s b e c o m e d a m a g e d b y t h e a c c u m u l a t e d a m o u n t s o f C d , r e -a b s o r p t i o n i s d e c r e a s e d a n d C d - t h i o n e i n i s e x c r e t e d i n t h e u r i n e . N o r d b e r g e t a l . (1 9 7 5 ) i n j e c t e d e q u i v a l e n t a m o u n t s o f C d i n t o r a t s a s f r e e C d o r C d - t h i o n e i n . C a d m i u m e x p o s u r e a l o n e r e s u l t e d i n C d u p t a k e b y l i v e r t i s s u e a n d s u b s e q u e n t b i n d i n g o f t h i s C d t o m e t a l l o t h i o n e i n , w h i l e C d - t h i o n e i n a p p e a r e d i n t h e k i d n e y s . C d - t h i o n e i n r e s u l t e d i n r e n a l d a m a g e w h e r e a s t h e f r e e C d d i d n o t . F u r t h e r , 5 t i m e s a s 6 m u c h C d w a s r e q u i r e d a s o p p o s e d t o C d - t h i o n e i n t o b e f a t a l . D e a t h w a s a t t r i b u t e d t o r e n a l d a m a g e . T h e a u t h o r s s u g g e s t t h a t r a p i d r e l e a s e o f l i v e r s t o r e s o f m e t a l 1 o t h i o n e i n f o r p u r p o s e s o f e x c r e t i o n w o u l d b e h a r m f u l t o t h e o r g a n i s m . T h i s m a y b e d u e t o t h e f a c t t h a t t h e l o w pH o f t h e u r i n e c o u l d r e s u l t i n d i s s o c i a t i o n o f C d , C u a n d Zn f r o m m e t a l l o -t h i o n e i n ( K a g i a n d V a l l e e , 1 9 6 0 , 1 9 6 1 ) . T h e s e w o u l d t h e n b e a v a i l a b l e t o b i n d a n d d a m a g e r e n a l s t r u c t u r a l p r o t e i n s . I t i s a p p a r e n t f r o m t h i s s u m m a r y t h a t m e t a l 1 o t h i o n e i n i s s y n t h e s i z e d i n t h e l i v e r ( o r k i d n e y ) a n d i s s l o w l y t r a n s -f e r r e d t o k i d n e y v i a t h e b l o o d s t r e a m ^ . R e n a l r e a b s o r p t i o n t h e n o c c u r s a n d t h e c o m p l e x i s s t o r e d i n k i d n e y c o r t e x . M e t a l 1 o t h i o n e i n n o t r e a b s o r b e d i s e x c r e t e d . D e v e l o p m e n t o f M e t a l 1 o t h i o n e i n - m e d i a t e d T o ! e r a n c e t o  H e a v y M e t a l s I t i s c o m m o n l y k n o w n t h a t p r e e x p o s u r e t o C d r e s u l t s i n i n c r e a s e d t o l e r a n c e t o s u b s e q u e n t c h a l l e n g e d o s e s o f C d . T h e m o s t o b v i o u s w a y b y w h i c h t h i s m i g h t b e e x p e c t e d t o o c c u r w o u l d b e b y s y n t h e s i s o f e x c e s s m e t a l 1 o t h i o n e i n u p o n i n i t i a l e x p o s u r e . T h i s e x c e s s m e t a l 1 o t h i o n e i n w o u l d t h e n b e r e a d i l y a v a i l a b l e t o q u i c k l y b i n d a n d d e t o x i f y h e a v y m e t a l s o n s u b s e q u e n t e x p o s u r e s . H o w e v e r , i t i s k n o w n t h a t m e t a l l o t h i o n e i n a l w a y s e x i s t s i n t h e s a t u r a t e d s t a t e i n o r g a n i s m s , i . e . , o n e m e t a l i o n f o r e a c h t h r e e c y s t e i n e r e s i d u e s ( K a g i a n d V a l l e e , 1 9 6 0 , 1 9 6 1 ; P u l i d o e t a l . , 1 9 6 6 ; B u h l e r a n d K a g i , 1 9 7 4 ; B r e m n e r a n d D a v i e s , 1 9 7 5 ) . 7 T h e r e f o r e s o m e o t h e r m e c h a n i s m o f t o l e r a n c e d e v e l o p m e n t m u s t e x i s t . L e b e r ( 1 9 7 4 ) p r e i n j e c t e d r a t s w i t h c a d m i u m d o s a g e s o f 0 , 1 . 0 a n d 3 . 2 m g / K g , f o l l o w e d 4 8 h o u r s l a t e r b y c a d m i u m c h a l l e n g e d o s e s , r e s u l t i n g i n L D - 5 0 v a l u e s o f 4 . 5 , 6 . 0 a n d 8 . 2 m g / K g , r e s p e c t i v e l y . L i k e w i s e , p r e e x p o s u r e t o Z n w a s f o u n d t o i n c r e a s e t h e L D - 5 0 t o s u b s e q u e n t Cd c h a l l e n g e d o s e s . L e b e r f o u n d l e v e l s o f m e t a l 1 o t h i o n e i n i n c r e a s e d l i n e a r l y w i t h t h e p r e t r e a t m e n t d o s e o f C d o r Zn b u t t h a t C d - i n d u c e d m e t a l l o t h i o n e i n c o n t a i n e d C d a n d Zn w h i l e m e t a l l o t h i o n e i n r e s u l t i n g f r o m Zn i n j e c t i o n s c o n t a i n e d o n l y Z n . W h e n c a d m i u m o r z i n c p r e t r e a t e d m i c e w e r e c h a l -l e n g e d w i t h C d 3 h o u r s p r i o r t o s a c r i f i c e , . ' t h i s r e s u l t e d i n a n J_n v i v o d i s p l a c e m e n t o f Zn f r o m b o t h C d - a n d Z n -m e t a l 1 o t h i o n e i n . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e i n c r e a s e d t o l e r a n c e i n b o t h c a s e s r e s u l t s f r o m Zn d i s p l a c e m e n t f r o m m e t a l l o -t h i o n e i n b y C d ( F i g u r e 1 ) . Zn i s m u c h l e s s t o x i c t o e n z y m e s t h a n C d a s i t i s a n a t u r a l c o m p o n e n t o f m a n y e n z y m e s . H e n c e , f r e e c e l l u l a r Zn r e s u l t s i n f a r l e s s t o x i c e f f e c t s t h a n f r e e C d . S i m i l a r i l y , e x p o s u r e t o A g , C u o r Hg r e s u l t s i n s y n t h e s i s o f m e t a l 1 o t h i o n e i n c o n t a i n i n g a p p r o x i m a t e l y e q u i m o l a r l e v e l s o f Zn a n d t h e e x p o s u r e m e t a l ( W i n g e e t a l . , 1 9 7 5 ) . T h e r e f o r e , e x p o s u r e t o a n y o n e o f C d , H g , A g , C u o r Zn s h o u l d r e s u l t i n i n c r e a s e d t o l e r a n c e t o a n y o f t h e o t h e r m e t a l s u p o n s u b s e q u e n t e x p o s u r e . 8 F i g u r e 1 . M e t a l ! o t h i o n e i n i s a p r o t e i n o f m o l e c u l a r w e i g h t o f a p p r o x i m a t e l y 1 0 , 0 0 0 . O n e t h i r d o f i t s a m i n o a c i d s a r e c y s t e i n e . T h e r e a r e 2 4 c y s t e i n e r e s i d u e s p e r m e t a l 1 o t h i o n e i n m o l e c u l e . E a c h 3 c y s t e i n e r e s i d u e s b i n d a m e t a l i o n s o t h a t e a c h m o l e c u l e o f m e t a l l o -t h i o n e i n b i n d s 8 m e t a l i o n s . E x p o s u r e t o l o w d o s e s o f C d r e s u l t s i n m e t a l 1 o t h i o n e i n p r o -d u c t i o n w i t h C d a n d Zn e a c h i n a p p r o x i -m a t e l y h a l f o f t h e b i n d i n g s i t e s . S u b -s e q u e n t e x p o s u r e t o a h i g h C d d o s e , r e s u l t s i n d i s p l a c e m e n t o f Zn f r o m m e t a l 1 o t h i o n e i n b y t h e C d . Zn i s m u c h l e s s t o x i c t h a n Cd s i n c e Zn i s a n a t u r a l c o m p o n e n t o f o v e r 7 0 m e t a l 1 o e n z y m e s . 9' Meta l l o t h i one in M.W. 10,000 I l I l L l I I I I I I I I I I I I I I I I I I f x 2 4 cys te ine res i dues Low Chron i c Cd Exposu res I I I I I I M J I I I II f M J I I I I I I Cd Zn Cd Zn Cd Zn Cd Zn 3 cys te ine r e s i d u e s / m e t a l ion Zn in a p p r o x i m a t e l y 5 0 % of binding s i t e s Fo l l owed by H igh A c u t e Cd E x p o s u r e LU LU LU LU LU UJ LU LL' Cd C d Cd Cd Cd Cd Cd Cd L e s s Tox ic Zn D i s p l a c e d by Cd 1 0 T h e O c c u r r e n c e o f M e t a l l o t h i o n e i n a n d I t s A s s o c i a t e d  H e a v y M e t a l s M e t a l l o t h i o n e i n w a s f i r s t i s o l a t e d f r o m h o r s e r e n a l c o r t e x b y M a r g o s h e s a n d V a l l e e ( 1 9 5 7 ) b y a n e t h a n o l -a m m o n i u m s u l f a t e f r a c t i o n a l p r e c i p i t a t r o n t e c h n i q u e . C a d m i u m a n d z i n c w e r e f o u n d a s s o c i a t e d w i t h t h e i s o l a t e d p r o t e i n i n a 1 : 0 . 4 2 m o l a r r a t i o . O t h e r h e a v y m e t a l s w e r e n o t d e t e r m i n e d . L a t e r K a g i a n d V a l l e e ( 1 9 6 0 ) u s i n g a n e t h a n o l - c h 1 o r o f o r m - a m m o n i u r n s u l f a t e f r a c t i o n a l p r e -c i p i t a t i o n t e c h n i q u e , i s o l a t e d m e t a l l o t h i o n e i n f r o m h o r s e r e n a l c o r t e x a n d i n t e n p r e p a r a t i o n s f o u n d C d a n d Zn p r e s e n t i n h i g h a m o u n t s ; A l , B a , C a , Mg a n d F e i n l e s s e r a m o u n t s w h i l e S r , C r , a n d P b o c c u r r e d i n s o m e p r e p a r a t i o n s . W h e n a m o r e p r e c i s e D E A E - c e l 1 u l o s e c h r o m a t o g r a p h y s t e p w a s i n c l u d e d ( K a g i a n d V a l l e e , 1 9 6 1 ) C d , Z n , F e a n d C u w e r e f o u n d i n a 1 : 0 . 6 4 : 0 . 0 7 : 0 . 0 3 m o l a r r a t i o . A l , B a , C a , M g , S r , C r a n d P b w e r e n o t f o u n d a s s o c i a t e d w i t h m e t a l l o t h i o n e i n . P i s c a t o r ( 1 9 6 4 ) i s o l a t e d m e t a l l o t h i o n e i n f r o m l i v e r t i s s u e o f r a b b i t s e x p o s e d t o C d . M e t a l l o t h i o n e i n w a s f i r s t i d e n t i f i e d i n h u m a n l i v e r b y B u h l e r a n d K a g i ( 1 9 7 4 ) . C d , Zn a n d C u w e r e f o u n d i n a 1 : 7 2 . 1 : 1 . 1 m o l a r r a t i o . I n 1 9 6 6 P u l i d o e t a l . i s o l a t e d m e t a l l o t h i o n e i n f r o m h u m a n r e n a l c o r t e x . C d , Z n , C u a n d Hg w e r e i n a 1 : 1 . 0 8 : 0 . 1 3 : 0 . 0 7 m o l a r r a t i o . R u g s t a d a n d N o r s e t h ( 1 9 7 5 ) h a v e i s o l a t e d C d - t h i o n e i n f r o m c u l t u r e d h u m a n s k i n e p i t h e l i a l c e l l s g r o w n 11 i n a C d r i c h m e d i u m . W i s n i e w s k a e t a l . ( 1 9 7 0 ) i n j e c t e d r a t s w i t h C d a n d Hg a n d f o u n d t h e s e m e t a l s b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n i n t h e i r k i d n e y . J a k u b o w s k i e t a l . ( 1 9 7 0 ) f o u n d H g - t h i o n e i n i n l i v e r , k i d n e y a n d o c c a s i o n a l l y i n u r i n e o f r a t s p r e i n j e c t e d w i t h r a d i o a c t i v e m e r c u r y . A f t e r i n j e c t i o n o f C d i n t o m i c e , N o r d b e r g ( 1 9 7 2 ) f o u n d C d - t h i o n e i n i n e r y t h r o c y t e s , p l a s m a , l i v e r , t e s t e s , k i d n e y a n d u r i n e ( N o r d b e r g a n d P i s c a t o r , 1 9 7 2 ) . W e b b ( 1 9 7 2 a ) f o u n d t h a t w h e n r a t s w e r e p r e e x p o s e d t o Zn o r C d a n d 2 - 4 d a y s l a t e r w e r e i n j e c t e d w i t h N i o r C o , t h a t l o w q u a n t i t i e s o f t h e s e c a t i o n s w e r e b o u n d t o m e t a 1 1 o t h i o n e i n . R a t s g i v e n C d i n t h e i r d r i n k i n g w a t e r h a v e b e e n s h o w n t o h a v e C d - t h i o n e i n i n t h e w a l l s o f t h e i r i n t e s t i n e s ( S u g a w a r a a n d S u g a w a r a , 1 9 7 5 ) . C o u s i n s e t a l . ( 1 9 7 3 ) h a v e i s o l a t e d C d - t h i o n e i n f r o m r e n a l c o r t e x o f s w i n e f e d v a r i o u s q u a n t i t i e s o f C d i n t h e i r d i e t s . W i n g e e t a l . ( 1 9 7 5 ) i n j e c t e d r a t s w i t h C d , A g , H g , o r Z n . A l l f o u r m e t a l s w e r e f o u n d a s s o c i a t e d w i t h t h e l i v e r m e t a l l o -t h i o n e i n f r a c t i o n . S a b b i o n i a n d M a r a f a n t e ( 1 9 7 5 ) i n j e c t e d r a t s w i t h C d t o s t i m u l a t e m e t a l 1 o t h i o n e i n p r o d u c t i o n a n d f o l l o w e d t h i s w i t h i n j e c t i o n s o f 4 2 d i f f e r e n t m e t a l s . T h e y c o n c l u d e d t h a t o n l y C d , Z n , H g , C u , A g a n d S n c o u l d b i n d m e t a l 1 o t h i o n e i n . I n 1 9 7 2 M a c L e a n e t a l . f o u n d a m e t a l 1 o t h i o n e i n - 1 i k e f r a c t i o n b i n d i n g C d a n d Zn i n b l u e g r e e n a l g a e ( A n a c y a t i s  n i d u l a n s ) e x p o s e d t o r a d i o a c t i v e C d . H o w e v e r i n a t r y -1 2 p a n o s o m i d f l a g e l l a t e ( C r i t h i d i a f a s c i c u l a t a ) g r o w n u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s , n o s u c h f r a c t i o n w a s f o u n d . N a t u r a l l y o c c u r r i n g ( n o n e x p e r i m e n t a l l y i n d u c e d ) C d - t h i o n e i n h a s b e e n f o u n d i n t h e A t l a n t i c g r e y s e a l ( H a l i c h o e r u s g r y p u s ) a n d t h e P a c i f i c f u r s e a l ( C a l T o r h i n u s u r s i n u s ) b y 0 1 a f s o n a n d T h o m p s o n ( 1 9 7 4 ) . T h e s e a u t h o r s a l s o r e p o r t t h e o c c u r r e n c e o f C d - t h i o n e i n i n l i v e r s o f t h e c o p p e r r o c k f i s h ( S e b a s t o d e s  c a u r i n u s i n j e c t e d w i t h C d . C a s t e r l i n e a n d Y i p ( 1 9 7 5 ) h a v e d e m o n s t r a t e d t h e p r e s e n c e o f C d - t h i o n e i n i n C d - e x p o s e d o y s t e r s b u t c o u l d n o t d e t e c t m e t a l . l o t h i o n e i n i n C d e x p o s e d s o y b e a n p l a n t s . C o m m o n l i m p e t s ( P a t e l 1 a v u l g a t a ) f r o m a n a r e a o f s e v e r e i n d u s t r i a l p o l l u t i o n c o n t a i n e d b o t h C d a n d Z n - t h i o n e i n s ( H o w a r d a n d N i c k l e s s , 1 9 7 5 ) . N o e l - L a m b o t ( 1 9 7 6 ) f o u n d m e t a l l o t h i o n e i n b i n d i n g C d , Zn a n d C u i n m u s s e l s f r o m t h e N o r t h S e a . H g - t h i o n e i n h a s b e e n f o u n d i n a p p r e c i a b l e l e v e l s i n l i v e r s , g i l l a n d k i d n e y t i s s u e o f Hg e x p o s e d e e l s , b u t i n m u c h l e s s e r a m o u n t s i n m u s c l e t i s s u e ( B o u q u e g n e a u e t a l . , 1 9 7 5 ) . T h e a b o v e s u m m a r y s u g g e s t s t h a t m e t a l l o -t h i o n e i n i s u b i q u i t o u s i n t h e a n i m a l k i n g d o m . T h e o c -c u r r e n c e o f m e t a l l o t h i o n e i n i n l i v e r , k i d n e y , t e s t e s , m u s c l e , p l a s m a , e r y t h r o c y t e s , t i s s u e c u l t u r e d s k i n e p i t h e l i a l c e l l s , a n d u r i n e s u g g e s t s t h e p o s s i b i l i t y t h a t m e t a l l o t h i o n e i n m a y e x i s t t o s o m e l e v e l i n m o s t o r a l l a n i m a l t i s s u e s . T h e r e i s a p a u c i t y o f s t u d i e s o f m e t a l l o t h i o n e i n i n t h e p l a n t k i n g d o m ; m e t a l l o -t h i o n e i n h a s b e e n f o u n d i n b l u e - g r e e n a l g a e ( M c L e a n e t a l . , 1 3 1 9 7 2 ) b u t n o t i n s o y b e a n p l a n t s ( C a s t e r l i n e a n d Y i p , 1 9 7 5 ) . N a t u r a l l y o c c u r r i n g m e t a l l o t h i o n e i n , i s o l a t e d b y m o r e a d v a n c e d g e l c h r o m a t o g r a p h y t e c h n i q u e s , t h u s f a r h a s b e e n f o u n d b i n d i n g m a i n l y C d a n d Zn w i t h l e s s e r a m o u n t s o f Hg a n d C u a n d p o s s i b l y s m a l l a m o u n t s o f F e . T h u s , r e c e n t w o r k s o n m e t a l l o t h i o n e i n r e f e r t o i t a s a p r o t e i n i n v o l v e d i n b i n d i n g s p e c i f i c a l l y f o r C d , Z n , C u a n d Hg ( N o e l - L a m b o t , 1 9 7 6 ; H i n g e e t a l . , 1 9 7 5 ; O l f a f s o n a n d T h o m p s o n , 1 9 7 4 ; C h e r i a n , 1 9 7 4 ) . W h i l e t h i s m a y b e s u f f i c i e n t f o r n a t u r a l l y o c c u r r i n g m e t a l l o t h i o n e i n , e x p e r i m e n t a l l y i n d u c e d m e t a l l o -t h i o n e i n h a s b e e n s h o w n i n a d d i t i o n , t o c o n t a i n F e ( P u l i d o e t a l . , 1 9 6 6 ; K a g i a n d V a l l e e , 1 9 6 1 ) , N i , C o ( W e b b , 1 9 7 2 a ) , A g ( W i n g e e t a l . , 1 9 7 5 ; S a b b i o n i a n d M a r a f a n t e , 1 9 7 5 ) a n d S n ( S a b b i o n i a n d M a r a f a n t e , 1 9 7 5 ) . I t m a y b e t h a t t h e s e m e t a l s a r e f o u n d o n m e t a l l o t h i o n e i n o n l y i n e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s b e c a u s e t h e y h a v e b e e n i n j e c t e d , a n d h e n c e a r e p r e s e n t i n o r g a n i s m s , i n q u a n t i t i e s h i g h e r t h a n t h o s e n o r m a l l y f o u n d i n e n v i r o n m e n t a l l y e x p o s e d o r g a n i s m s . A f f i n i t y o f V a r i o u s H e a v y M e t a l s f o r M e t a l l o t h i o n e i n M a r g o s h e s a n d V a l l e e ( 1 9 5 7 ) f o u n d t h a t C d w a s n o t r e m o v e d f r o m m e t a l l o t h i o n e i n b y d i a l y s i s a t pH 7 b u t t h a t i t w a s b y t r e a t m e n t w i t h h o t t r i c h l o r o a c e t i c a c i d . K a g i a n d V a l l e e ( 1 9 6 0 ) d e t e r m i n e d t h a t t h e a m o u n t o f C d o r Zn b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n d e c r e a s e d w i t h d e c r e a s i n g p H . F r o m t h e i r d a t a t h e y n o t e d t h a t 5 0 % o f Zn w a s r e m o v e d a t pH 4 . 6 w h e r e a s 5 0 % o f C d w a s n o t r e m o v e d u n t i l p H 3 . 5 . 14 T h e r e f o r e Cd r e m o v a l r e q u i r e s a 1 0 - f o l d h i g h e r c o n c e n t r a t i o n o f h y d r o g e n i o n s a n d t h e r e f o r e Cd i s p r o b a b l y more t i g h t l y b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n t h a n i s Z n . F u r t h e r t h e y f o u n d t h a t t h e n u m b e r o f s u l f h y d r y l g r o u p s t i t r a t a b l e w i t h Ag o r p - c h l o r o m e r c u r i b e n z o a t e r e m a i n s u n c h a n g e d a f t e r r e m o v a l o f Cd and Z n . Thus t t c a n be a s s u m e d t h a t b o t h Ag a n d Hg a r e a b l e t o d i s p l a c e Cd a n d Zn f r o m m e t a l l o t h i o n e i n . K a g i and V a l l e e ( 1 9 6 0 ) d i a l y z e d m e t a l l o t h i o n e i n a g a i n s t 5 X 1 0 " 3 M Cd o r Zn a t pH 7 . 1 . T h e y f o u n d t h a t d i a l y s i s a g a i n s t Zn d i d n o t a f f e c t t h e Cd c o n t e n t b u t t h a t d i a l y s i s a g a i n s t Cd d e c r e a s e d t h e Zn c o n t e n t o f m e t a l l o t h i o n e i n . T h e r e f o r e , i t c a n be a s s u m e d t h a t a t b o d y p H , an i n f u s i o n o f Cd c a n d i s p l a c e Zn f r o m m e t a l l o t h i o n e i n b u t n o t v i c e v e r s a . K a g i a n d V a l l e e s t a t e t h a t t h i s e x p e r i m e n t a l p r o -c e d u r e n e g l e c t s e l e c t r o s t a t i c f a c t o r s a n d s p e c i f i c e f f e c t s o f b u f f e r i o n s . P u l i d o e t a l . ( 1 9 6 6 ) a d j u s t e d a 3 X I O - 5 M s o l u t i o n o f human m e t a l l o t h i o n e i n t o pH 2 . 0 by t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 N H C 1 . T h e y t h e n p a s s e d t h i s t h r o u g h a S e p h a d e x . G - 2 5 c o l u m n e l u t e d w i t h p . l M HC1.. T h e y f o u n d t h a t u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , c a d m i u m , z i n c a n d c o p p e r w e r e r e m o v e d f r o m m e t a l l o t h i o n e i n w h i l e Hg r e m a i n e d b o u n d . T h e y a l s o f o u n d t h a t t i t r a t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n w i t h Ag d i s p l a c e d C d , Zn and Cu b u t n o t H g . W i s n i e w s k a e t a l . ( 1 9 7 0 ) a l s o c o n c l u d e d t h a t Cd was r e m o v e d f r o m m e t a l l o t h i o n e i n a t pH 2 b u t t h a t H g - t h i o n e i n i s s t a b l e i n a c i d i c m e d i u m . 1 5 W e b b ( 1 9 7 2 a ) f o u n d t h a t C d w a s m o r e f i r m l y b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n t h a n Z n . C a d m i u m w a s c o m p l e t e l y r e t a i n e d o n d i a l y s i s o f t h e p r e p a r a t i o n a g a i n s t 20mM a c e t a t e b u f f e r w h e r e a s Zn w a s r e m o v e d . When m e t a l l o t h i o n e i n w a s d i a l y z e d a g a i n s t 0 . 2 mM p - c h l o r o m e r c u r i b e n z o a t e i n 2 0 mM s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 4 ) , Hg r e p l a c e d C d . F u r t h e r , i t w a s f o u n d w h e n t h i o n e i n w a s d i a l y z e d a g a i n s t e q u i m o l a r c o n c e n t r a t i o n s o f N i a n d C d , b i n d i n g o f N i w a s t w i c e t h a t o f C d . E v a n s e t a l . ( 1 9 7 0 ) , u s i n g s i m i l a r d i a l y s i s p r o c e d u r e s , f o u n d t h a t H g , C d a n d Zn d i s p l a c e d C u f r o m m e t a l l o t h i o n e i n , i n v i t r o . F r o m t h e a b o v e s u m m a r y t h e f o l l o w i n g o r d e r o f d e c r e a s -i n g a f f i n i t y f o r b i n d i n g o f m e t a l l o t h i o n e i n c a n b e d e d u c e d : H g ^ > A g ^ > C d ^ > Z n ^ > C u . T h e r e f o r e , a f t e r e x p o s u r e t o h i g h l e v e l s o f a t r a c e e l e m e n t , C u s h o u l d s p i l l o v e r t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f i r s t , Zn n e x t , f o l l o w e d b y C d , A g a n d H g . I n a c c o r d a n c e w i t h t h i s p r e d i c t i o n , L e b e r ( 1 9 7 4 ) f o u n d t h a t m e t a l l o t h i o n e i n , i n r a t s r e c e i v i n g l o w i n j e c t i o n s o f C d , c o n t a i n e d m u c h m o r e Zn t h a n C d ; t h o s e r e c e i v i n g a h i g h C d d o s e h a d a l m o s t e q u a l l e v e l s o f C d a n d Z n ; b u t i n t h o s e r e c e i v i n g v e r y h i g h l e v e l s o f C d , o n l y C d w a s f o u n d o n m e t a l l o t h i o n e i n . T h e o r d e r o f t o x i c i t y o f C d , Z n a n d Hg i s H g ^ > C d ^ > Zn ( M c K e e a n d W o l f , 1 9 6 3 ) . T h i s i s e x a c t l y t h e s a m e a s t h e o r d e r o f t h e i r a f f i n i t y f o r m e t a l l o t h i o n e i n ; c o n v e n i e n t l y , t h e l e a s t t o x i c i o n s w i l l b e r e l e a s e d f i r s t i n a " s p i l l o v e r " 1 6 s i t u a t i o n . F u r t h e r m o r e , Z n , w h i c h s h o u l d b e r e l e a s e d f i r s t , i s a n o r m a l c o m p o n e n t o f m a n y e n z y m e s ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ) . M e r c u r y , c a d m i u m a n d z i n c g e n e r a l l y e x e r t t h e i r t o x i c e f f e c t s b y b i n d i n g e n z y m e s , p a r t i c u l a r i l y t h o s e h i g h i n s u l f h y d r y l g r o u p s ( W i l l i a m s , 1 9 7 1 ) . T h e r e f o r e , t h o s e m e t a l s w h i c h b i n d m o s t t i g h t l y t o t h e s u l f h y d r y l g r o u p s o n m e t a l l o -t h i o n e i n , p r o b a b l y b i n d m o s t t i g h t l y t o t h e s u l f h y d r y l g r o u p s o f e n z y m e s , i . e . , H g ^ > C d ^ > Z n . I t f o l l o w s t h a t i n c r e a s e d a b i l i t y t o b i n d m e t a l l o t h i o n e i n d o e s n o t n e c e s -s a r i l y r e s u l t i n a r e d u c e d t o x i c i t y o f a m e t a l , s i n c e t h e s e s a m e m e t a l s a l s o h a v e a n i n c r e a s e d a b i l i t y t o r e n d e r s u l f h y d r y l - c o n t a i n i n g e n z y m e s n o n f u n c t i o n a l . T h e r e f o r e , i t w a s p r o b a b l y o f e v o l u t i o n a r y n e c e s s i t y t h a t t h e s u l f h y d r y l - b a s e d m e t a l l o t h i o n e i n d e t o x i f y i n g s y s t e m d e v e l o p e d , b i n d i n g m o s t s t r o n g l y t h o s e h e a v y m e t a l s w h i c h a r e m o s t s t r o n g l y b o u n d t o s u l f h y d r y l c o n t a i n i n g e n z y m e s . E v o l u t i o n o f M e t a l l o t h i o n e i n T h e m e t a l d e t o x i f i c a t i o n s y s t e m m a y h a v e d e v e l o p e d w h e n l i f e f i r s t b e g a n o n e a r t h , 3 . 6 b i l l i o n y e a r s a g o . A t t h a t t i m e t h e h e a v y m e t a l l e v e l s i n t h e o c e a n s w e r e p r e s u m a b l y much h i g h e r , t h a n t o d a y . T h i s w a s p r o b a b l y d u e i n p a r t t o t h e h i g h e r l a v a o u t p u t , r e s u l t i n g f r o m t h e p r e s e n c e o f r a d i o -a c t i v e ( h e a t g e n e r a t i n g ) s u b s t a n c e s i n t h e a t m o s p h e r e i n q u a n t i t i e s 6 t i m e s a s h i g h t h e n a s n o w ( S t r a h l e r , 1 9 7 2 ) . F u r t h e r m o r e , t h e r e w a s t h e n 6 0 0 t i m e s a s m u c h C 0 2 i n t h e a t m o s p h e r e a n d o c e a n s a s n o w ( S t r a h l e r , 1 9 7 2 ) . T h e r e f o r e , t h e o c e a n s w o u l d h a v e b e e n m u c h m o r e a c i d i c . T h i s a c i d i t y w o u l d h a v e r e s u l t e d i n m o r e m e t a l b e i n g e x t r a c t e d f r o m t h e l a v a t h a n n o w , i n a d d i t i o n t o t h e f a c t t h a t m o r e l a v a w a s b e i n g p r o d u c e d b y v o l c a n i c a c t i v i t y . T h e r e f o r e l i f e p r o b a b l y e v o l v e d i n a m e t a l r i c h m e d i u m , a n d i n f a c t m e t a l c l a y t e m p l a t e s m a y h a v e b e e n t h e c a t a l y s t s f o r b o n d i n g o f t h e f i r s t p o l y m e r s o f a m i n o a c i d s a n d n u c l e i c a c i d s ( P a e c h t -H o r o w i t z , 1 9 7 4 ) . T h u s , l i f e e v o l v e d u t i l i z i n g m a n y m e t a l s ( e s p e c i a l l y C u , Z n , F e , Mg a n d M n ) i n e n z y m e s y s t e m s a n d n u c l e i c a c i d s , a n d f u r t h e r m o r e , p r o b a b l y e v o l v e d m e t a l l o -t h i o n e i n a s a n a t u r a l d e t o x i f y i n g s y s t e m f o r e x c e s s e s o f h e a v y m e t a l s . A s p o s t u l a t e d b y B r o w n ( 1 9 7 6 ) i t i s l i k e l y t h a t h e a v y m e t a l s l e v e l s d r o p p e d r e l a t i v e l y s u d d e n l y w h e n 0 ^ g e n e r a -t i n g p h o t o s y n t h e s i s b e g a n 2 . 7 b i l l i o n y e a r s a g o . A t t h a t t i m e i t i s p r o p o s e d t h a t F e a n d Mn h y d r o u s o x i d e s f o r m e d . T h e s e a r e i n s o l u b l e a n d a b s o r b v a s t q u a n t i t i e s o f o t h e r t r a c e m e t a l s i n a n d o n t h e f l o c c u l a n t , t h u s r e s u l t i n g i n d e c r e a s e d l e v e l s o f t h e s e m e t a l s i n t h e o c e a n s . F u r t h e r -m o r e , a t m o s p h e r i c C C ^ d e c r e a s e d s h a r p l y r e s u l t i n g i n i n -c r e a s e d pH o f " t h e s e a w a t e r a n d t h e r e f o r e l e s s l e a c h i n g o f m e t a l s f r o m l a v a . A s t h e m e t a l c o n t e n t o f t h e o c e a n s i s l o w e r n o w t h a n w h e n l i f e f i r s t e v o l v e d , i t i s n o t s u r p r i s i n g t h a t m e t a l s a r e o f t e n t h e l i m i t i n g f a c t o r i n g r o w t h b e c a u s e o f m e t a l d e f i c i e n c i e s ( U n d e r w o o d , 1 9 7 1 ) . B e c a u s e l i f e d e v e l o p e d i n a m e t a l r i c h e n v i r o n m e n t , i t w o u l d b e e x p e c t e d 1 8 t h a t p r e s e n t d a y o r g a n i s m s w o u l d b e w e l l a d a p t e d t o s u r v i v e e x p o s u r e t o m e t a l l i c p o l l u t a n t s . T h i s i s i n d i c a t e d b y t h e f a c t t h a t m u c h h i g h e r t h a n n o r m a l p h y s i o l o g i c a l l e v e l s o f m e t a l l o t h i o n e i n c a n b e s y n t h e s i z e d i n h i g h m e t a l e x p o s u r e e x p e r i m e n t s ( e . g . , O l a f s o n a n d T h o m p s o n , 1 9 7 4 ) . M e t a l s a n d C a r c i n o g e n e s i s S i n c e l i f e b e g a n i n a t r a c e e l e m e n t r i c h e n v i r o n m e n t , i t i s n o t s u r p r i s i n g t h a t m a n y e n z y m e s c o n t a i n m e t a l s a s e s s e n t i a l p a r t s o f t h e i r s t r u c t u r e . O f p a r t i c u l a r i n t e r e s t i n c a r c i n o g e n e s i s , a r e t h e Zn c o n t a i n i n g e n z y m e s i n v o l v e d i n c e l l d i v i s i o n p r o c e s s e s , e . g . , DNA p o l y m e r a s e , RNA p o l y m e r a s e , r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e , a n d t h y m i d i n e k i n a s e ( V a l l e e , 1 9 7 6 ; D u n c a n a n d D r e o s t i , 1 9 7 6 ) , a n d t h e C u c o n -t a i n i n g m o n o o x y g e n a s e s y s t e m ( Y a m a n e e t a l . , 1 9 6 9 ) r e -s p o n s i b l e , i n p a r t , f o r t h e b i o a c t i v a t i o n o f n o n c a r c i n o g e n i c o r g a n i c s u b s t a n c e s t o c a r c i n o g e n i c a r e n e o x i d e s . T h i s i s f o l l o w e d b y t h e i r s u b s e q u e n t m e t a b o l i s m t o n o n c a r c i n o g e n i c s u b s t a n c e s b y t h e e p o x i d e h y d r a s e a n d g l u t a t h i o n e - S - e p o x i d e e n z y m e s y s t e m s . L e v e l s o f C d , C u a n d Z n a r e c h a n g e d w i t h d e v e l o p m e n t o f c a n c e r s . H i g h C d l e v e l s c a n a l t e r o r i n h i b i t t h e n o r m a l f u n c t i o n o f b o t h C u - a n d Z n - c o n t a i n i n g m e t a l 1 o e n z y m e s . E l e v a t e d l i v e r C d , C u a n d Z n a n d k i d n e y C d a n d Zn a r e f o u n d i n m a n y c a n c e r p a t i e n t s ( . O l s o n e t a l . . , 1 9 5 4 , 1 9 5 8 ; T i e t z e t a l . , 1 9 5 7 ; L e w i s e t a l . , 1 9 6 9 ; M o r g a n , 1 9 7 0 , 1 9 7 1 ) . S a n d b e r g e t a l . ( 1 9 5 8 ) r e p o r t e d i n c r e a s e d h e p a t i c C u i n 1 9 s o m e c a s e s o f n e o p l a s i a , e s p e c i a l l y i n a s s o c i a t i o n w i t h w i d e s p r e a d m e t a s t a s i s , M o r g a n ( 1 9 7 0 ) f o u n d i n c r e a s e d l i v e r , k i d n e y a n d s e r u m C d / Z n i n l u n g c a n c e r p a t i e n t s w h i l e P o r i e s e t a l . ( 1 9 7 3 ) r e p o r t i n c r e a s e d s e r u m C u / Z n i n a l l c a n c e r p a t i e n t s . K a l s t e d a n d S m i t h ( 1 9 7 0 ) f o u n d p l a s m a Zn t o b e d e c r e a s e d i n m a l i g n a n t d i s e a s e s , p a r t i -c u l a r l y m e t a s t a t i c c a r c i n o m a . A r n o l d a n d S a s s e ( 1 9 6 1 ) ' . f o u n d i n c r e a s e d C u a n d d e c r e a s e d Zn i n r a t s w i t h DMBA i n -d u c e d t u m o r s . G o r o d i s k i i e t a l . (1 9 5 6 ) : i n _ F u r s t a n d H a r o , 1 9 6 9 ) r e p o r t i n c r e a s e s i n t h e C d c o n t e n t o f t u m o r s i n d u c e d b y n o n m e t a l c a r c i n o g e n s . T i e t z e t a l . ( 1 9 5 7 ) r e p o r t t h a t c h a n g e s i n m e t a l l e v e l s o c c u r b e f o r e t u m o r f o r m a t i o n w h i l e O l s o n e t a l . ( 1 9 5 8 ) r e p o r t h o i n c r e a s e i n l i v e r Zn i n a n i m a l s b e a r i n g t r a n s f e r r e d s u b c u t a n e o u s t u m o r s , s u g g e s t i n g t h a t a l t e r a t i o n s i n m e t a l l e v e l s d o n o t o c c u r a s a r e s u l t o f t h e c a r c i n o m a . K o c h e t a l . ( 1 9 5 7 ) r e p o r t e d e l e v a t e d C u i n l e u k e m i a p a t i e n t s a n d f o u n d t h a t t h i s c o u l d b e r e d u c e d b y t h e a n t i l e u k e m i c d r u g 6 - m e r c a p t o p u r i n e . A s s u g g e s t e d b y F u r s t ( 1 9 6 3 ) , t h e a c t i o n s o f a l l c a r c i n o g e n s a n d a n t i c a n c e r d r u g s c a n b e e x p l a i n e d a s t h o s e o f t r a c e m e t a l c h e l a t i n g a g e n t s . T h e p r e s e n t s t u d y w i l l i n v e s t i g a t e w h e t h e r o r n o t t h e o r g a n i c c a r c i n o g e n d i e t h y l n i t r o s a m i n e c a n i n f l u e n c e t h e l e v e l s a n d c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f C d , C u a n d Z n i n p r e t u m o r o u s t i s s u e . I t h a s b e e n f o u n d t h a t a m e t h y l g r o u p b o u n d t o Hg r e s u l t s i n Hg o c c u r r i n g i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l r a t h e r t h a n i n m e t a l l o t h i o n e i n ( C h e n e t a l . , 1 9 7 3 ) . T h u s , m e t h y l Hg i s m u c h m o r e t o x i c t h a n H g , a s m o r e Hg i s a v a i l a b l e t o b i n d e n z y m e s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . P e r h a p s o r g a n i c c a r c i n o g e n s c a n b i n d C d , C u a n d Zn , t h u s c h a n g i n g t h e i r c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n . I n p a r t i c u l a r , i f C d w e r e i n c r e a s e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , t h e n i t w o u l d b e a b l e t o i n t e r f e r w i t h t h e Z n - c o n t a i n i n g e n z y m e s i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f c e l l d i v i s i o n . I n m o s t Z n - c o n t a i n i n g e n z y m e s , Zn h o l d s s u b u n i t s t o -g e t h e r ( U l m e r , 1 9 7 0 ) . T h e s e s u b u n i t s c a n b e s e p a r a t e d b y v a r i o u s a g e n t s . F o r e x a m p l e , i n t a c t a s p a r t i c t r a n s c a r b a m y -l a s e h a s a m o l e c u l a r w e i g h t o f 3 0 0 , 0 0 0 w i t h c a t a l y t i c a n d r e g u l a t o r y s u b u n i t s j o i n e d t o g e t h e r b y Z n . I f e x p o s e d t o H g , t h e s u b u n i t s o f t h i s e n z y m e s e p a r a t e a n d t h e c a t a l y t i c s u b u n i t i s r e l e a s e d . I t h a s m o l e c u l a r w e i g h t 4 8 , 0 0 0 , s p e c i f i c a c t i v i t y 4 - 5 t i m e s h i g h e r t h a n t h e i n t a c t e n z y m e , a n d i t i s n o t s u b j e c t t o f e e d b a c k c o n t r o l ( W h i t e e t a l , 1 9 6 8 ) . L i k e a s p a r t i c t r a n s c a r b a m y l a s e , DNA p o l y m e r a s e c a n b e s e p a r a t e d i n t o s u b u n i t s b y Hg ( J o v i n e t a l . , 1 9 6 9 ) . R e c e n t l y i t h a s b e c o m e a p p a r e n t t h a t s o - c a l l e d DNA p o l y m e r a s e B i s a s u b u n i t o f DNA p o l y m e r a s e A ( H e c h t e t a l . , 1 9 7 3 ) , a n d m a y b e a n a r t i f a c t o f t h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r e ; t h e a m o u n t o f DNA p o l y m e r a s e B o b t a i n e d i n c r e a s e s w i t h i n -c r e a s i n g K + o r N a + u s e d i n t h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r e ( L a z a r u s e t a l . , 1 9 7 3 ; H e c h t e t a l . , 1 9 7 3 ) . DNA p o l y m e r a s e 21 A h a s a m o l e c u l a r w e i g h t o f 1 0 0 , 0 0 0 - 2 0 0 , 0 0 0 w h i l e DNA p o l y m e r a s e B h a s a m o l e c u l a r w e i g h t o f 4 5 , 0 0 0 , s p e c i f i c a c t i v i t y 4 - 5 t i m e s t h a t o f DNA p o l y m e r a s e A , a n d i s n o t s u b j e c t t o c o n t r o l b y a g e n t s w h i c h d e c r e a s e t h e a c t i v i t y o f DNA p o l y m e r a s e A ( L a z a r u s a n d K i t r o n , 1 9 7 3 ; K r a s n y , 1 9 7 3 ) . T h e p a r a l l e l s b e t w e e n t h e f r e e d c a t a l y t i c s i t e o f a s p a r t i c t r a n s c a r b a m y l a s e a n d DNA p o l y m e r a s e B a r e o b v i o u s . W h e n i n c r e a s e s i n a g e n t s s u c h a s Hg o r c h e m i c a l l y s i m i l a r C d o c c u r , t h e r e c o u l d b e a s p l i t t i n g o f DNA p o l y m e r a s e i n t o s u b u n i t s w i t h r e l e a s e o f f r e e DNA p o l y m e r a s e B . I f DNA p o l y m e r a s e w a s s p l i t i n t o s u b u n i t s i n v i v o , t h e l a c k o f f e e d b a c k c o n t r o l o f DNA p o l y m e r a s e B c o u l d b e i n s t r u m e n t a l i n t h e u n c h e c k e d c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n i n d i c a t i v e o f c a n c e r . T h e P r e s e n t S t u d i e s T h e m e t a l l o t h i o n e i n s t u d i e s d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s d i f f e r i n m a n y r e s p e c t s f r o m p r e v i o u s s t u d i e s . A s a r e s u l t o f t h e e s t a b l i s h m e n t o f p r e c i s e l y s t a n d a r d i z e d p r o c e d u r e s f o r t h e i s o l a t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n , t h i s s t u d y q u a n t i f i e s t h e l e v e l s o f m e t a l l o t h i o n e i n p r o d u c e d i n r e s p o n s e t o v a r i o u s t r e a t m e n t s . N o t o n l y a r e t h e l e v e l s o f m e t a l o n m e t a l l o t h i o n e i n m e a s u r e d , b u t a l s o t h e l e v e l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . A s a r e s u l t o f m e a s u r i n g t h e l e v e l o f m e t a l s i n b o t h o f t h e s e p o o l s , q u a n t i f i a b l e r e l a t i o n s h i p s a r e e s t a b l i s h e d b e t w e e n s a t u r a t i o n l e v e l s o f m e t a l l o t h i o n e i n , a n d s p i l l o v e r o f m e t a l s t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , a n d w i t h o n s e t o f p a t h o l o g i c a l e f f e c t s . T h u s , t h i s s t u d y c o r r e l a t e s t h e l e v e l s a n d c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f m e t a l s w i t h p a t h o l o g i c a l c h a n g e s . T h i s s t u d y a l s o m e a s u r e s t h r e e m e t a l s i n e a c h s t u d y . A l m o s t a l l p r e v i o u s s t u d i e s o n m e t a l l o t h i o n e i n h a v e m e a s u r e d o n l y o n e m e t a l . T h u s , t h e p r e s e n t s t u d y i s a b l e t o c l e a r l y e s t a b l i s h h o w h i g h l e v e l s o f C d a n d Hg a f f e c t t h e l e v e l s a n d d i s t r i b u t i o n o f C u a n d Zn b e t w e e n v a r i o u s c y t o p l a s m i c p o o l s . T h e s t u d i e s o f t r a c e e l e m e n t l e v e l s i n c a n c e r t o d a t e , h a v e c o n s i d e r e d m a i n l y a l t e r a t i o n s o c c u r r i n g a f t e r t u m o r s b e g i n . T h e p r e s e n t s t u d y c o n s i d e r s a l t e r a t i o n s i n C d , C u a n d Zn i n p r e t u m o r o u s t i s s u e . T h e s e a r e f o l l o w e d t h r o u g h t o t h e p o s t t u m o r o u s s t a g e s . F u r t h e r m o r e , t h i s s t u d y c o n s i d e r s a l t e r a t i o n s i n t h e c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f C d , C u a n d Zn a s t h e i r l e v e l s c h a n g e . C l e a r l y , i f c h a n g e s o f m e t a l l e v e l s w e r e o n l y f r o m m e t a l l o t h i o n e i n , t h e s e c h a n g e s w o u l d h a v e l i t t l e i n f l u e n c e o n c e l l u l a r p r o c e s s e s s i n c e e n z y m e s w o u l d n o t b e a f f e c t e d . T h i s t h e s i s c o n s i s t s o f c h a p t e r s , e a c h o f w h i c h i s o n e p a p e r , e i t h e r p u b l i s h e d , i n p r e s s , s u b m i t t e d , o r i n p r e -p a r a t i o n f o r s u b m i s s i o n ; t h e s t a t u s o f t h e s e p a p e r s , j o u r n a l s i n w h i c h t h e y a p p e a r e d o r m a y a p p e a r , a n d t h e a u t h o r s o f e a c h a r e d e s c r i b e d i n t h e p r e f a c e o f e a c h c h a p t e r . T h e p r e f a c e s a l s o d i s c u s s h o w v a r i o u s c h a p t e r s a r e i n t e r r e l a t e d . A s t h e t o p i c o f m e t a l l o t h i o n e i n i s u n -23 f a m i l i a r t o m o s t , e a c h i n t r o d u c t i o n h a s g i v e n a c u r s o r y d e s c r i p t i o n o f s o m e o f t h e r e l e v a n t l i t e r a t u r e . E a c h p a p e r h a s i t s o w n m a t e r i a l s a n d m e t h o d s , r e s u l t s a n d d i s c u s s i o n s e c t i o n s . F u r t h e r , t h e r e i s a m o r e d e t a i l e d m a t e r i a l a n d m e t h o d s d e s c r i p t i o n i n A p p e n d i x I . R e f e r e n c e s f r o m a l l p a p e r s a r e g i v e n a t t h e e n d o f t h e t h e s i s . S o m e f u n d a -m e n t a l f i n d i n g s o f a l l s t u d i e s a r e d i s c u s s e d i n a n o v e r a l l d i s c u s s i o n a t t h e e n d o f t h i s t h e s i s . 2 4 C H A P T E R I I T h e W i l d l i f e C o m m u n i t y o f I o n a I s l a n d J e t t y , V a n c o u v e r , B . C . , a n d H e a v y - m e t a l P o l l u t i o n E f f e c t s P r e f a c e T h i s p a p e r a p p e a r e d i n E n v i r o n m e n t a l C o n s e r v a t i o n , 1 9 7 7 , V o l u m e 4 , p a g e s 2 1 3 - 2 1 6 . A u t h o r s w e r e D . A . B r o w n , C . A . B a w d e n , K . W. C h a t e l , a n d T . R . . P a r s o n s . T h e b a s i c a p p r o a c h t a k e n i n o u r w o r k o n m e t a l l o t h i o n e i n i s d e s c r i b e d i n t h i s p a p e r . I t d i f f e r s f r o m t h a t o f o t h e r w o r k e r s , i n t h a t i t c o n s i d e r s t h e l e v e l s o f m e t a l s i n b o t h t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a n d o n m e t a l l o t h i o n e i n , a n d i t q u a n t i f i e s t h e s e l e v e l s . E x c e p t f o r W i n g e e t a l ( 1 9 7 3 ) , n o o n e e l s e h a s c o n s i d e r e d t h e m e t a l l e v e l s o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , a n d , o u r s t u d i e s a r e t h e f i r s t t o q u a n t i f y t h e s e m e t a l l e v e l s . T h e " s p i l l o v e r " t h e o r y i s p r o p o s e d i n t h i s p a p e r . I n t r o d u c t i o n T h e F r a s e r R i v e r e n t e r s t h e P a c i f i c O c e a n t h r o u g h a d e l t a w h i c h i s c h a r a c t e r i z e d b y a s e r i e s o f l a r g e m u d -b a n k s ( F i g u r e 2 ) . F i v e s t o n e j e t t i e s , e x t e n d i n g s e a w a r d s f o r s o m e t w o t o t h r e e m i l e s ( 3 . 2 t o 4 . 8 k m ) , h a v e b e e n b u i l t o u t t o t h e e d g e s o f t h e m i d - b a n k s , w h e r e d e e p w a t e r i s a v a i l a b l e f o r s h i p d o c k i n g a n d w h e r e t u r b u l e n t t i d a l a c t i o n c a u s e s m i x i n g o f t h e r i v e r w a t e r w i t h t h e s e a . T h e p u r p o s e o f t h e s e s t o n e j e t t i e s i s e i t h e r t o s e r v i c e a p o r t f a c i l i t y ( a f e r r y t e r m i n a l a n d c o a l p o r t ) , o r t o a c t a s 2 5 F i g u r e 2 . S k e t c h - m a p o f t h e F r a s e r R i v e r e s t u a r y , n e a r V a n c o u v e r , B r i t i s h C o l u m b i a . S c a l e i n d i c a t e d b y t h e I o n a I s l a n d J e t t y w h i c h i s c_a 4 km l o n g . T h e a p p r o x i m a t e e d g e s o f t h e m u d - b a n k s a r e i n -d i c a t e d b y f a i n t d o t t i n g . r e s t r a i n i n g w a l l s a g a i n s t t h e l a t e r a l f l o w o f c u r r e n t s . A l o n g t h e e d g e o f o n e o f t h e f i v e j e t t i e s t h e r e i s a t r e n c h t h r o u g h w h i c h t h e p r i m a r y e f f l u e n t f r o m V a n c o u v e r c i t y s e w e r s i s a l l o w e d t o f l o w , s o c o n s t i t u t i n g t h e I o n a I s l a n d o u t f a l l . T h i s h a s r e s u l t e d i n a b i o l o g i c a l l y d e -g r a d e d , a n o x i c e n v i r o n m e n t i n t h e i m m e d i a t e v i c i n i t y o f t h e t r e n c h . H o w e v e r , p e r i p h e r a l t o t h i s a r e a o f d e g r a d a t i o n i s a n a b u n d a n c e o f h i g h e r l i f e - f o r m s , i n c l u d i n g a p p r e c i -a b l e s t a n d s o f s e a w e e d s ( e . g . F u c u s d i s t i c h u s ) , b i v a l v e s ( e . g . M y t i 1 u s e d u l i s , M a c o m a i n c o n s p i c u a , a n d C r y p t o m y a  c a 1 i f o r n i c a ) , a n d a c o m m e r c i a l c r a b c o m m u n i t y ( C a n c e r  m a g i s t e r ) . L i v i n g a m o n g t h e r o c k s o f t h i s j e t t y i s a l a r g e p o p u l a t i o n o f r a t s ( R a t t u s n o r v e g i c u s ) , w h i c h f o r a g e i n t h e i n t e r t i d a l z o n e a n d i n p a r t i c u l a r h a v e b e e n o b s e r v e d t o f e e d o n m u s s e l s ( M y t i 1 u s e d u l i s ) . T h e r a t s a r e p r e y e d u p o n b y a n u m b e r o f r a p t o r i a l b i r d s , t h e m o s t c o m m o n o f w h i c h a r e t w o s p e c i e s o f o w l ( A s i o f 1 a m m e u s a n d N y c t e a  s c a n d i a c a ) a n d a h a r r i e r ( C i r c u s c y a n e u s ) . I n a d d i t i o n t o t h e s e r a p t o r i a l b i r d s t h e r e a r e p o p u l a t i o n s o f G r e a t e r S c a u p ( A y t h y a h e r o d i a s ) , w h i c h a r e a s s o c i a t e d d i r e c t l y w i t h t h e a q u a t i c e n v i r o n m e n t . I n c o n t r a s t t o t h e I o n a I s l a n d J e t t y , t h e o t h e r f o u r j e t t i e s c r o s s i n g t h e m i d - b a n k s l a c k s e w a g e o u t f a l l s a n d d o n o t a t t r a c t s u c h a b u n d a n t a n d d i v e r s e a n i m a l c o m m u n i t i e s . T h u s i t a p p e a r s t h a t t h e I o n a I s l a n d j e t t y s u p p o r t s a l a r g e a n i m a l c o m m u n i t y b e c a u s e o f t h e l o c a l e n r i c h m e n t o f t h e 2 8 m a r i n e e n v i r o n m e n t b y s e w a g e , i t s f o o d - w e b b e i n g i n d i c a t e d i n F i g u r e 3 . T h e b a s e o f t h i s f o o d - w e b h a s b e e n s t u d i e d b y O t t e a n d L e v i n g s ( 1 9 7 5 ) , w h o s h o w e d t h a t t h e p r o d u c t i v i t y o f m u d - f l a t a r e a s i n t h e v i c i n i t y o f t h e s e w a g e o u t f a l l w a s h i g h e r , i n t e r m s o f b o t h o r g a n i c m a t t e r a n d i n v e r t e -b r a t e p o p u l a t i o n s , t h a n t h a t o f o t h e r m u d - f l a t a r e a s . T h e l a r g e p o p u l a t i o n o f b i v a l v e s i s u t i l i z e d b y t h e r a t p o p u l a -t i o n o n t h e j e t t y a s w e l l a s b y t h e c r a b p o p u l a t i o n s i n t h e s e a . T h e f l o u r i s h i n g w i l d l i f e c o m m u n i t y i n d i c a t e d a b o v e e x i s t s i n s p i t e o f t h e f a c t t h a t t h e a r e a i s c o n t a m i n a t e d w i t h h e a v y - m e t a l s w h i c h a r e b e l i e v e d t o b e c o n t a i n e d i n t h e s e w a g e . T h u s t h e m e r c u r y c o n t e n t o f 3 - 5 - y e a r s - o l d c r a b s t a k e n n e a r I o n a I s l a n d w a s s h o w n t o r a n g e f r o m 1 . 5 t o 3 . 7 p p m , c o m p a r e d w i t h l e s s t h a n 1 ppm i n c r a b s f r o m o t h e r a r e a s . C a d m i u m w a s g e n e r a l l y l e s s t h a n 2 ppm i n a l l a n i m a l s a n a l y s e d f r o m t h e m u d - b a n k s , e x c e p t n e a r t h e s e w e r o u t -f a l l w h e r e v a l u e s o f u p t o 7 ppm w e r e e n c o u n t e r e d ( P a r s o n s e t a l . , 1 9 7 3 ) . W h e n c o n v e r t e d t o a m a r k e t - w e i g h t b a s i s , t h e s e v a l u e s a r e a p p r e c i a b l y h i g h e r t h a n t h e l e v e l s p e r m i t -t e d b y t h e C a n a d i a n F o o d a n d D r u g A c t ; f o r h u m a n c o n s u m p t i o n , m e r c u r y a n d c a d m i u m l e v e l s s h o u l d n o t e x c e e d 0 . 5 p p m . S i m i l a r s t u d i e s b y t h e G r e a t e r V a n c o u v e r S e w e r a g e a n d D r a i n a g e D i s t r i c t ( 1 9 7 4 ) s h o w e d t h a t t h e c a d m i u m a n d z i n c l e v e l s o f O y s t e r s ( C r a s s o s t r e a g i g a s ) f r o m I o n a I s l a n d w e r e a b o v e t h e m a x i m a p e r m i t t e d b y t h e C a n a d i a n F o o d a n d D r u g A c t . 29 F i g u r e 3. D i a g r a m o f a s i m p l i f i e d f o o d - w e b o f t h e w i l d -l i f e c o m m u n i t y a r o u n d t h e I o n a I s l a n d j e t t y . 31 S e a w e e d s a n a l y s e d a t t h e s a m e t i m e g e n e r a l l y s h o w e d l e v e l s o f h e a v y - m e t a l s w h i c h d e c r e a s e d w i t h t h e d i s t a n c e f r o m t h e s e w a g e o u t f a l l . F r o m s e d i m e n t a n a l y s i s d a t a ( I b i d . ) i t w a s e v i d e n t t h a t t h e h i g h e s t l e v e l s o f h e a v y - m e t a l p o l l u t i o n w e r e c l o s e s t t o t h e b a s i c o u t f a l l ( e . g . S t a t i o n B , F i g u r e 2 ) , a n d t h a t t h e y s p r e a d f r o m t h e r e a n d a c r o s s t h e m u d - f l a t s a w a y f r o m t h e j e t t y . T h u s S t a t i o n D ( F i g u r e 2 ) , l o c a t e d f a r t h e r d o w n t h e j e t t y , s h o w e d n o h i g h e r a c c u m u l a t i o n s o f h e a v y - m e t a l s t h a n o t h e r a r e a s o f t h e m u d - f l a t s . F r o m t h e a c c o u n t o f t h i s w i l d l i f e c o m m u n i t y w h i c h h a s b e e n g i v e n a b o v e , i t i s a p p a r e n t t h a t a n , u n e x p e c t e d s i t u a t i o n e x i s t s , i n w h i c h m a n y d i f f e r e n t f o r m s o f w i l d l i f e a r e f l o u r i s h i n g i n a n a r e a t h a t i s k n o w n t o b e c o n t a m i n a t e d b y h e a v y - m e t a l s . T h e q u e s t i o n a s t o h o w t h i s w i l d l i f e c o m m u n i t y i s p r o t e c t e d f r o m t h e e f f e c t s o f h e a v y - m e t a l s i s d i s c u s s e d i n t h e r e s t o f t h i s p a p e r . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s T h e a b i l i t y o f a n i m a l s t o t o l e r a t e l o w - l e v e l c h r o n i c h e a v y - m e t a l p o l l u t i o n m a y r e s u l t f r o m a d e t o x i f i c a t i o n m e c h a n i s m w h i c h w a s f i r s t p r o p o s e d b y P i s c a t o r ( 1 9 6 4 ) . T h e p r o c e s s i n v o l v e s t h e p r o d u c t i o n o f a p r o t e i n o f l o w m o l e -c u l a r w e i g h t ( e . g . 1 0 , 0 0 0 ) c a l l e d m e t a l l o t h i o n e i n , w h i c h b i n d s t h e h e a v y - m e t a l t h r o u g h s u l p h y d r y l l i n k i n g w i t h c y s t e i n e , t h a t c o m p r i s e s 2 5 - 3 0 % o f t h e a m i n o - a c i d s o f t h e p r o t e i n . . S u b s e q u e n t i n v e s t i g a t i o n s ( e . g . N o r d b e r g , 1 9 7 2 ; P i o t r o w s k i e t a l . , 1 9 7 3 ) h a v e t e n d e d t o c o n f i r m t h a t 3 2 m e t a l l o t h i o n e i n s a r e i n s t r u m e n t a l i n c o n f e r r i n g p r o t e c t i o n f r o m c h r o n i c c a d m i u m a n d m e r c u r y e x p o s u r e ; t h e p r o t e c t i v e p r o t e i n i s s y n t h e s i z e d i n t h e l i v e r , k i d n e y s , a n d o t h e r o r g a n s . T h e p r o c e d u r e f o r t h e i s o l a t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n w h i c h w a s u s e d i n t h e p r e s e n t w o r k w a s s i m i l a r t o t h a t o f S h a i k h a n d L u c i s ( 1 9 7 1 ) , W e b b ( 1 9 7 2 ) , a n d O l a f s o n a n d T h o m p s o n ( 1 9 7 4 ) . L i v e r o r o t h e r t i s s u e s a m p l e s w e r e t h o r o u g h l y h o m o g e n i z e d , a n d m o s t o f t h e t i s s u e d e b r i s w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 7 , 0 0 0 x g_ f o r 1 0 m i n u t e s . T h e s u p e r n a t a n t l i q u i d w a s t h e n h e a t e d t o 7 0 ° C f o r 6 0 s e c o n d s , f o l l o w e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 7 , 0 0 0 x g_ f o r 1 0 m i n u t e s ( W e b b , 1 9 7 2 a ) . T h e f i n a l , s u p e r n a t a n t w a s a p p l i e d d i r e c t l y t o a 2 . 5 x 1 0 0 cm c o l u m n o f S e p h a d e x G - 7 5 a n d e l u t e d w i t h l O m M N h ^ H C O g a t 6 0 m l / h r . A l i q u o t s w e r e c o l -l e c t e d o n a f r a c t i o n c o l l e c t o r a n d p r o t e i n s w e r e m e a s u r e d a t 2 5 0 a n d 2 8 0 nm i n a s p e c t r o p h o t o m e t e r . T h i s p r o c e d u r e w a s u s e d a s i t a l l o w s f o r d e t e c t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n w h i c h h a s a l o w 2 8 0 nm a b s o r p t i o n b u t a r e l a t i v e l y h i g h 2 5 0 nm a b s o r p t i o n . C a d m i u m , z i n c , a n d c o p p e r , w e r e m e a s u r e d b y u s i n g a P e r k i n E l m e r 4 0 3 a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o -p h o t o m e t e r . R e s u l t s a n d D i s c u s s i o n I n F i g u r e 4 t h e g r a p h s A , B , a n d C , i l l u s t r a t e t h e t o t a l a m o u n t o f c o p p e r , z i n c , a n d c a d m i u m , r e s p e c t i v e l y , i n f i v e p r o t e i n f r a c t i o n s i s o l a t e d f r o m t h e l i v e r o f a 33 F i g u r e 4. G r a p h s o f ( D ) p r o t e i n f r a c t i o n s ( c o m p o s - i n g p e a k s I t o V ) a n d c o n c e n t r a t i o n s o f ( A ) c o p p e r , ( B ) z i n c , a n d ( C ) c a d m i u m , f r o m d u c k l i v e r i n e a c h o f t h e s e f r a c t i o n s . Relative absorbance Cd (ppm) G r e a t e r S c a u p d u c k , u s i n g a S e p h a d e x c o l u m n . T h e p r o t e i n f r a c t i o n s i n t o w h i c h t h e m e t a l s a r e a b s o r b e d a r e t h e s a m e a s t h o s e s h o w n b y O l a f s o n a n d T h o m p s o n ( 1 9 7 4 ) ; t h u s p e a k I c o r r e s p o n d s t o h i g h - m o l e c u l a r - w e i g h t p r o t e i n s , p e a k I I t o h a e m o g l o b i n , p e a k I I I t o m e t a l l o t h i o n e i n , a n d p e a k s I V a n d V c o r r e s p o n d t o 1 o w - m o T . e c u l a r - w e i g h t c y t o p l a s m i c m a t e r i a l s u c h a s a m i n o - a c i d s , n u c l e i c a c i d s , A T P , e t c . P e a k I c o n t a i n s h i g h - m o l e c u l a r - w e i g h t p r o t e i n s , i n c l u d i n g c e l l u l a r e n z y m e s , a s a l m o s t a l l o f t h e s e w i l l h a v e m o l e c u l a r w e i g h t s g r e a t e r t h a n 6 5 , 0 0 0 , w h i c h c o r r e s p o n d s t o h a e m o -g l o b i n ( p e a k I I ) . M e t a l l o t h i o n e i n , w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t o f c a 1 0 , 0 0 0 , i s e l u t e d a f t e r t h e m u c h l a r g e r h a e m o g l o b i n m o l e c u l e . T h e q u a n t i t y o f m e t a l l o t h i o n e i n i n d i c a t e d i n D o f F i g u r e 4 i s v e r y s m a l l c o m p a r e d w i t h t h e o t h e r p r o t e i n f r a c t i o n s . T h e s i z e o f t h i s p e a k c a n b e g r e a t l y i n c r e a s e d b y i n j e c t i n g a n i m a l s w i t h c a d m i u m ( c f . O l a f s o n a n d T h o m p s o n , 1 9 7 4 ) . I n s a m p l e s f r o m a n a t u r a l e n v i r o n m e n t , t h e l o a d i n g o f c o p p e r a n d z i n c i s s i m i l a r o n m e t a l l o t h i o n e i n a n d o n t h e o t h e r p r o t e i n s ( A , B , a n d C , i n F i g u r e 4 ) , w h i l e c a d m i u m o c c u r s m a i n l y o n m e t a l l o t h i o n e i n . A s z i n c a n d c o p p e r b o t h o c c u r n a t u r a l l y i n e n z y m e s y s t e m s , t h e i r r e l a t i v e l y h i g h a b u n d a n c e i n p e a k I i s t o b e e x p e c t e d . H o w e v e r , b o t h m e t a l s h a v e a l s o b e e n i d e n t i f i e d i n a n a l y t i c a l s u r v e y s ( G r e a t e r V a n c o u v e r S e w e r a g e a n d D r a i n a g e D i s t r i c t , 1 9 7 4 ) a s b e i n g m o r e a b u n d a n t i n s e w a g e e f f l u e n t t h a n i n t h e s u r r o u n d i n g 3 6 e n v i r o n m e n t . I n t h e e x a m p l e s h o w n i n F i g u r e 4 , t h e r e i s e v i d e n c e o f l o w - l e v e l p o l l u t i o n i n w h i c h a s m a l l a m o u n t o f m e t a l l o t h i o n e i n p r o t e i n h a s b e e n i n d u c e d t o a b s o r b t h e s e e x c e s s m e t a l s - p a r t i c u l a r l y c a d m i u m . I n F i g u r e 5 we h a v e t o t a l l e d u p t h e q u a n t i t y o f c o p p e r , z i n c , a n d c a d m i u m , o c c u r r i n g i n t h e m e t a l l o t h i o n e i n p e a k ( I I I ) a s a r a t i o o f t h a t i n t h e e n z y m e p o o l p e a k ( I ) f o r f i v e g r o u p s o f a n i m a l s . F r o m t h e s e d a t a i t m a y b e s e e n t h a t t h e m u s s e l s a n d c l a m s f r o m S t a t i o n D ( F i g u r e 2 , a n a r e a o f l i t t l e h e a v y - m e t a l p o l l u t i o n ) h a d t h e l o w e s t m e t a l -t o - p r o t e i n r a t i o , w h i l e a n i m a l s f r o m p o l l u t e d a r e a s h a d a p p r e c i a b l y h i g h e r r a t i o s . T h u s t h e p o s i t i o n o f m u s s e l s f r o m S t a t i o n B c l e a r l y i n d i c a t e s a h i g h d e g r e e o f m e t a l l o a d i n g a s c o m p a r e d w i t h m u s s e l s f r o m S t a t i o n D. H o w e v e r , r a t s d e m o n s t r a t e l e v e l s o f c o n t a m i n a t i o n w h i c h a r e i n t e r -m e d i a t e b e t w e e n t h e s e t w o v a l u e s , a n d i t m i g h t t h u s b e a r g u e d t h a t t h e y c a n f e e d a t b o t h e n d s o f t h e j e t t y -p a r t l y o n m e t a l - c o n t a m i n a t e d m u s s e l s a n d p a r t l y o n r e l a t i v e l y m e t a l - f r e e m u s s e l s . D u c k s s h o w e d t h e h i g h e s t m e t a l l o a d i n g ( a r a t i o o f 0 . 7 0 + 0 . 1 9 f o r f o u r a n i m a 1 s ) . T h u s w h i l e h i g h e r m e t a l l o a d i n g s o n t h e m e t a l l o t h i o n e i n p e a k i n -d i c a t e a g r e a t e r d e g r e e o f p o l l u t i o n , t h e r e l a t i v e p o s i t i o n o f m e t a l - c o n t a m i n a t e d a n i m a l s m u s t a l s o b e t o s o m e e x t e n t a f u n c t i o n o f s p e c i e s d i f f e r e n c e s a n d t r o p h i c p o s i t i o n i n t h e f o o d - w e b ( F i g u r e 3 ) . F r o m t h e d a t a w h i c h h a v e b e e n p r e s e n t e d i t r e m a i n s a 37 F i g u r e 5. T o t a l q u a n t i t y o f m e t a l s ( C d , C u , a n d Z n ) p l o t t e d a g a i n s t t h e r a t i o o f t h e s a m e m e t a l s o n t h e m e t a l l o t h i o n e i n t o h i g h m o l e c u l a r -w e i g h t p r o t e i n ( e n z y m e - c o n t a i n i n g ) f r a c t i o n s f o r d i f f e r e n t a n i m a l s . 8£ 3 9 q u e s t i o n a s t o h o w m u c h m o r e m e t a l c o n t a m i n a t i o n c o u l d o c c u r i n t h i s w i l d l i f e c o m m u n i t y b e f o r e m a r k e d p a t h o l o g i c a l c h a n g e w o u l d b e o b s e r v e d a m o n g t h e a n i m a l s . A p a r t i a l a n s w e r t o t h i s q u e s t i o n c a n b e i n f e r r e d f r o m a f u r t h e r c o n s i d e r a t i o n o f t h e a b s o r p t i o n o f m e t a l s b y m e t a l l o t h i o n e i n a n d e n z y m e s . A s i t i s k n o w n t h a t h e a v y - m e t a l s c a n e x e r t t h e i r t o x i c e f f e c t b y b i n d i n g e n z y m e s a n d r e p l a c i n g n o r m a l m e t a l 1 o e n z y m e c o m p l e x e s ( W i l l i a m s , 1 9 7 1 ; B r e m n e r , 1 9 7 4 ; F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ) , i t c a n b e a r g u e d t h a t t h e m e t a l l o t h i o n e i n w i l l o n l y p r e f e r e n t i a l l y p r o t e c t e n z y m e s i f i t c a n b e i n d u c e d a t a r a t e ( o r p r o d u c e d i n t o t a l a m o u n t ) w h i c h i s s u f f i c i e n t t o o v e r c o m e t h e r a t e o f h e a v y - m e t a l e n t r y i n t o t h e a n i m a l ( o r t h e t o t a l l o a d w i t h i n t h e a n i m a l ) . A t s o m e p o i n t , i f t h e l o a d o r r a t e o f l o a d i n g o f h e a v y - m e t a l s i s s u f f i c i e n t t o o v e r c o m e t h e m e t a l l o t h i o n e i n p r o t e c t i o n , t h e n t h e r e w i l l b e a " s p i l l o v e r " o f h e a v y -m e t a l s [ e . g . c a d m i u m a n d m e r c u r y ) f r o m t h e m e t a l l o t h i o n e i n p e a k t o t h e h i . g h - m o l e c u l a r - w e i g h t p e a k , w i t h c o n c u r r e n t o n s e t o f p a t h o l o g i c a l c h a n g e s ( W i n g e e t a l . , 1 9 7 3 ) . T h e e n z y m e s w o u l d t h e n b e r e n d e r e d n o n f u n c t i o n a l b y c o n f o r m a -t i o n a l c h a n g e s b r o u g h t a b o u t b y b i n d i n g h e a v y - m e t a l s . T h i s w o u l d r e s u l t i n t h e i r h a v i n g p r o p e r t i e s d i f f e r e n t f r o m n o r m a l e n z y m e f u n c t i o n s w h e n t h e y a r e b o u n d t o t h e i r r e q u i r e d m e t a l s ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ) . N o n - f u n c t i o n i s d u e t o t h e f a c t t h a t , a f t e r c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s , s u b s t r a t e m o l e c u l e s n o l o n g e r f i t b i n d i n g s i t e s o n t h e e n z y m e s . T h u s p a t h o l o g i c a l c h a n g e s i n t h e c o m m u n i t y w o u l d b e c o m e a p p a r e n t i f h e a v y - m e t a l l o a d i n g e x c e e d e d t h e r a t e o f m e t a l l o t h i o n e i n p r o d u c t i o n . I n c o n c l u s i o n i t i s a p p a r e n t f r o m s u r v e y s o f t h e I o n a I s l a n d j e t t y a r e a t h a t , e x c e p t i n t h e a n o x i c c h a n n e l i m m e d i a t e l y a s s o c i a t e d w i t h t h e o u t f a l l , t h e t o t a l i t y o f w i l d l i f e i n t h i s s e w a g e - p o l l u t e d r e g i o n i s g r e a t e r t h a n i n o t h e r a r e a s o f t h e F r a s e r R i v e r m u d - f l a t s . F u r t h e r , i t h a s b e e n s h o w n t h a t h e a v y - m e t a l p o l l u t i o n o c c u r s i n t h i s a r e a b u t t h a t t h i s d o e s n o t a p p a r e n t l y a f f e c t t h e a b u n d a n c e o f w i l d l i f e . T h e p r o t e c t i v e m e c h a n i s m i n t h e s e a n i m a l s a p p e a r s t o b e d u e , a t l e a s t i n p a r t , t o t h e p r o d u c t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n . I n t h i s c o n t e x t , i t i s a p p r o p r i a t e t o r e c a l l t h a t l i f e h a s e v o l v e d o n t h i s p l a n e t f r o m a n a g e o f n a t u r a l p o l l u t i o n ( i . e . f r o m v o l c a n i c e m i s s i o n s ) t o o n e o f u n n a t u r a l p o l l u t i o n , d u e t o M a n ( C l o u d , 1 9 7 4 ) . , I t i s n o t s u r p r i s i n g , t h e r e f o r e , t o f i n d i n a c o m m u n i t y a n i n h e r e n t m e c h a n i s m w h i c h p r o t e c t s i t f r o m l o w - l e v e l h e a v y - m e t a l t o x i c i t y . P e r h a p s t h e s e r e s u l t s a r e b e s t s u m m a r i z e d b y r e c a l -l i n g S h a k e s p e a r e ' s e f f o r t a s a n e c o l o g i s t i n t h e l i n e s f r o m T w e l t h N i g h t ( A c t 1 , S c e n e 1 ) " . . . N a t u r e w i t h a b e a u t . i o u s . w a . i l d o t h o f t c l o s e i n p o l l u t i o n . " S u m m a r y M a r i n e a n d t e r r e s t i a l a n i m a l s h a v e b e e n s h o w n t o b e p a r t i c u l a r l y a b u n d a n t i n a w i l d l i f e c o m m u n i t y a s s o c i a t e d w i t h a m a r i n e s e w e r o u t f a l l f r o m t h e C i t y o f V a n c o u v e r . T h e s e s a m e a n i m a l s a r e c o n t a m i n a t e d w i t h h i g h l e v e l s o f h e a v y - m e t a l s b u t a r e a p p a r e n t l y p r o t e c t e d f r o m t h e i r p o i s o n o u s e f f e c t s b y t h e p r o d u c t i o n o f a p r o t e i n k n o w n a s m e t a l l o t h i o n e i n . T h e a m o u n t o f m e t a l l o t h i o n e i n a n d h e a v y -m e t a l l o a d i n g a p p e a r s t o d e p e n d p r i m a r i l y o n t h e d e g r e e o f p o l l u t i o n a n d s e c o n d l y o n t h e s p e c i e s o f a n i m a l a n d i t s p o s i t i o n i n t h e f o o d - w e b . 4 2 C H A P T E R I I I R e l a t i o n s h i p B e t w e e n S u r v i v a l o f M u s s e l s E x p o s e d t o C d , C u a n d Z n , a n d t h e C y t o -p l a s m i c D i s t r i b u t i o n o f t h e s e m e t a l s . P r e f a c e T h i s p a p e r w i l l b e s u b m i t t e d s h o r t l y f o r p u b l i c a t i o n . A u t h o r s a r e D. A . B r o w n a n d K . W. C h a t e l ( 1 9 7 8 b ) . T h i s s t u d y c o r r e l a t e s " s p i l l o v e r " o f m e t a l s i n t o t h e h i g h m o l e -c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w i t h s u r v i v a l . M u s s e l s f r o m a n u n p o l l u t e d a r e a a r e e x p o s e d t o C d , C u a n d Zn i n t h e l a b -o r a t o r y , a n d " s p i l l o v e r " i n t h e s e m u s s e l s i s r e l a t e d t o " s p i l l o v e r " a n d s u r v i v a l o f m u s s e l s f r o m a t r a c e e l e m e n t p o l l u t e d a r e a . T h i s s t u d y d e m o n s t r a t e s t h a t i t i s p o s s i b l e t o p r e d i c t s u r v i v a l p o s s i b i l i t i e s o f e n v i r o n m e n t a l l y m e t a l - e x p o s e d o r g a n i s m s b y c o m p a r i n g " s p i l l o v e r " l e v e l t o t h a t o f s u r v i v i n g a n d n o n s u r v i v i n g l a b o r a t o r y m e t a l -e x p o s e d m u s s e l s . T h u s , t h i s a p p r o a c h g o e s b e y o n d t h e t r a d i t i o n a l m e a s u r e o f t o t a l m e t a l l e v e l s i n o r g a n i s m s . I t t e l l s o n e v i a a b i o c h e m i c a l l y m e a n i n g f u l a s s a y ( i . e . , r e l a t e d t o t h e a c t u a l t o x i c o l o g y o f t h e t r a c e e l e m e n t s ) , w h a t t h e c h a n c e s o f s u r v i v a l o f a n o r g a n i s m a r e . I n t r o d u c t i o n I n m a n y s t u d i e s , i t h a s b e e n r e p o r t e d t h a t t h e p r o t e i n m e t a l l o t h i o n e i n m a y b e a b l e t o b i n d a n d t h u s d e t o x i f y t r a c e e l e m e n t s s u c h a s Hg a n d C d ( e . g . , P i s c a t o r , 1 9 6 4 ; L e b e r , 1 9 7 4 ; B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . E x c e s s e s o f C u a n d Zn ( i . e . , a b o v e l e v e l s r e q u i r e d f o r m e t a l 1 o e n z y m e s ) a l s o 4 3 a p p e a r t o b e s t o r e d o n m e t a l l o t h i o n e i n ( B r o w n a n d C h a t e l , 1 9 7 8 a ) . I f t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f m e t a l l o t h i o n e i n i s e x c e e d e d , t h e n H g o r C d m a y " s p i l l o v e r " t o t h e h i g h m o l e -c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w i t h c o n c u r r e n t p a t h o l o g i c a l e f f e c t s ( W i n g e e t a l . , 1 9 7 3 ; B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ; B r o w n a n d P a r s o n s , 1 9 7 8 ; I r o n s a n d S m i t h , 1 9 7 6 ) . T h e s e e f f e c t s a r e a t t r i b u t a b l e t o t h e d i s p l a c e m e n t o f C u a n d Zn b y Hg o r C d i n m e t a l 1 o e n z y m e s ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ; B r e m n e r , 1 9 7 4 ) . W h e n t h i s o c c u r s , e n z y m e s l o s e t h e i r n o r m a l c o n f o r m a t i o n a l s h a p e s o t h a t s u b s t r a t e m o l e c u l e s n o l o n g e r f i t b i n d i n g s i t e s o n e n z y m e s . R e c e n t l y , we h a v e s u g g e s t e d t h a t s u r v i v a l o f o r g a n i s m s i n t h e p r e s e n c e o f h i g h l e v e l s o f t r a c e e l e m e n t s n e a r a s e w e r . o u t f a l 1 , m a y b e d u e , i n p a r t , t o s y n t h e s i s o f t h e p r o t e i n m e t a l l o t h i o n e i n ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . T h e r e a p p e a r e d t o b e i n c r e a s e s i n t h e l e v e l s o f m e t a l l o t h i o n e i n b o u n d m e t a l r e l a t i v e t o h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n ( e . g . , e n z y m e ) b o u n d m e t a l w i t h i n c r e a s i n g t r o p h i c l e v e l o r n e a r n e s s t o t h e s e w e r o u t f a l l . T h u s i t w a s s u g g e s t e d t h a t a b n o r m a l l y h i g h l e v e l s o f C d , Cu a n d Z n w e r e b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n i n t h i s p o l l u t e d a r e a . I n t h e p r e s e n t s t u d y , m u s s e l s f r o m a r e l a t i v e l y n o n -p o l l u t e d a r e a n e a r t h e s a m e s e w e r o u t f a l l a r e e x p o s e d , i n t h e l a b o r a t o r y , t o i n c r e a s i n g l e v e l s o f C d , C u a n d Z n i n t h e s a m e r a t i o a s t h e y a r e f o u n d i n t h e s e d i m e n t n e a r t h e s e w e r o u t f a l l . A c o r r e l a t i o n i s t h e n c o n s t r u c t e d 4 4 b e t w e e n s u r v i v a l a n d . m e t a l l e v e l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a n d m e t a l l o t h i o n e i n . . M u s s e l s a r e t h e n s a m p l e d a t v a r i o u s d i s t a n c e s i n t o w a r d s t h e s e w e r o u t f a l l u n t i l t h e y c e a s e t o e x i s t n e a r t h e o u t f a l l . M e t a l l e v e l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a n d m e t a l l o -t h i o n e i n o f t h e s e m u s s e l s a r e t h e n r e l a t e d t o h i g h m o l e -c u l a r w e i g h t p r o t e i n a n d m e t a l l o t h i o n e i n m e t a l l e v e l s i n t h e l a b o r a t o r y - e x p o s e d m u s s e l s , a n d t o t h e i r s u r v i v a l . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s M u s s e l s w e r e c o l l e c t e d f r o m S t a t i o n s B , C , D a n d E , I o n a I s l a n d , V a n c o u v e r , B . C . , a n d f r o z e n u n t i l a n a l y s e d ( s e e B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 , f o r a m a p o f t h e s t u d y a r e a ) . S t a t i o n B i s c l o s e s t t o t h e o u t f a l l w h i l e S t a t i o n E i s f a r t h e s t a w a y . T r a c e e l e m e n t l e v e l s a r e g r e a t l y e l e v a t e d i n t h e s e d i m e n t s n e a r S t a t i o n B , v e r y s l i g h t l y e l e v a t e d n e a r S t a t i o n C , a n d n o r m a l a t S t a t i o n s D a n d E ( G r e a t e r V a n c o u v e r S e w e r a g e a n d D r a i n a g e D i s t r i c t , 1 9 7 4 ) . O t h e r p o r t i o n s o f m u s s e l s f r o m S t a t i o n E w e r e t r a n s -f e r r e d t o g l a s s b i o a s s a y t a n k s a t a l o a d i n g o f 1 g m u s s e l s / L o f b i o a s s a y w a t t e r ; b i o a s s a y w a t e r w a s o b t a i n e d f r o m S t a t i o n E . C a d m i u m , . C u a n d Zn w e r e a d d e d t o t h e s e t a n k s a t t h e l e v e l s s h o w n i n T a b l e 1 . T h e r a t i o o f t h e s e e l e m e n t s u s e d w a s s i m i l a r t o t h a t f o u n d i n t h e s e d i m e n t s n e a r S t a t i o n B ( G r e a t e r V a n c o u v e r S e w e r a g e a n d D r a i n a g e D i s t r i c t , 1 9 . 7 4 ) . S o l u t i o n s w e r e c h a n g e d e v e r y t h r e e d a y s . A t t h e t i m e o f d e a t h o r a f t e r 1 4 d a y s e x p o s u r e , m u s s e l s 4 5 T a b l e 1 . L e v e l s o f C d , C u a n d Zn a d d e d t o b i o a s s a y w a t e r ( c o l l e c t e d f r o m S t a t i o n E ) f o r t h e l a b o r a t o r y e x p o s u r e o f m u s s e l s f r o m S t a t i o n E , I o n a I s l a n d , V a n c o u v e r , B . C . M e t a l l e v e l s a r e i n mg m e t a l / L . E x p o s u r e Cd C u Zn 1 0 . 0 0 2 . 0 0 0 1 . 0 0 9 . 0 0 7 3 . 0 0 1 . 0 9 . 0 7 4 . 0 1 . 9 . 7 5 . 1 9 . 0 7 . 0 4 6 w e r e s a m p l e d a n d f r o z e n u n t i l a n a l y z e d . M u s s e l s w e r e t h a w e d a n d o n e g r a m p o r t i o n s o f t h e s o f t p a r t s o f t h e s e w e r e h o m o g e n i z e d f o r 3 m i n u t e s i n 3 m l o f 0 . 9 % N a C l s o l u t i o n , a t a s e t t i n g o f 4 . 5 o n a T R I - R S T I R - R l a b o r a t o r y m o t o r e q u i p p e d w i t h a t e f l o n h o m o g e n i z e r . H o m o g e n a t e s w e r e c e n t r i f u g e d a t 2 7 , 0 0 0 x g_ f o r 1 0 m i n u t e s . S u p e r n a t a n t s w e r e h e a t e d f o r e x a c t l y 5 m i n u t e s i n a 7 0 ° C w a t e r b a t h . S a m p l e s w e r e t h e n r e c e n t r i f u g e d a t 2 7 , 0 0 0 x £ f o r 1 0 m i n u t e s . T w o m l o f r e s u l t i n g s u p e r n a t a n t w e r e a p p l i e d t o a P h a r m a c i a K 9 / 6 0 c o l u m n p a c k e d w i t h G - 7 5 g e l . S a m p l e s w e r e e l u t e d w i t h 0 . 0 1 M N H 4 H C 0 3 a t a f l o w r a t e o f 1 0 m l / h o u r , a n d c o l l e c t e d a s 2 m l f r a c t i o n s . A b s o r b a n c e w a s r e a d a t 2 5 0 nm t o e s t a b l i s h t h e p o s i - 1 t i o n s o f t h e v a r i o u s c y t o p l a s m i c p o o l s , i . e . , t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t . p r o t e i n p o o l , m e t a l l o t h i o n e i n , a n d t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . C o p p e r a n d Zn l e v e l s w e r e d e t e r m i n e d i n e a c h f r a c t i o n u s i n g a P e r k i n E l m e r 3 0 3 a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o -m e t e r . C a d m i u m l e v e l s w e r e d e t e r m i n e d u s i n g a P e r k i n E l m e r 4 0 3 a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t e r e q u i p p e d w i t h a g r a p h i t e f u r n a c e . D e u t e r i u m a r c b a c k g r o u n d c o r -r e c t i o n w a s u s e d f o r a l l a n a l y s i s . M e t a l l e v e l s i n e a c h f r a c t i o n o f e a c h o f t h e c y t o p l a s m i c p o o l s w e r e a d d e d t o -g e t h e r t o g i v e t h e t o t a l m e t a l l e v e l i n e a c h p o o l p e r g r a m o f t i s s u e ( w e t w e i g h t ) . R e s u l t s M u s s e l s f r o m S t a t i o n E , I o n a I s l a n d , e x p o s e d t o C d , C u a n d Zn i n t h e l a b o r a t o r y s u r v i v e d f o r l e s s t h a n 4 8 h o u r s i n E x p o s u r e s 4 a n d 5 ( T a b l e 1 ) . M u s s e l s i n E x p o s u r e s 1 , 2 a n d 3 s u r v i v e d t h e e n t i r e e x p o s u r e p e r i o d o f 14 d a y s . A t I o n a I s l a n d , m u s s e l s w e r e p l e n t i f u l a t S t a t i o n s C , D a n d E , b u t s p a r s e a t S t a t i o n B . A t y p i c a l g e l e l u t i o n p r o f i l e , f r o m m u s s e l s f r o m S t a t i o n B i s s h o w n i n F i g u r e 6 . T h i s p r o f i l e a p p e a r s t o b e c h a r a c t e r i z e d b y h i g h l e v e l s o f C d , C u a n d Zn i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( I ) w i t h l e s s e r a m o u n t s o f t h e s e m e t a l s i n m e t a l l o t h i o n e i n ( I I ) a n d t h e l o w m o l e -c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l ( I I I ) . M u s s e l s f r o m S t a t i o n s C , D a n d E f r o m I o n a I s l a n d c o n t a i n e d l e s s e r l e v e l s o f C d , C u a n d Zn i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a n d m e t a l l o t h i o n e i n t h a n t h o s e f r o m S t a t i o n B ( T a b l e 2 ) . C a d m i u m a n d Zn w e r e l o w e r i n t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l a t S t a t i o n s C t o E , b u t . C u w a s i n c r e a s e d i n t h i s p o o l ( T a b l e 2 ) . M u s s e l s f r o m S t a t i o n E e x p o s e d t o C d , C u a n d Zn i n t h e l a b o r a t o r y , h a d d e c r e a s e d l e v e l s o f C d o n a l l t h r e e c y t o p l a s m i c p o o l s w i t h i n c r e a s i n g l e v e l s o f e x p o s u r e . C o p p e r a n d Zn w e r e i n c r e a s e d i n a l l t h r e e p o o l s w i t h i n -c r e a s i n g l e v e l s o f e x p o s u r e ( T a b l e 2 ) . T h e l e v e l s o f C d + C u + Zn i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l s a n d m e t a l l o t h i o n e i n i n c r e a s e d w i t h 48 F i g u r e 6. G e l e l u t i o n p r o f i l e o f m u s s e l s f r o m S t a t i o n B , I o n a . I s l a n d , V a n c o u v e r , B . C . I : h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ; I I : m e t a l l o -t h i o n e i n ; I I I : l o w m o l e c u l a r , w e i g h t c y t o -p l a s m i c p o o l . i 1 1 r 10 15 20 F r a c t i o n Number Table 2. The d i s t r i b u t i o n of Cd, Cu and Zn among c y t o p l a s m i c p o o l s of mussels exposed to v a r i o u s l e v e l s of these t r a c e elements i n the l a b o r a t o r y (Exposures 1-5) or near Iona I s l a n d , Vancouver, B. C. ( S t a t i o n B-E). L e v e l s of Exposures 1-5 are g i v e n i n T a b l e 1. A l l metal l e v e l s are i n jjmole metal/g t i s s u e (wet w e i g h t ) 3 . Cd , Cu Zn T o t a l High MWb pool M e t a l l o -t h i o n e i n Low MW poo 1 T o t a l High MW pool M e t a l l o -t h i o n e i n Low MW pool T o t a l High MW pool M e t a l l o -t h i o n e i n Low MW pool Exposure 1 .0190 .0089 .0018 .0083 .301 .074 .043 .184 .225 .132 .016 .077 2 .0205 .0067 . 0022 .0116 . 394 .079 .044 .271 .413 .151 .019 . .243 3 .0181 . 0057 .0017 .0107 .542 .128 . 063 . 351 .583 .215 .027 .341 4 .0147 .0049 .0014 .0084 .965 .211 .063 .691 1.058 .398 .034 .626 5 .0098 .0034 . 0012 .0052 3.416 .401 .223 2. 792 .769 .422 .032 .315 S t a t i o n B .0413 .0187 . 0052 .01 74 .757 .405 .188 .164 .473 .286 .029 .158 C .0169 .0071 .0031 .0067 .318 .089 .060 .169 .270 .153 .024 .093 D .0187 . 0077 .0027 .0083 .633 .125 .108 .400 .349 .181 .021 .147 E .01 75 . 0078 .0024 .0073 .631 .072 .050 . 509 .301 .164 .015 .122 Data i s compiled from p r o f i l e s such as those shown in Figure 6. 'Molecular weight. O e x p o s u r e l e v e l i n t h e l a b o r a t o r y e x p o s u r e ( F i g u r e 7 ) . M e t a l l o t h i o n e i n a p p e a r e d t o b i n d o n l y a s m a l l p o r t i o n o f m e t a l r e l a t i v e t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . M e t a l l o t h i o n e i n l e v e l s o f C d + C u +Zn a p p e a r e d t o i n c r e a s e s l i g h t l y f r o m E x p o s u r e s 1 t o . 3 , b u t t o p l a t e a u f r o m 3 t o 4 . W h e r e t h i s p l a t e a u o c c u r r e d , t h e r e w a s a d r a m a t i c i n -c r e a s e o f m e t a l i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . T h i s p l a t e a u c o r r e s p o n d e d t o t h e d i v i s i o n a l p o i n t b e t w e e n s u r v i v o r s a n d n o n s u r v i v o r s i n t h e l a b o r a t o r y e x p o s u r e s ( F i g u r e 7 ) . T h e r e w a s a f u r t h e r i n c r e a s e o f m e t a l l o t h i o n e i n l e v e l s f r o m e x p o s u r e s 4 t o 5 . T h e p o s i t i o n s o f m u s s e l s f r o m I o n a I s l a n d o n t h e g r a p h s o f t h e l a b o r a t o r y - e x p o s e d a n i m a l s a r e a l s o i n d i c a t e d i n F i g u r e 7 . M u s s e l s f r o m t h e s p a r s e l y p o p u l a t e d S t a t i o n B h a d l e v e l s o f m e t a l o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w h i c h w e r e i n d i c a t i v e o f n o n s u r v i v a l i n t h e l a b o r a t o r y -e x p o s e d a n i m a l s . M u s s e l s f r o m S t a t i o n s C t o E w e r e o n t h e s u r v i v a l p o r t i o n o f t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l g r a p h . M e t a l l o t h i o n e i n l e v e l s i n m u s s e l s f r o m S t a t i o n s B t o D w e r e a s h i g h a s t h o s e i n m u s s e l s f r o m t h e h i g h e s t m e t a l e x p o s u r e l e v e l s i n t h e l a b o r a t o r y e x p e r i m e n t . S t a t i o n E m u s s e l s c o r r e s p o n d e d t o t h e l o w e s t m e t a l e x p o s u r e s i n t h e l a b o r a t o r y e x p e r i m e n t . D i s c u s s i o n I t a p p e a r s e v i d e n t f r o m t h i s a n d p r e v i o u s s t u d i e s , t h a t m e t a l l o t h i o n e i n i s p r e s e n t i n m u s s e l s a n d m a y b e i m -5 2 F i g u r e 7 . T h e l e v e l s o f t o t a l C d + C u + Z n . i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t (HMW) p r o t e i n p o o l a n d m e t a l l o -t h i o n e i n . E x p o s u r e l e v e l s 1 - 5 a r e t h o s e g i v e n i n T a b l e 1. P o i n t s B - E r e p r e s e n t m u s -s e l s f r o m S t a t i o n s B - E , I o n a I s l a n d , V a n c o u v e r , B . C . T h e s e h a v e b e e n p l a c e d o n t h e g r a p h s o f e x p o s u r e s 1 - 5 a t t h o s e p o s i t i o n s w h e r e t h e y h a v e c o r r e s p o n d i n g m e t a l l e v e l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o r m e t a l l o -t h i o n e i n . A l l m e t a l l e v e l s , a r e i n j j m o l e m e t a l i n e a c h p o o l / g t i s s u e ( w e t w e i g h t ) . C9 D 1.0 CO CO +-> • U) 0.8 • c N + 0.6 u + 0.4 — U <s o 0.2 E ~i Bioassay Surv ivors H M W Pool Meta l lo th ione in >— &C B ioassay Nonsurvivors 2 3 4 Exposure Leve l T " 5 CO 5 4 p o r t a n t a s a t r a c e e l e m e n t d e t o x i f i c a t i o n s u b s t a n c e ( N o e l -L a m b o t , 1 9 7 6 ; T a l b o t a n d M a g e e , 1 9 7 8 ) . I n t h e l a b o r a t o r y p o r t i o n o f t h e p r e s e n t s t u d y , w h e n m e t a l l e v e l s o n m e t a l l o -t h i o n e i n a p p e a r e d t o p l a t e a u , t h e r e w a s a d r a m a t i c i n -c r e a s e o f m e t a l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . T h i s a p p a r e n t s a t u r a t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n , w i t h " s p i l l -o v e r " o f m e t a l i n t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l i s c o n c u r r e n t w i t h d e c r e a s e d s u r v i v a l o f t h e s e m u s s e l s . T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n " s p i l l o v e r " a n d a p p e a r a n c e o f t o x i c e f f e c t s h a s b e e n n o t e d i n p r e v i o u s s t u d i e s ( W i n g e e t a l . , 1 9 7 3 ; I r o n s a n d S m i t h , 1 9 7 6 ; B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ; B r o w n a n d P a r s o n s , 1 9 7 8 ) . T o x i c e f f e c t s c a n b e a t t r i b u t e d t o t h e i n t e r f e r e n c e o f n o n e s s e n t i a l , o r e x c e s s e s o f e s s e n t i a l m e t a l s , w i t h m e t a l b i n d i n g s i t e s i n m e t a l l o -e n z y m e s ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ) . C o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s c a u s e d b y t h e s e i n t e r f e r e n c e s r e s u l t i n m a l f u n c t i o n o f e n z y m e s e s s e n t i a l f o r n o r m a l m e t a b o l i s m . - T h e i n c r e a s e o f m e t a l l o -t h i o n e i n l e v e l s a f t e r " s p i l l o v e r " h a s o c c u r r e d , h a s b e e n f o u n d , a n d r e a s o n s f o r i t d i s c u s s e d , i n a n o t h e r s t u d y b y B r o w n a n d C h a t e l ( 1 9 7 8 c ) . I n t h e l a b o r a t o r y p o r t i o n o f t h e p r e s e n t s t u d y , i t a p p e a r s t h a t C d w a s p r o b a b l y n o t a m a j o r f a c t o r i n f l u e n c i n g s u r v i v a l o f m u s s e l s a s i t w a s d e c r e a s e d i n t h e c y t o p l a s m o f o r g a n i s m s w i t h i n c r e a s e d e x p o s u r e l e v e l . T h i s m a y b e d u e t o e x c l u s i o n r e s u l t i n g f r o m c o m p e t i t i o n o f h i g h l e v e l s o f C u a n d Zn f o r e n t r y s i t e s i n t o t h e m u s s e l s . A t S t a t i o n B , I o n a I s l a n d , C d m a y be a f a c t o r i n f l u e n c i n g s u r v i v a l a s i t i s g r e a t l y i n c r e a s e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l c o m p a r e d w i t h o t h e r s t a t i o n s . L a b o r a t o r y -e x p o s e d m u s s e l s w e r e a d m i n i s t e r e d C d + C u + Z n i n t h e r a t i o f o u n d i n t h e s e d i m e n t s n e a r t h e s e w e r o u t f a l l a t I o n a I s l a n d . A s C d i s i n c r e a s e d i n m u s s e l s ^ a t I o n a I s l a n d , b u t d e c r e a s e d i n t h e l a b o r a t o r y e x p o s u r e , t h i s m a y i n d i c a t e t h a t t h e r e i s a h i g h e r r a t i o o f C d : C u + Zn i n t h e w a t e r a t I o n a I s l a n d t h a n i n t h e s e d i m e n t s . A l t e r n a t i v e l y , u p t a k e o f C d a t I o n a I s l a n d m a y . b e i n c r e a s e d b y t h e p r e s e n c e o f h i g h l e v e l s o f o r g a n i c c h e l a t o r s i n t h e s e w e r e f f l u e n t . G e o r g e a n d C o o m b s ( 1 9 7 7 ) h a v e s u g g e s t e d t h a t i o n i c C d m u s t f i r s t b e c o m p l e x e d b e f o r e u p t a k e c a n o c c u r , a n d t h a t o r g a n i c c h e l a t o r s i n c r e a s e b o t h t h e r a t e o f a c c u m u l a t i o n a n d t h e f i n a l t i s s u e c o n c e n t r a t i o n o f C d . C o p p e r l e v e l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f m u s s e l s f r o m S t a t i o n B a r e a s h i g h a s t h o s e i n m u s s e l s f r o m t h e h i g h e s t l a b o r a t o r y e x p o s u r e ; t h e s e l a b o r a -t o r y - e x p o s e d m u s s e l s s u r v i v e d l e s s t h a n 4 8 h o u r s e x p o s u r e . T h e r e f o r e , i f t h e p r e s e n c e o f h i g h l e v e l s o f C u i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w e r e a c a u s a t i v e f a c t o r i n d e a t h o f m u s s e l s , t h e n i t w o u l d b e u n l i k e l y t h a t t h e r e w o u l d b e a n y s u r v i v i n g m u s s e l s a t S t a t i o n B . . Z i n c , h o w -e v e r , i s p r e s e n t i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l i n m u s s e l s f r o m S t a t i o n B a t l e v e l s i n t e r m e d i a t e b e t w e e n t h o s e f r o m E x p o s u r e s 3 a n d 4 , i . e . , h a l f w a y b e t w e e n l e v e l s 5 6 f o u n d i n s u r v i v o r s a n d n o n s u r v i v o r s . S i n c e m u s s e l s a t S t a t i o n B a r e v e r y s p a r s e , i t m a y b e t h a t Zn i s o n e o f t h e c o n t r o l l i n g f a c t o r s i n t h e s u r v i v a l o f m u s s e l s . T h e l e v e l o f m e t a l s o n m e t a l l o t h i o n e i n d o e s n o t s e e m t o c o r r e l a t e w i t h s u r v i v a l . M u s s e l s f r o m S t a t i o n s B t o D h a d l e v e l s o f C d + C u + Zn o n m e t a l l o t h i o n e i n e q u i v a l e n t t o t h e n o n s u r v i v o r s i n t h e l a b o r a t o r y - e x p o s e d m u s s e l s . M u s s e l s f r o m t h e s e s t a t i o n s m a y h a v e r e l a t i v e l y h i g h m e t a l l o t h i o n e i n l e v e l s a s c o m p a r e d t o l a b o r a t o r y e x p o s e d m u s s e l s a s t h e y m a y h a v e b e e n s u b j e c t t o l o n g e r b u t l o w e r l e v e l m e t a l e x p o s u r e t h a n t h o s e i n E x p o s u r e s 2 t o 5 . T h e r e f o r e , t h e y c o u l d h a v e h a d . m o r e t i m e t o a d a p t t o e x c e s s e s o f t r a c e e l e m e n t s v i a s y n t h e s i s o f m e t a l l o t h i o n e i n . T h u s , m u s s e l s f r o m S t a t i o n s B t o D h a v e a m e a n r a t i o o f m e t a l l o -t h i o n e i n / h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n b o u n d m e t a l o f 0 . 4 0 w h i l e t h o s e f r o m E x p o s u r e s 2 t o 5 h a v e a m e a n r a t i o o f 0 . 2 5 . I n a p r e v i o u s s t u d y , i t w a s f o u n d t h a t t h i s r a t i o i n c r e a s e d b o t h w i t h n e a r n e s s t o t h e s e w e r o u t f a l l o r i n -c r e a s i n g t r o p h i c l e v e l ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . I t i s a p p a r e n t t h a t s u r v i v a l o f m u s s e l s i n t h e p r e s e n t s t u d y d o e s n o t d e c r e a s e a s t h e l e v e l o f m e t a l o n m e t a l l o -t h i o n e i n i n c r e a s e s , N o r a s c y t o p l a s m i c m e t a l l e v e l s i n -c r e a s e . R a t h e r , t h e n u m b e r o f s u r v i v o r s d e c r e a s e s w h e n e x c e s s e s o f m e t a l o c c u r i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . T h u s t h e f a c t o r i n f l u e n c i n g t h e s u r v i v a l o f o r g a n i s m s e x p o s e d t o t r a c e e l e m e n t s m a y n o t b e t h e l e v e l o f m e t a l i n t h e s e o r g a n i s m s , b u t r a t h e r h o w m u c h o f t h e m e t a l i s n o t b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n , b u t i n s t e a d o c c u r s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . T h i s m a y d e p e n d u p o n b o t h t h e l e n g t h a n d l e v e l o f e x p o s u r e . S u m m a r y M u s s e l s w e r e s a m p l e d i n t h e v i c i n i t y o f t h e I o n a I s l a n d s e w e r , o u t f a l .1 , V a n c o u v e r , B . C . M u s s e l s s a m p l e d f r o m a r e l a t i v e l y n o n p o l l u t e d a r e a w e r e e x p o s e d , i n t h e l a b o r a t o r y f o r .14 d a y s , t o v a r i o u s l e v e l s o f C d + C u + Zn i n t h e r a t i o i n w h i c h t h e s e m e t a l s o c c u r r e d i n t h e s e d i -m e n t s n e a r t h e s e w e r o u t f a l 1 . I n t h e l a b o r a t o r y - e x p o s e d m u s s e l s , m e t a l l o t h i o n e i n b o u n d C d + C u + Zn i n c r e a s e d s l i g h t l y i n t h e l o w e r e x p o s u r e s a n d t h e n p l a t e a u e d . A t t h e e x p o s u r e s w h e r e m e t a l l o t h i o n e i n b o u n d C d + C u + Zn p l a t e a u e d , t h e r e w a s a d r a m a t i c i n c r e a s e i n h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n b o u n d e d + C u + ' Z n ; t h e s e m u s s e l s d i d n o t s u r v i v e t h e e x p o s u r e p e r i o d . T o x i c e f f e c t s a r e a t t r i b u t e d t o t h e e f f e c t s o f t h e s e m e t a l s o n e n z y m e s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . M u s s e l p o p u l a t i o n s a t a s a m p l i n g a r e a n e a r t h e s e w e r o u t f a l l w e r e s p a r s e . T h e s e m u s s e l s h a d l e v e l s o f C d + C u + Zn i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l i n d i c a t i v e o f n o n s u r v i v a l i n t h e l a b o r a t o r y - e x p o s e d m u s s e l s . M e t a l l o -t h i o n e i n l e v e l s i n m u s s e l s f r o m s a m p l i n g a r e a s n e a r t h e s e w e r o u t f a l l w e r e h i g h e r t h a n t h o s e f o r a l l b u t t h e h i g h e s t l a b o r a t o r y - e x p o s e d m u s s e l s . T h e s e h i g h e r m e t a l l o t h i o n e i n l e v e l s m a y b e d u e t o a l o n g e r e x p o s u r e t o h i g h m e t a l l e v e l s n e a r t h e s e w e r o u t f a l l t h a n i n t h e l a b o r a t o r y . 5 9 C H A P T E R I V I n t e r a c t i o n s B e t w e e n C a d m i u m a n d Z i n c i n C y t o p l a s m o f D u c k L i v e r a n d K i d n e y P r e f a c e T h i s p a p e r h a s b e e n a c c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n b y C h e m i c o - B i o l o g i c a l I n t e r a c t i o n s , a n d w i l l b e a p p e a r i n g i n 1 9 7 8 . T h e a u t h o r s a r e D. A . B r o w n a n d K . W. C h a t e l ( 1 9 7 8 a ) . T h i s s t u d y d e m o n s t r a t e s t h a t m e t a l l o t h i o n e i n , i n d u c k l i v e r a n d k i d n e y t i s s u e , s t o r e s e x c e s s e s o f Cu a n d Z n . M o s t i m p o r t a n t l y , i t d e m o n s t r a t e s t h a t C d c a n o c c u r i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l b e f o r e m e t a l l o t h i o n e i n i s s a t u r a t e d i f t h e r e a r e d e f i c i e n c i e s o f Zn i n t h i s p o o l . T h u s , t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f m e t a l l o t h i o n e i n d o e s n o t h a v e t o b e e x c e e d e d b e f o r e a p p a r e n t " s p i l l o v e r " o c c u r s . I n t r o d u c t i o n C o p p e r a n d Z n a r e n e c e s s a r y f o r t h e f u n c t i o n i n g o f m a n y e n z y m e s a s t h e y m a i n t a i n b o t h t e r t i a r y a n d q u a t e r n a r y p r o t e i n s t r u c t u r e . I f m e t a l 1 o e n z y m e s a r e e x p o s e d t o a n e x c e s s o f t h e f u n c t i o n a l h e a v y m e t a l o r t o c o m p e t i n g h e a v y m e t a l s s u c h a s Cd o r H g , t h e n t h e y m a y l o s e t h e i r a b i l i t y t o f u n c t i o n n o r m a l l y ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ) < D y s f u n c t i o n m a y b e a r e s u l t o f c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s p r o d u c e d w h e n e x c e s s e s o f e s s e n t i a l m e t a l s o r t o x i c m e t a l s i n t e r f e r w i t h , o r r e p l a c e , e s s e n t i a l m e t a l s o n m e t a l 1 o e n z y m e s ( F r i e d b e r g 1 9 7 4 ; B r e m n e r , 1 9 7 4 ) . A f t e r c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s , s u b s t r a t e m o l e c u l e s m a y n o l o n g e r f i t b i n d i n g s i t e s o n t h e e n z y m e s ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ) . A l t e r n a t i v e l y , s o m e t o x i c 6 0 m e t a l s ( e . g . , H g ) c a n s p l i t c e r t a i n e n z y m e s i n t o c a t a l y t i c a n d r e g u l a t o r y s u b u n i t s s o t h a t n o r m a l r e g u l a t i o n o f a c t i v i t y o f t h e c a t a l y t i c s u b u n i t i s l o s t ( G e r h a r t a n d S c h a c h m a n , 1 9 6 5 ; J o v i n e t a l . , 1 9 6 9 ; W h i t e e t a l . , 1 9 6 8 ; B r o w n , 1 9 7 7 ) . T h u s , t o e n s u r e p r o p e r c e l l u l a r f u n c t i o n i n g , e x c e s s e s o f e s s e n t i a l m e t a l s o r t o x i c m e t a l s m u s t b e r e -m o v e d f r o m t h e z o n e o f b i o l o g i c a l a c t i v i t y . T h i s i s a c c o m p l i s h e d b y p r o d u c t i o n o f t h e p r o t e i n m e t a l l o t h i o n e i n , w h i c h c a n b i n d h e a v y m e t a l s , t h e r e b y r e n d e r i n g t h e m b i o -l o g i c a l l y i n a c t i v e ( B r o w n e t a l . . , 1 9 7 7 ) . M e t a l l o t h i o n e i n i s a l o w m o l e c u l a r w e i g h t ( 1 0 , 0 0 0 ) p r o t e i n h i g h i n s u l f h y d r y l g r o u p s d u e t o t h e p r e s e n c e o f h i g h l e v e l s o f t h e a m i n o a c i d c y s t e i n e ( M a r g o s h e s a n d V a l l e e , 1 9 5 7 ; K a g i a n d V a l l e e , 1 9 6 0 ) . T h e s u l f h y d r y l g r o u p s c a n b i n d o r c h e l a t e h e a v y m e t a l s t h u s r e n d e r i n g t h e m n o n t o x i c t o t h e e x p o s e d o r g a n i s m ( P i s c a t o r , 1 9 6 4 ) . M e t a l l o t h i o n e i n i s s t o r e d s o l u b i l i z e d i n t h e c y t o -p l a s m o f l i v e r a n d k i d n e y t i s s u e . V e r y s m a l l a m o u n t s o f m e t a l l o t h i o n e i n m a y b e r e l e a s e d f r o m t h e l i v e r i n t o t h e b l o o d s t r e a m . T h e s e p a s s t h r o u g h t h e g l o m u l a r f i l t r a t i o n a p p a r a t u s a n d a r e e x c r e t e d i n t h e u r i n e o r r e a b s o r b e d i n t h e r e n a l t u b u l e s a n d s t o r e d i n t h e k i d n e y . O n l y a b o u t 0 . 0 1 % o f t h e b o d y b u r d e n o f m e t a l l o t h i o n e i n i s e x c r e t e d p e r d a y v i a t h e u r i n e ( P i s c a t o r , 1 9 6 4 ; N o r d b e r g , 1 9 7 2 ) . T h i s s t u d y r e p o r t s i n t e r r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e l e v e l s o f C d , C u a n d Z n o n m e t a l l o t h i o n e i n a n d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n ( e n z y m e - c o n t a i n i n g ) p o o l ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) i n d u c k l i v e r a n d k i d n e y t i s s u e . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s G r e a t e r S c a u p ( A y t h y a m a r i 1 a ) , S u r f S c o t e r ( M e l a n i t t a  p e r s p i c i l l a t a ) a n d W e s t e r G r e b e ( A e c h m o p h o r u s o c c i d e n t a l i s ) d u c k s w e r e c o l l e c t e d n e a r t h e I o n a I s l a n d s e w a g e o u t f a l l , V a n c o u v e r , B r i t i s h C o l u m b i a . T h i s a r e a i s k n o w n t o b e p o l l u t e d w i t h h i g h l e v e l s o f h e a v y m e t a l s ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . L i v e r a n d k i d n e y s a m p l e s w e r e r e m o v e d a t t h e t i m e o f c a p t u r e a n d f r o z e n u n t i l a n a l y z e d . T h r e e g r a m p o r t i o n s o f e a c h t i s s u e w e r e t h o r o u g h l y h o m o g e n i z e d i n 9 m l o f 0 . 9 % N a C l . T h e h o m o g e n a t e s w e r e c e n t r i f u g e d a t 2 7 , 0 0 0 x g_ f o r 1 0 m i n u t e s a n d t h e s u p e r -n a t a n t s c o l l e c t e d . P e l l e t s w e r e r e h o m o g e n i z e d i n 6 m l o f 0 . 9 % N a C l f o l l o w e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 7 , 0 0 0 x g_ f o r 1 0 m i n u t e s . S u p e r n a t a n t s w e r e c o m b i n e d a n d h e a t e d t o 7 0 ° C f o r 1 m i n u t e ( W e b b , 1 9 7 2 a ; C h e r i a n , 1 9 7 4 ; B r o w n , 1 9 7 7 ; B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . S a m p l e s w e r e t h e n r e c e n t r i f u g e d f o r 1 0 m i n u t e s a t 2 7 , 0 0 0 x g_. R e s u l t i n g s u p e r n a t a n t s (.14 m l ) w e r e a p p l i e d t o a P h a r m a c i a K 2 5 / 1 0 0 c o l u m n p a c k e d w i t h S e p h a d e x G - 7 5 f i n e g e l . F i l t r a t e s w e r e e l u t e d w i t h 0 . 0 1 M N H 4 H C 0 3 a n d c o l l e c t e d i n 1 0 . 2 m l f r a c t i o n s . A b s o r b a n c e w a s r e a d a t 2 5 0 a n d 2 8 0 nm o n a P e r k i n ; E l m e r C o l e m a n 1 2 4 D s p e c t r o p h o t o m e t e r . C a d m i u m l e v e l s w e r e d e t e r m i n e d b y g r a p h i t e f u r n a c e o n e a c h f r a c t i o n w i t h a P e r k i n E l m e r 4 0 3 a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t e r . C u a n d Zn l e v e l s w e r e d e t e r m i n e d b y t h e f l a m e m e t h o d w i t h a P e r k i n E l m e r 3 0 3 a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o m e t e r . D e u t e r i u m b a c k g r o u n d c o r r e c t i o n w a s u s e d f o r a l l d e t e r -m i n a t i o n s . R e s u l t s T y p i c a l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m d u c k l i v e r o r k i d n e y t i s s u e a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 8 . E a c h p e a k h a s b e e n i d e n t i f i e d a c c o r d i n g t o i t s s i m i l a r i t y o f p o s i t i o n t o p e a k s f o u n d i n p r e v i o u s s t u d i e s ( O l a f s o n a n d T h o m p s o n , 1 9 7 4 ; W i n g e e t a l . , 1 9 7 3 ; B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . T h e d u a l C d p e a k s o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f l i v e r t i s s u e a p p e a r t o c o r r e s p o n d t o t h e 3 0 , 0 0 0 m o l e c u l a r w e i g h t a n d 1 1 5 , 0 0 0 m o l e c u l a r w e i g h t C d - b i n d i n g m o i e t i e s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( P r o h a s k a e t a l . , 1 9 7 7 ) . A s u m m a r y o f t h e t o t a l l e v e l o f m e t a l s i n a l l p e a k s i s p r e s e n t e d i n T a b l e 3 . T h e C d , C u o r Zn l e v e l i n e a c h p e a k ( T a b l e 3 ) f o r e a c h m e t a l h a s b e e n p l o t t e d a g a i n s t t h e t o t a l c y t o p l a s m i c l e v e l o f e a c h m e t a l ( F i g u r e s 9 A - I ) . I t i s a p p a r e n t t h a t C u i n c r e a s e s l i n e a r l y o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a n d m e t a l l o t h i o n e i n w i t h i n c r e a s e s o f C u i n c y t o -p l a s m ( F i g u r e s 9 A - B ) . T h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o -p l a s m i c p o o l a p p e a r s t o b e c o m e C u s a t u r a t e d a t a b o u t 0 . 4 0 ; u m o l e c y t o p l a s m i c C u / g t i s s u e ( w e t w e i g h t ) , ( f i g u r e 9 C ) . Z i n c a p p e a r s t o i n c r e a s e l i n e a r l y o n t h e h i g h m o l e c u l w e i g h t p r o t e i n p o o l a t l o w t i s s u e l e v e l s o f Zn ( F i g u r e 9 D ) 63 F i g u r e 8. G e l e l u t i o n p r o f i l e s o f G r e a t e r S c a u p l i v e r ( A ) a n d k i d n e y ( B ) . i : h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ; I I : m e t a l l o t h i o n e i n ; I I I : l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . 0.4-0.3-Cu (ppm) 0.8-0.6-Zn(ppm) 0.4-0.2-Table 3. The d i s t r i b u t i o n of Cd, Cu and Zn amongst c y t o p l a s m i c pools from l i v e r and ki d n e y of ducks. Data are; c o m p i l a t i o n s . of metal l e v e l s from p r o f i l e s such as F i g u r e 4 i n ^ mole/g t i s s u e (wet w e i g h t ) . MW: m o l e c u l a r w e i g h t . ND: not d e t e c t a b l e . Cd Cu Zn T o t a l High MW poo 1 M e t a l l o -t h i o e i n Low MW pool T o t a l . High MW pool M e t a l l o -t h i o n e i n Low MW pool T o t a l High MW pool M e t a l l o -t h i o n e i n Low MW pool G r e a t e r Scaup L i v e r .00578 .00107 .00418 .00053 . 625 .252 . 265 .108 .234 .101 .098 .035 Ki dney .00845 .00187 .00632 .00026 . 342 .156 .096 .090 .067 .043 .006 .018 S u r f S c o t e r L i ver .00641 .00142 .00391 .00108 . 408 . 1 32 .153 .123 .151 .114 .020 .017 Kidney .00294 .00089 .00107 .00098 . 262 .102 .071 .089 .058 .041 .005 .012 G r e a t e r Scaup L i ver .01141 .00320 .00290 .00530 .230 .074 .088 .069 .119 .106 .010 .003 K i dney .01330 .00590 .00370 .00370 .225 .079 . 084 .062 .045 .040 .003 .002 Western Grebe L i ver .00164 .00065 .00040 .00059 .181 .081 . 041 .059 .078 .072 .002 .004 Kidney .00147 .00068 .00043 .00036 .170 .077 . 037 .056 .029. .028 ND .001 G r e a t e r Scaup L i v e r .01650 .00212 .00481 .00957 .230 .070 .106 . 054 .170 .123 .045 .002 Kidney .01571 .00408 .00788 .00375 .189 .062 .075 .052 .065 .053 .006 .006 67 F i g u r e 9. T h e v a r i a t i o n o f C d , C u a n d Z n o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , m e t a l l o t h i o n e i n a n d t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l w i t h i n c r e a s e s o f t h e s e m e t a l s i n l i v e r a n d k i d n e y c y t o p l a s m , o : l i v e r , © : k i d n e y . M e t a l l e v e l s a r e i n j j m o l e / g t i s s u e ( w e t w e i g h t ) . HIGH MOLECULAR WEIGHT PROTEIN POOL METALLOTHIONEIN Cu TOTAL 0 CYTOPLASMIC LOW MOLECULAR WEIGHT CYTOPLASMIC POOL ~20 AO~ To Zn •15i .10 .05 TOTAL 0 CYTOPLASMIC Zn .10 .20 o o .10 .20 .006 Cd .004 .002 TOTAL 0 • 8 # .008 .004 H • .008-o .004 CYTOPLASMIC Cd .005 .010 .015 .005 .010 .015 .005 .010 .015 T h e k i d n e y h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a p p e a r s t o b e Zn s a t u r a t e d a t a b o u t 0 . 0 6 j u m o l e c y t o p l a s m i c Z n / g t i s s u e w h i l e i n l i v e r s a t u r a t i o n a p p e a r s t o o c c u r a t 0 . 1 4 j j m o l e c y t o p l a s m i c Z n / g t i s s u e . C o n c u r r e n t w i t h Z n s a t u r a t i o n o f t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l i s a n a c c e l e r a t i o n o f Z n l e v e l s o n m e t a l l o t h i o n e i n ( F i g u r e 9 E ) . L o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c Z n s h o w s l i t t l e o r n o r e l a t i o n s h i p t o c y t o p l a s m i c Z n l e v e l s ( F i g u r e 9 F ) . L e v e l s o f C d o n t h e t h r e e c y t o p l a s m i c p o o l s g e n e r a l l y a p p e a r t o i n c r e a s e w i t h i n c r e a s i n g t o t a l c y t o p l a s m i c C d l e v e l s ( F i g u r e s 9 G - I ) . H o w e v e r , m o r e c l e a r l y , t h e p o r t i o n o f c y t o p l a s m i c C d p r e s e n t o n t h e h i g h a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t p o o l s a p p e a r s t o b e r e l a t e d t o l e v e l s o f Zn o n t h e s e p o o l s ( F i g u r e 1 0 ) . S e v e n t y - f i v e p e r c e n t o f c y t o -p l a s m i c C d a p p e a r s o n t h e h i g h a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t p o o l s a t l o w e r Z n l e v e l s . O n l y a t Z n l e v e l s w h e r e t h e k i d n e y a n d l i v e r h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l s a p p e a r t o b e Z n s a t u r a t e d ( F i g u r e 9 D ) d o e s m o r e t h a n 2 5 % o f t h e c y t o p l a s m i c C d a p p e a r o n m e t a l l o t h i o n e i n ( F i g u r e 1 1 ) . T h u s , Zn s a t u r a t i o n o f t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l s i n l i v e r a n d k i d n e y t i s s u e a p p e a r s t o c o i n c i d e w i t h a n i n c r e a s e o f t h e p o r t i o n o f c y t o p l a s m i c C d o n m e t a l l o -t h i o n e i n . D i s c u s s i o n R e s u l t s o f t h i s s t u d y i n d i c a t e t h a t o n c e t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l i s Z n s a t u r a t e d , e x c e s s Zn 7 0 i s s t o r e d o n m e t a l l o t h i o n e i n . A s . e n z y m e s o c c u r i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n f r a c t i o n o f c e l l c y t o -p l a s m , Zn s a t u r a t i o n o f t h i s p o o l m a y i n d i c a t e t h a t t h e Z n r e q u i r e m e n t s o f m e t a l 1 o e n z y m e s h a v e b e e n m e t . T h a t Z n s a t u r a t i o n o f t h e l i v e r h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o c c u r s a t a 2 - f o l d h i g h e r Zn l e v e l t h a n t h a t i n k i d n e y , m a y b e a r e f l e c t i o n o f t h e h i g h e r m e t a b o l i c a c t i v i t y o f l i v e r . A s t h e l i v e r i s t h e m e t a b o l i c c e n t e r o f h i g h e r o r g a n i s m s , i t m u s t c o n t a i n m o r e e n z y m e s , a c e r t a i n p r o -p o r t i o n o f t h e s e b e i n g m e t a 1 1 o e n z y m e s , a n d h e n c e , h a v e h i g h e r Z n r e q u i r e m e n t s o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o -t e i n p o o 1 . T h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l d o e s n o t a p p e a r t o b e C u s a t u r a t e d i n t h e s e d u c k s a l t h o u g h c y t o -p l a s m i c C u l e v e l s a r e 3 - f o l d h i g h e r t h a n Zn l e v e l s . C o p p e r r e q u i r e m e n t s m a y b e h i g h e r t h a n Zn r e q u i r e m e n t s f o r m e t a l 1 o e n z y m e s i n m a r i n e o r g a n i s m s . P r e v i o u s s t u d i e s h a v e f o u n d C u l e v e l s t o b e 3 - t o 8 - f o l d h i g h e r t h a n Z n l e v e l s o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f f i s h ( B r o w n , 1 9 7 7 ) , m u s s e l s ( B r o w n , a n d . C h a t e l , 1 9 7 8 b ) . p h y t o p l a n k t o n ( C l o u t i e r a n d B r o w n , 1 9 7 8 ) , a n d z o o p l a n k t o n ( B r o w n a n d P a r s o n s , 1 9 7 8 ) . P e r h a p s t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w o u l d b e c o m e C u s a t u r a t e d i n d u c k s w i t h C u l e v e l s h i g h e r t h a n t h o s e r e p o r t e d i n t h i s s t u d y , C u p r o f i l e s m i g h t t h e n a p p e a r t o b e s i m i l a r i n s h a p e t o Zn p r o f i l e s . 71 F i g u r e 1 0 . T h e v a r i a t i o n o f t h e p o r t i o n o f t o t a l c y t o -p l a s m i c C d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( B M W ) + t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l ( L M W ) w i t h i n c r e a s e s o f Z n o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l + t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . o : l i v e r , ® : k i d n e y . Z i n c l e v e l s a r e i n ^ u m o l e / g t i s s u e ( w e t w e i g h t ) . 72 M W 1 + M W H NO PO % 73 F i g u r e 1 1 . The v a r i a t i o n o f t h e p o r t i o n o f t o t a l c y t o -p l a s m i c Cd on m e t a l l o t h i o n e i n w i t h l e v e l s o f Zn on t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l (HMW) + t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o -p l a s m i c p o o l ( L M W ) . o : l i v e r , ®: k i d n e y . Z i n c l e v e l s a r e i n >imole/g t i s s u e ( w e t w e i g h t ) . 74 N I 3 N 0 I H 1 0 1 1 V 1 3 W NO PO % T h e p r e s e n t s t u d y i n d i c a t e s t h a t t h e p o r t i o n o f c y t o -p l a s m i c C d a p p e a r i n g o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p o o l i s h i g h e r w h e n Zn l e v e l s a r e l o w e r o n t h i s p o o l . I t a p p e a r s a s t h o u g h a c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t e q u i l i b r i u m e x i s t s , w h e r e b y w h e n h i g h l e v e l s o f Zn a r e a v a i l a b l e f o r t h e h i g h a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t p o o l s , m o s t C d w i l l n o t o c c u p y Z n b i n d i n g s i t e s o n t h e s e p o o l s . R a t h e r , C d a p p e a r s t o b e d i s p l a c e d b y h i g h Zn l e v e l s s o t h a t i t i s a v a i l a b l e t o i n d u c e s y n t h e s i s o f , a n d b i n d , m e t a l l o t h i o n e i n . S i n c e 75% o f C d a p p e a r s o n t h e h i g h a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t p o o l s w i t h l o w Zn l e v e l s i n b o t h k i d n e y a n d l i v e r t i s s u e , i t i s p r o b a b l e t h a t t h i s e q u i l i b r i u m r e a c t i o n i s n o t d e p e n d e n t u p o n t i s s u e t y p e . T h a t C d i s d i s p l a c e d f r o m t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l b y l o w e r Z n l e v e l s i n k i d n e y c o m p a r e d w i t h l i v e r , s u g g e s t s t h a t t h e r e a r e f e w e r b i n d i n g s i t e s f o r w h i c h C d a n d Z n c a n c o m p e t e i n k i d n e y t i s s u e . T h i s m a y r e f l e c t l o w e r l e v e l s o f m e t a l l o -e n z y m e b i n d i n g s i t e s i n t h e k i d n e y . C o m p e t i t i o n o f Zn a n d C d f o r s i m i l a r b i n d i n g s i t e s i n t i s s u e i s w e l l e s t a b l i s h e d . I t i s k n o w n t h a t C d e x e r t s t o x i c e f f e c t s v i a i t s e f f e c t o n Zn m e t a l 1 o e n z y m e s ( H o r v a t h , 1 9 7 6 ) a n d t h a t h i g h l e v e l s o f Zn p r e v e n t o r r e d u c e t h e t o x i c e f f e c t s o f C d ( F l i c k e t a l . , 1 9 7 1 ) . I t h a s a l s o b e e n s h o w n t h a t t o x i c e f f e c t s o f C d d o n o t o c c u r u n t i l t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f m e t a l l o t h i o n e i n i s e x c e e d e d a n d C d o c c u r s o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( W i n g e e t a l . , 1 9 7 3 ; I r o n s a n d S m i t h , 1 9 7 6 ) . C h e n a n d G a n t h e r ( 1 9 7 5 ) h a v e s u g g e s t e d t h a t t h e t o x i c e f f e c t s o f C d m a y b e c o m e a p p a r e n t w h e n i t o c c u r s o n a p r o t e i n o f a p p r o x i m a t e l y 3 0 , 0 0 0 m o l e c u l a r w e i g h t ; t h e y s u g g e s t t h i s p r o t e i n m a y b e t h e Zn m e t a l 1 o e n z y m e c a r b o n i c a n h y d r a s e . I t h a s b e e n s u g g e s t e d , t h e r e f o r e , t h a t h i g h l e v e l s o f C d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l m a y i n d i c a t e t h a t C d i s a v a i l a b l e , f r e e f r o m m e t a l l o t h i o n e i n , t o e x e r t t o x i c e f f e c t s v i a i n t e r f e r e n c e w i t h m e t a l 1 o e n z y m e s ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . T h e p r e s e n t s t u d y i n d i c a t e s t h a t C d m a y a p p e a r o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , n o t o n l y w h e n t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f m e t a l l o t h i o n e i n i s e x c e e d e d , b u t a l s o w h e n t h e r e a r e d e f i c i e n c i e s o f Zn o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . S i n c e t o x i c e f f e c t s o f C d o c c u r w h e n i t a p p e a r s o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , i t i s l i k e l y , t h e r e f o r e , t h a t d e -f i c i e n c i e s o f Zn i n c r e a s e t o x i c e f f e c t s o f C d b y p e r m i t t i n g a n i n c r e a s e o f C d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . R e s u l t s f r o m t h e p r e s e n t s t u d y m a y b e o f s i g n i f i c a n c e f o r u n d e r s t a n d i n g t r a c e m e t a l i n t e r a c t i o n s i n c a r c i n o -g e n e s i s . I t w a s r e p o r t e d i n a p r e v i o u s s t u d y t h a t e x p o s u r e o f m i c e t o t h e c a r c i n o g e n d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) f o r 1 2 . 5 w e e k s r e s u l t e d i n a 3 9 % r e d u c t i o n o f Zn l e v e l s o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l i n p r e t u m o r o u s l i v e r t i s s u e ( B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ) . W h e n C d w a s a d m i n i s -t e r e d c o n c u r r e n t l y w i t h D E N , a l m o s t a l l o f t h i s a d d i t i o n a l C d a c c u m u l a t e d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . C a d m i u m l e v e l s w e r e f a r t o o l o w t o h a v e e x c e e d e d t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f m e t a l l o t h i o n e i n ( B r o w n , 1 9 7 7 ; B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ) . R e s u l t s f r o m t h e p r e s e n t s t u d y i n d i c a t e t h a t a p p r o x i m a t e l y 7 5 % o f l i v e r C d w i l l a p p e a r o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l i f t h i s p o o l i s Z n d e f i c i e n t . T h u s , a n o r g a n i c c a r c i n o g e n m i g h t i n c r e a s e t h e p o r t i o n o f c y t o p l a s m i c C d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l b y d e c r e a s i n g Zn l e v e l s o n t h i s p o o l . C a d m i u m i s a p o t e n t c a r c i n o g e n a n d h a s b e e n m e n t i o n e d a s p o s s i b l y i n v o l v e d i n t h e e t i o l o g y o f c a n c e r s i n c e b o t h C d l e v e l s a n d t h e C d : Z n r a t i o a r e i n c r e a s e d i n t u m o r -b e a r i n g o r g a n i s m s ( M o r g a n , 1 9 7 0 ; M o r g a n , 1 9 7 1 ; B r o w n 1 9 7 7 ) , p a r t i c u l a r i 1 y o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( B r o w n , 1 9 7 7 ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t C d e x e r t s i t s c a r c i n o g e n i c i t y v i a i n t e r f e r e n c e w i t h Zn b i n d i n g s i t e s o n t h e Zn r e q u i r i n g e n z y m e s i n v o l v e d i n c e l l d i v i s i o n ( B r o w n , 1 9 7 7 ) . F u r t h e r m o r e , Zn p r e v e n t s c a n c e r f r o m o c c u r r i n g w h e n g i v e n w i t h Cd. . o r a n o r g a n i c c a r c i n o g e n ( G u n n e t a l . , 1 9 6 3 , 1 9 6 4 ; P o s w i l l o a n d C o h e n , 1 9 7 1 ; C i a p p a r e l l i e t a l . , 1 9 7 2 ) . T h u s , i f C d i s c a r c i n o g e n i c w h e n p r e s e n t o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , t h e n Z n g i v e n w i t h a c a r c i n o g e n m i g h t p r e v e n t t h e o c c u r r e n c e o f C d o n t h i s p o o l a n d t h u s p r e v e n t c a n c e r . I n p r e v i o u s s t u d i e s i t h a s b e e n f o u n d t h a t C d o r Hg 7 8 d i d n o t e x e r t t h e i r t o x i c e f f e c t s u n l e s s t h e y w e r e p r e s e n t i n l e v e l s h i g h e n o u g h t o h a v e e x c e e d e d t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f m e t a l l o t h i o n e i n ; i f t h e b i n d i n g c a p a c i t y w a s e x c e e d e d t h e n t h e y o c c u r r e d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w i t h c o n c u r r e n t p a t h o l o g i c a l . e f f e c t s ( W i n g e e t a l . , 1 9 7 3 ; B r o w n a n d P a r s o n s , 1 9 7 8 ) . T h e p r e s e n t s t u d y h a s d e m o n s t r a t e d t h a t C d m a y o c c u r o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l b e f o r e t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f m e t a l l o t h i o n e i n i s e x c e e d e d i f t h i s p o o l i s n o t Zn s a t u r a t e d . S i n c e t h e r e i s a n a p p a r e n t a s s o c i a t i o n b e t w e e n o c c u r r e n c e o f C d o n t h i s p o o l a n d c a n c e r , a n d b e c a u s e o f t h e p o s s i b i l i t y o f o t h e r s u b l e t h a l e f f e c t s , we s u g g e s t t h a t f u t u r e e n v i r o n -m e n t a l s t u d i e s m e a s u r e n o t o n l y t h e t i s s u e c o n c e n t r a t i o n s o f . C d , b u t a l s o i t s c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n , e s p e c i a l l y i n r e l a t i o n t o t h e Z n s t a t u s o f t h e o r g a n i s m . S u m m a r y D u c k s w e r e c o l l e c t e d f r o m a m a r i n e e n v i r o n m e n t k n o w n t o b e p o l l u t e d w i t h h e a v y m e t a l s . G e l e l u t i o n p r o f i l e s w e r e d e t e r m i n e d f o r b o t h l i v e r a n d k i d n e y t i s s u e u s i n g S e p h a d e x G - 7 5 g e l . Z i n c i n c r e a s e d l i n e a r l y o n . t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l u n t i l t h i s p o o l w a s a p p a r e n t -l y Z n s a t u r a t e d ; s a t u r a t i o n l e v e l s w e r e 0 . 0 6 > i m o l e c y t o -p l a s m i c Z n / g k i d n e y ( w e t w e i g h t ) a n d 0 . 1 4 / j m o l e c y t o -p l a s m i c Z n / g l i v e r ( w e t w e i g h t ) . S e v e n t y - f i v e p e r c e n t o f c y t o p l a s m i c C d w a s f o u n d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l u n l e s s i t w a s Zn s a t u r a t e d . I f t h i s p o o l w a s 79 Z n s a t u r a t e d , t h e n e x c e s s e s o f Z n a n d u p t o 7 5 % o f c y t o -p l a s m i c C d a p p e a r e d o n m e t a l l o t h i o n e i n . R e s u l t s a r e d i s c u s s e d i n t e r m s o f a c o m p e t i t i o n o f C d a n d Z n f o r Zn b i n d i n g s i t e s on1 m e t a l 1 o e n z y m e s . C o p p e r i n c r e a s e d l i n e a r l y o n b o t h t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a n d m e t a l l o -t h i o n e i n , w i t h i n c r e a s e s o f C u i n t i s s u e . C H A P T E R V R e l a t i o n s h i p B e t w e e n C y t o p l a s m i c D i s t r i b u t i o n o f M e r c u r y a n d T o x i c E f f e c t s t o Z o o p l a n k t o n a n d C h u m S a l m o n ( O n c o r h y n c h u s k e t a ) E x p o s e d t o M e r c u r y i n a C o n t r o l l e d E c o s y s t e m P r e f a c e T h i s p a p e r a p p e a r e d i n t h e J o u r n a l o f t h e F i s h e r i e s R e s e a r c h B o a r d o f C a n a d a , 1 9 7 8 , V o l u m e 3 5 , p a g e s 8 8 0 = 8 8 4 . T h e a u t h o r s a r e D. A . B r o w n a n d T . R . P a r s o n s . T h i s p a p e r c l e a r l y d e m o n s t r a t e s t h a t r e a d i l y a p p a r e n t p a t h o l o g i c a l e f f e c t s o f Hg d o n o t . a p p e a r u n t i l t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f m e t a l l o t h i o n e i n i s e x c e e d e d a n d m e r c u r y a p p e a r s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . T h u s , t h e " s p i l l o v e r " t h e o r y d e s c r i b e d b y B r o w n e t a l . ( 1 9 7 . 7 ) i s s u p p o r t e d . T h i s s t u d y , l i k e B r o w n a n d C h a t e l ( 1 9 7 8 b ) , d e m o n s t r a t e s i n t e r -a c t i o n s b e t w e e n a t o x i c t r a c e e l e m e n t , a n d e s s e n t i a l t r a c e e l e m e n t s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . F i g u r e s 1 2 a n d 1 3 d i d n o t a p p e a r i n t h e p u b l i s h e d v e r s i o n o f t h i s p a p e r a s t h e e d i t o r c o n s i d e r e d t h a t m o s t r e a d e r s w o u l d n ' t b e a b l e t o u n d e r s t a n d t h e m . I n t r o d u c t i o n H e a v y m e t a l s s u c h a s H g , C d , C u a n d Zn a r e t o x i c t o o r g a n i s m s b u t p r i o r e x p o s u r e t o t h e s e m e t a l s c a n r e s u l t i n a c q u i r e d t o l e r a n c e t o i n c r e a s i n g m e t a l l e v e l s ( B r y a n a n d H u m m e r s t o n e , 1 9 7 1 ; B r e m n e r , 1 9 7 4 ) . T o l e r a n c e o c c u r s a s a r e s u l t o f s y n t h e s i s o f t h e p r o t e i n m e t a l l o t h i o n e i n ( L e b e r , 1 9 7 4 ; P i s c a t o r , 1 9 6 4 ) . M e t a l l o t h i o n e i n i s a l o w m o l e c u l a r w e i g h t ( . 1 0 , 0 0 0 ) p r o t e i n h i g h i n s u l f h y d r y l g r o u p s d u e t o t h e p r e s e n c e o f h i g h l e v e l s o f t h e a m i n o a c i d c y s t e i n e ( M a r g o s h e s a n d V a l l e e , 1 9 5 7 ; K a g i a n d V a l l e e , 1 9 6 0 ) . T h e s u l f h y d r y l g r o u p s c a n b i n d o r c h e l a t e H g , C d , A g , C u , S n a n d Zn ( W i n g e e t a l . , 1 9 7 5 ; S a b b i o n i a n d M a r a f a n t e , 1 9 7 5 ) t h u s r e n d e r i n g t h e m l e s s t o x i c t o t h e e x p o s e d o r g a n i s m ( P i s c a t o r , 1 9 6 4 ) . M e t a l l o t h i o n e i n i s u s u a l l y s t o r e d s o l u b i l i z e d i n l i v e r a n d k i d n e y c y t o p l a s m i n h i g h e r o r g a n -i s m s . O n e o b v i o u s m e a n s b y w h i c h m e t a l l o t h i o n e i n - m e d i a t e d t o l e r a n c e t o h e a v y m e t a l s m i g h t . b e a c q u i r e d w o u l d b e b y s y n t h e s i s o f e x c e s s e s o f t h i s p r o t e i n u p o n i n i t i a l e x p o s u r e . T h i s e x c e s s m e t a l 1 o t h i o n e i n w o u l d t h e n b e r e a d i l y a v a i l -a b l e t o q u i c k l y b i n d a n d d e t o x i f y h e a v y m e t a l s u p o n s u b -s e q u e n t e x p o s u r e . H o w e v e r , i t i s k n o w n t h a t m e t a l l o -t h i o n e i n a l w a y s e x i s t s i n t h e s a t u r a t e d s t a t e i n o r g a n i s m s , i . e . o n e m e t a l i o n f o r e a c h t h r e e c y s t e i n e r e s i d u e s ( K a g i a n d V a l l e e , 1 9 6 0 , 1 9 6 1 ; P u l . i d o e t a l . , 1 9 6 6 ; B u h l e r a n d K a g i , 1 9 7 4 ; B r e m n e r a n d D a v i e s , 1 9 7 5 ) . R e c e n t l y i t h a s b e c o m e a p p a r e n t t h a t m e t a l 1 o t h i o n e i n p r o d u c e d i n r e s p o n s e t o C d , H g , A g o r C u c o n t a i n s Zn i n a p p r o x i m a t e l y h a l f o f i t s b i n d i n g s i t e s ( L e b e r , 1 9 7 4 ; B r e m n e r a n d D a v i e s , 1 9 7 5 ; W i n g e e t a l . , 1 9 7 5 ) . T h i s Zn h a s a m u c h l o w e r a f f i n i t y t h a n C d o r Hg f o r m e t a l l o t h i o n e i n b i n d i n g s i t e s ( K a g i a n d V a l l e e , 1 9 6 0 ; P u l i d o e t a l . , 1 9 6 6 ) . U p o n a . s e c o n d e x p o s u r e t o C d o r H g , t h e s e e l e m e n t s r e p l a c e Zn o n m e t a l l o -t h i o n e i n s o t h a t Zn i s r e l e a s e d i n t o t h e c y t o p l a s m r a t h e r t h a n C d o r Hg ( L e b e r 1 9 7 4 ) . Z i n c i s r e l a t i v e l y n o n t o x i c c o m p a r e d w i t h C d o r Hg ( B r e m n e r , 1 9 7 4 ) . I f a n o r g a n i s m i s e x p o s e d t o a v e r y h i g h d o s e o f C d o r H g , t h e n t h e r e m a y n o t b e e n o u g h Z n - c o n t a i n i n g b i n d i n g s i t e s o n m e t a l l o t h i o n e i n t o d e t o x i f y a l l o f t h e Hg o r C d . F u r t h e r , d e n o v o s y n t h e s i s o f m e t a l l o t h i o n e i n m a y b e s l o w e r t h a n t h e r a t e o f i n f l u x o f t h e s e m e t a l s . T h e s e c o n d i t i o n s w i l l r e s u l t i n a " s p i l l o v e r " o f Hg o r C d t o t h e e n z y m e p o o l . T h i s " s p i l l o v e r " c o i n c i d e s w i t h t h e a p p e a r a n c e o f p a t h o l o g i c a l e f f e c t s ( W i n g e e t a l . , 1 9 7 3 ; B r o w n , 1 9 7 7 ; B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ; I r o n s a n d S m i t h , 1 9 7 6 ) . M e r c u r y a n d c a d m i u m e x e r t t h e i r t o x i c e f f e c t s b y r e -p l a c i n g C u a n d Z n i n m e t a l 1 o e n z y m e s . T h i s c h a n g e s t h e t h r e e d i m e n s i o n a l c o n f o r m a t i o n a l s h a p e o f t h e s e e n z y m e s s o s u b s t r a t e m o l e c u l e s n o l o n g e r f i t b i n d i n g s i t e s ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ) , o r ' s p l i t s e n z y m e s i n t o s u b u n i t s ( G e r -h a r t a n d S c h a c h m a n , 1 9 6 5 ; J o v i n e t a l . , 1 9 6 9 ) s o t h a t r e g u l a t i o n o f e n z y m e a c t i v i t y m a y b e l o s t ( W h i t e e t a l . , 1 9 6 8 ; B r o w n e t a l . , 1 9 7 . 7 ; B r o w n , 1 9 7 7 ) . W h e n C d o r Hg d i s p l a c e C u o r Zn f r o m m e t a l l o t h i o n e i n , t h e s e l a t t e r m e t a l s m a y a l s o a p p e a r i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n ( e n z y m e - c o n t a i n i n g ) p o o l . H o w e v e r a s C u a n d Zn a r e n a t u r a l c o m p o n e n t s o f m a n y m e t a l 1 o e n z y m e s ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ) , t h e y a r e r e l a t i v e l y n o n t o x i c c o m p a r e d w i t h C d o r Hg ( B r e m n e r , 1 9 7 4 ) . 8 3 T h i s s t u d y r e p o r t s f i n d i n g s o n t h e r e l a t i o n s h i p o f p r e v i o u s l y r e p o r t e d g r o w t h r e d u c t i o n o f f i s h a n d z o o -p l a n k t o n e x p o s e d t o Hg ( K o e l l e r a n d W a l l a c e , 1 9 7 7 ) w i t h " s p i l l o v e r " o f Hg f r o m m e t a l l o t h i o n e i n t o t h e e n z y m e p o o l . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s T h e C E P E X ( C o n t r o l l e d E c o s y s t e m P o l l u t i o n E x p e r i m e n t ) 3 : f a c i l i t y c o n s i s t s o f 1 3 5 0 m p o l y e t h y l e n e c o n t r o l l e d e x p e r i m e n t a l e c o s y s t e m s ( C E E s ) s u s p e n d e d i n S a a n i c h I n l e t , V i c t o r i a ( M e n z e l a n d C a s e , 1 9 7 7 ) . T h e s e s i m u l a t e t h e n a t u r a l w a t e r c o l u m n , e x c e p t f o r t h e e f f e c t s o f l a r g e l a t e r a l c u r r e n t s a n d s e d i m e n t r e c y c l i n g . A n e x p e r i m e n t w a s c o n d u c t e d i n t h e s u m m e r o f 1 9 7 6 t o d e t e r m i n e t h e i m p a c t o f Hg o n t h e m a r i n e e c o s y s t e m . On d a y 1 o f t h i s e x p e r i -m e n t a p o r t i o n o f t h e n a t u r a l p e l a g i c p o p u l a t i o n o f S a a n i c h I n l e t w a s c a p t u r e d i n t o e a c h o f t h r e e C E E s . C h u m f r y w e r e a d d e d o n d a y 1 0 . A l s o o n d a y 1 0 , m e r c u r y ( i n t h e f o r m o f H . g C l g ) w a s i n t r o d u c e d i n t o t w o o f t h e C E E s t o p r o d u c e f i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 5 a n d 1 j u g / L . U n i f o r m d i s t r i b u t i o n o f m e r c u r y w a s a i d e d b y u s e o f a d i f f u s e r r i n g l o w e r e d t o 1 0 m b e l o w t h e s u r f a c e ( T o p p i n g a n d W i n d o m , 1 9 7 7 ) . M e r c u r y c o n c e n t r a t i o n s d e c r e a s e d t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t a t a r a t e o f a p p r o x i m a t e l y 2% p e r d a y . T h i s d e c r e a s e o c c u r r e d d u e t o a t t a c h m e n t o f Hg t o s e t t l i n g p a r t i c u l a t e m a t t e r g r e a t e r t h a n 1 0 , 0 0 0 m o l e c u l a r w e i g h t . B y d a y 7 2 , Hg l e v e l s w e r e a p p r o x i m a t e l y o n e - t e n t h t h o s e o f i n i t i a l c o n c e n t r a t i o n s ( G r i c e e t a l . , 1 9 7 7 ) . On d a y 7 2 , z o o p l a n k t o n w e r e s a m p l e d u s i n g a 2 5 jum m e s h n e t a s d e s c r i b e d b y G r i c e e t a l . , ( 1 9 7 7 ) . T h e z o o -p l a n k t o n w e r e d r a i n e d o f e x c e s s w a t e r a n d f r o z e n a t - 2 0 ° C . F i s h w e r e c a p t u r e d w i t h a s p e c i a l l y d e s i g n e d s e i n e a n d s i m i l a r l y f r o z e n u n t i l a n a l y z e d . T h r e e f i s h f r o m e a c h e x p o s u r e w e r e r a n d o m l y s e l e c t e d f o r a n a l y s i s i n t h e p r e s e n t s t u d y . F i s h l i v e r s o r z o o p l a n k t o n w e r e l a t e r t h a w e d , h o m o -g e n i z e d i n 0 . 9 % N a C l a n d c e n t r i f u g e d a t 2 7 , 0 0 0 x g_. T h e s u p e r n a t a n t w a s c o l l e c t e d , t h e p e l l e t r e h o m o g e n i z e d i n 0 . 9 % N a C l a n d c e n t r i f u g e d a t 2 7 , 0 0 0 x £ . S u p e r n a t a n t s w e r e c o m b i n e d , h e a t e d t o 7 0 ° C f o r 1 m i n ( W e b b , 1 9 7 . 2 a ) a n d c e n t r i -f u g e d a t 2 7 , 0 0 0 x g_. T h e s u p e r n a t a n t o f t h i s f i n a l c e n t r i -f u g a t i o n w a s a p p l i e d t o a 1 0 0 x 1 . 6 cm P h a r m a c i a c o l u m n c o n t a i n i n g P h a r m a c i a G - 7 5 g e l . F r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d a n d m e a s u r e d a t 2 5 0 a n d 2 8 0 nm o n a P e r k i n E l m e r s p e c t r o -p h o t o m e t e r . T h e C u a n d Zn c o n t e n t s o f t h e f r a c t i o n s w e r e m e a s u r e d o n a P e r k i n E l m e r 3 0 3 a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o -p h o t o m e t e r u s i n g t h e f l a m e m e t h o d w i t h d e u t e r i u m a r c b a c k -g r o u n d c o r r e c t i o n . M e r c u r y w a s m e a s u r e d b y a c o l d v a p o r m e t h o d u t i l i z i n g a 3 0 cm c e l l ( P h a r m a c i a UV C o n t r o l U n i t m o d e l 1 0 0 , P h a r m a c i a UV O p t i c a l U n i t m o d e l 1 0 0 ) . A n a l y t i -c a l p r e c i s i o n f o r C u w a s J + 3 . 3 % ( f r i e a n + s t a n d a r d d e v i a -t i o n , N = 1 5 ) , f o r Zn w a s J + 3 . 5 % ( m e a n + s t a n d a r d d e v i a -t i o n , N = 1 5 ) , a n d f o r Hg w a s 6 . 0 % ( m e a n + s t a n d a r d d e v i a t i o n , N = 1 5 ) . B y c o m p a r i n g p r o t e i n a b s o r b a n c e a n d m e t a l p r o f i l e s w i t h t h o s e f o u n d i n p r e v i o u s s t u d i e s ( C a s t e r l i n e a n d Y i p , 1 9 7 5 ; L e b e r , 1 9 7 4 ; O l a f s o n a n d T h o m p s o n , 1 9 7 4 ; M a r a f a n t e , 1 9 7 6 ; B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ; B r o w n , 1 9 7 7 ) , f r a c t i o n s w e r e i d e n t i f i e d a s b e l o n g i n g t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n ( e n z y m e -c o n t a i n i n g ) p o o l , m e t a l l o t h i o n e i n , o r t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . T h e C u . a n d Zn l e v e l s i n f r a c t i o n s c o m p r i s i n g t h e s e c y t o p l a s m i c p o o l s w e r e a d d e d t o g e t h e r , t o g i v e t h e t o t a l l e v e l o f e a c h . m e t a l i n e a c h p o o l . M e r c u r y w a s d e t e r m i n e d o n o n e c o m p o s i t e s a m p l e o f e a c h p o o l a s i t w a s n o t d e t e c t a b l e i n i n d i v i d u a l f r a c t i o n s . M e t a l l e v e l s i n e a c h p o o l w e r e t h e n . c a . l c u l a t e d p e r g r a m o f t i s s u e e x -t r a c t e d . R e s u l t s T h e m o s t p r o m i n e n t c h a n g e i s t h e v e r y l a r g e i n c r e a s e of Hg i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n ( e n z y m e - c o n t a i n -i n g ) p o o l o f b o t h f i s h a n d z o o p l a n k t o n e x p o s e d t o 5 j j g H g / L ( T a b l e s 4 a n d 5 ) . T h e r e a p p e a r s t o b e a l i m i t t o H g -t h i o n e i n p r o d u c t i o n r e a c h e d a t t h e 1 jug H g / L e x p o s u r e , a s t h e r e i s l i t t l e i n c r e a s e i n H g - t h i o n e i n f r o m 1 t o 5 jug H g / L . W h e n t h i s l i m i t o f H g - t h i o n e i n p r o d u c t i o n i s a p p a r e n t l y r e a c h e d , e x c e s s e s o f Hg a p p e a r i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( F i g u r e s 12 a n d 1 3 ) . I n f i s h l i v e r c y t o p l a s m , t h e r e a r e d e c r e a s e s o f t o t a l C u a n d Zn w i t h i n c r e a s i n g Hg e x p o s u r e . T h e s e d e c r e a s e s a p p e a r t o b e a r e f l e c t i o n o f d e c r e a s e s o f b o t h C u a n d Zn T a b l e 4 . D i s t r i b u t i o n o f H g , C u a n d Zn a m o n g s t c y t o p l a s m i c p o o l s f r o m l i v e r o r c h u m s a l m o n e x p o s e d t o v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f H g . MW: M o l e c u l a r W e i g h t . N D : N o t D e t e c t a b l e Hg e x p o s u r e c o n c e n t r a t i o n (f9 H g / L ) M e t a l C y t o p l a s m i c t o t a l ( j i m o l e m e t a l / g t i s s u e , w e t w e i g h t ) H i g h MW p r o t e i n p o o l ( j i m o l e m e t a l / g t i s s u e , w e t w e i g h t ) M e t a 1 l o t h i o n e i n ( j i m o l e m e t a l / g t i s s u e , w e t we i g h t ) L o w MW c y t o p l a s m i c p o o l ( . u m o l e m e t a l / g t i s s u e , w e t we i g h t ) . C o n t r o l Hg C u Zn Hg C u Zn 0 . 6 1 X 1 0 " 1 . 8 3 2 0 . 1 6 4 0 . 8 7 X 1 0 1 . 5 5 8 0 . 1 0 4 - 3 0 . 1 1 X 1 0 " 0 . 5 9 2 0 . 1 1 1 0 . 2 3 X 1 0 0 . 4 0 2 0 . 0 7 1 - 3 0 . 2 9 x 1 0 0 . 5 3 2 ND 0 . 3 5 x 1 0 " 0 . 4 2 4 ND 0 . 2 2 X 1 0 " 0 . 7 0 8 0 . 0 5 3 0 . 2 9 X 1 0 " 0 . 7 3 3 • 0 . 0 3 3 Hg C u Zn 4 . 7 7 1 0 " 1 . 4 4 5 0 . 1 1 4 4 . 0 4 X 1 0 " 0 . 3 5 3 0 . 0 7 5 0 . 3 8 X 1 0 " 0 . 3 4 7 ND 0 . 3 5 X 1 0 " 0 . 7 4 5 0 . 0 3 9 T a b l e 5 . D i s t r i b u t i o n o f H g , C u a n d Zn a m o n g s t c y t q p l a s m i c p o o l s f r o m t i s s u e o f z o o p l a n k t o n e x p o s e d t o v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s o f H g . MW: M o l e c u l a r W e i g h t . N D : N o t D e t e c t a b l e . Hg e x p o s u r e M e t a l C y t o p l a s m i c t o t a l ( p m o l e m e t a l / g t i s s u e , w e t w e i g h t ) H i g h MW p r o t e i n p o o l ( j i m o l e m e t a l / g t i s s u e , w e t w e i g h t ) M e t a 1 l o t h i o n e i n ( . u m o l e m e t a l / g t i s s u e , w e t w e i g h t ) L o w MW c y t o p l a s m i c p o o l ( j i m o l e m e t a l / g t i s s u e , w e t w e i g h t ) C o n t r o 1 Hg C u Zn 0 . 4 0 X 1 0 0 . 3 5 9 0 . 2 9 9 0 . 3 2 X 10 0 . 0 4 1 0 . 0 1 2 - 4 0 . 0 4 X 1 0 0 . 0 3 3 ND - 4 0 . 0 4 X 1 0 " 0 . 2 8 6 0 . 2 8 8 Hg C u Zn 0 . 9 6 X 1 0 0 . 3 5 2 0 . 2 8 3 - 4 0 . 4 0 X 1 0 0 . 0 4 6 0 . 0 1 6 - 4 0 . 2 7 X 1 0 " 0 . 0 3 9 0 . 0 0 5 0 . 2 8 X 1 0 " 0 . 2 6 7 0 . 2 6 2 Hg C u Zn 1 . 9 3 X 1 0 " 0 . 3 2 6 0 . 2 1 2 1 . 1 7 X 1 0 0 . 0 3 1 0 . 0 1 1 0 . 2 6 X 1 0 0 . 0 4 5 0 . 0 2 6 - 4 0 . 5 0 X 1 0 " 0 . 2 4 9 0 . 1 7 5 OO 88 F i g u r e 1 2 . G e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m c o n t r o l c h u m s a l m o n ( A ) , c h u m s a l m o n e x p o s e d t o 1 j j g H g / L ( B ) , a n d t h o s e e x p o s e d t o 5 jug H g / L ( C ) f o r 7 2 d a y s . H g ; o - o C u ; e -© Zn . I : h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ; I I : m e t a l l o t h i o n e i n ; I I I : l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . 90 F i g u r e 1 3 . G e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m c o n t r o l z o o p l a n k t o n ( A ) , z o o p l a n k t o n e x p o s e d t o 1 j j g H g / L ( B ) , a n d t h o s e e x p o s e d t o 5 jug H g / L f o r 7 2 d a y s . — H g ; o — - o C u ; ® © Z n . I : h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ; I I : m e t a l l o -t h i o n e i n ; I I I : l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o -p l a s m i c p o o l . i n t h e e n z y m e - c o n t a i n i n g p o o l , o f C u i n m e t a l l o t h i o n e i n a n d o f Zn i n t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l ( T a b l e 4 , . F i g u r e 1 2 ) . I n c y t o p l a s m o f z o o p l a n k t o n e x p o s e d t o 5 j j g H g / L , C u a p p e a r s t o d e c r e a s e i n t h e e n z y m e - c o n t a i n i n g p o o l , i n -c r e a s e i n m e t a l l o t h i o n e i n , a n d d e c r e a s e i n t h e l o w m o l e c u -l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l , r e s u l t i n g i n a n e t d e c r e a s e i n c y t o p l a s m i c C u ( T a b l e 5 ) . C o p p e r l e v e l s a r e r e l a t i v e l y u n c h a n g e d b y e x p o s u r e t o 1 j j g H g / L . A t b o t h m e r c u r y e x p o s u r e s , Zn i n z o o p l a n k t o n c y t o p l a s m a p p e a r s t o b e u n -c h a n g e d i n t h e e n z y m e - c o n t a i n i n g p o o l , w h i l e i n c r e a s e d i n m e t a l l o t h i o n e i n , a n d d e c r e a s e d i n t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . T h u s , t h e r e i s a n e t d e c r e a s e i n c y t o -p l a s m i c Zn ( T a b l e 5 , . F i g u r e 1 3 ) . P i s c u s s i o n R e s u l t s o f t h i s s t u d y a n d t h o s e o f K o e l l e r a n d W a l l a c e ( 1 9 7 7 ) a p p e a r t o s u p p o r t t h e " s p i l l o v e r " t h e o r y ( W i n g e e t a l . , 1 9 7 4 ; B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . T h i s t h e o r y s u g g e s t s t h a t i n t r a c e l l u l a r t o x i c e f f e c t s o f C d a n d Hg w i l l n o t o c c u r u n l e s s a n d u n t i l t h e s e m e t a l s a p p e a r i n t h e e n z y m e -c o n t a i n i n g p o o l . T h e s e m e t a l s w i l l s p i l l o v e r f r o m m e t a l l o -t h i o n e i n t o t h e e n z y m e - c o n t a i n i n g p o o l w h e n t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f m e t a l l o t h i o n e i n i s e x c e e d e d . I n t h e p r e s e n t s t u d y , i t a p p e a r s t h a t t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f m e t a l l o -t h i o n e i n w a s s u r p a s s e d i n t h e 5 j j g H g / L e x p o s u r e . M e r c u r y -t h i o n e i n i n c r e a s e d f r o m t h e c o n t r o l t o t h e 1 jug H g / L e x p o s u r e , b u t i n c r e a s e d v e r y l i t t l e f r o m 1 t o 5 j j g H g / L . R a t h e r , a t 5 jug H g / . L , e x c e s s Hg o c c u r r e d i n t h e e n z y m e -c o n t a i n l i n g p o o l . K o e l l e r a n d W a l l a c e ( 1 9 7 7 ) f o u n d b o t h f i s h a n d z o o -p l a n k t o n g r o w t h t o b e d e c r e a s e d i n t h e s e s a m e 5 j j g H g / L C E E s . On d a y 7 2 , f i s h e x p o s e d t o 5 , u g H g / L w e i g h e d a b o u t 6 g r a m s w h i l e c o n t r o l s o r 1 pg H g / L e x p o s e d f i s h w e i g h e d 1 2 . 5 g r a m s . Z o o p l a n k t o n c o u n t s i n t h e 5 j j g H g / L C E E s w e r e o n e - f o u r t h t h o s e o f c o n t r o l o r 1 jug H g / L e x p o s e d z o o p l a n k t o n c o u n t s o n d a y 7 2 . T h u s , a t t h a t c o n c e n t r a -t i o n o f Hg e x p o s u r e w h e r e t h e r e w a s a d r a m a t i c i n c r e a s e o f Hg i n t h e e n z y m e - c o n t a i n i n g p o o l , t h e r e w a s a s i m i l a r d r a m a t i c d e c r e a s e i n g r o w t h . A t l e a s t i n p a r t , t h e r e f o r e , r e d u c e d g r o w t h m a y b e a r e s u l t o f i n h i b i t i o n o r a l t e r a -t i o n o f e n z y m e f u n c t i o n i n g b y Hg ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ; B r e m n e r , 1 9 7 4 ; B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ; B r o w n , 1 9 7 7 ) . M o s t l i k e l y t o x i c e f f e c t s r e s u l t f r o m a c h a n g e i n m e t a l 1 o e n z y m e t e r t i a r y o r q u a t e r n a r y s t r u c t u r e w h e n C u o r Zn a r e d i s p l a c e d b y Hg i n t h e s e e n z y m e s ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ; B r e m n e r , 1 9 7 4 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , w i t h i n c r e a s e s o f Hg i n t h e e n z y m e - c o n t a i n i n g p o o l , t h e r e w e r e d e c r e a s e s o f C u a n d Z n . S i n c e Hg e x p o s u r e r e s u l t s i n a r e d u c t i o n o f C u a n d Zn i n t h e e n z y m e - c o n t a i n i n g p o o l , Hg e x p o s u r e m i g h t r e s u l t i n m e t a l d e f i c i e n c y e f f e c t s . T h u s , g r o w t h d e c r e a s e s c o u l d o c c u r i n d e p e n d e n t o f t h e o t h e r e n z y m a t i c i n h i b i t o r y t o x i c e f f e c t s o f H g , d u e s i m p l y t o d e c r e a s e s o f C u a n d Zn ( U n d e r w o o d , 1 9 7 1 ) . W h i l e i n t r a c e l l u l a r d i s p l a c e m e n t o f C u a n d Zn b y Hg p a r t i a l l y e x p l a i n s c e l l u l a r l o s s e s o f t h e s e m e t a l s , e x -c l u s i o n o f u p t a k e o f t h e s e m e t a l s i s a l s o a p o s s i b i l i t y . A s e x p l a i n e d b y S u g a w a r a a n d S u g a w a r a ( 1 9 7 5 ) a n d S t o n a r d a n d W e b b ( 1 9 7 6 ) , g a s t r o i n t e s t i n a l u p t a k e o f H g , C d , C u a n d Zn o c c u r s v i a d u o d e n a l m u c o s a l m e t a l l o t h i o n e i n . W h e n e x p o s e d t o h i g h l e v e l s o f C d o r H g , t h i s m e t a l l o t h i o n e i n i s s a t u r a t e d b y C d o r H g . I t . t h e n c a n n o t b i n d C u a n d Z n , a n d t h e r e f o r e t h e y a r e n o t a b s o r b e d i n t o t h e b l o o d s t r e a m f r o m t h e i n t e s t i n e ( S t o n a r d a n d W e b b , 1 9 7 6 ) . O t h e r w o r k e r s ( F o w l e r e t a l . , 1 9 7 5 ; O v e r n e l l , 1 9 7 5 ) f o u n d t h a t Hg e x p o s u r e r e s u l t s i n a l o s s o f c e r t a i n c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s i n c l u d i n g p o t a s s i u m . O v e r n e l l ( 1 9 7 5 ) e x p l a i n s t h e l o s s e s a s l e a k a g e d u e , t o m e m b r a n e d a m a g e c a u s e d b y H g . D e F i l i p p i s a n d P a l l a g h y ( 1 9 7 6 ) f o u n d t h a t 6 5 C h i o r e l l a e x p o s e d t o Hg h a d d e c r e a s e d u p t a k e o f Z n . T h e y c o n c l u d e t h a t t h i s d e c r e a s e i n u p t a k e i s d u e t o a n i n h i b i -t i o n o f t h e t e m p e r a t u r e s e n s i t i v e c o m p o n e n t o f Zn u p t a k e a n d t o a r e d u c t i o n i n t h e n u m b e r o f e x c h a n g e s i t e s a v a i l -a b l e f o r Zn i n t h e c e l l w e l l . T h e y a t t r i b u t e d i n c r e a s e d t o l e r a n c e o f C h i o r e l l a t o t r a c e e l e m e n t s a s c h a r a c t e r i z e d b y d e v e l o p m e n t o f t h i s e x c l u s i o n m e c h a n i s m . I n f i s h l i v e r , a s Hg i n c r e a s e d i n m e t a l l o t h i o n e i n , t h e r e w a s a c o n c u r r e n t d e c r e a s e o f C u i n m e t a l l o t h i o n e i n . T h i s i s c o n s i s t e n t w i t h L e b e r ' s ( 1 9 7 4 ) t h e o r y s u g g e s t i n g t h a t m e t a l l o t h i o n e i n r e s u l t s i n d e t o x i f i c a t i o n , i n p a r t , b y a d i s p l a c e m e n t o f l e s s t o x i c m e t a l s f r o m m e t a l l o -t h i o n e i n b y m o r e t o x i c o n e s . L e b e r f o u n d t h a t C d d i s -p l a c e d Zn f r o m m e t a l l o t h i o n e i n . I n t h e p r e s e n t s t u d y , H g a p p e a r s t o h a v e d i s p l a c e d C u . Z i n c i n f i s h l i v e r m e t a l l o -t h i o n e i n w a s n o t d e t e c t a b l e b y m e t h o d s e m p l o y e d h e r e . I n z o o p l a n k t o n , b o t h C u a n d Zn i n c r e a s e d i n m e t a l l o -t h i o n e i n w i t h i n c r e a s e s o f Hg i n m e t a l l o t h i o n e i n , e v e n a t t h e h i g h e s t l e v e l w h e r e s p i l l o v e r o c c u r r e d . T h e r e f o r e , i n z o o p l a n k t o n , C u a n d Zn w e r e n o t d i s p l a c e d b y i n c r e a s i n g l e v e l s o f K g i n m e t a l l o t h i o n e i n , a s o c c u r r e d i n f i s h . D i s -c r e p a n c i e s b e t w e e n f i s h a n d z o o p l a n k t o n m a y b e d u e t o d i f -f e r e n t t i s s u e t y p e s o r t o l e s s e r Hg l e v e l s i n z o o p l a n k t o n . Z o o p l a n k t o n c y t o p l a s m i c Hg l e v e l s a t 5 jug H g / L e x p o s u r e w e r e o n l y o n e - f i f t h t h o s e o f f i s h l i v e r c y t o p l a s m i c Hg l e v e l s a t 1 jug H g / L e x p o s u r e a n d o n e - t w e n t y - f i f t h t h o s e o f f i s h a t 5 j j g H g / L e x p o s u r e ( T a b l e s 4 a n d 5 ) . I n f i s h l i v e r c y t o p l a s m a t 5 j j g H g / L e x p o s u r e , 8 5 % o f Hg i s f o u n d i n t h e e n z y m e - c o n t a i n i n g p o o l , w h i l e i n z o o p l a n k t o n c y t o p l a s m o n l y 6 0 % o f Hg i s f o u n d i n t h e e n z y m e - c o n t a i n i n g p o o l , i n -d i c a t i n g m u c h l e s s . s p i l l o v e r i n z o o p l a n k t o n . T h e r e f o r e , t h e l e s s e r l e v e l s o f Hg i n z o o p l a n k t o n w o u l d p r o b a b l y p r e s e n t l e s s o f a c h a l l e n g e t o C u a n d Zn i n m e t a l l o t h i o n e i n . I t i s e v i d e n t f r o m t h i s a n d p r e v i o u s s t u d i e s t h a t t o x i c e f f e c t s o f C d o r Hg do. n o t o c c u r u n t i 1 " s p i 11 o v e r " o c c u r s . W h e t h e r o r n o t s p i l l o v e r o c c u r s w i l l d e p e n d u p o n w h e t h e r o r n o t m e t a l l o t h i o n e i n s y n t h e s i s c a n k e e p p a c e w i t h m e t a l i n f l o w . T h u s , e x p o s u r e t o l o w l e v e l s o f Hg o v e r a l o n g p e r i o d o f t i m e m i g h t r e s u l t i n v e r y h i g h t i s s u e l e v e l s o f H g , b u t w h i c h i s a l l b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n a n d h e n c e d e t o x i f i e d . M u c h s h o r t e r e x p o s u r e p e r i o d s b u t w i t h m u c h h i g h e r l e v e l s o f Hg e x p o s u r e m i g h t r e s u l t i n l o w e r t i s s u e l e v e l s o f H g , b u t w i t h m o s t o f t h e Hg a p p e a r -i n g i n t h e e n z y m e - c o n t a i n i n g . p o o l w i t h c o n c u r r e n t t o x i c e f f e c t s . T h u s , t h e f a c t o r c r i t i c a l t o a n o r g a n i s m ' s s u r v i v a l m a y n o t b e i t s t i s s u e l e v e l s o f C d o r H g , b u t r a t h e r , w h e t h e r t h e s e o c c u r o n t h e e n z y m e - c o n t a i n i n g p o o l o r a s m e t a l l o t h i o n e i n . T h i s s h o u l d d e p e n d u p o n b o t h t h e l e v e l a n d r a t e o f e x p o s u r e a n d u p t a k e . S u m m a r y F i s h a n d z o o p l a n k t o n w e r e s i m u l t a n e o u s l y e x p o s e d t o t r a c e , 1 a n d 5 jug H g / L . I n b o t h f i s h a n d z o o p l a n k t o n , p a t h o l o g i c a l e f f e c t s a p p e a r e d t o c o i n c i d e w i t h s a t u r a t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n a n d " s p i l l o v e r " o f Hg i n t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n ( e n z y m e - c o n t a i n i n g ) p o o l . C o i n c i -d e n t a l w i t h i n c r e a s e s o f Hg i n t i s s u e w e r e d e c r e a s e s o f C u a n d Z n . P a t h o l o g i c a l e f f e c t s o f Hg a r e e x p l a i n e d i n t e r m s o f t e r t i a r y a n d q u a t e r n a r y s t r u c t u r a l c h a n g e s i n m e t a l 1 o e n z y m e s r e s u l t i n g f r o m r e p l a c e m e n t o f C u a n d Zn b y H g . D e c r e a s e s i n t i s s u e C u a n d Z n w i t h i n c r e a s i n g H g c o n c e n t r a t i o n a r e d i s c u s s e d a s b o t h a n i n t r a c e l l u l a r d i s -p l a c e m e n t o f C u a n d Zn b y Hg a n d a s d u o d e n a l a n d c e l l u l a r e x c l u s i o n p r o c e s s e s . 9 7 C H A P T E R V I T h e E f f e c t o f M e r c u r y E x p o s u r e o n t h e C y t o p l a s m i c D i s t r i b u t i o n o f M e r c u r y , C o p p e r a n d Z i n c i n S k e l e t o n e m a c o s t a t u m P r e f a c e T h i s i s my v e r s i o n o f a p a p e r a u t h o r e d b y L . C l o u t i e r a n d D. A . B r o w n ( 1 9 7 8 ) , a n d a c c e p t e d f o r p u b l i c a t i o n i n t h e J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l M a r i n e B i o l o g y a n d E c o l o g y . T h i s p a p e r a g a i n d e m o n s t r a t e s t h a t t o x i c e f f e c t s o f Hg d o n o t o c c u r u n t i l i t a p p e a r s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . I n t e r a c t i o n s b e t w e e n Hg a n d Zn i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l i n p h y t o p i a n k t o n , a r e s i m i l a r t o t h o s e i n f i s h a n d z o o p l a n k t o n , b u t d i f f e r e n t t h a n t h o s e b e t w e e n Hg a n d C u ( B r o w n a n d P a r s o n s , 1 9 7 8 ) . I n t r o d u c t i o n I t i s k n o w n t h a t e x p o s u r e o f p h y t o p l a n k t o n t o t r a c e e l e m e n t s r e s u l t s i n i n c r e a s e d t o l e r a n c e t o s u b s e q u e n t e x p o s u r e s ( D e F i l i p p i s a n d P a l l a g h y , 1 9 7 6 ) , b u t i t i s n o t k n o w n w h e t h e r o r n o t m e t a l l o t h i o n e i n p l a y s a r o l e i n t h i s p r o c e s s . M e t a l 1 o t h i o n e i n i s a l o w m o l e c u l a r w e i g h t ( 1 0 , 0 0 0 ) p r o t e i n w h i c h c a n b i n d a n d t h u s r e n d e r n o n t o x i c , h e a v y m e t a l s s u c h a s C d a n d H g . I t a l s o s t o r e s C u a n d Zn w h e n t h e y o c c u r i n e x c e s s o f l e v e l s r e q u i r e d f o r m e t a l l o -e n z y m e s ( B r e m n e r a n d D a v i e s , 1 9 7 4 ; B r o w n a n d C h a t e l , 1 9 7 8 a ) . T o x i c e f f e c t s o f C d a n d Hg a r e f o u n d w h e n t h e r a t e o f i n f l o w o f t h e s e m e t a l s e x c e e d s t h e r a t e o f m e t a l l o -t h i o n e i n s y n t h e s i s ( W i n g e e t a l . , , 1 9 7 3 ; B r o w n a n d P a r s o n s , 1 9 7 8 ) . A t t h i s p o i n t , t h e y o c c u r o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a n d e x e r t t o x i c e f f e c t s b y r e p l a c i n g C u a n d Zn i n m e t a l 1 o e n z y m e s ( B r o w n , 1 9 7 7 ; B r o w n a n d P a r s o n s , 1 9 7 8 ) . M e t a l l o t h i o n e i n h a s b e e n u b i q u i t o u s l y f o u n d i n l a n d a n d m a r i n e a n i m a l s ( e . g . , B u h l e r a n d K a g i , 1 9 7 4 ; P i s c a t o r , 1 9 6 4 ; O l a f s o n a n d T h o m p s o n , 1 9 7 4 ) . H o w e v e r , t h e p r e s e n c e o f m e t a l l o t h i o n e i n i n p h y t o p l a n k t o n r e m a i n s t o b e c l a r i f i e d . M a c l e a n , e t a l . (1 9 7 2 ) f o u n d a m e t a l l o t h i o n e i n l i k e f r a c t i o n b i n d i n g C d a n d Zn i n b l u e g r e e n a l g a e e x p o s e d t o r a d i o -a c t i v e C d . I n t h e p r e s e n t s t u d y , p h y t o p l a n k t o n a r e e x p o s e d t o a r a n g e o f m e r c u r y c o n c e n t r a t i o n s i n o r d e r t o s e e i f a m e t a l l o t h i o n e i n l i k e p r o t e i n i s i n d u c e d . A l s o , t h e e f f e c t s o f Hg e x p o s u r e o n t h e c y t o p l a s m i c l e v e l s a n d d i s t r i b u t i o n s o f C u a n d Z n a r e e x a m i n e d . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s T h e c o a s t a l p e n n a t e d i a t o m S k e 1 e t o m e m a c o s t a t u m w a s o b t a i n e d f r o m t h e N o r t h e a s t P a c i f i c C u l t u r e C o l l e c t i o n , I n s t i t u t e o f O c e a n o g r a p h y , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a . A t t h e s t a r t o f t h e e x p e r i m e n t , p o r t i o n s o f s t o c k c u l t u r e w e r e t r a n s f e r r e d t o a r t i f i c i a l s e a w a t e r e n r i c h e d w i t h m o d i f i e d G u i l l a r d a n d R y t h e r ' s m e d i u m . T h e e n r i c h m e n t c o n s i s t e d o f 8 . 8 3 X I O - 4 M N a N O ^ » 5 . 3 X 1 0 " 5 M N a 2 S i 0 3 , 3 . 6 8 X 1 0 " 5 M K 2 H 2 P 0 4 , 1 . 9 6 X T O - 8 M C u S 0 4 , 3 . 8 3 X I O - 5 M Z n S 0 4 , 2 . 2 X I O - 8 M C o C l 2 « 6 H 2 0 , . 4 . 5 5 X I O - 9 M M n C l 2 m 1 . 3 X 1 0 " 8 M N a 2 M o 0 4 - 4 H 2 0 , 5 . 8 3 JJM F e a n d 5 . 8 5 J J M N a E D T A . V i t a m i n w a s a d d e d a t 2 5 % f u l l s t r e n g t h . T h e c u l t u r e s w e r e g r o w n b a t c h w i s e i n b o r o s i 1 i c a t e , 6 l i t e r , f l a t b o t t o m b o i l i n g f l a s k s , s t o p p e r e d b y a n a l u m i n u m f o i l s h e e t , i n a w a t e r b a t h m a i n t a i n e d a t 1 7 . 0 + 0 . 5 ° C . T h e c u l t u r e s w e r e c o n t i n u o u s l y s t i r r e d w i t h a t e f l o n c o v e r e d m a g n e t i c s t i r r e r a t 1 2 0 r p m . C u l t u r e s w e r e g r o w n u n d e r c o n t i n u o u s i l l u m i n a t i o n . G r o w t h w a s m e a s u r e d b y m o n i t o r i n g f l u o r e s c e n c e w i t h a T u r n e r M o d e l I I I f l u o r o m e t e r . T h e e x p e r i m e n t w a s s t a r t e d w i t h a v e r y c l e a n ( f e w b a c t e r i a ) u n i a l g a l l o g p h a s e S_. c o s t a t u m c u l t u r e . Two c u l t u r e s w e r e g r o w n f o r a p p r o x i m a t e l y 7 0 h o u r s b e f o r e a d d i t i o n o f Hg ( a s H g C ^ ) w h i l e t w o o t h e r c u l t u r e s w e r e g r o w n i n 0 . 5 j j g H g / L . A t 7 0 h o u r s , o n e c u l t u r e o f e a c h o f t h e s e s u b s e t s w a s p e r t u r b e d w i t h 1 . 5 pg H g / L . A n o t h e r . c u l t u r e w a s e x p o s e d t o 0 . 1 jug H g / L f o r t h e d u r a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t . C e l l s w e r e h a r v e s t e d a t 1 1 6 h o u r s b y c e n t r i -f u g a t i o n , i n 5 0 m l p o l y c a r b o n a t e t e s t t u b e s , i n a 6 ° C c e n t r i f u g e , f o r 6 m i n u t e s , a t 6 5 0 x g_. T h e s u p e r n a t a n t s w e r e d i s c a r d e d a n d t h e p e l l e t s f r o z e n u n t i l a n a l y z e d . O n e g r a m o f p e l l e t w a s h o m o g e n i z e d i n 3 m l o f 0 . 9 % N a C l f o r 5 m i n u t e s u s i n g a T R I - R S T I R - R m o d e l 5 6 3 C v a r i a b l e s p e e d l a b o r a t o r y h o m o g e n i z e r s e t a t 4 . 5 . H o m o g e n a t e s w e r e c e n t r i f u g e d a t 2 7 , 0 0 0 x £ f o r 1 0 m i n u t e s u s i n g a S o r v a l S u p e r s p e e d R C 2 - B a u t o m a t i c r e f r i g e r a t e d c e n t r i f u g e . S u p e r n a t a n t w a s f r a c t i o n a t e d o n a S e p h a d e x G - 7 5 ( P h a r m a c i a ) c o l u m n ( 0 . 9 x 6 0 c m ) w i t h 0 . 0 1 M N H 4 H C 0 3 b u f f e r a s e l u e n t . 1 0 0 Two m l f r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d . U l t r a v i o l e t a b s o r b a n c e ( 2 8 0 n m ) s p e c t r a w e r e d o n e w i t h a P e r k i n E l m e r m o d e l 1 2 4 D d o u b l e b e a m s p e c t r o p h o t o -m e t e r t o e s t a b l i s h t h e p o s i t i o n o f p e a k s . P e a k s w e r e i d e n t i f i e d a s b e i n g i n t h e p o s i t i o n o f t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n ( e n z y m e - c o n t a i n i n g ) p e a k , m e t a l l o t h i o n e i n , a n d t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . C o p p e r a n d Zn l e v e l s w e r e d e t e r m i n e d i n e a c h f r a c t i o n u s i n g a P e r k i n E l m e r m o d e l 3 0 3 f l a m e a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t e r . M e r c u r y w a s m e a s u r e d b y a c o l d v a p o r m e t h o d o n t h e c o m b i n e d f r a c t i o n s o f e a c h p e a k , u t i l i z i n g a 3 0 cm c e l l ( P h a r m a c i a UV C o n t r o l U n i t m o d e l 1 0 0 , P h a r m a c i a UV O p t i c a l U n i t m o d e l 1 0 0 ) . R e s u l t s A t t h e b e g i n n i n g o f t h e e x p e r i m e n t , c u l t u r e s g r e w e x p o n e n t i a l l y ( F i g u r e 1 4 ) . G r o w t h r a t e w a s d e a c c e l e r a t e d i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 5 j j g H g / L ( F i g u r e 1 4 ) . T h e c u l t u r e s i n i t i a l l y e x p o s e d t o 0 . 5 j j g H g / L h a d g r o w t h r a t e o f 1 . 3 1 + 0 . 2 7 d i v i s i o n s / d a y w h i l e t h o s e n o t e x p o s e d t o Hg u n t i l 7 0 h o u r s m a i n t a i n e d a g r o w t h r a t e o f 1 . 9 2 + 0 . 1 7 d i v i s i o n s / d a y . T h e c e l l u l a r d e n s i t y w a s r e d u c e d b y 2 5 % a f t e r 2 4 h o u r s , a n d b y 5 5 % a f t e r 4 6 h o u r s e x p o s u r e t o 0 . 5 j j g H g / L . A t y p i c a l g e l e l u t i o n p r o f i l e f r o m S_. c o s t a t u m e x p o s e d t o H g i s s h o w n i n F i g u r e 1 5 . T h i s p r o f i l e i s c h a r a c t e r i z e d b y r e l a t i v e l y h i g h l e v e l s o f C u a n d Zn i n t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l ( I I I ) , m u c h Zn b u t l e s s e r a m o u n t s 1 0 1 F i g u r e 1 4 . I_n v i v o f l u o r e s c e n c e o f b a t c h c u l t u r e s o f S k e l e t o n e m a c o s t a t u m e x p o s e d t o Hg f o r 1 1 6 h o u r s . — 0 — c o n t r o l ; — ® - — c o n t r o l p e r t u r b e d w i t h 1 . 5 j j g H g / L ; — A — 0 . 5 j j g H g / L ; — 0 . 5 j j g H g / L p e r t u r b e d w i t h 1 . 5 j j g H g / L . ^ t i m e o f p e r t u r b a t i o n w i t h 1 . 5 j j g H g / L a p p r o x i m a t e l y 7 0 h o u r s a f t e r t h e s t a r t o f t h e e x p e r i m e n t . 102 200 5ioo u 80 o 4 0 i _ o 20 -i 1 2 3 Time (Days) 1 0 3 F i g u r e 1 5 . G e l e l u t i o n p r o f i l e o f S k e l e t o n e m a c o s t a t u m e x p o s e d t o 0 . 5 jug H g / L f o r 1 1 6 h o u r s . I : h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ; I I : m e t a l l o - " t h i o n e i n ; I I I : l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . Absorbance(280nm) Zn (mg/L) p p o O Ki ' J ^ J3> bo o " i 1 1 1 r P O p O O O O O O O h J (jj oi ~i 1 1 1 r~ Cu(mg/L) P O O O f\) ^ 0) 00 O ~f 1 1 1 r 1 0 5 o f C u i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( I ) , a n d r a t h e r s m a l l C u a n d Zn p e a k s i n t h o s e f r a c t i o n s w h i c h c o r r e s p o n d t o t h e p o s i t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n ( I I ) i n p r e v i o u s s t u d i e s ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . G e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m o t h e r e x p o s u r e s w e r e s i m i l a r i n s h a p e t o F i g u r e 1 5 , b u t v a r i e d i n t h e l e v e l s o f m e t a l s i n e a c h o f t h e p e a k s ( T a b l e 6 ) . E x p o s u r e t o Hg r e s u l t e d i n d e c r e a s e s o f Zn i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a n d i n t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l ( T a b l e 6 ) . Z i n c l e v e l s w e r e i n -c r e a s e d i n t h e m e t a l l o t h i o n e i n l i k e f r a c t i o n s i n t h o s e S_. c o s t a t u r n e x p o s e d t o t h e h i g h e r Hg c o n c e n t r a t i o n s . T o t a l Z n l e v e l s w e r e d e c r e a s e d i n a l l Hg e x p o s u r e s . C o p p e r l e v e l s w e r e i n c r e a s e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f c u l t u r e s e x p o s e d t o Hg ( T a b l e 6 ) . L e v e l s o f C u i n t h e m e t a l l o t h i o n e i n l i k e p e a k w e r e i n -c r e a s e d s l i g h t l y i n t h o s e p h y t o p l a n k t o n e x p o s e d t o 1 . 5 j j g H g / L . T o t a l C u l e v e l s a p p e a r e d t o b e i n c r e a s e d i n t h o s e p h y t o p l a n k t o n e x p o s e d t o 1 . 5 j j g H g / L . M e r c u r y w a s d e t e c t a b l e , b y m e t h o d s e m p l o y e d i n t h i s s t u d y , o n l y i n t h o s e p h y t o p l a n k t o n e x p o s e d t o 1 . 5 | i g H g / L . P r e e x p o s u r e t o 0 . 5 j j g H g / L b e f o r e a d d i t i o n o f 1 . 5 j j g H g / L r e s u l t e d i n a d e c r e a s e i n u p t a k e o f Hg c o m p a r e d w i t h t h o s e p h y t o p l a n k t o n n o t p r e e x p o s e d t o Hg b e f o r e a d d i t i o n o f 1 . 5 j j g H g / L . A l l o f t h e d e t e c t a b l e H g i n t h o s e p h y t o -p l a n k t o n e x p o s e d t o 0 . 5 j j g H g / L , a n d t h e n 1 . 5 jug H g / L , T a b l e 6 . T h e d i s t r i b u t i o n o f Zn , C u a n d Hg a m o n g s t c y t o p l a s m i c p o o l s f r o m p h y t o p l a n k t o n e x p o s e d t o m e r c u r y i n b a t c h c u l t u r e s . D a t a a r e c o m p i 1 a t i o n s o f m e t a 1 l e v e l s f r o m p r o f i l e s s u c h a s F i g u r e 1 5 , i n p m o l e / g t i s s u e ( w e t w e i g h t ) . MW: m o l e c u l a r w e i g h t . N D : n o t d e t e c t a b l e . Zn C u Hg T o t a l H i g h MW p o o l M e t a l l o -t h i o n e i n L o w MW p o o l T o t a l H i g h MW p o o l M e t a l l o -t h i o n e i n L o w MW p o o l T o t a l H i g h MW p o o l M e t a l l o -t h i o n e i n L o w MW p o o l C o n t r o l . 0 2 3 1 . 0 0 8 3 ND . 0 1 4 8 . 2 7 0 . 0 3 2 . 0 3 5 . 2 0 3 ND ND ND ND D. 1 p g H g / L . 0 1 3 6 . 0 0 6 5 ND . 0 0 7 1 . 2 7 5 . 0 4 4 . 0 3 4 . 1 9 7 ND ND ND ND 3 . 5 j j g H g / L . 0 1 1 5 . 0 0 3 5 . 0 0 0 9 . 0 0 7 1 . 2 5 3 . 0 4 1 . 0 3 2 . 1 8 0 ND ND ND ND 1 . 5 p g H g / L . 0 1 4 4 . 0 0 4 6 . 0 0 1 1 . 0 0 8 7 . 3 2 8 . 0 4 2 . 0 4 0 . 2 4 6 . 0 1 3 8 . 0 1 1 7 . 0 0 2 1 ND 0 . 5 + 1 . 5 fig H g / L . 0 1 3 0 . 0 0 3 5 . 001 7 . 0 0 7 8 . 3 2 6 . 0 6 2 . 0 4 1 . 2 2 3 . 0 0 3 4 . 0 0 3 4 ND ND 1 0 7 a p p e a r e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . I n t h o s e p h y t o p l a n k t o n e x p o s e d o n l y t o 1 . 5 j j g H g / L , m o s t Hg a p p e a r e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , b u t s o m e a p p e a r e d i n t h o s e f r a c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h e p o s i t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n i n p r e v i o u s s t u d i e s ( B r o w n et a l . , 1 9 7 7 ) . D i s c u s s i o n R e s u l t s f r o m t h i s s t u d y a p p e a r t o i n d i c a t e t h a t m e t a l l o -t h i o n e i n d o e s n ' t p l a y a m a j o r r o l e i n t h e d e t o x i f i c a t i o n o f H g i n p h y t o p l a n k t o n . M o s t d e t e c t a b l e H g a p p e a r e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l r a t h e r t h a n i n t h o s e f r a c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h e u s u a l p o s i t i o n o f m e t a l l o -t h i o n e i n ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . O n l y i n t h o s e p h y t o p l a n k t o n c o n t a i n i n g t h e h i g h e s t Hg l e v e l s , w a s a H g - t h i o n e i n l i k e p e a k d e t e c t a b l e . T h e l a c k o f H g - t h i o n e i n a t m o s t e x p o s u r e l e v e l s m a y b e d u e t o p o o r d e t e c t i o n l i m i t s i n t h e p r e s e n t s t u d y , i . e . , i t m a y b e t h a t m e t a l l o t h i o n e i n w a s Hg s a t u r a t e d a t l e v e l s t o o l o w t o b e d e t e r m i n e d . T h e r e i s s o m e e v i d e n c e t h a t a m e t a l l o t h i o n e i n l i k e f r a c t i o n w a s i n d u c e d w i t h t h e h i g h e r H g e x p o s u r e s a s w i t h t h e s e e x p o s u r e s , Z n i n -c r e a s e d i n t h o s e f r a c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h e u s u a l p o s i t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n . I t h a s b e e n s u g g e s t e d p r e -v i o u s l y t h a t C d a n d Hg i n d u c e m e t a l l o t h i o n e i n w i t h Zn a p p e a r i n g i n a p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e b i n d i n g s i t e s ( W i n g e e t a l . , 1 9 7 5 ) . U p o n a s e c o n d e x p o s u r e , t h e 1 0 8 n o n t o x i c Zn i s d i s p l a c e d b y m o r e t o x i c C d o r Hg ( L e b e r , 1 9 7 4 ; B r o w n a n d P a r s o n s , 1 9 7 8 ) , s o t h a t t h e s e a r e d e -t o x i f i e d . Z i n c i s r e l e a s e d i n t o t h e c y t o p l a s m w h e r e i t i s r e l a t i v e l y h a r m l e s s a s i t i s a c o m p o n e n t o f m a n y m e t a l l o e n z y m e s . I n t h e p r e s e n t s t u d y , C u l i k e Z n , a p p e a r s t o b e i n c r e a s e d o n t h o s e f r a c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o m e t a l l o -t h i o n e i n , a t t h e t w o h i g h e s t H g e x p o s u r e s . I n a n i m a l s , m o s t H g i s b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n u n t i l t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f m e t a l l o t h i o n e i n i s e x c e e d e d . W h e n t h i s o c c u r s , e x c e s s e s o f Hg t h e n a p p e a r i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t , p r o t e i n p o o l , w i t h s i m u l t a n e o u s l y o c c u r r i n g p a t h o -l o g i c a l e f f e c t s ( B r o w n a n d P a r s o n s , 1 9 7 8 ) . P a t h o l o g i c a l e f f e c t s a r e t h o u g h t t o r e s u l t f r o m Hg d i s p l a c i n g C u a n d Zn f r o m m e t a l 1 o e n z y m e s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . M e t a l 1 o e n z y m e s t h e n b e c o m e n o n f u n c t i o n a l d u e t o c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s ( B r e m n e r , 1 9 7 4 ; F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , g r o w t h s u p p r e s s i o n o c c u r r e d i n Hg e x p o s u r e s w h e r e Hg a p p e a r e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . S i m i l a r g r o w t h r e d u c t i o n s w e r e f o u n d i n H g -e x p o s e d f i s h a n d z o o p l a n k t o n w h e n Hg a p p e a r e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( B r o w n a n d P a r s o n s , 1 9 7 8 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , p r e e x p o s u r e o f p h y t o p l a n k t o n t o Hg r e s u l t e d i n l e s s u p t a k e o f Hg d u r i n g s u b s e q u e n t Hg e x p o s u r e s . P r e e x p o s u r e t o 0 . 5 j j g H g / L w i t h s u b s e q u e n t e x p o s u r e t o 1 . 5 j j g H g / L r e s u l t e d i n o n l y 2.5% o f t h e u p t a k e o f Hg f o u n d u p o n e x p o s u r e t o 1 . 5 >ig H g / L w i t h o u t p r e -1 0 9 e x p o s u r e . De F i l i p p i s a n d P a l l a g h y ( 1 9 7 6 ) f o u n d t h a t e x p o s u r e o f C h i o r e ! 1 a t o Hg r e s u l t e d i n a n i n h i b i t i o n o f t h e t e m p e r a t u r e s e n s i t i v e c o m p o n e n t o f Zn u p t a k e a n d a r e d u c t i o n i n t h e n u m b e r o f Zn e x c h a n g e s i t e s i n t h e c e l l w a l l . T h e y a t t r i b u t e d i n c r e a s e d t o l e r a n c e o f C h i o r e l 1 a t o t r a c e e l e m e n t s a s c h a r a c t e r i z e d b y d e v e l o p m e n t o f t h i s e x c l u s i o n m e c h a n i s m . R e s u l t s f r o m t h e p r e s e n t s t u d y s u p p o r t t h e i d e a t h a t t o l e r a n c e o f S . c o s t a t u m t o Hg m i g h t a l s o b e m e d i a t e d b y a n e x c l u s i o n m e c h a n i s m . T h e r e a p p e a r s t o b e a n i n c r e a s e o f C u i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w i t h e x p o s u r e t o H g , . T h i s i n c r e a s e o f C u i s m o s t e v i d e n t w i t h p r e e x p o s u r e t o 0 . 5 j j g H g / L f o l l o w e d b y e x p o s u r e t o 1 . 5 j u g H g / L . P e r h a p s p h y t o -p l a n k t o n i n c r e a s e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n C u l e v e l s w h e n e x p o s e d t o H g , s o t h a t c o m p e t i t i o n o f C u a n d Hg f o r C u b i n d i n g s i t e s o n e n z y m e s f a v o r s C u u p t a k e . W i t h n o p r e e x p o s u r e , C u l e v e l s w e r e l o w e r o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a n d H g l e v e l s h i g h e r . Z i n c w a s d e c r e a s e d o n b o t h t h e h i g h a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t p o o l s w i t h i n c r e a s i n g Hg e x p o s u r e . T h i s e f f e c t w a s l o w e s t a t t h e l o w e r Hg e x p o s u r e o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , b u t w a s s i m i l a r o n t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l a t a l l e x p o s u r e l e v e l s . P e r h a p s Hg d i s p l a c e s Zn f r o m t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a s p a r t o f i t s t o x i c m o d e o f a c t i o n . Z i n c w a s p r e -v i o u s l y f o u n d t o b e r e d u c e d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t n o p r o t e i n p o o l o f f i s h e x p o s e d t o Hg ( B r o w n a n d P a r s o n s , 1 9 7 8 ) . A s t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l i s Zn d e p l e t e d a t a l l Hg e x p o s u r e l e v e l s w h i l e t h e h i g h m o -l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l i s n o t , i t m a y b e t h a t t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a c t s a s a r e s e r v o i r o f Zn f o r e n z y m e s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . M e t a l l o t h i o n e i n d o e s n o t a p p e a r t o b e a m a j o r s t o r a g e m o l e c u l e f o r C u a n d Zn a s i t i s i n h i g h e r o r g a n i s m s . I n d u c k s , w h e n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n ( e n z y m e -c o n t a i n i n g ) p o o l w a s a p p a r e n t l y Zn s a t u r a t e d , e x c e s s e s o f C u a n d Zn o c c u r r e d i n m e t a l l o t h i o n e i n ( B r o w n a n d C h a t e l , 1 9 7 8 a ) . I n p h y t o p 1 a n k t o n , e x c e s s e s o f C u a n d Zn a p p e a r t o be s t o r e d i n t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . T h i s p o o l c o n t a i n s a m i n o a c i d s , n u c l e i c a c i d s a n d o t h e r c e l l u l a r b u i l d i n g b l o c k s . I n a n i m a l s , o n l y a r e l a t i v e l y s m a l l p o r t i o n o f m e t a l s a r e f o u n d i n t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . T h e p r e s e n c e o f h i g h l e v e l s o f m e t a l s i n t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l i n p h y t o p l a n k t o n i n d i c a t e s t h e p o s s i b l e p r e s e n c e o f a s t o r a g e / d e t o x i f i c a t i o n s u b s t a n c e o t h e r t h a n m e t a l l o t h i o n e i n . P e r h a p s t h e s u b s t a n c e c o n s i s t s o f t h e i r o n - b i n d i n g h y d r o x a m i c a c i d s o r s i d e r o c h r o m e s , i d e n t i f i e d s p o r a d i c a l l y i n a l g a e a n d s o m e h i g h e r p l a n t s ( Z a h n e r e t a l . , 1 9 6 2 ) ; t h e i r f u n c t i o n i n t h e s e l i f e f o r m s h a s n o t b e e n d e f i n e d . S i d e r o c h r o m e s c a n b i n d C u a n d Z n , b u t m u c h l e s s s t r o n g l y t h a n F e ( Z a h n e r e t a l . , 1 9 6 2 ) . E l u c i d a t i o n o f t h e s t r u c t u r e a n d i d e n t i t y I l l o f t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t m e t a l - b i n d i n g m o e i t y s h o u l d b e a v a l u a b l e c o n t r i b u t i o n t o d e v e l o p i n g a n u n d e r s t a n d i n g o f t h e m e t a b o l i s m o f t r a c e e l e m e n t s i n p h y t o p l a n k t o n . S u m m a r y S k e l e t o n e m a c o s t a t u m w e r e g r o w n i n a r t i f i c i a l s e a w a t e r , w i t h a n d w i t h o u t e x p o s u r e t o H g . M e r c u r y e x p o s u r e l e v e l s w e r e 0 . 1 a n d 0 . 5 j j g H g / L f o r 1 1 6 h o u r s , o r n o m e r c u r y f o r 7 0 h o u r s f o l l o w e d b y 1 . 5 j j g H g / L f o r 4 6 h o u r s , a n d 0 . 5 j j g H g / L f o r 7 0 h o u r s f o l l o w e d b y 1 . 5 j j g H g / L f o r 4 6 h o u r s . G r o w t h r a t e s w e r e d e c r e a s e d i h . p h y t o p l a n k t o n e x p o s e d t o Hg l e v e l s e q u a l t o a n d g r e a t e r t h a n 0 . 5 j j g H g / L . C e l l s w e r e h a r v e s t e d , h o m o g e n i z e d , c e n t r i f u g e d a n d t h e s u p e r n a t a n t p a s s e d t h r o u g h a c o l u m n p a c k e d w i t h S e p h a d e x G - 7 5 g e l . T h e h i g h e s t Hg l e v e l s a c c u m u l a t e d i n p h y t o -p l a n k t o n e x p o s e d t o 1 . 5 j j g H g / L a f t e r n o p r e e x p o s u r e . M o s t o f t h i s Hg a c c u m u l a t e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o -t e i n p o o l , w i t h l e s s e r a m o u n t s i n . f r a c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h e p o s i t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n i n p r e v i o u s s t u d i e s . I n p h y t o p l a n k t o n p r e e x p o s e d t o 0 . 5 j j g H g / L f o l l o w e d b y e x p o s u r e t o 1 . 5 j j g H g / L , o n l y 2 5 % o f t h e H g a c c u m u l a t e d c o m p a r e d w i t h e x p o s u r e t o 1 . 5 j j g H g / L w i t h n o p r e e x p o s u r e ; a l l o f t h e Hg a p p e a r e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . T o l e r a n c e t o Hg i s d i s c u s s e d a s b e i n g p o s s i b l y c h a r a c t e r i z e d b y a m e t a l e x c l u s i o n m e c h a n i s m . M e r c u r y e x p o s u r e r e s u l t e d i n d e c r e a s e s o f Zn i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n a n d t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l s , b u t s m a l l i n c r e a s e s o f Zn i n t h o s e f r a c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o m e t a l l o t h i o n e i n i n p r e v i o u s s t u d i e s . G r o w t h d e c r e a s e s a r e d i s c u s s e d a s p o s s i b l y d u e t o t o x i c e f f e c t s r e s u l t i n g f r o m d i s p l a c e m e n t o f Z n f r o m Z n - c o n t a i n i n g m e t a l 1 o e n z y m e s . A s m o s t C u a n d Zn o c c u r r e d i n t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l , t h e p o s -s i b i l i t y o f a s t o r a g e / d e t o x i f i c a t i o n s u b s t a n c e o t h e r t h a n m e t a l l o t h i o n e i n i s d i s c u s s e d . 1 1 3 C H A P T E R V I I I n c r e a s e s o f C d a n d t h e C d : Z n R a t i o i n t h e H i g h M o l e c u l a r W e i g h t P r o t e i n P o o l f r o m A p p a r e n t l y N o r m a l L i v e r o f T u m o r - B e a r i n g F l o u n d e r s ( P a r o p h r y s V e t u T u s ) P r e f a c e T h i s p a p e r a p p e a r e d i n M a r i n e B i o l o g y , -1 9 7 7 , V o l u m e 4 4 , p a g e s 2 0 3 - 2 0 9 , a n d w a s a u t h o r e d b y D . A . B r o w n . T h i s s t u d y e x a m i n e d w h e t h e r C d a n d t h e C d : Z n r a t i o w e r e i n c r e a s e d i n c a n c e r o u s f i s h , a s i n c a n c e r o u s h u m a n s ( M o r g a n , 1 9 7 0 , 1 9 7 1 ) ; i n a d d i t i o n t h e c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f t h e s e e l e m e n t s w a s d e t e r m i n e d . I f t h e s e c h a n g e s w e r e o n l y o n m e t a l l o t h i o n e i n , a n d n o t t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , t h e n t h e y w o u l d n ' t i n f l u e n c e t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f t h e c e l l . I f t h e s e c h a n g e s o c c u r r e d i n t h e h i g h m o -l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , t h e n t h e i n c r e a s e d C d : Z n c o u l d m e a n t h a t C d w a s a v a i l a b l e t o i n t e r f e r w i t h t h e Z n -c o n t a i n i n g e n z y m e s i n v o l v e d i n c e l l d i v i s i o n p r o c e s s e s . I n t r o d u c t i o n I t h a s b e e n w e l l e s t a b l i s h e d t h a t h e a v y m e t a l l e v e l s a r e a l t e r e d i n b o t h t u m o r o u s a n d a p p a r e n t l y n o r m a l t i s s u e s o f t u m o r - b e a r i n g a n i m a l s ( W h i t e , 1 9 2 1 ; O l s e n e t a l . , 1 9 5 4 ) . E l e v a t e d l i v e r C d , C u a n d Zn a n d k i d n e y C d a n d Zn h a v e b e e n f o u n d i n m a n y c a n c e r p a t i e n t s ( O l s o n e t a l . , 1 9 5 4 , 1 9 5 8 ; T i e t z e t a l . , 1 9 5 7 ; S a n d b e r g e t a l . , 1 9 5 8 ; M o r g a n , 1 9 7 1 ; W r i g h t a n d D o r m a n d y , 1 9 7 2 ; K e w a n d M a l l e t t , 1 9 7 4 ) . M o r g a n (.1 9 7 0 ) f o u n d i n c r e a s e d C d : Z n i n l i v e r , k i d n e y a n d 1 1 4 s e r u m o f l u n g c a n c e r p a t i e n t s . H a l s t e d a n d S m i t h ( 1 9 7 0 ) f o u n d p l a s m a Zn t o d e c r e a s e i n m a l i g n a n t d i s e a s e s , p a r t i -c u l a r l y m e t a s t a t i c c a r c i n o m a . V a l l e e ( 1 9 7 6 ) r e p o r t e d d e -c r e a s e d Zn i n w h i t e b l o o d c e l l s o f l e u k e m i a p a t i e n t s . A r n o l d a n d S a s s e ( 1 9 6 1 ) d e s c r i b e d d e c r e a s e d Zn i n d i m e t h y l a m i n o a z o b e n z e n e - i n d u c e d t u m o r s o f r a t s . O l s o n e t a l . , ( 1 9 5 4 ) , 1 9 5 8 ) r e p o r t e d d e c r e a s e d Z n i n t u m o r t i s s u e o f h u m a n c a n c e r p a t i e n t s w i t h i n c r e a s e d Zn i n u n i n v o l v e d l i v e r o f t h e s e p a t i e n t s . G o r o d i s k i i e t a l . , (1 9 5 6 ; jn_ F u r s t a n d H a r o , 1 9 6 9 ) n o t e d i n c r e a s e s i n t h e C d c o n t e n t o f t u m o r s i n d u c e d b y n o n m e t a l c a r c i n o g e n s . T i e t z e t a l . , ( 1 9 5 7 ) c o n c l u d e d t h a t c h a n g e s i n m e t a l l e v e l s o c c u r b e f o r e t u m o r f o r m a t i o n , w h i l e O l s o n e t a l . , ( 1 9 5 8 ) r e p o r t e d n o i n c r e a s e i n l i v e r Zn i n r a t s b e a r i n g t r a n s f e r r e d s u b c u t a n e o u s t u m o r s , s u g g e s t i n g t h a t a l t e r a t i o n s i n m e t a l l e v e l s a r e c a u s a l a n d d o n o t o c c u r a s a r e s u l t o f t h e c a r c i n o m a . T h i s r e p o r t s t u d i e s t h e d i s t r i b u t i o n o f C d , C u a n d Zn a m o n g s t t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n ( e n z y m e -c o n t a i n i n g ) p o o l ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) , t h e m e t a l l o t h i o n e i n p o o l a n d t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l o f l i v e r s o f t u m o r - - a n d n o n t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s ( P a r o p h r y s  v e t u l u s ) . T h e m e t h o d s u s e d w e r e s p e c i f i c f o r t h e s t u d y o f m e t a l l o t h i o n e i n ( W e b b , 1 9 7 2 a ; O l a f s o n a n d T h o m p s o n , 1 9 7 4 ) . M e t a l 1 o t h i o n e i n s a r e k n o w n t o d e t o x i f y a n d s t o r e e x c e s s e s o f h e a v y m e t a l s i n l i v e r t i s s u e ( P i s c a t o r , 1 9 6 4 ; L e b e r , 1 1 5 1 9 7 4 ) . A s e x c e s s e s o f h e a v y m e t a l o c c u r i n l i v e r d u r i n g c a r c i n o g e n e s i s , ' i t w a s t h o u g h t t h a t m e t a l l o t h i o n e i n m i g h t s o m e h o w b e i n v o l v e d i n t h e c a r c i n o g e n i c p r o c e s s . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s , L i v e r s a m p l e s w e r e o b t a i n e d f r o m t h e C a n c e r R e s e a r c h C e n t e r o f B r i t i s h C o l u m b i a , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a C a m p u s . T h e s e l i v e r s h a d b e e n r e m o v e d f r o m n o n t u m o r - a n d t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s ( P a r o p h r y s v e t u l u s ) c o l l e c t e d f r o m w a t e r s a r o u n d C r e s c e n t B e a c h , B r i t i s h C o l u m b i a , C a n a d a ; G i b s o n s L a n d i n g , B r i t i s h . C o l u m b i a ; . . a n d B e l l i n g h a m , W a s h i n g t o n , U S A . F i s h w e r e 8 0 t o 1 2 0 mm i n l e n g t h . E a c h 1 i v e r . s a m p l e . w e i g h e d a p p r o x i m a t e l y 0 . 0 5 g . L i v e r s a m p l e s w e r e h o m o g e n i z e d a n d s u s p e n d e d i n a p p r o x i m a t e l y 2 . 5 m l o f 5 0 mM T r i s c h l o r i d e b u f f e r ( p H 7 . 5 ) w i t h 3 mM o f M g C 12 - E a c h s a m p l e w a s t h o r o u g h l y r e h o m o g e n i z e d a n d c e n t r i f u g e d a t 2 7 , 0 0 0 x £ f o r 1 0 m i n . S u p e r n a t a n t s w e r e c o l l e c t e d a n d h e a t e d t o 7 0 ° C f o r 1 m i n ( W e b b , 1 9 7 2 a ; C h e r i a n , 1 9 7 4 ) . S a m p l e s w e r e t h e n r e c e n t r i f u g e d f o r 1 0 m i n a t 2 7 , 0 0 0 x £ a n d t h e s u p e r n a t a n t a p p l i e d t o a P h a r m a c i a K 9 / 6 0 c o l u m n f i l l e d w i t h S e p h a d e x G - 7 5 g e l . F i l t r a t e w a s c o l l e c t e d a s 2 . 0 m l f r a c t i o n s . A b s o r b a n c e w a s r e a d a t 2 5 0 a n d 2 8 0 rnu o n a P e r k i n E l m e r C o l e m a n 1 2 4 D s p e c t r o -p h o t o m e t e r . C d a n d Zn l e v e l s w e r e t h e n d e t e r m i n e d b y g r a p h i t e f u r n a c e o n e a c h f r a c t i o n o n a P e r k i n E l m e r 4 0 3 a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t e r . C u w a s d e t e r m i n e d b y t h e f l a m e m e t h o d w i t h a P e r k i n E l m e r 3 0 3 a t o m i c 1 1 6 a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t e r . D e u t e r i u m b a c k g r o u n d c o r -r e c t i o n w a s u s e d f o r b o t h g r a p h i t e f u r n a c e a n d f l a m e d e t e r -m i n a t i o n s . A n a l y t i c a l p r e c i s i o n f o r C d w a s Y + 1 2 . 6 % ( m e a n + s t a n d a r d d e v i a t i o n , M = 1 2 ) , f o r Zn w a s X ± 1 5 . 5 % ( m e a n + s t a n d a r d d e v i a t i o n , N = 1 3 ) a n d f o r C u w a s T+_ 3 . 3 % ( m e a n + s t a n d a r d d e v i a t i o n , N = 1 5 ) . R e s u l t s C o m p o s i t e g e l e l u t i o n p r o f i l e s , e a c h o f 3 n o n t u m o r o r t u m o r ( s k i n t u m o r ) - b e a r i n g f l o u n d e r s ( P a r o p h r y s v e t u l u s ) , a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e s 1 6 a n d 1 7 . T h e i n d i v i d u a l m e t a l l e v e l s i n e a c h t u b e o f e a c h o f t h e t h r e e m a i n p e a k s h a v e b e e n a d d e d t o g e t h e r a n d a s u m m a r y o f t h e l e v e l s o f m e t a l s i n a l l p e a k s i s p r e s e n t e d i n T a b l e 7 . E a c h p e a k h a s b e e n i d e n t i f i e d a c c o r d i n g t o i t s s i m i l a r i t y o f p o s i t i o n t o p e a k s , f o u n d i n p r e v i o u s s t u d i e s ( L e b e r , 1 9 7 4 ; O l a f s o n a n d T h o m p s o n , 1 9 7 4 ; C a s t e r l i n e a n d Y i p , 1 9 7 5 ; M a r a f a n t e , 1 9 7 6 ) . A s c a n b e s e e n f r o m T a b l e 7 , t h e m o s t s t r i k i n g c h a n g e i s t h e i n c r e a s e o f C d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n ( e n z y m e - c o n t a i n i n g ) p e a k ; a 3 . 3 - f o l d i n c r e a s e i n t u m o r - b e a r i n g f i s h r e l a t i v e t o n o n t u m o r - b e a r i n g f i s h . T h e r e a r e a l s o i n c r e a s e s o f C d o n t h e m e t a l l o t h i o n e i n a n d t h e 1 ow. m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l p e a k s . O v e r a l l , t h e r e i s a 2 - f o l d i n c r e a s e o f C d i n t i s s u e h o m o g e n a t e s u p e r n a t a n t o f t h e t u m o r - b e a r i n g f i s h . Z i n c , l i k e C d , i s i n c r e a s e d o n a l l t h r e e p e a k s , b u t m o s t m a r k e d l y o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n 11 7 F i g u r e 1 6 . P a r o p h r y s v e t u l u s . C o m p o s i t e o f g e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m l i v e r o f 3 t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s . I : h i g h , m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ; I T : m e t a l l o t h i o n e i n ; I I I : l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . 118 =3 0-5 0-4 0-3 0-2 0-1 0 1 0 + | 0 0 8 * 0 0 6 0 0 4 • 0 0 2 • 0 0 1 0 + 'g 0 0 0 8 £ 0 0 0 6 + 2 0 0 0 4 0 0 0 2 + 2 CC O t o CQ 2 0 1-5 1 0 0 5 5 10 15 FRACTION NUMBER 11 9 F i g u r e 1 7 . P a r o p h r y s v e t u l u s . C o m p o s i t e o f g e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m l i v e r o f n o n t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s . I : h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ; I I : m e t a l l o t h i o n e i n ; I I I : l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . Q. CL CJ Uj OQ QC O (/> OQ 0 5 -0-4 0-3 0-2 0- 1 0 1 0 0 0 8 0 0 6 0 0 4 0 0 2 0 0 1 0 0-008 0 0 0 6 0-004 0-002 2 0 1- 5 • • 250 nm • • 280 nm m 5 10 15 FRACTION NUMBER 20 Table 7. P a r o p h r y s v e t u l u s . D i s t r i b u t i o n o f Cd, Cu and Zn amongst p r o t e i n peaks from l i v e r c y t o p l a s m of nontumor- and t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s . Data are compi1 a t i o n s of v a l u e s from F i g u r e s 14 and 15, i n /imole g t i s s u e " ^ (wet w e i g h t ) . MW: M o l e c u l a r w e i g h t . Cd Cu Zn T o t a l High Mw M e t a l l o - Low MW T o t a l High MW M e t a l l o - Low MW T o t a l High MW M e t a l l o - Low MW pool t h i o n e i n pool pool t h i o n e i n pool pool t h i o n e i n pool Nontumor .0098 a .0022 . 0016 . 0060 1.8117 . 4750 . 3977 . 9390 .1976 .0509 .0298 .1168 f l o u n d e r s (3) (.0048) b ( . 0 0 0 3 ) (.0007) (.0046) (0.7007) (. 2221 ) (.1901) (.3019 (.0768) (.0229) (.0053) (.0575) Tumor-bearing .0198 .0071** .0029 . 0099 1.8486 . 5429 .4161 .8896 .2930 .1242* .0328 .1360 f l o u n d e r s (3) (.0093) (.0011) (.0016) (.0067) (0. 7912) (.2682) (. 1 826) (.3416) (.0379) (.0439) (.0122) (.0194; aMean. ''standard d e v i a t i o n . *P < 0 . 0 5 ; S t u d e n t ' s t t e s t . **P <0.001. 1 2 2 p e a k . H e r e i t i s i n c r e a s e d 2 . 4 - f o l d i n t u m o r - b e a r i n g f i s h . O v e r a l l t h e r e i s a 1 . 5 - f o l d i n c r e a s e i n t o t a l Zn o f t u m o r -b e a r i n g f i s h r e l a t i v e t o n o n t u m o r - b e a r i n g f i s h . I t i s a p p a r e n t t h a t i n c r e a s e s i n C d i n l i v e r o f t u m o r - b e a r i n g f i s h a r e g r e a t e r t h a n t h o s e o f Z n , a s e v i d e n c e d b y t h e i n c r e a s e d r a t i o - o f • C d : Zn o n a l l p e a k s i n l i v e r o f t u m o r - b e a r i n g f i s h r e l a t i v e t o n o n t u m o r - b e a r i n g f i s h ( T a b l e 8). I t i s a l s o c l e a r t h a t i n t u m o r - b e a r i n g f i s h a m u c h h i g h e r p r o p o r t i o n o f c y t o p l a s m i c C d a n d Zn a r e i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n ( e n z y m e - c o n t a i n i n g ) p o o l t h a n i n n o n t u m o r - b e a r i n g f i s h ( T a b l e 9 ) . C u s h o w s o n l y s m a l l i n c o n s i s t e n t c h a n g e s i n t u m o r -b e a r i n g f i s h r e l a t i v e t o n o n t u m o r - b e a r i n g f i s h ( T a b l e s 7 a n d 9 ) . D i s c u s s i o n I t h a s b e e n s h o w n p r e v i o u s l y t h a t C d i s e l e v a t e d i n l i v e r o f t u m o r - b e a r i n g o r g a n i s m s ( T i e t z e t a l . , 1 9 5 7 ; M o r g a n , 1 9 7 0 , 1 9 7 1 ) . H o w e v e r , p r e v i o u s l y i t h a s n o t b e e n k n o w n t h a t t h i s C d a p p e a r s o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p e a k ( T a b l e 7 ) . T h i s i s a n u n u s u a l f i n d i n g i n t h a t e x c e s s C d u s u a l l y a p p e a r s o n t h e m e t a l l o t h i o n e i n p e a k ( e . g . C h e r i a n , 1 9 7 4 ; L e b e r , 1 9 7 4 ; C a s t e r l i n e a n d Y i p , 1 9 7 5 ; M a r a f a n t e , 1 9 7 6 ) . T h e r e a r e , h o w e v e r , s e v e r a l c i r c u m s t a n c e s u n d e r w h i c h h i g h l e v e l s o f C d a r e f o u n d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p e a k : ( 1 ) C a p a c i t y o f t h e O r g a n i s m t o S y n t h e s i z e M e t a l l o -1 2 3 T a b l e 8 . P a r o p h r y s v e t u l u s . R a t i o o f C d : Z n i n v a r i o u s p r o t e i n p e a k s f r o m l i v e r c y t o p l a s m o f n o n t u m o r -a n d t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s . R a t i o s c a l c u l a t e d f r o m T a b l e 7 . MW: M o l e c u l a r w e i g h t C d : Z n T o t a l H i g h MW M e t a l l o - L o w MW p o o l t h i o n e i n p o o l N o n t u m o r f 1 o u n d e r s ( 3 ) . 0 5 0 . 0 4 3 . 0 5 4 . 0 5 2 T u m o r - ' b e a r i n g • f l o u n d e r s (.3) . 0 6 8 . 0 6 0 . 0 8 7 . 0 7 3 T a b l e 9 . P a r o p h r y s v e t u l u s . P e r c e n t a g e o f t o t a l C d , C u o r Zn o n e a c h o f p r o t e i n p e a k s f r o m l i v e r c y t o p l a s m o f n o n t u m o r - a n d t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r . P e r c e n t a g e s c a l c u l a t e d f r o m T a b l e 7 . MW: C d M o l e c u l a r w e i g h t . C u Z n H i g h MW p o o l M e t a l l o -t h i o n e i n L o w p o o l Mw H i g h MW p o o l M e t a l l o -t h i o n e i n L o w p o o l MW H i g h MW p o o l M e t a l l o -t h i o n e i n L o w MW p o o l N o n t u m o r f 1 o u n d e r s ( 3 ) 2 2 . 1 1 6 . 4 6 1 . 5 2 6 . 2 2 2 . 0 51 . 8 2 5 . 8 1 5 . 1 5 9 . 1 T u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s ( 3 ) 3 5 . 7 1 4 . 4 4 9 . 9 2 9 . 4 2 2 . 5 4 8 . 1 4 2 . 4 1 1 . 2 4 6 . 4 •1 2 5 t h i o n e i n i s S u r p a s s e d . W i n g e e t a l . ( 1 9 7 3 ) s t a t e d t h a t p a t h o l o g i c a l e f f e c t s o f C d a p p e a r . w h e n t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f m e t a l l o t h i o n e i n i s e x c e e d e d a n d C d a p p e a r s o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p e a k . H o w e v e r , t h e i r l e v e l s o f C d w e r e i n t h e r a n g e o f 6 0 . 0 jug Cd g t i s s u e - 1 ( w e t w e i g h t ) , w h i l e t h e l e v e l s i n t h e p r e s e n t s t u d y w e r e m a x i -m a l l y o n l y a b o u t 2 j j g C d g t i s s u e " 1 ( w e t w e i g h t ) . S t o n a r d a n d W e b b ( 1 9 7 6 ) f o u n d t h a t e v e n w i t h m u c h h i g h e r l e v e l s o f C d t h a n t h o s e f o u n d i n t h e p r e s e n t s t u d y ( 8 5 j j g C d g t i s s u e " 1 , w e t w e i g h t ) , 8 5 t o 9 0 % o f t o t a l C d w a s f o u n d o n t h e m e t a l l o t h i o n e i n p e a k . ( 2 ) C d i s D i s p l a c e d f r o m M e t a l l o t h i o n e i n b y P r e s e n c e o f H i g h L e v e l s o f A n o t h e r H e a v y M e t a l . I t i s u n l i k e l y t h a t C d w o u l d b e d i s p l a c e d f r o m m e t a l 1 o t h i o n e i n b y C u o r Z n , a s t h e i r a f f i n i t y f o r m e t a l l o t h i o n e i n i s l e s s t h a n o r t h e s a m e a s t h a t o f C d ( K a g i a n d V a l l e e , I 9 6 0 ; P u l i d o e t a l . , 1 9 6 6 ) . A l s o , d i s p l a c e m e n t o f C d f r o m m e t a l l o - . . t h i o n e i n b y C u o r Zn i s l e s s l i k e l y i n t u m o r - b e a r i n g f i s h c o m p a r e d t o n o n t u m o r - b e a r i n g f i s h a s t h e r a t i o o f C d t o t h e s e m e t a l s i s i n c r e a s e d i n t u m o r - b e a r i n g f i s h ( T a b l e 8 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e r e a r e h i g h l e v e l s o f s o m e o t h e r u n m e a s u r e d h e a v y m e t a l w h i c h c a n d i s p l a c e C d f r o m m e t a l l o -t h i o n e i n , e . g . Hg o r A g ( K a g i a n d V a l l e e , 1 9 6 0 ; P u l i d o e t a l . , 1 9 6 6 ) . ( 3 ) P r e s e n c e o f C d o n H i g h M o l e c u l a r W e i g h t P r o t e i n 1 2 6 P e a k i s D u e t o a n A g g r e g a t i o n o f M e t a l l o t h i o n e i n . A s s h o w n b y I r o n s a n d S m i t h ( 1 9 7 6 ) , m e t a l l o t h i o n e i n c a n a g g r e g a t e i n t h e p r e s e n c e o f h i g h l e v e l s o f C u , r e s u l t i n g i n a g -g r e g a t e s o f m e t a l l o t h i o n e i n i n e x c e s s o f a m o l e c u l a r w e i g h t o f 6 0 , 0 0 0 . T h i s i s u n l i k e l y i n t h e p r e s e n t i n -s t a n c e , s i n c e C u d o e s n o t a p p e a r t o b e s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d i n t u m o r - b e a r i n g f i s h ( T a b l e 7 ) . S i m i l a r l y , O l s o n e t a l . ( 1 9 5 8 ) f o u n d m o s t v a l u e s f o r C u w e r e u n a l t e r e d i n p a t i e n t s w i t h m e t a s t a t i c c a n c e r , w h i l e M o r g a n (.1 9 7 2 ) f o u n d n o i n c r e a s e s i n l i v e r C u i n p a t i e n t s w i t h b r o n c h o g e n i c c a r c i n o m a . ( 4 ) C d i s B o u n d t o a n O r g a n i c C a r c i n o g e n . A s f o u n d b y C h e n e t a l . (.1 9 7 3 ) , f r e e i o n i c Hg w i l l b e b o u n d t o m e t a l l o -t h i o n e i n a n d h e n c e d e t o x i f i e d , w h i l e m e t h y l Hg w i l l n o t b i n d t o m e t a l l o t h i o n e i n , b u t r a t h e r w i l l b e f o u n d m a i n l y o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p e a k . C h e n e t a l . c o n c l u d e t h a t m e t h y l Hg i s m u c h m o r e t o x i c , s i n c e i t i s n o t b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n . T h e i n c r e a s e d t o x i c i t y o f m e t h y l Hg w h e n f o u n d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p e a k i s i n a c c o r d a n c e w i t h d a t a o f W i n g e e t a l . ( 1 9 7 3 ) , w h o c o n c l u d e t h a t t o x i c e f f e c t s o f m e t a l s d o n o t . o c c u r u n t i l t h e s e a p p e a r i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p e a k . I t m a y b e t h a t C d i n t u m o r - b e a r i n g f i s h i s s i m i l a r l y a l k y l a t e d , b u t b y " b i o a c t i v a t e d " o r g a n i c c a r c i n o g e n s . H e n c e , l i k e m e t h y l H g , t h i s a l k y l a t e d C d w o u l d n o t o c c u r o n t h e m e t a l l o t h i o n e i n p e a k , b u t r a t h e r o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p e a k . A s 1 2 7 e x p l a i n e d b y F u r s t ( 1 9 6 3 ) , o r g a n i c c a r c i n o g e n s c a n b e e x p l a i n e d a s h e a v y m e t a l c h e l a t o r s i n c r e a s i n g h e a v y m e t a l u p t a k e . I n a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e s ( O l s o n e t a l . , 1 9 5 4 , 1 9 5 8 ; M o r g a n , 1 9 7 0 , 1 9 7 1 ) , l i v e r Zn i n t h e p r e s e n t s t u d y u s i n g P a r o p h r y s v e t u l u s w a s e l e v a t e d i n t u m o r - b e a r i n g o r g a n i s m s r e l a t i v e t o n o n t u m o r - b e a r i n g o r g a n i s m s ( T a b l e 7 ) . I n n o r m a l o r g a n i s m s , e x c e s s Zn i s u s u a l l y f o u n d o n t h e m e t a l l o t h i o n e i n p e a k ( W e b b , 1 9 7 2 a , b ; D a v i e s e t a l . , 1 9 7 3 ) . H o w e v e r , i n t h i s i n s t a n c e e x c e s s Zn i s f o u n d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , p o s s i b l y f o r t h e s a m e r e a s o n s a s d i s c u s s e d f o r C d . O f s i g n i f i c a n c e m a y b e t h e s o u r c e o f t h e i n c r e a s e d l i v e r C d a n d Zn i n t u m o r - b e a r i n g o r g a n i s m s . A s C d i s n o t a n o r m a l c o n s t i t u e n t o f m o s t t i s s u e s ( e x c e p t w h e n b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n i n l i v e r a n d k i d n e y ) , i t i s p r o b a b l e t h a t b o d y b u r d e n s o f C d a r e i n c r e a s e d a s p a r t o f t h e c a r c i n o -g e n i c p r o c e s s . ( T i e t z e t a l . , 1 9 5 7 ; S t r a i n e t a l . , 1 9 7 2 ) . I t h a s b e e n f o u n d t h a t C d i s i n c r e a s e d i n l i v e r , k i d n e y , b l o o d a n d t u m o r t i s s u e o f t u m o r - b e a r i n g o r g a n i s m s ( G o r o -d i s k i i e t a l . , 1 9 5 6 , j _ n _ F u r s t a n d H a r o , 1 9 6 9 ; T i e t z e t a l . , 1 9 5 7 ; M o r g a n , 1 9 7 0 ) . Z i n c o n t h e o t h e r h a n d , i s i n c r e a s e d i n l i v e r o f t u m o r - b e a r i n g o r g a n i s m s b u t i s d e c r e a s e d i n t u m o r t i s s u e a n d b l o o d ( O l s o n e t a l . , 1 9 5 4 , 1 9 5 8 ; H e r r i n g e t a l . , 1 9 6 0 ; A r n o l d a n d S a s s e , 1 9 6 1 ; M o r g a n , 1 9 7 0 ; V a l l e e , 1 9 7 6 ) . T h u s , i t a p p e a r s t h a t i n t h e c a r c i n o g e n i c p r o c e s s , 1 2 8 C d a n d Zn i n c r e a s e i n t h e l i v e r , b u t C d m o r e s o t h a n Z n , s o t h a t t h e C d : Z n r a t i o i s i n c r e a s e d i n t h e l i v e r . A s Z n i s d e c r e a s e d i n b l o o d a n d t u m o r t i s s u e , i t m i g h t b e t h a t Zn i s t r a n s f e r r e d t o t h e l i v e r f r o m t h e s e a r e a s d u r i n g c a r c i n o g e n e s i s . C o n c u r r e n t l y , Cd i s i n c r e a s e d i n b l o o d a n d t u m o r t i s s u e s o t h a t e v e n h i g h e r C d : Z n r a t i o s w o u l d b e e x p e c t e d i n t u m o r t i s s u e t h a n i n t h e l i v e r . M o r g a n (.1 9 7 0 ) f o u n d l i v e r C d a n d r e n a l C d a n d Z n i n c r e a s e d i n l u n g c a n c e r p a t i e n t s . T h e C d : Z n r a t i o w a s i n c r e a s e d 47% i n l i v e r a n d 2 2 % i n k i d n e y . I n a s u b s e q u e n t s t u d y , M o r g a n ( 1 9 7 1 ) f o u n d b o t h C d a n d Z n i n c r e a s e d i n l i v e r o f l u n g c a n c e r p a t i e n t s , w i t h a 2 5 % i n c r e a s e i n t h e C d : Z n r a t i o . T h e p r e s e n t s t u d y f o u n d a 3 6 % i n c r e a s e o f t h e l i v e r C d : Z n r a t i o a n d a 4 0 % i n c r e a s e o f t h i s r a t i o i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p e a k . W i n g e e t a l . ( 1 9 7 3 ) , L e b e r ( 1 9 7 4 ) a n d I r o n s a n d S m i t h ( 1 9 7 6 ) h a v e f o u n d t h a t t o x i c e f f e c t s o f C d o c c u r w h e n i t a p p e a r s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n f r a c t i o n . S i n c e e n z y m e s o c c u r i n t h i s f r a c t i o n ( W h i t e e t a l . , 1 9 6 8 ) a n d h e a v y m e t a l s a r e k n o w n t o i n t e r f e r e w i t h e n z y m a t i c f u n c t i o n ( B r e m n e r , 1 9 7 4 ; F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ) , i t i s r e a s o n -a b l e t o c o n c l u d e t h a t , a t l e a s t i n p a r t , t h o s e h e a v y m e t a l s n o t b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n a n d h e n c e p r e s e n t i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p e a k , e x e r t t o x i c e f f e c t s b y b i n d i n g e n z y m e s . I t m a y b e t h a t t h e i n c r e a s e d C d : Z n r a t i o i n t h e h i g h 1 2 9 m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s r e s u l t s i n i n t e r f e r e n c e o f C d w i t h Zn i n Z n - r e q u i r i n g e n z y m e s i n p r e t u m o r t i s s u e . H o r v a t h ( 1 9 7 6 ) s t a t e s t h a t i t i s p r o b a b l e t h a t C d c o m p e t e s w i t h Zn , e x e r t i n g i t s t o x i c i t y t h r o u g h i n a c t i v a t i o n o f s u l f h y d r y l - c o n t a i n i n g e n z y m e s . V a l l e e ( 1 9 7 6 ) s a y s t h a t Zn h a s a r o l e i n e n z y m e s e s s e n t i a l t o n u c l e i c a c i d m e t a b o l i s m a n d i n r i b o n u c l e i c a c i d a n d d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d p o l y m e r a s e s i n n o r m a l t i s s u e a s w e l l a s r i b o n u c l e i c a c i d - d e p e n d e n t d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d p o l y m e r a s e s f r o m t u m o r v i r u s e s . I t m a y b e t h a t C d i n t e r f e r e s w i t h Zn b i n d i n g s i t e s o n t h e s e e n z y m e s w h i c h a r e i n s t r u m e n t a l i n c o n t r o l o f c e l l d i v i s i o n . S c h r o e d e r e t a l . ( 1 9 6 1 ) s u g g e s t t h a t i f C d i s a n e s s e n t i a l m e t a l , i t s p r i m a r y a c t i o n i s t h a t o f i n h i b i t i o n f o r i t i s a p o t e n t i n h i b i t o r o f m a n y e n z y m e s . T h e s e e n z y m e s a r e r e n d e r e d n o n f u n c t i o n a l b y c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s b r o u g h t a b o u t b y b i n d i n g w i t h h e a v y m e t a l s p o s s e s s i n g p r o p e r t i e s d i f f e r e n t f r o m t h e i r r e q u i r e d m e t a l s ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ) . N o n f u n c t i o n i s d u e t o t h e f a c t t h a t , a f t e r c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s , s u b s t r a t e m o l e c u l e s n o l o n g e r f i t b i n d i n g s i t e s o n t h e e n z y m e s ( B r e m n e r , 1 9 7 4 ; F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ) . A l t e r n a t i v e l y , d y s f u n c t i o n c a n r e s u l t v i a a s p l i t t i n g o f e n z y m e s i n t o s u b u n i t s . G e r h a r t a n d S c h a c h m a n ( 1 9 6 5 ) f o u n d t h a t a s p a r t i c t r a n s c a r b a m y l a s e f r o m E s c h e r i c h i a c o l i c a n b e s p l i t i n t o c a t a l y t i c a n d r e g u l a t o r y s u b u n i t s b y H g , w h i c h m i g h t i n t e r -f e r e w i t h Zn w h i c h h o l d s s u b u n i t s t o g e t h e r ( G r i f f i n e t a l . , 1 3 0 1 9 7 3 ) . O n c e t h e c a t a l y t i c s u b u n i t i s f r e e d f r o m t h e r e g u l a -t o r y s u b u n i t , i t h a s h i g h a c t i v i t y a n d i s n o l o n g e r s u b j e c t t o f e e d b a c k c o n t r o l . J o v i n e t a l . ( 1 9 6 9 ) h a v e f o u n d t h a t Z n - c o n t a i n i n g d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d p o l y m e r a s e f r o m E^ . c o l i c a n a l s o b e s p l i t i n t o s u b u n i t s b y H g . F l i c k e t a l . ( 1 9 7 1 ) r e v i e w e d t h e l i t e r a t u r e o n C d . T h e y c o n c l u d e t h a t C d i s a p o t e n t c a r c i n o g e n , w h o s e e f f e c t s c a n b e c o u n t e r a c t e d b y Z n . F u r t h e r , t h e y c o n c l u d e t h a t t h e i m p o r t a n t v a r i a b l e m a y b e t h e C d : Z n r a t i o . K o l o n e l ( 1 9 7 6 ) s t a t e s t h a t C d a c t s a s a c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r o f Z n a n d p r o d u c e s m a l i g n a n t t u m o u r s i n a n i m a l s . Z i n c h a s b e e n s h o w n t o p r e v e n t c a n c e r f r o m o c c u r r i n g i n r a t s , m i c e a n d h a m s t e r s w h e n a d m i n i s t e r e d s i m u l t a n e o u s l y w i t h t h e i n o r g a n i c c a r c i n o g e n C d o r w i t h t h e o r g a n i c c a r c i n o g e n d i m e t h y l a m i n o a z o b e n z e n e ( G u n n e t a l . , 1 9 6 3 , 1 9 6 4 ; P o s w i l l o a n d C o h e n , 1 9 7 1 ; C i a p p a r e l l i e t a l . , 1 9 7 2 ; D u n c a n a n d D r e o s t i , 1 9 7 5 ) . I t d e m o n s t r a t e d t h e s a m e p r e v e n t i v e e f f e c t w h e n g i v e n f r o m a n e a r l y a g e t o m i c e w h i c h w o u l d o t h e r w i s e h a v e d e v e l o p e d s p o n t a n e o u s m a m m a r y g l a n d t u m o r s ( B i s c h o f f a n d L o n g , 1 9 3 9 ) . F u r t h e r , Z n i n h i b i t e d t h e d e v e l o p m e n t a n d s p r e a d o f t u m o r t i s s u e t r a n s p l a n t e d i n t o m i c e a n d r a t s ( D u n c a n e t a l . , 1 9 7 4 ; D u n c a n a n d D r e o s t i , 1 9 7 5 , 1 9 7 6 ; W o s t e r e t a l . , 1 9 7 5 ) . T h e C d : Z n r a t i o h a s b e e n s h o w n i n t h i s a n d o t h e r s t u d i e s t o b e i n c r e a s e d i n t u m o r - b e a r i n g o r g a n i s m s . T h e f a c t t h a t i n t h i s s t u d y t h e C d : Z n r a t i o h a s b e e n s h o w n t o 1 3 1 b e i n c r e a s e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r p r o t e i n p o o l o f t u m o r -b e a r i n g o r g a n i s m s s u g g e s t s t h a t t h e r e i s a p o s s i b i l i t y t h a t i n c a r c i n o g e n e s i s , C d i s i n t e r f e r i n g w i t h Z n - c o n t a i n i n g e n z y m e s i n v o l v e d i n c e l l d i v i s i o n p r o c e s s e s . T h u s , h i g h l e v e l s o f Zn a d m i n i s t e r e d w i t h a c a r c i n o g e n m i g h t p r e v e n t c a r c i n o m a f r o m o c c u r r i n g b y s u c c e s s f u l l y c o m p e t i n g w i t h i n c r e a s e d l e v e l s o f C d f o r b i n d i n g s i t e s o n t h e s e e n z y m e s . S u m m a r y I t i s e v i d e n t f r o m p r e v i o u s s t u d i e s t h a t h e a v y m e t a l . -l e v e l s a r e c h a n g e d i n t u m o r - b e a r i n g o r g a n i s m s r e l a t i v e t o n o n t u m o r - b e a r i n g o r g a n i s m s , p a r t i c u l a r l y i n a p p a r e n t l y n o r m a l l i v e r t i s s u e . T h i s s t u d y c o n s i d e r e d t h e p o s s i b l e r o l e o f me t a l l o t h i o n e i n s i n b i n d i n g C d , C u o r Zn i n t h e l i v e r o f t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s ( P a r o p h r y s v e t u l u s ) . C a d m i u m a n d z i n c w e r e n o t i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y o n t h e m e t a l l o t h i o n e i n p e a k , b u t w e r e i n c r e a s e d 3 . 3 - a n d 2 . 4 -f o l d , r e s p e c t i v e l y , o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p e a k . I n a d d i t i o n , t h e C d : Z n r a t i o w a s i n c r e a s e d b y 4 0 % o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p e a k . R e s u l t s a r e d i s -c u s s e d i n t e r m s o f c o m p e t i t i o n o f C d a n d Zn f o r Z n - r e q u i r i n g e n z y m e s i n v o l v e d i n n u c l e i c a c i d m e t a b o l i s m . P o s s i b l e r e a s o n s f o r e x c e s s Cd o c c u r r i n g o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p e a k r a t h e r t h a n o n t h e m e t a l l o t h i o n e i n p e a k a r e d i s c u s s e d . C o p p e r l e v e l s d i d n o t c h a n g e . 1 3 2 C H A P T E R V I I I I n c r e a s e s o f C d a n d t h e C d : Z n R a t i o i n t h e H i g h M o l e c u l a r W e i g h t P r o t e i n P o o l f r o m A p p a r e n t l y N o r m a l K i d n e y o f T e r m i n a l H u m a n C a n c e r P a t i e n t s P r e f a c e T h i s s t u d y w a s d o n e b y D. A . B r o w n a n d B . K n i g h t ( 1 9 7 8 ) . U n f o r t u n a t e l y , t h e s a m p l e s i z e i s o n l y 2 f o r c o n t r o l s o r c a n c e r o u s h u m a n s . W h e n a l a r g e r s a m p l e s i z e i s a t t a i n e d , t h i s p a p e r w i l l b e s u b m i t t e d f o r p u b l i c a t i o n . T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o i n v e s t i g a t e i f c h a n g e s i n t h e c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f C d a n d Zn w e r e s i m i l a r i n c a n c e r o u s f i s h a n d h u m a n s . T h e f a c t t h a t t h e y d o p r o v e t o b e t h e s a m e , s u g g e s t s t h a t s u c h c h a n g e s a r e c o m m o n t o c a n c e r o u s o r g a n i s m s , a n d t h e r e f o r e m a y b e e t i o l o g i c i n c a n c e r . I n t r o d u c t i o n R e c e n t l y , B r o w n ( 1 9 7 7 ) h a s n o t e d i n c r e a s e s o f C d a n d t h e C d : Z n r a t i o i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s . O c c u r r e n c e s o f h i g h l e v e l s o f C d i n t h i s p o o l m a y b e u n i q u e t o c a r c i n o m a , s i n c e e x c e s s e s o f C d a r e u s u a l l y b o u n d a n d d e t o x i f i e d b y m a t a l l o t h i o n e i n i n l i v e r a n d k i d n e y t i s s u e ( C h e r i a n , 1 9 7 4 ; C a s t e r l i n e a n d Y i p , 1 9 7 5 ; M a r a f a n t e , 1 9 7 6 ) . P r e v i o u s l y , M o r g a n ( 1 9 7 0 ) f o u n d i n c r e a s e s o f b o t h C d a n d Zn a n d t h e C d : Z n r a t i o i n t h e l i v e r , k i d n e y a n d s e r u m o f l u n g c a n c e r p a t i e n t s . I n -c r e a s e s o f t h e C d : Z n r a t i o i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t 1 3 3 p r o t e i n p o o l m a y b e o f s i g n i f i c a n c e s i n c e e n z y m e s o c c u r i n t h i s p o o l . O f p a r t i c u l a r i n t e r e s t i n t h e s t u d y o f c a r c i n o m a , a r e t h e Z n - c o n t a i n i n g e n z y m e s i n v o l v e d i n n u c l e i c a c i d m e t a b o l i s m a n d c e l l d i v i s i o n p r o c e s s e s ; e . g . , DNA p o l y m e r a s e , RNA p o l y m e r a s e , r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e , a n d t h y m i d i n e k i n a s e ( V a l l e e , 1 9 7 6 ; D u n c a n a n d D r e o s t i , 1 9 7 6 ) . C a d m i u m e x e r t s i t s t o x i c a c t i o n b y r e p l a c i n g Zn i n t h e s e e n z y m e s , s o t h a t t h e i r f u n c t i o n i s i n h i b i t e d o r c h a n g e d d u e t o c o n f o r m a t i o n a l o r Q u a t e r n a r y c h a n g e s ( F l i c k e t a l . , 1 9 7 1 ; F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ; B r o w n , 1 9 7 7 ) . T h e p r e s e n t s t u d y w i l l e x a m i n e t i s s u e f r o m h u m a n s w i t h c a r c i n o m a , t o s e e i f i n c r e a s e s o f t h e C d : Z n r a t i o i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l m a y b e a c o m m o n f a c t o r i n c a r c i n o m a . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s F o u r k i d n e y s a m p l e s w e r e o b t a i n e d f r o m V a n c o u v e r G e n e r a l H o s p i t a l a n d R i c h m o n d G e n e r a l H o s p i t a l . O f t h e s e , t w o c a m e f r o m c a n c e r v i c t i m s a n d t w o f r o m p a t i e n t s d y i n g f r o m u n r e l a t e d c a u s e s . T h e a g e o f t h e p a t i e n t s i s u n k n o w n . B o t h c a n c e r p a t i e n t s h a d g e n e r a l i z e d m e t a s t a s i s a t d e a t h b u t t h e k i d n e y s w e r e n o t b e l i e v e d t o b e a f f e c t e d . T w o g r a m s o f k i d n e y t i s s u e w e r e h o m o g e n i z e d f o r 5 m i n u t e s i n 4 . 5 m l o f 0 . 9 % ( W / V ) N a C l a t a s e t t i n g o f 6 o n a T R I - R S T I R - R M o d e l S 6 3 C l a b o r a t o r y m o t o r e q u i p p e d w i t h a t e f l o n p e s t l e . H o m o g e n a t e s w e r e c e n t r i f u g e d a t 2 7 , 0 0 0 x £ f o r 1 0 m i n u t e s i n a S o r v a l l R C 2 - B c e n t r i f u g e . S u p e r -n a t a n t s w e r e c o l l e c t e d a n d t h e p e l l e t s w e r e r e h o m o g e n i z e d 1 3 4 f o r 3 m i n u t e s i n 2 . 5 m l o f 0 . 9 % N a C l . T h e s e w e r e c e n t r i -g u g e d a t 2 7 , 0 0 0 x £ f o r 1 0 m i n u t e s a n d s u p e r n a t a n t s c o m b i n e d w i t h p r e v i o u s s u p e r n a t a n t s . C o m b i n e d s u p e r n a t a n t s w e r e t h e n p l a c e d i n a 7 0 ° C w a t e r b a t h f o r 5 m i n u t e s t o c l e a r c e l l u l a r d e b r i s v i a h e a t p r e c i p i t a t i o n . T h e s e w e r e t h e n r e c e n t r i f u g e d a t 2 7 , 0 0 0 x £ f o r 10 m i n u t e s . R e s u l t i n g s u p e r n a t a n t s w e r e a p p l i e d t o a P h a r m a c i a c o l u m n ( 1 . 6 x 1 0 0 c m ) p a c k e d w i t h G - 7 5 g e l , a n d e l u t e d w i t h 0 . 0 1 M N H 4 H C 0 3 b u f f e r . P r o t e i n w a s r e a d a t 2 5 0 a n d 2 8 0 nm o n a P e r k i n E l m e r 1 2 4 D s p e c t r o p h o t o m e t e r o n e a c h 1 5 m l f r a c t i o n t o e s t a b l i s h t h e p o s i t i o n o f t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , m e t a l l o t h i o n e i n a n d . t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l ( B r o w n , 1 9 7 7 ; B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . C o p p e r a n d Zn w e r e d e t e r m i n e d b y f l a m e a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t r y w h i l e C d w a s d o n e b y g r a p h i t e f u r n a c e a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t r y . B o t h e m p l o y e d d e u t e r i u m a r c b a c k g r o u n d c o r r e c t i o n . T o t a l m e t a l l e v e l s f o r e a c h p e a k w e r e d e t e r m i n e d b y s u m m a t i o n o f t h e i n d i v i d u a l m e t a l l e v e l s i n e a c h t u b e o f e a c h p e a k . R e s u l t s C o m p o s i t e g e l e l u t i o n p r o f i l e s o f n o n c a n c e r o r c a n c e r p a t i e n t s a r e s h o w n i n F i g u r e s 1 8 a n d 1 9 . W h i l e b o t h h a v e s i m i l a r t o t a l Cd l e v e l s , i n n o n c a n c e r p a t i e n t s m o s t o f t h i s Cd o c c u r s o n m e t a l l o t h i o n e i n . I n c a n c e r p a t i e n t s m o r e o c c u r s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( T a b l e s 1 0 a n d 1 1 ) . Z i n c l e v e l s w e r e h i g h e r i n c a n c e r p a t i e n t s b u t 1 3 5 F i g u r e 1 8 . C o m p o s i t e o f g e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m k i d n e y s o f 2 t e r m i n a l n o n c a n c e r p a t i e n t s . I : h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ; I I : m e t a l l o -t h i o n e i n ; I I I : l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o -p l a s m i c p o o l . 1 3 7 F i g u r e 1 9 . C o m p o s i t e o f g e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m k i d n e y s o f 2 t e r m i n a l c a n c e r p a t i e n t s . I : h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ; I I : m e t a l l o -t h i o n e i n ; I I I : l o w m o l e c u l a r w e i g h t ' c y t o -p l a s m i c p o o l . 138 ^ .15 D ) .10 E ^ .05 U 3 0.4 o> 0.3 £ 0.2 n 0.1 3 0.8 o> 0.6 § 0.4 "D (J 0.2 o£4.0 ^ 2 3 - 0 %o2D o t o 1.0 n 1 — i — i — i — i — i — i — i — i — i — i 5 10 15 F r a c t i o n N u m b e r Table 10. D i s t r i b u t i o n of Cd, Cu and Zn amongst c y t o p l a s m i c pools from kidney t i s s u e of c a n c e r and noncancer p a t i e n t s . Data are compi1 a t i o n s of va1ues from F i g u r e s 18 and 19 i n >imole g t i s s u e " 1 (wet w e i g h t ) . MW: m o l e c u l a r w e i g h t . Cd Cu Zn T o t a l High MW pool Metal l o -th i one i n Low MW pool T o t a l High MW pool Metal l o -th ione i n Low MW pool T o t a l High MW pool M e t a l l o -t h i o n e i n Low MW pool Noncancer p a t i e n t s (2) .192 a .0.65 .126 .001 .149 .044 .050 .055 .115 .076 .032 .007 Cancer p a t i e n t s (2) .186 .096 .084 .006 .147 .046 .048 . 053 .176 .072 .014 .090 aMean. co LO T a b l e 1 1 . P e r c e n t a g e o f t o t a l C d , C u o r Zn o n v a r i o u s c y t o p l a s m i c p o o l s f r o m k i d n e y t i s s u e o f c a n c e r a n d n o n c a n c e r p a t i e n t s . P e r c e n t a g e s c a l c u l a t e d f r o m T a b l e 1 0 . MW: m o l e c u l a r w e i g h t . C d C u Zn H i g h MW p o o l M e t a l l o -t h i o n e i n L o w MW p o o l H i g h MW p o o l M e t a l l o -t h i o n e i n L o w MW p o o l H i g h MW p o o l M e t a l l o -t h i o n e i n L o w MW p o o l N o n c a n c e r p a t i e n t s ( 2 ) 3 3 . 9 6 5 . 6 0 . 5 2 9 . 5 3 3 . 6 3 6 . 9 6 6 . 1 2 7 . 8 6 . 1 C a n c e r p a t i e n t s ( 2 ) 51 . 6 4 5 . 2 3 . 2 3 1 . 3 3 2 . 7 3 6 . 0 4 0 . 9 8 . 0 51 . 5 1 4 1 m o s t o f t h i s i n c r e a s e w a s i n t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l ( F i g u r e s 1 8 a n d 1 9 ; T a b l e s 1 0 a n d 1 1 ) . T h e r a t i o o f C d : Z n w a s i n c r e a s e d i n c a n c e r p a t i e n t s i n b o t h t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a n d m e t a l l o t h i o n e i n ( T a b l e 1 2 ) . C o p p e r l e v e l s a p p e a r e d t o b e u n c h a n g e d b e -t w e e n n o n c a n c e r a n d c a n c e r v i c t i m s . P i s c u s s i o n T h e i n c r e a s e o f t h e C d : Z n r a t i o f o u n d i n h u m a n k i d n e y s o f c a n c e r p a t i e n t s i n t h e p r e s e n t s t u d y , i s s i m i l a r t o c h a n g e s f o u n d i n t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s ( B r o w n , 1 9 7 7 ) . I n b o t h i n s t a n c e s t h e r e w a s a n i n c r e a s e i n t h e p o r t i o n o f c y t o p l a s m i c C d o c c u r r i n g i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l r e l a t i v e t o t h e p o r t i o n b o u n d b y m e t a l l o t h i o n e i n . C a d m i u m b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n i s e s s e n t i a l l y b i o l o g i c a l y i n e r t i n t h a t i t i s n o t a v a i l a b l e t o p r o d u c e t o x i c e f f e c t s v i a d i s p l a c i n g Zn f r o m Z n - c o n t a i n i n g m e t a l 1 o e n z y m e s . S i n c e t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l c o n t a i n s e n z y m e s , t h e e x c e s s C d o c c u r r i n g i n t h i s p o o l i n c a r c i n o g e n e s i s , i s l i k e l y a v a i l a b l e t o a f f e c t t h e Z n - c o n t a i n i n g e n z y m e s i n v o l v e d i n c e l l u l a r d i v i s i o n p r o c e s s e s . I n t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s t h e r e w e r e i n c r e a s e s i n t h e l e v e l s o f Zn i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( B r o w n , 1 9 7 7 ) . T h i s d i d n o t o c c u r i n c a n c e r p a t i e n t s i n t h e p r e s e n t s t u d y . H o w e v e r , i n t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s t h e r e w a s a 3 . 2 - f o l d i n c r e a s e o f C d i n t h i s p o o l , w h i l e i n c a n c e r p a t i e n t s , t h e r e w a s a 1 . 5 - f o l d i n c r e a s e . T h e r e f o r e , 1 4 2 T a b l e 1 2 . R a t i o o f C d : Z n i n c y t o p l a s m i c p o o l s f r o m k i d n e y t i s s u e o f c a n c e r a n d n o n c a n c e r p a t i e n t s . R a t i o s c a l c u l a t e d f r o m v a l u e s i n F i g u r e s 1 8 a n d 1 9 i n m o l a r u n i t s . MW: m o l e c u l a r w e i g h t . C d : Z n T o t a l H i g h MW M e t a l l o - L o w MW p o o l t h i o n e i n p o o l N o n c a n c e r p a t i e n t s ( 2 ) 1 . 1 9 0 . 6 5 2 . 5 9 0 . 1 3 C a n c e r p a t i e n t s ( 2 ) 1 . 5 8 1 . 1 1 1 2 . 0 0 0 . 0 4 1 4 3 a l t h o u g h C d w a s i n c r e a s e d m o r e i n t h i s p o o l i n f l o u n d e r s , t h e r e w a s a l a r g e r i n c r e a s e o f t h e C d : Z n r a t i o i n h u m a n s ( 1 . 7 - f o l d ) c o m p a r e d w i t h f l o u n d e r s ( 1 . 4 - f o l d ) . I n b o t h h u m a n s w i t h c a n c e r , a n d t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s , C u l e v e l s w e r e u n c h a n g e d . T h u s t h e o v e r a l l c h a n g e i n t r a c e e l e m e n t s c o m m o n t o b o t h h u m a n s a n d f l o u n d e r s w i t h c a r c i n o m a , w a s a n i n c r e a s e o f t h e C d : Z n r a t i o i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . S i n c e t h e l e v e l o f d y s f u n c t i o n o f Z n - c o n t a i n i n g e n z y m e s , s u c h a s t h o s e i n -v o l v e d i n c e l l d i v i s i o n , w i l l d e p e n d u p o n a c o m p e t i t i o n o f C d a n d Zn f o r b i n d i n g s i t e s i n t h e s e e n z y m e s ( F l i c k e t a l . , 1 9 7 1 ) , i n c r e a s e s o f t h e C d : Z n r a t i o m a y b e i m -p o r t a n t f o r d e g e n e r a t i v e c h a n g e s s u c h a s t h o s e f o u n d i n c a r e i n o g e n e s i s . Summa r y T o t a l c y t o p l a s m i c C d l e v e l s w e r e s i m i l a r i n h u m a n c a n c e r v i c t i m s a n d c o n t r o l s b u t i n c a n c e r v i c t i m s t h e r e w a s a 1 . 5 - f o l d i n c r e a s e o f t h e p o r t i o n o f t h i s C d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . I n c o n t r o l s m o s t C d w a s f o u n d b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n . T o t a l c y t o p l a s m i c Zn l e v e l s w e r e i n c r e a s e d a s a r e s u l t o f i n c r e a s e s o f Zn i n t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l o f c a n c e r v i c t i m s . C o p p e r l e v e l s w e r e u n c h a n g e d . R e s u l t s a r e d i s -c u s s e d i n t e r m s o f a c o m p e t i t i o n o f C d a n d Zn f o r b i n d i n g s i t e s i n Z n - r e q u i r i n g e n z y m e s i n v o l v e d i n c e l l d i v i s i o n p r o c e s s e s . 1 4 4 C H A P T E R I X D e c r e a s e s o f C o p p e r a n d Z i n c i n t h e H i g h M o l e c u l a r W e i g h t P r o t e i n P o o l f r o m L i v e r s o f M i c e E x p o s e d t o D i e t h y l n i t r o s a m i n e , W i t h a n d W i t h o u t C a d m i u m o r Z i n c S u p p l e -m e n t a t i o n . P r e f a c e T h i s p a p e r w a s a u t h o r e d b y D. A . B r o w n a n d A . Y . C h a n ( 1 9 7 8 ) , a n d s u b m i t t e d t o t h e J o u r n a l o f t h e N a t i o n a l C a n c e r I n s t i t u t e . , T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o s e e i f a n o r g a n i c c a r c i n o g e n ( D E N ) c o u l d i n d u c e c h a n g e s i n t h e C d : Z n r a t i o s i m i l a r t o t h o s e f o u n d i n c a n c e r o u s f i s h ( B r o w n , 1 9 7 7 ) a n d h u m a n s ( B r o w n a n d K n i g h t , 1 9 7 8 ) . . H o w e v e r , a l l m i c e i n t h i s s t u d y w e r e s a m p l e d b e f o r e t u m o r s d e v e l o p e d ( a f t e r 1 2 . 5 w e e k s e x p o s u r e ) , s i n c e 1 0 w e e k s w a s t h e t i m e r e p o r t e d a s n e c e s s a r y i n o t h e r s t u d i e s , f o r t u m o r s t o b e i n d u c e d i n DEN e x p o s e d m i c e . T h e r e w a s n o i n c r e a s e o f C d : Zn i n p r e t u m o r o u s l i v e r s o f m i c e a d m i n i s t e r e d D E N . H o w e v e r , C d a d m i n i s t e r e d w i t h DEN d i d a p p e a r i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a n d d i d a d v a n c e p r e t u m o r o u s h i s t o l o g i c a l c h a n g e s . T h e m a i n e f f e c t o f DEN a p p e a r e d t o b e t o d e c r e a s e l e v e l s o f C u a n d Zn i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . " I n t r o d u c t i o n P r e v i o u s s t u d i e s h a v e i n d i c a t e d t h a t t r a c e h e a v y m e t a l s s u c h a s C d , C u a n d Zn a r e a l t e r e d i n t u m o r - b e a r i n g o r g a n i s m s . I t a p p e a r s w i t h , o c c u r r e n c e s o f c a n c e r s o t h e r t h a n c a n c e r o f t h e l i v e r , t h a t l i v e r C d , Zn a n d s o m e t i m e s C u a r e i n c r e a s e d ( O l s o n e t a l . , 1 9 5 4 , 1 9 5 8 ; K o c h e t a l . , 1 9 7 5 ; T e i t z e t a l . , 1 9 5 7 ; S a n d b e r g e t a l . , 1 9 5 8 ; M o r g a n , 1 9 7 0 , 1 9 7 1 , 1 9 7 2 ; B r o w n , 1 9 7 7 ) . N o t a b l e y , a l t h o u g h b o t h C d a n d Zn a r e i n -c r e a s e d , t h e r e i s a n i n c r e a s e i n t h e C d : Z n r a t i o i n n o n -t u m o r o u s l i v e r a n d k i d n e y o f t u m o r - b e a r i n g o r g a n i s m s ( M o r g a n , 1 9 7 0 , 1 9 7 1 ; F l i c k , 1 9 7 1 ; B r o w n , 1 9 7 7 ) . T u m o r o u s t i s s u e o t h e r t h a n f r o m l i v e r u s u a l l y h a s d e c r e a s e d l e v e l s o f Zn . ( . V a i l e e , . 1 9 7 6 ; L i n , 1 9 7 7 ) b u t i n c r e a s e d l e v e l s o f C u ( W h i t e , 1 9 2 1 ) a n d C d ( T e i t z e t a l . , 1 9 5 7 ; G o r o d i s k i i e t . , 1 9 5 6 : i n F u r s t a n d H a r o , 1 9 6 9 ) . W i t h t u m o r s i n t h e l i v e r , s o m e - s t u d i e s r e p o r t i n -c r e a s e d Zn i n a p p a r e n t l y n o r m a l l i v e r t i s s u e s u r r o u n d i n g t h e t u m o r s ( O l s o n e t a l . , 1 9 5 4 , 1 9 5 8 ; W r i g h t a n d D o r m a n d y , 1 9 7 2 ) . O t h e r s r e p o r t d e c r e a s e d ( A r n o l d a n d S a s s e , 1 9 6 1 ) o r u n c h a n g e d ( K e w a n d M a l l e t t , 1 9 7 4 ) Zn i n s u r r o u n d i n g l i v e r t i s s u e . Z i n c i n l i v e r t u m o r s i s c o n s i s t e n t l y r e -p o r t e d t o b e d e c r e a s e d ( O l s o n e t a l . , 1 9 5 4 , 1 9 5 8 ; A r n o l d a n d S a s s e , 1 9 6 1 ; W r i g h t a n d D o r m a n d y , 1 9 7 2 ; K e w a n d M a l l e t t , 1 9 7 4 ) . C o p p e r l e v e l s a r e n o r m a l ( O l s o n e t a l . , 1 9 5 8 ) o r d e c r e a s e d . ( A r n o l d a n d S a s s e , 1 9 6 1 ) i n l i v e r t i s s u e s u r -r o u n d i n g l i v e r t u m o r s . C o p p e r l e v e l s i n l i v e r t u m o r s h a v e b e e n r e p o r t e d b o t h t o b e d e c r e a s e d ( O l s o n e t a l . , 1 9 5 8 ) a n d i n c r e a s e d ( A r n o l d a n d S a s s e , 1 9 6 1 ) . C h a n g e s o f m e t a l l e v e l s c a n b e i n d u c e d b y o r g a n i c c a r c i n o g e n s . G o r o d i s k i i e t a l . ( 1 9 5 6 ; i n F u r s t a n d H a r o , 1 9 6 9 ) r e p o r t i n c r e a s e d C d c o n t e n t i n t u m o r s i n d u c e d b y n o n m e t a l c a r c i n o g e n s , O l s o n e t a l . ( 1 9 5 4 ) o b s e r v e t h a t l i v e r Zn l e v e l s o f DMBA ( d i m e t h y l a m i n o a z o b e n z e n e ) - e x p o s e d m i c e d e c r e a s e i n i t i a l l y d u r i n g t h e p e r i o d o f l i v e r d a m a g e , i n c r e a s e d u r i n g r e g e n e r a t i o n a n d p e a k j u s t b e f o r e g r o s s n e o p l a s i a o f t h e l i v e r i s e v i d e n t . H o w e v e r , n o d a t a a r e g i v e n . A r n o l d a n d S a s s e ( 1 9 6 1 ) f o u n d Zn t o b e d e c r e a s e d i n b o t h l i v e r t u m o r s a n d s u r r o u n d i n g l i v e r t i s s u e o f r a t s f e d D M B A . C o p p e r w a s f o u n d t o b e d e c r e a s e d i n l i v e r t i s s u e s u r r o u n d i n g l i v e r t u m o r s b u t i n c r a s e d i n t h e t u m o r s t h e m -s e l v e s . T h e s e d e c r e a s e s o f C u a n d Z n i n t i s s u e s u r r o u n d i n g t u m o r s i n d i c a t e t h a t DMBA d e c r e a s e s t h e s e m e t a l s i n a p -p a r e n t l y n o r m a l l i v e r t i s s u e . Y a m a n e e t a l . ( 1 9 6 9 ) f o u n d n o c h a n g e o r s l i g h t d e c r e a s e s o f C u c o n t e n t i n p r e t u m o r o u s l i v e r s o f r a t s e x p o s e d t o D M B A . H o w e v e r , F a r e ( 1 9 6 4 ) a n d F a r e a n d W o o d h o u s e ( 1 9 6 3 a , b ) f o u n d p r e t u m o r o u s r a t l i v e r C u l e v e l s t o b e p r o g r e s s i v e l y i n c r e a s e d b y DMBA e x p o s u r e . T h u s , t h e r e a r e i n d i c a t i o n s t h a t DMBA c h a n g e s Cu a n d Z n l e v e l s i n p r e t u m o r o u s l i v e r . H o w e v e r , f o r Z n t h e d a t a a r e n o t c l e a r l y d o c u m e n t e d a n d f o r C u t h e d a t a a p p e a r t o b e c o n t r a d i c t o r y . I n f a c t , t h e o n l y c o n s i s t e n t f i n d i n g s i n t h e s t u d y o f m e t a l c h a n g e s w i t h c a n c e r a r e t h a t Zn l e v e l s a r e d e c r e a s e d i n t u m o r t i s s u e a n d b o d y b u r d e n s o f C d a n d t h e C d : Z n r a t i o a r e i n c r e a s e d . T h e p r e s e n t s t u d y r e p o r t s t h e e f f e c t o f t h e c a r c i n o g e n DEN ( d i e t h y l n i t r o s a m i n e ) o n C d , C u a n d Z n l e v e l s i n p r e t u m o r 1 4 7 l i v e r t i s s u e . I n p a r t i c u l a r , t h e l e v e l s o f t h e s e e l e m e n t s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n ( e n z y m e - c o n t a i n i n g ) p o o l ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ; B r o w n , 1 9 7 7 ) a r e r e p o r t e d . O l s o n e t a l . ( 1 9 5 4 ) h a v e r e c o g n i z e d t h e i m p o r t a n c e o f C u a n d Zn a s n e c e s s a r y f o r t h e a c t i v i t y o f e n z y m e s a n d e n z y m e s y s t e m s . F u r t h e r , o t h e r i n v e s t i g a t o r s h a v e p o i n t e d o u t t h a t C d m a y r e p l a c e C u a n d Zn i n m e t a l 1 o e n z y m e s r e s u l t i n g i n e n z y m e d y s f u n c t i o n ( S c h r o e d e r e t a l . , 1 9 6 1 ; F l i c k e t a l . , 1 9 7 1 ; Y o s h i d a e t a l . , 1 9 7 5 ; K o l o n e l , 1 9 7 6 ; B r o w n , 1 9 7 7 ) . A s Zn h a s b e e n r e p e a t e d l y r e p o r t e d t o p r e v e n t c a n c e r f r o m o c c u r r i n g ( B i s c h o f f a n d L o n g , 1 9 3 9 ; G u n n e t a l . , 1 9 6 3 , 1 9 6 4 ; P o s w i l l o a n d C o h e n , 1 9 7 1 ; C i a p p a r e l l i e t a l . , 1 9 7 2 ; D u n c a n e t a l . , 1 9 7 4 ; D u n c a n a n d D r e o s t i , 1 9 7 5 , 1 9 7 6 ; W o s t e r e t a l . , 1 9 7 5 ) , t h i s s t u d y a l s o m e a s u r e d r e l a t i v e c h a n g e s i n C d , C u a n d Zn i n m i c e a d m i n i s t e r e d b o t h DEN a n d Zn i n t h e d r i n k i n g w a t e r . I n a d d i t i o n , we g a v e a n o t h e r g r o u p o f m i c e DEN a n d C d a s t h e r e i s e v i d e n c e o f i n c r e a s e d C d : Z n r a t i o i n t u m o r - b e a r i n g o r g a n i s m s ( M o r g a n 1 9 7 0 , 1 9 7 1 ; B r o w n , 1 9 7 7 ) . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s M i c e o f t h e S w i s s s t r a i n , a p p r o x i m a t e l y t h r e e m o n t h s o l d , w e r e s e p a r a t e d i n t o c a g e s , 3 m i c e o f t h e s a m e s e x p e r c a g e . M i c e r e c e i v e d e i t h e r t a p w a t e r , w a t e r w i t h 2 0 ppm D E N , 2 0 ppm DEN + 2 5 0 ppm Z n ( a s Z n S o 4 • 7 H 2 0 ) , o r 2 0 ppm DEN + 5 ppm C d ( a s C d C 1 2 ) f o r f i v e w e e k s . F r o m 6 w e e k s o n , t h e c o n c e n t r a t i o n o f DEN w a s 4 0 p p m . D r i n k i n g s o l u t i o n s 1 4 8 ( 1 0 0 m l ) w e r e r e n e w e d o n a l t e r n a t e d a y s . A l l w a t e r j a r s w e r e p a i n t e d b l a c k t o p r e v e n t p h o t o d e g r a d a t i o n o f D E N . D i e t c o n s i s t e d o f j P u r i n a r a t c h o w a d l i b i t u m . M i c e w e r e s a c r i f i c e d b y a s p h y x i a t i o n w i t h C O , , . A p o r t i o n o f l i v e r w a s i m m e d i a t e l y p r e s e r v e d i n a s t a n d a r d f o r m a l i n s o l u t i o n . T h i s t i s s u e w a s w a x e m b e d d e d , s e c t i o n e d ( 5 j j m ) a n d s t a i n e d ( P h o s p h o t u n g s t i c a c i d h e m a t o x y l i n ) . T h e r e m a i n i n g l i v e r p o r t i o n w a s s t o r e d a t - 2 0 ° C u n t i l a n a l y z e d . I n o r d e r t o e n s u r e c o n s i s t e n c y o f a n a l y s i s b e t w e e n d i f f e r e n t e x p o s u r e s , l i v e r s w e r e a n a l y z e d f o u r a t a t i m e , o n e f r o m e a c h e x p o s u r e t y p e (1 c o n t r o l , 1 D E N , 1 DEN + C d , 1 DEN + Z n ) f r o m t h e s a m e e x p o s u r e t i m e . Two g r a m s o f l i v e r w e r e p l a c e d i n a h o m o g e n i z i n g t u b e w i t h 4 . 5 m l o f 0 . 9 % N a C l a n d h o m o g e n i z e d a t a s t a n d a r d s p e e d ( s e t t i n g 4 . 5 ) o n a T R I - R S T I R - R v a r i a b l e s p e e d l a b o r a t o r y m o t o r m o d e l S 6 3 C f o r e x a c t l y 3 m i n u t e s . P r e v i o u s e x p e r i m e n t a t i o n d e m o n s t r a t e d t h a t t h e a m o u n t o f m e t a l e x t r a c t e d v a r i e d w i t h h o m o g e n i z i n g t i m e . E a c h h o m o g e n a t e w a s p o u r e d i n t o a 11 ml c a p a c i t y p y r e x S o r v a l l c e n t r i f u g e t u b e a n d e a c h g r o u p o f 4 h o m o g e n a t e s w a s t h e n c e n t r i f u g e d a t 2 7 , 0 0 0 x g_ f o r 1 0 m i n u t e s i n a S o r v a l l R C 2 - B c e n t r i f u g e . S u p e r n a t a n t s w e r e d e c a n t e d i n t o o t h e r p y r e x S o r v a l l c e n t r i f u g e t u b e s . P e l l e t s w e r e r e h o m o g e n i z e d f o r e x a c t l y 2 m i n u t e s i n 2 . 5 m l o f 0 . 9 % N a C l , c e n t r i f u g e s a t 2 7 , 0 0 0 x £ f o r 1 0 m i n u t e s a n d c o m b i n e d w i t h p r e v i o u s s u p e r n a t a n t s . G r o u p s o f 4 s u p e r n a t a n t s w e r e t h e n p l a c e d i n a 7 0 ° C 1 4 9 w a t e r b a t h f o r a p p r o x i m a t e l y 3 m i n u t e s t o c l e a r c e l l u l a r d e b r i s v i a h e a t p r e c i p i t a t i o n . I t i s i m p o r t a n t t h a t a l l t u b e s b e h e a t e d a t t h e s a m e t e m p e r a t u r e f o r e x a c t l y t h e s a m e p e r i o d o f t i m e a s t h e a m o u n t o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p r e c i p i t a t e d i n c r e a s e s w i t h i n c r e a s i n g l e n g t h o f t i m e e x p o s e d t o a h i g h t e m p e r a t u r e ( u n p u b l . d a t a ) . S u p e r n a t a n t s w e r e r e c e n t r i f u g e d a t 2 7 , 0 0 0 x £ f o r 1 0 m i n u t e s . R e s u l t i n g s u p e r n a t a n t w a s t h e n a p p l i e d t o a P h a r m a c i a c o l u m n ( 1 . 6 x 1 0 0 c m ) p a c k e d w i t h G - 7 5 g e l a n d e l u t e d w i t h 0 . 0 1 M N H ^ H C O ^ b u f f e r . P r o t e i n w a s r e a d a t 2 5 0 a n d 2 8 0 nm o n a P e r k i n E l m e r 1 2 4 D s p e c t r o p h o t o m e t e r o n e a c h 1 0 . 2 m l f r a c t i o n t o e s t a b l i s h t h e p o s i t i o n o f t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , m e t a l l o t h i o n e i n a n d t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l ( B r o w n , 1 9 7 7 ; B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . C o p p e r a n d z i n c w e r e d e t e r m i n e d . b y f l a m e a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t r y w h i l e C d w a s d o n e b y g r a p h i t e f u r n a c e a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t r y . B o t h d e t e r m i n a t i o n s e m p l o y e d d e u t e r i u m a r c b a c k g r o u n d c o r r e c t i o n . T o t a l m e t a l l e v e l s f o r e a c h p e a k w e r e d e t e r m i n e d b y s u m m i n g o f t h e i n d i v i d u a l m e t a l l e v e l s i n e a c h t u b e o f e a c h p e a k . R e s u l t s L i v e r t i s s u e h o m o g e n a t e s u p e r n a t a n t o f m i c e i s d e p l e t e d o f C u a n d Z n v u p o n e x p o s u r e t o D E N . T h i s d e p l e t i o n o f C u a n d Zn i s a p p a r e n t a t 3 w e e k s ( T a b l e 1 3 ) a n d c o n t i n u e s t o i n c r e a s e t h r o u g h o u t t h e e x p o s u r e p e r i o d o f 1 2 . 5 w e e k s Table 13. The d i s t r i b u t i o n of Cd, Cu and Zn amongst p r o t e i n peaks from l i v e r of mice exposed to DEN ( d i e t h y l n i t r o s a m i n e ) w i t h and w i t h o u t Cd or Zn. Data are c o m p i l a t i o n s of data from F i g u r e 20 i n ^mole/g t i s s u e (wet w e i g h t ) . MW: M o l e c u l a r w e i g h t . ND: Not d e t e c t a b l e . Cd Cu Zn T o t a l High MW pool Metal l o -th ione i n Low MW pool T o t a l High Mw pool M e t a l l o -t h i o n e i n Low MW pool T o t a l High MW pool M e t a l l o -t h i o n e i n Low MW pool 0 Weeks C o n t r o l (2) 00391 .00160 .00070 .00161 .0968 .0477 .0189 .0303 .0754 .0700 .0020 .0034 3 Weeks C o n t r o l (2) 00333 .00116 .00073 .00144 .0851 .0417 .0164 .0270 .0703 .0670 .0005 .0029 DEN (2) 00322 .00063 .00098 .00161 .0783 .0386 .0167 .0230 .0577 .0536 ND .0041 DEN + Zn (2) 00281 .00085 .00054 .00142 .0809 .0410 .0160 .0239 .0567 .0558 ND .0009 DEN + Cd (2) 00292 .00095 .00061 .00136 .0692 .0314 .0160 .0218 .0535 .0500 ND .0035 6 Weeks C o n t r o l (2) 00320 .00081 .00068 .00171 .0740 .0446 ND .0295 .0813 .0773 ND .0040 DEN (2) 00315 .00073 .00067 .00174 .0548 .0348 ND .0200 .0646 .0615 ND .0031 DEN + Zn (2) 00307 .00090 .00061 .00157 .0595 .0313 .0080 .0202 .0716 .0640 ND .0076 DEN + Cd (2) 00322 .00117 .00067 .00138 .0426 .0226 ND .0200 .0589 .0547 ND .0042 12 .5 Weeks C o n t r o l (3) 00376 3 .00139 .00086 .00151 .1447 .0698 .0340 .0409 .0873 .0822 ND .0051 (.00140)° (.00068) (.00042) (.00034) (.0073) (.0004) (.0148) (.0087) (.0046) (.0034) (.0059) DEN (3) .00375 .00126 .00097 .00152 .0993* .0401** .0188 .0404 .0538* .0501* ND .0037 (.00140) (.00072) (.00057) (.00030) (.0149) (.0052) (.0050) (.0101) (.0068) (.0098) (.0034) DEN + Zn (3) 00362 .00110 .00080 .00172 .1148* .0510** .0231 .0407 .0590* .0555* ND .0034 (.00119) (.0053) (.00042) (.00042) (.0110) (.0014) (.0005) (.0122) (.0073) (.0095) (.0022) DEN + Cd (3) 00685 .00389 .00092 .00204* .1004* .0466* .0193 .0345 .0542** .0525** ND .0017 (.00276) (.00317) (.00046) (.00005) (.0096) (.0089) (.0093) (.0093) (.0036) (.0020) (.0029) aMean. Standard deviation. *P <^0.05; 2-tailed Student's t test. **P <0.001. i—• cn o 1 5 1 ( T a b l e 1 4 ) . I t i s e v i d e n t t h a t t h e s e d e c r e a s e s o f C u a n d Zn r e -f l e c t d e c r e a s e s o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( T a b l e s 1 3 a n d 1 4 ; F i g u r e s 2 0 , 21 a n d 2 2 ) . C o p p e r a l s o a p p e a r s t o b e r e d u c e d o n m e t a l l o t h i o n e i n w i t h DEN e x p o s u r e , w i t h a n d w i t h o u t C d o r Zn a t 1 2 . 5 w e e k s ( T a b l e 1 3 ; F i g u r e 2 0 ) . C o p p e r w a s n o t a l w a y s d e t e c t a b l e o n m e t a l l o t h i o n e i n a t " 3 . a n d 6 w e e k s b y m e t h o d s e m p l o y e d i n t h i s s t u d y . F u r t h e r m o r e , i t i s a p p a r e n t t h a t a d m i n i s t r a t i o n o f Zn w i t h t h e c a r c i n o g e n i n t h e d r i n k i n g w a t e r t e n d s t o s l i g h t l y r e v e r s e t i s s u e d e p l e t i o n s o f C u a n d Zn o t h e r w i s e i n d u c e d b y DEN e x p o s u r e ( T a b l e s 1 3 a n d 1 4 ; F i g u r e s 2 0 , 21 a n d 2 2 ) , A d m i n i s t r a t i o n o f C d w i t h t h e c a r c i n o g e n i n i t i a l l y ( a t 3 a n d 6 w e e k s ) r e s u l t e d i n i n c r e a s e d l o s s e s o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n C u a n d Z n f r o m l i v e r . T h i s e f f e c t w a s n o t a p p a r e n t a t 1 2 . 5 w e e k s e x p o s u r e t o DEN ( T a b l e s 1 3 a n d 1 4 ; F i g u r e s 21 a n d 2 2 ) . T o t a l t i s s u e C d l e v e l s a p p e a r e d t o b e u n c h a n g e d b y DEN o r D E N + : - Z n . H o w e v e r , t h e r e a p p e a r e d t o b e s l i g h t d e -c r e a s e s o f C d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a t 1 2 . 5 w e e k s ( T a b l e 1 3 ) . T h e s e d e c r e a s e s o f C d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w e r e a l s o e v i d e n t a t 3 a n d 6 w e e k s i n m i c e e x p o s e d t o DEN a l o n e ( T a b l e 1 3 ) . T o t a l t i s s u e C d l e v e l s w e r e i n c r e a s e d b y DEN + C d a t 1 2 . 5 w e e k s ( T a b l e 1 3 ) . M o s t o f t h i s i n c r e a s e o f C d a c c u m u l a t e d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( T a b l e 1 3 , T a b l e 1 4 . P e r c e n t a g e d e c r e a s e s o f C u a n d Z n i n t o t a l t i s s u e h o m o g e n a t e s u p e r n a t a n t a n d t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m l i v e r s o f m i c e e x p o s e d t o DEN ( d i e t h y l n i t r o s a m i n e ) w i t h a n d w i t h o u t Cd o r Z n . C a l c u l a t e d f r o m d a t a i n T a b l e 1 3 . MW: M o l e c u l a r w e i g h t . C u Zn T o t a l H i g h MW T o t a l - H i g h MW p o o l p o o l 3 W e e k s DEN ( 2 ) 8 . 0 7 . 4 17 9 2 0 . 0 DEN + Z n ( 2 ) 4 . 9 1 . 7 1 9 3 1 6 7 DEN + C d ( 2 ) 1 8 7 2 4 . 7 2 3 9 2 5 . 4 6 W e e k s DEN ( 2 ) 2 5 9 2 2 0 2 0 5 2 0 4 DEN + Zn ( 2 ) 1 9 6 2 9 8 11 9 1 7 2 DEN + C d ( 2 ) 4 2 4 4 9 3 2 7 6 2 9 2 1 2 . 5 W e e k s DEN ( 3 ) 31 4 4 2 6 3 8 4 3 9 1 DEN + Zn ( 3 ) 2 0 7 2 6 9 3 2 4 3 2 5 DEN + C d ( 3 ) 3 0 6 3 3 2 3 7 9 3 6 1 ro 1 5 3 F i g u r e 2 0 . C o m p o s i t e g e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m n o n -c a n c e r o u s l i v e r s o f c o n t r o l m i c e a n d m i c e e x p o s e d t o DEN w i t h a n d w i t h o u t C d o r Z n f o r 1 2 . 5 w e e k s . E a c h c o m p o s i t e p r o f i l e i s t h e a v e r a g e o f t h r e e i n d i v i d u a l p r o f i l e s . I : h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ; I I : m e t a l l o t h i o n e i n ; I I I : l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . 1 5 5 F i g u r e 2 1 . T h e v a r i a t i o n o f C u l e v e l s o n t h e h i g h m o l e c u -l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m n o n c a n c e r o u s l i v e r s o f c o n t r o l m i c e a n d m i c e e x p o s e d t o DEN w i t h a n d w i t h o u t C d o r Z n f o r 1 2 . 5 w e e k s . E a c h p o i n t a t 0 , 3 a n d 6 w e e k s r e p r e s e n t s 2 a n i m a l s w h i l e a t 1 2 . 5 w e e k s e a c h p o i n t r e -p r e s e n t s 3 a n i m a l s . 1 5 7 F i g u r e 2 2 . T h e v a r i a t i o n o f Zn l e v e l s o n t h e h i g h m o l e c u -l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m n o n c a n c e r o u s l i v e r s o f c o n t r o l m i c e a n d m i c e e x p o s e d t o DEN w i t h a n d w i t h o u t C d o r Zn f o r 1 2 . 5 w e e k s . E a c h p o i n t a t 0 , 3 a n d 6 w e e k s r e p r e s e n t s 2 a n i m a l s w h i l e a t 1 2 . 5 w e e k s e a c h p o i n t r e -p r e s e n t s 3 a n i m a l s . F i g u r e 2 0 ) . I t i s p r o b a b l e t h a t d a t a e x p r e s s e d a s d e c r e a s e s i n % m e t a l ( T a b l e 1 4 ; F i g u r e s 2 3 a n d 2 4 ) g i v e a m o r e a c c u r a t e p o r t r a y a l o f t h e m e t a l c h a n g e s o c c u r r i n g w i t h t i m e a s t h i s e l i m i n a t e s d i f f e r e n c e s d u e t o s l i g h t v a r i a t i o n s i n h e a t i n g t i m e s f o r e a c h g r o u p o f s a m p l e s . H i s t o l o g i c a l e x a m i n a t i o n i n d i c a t e d t h a t l i v e r s o f D E N - e x p o s e d m i c e , w i t h a n d w i t h o u t C d o r Z n , w e r e p r e -t u m o r o u s . L i v e r s o f m i c e r e c e i v i n g DEN a l o n e o r DEN + C d h a d m o r e h e p a t i c c e l l d y s p l a s i a a n d r e g e n e r a t i o n t h a n DEN + Z n - e x p o s e d l i v e r s ( T a b l e 1 5 ) . M i c e e x p o s e d t o DEN + C d h a d l i v e r p a t h o l o g i e s m o s t a d v a n c e d t o w a r d s t u m o r d e v e l o p -m e n t . G r o s s c h o l a n g i o f i b r o s i s , i n d i c a t i v e o f b i l e d u c t e p i t h e l i a l c e l l p r o l i f e r a t i o n , w a s v i s i b l e i n a l l t h r e e o f t h e DEN + C d - e x p o s e d m o u s e l i v e r s , t w o o f t h e D E N - e x p o s e d l i v e r s , o n e o f t h e DEN + Z n - e x p o s e d l i v e r s , a n d n o n e o f t h e c o n t r o l s ( T a b l e 1 5 ) . A l t h o u g h v a r i a b l e , t h e o v e r a l l h i s t o l o g y c h a n g e r a t i n g f o r m i c e e x p o s e d t o DEN + C d w a s g r e a t e r t h a n t h a t f o r t h o s e e x p o s e d t o DEN o r DEN + Zn ( T a b l e 1 5 ) . P i s c u s s i o n T h i s r e p o r t p r e s e n t s c l e a r e v i d e n c e o f d e c r e a s e d C u a n d Zn i n p r e t u m o r t i s s u e r e s u l t i n g f r o m e x p o s u r e t o a n o r g a n i c c a r c i n o g e n . O l s e n e t a l . ( 1 9 5 4 ) r e p o r t OMBA d e -c r e a s e s l i v e r Zn d u r i n g t h e p e r i o d o f c a r c i n o g e n - i n d u c e d l i v e r d a m a g e b u t t h e y d o n o t p r e s e n t a n y d a t a . A r n o l d a n d 1 6 0 F i g u r e 2 3 . T h e p e r c e n t a g e d e c r e a s e s o f C u l e v e l s o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m n o n -c a n c e r o u s l i v e r s o f D E N - e x p o s e d m i c e . T h e 8 w e e k p o i n t i s f r o m a s u b s e q u e n t s t u d y i n w h i c h m i c e w e r e e x p o s e d t o 2 5 ppm D E N . E a c h p o i n t a t 0 , 3 a n d 6 w e e k s r e p r e s e n t s 2 a n i m a l s w h i l e t h o s e f r o m 8 a n d 1 2 . 5 w e e k s r e p r e s e n t s 3 a n i m a l s . 1 6 2 F i g u r e 2 4 . T h e p e r c e n t a g e d e c r e a s e s o f Z n l e v e l s o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m n o n -c a n c e r o u s l i v e r s o f D E N - e x p o s e d m i c e . T h e 8 w e e k p o i n t i s f r o m a s u b s e q u e n t s t u d y i n w h i c h m i c e w e r e e x p o s e d t o 2 5 ppm D E N . E a c h p o i n t a t 0 , 3 a n d 6 w e e k s r e p r e s e n t s 2 a n i m a l s w h i l e t h o s e f r o m 8 a n d 1 2 . 5 w e e k s r e p r e s e n t s 3 a n i m a 1 s . 163 Table 15. Changes i n h i s t o l o g y o f l i v e r a f t e r 12.5 weeks exposure to DEN ( d i e t h y l n i t r o s a m i n e ) w i t h and w i t h o u t Cd or Zn. He p a t o c y t e s P o r t a l duct areas O v e r a l l Gross I n c r e a s e d D y s p l a s i a R e t i c u l a r H e p a t i t i s H e p a t o c e l l u l a r P o r t a l B i l e duct c e l l h i s t o l o g y c h o l a n g i o -r e g e n e r a t i o n c o l l a p s e n e c r o s i s t r i a d i t i s p r o l i f e r a t i o n change f i b r o s i s and d i s a r r a y r a t i n g 3 r a t i n g * 5 C o n t r o l #1 #2 #3 DEN #1 #2 #3 DEN + Zn #1 #2 #3 DEN + Cd #1 #2 #3 1 2 1 From 0 to 3, based on m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f p h o s p h o t u n g s t i c a c i d h e m o t o x y l i n s t a i n e d t i s s u e . ''From 0 to 3, based on m a c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n at time o f autopsy. c A b s e n t . ''present. 1 6 5 S a s s e ( 1 9 6 1 ) i n d i c a t e t h a t l i v e r C u a n d Zn a r e d e c r e a s e d i n n o n t u m o r o u s a r e a s o f l i v e r o f r a t s w i t h D M B A - i n d u c e d l i v e r t u m o r s . T h e p r e s e n t s t u d y c o n f i r m s t h a t a n o r g a n i c c a r c i n o g e n c a n d e c r e a s e l i v e r Z n a n d C u a n d , d e m o n s t r a t e s u n e q u i v o c a l l y t h a t t h e s e c h a n g e s o c c u r b e f o r e t u m o r g r o w t h i s e v i d e n t . D e c r e a s e s o f C u a n d Zn i n p r e t u m o r t i s s u e a r e m a i n l y f r o m t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . S i n c e e n z y m e s o c c u r i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n f r a c t i o n o f c e l l c y t o p l a s m , t h e l e v e l s o f Cu a n d Zn i n t h i s p o o l g i v e a g o o d i n d i c a t i o n o f t h e l e v e l s o f t h e s e e l e m e n t s a v a i l a b l e f o r m e t a l 1 o e n z y m e f u n c t i o n i n g ( B r o w n , 1 9 7 7 ; B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . I n r e c e n t y e a r s , i t h a s b e c o m e a p p a r e n t t h a t e x c e s s e s o f h e a v y m e t a l s a r e s t o r e d o n m e t a l l o t h i o n e i n ( B r e m n e r a n d D a v i e s , 1 9 7 4 ; R i o r d a n a n d G o w e r , 1 9 7 5 ; W i n g e e t a l . , 1 9 7 5 ) . T h u s , i f c a r c i n o g e n - i n d u c e d d e c r e a s e s o f C u a n d Z n w e r e o n l y f r o m m e t a l l o t h i o n e i n , t h e s e d e c r e a s e s w o u l d h a v e l i t t l e e f f e c t o n e n z y m e f u n c t i o n a n d h e n c e c e l l u l a r p r o -c e s s e s . T h e s l i g h t d e c r e a s e o f C d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f D E N - e x p o s e d m i c e w a s u n e x p e c t e d . M a n y r e s e a r c h e r s r e p o r t i n c r e a s e ' s o f C d a n d t h e C d : Z n r a t i o i n t u m o r s a n d t h e a p p a r e n t l y n o r m a l l i v e r s o f t u m o r -b e a r i n g o r g a n i s m s ( G o r o d i s k i i e t a l . , 1 9 5 6 ; i n F u r s t a n d H a r o , 1 9 6 9 ; T e i t z e t a l . , 1 9 7 5 ; M o r g a n , 1 9 7 0 , 1 9 7 1 ; B r o w n , 1 9 7 7 ) . T h e o b s e r v e d C d d e c r e a s e s c o n c u r r e n t w i t h d e c l i n e 1 6 6 o f C u a n d Z n l e v e l s m i g h t b e t y p i c a l o f e a r l y m e t a l c h a n g e s i n p r e t u m o r o u s l i v e r . O l s o n e t a l . ( 1 9 5 4 ) r e p o r t l i v e r Zn t o i n i t i a l l y d e c r e a s e i n p r e t u m o r t i s s u e b u t t o p e a k j u s t b e f o r e g r o s s n e o p l a s i a i s e v i d e n t . Z i n c r e m a i n s d e -c r e a s e d i n t h e t u m o r t i s s u e a n d i s i n c r e a s e d o n l y i n s u r r o u n d i n g l i v e r t i s s u e ( O l s o n e t a l . , 1 9 5 8 ; W r i g h t a n d D o r m a n d y , 1 9 7 2 ) . A r n o l d a n d S a s s e ( 1 9 6 1 ) f o u n d t h a t C u i s d e c r e a s e d i n l i v e r t i s s u e s u r r o u n d i n g l i v e r t u m o r s b u t i s g r e a t l y i n c r e a s e d i n t h e t u m o r t i s s u e i t s e l f . T h i s s e e m s t o i n d i c a t e t h a t DMBA d e c r e a s e s C u i n a p p a r e n t l y n o r m a l l i v e r t i s s u e b u t t h a t . C u i n c r e a s e s w i t h d e v e l o p m e n t o f t u m o r t i s s u e . T h u s , i f C d c o n t i n u e s t o f o l l o w t h e p a t t e r n s o f C u a n d Z n , i t m i g h t i n c r e a s e j u s t a s o r a f t e r t h e t u m o r s t a r t s i n t u m o r a n d / o r s u r r o u n d i n g t i s s u e . T h e i n c r e a s e o f C d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o -t e i n p o o l o f m i c e g i v e n DEN + C d w a s s i m i l a r t o i n c r e a s e s o f C d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f t u m o r -b e a r i n g f l o u n d e r s ( B r o w n , 1 9 7 7 ) . I n b o t h s t u d i e s C d a c c u m u l a t e s o n t h i s p o o l a t l e v e l s t o o l o w t o h a v e s a t u r a t e d m e t a l l o t h i o n e i n ( B r o w n , 1 9 7 7 ) . P e r h a p s C d i s s i m p l y o c c u p y i n g e n z y m e b i n d i n g s i t e s v a c a t e d b y C u a n d Z n s o t h a t i n d u c t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n d o e s n o t o c c u r . A s C d i s i n c r e a s e d i n t u m o r - b e a r i n g o r g a n i s m s ( T e i t z e t a l . , 1 9 5 7 ; M o r g a n , 1 9 7 0 , 1 9 7 1 ; B r o w n , 1 9 7 7 ) , i t m a y b e o f s o m e s i g n i f i -c a n c e t h a t e x p o s u r e t o DEN + C d i n t h e p r e s e n t s t u d y r e -s u l t e d i n l i v e r p a t h o l o g i e s m o s t a d v a n c e d t o w a r d s t u m o r 1 6 7 d e v e l o p m e n t . A l s o , l a r g e d e c r e a s e s o f C u a n d Z n o c c u r r e d e a r l i e r w i t h DEN + C d , p e r h a p s i n d i c a t i v e o f e a r l i e r p r e -t u m o r m e t a l c h a n g e s . F u r t h e r m o r e , t h e r e i s s o m e e v i d e n c e t h a t C u a n d Zn l e v e l s a r e i n c r e a s i n g a t 1 2 . 5 w e e k s ' e x p o s u r e t o DEN + C d , p e r h a p s i n d i c a t i v e o f i n c r e a s e s o f t h e s e m e t a l s w i t h t h e o n s e t o f c a n c e r . T h a t a d m i n i s t r a t i o n o f Zn w i t h DEN r e d u c e d l o s s e s o f C u a s w e l l a s Zn i s s u g g e s t i v e . P e r h a p s Zn i n t h e d r i n k i n g w a t e r o c c u p i e s s i t e s o n , D E N w h i c h w o u l d o t h e r w i s e b i n d C u a n d Zn i n l i v e r . T h u s , DEN a l o n e c o u l d r e s u l t i n c h e l a t i o n a n d s u b s e q u e n t e x c r e t i o n o f C u a n d Z n , w h i l e a D E N - Z n c o m p l e x c o u l d n o t . A s e x p l a i n e d b y F u r s t ( 1 9 6 3 ) , t h e a c t i o n s o f m o s t o r a l l o r g a n i c c a r c i n o g e n s c a n b e e x p l a i n e d a s t h o s e o f h e a v y m e t a l c h e l a t o r s . T h e r e d u c t i o n o f p r e t u m o r o u s c h a n g e s b y Zn i n t h i s s t u d y i s i n a c c o r d a n c e w i t h p r e v i o u s r e p o r t s i n t h e l i t e r a -t u r e s t a t i n g t h a t Zn p r e v e n t s c a n c e r f r o m o c c u r r i n g ; i n -c l u d i n g s p o n t a n e o u s l y o c c u r r i n g m a m m a r y g l a n d c a n c e r ( B i s c h o f f a n d L o n g , 1 9 3 9 ) , c a n c e r i n d u c e d b y C d ( G u n n e t a l . , 1 9 6 3 , 1 9 6 4 ) , o r c a n c e r i n d u c e d b y DMBA ( P o s w i l l o a n d C o h e n , 1 9 7 1 ; C i a p p a r e l l i e t a l . , 1 9 7 2 ) . Z n a l s o p r e v e n t s t h e s p r e a d o f t r a n s p l a n t e d t u m o r s ( D u n c a n e t a l . , 1 9 7 4 , D u n c a n a n d D r e o s t i , 1 9 7 5 , 1 9 7 6 ; W o s t e r e t a l . , 1 9 7 5 ) . I t a p p e a r s a s t h o u g h t h e l i t e r a t u r e o n Zn i s c o n t r a d i c t o r y s i n c e b o t h Zn e x c e s s e s a n d Zn d e f i c i e n c i e s c a n p r e v e n t t h e g r o w t h o f t u m o r s ( B i s c h o f f a n d L o n g , 1 9 3 9 ; G u n n e t a l . , 1 6 8 1 9 6 3 , 1 9 6 4 ; P e t e r i n g e t a l . , 1 9 6 7 ; M c Q u i t t y e t a l . , 1 9 7 0 ; P o s w i l l o a n d C o h e n , 1 9 7 1 ; C i a p p a r e l l i e t a l . , 1 9 1 7 2 ; D e W y s a n d P o r i e s , 1 9 7 2 ; D u n c a n e t a l . , 1 9 7 4 ; D u n c a n a n d D r e o s t i , 1 9 7 5 , 1 9 7 6 ; W o s t e r e t a l . , 1 9 7 5 ) . T h i s m a y b e b e c a u s e Zn d e f i c i e n c i e s c o u l d . l e s s e n t h e a c t i v i t i e s o f Z n -d e p e n d e n t e n z y m e s e s s e n t i a l f o r c e l l d i v i s i o n ( D u n c a n e t a l . , 1 9 7 4 ; D u n c a n a n d D r e o s t i , 1 9 7 6 ; V a l l e e , 1 9 7 6 ) w h i l e Zn e x c e s s e s m i g h t r e v e r s e o r p r e v e n t t h e p r o c e s s e s w h i c h r e s u l t i n c a r c i n o g e n e s i s . C o p p e r , l i k e z i n c , h a s b e e n s h o w n t o h a v e a n i n h i b i t o r y e f f e c t o n D M B A - i n d u c e d t u m o r s ( S h a r p l e s s , 1 9 4 6 ; H o w e l l , 1 9 5 8 ; F a r e a n d W o o d h o u s e , 1 9 6 3 a , b ; F a r e , 1 9 6 4 ) . A s s u m m a r i z e d b y B e c k i n g ( 1 9 7 6 ) , d e f i c i e n c i e s o f b o t h . Zn a n d / o r C u r e s u l t i n r e d u c t i o n s i n a c t i v i t y o f t h e h e p a t i c d r u g m e t a b o l i z i n g c e n t e r , w h i c h i s e s s e n t i a l f o r t h e c o n -v e r s i o n o f c a r c i n o g e n s t o n o n c a r c i n o g e n i c m e t a b o l i t i e s . Y o s h i d a e t a l . ( 1 9 7 5 ) f o u n d t h a t h i g h l e v e l s o f C d c o u l d r e s u l t i n i n h i b i t i o n o f t h e h e p a t i c d r u g m e t a b o l i z i n g c e n t e r . D y s f u n c t i o n m a y p o s s i b l y b e a r e s u l t o f C d r e p l a c i n g C u o n m e t a l 1 o e n z y m e s i n t h i s e n z y m e s y s t e m . T h u s , c a r c i n o g e n -i n d u c e d r e d u c t i o n s o f C u a n d Z n a n d h i g h C d l e v e l s c o u l d r e d u c e t h e d e t o x i f i c a t i o n o f s u b s e q u e n t e x p o s u r e s t o c a r c i n o g e n s . I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t C u p r e v e n t s t h e o n s e t o f c a n c e r w h e n a d m i n i s t e r e d w i t h DMBA b y s t i m u l a t i n g a c t i v i t y o f t h e d r u g m e t a b o l i z i n g c e n t e r ( Y a m a n e e t a l . , 1 9 6 9 ) . P e r h a p s Zn a d m i n i s t r a t i o n h a s a s i m i l a r e f f e c t s i n c e 1 6 9 Zn d e f i c i e n c i e s i n h i b i t t h i s e n z y m e s y s t e m ( B e c k i n g , 1 9 7 6 ) . L o s s e s o f Zn f r o m t h e l i v e r m i g h t r e s u l t i n d y s f u n c t i o n o f Z n - c o n t a i n i n g e n z y m e s i n v o l v e d i n c e l l d i v i s i o n ( D u n c a n a n d D r e o s t i , 1 9 7 6 ; V a l l e e , 1 9 7 6 ; B r o w n , 1 9 7 7 ) . H i g h l e v e l s o f C d c o u l d s i m i l a r i l y d i s t u r b c e l l d i v i s i o n b y r e p l a c i n g Z n o n t h e s e e n z y m e s ( B r o w n , 1 9 7 7 ) . T h e r e f o r e , i t h a s b e e n p r o p o s e d . t h a t Zn p r e v e n t s c a n c e r w h e n a d m i n i s t e r e d w i t h a c a r c i n o g e n b y p r e v e n t i n g i n t e r f e r e n c e o f C d w i t h Z n - r e q u i r -i n g e n z y m e s i n v o l v e d i n c e l l d i v i s i o n ( B r o w n , 1 9 7 7 ) . C h v a p i l e t a l . ( 1 9 7 2 ) h a v e s u g g e s t e d t h a t Z n i s i m -p o r t a n t i n p r e v e n t i n g c a n c e r v i a s t a b i l i z a t i o n o f l y s o s o m a l m e m b r a n c e s . T h i s t h e o r y s u g g e s t s t h a t t h e b r e a k d o w n o f l y s o s o m a l m e m b r a n c e s r e s u l t s i n l o s s e s o f p r o t e o l y t i c e n z y m e s w h i c h d a m a g e DNA a n d RNA, . C h v a p i l e t . a l . , ( 9 7 2 ) s t a t e t h a t Z n s t a b i l i z e s m a c r o m o l e c u l e s w h i c h a r e p a r t o f o r c l o s e l y r e l a t e d t o b i o m e m b r a n e s . R e c e n t e v i d e n c e i s t h a t Zn s t i m u l a t e s t h e a s s e m b l y o f t u b u l i n i n t o m i c r o t u b u l e s ( G a s k i n a n d K r e s s , 1 9 7 7 ) . T h e s e m i c r o t u b u l e s a r e r e - : s p o n s i b l e . f o r m o v i n g c h r o m o s o m e s d u r i n g c e l l d i v i s i o n a n d f o r m a i n t a i n i n g t h e c o n t i n u i t y o f c e l l u l a r m e m b r a n e s ( G a s k i n a n d K r e s s , 1 9 7 7 ; M i l l e r , 1 9 7 7 ) . Z i n c c a n a l s o p r e v e n t l i p i d p e r o x i d a t i o n i n d u c e d b y a g e n t s s u c h a s C C l ^ . P e r o x i d a t i o n m o d i f i e s t h e t h r e e d i m e n s i o n a l c o n f o r m a t i o n a l s t r u c t u r e o f f a t t y a c i d s , t h u s w e a k e n i n g l i p o p r o t e i n c e l l a n d o r g a n e l l e m e m b r a n e s . O t h e r s h a v e s u g g e s t e d t h a t Z n p r e v e n t s c a n c e r b y i n c r e a s i n g t h e i m m u n e r e s p o n s e ( W o s t e r 1 7 0 e t a l . , 1 9 7 5 ; N i e p e r , 1 9 7 7 ) . T h i s m a y b e d u e i n p a r t t o t h e f a c t t h a t l y m p h o c y t e s a r e m o r e v i a b l e i n t h e p r e s e n c e o f Z n ; ( C h v a p i l e t a l . , 1 9 7 2 ) . B o t h C u a n d Zn h a v e b e e n s h o w n i n t h i s s t u d y t o b e r e d u c e d b y a n o r g a n i c c a r c i n o g e n i n p r e t u m o r t i s s u e , a n d b o t h h a v e b e e n s h o w n i n o t h e r s t u d i e s t o p r e v e n t o r s l o w d o w n t h e o n s e t o f c a n c e r w h e n a d m i n i s t e r e d w i t h a n o r g a n i c c a r c i n o g e n . T h e r e f o r e , i t a p p e a r s l i k e l y t h a t t h e r e -d u c t i o n s o f C u a n d Z n i n p r e t u m o r t i s s u e a r e i n s o m e w a y r e s p o n s i b l e f o r t h e o n s e t o f c a n c e r . H e n c e , a l l e v i a t i o n o f c a r c i n o g e n - i n d u c e d o r n a t u r a l l y o c c u r r i n g d e f i c i e n c i e s o f t h e s e e l e m e n t s m a y r e s u l t i n a r e d u c t i o n , o r e v e n . p r e v e n t i o n , o f c a n c e r . S u m m a r y M i c e w e r e g i v e n DEN ( d i e t h y l n i t r o s a m i n e ) i n t h e i r d r i n k i n g w a t e r w i t h a n d w i t h o u t s u p p l e m e n t a t i o n w i t h C d o r Z n . G e l e l u t i o n p r o f i l e s w e r e d o n e o n l i v e r t i s s u e h o m o -g e n a t e s u p e r n a t a n t a t 0 , 3 , 6 a n d 1 2 . 5 w e e k s o f e x p o s u r e . A l l l i v e r s f r o m D E N - a n d DEN + C d - o r DEN + Z n - e x p o s e d m i c e w e r e p r e t u m o r o u s . DEN a l o n e r e s u l t e d i n d e c r e a s e s o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n C u a n d Zn w i t h i n c r e a s i n g t i m e o f e x p o s u r e . C o p p e r w a s d e c r e a s e d 4 2 . 6 % a n d Zn 3 9 . 1 % o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a f t e r 1 2 . 5 w e e k s o f e x p o s u r e . . Z i n c s u p p l e m e n t a t i o n r e s u l t e d i n l e s s e r d e p l e t i o n s o f C u a n d Z n . C d s u p p l e m e n t a t i o n i n c r e a s e d C u a n d Zn l o s s e s a t 3 a n d 6 w e e k s b u t n o t a t 1 2 . 5 w e e k s , a n d r e s u l t e d i n C d a c c u m u l a t i o n o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . 171 A t 1 2 . 5 w e e k s , h e p a t i c c e l l r e g e n e r a t i o n a n d d y s p l a s i a w e r e h i g h e r i n m i c e r e c e i v i n g DEN a l o n e o r DEN + C d t h a n i n t h o s e e x p o s e d t o DEN + Z n . G r o s s c h o l a n g i o f i b r o s i s w a s e v i d e n t i n a l l 3 o f t h e m i c e e x p o s e d t o DEN + C d , 2 o f t h e m i c e e x p o s e d t o DEN a l o n e , 1 o f t h e m i c e e x p o s e d t o DEN + Z n , a n d n o n e o f t h e c o n t r o l s . D e c r e a s e s o f C u a n d Zn i n p r e t u m o r o u s l i v e r s o f a n i m a l s f e d DEN a r e p r o p o s e d t o b e r e l e v a n t i n t h e e t i o l o g y o f c a n c e r a s b o t h Cu a n d Z n h a v e b e e n s h o w n i n o t h e r s t u d i e s t o p r e v e n t c a n c e r w h e n g i v e n w i t h DMBA ( D i m e t h y l a m i n o a z o -b e n z e n e ) . I t i s s u g g e s t e d t h a t t h i s p r e v e n t a t i v e e f f e c t i s d u e t o t h e p r e v e n t i o n o f l o s s e s o f C u a n d Z n . P o s s i b l e m e c h a n i s m s o f c a n c e r i n d u c e m e n t r e s u l t i n g f r o m r e d u c e d l e v e l s o f C u a n d Z n a r e d i s c u s s e d . 1 7 2 C H A P T E R X D e c r e a s e s o f C o p p e r a n d Z i n c i n P r e t u m o r o u s a n d P o s t t u m o r o u s L i v e r s o f M i c e E x p o s e d t o D i e t h y l n i t r o s a m i n e , W i t h a n d W i t h o u t C a d m i u m o r Z i n c S u p p l e m e n t a t i o n P r e f a c e T h i s p a p e r w a s w r i t t e n b y D . A . B r o w n ( 1 9 7 8 ) , a n d w i l l b e s u b m i t t e d s h o r t l y f o r p u b l i c a t i o n . T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o f o l l o w c h a n g e s i n C d , C u a n d Z n f r o m p r e - t o p o s t t u m o r o u s s t a g e s . A s i n p r e t u m o r o u s l i v e r ( B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ) , p o s t t u m o r o u s l i v e r h a d d e c r e a s e s o f C d , C u a n d Z n . T h u s , i t w a s n o t d e m o n s t r a t e d t h a t a n o r g a n i c c a r c i n o g e n c a n i n c r e a s e C d a n d t h e C d : Z n r a t i o i n t h e h i g h , m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ; t h e s e c h a n g e s w e r e f o u n d p r e v i o u s l y i n c a n c e r o u s f i s h ( B r o w n , 1 9 7 7 ) a n d h u m a n s ( B r o w n a n d K n i g h t , 1 9 7 8 ) . A s i n B r o w n a n d C h a n (.1 9 7 8 ) , DEN e x p o s u r e r e s u l t e d i n d e c r e a s e s o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n C u a n d Z n . T i m e t o d e a t h d u e t o c a n c e r , i n c r e a s e d i n t h o s e e x p o s u r e s w h e r e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n C u a n d Zn w e r e m a i n t a i n e d c l o s e r t o , o r h i g h e r t h a n c o n t r o l l e v e l s . I n t r o d u c t i o n R e c e n t l y we h a v e r e p o r t e d t h a t a d m i n i s t r a t i o n o f 2 5 -4 0 mg d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) / L i n t h e d r i n k i n g w a t e r r e s u l t s i n d e p l e t i o n o f c o p p e r a n d z i n c i n p r e t u m o r o u s l i v e r t i s s u e u p t o 1 2 . 5 w e e k s ' e x p o s u r e ( B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ) . F u r t h e r m o r e , we f o u n d t h a t a d m i n i s t r a t i o n o f 2 5 0 mg 1 7 3 Z n / L w i t h DEN r e s u l t e d i n l e s s e r d e p l e t i o n s o f C u a n d Z n . W h e n 5 trig C d / L w a s a d m i n i s t e r e d w i t h D E N , t h e r e w e r e g r e a t e r d e p l e t i o n s o f C u a n d Zn u p t o s i x w e e k s ' e x p o s u r e , b u t n o t a t 1 2 . 5 w e e k s . M o s t o f t h i s C d a c c u m u l a t e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , r a t h e r t h a n i n m e t a l l o -t h i o n e i n a s i s u s u a l f o r e x c e s s e s o f C d i n l i v e r t i s s u e ( B r o w n , 1 9 7 7 ) . T h e s e i n c r e a s e s o f C d i n t h e h i g h m o l e c u -l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w e r e s i m i l a r t o i n c r e a s e s o f C d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s ( B r o w n , 1 9 7 7 ) a n d h u m a n c a n c e r v i c t i m s ( B r o w n a n d K n i g h t , 1 9 7 8 ) . I n a s t u d y o f t r a c e e l e m e n t i n t e r a c t i o n s i n d u c k l i v e r a n d k i d n e y , i t w a s d e t e r m i n e d t h a t e x c e s s e s o f C d m i g h t o c c u r i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l i f t h e r e w e r e d e f i c i e n c i e s o f Zn i n t h i s p o o l ( B r o w n a n d C h a t e l , 1 9 7 8 a ) . T h e r e f o r e , a s DEN r e d u c e s l e v e l s o f Zn i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , i t i s l i k e l y t h a t Cd s i m p l y o c c u p i e s b i n d i n g s i t e s v a c a t e d b y Zn i n t h i s p o o l . I n t h e p r e s e n t s t u d y , m i c e a r e e x p o s e d t o D E N . u n t i l t u m o r s d e v e l o p . C o p p e r , z i n c a n d c a d m i u m l e v e l s a r e m o n i -t o r e d t h r o u g h o u t t h i s e x p o s u r e p e r i o d . A n o t h e r g r o u p i s g i v e n DEN + 1 0 0 0 mg Z n / L t o d e t e r m i n e i f h i g h e r l e v e l s o f Zn t h a n i n t h e p r e v i o u s s t u d y ( . B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ) c a n c o m p l e t e l y r e v e r s e t h e c a r c i n o g e n - i n d u c e d l o s s e s o f C u a n d Z n . A n o t h e r g r o u p r e c e i v e s DEN + 1 0 0 mg C d / L t o d e t e r -m i n e t h e e f f e c t o f h i g h l e v e l s o f ' C d o n c a r c i n o g e n e s i s . 1 7 4 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s M i c e o f t h e S w i s s s t r a i n , a p p r o x i m a t e l y t w o m o n t h s o l d , w e r e s e p a r a t e d i n t o c a g e s , 3 m i c e o f t h e s a m e s e x p e r c a g e . M i c e w e r e a d m i n i s t e r e d e i t h e r t a p w a t e r , t a p w a t e r W i t h 2 5 mg D E N / L , 2 5 mg D E N / L + 1 0 0 0 mg Zn ( a s Z n S 0 4 • 7 H 2 0 ) / L , o r 2 5 mg D E N / L + 1 0 0 mg C d ( a s C d C l 2 ) / L . D r i n k i n g s o l u t i o n s w e r e c h a n g e d o n a l t e r n a t e d a y s . A l l w a t e r j a r s w e r e p a i n t e d b l a c k t o p r e v e n t p h o t o d e g r a d a t i o n o f D E N . M i c e w e r e f e d P u r i n a r a t c h o w _ad_ 1 i b i t u m . T h r e e m i c e f r o m e a c h e x p o s u r e t y p e w e r e s a m p l e d a t 0 , 8 a n d 1 7 w e e k s a f t e r t h e s t a r t o f e x p o s u r e v i a a s p h y x i a -t i o n w i t h C O , , . R e m a i n i n g m i c e w e r e s a m p l e d a f t e r d e a t h . O n l y t h e f i r s t s i x o f t h e s e m i c e t o d i e i n e a c h e x p o s u r e t y p e w e r e a n a l y z e d f o r t r a c e e l e m e n t l e v e l s i n t h e p r e s e n t s t u d y ; s i x c o n t r o l m i c e w e r e a l s o s a m p l e d a f t e r s i x D E N -e x p o s e d m i c e h a d d i e d . A l l m i c e w e r e e x a m i n e d f o r p r e s e n c e o f v i s i b l e t u m o r s a n d t h e n f r o z e n u n t i l a n a l y z e d . M i c e w e r e a n a l y z e d f o u r a t a t i m e , o n e f r o m e a c h e x p o s u r e t y p e ( i . e . , 1 C o n t r o l , 1 D E N , 1 DEN + Z n , a n d 1 DEN + C d ) i n o r d e r t o e n s u r e c o n s i s t e n c y o f a n a l y s i s b e -t w e e n d i f f e r e n t e x p o s u r e s . T w o g r a m s o f l i v e r w e r e h o m o -g e n i z e d f o r e x a c t l y 3 m i n u t e s i n a h o m o g e n i z i n g t u b e w i t h 4 . 5 m l o f Q . 9 % N a C l u s i n g a T R I - R S T I R - R l a b o r a t o r y m o t o r m o d e l S 6 3 C s e t t o a s t a n d a r d s p e e d ( s e t t i n g 4 . 5 ) a n d e q u i p p e d w i t h a t e f l o n h o m o g e n i z e r . H o m o g e n a t e s w e r e c e n t r i f u g e d f o r 1 0 m i n u t e s a t 2 7 , 0 0 0 x £ i n a S o r v a l l R C 2 - B 1 7 5 c e n t r i f u g e . S u p e r n a t a n t s w e r e c o l l e c t e d a n d p e l l e t s r e -h o m o g e n i z e d f o r e x a c t l y 2 m i n u t e s i n 2 . 5 m l o f 0 . 9 % N a C l . T h e s e w e r e t h e n c e n t r i f u g e d a t 2 7 , 0 0 0 x £ f o r 1 0 m i n u t e s a n d t h e s u p e r n a t a n t s c o m b i n e d w i t h p r e v i o u s s u p e r n a t a n t s . G r o u p s o f 4 s u p e r n a t a n t s w e r e t h e n p l a c e d i n a 7 0 ° C w a t e r b a t h f o r e x a c t l y 5 m i n u t e s t o c l e a r c e l l u l a r d e b r i s v i a h e a t p r e c i p i t a t i o n . T h e s e w e r e t h e n r e c e n t r i f u g e d a t 2 7 , 0 0 0 x £ f o r 1 0 m i n u t e s a n d t h e s u p e r n a t a n t s c o l l e c t e d . T o t a l t i s s u e h o m o g e n a t e s u p e r n a t a n t m e t a l l e v e l s w e r e d e t e r m i n e d ; C u a n d Zn a n d h i g h e r C d l e v e l s b y f l a m e , a n d l o w e r C d l e v e l s b y g r a p h i t e f u r n a c e a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t r y . Two m l o f e a c h o f t h e h o m o g e n a t e . s u p e r n a t a n t s f r o m e a c h e x p o s u r e t y p e f r o m 0 , 8 o r 17 w e e k s w e r e t h e n c o m b i n e d , a n d f i v e m l o f t h i s a p p l i e d t o a P h a r m a c i a c o l u m n ( . 1 . 6 x 1 0 0 cm), p a c k e d w i t h G - 7 5 g e l . T h i s w a s e l u t e d w i t h 0 . 0 1 M N H 4 H C 0 3 a n d c o l l e c t e d a s 1 5 m l f r a c t i o n s . A b s o r b a n c e w a s r e a d a t 2 5 0 a n d 2 8 0 nm o n a P e r k i n E l m e r 1 2 4 D s p e c t r o p h o t o m e t e r o n e a c h f r a c t i o n t o e s t a b l i s h t h e p o s i t i o n o f t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , m e t a l l o t h i o n e i n a n d t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o -p l a s m i c p o o l ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ; B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ) . M e t a l l e v e l s w e r e d e t e r m i n e d i n e a c h f r a c t i o n w i t h m e t h o d s s i m i l a r t o t o t a l m e t a l l e v e l s . T o t a l m e t a l l e v e l s f o r e a c h c y t o p l a s m i c p o o l w e r e d e t e r m i n e d b y s u m m i n g o f t h e i n d i v i d u a l m e t a l l e v e l s i n e a c h f r a c t i o n o f e a c h p o o l . G e l e l u t i o n p r o f i l e s w e r e n o t d o n e o n a n i m a l s w h i c h w e r e 1 7 6 c o l l e c t e d a f t e r d e a t h a s t h e s e w e r e n o t f r o z e n i m m e d i a t e l y ; t h e r e f o r e i t i s l i k e l y t h a t p r o t e o l y t i c e n z y m e s w o u l d h a v e d e c r e a s e d t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , a n d i n -c r e a s e d t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l , t h u s p r o v i d i n g m i s l e a d i n g r e s u l t s . ' R e s u l t s T o t a l t i s s u e h o m o g e n a t e s u p e r n a t a n t C u l e v e l s w e r e d e c r e a s e d b y e x p o s u r e t o DEN ( . T a b l e s 1 6 a n d 1 7 ) . T h e s e d e c r e a s e s r a n g e d f r o m 2 1 . 8 % a t 8 w e e k s t o 2 8 . 0 % a t t h e t i m e o f d e a t h . T o t a l C u . l e v e l s w e r e u n c h a n g e d i n m i c e e x p o s e d t o DEN + Zn f o r 8 w e e k s , a n d r e a c h e d a m a x i m u m d e c r e a s e o f o n l y 8 . 1 % a t t h e t i m e o f d e a t h . E x p o s u r e t o DEN + C d r e s u l t e d i n i n c r e a s e s o f C u u p t o 5 4 . 0 % ( T a b l e s 1 6 a n d 1 7 , F i g u r e s 2 5 a n d 2 6 ) . I n m i c e e x p o s e d t o DEN o r DEN + Z n , t h e s e r e d u c t i o n s i n C u l e v e l s r e f l e c t e d d e c r e a s e s o f C u i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( T a b l e 1 8 ) . I n m i c e e x p o s e d t o DEN + C d f o r 8 w e e k s , t h e r e w a s a d e c r e a s e o f C u i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , b u t l a r g e i n c r e a s e s i n m e t a l l o t h i o n e i n , a n d s m a l l e r i n c r e a s e s i n t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . A f t e r 1 7 w e e k s ' e x p o s u r e t o C d , C u w a s d e c r e a s e d o n l y s l i g h t l y i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , a n d i n c r e a s e d s l i g h t l y o n m e t a l l o -t h i o n e i n a n d t h e 1 o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l ( T a b l e 1 8 ) . T o t a l Zn l e v e l s d e c r e a s e d p r o g r e s s i v e l y f r o m 8 w e e k s ' T a b l e 16. L e v e l s o f Cd, Cu and Zn In l i v e r t i s s u e homogenate s u p e r n a t a n t o f mice exposed t o d 1 e t h y l n 1 t r o s a m 1 n e (DEN) w i t h and w i t h o u t s u p p l e m e n t a t i o n w i t h Cd o r Zn. V a l u e s a r e e x p r e s s e d 1n jimole/g t i s s u e (wet w e i g h t ) . 0 Weeks C o n t r o l (3) 8 Weeks C o n t r o l (3) DEN (3) DEN + Zn (3) DEN + Cd (3) 17 Weeks C o n t r o l (3) DEN (3) DEN + Zn (3) DEN + Cd (3) Time o f Death C o n t r o l (6) DEN (6) DEN + Zn (6) DEN + Cd (6) Cd 0.00068" (0.00017)° 0.00062 (0.0001 2) 0.00029* (0.00013) 0.00043 (0.00020) 0; 1266** (0,0116) 0.00064 (0.00028) 0.00118 (0.00118) 0.00024* (0.00008) 0.1611** (0.0134) 0.00053 (0.00022) 0.00032* (0.00016) 0.00040 (0.00013) 0.2689** (0.0635) Cu 0.0373 (0.0033) 0.0344 (0.003Z) 0.0269 (0.0080) 0.0345 (0.0077) 0.0448 (0.0079) 0.0291 (0.0010) 0.0220** (0.0006) 0.0279 (0.0026) 0.0448** (0.0019) 0.0236 (0.0028) 0.0170* (0.0061) 0.0217 (0.0038) 0.0274 (0.0085) Zn 0.0739 (0.0055) 0.0664 (0.0062) 0.0546* (0.0038) 0.0583 (0.0080 0.0920 (0,0189) 0.0772 (0.0022) 0.0566* (0.0058) 0.0589** (0.0022) 0.0935* (0.0094) 0.0739 (0.0115) 0.0413** (0.0184) 0.0863 (0.0528) 0.1919* (0.0822) "Mean. ''standard d e v i a t i o n . * P < 0 . 0 5 ; S t u d e n t ' s t t e s t . * * P < 0 . 0 0 1 . 1 7 8 T a b l e 1 7 . P e r c e n t a g e c h a n g e s o f C u a n d Zn l e v e l s i n t o t a l t i s s u e h o m o g e n a t e s u p e r n a t a n t f r o m l i v e r s o f m i c e e x p o s e d t o d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) , w i t h a n d w i t h o u t C d o r Zn s u p p l e m e n t a t i o n . 8 W e e k s DEN (.3) DEN + Zn ( 3 ) DEN + C d ( 3 ) C u - 2 1 . 8 + 0 . 1 + 3 0 . 2 Zn - 1 7 . 8 - 1 2 . 2 + 3 8 . 6 1 7 w e e k s DEN ( 3 ) DEN + Zn ( 3 ) DEN + C d ( 3 ) - 2 4 . 4 - 4 . 1 + 5 4 . 0 - 2 6 . 7 - 2 3 . 7 + 21 . 1 T i m e o f D e a t h DEN (.6) DEN + Zn ( .6) DEN + C d (.6) - 2 8 . 0 - 8 . 1 + 1 6 . 1 ^ 4 4 . 1 + 1 6 . 8 + 1 5 9 . 7 1 7 9 F i g u r e 2 5 . T h e v a r i a t i o n o f C u l e v e l s i n c y t o p l a s m f r o m l i v e r s o f m i c e e x p o s e d t o DEN w i t h a n d w i t h o u t C d o r Z n . E a c h p o i n t a t 0 , 8 a n d 17 w e e k s r e p r e s e n t s 3 a n i m a l s , w h i l e t h o s e a t 3 0 w e e k s r e p r e s e n t s 6 a n i m a l s e a c h . T h i r t y w e e k s w a s t h e m e a n t i m e t o d e a t h o f t h e f i r s t 6 a n i m a l s t o d i e a f t e r e x p o s u r e t o D E N , w i t h a n d w i t h o u t C d o r Zn s u p p l e m e n t a t i o n . C9 ZD to CO D) 0.05 h | 0.04 E 1 Z L ^ 0.03 U £ 0.02 CO ai o 0.01 u •+-» o h-DEN + Ccl DEN 8 12 16 20 24 28 Weeks of E xposu r e to DEN 32 CO o 1 81 F i g u r e 2 6 . T h e v a r i a t i o n o f Zn l e v e l s i n c y t o p l a s m f r o m l i v e r s o f m i c e e x p o s e d t o DEN w i t h a n d w i t h o u t C d o r Z n . E a c h p o i n t a t 0 , 8 a n d 17 w e e k s r e p r e s e n t s 3 a n i m a l s , w h i l e t h o s e a t 3 0 w e e k s r e p r e s e n t s 6 a n i m a l s e a c h . T h i r t y w e e k s w a s t h e m e a n t i m e t o d e a t h o f t h e f i r s t 6 a n i m a l s t o d i e a f t e r e x p o s u r e t o D E N , w i t h a n d w i t h o u t C d o r Zn s u p p l e m e n t a t i o n . D CO CO +-> 0.20 U) \ o E 0.15 3 -c N u 0.10 £ CO (TJ a 0.05 o • i u To • i o DEN+Cd Con t ro l _^o q-^~~ DEN + Zn DEN — i 1 1 1 1 1 1— 4 8 12 16 20 24 28 Weeks of E x p o s u r e to DEN 32 Table 18. The d i s t r i b u t i o n o f Cd, Cu and Zn among c y t o p l a s m i c p o o l s from l i v e r s of mice exposed to d i e t h y l n i t r o s a m i n e (DEN) w i t h and w i t h o u t s u p p l e m e n t a t i o n with,Cd or Zn. Values are e x p r e s s e d i n ^mole metal i n each p o o l / g t i s s u e (wet w e i g h t ) . Cd Cu Zn To t a l High HWa poo 1 M e t a l l o -t h i o n e i n Low MW pool T o t a l High MW pool M e t a l l o -t h i o n e i n Low MW pool T o t a l High MW pool M e t a l l o -t h i o n e i n Low MW pool 0 Weeks C o n t r o l (3) .00186 .00092 .00041 .00053 . 0520 . 0301 .0070 .0149 .0726 . 0652 ND b .0074 8 Weeks C o n t r o l (3) .00168 .00080 .00039 .00049 .0481 .0292 .0062 .0127 . 0644 .0626 ND .0018 DEN (3) .00153 .00061 .00047 .00045 . 0402 .0216 .0068 .0118 .0485 .0471 ND .0014 DEN + Zn (3) .00159 .00075 .00042 .00042 .0488 .0294 .0057 .0137 . 0536 .0527 ND .0009 DEN + Cd (3) .1084 .0212 .0860 .0012 .0630 .0188 .0243 .0199 . 0987 .0841 .0089 .0057 17 Weeks C o n t r o l (3) .00199 .00075 .00040 .00084 .0488 . 0281 .0077 .01 30 .0668 .0570 .0035 .0063 DEN (3) .00246 .00090 .00054 .00102 . 0374 . 01 93 .0082 .0099 .0487 .0435 .0008 .0044 DEN + Zn (3) .00177 .00063 .00036 .00078 .0385 .0198 .0069 .0118 .0478 .0415 .0005 .0058 DEN + Cd (3) .1927 .1241 .0174 .0512 .0547 .0249 .0085 .0213 . 0705 . 0553 .0033 .0119 a M o l e c u l a r w e i g h t . b N o t d e t e c t a b l e . 1 8 4 e x p o s u r e t i l l t h e t i m e o f d e a t h ; t h e m a x i m a l d e c r e a s e a t t h e t i m e o f d e a t h w a s 4 4 . 1 % ( T a b l e s 1 6 a n d 1 7 ) . E x p o s u r e t o DEN + Zn r e s u l t e d i n l e s s e r l o s s e s o f Zn a t 8 a n d 17 w e e k s , b u t i n c r e a s e s i n Zn a t t h e t i m e o f d e a t h . H o w e v e r , t h i s i n c r e a s e i n Zn a t t h e t i m e o f d e a t h i s a r e f l e c t i o n o f v e r y h i g h Z n l e v e l s i n t h e f i f t h a n d s i x t h l o n g e s t s u r v i v i n g m i c e ( F i g u r e 2 7 ) . Z i n c l e v e l s i n t h e f i r s t f o u r m i c e t o d i e a f t e r e x p o s u r e t o DEN + Z n , w e r e a c t u a l l y l e s s t h a n c o n t r o l l e v e l s . E x p o s u r e t o DEN + C d r e s u l t e d i n i n c r e a s e s i n Zn r a n g i n g u p t o 1 5 9 . 7 % a t t h e t i m e o f d e a t h ( T a b l e 1 7 ) . R e d u c t i o n s i n Zn l e v e l s o f a n i m a l s e x p o s e d t o DEN o r DEN + Zn r e f l e c t d e c r e a s e s o f Z n m a i n l y f r o m t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a f t e r 8 a n d 1 7 w e e k s ' e x p o s u r e ( T a b l e 1 8 ) . A f t e r 17 w e e k s ' e x p o s u r e i t i s a p p a r e n t t h a t Zn i s a l s o d e c r e a s e d i n m e t a l l o t h i o n e i n . E x p o s u r e t o DEN + C d f o r 8 w e e k s r e s u l t e d i n i n c r e a s e d l e v e l s o f Zn i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a n d m e t a l l o t h i o n e i n . A f t e r 17 w e e k s ' e x p o s u r e t o DEN + C d , Zn w a s i n c r e a s e d o n l y i n t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l , a l t h o u g h C d d i d s e e m t o r e v e r s e l o s s e s o f Z n f r o m t h e h i g h , m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , o t h e r w i s e i n d u c e d b y e x p o s u r e t o DEN a l o n e . T o t a l C d l e v e l s a p p e a r e d t o b e d e c r e a s e d b y e x p o s u r e t o DEN a t 8 w e e k s , i n c r e a s e d a t 1 7 w e e k s , a n d d e c r e a s e d a t t h e t i m e o f d e a t h ( T a b l e 1 6 ) . E x p o s u r e t o DEN + Zn r e -s u l t e d i n d e c r e a s e s o f C d a t a l l s a m p l e t i m e s . E x p o s u r e 1 85 F i g u r e 2 7 . T h e t i m e t o d e a t h a f t e r c o m m e n c e m e n t o f e x p o s u r e o f m i c e t o D E N , w i t h a n d w i t h o u t C d o r Z n s u p p l e m e n t a t i o n . 186 J I I I I I I I I l < l l o o o o o o o oo co CM o 00 CD CM C\J C\J C\J c\j v - v -1 8 7 t o DEN + C d r e s u l t e d i n i n c r e a s e s o f C d w i t h i n c r e a s e s o f e x p o s u r e t i m e . C h a n g e s o f C d l e v e l s w e r e n o t a s r e a d i l y a p p a r e n t o n g e l p r o f i l e s o f m i c e e x p o s e d t o DEN o r DEN + Zn a s o n t i s s u e h o m o g e n a t e s u p e r n a t a n t t o t a l s . C h a n g e s i n C d l e v e l s w e r e , f o r t h e m o s t p a r t , e q u i d i s t r i b u t e d o v e r a l l t h r e e p o o l s ( T a b l e 1 8 ) . E x p o s u r e t o DEN + C d r e s u l t e d i n a c c u m u l a t i o n o f m o s t C d o n m e t a l l o t h i o n e i n a t 8 w e e k s . H o w e v e r a t 17 w e e k s m o s t C d w a s f o u n d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . T h e r e w a s a l a r g e d e c r e a s e o f C d - t h i o n e i n f r o m 8 t o 17 w e e k s . A l l m i c e w h i c h d i e d a f t e r e x p o s u r e t o D E N , w i t h a n d w i t h o u t C d o r Z n , h a d r e a d i l y v i s i b l e t u m o r s . S u r v i v a l t i m e a p p e a r e d t o b e i n c r e a s e d s l i g h t l y b y e x p o s u r e t o DEN + Z n , a n d b y a m u c h l a r g e r , m a r g i n b y e x p o s u r e t o DEN + C d ( F i g u r e 2 7 ) . M e a n s u r v i v a l t i m e f o r t h e t h r e e e x p o s u r e t y p e s a p p e a r e d t o i n c r e a s e w i t h i n c r e a s e s o f t o t a l c y t o -p l a s m i c C u + Zn l e v e l s a t t h e t i m e o f d e a t h ( F i g u r e 2 8 ) . T h e l o n g e s t s u r v i v i n g m o u s e w a s o n e e x p o s e d t o DEN + Z n ; t h i s m o u s e w a s s t i l l a l i v e a t t h e t i m e t h i s r e p o r t w a s w r i t t e n . P i s c u s s i o n T h i s s t u d y c o n f i r m s t h a t P E N r e s u l t s i n d e c r e a s e s o f C u a n d Z n i n p r e t u m o r o u s l i v e r t i s s u e , a n d s h o w s t h a t t h e s e d e c r e a s e s a r e e v e n m o r e p r e v a l e n t a f t e r t u m o r s h a v e d e -v e l o p e d . F u r t h e r m o r e , t h e p r e s e n t s t u d y a p p e a r s t o s u g g e s t t h a t t h e t i m e t o d e a t h a f t e r e x p o s u r e t o P E N , i s d i r e c t l y 1 8 8 F i g u r e 2 8 T h e i n c r e a s e i n t i m e t o d e a t h w i t h i n c r e a s e s o f Cu a n d Zn i n l i v e r , a t t i m e o f d e a t h , o f m i c e e x p o s e d t o D E N , w i t h a n d w i t h o u t C d o r Z n s u p p l e m e n t a t i o n . > 2 4 0 h cu 9 2 3 0 1 1 2 2 0 (0 Q E c (fl 2 210 200 190 180 170 160 DEN i 1 0.1 0.2 To ta l C y t o p l a s m i c Cu+Zn (pmole/g t issue) a t the T ime of Death CO to 1 9 0 r e l a t e d t o l i v e r C u + Zn l e v e l s . I n t h o s e m i c e a d m i n i s t e r e d DEN + Zn , l o s s e s o f C u a n d Zn w e r e r e d u c e d a t 8 a n d 17 w e e k s a n d t h e s e l e v e l s w e r e a c t u a l l y i n c r e a s e d a t t h e t i m e o f d e a t h . H o w e v e r , t h i s i n c r e a s e a t t h e t i m e o f d e a t h w a s a r e f l e c t i o n o f i n c r e a s e s i n o n l y t w o o f t h e s i x a n i m a l s , s o t h a t o v e r a l l , Z n a d m i n i s t r a t i o n w"i t h DEN w a s o n l y p a r t i a l l y a b l e t o r e d u c e l o s s e s o f C u a n d Z n . L i k e w i s e , Z n a d m i n i s t r a -t i o n i n c r e a s e d o n l y s l i g h t l y (1 0 d a y s ) t h e m e a n t i m e . t o d e a t h o f t h e f i r s t s i x m i c e t o d i e ( F i g u r e 2 7 ) . A d m i n i s t r a t i o n o f C d r e s u l t e d i n l a r g e i n c r e a s e s o f t o t a l C u a n d Zn a t a l l e x p o s u r e t i m e s . T h e s e l a r g e i n -c r e a s e s o f t o t a l C u + Zn c o i n c i d e d w i t h a 5 0 d a y e x t e n s i o n o f s u r v i v a l t i m e . T h e p o s s i b l e m e c h a n i s m b y w h i c h r e -d u c t i o n s o f C u a n d Zn l e v e l s m i g h t r e s u l t i n c a r c i n o g e n e s i s h a v e b e e n d i s c u s s e d b y B r o w n a n d C h a n ( 1 9 7 8 ) . I n p r e v i o u s • s t u d i e s i t h a d b e e n f o u n d t h a t C d a n d t h e C d : Z n r a t i o i s i n c r e a s e d i n t u m o r - b e a r i n g o r g a n i s m s ( M o r g a n , 1 9 7 0 , 1 9 7 1 ; B r o w n , 1 9 7 7 ; B r o w n a n d K n i g h t , 1 9 7 8 ) . F u r t h e r -m o r e , w h e n o n l y 5 mg C d / L w e r e g i v e n w i t h D E N , t h e r e a p p e a r e d t o b e a n i n c r e a s e i n p r e t u m o r o u s l i v e r c h a n g e s ( B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ) . T h a t r e s u l t s i n t h e p r e s e n t s t u d y a p p e a r t o c o n t r a d i c t t h e s e p r e v i o u s s t u d i e s , m a y b e a r e f l e c t i o n o f t h e a b n o r m a l l y h i g h C d l e v e l s a d m i n i s t e r e d i n t h e p r e s e n t s t u d y . H i g h l e v e l s o f C d h a v e b e e n s h o w n t o b e a b l e t o d e a c t i v a t e t h e b i o a c t i v a t i o n e n z y m e s y s t e m ( J e r i n a a n d D a l e y , 1 9 7 4 ) f o r o r g a n i c c a r c i n o g e n s ( Y o s h i d a 1 91 e t a l . , 1 9 7 5 ) , i . e . , i n t h e p r e s e n c e o f h i g h l e v e l s o f C d , DEN w o u l d n ' t b e c a r c i n o g e n i c a s i t w o u l d n ' t b e b i o a c t i v a t e d . I f l o s s e s o f C u a n d Zn a r e n e c e s s a r y f o r c a r c i n o g e n e s i s , t h e n t h e r e v e r s a l o f t h e s e l o s s e s b y C d m a y b e r e s p o n s i b l e f o r t h e s l o w i n g o f t h e c a r c i n o g e n i c p r o c e s s . I n a p r e v i o u s s t u d y w h e n a l o w e r C d e x p o s u r e a d v a n c e d p r e t u m o r o u s c h a n g e s , t h e r e w e r e i n c r e a s e d l o s s e s o f C u a n d Z n a f t e r 3 a n d 6 w e e k s ' e x p o s u r e ( B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ) . T h e s e i n c r e a s e d l o s s e s o f C u a n d Zn c a n b e e x p l a i n e d a s e x c l u s i o n o f C u a n d Z n f r o m m u c o s a l m e t a l l o t h i o n e i n b y C d , s o t h a t t h e s e a r e n ' t a b s o r b e d i n t o t h e b l o o d s t r e a m ( . . S t o n a r d a n d W e b b , 1 9 7 6 ; E v a n s e t a l . , 1 9 7 0 ) . H o w e v e r , i n t h e p r e s e n t s t u d y i t m a y b e t h a t C d l e v e l s w e r e h i g h e n o u g h s o t h a t t h e l e v e l o f m u c o s a l m e t a l l o t h i o n e i n w a s i n c r e a s e d s o m u c h b y i n d u c t i o n b y C d , t h a t Cu a n d Zn u p t a k e l e v e l s w e r e i n c r e a s e d b y t h e C d - i n d u c e d m u c o s a l m e t a l l o t h i o n e i n . T h i s a r g u m e n t a s s u m e s t h a t C d l e v e l s i n t h e 5 mg C d / L e x p o s u r e w e r e n o t h i g h e n o u g h t o i n d u c e m u c o s a l m e t a l l o t h i o n e i n , b u t r a t h e r t h a t C d s i m p l y o u t c o m p e t e d C u a n d Zn f o r p r e e x i s t i n g m u c o s a l m e t a l l o t h i o n e i n b i n d i n g s i t e s . A l s o a s s u m e d , i s t h a t i n t h e h i g h e r e x p o s u r e , m a n y m o r e m u c o s a l b i n d i n g s i t e s w e r e c r e a t e d t h a n n e e d e d f o r t h e l e v e l o f C d e x p o s u r e , s o t h a t t h e r e w e r e m o r e a v a i l a b l e b i n d i n g s i t e s f o r t h e u p t a k e o f C u a n d Z n . . S u g a w a r a a n d S u g a w a r a (.1 9 7 7 ) f o u n d t h a t TOO mg C d / L i n t h e d r i n k i n g w a t e r i n d u c e d m e t a l l o t h i o n e i n a n d i n c r e a s e d Z n u p t a k e i n t h e d u o d e n a l m u c o s a o f r a t s . 1 9 2 I n t h e p r e s e n t s t u d y , e x p o s u r e t o DEN r e s u l t e d i n i n -c r e a s e s o f C d i n t i s s u e o n l y a t 17 w e e k s ' e x p o s u r e t o D E N , i . e . , j u s t b e f o r e t u m o r s s t a r t . H o w e v e r , C d w a s n o t i n -c r e a s e d i n t h e s e m i c e a f t e r t u m o r s d e v e l o p e d a s i t w a s i n c a n c e r o u s f i s h ( B r o w n , 1 9 7 7 ) a n d h u m a n s ( B r o w n a n d K n i g h t , 1 9 7 8 ) . T h i s s u g g e s t s s e v e r a l p o s s i b i l i t i e s . F i r s t , i n t h e p r e s e n t s t u d y we h a v e e x a m i n e d C d l e v e l s i n t h e a c t u a l t i s s u e i n w h i c h t u m o r s d e v e l o p e d , i . e . , t h e l i v e r . I n b o t h c a n c e r o u s f i s h a n d h u m a n s , n o n t u m o r o u s t i s s u e w a s e x a m i n e d . P e r h a p s C d i s i n c r e a s e d i n n o n t u m o r o u s t i s s u e s i n c a n c e r o u s o r g a n i s m s , a n d d e c r e a s e d i n t h e t u m o r s . T h i s , h o w e v e r , a p p e a r s t o c o n t r a d i c t f i n d i n g s b y T i e t z e t a l . (1 9 5 7 ) a n d G o r o d i s k i i e t a l . ( 1 9 5 6 ; , i n F u r s t a n d H a r o , 1 9 6 9 ) . S e c o n d , p e r h a p s t h e m o d e o f a c t i o n o f DEN i s d i f f e r e n t t h a n t h a t o f o t h e r c a r c i n o g e n s . S i n c e b o t h c a n c e r o u s f i s h a n d h u m a n s h a v e i n c r e a s e d C d l e v e l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , t h i s s e e m s t o s u g g e s t t h a t c a r c i n o g e n s t o w h i c h t h e s e o r g a n i s m s h a v e b e e n e x p o s e d , c a u s e d t h e s e c h a n g e s . T h i r d , p e r h a p s c o n d i t i o n s i n t h i s s t u d y w e r e u n n a t u r a l , a n d n o r m a l C d l e v e l s w e r e n o t a v a i l a b l e . I n a n o t h e r s t u d y , w h e n l o w l e v e l s o f C d w e r e g i v e n t o m i c e , C d a c c u m u l a t e d o n m e t a l l o -t h i o n e i n ( B r o w n a n d C h a t e l , 1 9 7 8 c ) . ; w h e n C d w a s g i v e n w i t h D E N , m o s t a c c u m u l a t e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l C B r o w n a n d C h a t e l , 1 9 7 8 c ) . . T h e r e f o r e t h e c a r c i n o g e n DEN d o e s h a v e t h e p o t e n t i a l t o i n c r e a s e C d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l i f C d i s a v a i l a b l e . P e r h a p s , 1 9 3 i f C d h a d b e e n a v a i l a b l e i n h i g h e r l e v e l s , i n t h e p r e s e n t s t u d y i n m i c e e x p o s e d t o DEN ( i ^ e . , 5 mg C d / L , b u t n o t a s h i g h a s 1 0 0 mg C d / L ) t h e n t h e c a r c i n o g e n i c p r o c e s s m i g h t h a v e b e e n s p e e d e d u p . T h e t i m e t o p r o d u c e t u m o r s v i a DEN i n t h i s s t u d y i s a b n o r m a l l y l o n g ; i n t h e p r e s e n t s t u d y 3 0 w e e k s w e r e r e q u i r e d f o r d e a t h d u e t o t u m o r s , a t l e a s t 17 w e e k s w e r e r e q u i r e d f o r t u m o r f o r m a t i o n . O t h e r s r e p o r t o n l y 1 0 w e e k s o f e x p o s u r e t o DEN a s r e s u l t i n g i n t u m o r f o r m a t i o n a n d 1 5 t o 1 9 ' w e e k s i n d e a t h ( W e i s b u r g e r e t a l . , 1 9 7 5 ; B . a r b a s o n e t a l . , 1 9 7 7 ) . F o u r t h , p e r h a p s t h e i n -c r e a s e s o f C d a n d C d ; Z n i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f c a n c e r o u s f i s h a n d h u m a n s a r e s i m p l y c o i n c i d e n t a l , a n d i r r e v e l a n t t o c a r c i n o g e n e s i s . A f t e r 8 w e e k s ' e x p o s u r e t o DEN + C d m o s t C d a c c u m u l a t e d i n m e t a l l o t h i o n e i n , b u t a t 1 7 w e e k s t h e r e w a s a n 8 0 % d r o p i n C d - t h i o n e i n . M o s t C d a t 17 w e e k s a c c u m u l a t e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . H i g h L e v e l s o f C d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a r e u s u a l l y a s s o c i a t e d w i t h c a n c e r o u s o r g a n i s m s ( B r o w n , 1 9 7 7 ; B r o w n a n d K n i g h t , 1 9 7 8 ) , b u t i n t h e p r e s e n t s t u d y t h e d e v e l o p m e n t o f t u m o r s w a s s l o w e d w i t h v e r y h i g h l e v e l s o f C d i n t h i s p o o l . P e r -h a p s t h i s i s d u e t o t h e h i g h l e v e l s o f C u a n d Z n a l s o o c c u r r i n g i n t h i s p o o l . A l t e r n a t i v e l y , s i n c e t h e r e i s a l a r g e u n e * p l a i n a b l e d r o p i n m e t a l l o t h i o n e i n f r o m 8 t o 17 w e e k s : , p e r h a p s h i g h l e v e l s o f C d , l i k e h i g h l e v e l s o f C u , c a n c a u s e m e t a l l o t h i o n e i n t o a g g r e g a t e ( I r o n s a n d S m i t h , 1 9 4 1 9 7 6 ) . T h e r e f o r e , h i g h l e v e l s o f C d w o u l d a p p e a r t o b e i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , b u t t h e s e w o u l d b e b o u n d t o a g g r e g a t e s o f m e t a l l o t h i o n e i n , a n d t h e r e f o r e n o t a f f e c t e n z y m e f u n c t i o n i n g . T h i s c l u m p i n g p r o b a b l y i s n o t r e s p o n s i b l e f o r i n c r e a s e d h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n C d l e v e l s i n f i s h ( B r o w n , 1 9 7 7 ) s i n c e C d l e v e l s a r e o n l y 10% o f C d l e v e l s . i n DEN + C d e x p o s e d * m i c e . I n h u m a n c o n t r o l s a n d c a n c e r p a t i e n t s , C d l e v e l s a r e h i g h , b u t n o t h i g h e r i n c o n t r o l s t h a n c a n c e r p a t i e n t s ( B r o w n a n d K n i g h t , 1 9 7 8 ) . T h e r e f o r e , i t i s u n l i k e l y t h a t h i g h l e v e l s o f C d w e r e r e s p o n s i b l e f o r m e t a l l o t h i o n e i n a g g r e g a t i o n o n l y i n c a n c e r v i c t i m s . I n t h i s s t u d y , a s i n a p r e v i o u s s t u d y ( B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ) , a d m i n i s t r a t i o n o f Zn w i t h DEN f a i l e d t o t o t a l l y c o u n t e r a c t D E N - i n d u c e d l o s s e s o f C u a n d Z n ; h o w e v e r , s i m i -l a r l y t o t h i s p r e v i o u s s t u d y , D E N - i n d u c e d l o s s e s o f b o t h C u a n d Zn w e r e r e d u c e d b y a d m i n i s t r a t i o n o f Zn w i t h D E N . T h i s s u g g e s t s t h a t Zn t i e s u p b i n d i n g s i t e s o n D E N , s o t h a t DEN i s n o t a b l e t o b i n d , a n d s u b s e q u e n t l y r e m o v e t i s s u e C u a n d Z n ( B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ) . O t h e r s t u d i e s h a v e r e p o r t e d t h a t Zn p r e v e n t s c a n c e r w h e n g i v e n w i t h a n o r g a n i c c a r c i n o g e n ( P o s ' w i l l o a n d C o h e n , 1 9 7 1 ; C i a p p a r e l l i e t a l . , 1 9 7 2 ) , C d ( G u n n e t a . l . , 1 9 6 3 . , 1 9 6 4 ) , t r a n s p l a n t e d t u m o r s ( D u n c a n e t a l . , 1 9 7 4 ; D u n c a n a n d D r e o s t i , 1 9 7 5 , 1 9 7 6 ; W o s t e r e t a l . , 1 9 7 5 ) , o r t o m i c e w i t h s p o n t a n e o u s l y o c c u r r i n g m a m m a r y g l a n d c a n c e r ( B i s c h o f f 1 9 5 a n d L o n g , 1 9 3 9 ) . S i n c e we w e r e u n a b l e t o m a i n t a i n t i s s u e Zn l e v e l s a t n o r m a l c o n t r o l l e v e l s t h r o u g h o u t t h e e x p o s u r e p e r i o d , i t i s d i f f i c u l t t o d e t e r m i n e , f r o m t h e p r e s e n t s t u d y , i f Zn p r e v e n t s D E N - i n d u c e d t u m o r s . H o w e v e r , i t i s o f i n t e r e s t , t h a t i n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e t w o l o n g e s t s u r v i v i n g DEN + Z n e x p o s e d m i c e h a d b y f a r t h e h i g h e s t Zn l e v e l s o f t h e f i r s t s i x DEN + Z n e x p o s e d m i c e . A l s o t h e l o n g e s t s u r v i v i n g m o u s e i n t h e p r e s e n t s t u d y w a s a DEN + Zn e x p o s e d m o u s e . P e r h a p s f u t u r e s t u d i e s s h o u l d c o m p a r e a l t e r n a t e m e a n s o f a d m i n i s t r a t i o n o f b o t h Cu a n d Z n w i t h D E N , t o t o t a l l y c o u n t e r a c t DEN i n d u c e d l o s s e s o f C u a n d Z n . I f a t t h i s p o i n t , c a r c i n o g e n e s i s i s n o t p r e v e n t e d , t h e n i t c a n b e c o n c l u d e d t h a t C u a n d Zn a r e n o t r e l e v a n t t o t h e e t i o l o g y o f DEN i n d u c e d t u m o r s . I n t h e p r e s e n t s t u d y , C d p r e v e n t e d l o s s e s o f C u a n d Z n b u t d i d n ' t p r e v e n t t u m o r f o r m a t i o n . H o w e v e r , C d i t s e l f i s a c a r c i n o g e n ( F l i c k e t a l . , 1 9 7 1 ) a n d a p p e a r s t o b e a s s o c i a t e d w i t h c a n c e r o u s o r g a n i s m s ( M o r g a n , 1 9 7 0 , 1 9 7 1 ; B r o w n , 1 9 7 7 ; B r o w n a n d K n i g h t , 1 9 7 8 ) . T h a t t i m e t o d e a t h , i n t h e p r e s e n t s t u d y , i s r e l a t e d t o C u a n d Zn l e v e l s , s e e m s t o s u g g e s t t h a t D E N - i n d u c e d l o s s e s o f C u a n d Zn a r e i m p o r t a n t t o t h e d e v e l o p m e n t o f t u m o r s . S u m m a r y M i c e w e r e e x p o s e d t o DEN i n t h e i r d r i n k i n g w a t e r , w i t h o r w i t h o u t 1 Q 0 0 mg Z n / L o r 1 0 0 mg C d / L . M i c e w e r e s a m p l e d a t 0 , 8 a n d 1 7 w e e k s o f e x p o s u r e a n d a t t h e t i m e o f 1 9 6 d e a t h . C a d m i u m , c o p p e r a n d z i n c l e v e l s w e r e d e t e r m i n e d i n t i s s u e h o m o g e n a t e s u p e r n a t a n t . DEN e x p o s u r e r e s u l t e d i n l o s s e s o f C u a n d Z n , i n c r e a s i n g f r o m 2 1 . 8 % a n d 1 7 . 8 % f o r C u a n d Zn r e s p e c t i v e l y , a t 8 w e e k s , t o 2 8 . 0 % a n d 4 4 . 1 % a t t h e t i m e o f d e a t h . G e l e l u t i o n p r o f i l e s a t 8 a n d 1 7 w e e k s r e v e a l e d t h a t t h e s e l o s s e s w e r e m a i n l y f r o m t h e h i g h m o -l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . M e a n t i m e t o d e a t h f o r DEN e x p o s e d m i c e w a s 1 8 3 d a y s . A l l d e a d m i c e h a d t u m o r s i n t h e i r l i v e r s . E x p o s u r e t o DEN + Zn r e d u c e d l o s s e s o f C u a n d Zn a n d e x t e n d e d m e a n s u r v i v a l t i m e t o a t l e a s t 1 9 8 d a y s . E x p o s u r e t o DEN + C d r e s u l t e d i n i n c r e a s e s o f C u a n d Z n o v e r c o n t r o l v a l u e s , a n d i n c r e a s e d t h e m e a n t i m e t o d e a t h t o 2 3 7 d a y s . 1 9 7 C H A R T E R X I T h e E f f e c t o f C a d m i u m E x p o s u r e , W i t h o r W i t h o u t D i e t h y l n i t r o s a m i n e , o n t h e C y t o -p l a s m i c L e v e l s a n d D i s t r i b u t i o n o f C a d m i u m , C o p p e r a n d Z i n c P r e f a c e T h i s s t u d y w a s a u t h o r e d b y D : A . B r o w n a n d K . W. C h a t e l ( 1 9 7 8 c ) , a n d w i l l b e s u b m i t t e d s h o r t l y f o r p u b l i c a -t i o n . T h e s t u d y w a s c o n d u c t e d i n o r d e r t o i n v e s t i g a t e w h e t h e r o r n o t DEN i n c r e a s e d h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l C d w h e n a d m i n i s t e r e d w i t h C d . I n a p r e v i o u s s t u d y , i t w a s d e m o n s t r a t e d t h a t C d a c c u m u l a t e d i n t h e h i g h m o -l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w h e n a d m i n i s t e r e d w i t h D E N , b u t C d w a s n o t a d m i n i s t e r e d a l o n e a s a c o n t r o l . T h i s s t u d y d e m o n s t r a t e s t h a t Cd a d m i n i s t e r e d a l o n e o c c u r s o n m e t a l l o -t h i o n e i n , b u t C d a d m i n i s t e r e d w i t h DEN a c c u m u l a t e s m o r e i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ; h o w e v e r , t h i s e f f e c t w a s d e m o n s t r a t e d o n l y a t l o w C d e x p o s u r e s ( < ^ 1 0 0 mg C d / L i n t h e d r i n k i n g w a t e r ) . A t h i g h e r Cd e x p o s u r e s , m e t a l l o -t h i o n e i n b e c a m e C d s a t u r a t e d a n d t h e r e w a s a " s p i l l o v e r " o f Cd t o t h e h i g h • m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w i t h c o n -c u r r e n t p a t h o l o g i c a l e f f e c t s . T h u s , t h e s t u d y d e m o n s t r a t e s t h a t a n o r g a n i c c a r c i n o g e n d o e s h a v e t h e p o t e n t i a l t o i n c r e a s e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n C d , a s f o u n d i n f i s h ( B r o w n , 1 9 7 7 ) a n d h u m a n s ( B r o w n a n d K n i g h t , 1 9 7 8 ) , i f C d i s r e a d i l y a v a i l a b l e . R e -s u l t s f r o m t h i s s t u d y a l s o s t r o n g l y s u p p o r t t h e " s p i l l -o v e r " t h e o r y s u g g e s t e d b y B r o w n e t a l ( 1 9 7 7 ) , a n d B r o w n 1 9 8 a n d P a r s o n s ( 1 9 7 8 ) . I n t r o d u c t i o n R e c e n t l y i t h a s b e c o m e a p p a r e n t t h a t C d , i n c a n c e r o u s o r g a n i s m s , o c c u r s m a i n l y i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o -t e i n p o o l , i n a p p a r e n t l y n o r m a l l i v e r a n d k i d n e y t i s s u e ( B r o w n , 1 9 7 7 ; B r o w n a n d K n i g h t , 1 9 7 8 ) . I n n o n c a n c e r o u s o r g a n i s m s , c a d m i u m o c c u r s m a i n l y b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n ( B r o w n a n d K n i g h t , 1 9 7 8 ) . M e t a l l o t h i o n e i n i s a l o w m o l e c u -l a r w e i g h t p r o t e i n w h i c h c a n b i n d C d , H g , C u a n d Z n , t h u s r e n d e r i n g t h e m n o n t o x i c a s t h e y a r e n o l o n g e r a v a i l a b l e t o b i n d e n z y m e s ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . C o p p e r a n d z i n c a r e l e s s t o x i c t h a n Hg o r C d a s t h e y a r e n a t u r a l c o m p o n e n t s o f m a n y m e t a l 1 o e n z y m e s ( F r i e d b e r t , 1 9 7 4 ; B r e m n e r , 1 9 7 4 ) . I t h a s b e e n e s t a b l i s h e d t h a t t o x i c e f f e c t s o f C d o r Hg d o n o t o c c u r u n t i l t h e s e e l e m e n t s a p p e a r i n l a r g e q u a n t i t i e s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( W i n g e e t a l . , 1 9 7 3 ; B r o w n a n d P a r s o n s , 1 9 7 8 ; C l o u t i e r a n d B r o w n , 1 9 7 8 ) . S i n c e C d o c c u r s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f c a n c e r o u s o r g a n i s m s , i t i s p o s -s i b l e t h a t C d i s i m p o r t a n t i n t h e c a r c i n o g e n i c p r o c e s s . B r o w n ( 1 9 7 7 ) h a s h y p o t h e s i z e d t h a t s i n c e C d d i s p l a c e s Zn f r o m Zn b i n d i n g s i t e s i n m e t a l 1 o e n z y m e s , C d i n c a n c e r o u s o r g a n i s m s m i g h t b e i n t e r f e r r i n g w i t h t h e Z n m e t a l 1 o e n z y m e s i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f c e l l d i v i s i o n ; e . g . , DNA p o l y m e r a s e , RNA p o l y m e r a s e , r e v e r s e t r a n s c r i p t a s e , a n d t h y m i d i n e k i n a s e ( V a l l e e , 1 9 7 6 ; D u n c a n a n d D r e o s t i , 1 9 7 6 ) . 1 9 9 T h e p r e s e n t s t u d y a i m s t o c o n f i r m t h a t a n o r g a n i c c a r c i n o g e n ( d i e t h y l n i t r o s a m i n e o r D E N ) c a n i n f l u e n c e t h e c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f c a d m i u m ; i n p a r t i c u l a r t h a t DEN c a n i n c r e a s e t h e l e v e l s o f C d b o u n d t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a n d c o n c u r r e n t l y d e c r e a s e t h e l e v e l s o f C d b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n . I n a p r e v i o u s s t u d y , w h e n 5 mg C d / L w e r e a d m i n i s t e r e d w i t h D E N , m o s t o f t h i s C d a c c u m u l a t e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ) . H o w e v e r , i n t h a t s t u d y C d w a s n o t a d m i n i -s t e r e d w i t h o u t DEN t o d e m o n s t r a t e t h a t t h e C d w o u l d o t h e r w i s e h a v e b e e n b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n . I n t h e p r e s e n t s t u d y , v a r i o u s l e v e l s o f C d a r e a d m i n i s t e r e d , w i t h a n d w i t h o u t D E N , t o e x a m i n e w h e t h e r o r n o t DEN d o e s i n d e e d i n f l u e n c e t h e c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f C d . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s M a l e m i c e o f t h e S w i s s s t r a i n , • a p p r o x i m a t e l y t w o m o n t h s o l d , w e r e s e p a r a t e d i n t o c a g e s , 3 m i c e p e r c a g e . M i c e w e r e a d m i n i s t e r e d e i t h e r t a p w a t e r , o r t a p w a t e r c o n t a i n i n g 2 5 , 5 0 , 1 0 0 , 2 0 0 o r 5 0 0 mg C d ( a s C d C l 2 ) / L , w i t h o r w i t h o u t 2 5 mg D E N / L . D r i n k i n g s o l u t i o n s w e r e c h a n g e d o n a l t e r n a t e d a y s . J a r s w h i c h c o n t a i n e d DEN w e r e p a i n t e d b l a c k t o p r e -v e n t p h o t o d e g r a d a t i o n o f t h e D E N . M i c e w e r e s a c r i f i c e d a f t e r 2 8 d a y s ' e x p o s u r e , v i a a s p h y x i a t i o n w i t h C 0 2 « T h e a n i m a l s w e r e f r o z e n u n t i l a n a l y z e d . M i c e w e r e a n a l y z e d s i x a t a t i m e , t h r e e f r o m e a c h o f t h e t w o e x p o s u r e t y p e s w i t h t h e s a m e Cd c o n c e n t r a -t i o n . T h i s w a s d o n e t o e n s u r e c o n s i s t e n c y o f a n a l y s i s b e t w e e n s a m p l e s w i t h t h e s a m e C d c o n c e n t r a t i o n . L i v e r s w e r e r e m o v e d , w e i g h e d , a n d t h e n 2 g r a m s o r l e s s o f l i v e r w a s h o m o g e n i z e d i n 4 . 5 ml o f 0 . 9 % N a C l f o r e x a c t l y 3 m i n u t e s , i n a h o m o g e n i z i n g t u b e , u s i n g a . T R I - R S T I R - R l a b o r a t o r y m o t o r S 6 3 C s e t t o a s t a n d a r d s p e e d ( s e t t i n g 4 . 5 ) a n d e q u i p p e d w i t h a t e f l o n h o m o g e n i z e r . H o m o g e n a t e s w e r e c e n t r i f u g e d f o r 1 0 m i n u t e s a t 2 7 , 0 0 0 x g_ i n a S o r v a l l R C 2 - B c e n t r i f u g e . S u p e r n a t a n t s w e r e c o l l e c t e d a n d p e l l e t s r e h o m o g e n i z e d f o r e x a c t l y 2 m i n u t e s i n 2 . 5 m l o f 0 . 9 % N a C l . T h e s e w e r e t h e n c e n t r i f u g e d f o r 1 0 m i n u t e s a t 2 7 , 0 0 0 x £ a n d t h e s u p e r n a t a n t s c o m b i n e d w i t h p r e v i o u s s u p e r n a t a n t s . G r o u p s o f 6 c o m b i n e d s u p e r n a t a n t s w e r e t h e n h e a t e d i n a 7 0 ° C w a t e r b a t h f o r e x a c t l y 5 m i n u t e s , t o c l e a r c e l l u l a r d e b r i s v i a h e a t p r e c i p i t a t i o n . T h e s e w e r e c e n t r i f u g e d f o r 1 0 m i n u t e s a t 2 7 , 0 0 0 x £ a n d t h e s u p e r n a t a n t s c o l l e c t e d . Two ml) o f e a c h o f t h e h e a t s t a b l e h o m o g e n a t e s u p e r n a -t a n t s w e r e c o m b i n e d , a n d 5 m l o f t h i s w a s a p p l i e d t o a P h a r m a c i a c o l u m n ( 1 . 6 x 1 0 0 c m ) p a c k e d w i t h S e p h a d e x G - 7 5 g e l . T h i s w a s e l u t e d w i t h 0 . 0 1 M N H 4 H C 0 3 a n d c o l l e c t e d a s 1 5 m l f r a c t i o n s . A b s o r b a n c e w a s r e a d a t 2 5 0 a n d 2 8 0 nm o n e a c h f r a c t i o n u s i n g a P e r k i n E l m e r 1 2 4 D s p e c t r o p h o t o m e t e r t o e s t a b l i s h t h e p o s i t i o n o f t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , m e t a l l o t h i o n e i n , a n d t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ; B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ) . C a d m i u m , C u a n d Z n l e v e l s w e r e d e t e r m i n e d o n e a c h 2 0 1 f r a c t i o n u s i n g t h e f l a m e m e t h o d o n a P e r k i n E l m e r 3 0 3 a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t e r e q u i p p e d w i t h d e u t e r i u m a r c b a c k g r o u n d c o r r e c t i o n . T o t a l m e t a l l e v e l s i n e a c h c y t o p l a s m i c p o o l w e r e d e t e r m i n e d b y s u m m i n g o f t h e i n d i v i d u a l m e t a l l e v e l s i n e a c h f r a c t i o n o f e a c h p o o l . R e s u l t s - ' . T y p i c a l g e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m c o n t r o l s a n d t h e 2 5 mg C d / L e x p o s u r e , w i t h o r w i t h o u t DEN e x p o s u r e , a r e s h o w n i n F i g u r e s 2 9 a n d 3 0 . Two t h i r d s o f c y t o p l a s m i c C d w a s b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n i n c o n t r o l s ( T a b l e s 1 9 a n d 2 2 ) . W i t h C d a d m i n i s t r a t i o n a l o n e , m o r e t h a n 7 5 % o f Cd w a s b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n u p t o 1 0 0 mg C d / L e x p o s u r e ( T a b l e 2 2 ) . T h e r e a p p e a r e d t o b e a p l a t e a u o f C d - t h i o n e i n p r o d u c t i o n f r o m 1 0 0 t o 2 0 0 mg C d / L e x p o s u r e , w i t h o r w i t h o u t DEN ( F i g u r e 3 2 ) ; i n m i c e e x p o s e d t o C d a l o n e , t h i s p l a t e a u c o i n c i d e d w i t h a l a r g e i n c r e a s e o f C d i n t h e h i g h m o l e c u -l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( F i g u r e s 31 a n d 3 2 ) . T h e r e w a s a l a r g e a c c e l e r a t i o n o f C d - t h i o n e i n p r o d u c t i o n a t t h e 5 0 0 mg C d / L e x p o s u r e , w i t h o r w i t h o u t DEN ( T a b l e s 1 9 a n d 2 2 , F i g u r e 3 2 ) . E x p o s u r e t o DEN w i t h C d , r e s u l t e d i n a 2 . 8 -f o l d i n c r e a s e o f C d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a t 2 5 mg C d / L e x p o s u r e c o m p a r e d w i t h C d e x p o s u r e a l o n e , a 1 . 4 - f o l d i n c r e a s e a t 5 0 mg C d / L a n d a 1 . 3 - f o l d i n c r e a s e a t 1 0 0 mg C d / L ( c a l c u l a t e d f r o m T a b l e 1 9 ) . A t t h e 2 0 0 a n d 5 0 0 mg C d / L e x p o s u r e s , m o r e C d w a s b o u n d t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w i t h o u t c o n c u r r e n t 2 0 2 T a b l e 1 9 . T h e c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f C d w i t h e x -p o s u r e t o a r a n g e o f C d c o n c e n t r a t i o n s , w i t h o r w i t h o u t d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) . D a t a i s a c o m p i l a t i o n o f v a l u e s f r o m g e l p r o f i l e s , i n j u m o l e / g t i s s u e ( w e t w e i g h t ) . MW: m o l e c u l a r w e i g h t . N D : n o t d e t e c t a b l e . Cd T o t a l H i g h MW p o o 1 M e t a l l o -t h i o n e i n L o w MW p o o l C o n t r o l . 0 0 3 6 . 0 0 0 4 . 0 0 2 4 . 0 0 0 8 2 5 mg C d / L . 0 1 9 4 . 0 0 4 7 . 0 1 4 7 ND 2 5 mg C d / L + DEN . 0 1 7 4 . 0 1 2 3 . 0 0 5 1 ND 5 0 mg C d / L . 0 7 6 5 . 0 0 7 3 . 0 6 5 5 . 0 0 3 7 5 0 mg C d / L + DEN . 0 6 1 5 . 0 1 0 3 . 0 4 8 3 . 0 0 2 9 1 0 0 mg C d / L . 0 8 8 0 . 0 1 4 5 . 0 7 1 4 . 0 0 2 1 1 0 0 mg C d / L + DEN . 1 1 8 8 . 0 1 8 7 . 0 9 8 5 . 0 0 1 6 2 0 0 mg C d / L . 1 5 9 3 . 0 8 2 2 . 0 6 7 8 . 0 0 9 3 2 0 0 mg C d / L + DEN . 1 4 0 8 . 0 3 0 3 . 1 0 8 1 . 0 0 2 4 5 0 0 mg C d / L . 4 1 2 5 . 0 8 4 9 . 3 2 7 6 ND 5 0 0 mg C d / L + DEN . 5 6 1 5 . 0 4 6 4 . 51 51 ND 2 0 3 T a b l e 2 0 . T h e c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f C u w i t h e x p o s u r e t o a r a n g e o f C d c o n c e n t r a t i o n s , w i t h o r w i t h o u t d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) . D a t a i s a c o m p i l a t i o n o f v a l u e s f r o m g e l p r o f i l e s , i n > i m o l e / g t i s s u e ( w e t w e i g h t ) . MW: m o l e c u l a r w e i g h t . N D : n o t d e t e c t a b l e C u T o t a l H i g h MW p o o l M e t a l l o -t h i o n e i n L o w MW p o o l C o n t r o l . 0 7 2 . 0 3 0 . 0 1 8 . 0 2 4 2 5 mg C d / L . 0 8 3 . 0 4 4 . 0 2 8 . 0 1 1 2 5 mg C d / L + DEN . 0 5 3 . 0 2 6 . 0 1 4 . 0 1 3 5 0 mg C d / L . 0 9 2 . 0 2 9 . 0 3 0 . 0 3 3 5 0 mg C d / L + DEN . 0 8 9 . 0 2 2 . 0 3 2 . 0 3 5 1 0 0 mg C d / L . . 1 1 7 . 0 3 2 . 0 3 9 . 0 4 6 1 0 0 mg C d / L + DEN . 0 9 6 . 0 2 6 . 0 3 5 . 0 3 5 2 0 0 mg C d / L . 1 0 1 . 0 3 6 . 0 2 7 . 0 3 8 2 0 0 mg C d / L + DEN . 0 8 4 . 0 2 9 . 0 2 9 . 0 2 6 5 0 0 mg C d / L . 1 6 5 . 0 3 7 . 0 4 0 . 0 8 8 5 0 0 mg C d / L + DEN . 1 6 1 . 0 4 4 . 0 4 9 . 0 6 8 2 0 4 T a b l e 2 1 . T h e c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f Z n w i t h e x p o s u r e t o a r a n g e o f C d c o n c e n t r a t i o n s , w i t h o r w i t h o u t d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) . D a t a i s a c o m p i l a t i o n o f v a l u e s f r o m g e l p r o f i l e s , i n j u m o l e / g t i s s u e ( w e t w e i g h t ) . MW: m o l e c u l a r w e i g h t . N D : n o t d e t e c t a b l e . T o t a l H i g h MW p o o l M e t a l l o -t h i o n e i n L o w MW p o o l C o n t r o l . 0 8 3 . 0 8 0 . 0 0 1 . 0 0 2 2 5 mg C d / L . 1 2 0 . 1 01 . 0 1 3 . 0 0 6 2 5 mg C d / L + DEN . 0 9 3 . 0 8 9 . 0 0 2 . 0 0 2 5 0 mg C d / L . 1 2 6 . 0 9 8 . 0 2 0 . 0 0 8 5 0 mg C d / L + DEN . 0 8 5 . 0 7 3 . 0 0 9 . 0 0 3 1 0 0 mg C d / L . 1 0 2 . 0 7 9 . 0 2 1 . 0 0 2 1 0 0 mg C d / L + DEN . 1 1 4 . 0 8 6 . 0 2 5 . 0 0 2 2 0 0 mg C d / L . 1 3 7 . 1 2 6 . 0 0 7 . 0 0 4 2 0 0 mg C d / L + DEN . 1 2 1 . 0 8 3 . 0 3 4 . 0 0 4 5 0 0 mg C d / L . 1 7 5 . 1 1 5 . 0 4 7 . 0 1 3 5 0 0 mg C d / L . 1 9 8 . 0 9 3 . 0 9 8 . 0 0 7 2 0 5 T a b l e 2 2 . P e r c e n t a g e d i s t r i b u t i o n o f t o t a l C d o n e a c h c y t o p l a s m i c p o o l w i t h e x p o s u r e t o a r a n g e o f C d c o n c e n t r a t i o n s , w i t h o r w i t h o u t d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) . P e r c e n t a g e c a l c u l a t e d f r o m T a b l e 1 9 . MW: m o l e c u l a r w e i g h t . N D : n o t d e t e c t a b l e . C d H i g h MW p o o l M e t a l l o -t h i o n e i n L o w p o o l MW C o n t r o l 1 1 . 1 6 6 . 7 2 2 . 2 2 5 mg C d / L 2 4 . 2 7 5 . 8 0 , 2 5 mg C d / L + DEN 7 0 . 7 2 9 . 3 0 5 0 mg C d / L 9 . 6 8 5 . 6 4 . 8 5 0 mg C d / L + DEN 1 6 . 8 7 8 . 5 4 . 7 1 0 0 mg C d / L 1 . 6 . 5 81 . 1 2 . 4 1 0 0 mg C d / L + DEN 1 5 . 8 8 2 . 9 : i . 3 2 0 0 mg C d / L 51 . 6 4 2 . 6 5 . 8 2 0 0 mg C d / L + DEN 21 . 5 7 6 . 8 V . 7 5 0 0 mg C d / L 2 0 . 6 7 9 . 4 0 5 0 0 mg C d / L + DEN 8 . 3 91 . 7 0 T a b l e 2 3 . P e r c e n t a g e d i s t r i b u t i o n o f t o t a l C u o n e a c h c y t o p l a s m i c p o o l w i t h e x p o s u r e t o a r a n g e o f C d c o n c e n t r a t i o n s , w i t h o r w i t h o u t d i e t h y l n i t r o s a m i n e ( D E N ) . P e r -c e n t a g e c a l c u l a t e d f r o m T a b l e 2 0 . MW: m o l e c u l a r w e i g h t . N D : n o t d e t e c t a b l e . C u H i g h MW p o o 1 M e t a l l o -t h i o n e i n L o w MW p o o l C o n t r o l 41 . 7 2 5 . 0 3 3 . 3 2 5 > m g C d / L 5 3 . 0 3 3 . 7 1 3 . 3 2 5 mg C d / L + DEN 4 9 . 1 2 6 . 4 2 4 . 5 5 0 mg C d / L 31 . 5 3 2 . 6 3 5 . 9 5 0 mg C d / L + DEN 2 4 . 7 3 6 . 0 3 9 . 3 1 0 0 mg C d / L 2 7 . 4 ; 3 3 . 3 3 9 . 3 1 0 0 mg C d / L + DEN 3 4 . 5 3 4 . 5 31 . 0 2 0 0 mg C d / L 3 5 . 7 2 6 . 7 3 7 . 6 2 0 0 mg C d / L + DEN 3 4 . 5 3 4 . 5 31 . 0 5 0 0 mg C d / L 2 2 . 4 2 4 . 3 5 3 . 3 5 0 0 mg C d / L + DEN 2 7 . 3 3 0 . 4 4 2 . 3 2 0 7 T a b l e 2 4 . P e r c e n t a g e d i s t r i b u t i o n o f t o t a l Zn o n e a c h c y t o p l a s m i c p o o l w i t h e x p o s u r e t o a r a n g e o f C d c o n c e n t r a t i o n s , w i t h o r w i t h o u t d i e t h y l -n i t r o s a m i n e ( D E N ) . P e r c e n t a g e c a l c u l a t e d f r o m T a b l e 2 1 . MW: m o l e c u l a r w e i g h t . N D : n o t d e t e c t a b l e . Zn H i g h MW p o o l M e t a l l o -t h i o n e i n L o w MW p o o l C o n t r o l 9 6 . 4 1 . 2 2 . 4 2 5 mg C d / L 8 4 . 2 1 0 . 8 5 . 0 2 5 mg C d / L + DEN 9 5 . 7 2 . 2 2 . 1 5 0 mg C d / L 7 7 . 8 1 5 . 9 6 . 3 5 0 mg C d / L + DEN 8 5 . 9 1 0 . 6 3 . 5 1 0 0 mg C d / L 7 7 . 5 2 0 . 6 1 . 9 1 0 0 mg C d / L + DEN 7 5 . 4 2 2 . 8 1 . 8 2 0 0 mg C d / L 9 2 . 0 5 . 1 2 . 9 2 0 0 mg C d / L 6 8 . 6 2 8 . 1 3 . 3 5 0 0 mg C d / L 6 5 . 7 2 6 . 9 7 . 4 5 0 0 mg C d / L + DEN 4 7 . 0 4 9 . 5 3 . 5 2 0 8 F i g u r e 2 9 . C o m p o s i t e g e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m t h r e e c o n t r o l m i c e . C o n t r o l ~ 0.201 u CO F r a c t i o n Number 2 1 0 F i g u r e 3 0 . C o m p o s i t e g e l e l u t i o n p r o f i l e s f r o m t h r e e m i c e e x p o s e d t o 2 5 mg C d / L i n t h e i r d r i n k i n g w a t e r , a n d f r o m t h r e e m i c e e x p o s e d t o 2 5 mg C d / L + 2 5 mg D E N / L . 25ppm Cd 0.20 H c n Frac t ion Number 25ppm Celt DEN - 0 2 0 H E 0.10-Fract ion Number 212 F i g u r e 3 1 . T h e v a r i a t i o n o f C d l e v e l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m m i c e e x p o s e d t o C d , w i t h o r w i t h o u t D E N . E a c h p o i n t r e p r e s e n t s a v a l u e c a l c u l a t e d f r o m a g e l e l u t i o n p r o f i l e d o n e o n a c o m p o s i t e s a m p l e f r o m t h r e e m i c e . 3 o.io-—I 1 1 1 1 100 200 3 0 0 4 0 0 5 0 0 Cd E x p o s u r e Leve l ro t—» co 2 1 4 F i g u r e 3 2 . T h e v a r i a t i o n o f C d l e v e l s i n m e t a l l o -t h i o n e i n f r o m m i c e e x p o s e d t o C d , w i t h o r w i t h o u t D E N . E a c h p o i n t r e p r e s e n t s a v a l u e c a l c u l a t e d f r o m a g e l e l u t i o n p r o -f i l e d o n e o n a c o m p o s i t e s a m p l e f r o m t h r e e m i c e . M e t a l l o t h i o n e i n Cd ( j j m o l e / g t i s s u e ) 913 e x p o s u r e t o DEN ( T a b l e 1 9 , F i g u r e 3 1 ) . A l s o , C d - t h i o n e i n l e v e l s w e r e h i g h e r a t t h e 2 0 0 t o 5 0 0 mg C d / L e x p o s u r e s w i t h c o n c u r r e n t e x p o s u r e t o D E N , c o m p a r e d w i t h e x p o s u r e t o C d a l o n e . T h e l e v e l s o f C u i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o -t e i n p o o l w e r e d e c r e a s e d b y e x p o s u r e t o DEN + C d c o m p a r e d w i t h e x p o s u r e t o C d a l o n e , e x c e p t a t t h e 5 0 0 mg C d / L e x p o s u r e s ( T a b l e 2 0 , F i g u r e 3 3 ) . A t t h e 2 5 mg C d / L e x p o s u r e , t h e r e w a s a l a r g e i n c r e a s e o f C u i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , c o m p a r e d w i t h c o n t r o l v a l u e s . T h e l e v e l s o f C u - t h i o n e i n i n c r e a s e d w i t h i n -c r e a s i n g C d e x p o s u r e l e v e l , a n d t e n d e d t o p a r a l l e l i n -c r e a s e s o f C d - t h i o n e i n ( T a b l e s 1 9 , 2 0 , 2 3 , F i g u r e s 3 2 a n d 3 4 ) . T h e r e a p p e a r e d t o b e a d i p i n l e v e l s o f C u - t h i o n e i n a t t h e 2 0 0 mg C d / L e x p o s u r e ( T a b l e 2 0 , F i g u r e 3 4 ) ; t h i s p o i n t c o i n c i d e d w i t h a p p a r e n t s a t u r a t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n b y C d , w i t h c o n c u r r e n t " s p i l l o v e r " o f C d t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( F i g u r e s 31 a n d 3 2 ) . I n g e n e r a l , C u t e n d e d t o b e d i s t r i b u t e d e q u a l l y a m o n g t h e t h r e e c y t o p l a s m i c p o o l s ( T a b l e 2 3 ) . T o t a l c y t o p l a s m i c C u l e v e l s t e n d e d t o i n c r e a s e w i t h i n c r e a s i n g l e v e l o f C d e x p o s u r e ; t h i s i n c r e a s e , h o w e v e r , w a s c o u n t e r a c t e d b y DEN a t t h e 2 5 mg C d / L e x p o s u r e ( T a b l e 2 0 ) . T h e l e v e l s o f Zn i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w e r e d e c r e a s e d b y e x p o s u r e t o DEN + C d a t 2 5 , 5 0 a n d 2 0 0 mg C d / L , c o m p a r e d w i t h e x p o s u r e t o C d a l o n e ( T a b l e 2 1 , 2 1 7 F i g u r e 33. T h e v a r i a t i o n o f C u l e v e l s i n t h e h i g h m o -l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m , m i c e e x p o s e d t o C d , w i t h o r w i t h o u t D E N . E a c h p o i n t r e p r e s e n t s a v a l u e c a l c u l a t e d f r o m a g e l e l u t i o n p r o f i l e d o n e o n a c o m p o s i t e s a m p l e f r o m t h r e e m i c e . Cu 0.40 U) 3" 0.35 to +-» °> 0.30 aJ o D E U EL 0.2 5 o 0.20 cn I o • — • Cd 0 - - 0 Cd + DEN 100 200 300 4 0 0 Cd E x p o s u r e Leve l 5 0 0 i—1 oo 2 1 9 F i g u r e 34. T h e v a r i a t i o n o f C u l e v e l s i n m e t a l l o t h i o n e i n f r o m m i c e e x p o s e d t o C d , w i t h o r w i t h o u t D E N . E a c h p o i n t r e p r e s e n t s a v a l u e c a l c u l a t e d f r o m a g e l e l u t i o n p r o f i l e d o n e o n a c o m p o s i t e s a m p l e f r o m t h r e e m i c e . (TJ 0.01 L 100 200 3 0 0 4 0 0 C d Exposure Level 5 0 0 F i g u r e . 3 5 . T h i s e f f e c t w a s p a r t i c u l a r l y p r e v a l e n t a t 2 5 a n d 5 0 mg C d / L . T h e l e v e l o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n Z n i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g C d e x p o s u r e l e v e l ( T a b l e 2 1 , F i g u r e 3 5 ) . L e v e l s o f Z n - t h i o n e i n i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g C d e x p o s u r e , a n d t e n d e d t o p a r a l l e l i n -c r e a s e s o f C d - t h i o n e i n ( T a b l e s 1 9 , 21 a n d 2 4 , F i g u r e s 3 2 a n d 3 6 ) . S i m i l a r l y t o C u - t h i o n e i n , t h e r e w a s a d i p i n l e v e l s o f Z n - t h i o n e i n a t t h e 2 0 0 mg C d / L e x p o s u r e ( F i g u r e s 3 4 a n d 3 6 ) . I n e a c h C d e x p o s u r e l e v e l , t h e s e t o f m i c e w i t h t h e l o w e s t h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n Z n ( T a b l e 2 1 ) h a d t h e l o w e s t p e r c e n t a g e o f Zn b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n ( T a b l e 2 4 ) . I n g e n e r a l , a p p r o x i m a t e l y t h r e e q u a r t e r s o f c y t o p l a s m i c Zn w a s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , w i t h m o s t o f t h e r e m a i n d e r b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n ( T a b l e 2 4 ) . T o t a l c y t o p l a s m i c Zn l e v e l s i n c r e a s e d w i t h i n -c r e a s i n g C d e x p o s u r e l e v e l ( T a b l e 2 1 ) . T o t a l c y t o p l a s m i c C u + Z n l e v e l s w e r e i n c r e a s e d b y e x p o s u r e t o C d , b u t t h i s i n c r e a s e w a s l a r g e r w i t h o u t c o n -c u r r e n t e x p o s u r e t o D E N , e x c e p t a t t h e 5 0 0 mg C d / L e x -p o s u r e ( F i g u r e 3 7 ) . D e c r e a s e s o f l i v e r w e i g h t w e r e a p -p a r e n t a t 1 0 0 mg C d / L w i t h c o n c u r r e n t DEN e x p o s u r e , a n d a t 2 0 0 mg C d / L e x p o s u r e w i t h e x p o s u r e t o C d a l o n e ( F i g u r e 3 8 ) . T h e d e c r e a s e o f l i v e r w e i g h t a p p e a r e d t o c o i n c i d e w i t h a p p a r e n t s a t u r a t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n a n d " s p i l l o v e r " o f C d f r o m m e t a l l o t h i o n e i n t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( T a b l e 1 9 , F i g u r e s 3 1 , 3 2 a n d 3 8 ) . L i v e r 2 2 2 F i g u r e 35. T h e v a r i a t i o n o f Zn l e v e l s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t . p r o t e i n p o o l f r o m m i c e e x p o s e d t o C d , w i t h o r w i t h o u t D E N . E a c h p o i n t r e p r e s e n t s a v a l u e c a l c u l a t e d f r o m a g e l e l u t i o n p r o f i l e d o n e o n a c o m p o s i t e s a m p l e f r o m t h r e e m i c e . o Q. < High Mo lecu la r Weight Zn (j jmol/g t issue) P o o o a o o ^ _ i ^ — ^ oo o rv> ^ O) oo O o rn ro x o TD o o c 2 Q O o o o (Jl o o 0 • 1 I o • o o a . GL + a m zzz 2 2 4 F i g u r e 3 6 . T h e v a r i a t i o n o f Zn l e v e l s i n m e t a l l o -t h i o n e i n f r o m m i c e . e x p o s e e l t o C d , w i t h o r w i t h o u t D E N . ; E a ' c h , p o i n t r e p r e s e n t s a v a l u e c a l c u l a t e d f r o m a g e l e l u t i o n p r o f i l e d o n e o n a c o m p o s i t e s a m p l e f r o m t h r e e m i c e . 0.1 O r c N - 0 O 8 C C9 — D U CO § $ 0.06 £ cn = "5 0.04 trJ f: •+-» t= 2 0.02 i 1 r 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 Cd Exposure Leve 5 0 0 ro ro 226 F i g u r e 3 7 . T h e v a r i a t i o n o f t o t a l t i s s u e h o m o g e n a t e s u p e r n a t a n t C u + Zn l e v e l s i n m i c e e x p o s e d t o C d , w i t h o r w i t h o u t D E N . E a c h p o i n t r e p r e s e n t s a v a l u e c a l c u l a t e d f r o m a g e l e l u t i o n p r o f i l e d o n e o n a c o m p o s i t e s a m p l e f r o m t h r e e m i c e . Total Cu+Zn(|jmolc2 /g t issue) LZZ 2 2 8 F i g u r e 3 8 . T h e v a r i a t i o n o f l i v e r w e i g h t w i t h e x p o s u r e t o v a r i o u s l e v e l s o f C d , w i t h o r w i t h o u t D E N . E a c h p o i n t r e p r e s e n t s t h e m e a n o f t h r e e m i c e . L f>'M' 2 3 0 w e i g h t s w e r e l e s s w i t h e x p o s u r e t o DEN + C d c o m p a r e d w i t h e x p o s u r e t o C d a l o n e . D i s c u s s i o n T h i s s t u d y h a s d e m o n s t r a t e d t h a t a t C d e x p o s u r e s e q u a l t o o r l e s s t h a n 1 0 0 mg C d / L , DEN i n c r e a s e s t h e p r o p o r t i o n o f C d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , a n d c o n -c u r r e n t l y d e c r e a s e s t h e l e v e l s b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n . T h i s e f f e c t d e c r e a s e d i n m a g n i t u d e a s t h e e x p o s u r e l e v e l o f C d i n c r e a s e d , p r e s u m a b l y d u e t o m a s k i n g o f t h e e f f e c t s o f DEN v i a h i g h l e v e l s o f C d . T h u s , i t i s p r o b a b l e t h a t t h e o c c u r r e n c e o f C d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l r a t h e r t h a n i n m e t a l l o t h i o n e i n , i n a s t u d y b y B r o w n a n d C h a n ( 1 9 7 8 ) , w a s d u e t o t h e e f f e c t s o f D E N , s i n c e t h e C d e x p o s u r e l e v e l w a s o n l y 5 mg C d / L . A l s o , i t i s p o s s i b l e t h a t o c c u r r e n c e s o f h i g h l e v e l s o f C d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f f i s h ( B r o w n , 1 9 7 7 ) a n d h u m a n s ( B r o w n a n d K n i g h t , 1 9 7 8 ) w a s d u e t o t h e e f f e c t s o f c a r c i n o g e n s w i t h a c t i o n s t h e s a m e a s , o r s i m i l a r t o D E N . A t t h e 2 0 0 a n d 5 0 0 mg C d / L e x p o s u r e s , t h e r e w a s l e s s C d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w i t h c o n -c u r r e n t DEN e x p o s u r e . I t a p p e a r e d a s t h o u g h , w i t h e x p o s u r e t o DEN + C d , t h a t t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l b e c a m e C d s a t u r a t e d ( p l a t e a u e d ) a t a b o u t 0 . 0 4 j j m o l e C d i n t h i s p o o l / g t i s s u e . W i t h C d e x p o s u r e a l o n e , i t d i d n o t a p p e a r t o b e c o m e s a t u r a t e d u n t i l a b o u t 0 . 0 8 j j m o l e C d i n t h i s p o o l / g t i s s u e . A n e x p l a n a t i o n f o r t h e l o w e r a p p a r e n t 2 3 1 s a t u r a t i o n l e v e l s o f t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w i t h DEN e x p o s u r e , d e r i v e s f r o m t h e f a c t t h a t t h e r e a p p e a r s t o b e m o r e n e c r o s i s o f t h e l i v e r w i t h D E N e x p o s u r e ( i . e . , F i g u r e 3 8 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t m o r e p r o t e o l y t i c e n z y m e s a r e r e l e a s e d f r o m l y s o s o m e s w i t h DEN e x p o s u r e , w h i c h i s a k n o w n e f f e c t o f c a r c i n o g e n s ( C h v a p i l e t a l . , 1 9 7 2 ) . T h e s e h i g h e r l e v e l s o f p r o t e o l y t i c e n z y m e s w o u l d a l m o s t c e r t a i n l y r e d u c e c y t o p l a s m i c e n z y m e l e v e l s , a n d t h e r e f o r e t h e n u m b e r o f m e t a l 1 o e n z y m e b i n d i n g s i t e s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . A l s o , s i n c e m e t a l l o t h i o n e i n i s n o t d e g r a d e d b y p r o t e o l y t i c e n z y m e s ( W e b b , 1 9 7 2 b ) , m e t a l l o t h i o n e i n c o u l d b e c o m e m o r e c o n -c e n t r a t e d i n t h e l i v e r a s l i v e r t i s s u e w a s d e s t r o y e d . T h i s m i g h t e x p l a i n t h e h i g h e r C d - t h i o n e i n l e v e l s o f m i c e e x p o s e d t o 1 0 0 t o 5 0 0 mg C d / L - a n d DEN i n t h e . p r e s e n t s t u d y . R e s u l t s f r o m t h i s s t u d y a p p e a r t o c o n f i r m t h e " s p i l l -o v e r " t h e o r y d i s c u s s e d b y B r o w n e t a l . ( 1 9 7 7 ) , B r o w n a n d P a r s o n s (1 9 7 8 ) , B r o w n a n d C h a t e l (1 9 7 8 a , b ) , a n d C l o u t i e r a n d B r o w n ( 1 9 7 8 ) . C a d m i u r n - t h i o n e i n l e v e l s , i n t h e p r e s e n t s t u d y , a p p e a r e d t o p l a t e a u f r o m 1 0 0 t o 2 0 0 mg C d / L e x -p o s u r e w i t h o r w i t h o u t DEN e x p o s u r e . I t w a s a t t h i s p o i n t t h a t t h e r e w e r e v e r y l a r g e i n c r e a s e s o f C d o n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f m i c e e x p o s e d t o C d a l o n e , a n d l e s s e r i n c r e a s e s i n t h i s p o o l i n m i c e e x p o s e d t o DEN + C d ; r e a s o n s f o r t h e s e l e s s e r l e v e l s w e r e d i s c u s s e d i n t h e p r e v i o u s p a r a g r a p h . A t t h a t p o i n t w h e r e m e t a l l o t h i o n e i n a p p e a r e d t o b e c o m e C d s a t u r a t e d , a n d C d a p p a r e n t l y s p i l l e d o v e r t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , t h e r e w a s a s i m u l t a n e o u s o c c u r r e n c e o f p a t h o l o g i c a l e f f e c t s ; i . e . , r e d u c e d l i v e r w e i g h t s . I n DEN e x p o s e d m i c e , i n c r e a s e d l e v e l s o f C d a p p e a r e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a t l o w e r C d e x p o s u r e s t h a n w i t h e x p o s u r e t o C d a l o n e , a n d l i v e r w e i g h t r e d u c t i o n s a l s o o c c u r r e d a t l o w e r C d e x p o s u r e s . B r o w n a n d C h a t e l ( 1 9 7 8 a ) h a v e f o u n d t h a t d e f i c i e n c i e s o f Zn i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l r e s u l t i n a c c u m u l a t i o n o f h i g h e r p r o p o r t i o n s o f c y t o -p l a s m i c C d i n t h i s p o o l . T h e r e f o r e , DEN i n d u c e d l o s s e s o f Zn f r o m t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l p r o b a b l y a c c o u n t f o r t h e a c c u m u l a t i o n o f Cd i n t h i s p o o l , r a t h e r t h a n i n m e t a l l o t h i o n e i n . T h e s u d d e n i n c r e a s e o f C d - t h i o n e i n p r o d u c t i o n o c c u r r i n g a t 5 0 0 mg C d / L , a f t e r m e t a l l o t h i o n e i n p r o d u c t i o n h a s a p p a r e n t l y p l a t e a u e d , i s s u r p r i s i n g , b u t m a y b e e x p l a i n -a b l e s i n c e C d - t h i o n e i n s y n t h e s i s i s i n d u c e d b y t w o d i f - : f e r e n t m e c h a n i s m s . W e b b ( 1 9 7 2 a ) h a s d e m o n s t r a t e d t h a t m e t a l l o t h i o n e i n i s i n d u c e d a t t h e t r a n s l a t i o n a l l e v e l ( i . e . , mRNA c o d e d f o r m e t a l l o t h i o n e i n e x i s t s i n t h e c y t o p l a s m a n d i s t u r n e d o n t o s y n t h e s i z e m e t a l l o t h i o n e i n i n t h e p r e s e n c e o f C d ) , b u t S q u i b a n d C o u s i n s ( 1 9 7 4 ) , u s i n g m u c h h i g h e r C d l e v e l s , h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t m e t a l l o t h i o n e i n c a n a l s o b e i n d u c e d a t t h e t r a n s c r i p t i o n a l l e v e l ( i . e . , p r o -d u c t i o n o f n e w mRNA f r o m DMA c o d e d f o r m e t a l l o t h i o n e i n ) . 2 3 3 A s C d - t h i o n e i n s y n t h e s i s p l a t e a u s u p t o 2 0 0 mg C d / L e x p o s u r e , b u t a c c e l e r a t e s a g a i n w i t h h i g h e r e x p o s u r e s , i t m a y b e t h a t s y n t h e s i s o f m e t a l l o t h i o n e i n u p t o 2 0 0 mg C d / L e x p o s u r e i s i n d u c e d a t t h e t r a n s l a t i o n a l l e v e l . W h e n t h i s m e t a l l o t h i o n e i n p r o d u c t i o n r e a c h e d i t s l i m i t , t h e n e x c e s s C d w o u l d s p i l l o v e r t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . A f t e r t h i s p o o l w a s C d s a t u r a t e d , t h e n e x c e s s C d w o u l d b e a v a i l a b l e t o p e n e t r a t e i n t o t h e n u c l e u s , r e s u l t i n g i n i n d u c t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n a t t h e t r a n - . s c r i p t i o n a l l e v e l . T h i s m a y e x p l a i n t h e s e c o n d p e a k i n m e t a l l o t h i o n e i n p r o d u c t i o n , a f t e r s p i l l o v e r h a s o c c u r r e d . A s t h e r e i s m o r e C d - t h i o n e i n w i t h h i g h e r e x p o s u r e s o f C d w i t h DEN t h a n w i t h C d a l o n e , i t m a y b e t h a t DEN g r e a t l y i n -c r e a s e s n u c l e a r p e n e t r a t i o n b y C d , w h i c h m i g h t b e v e r y i m p o r t a n t f o r d e v e l o p m e n t o f c a n c e r . A s i m i l a r i n c r e a s e i n m e t a l l o t h i o n e i n p r o d u c t i o n , a f t e r a n a p p a r e n t p l a t e a u o f m e t a l l o t h i o n e i n p r o d u c t i o n a n d s p i l l o v e r h a d o c c u r r e d , w a s n o t e d i n m u s s e l s e x p o s e d t o C d , C u a n d Z n i n t h e l a b o r a t o r y ( B r o w n a n d C h a t e l , 1 9 7 8 b ) . A s C d - t h i o n e i n l e v e l s i n c r e a s e d , s o d i d t h e l e v e l s o f C u a n d Zn f o u n d i n t h e m e t a l l o t h i o n e i n f r a c t i o n s . T h i s i s i n a c c o r d a n c e w i t h p r e v i o u s s t u d i e s w h i c h h a v e f o u n d t h a t Z n a n d C u o c c u p y a p o r t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n b i n d i n g s i t e s w h e n m e t a l l o t h i o n e i n i s p r o d u c e d i n r e s p o n s e t o C d ( S u z u k i a n d Y o s h i k a w a , 1 9 7 2 ; L e b e r , 1 9 7 4 ) . I t h a s b e e n f o u n d b y L e b e r ( 1 9 7 4 ) a n d B r o w n a n d P a r s o n s ( 1 9 7 8 ) 2 3 4 t h a t e x p o s u r e t o h i g h l e v e l s o f C d o r Hg c a n t h e n r e s u l t i n a d i s p l a c e m e n t o f l e s s t o x i c C u a n d Z n f r o m m e t a l l o t h i o n e i n . T h u s , t o l e r a n c e t o a c u t e d o s e s o f C d o r Hg i s m e d i a t e d b y t h e p r e s e n c e o f m e t a l l o t h i o n e i n b o u n d C u a n d Z n . I t i s t h e r e f o r e p r o b a b l e t h a t l e v e l s o f b o t h C u a n d Zn w e r e d e c r e a s e d o n m e t a l l o t h i o n e i n a t t h a t e x p o s u r e l e v e l w h e r e s p i l l o v e r o c c u r r e d ( 2 0 0 mg C d / L ) , t h r o u g h t h e d i s -p l a c e m e n t o f C u a n d Zn b y v e r y h i g h l e v e l s o f C d i n t h e c y t o p l a s m . T h u s , o n l y w h e r e t h e r e i s m o r e t h a n e n o u g h m e t a l l o t h i o n e i n i n d u c e d t o b i n d e x c e s s C d , a r e C u a n d Zn l e v e l s i n c r e a s e d i n m e t a l l o t h i o n e i n . P r e s u m a b l y , a c c o r d i n g t o t h e h y p o t h e s i s p r e s e n t e d i n t h i s d i s c u s s i o n , a t 5 0 0 mg C d / L e x p o s u r e , t r a n s c r i p t i o n a l i n d u c t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n r e s u l t e d i n a v e r y h i g h l e v e l o f m e t a l l o t h i o n e i n p r o d u c t i o n , s o t h a t C u a n d Z n w e r e n o t d i s p l a c e d b y h i g h C d l e v e l s . I n t h i s s t u d y , a s i n a p r e v i o u s s t u d y ( B r o w n , 1 9 7 8 ) , e x p o s u r e t o h i g h C d l e v e l s i n c r e a s e d Cu a n d Zn l e v e l s i n l i v e r . T h i s h a s b e e n a t t r i b u t e d t o i n d u c t i o n o f m u c o s a l m e t a l l o t h i o n e i n b y C d ( B r o w n , 1 9 7 8 ) s o t h a t t r a n s p o r t o f C u a n d Zn i n t o t h e b l o o d s t r e a m i s i n c r e a s e d . S i n c e C d i n t e r f e r e s w i t h C u a n d Zn b i n d i n g s i t e s i n m e t a l 1 o e n z y m e s ( F r i e d b e r g , 1 9 7 4 ; B r e m n e r , 1 9 7 4 ) , . i t i s l i k e l y t h a t i n -c r e a s e d u p t a k e o f C u a n d Zn w i t h i n c r e a s i n g C d e x p o s u r e l e v e l s , p a r t i c u l a r l y i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , a c t s a s a d e f e n s e a g a i n s t t h e t o x i c a c t i o n s o f C d o n m e t a l 1 o e n z y m e s . 2 3 5 A s i n p r e v i o u s s t u d i e s , e x p o s u r e t o D E N , r e s u l t e d i n r e d u c e d l e v e l s o f C u a n d Zn i n l i v e r t i s s u e a n d p a r t i -c u l a r l y i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ; B r o w n , 1 9 7 8 ) . W h e n h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n Zn l e v e l s w e r e d e c r e a s e d , t h e r e a p p e a r e d t o b e a s h i f t o f Z n f r o m m e t a l l o t h i o n e i n t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ; i . e . , t h e p e r c e n t a g e o f m e t a l l o t h i o n e i n b o u n d Zn w a s d e c r e a s e d a n d t h e p e r c e n t a g e o f h i g h m o -l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n Zn i n c r e a s e d . T h i s i s i n a c c o r d a n c e w i t h B r o w n a n d C h a t e l ( 1 9 7 8 a ) w h o r e p o r t e d t h a t m e t a l l o -t h i o n e i n a p p e a r e d t o a c t a s a s t o r a g e v e h i c l e f o r Z n . R e d u c t i o n s o f C u a n d Zn m a y h a v e b e e n d u e t o c o m p l e x i n g o f C u a n d Zn b y DEN a s i t p a s s e s t h r o u g h t h e b l o o d s t r e a m , a n d s u b s e q u e n t l y i n t o t h e u r i n e ( B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ) . F u r s t ( 1 9 6 3 ) h a s d e s c r i b e d m o s t c a r c i n o g e n s a s b e i n g p o t e n t i a l t r a c e e l e m e n t c h e l a t o r s . T h e p o s s i b l e m e c h a n i s t i c s i g n i f i c a n c e o f r e d u c t i o n s o f C u * a n d Zn i n c a r c i n o g e n e s i s h a s b e e n d i s c u s s e d b y B r o w n a n d C h a n ( 1 9 7 8 ) . T h i s s t u d y h a s c l e a r l y d e m o n s t r a t e d t h a t t o x i c e f f e c t s o f C d a p p e a r s i m u l t a n e o u s l y w i t h " s p i l l o v e r " o f C d f r o m m e t a l l o t h i o n e i n t o t h e h i g h m o l e c u l a r W e i g h t p r o t e i n p o o l . A l s o s h o w n , i s t h a t DEN r e d u c e s 1 h i g h m o l e c u l a r w e i g h t C u a n d Zn l e v e l s , t h u s a l l o w i n g C d t o s p i l l o v e r a t l o w e r e x p o s u r e l e v e l s s o t h a t p a t h o l o g i c a l e f f e c t s o c c u r a t l o w e r e x p o s u r e l e v e l s . W h a t i s n o t c l e a r , a t t h i s p o i n t , i s w h i c h a s p e c t s o f t h e a c t i o n s o f DEN a r e i m p o r t a n t i n 2 3 6 c a r c i n o g e n e s i s . T h i s s t u d y , a n d B r o w n a n d C h a n [ 1 9 7 8 ) , a n d B r o w n ( 1 9 7 8 ) h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t DEN r e s u l t s i n l o s s e s o f C u a n d Zn i n p r e t u m o r t i s s u e . O t h e r s h a v e d e m o n -s t r a t e d t h a t C u a n d Zn p r e v e n t c a n c e r ( d i s c u s s e d i n B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ) . T h e r e f o r e l o s s e s o f C u a n d Zn a p p e a r i m p o r t a n t f o r c a r c i n o g e n e s i s . S i n c e , i n p r e v i o u s s t u d i e s , C d w a s n o t i n c r e a s e d , b u t r a t h e r w a s d e c r e a s e d b y DEN ( B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 v B r o w n , 1 9 7 8 ) i t a p p e a r s t h a t C d i s n o t i m p o r t a n t t o c a r c i n o g e n e s i s . H o w e v e r , c a n c e r o u s o r g a n i s m s h a v e i n c r e a s e s o f h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n C d , a n d DEN h a s b e e n s h o w n i n t h i s s t u d y , t o h a v e t h e p o t e n t i a l t o i n c r e a s e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n C d i f h i g h e n o u g h l e v e l s o f C d a r e r e a d i l y a v a i l a b l e . T h e r e -f o r e , t h e r e d o e s s e e m t o b e c a u s e t o c o n t i n u e t o s t u d y t h e r e l e v a n c e o f C d t o t h e e t i o l o g y o f c a n c e r . S u m m a r y M i c e w e r e e x p o s e d t o 0 , 2 5 , 5 0 , 1 0 0 , 2 0 0 a n d 5 0 0 mg C d / L , w i t h o r w i t h o u t DEN e x p o s u r e , i n t h e i r d r i n k i n g w a t e r f o r 2 8 d a y s . S e p h a d e x G - 7 5 g e l e l u t i o n p r o f i l e s r e v e a l e d t h a t DEN + C d r e s u l t e d i n a n i n c r e a s e d a c c u m u l a t i o n o f C d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l a t 2 5 , 5 0 a n d 1 0 0 mg C d / L e x p o s u r e s , c o m p a r e d w i t h e x p o s u r e t o C d a l o n e . A t 2 0 0 a n d 5 0 0 mg C d / L , m o r e C d a c c u m u l a t e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f m i c e e x p o s e d t o C d a l o n e . T h i s w a s d i s c u s s e d a s p o s s i b l y d u e t o h i g h e r e n z y m e l e v e l s w i t h C d e x p o s u r e a l o n e , a s DEN i s k n o w n t o d a m a g e l y s o s o m e s , t h u s r e l e a s i n g p r o t e o l y t i c e n z y m e s . T h e r e w a s l e s s m e t a l l o -t h i o n e i n p r o d u c t i o n w i t h e x p o s u r e t o C d a l o n e , t h e n w i t h e x p o s u r e t o DEN + C d a t 2 0 0 a n d 5 0 0 mg C d / L e x p o s u r e s . M e t a l l o t h i o n e i n p r o d u c t i o n r e a c h e d a p l a t e a u f r o m 1 0 0 t o 2 0 0 mg C d / L e x p o s u r e , w i t h o r w i t h o u t DEN e x p o s u r e . A t 2 0 0 mg C d / L , t h e r e w a s a l a r g e i n c r e a s e o f C d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . T h i s a p p a r e n t s a t u r a t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n , a n d " s p i l l o v e r " o f C d i n t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l c o i n c i d e d w i t h r e d u c e d l i v e r w e i g h t s . L i v e r w e i g h t s w e r e m o r e r e d u c e d i n m i c e e x p o s e d t o DEN + C d r a t h e r t h a n t o C d a l o n e . I n c r e a s e s o f C d -t h i o n e i n o c c u r r e d a f t e r a n a p p a r e n t p l a t e a u o f C d - t h i o n e i n p r o d u c t i o n h a d b e e n r e a c h e d ; t h e s e a r e d i s c u s s e d a s p o s -s i b l y d u e t o a s w i t c h f r o m t r a n s l a t i o n a l t o t r a n s c r i p t i o n a l i n d u c t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n a t v e r y h i g h C d e x p o s u r e l e v e l s . E x p o s u r e t o C d r e s u l t e d i n i n c r e a s e d l e v e l s o f C u a n d Zn i n t h e l i v e r , a n d i n p a r t i c u l a r , i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . T h e s e i n c r e a s e s o f C u a n d Z n w e r e r e d u c e d b y e x p o s u r e t o DEN w i t h t h e C d . C o p p e r a n d z i n c l e v e l s i n c r e a s e d o n m e t a l l o t h i o n e i n w i t h i n c r e a s e s o f C d o n m e t a l l o t h i o n e i n , b u t d e c l i n e d s o m e w h a t a t t h a t e x p o s u r e l e v e l ( 2 0 0 mg C d / L ) w h e r e " s p i l l o v e r " o c c u r r e d ; p r e s u m a b l y d u e t o d i s p l a c e m e n t b y h i g h C d l e v e l s . 2 3 8 C H A P T E R X I I D i s c u s s i o n M e t a l l o t h i o n e i n S t u d i e s T h e s t u d i e s p r e s e n t e d i n t h i s t h e s i s h a v e e x a m i n e d o r g a n i s m s f o r t h e p r e s e n c e o f m e t a l b o u n d t o , g e l e l u t i o n f r a c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h e e l u t i o n p o s i t i o n o f m e t a l l o -t h i o n e i n . P h y t o p l a n k t o n d i d a p p e a r t o h a v e a m e t a l l o -t h i o n e i n p e a k , b u t i t w a s s m a l l c o m p a r e d w i t h t h e h i g h a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t p e a k s ( F i g u r e 1 5 ) . T h i s p e a k c o n t a i n e d C u , b u t n o t Z n , i n d e t e c t a b l e l e v e l s i n n o n -e x p o s e d p h y t o p l a n k t o n . T h e r e i s s o m e e v i d e n c e t h a t Hg i n d u c e d m e t a l l o t h i o n e i n s y n t h e s i s i n p h y t o p l a n k t o n , s i n c e , w i t h i n c r e a s i n g Hg e x p o s u r e l e v e l , b o t h Zn a n d C u l e v e l s i n c r e a s e d i n t h o s e f r a c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o m e t a l l o t h i o n e i n , e v e n t h o u g h Hg w a s n o t d e t e c t a b l e i n t h o s e f r a c t i o n s b y m e t h o d s e m p l o y e d i n t h a t s t u d y . P r e v i o u s s t u d i e s h a v e i n d i c a t e d t h a t m e t a l l o t h i o n e i n p r o d u c e d i n r e s p o n s e t o C d o r Hg e x p o s u r e , a l s o b i n d s Cu a n d Z n , t h e l e v e l s o f C u a n d Zn o n m e t a l l o t h i o n e i n i n -c r e a s i n g w i t h i n c r e a s i n g e x p o s u r e l e v e l ( L e b e r , 1 9 7 4 ; W i n g e e t a l . , 1 9 7 5 ; S t o n a r d a n d W e b b , 1 9 7 5 ) . T h e i n c r e a s e o f Zn o n m e t a l l o t h i o n e i n i n t h e p r e s e n t s t u d y o c c u r r e d e v e n t h o u g h Zn l e v e l s d e c r e a s e d i n b o t h t h e h i g h a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t p o o l s . T h u s , t h e r e i s a d i s t i n c t Z n p e a k i n t h e p o s i t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n i n F i g u r e 1 5 . T h e m a i n s t o r a g e a r e a f o r C u a n d Zn i n p h y t o p l a n k t o n a p p e a r s 239 t o b e t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . Z o o p l a n k t o n d i d n o t h a v e v e r y d i s t i n c t C u a n d Z n p e a k s i n t h o s e f r a c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h e u s u a l p o s i t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n ( F i g u r e 1 3 ) . H o w e v e r , l i k e p h y t o p i a n k t o n ( C l o u t i e r a n d B r o w n , 1 9 7 8 ) , t h e r e w e r e d i s t i n c t i n c r e a s e s o f C u a n d Z n i n t h e s e f r a c t i o n s w i t h i n c r e a s e s o f H g i n t h e s e f r a c t i o n s a n d w i t h i n c r e a s i n g Hg e x p o s u r e l e v e l ( T a b l e 5 ) . T h e s e i n c r e a s e s o c c u r r e d i n t h e m e t a l 1 o t h i o n e i n -l i k e f r a c t i o n s e v e n t h o u g h C u a n d Zn w e r e c o n c u r r e n t l y d e c r e a s i n g i n t h e h i g h a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t p o o l s . T h e s e i n c r e a s e s a r e g o o d e v i d e n c e f o r t h e i n d u c t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n ( W e b b , 1 9 7 2 a ) . T h e e l e v a t e d Hg i n t h e s e f r a c t i o n s w i t h i n c r e a s i n g Hg e x p o s u r e l e v e l , i s a l s o g o o d e v i d e n c e f o r t h e e x i s t e n c e o f m e t a l l o t h i o n e i n i n z o o -p l a n k t o n . A s i n p h y t o p l a n k t o n , t h e m a i n s t o r a g e a r e a f o r C u a n d Zn i n z o o p l a n k t o n , a p p e a r e d t o b e t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . I t h a s b e e n c l e a r l y e s t a b l i s h e d b y o t h e r w o r k e r s t h a t m u s s e l s p r o d u c e m e t a l l o t h i o n e i n ( N o e l - L a m b o t , 1 9 7 6 ; T a l b o t a n d M a g e e , 1 9 7 8 ) . T h e p r e s e n t s t u d y c o n f i r m s t h e s e f i n d -i n g s s i n c e d i s t i n c t C d , Cu a n d Zn p e a k s w e r e f o u n d i n t h e p o s i t i o n i n t h e g e l e l u t i o n p r o f i l e c o r r e s p o n d i n g t o m e t a l l o t h i o n e i n ( F i g u r e 6 ) . T h e r e w e r e a l s o d i s t i n c t i n c r e a s e s o f C u a n d Zn o n - m e t a l l o t h i o n e i n w i t h i n c r e a s i n g e x p o s u r e l e v e l ( T a b l e 2 ) . I n m u s s e l s , m o s t C u a n d Zn o c c u r r e d i n t h e h i g h a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c 2 4 0 p o o l , s u g g e s t i n g t h a t m u s s e l s , 1 i k e p h y t o p l a n k t o n a n d z o o -p l a n k t o n , u s e c o m p o n e n t s o f t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l a s t h e m a i n s t o r a g e a r e a f o r C u a n d Z n . T h e l i v e r s o f c h u m s a l m o n a p p e a r e d t o h a v e a d i s t i n c t C u p e a k i n t h e f r a c t i o n s i n w h i c h m e t a l l o t h i o n e i n o c c u r s ( F i g u r e 1 2 A ) . D u c k l i v e r ( F i g u r e s 4 a n d 8 A ) a n d k i d n e y ( F i g u r e 8 B ) h a d d i s t i n c t i v e m e t a l l o t h i o n e i n p e a k s c o n t a i n i n g h i g h l e v e l s o f C d , C u a n d Z n . , H u m a n k i d n e y s c o n t a i n e d v e r y h i g h C d - a n d C u - t h i o n e i n l e v e l s w i t h l e s s e r a m o u n t s o f Z n - t h i o n e i n ( F i g u r e s 1 8 a n d 1 9 ) . L a b o r a t o r y m i c e h a d r e l a t i v e l y i n s i g n i f i c a n t l e v e l s o f m e t a l l o t h i o n e i n ( F i g u r e 2 9 ) u n l e s s t h e s e w e r e e x p o s e d t o C d ( F i g u r e 3 0 ) . I t a p p e a r s , t h e r e f o r e , t h a t h i g h e r o r g a n i s m s c a n p r o d u c e m o r e m e t a l l o t h i o n e i n s i n c e a h i g h e r p o r t i o n o f t h e i r c y t o p l a s m i c m e t a l l e v e l s a r e b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n . T h i s i s p a r t i c u l a r l y e v i d e n t w h e n c o n s i d e r i n g o r g a n i s m s e x p o s e d t o h i g h m e t a l l e v e l s i n l a b o r a t o r y e x p e r i m e n t s . M u s s e l s h a d o n l y a 1 . 6 - f o l d i n c r e a s e i n l e v e l s o f m e t a l l o -t h i o n e i n b e f o r e t h e r e w a s a n a p p a r e n t s a t u r a t i o n o f m e t a l l o -t h i o n e i n w i t h s p i l l o v e r o f m e t a l t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l ( C a l c u l a t e d f r o m T a b l e 2 ) . M i c e e x p o s e d t o C d i n t h e l a b o r a t o r y , h a d a 6 . 1 - f o l d i n c r e a s e i n m e t a l l o t h i o n e i n l e v e l s b e f o r e s p i l l o v e r o c c u r r e d ( c a l c u l a t e d f r o m T a b l e s 1 9 - 2 1 ) . P e r h a p s t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e p o r t i o n o f m e t a l o n m e t a l l o t h i o n e i n i n l o w e r o r g a n i s m s ( i . e . , p h y t o p l a n k t o n , 2 4 1 z o o p l a n k t o n a n d m u s s e l s ) v e r s u s h i g h e r o r g a n i s m s ( i . e . , f i s h , d u c k s , m i c e a n d h u m a n s ) i s d u e t o t h e t i s s u e t y p e a n a l y z e d . F o r p h y t o p l a n k t o n , z o o p l a n k t o n a n d m u s s e l s , t h e e n t i r e o r g a n i s m w a s h o m o g e n i z e d f o r a n a l y s i s . I n h i g h e r o r g a n i s m s , o n l y l i v e r a n d k i d n e y t i s s u e w e r e a n a l y z e d . T h e s e c a n p r o d u c e h i g h l e v e l s o f m e t a l l o t h i o n e i n w h e r e a s o t h e r t i s s u e s i n h i g h e r o r g a n i s m s p r o d u c e o n l y v e r y l o w l e v e l s ( B o u q u e g n e a u e t a l . , 1 9 7 5 ) . I n t h e s e o t h e r t i s s u e s , t r a c e e l e m e n t s a r e b o u n d t o m e t a l 1 o e n z y m e s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , a n d t o c o m p o n e n t s o f t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . T h e r e f o r e , i f t h e e n t i r e b o d y o f h i g h e r o r g a n i s m s h a d b e e n a n a l y z e d , i t w o u l d h a v e a p p e a r e d t h a t o n l y a v e r y s m a l l p o r t i o n o f m e t a l w a s b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n . P e r h a p s i f e q u i v a l e n t o r g a n s w e r e a n a l y z e d f r o m p h y t o p l a n k t o n , z o o p l a n k t o n , o r m u s s e l s , a h i g h e r p o r t i o n o f m e t a l m i g h t h a v e a p p e a r e d o n m e t a l l o -t h i o n e i n . T h e c r o p a n d d i g e s t i v e g l a n d a r e t h e s t o r a g e a r e a s f o r h e a v y m e t a l s i n m o l l u s c s ( C o u g h t r e y a n d M a r t i n , 1 9 7 6 ) . T h i s s t u d y , u n l i k e a l m o s t a l l p r e v i o u s s t u d i e s , i n -v e s t i g a t e d t h e r e l a t i v e b i n d i n g o f m e t a l s t o o t h e r c y t o p l a s m i c p o o l s b e s i d e s m e t a l l o t h i o n e i n . T h i s s t u d y w a s m a d e t r u l y u n i q u e b y t h e f a c t t h a t l e v e l s o f m e t a l s b o u n d t o t h e s e v a r i o u s p o o l s w e r e q u a n t i f i e d . T h e m a i n p o i n t e s t a b l i s h e d b y t h e s e s t u d i e s , w a s t h a t t o x i c e f f e c t s o f t r a c e e l e m e n t s d o n o t o c c u r u n l e s s , a n d u n t i l , t h e s e t r a c e e l e m e n t s a p p e a r i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . T h i s w a s s u b s t a n t i a t e d b y s t u d i e s i n w h i c h p h y t o -p l a n k t o n w e r e e x p o s e d t o H g , z o o p l a n k t o n a n d f i s h w e r e e x p o s e d t o H g , m u s s e l s w e r e e x p o s e d t o C d , C u a n d Z n , m i c e w e r e e x p o s e d t o C d , a n d , s t u d i e s o f t h e c y t o p l a s m i c C d d i s t r i b u t i o n i n t i s s u e e x t r a c t f r o m c a n c e r o u s f i s h a n d h u m a n s . E x c e p t f o r t h e c a n c e r o u s o r g a n i s m s , a n d p h y t o -p l a n k t o n , t h i s a p p e a r a n c e o f t r a c e e l e m e n t s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w a s s h o w n t o o c c u r w i t h t h e a p p a r e n t s a t u r a t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n . T h u s , s t u d i e s i n t h i s t h e s i s h a v e c l e a r l y s u b -s t a n t i a t e d t h e " s p i l l o v e r t h e o r y " f i r s t s u g g e s t e d b y B r o w n e t a l . ( 1 9 7 7 ) , i . e . , t h a t t o x i c e f f e c t s o f t r a c e e l e m e n t s d o n o t o c c u r u n t i l m e t a l l o t h i o n e i n b e c o m e s m e t a l s a t u r a t e d a n d t h e s e m e t a l s s p i l l o v e r t o t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . T o x i c e f f e c t s a r e a t t r i b u t e d t o t h e i n t e r -f e r e n c e o f t o x i c m e t a l s , o r e x c e s s e s o f r e q u i r e d m e t a l s , w i t h m e t a l b i n d i n g s i t e s i n m e t a l 1 o e n z y m e s ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . I n p h y t o p l a n k t o n e x p o s e d t o H g , t h e e n t i r e " s p i l l o v e r t h e o r y " w a s n o t c o n f i r m e d s i n c e , e i t h e r Hg l e v e l s w e r e , i n m o s t c a s e s , t o o l o w t o b e d e t e c t a b l e o n m e t a l l o t h i o n e i n , o r H g - t h i o n e i n s i m p l y w a s n ' t p r o d u c e d i n t h e s e p h y t o p l a n k t o n . H o w e v e r , r e d u c e d g r o w t h d i d c o r r e l a t e w i t h a p p e a r a n c e o f Hg i n t h e h i g h m o l e c u l a r p r o t e i n p o o l i n p h y t o p 1 a n k t o n , s u g -g e s t i n g t h a t t h e o c c u r r e n c e o f t o x i c e l e m e n t s i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l i s t h e c o m m o n f a c t o r i n -f l u e n c i n g s u r v i v a l i n p h y t o p l a n k t o n , a s i t i s i n o t h e r o r g a n i s m s . C a r c i n o g e n e s i s S t u d i e s T h e s t u d i e s o f t u m o r o u s f i s h a n d h u m a n s , s u g g e s t e d t h a t t h e r e w a s a p o s s i b l e c o m m o n f a c t o r p r e s e n t i n c a n c e r o u s o r g a n i s m s , i . e . , t h a t t h e s e o r g a n i s m s c o n t a i n i n c r e a s e s o f b o t h C d a n d t h e C d : Z n r a t i o i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f a p p a r e n t l y n o r m a l l i v e r a n d k i d n e y t i s s u e . T h e r e f o r e , f u r t h e r r e s e a r c h w a s d i r e c t e d t o w a r d s a t t e m p t i n g t o d e m o n s t r a t e t h a t a n o r g a n i c c a r c i n o g e n ( D E N ) c o u l d c a u s e t h e s e c h a n g e s . H o w e v e r , i t w a s f o u n d t h a t DEN e x p o s u r e r e s u l t e d i n d e -c r e a s e s o f C d , C u a n d Zn f r o m t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f l i v e r t i s s u e o f m i c e . T o a d d c o n f u s i o n , i t w a s d e m o n s t r a t e d t h a t DEN c o u l d r e s u l t i n a c c u m u l a -t i o n o f C d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l r a t h e r t h a n o n m e t a l l o t h i o n e i n , i f a d d i t i o n a l C d w a s a d m i n i s t e r e d w i t h t h e D E N . I n f a c t , m i c e e x p o s e d t o DEN + C d h a d C d d i s t r i b u t i o n s v e r y s i m i l a r t o t u m o r o u s f i s h a n d h u m a n s . T h e r e f o r e , i t a p p e a r s a s t h o u g h a n o r g a n i c c a r c i n o g e n c a n r e s u l t i n g e l e l u t i o n p r o f i l e s w h i c h a r e s i m i l a r t o t u m o r o u s f i s h a n d h u m a n s . B u t , i t d o e s n o t a p p e a r t h a t t h i s d i s t r i -b u t i o n , o f C d i s n e c e s s a r y f o r c a n c e r . T h e r e f o r e , h i g h 2 4 4 l e v e l s o f C d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l m a y s i m p l y b e a c o i n c i d e n t a l e f f e c t o f c a r c i n o g e n s , o r e t i o l o g i c i n o n l y c e r t a i n c a n c e r s o r w i t h c e r t a i n c a r c i n o -g e n s . A l s o , i t i s c l e a r l y p o s s i b l e t h a t t h e r e c o u l d b e d i f f e r e n c e s i n n o n t u m o r o u s l i v e r ( e . g . , f i s h ) a n d k i d n e y ( e . g . , h u m a n ) f r o m t u m o r b e a r i n g o r g a n i s m s , a n d t u m o r o u s l i v e r ( e . g . , D E N - e x p o s e d m i c e ) . P e r h a p s i n p r e t u m o r o u s s t a g e s , c a r c i n o g e n s r e m o v e C d , C u a n d Zn f r o m s k i n o f t u m o r o u s f i s h a n d t r a n s f e r t h e m t o t h e l i v e r s o t h a t t h e s e a r e i n c r e a s e d i n t h e l i v e r . S i n c e t u m o r s d e v e l o p i n t h e l i v e r s o f DEN e x p o s e d m i c e , m e t a l s c o u l d b e t r a n s f e r r e d t o s o m e w h e r e e l s e , p o s s i b l e t h e k i d -n e y s . F u r t h e r s t u d i e s a r e n e c e s s a r y t o i n v e s t i g a t e c h a n g e s i n C d , C u a n d Zn l e v e l s i n v a r i o u s c y t o p l a s m i c p o o l s o f l i v e r a n d k i d n e y t i s s u e , a n d s o m e o t h e r t i s s u e w h i c h i s d e v e l o p -i n g t u m o r s . O f m a j o r i n t e r e s t w a s t h e f i n d i n g t h a t DEN r e d u c e d h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l C u a n d Zn l e v e l s , b u t t h a t r e v e r s a l o f t h e s e l o s s e s b y e i t h e r C d o r Z n a d m i n i s t r a t i o n , e x t e n d e d t h e t i m e t o d e a t h . T h e l e n g t h o f t h i s e x t e n s i o n w a s d i r e c t l y r e l a t e d t o t h e l e v e l o f C u + Z n i n t u m o r o u s l i v e r a t t h e t i m e o f d e a t h . T h a t C d i n c r e a s e d t h e t i m e t o d e a t h , a p p e a r s t o b e i n c o n f l i c t w i t h h y p o t h e s e s s u g g e s t i n g t h a t C d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l h a s a c a u s i t i v e r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s ( B r o w n , 1 9 7 7 ) . H o w e v e r , t h e C d l e v e l s a d m i n i s t e r e d ( 1 0 0 mg C d / L ) i n t h e s t u d y i n 2 4 5 w h i c h C d e x t e n d e d t h e t i m e t o d e a t h w e r e s o h i g h t h a t t h e y p r o b a b l y r e s u l t e d i n a l a r g e r e d u c t i o n o f t h e a c t i v i t y o f t h e m o n o o x y g e n a s e s y s t e m , s o t h a t DEN w a s n o t b i o a c t i v a t e d ( Y o s h i d a e t a l . , 1 9 7 5 ) ; i f t h i s w e r e t h e c a s e t h e n DEN w o u l d r e m a i n i n a p r e c a r c i n o g e n i c s t a t e . A n a d m i n i s t r a -t i o n o f l o w e r l e v e l s o f C d ( 5 mg C d / L ) a p p e a r e d t o i n c r e a s e t h e l e v e l s o f p r e c a r c i n o g e n i c c h a n g e s a f t e r 1 2 . 5 w e e k s ' e x p o s u r e ( B r o w n a n d C h a n , 1 9 7 8 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t C d c o u l d h a v e a t l e a s t a c a t a l y t i c r o l e i n c a r c i n o g e n e s i s . F u t u r e S t u d i e s A k e y p o i n t t h a t n e e d s t o b e d e m o n s t r a t e d i s t h a t t h e t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f t o x i c m e t a l s i n a n o r g a n i s m g i v e s l i t t l e i n d i c a t i o n o f t h e p o t e n t i a l f o r s u r v i v a l o f t h a t o r g a n i s m . I t i s l i k e l y t h a t a n e x p e r i m e n t c o u l d b e d e s i g n e d w i t h a l o w l e v e l c h r o n i c m e t a l e x p o s u r e r e s u l t i n g i n h i g h l e v e l s o f m e t a l c o n t a m i n a t i o n i n a n o r g a n i s m , b u t w i t h m o s t m e t a l b o u n d t o m e t a l l o t h i o n e i n - t h e r e f o r e t h e r e s h o u l d b e l i t t l e e v i d e n c e o f t o x i c e f f e c t s . A s i m i l a r l e v e l o f c o n t a m i n a t i o n m i g h t b e o b t a i n e d i n t h e s a m e t y p e o f o r g a n i s m a f t e r a h i g h l e v e l a c u t e e x p o s u r e , b u t w i t h l i t t l e o r n o m e t a l b o u n d b y m e t a l l o t h i o n e i n , s i n c e m e t a l l o -t h i o n e i n s y n t h e s i s w o u l d n ' t b e a b l e t o k e e p p a c e w i t h m e t a l i n f l o w i n t o t h e o r g a n i s m . I n t h i s l a t t e r o r g a n i s m , t o x i c e f f e c t s w o u l d b e c a u s e d b y n o n d e t o x i f i e d m e t a l . T h e f a c t t h a t w i t h o u t a m e a s u r e o f t h e p o r t i o n o f m e t a l b o u n d b y m e t a l l o t h i o n e i n , o n e d o e s n ' t k n o w i f a m e t a l i s e x e r t i n g t o x i c e f f e c t s o r n o t , h a s d i r e c t a n d i m m e d i a t e a p p l i c a t i o n t o s t r a t e g i e s o f e n v i r o n m e n t a l m o n i t o r i n g . T h e l i t e r a t u r e i s r e p l e t e w i t h e n v i r o n m e n t a l s u r v e y s o f l e v e l s o f v a r i o u s m e t a l s a n d o t h e r p o l l u t a n t s . B u t t h e i r n u m b e r s t e l l l i t t l e o f t h e o r g a n i s m s a b i l i t y t o s u r v i v e . I n o t h e r w o r d s , t h e y t e l l n o t h i n g o f t h e p o r t i o n o f t h e s e m e t a l s t h a t a r e d e t o x i f i e d w i t h i n t h e o r g a n i s m . O n e c a n n o t a s s u m e t h a t t h e s a m e p o r t i o n i s d e t o x i f i e d i n a l l o r g a n i s m s , s i n c e t h e p o r t i o n d e t o x i f i e d d e p e n d s u p o n t h e r a t e a n d l e v e l o f e x p o s u r e . A n d , u n l e s s o n e k n o w s h o w m u c h m e t a l i s d e t o x i f i e d b y m e t a l l o t h i o n e i n , a n d h o w m u c h n o n d e t o x i f i e d m e t a l m u s t b e p r e s e n t b e f o r e t o x i c e f f e c t s o c c u r , o n e i s i n n o p o s i t i o n t o c o m m e n t o n t h e d a n g e r o f a p o l l u t a n t ' l e v e l w i t h i n a n o r g a n i s m t o t h a t o r g a n i s m . T h e r e f o r e , f u t u r e e n v i r o n m e n t a l m o n i t o r i n g p r o g r a m s s h o u l d i n c o r p o r a t e a s t u d y o f d e t o x i f i c a t i o n o f m e t a l s b y m e t a l 1 o t h i o n e i n i h i d e s i g n a t e d : m e t a l - p o l 1 u t e d a r e a s . O t h e r p o s s i b l e m e c h a n i s m s o f m e t a l d e t o x i f i c a t i o n b y o r g a n i s m s a l s o n e e d t o b e s t u d i e d . F o r i n s t a n c e , i t h a s b e e n s h o w n t h a t l y s o s o m e s a r e i n t i m a t e l y i n v o l v e d i n t h e m e t a b o l i s m a n d d e t o x i f i c a t i o n o f t r a c e m e t a l s . F u r t h e r m o r e , i t h a s b e e n s h o w n t h a t m e t a l l o t h i o n e i n m a y b e s t o r e d w i t h i n l y s o s o m e s ( P o r t e r , 1 9 7 4 ) . T h e r e f o r e , a n e l u c i d a t i o n o f t h e e n t i r e s p e c t r u m o f m e t a l d e t o x i f i c a t i o n m e c h a n i s m s i s n e e d e d . S u c h s t u d i e s s h o u l d a t t e m p t t o p r o d u c e s t a n d a r d i z e d p r o -c e d u r e s r e a d i l y a m e n a b l e t o r o u t i n e m o n i t o r i n g p r o g r a m s . 247 S i n c e t o l e r a n c e c a n b e d e v e l o p e d t o m o s t p o l l u t a n t s , i t f o l l o w s t h a t t h e r e m a y b e d e t o x i f i c a t i o n s y s t e m s a v a i l -a b l e f o r m o s t p o l l u t a n t s . T h e r e f o r e , i t s h o u l d b e p o s -s i b l e t o s t u d y t h e i n d i v i d u a l d e t o x i f i c a t i o n s y s t e m s f o r e a c h p o l l u t a n t , h o w t h e s e w o r k , a n d t h e l e v e l s o f p o l l u t a n t a t w h i c h t h e i r c a p a c i t y t o d e t o x i f y i s s u r p a s s e d . T h i s h a s b e e n d o n e f o r t r a c e m e t a l s a n d m e t a l l o t h i o n e i n a n d c a n s u r e l y b e d o n e f o r o t h e r t o x i c a n t s - e . g . , t h e c a p a c i -t i e s o f t h e m o n o o x y g e n a s e - h y d r o x y 1 a s e e n z y m e s y s t e m s t o d e t o x i f y P C B ' s c o u l d p r o b a b l y b e r e a d i l y d e t e r m i n e d a s w e l l a s t h e a b i l i t y o f a d i p o s e t i s s u e , a n d e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m o f t h e l i v e r , t o s t o r e t h e s e b e f o r e t h e y a r e d e t o x i f i e d . T h e s t u d y o f t h e i n v o l v e m e n t o f t r a c e m e t a l s i n c a r c i n o g e n e s i s a p p e a r s t o b e a m o s t p r o m i s i n g a r e a o f r e s e a r c h . A s d i s c u s s e d i n t h i s t h e s i s , t h e r e a r e n u m e r o u s s t u d i e s s h o w i n g t h a t b o t h C u a n d Zn p r e v e n t c a n c e r f r o m o c c u r r i n g . T h i s t h e s i s h a s s h o w n t h a t o n e c a r c i n o g e n ( D E N ) c a u s e s d e c r e a s e s o f C u a n d Zn i n p r e t u m o r t i s s u e . R e v e r s a l o f t h e s e l o s s e s a p p e a r s t o d e l a y t h e o n s e t o f t u m o r s . U n f o r t u n a t e l y , t h e p r e s e n t s t u d i e s a d m i n i s t e r e d o n l y Z n w i t h D E N . F u t u r e s t u d i e s s h o u l d a d m i n i s t e r C u a s w e l l a s Z n w i t h D E N , s i n c e b o t h a r e d e p l e t e d b y D E N . M e t h o d s u t i l i z e d i n t h e p r e s e n t s t u d y f a i l e d t o c o u n t e r a c t t h e c a r c i n o g e n - i n d u c e d Zn d e p l e t i o n s . F u t u r e s t u d i e s s h o u l d s t u d y t h e c h e m i c a l f o r m a n d m e t h o d o f 2 4 8 a p p l i c a t i o n o f C u a n d Zn t h a t m o s t r e a d i l y c o u n t e r a c t s c a r c i n o g e n - i n d u c e d m e t a l l o s s e s . I f t h e s e c a r c i n o g e n -i n d u c e d l o s s e s o f m e t a l c a n b e p r e v e n t e d b y m e t a l a d m i n i s t r a -t i o n w i t h t h e c a r c i n o g e n , a n d t u m o r s p r e v e n t e d , t h e n i t w i l l b e c l e a r t h a t m e t a l l o s s e s a r e i n v o l v e d i n t h e e t i o l o g y o f c a n c e r . A v e r y r e c e n t s t u d y b y F o n g e t a l . ( 1 9 7 8 ) h a s f o u n d t h a t t h e o r g a n i c c a r c i n o g e n m e t h y l b e n z y l n i t r o s a m i n e ( M B M ) p r o d u c e s t u m o r s a n d Zn d e f i c i e n c y i n t h e e s o p h a g u s b f r a t s . T h e y f u r t h e r m o r e d e m o n s t r a t e d t h a t r a t s d e f i c i e n t - i n Zn d u e t o a Zn d e f i c i e n t d i e t , d e v e l o p e d t u m o r s f a s t e r f r o m e x p o s u r e t o MBM t h a n d i d c o n t r o l s g i v e n MBM w i t h a Zn r e p l e t e d i e t . T h e y c o n c l u d e t h a t : " p r e s e n t s t u d i e s w i t h e x p e r i m e n t a l a n i m a l s i n d i c a t e t h a t z i n c i s s o m e h o w i n v o l v e d i n t h e e t i o l o g y o f e s o p h a g e a l c a n c e r . S i n c e z i n c u s u a l l y i n t e r a c t s w i t h o t h e r t r a c e e l e m e n t s , o u r f i n d i n g s i m p l y t h a t t h e o b s e r v e d e f f e c t s i n v o l v e a t r a c e e l e m e n t i m b a l a n c e o n a b r o a d e r s c a l e . " A n a t t e m p t w a s m a d e i n s t u d i e s r e p o r t e d i n t h e p r e s e n t t h e s i s , t o s t u d y t h e s e i m b a l a n c e s o n a b r o a d e r s c a l e , p a r t i c u l a r l y w i t h r e s p e c t t o t h e C d : Z n r a t i o . A s i n d i c a t e d i n t h i s t h e s i s , t h e e l e v a t i o n o f t h i s r a t i o a p p e a r s t o b e a r e l a t i v e l y c o m m o n d e n o m i n a t o r o f t u m o r - b e a r i n g o r g a n i s m s . T h e f a c t t h a t t h e p r e s e n t s t u d y r e p o r t s t h a t DEN l o w e r e d C d l e v e l s i n p r e t u m o r t i s s u e , d e r i d e s t h e i m p o r t a n c e o f C d i n c a r c i n o g e n e s i s , w h i l e t h e i n c r e a s e d C d : Z n r a t i o i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f t u m o r - b e a r i n g f i s h a n d h u m a n s , a n d t h e i n c r e a s e d p o r t i o n o f c y t o p l a s m i c C d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l o f m i c e g i v e n DEN + l o w C d d o s e s , p o i n t s t o s o m e i m p o r t a n c e o f C d i n c a r c i n o -g e n e s i s . I t m a y b e t h a t C d i s s i m p l y a c a t a l y s t f o r c a r c i n o g e n e s i s a n d t h a t i t i s n e c e s s a r y f o r c a n c e r o n l y w h e n o r g a n i c c a r c i n o g e n l e v e l s a r e r e l a t i v e l y l o w , i . e . , s u c h a s t h o s e n o r m a l l y e n c o u n t e r e d i n t h e e n v i r o n m e n t . S i n c e b o t h t h e l e v e l s o f DEN a n d C d a d m i n i s t e r e d i n t h e p r e s e n t r e p o r t , w e r e p r o b a b l y f a r h i g h e r t h a n a n y e n -c o u n t e r e d i n t h e e n v i r o n m e n t , i t i s r e c o m m e n d e d t h a t f u t u r e s t u d i e s u s e l o w e r l e v e l s o f b o t h , i n o r d e r t o m o r e c l o s e l y s i m u l a t e t h e u s u a l p r o c e s s e s o f c a r c i n o g e n e s i s . 2 5 0 C H A P T E R X I I I R e f e r e n c e s A r n o l d , M . , a n d D . S a s s e . 1 9 6 1 . Q u a n t i t a t i v e a n d h i s t o -c h e m i c a l a n a l y s i s o f C u , Z n a n d F e i n s p o n t a n e o u s a n d i n d u c e d p r i m a r y t u m o r s o f r a t s . C a n c e r R e s . 2 1 : 7 6 1 - 7 6 6 . B a r b a s o n , H . , A . F r i d m a n - M a n d u z i o , P . L e l i e v r e , a n d E . H . B e t z . 1 977". V a r i a t i o n s o f l i v e r c e l l c o n t r o l d u r i n g d i e t h y l n i t r o s a m i n e c a r c i n o g e n e s i s . E u r o p . J . C a n d e r 1 . 3 : 1 3 - 1 8 . B e c k i n g , G . C . 1 9 7 6 . T r a c e e l e m e n t s a n d d r u g m e t a b o l i s m . M e d . C l i n . N . A m e r . 6 0 : 8 1 3 - 8 3 0 . B i s c h o f f , F . , a n d M . L . L o n g . 1 9 3 9 . T h e l o c a l e f f e c t o f z i n c u p o n t h e d e v e l o p m e n t o f t h e m a r s h - b u f f a l o a d e n o c a r c i n o m a . A m . J . C a n c e r 3 7 : 5 3 1 - 5 3 5 . B o u q u e g n e a u , J . M . , C . G e r d a y , a n d A . D i s t e c h e . 1 9 7 5 . F i s h m e r c u r y - b i n d i n g t h i o n e i n r e l a t e d t o a d a p t a t i o n m e c h a n i s m s . F E B S L e t t e r s . 5 5 : 1 7 3 - 1 7 7 B r e m n e r , I . 1 9 7 4 . H e a v y m e t a l t o x i c i t i e s . Q u a r t . R e v . B i o p h y s . 7 : 7 5 - 1 2 4 . ' B r e m n e r , I . , a n d N . T . D a v i e s . 1 9 7 4 . S t u d i e s o n t h e a p -p e a r a n c e o f a c o p p e r - b i n d i n g p r o t e i n i n r a t l i v e r . B i o c h e m . S o c . T r a n s . 2 : 4 2 5 - 4 2 7 . B r e m n e r , I . , a n d N . T . D a v i e s , 1 9 7 5 . T h e i n d u c t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n i n r a t l i v e r b y Zn i n j e c t i o n a n d r e s t r i c t i o n o f f o o d i n t a k e . B i o c h e m . J . 1 4 9 : 7 3 3 - 7 3 8 . B r y a n , G . W . , a n d L . G . H u m m e r s t o n e . 1 9 7 1 . A d a p t a t i o n o f t h e p o l y c h a e t e N e r e i s d i v e r s i c o l o r , t o e s t a u r i n e s e d i m e n t s c o n t a i n i n g h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f h e a v y m e t a l s . J . M a r . B i o l . A s s o c . U . K . 5 1 : 8 4 5 - 8 6 3 . B u h l e r , R . H . 0 . a n d J . H . R. K a g i . 1 9 7 4 . H u m a n h e p a t i c m e t a l l o t h i o n e i n s . F E B S L e t t e r s 3 9 : 2 2 9 - 2 3 4 . B r o w n , D . A . 1 9 7 6 . I n t e r a c t i o n s b e t w e e n b i o l o g i c a l a n d g e o l o g i c a l e v o l u t i o n w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o t r a c e e l e m e n t s . ( U n p u b l . m a n u s c r i p t ) . 2 5 1 B r o w n , D . A . 1 9 7 7 . I n c r e a s e s o f C d a n d t h e C d : Z n r a t i o i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m a p -p a r e n t l y n o r m a l l i v e r o f t u m o r - b e a r i n g f l o u n d e r s ( P a r o p h r y s v e t u l u s ) . M a r . B i o l . 4 4 : 2 0 3 - 2 0 9 . B r o w n , D. A . , C . A . B a w d e n , K . W. C h a t e l , a n d T . R . P a r s o n s . 1 9 7 7 . T h e w i l d l i f e c o m m u n i t y o f I o n a I s l a n d j e t t y , V a n c o u v e r , B . C , a n d h e a v y - m e t a l p o l l u t i o n e f f e c t s . E n v i r o n . C o n s e r v . 4 : 2 1 3 - 2 1 6 . B r o w n , D. A . 1 9 7 8 . D e c r e a s e s o f c o p p e r a n d z i n c i n p r e -t u m o r o u s a n d p o s t t u m o r o u s l i v e r s o f m i c e e x p o s e d t o d i e t h y 1 n i t r o s a m i n e , w i t h a n d w i t h o u t c a d m i u m o f z i n c s u p p l e m e n t a t i o n . ( I n p r e p a r a t i o n ) . B r o w n , D. A . , a n d A . Y . C h a n . 1 9 7 8 . D e c r e a s e s o f c o p p e r a n d z i n c i n p r e t u m o r o u s l i v e r s o f m i c e e x p o s e d . t o d i e t h y l r i i t r o s a m i n e . ( S u b m i t t e d t o J . N a t l . C a n c e r I n s t . ) . B r o w n , D. A . , a n d K . W. C h a t e l . 1 9 7 8 a . I n t e r a c t i o n s b e -t w e e n c a d m i u m a n d , z i n c i n c y t o p l a s m o f d u c k , l i v e r a n d k i d n e y . C h e m . - B i o l . I n t e r a c t i o n s ( I n p r e s s ) . B r o w n , D . A . , a n d K . W. C h a t e l . 1 9 7 8 b . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n s u r v i v a l o f m u s s e l s e x p o s e d t o C d , C u a n d Z n , a n d t h e c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f t h e s e e l e m e n t s . ( I n p r e p a r a t i o n ) . B r o w n , D . A . , a n d K . W. C h a t e l . 1 9 7 8 c . T h e e f f e c t o f c a d m i u m e x p o s u r e , w i t h o r w i t h o u t d i e t h y l n i t r o s a m i n e , o n t h e c y t o p l a s m i c l e v e l s a n d d i s t r i b u t i o n o f c a d m i u m , c o p p e r a n d z i n c . ( I n p r e p a r a t i o n ) . B r o w n , D . A . , a n d B . K n i g h t . 1 9 7 8 . I n c r e a s e s o f C d a n d t h e C d : Z n r a t i o i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l f r o m a p p a r e n t l y n o r m a l k i d n e y o f t e r m i n a l h u m a n c a n c e r p a t i e n t s . ( I n p r e p a r a t i o n ) . B r o w n , D. A . , a n d T . R . P a r s o n s . 1 9 7 8 . R e l a t i o n s h i p b e -t w e e n c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n o f m e r c u r y a n d t o x i c e f f e c t s t o z o o p l a n k t o n a n d c h u m s a l m o n ( O n c o r h y n c h u s  k e t a ) e x p o s e d t o m e r c u r y i n a c o n t r o l l e d e c o s y s t e m . J . F i s h . R e s . B o a r d C a n . 3 5 : 8 8 0 - 8 8 4 . C a s t e r l i n e , J . L . , a n d G . Y i p . 1 9 7 5 . T h e d i s t r i b u t i o n a n d b i n d i n g o f c a d m i u m i n o y s t e r , s o y b e a n , a n d r a t l i v e r a n d k i d n e y . A r c h . E n v i r o n . C o n t a m . T o x i c o l . 3 : 31 9 - 3 2 9 . 2 5 2 C h e n , R. W . , H . E . G a n t h e r a n d W. G . H o e k s t r a . 1 9 7 3 . S t u d i e s o n t h e b i n d i n g o f m e t h y l m e r c u r y b y t h i o n e i n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 5 1 : 3 8 3 - 3 9 0 . C h e n , R. W . , a n d H . E . G a n t h e r . 1 9 7 5 . S o m e p r o p e r t i e s o f a u n i q u e c a d m i u m - b i n d i n g m o i e t y i n t h e s o l u b l e f r a c t i o n o f r a t t e s t e s . E n v i r o n . P h y s i o l B i o c h e m . 5 : 2 3 5 - 2 4 3 . C h e r i a n , M . G . 1 9 7 4 . I s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f c a d m i u m b i n d i n g p r o t e i n s f r o m r a t l i v e r . B i o c h . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 6 1 : 9 2 0 - 9 2 6 . C h v a p i l , M . , S . L . E l i a s , J . N . R y a n , a n d C F . Z u k o s k i . 1 9 7 2 . P a t h o p h y s i o l o g y o f z i n c . I n : I n t e r n a t i o n a l R e v i e w o f N e u r o b i o l o g y , S u p p l e m e n t 1 , C . C . P f e i f f e r , E d . New Y o r k a n d L o n d o n , A c a d e m i c P r e s s , p p . 1 0 5 - 1 2 4 . C i a p p a r e l 1 i , L . , D . H . R e t i e f , a n d L . P . F a t t i . 1 9 7 2 . T h e e f f e c t o f z i n c o n 9 , 1 0 - d i m e t h y l - 1 , 2 - b e n z a n t h r a c e n e ( D M B A ) i n d u c e d s a l i v a r y g l a n d t u m o r s i n t h e a l b i n o r a t - a p r e l i m i n a r y s t u d y . S . A f r . J . M e d . S c i . 3 7 : 8 5 - 9 0 . C l o u d , P . 1 9 7 4 . E v o l u t i o n o f e c o s y s t e m s . A m e r . S c i . 6 2 : 5 4 - 6 6 . C l o u t i e r , L . , a n d D. A . B r o w n . 1 9 7 8 . T h e e f f e c t o f m e r c u r y e x p o s u r e o n i n t r a c e l l e i a r d i s t r i b u t i o n o f m e r c u r y , c o p p e r , a n d z i n c i n S k ' e T e t o n e m a c o s t a t u r n . J . E x p . M a r . B i o l . E c o l . ( I n p r e s s ) . C o u g h t r e y , P . I . , a n d M . H . M a r t i n . 1 9 7 6 . T h e d i s t r i b u t i o n o f P b , Z n , C d a n d . C u w i t h i n t h e p u l m o n a t e m o l l u s c H e l i x a s p e r s a M u l 1 e r . O e c o l o g i a 2 3 : 3 1 5 - 3 2 2 . C o u s i n s , R. J . , A . K . B a r b e r , a n d J . R . T r o u t . 1 9 7 3 . C a d m i u m t o x i c i t y i n g r o w i n g s w i n e . J . N u t r . 1 0 3 : 9 6 4 - 9 7 2 . D a v i e s , N . T . , I . B r e m n e r , a n d C . F . M i l l s . 1 9 7 3 . S t u d i e s o n t h e i n d u c t i o n o f a l o w - m o l e c u l a r w e i g h t z i n c -b i n d i n g p r o t e i n i n r a t l i v e r . B i o c h . S o c . T r a n s . 1 : 9 8 5 - 9 8 8 . De F i l i p p i s , L . F . , a n d C . K . P a l l a g h y . 1 9 7 6 . T h e e f f e c t o f s u b l e t h a l c o n c e n t r a t i o n s o f m e r c u r y a n d z i n c o n C h l o r e l l a : I I I . D e v e l o p m e n t a n d p o s s i b l e m e c h a n i s m s o f r e s i s t a n c e t o m e t a l s . Z . P f 1 a n z e n p h y s i o l . 7 9 : 3 2 3 - 3 3 5 . 2 5 3 D e W y s , W. , a n d W. P o r i e s . 1 9 7 2 . I n h i b i t i o n o f a s p e c t r u m o f a n i m a l t u m o r s b y d i e t a r y z i n c d e f i c i e n c y . J . N a t l . C a n c e r I n s t . 4 8 : 3 7 5 - 3 8 1 . D u n c a n , J . R . , I . E . D r e o s t i . , a n d C . F . A l b r e c h t . 1 9 7 4 . Z i n c i n t a k e a n d g r o w t h o f a t r a n s p l a n t e d h e p a t o m a i n d u c e d b y 3 ' - m e t h y l - 4 - d i m e t h y l a m i n o a z o b e n z e n e i n r a t s . J . N a t l . C a n c e r I n s t . 5 3 : 2 7 7 - 2 7 8 . D u n c a n , J . R . , a n d I . E . D r e o s t i . 1 9 7 5 . Z i n c i n t a k e , n e o p l a s t i c DNA s y n t h e s i s , a n d c h e m i c a l c a r c i n o g e n e s i s i n r a t s a n d m i c e . J . N a t l . C a n c e r I n s t . 5 5 : 1 9 5 - 1 9 6 . D u n c a n , J . R . , a n d I . E . D r e o s t i . 1 9 7 6 . A s i t e o f a c t i o n f o r z i n c i n n e o p l a s t i c t i s s u e . N u t r . R e s . 3 8 : 7 1 1 - 7 1 3 . E v a n s , G . W . , P . F . M a j o r s , a n d W. E . C o r n a t z e r . 1 9 7 0 . M e c h a n i s m f o r c a d m i u m a n d z i n c a n t a g o n i s m o f c o p p e r m e t a b o l i s m . B i o c h . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 4 0 : 1 1 4 2 -1 1 4 8 . F a r e , G . , a n d D . L . W o o d h o u s e . 1 9 6 3 a . T h e e f f e c t o f c o p p e r a c e t a t e o n b i o c h e m i c a l c h a n g e s i n d u c e d i n t h e r a t l i v e r b y p - d i m e t h y l a m i n o a z o b e n z e n e . B r i t . J . C a n c e r 1 7 : 5 1 2 - 5 2 3 . F a r e , G . , a n d D. L . W o o d h o u s e . 1 9 6 3 . T h e d i s t r i b u t i o n o f c o p p e r i n t h e t i s s u e s o f t h e r a t ; t h e e f f e c t s o f a g e a n d o f f e e d i n g p - d i m e t h y l a m i n o a z o b e n z e n e w i t h a n d w i t h o u t c o p p e r a c e t a t e . B r i t . J . C a n c e r 1 7 : 7 7 5 - 7 8 6 . F a r e , G . 1 9 6 4 . T h e e f f e c t o f c u p r i c o x y a c e t a t e o n t h e b i n d -i n g o f a z o - d y e b y p r o t e i n d u r i n g t h e i n d u c t i o n o f l i v e r t u m o u r s i n t h e r a t . B i o c h e m . J . 9 1 : 4 7 3 - 4 7 8 . F l i c k , D. F . , H . F . K r a y b i l l , a n d J . M . D i m i t r o f f . 1 9 7 1 . T o x i c e f f e c t s o f c a d m i u m : a r e v i e w . E n v i r o n R e s . 4 : 7 1 - 8 5 . F o n g , L . Y . Y . , S t v a k , A . , a n d P . M . N e w b e r n e . 1 9 7 8 . Z i n c d e f i c i e n c y a n d m e t h y l b e n z y l n i t r o s a m i n e - i n d u c e d e s o p h a g e a l c a n c e r i n r a t s . J . N a t l . C a n c e r I n s t . 6 1 : 1 4 ~ 5 - 1 5 0 . F o w l e r , B . A . , D. A . W o l f e , a n d W. F . H e t t l e r . 1 9 7 5 . M e r c u r y a n d i r o n u p t a k e b y c y t o s o m e s i n m a n t l e e p i t h e l i a l c e l l s o f q u a h o g c l a m s ( M e r c e n a r i a  m e r c e n a r i a ) e x p o s e d t o m e r c u r y . J . F i s h . R e s . B o a r d C a n . 3 2 : 1 7 6 7 - 1 7 7 5 . 2 5 4 F r i e d b e r g , F . 1 9 7 4 . E f f e c t s o f m e t a l b i n d i n g o n p r o t e i n s t r u c t u r e . Q u a r t . R e v . B i o p h y s . 7 : 1 - 3 3 . F u r s t , A . 1 9 6 3 . C h e m i s t r y o f C h e l a t i o n i n C a n c e r . C h a r l e s C . T h o m a s , P u b l i s h e r . S p r i n g f i e l d , I l l i n o i s . 1 4 3 p . G a s k i n , F . , a n d Y . K r e s s . 1 9 7 7 . Z i n c i o n - i n d u c e d a s s e m b l y o f t u b u l i n . J . B i o l . C h e m . 2 5 2 : 6 9 1 8 - 6 9 2 4 . G e o r g e , S . G . , a n d T . L . C o o m b s . 1 9 7 7 . T h e e f f e c t s o f c h e l a t i n g a g e n t s o n t h e u p t a k e a n d a c c u m u l a t i o n o f c a d m i u m b y M y t i l i s e d u l i s . . . M a r . B i o l . 3 9 : 2 6 1 - 2 6 8 . G e r h a r t , J . C , a n d H . K . S c h a c h m a n . 1 9 6 5 . D i s t i n c t s u b u n i t s f o r t h e r e g u l a t i o n a n d c a t a l y t i c a c t i v i t y o f a s p a r t a t e ' t r a n s c a r b a m y l a s e . B i o c h e m i s t r y 4 : 1 0 5 4 -1 0 6 2 . G r i c e , G . D . , M . R. R e e v e , P . K o e l l e r , a n d D. W. M e n z e l . 1 9 7 7 . T h e u s e o f l a r g e v o l u m e t r a n s p a r e n t e n c l o s e d s e a - s u r f a c e w a t e r c o l u m n s i n t h e s t u d y o f s t r e s s o n p l a n k t o n e c o s y s t e m s . H e l g o l . W i s s , M e e r e s u n t e r s . 3 0 : 1 1 8 - 1 3 3 . G r i f f i n , J . H . , J . P . R o s e n b u s c h , E . R . B l o u t , a n d K . K . W e b e r , 1 9 7 3 . C o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n a s p a r a t a t e t r a n s c a r b a m y l a s e . J . B i o l . C h e m . 2 4 8 : 5 0 5 7 - 5 0 6 2 . G o r o d i s k i i , V . I . , I . V . V e s e l a y a , a n d 0 . N . R o s t o v t s e v a . 1 9 5 6 . C o p p e r , z i n c , c a d m i u m a n d n i c k e l c o n t e n t o f m u s c l e s a n d t u m o r s . V o p . M e d . K h i m . 2 : 1 7 - 1 8 . ( C i t e d a f t e r : F u r s t , A . , a n d R. T . H a r o . 1 9 6 9 . A. s u r v e y o f m e t a l c a r c i n o g e n e s i s . P r o g . E x p . T u m o r R e s . 1 2 : 1 0 2 - 1 3 3 . G r e a t e r V a n c o u v e r S e w e r a g e a n d D r a i n a g e D i s t r i c t . 1 9 7 4 . E n v i r o n m e n t a l s t u d i e s a t I o n a I s l a n d . D e p t . N o . 2 , p r e p . B . C . R e s e a r c h : 1 6 2 p p . ( m i m e o g r . ) . G u n n , S . A . , T . C . G o u l d , a n d W. A . D. A n d e r s o n . 1 9 6 3 . C a d m i u r n - i n d u c e d i n t e r s t i t i a l c e l l t u m o r s i n r a t s a n d m i c e a n d t h e i r p r e v e n t a t i o n b y z i n c . J . N a t l . C a n c e r I n s t . 3 1 : 7 4 5 - 7 5 3 . G u n n , S . A . , T . C . G o u l d , a n d W. A . D . A n d e r s o n . 1 9 6 4 . E f f e c t o f z i n c o n c a n c e r o g e n e s i s b y . c a d m i u m . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 1 1 5 : 6 5 3 - 6 5 7 . 2 5 5 H a l s t e d , J . A . , a n d J . C . S m i t h . 1 9 7 0 . P l a s m a - z i n c i n h e a l t h a n d d i s e a s e . L a n c e t I : 3 2 2 - 3 2 4 . H e c h t , N . B . , a n d D. D a v i d s o n . 1 9 7 3 . T h e p r e s e n c e o f a c o m m o n a c t i v e s u b u n i t i n l o w a n d h i g h m o l e c u l a r w e i g h t m u r i n e DNA p o l y m e r a s e s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 5 1 : 2 9 9 - 3 0 5 . H e r r i n g , W. B . , B . S . L e a v e l l , L . M . P a i x a o a n d J . H . Y o e , 1 9 6 0 . T r a c e m e t a l s i n h u m a n p l a s m a a n d r e d b l o o d c e l l s . A m . J . C l i n . N u t r . 8 : 8 5 5 - 8 6 3 . H o r v a t h , D . J . 1 9 7 6 . T r a c e e l e m e n t s a n d h e a l t h . I n : T r a c e S u b s t a n c e s a n d H e a l t h , P . M . N e w b e r n e , E d . N e w Y o r k a n d B a s e l , M a r c e l D e k k e r , I n c . , p p . 31 9 - 3 5 6 . H o w a r d , A . G . , a n d G . N i c k l e s s . .1 9 7 5 . P r o t e i n b i n d i n g o f c a d m i u m , z i n c a n d c o p p e r i n e n v i r o n m e n t a l l y i n -s u l t e d - . ' l i m p e t s P a t e l l a v u l g a t a . J . C h r o m . 1 0 4 : 4 5 7 - 4 5 9 . H o w e l l , J . S . 1 9 5 8 . T h e e f f e c t o f c o p p e r a c e t a t e o n p -d i m e t h y l a m i n o a z o b e n z e n e c a r c i n o g e n e s i s i n t h e r a t . B r i t . J . C a n c e r 1 2 : 5 9 4 - 6 0 9 . I r o n s , R. D . , a n d J . C . S m i t h . 1 9 7 6 . P r e v e n t a t i o n b y c o p p e r o f c a d m i u m s e q u e s t r a t i o n b y m e t a l l o t h i o n e i n i n l i v e r . C h e m . - B i o l . I n t e r a c t i o n s 1 5 : 2 8 9 - 2 9 4 . J a k u b o w s k i , M . , 0 . P i o t r o w s k i , a n d B . T r o j a n o w s k a . 1 9 7 0 . B i n d i n g o f m e r c u r y i n t h e r a t : s t u d i e s u s i n g 2®3ftgQ-\ ^ a n d g e l f i l t r a t i o n . T o x . A p p l . P h a r m a c . 1 6 : 7 4 3 -7 5 2 . J e r i n a , D. M . , a n d J . W. D a l e y . 1 9 7 4 . A r e n e o x i d e s : a n e w a s p e c t o f d r u g m e t a b o l i s m . S c i e n c e 1 8 5 : 5 7 3 - 5 8 2 . J o v i n , T . M . , P . T . E n g l u n d , a n d A . K o r n b e r g . 1 9 6 9 . E n z y m a t i c s y n t h e s i s o f d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d . J . B i o l . C h e m . 2 4 4 : 3 0 0 9 - 3 0 1 8 . K a g i , J . H . R . , a n d B . L . V a l l e e . 1 9 6 0 . M e t a l l o t h i o n e i n : a c a d m i u m a n d z i n c c o n t a i n i n g p r o t e i n f r o m e q u i n e r e n a l c o r t e x . J . B i o l . C h e m . 2 3 5 : 3 4 6 0 - 3 4 6 5 . K a g i , J . H . R. , a n d B . L . V a l l e e . 1 9 6 1 M e t a l l o t h i o n e i n : a c a d m i u m a n d z i n c c o n t a i n i n g p r o t e i n f r o m e q u i n e r e n a l c o r t e x . I I . P h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s . J . B i o l . C h e m . 2 3 6 : 2 4 3 5 - 2 4 4 2 . 2 5 6 K e w , M . C . , a n d R . . C . M a l l e t t . 1 9 7 4 . H e p a t i c z i n c c o n -c e n t r a t i o n s i n p r i m a r y c a n c e r o f t h e l i v e r . B r i t . J . C a n c e r 2 9 : 8 0 - 8 3 . K o c k , J . J . , E . R . S m i t h , a n d J . M c N e e l y . 1 9 5 7 . A n a l y s i s o f t r a c e e l e m e n t s i n h u m a n t i s s u e s . C a n c e r 1 0 : 1 5 1 - 1 6 0 . K o e l l e r , P . A . , a n d . G . T . W a l l a c e . 1 9 7 7 . T h e g r o w t h o f y o u n g s a l m o n i d s ( O n c o r h y n c h u s k e t a ) : C o n t r o l l e d e c o s y s t e m p o l l u t i o n e x p e r i m e n t . B u l l . M a r . S c i . 2 7 : 1 1 4 - 1 1 8 . K o l o n e l , L . N . 1 9 7 6 . A s s o c i a t i o n o f c a d m i u m w i t h r e n a l c a n c e r . C a n c e r 3 7 : 1 7 8 2 - 1 7 8 7 . K r a s n y , J . L . 1 9 7 3 . D N A , P o l y m e r a s e s f r o m R a t I n t e s t i n a l M u c o s a , ( U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , M . S c . ) , 8 8 p . ( U n p u b l . t h e s i s ) . L a z a r u s , L . H . , a n d N . K i t r o n . 1 9 7 3 . C y t o p l a s m i c DNA p o l y -m e r a s e : p o l y m e r i c f o r m s a n d t h e i r c o n v e r s i o n i n t o a n a c t i v e m o n o m e r r e s e m b l i n g n u c l e a r DNA p o l y m e r a s e . J . M o l . B i o l . 8 1 : 5 2 9 - 5 3 4 . L e b e r , A . P . 1 9 7 4 . A m e c h a n i s m f o r c a d m i u m - a n d z i n c -i n d u c e d t o l e r a n c e t o c a d m i u m t o x i c i t y : i n v o l v e m e n t o f m e t a l l o t h i o n e i n . P u r d u e U n i v e r s i t y , P h . D . , U n i v e r s i t y M i c r o f i l m s , A n n A r b o r , M i c h i g a n . 7 2 p . L e w i s , G . P . , H . L y l e , a n d S . M i l l e r . 1 9 6 9 . A s s o c i a t i o n b e t w e e n e l e v a t e d h e p a t i c w a t e r - s o l u b l e p r o t e i n -b o u n d c a d m i u m l e v e l s a n d c h r o n i c b r o n c h i t i s a n d / o r e m p h y s e m a . L a n c e t I I : 1 3 3 0 - 1 3 3 2 . L i n , H . J . , W. C . C h a n , Y . Y . F o n g , a n d P . M . N e w b e r n e . 1 9 7 7 . Z i n c l e v e l s i n s e r u m , h a i r a n d t u m o r s f r o m p a t i e n t s w i t h e s o p h a g e a l c a n c e r . N u t r . R e p t . I n t . 1 5 : 6 3 5 - 6 4 3 . M a r a f a n t e , E . 1 9 7 6 . B i n d i n g o f m e r c u r y a n d z i n c t o c a d m i u m -b i n d i n g p r o t e i n i n l i v e r a n d k i d n e y o f g o l d f i s h ( C a r a s s i u s a u r a t u s L . ) E x p e r i m e n t i a 3 2 : 1 4 9 - 1 5 0 . M a r g o s h e s , M . , a n d B . L . V a l l e e . 1 9 5 7 ' . A c a d m i u m p r o t e i n f r o m e q u i n e k i d n e y c o r t e x . J . A m . C h e m . S o c . 7 9 : 4 8 1 3 - 4 8 1 4 . M c K e e , J . E . , a n d H . W. W o l f . 1 9 6 3 . W a t e r Q u a l i t y C r i t e r i a . T h e R e s o u r c e s A g e n c y o f C a l i f . S t a t e W a t e r Q u a l i t y C o n t r o l B o a r d P u b l i c a t i o n N o . 3 - A . 5 4 8 p . 2 5 7 M c L e a n , F . I . , 0 . J . L u c i s , Z . A . S h a k h , a n d E . E . R . J a n s z : . 1 9 7 2 . T h e u p t a k e a n d s u b c e l l u l a r d i s t r i -b u t i o n o f C d a n d Zn i n m i c r o o r g a n i s m s . . F e d n . P r o c . A m . S o c s . E x p . B i o l . 3 1 : 6 9 9 . M c Q u i t t y , J . T . , W. D. D e W y s , . L . M o n a c o , W. H . S t r a i n , C . G . R o b , J . A p g a r , a n d W. J . P o r i e s . 1 9 7 0 . I n h i b i t i o n o f t u m o r g r o w t h b y d i e t a r y z i n c d e f i c i e n c y . C a n c e r R e s . 3 0 : 1 3 8 7 - 1 3 9 0 . M e n z e l , D. W . , a n d J . C a s e . 1 9 7 7 . C o n c e p t a n d d e s i g n : c o n t r o l l e d e c o s y s t e m e x p e r i m e n t . B u l l . M a r . S c i . 2 7 : 1 - 7 . M i l l e r , J . A . 1 9 7 0 . C a r c i n o g e n e s i s b y c h e m i c a l s : a n o v e r -v i e w . C a n c e r R e s . 3 0 : 5 5 9 - 5 7 6 . M o r g a n , J . M . 1 9 7 0 . C a d m i u m a n d z i n c a b n o r m a l i t i e s i n b r o n c h o -g e n i c c a r c i n o m a . C a n c e r 2 5 : 1 3 9 4 - 1 3 9 8 . M o r g a n , J . M . 1 9 7 1 . T i s s u e c a d m i u m a n d z i n c c o n t e n t i n e m p h y s e m a a n d b r o n c h o g e n i c c a r c i n o m a . J . C h r o n . D i s . 2 4 : 1 0 7 - 1 1 0 . M o r g a n , J . M . 1 9 7 2 . H e p a t i c c o p p e r , m a n g a n e s e , a n d c h r o m i u m c o n t e n t i n b r o n c h o g e n i c c a r c i n o m a . C a n c e r 2 9 : 7 1 0 - 7 1 3 . N i e p e r , H . A . 1 9 7 7 . T h e N i e p e r a n t i c a n c e r r e g i m e n . P r e -p a r e d b y t h e S i l b e r s e e H o s p i t a l , H a n n o v e r , W e s t G e r m a n y . 6 p p . ( m i m e o g r . ) . N o e l - L a m b o t , F . 1 9 7 6 . D i s t r i b u t i o n o f c a d m i u m , z i n c a n d c o p p e r i n t h e m u s s e l M y t i 1 u s e d u l i s . E x i s t e n c e o f c a d m i u m - b i n d i n g p r o t e i n s s i m i l a r t o m e t a 1 1 o t h i o n e i n s . E x p e r i m e n t i a 3 2 : 3 2 4 - 3 2 6 . N o r d b e r g , G . F . 1 9 7 2 . C a d m i u m m e t a b o l i s m a n d t o x i c i t y . E n v i r o n . P h y s i o l . B i o c h e m . 2 : 7 - 3 6 . N o r d b e r g , G . F . , M . N o r d b e r g , M . P i s c a t o r , a n d 0 . V e s t e r b e r g . 1 9 7 2 . S e p a r a t i o n o f t w o f o r m s o f r a b b i t m e t a l l o -t h i o n e i n b y i s o e l e c t r i c f o c u s i n g . B i o c h e m . J . 1 2 6 : 4 9 1 - 4 9 8 . N o r d b e r g , G . F . , a n d M . P i s c a t o r . 1 9 7 2 . I n f l u e n c e o f l o n g -t e r m c a d m i u m e x p o s u r e o n u r i n a r y e x c r e t i o n o f p r o -t e i n a n d c a d m i u m i n m i c e . E n v i r o n . P h y s i o l . B i o c h e m . 2 : 3 7 - 4 9 . N o r d b e r g , G . F . , R . G o y e r , a n d M . N o r d b e r g . 1 9 7 5 . C o m -p a r a t i v e t o x i c i t y o f c a d m i u m - m e t a l l o t h i o n e i n a n d c a d m i u m , c h l o r i d e o n m o u s e k i d n e y . A r c h . P a t h o l . 9 9 : 1 9 2 - 1 9 7 . O l a f s o n , R . W. , a n d J . A . J . T h o m p s o n , 1 9 7 4 . I s o l a t i o n o f h e a v y m e t a l b i n d i n g p r o t e i n s f r o m m a r i n e v e r t e b r a t e s . M a r . B i o l . 2 8 : 8 3 - 8 6 . O l s o n , K . B . , G . H e g g e n , C . F . E d w a r d s , a n d L . W h i t t i n g t o n G o r h a m . 1 9 5 4 . T r a c e e l e m e n t c o n t e n t o f c a n c e r o u s a n d n o n c a n c e r o u s h u m a n l i v e r t i s s u e . S c i e n c e 1 1 9 : 7 7 2 - 7 7 3 . O l s o n , K . B . , G . H e g g e n , a n d C . F . E d w a r d s . 1 9 5 8 . A n a l y s o f 5 t r a c e e l e m e n t s i n t h e l i v e r o f p a t i e n t s d y i n g o f c a n c e r a n d n o n c a n c e r o u s d i s e a s e . C a n c e r 1 1 : 5 5 4 - 5 6 1 . O t t e , G . , a n d C . D. L e v i n g s . 1 9 7 5 . D i s t r i b u t i o n o f m a c r o i n v e r t e b r a t e s o n m u d - f l a t s i n f l u e n c e d b y s e w a g e , F r a s e r R i v e r e s t u a r y , B r i t i s h C o l u m b i a . T e c h . R e p t . N o . 4 7 6 , F i s h . M a r . S e r v . , E n v i r o n m e n t C a n a d a : 6 3 p p . ( m i m e o g r . ) . O v e r n e l l , J . 1 9 7 5 . T h e e f f e c t o f h e a v y m e t a l s o n p h o t o -s y n t h e s i s a n d l o s s o f c e l l p o t a s s i u m i n t w o s p e c i e s o f m a r i n e a l g a e . D u n a l i e l l a t e r t i o l e c t a a n d P h a e o d a c t y l u r n t r i c o r n u t u m . M a r . B i o l . 2 9 : 9 9 - 1 0 3 . P a e c h t - H o r o w i t z , M . 1 9 7 4 . T h e p o s s i b l e r o l e o f c l a y s i n p r e b i o t i c p e p t i d e s y n t h e s i s . O r i g i n s o f L i f e 5 : 1 7 3 - 1 8 7 . P a r s o n s , T . R . , C . A . B a w d e n , a n d W. A . H e a t h . 1 9 7 3 . P r e l i m i n a r y s u r v e y o f m e r c u r y a n d o t h e r m e t a l s c o n -t a i n e d i n a n i m a l s f r o m t h e F r a s e r R i v e r m u d - f l a t s . J . F i s h . R e s . B o a r d C a n a d a 3 0 : 1 0 1 4 - 1 0 1 6 . P e t e r i n g , H . G . , H . H . B u s k i r k , a n d J . A . C r i m . 1 9 6 7 . T h e e f f e c t o f d i e t a r y m i n e r a l s u p p l e m e n t s o f t h e . r a t o n t h e a n t i t u m o r a c t i v i t y o f 3 - e t h o x y - 2 - o x o b u t y r a l d e h y d e b i s ( t h i o s e m i c a r b a z o n e ) . C a n c e r R e s . 2 7 : 1 1 1 5 - 1 1 2 1 . P i o t r o w s k i , J . K . , B . T r o j a n o w s k a , J . M . W i s n i e w s k a - K n y p l a n d W. B o l a n o w s k a . 1 9 7 3 . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s o n b i n d i n g a n d r e l e a s e o f m e r c u r y i n t h e r a t . I n : M e r c u r y , M e r c u r i a l s a n d M e r c a p t a n s , M . W. M i l l e r a n d T . U . C l a r k s o n , E d s . S p r i n g f i e l d , I l l i n o i s , C h a r l e s C . T h o m a s , p p . 2 4 7 - 2 6 3 . 2 5 9 P i s c a t o r , M . 1 9 6 4 . On c a d m i u m i n n o r m a l h u m a n k i d n e y s t o -g e t h e r w i t h a r e p o r t o n t h e i s o l a t i o n o f m e t a l l o -t h i o n e i n f r o m l i v e r s o f c a d m i u r n - e x D o s e d r a b b i t s . N . H y g . T i d s k r . 4 5 : 7 6 - 8 2 . P o r i e s , W. J . , G . G . M a n s o u r , F . R . P l e c h a , A . F l y n n , a n d W . H . S t r a i n . 1 9 7 3 . I n h i b i t i o n o f b i o l o g i c a l a c t i o n o f z i n c i n m a n b y o t h e r t r a c e e l e m e n t s . I n : T r a c e E l e m e n t M e t a b o l i s m i n A n i m a l s - 2 , W. G . H o e k s t r a , J . W. S u t t i e , H . E . G a n t h e r , a n d W. M e r t z , E d s . B a l t i m o r e , U n i v e r s i t y P a r k P r e s s , p p . 6 5 6 . P o r t e r , H . 1 9 7 4 . T h e p a r t i c u l a t e h a i f - c y s t i n e - r i c h c o p p e r p r o t e i n o f n e w b o r n l i v e r . R e l a t i o n s h i p t o m e t a l l o -t h i o n e i n a n d s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n i n n o n -m i t o c h o n d r i a l p a r t i c l e s p o s s i b l y r e p r e s e n t i n g h e a v y l y s o s o m a s . B i o c h . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 5 6 : 6 6 1 - 6 6 8 . P o s w i l l o , D. E . , a n d B . C o h e n , 1 9 7 1 . I n h i b i t i o n o f c a r c i n o -g e n e s i s b y d i e t a r y z i n c . N a t u r e 2 3 1 : 4 4 7 - 4 4 8 . P r o h a s k a , J . R . , M . M o w a f y , H . E . G a n t h e r . 1 9 7 7 . I n t e r -a c t i o n s b e t w e e n c a d m i u m , s e l e n i u m a n d g l u t a t h i o n e p e r o x i d a s e i n r a t t e s t i s . C h e m . - B i o l . I n t e r a c t i o n s 1 8 : 2 5 3 - 2 6 5 . P u l i d o , P . , J . H . R. K a g i , a n d B . L . V a l l e e . 1 9 6 6 . I s o l a t i o n a n d s o m e p r o p e r t i e s o f h u m a n m e t a l l o t h i o n e i n . B i o c h e m . 5 : 1 7 6 8 - 1 7 7 7 . R i o r d a n , J . R . , a n d I . G o w e r . 1 9 7 5 . P u r i f i c a t i o n o f l o w m o l e c u l a r w e i g h t c o p p e r p r o t e i n s f r o m c o p p e r l o a d e d l i v e r . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 6 6 : 6 7 8 - 6 8 6 . R u g s t a d , H . E . , a n d T . N o r s e t h . 1 9 7 5 . C a d m i u m r e s i s t a n c e a n d c o n t e n t o f c a d m i u m - b i n d i n g p r o t e i n i n c u l t u r e d h u m a n s c e l l s . N a t u r e 2 5 7 : 1 3 6 - 1 3 7 . S a b b i o n i , E . , a n d E . M a r a f a n t e . 1 9 7 5 . H e a v y m e t a l s i n r a t l i v e r c a d m i u m b i n d i n g p r o t e i n . E n v i r o n . P h y s i o l . B i o c h e m . 5 : 1 3 2 - 1 4 1 . S a n d b e r g , M . , H . G r o s s , a n d 0 . M . H o l l y . 1 9 5 8 . C h a n g e s i n r e t e n t i o n o f c o p p e r a n d i r o n i n l i v e r a n d s p l e e n i n c h r o n i c d i s e a s e s a c c o m p a n i e d b y . s e c o n d a r y a n e m i a . A r c h . P a t h . 3 3 : 8 3 4 - 8 4 4 . S c h r o e d e r , H . A . , J . J . B a l a s s a , a n d J . C . H o g e n c a m p , . 1 9 6 1 . A b n o r m a l t r a c e m e t a l s i n m a n : c a d m i u m . J . C h r o n . D i s . 1 4 : 2 3 6 - 2 5 8 . 2 6 0 S h a i k h , Z . Z . , a n d 0 . J . L u c i s . 1 9 7 1 . I s o l a t i o n o f c a d m i u m -b i n d i n g p r o t e i n s . E x p e r i m e n t i a 2 7 : 1 0 2 4 - 1 0 2 5 . S l a t e r , J . P . , A . S . M i l d v a n , a n d L . A . L o e b . 1 9 7 1 . Z i n c i n DNA p o 1 m e r a s e s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 4 4 : 3 7 - 4 3 . S h a r p l e s s , G . R. 1 9 4 6 . . T h e e f f e c t s o f c o p p e r o n l i v e r t u m o r i n d u c t i o n b y p - d i m e t h y l a m i n o a z o b . e n z e . F e d . P r o c . 5 : 2 3 9 - 2 4 0 . S q u i b b , K. S . , a n d R. J . C o u s i n s . 1 9 7 4 . C o n t r o l o f c a d m i u m b i n d i n g p r o t e i n s y n t h e s i s i n r a t l i v e r . E n v i r o n . P h y s i o l . B i o c h e m . 4 : 2 4 - 3 0 . S t r a h l e r , A . N . 1 9 7 2 . P l a n e t E a r t h : i t s P h y s i c a l S y s t e m s T h r o u g h G e o l o g i c T i m e . H a r p e r a n d R o w , New Y o r k , 4 8 3 p . S t r a i n , W. H . , E . G . M a n s o u r , A . F l y n n , W. J . P o r i e s , A . J . T o m a r o , a n d 0 . A . H i l l . 1 9 7 2 . P l a s m a - z i n c c o n -c e n t r a t i o n i n p a t i e n t s w i t h b r o n c h o g e n i c c a n c e r . L a n c e t I: 1 0 2 1 - 1 0 2 2 . S t o n a r d , M . D . , a n d M . W e b b . 1 9 7 6 . I n f l u e n c e o f d i e t a r y c a d m i u m o n t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e e s s e n t i a l m e t a l s c o p p e r , z i n c a n d i r o n i n t i s s u e s o f t h e r a t . C h e m . -B i o l . I n t e r a c t i o n s 1 5 : 3 4 9 - 3 6 3 . S u g a w a r a , C , a n d N . S u g a w a r a . 1 9 7 5 . T h e i n d u c t i v e e f f e c t o f c a d m i u m o n p r o t e i n s y n t h e s i s o f r a t i n t e s t i n e . B u l l . E n v i r o n . C o n t a m i n . T o x . 1 4 : 1 5 9 - 1 6 2 . S u z u k i , Y . , a n d H . Y o s h i k a w a . 1 9 7 2 . E f f e c t s o f c a d m i u m i n j e c t i o n o n i n t r a c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f e s s e n t i a l m e t a l s i n r a t l i v e r . I n d . H e a l t h 1 0 : 9 3 - 1 0 6 . T a l b o t , V . , a n d R. J . M a g e e . 1 9 7 8 . N a t u r a l l y - o c c u r r i n g h e a v y m e t a l b i n d i n g p r o t e i n s i n i n v e r t e b r a t e s . A r c h . E n v i r o n m . C o n t a i n . T o x i c o l . 7 : 7 3 - 8 1 . T i e t z , N . W . , E . F . H i r s c h , a n d B . N e y m a n . 1 9 5 7 . S p e c t r o -g r a p h ^ s t u d y o f t r a c e e l e m e n t s i n c a n c e r o u s a n d n o n -c a n c e r o u s h u m a n t i s s u e s . J . A . M . A . 1 6 5 : 2 1 8 7 - 2 1 9 2 . T o p p i n g , G . , a n d H . W i n d o m . 1 9 7 7 . B i o l o g i c a l t r a n s p o r t o f c o p p e r a t L o c h Ewe a n d S a a n i c h I n l e t : c o n t r o l l e d e c o s y s t e m p o l l u t i o n e x p e r i m e n t . B u l l . M a r . S c i . 2 7 : 1 3 4 - 1 4 1 . 2 6 1 U l m e r , D. D. 1 9 7 0 . E f f e c t s o f m e t a l s o n p r o t e i n s t r u c t u r e . I n : E f f e c t s o f M e t a l s o n . C e l l s , S u b c e l l u l a r E l e m e n t s , a n d M a c r o m o l e c u l e s , M a n i l o f f , C o l e m a n a n d M i l l e r , E d s . S p r i n g f i e l d , I l l i n o i s , - U S A , C h a r l e s C . T h o m a s , p p . 1 1 - 3 7 . U n d e r w o o d , E . J . 1 9 7 1 . T r a c e E l e m e n t s i n H u m a n a n d A n i m a l N u t r i t i o n , 3 r d e d i t i o n . A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k a n d L o n d o n . 5 3 3 p . V a l l e e , B . L . 1 9 7 6 . Z i n c b i o c h e m i s t r y : a p e r s p e c t i v e . T r e n d s B i o c h e m . S c i . 1 : 8 8 - 9 1 . W e b b , M . 1 9 7 2 a . B i n d i n g o f c a d m i u m i o n s b y r a t l i v e r a n d k i d n e y . B i o c h e m . P h a r m a c . 2 1 : 2 7 5 1 - 2 7 6 5 . W e b b , M . 1 9 7 2 b . P r o t e c t i o n b y z i n c a g a i n s t c a d m i u m t o x i c i t y . B i o c h e m . P h a r m a c . 2 1 : 2 7 6 7 - 2 7 7 1 . W e i s b u r g e r , J . H . , R. M . M a d i s o n , J . M . W a r d , C . V i g u e r a , a n d E . K . W e i s b u r g e r . 1 9 7 5 . M o d i f i c a t i o n o f d i e t h y l n i t r o s a m i n e l i v e r c a r c i n o g e n e s i s w i t h p h e n o b a r b i t a 1 b u t n o t w i t h i m m u n o s u p p r e s s i o n . J . N a t l . C a n c e r I n s t . 5 4 : 1 1 8 5 - 1 1 8 7 . W h i t e , C . P . 1 9 2 1 . C o p p e r i n t u m o r s a n d i n n o r m a l t i s s u e s . L a n c e t I I : 7 0 1 - 7 0 3 . W h i t e , A . , P . H a n d l e r , a n d E . L . S m i t h . 1 9 6 8 . P r i n c i p l e s o f B i o c h e m i s t r y , 4 t h e d i t i o n . M c G r a w - H i l l B o o k C o . , New Y o r k , S y d n e y , T o r o n t o a n d L o n d o n . 1 1 8 7 p . W i l l i a m s , D. R . 1 9 7 1 . T h e M e t a l s o f L i f e . V a n N o s t r a n d R e i n h o l d C o . , L o n d o n , New Y o r k , C i n c i n n a t i , T o r o n o t a n d M e l b o u r n e , 1 7 2 p . W i n g e , D . , J . K r a s n o , a n d A . V . C o l u c c i . 1 9 7 3 . C a d m i u m a c c u m u l a t i o n i n r a t l i v e r : c o r r e l a t i o n b e t w e e n b o u n d m e t a l a n d p a t h o l o g y . I n : T r a c e E l e m e n t M e t a b o l i s m i n A n i m a l s - 2 , W. G . H o e k s t r a , J . W. S u t t i e , H . E . G a n t h e r , a n d W. M e r t z , E d s . B a l t i m o r e , U n i v e r s i t y P a r k P r e s s , p p . 5 0 0 - 5 0 1 . W i n g e , D. R . , R . P r e m a k u m a r , a n d K . V . R a j a g o p a l a n . 1 9 7 5 . M e t a l - i n d u c e d f o r m a t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n i n r a t l i v e r . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 7 0 : 2 4 2 - 2 5 2 . 2 6 2 W i s n i e w s k a . , J . M . , B . T r o j a n o w s k a , J . P i o t r o w s k i , a n d M . J a k u b o w s k i . 1 9 7 0 . B i n d i n g o f m e r c u r y i n t h e r a i t k i d n e y b y m e t a l l o t h i o n e i n . T o x i c . A p p l . P h a r m a c . 1 6 : 7 5 4 - 7 6 3 . W o s t e r , A . D. , M . L . F a i l l a , ! i . W. T a y l o r , a n d E . D. W e i n -b e r g . 1 9 7 5 . Z i n c s u p p r e s s i o n o f S a r c o m a 1 8 0 g r o w t h . J . N a t l . C a n c e r I n s t . 5 4 : 1 0 0 1 - 1 0 0 3 . W r i g h t , E . B . , a n d D o r m a n d y , T . L . 1 9 7 2 . L i v e r z i n c i n c a r c i n o m a . N a t u r e 2 3 7 : 1 6 6 . Y a m a n e , Y . , K . S a k a i , I . U c h i y a m a , M . T a b a t a , N . T a g a , a n d A . H a n a k i . 1 9 6 9 . E f f e c t o f b a s i c c u p r i c a c e t a t e o n t h e b i o c h e m i c a l c h a n g e s i n t h e l i v e r o f t h e r a t f e d c a r c i n o g e n i c a m i n o a z o d y e . I . C h a n g e s i n t h e a c t i v i t i e s o f DAB m e t a b o l i s m b y l i v e r h o m o g e n a t e . C h e m . P h a r m . B u l l . 1 7 : 2 4 8 8 - 2 4 9 3 . Y o s h i d a , T . , Y . I t o , Y . S u z u k i , a n d M . U c h i y a m a . 1 9 7 5 . I n h i b i t i o n o f h e p a t i c d r u g m e t a b o l i z i n g e n z y m e b y c a d m i u m i n m i c e . B u l l . E n v i r o n . C o n t a m . T o x . 1 5 : 4 0 2 - 4 0 5 . Z a h n e r , H . , E . B a c h m a . n n , R . H u t t e r , J . N u e s c h . 1 9 6 2 . S i d e r a m i n e , e i s e n h a l t i g e w a c h s t u m s f a k t o r e n a u s m i k r o o r g a n i s m e n . P a t h . M i c r o b i o l . 2 5 : 7 0 8 - 7 3 6 . 2 6 3 C H A P T E R X T V A p p e n d i x I : M e t h o d o l o g y S u m m a r y W h e r e a s d e t a i l e d m e t h o d o l o g y i s g i v e n i n e a c h c h a p t e r o f t h i s t h e s i s , t h i s s e c t i o n d e s c r i b e s r e c o m m e n d e d p r o c e d u r e s b a s e d u p o n e x p e r i e n c e g a i n e d d u r i n g t h e s e s t u d i e s . A s u m -m a r y o f t h e s t e p s u s e d i n t h e e x t r a c t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n a n d t h e h i g h a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l s i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 3 9 . L i v e r o r k i d n e y t i s s u e ( 1 ) a r e p r o -c e s s e d i n t h e u s u a l f a s h i o n a s d e s c r i b e d i n c u r r e n t l i t e r a -t u r e ( e . g . , O l a f s o n a n d T h o m p s o n , 1 9 7 4 ) . T h e s e p r o c e d u r e s i n v o l v e d a n i n i t i a l e x t r a c t i o n o f t h e t i s s u e ( 2 r 4 ) a n d a f u r t h e r e x t r a c t i o n o f t h e p e l l e t o b t a i n e d a f t e r c e n t r i f u g a -t i o n ( 6 - 8 ) . S a m p l e s i z e s a n d v o l u m e s o f s o d i u m c h l o r i d e s o l u t i o n u s e d i n t h e e x t r a c t i o n s a r e g i v e n i n T a b l e 2 5 . T h e d o u b l e e x t r a c t i o n p r o c e s s ( 1 - 9 ) i n c r e a s e s t h e p o r t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n a n d o t h e r p r o t e i n s e x t r a c t e d f r o m t i s s u e . H o m o g e n i z a t i o n s ( 3 & 7 ) a r e d o n e f o r e x a c t l y 3 m i n u t e s a t a s t a n d a r d s p e e d s e t t i n g o n a l a b o r a t o r y m o t o r e q u i p p e d w i t h a t e f l o n p e s t l e . C e n t r i f u g a t i o n s ( 4 , 8 & 1 2 ) a r e d o n e a t 2 7 , 0 0 0 x £ f o r e x a c t l y 10 m i n u t e s . F o r p h y t o p l a n k t o n , z o o p l a n k t o n a n d m u s s e l s , m i n i m a l s a m p l e s i z e m a y b e a v a i l a b l e . I n o r d e r t h a t m e a s u r e a b l e l e v e l s o f m e t a l a r e e l u t e d ( 1 5 ) , a n e x t r a c t i o n o f t h e p e l l e t ( 6 - 8 ) i s n o t d o n e a s t h i s w o u l d r e s u l t i n a d i l u t i o n o f t i s s u e m e t a l l e v e l s w i t h r e s u l t a n t d i l u t i o n o f m e t a l l e v e l s i n f r a c t i o n s c o l l e c t e d ( 1 7 ) . S i m i l a r p r o c e d u r e s a r e f o l l o w e d f o r v e r y s m a l l s a m p l e s o f l i v e r o r k i d n e y t i s s u e ( T a b l e 2 5 ) . 264 F i g u r e 39. A f l o w d i a g r a m o f t h e s t e p s i n v o l v e d i n t h e e x t r a c t i o n o f m e t a l l o t h i o n e i n a n d t h e h i g h a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t p o o l s f r o m t i s s u e . See t e x t f o r d e t a i l s . 265 0 ) ( 2 ) ( 3 ) ( 4 ) (6) (7) ( 8 ) T i s s u e I Add 0 . 9 % NaCl i H o m o g e n i z e I C e n t r i f u g e — I Add 0 . 9 % N a C l t o P e l l e t 1 R e h o m o g e n i z e P e l l e t 1 C e n t r i f u g e — D i s c a r d P e l l e t * ( 5 ) ^ C o l l e c t S u p e r n a t a n t -M u s s e l s , P h y t o p l a n k t o n o r Z o o p l a n k t o n ( 9 ) 0 0 ) ( I D ( 1 2 ) ( 1 3 ) ^ C o l l e c t S u D e r n a t a n t I C o m b i n e S u p e r n a t a n t s H e a t t o 7 0 ° C M u s s e l s C e n t r i f u g e 1 C o l l e c t S u p e r n a t a n t U 4 P h y t o p l a n k t o n o r Z o o p l a n k t o n A p p l y ^ S u p e r n a t a n t t o Column ( 1 5 ) C o l l e c t F r a c t i o n s ( 1 6 ) Read A b s o r b a n c e a t 2 5 0 a n d 280 jjm ( 1 7 ) R e a d C u , Z n , C d o r Hg l e v e l s i n e a c h F r a c t i o n T a b l e 2 5 . Recommended p r o c e d u r e s f o r v a r i o u s t i s s u e t y p e s . T i s s u e Type S a m p l e S i z e f l ) ( g r a m s ) F i r s t H o m o g e n 1 z a t i o n ( 3 ) 0 . 9 % N a C l V o l u m e ( m l ) S e c o n d H o m o g e n i z a t i o n ( 7 ) 0 . 9 % N a C l V o l u m e ( m l ) T i m e t o H e a t ( m l n ) a t 7 0 ° C ( 1 1 ) V o l u m e t o A p p l y ( m l ) t o C o l u m n ( 1 4 ) C o l u m n Type U s e d F r a c t i o n S 1 z e ( m l ) t o C o l l e c t ( 1 5 ) a P h y t o p l a n k t o n ( w h o l e t i s s u e ] 1 3 n o t done n o t d o n e 2 K . 9 / 6 0 1 . 5 Z o o p l a n k t o n ( w h o l e t i s s u e ) 1 3 n o t d o n e n o t done 2 K . 9 / 6 0 1 . 5 M u s s e l ( s o f t p a r t s ) 1 3 n o t d o n e 5 2 K . 9 / 6 0 1 . 5 L i v e r o r K i d n e y 0 . 1 1 . 5 n o t d o n e 5 1 . 0 K . 9 / 6 0 0 . 8 0 . 5 2 . 0 n o t done 5 1 . 5 K . 9 / 6 0 1 . 0 1 2 . 5 1 . 5 5 2 K . 9 / 6 0 1 . 5 2 4 . 5 2 . 5 5 5 K I . 6 / 1 0 0 6 3 9 6 5 14 K 2 . 5 / 1 0 0 15 a To p r o d u c e a b o u t 30 f r a c t i o n s p e r p r o f i l e . 2 6 7 S u p e r n a t a n t s f r o m m u s s e l ( 5 ) , l i v e r a n d k i d n e y ( 1 0 ) t i s s u e a r e h e a t e d i n a 7 0 ° C w a t e r b a t h f o r 5 m i n u t e s ( 1 1 ) a n d t h e n c e n t r i f u g e d ( 1 2 ) i n o r d e r t o c l e a r t h e t i s s u e e x -t r a c t o f c e l l u l a r d e b r i s . T h e s u p e r n a t a n t i s c o l l e c t e d ( 1 3 ) a n d t h e p e l l e t d i s c a r d e d . A l a l t e r n a t i v e t o t h i s p r o -c e d u r e i s t o c e n t r i f u g e t h e c o m b i n e d s u p e r n a t a n t s ( 1 3 ) a t 1 0 5 , 0 0 0 x £ f o r 6 0 m i n u t e s . T h i s l a t t e r p r o c e d u r e w a s n o t u t i l i z e d i n t h e p r e s e n t s t u d i e s a s a n u l t r a c e n t r i f u g e w a s n o t a v a i l a b l e . H o w e v e r , t o a v o i d l o s s e s o f h e a t c o a g u l a b l e e n z y m e s f r o m t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , t h e u l t r a c e n t r i f u g a t i o n t e c h n i q u e i s p r e f e r a b l e ; t h i s m e t h o d i s p a r t i c u l a r l y p r e f e r a b l e i f e n z y m e a c t i v i t i e s a r e t o b e m e a s u r e d i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l , a s m a n y e n z y m e s a r e i r r e v e r s i b l y d e n a t u r e d b y h e a t . I t i s n o t n e c e s s a r y t o h e a t p h y t o p 1 a n k t o n a n d z o o p l a n k t o n s u p e r -n a t a n t s . : : ( T a b l e 2 5 ) a s t h e s e a p p e a r c l e a r ( f r e e o f c e l l u l a r d e b r i s ) a f t e r o n e e x t r a c t i o n a n d c e n t r i f u g a t i o n ( 1 - 5 ) . R e s u l t i n g s u p e r n a t a n t s a r e a p p l i e d t o a c o l u m n p a c k e d w i t h S e p h a d e x G - 7 5 g e l ( 1 4 ) a n d e l u t e d w i t h 0 . 0 1 M N H 4 H C 0 3 . T h e s i z e o f c o l u m n e m p l o y e d ( 1 4 ) w i l l d e p e n d m a i n l y u p o n t h e s a m p l e s i z e u s e d ( T a b l e s 2 5 a n d 2 6 ) . A n a r r o w e r c o l u m n i s u s e d f o r s m a l l e r s a m p l e s i z e s . A l o n g e r c o l u m n i s p r e f e r a b l e t o a s h o r t e r c o l u m n a s i t p r o v i d e s a b e t t e r r e s o -l u t i o n o f p e a k s . B e t t e r r e s o l u t i o n o f p e a k s c a n a l s o b e o b t a i n e d b y c o l l e c t i n g s m a l l e r f r a c t i o n s i z e s a s e l u a n t f r o m t h e c o l u m n . R e s o l u t i o n i m p r o v e s d o w n t o 1 - 2 % o f t h e Table 26. The specifications for various sizes of Pharmacia columns when packed with Sephadex G-75 gel (from Pharmacia technical literature). Column Type (k) and size (cm) (Kdiameter/length) Bed Volume (ml) Minimum/Maximum Sample Size (ml) Maximum FLow Rate (ml/hr) Void Volume (ml) Time for First Macromolecules to Elute (hr) K.9/60 38 0.4/10 17 13 0.8 Kl.6/100 200 2/50 44 70 1.6 K2.5/100 485 5/120 114 168 1.5 2 6 9 b e d v o l u m e . S a m p l e s i z e s u p t o 2 5 - 4 0 % o f t h e b e d v o l u m e g i v e l e s s d i l u t e d c y t o p l a s m i c p o o l s , b u t w i t h l e s s r e s o l u t i o n . T h e p o s i t i o n o f p e a k s i s e s t a b l i s h e d i n i t i a l l y b y r e a d -i n g a b s o r b a n c e a t 2 5 0 a n d 2 8 0 jjm ( 1 6 ) . T h e h i g h a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t p o o l s h a v e h i g h a b s o r b a n c e a t 2 5 0 a n d 2 8 0 jjm w h e r e a s m e t a l l o t h i o n e i n i s u s u a l l y v e r y l o w a t 2 8 0 /jm d u e t o t h e a b s e n c e o f a r o m a t i c a m i n o a c i d s . M e t a l l o t h i o n e i n m a y h a v e h i g h a b s o r b a n c e a t 2 5 0 /jm i f m u c h C d i s b o u n d , d u e t o t h e p r e s e n c e o f s u l f h y d r y l - C d b o n d s . T h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l w i l l b e e l u t e d a s t h e f i r s t p e a k , w i t h a s h o u l d e r o r s e p a r a t e p e a k f o l l o w i n g d u e t o t h e p r e s e n c e o f h e m o g l o b i n , i f a p p l i c a b l e . T h e m e t a l l o t h i o n e i n p e a k w i l l a p p e a r n e x t , f o l l o w e d b y a d o u b l e p e a k e d l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l . E a c h a b s o r b a n c e p e a k w i l l c o r r e s p o n d t o a p e a k o f v a r i o u s m e t a l s . T h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l u s u a l l y c o n t a i n s C u a n d Zn d u e t o t h e p r e s e n c e o f m e t a l l o -e n z y m e s ( B r o w n e t a l . , 1 9 7 7 ) . M e t a l l o t h i o n e i n b i n d s t h e t o x i c m e t a l s , Hg a n d C d , a n d a l s o e x c e s s e s o f C u a n d Zn a b o v e l e v e l s r e q u i r e d f o r m e t a l 1 o e n z y m e s . T h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l s b i n d s a s m a l l p o r t i o n o f m e t a l s i n m o s t o r g a n i s m s , b u t v e r y h i g h p o r t i o n s i n p h y t o p l a n k t o n a n d z o o p l a n k t o n . I n t h e p r e s e n t s t u d y , i t w a s f o u n d t h a t i n a g e l e l u t i o n p r o f i l e c o m p r i s i n g 4 5 f r a c t i o n s , t h e h i g h m o l e -c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l c o m p r i s e d t u b e s 1 - 1 5 , m e t a l l o ^ t h i o n e i n c o m p r i s e d t u b e s 1 6 - 2 5 , a n d t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l c o m p r i s e d t u b e s 2 6 - 4 5 . I n o t h e r g e l e l u t i o n 2 7 0 p r o f i l e s , t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l c o m p r i s e d t h e f i r s t 1 5 / 4 5 ( . 3 3 ) t u b e s o f t h e p r o f i l e , m e t a l l o t h i o n e i n t h e n e x t 1 1 / 4 5 ( . 2 4 ) t u b e s o f t h e p r o f i l e , a n d t h e l o w m o l e -c u l a r w e i g h t c y t o p l a s m i c p o o l t h e l a s t 2 0 / 4 5 ( . 4 4 ) t u b e s o f t h e p r o f i l e . M e t a l l e v e l s a r e d e t e r m i n e d i n e a c h f r a c t i o n , a d d e d , a n d e x p r e s s e d a s a c o n c e n t r a t i o n o f m e t a l i n e a c h c y t o -p l a s m i c p o o l p e r g r a m o f t i s s u e ( w e t w e i g h t ) . F o r i n s t a n c e , i n a h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p o o l c o m p r i s i n g 1 0 f r a c t i o n s , t h e c o n c e n t r a t i o n s o f Zn i n e a c h f r a c t i o n ( a s mg Z n : / L ) a r e a d d e d c o r r e c t i n g f o r t h e v o l u m e o f e a c h f r a c t i o n ( e . g . , 6 m l ) : 1000 ml A c o r r e c t i o n i s a p p l i e d f o r - t h e w e t w e i g h t o f t i s s u e i n i t i a l l y h o m o g e n i z e d ( e . g . , 2 g l i v e r , w e t w e i g h t ) : A f u r t h e r c o r r e c t i o n i s m a d e f o r t h e f a c t t h a t n o t a l l s u p e r -n a t a n t ( 1 3 ) m a y b e a p p l i e d t o t h e c o l u m n ( 1 4 ) . F o r i n s t a n c e , a 2 g r a m l i v e r s a m p l e c o m p r i s i n g a p p r o x i m a t e l y 1 . 8 m l o f w a t e r a n d o t h e r e x t r a c t a b l e m a t e r i a l i s h o m o g e n i z e d i n i t i a l l y OR {x, + x 9 + + x r n ) mg Zn X 6 ml X 2 g l i v e r ( w e t w t ) 2 7 1 i n 4 . 5 m l o f 0 . 9 % N a C l a n d t h e p e l l e t e x t r a c t e d i n 2 . 5 m l o f s o l u t i o n . O f t h i s 8 . 8 m l o f e x t r a c t a b l e m a t e r i a l a n d s o d i u m c h l o r i d e s o l u t i o n , 5 m l a r e a p p l i e d t o t h e c o l u m n T a b l e 2 5 ) . T h e r e f o r e a c o r r e c t i o n f a c t o r i s n e e d e d f o r d i s c a r d e d t i s s u e e x t r a c t : X 8 J 3 5 . 0 A c o r r e c t i o n i s m a d e s i n c e d a t a i n t h e p r e s e n t s t u d y h a s b e e n c o n v e r t e d i n t o / j m o l e s o t h a t c o m p e t i t i o n b e t w e e n m e t a l s c a n b e e v a l u a t e d i n t e r m s o f t h e r e l a t i v e n u m b e r s o f m o l e c u l e s o f e a c h m e t a l p r e s e n t . X 1 mmole Zn x 1000 jwnole 6 5 . 4 mg Zn mmole The c o m p l e t e c a l u c u l a t i o n i s : ( X ' + V - + X ' ° ) r o 9 Z " x e m l x * x M x  1000 ml 2 g l i v e r ( w e t w t ) 5 . 0 x 1 mmole Zn x 1000 j j m o l e 6 5 . 4 mg Zn mmole I n a t y p i c a l g e l e l u t i o n p r o f i l e w h e r e x-j + x^ + X - J Q = Q . 8 m g , t h e r e w o u l d b e 0 . 0 6 5 > i m o l e Z n / g l i v e r ( w e t w e i g h t ) i n t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n p o o l . PUBLICATIONS: McLeay, D. J., and D. A. Brown. 1974. Growth stimulation and biochemical changes i n juvenile coho salmon (Oncorhynchus kisutch) exposed to bleached kraft pulpmill effluent f o r 200 days. J . Fish. Res. Board Can. 31« 1043-1049. McLeay, D. J,, and D. A. Brown. 1 9 7 5 . Effects of acute exposure to bleached kraft pulpmill effluent on carbohydrate metabolism of juvenile coho salmon (Oncorhynchus kisutch) during rest and exercise. J. Fish. Res. Board Can. 3 2 : 753-760. Brown, D. A., and D. J . McLeay. 1 9 7 5 . Effect of bleached kraft mill effluent on the survival of starved juvenile coho salmon (Oncorhynchus kisutch). J. Fish. Res. Board Can. 3 2 : 2 5 2 8 - 2 5 3 0 . Brown, D. A., and D. J . McLeay. 1 9 7 5 . Effect of n i t r i t e on methemoglobin and total hemoglobin of juvenile rainbow trout. Prog. Fish-Cult. 3 2 : 3 6 - 3 8 . Brown, D. A., C. A. Bawden, K. W. Chatel, and T. R. Parsons. 1977. The wildlife community of Iona Island jetty, Vancouver, B.C., and heavy-metal pollution effects. 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