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Molecular cell biology of Rubella virus structural proteins Hobman, Tom Cunningham 1989

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MOLECULAR CELL BIOLOGY OF RUBELLA VIRUS STRUCTURAL PROTEINS b y T o m C u n n i n g h a m H o b m a n B . S c , T h e U n i v e r s i t y o f M a n i t o b a , 1983 . M . S c , T h e U n i v e r s i t y o f M a n i t o b a , 1987 A thes i s s u b m i t t e d i n p a r t i a l f u l l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e d e g r e e o f D o c t o r o f P h i l o s o p h y i n t h e F a c u l t y o f G r a d u a t e S t u d i e s G e n e t i c s P r o g r a m W e a c c e p t th i s thes i s as c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a N o v e m b e r , 1989 © T o m C . H o b m a n In presenting this thesis in partial fulfilment of the requirements for an advanced degree at the University of British Columbia, I agree that the Library shall make it freely available for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of this thesis for scholarly purposes may be granted by the head of my department or by his or her representatives. It is understood that copying or publication of this thesis for financial gain shall not be allowed without my written permission. Department of fp^M o\ 0°) ' The University of British Columbia Vancouver, Canada D ^ e Q g l - Wit6} DE-6 (2/88) ABSTRACT R u b e l l a v i r u s ( R V ) is a s m a l l , e n v e l o p e d , p o s i t i v e - s t r a n d e d R N A v i r u s i n t h e f a m i l y T o g a v i r i d a e , a n d b e a r s s t r i k i n g s i m i l a r i t i e s t o t h e p r o t o t y p e a l p h a v i r u s e s S e m l i k i F o r e s t v i r u s ( S F V ) a n d S i n d b i s v i r u s ( S V ) i n t e r m s o f g e n o m e o r g a n i z a t i o n a n d s t r u c t u r a l p r o t e i n e x p r e s s i o n s t ra tegy . H o w e v e r u n l i k e a l p h a v i r u s e s , R V i n f e c t i o n o f c u l t u r e d ce l l s is c h a r a c t e r i z e d b y r e l a t i v e l y l o n g l a t e n c y p e r i o d s , s l o w r e p l i c a t i o n k i n e t i c s , l i m i t e d c y t o p a t h o l o g y , a n d t h e a b i l i t y t o e s t a b l i s h a p e r s i s t e n t i n f e c t i o n i n v i r t u a l l y e v e r y c e l l l i n e c a p a b l e o f s u p p o r t i n g its g r o w t h . R V v i r i o n s c o n t a i n t h r e e s t r u c t u r a l p r o t e i n s C , E 2 , a n d E l w h i c h a r e d e r i v e d b y p o s t - t r a n s l a t i o n a l p r o c e s s i n g o f a p r e c u r s o r p o l y p r o t e i n p l l O ( N F ^ - C - E Z - E l - C O O H ) . P r o c e s s i n g a n d i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t o f R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s h a s b e e n s t u d i e d b y j n v i t r o a n d j n v i v o e x p r e s s i o n o f R V c D N A s . It w a s f o u n d that t a r g e t i n g o f E l a n d E 2 i n t o t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m w a s m e d i a t e d b y t w o i n d e p e n d e n t l y f u n c t i o n i n g s i g n a l p e p t i d e s . C o i n c i d e n t w i t h t r a n s l o c a t i o n i n t o t h e E R , b o t h p r o t e i n s u n d e r w e n t a d d i t i o n o f N - l i n k e d g l y c a n s a n d p r o t e o l y t i c p r o c e s s i n g . C p r o t e i n d i d n o t a p p e a r t o p l a y a r o l e i n t h e p r o c e s s i n g o f p l l O . E x p r e s s i o n o f t h e R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s i n C O S c e l l s r e v e a l e d that E 2 e x i t e d t h e E R , a n d w a s t r a n s p o r t e d t h r o u g h t h e G o l g i t o t h e c e l l s u r f a c e i n a n E l - i n d e p e n d e n t m a n n e r , a l t h o u g h c o e x p r e s s i o n o f E l s e e m e d to i n c r e a s e t h e r a t e o f t r a n s p o r t . C o n v e r s e l y , E l w a s r e t a i n e d i n a G o l g i - l i k e r e g i o n a n d w a s n o t f o u n d o n t h e p l a s m a m e m b r a n e i n t h e a b s e n c e o f E 2 . O l i g o n u c l e o t i d e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s o f E l a n d E 2 c D N A s s h o w e d t h a t E l a n d E 2 b o t h c o n t a i n t h r e e N - l i n k e d g l y c a n s r e s p e c t i v e l y . L a c k o f g l y c o s y l a t i o n d i d n o t a p p e a r t o a f fec t t h e i n t r a c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f t h e R V g l y c o p r o t e i n s i n C O S ce l l s . A n u m b e r o f s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n R V a n d S F V / S V s t r u c t u r a l p r o t e i n e x p r e s s i o n s t r a t e g i e s w e r e d i s c o v e r e d , a n d t h e i r p o s s i b l e r e l a t i o n s h i p t o R V v i r i o n a s s e m b l y a r e d i s c u s s e d . i i T a b l e o f C o n t e n t s A B S T R A C T L I S T o f T A B L E S L I S T o f F I G U R E S L I S T o f A B B R E V I A T I O N S A C K N O W L E D G E M E N T S I N T R O D U C T I O N T r a n s p o r t a n d m o d i f i c a t i o n o f m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s T r a n s l o c a t i o n i n t o t h e E R T r a n s p o r t o f m e m b r a n e p r o t e i n s f r o m t h e E R C o v a l e n t m o d i f i c a t i o n s o f t h e g l y c o p r o t e i n s R o l e o f c a r b o h y d r a t e A c y l a t i o n A l p h a v i r u s S t r u c t u r e G e n o m e o r g a n i z a t i o n N o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s R N A s y n t h e s i s a n d r e p l i c a t i o n S t r u c t u r a l p r o t e i n e x p r e s s i o n a n d p r o c e s s i n g T r a n s l a t i o n o f 2 6 S m R N A C a p s i d p r o t e i n p 6 2 / E 2 g l y c o p r o t e i n E l g l y c o p r o t e i n E n t r y o f a l p h a v i r u s e s i n m a m m a l i a n ce l l s V i r u s a s s e m b l y a n d b u d d i n g R u b e l l a v i r u s C l a s s i f i c a t i o n M o r p h o l o g y a n d m o r p h o g e n e s i s C l i n i c a l a s p e c t s N u c l e i c a c i d a n d g e n o m e o r g a n i z a t i o n E x p r e s s i o n o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s C a p s i d p r o t e i n E 2 g l y c o p r o t e i n E l g l y c o p r o t e i n R e p l i c a t i o n E x p r e s s i o n s t u d i e s P r o j e c t r a t i o n a l e a n d thes i s o b j e c t i v e s M A T E R I A L S a n d M E T H O D S M a t e r i a l s a n d s u p p l i e s P r o p a g a t i o n a n d h a n d l i n g o f E . c o l i s t r a i n s P r e p a r a t i o n o f c o m p e t e n t c e l l s a n d t r a n s f o r m a t i o n I s o l a t i o n o f p l a s m i d a n d s i n g l e - s t r a n d e d D N A f r o m E . c o l i M i n i - p r e p p l a s m i d D N A i s o l a t i o n L a r g e s c a l e p l a s m i d D N A p r e p s I s o l a t i o n o f s i n g l e - s t r a n d e d D N A O l i g o n u c l e o t i d e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s P u r i f i c a t i o n a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s M u t a g e n e s i s I d e n t i f i c a t i o n o f m u t a n t s m D o t b l o t a n a l y s i s 4 5 R e s t r i c t i o n a n a l y s i s 46 D i d e o x y s e q u e n c i n g o f D N A 46 R e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e d i g e s t i o n s a n d D N A m o d i f i c a t i o n 46 C o m m o n s o l u t i o n s 48 E x p r e s s i o n v e c t o r s 48 R u b e l l a v i r u s c D N A c o n s t r u c t s 48 I n v i t r o t r a n s c r i p t i o n ; 5 2 I n v i t r o t r a n s l a t i o n ; 5 2 P r o t e a s e p r o t e c t i o n assay; 52 I m m u n o p r e c i p i t a t i o n s , E n d o - ^ - N - a c e t y l g l u c o s a m i n i d a s e H a n d N - g l y c a n a s e d i g e s t i o n s 5 3 T r a n s f e c t i o n o f C O S ce l l s 53 M e t a b o l i c l a b e l l i n g 54 I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e 54 E l e c t r o p h o r e s i s 5 5 S e p a r a t i o n o f D N A f r a g m e n t s 5 5 S e p a r a t i o n o f p r o t e i n s • 5 5 W e s t e r n b l o t t i n g 56 R E S U L T S a n d D I S C U S S I O N 58 S e c t i o n I . I n v i t r o e x p r e s s i o n a n d t a r g e t i n g o f R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s i n t o m i c r o s o m e s 58 R V c D N A c o n s t r u c t s 58 T r a n s c r i p t i o n / t r a n s l a t i o n 58 p 2 4 S 58 p E 2 E l 60 E x p r e s s i o n o f E 2 6 1 p E 2 6 1 p 4 S P E 2 6 5 E 2 a c q u i r e s N - l i n k e d g l y c a n s a n d is p r o t e o l y t i c a l l y p r o c e s s e d b y m i c r o s o m e s 6 5 E x p r e s s i o n o f E l 6 7 p E l 6 7 p A S P E l 68 E l a c q u i r e s N - l i n k e d g l y c a n s a n d is p r o t e o l y t i c a l l y p r o c e s s e d b y m i c r o s o m e s 68 D i s c u s s i o n 68 S e c t i o n I I . I n v i v o e x p r e s s i o n a n d p o s t - E R p r o c e s s i n g o f R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s 7 5 K i n e t i c s o f p r o c e s s i n g 7 5 p C M V 5 - 2 4 S 7 5 p C M V 5 - E 2 E l 7 7 E 2 g l y c o p r o t e i n 7 7 p C M V 5 - E 2 7 9 p C M V 5 - E l 7 9 S t e a d y s tate a n a l y s i s o f R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s i n transected c e l l s 8 1 H - p a l m i t a t e l a b e l i n g 81 W e s t e r n b l o t a n a l y s i s 8 3 F o r m a t i o n o f d i s u l f i d e b o n d s 8 3 C e l l s u r f a c e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n s 88 i v I m m u n o f l u o r e s c e n c e 88 p C M V 5 - 2 4 S 88 p C M V 5 - E 2 E l 9 1 p C M V 5 - E 2 9 1 p C M V 5 - E 2 n s 96 p C M V 5 - E l 96 M 3 3 i n f e c t i o n o f C O S ce l l s 100 D i s c u s s i o n 100 S e c t i o n I I I . D e t e r m i n a t i o n o f t h e n u m b e r o f N - l i n k e d g l y c a n s o n R V E l a n d E 2 g l y c o p r o t e i n 107 E l g l y c o p r o t e i n 107 E 2 g l y c o p r o t e i n 111 D i s c u s s i o n 112 / S U M M A R Y a n d P E R S P E C T I V E S 116 R E F E R E N C E S 119 v L I S T o f T A B L E S T a b l e I. D o m a i n s o f A l p h a v i r u s g l y c o p r o t e i n d o m a i n s T a b l e II . L i s t o f m u t a g e n i c o l i g o n u c l e o t i d e s v i L I S T o f F I G U R E S F i g u r e 1. C o m p o n e n t s o f t r a n s l o c a t i o n m a c h i n e r y i n t h e E R a n d c y t o p l a s m 3 F i g u r e 2. P r o c e s s i n g o f A s p a r a g i n e - l i n k e d o l i g o s a c c h a r i d e s 7 F i g u r e 3 . S t r u c t u r e o f o l i g o s c a c c h a r i d e s o n a l p h a v i r u s g l y c o p r o t e i n s 8 F i g u r e 4. E x p r e s s i o n s t r a t e g y o f S i n d b i s v i r u s g e n o m e 12 F i g u r e 5. A l t e r n a t i v e s p a t h w a y s f o r S i n d b i s v i r u s R N A s 17 F i g u r e 6. P r o c e s s i n g o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s s t r u c t u r a l p r o t e i n s 23 F i g u r e 7. A l p h a v i r u s g l y c o p r o t e i n s t r u c t u r e 26 F i g u r e 8. M o d e l f o r a l p h a v i r u s s p i k e i n t e r a c t i o n s w i t h n u c l e o c a p s i d 29 F i g u r e 9. E x p r e s s i o n o f R u b e l l a v i r u s s t r u c t u r a l p r o t e i n s 3 3 F i g u r e 10. E x p r e s s i o n v e c t o r s p S V L , p C M V 5 a n d p S P T 1 9 49 F i g u r e 11 . R u b e l l a v i r u s c D N A c o n s t r u c t s 51 F i g u r e 12. I n v i t r o t r a n s l a t i o n o f p 2 4 a n d p E 2 E l 59 F i g u r e 13. P h y s i c a l m a p s o f E 2 r e c o m b i n a n t s 62 F i g u r e 14. I n v i t r o t r a n s l a t i o n o f E 2 64 F i g u r e 15. P r o t e o l y t i c p r o c e s s i n g o f E 2 b y m i c r o s o m e s 66 F i g u r e 16. P h y s i c a l m a p s o f E l r e c o m b i n a n t s 6 9 F i g u r e 17. I n v i t r o t r a n s l a t i o n o f E l 7 2 F i g u r e 18. I n v i v o e x p r e s s i o n o f 2 4 S c D N A i n C O S ce l l s 76 F i g u r e 19 . I n v i v o e x p r e s s i o n o f E 2 E 1 c D N A i n C O S ce l l s 78 F i g u r e 20 . I n v i v o e x p r e s s i o n o f E 2 c D N A s i n C O S ce l l s 80 F i g u r e 2 1 . I n v i v o e x p r e s s i o n o f E l c D N A s i n C O S ce l l s 82 F i g u r e 22 . I n c o r p o r a t i o n o f p a l m i t a t e i n t o R V g l y c o p r o t e i n s 84 F i g u r e 2 3 . W e s t e r n b l o t o f t r a n s f e c t e d C O S ce l l s lysates 8 5 F i g u r e 24 . P r e s e n c e o f d i s u l f i d e b o n d s i n R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s 8 7 F i g u r e 2 5 . C e l l s u r f a c e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n o f R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s 89 F i g u r e 26 . I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e o f p C M V 5 - 2 4 S i n t r a n s f e c t e d c e l l s 9 2 F i g u r e 27 . I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e o f p C M V 5 - E 2 E l i n t r a n s f e c t e d c e l l s 94 F i g u r e 28 . I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e o f p C M V 5 - E 2 i n t r a n s f e c t e d c e l l s 9 7 F i g u r e 29 . I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e o f p C M V 5 - E 2 n s i n t r a n s f e c t e d c e l l s 98 F i g u r e 30 . I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e o f p C M V 5 - E l i n t r a n s f e c t e d ce l l s 99 F i g u r e 3 1 . I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e o f R V M 3 3 i n C O S ce l l s 101 F i g u r e 32 . M o d e l o f R V a s s e m b l y 106 F i g u r e 33 . S D S - P A G E a n a l y s i s o f E l g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s 108 F i g u r e 34 . I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e o f E l g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s 109 F i g u r e 35 . S D S - P A G E a n a l y s i s o f E 2 g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s 113 F i g u r e 36 . I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e o f E 2 g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s 113 v i i L I S T o f A B B R E V I A T I O N S A 2 6 0 A 6 0 0 A T P b p B S A C T P D N a s e d d N T P s d N T P s e n d o H E D T A E R G T P k b k D a M m A m g m l A*1 m M m o i n g n m v i i i a b s o r b a n c e at 2 6 0 n m a b s o r b a n c e at 6 0 0 n m a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e b a s e p a i r b o v i n e s e r u m a l b u m i n c y t i d i n e t r i p h o s h a t e d e o x y r i b o n u c l e a s e d i d e o x y n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e s d e o x y n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e s e n d o - ^ N - a c e t y l g l u c o s a m i n i d a s e H e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m g u a n o s i n e t r i p h o s p h a t e k i l o b a s e k i l o d a l t o n m o l a r m i l l i a m p m i l l i g r a m m i c r o g r a m m i l l i l i t e r i m i c r o l i t e r m i l l i m o l a r m u l t i p l i c i t y o f i n f e c t i o n n a n o g r a m n a n o m e t e r n t n u c l e o t i d e P B S p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e P M S F p h e n y l m e t h y l s u l f o n y l f l u o r i d e R N A s e r i b o n u c l e a s e R V r u b e l l a v i r u s S S v e d b e r g u n i t S D S s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e S F V S e m i l i k i F o r e s t v i r u s S R P s i g n a l r e c o g n i t i o n p a r t i c l e S V S i n d b i s v i r u s T r i s t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e T R I T C t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e i s o t h i o c y n a t e T T P t h y m i d i n e t r i p h o s p h a t e U T P u r i d i n e t r i p h o s p h a t e V S V V e s i c u l a r S t o m a t i t i s v i r u s ix A C K N O W L E D G E M E N T S F i r s t l y I w o u l d l i k e to t h a n k m y s u p e r v i s o r a n d f r i e n d D r . S h i r l e y G i l l a m f o r g i v i n g m e t h e o p p o r t u n i t y t o p u r s u e th is p r o j e c t , a n d f o r h e r e n c o u r a g e m e n t t h r o u g h o u t . I w i l l a l w a y s t r e a s u r e th i s e x p e r i e n c e . O f m y thes i s c o m m i t t e e m e m b e r s , a s p e c i a l t h a n k y o u g o e s t o D r . C a r o l i n e A s t e l l f o r h e r c r i t i c a l r e a d i n g o f t h e f irst d r a f t a n d s u g g e s t i o n s f o r w h i p p i n g it i n t o t o s h a p e . I a m g r a t e f u l t o m y e x a m i n e r s D r s . R o b M c M a s t e r , P e t e r C a n d i d o , A u b r e y T i n g l e , a n d H a y d n P r i t c h a r d f o r t h e i r c o m m e n t s a n d s u g g e s t i o n s . I w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k m y e x t e r n a l e x a m i n e r D r . J a c k R o s e f o r h e l p f u l c r i t i c i s m s a n d p r o m p t r e a d i n g o f t h e thes i s . F o r t h e gifts o f a n t i - R V s e r a a n d m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s I t h a n k D r s . A u b r e y T i n g l e , J o h n S a f f o r d , a n d J e r r y W o l i n s k y . T h a n k s a r e d u e to t h e m e m b e r s o f D r . T i n g l e s ' l a b f o r s u p p l y i n g r a d i o l a b e l e d R V . T o F r a n k T u f a r o f o r s t i m u l a t i n g d i s c u s s i o n s a n d t o M i k e W e i s s f o r h e l p w i t h t h e m i c r o s c o p i c p h o t o g r a p h y . I a m i n d e b t e d to B r a d B r u s h a n d H a y d n P r i t c h a r d f o r t h e i r h e l p w i t h t h e c o m p u t e r d u r i n g t h e p r e p a r a t i o n o f th is thes i s . T o B r a d , B o b , H e l e n a , C h r i s , H e l e n , R o g e r , P a u l , L i z a n d S u s a n f o r t h e i r f r i e n d s h i p a n d l a u g h t e r . L a s t l y t o M a r i t a f o r h e r n e v e r - e n d i n g e n t h u s i a s m a n d u n d e r s t a n d i n g d u r i n g t h e w o r k , a n d f o r b e i n g t h e r e w h e n I n e e d e d h e r . T h i s thes i s is d e d i c a t e d t o m y f a m i l y M o m , D a d , S t a c e y , M u f f i n , a n d t h e cat . x I N T R O D U C T I O N T h e i n t r o d u c t i o n w i l l b e p r e s e n t e d i n t h r e e s e c t i o n s , i ) T r a n s p o r t a n d m o d i f i c a t i o n o f m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s ; i i ) R e v i e w o f a l p h a v i r u s m o l e c u l a r b i o l o g y ; i i i ) R e v i e w o f R u b e l l a v i r u s . F o r t h e s a k e o f b r e v i t y , d i s c u s s i o n w i l l b e r e s t r i c t e d m a i n l y t o t y p e I m e m b r a n e p r o t e i n s w h i c h i n c l u d e a l p h a v i r u s a n d r u b e l l a v i r u s g l y c o p r o t e i n s ( S i n g e r et a l . , 1987) . T y p e I m e m b r a n e p r o t e i n s c o n s i s t o f l a r g e N - t e r m i n a l e c t o p l a s m i c d o m a i n s a n c h o r e d i n t h e m e m b r a n e b i l a y e r b y a C - t e r m i n a l t r a n s m e m b r a n e d o m a i n , w h i l e t y p e II m e m b r a n e p r o t e i n s a r e a n c h o r e d i n t h e m e m b r a n e b y a h y d r o p h o b i c N - t e r m i n a l s e g m e n t . T r a n s p o r t a n d m o d i f i c a t i o n o f m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s T r a n s l o c a t i o n i n t o t h e E R T h e m o s t w i d e l y a c c e p t e d m o d e l f o r t a r g e t i n g p r o t e i n s t o t h e E R m e m b r a n e i s t h e "s ignal h y p o t h e s i s " w h i c h s tates t h a t t h e s e p r o t e i n s a r e f irst s y n t h e s i z e d w i t h t r a n s i e n t h y d r o p h o b i c a m i n o - t e r m i n a l e x t e n s i o n s k n o w n as s i g n a l p e p t i d e s ( B l o b e l a n d D o b b e r s t e i n , 1 9 7 5 a , b ) . A s n o p r i m a r y s e q u e n c e h o m o l o g y i s f o u n d b e t w e e n s i g n a l p e p t i d e s , t h e s e d o m a i n s a r e t h o u g h t t o exer t t h e i r f u n c t i o n b y a d o p t i n g a c o m m o n s e c o n d a r y s t r u c t u r e s u c h as a n a l p h a h e l i x ( W a t s o n , 1984; v o n H e i j n e , 1985) . S i g n a l p e p t i d e s i n t e r a c t w i t h a c y t o s o l i c r i b o n u c l e o p r o t e i n c o m p l e x k n o w n as s i g n a l r e c o g n i t i o n p a r t i c l e ( S R P ) ( W a r r e n a n d D o b b e r s t e i n , 1978; W a l t e r a n d B l o b e l , 1980) . S R P is c o m p o s e d o f s ix d i f f e r e n t p o l y p e p t i d e s , o n e o f e a c h 9, 14, 19, 54 , 68 , a n d 7 2 k D a c b m p l e x e d t o g e t h e r o n a 3 0 0 nt m o l e c u l e o f R N A c a l l e d 7 S L ( W a l t e r a n d B l o b e l , 1982; S i e g e l a n d W a l t e r , 1985) . I n t e r a c t i o n o f S R P w i t h t h e n e w l y e m e r g e d s i g n a l p e p t i d e r e s u l t s i n a t r a n s i e n t b l o c k i n p o l y p e p t i d e e l o n g a t i o n w h i c h is n o t r e l e a s e d u n t i l t h e t r a n s l a t i o n c o m p l e x is t a r g e t e d t o t h e E R m e m b r a n e ( W a l t e r a n d B l o b e l , 1981) . T h e t r a n s l a t i o n a r r e s t f u n c t i o n o f S R P h a s b e e n m a p p e d to t h e 9 / 1 4 k D a p r o t e i n s a n d A l u - l i k e s e q u e n c e i n 7 S L ( S i e g e l a n d W a l t e r , 1985 , 1986) , a n d t h e 54 k D a p r o t e i n is k n o w n t o i n t e r a c t w i t h t h e s i g n a l p e p t i d e as it e m e r g e s f r o m t h e r i b o s o m e ( K r i e g et a l . , 1986) . T r a n s l a t i o n r e s u m e s a f ter S R P b i n d s to S R P r e c e p t o r o r d o c k i n g p r o t e i n w h i c h is a n E R m e m b r a n e p r o t e i n ( G i l m o r e et a l . , 1982a , b ; M e y e r et a l . , 1982) . A l s o i n t h e E R m e m b r a n e is a p r o t e a s e - s e n s i t i v e r i b o s o m e r e c e p t o r w h i c h fac i l i ta t e s b i n d i n g o f p o l y s o m e s w h i c h a r e - 1 -s y n t h e s i z i n g s e c r e t o r y o r m e m b r a n e p r o t e i n s ( A d e l m a n et a l . , 1973; H o r t s c h et a l . , 1986) . S e e F i g . l . A l t h o u g h its e x i s t e n c e h a d b e e n s u s p e c t e d f o r s o m e t i m e , o n l y r e c e n t l y h a s a s i g n a l s e q u e n c e r e c e p t o r b e e n i d e n t i f i e d as a n i n t e g r a l E R m e m b r a n e p r o t e i n ( P r e h n et a l . , 1980 , 1981; W i e d m a n n et a l . , 1987) . F o l l o w i n g its r e l e a s e f r o m S R P , t h e s i g n a l p e p t i d e d o m a i n o f p r o t e i n u n d e r g o i n g t r a n s l o c a t i o n is t r a n s f e r r e d to the s i g n a l s e q u e n c e r e c e p t o r ( F i g . 1 ) . F o r t h e m o s t p a r t , t r a n s l o c a t i o n o f e u k a r y o t i c s e c r e t o r y a n d m e m b r a n e p r o t e i n s a c r o s s t h e E R is a c o t r a n s l a t i o n a l e v e n t w h i c h c a n o n l y o c c u r d u r i n g a l i m i t e d p e r i o d o f n a s c e n t c h a i n e l o n g a t i o n . S R P is t h o u g h t to i n c r e a s e the l e n g t h o f th is t i m e w i n d o w d u r i n g w h i c h t i m e a p r o t e i n is i n a t r a n s l o c a t i o n - c o m p e t e n t state ( W a l t e r , 1987) . V e c t o r i a l d i s c h a r g e o f p r o t e i n s i n t o t h e E R r e q u i r e s G T P f o r a f u n c t i o n u n r e l a t e d to p r o t e i n syn thes i s ( C o n n o l l y a n d G i l m o r e , 1986; W i l s o n et a l . , 1988) . S e q u e n c i n g o f t h e c D N A f o r the 54 k D a p r o t e i n o f S R P r e v e a l e d a p u t a t i v e G T P - b i n d i n g d o m a i n w h i c h d e m o n s t r a t e s s i g n i f i c a n t h o m o l o g y w i t h t h e l a r g e s u b u n i t o f d o c k i n g p r o t e i n ( B e r s t e i n et a l . , 1989; R o m i s c h et a l . , 1989) . E x a c t l y h o w a p r o t e i n i s t r a n s f e r r e d a c r o s s t h e l i p i d b i l a y e r i s n o t k n o w n , b u t it is s u s p e c t e d t h a t t h e p r o c e s s o c c u r s t h r o u g h a n a q u e o u s c h a n n e l f o r m e d b y i n t e g r a l E R m e m b r a n e p r o t e i n s a c c o r d i n g to t h e s i g n a l h y p o t h e s i s ( B l o b e l a n d D o b b e r s t e i n , 1975a , b ) . M o r e r e c e n t l y , b i o c h e m i c a l e v i d e n c e f o r th i s t h e o r y h a s b e e n p r o v i d e d b y G i l m o r e a n d B l o b e l ( 1985) . S i g n a l s e q u e n c e s a r e t h o u g h t t o f o r m h a i r p i n l o o p s ( F i g . 1 ) u p o n i n s e r t i o n i n t o t h e E R r e s u l t i n g i n th i s d o m a i n n o t b e i n g t r a n s f e r r e d i n t o t h e E R l u m e n ( E n g e l m a n a n d S t e i t z , 1981) . S h a w et a l . ( 1 9 8 8 ) p r o v i d e d d i r e c t e v i d e n c e f o r the l o o p m o d e l o f s i g n a l s e q u e n c e i n s e r t i o n , a n d p r o p o s e d t h a t t h e s i g n a l s e q u e n c e o f a t y p e I m e m b r a n e p r o t e i n is t h e s t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l e q u i v a l e n t o f t h e s i g n a l p e p t i d e / m e m b r a n e a n c h o r d o m a i n o f t y p e II m e m b r a n e p r o t e i n s ( S i n g e r et a l . , 1987) . T h e o n l y p r o p o s e d d i f f e r e n c e is the p r e s e n c e o f a s i g n a l p e p t i d a s e c l e a v a g e s i te o n t h e c a r b o x y l - e n d o f t h e t y p e I p r o t e i n s i g n a l p e p t i d e ( F i g . 1) . S i g n a l p e p t i d a s e is a n e n d o p r o t e a s e o n t h e l u m i n a l s i d e o f t h e E R m e m b r a n e , a n d r e m o v e s t h e N - t e r m i n a l s i g n a l p e p t i d e s f r o m t y p e I t r a n s m e m b r a n e p r o t e i n s , a n d m o s t s e c r e t o r y p r o t e i n s w i t h s u c h e x c e p t i o n s as o v a l b u m i n ( B l o b e l a n d D o b b e r s t e i n , 1975a , b ; P a l m i t e r et a l . , 1978) . -2-A Signal peptidase receptor F i g u r e 1. S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n i l l u s t r a t i n g S R P e l o n g a t i o n a r r e s t a n d c o m p o n e n t s o f the t r a n s l o c a t i o n m a c h i n e r y i n t h e E R . A ) S R P c y c l e s b e t w e e n f r e e c y t o s o l i c f o r m ( a ) t o r i b o s o m e - b o u n d f o r m ( b ) t o S R P r e c e p t o r ( e ) . B ) S R P d i s p l a y s i n c r e a s e d a f f in i ty f o r t r a n s l a t i n g r i b o s o m e a f t e r e m e r g e n c e o f s i g n a l p e p t i d e ( z i g z a g l i n e s ) r e s u l t i n g i n t r a n s l a t i o n a r r e s t . C ) T a r g e t i n g t o E R m e m b r a n e r e s u l t s i n i n t e r a c t i o n o f t h e l a r g e r i b o s o m a l s u b u n i t w i t h its r e c e p t o r , S R P w i t h its r e c e p t o r a n d r e l e a s e o f the t r a n s l a t i o n b l o c k . D ) T h e s i g n a l s e q u e n c e is i n s e r t e d as a h a i r p i n l o o p a n d i n t e r a c t s w i t h s i g n a l s e q u e n c e r e c e p t o r . T h e p a s s e n g e r p r o t e i n d o m a i n is t r a n s l o c a t e d t h r o u g h a n a q u e o u s p o r e f o r m e d b y E R m e m b r a n e p r o t e i n s , a n d w i l l b e r e l e a s e d f r o m t h e s i g n a l p e p t i d e d o m a i n b y s i g n a l p e p t i d a s e , ( f r o m P e r a r a a n d L i n g a p p a , 1988) -3-T r a n s l o c a t i o n o f t y p e I m e m b r a n e p r o t e i n s i n t o t h e E R is h a l t e d b y t h e s t o p - t r a n s f e r o r t r a n s m e m b r a n e d o m a i n n e a r t h e C - t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n . S t o p - t r a n s f e r s e q u e n c e s , l i k e s i g n a l p e p t i d e s , d e m o n s t r a t e l i t t l e p r i m a r y s e q u e n c e h o m o l o g y a n d c o n s i s t o f 2 0 t o 3 0 h y d r o p h o b i c a n d n e u t r a l a m i n o a c i d s f l a n k e d b y at l east o n e b a s i c r e s i d u e o n t h e c y t o p l a s m i c s i d e ( S a b a t i n i et a l . , 1982) . T r a n s p o r t o f m e m b r a n e p r o t e i n s f r o m t h e E R T a r g e t i n g t o t h e E R is t h e f irst s tage o f t r a n s p o r t t h r o u g h t h e e x o c y t i c p a t h w a y f o r m o s t v i r a l a n d e u k a r y o t i c m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s . F o l l o w i n g t r a n s f e r a c r o s s t h e E R m e m b r a n e , p r o t e i n s c a n b e m o d i f i e d b y t h e a d d i t i o n o f a s p a r a g i n e - l i n k e d o l i g o s a c c h a r i d e s ( R o t h m a n a n d L o d i s h , 1977 ) , a n d fa t ty a c i d g r o u p s ( S c h m i d t a n d S c h l e s i n g e r , 1980) . T h e s e t o p i c s a r e d i s c u s s e d i n t h e n e x t s e c t i o n . T h e s t u d y o f v i r a l m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s h a s b e e n i n s t r u m e n t a l i n a n a l y s i s o f t r a n s p o r t f r o m t h e E R to t h e G o l g i i n e u k a r y o t i c ce l l s a n d r e s u l t s s e e m t o i n d i c a t e t h a t t e r t i a r y a n d / o r q u a t e r n a r y s t r u c t u r e s o f t h e p r o t e i n s a r e m o s t o f t e n c r i t i c a l f o r t r a n s p o r t o u t o f t h e E R . P r o t e i n d i s u l f i d e i s o m e r a s e , a n e n z y m e f o u n d i n t h e l u m e n o f the E R , c a t a l y z e s t h e f o r m a t i o n o f i n t e r m o l e c u l a r a n d i n t r a m o l e c u l a r d i s u l f i d e b o n d s ( F r e e d m a n , 1984) . F o l l o w i n g s i g n a l p e p t i d e c l e a v a g e , o x i d a t i o n o f c y s t e i n e r e s i d u e s o c c u r s a n d is u s u a l l y c r u c i a l f o r t h e a t t a i n m e n t o f a n a t i v e p r o t e i n c o n f i g u r a t i o n . S t u d i e s w i t h i n f l u e n z a v i r u s h e m a g g l u t i n i n ( H A ) a n d v e s i c u l a r s t o m a t i t i s v i r u s ( V S V ) G p r o t e i n sugges t that p r o t e i n f o l d i n g o c c u r s v e r y r a p i d l y i n t h e E R , w i t h i n o n e t o t h r e e m i n u t e s a f ter syn thes i s as m e a s u r e d b y e x p r e s s i o n o f a n t i b o d y r e c o g n i z e d e p i t o p e s ( C o p e l a n d et a l . , 1988; D o m s et a l . , 1988) . F o r m a n y v i r a l p r o t e i n s , a d d i t i o n o f N - l i n k e d c a r b o h y d r a t e is e s s e n t i a l f o r t h e a t t a i n m e n t o f a t e r t i a r y s t r u c t u r e c o n d u c i v e f o r t r a n s p o r t f r o m t h e E R ( F o r r e v i e w see O l d e n et a l . , 1982; R o s e a n d D o m s , 1988) . M o r e r e c e n t l y P i t t a 1 e t a l . ( 1989 ) h a v e s h o w n that a s i n g l e c h a n g e i n a m i n o a c i d s e q u e n c e i n t h e V S V G p r o t e i n c a n c o m p e n s a t e f o r a p r e v i o u s l y d e t e r m i n e d c a r b o h y d r a t e - s e n s i t i v e f o l d i n g s t e p ( M a c h a m e r et a l . , 1985; M a c h a m e r a n d R o s e , 1 9 8 8 b ) . -4-V e r y o f t e n b e f o r e p r o t e i n s a r e t r a n s p o r t e d f r o m t h e E R t o t h e G o l g i , t h e y m u s t a s s u m e s u i t a b l e q u a t e r n a r y s t r u c t u r e s w h i c h c a n c o n s i s t o f o n e o r m o r e s p e c i e s o f p r o t e i n ( F o r r e v i e w R o s e a n d D o m s , 1988) . F o r e x a m p l e , b o t h V S V G a n d i n f l u e n z a H A a r e k n o w n t o f o r m n o n c o v a l e n t l y a s s o c i a t e d t r i m e r s b e f o r e e x i t i n g t h e E R . T h i s p r o c e s s h a s b e e n s h o w n t o b e r e g u l a t e d b y A T P f o r H A at l eas t ( W i l s o n et a l . , 1981; D o m s et a l . , 1987) . A l p h a v i r u s g l y c o p r o t e i n s f o r m six m e m b e r h e t e r o t r i m e r i c s p i k e s ( E 2 - E 1 ) ^ p r i o r t o e x i t i n g t h e E R ( F u l l e r , 1987) . P r o t e i n s w h i c h f a i l t o exit t h e E R m a y b e r e t a i n e d i n t h e E R i n l a r g e i n s o l u b l e a g g r e g a t e s a s s o c i a t e d w i t h h e a v y c h a i n b i n d i n g p r o t e i n ( B i P ) w h i c h is t h o u g h t t o f u n c t i o n i n t h e E R b y r e c o g n i z i n g a n d r e t a i n i n g m i s f o l d e d p r o t e i n s ( B o l e et a l . , 1986; K o z u t s u m i et a l . , 1988; H u r t l e y et a l . , 1989) . P r o t e i n s d e s t i n e d f o r t h e p l a s m a m e m b r a n e o n l y c r o s s a m e m b r a n e b i l a y e r ( t h e E R ) o n c e w h e n t r a v e r s i n g t h e e x o c y t i c p a t h w a y w i t h a l l s u b s e q u e n t i n t e r a n d i n t r a - o r g a n e l l u l a r t r a n s p o r t b e i n g m e d i a t e d b y v e s i c u l a r c a r r i e r s ( J a m i e s o n a n d P a l a d e , 1967; P a l a d e , 1975) . T r a n s p o r t f r o m t h e E R t o t h e G o l g i o c c u r s b y b u d d i n g o f ve s i c l e s f r o m s p e c i a l i z e d a r e a s o f E R c a l l e d t r a n s i t i o n a l e l e m e n t s , a n d f u s i o n w i t h t h e c is G o l g i m e m b r a n e s . T h e G o l g i is o r g a n i z e d i n a p o l a r i z e d f a s h i o n w i t h p r o t e i n e n t r y o c c u r r i n g i n t h e c is c o m p a r t m e n t , p r o c e e d i n g t h r o u g h t h e m e d i a l c o m p a r t m e n t , a n d s o r t i n g a n d exit o c c u r r i n g t h r o u g h t h e t r a n s G o l g i n e t w o r k ( f o r r e v i e w see F a r q u h a r , 1985; P f e f f e r a n d R o t h m a n , 1987; F a r q u h a r , 1989) . T r a n s p o r t b e t w e e n t h e G o l g i s t a c k s is a l s o e f f e c t e d b y t r a n s p o r t ve s i c l e s w h i c h a r e d e r i v e d b y b u d d i n g a n d f u s i o n f r o m a n d t o t h e d i l a t e d r i m s o f t h e c i s t e r n a e . T h e s e v e s i c u l a r c a r r i e r s a r e c o a t e d w i t h a n o n - c l a t h r i n p r o t e i n c o m p o n e n t ( O r c i et a l . , 1986) , a n d t h e i r m o v e m e n t r e q u i r e s A T P , G T P - b i n d i n g p r o t e i n s , a n d a n N - e t h y l m a l e i m i d e - s e n s i t i v e f a c t o r f o r t h e f u s i o n p r o c e s s ( J a m i e s o n a n d P a l a d e , 1968; B a l c h et a l . , 1986; M e l a n c o n et a l . , 1987; M a l h o r t r a et a l . , 1988) . A s p r o t e i n s a r e t r a n s p o r t e d v e c t o r i a l l y a c r o s s t h e c i s - t r a n s axis t h e y e n c o u n t e r a g r a d u a l l y m o r e a c i d i c e n v i r o n m e n t ( M e l l m a n et a l . , 1986) . C u r r e n t l y it is b e l i e v e d that E R to G o l g i m o v e m e n t o f n e w l y s y n t h e s i z e d p r o t e i n s o c c u r s b y " b u l k flow", a n d t h a t d i f f e r e n t i a l r a t e s o f p r o t e i n t r a n s p o r t is t h e r e s u l t o f s e l e c t i v e r e t e n t i o n a n d d i f f e r e n c e s i n p r o t e i n f o l d i n g r a t e s ( P f e f f e r a n d R o t h m a n , 1987; W e i l a n d - 5 -et a l . , 1987; M u n r o a n d P e l h a m , 1987) . C o v a l e n t m o d i f i c a t i o n s o f t h e g l y c o p r o t e i n s D i s c u s s i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n m o d i f i c a t i o n w i l l b e l i m i t e d t o a l p h a v i r a l g l y c o p r o t e i n s b e c a u s e o f t h e i r s t r u c t u r a l s i m i l a r i t y t o R V g l y c o p r o t e i n s . R o l e o f c a r b o h y d r a t e A s w i t h o t h e r g l y c o p r o t e i n s s y n t h e s i z e d i n h i g h e r e u k a r y o t i c ce l l s , N - l i n k e d g l y c a n s o n a l p h a v i r u s p r o t e i n s a r e t r a n s f e r r e d e n b l o c as a p r e c u r s o r ( G l c ^ M a r i g G l c N A c 2 ) ( G l u c o s e ^ ( M a n n o s e ^ N - a c e t y l g l u c o s a m i n e ^ - to t h e c o n s e n s u s a c c e p t o r s e q u e n c e A s n - X - S e r / T h r , w h e r e X is a n y a m i n o a c i d e x c e p t p r o l i n e ( f o r r e v i e w see K o r n f e l d a n d K o r n f e l d , 1985; P a r e n t , 1988; R u n g e , 1988) . T h e G l c ^ M a n g G l c N A c 2 p r e c u r s o r is t r a n s f e r r e d f r o m a l i p i d c a r r i e r , d o l i c h o l d i p h o s p h a t e to t h e n a s c e n t p r o t e i n i n t h e l u m e n o f t h e E R d u r i n g t r a n s l o c a t i o n ( F i g . 2 ) . R e m o v a l o f t h e t e r m i n a l g l u c o s e r e s i d u e s a n d o n e o r m o r e m a n n o s e s b y E R g l u c o s i d a s e s a n d m a n n o s i d a s e s o c c u r s p r i o r t o e x i t i n g the E R . G l y c o p r o t e i n s a r e t r a n s p o r t e d f r o m t h e E R b y m e a n s o f v e s i c u l a r c a r r i e r s w h i c h b u d f r o m t h e t r a n s i t i o n a l E R a n d fuse w i t h t h e c i s G o l g i ( J a m i e s o n a n d P a l a d e , 1967; P a l a d e , 1975; L o d i s h , 1988) . P a s s a g e o f g l y c o p r o t e i n s t h r o u g h t h e m e d i a l G o l g i c i s t e r n a e is e a s i l y a s s a y e d b y m o n i t o r i n g s ens i t i v i ty t o e n d o - j i - N - a c e t y l g l u c o s a m i n i d a s e H ( e n d o H ) ( F i g . 2 ) . O l i g o s a c c h a r i d e s d e s t i n e d f o r c o n v e r s i o n t o c o m p l e x t y p e s b e c o m e e n d o H r e s i s t a n t s h o r t l y a f ter p r o c e s s i n g b y « ( - m a n n o s i d a s e II i n t h e m e d i a l G o l g i c o m p a r t m e n t ( D u n p h y a n d R o t h m a n , 1985) . A d d i t i o n o f t h e t e r m i n a l N - a c e t y l g l u c o s a m i n e a l s o o c c u r s i n m e d i a l G o l g i , w h i l e g a l a c t o s e a n d s i a l i c a c i d a r e a d d e d i n t h e t r a n s G o l g i . E x a m p l e s o f h i g h m a n n o s e a n d c o m p l e x s u g a r s f o u n d o n s o m e a l p h a v i r a l g l y c o p r o t e i n s a r e s h o w n i n F i g . 3 . G e n e r a l l y , c o m p l e x g l y c a n s a r e f o u n d c lo se s t to the a m i n o t e r m i n u s o f a p o l y p e p t i d e , m o s t l i k e l y d u e t o g r e a t e r a c c e s s o f th is e n d o f t h e p o l y p e p t i d e to t r i m m i n g a n d p r o c e s s i n g e n z y m e s b y v i r t u e o f l o c a t i o n ( P o l l a c k a n d A t k i n s o n , 1983) . H s i e h et a l . ( 1 9 8 3 ) s t u d i e d e n d o H r e s i s t a n c e o f g l y c o p r o t e i n s f r o m S V g r o w n i n a r i c i n - r e s i s t a n t C h i n e s e h a m s t e r o v a r y ( C H O ) c e l l l i n e 1 5 B -6 -F i g . 3.« P r o c e s s i n g o f A s n - l i n k e d o l i g o s a c c h a r i d e s t o a r e p r e s e n t a t i v e b i a n t e n n a r y c o m -p l e x s t r u c t u r e . T h e s c h e m e d e p i c t s the p r o c e s s i n g f r o m t h e t r a n s f e r o f G l c 3 M a n 9 G l c N A c 2 f r o m i t s d o l i c h o l p y r o p h o s p h o r y l d e r i v a t i v e to t h e n a s c e n t p o l y p e p t i d e c h a i n s t i l l b o u n d to t h e ribosome, f o l l o w e d b y p r o c e s s i n g r e a c t i o n s i n t h e E R a n d G o l g i c o m p l e x . O l i g o s a c -c h a r i d e p r o c e s s i n g e n z y m e s a r e l i s t e d a b o v e the l i n e ; t h e r e a c t i o n t h e y c a t a l y z e i s d i a g r a m e d b e l o w t h e l i n e ( e x c e p t f o r t h e a l t e r n a t e p r o c e s s i n g r e a c t i o n , 3 a ) . T h e s u b c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f p r o c e s s i n g e v e n t s a r e d e p i c t e d b y the b r a c k e t s . S t r u c t u r e s s u s c e p t i b l e o r r e s i s t a n t t o d i g e s t i o n b y e n d o H , a n e n z y m e f r e q u e n t l y u s e d as a d i a g n o s t i c tes t f o r p r o c e s s i n g to c o m p l e x s t r u c t u r e s , a r e i n d i c a t e d . S y m b o l s : Y , g l u c o s e ; O , m a n n o s e ; • , N - a c e t y l g l u c o -s a m i n e ; # , g a l a c t o s e ; • , f u c o s e ; • , s i a l i c a c i d . (f\o<c<ne»\ U n £ ToubVef \°v%S} S.A. S.A. c.2.3 Gal 01.4 GlcNAc PI.2 Man Man 01.4 GlcNAc 01.4 Fuc° 1 2 GlcNAc Gal 01.4 t GlcNAc 01.2 Man I Asn COMPLEX Man Man Man Man 01.4 GlcNAc 01.4 GlcNAc i Asn HIGH MANNOSE F i g u r e 3 . S t r u c t u r e o f t h e t w o m a j o r o l i g o s a c c h a r i d e s o n a l p h a v i r u s g l y c o p r o t e i n s . ( S A . ) s i a l i c a c i d ; ( G a l ) g a l a c t o s e ; ( M a n ) m a n n o s e ; ( G l c N A c ) N - a c e t y l g l u c o s a m i n e ; ( F u c ) f u c o s e ; ( A s n ) a s p a r a g i n e . ( S c h l e s i n g e r a n d S c h l e s i n g e r , 1986) -8 -which is deficient in N-acetylglucosaminyltransferase I, and is therefore unable to process oligomannose precursors to complex forms. Digestion of E l and E2 under non-denaturing conditions with endo H resulted in preferential cleavage at sites normally containing complex sugars. Resistance to d-mannosidase I, N-acetylglucosaminyltransferase I, and*-mannosidase II is likely due to steric hindrance (Hubbard, 1988). Host cell type is also known to be important in determining sugar structure of alphavirus glycoproteins (Keegstra et al., 1975; Hsieh et al., 1983a, Davidson and Hunt, 1983). Other factors such as stage of cell growth and nutritional environment may also influence sugar processing (Hakimi and Atkinson 1982; Davidson and Hunt, 1985). Two lines of study have been used to investigate the importance of carbohydrate in processing and function of alphavirus glycoproteins. Use of mutant host cell lines that process carbohydrates abnormally has given rise to mixed results regarding SFV and SV growth and infectivity. SV can grow in mosquito cells that do not process beyond Man^GlcNAc^ as well as in a CHO mutant cell line which stops at Man^Glcl^^, implying that terminal GlcNAc, galactose, or sialic acid are not essential for virus assembly and infectivity (Schlesinger et al., 1976; Hsieh and Robbins, 1984). However, enzymatic removal of carbohydrate from intact SFV virions results in non-infectious aggregates (Kennedy, 1974). Two additional examples include mutant mouse L cell lines, one that over sialylates glycoproteins, another that does not process beyond MangGlcNAc2, yet neither of which cleave p62 (Gottlieb et al., 1979; Tabas and Kornfeld, 1978). Use of agents that interfere with sugar processing is the second approach for studying the role of carbohydrate on glycoproteins. It is a widely held belief that some proteins require covalently bound glycans for correct tertiary structure. Tunicamycin completely inhibits N-linked glycosylation by blocking formation of GlcNAc-P-P-dolichol (Struck and Lennarz, 1980). Addition of GlcNAc to dolichol diphosphate is the first step in the biosynthesis of the Glc.jMangGlcNAc2 precursor. Tunicamycin inhibits SV and SFV virion formation and p62 cleavage even though the proteins are transported to the cell surface (Schwarz et al., 1976; -9-L e a v i t t et a l . , 1977; S c h e e f e r s et a l . , 1980; M a n n et a l . , 1983) . R e m o v a l o f g l u c o s e r e s i d u e s f r o m g l y c o p r o t e i n s s e e m s t o b e e s s e n t i a l f o r v i r u s a s s e m b l y s i n c e 1 - d e o x y n o j i r i m y c i n , c a s t a n o s p e r m i n e , a n d b r o m o c o n d u r i t o l w h i c h i n h i b i t E R g l u c o s i d a s e s , c a n a l l b l o c k r e p l i c a t i o n o f S V ( D a t e m a et a l . , 1984; S c h l e s i n g e r et a l . , 1985) . I n t e r e s t i n g l y , t h e e f fects o f d e o x y n o j i r i m y c i n a n d c a s t a n o s p e r m i n e a r e m o r e s e v e r e at 3 7 ° C t h a n at 3 0 ° C s u g g e s t i n g t h a t t h e t h e r m o s t a b i l i t y o f t h e p r o t e i n s is d e c r e a s e d ( S c h l e s i n g e r et a l . , 1985) . M o r e r e c e n t l y M c D o w e l l et a l . ( 1987 ) r e p o r t e d a s w i t c h f r o m b u d d i n g at t h e p l a s m a m e m b r a n e t o i n t e r n a l m e m b r a n e s i n S V - i n f e c t e d ce l l s t r e a t e d w i t h 1 - d e o x y m a n n o j i r i m y c i n ( d M M ) . T h i s m a n n o s e a n a l o g i n h i b i t s G o l g i m a n n o s i d a s e I a n d r e s u l t s i n g l y c o p r o t e i n s c a r r y i n g M a r i g G l c N A c 2 s t r u c t u r e s ( F u h r m a n n et a l . , 1984; B i s h c o f f a n d K o r n f e l d , 1984) . C l e a v a g e o f p 6 2 is n o t a f f e c t e d b y d M M , s u p p o r t i n g t h e n o t i o n that g l u c o s y l a t e d S V p r o t e i n s a r e n o t a s u b s t r a t e f o r the e n z y m e t h a t p r o c e s s e s p 6 2 ( M c D o w e l l et a l . , 1987; S c h l e s i n g e r et a l . , 1985) . F i n a l l y , N - l i n k e d s u g a r s a r e t h o u g h t to f u n c t i o n b y a i d i n g g l y c o p r o t e i n s i n a t t a i n i n g a n d m a i n t a i n i n g c o r r e c t t e r t i a r y s t r u c t u r e , a n d t h e i r i m p o r t a n c e v a r i e s w i t h t h e p a r t i c u l a r g l y c o p r o t e i n i n q u e s t i o n . A c y l a t i o n M a t u r e E 2 a n d E l i n a l p h a v i r u s e s c o n t a i n c o v a l e n t l y b o u n d fa t ty a c i d m o i e t i e s i n t h e f o r m o f p a l m i t i c a c i d ( S c h m i d t et a l . , 1979; S c h m i d t , 1982) . A t t a c h m e n t is t h o u g h t t o i n v o l v e fa t ty a c y l - C o A t r a n s f e r a s e m e d i a t e d t r a n s f e r o f t h e l o n g c h a i n fa t ty a c i d s t o c y s t e i n e s i n t h e c a r b o x y - t e r m i n a l r e g i o n o f E 2 a n d E l ( B e r g e r a n d S c h m i d t , 1984) , a n d l i k e l y o c c u r s i n t h e E R ( B e r g e r a n d S c h m i d t , 1985; R o s e a n d D o m s , 1989) , o r i n p o s t - E R / p r e - G o l g i s t r u c t u r e s ; ( B o n a t t i et a l . , 1989) . I n a n y event , p a l m i t o y l a t i o n s e e m s to p r e c e d e o l i g o s a c c h a r i d e t r i m m i n g b y m a n n o s i d a s e I w h i c h is b e l i e v e d t o b e a c is G o l g i e n z y m e ( B o n a t t i et a l . , 1989) . L a c k o f a c y l a t i o n d o e s n o t af fect i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t o f t h e g l y c o p r o t e i n s , b u t s e e m s t o i n t e r f e r e w i t h t h e final s tages o f v i r u s a s s e m b l y p o s s i b l y b y f o r m a t i o n o f a b e r r a n t i n t e r m o l e c u l a r d i s u l f i d e b o n d s ( S c h l e s i n g e r a n d M a l f e r , 1982) . C o v a l e n t l y - l i n k e d o l i g o m e r i c a g g r e g a t e s o f S V g l y c o p r o t e i n s f o r m af ter t r e a t m e n t o f v i r i o n s w i t h h y d r o x y l a m i n e w h i c h r e m o v e s fa t ty a c i d -10-m o i e t i e s ( M a g e e et a l . , 1984) . O n e o t h e r p o s s i b l e f u n c t i o n o f a c y l a t i o n c o u l d b e t o m o d u l a t e t h e l i p i d c o m p o n e n t s i n t h e i m m e d i a t e v i c i n i t y o f t h e e m b e d d e d v i r a l g l y c o p r o t e i n s ( S c h l e s i n g e r a n d S c h l e s i n g e r , 1986) . A l p h a v i r u s S t r u c t u r e A l p h a v i r u s e s c o m p r i s e a g e n u s o f s m a l l e n v e l o p e d R N A v i r u s e s i n t h e f a m i l y T o g a v i r i d a e . T h e p r o t o t y p e v i r u s e s o f th is g e n u s a r e S e m l i k i F o r e s t v i r u s ( S F V ) a n d S i n d b i s v i r u s ( S V ) . V i r i o n p a r t i c l e s a r e s p h e r i c a l a n d a p p r o x i m a t e l y 65 -70 n m i n d i a m e t e r w i t h 6 -10 n m g l y c o p r o t e i n s p i k e s p r o t r u d i n g f r o m t h e s u r f a c e ( G a r o f f et a l . , 1982) . T h e i r g e n o m e s c o n s i s t o f a m o l e c u l e o f p o s i t i v e - p o l a r i t y s i n g l e - s t r a n d e d R N A 11,200 nt ( S F V ) to 11 ,700 n t ( S V ) i n l e n g t h ( G a r o f f et a l . , 1982) . T h e g e n o m i c R N A is p o l y a d e n y l a t e d a n d c o n t a i n s a m e t h y l a t e d 5' c a p ( D u b i n et a l . , 1977; E a t o n et a l . , 1972) . T h r e e m a j o r s t r u c t u r a l p r o t e i n s c a p s i d ( C ) , a n d e n v e l o p e g l y c o p r o t e i n s E 2 a n d E l a r e f o u n d i n e q u i m o l a r a m o u n t s i n v i r i o n s . I n S F V a n a d d i t i o n a l p r o t e i n E 3 f o r m s t h e g l y c o p r o t e i n s p i k e w i t h E l a n d E 2 , w h i l e i n S V , E 3 is r e l e a s e d i n t o t h e e x t r a c e l l u l a r s p a c e ( G a r o f f et a l . , 1974; W e l c h a n d S e f t o n , 1979) . G e n o m e o r g a n i z a t i o n A l p h a v i r u s e s a r e a r r a n g e d i n a m a n n e r s u c h that t h e 5' t w o t h i r d s o f t h e g e n o m e e n c o d e t h e n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s ( S t r a u s s et a l . , 1984) a n d the 3' o n e t h i r d c o n t a i n s g e n e s s p e c i f y i n g t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s ( G a r o f f et a l . , 1980a , b ; R i c e a n d S t r a u s s , 1 9 8 1 ) ( F i g . 4 ) . T h e g e n o m i c R N A s e r v e s d i r e c t l y as a m R N A f o r t r a n s l a t i o n o f t h e n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s w h i c h a r e s y n t h e s i z e d as p o l y p r o t e i n p r e c u r s o r s ( S t r a u s s et a l . , 1984) . T h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s a r e t r a n s l a t e d as a 130 ,000 d a l t o n p r e c u r s o r f r o m a 2 6 S s u b g e n o m i c R N A c o r r e s p o n d i n g to t h e 3' o n e t h i r d o f t h e v i r a l g e n o m e ( S i m m o n s a n d S t r a u s s , 1974; G a r o f f et a l . , 1974) . T h e s u b g e n o m i c R N A is p r e s e n t i n a t h r e e - f o l d m o l a r excess o v e r t h e g e n o m i c R N A a l l o w i n g f o r a m p l i f i c a t i o n o f t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s ( G a r o f f et a l . , 1983) . I n a d d i t i o n , t h e g e n o m i c R N A is q u i c k l y i n c o r p o r a t e d i n t o n u c l e o c a p s i d s r e n d e r i n g it u n a b l e to f u n c t i o n as a m R N A ( G a r o f f et a l . , 1983) . - 1 1 -n s P l - 0 - n s P g n s P 3 5403a? 807aa? " 549aa? ^ P R O T E O L T T I C P R O C E S S I N G 0230 B E A D T M H O U G M T R A N S L A T I O N NONSTRUCTURAL P R O T E I N S H — : " I ( T R A N S L A T I O N | 0130 o r t s 2 PROTEIN 1245aa 1 J .VIBAL P R O T E A S E ? 1 C A P S I D .. 098 o r 6 PROTEIN 1 3' eoiy Mi GENOME RNA (11. 7 0 3 n t ) POIY (AI 2BS RNA ( 4 1 0 6 n t ) V I R I O N . P R O T E I N S 6 4 a a p62 o r PES 487aa S5aa G O L G I P R O T E A S E ? lE3 E l 439aa AZ3aa F i g u r e 4. E x p r e s s i o n s t r a t e g y o f t h e S i n d b i s v i r u s g e n o m e . U n t r a n s l a t e d r e g i o n s o f t h e g e n o m i c R N A a r e s h o w n as s i n g l e l i n e s a n d t h e t r a n s l a t e d r e g i o n s as a n a r r o w o p e n t r i a n g l e . T h e s u b g e n o m i c R N A w h i c h e n c o d e s t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s is s h o w n b e l o w i n a n e x p a n d e d f o r m a t . T h e f i n a l p r o t e i n s p r o d u c t s a r e s h o w n as b o l d l ine s . (A) I n i t i a t i o n c o d o n s ; (+) t e r m i n a t i o n c o d o n s ; (0) U G A c o d o n r e a d t h r o u g h to p r o d u c e n s P 4 . ( S t r a u s s et a l , 1984) . -12-B e t w e e n t h e n o n s t r u c t u r a l g e n e s a n d s t r u c t u r a l g e n e s is a s t r e t c h o f n u c l e o t i d e s t e r m e d t h e j u n c t i o n r e g i o n ( O u et a l . , 1982; R i e d e l et a l . , 1982) . I n th i s r e g i o n t h e r e a r e t h r e e c l o s e l y s p a c e d t e r m i n a t i o n c o d o n s p r e c e d i n g t h e o p e n r e a d i n g f r a m e o f t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s as w e l l as p r o p o s e d s i g n a l s f o r t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n f o r t h e 2 6 S R N A . H e n c e t h e a l p h a v i r u s g e n o m e s a r e o r g a n i z e d s u c h t h a t t h e n o n s t r u c t u r a l g e n e s m u s t b e 5' t e r m i n a l , a l l o w i n g t h e i r t r a n s c r i p t i o n a n d t r a n s l a t i o n b e f o r e s y n t h e s i s o f a n e g a t i v e p o l a r i t y g e n o m i c R N A , t h e n 2 6 S m R N A a n d s u b s e q u e n t e x p r e s s i o n o f t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s . N o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s E a r l y s t u d i e s w i t h a l p h a v i r u s - i n f e c t e d ce l l s s u g g e s t e d t h e e x i s t e n c e o f f o u r n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s ( L a c h m i a n d K a a r i a i n e n , 1976: B r z e s k i a n d K e n n e d y , 1977) . T h e s e p r o t e i n s a c t i n g i n c o n c e r t o r i n d e p e n d e n t l y m u s t f u n c t i o n to s y n t h e s i z e m i n u s - s t r a n d g e n o m i c R N A , a n d f r o m th i s t e m p l a t e t r a n s c r i b e 2 6 S s u b g e n o m i c R N A a n d p l u s - s t r a n d g e n o m i c R N A i n t h e a p p r o p r i a t e q u a n t i t i e s . T e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e m u t a n t s o f a l p h a v i r u s e s a r e c l a s s i f i e d as R N A + o r R N A m u t a n t s a c c o r d i n g to t h e i r a b i l i t y to s y n t h e s i z e R N A at t h e n o n p e r m i s s i v e t e m p e r a t u r e . R N A m u t a n t s c a n b e f u r t h e r s u b d i v i d e d i n t o f o u r c o m p l e m e n t a t i o n g r o u p s , t h u s l e n d i n g f u r t h e r s u p p o r t f o r t h e p r e s e n c e o f at l eas t f o u r n o n s t r u c t u r a l g e n e s ( S t r a u s s a n d S t r a u s s , 1986) . N u c l e o t i d e s e q u e n c e a n a l y s i s o f S V a n d S F V R N A s c o n f i r m e d t h a t f o u r g e n e s e n c o d e t h e n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s i n t h e o r d e r N H 2 - n s P l - n s P 2 - n s P 3 - n s P 4 - C O O H ( S t r a u s s et a l . , 1984; T a k k i n e n , 1 9 8 6 ) . T r a n s l a t i o n b e g i n s at a n A U G c o d o n 60 -80 n u c l e o t i d e s 5' t o t h e c a p s i te ( O u et a l . , 1983) . T h e n o n s t r u c t u r a l a n t i g e n s a r e s y n t h e s i z e d as t w o l a r g e p o l y p r o t e i n p r e c u r s o r s ( F i g . 4 ) . I n S V - i n f e c t e d ce l l s , a 2 3 0 K p o l y p r o t e i n P 1 2 3 , s p e c i f y i n g N H 2 - n s P l - n s P 2 - n s P 3 - C O O H a n d a 2 7 0 K P 1 2 3 4 , c o n t a i n i n g N H 2 - n s P l - n s P 2 - n s P 3 - n s P 4 - C O O H a r e t r a n s l a t e d a n d t h e n c l e a v e d t o g ive r i s e t o t h e n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s ( S t r a u s s a n d S t r a u s s , 1986) . T h e 2 7 0 K p r o t e i n is m a d e i n r e l a t i v e l y m i n o r a m o u n t s b y r e a d t h r o u g h t r a n s l a t i o n o f a n o p a l c o d o n ( U G A ) b e t w e e n n s P 3 a n d n s P 4 ( S t r a u s s et a l . , 1984) . O t h e r c h a r a c t e r i z e d a l p h a v i r u s e s c o n t a i n i n - f r a m e o p a l c o d o n s i n th i s r e g i o n as w e l l , r e s u l t i n g i n e x t r e m e l y l o w c o n c e n t r a t i o n s o f n s P 4 ( 7 2 K ) r e l a t i v e to n s P l ( 6 0 K ) , -13 -n s P 2 ( 8 9 K ) , a n d n s P 3 ( 7 6 K ) ( S t r a u s s et a l . , 1983) . I n c o n t r a s t , S F V d o e s n o t c o n t a i n s u c h a n o p a l c o d o n , a n d i n f e c t e d c e l l s s u b s e q u e n t l y p r o d u c e l a r g e r a m o u n t s o f n s P 4 ( T a k k i n e n , 1986; K e r a n e n a n d R u o h o n e n , 1983) . P r e s e n t l y it is u n c e r t a i n as t o t h e m e c h a n i s m o f t r a n s l a t i o n a l r e a d t h r o u g h o f t h e o p a l c o d o n i n S V , b u t it is s u s p e c t e d that n a t u r a l l y o c c u r r i n g o p a l s u p p r e s s o r t r a n s f e r R N A s m a y b e i n v o l v e d ( S t r a u s s a n d S t r a u s s , 1986) . P r o c e s s i n g o f S V n o n s t r u c t u r a l p o l y p r o t e i n s i n i n f e c t e d B H K - 2 1 c e l l s i n d i c a t e s t h a t i n t h e P 1 2 3 p r e c u r s o r , c l e a v a g e b e t w e e n n s P 2 a n d n s P 3 o c c u r s b e f o r e c l e a v a g e b e t w e e n n s P l a n d n s P 2 ( H a r d y a n d S t r a u s s , 1988) . P r o t e o l y t i c p r o c e s s i n g o f n s P 3 a n d n s P 4 s e e m s t o o c c u r las t . A v i r a l e n c o d e d p r o t e a s e c o n t a i n e d i n n s P l , 2 o r 3 is t h o u g h t to b e r e s p o n s i b l e f o r p r o c e s s i n g t h e n o n s t r u c t u r a l p o l y p r o t e i n s ( S t r a u s s et a l . , 1984) . K i n e t i c s o f S V n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n p r o c e s s i n g is r e l a t i v e l y s l o w c o m p a r e d t o t h e S F V c o u n t e r p a r t s ( K e r a n e n a n d R u o h o n e n , 1983) . T h e t a s k o f a s s i g n i n g d i s c r e t e f u n c t i o n a l r o l e s f o r t h e a l p h a v i r u s n o n s t r u c t u r a l a n t i g e n s is n o t c o m p l e t e d e s p i t e t h e w e a l t h o f i n f o r m a t i o n a v a i l a b l e r e g a r d i n g t h e i r s e q u e n c e a n d p r o c e s s i n g . A m o n g a l p h a v i r u s e s , n s P 4 is h i g h l y c o n s e r v e d a n d s h a r e s h o m o l o g y w i t h R N A - d e p e n d e n t R N A r e p l i c a s e o f p o l i o v i r u s a n d n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s o f o t h e r p o s i t i v e - s t r a n d a n i m a l a n d p l a n t v i r u s e s ( K a m e r a n d A r g o s , 1984; S t r a u s s a n d S t r a u s s , 1986) l e a d i n g t o t h e s u p p o s i t i o n t h a t it p o s s e s s e s t h e e l o n g a t i o n a c t i v i t y o f the R N A p o l y m e r a s e c o m p l e x . T h i s t h e o r y is s u p p o r t e d b y t h e e x i s t e n c e o f R N A t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e m u t a n t s w h i c h m a p t o n s P 4 ( H a h n et a l . , 1 9 8 9 a ) . T h i s g r o u p a l s o r e p o r t s that n s P 2 a n d n s P 4 m a y i n t e r a c t t o f o r m a f u n c t i o n a l c o m p l e x . I n S F V - i n f e c t e d ce l l s , n s P 3 is a p h o s p h o p r o t e i n f o u n d a s s o c i a t e d w i t h c y t o p l a s m i c v e s i c l e s w h i c h a r e t h o u g h t to b e the s i tes o f v i r u s - s p e c i f i c R N A s y n t h e s i s ( P e r a n e n et a l . , 1988) . It h a s a l s o b e e n s u g g e s t e d that n s P 3 m a y b e t h e v i r a l p r o t e a s e ( S t r a u s s a n d S t r a u s s , 1986) . B r z e s k i a n d K e n n e d y (1978) sugges t that n s P 2 is r e s p o n s i b l e f o r i n i t i a t i o n o f 2 6 S R N A t r a n s c r i p t i o n , a n d th i s h a s n o w b e e n c o n f i r m e d b y m a p p i n g R N A ts m u t a n t s ( H a h n et a l . , 1 9 8 9 b ) . T h e l a t t e r g r o u p r e p o r t s that n s P 2 a l s o s e r v e s as t h e v i r a l p r o t e a s e , a n d t h u s t h e f u n c t i o n o f n s P 3 r e m a i n s u n k n o w n . N o l a b o r a t o r i e s h a v e b e e n s u c c e s s f u l i n p u r i f y i n g a n a c t i v e r e p l i c a s e c o m p l e x f r o m a l p h a v i r u s i n f e c t e d ce l l s , b u t i n t h e p u r e s t p r e p a r a t i o n s s o f a r , n s P l s e e m s t o b e -14-t h e m a j o r c o m p o n e n t , w h i l e n s P 2 a n d n s P 4 a r e m i n o r o n e s ( G o m a b a t o s et a l . , 1980; R a n k i a n d K a a r i a i n e n , 1979) . M u t a t i o n s i n a n y f o u r o f t h e n o n s t r u c t u r a l g e n e s c a n l e a d t o R N A ( m u t a n t s i n d i c a t i n g that a l l f o u r p r o t e i n s a r e i n v o l v e d i n R N A s y n t h e s i s ( H a h n et a l . , 1 9 8 9 b ) . R N A s y n t h e s i s a n d r e p l i c a t i o n T h e g e n o m i c R N A is f irst t r a n s l a t e d to g ive r i s e to t h e n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s w h i c h m u s t f u n c t i o n as a r e p l i c a s e / t r a n s c r i p t i o n c o m p l e x . A c o n s e r v e d 19 n u c l e o t i d e s e q u e n c e i m m e d i a t e l y 5' t o t h e p o l y A t r a c t i n g e n o m i c R N A is b e l i e v e d to b e o n e c o n t r o l e l e m e n t r e s p o n s i b l e f o r i n i t i a t i o n o f g e n o m i c n e g a t i v e - s t r a n d R N A ( O u et a l . , 1982a , b , 1983) . A t l ea s t o n e o t h e r c o n t r o l l i n g m o t i f is n e e d e d i n l i ght o f the fact t h a t n o n e g a t i v e - s t r a n d s u b g e n o m i c R N A is d e t e c t e d i n i n f e c t e d ce l l s . S i n c e t h e 2 6 S s u b g e n o m i c R N A is p r e c i s e l y c o t e r m i n a l w i t h t h e g e n o m i c R N A ( O u et a l . , 1981) it s e e m s l i k e l y that t h e s e c o n d c o n t r o l l i n g e l e m e n t f o r i n i t i a t i o n o f g e n o m e - l e n g t h m i n u s - s t r a n d R N A c o u l d b e i n t h e 5' e n d o f t h e p l u s - s t r a n d R N A , a n d m a y b e b r o u g h t i n t o p l a y b y c y c l i z a t i o n o f t h e m o l e c u l e ( S t r a u s s a n d S t r a u s s , 1986) . I n d e e d t h e r e is a 5 1 n u c l e o t i d e c o n s e r v e d e l e m e n t i n a l p h a v i r u s e s l o c a t e d 150 n u c l e o t i d e s f r o m t h e 5' e n d of, t h e g e n o m e ( S t r a u s s a n d S t r a u s s , 1986) . B y v i r t u e o f its l e n g t h , t h e 5 1 n u c l e o t i d e m o t i f h a d b e e n s u g g e s t e d t o h a v e o t h e r f u n c t i o n s s u c h as s e r v i n g as a n u c l e a t i o n s i te f o r e n c a p s i d a t i o n . H o w e v e r , l a t e r e v i d e n c e o b t a i n e d b y s e q u e n c i n g R N A f r o m d e f e c t i v e i n t e r f e r i n g p a r t i c l e s , r e v e a l e d t h e 51 n u c l e o t i d e s e q u e n c e c o u l d b e r e p l a c e d b y t R N A a S * > ( L e v i s et a l . , 1986 ) , a n d w a s t h e r e f o r e n o t e s s e n t i a l f o r r e p l i c a t i o n o r e n c a p s i d a t i o n . T h e a u t h o r s c o n c l u d e d t h a t t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f the 5' e n d o f t h e g e n o m e r a t h e r t h a n t h e p r i m a r y s e q u e n c e , w a s i m p o r t a n t f o r t h e s e f u n c t i o n s . T h e h i g h l y c o n s e r v e d 21 n u c l e o t i d e j u n c t i o n r e g i o n b e t w e e n t h e n o n s t r u c t u r a l g e n e s a n d t h e s t r u c t u r a l g e n e s is p o s t u l a t e d to b e t h e c o n t r o l l i n g e l e m e n t w h i c h m o d u l a t e s 2 6 S R N A i n i t i a t i o n ( O u et a l . , 1982a) . F o r t r a n s c r i b i n g p l u s - s t r a n d R N A , a c o n s e r v e d s e q u e n c e at t h e 3 ' e n d o f t h e m i n u s - s t r a n d R N A w h i c h f o r m s a s t e m a n d l o o p s t r u c t u r e is t h o u g h t t o b e i n v o l v e d ( S t r a u s s a n d S t r a u s s , 1983) . -15 -C a p p i n g a c t i v i t y c a n b e s e p a r a t e d f r o m t h e t r a n s c r i p t i o n a c t i v i t y o f t h e r e p l i c a t i o n c o m p l e x , a n d w a s f o u n d t o o c c u r a f ter i n i t i a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n ( C r o s s a n d G o m b a t o s , 1981) . T h e p o l y A t r a c t o f t h e g e n o m i c a n d s u b g e n o m i c R N A is a d d e d b y c o p y i n g a p o l y U t r a c t l o c a t e d i n t h e 5' t e r m i n u s o f t h e m i n u s s t r a n d ( O u et a l . , 1981) . T h e r e a r e t h r e e p o s s i b l e fa tes f o r t h e v i r a l g e n o m e i n t h e h o s t c e l l c y t o p l a s m ; 1) b i n d i n g t o r i b o s o m e s a n d e n g a g i n g i n s y n t h e s i s o f m o r e n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s ; 2 ) b i n d i n g t o a r e p l i c a t i o n c o m p l e x a n d t r a n s c r i p t i o n o f a d d i t i o n a l m i n u s - s t r a n d R N A ; 3 ) f o r m a t i o n o f n u c l e o c a p s i d s b y c o m p l e x i n g w i t h c a p s i d p r o t e i n . C a p s i d p r o t e i n is t h o u g h t t o p l a y a r o l e i n r e g u l a t i n g t h e p a t h w a y s o f t h e g e n o m i c R N A b y s e q u e s t e r i n g it f r o m fates 1 a n d 2 ( s ee F i g . 5 ) . S t r u c t u r a l p r o t e i n e x p r e s s i o n a n d p r o c e s s i n g T r a n s l a t i o n o f 2 6 S m R N A S t r u c t u r a l p r o t e i n s o f a l p h a v i r u s e s a r e d e r i v e d b y p o s t - t r a n s l a t i o n a l p r o c e s s i n g o f a p o l y p r o t e i n p r e c u r s o r s p e c i f i e d b y the s u b g e n o m i c 2 6 S m R N A ( W i r t h et a l . , 1971) . U s e o f a s e p a r a t e R N A s p e c i e s f o r s y n t h e s i s o f s t r u c t u r a l a n t i g e n s a l l o w s f o r a m p l i f i c a t i o n o f t h e s e p r o d u c t s . I n i n f e c t e d ce l l s , g r e a t e r t h a n 9 0 % o f t h e v i r u s - s p e c i f i c R N A c o m p l e x e d i n p o l y s o m e s is 2 6 S , e v e n t h o u g h the s u b g e n o m i c R N A is p r o d u c e d i n o n l y a t h r e e f o l d m o l a r exces s t o t h e g e n o m i c R N A ( S t r a u s s a n d S t r a u s s , 1977; S c h l e s i n g e r a n d K a a r i a i n e n , 1980) . T r a n s l a t i o n o f t h e 2 6 S m R N A b e g i n s at a n A U G c o d o n s p e c i f y i n g t h e a m i n o - t e r m i n a l m e t h i o n i n e i n c a p s i d p r o t e i n ( C a n c e d d a et a l . , 1974) a n d p r o c e e d s N H 2 " C - p 6 2 - E l - C O O H ( L a c h m i et a l . , 1975; C l e g g , 1975) . N u c l e o t i d e s e q u e n c e a n a l y s i s o f t h e 2 6 S m R N A r e v e a l e d s m a l l p e p t i d e s E 3 a n d a 6 K p e p t i d e w h i c h a r e l o c a t e d a m i n o - t e r m i n a l to E 2 i n t h e p 6 2 p r e c u r s o r a n d b e t w e e n p 6 2 a n d E l r e s p e c t i v e l y ( G a r o f f et a l . , 1980a , b ) ( F i g . 4 ) . C a p s i d is r e l e a s e d f r o m t h e p o l y p r o t e i n p l 3 0 b y a n a u t o p r o t e o l y t i c c l e a v a g e b e t w e e n t h e c a r b o x y - t e r m i n a l t r y p t o p h a n o f c a p s i d a n d t h e a m i n o - t e r m i n a l s e r i n e o f E 3 ( S i m m o n s a n d S t r a u s s , 1974; A l i p e r t i a n d S c h l e s i n g e r , 1978; G a r o f f et a l . , 1 9 8 0 b ) . T h e N - t e r m i n a l s i g n a l s e q u e n c e f o r p 6 2 is c o n t a i n e d i n E 3 a n d is e x p o s e d u p o n r e l e a s e o f c a p s i d f r o m the p o l y p r o t e i n , a l l o w i n g it t o d i r e c t t r a n s l o c a t i o n o f p 6 2 -16-( + ) 49 S - polysome (2)J (1) Non-Structural proteins (-) 49 S R N A (3) (+)49 S R N A o r (+)26 S R N A (7 ) N Nucleocapsids Structural Proteins F i g u r e 5. A l t e r n a t i v e p a t h w a y s f o r R N A t r a n s c r i p t i o n a n d r e p l i c a t i o n i n S i n d b i s v i r u s . G e n o m e p l u s - s t r a n d 4 9 S b i n d s to p o l y s o m e s , a n d n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s a r e t r a n s l a t e d (1), w h i c h i n t u r n p r o d u c e f u l l - l e n g t h m i n u s - s t r a n d 4 9 S R N A (2 ) . T h e n e g a t i v e - s t r a n d s e r v e s as a t e m p l a t e f o r p r o d u c t i o n o f p l u s - s t r a n d g e n o m i c R N A (3) a n d 2 6 S s u b g e n o m i c R N A (5) . T h e n a s c e n t g e n o m i c p l u s - s t r a n d R N A c a n b i n d c a p s i d to f o r m n u c l e o c a p s i d s (4) , b i n d p o l y s o m e s to p r o d u c e m o r e n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s (4"), o r s e r v e as t e m p l a t e f o r m i n u s - s t r a n d synthes i s (4') . T h e s u b g e n o m i c R N A s e r v e s as a m R N A f o r syn thes i s o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s (6) . C a p s i d c o m b i n e s w i t h g e n o m i c R N A to f o r m n u c l e o c a p s i d s (7 ) . ( S c h l e s i n g e r , 1985) - 1 7 -i n t o t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( E R ) ( W i r t h et a l . , 1978; G a r o f f et a l . , 1978; B o n a t t i et a l . , 1979) ) . T h e 6 K p e p t i d e l o c a t e d b e t w e e n E 2 a n d E l f u n c t i o n s as a s i g n a l p e p t i d e r e i n i t i a t i n g t r a n s l o c a t i o n o f E l i n t o t h e E R ( H a s h i m o t o et a l . , 1981; M e l a n c o n a n d G a r o f f , 1986) . T a r g e t i n g a n d t r a n s p o r t o f t h e g l y c o p r o t e i n s w i l l b e d i s c u s s e d i n m o r e d e t a i l b e l o w . C a p s i d p r o t e i n T h e c a p s i d o r C p r o t e i n o f t h e p r o t o t y p e a l p h a v i r u s e s is 264 t o 2 6 7 a m i n o a c i d s l o n g i n S V a n d S F V r e s p e c t i v e l y ( R i c e a n d S t r a u s s , 1981; G a r o f f et a l . , 1 9 8 0 a ) . I n t h e a m i n o - t e r m i n a l o n e t h i r d o f t h e p r o t e i n a r e c l u s t e r s o f a r g i n i n e s a n d p r o l i n e s w h i c h a r e t h o u g h t t o p a r t i c i p a t e i n b i n d i n g g e n o m i c R N A d u r i n g n u c l e o c a p s i d a s s e m b l y ( G a r o f f et a l . , 1 9 8 0 a ) . U n l i k e t h e , a m i n o - t e r m i n a l p a r t o f c a p s i d , t h e c a r b o x y l e n d o f the m o l e c u l e is h i g h l y c o n s e r v e d a m o n g a l p h a v i r u s e s a n d l i k e l y p o s s e s s e s d o m a i n s n e c e s s a r y f o r p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s a n d s p i k e c o m p l e x a t t a c h m e n t d u r i n g v i r a l a s s e m b l y ( G a r o f f et a l . , 1982) . I n a d d i t i o n , t h e a u t o c a t a l y t i c m o t i f o f c a p s i d that r e l e a s e s it f r o m p l 3 0 is a s e r i n e p r o t e a s e ( H a h n et a l . , 1 9 8 5 ) r e s i d i n g i n t h e c a r b o x y - t e r m i n a l r e g i o n o f the p r o t e i n . I n v i t r o m u t a g e n e s i s o f S F V 2 6 S c D N A h a s l o c a l i z e d t h e a c t i v e s i te o f t h e c a p s i d a u t o p r o t e a s e to s e r i n e - 2 1 9 ( M e l a n c o n a n d G a r o f f , 1987) . C a p s i d b i n d s v e r y r a p i d l y (5-7 m i n u t e s ) a f t er s y n t h e s i s t o g e n o m i c R N A a n d a s s e m b l e s i n t o a n i c o s a h e d r a l n u c l e o c a p s i d c o n t a i n i n g 180 c o p i e s o f C ( S o d e r l u n d , 1973; F u l l e r , 1987) . T h i s is t h e f irst s t ep i n v i r i o n a s s e m b l y a n d o c c u r s i n the c y t o p l a s m o f i n f e c t e d ce l l s . p 6 2 / E 2 g l y c o p r o t e i n T h e p 6 2 o r P E 2 g l y c o p r o t e i n is 488 a m i n o a c i d s i n S F V a n d 4 8 7 i n S V ( G a r o f f et a l . , 1 9 8 0 b ; R i c e a n d S t r a u s s , 1981) . A s t h e l a t t er n a m e P E 2 sugges t s , p 6 2 is a p r e c u r s o r t o t h e E 2 g l y c o p r o t e i n . T h e a m i n o - t e r m i n a l r e g i o n c o n t a i n s t h e E 3 p r o t e i n (64 -66 a m i n o a c i d s ) w h i c h i n c l u d e s t h e s i g n a l p e p t i d e f o r t h e E 3 - E 2 p r e c u r s o r . B i o c h e m i c a l s t u d i e s r e v e a l e d that t h e a m i n o - t e r m i n u s o f E 3 is a c e t y l a t e d ( B e l l et a l . , 1982) . T r a n s l o c a t i o n o f p 6 2 a c r o s s t h e E R m e m b r a n e is d e p e n d e n t u p o n s i g n a l r e c o g n i t i o n p a r t i c l e ( S R P ) ( G a r o f f et a l . , 1978; B o n a t t i et a l . , - 18 -1984) as is t h e c a s e w i t h m a n y s e c r e t o r y a n d m e m b r a n e p r o t e i n s . H o w e v e r , t h i s p r e c u r s o r is u n u s u a l i n t h e s e n s e that c l e a v a g e b y s i g n a l p e p t i d a s e d o e s n o t o c c u r ( B o n a t t i et a l . , 1979) . A s w e l l , t h e s i g n a l p e p t i d e r e g i o n b e c o m e s g l y c o s y l a t e d at a s p a r a g i n e 13 ( S F V ) o r 14 ( S V ) ( B e l l et a l . , 1982) . O n e i n t r i g u i n g d i f f e r e n c e b e t w e e n S V a n d S F V is t h a t E 3 is r e t a i n e d i n t h e g l y c o p r o t e i n s p i k e o f S F V , b u t is s e c r e t e d i n t o t h e m e d i u m o f S V - i n f e c t e d c e l l s ( G a r o f f et a l . , 1974; W e l c h a n d S e f t o n , 1979) . E 2 g l y c o p r o t e i n is 4 2 2 a m i n o a c i d s l o n g i n S F V a n d 4 2 3 i n S V ( G a r o f f et a l . , 1 9 8 0 b ; R i c e a n d S t r a u s s , 1 9 8 1 ) a n d c o n t a i n s t w o p o t e n t i a l N - l i n k e d g l y c o s y l a t i o n s i tes w h i c h a r e b o t h u s e d ( B u r k e a n d K e e g s t r a , 1979) . B i o c h e m i c a l s t u d i e s b y th is g r o u p sugges t t h a t S V E 2 c o n t a i n s o n e c o m p l e x ( e n d o H r e s i s t a n t ) g l y c a n at A s n 196 a n d o n e h i g h m a n n o s e t y p e ( e n d o H s e n s i t i v e ) at A s n 318 . E 2 c o n t a i n s t w o c o n s e r v e d c y s t e i n e r e s i d u e s f o l l o w i n g a g r o u p o f 2 4 - 2 6 v e r y h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s i n t h e c a r b o x y - t e r m i n u s that f u n c t i o n s as t h e t r a n s m e m b r a n e a n c h o r o f t h e p r o t e i n ( G a r o f f et a l . , 1 9 8 0 b ; R i c e a n d S t r a u s s , 1981; G a r o f f et a l . , 1982) . I m m e d i a t e l y f o l l o w i n g t h e m e m b r a n e b i n d i n g d o m a i n a r e 31 -33 a m i n o a c i d s that c o m p r i s e t h e c y t o p l a s m i c d o m a i n o f E 2 ( T a b l e 1) . T h e p r e d i c t e d m e m b r a n e t o p o l o g y o f E 2 is t h e r e f o r e that o f a t y p e I m e m b r a n e p r o t e i n ( S i n g e r et a l . , 1 9 8 7 ) w i t h t h r e e d o m a i n s ; 1) N - t e r m i n a l e c t o p l a s m i c d o m a i n ; 2 ) t r a n s m e m b r a n e d o m a i n ; 3 ) C - t e r m i n a l c y t o p l a s m i c d o m a i n . ; T A B L E I. D o m a i n s of A l p h a v i r u s G l y c o p r o t e i n s " Sindbis virus Semliki Forest virus | Domain El E2 E3 El E2 E3 Hydrophilic, globular 395 364 45 396 367 47 j ; {outside) | Membrane-spanning 26 26 — 24 24 — | Cytoplasmic (inside) 2 33 — 2 31 — ' Hydrophobic (outside) 16 — 19 1 6 — 1 9 ! i (80-96) (80-96) j ' ° Numbers of amino acids in a domain are listed. The numbers in parentheses indicate the positions of ; \ the amino acids in the protein's sequence. T h e S F V p 6 2 g l y c o p r o t e i n g e n e h a s b e e n s u b c l o n e d i n t o a n S V 4 0 - b a s e d e x p r e s s i o n v e c t o r - 1 9 -a n d m i c r o i n j e c t e d a n d t r a n f e c t e d i n t o B H K a n d C O S ce l l s r e s p e c t i v e l y b y G a r o f f a n d c o w o r k e r s ( K o n d o r - K o c h et a l . , 1982; C u t l e r a n d G a r o f f , 1986) . D e l e t i o n m u t a g e n e s i s e x p e r i m e n t s r e v e a l e d t h a t t h e c y t o p l a s m i c t a i l o f E 2 is n o t r e q u i r e d f o r t r a n s p o r t to t h e p l a s m a m e m b r a n e ( K o n d o r - K o c h et a l . , 1983; G a r o f f et a l . , 1983) . I n c o n t r a s t , d e l e t i o n o f t h e t r a n s m e m b r a n e a n d c y t o p l a s m i c d o m a i n s r e s u l t s i n i n t r a c e l l u l a r a c c u m u l a t i o n o f p 6 2 as a r e s u l t o f a l t e r e d t e r t i a r y s t r u c t u r e ( R i e d e l , 1985) . F u s i o n o f p 6 2 e c t o p l a s m i c d o m a i n w i t h t h e m e m b r a n e b i n d i n g d o m a i n a n d c y t o p l a s m i c r e g i o n o f v e s i c u l a r s t o m a t i t i s v i r u s G p r o t e i n o r f o w l p l a q u e v i r u s h e m a g g l u t i n i n r e c o n s t i t u t e s t r a n s p o r t t o t h e c e l l s u r f a c e ( R i e d e l , 1985) . A l t h o u g h E 2 t r a v e r s e s t h e e x o c y t i c p a t h w a y w i t h o u t E l ( K o n d o r - K o c h et a l . , 1982) , t h e p 6 2 c l e a v a g e b e t w e e n E 3 a n d E 2 r e q u i r e s E l ( C u t l e r a n d G a r o f f , 1986; C u t l e r et a l . , 1986) . P r o t e o l y t i c c l e a v a g e o f S F V p 6 2 a f t e r t h e A r g - A r g p a i r i n t h e c a r b o x y - t e r m i n u s o f E 3 t a k e s p l a c e s h o r t l y a f t e r o r d u r i n g exit f r o m t h e t r a n s - G o l g i r e t i c u l u m , b u t p r i o r to r e a c h i n g t h e p l a s m a m e m b r a n e ( D e C u r t i s a n d S i m m o n s , 1988) . T h i s c l e a v a g e w h i c h is e s s e n t i a l f o r i n f e c t i v i t y ( W h i t e et a l . , 1 9 8 3 ) r e q u i r e s C a + + a n d A T P a n d is p r o b a b l y c a t a l y z e d b y a h o s t c e l l p r o t e a s e . I n c o n t r a s t , w o r k f r o m t h e l a b o r a t o r y o f B r o w n s e e m s to i n d i c a t e that P E 2 c a n b e i n c o r p o r a t e d i n t o S i n d b i s v i r u s v i r i o n s , a n d t h e r e f o r e s u g g e s t s t h a t P E 2 c l e a v a g e is n o t r e q u i r e d f o r v i r i o n f o r m a t i o n i n S V at l ea s t ( P r e s l e y a n d B r o w n ) . M o r e o v e r i n S V - i n f e c t e d ce l l s , e n d o H - s e n s i t i v e f o r m s o f E 2 a r e f o u n d i m p l y i n g t h a t t h e p E 2 c l e a v a g e e v e n t m a y b e i n d e p e n d e n t o f t r a n s p o r t as s u g g e s t e d a b o v e w i t h S F V , a n d a l s o r a i s e s t h e p o s s i b i l i t y that th is c l e a v a g e m a y b e v i r u s s p e c i f i e d ( K n i p f e r a n d B r o w n , 1989) . M o n o c l o n a l a n t i b o d y s t u d i e s d e f i n e at l eas t t h r e e n e u t r a l i z i n g d o m a i n s o n S V E 2 , o n e o f w h i c h a p p e a r s t o b e s t r a i n s p e c i f i c ( R o e h r i g et a l . , 1982; S t a n l e y et a l . , 1985; S t e c et a l . , 1986; O l m s t e a d et a l . , 1986; D a v i s et a l . , 1987) . U s i n g a m o u s e m o d e l to s t u d y S V n e u r o v i r u l e n c e t h e s e i n v e s t i g a t o r s h a v e d e m o n s t r a t e d s p e c i f i c c o d o n c h a n g e s i n E 2 w h i c h a f fec t r a t e o f p e n e t r a t i o n ( D a v i s et a l . , 1986) , p 6 2 c l e a v a g e a n d p a t h o g e n e s i s ( R u s s e l l et a l . , 1989) . I n a d d i t i o n t o c o n t a i n i n g s t r a i n - s p e c i f i c e p i t o p e s , E 2 is k n o w n t o p l a y a m a j o r r o l e i n t h e b u d d i n g p r o c e s s . T h e c y t o p l a s m i c d o m a i n o f E 2 is 31 -33 a m i n o a c i d s i n l e n g t h c o m p a r e d w i t h t w o a m i n o a c i d s i n t h e -20-a n a l o g o u s r e g i o n i n E l ( G a r o f f et a l . , 1980b; R i c e a n d S t r a u s s , 1981) . C o n s e q u e n t l y it w a s i a s s u m e d t h a t t h e c y t o p l a s m i c p o r t i o n o f E 2 i n t e r a c t e d w i t h n u c l e o c a p s i d s i n t h e b u d d i n g p r o c e s s . F u r t h e r m o r e , s u b t l e m u t a t i o n s i n t h e e c t o p l a s m i c d o m a i n o f S V E 2 c a n l e a d to d e f e c t s i n v i r a l a s s e m b l y . H a h n et a l . ( 1 9 8 9 c ) r e p o r t e d t h a t the l e s i o n i n S V . t s l 0 3 is i n E 2 ( A l a 3 4 4 - V a l ) a n d r e s u l t s i n w e a k e n e d i n t e r a c t i o n s b e t w e e n the s p i k e c o m p l e x a n d n u c l e o c a p s i d . R e v e r t a n t s w i t h a L y s - M e t c h a n g e i n E l at p o s i t i o n 2 2 7 w e r e i s o l a t e d w h i c h p a r t i a l l y s u p p r e s s e d t h e t s l 0 3 p h e n o t y p e . T h i s t o p i c w i l l b e d i s c u s s e d i n m o r e d e t a i l b e l o w . E l g l y c o p r o t e i n E l is t h e t h e l a r g e s t o f t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s , 438 a m i n o a c i d s i n S F V a n d 4 3 9 i n S V a n d is a l s o p a r t o f t h e v i r a l s p i k e c o m p l e x ( G a r o f f et a l . , 1980b; R i c e a n d S t r a u s s , 1981) . S e q u e n c e a n a l y s i s s u g g e s t s that E l is a l s o a t y p e I m e m b r a n e p r o t e i n ( S i n g e r et a l . , 1 9 8 7 ) w i t h a l a r g e N - t e r m i n a l e c t o p l a s m i c d o m a i n a n c h o r e d b y a 24-26 a m i n o a c i d m e m b r a n e - s p a n n i n g r e g i o n n e a r t h e C - t e r m i n u s . T h e c y t o p l a s m i c t a i l o f E l is o n l y t w o r e s i d u e s l o n g i n S V a n d S F V . S e e t a b l e 1. T r a n s l o c a t i o n o f t h e a l p h a v i r u s s t r u c t u r a l p o l y p r o t e i n i n t o t h e E R is h a l t e d b y t h e C - t e r m i n a l t r a n s m e m b r a n e d o m a i n o f p 6 2 / E 2 . T h i s n e c e s s i t a t e s E l h a v i n g a s e p a r a t e s i g n a l p e p t i d e t o r e i n i t i a t e t r a n s l o c a t i o n . A t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e m u t a n t o f S F V ts-3 a c c u m u l a t e s a c y t o p l a s m i c 86 ,000 d a l t o n C - p 6 2 f u s i o n p r o t e i n w h e n g r o w n at t h e r e s t r i c t i v e t e m p e r a t u r e ( H a s h i m o t o et a l . , 1981) . E l h o w e v e r , w a s f o u n d to b e o f n o r m a l s i ze , a n d w a s s e q u e s t e r e d a n d g l y c o s y l a t e d i n t h e E R i m p l y i n g that t w o s e p a r a t e s i g n a l s e q u e n c e s a r e r e q u i r e d f o r t r a n s l o c a t i o n o f p 6 2 a n d E l i n t o the E R . L o c a t e d b e t w e e n E 2 a n d t h e N - t e r m i n u s o f E l is a s t r e t c h o f 5 5 ( S F V ) to 6 0 ( S V ) a m i n o a c i d s k n o w n as t h e 6 K p e p t i d e ( W e l c h a n d S e f t o n , 1980; G a r o f f et a l . , 1 9 8 0 b ; R i c e a n d S t r a u s s , 1981) . T h e r e g i o n is q u i t e h y d r o p h o b i c a n d l i t t le s e q u e n c e h o m o l o g y is f o u n d b e t w e e n S F V a n d S V . T h e 6 K p e p t i d e is n o t f o u n d i n v i r i o n s ( W e l c h a n d S e f t o n , 1 9 7 9 ) a n d w a s p r o p o s e d t o c o n t a i n t h e s i g n a l p e p t i d e f o r E l ( G a r o f f et a l . , 1982) . B a l 3 1 e x o n u c l e a s e d e l e t i o n a n a l y s i s - 2 1 -l o c a l i z e d t h e s i g n a l s e q u e n c e ac t iv i ty to t h e last 26 a m i n o a c i d s o f 6 K p r e c e d i n g E l ( M e l a n c o n a n d G a r o f f , 1986) . T h e s e a u t h o r s a l s o s h o w e d that E l t r a n s l o c a t i o n w a s S R P - d e p e n d e n t a n d d i d n o t r e q u i r e p 6 2 . A m o d e l f o r t h e m e m b r a n e i n s e r t i o n o f a l p h a v i r u s s t r u c t u r a l p r o t e i n s i n t h e E R is s h o w n i n F i g . 6 ( M e l a n c o n a n d G a r o f f , 1987) . R e l e a s e o f t h e 6 K p e p t i d e f r o m p 6 2 a n d E l is m e d i a t e d b y s i g n a l p e p t i d a s e c l e a v a g e ( S t r a u s s a n d S t r a u s s , 1984) . S F V E l c o n t a i n s a s i n g l e N - l i n k e d g l y c o s y l a t i o n s i te ( A s n 141) w h i c h is o c c u p i e d b y a c o m p l e x s u g a r m o i e t y ( G a r o f f et a l . , 1980b; M a t t i l a et a l . , 1976; P e s o n e n a n d R e n k o n e n , 1976) . I n S V t h e r e a r e t w o g l y c o s y l a t i o n s i tes o n E l ( A s n 139, 2 4 5 ) w h i c h c o n t a i n c o m p l e x g l y c a n s w h e n t h e v i r u s is p r o p a g a t e d i n B H K ce l l s , h o w e v e r w h e n g r o w n i n p r i m a r y c h i c k e n ce l l s , o n e o f t h e s u g a r s is a h i g h m a n n o s e t y p e ( R i c e a n d S t r a u s s , 1981; S e f t o n a n d K e e g s t r a , 1974; B u r k e a n d K e e g s t r a , 1976, 1979) . C o e x p r e s s i o n o f p 6 2 is r e q u i r e d f o r c o n v e r s i o n o f E l o l i g o s a c c h a r i d e s t o t h e e n d o H r e s i s t a n t f o r m ( H a s h i m o t o et a l . , 1981; M e l a n c o n a n d G a r o f f , 1986) . P r e s u m a b l y , a p 6 2 / E l c o m p l e x is n e c e s s a r y f o r t r a n s p o r t o f E l f r o m t h e E R a n d t h r o u g h t h e G o l g i c o m p l e x . A m o n g a l p h a v i r u s i so la te s , E l is m o r e c o n s e r v e d t h a n E 2 , a n d m a y c o n f e r g e n u s s u b g r o u p v a r i a t i o n ( B e l l et a l . , 1984) . F o r th is r e a s o n , E l is t h o u g h t t o p o s s e s s d o m a i n s e s s e n t i a l f o r h o s t c e l l a t t a c h m e n t a n d m e m b r a n e f u s i o n . A h i g h l y c o n s e r v e d g r o u p o f 16 h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s l o c a t e d 8 0 r e s i d u e s f r o m t h e N - t e r m i n u s o f E l is t h o u g h t to f u n c t i o n as t h e m e m b r a n e f u s i o n d o m a i n ( W h i t e a n d H e l e n i u s , 1980; G a r o f f et a l . , 1980b; R i c e a n d S t r a u s s , 1981) . T h e m e m b r a n e f u s i o n e v e n t o c c u r s a f ter a d e c r e a s e i n p H c a u s e s a c o n f o r m a t i o n c h a n g e i n E l e v i d e n c e d b y i n c r e a s e i n r e s i s t a n c e to p r o t e o l y s i s b y t r y p s i n ( W h i t e a n d H e l e n i u s , 1980; W h i t e et a l . , 1983; O m a r a n d K o b l e t , 1988) . T h e l a t t e r g r o u p p r e p a r e d S F V v i r i o n s d e v o i d o f E 3 a n d E 2 a n d d e m o n s t r a t e d t h a t t h e s e p a r t i c l e s w e r e i n f e c t i o u s , a n d c a p a b l e o f i n d u c i n g c e l l - c e l l f u s i o n a f ter e x p o s u r e to l o w p H . F u s o g e n i c ac t iv i ty o f S F V s p i k e g l y c o p r o t e i n s c a n b e o b s e r v e d i n B H K a n d C O S c e l l s m i c r o i n j e c t e d o r t r a n s f e c t e d w i t h a p 6 2 / E l c o n s t r u c t , b u t n o t w i t h j u s t p 6 2 o r E l ( K o n d o r - K o c h et a l . , 1983; C u t l e r a n d G a r o f f , 1986) . -22 -F i g u r e 6. M o d e l f o r t h e p r o c e s s i n g o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s s t r u c t u r a l p r o t e i n s . T h e c a p s i d p r o t e i n is r e m o v e d b y a s e l f - c a t a l y z e d c l e a v a g e w h i c h o c c u r s i n t h e c y t o p l a s m (a ) . T r a n s l o c a t i o n o f p 6 2 i n t o t h e E R is m e d i a t e d b y a n u n c l e a v e d s i g n a l s e q u e n c e [ o p e n r e c t a n g l e ] w h i c h b e c o m e s g l y c o s y l a t e d [ b l a c k dot ] ( b ) , a n d is h a l t e d b y a c a r b o x y - t e r m i n a l t r a n s m e m b r a n e d o m a i n [ so l id r e c t a n g l e ] ( c ) . A s e p a r a t e s i g n a l s e q u e n c e ( o p e n r e c t a n g l e ) i n t h e 6 K p e p t i d e r e i n i t i a t e s t r a n s l o c a t i o n o f E l i n t o t h e E R ( d ) . T h e 6 K p e p t i d e itself , is t h o u g h t t o r e m a i n a n c h o r e d i n t h e m e m b r a n e b y a 15 a m i n o a c i d h y d r o p h o b i c r e g i o n [b lack b o x ] (e,f) . A c a r b o x y - t e r m i n a l t r a n s m e m b r a n e d o m a i n a n c h o r s E l i n the E R m e m b r a n e (f) . G l y c o s y l a t i o n o f E l a n d p 6 2 a r e i n d i c a t e d b y b l a c k d o t s , a n d t h e t w o s i g n a l p e p t i d a s e m e d i a t e d c l e a v a g e s that r e l e a s e t h e 6 K p e p t i d e f r o m p 6 2 a n d E l a r e i n d i c a t e d b y a r r o w s (e) . ( M e l a n c o n a n d G a r o f f , 1987) . -23 -E n t r y o f a l p h a v i r u s e s i n m a m m a l i a n c e l l s E n t r y o f a l p h a v i r u s e s i n t o a h o s t c e l l is i n i t i a t e d b y b i n d i n g o f t h e g l y c o p r o t e i n s p i k e s t o a n u n d e f i n e d p r o t e i n r e c e p t o r o n t h e p l a s m a m e m b r a n e ( f o r R e v i e w see K i e l i a n a n d H e l e n i u s , 1986) . B o u n d v i r i o n s a c c u m u l a t e i n c o a t e d p i t s w h i c h a r e e n d o c y t o s e d t o f o r m c o a t e d v e s i c l e s . T h e e n d o c y t i c v e s i c l e s f u s e w i t h e n d o s o m e s r e s u l t i n g i n a c i d i f i c a t i o n o f t h e v e s i c l e c o n t e n t s ( T y c k o a n d M a x f i e l d , 1 9 8 2 ) a n d th i s c a u s e s a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n t h e g l y c o p r o t e i n s p i k e c o m p l e x r e s u l t i n g i n f u s i o n o f the v i r a l e n v e l o p e w i t h t h e e n d o s o m a l m e m b r a n e . T h e n u c l e o c a p s i d is t h e n r e l e a s e d i n t o t h e h o s t c e l l c y t o p l a s m . S e m l i k i F o r e s t v i r u s p a r t i c l e s c o n t a i n i n g o n l y g l y c o p r o t e i n E l c a n i n d u c e the p H - d e p e n d e n t f u s i o n a n d a r e i n f e c t i o u s ( O m a r a n d K o b l e t , 1988) . T h i s r e c e n t e v i d e n c e s u p p o r t s e a r l i e r w o r k s u g g e s t i n g that E l c o n t a i n e d t h e f u s o g e n i c d o m a i n ( G a r o f f et a l . , 1980b; W h i t e et a l . , 1983) . L o w p H s h r i n k s t h e n u c l e o c a p s i d d i a m e t e r b y 1 5 % p o s s i b l y a l l o w i n g r e l e a s e o f t h e R N A f r o m t h e c a p s i d m a t r i x ( S c h l e s i n g e r , 1985) . V i r u s a s s e m b l y a n d b u d d i n g N u c l e o c a p s i d f o r m a t i o n is the first s t ep i n v i r u s m a t u r a t i o n , a n d o c c u r s v e r y r a p i d l y i n t h e c y t o p l a s m . L e v e l s o f f r e e c a p s i d p r o t e i n i n a l p h a v i r u s - i n f e c t e d ce l l s a r e n e g l i g i b l e d u e t o c o m p l e x i n g w i t h g e n o m i c R N A w i t h i n five m i n u t e s o f syn thes i s ( S o d e r l u n d , 1973) . P r o t e i n a n d R N A a r e u n i f o r m l y d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t t h e c o r e p a r t i c l e r a t h e r t h a n t h e p r o t e i n f o r m i n g a s h e l l a r o u n d t h e n u c l e i c a c i d ( S i m m o n s a n d W a r r e n , 1984) . T h e n u c l e o c a p s i d is a s t a b l e s t r u c t u r e , a n d r e m a i n s s o a f ter t h e e n v e l o p e h a s b e e n r e m o v e d b y g e n t l e d e t e r g e n t e x t r a c t i o n ( H e l e n i u s a n d S o d e r l u n d , 1973; C o o m b s et a l . , 1984) . C o o m b s a n d B r o w n ( 1 9 8 9 ) sugges t t h a t S V c a p s i d p r o t e i n s ac t s i m i l a r l y to h i s t o n e s b y o r g a n i z i n g the g e n o m i c R N A i n t o n u c l e o p r o t e i n b e a d s w h i c h i n t e r a c t w i t h e a c h o t h e r to f o r m t h e c o r e p a r t i c l e . T h e h i g h l y b a s i c a m i n o - t e r m i n a l r e g i o n o f c a p s i d is l i k e l y i n v o l v e d i n b i n d i n g o f R N A t h r o u g h e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s ( G a r o f f et a l . , 1980a; R i c e a n d S t r a u s s , 1981) . A l p h a v i r a l c o r e p a r t i c l e s a r e c o m p o s e d o f 180 c a p s i d m o l e c u l e s a r r a n g e d i n t r i m e r i c s u b u n i t s ( F u l l e r , 1987) . O n t h e s u r f a c e o f t h e n u c l e o c a p s i d a r e 8 0 -24-u n i f o r m l y s p a c e d i n d e n t a t i o n s w h i c h p r e s u m a b l y fac i l i t a t e t h e b i n d i n g o f 8 0 t r i m e r i c g l y c o p r o t e i n s p i k e s ( F u l l e r , 1987) . D u r i n g n u c l e o c a p s i d f o r m a t i o n i n t h e c y t o p l a s m , t h e g l y c o p r o t e i n s a r e s y n t h e s i z e d o n m e m b r a n e - b o u n d r i b o s o m e s a n d t h e n t r a n s p o r t e d t h r o u g h t h e E R , G o l g i a n d finally t o t h e p l a s m a m e m b r a n e w h i c h is t h e s i te o f b u d d i n g . T h e g l y c o p r o t e i n s p i k e o f S F V is a h e t e r o t r i m e t r i c c o m p l e x w i t h t h e c o m p o s i t i o n ( E l , E 2 , E 3 ) . j ( V o g e l et a l . , 1986; S c h l e s i n g e r a n d S c h l e s i n g e r , 1 9 8 6 ) ( F i g . 7 ) . S V s p i k e is s i m i l a r e x c e p t that E 3 is n o t p r e s e n t ( F u l l e r , 1987) . O l i g o m e r i z a t i o n l i k e l y o c c u r s i n t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m s h o r t l y a f ter s y n t h e s i s , as is o b s e r v e d w i t h o t h e r e n v e l o p e d v i r u s g l y c o p r o t e i n t r i m e r s s u c h as i n f l u e n z a h e m a g g l u t i n i n ( H A ) , V S V G p r o t e i n a n d R o u s s a r c o m a v i r u s e n v e l o p e g l y c o p r o t e i n ( W i l s o n et a l . , 1981; G e t h i n g et a l . , 1986; D o m s et a l . , 1987; E i n f e l d a n d H u n t e r , 1988) . T r i m e r i z a t i o n is e s s e n t i a l f o r t r a n s p o r t o f H A a n d V S V G p r o t e i n o u t o f t h e E R , a n d f a i l u r e to d o s o o f t e n r e s u l t s i n f o r m a t i o n o f i n t e r m o l e c u l a r a g g r e g a t e s ( G e t h i n g et a l . , 1986; D o m s et a l . , 1987) . T h e r o l e o f o l i g o m e r i z a t i o n i n t r a n s p o r t h a s n o t b e e n w e l l s t u d i e d f o r a l p h a v i r u s e s , a l t h o u g h it is c l e a r t h a t E l is r e q u i r e d t o c o m p l e x w i t h p 6 2 p r i o r t o e x i t i n g t h e E R . A f t e r l e a v i n g the E R , t h e p 6 2 / E l c o m p l e x t r a v e r s e s t h e G o l g i s t a c k s d u r i n g w h i c h t i m e t h e c a r b o h y d r a t e c h a i n s a r e t r i m m e d a n d p r o c e s s e d . A n e n d o p r o t e o l y t i c c l e a v a g e o c c u r s i n p 6 2 a f t e r t h e L y s - A r g ( S V ) o r A r g - A r g ( S F V ) p a i r at t h e E 3 C - t e r m i n u s d u r i n g o r s h o r t l y a f ter l e a v i n g t h e t r a n s - G o l g i n e t w o r k ( S i m o n s et a l . , 1973; Z i e m i e c k i et a l . , 1980; G a r o f f et a l . , 1980b; R i c e a n d S t r a u s s , 1981; D e C u r t i s a n d S i m o n s , 1988) . T h e p r o t e a s e is t h o u g h t t o b e h o s t - c e l l d e r i v e d a n d is l i k e l y c a t h e p s i n - B - l i k e t h i o m e t a l l o p r o t e a s e w h i c h p e r f o r m s s i m i l a r c l e a v a g e s i n p r o h o r m o n e p r e c u r s o r s ( S t e i n e r et a l . , 1984) . F o l l o w i n g t h e p 6 2 c l e a v a g e , a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e i n E 2 t a k e s p l a c e r e s u l t i n g i n a m u c h s t r o n g e r i n t e r a c t i o n w i t h E l ( R i c e a n d S t r a u s s , 1982) . A s c h e m e f o r S F V b u d d i n g w a s o r i g i n a l l y p r o p o s e d b y G a r o f f a n d S i m o n s ( 1 9 7 4 ) . A c c o r d i n g t o t h e i r m o d e l , g l y c o p r o t e i n s that a r r i v e at t h e p l a s m a m e m b r a n e m u s t h a v e a n a f f i n i t y f o r e a c h o t h e r t o a l l o w c o n c e n t r a t i o n o f t h e s p i k e s i n t o n u c l e a t i o n p a t c h e s . A s w e l l as -25-F I G U R E T: G l y c o p r o t e i n s p i k e o f a l p h a v -i r u s e s . D o m a i n s n o t e d a r e h y d r o p h i l i c g l o b u l a r p o r t i o n (1), m e m b r a n e - s p a n n i n g r e g i o n (2), c y t o p l a s m i c f r a g m e n t [3); a n d h y d r o p h o b i c a r e a n o t i n t h e m e m b r a n e (4). [l^J>] O l i g o s a c c h a r i d e s ; ( • ) a c e t y l a t e d a m i n o t e r m i n u s , - ) c o v a l e n t f a t t y a c i d s ; ( f H 3 ) h y d r o p h o b i c r e g i o n s . (ScY»\ftS»«yr -26-i n c r e a s i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f g l y c o p r o t e i n s i n s p e c i f i c r e g i o n s o f t h e p l a s m a m e m b r a n e , n u c l e a t i o n o f s p i k e s s e l e c t i v e l y e x c l u d e s h o s t - c e l l m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s . J o h n s o n et a l . ( 1 9 8 1 ) p r o v i d e d e v i d e n c e t h a t n u c l e o c a p s i d - s p i k e i n t e r a c t i o n s m a y o c c u r p r i o r t o s p i k e a r r i v a l at t h e p l a s m a m e m b r a n e . T h e y r e p o r t e d that i n S V - i n f e c t e d ce l l s , a l m o s t a l l o f t h e s u r f a c e v i r a l g l y c o p r o t e i n w a s f o u n d i n i m m o b i l i z e d p a t c h e s . S i m i l a r l y , P a v a n et a l . ( 1 9 8 7 ) f o u n d h i g h l y r e g i o n a l i z e d s m a l l c l u s t e r s o f s p i k e s o n S V - i n f e c t e d B H K p l a s m a m e m b r a n e s w h i c h t h e y a t t r i b u t e d to b e b u d d i n g p r o c e s s e s . S i n c e E l h a s a c y t o p l a s m i c d o m a i n o f o n l y t w o a m i n o a c i d s ( G a r o f f et a l . , 1 9 8 0 b ; R i c e a n d S t r a u s s , 1 9 8 1 ) it is l i k e l y t h a t t h e 31 r e s i d u e c y t o p l a s m i c p o r t i o n o f E 2 i n t e r a c t s w i t h n u c l e o c a p s i d s d u r i n g b u d d i n g . E a r l y e v i d e n c e c a m e f r o m c r o s s - l i n k i n g e x p e r i m e n t s w h i c h d e m o n s t r a t e d a C - E 2 i n t e r a c t i o n i n S F V ( Z i e m i e c k i a n d G a r o f f , 1978) . V a u x et a l . ( 1 9 8 8 ) r e c r e a t e d t h e C - E 2 i n t e r a c t i o n b y g e n e r a t i n g a s e r i e s o f t h r e e n e t w o r k a n t i b o d i e s . A n t i i d i o t y p i c a n t i b o d i e s t o a n t i - E 2 c y t o p l a s m i c t a i l a n t i b o d i e s r e a c t e d w i t h S F V c a p s i d p r o t e i n , a n d a n t i - a n t i i d i o t y p i c a n t i b o d i e s w e r e s p e c i f i c f o r t h e E 2 c y t o p l a s m i c d o m a i n . T h i s w o r k a l s o d e m o n s t r a t e d that the E 2 e p i t o p e that b i n d s to n u c l e o c a p s i d w a s h i g h l y c o n s e r v e d a m o n g a l p h a v i r u s e s , a n d d i d n o t r e q u i r e E 2 t o b e i n the t r i m e r i c s tate ( E 1 , E 2 , E 3 ) ^ t o e x p r e s s t h e b i n d i n g s i g n a l . A c c o r d i n g to F u l l e r ( 1987) t h e r e a r e t w o t y p e s o f C - E 2 i n t e r a c t i o n s , l o o s e a n d t ight a s s o c i a t i o n s b e t w e e n t h e c a p s i d t r i p l e t s a n d s p i k e c o m p l e x e s ( F i g . 8 ) . T h r e e m a i n r e a s o n s m a y e x p l a i n w h y b u d d i n g o f a l p h a v i r u s e s d o e s n o t o c c u r i n t r a c e l l u l a r l y ; 1) l o w c o n c e n t r a t i o n o f s p i k e s o n i n t r a c e l l u l a r ve s i c l e s ; 2 ) p 6 2 c o n v e r s i o n o c c u r s v e r y l a t e i n t r a n s p o r t ; 3 ) p o s s i b l e m a s k i n g o f E 2 c y t o p l a s m i c e p i t o p e s b y h o s t p r o t e i n s d u r i n g t r a n s p o r t ( S c h l e s i n g e r a n d S c h l e s i n g e r , 1986) . T h e i m p o r t a n c e o f c o n c e n t r a t i o n a n d c o n f o r m a t i o n o f t h e s p i k e s is m a d e o b v i o u s f r o m t h e facts that m o n e n s i n w h i c h i m p a i r s t r a n s p o r t t h r o u g h t h e G o l g i , i n d u c e s i n t r a c e l l u l a r b u d d i n g o f S F V a n d S V as d o e s t h e m a n n o s i d a s e i n h i b i t o r d M M ( K a a r i a i n e n et a l . , 1980; M c D o w e l l et a l . , 1987) . T h e E 2 p r e c u r s o r p 6 2 c a n a l s o b i n d n u c l e o c a p s i d at t h e p l a s m a m e m b r a n e , b u t e n v e l o p m e n t d o e s n o t n o r m a l l y o c c u r , p r e s u m a b l y b e c a u s e p 6 2 / E l d i m e r s c a n n o t p a c k t o g e t h e r t i gh t ly e n o u g h ( B r o w n a n d S m i t h , 1975) . H o w e v e r , r e c e n t w o r k b y -27-B r o w n ' s g r o u p i n d i c a t e t h a t t r e a t m e n t o f S V - i n f e c t e d ce l l s w i t h l o w c o n c e n t r a t i o n s o f m o n e n s i n r e s u l t s i n t h e i n c o r p o r a t i o n o f p 6 2 p r o t e i n s i n t o i n f e c t i o u s v i r i o n s , a l t h o u g h the p r o t e i n s e e m s t o b e i n a n a l t e r e d c o n f o r m a t i o n ( P r e s l e y a n d B r o w n , 1989) . T h e i r w o r k is s u p p o r t e d b y t h e e x i s t e n c e o f a S V m u t a n t w h i c h fa i l s t o u n d e r g o t h e p 6 2 p r o c e s s i n g t o E 2 , b u t s t i l l p r o d u c e s v i a b l e p r o g e n y , a n d t h e r e f o r e p o s e s t h e q u e s t i o n o f w h y the p 6 2 c l e a v a g e is n e c e s s a r y at a l l ( R u s s e l l et a l . , 1989) . T h e s e g r o s s d i s c r e p a n c i e s r e g a r d i n g t h e n a t u r e a n d f u n c t i o n o f t h e p 6 2 c l e a v a g e r e m a i n u n r e s o l v e d . F i n a l l y , a l t h o u g h n u c l e o c a p s i d a s s e m b l y a n d g l y c o p r o t e i n t r a n s p o r t a r e n o t s e n s i t i v e to l o w c o n c e n t r a t i o n s o f v e r a p a m i l o r c h l o r p r o m a z i n e , t h e s e c a l c i u m b l o c k i n g a g e n t s i n t e r f e r e w i t h t h e final s tages o f v i r u s m a t u r a t i o n ( S c h l e s i n g e r a n d C a h i l l , 1 9 8 9 ) . -28-F i g u r e 8. A s s o c i a t i o n o f s p i k e c o m p l e x e s w i t h the n u c l e o c a p s i d at t h e p l a s m a m e m b r a n e . A s the c o n c e n t r a t i o n o f s p i k e w i t h i n t h e p l a s m a m e m b r a n e p a s s e s a c r i t i c a l t h r e s h o l d , l a t e r a l i n t e r a c t i o n s r e s u l t i n t h e f o r m a t i o n o f c l o s e - p a c k e d p a t c h e s o f s p i k e p r o t e i n s a n d t h e e x c l u s i o n o f h o s t m e m b r a n e p r o t e i n s ( A , B ) . T w o types o f s p i k e - c a p s i d , i n t e r a c t i o n s a r e t h o u g h t t o o c c u r c a u s i n g t h e i n i t i a l c u r v i n g o f t h e v i r u s e n v e l o p e a n d e v e n t u a l b u d d i n g ( C ) . ( F u l l e r , 1987) . - 2 9 -R u b e l l a v i r u s C l a s s i f i c a t i o n R u b e l l a v i r u s ( R V ) is t h e s o l e m e m b e r o f the g e n u s R u b i v i r u s i n t h e f a m i l y T o g a v i r i d a e ( P o r t e r f i e l d et a l . , 1978) . U p u n t i l 1985, th is f a m i l y c o n t a i n e d t h r e e o t h e r g e n e r a ; A l p h a v i r u s , P e s t i v i r u s , a n d F l a v i v i r u s , b u t t h e T o g a v i r i d a e S t u d y G r o u p r e c o m m e n d e d F l a v i v i r u s b e r e c o g n i z e d as t h e b a s i s f o r a n e w f a m i l y , F l a v i v i r i d a e ( W e s t a w a y et a l . , 1985) . T o g a v i r u s e s a r e s i m p l e e n v e l o p e d R N A v i r u s e s w h o s e g e n o m e s c o n s i s t o f a s i n g l e m o l e c u l e o f s i n g l e - s t r a n d e d p o s i t i v e - p o l a r i t y R N A a r r a n g e d w i t h a s i n g l e s p e c i e s p r o t e i n i n t o a n i c o s a h e d r a l n u c l e o c a p s i d . S u r r o u n d i n g th i s n u c l e o c a p s i d is a h o s t c e l l - d e r i v e d l i p i d b i l a y e r w i t h p r o t r u d i n g g l y c o p r o t e i n s p i k e c o m p l e x e s . M o r p h o l o g y a n d m o r p h o g e n e s i s E l e c t r o n m i c r o s c o p y s t u d i e s o f R V g r o w n i n B H K - 2 1 c e l l s i n d i c a t e d t h a t v i r i o n s w e r e s p h e r i c a l a n d a p p r o x i m a t e l y 6 0 n m i n d i a m e t e r , w i t h a 3 0 n m d e n s e c o r e e n v e l o p e d b y a l i p i d b i l a y e r ( M u r p h y et a l . , 1968; v o n B o n s d o r f f a n d V a h e r i , 1969) . S u r f a c e p r o j e c t i o n s o f 5-6 n m a s s o c i a t e d w i t h t h e v i r a l h e m a g g l u t i n a t i n g p r o p e r t i e s h a v e b e e n r e p o r t e d ( H o l m e s et a l . , 1969) . T h e s i te o f b u d d i n g s e e m s t o d e p e n d o n w h i c h h o s t c e l l is u s e d . F o r i n s t a n c e , m a t u r a t i o n i n B H K - 2 1 ce l l s o c c u r s p r i m a r i l y i n c y t o p l a s m i c v e s i c l e s ( G o l g i a n d v a c u o l e s ) a n d t o a l e s s e r ex t en t at t h e p l a s m a m e m b r a n e , w h e r e a s i n V e r o ce l l s , v i r i o n s b u d e x c l u s i v e l y f r o m t h e p l a s m a m e m b r a n e ( B a r d e l e t t i et a l . , 1979) . T h e d e t a i l s o f R V m o r p h o g e n e s i s r e m a i n u n c l e a r . C l i n i c a l a s p e c t s I n f e c t i o n b y R V i n h u m a n s r e s u l t s i n s y m p t o m s r a n g i n g f r o m t h e i n a p p a r e n t t o c h a r a c t e r i s t i c f e a t u r e s o f G e r m a n M e a s l e s s u c h as a d e n o p a t h y , m a l a i s e , l o w g r a d e f e v e r , a n d e x a n t h e m . R a s h d e v e l o p m e n t m a y d e v e l o p 16 t o 20 d a y s a f ter e x p o s u r e ( C o o p e r a n d B u i m o v i c i - K l e i n , 1985) . D u e t o the c l i n i c a l v a r i a b i l i t y i n t h e d i s e a s e , d i a g n o s i s c a n o n l y b e c o n f i r m e d b y i s o l a t i o n o f R V o r d e m o n s t r a t i o n o f p r i m a r y s e r o c o n v e r s i o n . G e n e r a l l y , v i r u s -30-i s o l a t i o n is n o t e m p l o y e d b e c a u s e it is t i m e c o n s u m i n g a n d e x p e n s i v e . W h e n c i r c u m s t a n c e s n e c e s s i t a t e a p r e c i s e d i a g n o s i s , c o - c u l t i v a t i o n o f p e r i p h e r a l b l o o d l y m p h o c y t e s m a y b e u s e d t o i s o l a t e v i r u s ( C h a n t l e r et a l . , 1982) . C o m p l i c a t i o n s s u c h as p o l y a r t h r a l g i a a n d a r t h r i t i s f o l l o w i n g n a t u r a l i n f e c t i o n o r v a c c i n a t i o n a r e r a r e , h o w e v e r a d o l e s c e n t w o m e n a r e m o r e p r o n e t o t h e s e c o n d i t i o n s t h a n a r e m e n . R V - i n f e c t i o n is m o s t s e r i o u s w h e n c o n t r a c t e d b y w o m e n i n t h e f irst t r i m e s t e r o f p r e g n a n c y r e s u l t i n g i n f e t a l i n f e c t i o n . I n u t e r o , the v i r u s is e x t r e m e l y t e r a t o g e n i c d u e t o m i t o t i c i n h i b i t i o n i n v a r i o u s f e t a l t i s sues . V e r y o f t e n c a t a r a c t s , m e n t a l r e t a r d a t i o n , d e a f n e s s , c o n g e n i t a l h e a r t d i s e a s e , o r d e a t h a r e t h e r e s u l t . T h i s m u l t i s y s t e m o f b i r t h d e f e c t s is c o l l e c t i v e l y k n o w n as c o n g e n i t a l r u b e l l a s y n d r o m e ( C o o p e r a n d K r u g m a n , 1969) . R a r e l y , a p r o g r e s s i v e n e u r o d e g e n e r a t i v e c o n d i t i o n k n o w n as p r o g r e s s i v e r u b e l l a p a n e n c e p h a l i t i s m a y o c c u r 10 t o 2 0 y e a r s a f ter r u b e l l a i n f e c t i o n , o r m o r e f r e q u e n t l y a f ter c o n g e n i t a l r u b e l l a ( T o w n s e n d et a l . , 1975) . L i v e a t t e n u a t e d r u b e l l a v a c c i n e s s u c h as R A 2 7 / 3 a n d C e n d e h i l l s t r a i n s c u r r e n t l y i n u s e p r o d u c e s e r o c o n v e r s i o n i n m o r e that 9 5 % o f r e c i p i e n t s ( C o o p e r a n d B u i m o v i c i - K l e i n , 1985) , a n d 1 h a v e e f f e c t i v e l y e l i m i n a t e d e p i d e m i c r u b e l l a . . N u c l e i c a c i d a n d g e n o m e o r g a n i z a t i o n T h e g e n o m e o f R V is a n i n f e c t i o u s s i n g l e - s t r a n d e d R N A m o l e c u l e t h a t s e d i m e n t s at 4 0 S ( H o v i a n d V a h e r i , 1970) . R V - i n f e c t e d ce l l s i n a d d i t i o n to c o n t a i n i n g 4 0 S g e n o m i c R N A , h a r b o r a 2 4 S s u b g e n o m i c m R N A that is c a p p e d a n d p o l y a d e n y l a t e d l i k e t h e 4 0 S s p e c i e s ( O k e r - B l o m et a l . , 1984) . T h e s u b g e n o m i c m R N A is i d e n t i c a l t o the 3' o n e - t h i r d o f t h e 4 0 S R N A , a n d e n c o d e s t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s ( O k e r - B l o m et a l . , 1984) . R e c e n t l y t h e s e q u e n c e s o f t h e R V 2 4 S m R N A s f r o m w i l d i s o l a t e s M 3 3 ( C l a r k e et a l . , 1987; 1988) , a n d T h e r i e n ( F r e y et a l . , 1986; F r e y a n d M a r r , 1988; V i d g r e n et a l . , 1987; T a k k i n e n et a l . , 1988) s t r a i n s o f R V h a v e b e e n d e t e r m i n e d f r o m c D N A c l o n e s . T h e m R N A is a p p r o x i m a t e l y 3 3 4 6 nt , a n d c o n t a i n s a 3 1 8 9 nt o p e n r e a d i n g f r a m e s p e c i f y i n g t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s C , E 2 , a n d E l ( F r e y a n d M a r r , 1988) . A l i g n m e n t o f t h e 2 4 S s e q u e n c e s r e p o r t e d b y the t h r e e g r o u p s r e v e a l s m o r e t h a n 9 5 % h o m o l o g y at t h e n u c l e o t i d e l e v e l , - 3 1 -a n d it is b e l i e v e d t h a t s o m e o f t h e d i s c r e p a n c i e s c a n b e a t t r i b u t e d t o d i f f i c u l t i e s i n s e q u e n c i n g J. t h e u n u s u a l l y G / C r i c h R N A ( F r e y a n d M a r r , 1988) . N o s i g n i f i c a n t h o m o l o g y exists b e t w e e n t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s o f R V a n d t h o s e o f a l p h a v i r u s e s ( F r e y a n d M a r r , 1988) . N a k h a s i ' s g r o u p r e c e n t l y d e d u c e d t h e s e q u e n c e o f t h e 2 4 S m R N A f r o m t w o v a c c i n e s t r a i n s o f R V a n d r e l a t i v e t o T h e r i e n s t r a i n , f o u n d 3 1 a m i n o a c i d c h a n g e s i n R A 2 7 / 3 ( N a k h a s i et a l . , 1 9 8 9 ) a n d five i n H P V 7 7 ( Z h e n g et a l . , 1989) . F u t u r e w o r k s h o u l d b e a b l e t o r e v e a l w h i c h o f t h e s e a m i n o a c i d c h a n g e s a r e i m p o r t a n t f o r a t t e n u a t i o n . T o d a t e t h e g e n e s e n c o d i n g t h e n o n - s t r u c t u r a l p r o t e i n s i n t h e 5' t w o - t h i r d s o f t h e 4 0 S g e n o m e h a v e n o t b e e n c h a r a c t e r i z e d to a n y s i g n i f i c a n t ex tent . E x p r e s s i o n o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s V a h e r i a n d H o v i ( 1972) p r o v i d e d s o m e o f t h e e a r l i e s t i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s o f R V . I n 1983 h o w e v e r , t h e w o r k o f O k e r - B l o m et a l . w a s c r u c i a l i n e l u c i d a t i n g t h e e x p r e s s i o n s t r a t e g y o f R V s t r u c t u r a l a n t i g e n s . T h i s g r o u p r e p o r t e d t h a t R V v i r i o n s c o n t a i n f o u r s t r u c t u r a l p r o t e i n s ; c a p s i d ( C ) , E 2 a , E 2 b , a n d E l w i t h r e s p e c t i v e m o l e c u l a r w e i g h t s o f 33 ,000 , 47 ,000 , 42 ,000 , a n d 58 ,000 d a l t o n s . M o l e c u l a r w e i g h t e s t i m a t e s f o r t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s as d e t e r m i n e d b y o t h e r i n v e s t i g a t o r s r a n g e as h i g h as 38 ,000 ( C ) , 47 -54 ,000 ( E 2 ) , a n d 62 ,000 ( E l ) ( W a x h a m a n d W o l i n s k y , 1983) . I m m u n o p r e c i p i t a t i o n o f 3 5 S - l a b e l l e d R V p r o t e i n s f r o m t u n i c a m y c i n t r e a t e d ce l l s r e v e a l e d that E l a n d E 2 c o n t a i n N - l i n k e d g l y c a n s ( O k e r - B l o m et a l . , 1983) . I n v i t r o t r a n s l a t i o n o f R V 2 4 S m R N A y i e l d e d a 110 ,000 d a l t o n p o l y p e p t i d e ( p l l O ) w h i c h is a p r e c u r s o r t o t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s ( O k e r - B l o m et a l . , 1984; C l a r k e et a l . , 1987) . S y n c h r o n i z e d t r a n s l a t i o n e x p e r i m e n t s d e t e r m i n e d t h e o r d e r o f s y n t h e s i s t o b e N H 2 - C - E 2 - E I - C O O H ( O k e r - B l o m , 1984) . T h e s e r e s u l t s w e r e l a t e r c o n f i r m e d b y s e q u e n c e a n a l y s i s o f t h e 2 4 S m R N A ( C l a r k e et a l . , 1987) . T h e e x p r e s s i o n s t r a t e g y o f t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s is i l l u s t r a t e d i n F i g . 9. C a p s i d p r o t e i n T h e c a p s i d p r o t e i n is a n o n g l y c o s y l a t e d p r o t e i n ( 3 0 - 3 8 K ) a s s o c i a t e d w i t h t h e 4 0 S R N A -32-cap-© 40 S (~11.000 b) 7r+ - 1AA(A) n © 24 S (~3500 b) 5'H p110 i translation NH 2 r-processing capsid i r 11-C 33K <7 envelope Ii AA(A) n3' H COOH E2 E1 30K 53K JJ. glycosylation E2a (47K) 58K E2b (42K) F i g u r e 9. G e n e r a l s t r a t e g y f o r t h e e x p r e s s i o n a n d p r o c e s s i n g o f R u b e l l a v i r u s s t r u c t u r a l p r o t e i n s . ( O k e r - B l o m , 1984) . -33-f o r m i n g t h e n u c l e o c a p s i d s t r u c t u r e i n t h e v i r i o n i n t e r i o r ( V a h e r i a n d H o v i , 1972) . M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s d i s t i n g u i s h at l eas t f o u r n o n o v e r l a p p i n g e p i t o p e s ( W a x h a m a n d W o l i n s k y , 1985a , b ) . S e q u e n c e a n a l y s i s o f R V c D N A i n d i c a t e s t h e C p r o t e i n is r i c h i n a r g i n i n e a n d p r o l i n e , a n d h a s a m a x i m u m s i ze o f 3 0 0 a m i n o a c i d s ( C l a r k e et a l . , 1987; F r e y a n d M a r r , 1988; T a k k i n e n e t a l . , 1988) . T h e u n c e r t a i n t y i n s i ze is a c o n s e q u e n c e o f n o t k n o w i n g t h e p r e c i s e c a r b o x y - t e r m i n u s o f C . C a p s i d h a s b e e n s u g g e s t e d t o c o n s i s t o f d i s u l f i d e - b o n d e d d i m e r s i n n a t i v e v i r i o n s ( D o r s e t t et a l . , 1985) . C o n t r a r y t o a l p h a v i r u s e s , R V c a p s i d p r o t e i n d o e s n o t p o s s e s s a n a u t o c a t a l y t i c s e r i n e p r o t e a s e - l i k e a c t i v i t y ( O k e r - B l o m , 1984; C l a r k e et a l . , 1987) . E 2 g l y c o p r o t e i n R V E 2 g l y c o p r o t e i n is o n e o f the t w o c o m p o n e n t s f o r m i n g t h e s p i k e c o m p l e x o n t h e v i r i o n s u r f a c e . E 2 m i g r a t e s as a d i f fuse b a n d r a n g i n g i n s i ze f r o m 42-47 ,000 , a n d i n T h e r i e n s t r a i n c a n b e r e s o l v e d i n t o t w o d i s t i n c t s p e c i e s E 2 a (47 ,000) a n d E 2 b ( 4 2 , 0 0 0 ) ( O k e r - B l o m et a l . , 1983) . A n a l y s i s o f t h e s u g a r m o i e t i e s i n d i c a t e b o t h s p e c i e s c o n t a i n t e r m i n a l g a l a c t o s e a n d s i a l i c 3 a c i d b u t E 2 b l a b e l l e d m u c h m o r e s t r o n g l y w i t h H - m a n n o s e t h a n d i d E 2 a . T r y p t i c p e p t i d e m a p p i n g a n d t u n i c a m y c i n t r e a t m e n t o f i n f e c t e d ce l l s sugges t t h e e l e c t r o p h o r e t i c h e t e r o g e n e i t y i n E 2 r e s u l t s f r o m g l y c o s y l a t i o n d i f f e r e n c e s ( O k e r - B l o m et a l . , 1983) . I n t h e p r e s e n c e o f t u n i c a m y c i n , V e r o ce l l s i n f e c t e d w i t h R V a n d C O S ce l l s t r a n s f e c t e d w i t h a R V 2 4 S c D N A c o n s t r u c t p r o d u c e d E 2 w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t o f 30 ,000 i n d i c a t i n g that E 2 is v e r y h e a v i l y g l y c o s y l a t e d ( O k e r - B l o m et a l . , 1983; C l a r k e et a l . , 1988) . O k e r - B l o m a n d c o w o r k e r s sugges t t h e s u g a r s o n E 2 a n d E l a r e o f t h e c o m p l e x t y p e as d e t e r m i n e d b y t h e i r r e s i s t a n c e to e n d o H 3 5 ( O k e r - b l o m et a l . , 1983) . I n t e r e s t i n g l y , E 2 i m m u n o p r e c i p i t a t e d f r o m S - l a b e l l e d c y t o p l a s m i c ex trac t s o f R V - i n f e c t e d c e l l s is a u n i f o r m l y g l y c o s y l a t e d p r o t e i n o f 41 ,000 ( O k e r - B l o m et a l . , 1983; F r e y a n d M a r r , 1988) o r 43 ,000 ( W a x h a m a n d W o l i n s k y , 1 9 8 5 b ) . T h e b i o l o g i c a l f u n c t i o n o f E 2 is o b s c u r e a l t h o u g h it h a s b e e n r e p o r t e d t o p o s s e s s s t r a i n s p e c i f i c e p i t o p e s ( D o r s e t t et a l . , 1985) a n d at l eas t o n e n e u t r a l i z a t i o n d o m a i n ( G r e e n a n d D o r s e t t , 1986) . P r o d u c t i o n o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s to E 2 h a s m e t w i t h l i m i t e d s u c c e s s p r e s u m a b l y d u e to p o o r i m m u n o g e n i c i t y as a r e s u l t o f a s s o c i a t i o n w i t h E l g l y c o p r o t e i n ( G r e e n et a l . , 1985; -34-W a x h a m a n d W o l i n s k y , 1985a , b ) . D i g e s t i o n o f i n t a c t v i r i o n s w i t h m i x e d g l y c o s i d a s e s i n d i c a t e t h e c a r b o h y d r a t e m o i e t i e s o n E 2 a r e e x t r e m e l y r e s i s t a n t t o a t t a c k , w h i l e t h o s e o n E l a r e e a s i l y r e m o v e d ( H o - T e r r y a n d C o h e n , 1984) . F r o m this d a t a , t h e a u t h o r s sugges t t h a t E 2 e p i t o p e s m a y b e b u r i e d u n d e r E l i n t h e s p i k e c o m p l e x e s . A m i n o a c i d s e q u e n c e d e r i v e d f r o m E 2 c D N A p r e d i c t s a p r o t e i n o f 2 6 2 - 3 0 0 r e s i d u e s w i t h t h r e e p o t e n t i a l g l y c o s y l a t i o n s i tes i n M 3 3 a n d H P V 7 7 s t r a i n s a n d f o u r i n T h e r i e n a n d R A 2 7 / 3 s t r a i n s ( C l a r k e et a l . , 1987; F r e y a n d M a r r , 1988; V i d g r e n et a l . , 1987; N a k h a s i et a l . , 1989; Z h e n g et a l . , 1989) . A s is t h e c a s e w i t h c a p s i d , t h e u n c e r t a i n t y i n the s i ze o f E 2 s t e m s f r o m d i s a g r e e m e n t o v e r w h e r e t h e c a r b o x y - t e r m i n u s e n d s . C o n s i d e r i n g t h e h i g h d e g r e e o f g l y c o s y l a t i o n o f E 2 , it s e e m s l i k e l y that at l east t w o i f n o t t h r e e g l y c o s y l a t i o n s i tes a r e u s e d . I m m e d i a t e l y p r e c e d i n g t h e k n o w n N - t e r m i n u s o f E 2 is a s t r e t c h o f m a i n l y n o n j p o l a r a m i n o a c i d s t h a t is b e l i e v e d t o b e a s i g n a l p e p t i d e w h i c h f u n c t i o n s t o d i r e c t E 2 t o t h e E R m e m b r a n e ( C l a r k e et a l . , 1987; V i d g r e n et a l . , 1987; F r e y a n d M a r r , 1988) . R e l e a s e o f c a p s i d f r o m t h e p l l O p o l y p r o t e i n is t h o u g h t to o c c u r f o l l o w i n g c l e a v a g e o f t h e E 2 s i g n a l p e p t i d e b y s i g n a l p e p t i d a s e , b u t w h e t h e r t h e s i g n a l s e q u e n c e is r e m o v e d f r o m t h e c a p s i d c a r b o x y - t e r m i n u s , r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d . T h e p r e d i c t e d m e m b r a n e t o p o l o g y o f E 2 is t h a t o f a t y p e 1 m e m b r a n e p r o t e i n ( S i n g e r et a l . , 1987) , w i t h a l a r g e a m i n o - t e r m i n a l e c t o p l a s m i c d o m a i n a n c h o r e d * i n t h e e n v e l o p e b y 19 h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s n e a r t h e c a r b o x y - t e r m i n u s ( C l a r k e et a l . , 1987; V i d g r e n et a l . , 1987; F r e y a n d M a r r , 1988) . W a x h a m a n d W o l i n s k y ( 1 9 8 5 b ) s h o w e d t h a t p r o c e s s i n g o f E 2 i n c l u d e s c o v a l e n t a t t a c h m e n t o f p a l m i t i c a c i d , l i k e l y s o m e w h e r e i n t h e c a r b o x y - t e r m i n a l r e g i o n . E l g l y c o p r o t e i n E l ( M W = 5 8 , 0 0 0 ) is the l a r g e s t a n d m o s t w e l l s t u d i e d o f t h e R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s a n d c o n t a i n s h e m a g g l u t i n i n ( H A ) a c t i v i t y ( W a x h a m a n d W o l i n s k y , 1983) , as w e l l as v i r a l n e u t r a l i z a t i o n ( V N ) d o m a i n s ( W a x h a m a n d W o l i n s k y , 1985a; G r e e n a n d D o r s e t t , 1986 ) : T h e l a t t e r g r o u p h a s s h o w n t h a t H A a n d V N d o m a i n s d o n o t n e c e s s a r i l y c o r r e l a t e . H o - T e r r y a n d C o h e n ( 1 9 8 5 ) h a v e l o c a l i z e d t h e H A a c t i v i t y t o a 1 3 K t r y p t i c c l e a v a g e p r o d u c t o f E l . U s i n g S t a p h y l o c o c c u s V 8 p r o t e a s e a n d t r y p s i n g e n e r a t e d p e p t i d e s f r o m E l , T e r r y et a l . ( 1 9 8 8 ) h a v e -35-l o c a l i z e d t h r e e c l u s t e r e d n o n - o v e r l a p p i n g e p i t o p e s b e t w e e n r e s i d u e s 2 4 5 - 2 8 5 i n t h e 4 8 1 a m i n o a c i d p r o t e i n ( F r e y et a l . , 1986) . C o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n assays w i t h m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s d e f i n e at l ea s t s ix n o n - o v e r l a p p i n g e p i t o p e s o n E l ( W a x h a m a n d W o l i n s k y , 1985a) . E l is t h o u g h t to b e a t y p e I m e m b r a n e p r o t e i n , a n c h o r e d i n t h e m e m b r a n e b y a 2 7 a m i n o a c i d t r a n s m e m b r a n e d o m a i n i n t h e C - t e r m i n u s o f t h e p o l y p e p t i d e ( F r e y a n d M a r r , 1988; V i d g r e n et a l . , 1987) . N e a r t h e c a r b o x y - t e r m i n u s o f E 2 p r e c e d i n g E l is a g r o u p o f 20 a m i n o a c i d s w i t h t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f a c l e a v a b l e s i g n a l s e q u e n c e ( F r e y et a l . , 1986; N a k h a s i et a l . , 1986; V i d g r e n et a l . , 1987) . L o c a t e d b e t w e e n t h e p u t a t i v e t r a n s m e m b r a n e d o m a i n o f E 2 a n d t h e E l s i g n a l p e p t i d e is a g r o u p o f s e v e n a m i n o a c i d s , five o f t h e m a r g i n i n e r e s i d u e s , w h i c h is t h o u g h t t o b e t h e s i te o f a t r y p s i n - l i k e p r o c e s s i n g i n v i v o ( V i d g r e n et a l . , 1987) . T h e p u r p o s e o f s u c h a c l e a v a g e w o u l d b e t o r e l e a s e t h e s i g n a l p e p t i d e o f E l f r o m t h e c a r b o x y - t e r m i n u s o f E 2 . L a b e l l i n g R V i n t h e p r e s e n c e o f t u n i c a m y c i n r e v e a l e d that 5 0 0 0 d a l t o n s o f c a r b o h y d r a t e is a d d e d t o E l d u r i n g p r o c e s s i n g ( O k e r - B l o m et a l . , 1983) . T h e s a m e n u m b e r o f p o t e n t i a l g l y c o s y l a t i o n s ites ( 3 ) w a s f o u n d b y s e q u e n c i n g E l c D N A f r o m M 3 3 ( C l a r k e et a l . , 1987) , T h e r i e n ( F r e y et a l . , 1986; N a k h a s i et a l . , 1986; V i d g r e n et a l . , 1987) a n d J u d i t h s t r a i n s o f R V ( T e r r y et a l . , 1988) . D i g e s t i o n o f v i r i o n s w i t h e n d o H d i d n o t r e l e a s e a n y c a r b o h y d r a t e f r o m E l * a c c o r d i n g t o O k e r - B l o m et a l (1983) . I n c o n t r a s t , B o w d e n a n d W e s t a w a y ( 1 9 8 5 ) r e p o r t t h a t b o t h h i g h m a n n o s e a n d c o m p l e x g l y c a n s a r e f o u n d o n E l a n d E 2 f r o m lysates o f R V - i n f e c t e d ce l l s . E l a l s o c o n t a i n s c o v a l e n t l y b o u n d fat ty a c i d ( W a x h a m a n d W o l i n s k y , 1 9 8 5 b ) . R e p l i c a t i o n H u m a n s a r e t h e o n l y n a t u r a l h o s t f o r R V , a n d i n f e c t i o u s v i r u s c a n b e i s o l a t e d f r o m p e r i p h e r a l b l o o d m o n o n u c l e a r ce l l s f o l l o w i n g n a t u r a l a n d v a c c i n e - i n d u c e d i n f e c t i o n s ( B u i m o v i c i - K l e i n a n d C o o p e r , 1979; C h a n t l e r a n d T i n g l e , 1982) . I n p e r s i s t e n t l y i n f e c t e d i n d i v i d u a l s , v i r u s h a s b e e n r e c o v e r e d f r o m eye a n d b r a i n t i s sue , a n d s y n o v i a l m o n o n u c l e a r c e l l s ( M e n s e r et a l . , 1967; W e i l et a l . , 1975; C h a n t l e r et a l . , 1981, 1982, 1985) . N o a n i m a l m o d e l exists t h a t f a i t h f u l l y m i m i c s t h e h u m a n d i s e a s e , b u t a n u m b e r o f l a b o r a t o r y a n i m a l s c a n b e i n f e c t e d -36-r e s u l t i n g i n o n l y s u b c l i n i c a l s y m p t o m s . B H K , R K - 1 3 , a n d V e r o c e l l s a r e t h e m o s t c o m m o n l y u s e d c e l l l i n e s f o r p r o d u c t i o n o f l a r g e a m o u n t s o f v i r u s . E v e n t h o u g h R V a p p e a r s v e r y s i m i l a r to a l p h a v i r u s e s i n s t r u c t u r e a n d s t r u c t u r a l p r o t e i n e x p r e s s i o n , t h e r e p l i c a t i o n c y c l e k i n e t i c s a r e v e r y d i f f e r e n t . C e l l s i n f e c t e d w i t h a l p h a v i r u s e s g e n e r a l l y r e a c h m a x i m a l r a t e s o f v i r u s p r o d u c t i o n f o u r to e i g h t h o u r s a f t e r i n f e c t i o n r e s u l t i n g i n c e l l d e a t h w i t h i n 12-24 h o u r s ( K a a r i a i n e n a n d S o d e r l u n d , 1978) . R u b e l l a v i r u s i n c o n t r a s t , h a s a l a t e n t p e r i o d g r e a t e r t h a n 12 h o u r s a n d r e a c h e s p e a k v i r u s p r o d u c t i o n b e t w e e n 24 a n d 48 h o u r s p o s t - i n f e c t i o n d e p e n d i n g o n c e l l t y p e ( H e m p h i l l et a l . , 1988) . C y t o p a t h i c e f fec t i s m i n i m a l i n m o s t c e l l l i n e s , a n d h o s t c e l l p r o t e i n syn thes i s s e e m s to b e o n l y m o d e r a t e l y d e c r e a s e d . V i r a l p r o g e n y r e l e a s e d p e r c e l l is less t h a n 100 w i t h R V c o m p a r e d to 1000-10 ,000 f o r a l p h a v i r u s e s ( K a a r i a i n e n a n d S o d e r l u n d , 1978; W e n g l e r , 1980) . It h a s b e e n s u g g e s t e d that t h e a t t a c h m e n t o r r e p l i c a t i o n o f R V is d e p e n d e n t u p o n a c e l l - c y c l e s p e c i f i c f a c t o r i n c u l t u r e d ce l l s i n l i g h t o f t h e i n a b i l i t y t o a c h i e v e i n f e c t i o n of; g r e a t e r t h a n 1 0 % o f the ce l l s a f t er i n i t i a l a d s o r p t i o n ( H e m p h i l l et a l . , 1988; S e d w i c k a n d S o k o l , 1970; W o n g et a l . , 1969) . E v e n t u a l l y a l l o f the ce l l s i n c u l t u r e b e c o m e i n f e c t e d . A n o t h e r i n t e r e s t i n g f e a t u r e o f R V is t h e a b i l i t y to c a u s e a p e r s i s t e n t i n f e c t i o n i n e v e r y c e l l l i n e t e s t e d ( S t a n w i c k a n d H a l l u m , 1974; N o r v a l , 1979; C u n n i n g h a m a n d F r a s e r , 1985) . U n l i k e a l p h a v i r u s e s w h i c h r e q u i r e t h e p r e s e n c e o f d e f e c t i v e i n t e r f e r i n g ( D I ) p a r t i c l e s f o r i n i t i a t i o n o f p e r s i s t e n c e ( W e i s s et a l . , 1980) , th i s p r o p e r t y s e e m s to b e D I p a r t i c l e - i n d e p e n d e n t i n R V ( F r e y a n d H e m p h i l l , 1988) . T h e l a t t e r a u t h o r s d o sugges t that D I p a r t i c l e s m a y b e i n v o l v e d i n l o n g - t e r m s t a b i l i z a t i o n o f p e r s i s t e n c e i n R V - i n f e c t e d ce l l s . P r o b l e m s o f s l o w r e p l i c a t i o n a n d l o w v i r u s y i e l d h a v e h i n d e r e d t h e g a t h e r i n g o f i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g m o l e c u l a r d e t a i l s o f R V r e p l i c a t i o n . T h e a s s u m p t i o n h a s b e e n that t h e r e p l i c a t i o n s c h e m e s o f R V a n d a l p h a v i r u s e s a r e v e r y s i m i l a r . N o r t h e r n b l o t a n a l y s i s o f R V - i n f e c t e d c e l l s i n d i c a t e that a g e n o m i c - l e n g t h n e g a t i v e s t r a n d R N A s p e c i e s is p r e s e n t ( H e m p h i l l et a l . , 1988) . T h i s g r o u p a l s o f o u n d t h a t the 2 4 S s u b g e n o m i c m R N A w a s p r o d u c e d i n l a r g e r a m o u n t s t h a n t h e 4 0 S p l u s R N A , a n d c o n c l u d e d b o t h o f t h e s e p l u s - s t r a n d R N A s a r e -37-d e r i v e d f r o m t h e n e g a t i v e - s t r a n d i n t e r m e d i a t e . E x a m i n a t i o n o f t h e R N A f r o m R V D I p a r t i c l e s r e v e a l e d that t h e 3' e n d o f t h e g e n o m e w a s a l w a y s p r e s e n t as is t h e c a s e w i t h a l p h a v i r u s e s ( F r e y a n d H e m p h i l l , 1988; M o n r o e et a l . , 1982; L e h t o v a a r a et a l . , 1982) . N o i n f o r m a t i o n is a v a i l a b l e a b o u t t h e 5' e n d o f t h e R V 4 0 S R N A as it h a s n o t ye t b e e n c h a r a c t e r i z e d . I n R V - i n f e c t e d ce l l s , B o w d e n a n d W e s t a w a y (1984) f o u n d a p a r t f r o m t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s , o t h e r p r o m i n e n t p o l y p e p t i d e s o f 150 ,000 ( n s l 5 0 ) a n d 87 ,000 ( n s 8 7 ) d a l t o n s w h i c h t h e y i n t e r p r e t e d to b e n o n s t r u c t u r a l a n t i g e n s . I n a d d i t i o n t h e y i d e n t i f i e d m i n o r p r o t e i n s s p e c i e s w i t h s i zes o f 111 ,000 ( n s l l O ) , 92 ,000 (ns92 ) , 77 ,500 (ns 77 .5) , 75 ,000 ( n s 7 5 ) , 27 ,000 ( n s 2 7 ) , 20 ,000 ( n s 2 0 ) a n d 17 ,000 ( n s l 7 ) . P u l s e - c h a s e e x p e r i m e n t s i n d i c a t e d that n s l 5 0 w a s d e r i v e d f r o m a 200 ,000 d a l t o n p r e c u r s o r . S o m e o f t h e p r o t e i n s i d e n t i f i e d b y th is g r o u p , n a m e l y n s l l O , n s 9 2 , n s 7 5 , a n d n s 2 7 m a y b e e q u i v a l e n t t o t h e p l 0 9 , p 9 2 , p 7 5 , a n d p 2 8 / 2 9 i n R V - i n f e c t e d R K - 1 3 c e l l s ( C h a n t l e r , 1 9 7 9 ) . B o w d e n a n d W e s t a w a y d o n o t r u l e o u t t h e p o s s i b i l i t y t h a t s o m e o f t h e s e p r o t e i n s i e . n s l l O a n d n s 9 2 m a y b e d i s u l f i d e - l i n k e d d i m e r s o f E l a n d E 1 - E 2 r e p o r t e d p r e v i o u s l y w i t h s i zes o f 1 0 5 - 1 0 9 K a n d 9 5 - 9 6 K ( H o - T e r r y a n d C o h e n , 1980; O k e r - B l o m et a l . , 1983; W a x h a m a n d W o l i n s k y , 3 1 9 8 3 ) . T h e y f e e l th i s is u n l i k e l y h o w e v e r d u e to t h e f a i l u r e to d e t e c t H - m a n n o s e i n c o r p o r a t i o n i n t o t h e s e p r o t e i n s . O b v i o u s l y m o r e w o r k s u c h as t r y p t i c m a p p i n g a n d N - t e r m i n a l s e q u e n c i n g m u s t b e d o n e t o r u l e o u t s u c h p o s s i b i l i t i e s . I n v i e w o f t h e l i m i t e d d a t a a v a i l a b l e r e g a r d i n g R V r e p l i c a t i o n , it s e e m s t h e o v e r a l l s c h e m e is v e r y s i m i l a r to that o f a l p h a v i r u s e s , e x c e p t that t h e l a t e n t p e r i o d o f R V is l o n g e r , a n d t h e k i n e t i c s m u c h s l o w e r . C l o n i n g o f the n o n s t r u c t u r a l g e n e s o f R V s h o u l d c l a r i f y t h e p i c t u r e i m m e n s e l y . E x p r e s s i o n s t u d i e s N a k h a s i et a l . ( 1986 ) r e p o r t e d c l o n i n g a n d e x p r e s s i o n o f R V E l i n C O S ce l l s , b u t t h e i r r e s u l t s r e m a i n q u e s t i o n a b l e . T h e E l c o n s t r u c t t h e y u s e d , i n a d d i t i o n to o n l y e n c o d i n g a 4 1 0 a m i n o a c i d p r o t e i n , l a c k e d a f u n c t i o n a l s i g n a l p e p t i d e , ye t s u p p o s e d l y d i r e c t e d s y n t h e s i s o f a 5 8 K p r o t e i n i n t r a n s f e c t e d C O S ce l l s . R V E l is k n o w n to b e 4 8 1 a m i n o a c i d s l o n g ( F r e y et a l . , -38-1986; V i d g r e n et a l . , 1987; C l a r k e et a l . , 1988) , a n d p r e v i o u s s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s t h a t l a c k s i g n a l p e p t i d e s d o n o t b e c o m e g l y c o s y l a t e d , a n d a r e d e g r a d e d v e r y q u i c k l y i n t h e c y t o p l a s m ( G e t h i n g a n d S a m b r o o k , 1982; S e k i k i w a a n d L a i , 1983; J a b b a r a n d N a y a k , 1987) . B a s e d o n t h e s e o b s e r v a t i o n s , it is u n l i k e l y that t h e p r o t e i n N a k h a s i et a l . r e p o r t e d is R V E l . I n 1987 C l a r k e et a l . r e p o r t e d t h e c l o n i n g a n d s e q u e n c i n g o f t h e R V 2 4 S m R N A . S P 6 R N A p o l y m e r a s e w a s u s e d t o t r a n s c r i b e m R N A f r o m t h e c D N A , a n d t h e n t h e R N A w a s t r a n s l a t e d u s i n g a r a b b i t r e t i c u l o c y t e c e l l - f r e e t r a n s l a t i o n s y s t e m . I n t h e a b s e n c e o f p a n c r e a t i c m i c r o s o m e s , a R V - s p e c i f i c p r o t e i n o f a p p r o x i m a t e l y 110 ,000 d a l t o n s w a s p r o d u c e d w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e p l l O p r e c u r s o r d e s c r i b e d b y O k e r - B l o m et a l . ( 1984) . T r a n s l a t i o n o f t h e m R N A i n t h e p r e s e n c e o f m i c r o s o m e s r e s u l t e d i n s o m e p r o c e s s i n g t o s m a l l e r p r o t e i n s w h i c h c o r r e s p o n d e d to E l , E 2 a n d C . T h e R V 2 4 S c D N A w a s s u b c l o n e d i n t o a n S V 4 0 e x p r e s s i o n v e c t o r a n d t r a n s f e c t e d i n t o C O S ce l l s r e s u l t i n g i n syn thes i s o f p r o t e i n s a n t i g e n i c a l l y s i m i l a r t o E l , E 2 , a n d C ( C l a r k e et a l . , 1988) . T r e a t m e n t o f the t r a n s f e c t e d C O S ce l l s w i t h t u n i c a m y c i n c o n f i r m e d t h a t E l a n d E 2 c o n t a i n N - l i n k e d g l y c a n s ( O k e r - B l o m et a l . , 1983; C l a r k e et a l . , 1988) . T w o o t h e r r e p o r t s o f R V E l e x p r e s s i o n h a v e b e e n p u b l i s h e d i n 1989. d e M a z a n c o u r t a n d P e r r i c a u d e t ( 1989) u s i n g a c y t o m e g a l o v i r u s - b a s e d v e c t o r c o n t a i n i n g a m i n o a c i d s 17 -481 o f T h e r i e n E l f u s e d t o t h e t r a n s l a t i o n s tart site o f S V 4 0 l a r g e T a n t i g e n g e n e , o b t a i n e d t r a n s i e n t e x p r e s s i o n o f E l i n 2 9 3 ce l l s . D e t e c t i o n o f R V a n t i g e n w a s a c c o m p l i s h e d u s i n g i m m u n o f l u o r e s c e n c e o n l y , a n d n o o t h e r d e t a i l s r e g a r d i n g p r o t e i n s i ze , s tab i l i ty , o r i n t r a c e l l u l a r l o c a t i o n w e r e r e p o r t e d . T e r r y et a l . ( 1989 ) d e s i g n e d R V E l c o n s t r u c t s as f u s i o n p r o t e i n s w i t h t h e I g G - b i n d i n g r e g i o n o f S . a u r e u s p r o t e i n A e n a b l i n g e x p r e s s i o n i n E . c o l i . O n e p l a s m i d e n c o d e d t h e e n t i r e E l g e n e , w h i l e t h e o t h e r c o n t a i n e d o n l y a m i n o a c i d s 207 -353 w h i c h c o m p r i s e s a r e g i o n t h e y p r e v i o u s l y i d e n t i f i e d to c o n t a i n t h r e e n o n - o v e r l a p p i n g e p i t o p e s ( T e r r y et a l . , 1988) . B o t h f u s i o n p r o t e i n s r e a c t e d o n W e s t e r n b l o t s to m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s r a i s e d a g a i n s t w h o l e v i r u s c o n f i r m i n g that t h e r e a r e g l y c o s y l a t i o n i n d e p e n d e n t e p i t o p e s o n E l . I n t r o d u c t i o n o f t h e b i o e n g i n e e r e d E l f u s i o n p r o t e i n s i n t o r a b b i t s r e s u l t e d i n t h e p r o d u c t i o n o f l o w l e v e l s o f -39 -n e u t r a l i z i n g a n t i b o d i e s , h o w e v e r n o h e m a g g l u t i n a t i o n i n h i b i t i n g a n t i b o d i e s w e r e i d e n t i f i e d . F r o m t h e s e d a t a t h e a u t h o r s c o n c l u d e d that t h e s e E l f u s i o n p r o t e i n s w e r e p o o r l y i m m u n o g e n i c i n t h e i r p r e s e n t f o r m . P r o j e c t r a t i o n a l e a n d t h e s i s o b j e c t i v e s D e s p i t e b e i n g a n i m p o r t a n t h u m a n p a t h o g e n , t h e c e l l b i o l o g y o f R V r e m a i n s p o o r l y c h a r a c t e r i z e d . M u c h o f th i s l a c k o f i n f o r m a t i o n is a r e s u l t o f t h e d i f f i c u l t y i n g r o w i n g o f R V a n d t h e s u b s e q u e n t p o o r y i e l d s o f b i o l o g i c a l l y ac t ive v i r u s . T h i s , a n d t h e a p p a r e n t s i m i l a r i t y o f R V w i t h p r o t o t y p e a l p h a v i r u s e s , h a s left R V i n v e s t i g a t o r s w i t h f e w a l t e r n a t i v e s b u t t o c o n s t a n t l y r e f e r to a l p h a v i r u s m o d e l s . D e s p i t e t h e s i m i l a r i t i e s i n g e n o m e o r g a n i z a t i o n a n d s t r u c t u r a l p r o t e i n e x p r e s s i o n s tra teg ies , R V is c l e a r l y v e r y d i f f e r e n t f r o m a l p h a v i r u s e s w h e n o n e c o n s i d e r s t h e r e l a t i v e l y l o n g l a t e n c y p e r i o d , s l o w r e p l i c a t i o n k i n e t i c s a n d l i m i t e d c y t o p a t h o l o g y e x h i b i t e d b y R V i n f e c t i o n i n c u l t u r e d ce l l s . I n a d d i t i o n , i n i t i a t i o n o f p e r s i s t e n t i n f e c t i o n b y R V d o e s n o t s e e m t o b e d e p e n d e n t u p o n the p r e s e n c e o f d e f e c t i v e - i n t e r f e r i n g p a r t i c l e s . T h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s o f R V m u s t c o n t a i n i n f o r m a t i o n that f a c i l i t a t e s t h e i r d e l i v e r y f r o m t h e s i te o f s y n t h e s i s to a l o c a t i o n w i t h i n t h e c e l l w h e r e v i r i o n a s s e m b l y t a k e s p l a c e . C o n s e q u e n t l y t a r g e t i n g a n d t r a n s p o r t o f R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s e x p r e s s e d f r o m c D N A s s h o u l d p a r a l l e l e v e n t s w h i c h o c c u r i n i n f e c t e d ce l l s . U s i n g j n v i t r o a n d j n v i v o e x p r e s s i o n s y s t e m s t o e x p r e s s R V c D N A s , t h e a i m o f th is p r o j e c t is t o c h a r a c t e r i z e e v e n t s s u c h as p r o c e s s i n g o f R V p l l O p r e c u r s o r , t a r g e t i n g to t h e E R m e m b r a n e , a n d i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t i n C O S ce l l s . I n a d d i t i o n t h e n u m b e r o f N - l i n k e d g l y c a n s o n E l a n d E2 w i l l b e d e t e r m i n e d a n d t h e p o s s i b l e i m p o r t a n c e o f g l y c o s y l a t i o n i n p r o t e i n t a r g e t i n g w i l l b e d i s c u s s e d . -40-M A T E R I A L S a n d M E T H O D S M a t e r i a l s a n d s u p p l i e s D N A m o d i f y i n g e n z y m e s a n d r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s w e r e p u r c h a s e d f r o m B e t h e s d a R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s ( B R L ) , P r o m e g a B i o t e c , N e w E n g l a n d B i o l a b s , B o e h r i n g e r M a n n h e i m , 3 P h a r m a c i a , a n d U n i t e d S t a t e s B i o c h e m i c a l C o r p . [9,10 H ] - P a l m i t i c a c i d (28 .5 C i / m m o l e ) , [ 3 2 P ] - A T P (3000 C i / m m o l e ) , a n d L [ 3 5 S ] - m e t h i o n i n e (600-800 C i / m m o l e ) w e r e f r o m A m e r s h a m a n d / o r N e w E n g l a n d N u c l e a r . F l u o r e s c e i n - c o n j u g a t e d g o a t a n t i - h u m a n I g G w a s f r o m K i r k e g a a r d a n d P e r r y L a b o r a t o r i e s o r T a g o I n c . , a n d R h o d a m i n e ( T R I T C ) - c o n j u g a t e d g o a t a n t i - m o u s e a n t i b o d y w a s f r o m Z y m e d . A n t i - R u b e l l a h u m a n s e r u m w a s a gif t f r o m D r . A u b r e y T i n g l e , D e p t . o f P e d i a t r i c s , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a . M o u s e m o n o c l o n a l s t o E l w e r e p r o d u c e d i n th is l a b p r e v i o u s l y , a n d o t h e r s w e r e o b t a i n e d f r o m D r . J o h n S a f f o r d , A b b o t t L a b o r a t o r i e s . A n t i - C m o n o c l o n a l a n t i b o d y w a s a l s o o b t a i n e d f r o m D r . J o h n S a f f o r d . M o n o c l o n a l s t o E 2 w e r e a gift f r o m D r . J e r r y W o l i n s k y , D e p t o f N e u r o l o g y , U n i v e r s i t y o f T e x a s , H o u s t o n . T i s s u e c u l t u r e r e a g e n t s w e r e f r o m G i b c o a n d S i g m a . T R I T C - c o n j u g a t e d l e c t i n s w e r e f r o m S i g m a , a n d C O S ce l l s w e r e o b t a i n e d f r o m D r . D a v i d R u s s e l l ( D e p t . o f M o l e c u l a r G e n e t i c s , U n i v e r s i t y o f T e x a s , D a l l a s ) . E . c o l i s t r a i n s D H 5 « a n d D H 5 * F ' ce l l s w e r e p u r c h a s e d f r o m B R L , a n d C J 2 3 6 w a s o b t a i n e d f r o m B i o - R a d . P r o p a g a t i o n a n d h a n d l i n g o f E . c o l i s t r a i n s E . c o l i s t r a i n s c o n t a i n i n g r e c o m b i n a n t p l a s m i d s w e r e g r o w n i n L B m e d i u m ( 1 % t r y p t o n e ; 0 . 5 % y e a s t ex trac t ; 1% N a C l ) c o n t a i n i n g 100 j i g / m l a m p i c i l l i n . C J 2 3 6 ce l l s w e r e g r o w n i n m e d i u m c o n t a i n i n g 3 0 pg/ml c h l o r a m p h e n i c o l t o m a i n t a i n the F ' f a c t o r . F o r l o n g t e r m s t o r a g e t h e b a c t e r i a l s t r a i n s w e r e s t o r e d i n 1 5 % g l y c e r o l at - 7 0 ° C . F o r s c r e e n i n g M 1 3 r e c o m b i n a n t s , t r a n s f o r m e d D H 5 < F ' ce l l s w e r e m i x e d at 4 5 ° C w i t h t h r e e m l o f Y T t o p a g a r ( 0 . 8 % t r y p t o n e ; 0 . 5 % y e a s t ex trac t ; 0 . 5 % N a C l ; 0 . 6 % a g a r ) c o n t a i n i n g 0.05 m l o f 5 - b r o m o - 4 - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o y l - ^ - D - g a l a c t o s i d e ( X G A L ) at 2 m g / m l i n d i m e t h y l f o r m a m i d e a n d 0.02 m l o f 100 m M i s o p r o p y l - f t - D t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ( I P T G ) , a n d p o u r e d o n t o Y T a g a r ( 1 . 5 % ) - 4 1 -p l a t e s . R e c o m b i n a n t s g a v e r i s e t o c l e a r p l a q u e s , w h i l e w i l d t y p e p l a q u e s w e r e b l u e . P h a g e w e r e p r o p a g a t e d b y i n f e c t i n g D H S l F ce l l s w i t h i s o l a t e d p l a c q u e s , a n d g r o w i n g i n 2 X Y T b r o t h ( 1 . 6 % t r y p t o n e ; 1 % y e a s t ex trac t ; 0 . 5 % N a C l ) f o r six h o u r s . Preparation of competent cells and transformation C o m p e t e n t ce l l s w e r e p r e p a r e d u s i n g a m e t h o d d e s c r i b e d i n P r o m e g a - B i o t e c t e c h n i c a l b u l l e t i n 018 . B r i e f l y , E . c o l i ce l l s w e r e g r o w n i n 2 0 m l o f L B b r o t h u n t i l t h e a b s o r b a n c e at 6 0 0 n m r e a c h e d 0 .3-0 .5 . C e l l s w e r e c e n t r i f u g e d at 5 0 0 0 r p m i n a S o r v a l l S S 3 4 r o t o r at 4 ° C f o r f ive m i n u t e s , a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s d i s c a r d e d . A l l s u b s e q u e n t p r o c e d u r e s w e r e c a r r i e d o u t at 4 ° C . T h e b a c t e r i a l p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n 10 m l o f c o l d s o l u t i o n A [10 m M M O P S ( p H 7.0); 10 m M R b C l ] , a n d c e n t r i f u g e d as a b o v e . C e l l s w e r e t h e n g e n t l y r e s u s p e n d e d i n 10 m l o f i c e - c o l d s o l u t i o n B [10 m M M O P S ( p H 6.5); 10 m M R b C l ; 5 0 m M C a C y a n d h e l d o n i c e f o r 3 0 m i n u t e s . A f t e r p e l l e t i n g t h e ce l l s as a b o v e , t h e y w e r e r e s u s p e n d e d i n 1 m l o f s o l u t i o n B p l u s 1 5 % g l y c e r o l , a n d q u i c k f r o z e n i n 0.2 m l a l i q u o t s i n d r y i c e - e t h a n o l a n d s t o r e d at - 7 0 ° C . T o t r a n s f o r m c o m p e t e n t ce l l s , 10-50 n g o f D N A w a s a d d e d t o 0.2 m l o f c o m p e t e n t ce l l s , m i x e d g e n t l y a n d k e p t at 0 ° C f o r 20-30 m i n u t e s . A f t e r a t w o m i n u t e h e a t s h o c k at 3 7 ° C , 1 m l o f L B b r o t h w a s a d d e d to t h e t r a n s f o r m a t i o n m i x t u r e a n d the ce l l s w e r e a l l o w e d t o r e c o v e r at 3 7 ° C f o r o n e h o u r b e f o r e p l a t i n g o n t o s e l ec t i ve m e d i a . T r a n s f o r m a t i o n o f D H 5 < F o r C J 2 3 6 c e l l s w a s i d e n t i c a l t o t h e p r o c d u r e a b o v e e x c e p t that ce l l s w e r e p l a t e d o u t o n t o Y T p l a t e s w i t h o u t a n t i b i o t i c . Isolation of plasmid and single-stranded DNA from E.coli Mini-prep plasmid DNA isolation T h i s p r o c e d u r e w a s e m p l o y e d to i so la t e p l a s m i d D N A o r M 1 3 r e c o m b i n a n t r e p l i c a t i v e f o r m ( R F ) D N A f r o m s m a l l l i q u i d c u l t u r e s (1 .5-3.0 m l ) , a n d is e s s e n t i a l l y t h e a l k a l i n e - l y s i s m e t h o d d e s c r i b e d b y M a n i a t i s et a l . (1982) . B a c t e r i a l ce l l s f r o m 1.5 m l o f c u l t u r e w e r e p e l l e t e d f o r o n e m i n u t e i n a m i c r o f u g e , a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s d i s c a r d e d . T h e p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d -42-i n 100 pi o f 5 0 m M g l u c o s e ; 10 m M E D T A ; 25 m M T r i s - C l ( p H 8 .0 ) ) a n d l y s e d b y t h e a d d i t i o n o f 2 0 0 pi o f 0 . 2 N N a O H ; 1% S D S f o r f ive m i n u t e s at 0 ° . C h r o m o s o m a l D N A a n d p r o t e i n s w e r e p r e c i p i t a t e d b y i n c u b a t i n g t h e lysis m i x t u r e w i t h 150 p\ o f c o l d p o t a s s i u m a c e t a t e ( 3 M K + ; 5 M C K j C O O " ( p H 4 .8) ) at 0 ° C f o r five m i n u t e s , f o l l o w e d b y c e n t r i f u g i n g i n a m i c r o f u g e f o r five m i n u t e s at 4 ° C . T h e s u p e r n a t a n t w a s e x t r a c t e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f p h e n o l x h l o r o f o r m (1:1) , a n d D N A p r e c i p i t a t e d w i t h t w o v o l u m e s o f e t h a n o l at r o o m t e m p e r a t u r e ( R T ) f o r f ive m i n u t e s . P l a s m i d D N A w a s r e c o v e r e d b y c e n t r i f u g a t i o n i n a m i c r o f u g e f o r five m i n u t e s at R T , w a s h e d i n 7 0 % e t h a n o l , d r i e d i n a S p e e d V a c C o n c e n t r a t o r , a n d r e s u s p e n d e d i n 5 0 p i o f T E [10 m M T r i s - C l ( p H 8.0); 1 m M E D T A ] c o n t a i n i n g 2 0 p g / m l R N A s e A . A l i q u o t s w e r e u s e d f o r r e s t r i c t i o n a n a l y s i s o r s u b c l o n i n g . L a r g e s c a l e p l a s m i d D N A p r e p s T h e p r o t o c o l is a p r o c e d u r e o b t a i n e d f r o m P r o m e g a B i o t e c t e c h n i c a l b u l l e t i n 0 0 9 d e v e l o p e d b y D r . P K r i e g a n d D r . D . M e l t o n o f H a r v a r d U n i v e r s i t y , b u t w i t h s l i ght m o d i f i c a t i o n s . C e l l s g r o w n i n s e l ec t i ve m e d i a o v e r n i g h t i n 250 m l c u l t u r e s w e r e p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n at 5 0 0 0 r p m i n a S o r v a l l G S A r o t o r at 4 ° C f o r five m i n u t e s . T h e p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n five m l o f 5 0 m M G l u c o s e ; 10 m M E D T A ; 25 m M T r i s - C l ( p H 8 .0) , t h e n 2 0 m g o f l y s o z y m e d i s s o l v e d i n o n e m l o f t h e s a m e b u f f e r w a s a d d e d , a n d t h e m i x t u r e i n c u b a t e d ! o n i c e . T w e n t y m i n u t e s l a t e r , ce l l s w e r e l y s e d b y a d d i t i o n o f 12 m l o f 0.2 N N a O H ; 1 % S D S a n d i n c u b a t i o n o n i c e f o r 10 m i n u t e s . C h r o m o s o m a l D N A a n d p r o t e i n s w e r e p r e c i p i t a t e d w i t h e i g h t m l o f c o l d p o t a s s i u m a c e t a t e s o l u t i o n ( see m i n i - p r e p p r o c e d u r e ) o n i c e f o r 2 0 m i n u t e s , f o l l o w e d b y c e n t r i f u g a t i o n at 10 ,000 r p m i n a S S 3 4 r o t o r at 4 ° C f o r 15 m i n u t e s . R N A s e A (100 p g ) w a s a d d e d t o t h e c l e a r e d lysate f o l l o w e d b y i n c u b a t i o n at 3 7 ° C f o r 3 0 - 4 5 m i n u t e s . T h e ly sa te w a s e x t r a c t e d t w i c e w i t h e q u a l v o l u m e s o f p h e n o l x h l o r o f o r m , a n d t h e n u c l e i c a c i d s p r e c i p i t a t e d w i t h o n e v o l u m e o f i s o p r o p a n o l at R T f o r five m i n u t e s . R e m a i n i n g n u c l e i c a c i d s w e r e r e c o v e r e d i n s i l i c o n i z e d C o r e x t u b e s b y c e n t r i f u g i n g at 10 ,000 r p m f o r 10 m i n u t e s at R T i n a S S 3 4 r o t o r . T h e p e l l e t w a s d r i e d , a n d d i s s o l v e d i n 1.6 m l o f s t e r i l e w a t e r . D N A w a s s e l e c t i v e l y p r e c i p i t a t e d b y a d d i t i o n o f 0.4 m l o f 4 M N a C l a n d 2.0 m l 1 3 % p o l y e t h y l e n e g l y c o l ( P E G m w 8 ,000) , m i x i n g a n d -43-i n c u b a t i o n o n i c e f o r 6 0 m i n u t e s . T h e p l a s m i d D N A w a s p e l l e t e d i n s i l i c o n i z e d C o r e x t u b e s at 10 ,000 r p m f o r 15 m i n u t e s at 4 ° C i n a S S 3 4 r o t o r , w a s h e d w i t h 7 0 % e t h a n o l , d r i e d , a n d d i s s o l v e d i n T E . I s o l a t i o n o f s i n g l e - s t r a n d e d D N A M 1 3 m p l 8 o r m p l 9 r e c o m b i n a n t s w e r e p r o p a g a t e d b y a d d i n g a f r e s h l y c o r e d p l a q u e t o 2 m l o f 2 X Y T c o n t a i n i n g 2 0 u l o f s t a t i o n a r y p h a s e D H 5 * F ce l l s , a n d s h a k i n g v i g o r o u s l y at 3 7 ° C f o r f ive t o s e v e n h o u r s . C e l l s f r o m 1.5 m l o f c u l t u r e w e r e p e l l e t e d b y c e n t r i f u g i n g i n a m i c r o f u g e f o r f ive m i n u t e s at R T , a n d R F D N A w a s i s o l a t e d as d e s c r i b e d i n " m i n i - p r e p s " u s i n g t h e a l k a l i n e - l y s i s m e t h o d . P h a g e w e r e p r e c i p i t a t e d f r o m t h e s u p e r n a t a n t b y a d d i t i o n o f 0 .25 m l o f 2 5 % P E G ( m w 8 ,000); 2.5 M N a C l , v o r t e x i n g , a n d i n c u b a t i n g at R T f o r 2 0 m i n u t e s . P h a g e w e r e s p u n d o w n f o r f ive m i n u t e s i n a m i c r o f u g e , the s u p e r n a t a n t c a r e f u l l y a s p i r a t e d , a n d t h e p e l l e t r e s u s p e n d e d i n 0.1 m l o f T E b y v i g o r o u s v o r t e x i n g . T h e s u s p e n s i o n w a s s u c c e s s i v e l y e x t r a c t e d w i t h e q u a l v o l u m e s o f p h e n o l , p h e n o l x h l o r o f o r m , a n d e t h e r . T e n j i l o f 3 M s o d i u m a c e t a t e ( p H 5 .5) w a s a d d e d f o l l o w e d b y 0.25 m l o f e t h a n o l , a n d t h e s s D N A r e c o v e r e d b y c e n t r i f u g a t i o n a f t e r 3 0 m i n u t e s at - 2 0 ° C . T h e D N A w a s w a s h e d w i t h 7 0 % e t h a n o l , d r i e d , r e s u s p e n d e d i n 3 0 u l T E , a n d u s e d f o r s e q u e n c i n g o r o l i g o n u c l e o t i d e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s . O l i g o n u c l e o t i d e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s P u r i f i c a t i o n a n d p h o s p h o r y l a t i o n o f o l i g o n u c l e o t i d e s D e o x y r i b o - o l i g o n u c l e o t i d e s w e r e s y n t h e s i z e d i n the l a b o r a t o r y o f D r . M . S m i t h ( U B C , D e p t . o f B i o c h e m i s t r y ) . T h e c r u d e o l i g o n u c l e o t i d e w a s d i s s o l v e d i n o n e m l o f s t e r i l e w a t e r a n d l o a d e d o n t o a C 1 8 S E P - P A K ( W a t e r s S c i e n t i f i c ) that h a d b e e n p r e t r e a t e d w i t h 10 m l o f H P L C g r a d e a c e t o n i t r i l e a n d t h e n 10 m l o f s t e r i l e w a t e r . U n b o u n d m a t e r i a l w a s w a s h e d f r o m t h e r e v e r s e - p h a s e c o l u m n w i t h 10 m l o f w a t e r , a n d the b o u n d o l i g o n u c l e o t i d e w a s e l u t e d w i t h t h r e e m l o f 2 0 % a c e t o n i t r i l e i n t h r e e o n e m l f r a c t i o n s . S p e c t r o p h o t o m e t r y at 2 6 0 n m i n d i c a t e d t h a t 8 0 - 9 0 % o f t h e A-j^o msA&xl2^ w a s f o u n d i n the first f r a c t i o n . T h e s a m p l e w a s d r i e d i n a S p e e d V a c , r e d i s s o l v e d i n 0 .5-1.0 m l o f w a t e r , a n d the c o n c e n t r a t i o n d e t e r m i n e d b y r e a d i n g t h e -44-a b s o r b a n c e at 260 n m . O l i g o n u c l e o t i d e c o n c e n t r a t i o n s w e r e a d j u s t e d to 10-20 n m o l e s / m l , a n d 100-200 p m o l e s o f m u t a g e n i c o l i g o n u c l e o t i d e w a s k i n a s e d i n 3 0 ^ i l o f 5 0 m M T r i s - C l ( p H 7.5); 10 m M M g C l 2 ; 10 m M D T T ; 0.33 m M A T P ; 3 0 0 u n i t s / m l T 4 p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e f o r 4 5 m i n u t e s at 3 7 ° C . R e a c t i o n s w e r e t e r m i n a t e d b y h e a t i n g at 6 5 ° C f o r 10 m i n u t e s . M u t a g e n e s i s S i n g l e p r i m e r m u t a g e n e s i s b a s e d o n t h e m e t h o d o f K u n k e l ( 1985) w i t h m i n o r m o d i f i c a t i o n s w a s e m p l o y e d to i n t r o d u c e d e s i r e d c h a n g e s i n t a r g e t D N A . U r a c i l - c o n t a i n i n g s i n g l e - s t r a n d e d t e m p l a t e w a s i s o l a t e d f r o m p h a g e g r o w n o n C J 2 3 6 c e l l s i n 2 X Y T w i t h 0 .25 pg/ml u r i d i n e . K i n a s e d m u t a g e n i c o l i g o n u c l e o t i d e (5-10 p m o l e ) w a s a n n e a l e d to the t e m p l a t e D N A (0 .5-1 .0 p m o l e ) i n 10 pi o f 2 0 m M T r i s - C l ( p H 7.4); 10 m M M g C l 2 ; 5 0 m M N a C l at 7 0 ° C f o r five m i n u t e s , t h e n a l l o w e d to c o o l t o < 3 0 ° C o v e r 30 -45 m i n u t e s . E x t e n s i o n o f t h e p r i m e r w a s c a r r i e d o u t i n 15 pi o f 0 .5 m M e a c h d N T P ; 1 m M A T P ; 3 0 m M T r i s - C l ( p H 7.4); 15 m M M g C l 2 ; 5 0 m M N a C l ; 2 m M D T T f o r 10 m i n u t e s o n i ce , t h e n 3 7 ° C f o r 9 0 m i n u t e s . R e a c t i o n s w e r e t h e n d i l u t e d to 5 0 ^ i l w i t h T E o r w a t e r , a n d 5 ^ i l w a s u s e d to t r a n s f o r m D H S ( F ' ce l l s . N o t e , s o m e e x t e n s i o n r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t at r o o m t e m p e r a t u r e w h e n u s i n g s o m e p r i m e r s ( d e p e n d e n t u p o n t h e c a l c u l a t e d m e l t i n g t e m p e r a t u r e o f t h e o l i g o ) . I d e n t i f i c a t i o n o f m u t a n t s D o t b l o t a n a l y s i s P l a q u e s f r o m m u t a g e n e s i s r e a c t i o n s w e r e u s e d to i n f e c t D H 5 F c e l l s a n d s s D N A a n d R F D N A w e r e i s o l a t e d as d e s c r i b e d . O n e ^ i l o f s s D N A w a s s p o t t e d o n t o H y b o n d - N ( A m e r s h a m ) , d r i e d , a n d c r o s s - l i n k e d b y e x p o s u r e to a U V t r a n s i l l u m i n a t o r f o r five m i n u t e s . F i l t e r s w e r e p r e h y b r i d i z e d i n 6 X S S C ; 1 0 X D e n h a r d t s s o l u t i o n ; 0 . 2 % S D S at 5 0 - 6 0 ° C f o r at l eas t o n e h o u r , t h e n h y b r i d i z e d t o t h e m u t a g e n i c p r i m e r w h i c h h a d b e e n k i n a s e d w i t h T 4 p o l y m e r a s e a n d 3 2 *tf -[ P ] - A T P i n t h e s a m e s o l u t i o n m i n u s the S D S . H y b r i d i z a t i o n p r o c e e d e d f o r at l eas t t w o h o u r s a n d t e m p e r a t u r e s v a r i e d w i t h t h e p a r t i c u l a r o l i g o n u c l e o t i d e s , b u t w e r e g e n e r a l l y 1 0 - 1 5 ° C l o w e r t h a n t h e p r e d i c t e d m e l t i n g t e m p e r a t u r e ( T m ) o f t h e p r i m e r . A f t e r h y b r i d i z a t i o n , filters w e r e w a s h e d at R T i n 6 X S S C t w i c e , t h e n p r o g r e s s i v e l y w a s h e d m o r e s t r i n g e n t l y b y i n c r e a s i n g t h e -45-w a s h t e m p e r a t u r e b y 5 ° C i n c r e m e n t s . A f t e r e a c h w a s h , the filters w e r e a u t o r a d i o g r a p h e d . D N A s w h i c h c o n t i n u e d t o g ive a s t r o n g s i g n a l a f ter t h e p r o b e w a s h e d o f f t h e n o n - m u t a g e n i z e d c o n t r o l D N A w e r e s e q u e n c e t o c o n f i r m the p r e s e n c e o f t h e m u t a t i o n . R e s t r i c t i o n a n a l y s i s I n s o m e i n s t a n c e s , t h e m u t a t i o n s i n t r o d u c e d n e w r e s t r i c t i o n s i tes i n t o t h e t a r g e t D N A w h i c h c o u l d b e d e t e c t e d b y r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e d i g e s t i o n o f t h e R F D N A s . D i d e o x y s e q u e n c i n g o f D N A S e q u e n c e o f s s D N A w a s d e t e r m i n e d u s i n g S e q u e n a s e T 7 D N A p o l y m e r a s e ( U n i t e d S t a t e s B i o c h e m i c a l C o r p o r a t i o n ) a n d d i d e o x y n u c l e o t i d e s f o r c h a i n t e r m i n a t i o n . T h e p r o c e d u r e is a m o d i f i c a t i o n o f t h e c h a i n t e r m i n a t o r m e t h o d d e v e l o p e d b y S a n g e r et a l . ( 1977) . S e q u e n c i n g p r i m e r (1 -5 p m o l e ) w a s a n n e a l e d to s s D N A (0.5-1.0 u g ) i n 10 ^ i l o f s e q u e n c i n g b u f f e r [40 m M T r i s - C l ( p H 7.5); 10 m M M g C l 2 ; 5 0 m M N a C l ] at 6 5 ° C f o r five m i n u t e s t h e n s l o w c o o l e d t o R T . L a b e l i n g o f the m i x t u r e w a s c a r r i e d o u t b y a d d i n g t h e f o l l o w i n g c o m p o n e n t s a n d i n c u b a t i n g at R T f o r five m i n u t e s ; 1 p\ o f 100 pM D T T ; 2 u l d i l u t e d l a b e l l i n g m i x (1.5 pM e a c h d G T P , d C T P , 32 d T T P ) ; 10 ^ i C i o f * [ P ] - d A T P ; 2-4 u n i t s S e q u e n a s e . A f t e r the l a b e l l i n g r e a c t i o n , 3 .5 ^ i l a l i q u o t s w e r e t r a n s f e r r e d to p r e w a r m e d m i c r o f u g e t u b e s c o n t a i n i n g 2.5 pi o f A , G , C , a n d T t e r m i n a t i o n m i x e s , a n d i n c u b a t e d at 3 7 ° C f o r five m i n u t e s . C o m p o s i t i o n o f t h e t e r m i n a t o r m i x e s w e r e as f o l l o w s ; G m i x (80 pM e a c h d N T P ; 8 pM d d G T P ) ; A m i x (80 pM e a c h d N T P ; 8 pM d d A T P ) ; C m i x (80 pM e a c h d N T P ; 8 pM d d C T P ) ; T m i x (80 ; i M e a c h d N T P ; 8 ^ i M d d T T P ) . T h e r e a c t i o n s w e r e s t o p p e d b y a d d i n g 4 pi o f S T O P s o l u t i o n ( 9 5 % f o r m a m i d e ; 2 0 m M E D T A ; 0 . 0 5 % b r o m o p h e n o l b l u e ; 0 . 0 5 % x y l e n e c y a n o l F F ) . S a m p l e s w e r e d e n a t u r e d at 9 5 ° C f o r t h r e e m i n u t e s a n d q u e n c h e d o n i c e b e f o r e s e p a r a t i o n . S e q u e n c i n g ge l s c o n t a i n e d 6 - 8 % p o l y a c r y l a m i d e ; 7 M u r e a ; 0 . 5 X T B E a n d w e r e cast b e t w e e n s i l i c o n i z e d 4 0 X 2 0 c m g las s p l a t e s , a n d w e r e r u n at 1600 v o l t s f o r 2-3 h o u r s b e f o r e d r y i n g a n d a u t o r a d i o g r a p h y . R e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e d i g e s t i o n s a n d D N A m o d i f i c a t i o n A l l r e s t r i c t i o n d i g e s t i o n s r e a c t i o n s w e r e p e r f o r m e d a c c o r d i n g t o a s s a y c o n d i t i o n s s p e c i f i e d -46-b y s u p p l i e r s . D N A f r a g m e n t s w e r e l i g a t e d u s i n g T 4 D N A l i gase i n 5 0 m M T r i s - C l ( p H 7.6); 10 m M M g C l 2 ; 1 m M A T P ; 1 m M D T T ; 5 % ( w / v ) p o l y e t h y l e n e g l y c o l f o r f o u r h o u r s at R T e x c e p t f o r b l u n t - e n d e d f r a g m e n t s w h i c h w e r e l i g a t e d o v e r n i g h t . R e a c t i o n s w e r e d i l u t e d at l eas t five-fold w i t h T E b e f o r e t r a n s f o r m a t i o n . D N A f r a g m e n t s w i t h 5' o v e r h a n g s w e r e m a d e b l u n t - e n d e d b y i n c u b a t i n g w i t h E . c o l i D N A p o l y m e r a s e I K l e n o w e n z y m e i n 5 0 m M T r i s - C l ( p H 7.2); 10 m M M g S 0 4 ; 100 m M D T T ; 5 0 m M B S A ; 8 0 ^ M d N T P s ; f o r 10-30 m i n u t e s at R T . T h e e n z y m e w a s d e s t r o y e d b y h e a t i n g at 7 0 ° C f o r 5-10 m i n u t e s . F r a g m e n t s w i t h 3' p r o t r u s i o n s w e r e c o n v e r t e d t o f l u s h e n d s u s i n g T 4 D N A p o l y m e r a s e i n 3 3 m M T r i s - a c e t a t e ( p H 7.9); 66 m M p o t a s s i u m ace ta te ; 10 m M m a g n e s i u m a c e t a t e ; 0.5 m M D T T ; 100 m g / m l B S A ; f o r five m i n u t e s at 3 7 ° C . R e a c t i o n s w e r e a d j u s t e d to 2 5 m M E D T A , a n d t h e D N A p u r i f i e d b y p h e n o l x h l o r o f o r m e x t r a c t i o n a n d e t h a n o l p r e c i p i t a t i o n , o r u s i n g G E N E C L E A N ( B I O 101) . R e m o v a l o f t e r m i n a l 5' p h o s p h a t e s f r o m D N A f r a g m e n t s w i t h 5' o v e r h a n g s w a s a c c o m p l i s h e d u s i n g c a l f i n t e s t i n a l a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( C I P ) i n 5 0 m M T r i s - C l ( p H 9.0); 1 m M M g C l 2 ; 0.1 m M Z n C l 2 ; 1 m M s p e r m i d i n e ; at 3 7 ° C f o r t w o s u c c e s s i v e 3 0 m i n u t e i n c u b a t i o n p e r i o d s . A s e c o n d a l i q u o t o f C I P w a s a d d e d a f ter the first 3 0 m i n u t e p e r i o d . T o d e p h o s p h o r y l a t e f r a g m e n t s w i t h 5' r e c e s s e d o r b l u n t e n d s , t h e i n c u b a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t at 5 6 ° C . C I P r e a c t i o n s w e r e t e r m i n a t e d b y p h e n o l x h l o r o f o r m e x t r a c t i o n s f o l l o w e d b y e t h a n o l p r e c i p i t a t i o n o r p u r i f i c a t i o n u s i n g G E N E C L E A N . P u r i f i c a t i o n o f D N A f r a g m e n t s f r o m a g a r o s e ge l s o r e n z y m e r e a c t i o n m i x t u r e s w a s r o u t i n e l y d o n e u s i n g G E N E C L E A N . D e s i r e d f r a g m e n t s w e r e e x c i s e d f r o m e t h i d i u m b r o m i d e s t a i n e d T A E a g a r o s e ge l s , a n d the g e l m a t r i x s o l u b i l i z e d i n 2-3 v o l u m e s o f s a t u r a t e d s o d i u m i o d i d e at 5 5 ° C . D N A w a s r e m o v e d f r o m t h e a g a r o s e s o l u t i o n b y v o r t e x i n g t h e m i x t u r e w i t h a T M s u s p e n s i o n o f G l a s s m i l k , a n d a b r i e f s p i n i n a m i c r o f u g e . C o n t a m i n a n t s w e r e w a s h e d a w a y f r o m t h e g lass b o u n d D N A b y t h r e e s u c c e s s i v e w a s h e d w i t h a c o n c e n t r a t e d N a C l / e t h a n o l / w a t e r -47-( N E W ) s o l u t i o n . T h e D N A w a s e l u t e d f r o m t h e g lass f i b e r s w i t h T E o r w a t e r at 5 5 ° C , a n d w a s s u i t a b l e f o r a l l s u b s e q u e n t m a n i p u l a t i o n s a f ter th is t y p e o f p u r i f i c a t i o n . C o m m o n s o l u t i o n s S S C 0 .15 M N a C l ; 0 .015 M N a c i t r a t e ( p H 7.0) 1 0 X D e n h a r d t s 0 . 1 % e a c h ficoll, p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e , B S A T B E 8 9 m M T r i s - b o r a t e ( p H 8.0); 8 9 m M b o r i c a c i d ; 2 m M E D T A T A E 4 0 m M T r i s - a c e t a t e ; 1 m M E D T A ( p H 8 .0) T E 10 m M T r i s - C l ( p H 8.0); 1 m M E D T A E x p r e s s i o n v e c t o r s T h e m u l t i p l e c l o n i n g s ites o f p S P T 1 8 a n d p S P T 1 9 ( P h a r m a c i a ) a r e f l a n k e d b y o p p o s i t e l y o r i e n t e d T 7 a n d S P 6 R N A p o l y m e r a s e p r o m o t e r s w h i c h a l l o w t r a n s c r i p t i o n o f e i t h e r s t r a n d o f a D N A i n s e r t . S y n t h e t i c m R N A f r o m c D N A s c l o n e d i n t o these v e c t o r s w a s u s e d to d i r e c t t r a n s l a t i o n i n a r a b b i t r e t i c u l o c y t e lysate s y s t e m . F o r t r a n s i e n t m v i v o e x p r e s s i o n o f R V c D N A s i n C O S ce l l s , p S V L ( P h a r m a c i a ) a n d / o r p C M V 5 ( D . R u s s e l l , T e x a s ) w e r e u s e d . T h e s e v e c t o r s d i r e c t t r a n s c r i p t i o n o f i n s e r t s b y u t i l i z i n g t h e S V 4 0 l a t e p r o m o t e r ( p S V L ) o r the h u m a n C y t o m e g a l o v i r u s m a j o r i m m e d i a t e e a r l y g e n e p r o m o t e r ( p C M V 5 ) . B o t h v e c t o r s c o n t a i n the S V 4 0 o r i g i n o f r e p l i c a t i o n a l l o w i n g r e p l i c a t i o n i n C O S ce l l s , as w e l l as a p r o k a r y o t i c o r i g i n o f r e p l i c a t i o n a n d a m p i c i l l i n r e s i s t a n c e g e n e f o r g r o w t h i n E . c o l i ( F i g . 10) . R u b e l l a v i r u s c D N A c o n s t r u c t s R V c D N A s u s e d i n th is s t u d y a r e a l l d e r i v e d f r o m the f u l l - l e n g t h 2 4 S c D N A d e s c r i b e d b y C l a r k e et a l . ( 1987 ) p S P T 1 9 ( C / E 2 / E 1 ) . I h a v e t a k e n t h e l i b e r t y o f r e n a m i n g t h e c D N A i n s e r t e n c o d i n g C / E 2 / E 1 , s i m p l y 2 4 S . T h e 3.4 k b i n s e r t f r o m p S P T 1 9 ( C / E 2 / E 1 ) w a s e x c i s e d w i t h E c o R I a n d H i n d l l l a n d c l o n e d i n t o p C M V 5 to c r e a t e p C M V 5 - 2 4 S . T h i s c o n s t r u c t w h e n -48-Fn/I 'Bgll Multiple Cloning Site (MCS) PSPT18 • AfcGCTTGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTC ~ r PSM-GAATAC-+ 1 Spht pSPT19 • C ^ T T O S A G C T C G C T * C C C G G G G A T C C T C T A G A G T C G * C C T G C A G 0 C A T G C A * G C T T -+ 1 -GGGTCTCCC-PT; J n u n Aaet F i g u r e 10. P h y s i c a l m a p s o f t h e e x p r e s s i o n vec tors p S P T 1 8 / 1 9 , p S V L ( P h a r m a c i a ) a n d p C M V 5 ( A n d e r s s o n et a l . , 1 9 8 9 ) . t r a n s f e c t e d i n t o C O S ce l l s d i r e c t e d p r o d u c t i o n o f R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s j n v i v o . P l a s m i d p E l w a s c o n s t r u c t e d b y r e m o v i n g t h e 1500 nt N c o l f r a g m e n t f r o m p S P T 1 9 ( C / E 2 / E l ) ( C l a r k e et a l . , 1987) a n d r e l i g a t i o n , c r e a t i n g a c D N A e n c o d i n g t h e c a p s i d t r a n s l a t i o n s tar t s i te w i t h e i g h t r e s i d u e s f r o m C , 6 9 r e s i d u e s f r o m t h e C - t e r m i n a l E 2 , a n d a l l o f E l , i n c l u d i n g t h e p u t a t i v e s i g n a l p e p t i d e ( F i g . 11) . T o c o n s t r u c t p E 2 E l , a 9 9 0 nt f r a g m e n t c o n t a i n i n g t h e e n t i r e R V E 2 g e n e w a s e x c i s e d f r o m t h e R V c D N A p l a s m i d p S P T 1 9 ( C / E 2 / E l ) u s i n g S p h l a n d P s t l , a n d w a s i n s e r t e d i n t o p S P T 1 8 d i g e s t e d w i t h t h e s a m e e n z y m e s . T h i s p l a s m i d w a s t h e n l i n e a r i z e d u p s t r e a m f r o m t h e E 2 c o d i n g r e g i o n u s i n g H i n d l l l . d e p h o s p h o r y l a t e d , a n d the e n d s r e p a i r e d b y i n c u b a t i n g w i t h t h e K l e n o w f r a g m e n t o f D N A p o l y m e r a s e I. N c o l l i n k e r s ( P - C C C A T G G G - O H ) t r e a t e d w i t h p o l y n u c l e o t i d e k i n a s e a n d A T P w e r e l i g a t e d to the p l a s m i d , a n d c l o n e s c o n t a i n i n g t h e d e s i r e d N c o l s i te w e r e s e l e c t e d . A 8 0 0 nt N c o l f r a g m e n t c o n t a i n i n g a l l o f t h e 5' r e g i o n o f E 2 , b u t n o t t h e t r a n s m e m b r a n e d o m a i n , w a s i n s e r t e d i n t o p E l . T h e r e s u l t i n g p l a s m i d p E 2 E l , c o n t a i n s t h e e n t i r e E 2 a n d E l c o d i n g r e g i o n s i n c l u d i n g the 5' s i g n a l s e q u e n c e s a n d 3 ' t r a n s m e m b r a n e d o m a i n s . S e e F i g . 11. E l s e q u e n c e s w e r e r e m o v e d f r o m p E 2 E l b y d i g e s t i o n w i t h P s t l a n d r e c i r c u l a r i z a t i o n to c r e a t e p E 2 . P l a s m i d p E 2 c o n t a i n s the c o d i n g r e g i o n s f o r the e n t i r e E 2 , as w e l l as t h o s e f o r t h e c a r b o x y l - t e r m i n a l 58 r e s i d u e s a n d the a m i n o - t e r m i n a l e i g h t r e s i d u e s o f t h e c a p s i d p r o t e i n . T h e t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n s i te is c o n t a i n e d i n the a m i n o - t e r m i n u s o f the c a p s i d p r o t e i n . S e e F i g . 11. A l ist o f m u t a g e n i c o l i g o n u c l e o t i d e s u s e d i n th i s s t u d y is c o n t a i n e d i n t a b l e II . S V - 4 0 b a s e d v e c t o r p l a s m i d s w e r e m a d e b y e x c i s i n g i n s e r t s f r o m p S P . T 1 9 r e c o m b i n a n t p l a s m i d s w i t h E c o R I a n d H i n d l l l . c o n v e r t i n g the c o h e s i v e e n d s to b l u n t e n d s w i t h K l e n o w e n z y m e , a n d l i g a t i o n i n t o the S m a l s i te o f p S V L . C o n s t r u c t s w e r e t h e n s c r e e n e d f o r o r i e n t a t i o n b y r e s t r i c t i o n a n a l y s i s . T h e p C M V 5 r e c o m b i n a n t s w e r e m a d e b y c l o n i n g t h e R V c D N A i n s e r t s i n t o t h e E c o R I a n d H i n d l l l s i tes o f th is v e c t o r . C o n s t r u c t s w e r e n a m e d a c c o r d i n g t o t h e p a r e n t v e c t o r a n d i n s e r t t h e y c o n t a i n , ie . p S V L - E 2 , p C M V 5 - E 2 E l , e tc . -50-E 2 E l 2 4 S YY Y Y E 2 E 1 C E 2 E l •r ai Y Y Y m — * — C E 2 E l E 2 E2 H F i g u r e 11. S c h e m a t i c d i a g r a m o f R V c D N A c o n s t r u c t s . R e s p e c t i v e p o r t i o n s o f c a p s i d ( C ) , a n d e n v e l o p e g l y c o p r o t e i n s E2 a n d E l i n t h e c o n s t r u c t s a r e i n d i c a t e d as C , E2, a n d E l a b o v e the s c h e m a t i c s . T h e f l a n k i n g 5' E c o R I a n d 3' H i n d l U s ites a r e m a r k e d ( E a n d H r e s p e c t i v e l y ) . T h e p u t a t i v e s i g n a l p e p t i d e s a n d t r a n s m e m b r a n e r e g i o n s a r e i n d i c a t e d b y ( | ) a n d ( Q ) r e s p e c t i v e l y . P o t e n t i a l N - l i n k e d g l y c o s y l a t i o n s ites a r e r e p r e s e n t e d b y ( Y ) , a n d t h e a r g i n i n e r i c h r e g i o n b e t w e e n t h e t r a n s m e m b r a n e a n c h o r o f E2 a n d s i g n a l p e p t i d e o f E l is i n d i c a t e d ( r ) . T r a n s l a t i o n s tar t s i tes i n t h e c o n s t r u c t s a r e m a r k e d b y a r r o w h e a d s . 5 1 J n v i t r o t r a n s c r i p t i o n ; F i v e m i c r o g r a m s o f p l a s m i d w a s l i n e a r i z e d w i t h H i n d l l l . e x t r a c t e d w i t h p h e n o l / c h l o r o f o r m , a n d p r e c i p i t a t e d w i t h e t h a n o l . T h e D N A t e m p l a t e w a s t h e n a d d e d t o a t r a n s c r i p t i o n - c a p p i n g r e a c t i o n c o n t a i n i n g 4 0 m M T r i s - c h l o r i d e ( p H 7.5); 6 m M M g C L ^ ; 2 m M s p e r m i d i n e ; 10 m M N a C l ; 10 m M d i t h i o t h r e i t o l ; 5 0 0 u n i t s / m l R N A s i n ( P r o m e g a B i o t e c ) ; 100 m i c r o g r a m s / m l n u c l e a s e - f r e e b o v i n e s e r u m a l b u m i n ; 0.5 m M e a c h A T P , C T P , U T P , a n d c a p a n a l o g u e G p p p G ; 0.1 m M G T P ; 6 0 0 u n i t s / m l S P 6 R N A p o l y m e r a s e ( P r o m e g a ) . R e a c t i o n s w e r e t y p i c a l l y i n 5 0 ^ i l v o l u m e s , a n d w e r e i n c u b a t e d f o r o n e h o u r at 3 7 ° a f t e r w h i c h t h e D N A w a s r e m o v e d b y D N a s e I d i g e s t i o n . T h e r e a c t i o n s w e r e e x t r a c t e d s u c c e s s i v e l y w i t h p h e n o l / c h l o r o f o r m a n d e t h e r , a n d p r e c i p i t a t e d w i t h e t h a n o l , t a k e n u p i n 3 0 ^ i l o f w a t e r a n d s t o r e d at - 7 0 ° C . I n v i t r o t r a n s l a t i o n ; T r a n s l a t i o n o f S P 6 - d e r i v e d t r a n s c r i p t s w a s p e r f o r m e d i n a n u c l e a s e - t r e a t e d r a b b i t r e t i c u l o c y t e l y sa te s y s t e m ( P r o m e g a ) c o n t a i n i n g 0.02 m M a m i n o a c i d m i x t u r e m i n u s m e t h i o n i n e ; 3 5 S - m e t h i o n i n e at 1 2 0 0 u C i / m l ; R N A s i n at 1600 u n i t s / m l ; a n d R N A at 4 0 / i g / m l i n a 2 5 p i v o l u m e . S o m e r e a c t i o n s w e r e s u p p l e m e n t e d w i t h 1 p i o f c a n i n e p a n c r e a t i c m i c r o s o m e s ( P r o m e g a ) . A f t e r i n c u b a t i o n at 3 0 ° C f o r o n e h o u r , t r a n s l a t i o n p r o d u c t s w e r e a s s a y e d f o r p r o t e c t i o n f r o m e x o g e n o u s l y a d d e d p r o t e a s e a n d a n a l y z e d b y e l e c t r o p h o r e s i s o n a 1 0 % L a e m m l i g e l , f o l l o w e d b y f l u o r o g r a p h y at - 7 0 ° C . P r o t e a s e p r o t e c t i o n a s s a y ; P r o t e a s e d i g e s t i o n c o n d i t i o n s w e r e e s s e n t i a l l y as d e s c r i b e d ( W a l t e r a n d B l o b e l , 1983) . A f t e r c e l l - f r e e t r a n s l a t i o n , C a C L ^ w a s a d d e d t o 1 m M , a n d the r e a c t i o n s h e l d o n i c e f o r 10 m i n u t e s t o s t a b i l i z e t h e m e m b r a n e s . S a m p l e s w e r e t h e n i n c u b a t e d f o r 6 0 m i n u t e s o n i c e i n t h e p r e s e n c e o f t r y p s i n ( 3 0 0 p g / m l ) . P r o t e o l y s i s w a s s t o p p e d b y a d d i t i o n o f p h e n y l m e t h a n e s u l f o n y l f l u o r i d e to 1 m M , t r y p s i n i n h i b i t o r to 5 0 0 p g / m l , a n d i n c u b a t i n g o n i c e f o r 10 m i n u t e s . T r i t o n X - 1 0 0 w a s i n c l u d e d at a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1% i n s o m e r e a c t i o n s . S a m p l e s w e r e s e p a r a t e d o n 1 0 % L a e m m l i ge l s (1970) , a n d f l u o r o g r a p h e d . -52-I m m u n o p r e c i p i t a t i o n s , E n d o-p - N - a c e t y l g l u c o s a m i n i d a s e H a n d N - g l y c a n a s e d i g e s t i o n s H u m a n p o l y c l o n a l a n t i - r u b e l l a s e r u m ( a gift f r o m D r A . T i n g l e ) w a s p r e i n c u b a t e d w i t h P r o t e i n A - S e p h a r o s e ( P h a r m a c i a ) f o r at l eas t f o u r h o u r s a 4 ° C i n b i n d i n g b u f f e r (100 m M T r i s - C l ( p H 7.4); 4 0 0 m M N a C l ) w i t h c o n s t a n t m i x i n g . T h e s e r u m - c o a t e d b e a d s w e r e w a s h e d t w i c e w i t h b i n d i n g b u f f e r , a n d o n c e i n lysate b u f f e r [25 m M T r i s - C l ( p H 7.4); 100 m M N a C l ; 1 3 5 m M E D T A ; 1% N o n i d e t P - 4 0 ( N P - 4 0 ) ] . S - l a b e l l e d a n t i g e n ( C O S c e l l l y sa te o r m v i t r o t r a n s l a t i o n p r o d u c t s ) w a s m i x e d o v e r n i g h t at 4 ° C w i t h t h e c o a t e d b e a d s i n l y s a t e b u f f e r . B e a d s w e r e w a s h e d o n c e w i t h l y sa te b u f f e r , t w i c e w i t h w a s h b u f f e r (25 m M t r i e t h a n o l a m i n e ; 172 m M N a C l ; 1% d e o x y c h o l a t e ; 0 . 1 % S D S ; 1 m M E D T A ) , t h r e e t i m e s w i t h 10 m M T r i s - C l ( p H 7.4) , a n d o n c e w i t h w a t e r . I m m u n e c o m p l e x e s w e r e d i s s o c i a t e d f r o m the P r o t e i n A - S e p h a r o s e b y b o i l i n g i n 100 m M s o d i u m c i t r a t e ( p H 5.5); 1 m M p h e n y l - m e t h y l s u l f o n y l f l u o r i d e ( P M S F ) ; 0 . 1 5 % S D S f o r five m i n u t e s , v o r t e x i n g , a n d p e l l e t i n g t h e b e a d s b y c e n t r i f u g a t i o n . S u p e r n a t a n t s w e r e c o l l e c t e d a n d i n c u b a t e d at 3 7 ° C w i t h o r w i t h o u t e n d o ^ N - a c e t y l e n d o g l y c o s i d a s e H ( G e n z y m e ) at 2 5 m i l l i u n i t s / m l f o r at l eas t 8 h o u r s . I m m u n o p r e c i p i t a t e s t o b e d i g e s t e d w i t h N - g l y c a n a s e w e r e a d j u s t e d t o 0 . 1 7 % S D S ; 0.2 M s o d i u m p h o s p h a t e ( p H 8.6); 1 .12% n o n i d e t P - 4 0 ; 10 m M 1,10 p h e n a n t h r o l i n e h y d r a t e a n d d i g e s t e d w i t h 125 m i l l i u n i t s o f N - g l y c a n a s e f o r at l eas t e i g h t h o u r s . S a m p l e s w e r e b o i l e d f o r t h r e e m i n u t e s a n d s e p a r a t e d o n S D S - P A G E , a n d t h e n f l u o r o g r a p h e d . T o r e c o v e r c e l l s u r f a c e a n t i g e n s , r a d i o l a b e l e d C O S ce l l s w e r e w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h c o l d P B S (145 m M N a C l ; 7.5 m M N a ^ P O ^ 2.9 m M N a H 2 P 0 4 0 . 7 m M C a C l 2 ; 0.3 m M M g C t p , t h e n i n c u b a t e d w i t h 1 0 % n o r m a l g o a t s e r u m f o r 10 m i n u t e s at 0 ° C t o b l o c k n o n s p e c i f i c b i n d i n g o f a n t i b o d y . C e l l s w e r e t h e n i n c u b a t e d w i t h h u m a n a n t i - R V s e r u m f o r 60 -90 m i n u t e s at 0 ° , l y s e d a n d n u c l e i r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n at 13 ,000 r e v o l u t i o n s p e r m i n u t e i n a m i c r o f u g e . S u p e r n a t a n t s w e r e a d j u s t e d to 0 . 3 % S D S a n d t h e i m m u n e - c o m p l e x e s w e r e p r e c i p i t a t e d w i t h P r o t e i n A - s e p h a r o s e . S u p e r n a t a n t s w e r e i n c u b a t e d w i t h a n t i - R V s e r u m a n d P r o t e i n A - s e p h a r o s e to r e c o v e r i n t r a c e l l u l a r R V a n t i g e n . -53 -T r a n s f e c t i o n o f C O S c e l l s C O S c e l l s w e r e t r a n s f e c t e d w i t h p l a s m i d D N A c o n s t r u c t s a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f A d a m s a n d R o s e (1985) w i t h s o m e m o d i f i c a t i o n s . S u b c o n f l u e n t m o n o l a y e r s g r o w n i n D M E M / F C S ( D u l b e c c o ' s m o d i f i e d E a g l e m e d i u m p l u s 5 % f e t a l c a l f s e r u m ) w e r e w a s h e d t w i c e i n T r i s - s a l i n e (25 m M T r i s - C l ( p H 7.4); 140 m M N a C l ; 3 m M K C 1 ; 1 m M K C 1 ; 0.5 m M M g C L , ; 0 .9 m M N s ^ H P O ^ w a r m e d t o 3 7 ° C , a n d t h e n o v e r l a i d w i t h T r i s - s a l i n e c o n t a i n i n g 5 pg/ml o f p l a s m i d D N A , a n d 5 0 0 u g / m l D E A E - d e x t r a n M r = 5 x 1 0 ^ ) . A f t e r 30 m i n u t e s at 3 7 ° C , t h e D N A s o l u t i o n w a s r e m o v e d , a n d r e p l a c e d w i t h m e d i u m c o n t a i n i n g 80 ^ i M c h l o r o q u i n e . A f t e r t h r e e h o u r s at 3 7 ° C , th i s s o l u t i o n w a s r e m o v e d , a n d t h e ce l l s w e r e s u b j e c t e d to a s h o c k t r e a t m e n t w i t h 1 0 % d i m e t h y l s u l f o x i d e / D M E M f o r t h r e e m i n u t e s at r o o m t e m p e r a t u r e , f o l l o w e d b y t w o w a s h e s w i t h T r i s - s a l i n e . C O S ce l l s w e r e k e p t at 3 7 ° C p o s t - t r a n s f e c t i o n i n D M E M / F C S f o r 4 0 - 5 0 h o u r s b e f o r e 3 5 l a b e l l i n g w i t h S - m e t h i o n i n e o r p r o c e s s i n g f o r i m m u n o f l u o r e s c e n c e . M e t a b o l i c l a b e l l i n g T r a n s f e c t e d C O S ce l l s w e r e w a s h e d o n c e w i t h D M E M m i n u s m e t h i o n i n e , t h e n s t a r v e d i n th i s m e d i u m f o r 2 0 m i n u t e s at 3 7 ° C . C e l l u l a r p r o t e i n s w e r e p u l s e - l a b e l l e d b y i n c u b a t i n g c e l l s 3 5 w i t h 0.5 m l D M E M m i n u s m e t h i o n i n e / d i a l y z e d F C S c o n t a i n i n g 100 ^ i C i S - m e t h i o n i n e p e r 3 5 m m w e l l f o r t h e i n d i c a t e d t i m e s at 3 7 ° C , f o l l o w e d b y v a r i o u s c h a s e p e r i o d s w i t h D M E M / F C S p l u s 2 m M m e t h i o n i n e f o r s o m e s a m p l e s . A f t e r w a s h i n g w i t h c o l d T r i s - s a l i n e , c e l l s w e r e l y s e d w i t h 4 0 0 ju l o f 5 0 m M T r i s - C l ( p H 8.0); 6 2 . 5 m M E D T A ; 1% N P - 4 0 ; 0 .4% s o d i u m d e o x y c h o l a t e ; I m M P M S F . W h e r e i n d i c a t e d , s o m e ce l l s w e r e l y s e d i n the p r e s e n c e o f 10 m M i o d o a c e t a m i d e t o p r e v e n t f o r m a t i o n o f a b e r r a n t d i s u l f i d e b o n d s . L y s a t e s w e r e s c r a p e d o f f t h e p l a t e s , c l e a r e d o f n u c l e i a n d d e b r i s b y c e n t r i f u g a t i o n , t h e n u s e d f o r i m m u n o p r e c i p i t a t i o n . C e l l s w e r e l a b e l l e d w i t h 3 o 5 0 0 jiCi H - p a l m i t a t e i n 1.0 m l o f m e d i u m f o r 12 h o u r s at 3 7 C . I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e T r a n s f e c t e d C O S ce l l s g r o w n o n p o l y l y s i n e - c o a t e d 9 m m p l a s t i c c o v e r s l i p s w e r e w a s h e d -54-t h r e e t i m e s w i t h P B S , a n d f i x e d f o r 2 0 m i n u t e s at r o o m t e m p e r a t u r e i n 2% f o r m a l d e h y d e / P B S , f o l l o w e d b y w a s h i n g w i t h P B S . S o m e ce l l s w e r e p e r m e a b l i z e d w i t h 0 . 0 6 % N P - 4 0 / P B S f o r 3 0 m i n u t e s p r i o r to b l o c k i n g w i t h 1 % B S A / P B S . A l l w a s h e s a n d s o l u t i o n s a f t e r t h i s s t e p u t i l i z e B S A / P B S . C o v e r s l i p s w e r e o v e r l a i d w i t h d i l u t e d h u m a n s e r u m (1:200) o r m o u s e m o n o c l o n a l s (1:75) i n c u b a t e d f o r 6 0 m i n u t e s at r o o m t e m p e r a t u r e , t h e n w a s h e d . I n c u b a t i o n w i t h s e c o n d a r y a n t i b o d y , f l u o r e s c e i n - c o n j u g a t e d g o a t a n t i - h u m a n o r a n t i - m o u s e I g G ( T a g o ) d i l u t e d 1:100, w a s f o r 6 0 m i n u t e s . C o v e r s l i p s w e r e w a s h e d , m o u n t e d , e x a m i n e d u s i n g e p i f l u o r e s c e n c e , a n d p h o t o g r a p h e d . F o r d o u b l e - l a b e l l i n g u s i n g l e c t i n - c o n j u g a t e s , p e r m e a b l i z e d c e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h W h e a t G e r m a g g l u t i n i n - R h o d a m i n e ( W G A - T R I T C ) t o v i s u a l i z e G o l g i a n d p o s t - G b l g i s t r u c t u r e s o r C o n c a n a v a l i n A - R h o d a m i n e ( C o n A - T R I T C ) f o r E R s t a i n i n g at 1 0 - 1 5 y i g / m l f o r 3 0 m i n u t e s at R T p r i o r to b l o c k i n g w i t h B S A . Electrophoresis Separation of DNA fragments D N A s a m p l e s w e r e a d j u s t e d to 8 % s u c r o s e ; 2 0 m M E D T A ( p H 8.0); 0 . 0 5 % b r o m o p h e n o l b l u e ; 0 . 0 5 % x y l e n e c y a n o l a n d s e p a r a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s ( f o u r t o e i g h t v o l t s / c m ) o n 10 c m s u b m a r i n e h o r i z o n t a l a g a r o s e ge l s c o n t a i n i n g 1 pg/ml o f e t h i d i u m b r o m i d e . G e l b u f f e r s c o n s i s t e d o f I X T A E . Separation of proteins P r o t e i n s w e r e s e p a r a t e d u s i n g a d i s c o n t i n u o u s g e l s y s t e m d e s c r i b e d b y L a e m m l i ( 1970) . S a m p l e s w e r e a d j u s t e d t o 62 .5 m M T r i s - C l ( p H 6.8); 1 0 % g l y c e r o l ; 2 % S D S ; 2 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ( o p t i o n a l ) a n d d e n a t u r e d at 9 5 ° C f o r t w o m i n u t e s . S t a c k i n g ge l s c o n s i s t e d o f 4 % p o l y a c r y l a m i d e , a n d s e p a r a t i n g ge l s g e n e r a l l y c o n t a i n e d 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e . G e l s w e r e r u n at 2 5 - 5 5 m i l l i a m p e r e s u n t i l t h e b r o m o p h e n o l b l u e r e a c h e d the b o t t o m o f t h e s e p a r a t i n g g e l . T h e s t a c k i n g g e l w a s t r i m m e d a w a y , a n d t h e p r o t e i n s fixed b y s o a k i n g i n 1 0 % a c e t i c a c i d f o r 2 0 - 3 0 m i n u t e s . G e l s w e r e t h e n i m m e r s e d i n t h e f l u o r o g r a p h i c a g e n t A m p l i f y ( A m e r s h a m ) f o r 20 -30 m i n u t e s , d r i e d u n d e r v a c u u m a n d e x p o s e d t o X A R o r X R P film at - 7 0 ° C . -55-S o l u t i o n s u s e d f o r e l e c t r o p h o r e s i s 5 X S t a c k i n g g e l b u f f e r 0 .625 M T r i s - C l ( p H 6.8); 0 . 5 % S D S 5 X S e p a r a t i n g g e l b u f f e r 1.875 M T r i s - C l ( p H 8.8); 0 . 5 % S D S 5 X R u n n i n g g e l b u f f e r 0 .125 M T r i s - C l ; 0 .96 M g l y c i n e ; 0 . 5 % S D S ( p H 8 .3) G e l S t o c k ( p o l y a c r y l a m i d e s o l u t i o n ) 3 0 % a c r y l a m i d e ; 0 . 8 % N ' N ' - b i s m e t h y - l e n e - a c r y l a m i d e P r i o r t o c a s t i n g ge l s , s o l u t i o n s w e r e m i x e d , d e g a s s e d , a n d p o l y m e r i z a t i o n i n i t i a t e d b y a d d i n g a m m o n i u m p e r s u l f a t e to 0 . 5 % a n d T E M E D ( N , N , N ' , N ' - T e t r a m e t h y l e n e d i a m i n e ) t o 0 . 1 % . W e s t e r n b l o t t i n g C O S ce l l s lysates w e r e s e p a r a t e d b y S D S - P A G E a n d t r a n s f e r r e d to n i t r o c e l l u l o s e f i l t ers u s i n g a B i o R a d T r a n s - B l o t a p p a r a t u s ( w h i c h w a s s u b m e r g e d i n a n i c e - w a t e r b a t h ) f o r t w o h o u r s at 6 0 v o l t s i n 2 5 m M T r i s - 1 9 2 m M g l y c i n e ( p H 8.3); 2 0 % m e t h a n o l . T h e f i l t ers w e r e w a s h e d b r i e f l y i n T B S (0 .15 M N a C l ; 0 . 0 2 M T r i s - C l [ p H 7.5]) c o n t a i n i n g 0 . 3 % T w e e n 20 , a n d b l o c k e d f o r n o n - s p e c i f i c b i n d i n g i n T B S c o n t a i n i n g 4 % p o w d e r e d s k i m m e d m i l k . M e m b r a n e s w e r e t h e n i n c u b a t e d w i t h h u m a n a n t i - R V s e r u m (1:200) i n th is s a m e s o l u t i o n f o r t w o h o u r s , w a s h e d w i t h T B S / 0 . 3 % T w e e n 2 0 a n d t r e a t e d w i t h r a b b i t a n t i - h u m a n I g G c o n j u g a t e d to h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ( D a k o ) f o r t w o h o u r s . B l o t s w e r e w a s h e d as a b o v e a n d d e v e l o p e d w i t h 4 - c h l o r o - l - n a p h t h o l ( B i o R a d ) . A l l i n c u b a t i o n s w e r e p e r f o r m e d at r o o m t e m p e r a t u r e . -56 -T a b l e I I . M u t a g e n i c O l i g o n u c l e o t i d e s O l i g o S e q u e n c e T H 2 p G T A G T A C A A G C A T T T C T C C G C C C A G G T C T T H 3 p G T G T G C C T T T C C A G A T G T H 4 p T C G T G C A A A G T C A C C T H 6 p G C C T A T G G C A T G G A G G A G G C T T H 7 p A G C C C A C T A C G C C C A G G T H 1 0 p A G C C C G G C A T G C G C G G T G T H 1 3 p C C G G T G T A A A T C A T A A T G T A T H 1 5 p A G T A G T A C A A T C A T T T G G C A C G I p G T C G C T G G C T T G T C G G T G G 2 p C C A G T C G C C C A G G T T G T A G 3 p G C T G C T A A T G A G G C C D L 1 p C T A G T C T A G A C T A G C h a n g e s f r o m o r i g i n a l R V s e q u e n c e a r e u n d e r l i n e d . F u n c t i o n d e l e t e 2 7 a m i n o a c i d t r a n s m e m b r a n e ! a n c h o r o f E l d e s t r o y E l g l y c o s y l a t i o n s i te 1 b y c h a n g i n g A s n 76 t o L y s . d e s t r o y E l g l y c o s y l a t i o n s i te 2 b y c h a n g i n g A s n 177 t o L y s . i n s e r t s tar t c o d o n i n f r o n t o f E l i n t r o d u c e s t o p c o d o n i n f r o n t o f E l t r a n s m e m b r a n e a n c h o r b y c h a n g i n g G l u 4 4 1 to T A G c r e a t e S p h I s i te i n f r o n t o f E 2 d e s t r o y E l g l y c o s y l a t i o n s i te 3 b y c h a n g i n g A s n 2 0 9 t o H e c h a n g e E l C y s 4 7 0 t o s t o p c o d o n t o d e l e t e c y t o p l a s m i c d o m a i n d e s t r o y E 2 g l y c o s y l a t i o n s i te 1 b y c h a n g i n g A s n 5 3 to G i n d e s t r o y E 2 g l y c o s y l a t i o n s i te 2 b y c h a n g i n g S e r 7 3 t o G l y d e s t r o y E 2 g l y c o s y l a t i o n s i te 3 b y c h a n g i n g A s n 115 t o H e m u l t i p u r p o s e X b a l l i n k e r w i t h s t o p c o d o n s i n t h r e e r e a d i n g f r a m e s -57-R E S U L T S a n d D I S C U S S I O N S e c t i o n I . I n v i t r o e x p r e s s i o n a n d t a r g e t i n g o f R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s i n t o m i c r o s o m e s R V c D N A c o n s t r u c t s A l l R V c D N A c o n s t r u c t s u s e d i n th i s s t u d y w e r e d e r i v e d f r o m p S P T 1 9 ( C / E 2 / E l ) d e s c r i b e d b y C l a r k e et a l . ( 1987) . T h e 3.4 k b i n s e r t c o n t a i n s c o d i n g s e q u e n c e s f o r t h e R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s . A s p r e v i o u s l y s t a t e d , th is c D N A w i l l b e r e f e r r e d t o as 2 4 S ( F i g . 11) . T h e E 2 E 1 f r a g m e n t c o n t a i n s t h e E 2 a n d E l g e n e s i n f r a m e w i t h t h e t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n s i g n a l f r o m t h e c a p s i d g e n e . S i m i l a r l y , i n t h e E 2 a n d E l c o n s t r u c t s , t h e c a p s i d t r a n s l a t i o n s tar t s i te is u t i l i z e d ( F i g . 11) . R V c D N A s w e r e c l o n e d i n t o p S P T 1 9 i n f r o n t o f t h e S P 6 R N A p o l y m e r a s e p r o m o t e r t o g e n e r a t e t h e p l a s m i d s p 2 4 S , p E 2 E l , p E l , a n d p E 2 . N o t e t h a t i n H o b m a n et a l . , 1988, p E l w a s c a l l e d p 3 ' E 2 E l . P l a s m i d s w e r e l i n e a r i z e d at t h e H i n d l l l s i te , a n d S P 6 R N A p o l y m e r a s e w a s u s e d t o g e n e r a t e R V m R N A s w h i c h w e r e s u b s e q u e n t l y t r a n s l a t e d i n a r a b b i t r e t i c u l o c y t e l y sa te s y s t e m . T r a n s c r i p t i o n / t r a n s l a t i o n p 2 4 S S P 6 - d e r i v e d m R N A f r o m H i n d l l l - l i n e a r i z e d p 2 4 S w a s t r a n s l a t e d i n a c e l l - f r e e s y s t e m 3 5 c o n t a i n i n g S - m e t h i o n i n e w i t h o r w i t h o u t c a n i n e p a n c r e a t i c m i c r o s o m e s . P r o d u c t s o f t r a n s l a t i o n w e r e s e p a r a t e d o n S D S - P A G E a n d fluorographed. T r a n s l a t i o n o f p 2 4 S m R N A i n t h e a b s e n c e o f m i c r o s o m e s g a v e r i s e to a p o l y p e p t i d e o f a p p r o x i m a t e l y 110 ,000 d a l t o n s i n s i ze ( F i g . 12a) . T h i s p r o t e i n w a s i n t e r p r e t e d t o b e t h e 110 k D a p o l y p r o t e i n p r e c u r s o r N H 2 - C - E 2 - E I - C O O H i ( O k e r - B l o m et a l . , 1984; C l a r k e et a l . , 1987) . I n c l u s i o n o f m i c r o s o m e s i n t h e r e a c t i o n r e s u l t e d i n e f f i c i en t p r o c e s s i n g o f p l l O t o s m a l l e r p o l y p e p t i d e s , t w o o f w h i c h c o m i g r a t e d w i t h E l a n d C ( F i g . 12a ) . A 46 k D a b a n d w a s p r e s e n t i n a l l t h e l a n e s , a n d is k n o w n t o b e s o m e b y - p r o d u c t o f 3 5 t r a n s l a t i o n s p e c i f i c to t h e S - m e t h i o n i n e p r e p a r a t i o n ( A m e r s h a m p r o d u c t d a t a b u l l e t i n ) . T h e E 2 (39 k D a ) s y n t h e s i z e d i n th is s y s t e m is s i g n i f i c a n t l y s m a l l e r t h a n v i r i o n E 2 ( F i g . 1 2 a ) c o n t r a r y t o -58-24S E2E1 F i g u r e 12. T r a n s l a t i o n o f S P 6 - d e r i v ^ R V m R N A s i n r a b b i t r e t i c u l o c y t e l y sa te s . R V m R N A s w e r e t r a n s l a t e d i n t h e p r e s e n c e o f S - m e t h i o n i n e , a n d t h e t r a n s l a t i o n p r o d u c t s w e r e s e p a r a t e d o n 1 0 % L a e m m l i g e l s a n d f l u o r o g r a p h e d . T h e r e l a t i v e p o s i t i o n s o f t h e R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s a r e i n d i c a t e d , ( m i c ) i n c l u s i o n o f c a n i n e p a n c r e a t i c m i c r o s o m e s i n t r a n s l a t i o n ; ( t r y p s i n ) t r a n s l a t i o n a l o j j o d u c t s t r e a t e d w i t h t r y p s i n w i t h o r w i t h o u t T r i t o n X - 1 0 0 p r e s e n t ( T X - 1 0 0 ) . T h e 46 k D a S - m e t h i o n i n e - s p e c i f i c b a n d s a r e i n d i c a t e d b y a n a r r o w h e a d , ( a ) p 2 4 S m R N A . T h e p l l O b a n d is m a r k e d , ( b ) p E 2 E l m R N A . T h e 91 k D a E 2 E 1 p r e c u r s o r is s h o w n ( p 9 1 ) . t h e findings o f C l a r k e et a l . (1987) . T h e l a t t e r a u t h o r s r e p o r t e d f i n d i n g v i r i o n s i ze E 2 i n t h e i r t r a n s l a t i o n s y s t e m , a l t h o u g h it n o w a p p e a r s t h a t t h e y m i s t a k e n l y i d e n t i f i e d t h e 4 6 k D a b a n d as R V E 2 . M 3 3 E 2 c o n t a i n s t h r e e p o t e n t i a l N - l i n k e d g l y c o s y l a t i o n s i tes ( C l a r k e et a l . , 1 9 8 7 ) a n d u n g l y c o s y l a t e d E 2 is 3 0 k D a i n s i ze ( O k e r - B l o m et a l . , 1983) . M i c r o s o m a l v e s i c l e s c a n o n l y a d d h i g h m a n n o s e p r e c u r s o r s ( M W 2500 a p p r o x . ) , t h e r e f o r e t h e m a x i m u m t h e o r e t i c a l s i z e o f m i c r o s o m a l l y p r o c e s s e d E 2 w o u l d b e a b o u t 38 k D a a s s u m i n g a l l t h r e e g l y c o s y l a t i o n s i tes a r e u s e d , a n d c o r r e c t c l e a v a g e s o c c u r . F r o m t h e s e facts a n d a s s u m p t i o n s , it is l i k e l y that t h e 3 9 k D a b a n d is E 2 w h i c h c o n t a i n s h i g h m a n n o s e g l y c a n s . T r e a t m e n t o f t h e t r a n s l a t i o n p r o d u c t s w i t h t r y p s i n r e s u l t s i n p r o t e o l y s i s o f p l l O a n d c a p s i d . N o s i g n i f i c a n t c h a n g e i n s ize o f E l a n d E 2 o c c u r r e d s u g g e s t i n g that m o s t o f t h e p r o t e i n s a r e s e q u e s t e r e d i n t h e m i c r o s o m e s . F r o m n u c l e o t i d e s e q u e n c e d a t a , t h e p r e d i c t e d m e m b r a n e t o p o l o g i e s o f E 2 a n d E l ( V i d g r e n et a l . , 1987) a r e that o f t y p e I m e m b r a n e p r o t e i n s w i t h l a r g e N - t e r m i n a l e c t o p l a s m i c d o m a i n s e x p o s e d to t h e v i r i o n e x t e r i o r , o r i n th i s c a s e t h e m i c r o s o m a l l u m e n . T r i t o n X - 1 0 0 a b o l i s h e s t h e m i c r o s o m e - m e d i a t e d p r o t e c t i o n f r o m t r y p s i n . T h e d i s c r e p a n c y i n b a n d i n t e n s i t y c a n b e e x p l a i n e d b y t h e fact that E l h a s o n l y t h r e e m e t h i o n i n e s , w h i l e E 2 a n d C h a v e s e v e n a n d six r e s p e c t i v e l y . p E 2 E l T h e R V c D N A i n s e r t i n p E 2 E l e n c o d e s a n 8 2 9 a m i n o a c i d p r o t e i n w i t h a p r e d i c t e d s i z e o f a p p r o x i m a t e l y 91 ,000 . T r a n s l a t i o n o f p E 2 E l m R N A i n t h e a b s e n c e o f m i c r o s o m e s r e s u l t s i n a p o l y p e p t i d e a p p r o x i m a t i n g th is s i ze ( F i g . 1 2 b ) . M i c r o s o m e s e f f i c i e n t l y p r o c e s s t h e 9 1 , 0 0 0 p r e c u r s o r to E l a n d E 2 m o i e t i e s w h i c h a r e t r a n s l o c a t e d i n t o the v e s i c l e s as i n d i c a t e d b y r e s i s t a n c e t o t r y p s i n ( F i g . 1 2 b ) . A t r y p s i n r e s i s t a n t b a n d o f a p p r o x i m a t e l y 100 k D a is a l s o v i s i b l e i n th i s g e l , a n d m a y r e p r e s e n t a n E 2 - E 1 a g g r e g a t e ( a r r o w F i g . 1 2 b ) . A n E 2 - E 1 a g g r e g a t e w o u l d a l s o b e e x p e c t e d i n t h e p r o c e s s i n g o f the p l l O p r o t e i n e n c o d e d b y p 2 4 S . F r o m F i g . 1 2 a s u c h a b a n d is n o t c l e a r l y v i s i b l e , h o w e v e r a f ter l o n g e r e x p o s u r e s o f the g e l , a b a n d i n th i s r e g i o n d o e s a p p e a r . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e that o n l y E l a n d E 2 a r e t r a n s l o c a t e d i n t o m i c r o s o m e s a n d that a n -60-i n t a c t c a p s i d p r o t e i n is n o t r e q u i r e d f o r t h e t r a n s l o c a t i o n p r o c e s s . E x p r e s s i o n o f E 2 i n v i t r o T h e s t r u c t u r e s o f p E 2 a n d p A S P E 2 c D N A s a r e i l l u s t r a t e d i n f i g u r e 1 3 a . P l a s m i d p A S P E 2 w a s g e n e r a t e d b y c r e a t i n g a n e w S p h l s i te u p s t r e a m f r o m E 2 u s i n g t h e m u t a g e n i c o l i g o n u c l e o t i d e i' T H 1 0 ( P - A G C C C G G C A T G C G C G G T A - O H ) to c h a n g e t h e b a s e s at p o s i t i o n s 2 1 5 a n d 2 1 6 f r o m G C t o A T , a n d t h e 163 nt f r a g m e n t e n c o d i n g the p u t a t i v e s i g n a l s e q u e n c e o f E 2 w a s d e l e t e d b y d i g e s t i n g w i t h S p h l a n d r e l i g a t i o n ( F i g . 1 3 a , b ) . T o r e s t o r e t h e c o r r e c t r e a d i n g f r a m e , t h e c o n s t r u c t w a s l i n e a r i z e d at t h e N c o l s i te i n the C r e g i o n b y p a r t i a l d i g e s t i o n , a n d t h e c o h e s i v e e n d s filled i n u s i n g K l e n o w f r a g m e n t . D i d e o x y n u c l e o t i d e s e q u e n c i n g w a s e m p l o y e d t o v e r i f y t h e s p e c i f i c b a s e c h a n g e s a n d s u b s e q u e n t d e l e t i o n s . T h e r e s u l t i n g p l a s m i d p A S P E 2 , is m i s s i n g D N A c o d i n g f o r 54 r e s i d u e s o f the c a r b o x y l t e r m i n u s o f c a p s i d i n p E 2 . I n f i g u r e 13b , t h e N - t e r m i n a l c o d i n g r e g i o n s o f p E 2 a n d p A S P E 2 c D N A s a r e c o m p a r e d . F i g . 13c is a h y d r o p a t h y p l o t o f t h e N - t e r m i n a l r e g i o n o f p E 2 a n d i l l u s t r a t e s that t h e p u t a t i v e E 2 s i g n a l p e p t i d e d o m a i n is t h e o n l y h y d r o p h o b i c r e g i o n i n t h e 54 a m i n o a c i d s p r e c e d i n g t h e E 2 a m i n o - t e r m i n u s . p E 2 T r a n s l a t i o n o f p E 2 R N A i n the a b s e n c e o f m i c r o s o m a l v e s i c l e s p r o d u c e d t w o p r o t e i n s , 3 6 a n d 34 k D a i n s i z e ( F i g . 14a) . T h e o p e n r e a d i n g f r a m e i n p E 2 s p e c i f i e s a p o l y p e p t i d e o f 338 a m i n o a c i d s a s s u m i n g t h e first i n f r a m e m e t h i o n i n e is u s e d , s u g g e s t i n g t h a t t h e s m a l l e r p r o t e i n is t h e r e s u l t o f a n i n t e r n a l i n i t i a t i o n , p r e m a t u r e t e r m i n a t i o n , o r l i m i t e d p r o t e o l y s i s . I n t h e p r e s e n c e o f m i c r o s o m e s , a p o l y p e p t i d e o f 39 ,000 d a l t o n s w a s s y n t h e s i z e d ( F i g . 14a) . O n s o m e ge l s , a 37 ,000 d a l t o n p r o t e i n w a s o b s e r v e d ( F i g . 15) s u g g e s t i n g that t h e 34 k D a E 2 p r o t e i n is p r o c e s s e d b y m i c r o s o m e s as w e l l . T h e i n c r e a s e i n m o l e c u l a r w e i g h t f r o m 36 to 3 9 k D a ( o r 34 t o 3 7 k D a ) is t h e r e s u l t o f h i g h - m a n n o s e g l y c a n a d d i t i o n . T r a n s l a t i o n p r o d u c t s f r o m p E 2 m R N A a r e o n l y p r o t e c t e d f r o m t r y p s i n d i g e s t i o n w h e n m i c r o s o m e s a r e i n c l u d e d . M e m b r a n e t o p o l o g y o f E 2 p r e d i c t s that t h e C - t e r m i n a l 18 a m i n o a c i d s p r o t r u d e f r o m t h e m i c r o s o m e s i n t o t h e c y t o p l a s m ( C l a r k e et a l . , 1987; V i d g r e n et a l . , 1987; F r e y - 6 1 -A pE2 E2 PASPE2 C E2 + ENS SP N tmPH =3-E S N tm PH F i g u r e 13 . P h y s i c a l m a p s o f E2 r e c o m b i n a n t s , (a) S c h e m a t i c d i a g r a m r e p r e s e n t i n g R V c D N A i n s e r t s i n p E 2 a n d p * S P E 2 . S P 6 p r o m o t e r s a r e m a r k e d w i t h a r r o w heads , a n d the p u t a t i v e s igna l p e p t i d e ( s p ) a n d t r a n s m e m b r a n e d o m a i n ( t m ) a r e u n d e r l i n e d . D a s h e d l ines r e p r e s e n t p S P T 1 9 s e q u e n c e s , a n d r e g i o n s o f c a p s i d ( C ) a n d E 2 g e ne s a r e i n d i c a t e d . R e s t r i c t i o n sites; E = E c o R I . N = N c o I , S = S p h I . H=Hindm, a n d P = P s t I . ( b ) 5? s e q u e n c e s o f E 2 a n d A S P E 2 inserts . T r a n s l a t i o n s t a r t s i tes a r e m a r k e d w i t h a r r o w s , c a p s i d ( C ) a n d E 2 c o d i n g r e g i o n s a r e i n d i c a t e d . T h e p u t a t i v e s i g n a l p e p t i d e is u n d e r l i n e d , (c) H y d r o p a t h y p l o t o f N - t e n n i n a l r e g i o n o f p E 2 i n s e r t . T h e N - t e r m i n a l r e g i o n o f p E 2 i n s e r t w a s s u b j e c t e d to h y d r o p a t h y analys is ( K y t e a n d D o o l i t t l e , 1 9 8 2 ) u s i n g t h e S E Q N C E D N A sof tware analys i s p r o g r a m ( D e l a n e y S o f t w a r e L t d , V a n c o u v e r , B . C . ) . H y d r o p h o b i c r e s i d u e s a r e as s igned pos i t ive va lues a n d l i e a b o v e the z e r o l i n e , w h i l e h y d r o p h i l i c a m i n o a d d s h a v e a n e g a t i v e va lue a n d l ie b e l o w the l i n e . T h e i n i t i a t o r m e t h i o n i n e f o r c a p s i d i s r e s i d u e # 6 , a n d C , E 2 , a n d s igna l p e p t i d e ( sp) r e g i o n s a r e i n d i c a t e d (.31 B E2 15 £ 3 0 N c q 1 4 5 CCC CAG GGT GCC CGA A TG GCT TCC ACT ACC CCC ATC ACC ATG GGA P r o G i n G l y A l a Arg Met A l a Ser Thr Thr Pro l i e Thr Met 61y Sph1 60 75 90 GCT TGC ATG CCA GTG CGC GGC CTC GAC GGC GAC ACG GCC CCG CTT A l a C y s Met P r o Va 1 A r g Gly Leu Asp Gly Asp Thr Ala f r o Leu 105 120 135 CCC CCT CAC ACC ACC GAG CGC ATT GAG ACC CGC TCG GCG CGC CAT P r o P r o H i s Thr Thr GIu Arg l i e Glu Thr Arg Ser Ala Arg H i s 150 ' 165 180 CCT TGG CGC ATC CGC TTC GGT GCC CCC CAG GCC TTC CTC GCC GGG P r o T r p A r g l i e Arg Phe Gly A l a Pro Gin A l a Phe leu Ala G l y 195 ' 210 ^ 2 225 C T C TTG CTC GCC GCG GTC GCC GTT GGC ACC GCG.CGC GCC GGG CTC Leu Leu Leu A l a A l a VaI A l a VaI Gly Thr A l a Arg A la Gly Leu AspE2 15 £ 30 45 CCC CAG GGT GCC CGA ATG GCT TCC ACT ACC CCC ATC ACC ATG CAT P r o G i n G l y A l a Arg Met A l a Ser Thr Thr Pro l i e Thr Met H is E2 60 " 75 90 GGG AGC TTG CAT GCC GGG CTC CAG CCC CGC GCT 6AT ATG GCG GCA G l y Ser Leu H i s A l a G l y Leu Gin Pro Arg A la Asp Met A la A l a C milk. -1 --. m m iiiiiiiii (In. i m m m m i m m m m i c mmnmmunmwmmmmmm 4 sp - » - E 2 -63-+ TX-100 -|- _ + + no trypsin _ + . _|_ RNA mic PASPE2 F i g u r e 14. I n v i t r o t r a n s l a t i o n o f p E 2 a n d p A S P E 2 m R N A . ( m i c ) w i t h m i c r o s o m e s ; ( t r y p s i n ) t r a n s l a t i o n a l p r o d u c t s d i g e s t e d w i t h t r y p s i n w i t h o r w i t h o u t T r i t o n X - 1 0 0 ( T X - 1 0 0 ) ; ( R V ) r a d i o l a b e l e d R V m a r k e r ( a ) p E 2 m R N A ( b ) p A S P E 2 m R N A . a n d M a r r , 1988) . C l e a v a g e o f th is c y t o p l a s m i c d o m a i n b y a t r y p s i n c o u l d b e t h e o r i g i n o f t h e l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t E 2 b a n d s e e n i n t h e m i c r o s o m e ( + ) / t r y p s i n ( + ) l a n e ( F i g . 1 4 a ) . D i g e s t i o n w i t h p r o n a s e r e s u l t s i n c o m p l e t e shift o f the t r a n s l o c a t e d E 2 t o t h e l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t f o r m ( n o t s h o w n ) . p A S P E 2 T h e o p e n - r e a d i n g f r a m e i n p A S P E 2 s p e c i f i e s a p r o t e i n o f 2 8 5 a m i n o a c i d s . T r a n s l a t i o n o f m R N A f r o m this p l a s m i d r e s u l t e d i n syn thes i s o f a p r o t e i n 30 -31 k D a i n s i ze i n a d d i t i o n t o t h e o t h e r p r o t e i n w h i c h w a s a p p r o x i m a t e l y 2 k D a s m a l l e r ( F i g . 1 4 b ) . T h e s e t r a n s l a t i o n p r o d u c t s d i d n o t a p p e a r t o b e t r a n s l o c a t e d i n t o m i c r o s o m e s as d e t e r m i n e d b y t h e i r s e n s i t i v i t y t o t r y p s i n ( F i g . 1 4 b ) , a n d sugges t t h a t a s i g n a l p e p t i d e f u n c t i o n f o r E 2 is l o c a t e d i n t h e C - t e r m i n a l r e g i o n o f c a p s i d p r o t e i n . E 2 a c q u i r e s N - l i n k e d g l y c a n s a n d is p r o t e o l y t i c a l l y p r o c e s s e d b y m i c r o s o m e s T r a n s l a t i o n p r o d u c t s o f p E 2 m R N A w e r e i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t h h u m a n a n t i - R V s e r u m , d i g e s t e d w i t h e n d o H , s e p a r a t e d o n S D S - P A G E a n d f l u o r o g r a p h e d ( F i g . 15) . E n d o H h a d n o e f f ec t o n t h e m o b i l i t y o f E 2 p o l y p e p t i d e s s y n t h e s i z e d i n t h e a b s e n c e o f m e m b r a n e s . I n c o n t r a s t , e n d o g l y c o s i d a s e t r e a t m e n t o f m i c r o s o m e - p r o c e s s e d E 2 d e c r e a s e d the m o l e c u l a r w e i g h t b y 8 0 0 0 d a l t o n s ( F i g . 15) . T h e a d d i t i o n o f 8000 d a l t o n s o f c a r b o h y d r a t e b y m i c r o s o m e s s u g g e s t t h a t a l l t h r e e o f t h e p o t e n t i a l N - l i n k e d g l y c o s y l a t i o n s i tes a r e u s e d ( d i s c u s s e d i n R e s u l t s s e c t i o n III ) . D e g l y c o s y l a t e d E 2 w a s d e t e r m i n e d to b e 6 0 0 0 d a l t o n s s m a l l e r t h a n E 2 s y n t h e s i z e d i n t h e a b s e n c e o f m e m b r a n e s . T h e p r e d i c t e d s i g n a l p e p t i d a s e c l e a v a g e s i te is l o c a t e d 6 7 a m i n o a c i d s f r o m t h e i n i t i a t o r m e t h i o n i n e i n p E 2 ( F i g . 13b) . P r e s u m a b l y s i g n a l p e p t i d a s e is r e s p o n s i b l e f o r p r o t e o l y t i c a l l y r e m o v i n g 6 0 0 0 d a l t o n s o f p o l y p e p t i d e d u r i n g t r a n s l o c a t i o n o f the p E 2 p r o t e i n . A s s u m i n g s i g n a l p e p t i d a s e c l e a v e s the p E 2 p o l y p e p t i d e o n l y o n c e (at t h e E 2 N - t e r m i n u s ) , t h e l i k e l i h o o d that t h e l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t E 2 b a n d o r i g i n a t e s f r o m i n t e r n a l t r a n s l a t i o n i n i t i a t i o n s e e m s r e m o t e ( F i g . 15) . I f th is w e r e the case , o n l y o n e b a n d w o u l d b e e x p e c t e d a f ter i n s e r t i o n i n t o m i c r o s o m e s . S i g n a l p e p t i d a s e s h o u l d c l e a v e at a p o i n t 5 5 a m i n o a c i d s C - t e r m i n a l to -65-F i g u r e 15. P r o t e o l y t i c p r o c e s s i n g o f p E 2 p r o t e i n b y m i c r o s o m e s . S - l a b e l e d t r a n s l a t i o n p r o d u c t s s y n t h e s i z e d i n the p r e s e n c e o r a b s e n c e o f m i c r o s o m e s ( m i c ) w e r e i m m u n o p r e c i o i t a t e d w i t h h u m a n a n t i - R V s e r u m . S a m p l e s w e r e t h e n sp l i t i n t o t w o a l i q u o t s a n d i n c u b a t e d at 3 7 C w i t h o r w i t h o u t e n d o H , s e p a r a t e d o n S D S - P A G E a n d f l u o r o g r a p h e d . R a d i o l a b e l e d R V a n d p r o t e i n m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s ( k D a ) a r e i n c l u d e d . t h e t h i r d m e t h i o n i n e i n p E 2 ( 1 3 b ) . T h e r e f o r e the s m a l l e r E 2 b a n d p r o b a b l y r e s u l t s f r o m p r e m a t u r e t e r m i n a t i o n o r s o m e k i n d o f s p e c i f i c p r o t e o l y s i s i n t h e c a r b o x y l - e n d o f t h e p r o t e i n , p o s s i b l y t h e a r g i n i n e - r i c h r e g i o n b e t w e e n t h e E 2 t r a n s m e m b r a n e d o m a i n a n d p u t a t i v e E l s i g n a l p e p t i d e ( F i g s . 11 a n d 1 6 b ) . • E x p r e s s i o n o f E l T h e p h y s i c a l s t r u c t u r e o f t h e p E l a n d p A S P E l c D N A s a r e d i a g r a m m e d i n F i g . 1 6 a T h e o p e n r e a d i n g f r a m e o f p E l e n c o d e s a p r o t e i n 558 a m i n o a c i d s l o n g a n d i n c l u d e s t h e N - t e r m i n a l e i g h t r e s i d u e s f r o m c a p s i d , 6 9 a m i n o a c i d s f r o m the E 2 C - t e r m i n u s , a n d 4 8 1 a m i n o a c i d s o f E l . I n c l u d e d i n t h e 6 9 a m i n o a c i d s f r o m E 2 a r e t h e p u t a t i v e t r a n s m e m b r a n e d o m a i n o f E 2 a n d a s i g n a l p e p t i d e o f E l ( F i g . 1 6 a , b , c ) ( F r e y et a l . , 1986; V i d g r e n et a l . , 1987) . L o c a t e d b e t w e e n t h e E 2 t r a n s m e m b r a n e a n c h o r a n d E l s i g n a l s e q u e n c e is a n a r g i n i n e - r i c h ( 5 / 7 ) g r o u p o f a m i n o a c i d s ( F i g . 1 6 b ) . T h i s r e g i o n h a s b e e n p o s t u l a t e d to b e a site f o r a t r y p s i n - l i k e p r o c e s s i n g e n z y m e ( V i d g r e n et a l . , 1987) . T o c r e a t e p A S P E l , a 1550 nt P s t l f r a g m e n t f r o m p 2 4 S w a s e x c i s e d a n d s u b c l o n e d i n t o M 1 3 m p l 9 . T h e o l i g o n u c l e o t i d e T H 6 ( P - G C C T A T G G C A T G G A G G A G G C T - O H ) w a s u s e d to c r e a t e a s tar t c o d o n i n f r o n t o f t h e E l c o d i n g r e g i o n ( s tart c o d o n is u n d e r l i n e d ) . T h e i n s e r t w a s t h e n s u b c l o n e d b a c k i n t o p S P T 1 9 d o w n s t r e a m f r o m the p h a g e S P 6 p r o m o t e r ( F i g . 1 6 a , b ) . T h i s c o n s t r u c t l a c k s t h e p u t a t i v e s i g n a l p e p t i d e d o m a i n o f E l ( F i g . 1 6 a , b ) . N o t e t h a t i n a p r e v i o u s p u b l i c a t i o n ( H o b m a n et a l . , 1987) , p E l w a s c a l l e d p 3 ' E 2 E l , a n d p A S P E l w a s n a m e d p E l . p E l T r a n s l a t i o n o f p E l m R N A p r o d u c e d a p r o t e i n w h i c h w a s c o m p l e t e l y s e n s i t i v e t o t r y p s i n u n l e s s m i c r o s o m e s w e r e i n c l u d e d ( F i g . 17a , p a n e l i i ) . T r a n s l o c a t i o n a s s a y b y t r y p s i n d i g e s t i o n s u g g e s t e d t h a t m o s t o f t h e p E l p r o t e i n w a s s e q u e s t e r e d w i t h i n t h e m i c r o s o m e s , a n d is i n c o n c o r d a n c e w i t h the p r e d i c t e d m e m b r a n e t o p o l o g y o f E l w h i c h p o s t u l a t e s t h e 13 C - t e r m i n a l a m i n o a c i d s p r o t r u d e i n t o t h e c y t o p l a s m . A v e r y s l ight d e c r e a s e i n m o l e c u l a r w e i g h t is e v i d e n t a f t e r p r o t e a s e d i g e s t i o n , a n d m a y b e t h e r e s u l t o f p r o t e o l y s i s o f t h e C - t e r m i n a l r e g i o n o f E l ( F i g . 1 7 a , p a n e l i i ) . -67 -p A S P E l T h e E l p r o t e i n e n c o d e d b y p A S P E l h a s a p r e d i c t e d s i ze o f a b o u t 5 1 k D a w h i c h c o r r e s p o n d s w e l l w i t h t h e p o l y p e p t i d e p r o d u c e d b y c e l l - f r e e t r a n s l a t i o n ( F i g . 1 7 a , pane l ] i ) . A d d i t i o n o f m i c r o s o m e s d i d n o t af fect the s ize o f th is p r o t e i n , n o r d i d t h e y a f f o r d a n y p r o t e c t i o n f r o m p r o t e o l y s i s b y t r y p s i n i n d i c a t i n g that it w a s n o t t r a n s l o c a t e d i n t o t h e v e s i c l e s . T h e s e d a t a sugges t that t r a n s l o c a t i o n o f R V E l i n t o m i c r o s o m e s d o e s n o t r e q u i r e p r i o r a t t a c h m e n t o f E 2 t o t h e m e m b r a n e s , a n d is m e d i a t e d b y a s i g n a l p e p t i d e l o c a t e d w i t h t h e 6 9 C - t e r m i n a l a m i n o a c i d s o f E 2 . E l a c q u i r e s N - l i n k e d g l y c a n s a n d is p r o t e o l y t i c a l l y p r o c e s s e d b y m i c r o s o m e s . A s w a s t h e c a s e w i t h E 2 , i n c l u s i o n o f m i c r o s o m e s w h i l e t r a n s l a t i n g p E l m R N A r e s u l t e d i n a s l i gh t i n c r e a s e i n t h e s i ze o f E l ( F i g . 1 7 a , b ) . D i g e s t i o n o f t r a n s l o c a t e d E l p r o t e i n w i t h e n d o H d e c r e a s e d t h e m o l e c u l a r w e i g h t b y 5 -6000 d a l t o n s b y r e l e a s e o f h i g h m a n n o s e s u g a r s ( F i g . 1 7 b , a r r o w h e a d ) . E n d o H h a d n o ef fect o n t h e m o b i l i t y o f u n t r a n s l o c a t e d E l i n d i c a t i n g t h a t as w e l l as b e c o m i n g g l y c o s y l a t e d b y m i c r o s o m e s , E l w a s a l s o p r o t e o l y t i c a l l y p r o c e s s e d b y t h e v e s i c l e s . T h e m i c r o s o m e s u s e d i n th is e x p e r i m e n t h a d o b v i o u s l y los t a c o n s i d e r a b l e a m o u n t o f t h e i r a c t i v i t y j u d g i n g b y t h e fact t h a t less t h a n 5 0 % o f E l a p p e a r e d to b e p r o c e s s e d b y t h e v e s i c l e s ( F i g . 1 7 b ) . D i s c u s s i o n P r o c e s s i n g o f the R V p l l O p o l y p r o t e i n h a s b e e n s t u d i e d j n v i t r o b y u s i n g a c e l l - f r e e t r a n s l a t i o n / t r a n s l o c a t i o n a s s a y s y s t e m . A s p r e v i o u s l y r e p o r t e d , n o p r o c e s s i n g o f p l l O w a s o b s e r v e d w h e n 2 4 S m R N A w a s t r a n s l a t e d i n t h e a b s e n c e o f p a n c r e a t i c m i c r o s o m e s i m p l y i n g t h a t R V c a p s i d p r o t e i n d o e s n o t p o s s e s s a n a u t o p r o t e o l y t i c ac t iv i ty l i k e that f o u n d i n a l p h a v i r u s c a p s i d p r o t e i n s ( O k e r - B l o m et a l . , 1984; C l a r k e et a l . , 1987; S i m m o n s a n d S t r a u s s , 1974; G a r o f f et a l . , 1 9 8 0 a , b ) . E f f i c i e n t c l e a v a g e o f the p o l y p r o t e i n w a s o b s e r v e d b y i n c l u s i o n o f m i c r o s o m e s i n t h e t r a n s l a t i o n r e a c t i o n . R e s u l t i n g p r o d u c t s i n c l u d e d p r o t e i n s w h i c h c o m i g r a t e d w i t h R V v i r i o n -68-A E1 ASPE1 C E2 E1 S P 6 -} 6-EN P PH E1 SP6 E P PH 5 0 0 n t F i g u r e 16. P h y s i c a l m a p s o f RV E l c D N A s . (a ) S c h e m a t i c o f p E l a n d p ^ S P E l . S P 6 p r o m o t e r s are i n d i c a t e d b y b l a c k b o x e s , a n d t h e putat ive s i g n a l p e p t i d e a n d t r a n s m e m b r a n e d o m a i n o f E l a r e m a r k e d b y a n o p e n b o x a n d h a t c h e d b o x respect ive ly . R e p r e s e n t a t i v e p o r t i o n s o f C , E 2 a n d E l c o d i n g r e g i o n s a r e d e n o t e d a b o v e the cons truc t s . P = P s t I ; E = E c o R I ; N = N c o I ; H = H i n d U I . ( b ) S e q u e n c e s o f E l a n d ^ 6 P E 1 5' c o d i n g r e g i o n s . T r a n s l a t i o n start sites a r e d e s i g n a t e d b y a r r o w h e a d s , a n d t h e p u t a t i v e t r a n s m e m b r a n e d o m a i n o f E 2 a n d s ignal p e p t i d e o f E l are u n d e r l i n e d w i t h b r o k e n a n d s o l i d l i n e s r e s p e c t i v e l y . T h e N - t e r m i n a l c o d i n g r e g i o n (GAGGAG) o f E l i s m a r k e d , ( c ) H y d r o p a t h y p l o t o f t h e N - t e r m i n a l r e g i o n o f p E l i n s e r t H y d r o p h o b i c r e s i d u e s a r e a s s i g n e d p o s i t i v e v a l u e s a n d l i e a b o v e the z e r o l i n e , w h i l e h y d r o p h i l i c a m i n o ac ids h a v e a n e g a t i v e v a l u e . T h e i n i t i a t o r m e t h i o n i n e is r e s i d u e #6 , a n d C (6-14), E 2 (15-82) , a n d E l (83-) r e g i o n s a r e i n d i c a t e d . F o u r h y d r o p h o b i c d o m a i n s are presen t , a n d d o m a i n s l U a n d I V a r e b e l i e v e d t o b e the t r a n s m e m b r a n e d o m a i n o f E 2 a n d E l s igna l p e p t i d e r e s p e c t i v e l y . T h e a r g i n i n e r i c h r e g i o n is l o c a t e d b e t w e e n d o m a i n s H I a n d I V . B. A 0 _ _ CCC C C C GCC TAT GGC ATG GAG GAS oPEI p r o p r o A l a T y r G l r Met GIu G l u E2 E1 CCC CAG GGT GCC CGA ATG GCT TCC ACT ACC CCC ATC ACC ATG GGA P r o G i n G l y A l a A r g Met A l a S e r Thr Thr F r o l i e Tnr Met G l y CGT GC G A C T TGC TCC CCA GCC TCG GCC CTC TGG C T C GCC ACA GCG A r g A l a T h r C Y J S e r Pro A l a Ser A l a Leu T r p L e u A l a T h r A l a AAC GCG C T G TC T CTT GAC CAC GCG TTC GCG GCC T T T GTC CTG TTG Mn A l a L e u S e r Leu Aao H i s A l a Pfte A l a A l a Phe Ya I Leu Leu GTC C C G TGG GTC CTG ATA T T T ATS 6 T G TGC CGC CGC GCC TGT CGC Va I P r o T r p Ya I Leu l i e Pi le Met Ya I CYJ A r g A r g A l a C y s A r g CGC CGC GGC GCC GCC GCC GCC CTC ACC GCA GTC GTC CTS CAG 6GG A r g A r g G l y A l a A l a A l a A l a Leu Thr A l a Va1 Ya1 L^u G i n G l y El T A C AAC C C C C C C GCC TAT 6 S C 6 A G GAS T y r Asn P r o P r o A l a T y r S l y G l u GIu '. ' s ( T I I It II 12 u I M a n I I.I0J1 it.m 11.110 H . C I I i i.nu n.im f ( . M i l i nm II n.nn is I L K U II 10.1357 II 1I.«C7I II 11.1171 II C I . U I I It I M S T ?i tt.m U 1 I.SM3 23 I I.IIM 21 1 LOT n i 2.2211 n I U I U 27 12.2SM n i i.im 21 1 1.2211 30 I M M II I I.22H H I I.IIM 33 I 1.012! » I 1.17H 35 t 1.1357 31 I i.2W3 37 i o.nn 31 1 1.3711 31 F 1.2357 It 1 2.3357 11 I J . » l l 12 7 3.5121 43 1 3.HT! II 1 3.3211 «5 I I.IJ57 K 7 3.1500 a 7 3.I7M (i ri.nn II 1 3.0500 50 I 2.7211 51 I 1.5500 52 7 I.B357 53 12.7121 SI I I . U K 55 e 1.2357 SJ 11.2171 S7 11.2)21 51 I -O.fiOO 51 t-1.1505 U I -I.3U3 11 I -0.IM3 12 I -0.IH3 U I -(.SH3 II I 0.3357 IS I 1.5071 II 12.0500 17 1 7.3H3 U I 2.7071 II 1 3.0500 71 13.3211 71 J 2.SU1 72 t 1.1111 73 I I.II2I 71 I 1.1357 75 11.3971 71 7-0.5211 n H . 7 I 2 1 71 2-O.I7H n i -0.1711 10 1 -0.7121 11 14.7121 12 I 1)011 13 ( 1.3071 M M.tSOO o . . i . . i o ..I ..I ..I ..I . . . . ! ....I ..I ....I I.... I.. I.. I.... I.... I. O fc> ~ 4-+ + + + - - + - + -100 92.5 69 t _|_ mic _l_ EndoH B F i g u r e 17. ( a ) I n v i t r o t r a n s l a t i o n o f p E l a n d p A S P E l m R N A . ( m i c ) m i c r o s o m e s ; ( t r y p ) t r y p s i n d i g e s t i o n ; ( T X - 1 0 0 ) T r i t o n X - 1 0 0 . R e l a t i v e p o s i t i o n s o f m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s ( k D a ) a r e m a r k e d , ( i ) p ^ P E l m R N A ( i i ) p E l m R N A . ( b ) P r o t e o l y t i c p r o c e s s i n g o f p E l p r o t e i n b y m i c r o s o m e s . S - l a b e l e d t r a n s l a t i o n p r o d u c t s w e r e i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t h h u m a n a n t i - R v s e r u m t h e n sp l i t i n t o t w o f r a c t i o n s , a n d i n c u b a t e d o v e r n i g h t at 3 7 C w i t h o r w i t h o u t e n d o H , s e p a r a t e d o n S D S - P A G E a n d f l u o r o g r a p h e d . C - l a b e l e d p r o t e i n s t a n d a r d s ( k D a ) w e r e i n c l u d e d . A r r o w h e a d s h o w s t h e d e g l y c o s y l a t e d E l . E l a n d C , as w e l l as a 3 9 k D a E 2 p r o t e i n . T h e r e a s o n E 2 f r o m t h e i n v i t r o t r a n s l a t i o n r e a c t i o n is s m a l l e r t h a n v i r i o n E 2 , is t h a t m i c r o s o m e s o n l y a d d h i g h m a n n o s e g l y c a n s t o t r a n s l o c a t e d p r o t e i n s . I n c o n t r a s t , E 2 f r o m R V v i r i o n s is v e r y h e t e r o g e n e o u s l y g l y c o s y l a t e d a n d r a n g e s i n s i ze f r o m 4 2 - 4 7 k D a ( O k e r - b l o m et a l . , 1984) . P r o t e a s e p r o t e c t i o n a s s a y r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t o n l y E 2 a n d E l w e r e t r a n s l o c a t e d i n t o m i c r o s o m e s . P r o t e o l y s i s d i d n o t d r a m a t i c a l l y a l t e r t h e s i ze o f t r a n s l o c a t e d E 2 a n d E l w h i c h s u g g e s t e d that m o s t o f the p r o t e i n s w e r e s e q u e s t e r e d w i t h i n t h e v e s i c l e s . T r a n s l a t i o n o f p E 2 E l m R N A r e s u l t e d i n v i r i o n s i ze E l a n d a 3 9 k D a E 2 . T h e s e p r o t e i n s w e r e a l s o t r a n s l o c a t e d i n t o t h e m i c r o s o m e s , a n d t o g e t h e r t h e s e d a t a i n d i c a t e that c a p s i d p r o t e i n is n o t r e q u i r e d f o r t h e p r o c e s s i n g o f the R V p o l y p r o t e i n p r e c u r s o r i n c l u d i n g c o r r e c t t a r g e t i n g o f E l a n d E 2 t o t h e E R m e m b r a n e . T h e o b s e r v a t i o n t h a t t r a n s l o c a t i o n o f R V E l a n d E 2 i n t o m i c r o s o m e s c o u l d o c c u r i n d e p e n d e n t l y i m p l i e d t h a t at l eas t t w o s i g n a l s e q u e n c e s w e r e r e q u i r e d f o r t h e s e e v e n t s . S u b s e q u e n t l y , t h e s i g n a l p e p t i d e d o m a i n s o f E 2 w a s s h o w n t o r e s i d e w i t h i n t h e 58 a m i n o a c i d s o f t h e C - t e r m i n u s o f c a p s i d p r o t e i n . S e q u e n c e a n a l y s i s a n d h y d r o p a t h y e v a l u a t i o n o f th i s r e g i o n s u g g e s t e d that t h e s i g n a l s e q u e n c e is c o m p o s e d o f t h e 2 3 a m i n o a c i d s i m m e d i a t e l y p r e c e d i n g t h e E 2 N - t e r m i n u s ( C l a r k e et a l . , 1987; V i d g r e n et a l . , 1987; F r e y a n d M a r r , 1988; H o b m a n a n d G i l l a m , 1989) . A l t h o u g h s i g n a l p e p t i d a s e l i k e l y c a t a l y z e s t h e c l e a v a g e o f R V E 2 f r o m t h e c a p s i d , it r e m a i n s to b e d e t e r m i n e d i f the E 2 s i g n a l p e p t i d e is r e m o v e d f r o m t h e c a r b o x y - t e r m i n u s o f c a p s i d . S i m i l a r l y , t r a n s f e r o f E l a c r o s s t h e E R m e m b r a n e is m e d i a t e d b y a s i g n a l p e p t i d e d o m a i n l o c a t e d w i t h i n t h e C - t e r m i n u s o f E 2 g l y c o p r o t e i n ( H o b m a n et a l . , 1988) . N u c l e o t i d e s e q u e n c e a n a l y s i s h a s l e d o t h e r g r o u p s ( F r e y et a l . , 1986; V i d g r e n et a l . , 1 9 8 7 ) to p r e d i c t t h a t t h e h y d r o p h o b i c d o m a i n i m m e d i a t e l y p r e c e d i n g t h e k n o w n E l t e r m i n u s f u n c t i o n s as t h e E l s i g n a l ( K a l k i n n e n et a l . , 1984) , a l t h o u g h th i s r e m a i n s to b e d e t e r m i n e d . I n a d d i t i o n it is n o t k n o w n i f t h e E l s i g n a l d o m a i n r e m a i n s a t t a c h e d to the C - t e r m i n u s o f E 2 . V i d g r e n et a l ( 1 9 8 7 ) h a v e p o s t u l a t e d that t h e E l s i g n a l m a y b e r e l e a s e d f r o m E 2 b y t r y p s i n - l i k e p r o c e s s i n g i n t h e -73 -a r g i n i n e - r i c h r e g i o n b e t w e e n E2 a n d E l . I n c o n c l u s i o n , t a r g e t i n g a n d t r a n s l o c a t i o n o f R V E2 a n d E l a c r o s s t h e E R m e m b r a n e is c o n t r o l l e d b y at l eas t t w o i n d e p e n d e n t l y f u n c t i o n i n g s i g n a l p e p t i d e s . A t l eas t t w o m i c r o s o m e - d e p e n d e n t p r o t e o l y t i c c l e a v a g e s o f p l l O o c c u r d u r i n g p r o c e s s i n g , as w e l l as a d d i t i o n o f h i g h m a n n o s e g l y c a n s to E2 a n d E l . C a p s i d p r o t e i n d o e s n o t c r o s s t h e E R m e m b r a n e a n d d o e s n o t a p p e a r t o b e i n v o l v e d i n t h e p r o c e s s i n g o f p l l O . -74-S e c t i o n II. J n v i v o e x p r e s s i o n a n d p o s t - E R p r o c e s s i n g o f R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s I n t h e p r e v i o u s s e c t i o n , t h e t a r g e t i n g a n d i n s e r t i o n o f R V g l y c o p r o t e i n s i n t o m i c r o s o m a l v e s i c l e s w a s d i s c u s s e d . T h e r e s u l t s i m p l i e d that t h e t a r g e t i n g o f E 2 a n d E l to t h e E R c o u l d o c c u r as i n d e p e n d e n t e v e n t s a c c o m p l i s h e d b y i n d e p e n d e n t l y f u n c t i o n i n g s i g n a l p e p t i d e s . T o s t u d y t h e t r a n s p o r t o f R V g l y c o p r o t e i n s f r o m t h e E R to t h e G o l g i c o m p l e x , t h e R V c D N A s w e r e s u b c l o n e d i n t o t h e e u k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r p C M V 5 ( F i g . 10 A n d e r s s o n et a l . , 1989) . T h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d s w e r e i n t r o d u c e d i n t o C O S ce l l s a n d t h e i n d e p e n d e n t a n d c o o r d i n a t e e x p r e s s i o n o f t h e R V p r o t e i n s w a s e x a m i n e d . K i n e t i c s o f p r o c e s s i n g p C M V 5 - 2 4 S R e c o m b i n a n t p l a s m i d p C M V 5 - 2 4 S c o n t a i n s t h e R V 2 4 S c D N A u n d e r t h e c o n t r o l o f t h e i h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s m a j o r i m m e d i a t e e a r l y g e n e p r o m o t e r . C O S ce l l s w e r e t r a n s f e c t e d w i t h i' 3 5 p C M V 5 - 2 4 S u s i n g D E A E - d e x t r a n a n d c e l l u l a r p r o t e i n s w e r e l a b e l e d w i t h S - m e t h i o n i n e a n d R V - s p e c i f i c p r o t e i n s i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t h h u m a n a n t i - R V s e r u m . F i g . 18 s h o w s t h e r e s u l t s o f a p u l s e - c h a s e e x p e r i m e n t . A f t e r a 3 0 m i n u t e p u l s e w i t h l a b e l e d m e t h i o n i n e , t h e R V - s p e c i f i c p r o t e i n s c o m i g r a t i n g w i t h E l a n d C w e r e e v i d e n t , as w e l l as a p r o t e i n s l i g h t l y l a r g e r t h e n C . T h e l a t t e r p r o t e i n is 3 9 k D a a n d w a s d e t e r m i n e d to b e R V E 2 w i t h h i g h m a n n o s e s u g a r s ( s e c t i o n I ) . P r e s e n t i n l e s s e r a m o u n t s a r e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s o f > 100 k D a , a n 8 5 k D a d o u b l e t , a n d a 7 5 k D a p r o t e i n ( F i g . 18) . D i g e s t i o n w i t h e n d o H d e c r e a s e d t h e s i z e o f E l a n d E 2 b a n d s to 5 1 a n d 3 2 k D a r e s p e c t i v e l y , w h i l e C , > 100 k D a , a n d the 7 5 k D a p r o t e i n s w e r e u n a f f e c t e d . T h e 8 5 k D a p r o t e i n s a r e a l s o e n d o H sens i t i ve . T h e 75 k D a p r o t e i n c o u l d b e i m m u n o p r e c i p i t a t e d f r o m v e c t o r ( p C M V 5 ) t r a n s f e c t e d ce l l s ( n o t s h o w n ) u s i n g a m o n o c l o n a l a n t i b o d y to m u r i n e B i P ( B o l e et a l . , 1986) , h o w e v e r t h e o r i g i n o f t h e o t h e r h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s is u n c e r t a i n . A f t e r a 3 0 m i n u t e c h a s e w i t h excess m e t h i o n i n e the m o l e c u l a r w e i g h t o f E l a n d C r e m a i n t h e s a m e , h o w e v e r s o m e o f t h e 39 k D a E 2 is c o n v e r t e d i n t o a 42 k D a f o r m w h i c h c o n t a i n s c o m p l e x s u g a r s j u d g i n g b y t h e 3 7 k D a e n d o H d i g e s t i o n p r o d u c t ( F i g . 18) . A s t h e c h a s e p e r i o d i n c r e a s e d , s o d i d t h e 3 9 to 4 2 k D a E 2 c o n v e r s i o n i n a d d i t i o n to t h e a p p e a r a n c e o f a 5 3 k D a e n d o - 7 5 -F i g u r e 18. E x p r e s s i o n ^ p C M V 5 - 2 4 S i n C O S ce l l s . T r a n s f e c t e d C O S c e l l s w e r e p u l s e d f o r 3 0 m i n u t e s w i t h 100 u C i S - m e t h i o n i n e , t h e n c h a s e d f o r the i n d i c a t e d t i m e p e r i o d s w i t h exces s u n l a b e l e d m e t h i o n i n e . R V p r o t e i n s w e r e r e c o v e r e d b y i m m u n o p r e c i p i t a t i o n w^t| i h u m a n a n t i - R V s e r u m a n d i n c u b a t e d f o r 16 h o u r s at 3 7 C w i t h o r w i t h o u t e n d o H . R V a n d C - l a b e l e d p r o t e i n s t a n d a r d s ( k D a ) a r e i n c l u d e d . E R a n d G o l g i ( G ) - p r o c e s s e d f o r m s o f E 2 a r e i n d i c a t e d , a n d t h e 53 k D a e n d o H - r e s i s t a n t E l is m a r k e d b y a n a r r o w h e a d . H e t e r o g e n e o u s p r o c e s s i n g o f E 2 is i n d i c a t e d ( $,). T r a n s f e c t i o n s w i t h p C M V 5 c o n t r u c t s w e r e p e r f o r m e d i n 3 5 m m d i s h e s . H - r e s i s t a n t E l s p e c i e s ( a r r o w ) . I n the E R a n d m i c r o s o m e s , h i g h m a n n o s e ( e n d o H - s e n s i t i v e ) p r e c u r s o r g l y c a n s a r e a t t a c h e d to n a s c e n t l y t r a n s l o c a t e d p r o t e i n s . A c q u i s i t i o n o f e n d o H - r e s i s t a n c e o c c u r s a f ter p r o c e s s i n g o f g l y c a n s b y e n z y m e s i n t h e m e d i a l G o l g i c o m p a r t m e n t s ( D u n p h y a n d R o t h m a n , 1985) . U s i n g e n d o H - r e s i s t a n c e as e v i d e n c e o f G o l g i - s p e c i f i c p r o c e s s i n g , it c a n b e c o n c l u d e d that t h e 3 9 k D a a n d 4 2 k D a i s o f o r m s o f E 2 r e p r e s e n t g l y c o p r o t e i n s w i t h E R a n d G o l g i - s p e c i f i c s u g a r s r e s p e c t i v e l y , h e n c e t h e r e f e r e n c e as E R a n d G f o r m s o f E 2 ( F i g . 18) . T r a n s p o r t f r o m t h e E R t o G o l g i is a r a t e l i m i t i n g s t ep i n t h e p a s s a g e o f p r o t e i n s t h r o u g h t h e e x o c y t i c p a t h w a y a n d v a r i e s w i d e l y w i t h d i f f e r e n t p r o t e i n s , w i t h E R r e s i d e n t h a l f t i m e s r a n g i n g f r o m s e v e r a l m i n u t e s to s e v e r a l h o u r s ( L o d i s h , 1988) . I n th is s t u d y , t h e r a t e o f t r a n s p o r t o f E 2 a n d E l f r o m t h e E R to t h e m e d i a l G o l g i o c c u r s r e l a t i v e l y s l o w l y . A f t e r t h r e e h o u r s o n l y a b o u t 5 0 % o f E 2 w a s i n t h e 42 k D a f o r m , w h i l e less t h a n 1 0 % o f E l c o n t a i n e d e n d o H - r e s i s t a n t s u g a r s ( F i g . 18) . T h e h e t e r o g e n o u s p r o c e s s i n g o f E 2 s u g a r s f r o m 42 -46 k D a c o u l d b e o b s e r v e d a f t e r l o n g e r c h a s e p e r i o d s ( F i g . 18 a n d 19) . p C M V 5 - E 2 E l F i g . 19 s h o w s t h e r e s u l t s o f a p u l s e - c h a s e e x p e r i m e n t u s i n g p C M V 5 - E 2 E l t r a n s f e c t e d ce l l s . S u r p r i s i n g l y t h e p r o c e s s i n g o f E 2 a n d E l g l y c a n s o c c u r r e d m o r e r a p i d l y i n t h e a b s e n c e o f c a p s i d . A f t e r a 6 0 m i n u t e c h a s e p e r i o d t h e E R a n d G f o r m s o f E 2 a r e p r e s e n t i n e q u a l a m o u n t s , a n d e n d o H - r e s i s t a n t E l is f o r m e d m o r e q u i c k l y w i t h o u t c a p s i d p r e s e n t ( c o m p a r e F i g . 18 a n d 19) . H e t e r o g e n e o u s p r o c e s s i n g o f E 2 b e y o n d the 4 2 k D a s i ze a p p e a r s to t a k e p l a c e m o r e r a p i d l y as w e l l . T h e e n d o H - s e n s i t i v e 8 5 k D a p r o t e i n s w e r e a l s o p r e s e n t i n p C M V 5 - E 2 E l t r a n s f e c t e d ce l l s , a n d a r e t h e r e f o r e n o t c a p s i d - s p e c i f i c . W h e t h e r o r n o t t h e y r e p r e s e n t R V g l y c o p r o t e i n a g g r e g a t e s o r C O S c e l l p r o t e i n s i n d u c e d b y the e x p r e s s i o n o f R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d . A l s o p r e s e n t w e r e t h e > 100 k D a p r o t e i n , a n d B i P w h i c h d i d n o t s e e m t o c h a n g e i n i n t e n s i t y t h r o u g h o u t t h e c h a s e p e r i o d . E 2 g l y c o p r o t e i n T h e o n e k b c D N A c o n t a i n i n g the e n t i r e E 2 g e n e a n d f l a n k i n g s e q u e n c e s ( F i g . 1 1 ) w a s -77-F i g u r e 19. E x p r e s s i o n ^ p C M V 5 - E 2 E l i n C O S ce l l s . T r a n s f e c t e d C O S c e l l s w e r e p u l s e d f o r 30 m i n u t e s w i t h 100 u C i S - m e t h i o n i n e , t h e n c h a s e d f o r the i n d i c a t e d t i m e p e r i o d s w i t h exces s u n l a b e l e d m e t h i o n i n e . R V p r o t e i n s w e r e r e c o v e r e d b y i m m u n o p r e c i p i t a t i o n w i t h h u m a n a n t i - R V s e r u m a n d i n c u b a t e d f o r 16 h o u r s at 37 C w i t h o r w i t h o u t e n d o H . R V a n d C - l a b e l e d p r o t e i n s t a n d a r d s ( k D a ) a r e i n c l u d e d . E R a n d G o l g i ( G ) - p r o c e s s e d f o r m s o f E 2 a r e i n d i c a t e d , a n d t h e 53 k D a e n d o H - r e s i s t a n t E l is m a r k e d b y a n a r r o w h e a d . H e t e r o g e n e o u s p r o c e s s i n g o f E 2 is i n d i c a t e d ( J ). s u b c l o n e d b e t w e e n t h e E c o R I a n d H i n d l l l s i tes o f p C M V 5 . T h i s c o n s t r u c t d i d n o t c o n t a i n a s t o p c o d o n f o r t h e E 2 g e n e a n d w a s n a m e d p C M V 5 - E 2 n s . T r a n s l a t i o n w a s p r e d i c t e d t o p r o c e e d t h r o u g h t h e 3' e n d o f the p o l y l i n k e r a n d i n t o t h e h u m a n g r o w t h h o r m o n e r e g i o n ( F i g . 10) . T h e h u m a n g r o w t h h o r m o n e f r a g m e n t p r o v i d e s t h e t r a n s c r i p t i o n t e r m i n a t i o n a n d p o l y - a d e n y l a t i o n s i g n a l f o r g e n e s c l o n e d i n t o th i s v e c t o r . D e p e n d i n g u p o n e x a c t l y w h e r e t r a n s c r i p t i o n s t o p s , u p t o 4 0 n o n - R V a m i n o a c i d s c o u l d b e a d d e d o n t o t h e e n d o f E 2 p r o t e i n b y e x p r e s s i o n o f p C M V 5 - E 2 n s i n C O S ce l l s . T r a n s f e c t i o n o f p C M V 5 - E 2 n s i n t o C O S c e l l s d i r e c t e d t h e s y n t h e s i s o f a 38 k D a p r o t e i n w h i c h w a s r a p i d l y d e g r a d e d f o l l o w i n g c h a s e w i t h m e d i u m c o n t a i n i n g exces s m e t h i o n i n e ( F i g . 2 0 a ) . p C M V 5 - E 2 T o d e t e r m i n e i f t h e i n s t a b i l i t y o f E 2 i n C O S ce l l s w a s d u e to t h e l a c k o f a s t o p c o d o n , a n X b a l l i n k e r c o n t a i n i n g s t o p c o d o n s i n a l l t h r e e r e a d i n g f r a m e s ( T a b l e I ) w a s e n g i n e e r e d i n t o t h e E 2 g e n e at t h e P s t I s i te af ter the t r a n s m e m b r a n e r e g i o n ( F i g . 14) . T h e r e s u l t i n g p l a s m i d w a s n a m e d p C M V 5 - E 2 . R e s u l t s f r o m a p u l s e - c h a s e e x p e r i m e n t u s i n g th is p l a s m i d a r e s h o w n i n F i g . 2 0 b . I m m e d i a t e l y a f ter a 3 0 m i n u t e p u l s e , 38 a n d 4 3 k D a E 2 ( F i g . 2 0 b a r r o w h e a d ) p r o t e i n s w e r e s e e n as w e l l as t h e e n d o H - r e s i s t a n t 7 5 k D a p r o t e i n ( B i P ) . R e m o v a l o f h i g h m a n n o s e s u g a r s w i t h e n d o H r e d u c e d t h e m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e E 2 g l y c o p r o t e i n s to 3 1 a n d 3 6 k D a . C h a s e w i t h u n l a b e l e d m e t h i o n i n e r e s u l t e d i n d e g r a d a t i o n o f the 43 k D a p r o t e i n , a n d h e t e r o g e n e o u s p r o c e s s i n g o f t h e g l y c a n s o n 38 k D a E 2 ( ) p r e s u m a b l y b y G o l g i - s p e c i f i c e n z y m e s . D i g e s t i o n o f t h e h e t e r o g e n e o u s l y p r o c e s s e d E 2 w i t h e n d o H g a v e r i se to a 34 k D a c l e a v a g e p r o d u c t ( F i g . 2 0 b ) . T h e n a t u r e o f t h e s h o r t - l i v e d 4 3 k D a g l y c o p r o t e i n is u n c e r t a i n b u t m a y r e p r e s e n t a s u b p o p u l a t i o n o f E 2 that is r a p i d l y t r a n s p o r t e d t h r o u g h t h e G o l g i t o t h e c e l l s u r f a c e , t h e n t a r g e t e d t o t h e l y s o s o m e s w h e r e it w a s d e g r a d e d ( R i z z o l o , 1989) . p C M V 5 - E l E l f r o m c e l l s e x p r e s s i n g p C M V 5 - E l w a s s i m i l a r i n s ize to R V v i r i o n E l , a n d i n i t i a l l y c o n t a i n s o n l y h i g h m a n n o s e s u g a r s ( F i g . 2 1 a ) . T h e e n d o H c l e a v a g e p r o d u c t w a s 5 1 k D a w h i c h c o r r e s p o n d s w e l l w i t h t h e p r e d i c t e d s ize o f 51.5 k D a f o r u n g l y c o s y l a t e d E l ( V i d g r e n et a l . , 1987) . -79 -RV 90 El E 2 i 0 30 60 120 R V - + -+ - + - + 180 chase(min) — «|_ endo H E1 E2 I m m -B 30 F i g u r e 20 . E x p r e s s i o n ^ " E 2 i n C O S ce l l s , (a ) p C M V 5 - E 2 n s . T r a n s f e c t e d C O S c e l l s w e r e p u l s e d f o r 3 0 m i n u t e s w i t h S - m e t h i o n i n e a n d c h a s e d w i t h excess u n l a b e l e d m e t h i o n i n e f o r 0 a n d 9 0 m i n u t e s b e f o r e h a r v e s t i n g . R V a n t i g e n s w e r e i m m u n o p r e c i p i t a t e d w i t h h u m a n a n t i - R V s e r u m a n d s e p a r a t e d b y S D S - P A G E . N o t e t h e r e l a t i v e l y r a p i d d e g r a d a t i o n o f t h e E 2 n s p r o t e i n a f ter t h e c h a s e p e r i o d , ( b ) p C M V 5 - E 2 . C O S ce l l s w e r e r a d i o l a b e l e d as a b o v e a n d t h e R V a n t i g e n s i s o l a t e d b y i m m u n o p r e c i p i t a t i o n . S o m e s a m p l e s w e r e t r e a t e d w i t h e n d o H as i n d i c a t e d . T h e s h o r t - l i v e d 4 3 k D a E 2 is i n d i c a t e d w i t h a n a r r o w h e a d , a n d h e t e r o g e n e o u s p r o c e s s i n g o f E 2 b y G o l g i - s p e c i f i c e n z y m e s is s h o w n ( * ) . SO P r o c e s s i n g o f E l g l y c a n s is e v i d e n t af ter c h a s e w i t h 2 m M m e t h i o n i n e b y t h e a p p e a r a n c e o f a 5 3 k D a e n d o H - r e s i s t a n t p r o t e i n ( F i g . 2 1 a a r r o w ) . T h e s e r e s u l t s sugges t that E l is a b l e t o exi t t h e E R a n d e n t e r t h e G o l g i c o m p a r t m e n t s . E x p r e s s i o n o f A S P E 1 a n d A S P E 2 i n C O S c e l l s d i d n o t r e s u l t i n a n y d e t e c t a b l e R V a n t i g e n p r e s u m a b l y d u e t o r a p i d d e g r a d a t i o n i n t h e c y t o p l a s m ( n o t s h o w n ) . N e w l y s y n t h e s i z e d m e m b r a n e p r o t e i n s that f a i l t o u n d e r g o t r a n s l o c a t i o n i n t o t h e E R h a v e b e e n s h o w n to b e e x t r e m e l y u n s t a b l e i n t h e c y t o p l a s m ( G e t h i n g a n d S a m b r o o k , 1982; J a b b a r a n d N a y a k , 1987; S e k i k i w a a n d L a i , 1983) . T o d e t e r m i n e i f d e l e t i o n o f the p u t a t i v e m e m b r a n e a n c h o r r e g i o n o f E l w o u l d r e s u l t i n s e c r e t i o n o f E l i n t o t h e e x t r a c e l l u l a r s p a c e , t w o C - t e r m i n a l d e l e t i o n m u t a n t s o f E l w e r e c o n s t r u c t e d b y o l i g o n u c l e o t i d e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s ( T a b l e II) a n d s u b c l o n e d i n t o p S V L . T h e r e s u l t i n g p l a s m i d s p S V L - E l A T M a n d - E 1 T M C T - c o n t a i n i d e n t i c a l R V c D N A s as i n p C M V 5 - E l a n d p E l e x c e p t that the 2 7 a m i n o a c i d t r a n s m e m b r a n e d o m a i n o f E l , a n d t h e t r a n s m e m b r a n e d o m a i n a n d c y t o p l a s m i c t a i l o f E l a r e d e l e t e d r e s p e c t i v e l y i n E 1 A T M a n d E 1 T M C T - r e s p e c t i v e l y . A f t e r a t w o h o u r p o s t - l a b e l c h a s e , A T M a n d T M C T - E l p r o t e i n s w e r e n o t d e t e c t a b l e i n t h e m e d i u m o f t r a n s f e c t e d C O S ce l l s ( F i g . 2 1 b ) . E v e n a f ter t h r e e h o u r s o f c h a s e , n o R V a n t i g e n w a s f o u n d i n t h e m e d i u m ( n o t s h o w n ) . T h e r e a s o n s f o r l a c k o f s e c r e t i o n m a y i n c l u d e i ) d e f e c t i v e f o l d i n g a b r o g a t i n g t r a n s p o r t to t h e c e l l s u r f a c e ; i i ) p r e s e n c e o f a G o l g i r e t e n t i o n s i g n a l i n t h e e c t o p l a s m i c d o m a i n o f E l ; i i i ) t h e 2 7 a m i n o a c i d r e g i o n d e l e t e d is n o t the t r a n s m e m b r a n e a n c h o r o f E l ; i v ) s l o w t r a n s p o r t k i n e t i c s r e s u l t i n g i n v e r y l o n g t i m e s f o r s e c r e t i o n . S t e a d y s t a t e a n a l y s i s o f R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s i n t r a n s f e c t e d c e l l s 3 H - p a l m i t a t e l a b e l i n g P r e v i o u s i n v e s t i g a t o r s h a v e d e m o n s t r a t e d the p r e s e n c e o f c o v a l e n t l y b o u n d p a l m i t i c a c i d t o a w i d e v a r i e t y o f v i r a l g l y c o p r o t e i n s ( f o r r e v i e w , G r a n d , 1989) i n c l u d i n g R V E l a n d E 2 3 ( W a x h a m a n d W o l i n s k y , 1 9 8 5 b ) . I d e c i d e d to t r y a n d l a b e l R V g l y c o p r o t e i n s w i t h H - p a l m i t a t e i n t r a n s f e c t e d ce l l s f o r t w o r e a s o n s : 1) t o see i f a c y l a t i o n o f R V d o e s o c c u r i n t h e a b s e n c e o f n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s a n d v i r u s b u d d i n g , a n d i f s o d o e s E 2 r e q u i r e E l f o r th is p r o c e s s a n d v i c e - 8 1 -chaselminl endo H 0 3 0 a ATM TMCT P p c p p c L M L M L M L M 1 '•5*".-Figure 21. a) Expression of pCMV5-El in COS cells. Transfected cells were labeled with 100 juCi S-methionine and chased with excess unlabeled methionine as described above. RV-specific proteins were recovered with human anti-RV serum. The 53 kDa endo H-resistant band is indicated by an arrow head. b^Expression of pSVL-El^TM and pSVL-ElTMCT- in COS cells, (p) 2 hour pulse with 100 uCi S-methionine; (pc) cells were chased for 2 hours with excess methionine following pulse; (L) cell lysate; (M) medium (radioimmunoprecipitate from 1.0 ml). v e r s a a n d 2 ) t o d e t e r m i n e w h i c h i s o f o r m s o f E 2 a r e l a b e l e d , a n d e x a m i n e t h e r e l a t i v e l eve l s o f t h e s e s p e c i e s i n t h e t r a n s f e c t e d C O S ce l l s . E l a n d E 2 f r o m t r a n s f e c t e d ce l l s b o t h i n c o r p o r a t e p a l m i t a t e , a l t h o u g h E l s e e m s t o c o n t a i n h i g h e r m o l a r a m o u n t s o f t h e fa t ty a c i d ( F i g . 22 ) . T h e s i tes o f a c y l a t i o n o n E l a n d E 2 a r e u n k n o w n , b u t a r e l i k e l y o n e o r m o r e o f the c y s t e i n e r e s i d u e s l o c a t e d i n t h e C - t e r m i n a l r e g i o n s o f t h e p r o t e i n s ( R o s e et a l . , 1984; G r a n d , 1989) . C u r r e n t l y the exac t s u b c e l l u l a r l o c a t i o n o f p a l m i t a t e a d d i t i o n is n o t k n o w n , a l t h o u g h a n u m b e r o f i n v e s t i g a t o r s b e l i e v e that a c y l a t i o n o f p r o t e i n s o c c u r s i n t h e E R i m m e d i a t e l y p r i o r t o t h e i r exit ( S c h m i d t et a l . , 1985; R o s e a n d D o m s , 1988) , w h i l e B o n a t t i et a l ( 1989 ) h a v e e v i d e n c e that th is p r o c e s s o c c u r s i n a p o s t - E R / p r e - c i s G o l g i c o m p a r t m e n t . T h i s e x p e r i m e n t c l e a r l y s h o w s that E l a n d E 2 a r e c a p a b l e o f r e a c h i n g t h e s i te o f p a l m i t o y l a t i o n i n d e p e n d e n t l y i n t r a n s f e c t e d C O S ce l l s , a n d a c c o r d i n g t o t h e f i n d i n g s o f B o n a t t i et a l . , sugges t s t h a t R V E l is i n d e e d c a p a b l e o f e x i t i n g t h e E R w i t h o u t c o m p l e x i n g t o E 2 . I n a d d i t i o n , t h r e e s p e c i e s o f E 2 (39,42, 4 5 k D a ) c a n b e d e t e c t e d i n p C M V 5 - 2 4 S a n d p C M V 5 - E 2 E l t r a n s f e c t e d ce l l s , a n d l i k e l y r e f l e c t d i f f e r e n c e s i n g l y c o s y l a t i o n ( F i g . 22 ) . T h e h i g h e s t l e v e l s o f 3 9 k D a E 2 a r e f o u n d i n p C M V 5 - E 2 c o n t a i n i n g ce l l s , f o l l o w e d b y p C M V 5 - 2 4 S , t h e n p C M V 5 - E 2 E l i n d i c a t i n g t h a t g l y c a n p r o c e s s i n g a n d t r a n s p o r t o f E 2 o c c u r s m o s t r a p i d l y w i t h E l p r e s e n t , a n d c a p s i d a b s e n t . W e s t e r n b l o t a n a l y s i s I m m u n o b l o t t i n g w a s a l s o u s e d to e x a m i n e the s t e a d y s tate l eve l s o f t h e E 2 i s o f o r m s i n t r a n s f e c t e d C O S ce l l s lysates . B y th is t e c h n i q u e , o n l y t w o s p e c i e s o f E 2 a r e d e t e c t a b l e , as w e l l as o n e s p e c i e s o f E l a n d c a p s i d r e s p e c t i v e l y ( F i g . 23) . A g a i n t h e l eve l s o f 4 2 k D a E 2 a r e h i g h e s t i n p C M V 5 - E 2 E l t r a n s f e c t e d ce l l s , f o l l o w e d b y p C M V 5 - 2 4 S a n d p C M V 5 - E 2 . T h e s e r e s u l t s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e k i n e t i c a n a l y s i s a n d p a l m i t a t e l a b e l i n g d a t a , a n d sugges t that E l i n c r e a s e s t h e r a t e o f E R t o G o l g i t r a n s p o r t o f E 2 , w h i l e c a p s i d h a s a n e g a t i v e ef fect . F o r m a t i o n o f d i s u l f i d e b o n d s P r e v i o u s i n v e s t i g a t o r s h a v e s u g g e s t e d that d i s u l f i d e - b o n d e d E l - E l , E 2 - E 1 , a n d C - C -83-F i g u r e 22 . I n c o r p o r a t i o n o f p a l m i t a t e i n t o R V g l y c o p r o t e i n s . T r a n s f e c t e d c e l l s w e r e l a b e l e d w i t h 5 0 0 ; i C i o f [9,10 H ] - p a l m i t i c a c i d i n ^ O m l o f m e d i u m f o r 12 h o u r s , a n d t h e R V p r o t e i n s w e r e r e c o v e r e d b y i m m u n o p r e c i p i t a t i o n . S - l a b e l e d R V a n d p r o t e i n m a r k e r s w e r e i n c l u d e d f o r r e f e r e n c e . E1 E2 E2E1 24S RV F i g u r e 23 . W e s t e r n b l o t a n a l y s i s o f t r a n s f e c t e d C O S c e l l lysates . L y s a t e s f r o m t r a n s f e c t e d c e l l s w e r e s e p a r a t e d b y S D S - P A G E , t r a n s f e r r e d to n i t r o c e l l u l o s e , a n d p r o b e d w i t h h u m a n a n t i - R V s e r u m . G o l g i ( G ) a n d E R - p r o c e s s e d f o r m s o f E 2 a r e m a r k e d . R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s w e r e i n c l u d e d as m a r k e r . IS d i m e r s a r e f o u n d i n R V v i r i o n s ( W a x h a m a n d W o l i n s k y , 1983, 1 9 8 5 b ; D o r s e t t et a l . , 1985; G r e e n a n d D o r s e t t 1986) . T o d e t e r m i n e i f th i s p h e n o m e n o n o c c u r s i n t h e a b s e n c e o f v i r u s p r o d u c t i o n a n d n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s , R V p r o t e i n s f r o m t r a n s f e c t e d C O S ce l l s w e r e e x a m i n e d b y 3 5 S D S - P A G E u n d e r n o n r e d u c i n g c o n d i t i o n s . P r o t e i n s f r o m S - l a b e l e d C O S c e l l s w e r e l y s e d at t w o t i m e p o i n t s , a f t er a 3 0 m i n u t e p u l s e l a b e l , a n d f o l l o w i n g a t w o h o u r c h a s e w i t h e x c e s s u n l a b e l e d i m e t h i o n i n e . C e l l s w e r e l y s e d i n t h e p r e s e n c e o f 10 m M i o d o a c e t a m i d e to e n s u r e t h a t o x i d a t i o n o f c y s t e i n e s d i d n o t o c c u r d u r i n g h a r v e s t i n g . F o l l o w i n g a 3 0 m i n u t e p u l s e , n o d i s t i n c t R V - p r o t e i n o l i g o m e r s w e r e a p p a r e n t w h e n i m m u n o p r e c i p i t a t e s w e r e s e p a r a t e d u n d e r n o n r e d u c i n g c o n d i t i o n s ( F i g . 24 l a n e s I ,K,M ,6 ) . I n c o n t r a s t E l a n d E 2 m i g r a t e d at a fas ter r a t e u n d e r these c o n d i t i o n s s u g g e s t i n g t h e p r e s e n c e o f i n t r a m o l e c u l a r d i s u l f i d e b o n d s . T h e m o l e c u l a r w e i g h t o f c a p s i d w a s n o t s i g n i f i c a n t l y a l t e r e d w h e n s u b j e c t e d to n o n r e d u c i n g ( e x c l u s i o n o f 2 - m e r c a p t o e t h a n o l w h e n i n p r o t e i n s a m p l e b u f f e r ) c o n d i t i o n s ( c o m p a r e l a n e s A , B to IJ). T h e s e r e s u l t s c o n f l i c t e d w i t h p r e v i o u s r e p o r t s w h i c h s e e m e d t o i n d i c a t e that c a p s i d is f o u n d as a d i s u l f i d e - l i n k e d d i m e r w i t h a n a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t o f 78 ,000 ( W a x h a m a n d W o l i n s k y , 1983) o r 68 ,000 d a l t o n s ( D o r s e t t et a l . , 1 9 8 5 ) i n u n r e d u c e d p r e p a r a t i o n s . E x p e r i m e n t s p e r f o r m e d b y the a b o v e a u t h o r s w e r e c a r r i e d o u t u s i n g R V v i r i o n p r o t e i n s , w h e r e as i n th i s case , lysates o f t r a n s f e c t e d C O S ce l l s w e r e u s e d . T h e c y t o p l a s m o f e u k a r y o t i c ce l l s is v e r y r e d u c i n g d u e to the p r e s e n c e o f g l u t a t h i o n e a n d t h i o r e d o x i n , a n d it is t h e r e f o r e u n l i k e l y t h a t o x i d i z e d c a p s i d d i m e r s w o u l d b e f o u n d i n th is e n v i r o n m e n t . C o n s e q u e n t l y i f t h e c a p s i d d i m e r s r e p o r t e d b y the a b o v e a u t h o r s r e q u i r e v i r u s b u d d i n g f o r t h e i r f o r m a t i o n a n d t h e y w o u l d n o t b e d e t e c t e d i n t r a n s f e c t e d o r i n f e c t e d ce l l s . L a n e s J , L , N , a n d P ( F i g . 2 4 ) c o n t a i n u n r e d u c e d i m m u n o p r e c i p i t a t e s f r o m t r a n s f e c t e d C O S ce l l s p u l s e - l a b e l e d a n d c h a s e d f o r t w o h o u r s p r i o r to lysis t o d e t e r m i n e i f a n y s u b s e q u e n t d i s u l f i d e b o n d i n g o c c u r r e d . O n c e a g a i n , n o o l i g o m e r i c f o r m s o f the s t r u c t u r a l p r o t e i n s c o u l d b e o b s e r v e d e v e n t h o u g h a f ter a l l o w i n g a d e q u a t e t i m e f o r s o m e o f E 2 a n d E l to exi t t h e E R . E 2 w a s p r e d o m i n a n t l y o f t h e 4 2 k D a i s o f o r m af ter th is t i m e p e r i o d i n p C M V 5 - 2 4 S a n d p C M V 5 - E 2 E l t r a n s f e c t e d ce l l s , b u t a p p e a r e d to c o n t a i n o n l y i n t r a m o l e c u l a r d i s u l f i d e - b r i d g e s ( c o m p a r e l a n e s -86-reduced non-reduced RV A B C D E F G H mw I J K L M N O P F i g u r e 24 . S D S - P A G E o f S - l a b e l e d R V p r o t e i n s f r o m t r a n s f e c t e d C O S c e l l l y sa te s u n d e r n o n - r e d u c i n g a n d r e d u c i n g c o n d i t i o n s . A , B , I , J - p C M V 5 - 2 4 S ; C , D , K , L - p C M V 5 - E 2 E l ; E , F , M , N - p C M V 5 - E 2 ; C H . O . P - p C M V S - E l t r a n s f e c t e d ce l l s . L a n e s A > C , E , G , I , K , M ) 0 , ce l l s w e r e p u l s e d f o r 3 0 m i n u t e s w i t h r a d i o a c t i v e m e t h i o n i n e a n d h a r v e s t e d . I n l a n e s B , D , F , H , J , L . N , P , ce l l s w e r e c h a s e d f o r t w o h o u r s w i t h excess m e t h i o n i n e f o l l o w i n g the p u l s e . P u t a t i v e R V g l y c o p r o t e i n o l i g o m e r s a r e m a r k e d w i t h a n a r r o w . J , L t o B , D ) . S o m e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t R V - s p e c i f i c b a n d s a r e p r e s e n t i n t h e r e d u c e d s a m p l e s ( a r r o w l a n e s A , B , C , D ) as w e l l as i n t h e v i r i o n m a r k e r l a n e ( R V ) a n d a r e t h e r e f o r e p r o b a b l y n o t t h e r e s u l t o f c y s t e i n e o x i d a t i o n . F o r m a t i o n o f d i s u l f i d e - b o n d s i n m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s is t h o u g h t t o b e c a t a l y z e d b y t h e E R e n z y m e p r o t e i n d i s u l f i d e i s o m e r a s e ( F r e e d m a n , 1984) . I n t r a n s f e c t e d C O S ce l l s , f o r m a t i o n o f i n t e r m o l e c u l a r d i s u l f i d e b o n d s d o e s n o t a p p e a r t o b e i n v o l v e d i n t h e m a t u r a t i o n o f R V E l a n d E 2 g l y c o p r o t e i n s . W h e t h e r o r n o t t h i s p r o c e s s o c c u r s i n R V v i r i o n s r e m a i n s u n s u b s t a n t i a t e d . C e l l s u r f a c e i m m u n o p r e c i p i t a t i o n s T o d e t e r m i n e w h i c h o f t h e R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s a r e t r a n s p o r t e d to t h e p l a s m a m e m b r a n e , t r a n s f e c t e d C O S ce l l s w e r e p r o c e s s e d f o r c e l l s u r f a c e R V a n t i g e n as d e s c r i b e d a b o v e i n m a t e r i a l a n d m e t h o d s . F i g . 25 s h o w s that i n C O S ce l l s e x p r e s s i n g p C M V 5 - 2 4 S , o n l y E l a n d E 2 a r e a c c e s s i b l e t o a n t i b o d y i n u n p e r m e a b l i z e d ce l l s . I n a d d i t i o n , t h e a p p e a r a n c e o f E l a n d E 2 at t h e c e l l s u r f a c e w a s t i m e d e p e n d e n t . N o c a p s i d p r o t e i n w a s d e t e c t e d at t h e p l a s m a m e m b r a n e e v e n a f t e r a 180 m i n u t e c h a s e p e r i o d . N o t e that p r e d o m i n a n t f o r m o f E 2 at t h e p l a s m a m e m b r a n e is t h e 4 2 k D a i s o f o r m . S o m e 39 k D a E 2 w a s a l s o p r e s e n t s u g g e s t i n g that a . p o r t i o n o f h i g h m a n n o s e c o n t a i n i n g E 2 is t r a n s p o r t e d to the p l a s m a l e m m a . M o v e m e n t o f t h e R V a n t i g e n to t h e c e l l s u r f a c e a p p e a r e d r e l a t i v e l y s l o w w i t h the vast m a j o r i t y o f E l a n d E 2 s t i l l f o u n d i n t h e i n t r a c e l l u l a r f r a c t i o n a f ter t h e t h r e e h o u r c h a s e p e r i o d ( F i g . 2 5 ) I m m u n o f l u o r e s c e n c e T r a n s f e c t e d a n d i n f e c t e d C O S ce l l s w e r e e x a m i n e d u s i n g i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e to d e t e r m i n e t h e s u b c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f C , E 2 , a n d E l w h e n t h e y w e r e e x p r e s s e d c o o r d i n a t e l y o r i n d i v i d u a l l y . p C M V 5 - 2 4 S I n i t i a l l y h u m a n a n t i - R V s e r a w a s u s e d to v i s u a l i z e t h e R V s t r u c t u r a l a n t i g e n s i n c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h p C M V 5 - 2 4 S . I n s o m e cases , ce l l s w e r e first t r e a t e d w i t h R h o d a m i n e - c o n j u g a t e d -88-0 30 60 120 180 chaselminl RV i s i s i s i s i s E1 E 2 I m - m 200 100 925 • # • • -« 46 30 F i g u r e 25 . C e l l s u r f a c e i m m u n o p r e c i p i t a ^ o n o f R V p r o t e i n s f r o m p C M V 5 - 2 4 S t r a n s f e c t e d C O S ce l l s . C e l l s w e r e p u l s e d w i t h 100 j u C i S - m e t h i o n i n e f o r 3 0 m i n u t e s f o l l o w e d b y v a r i o u s c h a s e p e r i o d s w i t h excess m e t W o n i n e . C e l l s u r f a c e ( S ) a n d i n t r a c e l l u l a r ( i ) R V a n t i g e n s w e r e i s o l a t e d b y i m m u n o p r e c i p i t a t i o n w i t h h u m a n a n t i - R V s e r u m , f o l l o w e d b y S D S - P A G E a n d f l u o r o g r a p h y . A r r o w s s h o w t h e c e l l s u r f a c e E l a n d E 2 . WGA to identify Golgi and post-Golgi structures (Virtanen et al., 1980). Cells were permeablized with Nonidet NP40, treated with primary anti-RV serum followed by secondary Fluorescein-conjugated or Rhodamine-conjugated antibody. Fig. (26a) shows pCMV5-24S transfected cells treated with polyclonal anti-RV sera. A very prominent juxtanuclear structure presumed to be the Golgi complex was evident (Fig. 26a,b) as well as some vesicular structures in the cytoplasm. No staining of the plasma membrane was observed in these detergent-treated cells. Next the distribution of the individual antigens were examined using monoclonal antibodies. E l appeared to localize primarily to a Golgi-like region (Fig. 26c) with some vesicular staining evident as well. In addition to staining the juxtanuclear area, anti-E2 antibodies displayed a reticular pattern which probably corresponded to the ER (Fig. 26d). Capsid protein was found distributed throughout the cytoplasm, and surprisingly, seemed to be concentrated in the Golgi region (Fig. 26e). To determine if the juxtanuclear organization of capsid was due to an interaction with the spike glycoproteins, COS cells were transfected with pSVL-RV2 (Clarke et al., 1988) which contains the entire RV capsid gene and the 5' one third of E2 under the transcriptional control of the SV40 late promoter. Capsid protein in these cells displayed a diffuse cytoplasmic staining devoid of any antigen in the Golgi region (Fig. 26f). The latter results were consistent with the finding of Kondor-Koch et al (1982) who reported that in cells expressing SFV structural proteins, anti-SFV capsid antibodies displayed a diffuse cytoplasmic pattern whether glycoproteins E2 and E l were present or not. Normally, SFV-infected cells exhibit a homogeneous punctate cytoplasmic fluorescence when stained for capsid, however when treated with monensin, capsid protein was found in the juxtanuclear area due to a switch in virus budding from the plasmalemma to the Golgi membranes (Kuismanen et al., 1982). RV glycoproteins had a profound effect on the intracellular distribution of capsid protein. Moreover, E l seemed to manifest a juxtanuclear distribution as opposed to a reticular localization in cells expressing the SFV structural proteins (Kondor-Koch et al., 1982). Visualization of RV antigens on the cell surface was accomplished by processing fixed, -90-u n p e r m e a b l i z e d ce l l s f o r i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e . U s i n g p o l y c l o n a l s e r a a g a i n s t R V , c o p i o u s a m o u n t s o f R V a n t i g e n w a s d e t e c t e d o n the s u r f a c e o f c e l l s e x p r e s s i n g p C M V 5 - 2 4 S ( F i g . 2 6 g ) . T h i s a n t i g e n w a s d u e to b o t h E l a n d E 2 g l y c o p r o t e i n s , b u t n o t C ( F i g . h , i , j ) . S i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s w a s e m p l o y e d to p l a c e a s t o p c o d o n b e t w e e n the E l t r a n s m e m b r a n e d o m a i n a n d t h e 13 a m i n o a c i d c y t o p l a s m i c d o m a i n s u c h that the la t ter d o m a i n w a s d e l e t e d ( T a b l e II ) . E x p r e s s i o n o f th is c o n s t r u c t p C M V 5 - 2 4 S E l C T - i n C O S ce l l s r e s u l t e d i n c o r r e c t p r o c e s s i n g o f E l a n d E 2 w i t h s i m i l a r i f n o t fas ter k i n e t i c s that o f p C M V 5 - 2 4 S , a n d t r a n s p o r t o f E l a n d E 2 to t h e c e l l s u r f a c e ( n o t s h o w n ) . T h e d i s t r i b u t i o n o f c a p s i d p r o t e i n i n these ce l l s w a s s o m e w h a t v a r i a b l e w i t h s o m e ce l l s e x h i b i t i n g a d i f f u s e c y t o p l a s m i c d i s t r i b u t i o n w h i l e o t h e r s s h o w e d a p e r i n u c l e a r o r j u x t a n u c l e a r l o c a l i z a t i o n ( F i g . 2 6 k ) . F r o m these re su l t s it was n o t p o s s i b l e to d e t e r m i n e i f t h e c y t o p l a s m i c t a i l o f E l w a s s o l e l y r e s p o n s i b l e for the j u x t a n u c l e a r o r g a n i z a t i o n o f c a p s i d i n p C M V 5 - 2 4 S t r a n s f e c t e d ce l l s . C O S ce l l s t r a n s f e c t e d w i t h p C M V 5 - C E 2 ( c o n s t r u c t e d b y H . M c D o n a l d , this l a b ) d i d n o t s h o w a n y c o l o c a l i z a t i o n o f c a p s i d w i t h E 2 i n t h e G o l g i r e g i o n ( n o t s h o w n ) s u g g e s t i n g that E 2 a l o n e c a n n o t b i n d c a p s i d p r o t e i n . p C M V 5 - E 2 E l T h e d i s t r i b u t i o n o f a n t i g e n i n C O S ce l l s e x p r e s s i n g p C M V 5 - E 2 E l w a s s i m i l a r to t h o s e t r a n s f e c t e d w i t h p C M V 5 - 2 4 S w h e n a n a l y z e d u s i n g p o l y c l o n a l s e r u m . A s t r o n g j u x t a n u c l e a r s i g n a l w h i c h c o l o c a l i z e d w i t h W G A b i n d i n g m o i e t i e s w a s p r e s e n t i n a d d i t i o n to t h e w e a k e r r e t i c u l a r s t a i n i n g ( F i g . 2 7 a , b ) . E l w a s f o u n d p r i m a r i l y i n the G o l g i r e g i o n w h i l e E 2 w a s d i s t r i b u t e d i n t h e c y t o p l a s m i c r e t i c u l a r a r e a , as w e l l as i n the j u x t a n u c l e a r r e g i o n ( F i g . 2 7 c , d ) . N o s i g n a l w a s o b t a i n e d b y u s i n g the a n t i - c a p s i d m o n o c l o n a l ( F i g . 27e , f ) . C e l l s u r f a c e a n t i g e n s i n these ce l l s w a s d u e to the p r e s e n c e o f b o t h E l a n d E 2 ( F i g . 2 7 g , h , i ) . p C M V 5 - E 2 A l o n g w i t h the s t r o n g j u x t a n u c l e a r s i g n a l , C O S ce l l s e x p r e s s i n g p C M V 5 - E 2 e x h i b i t e d b r i g h t s t a i n i n g o f the n u c l e a r e n v e l o p e , a n d to a l e s ser extent the r e t i c u l a r a r e a ( F i g . 2 8 a ) . T h e j u x t a n u c l e a r a n t i g e n c o s t a i n e d w i t h W G A i n d i c a t i n g t r a n s p o r t o f E 2 i n t o the G o l g i c o m p l e x ( F i g . -91-I * F i g u r e 26. I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e o f p C M V 5 - 2 4 S t r a n s f e c t e d C O S ce l l s . F r a m e s a-f, c e l l s w e r e p e r m e a b l i z e d w i t h d e t e r g e n t t o a l l o w d e t e c t i o n o f i n t r a c e l l u l a r a n t i g e n s , ( a ) h u m a n a n t i - R V ; ( b ) s a m e ce l l s , T R I T C - W G A ; ( c ) a n t i - E l ; ( d ) a n t i - E 2 ; ( e ) a n t i - C ; (f) p S V L - R V 2 ( e n c o d e s c a p s i d a n d 5' o n e - t h i r d o f E 2 g e n e ) a n t i - C : F r a m e s g- j , c e l l s u r f a c e ( u n p e r m e a b l i z e d c e l l s ) a n t i g e n s , ( g ) h u m a n a n t i - R V ; ( h ) a n t i - E l ; ( i ) a n t i - E 2 ; ( j ) a n t i - C ; ( k ) p C M V 5 - 2 4 S E l C T - , a n t i - C ( i n t r a c e l l u l a r ) . N o t e - c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h v e c t o r ( p C M V 5 ) d i d n o t e x h i b i t a n y p r o t e i n s r e c o g n i z e d b y h u m a n a n t i - R V s e r u m ( n o t s h o w n ) . F i g u r e 27 . I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e o f p C M V 5 - E 2 E l t r a n s f e c t e d ce l l s . F r a m e s a-f, ce l l s were p e r m e a b l i z e d . (a ) h u m a n a n t i - R V ; ( b ) s a m e ce l l s , T R I T C - W G A ; ( c ) a n t i - E l ; ( d ) a n t i - E 2 ; ( e ) h u m a n a n t i - R V ; (f) s a m e ce l l s , a n t i - C : F r a m e s g- i , c e l l s u r f a c e a n t i g e n , ( g ) h u m a n a n t i - R V ; ( h ) a n t i - E l ; ( i ) a n t i - E 2 . <\5 2 8 b ) . M o r e o v e r , a n t i g e n w a s f o u n d o n t h e c e l l s u r f a c e s i g n i f y i n g t h a t E l is h o t r e q u i r e d f o r E 2 t o r e a c h t h e p l a s m a m e m b r a n e ( F i g . 2 8 c , d ) . pCMV5-E2ns T h e l a c k o f a s t o p c o d o n i n R V E 2 g l y c o p r o t e i n w a s f o u n d t o h a v e a p r o f o u n d e f fec t o n t h e i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t o f th is p r o t e i n . F i g s . 2 9 a , b s h o w that E 2 n s is f o u n d e x c l u s i v e l y i n a r e t i c u l a r d i s t r i b u t i o n w h i c h d o e s n o t c o r r e s p o n d to t h e G o l g i r e g i o n . C o l o c a l i z a t i o n o f E 2 n s w i t h R h o d a m i n e - C o n A ( F i g . 2 9 c , d ) r e v e a l e d that th is p r o t e i n w a s a c c u m u l a t i n g i n t h e E R ( V i r t a n e n et a l . , 1980) . C o n s e q u e n t l y , n o R V a n t i g e n w a s d e t e c t e d o n the c e l l s u r f a c e o f p C M V 5 - E 2 n s t r a n s f e c t e d c e l l s ( F i g . 29e , f ) . A s a r e s u l t o f n o t c o n t a i n i n g a s t o p c o d o n , E 2 n s p r o t e i n m a y c o n t a i n u p to 4 0 n o n - R V a m i n o a c i d s a p p e n d e d o n t o the C - t e r m i n u s . A l t h o u g h t h e s e n o n - R V a m i n o a c i d s a r e p r e d i c t e d to p r o t r u d e i n t o the c y t o p l a s m , t h e i r ef fect w a s t o p e r t u r b t h e s t r u c t u r a l i n t e g r i t y o f E 2 s u c h that it w a s u n a b l e to exit t h e E R . A l t e r n a t i v e l y , t h e y m a y c o n t a i n a s i g n a l that m e d i a t e s r e t e n t i o n i n the E R o r p r o m o t e s r a p i d p r o t e o l y s i s . p C M V 5 - E l C O S c e l l s e x p r e s s i n g o n l y R V E l g l y c o p r o t e i n d i s p l a y e d a n t i g e n i n a n e x t r e m e l y r e s t r i c t e d i j u x t a n u c l e a r r e g i o n w h i c h c o s t a i n e d w i t h W G A ( F i g . 3 0 a , b ) . N o f l u o r e s c e n c e o f r e t i c u l a r s t r u c t u r e s o r t h e n u c l e a r m e m b r a n e w a s o b s e r v e d , n o r w a s t h e r e a n y s i g n i f i c a n t c e l l s u r f a c e I; a n t i g e n ( F i g . 30e , f ) . T h e s e r e s u l t s s u p p o r t the p u l s e - c h a s e d a t a a n d p a l m i t i c a c i d l a b e l i n g e x p e r i m e n t w h i c h sugges t that R V E l c a n exit the E R a n d e n t e r t h e G o l g i c o m p a r t m e n t i n t h e a b s e n c e o f E 2 . H o w e v e r , c o e x p r e s s i o n o f E 2 s e e m s to b e s t r i c t l y r e q u i r e d f o r t r a n s p o r t o f E l f r o m t h e G o l g i t o t h e p l a s m a l e m m a . T r a n s f e c t i o n o f C O S ce l l s w i t h p C M V 5 - E l a n d p C M V 5 - E 2 r e s u l t e d i n t h e a p p e a r a n c e o f E l o n t h e c e l l s u r f a c e ( F i g . 30g ) , a n d p r o v i d e d f u r t h e r e v i d e n c e t h a t E l m u s t c o m p l e x w i t h E 2 to b e t r a n s p o r t e d to the p l a s m a m e m b r a n e . N o t e that C O S c e l l s t r a n s f e c t e d w i t h v e c t o r p C M V 5 d i d n o t b i n d a n t i - R V s e r a , o r a n y o f t h e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o t h e i n d i v i d u a l R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s ( n o t s h o w n ) . -96-F i g u r e 28 . I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e o f p C M V 5 - E 2 t r a n s f e c t e d C O S ce l l s . F r a m e s a ,b , ce l l s a r e p e r m e a b l i z e d . (a ) h u m a n a n t i - R V ; ( b ) s a m e ce l l s , T R I T C - W G A : F r a m e s c , d , c e l l s w e r e n o t p e r m e a b l i z e d . ( c ) h u m a n a n t i - R V ; ( d ) s a m e ce l l s , p h a s e c o n t r a s t . Figure 29. Indirect immunofluorescence of pCMV5-E2ns transfected COS cells. Frames a-d, cells are permeablized. ( a ) human anti-RV; (b) same cells, T R I T C - W G A ; (c) human anti-RV; (d) same cells, TRITC-ConA: Frames e,f, cells were not permeablized. (e) human anti-RV; (f) same cells, phase contrast. F i g u r e 30. I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e o f p C M V 5 - E l t r a n s f e c t e d C O S c e l l s . F r a m e s a ,b , ce l l s a r e p e r m e a b l i z e d . ( a ) h u m a n a n t i - R V ; ( b ) s a m e ce l l s , T R I T C - W G A : F r a m e s c-e, c e l l s w e r e n o t p e r m e a b l i z e d . ( c ) h u m a n a n t i - R V ; ( d ) s a m e ce l l s , p h a s e c o n t r a s t ; ( e ) p C M V 5 - E l + p C M V 5 - E 2 c o t r a n s f e c t i o n , a n t i - E l . M 3 3 i n f e c t i o n o f COS c e l l s C O S ce l l s w e r e i n f e c t e d w i t h M 3 3 R V a n d p r o c e s s e d b y i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f s t r u c t u r a l a n t i g e n 40 h o u r s p o s t - i n f e c t i o n . I n t r a c e l l u l a r a n t i g e n w a s f o u n d t o b e d i s t r i b u t e d m a i n l y i n a G o l g i - l i k e r e g i o n w i t h l e s ser a m o u n t s i n r e t i c u l a r a n d v e s i c u l a r s t r u c t u r e s ( F i g . 3 1 a , b ) . E l g l y c o p r o t e i n s e e m e d to b e m a i n l y i n the j u x t a n u c l e a r a r e a ( F i g . 3 1 c ) . E 2 a l s o l o c a l i z e d to this r e g i o n , b u t w a s a l s o p r e v a l e n t i n ves ic les that a p p e a l e d to r a d i a t e f r o m this a r e a ( F i g . 3 1 d ) . C a p s i d p r o t e i n e x h i b i t e d a d i f fuse c y t o p l a s m i c s t a i n i n g p a t t e r n i n a d d i t i o n to c o n c e n t r a t i n g i n the G o l g i r e g i o n ( F i g . 31e ) . L i m i t e d a m o u n t s o f R V a n t i g e n w a s d e t e c t e d o n the s u r f a c e o f i n f e c t e d ce l l s u s i n g p o l y c l o n a l s e r u m ( F i g . 31f) , a n d w a s c o m p o s e d o f E l a n d E 2 ( n o t s h o w n ) . D i s c u s s i o n P r o c e s s i n g a n d t r a n s p o r t o f R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s h a s b e e n a n a l y z e d b y t r a n s i e n t e x p r e s s i o n i n C O S ce l l s . J n v i v o e x p r e s s i o n o f the 24S c D N A r e s u l t e d i n the s y n t h e s i s o f R V a n t i g e n s s i m i l a r i n s i ze t o v i r i o n E l a n d C , i n a d d i t i o n to a 39 k D a E 2 p r o t e i n . P l a s m i d - d e r i v e d E l a n d E 2 w e r e s h o w n to c o n t a i n h i g h m a n n o s e s u g a r s w h i c h c o u l d b e r e m o v e d b y d i g e s t i o n w i t h e n d o H . T h e 3 9 k D a E 2 c o u l d b e c h a s e d i n t o a 42 k D a f o r m w h i c h p o s s e s s e d e n d o H - r e s i s t a n t s u g a r s i n d i c a t i n g t r a n s p o r t o f E 2 in to the G o l g i s tacks . A t l eas t o n e o f t h e N - l i n k e d s u g a r s o n E l w a s c o n v e r t e d to a c o m p l e x type , a n d s u g g e s t e d that E l a l s o e n t e r s t h e G o l g i . H e t e r o g e n e o u s p r o c e s s i n g o f E 2 f r o m 42-46 k D a w a s e v i d e n t a f ter p r o l o n g e d c h a s e p e r i o d s w i t h excess m e t h i o n i n e . P r o t e i n s r a n g i n g f r o m 7 5 k D a to > 100 k D a w e r e a l s o p r e s e n t i n p C M V 5 - 2 4 S t r a n s f e c t e d ce l l s , h o w e v e r t h e c o m p o s i t i o n a n d o r i g i n o f the 85 k D a a n d > 100 k D a p r o t e i n s r e m a i n u n c e r t a i n . T h e 7 5 k D a p r o t e i n ( i d e n t i f i e d as B i P ) c o p r e c i p i l a l e d w i t h R V a n t i g e n s i n ce l l s t r a n s f e c t e d w i t h a l l the p C M V 5 - R V p l a s m i d s b u t was no t f o u n d i n the (he lysates o f v e c t o r ( p C M V 5 ) t r a n s f e c t e d ce l l s ( s h o w n i n F i g 33 , next s e c t i o n ) . B i P , a r e s i d e n t E R p r o t e i n h a s b e e n s h o w n to b i n d to a n u m b e r o f m a l f o l d e d a n d p r o t e i n s i n the E R as w e l l as to s o m e v i r a l g l y c o p r o t e i n s ( K o z u t s u m i et -100-F i g u r e 3 1 . I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e o f R V M 3 3 i n f e c t e d C O S ce l l s . F r a m e s a-e , c e l l s w e r e p e r m e a b l i z e d . (a ) h u m a n a n t i - R V ; ( b ) s a m e ce l l s , T R I T C - W G A ; ( c ) a n t i - E l ; ( d ) a n t i - E 2 ; (e ) a n t i - C : (f) c e l l s u r f a c e a n t i g e n , h u m a n a n t i - R V s e r u m . a l . , 1988; R o s e et a l . , 1988; H u r t l e y et a l . , 1989) . S i g n i f i c a n t c o p r e c i p i t a t i o n o f R V g l y c o p r o t e i n s w i t h B i P w a s n o t o b s e r v e d u s i n g t h e a n t i - m u r i n e B i P m o n o c l o n a l a n t i b o d y ( d a t a n o t s h o w n ) . I n a d d i t i o n t h e B i P a n t i b o d y w a s i n v e r y s h o r t s u p p l y a n d it w a s n o t p o s s i b l e t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e a s s o c i a t i o n o f R V E l a n d E 2 w i t h B i P w a s t r a n s i e n t o r i f a f r a c t i o n o f t h e E l a n d / o r E 2 p o o l r e m a i n e d p e r m a n e n t l y a s s o c i a t e d w i t h B i P . T h e o t h e r t h r e e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s m a y r e p r e s e n t g l y c o p r o t e i n o l i g o m e r s o r a g g r e g a t e s ( W a x h a m a n d W o l i n s k y , 1983) . A s t h e y w e r e a l s o f o u n d i n p C M V 5 - E 2 E l t r a n s f e c t e d ce l l s , t h e y a r e n o t c a p s i d s p e c i f i c . E x p r e s s i o n o f a n E 2 E 1 m R N A r e s u l t e d i n i d e n t i c a l g l y c o p r o t e i n p r o c e s s i n g as i n p C M V 5 - 2 4 S c o n t a i n i n g c e l l s e x c e p t t h a t t h e k i n e t i c s w e r e n o t i c e a b l y m o r e r a p i d i n the f o r m e r case . i e . c o n v e r s i o n o f E 2 a n d E l g l y c a n s t o e n d o H - r e s i s t a n t types o c c u r r e d m o r e s l o w l y i n the p r e s e n c e o f c a p s i d . O k e r - B l o m et a l ( 1983 ) r e p o r t e d that i n R V - i n f e c t e d ce l l s , E 2 exists as a 41 k D a p r o t e i n i n c o n t r a s t to t h e h e t e r o g e n e o u s l y g l y c o s y l a t e d E 2 f o u n d i n v i r i o n s . R e s u l t s f r o m the p r e s e n t s t u d y s u g g e s t s t h a t m a t u r a t i o n o f R V E 2 i n v o l v e s at least t w o i n t e r m e d i a t e s . I n i t i a l l y E 2 is s y n t h e s i z e d as a 3 9 k D a h i g h m a n n o s e c o n t a i n i n g g l y c o p r o t e i n w h i c h is t h e n p r o c e s s e d t o a 4 2 k D a f o r m c o n t a i n i n g s o m e e n d o H - r e s i s t a n t s u g a r s . T h e 42 k D a E 2 o b s e r v e d i n th is s t u d y m a y w e l l b e i d e n t i c a l t o t h e 4 1 k D a E 2 d e s c r i b e d b y O k e r - B l o m et a l . F i n a l l y , h e t e r o g e n e o u s p r o c e s s i n g o f t h e g l y c a n m o i e t i e s o c c u r s g i v i n g r i s e to t h e c h a r a c t e r i s t i c 4 2 - 4 7 k D a E 2 o f R V v i r i o n s . r A l t h o u g h E 2 a p p a r e n t l y w a s a b l e to exit t h e E R a n d e n t e r t h e G o l g i w h e r e m o d i f i c a t i o n o f t h e N - l i n k e d s u g a r s o c c u r r e d i n the a b s e n c e o f E l , this p r o c e s s t o o k p l a c e m o r e r a p i d l y d u r i n g c o e x p r e s s i o n w i t h E l . M o r e o v e r , t r a n s p o r t o f E 2 w a s s h o w n to b e s e n s i t i v e t o m o d e r a t e c h a n g e s i n s t r u c t u r e s u c h as C - t e r m i n a l a d d i t i o n o f n o n - R V a m i n o a c i d s . E 2 e x p r e s s e d f r o m a c o n s t r u c t l a c k i n g a s t o p c o d o n r e s u l t e d i n a p r o t e i n w h i c h d i d n o t a p p e a r t o l e a v e t h e E R a n d w a s r a p i d l y d e g r a d e d . S u r p r i s i n g l y , e x p r e s s i o n o f E l a l o n e r e s u l t e d i n the a p p e a r a n c e o f e n d o H - r e s i s t a n t f o r m s o f t h e g l y c o p r o t e i n i n d i c a t i n g t r a n s p o r t to the G o l g i c o u l d o c c u r i n t h e a b s e n c e o f E 2 , j, e v e n t h o u g h it o c c u r r e d r e l a t i v e l y s l o w l y . T h e l a t t e r o b s e r v a t i o n is i n c o n t r a s t t o S F V E l w h i c h r e q u i r e s b i n d i n g o f p 6 2 i n o r d e r to exit the G o l g i ( K o n d o r - K o c h et a l . , 1983; M e l a n c o n a n d G a r o f f , 1986) . -102-B o t h R V g l y c o p r o t e i n s b e c a m e a c y l a t e d w i t h p a l m i t a t e i n t r a n s f e c t e d c e l l s a n d w a s i n a g r e e m e n t w i t h t h e f i n d i n g o f W a x h a m a n d W o l i n s k y ( 1 9 8 5 b ) w h o s u c c e s s f u l l y l a b e l e d v i r i o n E l 3 a n d E 2 w i t h H - p a l m i t a t e . F u r t h e r m o r e , a c y l a t i o n o f E l w a s i n d e p e n d e n t o f E 2 , a n d v i c e v e r s a W h e r e e x a c t l y th i s m o d i f i c a t i o n o c c u r s w i t h i n the c e l l i n s t i l l u n c e r t a i n , b u t t h e la tes t r e p o r t sugges t s t h a t a d d i t i o n o f p a l m i t a t e t o v i r a l g l y c o p r o t e i n s t a k e s p l a c e i n a p o s t - E R / p r e - G o l g i c o m p a r t m e n t ( B o n a t t i et a l . , 1989) . I f th is is c o r r e c t , t h e n p a l m i t o y l a t i o n o f E 2 a n d E l is f u r t h e r p r o o f t h a t t h e s e p r o t e i n s c a n exit the E R i n d e p e n d e n t l y . C o e x p r e s s i o n w i t h E l a l w a y s r e s u l t e d i n a g r e a t e r p r o p o r t i o n o f E 2 i n the 42 k D a f o r m w h e n s t e a d y s tate l e v e l s o f a n t i g e n 3 f r o m t r a n s f e c t e d ce l l s w e r e e x a m i n e d ( ie . H - p a l m i t a t e l a b e l i n g a n d w e s t e r n b l o t t i n g ) s u p p o r t i n g t h e n o t i o n t h a t E l fac i l i ta tes the t r a n s p o r t o f E 2 o u t o f t h e E R . I m m u n o p r e c i p i t a t i o n o f R V a n t i g e n f r o m the c e l l s u r f a c e o f p C M V 5 - 2 4 S t r a n s f e c t e d ce l l s r e v e a l e d t h a t o n l y E l a n d E 2 w e r e t r a n s p o r t e d to the p l a s m a m e m b r a n e . T h e fac t t h a t s m a l l a m o u n t o f 3 9 k D a E 2 w e r e f o u n d o n t h e c e l l s u r f a c e w o u l d sugges t t h a t 3 9 k D a E 2 is n o t n e c e s s a r i l y E R - a s s o c i a t e d a l t h o u g h t h e p o s s i b i l i t y that th is w a s a n a r t i f a c t h a s n o t b e e n r u l e d o u t . M o v e m e n t o f t h e g l y c o p r o t e i n s to the p l a s m a l e m m a a p p e a r e d to t a k e p l a c e r e l a t i v e l y s l o w l y w i t h less t h a n 1 0 % o f E 2 a n d E l r e a c h i n g the p l a s m a m e m b r a n e a f ter t h r e e h o u r s . F o r m a t i o n o f d i s u l f i d e - l i n k e d E 1 - E 2 a n d E l - E l d i m e r s w a s n o t o b s e r v e d i n t r a n s f e c t e d C O S c e l l s i n c o n t r a s t to s t u d i e s w i t h R V i n f e c t e d ce l l s ( W a x h a m a n d W o l i n s k y , 1983) . A n a l y s i s o f t r a n s f e c t e d a n d R V - i n f e c t e d C O S ce l l s b y i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e a l s o d e m o n s t r a t e d t h a t o n l y E 2 a n d E l w e r e p r e s e n t o n the c e l l s u r f a c e . A l t h o u g h E 2 w a s t r a n s p o r t e d t o t h e p l a s m a m e m b r a n e i n a n E l - i n d e p e n d e n t m a n n e r , n o c e l l s u r f a c e e x p r e s s i o n o f E l w a s o b s e r v e d w i t h o u t c o e x p r e s s i o n o f E 2 . T h e s e finding a r e s i m i l a r to t h o s e o f K o n d o r - K o c h et a l ( 1 9 8 3 ) i n that S F V E l r e q u i r e s E 2 f o r c e l l s u r f a c e e x p r e s s i o n , w h e r e a s E 2 c a n t r a v e r s e t h e e x o c y t i c p a t h w a y w i t h o u t E l . O n e i m p o r t a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n R V a n d S F V , is t h a t R V E l is t a r g e t e d to a G o l g i - l i k e r e g i o n i n the a b s e n c e o f E 2 , i n c o n t r a s t to S F V E l w h i c h r e m a i n s i n t h e E R . E v e n i n t h e p r e s e n c e o f E 2 , m u c h o f the i n t r a c e l l u l a r R V E l is l o c a l i z e d to t h e j u x t a n u c l e a r a r e a w h i l e E 2 is d i s t r i b u t e d m o r e e v e n l y b e t w e e n t h e r e t i c u l a r n e t w o r k a n d G o l g i . -103-I n R V - i n f e c t e d ce l l s , E 2 w a s a l s o f o u n d i n ve s i c l e s that s e e m e d to r a d i a t e f r o m t h e j u x t a n u c l e a r a r e a . N o E n d o D - s e n s i t i v e f o r m s o f E l c o u l d b e f o u n d i n t r a n s f e c t e d c e l l s ( n o t s h o w n ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e M a n ^ - G l c N A c ^ t o G I c N A c - M a n ^ - G l c N A c 2 t r a n s i t i o n ( s ee F i g . 2 ) o c c u r s t o r a p i d l y t o b e d e t e c t e d ( G o t t l i e b et a l . , 1979; K o r n f e l d a n d K o r n f e l d , 1985) . D e l a y o r r e t e n t i o n i n a p r e - m e d i a l G o l g i c o m p a r t m e n t m a y e x p l a i n w h y o n l y a f r a c t i o n o f E l b e c o m e s e n d o H - r e s i s t a n t i n t r a n s f e c t e d ce l l s , a n d p o s s i b l y w h y a n c h o r l e s s f o r m s o f E l a r e n o t s e c r e t e d . . C a p s i d w h i c h is b e l i e v e d to b e a s o l u b l e c y t o p l a s m i c p r o t e i n , w a s f o u n d t o b e c o n c e n t r a t e d i n t h e j u x t a n u c l e a r r e g i o n i n M 3 3 R V - i n f e c t e d ce l l s a n d i n p C M V 5 - 2 4 S t r a n s f e c t e d ce l l s , b u t n o t i n ce l l s e x p r e s s i n g c a p s i d a l o n e . P r e s u m a b l y c a p s i d c o n t a i n s a d o m a i n t h a t i n t e r a c t s w i t h the s p i k e g l y c o p r o t e i n s d u r i n g the b u d d i n g p r o c e s s . H o w this p r e s u m e d i n t e r a c t i o n b e t w e e n c a p s i d a n d the g l y c o p r o t e i n s c a u s e s t h e c a p s i d - a s s o c i a t e d d e l a y i n p r o c e s s i n g o f E l a n d E 2 r e m a i n s to b e d e t e r m i n e d . T a r g e t i n g i n f o r m a t i o n m a y b e e n c o d e d e x c l u s i v e l y w i t h t h e R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s t h e m s e l v e s , c o n s e q u e n t l y b e h a v i o r o f these a n t i g e n s i n t r a n s f e c t e d c e l l s m a y r e f l e c t r e l e v a n t e v e n t s i n t h e v i r u s l i fe c y c l e . F o r e x a m p l e , S F V a n d V S V g l y c o p r o t e i n s a r e t a r g e t e d t o t h e p l a s m a m e m b r a n e w h i l e E l g l y c o p r o t e i n o f c o r o n a v i r u s e s is r e t a i n e d i n the G o l g i . I n e a c h c a s e , t h e f i n a l d e s t i n a t i o n o f t h e v i r a l a n t i g e n c o r r e s p o n d s to t h e s i te o f v i r u s b u d d i n g . R u b e l l a v i r u s r e p o r t e d l y b u d s f r o m i n t e r n a l m e m b r a n e s o r t h e p l a s m a m e m b r a n e d e p e n d i n g o n t h e c e l l t y p e ( B a r d e l e t t i et a l . , 1979) . T h e t a r g e t i n g o f E l to the G o l g i r e g i o n a n d i n e f f i c i e n t t r a n s p o r t o f t h e g l y c o p r o t e i n s s p i k e s to the c e l l s u r f a c e m a y b e s i g n i f i c a n t i n t r y i n g to e x p l a i n t h e o b s e r v a t i o n s o f t h e a b o v e a u t h o r s . I n a d d i t i o n , l i m i t i n g the a m o u n t o f s t r u c t u r a l a n t i g e n o n t h e p l a s m a m e m b r a n e o f i n f e c t e d ce l l s w o u l d d e c r e a s e the c h a n c e s o f d e t e c t i o n b y h o s t i m m u n e - s u r v e i l l a n c e , a n d m a y p o s s i b l y b e c r u c i a l i n i n i t i a t i o n a n d m a i n t e n a n c e o f p e r s i s t e n t i n f e c t i o n s w h i c h a r e c h a r a c t e r i s t i c the s l o w l y r e p l i c a t i n g R V . T a k i n g i n t o a c c o u n t the t w o o b s e r v e d b u d d i n g s ites o f R V , the s l o w r e p l i c a t i o n k i n e t i c s a n d the d a t a f r o m t h e p r e s e n t s t u d y I p r o p o s e the f o l l o w i n g m o d e l f o r R V v i r u s a s s e m b l y w h i c h is i l l u s t r a t e d s c h e m a t i c a l l y i n F i g u r e 32 . T h e m o d e l is b a s e d o n t h e a s s u m p t i o n that t h e -104-n u c l e o c a p s i d - b i n d i n g s i te is l o c a t e d i n the 13 a m i n o a c i d c y t o p l a s m i c d o m a i n o f E l . G l y c o p r o t e i n s E 2 a n d E l a r e t r a n s l o c a t e d i n t o t h e E R w h e r e t h e y a r e a n c h o r e d i n t h e m e m b r a n e b y C - t e r m i n a l t r a n s m e m b r a n e d o m a i n s , b e c o m e g l y c o s y l a t e d a n d u n d e r g o o x i d a t i o n o f c y s t e i n e r e s i d u e s to f o r m i n t r a m o l e c u l a r d i s u l f i d e b o n d s w h i l e a s s u m i n g t h e i r t e r t i a r y s t r u c t u r e s . E l a n d E 2 c a n t h e n b e t a r g e t e d i n d i v i d u a l l y to the G o l g i c o m p a r t m e n t ( F i g . 3 2 B ) o r as a m o r e r a p i d l y t r a n s p o r t e d h e t e r o d i m e r ( F i g 3 2 A ) . T h e h e t e r o d i m e r m o v e s t h r o u g h t h e G o l g i c o m p l e x w h e r e t h e o l i g o s a c c h a r i d e s a r e m o d i f i e d a n d is t h e n t r a n s p o r t e d to t h e p l a s m a m e m b r a n e w h e r e b i n d i n g o f n u c l e o c a p s i d s o c c u r s a n d s u b s e q u e n t f o r m a t i o n o f v i r i o n s a n d b u d d i n g t a k e s p l a c e . T h e p o o l o f E l that is t r a n s f e r r e d t o t h e G o l g i w i t h o u t p r e v i o u s b i n d i n g to E 2 , r e m a i n s i n t h e G o l g i m e m b r a n e s a n d t h r o u g h a n i n t e r a c t i o n b e t w e e n its 13 a m i n o a c i d C - t e r m i n a l c y t o p l a s m i c d o m a i n a n d c a p s i d , is a b l e t o b i n d n u c l e o c a p s i d s . F r e e E 2 that is s l o w l y m o v i n g t h r o u g h t h e G o l g i b i n d s t o t h e E l - n u c l e o c a p s i d c o m p l e x e s c a u s i n g a c o n f o r m a t i o n c h a n g e w h i c h a l l o w s t h e s l o w m o v e m e n t o f t h e s e p a r t i c l e s t h r o u g h the G o l g i s tacks ( F i g . 3 2 B ' ) , a n d r e l e a s e f r o m t h e c e l l b y f u s i n g o f c a r r i e r v e s i c l e s w i t h the p l a s m a m e m b r a n e . C o n v e r s e l y , b i n d i n g o f E 2 to E l i n t h e G o l g i m a y b e r e q u i r e d f o r b i n d i n g o f n u c l e o c a p s i d to o c c u r . T h e s l o w t r a n s i t t i m e o f th i s c o m p l e x t h r o u g h t h e G o l g i a f f o r d s the g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s a l o n g e r t i m e p e r i o d i n w h i c h t o m o d i f y t h e N - l i n k e d s u g a r s o n E 2 a n d E l , r e s u l t i n g i n l a r g e r s u g a r m o i e t i e s o n E 2 o r b i n d i n g o f E 2 to t h e E l - n u c l e o c a p s i d c o m p l e x m a y r e s u l t i n a g r e a t e r a c c e s s i b i l i t y o f t h e E 2 ( a n d E l ) g l y c a n s to t h e g l y c o s y l t r a n s f e r a s e s t h a n i n a n E 2 - E 1 d i m e r d e v o i d o f n u c l e o c a p s i d . C o n s e q u e n t l y , v i r i o n s that f o r m o n G o l g i m e m b r a n e s g ive r i s e to v i r i o n s w i t h l a r g e r E 2 g l y c o p r o t e i n s , w h i l e v i r i o n s b u d d i n g at the p l a s m a m e m b r a n e c o n t a i n s m a l l e r E 2 m o i e t i e s , t h u s e x p l a i n i n g t h e h e t e r o g e n e i t y i n E 2 . E 2 that d o e s n o t b i n d to E l is t r a n s p o r t e d to t h e p l a s m a m e m b r a n e b u t is n o t i n c o r p o r a t e d i n t o v i r u s p a r t i c l e s ( B " ) . -105-F i g u r e 32 . M o d e l f o r R V a s s e m b l y . G l y c o p r o t e i n s E 2 a n d E l a r e i n s e r t e d i n t o t h e E R m e m b r a n e f o l l o w i n g t r a n s l a t i o n o f t h e 2 4 S R N A w h i l e c a p s i d r e m a i n s i n t h e c y t o p l a s m a n d c o m p l e x e s w i t h 4 0 S R N A to f o r m n u c l e o c a p s i d s . E 2 is r e p r e s e n t e d as ( J), b e c a u s e it is p r e s e n t l y u n k n o w n w h e t h e r the s i g n a l p e p t i d e o f E l is r e l e a s e d f r o m the E 2 C - t e r m i n u s . T h e a r g i n i n e r i c h r e g i o n a n d s i g n a l p e p t i d e o f E l c o m p r i s e t h e ( - ) a n d ( i) s e g m e n t s o n E 2 r e s p e c t i v e l y . A ) E 2 a n d E l c a n b e t r a n s p o r t e d as a c o m p l e x o u t o f t h e E R a n d t h r o u g h t h e G o l g i s t a c k s t o t h e p l a s m a m e m b r a n e . B u d d i n g at t h e p l a s m a m e m b r a n e is i n i t i a t e d b y b i n d i n g o f n u c l e o c a p s i d s t o t h e s p i k e g l y c o p r o t e i n s w h i c h a r e e m b e d d e d i n t h e p l a s m a m e m b r a n e . T h e s e v i r i o n s c o n t a i n p r e d o m i n a n t l y 4 2 k D a E 2 . B ) E l a n d E 2 a r e t a r g e t e d t o t h e G o l g i c o m p l e x i n d i v i d u a l l y . E l c a n n o t b e t r a n s p o r t e d o u t o f t h e G o l g i a n d a c c u m u l a t e s b e t w e e n t h e c i s a n d t r a n s - m o s t c i s t e r n a e o f th i s o r g a n e l l e . E 2 c a n e i t h e r b e t r a n s p o r t e d to t h e p l a s m a m e m b r a n e ( B " ) o r m a y b i n d w i t h t h e E l - n u c l e o c a p s i d c o m p l e x ( B ' ) l e a d i n g t o t h e f o r m a t i o n o f a v i r u s p a r t i c l e w h i c h t r a v e l s s l o w l y t h r o u g h t h e G o l g i c o m p l e x . H e t e r o g e n e i t y o f E 2 r e s u l t s f r o m s l o w t r a n s i t t i m e o f t h e n e w l y f o r m e d v i r i o n t h r o u g h t h e G o l g i a n d is a l s o a f f e c t e d b y w h e r e i n th i s o r g a n e l l e E 2 c o m p l e x e s w i t h E l . -106-S e c t i o n I I I . D e t e r m i n a t i o n o f t h e n u m b e r o f N - l i n k e d g l y c a n s o n R V E l a n d E2 g l y c o p r o t e i n T h e r o l e o f c a r b o h y d r a t e i n R V v i r i o n a s s e m b l y a n d i n f e c t i v i t y is u n k n o w n , b u t it s e e m s t o b e i m p o r t a n t f o r h e m a g g l u t i n a t i n g a c t i v i t y ( H o - T e r r y a n d C o h e n , 1984) . M 3 3 R V E l a n d E 2 g l y c o p r o t e i n s e a c h c o n t a i n t h r e e p o t e n t i a l s i tes f o r a t t a c h m e n t o f N - l i n k e d s u g a r s ( A s n - X - S e r / T h r ) , h o w e v e r it is u n k n o w n h o w m a n y a n d w h i c h a s p a r a g i n e r e s i d u e s a r e n o r m a l l y u s e d ( C l a r k e et a l . , 1987) . O l i g o n u c l e o t i d e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s w a s e m p l o y e d t o c h a n g e t h e A s n o r S e r / T h r r e s i d u e s i n t h e p o t e n t i a l g l y c a n a c c e p t o r s i tes o f E l a n d E 2 t o a m i n o a c i d s n o t s u i t a b l e f o r a t t a c h m e n t o f N - l i n k e d g l y c a n s . G l y c o s y l a t i o n s ites a r e n u m b e r e d f r o m o n e t o t h r e e , w i t h n u m b e r o n e ( G l ) b e i n g t h e g l y c o s y l a t i o n s i te n e a r e s t to t h e N - t e r m i n u s o f t h e p r o t e i n ( F i g . 11) . M u t a n t s w e r e s u b s e q u e n t l y n a m e d a c c o r d i n g to t h e e x p r e s s i o n v e c t o r , g l y c o p r o t e i n , a n d g l y c o s y l a t i o n s i t e ( s ) t h a t w a s i n a c t i v a t e d , i e . p C M V 5 - E l G l , p S V L - E 2 G 2 . E l g l y c o p r o t e i n E x p r e s s i o n o f E l g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s i n C O S ce l l s w a s a n a l y z e d b y r a d i o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n a n d i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e . F i g u r e 3 3 i l l u s t r a t e s that a l l t h r e e p o t e n t i a l g l y c o s y l a t i o n s ites o n E l a r e u t i l i z e d . D e s t r u c t i o n o f e a c h g l y c o s y l a t i o n s i te r e s u l t e d i n a 2 k D a d e c r e a s e i n m o l e c u l a r w e i g h t . T h e t r i p l e g l y c o s y l a t i o n m u t a n t E 1 G 1 2 3 w a s 5 1 k D a i n s i ze a n d w a s n o t s ens i t i ve t o e n d o H i n d i c a t i n g the a b s e n c e o f a n y N - l i n k e d s u g a r s ( F i g . 3 3 ) . F r o m F i g . 2 1 a , E l a p p e a r s to c o n t a i n at l east o n e c o m p l e x o l i g o s a c c h a r i d e , h o w e v e r I w a s n o t a b l e t o u n a m b i g u o u s l y d e t e r m i n e w h i c h o f the g l y c o s y l a t i o n s ites c o n t a i n e d th is m o e i t y ( n o t s h o w n ) . L o s s o f o n e , t w o o r t h r e e g l y c o s y l a t i o n s ites o n E l d i d n o t a p p e a r to af fect t h e i n t r a c e l l u l a r t a r g e t i n g i n C O S ce l l s . M u t a n t s p r o t e i n s f r o m p C M V 5 - E l G l , p C M V 5 - E l G 2 , p C M V 5 - E l G 3 a n d p C M V 5 - E l G 2 3 l o c a l i z e d to a j u x t a n u c l e a r s i te w h i c h l i k e l y c o r r e s p o n d s t o t h e G o l g i c o m p l e x as i n d i c a t e d b y c o s t a i n i n g w i t h W G A ( F i g . 3 4 a - h ) . T h e E 1 G 1 2 3 t r i p l e m u t a n t a l s o d i s p l a y e d t h e s a m e j u x t a n u c l e a r p a t t e r n ( n o t s h o w n ) as w i l d t y p e E l f r o m p C M V 5 - E l ( F i g . . i , -107-rv wt G3 G23 G123 mw V + H -E 2 M F j g u r e 33 . E x p r e s s i o n o f E l g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s i n C O S ce l l s . C e l l s w e r e l a b e l e d w i t h 100 u C i S - m e t h i o n i n e a n d R V - s p e c i f i c p r o t e i n s r e c o v e r e d b y i m m u n o p r e c i p i t a t i o n w i t h h u m a n a n t i - R V s e r u m . w t = p C M V 5 - E l ; G 3 = p C M V 5 - E l G 3 ; G 2 3 = p C M V 5 - E l G 2 3 ; G 1 2 3 = p C M V 5 - E l G 1 2 3 ; H = t r e a t m e n t w i t h e n d o H . V = C O S ce l l s t r a n s f e c t e d w i t h p C M V 5 f o l l o w e d b y r a d i o i m m u n o p r e c i p i t a t i o n w i t h h u m a n a n t i - R V s e r u m . M o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r s ( k D a ) a n d R V a r e i n c l u d e d . N o t i c e that t h e 7 5 k D a p r o t e i n ( B i P ) p r e s e n t i n F i g s . 18-21 is n o t p r e s e n t i n v e c t o r t r a n s f e c t e d c e l l s ( a r r o w h e a d ) . |0% F i g u r e 34 . I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e o f E l g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s i n t r a n s f e c t e d C O S ce l l s . C e l l s w e r e d e t e r g e n t p e r m e a b l i z e d p r i o r t o i n c u b a t i o n w i t h T R I T C - W G A a n d h u m a n a n t i - R V s e r u m , ( a ) p C M V 5 - E l G l , a n t i - R V ; ( b ) s a m e ce l l s , T R I T C - W G A ; ( c ) p C M V 5 - E l G 2 , a n t i - R V ; ( d ) s a m e c e l l , T R I T C - W G A ; ( e ) p C M V 5 - E l G 3 , a n t i - R V ; (f) s a m e c e l l , T R I T C - W G A ; ( g ) p C M V 5 - E l G 2 3 , a n t i - R V ; ( h ) s a m e c e l l , T R I T C - W G A . T r i p l e m u t a n t p C M V 5 - E l G 1 2 3 e x p r e s s i n g ce l l s a r e n o t s h o w n , b u t t h e y e x h i b i t the s a m e p a t t e r n o f R V a n t i g e n . \0°l * o 1* a f a uo 3 0 a , b ) . N o n e o f t h e E l g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s e x h i b i t e d c e l l s u r f a c e a n t i g e n ( n o t s h o w n ) . E 2 g l y c o p r o t e i n E 2 g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s w e r e s u b c l o n e d i n t o t h e e x p r e s s i o n v e c t o r p S V L at t h e S m a l s i te ( F i g . 1 0 ) b e c a u s e at t h e t i m e o f a n a l y s i s , o u r l a b d i d n o t h a v e t h e p C M V 5 v e c t o r . M u t a t i o n s w e r e m a d e at t h e i n d i v i d u a l g l y c o s y l a t i o n s ites i n E 2 ( T a b l e I I ) a n d t h e m u t a n t s w e r e a n a l y z e d b y e x p r e s s i o n i n C O S ce l l s . A s w a s f o u n d i n E l , a l l t h r e e g l y c o s y l a t i o n s i tes o n R V E 2 w e r e u t i l i z e d . A f t e r a 6 0 m i n u t e c h a s e p e r i o d , p S V L - E 2 e x p r e s s i n g ce l l s c o n t a i n e d a p r o m i n e n t 3 9 k D a E 2 g l y c o p r o t e i n a n d a 4 2 k D a g l y c o p r o t e i n ( F i g . 3 5 a ) w h i c h w e r e d e t e r m i n e d t o c o r r e s p o n d t o i s o f o r m s o f E 2 c o n t a i n i n g h i g h m a n n o s e a n d c o m p l e x s u g a r s r e s p e c t i v e l y b a s e d o n t h e i r s e n s i t i v i t y to e n d o H . T h e e n d o H c l e a v a g e p r o d u c t s o f t h e 3 9 k D a a n d 4 2 k D a p r o t e i n s w e r e 3 2 a n d 3 7 k D a r e s p e c t i v e l y ( F i g . 3 5 a ) i n d i c a t i n g that n o t a l l t h r e e s u g a r s o n t h e 4 2 k D a E 2 a r e o f t h e c o m p l e x t y p e , at l east at th is t i m e p o i n t . R e m o v a l o f a s i n g l e g l y c o s y l a t i o n site at p o s i t i o n s 1,2, o r 3 r e s u l t e d i n s y n t h e s i s o f a 3 6 k D a h i g h m a n n o s e c o n t a i n i n g g l y c o p r o t e i n , a n d m i n o r s p e c i e s at 3 9 a n d 4 0 k D a w h i c h a p p e a r e d t o c o n t a i n s o m e e n d o H - r e s i s t a n t s u g a r s ( F i g . 3 5 a ) . T r e a t m e n t w i t h e n d o H r e s u l t e d i n a d e c r e a s e i n s i ze o f t h e a b o v e p r o t e i n s to 32 , 35 , a n d 36 k D a r e s p e c t i v e l y ( F i g . 3 5 a ) . T h e d o u b l e g l y c o s y l a t i o n m u t a n t p S V L - E 2 G 1 2 d i r e c t e d t h e s y n t h e s i s o f a h i g h m a n n o s e c o n t a i n i n g 33 .5 k D a g l y c o p r o t e i n , p l u s t w o m i n o r s p e c i e s at 36 a n d 37 .5 k D a ( F i g . 3 5 a ) . T h e t w o l a t t e r p r o t e i n s w e r e r e d u c e d t o 3 5 a n d 36 .5 r e s p e c t i v e l y b y e n d o H , w h i l e the h i g h m a n n o s e c o n t a i n i n g 33 .5 k D a E 2 w a s c l e a v e d t o 3 2 k D a b y th is e n z y m e ( F i g . 3 5 a ) . A s e x p e c t e d , d i g e s t i o n o f t h e t r i p l e g l y c o s y l a t i o n m u t a n t e n c o d e d b y p S V L - E 2 G 1 2 3 w i t h N - g l y c a n a s e d i d n o t r e s u l t i n a n y c h a n g e i n m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e 32 .5 k D a p r o t e i n ( F i g . 3 5 b ) , n o r d i d t r e a t m e n t w i t h e n d o H ( n o t s h o w n ) . T h e r e a s o n w h y t h e N - g l y c a n a s e - t r e a t e d w i l d t y p e E 2 is s l i g h t l y s m a l l e r t h a n t h e t r i p l e m u t a n t is n o t c l e a r . T r a n s p o r t o f t h e E 2 g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s i n t o t h e G o l g i c o m p a r t m e n t s w a s e v i d e n t b y t h e p r e s e n c e o f p a r t i a l l y e n d o H - r e s i s t a n t b a n d s a f ter the c h a s e p e r i o d . N o e v i d e n c e o f c o m p l e x -111 -s u g a r s o n t h e w i l d t y p e E 2 o r g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s w a s a p p a r e n t w h e n c e l l s w e r e h a r v e s t e d i m m e d i a t e l y a f t e r t h e p u l s e w i t h r a d i o l a b e l e d m e t h i o n i n e ( n o t s h o w n ) . I n C O S ce l l s e x p r e s s i n g w i l d t y p e E 2 , t h e p r o m i n e n t 3 9 k D a g l y c o p r o t e i n w a s a p p a r e n t l y a p r e c u r s o r t o t h e c o m p l e x g l y c a n c o n t a i n i n g 4 2 k D a E 2 ( H o b m a n a n d G i l l a m , 1989) . H o w e v e r , i n C O S c e l l s e x p r e s s i n g E 2 G 1 , G 2 , o r G 3 , a 3 6 k D a h i g h m a n n o s e g l y c o p r o t e i n p r e c e d e d t h e 3 9 a n d 4 0 k D a G o l g i - p r o c e s s e d f o r m s , w h i l e t h e d o u b l e m u t a n t G 1 2 h i g h m a n n o s e f o r m w a s o n l y 3 3 k D a . U n f o r t u n a t e l y , s u b s e q u e n t a t t e m p t s to w o r k o u t d e t a i l e d p r o c e s s i n g k i n e t i c s o f t h e m u t a n t s w e r e u n s u c c e s s f u l . A s a r e s u l t , I w a s u n s u r e w h e t h e r t h e e n d o - H r e s i s t a n t g l y c o p r o t e i n s w e r e s y n t h e s i z e d s u c c e s s i v e l y i n t h e o r d e r 36 t o 3 9 t o 4 0 k D a , o r w h e t h e r t h e 3 9 a n d 4 0 k D a p r o t e i n s w e r e t h e r e s u l t o f s i m u l t a n e o u s b u t d i f f e r e n t g l y c a n p r o c e s s i n g e v e n t s . A s w e l l , t h e p S V L - R V c D N A d e r i v a t i v e s w h e n t r a n s f e c t e d i n t o C O S ce l l s , c o n s i s t e n t l y p r o d u c e d l o w e r a m o u n t s o f R V a n t i g e n t h a n s i m i l a r p C M V 5 - R V c D N A c o n s t r u c t s . E x a m i n a t i o n o f t h e E 2 g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s b y i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e d i d n o t r e v e a l a n y o b v i o u s d i f f e r e n c e s i n i n t r a c e l l u l a r l o c a t i o n f r o m t h e w i l d t y p e E 2 . C e l l s e x p r e s s i n g p S V L - E 2 e x h i b i t e d R V a n t i g e n t h r o u g h o u t the c y t o p l a s m i c r e t i c u l a r n e t w o r k as w e l l as i n t h e j u x t a n u c l e a r r e g i o n ( F i g . 3 6 a ) . T h e s ing l e , d o u b l e , a n d t r i p l e E 2 g l y c o s y l a t i o n m u t a n t p r o t e i n s d i s p l a y e d a s i m i l a r p a t t e r n to t h e w i l d t y p e E 2 ( F i g . 36b ,c ,d ,e , f ) - T h i s i n t r a c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f R V a n t i g e n is c l e a r l y d i f f e r e n t f r o m t h e p C M V 5 - E 2 n s p r o t e i n w h i c h is t r a p p e d i n t h e E R , a n d e x h i b i t s a s t r i c t l y r e t i c u l a r f l u o r e s c e n c e ( F i g . 29c ) , a n d sugges t s that t h e E 2 g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s a r e d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t the E R a n d G o l g i c o m p l e x . A t t e m p t s t o u n a m b i g u o u s l y d e t e r m i n e w h e t h e r t h e E 2 g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s w e r e t r a n s p o r t e d to t h e c e l l s u r f a c e o r n o t w e r e u n s u c c e s s f u l . A l t h o u g h l a c k o f g l y c o s y l a t i o n d i d n o t a p p e a r to a l t er t h e i n t r a c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f E 2 , its r o l e i n G o l g i to c e l l s u r f a c e t r a n s p o r t r e m a i n s to b e d e t e r m i n e d . D i s c u s s i o n T h e n u m b e r o f N - l i n k e d g l y c a n s o n R V E l a n d E 2 g l y c o p r o t e i n s h a s b e e n d e t e r m i n e d u s i n g o l i g o n u c l e o t i d e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s a n d it w a s d e t e r m i n e d that a l l t h r e e p o t e n t i a l -112-WT GI R V H H G 2 G 3 G12 H H H G123 WT N N F i g u r e 35 . E x p r e s s i o n o f E 2 g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s i n C O S ce l l s , ( a ) C e l l s w e r e p u l s e - l a b e l e d f o r 3 0 m i n u t e s w i t h 100 j i C i r a d i o a c t i v e m e t h i o n i n e , c h a s e d f o r 6 0 m i n u t e s w i t h e x c e s s m e t h i o n i n e , a n d t h e R V p r o t e i n s r e c o v e r e d b y i m m u n o p r e c i p i t a t i o n . w t = p S V L - E 2 ; G I = p S V L - E 2 G l ; e tc . H = e n d o H t r e a t e d , ( b ) N - g l y c a n a s e d i g e s t i o n o f p S V L - E 2 ( w t ) a n d p S V L - E 2 G 1 2 3 ( G 1 2 3 ) p r o t e i n s . T r a n s f e c t e d ce l l s w e r e p u l s e - l a b e l e d f o r 3 0 m i n u t e s o n l y , n o c h a s e p e r i o d . N = N - g l y c a n a s e d i g e s t e d . F i g u r e 36 . I n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e o f E 2 g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s i n C O S ce l l s . C e l l s w e r e p e r m e a b l i z e d p r i o r to a d d i t i o n o f a n t i - R V s e r u m , (a ) p S V L - E 2 ; ( b ) p S V L - E 2 G l ; ( c ) p S V L - E 2 G 2 ; ( d ) p S V L - E 2 G 3 ; ( e ) p S V L - E 2 G 1 2 ; (f) p S V L - E 2 G 1 2 3 . \ \3 -114-g l y c o s y l a t i o n s i tes o n b o t h E l a n d E 2 a r e u t i l i z e d . T i m e c o u r s e d i g e s t i o n o f R V E l a n d E 2 w i t h N - g l y c a n a s e s u p p o r t th is d a t a as w e l l ( M . L u n d s t r o m , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . D e l e t i o n o f a n y o r a l l o f t h e g l y c o s y l a t i o n s i tes d i d n o t a l t er the t a r g e t i n g o f E l t o t h e G o l g i r e g i o n , a n d d i d n o t r e s u l t i n t r a n s p o r t t o t h e c e l l s u r f a c e . S i m i l a r l y , the i n t r a c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f E 2 w a s n o t a f f e c t e d b y l a c k o f g l y c o s y l a t i o n . T h e i m p o r t a n c e o f g l y c o s y l a t i o n i n t r a n s p o r t t o t h e c e l l s u r f a c e c o u l d n o t b e u n a m b i g u o u s l y d e t e r m i n e d f o r E 2 d u e to e x p e r i m e n t a l d i f f i c u l t i e s . T h e r o l e o f i m p o r t a n c e o f g l y c o s y l a t i o n g e n e r a l l y v a r i e s f o r a n y g i v e n p r o t e i n , a n d n o c o n c r e t e r u l e s exist t h a t c a n b e u s e d to a c c u r a t e l y p r e d i c t the p h e n o t y p e o f a p a r t i c u l a r g l y c o s y l a t i o n m u t a n t . A n a l y s i s o f th is t y p e is f u r t h e r c o m p l i c a t e d b y t h e fac t t h a t w h e n g l y c o s y l a t i o n s i tes a r e c h a n g e d b y s i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s , t a r g e t i n g a n d / o r p r o c e s s i n g k i n e t i c d i f f e r e n c e s m a y o c c u r as a c o n s e q u e n c e o f the a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n , r a t h e r t h a n l a c k o f g l y c o s y l a t i o n p e r se ( G u a n et a l . , 1988) . G l y c o s y l a t i o n m a y a l s o b e i m p o r t a n t f o r e x p r e s s i o n o f i m m u n o l o g i c e p i t o p e s ( W r i g h t et a l . , 1989) , h o w e v e r i n this case , t h e h u m a n a n t i - R V s e r a s e e m e d t o r e c o g n i z e the g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s jus t as w e l l as the w i l d t y p e R V a n t i g e n s . P r e l i m i n a r y r e s u l t s f r o m l e c t i n a f f i n i t y s t u d i e s w i t h p u r i f i e d R V E l a n d E 2 sugges t t h a t E 2 m a y c o n t a i n g a l a c t o s e - N - a c e t y l g a l a c t o s a m i n e d i s a c c h a r i d e s w h i c h is c o m m o n l y f o u n d i n O - l i n k e d s u g a r s ( M . L u n d s t r o m , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . -115-S U M M A R Y a n d P E R S P E C T I V E S ) T h e m o l e c u l a r c e l l b i o l o g y o f R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s h a s b e e n s t u d i e d b y e x p r e s s i o n o f R V c D N A s j n v i t r o a n d i n v i v o . L i k e a l p h a v i r u s e s , t h e t a r g e t i n g o f E 2 a n d E l t o t h e E R m e m b r a n e is m e d i a t e d b y at l east t w o i n d e p e n d e n t l y f u n c t i o n i n g s i g n a l p e p t i d e s ( H o b m a n et a l . , 1988; H o b m a n a n d G i l l a m , 1989) . I n c o n t r a s t to a l p h a v i r u s e s , c a p s i d p r o t e i n d o e s n o t s e e m t o f u n c t i o n i n t h e p r o c e s s i n g o f t h e s t r u c t u r a l p o l y p r o t e i n p r e c u r s o r p l l O ( O k e r - B l o m et a l . , 1984; C l a r k e et a l . , 1987) . A t l eas t t w o e n d o p r o t e o l y t i c c l e a v a g e s a r e r e q u i r e d f o r p r o c e s s i n g o f p l l O to C , E 2 a n d E l , a n d s i g n a l p e p t i d a s e c o u l d a c c o u n t f o r b o t h o f these . T h e exac t C - t e r m i n i o f C a n d E 2 h a v e n o t b e e n d e t e r m i n e d a n d c o n s e q u e n t l y it is u n k n o w n w h e t h e r m o r e t h a n t w o c l e a v a g e s t a k e p l a c e to g e n e r a t e t h e m a t u r e s t r u c t u r a l p r o t e i n s . F o l l o w i n g t r a n s l o c a t i o n i n t o t h e E R , t h r e e N - l i n k e d g l y c a n s a r e a d d e d t o E 2 a n d E l r e s p e c t i v e l y . T h e s i zes o f t h e h i g h m a n n o s e p r e c u r s o r s o f E 2 a n d E l a r e 3 9 a n d 5 7 k D a r e s p e c t i v e l y . T r a n s p o r t o f E 2 i n t o the G o l g i c o m p a r t m e n t r e s u l t s i n t h e a p p e a r a n c e o f a 4 2 k D a g l y c o p r o t e i n b e a r i n g c o m p l e x s u g a r s . P r e v i o u s l y , O k e r - B l o m et a l ( 1983 ) i d e n t i f i e d a 4 1 k D a E 2 m o i e t y as t h e s o l e f o r m o f E 2 i n T h e r i e n s t r a i n R V - i n f e c t e d ce l l s . A s T h e r i e n s t r a i n E 2 c o n t a i n s f o u r p o t e n t i a l g l y c o s y l a t i o n s ites ( V i d g r e n et a l . , 1987; F r e y a n d M a r r , 1988) , it is n o t k n o w n i f a 3 9 k D a h i g h m a n n o s e E 2 p r e c e d e s the 41 k D a E 2 , o r m e r e l y that a l l f o u r s i tes a r e u s e d i n T h e r i e n R V . A f t e r p r o l o n g e d c h a s e p e r i o d s , h e t e r o g e n e o u s p r o c e s s i n g o f R V E 2 g l y c a n s (42 -46 k D a ) w a s o b s e r v e d . U n t i l the p r e s e n t s tudy , p r o c e s s i n g o f this t y p e o n E 2 h a d o n l y b e e n o b s e r v e d i n m a t u r e v i r i o n s , a n d w a s t h o u g h t to o c c u r late i n v i r u s m a t u r a t i o n ( O k e r - B l o m et a l . , 1983) . C l e a r l y , v i r u s b u d d i n g is n o t r e q u i r e d f o r this e v e n t to o c c u r . O n l y o n e o f t h e N - l i n k e d s u g a r s o n E l s e e m s to b e o f the e n d o H - r e s i s t a n t v a r i e t y i n c o n t r a s t t o t h e finding o f O k e r - B l o m et a l . (1983) that b o t h E l a n d E 2 c o n t a i n e d o n l y e n d o H - r e s i s t a n t s u g a r s . It s h o u l d b e n o t e d that these a u t h o r s p e r f o r m e d t h e i r g l y c o s i d a s e d i g e s t i o n s o n i n t a c t v i r i o n s . E n d o H d i g e s t i o n o f S D S - d e n a t u r e d / r e d u c e d R V v i r i o n s i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f e n d o H - s e n s i t i v e s u g a r s o n b o t h E 2 a n d E l ( M . L u n d s t r o m , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . E l a n d E 2 g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s w i l l a l s o b e u s e f u l f o r d e f i n i n g c a r b o h y d r a t e - d e p e n d e n t e p i t o p e s . -116-T h e ef fects o f E 2 g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s o n t r a n s p o r t o f E l , a n d v i c e v e r s a a r e p e r h a p s m o r e b i o l o g i c a l l y r e l e v a n t p r o b l e m s that n e e d to b e a d d r e s s e d , r a t h e r t h a n s t u d y i n g E l a n d E 2 g l y c o s y l a t i o n m u t a n t s i n d i v i d u a l l y . S i n c e R V E 2 a n d E l a r e n o r m a l l y t r a n s l a t e d f r o m t h e s a m e p o l y c i s t r o n i c m R N A , t h e y a r e a l w a y s c o e x p r e s s e d . T h e l a b o f D r . T . K . F r e y h a s r e c e n t l y s u c c e e d e d i n s e q u e n c i n g t h e n o n s t r u c t u r a l g e n e s o f R V i n t h e 5' t w o t h i r d s o f t h e v i r a l g e n o m e . C o n s t r u c t i o n o f i n f e c t i o u s R V c D N A s s h o u l d s o o n b e p o s s i b l e f a c i l i t a t i n g t h e a n a l y s i s o f t h e r o l e o f g l y c o s y l a t i o n i n v i r a l a s s e m b l y a n d in fec t iv i ty . I n a d d i t i o n , e x p r e s s i o n o f c D N A s f r o m v a c c i n e s t r a i n s o f R V s h o u l d fac i l i ta te the m o l e c u l a r m e c h a n i s m s o f a t t e n u a t i o n . E l is n o t r e q u i r e d f o r exit o f E 2 f r o m the E R a n d p a s s a g e t h r o u g h t h e G o l g i c o m p l e x t o t h e c e l l s u r f a c e , h o w e v e r E l s e e m s to i n c r e a s e t h e r a t e o f t r a n s p o r t as m o n i t o r e d b y g l y c a n p r o c e s s i n g . U n l i k e a l p h a v i r a l E l g l y c o p r o t e i n s , i n t h e a b s e n c e o f E 2 R V E l is t a r g e t e d t o t h e G o l g i c o m p l e x w h e r e it is r e t a i n e d , a n d is o n l y t r a n s p o r t e d to t h e c e l l s u r f a c e i n t h e p r e s e n c e o f E 2 . T h e p r o c e s s e s g o v e r n i n g t a r g e t i n g o f p r o t e i n s to the G o l g i c o m p l e x , a n d t h e i r s p e c i f i c r e t e n t i o n w i t h t h e i n d i v i d u a l c i s t e r n a e a r e p o o r l y u n d e r s t o o d . R e c e n t l y h o w e v e r , b y d e l e t i o n a n a l y s i s o f a c o r o n a v i r u s E l g l y c o p r o t e i n , M a c h a m e r a n d R o s e ( 1 9 8 7 ) w e r e a b l e t o d e m o n s t r a t e t h a t a s i n g l e s h o r t h y d r o p h o b i c m e m b r a n e s p a n n i n g d o m a i n w a s r e s p o n s i b l e f o r p r e v e n t i n g t h e t r a n s p o r t o f th is p r o t e i n f r o m t h e G o l g i t o the p l a s m a l e m m a . A s s u m i n g t h a t t r a n s p o r t f r o m t h e G o l g i t o t h e c e l l s u r f a c e is p a s s i v e , it s h o u l d b e p o s s i b l e to d e f i n e t h e d o m a i n ( s ) w i t h i n R V E l that m o d u l a t e its a c c u m u l a t i o n i n t h e G o l g i . A l t h o u g h i n t r a m o l e c u l a r c y s t e i n e o x i d a t i o n o c c u r s i n t h e R V g l y c o p r o t e i n s , I d i d n o t find a n y e v i d e n c e to s u p p o r t p r e v i o u s w o r k s u g g e s t i n g that E l a n d E 2 exist as d i s u l f i d e - b o n d e d h e t e r o d i m e r s ( W a x h a m a n d W o l i n s k y , 1983) . I n S F V , the g l y c o p r o t e i n s p i k e s i n v i r i o n s a r e c o m p o s e d o f n i n e m e m b e r h e t e r o t r i m e r s ( E 3 / E 2 / E 1 ) ^ ( F u l l e r , 1987) . A s i d e f r o m t h e o b s e r v a t i o n t h a t R V E l a n d E 2 s e e m to f o r m a c o m p l e x , f u r t h e r d e t a i l s r e g a r d i n g t h e p r e c i s e s t r u c t u r e o f t h e R V s p i k e a r e u n k n o w n . F u r t h e r m o r e , it is n o t c l e a r w h e t h e r E l a n d E 2 f o r m h o m o - o l i g o m e r s w h e n e x p r e s s e d i n d i v i d u a l l y i n C O S ce l l s . F o r m a t i o n o f V S V G t r i m e r s a n d i n f l u e n z a H A t r i m e r s is d e t e c t e d b y a n i n c r e a s e i n s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y o f the g l y c o p r o t e i n s i n s u c r o s e -117-g r a d i e n t s s h o r t l y a f ter s y n t h e s i s ( D o m s et a l . , 1987; G e t h i n g et a l . , 1986) . T h i s t y p e o f a n a l y s i s c o u l d p o s s i b l y c l a r i f y t h e s i t u a t i o n f o r R V . B o t h g l y c o p r o t e i n s E l a n d E 2 a r e t r a n s p o r t e d to t h e p l a s m a m e m b r a n e , h o w e v e r th i s p r o c e s s o c c u r r e d s l o w l y a n d i n e f f i c i e n t l y i n t r a n s f e c t e d C O S ce l l s . E x a m i n a t i o n o f t r a n s f e c t e d c e l l s a n d i n f e c t e d ce l l s r e v e a l e d that the R V s t r u c t u r a l p r o t e i n s , i n c l u d i n g C p r o t e i n , w e r e c o n c e n t r a t e d i n t h e G o l g i r e g i o n . T h e s e o b s e r v a t i o n b e c o m e e v e n m o r e s i g n i f i c a n t i n l i g h t o f t h e fac t t h a t R V h a s b e e n s e e n b u d d i n g f r o m b o t h i n t e r n a l m e m b r a n e s a n d t h e p l a s m a m e m b r a n e d e p e n d i n g o n t h e c e l l t y p e ( B a r d e l e t t i et a l . , 1979) . P o s s i b l y t h e s l o w t r a n s p o r t o f R V g l y c o p r o t e i n s t h r o u g h t h e e x o c y t i c p a t h w a y is m e d i a t e d b y E l , o r b y c a p s i d i n t e r a c t i o n w i t h E l a n d E 2 , a n d a l l o w s s u f f i c i e n t t i m e f o r a s s e m b l y o f v i r u s p a r t i c l e s o n i n t r a c e l l u l a r m e m b r a n e s . S p i k e c o m p l e x e s that a r e t r a n s p o r t e d to t h e p l a s m a m e m b r a n e w i t h o u t p r i o r b i n d i n g t o n u c l e o c a p s i d s , t h e n g i v e r i s e to v i r u s p a r t i c l e s w h i c h a r e a s s e m b l e d l i k e a l p h a v i r u s e s at t h e p l a s m a m e m b r a n e . It f o l l o w s that h e t e r o g e n e o u s g l y c o s y l a t i o n o f E 2 m a y b e a r e s u l t o f t h e t w o p a t h w a y s o f v i r u s b u d d i n g , o r that p r o c e s s i n g o f E 2 m a y b e a n i m p o r t a n t f a c t o r i n d e t e r m i n i n g t h e v i r a l b u d d i n g s i te . -118-R E F E R E N C E S A d a m s , G A . , a n d R o s e , J . K . ( 1985) S t r u c t u r a l r e q u i r e m e n t s o f a m e m b r a n e - s p a n n i n g d o m a i n f o r p r o t e i n a n c h o r i n g a n d c e l l s u r f a c e t r a n s p o r t . C e l l 41: 1007-1015 . A d e l m a n , M . R . , S a b a t i n i , D . D . a n d B l o b e l , G . ( 1973) R i b o s o m e - m e m b r a n e i n t e r a c t i o n . N o n d e s t r u c t i v e d i s a s s e m b l y o f r a t l i v e r r o u g h m i c r o s o m e s i n t o r i b o s o m a l a n d m e m b r a n o u s c o m p o n e n t s . J . C e l l B i o l . 56: 206 -229 . A l i p e r t i , G . a n d S c h l e s i n g e r , M J . ( 1978) E v i d e n c e f o r a n a u t o p r o t e a s e a c t i v i t y o f S i n d b i s v i r u s c a p s i d p r o t e i n . V i r o l o g y 90: 366 -369 . A n d e r s s o n , S . , D a v i s , D . L . , D a h l b a c k , H . , J o r n v a l l , H . , a n d R u s s e l l , D . W . ( 1 9 8 9 ) C l o n i n g , s t r u c t u r e , a n d e x p r e s s i o n o f t h e m i t o c h o n d r i a l c y t o c h r o m e P - 4 5 0 s t e r o l 2 6 - h y d r o x y l a s e , a b i l e a c i d b i o s y n t h e t i c e n z y m e . J . B i o l . C h e m . 264: 8222-8229 . B a l c h , W . E . , E l l i o t , M . M . a n d K e l l e r , D . S . (1986) A T P - c o u p l e d t r a n s p o r t o f v e s i c u l a r s t o m a t i t i s v i r u s G p r o t e i n b e t w e e n t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m a n d the G o l g i . J . B i o l . C h e m . 261 : 1 4 6 8 1 - 1 4 6 8 9 . B a r d e l e t t i , G . , T e k t o f f , J . , a n d G a u t h e r o n , D . ( 1979) R u b e l l a v i r u s m a t u r a t i o n a n d p r o d u c t i o n i n t w o h o s t c e l l s y s t e m s . I n t e r v i r o l o g y 11: 97 -103 . B e l l , J . R . , R i c e , C M . , H u n k a p i l l a r , M . W . a n d S t r a u s s , J . H . ( 1982) T h e N - t e r m i n u s o f P E 2 i n S i n d b i s v i r u s - i n f e c t e d ce l l s . V i r o l o g y 119: 255-267 . B e l l , J . R . , K i n n e y , R . M . , T r e n t , D . W . , S t r a u s s , E . G . a n d S t r a u s s , J . H . ( 1 9 8 4 ) A n e v o l u t i o n a r y t r e e r e l a t i n g e i g h t a l p h a v i r u s e s , b a s e d o n a m i n o - t e r m i n a l s e q u e n c e s o f t h e i r g l y c o p r o t e i n s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 81 : 4702-4706 . B e r g e r , M . a n d S c h m i d t , M . F . G . ( 1984 ) C e l l - f r e e fat ty a c i d a c y l a t i o n o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s w i t h m i c r o s o m a l m e m b r a n e s f r o m e u k a r y o t i c ce l l s . J . B i o l . C h e m . 259: 7 2 4 5 -B e r g e r , M . a n d S c h m i d t , M . F . G . ( 1985 ) P r o t e i n fat ty a c y l t r a n s f e r a s e is l o c a t e d i n t h e r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . ( F E B S L e t t . 187: 289-294 . B e r n s t e i n , H . D . , P o r i t z , M A . , S t r u b , K . , H o b e n , P . J . , B r e n n e r , S . a n d W a l t e r , P . ( 1 9 8 9 ) M o d e l f o r s i g n a l s e q u e n c e r e c o g n t i o n f r o m a m i n o - a c i d s e q u e n c e o f 5 4 K s u b u n i t o f s i g n a l r e c o g n i t i o n p a r t i c l e . N a t u r e 340: 86 . B i s c h o f f , J . a n d K o r n f e l d , R . ( 1984) T h e ef fect o f 1 - d e o x y m a n n o j i r i m y c i n o n r a t l i v e r o C - m a n n o s i d a s e s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m u n . 125: 324 -331 . B l o b e l , G . a n d D o b b e r s t e i n , B . ( 1 9 7 5 a ) T r a n s f e r o f p r o t e i n s a c r o s s m e m b r a n e s I. P r e s e n c e o f p r o t e o l y t i c a l l y p r o c e s s e d a n d u n p r o c e s s e d n a s c e n t i m m u n o g l o b u l i n m u r i n e m y e l o m a . J . C e l l B i o l . 67: 8 3 5 - 8 5 1 . B l o b e l , G . a n d D o b b e r s t e i n , B . ( 1 9 7 5 b ) T r a n s f e r o f p r o t e i n s a c r o s s m e m b r a n e s II . R e c o n s t i t u t i o n o f f u n c t i o n a l r o u g h m i c r o s o m e s f r o m h e t e r o l o g o u s c o m p o n e n t s . J . C e l l B i o l . 67: 8 5 2 - 8 6 2 . B l o k , J . , A i r , G . M . , L a u e r , W . G . , W a r d , C . W . , L i l l e y , G . G . , W o o d s , E . F . , R o x b u r g h , C M . a n d Ing l i s , A . S . ( 1 9 8 2 ) S t u d i e s o n t h e s ize , c h e m i c a l c o m p o s i t i o n a n d p a r t i a l s e q u e n c e o f t h e n e u r a m i n i d a s e ( N A ) f r o m t y p e A i n f l u e n z a v i r u s e s s h o w s the N - t e r m i n a l r e g i o n o f N A is n o t p r o c e s s e d a n d s e r v e s to a n c h o r N A i n the v i r a l m e m b r a n e . V i r o l o g y 199: 109-121 . -119-B o l e , D . G . , H e n d e r s h o t , L . M . a n d K e a r n e y , J . F . ( 1986) P o s t t r a n s l a t i o n a l a s s o c i a t i o n o f i m m u n o g l o b u l i n h e a v y c h a i n b i n d i n g p r o t e i n w i t h n a s c e n t h e a v y c h a i n i n n o n s e c r e t i n g a n d s e c r e t i n g h y b r i d o m a s . J . C e l l B i o l . 102: 1558-1566 . B o n a t t i , S . , C a n c e d d a , R . a n d B l o b e l , G . ( 1979) M e m b r a n e b i o g e n e s i s : I n v i t r o c l e a v a g e , c o r e g l y c o s y l a t i o n , a n d i n t e g r a t i o n o f S i n d b i s v i r u s g l y c o p r o t e i n s . J . C e l l B i o l . 80: 219-224 . B o n a t t i , S . , M i g l i a c c i o , G . , B l o b e l , G . a n d W a l t e r , P . ( 1984 ) R o l e o f s i g n a l r e c o g n i t i o n p a r t i c l e i n t h e m e m b r a n e a s s e m b l y o f S i n d b i s v i r a l g l y c o p r o t e i n s . E u r . J . B i o c h e m . 140: 4 9 9 - 5 0 2 . B o n a t t i , S . , M i g l i a c c i o , G . , a n d S i m o n s , K . ( 1989) P a l m i t y l a t i o n o f v i r a l m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s t a k e s p l a c e a f ter exi t f r o m t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . J . B i o l . C h e m . 264: 1 2 5 9 0 - 1 2 5 9 5 . B o s , T . J . , D a v i s , A . R . a n d N a y a k , D . P . ( 1984) N H 2 - t e r m i n a l h y d r o p h o b i c r e g i o n o f i n f l u e n z a v i r u s n e u r a m i n i d a s e p r o v i d e s t h e s i g n a l f u n c t i o n i n t r a n s l o c a t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S A . 81: 2 3 2 7 - 2 3 3 1 . B o w d e n , D . S . , a n d W e s t a w a y , E . G . (1985) C h a n g e s i n g l y c o s y l a t i o n o f r u b e l l a v i r u s e n v e l o p e p r o t e i n s d u r i n g m a t u r a t i o n . J . G e n . V i r o l . 66: 201-206 . B r o w n , D . T . a n d S m i t h , J . F . ( 1975 ) M o r p h o l o g y o f B H K - 2 1 ce l l s i n f e c t e d w i t h S i n d b i s v i r u s t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e m u t a n t s i n c o m p l e m e n t a t i o n g r o u p s D a n d E . J . V i r o l . 15: 1262-B r z e s k i , H . a n d K e n n e d y , S . I . T . ( 1977) S y n t h e s i s o f S i n d b i s v i r u s n o n s t r u c t u r a l p o l y p e p t i d e s i n c h i c k e n e m b r y o f i b r o b l a s t s . J . V i r o l . 22: 4 2 0 - 4 2 9 . B r z e s k i , H . a n d K e n n e d y , S . I . T . (1978) S y n t h e s i s o f a l p h a v i r u s - s p e c i f i e d R N A . J . V i r o l . 25: 6 3 0 - 6 4 0 . B u i m o v i c i - K l e i n , E . a n d C o o p e r , L . Z . (1979) I m m u n o s u p p r e s s i o n a n d i s o l a t i o n o f r u b e l l a v i r u s f r o m l y m p h o c y t e s a f t e r v a c c i n a t i o n w i t h t w o r u b e l l a v a c c i n e s . In fec t . I m m u n . 2 5 : 352 -356 . B u r k e , D . a n d K e e g s t r a , K . ( 1976) P u r i f i c a t i o n a n d c o m p o s i t i o n o f t h e p r o t e i n s f r o m S i n d b i s v i r u s g r o w n i n c h i c k a n d B H K ce l l s . J . V i r o l . 20: 676-686 . B u r k e , D . a n d K e e g s t r a , K . ( 1979) C a r b o h y d r a t e s t r u c t u r e o f S i n d b i s v i r u s g l y c o p r o t e i n E 2 f r o m v i r u s g r o w n i n h a m s t e r a n d c h i c k e n ce l l s . J . V i r o l . 29: 546 -554 . C a n c e d d a , R . , S w a n s o n , R . a n d S c h l e s i n g e r , M . J . ( 1974 ) V i r a l p r o t e i n s f o r m e d i n a c e l l f r e e r a b b i t r e t i c u l o c y t e s y s t e m p r o g r a m m e d w i t h R N A f r o m a t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e m u t a n t o f S i n d b i s v i r u s . J . V i r o l . 14: 6 6 4 - 6 7 1 . C a p p e l , R . , a n d D e C u y p e r , F . ( 1975 ) E f f i c a c y a n d i m m u n e r e s p o n s e t o r u b e l l a s u b u n i t v a c c i n e s . A r c h . V i r o l . 50: 207 -213 . C h a n t l e r , J . K . ( 1979) R u b e l l a v i r u s : i n t r a c e l l u l a r p r o t e i n syn thes i s . V i r o l o g y 98: 275 -278 . C h a n t l e r , J . K . , F o r d , D . K . a n d T i n g l e , A . J . ( 1981 ) R u b e l l a a s s o c i a t e d a r t h r i t i s : R e s c u e o f r u b e l l a v i r u s f r o m p e r i p h e r a l b l o o d l y m p h o c y t e s t w o y e a r s p o s t v a c c i n a t i o n . I n f e c . I m m u n . 32: 1274-1280 . C h a n t l e r , J . K . a n d T i n g l e , A . J . ( 1982 ) I s o l a t i o n o f r u b e l l a v i r u s f r o m h u m a n l y m p h o c y t e s a f ter a c u t e n a t u r a l i n f e c t i o n . J . In fec t . D i s . 145: 673-677 . -120-C h a n t l e r , J . K . , F o r d , D . K . , a n d T i n g l e , A J . ( 1982) P e r s i s t e n t r u b e l l a v i r u s i n f e c t i o n a n d r u b e l l a - a s s o c i a t e d a r t h r i t i s . L a n c e t 1: 1323-1325 . C h a n t l e r , J . K . , T i n g l e , A J . a n d P e t t y , R . E . ( 1985) P e r s i s t e n t r u b e l l a v i r u s i n f e c t i o n a s s o c i a t e d w i t h c h r o n i c a r t h r i t i s i n c h i l d r e n . N e w E n g . J . M e d . 313: 1117-1122 . C l a r k e , D . M . , T . W . L o o , I . H u i , P . C h o n g , a n d G i l l a m , S . ( 1987 ) N u c l e o t i d e s e q u e n c e a n d i n v i t r o e x p r e s s i o n o f r u b e l l a v i r u s 2 4 S s u b g e n o m i c m R N A e n c o d i n g t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s E l , E 2 , a n d C . N u c l . A c i d s R e s . 15: 3 0 4 1 - 3 0 5 7 . C l a r k e , D . M . , T . W . L o o , H . M c D o n a l d , a n d G i l l a m , S . ( 1988 ) E x p r e s s i o n o f r u b e l l a v i r u s c D N A c o d i n g f o r t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s . G e n e 65: 23 -30 . C l e g g , J . C . S . ( 1 9 7 5 ) S e q u e n t i a l t r a n s l a t i o n o f c a p s i d a n d m e m b r a n e p r o t e i n g e n e s o f a l p h a v i r u s e s . N a t u r e ( L o n d o n ) 254: 4 5 4 - 4 5 5 . C o n n o l l y , T . a n d G i l m o r e , R . ( 1986) F o r m a t i o n o f a f u n c t i o n a l r i b o s o m e - m e m b r a n e j u n c t i o n d u r i n g t r a n s l o c a t i o n r e q u i r e s t h e p a r t i c i p a t i o n o f a G T P - b i n d i n g p r o t i e n . J . C e l l B i o l . 103: 2 2 5 3 - 2 2 6 1 . C o o m b s , K . M . , B r o w n , B . a n d B r o w n , D . T . ( 1984) E v i d e n c e f o r a c h a n g e i n c a p s i d m o r p h o l o g y d u r i n g S i n d b i s v i r u s e v e l o p m e n t . V i r u s R e s . 1: 297-302 . C o o m b s , K . M . a n d B r o w n , D . T . (1989) F o r m - d e t e r m i n i n g f u n c t i o n s i n S i n d b i s v i r u s n u c l e o c a p s i d s : N u c l e o s o m e - l i k e o r g a n i z a t i o n o f the n u c l e o c a p s i d . J . V i r o l . 63: 8 8 3 - 8 9 1 . C o o p e r , L . Z . , a n d K r u g m a n , S . ( 1 9 6 9 ) T h e r u b e l l a p r o b l e m . D M F e b 3-38 . C o o p e r , L . Z . , a n d B u i m o v i c i - K l e i n , E . (1985) R u b e l l a , p . 1005-1020 . I n V i r o l o g y b y B . N . F i e l d s , R a v e n P r e s s , N e w Y o r k . C o p e l a n d , C . S . , Z i m m e r , K . - P . , W a g n e r , K . R . , H e a l e y , G . A . , M e l l m a n , I . , a n d H e l e n i u s , A . ( 1988) F o l d i n g , t r i m e r i z a t i o n a n d t r a n s p o r t a r e s e q u e n t i a l e v e n t s i n b i o g e n e s i s o f v i r u s h e m a g g l u t i n i n . C e l l 53: 197-209 . C r o s s , R . K . a n d G o m b a t o s , P J . ( 1981 ) C o n c a m i t a n t m e t h y l a t i o n a n d s y n t h e s i s i n v i t r o o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s ( S F V ) s s R N A s b y a f r a c t i o n f r o m i n f e c t e d ce l l s . V i r o l o g y 114: 542 -554 . C u n n i n g h a m , A . L . a n d F r a s e r , J . R . E . ( 1985 ) P e r s i s t e n t r u b e l l a v i r u s i n f e c t i o n o f h u m a n s y n o v i a l c e l l s c u l t u r e d i n v i t r o . J . In fec t . D i s . 151: 638 -645 . C u t l e r , D . F . a n d G a r o f f , H . ( 1986) M u t a n t s o f the m e m b r a n e - b i n d i n g r e g i o n o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s E 2 P r o t e i n . I . C e l l s u r f a c e t r a n s p o r t a n d f u s o g e n i c act iv i ty . J . C e l l B i o l o g y 102: 8 8 9 - 9 0 1 . C u t l e r , D . F . , M e l a n c o n , P . a n d G a r o f f , H . ( 1986) M u t a n t s o f t h e m e m b r a n e - b i n d i n g r e g i o n o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s E 2 p r o t e i n . II. T o p o l o g y a n d m e m b r a n e b i n d i n g . 102: 902 -910 . D a t e m a , R . , R o m e r o , P A . , R o t t , R . a n d S c h w a r z , R . T . ( 1984) O n the r o l e o f o l i g o s a c c h a r i d e t r i m m i n g i n t h e m a t u r a t i o n o f S i n d b i s a n d i n f l u e n z a v i r u s . A r c h . V i r o l . 81 : 2 5 - 3 9 . D a v i d s o n , S . K . a n d H u n t , L A . ( 1 9 8 3 ) U n u s u a l n e u t r a l o l i g o s a c c h a r i d e s i n m a t u r e g l y c o p r o t e i n s a r e s y n t h e s i z e d f r o m t r u n c a t e d p r e c u r s o r o l i g o s a c c h a r i d e s i n C h i n e s e h a m s t e r o v a r y ce l l s . J . G e n V i r o l . 64: 6 1 3 --121 -D a v i d s o n , S . K . a n d H u n t , L A . (1985) S i n d b i s v i r u s g l y c o p r o t e i n s a r e a b n o r m a l l y g l y c o s y l a t e d i n C h i n e s e h a m s t e r o v a r y ce l l s d e p r i v e d o f g l u c o s e . J . G e n . V i r o l . 66: 1457-D a v i s , N . L . , F u l l e r , F J . , D o u g h e r t y , W . G . , O l m s t e d , R A . a n d J o h n s t o n , R . E . ( 1 9 8 6 ) A s i n g l e n u c l e o t i d e c h a n g e i n t h e E 2 g l y c o p r o t e i n o f S i n d b i s v i r u s a f fec ts p e n e t r a t i o n r a t e i n c e l l c u l t u r e a n d v i r u l e n c e i n n e o n a t a l m i c e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S A . 83: 6 7 7 1 - 6 7 7 5 . D a v i s , N . L . , P e n c e , D . F . , M e y e r , W J . , S c h m a l j o h n , A . L . a n d J o h n s t o n , R . E . ( 1 9 8 7 ) A l t e r n a t i v e F o r m s o f a s t r a i n - s p e c i f i c n e u t r a l i z i n g a n t i g e n i c s i te o n t h e S i n d b i s v i r u s E 2 g l y c o p r o t e i n . V i r o l o g y 161: 101-108 . D e C u r t i s , I . a n d S i m o n s , K . ( 1988) D i s s e c t i o n o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s g l y c o p r o t e i n d e l i v e r y f r o m t h e t r a n s - G o l g i n e t w o r k to t h e c e l l s u r f a c e i n p e r m e a b l i z e d B H K c e l l . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S A . 85: 8052 -8056 . d e M a z a n c o u r t , A . a n d P e r r i c a u d e t , M . (1989) E x p r e s s i o n o f r u b e l l a v i r u s c D N A e n c o d i n g t h e E l s t r u c t u r a l p r o t e i n . B i o c h i m i e 71: 681 -685 . D o m s , R . W . , K e l l e r , D . S . , H e l e n i u s , A . a n d B a l c h , W . E . ( 1 9 8 7 ) R o l e f o r a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e i n r e g u l a t i n g t h e a s s e m b l y a n d t r a n s p o r t o f v e s i c u l a r s t o m a t i t i s v i r u s G p r o t e i n t r i m e r s . J . C e l l . B i o l . 105: 1957-1969 . D o m s , R . W . , R u u s a l a , A . , M a c h a m e r , C , H e l e n i u s , A . a n d R o s e , J . K . ( 1 9 8 8 ) D i f f e r e n t i a l e f fects o f m u t a t i o n s i n t h r e e d o m a i n s o n f o l d i n g , q u a t e r n e r y s t r u c t u r e , a n d i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t o f V S V G p r o t e i n . J . C e l l B i o l . 107: 89 -99 . D o r s e t t , P . H . , M i l l e r , D . C . , G r e e n , K . Y . , a n d B y r d , F . I . ( 1985 ) S t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f t h e r u b e l l a v i r u s p r o t e i n s . R e v . Inf . D i s . 7 ( S 1 ) : S 1 5 0 - S 1 5 7 . D u b i n , D . T . , S t o l l a r , V . , H s u c h e n , C C , T i m k o , K . , a n d G u i l d , G . M . (1977) S i n d b i s v i r u s m e s s e n g e r R N A : T h e 5 ' - t e r m i n a l a n d m e t h y l a t e d r e s i d u e s o f 2 6 S a n d 4 9 S R N A . V i r o l o g y 77: 457 -470 . D u n p h y , W . G . , a n d R o t h m a n , J . E . ( 1985) C o m p a r t m e n t a l o r g a n i z a t i o n o f t h e G o l g i s t a c k . C e l l 42: 13-21 . E a t o n , B . T . , D o n a g h u e , T . P . , a n d F a u l k n e r , P . (1972) P r e s e n c e o f p o l y ( A ) i n t h e p o l y r i b o s o m e - a s s o c i a t e d R N A o f S i n d b i s - i n f e c t e d B H K ce l l s . N a t u r e N e w B i o l . 238: 109-111 . E i n f e l d , D . a n d H u n t e r , E . ( 1988) O l i g o m e r i c s t r u c t u r e o f a p r o t o t y p e r e t r o v i r u s g l y c o p r o t e i n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 85: 8688-8692 . E n g l e m e n , D . M . a n d S t e i t z , T A . (1981) T h e s p o n t a n e o u s i n s e r t i o n o f p r o t e i n s i n t o a n d a c r o s s m e m b r a n e s : t h e h e l i c a l h a i r p i n h y p o t h e s i s . C e l l 23: 411-422 . F a r q u h a r , M . G . (1985) P r o g r e s s i n u n r a v e l i n g p a t h w a y s o f G o l g i t ra f f i c . A n n . R e v . C e l l B i o l . 1: 447 -488 . F a r q u h a r , M . G . (1989) P r o t e i n t ra f f i c t h r o g h the G o l g i c o m p l e x , i n I n t r a c e l l u l a r M e m b r a n e T r a f f i c , i n p r e s s . F r e e d m a n , R . ( 1 9 8 4 ) N a t i v e d i s u l f i d e b o n d f o r m a t i o n i n p r o t e i n b i o s y n t h e s i s : e v i d e n c e f o r t h e r o l e o f p r o t e i n d i s u l f i d e i s o m e r a s e . T r e n d s B i o l . S c i . 9: 438 -441 . -122-F r e y , T . K . , a n d M a r r , I.D. ( 1988 ) S e q u e n c e o f t h e r e g i o n c o d i n g f o r v i r i o n p r o t e i n s C a n d E 2 a n d t h e c a r b o x y t e r m i n u s o f t h e n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s o f r u b e l l a v i r u s : c o m p a r i s o n t o a l p h a v i r u s e s . G e n e 62: 8 5 - 9 9 . F r e y , T . K . , I . D . M a r r , M . L . H e m p h i l l , a n d D o m i n q u e z , G . ( 1986) M o l e c u l a r c l o n i n g a n d s e q u e n c i n g o f t h e r e g i o n o f t h e r u b e l l a v i r u s g e n o m e c o d i n g f o r g l y c o p r o t e i n E l . V i r o l o g y 154: 228 -232 . F r e y , T . K . a n d H e m p h i l l , M . L . ( 1988) G e n e r a t i o n o f d e f e c t i v e - i n t e r f e r i n g p a r t i c l e s b y r u b e l l a v i r u s i n V e r o ce l l s . V i r o l o g y 164: 22 -29 . F u l l e r , S . D . ( 1 9 8 7 ) T h e T = 4 e n v e l o p e o f S i n b i s v i r u s is o r g a n i z e d b y i n t e r a c t i o n s w i t h a c o m p l e m e n t a r y T = 3 c a p s i d . C e l l 48: 923-934 . F u h r m a n n , U . , B a u s e , E . , L e g l e r , G . a n d P l o e g h , H . ( 1984) N o v e l m a n n o s i d a s e i n h i b i t o r b l o c k i n g c o n v e r s i o n o f h i g h m a n n o s e to c o m p l e x o l i g o s a c c h a r i d e s . N a t u r e ( L o n d o n ) 3 0 7 : 7 5 5 - 7 5 8 . G a r o f f , H . a n d S i m o n s , K . ( 1974) L o c a t i o n o f t h e s p i k e g l y c o p r o t e i n s i n t h e S e m l i k i F o r e s t v i r u s m e m b r a n e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S A . 71: 3988-3992 . G a r o f f , H . , S i m o n s , K . a n d R e n k o n e n , O . ( 1974) I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e m e m b r a n e p r o t e i n s o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s . V i r o l o g y 61: 493-504 . G a r o f f , H . , S i m o n s , K . a n d D o b b e r s t e i n , B . (1978) A s s e m b l y o f the S e m l i k i F o r e s t v i r u s m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s i n t h e m e m b r a n e o f t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m i n v i t r o . J . M o l . B i o l . 124: 5 8 7 - 6 0 0 . G a r o f f , H . , F r i s c h a u f , A . M . , S i m o n s , K . , L e h r a c h , H . , a n d D e l i u s , H . ( 1 9 8 0 a ) T h e c a p s i d p r o t e i n o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s h a s c l u s t e r s o f b a s i c a m i n o a c i d s a n d p r o l i n e s i n its a m i n o - t e r m i n a l r e g i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S A . 77: 6376-6380 . G a r o f f , H . , F r i s c h a u f , A . M . , S i m o n s , K . , L e h r a c h , H . , a n d D e l i u s , H . ( 1 9 8 0 b ) N u c l e o t i d e s e q u e n c e o f c D N A c o d i n g f o r S e m l i k i F o r e s t v i r u s m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s . N a t u r e ( L o n d o n ) 288: 236 -241 . G a r o f f , H . , K o n d o r - K o c h , C , a n d R i e d e l , H . ( 1982) S t r u c t u r e a n d a s s e m b l y o f A l p h a v i r u s e s . C u r r . T o p i c s M i c r o b . I m m u n . 99: 1-50. G a r o f f , H . , K o n d o r - K o c h , C , P e t t e r s s o n , R . a n d B u r k e , B . ( 1983) E x p r e s s i o n o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s p r o t e i n s f r o m c l o n e d c o m l e m e n t a r y D N A . II. T h e m e m b r a n e - s p a n n i n g g l y c o p r o t e i n E 2 is t r a n s p o r t e d t o t h e c e l l s u r f a c e w i t h o u t its n o r m a l c y t o p l a s m i c d o m a i n . J . C e l l B i o l . 97: 652 -658 . G a r n i e r , J . , D J . O s g u t h o r p e , a n d R o b s o n , B . ( 1978) A n a l y s i s o f t h e a c c u r a c y a n d i m p l i c a t i o n s o f s i m p l e m e t h o d s f o r p r e d i c t i n g t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f g l o b u l a r p r o t e i n s . J . M o l . B i o l . 120: 97 -120 . G e t h i n g , M J . , a n d S a m b r o o k , J . (1982) C o n s t r u c t i o n o f i n f l u e n z a h a e m a g g l u t i n i n g e n e s t h a t c o d e f o r i n t r a c e l l u l a r a n d s e c r e t e d f o r m s o f the p r o t e i n . N a t u r e ( L o n d o n ) 300: 5 9 8 - 6 0 3 . G e t h i n g , M . J . , M c C a m m o n , K . a n d S a m b r o o k , J . ( 1986 ) E x p r e s s i o n o f w i l d - t y p e a n d m u t a n t s f o r m s o f i n f l u e n z a h e m a g g l u t i n i n : the r o l e o f f o l d i n g i n i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t . C e l l 46: 939 -950 . G i l m o r e , R . , W a l t e r , P . a n d B l o b e l , G . ( 1 9 8 2 a ) P r o t e i n t r a n s l o c a t i o n a c r o s s t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m I. D e t e c t i o n i n t h e m i c r o s o m a l m e m b r a n e o f a r e c e p t o r f o r t h e s i g n a l r e c o g n i t i o n p a r t i c l e . J . C e l l B i o l . 95: 4 6 3 - 4 6 9 . -123-G i l m o r e , R . , W a l t e r , P . a n d B l o b e l , G . ( 1 9 8 2 a ) P r o t e i n t r a n s l o c a t i o n a c r o s s t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m II . I s o l a t i o n a n d c h a r a t e r i z a t i o n o f the s i g n a l r e c o g n i t i o n p a r t i c l e r e c e p t o r . J . C e l l B i o l . 95: 4 7 0 - 4 7 7 . G i l m o r e , R . a n d B l o b e l , G . ( 1985) T r a n s l o c a t i o n o f s e c r e t o r y p r o t e i n s a c r o s s t h e m i c r o s o m a l m e m b r a n e o c u r r s t h r o u g h a n e n v i r o m e n t a c c e s s i b l e to a q u e o u s p e r t u r b a n t s . C e l l 46: 4 9 7 - 5 0 5 . G o m b a t o s , P J . , K a a r i a i n e n , L . , K e r a n e n , S. , R a n k i , M . a n d S a w i c k i , D . L . ( 1 9 8 0 ) S e m l i k i F o r e s t v i r u s r e p l i c a t i o n c o m p l e x c a p a b l e o f s y n t h e s i z i n g 4 2 S a n d 2 6 S n a s c e n t R N A c h a i n s . J . g e n . V i r o l . 49: 6 1 - 6 9 . G o t t l i e b , C , K o r n f e l d , S . a n d S c h l e s i n g e r , S . ( 1979 ) R e s t r i c t e d r e p l i c a t i o n o f t w o a l p h a v i r u s e s i n R i c i n - r e s i s t a n t m o u s e L ce l l s w i t h a l t e r e d g l y c o s y l t r a n s f e r a s e ac t iv i t e s . J . V i r o l . 29 : 3 4 4 - 3 5 1 . G r a n d , R J A . (1989) A c y l a t i o n o f v i r a l a n d e u k a r y o t i c p r o t e i n s . B i o c h e m . J . 258: 6 2 5 - 6 3 8 . G r e e n , K . Y . , a n d D o r s e t t , P . H . ( 1986) R u b e l l a v i r u s a n t i g e n s : L o c a l i z a t i o n o f e p i t o p e s i n v o l v e d i n h e m a g g l u t i n a t i o n a n d n e u t r a l i z a t i o n b y u s i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . J . V i r o l . 57: 8 9 3 - 8 9 8 . G u a n , J - L . , C a o , H . a n d R o s e , J . K . ( 1988) C e l l - s u r f a c e e x p r e s s i o n o f a m e m b r a n e - a n c h o r e d f o r m o f t h e h u m a n c h o r i o n i c g o n a d o t r o p i n a - s u b u n i t . J . B i o l . C h e m . 263: 5 3 0 6 - 5 3 1 3 . H a h n , C . S . , S t r a u s s , E . G . a n d S t r a u s s , J . H . ( 1985) S e q u e n c e a n a l y s i s o f t h r e e S i n d b i s v i r u s m u t a n t s t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e i n t h e c a p s i d p r o t e i n a u t o p r o t e a s e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S A . 82: 4 6 4 8 - 4 6 5 2 . H a h n , C . S . , R i c e , C M . , S t r a u s s , E . G . , L e n c h e s , E . M . a n d S t r a u s s , J . H . ( 1 9 8 9 c ) S i n d b i s v i r u s t s l 0 3 h a s a m u t a t i o n i n g l y c o p r o t e i n E 2 that l e a d s to d e f e c t i v e a s s e m b l y o f v i r i o n s . J . V i r o l . 63: 3 4 5 9 - 3 4 6 5 . H a h n , Y . S . , G r a k o u i , A . , R i c e , C M . , S t r a u s s , E . G . a n d S t r a u s s , J . H . ( 1 9 8 9 a ) M a p p i n g o f R N A " t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e m u t a n t s o f S i n d b i s v i r u s : C o m p l e m e n t a t i o n g r o u p F m u t a n t s h a v e l e s i o n s i n n s P 4 . J . V i r o l . 63: 1194-1202 . H a h n , Y . S . , S t r a u s s , E . G . a n d S t r a u s s , J . H . ( 1 9 8 9 b ) M a p p i n g o f R N A t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e m u t a n t s o f S i n d b i s v i r u s : A s s i g n m e n t o f c o m p l e m e n t a t i o n g r o u p s A , B , a n d G t o n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s . J . V i r o l . 63: 3142-3150 . H a k i m i , J . a n d A t k i n s o n , P . H . (1980) G r o w t h - d e p e n d e n t a l t e r a t i o n i n o l i g o m a n n o s y l g l y c o p e p t i d e s e x p r e s s e d i n S i n b i s v i r u s g l y c o p r o t e i n s . B i o c h e m i s t r y 19: 5619-5624 . H a r d y , W . R . a n d S t r a u s s , J . H . ( 1988) P r o c e s s i n g t h e n o n s t r u c t u r a l p o l y p r o t e i n s o f S i n d b i s V i r u s : S t u d y o f t h e k i n e t i c s in v i v o b y u s i n g m o n o s p e c i f i c a n t i b o d i e s . J . V i r o l . 62: 9 9 8 - 1 0 0 7 . H a s h i m o t o , K . , E r d e i , S . , K e r a n e n , S. , S a r a s t e , J . a n d K a a r i a i n e n , L . ( 1 9 8 1 ) E v i d e n c e f o r a s e p a r a t e s i g n a l s e q u e n c e f o r t h e c a r b o x y - t e r m i n a l e n v e l o p e g l y c o p r o t e i n E l o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s . J . V i r o l . 38: 34 -40 . H e l e n i u s , A . a n d S o d e r l u n d , H . ( 1973) S t e p w i s e d i s s o c i a t i o n o f the S e m l i k i F o r e s t v i r u s m e m b r a n e w i t h T r i t o n X - 1 0 0 . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a . 307: 287-300 . H e m p h i l l , M . L . , F o r n g , R . , A b e r n a t h y , E . S . , a n d F r e y , T . K . (1988) T i m e c o u r s e o f v i r u s - s p e c i f i c m a c r o m o l e c u l a r s y n t h e s i s d u r i n g r u b e l l a v i r u s i n f e c t i o n i n V e r o C e l l s . V i r o l o g y 162: 6 5 - 7 5 . -124-H o b m a n , T . C . , R . S h u k i n , a n d G i l l a m , S . ( 1988 ) T r a n s l o c a t i o n o f r u b e l l a v i r u s g l y c o p r o t e i n E l i n t o t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . J . V i r o l . 62:4259-4264 . H o b m a n , T . C . a n d G i l l a m , S . ( 1989 ) I n v i t r o a n d i n v i v o e x p r e s s i o n o f r u b e l l a v i r u s g l y c o p r o t e i n E 2 : T h e s i g n a l p e p t i d e is c o n t a i n e d i n t h e C - t e r m i n a l r e g i o n o f c a p s i d p r o t e i n . V i r o l o g y 173: 241-250 . H o - T e r r y , L . a n d C o h e n , A . ( 1980) D e g r a d a t i o n o f r u b e l l a v i r u s e n v e l o p e c o m p o n e n t s . A r c h . V i r o l . 72: 47-54 . H o - T e r r y , L . , a n d C o h e n , A . ( 1984) T h e r o l e o f g l y c o s y l a t i o n o n h a e m a g g l u t i n a t i o n a n d i m m u n o l o g i c a l r e a c t i v i t y o f r u b e l l a v i r u s . A r c h . V i r o l . 79: 139-146 . H o - T e r r y , L . , a n d C o h e n , A . ( 1985) R u b e l l a v i r u s h a e m a g g l u t i n i n : A s s o c i a t i o n w i t h a s i n g l e v i r i o n g l y c o p r o t e i n . A r c h . V i r o l . 84: 207 -215 . H o l m e s , I . H . , W o r k , M . C . , a n d W a r b u r t o n , M . F . ( 1969) Is r u b e l l a a n a r b o v i r u s ? II U l t r a s t r u c t u r e , m o r p h o l o g y , a n d d e v e l o p m e n t . V i r o l o g y 37: 15-25 . H o r t s c h , M . , A v o s s a , D . a n d M e y e r , D . I . ( 1986 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f s e c r e t o r y p r o t e i n t r a n s l o c a t i o n : R i b o s o m e - m e m b r a n e i n t e r a c t i o n i n the e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . J . C e l l B i o l . 103: 2 4 1 - 2 5 3 . H o v i , T . , a n d V a h e r i , A . ( 1 9 7 0 ) In fec t iv i ty a n d s o m e p h y s i c o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f r u b e l l a v i r u s r i b o n u c l e i c a c i d s . V i r o l o g y 42: 1-8. H s i e h , P . , R o s n e r , M . R . a n d R o b b i n s , P . W . ( 1 9 8 3 a ) H o s t - d e p e n d e n t v a r i a t i o n o f a s p a r a g i n e - l i n k e d o l i g o s a c c h a r i d e s at i n d i v i d u a l g l y c o s y l a t i o n s ites o f S i n d b i s v i r u s g l y c o p r o t e i n s . J . B i o l . C h e m . 258: 2 5 4 8 - 2 5 5 4 . H s i e h , P . , R o s n e r , M . R . a n d R o b b i n s , P . W . ( 1 9 8 3 b ) S e l e c t i v e c l e a v a g e b y e n d o - - N - a c e t y l g l u c o s a m i n i d a s e H at i n d i v i d u a l g l y c o s y l a t i o n s i tes o f S i n d b i s v i r i o n E n v e l o p e g l y c o p r o t e i n s . J . B i o l . C h e m . 258: 2555-2561 . H s i e h , P . a n d R o b b i n s , P . W . (1984) R e g u l a t i o n o f a s p a r a g i n e - l i n k e d o l i g o s a c c h a r i d e p r o c e s s i n g . J . B i o l . C h e m . 259: 2375 -2382 . H u b b a r d , S . C . ( 1 9 8 8 ) R e g u l a t i o n o f G l y c o s y l a t i o n : T h e i n f l u e n c e o f p r o t e i n s t r u c t u r e o n N - l i n k e d o l i g o s a c c h a r i d e p r o c e s s i n g . J . B i o l . C h e m . 263: 19303-19317 . H u r t l e y , S . M . , B o l e , D . G . , H o o v e r - L i t t y , H . , H e l e n i u s , A . a n d C o p e l a n d , C . S . ( 1 9 8 9 ) I n t e r a c t i o n s o f m i s f o l d e d I n f l u e n z a v i r u s h e m a g g l u t i n i n w i t h b i n d i n g p r o t e i n ( B i P ) . J . C e l l B i o l . 108: 2117 -2126 . J a b b a r , M A . , a n d N a y a k , D . P . ( 1987) S i g n a l p r o c e s s i n g , g l y c o s y l a t i o n , a n d s e c r e t i o n o f m u t a n t h e m a g g l u t i n i n s o f h u m a n i n f l u e n z a v i r u s b y S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s c i a e . M o l . C e l l B i o l . 7: 1476-1485 . J a m i e s o n , J . a n d P a l a d e , G . ( 1 9 6 7 ) I n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t o f s e c r e t o r y p r o t e i n s i n t h e p a n c r e a t i c e x o c r i n e c e l l . I . R o l e o f t h e p e r i p h e r a l e l e m e n t s o f the G o l g i c o m p l e x . J . C e l l B i o l . 34: 5 7 7 - 5 9 6 . J a m i e s o n , J . a n d P a l a d e , G . ( 1968) I n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t o f s e c r e t o r y p r o t e i n s i n t h e p a n c r e a t i c e x o c r i n e c e l l I V . M e t a b o l i c r e q u i r e m e n t s . J . C e l l B i o l . 39 : 589 -603 . J o h n s o n , D . C . , S c h l e s i n g e r , M . J . a n d E l s o n , E . L . ( 1981) F l u o r e s c e n c e p h o t o b l e a c h i n g r e c o v e r y r e v e a l s d i f f e r e n c e s i n e v e l o p m e n t o f S i n d b i s a n d V e s i c u l a r S t o m a t i t i s v i r u s e s . C e l l 23 : 4 2 3 - 4 3 1 . -125-K a a r i a i n e n , L . a n d S o d e r l u n d , H . ( 1978) S t r u c t u r e a n d r e p l i c a t i o n o f a l p h a v i r u s e s . C u r r . T o p . M i c r o b i o l . I m m u n o l . 82: 15-69 . K a a r i a i n e n , L . , H a s h i m o t o , K . , S a r a s t e , J . , V i r t a n e n , I. a n d P e n t t i n e n , K . ( 1 9 8 0 ) M o n e n s i n a n d F C C P i n h i b i t t h e i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t o f A l p h a v i r u s m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s . J . C e l l B i o l . 87: 7 8 3 - 7 9 1 . K a l k k i n e n , N . , C . O k e r - B l o m , a n d P e t t e r s s o n , R . F . ( 1984) T h r e e g e n e s c o d e f o r r u b e l l a v i r u s s t r u c t u r a l p r o t e i n s E l , E 2 a , E 2 b , a n d C . J . G e n . V i r o l . 65: 1549-1557 . K a m e r , G . a n d A r g o s , P . ( 1984 ) P r i m a r y s t r u c t u r a l c o m p a r i s o n o f R N A - d e p e n d e n t p o l y m e r a s e s f r o m p l a n t , a n i m a l a n d b a c t e r i a l v i r u s e s . N u c l . A c i d s R e s . 12: 7269 -7282 . K e e g s t r a , K . , S e f t o n , B . a n d B u r k e , B . ( 1975) S i n d b i s v i r u s g l y c o p r o t e i n s ; e f fec t o f t h e h o s t c e l l o n t h e o l i g o s a c c h a r i d e s . J . V i r o l . 16: 613-620 . K e n n e d y , S . I . T . ( 1 9 7 4 ) T h e ef fect o f e n z y m e s o n s t r u c t u r a l a n d b i o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s . ( 1 9 7 4 ) J . g e n V i r o l . 23: 129- . K e r a n e n , S . a n d R u o h o n e n , L . ( 1983) N o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s : S y n t h e s i s , p r o c e s s i n g a n d s t a b i l i t y i n i n f e c t e d ce l l s . J . V i r o l . 47: 505 -515 . K i e l i a n , M . a n d H e l e n i u s , A . ( 1986) E n t r y o f A l p h a v i r u s e s , p . 9 1 - 1 1 9 I n S . S c h l e s i n g e r a n d M J . S c h l e s i n g e r ( e d ) , T h e T o g a v i r i d a e a n d F l a v i v i r i d a e . P l e n u m P u b l i s h i n g C o r p . N e w Y o r k . K n i p f e r , M . E . a n d B r o w n , D . T . ( 1989) I n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t a n d p r o c e s s i n g o f S i n d b i s v i r u s g l y c o p r o t e i n s . V i r o l o g y 170: 117-122 . K o n d o r - K o c h , C . R i e d e l , H . , S o d e r b e r g , K . a n d G a r o f f , H . ( 1982) E x p r e s s i o n o f t h e s t r u c t u r a l p r o t e i n s o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s f r o m c l o n e d c D N A m i c r o i n j e c t e d i n t o t h e n u c l e u s o f b a b y h a m s t e r k i d n e y ce l l s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 79: 4525-4529 . K o n d o r - K o c h , C , B u r k e , B . , a n d G a r o f f , H . ( 1983) E x p r e s s i o n o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s p r o t e i n s f r o m c l o n e d c o m l e m e n t a r y D N A . I. T h e f u s i o n a c t i v i t y o f t h e s p i k e g l y c o p r o t e i n . J . C e l l B i o l . 97: 6 4 4 - 6 5 1 . K o r n f e l d , R . a n d K o r n f e l d , S . ( 1985 ) A s s e m b l y o f a s p a r a g i n e - l i n k e d o l i g o s a c c h a r i d e s . A n n . R e v . B i o c h e m . 54: 631 -664 . K o z u t s u m i , Y . , S e g a l , M . , N o r m i n g t o n , K . , G e t h i n g , M J . a n d S a m b r o o k , J . ( 1 9 8 8 ) T h e p r e s e n c e o f m a l f o l d e d p r o t e i n s i n t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m s i g n a l s the i n d u c t i o n o f g l u c o s e - r e g u l a t e d p r o t e i n s . N a t u r e ( L o n d o n ) 332: 462-464 . K r i e g , U . C . , W a l t e r , P . a n d J o h n s o n , A . E . ( 1986) P h o t o c r o s s - l i n k i n g o f t h e s i g n a l s e q u e n c e o f n a s c e n t p r e p r o l a c t i n to 54 k D a p o l y p e p t i d e o f the s i g n a l r e c o g n i t i o n p a r t i c l e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 83: 8604 -8608 . K u n k e l , T A . (1985) R a p i d a n d e f f i c i en t s i t e - s p e c i f i c m u t a g e n e s i s w i t h o u t p h e n o t y p i c s e l e c t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 82: 4753-4757 . K y t e , J . , a n d D o o l i t t l e , R . F . ( 1982) A s i m p l e m e t h o d f o r d i s p l a y i n g t h e h y d r o p a t h i c c h a r a c t e r o f a p r o t e i n . J . M o l . B i o l . 157: 105-132 . -126-L a c h m i , B . , G l a n v i l l e , N . , K e r a n e n , S . a n d K a a r i a i n e n , L . ( 1 9 7 5 ) T r y p t i c p e p t i d e a n a l y s i s o f n o n s t r u c t u r a l a n d s t r u c t u r a l p r e c u r s o r p r o t e i n s f r o m S e m l i k i F o r e s t v i r u s m u t a n t - i n f e c t e d ce l l s . J . V i r o l . 16: 1615-1629 . L a c h m i , B . a n d K a a r i a i n e n , L . ( 1976) S e q u e n t i a l t r a n s l a t i o n o f n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s i n ce l l s i n f e c t e d w i t h a S e m l i k i F o r e s t v i r u s m u t a n t . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 73: 1396-1940 . L a e m m l i , U . K . (1970) C l e a v a g e o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s d u r i n g a s s e m b l e o f t h e h e a d o f b a c t e r i o p h a g e T 4 . N a t u r e ( L o n d o n ) 227: 680 -685 . L e a v i t t , R . , S c h l e s i n g e r , S . a n d K o r n f e l d , S . ( 1977 ) T u n i c a m y c i n i n h i b i t s g l y c o s y l a t i o n a n d m u l t i p l i c a t i o n o f S i n d b i s a n d v e s i c u l a r s t o m a t i t i s v i r u s . J . V i r o l . 21 : 3 7 5 - 3 8 5 . L e h t o v a a r a , P . , S o d e r l u n d , H . , K e r a n e n , S. , P e t t e r s s o n , R . F . , a n d K a a r i a i n e n , L . ( 1 9 8 2 ) E x t r e m e e n d s o f t h e g e n o m e a r e c o n s e r v e d a n d r e a r r a n g e d i n t h e d e f e c t i v e i n t e r f e r i n g R N A s o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s . J . M o l . B i o l . 156: 731-748 . L i , G . a n d R i c e , C M . (1989) M u t a g e n e s i s o f t h e i n - f r a m e o p a l t e r m i n a t i o n c o d o n p r e c e d i n g n s P 4 o f S i n d b i s v i r u s : S t u d i e s o n t r a n s l a t i o n a l r e a d t h r o u g h a n d its e f fect o n v i r u s r e p l i c a t i o n . J . V i r o l . 63 : 1326-1337 . L o d i s h , H . F . ( 1988) T r a n s p o r t o f s e c r e t o r y a n d m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s f r o m t h e r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m t o t h e G o l g i . J . B i o l . C h e m . 263: 2107-2110 . M a c h a m e r , C . E . , F l o r k i e w i c z , R . Z . a n d R o s e , J . K . ( 1985) A s i n g l e N - l i n k e d o l i g o s a c c h a r i d e at e i t h e r o f t h e t w o n o r m a l s i tes is su f f i c i en t f o r t r a n s p o r t o f v e s i c u l a r s t o m a t i t i s v i r u s G p r o t e i n t o t h e c e l l s u r f a c e . M o l . C e l l B i o l . 5: 3074-3083 . M a c h a m e r , C . E . a n d R o s e , J . K . ( 1987) A s p e c i f i c t r a n s m e m b r a n e d o m a i n o f a c o r o n a v i r u s E l g l y c o p r o t e i n is r e q u i r e d f o r r e t e n t i o n i n the G o l g i r e g i o n . J . C e l l B i o l . 105: 1205-1214 . M a c h a m e r , C . E . a n d R o s e , J . K . ( 1 9 8 8 a ) I n f l u e n c e o f n e w g l y c o s y l a t i o n s i tes o n e x p r e s s i o n o f v e s i c u l a r s t o m a t i t i s v i r u s at t h e p l a s m a m e m b r a n e . J . B i o l . C h e m . 263: 5948-5954 . M a c h a m e r , C . E . a n d R o s e , J . K . ( 1 9 8 8 b ) V e s i c u l a r s t o m a t i t i s v i r u s G p r o t e i n s w i t h a l t e r e d g l y c o s y l a t i o n s i tes d i s p l a y s t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t a n d a r e s u b j e c t t o a b e r r a n t i n t e r m o l e c u l a r d i s u l f i d e b o n d i n g . J . B i o l . C h e m . 263: 5955 -5960 . M a g e e , A . L , K o y a m a , A . H . , M a l f e r , C , W e n , D . a n d S c h l e s i n g e r , M . J . ( 1 9 8 4 ) R e l e a s e o f fa t ty a c i d s f r o m v i r u s g l y c o p r o t e i n s b y h y d r o x y l a m i n e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 798: 156-M a l h o r t r a , V . , O r c i , L . , G l i c k , B . S . , B l o c k , M . R . , a n d R o t h m a n , J . E . ( 1 9 8 8 ) R o l e o f a n N - e t h y l m a l e i m i d e - s e n s i t i v e t r a n s p o r t c o m p o n e n t i n p r o m o t i n g f u s i o n o f t r a n s p o r t v e s i c l e s w i t h c i s t e r n a e o f t h e G o l g i s tack . C e l l 54: 221-227 . M a n i a t i s , T . , E . F . F r i t s c h , a n d S a m b r o o k , J . ( 1982 ) M o l e c u l a r C l o n i n g . A l a b o r a t o r y m a n u a l . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y . M a n n , E . , E d w a r d s , J . a n d B r o w n , D . T . ( 1983) P o l y c a r y o t e f o r m a t i o n m e d i a t e d b y S i n d b i s v i r u s g l y c o p r o t e i n s . J . V i r o l . 45: 1083-M a t t h e w s , R . E . F . ( 1 9 8 2 ) C l a s s i f i c a t i o n a n d n o m e n c l a t u r e o f v i r u s e s . T h i r d r e p o r t o f t h e I n t e r n a t i o n a l C o m m i t t e e o n T a x o n o m y o f V i r u s e s . I n t e r v i r o l o g y . -127-M a t t i l a , K . L u u k k o n e n , A . a n d R e n k o n e n , O . ( 1976) P r o t e i n - b o u n d o l i g o s a c c h a r i d e s o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 419: 435-444 . M c D o w e l l , W . , R o m e r o , P A . , D a t e m a , R . a n d S c h w a r z , R . T . ( 1987) G l u c o s e t r i m m i n g a n d m a n n o s e t r i m m i n g af fect d i f f e r e n t p h a s e s o f the m a t u r a t i o n o f S i n d b i s v i r u s i n i n f e c t e d B H K ce l l s . V i r o l o g y 161: 37 -44 . M e l a n c o n , P . , a n d G a r o f f , H . ( 1986) R e i n i t i a t i o n o f t r a n s l o c a t i o n i n t h e S e m l i k i F o r e s t v i r u s s t r u c t u r a l p o l y p r o t e i n : i d e n t i f i c a t i o n o f the s i g n a l f o r t h e E l g l y c o p r o t e i n . E M B O J . 5: 1551-1560 . M e l a n c o n , P . , a n d G a r o f f , H . ( 1987) P r o c e s s i n g o f t h e S e m l i k i F o r e s t v i r u s s t r u c t u r a l p o l y p r o t e i n : R o l e o f t h e c a p s i d p r o t e a s e . J . V i r o l . 61: 1301-1309 . M e l a n c o n , P . , G l i c k , B . S . , M a l h o r t r a , V . , W e i d m a n , P J . , S e r a f i n i , T . , G l e a s o n , M . L . , O r c i , L . a n d R o t h m a n , J . E . ( 1 9 8 7 ) I n v o l v e m e n t o f G T P - b i n d i n g " G " p r o t e i n s i n t r a n s p o r t t h r o u g h t h e G o l g i s t a c k . C e l l 51: 1053-1062 . M e l l m a n , I. , F u c h s , R . a n d H e l e n i u s , A . ( 1986) A c i d i f i c a t i o n o f t h e e n d o c y t i c a n d e x o c y t i c p a t h w a y s . A n n . R e v . B i o c h e m . 55: 663-700 . M e n s e r , M . , H a r l e y , J . D . , H e r t z b e r g , R . , D o r m a n , D . C . a n d M u r p h y , A . M . ( 1 9 6 7 ) P e r s i s t e n c e o f v i r u s i n l e n s f o r t h r e e y e a r s a f ter p r e n a t a l r u b e l l a . L a n c e t . 2: 387-388 . > M e y e r , D . L , K r a u s e , E . a n d D o b b e r s t e i n , B . ( 1982) S e c r e t o r y p r o t e i n t r a n s l o c a t i o n a c r o s s m e m b r a n e s : T h e r o l e o f " d o c k i n g p r o t e i n " . N a t u r e ( L o n d o n ) 297: 647 -650 . M o r e m e n , K . W . a n d T o u s t e r , O . (1988) M a n n o s i d a s e s i n m a m m a l i a n g l y c o p r o t e i n p r o c e s s i n g . I n P r o t e i n t r a n s f e r a n d o r g a n e l l e b i o g e n e s i s . ( R . C . D a s a n d P . W . R o b b i n s e d . ) p . 209 -240 . A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o . M o n r o e , S . S . , O u , J . H . , R i c e , C M . , S c h l e s i n g e r , S. , S t r a u s s , E . G . a n d S t r a u s s , J . H . ( 1 9 8 2 ) S e q u e n c e a n a l y s i s o f c D N A ' s d e r i v e d f r o m the R N A o f S i n d b i s v i r i o n s a n d o f d e f e c t i v e i n t e r f e r i n g p a r t i c l e s . J . V i r o l . 41: 153-162 . M u n r o , S . a n d P e l h a m , H . R . B . ( 1987 ) A C - t e r m i n a l s i g n a l p r e v e n t s s e c r e t i o n o f l u m i n a l E R p r o t e i n s . C e l l 48: 8 9 9 - 9 0 7 . M u r p h y , F A . , H a l o n e n , P . E . , a n d H a r r i s o n , A . K . ( 1968) E l e c t r o n m i c r o s c o p y o f t h e d e v e l o p m e n t o f r u b e l l a i n B H K - 2 1 ce l l s . J . V i r o l . 2 (10 ) : 1223-1227 . N a k h a s i , H . L . , M e y e r , B . C . a n d L i u , T - Y . ( 1986) R u b e l l a v i r u s c D N A . S e q u e n c e a n d e x p r e s s i o n o f E l e n v e l o p e p r o t e i n . J . B i o l . C h e m . 261: 16616-16621 . N a k h a s i , H . L . , T h o m a s , D . , Z h e n g , D . a n d L i u , T - Y . ( 1989) N u c l e o t i d e s e q u e n c e o f c a p s i d , E 2 a n d E l g e n e s o f R u b e l l a v i r u s v a c c i n e s t r a i n R A 2 7 / 3 . N u c l . A c i d s R e s . 17: 4393-4394 . N o r v a l , M . ( 1 9 7 9 ) M e c h a n i s m o f p e r s i s t e n c e o f r u b e l l a v i r u s i n L L C - M K 2 ce l l s . J . G e n . V i r o l . 43: 289 -298 . O k e r - B l o m , C . ( 1 9 8 4 ) T h e g e n e o r d e r f o r r u b e l l a v i r u s s t r u c t u r a l p r o t e i n s is N H 2 - C - E 2 - E 1 - C O O H . J . V i r o l . 51 : 354-358 . -128-O k e r - B l o m , C , N . K a l k k i n e n , L . K a a r i a n e n , a n d P e t t e r s s o n , R . F . ( 1 9 8 3 ) R u b e l l a v i r u s c o n t a i n s o n e c a p s i d p r o t e i n a n d t h r e e e n v e l o p e g l y c o p r o t e i n , E l , E 2 a , a n d E 2 b . J . V i r o l . 46: 9 6 4 - 9 7 3 . O k e r - B l o m , C , I . U l m a n e n , L . K a a r i a n e n , a n d P e t t e r s s o n , R . F . ( 1984) R u b e l l a v i r u s 4 0 S R N A s p e c i f i e s a 2 4 S s u b g e n o m i c R N A that c o d e s f o r a p r e c u r s o r t o s t r u c t u r a l p r o t e i n s . J . V i r o l . 49: 403 -408 . O l d e n , K . , P a r e n t , J . B . a n d W h i t e , S . L . ( 1982) C a r b o h y d r a t e m o i e t i e s o f g l y c o p r o t e i n s . A r e e v a l u a t i o n o f t h e i r f u n c t i o n . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 650: 209-232 . O l m s t e d , R A . , M e y e r , W J . a n d J o h n s t o n , R . E . ( 1986) C h a r a c t e r i z a t i o n o f S i n d b i s v i r u s e p i t o p e s i m p o r t a n t f o r p e n e t r a t i o n i n c e l l c u l t u r e a n d p a t h o g e n e s i s i n a n i m a l s . V i r o l o g y 148: 245 -254 . O m a r , A . a n d K o b l e t , H . ( 1988) S e m l i k i F o r e s t v i r u s p a r t i c l e s c o n t a i n i n g o n l y t h e E l e n v e l o p e g l y c o p r o t e i n a r e i n f e c t i o u s a n d c a n i n d u c e c e l l - c e l l f u s i o n . V i r o l o g y 166: 17-23 . O r c i , L . , G l i c k , B . S . a n d R o t h m a n , J . E . ( 1986) A n e w t y p e o f c o a t e d v e s i c u l a r c a r r i e r t h a t a p p e a r s n o t t o c o n t a i n c l a t h r i n : Its p o s s i b l e r o l e i n p r o t e i n t r a n s p o r t w i t h i n t h e G o l g i s t a c k . C e l l 46: 171-184 . O s h i r o , L . S . , S c h m i d t , N . J . , a n d L e n n e t t e , E . H . ( 1969) E l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e s o f r u b e l l a v i r u s . J . g e n . V i r o l . 5: 205-210 . O u , J . H . , S t r a u s s , E . G . , a n d S t r a u s s , J . H . (1981) C o m p a r a t i v e s t u d i e s o f t h e 3' t e r m i n a l s e q u e n c e s o f s e v e r a l a l p h a v i r u s R N A s . V i r o l o g y 109: 281-289 . O u , J . H . , R i c e , C M . , D a l g a r n o , L . , S t r a u s s , E . G . , a n d S t r a u s s , J . H . ( 1 9 8 2 a ) S e q u e n c e s t u d i e s o f s e v e r a l a l p h a v i r u s g e n o m i c R N A s i n the r e g i o n c o n t a i n i n g t h e s tar t o f t h e s u b g e n o m i c R N A . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S A . 79: 5235-5239 . O u , J . H . , T r e n t , D . W . a n d S t r a u s s , J . H . ( 1 9 8 2 b ) T h e 3 ' n o n - c o d i n g r e g i o n s o f t h e a l p h a v i r u s R N A s c o n t a i n r e p e a t i n g s e q u e n c e s . J . M o l . B i o l . 156: 719-730 . O u , J . H . , S t r a u s s , E . G . , a n d S t r a u s s , J . H . ( 1983) T h e 5 ' - t e r m i n a l s e q u e n c e s o f t h e g e n o m i c R N A s o f s e v e r a l a l p h a v i r u s e s . J . M o l . B i o l . 16 : 1-15. P a l a d e , G . ( 1 9 7 5 ) I n t r a c e l l u l a r a s p e c t s o f the p r o c e s s o f p r o t e i n s e c r e t i o n . S c i e n c e 189: 347 -358 . P a l m i t e r , R . D . , G a g n o n , J . a n d W a l s h , K . A . (1978) O v a l b u m i n : A s e c r e t e d p r o t e i n w i t h o u t a t r a n s i e n t h y d r o p h o b i c l e a d e r s e q u e n c e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 75: 94 -98 . P a r e n t , J . P . ( 1 9 8 8 ) R o l e o f c a r b o h y d r a t e i n g l y c o p r o t e i n t ra f f i c a n d s e c r e t i o n . I n P r o t e i n t r a n s f e r a n d o r g a n e l l e b i o g e n e s i s p . 5 1 - 9 0 . ( R . C . D a s a n d P . W . R o b b i n s e d . ) A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o . P a v a n , A . , L o t t i , L . V . , T o r r i s i , M . S . , M i g l i a c c i a o , G . a n d B o n a t t i , S . ( 1987 ) R e g i o n a l d i s t r i b u t i o n o f S i n d b i s v i r u s g l y c o p r o t e i n s o n t h e p l a s m a m e m b r a n e o f i n f e c t e d b a b y h a m s t e r k i d n e y ce l l s . E x . C e l l R e s . 168: 53 -62 . P e r a n e n , J . , T a k k i n e n , C , K a l a k k i n e n , N . a n d K a a r i a i n e n , L . ( 1988) S e m l i k i F o r e s t v i r u s - s p e c i f i c N o n - s t r u c t u r a l P r o t e i n n s P 3 is a P h o s p h o p r o t e i n . J . g e n . V i r o l . 69: 2165-2178 . P e r a r a , E . a n d L i n g a p p a , V . R . ( 1988) T r a n s p o r t o f p r o t e i n s a c r o s s t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m m e m b r a n e J n P r o t e i n t r a n s f e r a n d o r g a n e l l e b i o g e n e s i s , p . 3 -47 . ( R . C . D a s a n d P . W . R o b b i n s e d . ) A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o . -129-P e s o n e n , M . a n d R e n k o n e n , O . ( 1976) S e r u m g l y c o p r o t e i n - t y p e s e q u e n c e o f m o n o s a c c h a r i d e s i n m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 455: 5 1 0 - 5 2 5 . P f e f f e r , S . R . a n d R o t h m a n , J . E . ( 1987) B i o s y n t h e t i c p r o t e i n t r a n s p o r t a n d s o r t i n g b y t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m a n d G o l g i . A n n . R e v . B i o c h e m . 56: 829 -852 . P i t t a , A . M . , R o s e , J . K . a n d M a c h a m e r , C . E . ( 1989) A s i n g l e a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n e l i m i n a t e s t h e s t r i n g e n t c a r b o h y d r a t e r e q u i r e m e n t f o r i n t r a c e l l u l a r t r a n s p o r t o f a v i r a l g l y c o p r o t e i n . J . V i r o l . 63 : 3 8 0 1 - 3 8 0 9 . P o l l a c k , L . a n d A t k i n s o n , P . H . ( 1983) C o r r e l a t i o n o f g l y c o s y l a t i o n f o r m s w i t h p o s i t i o n i n a m i n o a c i d s e q u e n c e . J . C e l l B i o l . 97: 2 9 3 -P o r t e r f i e l d , J . S . , C a s a l s , J . , C h u m a k o v , M . P . , G a i d a m o v i c h , S . Y . , H a n n o u n , C , H o l m e s , I . H . , H o r z i n e k , M . , M u s s g a y , M . , O k e r - B l o m , N . , R u s s e l , P . K . a n d T r e n t , D . W . ( 1 9 7 8 ) T o g a v i r i d a e . I n t e r v i r o l o g y . 9: 129-148 . P r e h n , S . , T s a m a l o u k a s , A . a n d R a p o p o r t , T . ( 1980) D e m o n s t r a t i o n o f s p e c i f i c r e c e p t o r s o f t h e r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m f o r t h e s i g n a l s e q u e n c e o f c a r p p r e p r o i n s u l i n . E u r . J . B i o c h e m . 107: 185 -105 . P r e h n , S. , N u r n b e r g , P . a n d R a p o p o r t , T . ( 1981) A r e c e p t o r f o r s i g n a l s e g m e n t s o f s e c r e t o r y p r o t e i n s i n r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m m e m b r a n e s . F E B S L e t t . 123: 79 -84 . P r e s l e y , J . F . a n d B r o w n , D . T . ( 1989) T h e p r o t e o l y t i c c l e a v a g e o f P E 2 t o e n v e l o p e g l y c o p r o t e i n E 2 is n o t s t r i c t l y r e q u i r e d f o r t h e m a t u r a t i o n o f S i n d b i s v i r u s . J . V i r o l . 63: 1975-1980 . R a n k i , M . a n d K a a r i a i n e n , L . ( 1979) S o l u b l i z e d R N A r e p l i c a t i o n c o m p l e x f r o m S e m l i k i F o r e s t v i r u s - i n f e c t e d ce l l s . V i r o l o g y 98: 298 -307 . R i e d e l , H . , L e h r a c h , H . , a n d G a r o f f , H . ( 1982) N u c l e o t i d e s e q u e n c e at t h e j u n c t i o n b e t w e e n t h e n o n s t r u c t u r a l a n d t h e s t r u c t u r a l g e n e s o f the S e m l i k i F o r e s t v i r u s g e n o m e . J . V i r o l . 42: 7 2 5 - 7 2 9 . R i e d e l , H . ( 1985) D i f f e r e n t m e m b r a n e a n c h o r s a l l o w t h e S e m l i k i F o r e s t v i r u s s p i k e s u b u n i t E 2 t o r e a c h t h e c e l l s u r f a c e . J . V i r o l . 54: 224-228 . R i c e , C M . a n d S t r a u s s , J . H . ( 1981) N u c l e o t i d e s e q u e n c e o f the 2 6 S m R N A o f S i n d b i s v i r u s a n d d e d u c e d s e q u e n c e o f t h e e n c o d e d v i r u s s t r u c t u r a l p r o t e i n s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S A . 78: 2062 -2066 . R i c e , C M . a n d S t r a u s s , J . H . ( 1982) A s s o c i a t i o n o f S i n d b i s v i r u s g l y c o p r o t e i n s a n d t h e i r p r e c u r s o r s . J . M o l . B i o l . 154: 325-348 . R i z z o l o , L . J . ( 1 9 8 9 ) A g r o w t h h o r m o n e - v e s i c u l a r s t o m a t i t i s v i r u s G h y b r i d p r o t e i n is r a p i d l y d e g r a d e d i n l y s o s o m e s f o l l o w i n g t r a n s p o r t to the c e l l s u r f a c e . E u r . J . C e l l B i o l . 49: 9 2 - 9 8 . R o e h r i g , J . T . , G o r s k i , D . a n d S c h l e s i n g e r , M . J . ( 1982 ) P r o p e r t i e s o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s d i r e c t e d a g a i n s t t h e g l y c o p r o t e i n s S i n d b i s v i r u s . J . g e n . V i r o l . 59: 421 -425 . R o m i s c h , K . , W e b b , J . , H e r z , J . , S i e g f r e i d , P . , F r a n k , R . , V i n g r o n , M . a n d D o b b e r s t e i n , B . ( 1 9 8 9 ) H o m o l o g y o f 5 4 K p r o t e i n o f s i g n a l - r e c o g n i t i o n p a r t i c l e , d o c k i n g p r o t e i n a n d t w o E . c o l i p r o t e i n w i t h p u t a t i v e G T P - b i n d i n g p r o t e i n s . N a t u r e 340: 478-482 . -130-R o t h m a n , J . E . a n d L o d i s h , H . F . ( 1977) S y n c h r o n i z e d t r a n s m e m b r a n e i n s e r t i o n a n d g l y c o s y l a t i o n o f a n a s c e n t m e m b r a n e p r o t e i n . N a t u r e ( L o n d o n ) 269: 775-780 . R u n g e , K . W . ( 1 9 8 8 ) P o s t t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n d u r i n g p r o t e i n s e c r e t i o n . I n P r o t e i n t r a n s f e r a n d o r g a n e l l e b i o g e n e s i s , p .159 -199 . ( R . C . D a s a n d P . W . R o b b i n s e d . ) A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o . R u s s e l , D . L . , D a l r y m p l e , J . M . a n d J o h n s t o n , R . E . ( 1989) S i n d b i s V i r u s m u t a t i o n s w h i c h c o o r d i n a t e l y a f fec t g l y c o p r o t e i n p r o c e s s i n g , p e n e t r a t i o n , a n d v i r u l e n c e i n m i c e . J . V i r o l . 63 : 1619-1629 . S a b a t i n i , D . D . , K r e i b i c h , G . , M o r i m o t o , T . a n d A d e s n i k , M . (1982) M e c h a n i s m s f o r t h e i n c o r p o r a t i o n o f p r o t e i n s i n t o m e m b r a n e s a n d o r g a n e l l e s . J . C e l l B i o l . 92: 1-22. S a n g e r , F . , S . N i c k l e n , a n d C o u l s o n , A . R . ( 1977) D N A s e q u e n c i n g w i t h c h a i n t e r m i n a t i n g i n h i b i t o r s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 74: 5463-5467 . S c h e e f e r s , H . , S c h e e f e r s - B o r c h e l , U . , E d w a r d s , J . a n d B r o w n , D . T . ( 1 9 8 0 ) D i s t r i b u t i o n o f v i r u s s t r u c t u r a l p r o t e i n s a n d p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s i n p l a s m a m e m b r a n e o f b a b y h a m s t e r k i d n e y c e l l s i n f e c t e d w i t h S i n b i s v i r u s o r v e s i c u l a r s t o m a t i t i s v i r u s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S A . 77: 7 2 7 7 - 7 2 8 1 . S c h l e s i n g e r , S. , G o t t l i e b , C , F e i l , P . , G e l b , N . a n d K o r n f e l d , S . ( 1 9 7 6 ) G r o w t h o f e v e l o p e d R N A v i r u s e s i n a l i n e o f C h i n e s e h a m s t e r o v a r y ce l l s w i t h d e f i c i e n t N - a c e t y l - g l u c o s a m i n y l t r a n s f e r a s e ac t iv i ty . J . V i r o l . 17: 239-S c h l e s i n g e r , M J . a n d K a a r i a i n e n , L . ( 1980) T r a n s l a t i o n a n d p r o c e s s i n g o f a l p h a v i r u s p r o t e i n s , i n : T h e T o g a v i r u s e s ( R . W . S c h l e s i n g e r e d ) p . 371-392 , A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . S c h l e s i n g e r , M . J . a n d M a l f e r , C . ( 1982) C e r u l e n i n b l o c k s fat ty a c i d a c y l a t i o n o f g l y c o p r o t e i n s a n d i n h i b i t s v e s i c u l a r s t o m a t i t i s a n d S i n d b i s v i r u s p a r t i c l e f o r m a t i o n . J . B i o l . C h e m . 257: 9 8 8 7 - 9 8 9 0 . S c h l e s i n g e r , M . J . ( 1 9 8 5 ) R e p l i c a t i o n o f T o g a v i r u s e s , p . 1021-1032 . I n V i r o l o g y b y B . N . F i e l d s , R a v e n P r e s s , N e w Y o r k . S c h l e s i n g e r , M . J . a n d C a h i l l , D . ( 1989) V e r a p a m i l a n d c h l o r p r o m a z i n e i n h i b i t t h e b u d d i n g o f S i n b i s a n d V e s i c u l a r S t o m a t i t i s v i r u s e s f r o m i n f e c t e d c h i c k e n e m b r y o f i b r o b l a s t s . V i r o l o g y 168: 187-190 . S c h l e s i n g e r , M . J . a n d S c h l e s i n g e r , S . ( 1986 ) F o r m a t i o n a n d a s s e m b l y o f A l p h a v i r u s g l y c o p r o t e i n s , p . 121-148 . I n S . S c h l e s i n g e r a n d M J . S c h l e s i n g e r ( e d ) , T h e T o g a v i r i d a e a n d F l a v i v i r i d a e . P l e n u m P u b l i s h i n g C o r p . N e w Y o r k . S c h l e s i n g e r , S . , K o y a m a , H . , M a l f e r , C , G e e , S . L . a n d S c h l e s i n g e r , M J . ( 1 9 8 5 ) T h e e f fects o f i n h i b i t o r s o f g l u c o s i d a s e I o n t h e f o r m a t i o n o f S i n d b i s v i r u s . V i r u s R e s . 2: 139-149 . S c h m i d t , M . F . G . ( 1982 ) A c y l a t i o n o f v i r a l s p i k e g l y c o p r o t e i n s , a f e a t u r e o f e n v e l o p e d R N A v i r u s e s . V i r o l o g y 116: 327-338 . S c h m i d t , M . F . G . , B r a c h a , M . a n d S c h l e s i n g e r , M J . (1979) E v i d e n c e f o r c o v a l e n t a t t a c h m e n t o f fa t ty a c i d s t o S i n d b i s v i r u s g l y c o p r o t e i n s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S A . 76: 1687 -1691 . S c h m i d t , M . F . G . a n d S c h l e s i n g e r , M J . ( 1980) R e l a t i o n o f fat ty a c i d a t t a c h m e n t t o t h e t r a n s l a t i o n a n d m a t u r a t i o n o f v e s i c u l a r s t o m a t i t i s v i r u s a n d S i n d b i s v i r u s m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s . J . B i o l . C h e m . 255: 3 3 3 4 - 3 3 3 9 . -131 -S c h w a r z , R . T . , R o h r s c h n e i d e r , J . M . a n d S c h m i d t , M . F . G . ( 1976 ) S u p p r e s s i o n o f g l y c o p r o t e i n f o r m a t i o n o f S e m l i k i F o r e s t , i n f l u e n z a , a n d a v i a n s a r c o m a v i r u s b y t u n i c a m y c i n . J . V i r o l . 19: 7 8 2 - 7 9 1 . S e d w i c k , D . W . a n d S o k o l , F . ( 1970 ) N u c l e i c a c i d o f r u b e l l a v i r u s a n d its r e p l i c a t i o n i n h a m s t e r k i d n e y ce l l s . J . V i r o l . 5: 478 -489 . S e f t o n , B . M . a n d K e e g s t r a , K . ( 1974) G l y c o p r o t e i n s o f S i n d b i s v i r u s : p r e l i m i n a r y c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e o l i g o s a c c h a r i d e s . J . V i r o l . 14: 522-530 . S e k i k i w a , K . a n d L a i , C . J . ( 1983 ) D e f e c t s i n f u n c t i o n a l e x p r e s s i o n o f a n i n f l u e n z a h e m a g g l u t i n i n l a c k i n g t h e s i g n a l p e p t i d e s e q u e n c e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 80: 3 5 6 3 - 3 5 6 7 . S h a w , A . S . , R o t t i e r , P . J . M . a n d R o s e , J . K . ( 1988) E v i d e n c e f o r the l o o p m o d e l o f s i g n a l s e q u e n c e i n s e r t i o n i n t o t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S A . 85: 7 5 9 2 - 7 5 9 6 . S i e g e l , V . a n d W a l t e r , P . ( 1985 ) E l o n g a t i o n a r r e s t is n o t a p r e r e q u i s i t e f o r s e c r e t o r y p r o t e i n t r a n s l o c a t i o n a c r o s s t h e m i c r o s o m a l m e m b r a n e . J . C e l l B i o l . 100: 1913-1921 . S i e g e l , V . a n d W a l t e r , P . ( 1986 ) R e m o v a l o f the A l u s t r u c t u r a l d o m a i n f r o m s i g n a l r e c o g n i t i o n p a r t i c l e l e a v e s its p r o t e i n t r a n s l o c a t i o n a c t i v i t y i n t a c t . N a t u r e ( L o n d o n ) 320 : 81 -84 . S i n g e r , S . J . , M a h e r , P A . a n d Y a f f e , M . P . ( 1987) O n the t r a n s f e r o f i n t e g r a l m e m b r a n e p r o t e i n s i n t o m e m b r a n e s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 84: 1960-1964 . S i m m o n s , D . T . , a n d S t r a u s s , J . H . ( 1974) T r a n s l a t i o n o f S i n d b i s v i r u s 2 6 S R N A a n d 4 9 S R N A i n l y sa tes o f r a b b i t r e t i c u l o c y t e s . J . M o l . B i o l . 86: 397 -409 . S i m o n s , K . , K e r a n e n , S . a n d K a a r i a i n e n , L . ( 1973) I d e n t i f i c a t i o n o f a p r e c u r s o r f o r o n e o f t h e S e m l i k i F o r e s t v i r u s m e m b r a n e p r o t e i n s . F E B S L e t t . 29: 87 -91 . S o d e r l u n d , H . ( 1 9 7 3 ) K i n e t i c s o f f o r m a t i o n o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s n u c l e o c a p s i d . I n t e r v i r o l o g y 1: 3 5 4 - 3 6 1 . S t a n l e y , J . , C o o p e r , S . J . a n d G r i f f i n , D . E . (1985) A l p h a v i r u s n e u r o v i r u l e n c e : M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s d i s c r i m i n a t i n g w i l d - t y p e f r o m n e u r o a d a p t e d S i n d b i s v i r u s . J . V i r o l . 56: 110-119 . S t a n w i c k , T . L . a n d H a l l u m , J . V . ( 1974) R o l e o f i n t e r f e r o n i n s ix c e l l l i n e s p e r s i s t e n t l y i n f e c t e d w i t h r u b e l l a v i r u s . In fec t . I m m u n . 10: 810-815 . S t e c , D . S . , W a d d e l l , A . , S c h m a l j o h n , C . S . , C o l e , G A . a n d S c h m a l j o h n , A . L . ( 1 9 8 6 ) A n t i b o d y - s e l e c t e d v a r i a t i o n a n d r e v e r s i o n i n S i n d b i s v i r u s n e u t r a l i z a t i o n e p i t o p e s . J . V i r o l . 57: 715 -720 . S t e i n e r , D . F . , D o c h e r t y , K . a n d C a r r o l l , R . ( 1984) G o l g i / g r a n u l e p r o c e s s i n g o f p e p t i d e h o r m o n e a n d n e u r o p e p t i d e p r e c u r s o r s : A m i n i r e v i e w . J . C e l l . B i o c h e m . 24: 121- . S t r a u s s , E . G . , R i c e , C M . a n d S t r a u s s , J . H . ( 1983) S e q u e n c e c o d i n g f o r t h e a l p h a v i r u s n o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s is i n t e r r u p t e d b y a n o p a l t e r m i n a t i o n c o d o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S A . 80: 5 2 7 1 - 5 2 7 5 . S t r a u s s , E . G . , R i c e , C M . , a n d S t r a u s s , J . H . ( 1984) C o m p l e t e n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e g e n o m i c R N A o f S i n d b i s v i r u s . V i r o l o g y 133: 92 -110 . -132-S t r a u s s , E . G . a n d S t r a u s s , J . H . ( 1986) S t r u c t u r e a n d r e p l i c a t i o n o f t h e a l p h a v i r u s g e n o m e , p . 35 -90 , I n S . S c h l e s i n g e r a n d M J . S c h l e s i n g e r ( e d ) , T h e T o g a v i r i d a e a n d F l a v i v i r i d a e . P l e n u m P u b l i s h i n g C o r p . N e w Y o r k . S t r a u s s , J . H . a n d S t r a u s s , E . G . ( 1977) T o g a v i r u s e s i n : T h e m o l e c u l a r b i o l o g y o f a n i m a l v i r u s e s , V o l . I ( D . P . N a y a k e d ) p . 111-166, M a r c e l D e k k e r , N e w Y o r k . S t r u c k , D . K . a n d L e n n a r z , W J . (1980) T h e f u n c t i o n o f s a c c h a r i d e - l i p i d s i n s y n t h e s i s o f g l y c o p r o t e i n s . I n : T h e b i o c h e m i s t r y o f g l y c o p r o t e i n s a n d p r o t e o g l y c a n s ( W . J . L e n n a r z e d . ) , p . 35 -83 , P l e n u m P r e s s , N e w Y o r k . T a b a s , I . a n d K o r n f e l d , S . ( 1978 ) T h e s y n t h e s i s o f c o m p l e x - t y p e o l i g o s a c c h a r i d e s . J . B i o l . C h e m . 253: 779-786 . T a k k i n e n , K . ( 1986) C o m p l e t e n u c l e o t i d e s e q u e n c e c o d i n g f o r t h e a l p h a v i r u s n o n s t r u c t u r a l g e n e s o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s . N u c l . A c i d s R e s . 14: 5667-5682 . T a k k i n e n , K . , V i d g r e n , G . , E k s t r a n d , J . , H e l l m a n , U . , K a l k k i n e n , N . , W e r n s t e d t , C , a n d P e t t e r s s o n , R . F . ( 1988) J . g e n . V i r o l . 69: 603-612 . T a r e n t i n o , A . L . , T . H . P l u m m e r , a n d M a l e y , F . ( 1974 ) T h e r e l e a s e o f i n t a c t o l i g o s a c c h a r i d e s f r o m s p e c i f i c g l y c o p r o t e i n s b y e n d o - - N - a c e t y l g l u c o s a m i n i d a s e H . J . B i o l . C h e m . 249: 8 1 8 - 8 2 4 . T e r r y , G . M . , H o - T e r r y , L . , L o n d e s b o r o u g h , P . , a n d R e s s , K . R . ( 1 9 8 8 ) L o c a l i z a t i o n o f t h e r u b e l l a E l e p i t o p e s . A r c h . V i r o l . 98: 189-197 . T e r r y , G . M . , H o - T e r r y , L . , L o n d e s b o r o u g h , P . , a n d R e s s , K . R . ( 1 9 8 9 ) A b i o - e n g i n e e r e d r u b e l l a E l a n t i g e n . A r c h . V i r o l . 104: 63 -75 . T o w n s e n d , J J . , B a r i n g e r , J . R . , W o l i n s k y , J . S . , M a l a m u d , N . , M e d n i c k , J . P . , P a n i t c h , H . S . , S c o t t , R . S . , O s h i r o , L . S . , a n d C r e m e r , N . E . (1975) P r o g r e s s i v e r u b e l l a p a n e c e p h a l i t i s ; l a t e o n s e t a f t e r c o n g e n i t a l r u b e l l a . N . E n g l J . M e d . 292; 990 -993 . T y c k o , B . a n d M a x f i e l d , F . R . ( 1982) R a p i d a c i d i f i c a t i o n o f e n d o c y t i c v e s i c l e s c o n t a i n i n g 2 - m a c r o g l o b u l i n . C e l l 28: 17-23 . V a h e r i , A . , a n d H o v i , T . ( 1972 ) S t r u c t u r a l p r o t e i n s a n d s u b u n i t s o f r u b e l l a v i r u s . J . V i r o l . 9: 10-16 . V i d g r e n , G . , K T a k k i n e n , N . K a l k k i n e n , L . K a a r i a n e n , a n d P e t t e r s s o n , R . F . ( 1 9 8 7 ) N u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e g e n e s c o d i n g f o r the m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s E l a n d E 2 o f r u b e l l a v i r u s . J . G e n . V i r o l . 68: 2347-2357 . V o g e l , R . H . , P r o v e n c h e r , S . W . , v o n B o n s d o r f f , C M . , A d r i a n , M . a n d D u b o c h e t , J . ( 1 9 8 6 ) E v e l o p e s t r u c t u r e o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s r e c o n s t i t u t e d f r o m c r y t o - e l e c t r o n m i c r o g r a p h s . N a t u r e ( L o n d o n ) 320: 533 -535 . v o n B o n s d o r f f , C . - H . , a n d V a h e r i , A . ( 1969) G r o w t h o f r u b e l l a v i r u s i n B H K 2 1 ce l l s : E l e c t r o n m i c r o s c o p y o f m o r h p h o g e n e s i s . J . g e n . V i r o l . 5: 47 -51 . v o n H e i j n e , G . ( 1984) H o w s i g n a l s e q u e n c e s m a i n t a i n c l e a v a g e s p e c i f i c i t y . J . M o l . B i o l . 173: 2 4 3 - 2 5 1 . v o n H e i j n e , G . ( 1985) S i g n a l s e q u e n c e s : T h e l i m i t s o f v a r i a t i o n . J . M o l . B i o l . 184: 9 9 - 1 0 5 . -133-W a l t e r , P . ( 1987 ) S i g n a l r e c o g n i t i o n : T w o r e c e p t o r s act s e q u e n t i a l l y . N a t u r e ( L o n d o n ) 328: 763-764 . W a l t e r , P . a n d B l o b e l , G . ( 1980) P u r i f i c a t i o n o f a m e m b r a n e - a s s o c i a t e d p r o t e i n c o m p l e x r e q u i r e d f o r t r a n s l o c a t i o n a c r o s s t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S A . 77: 7 1 1 2 - 7 1 1 6 . W a l t e r , P . a n d B l o b e l , G . ( 1981) T r a n s l o c a t i o n o f p r o t e i n s a c r o s s t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m III . S i g n a l r e c o g n i t i o n p a r t i c l e ( S R P ) c a u s e s s i g n a l s e q u e n c e - d e p e n d e n t a n d s i t e - s p e c i f i c a r r e s t o f e l o n g a t i o n that is r e l e a s e d b y m i c r o s o m a l m e m b r a n e s . J . C e l l B i o l . 91: 5 5 7 - 5 6 1 . W a l t e r , P . a n d B l o b e l , G . ( 1982) S R P c o n t a i n s a 7 S R N A e s s e n t i a l f o r p r o t e i n t r a n s l o c a t i o n a c r o s s t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . N a t u r e ( L o n d o n ) 299: 691-698 . W a r r e n , G . a n d D o b b e r s t e i n , M . (1978) P r o t e i n t r a n s f e r a c r o s s m i c r o s o m a l m e m b r a n e s r e a s s e m b l e d f r o m s e p a r a t e d m e m b r a n e c o m p o n e n t s . N a t u r e ( L o n d o n ) 273: 569 -571 . W a t s o n , M . E . E . ( 1 9 8 4 ) C o m p i l a t i o n o f p u b l i s h e d s i g n a l s e q u e n c e s . N u c l . A c i d s R e s . 12: 5145-5164 . W a x h a m , M . N . , a n d W o l i n s k y , J . S . ( 1983 ) I m m u n o c h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o n o f r u b e l l a v i r u s h e m a g g l u t i n i n . V i r o l o g y 126: 194-203 . W a x h a m , M . N . , a n d W o l i n s k y , J . S . ( 1985a ) D e t a i l e d i m m u n o l o g i c a n a l y s i s o f t h e s t r u c t u r a l p o l y p e p t i d e s o f r u b e l l a v i r u s u s i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . V i r o l o g y 143: 153-165 . W a x h a m , M . N . , a n d W o l i n s k y , J . S . ( 1 9 8 5 b ) A m o d e l o f t h e s t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n o f r u b e l l a v i r i o n s . R e v . Inf . D i s . 7: S 1 3 3 - S 1 3 9 . W e i d m a n n , M . , K u r z c h a l i a , T . , H a r t m a n n , E . a n d R a p o p o r t , T . ( 1987) A s i g n a l s e q u e n c e r e c e p t o r i n t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . N a t u r e ( L o n d o n ) 328: 830 -833 . W e i l , M . L . , I t a b a s h i , H . H . , C r e m e r , N . E . , O s h i r o , L . S . , L e n n e t t e , E . H . a n d C a r n a y , L . ( 1 9 7 5 ) C h r o n i c p r o g r e s s i v e p a n e n c e p h a l i t i s d u e to r u b e l l a s i m u l a t i n g S S P E . N . E n g . J . M e d . 292: 994 -998 . W e i l a n d , F . T . , G l e a s o n , M . L . , S e r a f i n i , T . A . a n d R o t h m a n , J . E . ( 1987) T h e r a t e o f b u l k f l o w f r o m t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m t o the c e l l s u r f a c e . C e l l 50: 289-300 . W e l c h , W J . a n d S e f t o n , B . M . (1979) T w o s m a l l v i r u s - s p e c i f i c p o l y p e p t i d e s a r e p r o d u c e d d u r i n g i n f e c t i o n w i t h S i n b i s v i r u s . J . V i r o l . 29: 1186-1195 . W e l c h , W . J . a n d S e f t o n , B . M . (1980) C h a r a c t e r i z a t i o n o f a s m a l l , n o n s t r u c t u r a l v i r a l p o l y p e p t i d e p r e s e n t l a t e d u r i n g i n f e c t i o n o f B H K ce l l s b y S e m l i k i F o r e s t v i r u s . J . V i r o l . 33 : 230 -237 . W e n g l e r , G . ( 1 9 8 0 ) E f f e c t s o f a l p h a v i r u s e s o n h o s t c e l l m a c r o m o l e c u l a r s y n t h e s i s . I n T h e T o g a v i r u s e s : B i o l o g y , S t r u c t u r e a n d R e p l i c a t i o n . ( R . W . S c h l e s i n g e r e d . ) p . 459 -472 . A c a d e m i c P r e s s , N e w Y o r k . W e s t a w a y , E . G . , B r i n t o n , M A . , G a i d a m a v i c h , S . Y a . , H o r z i n e k , M . C . , I g a r a s h i , A . , K a a r i a i n e n , L . , L v o v , D . K - , P o r t e r f i e l d , J . S . , R u s s e l l , P . K . , a n d T r e n t , D . W . ( 1 9 8 5 ) F l a v i v i r i d a e . I n t e r v i r o l o g y 24: 183-192 . W h i t e , J . a n d H e l e n i u s , H . ( 1980) p H - d e p e n d e n t f u s i o n b e t w e e n t h e S e m l i k i F o r e s t v i r u s m e m b r a n e a n d l i p o s o m e s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S A . 77: 3 2 7 3 - 3 2 7 7 . W h i t e , J . , K i e l i a n , M . a n d H e l e n i u s , A . (1983) M e m b r a n e f u s i o n p r o t e i n s o f e n v e l o p e d a n i m a l v i r u s e s . Q u a r t . R e v . B i o p h y s . 16: 151-195 . -134-W i e s s , B . , R o s e n t h a l , R . a n d S c h l e s i n g e r , S . (1980) E s t a b l i s h m e n t a n d m a i n t e n e n c e o f p e r s i s t e n t i n f e c t i o n b y S i n d b i s v i r u s i n B H K ce l l s . J . V i r o l . 33 : 463-474 . W i l s o n , C , C o n n o l l y , T . , M o r r i s o n , T . a n d G i l m o r e , R . ( 1988) I n t e g r a t i o n o f m e m b r a n e p r o t e i n s i n t o t h e e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m r e q u i r e s G T P . J . C e l l B i o l . 107: 69 -77 . W i l s o n , I . , S k e h e l , J . a n d W i l e y , D . ( 1981) S t r u c t u r e o f t h e h e m a g g l u t i n i n m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n o f i n f l u e n z a at 3 A r e s o l u t i o n . N a t u r e 292: 366 -373 . W i r t h , D . F . , K a t z , F . , S m a l l , B . a n d L o d i s h , H . F . ( 1977) H o w a s i n g l e S i n d b i s v i r u s m R N A d i r e c t e d t h e s y n t h e s i s o f o n e s o l u b l e p r o t e i n a n d t w o i n t e g r a l m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n s . C e l l 10: 2 5 3 - 2 6 3 . W o n g , K . T . , R o b i n s o n , W . S . a n d M e r i g a n , T . C . ( 1969) S y n t h e s i s o f v i r a l - s p e c i f i c r i b o n u c l e i c a c i d i n r u b e l l a v i r u s - i n f e c t e d ce l l s . J . V i r o l . 4: 901 -903 . W r i g h t , K . E . , S a l v a t o , M . S . a n d B u c h m e i r , M J . ( 1989) N e u t r a l i z i n g e p i t o p e s o f l y m p h o c y t i c c h o r i o m e n i n g i t i s v i r u s a r e c o n f o r m a t i o n a l a n d r e q u i r e b o t h g l y c o s y l a t i o n a n d d i s u l f i d e b o n d s f o r e x p r e s s i o n . V i r o l o g y 171: 417 -426 . V a u x , D . , H e l e n i u s , A . a n d M e l l m a n , I. ( 1988 ) S p i k e - n u c l e o c a p s i d i n t e r a c t i o n i n S e m l i k i F o r e s t v i r u s r e c o n s t r u c t e d u s i n g n e t w o r k a n t i b o d i e s . N a t u r e ( L o n d o n ) 336: 36 -42 . V i r t a n e n , I. , E k b l o m , P . a n d L a u r i l a , P . (1980) S u b c e l l u l a r c o m p a r t m e n t a l i z a t i o n o f s a c c h a r i d e m o e i t i e s i n c u l t u r e d n o r m a l a n d m a l i g n a n t ce l l s . J . C e l l B i o l . 85: 429-434 . Z h e n g , D . et a l . ( 1989 ) G e n e , i n p r e s s . Z i e m i e c k i , A . a n d G a r o f f , H . ( 1978) S u b u n i t c o m p o s i t i o n o f the m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n o f S e m l i k i F o r e s t v i r u s . J . M o l . B i o l . 122: 259 -269 . Z i e m i e c k i , A . , G a r o f f , H . a n d S i m o n s , K . ( 1980) F o r m a t i o n o f t h e S e m l i k i F o r e s t m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n c o m p l e x e s i n t h e i n f e c t e d c e l l . J . g e n . V i r o l . 50: 111-123 . -135-

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