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A chromatographic method for estimating hydrophobic and electrostatic surface properties of soluble proteins Wijewickreme, Arosha Nilmini 1990

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831-UBC_1990_A6_7 W54.pdf [ 4.69MB ]
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CHROMATOGRAPHIC METHOD FOR E S T I M A T I N G HYDROPHOBIC AND E L E C T R O S T A T I C S U R F A C E P R O P E R T I E S O F S O L U B L E P R O T E I N S By AROSHA N I L M I N I WIJEWICKREME . ( A g r i ) H o n s . , U n i v e r s i t y o f P e r a d e n i y a , S r i L a n k a , 198 A T H E S I S S U B M I T T E D IN P A R T I A L F U L F I L M E N T OF T H E REQUIREMENT FOR THE DEGREE OF MASTER OF S C I E N C E i n THE F A C U L T Y OF GRADUATE S T U D I E S D e p a r t m e n t o f F o o d S c i e n c e We a c c e p t t h e t h e s i s a s c o n f i r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d T H E U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H COLUMBIA A p r i l 1990 (c) A r o s h a N i l m i n i W i j e w i c k r e m e I n p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r a n a d v a n c e d d e g r e e a t t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , I a g r e e t h a t l i b r a r y s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e a n d s t u d y . I f u r t h e r a g r e e t h a t p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e c o p y i n g o f t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y p u r p o s e s may b e g r a n t e d b y t h e h e a d o f my d e p a r t m e n t o r b y h i s o r h e r r e p r e s e n t a t i v e s . I t i s u n d e r s t o o d t h a t c o p y i n g o r p u b l i c a t i o n o f t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l n o t b e a l l o w e d w i t h o u t my w r i t t e n p e r m i s s i o n . D e p a r t m e n t o f F o o d S c i e n c e a n d T e c h n o l o g y T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a 6 6 5 0 , N . W . M a r i n e D r i v e V a n c o u v e r , C a n a d a V 6 T 1W5 D a t e : A B S T R A C T I n t h i s r e s e a r c h e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t t o e s t i m a t e h y d r o p h o b i c a n d e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s i n s o l u b l e p r o t e i n s . F i v e p r o t e i n s , l y s o z y m e , l a c t a l b u m i n , o v a l b u m i n , m y o g l o b i n a n d r i b o n u c l e a s e - A w e r e c h r o m a t o g r a p h e d i s o c r a t i c a l l y o n a H I C c o l u m n a t s e v e r a l m o l a l i t i e s ( 0 . 3 - 1 . 3 m ) o f e a c h o f t h r e e d i f f e r e n t n e u t r a l s a l t s , f e r r o u s s u l f a t e , ammonium s u l f a t e a n d s o d i u m s u l f a t e . T h e c a l c u l a t e d r e t e n t i o n c o e f f i c i e n t s w e r e t h e n f i t t e d t o a r e c e n t l y d e v e l o p e d c h r o m a t o g r a p h i c m o d e l i n two w a y s , a) M u l t i p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s was c o n d u c t e d t o e s t i m a t e C v a l u e s a c c o r d i n g t o t h e n o n - l i n e a r m o d e l ( l o g k = A + B l o g m + C m) . b) S i m p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s was c o n d u c t e d t o e s t i m a t e C v a l u e s a c c o r d i n g t o t h e l i n e a r m o d e l ( l o g k = A ' + C m ) a t h i g h e r s a l t c o n c e n t r a t i o n s ( a b o v e 0 . 3 m ) . R e s u l t s i n d i c a t e d t h a t C v a l u e s b e t t e r e s t i m a t e t h e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s t h a n C v a l u e s , i n e x p e r i m e n t s c o n d u c t e d o n l y a t h i g h e r s a l t c o n c e n t r a t i o n s . T h e c o m p a r i s o n o f C a n d C v a l u e s w i t h A N S , C P A , a n d B i g e l o w ' s a v e r a g e h y d r o p h o b i c i t y i n d i c e s showed no c l e a r c o r r e l a t i o n s . B u t , o m i s s i o n o f o v a l b u m i n i m p r o v e d t h e c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t o f C w i t h A N S . B o t h p a r a m e t e r s i n d i c a t e d s t r a i g h t l i n e r e l a t i o n s h i p s w i t h m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t o f s a l t s . F u r t h e r , t h e same m o d e l was u s e d t o e s t i m a t e t h e h y d r o p h o b i c a n d e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s i n p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s . L y s o z y m e a n d a v i d i n w e r e c h r o m a t o g r a p h e d on a l y s o z y m e i m m o b i l i z e d a f f i n i t y c o l u m n . L y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n showed more a f f i n i t y f o r h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s a t l o w p H v a l u e s . A v i d i n - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n showed b o t h h y d r o p h o p h o b i c a n d e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s . B o t h i n t e r a c t i o n s showed a g r e a t e r c h a n g e i n t h e s t r e n g t h o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n r a t h e r t h a n t h e s u r f a c e a r e a o f i n t e r a c t i o n , t o c h a n g i n g p H . i v T A B L E OF CONTENTS P a g e A B S T R A C T i i T A B L E OF CONTENTS i v L I S T OF T A B L E S v i L I S T OF F I G U R E S v i i ACKNOWLEDGEMENT i x 1. INTRODUCTION 1 2 . L I T E R A T U R E REVIEW 4 2 . 1 H y d r o p h o b i c I n t e r a c t i o n 4 2 . 1 . 1 E n t r o p i c a p p r o a c h 4 2 . 1 . 2 S o l v e n t a p p r o a c h 5 2 . 2 I m p o r t a n c e o f H y d r o p h o b i c i t y 7 2 . 3 H y d r o p h o b i c i t y S c a l e s 11 2 . 3 . 1 S o l u t i o n s c a l e s 11 2 . 3 . 1 . 1 N o z a k i a n d T a n f o r d (1971) s c a l e 11 2 . 3 . 1 . 2 W o l f e n d e n e t a l . (1981) s c a l e 12 2 . 3 . 2 E m p i r i c a l s c a l e s 12 2 . 3 . 2 . 1 S w e e t a n d E i s e n b e r g (1983) s c a l e 12 2 . 3 . 2 . 2 R o s e e t a l . (1985b) s c a l e 13 2 . 3 . 3 E m p i r i c a l a n d m e a s u r e d s c a l e s 14 2 . 3 . 3 . 1 M a n a v a l a n a n d Ponnaswamy (1978) s c a l e . 14 2 . 3 . 4 C o m p a r i s o n o f h y d r o p h o b i c i t y s c a l e s 15 2 . 5 M e t h o d s o f M e a s u r i n g H y d r o p h o b i c i t y 17 2 . 5 . 1 H y d r o p h o b i c p r o b e m e t h o d . 17 2 . 5 . 2 H y d r o p h o b i c c h r o m a t o g r a p h y 19 2 . 5 . 3 H y d r o p h o b i c p a r t i t i o n i n g 22 2 . 6 C o m p a r i s o n o f M e t h o d s o f H y d r o p h o b i c i t y m e a s u r e m e n t 24 2 . 7 H y d r o p h o b i c I n t e r a c t i o n C h r o m a t o g r a p h y (HIC) . . . 26 2 . 7 . 1 S a l t e f f e c t s o n H I C 26 2 . 8 P r o t e i n - p r o t e i n I n t e r a c t i o n s 33 2 . 8 . 1 A f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y 34 2 . 8 . 2 L y s o z y m e 39 2 . 8 . 3 A v i d i n 41 3 . M A T E R I A L S AND METHODS 42 3 . 1 H i g h P r e s s u r e H y d r o p h o b i c I n t e r a c t i o n C h r o m a t o g r a p h y (HPHIC) 42 3 . 1 . 1 M a t e r i a l s 42 3 . 1 . 2 I n s t r u m e n t s 42 3 . 1 . 3 B u f f e r s 43 3 . 1 . 4 E s t i m a t i o n o f t Q 43 3 . 1 . 5 C h r o m a t o g r a p h y 43 V 3 . 1 . 6 D a t a a n a l y s i s 44 3 . 2 H y d r o p h o b i c P r o b e M e a s u r e m e n t s (ANS a n d CPA m e t h o d s ) 44 3 . 2 . 1 M a t e r i a l s 44 3 . 2 . 2 . I n s t r u m e n t s 45 3 . 2 . 3 . M e t h o d 45 ANS m e t h o d 45 CPA m e t h o d 47 3 . 3 A f f i n i t y C h r o m a t o g r a p h y 47 3 . 3 . 1 M a t e r i a l s 47 3 . 3 . 2 I n s t r u m e n t s 48 3 . 3 . 3 B u f f e r s 48 3 . 3 . 4 C o u p l i n g o f l y s o z y m e t o A f f i g e l - 1 0 48 3 . 3 . 5 C h r o m a t o g r a p h y 49 3 . 3 . 6 D a t a a n a l y s i s 50 3 . 3 . 7 M e a s u r e m e n t o f l i g a n d c o n c e n t r a t i o n i n s t a t i o n a r y p h a s e 50 4 . R E S U L T S AND D I S C U S S I O N 52 4 . 1 H i g h P r e s s u r e H y d r o p h o b i c I n t e r a c t i o n C h r o m a t o g r a p h y 52 4 . 1 . 1 M e a s u r e m e n t o f h o l d up t i m e ( t Q ) i n H P H I C . 52 4 . 1 . 2 R e t e n t i o n o f p r o t e i n s i n H I C 53 4 . 1 . 3 C o m p a r i s o n o f C a n d C w i t h ANS a n d CPA h y d r o p h o b i c i t y i n d i c e s 64 4 . 1 . 4 R e l a t i o n s h i p o f C a n d C t o m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t 67 4 . 2 P r o t e i n - p r o t e i n I n t e r a c t i o n s 72 4 . 2 . 1 L y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n 72 4 . 2 . 2 A v i d i n - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n 75 4 . 2 . 3 E f f e c t o f s a l t a n d pH o n h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r 78 4 . 2 . 3 . 1 L y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n 78 4 . 2 . 3 . 2 L y s o z y m e - a v i d i n i n t e r a c t i o n 82 4 . 2 . 4 E f f e c t o f s a l t a n d pH o n e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r 83 4 . 2 . 4 . 1 L y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n 84 4 . 2 . 4 . 2 L y s o z y m e - a v i d i n i n t e r a c t i o n 84 4 . 2 . 5 E f f e c t o f pH o n d i m e r i z a t i o n o f l y s o z y m e : A c o m p a r i s o n o f K = v a l u e s w i t h s e d i m e n t a t i o n e q u i l i b r i u m c o n s t a n t s 86 5 . CONCLUSIONS . . . 88 6 . B I B L I O G R A P H Y 91 v i L I S T OF T A B L E S F i g u r e P a g e 2 . 1 H y d r o p h o b i c i t y s c a l e v a l u e s o f a m i n o a c i d r e s i d u e s . ( N a k a i a n d L i - C h a n , 1987) 16 2 . 2 C o r r e l a t i o n m a t r i x o f h y d r o p h o b i c i t y s c a l e s f o r a m i n o a c i d r e s i d u e s . ( N a k a i a n d L i - C h a n , 1987) 18 3 . 1 E x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s o f p r o t e i n s u s e d i n H P H I C 46 4 . 1 T h e m o l e c u l a r w e i g h t s , i s o e l e c t r i c p o i n t s a n d t h e c h a r g e s o f p r o t e i n s u s e d i n H P H I C . . . 58 4 . 2 H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s (C) o f t h e p l o t s o f l o g k v s m o f f e r r o u s s u l f a t e , ammonium s u l f a t e a n d s o d i u m s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e 60 4 . 3 S l o p e ( C ) a n d i n t e r c e p t s o f t h e p l o t s o f l o g k v s s a l t m o l a l i t y o f ammonium s u l f a t e , f e r r o u s s u l f a t e a n d s o d i u m s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e 61 4 . 4 A , B a n d C p a r a m e t e r s o f l y s o z y m e - l y s o z y m e a n d l y s o z y m e - a v i d i n i n t e r a c t i o n s 79 4 . 5 S l o p e s ( C ) a n d i n t e r c e p t s o f l y s o z y m e -l y s o z y m e a n d l y s o z y m e - a v i d i n i n t e r a c t i o n s . . . 80 4 . 6 D i s s o c i a t i o n e q u i l i b r i u m c o n s t a n t s (Kj^p) o f l y s o z y m e - l y s o z y m e a n d l y s o z y m e - a v i d i n i n t e r a c t i o n s 81 4 . 7 E l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s (B) o f l y s o z y m e - l y s o z y m e a n d l y s o z y m e - a v i d i n i n t e r a c t i o n s 85 v i i L I S T OF F I G U R E S F i g u r e P a g e 2 . 1 V a r i a t i o n o f ^he a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t w i t h p H a t 20 C . P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n a p p r o x i m a t e l y 1 .4 g / 1 0 0 mL i n 0 . 1 5 M K C l . ( S o p h i a n o p o u l o s a n d V a n H o l d e , 1964) 40 4 . 1 P l o t o f t h e l o g a r i t h m i c r e t e n t i o n f a c t o r o f p r o t e i n s a g a i n s t s a l t m o l a l i t y o f f e r r o u s s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e . 54 4 . 2 P l o t o f t h e l o g a r i t h m i c r e t e n t i o n f a c t o r o f p r o t e i n s a g a i n s t s a l t m o l a l i t y o f ammonium s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e 55 4 . 3 P l o t o f t h e l o g a r i t h m i c r e t e n t i o n f a c t o r o f p r o t e i n s a g a i n s t s a l t m o l a l i t y o f s o d i u m s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e . 56 4 . 4 G r a p h i l l u s t r a t i n g t h e l a c k o f d e p e n d e n c e o f C a n d C ( s o d i u m s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e ) o n ANS 65 4 . 5 G r a p h i l l u s t r a t i n g t h e l a c k o f d e p e n d e n c e o f C a n d C ( s o d i u m s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e ) o n CPA 66 4 . 6 G r a p h i l l u s t r a t i n g t h e l a c k o f d e p e n d e n c e o f C ( s o d i u m s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e ) o n B i g e l o w ' s a v e r a g e h y d r o p h o b i c i t y 68 4 . 7 G r a p h i l l u s t r a t i n g t h e d e p e n d e n c e o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s (C) o n t h e m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t o f s a l t s ( f e r r o u s s u l f a t e , ammonium s u l f a t e , a n d s o d i u m s u l f a t e ) i n t h e e l u e n t 70 4 . 8 G r a p h i l l u s t r a t i n g t h e d e p e n d e n c e o f s l o p e ( C ) o n t h e m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t o f s a l t s ( f e r r o u s s u l f a t e , ammonium s u l f a t e , a n d s o d i u m s u l f a t e ) i n t h e e l u e n t 71 4 . 9 P l o t o f t h e l o g a r i t h m i c r e t e n t i o n f a c t o r s o f l y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n a g a i n s t s a l t m o l a l i t y o f ammonium s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e 73 4 . 1 0 P l o t o f t h e l o g a r i t h m i c r e t e n t i o n f a c t o r s o f l y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n a g a i n s t v i i i l o g a r i t h m i c s a l t m o l a l i t y o f ammonium s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e 74 4 . 1 1 P l o t o f t h e l o g a r i t h m i c r e t e n t i o n f a c t o r o f l y s o z y m e - a v i d i n i n t e r a c t i o n a g a i n s t s a l t m o l a l i t y o f ammonium s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e 76 4 . 1 2 P l o t o f t h e l o g a r i t h m i c r e t e n t i o n f a c t o r s o f l y s o z y m e - a v i d i n i n t e r a c t i o n a g a i n s t l o g a r i t h m i c s a l t m o l a l i t y o f ammonium s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e 77 i x ACKNOWLEDGEMENT I am g r e a t l y i n d e b t e d t o my s u p e r v i s o r , P r o f e s s o r T . D . D u r a n c e , f o r h i s g u i d a n c e , e n c o u r a g e m e n t a n d e n t h u s i a s t i c i n t e r e s t t h r o u g h o u t t h i s r e s e a r c h . I w o u l d l i k e t o t h a n k t h e members o f my s u p e r v i s o r y c o m m i t t e e , P r o f e s s o r s S . N a k a i , J . V a n d e r s t o e p a n d W . D . P o w r i e f o r t h e i r h e l p f u l d i s c u s s i o n s a n d c o n s t r u c t i v e c r i t i c i s m s . T h a n k s a r e a l s o d u e t o M r . D . Y a n a n d M r . S . Y e e f o r t h e i r t e c h n i c a l a s s i s t a n c e a n d h e l p f u l s u g g e s t i o n s d u r i n g t h e l a b o r a t o r y o p e r a t i o n s . T h e f i n a n c i a l s u p p o r t p r o v i d e d b y t h e N a t u r a l S c i e n c e s a n d E n g i n e e r i n g R e s e a r c h C o u n c i l o f C a n a d a i s g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . F i n a l l y , a v e r y s p e c i a l t h a n k s g o t o my h u s b a n d W i j e f o r t h e e n c o u r a g e m e n t a n d s u p p o r t d u r i n g t h e e n t i r e c o u r s e o f my s t u d i e s . 1 1 . INTRODUCTION T h e m o l e c u l a r s u r f a c e p r o p e r t i e s o f p r o t e i n s , i n c l u d i n g e l e c t r o s t a t i c a n d h y d r o p h o b i c c h a r a c t e r i s t i c s , p l a y a m a j o r r o l e i n a w i d e r a n g e o f n o n - c o v a l e n t i n t e r a c t i o n s o f p r o t e i n s w i t h o t h e r c o m p o u n d s : l i p i d s , f a t t y a c i d s a n d p e p t i d e s . S u c h p r o p e r t i e s a r e o f c e n t r a l i n t e r e s t i n t h e s t u d y o f p r o t e i n a t t r i b u t e s s u c h a s s o l u b i l i t y , a n t i g e n i c i t y , s u r f a c e a c t i v i t y , a g g r e g a t i o n , f o a m i n g a n d g e l a t i o n . H o w e v e r , t h e q u a n t i f i c a t i o n o f h y d r o p h o b i c p r o p e r t i e s o f p r o t e i n s s t i l l r e m a i n s a p r o b l e m . I n a r e l a t i v e l y few c a s e s o f p r o t e i n s w i t h known t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e s , t h e e s t i m a t e o f s u r f a c e h y d r o p h o b i c r e g i o n s i s p o s s i b l e b y c a l c u l a t i n g e x p o s u r e o f h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s ( L i p m a n , 1 9 8 7 ) . I n t h e c a s e o f l e s s w e l l d e f i n e d p r o t e i n s , t h e m e a s u r e o f a c t u a l n o n - p o l a r s u r f a c e a r e a r e q u i r e s a p r o b e , a n d t h e m e a s u r e d h y d r o p h o b i c i t y i s r e l a t e d t o t h e c o n t a c t a r e a b e t w e e n t h e m o l e c u l e a n d t h e n o n -p o l a r s u r f a c e a r e a o f t h e p r o b e . P r o b e s w h i c h e x h i b i t e d c h a n g e s i n f l u o r e s c e n c e i n r e l a t i o n t o t h e h y d r o p h o b i c i t y o f t h e i r e n v i r o n m e n t h a v e b e e n w i d e l y u s e d f o r t h i s p u r p o s e . R e c e n t l y , a c h r o m a t o g r a p h i c m o d e l ( l o g k = A + B l o g m + C m) was p r o p o s e d b y E l - R a s s i a n d H o r v a t h (1986a) t o e s t i m a t e b o t h h y d r o p h o b i c (C) a n d e l e c t r o s t a t i c (B) i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s b e t w e e n a p r o t e i n a n d a c h r o m a t o g r a p h i c s t a t i o n a r y p h a s e . T h e m o d e l i s b a s e d o n t h e o b s e r v a t i o n t h a t l o g c a p a c i t y f a c t o r s ( l o g k) d e c r e a s e l i n e a r l y w i t h l o g s a l t 2 m o l a l i t y ( l o g m) when r e t e n t i o n i s d u e t o e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n , a n d i n c r e a s e l i n e a r l y w i t h s a l t m o l a l i t y when r e t e n t i o n i s d u e t o h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n . P a r a m e t e r s B a n d C a r e t h e l i m i t i n g s l o p e s o f l o g k v s l o g m a n d l o g k v s m r e l a t i o n s h i p s r e s p e c t i v e l y . P a r a m e t e r C i s b e l i e v e d t o b e c l o s e l y r e l a t e d t o t h e m o l e c u l a r s u r f a c e a r e a o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n a n d t h e m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t o f s a l t s . T h e a d v a n t a g e o f u s i n g t h i s m e t h o d i s t h a t t h e c o n s i d e r a t i o n o f c a p a c i t y r a t i o s o v e r a w i d e r a n g e o f s a l t m o l a l i t i e s o v e r c o m e s t h e e r r o r s t h a t c o u l d s i m p l y r e s u l t f r o m e s t i m a t i o n o f h y d r o p h o b i c i t y a s t h e c a p a c i t y r a t i o a t a g i v e n s a l t m o l a l i t y . F u r t h e r m o r e , a s t h e h y d r o p h o b i c s u r f a c e o f t h e p r o t e i n i n t e r a c t s d i r e c t l y w i t h t h e s t a t i o n a r y p h a s e , a n a c t u a l e s t i m a t e o f t h e h y d r o p h o b i c s u r f a c e a r e a o f c o n t a c t b e t w e e n a p r o t e i n a n d t h e H I C s t a t i o n a r y p h a s e may b e p o s s i b l e . T h e m o d e l a l s o shows t h a t t h e r e a r e two ways o f e s t i m a t i n g h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s , a) By f i t t i n g d a t a t o t h e a b o v e n o n - l i n e a r m o d e l a n d c a l c u l a t i n g C v a l u e s b y m u l t i p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s , b) By f i t t i n g d a t a t o t h e l i n e a r m o d e l ( i . e . e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s become i n s i g n i f i c a n t a t h i g h e r s a l t c o n c e n t r a t i o n s a n d t h e m o d e l r e d u c e s t o , l o g k = A ' + C m w h e r e , C i s t h e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r a t h i g h e r s a l t c o n c e n t r a t i o n s a n d A ' i s a c o n s t a n t ) a n d c a l c u l a t i n g C v a l u e s b y l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s . T h i s m o d e l a l s o h a s p o t e n t i a l f o r i n v e s t i g a t i n g t h e 3 f o r c e s i n v o l v e d i n p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s . T h i s c a n b e a c h i e v e d b y c o v a l e n t l y i m m o b i l i z i n g a p r o t e i n t o t h e s t a t i o n a r y p h a s e a n d p a s s i n g a s o l u b l e p r o t e i n t h r o u g h t h e c o l u m n s e v e r a l t i m e s w i t h v a r y i n g s a l t m o l a l i t i e s i n t h e m o b i l e p h a s e . I n t h i s r e s e a r c h t h e i n v e s t i g a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t t o , 1 . C o r r e l a t e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s (C a n d C ) o f l y s o z y m e , l a c t a l b u m i n , o v a l b u m i n , m y o g l o b i n , a n d r i b o n u c l e a s e w i t h A N S , CPA a n d B i g e l o w ' s a v e r a g e h y d r o p h o b i c i t y i n d i c e s . 2 . C o r r e l a t e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s (C a n d C ) w i t h m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t s o f n e u t r a l s a l t s ( f e r r o u s s u l f a t e , ammonium s u l f a t e , s o d i u m s u l f a t e ) . 3 . E x p l a i n l y s o z y m e d i m e r i z a t i o n i n t e r m s o f e x p e r i m e n t a l h y d r o p h o b i c (C a n d C ) a n d e l e c t r o s t a t i c (B) i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s . 4 . E x p l a i n a v i d i n - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n i n t e r m s o f e x p e r i m e n t a l C , C a n d B p a r a m e t e r s . 4 2 . L I T E R A T U R E REVIEW 2 - 1 HYDROPHOBIC I N T E R A C T I O N T h e a t t r a c t i o n b e t w e e n h y d r o p h o b i c p o l y m e r s ( e g . p r o t e i n s ) a n d h y d r o p h o b i c s u r f a c e s o f o t h e r c o m p o u n d s w h i l e i m m e r s e d i n a q u e o u s m e d i a i s g e n e r a l l y r e f e r r e d t o a s " h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n " (Van O s s e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h i s same p h e n o m e n o n i s a l s o r e f e r r e d t o a s " h y d r o p h o b i c e f f e c t " o r e v e n a s " h y d r o p h o b i c b o n d s " . H y d r o p h o b i c i t y i s a s t r u c t u r a l f e a t u r e o f a c o m p o u n d t h a t h a s i m p o r t a n t i m p l i c a t i o n s f o r b i o l o g i c a l a c t i v i t y . T h e t h e o r e t i c a l f r a m e w o r k f o r e x p l a i n i n g h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s o f p r o t e i n s i n s o l u t i o n i s somewhat c o n t r o v e r s i a l a t t h i s t i m e . T h e r e e x i s t , two c o m p l e t e l y d i f f e r e n t i n t e r p r e t a t i o n s c o n c e r n i n g t h i s d r i v i n g f o r c e b e t w e e n two n o n -p o l a r m o l e c u l e s . One a p p r o a c h i s t o e x p l a i n h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n a s a n e n t r o p i c f o r c e w h i c h i s c a l l e d t h e e n t r o p i c a p p r o a c h ( T a n f o r d , 198 0 ) . T h e o t h e r i s t o c o n s i d e r h y d r o p h o b i c i t y a s a s p e c i a l c a s e o f v a n d e r W a a l s a t t r a c t i o n ( V a n O s s e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h i s i s c a l l e d t h e s o l v e n t a p p r o a c h . 2 . 1 . 1 E n t r o p i c a p p r o a c h I n t h i s t h e o r y , h y d r o p h o b i c e f f e c t i s s a i d t o a r i s e d u e t o t h e u n f a v o u r a b l e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n n o n - p o l a r s u r f a c e s a n d w a t e r m o l e c u l e s . T h e r e f o r e , i t i s m a i n l y t h e s o l v e n t t h a t f o r c e s m o l e c u l e s t o a s s o c i a t e , r a t h e r t h a n t h e a t t r a c t i o n b e t w e e n t h e m ( H o r v a t h e t a l . , 1 9 7 6 ) . When a n o n - p o l a r m o l e c u l e 5 i s i n t r o d u c e d i n t o w a t e r , b o t h e n t h a l p y a n d e n t r o p y c h a n g e s o c c u r i n t h e s y s t e m . T h i s u n f a v o u r a b l e e n t h a l p y c h a n g e i s c a u s e d b y t h e c r e a t i o n o f a h o l e i n t h e h y d r o g e n b o n d e d s t r u c t u r e o f w a t e r t o a c c o m m o d a t e t h e n o n - p o l a r m o l e c u l e . T h e r e s u l t i n g f o r m a t i o n i s a "cage" o f m o r e o r l e s s f u l l y H - b o n d e d w a t e r m o l e c u l e s i m m e d i a t e l y s u r r o u n d i n g t h e n o n - p o l a r m o l e c u l e . T h i s s t r u c t u r e i s c a l l e d a n " i c e b e r g " ( F r a n k a n d E v a n s , 1 9 4 5 ) . F o r m a t i o n o f t h e "cage" c a u s e s t h e e n t r o p y o f t h e s y s t e m t o d e c r e a s e . T o m i n i m i z e t h i s u n f a v o u r a b l e e n t r o p y e f f e c t , n o n - p o l a r m o l e c u l e s a r e f o r c e d t o s e l f - a s s o c i a t e i n w a t e r . I n d o i n g s o , t h e t o t a l n o n - p o l a r s u r f a c e a r e a i n c o n t a c t w i t h t h e s o l v e n t i s d e c r e a s e d a n d t h e u n f a v o u r a b l e e n t r o p y d e c r e a s e i s m i n i m i z e d . T o a l a r g e e x t e n t t h i s u n f a v o u r a b l e c h a n g e i s o f f s e t b y L o n d o n f o r c e s b e t w e e n t h e n o n - p o l a r m o l e c u l e s a n d w a t e r ( T a n f o r d , 1 9 8 0 ) . T h u s t h e a g g r e g a t i o n o f n o n - p o l a r s o l u t e s i n w a t e r i s " e n t r o p y d r i v e n " a n d no " h y d r o p h o b i c b o n d " e x i s t s a s s u c h . T h e r e f o r e a c c o r d i n g t o t h e a b o v e t h e o r y , t h e c o r r e c t t e r m i s " h y d r o p h o b i c e f f e c t " a n d n o t " h y d r o p h o b i c b o n d " . 2 . 1 . 2 S o l v e n t a p p r o a c h T h i s g e n e r a l a p p r o a c h c o n s i d e r s h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n a s a s p e c i a l c a s e o f v a n d e r W a a l s a n d h y d r o g e n b o n d s . I n a d d i t i o n t o t h e a t t r a c t i o n b e t w e e n h y d r o p h o b i c r e g i o n s , s o l v e n t - s o l v e n t i n t e r a c t i o n s a n d s o l u t e - s o l v e n t i n t e r a c t i o n s a r e a l s o c o n s i d e r e d ( V a n O s s e t a l . , 1 9 8 6 ; N a k a i a n d L i - C h a n , 1 9 8 7 ) . T h e r e f o r e t h e h y d r o p h o b i c e f f e c t i s a t t r i b u t e d t o t h e i n t e r p l a y o f a l l t h r e e i n t e r m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n s . T h e r e a r e two g r o u p s o f s u r f a c e t h e r m o d y n a m i c i n t e r a c t i o n s . (1) L o n g - r a n g e L i f s h i t z v a n d e r W a a l s i n t e r a c t i o n s (LW) o f t h e L o n d o n ( d i s p e r s i o n ) , Keesom ( o r i e n t a t i o n ) , a n d Debye ( i n d u c t i o n ) v a r i e t i e s . (2) S h o r t - r a n g e (SR) h y d r o g e n b o n d s . E n e r g y o f H - b o n d s d e c a y r a p i d l y w i t h d i s t a n c e a n d i t d r o p s t o z e r o a t a d i s t a n c e o f 2 A , o r s o b e y o n d t h e n o r m a l b o n d l e n g t h . T h e r e f o r e t h e s e a r e c a l l e d s h o r t r a n g e i n t e r a c t i o n s . A c c o r d i n g t o H a m a r k e r ' s c o m b i n i n g r u l e , t h e p o t e n t i a l o f v a n d e r W a a l s i n t e r a c t i o n b e t w e e n two b o d i e s o f m a t e r i a l s , o n e a n d t w o , a c r o s s a medium t h r e e i s g i v e n b y t h e sum o f g e o m e t r i c t e r m s t h a t a r e i n f l u e n c e d b y t h e s i z e a n d s h a p e o f e a c h b o d y . T h u s t h e H a m a r k e r c o e f f i c i e n t A 1 3 2 i s g i v e n b y : A 1 3 2 A 1 2 + A 3 3 A 1 3 A 2 3 ( 2 ' 1 ) H y d r o p h o b i c b o n d p r e v a i l s when A 3 3 > ( A 1 3 + A 2 3 ) . T h e t o t a l f r e e T O T e n e r g y o f a d h e s i o n ( A G ^ 3 2 ) , b e t w e e n n o n - p o l a r s u r f a c e s d u e t o h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n when d i s t a n c e d Q « 1 . 3 5 A i s g i v e n b y : T O T LW SR A G 1 3 2 = A G 1 3 2 + A G 1 3 2 ( 2 - 2 ) T h e r e f o r e , a l l t h a t i s n e c e s s a r y f o r a h y d r o p h o b i c b o n d t o T W "^R LW o c c u r i s A ^ 3 2 + &^22 t o b e P o s i t i v e ( w h i c h h a p e n s when G 1 3 2 + SR G 1 3 2 i s n e g a t i v e ) . A s shown b y V a n O s s e t a l . (1986) LW f o r c e s 7 b e t w e e n h y d r o p h o b i c m o i e t i e s a n d a q u e o u s s o l v e n t a r e a l w a y s a t t r a c t i v e , a n d SR f o r c e s b e t w e e n t h e same e n t i t i e s a r e e i t h e r z e r o o r a t t r a c t i v e , b u t n e v e r r e p u l s i v e . A s s u c h , t h e h y d r o p h o b i c e f f e c t i s a n a t t r a c t i o n b e t w e e n m a c r o m o l e c u l e s b y w h i c h some o f t h e m o r e h y d r o p h o b i c s i t e s p r e f e r e n t i a l l y i n t e r a c t w i t h e a c h o t h e r b y v a n d e r W a a l s i n t e r a c t i o n . T h e r e f o r e T a n f o r d ' s d e f i n i t i o n o f h y d r o p h o b i c e f f e c t b a s e d u p o n r e p u l s i o n b y t h e s o l v e n t , i n s t e a d o f a t t r a c t i v e f o r c e s a t t h e s i t e o f o r g a n i z a t i o n i s m i s l e a d i n g . M o r e o v e r , t h e s o l v e n t a p p r o a c h p r o p o s e s t h a t t h e t e r m " i n t e r f a c i a l f o r c e " i s more a p p r o p r i a t e t h a n t h e t e r m " h y d r o p h o b i c e f f e c t " , a s LW a n d SR f o r c e s a r e i n t e r f a c i a l f o r c e s . I t h a s b e e n a r g u e d t h a t c h a n g e s i n w a t e r s t r u c t u r e do n o t p l a y a m a j o r r o l e i n s o l u t i o n p r o c e s s e s o f h y d r o c a r b o n s , b e c a u s e t h e m a j o r c o m p o n e n t o f t h e f r e e e n e r g y o f t r a n s f e r s t e m s f r o m v a n d e r W a a l s i n t e r a c t i o n . On t h e o t h e r h a n d , t h e u n u s u a l l y l a r g e c h a n g e s i n e n t r o p y a n d h e a t c a p a c i t y t h a t a r e o b s e r v e d i n a c c o m p a n y i n g t h e t r a n s f e r o f n o n - p o l a r s o l u t e s t o w a t e r c a n n o t b e e x p l a i n e d o n l y b y v a n d e r W a a l s i n t e r a c t i o n s . T h e r e f o r e , t h e c h a n g e s i n w a t e r s t r u c t u r e m u s t a l s o b e c o n s i d e r e d i n u n d e r s t a n d i n g t h e h y d r o p h o b i c e f f e c t ( N a k a i a n d L i - C h a n , 1 9 8 7 ) . 2 . 2 IMPORTANCE OF HYDROPHOBICITY H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s a r e known t o b e o f e s s e n t i a l i m p o r t a n c e f o r t h e s t a b i l i t y , c o n f o r m a t i o n , a n d f u n c t i o n o f c e l l s a n d b i o l o g i c a l m a c r o m o l e c u l e s ( e g . p r o t e i n s ) . P r o t e i n s 8 a r e a m p h i p a t h i c m o l e c u l e s a n d a r e c o m p o s e d o f a m i n o a c i d s t h a t h a v e a s t r o n g l y h y d r o p h o b i c p e p t i d e g r o u p a n d e i t h e r h y d r o p h o b i c o r h y d r o p h i l i c s i d e c h a i n s . R e c e n t l y R o s e e t a l . (1985b) d i v i d e d a m i n o a c i d s i n t o t h r e e g r o u p s , s u c h a s v e r y p o l a r ( s e r i n e , p r o l i n e , a s p a r t a t e , a s p a r a g i n e , g l u t a m a t e , l y s i n e , a n d a r g i n i n e ) , m o d e r a t e l y p o l a r ( a l a n i n e , t h r e o n i n e , h i s t i d i n e , a n d t y r o s i n e ) , a n d h y d r o p h o b i c ( g l y c i n e , c y s t e i n e , v a l i n e , i s o l e u c i n e , l e u c i n e , m e t h i o n i n e , p h e n y l a l a n i n e , a n d t r y p t o p h a n ) . T h e r e f o r e a l l p r o t e i n s a r e c h a r a c t e r i z e d b y a c e r t a i n d e g r e e o f h y d r o p h o b i c i t y (Mann a n d M o r e n o , 1 9 8 4 ) . P r o t e i n f o l d i n g was t h o u g h t - to b e r e l a t e d t o t h e h y d r o p h o b i c i t y o f a m i n o a c i d s a n d s i d e c h a i n s . T h e c h a r g e d g r o u p s o f t h e p r o t e i n m o l e c u l e w e r e a s s u m e d t o b e a t t h e p r o t e i n / s o l v e n t i n t e r f a c e o f t h e n a t i v e s t r u c t u r e a n d m o s t o f t h e n o n - p o l a r p a r t s t o b e i n t h e i n t e r i o r o f t h e n a t i v e s t r u c t u r e ( T a n f o r d , 1 9 6 2 ) . H o w e v e r , t h e a n a l y s i s o f t h r e e d i m e n s i o n a l p r o t e i n s t r u c t u r e s r e c e n t l y r e v e a l e d t h a t 40-55% o f t h e s u r f a c e a r e a o f e a c h p r o t e i n i s o c c u p i e d b y n o n - p o l a r a t o m s ( L e e a n d R i c h a r d , 1 9 7 0 ) . Some r e l a t i o n s h i p s t h a t h a v e b e e n o b s e r v e d b e t w e e n s e c o n d a r y s t r u c t u r e a n d h y d r o p h o b i c i t y a r e : 1. A l p h a h e l i c e s t h a t l i e a t p r o t e i n s u r f a c e s t e n d t o h a v e one f a c e p r o j e c t i n g m a i n l y h y d r o p h o b i c r e s i d u e s a n d a n o p p o s i t e f a c e p r o j e c t i n g h y d r o p h i l i c r e s i d u e s . 2 . B e t a s h e e t s w h i c h f r e q u e n t l y o c c u r i n t h e i n t e r i o r o f t h e g l o b u l a r p r o t e i n s t e n d t o b e p a r t i c u l a r l y r i c h i n h y d r o p h o b i c r e s i d u e s . 9 3 . B e t a t u r n s a n d o t h e r a b r u p t b e n d s t h a t r e v e r s e c h a i n d i r e c t i o n s a t t h e s u r f a c e o f g l o b u l a r p r o t e i n s t e n d t o b e e s p e c i a l l y h y d r o p h i l i c (Sweet a n d E i s e n b e r g , 1 9 8 3 ) . H y d r o p h o b i c i t y i s n o t o n l y i m p o r t a n t i n s t a b i l i t y a n d c o n f o r m a t i o n o f p r o t e i n s . I t i s a m o l e c u l a r s u r f a c e p r o p e r t y t h a t p l a y s a m a j o r r o l e i n a w i d e r a n g e o f n o n - c o v a l e n t i n t e r a c t i o n s o f p r o t e i n s w i t h o t h e r c o m p o u n d s s u c h a s p e p t i d e s , p r o t e i n s , l i p i d s , e t c . T h e s e p r o p e r t i e s a r e o f c e n t r a l i n t e r e s t i n s t u d i e s o f p r o t e i n s o l u b i l i t y , s u r f a c e a c t i v i t y , a n t i g e n i c i t y , f o a m i n g , a g g r e g a t i o n , g e l a t i o n , e t c . S o l u b i l i t y o f a compound i s r e l a t e d t o i t s p o l a r i t y . I f p o l a r i t y o f s o l v e n t a n d s o l u t e m a t c h e s , s o l u t e e a s i l y d i s s o l v e s i n s o l v e n t . " H y d r o p h i l i c " i s a s y n o n y m f o r " p o l a r " a n d " h y d r o p h o b i c " i s a s y n o n y m f o r " n o n - p o l a r " . T h e r e f o r e s o l u b i l i t y i s r e l a t e d t o h y d r o p h o b i c i t y . T h e H y d r o p h i l e L i p o p h i l e B a l a n c e (HLB) c o n c e p t w h i c h i s u s e d t o s e l e c t p r o p e r s u r f a c t a n t s i s a n o t h e r e x p r e s s i o n o f p o l a r i t y . H L B i s d e f i n e d a s , [ p o l a r r a d i c a l s ] / { [ p o l a r ] + [ n o n - p o l a r ] } a n d h y d r o p h o b i c i t y i s d e f i n e d a s , [ n o n - p o l a r r a d i c a l s ] / { [ p o l a r ] + [ n o n - p o l a r ] ) . T h e r e f o r e , p r o t e i n h y d r o p h o b i c i t y = 1 - [ H L B ] . I n s u c h a way h y d r o p h o b i c i t y , s o l u b i l i t y a n d e m u l s i f i c a t i o n a r e a l l r e l a t e d t o e a c h o t h e r ( N a k a i a n d L i - C h a n , 1 9 8 7 ) . S i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n s h a v e b e e n e x p e r i m e n t a l l y o b s e r v e d among t h e s e p r o p e r t i e s o f p r o t e i n s . T h e r e f o r e many a t t e m p t s h a v e b e e n made t o q u a n t i t a t e t h e h y d r o p h o b i c e f f e c t . A s a r e s u l t , a l a r g e number o f h y d r o p h o b i c i t y s c a l e s h a v e e v o l v e d w i t h i n a g i v e n c l a s s o f b i o l o g i c a l s u b s t a n c e s . F e n d l e r e t a l . 10 (1975) d e v e l o p e d a s c a l e b a s e d o n t h e f r e e e n e r g y o f t r a n s f e r o f a m i n o a c i d s f r o m w a t e r t o h e x a n e . B u l l a n d B r e e z e (1974) m e a s u r e d t h e t e n d e n c y o f a m i n o a c i d s n e a r t h e i r i s o - e l e c t r i c p o i n t ( p i ) t o b e t r a n s f e r r e d f r o m b u l k t o t h e s u r f a c e . C h o t h i a (1976) g e n e r a t e d a l i s t o f " r e s i d u e a c c e s s i b i l i t i e s " o f i n d i v i d u a l a m i n o a c i d s t h a t a r e f o u n d t o b e i n a c c e s s i b l e t o s o l v e n t o v e r 95% o f t h e i r r e s p e c t i v e s u r f a c e a r e a s i n t h e s t r u c t u r e s o f g l o b u l a r p r o t e i n s . U s i n g t h e h y d r o p h o b i c i t y v a l u e s o f i n d i v i d u a l a m i n o a c i d s , T a n f o r d (1962) c a l c u l a t e d t h e t o t a l h y d r o p h o b i c i t y o f s e v e r a l p r o t e i n s , a n d u s i n g t h e N o z a k i T a n f o r d s c a l e , B i g e l o w (1967) c a l c u l a t e d t h e a v e r a g e h y d r o p h o b i c i t y (H$ ' = t o t a l h y d r o . / # o f r e s i d u e s ) o f s e v e r a l p r o t e i n s . T h e s e s c a l e s c a n b e c l a s s i f i e d a s s o l u t i o n m e a s u r e m e n t s , e m p i r i c a l s c a l e s , o r some c o m b i n a t i o n o f t h e two ( R o s e e t a l . , 1 9 8 5 b ; N a k a i a n d L i - C h a n , 1 9 8 7 ) . S o l u t i o n s c a l e s a r e b a s e d o n d i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n t s b e t w e e n a n a q u e o u s p h a s e a n d a s u i t a b l y c h o s e n o r g a n i c p h a s e . E m p i r i c a l s c a l e s a r e b a s e d o n p a r t i t i o n i n g b e t w e e n t h e s o l v e n t a c c e s s i b l e s u r f a c e a n d t h e b u r i e d i n t e r i o r i n t h e p r o t e i n s o f known s t r u c t u r e s . Some o f t h e s e s c a l e s a r e d i s c u s s e d i n d e t a i l i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n . 2 . 3 HYDROPHOBICITY S C A L E S 11 2 . 3 . 1 S o l u t i o n s c a l e s 2 . 3 . 1 . 1 N o z a k i a n d T a n f o r d (1971) s c a l e T h e d i f f e r e n c e i n s o l v a t i o n f r e e e n e r g i e s i n w a t e r a n d 100% e t h a n o l o r o t h e r n o n a q u e o u s m e d i a h a s b e e n u s e d t o e s t a b l i s h a h y d r o p h o b i c i t y s c a l e . T h e f r e e e n e r g y o f t r a n s f e r ( A G ^ . ) o f a n a m i n o a c i d n e a r i t s i s o - e l e c t r i c p o i n t ( p i ) was d e f i n e d a s t h e c h a n g e i n c h e m i c a l p o t e n t i a l o f s o l u t e " i " i n g o i n g f r o m w a t e r t o a n y o t h e r s o l v e n t a t t h e same m o l e f r a c t i o n , a t t h e l i m i t o f i n f i n i t e d i l u t i o n . I n t h i s s c a l e , e t h a n o l was c o n s i d e r e d a s a m o d e l f o r t h e o r g a n i c i n t e r i o r o f a g l o b u l a r p r o t e i n . I f s o l u b i l i t y o f a c e r t a i n a m i n o a c i d , f o r e x a m p l e was N H Q H i n w a t e r a n d N e ^ - 0 H i ° e t h y l a l c o h o l , t h e n t h e f r e e e n e r g y o f t r a n s f e r o f one m o l e o f t h e a m i n o a c i d f r o m w a t e r t o e t h a n o l was g i v e n b y : A G ; = - R T i n N e t O H / N H Q H ( 2 . 3 ) N e g a t i v e v a l u e s o f h y d r o p h o b i c i t y meant t h a t t h e s i d e c h a i n p r e f e r r e d w a t e r t o e t h a n o l a n d w o u l d t e n d t o o c c u r i n t h e o u t e r s h e l l o f t h e p r o t e i n m o l e c u l e . T a n f o r d a l s o p o i n t e d o u t t h a t A G ^ . i s a r o u g h l y a d d i t i v e f u n c t i o n o f m o l e c u l a r s t r u c t u r e . A c c o r d i n g t o t h i s s c a l e , h i s t i d i n e a n d g l y c i n e w e r e l o c a t e d a t t h e h y d r o p h i l i c e n d a n d t y r o s i n e a n d t r y p t o p h a n w e r e l o c a t e d a t t h e h y d r o p h o b i c e n d . A r o m a t i c s i d e c h a i n s w e r e 12 m o r e h y d r o p h o b i c t h a n a l i p h a t i c s i d e c h a i n s . T h i s was d u e t o t h e l a r g e r s i z e o f t h e a r o m a t i c g r o u p s . B u t i f A G ^ . p e r c o n s t i t u e n t a t o m was c o n s i d e r e d , t h e n a l i p h a t i c c h a i n s become m o r e h y d r o p h o b i c . I n t h i s s c a l e no d a t a w e r e p r o v i d e d f o r t h e f i v e a m i n o a c i d s c y s t e i n e , c y s t i n e , h i s t i d i n e , g l u t a m a t e a n d a s p a r t a t e . 2 . 3 . 1 . 2 W o l f e n d e n e t a l . (1981) s c a l e T h e t e n d e n c y o f a d i s s o l v e d compound t o l e a v e w a t e r a n d e n t e r a n e m p t y c a v i t y t h a t n e i t h e r a t t r a c t e d n o r r e p e l l e d s o l u t e s was u s e d t o e s t a b l i s h a h y d r o p h o b i c i t y s c a l e . T h e h y d r a t i o n p o t e n t i a l ( A G ^ ) o f a n a m i n o a c i d was d e f i n e d a s t h e f r e e e n e r g y o f t r a n s f e r o f a n a m i n o a c i d f r o m t h e v a p o u r p h a s e t o n e u t r a l a q u e o u s s o l u t i o n a t pH 7 . 0 . A f f i n i t y o f a compound t o a n a q u e o u s e n v i r o n m e n t was e v a l u a t e d b y d e t e r m i n i n g i t s v a p o u r p r e s s u r e o v e r d i l u t e a q u e o u s s o l u t i o n . A c c o r d i n g t o t h i s s c a l e , t h e s i d e c h a i n o f a r g i n i n e was l o c a t e d a t t h e h y d r o p h i l i c e x t r e m e a n d g l y c i n e was l o c a t e d a t t h e h y d r o p h o b i c e x t r e m e . T r y p t o p h a n a n d t y r o s i n e w e r e i n t h e m i d r a n g e c l o s e r t o t h e h y d r o p h i l i c e n d . 2 . 3 . 2 E m p i r i c a l s c a l e s 2 . 3 . 2 . 1 . S w e e t a n d E i s e n b e r q (1983) s c a l e T h e d e v e l o p m e n t o f t h i s h y d r o p h o b i c i t y s c a l e was b a s e d o n t h e t h e o r y t h a t two a m i n o a c i d s e q u e n c e s f o l d i n g i n t o s i m i l a r t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e s w e r e l i k e l y t o h a v e 13 h i g h l y c o r r e l a t e d h y d r o p h o b i c i t i e s . E a c h a m i n o a c i d was a s s i g n e d w i t h a n u m e r i c a l h y d r o p h o b i c i t y v a l u e t a k e n f r o m t h e s c a l e o f E i s e n b e r g ( 1 9 8 2 ) , i n w h i c h h y d r o p h o b i c i t y was m e a s u r e d a s t h e f r e e e n e r g y o f t r a n s f e r o f a n a m i n o a c i d r e s i d u e f r o m t h e i n t e r i o r t o t h e s u r f a c e o f a h y d r a t e d p r o t e i n . T h e n t h e c o r r e l a t i o n s b e t w e e n a l l p a i r s o f r e s i d u e s i n t h e two s e q u e n c e s w e r e c a l c u l a t e d . A c c o r d i n g t o t h e d i s c o v e r y o f D a y h o f f e t a l . ( 1 9 7 9 ) , t h a t a m i n o a c i d s t h a t s u b s t i t u t e f o r e a c h o t h e r i n r e l a t e d t h r e e d i m e n s i o n a l p r o t e i n s h a d s i m i l a r c h e m i c a l p r o p e r t i e s , S w e e t a n d E i s e n b e r g (1983) d e r i v e d a s e t o f o p t i m u m m a t c h i n g h y d r o p h o b i c i t i e s (OMH) b y c o n s i d e r i n g t h e o b s e r v e d f r e q u e n c y o f a m i n o a c i d r e p l a c e m e n t s among r e l a t e d s t r u c t u r e s . W i t h t h i s s e t o f O M H ' s s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n s h a v e b e e n c a l c u l a t e d f o r s i m i l a r t h r e e d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e s e v e n t h o u g h t h e two s e q u e n c e s c o n t a i n few i d e n t i c a l r e s i d u e s . I n t h i s s c a l e , p h e n y l a l a n i n e a n d t y r o s i n e w e r e l o c a t e d a t t h e h y d r o p h o b i c e x t r e m e a n d h i s t i d i n e a n d g l y c i n e w e r e l o c a t e d a t t h e h y d r o p h i l i c e x t r e m e . 2 . 3 . 2 . 2 R o s e e t a l . (1985b) s c a l e T h i s s c a l e was b a s e d o n t h e c a l c u l a t i o n o f t h e a r e a o f a r e s i d u e b u r i e d u p o n f o l d i n g , when t r a n s f e r r e d f r o m a d e f i n e d s t a n d a r d s t a t e t o a f o l d e d s t a t e . T h i s a r e a was p r o p o t i o n a l t o i t s h y d r o p h o b i c c o n t r i b u t i o n t o t h e c o n f o r m a t i o n a l f r e e e n e r g y A G ° . . . T h e mean a r e a b u r i e d u p o n t r a n s f e r was g i v e n b y : c o n f ^ -a -r A-<A> w h e r e A. i s t h e s o l v e n t a c c e s s i b l e s u r f a c e a r e a o f a r e s i d u e i n t h e s t a n d a r d s t a t e a n d <A> i s t h e a v e r a g e s o l v e n t 14 a c c e s s i b l e a r e a o f a r e s i d u e i n t h e f o l d e d p r o t e i n . T h e r e f o r e t h e mean f r a c t i o n a l a r e a l o s s d e n o t e d b y f was g i v e n b y : f = 1 - (<A>/A ) ( 2 . 4 ) A c c o r d i n g t o t h i s s c a l e t r y p t o p h a n a n d t y r o s i n e w e r e l o c a t e d a t t h e h y d r o p h o b i c e n d a n d a l a n i n e a n d a r g i n i n e w e r e l o c a t e d a t t h e h y d r o p h i l i c e n d . 2 . 3 . 3 E m p i r i c a l a n d m e a s u r e d s c a l e s 2 . 3 . 3 . 1 M a n a v a l a n a n d Ponnaswamy (1978) s c a l e T h e s e r e s e a r c h e r s m e a s u r e d a p a r a m e t e r c a l l e d " b u l k h y d r o p h o b i c i t y " f r o m a n a n a l y s i s o f t h e s u r r o u n d i n g h y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n t o f t h e a m i n o a c i d r e s i d u e s i n t h e p r o t e i n . T h e s u r r o u n d i n g h y d r o p h o b i c i t y (H^) o f a r e s i d u e was d e f i n e d a s t h e sum o f h y d r o p h o b i c i n d i c e s a s s i g n e d t o t h e v a r i o u s r e s i d u e s t h a t a p p e a r w i t h i n a n 8A r a d i u s v o l u m e i n t h e p r o t e i n c r y s t a l a n d i s g i v e n b y : 20 H i = L . . h i . . . ( 2 . 5 ) i = l ' X ' J w h e r e L . . i s t h e t o t a l number o f r e s i d u e s o f t h e i t h t y p e t h a s s o c i a t e d w i t h t h e j r e s i d u e i n a g i v e n p r o t e i n a n d h ^ i s t h t h e h y d r o p h o b i c i n d e x o f t h e i r e s i d u e , c a l c u l a t e d b y c r y s t a l l o g r a p h i c d a t a . T h e a r i t h m a t i c a v e r a g e <H> o f a l l v a l u e s t h a t b e l o n g t o t h e same t y p e o f r e s i d u e i n s e v e r a l 15 p r o t e i n s w e r e c a l c u l a t e d a n d c a l l e d t h e b u l k h y d r o p h o b i c i t y o f t h a t r e s i d u e . 2 . 3 . 4 C o m p a r i s o n o f h y d r o p h o b i c i t y s c a l e s H y d r o p h o b i c i t y v a l u e s o f a m i n o a c i d r e s i d u e s o b t a i n e d f r o m s e v e r a l s c a l e s h a v e b e e n r e p o r t e d b y N a k a i a n d L i - C h a n , ( 1 9 8 7 ) . T h e i r r e s u l t s a r e r e p r o d u c e d i n T a b l e 2 . 1 . S i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s e x i s t among s c a l e s . R e s i d u e s t h a t a r e s t r o n g l y h y d r o p h o b i c i n one s c a l e may a p p e a r t o b e s t r o n g l y h y d r o p h i l i c i n a n o t h e r s c a l e . F o r e x a m p l e , t r y p t o p h a n a n d t y r o s i n e w h i c h seemed t o b e more h y d r o p h o b i c i n N o z a k i T a n f o r d s c a l e a r e m o r e h y d r o p h i l i c i n W o l f e n d e n e t a l . (1981) s c a l e . E v e n t h o u g h b o t h a r e m e a s u r e d s c a l e s , t h e c o r r e l a t i o n 2 . . . c o e f f i c i e n t ( r = - 0 . 0 4 ) seemed t o b e q u i t e l o w ( N a k a i a n d L i -C h a n , 1 9 8 7 ) . B u t W o l f e n d e n e t a l . ' s s c a l e c o r r e l a t e d w e l l w i t h C h o t h i a ' s a n d J a n i n ' s s c a l e s ( J a n i n , 1 9 7 9 ) . C h o t h i a (1976) showed t h a t t h e c o r r e l a t i o n o f h y d r o p h o b i c i t y w i t h t h e r e s i d u e t o t a l s u r f a c e a r e a i s e x c e l l e n t b u t t h e c o r r e l a t i o n w i t h t h e r e s i d u e a r e a b u r i e d u p o n f o l d i n g i s v e r y l o w . S u r p r i s i n g l y , t h i s was a c o m p l e t e c o n t r a d i c t i o n t o t h e f i n d i n g b y R o s e e t a l . ( 1 9 8 5 b ) . T h e y f o u n d a s t r o n g c o r r e l a t i o n b e t w e e n h y d r o p h o b i c i t y a n d t h e s u r f a c e a r e a r e s i d u e s b u r i e d u p o n f o l d i n g . I n t h e m e t h o d o f M a n a v a l a n a n d Ponnaswamy (1978) a l o w h y d r o p h o b i c i t y v a l u e was o b s e r v e d f o r t r y p t o p h a n a n d t y r o s i n e c o m p a r e d t o N o z a k i T a n f o r d s c a l e a n d v a l i n e h a d a h y d r o p h o b i c v a l u e s i m i l a r t o t r y p t o p h a n . B u t i n t h e N o z a k i T a n f o r d s c a l e , T a b l e 2 . 1 ; H y d r o p h o b i c i t y s c a l e v a l u e s o f a m i n o a c i d r e s i d u e s . ( N a k a i a n d L i - C h a n , 1 9 8 7 ) . £> < b" i u7 u (1 t. U. A k V (1) a) (3) (4) (5) Ala 0.87 0.5 4.32 0.52 (1.93 Arg 0.85 — 6.55 0.49 0.98 Asn 0.09 — 6 24 0.42 0.98 Asp 0.6* — 6.IU 0.37 1.01 Cys 1.52 — 1.73 0.83 0.88 Gin 0.00 — 6.13 0.35 1.02 Glu 0.67 — 6.17 0.38 1.02 Gly o . in 0.0 6.09 0.41 1.00 Hi* 0.87 0.5 .V66 0.71) (1.89 tic 3.15 — 2.31 0.79 0.79 l.CU 2.17 1.8 3.93 0.77 0.85 L y 1.64 — 7.92 0.31 1.05 Mcl 1.67 1.3 2.44 0.76 0.84 Phe 2.87 2.5 2.59 0.87 0.78 Pro 2.77 7.19 0.35 1.00 Scr 0.07 - 0 . 3 5.37 0.49 1.02 Thr 0.07 0.4 5.16 0.38 0.99 Trp 3.77 3.4 2.78 0.86 0.83 Tyr 2.67 2.3 3.58 0.64 0.93 Val 1.87 1.5 3.31 0.72 0.81 Note: Reference numbers are in parentheses. • 0.50 and 0.40 (or Cys and l'2 Cy*. respectively (1) Jones- < i 9 W (2) Nozaki and Tanford 0 9 7 0 ,(3) Krlgbaum and Komoriya (I9»9) (4) Wettt and Sherapa ( l o f g ; 3 A tr. *> < c u j* X V (rf 1% < 1 X c u. (6) (7) (8) (9)' (10) (II) - 1.0 -0 .5 12.97 -0 .40 86.6 0.38 0 3 3.0 11.72 -0 .59 162.2 0 01 -0 .7 0.2 11.42 -0.92 103.3 0 12 - 1.2 2.5 10.85 - 1.31 97.8 0.15 2.1 - 1.0 14.63 0.17 132.3 0.45--0.1 0.2 11.76 -0.91 119.2 0.07 -0 .7 2.5 11.89 - 1.22 113 9 0.18 (1.0 0.0 12.43 -0.67 62.9 0.36 I I - 0 .5 12.16 -0.64 155.8 0.17 4.0 - 1.8 15.67 1.25 158.0 0 60 2.0 - 1.8 14.90 1.22 164.1 0.45 - 0 . 9 3.0 11.36 -0 .67 115.5 0.03 1.8 - 1.3 14.39 1.02 172.9 0.40 2.8 -2 .5 14.00 1.92 194.1 0.50 0.4 - 1.4 11.37 -0 .49 92.9 0.18 - 1.2 0.3 11.23 -0 .55 85.6 0.22 -0 .5 -0 .4 11.69 -0.28 106.5 0.23 3.0 -3 .4 13.93 0.50 224.6 0.27 2.1 -2 .3 13.42 1.67 177.7 0.15 i.4 - 1.5 15.71 0.91 141.0 0.54 a  £ c O >. U « = a < X 1 2 -K (12) (13) 04) (15) (16) 0.59 1.8 1.12 -2 .74 0.23 -1 .82 - 4 . 5 -2 .55 - 1.99 -0 .26 -0 .55 - 3 . 5 -0 .83 — -0 .94 - 0.69 - 3 . 5 -0.83 — - 1.13 1.44 2.5 0.59 — 1.78 -0 .83 - 3 . 5 -0 .78 — -0 .57 -0 .83 - 3 . 5 -0.92 - 0.94 -0 .75 0 59 - 0 . 4 1.20 -3.11 -0 .07 I) 02 - 3 2 -0 .93 - 1.91 0.11 1,16 4.5 1.16 - 1.69 1.19 0.87 3.K 1.18 - 1.79 1 03 -2 .39 - 3 . 9 - 0 . 8 0 - 1.15 - 1.05 0.73 1.9 0.55 - 1.87 0 66 0.87 2.8 0.67 - 1.43 0.48 -0 .26 - 1.6 0.54 -2 .54 -0 .76 0.02 - 0 . 8 -0 .05 -3 .07 -0 .67 -0 ,12 - 0 . 7 -0 .02 - 2.94 -0 .36 0.59 - 0 . 9 -0 .19 - I l l 0.90 -0 .40 - 1.3 -0 .23 - 2.03 0.59 1.02 4.2 1.13 o- 2.26 1.24 (5) Meirovitch c l al. fi»«6) (6) Robion and Oiguthorpe o«79) (7) Levitt O076) (8) Manavalan and Ponnujwamy fj978> (9) Sweet and Elienberp, 09»3> (10) Rosee ta l . ( l 9 8 S b ) (11) Chothia 0<>76) (12) Jannln (1979) (13) Ky le and Doolittle 0M») (14) Wolfenden et al. 09»0 (15) Yunjcr and Cramer 09*0 (16) Nishikawa and Ool Ci9So) 17 v a l i n e h a d a v a l u e a l m o s t h a l f t h a t o f t r y p t o p h a n . T h e r e a s o n f o r t h e o b s e r v e d l o w v a l u e s f o r t r y p t o p h a n a n d t y r o s i n e , a s i n d i c a t e d b y M a n a v a l a n a n d Ponnaswamy (1978) was t h a t e v e n i n a a l a r g e n o n - p o l a r s i d e c h a i n , one p o l a r a t o m was s u f f i c i e n t t o c a u s e a l a r g e r e d u c t i o n i n t h e h y d r o p h o b i c e n v i r o n m e n t . S u c h d i s c r e p a n c i e s b e t w e e n s c a l e s a r i s e p r o b a b l y i n p a r t f r o m d i f f e r e n c e s b e t w e e n c o n d i t i o n s c h o s e n f o r d i s t r i b u t i o n e x p e r i m e n t s . U n r e c o g n i z e d s e l f - a s s o c i a t i o n o f a m i n o a c i d s n e a r t h e i r l i m i t s o f s o l u b i l i t y i n o r g a n i c s o l v e n t s may h a v e t e n d e d t o i n t e r f e r e w i t h t h e d e t e r m i n a t i o n o f f r e e e n e r g i e s o f t r a n s f e r ( W o l f e n d e n e t a l . , 1 9 8 1 ) . A c o m p r e h e n s i v e s t u d y b y R o s e e t a l . ( 1 9 8 5 a , 1985b) c o m p a r e d f i f t e e n d i f f e r e n t s c a l e s a n d was s u m m a r i z e d b y N a k a i a n d L i - C h a n ( 1 9 8 7 ) . T h i s i s g i v e n i n T a b l e 2 . 2 . S c a l e s 1-10 h a d r e l a t i v e l y h i g h c o r r e l a t i o n s . S c a l e s 11 -14 made a n o t h e r g r o u p . B u t 15 a n d 16 d i d n o t b e l o n g t o e i t h e r g r o u p n o r d i d t h e y c o r r e l a t e w i t h e a c h o t h e r . T h e r e f o r e i t i s i m p o r t a n t t o f i n d a r e l i a b l e m e t h o d t o m e a s u r e t h e a c t u a l h y d r o p h o b i c i t y . 2 . 5 METHODS O F MEASURING HYDROPHOBICITY Among t h e many m e t h o d s o f m e a s u r i n g h y d r o p h o b i c i t y o n l y t h e h y d r o p h o b i c p r o b e m e t h o d , h y d r o p h o b i c c h r o m a t o g r a p h y , a n d h y d r o p h o b i c p a r t i t i o n i n g a r e d i s c u s s e d i n t h i s s e c t i o n . 2 . 5 . 1 H y d r o p h o b i c p r o b e m e t h o d T h i s i s t h e s i m p l e s t m e t h o d o f m e a s u r i n g p r o t e i n h y d r o p h o b i c i t y . Many d i f f e r e n t h y d r o p h o b i c p r o b e s a r e T a b l e 2.2 C o r r e l a t i o n m a t r i x o f h y d r o p h o b i c i t y s c a l e s f o r a m i n o a c i d r e s i d u e s . ( N a k a i a n d L i - C h a n , 1 9 8 7 ) . Scale T y p e b (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) ( U ) (15) (16) Mean » SD (1) Jones U W ) M / E .53 .66 .68 .83 .70 .63 .75 .72 .41 .35 .47 .34 .47 .40 .60 t .190 (2) Noiak l and Tanford ( io? l ) M .81 .82 .75 .91 .99 .66 .78 .91 .20 .28 .24 .04 .89 .63 .66 i .134 ,(3) Kriftbaum and Komorlya f i9W) E . .89 .87 .78 .74 .86 .78 .61 .79 .81 .79 .63 .15 .04 .67 t .255 (4) Went and Sherapa (iffa) E ^ ^ 3 .88 .72 .85 .80 .78 .71 .74 .71 .49 .35 .15 .70 i .215 (5) Meirovltch et al. fiofio) E .75 .89 .82 .73 .79 .75 .78 .56 .29 .34 .72 J .188 (6) Robson and Osguthorpe Ci07<5> E 74 .83 .84 .80 .65 .64 .64 .48 .40 .21 .70 l .201 (7) Levitt ((9745 M / E ^67 .75 .52 .62 .77 .67 .65 .05 .14 .63 t .240 (8) Manavalan and Ponnuswamy o9F«7 M / E ^82 .58 .86 .76 .71 .25 .23 .82 .70 1 .208 (9) Sweet and Elsenberg fi9Sj") E ^71 .67 .58 .75 .57 .22 .34 .68 t .182 (10) Rosee ta l . fiossrO E .24 .23 .27 .06 .66 .58 .56 1 .249 ( l l ) C h o l h i a 0 4 7 6 ) E ^ 9 1 .96 .86 .06 .00 .58 J .319 (12) Jannln d o » 9 ) E ^ 8 7 .83 .22 .15 .59 i .269 (13) Kyle and Doolill le 00.82) M / E ^ £ 9 .12 .07 .60 t .290 (14) Wolfenden ft al. (19SO M .30 .10 .47 t .283 (15) Yungcr and Cramer (1981) M .43 .32 t .227 (16) Nishlkawa and Ooi (1980) E .29 * .24 1 ' T h e abjolute value! of correlation coefficient are shown, solubility measurement. E: empirical calculation. H CO 19 a v a i l a b l e . T h e m o s t f r e q u e n t l y u s e d p r o b e i s 1 - a n i l i n o n a p h t h a l e n e - 8 - s u l f o n a t e ( A N S ) . T h e m e t h o d i s b a s e d o n t h e f a c t t h a t f l u o r e s c e n t e m i s s i o n o f ANS i s d e p e n d e n t o n i t s e n v i r o n m e n t . F o r e x a m p l e , t h e q u a n t u m y i e l d o f f l u o r e s c e n c e o f ANS e x c e e d s 0 . 7 i n a n o n - p o l a r s o l v e n t , w h i l e i t i s o n l y 0 . 0 0 3 2 i n w a t e r ( N a k a i a n d L i - C h a n , 1 9 8 7 ) . ANS i n s o l u t i o n h a s two d i f f e r e n t c o n f o r m a t i o n s . I n one c a s e t h e p l a n e s o f b e n z e n e a n d n a p h t h a l e n e a r e p e r p e n d i c u l a r . I n t h e o t h e r c a s e t h e two r i n g s a r e n e a r l y c o p l a n a r d u e t o h y d r o g e n b o n d i n g b e t w e e n - N H a n d ~ S 0 3 g r o u p s . T h i s s e c o n d t y p e o f c o n f o r m a t i o n i s more r i g i d a n d f l u o r e s c e n t . A n o t h e r f l u o r e s c e n t p r o b e i s c i s p a r i n a r a t e (CPA) ( S k l a r e t a l . , 1 9 7 7 ) . CPA ( 9 , 1 1 , 1 3 , 1 5 , c i s , t r a n s , t r a n s , c i s - o c t a d e c a t e t r a e n o i c a c i d ) p o s s e s s a n a l i p h a t i c h y d r o c a r b o n c h a i n a n d i s s t r u c t u r a l l y s i m i l a r t o f a t t y a c i d s w h i l e ANS i s c o m p o s e d o f a r o m a t i c r i n g s . T h e r e f o r e , t h e CPA p r o b e c a n b e u s e d t o i n t e r p r e t n a t u r a l l y o c c u r i n g f a t t y a c i d - p r o t e i n a n d l i p i d - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s . A p p l i c a t i o n s o f t h e h y d r o p h o b i c p r o b e m e t h o d i n f o o d c h e m i s t r y h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d b y many w o r k e r s ( T o w n s e n d a n d N a k a i , 1 9 8 3 ; V o u t s i n a s e t a l . , 1 9 8 3 ; L i - C h a n e t a l . , 1984; e t c . ) . 2 . 5 . 2 H y d r o p h o b i c c h r o m a t o g r a p h y I n e a r l i a r s t u d i e s h y d r o p h o b i c i t y o f a s o l u t e i s m e a s u r e d a s t h e p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t o f a s o l u t e i n a n a q u e o u s two p h a s e s y s t e m . T h e two p h a s e s u s e d w e r e o c t a n o l a n d 20 w a t e r a n d t h e p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t (P) o f t h e s o l u t e was d e f i n e d a s : V C w < 2 - 6 > w h e r e C a n d C a r e t h e s o l u t e c o n c e n t r a t i o n a t e q u i l i b r i u m i n s w ^ t h e o r g a n i c a n d w a t e r p h a s e r e s p e c t i v e l y . S i n c e , a t e q u i l i b r i u m , t h e c h e m i c a l p o t e n t i a l o f t h e s o l u t e i s e q u a l i n b o t h p h a s e s , t h e l o g a r i t h m o f t h e p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t ( l o g P o / w ^ ^ s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e f r e e e n e r g y ( A G ) r e q u i r e d t o t r a n s p o r t one m o l e o f s o l u t e f r o m o n e p h a s e t o a n o t h e r . T h i s f r e e e n e r g y o f t r a n s f e r o f t h e s o l u t e c a n b e s p l i t i n t o f r a g m e n t s : l o g P = 2_ a i f i ( 2 . 7 ) w h e r e a^ r e p r e s e n t t h e number o f t i m e s a p a r t i c u l a r f r a g m e n t " i " i s f o u n d i n a g i v e n m o l e c u l e a n d i s t h e h y d r o p h o b i c f r a g m e n t a l c o n s t a n t o f f r a g m e n t 1 1 i " . T h e r e f o r e a m o l e c u l e c a n b e v i s u a l i z e d a s a s e r i e s o f f r a g m e n t s e a c h o f w h i c h c o n t r i b u t e s t o i t s h y d r o p h o b i c c h a r a c t e r . T h e l o g P v a l u e o f a g i v e n s u b s t a n c e c a n b e c a l c u l a t e d u s i n g t h e a b o v e e q u a t i o n a n d f^ v a l u e s d e r i v e d f r o m t h e p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t s i n o c t a n o l / w a t e r . R e k k e r (1977) c a l c u l a t e d t h e l o g P v a l u e s f o r a s e r i e s o f compounds w h i c h a r e now c a l l e d a s R e k k e r f r a g m e n t a l c o n s t a n t s . C l a s s i c a l l y , d e t e r m i n a t i o n o f l o g P h a s b e e n c a r r i e d 21 o u t b y t h e " s h a k e f l a s k " m e t h o d o f . F u j i t a e t a l . ( 1 9 6 4 ) . H o w e v e r t h i s m e t h o d h a s b e e n f o u n d t o b e t i m e c o n s u m i n g a n d e x p e n s i v e . M o r e o v e r , t h e s e n s i t i v i t y o f t h e r e s u l t s t o i m p u r i t i e s o f t h e s a m p l e a d d e d a n o t h e r d r a w b a c k . T h e r e f o r e many a t t e m p t s h a v e b e e n made t o e v a l u a t e l o g P v a l u e s b y means o f c h r o m a t o g r a p h i c t e c h n i q u e s . T h e s e t e c h n i q u e s c a n b e d i v i d e d i n t o t w o c l a s s e s (Gago e t a l . , 1 9 8 7 ) . 1 . O c t a n o l s e p a r a t i o n s y s t e m s , w h e r e T L C p l a t e s o r H P L C p a c k i n g m a t e r i a l s a r e c o v e r e d w i t h o c t a n o l a n d t h e e l u e n t c o n s i s t s o f o c t a n o l s a t u r a t e d b u f f e r o r w a t e r . 2 . R e v e r s e d p h a s e s e p a r a t i o n s y s t e m s , w h e r e o c t a d e c y l s i l i c a i s u s e d a s t h e s t a t i o n a r y p h a s e a n d b i n a r y m i x t u r e s o f w a t e r a n d a n o r g a n i c m o d i f i e r a r e u s e d a s e l u e n t s . H i g h c o r r e l a t i o n s b e t w e e n l o g P Q y w c a l c u l a t e d b y t h e m e t h o d o f R e k k e r (1977) a n d c h r o m a t o g r a p h i c c a p a c i t y f a c t o r l o g k (k = - { t R - t 0 } / t w h e r e t R a n d t Q a r e e l u t i o n t i m e s o f r e t a i n e d a n d u n r e t a i n e d s u b s t a n c e s ) h a v e b e e n r e p o r t e d f o r a s e r i e s o f c o m p o u n d s s u c h a s a l k y l b e n z e n e s a n d a l c o h o l s (Gago e t a l . , 1 9 8 7 ) , a r o m a t i c compounds ( D ' a m b r o i s e a n d H a n a i , 1982) e t c . T h e d i f f e r e n c e b e t w e e n l o g P a n d l o g k , a s r e p o r t e d b y M i n i c k (1987) i s t h a t t h e y d e s c r i b e two d i f f e r e n t e q u i l i b r i a , s t a t i c e q u i l i b r i u m a n d d y n a m i c e q u i l i b r i u m r e s p e c t i v e l y . W i t h t h e d e v e l o p m e n t o f h i g h p r e s s u r e p u m p s , s e n s i t i v e d e t e c t o r s , a n d t h e a t t a c h m e n t o f d i f f e r e n t l e n g t h a l k y l a n d a r y l g r o u p s t o c o l u m n m a t e r i a l , r e v e r s e d p h a s e c h r o m a t o g r a p h y (RPC) b e c a m e m o r e p o p u l a r a n d t h e s h a k e f l a s k m e t h o d was g r a d u a l l y r e p l a c e d b y RPC m e t h o d s . 22 T h e a d d i t i v e n a t u r e o f h y d r o p h o b i c r e t e n t i o n p a r a m e t e r s o f p e p t i d e s a n d p r o t e i n s i n RPC h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d b y 0 ' H a i r a n d N i c e ( 1 9 7 9 ) . T h e y r e p o r t e d t h a t t h e r e t e n t i o n o r d e r o f s m a l l e r c o m p o u n d s w i t h l e s s t h a n f i f t e e n a m i n o a c i d s g e n e r a l l y c o r r e l a t e d w e l l w i t h t h e sum o f R e k k e r f r a g m e n t a l 2 c o n s t a n t s o f t h e i n d i v i d u a l a m i n o a c i d s ( r = 0 . 9 1 9 4 ) . A l s o , t h e e l u t i o n b e h a v i o u r o f p e p t i d e s i n RPC showed g o o d c o r r e l a t i o n w i t h t h e p r e d i c t e d h y d r o p h o b i c i t y v a l u e s c o m p u t e d b y a d d i n g t h e h y d r o p h o b i c i t y o f c o n s t i t u e n t a m i n o a c i d r e s i d u e s . Meek (1980) o b s e r v e d a c o r r e l a t i o n o f 0 . 9 9 7 b e t w e e n p r e d i c t e d a n d o b s e r v e d r e t e n t i o n t i m e s o f p e p t i d e s . A l l t h e s e o b s e r v a t i o n s recommend RPC a s a t o o l f o r h y d r o p h o b i c i t y m e a s u r e m e n t . T o e l u t e s o l u t e s i n R P C , t h e p o l a r i t y o f t h e e l u e n t i s d e c r e a s e d b y i n c r e a s i n g t h e p r o p o t i o n o f m i s c i b l e n o n - p o l a r s o l v e n t i n t h e a q u e o u s e l u e n t . T h e d i s a d v a n t a g e o f t h i s m e t h o d i s t h a t i t c a n d e n a t u r e t h e s o l u t e s . B u t t o e l u t e s o l u t e s w i t h o u t d e n a t u r a t i o n , d e c r e a s i n g s a l t c o n c e n t r a t i o n s may a l s o b e u s e d a n d t h i s t e c h n i q u e was c a l l e d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y ( H I C ) . 2 . 5 . 3 H y d r o p h o b i c p a r t i t i o n i n g A s d e s c r i b e d i n t h e e a r l i e r s e c t i o n , e s t i m a t i o n o f p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t s i s a u s e f u l t e c h n i q u e f o r d e t e r m i n a t i o n o f h y d r o p h o b i c i t y o f p r o t e i n s . H o w e v e r , t h e u s e o f w a t e r i m m i s c i b l e o r g a n i c s o l v e n t s may c a u s e a p r o b l e m s i n c e m o s t p r o t e i n s do n o t d i s s o l v e i n o r g a n i c s o l v e n t s . T h e r e f o r e S h a n b h a g a n d A x e l s s o n (1975) u s e d ' a two p h a s e s y s t e m 23 c o n t a i n i n g a d e x t r a n r i c h l o w e r p h a s e a n d p o l y e t h y l e n e g l y c o l (PEG) r i c h u p p e r p h a s e f o r t h e p a r t i t i o n i n g o f p r o t e i n s . T h e p a r t i t i o n i n g c o e f f i c i e n t o f a p r o t e i n i n t h e s y s t e m was d e f i n e d a s : K = C u / C 1 ( 2 . 8 ) w h e r e C u a n d w e r e t h e e q u i l i b r i u m c o n c e n t r a t i o n s o f p r o t e i n i n t h e u p p e r a n d l o w e r p h a s e s r e s p e c t i v e l y . T h e l o g a r i t h m o f t h e p a r t i t i o n i n g c o e f f i c i e n t l o g k was d e f i n e d a s t h e f r e e e n e r g y r e q u i r e d t o t r a n s p o r t one m o l e o f s o l u t e f r o m t h e d e x t r a n r i c h l o w e r p h a s e t o t h e P E G r i c h u p p e r p h a s e . T h i s l o g k c o u l d b e d i v i d e d i n t o two f a c t o r s , l o g k Q a n d l o g k u s i n g t h e r e l a t i o n s h i p : l o g k = l o g k Q + l o g k £ l ( 2 . 9 ) w h e r e , l o g k Q was a m e a s u r e o f r e l a t i v e s o l v a t i o n o f a s u b s t a n c e i n t h e two p h a s e s a n d may a l s o i n c l u d e some s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s w i t h some c o m p o n e n t s i n t h e s y s t e m . L o g k ^ d e p e n d s o n t h e n e t c h a r g e (Z) o f t h e p a r t i t i o n e d s u b s t a n c e a n d o n t h e d i f f e r e n c e i n e l e c t r i c a l p o t e n t i a l (qs) b e t w e e n t h e p h a s e s . T h e l a t t e r w o u l d a r i s e o n l y when t h e s y s t e m c o n t a i n e d e l e c t r o l y t e s o r when t h e p o l y m e r s t h e m s e l v e s c a r r y i o n i z a b l e g r o u p s . T h e r e f o r e l o g k ^ = f ( Z , i £ ) a n d t h i s became z e r o when a s u b s t a n c e was p a r t i t i o n e d a t i t s p i o r when t h e s a l t s i n c l u d e d i n t h e s y s t e m d i d n o t i n c r e a s e i n t e r f a c i a l t e n s i o n ( S h a n b h a g 24 a n d A x e l s s o n , 1 9 7 5 ) . A n o t h e r way o f e l i m i n a t i n g t h i s c h a r g e f a c t o r was b y u s i n g t h e same c o n c e n t r a t i o n o f p o l y m e r s b u t w i t h o n l y o n e o f t h e s y s t e m s c o n t a i n i n g a p o l y m e r - b o u n d , u n c h a r g e d l i g a n d . T h u s t h e m e a s u r e o f h y d r o p h o b i c i t y A l o g k was c o m p u t e d a s : A l o g k = l o g k" - l o g k ' = l o g ( C / C ^ ) " - ( l o g ( C y c ^ ) ' ( 2 . 1 0 ) w h e r e k" was t h e p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t i n a s y s t e m c o n t a i n i n g p o l y m e r b o u n d l i g a n d a n d k ' was t h e p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t i n t h e same s y s t e m w i t h o u t t h e l i g a n d . L o g k Q i n e q u a t i o n ( 2 . 9 ) i s a m e a s u r e o f a t l e a s t two p r o c e s s e s . B o t h t h e h y d r o p h i l i c a n d h y d r o p h o b i c p o r t i o n s o f t h e p r o t e i n c o n t r i b u t e t o l o g k Q . T h u s A l o g k w o u l d b e n e g a t i v e when t h e h y d r o p h i l i c p a r t d o m i n a t e s , z e r o when two e f f e c t s a r e e q u a l a n d p o s i t i v e when t h e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n d o m i n a t e s . 2 . 6 COMPARISON OF METHODS OF HYDROPHOBICITY MEASUREMENT Among t h e v a r i o u s m e t h o d s d i s c u s s e d a b o v e , t h e ANS a n d CPA h y d r o p h o b i c p r o b e m e t h o d s a r e t h e m o s t p o p u l a r a n d w i d e l y u s e d . T h e y a r e l e s s t i m e c o n s u m i n g a n d h a v e a l o n g h i s t o r y o f u t i l i z a t i o n , m a k i n g s u c h r e s u l t s e a s y t o c o m p a r e w i t h o t h e r r e s u l t s . T h e CPA p r o b e may h a v e a d v a n t a g e s o v e r t h e ANS m e t h o d d u e t o i t s s i m i l a r i t y t o n a t u r a l l y o c c u r i n g f a t t y a c i d s . A s ANS i s a n a r o m a t i c compound a n d CPA i s a n a l i p h a t i c compound 25 i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t ANS m e a s u r e m e n t s r e p r e s e n t a r o m a t i c h y d r o p h o b i c i t y a n d CPA m e a s u r e m e n t s r e p r e s e n t a l i p h a t i c h y d r o p h o b i c i t y . E v e n t h o u g h t h e s e two m e t h o d s d e p e n d u p o n t h e same p r i n c i p l e , t h e y do n o t t y p i c a l l y y i e l d c o m p a r a b l e o r r e p r o d u c i b l e r e s u l t s . H y d r o c a r b o n p a r t i t i o n i n g m e t h o d s a r e t e d i o u s a n d some p r o t e i n s a r e i n s o l u b l e i n t h e n o n - p o l a r p h a s e a n d t h e r e f o r e f l o a t a t t h e i n t e r f a c e w i t h o u t a t t a i n i n g e q u i l i b r i u m ( N a k a i a n d L i - C h a n , 1 9 8 7 ) . T h e r e f o r e s u c h m e t h o d s a r e o f l i t t l e v a l u e i n e v a l u a t i o n o f f o o d p r o t e i n s . H y d r o p h o b i c c h r o m a t o g r a p h y m e t h o d s a r e s a i d t o b e r e l a t e d t o t h e s u r f a c e h y d r o p h o b i c i t y o f s o l u t e s , a s t h e s u r f a c e o f t h e s o l u t e i s d i r e c t l y i n c o n t a c t w i t h t h e c h r o m a t o g r a p h i c s t a t i o n a r y p h a s e ( M o l n a r a n d H o r v a t h , 1 9 7 7 ) . T h e i r m a j o r d i s a d v a n t a g e i s t h e p o t e n t i a l f o r d e n a t u r a t i o n o f p r o t e i n s . E v e n t h o u g h H I C i s m i l d e r t h a n R P C , t h e r e i s s t i l l no g u a r a n t e e o f m e a s u r i n g h y d r o p h o b i c i t y o f n a t i v e p r o t e i n s b y t h i s m e t h o d . T h e n e e d t o h a v e s p e c i a l e q u i p m e n t a n d e x p e r i m e n t a l s k i l l s i s a a n o t h e r d i s a d v a n t a g e o f t h i s m e t h o d ( N a k a i a n d L i - C h a n , 1 9 8 7 ) . V a r i o u s m e t h o d s o f m e a s u r i n g h y d r o p h o b i c i t y a n d t h e c o r r e l a t i o n s b e t w e e n t h e m h a v e b e e n d i s c u s s e d b y N a k a i a n d L i -C h a n ( 1 9 8 7 ) . No m e t h o d i s e n t i r e l y a d e q u a t e a n d no g e n e r a l l y a c c e p t e d d e f i n i t i o n o f p r o t e i n h y d r o p h o b i c i t y e x i s t s a t p r e s e n t . 26 2 . 7 HYDROPHOBIC I N T E R A C T I O N CHROMATOGRAPHY (HIC) H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y was i n t r o d u c e d i n 1957 u n d e r t h e name o f s a l t i n g o u t c h r o m a t o g r a p h y a s a t e c h n i q u e f o r s e p a r a t i n g s u b s t a n c e s a c c o r d i n g t o t h e i r h y d r o p h o b i c i t y ( K a t o , 1 9 8 7 ) . C o n v e n t i o n a l H I C h a s b e e n c a r r i e d o u t m a i n l y o n u n c h a r g e d a l k y l a n d a r y l d e r i v a t i v e s o f a g a r o s e ( H j e r t e n e t a l . , 1 9 7 4 ) . A s t h i s t y p e o f c o l u m n m a t e r i a l c a n n o t w i t h s t a n d h i g h p r e s s u r e s , u n t i l t h e d e v e l o p m e n t o f T S K - p h e n y l -5PW c o l u m n , H I C h a d t o b e p e r f o r m e d a t l o w p r e s s u r e s ( K a t o e t a l . , 1 9 8 3 ) . T S K - p h e n y l - 5 P W c o l u m n s t a t i o n a r y p h a s e s a r e p a c k e d o w i t h l O u (1000A) p o r o u s h y d r o x y l a t e d p o l y e t h e r s u p p o r t s w i t h a l o w d e n s i t y o f c o v a l e n t l y b o u n d s u r f a c e p h e n y l g r o u p s . C o n c e p t u a l l y H I C i s s i m i l a r t o R P C . One m a i n d i f f e r e n c e i s t h a t RPC s t a t i o n a r y p h a s e s h a v e more h y d r o p h o b i c g r o u p s t h a n H I C s t a t i o n a r y p h a s e s . T h u s t h e n a t i v e s t r u c t u r e o f p r o t e i n s i s more l i k e l y t o b e m a i n t a i n e d i n H I C t h a n RPC ( G o h e e n a n d E n g e l h o r n , 1 9 8 4 ) . 2 . 7 . 1 S a l t e f f e c t s o n H I C A c h a r a c t e r i s t i c f e a t u r e o f H I C i s t h a t r e t e n t i o n i n c r e a s e s w i t h t h e s a l t c o n c e n t r a t i o n i n t h e e l u e n t d u e t o t h e e n h a n c e m e n t o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e p r o t e i n a n d t h e n o n - p o l a r s t a t i o n a r y p h a s e s . When d i f f e r e n t s a l t s a r e u s e d i n t h e e l u e n t , r e t e n t i o n o f p r o t e i n s p a r a l l e l t h e H o f m e i s t e r s e r i e s ( M e l a n d e r a n d H o r v a t h , 1 9 7 7 ) . T h i s r e t e n t i o n e n h a n c i n g e f f e c t o f n e u t r a l s a l t s h a s b e e n shown t o r e p r e s e n t t h e e f f e c t o f s a l t i n i n c r e a s i n g t h e s u r f a c e t e n s i o n o f 27 a q u e o u s s o l u t i o n ( M e l a n d e r a n d H o r v a t h , 1 9 7 7 ) . S t r u c t u r e f o r m i n g s a l t s e n h a n c e h y d r o p h o b i c b o n d i n g t h r o u g h t h e s a l t i n g o u t e f f e c t ( H o f s t e e , 1 9 7 5 ) . T h e r e f o r e , t h e p r i n c i p a l p a r a m e t e r s t h a t d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f s a l t o n t h e r e t e n t i o n t i m e o f s o l u t e s a r e s a l t m o l a l i t y a n d m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t ( M e l a n d e r a n d H o r v a t h , 1 9 7 7 ; M e l a n d e r e t a l . , 1984; M e l a n d e r e t a l . , 1 9 8 9 ) . A s h a s b e e n d i s c u s s e d e a r l i e r i n t h i s c h a p t e r , t h e r e a r e t w o s c h o o l s o f t h o u g h t c o n c e r n i n g t h e h y d r o p h o b i c e f f e c t o f s o l u t e s . F r o m t h e s e two a p p r o a c h e s , a v a r i a t i o n o f t h e s o l v e n t e f f e c t a p p r o a c h c a l l e d t h e S o l v o p h o b i c t h e o r y h a s b e e n a p p l i e d t o t h e s a l t i n g o u t o f p r o t e i n s i n H I C a n d RPC b y M e l a n d e r a n d H o r v a t h a n d t h e i r c o - w o r k e r s a t Y a l e u n i v e r s i t y . T h e y d e v e l o p e d a s i m p l e t h e o r y t o d e s c r i b e t h e e f f e c t o f s a l t s o n b o t h e l e c t r o s t a t i c a n d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s i n H I C . o I n t h i s t h e o r y , t h e f r e e e n e r g y c h a n g e ( A G ) a s s o c i a t e d w i t h a t r a n s f e r o f a m o l e c u l e f r o m a h y p o t h e t i c a l g a s p h a s e i n t o s o l u t i o n i s g i v e n b y : A G = A G c a v + A G e s + A G v d w + RT l n ( R T / P V ) ( 2 . l l ) w h e r e ^ G C a v ^ s ^ e ^ r e e e n e r < ? y c h a n g e f o r f o r m a t i o n o f a c a v i t y i n t h e s o l v e n t , A G i s t h e f r e e e n e r g y a s s o c i a t e d w i t h t h e e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e s o l u t e a n d t h e s o l v e n t , A G y ( j w i s t h e f r e e e n e r g y c h a n g e d u e t o v a n d e r W a a l s i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e s o l u t e a n d s o l v e n t , R i s t h e u n i v e r s a l g a s c o n s t a n t , T i s t h e a b s o l u t e t e m p e r a t u r e , P i s t h e 28 p r e s s u r e , a n d V i s t h e mean m o l a r v o l u m e o f t h e s o l v e n t . A p p l i c a t i o n o f a b o v e r e l a t i o n s h i p t o H I C g i v e s t h e f o l l o w i n g e q u a t i o n f o r t h e i s o c r a t i c r e t e n t i o n f a c t o r k o f a s o l u t e : i n k - - 1 / R T ( A G C A Y + A G E S + A G V ( J W + A G a s s o c + A G r e d > + l n ( R T / P V ) + * ( 2 . 1 2 ) w h e r e A G i s t h e f r e e e n e r g y c h a n g e f o r l i g a t e - e l u a t e a s s o c a s s o c i a t i o n i n t h e a b s e n c e o f s u r r o u n d i n g s o l v e n t , ^ G r e ( j i s t h e r e d u c t i o n o f f r e e e n e r g y d u e t o s o l v e n t - l i g a t e a n d s o l v e n t - e l u a t e i n t e r a c t i o n a n d i s a c o n s t a n t r e l a t e d t o t h e c o n c e n t r a t i o n o f a c c e s s i b l e l i g a t e s i n t h e c o l u m n . A s o n l y t h e s a l t c o n c e n t r a t i o n i n t h e a q u e o u s s o l v e n t c h a n g e s , a n d t h e r e a r e no s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s s e t w e e n t h e s o l u t e a n d s a l t s , t h e e n e r g e t i c s o f t h e t r a n s f e r p r o c e s s i s a s s u m e d t o b e o n l y a f f e c t e d b y t h e c h a n g e s i n A G a n d A G p a r a m e t e r s ( M e l a n d e r CSV 6S a n d H o r v a t h , 1 9 7 7 ) . T h e r e f o r e t h e a b o v e e q u a t i o n r e d u c e s t o , I n k = - 1 / R T ( A G + A G ) + c o n s ( 2 . 1 3 ) ' v c a v e s ' v ' T h i s e q u a t i o n c a n b e f u r t h e r s i m p l i f i e d i f one c o n s i d e r s . I n ( k / k Q ) i n s t e a d o f I n k w h e r e k Q i s t h e r e t e n t i o n f a c t o r a t z e r o s a l t c o n c e n t r a t i o n . T h e e n e r g y o f c a v i t y f o r m a t i o n i n t h e m o b i l e p h a s e i s r e l a t e d t o t h e s u r f a c e t e n s i o n (#) a n d s u r f a c e a r e a o f t h e m o l e c u l e (A ) a n d i s g i v e n b y : A G c a v = [ N A s + 4 . 8 N 1 / 3 ( K e - l ) V 2 / 3 ] ( 2 . 1 4 ) e w h e r e K i s a c o n s t a n t w h i c h c o r r e c t s f o r t h e c u r v a t u r e o f t h e c a v i t y . N i s t h e A v o g a d r o ' s n u m b e r . T h e s u r f a c e t e n s i o n o f a q u e o u s s a l t s o l u t i o n s i s a f u n c t i o n o f m o l a l s a l t c o n c e n t r a t i o n , 8 = IS + dm (2 .15) w h e r e 6 i s t h e m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t o f t h e s a l t , <j° i s t h e s u r f a c e t e n s i o n o f t h e p u r e w a t e r , a n d m i s t h e s a l t c o n c e n t r a t i o n . When e q u a t i o n s ( 2 . 1 4 ) a n d ( 2 . 1 5 ) a r e c o m b i n e d , A G c a v = [ N A s + 4 - 8 n V 3 ( K e - l ) V 2 / 3 ] g ° + [ N A g + 4 . 8 N 1 / 3 ( K e - l ) V 2 / 3 ] 6m ( 2 . 1 6 ) T h u s o v e r a l l e n e r g y o f c a v i t y f o r m a t i o n w i l l b e , A G c a v = ~ t N A A s + 4 . 8 N 1 / 3 ( K e - l ) V 2 / 3 ] 6m + c o n s t a n t ( 2 . 1 7 ) w h e r e , A A g i s t h e d i f f e r e n c e i n s u r f a c e a r e a o f l i g a t e a n d p r o t e i n e x p o s e d t o t h e m o b i l e p h a s e . T h e r e a r e two t h e o r i e s t o e x p l a i n t h e e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s . 1. A t l o w i o n i c s t r e n g t h t h e p r o t e i n m o l e c u l e i s u s u a l l y a s s u m e d t o b e a s i m p l e i o n a n d i t s e l e c t r o s t a t i c f r e e 30 e n e r g y i s c a l c u l a t e d f r o m D e b y e - H u c k e l t h e o r y . 2 . A t h i g h i o n i c s t r e n g t h a c c o r d i n g t o t h e K i r k w o o d s t h e o r y , t h e a v e r a g e d i s t a n c e b e t w e e n t h e c h a r g e d i o n s become s m a l l e r a n d s m a l l e r a n d t h e c o n c o m i t a n t i o n i c s h i e l d i n g makes t h e c h a r g e d m a c r o m o l e c u l e b e h a v e a s a n e u t r a l d i p o l e . T h e r e f o r e , t o e x p l a i n A G e s o v e r a w i d e r a n g e o f s a l t c o n c e n t r a t i o n s b o t h t h e o r i e s h a v e t o b e c o n s i d e r e d a n d t h e f r e e e n e r g y o f e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n i s g i v e n b y : A G e s = A - [ B ( m 1 / 2 ) ] / [ l + C ( m 1 / 2 ) ] - Dpm . . ( 2 . 1 8 ) w h e r e A , B , C , a n d D a r e c o n s t a n t s a n d p i s t h e d i p o l e moment o f t h e p r o t e i n . T h e f i r s t two t e r m s o f t h e a b o v e e q u a t i o n comes f r o m t h e D e b y e - H u c k l e t h e o r y a n d t h e l a s t t e r m comes f r o m t h e K i r k w o o d s t h e o r y . When p r o t e i n h a s no n e t c h a r g e ( i . e a t i t s p i ) t h e f i r s t two t e r m s i n t h e e q u a t i o n become n e g l i g i b l e a n d t h e A G i s e x p e c t e d t o b e p r o p o t i o n a l t o t h e s a l t c o n c e n t r a t i o n . Away f r o m p i , t h e r e l a t i o n s h i p i s n o n - l i n e a r a t l o w i o n i c s t r e n g t h . When e q u a t i o n s ( 2 . 1 3 ) , ( 2 . 1 7 ) , a n d ( 2 . 1 8 ) a r e c o m b i n e d : I n k / k Q = - ( 1 / R T ) { [ B m 1 / / 2 ] / [ l + C m 1 / ' 2 ] + Dpm) + ( l / R T ) {[NA$ + 4 . 8 N 1 / 3 ( K e - l ) V 2 / / 3 ] 6 m } ( 2 . 1 9 ) I n t h i s e q u a t i o n , t h e t o t a l s u r f a c e a r e a o f t h e p r o t e i n (A ) h a s b e e n r e p l a c e d b y t h e n o n p o l a r s u r f a c e a r e a o f t h e 31 p r o t e i n m o l e c u l e ( $ ) . I f , A . = D u / R T a n d -0- = [ N A $ + 4 . 8 N 1 / 3 ( K S - l ) V 2 / 3 ] / R T T h e n e q u a t i o n ( 2 . 1 9 ) w i l l b e , I n k / k Q = -{ ( B m 1 / / 2 ) / R T ( l + C m 1 / / 2 ) } - A m + .Oom ( 2 . 2 0 ) A c c o r d i n g t o t h e a b o v e e q u a t i o n , r e t e n t i o n f a c t o r s f i r s t d e c r e a s e w i t h i n c r e a s i n g s a l t c o n c e n t r a t i o n a s t h e e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s ( 1 s t a n d 2 n d t e r m s ) a r e n e g a t i v e . B u t f u r t h e r i n c r e a s e i n s a l t c o n c e n t r a t i o n w i l l i n c r e a s e t h e r e t e n t i o n f a c t o r s a n d t h e d e p e n d e n c e o f l o g k v s m become l i n e a r a t s u f f i c i e n t l y h i g h s a l t c o n c e n t r a t i o n s . U n d e r s u c h c o n d i t i o n s , t h e l i m i t i n g s l o p e o f l o g k v s m p l o t s i s g i v e n b y (r26-A) w h i c h i s t e r m e d the - h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r . A c c o r d i n g t o t h e a b o v e e q u a t i o n s l o p e i s d e p e n d e n t o n t h e h y d r o p h o b i c c o n t a c t a r e a , t h e m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t o f t h e s a l t a n d a n e l e c t r o s t a t i c p a r a m e t e r r e l a t e d t o t h e d i p o l e moment o f t h e m o l e c u l e . I n h y d r o p h o b i c c h r o m a t o g r a p h y .A. i s e x p e c t e d t o b e s m a l l e r t h a n fi<S. T h e r e f o r e t h e m a g n i t u d e o f s l o p e i s m a i n l y d e p e n d e n t o n t h e n o n - p o l a r c o n t a c t a r e a b e t w e e n t h e p r o t e i n a n d t h e l i g a n d . R e c e n t l y t h i s e q u a t i o n a n d t h e t h e o r y o f M a n n i n g ' s c o u n t e r i o n c o n d e n s a t i o n w e r e c o m b i n e d t o d e v e l o p a new m o d e l t o e v a l u a t e h y d r o p h o b i c a n d e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s i n i o n e x c h a n g e , m e t a l c h e l a t e , a n d b i o - p o l y m e r c h r o m a t o g r a p h y ( M e l a n d e r e t a l . , 1 9 8 9 ; E l - R a s s i a n d H o r v a t h , 1 9 8 6 a ) . A n e q u a t i o n o f t h e f o l l o w i n g f o r m h a s b e e n p r o p o s e d : l o g k = A + B l o g m + C m ( 2 . 2 1 ) w h e r e k i s t h e c a p a c i t y f a c t o r , m i s t h e s a l t m o l a l i t y , a n d " B " a n d " C " a r e t h e e l e c t r o s t a t i c a n d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s r e s p e c t i v e l y . " A " i s a c o n s t a n t e n c o m p a s s i n g a l l c h a r a c t e r i s t i c s y s t e m p a r a m e t e r s . A c c o r d i n g t o t h e m o d e l , t h e m a g n i t u d e o f t h e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r C i s d e t e r m i n e d b y t h e h y d r o p h o b i c c o n t a c t a r e a b e t w e e n t h e p r o t e i n a n d t h e s t a t i o n a r y p h a s e s u r f a c e a n d t h e p r o p e r t i e s o f t h e s a l t a s m e a s u r e d b y i t s m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t . A t s u f f i c i e n t l y h i g h s a l t c o n c e n t r a t i o n s , t h e e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s w i l l a p p r o a c h a c o n s t a n t a n d t h e r e l a t i o n s h i p i s g o v e r n e d b y t h e l o g k v s m l i n e a r r e l a t i o n s h i p o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n . B o n t h e o t h e r h a n d i s t h e s l o p e o f t h e l o g k v s l o g m r e l a t i o n s h i p a t l o w s a l t c o n c e n t r a t i o n s a n d i s a m e a s u r e o f t h e e f f e c t o f s a l t o n t h e m a g n i t u d e o f t h e e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n . T r a d i t i o n a l l y , t h e m e a s u r e m e n t o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s u s i n g c h r o m a t o g r a p h y h a v e b e e n c a r r i e d o u t u n d e r f i x e d v a l u e s o f s a l t c o n c e n t r a t i o n s o r b y g r a d i e n t e l u t i o n s . B u t t h e s e m o d e l s ( 2 . 2 0 , 2 . 2 1 ) , h a v e shown t h a t t h e s a l t c o n c e n t r a t i o n h a s a s i g n i f i c a n t i n f l u e n c e o n t h e m e a s u r e d v a l u e s o f c a p a c i t y f a c t o r s . A l s o , t o o b t a i n a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e s e c h a n g e s , i s o c r a t i c e l u t i o n may b e more s u i t a b l e t h a n g r a d i e n t e l u t i o n . T h e r e f o r e t h e a b o v e c h r o m a t o g r a p h i c m o d e l s , w h i c h t a k e s i n t o a c c o u n t t h e e f f e c t o f 33 s a l t c o n c e n t r a t i o n o v e r a w i d e r a n g e , i s m o r e a p p r o p r i a t e a s a m e a s u r e o f h y d r o p h o b i c i t y o v e r t h e s i m p l e e s t i m a t i o n o f r e t e n t i o n t i m e i n a s i n g l e c o n c e n t r a t i o n o f s a l t o r s a l t g r a d i e n t s . M o d e l ( 2 . 2 0 ) h a s b e e n u s e d b y E l - R a s s i a n d H o r v a t h (1986a) i n M e t a l C h e l a t e I n t e r a c t i o n C h r o m a t o g r a p h y ( M C I C ) , D u r a n c e a n d N a k a i (1987) i n H I C , a n d M e l a n d e r e t a l . (1989) i n b i o - p o l y m e r c h r o m a t o g r a p h y . 2 . 8 P R O T E I N - P R O T E I N I N T E R A C T I O N S K l o t z (1953) c l a s s i f i e d t h e i n t e r a c t i o n s o f p r o t e i n s i n t o two g r o u p s , 1 . T h o s e i n w h i c h e l e c t r o s t a t i c f o r c e s a r e o f m a j o r i m p o r t a n c e 2 . T h o s e i n w h i c h s p e c i f i c s t r u c t u r a l f a c t o r s p l a y a m a j o r r o l e . H o w e v e r , F r i e d e n a n d N i c h o l (1981) c a t e g o r i z e d p r o t e i n -p r o t e i n i n t e r a c t i o n s i n t o t h r e e g r o u p s s u c h a s h o m o g e n e o u s p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s , h e t e r o g e n e o u s p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s , a n d o t h e r s ( e g . i s o m e r i z a t i o n s , a c c e p t o r - l i g a n d b i n d i n g , e t c . ) . T h e f o r c e s i n v o l v e d i n t h e s e i n t e r a c t i o n s c a n b e d i - s u l f i d e , i n t e r m o l e c u l a r c h a r g e - c h a r g e i n t e r a c t i o n s ( s a l t b r i d g e s ) , i n t e r m o l e c u l a r H - b o n d i n g , h y d r o p h o b i c b o n d i n g , o r e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s (Von H i p p e l , 1 9 7 4 ) . T h e s e t y p e s o f i n t e r a c t i o n s a r e i m p o r t a n t i n d e t e r m i n i n g t h e s t r u c t u r e a n d t e x t u r e o f f o o d p r o d u c t s . 3 4 2 . 8 . 1 A f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y A s s o c i a t i o n p r o c e s s e s u n d o u b t e d l y p l a y a m o s t i m p o r t a n t r o l e i n b i o - c h e m i c a l p r o c e s s e s . M e t h o d s i n w h i c h l i g a n d -p r o t e i n i n t e r a c t i o n s a r e m e a s u r e d b y d i r e c t a n a l y s i s , s u c h a s u l t r a f i l t r a t i o n , g e l f i l t r a t i o n , e q u i l i b r i u m d i a l y s i s , e t c . h a v e now b e e n s u p p l e m e n t e d b y a new t e c h n i q u e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s b a s e d o n a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y (Dunn a n d C h a i k e n , 1 9 7 4 ; L a r s s o n e t a l . , 1 9 8 1 ; F a s s i n a a n d C h a i k e n , 1 9 8 7 ) . T h i s t e c h n i q u e was r a p i d l y d e v e l o p e d d u r i n g t h e 1 9 7 0 ' s b e c a u s e o f i t s s p e c t a c u l a r s u c c e s s a s a p u r i f i c a t i o n m e t h o d f o r p r o t e i n s . A f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y h a s o t h e r i m p o r t a n t a n d e x c i t i n g u s e s a l s o . I m m o b i l i z e d l i g a n d s , s u b s t r a t e s , o r e n z y m e s c a n b e u s e d t o s t u d y t h e n a t u r e o f b i o l o g i c a l i n t e r a c t i o n s , t h e m e c h a n i s m a n d k i n e t i c c o n s t a n t s o f enzyme i n t e r a c t i o n s , s u b u n i t i n t e r a c t i o n s o f o l i g o m e r i c p r o t e i n s , a n d i m m u n o l o g i c a l r e s p o n s e s e t c . ( P a r i k h a n d C u a t r i c a s a s , 1985) . I t a l s o h a s p o t e n t i a l f o r s t u d y i n g t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n m o b i l e a n d i m m o b i l i z e d b i o m o l e c u l e s (Dunn a n d C h a i k e n , 1 9 7 4 . , K a s a i a n d I s h i i , 1 9 7 5 ) . T h e s e p a r a t i o n p r o c e s s e s o f a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y c a n b e v a r i e d a c c o r d i n g t o c i r c u m s t a n c e s , b u t a r e u s u a l l y c h a r a c t e r i z e d b y t h r e e s t e p s : s a m p l e a d s o r p t i o n , w a s h i n g o f t h e c o l u m n , a n d f i n a l l y e l u t i o n o f t h e d e s i r e d c o m p o u n d . A n u n d e r l y i n g a s s u m p t i o n o f a f f i n i t y s e p a r a t i o n i s t h a t t h e m o b i l e m o l e c u l e b i n d s t o a n a f f i n i t y m a t r i x t h r o u g h t h e c o m p l e m e n t a r y b i n d i n g s u r f a c e s o f t h e i m m o b i l i z e d m o l e c u l e , 35 b u t n o t t o n o n - b i o s p e c i f i c m a t r i x s i t e s . G i v e n s u c h b i o -s p e c i f i c a d s o r p t i o n , a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h i c e l u t i o n b e h a v i o u r o f t h e m o b i l e f o r m c a n b e e x p e c t e d t o b e a d i r e c t m e a s u r e o f q u a n t i t a t i v e i n t e r a c t i o n p r o p e r t i e s o f m o b i l e a n d i m m o b i l i z e d i n t e r a c t a n t s i n c l u d i n g e q u i l i b r i u m b i n d i n g c o n s t a n t s , a n d i n m o r e r e s t r i c t e d c i r c u m s t a n c e s , r a t e c o n s t a n t s f o r a s s o c i a t i o n s a n d d i s s o c i a t i o n s ( F a s s i n a a n d C h a i k e n , 1 9 8 7 ) . S e v e r a l r e v i e w s h a v e a p p e a r e d o n a n a l y t i c a l a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y ( C h a i k e n , 1 9 7 9 , 1 9 8 6 ; K a s a i e t a l . , 1 9 8 6 ) . T h e m o s t commonly u s e d m e t h o d o f q u a n t i t a t i v e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y i s b a s e d o n t h e e l u t i o n o f a b i o l o g i c a l m a c r o m o l e c u l a r s u b s t a n c e f r o m a n a f f i n i t y m a t r i x w i t h s o l u b l e m a c r o m o l e c u l a r s o l u t i o n s o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s (Dunn a n d C h a i k e n , 1 9 7 4 ) . T h e e l u t i o n v o l u m e o f a m a c r o m o l e c u l a r s u b s t a n c e i s d i r e c t l y d e p e n d e n t o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e a f f i n i t y l i g a n d b o u n d t o a s o l i d m a t r i x , i f t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e s o l u b l e a f f i n i t y l i g a n d i s c o n s t a n t . T h e s e d e p e n d e n c e s c a n b e e x p r e s s e d b y t h e f o l l o w i n g e q u a t i o n s (Dunn a n d C h a i k e n , 1 9 7 4 ) : P + M »- MP P P + M =5=2=: MP + + L L I 1 L P L P w h e r e P i s t h e m o b i l e m a c r o m o l e c u l e , M i s t h e m a t r i x i m m o b i l i z e d i n t e r a c t a n t , a n d L i s t h e s o l u b l e i n t e r a c t a n t . O v e r b a r s r e p r e s e n t s p e c i e s w i t h i n t h e g e l m a t r i x . A s shown i n t h e a b o v e f i g u r e M P , L P a n d L P a r e t h e p o s s i b l e b i n a r y 36 c o m p l e x e s i n t h e s y s t e m a n d t h e i r d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s a r e g i v e n b y : K L p = [ L ] [ P ] / [ L P ] ( 2 . 2 2 ) = [ L ] [ P ] / [ L P ] ( 2 . 2 3 ) K ^ p = [M] [ P ] / [MP] ( 2 . 2 4 ) F o r l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( F r e e m a n , 1 9 7 2 ) , V = V + D [ V ] (2 . 25 ) m L s J v ' w h e r e V i s t h e v o l u m e r e q u i r e d t o h a l f e l u t e t h e p r o t e i n , V m i s t h e m o b i l e p h a s e v o l u m e ( i n s i d e g e l ) a n d V g i s t h e s t a t i o n a r y p h a s e v o l u m e ( i n s i d e g e l ) a n d D i s t h e d i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n t f o r i n t e r a c t i o n s w i t h t h e g e l . T h e n , D = ( v - v ™ ) / V o ( 2 . 2 6 ) T h e d i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n t r e l a t e s t o t h e r a t i o o f p r o t e i n s p e c i e s i n t e r a c t i n g w i t h t h e m a t r i x t o t h o s e p r e s e n t f r e e i n s o l u t i o n . T h u s , D = (P + L P + M P ) / ( P +LP) ( 2 . 2 7 ) D i v i d i n g ( 2 . 2 7 ) b y P a n d u s i n g D Q = P / P ( t h e r e f o r e P = P / D Q ) f o r d i s t r i b u t i o n o f m o b i l e m a c r o m o l e c u l e i n t o t h e g e l y i e l d s : 37 D = {D Q + D n ( L P / P ) + D n ( M P / P ) } / ( 1 + L P / P ) ( 2 . 2 8 ) S i n c e L p / V s = [ L p ] ( 2 . 2 9 ) a n d P / V = [P ] ( 2 . 3 0 ) L P / P = [ L P ] / [ P ] ( 2 . 3 1 ) T h u s a l l r a t i o s i n e q u a t i o n ( 2 . 2 8 ) may b e c o n v e r t e d t o r a t i o s o f c o n c e n t r a t i o n s . T h e n s u b s t i t u t i o n f r o m e q u a t i o n s ( 2 . 2 2 ) t o ( 2 . 2 4 ) y i e l d s : D = D 0 { ( l + [ " L ] / K i : j 5 ) / ( 1 + [ L ] / K L p ) } + D 0 ( ( [ M ] / K M 1 , ) / ( 1 + [ L ] / K L p ) > ( 2 . 3 2 ) T h e n , (V - V m ) / V s = D Q { ( 1 + [ L l / K j - p O / U + [ L ] / K L p ) } + D Q { ( [ M ] / K R p ) / ( l + [ L ] / K L p ) } ( 2 . 3 3 ) F o r [M]= 0 a n d [ L ] = 0 <V0 " V / V S = ° 0 . . . . ( 2 . 3 4 ) w h e r e i s t h e e l u t i o n v o l u m e o f t h e p r o t e i n i n t h e a b s e n c e o f i n t e r a c t i o n w i t h g e l . T h e n , V = ( V 0 " V m } { ( 1 + [ £ ] / « £ ! > ) / ( 1 + [ L ] / K L p ) > + ( V 0 " V { ( [ M ] / K ^ ) / ( l + [ L ] / K L p ) ) + V m . . . . ( 2 . 3 5 ) 3 8 S i n c e t h e g e l i s c o n s i d e r e d t o b e q u i t e p o r o u s , b o t h p r o t e i n ( P ) a n d s o l u b l e i n h i b i t o r s ( L ) w i l l b e d i f f u s i b l e t h r o u g h o u t t h e s y s t e m . T h e r e f o r e a r e a s o n a b l e s i m p l i f i c a t i o n t o t h i s s y s t e m i s t h e a s s u m p t i o n t h a t b i n d i n g o f s o l u b l e i n h i b i t o r i s n o t a f f e c t e d b y t h e p r e s e n c e o f t h e g e l . i . e , K ^ ^ K . . ^ J_iP LiP T h e r e f o r e , 1 + [ L l / K ^ = 1 + [ L ] / K T P ( 2 . 3 6 ) T h e r e f o r e e q u a t i o n ( 2 . 3 5 ) r e d u c e s t o : V = V Q + { ( V 0 - V M ) ( [ M J / K g j , ) }/{ ( 1 + [ L I / K J J , ) } . . ( 2 . 3 7 ) By l i n e a r i z a t i o n o f t h i s e q u a t i o n : 1 / ( V - V 0 > = K ^ { ( V 0 - V n ) [ M ] > + K f l p C I O / K j ^ C V Q - V ^ [ M ] ( 2 . 3 8 ) w h e r e V i s t h e e x p e r i m e n t a l l y m e a s u r e d e l u t i o n v o l u m e o f m o b i l e m a c r o m o l e c u l e , V . a n d V a r e v o l u m e s o f a n u n r e t a i n e d 0 m s u b s t a n c e a n d m o b i l e p h a s e v o l u m e r e s p e c t i v e l y . [ M ] i s t h e t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f i m m o b i l i z e d l i g a n d a n d [ L ] i s t h e t o t a l c o n c e n t r a t i o n o f s o l u b l e c o m p e t i n g l i g a n d . a n d a r e d i s s o c i a t i o n e q u i l i b r i u m c o n s t a n t s o f t h e M P a n d L P c o m p l e x e s . When e l u t i o n s a r e p e r f o r m e d i n t h e a b s e n c e o f c o m p e t i n g s o l u b l e l i g a n d ( [ L ] = 0 ) a n d [ P ] / [ M ] « 1 e q u a t i o n ( 2 . 3 8 ) i s s i m p l i f i e d t o : 39 V ( V - V Q ) = K M P / ( ( V 0 - V m ) [ M ] } ( 2 . 3 9 ) T h u s K ^ p c a n b e c a l c u l a t e d i n d e p e n d e n t l y o f c o m p e t i t i v e l i g a n d . T h i s r e l a t i o n s h i p c a n t h e r e f o r e b e u s e d t o d e t e r m i n e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s o f i n t e r a c t i o n s b e t w e e n s o l u b l e m a c r o m o l e c u l e s a n d i m m o b i l i z e d l i g a n d s f r o m c h r o m a t o g r a p h i c r e t e n t i o n v o l u m e s . 2 . 8 . 2 L y s o z y m e L y s o z y m e i s a n enzyme t h a t l y s e s t h e m i c r o o r g a n i s m M i c r o c o c c u s l y s o d i e k t i c u s a n d i s d e f i n e d a s 1 , 4 b e t a - N - a c e t y l -m u r a m i d a s e . I t i s a b a s i c p r o t e i n o f l o w m o l e c u l a r w e i g h t ( 1 4 , 3 0 0 ) a n d i s s t a b l e a t a c i d i c p H a t f a i r l y h i g h t e m p e r a t u r e s b u t l a b i l e a t a l k a l i n e p H . I t a c c o u n t s f o r 3 % o f t h e p r o t e i n i n e g g w h i t e ( O s u g a a n d F e e n y , 1 9 7 4 ) . S e l f - a s s o c i a t i o n o f l y s o z y m e m o l e c u l e s h a s b e e n r e p o r t e d e a r l i e r b y O s u g a a n d F e e n y ( 1 9 7 4 ) . T h e p H d e p e n d e n c e o f l y s o z y m e d i m e r i z a t i o n h a s b e e n s t u d i e d b y S o p h i a n o p o u l o s a n d V a n H o l d e ( 1 9 6 4 ) . A c c o r d i n g t o t h e i r o b s e r v a t i o n s d i m e r i z a t i o n o f l y s o z y m e o c c u r s i n t h e p H r a n g e o f 5 - 9 a n d p o l y m e r i z a t i o n o c c u r s a b o v e pH 9 . 0 ( F i g 2 . 1 ) . A l s o , i t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h e d i m e r f o r m a t i o n i n s o l u t i o n s o f l y s o z y m e a t a l k a l i n e pH d i r e c t l y o b s c u r e d one o r two b i n d i n g s i t e s a n d t h e e x t e n t o f a s s o c i a t i o n i s c r i t i c a l l y d e p e n d e n t on t h e c o n t r i b u t i o n o f n e t e l e c t r o s t a t i c r e p u l s i v e f o r c e s . T h u s F i g . 2 . 1 ; V a r i a t i o n o f t h e a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t w i t h p H a t 20 C . P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n a p p r o x i m a t e l y 1 .4 g / 1 0 0 mL i n 0 . 1 5 M K C 1 . ( S o p h i a n o p o u l o s a n d V a n H o l d e , 1 9 6 4 ) . 41 a t p H 5 . 0 , w h e r e t h e n e t c h a r g e o f t h e l y s o z y m e monomer (MW 1 4 , 3 0 0 ) i s a b o u t + 1 1 . 5 o n l y a l i t t l e i f a n y s e l f a s s o c i a t i o n i s d e t e c t e d i n s o l u t i o n s o f i o n i c s t r e n g t h 0 . 1 5 . A t p H 8 . 0 w h e r e t h e n e t c h a r g e o f l y s o z y m e h a s d e c r e a s e d t o + 7 . 3 , s i g n i f i c a n t p r o p o r t i o n s o f h i g h e r p o l y m e r s c o - e x i s t i n e q u i l i b r i u m w i t h t h e monomers ( F r i e d e n a n d N i c h o l , 1 9 8 1 ) . H o w e v e r , y e t t h e t y p e o f b o n d i n g i s n o t k n o w n . L y s o z y m e n o t o n l y s e l f a s s o c i a t e s , i t a l s o makes h e t e r o g e n e o u s c o m p l e x e s w i t h o t h e r e g g w h i t e p r o t e i n s s u c h a s o v o m u c o i d ( M a t s u d a e t a l . , 1 9 8 2 ) , o v o m u c i n ( K a t o e t a l . , 1 9 7 5 . , G a r i b a l d i e t a l . 1 9 6 8 ) , c o n a l b u m i n ( E h r e n p r e i s a n d W a r n e r , 1956) a n d o v a l b u m i n ( F o r s y t h e a n d F o s t e r , 1 9 5 0 ) . T h e p o s s i b i l i t y o f a v i d i n i n t e r a c t i n g w i t h l y s o z y m e h a s b e e n s u g g e s t e d b y D u r a n c e ( 1 9 8 7 ) . T h i s w i l l b e f u r t h e r i n v e s t i g a t e d i n t h e p r e s e n t s t u d y . 2 . 8 . 3 A v i d i n A v i d i n i s a g l y c o - p r o t e i n w i d e l y f o u n d i n e g g s o f a v i a n ( 0 . 0 5 g / 1 ) a n d o t h e r o v i p a r o u s v e r t i b r a t e s . I t i s a b a s i c s e c r e t o r y o v i d u c t p r o t e i n ( H e r t z e t a l . , 1943) w i t h a n p i o f 1 0 . 0 ( G r e e n , 1 9 7 5 ) . M o l e c u l a r w e i g h t i s a b o u t 6 8 , 0 0 0 , much h i g h e r t h a n t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f l y s o z y m e . I n i t s n a t i v e f o r m a v i d i n i s a t e t r a m e r . T h i s p r o t e i n i s r e m a r k a b l y s t a b l e o v e r a w i d e r a n g e o f p H a n d t e m p e r a t u r e (Wei a n d W r i g h t , 1 9 6 4 ) . 3 . M A T E R I A L S AND METHODS 3 . 1 H I G H P R E S S U R E HYDROPHOBIC I N T E R A C T I O N CHROMATOGRAPHY  (HPHIC) 3 . 1 . 1 M a t e r i a l s B o v i n e p a n c r e a s e (5x c r y s t a l l i z e d t y p e - l - A S p r o t e a s e f r e e ) r i b o n u c l e a s e - A , c h i c k e n e g g w h i t e G r a d e - l (3x c r y s t a l l i z e d d i a l i z e d a n d l y o p h i l i z e d ) l y s o z y m e , b o v i n e m i l k t y p e - 3 a l p h a - l a c t a l b u m i n , c r y s t a l l i z e d l y o p h i l i z e d t y p e - 3 w h a l e s k e l e t a l m u s c l e m y o g l o b i n , c r y s t a l l i z e d l y o p h i l i z e d t y p e - 5 o v a l b u m i n , s o d i u m a z i d e , T r i z m a b a s e [ t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ] a n d t y p e - 3 s i a l i c a c i d ( N - a c e t y l n e u r a m i n i c a c i d ) w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o . ( S t . L o u i s , MO, U S A ) . Ammonium s u l f a t e (BDH a s s u r e d ) was o b t a i n e d f r o m BDH C h e m i c a l C o . (W. G e r m a n y ) . F e r r o u s s u l f a t e a n d s o d i u m s u l f a t e w e r e p u r c h a s e d f r o m F i s h e r S c i e n t i f i c ( P i t t s b u r g , P A , USA) . D i s t i l l e d w a t e r was p r e p a r e d w i t h a B a r n s t e d d i s t i l l a t i o n a p p a r a t u s . M i l l i p o r e ( B e d f o r d , MA, USA) a l l g l a s s f i l t e r i n g a p p a r a t u s was u s e d t o p r e p a r e H P L C g r a d e h i g h p u r i t y w a t e r a n d b u f f e r s . M i l l i p o r e p r o t e i n f i l t e r i n g u n i t was u s e d t o f i l t e r t h e p r o t e i n s a m p l e s . 3 . 1 . 2 I n s t r u m e n t s H P L C c h r o m a t o g r a p h i c s y s t e m e m p l o y e d c o n s i s t s o f a V a r i a n ( P a l o A l t o , C A , USA) 5000 l i q u i d c h r o m a t o g r a p h , 20 u L 43 s a m p l e l o o p , B i o g e l - T S K - P h e n y l - 5 P W 7 5 x 7 . 5 mm I . D h y d r o p h o b i c c o l u m n p u r c h a s e d f r o m B i o - R a d ( R i c h m o n d , C A , U S A ) , V a r i a n m o d e l 50 UV d e t e c t o r a n d V a r i a n CDS 401 c h r o m a t o g r a p h i c d a t a s y s t e m . 3 . 1 . 3 B u f f e r s A s e r i e s o f b u f f e r s w e r e p r e p a r e d f r o m 0 . 0 2 5 m T r i s - H C l a t p H 8 . 0 w i t h v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s ( 0 . 3 - 1 . 3 m ) o f ammonium s u l f a t e , s o d i u m s u l f a t e a n d f e r r o u s s u l p f a t e n e u t r a l s a l t s . 3 . 1 . 4 E s t i m a t i o n o f t Q S e v e r a l m e t h o d s o f o b t a i n i n g t Q i n H P H I C w e r e c a r r i e d o u t i n t h i s r e s e a r c h . 20 j i L o f s o d i u m n i t r a t e (0.001% w / v ) , s i a l i c a c i d (0.1% w / v ) a n d m e t h a n o l w e r e i n j e c t e d i n t o t h e c o l u m n a n d d e t e c t e d a t 235 nm. D i s t i l l e d w a t e r was a l s o u s e d a s a m e t h o d o f m e a s u r i n g t Q a n d d e t e c t e d a s a n e g a t i v e p e a k a t 210 nm. 3 . 1 . 5 C h r o m a t o g r a p h y C h r o m a t o g r a m s w e r e o b t a i n e d u n d e r i s o c r a t i c c o n d i t i o n s a t r o o m t e m p e r a t u r e a t a f l o w r a t e o f 1 m L / m i n . A f t e r e a c h c h a n g e o f m o b i l e p h a s e 30 m i n was a l l o w e d f o r e q u i l i b r a t i o n . P r o t e i n s a m p l e s (2 mg) w e r e d i s s o l v e d i n 2 mL o f t h e same b u f f e r a n d i n j e c t e d i n t o t h e c o l u m n . E l u t i o n t i m e was t a k e n a s t h e p o i n t o f maximum A _ o r i f o r a l l t h e p r o t e i n s . T h e m o b i l e p h a s e h o l d u p t i m e was t a k e n a s t h e maximum p o i n t o f ^235 s i a l i c a c i d (1% w / v ) . T h e c a p a c i t y f a c t o r k was c a l c u l a t e d u s i n g t h e e q u a t i o n : 44 k = ^ R ' V t 0 ( 3 . 1 ) w h e r e t R i s t h e e l u t i o n t i m e o f p r o t e i n a n d t Q i s t h e e l u t i o n t i m e o f s i a l i c a c i d . A t l e a s t two r e p r o d u c i b l e c h r o m a t o g r a m s f o r e a c h compound w e r e u s e d t o c a l c u l a t e " k " . T h e c h r o m a t o g r a m s w e r e c o n s i d e r e d t o b e r e p r o d u c i b l e when t h e d e v i a t i o n i n e l u t i o n t i m e i s l e s s t h a n 0 . 0 1 m i n . 3 . 1 . 6 D a t a A n a l y s i s L o g a r i t h m s o f t h e c a p a c i t y f a c t o r s ( l o g k) w e r e p l o t t e d a g a i n s t t h e s a l t m o l a l i t y (m) f o r a l l t h r e e n e u t r a l s a l t s a n d s o l i d l i n e s w e r e d r a w n b y f i t t i n g t h e d a t a p o i n t s a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g e q u a t i o n . R e s u l t s w e r e e x a m i n e d b y e v a l u a t i n g t h e C v a l u e s o b t a i n e d b y m u l t i p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s a n d t h e s l o p e s ( C ) o f l o g k v s m r e l a t i o n s i p s o b t a i n e d b y s i m p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s , p e r f o r m e d w i t h S t a t g r a f D a t a S y s t e m ( S t a t i s t i c a l G r a p h i c s C o . ) . 3 . 2 HYDROPHOBIC PROBE MEASUREMENTS (ANS a n d C P A m e t h o d s ) 3 . 2 . 1 M a t e r i a l s M o n o - s o d i u m h y d r o g e n p h o s p h a t e a n d d i - s o d i u m h y d r o g e n p h o s p h a t e w e r e o b t a i n e d f r o m F i s h e r S c i e n t i f i c ( P i t t s b u r g , P A , l o g k = A + B l o g m + C m ( 3 . 2 ) 45 U S A ) . B u t y l a t e d h y d r o x y a n i s o l e (BHA) a n d 1 - a n i l i n o n a p h t h a l -e n e - 8 - s u l f o n a t e (ANS) w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o . ( S t . L o u i s , MO, U S A ) . C i s p a r i n a r i c a c i d (CPA) was p u r c h a s e d f r o m M o l e c u l a r P r o b e I n c . , ( E u g e n e , R O , U S A ) . n - D e c a n e , e t h a n o l a n d m e t h a n o l w e r e o b t a i n e d f r o m BDH C h e m i c a l C o . (W. G e r m a n y ) . 3 . 2 . 2 I n s t r u m e n t s F l u o r e s c e n t m e a s u r e m e n t s w e r e made o n a S h i m a d z u R F - 5 4 0 r e c o r d i n g s p e c t r o f l u o r o p h o t o m e t e r ( K y o t o , J a p a n ) . A V a r i a n ( P a l o A l t o , C A , USA) C a r y m o d e l 210 s p e c t r o p h o t o m e t e r was u s e d t o m e a s u r e t h e a b s o r b a n c e o f p r o t e i n s a t 280 nm. 3 . 2 . 3 M e t h o d ANS m e t h o d A n ANS s o l u t i o n was p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g 1 2 . 4 2 mg o f ANS i n 5 mL o f 0 .05m T r i s HC1 (pH 8 . 0 ) b u f f e r . A s e r i e s o f p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 0 . 0 0 5 - 0 . 0 3 0% w e r e o b t a i n e d b y d i l u t i n g a c o n c e n t r a t e d p r o t e i n s t o c k s o l u t i o n w i t h t h e same b u f f e r . C o n c e n t r a t i o n o f t h e d i l u t e d p r o t e i n s o l u t i o n s was c a l c u l a t e d u s i n g t h e e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t {E}'* ) a t 280 3 v 1cm nm ( T a b l e 3 . 1 ) . T h e n 10 u L o f ANS s o l u t i o n was a d d e d t o 2 mL o f e a c h p r o t e i n s o l u t i o n a n d r e l a t i v e f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t y ( R F I ) was m e a s u r e d b y a s p e c t r o f l u o r o p h o t o m e t e r a t e x c i t a t i o n a n d e m i s s i o n wave l e n g t h s o f 390 a n d 470 nm r e s p e c t i v e l y . T h e e x c i t a t i o n a n d e m i s s i o n s l i t w i d t h s w e r e 5 nm. T h e R F I r e a d i n g was s t a n d a r d i z e d b y a d j u s t i n g t h e r e a d i n g o f t h e f l u o r o m e t e r t o 3 0% f u l l s c a l e f o r 10 u L o f ANS i n 2 mL o f m e t h a n o l . T h e 46 T a b l e 3 . 1 ; E x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t s o f p r o t e i n s u s e d i n H P H I C P r o t e i n E}'4 O v a l b u m i n 7 . 50 L a c t a l b u m i n 2 0 . 90 L y s o z y m e 2 6 . 00 M y o g l o b i n 1 0 . 00 R i b o n u c l e a s e 6 . 95 R e f . S o r b e r a n d H a r t e (1970) 47 n e t R F I o f e a c h p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n was m e a s u r e d b y s u b s t r a c t i n g R F I o f e a c h s o l u t i o n w i t h o u t t h e p r o b e f r o m t h a t w i t h t h e p r o b e . CPA m e t h o d CPA s o l u t i o n was p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g 10 mg o f CPA a n d 100 p g o f BHA i n 10 mL o f a b s o l u t e e t h a n o l . Same m e t h o d d e s c r i b e d i n t h e ANS p r o c e d u r e was c a r r i e d o u t t o p r e p a r e t h e p r o t e i n d i l u t i o n s . T h e n 10 p L o f CPA was a d d e d t o 2 mL o f p r o t e i n d i l u t i o n s a n d R F I was m e a s u r e d a t wave l e n g t h s o f e x c i t a t i o n a n d e m i s s i o n , 325 a n d 420 nm r e s p e c t i v e l y . T h e R F I r e a d i n g was s t a n d a r d i z e d b y a d j u s t i n g t h e r e a d i n g o f t h e f l u o r o m e t e r t o 75% f u l l s c a l e f o r 10 u L o f CPA i n 2 mL o f n -D e c a n e . 3 . 3 A F F I N I T Y CHROMATOGRAPHY 3 . 3 . 1 M a t e r i a l s G r a d e - 1 3x c r y s t a l l i z e d h e n e g g w h i t e l y s o z y m e , a v i d i n , F i c o l l 7 0 , 0 0 0 , F i c o l l 4 0 0 , 0 0 0 , a n d s o d i u m a z i d e w e r e p u r c h a s e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o . ( S t . L o u i s , MO, U S A ) . BDH a s s u r e d ammonium s u l f a t e , d i - s o d i u m h y d r o g e n o r t h o p h o s p h a t e , a n d c i t r i c a c i d m o n o h y d r a t e w e r e o b t a i n e d f r o m BDH C h e m i c a l C o . (W. G e r m a n y ) . A c t i v a t e d i m m u n o - a f f i n i t y s u p p o r t s ( A f f i g e l - 1 0 ) w e r e p u r c h a s e d f r o m B i o - R a d C h e m i c a l C o . ( R i c h m o n d , C A , U S A ) . 48 3 . 3 . 2 I n s t r u m e n t s A l i q u i d c h r o m a t o g r a p h a p p a r a t u s was a s s e m b l e d f r o m a G i l s o n M i n i p l u s - 3 - p e r i s t a l t i c pump, a R h e o d y n e t y p e 50 t e f l o n r o t a r y v a l v e e q u i p p e d w i t h a 1 mL s a m p l e l o o p , G i l s o n m o d e l 112 UV d e t e c t o r , a n d m o d e l 203 G i l s o n f r a c t i o n c o l l e c t o r p u r c h a s e d f r o m G i l s o n M e d i c a l E l e c t r o n i c s ( U S A ) . K o n t e s f l e x c o l u m n s a n d c o l u m n f l o w a d a p t e r s w e r e o b t a i n e d f r o m M a n d e l S c i e n t i f i c C o . ( T o r o n t o , C a n a d a ) . T h e J C L 6000 c h r o m a t o g r a p h y d a t a s y s t e m o b t a i n e d f r o m t h e same company was u s e d t o p r o c e s s t h e s i g n a l f r o m t h e UV d e t e c t o r t o o b t a i n t h e p e a k . R e f r a c t i v e i n d e x o f t h e e l u t e d f r a c t i o n s o f F i c o l l w e r e m e a s u r e d b y a A B B E M a r k 2 d i g i t a l r e f r a c t o m e t e r ( C a m b r i d g e I n s t r u m e n t s I n c . , B u f f a l o , N Y , U S A ) . 3 . 3 . 3 B u f f e r s A s e r i e s o f m o b i l e p h a s e b u f f e r s w e r e p r e p a r e d w i t h 0 .01m c i t r i c p h o s p h a t e b u f f e r w i t h v a r y i n g m o l a l i t i e s o f ammonium s u l p h a t e ( 0 . 0 0 1 - 1 . 7 m ) i n f o u r p H v a l u e s ( 3 . 2 , 5 . 0 , 6 . 8 , 7 . 2 ) f o r t h e l y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n . p H o f t h e b u f f e r s u s e d f o r a v i d i n - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n w e r e 6 . 5 a n d 7 . 8 . . 3 . 3 . 4 C o u p l i n g o f l y s o z y m e t o A f f i g e l - 1 0 c o l u m n L i g a n d s o l u t i o n ( l y s o z y m e ) was p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g l y s o z y m e (30 mg l y s / m L g e l ) i n 0 .01m p h o s p h a t e b u f f e r . 25 mL o f A f f i g e l 10 s u s p e n s i o n was t r a n s f e r r e d t o a s m a l l b u c h n e r f u n n e l a n d a l l o w e d t h e s u p e r n a t e n t s o l v e n t t o d r a i n . T h e n t h e g e l b e d was w a s h e d w i t h t h r e e t o f o u r t i m e s t h e v o l u m e o f 4 ° C 49 d e i o n i z e d w a t e r . T h e m o i s t g e l r e m a i n i n g o n t h e f u n n e l was t h e n t r a n s f e r r e d t o a c o n i c a l f l a s k a n d m i x e d w i t h t h e c o l d ( 4 ° C ) l i g a n d s o l u t i o n ( 0 . 5 mL o f l i g a n d s o l u t i o n / m L g e l ) . A g i t a t i o n was c o n t i n u e d f o r 1 h r a t 4 ° C . A t t h e e n d , lm g l y c i n e e t h y l e s t e r (pH 8) b l o c k i n g a g e n t p e r mL g e l was a d d e d t o t h e l i g a n d s o l u t i o n a n d k e p t f o r a n o t h e r o n e h o u r f o r c o m p l e t i o n o f t h e b l o c k i n g r e a c t i o n . F i n a l l y t h e g e l was t r a n s f e r r e d t o a c o l u m n a n d w a s h e d w i t h t h e same b u f f e r (0 .01m p h o s p h a t e ) u n t i l i t i s f r e e f r o m r e a c t a n t s . 3 . 3 . 5 C h r o m a t o g r a p h y T o s t u d y t h e l y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n 1 mL o f 0.2% (w/v) s o l u b l e l y s o z y m e was i n j e c t e d i n t o t h e p r e s a t u r a t e d l y s o z y m e i m m o b i l i z e d c o l u m n i n b u f f e r s o f 0 . 0 0 1 t o 1 .7m ammonium s u l f a t e i n pH v a l u e s o f 3 . 2 , 5 . 0 , 6 . 5 a n d 7 . 2 . T o s t u d y t h e a v i d i n - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n , same p r o c e d u r e was c a r r i e d o u t w i t h s o l u b l e a v i d i n (0.2% w / v ) i n b u f f e r s o f 0 . 0 0 1 t o 1 .3m ammonium s u l f a t e i n p H v a l u e s o f 6 . 5 a n d 7 . 8 . T h e e x p e r i m e n t was d o n e a t room t e m p e r a t u r e a t a f l o w r a t e o f 0 . 6 5 m L / m i n . R e t e n t i o n t i m e s o f t h e p r o t e i n s w i t h i s o c r a t i c e l u t i o n w e r e m e a s u r e d b y a UV d e t e c t o r a t 280 nm. F i c o l l 7 0 , 0 0 0 a n d F i c o l l 4 0 0 , 0 0 0 w e r e a p p l i e d t o t h e c o l u m n t o m e a s u r e t h e v o i d v o l u m e a n d t h e m o b i l e p h a s e v o l u m e r e s p e c t i v e l y . E l u t i o n v o l u m e o f F i c o l l was t a k e n a s t h e p o i n t o f maximum r e f r a c t i v e i n d e x . T o m e a s u r e t h e i m m o b i l i z e d l i g a n d c o n c e n t r a t i o n i n t h e c o l u m n , p r o c e d u r e g i v e n i n s e c t i o n 3 . 3 . 7 was c a r r i e d o u t . 50 3 . 3 . 6 D a t a a n s l v s i s L o g a r i t h m i c c a p a c i t y f a c t o r s ( l o g k) o f p r o t e i n s w e r e c a l c u l a t e d f r o m k i n t h e e q u a t i o n ( 3 . 1 ) . T h e d a t a w e r e a n a l y s e d b y p e r f o r m i n g m u l t i p l e r e g r e s s i o n a s w e l l a s l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s ( f o r p o i n t s a b o v e 0.3m) a c c o r d i n g t o e q u a t i o n 3 . 2 . T o c a l c u l a t e t h e a p p a r e n t d i s s o c i a t i o n e q u i l i b r i u m c o n s t a n t s (K^p) ° f l y s o z y m e - l y s o z y m e a n d a v i d i n -l y s o z y m e i n t e r a c t i o n s d a t a w e r e f i t t e d t o t h e f o l l o w i n g e q u a t i o n a t 1 .1m a n d 0 .9m s a l t m o l a l i t i e s r e s p e c t i v e l y . 1 / ( V - V 0 ) = I % p / { ( V - V Q ) [M]} ( 3 . 3 ) 3 . 3 . 7 M e a s u r e m e n t o f l i g a n d c o n c e n t r a t i o n i n s t a t i o n a r y p h a s e B i o - R a d p r o t e i n a s s a y m e t h o d was u s e d t o m e a s u r e t h e l i g a n d c o n c e n t r a t i o n i n s t a t i o n a r y p h a s e . Dye r e a g e n t was p r e p a r e d a s d e s c r i b e d i n t h e B i o - R a d m a n u a l . S e v e r a l d i l u t i o n s o f l y s o z y m e c o n t a i n i n g 0 . 2 - 1 . 4 mg/mL w e r e t a k e n a s t h e p r o t e i n s t a n d a r d s . 5 mL o f d i l u t e d d y e r e a g e n t was a d d e d t o 0 . 1 mL o f l y s o z y m e s t a n d a r d a n d 0 . 1 mL o f s a m p l e b u f f e r ( 0 . 0 1 m p h o s p h a t e b u f f e r ) . O n l y 0 . 1 mL o f s a m p l e b u f f e r a n d 5 mL o f d y e r e a g e n t was u s e d a s t h e b l a n k . T h e s o l u t i o n s w e r e m i x e d s e v e r a l t i m e s a n d a f t e r a p e r i o d o f 5 m i n t o 1 h r , O D 5 g 5 v s r e a g e n t b l a n k was m e a s u r e d i n a s p e c t r o p h o t o m e t e r . T h e p l o t o f 0 D 5 g 5 v s p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n (ug) was u s e d a s t h e s t a n d a r d c u r v e . T o m e a s u r e t h e l i g a n d c o n c e n t r a t i o n i n t h e c o l u m n 0 . 1 g o f d r a i n e d l y s o z y m e i m m o b i l i z e d g e l was s u s p e n d e d i n 5 mL o f d y e a n d t h e a b s o r b a n c e was m e a s u r e d a t O D ^ . , . . T h e n t h e l i g a n d c o n c e n t r a t i o n was r e a d f r o m t h e s t a n d a r d c u r v e . 52 4 . 0 R E S U L T S AND D I S C U S S I O N T h i s c h a p t e r p r e s e n t s t h e i n v e s t i g a t i o n o f t h e s u r f a c e h y d r o p h o b i c i t y o f p r o t e i n s a n d t h e b e h a v i o u r o f h y d r o p h o b i c a n d e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s i n p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s , c o n d u c t e d o n h i g h p r e s s u r e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y (HPHIC) a n d l o w p r e s s u r e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y w i t h i n c r e a s i n g a n d d e c r e a s i n g s a l t m o l a l i t i e s . 4 . 1 H I G H P R E S S U R E HYDROPHOBIC I N T E R A C T I O N CHROMATOGRAPHY 4 . 1 . 1 M e a s u r e m e n t o f h o l d u p t i m e ( t Q ) i * i H P H I C T h e h o l d up t i m e t Q i s a c r u c i a l p a r a m e t e r t h a t i s n e e d e d f o r t h e a c c u r a t e d e t e r m i n a t i o n o f r e t e n t i o n f a c t o r s ( k ) . T h e c o r r e c t m e a s u r e m e n t o f t Q i s a n i n t e n s e l y a c t i v e r e s e a r c h a r e a ( S m i t h e t a l . , 1986) a n d no g e n e r a l a g r e e m e n t e x i s t s . I n t h e p r e s e n t s t u d y , s e v e r a l m e t h o d s o f o b t a i n i n g t Q w e r e e x a m i n e d ( s e c t i o n 3 . 1 . 4 ) . T h e e l u t i o n t i m e s o b t a i n e d w i t h m e t h a n o l a n d a c e t o n e w e r e h i g h e r t h a n t h e e l u t i o n t i m e o f m y o g l o b i n a t l o w s a l t c o n c e n t r a t i o n s a n d t e n d e d t o d e v i a t e w i t h t h e c h a n g i n g s a l t m o l a l i t i e s . D i s t i l l e d w a t e r g a v e r e t e n t i o n t i m e s s i m i l a r t o o r g r e a t e r t h a n m y o g l o b i n a n d s o m e t i m e s e l u t e d a s f l a t p e a k s t h a t t h e c o m p u t e r p r o g r a m was u n a b l e t o i d e n t i f y . T h e r e s u l t s o b t a i n e d w i t h s i a l i c a c i d w e r e f a i r l y c o n s t a n t w i t h no n o t i c e a b l e d e v i a t i o n s f r o m e x p e c t e d b e h a v i o u r u n d e r a l l 53 e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s . T h e a v e r a g e r e t e n t i o n t i m e was 2 . 1 5 7 m i n a n d t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n was 0 . 0 2 . T h e r e f o r e i n v i e w o f t h e f a i l u r e o f o t h e r t e c h n i q u e s t h i s r e t e n t i o n t i m e was u s e d t o c a l c u l a t e t Q a n d t h u s t h e c a p a c i t y r a t i o s . 4 . 1 . 2 R e t e n t i o n o f p r o t e i n s i n H P H I C E f f e c t o f s a l t s o n t h e r e t e n t i o n b e h a v i o u r o f p r o t e i n s i n t h e e l e c t r o s t a t i c a n d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y h a s b e e n d e s c r i b e d b y a t h r e e p a r a m e t e r m o d e l : l o g k = A + B l o g m + C m ( 4 . 1 ) T h e m o d e l a l l o w s t h e e s t i m a t i o n o f b o t h e l e c t r o s t a t i c (B) a n d h y d r o p h o b i c (C) b i n d i n g p a r a m e t e r s c o n c u r r e n t l y , b e t w e e n a s o l u t e a n d a r e s i n , b y q u a n t i t a t i v e l y e x a m i n i n g t h e e f f e c t o f n e u t r a l s a l t c o n c e n t r a t i o n s i n t h e m o b i l e p h a s e o n s o l u t e r e t e n t i o n ( E l - R a s s i a n d H o r v a t h , 1 9 8 6 a ; M e l a n d e r a n d H o r v a t h , 1989) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e c a p a c i t y f a c t o r s ( l o g k) o f p r o t e i n s w e r e c a l c u l a t e d f r o m k v a l u e s d e r i v e d f r o m e q u a t i o n ( 3 . 1 ) a t s e v e r a l s a l t m o l a l i t i e s a n d t h e p l o t s o f s a l t m o l a l i t y (m) v s l o g k a r e g i v e n i n F i g s . 4 . 1 t o 4 . 3 . A c c o r d i n g t o t h e a b o v e e q u a t i o n ( 4 . 1 ) , C i s t h e l i m i t i n g s l o p e a t s u f f i c i e n t l y h i g h s a l t c o n c e n t r a t i o n s , w h i c h i s a m e a s u r e o f s o l u t e r e s i n i n t e r a c t i o n i n c o n d i t i o n s w h i c h m a x i m i z e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s a n d m i n i m i z e e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s . On t h e o t h e r h a n d , B i s t h e l i m i t i n g s l o p e a t s u f f i c i e n t l y l o w s a l t c o n c e n t r a t i o n s . T h u s t h e p l o t s o f l o g k 54 Salt Molality (m) F i g 4 . 1 ; P l o t o f t h e l o g a r i t h m i c r e t e n t i o n f a c t o r o f p r o t e i n s a g a i n s t s a l t m o l a l i t y o f f e r r o u s s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e . 55 F i g . 4 . 2 ; P l o t o f t h e l o g a r i t h m i c r e t e n t i o n f a c t o r o f p r o t e i n s a g a i n s t s a l t m o l a l i t y o f ammonium s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e . Salt Molality (m) F i g . 4 . 3 ; P l o t o f t h e l o g a r i t h m i c r e t e n t i o n f a c t o r o f p r o t e i n s a g a i n s t s a l t m o l a l i t y o f s o d i u m s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e . 57 v s m s h o u l d y i e l d s t r a i g h t l i n e s a t s u f f i c i e n t l y h i g h s a l t c o n c e n t r a t i o n s , w i t h s l o p e s r e p r e s e n t i n g h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s , a s t h e e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s a r e i n s i g n i f i c a n t a t h i g h e r s a l t c o n c e n t r a t i o n s . F r o m t h e F i g u r e s 4 . 1 t o 4 . 3 i t c a n b e o b s e r v e d t h a t o v a l b u m i n g e n e r a l l y h a s a m o r e c u r v e l i n e a r n a t u r e t h a n t h e o t h e r f o u r p r o t e i n s . T h i s c a n b e e x p l a i n e d b y c o n s i d e r i n g t h e c h a r g e s o n t h e p r o t e i n m o l e c u l e . T a b l e 4 . 1 g i v e s t h e i s o -e l e c t r i c p o i n t s ( p i ) a n d t h e c h a r g e s o f t h e f i v e p r o t e i n s s t u d i e d i n H P H I C . C h a r g e s w e r e r e p r o d u c e d f r o m B i g e l o w (19 6 7 ) . I t i s c l e a r f r o m t h i s t a b l e t h a t t h e c h a r g e f r e q u e n c y i s i n d e p e n d e n t o n t h e p i v a l u e s . A l s o , t h e two p r o t e i n s o v a l b u m i n a n d l a c t a l b u m i n h a v e c l o s e p i v a l u e s a n d c h a r g e f r e q u e n c i e s . B u t l a c t a l b u m i n g a v e s t r a i g h t l i n e r e l a t i o n s h i p s i n t h i s s t u d y w i t h a l l t h r e e s a l t t y p e s . T h e r e f o r e , t h e r e a s o n f o r t h e c u r v e l i n e a r n a t u r e o f o v a l b u m i n i s n o t d u e t o a s i g n i f i c a n t f r a c t i o n o f c h a r g e r e s i d u e s o n t h e p r o t e i n m o l e c u l e . I t c a n b e a r e a s o n o f p r o t e i n d e n a t u r a t i o n a t h i g h e r s a l t c o n c e n t r a t i o n s t h a t make o v a l b u m i n t o b e h a v e a s a v e r y h y d r o p h o b i c p r o t e i n i n H P H I C . On t h e o t h e r h a n d i t h a s b e e n r e p o r t e d , t h a t l a c t a l b u m i n i s a p r o t e i n w h i c h p o s s e s s e s u n u s u a l l y l a r g e amount o f t r y p t o p h a n (5.6% p e r m o l e ) ( G o r d o n , 1 9 7 1 ) . T r y p t o p h a n i s a h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d . T h e r e f o r e i t may make l a c t a l b u m i n b e h a v e a s a v e r y h y d r o p h o b i c p r o t e i n . I n t h i s e x p e r i m e n t a l p r o g r a m , t h e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s w e r e c a l c u l a t e d b y two m e t h o d s . I n one m e t h o d , t h e r e t e n t i o n d a t a m e a s u r e d a t d i f f e r e n t s a l t T a b l e 4 . 1 ; T h e m o l e c u l a r w e i g h t s , i s o — e l e c t r i c p o i n t s , a n d t h e c h a r g e s o f p r o t e i n s u s e d i n H P H I C . P r o t e i n M o l e c u l a r W t . P i C h a r g e s O v a l b u m i n 4 4 , 0 0 0 * 4 . 7 0 . 24 L a c t a l b u m i n 1 7 , 4 0 0 * * 4 . 8 0 . 2 8 L y s o z y m e 1 4 , 0 0 0 * 1 1 . 0 0 . 1 4 M y o g l o b i n 1 7 , 5 0 0 * 7 . 1 0 . 3 4 R i b o n u c l e a s e 1 3 , 7 0 0 * 9 . 4 0 . 2 4 N o t e ; * R e f . S o b e r a n d H a r t e (1970) * * R e f . G o r d o n (1971) 59 c o n c e n t r a t i o n s i n t h e e l u e n t w e r e f i t t e d t o t h e a b o v e t h r e e p a r a m e t e r m o d e l ( 4 . 1 ) t o o b t a i n C v a l u e s . I n t h e o t h e r m e t h o d , t h e d a t a w e r e e x a m i n e d b y l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s ( l o g k = A + C m ) a n d t h e s l o p e s ( C ) w e r e e v a l u a t e d . I n t h e c a s e o f o v a l b u m i n , l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s was c o n d u c t e d f o r t h e p o i n t s a b o v e 0 . 8 m . T h e s e r e s u l t s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e s 4 . 2 a n d 4 . 3 r e s p e c t i v e l y . A c c o r d i n g t o t h e t h e o r y b o t h t h e s e v a l u e s a r e m e a s u r e s o f h y d r o p h o b i c i t y . T h e r e f o r e t h e y s h o u l d b e i n g o o d a g r e e m e n t . B u t t h e c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t s c a l c u l a t e d b e t w e e n t h e s e two p a r a m e t e r s f o r t h e t h r e e s a l t t y p e s , f e r r o u s s u l f a t e , ammonium s u l f a t e , a n d s o d i u m s u l f a t e w e r e 0 . 1 2 , 0 . 8 8 , a n d 0 . 7 9 r e s p e c t i v e l y . When C v a l u e s g i v e n i n T a b l e 4 . 3 a r e c o n s i d e r e d , o v a l b u m i n a n d l a c t a l b u m i n h a d h i g h e r v a l u e s c o m p a r e d t o m y o g l o b i n a n d r i b o n u c l e a s e w i t h a l l t h r e e s a l t t y p e s . L y s o z y m e p o s s e s s e d t h e t h i r d p l a c e i n ammonium a n d s o d i u m s u l f a t e s a l t s . T h i s o r d e r o f h y d r o p h o b i c i t y was o b s e r v e d i n C v a l u e s , o n l y w i t h ammonium s u l f a t e . H o w e v e r f r o m t h e C v a l u e s ( T a b l e 4 . 3 ) i t seems t h a t o v a l b u m i n , l a c t a l b u m i n a n d l y s o z y m e a r e m o r e h y d r o p h o b i c t h a n m y o g l o b i n a n d r i b o n u c l e a s e . E l - R a s s i a n d H o r v a t h (1986b) h a v e f o u n d t h a t t h e s l o p e s o f l o g k v s m p l o t s o f o v a l b u m i n a n d l y s o z y m e i n c r e a s e w i t h t h e c h a i n l e n g t h o f t h e s t a t i o n a r y p h a s e l i g a t e s , i n d i c a t i n g a n i n c r e a s e i n t h e h y d r o p h o b i c c o n t a c t a r e a u p o n i n c r e a s i n g t h e l e n g t h o f b o u n d p o l y e t h e r c h a i n s . On t h e o t h e r h a n d , t h e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r o f r i b o n u c l e a s e was p a r t i c u l a r l y i n d e p e n d e n t o f t h e l e n g t h o f b o u n d p o l y e t h e r l i g a t e s . T h e s e 60 T a b l e 4 . 2 ; H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s (C) o f t h e p l o t s o f l o g k v s m o f f e r r o u s s u l f a t e , ammonium s u l f a t e a n d s o d i u m s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e . FeSO P r o t e i n A B C R 4 O v a l b u m i n - 1 . 7 5 5 9 1 .3644 1 . 2 4 9 6 0 . 9 7 8 L a c t a l b u m i n - 1 . 4 6 9 2 - 0 . 4 6 2 6 1 . 1 9 3 0 0 . 967 L y s o z y m e - 1 . 4 6 7 3 0 . 6 4 6 3 1 . 7 6 1 6 0 . 9 8 7 M y o g l o b i n - 0 . 8 5 2 1 2 . 3 5 4 2 0 . 3 8 2 2 0 . 973 R i b o n u c l e a s e - 5 . 3 6 5 7 - 5 . 7 7 8 3 1 .4942 0 . 945 (NH ) SO P r o t e i n A B C R 2 O v a l b u m i n - 4 . 4 5 0 3 -3 . 0816 4 . 5 2 6 6 0 . 9 9 6 L a c t a l b u m i n - 2 . 3 2 8 1 - 0 . 8 9 5 4 3 . 0 5 8 2 0 . 9 9 8 Lyso7""Tne - 2 . 6 1 2 6 - 1 . 9 5 0 4 3 . 0 4 9 1 0 . 9 9 5 MyogjL<_>L>xii - 3 . 3 4 3 4 2 . 6 9 2 8 0 . 9 4 1 R i b o n u c l e a s e - 2 . 2 8 8 0 - 0 . 4 2 6 8 1 . 9 6 3 7 0 . 9 9 7 Na „ S 0 i A P r o t e i n 2. 4 A B c R* O v a l b u m i n - 6 . 5 0 9 4 - 5 . 9 7 8 2 7 . 6 9 5 3 0 . 9 9 6 L a c t a l b u m i n - 2 . 6 8 8 9 - 1 . 3 3 1 3 3 . 8 4 1 8 0 . 9 9 9 L y s o z y m e - 3 . 1 7 6 7 - 2 . 9 0 9 0 4 . 5 0 4 7 0 . 9 9 9 M y o g l o b i n - 4 . 0 7 1 7 - 3 . 2 1 4 9 4 . 2 1 5 6 0 . 9 7 5 R i b o n u c l e a s e - 2 . 8 4 9 8 - 1 . 7 1 1 8 3 . 1 3 0 8 0 . 9 8 1 61 T a b l e 4 . 3 ; S l o p e s ( C ) a n d i n t e r c e p t s o f t h e p l o t s o f l o g k v s s a l t m o l a l i t y o f f e r r o u s s u l f a t e , ammonium s u l f a t e a n d s o d i u m s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e . P r o t e i n F e S O , 4 s l o p e i n t e r c e p t ( C M  O v a l b u m i n (>0.8m) 2 . 1 8 9 5 - 2 . 7 3 0 3 0 . 9 9 8 ( a l l p o i n t s ) 1 . 9 7 6 9 - 2 . 5 6 0 2 0 . 9 9 3 L a c t a l b u m i n 1 . 9 6 4 0 - 2 . 0 9 6 9 0 . 9 9 4 L y s o z y m e 1 . 4 7 7 9 - 1 . 1 5 0 4 0 . 9 9 3 M y o g l o b i n 1 . 8 2 0 2 - 2 . 1 8 6 2 0 . 9 8 2 R i b o n u c l e a s e 1 . 4 9 4 2 - 1 . 8 4 7 2 0 . 9 5 0 P r o t e i n ( N H 4 ) 2 S 0 4 s l o p e i n t e r c e p t r a CCJJ O v a l b u m i n (>0.8m) 3 . 3 5 8 6 - 2 . 4 0 8 5 0 . 9 9 7 ( a l l p o i n t s ) 2 . 4 3 7 9 - 2 . 4 0 8 5 0._,~.. L a c t a l b u m i n 2 . 3 5 5 4 - 1 . 6 8 2 6 0 . 9 9 8 L y s o z y m e 1 . 8 8 3 2 - 1 . 4 1 7 0 0 . 9 8 8 M y o g l o b i n 1 . 8 2 2 8 - 2 . 4 5 1 3 0 . 9 9 0 R i b o n u c l e a s e 1 . 7 0 8 6 - 2 . 0 2 6 4 0 . 9 9 8 N a 2 S 0 4 P r o t e i n s l o p e ' C M i n t e r c e p t r a O v a l b u m i n (>0.8m) 4 . 1 7 1 0 - 2 . 4 2 4 1 0 . 9 9 9 ( a l l p o i n t s ) 3 . 2 2 3 0 - 2 . 4 2 4 1 0 . 988 L a c t a l b u m i n 2 . 7 6 5 9 - 1 . 7 3 9 4 0 . 9 9 9 L y s o z y m e 2 . 1 5 3 7 - 1 . 1 0 1 4 0 . 9 9 9 M y o g l o b i n 1 . 8 3 6 1 - 1 . 8 3 1 7 0 . 9 7 6 R i b o n u c l e a s e 1 . 9 3 7 4 - 1 . 7 2 6 5 0 . 9 8 8 62 o b s e r v a t i o n s a r e i n a g r e e m e n t w i t h t h e p r e s e n t s t u d y s h o w i n g t h a t l y s o z y m e a n d o v a l b u m i n a r e m o r e h y d r o p h o b i c t h a n r i b o n u c l e a s e . S l o p e , w h i c h i s t h e t a n g e n t v a l u e , i s s e n s i t i v e t o s m a l l c h a n g e s i n i n c l i n a t i o n . T h u s , e v e n t h o u g h t h e c u r v e s f i t t e d u s i n g m u l t i p l e l i n e a r r e l a t i o n s h i p a n d s i m p l e l i n e a r r e l a t i o n s h i p s o v e r l a p a t h i g h e r s a l t c o n c e n t r a t i o n s , t h e v a l u e s o f C a n d C a r e n o t e d t o b e q u i t e d i f f e r e n t . T h e r e f o r e a q u e s t i o n a r i s e s a s t o w h i c h p a r a m e t e r i s b e s t . T h e c o e f f i c i e n t s o f c o r r e l a t i o n ( r ) o b s e r v e d i n t h e s e a n a ] y s e s a r e a l s o g i v e n i n T a b l e s 4 . 2 a n d 4 . 3 . T h e c o r r e l a t i o n s w e r e b e t t e r i n s i m p l e l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s ( C ) t h a n i n m u l t i p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s (C) e x c e p t f o r o v a l b u m i n . When a l l t h e 2 p o i n t s w e r e c o n s i d e r e d , o v a l b u m i n h a d a h i g h e r R v a l u e w i t h m u l t i p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s . T h e r e f o r e i t a p p e a r s t h a t s i m p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s i s more s u i t a b l e f o r t h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e d a t a c o n d u c t e d a t h i g h e r s a l t c o n c e n t r a t i o n s . E l - R a s s i a n d H o r v a t h (1986b) h a v e a l s o u s e d , b o t h t h e m u l t i p l e a n d l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s t o e v a l u a t e t h e i r d a t a . T h e C a n d C v a l u e s o f c h r o m a t o g r a p h i c r e t e n t i o n a r e b e l i e v e d t o b e r e l a t e d t o t h e h y d r o p h o b i c c o n t a c t a r e a b e t w e e n a p r o t e i n a n d t h e c h r o m a t o g r a p h i c s t a t i o n a r y p h a s e , a n d t h e i n t e r c e p t s o f l o g k v s m r e l a t i o n s h i p s a r e b e l i e v e d t o be r e l a t e d t o t h e s t r e n g t h o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n ( F a u s n a u g h , e t a l , 1 9 8 6 ) . A s i l l u s t r a t e d i n T a b l e 4 . 3 , w i t h a l l t h r e e s a l t t y p e s , l y s o z y m e h a d t h e h i g h e s t i n t e r c e p t v a l u e a n d o v a l b u m i n h a d t h e l o w e s t i n t e r c e p t v a l u e . T h e r e f o r e , i f t h e a b o v e 63 s t a t e m e n t i s t r u e , t h e s t r e n g t h o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n o f l y s o z y m e w i t h t h e s t a t i o n a r y p h a s e i s h i g h e r t h a n t h e s t r e n g t h o f t h e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n o f o v a l b u m i n w i t h t h e s t a t i o n a r y p h a s e e v e n t h o u g h o v a l b u m i n p o s s e s s h i g h e r C a n d C v a l u e s . T h e r e f o r e t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e s u r f a c e h y d r o p h o b i c a r e a i s n o t p r o p o t i o n a l t o t h e s t r e n g t h o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n . A s g i v e n i n T a b l e s 4 . 1 , 4 . 2 a n d 4 . 3 m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e p r o t e i n s do n o t show a n y c o r r e l a t i o n w i t h t h e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s . F o r e x a m p l e , i n t h i s e x p e r i m e n t , a l t h o u g h l y s o z y m e a n d r i b o n u c l e a s e - A h a v e s i m i l a r m o l e c u l a r w e i g h t s , l y s o z y m e h a s h i g h e r C a n d C v a l u e s . B u t a r e l a t i o n s h i p b e t w e e n m o l e c u l a r w e i g h t s a n d t h e s l o p e s o f l o g k v s m g r a p h s h a s b e e n r e p o r t e d b y E l - R a s s i a n d H o r v a t h ( 1 9 8 6 b ) . A s p r e v i o u s l y i n d i c a t e d , a n i n c r e a s e i n t h e a l k y l c h a i n l e n g t h a n d t h e l i g a n d d e n s i t y c a u s e d a n i n c r e a s e d r e t e n t i o n o f c e r t a i n p r o t e i n s o n H I C c o l u m n s . T h e e x t e n t o f t h i s e f f e c t c o u l d b e d e p e n d e n t o n t h e s i z e o f p r o t e i n s , i f one a s s u m e s t h a t p r o t e i n s a r e s p h e r i c a l m o l e c u l e s . S m a l l e r p r o t e i n s w o u l d i n t e r a c t w i t h t h e s u p p o r t o v e r a s m a l l e r s u r f a c e a r e a . S m a l l p r o t e i n s w i t h l e s s s u r f a c e a r e a o f c o n t a c t w i t h t h e c o l u m n m a t e r i a l h a v e shown a d e c r e a s e i n p r o t e i n r e t e n t i o n , w h i c h l e v e l l e d o f f a t l o w e r l i g a n d d e n s i t i e s . L a r g e r p r o t e i n s w i t h h i g h e r c o n t a c t s u r f a c e a r e a e x h i b i t e d a c o n t i n u o u s d e c r e a s e i n p r o t e i n r e t e n t i o n w i t h d e c r e a s i n g l i g a n d d e n s i t y ( F a u s n a u g h e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h u s , e v e n t h o u g h s i z e c a n b e a c o n t r i b u t i n g f a c t o r t o p r o t e i n r e t e n t i o n i n H I C , s u r f a c e 64 h y d r o p h o b i c i t y i s t h e m o s t i m p o r t a n t d e t e r m i n a n t o f p r o t e i n r e t e n t i o n . 4 . 1 . 3 C o m p a r i s o n o f C a n d C f w i t h ANS a n d C P A h y d r o p h o b i c i t y  i n d i c e s ANS a n d CPA h y d r o p h o b i c p r o b e s a r e t h e m o s t w i d e l y u s e d m e t h o d s o f m e a s u r i n g s u r f a c e h y d r o p h o b i c i t y . A l t h o u g h s u c h p r o b e s a r e u s e f u l a s m e a s u r e s o f r e l a t i v e h y d r o p h o b i c i t y t h e p r e c i s e m e a n i n g o f t h e m e a s u r e m e n t i n t e r m s o f p r o t e i n s t r u c t u r e s h a s n o t y e t b e e n d e f i n e d . A s a n a c t u a l e s t i m a t e o f t h e s u r f a c e a r e a o f h y d r o p h o b i c c o n t a c t b e t w e e n a p r o t e i n a n d t h e H I C s t a t i o n a r y p h a s e may b e p o s s i b l e , c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t s w e r e c a l c u l a t e d t o f i n d o u t a r e l a t i o n s h i p b e t w e e n C a n d C p a r a m e t e r s w i t h ANS a n d CPA i n d i c e s . F i g s . 4 . 4 a n d 4 . 5 show t h e p l o t s o f C a n d C v s ANS a n d CPA m e a s u r e m e n t s r e s p e c t i v e l y f o r e x p e r i m e n t s w i t h s o d i u m s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e . I t a p p e a r s f r o m t h e s e f i g u r e s t h a t o v a l b u m i n C a n d C v a l u e s a r e i n g r e a t e s t d i s a g r e e m e n t w i t h t h e ANS r e s u l t s . O v a l b u m i n i s a p r o t e i n known t o b e s u s c e p t i b l e t o s u r f a c e d e n a t u r a t i o n ( W a r n e r , 1954) . T h i s may e x p l a i n t h e h i g h e r C a n d C v a l u e s o b t a i n e d f o r o v a l b u m i n , e v e n t h o u g h i t p o s s e s s e s a l o w e r v a l u e - f o r A N S . C o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t v a l u e s o f ANS v s C a n d ANS v s C , w i t h f e r r o u s s u l f a t e , ammonium s u l f a t e , a n d s o d i u m s u l f a t e w e r e 0 . 0 0 6 8 , 0 . 0 0 4 3 , 0 . 0 3 5 a n d 0 . 1 2 9 7 , 0 . 0 4 1 3 , 0 . 0 4 8 7 2 r e s p e c t i v e l y . When o v a l b u m i n was n o t c o n s i d e r e d r v a l u e o f ANS v s C i m p r o v e d t r e m e n d o u s l y . F o r ammonium s u l f a t e t h e 65 (C) ANS F i g . 4 . 4 ; G r a p h i l l u s t r a t i n g t h e l a c k o f d e p e n d e n c e o f C a n d C ( s o d i u m s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e ) o n A N S . 66 CPA F i g . 4 . 5 ; G r a p h i l l u s t r a t i n g t h e l a c k o f d e p e n d e n c e o f C a n d C ( s o d i u m s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e ) o n C P A . 67 v a l u e c h a n g e d f r o m 0 . 0 4 8 t o 0 . 9 1 4 . A l s o t h e a n a l y s i s o f v a r i a n c e showed t h a t t h e s e v a l u e s a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t a t 5% l e v e l . B u t t h e o m i s s i o n o f o v a l b u m i n d o e s 2 n o t i m p r o v e t h e r v a l u e s o f ANS v s C . T h e r e w e r e no s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n s b e t w e e n CPA v s C o r C . A n o t h e r a t t e m p t was made t o c o r r e l a t e C v a l u e s w i t h B i g e l o w ' s a v e r a g e h y d r o p h o b i c i t y m e a s u r e m e n t s ( F i g . 4 . 6 ) . . . . . 2 H o w e v e r , no s i g n i f i c a n t i m p r o v e m e n t s i n t h e r v a l u e s w e r e o b s e r v e d b y o m i t t i n g o v a l b u m i n . B i g e l o w ' s a v e r a g e h y d r o p h o b i c i t y i s a m e a s u r e o f t o t a l h y d r o p h o b i c i t y . T h e r e f o r e 2 . . . r v a l u e s w e r e n o t e x p e c t e d t o i m p r o v e w i t h t h e o m i s s i o n o f o v a l b u m i n . I n t h e l i t e r a t u r e i t h a s b e e n s t a t e d t h a t h y d r o p h o b i c c h r o m a t o g r a p h y d o e s n o t d e t e r m i n e t h e t o t a l c o n t e n t o f t h e n o n - p o l a r a m i n o a c i d s i n t h e m o l e c u l e b u t r a t h e r m e a s u r e s t h e a b i l i t y o f p r o t e i n s t o t a k e p a r t i n h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s ( K e s h a v a r z a n d N a k a i , 1 9 7 9 ) . 4 . 1 . 4 R e l a t i o n s h i p o f C a n d C t o m o l a l s u r f a c e t e n s i o n  i n c r e m e n t " L y o t r o p y " i s a t e r m w h i c h d e s c r i b e s t h e o r d e r o f e f f e c t i v e n e s s o f i o n s i n i n f l u e n c i n g a l a r g e number o f c h e m i c a l a n d p h y s i c a l phenomena ( R o b i n s o n a n d J e n c k s , 1 9 6 5 ) . A l t h o u g h many a t t e m p t s h a v e b e e n made t o e l u c i d a t e t h e n a t u r e o f l y o t r o p y , b y e v o k i n g h y d r a t i o n t h e o r i e s , e l e c t r o s t a t i c e f f e c t s , a n d v a n d e r W a a l s f o r c e s n o n e h a v e s a t i s f a c t o r i l y a c c o u n t e d f o r e x p e r i m e n t a l o b s e r v a t i o n s ( M e l a n d e r a n d H o r v a t h , 1 9 7 7 ) . H o w e v e r t h e m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t s (<5) o f o 2 + g + + I I I I I 1 1 1 1 1 1 1 0 9 6 1 1 04 1.08 . 1.12 1.16 ,.2 (Thousands) Bigelow's Average Hydrophobicity F i g . 4 . 6 ; G r a p h i l l u s t r a t i n g t h e l a c k o f d e p e n d e n c e o f C ( s o d i u m s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e ) o n B i g e l o w ' s a v e r a g e h y d r o p h o b i c i t y . 69 s a l t s , c a l c u l a t e d b y t h e a b o v e w o r k e r s p r o v i d e d a s t r o n g t h e o r e t i c a l s u p p o r t t o t h e l y o t r o p i c s e r i e s . T h e r e a r e two d i f f e r e n t t y p e s o f s a l t s , " s a l t i n g i n " a n d " s a l t i n g o u t " . " S a l t i n g i n " s a l t s d e p r e s s t h e s u r f a c e t e n s i o n o f w a t e r a n d " s a l t i n g o u t " s a l t s i n c r e a s e i t . T h e r e f o r e a " s a l t i n g o u t " s a l t a t h i g h i o n i c s t r e n g t h i n c r e a s e s t h e v a n d e r W a a l s a t t r a c t i o n b e t w e e n p r o t e i n s a n d a d s o r b e n t a c r o s s t h e m e d i u m , l e a d i n g t o a s s o c i a t i o n , w h i l e " s a l t i n g i n " s a l t s r e d u c e i t ( N a k a i a n d L i - C h a n , 1 9 8 7 ) . A m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t v a l u e o f a b o u t 1 . 5 ( d y n e g / c m m o l ) i o 3 m a r k s t h e d i v i d i n g l i n e b e t w e e n t h e s e two s a l t t y p e s i n t h e l y o t r o p i c s e r i e s . I n t h i s e x p e r i m e n t , o n l y s a l t s o f t h e " s a l t i n g o u t " t y p e (6 > 1 .5 ) w e r e u s e d . F i g s . 4 . 7 a n d 4 . 8 i l l u s t r a t e t h e p l o t s o f p a r a m e t e r C a n d C a g a i n s t t h e m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t (<5) , t h a t h a s t h e d i m e n s i o n s o f ( d y n e g / c m mol ) r e s p e c t i v e l y . T h e v a l u e s o f d w e r e 1 . 5 5 f o r f e r r o u s s u l f a t e , 2 . 1 6 f o r ammonium s u l f a t e , a n d 2 . 7 3 f o r s o d i u m s u l f a t e ( M e l a n d e r a n d H o r v a t h , 1 9 7 7 ) . A c c o r d i n g t o e q u a t i o n 2 . 2 0 , c h r o m a t o g r a p h i c r e t e n t i o n i s n o t o n l y g o v e r n e d b y t h e e l e c t r o s t a t i c a n d h y d r o p h o b i c e f f e c t b u t a l s o b y t h e s a l t m e d i a t e d c h a n g e s i n t h e s u r f a c e t e n s i o n . T h u s a s t r a i g h t l i n e s h o u l d r e s u l t when C a n d C a r e p l o t t e d a g a i n s t 6 . I n t h i s e x p e r i m e n t , s t r a i g h t l i n e r e l a t i o n s h i p s w e r e o b s e r v e d b e t w e e n C v s 6 f o r a l l t h e f i v e p r o t e i n s s t u d i e d ( F i g . 4 . 8 ) . I n t h e c a s e o f C v s 6 h i g h c o r r e l a t i o n s w e r e o b s e r v e d f o r a l l t h e p r o t e i n s e x c e p t f o r r i b o n u c l e a s e . A s i m i l a r e x p e r i m e n t was c o n d u c t e d b y M e l a n d e r e t a l . (1984) w i t h s i m i l a r r e s u l t s . F i g . 4 . 7 ; G r a p h i l l u s t r a t i n g t h e d e p e n d e n c e o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s (C) o n t h e m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t o f s a l t s ( f e r r o u s s u l f a t e , ammonium s u l f a t r e , a n d s o d i u m s u l f a t e ) i n t h e e l u e n t . 71 j 4 I t \ I I I I I 1 I I 1.5 1.7 15 2.1 2.3 2.5 2.7 Molal Surface Tension Increment 3 (10 x dyne g/cm mol) F i g . 4 . 8 ; G r a p h i l l u s t r a t i n g t h e d e p e n d e n c e o f s l o p e ( C ) o n t h e m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t o f s a l t s ( f e r r o u s s u l f a t e , ammonium s u l f a t r e , a n d s o d i u m s u l f a t e ) i n t h e e l u e n t . 72 F i g . 4 . 8 a l s o shows t h a t t h e c h a n g e o f C p e r u n i t c h a n g e i n m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t i s h i g h e r f o r m o r e h y d r o p h o b i c p r o t e i n s t h a n f o r l e s s h y d r o p h o b i c p r o t e i n s ( m y o g l o b i n a n d r i b o n u c l e a s e ) . 4 . 2 P R O T E I N - P R O T E I N I N T E R A C T I O N S 4 . 2 . 1 L y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n F i g . 4 . 9 i l l u s t r a t e s t h e r e t e n t i o n f a c t o r s o f l y s o z y m e -l y s o z y m e i n t e r a c t i o n a t f o u r p H v a l u e s . T h e v a l u e s w e r e o b t a i n e d b y a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y w i t h s t a t i o n a r y p h a s e s h a v i n g l y s o z y m e a s t h e i m m o b i l i z e d l i g a n d a n d w i t h i n c r e a s i n g a n d d e c r e a s i n g s a l t g r a d i e n t s i n t h e e l e c t r o s t a t i c a n d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n modes o f c h r o m a t o g r a p h y . T h e a b o v e g r a p h shows t h a t a t pH 7 . 2 , i s o c r a t i c r e t e n t i o n f a c t o r s f i r s t d e c r e a s e w i t h i n c r e a s i n g s a l t m o l a l i t y u n t i l a minimum i s r e a c h e d , a f t e r w h i c h f u r t h e r i n c r e a s e s i n s a l t m o l a l i t y r e s u l t s i n i n c r e a s e d r e t e n t i o n f a c t o r s , i n a c c o r d a n c e w i t h e q u a t i o n 4 . 1 . A t s u f f i c i e n t l y h i g h s a l t c o n c e n t r a t i o n s , p l o t s o f l o g k v s m y i e l d s t r a i g h t l i n e s w i t h s l o p e s r e p r e s e n t i n g h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s . T h i s b e h a v i o u r was o b s e r v e d a t h i g h e r s a l t c o n c e n t r a t i o n s i n a l l f o u r p H v a l u e s . F i g u r e 4 . 1 0 r e p r e s e n t s t h e p l o t o f l o g k v s l o g m r e l a t i o n s h i p o f l y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n a t p H 7 . 2 w i t h s l o p e s r e p r e s e n t i n g e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s a t s u f f i c i e n t l y l o w s a l t c o n c e n t r a t i o n s . A d e t a i l e d d i s c u s s i o n o f t h e a b o v e d a t a a r e g i v e n i n l a t e r s e c t i o n s . F i g . 4 . 9 ; P l o t o f t h e l o g a r i t h m i c r e t e n t i o n f a c t o r s o f l y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n a g a i n s t t h e s a l t m o l a l i t y ammonium s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e . 74 F i g . 4 . 1 0 ; p l o t o f t h e l o g a r i t h m i c r e t e n t i o n f a c t o r s o f l y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n a g a i n s t t h e l o g a r i t h m i c s a l t m o l a l i t y o f ammonium s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e . 75 4 . 2 . 2 A v i d i n - l v s o z y m e i n t e r a c t i o n S e v e r a l m e t h o d s o f i s o l a t i n g a n d p u r i f y i n g l y s o z y m e a n d a v i d i n h a v e a p p e a r e d i n t h e s c i e n t i f i c l i t e r a t u r e ( D u r a n c e , 1987) . T h e f a c t t h a t a v i d i n was d i f f i c u l t t o s e p a r a t e f r o m l y s o z y m e p r o m p t e d t h e s u g g e s t i o n t h a t some f o r m o f i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e two p r o t e i n s may h a v e o c c u r e d . C e r t a i n p o s i t i v e o b s e r v a t i o n s f o r t h i s s u g g e s t i o n made b y D u r a n c e (1987) a r e g i v e n b e l o w . 1. When p r o t e i n f r a c t i o n s r i c h i n l y s o z y m e a n d a v i d i n w e r e s e p a r a t e d o n a c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e (CMC) c o l u m n , t h e a v i d i n p e a k was w e l l s e p a r a t e d f r o m t h e l y s o z y m e p e a k , a s s e e n i n a A 2 8 0 p r o f i l e . B u t t h e s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S D S - P A G E ) p r o f i l e o f a v i d i n f r a c t i o n s r e v e a l e d a d i s t i n c t p r o t e i n b a n d a t t h e p o s i t i o n t y p i c a l o f l y s o z y m e . 2 . S D S - P A G E o f t h e a v i d i n c o n t a i n i n g f r a c t i o n s f r o m t h e p r i m a r y i s o l a t i o n o n D u o l i t e - C - 4 6 4 a l s o i n d i c a t e d t h a t l y s o z y m e was a m a j o r c o n t a m i n e n t o f a v i d i n . 3 . E l e c t r o p h o r e s i s o f e g g w h i t e w i t h a d d e d a v i d i n showed a d e c r e a s e d m o b i l i t y o f a v i d i n a s c o m p a r e d t o p u r e a v i d i n . I n t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t , a v i d i n - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n was s t u d i e d w i t h a l y s o z y m e i m m o b i l i z e d a f f i n i t y c o l u m n a n d t h e r e s u l t s a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e s 4 . 1 1 a n d 4 . 1 2 . T h e r e s u l t s show a n i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e two p r o t e i n s a t b o t h pH v a l u e s s t u d i e d . U - s h a p e d g r a p h s w e r e o b t a i n e d i n a g r e e m e n t w i t h t h e e q u a t i o n ( 4 . 1 ) when l o g k v s ' m was p l o t t e d . F r o m 76 F i g . 4 . 1 1 ; P l o t o f t h e l o g a r i t h m i c r e t e n t i o n f a c t o r s o f l y s o z y m e - a v i d i n i n t e r a c t i o n a g a i n s t t h e s a l t m o l a l i t y o f ammonium s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e . 77 F i g . 4 . 1 2 ; P l o t o f t h e l o g a r i t h m i c r e t e n t i o n f a c t o r s o f l y s o z y m e - a v i d i n i n t e r a c t i o n a g a i n s t t h e l o g a r i t h m i c s a l t m o l a l i t y o f ammonium s u l f a t e i n t h e m o b i l e p h a s e . 78 t h e s e g r a p h s i t i s c l e a r t h a t b o t h h y d r o p h o b i c a n d e l e c t r o s t a -t i c i n t e r a c t i o n s a r e i n v o l v e d i n a v i d i n - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n . 4 . 2 . 3 E f f e c t o f s a l t a n d p H o n t h e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n  p a r a m e t e r 4 . 2 . 3 . 1 L y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n R e s u l t s o b t a i n e d f r o m t h e s i m p l e a n d m u l t i p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s a r e g i v e n i n T a b l e s 4 . 4 a n d 4 . 5 2 r e s p e c t i v e l y . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e r v a l u e s o f t h e 2 l i n e a r m o d e l ( C ) w e r e h i g h e r t h a n t h e R v a l u e s o f m u l t i p l e r e g r e s s i o n m o d e l ( C ) . T h e r e f o r e , i n t h e c a s e o f l y s - l y s i n t e r a c t i o n , r e s u l t s w e r e i n t e r p r e t e d u s i n g t h e C v a l u e s . I t c a n b e s e e n f r o m T a b l e 4 . 5 a n d F i g . 4 . 9 t h a t t h e C v a l u e s a r e d e c r e a s i n g s l i g h t l y w i t h i n c r e a s i n g p H . T h i s s u g g e s t s i n v i e w o f e q u a t i o n 4 . 1 , t h a t t h e h y d r o p h o b i c c o n t a c t a r e a b e t w e e n t h e p r o t e i n a n d t h e i m m o b i l i z e d l i g a n d d e c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g p H . A c c o r d i n g t o M e l a n d e r e t a l . ( 1 9 8 9 ) , when h y d r o p h o b i c b i n d i n g s i t e s c o n t a i n i o n o g e n i c g r o u p s , C p a r a m e t e r s c a n b e a f f e c t e d b y p H . B u t when t h e s t r e n g t h o f i n t e r a c t i o n was e v a l u a t e d b y t h e l y s o z y m e - l y s o z y m e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t v a l u e s (Kjfp) ( T a b l e 4 . 6 ) , a g r a d u a l d e c r e a s e w i t h i n c r e a s i n g p H , i n d i c a t i n g s t r o n g e r i n t e r a c t i o n s was f o u n d . A s i m i l a r o b s e r v a t i o n h a s b e e n made b y F a u s n a u g h a n d R e g n i e r (1986) when l y s o z y m e was c h r o m a t o g r a p h e d o n a h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c o l u m n a t v a r y i n g pH v a l u e s . T h e y a l s o n o t e d a n i n c r e a s e i n t h e s t r e n g t h o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n 79 T a b l e 4 . 4 ; A , B a n d C p a r a m e t e r s o f l y s o z y m e - l y s o z y m e a n d l y s o z y m e - a v i d i n i n t e r a c t i o n s . p H A B C R 1 7 . 2 - 1 . 2 4 5 5 - 0 . 1782 1 . 1 5 0 5 0 .942 6 . 8 - 1 . 5 2 1 8 - 0 . 0269 1 . 3 6 2 7 0 . 9 9 3 L y s - L y s 5 . 0 - 2 . 2 8 3 9 - 0 . 3042 1 . 9 1 4 5 0 . 9 9 5 3 . 2 - 2 . 3 9 5 7 0 . 3422 1 . 6 1 3 3 0 . 9 8 5 7 . 8 - 1 . 6 7 6 4 - 0 . 5 1 3 5 1 . 4 5 7 6 0 . 9 9 1 A v i - L y s 6 . 5 - 1 . 0 9 1 0 - 0 . 0 9 7 2 1 . 2 0 5 7 0 . 9 9 8 T a b l e 4 . 5 ; S l o p e s ( C ) a n d i n t e r c e p t s o f t h e p l o t s o f l y s o z y m e - l y s o z y m e a n d l y s o z y m e - a v i d i n i n t e r a c t i o n s . p H S l o p e ( C ) I n t e r c e p t r a 7 . 2 1 . 0 5 6 6 - 1 . 4 9 1 2 0 . 9 6 4 6 . 8 1 .3522 - 1 . 5 1 1 8 0 . 9 9 6 L y s - L y s 5 . 0 1 . 7 8 5 1 - 2 . 1 5 1 4 0 . 9 9 8 3 . 2 1 . 7 3 0 9 - 2 . 5 1 2 8 0 . 9 9 3 7 . 8 0 . 9 4 4 6 - 1 . 1 9 9 6 0 . 9 9 0 A v i - L y s 6 . 5 0 . 9 7 1 1 - 0 . 9 2 3 6 0 . 9 5 4 T a b l e 4 . 6 ; D i s s o c i a t i o n e q u i l i b r i u m c o n s t a n t s (K o f " l y s o z y m e - l y s o z y m e a n d l y s o z y m e - a v i ; i n t e r a c t i o n s . pH V m (ml) V (ml) V t (ml) (mcr/ml) 3 . 2 6 . 1 9 6 7 .04 9 . 4 0 8 0 . 2 6 0 2 5 . 0 6 . 1 9 6 7 . 0 4 1 2 . 0 5 0 . 1 2 2 9 L y s -- l y s * 6 . 8 6 . 196 7 . 2 1 1 4 . 9 5 0 . 0 9 5 6 7 . 2 6 . 1 9 6 7 . 2 1 1 7 . 2 3 0 . 0 7 3 8 A v i - - l y s * * 6 . 5 7 . 8 8 . 4 5 8 . 4 5 9 . 8 5 8 9 . 8 5 8 1 6 . 9 0 1 4 . 4 5 0 . 1 4 5 9 0 . 2 2 3 8 v a l u e s a r e c a l c u l a t e d a t l . l m s a l t m o l a l i t y ^ r = v a l u e s a r e c a l c u l a t e d a t 0 .9m s a l t m o l a l i t y 82 ( i . e . a n i n c r e a s e i n i n t e r c e p t ) w i t h i n c r e a s i n g p H when l o g k v s m was p l o t t e d . B u t no c h a n g e s w e r e o b s e r v e d i n t h e s u r f a c e a r e a o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n . A c c o r d i n g t o t h e i r s u g g e s t i o n , c h a n g e s i n t h e s t r e n g t h o f i n t e r a c t i o n w e r e d u e t o c h a n g e s i n t h e i o n i z a t i o n s t a t e o f a m i n o a c i d s i n t h e c o n t a c t s u r f a c e a r e a . W i t h i n c r e a s i n g p H , i o n i z a t i o n s t a t e o f l y s o z y m e d e c r e a s e d a n d h e n c e t h e s t r e n g t h o f i n t e r a c t i o n i n c r e a s e d . T h i s c o u l d b e t h e r e a s o n f o r t h e p r e s e n t o b s e r v a t i o n a l s o . B u t , i t i s d i f f i c u l t t o g i v e a r e a s o n a b l e e x p l a n a t i o n f o r t h e r e d u c t i o n i n t h e s u r f a c e a r e a o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n w i t h i n c r e a s i n g p H . I t a p p e a r s t h a t h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s p l a y a d o m i n a n t r o l e i n l y s o z y m e d i m e r i z a t i o n a t h i g h e r pH v a l u e s . 4 . 2 . 3 . 2 L y s o z y m e - a v i d i n i n t e r a c t o n F i g 4 . 1 1 i l l u s t r a t e t h e l o g k v s m p l o t o f a v i d i n -l y s o z y m e i n t e r a c t i o n a n d t h e c a l c u l a t e d C a n d C v a l u e s a r e g i v e n i n T a b l e s 4 . 4 a n d 4 . 5 . I t c a n b e s e e n f r o m t h e s e r e s u l t s 2 . 2 t h a t t h e R v a l u e s o f C a r e h i g h e r t h a n t h e r v a l u e s o f C . R e s u l t s show t h a t , t h e C v a l u e s a r e n o t v a r y i n g much w i t h t h e c h a n g i n g p H . On t h e o t h e r h a n d C v a l u e s show a s m a l l e r r e d u c t i o n i n t h e s u r f a c e a r e a o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n w i t h d e c r e a s i n g p H . B u t t h e s t r e n g t h o f i n t e r a c t i o n , e v a l u a t e d b y K ^ , v a l u e s ( T a b l e 4 . 6 ) a n d b y t h e i n t e r c e p t o f t h e l i n e t a n g e n t t o t h e h y d r o p h o b i c p o r t i o n o f t h e l o g k v s m p l o t showed s t r o n g e r i n t e r a c t i o n s a t l o w p H . A c c o r d i n g t o t h i s o b s e r v a t i o n s t r e n g t h o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n i s i n c r e a s i n g a t l o w p H . 83 4 . 2 . 4 E f f e c t o f s a l t a n d p H o n e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n  p a r a m e t e r Many p r o t e i n s a r e r e g a r d e d a s s p h e r i c a l m o l e c u l e s w i t h r a n d o m l y d i s p e r s e d c h a r g e s o n t h e p r o t e i n s u r f a c e . I f t h e c h a r g e d i s t r i b u t i o n o n t h e p r o t e i n m o l e c u l e i s n o t s y m m e t r i c a l , i t w i l l l e a d t o a n u n e v e n e l e c t r o s t a t i c p o t e n t i a l , d e p e n d i n g o n t h e o r i e n t a t i o n o f t h e m o l e c u l e w i t h r e s p e c t t o t h e c h a r g e d g r o u p s o n t h e m o l e c u l e ( K o p a c i e w i c z , 1 9 8 3 ) . T h e r e f o r e , u n l e s s t h e c h a r g e d g r o u p s o n t h e p r o t e i n m o l e c u l e i s h i g h l y a s y m m e t r i c a l , o n l y a f r a c t i o n o f t h e t o t a l c h a r g e o n t h e m o l e c u l e c a n i n t e r a c t w i t h t h e s t a t i o n a r y p h a s e ( M e l a n d e r e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h u s , B i s d e p e n d e n t o n t h e e f f e c t i v e c h a r g e o f t h e p r o t e i n m o l e c u l e a n d n o t o n i t s n e t c h a r g e ( M e l a n d e r e t a l . , 1 9 8 9 ) . V a l u e s o f B f o r a g i v e n p r o t e i n w e r e e x p e c t e d t o b e d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e s u r f a c e d e n s i t y o f i o n i z e d l i g a t e s o n t h e s t a t i o n a r y p h a s e s u r f a c e a n d t h e c h a r g e o n t h e p r o t e i n s u r f a c e , a n d i n v e r s e l y p r o p o t i o n a l t o t h e c h a r g e o n t h e s a l t c o - i o n ( M e l a n d e r e t a l . , 1 9 8 9 ) . T h u s , i n l y s o z y m e -l y s o z y m e a n d a v i d i n - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n s , B i s a m e a s u r e o f s u r f a c e c h a r g e a n d d e n s i t y o f i o n i z e d l i g a t e s o n l y s o z y m e a n d a v i d i n m o l e c u l e s . T h e n e t c h a r g e o f a p r o t e i n a t i t s p i i s z e r o a n d i n c r e a s i n g l y p o s i t i v e a s t h e pH f a l l s o r i n c r e a s i n g l y n e g a t i v e a s t h e p H r i s e s . B u t c e r t a i n s t u d i e s d o n e w i t h i o n e x c h a n g e r e s i n s h a v e i n d i c a t e d , t h a t e v e n a t t h e i s o - e l e c t r i c p o i n t p r o t e i n s h a v e many c h a r g e d g r o u p s o n t h e i r s u r f a c e s ( G o r b a n o v e e t a l . , 1 9 8 6 ) . I n t h e pH r a n g e o f t h i s s t u d y , b o t h 84 a v i d i n (p l=10 ) a n d l y s o z y m e ( p l = l l ) a r e p o s i t i v e l y c h a r g e d . 4 . 2 . 4 . 1 L y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n I n l y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n i t was p o s s i b l e t o o b t a i n a n e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r o n l y a t pH 7 .2 ( T a b l e 4 . 7 a n d F i g . 4 . 1 0 ) . B e l o w t h a t p H , t h e r e w e r e no e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s d e t e c t e d . E v e n a t t h a t p H , t h e s l o p e o f l o g k v s l o g m c u r v e was v e r y l o w c o m p a r e d t o t h e C p a r a m e t e r . Z e r o e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s a t l o w p H may b e d u e t o h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f p o s i t i v e c h a r g e s o n l y s o z y m e m o l e c u l e s , s u c h t h a t t h e y r e p e l e a c h o t h e r . T h e r e f o r e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s m u s t p l a y a d o m i n e n t r o l e i n l y s - l y s i n t e r a c t i o n s e s p e c i a l l y a t l o w p H . 4 . 2 . 4 . 2 A v i d i n - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n T h e o b s e r v e d d e p e n d e n c e o f B o n t h e e l u e n t p H i s d e p i c t e d i n T a b l e 4 . 7 a n d F i g . 4 . 1 2 . I n a v i d i n - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n , p a r a m e t e r B i n c r e a s e d i n a b s o l u t e v a l u e w i t h i n c r e a s i n g p H a n d seemed t o b e m o r e h i g h l y d e p e n d e n t o n pH t h a n C . A s M e l a n d e r e t a l . (1989) h a v e i n d i c a t e d , c h a n g e s i n B a n d C p a r a m e t e r s c o u l d o c c u r w i t h c h a n g e s i n p H d u e t o t h e l a r g e c h a n g e s i n a n i o n i c a n d c a t i o n i c s i t e s o n t h e m a c r o m o l e c u l e . I n t h e two pH v a l u e s o f t h i s s t u d y l y s o z y m e a n d a v i d i n w e r e m o r e h i g h l y c h a r g e d a t pH 6 . 5 t h a n a t pH 7 . 8 . T h e r e f o r e t h e t e n d e n c y o f a v i d i n t o i n t e r a c t w i t h l y s o z y m e may b e g r e a t e r a t pH 7 . 8 t h a n a t pH 6 . 5 . T h i s may l e a d t o a h i g h e r B v a l u e a t a h i g h e r p H . T a b l e 4 . 7 ; E l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s (B) o f l y s o z y m e - l y s o z y m e a n d l y s o z y m e - a v i d i n i n t e r a c t i o n s . p H B L y s - L y s 7 . 2 - 0 . 1 7 8 2 A v i - L y s 7 . 8 - 0 . 5 1 3 5 6 . 5 - 0 . 0 9 7 2 86 4 . 2 . 5 E f f e c t o f p H o n d i m e r i z a t i o n o f l y s o z y m e : A c o m p a r i s o n o f v a l u e s w i t h s e d i m e n t a t i o n e q u i l i b r i u m c o n s t a n t s S o p h i a n o p o u l o s a n d V a n H o l d e (1964) h a v e p r o p o s e d t h a t d i m e r i z a t i o n i n s o l u t i o n s o f l y s o z y m e o c c u r s i n t h e p H r a n g e o f 5 -9 a n d p o l y m e r i z a t i o n o c c u r s a b o v e p H 9 . T h e s e c o n c l u s i o n s w e r e b a s e d o n t h e s e d i m e n t a t i o n e q u i l i b r i u m s t u d i e s p e r f o r m e d w i t h l y s o z y m e s o l u t i o n s . T h e y a l s o d i s c o v e r e d t h a t d i m e r i z a t i o n was f a v o u r e d when monomers l o s t p r o t o n s a n d t h u s t h e p r o c e d u r e was p H d e p e n d e n t . I n t h e p H r a n g e o f t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t ( 3 . 2 - 7 . 2 ) a c c o r d i n g t o S o p h i a n o p o u l o s a n d V a n - H o l d e , l y s o z y m e monomers w e r e p r e s e n t a t pH 3 . 2 a n d d i m e r s w e r e p r e s e n t i n t h e o t h e r t h r e e p H v a l u e s . T h e a p p a r e n t d i s s o c i a t i o n e q u i l i b r i u m c o n s t a n t s c a l c u l a t e d a t t h e f o u r pH v a l u e s a r e g i v e n i n T a b l e 4 . 6 . L o w e r v a l u e s o f i n d i c a t e d s t r o n g e r i n t e r a c t i o n s b e t w e e n m o b i l e a n d i m m o b i l i z e d p r o t e i n s . T h e r e s u l t s show a d e c r e a s e i n v a l u e s w i t h i n c r e a s i n g p H i n d i c a t i n g s t r o n g e r i n t e r a c t i o n s b e t w e e n l y s o z y m e m o l e c u l e s . A r e a s o n f o r t h i s may b e d i m e r i z a t i o n . D i m e r i z a t i o n e q u i l i b r i u m c o n s t a n t s o b t a i n e d b y S o p h i a n o p o u l o s a n d V a n H o l d e (19 64) a t t h r e e p H v a l u e s 6 . 5 1 , 7 . 9 5 , a n d 9 . 0 w e r e 6 . 2 3 , 3 . 6 6 , a n d 2 . 9 g / l O O m l r e s p e c t i v e l y . T h e s e r e s u l t s a l s o show a d e c r e a s e w i t h i n c r e a s i n g p H a n d a r e t h e r e f o r e i n a g r e e m e n t w i t h t h e p r e s e n t s t u d y . T h e r e a s o n f o r t h e r e v e r s e t r e n d o b s e r v e d i n a v i d i n -l y s o z y m e i n t e r a c t i o n , t h a t i s a n i n c r e a s e i n v a l u e s w i t h d e c r e a s i n g p H , i s m o r e d i f f i c u l t t o e x p l a i n f r o m t h e p r e s e n t 87 e x p e r i m e n t . I t may b e d u e t o a c h a n g e i n t h e c o n f i g u r a t i o n o f a v i d i n o r l y s o z y m e . I n g r a h a m e t a l . (1985) i n d i c a t e d t h a t l y s o z y m e m o l e c u l e s do n o t u n d e r g o l a r g e s t r u c t u r a l c h a n g e s a s t h e y move t h r o u g h t h e c o l u m n d u r i n g H I C a n d R P C . T h e r e f o r e c h a n g e s i n a v i d i n may c a u s e v a l u e s t o i n c r e a s e w i t h i n c r e a s i n g p H . 88 5. CONCLUSIONS T h e e f f e c t o f s a l t s o n h y d r o p h o b i c a n d e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s o f p r o t e i n s w i t h c h r o m a t o g r a p h i c s t a t i o n a r y p h a s e a n d t h e e f f e c t o f s a l t o n p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s w e r e i n v e s t i g a t e d i n t h i s s t u d y . M e l a n d e r a n d H o r v a t h ' s r e c e n t l y d e v e l o p e d c h r o m a t o g r a p h i c m o d e l was u s e d f o r t h i s p u r p o s e . Two m e t h o d s o f e v a l u a t i n g h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n p a r a m e t e r s w e r e e m p l o y e d , v i z . a) m u l t i p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s t o c a l c u l a t e C v a l u e s a c c o r d i n g t o t h e t h r e e p a r a m e t e r m o d e l , b) s i m p l e r e g r e s s i o n a n a l y s i s t o c a l c u l a t e s l o p e s ( C ) , a c c o r d i n g t o t h e l i n e a r m o d e l a t h i g h e r s a l t c o n c e n t r a t i o n s ( > 0 . 3 m ) . C o m p a r i s o n o f c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t s o b t a i n e d f o r C a n d C v a l u e s showed t h a t C v a l u e s a r e s u i t a b l e t o e v a l u a t e e x p e r i m e n t s c a r r i e d o u t o n l y a t h i g h e r s a l t c o n c e n t r a t i o n s ( > 0 . 3 m ) , a n d C v a l u e s a r e s u i t a b l e t o e v a l u a t e e x p e r i m e n t s d o n e a t b o t h l o w e r a n d h i g h e r s a l t c o n c e n t r a t i o n s a n d h a v i n g p r o m i n a n t U s h a p e c u r v e s ( e g . a v i - l y s i n t e r a c t i o n ) . T h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t l a c t a l b u m i n , l y s o z y m e a n d o v a l b u m i n a r e m o r e h y d r o p h o b i c t h a n m y o g l o b i n a n d r i b o n u c l e a s e . T h e o b s e r v e d h i g h c o r r e l a t i o n s o f C a n d C v a l u e s w i t h m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t s (6) c o n f i r m e d t h e v i e w , t h a t t h e d e p e n d e n c e o f r e t e n t i o n i n H I C i s r e l a t e d t o t h e s a l t 89 c o n c e n t r a t i o n a n d m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t o f s a l t s . F u r t h e r m o r e , i t was o b s e r v e d t h a t t h e p r o t e i n s w i t h h i g h e r C v a l u e s h a d h i g h e r s l o p e s when C was p l o t t e d a g a i n s t 6. T h i s i n d i c a t e d t h a t m o r e h y d r o p h o b i c p r o t e i n s a r e m o r e s e n s i t i v e t o m o l a l s u r f a c e t e n s i o n i n c r e m e n t s t h a n l e s s h y d r o p h o b i c p r o t e i n s . T h e a t t e m p t made t o c o r r e l a t e C a n d C v a l u e s w i t h A N S , CPA a n d B i g e l o w ' s a v e r a g e h y d r o p h o b i c i t y i n d i c e s s h o w e d no c l e a r c o r r e l a t i o n s . O m i s s i o n o f o v a l b u m i n i m p r o v e d t h e c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t o f C w i t h ANS t o a 5% s i g n i f i c a n c e l e v e l . L a c k o f c o r r e l a t i o n w i t h a v e r a g e h y d r o p h o b i c i t y i n d i c a t e d t h a t C o r C a r e n o t m e a s u r e s o f t o t a l h y d r o p h o b i c i t y . A n a t t e m p t was made t o d e v e l o p a new c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d t o q u a n t i f y b o t h h y d r o p h o b i c a n d e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s i n p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s u s i n g t h e same m o d e l . T h e s t u d y d o n e o n l y s o z y m e d i m e r i z a t i o n i n d i c a t e d t h a t l y s o z y m e - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n was p r e d o m i n a n t l y h y d r o p h o b i c i n t h e p H r a n g e o f t h i s s t u d y . S l i g h t e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s w e r e o b s e r v e d o n l y a t pH 7 . 2 . I n t h e c a s e o f a v i d i n - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n , b o t h e l e c t r o s t a t i c a n d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s w e r e o b s e r v e d . A t b o t h p H v a l u e s s t u d i e d , a g r e a t e r c h a n g e was o b s e r v e d i n t h e s t r e n g t h o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n t h a n i n t h e s u r f a c e a r e a o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n . A l s o , p a r a m e t e r B seemed t o b e m o r e d e p e n d e n t o n pH t h a n p a r a m e t e r C . T h e r e s u l t s a l s o i n d i c a t e d t h a t t h e r e a r e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n l y s o z y m e a n d 90 a v i d i n i n t h e two pH v a l u e s s t u d i e d . F u r t h e r m o r e , t h e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y m e t h o d d e v e l o p e d i n t h i s r e s e a r c h may b e a u s e f u l t e c h n i q u e f o r s t u d i e s o n l i p i d - p r o t e i n , c a r b o h y d r a t e -p r o t e i n , e t c . i n t e r a c t i o n s u s i n g p r o p e r l i g a n d b i n d i n g t e c h n i q u e s . 6 . B I B L I O G R A P H Y 91 B i g e l o w , C . C . ( 1 9 6 7 ) . On t h e a v e r a g e h y d r o p h o b i c i t y o f p r o t e i n s a n d t h e r e l a t i o n b e t w e e n i t a n d p r o t e i n s t r u c t u r e . J . T h e o r e t . B i o l . , 1 6 : 1 8 7 . B u l l , H . B . a n d B r e e s e , K . ( 1 9 7 4 ) . S u r f a c e t e n s i o n o f a m i n o a c i d s o l u t i o n s : A h y d r o p h o b i c i t y s c a l e o f a m i n o a c i d r e s i d u e s . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . , 1 6 1 : 6 6 5 . C h a i k e n , I . M . ( 1 9 7 9 ) . Q u a n t i t a t i v e u s e s o f a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y . A n a l . B i o c h e m . , 9 7 : 1 . C h a i k e n , I . M . ( 1 9 8 6 ) . A n a l y t i c a l a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y i n s t u d i e s o f m o l e c u l a r r e c o g n i t i o n i n b i o l o g y : A r e v i e w . J . o f C h r o m a t o g . , 3 7 6 : 1 1 . C h o t h i a , C . ( 1 9 7 6 ) . T h e n a t u r e o f t h e a c c e s s i b l e a n d b u r i e d s u r f a c e s i n p r o t e i n s . J . M o l . B i o l . , 1 0 5 : 1 . D ' a m b r o i s e , M . a n d H a n a i , T . ( 1 9 8 2 ) . H y d r o p h o b i c i t y a n d r e t e n t i o n i n r e v e r s e d p h a s e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . J . o f L i q u i d C h r o m a t o g . , 5 ( 2 ) : 2 2 9 . D a y h o f f , M . 0 . , S c h w a r t z , R . M . a n d O r c u t t , B . C . ( 1 9 7 9 ) . I n " A t l a s o f p r o t e i n s e q u e n c e a n d s t r u c t u r e " . 1 9 7 8 . V o l . 5 , s u p p l . 3 , N a t i o n a l B i o m e d i c a l R e s e a r c h F o u n d a t i o n , S i l v e r S p r i n g , p . 3 4 5 . D u n n , B . M . a n d C n a i k e n , I . R . ( 1 9 7 4 ) . Q u a n t i t a t i v e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y . D e t e r m i n a t i o n o f b i n d i n g c o n s t a n t s b y e l u t i o n w i t h c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r s . P r o c . N a t . A c a d . S c i . , ( U S A ) , 7 1 ( 6 ) : 2 3 8 2 . D u r a n c e , T . D . ( 1 9 8 7 ) . I s o l a t i o n o f a v i d i n a n d l y s o z y m e f r o m e g g a l b u m e n . P h . D T h e s i s . U n i v . o f B r i t i s h C o l u m b i a . D u r a n c e T . D . a n d N a k a i S . ( 1 9 8 7 ) . S i m u l t a n e o u s i s o l a t i o n o f a v i d i n a n d l y s o z y m e f r o m e g g a l b u m e n . J . F o o d S c i . , 5 4 ( 4 ) : 1 0 9 6 . E h r e n p r e i s , S . a n d W a r n e r , R . C . ( 1 9 5 6 ) . T h e i n t e r a c t i o n o f c o -n a l b u m i n a n d l y s o z y m e . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . , 6 1 : 3 8 . E i s e n b e r g , D . , W e i s s , R . M . T e r w i l l e g e r , T . C . a n d W i l s o n , W. ( 1 9 8 2 ) . F a r a d a y Symp. Chem. S o c , 1 7 : 1 0 9 . E l - R a s s i , Z . a n d H o r v a t h , C s . ( 1 9 8 6 a ) . M e t a l c h e l a t e i n t e r a c t i o n c h r o m t o g r a p h y o f p r o t e i n s w i t h i m i n o d i -a c e t i c a c i d b o n d e d s t a t i o n a r y p h a s e s o n s i l i c a s u p p o r t . J . C h r o m a t o g . , 3 5 9 : 2 4 1 . 92 E l - R a s s i , Z . a n d H o r v a t h , C s . ( 1 9 8 6 b ) . H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f t - R N A ' s a n d p r o t e i n s . J . L i q u i d C h r o m a t o g . , 9 ( 1 5 ) : 3 2 4 5 . F a s s i n a , G . a n d C h a i k e n , I . M . ( 1 9 8 7 ) . A n a l y t i c a l h i g h p e r f o r m a n c e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y . A d v . i n C h r o m a t o g . , 2 7 : 2 4 7 . F a u s n a u g h , J . L . , K e n n e d y , L . A . a n d R e g n i e r , F . E . ( 1 9 8 4 ) . C o m p a r i s o n o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n a n d r e v e r s e d p h a s e c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e i n s . J . C h r o m a t o g . , 3 1 7 : 1 4 1 . F a u s n a u g h , I . L . a n d R e g n i e r , F . E . ( 1 9 8 6 ) . S o l u t e a n d m o b i l e p h a s e c o n t r i b u t i o n s t o r e t e n t i o n i n h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e i n s . J . C h r o m a t o g . , 3 5 9 : 1 3 1 . F e n d l e r , J . , Nome, F . a n d N a g y v a r y , J . ( 1 9 7 5 ) . C o m p a r t m e n t a l i z a t i o n o f a m i n o a c i d s i n s u r f a c t a n t a g g r e g a t e s . J . M o l . E v o l . 6 : 2 1 5 . F o r s y t h e , R . H . a n d F o s t e r , J . F . ( 1 9 5 0 ) . E g g w h i t e p r o t e i n s . J . B i o l . C h e m . , 1 8 4 : 3 7 7 . F r a n k , S . F a n d E v a n s , M . W. ( 1 9 4 5 ) . F r e e v o l u m e a n d e n t r o p y i n c o n d e n s e d s y s t e m s . I I I . E n t r o p y i n b i n a r y l i q u i d m i x t u r e s ; P a r t i a l m o l a l e n t r o p y i n d i l u t e s o l u t i o n s ; S t r u c t u r e a n d t h e r m o d y n a m i c s i n a q u e o u s e l e c t r o l y t e s . T h e J . Chem. P h y s . , 1 3 ( 1 1 ) : 5 0 7 . F r e e m a n , D . H . ( 1 9 7 2 ) . I n t e r a c t i v e g e l n e t w o r k s . T r e a t m e n t o f s i m p l e c o m p l e x a t i o n a n d m a k i n g p h e n o m e n a . A n a l . C h e m . , 4 4 ( 1 ) : 1 1 7 . F r i e d e n , C . a n d N i c h o l , L . W. ( 1 9 8 1 ) . P r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s . J o h n W i l e y a n d S c i e n c e , New Y o r k , p . 8 . F u g i t a , T . , I w a s a , J . , H a n c h , C . ( 1 9 6 4 ) . A new s u b s t i t u e n t c o n s t a n t . , 7T d e r i v e d f r o m p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t . J . Am. Chem. S o c , 8 6 : 5 1 7 5 . G a g o , F . , A l v a r e z - B u i l l a , J . a n d E l g u e r o , J . ( 1 9 8 7 ) . H y d r o p h o b i c i t y m e a s u r e m e n t s b y H P L C . A new a p p r o a c h t o ft c o n s t a n t s . J . L i q u i d C h r o m a t o g . 1 0 ( 6 ) : 1 0 3 1 . G a r i b a l d i , J . A . , D o n o v a n , J . W. a n d D a v i s , J . G . ( 1 9 6 8 ) . H e a t d e n a t u r a t i o n o f t h e o v o m u c i n - l y s o z y m e e l e c t r o s t a t i c c o m p l e x - A s o u r c e o f damage t o t h e w h i p p i n g p r o p e r t i e s o f p a s t e u r i z e d e g g w h i t e . J . F o o d S c i . , 3 3 : 5 1 4 . G o h e e n , S . a n d E n g e l h o r n , S . C . ( 1 9 8 4 ) . H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . J . 93 C h r o m a t o g . , 3 1 7 : 5 5 . G o r b a n o v , A . A . , L u k y a n o v , A . Y e . , P a s e c h n i k , V . A . a n d V a k h r u s h e v , A . V . ( 1 9 8 6 ) . C o m p u t e r s i m u l a t i o n o f p r o t e i n a d s o r p t i o n a n d c h r o m a t o g r a p h y . J . C h r o m a t o g . , 3 6 5 . G o r d o n , W . G . ( 1 9 7 1 ) . A l p h a l a c t a l b u m i n . I n " M i l k P r o t e i n s " . Mc K e n z i e , H . A . E d . A c a d e m i c P r e s s , N . Y a n d L o n d o n , p . 3 4 6 . G r e e n , N . M . ( 1 9 7 5 ) . A v i d i n . A d v . P r o t . C h e m . , 2 9 : 8 5 . H e r t z , R . , R a p s , R . M . a n d S e b r e l l , W. H . ( 1 9 4 3 ) . I n d u c t i o n o f a v i d i n f o r m a t i o n i n t h e a v i a n o v i d u c t b y s t i l b e s t r o l p r o g e s t e r o n e . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . , 5 2 : 1 5 . H j e r t e n , S . , R o s e n g r e n , J . a n d P a h l m a n , S . ( 1 9 7 4 ) . H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y : T h e s y n t h e s i s a n d t h e u s e o f some a l k y l a n d a r y l d e r i v a t i v e s o f a g a r o s e . J . C h r o m a t o g . , 1 0 1 : 2 8 1 . H o f s t e e , B . H . J . ( 1 9 7 5 ) . S a l t s t a b l e - h y d r o p h o b i c v e r s u s s a l t - r e v e r s i b l e e l e c t r o s t a t i c e f f e c t s i n a d s o r p t i v e p r o t e i n b i n d i n g . I n " E n z . E n g . " P y e , E . K . a n d W e e t a l , H . H . E d s . V o l . 3 , p . 3 4 7 . H o r v a t h , C s . , M e l a n d e r , W. a n d M o l n a r , I . ( 1 9 7 6 ) . S o l v o p h o b i c i n t e r a c t i o n s i n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y w i t h n o n - p o l a r s t a t i o n a r y p h a s e s . J . C h r o m a t o g . , 1 2 5 : 1 2 9 . I n g r a h a m , R . H . , L a u , S . Y . M . , T a n e j a , A . K . a n d H o d g e s , R . S . ( 1 9 8 5 ) . D e n a t u r a t i o n a n d t h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e o n h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n a n d r e v e r s e d p h a s e h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e i n s . B i o g e l T S K - P h e n y l - 5 P W c o l u m n . J . C h r o m a t o g . , 3 2 7 : 7 7 . J a n i n , J . ( 1 9 7 9 ) . S u r f a c e a n d i n s i d e v o l u m e s i n g l o b u l a r p r o t e i n s . N a t u r e ( L o n d o n ) . 2 7 7 : 4 9 1 . J o n e s , D . D . ( 1 9 7 5 ) . A m i n o a c i d p r o p e r t i e s a n d s i d e c h a i n o r i e n t a t i o n i n p r o t e i n s : a c r o s s c o r r e l a t i o n a p p r o a c h . J . T h e o r . B i o l . , 5 0 : 1 6 7 . K a s a i , K . a n d I s h i i , S . ( 1 9 7 5 ) . Q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f t r i p s i n . A new t e c h n i q u e f o r i n v e s t i g a t i o n o f p r o t e i n - l i g a n d i n t e r a c t i o n . J . B i o c h e m i s t r y , 7 7 : 2 6 1 . K a s a i , K . , O d a , Y . , N i s h i k a t a , M . a n d I s h i i , S . I . ( 1 9 8 6 ) . F r o n t a l a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y : T h e o r y f o r i t s a p p l i c a t i o n t o s t u d i e s o n s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s o f b i o m o l e c u l e s . J . C h r o m a t o g . , 3 7 6 : 3 3 . 94 K a t o , A . , I m o t o , T . a n d Y i g i s h i t a , K . ( 1 9 7 5 ) . T h e b i n d i n g g r o u p s i n o v o m u c i n - l y s o z y m e i n t e r a c t i o n . A g r i c . B i o l . C h e m . , 3 9 ( 2 ) : 5 4 1 . K a t o , Y . , K i t a m u r a , T . a n d H a s h i m o t o , T . ( 1 9 8 3 ) . H i g h p e r f o r m a n c e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e i n s . J . C h r o m a t o g . , 2 6 6 : 4 9 . K a t o , Y . ( 1 9 8 7 ) . H i g h p e r f o r m a n c e h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e i n s . A d v . i n C h r o m a t o g . , 2 6 : 9 7 . K e s h a v a r z , E . a n d N a k a i , S . ( 1 9 7 9 ) . T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n h y d r o p h o b i c i t y a n d i n t e r f a c i a l t e n s i o n o f p r o t e i n s . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a , 576 :2 6 9 . K l o t z , I . M . ( 1 9 5 3 ) . P r o t e i n i n t e r a c t i o n s . I n " T h e p r o t e i n s " . N e u r a t h , H . , a n d B a i l y , K . E d s , A c a d e m i c P r e s s I n c . New Y o r k , p . 7 2 7 . K o p a c i e w i c z , W . , R o u n d s , M . A . , F a u s n a u g h , J . a n d R e g n i e r , F . E . ( 1 9 8 3 ) . R e t e n t i o n m o d e l f o r h i g h p e r f o r m a n c e i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y . J . C h r o m a t o g . , 2 6 6 : 3 . K r i g b a u m , W . R . a n d K o m o r i y a , A . ( 1 9 7 9 ) . L o c a l i n t e r a c t i o n s a s a s t r u c t u r e d e t e r m i n e n t f o r p r o t e i n m o l e c u l e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a , 5 7 6 : 2 0 4 . K y t e , J . a n d D o o l i t t l e , R . F . ( 1 9 8 2 ) . A s i m p l e m e t h o d f o r d i s p l a y i n g t h e h y d r o p h o b i c c h a r a c t e r o f a p r o t e i n . J . M o l . B i o l . , 1 5 7 : 1 0 5 . L a r s s o n . P . O . , G l a d , M . , H a n s s o n , L . , M a n s s o n , M - 0 . , O h l s o n , S . a n d M o s b a c h , K . ( 1 9 8 1 ) . H i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . A d v . i n C h r o m a t o g . , 2 1 : 4 1 . L e e , B . a n d R i c h a r d s , F . M . ( 1 9 7 0 ) . T h e i n t e r p r e t a t i o n o f p r o t e i n s t r u c t u r e s : E s t i m a t i o n o f s t a t i c a c c e s s i b i l i t y . J . M o l . B i o l . , 5 5 : 3 7 9 . L e v i t t , M . ( 1 9 7 6 ) . A s i m p l i f i e d r e p r e s e n t a t i o n o f p r o t e i n c o n f o r m a t i o n s f o r r a p i d s i m u l a t i o n o f p r o t e i n f o l d i n g . J . M o l . B i o l . , 1 0 4 : 5 9 . L i - C h a n , B . , N a k a i , S . a n d Wood , D . F . ( 1 9 8 4 ) . H y d r o p h o b i c i t y a n d s o l u b i l i t y o f m e a t p r o t e i n s a n d t h e i r r e l a t i o n s h i p t o e m u l s i f y i n g p r o p e r t i e s . J . F o o d S c i . , 4 9 : 3 4 5 . L i p m a n , D . J . ( 1 9 8 7 ) . L o c a l s e q u e n c e p a t t e r n s o f h y d r o p h o b i c i t y a n d s o l v e n t a c c e s s i b i l i t y i n s o l u b l e g l o b u l a r p r o t e i n s . B i o p o l y m e r s , 2 6 : 1 7 . M a n a v a l a n , P . a n d Ponnaswamy, P . K . ( 1 9 7 8 ) . H y d r o p h o b i c c h a r a c t e r o f a m i n o a c i d r e s i d u e s i n g l o b u l a r p r o t e i n s . 95 N a t u r e , 2 7 5 : 6 7 3 . M a n n , D . F . a n d M o r e n o , R . 0 . ( 1 9 8 4 ) . M e c h a n i s m o f p r o t e i n h y d r o p h o b i c c h r o m a t o g r a p h y . P r o t e i n u n f o l d i n g a n d i t s c o n t r i b u t i o n t o e f f e c t i v e h y d r o p h o b i c i t y . P r e p . B i o c h e m . , 1 4 ( 2 ) : 9 1 . M a t z u d a , T . , W a t a n a b e , K . a n d S a t o , Y . ( 1 9 8 2 ) . I n t e r a c t i o n b e t w e e n o v o m u c o i d a n d l y s o z y m e . J . F o o d S c i . , 4 7 : 6 3 7 . M e e k , J . L . ( 1 9 8 0 ) . P r e d i c t i o n o f p e p t i d e r e t e n t i o n t i m e s i n h i g h p r e s s u r e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o n t h e b a s i s o f a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n . P r o c . N a t . A c a d . S c i . , U S A , 1 7 ( 3 ) : 1 6 3 2 . M e i r o v i t c h , H . , R a c k o v s k y , S . a n d S c h e r a g a , H . A . ( 1 9 8 0 ) . E m p i r i c a l s t u d i e s o f h y d r o p h o b i c i t y : E f f e c t o f p r o t e i n s i z e o n t h e h y d r o p h o b i c b e h a v i o u r o f a m i n o a c i d s . M a c r o m o l e c u l e s , 1 3 : 1 3 9 8 . M e l a n d e r , W. a n d H o r v a t h , C s . ( 1 9 7 7 ) . S a l t e f f e c t s o n h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n i n p r e c i p i t a t i o n a n d c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e i n s : A n i n t e r p r e t a t i o n o f t h e l y o t r o p i c s e r i e s . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . , 1 8 3 : 2 0 . M e l a n d e r , W. R . , C o r r a d i n i , D . a n d H o r v a t h , C s . ( 1 9 8 4 ) . S a l t m e d i a t e d r e t e n t i o n o f p r o t e i n s i n h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h y . A p p l i c a t i o n o f s o l v o p h o b i c t h e o r y . J . C h r o m a t o g . , 3 1 7 : 6 7 . M e l a n d e r , W . , E l - R a s s i , Z . a n d H o r v a t h , C s . ( 1 9 8 9 ) . I n t e r p l a y o f h y d r o p h o b i c a n d e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s i n b i o p o l y m e r c h r o m a t o g r a p h y . J . C h r o m a t o g . , 4 6 9 : 3 . M i n i c k , D . J . , S a b a t k a , J . J . a n d B r e n t , D . A . ( 1 9 8 7 ) . Q u a n t i t a t i v e s t r u c t u r e a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p s u s i n g h y d r o p h o b i c i t y c o n s t a n t s m e a s u r e d b y h i g h p r e s s u r e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . A c o m p a r i s o n w i t h o c t a n o l - w a t e r p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t s . J . L i q u i d C h r o m a t o g . , 1 0 ( 1 3 ) : 2 5 6 5 . M o l n a r , I . a n d H o r v a t h , C s . ( 1 9 7 7 ) . S e p a r a t i o n o f a m i n o a c i d s a n d p e p t i d e s o n n o n - p o l a r s t a t i o n a r y p h a s e s b y h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . J . C h r o m a t o g . , 1 4 2 : 6 2 3 . N a k a i , S . a n d L i - C h a n , E . ( 1 9 8 7 ) . " H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s i n f o o d s y s t e m s " . CRC P r e s s : B o c a R a t o n , F l . N i s h i k a w a , K . a n d O o i , T . ( 1 9 8 0 ) . P r e d i c t i o n o f t h e s u r f a c e i n t e r i o r d i a g r a m s o f g l o b u l a r p r o t e i n s b y a n e m p i r i c a l m e t h o d . I n t . J . P e p t i d e P r o t e i n R e s . , 1 6 : 1 9 . 96 N o z a k i , Y . a n d T a n f o r d , C . ( 1 9 7 1 ) . S o l u b i l i t y o f a m i n o a c i d s a n d two g l y c i n e p e p t i d e s i n a q u e o u s e t h a n o l a n d d i o x a n e s o l u t i o n s . E s t a b l i s h m e n t o f a h y d r o p h o b i c i t y s c a l e . T h e J . B i o l . C h e m . , 2 4 6 ( 7 ) : 2 2 1 1 . O ' H a i r , M . J . a n d N i c e , E . C . ( 1 9 7 9 ) . H y d r o p h o b i c h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o f h o r m o n a l p o l y p e p t i d e s a n d p r o t e i n s o n a l k y l s i l a n e b o n d e d s i l i c a . J . C h r o m a t o g . , 1 7 1 : 2 0 9 . O s u g a , D . T . a n d F e e n e y , R . E . ( 1 9 7 4 ) . A v i a n e g g w h i t e s . I n " T o x i c c o n s t i t u e n t s i n a n i m a l f o o d s t u f f s " . I . E . L i e n e r , E d . , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k . P a r i k h , I . a n d C u a t r e c a s a s , P . ( 1 9 8 5 ) . A f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y . C a n d N R e p o r t , 26 ( A u g ) : 1 7 . R e k k e r , R . F . ( 1 9 7 7 ) . I n " H y d r o p h o b i c F r a g m e n t a l C o n s t a n t s " R e k k e r , R . F . E d . , V o l . 1, E l s v i e r , New Y o r k . R o b i n s o n , D . R . a n d J e n c k s , W. P . ( 1 9 6 5 ) . T h e e f f e c t o f c o n c e n t r a t e d s a l t s o l u t i o n s on t h e a c t i v i t y c o e f f i c i e n t o f a c e t y l t e t r a g l y c i n e e t h y l e s t e r . J . A m r . C h e m . S o c , 8 7 ( 1 ) : 2 4 7 0 . R o b s o n , B . a n d O s g u t h o r p e , D . J . ( 1 9 7 9 ) . R e f i n e d m o d e l s f o r c o m p u t e r s i m u l a t i o n o f p r o t e i n f o l d i n g . A p p l i c a t i o n s t o t h e s t u d y o f c o n s e r v e d s e c o n d a r y s t r u c t u r e a n d f l e x i b l e h i n g e p o i n t s d u r i n g t h e f o l d i n g o f p a n c r e a t i c t r i p s i n i n h i b i t o r . J . M o l . B i o l . , 1 3 2 : 1 9 . R o s e , G . D . , G i e r a s c h , I . M . a n d S m i t h , J . A . ( 1 9 8 5 a ) . T u r n s i n p e p t i d e s a n d p r o t e i n s . A d v . P r o t e i n C h e m . , 3 7 : 1 . R o s e , G . D . , G e s e l o w i t z , A . R . , L e s s e r , G . J . , L e e , R . H . a n d Z e h f u s , m. h . ( 1 9 8 5 b ) . H y d r o p h o b i c i t y o f a m i n o a c i d r e s i d u e s i n g l o b u l a r p r o t e i n s . S c i e n c e , 2 2 9 : 8 3 4 . S h a n b h a g , V . P . a n d A x e l s s o n , C - G . ( 1 9 7 5 ) . H y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n d e t e r m i n e d b y p a r t i t i o n i n a q u e o u s two p h a s e s y s t e m s . P a r t i t i o n o f p r o t e i n s i n s y s t e m s c o n t a i n i n g f a t t y a c i d e s t e r s o f p o l y e t h y l g l y c o l . E u r . J . B i o c h e m . , 60 : 1 7 . S k l a r , L . A . , H u d s o n , B . S . a n d S i m o n i , R . D . ( 1 9 7 7 ) . C o n j u g a t e d p o l y e n e f a t t y a c i d s a s f l u o r e s c e n t p r o b e s : B i n d i n g t o b o v i n e s e r u m a l b u m i n . B i o c h e m . , 1 6 : 5 1 0 0 . S m i t h , R . J . , N i e a s s , C . S . a n d W a i n w r i g h t , M . S . ( 1 9 8 6 ) . A r e v i e w o f m e t h o d s f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f h o l d u p v o l u m e i n m o d e r n l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . J . L i q u i d C h r o m a t o g . , 9 ( 7 ) : 1 3 8 7 - 1 4 3 0 . 97 S o r b e r , H . A . a n d H a r t e , R . A . ( 1 9 7 0 ) . CRC H a n d b o o k o f B i o c h e m i s t r y . T h e c h e m i c a l r u b b e r C o . , C l e v e l a n d , O h i o . S o p h i a n o p o u l o s , A . J . a n d V a n - H o l d e K . E . ( 1 9 6 4 ) . P h y s i c a l s t u d i e s o f m u r a m i d a s e ( l y s o z y m e ) , p H d e p e n d e n t d i m e r i z a t i o n . T h e J . B i o l . C h e m . , 2 3 9 ( 8 ) : 2 5 1 6 . S w e e t , R . M . a n d E i s e n b e r g , D . ( 1 9 8 3 ) . C o r r e l a t i o n o f s e q u e n c e h y d r o p h o b i c i t y m e a s u r e s s i m i l a r i t y i n t h r e e d i m e n s i o n a l p r o t e i n s t r u c t u r e s . J . M o l . B i o l . , 1 7 1 : 4 7 9 . T a n f o r d , C . ( 1 9 6 2 ) . C o n t r i b u t i o n s o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s t o t h e s t a b i l i t y o f t h e g l o b u l a r c o n f o r m a t i o n o f p r o t e i n s . A m r . Chem. S o c . J . , 8 4 : 4 2 4 0 . T a n f o r d , C . ( 1 9 8 0 ) . " T h e H y d r o p h o b i c E f f e c t : F o r m a t i o n o f M i c e l l s a n d B i o l o g i c a l M e m b r a n e s " . 2 n d E d i t i o n , T a n f o r d , C . E d . J o h n W i l e y a n d S o n s , New Y o r k . T o w n s e n d , A . A . a n d N a k a i , S . ( 1 9 8 3 ) . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n h y d r o p h o b i c i t y a n d f o a m i n g c h a r a c t e r i s t i c s o f f o o d p r o t e i n s . J . F o o d S c i . , 4 8 : 5 8 8 . V a n - O s s , C . J . , G o o d , R . J . a n d C h a u d h u r y , M . K . ( 1 9 8 6 ) . T h e r o l e o f v a n d e r W a a l s f o r c e s a n d H y d r o g e n b o n d s i n " h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s " b e t w e e n b i o p o l y m e r s a n d l o w e n e r g y s u r f a c e s . J . C o l l o i d a n d I n t e r f a c e S c i . , 1 1 1 ( 2 ) : 3 7 8 . V o n - H i p p e l , P . H . ( 1 9 7 4 ) . N e u t r a l s a l t e f f e c t s o n t h e c o n f o r m a t i o n a l s t a b i l i t y o f b i o l o g i c a l m a c r o m o l e c u l e s . I n " P r o t e i n l i g a n d i n t e r a c t i o n " , S u n d , H . a n d B l a u e r , G . , E d s . W a l t e r de G r u y t e r , B e r l i n , New Y o r k . V o u t s i n a s , L . P . , C h e u n g , E . a n d N a k a i , S . ( 1 9 8 3 ) . R e l a t i o n s h i p o f h y d r o p h o b i c i t y t o e m u l s i f y i n g p r o p e r t i e s o f h e a t d e n a t u r e d p r o t e i n s . J . F o o d S c i . , 4 8 : 2 6 . W a r n e r , R . C . ( 1 9 5 4 ) . E g g P r o t e i n s . I n " T h e P r o t e i n s " . N e u r a t h , H . a n d B a i l e y , K . E d s . , A c a d e m i c P r e s , N Y . W e i , R . D . a n d W r i g h t , L . D . ( 1 9 6 4 ) . H e a t s t a b i l i t y o f a v i d i n a n d a v i d i n - b i o t i n c o m p l e x a n d i n f l u e n c e o f i o n i c s t r e n g t h o n a f f i n i t y o f a v i d i n f o r b i o t i n . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . , 1 1 7 : 3 4 1 . W e r t z , D . H . a n d S c h e r a g a , H . A . ( 1 9 7 8 ) . I n f l u e n c e o f w a t e r o n p r o t e i n s t r u c t u r e . A n a n a l y s i s o f t h e p r e f e r e n c e s o f a m i n o a c i d r e s i d u e s f o r t h e i n s i d e o r o u t s i d e a n d f o r t h e s p e c i f i c c o n f o r m a t i o n i n a p r o t e i n m o l e c u l e . M a c r o m o l e c u l e s , 1 1 : 9 . W o l f e n d e n , R . , A n d e r s s o n , L . , C u l l i s , P . M . a n d S o u t h g a t e , C . C . B . ( 1 9 8 1 ) . A f f i n i t i e s o f a m i n o a c i d s i d e c h a i n s s o l v e n t w a t e r . B i o c h e m . , 2 0 : 8 4 9 . Y u n g e r , L . M . a n d C r a m e r , R . D . ( 1 9 8 1 ) . I l l M e a s u r e m e n t a n d c o r r e l a t i o n o f p a r t i t i o n c o e f f i c i e n t s o f p o l a r a m i n o a c i d s . M o l . P h a r m . , 2 0 : 6 0 2 . 

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