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The survival and physiology of rainbow trout (oncorhynchus mykiss) in alkaline hard water Yesaki, Timothy Yoji 1990

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831-UBC_1990_A6_7 Y47.pdf [ 5.82MB ]
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T H E S U R V I V A L AND PHYSIOLOGY O F RAINBOW TROUT ( O n c o r h y n c h u s m y k i s s ) I N A L K A L I N E HARD WATER b y TIMOTHY Y O J I Y E S A K I B . S c . ( A g r . ) , T h e U n i v e r s i t y o f B . C . , 1 9 8 8 . A T H E S I S SUBMITTED IN P A R T I A L F U L F I L M E N T OF T H E REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF MASTER OF S C I E N C E i n THE F A C U L T Y OF GRADUATE S T U D I E S (DEPARTMENT OF ANIMAL S C I E N C E ) We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d T H E U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H COLUMBIA S e p t e m b e r , 1 9 9 0 . (cT) T i m Y . Y e s a k i , 1 9 9 0 . I n p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r a n a d v a n c e d d e g r e e a t T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , I a g r e e t h a t t h e L i b r a r y s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e a n d s t u d y . I f u r t h e r a g r e e t h a t p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e c o p y i n g o f t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y p u r p o s e s may be g r a n t e d b y t h e H e a d o f my D e p a r t m e n t o r b y h i s o r h e r r e p r e s e n t a t i v e s . I t i s u n d e r s t o o d t h a t c o p y i n g o r p u b l i c a t i o n o f t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l n o t be a l l o w e d w i t h o u t my w r i t t e n p e r m i s s i o n . ANIMAL S C I E N C E T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a 2075 W e s b r o o k P l a c e V a n c o u v e r , C a n a d a V 6 T 1W5 D a t e : 1 2 / 0 9 / 9 0 i i A B S T R A C T T h e s u r v i v a l a n d p h y s i o l o g y o f r a i n b o w t r o u t i n a l k a l i n e w a t e r s was t h e f o c u s o f t h i s t h e s i s . I t i s known t h a t s a l m o n i d s h a v e p r o b l e m s w i t h ammonia e x c r e t i o n i n a l k a l i n e w a t e r ( C a m e r o n a n d H e i s l e r , 1 9 8 3 ; W r i g h t a n d Wood , 1 9 8 5 ) . T h e f i r s t s e t o f s t u d i e s a t t e m p t e d t o i n c r e a s e t h e s u r v i v a l r a t e s o f r a i n b o w t r o u t p l a n t e d i n t o a l k a l i n e l a k e s b y a c c l i m a t i n g t h e m t o t h e a l k a l i n e c o n d i t i o n s b e f o r e t h e i r r e l e a s e . T h e f i r s t f i e l d s t u d y a c c l i m a t e d r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r s b y a c i d i f y i n g t h e l a k e w a t e r w i t h C 0 2 i n o r d e r t o r e d u c e t h e m a g n i t u d e o f t h e pH c h a n g e e x p e r i e n c e d b y t h e f i s h . T h e s e c o n d f i e l d s t u d y a c c l i m a t e d r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r s b y i n c r e a s i n g t h e a l k a l i n i t y o f t h e h a t c h e r y w a t e r i n w h i c h t h e f i s h w e r e h e l d , o v e r a s i x d a y p e r i o d . I n b o t h s t u d i e s t h e a c c l i m a t e d f i s h e x p e r i e n c e d h i g h e r s u r v i v a l r a t e s r e l a t i v e t o n o n - a c c l i m a t e d f i s h . P l a s m a s o d i u m c o n c e n t r a t i o n s ( [ N a + ] p 1 ) o f t h e f i s h w e r e shown t o i n c r e a s e , w h i l e p l a s m a c h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n s d e c r e a s e d . T h e s e c h a n g e s w e r e a t t r i b u t e d t o a n i n c r e a s e i n t h e e x c h a n g e o f e x t e r n a l N a + w i t h e n d o g e n o u s H + , a n d t h e d e c r e a s e i n t h e e x c h a n g e o f e n d o g e n o u s H C 0 3 ~ w i t h e x t e r n a l C l ~ , r e s p e c t i v e l y . T h e i n c r e a s e d [ N a + ] p l may h a v e a l s o b e e n i i i t h e r e s u l t o f t h e e x c h a n g e o f p l a s m a ammonium ( N H 4 ) w i t h e x t e r n a l N a + . T h e s e c o n d s e t o f s t u d i e s i n v e s t i g a t e d t h e p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r s . T h e f i r s t s t u d y , t h e c h r o n i c e x p o s u r e o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r , showed t h a t t r o u t i n h a r d a l k a l i n e w a t e r e x p e r i e n c e d h i g h e r s u r v i v a l r a t e s a n d r e g u l a t e d p l a s m a ammonia a n d i o n c o n c e n t r a t i o n s more c o m p e t e n t l y t h a n t r o u t i n s o f t a l k a l i n e w a t e r . T h i s i n c r e a s e d a b i l i t y t o r e g u l a t e p l a s m a ammonia a n d i o n c o n c e n t r a t i o n s was a t t r i b u t e d t o t h e p o s s i b l e " r e a c t i v a t i o n " o f t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e . T h e p u r p o s e o f t h e s e c o n d s t u d y , t h e a c u t e e x p o s u r e o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r , was t o f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h e m e c h a n i s m s t h a t e n a b l e f i s h i n h a r d a l k a l i n e w a t e r t o s u r v i v e b e t t e r t h a n f i s h i n s o f t a l k a l i n e w a t e r . T h e p o s s i b l e a c t i v i t y o f t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e was a g a i n o b s e r v e d i n t h e h a r d a l k a l i n e w a t e r . T h e a d d i t i o n o f a m i l o r i d e t o t h e a l k a l i n e h a r d t r e a t m e n t w a t e r i n c r e a s e d p l a s m a t o t a l ammonia a n d s t a b i l i z e d [ N a + ] p ^ , w h i c h s u p p o r t e d t h e " r e a c t i v a t i o n " o f t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e i n h a r d a l k a l i n e w a t e r . A s a r e s u l t o f t h e s e s t u d i e s , t h e a c c l i m a t i o n o f r a i n b o w t r o u t t o h a r d a l k a l i n e w a t e r b e f o r e b e i n g p l a n t e d i n t o a n y a l k a l i n e b o d y o f w a t e r was r e c o m m e n d e d . i v T A B L E OF CONTENTS A b s t r a c t i i L i s t o f T a b l e s v L i s t o f F i g u r e s v i A c k n o w l e d g e m e n t s x C h a p t e r 1 1 T h e a c c l i m a t i o n o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r s . G e n e r a l I n t r o d u c t i o n : C h a p t e r 1 2 G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s : C h a p t e r 1 6 S e c t i o n 1: F i e l d S t u d y 1988 11 T h e o n - s i t e a c c l i m a t i o n o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r s . S e c t i o n 2: F i e l d S t u d y 1989 34 T h e h a t c h e r y a c c l i m a t i o n o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r s . G e n e r a l C o n c l u s i o n s a n d R e c o m m e n d a t i o n s : C h a p t e r 1 52 C h a p t e r 2 53 T h e p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e o f r a i n b o w t r o u t t o t h e e x p o s u r e o f h a r d a l k a l i n e w a t e r . G e n e r a l I n t r o d u c t i o n : C h a p t e r 2 54 G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s : C h a p t e r 2 59 S e c t i o n 1: C h r o n i c S t u d y 64 T h e c h r o n i c e x p o s u r e o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r s . S e c t i o n 2: A c u t e S t u d y 94 T h e a c u t e e x p o s u r e o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r s . G e n e r a l C o n c l u s i o n s a n d R e c o m m e n d a t i o n s : C h a p t e r 2 132 R e f e r e n c e s 134 V L I S T OF T A B L E S T a b l e 1: M o r t a l i t i e s a n d S u r v i v a l R a t e s o f r a i n b o w t r o u t i n n e t p e n s a c i d i f i e d w i t h C 0 2 29 T a b l e 2: S a m p l e N e t t i n g o f G r e e n L a k e , B r i t i s h C o l u m b i a . . . 3 0 T a b l e 3 : A c c u m u l a t e d m o r t a l i t i e s a t e a c h s a m p l e p e r i o d a n d S u r v i v a l R a t e s o f a c c l i m a t e d a n d n o n - a c c l i m a t e d j u v e n i l e r a i n b o w t r o u t p l a n t e d i n t o h a r d a l k a l i n e w a t e r (pH 9 . 5 ) 51 v i L I S T OF F I G U R E S F i g u r e 1: T h e S t r u c t u r e o f One o f t h e E x p e r i m e n t a l N e t p e n s 9 F i g u r e 2: T h e E x p e r i m e n t a l N e t p e n s A t t a c h e d t o t h e B a s e F l o a t w i t h C 0 2 D e l i v e r y S y s t e m V i s i b l e 10 F i g u r e 3 : Means + / - 1 S . E . o f h e m a t o c r i t i n j u v e n i l e r a i n b o w t r o u t a c c l i m a t e d t o a l k a l i n e w a t e r (pH 9 . 5 ) a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 31 F i g u r e 4: Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a N a + c o n c e n t r a t i o n s i n j u v e n i l e r a i n b o w t r o u t a c c l i m a t e d t o a l k a l i n e w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 32 F i g u r e 5: Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a C l ~ c o n c e n t r a t i o n s i n j u v e n i l e r a i n b o w t r o u t a c c l i m a t e d t o a l k a l i n e w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h ) 33 F i g u r e 6: Means + / - 1 S . E . o f h e m a t o c r i t i n a c c l i m a t e d a n d n o n - a c c l i m a t e d j u v e n i l e r a i n b o w t r o u t p l a n t e d i n t o a l k a l i n e h a r d w a t e r (pH 9 . 5 ) a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 48 F i g u r e 7: Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a N a + c o n c e n t r a t i o n s i n a c c l i m a t e d a n d n o n - a c c l i m a t e d j u v e n i l e r a i n b o w t r o u t p l a n t e d i n t o a l k a l i n e h a r d w a t e r (pH 9 . 5 ) a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 49 F i g u r e 8: Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a C l ~ c o n c e n t r a t i o n s i n a c c l i m a t e d a n d n o n - a c c l i m a t e d j u v e n i l e r a i n b o w t r o u t p l a n t e d i n t o a l k a l i n e h a r d w a t e r (pH 9 . 5 ) a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 50 F i g u r e 9 : Means + / - 1 S . E . o f h e m a t o c r i t i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 83 v i i F i g u r e 1 0 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a pH i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 84 F i g u r e 1 1 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a p C o 2 i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 85 F i g u r e 1 2 : Means + / " 1 S.E. o f p l a s m a [ H C 0 3 ~ ] i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 86 F i g u r e 1 3 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a t o t a l ammonia i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 87 F i g u r e 14 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a p N H 3 i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 88 F i g u r e 1 5 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a [ N H 4 + ] i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 89 F i g u r e 1 6 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a b l o o d u r e a n i t r o g e n i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 90 F i g u r e 1 7 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a N a + c o n c e n t r a t i o n s i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 91 F i g u r e 1 8 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a C l ~ c o n c e n t r a t i o n s i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 92 F i g u r e 1 9 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a C o r t i s o l c o n c e n t r a t i o n s i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) 93 v i i i F i g u r e 20 : A s c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e N e t Ammonia F l u x S e t u p ,103 F i g u r e 2 1 : Means + / - 1 S . E . o f h e m a t o c r i t i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e .119 F i g u r e 2 2 : Means + / - l S . E . o f p l a s m a pH i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e 120 F i g u r e 2 3 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a p C 0 2 i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e 121 F i g u r e 24: Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a [ H C 0 3 ~ ] i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e 122 F i g u r e 2 5 : M e a n s + / - 1 S . E . o f p l a s m a T amm i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e 123 F i g u r e 2 6 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a p N H 3 i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e 124 F i g u r e 2 7 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a [ N H 4 + ] i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e 125 i x F i g u r e 28 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a N a + c o n c e n t r a t i o n s i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e 126 F i g u r e 2 9 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a C l ~ c o n c e n t r a t i o n s i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e 127 F i g u r e 3 0 : Means + / - 1 S . E . o f w a t e r T a i t u n i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( A ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e 128 F i g u r e 3 1 : Means + / - 1 S . E . o f w a t e r p N H 3 i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( A ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e 129 F i g u r e 32 : Means + / - 1 S . E . o f w a t e r [ N H 4 + ] i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( A ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e 130 F i g u r e 3 3 : Means + / - 1 S . E . o f w a t e r T a m m e x c r e t i o n r a t e s o f r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e 131 X ACKNOWLEDGEMENTS I am p l e a s e d t o a c k n o w l e d g e my g r a d u a t e s t u d i e s s u p e r v i s o r , D r . G e o r g e Iwama, who i n i t i a t e d t h i s s t u d y o f a l k a l i n e l a k e s i n B . C . , a n d who was t h e d r i v i n g f o r c e b e h i n d a l l o f t h e s t u d i e s i n t h i s t h e s i s . I w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k D r . Iwama f o r h i s e x p e r t g u i d a n c e d u r i n g my s t u d i e s a n d t h e p r e p a r a t i o n o f t h i s t h e s i s . I w o u l d a l s o l i k e t o a c k n o w l e d g e t h e u n s e l f i s h t e a c h i n g o f M r . Jam es M c G e e r whose e x p e r i e n c e i n v a r i o u s f i e l d s ( c o m p u t e r s , g l a s s c u t t i n g , c o n s t r u c t i o n e t c . ) was i n v a l u a b l e d u r i n g my s t u d i e s . T h e s u p p o r t f r o m J a c k L e g g e t t , E r i c P a r k i n s o n , a n d K a n j i T s u m u r a a n d t h e o t h e r b i o l o g i s t s a t t h e B . C . M i n i s t r y o f E n v i r o n m e n t , R e c r e a t i o n a l F i s h e r i e s B r a n c h , i s a l s o g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . I am e s p e c i a l l y g r a t e f u l t o my p a r e n t s , Mae a n d T a d , f o r t h e i r s u p p o r t t h r o u g h o u t my a c a d e m i c c a r e e r . F i n a l l y , I w o u l d l i k e t o a c k n o w l e d g e P a m e l a f o r h e r l o v e a n d u n d e r s t a n d i n g a t a l l t i m e s . 1 C H A P T E R 1: T h e a c c l i m a t i o n o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r s . 2 C h a p t e r 1: G e n e r a l I n t r o d u c t i o n I n B r i t i s h C o l u m b i a , t h e r e a r e many a e s t h e t i c a l l y p l e a s i n g b u t h i g h l y a l k a l i n e l a k e s . Many o f t h e s e l a k e s a l s o do n o t s u p p o r t h e a l t h y , r e p r o d u c i n g p o p u l a t i o n s o f g a m e f i s h . T h e a l k a l i n e c o n d i t i o n s a n d p o o r s u r v i v a l may be r e l a t e d d i r e c t l y o r t h r o u g h e n h a n c e m e n t / h a t c h e r y p r o c e d u r e s . T h e s e l a k e s h a v e g r e a t p o t e n t i a l f o r r e c r e a t i o n a l u s a g e , s u c h a s c a m p i n g , f i s h i n g a n d b o a t i n g , b e c a u s e o f t h e i r e u t r o p h i c c o n d i t i o n s a n d l a r g e s i z e s . H o w e v e r , many p o t e n t i a l r e c r e a t i o n a l u s e r s a v o i d t h e s e a l k a l i n e l a k e s a n d p u r s u e l a k e s t h a t h a v e b e t t e r f i s h i n g . T h e i n t e n t i o n a l a v o i d a n c e o f a l k a l i n e l a k e s was o b s e r v e d i n t h e 70 M i l e H o u s e a r e a o f B r i t i s h C o l u m b i a , C a n a d a . W a t c h L a k e ( s m a l l , 8 . 0 p H , p r i v a t e c a m p s i t e s a n d g o o d f i s h i n g ) c o n s i s t e n t l y a t t r a c t e d l a r g e r n u m b e r s o f c a m p e r s t h a n G r e e n L a k e ( l a r g e , pH 9 . 5 , l a r g e p u b l i c c a m p s i t e s a n d p o o r f i s h i n g ) . I n t h e p a s t 21 y e a r s , r e p e a t e d e f f o r t s t o s t o c k G r e e n L a k e w i t h o v e r 4 . 1 m i l l i o n y e a r l i n g s a l m o n i d s h a v e l a r g e l y f a i l e d t o e s t a b l i s h a s u c c e s s f u l f i s h e r y ( i n t e r m s o f c a t c h p e r u n i t e f f o r t ( C P U E ) ) i n t h i s l a k e ( B . C . M i n i s t r y o f E n v i r o n m e n t , L a k e S t o c k i n g R e c o r d s , W i l l i a m s L a k e ) . R a i n b o w t r o u t (Oncorhynchus mykiss) a n d k o k a n e e (Oncorhynchus nerka) make u p t h e m a j o r i t y o f t h e f i s h t h a t h a v e b e e n p l a n t e d i n t o 3 G r e e n L a k e . A t one p o i n t , s t e r i l i z e d C h i n o o k s a l m o n (Oncorhynchus tschawytscha) w e r e e v e n s t o c k e d i n t o t h i s l a k e i n a f u t i l e a t t e m p t t o e s t a b l i s h a c a t c h a b l e p o p u l a t i o n o f g a m e f i s h i n t h i s l a k e ( B . C . M i n i s t r y o f E n v i r o n m e n t , L a k e S t o c k i n g R e c o r d s , W i l l i a m s L a k e ) . T h e l o w s u r v i v a l r a t e s o f r a i n b o w t r o u t i n a l k a l i n e l a k e s i n t h e C a r i b o o o f B . C . h a s b e e n a m a j o r p r o b l e m t o t h e B . C . M i n i s t r y o f E n v i r o n m e n t . I t i s i n t e r e s t i n g t h a t t h i s p r o b l e m h a s n o t b e e n i n v e s t i g a t e d m o r e , w h i l e t h e l o w s u r v i v a l r a t e o f r a i n b o w t r o u t i n a c i d i c l a k e s i n e a s t e r n C a n a d a h a s b e e n a m a j o r t o p i c o f r e s e a r c h . M u r r a y a n d Z i e b e l l ( 1 9 8 4 ) , showed t h a t r a i n b o w t r o u t c o u l d b e a c c l i m a t e d t o a l k a l i n e w a t e r (pH 1 0 ) . I t was shown t h a t when r a i n b o w t r o u t a r e a c c l i m a t e d t o a pH o f 9 . 7 - 9 . 9 o v e r a f o u r d a y p e r i o d , no m o r t a l i t y o c c u r r e d a n d t h e f i s h showed no s i g n s o f a l t e r e d b e h a v i o u r o r f e e d i n g a c t i v i t y . P h y s i o l o g i c a l s t u d i e s h a v e shown t h a t f i s h h a v e p r o b l e m s w i t h t h e e x c r e t i o n o f ammonia* i n a l k a l i n e w a t e r s ( R a n d a l l a n d W r i g h t , 1988 ; R u s s o e t a l . , 1 9 8 8 ; W r i g h t , H e m i n g a n d R a n d a l l , 1988 ; W r i g h t a n d W o o d , 1 9 8 5 ; T h u r s t o n e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h i s i s e s p e c i a l l y t r u e f o r t h e s a l m o n i d s i n w h i c h t h e i n c r e a s e d ammonia l e v e l s i n t h e b l o o d c a n c a u s e * T h e t e r m ammonia r e f e r s t o t o t a l ammonia (NHj + N H 4 + ) . T h e t e r m NH 3 r e f e r s t o t h e u n i o n i z e d f o r m o f a m m o n i a , w h i l e N H 4 + r e f e r s t o t h e i o n i z e d f o r m . 4 c o n v u l s i o n s a n d l e a d t o d e a t h w i t h i n s e v e r a l h o u r s ( W r i g h t a n d Wood , 1 9 8 5 ) . T h e f a i l u r e t o e s t a b l i s h a n y f i s h p o p u l a t i o n s i n t h i s l a k e p r o m p t e d t h e g o v e r n m e n t t o a p p r o a c h t h i s p r o b l e m f r o m a more s c i e n t i f i c a n g l e . I n t h e s p r i n g o f 1 9 8 8 , t h e B . C . M i n i s t r y o f t h e E n v i r o n m e n t a n d P a r k s i n i t i a t e d a s t u d y t o i n v e s t i g a t e t h e l a c k o f s u b s t a n t i a l f i s h p o p u l a t i o n s i n a l k a l i n e l a k e s . T h r o u g h t h e c o l l a b o r a t i o n o f t h e R e c r e a t i o n a l F i s h e r i e s B r a n c h o f t h e B . C . M i n i s t r y o f t h e E n v i r o n m e n t a n d D r . G . K . Iwama, i t was d e c i d e d t h a t a c c l i m a t i o n s t u d i e s w i t h y e a r l i n g r a i n b o w t r o u t o n G r e e n L a k e w e r e t o b e c a r r i e d o u t . T h e m a i n o b j e c t i v e o f t h e s e a c c l i m a t i o n s t u d i e s was t o i n c r e a s e t h e s u r v i v a l r a t e o f r a i n b o w t r o u t p l a n t e d i n t o a l k a l i n e w a t e r s . T h e s e i n i t i a l s t u d i e s w o u l d c o n s i s t o f r e l a t i v e l y s m a l l n u m b e r s o f f i s h ( a p p r o x i m a t e l y 5 0 0 0 - 1 0 , 0 0 0 ) a n d i f s u c c e s s f u l , t h e 9 0 , 0 0 0 r a i n b o w t r o u t d e s t i n e d f o r t h i s l a k e i n t h e l a t e summer, w o u l d b e t r e a t e d i n t h e same m a n n e r a s t h e i n i t i a l f i s h . G r e e n L a k e was a p r i m e c a n d i d a t e f o r t h e e x p e r i m e n t s . I t was o b s e r v e d t h a t , t h e two l a r g e s t o v e r n i g h t c a m p i n g f a c i l i t i e s o n t h i s l a k e w e r e u n d e r - u t i l i z e d i n t h e s p r i n g ( p e a k f i s h i n g p e r i o d ) b e c a u s e o f t h e v e r y p o o r f i s h e r y . C o n s e q u e n t l y , i f t h e s e s t u d i e s d i d e s t a b l i s h a r a i n b o w t r o u t p o p u l a t i o n i n G r e e n L a k e , n o t o n l y w o u l d i n c r e a s e s i n a n g l e r 5 d a y s (# o f i n d i v i d u a l d a y s s p e n t a n g l i n g o n a s p e c i f i c b o d y o f w a t e r ) o c c u r , b u t i n c r e a s e s i n c a m p i n g f a c i l i t y u s a g e w o u l d a l s o r e s u l t . I n t h i s c h a p t e r , two a c c l i m a t i o n s t u d i e s a r e p r e s e n t e d . I n t h e f i r s t s t u d y , c o n d u c t e d i n t h e s p r i n g o f 1 9 8 8 , r a i n b o w t r o u t w e r e a c c l i m a t e d a t t h e l a k e t o t h e a l k a l i n e c o n d i t i o n s . T h e s e c o n d s t u d y , c o n d u c t e d i n t h e s p r i n g o f 1 9 8 9 , a c c l i m a t e d r a i n b o w t r o u t a t t h e h a t c h e r y t o t h e a l k a l i n e c o n d i t i o n s o f t h e l a k e . 6 G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s f o r C h a p t e r 1: T h e L a k e : G r e e n L a k e i s a c h a r a c t e r i s t i c a l l y e u t r o p h i c l a k e w i t h h i g h t o t a l d i s s o l v e d s o l i d s c o n c e n t r a t i o n (800 t o 1100 ppm) a n d h i g h a v e r a g e y e a r l y pH ( 9 . 5 ) . T h i s l a k e i s l o c a t e d a p p r o x i m a t e l y 27 km n o r t h w e s t o f 70 M i l e H o u s e , B r i t i s h C o l u m b i a , C a n a d a . I t i s a r e l a t i v e l y l a r g e l a k e f o r t h i s a r e a o f B r i t i s h C o l u m b i a , h a v i n g a n a r e a o f 28 s q km a n d a maximum a n d mean d e p t h o f 3 4 . 2 5 a n d 1 0 . 2 5 ra, r e s p e c t i v e l y . D u r i n g t h e summer m o n t h s , a s a m b i e n t t e m p e r a t u r e s r i s e , t h e l a k e u n d e r g o e s r i g i d t h e r m a l s t r a t i f i c a t i o n a n d b e c o m e s a n o x i c b e l o w 20 m e t e r s o f d e p t h . E x p e r i m e n t a l F i s h : R a i n b o w t r o u t w e r e h a t c h e d a n d r a i s e d a t t h e K o o t e n a y T r o u t H a t c h e r y , n e a r C r a n b r o o k , B r i t i s h C o l u m b i a a n d t h e n t r a n s p o r t e d b y t a n k e r t r u c k t o t h e L o o n L a k e T r o u t H a t c h e r y , n e a r C l i n t o n , B r i t i s h C o l u m b i a . A t L o o n L a k e , t h e f i s h w e r e h e l d i n l a r g e c e m e n t r a c e w a y s t h a t w e r e f e d b y t h e L o o n C r e e k S p r i n g ( 7 . 0 - 7 . 5 ° C , pH 8 . 1 ) . T h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t t h e t r o u t w e r e m a i n t a i n e d o n a c o m m e r c i a l t r o u t d i e t . 7 E x p e r i m e n t a l N e t p e n s : S i x s q u a r e n e t p e n s w e r e c o n s t r u c t e d o f 1 /4 i n c h k n o t l e s s , w h i t e n y l o n mesh w i t h d i m e n s i o n s o f 1 .22 x 1 .22 x 2 . 4 4 m. T h e n e t p e n s w e r e s u p p o r t e d b y wooden f r a m e s t h a t f l o a t e d o n t h e w a t e r s u r f a c e a n d w e r e c o v e r e d t o p r e v e n t p r e d a t i o n f r o m w a t e r f o w l ( F i g . 1 ) . T h e s i x n e t p e n s w e r e a t t a c h e d t o a l a r g e r f l o a t , w h i c h was s e c u r e l y a n c h o r e d a n d a c t e d a s a w o r k a r e a ( F i g . 2 ) . T h i s s e t u p was a n c h o r e d i n a p p r o x i m a t e l y f o u r m e t e r s o f w a t e r a n d a b o u t 30 m e t e r s o f f o f t h e n o r t h s h o r e o f t h e l a k e . T h i s p l a c e m e n t o f t h e n e t p e n s p r e v e n t e d t h e b o t t o m s o f t h e n e t p e n s f r o m c o m i n g i n t o c o n t a c t w i t h t h e l a k e b o t t o m . A n a l y s e s : A n a l y s e s f o r p l a s m a s o d i u m [ N a + ] p ^ a n d c h l o r i d e [ C l ~ ] p ^ c o n c e n t r a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t u s i n g t h e f r o z e n p l a s m a o b t a i n e d f r o m t h e f i e l d w o r k . P l a s m a [ N a + ] was m e a s u r e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y u s i n g a C o r n i n g 410C f l a m e p h o t o m e t e r ( C o r n i n g , E n g l a n d ) w h i c h was s t a n d a r d i z e d w i t h 140 mmol l - 1 N a + s t a n d a r d s ( C o r n i n g ) . P l a s m a c h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n was d e t e r m i n e d a m p e r o m e t r i c a l l y b y a d i g i t a l c h l o r i d o m e t e r ( H a a k e B u c h l e r I n s t r u m e n t s , New J e r s e y ) t h a t was s t a n d a r d i z e d w i t h 100 mmol l - 1 C I - s o l u t i o n ( H a a k e B u c h l e r ) . 8 S t a t i s t i c a l A n a l y s e s : A 2 x 2 c o n t i n g e n c y t a b l e was c r e a t e d t o t e s t f o r t h e i n d e p e n d e n c e o f v a r i a b l e s . T h e c h i - s q u a r e t e s t s t a t i s t i c was u s e d t o t e s t f o r t h e i n d e p e n d e n c e o f a c c l i m a t i o n a n d s u r v i v a l r a t e i n t h i s s t u d y . A n a l y s i s o f v a r i a n c e (ANOVA) was u s e d t o d e t e r m i n e s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e among a t a 5 % l e v e l o f r e j e c t i o n . T u k e y ' s t e s t was u s e d t o d e t e r m i n e t h e s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s a t a r e j e c t i o n l e v e l o f 5 % ( O t t , 1 9 8 4 ) . 9 F i g u r e 1: T h e S t r u c t u r e o f One o f t h e E x p e r i m e n t a l N e t p e n s . 10 F i g u r e 2: T h e E x p e r i m e n t a l N e t p e n s A t t a c h e d t o t h e B a s e F l o a t w i t h CO? D e l i v e r y S y s t e m V i s i b l e . 11 C h a p t e r 1 S e c t i o n 1: F i e l d S t u d y 1 9 8 8 . T h e O n - S i t e A c c l i m a t i o n o f R a i n b o w T r o u t t o A l k a l i n e W a t e r s , 12 I n t r o d u c t i o n A t t h e b e g i n n i n g o f t h i s s t u d y two s t r e s s e s a s s o c i a t e d w i t h t h e l o w s u r v i v a l r a t e s o f f i s h p l a n t e d i n t o a l k a l i n e l a k e s w e r e i d e n t i f i e d . T h e f i r s t s t r e s s was t h e p o s s i b l e s t r e s s t h a t i s e x p e r i e n c e d b y t h e f i s h a s t h e y a r e t r a n s p o r t e d t o t h e l a k e . Many s t u d i e s i n W a s h i n g t o n s t a t e a n d O r e g o n i n t h e U . S . h a v e b e e n i n i t i a t e d i n a t t e m p t s t o m i t i g a t e t h e s t r e s s e s e x p e r i e n c e d b y y o u n g s a l m o n i d s a s t h e y a r e t r a n s p o r t e d down s t r e a m , p a s t o b s t a c l e s s u c h a s h y d r o -e l e c t r i c d a m s . A s a r e s u l t o f one s u c h s t u d y b y Wedemeyer e t a l . ( 1 9 8 5 ) , i t was d e c i d e d t h a t t h e a l t e r a t i o n o f t h e t r a n s p o r t m e d i a w i t h a c o m b i n a t i o n o f c h e m i c a l s w o u l d b e u s e d t o m i t i g a t e t r a n s p o r t a t i o n s t r e s s i n t h e p r e s e n t s t u d y . T h e s e c o n d p o s s i b l e s t r e s s was t h e l a r g e c h a n g e i n w a t e r pH t h a t t h e f i s h e x p e r i e n c e , a s t h e y a r e t a k e n f r o m n e a r l y n e u t r a l pH h a t c h e r y w a t e r a n d p l a n t e d i n t o v e r y h i g h pH l a k e w a t e r . C o m p r e s s e d C a r b o n D i o x i d e ( C 0 2 ) c y l i n d e r s w e r e u s e d t o d e l i v e r C 0 2 i n t o t h e n e t p e n s t o a c i d i f y t h e w a t e r pH i n s i d e h o l d i n g p e n s s i t u a t e d d i r e c t l y o n t h e l a k e . T h e r e s u l t i n g a c i d i f i c a t i o n o f t h e n e t p e n w a t e r s e r v e d t o d e c r e a s e t h e l a r g e pH c h a n g e e x p e r i e n c e d b y t h e f i s h when p l a n t e d i n t o t h e n e t p e n s . 13 T h e p u r p o s e o f t h i s e x p e r i m e n t was t o a d d r e s s t h e p o o r s u r v i v a b i l i t y o f r a i n b o w t r o u t when t h e y a r e s t o c k e d i n h i g h pH l a k e s . T h i s e x p e r i m e n t was d e s i g n e d t o t e s t t h e h y p o t h e s e s t h a t t h e a d d i t i o n o f t r i c a i n e m e t h a n e s u l p h o n a t e ( M S 2 2 2 ) a n d / o r c a l c i u m c h l o r i d e ( C a C l 2 ) t o t h e t r a n s p o r t medium w o u l d r e d u c e m o r t a l i t i e s a s s o c i a t e d w i t h t r a n s p o r t a n d t h a t r e d u c i n g t h e d e g r e e o f pH c h a n g e u p o n i n t r o d u c t i o n t o t h e l a k e w a t e r w o u l d i n c r e a s e s u r v i v a l o f s t o c k e d f i s h . 14 M e t h o d s a n d M a t e r i a l s : L o c a t i o n : See G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 1 . E x p e r i m e n t a l F i s h : See G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 1 , f o r more d e t a i l s . T h e mean w e i g h t a n d l e n g t h o f t h e y e a r l i n g t r o u t u s e d i n t h i s e x p e r i m e n t w e r e 2 4 . 0 2 g + 1 . 3 5 ( S . E . ) a n d 1 4 . 2 9 cm + 0 . 2 3 ( S . E . ) , r e s p e c t i v e l y . A t o t a l o f 6 , 0 0 0 f i s h w e r e u s e d i n t h e e x p e r i m e n t . E x p e r i m e n t a l N e t p e n s : See G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 1 , f o r more d e t a i l s . F o r t h i s e x p e r i m e n t , t h r e e o f t h e n e t p e n s h a d C 0 2 b u b b l e d i n t o t h e m f r o m a c o m p r e s s e d g a s c y l i n d e r t h a t was c o n t r o l l e d b y a f l o w m e t e r . P l a s t i c t u b i n g ( 1 / 4 " O . D . ) c a r r i e d t h e C 0 2 f r o m t h e c y l i n d e r t o t h e n e t p e n s a n d t h e n c o n n e c t e d w i t h m a n u a l l y p u n c t u r e d v i n y l t u b i n g t h a t l i n e d t h e b o t t o m o f t h e t h r e e n e t p e n s . T h e p u n c t u r e d t u b i n g a l l o w e d m i n u t e b u b b l e s o f C 0 2 t o e s c a p e i n t o t h e w a t e r , t h u s a c i d i f y i n g t h e n e t p e n s f r o m t h e b o t t o m u p . 15 P r o t o c o l : T h e f i s h w e r e g r a d e d f o r s i z e a t t h e L o o n L a k e T r o u t H a t c h e r y a n d t h e n t r a n s p o r t e d t o t h e e x p e r i m e n t s i t e i n a 780 1 i n s u l a t e d , f i b e r g l a s s c o n t a i n e r t h a t was o x y g e n a t e d . A t t h e h a t c h e r y , t h e f i s h w e r e d i v i d e d r o u g h l y i n t o t h r e e g r o u p s o f 2 , 0 0 0 e a c h a n d t r a n s p o r t e d t o t h e s i t e u n d e r t h r e e r e g i m e s . 1 . C o n t r o l , no c h e m i c a l t r e a t m e n t . 2 . M i l d A n e s t h e s i a , 25 mg/1 MS222 a n d 25 mg/1 S o d i u m B i c a r b o n a t e ( N a H C 0 3 ) . 3 . S a l t s a n d L i g h t A n e s t h e s i a , 25 mg/1 C a C l 2 / 10 mg/1 MS222 a n d 10 mg/1 N a H C 0 3 . A l a r g e t r a n s p o r t t r u c k t h a t h a d t h r e e s e p a r a t e c o m p a r t m e n t s , one f o r e a c h t r e a t m e n t was u s e d t o t r a n s p o r t t h e f i s h t o t h e l a k e . T h e f i s h i n e a c h c o m p a r t m e n t w e r e c h e c k e d a t t h e h a l f w a y p o i n t o f t h e t r i p f o r m o r t a l i t y a n d o u t w a r d s i g n s o f s t r e s s ( i . e . d a r k c o l o r a t i o n a n d l e t h a r g y ) . Wedemeyer ( 1 9 7 2 ) , a n d Wedemeyer e t a l . ( 1 9 8 5 ) , d e s c r i b e d t h a t t r a n s p o r t a t i o n was a m a j o r c a u s e o f s t r e s s i n s a l m o n i d s a n d t h a t d a r k c o l o r a t i o n a n d l e t h a r g y w e r e a s s o c i a t e d w i t h t h a t s t r e s s . Up on a r r i v a l a t G r e e n L a k e , b l o o d s a m p l e s a n d o b s e r v a t i o n s w e r e t a k e n f r o m f i s h o f e a c h t r e a t m e n t g r o u p . 16 F o u r f i s h p e r t r e a t m e n t w e r e s a m p l e d t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t . T h e w h o l e b l o o d was c e n t r i f u g e d f o r h e m a t o c r i t r e a d i n g s a n d t h e r e s u l t i n g p l a s m a was f r o z e n f o r l a t e r [ N a + ] p i a n d [ C l ~ ] p i a n a l y s i s . F i s h i n a l l t h r e e t r a n s p o r t r e g i m e s w e r e t h e n d i v i d e d i n t o two h a l v e s . One h a l f , c o n s i s t i n g o f a b o u t 1 , 0 0 0 f i s h , was p l a n t e d i n t o a n o n - a c i d i f i e d ( c o n t r o l ) n e t p e n a n d t h e o t h e r h a l f went i n t o a n a c i d i f i e d n e t p e n . T h e C 0 2 i n t h e n e t p e n s was u s e d t o a c i d i f y t h e w a t e r a n d t h u s r e d u c e t h e g r e a t c h a n g e i n pH t h a t w o u l d h a v e n o r m a l l y o c c u r r e d w i t h t h e u s e o f t r a d i t i o n a l s t o c k i n g p r o c e d u r e s i n a l k a l i n e w a t e r s . I d e a l l y , t h e pH i n t h e n e t p e n s s h o u l d h a v e m a t c h e d t h a t o f t h e t r a n s p o r t a n d h a t c h e r y w a t e r . T h e n , b y r e d u c i n g t h e f l o w o f t h e C 0 2 e a c h d a y , t h e n e t p e n pH w o u l d h a v e b e e n i n c r e a s e d t o m a t c h t h e pH o f t h e l a k e . H o w e v e r , t h e pH o f t h e n e t p e n s c o u l d n o t b e c o n t r o l l e d w i t h s u c h p r e c i s i o n . I n s t e a d o f a n i n c r e a s e i n pH e a c h d a y f o r s i x d a y s , t h e pH was r a i s e d o n d a y 2 a n d 4 u n t i l t h e n e t p e n pH m a t c h e d t h e l a k e w a t e r p H . E v e n t h o u g h t h e pH o f t h e n e t p e n s w e r e n o t i n c r e a s e d o n c e a d a y f o r s i x d a y s , t h e a l t e r n a t e p r o c e d u r e s t i l l s e r v e d t o d e c r e a s e t h e pH c h a n g e t h a t t h e f i s h e x p e r i e n c e d . W i t h t r a d i t i o n a l s t o c k i n g p r o c e d u r e s t h e f i s h e x p e r i e n c e d a pH c h a n g e o f +1 .4 u n i t s . U s i n g t h e 17 e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e , t h e f i s h e x p e r i e n c e d a pH c h a n g e o f a b o u t + 0 . 5 pH u n i t s when f i r s t p l a n t e d i n t o t h e l a k e . B l o o d s a m p l e s w e r e t a k e n f r o m f i s h i n e a c h n e t p e n a t 2 4 , 4 8 , 7 2 , 9 6 , 120 a n d 144 h a f t e r i n t r o d u c t i o n . A t e a c h s a m p l i n g t i m e a number o f o b s e r v a t i o n s w e r e t a k e n i n e a c h o f t h e n e t p e n s . T h e s e o b s e r v a t i o n s w e r e o f : a ) m o r t a l i t y ( S e e T a b l e 1 ) . b ) g e n e r a l a c t i v i t y c ) f e e d i n g a c t i v i t y d ) b o d y c o l o r a t i o n e) e q u i l i b r i u m A l l f i s h w e r e f e d a c o m m e r c i a l t r o u t d i e t f o r a maximum o f 14 d a n d t h e n w e r e r e l e a s e d i n t o t h e l a k e . S a m p l e N e t t i n g : S a m p l i n g o f t h e l a k e ' s e n d e m i c f i s h p o p u l a t i o n was c a r r i e d o u t u s i n g a v a r i a b l e mesh g i l l n e t . Two s e t s w e r e made a t t h e W a t c h C r e e k C u l v e r t t o a s s e s s t h e s t a t u s o f a l l t h e f i s h s p e c i e s i n t h e l a k e a t t h a t t i m e . One s e t was made a t d u s k a n d o n e was made a t d a w n . T h e d e p t h s o f t h e s e t s r a n g e d f r o m 2 m t o 20 m. P l a s m a I o n A n a l y s e s : S e e G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 1 . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s : See G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 19 R e s u l t s : O b s e r v a t i o n s : 1) C o n t r o l t r a n s p o r t / c o n t r o l n e t p e n . ( n e t p e n 1 ) . D u r i n g t r a n s p o r t t h e c o n t r o l f i s h w e r e v e r y a c t i v e a n d w o u l d r e s p o n d t o movement a n d l i g h t when t h e l i d o f t h e t r a n s p o r t b o x was o p e n e d f o r o b s e r v a t i o n . T h e s e f i s h w e r e a c t i v e i m m e d i a t e l y a f t e r i n t r o d u c t i o n t o t h e n e t p e n . T h i s g r o u p o f f i s h b e g a n t o t a k e f e e d 48 h o u r s a f t e r i n t r o d u c t i o n . 2) C o n t r o l t r a n s p o r t / a c i d i f i e d n e t p e n . ( n e t p e n 2) T h i s g r o u p d i f f e r e d f r o m t h e f i r s t c o n t r o l g r o u p i n t h a t t h e y e x h i b i t e d some r e s p o n s e t o f e e d a t 24 h o u r s . L i k e t h e f i r s t c o n t r o l g r o u p , t h e s e f i s h w e r e a c t i v e a n d r e s p o n s i v e t o s t i m u l u s t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t . 3) MS222 t r e a t e d t r a n s p o r t / c o n t r o l n e t p e n . ( n e t p e n 3) T h e f i s h i n t h i s g r o u p w e r e t r e a t e d w i t h MS222 a n d a s a r e s u l t w e r e n o t r e s p o n s i v e t o l i g h t o r t a c t i l e s t i m u l u s . A p p r o x i m a t e l y 80% o f t h e f i s h i n t h i s t r a n s p o r t b o x e x p e r i e n c e d a l o s s o f e q u i l i b r i u m . U p o n i n t r o d u c t i o n i n t o t h e n e t p e n , r e c o v e r y was i m m e d i a t e a n d f e e d i n g was o b s e r v e d w i t h i n 24 h o u r s . 4) MS222 t r e a t e d t r a n s p o r t / a c i d i f i e d n e t p e n . ( n e t p e n 4 ) . D u r i n g t r a n s p o r t , t h e s e f i s h w e r e t r e a t e d w i t h t h e p r e v i o u s g r o u p a n d t h e r e f o r e h a d t h e same r e s p o n s e . H o w e v e r , 20 d u r i n g t h e l a t t e r s t a g e s o f t h e e x p e r i m e n t (96 t o 120 h o u r s ) , t h e s e f i s h w e r e o b s e r v e d t o b e more a c t i v e . 5) C a C l 2 & MS222 t r e a t e d t r a n s p o r t / c o n t r o l n e t p e n . ( p e n 5 ) . T r e a t e d w i t h C a C l 2 a n d a l i g h t d o s e o f MS222 f o r t r a n s p o r t t h e s e f i s h m a i n t a i n e d t h e i r e q u i l i b r i u m a n d w e r e s l i g h t l y r e s p o n s i v e t o t a c t i l e s t i m u l u s b u t a t t h e same t i m e were e a s i l y h a n d l e d . W i t h t h i s t y p e o f t r e a t m e n t , t h e r e was a r e l e a s e o f l o n g ( 4 - 5 c m ) , t r a n s l u c e n t s t r a n d s o f f e c a l m a t t e r ( f e c a l c a s t s ) . R e c o v e r y f r o m t h e a n e s t h e t i c was i m m e d i a t e u p o n i n t r o d u c t i o n i n t o t h e n e t p e n . T h i s g r o u p was o b s e r v e d t o be n o t a s a c t i v e a s t h e 25 mg/1 MS222 g r o u p o r t h e c o n t r o l g r o u p . F e e d i n g was o b s e r v e d a t 24 h o u r s . 6) C a C l 2 & MS222 t r e a t e d t r a n s p o r t / a c i d i f i e d n e t p e n . ( p e n 6) D u r i n g t r a n s p o r t , t h i s g r o u p was t r e a t e d w i t h t h e p r e v i o u s g r o u p a n d t h e r e f o r e o b s e r v a t i o n s w e r e t h e s a m e . M o r t a l i t y : No m o r t a l i t y o c c u r r e d d u r i n g t h e t r a n s p o r t a t i o n o f t h e f i s h t o t h e l a k e . T h e l a c k o f m o r t a l i t y d u r i n g t r a n s p o r t a t i o n , i n a l l t r e a t m e n t s , c o u l d b e a t t r i b u t e d t o t h e b r e v i t y o f t h e t r i p i t s e l f ( a p p r o x i m a t e l y on e h o u r ) . W i t h t r a d i t i o n a l s t o c k i n g p r o c e d u r e s , f i s h e x p e r i e n c e a pH c h a n g e o f +1 .4 u n i t s when p l a n t e d d i r e c t l y i n t o a l k a l i n e l a k e s . U s i n g t h e e x p e r i m e n t a l p r o c e d u r e , t h e f i s h 21 e x p e r i e n c e d a pH c h a n g e o f +0 .5 pH u n i t s . T h e MS222 t r e a t e d t r a n s p o r t / a c i d i f i e d g r o u p ( n e t p e n 4) e x p e r i e n c e d t h e l o w e s t m o r t a l i t y w h i l e t h e C a C l 2 a n d MS222 t r e a t e d t r a n s p o r t / a c i d i f i e d g r o u p ( n e t p e n 6) e x p e r i e n c e d t h e n e x t l o w e s t m o r t a l i t y . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e m i t i g a t i o n o f t r a n s p o r t s t r e s s w i t h c h e m i c a l s i n c o m b i n a t i o n w i t h C 0 2 was e f f e c t i v e i n d e c r e a s i n g m o r t a l i t y a s s o c i a t e d w i t h t h e s t o c k i n g o f a l k a l i n e l a k e s . C o n s e q u e n t l y , t h e s e n e t p e n s p r o d u c e d t h e s m a l l e s t number o f m o r t a l i t i e s ( T a b l e 1 ) . T h e n o n - a c i d i f i e d n e t p e n t h a t h o u s e d n o n - c h e m i c a l l y t r e a t e d f i s h ( n e t p e n 1) c o n t a i n e d f i s h t h a t h a d n o n e o f t h e s t r e s s e s m i t i g a t e d a n d t h i s n e t p e n e x p e r i e n c e d t h e h i g h e s t m o r t a l i t y r a t e ( T a b l e 1 ) . H e m a t o c r i t : Due t o i m p r o p e r s t o r a g e o f p l a s m a s a m p l e s , a l a r g e p r o p o r t i o n o f t h e s a m p l e s w e r e d e s t r o y e d . C o n s e q u e n t l y , s a m p l e s f r o m a l l s i x n e t p e n s w e r e p o o l e d f o r h c t . d e t e r m i n a t i o n . T h i s p r e v e n t e d t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f t r e a t m e n t s , h o w e v e r , a n o v e r a l l p i c t u r e o f t h e r e s p o n s e o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r was o b t a i n e d f r o m t h e p o o l e d s a m p l e s . H e m a t o c r i t v a l u e s g e n e r a l l y i n c r e a s e d o v e r t i m e t h r o u g h t r a n s p o r t a n d a c c l i m a t i o n i n t h e l a k e w a t e r ( F i g . 3 ) . 22 H e m a t o c r i t v a l u e s i n c r e a s e d f r o m a c o n t r o l v a l u e , t a k e n a t t h e h a t c h e r y , o f 42% t o a maximum o f 77.5% a t 144 h o u r s . P l a s m a I o n C o n c e n t r a t i o n s : See n o t e a b o v e , c o n c e r n i n g t h e l o s s o f s t o r e d p l a s m a s a m p l e s . P l a s m a s o d i u m c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y a t 24 h o u r s a n d r e m a i n e d a t a s i g n i f i c a n t l y h i g h e r c o n c e n t r a t i o n f r o m t h e c o n t r o l v a l u e t h r o u g h o u t t h e s i x d a y s a m p l e p e r i o d ( F i g . 4 ) . P l a s m a c h l o r i d e l e v e l s d i d n o t c h a n g e f r o m t h e c o n t r o l v a l u e a t 24 a n d 48 h . A t 7 2 , 9 6 , a n d 120 h , t h e [ C l ~ ] p i d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y f r o m c o n t r o l v a l u e s . A t 144 h o u r s , [ C l ~ ] p ^ was r e e s t a b l i s h e d t o l e v e l s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e s . S a m p l e n e t t i n g : T h r e e s p e c i e s o f f i s h w e r e c a u g h t i n t h e v a r i a b l e - m e s h g i l l n e t . Two s p e c i e s o f s u c k e r s , t h e L o n g n o s e s u c k e r (Catastomus catastomus) a n d t h e W h i t e s u c k e r ( C . commersoni), a n d r a i n b o w t r o u t w e r e t a k e n . A t o t a l o f 91 f i s h w e r e c a u g h t i n t h e two s e t s made ( T a b l e 2 ) . 23 D i s c u s s i o n : M i t i g a t i n g S t r e s s e s : I n a t t e m p t i n g t o a d d r e s s t h e p r o b l e m o f h i g h m o r t a l i t y i n t h e s t o c k i n g o f a l k a l i n e l a k e s , b o t h a l k a l i n e a n d t r a n s p o r t s t r e s s w e r e c o n s i d e r e d . T h e s t r e s s t h a t f i s h e x p e r i e n c e d u r i n g t r a n s p o r t a t i o n i s w e l l d o c u m e n t e d (Wedemeyer , 1 9 7 2 ; S p e c k e r a n d S h r e c k 1 9 8 0 ; Wedemeyer a n d M c L e a y , 1 9 8 1 ) . I n a s t u d y b y Wedemeyer e t a l . ( 1 9 8 5 ) , i t was f o u n d t h a t t h e u s e o f MS222 i n t h e t r a n s p o r t m e d i a i m p r o v e d s u r v i v a l a n d m i t i g a t e d s t r e s s i n f i s h . I t was a l s o s u g g e s t e d i n t h a t s t u d y t h a t m i n e r a l s a l t s ( i . e . C a C l 2 ) a d d e d t o t h e t r a n s p o r t m e d i a p r o v i d e d a d d e d p r o t e c t i o n a g a i n s t o s m o r e g u l a t o r y i m b a l a n c e s t h a t o c c u r d u r i n g s t r e s s f u l t r a n s p o r t s b y a c t i n g a s a d d e d e l e c t r o l y t e s . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h r e e r e g i m e s o f w a t e r q u a l i t y w e r e u s e d t o t r a n s p o r t t h e f i s h t o t h e s i t e . I n t h i s w a y , o b s e r v a t i o n s made o f t h e e x p e r i m e n t a l t r a n s p o r t m e d i a c o u l d b e c o m p a r e d t o t h o s e o f t h e c o n t r o l m e d i a ( h a t c h e r y w a t e r ) . H o w e v e r , n o m o r t a l i t y o c c u r r e d d u r i n g t r a n s p o r t o f t h e f i s h t o a l l o w f o r c o m p a r i s o n b e t w e e n t r e a t m e n t s . C o n s e q u e n t l y , i t c o u l d n o t be d e t e r m i n e d i f t h e u s e o f t h e s e c h e m i c a l s r e d u c e d t h e number o f m o r t a l i t i e s d u r i n g t r a n s p o r t . T h e s e c h e m i c a l s d i d , h o w e v e r , e f f e c t i v e l y r e d u c e t h e f i s h ' s 24 r e a c t i o n t o e x t e r n a l s t i m u l i a n d s e d a t e them e n o u g h t o b e h a n d l e d e a s i e r t h a n t h e c o n t r o l f i s h . T h u s , i t c o u l d be i n f e r r e d t h a t t h e f i s h t r e a t e d w i t h t h e c h e m i c a l s d u r i n g t r a n s p o r t a t i o n e x p e r i e n c e d l e s s s t r e s s . T h e s e o b s e r v a t i o n s a g r e e s t r o n g l y w i t h a s t u d y b y Wedemeyer e t a l . ( 1 9 8 5 ) , i n w h i c h c h i n o o k s a l m o n s m o l t s r e s p o n d e d s i m i l a r l y t o t h e same c h e m i c a l a l t e r a t i o n o f t h e t r a n s p o r t m e d i a . W h i l e m o r t a l i t y i s r a t h e r a n e x t r e m e p a r a m e t e r > o t h e r e f f e c t s s u c h a s l o w e r e d d i s e a s e r e s i s t a n c e o r p r e d a t o r a v o i d a n c e w e r e n o t a s s e s s e d . T h e s t r e s s t h a t o c c u r s u p o n t h e i n t r o d u c t i o n o f f i s h i n t o a l k a l i n e w a t e r s h a s a l s o b e e n d o c u m e n t e d ( W i t s c h i a n d Z i e b e l l , 1 9 7 9 ; M u r r a y a n d Z i e b e l l , 1984 ; W r i g h t a n d Wood , 1 9 8 5 ) . T h e b u b b l i n g o f C 0 2 t h r o u g h n e t p e n s was i m p l e m e n t e d t o r e d u c e t h e pH i n c r e a s e e x p e r i e n c e d b y t h e f i s h u p o n i n t r o d u c t i o n t o t h e a l k a l i n e w a t e r o f t h e l a k e . By r e d u c i n g t h e l a r g e pH c h a n g e a s s o c i a t e d w i t h t h e s t o c k i n g o f f i s h i n t o a l k a l i n e l a k e s , a n d b y s l o w l y i n c r e a s i n g t h e pH t o 9 . 5 , t h e s u r v i v a l r a t e s o f t h e f i s h w e r e i m p r o v e d . T h i s i n d i c a t e s t h a t a r e d u c t i o n i n t h e m a g n i t u d e o f t h e pH c h a n g e t h a t t h e f i s h e x p e r i e n c e when s t o c k e d f r o m n e u t r a l p H , h a t c h e r y w a t e r , t o a l k a l i n e w a t e r may b e n e c e s s a r y t o a v o i d a l a r g e number o f m o r t a l i t i e s . 25 D u r i n g t h e c o u r s e o f t h i s s t u d y , [Na ] p i was e l e v a t e d w h i l e [ C l ~ ] p i r e m a i n e d s t a b l e a t 24 a n d 48 h o u r s a n d t h e n d e c r e a s e d a t 7 2 , 9 6 , a n d 120 h ( F i g . 4 a n d 5 ) . I t i s q u i t e p o s s i b l e t h a t t h e e l e v a t e d [ N a + ] p ^ was a r e s u l t o f t h e e x c h a n g e o f p l a s m a N H 4 + f o r e x t e r n a l N a + . P a y a n ( 1 9 7 8 ) , s u g g e s t e d t h a t t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e f u n c t i o n e d t o e x c r e t e n i t r o g e n o u s w a s t e i n t h e f o r m o f N H 4 + a n d m a i n t a i n [ N a + ] p 2 . I n t h a t s t u d y i t was a r g u e d t h a t b e c a u s e ammonia e x c r e t i o n i s i n h i b i t e d a t h i g h w a t e r p H , t h e e x c h a n g e o f e x t e r n a l N a + f o r p l a s m a N H 4 + was n e c e s s a r y t o a m e l i o r a t e t h e p l a s m a ammonia b u i l d u p . A n o t h e r p o s s i b l e e x p l a n a t i o n f o r t h e s e c o n c e n t r a t i o n s o f p l a s m a i o n s was g i v e n i n a s t u d y b y P o u p i n a n d Thomas ( 1 9 8 5 ) . I n t h a t s t u d y , i t was s u g g e s t e d t h a t [ N a + ] p 1 i n c r e a s e d b y t h e d i r e c t e x c h a n g e o f e x t e r n a l N a + w i t h e n d o g e n o u s [ H + ] . A t t h e same t i m e , t h e e x c h a n g e o f e n d o g e n o u s H C 0 3 ~ w i t h e x t e r n a l C l ~ was r e d u c e d b e c a u s e o f t h e t r e m e n d o u s i n c r e a s e i n e x t e r n a l [ H C 0 3 ~ ] . A s a r e s u l t , t C l ~ ] p ^ d e c r e a s e d i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o w a t e r w i t h h i g h c a r b o n a t e a l k a l i n i t y . T h e a l m o s t t w o - f o l d i n c r e a s e i n h e m a t o c r i t v a l u e s m i g h t h a v e b e e n t h e r e s u l t o f t h e d i s p l a c e m e n t o f e x t r a c e l l u l a r f l u i d i n r e s p o n s e t o t h e a l k a l i n e w a t e r e x p o s u r e . F i r s t , t h e i n c r e a s e i n h e m a t o c r i t c o u l d h a v e b e e n a r e s u l t o f p l a s m a C l ~ l o s s , w h i c h was o b s e r v e d i n t h e p r e s e n t s t u d y . 26 I t h a s b e e n shown t h a t , b r a n c h i a l i o n l o s s d e c r e a s e d o s m o t i c p r e s s u r e o f p l a s m a a n d t h i s c a u s e d t h e d i s p l a c e m e n t o f e x t r a c e l l u l a r f l u i d ( M i l l i g a n a n d Wood , 1 9 8 2 ) . A d i r e c t r e s u l t o f t h i s d i s p l a c e m e n t i s a n i n c r e a s e i n h e m a t o c r i t ( M c D o n a l d , 1 9 8 3 ) . A c c o r d i n g t o R a n d a l l e t a l . ( 1 9 8 8 ) , w a t e r s w i t h h i g h b u f f e r i n g c a p a c i t i e s s e r v e t o r e m o v e t h e a c i d - b o u n d a r y l a y e r o f t h e g i l l s a n d t h u s i n h i b i t ammonia e x c r e t i o n i n t r o u t . F r o m t h i s e v i d e n c e i t w o u l d seem t h a t t r o u t s h o u l d n o t be a b l e t o s u r v i v e i n G r e e n L a k e . H o w e v e r , t h e s a m p l e n e t t i n g s showed t h a t r a i n b o w t r o u t do s u r v i v e i n t h i s l a k e a n d t h e y c a n g r o w t o q u i t e a l a r g e s i z e ( T a b l e , 2 ) . R a n d a l l e t a l . ( 1 9 8 8 ) , d e s c r i b e d c e r t a i n c i c h l i d s p e c i e s t h a t c a n s u r v i v e i n a l k a l i n e K e n y a n l a k e s b y c o n v e r t i n g ammonia t o u r e a . O l s o n a n d Fromm (1971) s u g g e s t t h a t r a i n b o w t r o u t c a n n o t e x c r e t e ammonia v i a t h e o r n i t h i n e - u r e a c y c l e . H o w e v e r , H u g g i n s e t a l . (1969) s t a t e t h a t t h e o r n i t h i n e - u r e a c y c l e h a s b e e n s u p p r e s s e d i n f r e s h w a t e r t e l e o s t s b u t c a n b e " d e r e p r e s s e d " when ammonia e x c r e t i o n i s i n h i b i t e d . T h e r e f o r e , t h e n e x t l o g i c a l s t e p i n t r y i n g t o i n c r e a s e t h e s u r v i v a l o f r a i n b o w t r o u t i n a l k a l i n e l a k e s w o u l d be t o c l o s e l y e x a m i n e t h e s e f i s h t o s e e i f t h e y h a v e t h e c a p a c i t y t o c o n v e r t ammonia t o u r e a v i a t h e o r n i t h i n e - u r e a c y c l e o r e x c r e t e ammonia v i a some o t h e r m e c h a n i s m . I f , i n f a c t , 27 r a i n b o w t r o u t a r e f o u n d t o c o n v e r t ammonia t o u r e a o r e x c r e t e ammonia b y some o t h e r m e a n s , t h i s i n f o r m a t i o n w o u l d b e i n v a l u a b l e i n e x p l a i n i n g how t r o u t s u r v i v e i n a l k a l i n e w a t e r s a n d c o u l d b e a p p l i e d t o t h e p r o b l e m o f l o w s u r v i v a l r a t e s o f f i s h i n a l k a l i n e l a k e s . Management I m p l i c a t i o n s : M i t i g a t i n g t h e s t r e s s e s a s s o c i a t e d w i t h t h e s t o c k i n g r a i n b o w t r o u t i n t o a l k a l i n e l a k e s p r o v e d t o be b e n e f i c i a l t o t h e t r o u t i n t e r m s o f i n c r e a s i n g s u r v i v a l r a t e s . R e d u c i n g t h e s e s t r e s s e s a l s o a l t e r e d b e h a v i o u r s o t h a t t h e e x p e r i m e n t a l f i s h w e r e more a c t i v e i n f e e d i n g a n d b e h a v i o u r . M u r r a y a n d Z i e b e l l ( 1 9 8 4 ) , d e s c r i b e d a f i s h e r i e s management i m p l i c a t i o n o f t h i s a l t e r e d b e h a v i o u r . I n a l k a l i n e l a k e s w h e r e f i s h i n g p r e s s u r e i s h i g h , e s s e n t i a l l y " p u t a n d t a k e " l a k e s , a n a c t i v e l y f e e d i n g f i s h i s a g r e a t e r b e n e f i t t o t h e f i s h e r y t h a n a f i s h t h a t d o e s n o t f e e d . I t was a l s o s t a t e d t h a t a more a c t i v e l y f e e d i n g f i s h i s more l i k e l y t o s u r v i v e , t o be c a u g h t o n a n o t h e r d a y , t h a n a f i s h t h a t i s n o t . R e c o m m e n d a t i o n s : T h e m i t i g a t i o n o f b o t h t r a n s p o r t a n d a l k a l i n e s t r e s s i n c r e a s e t h e s u r v i v a l o f R a i n b o w t r o u t t h a t a r e s t o c k e d i n t o a l k a l i n e w a t e r s . B o t h c h e m i c a l t r e a t m e n t s t h a t w e r e u s e d (MS222 a n d C a C l 2 + MS222) seemed t o r e d u c e t h e s t r e s s o f t r a n s p o r t a t i o n e q u a l l y . T h e r e f o r e , b o t h c a n be 28 r e c o m m e n d e d f o r u s e . T h e n e t p e n a c c l i m a t i o n p r o c e d u r e u s e d t o r e d u c e t h e s t r e s s o f a l k a l i n e s h o c k was c o n s t r u c t e d t o b e p o r t a b l e a n d c o m p a c t . C o n s e q u e n t l y , t h e number o f f i s h t h a t t h i s a p p a r a t u s c o u l d a c c l i m a t e t o a l k a l i n e w a t e r s was q u i t e s m a l l . A p r o c e s s t h a t c o u l d a c c l i m a t e t h e f i s h i n t h e same m a n n e r b u t i n l a r g e r n u m b e r s w o u l d b e more p r a c t i c a l a n d e c o n o m i c . S i n c e t h e r e a number o f a l k a l i n e l a k e s i n t h e C a r i b o o i t w o u l d be m o s t e f f i c i e n t i f a l a r g e number o f f i s h c o u l d be a c c l i m a t e d t o a l k a l i n e w a t e r i n one b a t c h . T h e h a t c h e r y a c c l i m a t i o n p r o c e s s i s a p r o c e s s t h a t u s e s l a r g e C a p i l a n o t r o u g h s i n h a t c h e r i e s a n d h a s t h e c a p a c i t y t o a c c l i m a t e many t h o u s a n d s o f f i s h a t one t i m e . T h e f i s h a r e a c c l i m a t e d t o t h e h i g h pH w a t e r b y s l o w l y i n f u s i n g a s o l u t i o n o f s o d i u m h y d r o x i d e (NaOH) a n d w a t e r a t t h e i n f l o w o f t h e t r o u g h s t o r a i s e t h e p H . T h e r a t e o f f l o w o f t h e NaOH s o l u t i o n i s t h e n i n c r e a s e d s t e p - w i s e o v e r a 6 d a y p e r i o d u n t i l t h e pH o f t h e t r o u g h m a t c h e s t h a t o f t h e t a r g e t l a k e s . T h i s a c c l i m a t i o n p r o c e s s h a s b e e n c a r r i e d o u t s u c c e s s f u l l y b y M u r r a y a n d Z i e b e l l ( 1 9 8 5 ) . T h i s p r o c e d u r e h a s n e v e r b e e n u n d e r t a k e n i n t h e h a t c h e r y s y s t e m o f B r i t i s h C o l u m b i a . H o w e v e r , t h i s p r o c e d u r e w o u l d b e q u i t e f e a s i b l e b e c a u s e i t s h o u l d be c a r r i e d o u t b e t w e e n A p r i l a n d J u l y . I t i s d u r i n g t h e s e m o n t h s o f t h e y e a r , t h a t many o f t h e l a r g e t r o u g h s i n t h e h a t c h e r i e s a r e n o t u s e d . 29 N e t p e n : 1 2 3 4 5 6 T r e a t : n o n e none MS222 MS222 C a C a W a t e r : n o n e C 0 2 n o n e C 0 2 n o n e C 0 2 T i m e : N o . o f d e a t h s (h) 1 0 0 0 0 0 0 6 0 0 0 0 0 0 24 28 26 0 0 9 0 48 42 51 17 12 21 13 72 135 89 96 80 82 17 96 65 23 54 11 27 25 120 70 37 20 3 23 21 144 80 23 18 22 15 15 T o t a l M o r t . 420 239 205 128 177 91 T o t a l F i s h 1000 1000 1000 1000 1000 1000 % S u r v . 58 7 6 . 1 7 9 . 5 8 7 . 2 8 2 . 3 9 2 . 9 T a b l e 1: M o r t a l i t y a n d S u r v i v a l R a t e s o f r a i n b o w t r o u t i n n e t p e n s a c i d i f i e d w i t h C 0 2 . C a d e n o t e s C a C l 2 + MS222 t r e a t m e n t . S e t #1 D a t e : J u n e 1 3 , 1 9 8 8 . L o c a t i o n : 150 y a r d s i n f r o n t o f W a t c h C r e e k . T i m e : 4 : 0 0 - 9 : 0 0 PM C a t c h : 6 S u c k e r s - a l l Catastomus catastomus 0 r a i n b o w t r o u t - Oncorhynchus mykiss S e t #2 D a t e : J u n e 1 5 , 1 9 8 8 . L o c a t i o n : 50 y a r d s i n f r o n t o f W a t c h C r e e k . T i m e : 4 : 3 0 - 1 0 : 0 0 AM C a t c h : 46 S u c k e r s - 19 Catastomus commersoni - 27 Catastomus catastomus 2 R a i n b o w t r o u t - Oncorhynchus mykiss - 1 s p a w n i n g f e m a l e (27 i n c h e s ) . - 1 s p a w n i n g m a l e (18 i n c h e s ) . G e a r = 200 f t . v a r i a b l e mesh m o n o f i l a m e n t g i l l n e t . T a b l e 2: S a m p l e N e t t i n g o f G r e e n L a k e , B r i t i s h C o l u m b i a . 31 F i g u r e 3 : Means + / - 1 S . E . o f h e m a t o c r i t i n j u v e n i l e r a i n b o w t r o u t a c c l i m a t e d t o a l k a l i n e w a t e r (pH 9 . 5 ) a s a f u n c t i o n o f t i m e ( h ) . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . N = 9 . 32 2 2 0 T Time (hours) F i g u r e 4: Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a N a + c o n c e n t r a t i o n s i n j u v e n i l e r a i n b o w t r o u t a c c l i m a t e d t o a l k a l i n e w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e ( h ) . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . N = 9 . 33 1 3 0 T 1 2 5 -Time (hours) F i g u r e 5 : Means + / " 1 S - E - o f P l a s m a C I " c o n c e n t r a t i o n s i n j u v e n i l e r a i n b o w t r o u t a c c l i m a t e d t o a l k a l i n e w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e ( h r s . ) . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . N = 9 . 34 C h a p t e r 1 S e c t i o n 2: F i e l d S t u d y 1989 T h e H a t c h e r y A c c l i m a t i o n o f R a i n b o w T r o u t t o A l k a l i n e W a t e r s I n t r o d u c t i o n : F o l l o w i n g t h e 1988 f i e l d s t u d y , i t was d e s i r a b l e t o u s e a more p r a c t i c a l , c o s t - e f f e c t i v e m e t h o d o f a c c l i m a t i n g f i s h t o a l k a l i n e l a k e s . T h e r e f o r e , a p r o c e d u r e f r o m M u r r a y a n d Z i e b e l l ( 1 9 8 4 ) , was a d a p t e d . I n s t e a d o f a c c l i m a t i n g f i s h a t t h e l a k e i n n e t p e n s , a s was c a r r i e d o u t i n t h e f i r s t e x p e r i m e n t , t h e f i s h w e r e f i r s t a c c l i m a t e d t o some f e a t u r e s o f t h e l a k e s ' w a t e r q u a l i t y a t t h e h a t c h e r y , a n d t h e n p l a n t e d i n t o t h e l a k e . A u d e t a n d Wood ( 1 9 8 8 ) , showed t h a t f i s h do n o t a c c l i m a t e t o l o w pH c o n d i t i o n s a l o n e , h o w e v e r , i n t h a t same p a p e r , i t was s t a t e d t h a t s a l m o n i d s a c c l i m a t e d t o l o w pH a n d e l e v a t e d c o n c e n t r a t i o n s o f a l u m i n u m t o g e t h e r . C o n s e q u e n t l y , t h e f i s h i n t h e p r e s e n t s t u d y w e r e a c c l i m a t e d t o b o t h h i g h pH a n d e l e v a t e d w a t e r h a r d n e s s i n a a t t e m p t t o a c c l i m a t e t h e m t o t h e c o n d i t i o n s o f t h e l a k e . Many a c c l i m a t i o n s t u d i e s h a v e b e e n c a r r i e d o u t i n a c i d i c w a t e r ( M c W i l l i a m s , 1 9 8 2 ; Wood e t a l . 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 b ) . Some o f t h e s e s t u d i e s h a v e shown p h y s i o l o g i c a l e v i d e n c e o f a c c l i m a t i o n (Wood e t a l . 1 9 8 8 a , 1 9 8 8 b ) . One s t u d y , ( A u d e t a n d W o o d , 1 9 8 8 ) , d e t e r m i n e d t h a t a c c l i m a t i o n o f f i s h t o a c i d i c c o n d i t i o n s a l o n e d o e s n o t o c c u r . M u r r a y a n d Z i e b e l l ( 1 9 8 4 ) , h a s b e e n t h e o n l y p a p e r t o a c c l i m a t e f i s h t o a l k a l i n e w a t e r w i t h s u c c e s s . I n t h e i r s t u d y , s u c c e s s f u l 36 a c c l i m a t i o n was b a s e d o n t h e f i s h ' s a b i l i t y t o t a k e f e e d ( o n l y n o n - s t r e s s e d f i s h t a k e f e e d ) , b e h a v i o u r , a n d number o f m o r t a l i t i e s . T h e p r e s e n t s t u d y was d e s i g n e d t o s t u d y n o t o n l y f e e d i n g a c t i v i t y a n d b e h a v i o u r , b u t t o a l s o l o o k a t p h y s i o l o g i c a l p a r a m e t e r s a s i n d i c a t o r s o f a s u c c e s s f u l a c c l i m a t i o n . I n t h e p r e v i o u s 1988 f i e l d s t u d y , p l a s m a s a m p l e s w e r e p o o l e d d u e t o i m p r o p e r s t o r a g e o f t h e p l a s m a a n d c o n s e q u e n t l y no d i f f e r e n t i a t i o n b e t w e e n t h e c o n t r o l a n d e x p e r i m e n t a l f i s h was p o s s i b l e . C o n s e q u e n t l y , t h i s e x p e r i m e n t was c o n d u c t e d i n o r d e r t o o b t a i n a more a c c u r a t e a n d t h o r o u g h s a m p l i n g o f t h e b l o o d p a r a m e t e r s o f c o n t r o l a n d e x p e r i m e n t a l f i s h , t h a t a r e p l a n t e d i n t o a n a l k a l i n e l a k e . T h e m a i n o b j e c t i v e o f t h i s s t u d y was t o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t a c c l i m a t i o n p r o c e d u r e s c a r r i e d o u t a t t h e h a t c h e r y t o i n c r e a s e d w a t e r pH a n d w a t e r h a r d n e s s w o u l d i n c r e a s e t h e s u r v i v a l r a t e o f r a i n b o w t r o u t p l a n t e d i n t o a l k a l i n e l a k e s . 37 M e t h o d s a n d M a t e r i a l s : L o c a t i o n : See G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 1, f o r more d e t a i l s . E x p e r i m e n t a l F i s h : See G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 1 , f o r more d e t a i l s . T h e mean w e i g h t a n d l e n g t h o f t h e y e a r l i n g t r o u t u s e d i n t h i s e x p e r i m e n t was 1 2 . 3 g ± 1 .2 ( S . E . ) a n d 1 5 . 3 c m + 2 . 5 ( S . E . ) , r e s p e c t i v e l y . A t o t a l o f 4 , 0 0 0 f i s h , 2 , 0 0 0 p e r t r e a t m e n t , w e r e u s e d i n t h e e x p e r i m e n t . H o l d i n g a n d A c c l i m a t i n g F a c i l i t i e s : T h e f i s h w e r e h a n d g r a d e d f o r s i z e a t t h e L o o n L a k e T r o u t H a t c h e r y a n d t h e n d i v i d e d i n t o two g r o u p s . One g r o u p was t h e c o n t r o l a n d t h e o t h e r was t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p . T h e c o n t r o l g r o u p was h e l d i n a C a p i l a n o t r o u g h f e d w i t h s p r i n g w a t e r (pH 7 . 8 , 300 m g / 1 ) . T h e e x p e r i m e n t a l g r o u p was h e l d i n a s i m i l a r t r o u g h h o w e v e r , o v e r a 6 d a y p e r i o d c o n c e n t r a t e d s o d i u m h y d r o x i d e ( 0 . 2 M NaOH) a n d c a l c i u m c a r b o n a t e (3200 mg l - 1 C a C 0 3 ) w e r e s l o w l y m e t e r e d i n t o t h e r a c e w a y . P e r i s t a l t i c pumps ( H a r v a r d A p p a r a t u s , M a s s a c h u s e t t s ) w e r e u s e d t o i n f u s e t h e c o n c e n t r a t e d c h e m i c a l 38 s o l u t i o n s i n t o t h e t r o u g h . T h e w a t e r pH a n d h a r d n e s s o f t h e e x p e r i m e n t a l t r o u g h was s l o w l y i n c r e a s e d s t e p - w i s e o v e r t h e 6 d a y p e r i o d u n t i l i t m a t c h e d t h e pH a n d h a r d n e s s o f G r e e n L a k e (pH 9 . 5 , 800 mg/1 C a C 0 3 ) . T h e t r o u g h w a t e r pH was i n c r e a s e d i n i n c r e m e n t s o f 0 . 3 pH u n i t s p e r d a y e x c e p t o n s i x t h d a y t h e pH was i n c r e a s e d 0 . 2 pH u n i t s t o 9 . 5 pH u n i t s . T h e h a r d n e s s o f t h e w a t e r i n t h e t r o u g h was i n c r e a s e d b y * 1 0 0 mg l - 1 p e r d a y b y c a l c u l a t i n g w h a t c o n c e n t r a t i o n o f C a C 0 3 was n e e d e d t o be a d d e d t o t h e t r o u g h t o m a i n t a i n t h e d e s i r e d t a r g e t w a t e r h a r d n e s s . T h e w a t e r pH o f t h e t r o u g h s w e r e m o n i t o r e d w i t h a g l a s s c a p i l l a r y e l e c t r o d e ( R a d i o m e t e r , C o p e n h a g e n ) c o u p l e d t o a PHM84 pH m e t e r ( R a d i o m e t e r ) . F l o w r a t e s i n b o t h t r o u g h s w e r e s e t a t 2 l i t e r s m i n " " 1 . T r a n s p o r t a t i o n : On t h e s e v e n t h d a y , f o l l o w i n g a c c l i m a t i o n , t h e f i s h w e r e t r a n s p o r t e d t o t h e e x p e r i m e n t a l s i t e i n a 150 g a l l o n i n s u l a t e d , f i b e r g l a s s t r a n s p o r t t a n k t h a t was o x y g e n a t e d . T h e f i s h w e r e t r a n s p o r t e d t o t h e s i t e i n c h e m i c a l l y a l t e r e d t r a n s p o r t m e d i a . C a l c i u m c h l o r i d e a n d M S 2 2 2 , (25 mg/1 C a C l 2 , 10 mg/1 MS222 a n d 10 mg/1 N a H C 0 3 ) , w e r e a d d e d t o t h e t r a n s p o r t w a t e r ( S e e F i e l d S t u d y 1988 f o r more d e t a i l s ) . T h e s e c h e m i c a l s w e r e u s e d t o h e l p i n r e d u c i n g t h e s t r e s s o f t r a n s p o r t a t i o n i n t h e f i s h a s shown b y Wedemeyer e t a l . 39 ( 1 9 8 5 ) . By r e d u c i n g t h e t r a n s p o r t a t i o n s t r e s s e x p e r i e n c e d b y t h e f i s h , t h e e x p e r i m e n t c o u l d t h e n be f o c u s e d o n a d d r e s s i n g i t s m a i n o b j e c t i v e , i n v e s t i g a t i n g t h e s t r e s s e s a s s o c i a t e d w i t h t h e s t o c k i n g o f a l k a l i n e l a k e s . T h e f i s h w e r e c h e c k e d f o r p h y s i c a l s i g n s o f s t r e s s ( l e t h a r g y , l o s s o f e q u i l i b r i u m , l e t h a r g y e t c . ) a n d m o r t a l i t y a t t h e h a l f way p o i n t o f t h e t r i p . Two t r a n s p o r t t r i p s t o t h e l a k e w e r e made . T h e e x p e r i m e n t a l a n d c o n t r o l g r o u p s w e r e t r a n s p o r t e d s e p a r a t e l y . E x p e r i m e n t a l N e t p e n s : See G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 1 , f o r more d e t a i l s . P r o t o c o l : A t t h e h a t c h e r y , p r i o r t o a c c l i m a t i o n , b l o o d s a m p l e s w e r e t a k e n f r o m e a c h t r e a t m e n t . S i x t e e n f i s h p e r t r e a t m e n t w e r e s a m p l e d t h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t . W h o l e b l o o d was c e n t r i f u g e d f o r h c t d e t e r m i n a t i o n a n d t h e r e s u l t i n g p l a s m a was f r o z e n f o r l a t e r i o n a n a l y s i s . U p o n a r r i v a l a t G r e e n L a k e , t h e f i s h w e r e a g a i n s a m p l e d ( p o s t a c c l i m a t i o n ) . T h e t r a n s p o r t e d f i s h w e r e t h e n p l a c e d i n t o b l a c k p l a s t i c 77 l i t e r g a r b a g e c a n s , m a k i n g s u r e t h a t 40 t h e f i s h w e r e n o t t o o c r o w d e d , a n d p l a c e d i n t o a n a w a i t i n g b o a t . T h e f i s h w e r e t h e n r o w e d o u t t o t h e n e t p e n s w h e r e t h e y w e r e r e l e a s e d i n t o t h e n e t p e n s . A p p r o x i m a t e l y , 2 , 0 0 0 f i s h w e r e p l a c e d i n t o e a c h n e t p e n . B l o o d s a m p l e s w e r e t a k e n f r o m e a c h n e t p e n a t 2 4 , 4 8 , 7 2 , 9 6 , 120 a n d 144 h a f t e r i n t r o d u c t i o n . O b s e r v a t i o n s o f f e e d i n g a c t i v i t y , b o d y c o l o r i n g a n d m o r t a l i t y w e r e a l s o n o t e d a t t h e s e t i m e s . A l l f i s h w e r e f e d a c o m m e r c i a l t r o u t d i e t f o r a maximum o f 14 d a y s a n d t h e n w e r e r e l e a s e d i n t o t h e l a k e . P l a s m a I o n A n a l y s e s : See G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 1 , f o r more d e t a i l s . S t a t i s t i c s : See G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 1 , f o r more d e t a i l s . R e s u l t s : C o n t r o l v a l u e s f o r h c t , [ N a + ] p 2 a n d [ C l ' J p ^ w e r e w e l l w i t h i n t h e r a n g e o f n o r m a l v a l u e s o f n o n - s t r e s s e d r a i n b o w t r o u t d e t e r m i n e d b y Wedemeyer ( 1 9 7 2 ) . T h e d i f f e r e n c e i n t o t a l a c c u m u l a t e d m o r t a l i t y o v e r t h e 120 h o u r p e r i o d was l a r g e ( T a b l e 3 ) . T h e c o n t r o l g r o u p o f f i s h e x p e r i e n c e d m o r t a l i t y a l m o s t t h r e e t i m e s g r e a t e r t h a n t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p . S t a t i s t i c a l l y , t h e c h i - s q u a r e t e s t o f i n d e p e n d e n c e d e t e r m i n e d t h a t t h e p r o p o r t i o n s o f t h e f i s h s u r v i v i n g v a r i e d d e p e n d i n g o n t h e t r e a t m e n t . I n o t h e r w o r d s , t h e a c c l i m a t i o n p r o c e d u r e p r o d u c e d h i g h e r s u r v i v a l r a t e s t h a n t h e c o n t r o l g r o u p . H e m a t o c r i t v a l u e s i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y a t 7 2 , 9 6 , a n d 120 h o f t h e e x p e r i m e n t ( F i g . 6 ) . B o t h t r e a t m e n t s e x p e r i e n c e d t h i s i n c r e a s e i n h c t a n d t h e r e was no d i f f e r e n c e i n h e m a t o c r i t v a l u e s b e t w e e n t r e a t m e n t s a t a n y t i m e d u r i n g t h e e x p e r i m e n t . P l a s m a s o d i u m c o n c e n t r a t i o n s i n c r e a s e d t r a n s i e n t l y a t p o s t a c c l i m a t i o n a n d a t 24 h o u r s o f t h e e x p e r i m e n t ( F i g . 7 ) . H o w e v e r , a f t e r 24 h o u r s b o t h t r e a t m e n t s e x p e r i e n c e d d e c r e a s e s i n [ N a + ] p 1 . T h i s d e c r e a s e was o n l y s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t f o r t h e c o n t r o l g r o u p a t 120 h o u r s . A t 120 h o u r s t h e r e was a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n [ N a + ] p l b e t w e e n t h e two t r e a t m e n t s . P l a s m a c h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n s d e c r e a s e d 42 s i g n i f i c a n t l y a t 24 h o u r s o f e x p o s u r e t o t h e a l k a l i n e w a t e r f o r b o t h t r e a t m e n t s ( F i g . 8 ) . P l a s m a c h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n s f o r t h e c o n t r o l ( n o n - a c c l i m a t e d ) t r e a t m e n t r e m a i n e d s i g n i f i c a n t l y l o w e r a t 48 a n d 72 h a n d t h e n i n c r e a s e d t o l e v e l s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e s a t 96 a n d 120 h . A f t e r a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e a t 24 h o u r s t h e [ C l ~ ] p 1 o f t h e e x p e r i m e n t a l t r e a t m e n t i n c r e a s e d t o l e v e l s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f o r m t h e c o n t r o l v a l u e s . T h e a c c l i m a t e d f i s h w e r e a b l e t o r e g u l a t e t h e i r p l a s m a i o n s more e f f e c t i v e l y i n t h e a l k a l i n e w a t e r . T h i s was more o b v i o u s w i t h [ C l ~ ] p j b e c a u s e t h e r e w e r e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e two t r e a t m e n t s a t 48 a n d 72 h . W h e r e a s w i t h [ N a + ] p 1 t h e r e was o n l y a s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e two t r e a t m e n t s a t 120 h o u r s . D e f i n i t e d i f f e r e n c e s i n b e h a v i o u r a t 24 h o u r s w e r e v i s i b l e b e t w e e n t h e two t r e a t m e n t s . A l a r g e p r o p o r t i o n o f t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p was t a k i n g f e e d a n d p o s s e s s e d t h e l i g h t b o d y c o l o r a t i o n t y p i c a l o f n o n - s t r e s s e d f i s h . A t 24 h o u r s , o n l y a s m a l l p r o p o r t i o n o f t h e c o n t r o l g r o u p w o u l d a c c e p t f e e d . A l a r g e p r o p o r t i o n o f t h e c o n t r o l g r o u p e x h i b i t e d d a r k b o d y c o l o r a t i o n a n d l e t h a r g y a s s o c i a t e d w i t h s t r e s s . T h r o u g h t h e s e o b s e r v a t i o n s , i t was v i s i b l e t h a t t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p o f f i s h e x p e r i e n c e d l e s s s t r e s s t h a n t h e c o n t r o l g r o u p when p l a n t e d i n t o t h e a l k a l i n e w a t e r . 43 D i s c u s s i o n : T h e p r a c t i c e o f a c c l i m a t i n g r a i n b o w t r o u t a t t h e h a t c h e r y t o t h e a l k a l i n e , h a r d w a t e r c o n d i t i o n s o f t h e t a r g e t l a k e was s u c c e s s f u l i n r e d u c i n g t h e m o r t a l i t y a s s o c i a t e d w i t h t h e s t o c k i n g o f f i s h i n t o a l k a l i n e w a t e r . T h e l a r g e d i f f e r e n c e i n m o r t a l i t y was p r o b a b l y d u e t o a l o s s o f i o n o r e g u l a t o r y c a p a c i t i e s . I n a c i d i c c o n d i t i o n s , t h e l o w pH c o n d i t i o n s m o d i f i e s t h e " t i g h t " b r a n c h i a l e p i t h e l i a c a u s i n g a n e f f l u x o f p l a s m a i o n s o u t o f t h e g i l l s o f s a l m o n i d s ( M c D o n a l d , 1 9 8 2 ) . T h i s e f f l u x i s d u e t o t h e l o s s o f c a l c i u m i n t h e e p i t h e l i a l j u n c t i o n s ( M i l l i g a n a n d Wood , 1 9 8 2 ) . I n a s t u d y b y W r i g h t a n d Wood , 1 9 8 5 , [ N a + ] p l d e c r e a s e d w i t h b o t h s e v e r e a c i d i c a n d a l k a l i n e e x p o s u r e . I n t h a t s t u d y t h a t t h e n e t e f f l u x o f [ N a + ] p j was d u e t o t h e i n h i b i t i o n o f t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e m e c h a n i s m a n d t h e l o s s o f [ N a + ] p 2 v i a t h e b r a n c h i a l e p i t h e l i a . A u d e t a n d Wood ( 1 9 8 8 ) , f o u n d s i m i l a r r e s u l t s when r a i n b o w t r o u t w e r e a c c l i m a t e d t o l o w pH c o n d i t i o n s . T h e p r e s e n t s t u d y showed t h a t [ N a + ] p j L d e c r e a s e d a n d t h a t [ C l ~ ] p i i n i t i a l l y d e c r e a s e d i n t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e w a t e r , i n d i c a t i n g t h a t t h e t r o u t p o s s i b l y l o s t i o n o r e g u l a t o r y c a p a c i t i e s d u e t o t h e l o s s o f C a 2 + f r o m t h e g i l l e p i t h e l i a a n d t h e i n h i b i t i o n o f t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e m e c h a n i s m . M c D o n a l d e t a l . (1980) a n d 44 M c D o n a l d ( 1 9 8 3 ) , r e p o r t e d t h a t t h e r a p i d l o s s o f p l a s m a i o n s v i a i o n o r e g u l a t o r y m a l f u n c t i o n was t h e i m p o r t a n t k e y i n t h e d e a t h o f s a l m o n i d s p l a n t e d i n t o a c i d i c e n v i r o n m e n t s . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e r a p i d l o s s o f p l a s m a i o n s d u e t o p o s s i b l e i o n o r e g u l a t o r y m a l f u n c t i o n a n d s u b s e q u e n t m o r t a l i t i e s w e r e a l s o o b s e r v e d when t h e f i s h w e r e p l a c e d i n t o a n a l k a l i n e e n v i r o n m e n t . A l a r g e i n i t i a l l o s s o f [ c l ~ ] p i a t 2 4 h o u r s was o b s e r v e d i n t h e p r e s e n t s t u d y i n b o t h a c c l i m a t e d a n d n o n -a c c l i m a t e d f i s h . P l a s m a c h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n s f o r t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p r e c o v e r e d b a c k t o c o n t r o l l e v e l s a t 48 h o u r s . I t a p p e a r e d t h a t t h e c o n t r o l g r o u p h a d more d i f f i c u l t i e s i n r e g u l a t i n g p l a s m a i o n l e v e l s b e c a u s e t h e i r [ C l ~ ] p 1 d i d n o t r e c o v e r t o c o n t r o l l e v e l s u n t i l 96 h o u r s . T h e d e c r e a s e i n [ N a + ] p 1 was n o t a s p r o n o u n c e d a s t h e [ C l ~ 3 p i * I t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t i n b o t h g r o u p s , [ N a + ] p ^ a n d [ c l ~ ] p i * t n e c o n t r o l g r o u p h a d s i g n i f i c a n t l y l o w e r [ N a + ] p i a n d [ C l ~ ] p ^ t h a n t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p . T h i s d i f f e r e n c e i n p l a s m a i o n c o n c e n t r a t i o n s b e t w e e n t h e two g r o u p s s u g g e s t s t h a t t h e a c c l i m a t i o n t o t h e h i g h pH a n d w a t e r h a r d n e s s a l l o w e d t h e e x p e r i m e n t a l f i s h t o r e g u l a t e t h e i r p l a s m a i o n s w i t h more e f f i c i e n c y . E v e n t h o u g h t h e y w e r e a b l e t o r e g u l a t e p l a s m a i o n s more e f f e c t i v e l y t h a n t h e c o n t r o l f i s h , t h e e x p e r i m e n t a l f i s h s t i l l e x p e r i e n c e d a 45 d e c r e a s e i n p l a s m a i o n c o n c e n t r a t i o n s . C o n s e q u e n t l y , t h e a c c l i m a t i o n p r o c e d u r e d i d n o t c o n f e r t o t a l p r o t e c t i o n f r o m t h e e f f e c t s o f t h e a l k a l i n e c o n d i t i o n s . P o u p i n a n d Thomas ( 1 9 8 5 ) , showed t h a t f i s h l i v i n g i n h i g h c a r b o n a t e a l k a l i n i t y ( e . g . 300 mg l - 1 C a C 0 3 ) e x h i b i t a r i s e i n [ N a + ] p 1 a n d c o n v e r s e l y a d e c r e a s e i n [ C l ~ ] p j . I t was s u g g e s t e d t h a t [ N a + ] p i i n c r e a s e d b e c a u s e o f t h e e x c h a n g e o f e x t e r n a l N a + w i t h e n d o g e n o u s H + . A t t h e same t i m e , b e c a u s e o f t h e i n c r e a s e i n e x t e r n a l [ H C 0 3 ~ ] d u e t o t h e h i g h c a r b o n a t e a l k a l i n i t y , t h e e x c h a n g e o f e n d o g e n o u s H C 0 3 _ w i t h e x t e r n a l C l ~ was r e d u c e d , r e s u l t i n g i n d e c r e a s e d [ C l ~ ]p2_. T h e s e r e s u l t s a g r e e w i t h t h o s e o f t h e p r e s e n t s t u d y i n w h i c h t h e f i s h e x p e r i e n c e d a t r a n s i e n t r i s e i n [Na+]p^ w h i l e [ C l ~ ] p 1 d e c r e a s e d i n w a t e r o f h i g h c a r b o n a t e a l k a l i n i t y (880 mg l " 1 ) . M u r r a y a n d Z i e b e l l ( 1 9 8 4 ) , r e p o r t e d t h a t r a i n b o w t r o u t became a c c l i m a t e d t o pH l e v e l s a b o v e 9 . 0 b u t t h e l e v e l s t o l e r a t e d d e p e n d e d o n t h e r a t e o f a c c l i m a t i o n . T h e y a c c l i m a t e d t r o u t t o pH 9 . 7 - 9 . 9 o v e r a f o u r d a y p e r i o d . S u c c e s s f u l a c c l i m a t i o n was b a s e d o n n o r m a l b e h a v i o u r (no l o s s o f e q u i l i b r i u m ) , p r e s e n c e o f f e e d i n g a c t i v i t y a n d l a c k o f m o r t a l i t y . A c c o r d i n g t o t h e a b o v e c r i t e r i a , t h e p r e s e n t s t u d y was s u c c e s s f u l i n a c c l i m a t i n g r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r s . 46 M i l l i g a n a n d Wood ( 1 9 8 2 ) , d e s c r i b e d a p h y s i o l o g i c a l s e r i e s o f e v e n t s t h a t l e a d t o t h e d e a t h o f f i s h i n l o w pH w a t e r . T h e s e e v e n t s b e g i n when b r a n c h i a l i o n l o s s c a u s e s a d e c r e a s e i n o s m o t i c p r e s s u r e o f t h e p l a s m a t h u s p r o d u c i n g a n o s m o t i c g r a d i e n t a c r o s s a l l m e m b r a n e s . C o n s e q u e n t l y , i n t r a c e l l u l a r f l u i d s p a c e e x p a n d s d i s p l a c i n g e x t r a c e l l u l a r f l u i d ( M i l l i g a n a n d Wood , 1 9 8 2 ) . T h i s d i s p l a c e m e n t i s r e s p o n s i b l e f o r t h r e e e f f e c t s : h e m o c o n c e n t r a t i o n ; i n c r e a s e s i n h e m a t o c r i t a n d i n p l a s m a p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s ; a n d i n c r e a s e d b l o o d v i s c o s i t y a n d p r e s s u r e ( M i l l i g a n a n d Wood , 1 9 8 2 ) . T h i s i n c r e a s e i n b l o o d v i s c o s i t y a n d d e c r e a s e i n b l o o d v o l u m e c a u s e s d e a t h d u e t o t h e n e c e s s a r y i n c r e a s e i n c a r d i a c w o r k , d e c r e a s e d t i s s u e o x y g e n p e r f u s i o n a n d t i s s u e h y p o x e m i a ( M i l l i g a n a n d W o o d , 1 9 8 2 ) . T h i s i n c r e a s e i n h c t a n d d e c r e a s e i n p l a s m a i o n c o n c e n t r a t i o n s w e r e a l s o e x h i b i t e d b y t r o u t when p l a n t e d i n t o t h e a l k a l i n e w a t e r . C o n s e q u e n t l y , t h e t r o u t t h a t d i e d when p l a n t e d i n t o t h e a l k a l i n e w a t e r m o s t l i k e l y d i e d d u e t o t h e i n c r e a s e d c a r d i a c w o r k , d e c r e a s e d t i s s u e o x y g e n p e r f u s i o n a n d t i s s u e h y p o x e m i a d e s c r i b e d b y M i l l i g a n a n d Wood ( 1 9 8 2 ) . T h e h a t c h e r y a c c l i m a t i o n p r o c e d u r e c a r r i e d o u t i n t h i s s t u d y was more c o s t e f f e c t i v e t h a n t h e p r o c e d u r e u s e d i n t h e p r e v i o u s f i e l d s t u d y . F o r e x a m p l e , a l l o f t h e e q u i p m e n t u s e d was a l r e a d y i n p l a c e a t t h e h a t c h e r y , c o n s t r u c t i o n o f 47 n e t p e n s was n o t c a l l e d f o r , a n d a l l o f t h e l a b o u r i n v o l v e d was e a s i l y c o v e r e d b y t h e e v e r y d a y d u t i e s o f t h e h a t c h e r y w o r k e r s . I n t h e p r e v i o u s s t u d y , e q u i p m e n t h a d t o be p u r c h a s e d a n d t r a n s p o r t e d t o t h e s i t e , n e t p e n s h a d t o b e c o n s t r u c t e d , a n d s p e c i a l w o r k e r s w e r e h i r e d t o f e e d a n d o b s e r v e t h e f i s h a t t h e s i t e . T h e a c c l i m a t i o n o f t h e f i s h was c a r r i e d o u t i n e a r l y s p r i n g , when many o f t h e C a p i l a n o t r o u g h s i n t h e h a t c h e r y w e r e n o t i n u s e , c o n s e q u e n t l y t h i s p r o c e d u r e d i d n o t i n t e r f e r e w i t h t h e d a i l y a c t i v i t i e s o f t h e h a t c h e r y . T h e m o s t i m p o r t a n t a d v a n t a g e o f t h i s p r o c e d u r e i s t h a t t h o u s a n d s o f f i s h may b e a c c l i m a t e d i n one C a p i l a n o t r o u g h t h e r e f o r e , many a l k a l i n e l a k e s c a n be s t o c k e d w i t h one a c c l i m a t i o n . I n c o m p a r i s o n , t h e C 0 2 - n e t p e n p r o c e d u r e c a n o n l y a c c l i m a t e f i s h f o r one l a k e a t a t i m e . I n s u m m a r y , t h e h a t c h e r y a c c l i m a t i o n p r o c e d u r e t h a t was u s e d t o a c c l i m a t e r a i n b o w t r o u t t o t h e a l k a l i n e c o n d i t i o n s o f G r e e n L a k e was b e n e f i c i a l t o t h e a c c l i m a t e d f i s h . T h e a c c l i m a t e d f i s h e x p e r i e n c e d a h i g h e r s u r v i v a l r a t e t h a n t h e c o n t r o l g r o u p . P h y s i o l o g i c a l l y , t h e a c c l i m a t e d f i s h w e r e a b l e t o i o n r e g u l a t e more e f f i c i e n t l y t h a n t h e c o n t r o l f i s h when p l a n t e d i n t o t h e a l k a l i n e w a t e r . F i n a l l y , t h e h a t c h e r y a c c l i m a t i o n p r o c e d u r e u t i l i z e d was more c o s t e f f e c t i v e a n d c a p a b l e o f a c c l i m a t i n g l a r g e r n u m b e r s o f f i s h a t a n y one t i m e t h a n t h e p r o c e d u r e u s e d i n t h e p r e v i o u s s t u d y . 48 O 60 55 50 45 40 35 30 ES3 Acc l imated CZD N o n - A c c l i m a t e d I J L Ctr l . Pos t A c c . t 24 48 72 Time (hours) 96 120 F i g u r e 6: M e a n s + / - 1 S . E . o f h e m a t o c r i t i n a c c l i m a t e d a n d n o n - a c c l i m a t e d j u v e n i l e r a i n b o w t r o u t p l a n t e d i n t o a l k a l i n e h a r d w a t e r (pH 9 . 5 ) a s a f u n c t i o n o f t i m e ( h ) . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . # d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s a t p = 0 . 0 5 . N = 1 6 . 49 O E E + o E CO _o CL 175 170 165 160 155 150 145 140 135 130 125 11 A 1 CZJ Non—Accl imated ESS Acc l ima ted Ctr l . Pos t Ace . 24 48 72 96 120 Time (hours) F i g u r e 7: Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a N a + c o n c e n t r a t i o n s i n a c c l i m a t e d a n d n o n - a c c l i m a t e d j u v e n i l e r a i n b o w t r o u t p l a n t e d i n t o a l k a l i n e h a r d w a t e r (pH 9 . 5 ) a s a f u n c t i o n o f t i m e ( h ) . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . # d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s a t p = 0 . 0 5 . N = 1 6 . 50 A c c . Time (hours) F i g u r e 8: Means + / - 1 S - E - o f P l a s m a c l c o n c e n t r a t i o n s i n a c c l i m a t e d a n d n o n - a c c l i m a t e d j u v e n i l e r a i n b o w t r o u t p l a n t e d i n t o a l k a l i n e h a r d w a t e r (pH 9 . 5 ) a s a f u n c t i o n o f t i m e ( h ) . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . # d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s a t p = 0 . 0 5 . N = 1 6 . 51 T r e a t m e n t N o n - A c c l i m a t e d A c c l i m a t e d T i m e (h) 0 24 48 72 96 120 N o . o f 0 604 1254 1402 1502 1598 D e a t h s 0 134 267 306 331 346 T o t a l # 2007 1981 % S u r v . 2 0 . 4 8 2 . 5 T a b l e 3 : A c c u m u l a t e d m o r t a l i t i e s a t e a c h s a m p l e p e r i o d a n d S u r v i v a l R a t e s o f a c c l i m a t e d a n d n o n - a c c l i m a t e d j u v e n i l e r a i n b o w t r o u t p l a n t e d i n t o h a r d a l k a l i n e w a t e r (pH 9 . 5 ) . 52 C h a p t e r 1 G e n e r a l C o n c l u s i o n s a n d R e c o m m e n d a t i o n s T h e a c c l i m a t i o n p r o c e d u r e s u s e d i n t h i s c h a p t e r e f f e c t i v e l y i n c r e a s e d t h e s u r v i v a l r a t e s o f r a i n b o w t r o u t t h a t w e r e p l a n t e d i n t o t h e a l k a l i n e w a t e r s o f G r e e n L a k e . I n b o t h s t u d i e s , t h e a c c l i m a t e d f i s h e x p e r i e n c e d a h i g h e r s u r v i v a l r a t e t h a n t h e c o n t r o l g r o u p . P h y s i o l o g i c a l l y , t h e a c c l i m a t e d f i s h w e r e a b l e t o i o n r e g u l a t e more e f f e c t i v e l y t h a n t h e c o n t r o l f i s h when p l a n t e d i n t o t h e a l k a l i n e w a t e r . T h e h a t c h e r y a c c l i m a t i o n p r o c e d u r e u t i l i z e d was more c o s t e f f e c t i v e a n d c a p a b l e o f a c c l i m a t i n g l a r g e r n u m b e r s o f f i s h a t a n y one t i m e t h a n t h e C 0 2 p r o c e d u r e u s e d i n t h e p r e v i o u s s t u d y . T h e i m p l e m e n t a t i o n o f s u c h p r o c e d u r e s a s t h e c h e m i c a l t r e a t m e n t o f t h e t r a n s p o r t m e d i a a n d t h e a c c l i m a t i o n o f t h e t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r s w i l l i n c r e a s e t h e s u r v i v a l o f t r o u t i n a l k a l i n e l a k e s . H o w e v e r , o n c e t r o u t p o p u l a t i o n s h a v e b e e n e s t a b l i s h e d i n a l k a l i n e l a k e s a n d t h e s u b s e q u e n t r e c r e a t i o n a l u s a g e o f t h e s e l a k e s i n c r e a s e , p r o p e r management p r a c t i c e s o f t h e f i s h r e s o u r c e m u s t o c c u r t o e n s u r e t h a t t h e p o p u l a t i o n s s t a y h e a l t h y a n d v i a b l e a n d do n o t become o v e r f i s h e d . 5 3 C h a p t e r 2: T h e P h y s i o l o g i c a l R e s p o n s e o f R a i n b o w T r o u t t o t h e E x p o s u r e o f A l k a l i n e W a t e r . 54 C h a p t e r 2: G e n e r a l I n t r o d u c t i o n I n t h e p r e v i o u s f i e l d s t u d i e s , r a i n b o w t r o u t w e r e d i s c o v e r e d t o be l i v i n g a n d g r o w i n g t o l a r g e s i z e s i n h a r d a l k a l i n e w a t e r . A l s o , i n t h e s e c o n d f i e l d s t u d y , i t was c o n c l u d e d t h a t r a i n b o w t r o u t a r e more c o m p e t e n t i n i o n r e g u l a t i o n a n d h a v e h i g h e r s u r v i v a l r a t e s when a c c l i m a t e d t o a l k a l i n e h a r d w a t e r . I n t h e r e c e n t l i t e r a t u r e , p r e v i o u s a l k a l i n e e x p o s u r e s t u d i e s h a v e o n l y e x p o s e d f i s h t o r e l a t i v e l y s o f t a l k a l i n e w a t e r (140 mg l - 1 C a C 0 3 ) . C o n s e q u e n t l y , i t was t h e o b j e c t i v e o f t h e n e x t two s t u d i e s d e s c r i b e d i n t h i s c h a p t e r t o o b s e r v e t h e p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s o f r a i n b o w t r o u t u p o n t h e e x p o s u r e t o a l k a l i n e (pH 10) h a r d w a t e r (320 mg l " 1 ) . T h e n a t u r a l d i e t s o f s a l m o n i d s o f t e n i n c l u d e c o p e p o d s , e u p h a u s i d s , i n s e c t s , a n d s m a l l f i s h , a l l o f w h i c h a r e r i c h i n p r o t e i n . S a l m o n i d s consume r o u g h l y t w i c e t h e amount o f p r o t e i n ( p e r k g b o d y w e i g h t ) r e l a t i v e t o t e r r e s t r i a l o m n i v o r e s , b u t t h e y do n o t r e t a i n t w i c e a s much p r o t e i n i n t h e i r b o d i e s (Cowey a n d S a r g e n t , 1 9 7 5 ) . T h e a m i n o a c i d s t h a t a r e n o t r e q u i r e d f o r p r o t e i n s y n t h e s i s a r e c o n v e r t e d t o a m m o n i a , p r i m a r i l y i n t h e l i v e r . T h e enzymes i n v o l v e d i n ammonia p r o d u c t i o n i n f i s h h a v e a l s o b e e n l o c a t e d i n t h e k i d n e y , g i l l s , a n d t h e m u s c l e . T h e t o x i c i t y o f ammonia h a s 55 b e e n w e l l d o c u m e n t e d i n f i s h ( G . R . S m a r t , 1 9 7 8 ; T h u r s t o n a n d R u s s o , 1 9 8 3 ; T h u r s t o n e t a l . 1 9 8 4 ; a n d R u s s o e t a l . 1 9 8 8 ) . C o n s e q u e n t l y , t h e ammonia p r o d u c e d i n t h e l i v e r , mus t be e i t h e r e x c r e t e d o r c o n v e r t e d t o l e s s t o x i c c o m p o u n d s , s u c h a s u r e a o r g l u t a m i n e . Ammonia e x c r e t i o n i s a v e r y s o u n d e v o l u t i o n a r y s t r a t e g y f o r a q u a t i c a n i m a l s . F r o m a n e n e r g e t i c s t a n d p o i n t , t h e e x c r e t i o n o f a m m o n i a , v e r s u s t h e c o n v e r s i o n o f ammonia t o l e s s t o x i c n i t r o g e n o u s c o m p o u n d s , i s t h e l e a s t c o s t l y mode o f e x c r e t i n g n i t r o g e n o u s c o m p o u n d s . F i s h a r e a b l e t o e x c r e t e N H 3 d i r e c t l y a c r o s s b r a n c h i a l d i f f u s i o n g r a d i e n t s w i t h v e r y l i t t l e , i f a n y , c o n s u m p t i o n o f e n e r g y . W h e r e a s , v a l u a b l e e n e r g y ( A T P ) m u s t be c o n s u m e d t o p r o d u c e n o n - t o x i c n i t r o g e n o u s w a s t e p r o d u c t s , s u c h a s u r e a o r g l u t a m i n e . H o w e v e r , i n some e x t r e m e c a s e s , t h e c o n v e r s i o n o f ammonia t o n o n - t o x i c n i t r o g e n o u s c o m p o u n d s m u s t o c c u r . F o r e x a m p l e , R a n d a l l e t a l . (1989) showed t h a t t i l a p i a {Oreochromis alcalicus grahami), e x c r e t e m o s t n i t r o g e n o u s w a s t e s a s u r e a b e c a u s e t h e e x c r e t i o n o f N H 3 i s i n h i b i t e d i n t h e h i g h pH c o n d i t i o n s t h e y i n h a b i t . I n f i s h , m o s t o f t h e ammonia p r o d u c e d i s e x c r e t e d a c r o s s t h e g i l l s ( E v a n s , 1 9 8 2 ) . M o s t o f t h e ammonia e x c r e t e d a c r o s s t h e g i l l s i s n i t r o g e n o u s m e t a b o l i c w a s t e , h o w e v e r , e n d o g e n o u s g i l l m e t a b o l i s m c a n c o n t r i b u t e up t o 5 -8 56 % o f n e t ammonia e x c r e t i o n ( C a m e r o n a n d H e i s l e r , 1 9 8 3 ) . T h r e e m e c h a n i s m s o f ammonia a c r o s s t h e b r a n c h i a l e p i t h e l i a h a v e b e e n p o s t u l a t e d i n r e c e n t y e a r s : 1) T h e p a s s i v e d i f f u s i o n o f N H 3 a c r o s s t h e b r a n c h i a l e p i t h e l i a t o t h e a m b i e n t w a t e r . T h e N H 3 f o l l o w s a d e f i n i t e p N H 3 g r a d i e n t ( b l o o d t o w a t e r ) w h i c h i s m a i n t a i n e d b y t h e p r o t o n a t i o n o f t h e N H 3 a s i t e n t e r s t h e a c i d b o u n d a r y l a y e r o f t h e g i l l e p i t h e l i a ( C a m e r o n a n d H e i s l e r , 1 9 8 3 ; W r i g h t a n d Wood , 1 9 8 5 ) . 2) T h e a c t i v e e x c h a n g e o f e x t e r n a l Na+ w i t h N H 4 + i n t h e g i l l e p i t h e l i a c e l l s ( P a y a n , 1 9 7 8 ; W r i g h t a n d Wood , 1 9 8 5 ; a n d C a m e r o n , 1 9 8 6 ) . 3) T h e p a s s i v e d i f f u s i o n o f N H 4 + a c r o s s t h e g i l l e p i t h e l i a . E v a n s a n d M o r e ( 1 9 8 8 ) , showed t h a t t h e p a s s i v e d i f f u s i o n o f N H 4 + f o l l o w e d a n N H 4 + e l e c t r o c h e m i c a l g r a d i e n t s i t u a t e d a c r o s s t h e g i l l e p i t h e l i a . T h e two m o s t i m p o r t a n t modes o f ammonia e x c r e t i o n a r e t h e p a s s i v e d i f f u s i o n o f N H 3 a n d t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e . T h e r e i s , h o w e v e r , some d i s a g r e e m e n t o n w h i c h one o f t h e s e m e c h a n i s m s i s t h e m o s t d o m i n a n t . W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) , showed t h a t t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e was r e s p o n s i b l e f o r t h e m a j o r i t y o f ammonia e x c r e t i o n , w h i l e N H 3 d i f f u s i o n 57 c o n t r i b u t e d t o a s m a l l e r d e g r e e . I n c o n t r a s t , C a m e r o n a n d H e i s l e r ( 1 9 8 3 ) , a r g u e d t h a t t h e m a j o r i t y o f ammonia e x c r e t i o n o c c u r r e d v i a t h e p a s s i v e d i f f u s i o n o f N H 3 u n d e r n o r m a l pH a n d p N H 3 . U n d e r " n o r m a l " c o n d i t i o n s ( n e u t r a l p H ) , t h e a b o v e m e n t i o n e d ammonia e x c r e t i o n m e c h a n i s m s a r e e f f e c t i v e i n p r e v e n t i n g ammonia l e v e l s f r o m i n c r e a s i n g i n t h e b l o o d o f t h e f i s h . U n d e r a l k a l i n e c o n d i t i o n s , when t h e pH o f t h e w a t e r i s a b o v e t h e pK o f t h e N H 3 / N H 4 + e q u i l i b r i u m ( 9 . 5 8 ) , N H 3 b e c o m e s t h e d o m i n a n t f o r m o f ammonia p r e s e n t . A t t h i s p H , t h e g i l l a c i d b o u n d a r y l a y e r becomes s t r i p p e d o f p r o t o n s ( H + ) . When t h i s o c c u r s , N H 3 c a n n o t be c o n v e r t e d t o N H 4 + i n t h e a c i d b o u n d a r y l a y e r o f t h e g i l l s b e c a u s e o f t h e l a c k o f p r o t o n s ( W r i g h t a n d Wood , 1 9 8 5 ) . C o n s e q u e n t l y , t h e p N H 3 g r a d i e n t a c r o s s t h e g i l l e p i t h e l i a c a n n o t b e m a i n t a i n e d . T h u s , t h e N H 3 a c c u m u l a t e s i n t h e b o u n d a r y l a y e r s u r r o u n d i n g t h e g i l l s a n d s o o n t h e b l o o d t o w a t e r p N H 3 d i f f u s i o n g r a d i e n t r e v e r s e s ( W r i g h t a n d Wood , 1 9 8 5 ) . A s a r e s u l t , p l a s m a ammonia l e v e l s r i s e i n t h e b o d y . I n t h i s c h a p t e r , t h e p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r e x p o s u r e was f u r t h e r i n v e s t i g a t e d . I n t h e f i r s t s t u d y , r a i n b o w t r o u t w e r e e x p o s e d c h r o n i c a l l y t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r i n a n a t t e m p t t o f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h e f i n d i n g s o f t h e 1989 f i e l d s t u d y . I n t h e 58 1989 f i e l d s t u d y , i t was d e s c r i b e d t h a t f i s h s u r v i v e b e t t e r a n d r e g u l a t e p l a s m a i o n s more e f f e c t i v e l y i n a l k a l i n e w a t e r when t h e y h a v e b e e n p r e v i o u s l y a c c l i m a t e d t o a l k a l i n e h a r d w a t e r . T h e s e c o n d s t u d y a c u t e l y e x p o s e d r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e h a r d w a t e r a n d a m i l o r i d e i n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h e p o s s i b l e m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n t h e e x c r e t i o n o f ammonia i n a l k a l i n e h a r d w a t e r . 59 G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s f o r C h a p t e r 2 . A n i m a l s : R a i n b o w t r o u t w e r e u s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s . T h e t r o u t w e r e o b t a i n e d f r o m a c o m m e r c i a l t r o u t f a r m i n t h e F r a s e r V a l l e y o f B r i t i s h C o l u m b i a . T h e t r o u t w e r e h e l d i n 1000 1 t a n k s t h a t w e r e s u p p l i e d w i t h d e c h l o r i n a t e d V a n c o u v e r c i t y w a t e r (pH 6 . 8 , 4 mg l - 1 C a C 0 3 ) a t a c o n s t a n t t e m p e r a t u r e o f 10 ± 1 ° C . T h e f i s h w e r e m a i n t a i n e d o n a s t a n d a r d c o m m e r c i a l t r o u t d i e t . F e e d i n g was h a l t e d 7 d a y s p r i o r t o e x p e r i m e n t a t i o n . F i s h S u r g e r y : F o r r e p e a t e d b l o o d s a m p l i n g o f i n d i v i d u a l f i s h , e a c h f i s h was f i t t e d w i t h a c h r o n i c i n d w e l l i n g c a n n u l a . T h e a n i m a l s w e r e i n i t i a l l y a n e s t h e t i z e d i n a s o l u t i o n o f 100 mg l - 1 MS222 b u f f e r e d w i t h 200 mg l " 1 N a H C 0 3 . T h e f i s h w e r e t h e n t r a n s f e r r e d t o a n o p e r a t i n g t a b l e w h i c h was s e t up t o a r t i f i c i a l l y i r r i g a t e t h e g i l l s o f t h e f i s h w i t h a s o l u t i o n o f 50 mg l " 1 MS222 a n d 100 mg l - 1 N a H C 0 3 w h i l e t h e s u r g i c a l p r o c e d u r e was c a r r i e d o u t . A l l s y r i n g e s a n d c a n n u l a s w e r e r i n s e d w i t h h e p a r i n i z e d C o r t l a n d s a l i n e p r i o r t o u s e . T h e s n o u t was p i e r c e d w i t h a l a r g e b o r e n e e d l e j u s t a n t e r i o r t o t h e n a r e s . A 3-4 c e n t i m e t e r l e n g t h o f P E 190 p o l y e t h y l e n e 60 t u b i n g was f i t t e d i n t o t h e h o l e c r e a t e d b y t h e n e e d l e . T h i s p i e c e o f PE190 t u b i n g was f l a r e d a t one e n d w i t h h e a t t o a n c h o r i t t o t h e r o o f o f t h e m o u t h o f t h e f i s h . N e x t , a n i n d w e l l i n g d o r s a l a o r t i c c a n n u l a was f i t t e d i n t o e a c h f i s h a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d d e s c r i b e d b y S o i v i o e t a l . ( 1 9 7 5 ) . T h e c a n n u l a was a 25 c e n t i m e t e r l e n g t h o f P E 60 p o l y e t h y l e n e t u b i n g s t r e t c h e d a t one e n d t h e n c u t w i t h a r a z o r t o p r o d u c e a t a p e r e d e n d . F o r t h i s o p e r a t i o n , a s h a r p e n e d s t e e l w i r e was i n s e r t e d i n t o t h e c a n n u l a s o t h a t i t s t i p j u s t p r o t r u d e d f r o m t h e t a p e r o f t h e c a n n u l a . T h i s p r o t r u d i n g t i p was u s e d i n m a k i n g a b l i n d p u n c t u r e o f t h e d o r s a l a o r t a . T h e p u n c t u r e was made b e t w e e n t h e f i r s t a n d s e c o n d g i l l a r c h e s a t t h e m i d l i n e o f t h e r o o f o f t h e m o u t h . A f t e r t h e p u n c t u r e , t h e w i r e was w i t h d r a w n a n d t h e c a n n u l a i n s e r t e d a n o t h e r 5 c e n t i m e t e r s i n t o t h e a o r t a . T h e c a n n u l a was t h e n p a s s e d t h r o u g h t h e f l a r e d p i e c e o f P E 190 t u b i n g i n t h e r o o f o f t h e m o u t h a n d c o n n e c t e d t o a n o t h e r 30 c e n t i m e t e r l e n g t h o f P E 60 t u b i n g w h i c h s e r v e d t o f u n c t i o n a l l y i n c r e a s e t h e l e n g t h o f t h e c a n n u l a . T o s e c u r e t h e c a n n u l a t o t h e s n o u t o f t h e f i s h , s i l k t h r e a d was t i e d a r o u n d t h e P E 190 t u b i n g a t t h e p o i n t w h e r e i t p e n e t r a t e d t h e e p i d e r m i s o f t h e f i s h . T h i s p r o c e d u r e c i n c h e d t h e c a n n u l a i n s i d e t h e P E 190 t u b i n g a n d f u r t h e r p r e v e n t e d t h e c a n n u l a f r o m b e i n g p u l l e d o u t . T h e f i s h w e r e a l l o w e d t o r e c o v e r i n t h e 6 - c h a m b e r e d h o l d i n g 61 b o x d e s c r i b e d a b o v e . T h e c a n n u l a s w e r e f l u s h e d t w i c e d a i l y w i t h h e p a r i n i z e d C o r t l a n d s a l i n e t o p r e v e n t b l o o d f r o m c l o t t i n g i n s i d e t h e c a n n u l a s . A n a l y t i c a l t e c h n i q u e s : 1) M e a s u r e m e n t s a n d C a l c u l a t i o n s o f B l o o d P a r a m e t e r s : A t e a c h s a m p l e t i m e , a r t e r i a l b l o o d was c o l l e c t e d f r o m e a c h c a n n u l a a n d r e p l a c e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f p h y s i o l o g i c a l s a l i n e . T h e e x t r a c t e d b l o o d s a m p l e s w e r e u s e d i n t h e m e a s u r e m e n t o f t h e f o l l o w i n g p a r a m e t e r s . A) pH : A r t e r i a l b l o o d pH was m e a s u r e d w i t h a R a d i o m e t e r m i c r o - e l e c t r o d e u n i t c o n n e c t e d t o a PHM72 A c i d - B a s e A n a l y z e r . T h e e l e c t r o d e was t h e r m o s t a t e d t o t e m p e r a t u r e s e q u a l t o t h o s e o f t h e e x p e r i m e n t a l a n i m a l s . P r e c i s i o n p h o s p h a t e b u f f e r s w e r e u s e d t o c a l i b r a t e t h e e l e c t r o d e ( R a d i o m e t e r S1500 a n d S1510 b u f f e r s ) . B) T o t a l C 0 2 : T o t a l C 0 2 c o n t e n t ( T c o 2 ) was m e a s u r e d u s i n g a C a p n i - C o n t o t a l C 0 2 a n a l y z e r ( C a m e r o n I n s t r u m e n t s L t d . , T e x a s ) . S t a n d a r d s f o r t h i s a n a l y s i s w e r e made f r o m d r i e d N a H C 0 3 . T h i s m a c h i n e c o n v e r t e d H C 0 3 ~ t o C 0 2 b y a c i d i f i c a t i o n a n d m e a s u r e d t h e c h a n g e i n P c 0 2 « P l a s m a s a m p l e s f o r t h i s a n a l y s i s w e r e t a k e n f r o m t h e h c t t u b e s i m m e d i a t e l y a f t e r b e i n g c e n t r i f u g e d . 62 C) P C 0 2 ' P l a s m a C 0 2 t e n s i o n s (Pco2^ w e r e c a l c u l a t e d b y u s e o f t h e H e n d e r s o n - H a s s e l b a c h e q u a t i o n , t h e m e a s u r e d v a l u e s o f pH a n d T C 0 2 a n d , t h e p r o p e r p K a p p a n d a - C 0 2 v a l u e s o f B o u t i l i e r e t a l . ( 1 9 8 5 ) . D) H C 0 3 ~ : P l a s m a b i c a r b o n a t e c o n c e n t r a t i o n s [ H C 0 3 ~ ] w e r e o b t a i n e d f r o m t h e e q u a t i o n [ H C 0 3 ~ ] = T c o 2 - ( a - C 0 2 * P C 0 2 ) . E ) H c t . : H e m a t o c r i t v a l u e s w e r e d e t e r m i n e d b y c e n t r i f u g i n g w h o l e b l o o d i n h e p a r i n i z e d c a p i l l a r y t u b e s ( F i s h e r S c i e n t i f i c , V a n c o u v e r ) . F ) P l a s m a Tamm : P l a s m a t o t a l ammonia l e v e l s w e r e m e a s u r e d i m m e d i a t e l y a f t e r s a m p l i n g u s i n g a m i c r o - m o d i f i c a t i o n o f t h e L - G L D H / N A D m e t h o d ( S i g m a , M i s s o u r i ) . G) P l a s m a N H 4 + : P l a s m a N H 4 + c o n c e n t r a t i o n s w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e H e n d e r s o n - H a s s e l b a c h e q u a t i o n , t h e m e a s u r e d pH v a l u e s a n d p l a s m a Tamm a n d , t h e p r o p e r p K ' f r o m C a m e r o n a n d H e i s l e r ( 1 9 8 3 ) . N H 4 + = Tamm ._ l + ( a n t i l o g ( p H + p K / ) T h e r e f o r e , N H 3 = Tamm - N H 4 + H) P l a s m a N H 3 : P a r t i a l p r e s s u r e o f f r e e ammonia was t h e n c a l c u l a t e d u s i n g a s o l u b i l i t y c o e f f i c i e n t ( a l p h a N H 3 ) o b t a i n e d f r o m C a m e r o n a n d H e i s l e r ( 1 9 8 3 ) . P N H 3 = —iffl3 a l p h a N H 3 63 I ) P l a s m a I o n A n a l y s i s : A n a l y s e s f o r [ N a + ] p 1 a n d [ C l " ; ^ w e r e c a r r i e d o u t a t a l a t e r t i m e u s i n g p l a s m a t h a t was f r o z e n a t - 7 0 ° C . P l a s m a s o d i u m c o n c e n t r a t i o n s w e r e m e a s u r e d u s i n g a C o r n i n g 410C f l a m e p h o t o m e t e r ( C o r n i n g , E n g l a n d ) , s t a n d a r d i z e d w i t h 1 4 0 + mmol N a + s t a n d a r d s ( C o r n i n g ) . P l a s m a c h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n s w e r e m e a s u r e d w i t h a d i g i t a l c h l o r i d o m e t e r ( H a a k e B u c h l e r I n s t r u m e n t s , New J e r s e y ) . S t a t i s t i c a l A n a l y s e s : A n a l y s i s o f v a r i a n c e (ANOVA) was u s e d t o d e t e r m i n e s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e among means a t a 5% l e v e l o f r e j e c t i o n . T u k e y ' s t e s t was u s e d t o d e t e r m i n e t h e s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s a t a 5% l e v e l o f r e j e c t i o n ( O t t , 1 9 8 4 ) . 64 C h a p t e r 2 S e c t i o n 1: C h r o n i c S t u d y T h e C h r o n i c E x p o s u r e o f R a i n b o w T r o u t t o A l k a l i n e W a t e r s I n t r o d u c t i o n : T h e p r e v i o u s 1989 f i e l d s t u d y i n d i c a t e d t h a t a c c l i m a t e d f i s h r e g u l a t e p l a s m a i o n s more c o m p e t e n t l y a n d s u r v i v e b e t t e r i n a l k a l i n e w a t e r when t h e y h a v e b e e n p r e v i o u s l y a c c l i m a t e d t o a l k a l i n e h a r d w a t e r . C o n s e q u e n t l y , i n a n a t t e m p t t o f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h e s e f i n d i n g s , i t was d e c i d e d t o s t u d y t h e p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s o f r a i n b o w t r o u t e x p o s e d c h r o n i c a l l y t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r . W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) , s t u d i e d t h e a c u t e e x p o s u r e o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r . T h e y showed t h a t Tamm i n c r e a s e d a n d ammonia e x c r e t i o n was i n h i b i t e d a t h i g h p H . T h e y a l s o showed t h a t N a + i n f l u x f e l l b y 55% a n d t h a t t h e r e was a n e t e f f l u x o f N a + . T h e y a l s o showed t h e f i s h e x p e r i e n c e d a r e s p i r a t o r y a l k a l o s i s , a n d t h a t H C 0 3 ~ d i d n o t c h a n g e . T h e r e f o r e , t h e f i s h d i d n o t e x p e r i e n c e a n m e t a b o l i c a c i d o s i s i n a n a t t e m p t t o c o u n t e r b a l a n c e t h e r e s p i r a t o r y a l k a l o s i s . I n t h i s p r e s e n t s t u d y , t h e u s e o f c h r o n i c i n d w e l l i n g c a t h e t e r s was u t i l i z e d t o o b s e r v e t h e p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e o f r a i n b o w t r o u t t o t h e c h r o n i c e x p o s u r e o f a l k a l i n e w a t e r . W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) , d i d n o t e x p o s e f i s h t o pH l e v e l s a b o v e t h e pK o f t h e NH3/NH4+ e q u i l i b r i u m ( 9 . 5 8 ) . B e l o w t h i s v a l u e , some o f t h e ammonia w i l l b e i n t h e n o n -66 t o x i c f o r m ( N H 4 + ) , b u t a b o v e t h i s v a l u e , g r e a t e r t h a n 50 % o f t h e ammonia i s i n t h e t o x i c f o r m , N H 3 ( L i n a n d R a n d a l l , 1 9 9 0 ) . T h e r e f o r e , i t was d e c i d e d t o e x p o s e t h e f i s h t o pH l e v e l s a b o v e 9 . 5 8 i n o r d e r t o o b s e r v e t h e r e a l t o x i c o r l e t h a l e f f e c t s o f a m m o n i a . T h e p r e v i o u s 1988 f i e l d s t u d y f o u n d f i s h l i v i n g a n d g r o w i n g t o l a r g e s i z e s i n G r e e n L a k e (pH 9 . 5 , 880 mg l " 1 c a l c i u m c a r b o n a t e ( C a C 0 3 ) ) . A s a r e s u l t , t h e i n v e s t i g a t i o n o f a l t e r n a t i v e p a t h w a y s f o r n i t r o g e n o u s w a s t e e x c r e t i o n s u c h a s o r n i t h i n e - u r e a c y c l e o r u r i c o l y s i s p a t h w a y was t o b e c a r r i e d o u t b e c a u s e t h e s e f i s h w e r e f o u n d t o be t h r i v i n g i n G r e e n L a k e a n d N H 3 e x c r e t i o n i n h i g h w a t e r pH h a s b e e n shown t o be i n h i b i t e d . Many s t u d i e s ( B r a d l e y a n d S p r a g u e , 1 9 8 5 ; L a u r e n a n d M c D o n a l d , 1 9 8 6 ; M c D o n a l d e t a l . 1980) h a v e f o u n d t h a t e l e v a t e d c a l c i u m l e v e l s h a v e a f f o r d e d f i s h p r o t e c t i o n f r o m t h e e x p o s u r e t o a c i d i c w a t e r , i n t e r m s o f d e c r e a s e d i o n l o s s a n d h i g h e r s u r v i v a l r a t e s . T h e r e f o r e , i t was d e c i d e d t h a t t h i s s t u d y was t o b e d e s i g n e d t o o b s e r v e i f h i g h C a C 0 3 l e v e l s i n a l k a l i n e w a t e r a f f o r d e d a n y e x t r a p r o t e c t i o n i n c o m p a r i s o n t o l o w C a C 0 3 , a l k a l i n e w a t e r . T h e m a i n o b j e c t i v e f o r t h i s s t u d y , was t o t e s t t h e h y p o t h e s i s t h a t r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o h i g h l y a l k a l i n e h a r d w a t e r a r e b e t t e r a b l e t o r e g u l a t e p h y s i o l o g i c a l b l o o d p a r a m e t e r s t h a n f i s h i n a l k a l i n e s o f t w a t e r . 67 M e t h o d s a n d M a t e r i a l s : A n i m a l s : T h e e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d o n r a i n b o w t r o u t w e i g h i n g 412 + 52 g . (mean + S . E . ) w i t h a s t a n d a r d l e n g t h o f 3 1 . 3 + 4 . 6 c m . (mean + S . E . ) . S e e G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , c h a p t e r 2 , f o r more d e t a i l s . F i s h S u r g e r y : See G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 2 , f o r more d e t a i l s . A p p a r a t u s : T h e f i s h w e r e h e l d i n a d a r k 6 - c h a m b e r e d P l e x i g l a s s h o l d i n g b o x . T h e h o l d i n g b o x was f e d w i t h f u l l y a e r a t e d d e c h l o r i n a t e d w a t e r f r o m a h e a d t a n k . T h e e f f l u e n t f r o m t h e h o l d i n g b o x was n o t r e u s e d . T o i n c r e a s e t h e pH o f t h e w a t e r , a c o n c e n t r a t e d s o d i u m h y d r o x i d e s o l u t i o n (NaOH, 0 . 2 M) was m e t e r e d i n t o t h e h e a d t a n k v i a p e r i s t a l t i c pump ( H a r v a r d A p p a r a t u s , M a s s a c h u s e t t s ) . T h e c o n c e n t r a t e d NaOH was c o n t a i n e d i n a 40 l i t e r p l a s t i c c a r b o y . T o i n c r e a s e w a t e r h a r d n e s s , a c o n c e n t r a t e d c a l c i u m c a r b o n a t e s o l u t i o n ( C a C 0 3 , 3200 mg 1 _ 1 ) was m e t e r e d i n t o t h e h e a d t a n k v i a a s e p a r a t e p e r i s t a l t i c pump. T h e C a C 0 3 was p r e m i x e d p r i o r t o 68 e x p e r i m e n t a t i o n a n d c o n t a i n e d i n a 90 l i t e r g a r b a g e c a n . T o k e e p t h i s c o n c e n t r a t e d s o l u t i o n w e l l m i x e d a n d t o p r e v e n t t h e C a C 0 3 f r o m s e t t l i n g o u t o f s o l u t i o n a s u b m e r s i b l e w a t e r pump ( L i t t l e G i a n t Pumps , O k l a h o m a ) was p l a c e d i n t o t h e g a r b a g e c a n t o c r e a t e c i r c u l a r f l o w . P u m p i n g r a t e s f o r t h e c o n c e n t r a t e d NaOH a n d C a C 0 3 s o l u t i o n s w e r e p r e d e t e r m i n e d t o s u s t a i n t h e s y s t e m a t pH 1 0 . 1 a n d 4 mg l " 1 C a C 0 3 a n d a t pH 1 0 . 1 a n d 320 mg l " 1 C a C 0 3 . T o i n c r e a s e t h e pH a n d t h e h a r d n e s s o f t h e w a t e r o f t h e f i s h h o l d i n g b o x t h e pumps w e r e s e t t o t h e i r p r e d e t e r m i n e d s e t t i n g s a n d t u r n e d o n . T h e pH o f t h e h o l d i n g b o x was m o n i t o r e d w i t h a g l a s s e l e c t r o d e ( R a d i o m e t e r , C o p e n h a g e n ) c o u p l e d w i t h a PHM84 pH m e t e r ( R a d i o m e t e r ) . W a t e r f l o w r a t e s t h r o u g h o u t t h i s f l o w - t h r o u g h s y s t e m w e r e s e t a t 2 1 m i n - 1 . P r o t o c o l : C o n t r o l b l o o d s a m p l e s w e r e t a k e n 72 h o u r s p o s t - s u r g e r y t o a l l o w t h e f i s h t o r e t u r n t o a r e s t i n g h o m e o s t a t i c c o n d i t i o n . F o l l o w i n g t h e c o n t r o l s a m p l e s , two d i f f e r e n t e x p e r i m e n t a l p r o t o c o l s w e r e f o l l o w e d , f o r two d i f f e r e n t g r o u p s o f f i s h : 1) A l k a l i n e S o f t W a t e r E x p o s u r e ( A S W ) : W a t e r pH was i n c r e a s e d f r o m 5 . 8 t o 1 0 . 1 b y p u m p i n g t h e c o n c e n t r a t e d NaOH i n t o t h e h e a d t a n k . B l o o d s a m p l e s w e r e 69 c o l l e c t e d a t 2 4 , 4 8 , 96 a n d , 192 h o u r s f o l l o w i n g t h e i n c r e a s e i n w a t e r p H . N = 7 . 2) A l k a l i n e H a r d W a t e r E x p o s u r e (AHW): W a t e r pH a n d w a t e r h a r d n e s s i n t h e h o l d i n g b o x w e r e i n c r e a s e d t o pH 1 0 . 1 a n d 320 mg l - 1 C a C 0 3 b y p u m p i n g t h e NaOH a n d C a C 0 3 i n t o t h e h e a d t a n k . B l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d a t 2 4 , 4 8 , 96 a n d , 192 h o u r s f o l l o w i n g t h e i n c r e a s e i n w a t e r pH a n d h a r d n e s s . N = 7 . A n a l y t i c a l T e c h n i q u e s : A t e a c h s a m p l e t i m e , 750 u l o f a r t e r i a l b l o o d was c o l l e c t e d f r o m e a c h c a n n u l a a n d r e p l a c e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f C o r t l a n d s a l i n e . T h e e x t r a c t e d b l o o d s a m p l e s w e r e u s e d i n t h e m e a s u r e m e n t o f t h e p a r a m e t e r s l i s t e d i n t h e G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 2 . I n a d d i t i o n t o t h e m e a s u r e m e n t s l i s t e d i n t h e G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 2 , t h e b e l o w l i s t e d m e a s u r e m e n t s w e r e a l s o e x e c u t e d . A) B l o o d U r e a N i t r o g e n : A m i c r o - m o d i f i c a t i o n o f t h e d i a c e t y l monoxime a s s a y was u s e d i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f b l o o d u r e a n i t r o g e n ( S i g m a ) . 70 B) C o r t i s o l : P l a s m a C o r t i s o l c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d b y r a d i o i m m u n o a s s a y ( C l i n i c a l A s s a y , M a s s a c h u s e t t s ) . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s : D u n n e t t ' s t e s t was u s e d t o c o m p a r e c o n t r o l v a l u e s t o means w i t h i n e a c h t r e a t m e n t a t a r e j e c t i o n l e v e l o f 5 % . See G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 2 , f o r more d e t a i l s . 71 R e s u l t s : C o n t r o l v a l u e s f o r p H a , [ H C 0 3 ~ ] , p C o 2 ' T a m m / P l a s m a i o n a n d C o r t i s o l c o n c e n t r a t i o n s w e r e a l l i n d i c a t i v e o f n o r m a l r e s t i n g b l o o d p a r a m e t e r s o f r a i n b o w t r o u t . T h e s e v a l u e s w e r e i n a g r e e m e n t w i t h c o n t r o l v a l u e s o b t a i n e d b y W r i g h t a n d Wood, (1985) a n d Iwama e t a l . ( 1 9 8 9 ) . H e m a t o c r i t v a l u e s d e c r e a s e d c o n t i n u o u s l y f r o m t h e c o n t r o l m e a s u r e m e n t s a n d w e r e i n d i c a t i v e o f t h e r e p e a t e d b l o o d s a m p l i n g o f t h i s s t u d y ( F i g . 9 ) . None o f t h e s e v e n f i s h e x p o s e d t o t h e a l k a l i n e s o f t w a t e r s u r v i v e d p a s t 96 h o u r s o f e x p o s u r e a n d c o n s e q u e n t l y t h e d a t a p o i n t a t 192 h o u r s f o r t h e (ASW) t r e a t m e n t s i s n o t s h o w n . A l l s e v e n f i s h e x p o s e d t o t h e a l k a l i n e h a r d w a t e r r e m a i n e d a l i v e a n d i n a p p a r e n t l y g o o d c o n d i t i o n f o r t h e d u r a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t . C o n t r o l , 24 h o u r a n d 48 h o u r pHa v a l u e s f o r b o t h t r e a t m e n t s (ASW & AHW) w e r e s t a t i s t i c a l l y s i m i l a r ( F i g . 1 0 ) . E x p o s u r e t o t h e a l k a l i n e w a t e r p r o d u c e d a p r o n o u n c e d b l o o d a l k a l o s i s f o r b o t h ASW a n d AHW f i s h . F o r b o t h t r e a t m e n t s , a l l mean p l a s m a pHa v a l u e s w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h e c o n t r o l v a l u e s . A f t e r 48 h o u r s o f e x p o s u r e , t h e mean p l a s m a pHa v a l u e s o f t h e two t r e a t m e n t s b e g a n t o d i v e r g e . A t 96 h o u r s t h e f i s h e x p o s e d t o t h e a l k a l i n e s o f t w a t e r h a d a s i g n i f i c a n t l y h i g h e r mean pHa v a l u e (+ 0 . 3 1 4 pH u n i t s ) . 72 T h e AHW g r o u p was a b l e t o r e g u l a t e b l o o d pHa more e f f i c i e n t l y t h a n t h e ASW g r o u p a n d a t 192 h o u r s o f e x p o s u r e t h e i r mean pHa v a l u e s h a d d e c r e a s e d t o w a r d s c o n t r o l v a l u e s . A f t e r 24 h o u r s o f e x p o s u r e , b o t h ASW a n d AHW g r o u p s e x p e r i e n c e d a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n P C Q 2 ( F i g . 1 1 ) . H o w e v e r , a t 24 h o u r s o f e x p o s u r e , p l a s m a [ H C 0 3 ~ ] v a l u e s f o r b o t h g r o u p s r e m a i n e d c o n s t a n t w i t h c o n t r o l v a l u e s ( F i g . 1 2 ) . T h e r e f o r e , a t 24 h o u r s o f e x p o s u r e t o a l k a l i n e h a r d a n d a l k a l i n e s o f t w a t e r , b o t h g r o u p s e x p e r i e n c e d a r e s p i r a t o r y b l o o d a l k a l o s i s . A t 48 h o u r s , [ H C 0 3 ~ ] p 2 v a l u e s f o r t h e ASW f i s h d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h e c o n t r o l v a l u e s . C o n s e q u e n t l y , t h e s e f i s h c o u n t e r a c t e d t h e r e s p i r a t o r y a l k a l o s i s w i t h a m e t a b o l i c a c i d o s i s . P l a s m a b i c a r b o n a t e l e v e l s f o r t h e AHW g r o u p d i d n o t s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e u n t i l 96 h o u r s o f e x p o s u r e t o t h e a l k a l i n e h a r d w a t e r . A s a r e s u l t , t h e AHW f i s h d i d n o t c o u n t e r a c t t h e r e s p i r a t o r y a l k a l o s i s w i t h a d e c r e a s e i n [ H C 0 3 ~ ] p - ^ u n t i l 24 h o u r s a f t e r t h e ASW f i s h . P l a s m a Tamm l e v e l s i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y f r o m c o n t r o l v a l u e s a t 24 h o u r s a n d r e m a i n e d e l e v a t e d f o r t h e d u r a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t f o r b o t h t r e a t m e n t s ( F i g . 1 3 ) . C o n t r o l a n d 24 h o u r Tamm v a l u e s w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t b e t w e e n t r e a t m e n t s h o w e v e r , a t 48 h o u r s t h e ASW f i s h h a d s i g n i f i c a n t l y h i g h e r p l a s m a Tamm l e v e l s . I t a p p e a r e d a s i f 73 Tamm l e v e l s f o r t h e AHW g r o u p h a d p l a t e a u e d a t 96 h o u r s a n d e v e n d e c r e a s e d a t 192 h o u r s . P l a s m a N H 3 l e v e l s f o r b o t h t r e a t m e n t s i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y f r o m c o n t r o l v a l u e s a t 24 h o u r s o f e x p o s u r e ( F i g . 1 4 ) . A t 48 h o u r s p l a s m a N H 3 l e v e l s f o r t h e ASW g r o u p i n c r e a s e d t o 2 1 3 . 4 u T o r r a n d w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h e AHW g r o u p . A t 96 h o u r s o f e x p o s u r e , t h e ASW f i s h e x p e r i e n c e d a 3 f o l d i n c r e a s e o f p l a s m a N H 3 o v e r t h e ASW g r o u p . P l a s m a N H 3 l e v e l s i n t h e AHW f i s h s eemed t o h a v e s t a b i l i z e d a t 100 u T o r r . A t 192 h o u r s , n o n e o f t h e ASW f i s h s u r v i v e d t o a l l o w f o r t h e c o m p a r i s o n b e t w e e n t r e a t m e n t m e a n s . N H 3 i s t h e t o x i c f o r m o f ammonia a n d q u i t e p o s s i b l y t h e ASW f i s h s u c c u m b e d t o t o x i c l e v e l s o f p l a s m a N H 3 . P l a s m a N H 4 + r e s u l t s f o l l o w e d t h e same t r e n d s a s Tamm a n d p l a s m a N H 3 ( F i g . 1 5 ) . B l o o d u r e a n i t r o g e n l e v e l s f o r b o t h t r e a t m e n t s d i d n o t f l u c t u a t e f r o m c o n t r o l v a l u e s . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e f i s h d i d n o t c o n v e r t ammonia t o u r e a v i a t h e o r n i t h i n e - u r e a c y c l e o r u r i c o l y s i s i n t i m e s o f e x c e s s ammonia l o a d a n d i n h i b i t e d ammonia e x c r e t i o n ( F i g . 16) . T h e r e was a s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n p l a s m a i o n c o n c e n t r a t i o n b e t w e e n t h e two t r e a t m e n t s ( F i g . 17 & 1 8 ) . A s i g n i f i c a n t l o s s o f [ N a + ] p 1 a n d [CT~]p-L o c c u r r e d i n t h e ASW f i s h a t 24 h o u r s a n d t h e s e l e v e l s r e m a i n e d d e p r e s s e d f o r t h e d u r a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t . T h e AHW f i s h r e g u l a t e d p l a s m a 74 i o n l e v e l s more e f f i c i e n t l y . A t 24 a n d 48 h , [ N a + ] p ^ was t h e same a s c o n t r o l v a l u e s a n d [ C l ' J p ! d i d n o t d e v i a t e f o r t h e d u r a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t . A t 96 h o u r s o f e x p o s u r e t h e ASW f i s h e x h i b i t e d a l a r g e l o s s o f [ N a + ] p ^ t o 104 mmol 1 _ 1 , w h i c h i s n e a r t h e l e t h a l r a n g e f o r [ N a + ] p l . T h e i n a b i l i t y t o r e g u l a t e p l a s m a i o n l e v e l s i n a l k a l i n e s o f t w a t e r c o u l d h a v e a l s o l e a d t o t h e d e a t h o f t h e ASW f i s h . P l a s m a C o r t i s o l l e v e l s w e r e s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r i n t h e ASW f i s h t h a n t h e AHW f i s h a t 48 a n d 96 h , i n d i c a t i n g t h a t t h e ASW f i s h w e r e u n d e r a g r e a t e r d e g r e e o f s t r e s s t h a n t h e AHW f i s h ( F i g . 1 9 ) . 75 D i s c u s s i o n : When t h e pH o f w a t e r was i n c r e a s e d f r o m 6 . 8 0 t o 9 . 9 1 , t h e C 0 2 / H C 0 3 ~ r a t i o d e c r e a s e d f r o m a b o u t 0 . 2 t o 0 . 0 0 2 ( L i n a n d R a n d a l l , 1 9 9 0 ) . T h i s d e c r e a s e i n t h e r a t i o r e s u l t e d i n a d e c r e a s e i n a m b i e n t w a t e r P C 0 2 ' A s a r e s u l t , t h i s s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n i n s p i r e d w a t e r P C 0 2 was r e s p o n s i b l e f o r l o w e r e d p l a s m a P C Q 2 ( L i n a n d R a n d a l l , 1 9 9 0 ) . I n s u p p o r t o f t h i s , i t i s known t h a t c h a n g e s i n e n v i r o n m e n t a l P C Q 2 / s m a l l i n a b s o l u t e t e r m s , a r e r e s p o n s i b l e f o r l a r g e c h a n g e s i n a r t e r i a l P C Q 2 a n d e v e n l a r g e r i n c r e a s e s i n pH ( H e i s l e r , 1 9 8 6 ) . F o r e x a m p l e , a n i n c r e a s e i n e n v i r o n m e n t a l P C 0 2 o f 8 T o r r w i l l r e s u l t i n a 5 f o l d i n c r e a s e i n p l a s m a P C 0 2 i n f i s h e s ( c o n t r o l v a l u e o f 2 T o r r ) . W h e r e a s , t h i s c h a n g e w o u l d b e o n l y 20 % i n mammals . A h y p e r v e n t i l a t o r y r e s p o n s e i n r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e c o n d i t i o n s h a s a l s o b e e n r e p o r t e d a n d may a l s o c o n t r i b u t e t o t h e d e c r e a s e i n p l a s m a p c o 2 ( R a n d a l l a n d W r i g h t , 1 9 8 9 ) . I n a s h o r t t e r m e x p o s u r e s t u d y b y W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) , P c o 2 was h a l v e d w i t h no c h a n g e i n [ H C 0 3 ~ ] p 1 d u r i n g e x p o s u r e t o pH 9 . 5 4 w a t e r . T h e f i s h i n t h e p r e s e n t s t u d y e x h i b i t e d t h e same r e s p i r a t o r y a l k a l o s i s when e x p o s e d t o pH 1 0 . 1 w a t e r . H o w e v e r , i n c o n t r a s t t o t h e s t u d y o f W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) , t h e f i s h i n t h e p r e s e n t s t u d y 76 c o u n t e r b a l a n c e d t h e r e s p i r a t o r y a l k a l o s i s w i t h a m e t a b o l i c a c i d o s i s ( d e c r e a s e d [ H C 0 3 ~ ] p ^ ) . T h i s m e t a b o l i c a c i d o s i s was m o s t l i k e l y n o t r e p o r t e d i n t h e s t u d y b y W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) , b e c a u s e o f t h e b r e v i t y o f t h e e x p o s u r e p e r i o d i n t h e i r s t u d y . T h e ASW g r o u p c o u n t e r a c t e d t h e r e s p i r a t o r y a l k a l o s i s w i t h a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n [ H C 0 3 ~ ] p i a t 4 8 h o u r s , w h i l e t h e AHW g r o u p d i d n o t e x p e r i e n c e a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e u n t i l 96 h o u r s . I n b o t h g r o u p s , t h e d e c r e a s e i n [ H C 0 3 ~ ] p i w a s n o t s u f f i c i e n t t o r e g u l a t e p l a s m a pH t o c o n t r o l l e v e l s . A s a r e s u l t , p l a s m a pH l e v e l s i n c r e a s e d . A f t e r t h e i n i t i a l i n c r e a s e i n p l a s m a p H , t h e AHW g r o u p was more e f f i c i e n t a t r e g u l a t i n g a c i d - b a s e s t a t u s , a s r e f l e c t e d i n t h e p l a s m a pH v a l u e s . T h e ASW g r o u p e x h i b i t e d a n i n a b i l i t y t o r e g u l a t e p l a s m a pH ( l a r g e a l k a l o s i s ) w h i c h c o u l d b e d i r e c t l y a s s o c i a t e d t o t h e m o r t a l i t y e x p e r i e n c e d b y t h a t g r o u p . T h e o n l y d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e two g r o u p s was w a t e r h a r d n e s s . T h e r e f o r e , t h e i n c r e a s e d w a t e r h a r d n e s s o r t h e e l e v a t e d C a + 2 l e v e l s a s s o c i a t e d w i t h t h e i n c r e a s e i n w a t e r h a r d n e s s , m u s t h a v e p l a y e d a r o l e i n a l l o w i n g t h e AHW g r o u p t o r e g u l a t e b l o o d a c i d - b a s e s t a t u s w i t h more e f f i c i e n c y . T h i s i s a v e r y i n t e r e s t i n g p o s s i b i l i t y a n d i t d e s e r v e s f u r t h e r s t u d y . I n i t i a l l y , p l a s m a T a m m l e v e l s r o s e i n b o t h t h e ASW a n d AHW g r o u p s . T h i s r i s e i n p l a s m a T a i m i s e x p e c t e d b e c a u s e 77 t h e p a s s i v e d i f f u s i o n o f N H 3 i s g r e a t l y i n h i b i t e d a n d t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e m e c h a n i s m i s s u p p r e s s e d b y a l k a l i n e a m b i e n t w a t e r ( W r i g h t a n d Wood , 1 9 8 5 ) . A t some p o i n t d u r i n g e x p o s u r e t o a l k a l i n e w a t e r , t h e i n c r e a s e i n b l o o d pH a s s o c i a t e d w i t h a l k a l i n e e x p o s u r e , r a i s e s t h e b l o o d N H 3 / T a m m r a t i o a n d r e s u l t s i n t h e p a s s i v e d i f f u s i o n o f ammonia a n d s u b s e q u e n t d e c r e a s e i n p l a s m a T a m m ( L i n A n d R a n d a l l , 1 9 9 0 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , p l a s m a T a m m o f t h e ASW g r o u p i n c r e a s e d t o s i g n i f i c a n t l y h i g h e r l e v e l s t h a n AHW p l a s m a T a m m . P l a s m a T amm l e v e l s o f t n e A S W g r o u p p l a t e a u e d a t 24 h o u r s a n d r e m a i n e d a t a p p r o x i m a t e l y 225 u m o l l - 1 f o r t h e r e m a i n d e r o f t h e s t u d y . T h e r e a r e f o u r p o s s i b l e r e a s o n s why t h i s o c c u r r e d : 1) T h e h i g h a m b i e n t C a + 2 l e v e l s o f t h e a l k a l i n e h a r d w a t e r a f f e c t e d t h e g i l l e p i t h e l i u m s o t h a t p a s s i v e N H 3 d i f f u s i o n o c c u r r e d . 2) T h e AHW e x p o s u r e h a l t e d e n d o g e n o u s N H 3 p r o d u c t i o n w h i l e t h e ASW e x p o s u r e d i d n o t . 3) A n i n c r e a s e i n p l a s m a T a m m e q u a l t o t h e ASW e x p o s u r e was n o t o b s e r v e d b e c a u s e i n t h e AHW e x p o s u r e t h e N H 3 was c o n v e r t e d i n t o a n o n - t o x i c compound , s u c h a s , u r e a a n d e x c r e t e d a s s u c h . 4) N a + / N H 4 + e x c h a n g e , t h o u g h t t o be i n h i b i t e d a t h i g h w a t e r p H , was r e a c t i v a t e d i n AHW e x p o s u r e . 78 I f a n y t h i n g , h i g h w a t e r [ C a + ^ ] s h o u l d h a v e t i g h t e n e d t h e g i l l e p i t h e l i a a n d p r o d u c e d a d e c r e a s e i n t h e p a s s i v e d i f f u s i o n o f N H 3 t h r o u g h t h e e p i t h e l i a l j u n c t i o n s . A t s u c h a h i g h w a t e r p H , t h e p N H 3 d i f f u s i o n g r a d i e n t w o u l d be r e v e r s e d ( w a t e r t o b l o o d ) r e s u l t i n g i n a d i f f u s i o n o f N H 3 i n t o t h e b l o o d . T h e r e f o r e , i t i s h i g h l y d o u b t f u l t h a t p a s s i v e d i f f u s i o n o f N H 3 o c c u r r e d . A l s o , W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) , showed t h a t o n e x p o s u r e t o a l k a l i n e w a t e r ( 9 . 5 4 ) , e n d o g e n o u s ammonia p r o d u c t i o n was n o t b l o c k e d . I n t h a t s t u d y , i t was r e p o r t e d t h a t p l a s m a T a m m i n c r e a s e d 2 . 5 f o l d d u r i n g t h e e x p e r i m e n t a l p e r i o d a n d t h e n d r o p p e d d u r i n g r e c o v e r y , s h o w i n g t h a t t h e r e d u c t i o n i n ammonia e x c r e t i o n was n o t d u e t o a b l o c k a g e o f e n d o g e n o u s ammonia p r o d u c t i o n . F i g u r e 16 shows t h a t b l o o d u r e a n i t r o g e n l e v e l s w e r e n o t i n c r e a s e d d u r i n g e x p o s u r e t o e i t h e r ASW o r AHW. T h e r e f o r e , p l a s m a T a m i n was n o t b e i n g c o n v e r t e d i n t o n o n - t o x i c u r e a b y t h e f i s h . T e s t s f o r o t h e r n i t r o g e n o u s w a s t e c o m p o u n d s , s u c h a s g l u t a m i n e w e r e n o t c a r r i e d o u t a n d a s a r e s u l t i t i s n o t known i f p l a s m a T a m m was b e i n g c o n v e r t e d i n t o g l u t a m i n e . A s a r e s u l t o f t h e a b o v e d i s c u s s i o n , t h e f i r s t t h r e e e x p l a n a t i o n s i n a l l p r o b a b i l i t y , d i d n o t o c c u r . H o w e v e r , t h e r e a c t i v a t i o n o f t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e c o u l d h a v e o c c u r r e d d u r i n g AHW e x p o s u r e . T h i s i s s u p p o r t e d 79 b y t h e f a c t s t h a t p l a s m a T a m m a n d N H 4 l e v e l s p l a t e a u e d a n d [ N a + ] p - L l e v e l s r e m a i n e d c o n s t a n t f o r t h e f i r s t few d a y s o f e x p o s u r e t o t h e AHW. T h e e x c h a n g e o f e x t e r n a l N a + f o r p l a s m a N H 4 + c o u l d h a v e b e e n r e s p o n s i b l e , i n p a r t , f o r t h e s t a t i c l e v e l s o f [ N a + ] p ^ . S i m u l t a n e o u s N a + / N H 4 + e x c h a n g e a n d a l a r g e r n e t N a + e f f l u x v i a t h e e p i t h e l i a l j u n c t i o n s c o u l d e x p l a i n t h e d e c r e a s e i n [ N a + ] p 1 a t 96 a n d 192 h o f e x p o s u r e . T h e ASW f i s h e x p e r i e n c e d a d e c r e a s e i n [Na + ]p -^ a n d a n i n c r e a s e p l a s m a T a m m w h i c h i n d i c a t e d t h a t i n ASW N a + / N H 4 + e x c h a n g e i s i n h i b i t e d . T h e s t u d y c o n d u c t e d b y W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) , i n w h i c h N a + / N H 4 + e x c h a n g e was f o u n d t o b e i n h i b i t e d a t h i g h p H , was c a r r i e d o u t i n w a t e r w i t h a t o t a l w a t e r h a r d n e s s o f 140 mg l - 1 a s CaCO-3. T h e AHW e x p o s u r e o f t h e p r e s e n t s t u d y was c o n d u c t e d a t a t o t a l w a t e r h a r d n e s s o f 320 mg l - 1 C a C 0 3 , w h i c h i s a more t h a n two f o l d i n c r e a s e i n t h e C a C 0 3 c o n t e n t o f t h e w a t e r . T h e a c t i v i t y o f t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e i n t h e AHW e x p o s u r e g r o u p m i g h t h a v e b e e n s t i m u l a t e d b y t h e h i g h c i r c u l a t i n g [ C a + 2 ] i n t h e a l k a l i n e h a r d w a t e r . T h e a c t i v i t y o f t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e i n (AHW) w i l l be a d d r e s s e d w i t h f u r t h e r s t u d i e s . I n t h e p r e v i o u s 1989 f i e l d s t u d y , a d e c r e a s e i n p l a s m a i o n l e v e l s was a t t r i b u t e d t o : t h e l e a c h i n g o f C a + 2 f r o m t h e g i l l e p i t h e l i a ( M c D o n a l d , 1 9 8 2 ; M i l l i g a n a n d Wood , 1 9 8 2 ; 80 L a u r e n a n d M c D o n a l d , 1986) a n d t h e i n h i b i t i o n o f t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e a t h i g h e n v i r o n m e n t a l w a t e r pH ( W r i g h t a n d Wood , 1 9 8 5 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y i t was o b s e r v e d t h a t , i n a l k a l i n e h a r d w a t e r c o n d i t i o n s , w h e r e [ C a + 2 ] i s much h i g h e r , [ N a + ] p 1 a n d [ C l ~ ] p ^ l o s s was l e s s s e v e r e . T h i s i s d u e t o t h e f a c t t h a t more C a + 2 f r o m t h e a m b i e n t w a t e r i s a v a i l a b l e t o r e p l a c e a n y C a + 2 t h a t l e a c h e s f r o m t h e g i l l e p i t h e l i a l j u n c t i o n s ( L a u r e n a n d M c D o n a l d , 1 9 8 6 ) . T h e r e f o r e , t h e " t i g h t " e p i t h e l i a l j u n c t i o n s r e m a i n " t i g h t " . W h e r e a s , i n t h e a l k a l i n e s o f t w a t e r , t h e " t i g h t " j u n c t i o n s become " l o o s e " d u e t o C a + 2 l e a c h i n g o u t o f t h e s e j u n c t i o n s . T h e s t a b l e [ N a + ] p ^ c o u l d h a v e a l s o b e e n a r e s u l t o f N a + / N H 4 + e x c h a n g e a c t i v i t y . E v e n t h o u g h , N a + / N H 4 + e x c h a n g e i s t h o u g h t t o b e i n h i b i t e d a t h i g h p H , t h e c o n s t a n t [ N a + ] p i may be i n d i c a t i v e o f N a + / N H 4 + e x c h a n g e a n d m i n i m a l [ N a + ] p ^ l o s s d u e t o t h e h a r d a l k a l i n e w a t e r . I o n r e g u l a t i o n i n t h e a l k a l i n e h a r d w a t e r was n o t 100 % e f f i c i e n t , h o w e v e r , a s t h e AHW g r o u p e x p e r i e n c e d s i g n i f i c a n t [ N a + ] p 1 l o s s e s a t 96 a n d 192 h o f t h e s t u d y . T h e s e [ N a + ] p 1 l o s s e s d u r i n g t h e l a t t e r s t a g e s o f t h e s t u d y do n o t n e c e s s a r i l y i n d i c a t e t h a t N a + / N H 4 + e x c h a n g e was i n h i b i t e d . T h e s e l o s s e s may h a v e o c c u r r e d d u r i n g N a + / N H 4 + e x c h a n g e a c t i v i t y a n d a s a r e s u l t o f a n i n c r e a s e o f [ N a + ] l o s s . 81 M c D o n a l d e t a l . (1980) a n d M c D o n a l d ( 1 9 8 3 ) , s t a t e d t h a t t h e r a p i d l o s s o f p l a s m a i o n s i n a n a c i d i c e n v i r o n m e n t was l e t h a l t o f i s h e s . T h i s i s p r o b a b l y t h e c a s e i n t h e p r e s e n t s t u d y , w h e r e t h e ASW g r o u p e x p e r i e n c e d a g r e a t e r l o s s o f p l a s m a i o n s r e l a t i v e t o t h e AHW g r o u p . M o r t a l i t y : When i n d i v i d u a l s o f a g r o u p d i e , a s o b s e r v e d w i t h t h e ASW g r o u p , a t d i f f e r e n t t i m e s d u r i n g t h e e x p e r i m e n t a l p e r i o d , d i f f i c u l t i e s a r i s e i n r e p r e s e n t i n g mean p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s (Wood e t a l . 1 9 8 8 a ) . C o n s e q u e n t l y , t h e mean r e s p o n s e s o f t h e ASW g r o u p m u s t be v i e w e d a s b e i n g r e p r e s e n t a t i v e o f t h e b l o o d s t a t u s i m m e d i a t e l y p r e c e d i n g d e a t h a n d a t i m e o f g r e a t d i s e a s e f o r t h e s e f i s h . Summary: I n s u m m a r y , t h e m o r t a l i t y e x p e r i e n c e d b y t h e ASW g r o u p w e r e l i k e l y i n p a r t d u e t o t h e i n a b i l i t y t o r e g u l a t e a c i d -b a s e b a l a n c e , p l a s m a i o n b a l a n c e a n d p l a s m a T a m m a c c u m u l a t i o n d u r i n g t h e a l k a l i n e s o f t w a t e r e x p o s u r e . T h e r a i n b o w t r o u t i n t h e AHW g r o u p w e r e b e t t e r a b l e t o r e g u l a t e t h e p h y s i o l o g i c a l b l o o d p a r a m e t e r s d e s c r i b e d a b o v e . T h e n e x t l o g i c a l s t e p w o u l d b e t o i n v e s t i g a t e t h e m e c h a n i s m s 82 i n v o l v e d t h a t a l l o w r a i n b o w t r o u t t o r e g u l a t e b l o o d p a r a m e t e r s i n a l k a l i n e h a r d w a t e r . 83 2 4 . 0 -2 2 . 0 -T A > 2 0 . 0 - O 1 8 . 0 - 1 <—<< 1 6 . 0 -• O 1 4 . 0 -X 1 2 . 0 -1 0 . 0 -8 . 0 -6 . 0 - h Ctr l . 2 4 48 + O — O 4 mg/l CaC0 3 A — A 320 mg/1 CqC0 3 —I 1 1 1 h-72 96 120 144 168 192 Time (hours) F i g u r e 9 : M e a n s + / - 1 S . E . o f h e m a t o c r i t i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e ( h ) . N = 7 . 84 X Q. O E CO _o Q_ 8.6 8.5 8.4 8.3 8.2 8.1 • 8.0 7.9-7.8-Ctr l . 24 48 -f-O — O 4 mg/l CaC0 3 A — A 320 mg/l CaC0 3 72 96 120 144 168 192 Time (hours) F i g u r e 1 0 : M e a n s + / - 1 S . E . o f p l a s m a pH i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e ( h ) . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . # d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s a t p = 0 . 0 5 . N = 7 . 85 O O 4 mg/1 CaC0 3 A — A 320 mg/1 CaC0 3 72 96 120 Time (hours) 144 168 192 F i g u r e 1 1 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a p C o 2 i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . # d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s a t p = 0 . 0 5 . N = 7 . 86 ro O O X o E CO 1 2 . 5 n 1 0 . 0 -7 . 5 5 . 0 -2 . 5 O — O 4 mg/l CaC0 3 A — A 320 mg/l CaC0 3 Ctr l . 2 4 4 8 + 7 2 9 6 1 2 0 Time (hours) 1 4 4 1 6 8 1 9 2 F i g u r e 1 2 : M e a n s + / - 1 S . E . o f p l a s m a [ H C 0 3 ~ ] i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . # d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s a t p = 0 . 0 5 . N = 7 . 87 5 5 0 n —I 1 1 1 1 1 1 1 h Ctr l . 24 48 72 96 120 144 168 192 Time (hours) F i g u r e 1 3 : M e a n s + / - 1 S . E . o f p l a s m a t o t a l ammonia i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . # d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s a t p = 0 . 0 5 . N = 7 . 88 0 T 1 1 1 1 1 1 I 1 1 ctr l . 24 48 72 96 120 144 168 192 Time (hours) F i g u r e 14 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a p N H 3 i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e ( h ) . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . # d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s a t p = 0 . 0 5 . N = 7 . 89 5 5 0 n 0 n 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Ctrl. 2 4 4 8 7 2 9 6 1 2 0 1 4 4 1 6 8 1 9 2 Time (hours) F i g u r e 1 5 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a [ N H 4 + ] i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e ( h ) . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . # d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s a t p = 0 . 0 5 . N = 7 . 90 CTi C d) CD O 0) O m 12 1 0 -8 -4 -O — O 4 mg/l CaC0 3 A — A 320 mg/l CaC0 3 Ctr l . 24 48 72 96 120 Time (hours) —I 1 144 168 192 F i g u r e 1 6 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a b l o o d u r e a n i t r o g e n i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h ) . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . # d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s a t p = 0 . 0 5 . N = 7 . 91 O E E + o E to _2 150 140 130 120 110 100 90 O — O 4 mg/l CaC0 3 A — A 320 mg/l CaC0 3 * -A Ctr l . 24 48 —I 1 r — 72 96 120 Time (hours) 144 168 192 F i g u r e 1 7 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a N a + c o n c e n t r a t i o n s i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e (h) , . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . # d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s a t p - 0 . 0 5 . N = 7 . 9 2 O E E o D E CO _ D Q_ 1 5 0 -1 4 0 -1 3 0 -A 1 2 0 - T o 1 1 0 - 1 1 0 0 -9 0 -8 0 -7 0 - h O — O 4 mg/l CaC0 3 A — A 320 mg/l CaC0 3 T -A i Ctr l . 24 48 72 96 120 Time (hours) 144 168 192 F i g u r e 1 8 : M e a n s + / - 1 S . E . o f p l a s m a C l ~ c o n c e n t r a t i o n s i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e ( h ) . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . # d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s a t p = 0 . 0 5 . N = 7 . 93 '3 Ctrl. 24 48 72 96 120 144 168 192 Time (hours) F i g u r e 1 9 : M e a n s + / - 1 S . E . o f p l a s m a C o r t i s o l c o n c e n t r a t i o n s i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d a n d s o f t w a t e r a s a f u n c t i o n o f t i m e ( h ) . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . # d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t r e a t m e n t s a t p = 0 . 0 5 . N = 7 . 9 4 C h a p t e r 2 S e c t i o n 2 : A c u t e S t u d y T h e A c u t e E x p o s u r e o f R a i n b o w T r o u t t o A l k a l i n e W a t e r s 95 I n t r o d u c t i o n : W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) , s t u d i e d t h e a c u t e e x p o s u r e o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e c o n d i t i o n s (pH 9 . 5 4 , 140 mg l - 1 C a C 0 3 ) . T h e p r e v i o u s c h r o n i c e x p o s u r e s t u d y was 192 h o u r s i n l e n g t h a n d h a d s a m p l i n g i n t e r v a l s o f 24 h o u r s . W i t h t h e p r e s e n t s t u d y , we w a n t e d t o i n v e s t i g a t e t h e a c u t e r e s p o n s e o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e h a r d w a t e r (320 mg l - 1 C a C 0 3 ) . I t was d e c i d e d t o f u r t h e r e x p l o r e t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e a c t i v i t y t h a t was d i s c u s s e d i n t h e p r e v i o u s c h r o n i c e x p o s u r e s t u d y , v i a t h e u s e o f a m i l o r i d e . A m i l o r i d e i s a s p e c i f i c N a + t r a n s p o r t i n h i b i t o r a n d i f N a + / N H 4 + e x c h a n g e i s a c t i v e , one m i g h t e x p e c t t o o b s e r v e l o w e r w a t e r T a m m l e v e l s a n d s t a b l e [ N a + ] p 1 u p o n e x p o s u r e o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e h a r d w a t e r a n d a m i l o r i d e . W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) , e f f e c t i v e l y u t i l i z e d a m i l o r i d e t o show t h a t N a + / N H 4 + e x c h a n g e i s i n h i b i t e d a t h i g h w a t e r p H . C o n s e q u e n t l y , i t was d e c i d e d t o i n v e s t i g a t e t h e p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s o f r a i n b o w t r o u t t o t h e a c u t e e x p o s u r e o f a l k a l i n e s o f t w a t e r , a l k a l i n e h a r d w a t e r a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e , o n e a f t e r t h e o t h e r . I t was r a t i o n a l i z e d , t h a t b y e x p o s i n g t h e same f i s h t o t h e d i f f e r e n t w a t e r q u a l i t i e s , one a f t e r t h e o t h e r , t h e v a r i a t i o n o b s e r v e d i n some p h y s i o l o g i c a l p a r a m e t e r s , s u c h a s p l a s m a T a m m , w o u l d b e r e d u c e d . T h r e e 96 h o u r e x p o s u r e p e r i o d s f o r e a c h w a t e r q u a l i t y w e r e u t i l i z e d b e c a u s e t h a t was t h e s t a n d a r d t i m e p e r i o d u s e d i n many o f t h e p r e v i o u s a c u t e e x p o s u r e s t u d i e s , s u c h a s C a m e r o n a n d H e i s l e r ( 1 9 8 3 ) , a n d W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) . T h i s s t u d y was o r g a n i z e d i n a n a t t e m p t t o i n v e s t i g a t e " w h o l e b o d y " r e s p o n s e s o f r a i n b o w t r o u t , i n c l u d i n g a c i d - b a s e a n d i o n r e g u l a t i o n , u p o n e x p o s u r e t o a l k a l i n e h a r d w a t e r . W h e r e a s p r e v i o u s s t u d i e s , s u c h a s W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) , c o n c e n t r a t e d o n s p e c i f i c r e s p o n s e s s u c h a s ammonia e x c r e t i o n a n d s o d i u m u p t a k e . C o n s e q u e n t l y , t h e r e s u l t s o f t h i s s t u d y may h a v e f i s h e r i e s management i m p l i c a t i o n s , b e c a u s e t h e r e s u l t s may g i v e some i n s i g h t o n t h e " w h o l e b o d y " r e s p o n s e a n d a p p a r e n t s t r e s s e s a s s o c i a t e d w i t h t h e s t o c k i n g o f r a i n b o w t r o u t f r o m s o f t n e u t r a l w a t e r t o h a r d a l k a l i n e w a t e r . T h e h y p o t h e s e s t e s t e d i n t h i s s t u d y was t h a t N a + / N H 4 + e x c h a n g e p l a y e d a r o l e i n ammonia e x c r e t i o n i n a l k a l i n e h a r d w a t e r . T h i s i o n e x c h a n g e was b l o c k e d w i t h a m i l o r i d e , a known N a + t r a n s p o r t b l o c k e r . 97 M e t h o d s a n d M a t e r i a l s : A n i m a l s : R a i n b o w t r o u t w e i g h i n g 3 8 3 . 6 + 3 2 . 3 g r a m s (mean ± S . E . ) w i t h a s t a n d a r d l e n g t h o f 3 1 . 2 + 2 . 4 c m . (mean + S . E . ) w e r e u s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s . See G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 2 , f o r more d e t a i l s . F i s h S u r g e r y : See G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 2 , f o r more d e t a i l s . A p p a r a t u s : Two e x p e r i m e n t a l a p p a r a t u s e s w e r e u s e d i n t h i s e x p e r i m e n t . 1) B l o o d p a r a m e t e r r e s p o n s e . C a n n u l a t e d f i s h w e r e p l a c e d i n a d a r k 6 - c h a m b e r e d P l e x i g l a s s h o l d i n g b o x . T h e h o l d i n g b o x was f e d w i t h d e c h l o r i n a t e d V a n c o u v e r c i t y w a t e r f r o m a f u l l y a e r a t e d h e a d t a n k . T h e e f f l u e n t f r o m t h e h o l d i n g b o x was n o t r e u s e d . T o i n c r e a s e t h e pH o f t h e w a t e r , a c o n c e n t r a t e d s o d i u m h y d r o x i d e s o l u t i o n ( N a O H , 0 . 2 M) was m e t e r e d i n t o t h e h e a d t a n k v i a p e r i s t a l t i c pump ( H a r v a r d A p p a r a t u s , M a s s a c h u s e t t s ) . T h e c o n c e n t r a t e d NaOH was c o n t a i n e d i n a 40 1 p l a s t i c c a r b o y . T o i n c r e a s e w a t e r h a r d n e s s , a 98 c o n c e n t r a t e d c a l c i u m c a r b o n a t e s o l u t i o n ( C a C 0 3 , 3200 mg l - ± ) was m e t e r e d i n t o t h e h e a d t a n k v i a a s e p a r a t e p e r i s t a l t i c pump. T h e CaCG-3 was p r e m i x e d p r i o r t o e x p e r i m e n t a t i o n a n d c o n t a i n e d i n a 90 1 g a r b a g e c a n . T o k e e p t h i s c o n c e n t r a t e d s o l u t i o n w e l l m i x e d a n d t o p r e v e n t t h e C a C 0 3 f r o m s e t t l i n g o u t o f s o l u t i o n , a s u b m e r s i b l e w a t e r pump ( L i t t l e G i a n t Pumps , O k l a h o m a ) was p l a c e d i n t o t h e g a r b a g e c a n t o c r e a t e c i r c u l a r f l o w . P u m p i n g r a t e s f o r t h e c o n c e n t r a t e d NaOH a n d C a C 0 3 s o l u t i o n s w e r e p r e d e t e r m i n e d t o s u s t a i n t h e s y s t e m a t pH 1 0 . 1 a n d 4 mg l " 1 C a C 0 3 a n d a t pH 1 0 . 1 a n d 320 mg l " 1 C a C 0 3 . T o i n c r e a s e t h e pH a n d t h e h a r d n e s s o f t h e w a t e r o f t h e f i s h h o l d i n g b o x t h e pumps w e r e s e t t o t h e i r p r e d e t e r m i n e d s e t t i n g s a n d t u r n e d o n . T h e w a t e r pH o f t h e h o l d i n g b o x was m o n i t o r e d w i t h a g l a s s e l e c t r o d e ( R a d i o m e t e r , C o p e n h a g e n ) c o n n e c t e d t o a PHM84 pH m e t e r ( R a d i o m e t e r ) . W a t e r f l o w r a t e s o f t h i s s y s t e m w e r e s e t a 2 . 0 1 m i n - 1 . 2) N e t Ammonia F l u x ( S e e F i g . 2 0 ) . T h i s s y s t e m c o n s i s t e d o f two d a r k P e r s p e x f i s h c h a m b e r s t h a t w e r e i n d i v i d u a l l y c o n n e c t e d t o a h e a d t a n k , p r o d u c i n g two s e p a r a t e f l o w - t h r o u g h s y s t e m s . T h e h e a d t a n k a n d c h a m b e r s w e r e s u p p l i e d w i t h f u l l y a e r a t e d , d e c h l o r i n a t e d V a n c o u v e r c i t y w a t e r a t 10 + 1 ° C . T - v a l v e s a t t h e i n l e t a n d 99 o u t l e t o f e a c h c h a m b e r c o u l d be c l o s e d t o o p e r a t e e a c h c h a m b e r a s a c l o s e d r e c i r c u l a t i n g ~ s y s t e m t o a l l o w f o r t h e m e a s u r e m e n t o f w a t e r T a m m . When t h e s y s t e m was c l o s e d , t h e w a t e r e x i t e d t h e c h a m b e r a n d f l o w e d down i n t o a s m a l l r e s e r v o i r w h e r e i t was a e r a t e d a n d pumped ( L i t t l e G i a n t Pumps , O k l a h o m a ) b a c k t o t h e i n l e t o f t h e f l u x c h a m b e r . C o n c e n t r a t e d s o d i u m h y d r o x i d e (NaOH, 0 . 2 M) a n d c a l c i u m c a r b o n a t e ( C a C 0 3 , 3200 mg l " 1 ) w e r e m e t e r e d i n t o t h e h e a d t a n k b y p e r i s t a l t i c pump ( H a r v a r d A p p a r a t u s , M a s s a c h u s e t t s ) t o i n c r e a s e w a t e r pH t o 1 0 . 1 a n d w a t e r h a r d n e s s t o 320 mg 1" 1/ r e s p e c t i v e l y . T h e w a t e r pH o f e a c h c l o s e d s y s t e m was m o n i t o r e d w i t h a g l a s s e l e c t r o d e ( R a d i o m e t e r , C o p e n h a g e n ) c o n n e c t e d t o a PHM84 pH m e t e r ( R a d i o m e t e r ) . E a c h r e c i r c u l a t i n g s y s t e m h a d a t o t a l v o l u m e o f 4 . 0 1. W a t e r f l o w r a t e s t h r o u g h t h e s e s y s t e m s d u r i n g t h e f l o w - t h r o u g h a n d r e c i r c u l a t i n g p h a s e s w e r e s e t a 2 . 0 1 m i n " 1 . P r o t o c o l : 1) B l o o d P a r a m e t e r S e t u p : T h e f i r s t b l o o d s a m p l e s w e r e t a k e n 72 h p o s t - s u r g e r y w h i c h a l l o w e d t h e f i s h t o f u l l y r e c o v e r f r o m s u r g e r y . E a c h f i s h Was e x p o s e d t o t h e f o l l o w i n g f o u r d i f f e r e n t t r e a t m e n t s i n s u c c e s s i o n : 100 i ) CW- d e c h l o r i n a t e d V a n c o u v e r c i t y w a t e r (pH 6 . 8 , 4 mg l " 1 C a C 0 3 ) . i i ) ASW- a l k a l i n e w a t e r (pH 1 0 . 1 , 4 mg l " 1 C a C 0 3 ) . i i i ) AHW- a l k a l i n e h a r d w a t e r (pH 1 0 . 1 , 320 mg l " 1 ) . i v ) AHWA- a l k a l i n e w a t e r t r e a t e d w i t h a m i l o r i d e ( 1 0 ~ 4 m o l l " 1 ) . C o n t r o l b l o o d s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n f r o m t h e d o r s a l a o r t i c c a n n u l a e a t 1 , 2 , a n d , 3 h i n t e r v a l s . T h e pH o f t h e w a t e r was t h e n r a i s e d t o 1 0 . 1 a n d b l o o d s a m p l e s w e r e t a k e n a f t e r 1 , 2 , a n d , 3 h o f e x p o s u r e . T h e h a r d n e s s o f t h e w a t e r was t h e n r a i s e d t o 320 mg l - 1 C a C 0 3 a n d b l o o d s a m p l e s w e r e t a k e n a f t e r 1 , 2 , a n d , 3 h o f e x p o s u r e t o t h e h a r d a l k a l i n e w a t e r . F i n a l l y , t h e w a t e r f l o w r a t e was d e c r e a s e d t o 0 . 2 5 1 m i n - 1 a n d a m i l o r i d e ( 1 0 ~ 4 m o l l - 1 ) was i n t r o d u c e d i n t o t h e s y s t e m . S a m p l e s w e r e t a k e n a f t e r 1 , 2 , a n d , 3 h o f e x p o s u r e t o t h e h a r d a l k a l i n e , a m i l o r i d e t r e a t e d w a t e r . 2) N e t Ammonia F l u x S e t u p : N o n - c a n n u l a t e d f i s h , one p e r c h a m b e r , w e r e p l a c e d i n t o t h e c h a m b e r s 72 h p r i o r t o e x p e r i m e n t a t i o n t o a c c l i m a t e t h e f i s h t o t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s . T h e f i s h w e r e t h e n e x p o s e d t o t h e same f o u r t r e a t m e n t s , i n t h e same o r d e r , u s e d i n t h e b l o o d p a r a m e t e r s e t u p . R e f e r t o t h e p r o t o c o l f o r t h e 101 b l o o d p a r a m e t e r s e t u p f o r d e t a i l s r e g a r d i n g t h e t r e a t m e n t s . T h e f i s h w e r e e x p o s e d t o e a c h t r e a t m e n t f o r t h r e e h o u r s . F o r t h e e n t i r e t h r e e h o u r s e a c h s y s t e m was c l o s e d o f f a n d r e c i r c u l a t e d . A t t h e e n d o f e a c h t h r e e h o u r p e r i o d , t h e c h a m b e r s w e r e t u r n e d i n t o f l o w - t h r o u g h s y s t e m s a n d f l u s h e d o u t w i t h t h e t r e a t m e n t t h a t h a d j u s t b e e n r e c i r c u l a t e d . T h i s was d o n e t o m a x i m i z e t h e s e n s i t i v i t y w i t h w h i c h t h e c h a n g e s i n w a t e r T a m m c o u l d be m e a s u r e d . I t was o b s e r v e d t h a t t h i s p r o c e d u r e was o f no a d d e d d i s t u r b a n c e t o t h e f i s h . O n c e t h e s y s t e m s w e r e t h o r o u g h l y f l u s h e d ( a p p r o x i m a t e l y f o u r m i n u t e s ) , t h e f i s h w e r e t h e n e x p o s e d t o n e x t t r e a t m e n t t y p e f o r t h r e e h o u r s . W a t e r s a m p l e s w e r e t a k e n a t 0 , 1 , 2 a n d , 3 > h f o r e a c h t r e a t m e n t . F i v e m l w a t e r s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n b y s y r i n g e , a c i d i f i e d w i t h 200 u l H N 0 3 a n d f r o z e n i m m e d i a t e l y a t - 7 0 ° C f o r l a t e r a n a l y s i s . T o m a i n t a i n t h e h i g h w a t e r pH o f w a t e r q u a l i t i e s i i - i v i n t h e c l o s e d r e c i r c u l a t i n g s y s t e m s , 0 . 2 M NaOH was m a n u a l l y t i t r a t e d i n t o t h e r e s e r v o i r s o f e a c h s y s t e m a t 15 m i n u t e i n t e r v a l s . I t m u s t be n o t e d t h a t t h i s s y s t e m was n o t c l o s e d t o t h e e n v i r o n m e n t t o p r e v e n t t h e d i f f u s i o n o f N H 3 t o t h e a t m o s p h e r e . A v e l l a a n d B o r n a c i n ( 1 9 8 9 ) , r e p o r t e d t h a t N H 3 d o e s n o t l e a v e t h e e x t e r n a l c o m p a r t m e n t b e c a u s e t h e r a t e o f d i f f u s i o n o f N H 3 t o t h e a t m o s p h e r e i s v e r y s l o w . T h e r e f o r e , 102 i t was d e c i d e d t h a t a c l o s e d s y s t e m " c l o s e d " o f f t h e a t m o s p h e r e was n o t n e c e s s a r y . A n a l y t i c a l T e c h n i q u e s : 1) M e a s u r e m e n t a n d C a l c u l a t i o n o f B l o o d P a r a m e t e r s : A t e a c h s a m p l e t i m e , 300 u l o f a r t e r i a l b l o o d was c o l l e c t e d f r o m e a c h c a n n u l a a n d r e p l a c e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f C o r t l a n d s a l i n e . T h e e x t r a c t e d b l o o d s a m p l e s w e r e u s e d i n t h e m e a s u r e m e n t o f p a r a m e t e r s l i s t e d i n t h e G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 2 . 2) M e a s u r e m e n t o f W a t e r T o t a l A m m o n i a : A ) W a t e r Tamm : W a t e r t o t a l ammonia was m e a s u r e d u s i n g a m i c r o - m o d i f i c a t i o n o f t h e s a l i c y l a t e - h y p o c h l o r i t e a s s a y ( V e r d o u w , v a n E c h t e d a n d , D e k k e r s , 1 9 7 8 ) . B) W a t e r N H 4 + : See p l a s m a N H 4 + i n t h e G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 2 , f o r c a l c u l a t i o n . C) W a t e r N H 3 : See p l a s m a N H 3 i n t h e G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 2 , f o r c a l c u l a t i o n . S t a t i s t i c s : See G e n e r a l M e t h o d s a n d M a t e r i a l s , C h a p t e r 2 , f o r d e t a i l s . 103 H e a d T a n k 0.2.M NQDH denotes r e c i r c u l a t e d water. p H m e t e r Cone CaCD 3 F i g u r e 2 0 : A s c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f t h e N e t Ammonia F l u x S e t u p . 104 R e s u l t s : I ) B l o o d p a r a m e t e r r e s p o n s e t o a c u t e e x p o s u r e . i ) C o n t r o l W a t e r E x p o s u r e ( C W ) : P l a s m a p H , P C Q 2 / H C 0 3 " , P l a s m a Tamm, [ N a + ] p 1 a n d [ C l ~ ]p2 l e v e l s f o r t h e f i r s t t h r e e c o n t r o l m e a s u r e m e n t s ( C 1 - C 3 ) w e r e c h a r a c t e r i s t i c o f r e s t i n g R a i n b o w t r o u t i n n e u t r a l pH w a t e r . T h i s i s s u p p o r t e d b y t h e a g r e e m e n t o f p l a s m a T a m m a n d P C 0 2 v a l u e s t o t h o s e r e p o r t e d b y W r i g h t a n d Wood (1985) f o r r e s t i n g f i s h . A n a v e r a g e o f t h e t h r e e c o n t r o l m e a s u r e m e n t s was u s e d i n t h e c o m p a r i s o n o f t h e c o n t r o l v a l u e t o t h e e x p e r i m e n t a l means b e c a u s e o f t h e f a c t t h a t t h e r e w e r e t h r e e . H e m a t o c r i t v a l u e s d e c r e a s e d , w h i c h i s i n d i c a t i v e o f t h e r e p e a t e d b l o o d s a m p l i n g d u r i n g t h i s s t u d y ( F i g . 2 1 ) . i i ) A l k a l i n e S o f t W a t e r E x p o s u r e ( A S W ) : When t h e f i s h w e r e t h e n e x p o s e d t o a n a l k a l i n e pH o f 1 0 . 1 , a p r o n o u n c e d b l o o d a l k a l o s i s (+ 0 . 2 2 pH u n i t s ) o c c u r r e d ( F i g . 2 2 ) . W i t h i n t h e f i r s t h o u r o f e x p o s u r e t o t h e a l k a l i n e w a t e r , p l a s m a pH r o s e s i g n i f i c a n t l y a n d r e m a i n e d e l e v a t e d t h r o u g h o u t t h e t h r e e h o u r s o f e x p o s u r e . P l a s m a P C Q 2 l e v e l s d e c r e a s e d ( - 1 . 0 T o r r ) s i g n i f i c a n t l y f r o m 105 t h e CW v a l u e s w i t h i n t h e f i r s t h o u r o f e x p o s u r e a n d r e m a i n e d s o f o r t h e t h r e e h o u r p e r i o d ( F i g . 2 3 ) . P l a s m a [ H C 0 3 ~ ] l e v e l s i n c r e a s e d ( 1 . 0 9 mmol 1 _ 1 ) b u t t h e s e i n c r e a s e s w e r e n o t s i g n i f i c a n t ( F i g . 2 4 ) . C o n s e q u e n t l y , t h e b l o o d a l k a l o s i s was r e s p i r a t o r y i n o r i g i n d u e t o t h e f a c t t h a t C 0 2 e x c r e t i o n was g r e a t l y e n h a n c e d a t t h e h i g h w a t e r pH ( W r i g h t a n d W o o d , 1 9 8 5 ) . P l a s m a T o t a l Ammonia i n c r e a s e d 3 f o l d b y t h e t h i r d h o u r o f e x p o s u r e , h o w e v e r , t h e s e i n c r e a s e s w e r e d e t e r m i n e d t o b e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m CW v a l u e s ( F i g . 2 5 ) . A c c o r d i n g l y , p l a s m a N H 3 a n d N H 4 + l e v e l s i n c r e a s e d w i t h t h e e x p o s u r e t o t h e a l k a l i n e c o n d i t i o n s ( F i g . 26 & 2 7 ) . T h e s e i n c r e a s e s w e r e o n l y s i g n i f i c a n t f o r p l a s m a N H 3 a t t h e t h i r d h o u r o f e x p o s u r e . A n e f f l u x o f p l a s m a i o n s o c c u r r e d w i t h t h e e x p o s u r e t o t h e a l k a l i n e w a t e r . P l a s m a s o d i u m c o n c e n t r a t i o n d e c r e a s e d b y 6 mmol l - 1 a n d [ C l ' l p ^ d e c r e a s e d b y 4 mmol l - 1 , h o w e v e r , b o t h d e c r e a s e s w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e CW v a l u e s ( F i g . 28 & 2 9 ) . i i i ) A l k a l i n e H a r d W a t e r E x p o s u r e (AHW): T h e f i s h w e r e n e x t e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d w a t e r w h i c h i n c r e a s e d t h e b u f f e r i n g c a p a c i t y o f t h e w a t e r e n v i r o n m e n t a s a r e s u l t o f t h e i n c r e a s e i n C a C 0 3 . P l a s m a pH i n c r e a s e d 0 . 1 2 6 pH u n i t s o v e r t h e p r e v i o u s ASW g r o u p ( F i g 2 2 ) . T h i s i n c r e a s e was n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e ASW v a l u e s 106 h o w e v e r , t h e e l e v a t e d pH l e v e l s r e m a i n e d s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e CW v a l u e s . P l a s m a [ H C 0 3 ~ ] i n c r e a s e d 0 . 7 8 mmol l " 1 o v e r t h e p r e v i o u s e x p o s u r e v a l u e s ( F i g . 2 4 ) . T h e s e v a l u e s w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m e i t h e r p r e v i o u s ASW v a l u e s o r t h e CW v a l u e s . W i t h t h e i n c r e a s e d b u f f e r i n g c a p a c i t y o f t h e h a r d a l k a l i n e w a t e r , C 0 2 e x c r e t i o n was e n h a n c e d e v e n more t h a n t h e ASW g r o u p . T h i s was e v i d e n t a s p l a s m a P C 0 2 v a l u e s d e c r e a s e d 0 . 3 6 T o r r b e l o w t h e ASW p l a s m a p c o 2 v a l u e s a n d r e m a i n e d s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h e CW v a l u e s ( F i g . 2 3 ) . When t h e f i s h w e r e e x p o s e d t o t h e a l k a l i n e h a r d w a t e r , p l a s m a Tamm l e v e l s p l a t e a u e d a n d d i d n o t i n c r e a s e p a s t t h e ASW Tamm l e v e l s ( F i g . 2 5 ) . C o n s e q u e n t l y , p l a s m a N H 4 + v a l u e s p l a t e a u e d a t l e v e l s s i m i l a r t o t h e ASW v a l u e s ( F i g . 2 7 ) . I n t e r e s t i n g l y , p l a s m a N H 3 v a l u e s i n c r e a s e d a b o v e t h e ASW v a l u e s , s t a b i l i z e d a t a p p r o x i m a t e l y 133 u T o r r a n d w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h e c o n t r o l p l a s m a N H 3 v a l u e s ( F i g . 2 6 ) . W i t h t h e i n c r e a s e o f C a C 0 3 i n t h e w a t e r , t N a + ] p i s t a b i l i z e d a n d a c t u a l l y i n c r e a s e d a b o v e t h e p r e v i o u s ASW g r o u p h o w e v e r , t h e s e w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t c h a n g e s ( F i g . 2 8 ) . P l a s m a c h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n r e m a i n e d a t l o w e r l e v e l s t h e n t h e CW [ C l ~ ] p l b u t a g a i n , t h e s e v a l u e s w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e CW v a l u e s ( F i g . 2 9 ) . 107 i v ) A l k a l i n e H a r d W a t e r + A m i l o r i d e E x p o s u r e (AHWA): T o s e e t h e e f f e c t s o f s o d i u m t r a n s p o r t i n h i b i t i o n i n a l k a l i n e h a r d w a t e r , t h e same p r o t o c o l was f o l l o w e d w i t h t h e a d d i t i o n o f a m i l o r i d e . A m i l o r i d e , t h e s p e c i f i c s o d i u m t r a n s p o r t b l o c k e r i s a c i d i c i n n a t u r e a n d c o n s e q u e n t l y when a d d e d t o t h e w a t e r i t c a u s e d a s l i g h t d e c r e a s e i n w a t e r pH a n d s u b s e q u e n t l y a s l i g h t b u t n o t s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n p l a s m a pH ( F i g . 2 2 ) . P l a s m a P C 0 2 l e v e l s r e m a i n e d a t l e v e l s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n CW v a l u e s a n d s i m i l a r t o t h e p r e v i o u s two e x p o s u r e (ASW & AHW) v a l u e s ( F i g . 2 3 ) . P l a s m a [ H C 0 3 ~ ] d e c r e a s e d f r o m t h e p r e v i o u s two e x p o s u r e (ASW & AHW) v a l u e s t o l e v e l s c o m p a r a b l e t o t h e CW v a l u e s b u t , t h e s e d e c r e a s e s w e r e n o t s i g n i f i c a n t ( F i g . 2 4 ) . When a m i l o r i d e was a d d e d t o t h e a l k a l i n e h a r d w a t e r , p l a s m a Tamm l e v e l s i n c r e a s e d b y 125 u m o l l - 1 ( F i g . 2 5 ) . P l a s m a N H 3 a n d N H 4 + v a l u e s w e r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e CW v a l u e s b u t w e r e n o t d i f f e r e n t f r o m t h e p r e v i o u s AHW v a l u e s ( F i g . 26 & 2 7 ) . P l a s m a s o d i u m c o n c e n t r a t i o n s d i d n o t c h a n g e f r o m t h e p r e v i o u s AHW v a l u e s ( F i g . 2 8 ) . P l a s m a c h l o r i d e c o n c e n t r a t i o n s b e h a v e d s i m i l a r l y ( F i g . 2 9 ) . 108 I I ) T o t a l W a t e r Ammonia E x c r e t i o n i n R e s p o n s e t o A c u t e  E x p o s u r e . i ) C o n t r o l W a t e r E x p o s u r e (CW): U n d e r n o r m a l r e s t i n g c o n d i t i o n s R a i n b o w t r o u t e x c r e t e ammonia t o t h e e n v i r o n m e n t . When t h e e x p e r i m e n t a l s e t u p was c l o s e d a n d t u r n e d i n t o a r e c i r c u l a t i n g s y s t e m , w a t e r Tamm r o s e f r o m 2 . 3 u m o l l - 1 a t 0 h o u r s t o 4 6 . 5 u m o l l - 1 a f t e r t h r e e h o u r s o f r e c i r c u l a t i o n ( F i g . 3 0 ) . T h i s i n c r e a s e i n w a t e r Tamm was d e t e r m i n e d t o b e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e 0 h o u r c o n t r o l v a l u e a n d i n d i c a t i v e o f s a l m o n i d ammonia e x c r e t i o n i n a r e s t i n g c o n d i t i o n . A t c o n t r o l pH v a l u e s a m a j o r i t y o f t h e ammonia e x c r e t e d i n t o t h e w a t e r w o u l d b e e x p e c t e d t o be i n t h e i o n i z e d f o r m ( N H 4 + ) . T h i s i s b e c a u s e t h e c o n t r o l w a t e r pH v a l u e o f 6 . 8 i s w e l l b e l o w t h e pK o f t h e N H 3 / N H 4 + r e a c t i o n . A s e x p e c t e d , d u r i n g t h e c o n t r o l e x p o s u r e , w a t e r N H 3 l e v e l s a r e a l m o s t n o n - e x i s t e n t ( 0 . 0 5 u T o r r ) w h i l e w a t e r N H 4 + l e v e l s makes u p m o s t o f t h e Tamm e x c r e t e d i n t o t h e w a t e r ( F i g . 31 & 3 2 ) . W a t e r N H 4 + l e v e l s i n c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y f r o m t h e 0 h o u r c o n t r o l v a l u e f o r a l l t h r e e h o u r s o f e x p o s u r e t o t h e c o n t r o l c o n d i t i o n s . C a l c u l a t e d c o n t r o l w a t e r Tamm e x c r e t i o n r a t e s , i n t e r e s t i n g l y , d e c r e a s e d o v e r t h e t h r e e h o u r p e r i o d ( F i g . 3 3 ) . A l t h o u g h t h e d e c r e a s e i n e x c r e t i o n r a t e s w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m e a c h o t h e r , t h e y were c o n s i s t e n t w i t h r e s u l t s o b t a i n e d b y W r i g h t a n d Wood , ( 1 9 8 5 ) . 109 I n t h e i r s t u d y , t h e y c o r r e l a t e d t h e d e c l i n e i n w a t e r Tamm e x c r e t i o n r a t e s t o t h e r i s e i n t h e e x t e r n a l Tamm i n t h e c l o s e d s y s t e m o v e r t i m e . i i ) A l k a l i n e S o f t W a t e r E x p o s u r e ( A S W ) : When t h e s y s t e m was f i l l e d w i t h pH 1 0 . l w a t e r a n d r e c i r c u l a t e d , w a t e r Tamm l e v e l s d i d n o t r i s e a s b e f o r e a n d w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e 0 h o u r c o n t r o l ASW v a l u e s i n d i c a t i n g t h a t a n i n h i b i t i o n o f ammonia e x c r e t i o n t o t h e w a t e r o c c u r r e d ( F i g . 3 0 ) . T h i s was a l s o e v i d e n t i n t h e w a t e r Tamm e x c r e t i o n r a t e c a l c u l a t i o n w h e r e , a l t h o u g h d e t e r m i n e d t o b e n o t s i g n i f i c a n t , e x c r e t i o n r a t e s d e c r e a s e d f r o m 130 u m o l k g - 1 h r - 1 i n t h e c o n t r o l w a t e r t o 20 u m o l k g " 1 hr"" 1 i n ASW ( F i g . 3 3 ) . W a t e r Tamm e x c r e t i o n r a t e s d u r i n g ASW e x p o s u r e d e c r e a s e d w i t h t i m e t o a l m o s t 0 u m o l k g - 1 h r - 1 . T h i s d e c r e a s e i n e x c r e t i o n r a t e was s i m i l a r t o w h a t h a d o c c u r r e d i n t h e CW, b u t a t a s m a l l e r s c a l e . A s t h e w a t e r pH was i n c r e a s e d ( 6 . 8 t o 1 0 . 1 ) s o d i d t h e r a t i o o f N H 3 / N H 4 + . T h e w a t e r pH was w e l l a b o v e t h e pK o f t h e N H 3 / N H 4 + r e a c t i o n c a u s i n g t h e m a j o r i t y o f t h e Tamm t o be i n t h e u n i o n i z e d N H 3 f o r m . A s s e e n f r o m F i g u r e 3 1 , w a t e r N H 3 l e v e l s r o s e s i g n i f i c a n t l y f r o m t h e c o n t r o l 0 h o u r ASW a n d t h e t h r e e h o u r CW. W a t e r N H 4 + l e v e l s d e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y f r o m t h e t h r e e h o u r c o n t r o l w a t e r e x p o s u r e a n d d i d n o t a p p e a r t o 110 i n c r e a s e ( F i g . 3 1 ) . T h i s i n d i c a t e d a d e f i n i t e d e c r e a s e i n Tamm e x c r e t i o n f r o m t h e CW. i i i ) A l k a l i n e H a r d W a t e r E x p o s u r e (AHW): W a t e r Tamm l e v e l s r e a c h e d h i g h e r l e v e l s (>20 u m o l l - 1 ) d u r i n g e x p o s u r e t o h a r d a l k a l i n e w a t e r t h a n d u r i n g ASW b u t t h e s e i n c r e a s e s w e r e d e t e r m i n e d t o b e n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t ( F i g . 3 0 ) . W a t e r Tamm a p p e a r e d t o i n c r e a s e w i t h e a c h h o u r o f e x p o s u r e h o w e v e r , t h e s e i n c r e a s e s w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r t h a n t h e 0 h o u r AHW c o n t r o l v a l u e . W a t e r N H 3 l e v e l s i n c r e a s e d o v e r t h e l e v e l s r e a c h e d i n t h e ASW g r o u p ( F i g . 3 1 ) . T h e s e l e v e l s w e r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e 0 h o u r AHW d u r i n g t h e t h i r d h o u r o f e x p o s u r e . W a t e r N H 4 + l e v e l s a l s o i n c r e a s e d a b o v e t h e l e v e l s r e a c h e d i n t h e ASW h o w e v e r , n o t s i g n i f i c a n t l y ( F i g . 3 2 ) . T h e s e r e s u l t s s eemed t o i n d i c a t e a d e c r e a s e i n t h e i n h i b i t i o n o f Tamm e x c r e t i o n d u r i n g AHW c o m p a r e d t o t h e l e v e l s r e a c h e d d u r i n g ASW. i v ) A l k a l i n e H a r d W a t e r + A m i l o r i d e E x p o s u r e (AHWA): When t h e f i s h w e r e e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d w a t e r a n d a m i l o r i d e , Tamm l e v e l s w e r e l o w ( 9 . 2 u m o l l " 1 ) a n d d i d n o t i n c r e a s e w i t h t i m e ( F i g . 3 0 ) . T h e e x c r e t i o n o f ammonia was d e c r e a s e d t o r a t e s s i m i l a r t o t h e ASW e x p o s u r e , i n w h i c h I l l e x c r e t i o n i s known t o be i n h i b i t e d ( F i g . 3 3 ) . T h e d e c r e a s e i n w a t e r Tamm was e v i d e n t i n t h e w a t e r N H 3 a n d N H 4 + l e v e l s a s t h e y w e r e s t a b i l i z e d n e a r 0 h o u r AHWA c o n t r o l v a l u e s o v e r t h e t h r e e h o u r e x p o s u r e p e r i o d ( F i g . 31 & 3 2 ) . D i s c u s s i o n : C a m e r o n a n d H e i s l e r ( 1 9 8 3 ) , showed t h a t u p o n t h e e x p o s u r e t o e l e v a t e d pH ( 8 . 0 0 ) a n d e x t e r n a l ammonia ( 0 . 8 5 mM), a r a p i d b l o o d a l k a l o s i s o c c u r r e d . A l s o , i n t h e a c u t e e x p o s u r e s t u d y b y W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) , r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l k a l i n e c o n d i t i o n s o f 9 . 5 4 e x p e r i e n c e d a b l o o d a l k a l o s i s (+0 .3 pH u n i t s ) o f r e s p i r a t o r y o r i g i n . I t was r e p o r t e d t h a t i n t h a t s t u d y , P a C 0 2 d e c r e a s e d b y 50 % a n d [ H C 0 3 ~ ] p 2 r e m a i n e d u n c h a n g e d b e c a u s e a t a h i g h p H , w a t e r a c t s a s a v a c u u m f o r C 0 2 . T h e r e s u l t s o f t h e p r e s e n t s t u d y a g r e e w i t h t h e w o r k d o n e b y C a m e r o n a n d H e i s l e r ( 1 9 8 3 ) , a n d W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) . When e x p o s e d t o t h e ASW, t h e t r o u t i n t h e p r e s e n t s t u d y e x p e r i e n c e d a m a j o r b l o o d a l k a l o s i s v i a a d e c r e a s e i n p l a s m a P c o 2 . P l a s m a [ H C 0 3 ~ ] i n c r e a s e d , b u t t h i s i n c r e a s e was n o t s i g n i f i c a n t i n n a t u r e . When t h e f i s h w e r e n e x t e x p o s e d t o t h e AHW, t h e same r e s p o n s e o c c u r r e d b u t i t was l a r g e r d u e t o t h e i n c r e a s e d b u f f e r i n g c a p a c i t y o f t h e w a t e r . L i n a n d R a n d a l l ( 1 9 9 0 ) , r e p o r t e d t h a t i n h i g h pH w a t e r a d e c r e a s e i n p l a s m a P C 0 2 i s t o b e e x p e c t e d . T h i s i s b e c a u s e a t h i g h w a t e r p H , t h e r e i s a d e c r e a s e i n t h e P c o 2 o f t h e i n s p i r e d w a t e r ( L i n a n d R a n d a l l , 1 9 9 0 ) . 113 I n t h e p r e v i o u s c h r o n i c e x p o s u r e s t u d y , p l a s m a [ H C 0 3 ~ ] was shown t o d e c r e a s e . T h e s e d e c r e a s e s , h o w e v e r , o c c u r r e d a f t e r 48 h o u r s o f e x p o s u r e . A t 24 h o u r s , p l a s m a [ H C 0 3 ~ ] r e m a i n e d u n c h a n g e d . C o n s e q u e n t l y , t h e two s t u d i e s a g r e e t h a t u p o n e x p o s u r e t o a l k a l i n e w a t e r , r a i n b o w t r o u t e x p e r i e n c e a n i m m e d i a t e b l o o d a l k a l o s i s o f r e s p i r a t o r y o r i g i n a n d p l a s m a [ H C 0 3 ~ ] a t 1 , 2 , 3 , a n d 24 h r e m a i n s u n c h a n g e d . T h e c h r o n i c s t u d y showed t h a t b e y o n d 48 h o u r s , [ H C 0 3 ~ ] p ^ d e c r e a s e d i n a n a t t e m p t t o o f f s e t t h e d e c r e a s e i n p l a s m a P C Q 2 ' W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) , showed t h a t w i t h h i g h pH e x p o s u r e t h e [ N a + ] p 1 i n f l u x d e c r e a s e d i n r a i n b o w t r o u t b y 55 %, w h i c h p r o d u c e d a n e t e f f l u x o f [ N a + ] p i . I n t h e p r e s e n t s t u d y , [ N a + ] p 1 d e c r e a s e d ( t o 135 mmol l - 1 ) u p o n e x p o s u r e t o ASW, b u t s t a b i l i z e d a t 138 mmol 1 _ 1 d u r i n g t h e AHW e x p o s u r e . T h e s e c h a n g e s w e r e s t a t i s t i c a l l y n o t s i g n i f i c a n t . A s d i s c u s s e d i n t h e p r e v i o u s , c h r o n i c e x p o s u r e s t u d y , t h e s e c h a n g e s i n p l a s m a i o n c o n c e n t r a t i o n may be c o r r e l a t e d t o t h e amount o f C a + 2 i n t h e e n v i r o n m e n t a l w a t e r . T h e d e c r e a s e i n [ N a + ] p 1 d u r i n g t h e ASW e x p o s u r e a n d t h e s u b s e q u e n t i n c r e a s e o f [ N a + ] p 1 d u r i n g AHW e x p o s u r e may a l s o b e i n d i c a t i v e o f t h e r e a c t i v a t i o n o f N a + / N H 4 + e x c h a n g e i n t h e AHW. See b e l o w . 114 I n t h i s s t u d y a n d i n o t h e r s ( C a m e r o n a n d H e i s l e r , 1 9 8 3 ) , NaOH ( 0 . 2 M) was u s e d t o a l k a l i n i z e t h e e x p e r i m e n t a l w a t e r . T h e a d d i t i o n o f NaOH d i d n o t h a v e a n y m a r k e d e f f e c t o n [ N a + ] p ^ . T h i s c a n b e s e e n i n F i g u r e 2 8 , a s [ N a + ] p 1 a c t u a l l y d e c r e a s e w i t h t h e i n t r o d u c t i o n o f t h e N a O H . One d r a w b a c k t h a t o c c u r r e d w i t h t h e u s e o f 0 . 2 M NaOH was t h a t N a + f l u x r a t e s c o u l d n o t be m o n i t o r e d d u e t o t h e i n c r e a s e i n w a t e r [ N a + ] f r o m t h e a d d i t i o n o f t h e N a O H . T h e m o n i t o r i n g o f N a + f l u x r a t e s m i g h t h a v e p r o v i d e d a more c o m p l e t e p i c t u r e o f t h e r e s p o n s e o f r a i n b o w t r o u t t o a l k a l i n e w a t e r . I n t h e c o n t r o l w a t e r e x p o s u r e p e r i o d , p l a s m a T a m m v a l u e s r e m a i n e d c o n s t a n t a n d w a t e r T a m m l e v e l s i n c r e a s e d , i n d i c a t i n g t h a t N H 3 e x c r e t i o n o c c u r r e d . T h e c a l c u l a t e d w a t e r T a m I t l e x c r e t i o n r a t e a l s o s u p p o r t e d t h i s . I n t h e ASW e x p o s u r e p e r i o d , p l a s m a T a m r [ l l e v e l s i n c r e a s e d w h i l e w a t e r T amm l e v e l s w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l v a l u e s , i n d i c a t i v e o f a n i n h i b i t i o n o f N H 3 e x c r e t i o n . T h e N H 3 e x c r e t i o n r a t e d e c r e a s e d b y 75 %, t o a l m o s t 0 u m o l k g " 1 h r " 1 , d u r i n g ASW e x p o s u r e . T h e s e r e s u l t s a g r e e w i t h f i n d i n g s o f t h e few a l k a l i n e e x p o s u r e s t u d i e s i n t h e l i t e r a t u r e . C a m e r o n a n d H e i s l e r ( 1 9 8 3 ) , r e p o r t e d a r a p i d i n c r e a s e i n p l a s m a T a m m w i t h i n 30 m i n u t e s o f t h e e x p o s u r e o f r a i n b o w t r o u t t o h i g h pH ( 9 . 5 4 ) . T h e i n c r e a s e i n p l a s m a T amm w a s a t t r i b u t e d t o a n e t i n w a r d movement o f N H 3 down i t s 115 d i f f u s i v e g r a d i e n t . T h e s t u d y b y W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) , a l s o o b t a i n e d s i m i l a r r e s u l t s t o t h e p r e s e n t s t u d y . W r i g h t a n d Wood ( 1 9 8 5 ) , t h e o r i z e d t h a t a t a h i g h w a t e r p H , p l a s m a T amm l e v e l s i n c r e a s e d d u e t o t h e i n h i b i t i o n o f b o t h N a + / N H 4 + e x c h a n g e a n d N H 3 d i f f u s i o n . L i n a n d R a n d a l l ( 1 9 9 0 ) , r e p o r t e d t h a t p l a s m a T a m m i n c r e a s e d b y 70 % i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o pH 9 . 9 1 w a t e r . I n t h a t s t u d y , i t was d e t e r m i n e d t h a t p l a s m a T a m m i n c r e a s e d b e c a u s e o f t h e i n h i b i t i o n o f N a + / N H 4 + e x c h a n g e a n d t h e i n c r e a s e i n b l o o d p H . T h e e l e v a t e d b l o o d pH i n c r e a s e d t h e b l o o d N H 3 / T a m i n r a t i o w h i c h i n t u r n , f a c i l i t a t e d t h e p a s s i v e d i f f u s i o n o f N H 3 ( L i n a n d R a n d a l l , 1 9 9 0 ) . M c D o n a l d ( 1 9 8 3 ) , d e s c r i b e d t h r e e p o s s i b l e i n h i b i t o r y e f f e c t s o f l o w pH o n N a + i n f l u x . T h e s e i n c l u d e d , t h e H + c o m p e t i t i o n f o r t h e c a r r i e r , H + t i t r a t i o n o f n e g a t i v e c h a r g e s i n c h a n n e l s l e a d i n g t o t h e c a r r i e r , a n d a d i r e c t e f f e c t o n t h e c a r r i e r i t s e l f . I t i s l o g i c a l t h a t , o n l y t h e d i r e c t e f f e c t o f h i g h pH o n t h e c a r r i e r ( N a + / N H 4 + e x c h a n g e ) c o u l d i n h i b i t N a + i n f l u x ( W r i g h t a n d Wood , 1 9 8 5 ) . A c c o r d i n g t o t h e a b o v e s t u d i e s , t h e r e s u l t s o f t h e ASW e x p o s u r e c a n b e a t t r i b u t e d t o a c o m b i n a t i o n o f : t h e i n h i b i t i o n o f N a + / N H 4 + e x c h a n g e ; t h e r e v e r s a l o f t h e N H 3 d i f f u s i o n g r a d i e n t ; a n d t h a t t h e i n t e r n a l p N H 3 ( p N H 3 ^ ) d i d n o t e x c e e d t h e e x t e r n a l p N H 3 ( p N H 3 e ) t o t h e p o i n t w h e r e 116 p a s s i v e d i f f u s i o n o f N H 3 t o t h e e n v i r o n m e n t o c c u r r e d . T h e d e c r e a s e i n [ N a + ] p 1 s e e n w i t h ASW e x p o s u r e a l s o s u p p o r t e d t h e t h e o r y t h a t N a + / N H 4 + e x c h a n g e i s i n h i b i t e d . W i t h i n h i b i t i o n o f t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e , N a + i n f l u x d e c r e a s e d w h i l e N a + l o s s e s v i a t h e b r a n c h i a l e p i t h e l i a c o n t i n u e d , u l t i m a t e l y r e s u l t i n g i n d e c r e a s e d [ N a + ] p j L . When t h e t r o u t w e r e n e x t e x p o s e d t o t h e AHW: p l a s m a T amm l e v e l s s t a b i l i z e d a t a p p r o x i m a t e l y 300 u m o l l - 1 ; w a t e r Tamra l e v e l s i n c r e a s e d a b o v e t h e p r e v i o u s ASW e x p o s u r e , a s d i d w a t e r T a m m e x c r e t i o n ; a n d [ N a + ] p i i n c r e a s e d o v e r t h e p r e v i o u s ASW e x p o s u r e l e v e l s a n d s t a b i l i z e d a t 138 mmol l - 1 . Two p o s s i b l e m e c h a n i s m s may e x p l a i n t h e s e r e s u l t s . F i r s t l y , t h e p N H 3 ^ may h a v e i n c r e a s e d t o l e v e l s w h e r e p N H 3 ^ a c t u a l l y e x c e e d e d p N H 3 e . A s a r e s u l t , N H 3 d i f f u s e d p a s s i v e l y t h r o u g h t h e b r a n c h i a l e p i t h e l i a , p r o d u c i n g t h e o b s e r v e d r e s u l t s . T h i s p a s s i v e d i f f u s i o n w o u l d b e e s s e n t i a l l y a n a l o g o u s t o w h a t o c c u r s a t n e u t r a l p H , t h e o n l y d i f f e r e n c e b e i n g , t h e b l o o d t o w a t e r g r a d i e n t w o u l d b e e s t a b l i s h e d a t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f p N H 3 ^ a n d p N H 3 e . T h e o t h e r p o s s i b l e o c c u r r e n c e t h a t m i g h t h a v e a m e l i o r a t e d p l a s m a T a m i n l e v e l s i n AHW c o u l d b e t h e " r e a c t i v a t i o n " o r i n c r e a s e d a c t i v i t y o f t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e . T h i s e x c h a n g e o f e x t e r n a l N a + f o r p l a s m a N H 4 + c o u l d a c c o u n t f o r t h e s t a b i l i z e d p l a s m a T a m i t l a n d i n c r e a s e s 117 i n w a t e r T a m i n a n d w a t e r T a m m e x c r e t i o n r a t e , t h a t w e r e o b s e r v e d . T h e i n c r e a s e d [ N a + ] p i s e e n i n t h e AHW e x p o s u r e r e l a t i v e t o t h e ASW e x p o s u r e a l s o s u p p o r t s t h e t h e o r y o f N a + / N H 4 + e x c h a n g e a c t i v i t y i n AHW. T h i s o c c u r r e n c e h a s n o t b e e n r e p o r t e d i n a n y s t u d i e s i n t h e c u r r e n t l i t e r a t u r e . T h e f i n a l AHWA e x p o s u r e p e r i o d was i m p l e m e n t e d i n a n a t t e m p t t o u t i l i z e t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f a m i l o r i d e t o o b t a i n i n f o r m a t i o n t h a t w o u l d s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s o f i n c r e a s e d N a + / N H 4 + e x c h a n g e a c t i v i t y i n AHW. Upon a m i l o r i d e a d d i t i o n , [ N a + ] p l r e m a i n e d u n c h a n g e d r e l a t i v e t o [ N a + ] p 1 i n t h e AHW e x p o s u r e . A m i l o r i d e i s a s p e c i f i c N a + t r a n s p o r t i n h i b i t o r , c o n s e q u e n t l y , t h e s e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t N a + i n f l u x was a b o l i s h e d w h i l e n e t N a + f l u x r e m a i n e d c o n s t a n t . T h e c o n s t a n t [ N a + ] p ^ may b e c o r r e l a t e d t o t h e h i g h C a + 2 l e v e l s i n t h e AHW. W i t h t h e i n t r o d u c t i o n o f t h e a m i l o r i d e , p l a s m a T a m i n l e v e l s i n c r e a s e d d r a m a t i c a l l y , w h i l e w a t e r T a m m d e c r e a s e d a n d s t a b i l i z e d i n c o m p a r i s o n t o t h e AHW v a l u e s . T h e s e r e s u l t s a g a i n , s u p p o r t e d t h e t h e o r y t h a t i n AHW e x p o s u r e , t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e i s a c t i v e . T h e o n l y d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e ASW a n d AHW t r e a t m e n t s was t h e i n c r e a s e i n C a C C ^ i n t h e AHW t r e a t m e n t . I t i s t h o u g h t t h a t , a l k a l i n e w a t e r d i r e c t l y a f f e c t s t h e c a t i o n c a r r i e r ( N a + / N H 4 + e x c h a n g e ) i t s e l f ( W r i g h t a n d W o o d , 1 9 8 5 ) . C o n s e q u e n t l y , a n e x p l a n a t i o n f o r t h e " r e a c t i v a t i o n " o f t h e 118 N a + / N H 4 e x c h a n g e c o u l d be t h a t t h e h i g h C a + ^ l e v e l s i n t h e AHW somehow a m e l i o r a t e d t h e e f f e c t s o f t h e a l k a l i n i t y o n t h e c a t i o n e x c h a n g e . A l t h o u g h t h e s e r e s u l t s s u p p o r t e d t h e h y p o t h e s i s o f N a + / N H 4 + e x c h a n g e a c t i v i t y d u r i n g AHW e x p o s u r e , t h e y a r e n o t c o n c l u s i v e . I n f a c t , a s s t a t e d b y R a n d a l l a n d W r i g h t ( 1 9 8 7 ) , w i t h p r e s e n t a n a l y t i c a l t e c h n i q u e s , i t i s i m p o s s i b l e t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e t r a n s f e r o f a m o l e c u l e o f N H 3 p l u s a H + i o n f r o m t h e t r a n s f e r o f a N H 4 + i o n . A l s o , i n t h i s s t u d y , t h e d i f f u s i o n o f N H 4 + t h r o u g h t h e b r a n c h i a l e p i t h e l i a c o u l d n o t b e c o m p l e t e l y i g n o r e d . E v a n s a n d C a m e r o n ( 1 9 8 6 ) , s t a t e d t h a t N H 4 + d i f f u s i o n c a n n o t be r u l e d o u t a s a m e c h a n i s m f o r N H 3 e x c r e t i o n . H o w e v e r , b e c a u s e l i p i d membranes a r e r e l a t i v e l y i m p e r m e a b l e t o c a t i o n s ( t h e t h e o r y o f n o n - i o n i c d i f f u s i o n ) a n d b r a n c h i a l e p i t h e l i a l c e l l s o f r a i n b o w t r o u t a r e j o i n e d b y " t i g h t " j u n c t i o n s c o n s e q u e n t l y , t h e p a s s i v e N H 4 + f l u x was c o n s i d e r e d a s o f no q u a n t i t a t i v e i m p o r t a n c e . T h e i n t e r e s t i n g r e s u l t s o f t h i s a c u t e e x p o s u r e s t u d y w a r r a n t f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n i n t o t h e e x a c t m e c h a n i s m o f t h e a p p a r e n t ammonia e x c r e t i o n i n AHW. 119 O X 24.0-J 2 2 . 0 -2 0 . 0 -1 8 . 0 -1 6 . 0 -1 4 . 0 -12.0 I I I I I i c1 c2 c 3 a l l a l2 a l3 ca1 c a 2 c a 3 a m i a m 2 a m 3 Time (hours) F i g u r e 2 1 : M e a n s + / - 1 S . E . o f h e m a t o c r i t i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e . N u m b e r s o n Y -a x i s d e n o t e s a m p l i n g t i m e s . N = 9 . 120 8 . 4 0 n 8 . 3 0 -8 . 2 0 -x ° - 8 . 1 0 £ g 8 . 0 0 - j 7 . 9 0 7 . 8 0 7 . 7 0 i * * i 1 * i • • i • • i • • i • • i • * i • • i • • i — i c1 c 2 c 3 a l l a l2 a l3 ca1 c a 2 c a 3 a m i a m 2 a m 3 Time (hours) F i g u r e 2 2 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a pH i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e . Numbers o n Y -a x i s d e n o t e s a m p l i n g t i m e s . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a v e r a g e c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . N = 9 . 121 4.00 3 . 5 0 -p 3 . 0 0 -o - 2 .50 CM O o 2 . 0 0 -1.50-1.00-0.50 0.00 i • • i • • i • • i * • i * i * i * i * i i i i — i c1 c 2 c 3 a l l a l2 a l3 ca1 c a 2 c a 3 a m i a m 2 a m 3 Time (hours) F i g u r e 2 3 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a p C 0 2 i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e . Numbers on Y -a x i s d e n o t e s a m p l i n g t i m e s . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a v e r a g e c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . N = 9 . 122 O E E O O o E CO _D CL 10.5 10.0 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 i • • i * 1 i *—• i • • i • • i • • i • • i • • i • i i c1 c 2 c 3 a l l a l2 a l3 ca1 c a 2 c a 3 a m i a m 2 a m 3 Time (hours) F i g u r e 24: M e a n s + / - 1 S . E . o f p l a s m a [ H C 0 3 ~ ] i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e . Numbers o n Y - a x i s d e n o t e s a m p l i n g t i m e s . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a v e r a g e c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . N = 9 . 123 O E E E D h-D E CO D 500 -J 4 5 0 -4 0 0 -3 5 0 -300 250 200 150 100 50 0 i • • i * 1 i * • i 1 ' i ' • i • * i • • i • • i * • i i i — i c1 c 2 c 3 a l l a l2 a l3 ca1 c a 2 c a 3 a m i a m 2 a m 3 Time (hours) F i g u r e 2 5 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a T ^ m m i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e . Numbers o n Y -a x i s d e n o t e s a m p l i n g t i m e s . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a v e r a g e c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . N = 9 . 124 O D_ D E CO D_ 2 2 5 1 200 175H 150 125 H 100 7 5 50 25 0 i i i i i i i i i i i i * c1 c 2 c 3 a l l a l2 a l3 ca1 c a 2 c a 3 a m i a m 2 a m 3 Time (hours) F i g u r e 2 6 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a p N H 3 i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e . Numbers o n Y -a x i s d e n o t e s a m p l i n g t i m e s . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a v e r a g e c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . N = 9 . 125 O E •3 + o E CO a Q. 500 -I 4 5 0 -400 350 300 2 5 0 -2 0 0 -1 5 0 -1 0 0 -5 0 -0 c l c 2 c 3 a l l a l2 a l3 c a l c a 2 c a 3 a m i a m 2 a m 3 Time (hours) F i g u r e 2 7 : M e a n s + / - 1 S . E . o f p l a s m a [ N H 4 + ] i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e . Numbers o n Y - a x i s d e n o t e s a m p l i n g t i m e s . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a v e r a g e c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . N = 9 . 126 O E E + o z : i i D £ CO _D CL 1 4 5 . 0 n 142.5 140.0 137.5 135.0 132.5 130.0 i 1 1 * * i * * i * * i 1 1 ' * i * * i i i c1 c 2 c 3 a l l a l2 a l3 ca1 c a 2 c a 3 a m i a m 2 a m 3 Time (hours) F i g u r e 2 8 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a N a + c o n c e n t r a t i o n s i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e . Numbers o n Y - a x i s d e n o t e s a m p l i n g t i m e s . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a v e r a g e c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . N = 9 . 127 1 3 2 . 5 n ^ 1 3 0 . 0 -"o £ J , 1 2 7 . 5 -i — i ' - , 1 2 5 . 0 -D E CO E 1 2 2 . 5 -120.0 -I— i i i i i i i i * i i * c1 c2 c 3 a l l a l2 a l3 ca1 c a 2 c a 3 a m i a m 2 a m 3 Time (hours) F i g u r e 2 9 : Means + / - 1 S . E . o f p l a s m a C l ~ c o n c e n t r a t i o n s i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e . Numbers o n Y - a x i s d e n o t e s a m p l i n g t i m e s . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a v e r a g e c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . N = 9 . 128 O E E E o ( — CO - M O 60.0-1 5 0 . 0 -4 0 . 0 -30 .0 2 0 . 0 -1 0 . 0 -0.0 c0 c1 c2 c 3 alO a l l a l 2 a l 3 c a 0 c a 1 ca2ca3A0A1 A2 A3 Time (hours) F i g u r e 30 : Means + / - 1 S . E . o f w a t e r T a m m i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( A ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e . Numbers o n Y - a x i s d e n o t e s a m p l i n g t i m e s . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m ( c ) c o n t r o l v a l u e a t p = 0 . 0 5 . N = 9 . o I— 350 .0 3 0 0 . 0 -2 5 0 . 0 -200 .0 oT 1 5 0 . 0 -o 1 0 0 . 0 -5 0 . 0 -0.0 a a cO d c 2 c 3 a l 0 a l 1 a l 2 a l 3 c a 0 c a 1 c a 2 c a 3 A 0 A1 A2 A3 Time (hours) F i g u r e 3 1 : M e a n s + / - 1 S . E . o f w a t e r p N H 3 i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( A ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e . Numbers o n Y - a x i s d e n o t e s a m p l i n g t i m e s . a d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m ( a l ) c o n t r o l v a l u e a t p = 0 . 0 5 . b d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m ( c a ) c o n t r o l v a l u e a t p = 0 . 0 5 . N = 9 . 130 O E + X CD -t-J O 60.0 50 .0 40 .0 H 30 .0 20 .0 10.0 4 0.0 c 0 d c 2 c 3 a l 0 a l 1 a l 2 a l 3 c a 0 c a 1 c a 2 c a 3 A 0 A1 A2 A3 Time (hours) F i g u r e 3 2 : Means + / - 1 S . E . o f w a t e r [ N H 4 + ] i n r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( A ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e . Numbers o n Y - a x i s d e n o t e s a m p l i n g t i m e s . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m ( c ) c o n t r o l v a l u e a t p = 0 . 0 5 . N = 9 . 131 C O o E E E a I— L-CD -t-> O 160.0 140.0 4 120.0 100.0 80 .0 4 60.0 40 .0 20 .0 0.0 - 2 0 . 0 r - g - i r*i rh ~r T " T - - r — i 1 1 1 1 1 r -c1 c 2 c 3 a l l a l2 a l3 ca1 c a 2 c a 3 a m i a m 2 a m 3 Time (hours) F i g u r e 3 3 : M e a n s + / - 1 S . E . o f w a t e r T a m m e x c r e t i o n r a t e s o f r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o c o n t r o l w a t e r ( c ) , a l k a l i n e s o f t w a t e r ( a l ) , a l k a l i n e h a r d w a t e r ( c a ) , a n d a l k a l i n e h a r d w a t e r p l u s a m i l o r i d e ( a m ) , a s a f u n c t i o n o f t i m e . Numbers o n Y - a x i s d e n o t e s a m p l i n g t i m e s . * d e n o t e s s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e f r o m a v e r a g e c o n t r o l a t p = 0 . 0 5 . N = 9 . 132 C h a p t e r 2 G e n e r a l C o n c l u s i o n s a n d R e c o m m e n d a t i o n s I n t h e c h r o n i c e x p o s u r e s t u d y , r a i n b o w t r o u t e x p e r i e n c e d l e s s m o r t a l i t y when e x p o s e d t o a l k a l i n e h a r d w a t e r t h a n when e x p o s e d t o a l k a l i n e s o f t w a t e r . T h e i n c r e a s e d m o r t a l i t y o f t h e r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o t h e a l k a l i n e s o f t w a t e r was l i k e l y i n p a r t d u e t o t h e i n a b i l i t y t o r e g u l a t e a c i d - b a s e a n d p l a s m a i o n b a l a n c e a n d p l a s m a T a m m a c c u m u l a t i o n d u r i n g t h e a l k a l i n e s o f t w a t e r e x p o s u r e . T h e r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o t h e a l k a l i n e h a r d w a t e r w e r e more e f f e c t i v e i n r e g u l a t i n g t h e p h y s i o l o g i c a l b l o o d p a r a m e t e r s d e s c r i b e d a b o v e . T h e a c u t e e x p o s u r e s t u d y i n v e s t i g a t e d p o s s i b l e m e c h a n i s m s t h a t a l l o w e d t h e r a i n b o w t r o u t i n a l k a l i n e h a r d w a t e r t o r e g u l a t e b l o o d ammonia l e v e l s more e f f e c t i v e l y . T h e r e s u l t s o f t h i s s t u d y i n d i c a t e d t h a t i n a l k a l i n e h a r d w a t e r , r a i n b o w t r o u t a r e a b l e t o e x c r e t e ammonia t h r o u g h t h e " r e a c t i v a t i o n " o f t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e . T h e f i s h e r i e s management i m p l i c a t i o n o f t h e s e two s t u d i e s was t h a t i f N a + / N H 4 + e x c h a n g e i s i n d e e d a c t i v e i n a l k a l i n e h a r d w a t e r , r a i n b o w t r o u t d e s t i n e d f o r a l k a l i n e l a k e s s h o u l d b e a c c l i m a t e d t o n o t o n l y h i g h p H , b u t a l s o h i g h C a C 0 3 l e v e l s . T h i s w o u l d e n a b l e t h e f i s h t o e x c r e t e 133 some o f t h e ammonia l o a d b u i l t u p , ( f r o m t h e i n h i b i t i o n o f p a s s i v e N H 3 d i f f u s i o n ) v i a t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e . F u t u r e s t u d i e s i n t h i s v e r y i n t e r e s t i n g a r e a o f f i s h p h y s i o l o g y w i l l h a v e t o f o c u s o n p i n p o i n t i n g , w i t h o u t a d o u b t , t h e e x a c t m e c h a n i s m t h a t e n a b l e s r a i n b o w t r o u t t o r e g u l a t e p l a s m a ammonia l e v e l s i n a l k a l i n e h a r d w a t e r a n d n o t i n a l k a l i n e s o f t w a t e r . A n o t h e r i n t e r e s t i n g t o p i c t h a t a r o s e d u r i n g t h e s e s t u d i e s was t h e e f f e c t o f C a + 2 o n t h e g i l l e p i t h e l i a d u r i n g a l k a l i n e h a r d w a t e r e x p o s u r e . P e r h a p s , t h e s t u d y o f t h e e f f e c t s o f h i g h C a + 2 l e v e l s o n t h e g i l l m i c r o - e n v i r o n m e n t d u r i n g a l k a l i n e e x p o s u r e w i l l l e a d t o a n e x p l a n a t i o n o f how r a i n b o w t r o u t r e g u l a t e p l a s m a ammonia l e v e l s i n a l k a l i n e h a r d w a t e r . 134 R E F E R E N C E S A u d e t , C . a n d C M . Wood . 1 9 8 8 . Do r a i n b o w t r o u t (Salmo gairdneri) a c c l i m a t e t o l o w pH? C a n . J . F i s h . A q u a t . S c i . 4 5 : 1 3 9 9 - 1 4 0 5 . A v e l l a , M . a n d , M . B o r n a n c i n . 1 9 8 9 . A new a n a l y s i s o f ammonia a n d s o d i u m t r a n s p o r t t h r o u g h t h e g i l l s o f t h e f r e s h w a t e r r a i n b o w t r o u t (Salmo gairdneri). J . E x p . B i o l . 1 4 2 : 1 5 5 - 1 7 5 . C o w e y , C . B . , a n d J . R . S a r g e n t . 1 9 7 5 . N u t r i t i o n , I n : F i s h P h y s i o l o g y : B i o e n e r g e t i c s a n d G r o w t h . H o a r , W . S . , D . J . R a n d a l l , a n d J . R . B r e t t ( e d s . ) . A c a d e m i c P r e s s . S a n F r a n c i s c o . B . C . M i n i s t r y o f E n v i r o n m e n t . 1 9 6 7 - p r e s e n t . B . C . l a k e s s t o c k i n g r e c o r d s . W i l l i a m s L a k e , B r i t i s h C o l u m b i a . B a r t o n , B . A . 1 9 8 8 . E n d o c r i n e a n d m e t a b o l i c r e s p o n s e s o f f i s h t o s t r e s s . I n : I n t e r n a t i o n a l A s s o c i a t i o n o f A q u a t i c A n i m a l M e d i c i n e P r o c e e d i n g s . 1 9 : 4 1 - 5 5 . B r a d l e y , R . W . , a n d J . B . S p r a g u e . 1 9 8 5 . T h e i n f l u e n c e o f p H , w a t e r h a r d n e s s , a n d a l k a l i n i t y o n t h e a c u t e l e t h a l i t y o f z i n c t o r a i n b o w t r o u t (Salmo gairdneri). C a n . J . F i s h . A q u a t . S c i . 4 2 : 7 3 1 - 7 3 6 . C a m e r o n , J . N . 1 9 8 6 . R e s p o n s e s t o r e v e r s e d N H 3 a n d N H 4 + g r a d i e n t s i n a t e l e o s t (Ictalurus punctatus), a n 135 e l a s m o b r a n c h (Raja erinacea), a n d a c r u s t a c e a n (Callinectes sapidus): E v i d e n c e f o r N a + / N H 4 + e x c h a n g e i n t h e t e l e o s t a n d e l a s m o b r a n c h . J . E x p . Z o o l . 2 3 9 : 1 8 3 - 1 9 5 . C a m e r o n , J . N . a n d , N . H e i s l e r . 1 9 8 3 . S t u d i e s o f ammonia i n t h e r a i n b o w t r o u t : p h y s i c o - c h e m i c a l p a r a m e t e r s , a c i d -b a s e b e h a v i o u r a n d r e s p i r a t o r y c l e a r a n c e . J . E x p . B i o l . 1 0 5 : 1 0 7 - 1 2 5 . C a m e r o n , J . N . . 1 9 7 8 . R e g u l a t i o n o f b l o o d pH i n t e l e o s t f i s h . R e s p i r . P h y s i o l . 3 3 : 1 2 9 - 1 4 4 . C . B . E . S t y l e M a n u a l . 1 9 8 3 . F i f t h E d i t i o n . C o u n c i l o f B i o l o g y E d i t o r s , I n c . B e t h e s d a M a r y l a n d . C l a i b o r n e , J . B . , D . H . E v a n s , a n d L . G o l d s t e i n . 1 9 8 2 . F i s h b r a n c h i a l N a + / N H 4 + e x c h a n g e i s v i a b a s o l a t e r a l N a + - K + -a c t i v a t e d A T P a s e . J . E x p . B i o l . 9 6 : 4 3 1 - 4 3 4 . E d d y , B . F . 1 9 8 1 . E f f e c t s o f s t r e s s o n o s m o t i c a n d i o n i c r e g u l a t i o n i n f i s h . I n , S t r e s s a n d F i s h . A . D . P i c k e r i n g e d . A c a d e m i c P r e s s , L o n d o n , U . K . p p . 7 7 - 1 0 2 . E v a n s , D . H . 1 9 7 7 . F u r t h e r e v i d e n c e f o r N a + / N H 4 + e x c h a n g e i n m a r i n e t e l e o s t f i s h . J . E x p . B i o l . 7 0 : 2 1 3 - 2 2 0 . E v a n s , D . H . a n d J . N . H e i s l e r . ( 1 9 8 6 ) . G i l l ammonia t r a n s p o r t . J . E x p . Z o o l . 2 3 9 : 1 7 - 2 3 . 136 E v a n s , D . H . a n d K . J . M o r e . 1 9 8 8 . Modes o f ammonia t r a n s p o r t a c r o s s t h e g i l l e p i t h e l i u m o f t h e d o g f i s h p u p (Squalus acanthius). J . E x p . B i o l . 1 3 8 : 3 7 5 - 3 9 7 . E v a n s , D . H . , K . J . M o r e , a n d S . L . R o b b i n s . 1 9 8 9 . Modes o f ammonia t r a n s p o r t a c r o s s t h e g i l l e p i t h e l i u m o f t h e m a r i n e t e l e o s t f i s h Opsanus beta. J . E x p . B i o l . 1 4 4 : 3 3 9 - 3 5 6 . G a l a t , D . L . , G . P o s t , T . J . K e e f e a n d G . R . B o u c k s . 1 9 8 5 . H i s t o l o g i c a l c h a n g e s i n t h e g i l l , k i d n e y a n d l i v e r o f L a h o n t a n c u t t h r o a t t r o u t , Salmo clarkii henshawi, l i v i n g i n l a k e s o f d i f f e r e n t s a l i n i t y - a l k a l i n i t y . J . F i s h B i o l . 2 7 : 5 3 3 - 5 5 2 . H e i s l e r , N . 1 9 8 6 . M e c h a n i s m s a n d l i m i t a t i o n s o f f i s h a c i d -b a s e r e g u l a t i o n , i n F i s h P h y s i o l o g y : R e c e n t A d v a n c e s . E d i t e d b y S t e f a n N i l s s o n a n d S u s a n n e H o l m g r e n . C r o o m H e l d L t d . H e m i n g , T . A . , a n d K . A . B l u m h a g e n . 1 9 8 8 . P l a s m a a c i d - b a s e a n d e l e c t r o l y t e s t a t e s o f r a i n b o w t r o u t e x p o s e d t o a l u m ( a l u m i n u m s u l p h a t e ) i n a c i d i c a n d a l k a l i n e e n v i r o n m e n t s . A q u a t . T o x i c o l . 1 2 : 1 2 5 - 1 4 0 . H i l l a b y , B . A . a n d , D . J . R a n d a l l . 1 9 7 9 . A c u t e ammonia t o x i c i t y a n d ammonia e x c r e t i o n i n r a i n b o w t r o u t (Salmo gairdneri). J . F i s h . R e s . B o a r d C a n . 3 6 : 6 2 1 - 6 2 9 . 137 H u g g i n s , A . K . , G . S k u t c h a n d E . B a l d w i n . 1 9 6 9 . O r n i t h i n e -u r e a c y c l e , e n z y m e s i n t e l e o s t e a n f i s h . Comp. B i o c h e m . P h y s i o l . 2 8 : 5 8 7 - 6 0 2 . J o h a n s e n , K . , G . M . O . M a l o i y a n d , G . L y k k e b o e . 1 9 7 5 . A f i s h i n e x t r e m e a l k a l i n i t y . R e s p i r . P h y s i o l . 2 4 : 1 5 9 - 1 6 2 . K e t o l a , G . H . , D . L o n g a c r e , A . G r u e l i c h , L . P h e t t e r p l a c e a n d , R . L a s h o m b . 1 9 8 8 . H i g h c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n i n w a t e r i n c r e a s e s m o r t a l i t y o f s a l m o n a n d t r o u t e g g s . P r o g . F i s h - C u l t . V o l . 5 0 , N o . 3 . p p . 1 2 9 - 1 3 5 . K u c e r a , P . A . , D . L . K o c h a n d , G . F . M a r c o . 1 9 8 5 . I n t r o d u c t i o n s o f L a h o n t a n c u t t h r o a t t r o u t i n t o Omak l a k e , W a s h i n g t o n . N o r t h A m e r i c a n J o u r n a l o f F i s h e r i e s M a n a g e m e n t . 5 : 2 9 6 -3 0 1 . L a u r e n , D . J . , a n d D . G . M c D o n a l d . 1 9 8 6 . I n f l u e n c e o f w a t e r h a r d n e s s , p H , a n d a l k a l i n i t y o n t h e m e c h a n i s m s o f c o p p e r t o x i c i t y i n j u v e n i l e r a i n b o w t r o u t , Salmo gairdneri. C a n . J . F i s h . A q u a t . S c i . 4 3 : 1 4 8 8 - 1 4 9 6 . L i n , H . a n d , D . J . R a n d a l l . 1 9 9 0 . T h e e f f e c t o f v a r y i n g w a t e r pH o n t h e a c i d i f i c a t i o n o f e x p i r e d w a t e r i n r a i n b o w t r o u t . J . E x p . B i o l . M a z e a u d , M . M . , F . M a z e a u d , a n d E . M . D o n a l d s o n . 1 9 7 7 . P r i m a r y a n d s e c o n d a r y e f f e c t s o f s t r e s s i n f i s h : some new d a t a w i t h a g e n e r a l r e v i e w . T r a n s . Am. F i s h . S o c . 1 0 6 : 2 0 1 - 2 1 2 . 138 M c D o n a l d , D . G . 1 9 8 3 . T h e e f f e c t s o f H + u p o n t h e g i l l s o f f r e s h w a t e r f i s h . C a n . J . Z o o l . 6 1 : 6 9 1 - 7 0 3 . M c D o n a l d , D . G . 1 9 8 3 . T h e i n t e r a c t i o n o f e n v i r o n m e n t a l c a l c i u m a n d l o w pH o n t h e p h y s i o l o g y o f t h e r a i n b o w t r o u t , Salmo gairdneri. J . E x p . B i o l . 1 0 2 : 1 2 3 - 1 4 0 M c D o n a l d , D . G . , H . Hobe a n d , C M . Wood. 1 9 8 0 . T h e i n f l u e n c e o f c a l c i u m o n t h e p h y s i o l o g i c a l r e s p o n s e s o f t h e r a i n b o w t r o u t , Salmo gairdneri, t o l o w e n v i r o n m e n t a l p H . J . E x p . B i o l . 8 8 : 1 0 9 - 1 3 1 . M c W i l l i a m s , P . G . 1 9 8 2 . T h e e f f e c t s o f c a l c i u m o n s o d i u m f l u x e s i n t h e b r o w n t r o u t , Salmo trutta, i n n e u t r a l a n d a c i d w a t e r . J . E x p . B i o l . 9 6 : 4 3 9 — 4 4 2 . M i l l i g a n , C L . , a n d C M . Wood . 1 9 8 2 . D i s t u r b a n c e s i n h a e m a t o l o g y , f l u i d v o l u m e d i s t r i b u t i o n a n d c i r c u l a t o r y f u n c t i o n a s s o c i a t e d w i t h l o w e n v i r o n m e n t a l pH i n t h e r a i n b o w t r o u t , Salmo gairdneri. J . E x p . B i o l . 9 9 : 3 9 7 -4 1 5 . M u r r a y , C A . a n d C D . Z i e b e l l . 1 9 8 4 . A c c l i m a t i o n o f r a i n b o w t r o u t t o h i g h pH t o p r e v e n t s t o c k i n g m o r t a l i t y i n summer. T r a n s . Am. F i s h . S o c . p p . 1 7 6 - 1 7 9 . M u r r a y , C . A . a n d C D . Z i e b e l l . 1 9 8 4 . A c c l i m a t i o n o f r a i n b o w t r o u t t o h i g h pH t o p r e v e n t s t o c k i n g m o r t a l i t y i n summer . P r o g . F i s h - C u l t . V o l . 4 6 , N o . 3 p p . 1 7 6 - 1 7 9 . 139 O l s o n , K . R . a n d P . O . Fromm. 1 9 7 1 . E x c r e t i o n o f u r e a b y two t e l e o s t s e x p o s e d t o d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f a m b i e n t a m m o n i a . Comp. B i o c h e m . P h y s i o l . 4 0 A : 9 9 9 - 1 0 0 7 . O t t , L . 1 9 8 4 . A n i n t r o d u c t i o n t o s t a t i s t i c a l m e t h o d s a n d d a t a a n a l y s i s . PWS P u b l i s h e r s . B o s t o n . M a s s . P a y a n , P . 1 9 7 8 . A s t u d y o f t h e N a + / N H 4 + e x c h a n g e a c r o s s t h e -g i l l o f t h e p e r f u s e d h e a d o f t h e t r o u t (Salmo gairdneri). J . Comp. P h y s i o l . 1 2 4 : 1 8 1 - 1 8 8 . P e t e r s o n , R . H . , K . C o o m b s , J . P o w e r , a n d U . P a i m . 1 9 8 9 . R e s p o n s e s o f s e v e r a l f i s h s p e c i e s t o pH g r a d i e n t s . C a n . J . Z o o l . 6 7 : 1 5 6 6 - 1 5 7 2 . P l a y l e , R . C . , G . G . R o s s a n d , C M . Wood . 1 9 8 9 . P h y s i o l o g i c a l d i s t u r b a n c e s i n r a i n b o w t r o u t (Salmo gairdneri) d u r i n g a c i d a n d a l u m i n u m e x p o s u r e s i n s o f t w a t e r o f two c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n s . C a n . J . Z o o l . 6 7 : 3 1 4 - 3 2 4 . R a n d a l l , D . J . a n d , P . A . W r i g h t . 1 9 8 7 . Ammonia d i s t r i b u t i o n a n d e x c r e t i o n i n f i s h . F i s h P h y s i o l . B i o c h e m . V o l . 3 : 1 0 7 - 1 2 0 . R a n d a l l , D . J . a n d , P . A . W r i g h t . 1 9 8 9 . T h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n c a r b o n d i o x i d e a n d ammonia e x c r e t i o n a n d w a t e r pH i n f i s h . C a n . J . Z o o l . ( I n p r e s s ) . R a n d a l l , D . J . , C M . Wood , T . P . Mommsen, S . F P e r r y , H . B e r g m a n , G . M . O . M a l o i y a n d , P . A . W r i g h t . 1 9 8 9 . U r e a 140 e x c r e t i o n a s a s t r a t e g y f o r s u r v i v a l i n a f i s h l i v i n g i n a v e r y a l k a l i n e e n v i r o n m e n t . N a t u r e . 3 3 7 : 1 6 5 - 1 6 6 . R a n d a l l , D . J . , W o o d , C M . , P e r r y , S . F . , B e r g m a n , H . , M a l o i y , G . M . O . , a n d W r i g h t , P . A . 1 9 8 8 . A c o m p l e t e l y a q u a t i c f i s h t h a t i s u r e o t e l i c : a r e s p o n s e t o a l k a l i n e c o n d i t i o n s . I n p r e p a r a t i o n . R u s s o , R . C . , D . J . R a n d a l l a n d , R . V . T h u r s t o n . 1 9 8 8 . Ammonia t o x i c i t y a n d m e t a b o l i s m i n f i s h e s . I n , P r o t e c t i o n o f R i v e r B a s i n s , L a k e s a n d E s t u a r i e s . E d i t e d b y R . C . R y a n s . p p . 1 5 9 - 1 7 3 . S m a r t , G . R . 1 9 7 8 . I n v e s t i g a t i o n s o f t h e t o x i c m e c h a n i s m s o f ammonia t o f i s h - g a s e x c h a n g e i n r a i n b o w t r o u t (Salmo gairdneri) e x p o s e d t o a c u t e l y l e t h a l c o n c e n t r a t i o n s . J . F i s h . B i o l . 1 2 : 9 3 - 1 0 4 . S o i v i o , A . , K . N y n h o l m , a n d K . W e s t m a n . 1 9 7 5 . A t e c h n i q u e f o r r e p e a t e d s a m p l i n g o f t h e b l o o d o f i n d i v i d u a l r e s t i n g f i s h . J . E x p . B i o l . 6 2 : 2 0 7 - 2 1 7 . S p e c k e r , J . L . a n d C . B . S h r e c k . 1 9 8 0 . S t r e s s r e s p o n s e t o t r a n s p o r t a t i o n a n d f i t n e s s f o r m a r i n e s u r v i v a l i n c o h o s a l m o n (Oncorhynchus kisutch) s m o l t s . C a n . J . F i s h . A q u a t . S c i . 3 7 : 7 6 5 - 7 6 9 . T h o m a s , S . a n d J P o u p i n . 1 9 8 5 . A s t u d y o f t h e e f f e c t s o f w a t e r c a r b o n a t e a l k a l i n i t y o n some p a r a m e t e r s o f b l o o d 141 a c i d - b a s e s t a t u s i n r a i n b o w t r o u t (Salmo Gairdneri R . ) . J . Comp. P h y s i o l . B . 1 5 6 : 2 9 - 3 4 . T h u r s t o n , R . V . , R . C . R u s s o , R . J . L u e d t k e , C . E . S m i t h , E . L . M e y n , C . C h a k o u m a k o s , K . C . Wang a n d , C . J . D . B r o w n . 1 9 8 4 . C h r o n i c t o x i c i t y o f ammonia t o r a i n b o w t r o u t . T r a n s . Am. F i s h . S o c . 1 1 3 : 5 6 - 7 3 . W e d e m e y e r , G . A . 1 9 7 2 . Some p h y s i o l o g i c a l c o n s e q u e n c e s o f h a n d l i n g s t r e s s i n t h e j u v e n i l e c o h o s a l m o n (Oncorhynchus kisutch) a n d s t e e l h e a d t r o u t (Salmo gairdneri). J . F i s h . R e s . B o a r d . C a n . 2 9 : 1 7 8 0 - 1 7 8 3 . W e d e m e y e r , G . A . a n d D . J . M c L e a y . 1 9 8 1 . M e t h o d s f o r d e t e r m i n i n g t h e t o l e r a n c e o f f i s h e s t o e n v i r o n m e n t a l s t r e s s o r s . S t r e s s a n d F i s h . A . D . P i c k e r i n g . e d . A c a d e m i c P r e s s , L o n d o n E n g l a n d , p p . 2 4 7 - 2 7 5 . W e d e m e y e r , G . A . , P a l m i s a n o , A . N . a n d L . E . S a l s b u r y . 1 9 8 5 . D e v e l o p m e n t o f a n e f f e c t i v e t r a n s p o r t m e d i a f o r j u v e n i l e s p r i n g C h i n o o k s a l m o n t o m i t i g a t e a n d i m p r o v e s m o l t s u r v i v a l d u r i n g C o l u m b i a R i v e r f i s h h a u l i n g o p e r a t i o n s . B o n n e v i l l e P o w e r A d m i n i s t r a t i o n , F i s h a n d W i l d l i f e D i v i s i o n . W i t s c h i , A . W . , a n d C A . Z i e b e l l . 1 9 7 9 . E v a l u a t i o n o f pH s h o c k o n h a t c h e r y r a i n b o w t r o u t . P r o g . F i s h - C u l t . V o l . 4 1 , N o . 1 , p p . 3 - 5 . 142 Wood , C M . , B . P . S i m o n s , D . R . M o u n t , a n d H . L . B e r g m a n . 1 9 8 8 b . P h y s i o l o g i c a l e v i d e n c e o f a c c l i m a t i o n t o a c i d / a l u m i n u m s t r e s s i n a d u l t b r o o k t r o u t (Salvelinus fontinalus). 2. B l o o d p a r a m e t e r s b y c a n n u l a t i o n . C a n . J . F i s h . A q u a t . S c i . 4 5 : 1 5 9 7 - 1 6 0 5 . Wood , C M . , D . G . M c D o n a l d , C E . B o o t h , B . P . S i m o n s , C G . I n g e r s o l l , a n d H . L . B e r g m a n . 1 9 8 8 a . P h y s i o l o g i c a l e v i d e n c e o f a c c l i m a t i o n t o a c i d / a l u m i n u m s t r e s s i n a d u l t b r o o k t r o u t (Salvelinus fontinalus). 1 . B l o o d c o m p o s i t i o n a n d n e t s o d i u m f l u x e s . C a n . J . F i s h . A q u a t . S c i . 4 5 : 1 5 8 7 - 1 5 9 6 . Wood , C M . , R . S . M u n g e r , a n d D . P . T o e w s . 1 9 8 9 . A m m o n i a , u r e a a n d H + d i s t r i b u t i o n a n d t h e e v o l u t i o n o f u r e o t e l i s m i n a m p h i b i a n s . J . E x p . B i o l . 1 4 4 : 2 1 5 - 2 3 3 . W r i g h t , P . A . a n d , C M . Wood . 1 9 8 5 . A n a n a l y s i s o f b r a n c h i a l ammonia e x c r e t i o n i n t h e f r e s h w a t e r r a i n b o w t r o u t : e f f e c t s o f e n v i r o n m e n t a l pH c h a n g e a n d s o d i u m u p t a k e b l o c k a d e . J . E x p . B i o l . 1 1 4 : 3 2 9 - 3 5 3 . W r i g h t , P . A . a n d , C M . Wood . 1 9 8 8 . M u s c l e ammonia s t o r e s a r e n o t d e t e r m i n e d b y pH g r a d i e n t s . F i s h P h y s i o l . B i o c h e m . V o l . 5 , 3 : 1 5 9 - 1 6 2 . W r i g h t , P . A . , C M . Wood , a n d D . J . R a n d a l l . 1 9 8 8 . A n in vitro a n d in vivo s t u d y o f t h e d i s t r i b u t i o n o f ammonia 143 b e t w e e n p l a s m a a n d r e d c e l l s o f r a i n b o w t r o u t (Salmo gairdneri). J . E x p . B i o l . 1 3 4 : 4 2 3 - 4 2 8 . W r i g h t , P . A . , D . J . R a n d a l l , a n d , C M . W o o d . 1 9 8 8 . T h e d i s t r i b u t i o n o f ammonia a n d H + b e t w e e n t i s s u e c o m p a r t m e n t s i n Lemon s o l e (Parophrys vetulus) a t r e s t , d u r i n g h y p e r c a p n i a a n d f o l l o w i n g e x e r c i s e . J . E x p . B i o l . 1 3 6 : 1 4 9 - 1 7 5 . W r i g h t , P . A . , H e m i n g , T . A . a n d D . J . R a n d a l l . 1 9 8 6 . D o w n s t r e a m pH c h a n g e s i n w a t e r f l o w i n g o v e r t h e g i l l s o f r a i n b o w t r o u t . J . E x p . B i o l . 1 2 6 : 4 9 9 - 5 1 2 . W r i g h t , P . A . , R a n d a l l , D . J . a n d C M . Wood . 1 9 8 7 . T h e d i s t r -i b u t i o n o f ammonia a n d H + b e t w e e n t i s s u e c o m p a r t m e n t s i n Lemon S o l e (Parophrys vetulus) a t r e s t , d u r i n g h y p e r c a p n i a a n d f o l l o w i n g e x e r c i s e . J . E x p . B i o l . 136 : 1 4 9 - 1 7 5 . 

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