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A developmental analysis of the reversal response in the nematode Caenorhabditis elegans Chiba, Catherine Meye 1989

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A DEVELOPMENTAL ANALYSIS OF THE REVERSAL RESPONSE IN THE NEMATODE CAENORHABDITIS ELEGANS by CATHERINE MEYE CHIBA B . S c , The U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1986 A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF MASTER OF ARTS i n THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES D e p a r t m e n t o f P s y c h o l o g y We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE UNIVERSITY OF B R I T I S H COLUMBIA A u g u s t 1989 © C a t h e r i n e Meye C h i b a , 1989 In presenting this thesis in partial fulfilment of the requirements for an advanced degree at the University of British Columbia, I agree that the Library shall make it freely available for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of this thesis for scholarly purposes may be granted by the head of my department or by his or her representatives. It is understood that copying or publication of this thesis for financial gain shall not be allowed without my written permission. Department of B > v g . w o t . O ^ V The University of British Columbia Vancouver, Canada DE-6 (2/88) A b s t r a c t The nematode C a e n o r h a b d i t i s e l e q a n s e x h i b i t s a number o f l o c o m o t o r y b e h a v i o u r s , among them a f a m i l y o f r e v e r s a l r e s p o n s e s w h i c h c a n o c c u r e i t h e r s p o n t a n e o u s l y , i n t h e a b s e n c e o f o b v i o u s s t i m u l i , o r r e f l e x i v e l y , i n r e s p o n s e t o m e c h a n i c a l s t i m u l i . T h e s e b e h a v i o u r s a r e t h o u g h t t o be m e d i a t e d by a common n e u r a l c i r c u i t , t h e t o u c h w i t h d r a w a l c i r c u i t , whose g e n e t i c s , n e u r a n a t o m y , and d e v e l o p m e n t have b e e n e x c e p t i o n a l l y w e l l - c h a r a c t e r i z e d . D e s p i t e known c h a n g e s i n t h e f u n c t i o n a l n e u r o a n a t o m y o f t h i s c i r c u i t o v e r d e v e l o p m e n t , a t l e a s t one b e h a v i o u r m e d i a t e d by t h i s c i r c u i t , t h e t o u c h w i t h d r a w a l r e f l e x , shows no a p p a r e n t c h a n g e s o v e r d e v e l o p m e n t . T h i s t h e s i s e x a m i n e d t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e s e c h a n g e s may be r e f l e c t e d i n two o t h e r r e v e r s a l r e s p o n s e s , s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s a n d t h e t a p r e v e r s a l r e f l e x . I n t h e e x p e r i m e n t s r e p o r t e d h e r e , b o t h s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s and t h e t a p r e v e r s a l r e f l e x w e r e e x a m i n e d o v e r s i x d e v e l o p m e n t a l s t a g e s : f o u r l a r v a l s t a g e s ( L I , L 2 , L 3 , a n d L 4 ) , and two a d u l t s t a g e s ( y o u n g a d u l t a n d 4 day o l d s ) . I n a l l e x p e r i m e n t s , a n i m a l s w e re o b s e r v e d i n d i v i d u a l l y u n d e r a l i g h t m i c r o s c o p e and t h e i r b e h a v i o u r v i d e o t a p e d f o r l a t e r a n a l y s i s . R e s u l t s i n d i c a t e d t h a t b o t h s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s and t h e t a p r e v e r s a l r e f l e x show d e v e l o p m e n t a l c h a n g e s i n C.  e l e g a n s . Young a d u l t a n i m a l s showed an i n c r e a s e i n t h e f r e q u e n c y o f s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s r e l a t i v e t o t h e o t h e r i i d e v e l o p m e n t a l s t a g e s ; t h i s i n c r e a s e was n e i t h e r a f u n c t i o n o f i n c r e a s e d a c t i v i t y o r c h a n g e i n s e n s o r y t h r e s h o l d . L a r v a l a n i m a l s o f a l l s t a g e s a l s o showed s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t p a t t e r n s o f r e s p o n d i n g t o t a p s r e l a t i v e t o a d u l t s t a g e s , w i t h L2 a n i m a l s s h o w i n g t h e most p r o n o u n c e d d i f f e r e n c e s . A l t h o u g h a n i m a l s o f a l l s t a g e s r e v e r s e d i n r e s p o n s e t o t o u c h , t a p s e l i c i t e d n o t o n l y r e v e r s a l s , b u t a p r e v i o u s l y u n d e s c r i b e d r e s p o n s e , a c c e l e r a t i o n s . W h i l e a d u l t s c o n s i s t e n t l y showed r e v e r s a l s i n r e s p o n s e t o s i n g l e t a p s , l a r v a l a n i m a l s showed a c c e l e r a t i o n s on a p p r o x i m a t e l y h a l f t h e r e s p o n s e s . The t a p r e v e r s a l r e f l e x was a l s o f o u n d t o be g r a d e d , s h o w i n g a s i g n i f i c a n t t r e n d t o i n c r e a s e i n m a g n i t u d e w i t h i n c r e a s i n g s t i m u l u s m a g n i t u d e . I n c r e a s i n g s t i m u l u s m a g n i t u d e a l s o i n c r e a s e d t h e p r o b a b i l i t y o f a c c e l e r a t i o n s r e l a t i v e t o s i n g l e t a p s f o r a l l d e v e l o p m e n t a l s t a g e s , t h o u g h l a r v a l a n i m a l s s t i l l showed f e w e r r e v e r s a l s and more a c c e l e r a t i o n s t h a n a d u l t a n i m a l s . T h e r e a p p e a r e d t o be two p h a s e s i n t h e d e v e l o p m e n t o f t h e r e f l e x : o ne, t h e t r a n s i t i o n f r o m n e w l y h a t c h e d L I a n i m a l t o s u b s e q u e n t l a r v a l s t a g e s ; t h e o t h e r , t h e t r a n s i t i o n f r o m l a r v a l s t a g e L4 t o y o u n g a d u l t , when t h e p a t t e r n o f r e s p o n d i n g t o t a p s c h a n g e s f r o m t h e l a r v a l t o t h e a d u l t p a t t e r n . T h e s e p e r i o d s c o r r e l a t e d w i t h p e r i o d s o f known n e u r o n a l change i n t h e n e u r a l c i r c u i t . I t was h y p o t h e s i z e d t h a t t h e t r a n s i t i o n f r o m l a r v a l t o a d u l t p a t t e r n s o f r e s p o n d i n g m i g h t be t h e r e s u l t o f t h e a d d i t i o n o f a s p e c i f i c s e n s o r y n e u r o n , AVM, and i t s a s s o c i a t e d c o n n e c t i o n s . i v T a b l e o f C o n t e n t s A b s t r a c t i i T a b l e o f C o n t e n t s v L i s t o f T a b l e s v i i L i s t o f F i g u r e s v i i i A c k n o w l e d g e m e n t i x INTRODUCTION 1 BACKGROUND 6 The L i f e C y c l e 6 The B e h a v i o u r 9 The T o u c h C i r c u i t 10 P o s t - E m b r y o n i c Changes i n The T o u c h C i r c u i t 14 G e n e r a l M e t h o d s 17 A n i m a l s 17 E s t a b l i s h m e n t o f S y n c h r o n o u s C o l o n i e s a n d V e r i f i c a t i o n o f S t a g e s 17 C h a r a c t e r i s t i c s o f D e v e l o p m e n t a l S t a g e s 18 A p p a r a t u s a n d G e n e r a l T e c h n i q u e 20 S c o r i n g 23 S t a t i s t i c a l A n a l y s e s 27 E x p e r i m e n t 1: S p o n t a n e o u s R e v e r s a l s 29 I n t r o d u c t i o n 29 M e t h o d 31 R e s u l t s 31 D i s c u s s i o n 32 E x p e r i m e n t 2: R e f l e x R e v e r s a l s t o T o u c h e s a nd T a p s . . . . 3 7 I n t r o d u c t i o n 37 v M e t h o d 3 8 R e s u l t s 39 D i s c u s s i o n 44 E x p e r i m e n t 3: G r a d e d R e s p o n s e 45 I n t r o d u c t i o n 45 M e t h o d s 46 R e s u l t s 4 7 D i s c u s s i o n 6 5 GENERAL DISCUSSION 68 C o n c l u s i o n 8 0 REFERENCES 8 1 v i L i s t o f T a b l e s 1. Mean A c c e l e r a t i o n M a g n i t u d e s t o Tap S t i m u l i o f T h r e e D i f f e r e n t I n t e n s i t i e s 63 2. Mean R e v e r s a l M a g n i t u d e s t o Tap S t i m u l i o f T h r e e D i f f e r e n t I n t e n s i t i e s : 64 v i i L i s t o f F i g u r e s 1. The L i f e C y c l e o f C. e l e q a n s 7 2. The T o u c h C i r c u i t o f C. e l e q a n s 12 3. A p p a r a t u s f o r S t u d i e s o f B e h a v i o u r i n C. e l e q a n s 21 4. Mean Number S p o n t a n e o u s R e v e r s a l s i n 10 m i n O b s e r v a t i o n P e r i o d 33 5. Mean P e r c e n t Time A c t i v e i n 10 m i n O b s e r v a t i o n P e r i o d 35 6. P r o p o r t i o n s o f A n i m a l s R e v e r s i n g a n d A c c e l e r a t i n g t o T o u c h and Tap S t i m u l i 41 7. P r o p o r t i o n s o f A n i m a l s R e v e r s i n g t o Tap S t i m u l i o f V a r y i n g I n t e n s i t y 51 8. P r o p o r t i o n s o f A n i m a l s R e v e r s i n g t o Tap S t i m u l i o f V a r y i n g I n t e n s i t y 53 9. I n t e r a c t i o n s B e t w e e n R e s p o n s e Type and S t i m u l u s I n t e n s i t y on R e s p o n s e M a g n i t u d e 56 10. R e s p o n s e M a g n i t u d e s f o r S t i m u l i o f V a r y i n g I n t e n s i t y : L a r v a e a n d A d u l t s 61 v i i i A c k n o w l e d g e m e n t s I d i d n ' t do t h i s a l o n e . T h a n k s t o Ann Rose a nd h e r s t u d e n t s f o r a l l t h e i r h e l p : t h e i r a s s i s t a n c e , a d v i c e , a n d e s s e n t i a l s u p p l i e s f o r t h e c a r e a n d f e e d i n g o f C. e l e g a n s ( a n d t h e i r p r o v i s i o n o f C. e l e g a n s i t s e l f ) made t h i s w o r k p o s s i b l e . T h a n k s e s p e c i a l l y , Ann, f o r i n t r o d u c i n g o u r l a b t o C. e l e g a n s i n t h e f i r s t p l a c e : i t ' s a w o n d e r f u l a n i m a l . T h a n k s a l s o t o Rod Wong, who was t h e r e a t t h e b e g i n n i n g , a n d i n t r o d u c e d a r o m a n t i c t o t h e s t u d y o f a n i m a l b e h a v i o u r . Thank y o u f o r y o u r c o n s i d e r a t i o n , g o o d w i l l , and e n c o u r a g e m e n t . I h a v e c h e r i s h e d y o u r p o i n t o f v i e w . F i n a l l y , I w o u l d l i k e t o t h a n k C a t h a r i n e R a n k i n , who hung on t o t h e end, and i n d o i n g s o t a u g h t me a l e s s o n i n f r i e n d s h i p , c r a f t s m a n s h i p , a n d t e n a c i t y t h a t I n e v e r t h o u g h t I h a d t o l e a r n . And I t h o u g h t I was s t u b b o r n . T h i s t h e s i s i s d e d i c a t e d t o J o h n T.M. Kam: I n t h e w o r s t o f i t y o u were my s o l a c e , my s a n c t u a r y , my s a n i t y . Thank y o u . You made t h e d i f f e r e n c e . i x 1 A f u n d a m e n t a l i s s u e i n b o t h p s y c h o l o g y a n d b i o l o g y i s t h e q u e s t i o n o f how b e h a v i o u r i s p r o d u c e d . T h e r e i s g e n e r a l a g r e e m e n t t h a t t h e n e r v o u s s y s t e m p l a y s a k e y r o l e i n p r o d u c i n g b e h a v i o u r . One a s s u m p t i o n t h a t f o l l o w s f r o m t h i s i s t h a t c h a n g e s i n t h e s t r u c t u r e o f n e r v o u s s y s t e m s l e a d t o c h a n g e s i n b e h a v i o u r . The r e l a t i o n s h i p , h o w e v e r , i s n o t a l w a y s c l e a r c u t . One way t o a n a l y z e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n n e r v o u s s y s t e m s and b e h a v i o u r i s t o s t u d y b e h a v i o u r a s a n e r v o u s s y s t e m d e v e l o p s . A d e v e l o p i n g a n i m a l d o e s n o t s t a r t w i t h a f u n c t i o n i n g n e r v o u s s y s t e m : i t a s s e m b l e s i t , a n d t h e n a t u r e o f b e h a v i o u r d u r i n g t h i s a s s e m b l y c a n g i v e us i n s i g h t s i n t o t h e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n n e r v o u s s y s t e m s t r u c t u r e and n e r v o u s s y s t e m f u n c t i o n . The d i f f i c u l t y comes i n d e t e r m i n i n g t h e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e t w o , as n e r v o u s s y s t e m s a n d b e h a v i o u r a r e n o t i d e n t i c a l . B o t h a r e p r o d u c t s o f i n t e r a c t i o n s a nd a c t i v i t i e s a t s e v e r a l l e v e l s o f o r g a n i z a t i o n , r a n g i n g f r o m t h e l e v e l o f m o l e c u l e s t o t h e l e v e l o f n e u r o n s ; f r o m t h e l e v e l o f n e u r o n s a n d n e u r a l c i r c u i t s t o t h e l e v e l o f e n t i r e o r g a n i s m s . Changes c a n t a k e p l a c e a t any o f t h e s e l e v e l s , w i t h no g u a r a n t e e t h a t c h a n g e s a t one l e v e l a r e n e c e s s a r i l y r e f l e c t e d i n c h a n g e s a t a n o t h e r l e v e l . F u r t h e r m o r e , t h e s h e e r c o m p l e x i t y o f i n t e r a c t i o n s a t any one l e v e l — b e i t m o l e c u l a r , c e l l u l a r , a n a t o m i c a l , o r b e h a v i o u r a l , o f t e n p r e c l u d e s o u r a b i l i t y t o d r a w c o n c l u s i o n s a b o u t t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n i n t e r a c t i o n s 2 a c r o s s l e v e l s . Y e t u l t i m a t e l y , t o u n d e r s t a n d how b e h a v i o u r a r i s e s o u t o f t h e w o r k i n g s o f a n e r v o u s s y s t e m , we must be a b l e t o i n t e g r a t e i n f o r m a t i o n a c r o s s l e v e l s . Our g o a l i s t o u n d e r s t a n d how c h a n g e s a t one l e v e l o f o r g a n i z a t i o n may be r e f l e c t e d i n a n o t h e r ; t o u n d e r s t a n d how t h e s e l e v e l s may i n t e r a c t . No s i n g l e l e v e l i s t h e s o l e p r o d u c e r o f b e h a v i o u r ; a l l a p p e a r t o be i n t e r d e p e n d e n t . The q u e s t i o n i s how t o i n t e g r a t e t h e i n p u t s and o u t p u t s o f v a r i o u s l e v e l s . One a p p r o a c h t o t h e p r o b l e m i s t o s t u d y a v e r y s i m p l e a n i m a l s u c h as t h e nematode C a e n o r h a b d i t i s e l e q a n s . I n many r e s p e c t s , C. e l e q a n s i s i d e a l l y s u i t e d f o r j u s t s u c h an i n t e g r a t i v e a p p r o a c h . S i d n e y B r e n n e r , who s e l e c t e d and p r o m o t e d t h i s s p e c i e s as a model o r g a n i s m i n t h e e a r l y 7 0's ( B r e n n e r , 1974; s e e a l s o B r e n n e r 1988) r e c o g n i z e d t h e p r o b l e m o f c o m p l e x i t y a s a m a j o r h i n d r a n c e t o p r o g r e s s i n o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e p r o c e s s e s o f d e v e l o p m e n t and n e r v o u s s y s t e m f u n c t i o n . He saw i n C. e l e q a n s t h e p o t e n t i a l t o become t o t h e s t u d y o f n e r v o u s s y s t e m s and d e v e l o p m e n t what b a c t e r i a h a d b e e n t o m o l e c u l a r b i o l o g y : a p o w e r f u l model o r g a n i s m f r o m w h i c h t o e x t r a c t f i r s t p r i n c i p l e s . W i t h o n l y 302 n e u r o n s , c o n s i s t e n t , p r e c i s e , and h i g h l y d e t e r m i n a t e d e v e l o p m e n t , and a genome and l i f e s t y l e h i g h l y c o n d u c i v e t o g e n e t i c d i s s e c t i o n , C. e l e q a n s i s one 3 o f t h e most i n t e n s i v e l y s t u d i e d and e x t e n s i v e l y d e s c r i b e d m u l t i c e l l u l a r o r g a n i s m s i n b i o l o g y t o d a y . M e a s u r i n g l e s s t h a n a m i l l i m e t e r l o n g a s a y o u n g a d u l t , t h i s t i n y , t r a n s p a r e n t , f r e e - l i v i n g s o i l nematode i s t h e model s y s t e m o f c h o i c e f o r t h e s t u d y o f p r o b l e m s as d i v e r s e a s d e v e l o p m e n t a l g e n e t i c s , t o x i c o l o g y , a n d a g i n g ( e . g . , s e e r e f e r e n c e s i n Z u c k e r m a n , 1980a; 1980b; a l s o Wood, 1 9 8 8 ) . S u c h i n t e n s i v e s t u d y h a s made C. e l e g a n s a t e m p t i n g c h o i c e f o r t h e n e u r o b i o l o g i s t i n s e a r c h o f a m o del s y s t e m . I n a d d i t i o n t o a n e a r l y c o m p l e t e d p h y s i c a l map o f t h e w i l d - t y p e genome ( C o u l s o n , S u l s t o n , B r e n n e r , & K a r n , 1 9 8 6 ) , t h e r e now e x i s t c o m p l e t e d e v e l o p m e n t a l l i n e a g e s f o r e v e r y c e l l o f e v e r y t y p e i n t h e a d u l t h e r m a p h r o d i t e ( S u l s t o n & H o r v i t z , 1977; S u l s t o n , S c h i e r e n b e r g , W h i t e , &. Thomson, 1 9 8 3 ) , as w e l l a s a c o m p l e t e n e u r o a n a t o m i c a l map o f t h e e n t i r e a d u l t n e r v o u s s y s t e m , i n c l u d i n g l o c a t i o n s o f p u t a t i v e c h e m i c a l a n d e l e c t r i c a l s y n a p s e s and a n a t o m i c a l w i r i n g d i a g r a m s f o r s e v e r a l b e h a v i o u r s ( W h i t e , S o u t h g a t e , Thomson, & B r e n n e r , 1 9 8 6 ) . One f a m i l y o f b e h a v i o u r s i n t h i s a n i m a l h a s b e e n e s p e c i a l l y w e l l s t u d i e d — b e h a v i o u r s r e l a t e d t o l o c o m o t i o n . C. e l e g a n s e x h i b i t s a number o f l o c o m o t o r y b e h a v i o u r s , one o f w h i c h i s a r e v e r s a l r e s p o n s e t h a t c a n o c c u r e i t h e r s p o n t a n e o u s l y o r r e f l e x i v e l y ( C r o l l , 1 9 7 5 ) . The a n i m a l n o r m a l l y swims f o r w a r d on a s o l i d s u b s t r a t e , p r o p e l l i n g i t s e l f on i t s s i d e w i t h u n d u l a t o r y waves o f m u s c u l a r c o n t r a c t i o n t h a t p a s s down t h e l e n g t h o f i t s body f r o m 4 h e a d t o t a i l . When t h e a n i m a l r e v e r s e s , t h e f l o w o f t h e s e waves r e v e r s e s d i r e c t i o n , t h e c o n t r a c t i o n s p a s s i n g f r o m t a i l t o h e a d r e s u l t i n g i n t h e a n i m a l ' s b a c k w a r d m o t i o n . T h i s b e h a v i o u r c a n o c c u r i n r e s p o n s e t o d i r e c t m e c h a n i c a l s t i m u l a t i o n , s u c h a s t o u c h t o t h e h e a d , and i s t e r m e d t h e h e a d t o u c h w i t h d r a w a l r e f l e x ( C h a l f i e & S u l s t o n , 1 9 8 1 ) . A s i m i l a r r e s p o n s e , t h e t a i l t o u c h w i t h d r a w a l r e f l e x , r e s u l t s i n t h e a n i m a l ' s f o r w a r d m o t i o n ( C h a l f i e & S u l s t o n , 1 9 8 1 ) . O t h e r s t i m u l i , s u c h a v i b r a t i o n p a s s i n g t h r o u g h t h e s u b s t r a t e b e n e a t h t h e a n i m a l , c a n a l s o e l i c i t r e f l e x i v e r e v e r s a l s i n a d u l t a n i m a l s . We h a v e c a l l e d t h i s l a t t e r r e s p o n s e t h e t a p r e v e r s a l r e f l e x , as i t c a n be e l i c i t e d by t a p p i n g t h e s i d e o f t h e a n i m a l ' s d i s h ( R a n k i n & C h i b a , 1988; R a n k i n , B e c k , & C h i b a , i n p r e s s ) . The t a p r e v e r s a l r e f l e x h a s b e e n t h e s u b j e c t o f s t u d i e s o f b e h a v i o u r a l p l a s t i c i t y . e l e q a n s i s c a p a b l e o f n o n - a s s o c i a t i v e l e a r n i n g — h a b i t u a t i o n , d i s h a b i t u a t i o n and s e n s i t i z a t i o n — a n d i s a l s o c a p a b l e o f l o n g - t e r m memory ( R a n k i n & C h i b a , 1988; R a n k i n , B e c k , & C h i b a , i n p r e s s ) . I n a d d i t i o n , t h e t a p r e v e r s a l i s i n h i b i t e d by g e n t l e t o u c h t o t h e t a i l , s u g g e s t i n g an i n t e r a c t i o n b e t w e e n c o m p e t i n g r e s p o n s e s ( R a n k i n , u n p u b l i s h e d d a t a ) . The t o u c h w i t h d r a w a l r e f l e x h a s been e x t e n s i v e l y s t u d i e d by M a r t i n C h a l f i e and h i s c o l l e a g u e s ( C h a l f i e & S u l s t o n , 1981; C h a l f i e , Thomson, & S u l s t o n , 1983; C h a l f i e , 1984; C h a l f i e , S u l s t o n , W h i t e , S o u t h g a t e , Thomson, & 5 B r e n n e r , 1985; W a l t h a l l & C h a l f i e , 1988; C h a l f i e & Au, 1 9 8 9 ) . The f u n c t i o n a l anatomy o f t h e n e u r a l c i r c u i t f o r t h i s b e h a v i o u r h a s b e e n w o r k e d o u t i n c o n s i d e r a b l e d e t a i l u s i n g a c o m b i n a t i o n o f g e n e t i c l e s i o n s and l a s e r m i c r o s u r g e r y t o d e t e r m i n e t h e r o l e s o f i n d i v i d u a l c e l l s . B o t h t h e t o u c h w i t h d r a w a l r e f l e x a n d t h e t a p r e v e r s a l r e f l e x a r e t h o u g h t t o be m e d i a t e d by t h e n e u r a l c i r c u i t e l u c i d a t e d by C h a l f i e e t a l ( C h a l f i e , S u l s t o n , W h i t e , S o u t h g a t e , Thomson, & B r e n n e r , 1985) A n i m a l s d e f e c t i v e i n c r i t i c a l e l e m e n t s o f t h e t o u c h w i t h d r a w a l c i r c u i t and known t o be t o u c h i n s e n s i t i v e a l s o show a b n o r m a l r e s p o n s e s t o t a p ( R a n k i n & C h a l f i e , 1 9 8 9 ) . I n a d d i t i o n , C h a l f i e a n d h i s c o l l e a g u e s h a v e d e t a i l e d many f e a t u r e s o f t h e n e u r o a n a t o m i c a l d e v e l o p m e n t o f t h i s c i r c u i t ( C h a l f i e & S u l s t o n , 1981; C h a l f i e , Thomson, & S u l s t o n , 1983; C h a l f i e , 1984; W a l t h a l l & C h a l f i e , 1988) One i n t r i g u i n g a s p e c t o f t h i s r e s p o n s e t o t o u c h i s t h a t i t i s p r e s e n t t h r o u g h o u t p o s t - e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t , d e s p i t e t h e o c c u r e n c e o f s u b s t a n t i a l c h a n g e s i n t h e c i r c u i t ' s n e u r a l anatomy ( C h a l f i e & S u l s t o n , 1 9 8 1 ) . The r e v e r s a l r e s p o n s e s t h u s f o r m a f a m i l y o f r e s p o n s e s e s p e c i a l l y s u i t a b l e f o r t h e s t u d y o f t h e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n d e v e l o p m e n t a l c h a n g e s i n n e r v o u s s y s t e m s a nd t h e b e h a v i o u r t h e y p r o d u c e . T h e y a r e p a r t i c u l a r l y i n t e r e s t i n g g i v e n t h a t a t l e a s t one b e h a v i o u r , t h e t o u c h w i t h d r a w a l r e f l e x , a p p e a r s n o t t o r e f l e c t s u b s t a n t i a l n e u r o a n a t o m i c a l c h a n g e s a s t h e y o c c u r 6 o v e r d e v e l o p m e n t . The f o l l o w i n g e x p e r i m e n t s r e p r e s e n t an e x a m i n a t i o n o f b o t h t h e t o u c h and t h e t a p r e v e r s a l r e s p o n s e t h r o u g h o u t d e v e l o p m e n t . The a i m s o f t h e s e e x p e r i m e n t s w e re t h r e e f o l d : (1) t o e x a m i n e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n two t o p o g r a p h i c a l l y s i m i l a r b e h a v i o u r s — t h e t o u c h w i t h d r a w a l r e f l e x and t h e t a p r e v e r s a l r e f l e x ; (2) t o e x a m i n e t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e s u b s t a n t i a l c h a n g e s i n t h e u n d e r l y i n g n e u r a l c i r c u i t may be r e f l e c t e d i n t a p r e v e r s a l r e f l e x ; and (3) t o l a y t h e g r o u n d w o r k f o r an e x a m i n a t i o n o f t h e d e v e l o p m e n t o f b e h a v i o u r a l p l a s t i c i t y i n C. e l e g a n s by a d e t a i l e d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e t a p r e v e r s a l r e f l e x o v e r d e v e l o p m e n t . B e f o r e o u t l i n i n g t h e e x p e r i m e n t s I w i l l f i r s t d e s c r i b e t h e r e l e v a n t c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e a n i m a l ' s d e v e l o p m e n t a n d n e u r a l anatomy. BACKGROUND The L i f e C y c l e C. e l e g a n s d e v e l o p s r a p i d l y , p r o c e e d i n g f r o m egg t o r e p r o d u c i n g a d u l t i n a p p r o x i m a t e l y t h r e e and a h a l f d a y s a t 20° C ( s e e F i g u r e 1 ) . Eggs a r e l a i d a p p r o x i m a t e l y t h r e e h o u r s a f t e r f e r t i l i z a t i o n , a n d t h e d e v e l o p i n g a n i m a l p a s s e s t h r o u g h f o u r l a r v a l m o l t s b e f o r e r e a c h i n g i t s f i n a l a d u l t f o r m . E g g - l a y i n g b e g i n s s e v e r a l h o u r s a f t e r t h e l a s t m o l t and c o n t i n u e s f o r a b o u t f o u r d a y s , a f t e r w h i c h t h e 7 F i g u r e 1. The l i f e c y c l e o f e 1 e g a n s . From d a t a p r e s e n t e d i n B y e r l y e t a 1, 1975. F i g u r e 1 ( a ) shows t h e t y p i c a l l i f e c y c l e o f C a e n o r h a b d i t i s e l e g a n s i n d a y s a t 20° C. Eggs a r e l a i d a p p r o x i m a t e l y 3 h o u r s a f t e r f e r t i l i z a t i o n ; 0 r e p r e s e n t s t h e t i m e a t w h i c h t h e eggs a r e l a i d . A n i m a l s s p e n d a p p r o x i m a t e l y 2.5 d a y s i n l a r v a l d e v e l o p m e n t ( i n c l u d i n g e m b r y o g e n e s i s ) , and b e g i n t o l a y e g g s a t a p p r o x i m a t e l y 3 t o 3.5 d a y s . A r r o w s i n d i c a t e t i m e o f peak e g g - l a y i n g and e f f e c t i v e end o f e g g - l a y i n g . F i g u r e 1 ( b ) shows a more d e t a i l e d v i e w o f e a r l y d e v e l o p m e n t . T i m e s a r e g i v e n i n h o u r s . On a v e r a g e , e g g s h a t c h a p p r o x i m a t e l y 11 h o u r s a f t e r b e i n g l a i d . D a r k r e c t a n g l e s mark s t a g e s o f l a r v a l d e v e l o p m e n t f r o m L I t h r o u g h L4; t h e t h i c k v e r t i c a l b l a c k l i n e s i n d i c a t e a p p r o x i m a t e t i m e s o f m o l t i n g . B o x e s w i t h d i a g o n a l l i n e s i n d i c a t e a p p r o x i m a t e p e r i o d s o f l e t h a r g u s . Young a d u l t h o o d e n d s when t h e a n i m a l b e g i n s t o l a y e g g s . A p p r o x i m a t e p e r i o d s o f t e s t i n g a r e m a r k e d w i t h a s t e r i s k s . T H E L I F E C Y C L E (a) (b) _ l _ egg laying maximal egg laying ends t egg larva young reproducing adult adult to approx. 21 days old adult (b) egg 9 a n i m a l may c o n t i n u e t o l i v e t o an e s t i m a t e d maximum o f a b o u t 21 d a y s . As shown i n F i g u r e 1, e a c h o f t h e f o u r l a r v a l s t a g e s l a s t s a p p r o x i m a t e l y t e n t o f i f t e e n h o u r s , t h e l o n g e s t s t a g e b e i n g l a r v a l s t a g e 1, o r L I . The a n i m a l g r o w s c o n t i n u o u s l y b e t w e e n m o l t s , a n d t h e p a t t e r n a n d t i m i n g o f c e l l d i v i s i o n b e t w e e n i n d i v i d u a l s u n d e r s i m i l a r c o n d i t i o n s i s h i g h l y c o n s i s t e n t ( s e e S u l s t o n , 1988, f o r summary). The a n i m a l ends a g i v e n l a r v a l s t a g e when i t s h e d s i t s c u t i c l e , a b o u t two h o u r s a f t e r e n t e r i n g a p e r i o d o f i n a c t i v i t y . The B e h a v i o u r I m m e d i a t e l y a f t e r h a t c h i n g , t h e a n i m a l i s a b l e t o l o c o m o t e , swimming o v e r o r t h r o u g h s e m i - s o l i d s u b s t r a t e s s u c h a s a g a r w i t h s i n u s o i d a l waves t h a t p r o p a g a t e down t h e l e n g t h o f i t s body. I t r e s p o n d s t o g e n t l e t o u c h on b o t h t h e h e a d a nd t h e t a i l by swimming away f r o m t h e s t i m u l u s , a n d , when swimming u n d i s t u r b e d , shows c o n t i n o u s h e a d o s c i l l a t i o n s w h i c h a p p e a r i n d e p e n d e n t o f t h e s i n u s o i d a l body waves. (See C r o l l , 1975, f o r a d e t a i l e d a n a l y s i s o f l o c o m o t o r y b e h a v i o u r i n C. e l e g a n s . ) The a n i m a l a l s o shows a s i m i l a r r e f l e x , t h e t a p r e v e r s a l r e f l e x , w h i c h i s e l i c i t e d when a v i b r a t i o n a l s t i m u l u s i s t r a n s m i t t e d t o t h e a n i m a l v i a t h e u n d e r l y i n g s u b s t r a t e . I n s t u d i e s o f n o n - a s s o c i a t i v e l e a r n i n g , t h i s r e f l e x i s e l i c i t e d by t a p p i n g t h e s i d e o f a p l a t e c o n t a i n i n g t h e worm on a g a r o s e g e l . B o t h r e s t i n g a n d 10 f o r w a r d - t r a v e l l i n g a n i m a l s s t o p and r e v e r s e , u n d u l a t i n g b a c k w a r d s f o r some d i s t a n c e . The t a p r e v e r s a l r e f l e x i s t h e p r i m a r y f o c u s o f t h e e x p e r i m e n t s r e p o r t e d h e r e . The T o u c h C i r c u i t The t a p r e v e r s a l r e f l e x a p p e a r s t o be m e d i a t e d by t h e same c i r c u i t t h a t u n d e r l i e s t h e r e v e r s a l r e s p o n s e t o g e n t l e h e a d t o u c h . The f u n c t i o n a l n e u r o a n a t o m y , g e n e t i c c o n t r o l , and d e v e l o p m e n t o f t h i s c i r c u i t h a s b e e n d e s c r i b e d by C h a l f i e and c o l l e a g u e s ( C h a l f i e & S u l s t o n , 1981; C h a l f i e , Thomson, & S u l s t o n , 1983; C h a l f i e , 1984; C h a l f i e , S u l s t o n , W h i t e , S o u t h g a t e , Thomson, & B r e n n e r , 1985; W a l t h a l l & C h a l f i e , 1988; C h a l f i e & Au, 1 9 8 9 ) . The b a s i c e l e m e n t s o f t h e t o u c h c i r c u i t i n C. e l e q a n s a r e 6 t o u c h r e c e p t o r s , 5 p a i r s o f i n t e r n e u r o n s , a n d 69 m o t o r n e u r o n s . The t o u c h r e c e p t o r s , a l s o known a s m i c r o t u b u l e c e l l s , a r e t h e s e n s o r y e l e m e n t s o f t h e c i r c u i t . The s i x t o u c h r e c e p t o r s o f t h e a d u l t a n i m a l c a n be d i v i d e d i n t o t h r e e g r o u p s b a s e d upon t h e i r p o s i t i o n . Two o f t h e c e l l s , t h e l e f t a n d r i g h t a n t e r i o r l a t e r a l m i c r o t u b u l e c e l l s ( a b b r e v i a t e d a s ALML and ALMR, r e s p e c t i v e l y : s e e W h i t e e t a l , 1986, f o r a more d e t a i l e d e x p l a n a t i o n o f a b b r e v i a t i o n s ) , a r e p o s i t i o n e d l a t e r a l l y on e i t h e r s i d e o f t h e a n t e r i o r h a l f o f t h e a n i m a l , e x t e n d i n g t h e i r p r o c e s s e s a n t e r i o r l y . Two o t h e r c e l l s , t h e l e f t and r i g h t p o s t e r i o r l a t e r a l m i c r o t u b u l e c e l l s (PLML a n d PLMR, 11 r e s p e c t i v e l y ) a r e p o s i t i o n e d p o s t e r i o r l y , on e i t h e r s i d e o f t h e a n i m a l ' s t a i l . T h e s e a l s o e x t e n d t h e i r p r o c e s s e s a n t e r i o r l y , t o t h e a n i m a l ' s l o n g i t u d i n a l m i d l i n e . The two o t h e r c e l l s , t h e a n t e r i o r and p o s t e r i o r v e n t r a l m i c r o t u b u l e c e l l s (AVM and PVM, r e s p e c t i v e l y ) a r e p o s i t i o n e d m e d i a l l y and v e n t r a l l y : AVM i n t h e a n t e r i o r h a l f o f t h e a n i m a l , e x t e n d i n g i t s p r o c e s s a n t e r i o r l y ; a n d PVM i n t h e p o s t e r i o r h a l f o f t h e a n i m a l , e x t e n d i n g i t s p r o c e s s a n t e r i o r l y i n t o t h e a n t e r i o r p o r t i o n o f t h e a n i m a l . Of t h e s e c e l l s , f i v e a r e known t o c o n t r i b u t e d i r e c t l y t o t h e w i t h d r a w a l r e s p o n s e s s e e n t o p o s t e r i o r and a n t e r i o r t o u c h . The f u n c t i o n o f t h e s i x t h , PVM, i s n o t y e t known, b u t may i n v o l v e t h e m e d i a t i o n o f o t h e r t o u c h -r e l a t e d b e h a v i o u r s . The t o u c h c i r c u i t i n C. e l e g a n s c a n be d i v i d e d i n t o two i n t e r c o n n e c t e d u n i t s : (1) t h e n e u r a l c i r c u i t f o r a n t e r i o r t o u c h ( h e a d t o u c h ) a n d (2) t h e n e u r a l c i r c u i t f o r p o s t e r i o r t o u c h ( t a i l t o u c h ) . (See F i g u r e 2 ) . The ALM (R an d L) c e l l s a n d t h e AVM c e l l s a r e t h e s e n s o r y r e c e p t o r s f o r a n t e r i o r t o u c h . T h e s e c e l l s a r e c o u p l e d t o e a c h o t h e r by gap j u n c t i o n s a nd a r e t h u s e l e c t r i c a l l y c o u p l e d , w o r k i n g as a u n i t . When s t i m u l a t e d , t h e s e c e l l s c a u s e t h e r e s p o n s e t o g e n t l e t o u c h v i a gap j u n c t i o n s t o a p a i r o f i n t e r n e u r o n s , t h e AVDs, w h i c h f o r m e x c i t a t o r y c h e m i c a l s y n a p s e s o n t o t h e m o t o r n e u r o n s r e s p o n s i b l e f o r b a c k w a r d movement, t h e A and AS c e l l s . AVD a l s o makes i n d i r e c t c o n n e c t i o n s t o t h e s e m o t o r n e u r o n s v i a a c h e m i c a l s y n a p s e 12 F i g u r e 2. The t o u c h c i r c u i t o f C. e l e g a n s ( a d u l t h e r m a p h r o d i t e ) . F rom i n f o r m a t i o n p r e s e n t e d i n C h a l f i e e t a l . , 1985, and f r o m C h a l f i e , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n t o C a t h a r i n e R a n k i n . The t o u c h c e l l s a r e r e p r e s e n t e d a s r e c t a n g l e s , a s a r e t h e t o u c h c e l l c o n n e c t o r s , LUA. I n t e r n e u r o n s a r e r e p r e s e n t e d as d i a m o n d s ; m o t o r n e u r o n s as c i r c l e s . C h e m i c a l s y n a p s e s a r e i n d i c a t e d w i t h a r r o w s (-•=>) and gap j u n c t i o n s w i t h b a r s ( | — | ) . I n h i b i t o r y and e x c i t a t o r y c o n n e c t i o n s a r e a l s o d e p i c t e d : d o t t e d l i n e s i n d i c a t e i n h i b i t o r y c o n n e c t i o n s , s o l i d l i n e s e x c i t a t o r y . The AVB c e l l s f o r m c h e m i c a l s y n a p s e s w i t h t h e AS c e l l s b u t n o t t h e A c e l l s ; o n l y AVM o f t h e a n t e r i o r t o u c h r e c e p t o r s s y n a p s e s w i t h AVB. B o t h t h e l a t t e r c o n n e c t i o n s (marked w i t h *) a r i s e p o s t e m b r y o n i c a l l y ; t h e c o n n e c t i o n f r o m AVM t o AVB i s c o m p l e t e d a p p r o x i m a t e l y 40 h o u r s a f t e r h a t c h i n g ( C h a l f i e & S u l s t o n , 1981; S u l s t o n & H o r v i t z , 1 9 7 7 ) . Gap j u n c t i o n s b e t w e e n i d e n t i c a l m o t o r n e u r o n s and i n t e r n e u r o n s a r e n o t shown. HEAD TOUCH FORWARD MOTOR NEURONS • Y A V E O INTERNEURONS SENSORY NEURONS TAIL TOUCH 14 t o AVA, a l a r g e i n t e r n e u r o n c o u p l e d by gap j u n c t i o n s t o t h e A and AS m o t o r n e u r o n s . The ALM and AVM c e l l s a r e a l s o t h o u g h t t o make i n h i b i t o r y c o n n e c t i o n s o n t o t h e p o s t e r i o r t o u c h c i r c u i t ( s e e F i g u r e 2 ) : one t o PVC, t h e i n t e r n e u r o n a n a l o g o u s t o AVD i n t h e p o s t e r i o r t o u c h c i r c u i t , a n d one t o v i a AVM t o AVB, t h e i n t e r n e u r o n a n a l o g o u s t o AVA i n t h e t o u c h c i r c u i t . The p o s t e r i o r t o u c h c i r c u i t i s s t r u c t u r e d s i m i l a r l y . The s e n s o r y r e c e p t o r s , t h e PLM c e l l s , a r e e l e c t r i c a l l y c o u p l e d v i a gap j u n c t i o n s t o PVC, an i n t e r n e u r o n m a k i n g e x c i t a t o r y c h e m i c a l s y n a p s e s o n t o t h e B m o t o r n e u r o n s . When s t i m u l a t e d by g e n t l e t o u c h t o t h e p o s t e r i o r h a l f o f t h e a n i m a l , t h e PLMs a c t i v a t e t h e B m o t o r n e u r o n s v i a PVC, e l i c i t i n g f o r w a r d movement. PVC, l i k e i t s c o u n t e r p a r t AVD, makes a s e c o n d s e t o f e x c i t a t o r y c o n n e c t i o n s t o t h e B m o t o r n e u r o n s v i a AVB, w h i c h ( l i k e AVA) f o r m s gap j u n c t i o n s w i t h t h e B c e l l s . The PLM c e l l s a r e a l s o e l e c t r i c a l l y c o u p l e d t o a p a i r o f i n t e r n e u r o n s , t h e LUAs, w h i c h a p p e a r t o a c t a s e x t e n s i o n s o f t h e PLMs, a l l o w i n g them b o t h t o make c o n t a c t w i t h t h e AVA and AVD c e l l s o f t h e a n t e r i o r t o u c h c i r c u i t ( C h a l f i e e t a l , 1 9 8 5 ) . T h e s e c h e m i c a l s y n a p s e s , a l o n g w i t h c h e m i c a l s y n a p s e s f r o m t h e AVBs o n t o t h e AVA i n t e r n e u r o n s and t h e AS m o t o r n e u r o n s , a r e t h o u g h t t o be i n h i b i t o r y ( s e e F i g u r e 2 ) . P o s t - E m b r y o n i c Changes i n t h e T o u c h C i r c u i t Many o f t h e e l e m e n t s o f t h e a d u l t t o u c h c i r c u i t a r i s e p o s t - e m b r y o n i c a l l y . The n e w l y h a t c h e d L I a n i m a l , a l t h o u g h 15 c a p a b l e o f l o c o m o t i n g and r e s p o n d i n g t o g e n t l e h e a d t o u c h ( C h a l f i e &. S u l s t o n , 1 9 8 1 ) , h a s a n e r v o u s s y s t e m s u b s t a n t i a l l y d i f f e r e n t f r o m t h a t o f t h e a d u l t . The n e w l y h a t c h e d L I s t a r t s w i t h a t o u c h c i r c u i t i n w h i c h o n l y t h e f o u r l a t e r a l t o u c h r e c e p t o r s a r e p r e s e n t ; AVM and PVM a r i s e p o s t - e m b r y o n i c a 1 l y . The i n t e r n e u r o n p a i r s AVD, AVA, PVC, and AVB a r e p r e s e n t , b u t t h e c o n n e c t i o n s b e t w e e n AVBs and t h e ALMs a r e m i s s i n g due t o t h e a b s e n c e o f AVM. The AS m o t o r n e u r o n s a r e a b s e n t a s w e l l , so t h a t t h i s c o n n e c t i o n b e t w e e n AVB and t h e c i r c u i t f o r a n t e r i o r t o u c h i s a l s o m i s s i n g . The n e w l y h a t c h e d L I a n i m a l h a s o n l y 22 o f t h e 76 v e n t r a l c o r d m o t o r n e u r o n s i t w i l l have as a n a d u l t ( S u l s t o n , 1976; S u l s t o n & H o r v i t z , 1 9 7 7 ) . A t h a t c h i n g , o n l y t h r e e t y p e s o f m o t o r n e u r o n s , t h e d o r s a l A ( DA), d o r s a l B ( D B ) , and d o r s a l D (DD), a r e p r e s e n t ; t h e a d u l t complement c o n s i s t s o f e i g h t t y p e s , i n c l u d i n g t h e v e n t r a l c o u n t e r p a r t s o f t h e s e n e u r o n s ( t h e VA, VB, and VD m o t o r n e u r o n s ) , t h e C n e u r o n s , and t h e AS n e u r o n s . I n a d d i t i o n , one o f t h e s e c l a s s e s o f m o t o r n e u r o n s , t h e DD m o t o r n e u r o n s , c o m p l e t e l y r e v e r s e s i t s p a t t e r n o f c o n n e c t i v i t y f r o m l a r v a t o a d u l t ( W h i t e , A l b e r t s o n , & A n n e s s , 1 9 7 8 ) . Changes b e g i n i n t h e l a r v a l n e r v o u s s y s t e m t h r e e h o u r s a f t e r h a t c h i n g . A t t h i s t i m e c e l l d i v i s i o n i s r e i n i t i a t e d . W i t h i n t h e n e x t 10 h o u r s , many o f t h e c e l l s t h a t w i l l c o m p r i s e t h e a d u l t n e r v o u s s y s t e m a r e g e n e r a t e d . 16 The t o u c h r e c e p t o r s AVM and PVM a r i s e d u r i n g t h i s t i m e , as do t h e v e n t r a l A, v e n t r a l B, v e n t r a l D, and AS m o t o r n e u r o n s . A l t h o u g h t h e s e new c e l l s a r e b o r n a t t h i s t i m e , t h e y a r e n o t n e c e s s a r i l y f u n c t i o n a l . Some s t r u c t u r a l c h a n g e s ( s u c h a s t h e r e w i r i n g o f t h e DD n e u r o n s ) may be e s s e n t i a l l y c o m p l e t e by t h e o n s e t o f t h e s e c o n d l a r v a l m o l t ( e g . , s e e W h i t e e t a l , 1 9 7 8 ) . However, o t h e r s may n o t be c o m p l e t e u n t i l as l a t e a s t h e f o u r t h l a r v a l m o l t ; some n e u r o n s , s u c h a s t h e AVM n e u r o n , may n e e d t o m i g r a t e a n d e x t e n d p r o c e s s e s t o t h e i r a p p r o p r i a t e t a r g e t s b e f o r e b e c o m i n g f u n c t i o n a l ( s e e W a l t h a l l & C h a l f i e , 1 9 8 8 ) . The o c c u r r e n c e o f s u c h l a r g e c h a n g e s i n t h e n e u r a l c i r c u i t w o u l d seem i n d i c a t e t h a t t h e r e s h o u l d be c o r r e s p o n d i n g l y l a r g e c h a n g e s i n b e h a v i o u r . However, t h i s i s a p p a r e n t l y n o t t h e c a s e : b o t h t h e h e a d a n d t h e t a i l t o u c h w i t h d r a w a l r e f l e x a r e o b s e r v e d a t a l l l a r v a l s t a g e s ( C h a l f i e & S u l s t o n , 1 9 8 1 ) . The e x p e r i m e n t s r e p o r t e d h e r e a d d r e s s t h e p o s s i b i l i t y t h a t c o n n e c t i v i t y c h a n g e s i n t h e t o u c h c i r c u i t m i g h t be r e f l e c t e d i n o t h e r b e h a v i o u r s m e d i a t e d by t h e c i r c u i t , s u c h a s s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s and t h e t a p r e v e r s a l r e f l e x . To d a t e n e i t h e r o f t h e s e b e h a v i o u r s h a v e b e e n e x a m i n e d w i t h r e s p e c t t o d e v e l o p m e n t . T h e s e e x p e r i m e n t s were t h e r e f o r e d e s i g n e d t o t e s t f o r d e v e l o p m e n t a l d i f f e r e n c e s i n s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s and i n t h e t a p r e v e r s a l r e f l e x . 17 G e n e r a l M e t h o d s A n i m a l s C. e l e q a n s B r i s t o l ( s t r a i n N2) were m a i n t a i n e d a t room t e m p e r a t u r e (20 ± 2° C) on E. c o l i ( s t r a i n O p 5 0 ) ~ s e e d e d NGM a g a r ( a s d e s c r i b e d by B r e n n e r , 1 9 7 4 ) . A l l a n i m a l s w e re t e s t e d i n t h e f i r s t f i v e h o u r s o f e a c h l a r v a l s t a g e , a nd a t v a r i o u s a g e s i n t h e a d u l t a n i m a l . J u v e n i l e a n i m a l s w e r e t h u s t e s t e d i n e a r l y L I , L 2 , L 3 , and L 4 ; a d u l t a n i m a l s i m m e d i a t e l y a f t e r t h e f i n a l m o l t ( a t 55-60 h o u r s ; t h e "young a d u l t " s t a g e ) , and a t 4 d a y s , when most a n i m a l s h a v e r e a c h e d t h e i r p e a k r a t e o f e g g - l a y i n g . The L I a n i m a l s w e r e t e s t e d w i t h i n t h e f i r s t t h r e e h o u r s o f h a t c h i n g , as c e l l d i v i s i o n r e s u m e s 3 h o u r s a f t e r h a t c h i n g ( S u l s t o n , 1 9 8 8 ) . E s t a b l i s h m e n t o f S y n c h r o n o u s C o l o n i e s a n d V e r i f i c a t i o n o f S t a g e s I n o r d e r t o e n s u r e t h a t t h e a n i m a l s t e s t e d were t h e same age, s y n c h r o n o u s c o l o n i e s w e r e e s t a b l i s h e d by a l l o w i n g s e v e r a l g r a v i d a d u l t s t o l a y eggs on E. c o l i -s e e d e d p l a t e s f o r 30 t o 90 m i n u t e s . As t h e y o u n g e s t a n i m a l s a r e a l m o s t i n v i s i b l e i n t h i c k b a c t e r i a , c o l o n i e s f o r L I a n i m a l s w e re e s t a b l i s h e d on p l a t e s d o t t e d w i t h b a c t e r i a j u s t p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f a d u l t s . The h o u r s g i v e n i n F i g u r e 1 s e r v e d as r o u g h g u i d e s t o t h e d e v e l o p m e n t o f t h e a n i m a l s . However, g i v e n t h a t t h e t e m p e r a t u r e s u n d e r w h i c h t h e s e a n i m a l s w e re k e p t were 18 s u b j e c t t o s m a l l f l u c t u a t i o n s , o t h e r m e t h o d s w e r e u s e d t o v e r i f y s t a g e s . T h e s e i n c l u d e d c h e c k i n g t h e a n i m a l s f o r h a t c h i n g o r l e t h a r g u s ( d e f i n e d by i n a c t i v i t y a n d l a c k o f p h a r y n g e a l pumping i n t h e m a j o r i t y o f t h e a n i m a l s w i t h i n a c o l o n y ) p r i o r t o t h e e x p e c t e d t i m e o f m o l t i n g , a s w e l l as m a k i n g v i s u a l c h e c k s f o r f e a t u r e s c h a r a c t e r i s t i c o f p a r t i c u l a r s t a g e s a nd t i m e s . S i z e c o n s i s t e n c y was a l s o c h e c k e d u s i n g a g r a d i c u l e (a measurement d e v i c e i n s e r t e d i n t o one o f t h e m i c r o s c o p e e y e p i e c e s ) . C h a r a c t e r i s t i c s o f D e v e l o p m e n t a l S t a g e s L I a n i m a l s . N e w l y h a t c h e d L I a n i m a l s a r e a p p r o x i m a t e l y 200 jim l o n g . U n d e r t h e d i s s e c t i n g l i g h t m i c r o s c o p e , t h e y a r e c o m p l e t e l y t r a n s p a r e n t , w i t h no v a r i a t i o n i n body c o l o u r i n g , a nd c a n be d i s t i n g u i s h e d f r o m o l d e r L i s by t h e i r t o r p e d o - l i k e s h a p e . S l i g h t l y o l d e r L i s a r e more c y l i n d r i c a l . L2 a n i m a l s . L2 a n i m a l s a r e a p p r o x i m a t e l y 370 urn l o n g a t t h e t i m e o f t h e f i r s t m o l t ( B y e r l y e t a l , 1 9 7 6 ) . The h e a d o f t h e a n i m a l i s t r a n s p a r e n t , and t a k e s up a p p r o x i m a t e l y o n e - t h i r d o f t h e a n i m a l ' s b ody l e n g t h . The r e s t o f t h e body i s d a r k l y c o l o u r e d , w i t h t h e f u t u r e g o n a d a p p e a r i n g a s a n a r r o w w h i t e o v a l a p p r o x i m a t e l y o n e - t h i r d o f t h e a n i m a l ' s b ody l e n g t h f r o m t h e t a i l . L3 a n i m a l s . A f t e r t h e s e c o n d m o l t , L3 a n i m a l s a r e a p p r o x i m a t e l y 480 \xm l o n g ( B y e r l y e t a l , 1976) . Newly-m o l t e d L3 a n i m a l s a r e c l e a r (no d a r k body c o l o u r i n g ) and f a i n t l y m o t t l e d a l o n g t h e i r l e n g t h s . As L3 a n i m a l s become 19 o l d e r , t h e b ody p o s t e r i o r t o t h e p h a r y n g e a l b u l b becomes d a r k l y c o l o u r e d , a l t h o u g h t h e h e a d r e m a i n s c l e a r and l i g h t - c o l o u r e d . The g o n a d i s t h i n , f l a t , a n d s l i g h t l y e l o n g a t e d i n a p p e a r a n c e , a s h o r t w h i t e l i n e on one s i d e o f t h e a n i m a l . L4 a n i m a l s . S h o r t l y p r i o r t o t h e t h i r d m o l t , L3 a n i m a l s l o s e t h e i r d a r k c o l o u r i n g and become t r a n s p a r e n t a g a i n . A f t e r s h e d d i n g t h e i r L 3 c u t i c l e s , t h e 640 jim l o n g ( B y e r l y e t a l , 1976) L 4 s a r e t r a n s p a r e n t f o r a s h o r t t i m e b u t r e g a i n t h e i r d a r k body c o l o u r i n g s o o n a f t e r . The l i g h t - c o l o u r e d h e a d a p p e a r s t o t a k e up a b o u t o n e - f i f t h o f t h e a n i m a l ' s b o d y l e n g t h , and t h e p h a r y n g e a l b u l b i s c l e a r l y v i s i b l e . The g o n a d a p p e a r s as a l a r g e w h i t e c r e s c e n t w i t h i t s f l a t e n d a p p o s e d t o t h e l o c a t i o n o f t h e f u t u r e v u l v a . I n e a r l y L 4 s , t h e g o n a d a p p e a r s a s a t i g h t , r o u n d s e m i c i r c l e a g a i n s t a g r a y i s h body; i n o l d e r L 4 s , t h e g o n a d r e s e m b l e s a w i d e a n d f l a t t e n e d q u a r t e r - m o o n a g a i n s t a b l a c k i s h body. Young a d u l t a n i m a l s ( Y A P ) . A f t e r t h e f i n a l l a r v a l m o l t , y o u n g a d u l t a n i m a l s a r e a p p r o x i m a t e l y 850 nm l o n g ( B y e r l y e t a l , 1 9 7 6 ) . They h a v e n o r m a l a d u l t p r o p o r t i o n s , w i t h t h e h e a d ( p o r t i o n o f t h e body a n t e r i o r t o and i n c l u d i n g t h e p h a r y n g e a l b u l b ) t a k i n g up a p p r o x i m a t e l y o n e - f i f t h o f t h e body. The v u l v a h a s o p e n e d t o t h e o u t s i d e ; h o w e v e r , no e g g s a r e v i s i b l e a nd t h e a n i m a l i s s t i l l t r a n s p a r e n t . 20 A d u l t s . F o u r d a y o l d a d u l t s (4D) c a n be d i s t i n g u i s h e d f r o m y o u n g a d u l t s by t h e i r d a r k e r c o l o u r i n g and l a r g e s i z e (1 mm and l a r g e r ) . R i p e n i n g eggs a r e v i s i b l e i n t h e a n i m a l ' s u t e r u s ; t h e s e e g g s a r e g r a y i s h u n d e r t h e l i g h t m i c r o s c o p e . A d u l t s c o n t i n u e t o g r o w t h r o u g h o u t t h e r e s t o f t h e l i f e s p a n , a n d t h e i r i n t e s t i n e s a p p e a r t o become m o t t l e d w i t h d a r k , b l a c k i s h p i g m e n t a s t h e y age. M a l e s . M a l e s a r i s e s p o n t a n e o u s l y i n p o p u l a t i o n s a p p r o x i m a t e l y o n c e e v e r y 1000 a n i m a l s a t 20° C ( H o d g k i n , H o r v i t z , & B r e n n e r , 1979; Rose a nd B a i l l i e , 1 9 7 9 ) . As o n l y h e r m a p h r o d i t e s were u s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s , any m a l e s f o u n d i n t h e s t o c k a n d s u b j e c t p o p u l a t i o n s w e re removed. T h i s c a n be done v i s u a l l y a f t e r t h e L3 s t a g e , due t o t h e m a l e ' s d i s t i n c t i v e t a i l s h a p e . A d u l t m a l e s a r e d i s t i n g u i s h a b l e by t h e i r s p a d e - s h a p e d t a i l s . A n i m a l s t e s t e d a t L 3 o r e a r l i e r , h o w e v e r , were m a i n t a i n e d on t h e i r o r i g i n a l t e s t p l a t e s w i t h b a c t e r i a u n t i l t h e i r s e x c o u l d be f i r m l y e s t a b l i s h e d . A p p a r a t u s a n d G e n e r a l T e c h n i q u e F o r a l l e x p e r i m e n t s , o b s e r v a t i o n s were made t h r o u g h a W i l d M3Zoom s t e r e o m i c r o s c o p e e q u i p p e d w i t h a p h o t o t u b e f o r v i d e o t a p i n g ( s e e F i g u r e 3 ) . A l l o b s e r v a t i o n s w e re made u n d e r b r i g h t f i e l d i l l u m i n a t i o n a n d v i d e o t a p e d u s i n g a P a n a s o n i c D5000 l o w - l i g h t , h i g h - r e s o l u t i o n v i d e o c amera. To f a c i l i t a t e s c o r i n g , t h e d a t e , t i m e , and t i m e e l a p s e d f o r i n d i v i d u a l a n i m a l s were s u p e r i m p o s e d on t h e v i d e o t a p e d 21 F i g u r e 3. A p p a r a t u s u s e d f o r s t u d i e s o f b e h a v i o u r i n C. e l e g a n s . Top d e p i c t s m i c r o s c o p e w i t h v i d e o r e c o r d i n g e q u i p m e n t and s t i m u l u s g e n e r a t o r ; b o t t o m shows d e t a i l o f p l a t e h o l d e r a n d t a p p e r . See G e n e r a l M e t h o d s f o r d e t a i l e d d e s c r i p t i o n . 22 23 r e c o r d u s i n g a P a n a s o n i c WJ810 t i m e - d a t e g e n e r a t o r . A n i m a l s w e r e r e m o v e d f r o m p l a t e s f o r t e s t i n g w i t h a f i n e h a i r ( t h i c k e r h a i r s were u s e d f o r l a r g e r a n i m a l s ) a nd t r a n s f e r r e d t o a b a c t e r i a - f r e e p l a t e (a 5 cm d i a m e t e r P e t r i e p l a t e ) c o n t a i n i n g 10 mL o f NGM a g a r . T h e s e p l a t e s w e r e t h e n p l a c e d w i t h i n a h o l d e r m o u n t e d i n a M a r z h a u s e r MM33 m i c r o m a n i p u l a t o r on a m a g n e t i c b a s e . The h o l d e r a l l o w e d t h e d i s h t o v i b r a t e f r e e l y when t a p p e d , w h i l e s t i l l a l l o w i n g s m o o t h t r a c k i n g o f t h e a n i m a l d u r i n g v i d e o t a p i n g . I n E x p e r i m e n t s 2 and 3, t a p s w e re d e l i v e r e d u s i n g a m e c h a n i c a l t a p p e r m ounted i n a s e p a r a t e m i c r o m a n i p u l a t o r . The number and r a t e o f t a p s was c o n t r o l l e d w i t h a G r a s s S88 s t i m u l a t o r . S c o r i n g I n E x p e r i m e n t 1 v i d e o t a p e d r e c o r d s w e re s c o r e d f o r t o t a l number o f s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s a n d p e r c e n t o f t i m e a c t i v e . I n E x p e r i m e n t s 2 and 3 t h e r e c o r d s w e re s c o r e d f o r f r e q u e n c i e s o f s p e c i f i c r e s p o n s e t y p e s a nd m a g n i t u d e s o f r e s p o n s e s o b s e r v e d . The m e t h o d s o f s c o r i n g a r e d e s c r i b e d b e l o w . Numbers o f S p o n t a n e o u s R e v e r s a l s . When c o u n t i n g numbers o f s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s i n E x p e r i m e n t 1, t h e a n i m a l was s a i d t o be r e v e r s i n g i f b a c k w a r d - p r o p a g a t i n g ( h e a d t o t a i l ) waves were s e e n p a s s i n g down t h e a n i m a l ' s body. T h i s n o r m a l l y r e s u l t e d i n t h e a n i m a l ' s b a c k w a r d movement; h o w e v e r , some o f t h e s m a l l e r a n i m a l s ( L i s i n p a r t i c u l a r ) w e r e o c c a s i o n a l l y u n s u c c e s s f u l i n m o v i n g 24 b a c k w a r d ( s o m e t i m e s t h e a n t e r i o r p a r t o f t h e a n i m a l a p p e a r e d t o "bunch up" i n f r o n t o f t h e t a i l ) . E a c h c o n t i n u o u s b o u t o f b a c k w a r d - p r o p a g a t i n g waves was c o u n t e d a s one r e v e r s a l . P e r c e n t Time A c t i v e . I n E x p e r i m e n t 1, t h e amount o f t i m e s p e n t a c t i v e i n t h e o b s e r v a t i o n p e r i o d was s c o r e d t o t h e n e a r e s t s e c o n d u s i n g a s t o p w a t c h . O n l y t h o s e p e r i o d s i n w h i c h b a c k w a r d - o r f o r w a r d - p r o p a g a t i n g waves were p a s s i n g down t h e a n i m a l ' s body were c o u n t e d as " a c t i v e " p e r i o d s (momentary p a u s e s c a u s e d by t r a n s i t i o n s f r o m b a c k w a r d t o f o r w a r d movement w e r e i g n o r e d ) . T h o s e p e r i o d s i n w h i c h an a n i m a l r e m a i n e d s t a t i o n a r y w i t h o u t u n d u l a t i o n were s c o r e d as i n a c t i v e p e r i o d s , e v e n i f t h e a n i m a l moved i t s h ead o c c a s i o n a l l y : movements i n v o l v i n g o n l y t h a t p o r t i o n o f t h e body i m m e d i a t e l y a n t e r i o r t o t h e p h a r y n x were t h u s i g n o r e d i f u n a c c o m p a n i e d by waves o f c o n t r a c t i o n i n v o l v i n g t h e r e s t o f t h e body. The number o f s e c o n d s a c t i v e was t h e n c o n v e r t e d t o a p e r c e n t a g e o f t h e t o t a l number o f s e c o n d s i n t h e o b s e r v a t i o n p e r i o d . R e s p o n s e T y p e . R e s p o n s e s t o t a p and t o u c h i n E x p e r i m e n t s 2 and 3 f e l l i n t o one o f two m a j o r c a t e g o r i e s : (1) r e v e r s a l s ( f o r d e f i n i t i o n , s e e Numbers o f S p o n t a n e o u s R e v e r s a l s , a b o v e ) , and (2) a c c e l e r a t i o n s , d e f i n e d as i n c r e a s e s i n swimming s p e e d r e l a t i v e t o t h e a v e r a g e s p e e d o f t h e a n i m a l 2 s e c o n d s p r i o r t o t h e s t i m u l u s . O n l y r e s p o n s e s o c c u r r i n g w i t h i n 1 s e c o n d o f s t i m u l u s c o m p l e t i o n 25 were c o u n t e d . I n c a s e s i n w h i c h b o t h t y p e s o f r e s p o n s e s o c c u r r e d w i t h i n a s i n g l e s e c o n d , t h e r e s p o n s e was c l a s s i f i e d as w h a t e v e r t y p e o c c u r r e d f i r s t . R e s p o n s e s t h a t f e l l i n t o n e i t h e r o f t h e r e v e r s a l o r a c c e l e r a t i o n c a t e g o r i e s b u t were c l e a r l y r e s p o n s e s t o t h e s t i m u l u s were c l a s s i f i e d as " o t h e r " , a s w e r e r e s p o n s e s i n w h i c h no d e t e c t a b l e change i n b e h a v i o u r o c c u r r e d . M a g n i t u d e . M a g n i t u d e s o f r e s p o n s e s i n E x p e r i m e n t s 2 and 3 were o b t a i n e d by t r a c i n g t h e p a t h s t r a v e l l e d by a n i m a l s o n t o a c e t a t e s h e e t s w i t h t h e a i d o f s t o p - f r a m e v i d e o a n a l y s i s . As a n i m a l s o f v a r i o u s s t a g e s w e r e f i l m e d a t d i f f e r e n t m a g n i f i c a t i o n s , t h e l e n g t h o f t h e v i d e o image o f e a c h a n i m a l ' s body was a l s o t r a c e d , and a l l m e a s u r e m e n t s e x p r e s s e d i n t e r m s o f t h e a n i m a l ' s own body l e n g t h . Thus t h e m e a s u r e o f r e s p o n s e m a g n i t u d e was d i s t a n c e t r a v e l l e d r e l a t i v e t o body s i z e ( d i s t a n c e t r a v e l l e d / body l e n g t h ) , a l l o w i n g an e x a m i n a t i o n o f t h e e f f e c t s o f s t a g e on r e s p o n d i n g r a t h e r t h a n t h e e f f e c t s o f body s i z e (an L I a n i m a l t r a v e r s i n g t h e a c t u a l d i s t a n c e c o v e r e d by two a d u l t body l e n g t h s t r a v e l s a d i s t a n c e e q u i v a l e n t t o 8 t o 10 t i m e s i t s own body l e n g t h ) . R e v e r s a l s w e r e s c o r e d by t r a c i n g t h e p a t h t r a v e l l e d by t h e h e a d o f t h e a n i m a l i m m e d i a t e l y f o l l o w i n g t h e end o f t h e s t i m u l u s . A r e v e r s a l e n d e d when t h e a n i m a l e i t h e r s t o p p e d o r c h a n g e d d i r e c t i o n , r e s u m i n g f o r w a r d m o t i o n . A c c e l e r a t i o n s w e re s c o r e d by t r a c i n g t h e p a t h t r a v e l l e d by t h e t a i l o f t h e a n i m a l i m m e d i a t e l y f o l l o w i n g 26 t h e s t i m u l u s . A m e asure o f t h e p r e - s t i m u l u s s p e e d was o b t a i n e d by t r a c i n g t h e p a t h t r a v e l l e d by t h e a n i m a l ' s t a i l 2 s e c o n d s p r i o r t o t h e o n s e t o f t h e s t i m u l u s and a v e r a g i n g t h e d i s t a n c e t r a v e l l e d f o r t h e two s e c o n d s . B o t h r e c o r d s w e re m a r k e d i n i n t e r v a l s o f one h a l f s e c o n d t o d e t e r m i n e c h a n g e s i n s p e e d . An a c c e l e r a t i o n was j u d g e d t o have o c c u r r e d i f t h e d i s t a n c e t r a v e l l e d i n e i t h e r i n t e r v a l i n t h e s e c o n d i m m e d i a t e l y f o l l o w i n g t h e s t i m u l u s e x c e e d e d t h e a v e r a g e d i s t a n c e t r a v e l l e d p e r i n t e r v a l i n t h e 2 s e c o n d s p r i o r t o t h e s t i m u l u s . The b e g i n n i n g o f t h e a c c e l e r a t i o n was d e f i n e d as t h e i n t e r v a l i n w h i c h t h i s i n c r e a s e i n s p e e d o c c u r r e d . The end o f t h e a c c e l e r a t i o n was d e f i n e d as t h e i n t e r v a l a f t e r w h i c h t h e a n i m a l e i t h e r s t o p p e d , c h a n g e d d i r e c t i o n , o r d e c r e a s e d i t s s p e e d f o r two c o n s e c u t i v e i n t e r v a l s t o a s p e e d l e s s t h a n o r e q u a l t o e i t h e r (a) t h e a v e r a g e s p e e d i t was t r a v e l l i n g i n t h e 2 s e c o n d s p r i o r t o t h e s t i m u l u s o r (b) h a l f t h e s p e e d o f t h e f i r s t i n t e r v a l o f t h e a c c e l e r a t i o n , w h i c h e v e r o c c u r r e d f i r s t . The t i m e e l a p s e d b e t w e e n t h e b e g i n n i n g and end o f t h e a c c e l e r a t i o n was a l s o r e c o r d e d f o r e a c h a c c e l e r a t i o n . L e n g t h s o f t h e p a t h s t r a v e l l e d by a n i m a l s i n e i t h e r a c c e l e r a t i o n s o r r e v e r s a l s w e r e o b t a i n e d by r e t r a c i n g t h e t r a c i n g s on a d i g i t i z i n g pad ( S u m m a g r a p h i c s B i t P a d P l u s ) , w h i c h t r a n s f e r r e d t h e image i n t o a M a c i n t o s h SE 27 m i c r o c o m p u t e r . The l e n g t h s o f t h e images w e r e t h e n c omputed u s i n g M a c M e a s u r e , a p r o g r a m s u i t a b l e f o r m e a s u r i n g t h e l e n g t h s o f i r r e g u l a r c u r v e s . S t a t i s t i c a l A n a l y s e s Two b a s i c t y p e s o f m e a s u r e m e n t s were o b t a i n e d i n t h e e x p e r i m e n t s : r a t i o a n d c a t e g o r i c a l m e a s u r e m e n t s . Numbers o f s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s , p e r c e n t s o f t i m e a c t i v e , a n d r e s p o n s e m a g n i t u d e s were r a t i o m e a s u r e m e n t s ; f r e q u e n c i e s o f r e s p o n s e t y p e w e re c a t e g o r i c a l m e a s u r e m e n t s . R a t i o M e a s u r e m e n t s . I n o r d e r t o t e s t f o r a g e - r e l a t e d c h a n g e s i n t h e s e t y p e s o f m e a s u r e m e n t s , a n a l y s e s o f v a r i a n c e (ANOVAs) were u s e d f o r t h e i n i t i a l a n a l y s e s o f t h e d a t a . The ANOVA a l l o w s one t o d e c i d e w h e t h e r d i f f e r e n c e s o b s e r v e d b e t w e e n g r o u p s a r e l a r g e e n o u g h t o be a t t r i b u t a b l e t o t h e f a c t o r ( e . g . , s t a g e ) b e i n g t e s t e d , r a t h e r b e i n g a t t r i b u t a b l e t o t h e k i n d o f v a r i a t i o n t h a t o c c u r s w i t h i n a l l g r o u p s r e g a r d l e s s o f t r e a t m e n t . ( f o r d i s c u s s i o n , s e e B a i l e y , 1981, pp. 99-114; G l a s s & H o p k i n s , 1984, pp. 3 2 4 - 3 5 9 ) . The t e s t s t a t i s t i c , F, i s a r a t i o o f t h e amount o f v a r i a t i o n p r e s e n t a t t r i b u t a b l e t o t h e f a c t o r b e i n g t e s t e d t o t h e amount o f v a r i a t i o n a t t r i b u t a b l e t o e r r o r . ANOVAs c a n be m o d i f i e d t o s u i t t h e e x p e r i m e n t a l d e s i g n , t h e p r i m a r y change b e i n g i n c o m p o s i t i o n o f t h e e r r o r t e r m . As t h e ANOVA t e s t s a l l g r o u p s s i m u l t a n e o u s l y , a s i g n i f i c a n t v a l u e f o r F i n d i c a t e s o n l y t h a t a d i f f e r e n c e b e t w e e n g r o u p means e x i s t s , n o t where a d i f f e r e n c e o c c u r s . 28 F o r most a n a l y s e s , any t e s t r e a c h i n g s i g n i f i c a n c e w i t h a p r o b a b i l i t y o f t y p e I e r r o r o f .05 o r l e s s was f o l l o w e d w i t h an a p p l i c a t i o n o f t h e Newman-Keuls m e t h o d f o r m a k i n g m u l t i p l e p a i r w i s e c o m p a r i s o n s b e t w e e n means. An a l t e r n a t i v e m e t hod, t r e n d a n a l y s i s , was u s e d i n E x p e r i m e n t 3 t o t e s t r e s p o n s e m a g i t u d e s t o s t i m u l i o f g r a d e d m a g n i t u d e . T h i s t e s t , w h i c h g e n e r a t e s F - s t a t i s t i c s , i s u s e d i n t h o s e s i t u a t i o n s i n w h i c h t h e r e i s a c o n t i n u u m u n d e r l y i n g t h e i n d e p e n d e n t v a r i a b l e , and one i s i n t e r e s t e d i n d e t e r m i n i n g w h e t h e r t h e v a r i a t i o n p r e s e n t c a n be a t t r i b u t e d t o s p e c i f i c t r e n d a c r o s s l e v e l s o f t h e i n d e p e n d e n t v a r i a b l e . ( F o r d i s c u s s i o n o f t h e Newman-K e u l s , t r e n d a n a l y s i s , and b a s i c r a t i o n a l e f o r c h o o s i n g m u l t i p l e c o m p a r i s o n s , s e e G l a s s and H o p k i n s , 1984, pp. 3 68-392, and i n p a r t i c u l a r pp. 374-376, 3 9 6 - 3 9 1 ) . C a t e g o r i c a l D a t a . As c o u n t s o f r e s p o n s e t y p e s were c a t e g o r i c a l d a t a , t h e y c o u l d n o t be a n a l y z e d u s i n g an a n a l y s i s o f v a r i a n c e . I n s t e a d , c o n t i n g e n c y t a b l e s w e re c o n s t r u c t e d f o r t h e d a t a a n a l y z e d and c h i - s q u a r e d t e s t s o f a s s o c i a t i o n ( G l a s s &. H o p k i n s , 1984, pp. 285-289) a p p l i e d t o p r o p o r t i o n s o f r e v e r s a l s and a c c e l e r a t i o n s o b s e r v e d w i t h r e s p e c t t o t h e s t a g e s t e s t e d . T h i s t e s t i s s i m i l a r t o t h e a n a l y s i s o f v a r i a n c e i n t h a t i t t e s t s t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e r e e x i s t no d i f f e r e n c e s b e t w e e n g r o u p s i n t h e p r o p o r t i o n o f i n d i v i d u a l s e x h i b i t i n g a g i v e n a t t r i b u t e . No t h e o r e t i c a l v a l u e s f o r t h e p r o p o r t i o n s 29 e x p e c t e d a r e assumed; r a t h e r , e x p e c t e d f r e q u e n c i e s a r e c a l c u l a t e d b a s e d on t h e d a t a a c t u a l l y o b t a i n e d . T h i s t e s t w o r k s w e l l e v e n when t h e a v e r a g e e x p e c t e d f r e q u e n c y o f t h e r e s p o n s e i n a c e l l i s as low a s 2 ( s e e n o t e s i n G l a s s & H o p k i n s , 1984, p. 2 8 8 ) . As w i t h t h e F - t e s t f o r t h e ANOVA, a s i g n i f i c a n t t e s t s t a t i s t i c ( x 2 ) i n d i c a t e s o n l y t h a t a s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e e x i s t s b e t w e e n p r o p o r t i o n s o b s e r v e d i n a c o n t i n g e n c y t a b l e , w i t h no i n d i c a t i o n a s t o w h i c h p r o p o r t i o n s c a n a c t u a l l y be c o n s i d e r e d d i f f e r e n t . S i g n i f i c a n t (JD < .05) c h i - s q u a r e v a l u e s were t h u s f o l l o w e d w i t h m u l t i p l e p a i r w i s e c o m p a r i s o n s b e t w e e n t h e p r o p o r t i o n s o b s e r v e d ( s e e G l a s s & H o p k i n s , 1984, pp. 3 9 1 - 3 9 2 ) . T h e s e t e s t s compare t h e v a r i a n c e o f t h e p r o p o r t i o n s t e s t e d i n t h e c o n t r a s t w i t h t h e e x p e c t e d v a r i a n c e o f t h e c o n t r a s t , t h e r a t i o h a v i n g a c h i - s q u a r e d d i s t r i b u t i o n w i t h d e g r e e s o f f r e e d o m e q u a l t o one l e s s t h a n t h e number o f g r o u p s i n t h e d a t a s e t . C o n f i d e n c e i n t e r v a l s f o r t h e p r o p o r t i o n s were a l s o c o n s t r u c t e d , u s i n g c o n f i d e n c e i n t e r v a l t a b l e s g i v e n f o r b i n o m i a l p r o p o r t i o n s (pp. 2 80-281. G l a s s & H o p k i n s , 1 9 8 4 ) . E x p e r i m e n t 1: S p o n t a n e o u s R e v e r s a l s C. e l e g a n s shows a t l e a s t two t y p e s o f r e v e r s a l . One, d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , i s t h e r e f l e x r e v e r s a l : a r e v e r s a l t h a t o c c u r s i n r e s p o n s e t o m e c h a n i c a l 30 s t i m u l a t i o n . B o t h t h e h e a d t o u c h w i t h d r a w a l r e s p o n s e and t h e t a p r e v e r s a l r e f l e x a r e r e f l e x r e v e r s a l s . The o t h e r , s e e n f r e q u e n t l y i n a d u l t a n i m a l s , i s t h e s p o n t a n e o u s o r u n i n d u c e d r e v e r s a l . A d u l t a n i m a l s f r e q u e n t l y r e v e r s e d i r e c t i o n w h i l e swimming u n d i s t u r b e d on a b a r e a g a r s u r f a c e , and a l t h o u g h t h e y may be r e s p o n d i n g t o u n s e e n f a c t o r s i n t h e a g a r o r t o m i n u t e v i b r a t i o n s n o t d e t e c t a b l e by o b s e r v e r s , t h e r e s p o n s e i s n o t c a u s e d by any o b v i o u s e x o g e n o u s m e c h a n i c a l s t i m u l a t i o n . E v i d e n c e f r o m a n o t h e r i n v e r t e b r a t e s p e c i e s s u g g e s t s t h a t d e v e l o p m e n t a l c h a n g e s may be r e f l e c t e d i n t h e f r e q u e n c y o f s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s . R a n k i n e t a 1 ( R a n k i n , S t o p f e r , M a r c u s , & Carew, 1987) f o u n d t h a t j u v e n i l e A p l y s i a showed a h i g h f r e q u e n c y o f s p o n t a n e o u s c o n t r a c t i o n s o f t h e n e w l y d e v e l o p e d g i l l a n d s i p h o n . The f r e q u e n c y o f s p o n t a n e o u s c o n t r a c t i o n s d e c r e a s e d a s t h e a n i m a l s m a t u r e d . T h i s s u g g e s t s t h a t as new e l e m e n t s i n a c i r c u i t d e v e l o p , t h e r e may be a c o n c u r r e n t h i g h r a t e o f s p o n t a n e o u s a c t i v i t y i n t h o s e e l e m e n t s . I f t h i s r e f l e c t s a g e n e r a l p r i n c i p l e o f n e u r o n a l d e v e l o p m e n t and i t s e f f e c t upon b e h a v i o u r , t h e n p e r h a p s s i m i l a r i n c r e a s e s w i l l o c c u r i n t h e o c c u r r e n c e o f s p o n t a n e o u s a c t i v i t y i n t h e t o u c h c i r c u i t . The f i r s t e x p e r i m e n t was t h u s d e s i g n e d t o e x a m i n e t h e f r e q u e n c y o f s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s as t h e y o c c u r r e d o v e r d e v e l o p m e n t . 31 M e t h o d S u b j e c t s Ten a n i m a l s f o r e a c h o f t h e s i x d e v e l o p m e n t a l s t a g e s were u s e d (60 a n i m a l s i n t o t a l ) . P r o t o c o 1 S i n g l e a n i m a l s were t r a n s f e r r e d t o a t e s t p l a t e 3 m i n p r i o r t o f i l m i n g . The p l a t e was t h e n l e f t on t h e l i g h t e d m i c r o s c o p e s t a g e f o r t h e s e 3 m i n u t e s , a f t e r w h i c h t h e s e a n i m a l s were f i l m e d f o r 10 m i n u t e s u n d e r t h e same i l l u m i n a t i o n . F o r a l l e x p e r i m e n t s and a l l s t a g e s , t h e b r i g h t - f i e l d i l l u m i n a t i o n was h e l d a t a c o n s t a n t l e v e l . A n i m a l s a t e a c h s t a g e were f i l m e d a t m a g n i f i c a t i o n s a l l o w i n g t h e b e s t c o m b i n a t i o n o f r e s o l u t i o n and e a s e o f t r a c k i n g . I n o r d e r t o e q u a t e t h e amount o f t r a c k i n g r e q u i r e d b e t w e e n s t a g e s , m a g n i f i c a t i o n s g i v i n g a p p r o x i m a t e l y e q u i v a l e n t - s i z e d v i d e o s c r e e n i m a g e s were c h o s e n . S c o r i n g and S t a t i s t i c a l A n a l y s e s V i d e o t a p e s were s c o r e d f o r t o t a l number o f s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s ( i n t e n m i n u t e s ) and p e r c e n t o f t i m e s p e n t a c t i v e . O n e - f a c t o r b e t w e e n g r o u p s a n a l y s e s o f v a r i a n c e were u s e d t o a n a l y s e t h e d a t a . D e v e l o p m e n t a l s t a g e was s e t a s t h e b e t w e e n g r o u p s f a c t o r . R e s u l t s D e v e l o p m e n t a l s t a g e had a s i g n i f i c a n t e f f e c t on t h e mean number o f s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s o b s e r v e d d u r i n g t h e 1 0 - m i n u t e o b s e r v a t i o n p e r i o d ; F ( 5 , 54) = 4.84, p_ < .005. 3 2 Newman-Keuls posthoc multiple comparisons revealed that the young adult stage showed s i g n i f i c a n t l y larger numbers of reversals than any other age group (p_ < .05; see Figure 4) .The number of spontaneous reversals was s i m i l a r across a l l other stages tested. Animals of a l l stages were active for most of the ten minute observation period. The percentage of time an animal spent active showed a s i g n i f i c a n t e f f e c t of developmental stage; F(5, 54) = 3.106, p_ < .02. Multiple comparisons showed that the LI animals spent s i g n i f i c a n t l y less time active than any other stage (p_ < .05; see Figure 5) . Other developmental stages were not s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t from each other. Discussion Spontaneous reversals occur at similar rates across most developmental stages tested. However, in the hours immediately following the last larval molt, young adult animals show a greatly elevated tendency to engage in spontaneous reversals. This increase was not the result of a increase in locomotor a c t i v i t y in general, as a l l stages with the exception of LI were active for approximately the same percentage of time. Interestingly, i t is at approximately th i s stage (about 40 hours post-hatch) that Chalfie and Sulston (1981) report that the AVM-ALM connections become functional. 33 F i g u r e 4. T o t a l number o f s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s i n t e n m i n u t e s , a l l d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . B l a c k b a r s i n d i c a t e mean number o f s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s s e e n d u r i n g a 10 m i n u t e o b s e r v a t i o n p e r i o d f o r e a c h s t a g e t e s t e d . O n l y t h e y o u n g a d u l t s t a g e (*) was s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e o t h e r s t a g e s t e s t e d . Means a r e p r e s e n t e d w i t h s t a n d a r d e r r o r s ( w h i c h i n t h e c a s e o f t h e ANOVA, i s * V M S p / n' t h e s q u a r e r o o t o f {the a v e r a g e d s t a n d a r d d e v i a t i o n / rty ; s e e G l a s s & H o p k i n s , 1984, pp. 217, 233, 436, f o r d i s c u s s i o n o f s t a n d a r d e r r o r s ) . Mean Number Spontaneous Reversals L1 L2 L3 L4 YAD 4D developmental stage 35 F i g u r e 5. Mean p e r c e n t t i m e a c t i v e i n 10 m i n u t e o b s e r v a t i o n p e r i o d , ± s t a n d a r d e r r o r s . L I a n i m a l s (*) s p e n d s i g n i f i c a n t l y l e s s t i m e a c t i v e t h a n t h e o t h e r d e v e l o p m e n t a l s t a g e s t e s t e d , w i t h t h e e x c e p t i o n o f L 2 . 36 Mean Percent Time Active developmental stage 37 It i s p o s s i b l e that the change i n spontaneous r e v e r s a l f requency i s due to a neuroanatomica1 change m a n i f e s t i n g i t s e l f i n b e h a v i o u r . However, i t i s d i f f i c u l t to say whether the observed change i s the d i r e c t r e s u l t of c o n n e c t i v i t y changes o c c u r i n g i n the c i r c u i t m e d i a t i n g r e v e r s a l s , or the r e s u l t of another f a c t o r , such as a change i n sensory t h r e s h o l d . One method of a d d r e s s i n g t h i s problem i s to examine r e f l e x b e h a v i o u r s i n which the source of the s t i m u l u s f o r r e v e r s a l i s c l e a r l y i d e n t i f i e d and q u a n t i f i a b l e . Experiment 2: R e f l e x R e v e r s a l s to Touches and Taps In the a d u l t , both tap and head touch e l i c i t the r e v e r s a l r e f l e x . A l though we h y p o t h e s i z e t h a t both s t i m u l i are a c t i n g upon the touch wi thdrawal c i r c u i t , i t i s p o s s i b l e tha t the two s t i m u l i are i n t e r a c t i n g w i t h the c i r c u i t i n s l i g h t l y d i f f e r e n t ways. As the tap opera te s by sending v i b r a t i o n s through the agar , i t may a c t u a l l y be s t i m u l a t i n g touch r e c e p t o r s i n both the head and the t a i l of the a n i m a l . The head touch s t i m u l a t e s the touch r e c e p t o r s i n the head a l o n e . Thus , i n the second experiment the responses e l i c i t e d by head touches were compared to those e l i c i t e d by taps a c r o s s deve lopmental s t a g e s . T h i s experiment was u s e f u l bo th i n d e t e r m i n i n g whether younger animals respond to the tap at a l l , and i n d e t e r m i n i n g whether responses d i f f e r e d 38 as a function of developmental stage. Method The general methods and apparatus for t h i s experiment are described under "General Methods". Detailed below are the relevant features of Experiment 2. Subjects Twenty animals were used for each of the s i x developmental stages ( t o t a l : 120 animals). Half the animals in each stage were randomly assigned to a "touch f i r s t " group, while the other half were assigned to a "tap f i r s t " group. This was done to control for order e f f e c t s . Protocol A l l animals were given two s t i m u l i , 7-15 minutes apart, one a gentle touch to the head of the animal, delivered using a fine hair glued to the needle of a 1 cc syringe; the other a single tap, delivered to the side of the dish with a mechanical tapper. Scoring and S t a t i s t i c a l Analyses Responses to touches and taps were scored for both response type and response magnitude. Frequencies of animals giving s p e c i f i c response types were analyzed using chi-squared tests of association to test for effects of developmental stage. Reversal and acceleration frequencies were analyzed separately. Magnitudes of responses (regardless of response type) were f i r s t analysed with a 2-factor repeated measures ANOVA with 39 d e v e l o p m e n t a l s t a g e as t h e b e t w e e n g r o u p s f a c t o r and s t i m u l u s t y p e a s t h e w i t h i n - g r o u p s f a c t o r , n e s t e d w i t h i n s t a g e (as e a c h a n i m a l i n a g i v e n d e v e l o p m e n t a l s t a g e was t e s t e d on i t s r e s p o n s e s t o b o t h t h e t o u c h a n d t h e t a p ) . R e s u I t s I n e x p e r i m e n t s w i t h a d u l t s , t a p s a l m o s t a l w a y s e l i c i t r e v e r s a l s . I n t h i s e x p e r i m e n t , l a r v a l a n i m a l s s o m e t i m e s r e v e r s e d t o t h e t a p , and s o m e t i m e s showed a p r e v i o u s l y u n d e s c r i b e d r e s p o n s e t o t a p , an a c c e l e r a t i o n . When a n i m a l s a c c e l e r a t e t o a t a p , t h e y t r a v e l f o r w a r d r a t h e r t h a n b a c k w a r d , m o v i n g f o r w a r d i f t h e y h a d b e e n s t a t i o n a r y p r i o r t o t h e s t i m u l u s , m o v i n g f a s t e r i f t h e y h a d been m o v i n g f o r w a r d . R e g a r d l e s s o f s t a g e , t h e s p e e d o f t h e a n i m a l p r i o r t o t h e s t i m u l u s was on a v e r a g e 4 3 . 3 % o f t h e s p e e d a t t a i n e d d u r i n g a c c e l e r a t i o n . R e s p o n s e F r e q u e n c i e s R e g a r d l e s s o f d e v e l o p m e n t a l s t a g e , h e a d t o u c h e s a l w a y s e l i c i t e d r e v e r s a l s f r o m a n i m a l s ( s e e F i g u r e 6 a ) . T h i s was n o t t h e c a s e f o r t a p s , w h i c h e l i c i t e d b o t h r e v e r s a l s and a c c e l e r a t i o n s ( s e e F i g u r e s 6a & 6 b ) . S e p a r a t e c h i - s q u a r e d t e s t s o f a s s o c i a t i o n w e r e a p p l i e d t o t h e r e v e r s a l a nd a c c e l e r a t i o n f r e q u e n c i e s e x h i b i t e d i n r e s p o n s e t o t a p s . I . F r e q u e n c y o f R e v e r s a l s . The p r o p o r t i o n o f a n i m a l s e x h i b i t i n g r e v e r s a l s i n r e s p o n s e t o t a p d i f f e r e d s i g n i f i c a n t l y a s a f u n c t i o n o f s t a g e ; x 2 ( 5 ) = 4 1 . 6 , p_ < .0001. T h e s e p r o p o r t i o n s and t h e i r a s s o c i a t e d c o n f i d e n c e 40 i n t e r v a l s a r e p l o t t e d i n F i g u r e 6 a . M u l t i p l e p a i r w i s e c o m p a r i s o n s o f t h e p r o p o r t i o n s i n d i c a t e d t h a t t h e 4 d a y o l d a d u l t s showed s i g n i f i c a n t l y h i g h e r p r o p o r t i o n s o f r e v e r s a l s t o t a p s t h a n a n y o f t h e l a r v a l s t a g e s . Young a d u l t s were s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m L 2 s and L 3 s . b u t n o t f r o m e i t h e r L i s o r L 4 s , a l t h o u g h b o t h p r o p o r t i o n s w e r e l o w e r t h a n t h a t o b s e r v e d f o r y o u n g a d u l t s . M u l t i p l e c o m p a r i s o n s r e v e a l e d no s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n l a r v a l s t a g e s . I I . F r e q u e n c i e s o f A c c e l e r a t i o n . The p r o p o r t i o n s o f a n i m a l s e x h i b i t i n g a c c e l e r a t i o n s i n r e s p o n s e t o t a p a r e p l o t t e d w i t h t h e i r a s s o c i a t e d c o n f i d e n c e i n t e r v a l s i n F i g u r e 6b. A c h i - s q u a r e d t e s t o f a s s o c i a t i o n on t h e p r o p o r t i o n o f a c c e l e r a t i o n s a s a f u n c t i o n o f s t a g e i n d i c a t e d a s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n s t a g e s ; X 2 (5) = 42.44, _p_ < .0001. M u l t i p l e p a i r w i s e c o m p a r i s o n s on t h e s e p r o p o r t i o n s i n d i c a t e d t h a t a l l l a r v a l s t a g e s showed s i g n i f i c a n t l y more a c c e l e r a t i o n s t h a n e i t h e r a d u l t s t a g e (p_ < .05 o r s m a l l e r ) , a l t h o u g h t h e h y p o t h e s i s t h a t L4 a n i m a l s were d i f f e r e n t f r o m y o u n g a d u l t s was n o t r e j e c t e d . I I I . O t h e r R e s p o n s e s . O n l y t e n o u t o f 120 a n i m a l s showed r e s p o n s e s t h a t were n o t c l e a r l y d e f i n e d a s e i t h e r a c c e l e r a t i o n s o r r e v e r s a l s . Of t h e s e , f i v e showed no o b s e r v a b l e r e s p o n s e t o t a p (1 a n i m a l o u t o f t h e 20 i n e a c h o f s t a g e s L I , L 2 , and YAD; 2 a n i m a l s o u t o f 20 i n L 4 ) , 41 F i g u r e 6. P r o p o r t i o n s o f a n i m a l s r e v e r s i n g a n d a c c e l e r a t i n g t o t a p and t o u c h s t i m u l i . E a c h b a r r e p r e s e n t s d a t a f o r 20 a n i m a l s ; e a c h a n i m a l was t e s t e d w i t h b o t h t a p a n d t o u c h . F i g u r e 6 ( a ) shows t h e p r o p o r t i o n s o f a n i m a l s r e v e r s i n g a t e a c h s t a g e t o t a p ( b l a c k b a r s ) and t o h e a d t o u c h ( h a t c h e d b a r s ) . F i g u r e 6 ( b ) shows p r o p o r t i o n o f a n i m a l s t h a t a c c e l e r a t e d t o t h e same s t i m u l i ( b l a c k b a r s , r e s p o n s e s t o t a p ; n o n - e x i s t e n t h a t c h e d b a r s , r e s p o n s e s t o t o u c h ) . A l l a n i m a l s a t a l l d e v e l o p m e n t a l s t a g e s r e v e r s e d t o h e a d t o u c h ; none a c c e l e r a t e d . P r o p o r t i o n s o f r e s p o n s e t y p e s t o t a p a r e d e p i c t e d w i t h 9 5 % c o n f i d e n c e i n t e r v a l s . B o t h a d u l t s t a g e s showed s i g n i f i c a n t l y h i g h e r p r o p o r t i o n s o f r e v e r s a l s and l o w e r p r o p o r t i o n s o f a c c e l e r a t i o n s t h a n l a r v a l s t a g e s (YAD (*) s i g n i f i c a n t l y more r e v e r s a l s a n d f e w e r a c c e l e r a t i o n s t h a n L I , L 2 , a n d L3 s t a g e s ; 4D (**) s i g n i f i c a n t l y more r e v e r s a l s a n d f e w e r a c c e l e r a t i o n s t h a n a l l l a r v a l s t a g e s . ) (a) Reversals to Tap and Touch 1.0 n en •5J 0.8 H > £ 0.6-c .2 0.4 H o Q. o 0.2 H 0.0 •+• • tap touch developmental stage (b) Accelerations to Tap and Touch 43 4 p a u s e d o r c e a s e d m o v i n g f o r more t h a n 1 s e c o n d f o l l o w i n g t h e t a p (1 a n i m a l i n L4; 2 i n 4 D ) , and 1 e x h i b i t e d a s l i g h t movement f o r w a r d f o l l o w e d by a r e v e r s a l t h a t o c c u r r e d j u s t b e y o n d t h e 1 s e c o n d c u t - o f f p o i n t (1 a n i m a l i n L 2 ) . As v e r y few o f t h e s e r e s p o n s e s f e l l i n t o t h e " o t h e r " c a t e g o r y , a n d as t h e y a p p e a r e d t o be d i s t r i b u t e d e v e n l y b e t w e e n g r o u p s , t h e f r e q u e n c i e s o f t h e s e r e s p o n s e s w e r e n o t a n a l y z e d . R e s p o n s e M a g n i t u d e s A l l m a g n i t u d e s were e x p r e s s e d as d i s t a n c e t r a v e l l e d r e l a t i v e t o t h e a n i m a l s ' own b o d y l e n g t h s . T h e r e was a s i g n i f i c a n t e f f e c t o f s t i m u l u s t y p e ( t a p v e r s u s t o u c h ) on t h e m a g n i t u d e s o f t h e r e s p o n s e s o b s e r v e d ; F ( l , 114) = 98.897. p_ < .0001. R e s p o n s e s t o t o u c h e s showed s i g n i f i c a n t l y l a r g e r r e l a t i v e m a g n i t u d e s t h a n r e s p o n s e s t o t a p s r e g a r d l e s s o f s t a g e ( o v e r a l l means and s t a n d a r d e r r o r s f o r t o u c h e s a n d t a p s w e re 2.33 ± 0.13 and 1.04 ± 0.13 body l e n g t h s r e s p e c t i v e l y ) . T h e r e were a l s o s i g n i f i c a n t age ( F ( 5 , 1 1 4 ) = 4.561; p_ < .0008) and age by s t i m u l u s i n t e r a c t i o n ( F ( l , 1 1 4 ) = 4.417; p_ < .001) e f f e c t s on r e s p o n s e m a g n i t u d e , b u t t h e s e e f f e c t s w e r e m a n i f e s t e d o n l y i n r e s p o n s e s t o t o u c h . As t h e a c t u a l m a g n i t u d e o f t o u c h was n e i t h e r c o n t r o l l e d n o r q u a n t i f i a b l e ( t o u c h e s were d e l i v e r e d by h a n d w i t h a n o n - c a l i b r a t e d h a i r ) , t h i s d i f f e r e n c e was n o t p u r s u e d . A d d i t i o n a l o n e - f a c t o r a n a l y s e s o f v a r i a n c e p e r f o r m e d on t h e r e v e r s a l s a n d a c c e l e r a t i o n s t o t a p showed no s i g n i f i c a n t e f f e c t s o f 44 s t a g e upon m a g n i t u d e s o f e i t h e r r e v e r s a l s o r a c c e l e r a t i o n s o b s e r v e d ; F ( 5 , 5 4 ) = 0.556, p_ > . 7 f o r r e v e r s a l s ; F ( 4 , 45) = 1.299, p_ > . 25 f o r a c c e l e r a t i o n s ) , n o r were t h e r e any d e t e c t a b l e d i f f e r e n c e s i n v e l o c i t y o r d u r a t i o n o f a c c e l e r a t i o n f o r any o f t h e s t a g e s t e s t e d ( F ( 4 , 45) = 0.283; p. > .85 f o r v e l o c i t y ; F ( 4 , 45) = 0.698, p > .5 f o r d u r a t i o n ) . D i s c u s s i o n As C h a l f i e and S u l s t o n (1981) f o u n d , b o t h l a r v a l and a d u l t a n i m a l s r e v e r s e d t o h e a d t o u c h a t a l l a g e s t e s t e d . T h i s was n o t t h e c a s e , h o w e v e r , w i t h r e s p o n s e s t o t a p . L a r v a l and a d u l t a n i m a l s d i f f e r e d s i g n i f i c a n t l y i n t h e i r t e n d e n c y t o r e v e r s e t o t a p s : y o u n g a d u l t s a n d 4 day o l d a d u l t s n e a r l y a l w a y s r e v e r s e d t o t a p s , w h e r e a s l a r v a l a n i m a l s were a l m o s t as l i k e l y t o a c c e l e r a t e a s r e v e r s e . The a c c e l e r a t i o n s w e r e an u n e x p e c t e d r e s p o n s e . I n a d u l t a n i m a l s , i n s t u d i e s o f n o n - a s s o c i a t i v e l e a r n i n g i n C. e l e g a n s , o n l y r e v e r s a l s h a d b e e n r e c o r d e d a s r e s p o n s e s t o t a p . O t h e r r e s p o n s e s a p p e a r e d o n l y i n f r e q u e n t l y , and some, s u c h as p a u s e s , t y p i c a l l y o c c u r r e d o nce t h e a n i m a l h a d b e e n h a b i t u a t e d . I t i s c l e a r f r o m t h i s d a t a , h o w e v e r , t h a t a c c e l e r a t i o n s a r e a s i g n i f i c a n t c l a s s o f r e s p o n s e s t o t h e t a p , a t l e a s t i n l a r v a l a n i m a l s . I t i s a l s o c l e a r f r o m t h e d a t a t h a t t o u c h e s and t a p s p r o d u c e d i f f e r e n t r e s p o n s e p a t t e r n s i n C. e l e g a n s . Not o n l y do t h e y e l i c i t d i f f e r e n t r e s p o n s e t y p e s a c r o s s 45 d e v e l o p m e n t a l s t a g e s , t h e y a l s o e l i c i t d i f f e r e n t m a g n i t u d e s o f r e s p o n s e r e g a r d l e s s o f d e v e l o p m e n t a l s t a g e . R e s p o n s e s t o t o u c h e l i c i t e d s i g n i f i c a n t l y l a r g e r m a g n i t u d e s o f r e s p o n s e t h a n d i d t a p s a c r o s s a l l d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . I n a d d i t i o n , r e s p o n s e m a g n i t u d e t o t o u c h showed an a p p a r e n t e f f e c t o f d e v e l o p m e n t a l s t a g e . However, i t i s d i f f i c u l t t o make s t a t e m e n t s a b o u t r e s p o n s e m a g n i t u d e s t o t o u c h as t h e m a g n i t u d e o f t h e t o u c h was n o t c o n t r o l l e d . The t a p , h o w e v e r , was o f u n i f o r m m a g n i t u d e . A n i m a l s g a v e a p p r o x i m a t e l y e q u i v a l e n t r e s p o n s e s t o t a p a c r o s s d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . The f i n a l e x p e r i m e n t was t h u s d e s i g n e d t o t e s t t h e e f f e c t s o f t a p s t i m u l i o f q u a n t i f i a b l y d i f f e r e n t m a g n i t u d e s a c r o s s d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . E x p e r i m e n t 3: G r a d e d R e s p o n s e A d u l t e 1 e q a n s show a g r a d e d r e s p o n s e t o t a p s o f i n c r e a s i n g m a g n i t u d e . S i n g l e t a p s e l i c i t s h o r t r e v e r s a l s , w h i l e m u l t i p l e t a p s e l i c i t l o n g e r r e v e r s a l s ( R a n k i n , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . E x p e r i m e n t 3 was d e s i g n e d t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f d i f f e r i n g s t i m u l u s m a g n i t u d e s on r e s p o n s e m a g n i t u d e i n e a c h o f t h e d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . L a r g e , i n t e r m e d i a t e , and s m a l l m a g n i t u d e t a p s w e re u s e d i n o r d e r t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e r e s p o n s e i s g r a d e d t h r o u g h o u t d e v e l o p m e n t . 46 M e t h o d S u b j e c t s S i x t y a n i m a l s o f e a c h o f t h e s i x d e v e l o p m e n t a l s t a g e s were u s e d ( t o t a l : 360 a n i m a l s ) . P r o t o c o 1 E a c h a n i m a l r e c e i v e d o n l y a s i n g l e s t i m u l u s . I n e a c h s t a g e , a n i m a l s were t e s t e d f o r t h e i r r e s p o n s e t o e i t h e r (a) weak ( s i n g l e t a p ) , (b) i n t e r m e d i a t e ( t r a i n o f t h r e e t a p s ) o r (c) s t r o n g ( t r a i n o f s i x t a p s ) s t i m u l i . A G r a s s S88 s t i m u l u s g e n e r a t o r was u s e d t o g e n e r a t e t h e t a p s v i a a m e c h a n i c a l t a p p e r : s i n g l e t a p s were g e n e r a t e d by a s i n g l e 60 v o l t , 25 msec s i g n a l t o an e l e c t r o m a g n e t i c r e l a y i n t h e m e c h a n i c a l t a p p e r ; t r a i n s o f t h r e e t a p s by a 60 V, 300 msec s i g n a l w i t h a f r e q u e n c y o f 8.5 p u l s e s a s e c o n d ; a nd t r a i n s o f s i x t a p s by a 60 V, 600 msec s i g n a l w i t h a f r e q u e n c y o f 8.5 p u l s e s p e r s e c o n d . S c o r i n g R e s p o n s e s were v i d e o t a p e d and s c o r e d f o r f r e q u e n c y and m a g n i t u d e a s d e s c r i b e d i n t h e G e n e r a l M e t h o d s . S t a t i s t i c a l A n a l y s e s F r e q u e n c y o f R e s p o n s e . S e p a r a t e s e t s o f c o n t i n g e n c y t a b l e s were c o n s t r u c t e d f o r r e v e r s a l s and a c c e l e r a t i o n s . C h i - s q u a r e d t e s t s o f a s s o c i a t i o n were u s e d t o e x a m i n e f r e q u e n c i e s o f r e s p o n s e t y p e , f i r s t as a f u n c t i o n o f age and s e c o n d as a f u n c t i o n o f s t i m u l u s t y p e . As b o t h t h e e f f e c t s o f age and s t i m u l u s t y p e w e re s i g n i f i c a n t . 47 a d d i t i o n a l c h i - s q u a r e d t e s t s o f a s s o c i a t i o n were a p p l i e d t o r e s p o n s e s a t e a c h s t i m u l u s m a g n i t u d e t o t e s t f o r d i f f e r e n c e s a c r o s s d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . S i g n i f i c a n t r e s u l t s on t h e s e t e s t s were f o l l o w e d w i t h m u l t i p l e p a i r w i s e c o m p a r i s o n s , as d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . M a g n i t u d e . M a g n i t u d e s o f r e s p o n s e s w e re t e s t e d i n i t i a l l y w i t h 2 - f a c t o r a n a l y s e s o f v a r i a n c e , w i t h b e t w e e n g r o u p f a c t o r s o f s t a g e a n d s t i m u l u s m a g n i t u d e . S i g n i f i c a n t r e s u l t s were f o l l o w e d w i t h s e p a r a t e o n e - f a c t o r a n a l y s e s o f v a r i a n c e (where a p p r o p r i a t e ) a n d t r e n d s a n a l y s e s . R e s u 1 t s R e s p o n s e F r e g u e n c i e s I . F r e g u e n c i e s o f R e v e r s a l s . The p r o p o r t i o n o f a n i m a l s e x h i b i t i n g r e v e r s a l s was a f f e c t e d by b o t h s t a g e and s t i m u l u s m a g n i t u d e ; x 2 ( 5 ) = 104.191, p_ < .0001 f o r s t a g e ; x 2 ( 2 ) = 21.055, p- < .0001 f o r m a g n i t u d e . R e g a r d l e s s o f s t i m u l u s m a g n i t u d e , a d u l t s t e n d e d t o r e v e r s e : 40 o u t o f 60 y o u n g a d u l t s and 49 o u t o f 60 f o u r d a y o l d a d u l t s r e v e r s e d . L a r v a l a n i m a l s t e n d e d n o t t o r e v e r s e : u n d e r t h e same c o n d i t i o n s , o n l y 19 o u t 60 L i s , 4 o u t o f 60 L 2 s , 13 o u t o f 60 L 3 s , and 16 o u t o f 60 L 4 s r e v e r s e d . However, when f r e q u e n c i e s o f r e v e r s a l s t o t h e t h r e e d i f f e r e n t s t i m u l u s m a g n i t u d e s w ere e x a m i n e d w i t h o u t r e s p e c t t o d e v e l o p m e n t a l s t a g e , t h e d a t a i n d i c a t e d t h a t s i n g l e t a p s p r o d u c e d t h e g r e a t e s t number o f r e v e r s a l s (67 o u t o f a p o s s i b l e 120 r e v e r s a l s ) , w h i l e m u l t i p l e t a p s e l i c i t e d f e w e r r e v e r s a l s (38 o u t o f 120 f o r 3 t a p s , 36 o u t 48 o f 120 f o r 6 t a p s ) . D a t a were t h e n a n a l y z e d s e p a r a t e l y t o d e t e r m i n e e f f e c t s o f d e v e l o p m e n t a l s t a g e a t e a c h s t i m u l u s magni t u d e . S i n g l e t a p s . The p r o p o r t i o n o f r e s p o n s e s t o s i n g l e t a p s d i f f e r e d s i g n i f i c a n t l y a c r o s s s t a g e s ; x 2 ( 5 ) = 52.075; p_ < .0001; s e e F i g u r e 7 a ) . P a i r w i s e c o m p a r i s o n s o f t h e p r o p o r t i o n s i n d i c a t e d t h a t l a r v a l a n i m a l s ( L I , L 2 , L 3 , and L4) were l e s s l i k e l y t o r e v e r s e t o s i n g l e t a p t h a n a d u l t s o f e i t h e r age. L a r v a l s t a g e L2 a n i m a l s showed t h e l o w e s t f r e q u e n c i e s o f r e v e r s a l s t o t a p o f a l l l a r v a l s t a g e s ( s e e F i g u r e 7 a ) ; t h i s d i f f e r e n c e d i d n o t r e a c h s i g n i f i c a n c e . T h r e e t a p s . _ F e w e r a n i m a l s t e n d e d t o r e v e r s e when g i v e n a t r a i n o f t h r e e t a p s . However, d e v e l o p m e n t a l s t a g e c o n t i n u e d t o h a v e a s i g n i f i c a n t e f f e c t upon t h e p r o p o r t i o n s o f r e v e r s a l s o b s e r v e d ; x 2 ( 5 ) = 34.044; p_ < .0001. A l t h o u g h a l l l a r v a l s t a g e s ( L I , L 2 , L 3 , a n d L4) showed f e w e r r e v e r s a l s t o t r a i n s o f 3 t a p s t h a n a d u l t s , o n l y t h e L i s and L 2 s were s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e two a d u l t s t a g e s ( s e e F i g u r e 7 b ) . S i x t a p s . The t r a i n o f s i x t a p s a l s o p r o d u c e d a g e n e r a l t r e n d f o r f e w e r r e v e r s a l s r e l a t i v e t o t h o s e g i v e n f o r s i n g l e t a p s , t h o u g h t h i s t r e n d was n o t u n i f o r m ( s e e F i g u r e 7 c ) . D e v e l o p m e n t a l s t a g e c o n t i n u e d t o e x e r t a s i g n i f i c a n t e f f e c t upon t h e p r o p o r t i o n s o f r e v e r s a l s o b s e r v e d ; x 2 ( 5 ) = 39.524; p. < .0001. L a r v a l s t a g e s L 2 , L 3 , and L 4 , a l l showed s i g n i f i c a n t l y f e w e r r e v e r s a l s t h a n 4 9 d i d 4 day o l d a d u l t s ; L3 a n i m a l s a l s o show s i g n i f i c a n t l y f e w e r r e v e r s a l s t h a n y o u n g a d u l t s . L I a n i m a l s d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m e i t h e r a d u l t s t a g e . I I . F r e q u e n c i e s o f A c c e l e r a t i o n . Not s u r p r i s i n g l y , a c c e l e r a t i o n s t o t h e t a p s m i r r o r e d t h e t r e n d s s e e n f o r r e v e r s a l s . I n g e n e r a l , l a r v a l a n i m a l s a c c e l e r a t e d more f r e q u e n t l y t h a n d i d a d u l t s , a n d m u l t i p l e t a p s p r o d u c e d more a c c e l e r a t i o n s o v e r a l l t h a n d i d s i n g l e t a p s . R e g a r d l e s s o f s t i m u l u s m a g n i t u d e , t h e p r o p o r t i o n o f a n i m a l s a c c e l e r a t i n g t o t a p s d i f f e r e d s i g n i f i c a n t l y a s a f u n c t i o n o f s t a g e ; x 2 ( 5 ) = 96.518, p_ < . 0 0 0 1 ) . S i m i l a r l y , r e g a r d l e s s o f d e v e l o p m e n t a l s t a g e , t h e p r o p o r t i o n o f a n i m a l s a c c e l e r a t i n g d i f f e r e d s i g n i f i c a n t l y as a f u n c t i o n o f s t i m u l u s m a g n i t u d e ; x 2 ( 2 ) = 2 6 . 1 3 1 , p_ < .0001. S i n g l e t a p s p r o d u c e d t h e f e w e s t a c c e l e r a t i o n s (48 o u t o f a p o s s i b l e 120 a c c e l e r a t i o n s ) ; m u l t i p l e t a p s p r o d u c e d a c c e l e r a t i o n s more f r e q u e n t l y (79 o u t o f a p o s s i b l e 120 and 84 o u t o f a p o s s i b l e 120 f o r 3 and 6 t a p s , r e s p e c t i v e l y ) . S i n g l e t a p s . The p r o p o r t i o n o f a c c e l e r a t i o n s t o s i n g l e t a p s d i f f e r e d s i g n i f i c a n t l y a c r o s s s t a g e s : x 2 ( 5 ) = 46.25 ; p < .0001; s e e F i g u r e 8 a ) . P a i r w i s e c o m p a r i s o n s i n d i c a t e d l a r v a l a n i m a l s were s i g n i f i c a n t l y more l i k e l y t o a c c e l e r a t e t h a n 4 day o l d a n i m a l s ; a l l l a r v a l s t a g e s e x c e p t L I were a l s o s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m y o u n g a d u l t s . The a d u l t s t a g e s d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m e a c h o t h e r . A g a i n , L2 a n i m a l s showed t h e h i g h e s t 50 f r e q u e n c i e s o f a c c e l e r a t i o n t o s i n g l e t a p s o f a l l l a r v a l s t a g e s , b u t were s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t o n l y f r o m L i s and a d u l t s . T h r e e t a p s . R e g a r d l e s s o f d e v e l o p m e n t a l s t a g e , a n i m a l s g i v e n a t r a i n o f t h r e e t a p s p r o d u c e d a h i g h e r p r o p o r t i o n o f a n i m a l s a c c e l e r a t i n g r e l a t i v e t o a n i m a l s g i v e n a s i n g l e t a p ( s e e F i g u r e 8b; compare w i t h F i g u r e 8 b ) . D e v e l o p m e n t a l s t a g e c o n t i n u e d t o h a v e a s i g n i f i c a n t e f f e c t upon t h e p r o p o r t i o n s o f a c c e l e r a t i o n s o b s e r v e d ; X 2 ( 5 ) = 3 1 . 7 5 1 ; p < .0001. A l l l a r v a l s t a g e s showed more a c c e l e r a t i o n s t o t r a i n s o f 3 t a p s t h a n d i d a d u l t s ; t h e L i s , L 2 s , and L 3 s were s i g n i f i c a n t l y more l i k e l y t o a c c e l e r a t e t h a n 4 d a y o l d a d u l t s . The L 2 s a l s o g a v e s i g n i f i c a n t l y more a c c e l e r a t i o n s t h a n y o u n g a d u l t a n i m a l s . S i x t a p s . The t r a i n o f s i x t a p s t e n d e d t o p r o d u c e more a c c e l e r a t i o n s t h a n t h e s i n g l e t a p ; h o w e v e r , t h i s e f f e c t was n o t u n i f o r m (compare F i g u r e 8a and 8 c ) . D e v e l o p m e n t a l s t a g e c o n t i n u e d t o e x e r t a s i g n i f i c a n t e f f e c t upon t h e p r o p o r t i o n s o f a n i m a l s a c c e l e r a t i n g ; X 2 ( 5 ) = 39.524; p_ < .0001. L a r v a l s t a g e s L 2 , L 3 , and L4 w e r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e 4 day o l d s . L I a n i m a l s d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m e i t h e r a d u l t s t a g e . I I I . O t h e r R e s p o n s e s . O t h e r r e s p o n s e s c o n t r i b u t e d o n l y 8 o u t o f t h e t o t a l 360 r e s p o n s e s . Of t h e s e , 5 o c c u r r e d i n r e s p o n s e t o s i n g l e t a p , t h r e e i n r e s p o n s e t o 51 F i g u r e 7. P r o p o r t i o n s o f a n i m a l s r e v e r s i n g t o t a p s t i m u l i o f v a r y i n g m a g n i t u d e . Twenty a n i m a l s w e re t e s t e d f o r e a c h c o m b i n a t i o n o f age and s t i m u l u s m a g n i t u d e ; p r o p o r t i o n s o f a n i m a l s a c c e l e r a t i n g i n e a c h o f t h e s e g r o u p s a r e d e p i c t e d i n F i g u r e 8. F i g u r e 7 ( a ) r e p r e s e n t s p r o p o r t i o n s o f a n i m a l s r e v e r s i n g t o s i n g l e t a p ; F i g u r e 7 ( b ) , t o 3 t a p s ; F i g u r e 7 ( c ) , t o 6 t a p s . A l l p r o p o r t i o n s a r e p r e s e n t e d w i t h 9 5 % c o n f i d e n c e i n t e r v a l s . R E V E R S A L S 52 (a) 1 Tap 1.0-1 (b) 3 Taps 1.0n O) £ 0.6 H O 0.2-L4 YAD 4D (c) 6 Taps 1.0-1 O) < 0 I— a> £ 0.6-O 0.2-L4 YAD 4D developmental stage 53 F i g u r e 8. P r o p o r t i o n s o f a n i m a l s a c c e l e r a t i n g t o t a p s t i m u l i o f v a r y i n g m a g n i t u d e . T w e n t y a n i m a l s w e re t e s t e d f o r e a c h c o m b i n a t i o n o f age and s t i m u l u s m a g n i t u d e ; p r o p o r t i o n s o f a n i m a l s r e v e r s i n g i n e a c h o f t h e s e g r o u p s a r e d e p i c t e d i n F i g u r e 7. F i g u r e 8 ( a ) r e p r e s e n t s p r o p o r t i o n s o f a n i m a l s r e v e r s i n g t o s i n g l e t a p ; F i g u r e 8 ( b ) , t o 3 t a p s ; F i g u r e 8 ( c ) , t o 6 t a p s . A l l p r o p o r t i o n s a r e p r e s e n t e d w i t h 95% c o n f i d e n c e i n t e r v a l s . ACCELERATIONS L4 YAD (b) 3 Taps 1.0 -| Bui • C O 0.8-a> accel 0.6-c o 0.4-propoi 0.2-(c) 0.0 1.0-1 L1 L2 L3 L4 YAD developmental stage 55 a t r a i n o f 3 t a p s , and none i n r e s p o n s e t o 6 t a p s . R e s p o n s e M a g n i t u d e . B e c a u s e b o t h s t a g e and s t i m u l u s m a g n i t u d e s i g n i f i c a n t l y a f f e c t e d t h e f r e q u e n c i e s o f r e v e r s a l s and a c c e l e r a t i o n s , t h e n e x t s t e p was t o d e t e r m i n e w h e t h e r a c c e l e r a t i o n s and r e v e r s a l s d i f f e r e d i n m a g n i t u d e r e g a r d l e s s o f d e v e l o p m e n t a l s t a g e . I n o r d e r t o a s s e s s t h e e f f e c t s o f s t i m u l u s t y p e and r e s p o n s e t y p e on r e s p o n s e , a t w o - f a c t o r a n a l y s i s o f v a r i a n c e was p e r f o r m e d u s i n g r e s p o n s e m a g n i t u d e a s a b e t w e e n s u b j e c t s f a c t o r . T h i s a n a l y s i s r e v e a l e d s i g n i f i c a n t m a i n e f f e c t s o f b o t h s t i m u l u s m a g n i t u d e and r e s p o n s e t y p e ( F ( 2 , 3 4 6 ) = 15.12, p_ < .0001 f o r s t i m u l u s m a g n i t u d e ; F ( l , 346) = 6 8 . 2 7 1 , p_ < .0001 f o r r e s p o n s e t y p e ) a s w e l l as a s i g n i f i c a n t i n t e r a c t i o n e f f e c t ( F ( 2 , 346) = 3.812, p. < .05) b e t w e e n t h e two v a r i a b l e s . T h i s i n t e r a c t i o n i s p l o t t e d i n F i g u r e 9. B o t h a c c e l e r a t i o n s and r e v e r s a l s show a t e n d e n c y t o i n c r e a s e a s s t i m u l u s m a g n i t u d e s i n c r e a s e ; h o w e v e r , a c c e l e r a t i o n s i n c r e a s e more m a r k e d l y . I n a d d i t i o n , a v e r a g e m a g n i t u d e s o f a c c e l e r a t i o n s were u n i f o r m l y g r e a t e r t h a n a v e r a g e m a g n i t u d e s o f r e v e r s a l s a t a l l s t i m u l u s m a g n i t u d e s ( s e e F i g u r e 9 ) . The a n a l y s e s o f f r e q u e n c i e s o f r e s p o n s e t y p e s showed t h a t , r e g a r d l e s s o f s t i m u l u s m a g n i t u d e , t h e p r e d o m i n a n t r e s p o n s e o f l a r v a l a n i m a l s t o t a p s was an a c c e l e r a t i o n , t h e p r e d o m i n a n t r e s p o n s e o f a d u l t a n i m a l s a r e v e r s a l . 56 F i g u r e 9. I n t e r a c t i o n s b e t w e e n r e s p o n s e t y p e a nd s t i m u l u s m a g n i t u d e on r e s p o n s e m a g n i t u d e s , c o l l a p s e d a c r o s s d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . D i s t a n c e s t r a v e l l e d by a n i m a l s ( r e l a t i v e t o body l e n g t h ) a r e g r e a t e r when t h e r e s p o n s e s a r e a c c e l e r a t i o n s r a t h e r t h a n r e v e r s a l s , and i n c r e a s e more s t e e p l y as a f u n c t i o n o f i n c r e a s i n g s t i m u l u s m a g n i t u d e when t h e r e s p o n s e s a r e a c c e l e r a t i o n s r a t h e r t h a n r e v e r s a l s . Mean d i s t a n c e s t r a v e l l e d a r e p r e s e n t e d w i t h s t a n d a r d e r r o r s . 57 Response Magnitudes : Accelerat ion vs . Reversals 58 B e c a u s e t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n s t i m u l u s m a g n i t u d e and r e s p o n s e t y p e s i g n i f i c a n t l y a f f e c t e d t h e m a g n i t u d e s o f r e s p o n s e s s e e n , t h e q u e s t i o n a s t o w h e t h e r r e s p o n s e m a g n i t u d e d i f f e r e d a s a f u n c t i o n o f s t i m u l u s m a g n i t u d e was a d d r e s s e d w i t h r e s p e c t t o a c c e l e r a t i o n s i n l a r v a l a n i m a l s a n d w i t h r e s p e c t t o r e v e r s a l s i n a d u l t a n i m a l s . M a g n i t u d e o f a c c e l e r a t i o n s i n l a r v a l a n i m a l s . When o n l y l a r v a l ( L I , L 2 , L 3 , and L4) a n i m a l s were e x a m i n e d , b o t h d e v e l o p m e n t a l s t a g e and s t i m u l u s m a g n i t u d e h a d s i g n i f i c a n t e f f e c t s upon m a g n i t u d e s o f a c c e l e r a t i o n ; F ( 3 , 169) = 5.016, p < .005 f o r d e v e l o p m e n t a l s t a g e ; F ( 2 , 1 6 9 ) = 11.744, p < .0001 f o r s t i m u l u s m a g n i t u d e . T r e n d a n a l y s i s o f t h e mean m a g n i t u d e s o f a c c e l e r a t i o n f o r e a c h o f t h e t h r e e s t i m u l u s m a g n i t u d e s showed t h a t a p o s i t i v e l i n e a r ( F ( l , 169) = 17.07, p_ < .001) t r e n d a c c o u n t e d f o r most o f t h e v a r i a b i l i t y i n t h e d a t a . R e g a r d l e s s o f l a r v a l s t a g e , mean m a g n i t u d e s o f a c c e l e r a t i o n s t e n d e d t o i n c r e a s e a s s t i m u l u s m a g n i t u d e i n c r e a s e d f r o m 1 t o 3 t o 6 t a p s . However, t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n means a t 3 and 6 t a p s was l e s s t h a n t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n means a t 1 and 3 t a p s (mean o v e r a l l m a g n i t u d e s [ i n body l e n g t h s ] a n d s t a n d a r d e r r o r s f o r 1, 3, and 6 t a p s r e g a r d l e s s o f l a r v a l s t a g e were 1.84 ± 0.27, 2.85 ± 0.23, and 3.43 ± 0.23 r e s p e c t i v e l y ) . As t h e r e w e re no s i g n i f i c a n t i n t e r a c t i o n e f f e c t s b e t w e e n s t a g e and s t i m u l u s m a g n i t u d e ( F ( 6 , 169) = 1.141; p_ > . 3 0 ) , s e p a r a t e one f a c t o r ANOVAs were u s e d t o e x a m i n e 5 9 t h e e f f e c t s o f s t i m u l u s m a g n i t u d e on a c c e l e r a t i o n s i z e w i t h i n e a c h l a r v a l s t a g e . L a r v a l s t a g e s L I , L 3 , and L4 a l l showed s i g n i f i c a n t e f f e c t s o f s t i m u l u s m a g n i t u d e on a c c e l e r a t i o n m a g n i t u d e (F ( 2 , 35) = 3.328, p_ < .05 f o r L I ; F ( 2 , 4 3 ) = 6.396, p. < .005 f o r L 3 ; F ( 2 , 4 0 ) , p_ < .002 f o r L 4 ) . I n e a c h o f t h e s e s t a g e s , t r e n d s a n a l y s e s o f t h e mean a c c e l e r a t i o n m a g n i t u d e s showed s i g n i f i c a n t l i n e a r t r e n d s ( F ( l , 35) = 5.228, p. < .05 f o r L I ; F ( l , 4 3 ) = 11.379, p < .01 f o r L 3 ; F ( l , 41) = 14.497, p < .001 f o r L4) A g a i n , mean m a g n i t u d e s o f a c c e l e r a t i o n t e n d e d t o i n c r e a s e a s s t i m u l u s m a g n i t u d e i n c r e a s e d , b u t t e n d e d t o i n c r e a s e l e s s f r o m 3 t o 6 t a p s t h a n f r o m 1 t o 3 t a p s ( s e e F i g u r e 1 0 a ) . A l t h o u g h L2 a n i m a l s a l s o seemed t o show an upwa r d t r e n d , an a n a l y s i s o f v a r i a n c e showed t h a t t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n means was n o t s i g n i f i c a n t ( F ( 2 , 51) = 0.468, p > .5) . A c c e l e r a t i o n m a g n i t u d e s f o r a d u l t s t a g e s w e r e n o t a n a l y z e d due s m a l l a n d h i g h l y u n e q u a l n's ( r a n g i n g f r o m 0 t o 12 f o r a g i v e n c o m b i n a t i o n o f s t a g e and s t i m u l u s m a g n i t u d e ) . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d f o r c o m p a r i s o n i n T a b l e 1. M a g n i t u d e o f r e v e r s a l s i n a d u l t a n i m a l s . T h e r e was a s i g n i f i c a n t e f f e c t o f b o t h s t a g e ( F ( l , 83) = 24.0 2 5 , p < .0001) and s t i m u l u s m a g n i t u d e ( F ( 2 . 83) = 8.008, p < .0 0 1 ) . T r e n d a n a l y s i s o f t h e mean m a g n i t u d e s o f r e v e r s a l s t o s t i m u l i o f i n c r e a s i n g m a g n i t u d e r e g a r d l e s s o f 60 a d u l t s t a g e showed a s i g n i f i c a n t l i n e a r ( F ( l , 8 3 ) = 16.072, p_ < .001) t r e n d . As w i t h a c c e l e r a t i o n s f o r l a r v a l a n i m a l s , mean r e v e r s a l m a g n i t u d e s f o r t h e c o m b i n e d a d u l t s t a g e s t e n d e d t o i n c r e a s e w i t h s t i m u l u s m a g n i t u d e , b u t i n c r e a s e d most when i n c r e a s i n g f r o m 1 t o 3 t a p s (mean o v e r a l l m a g n i t u d e s a n d s t a n d a r d e r r o r s f o r r e v e r s a l s i n a d u l t s were 1.01 ± 0.11, 1.573 ± 0.13, and 1.72 ± 0.14 body l e n g t h s f o r 1, 3, and 6 t a p s , r e s p e c t i v e l y ) . As t h e r e w e r e no s i g n i f i c a n t i n t e r a c t i o n e f f e c t s b e t w e e n a d u l t s t a g e and s t i m u l u s m a g n i t u d e ( F ( 2 , 83) = 0.63, p > . 5 ) , s e p a r a t e one f a c t o r ANOVAs were p e r f o r m e d t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f s t i m u l u s m a g n i t u d e i n e a c h a d u l t s t a g e . R e v e r s a l m a g n i t u d e s o f f o u r day o l d a d u l t a n i m a l s showed a s i g n i f i c a n t e f f e c t o f s t i m u l u s m a g n i t u d e ( F ( 2 . 46) = 6.594, p < . 0 0 3 ) ; t r e n d s a n a l y s i s showed t h a t a s i g n i f i c a n t l i n e a r ( F ( l , 46) = 9.555, p < .01) t r e n d a c c o u n t e d f o r much o f t h e v a r i a b i l i t y i n t h e d a t a . A l t h o u g h y o u n g a d u l t a n i m a l s a l s o a p p e a r e d t o show a t e n d e n c y t o g i v e i n c r e a s i n g m a g n i t u d e s o f r e v e r s a l i n r e s p o n s e t o i n c r e a s i n g m a g n i t u d e s o f s t i m u l i ( s e e F i g u r e 1 0 b ) , t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n means were n o t s i g n i f i c a n t ( F ( 2 , 3 7 ) = 2.176; p > . 1 0 ) . Mean r e v e r s a l m a g n i t u d e s f o r b o t h a d u l t s t a g e s a r e p l o t t e d i n F i g u r e 10b. Mean r e v e r s a l m a g n i t u d e s f o r l a r v a l s t a g e s w e r e a l s o r e c o r d e d , b u t n o t a n a l y z e d due t o s m a l l and h i g h l y u n e q u a l n's ( r a n g i n g f r o m 0 t o 9 f o r a g i v e n c o m b i n a t i o n o f s t a g e and s t i m u l u s m a g n i t u d e ) . T h e s e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n 61 F i g u r e 10. R e s p o n s e m a g n i t u d e s f o r s t i m u l i o f v a r y i n g m a g n i t u d e ; l a r v a e and a d u l t s . H a t c h e d b a r s r e p r e s e n t mean r e s p o n s e m a g n i t u d e s ( r e l a t i v e t o body l e n g t h ) t o s i n g l e t a p ; open b a r s , t o t h r e e t a p s ; b l a c k b a r s , t o s i x t a p s . Means and s t a n d a r d e r r o r s a r e p r e s e n t e d ; s e e T a b l e s 1 and 2 number o f a n i m a l s c o n t r i b u t i n g t o e a c h mean. F i g u r e 1 0 ( a ) r e p r e s e n t s mean a c c e l e r a t i o n m a g n i t u d e s f o r l a r v a e : F i g u r e 1 0 ( b ) r e p r e s e n t s mean r e v e r s a l m a g n i t u d e s f o r a d u I t s . 62 (b) Reversal Magnitudes: Adults YAD developmental stage 1 TAP • 3 TAPS • 6 TAPS T a b l e 1 63 Mean A c c e l e r a t i o n M a g n i t u d e s To Tap S t i m u l i o f T h r e e  D i f f e r e n t I n t e n s i t i e s : A l l D e v e l o p m e n t a l S t a g e s S t i m u l u s I n t e n s i t y -S t a g e 1 Tap 3 Taps 6 T a p s L a r v a e L I 0.56 ± 0.62 2.41 ± 0.47 2.43 ± 0.52 (9) (16) (13) L2 2.91 ± 0.44 3.25 ± 0.43 2.00 ± 0.34 (18) (19) (17) L3 1.82 ± 0.59 2.73 ± 0.47 4.19 ± 0.42 (10) (16) (20) L4 1.07 ± 0.59 2.92 ± 0.48 3.11 ± 0.44 (10) (15) (18) A d u l t s YAD* 0.13; no SE 2.61 ± 0.41 3.88 ± 0.50 (1) (7) (8) 4D* — 2.75 ± 0.90 4.80 ± 1.52 (0) (6) (4) N o t e . Means shown w i t h s t a n d a r d e r r o r s when a p p l i c a b l e ; number o f a c c e l e r a t i o n s c o n t r i b u t i n g t o mean i n b r a c k e t s ( n ) . T o t a l p o s s i b l e a c c e l e r a t i o n s i n e a c h c e l l = 20. A l l m a g n i t u d e s i n body l e n g t h s . *n's f o r t h e s e g r o u p s w ere t o o s m a l l a n d t o o u n e q u a l f o r a p p l i c a t i o n o f t h e ANOVA. I n t h e s e c a s e s , s t a n d a r d e r r o r s (SE) were c a l c u l a t e d as Vs 2 / rT. O t h e r w i s e , SE = V M S e /n*. 64 T a b l e 2 Mean R e v e r s a l M a g n i t u d e s To Tap S t i m u l i o f T h r e e D i f f e r e n t  I n t e n s i t i e s : A l l D e v e l o p m e n t a l S t a g e s S t i m u l u s I n t e n s i t y S t a g e 1 Tap 3 T a p s 6 T a p s L a r v a e L I * 1.12 ± 0.19 1.14 ± 0.43 0.82 ± 0.24 (9) (3) (7) L 2 * 1.01; no SE — 2.00 ± 0.34 (1) (0) (3) L 3 * 0.68 ± 0.17 0.95 ± 0.24 (9) (4) (0) L 4 * 0.81 ± 0.19 0.58 ± 0.27 1.00 ± 0.70 (9) (5) (2) A d u l t s YAD 0.74 ± 0.15 1.14 ± 0.19 1.19 ± 0.24 (19) (13) (8) 4D 1.26 ± 0.15 2.00 ± 0.19 1.98 ± 0.17 (20) (13) (16) N o t e . Means shown w i t h s t a n d a r d e r r o r s when a p p l i c a b l e ; number o f r e v e r s a l s c o n t r i b u t i n g t o mean i n b r a c k e t s ( n ) . T o t a l p o s s i b l e r e v e r s a l s i n e a c h c e l l = 20. A l l m a g n i t u d e s i n body l e n g t h s . *n's f o r t h e s e g r o u p s w e r e t o o s m a l l and t o o u n e q u a l f o r a p p l i c a t i o n o f t h e ANOVA. I n t h e s e c a s e s , s t a n d a r d e r r o r s ( S E ) were c a l c u l a t e d as V s 2 / n\ O t h e r w i s e , S E = V M S b /n\ 65 T a b l e 2. O t h e r F e a t u r e s o f A c c e l e r a t i o n s Not s u r p r i s i n g l y , when a c c e l e r a t i o n s w e re e x a m i n e d f o r a l l d e v e l o p m e n t a l s t a g e s , t h e r e were s i g n i f i c a n t e f f e c t s o f s t i m u l u s m a g n i t u d e on t h e d u r a t i o n o f a c c e l e r a t i o n s , w i t h d u r a t i o n i n c r e a s i n g a s m a g n i t u d e i n c r e a s e d ( F ( 5 , 1 9 4 ) = 4.11, p_ < . 0 2 ) . Mean d u r a t i o n s o f a c c e l e r a t i o n r e g a r d l e s s o f d e v e l o p m e n t a l s t a g e w e r e 4.1 ± 0.59 s f o r 1 t a p (n = 4 8 ) , 5.7 ± 0.46 s f o r 3 t a p s (n = 7 9 ) , and 7.2 s ± 0.45 s f o r 6 t a p s (n = 8 4 ) . No s i g n i f i c a n t e f f e c t s o f e i t h e r s t a g e o r s t i m u l u s t y p e w e re f o u n d f o r a c c e l e r a t i o n v e l o c i t y ; F ( 5 , 194) = 0.418, p_ > .80 f o r s t a g e ; F ( 2 , 194) = 0.493, p, > .60 f o r s t i m u l u s m a g n i t u d e . D i s c u s s i o n The a n a l y s i s o f g r a d e d r e s p o n s e i n t h i s e x p e r i m e n t showed t h r e e m a j o r t r e n d s : (1) l a r v a l a n i m a l s a c c e l e r a t e d more f r e q u e n t l y t o t a p s t h a n a d u l t s a t a l l s t i m u l u s m a g n i t u d e s ; (2) m u l t i p l e t a p s e l i c i t e d g r e a t e r f r e q u e n c i e s o f a c c e l e r a t i o n s t h a n s i n g l e t a p s , r e g a r d l e s s o f d e v e l o p m e n t a l s t a g e ; and (3) l a r g e r s t i m u l u s m a g n i t u d e s t e n d e d t o e l i c i t r e s p o n s e s o f l a r g e r m a g n i t u d e s . I n a d d i t i o n , m a g n i t u d e s o f a c c e l e r a t i o n s t e n d e d t o be g r e a t e r t h a n m a g n i t u d e s o f r e v e r s a l s , and were more s e n s i t i v e t o c h a n g e s i n s t i m u l u s m a g n i t u d e . As t h e p u r p o s e o f t h i s e x p e r i m e n t was t o d e t e r m i n e 66 w h e t h e r r e s p o n s e m a g n i t u d e was g r a d e d as a f u n c t i o n o f s t i m u l u s m a g n i t u d e , and a s l a r v a l and a d u l t a n i m a l s d i f f e r e d s i g n i f i c a n t l y i n t h e i r t e n d e n c i e s t o e i t h e r r e v e r s e o r a c c e l e r a t e i n r e s p o n s e t o t a p s r e g a r d l e s s o f s t i m u l u s m a g n i t u d e , o n l y t h e m a g n i t u d e s o f t h e p r e d o m i n a n t r e s p o n s e t y p e s g i v e n by t h e s e g r o u p s w ere a n a l y z e d . O v e r a l l , b o t h a c c e l e r a t i o n s i n l a r v a l a n i m a l s and r e v e r s a l s i n a d u l t s were g r a d e d i n m a g n i t u d e as a f u n c t i o n o f s t i m u l u s m a g n i t u d e : m a g n i t u d e s o f b o t h a c c e l e r a t i o n s and r e v e r s a l s t e n d e d t o i n c r e a s e a s t a p s t i m u l i i n c r e a s e d i n m a g n i t u d e f r o m 1 t o 3 t o 6 t a p s , a l t h o u g h t h e i n c r e a s e s -o c c u r r i n g b e t w e e n t h e two m u l t i p l e t a p s t h a n w e r e s m a l l e r t h a n t h o s e o c c u r r i n g b e t w e e n s i n g l e and m u l t i p l e t a p s . T h e s e t r e n d s w e re m a i n t a i n e d f o r a c c e l e r a t i o n s i n l a r v a l s t a g e s L I , L 3 , and L 4 , and f o r r e v e r s a l s i n t h e f o u r day o l d a d u l t s ; b o t h g r o u p s o f a n i m a l s gave l a r g e r r e s p o n s e s i n r e s p o n s e t o l a r g e r s t i m u l i , b u t seemed t o d i f f e r e n t i a t e l e s s b e t w e e n t h e two l a r g e s t s t i m u l i . O n l y l a r v a l s t a g e L2 and t h e y o u n g a d u l t s t a g e d i d n o t show a s i g n i f i c a n t t r e n d t o w a r d s g r a d e d n e s s o f r e s p o n s e , a l t h o u g h t h e i r g r o u p means were c o n s i s t e n t w i t h t h e t r e n d t o i n c r e a s e as a f u n c t i o n as s t i m u l u s m a g n i t u d e ( s e e T a b l e s 1 and 2 ) . I t t h e r e f o r e a p p e a r s t h a t , a t l e a s t w i t h a c c e l e r a t i o n s i n l a r v a l a n i m a l s and r e v e r s a l s i n a d u l t s , t h e r e s p o n s e m a g n i t u d e s t o t a p s t i m u l i i n c r e a s e a s t h e t a p s i n c r e a s e i n m a g n i t u d e . The l a r g e s t i n c r e a s e s i n 67 r e s p o n s e m a g n i t u d e o c c u r as t h e s t i m u l i i n c r e a s e f r o m s i n g l e t o m u l t i p l e t a p s ; h o w e v e r , a n i m a l s t e n d t o d i f f e r e n t i a t e l e s s b e t w e e n t h e two m u l t i p l e t a p s . T h i s t r e n d a l s o a p p e a r s t o be r e f l e c t e d i n t h e p r o p o r t i o n s o f a n i m a l s g i v i n g e i t h e r r e v e r s a l s o r a c c e l e r a t i o n s f o r s t i m u l i o f i n c r e a s i n g magnitude.- r e g a r d l e s s o f d e v e l o p m e n t a l s t a g e , more a n i m a l s t e n d e d t o a c c e l e r a t e ( a n d n o t r e v e r s e ) t o m u l t i p l e t a p s r e l a t i v e t o s i n g l e t a p s , b u t d i d n o t n e c e s s a r i l y a c c e l e r a t e more (and r e v e r s e l e s s ) t o a m u l t i p l e t a p c o n s i s t i n g o f 6 t a p s r e l a t i v e t o a m u l t i p l e t a p c o n s i s t i n g o f 3 t a p s . I t s h o u l d a l s o be n o t e d t h a t t h e g r a d e d n e s s o f t h e r e s p o n s e was n o t r e f l e c t e d i n d i f f e r e n c e s i n v e l o c i t y -a t t a i n e d by a n i m a l s t h a t a c c e l e r a t e d . The s o l e d i f f e r e n c e s b e t w e e n r e s p o n s e s t o d i f f e r i n g s t i m u l u s m a g n i t u d e s seemed t o l i e i n t h e t o t a l t i m e and d i s t a n c e t h a t p a s s e d b e f o r e t h e r e s p o n s e s e n d e d . I t i s a l s o i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t t h e r e s u l t s o b t a i n e d i n E x p e r i m e n t 3 f o r r e s p o n s e s t o s i n g l e t a p r e p l i c a t e d t h e p a t t e r n o f r e s u l t s o b t a i n e d f o r s i n g l e t a p i n E x p e r i m e n t 2. As i n E x p e r i m e n t 2, l a r v a l a n i m a l s i n E x p e r i m e n t 3 t e n d e d t o g i v e f e w e r r e v e r s a l s and more a c c e l e r a t i o n s t o s i n g l e t a p t h a n e i t h e r a d u l t s t a g e . More i n t e r e s t i n g l y , l a r v a l s t a g e L2 a n i m a l s a g a i n showed t h e l o w e s t p r o p o r t i o n o f r e v e r s a l s (and h i g h e s t p r o p o r t i o n o f a c c e l e r a t i o n s ) t o s i n g l e t a p s o f a l l d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . 68 GENERAL DISCUSSION B o t h s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s a n d t h e t a p r e v e r s a l r e f l e x show d e v e l o p m e n t a l c h a n g e s i n C. e l e q a n s . I n E x p e r i m e n t 1, y o u n g a d u l t a n i m a l s showed an i n c r e a s e i n t h e f r e q u e n c y o f s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s o c c u r r i n g r e l a t i v e t o t h e o t h e r d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . I n E x p e r i m e n t s 2 and 3, l a r v a l a n i m a l s o f a l l s t a g e s showed s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t p a t t e r n s o f r e s p o n d i n g t o t a p s t h a n e i t h e r o f t h e a d u l t s t a g e s . A l t h o u g h a n i m a l s o f a l l s t a g e s r e v e r s e d i n r e s p o n s e t o t o u c h , t a p s e l i c i t e d n o t o n l y r e v e r s a l s , b u t a p r e v i o u s l y u n d e s c r i b e d r e s p o n s e , a c c e l e r a t i o n s . L a r v a l a n i m a l s showed r e v e r s a l s on a p p r o x i m a t e l y h a l f t h e r e s p o n s e s t o t a p s , w h i l e y o u n g a d u l t and 4 d a y o l d a d u l t s c o n s i s t e n t l y showed r e v e r s a l s i n r e s p o n s e t o s i n g l e t a p s . I n c r e a s i n g s t i m u l u s m a g n i t u d e a l s o i n c r e a s e d t h e p r o b a b i l i t y o f a c c e l e r a t i o n s r e l a t i v e t o s i n g l e t a p s ; t h i s was t r u e f o r a l l d e v e l o p m e n t a l s t a g e s , t h o u g h l a r v a l a n i m a l s s t i l l showed f e w e r r e v e r s a l s and more a c c e l e r a t i o n s t h a n a d u l t a n i m a l s . S p o n t a n e o u s R e v e r s a 1 s . Young a d u l t s showed a s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d t e n d e n c y t o e x h i b i t s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s o v e r a t e n - m i n u t e o b s e r v a t i o n p e r i o d . T h i s was n o t m e r e l y a f u n c t i o n o f i n c r e a s e d a c t i v i t y , as o t h e r s t a g e s ( e x c e p t L i s ) showed s i m i l a r a c t i v i t y r a t e s and f a i l e d t o show e l e v a t e d r a t e s o f s p o n t a n e o u s r e v e r s i n g . The e l e v a t i o n was a l s o u n l i k e l y t o be t h e r e s u l t o f a 69 d i f f e r e n c e i n s e n s o r y t h r e s h o l d as y o u n g a d u l t s d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m any o t h e r s t a g e i n t h e m a g n i t u d e o f r e s p o n s e t o e i t h e r t o u c h e s o r t a p s . A l t h o u g h o t h e r s t u d i e s h a v e a l s o l o o k e d a t t h e f r e q u e n c y o f s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s i n C. e l e g a n s and r e l a t e d n ematodes ( e . g . , s e e C r o l l , 1975; P o l l o c k & S a m o i l o f f , 1 9 7 6 ) , none h a v e l o o k e d s p e c i f i c a l l y a t t h e y o u n g a d u l t s t a g e . I n P a n a g r e l l u s r e d i d i v u s , a r e l a t e d nematode. P o l l o c k and S a m o i l o f f (1976) o b t a i n e d d a t a t h a t seemed t o i n d i c a t e a g e n e r a l t r e n d t o w a r d s i n c r e a s i n g f r e q u e n c i e s o f r e v e r s a l s p e r u n i t t i m e as a f u n c t i o n o f age ( d a t a r e c o m p u t e d by D u s e n b e r r y , 1 9 8 0 ) ; h o w e v e r , t h e a g e s o f t h e a d u l t a n i m a l s s t u d i e d were n o t s p e c i f i e d . The i n c r e a s e i n f r e q u e n c i e s o f s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s i n y o u n g a d u l t a p p e a r s t o be a t r a n s i e n t phenomenon. A d u l t a n i m a l s a t 4 d a y s o f age do n o t d i f f e r f r o m l a r v a l s t a g e s , i n d i c a t i n g t h a t i f t h i s i n c r e a s e i s a f u n c t i o n o f some n e u r o n a l c h a n g e , i t i s one t h a t o c c u r s o n l y b r i e f l y , as an e v e n t r a t h e r t h a n a l o n g - t e r m a d j u s t m e n t . One p o s s i b i l i t y i s t h a t t h e i n c r e a s e i n s p o n t a n e o u s r e v e r s a l s i s a r e s u l t o f t h e i n c o r p o r a t i o n o f new e l e m e n t s i n t o t h e t o u c h c i r c u i t . ( e . g . , s e e R a n k i n , Carew, 1987; s e e a l s o B e k o f f , 1981, f o r a d i s c u s s i o n o f s p o n t a n e o u s a c t i v i t y i n d e v e l o p i n g m o t o r s y s t e m s ) . T o u c h e s a n d T a p s . As C h a l f i e & S u l s t o n (1981) showed, t h e t o u c h w i t h d r a w a l r e f l e x was p r e s e n t i n C.  e l e g a n s t h r o u g h o u t d e v e l o p m e n t : a l l a n i m a l s a t a l l 70 d e v e l o p m e n t a l s t a g e s r e s p o n d e d t o h e a d t o u c h by r e v e r s i n g . I t was n o t c l e a r w h e t h e r d i f f e r e n c e s i n r e s p o n s e m a g n i t u d e o c c u r r e d o v e r d e v e l o p m e n t , as t h e t o u c h e s i n t h e s e e x p e r i m e n t s w e re n e i t h e r c o n t r o l l e d n o r q u a n t i f i a b l e . T h i s q u e s t i o n c o u l d be a d d r e s s e d , h o w e v e r , by u s i n g t o u c h s t i m u l i t h a t a p p l y f o r c e o f known m a g n i t u d e ( e . g . , v o n F r e y h a i r s ) . The t a p r e v e r s a l r e f l e x was a l s o p r e s e n t t h r o u g h o u t d e v e l o p m e n t . However, n o t a l l a n i m a l s a t a l l d e v e l o p m e n t a l s t a g e s r e v e r s e d i n r e s p o n s e t o t a p : l a r v a l a n i m a l s s o m e t i m e s a c c e l e r a t e d , m o v i n g f o r w a r d i f i n i t i a l l y s t a t i o n a r y , m o v i n g f a s t e r i f a l r e a d y i n m o t i o n . I n r e s p o n s e t o s i n g l e t a p , l a r v a l a n i m a l s were a t l e a s t as l i k e l y t o a c c e l e r a t e a s r e v e r s e ; y o u n g a d u l t and f o u r day o l d a n i m a l s n e a r l y a l w a y s r e v e r s e d . T h i s d i f f e r e n c e b e t w e e n l a r v a l a n d a d u l t s t a g e s was p a r t i c u l a r l y p r o n o u n c e d a t l a r v a l s t a g e L 2 , w h i c h i n b o t h E x p e r i m e n t s 2 and 3 showed t h e l o w e s t p r o b a b i l i t y o f r e v e r s i n g t o s i n g l e t a p r e l a t i v e t o a l l o t h e r d e v e l o p m e n t a l s t a g e s t e s t e d . The p a t t e r n o f r e s u l t s o b t a i n e d f o r s i n g l e t a p i n E x p e r i m e n t 2 was t h u s r e p r o d u c e d i n E x p e r i m e n t 3. M a g n i t u d e s o f r e s p o n s e s t o s i n g l e t a p d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y b e t w e e n d e v e l o p m e n t a l s t a g e s , n o r d i d t h e v e l o c i t y o r d u r a t i o n s o f t h e a c c e l e r a t i o n s , s u g g e s t i n g t h a t t h e s i n g l e t a p d i d n o t d i f f e r i n m a g n i t u d e a c r o s s d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . The s i n g l e t a p d i d , h o w e v e r , d i f f e r 71 i n a p p a r e n t i n t e n s i t y f r o m t o u c h : t o u c h e s t e n d e d t o e l i c i t g r e a t e r m a g n i t u d e s o f r e s p o n s e t h a n s i n g l e t a p s . G r a d e d R e s p o n s e . S i m i l a r d e v e l o p m e n t a l c h a n g e s o c c u r r e d i n t h e t a p r e v e r s a l r e f l e x when a s s e s s e d w i t h t a p s t i m u l i o f v a r y i n g m a g n i t u d e . I n c r e a s i n g t h e m a g n i t u d e o f t a p s t i m u l i f r o m s i n g l e t o m u l t i p l e ( t r a i n s o f 3 o r 6) t a p s had two g e n e r a l e f f e c t s : (a) a t e n d e n c y t o e l i c i t g r e a t e r m a g n i t u d e s o f r e s p o n s e and (b) a t e n d e n c y t o e l i c i t g r e a t e r p r o p o r t i o n s o f a c c e l e r a t i o n s r e l a t i v e t o r e v e r s a 1 s . The t e n d e n c y f o r a n i m a l s t o g i v e g r e a t e r m a g n i t u d e s o f r e s p o n s e t o t a p s t i m u l i o f i n c r e a s i n g m a g n i t u d e i n d i c a t e d t h a t t h e t a p r e v e r s a l r e f l e x i n C. e l e g a n s i s g r a d e d as a f u n c t i o n o f s t i m u l u s m a g n i t u d e : l a r g e r s t i m u l i e l i c i t l a r g e r r e s p o n s e s . I n g e n e r a l , l a r v a l a n i m a l s t e n d e d t o show s i g n i f i c a n t l y l a r g e r m a g n i t u d e a c c e l e r a t i o n s a s s t i m u l u s m a g n i t u d e i n c r e a s e d , w h i l e a d u l t a n i m a l s showed s i g n i f i c a n t l y l a r g e r m a g n i t u d e r e v e r s a l s as s t i m u l u s m a g n i t u d e i n c r e a s e d . Young a d u l t and L2 a n i m a l s were t h e o n l y s t a g e s i n w h i c h t h e t r e n d s w e re n o t p r o n o u n c e d enough t o r e a c h s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e . I n t e r e s t i n g l y , i n t h o s e s t a g e s where s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s o c c u r r e d , i t a p p e a r e d t h a t t h e l a r g e s t d i f f e r e n c e i n r e s p o n s e m a g n i t u d e o c c u r r e d as t h e t a p s t i m u l i i n c r e a s e d f r o m s i n g l e t o m u l t i p l e t a p s ; r e l a t i v e l y l i t t l e d i f f e r e n c e a p p e a r e d t o e x i s t b e t w e e n r e s p o n s e s t o t h r e e v e r s u s s i x t a p s . T h i s f i n d i n g may 72 i n d i c a t e t h a t t h e r e i s a c e i l i n g e f f e c t f o r r e s p o n s e s t o s t i m u l i g r e a t e r t h a n a m a g n i t u d e o f 3 t a p s ; i t may a l s o i n d i c a t e t h a t 3 and 6 t a p s may h a v e been t o o c l o s e i n m a g n i t u d e t o be d i s t i n g u i s h a b l e by t h e a n i m a l . A d d i t i o n a l t e s t s u s i n g s t i m u l i o f more w i d e l y v a r y i n g m a g n i t u d e w o u l d h e l p t o c l a r i f y t h i s i s s u e . The a n a l y s i s o f g r a d e d r e s p o n s e was r e s t r i c t e d t o a c c e l e r a t i o n s i n l a r v a e and r e v e r s a l s i n a d u l t s f o r two r e a s o n s . F i r s t , a c c e l e r a t i o n s i n g e n e r a l w e r e l a r g e r i n m a g n i t u d e and more s e n s i t i v e t o i n c r e a s e s i n s t i m u l u s m a g n i t u d e t h a n r e v e r s a l s , m a k i n g i t u n w i s e t o c o m b i n e m a g n i t u d e s o f a c c e l e r a t i o n s and r e v e r s a l s t o g i v e a s i n g l e m e a s ure o f r e s p o n s e m a g n i t u d e . S e c o n d , t h e p r o p o r t i o n o f l a r v a l a n i m a l s e x h i b i t i n g r e v e r s a l s and a d u l t a n i m a l s e x h i b i t i n g a c c e l e r a t i o n s were a t some s t i m u l u s m a g n i t u d e s so low t h a t m e a n i n g f u l a n a l y s e s w e re n o t p o s s i b l e . The r e s p o n s e s t h a t were o b t a i n e d i n e a c h o f t h e s e c a t e g o r i e s w ere n o t i n c o n s i s t e n t w i t h t h e t r e n d s f o r g r a d e d r e s p o n s e ( s e e T a b l e s 1 and 2 ) ; h o w e v e r , l a r g e r numbers o f r e s p o n s e s w o u l d have t o be o b t a i n e d b e f o r e a c l e a r p i c t u r e o f t h e s e t r e n d s c o u l d be e s t a b l i s h e d . The e f f e c t o f i n c r e a s i n g s t i m u l u s m a g n i t u d e s on p r o p o r t i o n s o f r e s p o n s e t y p e s added a n o t h e r d i m e n s i o n t o t h e r e s u l t s o b t a i n e d i n E x p e r i m e n t 2. The s h i f t i n p r o p o r t i o n s o f a c c e l e r a t i o n s r e l a t i v e t o r e v e r s a l s o c c u r r e d n o t o n l y as a f u n c t i o n o f d e v e l o p m e n t a l s t a g e . 73 b u t a l s o a s a f u n c t i o n o f s t i m u l u s m a g n i t u d e . R e s u l t s o f E x p e r i m e n t 3 i n d i c a t e d t h a t a s t h e number o f t a p s g i v e n i n a s t i m u l u s i n c r e a s e d f r o m s i n g l e t o m u l t i p l e t a p s , t h e p r o p o r t i o n o f a n i m a l s a c c e l e r a t i n g i n a l l s t a g e s i n c r e a s e d — i n a d u l t s t a g e s as w e l l as l a r v a l . A l t h o u g h a d u l t a n i m a l s s t i l l t e n d e d t o r e v e r s e more f r e q u e n t l y t o t a p s t h a n l a r v a l s t a g e s a t any s t i m u l u s m a g n i t u d e , an a d u l t a n i m a l r e s p o n d i n g t o m u l t i p l e t a p s was a l m o s t a s l i k e l y t o a c c e l e r a t e as a l a r v a l a n i m a l r e s p o n d i n g t o s i n g l e t a p . A g a i n , t h e g r e a t e s t d i f f e r e n c e seemed t o o c c u r b e t w e e n t h e p a t t e r n s e l i c i t e d by s i n g l e t a p s r e l a t i v e t o t h e p a t t e r n s e l i c i t e d by m u l t i p l e t a p s ; r e s p o n s e s t o t h r e e t a p s and r e s p o n s e s t o s i x t a p s showed r o u g h l y s i m i l a r o v e r a l l f r e q u e n c i e s o f b o t h r e s p o n s e t y p e s . The d u a l e f f e c t s o f i n c r e a s i n g m a g n i t u d e o f t a p s t i m u l i o b s e r v e d i n E x p e r i m e n t 2 and t h e d i f f e r e n c e s o b s e r v e d b e t w e e n t o u c h e s and t a p s o b s e r v e d i n E x p e r i m e n t 2 s u g g e s t a number o f a r e a s f o r f u r t h e r e x p l o r a t i o n . One i s t h e n a t u r e o f t h e s t i m u l i u s e d : what f e a t u r e s o f t h e t a p r e l a t i v e t o t o u c h make i t more l i k e l y t o e l i c i t a c c e l e r a t i o n s , e s p e c i a l l y i n l a r v a l a n i m a l s ? A n o t h e r m a j o r a r e a t o e x p l o r e i s t h e n a t u r e o f t h e e f f e c t s o f v a r y i n g s t i m u l u s m a g n i t u d e s on r e s p o n s e s t o t a p , n a m e l y , what a s p e c t s o f t h e s t i m u l i a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e i n c r e a s e s s e e n i n (a) r e s p o n s e m a g n i t u d e and (b) p r o p o r t i o n o f a c c e l e r a t i o n s . 74 The r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t o u c h e s and t a p s a s s t i m u l i was an i s s u e f i r s t r a i s e d i n E x p e r i m e n t 2. T o u c h e s n o t o n l y a l w a y s p r o d u c e d r e v e r s a l s a t a l l d e v e l o p m e n t a l s t a g e s , t h e y a l s o a p p e a r e d t o be more i n t e n s e s t i m u l i , e l i c i t i n g l a r g e r o v e r a l l m a g n i t u d e s o f r e s p o n s e r e g a r d l e s s o f d e v e l o p m e n t a l s t a g e . Was t h i s b e c a u s e t h e t o u c h e s u s e d were o f g r e a t e r p h y s i c a l m a g n i t u d e t h a n t h e s i n g l e t a p s u s e d ? Or do t o u c h s t i m u l i a l w a y s p r o d u c e l a r g e r m a g n i t u d e s o f r e s p o n s e r e l a t i v e t o t a p s , e v e n i f b o t h a r e o f e q u i v a l e n t p h y s i c a l m a g n i t u d e s ? I n o r d e r t o a d d r e s s t h i s i s s u e , one n e e d s t o know t h e p h y s i c a l m a g n i t u d e s o f t h e f o r c e s a p p l i e d by b o t h t h e t a p and t h e t o u c h , and be a b l e t o f i n d c a l i b r a t e t h e s t i m u l i s o t h a t one c a n g i v e an a n i m a l b o t h t o u c h e s and t a p s o f known and c o n t r o l l a b l e m a g n i t u d e . S u c h an a n a l y s i s w o u l d p r o v i d e i n f o r m a t i o n a b o u t t h e ways i n w h i c h t o u c h and t a p s t i m u l i i n t e r a c t w i t h t h e n e u r a l c i r c u i t s u n d e r l y i n g t h e r e s p o n s e s o b s e r v e d . A n o t h e r q u e s t i o n t h a t b e a r s f u r t h e r e x p l o r a t i o n i s t h e n a t u r e o f t h e s e n s o r y s i g n a l s t h a t t o u c h e s a nd t a p s r e p r e s e n t . I n t h e i n t r o d u c t i o n t o E x p e r i m e n t 3, one s p e c u l a t i o n p u t f o r t h was t h a t t h e t a p s may be s t i m u l a t i n g r e c e p t o r s f r o m b o t h t h e h e a d and t h e t a i l o f t h e a n i m a l , w h e r e a s t h e h e a d t o u c h s t i m u l a t e s r e c e p t o r s o n l y i n t h e h e a d . T h i s i s a n a t t r a c t i v e h y p o t h e s i s g i v e n t h a t t h e a c c e l e r a t i o n r e s p o n s e a p p e a r s t o be s i m i l a r t o t h e t a i l 75 t o u c h w i t h d r a w a l r e s p o n s e — t h a t i s , t h e a n i m a l moves f o r w a r d — a n d m i g h t be m e d i a t e d by t h i s p o r t i o n o f t h e n e u r a l c i r c u i t . I n a d d i t i o n , i f i t i s s u p p o s e d t h a t t o u c h s t i m u l a t e s t h e a n t e r i o r h e a d t o u c h r e c e p t o r s d i r e c t l y , w h i l e t a p s t i m u l a t e s b o t h a n t e r i o r and p o s t e r i o r r e s p o n s e s , i t m i g h t be t h a t r e s p o n s e m a g n i t u d e s t o t o u c h a r e a l w a y s l a r g e r t h a n r e s p o n s e s m a g n i t u d e s t o t a p , g i v e n t h a t t h e y a r e l i k e l y t o be l e s s i n h i b i t e d o r i n h i b i t e d l a t e r by c o m p e t i n g r e s p o n s e s m e d i a t e d by t h e p o r t i o n o f t h e c i r c u i t m e d i a t i n g t h e o p p o s i n g r e s p o n s e . One way t o t e s t t h i s h y p o t h e s i s i s t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f s t i m u l i o v e r d e v e l o p m e n t i n m u t a n t s t h a t l a c k e i t h e r t h e a n t e r i o r o r p o s t e r i o r t o u c h r e c e p t o r s ( b u t n o t b o t h ) . M u t a n t s m i s s i n g t h e t a i l t o u c h r e c e p t o r s (PLMs) t h r o u g h o u t d e v e l o p m e n t s h o u l d a l w a y s r e s p o n d t o t a p s w i t h r e v e r s a l s r e g a r d l e s s o f d e v e l o p m e n t a l s t a g e . M u t a n t s m i s s i n g a l l o f t h e a n t e r i o r t a i l t o u c h r e c e p t o r s (ALMs and AVM) t h r o u g h o u t d e v e l o p m e n t s h o u l d a l w a y s show a c c e l e r a t i o n s t o t a p , r e g a r d l e s s o f d e v e l o p m e n t a l s t a g e . I n a d d i t i o n , i n n o r m a l a n i m a l s , t h e use o f a s t i m u l u s t h a t s t i m u l a t e s b o t h t h e he a d and t a i l o f t h e a n i m a l s i m u l t a n e o u s l y ( p e r h a p s a p a i r o f h a i r s ) s h o u l d e l i c i t p a t t e r n s o f r e s p o n d i n g o v e r d e v e l o p m e n t s i m i l a r t o t h o s e e l i c i t e d by t a p . A n o t h e r i s s u e r a i s e d by E x p e r i m e n t s 2 and 3 i s w h e t h e r t h e i n c r e a s e s i n r e s p o n s e m a g n i t u d e and f r e q u e n c y o f a c c e l e r a t i o n s w e r e p r o d u c e d by t h e same f e a t u r e s o f 76 s t i m u l u s m a g n i t u d e . T h i s i s s u e i s r a i s e d b e c a u s e t h e s t i m u l i u s e d t o t e s t g r a d e d r e s p o n s e i n E x p e r i m e n t 3 v a r i e d a l o n g two p a r a m e t e r s : (1) t h e t o t a l amount o f f o r c e s t r i k i n g t h e a n i m a l ( t h e sum o f t h e f o r c e s o f t h e i n d i v i d u a l t a p s ) a n d (2) t h e t o t a l number o f t a p s . E x a m i n a t i o n o f t h e r e s u l t s o f E x p e r i m e n t 2 s u g g e s t s t h a t t h e two b e h a v i o u r a l c h a n g e s may ha v e i n d e p e n d e n t c a u s e s : t h e m a g n i t u d e o f t h e r e s p o n s e t o s i n g l e t a p d i d n o t change o v e r d e v e l o p m e n t . w h i l e t h e number o f a c c e l e r a t i o n s e 1 i c i t e d d i d . One way t o r e s o l v e t h i s i s s u e i s compare s t i m u l i t h a t v a r y i n m a g n i t u d e a l o n g o n l y one p a r a m e t e r . T h u s , s i n g l e t a p s o f v a r y i n g f o r c e c o u l d be u s e d , w i t h c o r r e c t i o n s ( s u c h as l o w e r w a t e r c o n t e n t i n t h e a g a r ) made t o damp o u t o s c i l l a t i o n s . I f t h e s h i f t i n p r o p o r t i o n s o f a n i m a l s e x h i b i t i n g a c c e l e r a t i o n s and r e v e r s a l s i s s o l e l y a f u n c t i o n o f t h e m a g n i t u d e o f t h e f o r c e s t r i k i n g t h e a n i m a l i n a g i v e n t a p s t i m u l u s , t h e n i t s h o u l d o c c u r when o n l y h i g h m a g n i t u d e s i n g l e t a p s a r e u s e d , p e r h a p s s h o w i n g a c e i l i n g e f f e c t a t h i g h e s t m a g n i t u d e s . S i m i l a r l y , i f t h e s h i f t i n p r o p o r t i o n s i s a f u n c t i o n o f t h e q u a l i t a t i v e n a t u r e o f t h e s t i m u l u s — t h a t i s , t h e f a c t t h a t t h e t a p s a r e m u l t i p l e r a t h e r t h a n s i n g l e , o r i n r a p i d s u c c e s s i o n r a t h e r t h a n s i n g u l a r — t h e n v a r y i n g t h e s e p a r a m e t e r s s h o u l d c a u s e t h e s h i f t i n p r o p o r t i o n s s e e n , e v e n i f t h e t o t a l f o r c e o f t h e s t i m u l i were e q u i v a l e n t . T h e s e e x p e r i m e n t s 77 s h o u l d a l s o h e l p t o d e t e r m i n e what a s p e c t s o f t h e t a p s t i m u l i a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e i n c r e a s e s s e e n i n r e s p o n s e m a g n i t u d e . The r e s u l t s o f E x p e r i m e n t s 2 and 3 a l s o r a i s e a number o f i s s u e s f o r t h e a n a l y s i s o f p l a s t i c i t y i n t h e t a p s r e v e r s a l r e f l e x o v e r d e v e l o p m e n t i n t h i s a n i m a l . The f i r s t o f t h e s e i s p r a c t i c a l : as a c c e l e r a t i o n s a p p e a r e d t o be g r e a t e r i n m a g n i t u d e t h a n r e v e r s a l s , and a s l a r v a l a n i m a l s t e n d e d t o show b o t h t y p e s o f b e h a v i o u r s i n r e s p o n s e t o t a p , i t may be more i n f o r m a t i v e t o u s e a s i m p l e m e a s u r e o f r e s p o n s e o c c u r r e n c e ( i . e . , y e s / n o , d i d a r e s p o n s e o c c u r o r n o t ) r a t h e r t h a n a m e a s u r e o f r e s p o n s e m a g n i t u d e i n o r d e r t o t r a c k t h e c h a n g e s t h a t may o c c u r due t o l e a r n i n g . A n o t h e r a l t e r n a t i v e w o u l d be t o u s e a s t r i c t l y c a t e g o r i c a l method o f c l a s s i f y i n g r e s p o n s e s — i n t o r e v e r s a l s , a c c e l e r a t i o n s , p a u s e s , and no r e s p o n s e s , f o r i n s t a n c e . S t u d y i n g t h e h a b i t u a t i o n o f r e s p o n s e s t o t o u c h may be a n o t h e r way o f a s s e s s i n g w h e t h e r t h e t e n d e n c y t o a c c e l e r a t e t o t a p i s a s o l e f u n c t i o n o f s t i m u l u s m a g n i t u d e : i f i t i s t h e c a s e t h a t a c c e l e r a t i o n s t e n d t o o c c u r t o l a r g e s t i m u l i and r e v e r s a l s t o s m a l l e r s t i m u l i , t h e n we m i g h t s e e an i n c r e a s e i n t h e p r o b a b i l i t y o f r e v e r s a l s d u r i n g h a b i t u a t i o n , when t h e p e r c e i v e d i n t e n s i t y o f t h e s t i m u l u s i s t h o u g h t t o become p r o g r e s s i v e l y sma11er. The r e s u l t s o f t h e s e e x p e r i m e n t s i n d i c a t e t h a t t h e r e a r e two k e y t r a n s i t i o n p o i n t s i n t h e d e v e l o p m e n t o f t h e 78 tap r e v e r s a l r e f l e x . These are the t r a n s i t i o n r e p r e s e n t e d from the newly hatched l a r v a l s tage LI to l a r v a l s tage L2 and the t r a n s i t i o n from l a r v a l s tage L4 to the young a d u l t . Newly hatched L i s were the l e a s t a c t i v e of a l l deve lopmental s t a g e s , and the L2s c o n s i s t e n t l y showed the lowest frequency of r e v e r s a l s and h i g h e s t f requency of a c c e l e r a t i o n s to s i n g l e taps and t r a i n s of three taps in Exper iments 2 and 3. Young a d u l t s not o n l y showed i n c r e a s e d f r e q u e n c i e s of spontaneous r e v e r s a l s r e l a t i v e to any o t h e r s t a g e , but were a l s o the f i r s t s tage at which animals s t a r t e d to show an a d u l t - l i k e p a t t e r n of r e s p o n d i n g , predominant ly r e v e r s i n g r a t h e r than a c c e l e r a t i n g to t a p . Both of these p e r i o d s of b e h a v i o u r a l change appear to c o r r e l a t e w i t h p e r i o d s of neuronal change w i t h i n the a n i m a l . The LI to L2 s tage i s the p e r i o d i n which the j u v e n i l e (embryonic) nervous system begins the s w i t c h to the a d u l t nervous system. New c e l l s are born d u r i n g t h i s t ime , i n c l u d i n g many members of the touch c i r c u i t . AVM, the AS motor neurons , and the v e n t r a l A and v e n t r a l B motoneurons a l l a r i s e d u r i n g t h i s time ( S u l s t o n &. H o r v i t z , 1976, 1977; C h a l f i e et a l , 1985; White et a l , 1978). In a d d i t i o n , the e x i s t i n g d o r s a l D motorneurons , r e s p o n s i b l e f o r the c o o r d i n a t i o n of c o n t r a c t i o n between muscle groups i n the a n i m a l , lose t h e i r embryonic p a t t e r n s of connec t ions and become c o m p l e t e l y r e w i r e d (White et a l , 79 1 9 7 8 ) . The y o u n g a d u l t s t a g e r e p r e s e n t s a s e c o n d t r a n s i t i o n : a t a p p r o x i m a t e l y 40 h o u r s a f t e r h a t c h i n g , t h e c o u p l i n g b e t w e e n t h e AVM and ALM n e u r o n s becomes f u n c t i o n a 1 . F i g u r e 2 r e p r e s e n t s r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e n e u r a l c i r c u i t f o r t o u c h s e n s i t i v i t y as w o r k e d o u t t h u s f a r by M a r t i n C h a l f i e a n d c o l l e a g u e s ( C h a l f i e e t a l , 1985: C h a l f i e , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n t o C. R a n k i n ) . I f t h e c i r c u i t d e p i c t e d i s c o r r e c t , t h e n t h e f o l l o w i n g h y p o t h e s i s a p p e a r s t e n a b l e : A d u l t a n i m a l s r e v e r s e t o t h e t a p s more f r e q u e n t l y t h a n l a r v a l a n i m a l s b e c a u s e o f a new i n h i b i t o r y c o n n e c t i o n b e t w e e n AVB v i a AVM, and p o s s i b l y b e c a u s e o f t h e a d d i t i o n o f a s e n s o r y n e u r o n , AVM. I f t h e r e l a t i v e number o f i n h i b i t o r y c o n n e c t i o n s a f f e c t s t h e p r o b a b i l i t y t h a t a r e s p o n s e w i l l i n h i b i t e d , i t becomes c l e a r e r why a d u l t s r e v e r s e more f r e q u e n t l y t o t a p s t h a n do l a r v a l a n i m a l s . I n t h e a d u l t , t h e r e a r e two r o u t e s o f i n h i b i t i o n g o i n g f r o m t h e a n t e r i o r ( h e a d t o u c h ) c i r c u i t t o t h e p o s t e r i o r ( t a i l t o u c h ) c i r c u i t ; i n l a r v a l a n i m a l s , t h e r e i s o n l y one. One g o e s f r o m t h e ALMs t o PVC, w h i c h s h o u l d p r e v e n t f o r w a r d movement by p r e v e n t i n g PVC f r o m e x c i t i n g t o t h e B m o t o n e u r o n s and AVB. The o t h e r g o e s f r o m t h e AVM c e l l t o AVB. The AVBs a r e t h e o n l y i n t e r n e u r o n s i n t h e p o s t e r i o r c i r c u i t whose i n h i b i t o r y c o n n e c t i o n s a r e n o t m i r r o r e d by c o n n e c t i o n s c o m i n g f r o m t h e a n t e r i o r c i r c u i t . They a r e a l s o t h e o n l y n e u r o n s t h a t i n h i b i t t h e m o t o r n e u r o n s p r o d u c i n g t h e c o m p e t i n g r e s p o n s e 80 d i r e c t l y . The c r i t i c a l d i f f e r e n c e between a d u l t and l a r v a l animals may thus be the a d d i t i o n of AVM, and the consequent a d d i t i o n of an i n h i b i t o r y c o n n e c t i o n to AVB. Because AVB makes two i n h i b i t o r y c o n n e c t i o n s upon the a n t e r i o r touch c i r c u i t , the i n h i b i t i o n of t h i s neuron reduces the i n h i b i t i o n of backward movement by the t a i l touch c i r c u i t w h i l e s i m u l t a n e o u s l y i n h i b i t i n g the p r o b a b i l i t y of forward movement. Thus , w h i l e the p o s t e r i o r touch c i r c u i t has more r o u t e s to i n h i b i t the workings of the a n t e r i o r touch c i r c u i t , two of these r o u t e s are b l o c k e d by the a d d i t i o n of AVM. Removal of AVM (or more p a r t i c u l a r l y , the AVM to AVB connec t ion) v i a l a s e r a b l a t i o n or g e n e t i c l e s i o n sh ou ld r e s u l t i n a d u l t s that show the l a r v a l p a t t e r n of r e s p o n d i n g . C o n c l u s i o n Both spontaneous r e v e r s a l s and r e f l e x i v e r e v e r s a l s to tap show deve lopmenta l changes i n C. e l e g a n s . These changes, seen at the b e h a v i o u r a l l e v e l , appear to c o r r e l a t e w i t h s p e c i f i c changes the neuronal c i r c u i t thought to mediate the r e s p o n s e s . These r e s u l t s suggest f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s to e x p l o r e the nature of the r e l a t i o n s h i p between these b e h a v i o u r s and t h e i r neuronal c o r r e1a t e s . 81 References B a i l e y , N . T . J . (1981). S t a t i s t i c a l methods i n b i o l o g y (2nd e d . ) . New Y o r k : John W i l e y and Sons. B e k o f f , A. (1981). 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