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A correlation between the distribution of biological apatite and amino acid sequence of type I collagen Maitland, Murray E. 1989

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A CORRELATION BETWEEN THE DISTRIBUTION OF BIOLOGICAL APATITE AND AMINO ACID SEQUENCE OF TYPE I COLLAGEN By MURRAY E. MAITLAND B.S.R.(P.T. and O.T.), U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1984 A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF MASTER'S OF SCIENCE i n THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES ( D e p a r t m e n t o f Anatomy) We a c c e p t t h i s t h e s i s as c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e s t a n d a r d THE UNIVERSITY OF B R I T I S H COLUMBIA Ma r c h 1989 ®Murray E. M a i t l a n d In presenting this thesis in partial fulfilment of the requirements for an advanced degree at the University of British Columbia, I agree that the Library shall make it freely available for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of this thesis for scholarly purposes may be granted by the head of my department or by his or her representatives. It is understood that copying or publication of this thesis for financial gain shall not be allowed without my written permission. (Signature) _ Murray E. Maitland Department of A n a t o m y  The University of British Columbia Vancouver, Canada Date Apr i l 25, 1989  DE-6 (2/88) i i ABSTRACT The p r e s e n t s t u d y was u n d e r t a k e n t o e x a m i n e t h e d i s t r i b u t i o n o f b i o l o g i c a l a p a t i t e w i t h i n t y p e I c o l l a g e n f i b r i l s o f c a l c i f y i n g t u r k e y l e g t e n d o n s . The l o c a l i z a t i o n o f a p a t i t e was d e t e r m i n e d by b o t h b r i g h t f i e l d a n d s e l e c t e d - a r e a d a r k f i e l d e l e c t r o n m i c r o s c o p y and was c o r r e l a t e d w i t h s p e c i f i c c l a s s e s o f a m ino a c i d s f r o m c h i c k t y p e I c o l l a g e n s e q u e n c e d a t a by c o m p u t e r m o d e l l i n g . T h e s e e l e c t r o n m i c r o s c o p i c t e c h n i q u e s i l l u s t r a t e d t h a t a p a t i t e o c c u r s i n b o t h t h e gap and o v e r l a p z o n e s a t e a r l y s t a g e s o f m i n e r a l i z a t i o n i n an a s y m m e t r i c p a t t e r n w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e p o l a r i z e d IM- t o C- m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n w i t h i n t h e c o l l a g e n f i b r i l . B a s e d on c o m p a r i s o n s w i t h t h e o r e t i c a l c o m p u t e r i m a g e s o f t h e known amino a c i d s e q u e n c e o f c o l l a g e n i t was d e t e r m i n e d f o r e a r l y s t a g e s o f m i n e r a l d e p o s i t i o n t h a t a p a t i t e i s e x c l u d e d f r o m a r e a s o f h i g h h y d r o p h o b i c d e n s i t y . The gap z o n e i s l e s s h y d r o p h o b i c t h a n t h e o v e r l a p z o n e on a v e r a g e b u t e a c h o f t h e s e z o n e s had a r e a s o f h i g h d e n s i t y o f h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s w h i c h c o r r e s p o n d e d t o s i t e s o f l o w m i n e r a l d e n s i t y . C o n v e r s e l y , r e g i o n s w i t h a h i g h p r o p o r t i o n o f m i n e r a l were lo w i n d e n s i t y o f h y d r o p h o b i c a mino a c i d s . The p o s s i b l e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n h y d r o p h o b i c e f f e c t s and t h e p r o c e s s o f m i n e r a l d e p o s i t i o n a r e d i s c u s s e d . I n a d d i t i o n , t h e a c c o m m o d a t i o n o f c o l l a g e n t o t h e d e p o s i t i o n o f a p a t i t e i n t h e o v e r l a p z o n e i s d i s c u s s e d . i i i TABLE OF CONTENTS Page Numb A b s t r a c t n A b b r e v i a t i o n s L i s t o f F i g u r e s v A c k n o i u l e d g e m e n t s y i H i s t o r i c a l R e v i e w 1 I n t r o d u c t i o n 28 M a t e r i a l s and M e t h o d s 32 R e s u l t s 3 7 D i s c u s s i o n gg C o n c l u s i o n s 58 R e f e r e n c e s 7Q i v L I S T OF FIGURES F i g u r e T i t l e Page Number 1. Hodge and P e t r u s k a ( 1 9 6 3 ) p a c k i n g m o d e l . 16 2. E l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f n o n - m i n e r a l i z e d t u r k e y l e g t e n d o n . 39 3. P e r i o d i c s t a i n i n g p a t t e r n o f c o l l a g e n f i b r i l s . 42 4. L o u m a g n i f i c a t i o n o f g l y c e r o l t r e a t e d t u r k e y t e n d o n . 45 5. S t a g e s o f c a l c i f i c a t i o n n e a r t h e m i n e r a l i z a t i o n f r o n t . 46 6. L o c a l i z a t i o n o f a p a t i t e i n c o l l a g e n . 50 7. A n a l y s i s o f c o l l a g e n o r i e n t a t i o n i n m i n e r a l i z e d t e n d o n . 54 8. E l e c t r o n d i f f r a c t i o n i n u n s t a i n e d m i n e r a l i z e d and a l c o h o l i c s t a i n e d m i n e r a l i z e d t e n d o n . 54 9. A c o m p a r i s o n o f t h e d i s t r i b u t i o n o f h y d r o p h o b i c a mino a c i d s and m i n e r a l a p a t i t e . 59 10. D i s t r i b u t i o n o f p r o l i n e and h y d r o x y p r o l i n e . 59 ABBREVIATIONS K L y s i n e R A r g i n i n e L L e u c i n e S S e r i n e 1*1 M e t h i o n i n e T T h r e o n i n e N A s p a r a g i n e U H y d r o x y l y s i n e 0 H y d r o x y p r o l i n e V V a l i n e P P r o l i n e Ui T r y p t o p h a n Q G l u t a m i n e Y T y r o s i n Amino A c i d s A A l a n i n e C C y s t e i n e D A s p a r t i c A c i d E G l u t a m i c A c i d F P h e n y l a l a n i n e G G l y c i n e H H i s t i d i n e I I s o l e u c i n e O t h e r A b b r e v i a t i o n s a " a " b a n d s o f c o l l a g e n s t a i n i n g p a t t e r n b "b" b a n d s o f c o l l a g e n s t a i n i n g p a t t e r n c - " c " b a n d s o f c o l l a g e n s t a i n i n g p a t t e r n C- C a r b o x y t e r m i n u s o f p e p t i d e c h a i n d " d " band o f c o l l a g e n s t a i n i n g p a t t e r n D A x i a l p e r i o d o f t y p e I c o l l a g e n e " e " b a n d s o f c o l l a g e n s t a i n i n g p a t t e r n h Hour min M i n u t e Amino t e r m i n u s o f p e p t i d e c h a i n nm n a n o m e t e r PTA P h o s p h o t u n g s t i c a c i d SADF S e l e c t e d - a r e a d a r k f i e l d e l e c t r o n m i c r o s c o p y UA U r a n y l A c e t a t e jqm M i c r o m e t e r v i ACKNOWLEDGEMENTS At t h i s t i m e I w o u l d l i k e t o t h a n k two i n d i v i d u a l s who we r e i n s t r u m e n t a l i n my c o m p l e t i o n o f t h i s t h e s i s . D r . A r s e n a u l t has c r e a t e d a w o n d e r f u l e n v i r o n m e n t w i t h i n h i s l a b t h r o u g h h i s p a t i e n t g u i d a n c e a n d s u p e r v i s i o n . A l s o , h i s c r e a t i v e i d e a s and p r o d u c t i v i t y a r e c h a r a c t e r i s t i c s w h i c h i n s p i r e a n d m o t i v a t e . L i s a , my w i f e , was l a r g e l y r e s p o n s i b l e f o r t h e s u c c e s s o f t h i s e n d e a v o u r b e c a u s e s h e c o n s i d e r e d my g o a l s i m p o r t a n t e nough t o e n d u r e my many y e a r s a s a s t u d e n t . I n a d d i t i o n , I w o u l d l i k e t o c o l l e c t i v e l y t h a n k t h e ' g r a d u a t e s t u d e n t s , p r o f e s s o r s and r e s e a r c h e r s who s u f f e r e d my many q u e s t i o n s and a s s i s t e d me i n l e a r n i n g t h r o u g h o u t t h i s p r o g r a m . F i n a n c i a l l y t h i s work was s u p p o r t e d by a g r a n t t o D r . A.L. A r s e n a u l t f r o m t h e M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l o f C a n a d a and a s c h o l a r s h i p t o M. E. M a i t l a n d f r o m t h e P h y s i o t h e r a p y F o u n d a t i o n o f C a n a d a . 1 HISTORICAL REVIEW I n t r o d u c t i o n As a m a j o r c o m ponent o f b o n e , t e n d o n and o t h e r t y p e s o f l o o s e and d e n s e c o n n e c t i v e t i s s u e s , t y p e I c o l l a g e n i s t h e most p r e v a l e n t p r o t e i n i n v e r t e b r a t e s . I t s r e c o g n i z e d i m p o r t a n c e i n a v a r i e t y o f b i o l o g i c a l p r o c e s s e s has r e s u l t e d i n an a b u n d a n c e o f i n f o r m a t i o n a b o u t t h i s p r o t e i n , b u t i t s r o l e i n m i n e r a l i z a t i o n r e m a i n s p o o r l y u n d e r s t o o d . The p u r p o s e o f t h i s h i s t o r i c a l r e v i e w i s t o e x a m i n e p r e v i o u s w o r k s a b o u t c o l l a g e n m o l e c u l a r s t r u c t u r e , a p a t i t e s t r u c t u r e and t h e i r i n t e r - r e l a t i o n s h i p s w h i c h have f o r m e d o u r c u r r e n t c o n c e p t s o f b i o l o g i c a l m i n e r a l i z a t i o n w i t h i n t y p e I c o l l a g e n f i b r i l s . T h e s e w o r k s have been c o l l e c t e d f r o m s e v e r a l a r e a s o f c o l l a g e n r e s e a r c h i n c l u d i n g m o r p h o l o g y , p r o t e i n s t r u c t u r e , b i o c h e m i s t r y , and e l e c t r o n m i c r o s c o p y i n o r d e r t o a s s e s s t h e d e v e l o p m e n t o f i d e a s i n t h i s a r e a . The v o l u m e o f w o r k s on c o l l a g e n and m i n e r a l i z a t i o n i n v a r i o u s t i s s u e s r e q u i r e s t h a t t h i s r e v i e w be s e l e c t i v e o f p a p e r s w h i c h a r e d i r e c t l y r e l a t e d t o t h e t h e s i s r a t h e r t h a n e x p l o r e t h e e n t i r e w o r l d o f m i n e r a l i z a t i o n r e s e a r c h . H owever, s i n c e t h e t u r k e y t e n d o n u s e d f o r t h i s s t u d y i s a m o d e l o f bone d e v e l o p m e n t , some o f t h e s i m i l a r i t i e s and d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e two t i s s u e s w i l l be d i s c u s s e d . I n t h i s t h e s i s t h e u s e o f " c o l l a g e n " w i l l r e f e r s p e c i f i c a l l y t o t y p e I c o l l a g e n i n o r d e r t o a v o i d u n n e c c e s s a r y r e p e t i t i o n . The t e r m 2 " b i o l o g i c a l a p a t i t e " i s u s e d i n t h i s t h e s i s t o e m p h a s i z e t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n h y d r o x y a p a t i t e , c o n s i d e r e d t h e b e s t m o d e l f o r a p a t i t e c r y s t a l s i n t u r k e y t e n d o n , and t h e a c t u a l b i o l o g i c a l c r y s t a l s t r u c t u r e . I f t h e r e a d e r w i s h e s f u r t h e r i n f o r m a t i o n s e v e r a l good r e v i e w s have been p u b l i s h e d r e c e n t l y ( M i l l e r , 1 9 8 4 ; Chapman and H u l m e s , 1 9 8 4 ; B o n n u c c i , 1 984; K'uhn, 1 9 8 7 ) . C o l l a g e n has s i m i l a r i t i e s and d i f f e r e n c e s f r o m t i s s u e t o t i s s u e . W i t h i n a l l c o n n e c t i v e t i s s u e s , c o l l a g e n h a s a h i e r a r c h y o f s t r u c t u r a l o r d e r f r o m t h e m o l e c u l a r t o t h e m i c r o s c o p i c . T h r e e p e p t i d e c h a i n s f o r m t h e c o l l a g e n m o l e c u l e ; s e v e r a l c o l l a g e n m o l e c u l e s c o m b i n e t o f o r m a m i c r o f i b r i l ; many m i c r o f i b r i l s f o r m a c o l l a g e n f i b r i l ; a n d c o l l a g e n f i b e r s c o n s i s t o f many f i b r i l s . D i f f e r e n c e s r e s u l t f r o m t i s s u e - s p e c i f i c p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s and i n t e r a c t i o n s w i t h o t h e r m o l e c u l e s o f t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x , r e s u l t i n g i n a v a r i e t y o f a r c h i t e c t u r e s t o s u p p o r t t h e t i s s u e s i n t h e bod y . T h e s e a r c h i t e c t u r e s a r e , i n p a r t , r e s p o n s i b l e f o r t h e b i o m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s o f t h e d i f f e r e n t t i s s u e s . F o r e x a m p l e , c o l l a g e n f i b r i l s a r e v e r y l o n g and may e x t e n d f o r m i c r o n s o r c e n t i m e t e r s d e p e n d i n g on t h e t i s s u e . F i b r i l d i a m e t e r s v a r y f r o m 1Onm i n t h e v i t r e o u s humour o f t h e eye t o 500nm i n m a t u r e r a t t a i l t e n d o n ( P a r r y e t a l . , 1 9 7 8 ) . I n b o n e , c o l l a g e n f i b r i l s w i t h i n t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x o f o s t e o i d a r e i n t e r w o v e n , i n a p o o r l y d e f i n e d n e t w o r k , p r i o r t o m i n e r a l i z a t i o n . F o l l o w i n g 3 r e m o d e l l i n g o f b o n e , t h e l a m i n a t e d a r c h i t e c t u r e o f c o l l a g e n w i t h i n t h e m i n e r a l i z e d m a t r i x i s a r e f l e c t i o n o f c o m p r e s s i v e , s h e a r and d i s t r a c t i v e f o r c e s . C o l l a g e n f i b r i l s i n bone a r e d i s t r i b u t e d i n two d i f f e r e n t f o r m s . I n t h e " o r t h o g o n a l p l y w o o d " m o d e l , f i b r i l s a r e o r g a n i z e d i n t o d i s t i n c t l a m e l l a . W i t h i n e a c h l a m e l l a t h e f i b r i l s a r e p r e d o m i n a n t l y p a r a l l e l t o one a n o t h e r and t h e d i r e c t i o n o f t h e f i b r i l s c h a n g e s f r o m one l a m e l l a t o t h e n e x t by an a n g l e c l o s e t o 90 d e g r e e s . An a l t e r n a t i v e o r g a n i z a t i o n o f f i b r i l s w i t h i n b o n e , w h i c h may o c c u r w i t h i n t h e same s p e c i m e n , i s t h e " t w i s t e d p l y w o o d " a r c h i t e c t u r e o f f i b r i l s . I n t h i s m o d e l t h e f i b r i l s w i t h i n e a c h l a m e l l a a r e o r g a n i z e d i n t o a s u p e r i m p o s e d s e r i e s o f n e s t e d a r c s . The d i r e c t i o n o f t h e f i b r i l s f r o m one l a m e l l a t o a n o t h e r r o t a t e s c o n t i n u o u s l y by a c o n s t a n t a n g l e . A l t h o u g h t h e s e two g e n e r a l p a t t e r n s a r e p r e s e n t , t h e l o c a l t h r e e - d i m e n s i o n a l a r r a n g e m e n t o f c o l l a g e n f i b r i l s w i t h i n bone i s v e r y c o m p l e x . They f o l l o w a s i n u s o i d a l c o u r s e , l o c a l h e l i c o i d a l b u n d l e s o c c u r and f i b r i l s may a b r u p t l y c h a n g e d i r e c t i o n ( G i r a u d - G u i l l e , 1 9 8 8 ) . I n c o n t r a s t t o b o n e , t e n d o n s c o n t a i n p a r a l l e l , d e n s e l y - p a c k e d f i b r i l s w h i c h c a n s u s t a i n h i g h t e n s i l e f o r c e s . The s t r u c t u r e and c o m p o s i t i o n o f t e n d o n s p e r m i t t h e r a p i d t r a n s m i s s i o n o f f o r c e s g e n e r a t e d by c o n t r a c t i l e e l e m e n t s o f m u s c l e . T e n d o n s t r a n s m i t t h e s e l o a d s w i t h a minimum o f e n e r g y l o s s and d e f o r m a t i o n ( S i l v e r , 1 9 8 7 ) . T u r k e y l e g t e n d o n s , w h i c h m i n e r a l i z e as a p a r t o f n o r m a l 4 g r o w t h a f t e r 9 weeks o f a g e , have been u s e d i n e l e c t r o n m i c r o s c o p i c i n v e s t i g a t i o n s o f c o l l a g e n m i n e r a l i z a t i o n b e c a u s e t h e l i n e a r , p a r a l l e l a r r a n g e m e n t o f f i b r i l s p e r m i t s a n a l y s i s a l o n g i n d i v i d u a l f i b r i l s ( N y l e n e t a l . , 1 9 6 0 ; M y e r s and E n g s t r b m , 1 9 6 5 ; A r s e n a u l t , 1 9 8 8 ) . C o l l a g e n , i n a d d i t i o n t o i t s b i o m e c h a n i c a l r o l e , i s a l s o i n t i m a t e l y i n v o l v e d i n t h e p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s o f m i n e r a l i z a t i o n i n b o n e , d e n t i n and t u r k e y l e g t e n d o n . E v i d e n c e f o r t h e c l o s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c o l l a g e n and b i o l o g i c a l a p a t i t e i n n o r m a l bone f u n c t i o n comes, i n p a r t , f r o m s t u d i e s o f o s t e o g e n e s i s i m p e r f e c t a , a h e t e r o g e n e o u s g r o u p o f i n h e r i t e d d i s e a s e s . I n most i n s t a n c e s , t h e s k e l e t a l m a n i f e s t a t i o n s " o f o s t e o g e n e s i s i m p e r f e c t a a r e due t o m o l e c u l a r d e f e c t s o f t y p e I c o l l a g e n ( H o l l i s t e r , 1 9 8 7 ) . D e s p i t e t h e i m p o r t a n c e o f c o l l a g e n i n t h e f u n c t i o n o f m i n e r a l i z e d t i s s u e s v e r y l i t t l e i s known a b o u t t h e m e c h a n i s m s w h i c h g i v e r i s e t o t h i s r e l a t i o n s h i p . The p r i m a r y i n t e r e s t o f t h i s work i s t h e l o c a l i z a t i o n o f a p a t i t e c r y s t a l s w i t h r e s p e c t t o t h e amino a c i d c o m p o s i t i o n o f c o l l a g e n and s t e m s f r o m an a p p a r e n t n e e d t o i n t e g r a t e new f i n d i n g s w i t h c u r r e n t c o n c e p t s o f c o l l a g e n / m i n e r a l i n t e r a c t i o n . R e c e n t i n f o r m a t i o n s u g g e s t s a p e r i o d i c d i s t r i b u t i o n o f a p a t i t e c r y s t a l s w i t h i n t h e o v e r l a p and gap z o n e s o f c o l l a g e n f i b r i l s ( A r s e n a u l t , 1 9 8 8 ) , and a d e v e l o p m e n t a l g r a d i e n t i n t h e e a r l y s t a g e s o f m i n e r a l i z a t i o n w i t h i n t h e s e z o n e s ( A r s e n a u l t , 1 9 8 9 ) . As an e x t e n s i o n o f 5 t h e s e w o r k s t h e p r e s e n t s t u d y a t t e m p t s t o f u r t h e r a n a l y z e t h e p e r i o d i c d i s t r i b u t i o n o f a p a t i t e . I t i s t h e r e f o r e n e c e s s a r y t o r e v i e w some c o n c e p t s o f c o l l a g e n m o l e c u l a r s t r u c t u r e and t h e p r o p e r t i e s o f b i o l o g i c a l a p a t i t e c r y s t a l s w h i c h have g i v e n r i s e t o t h e d e v e l o p m e n t o f t h i s t h e s i s . The C o l l a g e n M o l e c u l e The c o l l a g e n m o l e c u l e c o n s i s t s o f t h r e e h e l i c a l p e p t i d e c h a i n s w h i c h i n t e r a c t t o f o r m a t r i p l e h e l i x ( R a m a c h a n d r a n and K a r t h a , 1 9 5 5 ; R i c h and C r i c k , 1 9 5 5 ; Cowan e t a l . , 1 9 5 5 ) . T h e s e t h r e e p o l y p e p t i d e c h a i n s e a c h have t h e i r i n d i v i d u a l h e l i c a l c o i l and a r e c o i l e d a b o u t e a c h o t h e r ( R i c h and C r i c k , 1 9 5 5 ) . P i e z e t a l . ( 1 9 6 3 ) d e t e r m i n e d t h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f t h e t h r e e p e p t i d e c h a i n s and d e s c r i b e d t h e c o l l a g e n m o l e c u l a r u n i t as c o n s i s t i n g o f two i d e n t i c a l 1 ( 1 ) p e p t i d e s and one 2 ( l ) p e p t i d e . The s i z e and s h a p e o f t h e c o l l a g ' e n m o l e c u l e was f i r s t d e s c r i b e d by B o e d t k e r a n d D o t y ( 1 9 5 6 ) a s a r i g i d r o d 300nm i n l e n g t h and h a v i n g a d i a m e t e r o f 1.25nm. L a t e r , when t h e amino a c i d s e q u e n c e was b e i n g r e s o l v e d , i t was f o u n d t h e r e a r e two n o n - h e l i c a l p o r t i o n s , one a t e a c h end o f t h e m o l e c u l e . T h e s e a r e t h e and C-t e r m i n a l p o r t i o n s c a l l e d t e l o p e p t i d e s . The c o n f o r m a t i o n s o f b o t h t h e N- and C- t e l o p e p t i d e s a r e n o t known a t p r e s e n t . T h e s e c o n f o r m a t i o n s a r e m o d e l l e d u s i n g s e c o n d a r y s t r u c t u r e p r e d i c t i o n b a s e d on e n e r g y and s t e r i c c a l c u l a t i o n s . S e v e r a l 6 s t e r e o c h e m i c a l m o d e l s may be p o s s i b l e f o r t h e s e r e g i o n s f r o m t h i s m ethod ( J o n e s and M i l l e r , 1 9 8 7 ) . C o n c e p t u a l i z a t i o n o f t h e c o l l a g e n m o l e c u l e a s a r i g i d r o d may n o t be e n t i r e l y c o r r e c t . The t r i p l e h e l i c a l p o r t i o n o f t h e c o l l a g e n m o l e c u l e c a n a l s o be d e s c r i b e d a s a s e m i f l e x i b l e c y l i n d e r (K'uhn, 1 9 8 2 ) . Two c y l i n d r i c a l m o l e c u l e s w o u l d i n t e r a c t w i t h e a c h o t h e r v i a r e a c t i o n e d g e s on t h e i r s u r f a c e s d e p e n d i n g on t h e p o s i t i o n o f a m ino a c i d s i d e c h a i n s . F u n c t i o n a l g r o u p s o f a m ino a c i d s i d e c h a i n s t o w a r d s t h e e x t e r i o r o f t h e c y l i n d e r w o u l d d e t e r m i n e t h e i n t e r m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n s w h i l e t h e a m ino a c i d s i d e c h a i n s w i t h i n t h e t r i p l e h e l i x w o u l d d e t e r m i n e t h e i n t r a m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n s . The c o m p o s i t i o n o f t h e e d g e s w o u l d be d e p e n d e n t on t h e h e l i c a l p i t c h and any a l t e r a t i o n o f t h e p i t c h w i l l c h a n g e t h e c o m p o s i t i o n o f t h e r e a c t i o n e d g e . A l t h o u g h d e t e r m i n a t i o n o f t h e p i t c h o f t h e c o l l a g e n m o l e c u l e i s c r i t i c a l t o d e t e r m i n i n g t h e i n t e r - and i n t r a m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n s , a s i n g l e v a l u e has n o t y e t been a g r e e d u p o n . The p i t c h o f r a t t a i l t e n d o n c o l l a g e n h a s b een r e p o r t e d t o be b e t w e e n 29 and 45 r e s i d u e s ( M i l l e r , 1 9 7 6 ) . The s t u d y o f F r a s e r e t a l . ( 1 9 8 3 ) c a l c u l a t e d t h e p i t c h t o be 30 r e s i d u e s o r 8.68nm. I n d i v i d u a l c o l l a g e n m o l e c u l e s show s u b s t a n t i a l l a t e r a l f l e x i b i l i t y ( V e i s , 1 9 8 5 a ) . T h i s c a n o c c u r b e c a u s e s e g m e n t a l f l u c t u a t i o n s a r e a c c o m m o d a t e d by c h a n g e s i n t h e t r i p l e h e l i x w i t h o u t a p p r e c i a b l e c h a n g e s i n f r e e e n e r e g y (Okuyama e t a l . , 7 1 9 8 1 ) . F l e x i b i l i t y may o c c u r i n two f o r m s 1) s l o w f l e x u r a l m o t i o n s and 2) h i n g e r e g i o n s . V e i s ( 1 9 8 4 ) s u g g e s t e d h i n g e r e g i o n s l o c a t e d b e t w e e n r e s i d u e s 81-102 and 915-939 b e c a u s e t h e y a r e d e v o i d o f p r o l i n e and h y d r o x y p r o l i n e r e s i d u e s w h i c h s t a b i l i z e t h e t r i p l e h e l i x . P r o l i n e i s a m a j o r e l e m e n t i n h e l i x s t a b i l i t y b e c a u s e t h e r i n g s t r u c t u r e p r e v e n t s r o t a t i o n a b o u t t h e N-C bond and t h e r o t a t i o n a b o u t t h e C-C=0 bond i s r e s t r i c t e d . T h u s , w i t h i n t h e c o l l a g e n m o l e c u l e t h e r e i s a s e m i f l e x i b l e r e g i o n o f a b o u t 250nm l e n g t h f l a n k e d by two r e l a t i v e l y f l e x i b l e r e g i o n s . V i e w i n g t h e c o l l a g e n m o l e c u l e a s a c y l i n d e r may a l s o be somewhat s i m p l i s t i c . The m o l e c u l a r m o t i o n s o f t h e p e p t i d e b a c k b o n e and s i d e c h a i n f l e x i b i l i t y o b s e r v e d i n NMR e x p e r i m e n t s ( S a r k a r e t a l . , 1 9 8 3 ; S a r k a r e t a l . , 1987) s u g g e s t t h a t t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n a d j a c e n t m o l e c u l e s i n v o l v e a m y r i a d o f c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n f l u i d - l i k e d o m a i n s . A c c o m m o d a t i o n o f t h e s e c h a n g e s w o u l d c a u s e l o c a l d i s t o r t i o n s i n b o t h t h e l o n g a x i s and t r a n s v e r s e a x i s o f t h e t r i p l e h e l i x . I n o r d e r t o e x p l o r e more f u l l y t h e p r o p e r t i e s o f c o l l a g e n m o l e c u l e s and f i b r i l s i n m i n e r a l i z a t i o n I w o u l d now l i k e t o d i s c u s s r e l e v a n t i s s u e s o f p r o t e i n t r a n s l a t i o n and p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s . The Type _I C o l l a g e n Genes The g e n e s f o r t y p e I c o l l a g e n a r e l a r g e and c o m p l e x . They a r e a b o u t 38Kb i n l e n g t h o f w h i c h 1 0 % i s a c o d i n g a s e q u e n c e o f a b o u t 50 e x o n s (K'uhn, 1 9 8 4 ) . The f i n d i n g t h a t many e x o n s have an i d e n t i c a l l e n g t h o f 54bp s u g g e s t s t h a t t h e a n c e s t r a l gene a r o s e by a m p l i f i c a t i o n o f a s i n g l e g e n e t i c u n i t o f 54bp w h i c h i n t u r n may have a r i s e n f r o m a s i x f o l d r e p e t i t i o n o f a o l i g o n u c l e o t i d e c o d i n g f o r t h e t r i p e p t i d e g l y c i n e - p r o l i n e - p r o l i n e . The f i x a t i o n o f t h i s p a t t e r n o f e x o n s i z e s may due t o an i n t o l e r a n c e t o r e c o m b i n a t i o n a l e v e n t s r e f l e c t e d by a c h a n g e i n p r o t e i n f u n c t i o n (De C r o m b r u g g h e e t a l . , 1 9 8 5 ) . C o l l a g e n shows a h i g h d e g r e e o f c o n s e r v a t i o n ' i n a m i n o a c i d s e q u e n c e and s t r u c t u r e b e t w e e n s p e c i e s . N o r d w i g and Hayduk ( 1 9 6 9 ) p r e s e n t e d e v i d e n c e f o r t h e i n v a r i a n c e o f t h e t e r t i a r y and q u a t e r n a r y s t r u c t u r e s o f t h e t y p e I c o l l a g e n m o l e c u l e b a s e d on " b i o c h e m i c a l and e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e s o f c o l l a g e n s i s o l a t e d f r o m s e v e r a l s p e c i e s w h i c h d i f f e r i n e v o l u t i o n a r y l e v e l . S e y e r and Kang ( 1 9 8 5 ) u s e d a v a i l a b l e a m ino a c i d d a t a t o com p a r e c h i c k t y p e I c o l l a g e n t o a c o m b i n e d s e q u e n c e f r o m b o v i n e and human c o l l a g e n . They f o u n d 1 0 0 % o f t h e b a s i c amino a c i d s (R and K; s e e " A b b r e v i a t i o n s " f o r amino a c i d s i n g l e l e t t e r c o d e s ) , 91/5 o f t h e a c i d i c a m ino a c i d s (D and E) and 79% o f h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s i n t h e a l ( l ) p e p t i d e were r e t a i n e d . I n t h e a 2 ( l ) p e p t i d e , 96% o f t h e b a s i c a m ino a c i d s , 8 7 % o f t h e a c i d i c a m i n o a c i d s , and 66% o f t h e h y d r o p h o b i c amino a c i d s were u n s u b s t i t u t e d . O v e r a l l h o m o l o g y b e t w e e n t h e s e q u e n c e o f 9 t h e a l ( l ) c h a i n s o f c h i c k and a c o m b i n e d s e q u e n c e f r o m r a t and c a l f was f o u n d t o be 9 3 . 4 % ( H i g h b e r g e r e t a l . , 1 9 8 2 ) . C o n s i s t e n c y o f t h e c o l l a g e n g e n e t i c c o d e may be a p r e r e q u i s i t e f o r t h e n o r m a l i n t e r a c t i o n b e t w e e n o r g a n i c and i n o r g a n i c c o m p o n e n t s o f t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x . E v i d e n c e f o r t h i s comes n o t o n l y f r o m i n t e r s p e c i e s h o m o l o g y b u t a l s o f r o m g e n e t i c s t u d i e s o f p a t h o l o g i c a l bone f o r m a t i o n s u c h a s o s t e o g e n e s i s i m p e r f e c t a . S m a l l c h a n g e s i n t h e g e n e t i c c o d e r e s u l t s i n m a j o r b i o m e c h a n i c a l a l t e r a t i o n s . T h e s e c h a n g e s may i n v o l v e e i t h e r t h e a 1 o r t h e a 2 c h a i n and be as s m a l l a s a s i n g l e p o i n t m u t a t i o n ( H o l l i s t e r , 1 9 8 7 ) . The Amino A c i d S e q u e n c e F o l l o w i n g t r a n s c r i p t i o n , t h e p r o c o l l a g e n p e p t i d e s c a n be s u b d i v i d e d i n t o s i x f u n c t i o n a l r e g i o n s d i f f e r i n g i n s i z e and s e q u e n c e c h a r a c t e r i s t i c s . T h e s e a r e d e s c r i b e d s t a r t i n g a t t h e a m ino t e r m i n u s . The f i r s t r e g i o n i s a s i g n a l p e p t i d e w h i c h e n a b l e s t h e p r o t e i n t o move f r o m t h e r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( r E R ) . I t i s c l e a v e d f r o m t h e p r o p e p t i d e i m m e d i a t e l y f o l l o w i n g movement a c r o s s t h e rER membrane ( K r i e l , 1981 ) . The a d j a c e n t f u n c t i o n a l r e g i o n i s t h e a m i n o p r o p e p t i d e . I t i s c o n s i d e r e d i m p o r t a n t i n t h e m o l e c u l a r a s s e m b l y a l o n g w i t h c a r b o x y p r o p e p t i d e , a t t h e o p p o s i t e end o f t h e m o l e c u l e , b e c a u s e c r o s s b r i d g e s a r e f o r m e d a t s p e c i f i c s i t e s o f t h e p r o p e p t i d e s . F o l l o w i n g t h e c l e a v a g e o f t h e s e r e g i o n s by N- and C- p r o p e p t i d e s p e c i f i c p r o t e i n a s e s i n t h e 1 0 e x t r a c e l l u l a r m a t r i x , no c y s t e i n e r e m a i n s t o f o r m d i s u l p h i d e c r o s s b r i d g e s . A d j a c e n t t o t h e amino p r o p e p t i d e , t h e a m i n o t e l o p e p t i d e , i s a s h o r t n o n - h e l i c a l s e g m e n t , 16 r e s i d u e s i n l e n g t h . The t r i p l e h e l i c a l p o r t i o n i s 1014 amino a c i d r e s i d u e s i n l e n g t h . The c a r b o x y t e l o p e p t i d e i s 25 r e s i d u e s i n l e n g t h ( M i l l e r , 1 9 8 4 ) . The amino a c i d s e q u e n c e o f c o l l a g e n i s c h a r a c t e r i z e d by a v / a r i e t y o f r e p e a t i n g p a t t e r n s w h i c h a r e f u n c t i o n a l l y s i g n i f i c a n t . The r e p e a t i n g D p e r i o d , 234 a m i n o a c i d s i n l e n g t h ( H u l m e s e t a l . , 1 9 7 3 ) , i s v i s u a l i z e d i n t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e f o l l o w i n g h e a v y m e t a l s t a i n i n g and a l s o i n e a r l y s t a g e s o f m i n e r a l i z a t i o n , i n u n s t a i n e d t i s s u e , due t o t h e p e r i o d i c d i s t r i b u t i o n o f a p a t i t e . I t i s c o n s i d e r e d t o be t h e s t r u c t u r a l u n i t r e s p o n s i b l e f o r f i b r i l l a r o r g a n i z a t i o n . The a m i n o a c i d t r i p l e t r e p e a t w i t h g l y c i n e i n e v e r y t h i r d p o s i t i o n o f t h e p e p t i d e c h a i n i s r e s p o n s i b l e f o r t h e t r i p l e h e l i c a l s t r u c t u r e o f t h e m o l e c u l e - ( R a m a c h a n d r a n and K a r t h a , 1 9 5 5 ) . The t r i p l e t r e p e a t o f t h i s r e g i o n i s o f t e n a b b r e v i a t e d G-X-Y where G i s g l y c i n e , and X o r Y c a n be any amino a c i d e x c e p t c y s t e i n e o r t r y p t o p h a n . J o n e s e t a l . ( 1 9 8 5 ) s u g g e s t e d t h a t t h e X and Y p o s i t i o n s d i f f e r s t e r e o c h e m i c a l l y i n t h e t r i p l e h e l i x s u c h t h a t t h e Y p o s i t i o n was more i n v o l v e d i n i n t e r m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n s w h i l e t h e X p o s i t i o n was i n v o l v e d more i n i n t r a m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n s . O t h e r p o t e n t i a l r e p e a t i n g u n i t s o f amino a c i d s e q u e n c e were a n a l y s e d by Hofrnann e t a l . (1 9 8 0 ) . They f o u n d 11 s e v e r a l p a t t e r n s i n t h e two p e p t i d e c h a i n s . The r e p e a t u n i t s D, 2D, 3D, D/3, D/2, D/13 and 4D/11 s t a t i s t i c a l l y a r e u n l i k e l y t o o c c u r by c h a n c e and a r e p r e s u m e d t o h a v e some f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e . The a m ino a c i d s e q u e n c e has l o n g b e en c o n s i d e r e d o f p a r a m o u n t i m p o r t a n c e t o t h e b i o m e c h a n i c a l and p h y s i o l o g i c f u n c t i o n s o f c o l l a g e n and y e t t h e r e h a s n o t b e e n an a n a l y s i s o f t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e a m ino a c i d s e q u e n c e and m i n e r a l i z a t i o n . F o l l o w i n g t r a n s l a t i o n o f t h e p e p t i d e s e v e r a l e v e n t s t a k e p l a c e w h i c h m o d i f y t h e p r o t e i n . T h e s e m o d i f i c a t i o n s a r e e s s e n t i a l f o r m o l e c u l a r a s s e m b l y , f o r f i b r i l l a r o r g a n i z a t i o n and may i n f l u e n c e b i o m i n e r a l i z a t i o n . P o s t - T r a n s l a t i o n a l M o d i f i c a t i o n s P r i o r t o m o l e c u l a r a s s e m b l y , w h i l e t h e i n d i v i d u a l p o l y p e p t i d e s a r e a s s o c i a t e d w i t h t h e r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m , a l a r g e number o f s e g m e n t s o f t h e u n h y d r o x y l a t e d p r o c o l l a g e n m o l e c u l e s e x i s t i n g - t u r n c o n f o r m a t i o n s ( B r a h m a c h a r i and A n a n t h a n a r a y a n a n , 1 9 7 8 ) . Th i s c o n f o r m a t i o n may be t h e s p e c i f i c s i t e o f p r o l i n e h y d r o x y l a t i o n . The r e s u l t o f p r o l i n e h y d r o x y l a t i o n i s a c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e o f t h e i n d i v i d u a l p e p t i d e s w h i c h i s n e c e s s a r y p r i o r t o t h e i n t e r t w i n i n g o f t h e t h r e e c h a i n s ( C h o r p r a and A n a n t h a n a r a y a n a n , 1 9 8 2 ) . H y d r o x y p r o l i n e p l a y s an i m p o r t a n t r o l e i n t h e s t a b i l i z a t i o n n o t o n l y o f t h e t r i p l e - h e l i c a l c o l l a g e n m o l e c u l e b u t a l s o o f i t s a s s e m b l y i n t o m i c r o f i b r i l s 1 2 (Nemethy and S c h e r a g a , 1 9 8 6 ) . H y d r o x y p r o l i n e when f o u n d i s a l w a y s i s t h e Y p o s i t i o n ( G l y - X - Y ) o f t h e t r i p l e h e l i c a l p o r t i o n ( B o r n s t e i n a nd T r a u b , 1 9 7 9 ) . I t has been s u g g e s t e d t h a t h y d r o g e n b o n d s b e t w e e n t r i p l e - h e l i c e s o c c u r b e t w e e n h y d r o x y p r o l i n e and a C=0 g r o u p on an a d j a c e n t h e l i x ( B a n s a l e t a l . , 1 9 7 5 ) . Hyd r o x y p r o l i n e i s known t o be e s s e n t i a l f o r t h e s t r u c t u r a l i n t e g r i t y o f c o l l a g e n a t body t e m p e r a t u r e ( P r o c k o p e t a l . , 1 9 7 6 ) . R a m a c h a n d r a n e t a l . ( 1 9 7 3 ) h a s s u g g e s t e d t h e e x i s t e n c e o f s p e c i f i c w a t e r - b r i d g e d h y d r o g e n b o n d s a s s o c i a t e d w i t h h y d r o x y p r o l i n e w h i c h f u r t h e r s t a b i l i z e t h e t r i p l e h e l i x . F o l l o w i n g p e p t i d e t r a n s l a t i o n and p r i o r t o t r i p l e h e l i x f o r m a t i o n a v a r i a b l e number o f t h e l y s i n e r e s i d u e s a r e h y d r o x y l a t e d . The d e g r e e o f h y d r o x y l a t i o n o f l y s i n e i s v a r i a b l e b e t w e e n t i s s u e s and a g e s . The i m p o r t a n c e o f h y d r o x y l y s i n e t o c o l l a g e n i s i n t h e r o l e o f c r o s s l i n k f o r m a t i o n and g l y c o s y l a t i o n ( K i v i r i k k o , 1 9 8 0 ) . H y d r o x y l y s i n e i s f o r m e d i m m e d i a t e l y p r i o r t o t r i p l e h e l i x f o r m a t i o n a t t h e r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( K i v i r i k k o e t a l . , 1 9 7 3 ) . I n t r a c e l l u l a r p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s c o n t i n u e w i t h t h e a t t a c h m e n t o f mono- and d i s a c c h a r i d e s t o t h e m o l e c u l e . D - g a l a c t o s e and D - g l u c o s e a r e c o v a l e n t l y a t t a c h e d t o t h e p o l y p e p t i d e a t h y d r o x y l y s i n e r e s i d u e s v i a an 0 - g l y c o s i d i c l i n k a g e ( B u t l e r and C u n n i n g h a m , 1 9 6 6 ) . T h e r e a p p e a r s t o be a h i g h d e g r e e o f s p e c i f i c i t y f o r t h e g l y c o s y l a t i n g enzymes due t o t h e few s p e c i f i c s i t e s t o w h i c h 1 3 t h e c a r b o h y d r a t e s a t t a c h ( M i l l e r , 1 9 7 6 ) . To d a t e I h a v e f o u n d no s t u d i e s d i r e c t e d a t t h e f u n c t i o n o f t h e g l y c o s y l a t i o n o f c o l l a g e n i n bone f o r m a t i o n o r m i n e r a l d e p o s i t i o n . S e l f a s s e m b l y F o l l o w i n g s e c r e t i o n o f p r o c o l l a g e n m o l e c u l e s i n t o t h e e x t r a c e l l u l a r e n v i r o n m e n t , where t h e y b e h a v e a s e l o n g a t e d and a s y m m e t r i c a l m o l e c u l e s i n s o l u t i o n ( l / e i s , 1 9 8 5 a ) , t h e s e m o l e c u l e s a r e o r g a n i z e d i n t o f i b r i l s . The a r c h i t e c t u r e o f t h e c o l l a g e n f i b r i l s d e r i v e d may i n i t i a l l y be a f u n c t i o n o f t h e m o l e c u l a r g e o m e t r y and s o l u b i l i t y w i t h i n t h e l o c a l e n v i r o n m e n t ( G i r a u d - G u i l l e , 1 9 8 8 ) . C o l l a g e n m o l e c u l e s a r e b e l i e v e d t o p o l y m e r i z e s p o n t a n e o u s l y t o f o r m f i b r i l s i n t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x b a s e d on i n v i t r o s t u d i e s ( G r o s s and D i r k , 1 9 5 8 ) . F u r t h e r m o r e , t h e i n v i t r o f o r m s o f c o l l a g e n , f i b r o u s l o n g s p a c i n g , s e g m e n t e d l o n g s p a c i n g and n a t i v e f i b r i l s a r e i n t e r c o n v e r t i b l e by d i s s o l u t i o n a nd s u b s e q u e n t r e a g g r e g a t i o n u n d e r s p e c i f i c c o n d i t i o n s ( S c h m i t t e t a l . , 1 9 5 3 ) . T h u s , i t has been s u g g e s t e d t h a t i n t e r a c t i o n s among s i d e c h a i n s on a d j a c e n t m o l e c u l e s have a m a j o r r o l e i n d i r e c t i n g c o l l a g e n f i b r i l a s s e m b l y ( H u l m e s e t a l . , 1 9 73) and s t a b i l i z a t i o n o f c o l l a g e n s t r u c t u r e . I o n i c c l u s t e r i n g o f s i d e c h a i n s o c c u r s due t o t h e r e l a t i v e p o s i t i o n o f n e g a t i v e and p o s i t i v e c h a r g e s i n t h e G-X-Y t r i p l e t ( D o y l e e t a l , 1 9 7 4 ) . A l t e r n a t i n g c h a r g e s , p o s i t i v e and n e g a t i v e , may o c c u r 1 A l i n e a r l y t o p r o v i d e s t a b i l i t y ( P i e z and T o r c h i a , 1 9 7 5 ) . I n t h r e e - d i m e n s i o n s t h i s w o u l d r e s u l t i n more t h a n two m o l e c u l e s c o n t r i b u t i n g t o an o r d e r l y a r r a n g e m e n t o f i o n s and h ave p r o p e r t i e s o f an i o n i c c r y s t a l . I n a d d i t i o n , h y d r o p h o b i c g r o u p s o c c u r i n p e r i o d i c s p a c i n g ( P i e z and T r u s , 1 9 7 8 ) . The a g g r e g a t i o n o f h y d r o p h o b i c g r o u p s w o u l d l e a d t o l e s s d i s r u p t i o n o f t h e s t r o n g p o l a r f o r c e s o f t h e a q u e o u s e n v i r o n m e n t w h i c h s u r r o u n d s them ( T a n f o r d , 1 9 8 0 ) . The c l o s e a s s o c i a t i o n o f h y d r o p h o b i c a mino a c i d s w o u l d t h e r e f o r e l e a d t o s t a b i l i t y i n t h e c o l l a g e n f i b r i l p r i o r t o t h e f o r m a t i o n o f c r o s s l i n k s . Hulmes ( 1 9 8 3 ) s u g g e s t e d t h a t c o l l a g e n f i b r i l g r o w t h o c c u r s by a c c r e t i o n o f c o n c e n t r i c l a y e r s o f c o l l a g e n m o l e c u l e s . P r o c o l l a g e n p r o c e s s i n g ( F l e i s c h m a j e r e t a l . , 1 9 8 3 ) o r i n t e r a c t i o n s w i t h p r o t e o g l y c a n s (Wood, 1960) have been s u g g e s t e d a s f a c t o r s l i m i t i n g t h e t i s s u e s p e c i f i c f i b r i l d i a m e t e r . A m i n o p r o p e p t i d e s p a r t i c i p a t e i n f i b r i l l o g e n e s i s a n d may r e g u l a t e f i b r i l d i a m e t e r ( F l e i s c h m a j e r e t a l . , 1 9 8 3 ) . P r o c o l l a g e n a m i n o p r o p e p t i d e s o f t y p e I c o l l a g e n h a v e been d e m o n s t r a t e d c o l l a g e n f i b r i l s by i m m u n o f l u o r e s c e n c e (Nowack e t a l . , 1 9 7 6 ) and i m m u n o e l e c t r o n m i c r o s c o p i c t e c h n i q u e s ( F l e i s c h m a j e r e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e r e f o r e , f i b r i l f o r m a t i o n may i n v o l v e t h e p o l y m e r i z a t i o n o f a m i n o p r o c o l l a g e n ( F l e i s c h m a j e r e t a l . , 1 9 8 5 ) . P r o c o l l a g e n N - p r o t e i n a s e w o u l d t h e n a c t on t h e f i b r i l s t o remove t h e amino p r o p e p t i d e . An a l t e r n a t i v e h y p o t h e s i s o f t h e c o n t r o l o f f i b r i l s i z e i s 1 5 d e r i v e d f r o m i n v i t r o s t u d i e s o f p r o t e o g l y c a n / c o l l a g e n i n t e r a c t i o n s w h i c h have f o u n d c h a n g e s i n f i b r i l d i a m e t e r r e l a t e d t o t h e c o n c e n t r a t i o n and t y p e o f p r o t e o g l y c a n p r e s e n t ( P a r r y e t a l . , 1 9 8 2 ) . The s t r i k i n g u l t r a s t r u c t u r a l f e a t u r e o f c o l l a g e n i s t h e c r o s s - s t r i a t e d s t a i n i n g p a t t e r n w h i c h r e p e a t s i n e a c h D p e r i o d due t o t h e l o c a l i z a t i o n o f c h a r g e d a mino a c i d s ( B e a r , 1 9 5 2 ) . E a r l y e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e s o f c o l l a g e n d e t e r m i n e d t h e l e n g t h o f t h e D p e r i o d t o be 64 nm ( H a l l e t a l . , 1 9 4 2 ) . H o w e v e r , x - r a y d i f f r a c t i o n m e t h o d s y i e l d g r e a t e r v a l u e s (67.8nm) d e p e n d i n g on t h e d e g r e e o f s t r e t c h ( F r a s e r e t a l . , 1 9 8 3 ) . The t r u e v a l u e f o r t h i s u n i t r e m a i n s i n d e b a t e b e c a u s e c o l l a g e n f i b r i l s a r e p r o n e t o a r t i f a c t u a l c h a n g e s i n D l e n g t h b u t i t may a l s o be t i s s u e s p e c i f i c o r d e p e n d e n t on t h e l o c a l e n v i r o n m e n t . The e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a n a l y s i s o f r e p e a t i n g u n i t s o f i n v i t r o c o l l a g e n a g g r e g a t e s h a s r e s u l t e d i n t h e o r i e s o f t h e m o l e c u l a r t w o - d i m e n s i o n a l p a c k i n g a r r a n g m e n t . T h i s e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a p p r o a c h l e d t o t h e q u a r t e r - s t a g g e r e d p a c k i n g m o d e l (Hodge and S c h m i t t , 1 9 6 0 ) . I n a d d i t i o n , Hodge and S c h m i t t ( i 9 6 0 ) d e f i n e d t h e " a , b, c, d and e" n o m e n c l a t u r e f o r t h e c o l l a g e n f i b r i l b a n d i n g w h i c h w i l l be u s e d i n t h i s t h e s i s . Hodge and P e t r u s k a ( 1 9 6 3 ) f i r s t s u g g e s t e d a m o d e l i n w h i c h l o n g i t u d i n a l l y a d j a c e n t m o l e c u l e s were s e p a r a t e d by a s p a c e ( s e e F i g u r e 1 ) . 1 6 D=67nm OVER-GAP, | A P D=234 RESIDUES ZONt •'.•'.•'.•'.•'.•'A ZONE it t • •>: : . :>>::v^^ E S s d •^•••••••Vr] K-WX-K .6D AD 40.2nm 26.8nm 44D=300nrn F i g u r e 1. The Hodge and P e t r u s k a ( 1 9 6 3 ) p a c k i n g m o d e l o f t y p e I c o l l a g e n m o l e c u l e s . T h e s e m o l e c u l e s a r e d e p i c t e d a s l i n e a r r o d s s t a g g e r e d by 234 amino a c i d r e s i d u e s , o r D, t o t h e a d j a c e n t m o l e c u l e . T h i s m o d e l h a s two i m p o r t a n t c o n s e q u e n c e s . F i r s t , t h e mo d e l p r e d i c t s two z o n e s o f d i f f e r e n t d e n s i t i e s w i t h i n t h e r e p e a t i n g D u n i t , a d e n s e l y p a c k e d o v e r l a p z o n e and a gap zone w i t h p o t e n t i a l s p a c e a v a i l a b l e . S e c o n d , t h e p e r i o d i c l o c a l i z a t i o n o f amino a c i d s c a n be a n a l y z e d by c o m p u t e r m o d e l l i n g u s i n g t h e p r i m a r y s e q u e n c e o f c o l l a g e n . I n t h i s t h e s i s t h e s i n g l e l e t t e r c o d e s f o r t h e amino a c i d s e q u e n c e o f c o l l a g e n were o r g a n i z e d i n t o r e p e a t i n g u n i t s a c c o r d i n g t o t h e Hodge and P e t r u s k a ( 1 9 6 3 ) m o d e l . 1 7 The Hodge and P e t r u s k a ( 1 9 6 3 ) m o d e l has t h e i m p o r t a n t c o n s e q u e n c e t h a t i t p r e d i c t s two a l t e r n a t i n g z o n e s o f d i f f e r e n t d e n s i t i e s . A c l o s e l y p a c k e d o v e r l a p z o n e w o u l d c o n t a i n t i g h t l y f i t t i n g p a r a l l e l m o l e c u l e s . T h e gap zo n e w o u l d c o n t a i n one s p a c e f o r e v e r y f o u r m o l e c u l e s b e c a u s e o f t h e l o n g i t u d i n a l s e p a r a t i o n b e t w e e n m o l e c u l e s . The Hodge and P e t r u s k a ( 1 9 6 3 ) m o d e l h a s been v e r y i m p o r t a n t t o t h e c u r r e n t u n d e r s t a n d i n g o f c o l l a g e n s t r u c t u r e and h i s t o c h e m i s t r y . T h i s m o d e l p e r m i t s t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a n a l y s i s o f c o l l a g e n f i b r i l a m i no a c i d c o m p o s i t i o n (Meek e t a l . , 1 9 7 9 ) w h i c h w i l l be u s e d i n t h i s s t u d y . D e s p i t e i t s u t i l i t y i n e l e c t r o n m i c r o s c o p i c i n v e s t i g a t i o n s t h e f i b r i l l a r s t r u c t u r e o f t h i s m o d e l i s o v e r s i m p l i f i e d . I t g i v e s t h e i l l u s i o n t h a t t h e m o l e c u l e s a r e l i n e a r and r i g i d . I n r e a l i t y t h e t h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f t h e c o l l a g e n m o l e c u l e s i n s p a c e i s c o m p l e x . T h e r e a r e t h r e e o r f o u r l e v e l s o f c o i l i n g t o t h e l e v e l o f t h e f i b r i l . The c o i l o f t h e c h a i n , t h e c o i l a b o u t t h e m o l e c u l a r a x i s , t h e c o i l a b o u t t h e m i c r o f i b r i l l a r a x i s and i n some c a s e s , t h e m i c r o f i b r i l s a r e c o i l e d w i t h i n t h e f i b r i l ( R u g g e r i e t a l . , 1 9 7 9 ) . I n a d d i t i o n , i n F i g u r e 1, i t a p p e a r s a s i f t h e r e a r e l a r g e , p o r o u s h o l e s a t t h e l e v e l o f t h e gap zo n e b e c a u s e o f t h e way F i g u r e 1 was c o n s t r u c t e d . H o w e v e r , t o be more t o t h e s c a l e o f t h e a c t u a l m o l e c u l e , i n t h i s i l l u s t r a t i o n t h e w i d t h o f t h e gap zo n e w o u l d be 5/1000 x t h e l e n g t h o f t h e m o l e c u l e ( o r 0.5mm). So t h e v o l u m e o f t h e i n d i v i d u a l gap z o n e s i s v e r y s m a l l b a s e d on t h i s m o d e l . 1 8 F o r e x a m p l e , i f we c o n s i d e r t h e i n d i v i d u a l gap as a box s h a p e d s p a c e w i t h t h e l o n g e s t d i m e n s i o n 40nm and t h e o t h e r s i d e s 1.5nm (Hodge and P e t r u s k a , 1 9 6 3 ) t h e n t h e t o t a l v o l u m e o f one gap w o u l d be 90nm^ a s s u m i n g no o t h e r n o n - c o l l a g e n o u s m o l e c u l e s a r e o c c u p y i n g t h i s s p a c e . I n o r d e r t o e x p l a i n t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e v o l u m e o f m i n e r a l (minimum 300nm^ t o a b o u t 3,000nm^, s e e b e l o w ) and t h e v o l u m e o f i n d i v i d u a l g a p s , two i d e a s h a v e e m e r g e d . F i r s t , t h e gap z o n e s may be a l i g n e d i n t h r e e d i m e n s i o n s t o p r o v i d e s u f f i c i e n t s p a c e ( W e i n e r and T r a u b , 1 9 8 6 ) . T h i s t h e o r y w o u l d p r e d i c t d i s t o r t i o n s i n t h e Hodge and P e t r u s k a ( 1 9 6 3 ) p a c k i n g a r r a n g m e n t b e c a u s e m o l e c u l e s w o u l d n o t be i n t h e s t a g g e r e d o r d e r . S e c o n d , H ' o h l i n g (1 9 8 0) s u g g e s t e d t h a t l a r g e r s p a c e s a r e b u i l t i n t o t h e m i c r o f i b r i l l a r o r g a n i z a t i o n a n d t h e s e a r e t h e p r i m a r y l o c a t i o n o f c r y s t a l f o r m a t i o n and n o t t h e gap z o n e s . C u r r e n t v i e w s o f t h e t h r e e d i m e n s i o n a l p a c k i n g a r r a n g e m e n t do n o t e x c l u d e t h e s e t h e o r i e s b u t n e i t h e r have t h e y b een d e m o n s t r a t e d . The t h r e e - d i m e n s i o n a l p a c k i n g a r r a n g e m e n t o f c o l l a g e n m o l e c u l e s w i t h i n t h e f i b r i l i s n o t known d e s p i t e s e v e r a l a t t e m p t s a t d e f i n i n g a r e g u l a r o r d e r . I n c r o s s - s e c t i o n f i b r i l s e x h i b i t c r y s t a l l i n e q u a l i t i e s i n some r e g i o n s w h i c h s u p p o r t t h e c o n c e p t o f p e r i o d i c i t y i n t h r e e - d i m e n s i o n s . H o w e v e r , p o r t i o n s o f t h e f i b r i l a r e n o t c o n s i s t e n t . I n some r e g i o n s t h e c r o s s - s e c t i o n p a t t e r n i s d i s t o r t e d o v e r i r r e g u l a r a r e a s . T h e r e may a l s o be s h a r p d i s c o n t i n u i t i e s t o 1 9 t h e l a t t i c e - l i k e s t r u c t u r e ( H u l m e s e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e r e f o r e , c l o s e p a c k e d , o p t i m a l a r r a n g e m e n t s s u c h a s t h e q u a s i - h e x a g o n a l m o l e c u l a r p a c k i n g a r r a n g e m e n t ( H u l m e s and M i l l e r , 1 9 7 9 ) o r a m i c r o f i b r i l a r r a n g e m e n t ( T r u s and P i e z , 1 9 7 6 ) may be c o n s i s t e n t o v e r s h o r t d i s t a n c e s b u t t h e r e a r e s i g n i f i c a n t r e g i o n s w h i c h do n o t c o n f o r m t o a p e r f e c t l y r e g u l a r p a t t e r n . The t h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f c o l l a g e n f i b r i l s i s c o n s i d e r e d i m p o r t a n t f o r t h e g r o w t h o f a p a t i t e c r y s t a l s i n c e t h e r e n e e d s t o be t h e a p p r o p r i a t e e n v i r o n m e n t f o r c r y s t a l f o r m a t i o n and s u f f i c i e n t s p a c e t o have c r y s t a l g r o w t h t o t h e b i o l o g i c a l l y a p p r o p r i a t e v o l u m e . T h e r e i s some e v i d e n c e t h a t t h e t h r e e - d i m e n s i o n a l o r g a n i z a t i o n i s t i s s u e s p e c i f i c . K a t z and L i ( 1 9 7 2 ) f o u n d t h e i n t e r m o l e c u l a r d i s t a n c e t o v a r y b e t w e e n m i n e r a l i z e d and n o n - m i n e r a l i z e d c o l l a g e n s . They f o u n d t h a t i n t e r m o l e c u l a r s p a c e s a r e g r e a t e r i n m i n e r a l i z i n g t i s s u e s t h a n i n n o n - m i n e r a l i z i n g t i s s u e s and t h a t m i n e r a l i z a t i o n may be i n h i b i t e d i n c e r t a i n t i s s u e s f o r s t e r i c r e a s o n s . I n a d d i t i o n , t h e g e o m e t r y o f p a c k i n g may be d i f f e r e n t i n v a r i o u s t i s s u e s and r e s u l t i n d i f f e r e n t c r o s s l i n k s ( M e c h a n i c e t a l . , 1 9 8 7 ) . C r o s s l i n k i n q C o v a l e n t c r o s s l i n k s b e t w e e n c o l l a g e n m o l e c u l e s a r e i m p o r t a n t d e t e r m i n a n t s o f t h e m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s o f c o n n e c t i v e t i s s u e m a t r i c e s and a r e an e x a m p l e o f t h e t i s s u e s p e c i f i c p o s t - t r a n s l a t i o n a l h e t e r o g e n e i t y o f t y p e I 20 c o l l a g e n . C r o s s l i n k i n g r e s u l t s f r o m t h e r e a c t i o n o f s p e c i f i c a l d e h y d e s , i n t h e amino and c a r b o x y t e r m i n a l n o n h e l i c a l p e p t i d e s , w i t h a m ino g r o u p s o f l y s i n e and h y d r o x y l y s i n e l o c a t e d i n t h e t r i p l e h e l i c a l r e g i o n s o f m o l e c u l e s ( Y a m a u c h i e t a l . , 1 9 8 6 ) . Two p a t h w a y s o f c r o s s l i n k i n g have been d e m o n s t r a t e d f o r t h e f i b r i l l a r c o l l a g e n s - one b a s e d on l y s i n e a l d e h y d e s w h i c h p r e d o m i n a t e s i n a d u l t s k i n , c o r n e a , s c l e r a and r a t t a i l t e n d o n ; t h e o t h e r b a s e d on h y d r o x y l y s i n e a l d e h y d e p a t h w a y w h i c h p r e d o m i n a t e s i n b o n e , l i g a m e n t and most t e n d o n s ( E y r e , 1 9 8 7 ) . H i s t i d i n e may a l s o p a r t i c i p a t e i n c r o s s l i n k s ( T a n z e r e t a l . , 1 9 7 3 ) . I n bone c o l l a g e n , t h e l a b i l e r e d u c i b l e c r o s s l i n k s a r e S c h i f f - b a s e ( a l d i m i n e ) compounds ( M e c h a n i c e t a l . , 1 9 7 1 ) . T h e s e c a n r e a r r a n g e t o f o r m r e d u c i b l e s t a b l e k e t o a m i n e c r o s s l i n k s ( E y r e and G l i m c h e r , 1 9 7 2 ; M e c h a n i c , 1 9 7 4 ) . The two p r i n c i p a l r e d u c e d c r o s s l i n k s o f bone c o l l a g e n a r e d i h y d r o x y l y s i n o n o r l e u c i n e (DHLNL) and h y d r o x y l y s i n o n o r l e u c i n e . As n o r m a l bone a g e s DHLNL c r o s s l i n k s u n d e r g o a t r a n s i t i o n t o n o n r e d u c i b l e p y r i d i n o l i n e ( F u j i i and T a n z e r , 1 9 7 4 ) . The c r o s s l i n k i n g c h e m i s t r y i n t y p e I c o l l a g e n f i b r i l s i n i t i a l l y i n v o l v e s r e s i d u e s f r o m two c o l l a g e n c h a i n s , b u t s u b s e q u e n t l y , r e s i d u e s f r o m o t h e r c h a i n s f o r m t r i and t e t r a - c h a i n l i n k s . A l t h o u g h i t i s b e l i e v e d t h a t t h e c r o s s l i n k s i n t h e m i n e r a l i z e d and n o n - m i n e r a l i z e d c o l l a g e n a r e d i f f e r e n t t h e r e r e m a i n s some d e b a t e a s t o t h e n a t u r e o f t h e s t r u c t u r e s i n v o l v e d . B a n e s e t a l . ( 1 9 8 3 ) d i d n o t f i n d p y r i d i n o l i n e i n 21 t h e m i n e r a l i z e d c o l l a g e n o f bone b u t i t was f o u n d i n t h e n o n - m i n e r a l i z e d p o r t i o n . They s u g g e s t e d t h a t m i n e r a l i z a t i o n p h y s i c a l l y i n h i b i t s f o r m a t i o n o f p y r i d i n o l i n e by p r e v e n t i n g a p p r o x i m a t i o n o f t h e c o l l a g e n m o l e c u l e s . Wu and E y r e (1 988) f o u n d t h a t t h e s m a l l p a r t i c l e s i z e u s e d i n p o w d e r i n g bone f o r a n a l y s i s r e s u l t e d i n p r o t e a s e d i g e s t i o n o f p y r i d i n o l i n e c r o s s l i n k s . They f o u n d no d i f f e r e n c e i n p y r i d i n o l i n e b e t w e e n m i n e r a l i z e d and n o n - m i n e r a l i z e d t i s s u e . I e x p e c t c r o s s l i n k i n g t o be o f some s i g n i f i c a n c e i n m i n e r a l i z a t i o n p r o c e s s . A t t h i s t i m e t h o u g h , t h e r e r e m a i n s a ne e d f o r f u r t h e r c l a r i f i c a t i o n . B i o l o g i c a l A p a t i t e I n d i v i d u a l a p a t i t e c r y s t a l s h ave been d e s c r i b e d e i t h e r a s h a v i n g an i r r e g u l a r , t h i n , e l o n g a t e d , p l a t e - l i k e s h a p e ( J a c k s o n e t a l . , 1 9 7 8 ; W e i n e r and T r a u b , 1 986) o r a s a r o d - l i k e s t r u c t u r e ( M y e r s and E n g s t r o m , 1 9 6 5 ) . The d i m e n s i o n s o f t h e c r y s t a l s h a v e been m e a s u r e d by x - r a y d i f f r a c t i o n , b r i g h t f i e l d e l e c t r o n m i c r o s c o p y and s e l e c t e d - a r e a d a r k f i e l d e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( S A D F ) . Due t o t e c h n i c a l d i f f i c u l t i e s a s s o c i a t e d w i t h s t u d y i n g t h i s c h a r a c t e r i s t i c a w i d e r a n g e o f v a l u e s have been r e p o r t e d . D i r e c t m e a s u r e m e n t s by b r i g h t f i e l d e l e c t r o n m i c r o s c o p y h a v e g i v e n a mean s i z e b e t w e e n 3D t o 70nm ( R o b i n s o n , 1 9 5 2 ; R o b i n s o n a n d W a t s o n , 1 9 5 2 ; S t e v e - B o c c i a r e l l i , 1 9 7 0 ; J a c k s o n e t a l . , 1 9 7 8 ; L a n d i s and G l i m c h e r , 1 9 7 8 ; W e i n e r and P r i c e , 22 1 9 8 6 ) . H o w e v e r , v i s u a l i n t e r p r e t a t i o n o f b r i g h t f i e l d e l e c t r o n m i c r o g r a p h s r e s u l t s i n two b a s i c p r o b l e m s . F i r s t , b a c k g r o u n d e l e c t r o n d e n s i t y o f t h e s p e c i m e n r e s u l t s i n d i f f e r e n c e s i n d e t e c t i o n o f c r y s t a l s ( A r s e n a u l t and H u n z i k e r , 1 9 8 8 ) . T h e r e f o r e , one w o u l d e x p e c t a b i a s e d i n t e r p r e t a t i o n o f s i z e due t o s e l e c t i o n o f l a r g e r , more o b v i o u s c r y s t a l s . S e c o n d , t h e r e may be o v e r l a p i n c r y s t a l p o s i t i o n l e a d i n g t o l a r g e r e s t i m a t e s o f c r y s t a l s i z e . Due t o t h e s m a l l c r y s t a l c r o s s - s e c t i o n a l s i z e , e v e n t h e t h i n n e s t s e c t i o n c o n t a i n s many c r y s t a l s . T h i s i n c r e a s e s t h e p r o b a b i l i t y o f o v e r p r o j e c t i o n ( H u n z i k e r e t a l . , 1 9 8 9 ) and t h e p e r c e p t i o n t h a t t h e c u m u l a t i v e e l e c t r o n d e n s i t y o f many c r y s t a l s i s a s i n g l e c r y s t a l ( A r s e n a u l t and G r y n p a s , 1 9 8 8 ) . X - r a y d i f f r a c t i o n h a s p r o d u c e d r e s u l t s f o r c r y s t a l l e n g t h f r o m 1 Dnm t o 36nm ( M y e r s and Engstrb'm, 1 9 6 5 ; J a c k s o n e t a l . , 1 9 7 8 ; E n g s t r b m , 1 9 7 2 ; B o n a r e t a l . , 1 9 8 3 ; B o s k e y e t a l . , 1 9 8 5 ; G r y n p a s e t a l . , 1 9 8 6 ; A r s e n a u l t and G r y n p a s , 1 9 8 8 ) . The s m a l l c r y s t a l s i z e i s r e l a t e d t o i t s l a r g e s u r f a c e a r e a w h i c h has been r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e a s b e t w e e n 2 85-265m /g ( R o b i n s o n a n d W a t s o n , 1 9 5 2 ; Hodge and P e t r u s k a , 1 9 6 3 ; M i l l e r , 1 9 8 4 ; W e i n e r and P r i c e , 1 9 8 6 ; A r s e n a u l t a n d G r y n p a s , 1 9 8 8 ) . The b i o l o g i c a l c o n t r o l o f c r y s t a l s i z e i s e x t r e m e l y i m p o r t a n t i n d e t e r m i n i n g b i o m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s and c r y s t a l c h e m i s t r y . S t u d i e s w h i c h r e p o r t s i n g l e mean v a l u e s f o r c r y s t a l s i z e may m i s l e a d t h e r e a d e r i n t o a s s u m i n g t h a t t h e r e i s a 23 n a r r o w r a n g e i n t h e s a m p l e . On t h e c o n t r a r y , t h e l a r g e s t a n d a r d d e v i a t i o n s r e p o r t e d a r e e v i d e n c e f o r a h e t e r o g e n e o u s p o p u l a t i o n . T h e r e a r e s e v e r a l p o s s i b l e s o u r c e s o f t h i s l a r g e r a n g e o f c r y s t a l s i z e s . A common p r o b l e m i n a l l o f t h e t e c h n i q u e s i s t h e s t a n d a r d i z a t i o n o f t i s s u e m a t u r i t y . I assume t h a t c r y s t a l s i z e and s h a p e w o u l d d e p e n d on t h e s t a g e o f m i n e r a l i z a t i o n and r e m o d e l l i n g . I t may a l s o d e p e n d on t h e l o c a l e n v i r o n m e n t s u c h t h a t a d j a c e n t c r y s t a l s a r e r e s t r i c t e d i n g r o w t h a t d i f f e r e n t l e v e l s . I w o u l d l i k e t o e m p h a s i z e t h a t t h e c r y s t a l d i m e n s i o n s do n o t seem t o r e f l e c t t h e s i z e o f t h e gap z o n e i n t h e Hodge and P e t r u s k a ( 1 9 6 3 ) m o d e l f o r t w o - d i m e n s i o n a l p a c k i n g o f c o l l a g e n ( A r s e n a u l t and G r y n p a s , 1 9 8 8 ) . F o r e x a m p l e , t h e w i d t h o f t h e c r y s t a l s m e a s u r e d a r e a t l e a s t t e n t i m e s t h e w i d t h o f t h e p r e d i c t e d gap z o n e s . I n e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e s t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f a p a t i t e p o s e m a j o r t e c h n i c a l p r o b l e m s . O f t e n , i n t h e l i t e r a t u r e , i t h a s been s u g g e s t e d t h a t c h a n g e s i n m i n e r a l u l t r a s t r u c t u r e a r e a r e s u l t o f t h e m e t h o d s u s e d f o r t i s s u e p r e p a r a t i o n and s p e c i m e n v i s u a l i z a t i o n . One s u c h p r o b l e m i s a s s o c i a t e d w i t h t h e s o l u b i l i t y p r o p e r t i e s o f a p a t i t e . A r s e n a u l t and H u n z i k e r ( 1 9 8 8 ) showed t h a t c o n v e n t i o n a l a q u e o u s s t a i n s t o t a l l y d e m i n e r a l i z e t h i n s e c t i o n s and t h i s l e a d s t o a m b i g u i t i e s i n what i s b e i n g s t a i n e d . I n a d d i t i o n , a p a t i t e c r y s t a l s a r e l a b i l e t o r a d i a t i o n damage d u r i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( A r s e n a u l t , 1 9 8 8 ) . As a c o n s e q u e n c e o f 24 t h e s e t e c h n i c a l d i f f i c u l t i e s , m e t h o d s s u c h as q u i c k - f r e e z i n g / f r e e z e - s u b s t i t u t i o n ( A r s e n a u l t and H u n z i k e r , 1 9 8 8 ; A r s e n a u l t e t a l . , 1988) and a n h y d r o u s t e c h n i q u e s ( L a n d i s e t a l . , 1 9 7 7 ; L a n d i s e t a l ; 1980) have been d e v e l o p e d t o m i n i m i z e a r t i f a c t u a l c h a n g e s . A l t h o u g h h y d r o x y a p a t i t e , C a ^ ^ ( P 0 ^ ) g O H , 4 s c o n s i d e r e d t h e i d e a l i z e d m o d e l f o r b i o l o g i c a l a p a t i t e t h e r e a r e some d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e t w o . C h e m i c a l a n a l y s e s r e v e a l t h a t bone d i f f e r s c o n s i d e r a b l y f r o m t h e i d e a l f o r m u l a . F i r s t , n u merous i m p u r i t i e s e x i s t i n bone i n c l u d i n g f l u o r i d e , m a g n e s i u m , c h l o r i d e , and c a r b o n a t e ( H a g e n , 1 9 7 3 ) . S e c o n d , t h e r e may a l s o be a l t e r n a t i v e s t o i c h i o m e t r i c r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n c a l c i u m and p h o s p h o r u s w h i c h r e s u l t i n o t h e r c r y s t a l l i n e a r r a n g e m e n t s . T h e s e a r r a n g e m e n t s may be i m p o r t a n t a t v a r i o u s s t a g e s o f m i n e r a l i z a t i o n . T h e r e f o r e , b i o l o g i c a l a p a t i t e c r y s t a l s t r u c t u r e must d e v i a t e f r o m t h e s t r u c t u r e o f g e o l o g i c a l o r s y n t h e t i c h y d r o x y a p a t i t e o f i d e a l c o m p o s i t i o n . The u n i t c e l l o f a p a t i t e i s r e p e a t e d t h r o u g h o u t t h e c r y s t a l s t r u c t u r e . I t h a s a l l t h e c h a r a c t e r i s t i c s , i n c l u d i n g t h e s y m m e t r y and c h e m i c a l e l e m e n t s , o f t h e c r y s t a l and h a s b e en d e s c r i b e d as a s t r u c t u r a l m o l e c u l e ( H a g e n , 1 9 7 3 ) . I n a p a t i t e , t h e u n i t c e l l i s d e f i n e d by t h r e e a x e s l a b e l l e d a,b and c. The c r y s t a l p l a n e s a r e l a b e l l e d a c c o r d i n g t o t h e l e n g t h o f t h e a x e s , t h e i r i n c l i n a t i o n t o one a n o t h e r , and t h e p o s i t i o n s o f t h e a t o m s . The u n i t c e l l o f t h e c r y s t a l i n 25 c a l c i f i e d t u r k e y t e n d o n i s h e x a g o n a l w i t h t h e d i m e n s i o n s a=Q.942nm and c=0.688nm ( M y e r s and E n g s t r o m , 1 9 6 5 ) . T h e s e b a s i c c e l l s o f c r y s t a l o r g a n i z a t i o n d i f f r a c t e l e c t r o n s i n a c o n s i s t e n t manner and t h i s makes p o s s i b l e t h e v i s u a l i z a t i o n o f d i f f r a c t e d e l e c t r o n s f r o m s p e c i f i c c r y s t a l p l a n e s i n s e l e c t e d - a r e a d a r k f i e l d e l e c t r o n m i c r o s c o p y . A p a t i t e / C o l l a g e n R e l a t i o n s h i p s B i o l o g i c a l a p a t i t e c r y s t a l s i n m i n e r a l i z i n g t u r k e y l e g t e n d o n and bone a r e f o u n d w i t h i n t h e c o l l a g e n f i b r i l s and w i t h i n t h e n o n - c o l l a g e n o u s e x t r a c e l l u l a r m a t r i x o u t s i d e t h e f i b r i l s ( G l i m c h e r , 1 9 5 9 ; W e i n e r and T r a u b , 1 9 8 6 ) . Y e t t h e l o c a l i z a t i o n o f t h e c r y s t a l s w i t h i n t h e f i b r i l s r e m a i n s t h e s u b j e c t o f d e b a t e . Hodge and P e t r u s k a ( 1 9 6 3 ) i n p r o p o s i n g t h e i r m o d e l s u g g e s t e d t h a t t h e gap z o n e w o u l d be t h e p r e f e r r e d l o c a t i o n f o r m i n e r a l d e p o s i t i o n w i t h i n f i b r i l s b e c a u s e o f t h e p o t e n t i a l s p a c e a v a i l a b l e . S i n c e t h a t t i m e , c e r t a i n s t u d i e s h ave s u p p o r t e d t h i s v i e w ( W h i t e e t a l . , 1 9 7 7 ) . A l t e r n a t i v e l y , G l i m c h e r ( 1 9 8 3 ) s t a t e s t h e m i n e r a l i s i n i t i a l l y l o c a l i z e d i n t h e gap z o n e b u t s p r e a d s t h r o u g h o u t t h e o v e r l a p z o n e . The p r i m a r y e x p l a n a t i o n f o r t h e l o c a l i z a t i o n o f c r y s t a l s i n t h e gap zone s t i l l r e m a i n s f o c u s s e d on t h e p o t e n t i a l s p a c e b e l i e v e d t o e x i s t a s a r e s u l t o f t h e s t a g g e r e d a r r a n g e m e n t o f c o l l a g e n m o l e c u l e s . H o w e v e r , r e c e n t i n f o r m a t i o n s u g g e s t s t h a t e a r l y s i t e s o f m i n e r a l d e p o s i t i o n a r e w i t h i n b o t h t h e gap and o v e r l a p z o n e s 26 ( A r s e n a u l t , 1 9 8 8 ) . A r s e n a u l t (1 989) r e p o r t e d t h e p r o p o r t i o n o f m i n e r a l i s i n i t i a l l y g r e a t e r i n t h e gap z o n e t h a n i n t h e o v e r l a p z o n e b u t t h i s becomes more e q u a l as m i n e r a l i z a t i o n p r o g r e s s e s . I f a p a t i t e i s l o c a l i z e d i n t h e o v e r l a p z o n e t h e n t h e i n t e g r a t i o n o f a p a t i t e w i t h i n t h e c o l l a g e n f i b r i l r e q u i r e s a much more c o m p l e x e x p l a n a t i o n t h a n has b een p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . The c - a x i s o f t h e a p a t i t e c r y s t a l i s c o n s i d e r e d t o r u n p a r a l l e l t o c o l l a g e n m o l e c u l e s i n t u r k e y t e n d o n ( E n g s t r o m and Z e t t e r s t r o m , 1 9 5 1 ) . When a p a t i t e c r y s t a l p l a n e s a r e s p e c i f i c a l l y v i e w e d by s e l e c t e d - a r e a d a r k f i e l d e l e c t r o n m i c r o s c o p y , t h e a x i a l o r i e n t a t i o n o f a p a t i t e c r y s t a l s i s o b s e r v e d t o a l t e r n a t e a l o n g t h e f i b r i l l e n g t h ( A r s e n a u l t , 1 9 8 8 ) . T h i s i s most l i k e l y due t o t h e t h r e e - d i m e n s i o n a l a r r a n g e m e n t o f t h e c o l l a g e n m o l e c u l e s s u c h t h a t t h e r o t a t i o n o f a p a t i t e a x i a l o r i e n t a t i o n r e f l e c t s s t r u c t u r a l p r o p e r t i e s o f t h e c o l l a g e n f i b r i l . C o n c l u s i o n t o H i s t o r i c a l R e v i e w The a m i n o a c i d s e q u e n c e o f c o l l a g e n may p l a y a r o l e i n b i o m i n e r a l i z a t i o n and t h e l o c a l i z a t i o n o f m i n e r a l a p a t i t e f o r s e v e r a l r e a s o n s . F i r s t , t h e t h r e e - d i m e n s i o n a l p a c k i n g a r r a n g e m e n t o f c o l l a g e n f i b r i l s may r e s u l t i n r e g i o n s o f p o t e n t i a l s p a c e b e c a u s e o f r e g i o n a l f l e x i b i l i t y o r i n t r a f i b r i l l a r s p a c e s . S e c o n d , s p e c i f i c amino a c i d s may have p o s i t i v e o r n e g a t i v e e f f e c t s on t h e n u c l e a t i o n o r g r o w t h o f 27 a p a t i t e c r y s t a l s . T h i r d l y , p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s s u c h a s h y d r o x y l a t i o n , c r o s s l i n k i n g and g l y c o s y l a t i o n may be f a c t o r s w h i c h d e t e r m i n e t h e l o c a l i z a t i o n o f a p a t i t e . F o u r t h , s p e c i f i c n o n - c o l l a g e n o u s p r o t e i n s i n v o l v e d i n - t h e p r o c e s s o f m i n e r a l i z a t i o n may i n t e r a c t w i t h c o l l a g e n a t p r e c i s e l o c a t i o n s d e t e r m i n e d by t h e amino a c i d s e q u e n c e . C o n s i d e r a b l e u n c e r t a i n t y r e g a r d i n g t h e m e c h a n i s m s o f m i n e r a l i z a t i o n and t h e r o l e o f t y p e I c o l l a g e n e x i s t s i n t h e l i t e r a t u r e . Numerous b a s i c q u e s t i o n s r e m a i n u n a n s w e r e d . F o r e x a m p l e , where i s t h e m i n e r a l l o c a t e d i n r e l a t i o n t o t h e c o l l a g e n f i b r i l D p e r i o d ? What i s t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e a m ino a c i d s e q u e n c e o f c o l l a g e n and t h e l o c a t i o n o f a p a t i t e ? A r e t h e r e p r o p e r t i e s o f c o l l a g e n w h i c h c a n e x p l a i n t h e l o c a l i z a t i o n o f a p a t i t e i n t h e o v e r l a p z o n e ? I n an a t t e m p t t o u n d e r s t a n d some o f t h e s e a s p e c t s o f m i n e r a l i z a t i o n t h e f o l l o w i n g s t u d y was c a r r i e d o u t . 28 INTRODUCTION Type I c o l l a g e n p r o v i d e s s t r u c t u r a l i n t e g r i t y t o numerous c o n n e c t i v e t i s s u e s and i s d i r e c t l y i n v o l v e d i n t h e m i n e r a l i z a t i o n o f b o n e , d e n t i n and t u r k e y l e g t e n d o n s . The c o l l a g e n m o l e c u l e i s a s e m i f l e x i b l e r o d , 300nm i n l e n g t h f o r m e d by two a 1 ( I ) and one a 2 ( l ) p e p t i d e c h a i n s ( P i e z e t a l . , 1 9 6 3 ; U e i s , 1 9 8 5 a ) . T h e s e m o l e c u l e s have a t r i p l e h e l i c a l p o r t i o n ( 1 0 1 4 amino a c i d r e s i d u e s ) and s m a l l N- and C- t e r m i n a l , n o n h e l i c a l p o r t i o n s . Hodge and P e t r u s k a ( 1 9 6 3 ) showed t h a t t h e c o l l a g e n m o l e c u l e s a r e l o n g i t u d i n a l l y o r g a n i z e d i n a r e g u l a r 67nm, D - s t a g g e r e d f a s h i o n w h i c h g i v e s r i s e t o i t s a x i a l p e r i o d . The m o l e c u l e s a r e l i n e a r l y a r r a n g e d s u c h t h a t t h e r e i s a 35nm s e p a r a t i o n b e t w e e n a d j a c e n t e n d s and e a c h m o l e c u l e i s s t a g g e r e d t o i t s l a t e r a l n e i g h b o r by 67nm, c o r r e s p o n d i n g t o 234 amino a c i d r e s i d u e s ( H u l m e s e t a l . , 1 9 7 3 ) . The r e p e a t i n g D p e r i o d o f t h e c o l l a g e n f i b r i l was e n v i s i o n e d a s h a v i n g two r e g i o n s , a d e n s e l y p a c k e d o v e r l a p r e g i o n , .4D i n l e n g t h , a n d a " g a p " r e g i o n , .60 i n l e n g t h , where t h e r e w o u l d be p o t e n t i a l s p a c e as t h e r e s u l t o f t h e s e p a r a t i o n b e t w e e n l o n g i t u d i n a l l y a r r a n g e d m o l e c u l e s . Hodge and P e t r u s k a ( 1 9 6 3 ) s u g g e s t e d t h a t t h e gap r e g i o n w o u l d be t h e p r e f e r e n t i a l l o c a t i o n o f a p a t i t e c r y s t a l s d u r i n g m i n e r a l i z a t i o n due t o t h e s p a c e a v a i l a b l e f o r c r y s t a l g r o w t h . 29 The r e g u l a r D - s t a g g e r o f t h e c o l l a g e n m o l e c u l e s a l s o r e s u l t s i n t h e p e r i o d i c l o c a l i z a t i o n o f amino a c i d s w i t h s p e c i f i c s t r u c t u r a l and h i s t o c h e m i c a l i m p l i c a t i o n s ( B e a r , 1 9 5 2 ) . Meek e t a l . ( 1 9 7 9 ) were a b l e t o i n t e g r a t e t h e known a m i n o a c i d s e q u e n c e , s t r u c t u r a l i n f o r m a t i o n a n d t h e s t a i n i n g p a t t e r n s o f t y p e I c o l l a g e n t o m o d e l t h e l o c a l i z a t i o n o f i n d i v i d u a l a m ino a c i d s w i t h i n t h e f i b r i l . A h i g h c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t ( r = . 9 2 B ) was f o u n d b e t w e e n t h e e l e c t r o n - o p t i c a l d e n s i t y o f p o s i t i v e l y s t a i n e d c o l l a g e n and t h e t h e o r e t i c a l d e n s i t y o f t h e i r m o d e l . S u b s e q u e n t s t u d i e s h a v e u s e d t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e d a t a o f c o l l a g e n t o d e t e r m i n e t h e l o c a l i z a t i o n o f e l e c t r o n - d e n s e s t a i n s w i t h s p e c i f i c c l a s s e s o f a m i n o a c i d s ( T z a p h i l i d o u e t a l . , 1 9 8 2 a , 1 9 8 2 b ; Chapman and H u l m e s , 1 9 8 4 ; Meek and Chapman, 1 9 8 5 ) . An a n a l o g o u s a p p r o a c h c a n be u s e d t o u n d e r s t a n d t h e i m p r e g n a t i o n o f m i n e r a l i n t o c o l l a g e n f i b r i l s by t h e l o c a l i a t i o n o f a p a t i t e c r y s t a l s r e l a t i v e t o t h e known amino a c i d c o m p o s i t i o n . I n t h i s p r e s e n t s t u d y , i n a d d i t i o n t o h e a v y m e t a l s t a i n i n g , t h e e l e c t r o n d e n s i t y and d i f f r a c t e d e l e c t r o n s o f a p a t i t e a r e a n a l y z e d and c o m p a r e d t o m o d e l s o f c o l l a g e n a m ino a c i d s e q u e n c e s . The r o l e and i n t e r a c t i o n s o f t y p e I c o l l a g e n i n t h e m i n e r a l i z a t i o n p r o c e s s r e m a i n s an e n i g m a . C o r r o b o r a t i n g t h e s u g g e s t i o n by Hodge and P e t r u s k a ( 1 9 6 3 ) s e v e r a l a u t h o r s have r e p o r t e d t h e o c c u r r e n c e o f a p a t i t e i n t h e gap z o n e and i t s e x c l u s i o n f r o m t h e o v e r l a p z o n e ( W h i t e e t a l . , 1 9 7 7 ; 30 B e r t h e t - C o l o m i n a s e t a l . , 1 9 7 9 ) . O t h e r a u t h o r s d e s c r i b e t h e i n i t i a l l o c a l i z a t i o n o f m i n e r a l t o be e x c l u s i v e l y i n t h e gap z o n e f o l l o w e d by p r o g r e s s i v e s p r e a d t h r o u g h o u t t h e o v e r l a p z o n e ( G l i m c h e r , 1 9 8 3 ) . R e c e n t i n f o r m a t i o n i n d i c a t e s t h a t t h e e a r l i e s t d e t e c t a b l e a p a t i t e c r y s t a l s a r e l o c a l i z e d w i t h i n t h e o v e r l a p z o n e i n a d d i t i o n t o ' t h e gap z o n e ( A r s e n a u l t , 1988) and t h a t t h e p r o p o r t i o n o f m i n e r a l i n t h e gap and o v e r l a p z o n e s c h a n g e s as m i n e r a l i z a t i o n p r o c e e d s ( A r s e n a u l t , 1989) . T h e r e r e m a i n many q u e s t i o n s c o n c e r n i n g t h e r o l e o f c o l l a g e n s t r u c t u r e i n t h e m e c h a n i s m o f b i o l o g i c a l a p a t i t e d e p o s i t i o n - w h e t h e r t h e a s s o c i a t i o n b e t w e e n c o l l a g e n a n d m i n e r a l i s a p a s s i v e a s s o c i a t i o n , an i n t e r a c t i v e p r o c e s s o r w h e t h e r an i n t e r m e d i a r y i s t h e d o m i n a n t f o r c e ? Many s t u d i e s h a ve u s e d t h e m i n e r a l i z e d t u r k e y t e n d o n i n s t e a d o f bone t i s s u e p r o p e r b e c a u s e o f t h e t e n d o n ' s h i g h d e g r e e o f c o l l a g e n f i b r i l a l i g n m e n t , t h e r e b y , p e r m i t t i n g e a s e o f s e q u e n t i a l a n a l y s e s o f t h e m i n e r a l i z a t i o n p r o c e s s a l o n g i n d i v i d u a l f i b r i l s . The p r e s e n t s t u d y was u n d e r t a k e n t o i n v e s t i g a t e t h e i n t r a f i b r i l l a r l o c a l i z a t i o n o f a p a t i t e i n r e l a t i o n t o t h e amino a c i d s e q u e n c e o f t y p e I c o l l a g e n . The a s y m m e t r i c o r g a n i z a t i o n o f a p a t i t e w i t h i n t h e c o l l a g e n D p e r i o d was f o u n d t o be r e l a t e d t o t h e p o l a r i z e d t o C- d i r e c t i o n o f t h e c o l l a g e n f i b r i l a s d e t e r m i n e d by t h e s t a i n i n g p a t t e r n . A i n v e r s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e l o c a l i z a t i o n o f a p a t i t e a n d t h e l o c a l i z a t i o n o f h y d r o p h o b i c a mino a c i d s was f o u n d t o be 31 e v i d e n t i n b o t h t h e gap and o v e r l a p z o n e s . The p r i m a r y c o n c l u s i o n o f t h i s t h e s i s t h e r e f o r e , i s t h a t t h e h y d r o p h o b i c e f f e c t , w h i c h i s i m p o r t a n t t o c o l l a g e n s t r u c t u r e , a l s o s e r v e s t o i n f l u e n c e t h e d i s t r i b u t i o n o f a p a t i t e . The d i s t r i b u t i o n o f t h e c r y s t a l s d o e s n o t a p p e a r t o be s o l e l y d e t e r m i n e d by t h e gap r e g i o n i n c o l l a g e n f i b r i l s b u t c o u l d be c o n t r o l l e d by o t h e r c o l l a g e n o u s o r n o n - c o l l a g e n o u s i n f l u e n c e s . 32 MATERIALS AND METHODS T i s s u e P r e p a r a t i o n and V i s u a l i z a t i o n S m a l l p i e c e s o f f r e s h l y e x c i s e d , n o n - m i n e r a l i z e d l e g t e n d o n s o f 10 week o l d d o m e s t i c t u r k e y s were p l a c e d i n a s o l u t i o n o f 2.3% v/v g l u t a r a l d e h y de, 2% w/v s u c r o s e and 0.05M s o d i u m c a c o d y l a t e , pH 7.4, f o r 2h. The t i s s u e s were t h e n r i n s e d w i t h 3 c h a n g e s o f 0.05M s o d i u m c a c o d y l a t e and 2% s u c r o s e f o r 15 min e a c h f o l l o w e d by 1h p o s t - f i x a t i o n i n a s o l u t i o n o f 1% w/v osmium t e t r o x i d e , 2% s u c r o s e and 0.05M s o d i u m c a c o d y l a t e . D e h y d r a t i o n was c a r r i e d o u t by p l a c i n g t h e t i s s u e s i n i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f m e t h a n o l i n d i s t i l l e d w a t e r ( 5 0 % , 7 0 % , 8 0 % , 9 0 % , 3 x 1 0 0 % ) f o r 15 min e a c h f o l l o w e d by 3 c h a n g e s o f a c e t o n e . The t i s s u e s were t h e n p l a c e d i n a s e r i e s o f a c e t o n e : S p u r r ' s r e s i n ( 3 : 1 , 1:1, 1:3, 1 0 0 % r e s i n ) f o r one h o u r e a c h . F o l l o w i n g o v e r n i g h t i n f i l t r a t i o n ' o f t h e t i s s u e s w i t h a f r e s h c h a n g e o f 1 0 0 % r e s i n i t was p o l y m e r i z e d a t 60 C f o r 16 h. T h i n s e c t i o n s ( g o l d i n t e r f e r e n c e c o l o r ) were p l a c e d on f o r m v a r - c o a t e d 75 mesh o r 200 mesh c o p p e r g r i d s . T h e s e s e c t i o n s were s t a i n e d w i t h R e y n o l d s l e a d c i t r a t e ( R e y n o l d s , 1963) f o r 6 min and 3% w/v UA i n 7 5 % m e t h a n o l pH 4.2 f o r 6 m i n . M i n e r a l i z e d p o r t i o n s o f l e g t e n d o n s f r o m 10 t o 14 week o l d d o m e s t i c t u r k e y s were e x c i s e d and p l a c e d i n 1 0 0 % g l y c e r o l f o r 2h. N o n - m i n e r a l i z e d t e n d o n becomes t r a n s p a r e n t u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s and so a r e a s o f i n t e r e s t n e a r t h e 33 m i n e r a l i z a t i o n f r o n t , u n m i n e r a l i z e d t e n d o n and h e a v i l y m i n e r a l i z e d r e g i o n s c a n be i d e n t i f i e d . S m a l l p i e c e s o f g l y c e r i n a t e d t e n d o n were p l a c e d i n a g r a d e d s e r i e s o f g l y c e r o l : m e t h a n o l ( 3 : 1 , 1:1, 1:3) f o l l o w e d by 3 c h a n g e s o f 100% m e t h a n o l and 3 c h a n g e s o f a c e t o n e f o r 15 min e a c h . The t i s s u e s were t h e n embedded i n S p u r r ' s r e s i n a s a b o v e . S e c t i o n s were c u t i n l o n g i t u d i n a l p l a n e s a l o n g t h e t e n d o n s w i t h a d i a m o n d k n i f e i n d i f f e r e n t t h i c k n e s s e s d e p e n d i n g on t h e v i s u a l i z a t i o n t e c h n i q u e t o be e m p l o y e d . S e c t i o n s t o be s t a i n e d f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a n a l y s i s o f c o l l a g e n b a n d i n g were g o l d i n t e r f e r e n c e c o l o r on d i s t i l l e d w a t e r . S e c t i o n s f o r a n a l y s i s o f m i n e r a l l o c a l i z a t i o n and s e l e c t e d - a r e a d a r k f i e l d were g r a y i n t e r f e r e n c e c o l o r on d i s t i l l e d w a t e r . T h e s e s e c t i o n s were q u i c k l y p l a c e d on f o r m v a r - c o a t e d 75 mesh o r 600 h e x a g o n a l c o p p e r g r i d s . S e l e c t e d - a r e a d a r k f i e l d e l e c t r o n m i c r o s c o p y a nd b r i g h t f i e l d e l e c t r o n m i c r o s c o p y o f m i n e r a l i z e d s e c t i o n s were p e r f o r m e d on u n s t a i n e d s e c t i o n s . I n o r d e r t o v i s u a l i z e c o l l a g e n b a n d i n g , s e c t i o n s were s t a i n e d w i t h 1% a q u e o u s p h o s p h o t u n g s t i c a c i d (PTA) a t pH 3.2 f o r 15 min and 1 % a q u e o u s u r a n y l a c e t a t e (UA) a t pH 4.2 f o r 10 m i n . A l t h o u g h t h e s e s t a i n i n g m e t h o d s p r o d u c e t h e c o n v e n t i o n a l b a n d i n g p a t t e r n o f t y p e I c o l l a g e n t h e y were f o u n d t o d e m i n e r a l i z e t u r k e y l e g t e n d o n s ( A r s e n a u l t , 1 9 8 8 ) . I n o r d e r t o v i s u a l i z e t h e m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n o f c o l l a g e n f i b r i l s by a n a l y s i s o f t h e i r b a n d i n g p a t t e r n s and t o m a i n t a i n t h e n a t i v e 34 d i s t r i b u t i o n o f a p a t i t e , n o n - m i n e r a l i z e d and m i n e r a l i z e d s e c t i o n s were s t a i n e d w i t h 1% UA i n 1 0 0 % m e t h a n o l f o r 5 m i n . B r i g h t f i e l d e l e c t r o n m i c r o s c o p y a nd SADF were p e r f o r m e d u s i n g a P h i l i p s 300 e l e c t r o n m i c r o s c o p e o p e r a t i n g a t 80 kV. The t e c h n i q u e o f SADF i s d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( J a c k s o n e t a l . , 1 9 7 8 ; A r s e n a u l t , 1 9 8 8 ) . T h i s t e c h n i q u e u s e s t i l t i n g o f t h e m a i n beam so t h a t s e l e c t e d d i f f r a c t e d e l e c t r o n s a r e a l l o w e d t o p a s s t h r o u g h t h e o b j e c t i v e a p e r t u r e . W i t h t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e i n t h e d i f f r a c t i o n mode t h e t i l t e d beam i s p o s i t i o n e d so t h a t s p e c i f i c e l e c t r o n s c a n be c o l l e c t e d f r o m t h e c h a r a c t e r i s t i c e l e c t r o n d i f f r a c t i o n p a t t e r n o f a p a t i t e . I n t h i s s t u d y t h e o b j e c t i v e a p e r t u r e was p o s i t i o n e d t o c o l l e c t e l e c t r o n s d i f f r a c t e d f r o m t h e c - a x i a l l a t t i c e p l a n e s o f a p a t i t e w h i c h c o r r e s p o n d t o t h e ( 0 0 2 ) d l a t t i c e s p a c i n g . C o m p u t e r M o d e l l i n g The s y s t e m o f m o d e l l i n g a m i n o a c i d s e q u e n c e i n c o l l a g e n f i b r i l s u s e d h e r e i s an a d a p t a t i o n o f t h e s y s t e m d e v e l o p e d by Meek e t a l . ( 1 9 7 9 ) . The amino a c i d s e q u e n c e s f o r a l ( l ) ( H i g h b e r g e r e t a l . , 1 9 82) a n d a 2 ( l ) ( B o e d t k e r e t a l . , 1 9 8 5 ) c h i c k c o l l a g e n were t r a n s l a t e d i n t o s i n g l e l e t t e r c o d e s and e n t e r e d e a c h a s a s i n g l e s t r i n g i n t o a t e x t e d i t o r . C h i c k c o l l a g e n s e q u e n c e s were u s e d b e c a u s e amino a c i d d a t a f o r t u r k e y i s u n a v a i l a b l e a t t h i s t i m e . The r e s u l t s when u s i n g e i t h e r t u r k e y o r c h i c k d a t a a r e e x p e c t e d t o d i f f e r o n l y 35 m i n i m a l l y b e c a u s e t h e r e i s a l a r g e d e g r e e o f s e q u e n c e h o m o l o g y b e t w e e n s p e c i e s ( B o e d t k e r e t a l . , 1 9 8 5 ) . T h e s e s i n g l e s t r i n g s were o r g a n i z e d i n t o r e p e a t i n g D u n i t s , 234 amino a c i d s i n l e n g t h and 5 m o l e c u l e s i n w i d t h . The r e l a t i v e p o s i t i o n s o f t h e two a 1 ( I ) and t h e a 2 ( l ) c h a i n s were a s s u m e d t o be a1-a2-a1 (Chapman and H u l m e s , 1 9 8 4 ) . The r e p e a t i n g u n i t s were t h e n s t a c k e d t o s i m u l a t e f o u r D u n i t s i n l e n g t h by f i f t y m o l e c u l e s i n w i d t h . Some e r r o r i n t h e l o c a l i z a t i o n a m i n o a c i d s i n t h e t e l o p e p t i d e s c a n be e x p e c t e d b e c a u s e t h e s e r e g i o n s d e v i a t e t h e g r e a t e s t f r o m l i n e a r i t y and t h e i r c o n f o r m a t i o n s a r e n o t known. F u n c t i o n a l c l a s s e s o f a m i n o a c i d s were t h e n i d e n t i f i e d . I n o r d e r t o r e p r e s e n t t h e c h a r g e d a mino a c i d s r e s p o n s i b l e f o r t h e p o s i t i v e s t a i n i n g p a t t e r n o f c o l l a g e n D,E,R,K and H ( s e e t a b l e o f a b b r e v i a t i o n s f o r amino a c i d s , p. i v ) were l e f t i n t h e i r p o s i t i o n s w h i l e a l l o t h e r a m i n o a c i d s were r e p l a c e d by s p a c e s . The r e s u l t a n t d i s t r i b u t i o n was r e d u c e d by c o m p u t e r and t h e n f u r t h e r r e d u c e d p h o t o g r a p h i c a l l y t o t h e e q u i v a l e n t s i z e o f e l e c t r o n m i c r o s c o p i c i m a g e s . The m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n o f c o l l a g e n s t a i n e d w i t h a l c o h o l i c UA was d e t e r m i n e d by f o u r a l t e r n a t i v e m e t h o d s o f c o m p a r i s o n : 1) w i t h a t h e o r e t i c a l m o d e l o f t h e d i s t r i b u t i o n o f n e g a t i v e l y c h a r g e d a mino a c i d s (D and E ) ; 2) w i t h a m o d e l o f p o s i t i v e l y c h a r g e d a mino a c i d s (K,R and H ) ; 3) w i t h a s c a l e d m i c r o g r a p h o f a q u e o u s PTA/UA s t a i n e d c o l l a g e n ; and 4) w i t h d a t a f r o m T z a p h i l i d o u e t a l . ( 1 9 8 2 b ) . The p e r i o d i c d i s t r i b u t i o n o f t h e 36 h y d r o p h o b i c a mino a c i d s h a v i n g l o n g s i d e - c h a i n s , F, M, \J, L and I , h a s been c o n s i d e r e d t o be i m p o r t a n t i n f i b r i l s t r u c t u r e (Hofmann e t a l . , 1 978) T h e s e h y d r o p h o b i c a mino a c i d s were s e l e c t e d and t h e n r e d u c e d t o t h e s c a l e o f m i n e r a l i z e d c o l l a g e n f i b r i l s f o r d i r e c t v i s u a l c o m p a r i s o n s . The r e v e r s e c o n t r a s t o f t h i s image r e p r e s e n t s a r e a s l o w i n h y d r o p h o b i c g r o u p s as b l a c k and a r e a s h i g h i n h y d r o p h o b i c g r o u p s a s w h i t e . H y d r o x y p r o l i n e and p r a l i n e , w h i c h a r e c o n s i d e r e d t o be i m p o r t a n t i n m o l e c u l a r f l e x i b i l i t y and h e l i x s t a b i l i t y were a l s o s e l e c t e d i n t h i s f a s h i o n . 37 RESULTS E l e c t r o n m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f n o n - m i n e r a l i z e d , g l u t a r a l d e h y d e f i x e d t u r k e y t e n d o n , p o s t - f i x e d w i t h osmium t e t r o x i d e and s t a i n e d w i t h UA and l e a d c i t r a t e , c l e a r l y i l l u s t r a t e s t h e o r g a n i z a t i o n o f t e n o c y t e s ( f i b r o b l a s t - l i k e c e l l s ) and c o l l a g e n f i b r i l s ( F i g u r e s 2a and b) w h i c h makes t h i s an e f f i c i e n t s y s t e m f o r s t u d y i n g t h e m i n e r a l i z a t i o n p r o c e s s . T e n o c y t e s a r e o r g a n i z e d i n t o c o l u m n s s e p a r a t e d by e x t r a c e l l u l a r m a t r i x . T h e s e c e l l s a r e g e n e r a l l y e l o n g a t e d and a r e s e e n t o h a v e a v a r i e t y o f c r o s s - s e c t i o n a l d i a m e t e r s b e c a u s e t h e s e c t i o n i s t h r o u g h b o d i e s o f c e l l s and t h r o u g h c e l l p r o c e s s e s w h i c h e x t e n d p a r a l l e l t o c o l l a g e n f i b r i l s . The s m a l l e s t o f t h e s e p r o c e s s e s a r e a b o u t 60nm i n w i d t h . I n t r a c e l l u l a r o r g a n e l l e s v i s u a l i z e d i n t h e t e n o c y t e s v a r y f r o m c e l l t o c e l l and b e t w e e n t h e c e l l and i t s p r o c e s s e s . Rough e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m , m i t o c h o n d r i a , s e c r e t o r y v a c u o l e s , f i l a m e n t o u s s t r u c t u r e s , and m i c r o t u b u l e s a r e p r o m i n e n t f e a t u r e s o f t h e s e c e l l s . W i t h i n t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x , c o l l a g e n f i b r i l s a r e a l i g n e d i n a p a r a l l e l f a s h i o n b e t w e e n t h e c e l l s . I n d i v i d u a l c o l l a g e n f i b r i l s c a n be f o l l o w e d l o n g i t u d i n a l l y f o r many m i c r o n s . T h e i r d i a m e t e r s a p p e a r t o v a r y f r o m a p p r o x i m a t e l y 70nm t o 300nm. At a r e l a t i v e l y l o w m a g n i f i c a t i o n t h e p r o n o u n c e d a x i a l r e p e a t o f t h e s e f i b r i l s c o n s i s t s o f a l t e r n a t i n g l i g h t and d a r k r e g i o n s w h i c h a r e due t o t h e 38 F i g u r e 2a and b. E l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f n o n - m i n e r a l i z e d t e n d o n . P a r a l l e l c o l u m n s o f t e n o c y t e s ( T) and t h e i r p r o c e s s e s ( C P) a r e s e p a r a t e d by p a r a l l e l c o l l a g e n f i b r i l s ( F ) . Rough e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( r E R ) , m i t o c h o n d r i a ( f f l ) , a nd m i c r o t u b u l e s ( a r r o w ) a r e i n t r a c e l l u l a r o r g a n e l l e s w h i c h a r e commonly o b s e r v e d i n t h e s e c e l l s . The p a r a l l e l c o l l a g e n f i b r i l s e x t e n d l o n g i t u d i n a l l y f o r many m i c r o n s p e r m i t t i n g a n a l y s i s a l o n g i n d i v i d u a l f i b r i l s . G l u t a r a l d e h y d e / o s m i u m t e t r o x i d e f i x e d , UA and l e a d c i t r a t e s t a i n e d . B a r s a=400nm, b=2DD; a X 2 5 . 0 0 0 ; b X 5 0 , 0 0 0 . 40 s p e c i f i c s t a i n i n g p r o p e r t i e s o f t h e h i g h l y o r d e r e d c o l l a g e n m o l e c u l e s w i t h i n t h e f i b r i l s t r u c t u r e . A t a h i g h e r m a g n i f i c a t i o n ( F i g u r e 3a) e a c h a x i a l r e p e a t i s shown t o be composed o f an a s y m m e t r i c s e r i e s o f n a r r o w b a n d s w h i c h h a v e been g i v e n an " a , b , c , d , e " n o m e n c l a t u r e (Hodge and S c h m i t t , 1 9 6 0 ) . E a c h band c a n be i d e n t i f i e d by i t s r e l a t i v e s t a i n i n g i n t e n s i t y , w i d t h and s p a t i a l r e l a t i o n s h i p s t o o t h e r b a n d s . The i n t e n s i t y , and t h e r e f o r e t h e f i n e s t r u c t u r e , o f t h e s e b a n d s v a r i e s d e p e n d i n g upon t h e s t a i n i n g m e t h o d s u s e d ; f i b r i l s i n F i g u r e 3a have been s t a i n e d w i t h a q u e o u s PTA/UA w h i c h g i v e s c l e a r d e f i n i t i o n t o e a c h b a n d . The m o r p h o l o g i c a l d e t a i l s o f t h e s e b a n d s a r e a s f o l l o w s : The " a " b a n d s ( a ^ , a ^ , a^» and a^) a r e n a r r o w , c l o s e l y s p a c e d b a n d s w h i c h t e n d n o t t o be c l e a r l y d e l i n e a t e d ; t h e two "b" b a n d s (b^ and b^) a r e v e r y d i s t i n c t and w e l l s e p a r a t e d , a l s o t h e y h a v e a w e l l d e f i n e d b o r d e r b e t w e e n t h e a d j a c e n t " a " and " c " b a n d s ; f o r t h e " c " b a n d s ( c ^ , C2> and c^) o n l y c^ i s r e a d i l y a p p a r e n t w h i l e t h e o t h e r s a r e f a i n t ; t h e s i n g l e " d " band i s an i n t e n s e s i n g l e band w i t h w e l l d e f i n e d b o r d e r s ; t h e " e " b a n d s ( e ^ and 62) a r e d i s t i n c t l i n e s n a r r o w l y s e p a r a t e d f r o m ea'ch -o t h e r , and a^ a r e s e p a r a t e d by a n a r r o w l u c e n t s p a c e . I n F i g u r e 3 t h e d e n s e l y s t a i n e d r e g i o n s a r e due t o b a n d s e, a and b, w h i l e c and d a r e w i t h i n t h e l i g h t r e g i o n . A t t h e m o l e c u l a r l e v e l o t h e r s t u d i e s have shown t h a t t h e gap z o n e , t h e d i s t a n c e s e p a r a t i n g 41 F i g u r e 3 a . The p e r i o d i c s t a i n i n g p a t t e r n o f c o l l a g e n f i b r i l s . The D r e p e a t i n g u n i t , (D) c a n be l a b e l l e d a c c o r d i n g t o t h e r e c o g n i z a b l e s e r i e s o f b a n d s d e f i n e d by t h e i r i n t e n s i t y and t h e i r s p a t i a l r e l a t i o n s h i p s . The b a n d s " a , b, c, d, and e" p e r m i t t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e N- t o C-m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n o f t h e c o l l a g e n f i b r i l . 3b. A c o m p u t e r d i s p l a y e d i m age o f p o s i t i v e l y and n e g a t i v e l y c h a r g e d a m i n o a c i d s i s shown i n t h e same m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n a s F i g u r e 3 a . T h i s d i s p l a y d e p i c t s t h e s p a t i a l d i s t r i b u t i o n and c h a r a c t e r i s t i c a l i g n m e n t s o f t h e s e c h a r g e d a m i n o a c i d s ; t h e r e s u l t i n g b a n d s a r e l a b e l l e d f r o m "e t o a" i n d i c a t i n g t h a t t h e N- t o C- d i r e c t i o n i s f r o m l e f t t o r i g h t . A c o m p u t e r d i s p l a y e d i m age f r o m F i g u r e 3b i s s c a l e d and a l i g n e d t o t h e c o l l a g e n image o f F i g u r e 3a ( i n s e t ) . The b a n d i n g p a t t e r n s o f b o t h i m a g e s l i e i n r e g i s t r a t i o n . G l y c e r o l t r e a t e d , a q u e o u s PTA and UA s t a i n e d ; Bar=10Qnm; X13D,QQ0. 42 3b 43 l o n g i t u d i n a l l y a r r a n g e d c o l l a g e n m o l e c u l e s c o n s i s t s o f a., _ . , e„ . , d and c , w h i l e t h e o v e r l a p z o n e c o n s i s t s o f C2 ^» b2 ^ and a^ (Hodge and P e t r u s k a , 1 9 6 3 ) . The b a n d i n g p a t t e r n o f t y p e I c o l l a g e n r e p r e s e n t s t h e d i s t r i b u t i o n and d e n s i t y o f c h a r g e d g r o u p s o f amino a c i d s ; t h e r e f o r e , t h e o r e t i c a l m o d e l s c a n be c o n s t r u c t e d f r o m t h e known a m i n o a c i d s e q u e n c e o f t y p e I c o l l a g e n . I n o u r c o m p u t e r g e n e r a t e d m o d e l ( F i g u r e 3b) c h a r g e d a mino a c i d s a l i g n v e r t i c a l l y t o g i v e t h e "a t o e" b a n d i n g p a t t e r n o f n a t i v e c o l l a g e n f i b r i l s . T h i s m o d e l was t h e n s c a l e d and a l i g n e d t o t h e s t a i n e d c o l l a g e n f i b r i l ( F i g u r e 3a and i n s e t ) . The r e g i s t r a t i o n and i n t e n s i t y o f t h e b a n d s d e r i v e d by c o m p u t e r m o d e l l i n g c o r r e s p o n d t o t h e s t a i n e d i m age and p e r m i t u n a m b i g u o u s d e t e r m i n a t i o n o f c o l l a g e n o r i e n t a t i o n . The t o C- d i r e c t i o n o f c o l l a g e n m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n c o r r e l a t e s w i t h t h e " e , d, c, b, a" p r e s e n t a t i o n o f t h i s a s y m m e t r i c p a t t e r n o f b a n d s ( F i g u r e 3b and i n s e r t ) . I n t h i s s t u d y i t was f o u n d t h a t a d j a c e n t f i b r i l s i n t u r k e y t e n d o n may be o f t h e same o r o f o p p o s i t e o r i e n t a t i o n a nd t h u s , t h e d e t e r m i n a t i o n o f m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n w i t h i n t h e c o l l a g e n f i b r i l i s c r i t i c a l t o t h e a n a l y s i s o f a p a t i t e l o c a l i z a t i o n . 44 F i g u r e 4. Low m a g n i f i c a t i o n o f g l y c e r o l t r e a t e d t e n d o n j u s t d i s t a l t o t h e m i n e r a l i z a t i o n f r o n t . The c a l c i f i e d r e g i o n s a p p e a r w h i t e w h i l e t h e n o n - m i n e r a l i z e d r e g i o n s a r e t r a n s l u c e n t . M i n e r a l i z a t i o n p r e c e d e s d i s t a l t o p r o x i m a l ( M i n ) . T i s s u e a t t h e b o u n d a r y o f v i s i b l e m i n e r a l i z a t i o n was s e l e c t e d f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a n a l y s i s o f e a r l y s t a g e s o f a p a t i t e c r y s t a l d e p o s i t i o n . Bar=0.5mm; X25. F i g u r e 5. D i f f e r i n g s t a g e s o f m i n e r a l i z a t i o n p r e s e n t n e a r t h e m i n e r a l i z a t i o n f r o n t i n u n s t a i n e d s e c t i o n s . 5a I n r e g i o n s w i t h l e a s t m i n e r a l d e n s i t y s m a l l l o c a l i z e d , e l e c t r o n d e n s e , r e g i o n s o f c a l c i f i c a t i o n ( a r r o w ) a r e e v i d e n t w i t h i n t h e o t h e r w i s e e l e c t r o n - l u c e n t , n o n - m i n e r a l i z e d m a t r i x . 5b. The p r o p o r t i o n o f m i n e r a l i z e d m a t r i x i n c r e a s e s and p e r i o d i c b a n d i n g ( a r r o w h e a d s ) w i t h i n t h e c o l l a g e n f i b r i l s i s p r e s e n t . 5 c . S m a l l r e g i o n s o f n o n - m i n e r a l i z e d m a t r i x (*) r e m a i n i n a more h e a v i l y m i n e r a l i z e d r e g i o n b u t w i l l be f i l l e d i n by s u b s e q u e n t c a l c i f i c a t i o n . B ars=200nm; a X 4 5 , 0 0 0 , b X40,QQQ, c X5Q,0Q0. 47 T r e a t m e n t o f m i n e r a l i z e d d o m e s t i c t u r k e y l e g t e n d o n s w i t h g l y c e r o l makes c o l l a g e n t r a n s l u c e n t and t h e m i n e r a l i z e d r e g i o n s e a s i l y r e c o g n i z a b l e ( F i g u r e 4 ) . Nea r t o t h e i n s e r t i o n o f t h e t e n d o n s i n t o b o n e , t h e t e n d o n s a r e h e a v i l y m i n e r a l i z e d . The d e g r e e o f m i n e r a l i z a t i o n p r o g r e s s i v e l y d e c r e a s e s away f r o m t h e i n s e r t i o n u n t i l i t d i s a p p e a r s t o g r o s s o b s e r v a t i o n ; t h i s i s r e p r e s e n t a t i v e o f t h e r e g i o n w h i c h was p r e p a r e d f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a n a l y s i s o f t h e m i n e r a l i z a t i o n f r o n t . When v i s u a l i z e d i n t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e an i n d i v i d u a l , u n s t a i n e d , l o n g i t u d i n a l s e c t i o n a t t h e m i n e r a l i z a t i o n f r o n t h a s w i t h i n i t an a p p a r e n t g r a d i e n t o f m i n e r a l s p r e a d . I n i t i a l l y s m a l l , l o c a l i z e d r e g i o n s o f e l e c t r o n d e n s e c a l c i f i c a t i o n a r e e v i d e n t w i t h i n t h e e l e c t r o n - l u c e n t m a t r i x ( F i g u r e 5 a ) . As t h e d e g r e e o f c a l c i f i c a t i o n i n c r e a s e s b a n d i n g o c c u r s w i t h a p e r i o d i c i t y e q u i v a l e n t t o t h e c o l l a g e n D p e r i o d ( F i g u r e 5 b ) . I n a d d i t i o n t o t h e m i n e r a l w h i c h h a s a p e r i o d i c n a t u r e t h e r e a r e r e g i o n s w h i c h do n o t have a b a n d i n g p a t t e r n . I n t h i s s t u d y I am o n l y c o n s i d e r i n g m i n e r a l w h i c h e x i b i t s a p e r i o d i c p a t t e r n b e c a u s e t h e n o n - p e r i o d i c m i n e r a l d e p o s i t i o n i s most l i k e l y o c c u r r i n g w i t h i n t h e n o n - c o l l a g e n o u s e x t r a c e l l u l a r m a t r i x . I n r e g i o n s w h i c h a r e more h e a v i l y m i n e r a l i z e d ( F i g u r e 5 c ) t h e b a n d i n g p a t t e r n r e m a i n s . The ma i n f e a t u r e a t t h i s s t a g e i s t h e p r o g r e s s i v e s p r e a d o f m i n e r a l , s e e m i n g l y i n a l l d i m e n s i o n s . A t h i g h e r m a g n i f i c a t i o n u n s t a i n e d , l o n g i t u d i n a l s e c t i o n s a t t h e m i n e r a l i z a t i o n f r o n t o f t u r k e y l e g t e n d o n s 48 ( F i g u r e 6a) r e v e a l a d i s t i n c t r e p e a t i n g p a t t e r n due t o t h e e l e c t r o n d e n s i t y o f a p a t i t e c r y s t a l s . I n c o n t r a s t , n o n - m i n e r a l i z e d r e g i o n s o f t h e same s e c t i o n do n o t d e m o n s t r a t e any s t r u c t u r a l d e t a i l . I n r e g i o n s o f e a r l y m i n e r a l i z a t i o n , most e l e c t r o n d e n s i t y o c c u r s i n t h e gap z o n e ; h o w e v e r , e l e c t r o n - d e n s e m a t e r i a l i s a l s o p r e s e n t i n t h e o v e r l a p z o n e . More s p e c i f i c a l l y , one o b s e r v e s t h a t e a c h z o n e h a s a p a t t e r n o f e l e c t r o n d e n s i t y w h i c h i s n e i t h e r random n o r homogeneous. The gap z o n e a p p e a r s t o be d e l i n e a t e d , on e i t h e r s i d e , by an e l e c t r o n - l u c e n t l i n e a n d w i t h i n t h e gap zone i s a s i n g l e a s y m m e t r i c a l l y p o s i t i o n e d l u c e n t a r e a . W i t h i n t h e o v e r l a p z o n e e a r l y m i n e r a l i z a t i o n o c c u r s i n t h e m i d - p o r t i o n . I n r e g i o n s o f i n c r e a s e d m i n e r a l d e p o s i t i o n s i m i l a r f e a t u r e s a r e o b s e r v e d b u t t h e d i f f e r e n c e i n c o n t r a s t b e t w e e n t h e gap and o v e r l a p z o n e s i s l e s s m a r k e d . 49 F i g u r e 6. The l o c a l i z a t i o n o f a p a t i t e i n c o l l a g e n . 6 a . A b r i g h t f i e l d image o f an u n s t a i n e d , l o n g i t u d i n a l s e c t i o n o f m i n e r a l i z e d t u r k e y l e g t e n d o n s h o w i n g t h e i n h e r e n t b a n d i n g p a t t e r n due t o a h i g h m i n e r a l c o n t e n t i n gap z o n e s (GZ) a s c o m p a r e d t o l e s s m i n e r a l i n t h e i n t e r s p a c e d o v e r l a p z o n e s ( O Z ) . The m i n e r a l h a s an a s y m m e t r i c d i s t r i b u t i o n w i t h i n gap z o n e s d e m a r c a t e d by a l u c e n t s p a c e ( w h i t e a r r o w h e a d s ) . T h i s d i s t r i b u t i o n i s c o n s i s t e n t w i t h i n a g i v e n f i b r i l . A l s o , t h e gap z o n e s a r e b o r d e r e d on b o t h s i d e s by a n a r r o w l u c e n t s p a c e ( w h i t e a r r o w s ) . N o n - m i n e r a l i z e d p o r t i o n o f m a t r i x ( * ) . 6b and c. Two r e p r e s e n t a t i v e SADF i m a g e s o f m i n e r a l i z e d u n s t a i n e d c o l l a g e n f i b r i l s s h o w i n g t h e s p e c i f i c l o c a l i z a t i o n o f a p a t i t e c r y s t a l s ( c - a x i a l l e n g t h s ) w h i c h a p p e a r i n t h e r e v e r s e c o n t r a s t t o b r i g h t f i e l d e l e c t r o n m i c r o g r a p h s . A p a t i t e i s i d e n t i f i e d as w h i t e h i g h l i g h t s w i t h i n b o t h t h e gap z o n e s (GZ) and o v e r l a p z o n e s (OZ) a t t h e e a r l i e s t s t a g e s o f m i n e r a l i z a t i o n . Bars=100nm; X 1 2 0 , 0 0 0 . 50 51 SADF s p e c i f i c a l l y i d e n t i f i e s and d i r e c t l y v i s u a l i z e s a p a t i t e c r y s t a l s w i t h i n b o t h gap and o v e r l a p z o n e s ( F i g u r e 6 b ) ; t h e s e c - a x i a l l y o r i e n t e d ' c r y s t a l s a p p e a r i n r e v e r s e c o n t r a s t t o t h e b r i g h t f i e l d i m a g e s . I t i s a p p a r e n t t h a t t h e p a t t e r n o f m i n e r a l d e p o s i t i o n w i t h i n t h e gap and o v e r l a p z o n e s d e m o n s t r a t e d by SADF i s t h e same as by b r i g h t , f i e l d e l e c t r o n m i c r o s c o p y . I n o r d e r t o c o r r e l a t e t h e m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n o f c o l l a g e n w i t h t h e p a t t e r n o f a p a t i t e d e p o s i t i o n i t i s n e c e s s a r y t o r e l a t e t h e s t a i n e d c o l l a g e n b a n d i n g p a t t e r n o f n o n - m i n e r a l i z e d a r e a s w i t h m i n e r a l i z e d a r e a s on t h e same f i b r i l . C e r t a i n t e c h n i c a l d i f f i c u l t i e s must be o v e r c o m e b e c a u s e i t i s known t h a t a q u e o u s s t a i n i n g p r o c e d u r e s t o t a l l y d e m i n e r a l i z e s e c t i o n s . A l s o , i t was f o u n d t h a t r e g i o n s a d j a c e n t t o m i n e r a l d e p o s i t i o n a r e n o t a s c l e a r i n t h e i r b a n d i n g a s r e g i o n s more d i s t a n t . T h e r e f o r e , t o e n h a n c e t h e f i n e s t r u c t u r e o f c o l l a g e n f i b r i l s and t o r e t a i n t h e n a t i v e d i s t r i b u t i o n o f a p a t i t e c r y s t a l s , s e c t i o n s were s t a i n e d w i t h a l c o h o l i c UA. The a l c o h o l i c UA s t a i n i n g p r o d u c e d a d i f f e r e n t b a n d i n g p a t t e r n a s c o m p a r e d t o t h e a q u e o u s PTA/UA s t a i n s . So t o u n a m b i g u o u s l y d e t e r m i n e t h e m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n o f c o l l a g e n w i t h t h i s UA s t a i n , a t h e o r e t i c a l m o d e l o f c h a r g e d a m ino a c i d s was s c a l e d and a l i g n e d t o a r e p r e s e n t a t i v e n o n - m i n e r a l i z e d r e g i o n o f a c o l l a g e n f i b r i l ( F i g u r e 7a).. The b a n d i n g p a t t e r n s o f t h e s t a i n e d f i b r i l and t h e s c a l e d c o m p u t e r m o d e l a r e i n r e g i s t r a t i o n , t h e r e b y e n a b l i n g t h e 52 d e t e r m i n a t i o n o f IM- t o C- m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n w h i c h i s d i r e c t e d f r o m l e f t t o r i g h t . The and b a n d s o b s e r v e d w i t h a l c o h o l i c UA s t a i n i n g were s i m i l a r i n a p p e a r a n c e t o t h e PTA/UA s t a i n e d p a t t e r n a n d c o n s i s t e d o f a d i s t i n c t p a i r o f b a n d s w i t h i n t h e more e l e c t r o n - d e n s e r e g i o n o f t h e D p e r i o d . The d band a l s o r e t a i n e d i t s c h a r a c t e r i s t i c i n t e n s i t y . H o w e v e r , t h e a, e, and c b a n d s m a i n t a i n e d t h e i r r e l a t i v e p o s i t i o n s b u t were n o t a s i n t e n s e l y s t a i n e d a s w i t h PTA/UA. A d v a n c i n g t o w a r d t h e m i n e r a l i z e d p o r t i o n o f t h e f i b r i l s t h e s t a i n e d b a n d i n g p a t t e r n i s r e p l a c e d by t h e c h a r a c t e r i s t i c p a t t e r n o f a p a t i t e d i s t r i b u t i o n ( F i g u r e 7 b ) . The d i s t r i b u t i o n o f a p a t i t e i n t h e s e gap and o v e r l a p z o n e s was p r e c i s e l y t h e same as was o b s e r v e d f o r u n s t a i n e d m i n e r a l i z e d s e c t i o n ( c o m p a r e F i g u r e s 7b and 5 a ) . W i t h i n t h e gap zo n e t h e a s y m m e t r i c d i s t r i b u t i o n o f m i n e r a l i s c r e a t e d by a l u c e n t s p a c e . The p o s i t i o n i n g o f t h i s s p a c e i s c o n s i s t e n t w i t h t h e t o C- o r i e n t a t i o n o f t h e c o l l a g e n m o l e c u l e s and when a p p a r e n t i s n e a r e s t t o t h e t e r m i n u s . I t was o b s e r v e d t h a t a d j a c e n t f i b r i l s h a v i n g o p p o s i t e m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n s a s d e t e r m i n e d by t h e i r s t a i n i n g p a t t e r n a l s o h ave c o n s i s t e n t l u c e n t s p a c e s p o s i t i o n e d on o p p o s i t e s i d e s o f t h e gap zo n e ( F i g u r e 7 b ) . 53 F i g u r e 7. A n a l y s i s o f c o l l a g e n o r i e n t a t i o n i n m i n e r a l i z e d t u r k e y t e n d o n . 7 a . A n o n - m i n e r a l i z e d p o r t i o n o f a c o l l a g e n f i b r i l s t a i n e d w i t h a l c o h o l i c UA. A c o m p u t e r image ( 7 a i n s e r t ) d i s p l a y i n g t h e s p a t i a l d i s t r i b u t i o n o f c h a r g e d a m i n o a c i d s h a s been s c a l e d and a l i g n e d t o d e t e r m i n e t h e N- t o C-m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n . T h i s s t a i n i n g p a t t e r n i s n o t e q u i v a l e n t t o t h e PTA/UA s t a i n i n g b u t t h e o r i e n t a t i o n i s r e a d i l y d e t e r m i n e d by t h e p r o m i n e n t b and d b a n d s . 7b. N o n - m i n e r a l i z e d and m i n e r a l i z e d p o r t i o n s o f t h e same c o l l a g e n f i b r i l s t a i n e d w i t h a l c o h o l i c UA. The a d j a c e n t f i b r i l s h a v e o p p o s i t e o r i e n t a t i o n s a s i n d i c a t e d by t h e i r o p p o s i t e b a n d i n g p a t t e r n s i n t h e n o n - m i n e r a l i z e d a r e a s . The m i n e r a l i z e d p o r t i o n shows t h e same p e r i o d i c d i s t r i b u t i o n o f a p a t i t e o f t h e u n s t a i n e d s e c t i o n s . E l e c t r o n l u c e n t s p a c e s b o r d e r t h e gap zo n e and w i t h i n t h e gap zo n e l u c e n t s p a c e s ( a r r o w h e a d s ) a r e p o s i t i o n e d a s y m m e t r i c a l l y c o n s i s t e n t w i t h t h e o p . p o s i t e o r i e n t a t i o n . Bars=100nm; X 1 2 0 , 0 0 0 . F i g u r e 8. E l e c t r o n d i f f r a c t i o n o f a l c o h o l i c UA s t a i n e d m i n e r a l i z e d ( 8 a ) and u n s t a i n e d m i n e r a l i z e d t e n d o n ( 8 b ) . The c h a r a c t e r i s t i c p a t t e r n o f a p a t i t e i s o b s e r v e d u n d e r b o t h c o n d i t i o n s d e m o n s t r a t i n g t h a t a p a t i t e i s r e t a i n e d when s e c t i o n s a r e s t a i n e d w i t h UA i n 100% m e t h a n o l . Two p r o m i n e n t r e f l e c t i o n s a r e r e a d i l y i n d e n t i f i e d : t h e i n n e r ( 0 0 2 ) r e f l e c t i o n , and t h e c o m b i n e d ( 2 1 1 , 1 1 2 , 300, 2 0 2 , 301) r e f l e c t i o n . 54 55 E l e c t r o n d i f f r a c t i o n a n a l y s i s f r o m t h e s e d e n s e m i n e r a l i z e d a r e a s o f a l c o h o l i c UA s t a i n e d s e c t i o n s showed t h e c h a r a c t e r i s t i c maxima f o r b i o l o g i c a l a p a t i t e c r y s t a l s and t h e r e b y c o n f i r m i n g i t s p r e s e n c e ( F i g u r e 8a and b ) . A f t e r d e t e r m i n i n g t h e N- t o C- m o l e c u l a r d i r e c t i o n o f m i n e r a l i z e d c o l l a g e n f i b r i l s t h e n a t u r e o f t h e a p a t i t e - c o l l a g e n d i s t r i b u t i o n was f u r t h e r a n a l y z e d by c o m p a r i s o n t o c o m p u t e r m o d e l s s e l e c t i n g f o r v a r i o u s amino a c i d g r o u p s s u c h a s : c h a r g e d ( p o s i t i v e a n d / o r n e g a t i v e ) , p o l a r n o n - c h a r g e d , a r o m a t i c , and h y d r o p h o b i c g r o u p s . T h e s e c l a s s e s o f amino a c i d s were s e l e c t e d b e c a u s e o f t h e i r i n f l u e n c e on c o l l a g e n s t r u c t u r e . Of t h e s e , t h e m o d el h a v i n g t h e b e s t f i t t o t h e u n s t a i n e d m i n e r a l i z e d c o l l a g e n f i b r i l was t h e h y d r o p h o b i c a mino a c i d s d i s p l a y e d i n n o r m a l and r e v e r s e c o n t r a s t ( F i g u r e 9 a ) . I t was o b s e r v e d f r o m t h e c o m p u t e r model t h a t t h e r e a r e t h r e e r e g i o n s w i t h h i g h s p a t i a l d e n s i t i e s o f h y d r o p h o b i c amino a c i d s w h i c h a r e d i s p l a y e d a s w h i t e a r e a s i n t h e r e v e r s e c o n t r a s t i m a g e . Two o f t h e s e h y d r o p h o b i c r e g i o n s , a ^ - a ^ and c ^ - c ^ , b o r d e r e a c h s i d e o f t h e gap z o n e ; t h e t h i r d l i e s a s y m m e t r i c a l l y p o s i t i o n e d i n t h e gap zone b e t w e e n a^ and e^ n e a r e r t h e t e r m i n u s o f t h e m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n . R e g i o n s o f t h e c o l l a g e n f i b r i l c o n t a i n i n g l o w s p a t i a l d e n s i t i e s o f h y d r o p h o b i c amino a c i d s i n c l u d e most o f t h e gap z o n e ; i n t e r m e d i a t e r e g i o n s l i e w i t h i n t h e o v e r l a p z o n e f r o m c 1 t o 56 a ^ , and w i t h i n t h e gap z o n e f r o m e^ t o c^* T h e s e c o m p u t e r - g e n e r a t e d h y d r o p h o b i c r e p e a t s a l i g n and c o r r e l a t e w i t h m i c r o g r a p h s o f u n s t a i n e d m i n e r a l i z e d c o l l a g e n ( F i g u r e 9b and i n s e t ) . I n t h i s s e t o f i m a g e s i t i s c l e a r l y shown t h a t a p a t i t e i s l e s s d e n s e i n t h o s e a r e a s o c c u p i e d by h i g h s p a t i a l d e n s i t i e s o f h y d r o p h o b i c a mino a c i d r e s i d u e s . A n a l y s i s o f t h e h y d r o p h o b i c a mino a c i d c o m p o s i t i o n o f t h e gap and o v e r l a p z o n e s o f t h e c o l l a g e n D p e r i o d shows t h a t gap z o n e i s l e s s h y d r o p h o b i c , on a v e r a g e , t h a n t h e o v e r l a p z o n e . I n one r e p e a t i n g u n i t , 5 m o l e c u l e s i n w i d t h and D i n l e n g t h , t h e r e a r e 129 h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s w i t h i n t h e o v e r l a p zone and 100 h y d r o p h o b i c a mino a c i d s i n t h e gap z o n e . T h e r e f o r e , t h e o v e r l a p zone has a b o u t t w i c e ( 1 . 9 3 ) t h e d e n s i t y o f h y d r o p h o b i c amino a c i d s . The r a t i o s o f t h e i n d i v i d u a l c o n s t i t u e n t h y d r o p h o b i c a mino a c i d s v a r i e s b e t w e e n t h e two z o n e s by a t most 4%. W i t h i n t h e gap zone t h e p e r c e n t a g e o f h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s a r e : 1*1 = 9%, V=27%, L=30%, F=17%, 1=17%. W i t h i n t h e o v e r l a p z o n e t h e p e r c e n t a g e s a r e : 1*1 = 1 1 % , V = 2 5 % , L = 3 4 % , F = 1 6 % , 1 = 14%. U s i n g f i g u r e s f o r t h e a d d i t i o n a l f r e e e n e r g y o f t r a n s f e r f r o m w a t e r t o an o r g a n i c s o l v e n t as a m e a s u r e o f a m i n o a c i d h y d r o p h o b i c i t y ( s e e T a n f o r d , 1 9 8 0 , p. 140) t h e d i f f e r e n c e s i n a mino a c i d c o m p o s i t i o n v a r y t h e o v e r a l l h y d r o p h o b i c i t y by a b o u t 0.1%. T h u s , t h e d i f f e r e n c e s i n a v e r a g e h y d r o p h o b i c i t y t h r o u g h o u t t h e s e two z o n e s r e l a t e t o d i f f e r e n c e s i n d e n s i t y and n o t t o d i f f e r e n c e s i n c o m p o s i t i o n . 57 The p r o p o r t i o n s o f gap and o v e r l a p z o n e s r e l a t i v e t o t h e D u n i t were c a l c u l a t e d by c o u n t i n g t h e amino a c i d s f o r e a c h z o n e ; 101 f o r t h e o v e r l a p zone and 133 f o r t h e gap z o n e . T h i s r e s u l t s i n t h e p r e d i c t e d p r o p o r t i o n o f t h e D u n i t o c c u p i e d by t h e o v e r l a p z o n e t o be .432D and t h e gap z o n e t o be .568D a s s u m i n g t h a t t h e l e n g t h s o c c u p i e d by amino a c i d s a r e e q u i v a l e n t . T h e s e f i g u r e s c o u l d t h e n be u s e d t o p r e d i c t t h e d e n s i t y o f amino a c i d s p e r m o l e c u l e and t o s t a n d a r d i z e f o r l e n g t h o f e a c h z o n e . H y d r o x y p r o l i n e and p r o l i n e a r e p e r i o d i c a l l y l o c a l i z e d a l o n g t h e D p e r i o d ( F i g u r e 1 0 ) . The d e n s i t y o f t h e s e r e s i d u e s a r e a r e f l e c t i o n o f s t a b i l i t y o f t h e m o l e c u l a r t r i p l e h e l i x . T h e r e a r e 359 h y d r o x y p r o l i n e and p r o l i n e r e s i d u e s w i t h i n t h e o v e r l a p z o n e c o m p a r e d t o 335 w i t h i n t h e o v e r l a p z o n e . T h e r e f o r e , t h e r e i s a g r e a t e r p r o p o r t i o n a l d e n s i t y o f t h e s e r e s i d u e s i n t h e o v e r l a p z o n e as c o m p a r e d t o t h e gap z o n e ( 1 . 1 3 : 1 ) . Two r e g i o n s , one a t e a c h end o f t h e gap z o n e have v e r y few p r o l i n e o r h y d r o x y p r o l i n e r e s i d u e s . T h e s e r e g i o n s may r e p r e s e n t more f l e x i b l e p o r t i o n s o f t h e D u n i t . 58 F i g u r e 9. A c o m p a r i s o n o f t h e d i s t r i b u t i o n o f h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s and m i n e r a l a p a t i t e . 9 a . A c o m p u t e r image o f h y d r o p h o b i c a m ino a c i d g r o u p s d i s p l a y e d i n n o r m a l a nd r e v e r s e c o n t r a s t ; t h e t o C- m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n i s f r o m l e f t t o r i g h t . P e r i o d i c r e g i o n s o f t h e c o l l a g e n f i b r i l c o n t a i n h i g h d e n s i t i e s o f h y d r o p h o b i c a m ino a c i d s d e p i c t e d i n t h e t o p image a s b l a c k and i n t h e r e v e r s e c o n t r a s t i m age as w h i t e . 9b. An u n s t a i n e d m i n e r a l i z e d c o l l a g e n f i b r i l i s shown w i t h an a l i g n e d and s c a l e d r e v e r s e c o n t r a s t c o m p u t e r image o f h y d r o p h o b i c amino a c i d s ( i n s e t ) . The r e g i s t r a t i o n and d e n s i t i e s o f t h e two i m a g e s c o r r e s p o n d . The a s y m m e t r i c a l l o c a l i z e d m i n e r a l ( d e n s i t y ) c o r r e s p o n d s t o r e g i o n s l o w i n h y d r o p h o b i c a m ino a c i d s ; w h i l e l u c e n t a r e a s , w i t h l e s s m i n e r a l d e n s i t y , c o r r e s p o n d t o r e g i o n s h i g h i n h y d r o p h o b i c i t y . Bar=1QQnm; X12Q,0Q0. F i g u r e 1 0 . A c o m p u t e r image o f p r o l i n e and h y d r o x y p r o l i n e d i s t r i b u t i o n . T h e s e amino a c i d s c o n f e r s t a b i l i t y t o t h e s t r u c t u r e o f c o l l a g e n m o l e c u l e s . T h i s image i n d i c a t e s t h a t t h e r e i s a p e r i o d i c l o c a l i z a t i o n t o t h e s e r e s i d u e s w h i c h may have i m p l i c a t i o n s on t h e a d a p t a t i o n o f c o l l a g e n m o l e c u l e s t o a p a t i t e c r y s t a l g r o w t h . R e g i o n s w i t h f e w e r p r o l i n e and h y d r o x y p r o l i n e r e s i d u e s a r e c o n s i d e r e d t o be more f l e x i b l e and may a c c o m o d a t e t o c h a n g e s i n c o n f o r m a t i o n . 59 60 DISCUSSION The o r d e r e d d i s t r i b u t i o n o f a p a t i t e c r y s t a l s i n t y p e I c o l l a g e n h a s been an i m p o r t a n t s u b j e c t o f s t u d y b e c a u s e o f t h e i n t e r a c t i v e r o l e o f m i n e r a l and c o l l a g e n i n p r o d u c i n g t h e b i o m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s o f s k e l e t a l t i s s u e s . T h i s d i s t r i b u t i o n has l o n g been v i e w e d t o r e f l e c t t h e n a t u r e o f c o l l a g e n s t r u c t u r e . H o w e v e r , a t t h i s t i m e o u r k n o w l e d g e o f how a p a t i t e c r y s t a l s may i n t e r a c t w i t h c o l l a g e n i s v e r y l i m i t e d . To d a t e , t h e o r i e s o f m i n e r a l / c o l l a g e n r e l a t i o n s h i p s h a v e f o c u s s e d on t h e p o t e n t i a l s p a c e p r e s u m e d t o be a v a i l a b l e w i t h i n t h e gap zone as a r e s u l t o f t h e D - s t a g g e r o f c o l l a g e n m o l e c u l e s (Hodge and P e t r u s k a , 1 9 6 3 ; G l i m c h e r , 1 9 8 3 ) . T h e r e f o r e , a p a t i t e h a s been b e l i e v e d t o be e x c l u d e d f r o m t h e o v e r l a p z o n e s d u r i n g t h e e a r l y s t a g e s o f t h e m i n e r a l i z a t i o n p r o c e s s . E v i d e n c e t o s u p p o r t t h i s v i e w p o i n t comes f r o m e l e c t r o n m i c r o s c o p i c ( G l i m c h e r , 1 9 5 9 ) , e l e c t r o n d i f f r a c t i o n ( E n g s t r o m , 1 9 6 6 ) , n e u t r o n d i f f r a c t i o n a nd x - r a y d i f f r a c t i o n s t u d i e s ( W h i t e e t a l . , 1 9 7 7 ) . A r e c e n t s t u d y on t h e s p e c i f i c and d i r e c t v i s u a l i z a t i o n o f a p a t i t e by SADF i m a g i n g h a s shown c r y s t a l s t o be p r e s e n t i n b o t h gap and o v e r l a p z o n e s a t t h e e a r l i e s t d e t e c t a b l e s t a g e s o f m i n e r a l i z a t i o n ( A r s e n a u l t , 1 9 8 8 ) . As an e x t e n s i o n o f t h e s e r e c e n t f i n d i n g s t h e p r e s e n t s t u d y c o m p a r e s a p a t i t e l o c a l i z a t i o n t o t h e m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n and a m ino a c i d s e q u e n c e o f c o l l a g e n ; and c o n s e q u e n t l y o f f e r s a h y p o t h e s i s 61 o f c o l l a g e n i n f l u e n c e on bone f o r m a t i o n . I t was o b s e r v e d by b o t h b r i g h t f i e l d and s e l e c t e d - a r e a d a r k f i e l d i m a g i n g t h a t e a r l y s t a g e s o f i n t r a f i b r i l l a r m i n e r a l i z a t i o n a r e c h a r a c t e r i z e d by an a s y m m e t r i c and p e r i o d i c d i s t r i b u t i o n o f a p a t i t e c r y s t a l s w h i c h c o r r e s p o n d s t o s p e c i f i c r e g i o n s a l o n g t h e t o C- m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n o f t h e c o l l a g e n f i b r i l . A r e a s w h i c h had g r e a t e r d e n s i t y o f m i n e r a l c o n s i s t e d o f most o f t h e gap zone and t h e m i d p o r t i o n o f t h e o v e r l a p z o n e . A r e a s o f l e a s t m i n e r a l d e n s i t y were d i s c r e t e r e g i o n s on e i t h e r s i d e o f t h e gap z o n e and an a r e a w i t h i n t h e gap z o n e i n v a r i a b l y p o s i t i o n e d n e a r e r t h e t e r m i n a l d i r e c t i o n o f t h e f i b r i l . I t was c o n c l u d e d f r o m t h e s e o b s e r v a t i o n s t h a t t h e h e t e r o g e n e o u s d i s t r i b u t i o n o f a p a t i t e c r y s t a l s w i t h i n t h e gap and o v e r l a p z o n e s most l i k e l y r e f l e c t s p e r i o d i c p r o p e r t i e s o f t h e c o l l a g e n f i b r i l w i t h i n b o t h z o n e s . R e g i o n s o f t h e D p e r i o d w h i c h h a v e l e a s t m i n e r a l d e n s i t y c o r r e l a t e i n p o s i t i o n t o t h e p e r i o d i c d e n s i t y o f h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s as d e p i c t e d by c o m p u t e r m o d e l l i n g . C o n v e r s e l y , r e g i o n s w h i c h have t h e g r e a t e s t m i n e r a l i z a t i o n c o r r e l a t e i n p o s i t i o n t o r e g i o n s o f l e s s h y d r o p h o b i c i t y . T h e s e f i n d i n g s p r o v i d e e v i d e n c e f o r a more c o m p l i c a t e d d i s t r i b u t i o n o f a p a t i t e c r y s t a l s i n c o l l a g e n t h a n s i m p l e c o n f i n e m e n t t o t h e gap z o n e s . T h u s , h y d r o p h o b i c i t y may be i n v o l v e d i n t h e m e c h a n i s m o f c o l l a g e n m i n e r a l i z a t i o n a s a r e s u l t o f a p a t i t e e x c l u s i o n f r o m t h e s e d o m a i n s . T h i s work has a number o f i m p l i c a t i o n s on t h e i n t e r r e l a t i o n s h i p 62 b e t w e e n t h e m e c h a n i s m o f c o l l a g e n m i n e r a l i z a t i o n and t h e a r c h i t e c t u r e o f c r y s t a l d i s t r i b u t i o n as d e f i n e d by t h e m o l e c u l a r o r d e r i n g o f c o l l a g e n . S p e c i f i c r e g i o n s l o c a l i z e d a l o n g t h e c o l l a g e n f i b r i l a r e h i g h i n h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s (a^-a^> c^-c^ and a^-e^) and c o r r e l a t e t o a r e a s w h i c h may i n h i b i t c r y s t a l f o r m a t i o n o r p r e v e n t c r y s t a l g r o w t h i n t o t h e a r e a . C o n v e r s l y , m i n e r a l d i s t r i b u t i o n c a n be e x p e c t e d t o o c c u r i n r e g i o n s w i t h l e s s s p a t i a l d e n s i t y o f h y d r o p h o b i c a mino a c i d s . We a r e s p e c u l a t i n g t h a t t h e h y d r o p h o b i c e f f e c t may i n f l u e n c e e i t h e r o f two p r o c e s s e s . F i r s t , t h e i n i t i a l s i t e o f n u c l e a t i o n may be d e t e r m i n e d by a s p e c i f i c e n v i r o n m e n t i s o l a t e d f r o m t h e h y d r o p h o b i c a r e a s . F o r e x a m p l e , t h e d i f f u s i o n and l o c a l i z a t i o n o f v a r i o u s i o n s i n c l u d i n g c a l c i u m and p h o s p h a t e w i l l be a f f e c t e d by t h e c l o s e a s s o c i a t i o n o f h y d r o p h o b i c g r o u p s . L o c a l c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t s o f t h e s e i o n s a r e l i k e l y t o be c r i t i c a l f o r t h e n u c l e a t i o n o f b i o l o g i c a l a p a t i t e . A l s o , p r o p e r t i e s o f t h e c o l l a g e n f i b r i l may be i n s t r u m e n t a l i n t h e l o c a l i z a t i o n o f n o n - c o l l a g e n o u s m o l e c u l e s w h i c h h a v e n e g a t i v e o r p o s i t i v e c o n t r o l on c r y s t a l g r o w t h . M a c r o m o l e c u l e s , s u c h as p r o t e o g l y c a n s ( S c o t t and H a i g h , 1985) have s p e c i f i c s i t e s o f a s s o c i a t i o n w i t h c o l l a g e n . V a r i o u s m a c r o r n o l e c u l e s s u c h a s p h o s p h o p r o t e i n s ( V e i s , 1 9 8 5 b ) , y - c a r b o x y g l u t a m i c a c i d ( G l i m c h e r e t a l . , 1 9 7 9 ) and o s t e o c a l c i n ( H a u s c h k a e t a l . , 1975) have been a s s o c i a t e d w i t h c o l l a g e n - r i c h m i n e r a l i z i n g t i s s u e s . 63 S e c o n d l y , a p a t i t e c r y s t a l s i z e and g r o w t h may be i n f l u e n c e d by s p a c e and e n e r g y r e q u i r e m e n t s . The d i s s o c i a t i o n o f h y d r o p h o b i c g r o u p s d u r i n g t h e m i n e r a l i z a t i o n p r o c e s s w i l l r e q u i r e a n e t e n e r g y w h i c h w i l l a f f e c t t h e d i s t r i b u t i o n o f m i n e r a l . The r e s u l t b e i n g t h a t a r e a s o f h y d r o p h o b i c i t y may c o m p a r t m e n t a l i z e r e g i o n s o f o p t i m a l c r y s t a l g r o w t h . B o t h o f t h e s e two p r o c e s s e s , w h e t h e r l o c a l e n v i r o n m e n t a l c o n d i t i o n s o r e n e r g y c o n s i d e r a t i o n s , o c c u r as a r e s u l t o f t h e f a v o r a b l e f r e e e n e r g y s t a t e a c h i e v e d by m i n i m i z i n g t h e i n t e r a c t i o n o f h y d r o p h o b i c g r o u p s w i t h t h e a q u e o u s medium ( T a n f o r d , 1 9 8 0 ) ; and n e i t h e r i s m u t u a l l y e x c l u s i v e . I n a d d i t i o n , t h e s e p o t e n t i a l p r o c e s s e s do n o t e x c l u d e c o n c u r r e n t i n f l u e n c e s . A l t h o u g h t h e r e d o e s seem t o be e x c l u s i o n o f m i n e r a l f r o m h y d r o p h o b i c r e g i o n s t h e r e a r e a l s o p o i n t s a l o n g t h e s e r e g i o n s where m i n e r a l i s p r e s e n t ( F i g u r e 6 ) . I n a d d i t i o n , some D p e r i o d s v i s u a l i z e d do n o t e x i b i t t h e a^-e^ l i n e w i t h i n t h e gap z o n e . One must a s k t h e q u e s t i o n "Why i s t h e p e r i o d i c d i s t r i b u t i o n o f a p a t i t e i n c o l l a g e n i n t h e u n s t a i n e d , m i n e r a l i z e d s e c t i o n s n o t more d e f i n e d and c o n s i s t e n t ? " I n o t h e r w o r d s , one must e x a m i n e t h e m i n e r a l c r y s t a l s w h i c h r e p r e s e n t e x c e p t i o n s t o t h i s p r o p o s e d h y p o t h e s i s . S e v e r a l p o t e n t i a l e x p l a n a t i o n s a r e p o s s i b l e . F i r s t , t h e c o m p u t e r i m a g e s ( F i g u r e 9) show t h a t t h e a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n i s n o t homogeneous w i t h i n t h e h y d r o p h o b i c r e g i o n s . R a t h e r t h a n a p e r f e c t l y l i n e a r a r r a n g e m e n t , t h i s c l a s s o f a m ino a c i d s i s d e p i c t e d more as c l u m p s . T h i s 64 c o n c e p t i s c o m p a t i b l e w i t h t h e r m o d y n a m i c c o n c e p t s o f h y d r o p h o b i c i t y i n t h a t t h e h y d r o p h o b i c a m ino a c i d s t e n d t o a g g r e g a t e . T h e r e f o r e , i t may be more a c c u r a t e t o d e s c r i b e t h e s e r e g i o n s a s d i f f e r i n g i n t h e d e n s i t y o f h y d r o p h o b i c a m i no a c i d s . T h e r e may be s u f f i c i e n t n o n - h y d r o p h o b i c a mino a c i d s ( i n a t h r e e - d i m e n s i o n a l p a c k i n g a r r a n g e m e n t ) t o p e r m i t some c r y s t a l f o r m a t i o n w i t h i n e a c h o f t h e s e h y d r o p h o b i c r e g i o n s . S e c o n d , t h e t h r e e - d i m e n s i o n a l p a c k i n g a r r a n g e m e n t o f c o l l a g e n i s somewhat d i s t o r t e d and d i s c o n t i n u o u s ( H u l m e s e t a l . , 1 9 8 5 ) . The H o d g e - P e t r u s k a ( 1 9 6 3 ) m o d e l c o u l d n o t be e x p e c t e d t o h o l d t r u e f o r t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n a l l c o l l a g e n m o l e c u l e s v i s u a l i z e d i n a s e c t i o n w h i c h i s a p p r o x i m a t e l y 70nm t h i c k . T h e r e f o r e , s u f f i c i e n t m o l e c u l e s o f a 70nm t h i c k s e c t i o n may be o f f s e t t o r e s u l t i n c r y s t a l s f o r m i n g o u t s i d e o f t h e g e n e r a l p a t t e r n . H owever, t h e r e i s no means t o p r e d i c t t h e d e g r e e o f t h i s d i s t o r t i o n . T h i r d , t h e t h i c k e r t h e s e c t i o n , t h e more l i k e l y t h e e l e c t r o n l u c e n t r e g i o n s w i t h i n t h e gap zone w i l l n o t be v i s u a l i z e d . T h i s i s b e c a u s e t h e s p a c e ( i n t h i s c a s e t h e p r o p o s e d h y d r o p h o b i c r e g i o n s ) b e t w e e n c r y s t a l s a r e s m a l l r e l a t i v e t o t h e t h i c k n e s s o f t h e s e c t i o n . I n c i d e n t e l e c t r o n s e n t e r i n g t h e s p a c e a t 0°would p a s s t h r o u g h b u t i f t h e s p e c i m e n were t i l t e d t h e s p a c e w o u l d a p p e a r s m a l l e r as t h e a n g l e became g r e a t e r . A t a c e r t a i n a n g l e o f i n c i d e n c e t h e s p a c e w o u l d no l o n g e r p e r m i t t h e p a s s a g e o f e l e c t r o n s . The p r e d i c t e d s i z e o f t h e h y d r o p h o b i c r e g i o n s b a s e d on t h e c o m p u t e r m o d e l s 65 (a^-a2=.12D o r a b o u t 7.8nm; 0 ^ - 0 ^ = . 1 4 D o r a b o u t 9.4nm; and a^-e2=.07D o r a b o u t 4.7nm) and an e s t i m a t e d s p e c i m e n t h i c k n e s s (70nm) g i v e s a c r i t i c a l i n c i d e n t a n g l e a t w h i c h t h e s p a c e w o u l d no l o n g e r be d e t e c t a b l e . A s s u m i n g t h a t t h e m i n e r a l w i t h i n t h e gap zo n e a r e b l o c k s , e q u a l t o t h e s p e c i m e n i n t h i c k n e s s , p o s i t i o n e d i n p a r a l l e l , t h e a^-e^ r e g i o n w i t h i n t h e gap zo n e w o u l d d i s a p p e a r a t an e l e c t r o n i n c i d e n t a n g l e o f 3.5? The l a r g e s t o f t h e s e p r e d i c t e d s p a c e s , t h e c^-c^ r e g i o n , w o u l d no l o n g e r be v i s i b l e a t an a n g l e o f 7.6° T h e r e f o r e , t h e n o n - m i n e r a l i z e d r e g i o n s b o r d e r i n g t h e gap zone w o u l d be d e t e c t e d much more f r e q u e n t l y t h a n t h e r e g i o n w i t h i n t h e gap z o n e . The a n g l e o f s e c t i o n i n g becomes c r i t i c a l l y i m p o r t a n t as d o e s t h e n o r m a l c h a n g e i n d i r e c t i o n o f c o l l a g e n w i t h i n t h e t e n d o n . And s o t h i s p a t t e r n w o u l d be more d i f f i c u l t t o image i n bone b e c a u s e o f i t s more c o m p l e x s t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n o f c o l l a g e n f i b r i l s . E l e c t r o n m i c r o s c o p i c i m a g i n g o f c a l c i f i e d t i s s u e s r e p r e s e n t s a t e c h n i c a l c h a l l e n g e t o m a i n t a i n t h e m i n e r a l c o m p o n e n t w h i l e v i s u a l i z i n g t h e a s s o c i a t e d o r g a n i c m a t r i x . The s t a i n i n g o f c o l l a g e n w i t h UA i n a l c o h o l i s an a l t e r n a t i v e a p p r o a c h t o t h e d e m i n e r a l i z i n g e f f e c t s o f a q u e o u s PTA/UA s t a i n s b u t p r o d u c e s a d i f f e r e n t c o l l a g e n b a n d i n g p a t t e r n . W h i l e t h e p o s i t i o n i n g a n d r e g i s t r a t i o n o f t h e b a n d s "a t o e" a r e t h e same due t o t h e i n t e r a c t i o n o f UA w i t h c h a r g e d g r o u p s , t h e r e l a t i v e i n t e n s i t i e s and 66 d e l i n e a t i o n s o f t h e b a n d s a r e n o t a s c l e a r . An e x p l a n a t i o n o f t h e o b s e r v e d p a t t e r n i s n o t r e a d i l y a p p a r e n t f o r two r e a s o n s . F i r s t , a l t h o u g h e a r l y w o r k s o f UA s t a i n i n g c o n s i d e r UA t o be a c a t i o n i c s t a i n i t a c t u a l l y s t a i n s b o t h n e g a t i v e l y and p o s i t i v e l y c h a r g e d a mino a c i d s d e p e n d i n g on c o n c e n t r a t i o n and pH v a r i a b l e s ( T z a p h i l i d o u e t a l . , 1 9 8 2 b ) . S e c o n d l y , t h e e f f e c t s o f a l c o h o l as a s o l v e n t i n t h e s t a i n i n g o f c o l l a g e n has n o t been s t u d i e d and so a c o m p a r i s o n b e t w e e n w a t e r and a l c o h o l as s o l v e n t s i n t h i s p r o c e d u r e has n o t been d o n e . The v i s u a l i n t e r p r e t a t i o n o f r e p e a t i n g p a t t e r n s i n c o l l a g e n f i b r i l s i s a p r e l i m i n a r y t o more p r e c i s e c o r r e l a t i o n a l m e t h o d s . A m a t h e m a t i c a l c o r r e l a t i o n b e t w e e n d e n s i t y o f m i n e r a l and t h e d e g r e e o f h y d r o p h o b i c i t y w i t h i n e a c h r e g i o n w o u l d h e l p t o s u b s t a n t i a t e t h e p r o p o s e d r e l a t i o n s h i p . H o w e v e r , d e s p i t e t h e a v a i l a b i l i t y o f s e v e r a l h y d r o p h o b i c s c a l e s , h y d r o x y p r o l i n e h a s n o t been a s s i g n e d a v a l u e on t h e s e s c a l e s , t h u s m a k i n g c a l c u l a t i o n s i n t h e s t a n d a r d method i m p o s s i b l e f o r c o l l a g e n m o l e c u l e s . The l i m i t a t i o n o f v i s u a l m e t h o d s i s i n e s t i m a t i n g t h e s t r e n g t h o f t h e r e l a t i o n s h i p b e c a u s e t h e r e i s a s u b j e c t i v e i n t e r p r e t a t i o n o f t h e d e g r e e o f f i t . The p e r i o d i c l o c a l i z a t i o n o f a p a t i t e c r y s t a l s w i t h i n t h e o v e r l a p z o n e s o f c o l l a g e n f i b r i l s ( A r s e n a u l t , 1988) i s e v i d e n c e w h i c h c o n t r a d i c t s t h e o r i e s e x c l u s i v e l y l o c a l i z i n g c r y s t a l s w i t h i n gap s p a c e s ( e g . UJeiner and T r a u b , 1 986) o r 67 s p a c e s w i t h i n m i c r o f i b r i l s ( H o h l i n g , 1 9 8 0 ) . O t h e r e v i d e n c e comes f r o m s t u d i e s t h a t have shown t h a t c r y s t a l s i z e i s v a r i a b l e and n o t d e t e r m i n e d by t h e s i z e o f t h e gap s p a c e ( A r s e n a u l t and G r y n p a s , 1 9 8 8 ) . A l t h o u g h t h e s e p o t e n t i a l s p a c e s may be i n f l u e n t i a l i n c r y s t a l g r o w t h o r t h e l o c a l i z a t i o n o f n o n - c o l l a g e n o u s m a t e r i a l s t h e y do n o t e x p l a i n t h e s e o b s e r v a t i o n s . C o n s i d e r a t i o n must t h e r e f o r e be g i v e n t o t h e d i s c r e t e e n v i r o n m e n t w h i c h g i v e s r i s e t o h e t e r o g e n e i t y o f c r y s t a l s i z e and h e t e r o g e n e i t y o f c r y s t a l d e p o s i t i o n w i t h i n t h e e n t i r e D u n i t . So how d o e s t h e a p a t i t m i n e r a l become d e p o s i t e d i n t h e d e n s e l y p a c k e d o v e r l a p z o n e C o l l a g e n p e p t i d e s c a n be c o n c e p t u a l i z e d a s s e m i f l e x i b l c y l i n d e r s w h i c h i n t e r t w i n e t o f o r m a h i g h e r o r d e r s e m i f l e x i b l e c y l i n d e r , t h e c o l l a g e n m o l e c u l e ( V e i s , 1 9 8 5 a ) . T h e s e m o l e c u l e s h a v e a h i g h d e g r e e o f b a c k b o n e and s i d e c h a i n f l e x i b i l i t y ( S a r k a r e t a l . , 1987) b e c a u s e t h e t r i p l e h e l i x c a n accommodate f l u c t u a t i o n s w i t h o u t a p p r e c i a b l e c h a n g e s i n f r e e e n e r g y (Okuyama e t a l . , 1 9 8 1 ) . T h e s e m o l e c u l e s i n t e r t w i n e t o f o r m c o l l a g e n f i b r i l s w h i c h a l s o h ave l o n g i t u d i n a l and l a t e r a l f l e x i b i l i t y a c c o r d i n g t o e l e c t r o n m i c r o s c o p i c and b i o m e c h a n i c a l s t u d i e s ( l / i i d i k , 1 9 8 0 ; G i r a u d - G u i l l e , 1 9 8 8 ) . The f l e x i b i l i t y o f c o l l a g e n ( a n i t s s t a b i l i t y ) a r e d e p e n d e n t o n : 1) t h e G-X-Y t r i p l e t ; 2) p r o l i n e and h y d r o x y p r o l i n e l o c a l i z a t i o n ; 3) c r o s s l i n k i n g 4) c h a r g e d amino a c i d s i d e c h a i n i n t e r a c t i o n s ; and 68 5) h y d r o p h o b i c a m ino a c i d s i d e c h a i n i n t e r a c t i o n s . T h u s , t h e c o l l a g e n m o l e c u l e s e x i b i t f l e x i b l e and i n f l e x i b l e r e g i o n s ( V e i s , 1 9 8 5 a ) w h i c h c a n be b u i l t i n t o r e p e a t i n g u n i t s and d e p i c t e d by c o m p u t e r m o d e l l i n g ( F i g u r e 1 0 ) . From t h i s m o d e l l i n g i t c a n be o b s e r v e d t h a t t h e r e a r e p e r i o d i c f l e x i b l e r e g i o n s and t h a t t h e gap zone i s more f l e x i b l e t h a t t h e o v e r l a p z o n e . I t i s p o s s i b l e t h a t m i n e r a l i s a c c o m m o d a t e d i n t o t h e c o l l a g e n o v e r l a p z o n e s by t h e s e m i f l e x i b i l i t y o f c o l l a g e n m o l e c u l e s w i t h i n t h e f i b r i l s . Some o f t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n m i n e r a l d e n s i t y i n gap and o v e r l a p z o n e s may be e x p l a i n e d by d i f f e r e n c e s i n l o c a l i z e d c o l l a g e n f l e x i b i l i t y . The gap z o n e i s b o u n d e d by r e g i o n s w i t h v e r y l o w d e n s i t i e s o f p r o l i n e and h y d r o x y p r o l i n e ( a ^ - a ^ and c ^ - c ^ ) . T h e s e r e g i o n s c o r r e s p o n d t o r e g i o n s w i t h a l o w d e n s i t y o f h y d r o p h o b i c amino a c i d s and a r e a d j a c e n t t o t h e r e g i o n s o f h i g h h y d r o p h o b i c i t y d i s c u s s e d a b o v e . C o n c l u s i o n s I n an o b s e r v a t i o n a l , c o r r e l a t i o n a l s t u d y s u c h a s . t h i s , i t w o u l d be i m p r o p e r t o s u g g e s t t h a t a c a u s e and e f f e c t r e l a t i o n s h i p e x i s t s b e t w e e n t h e v a r i a b l e s u n d e r e x a m i n a t i o n . B a s e d on p r e v i o u s s t u d i e s t h e r e l a t i o n s h i p s d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s a r e b i o l o g i c a l l y p l a u s i b l e b u t a l t e r n a t i v e e x p e r i m e n t a l d e s i g n s a r e r e q u i r e d t o s u b s t a n t i a t e and c l a r i f y t h e p o t e n t i a l r o l e o f h y d r o p h o b i c i t y and f l e x i b i l i t y i n m i n e r a l i z a t i o n . I n c o n c l u s i o n , t h e a s y m m e t r i c and 69 p e r i o d i c d i s t r i b u t i o n s o f a p a t i t e c r y s t a l s w i t h i n t h e gap and o v e r l a p z o n e s o f c o l l a g e n f i b r i l s were o b s e r v e d t o c o r r e s p o n d ' t o c o l l a g e n m o l e c u l a r o r i e n t a t i o n . T h i s m i n e r a l d i s t r i b u t i o n has a r e v e r s e c o r r e l a t i o n t o t h e p o s i t i o n o f h y d r o p h o b i c g r o u p s a s d e t e r m i n e d by c o m p u t e r m o d e l l i n g and may r e f l e c t i n t r i n s i c p r o p e r t i e s o f c o l l a g e n s t r u c t u r e t h r o u g h o u t t h e gap and o v e r l a p z o n e s . I n a d d i t i o n , i t was f o u n d t h a t p e r i o d i c d i f f e r e n c e s i n i n t r a f i b r i l l a r f l e x i b i l i t y d e t e r m i n e d by d e n s i t y o f p r o l i n e and h y d r o x y p r o l i n e , may e x p l a i n p r e f e r e n t i a l a c c o m m o d a t i o n o f a p a t i t e i n t o s p e c i f i c r e g i o n s . T h e r e f o r e , t o u n d e r s t a n d t h e r o l e o f c o l l a g e n d u r i n g m i n e r a l i z a t i o n , c o n s i d e r a t i o n s h o u l d be g i v e n t o t h e d i s c r e t e p r o p e r t i e s o f c o l l a g e n a s t h e y v a r y t h r o u g h o u t t h e D p e r i o d r a t h e r t h a n f o c u s s i n g on t h e p o t e n t i a l s p a c e w i t h i n t h e gap z o n e . F u r t h e r s t u d y o f t h e a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e l o c a l i z a t i o n o f a p a t i t e and p r o p e r t i e s o f c o l l a g e n f i b r i l s may e n h a n c e o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e m e c h a n i s m s o f b i o m i n e r a l i z a t i o n and t h e m e c h a n i c s o f m i n e r a l i z e d t i s s u e s . 70 REFERENCES A r s e n a u l t , A.L. 1 9 8 8 . C r y s t a l - c o l l a g e n r e l a t i o n s h i p s i n c a l c i f i e d t u r k e y l e g t e n d o n s v i s u a l i z e d by s e l e c t e d - a r e a d a r k f i e l d e l e c t r o n m i c r o s c o p y . C a l c i f . T i s s u e I n t . 4 3 : 2 0 2 - 2 1 2 . A r s e n a u l t , A.L. 1 9 8 9 . A c o m p a r a t i v e s t u d y by e l e c t o n m i c r o s c o p y o f a p a t i t e c r y s t a l s i n c o l l a g e n f i b r i l s o f c a l c i f i e d t u r k e y l e g t e n d o n s and r a t bone and d e n t i n . Bone and M i n e r a l , I n P r e s s . A r s e n a u l t , A.L. and M.D. G r y n p a s . 1 9 8 8 . C r y s t a l s i n c a l c i f i e d e p i p h y s e a l c a r t i l a g e and c o r t i c a l bone o f t h e r a t . C a l c i f . T i s s u e . I n t . 4 3 : 2 1 9 - 2 2 5 . A r s e n a u l t , A.L. and E.B. H u n z i k e r . 1 9 8 8 . E l e c t r o n m i c r o s c o p i c a n a l y s i s o f m i n e r a l d e p o s i t s i n t h e c a l c i f y i n g e p i p h y s e a l g r o w t h p l a t e . C a l c i f . T i s s u e I n t . 4 2 : 1 1 9 - 1 2 6 . A r s e n a u l t , A.L., F.P. O t t e n s m e y e r , and I . B . H e a t h . 1 9 8 8 . An e l e c t r o n m i c r o s c o p i c and s p e c t r o s c o p i c s t u d y o f m u r i n e e p i p h y s e a l c a r t i l a g e : a n a l y s i s o f f i n e s t r u c t u r e a n d m a t r i x v e s i c l e s p r e s e r v e d by s l a m f r e e z i n g and f r e e z e s u b s t i t u t i o n . J . U l t r a s t r u c . M o l . R e s . 9 8 : 3 2 - 4 7 . B a n e s , A . J . , M. Y a m a u c h i , and G.L. M e c h a n i c . 1 9 8 3 . N o n m i n e r a l i z e d and m i n e r a l i z e d c o m p a r t m e n t s o f b o n e : t h e r o l e o f p y r i d i n o l i n e i n n o n m i n e r a l i z e d c o l l a g e n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 1 1 3 : 9 7 5 - 9 8 1 . B a n s a l , M., C. R a m a k r i s h n a n , a nd G. N. R a m a c h a n d r a n . 1 9 7 5 . S t a b i l i z a t i o n o f t h e c o l l a g e n s t r u c t u r e by h y d r o x y p r o l i n e r e s i d u e s . P r o c . I n d i a n A c a d . S c i . A 8 2 : 1 5 2 - 1 6 4 . B e a r , R.S. 1 9 5 2 . The s t r u c t u r e o f c o l l a g e n f i b r i l s . Adv. P r o t e i n Chem. 7:69-160. B e r t h e t - C o l o m i n a s , C , A. M i l l e r , and S.W. W h i t e . 1 9 7 9 . S t r u c t u r a l s t u d y o f t h e c a l c i f y i n g c o l l a g e n i n t u r k e y l e g t e n d o n s . J . M o l . B i o l . 1 3 4 : 4 3 1 - 4 4 5 . B o e d t k e r , H., and P. D o t y . 1 9 5 6 . The n a t i v e and d e n a t u r e d s t a t e s o f s o l u b l e c o l l a g e n . J . Am. Chem. S o c . 7 8 : 4 2 6 7 - 4 2 8 0 . B o e d t k e r , H., M. F i n e r , and A. S i r p a . 1 9 8 5 . The s t r u c t u r e o f t h e c h i c k e n ct 2 c o l l a g e n g e n e . I n : The B i o l o g y , C h e m i s t r y and P a t h o l o g y o f C o l l a g e n . R. F l e i s c h m a j e r , F.R. O l s e n , and K. Kuhn, e d i t o r s . Ann. N.Y. A c a d . S c i . 4 6 0 : 8 5 - 1 1 6 . 71 B o n a r , L.C., A.H. R o u f o s s e , U.K. S a b i n e , and M.D. G l i m c h e r . 1 9 8 3 . X - r a y d i f f r a c t i o n s t u d i e s o f t h e c r y s t a l l i n i t y o f bone m i n e r a l i n n e w l y s y n t h e s i z e d and d e n s i t y f r a c t i o n a t e d b o n e . C a l c i f . T i s s u e I n t . 3 5 : 2 0 2 - 2 0 9 . B o n u c c i , E. 1 9 8 4 . The s t r u c t u r a l b a s i s o f c a l c i f i c a t i o n . I n : U l t r a s t r u c t u r e o f t h e C o n n e c t i v e T i s s u e M a t r i x . A. R u g g e r i and P.M. M o t t a , e d i t o r s . M a r t i n u s N i j h o f f P u b l i s h e r s , B o s t o n . pp. 1 6 5 - 1 9 1 . B o r n s t e i n , P. and W. T r a u b . 1 9 7 9 . The c h e m i s t r y and b i o l o g y o f c o l l a g e n . I n : The P r o t e i n s , t h i r d e d . , v o l . 4. H. N e u r a t h and R.L. H i l l , e d i t o r s . A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k . pp. 4 1 1 - 6 3 2 . B o s k e y , A.L., and S.C. M a r k s . 1 9 8 5 . M i n e r a l a n d m a t r i x a l t e r a t i o n s i n t h e b o n e s o f i n c i s o r s - a b s e n t ( i a / i a ) o s t e o p e t r o t i c r a t s . C a l c i f . T i s s u e I n t . 3 7 : 2 0 2 - 2 9 2 . B r a h m a c h a r i , S.K., and M.S. A n a n t h a n a r a y a n a n . 1 9 7 9 . g - T u r n s i n n a s c e n t p r o c o l l a g e n a r e s i t e s o f p o s t r a n s l a t i o n a l e n z y m a t i c h y d r o x y l a t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 6 : 5 1 1 9 - 5 1 2 3 . B u t l e r , W.T. and L.W. C u n n i g h a m . 1 9 6 6 . E v i d e n c e f o r t h e l i n k a g e o f a d i s a c c h a r i d e t o h y d r o x y l y s i n e i n t r o p o c o l l a g e n . J . B i o l . Chem. 2 4 1 : 3 8 8 2 - 3 8 8 8 . Chapman, J.A. and D.J.S. H u l m e s . 1 9 8 4 . E l e c t r o n m i c r o s c o p y o f t h e c o l l a g e n f i b r i l . I n : U l t r a s t r u c t u r e o f t h e C o n n e c t i v e T i s s u e M a t r i x . A. R u g g e r i and P.M. M o t t a , e d i t o r s . M a r t i n u s N i j h o f f P u b l i s h e r s , B o s t o n , pp. 1-33. C h o r p r a , R.K. and U.S. A n a n t h a n a r a y a n a n . 1 9 8 2 . C o n f o r m a t i o n a l i m p l i c a t i o n s o f e n z y m a t i c p r o l i n e h y d r o x y l a t i o n i n c o l l a g e n . P r o c . N a t l . A c a . S c i . U.S.A. 7 9 : 7 1 8 0 - 7 1 8 4 . Cowan, P.M., S. M c G a v i n , and A.C.T. N o r t h . 1 9 5 5 . The p o l y p e p t i d e c h a i n c o n f i g u r a t i o n o f c o l l a g e n . N a t u r e 1 76:1 062-1 064. De C r o m b r u g g h e , B., A. S c h m i d t , G. L i a u , C. S e t o y a m a , M. M u d r y j , Y. Yamada, and C. McKeon. 1 9 8 5 . S t r u c t u r a l and f u n c t i o n a l a n a l y s i s o f t h e g e n e s f o r «2(l) and a 1 ( i l l ) c o l l a g e n s . Ann. N.Y. A c a d . S c i . 4 6 0 : 1 5 4 - 1 6 2 . D o y l e , B.B., D.W.L. H u k i n s , D.J.S. H u l m e s , A. M i l l e r , C . J . R a t t e w , and J o h n W o o d h e a d - G a l l o w a y . 1 9 7 4 . O r i g i n s and i m p l i c a t i o n s o f t h e D s t a g g e r i n c o l l a g e n . - B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Comm. 6 0 : 8 5 8 - 8 6 4 . 72 E a n e s , E.D., D.R. L u n d y , and G.N. M a r t i n . 1 9 7 0 . X - r a y d i f f r a c t i o n s t u d y o f t h e m i n e r a l i z a t i o n o f t u r k e y l e g t e n d o n . C a l c i f . T i s s u e R e s . 6:239-248. E n g s t r o m , A. and R. Z e t t e r s t r o m . 1 9 5 1 . S t u d i e s on t h e u l t r a s t r u c t u r e o f b o n e . E x p . C e l l R e s . 2:268-. E n g s t r o m , A. 1 9 6 6 . A p a t i t e - c o l l a g e n o r g a n i z a t i o n i n c a l c i f i e d t e n d o n . E x p . C e l l R e s . 4 3 : 2 4 1 - 2 4 5 . E n g s t r o m , A. 1 9 7 2 . A s p e c t s o f t h e m o l e c u l a r s t r u c t u r e o f b o n e . I n : The B i o c h e m i s t r y and P h y s i o l o g y o f B o n e , v o l . 1. G.H. B o u r n e , e d i t o r . A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , pp. 2 3 7 - 2 5 7 . E y r e , D. 1 9 8 7 . C o l l a g e n c r o s s - l i n k i n g amino a c i d s . M e t h o d s i n E n z y m o l o g y 1 4 4 : 1 1 5 - 1 3 9 . E y r e , D.R., and M.J. G l i m c h e r . 1 9 7 2 . R e d u c i b l e c r o s s l i n k s i n h y d r o x y l y s i n e - d e f i c i e n t c o l l a g e n s o f a h e r i t a b l e d i s o r d e r o f c o n n e c t i v e t i s s u e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 6 9 : 2 5 9 4 - 2 5 9 8 . F l e i s c h m a j e r , R., B.R. O l s e n , R. T i m p l , J . S. P e r l i s h , and 0. L o v e l a c e . 1 9 8 3 . C o l l a g e n f i b r i l f o r m a t i o n d u r i n g e m b r y o g e n e s i s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 8 0 : 3 3 5 4 - 3 3 5 8 . F l e i s c h m a j e r , R., J . S . P e r l i s h , and R. T i m p l . 1 9 8 5 . C o l l a g e n f i b r i l l o g e n e s i s i n human s k i n . Ann. N.Y. A c a d . S c i . 4 6 0 : 2 4 6 - 2 5 7 . F r a s e r , R.D.B., T.P. M a c r a e , A. M i l l e r , and E. S u z u k i . 1 9 8 3 . M o l e c u l a r c o n f o r m a t i o n and p a c k i n g i n c o l l a g e n f i b r i l s . J . M o l e c . B i o l . 1 6 7 : 4 9 7 - 5 2 1 . F u j i i , K., and M.L. T a n z e r . 1 9 7 4 . A g e - r e l a t e d c h a n g e s i n t h e r e d u c i b l e c r o s s l i n k s o f human t e n d o n c o l l a g e n . FEBS L e t t . 4 3 : 3 0 0 - 3 0 2 . G i r a u d - G u i l l e , M.M. 1 9 8 8 . T w i s t e d p l y w o o d a r c h i t e c t u r e o f c o l l a g e n f i b r i l s i n human c o m p a c t bone o s t e o n s . C a l c i f . T i s s u e . I n t . 4 2 : 1 6 7 - 1 8 0 . G l i m c h e r , M.J. 1 9 5 9 . M o l e c u l a r b i o l o g y o f m i n e r a l i z e d t i s s u e s w i t h p a r t i c u l a r r e f e r e n c e t o b o n e . Rev. Mod. P h y s . 3 1 : 3 5 9 - 3 9 3 . G l i m c h e r , M.J., D. B r i c k l e y - P a r s o n , and D. K o s s i v a . 1 9 7 9 . P h o s p h o p r o t e i n s and y - g l u t a m i c a c i d - c o n t a i n i n g p e p t i d e s i n c a l c i f i e d t u r k e y t e n d o n : t h e i r a b s e n c e i n u n c a l c i f i e d t e n d o n . C a l c i f . T i s s u e I n t . 2 7 : 2 8 1 - 2 8 4 . 73 G l i m c h e r , M.J. 1 9 8 3 . The r o l e o f c o l l a g e n and p h o s p h o p r o t e i n s i n t h e c a l c i f i c a t i o n o f bone and o t h e r c o l l a g e n o u s t i s s u e s . P r o c . F e d n . Am. S o c s . E x p . B i o l . 6 0 7 - 6 1 6 . G r y n p a s , M.D., P. P a t t e r s o n - A l l e n , and D.J. Simmons. 1 9 8 6 . The c h a n g e s i n q u a l i t y o f m a n d i b u l a r bone i n o t h e r w i s e t o t a l l y i m m o b i l i z e d r h e s u s m o n keys. C a l c i f . T i s s u e I n t . 3 9 : 5 7 - 6 2 . G r o s s , J . and D. D i r k . 1 9 5 8 . H e a t p r e c i p i t a t i o n o f c o l l a g e n f r o m n e u t r a l s a l t s o l u t i o n s : some r a t e - r e g u l a t i n g f a c t o r s . J . B i o l . Chem. 2 3 3 : 3 5 5 - 3 6 0 . H a l l , C.E., M.A. J a k u s a nd J . 0. S c h m i t t . 1 9 4 2 . E l e c t r o n m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s o f c o l l a g e n . J . Am. Chem. S o c . 6 4 : 1 2 3 4 . Hagen, A.R. 1 9 7 3 . S t r u c t u r a l f e a t u r e s o f b i o l o g i c a l l y i n v o l v e d p h o s p h a t e s . A c t a . O d o n t . S c a n d . 3 1 : 1 4 9 - 1 7 3 . H a u s c h k a , P.M., J . B . L i a n , and P.M. G a l l o p . 1 9 7 5 . D i r e c t i d e n t i f i c a t i o n o f t h e c a l c i u m b i n d i n g amino a c i d > - - c a r b o x y g l u t a m a t e i n m i n e r a l i z e d t i s s u e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 2 : 3 9 2 5 - 3 9 2 9 . H i g h b e r g e r , J . H . , C. C o r b e t t , S.N. D i x i t , Y. W i n g , M.S. J e r o m e , A.H. K a n g , and J . G r o s s . 1 9 8 2 . Amino a c i d s e q u e n c e o f c h i c k s k i n c o l l a g e n a 1 ( 1 ) -CB8 and t h e c o m p l e t e p r i m a r y s t r u c t u r e o f t h e h e l i c a l p o r t i o n o f c h i c k s k i n c o l l a g e n a l ( l ) c h a i n . B i o c h e m . 2 1 : 2 0 4 8 - 2 0 5 4 . Hodge, A . J . , and J.A. P e t r u s k a . 1 9 6 3 . R e c e n t s t u d i e s w i t h t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e on o r d e r e d a g g r e g a t e s o f t h e t r o p o c o l l a g e n m a c r o m o l e c u l e . I n : A s p e c t s o f P r o t e i n S t r u c t u r e . G.N. R a m a c h a n d r a n , e d i t o r . A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k . pp. 2 8 9 - 3 0 0 . Hodge, A . J . and F.0. S c h m i d t t . 1 9 6 0 . The c h a r g e p r o f i l e o f t h e t r o p o c o l l a g e n m a c r o m o l e c u l e and t h e p a c k i n g a r r a n g e m e n t i n n a t i v e - t y p e c o l l a g e n f i b r i l s . P r o c . N a t n . A c a d . S c i . U.S.A. 4 6 : 1 8 6 - 1 9 7 . Hofmann, H., P.P. F i e t z e k , and K. K'uhn. 1 978. The r o l e o f p o l a r and h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s f o r t h e m o l e c u l a r p a c k i n g o f t y p e I c o l l a g e n : a t h r e e - d i m e n s i o n a l e v a l u a t i o n o f t h e amino a c i d s e q u e n c e . J . M o l . B i o l . 1 2 5 : 1 3 7 - 1 6 5 . 74 Hofmann, H., P.P. F i e t z e k , and K. K l j h n . 1 980. C o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f t h e s e q u e n c e s o f t h e t h r e e c o l l a g e n c h a i n s a l ( l ) > a2 and a1 ( H i ) : f u n c t i o n a l and g e n e t i c a s p e c t s . J . M o l . B i o l . 1 4 1 : 2 9 3 - 3 1 4 . H o h l i n g , H . J . , R.H. B a r c k h a u s , and E.R. K r e f t i n g . 1 9 8 0 . H a r d t i s s u e f o r m a t i o n i n c o l l a g e . n - r i c h s y s t e m s : c a l c i u m p h o s p h a t e n u c l e a t i o n and o r g a n i c m a t r i x . TIBS 8-11. H o l l i s t e r , D.W. 1 9 8 7 . M o l e c u l a r b a s i s o f o s t e o g e n e s i s i m p e r f e c t a . C u r r . P r o b . Derm. 1 7 : 7 6 - 9 4 . H u l m e s , D.J. S. 1 9 8 3 . M e c h a n i s m f o r t h e r e g u l a t i o n o f c o l l a g e n f i b r i l d i a m e t e r i n v i v o . C o l l a g e n R e l . R e s . 3 : 3 1 7 - 3 2 1 . H u l m e s , D.J.S., A. M i l l e r , D.A.D. P a r r y , K.A. P i e z , and J . W o o d h e a d - G a l l o w a y . 1 9 7 3 . A n a l y s i s o f t h e p r i m a r y s t r u c t u r e o f c o l l a g e n f o r t h e o r i g i n s o f m o l e c u l a r p a c k i n g . J . M o l . B i o l . 7 9 : 1 3 7 - 1 4 8 . H u l m e s , D.J. S., and A. M i l l e r . 1 9 7 9 . Q u a s i - h e x a g o n a l p a c k i n g i n c o l l a g e n f i b r i l s . N a t u r e 2 8 2 : 8 7 8 - 8 8 0 . H u l m e s , D.J.S., A. M i l l e r , S.W. W h i t e , P.A. T i m m i n s , and C. B e r t h e t - C o l o m i n a s . 1 9 8 0 . I n t e r p r e t a t i o n o f t h e l o w - a n g l e m e r i d i o n a l n e u t r o n d i f f r a c t i o n p a t t e r n s f r o m c o l l a g e n f i b r e s i n t e r m s o f t h e amino a c i d s e q u e n c e . I n t . J . B i o l . M a c r o m o l . 2 : 3 3 8 - 3 4 6 . H u l m e s , D.J.S., D.F. H o l m e s , and C. Cummings. 1 9 8 5 . C r y s t a l l i n e r e g i o n s i n c o l l a g e n f i b r i l s . J . M o l . B i o l . 1 8 4 : 4 7 3 - 4 7 7 . H u n z i k e r , E.B., W. H e r r m a n n , L.M. C r u z - O r i v e , and A.L. A r s e n a u l t . 1 9 8 9 . Image a n a l y s i s o f e l e c t r o n m i c r o g r a p h s r e l a t i n g t o m i n e r a l i z a t i o n i n c a l c i f y i n g c a r t i l a g e : t h e o r e t i c a l c o n s i d e r a t i o n s . J . E l e c t r o n M i c r o s c o p y T e c h . 1 1:9-15. J a c k s o n , S.A., A.G. C a r t w r i g h t , and D. L e w i s . 1 9 7 8 . The m o r p h o l o g y o f bone m i n e r a l c r y s t a l s . C a l c i f . T i s s u e R e s . 2 5 : 2 1 7 - 2 2 2 . J o n e s , E.Y., A. M i l l e r , R.D.B. F r a s e r , T.P. M a c r a e , and E. S u z u k i . 1 9 8 5 . S t r u c t u r a l s t u d i e s on t y p e I c o l l a g e n . I n : E x t r a c e l l u l a r M a t r i x : S t r u c t u r e and F u n c t i o n . A.H. R e d d i , e d i t o r . A l a n R. L i s s , I n c . , New Y o r k . pp. 3 5 9 - 3 6 5 . 75 J o n e s , E.Y. and A. M i l l e r . 1 9 8 7 . S t r u c t u r a l m o d e l s f o r t h e and C- t e r m i n a l t e l o p e t i d e r e g i o n s o f i n t e r s t i t i a l c o l l a g e n s . B i o p o l y m e r s 2 6 : 4 6 3 - 4 8 0 . K a t z , E.P. and S. L i . 1 9 7 2 . The m o l e c u l a r p a c k i n g o f c o l l a g e n i n m i n e r a l i z e d and n o n - m i n e r a l i z e d t i s s u e s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 4 6 : 1 3 6 8 - 1 3 7 3 . K i v i r i k k o , K . I . 1 9 8 0 . P o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s o f c o l l a g e n . I n : Gene F a m i l i e s o f C o l l a g e n and O t h e r P r o t e i n s . D . J . P r o c k o p and P.C. Champe, e d i t o r s . E l s e v i e r / N o r t h H o l l a n d , New.York. pp. 1 0 7 - 1 1 9 . K i v i r i k k o , K . I . , L. R y h a n e n , H. A n t t i n e n , P. B o r n s t e i n , and D.J. P r o c k o p . 1 9 7 3 . F u r t h e r h y d r o x y l a t i o n o f l y s y l r e s i d u e s i n c o l l a g e n by p r o t o c o l l a g e n l y s y l h y d r o x y l a s e i n v i t r o . B i o c h e m . 1 2 : 4 9 6 6 - 4 9 7 1 . K r i e l , G. 1 9 8 1 . T r a n s f e r o f p r o t e i n s a c r o s s membranes. Ann. Rev. B i o c h e m . 5 0 : 3 1 7 - 3 4 8 . Kuhn, K. 1 9 8 2 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n amino a c i d s e q u e n c e and h i g h e r s t r u c t u r e s o f c o l l a g e n . Conn. T i s s u e R e s . 1 0 : 5 - 1 0 . KUhn, K. 1 9 8 4 . S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l d o m a i n s o f c o l l a g e n : a c o m p a r i s o n o f t h e p r o t e i n w i t h - i t s g e n e . C o l l a g e n R e l . R e s . 4 : 3 0 9 - 3 2 2 . K u h n , K. 1 9 8 7 . The c l a s s i c a l c o l l a g e n s : t y p e s I , I I , a nd I I I . I n : S t r u c t u r e and F u n c t i o n o f C o l l a g e n T y p e s . R. Mayne and R.E. B u r g e s o n , e d i t o r s . A c a d e m i c P r e s s , T o r o n t o , pp. 1-42. L a n d i s , W.J., M.C. P a i n e , and M.J. G l i m c h e r . 1 9 7 7 . E l e c t r o n m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s o f bone t i s s u e p r e p a r e d a n h y d r o u s l y i n o r g a n i c s o l v e n t s . J . U l t r a s t r u c t . R e s . 5 9 : 1 - 5 0 . L a n d i s , W.J., and M.J. G l i m c h e r . 1 9 7 8 . E l e c t r o n d i f f r a c t i o n a n d e l e c t r o n p r o b e m i c r o a n a l y s i s o f t h e m i n e r a l p h a s e o f bone t i s s u e p r e p a r e d by a n h y d r o u s t e c h n i q u e s . J . U l t r a s t r u c t . R e s . 6 3 : 1 8 8 - 2 2 3 . L a n d i s , W.J., M.C. P a i n e , and M.J. G l i m c h e r . 1 9 8 0 . Use o f a c r o l e i n v a p o r s f o r a n h y d r o u s p r e p a r a t i o n o f bone t i s s u e f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y . J . U l t r a s t r u c t . R e s . 7 0 : 1 7 1 - 1 8 0 . M e c h a n i c , G.L. 1 9 7 4 . C o l l a g e n c r o s s l i n k s : d i r e c t e v i d e n c e o f a r e d u c i b l e s t a b l e f o r m o f t h e S c h i f f b a s e A d e h y d r o -5 , 5 ' d i h y d r o x y l y s i n o n o r l e u c i n e a s 5 - k e t o - 5 ' -h y d r o x y l y s i n o n o r l e u c i n e i n bone c o l l a g e n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 5 6 : 4 5 5 - 9 2 7 . 76 M e c h a n i c , G., P.M. G a l l o p , and M.L. T a n z e r . 1 9 7 1 . The n a t u r e o f c r o s s l i n k i n g i n c o l l a g e n s f r o m m i n e r a l i z e d t i s s u e s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 4 5 : 6 4 4 - 6 5 3 . M e c h a n i c , G.L., E.P. K a t z , M. Henmi, C. N o y e s , and M. Y a m a u c h i . 1 9 8 7 . L o c u s o f a h i s t i d i n e - b a s e d , s t a b l e t r i f u n c t i o n a l , h e l i x t o h e l i x c o l l a g e n c r o s s - l i n k : s t e r e o s p e c i f i c c o l l a g e n s t r u c t u r e o f t y p e I s k i n f i b r i l s . B i o c h e m . 2 6 : 3 5 0 0 - 3 5 0 9 . Meek, K.M., J.A. Chapman, and R.A. H a r d c a s t l e . 1 9 7 9 . The s t a i n i n g p a t t e r n o f c o l l a g e n f i b r i l s : i m p r o v e d c o r r e l a t i o n w i t h s e q u e n c e d a t a . J . B i o l . Chem. 2 5 4 : 1 0 7 1 0 - 1 0 7 1 4 . Meek, K.M., and J.A. Chapman. 1 9 8 5 . G l u t a r a l d e h y d e - i n d u c e d c h a n g e s i n t h e a x i a l l y p r o j e c t e d f i n e s t r u c t u r e o f c o l l a g e n f i b r i l s . J . M o l . B i o l . 1 8 5 : 3 5 9 - 3 7 0 . M i l l e r , A. 1 9 8 4 . C o l l a g e n : t h e o r g a n i c m a t r i x o f b o n e . P h i l . T r a n s . R. S o c . L o n d . B 3 0 4 : 4 5 5 - 4 7 7 . M i l l e r , E . J . 1 9 7 6 . B i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d b i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e o f t h e g e n e t i c a l l y - d i s t i c t c o l l a g e n s . M o l . C e l l . B i o c h e m . 1 3 : 1 6 5 - 1 9 2 . M y e r s , H.M. and A. E n g s t r o m . 1 9 6 5 . A n o t e on t h e o r g a n i z a t i o n o f h y d r o x y a p a t i t e i n c a l c i f i e d t e n d o n s . E x p . C e l l R e s . 4 0 : 1 8 2 - 1 8 5 . Nemethy, G., and H.A. S c h e r a g a . 1 9 8 6 . S t a b i l i z a t i o n o f c o l l a g e n f i b r i l s by h y d r o x y p r o l i n e . B i o c h e m . 2 5 : 3 1 8 4 - 3 1 8 8 . N o r d w i g , A. and U. Hayduk. 1 9 6 9 . I n v e r t e b r a t e c o l l a g e n s : i s o l a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o n and p h y l o g e n e t i c a s p e c t s . J . M o l . B i o l . 4 4 : 1 6 1 - 1 7 2 . Nowack, H., S. Gay, G. W i c k , U. B e c k e r , and R. T i m p l . 1 9 7 6 . P r e p a r a t i o n and u s e i n i m m u n o h i s t o l o g y o f a n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r t y p e I and t y p e I I I c o l l a g e n and p r o c o l l a g e n . J . I mmunol. M e t h o d s 1 2 : 1 1 7 - 1 2 4 . N y l e n , M.U., D.B. S c o t t , and V.M. M o s l e y . 1 9 6 0 . M i n e r a l i z a t i o n o f t u r k e y l e g t e n d o n . I I . C o l l a g e n - m i n e r a l r e l a t i o n s r e v e a l e d by e l e c t r o n and x - r a y m i c r o s c o p y . I n : C a l c i f i c a t i o n i n b i o l o g i c a l s y s t e m s . R.F. S o g n n a e s , e d i t o r . A m e r i c a n A s s o c i a t i o n f o r t h e A d v a n c e m e n t o f S c i e n c e , W a s h i n g t o n D.C. pp. 1 2 9 - 1 4 2 . 77 Qkuyama, K., K. Okuyama, S. A r n o t t , 1*1. T a k a y a n a g i , and 1*1. K a k u d o . 1 9 8 1 . C r y s t a l and m o l e c u l a r s t r u c t u r e o f a c o l l a g e n - l i k e p o l y p e p t i d e ( P r o - P r o - G l y ) i n . J . l * l o l . B i o l . 1 5 2 : 4 2 7 - 4 4 3 . P a r r y , D.A.D., A.S. C r a i g , and G.R.C. B a r n e s . 1 9 7 8 . A c o m p a r i s o n o f t h e s i z e d i s t r i b u t i o n o f c o l l a g e n f i b r i l s i n c o n n e c t i v e t i s s u e s as a f u n c t i o n o f age and a p o s s i b l e r e l a t i o n b e t e e n f i b r i l s i z e d i s t r i b u t i o n and m e c h a n i c a l p r o p e r t i e s . P r o c . Roy. S o c . L o n d . B 2 0 3 : 3 0 5 - 3 2 1 . P a r r y , D.A.D., l * l . H. F l i n t , G.C. G i l l a r d , and A.S. C r a i g . 1 9 8 2 . A r o l e f o r g l y c o s a m i n o g l y c a n s i n t h e d e v e l o p m e n t o f c o l l a g e n f i b r i l s . FEBS L e t t . 1 4 9 : 1 - 7 . P i e z , K.A., E.A. E i g n e r , and M.S. L e w i s . 1 9 6 3 . The c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n and amino a c i d c o m p o s i t i o n o f t h e s u b u n i t s o f s e v e r a l c o l l a g e n s . B i o c h e m . 2 : 5 8 - 6 5 . P i e z , K.A. and D.A. T o r c h i a . 1 9 7 5 . P o s s i b l e c o n t r i b u t i o n o f i o n i c c l u s t e r i n g t o m o l e c u l a r p a c k i n g o f c o l l a g e n . N a t u r e 2 5 8 : 8 7 . P i e z , -K.A. and B.L. T r u s . 1 978. S e q u e n c e r e g u l a r i t i e s and p a c k i n g o f c o l l a g e n m o l e c u l e s . J . M o l . B i o l . 1 2 2 : 4 1 9 - 4 3 2 . P r o c k o p , D . J . , R.A. B e r g , K . I . K i v i r i k k o , and J . U i t t o . I n t r a c e l l u l a r s t e p s i n t h e b i o s y t h e s i s o f c o l l a g e n . I n : B i o c h e m i s t r y o f C o l l a g e n . G.N. R a m a c h a n d r a n and A.H. R e d d i , e d i t o r s . P l e n u m P r e s s , New Y o r k . pp. 1 6 3 - 2 7 3 . R a m a c h a n d r a n , G.N., and G. K a r t h a . 1 9 5 5 . S t r u c t u r e o f c o l l a g e n . N a t u r e 1 7 4 : 2 6 9 - 2 7 0 . R a m a c h a n d r a n , G.N., M. B a n s a l , and R.S. B h a t n a g a r . 1 9 7 3 . A h y p o t h e s i s on t h e r o l e o f h y d r o x y p r o l i n e i n s t a b i l i z i n g c o l l a g e n s t r u c t u r e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 3 2 2 : 1 6 6 - 1 7 1 . R e y n o l d s , E.S. 1 9 6 3 . The u s e o f l e a d c i t r a t e a t h i g h pH a s an e l e c t r o n opaque s t a i n i n e l e c t r o n m i c r o s c o p y . J . C e l l B i o l . 1 7 : 2 0 8 - 1 2 . R i c h , A. and F.H.C. C r i c k . The s t r u c t u r e o f c o l l a g e n . N a t u r e 1 7 6 : 9 1 5 - 9 1 6 . R o b i n s o n , R.A. 1 9 5 2 . An e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d y o f t h e c r y s t a l l i n e i n o r g a n i c c o m p o nent o f bone and i t s r e l a t i o n s h i p t o t h e o r g a n i c m a t r i x . J . Bone J o i n t S u r g . 3 4 A : 3 8 9 - 4 3 4 . 78 R o b i n s o n , R.A. and M.L. W a t s o n . 1 9 5 2 . C o l l a g e n - c r y s t a l r e l a t i o n s h i p s i n bone as s e e n i n t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e . A n a t . R e c . 1 1 4 : 3 8 3 - 4 1 0 . R u g g e r i , A., F. B e n a z z o , and E. R e a l e . 1 9 7 9 . C o l l a g e n f i b r i l s w i t h s t r a i g h t and h e l i c o i d a l m i c r o f i b r i l s : a f r e e z e - f r a c t u r e and t h i n s e c t i o n s t u d y . J . U l t r a s t r u c . R e s . 6 8 : 1 0 1 - 1 0 8 . S a r k a r ^ ^ 5 . K . , C.E. S u l l i v a n , and D.A. T o r c h i a . 1 9 8 3 . S o l i d s t a t e C NMR s t u d y o f c o l l a g e n m o l e c u l a r d y n a m i c s i n h a r d and s o f t t i s s u e s . J . B i o l . Chem. 2 5 8 : 9 7 5 2 - 9 7 6 7 . S a r k a r , S.K., Y. H i y a m a , C.H. N i u , P.E. Yo u n g , J . T . G e r i g and D.A. T o r c h i a . 1 9 8 7 . M o l e c u l a r d y n a m i c s o f c o l l a g e n s i d e c h a i n s i n h a r d and s o f t t i s s u e s . A m u l t i n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e s t u d y . B i o c h e m . 2 6 : 6 7 9 3 - 6 8 0 0 . S c o t t , J . E . and M. H a i g h . 1 9 8 5 . P r o t e o g l y c a n - t y p e I c o l l a g e n f i b r i l i n t e r a c t i o n s i n bone and n o n - c a l c i f y i n g c o n n e c t i v e t i s s u e s . B i o s c i e n c e R e p o r t s 5 : 7 1 - 8 1 . S e y e r , J.M. and A.H. K a n g . 1 9 8 5 . C o v a l e n t s t r u c t u r e o f c o l l a g e n : s a l i e n t d i f f e r e n c e s i n t h e a 2 ( l ) c h a i n . Ann. N.Y. A c a d . S c i . 4 6 0 : 5 0 3 - 5 0 5 . S c h m i t t , F.O., J . G r o s s , a n d J.H. H i g h b e r g e r . 1 9 5 3 . A new p a r t i c l e t y p e i n c e r t a i n c o n n e c t i v e t i s s u e e x t r a c t s . B i o c h e m . 3 9 : 4 5 9 - 4 7 0 . S i l v e r , F.H. 1 9 8 7 . B i o l o g i c a l M a t e r i a l s : S t r u c t u r e , M e c h a n i c a l P r o p e r t i e s and M o d e l l i n g o f S o f t T i s s u e . U n i v e r s i t y P r e s s , New Y o r k . pp. 1 6 4 - 1 7 4 . S t e v e - B o c c i a r e l l i , D. 1 9 7 0 . M o r p h o l o g y o f c r y s t a l l i t e s i n b o n e . C a l c i f . T i s s u e R e s . 5 : 2 6 1 - 2 6 9 . T a n f o r d , C. -1 9 8 0 . The H y d r o p h o b i c E f f e e t : F o r m a t i o n o f M i c e l l e s and B i o l o g i c a l Membranes, s e c o n d e d i t i o n . J o h n W i l e y a n d S o n s , New Y o r k . pp. 1 3 9 - 1 4 5 . T a n z e r , M.L., T. H o u s l e y , L. B e r u b e , R. F a i r w e a t h e r , C. F r a n z b l a u , and P.M. G a l l o p . 1 9 7 3 . S t r u c t u r e o f two h i s t i d i n e - c o n t a i n i n g c r o s s - l i n k s f r o m c o l l a g e n . J . B i o l . Chem. 2 4 8 : 3 9 3 - 4 0 2 . T r u s and P i e z . 1 9 7 6 . M o l e c u l a r p a c k i n g o f c o l l a g e n : t h r e e - d i m e n s i o n a l a n a l y s i s o f e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s . J . M o l . B i o l . 1 0 8 : 7 0 5 - 7 3 2 . 79 T z a p h i l i d o u , M. , J . A. Chapman, and K.M. Meek. 1 9 8 2 a . A s t u d y o f p o s i t i v e s t a i n i n g f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y u s i n g c o l l a g e n a s a m o d e l s y s t e m - I . S t a i n i n g by p h o s p h o t u n g s t a t e and t u n g s t a t e i o n s . M i c r o n 1 3 : 1 1 9 - 1 3 1 . T z a p h l i d o u , M., J.A. Chapman, and M.H. Al-Samrnan. 1 982b. A s t u d y o f p o s i t i v e s t a i n i n g f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y u s i n g c o l l a g e n a s a m o d e l s y s t e m - I I . S t a i n i n g by u r a n y l i o n s . M i c r o n . 1 3 : 1 3 3 - 1 4 5 . V e i s , A. 1 9 8 5 a . M o l e c u l a r s t r u c t u r e and m o d e l s o f c o l l a g e n f i b r i l a s s e m b l y . I n : E x t r a c e l l u l a r M a t r i x : S t r u c t u r e and F u n c t i o n . A.H. R e d d i , e d i t o r . A l a n R. L i s s , I n c . , New Y o r k , pp. 3 5 1 - 3 5 8 . U e i s , A. 1 9 8 5 b . P h o s p h o p r o t e i n s o f d e n t i n and b o n e : do t h e y h a v e a r o l e i n m a t r i x m i n e r a l i z a t i o n ? I n : The C h e m i s t r y and B i o l o g y o f M i n e r a l i z e d T i s s u e s . W.T. B u t l e r , e d i t o r . E b s c o M e d i a , B i r m i n g h a m , A l a b a m a , pp. 9 8 - 1 0 2 . W i i d i k , A. 1 9 8 0 . I n t e r d e p e n d e n c e b e t w e e n s t r u c t u r e and f u n c t i o n i n c o l l a g e n o u s t i s s u e s . I n : B i o l o g y o f C o l l a g e n . A. V i i d i k and J . V u u s t , e d i t o r s . A c a d e m i c P r e s s , T o r o n t o , pp. 2 5 7 - 2 8 0 . W e i n e r , S., and P.A. P r i c e . 1 9 8 6 . D i s a g g r e g a t i o n o f bone i n t o c r y s t a l s . C a l c i f . T i s s u e I n t . 3 9 : 3 6 5 - 3 7 5 . W e i n e r , S., and W. T r a u b . 1 9 8 6 . O r g a n i z a t i o n o f h y d r o x y a p a t i t e c r y s t a l s w i t h i n c o l l a g e n f i b r i l s . FEBS L e t t . 2 0 6 : 2 6 2 - 2 6 6 . W h i t e , S.W., D.J.S H u l m e s , A. M i l l e r , and P.A. T i m m i n s . 1 9 7 7 . C o l l a g e n - m i n e r a l a x i a l r e l a t i o n s h i p i n c a l c i f i e d t u r k e y l e g t e n d o n by x - r a y a nd n e u t r o n d i f f r a c t i o n . N a t u r e 2 6 6 : 4 2 1 - 4 2 5 . Wood, G.C. 1 9 6 0 . The f o r m a t i o n o f f i b r i l s f r o m c o l l a g e n s o l u t i o n s . B i o c h e m . J . 7 5 : 6 0 5 - 6 1 2 . Wu, J . , and D.R. E y r e . 1 9 8 8 . F i n e p o w d e r i n g e x p o s e s t h e m i n e r a l - p r o t e c t e d c o l l a g e n o f bone t o p r o t e a s e d i g e s t i o n . C a l c i f . T i s s u e . I n t . 4 2 : 2 4 3 - 2 4 7 . Y a m a u c h i , M., E . P . K a t z , and G.L. M e c h a n i c . 1 9 8 6 . I n t e r m o l e c u l a r c r o s s - l i n k i n g a n d s t e r e o s p e c i f i c m o l e c u l a r p a c k i n g i n t y p e I c o l l a g e n f i b r i l s o f t h e p e r i o d o n t a l l i g a m e n t . B i o c h e m . 2 5 : 4 9 0 7 - 4 9 1 3 . 

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