Open Collections

UBC Theses and Dissertations

UBC Theses Logo

UBC Theses and Dissertations

Neurochemical studies of the pathogenesis of four central nervous system disorders : Parkinson's disease,… Yong, Voon Wee 1986

Your browser doesn't seem to have a PDF viewer, please download the PDF to view this item.

Item Metadata

Download

Media
831-UBC_1986_A1 Y66.pdf [ 9.25MB ]
Metadata
JSON: 831-1.0097345.json
JSON-LD: 831-1.0097345-ld.json
RDF/XML (Pretty): 831-1.0097345-rdf.xml
RDF/JSON: 831-1.0097345-rdf.json
Turtle: 831-1.0097345-turtle.txt
N-Triples: 831-1.0097345-rdf-ntriples.txt
Original Record: 831-1.0097345-source.json
Full Text
831-1.0097345-fulltext.txt
Citation
831-1.0097345.ris

Full Text

NEUROCHEMICAL STUDIES OF THE PATHOGENESIS OF FOUR CENTRAL NERVOUS SYSTEM DISORDERS: PARKINSON'S D I S E A S E , HUNTINGTON'S CHOREA, D I A L Y S I S ENCEPHALOPATHY, AND HALLERVORDEN-SPATZ SYNDROME By VOON WEE YONG B . S c . ( H o n s ) , The U n i v e r s i t y o f M a n c h e s t e r , 1 9 8 1 A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY i n THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES D e p a r t m e n t o f P h a r m a c o l o g y and T h e r a p e u t i c s F a c u l t y o f M e d i c i n e We a c c e p t t h i s t h e s i s as c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d TttE UNIVERSITY OF B R I T I S H COLUMBIA May 1986 © Voon Wee Y o n g , 1986 In p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t of the requirements f o r an advanced degree at the U n i v e r s i t y of B r i t i s h Columbia, I agree t h a t the L i b r a r y s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e and study. I f u r t h e r agree t h a t p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e copying of t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y purposes may be granted by the head o f my department or by h i s or her r e p r e s e n t a t i v e s . i t i s understood t h a t copying or p u b l i c a t i o n of t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l not be allowed without my w r i t t e n p e r m i s s i o n . Department of The U n i v e r s i t y of B r i t i s h Columbia 1956 Main Mall Vancouver, Canada V6T 1Y3 - i i -ABSTRACT My t h e s i s i s d i v i d e d i n t o . 4 c h a p t e r s , e a c h d e a l i n g w i t h a p a r t i c u l a r c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m d i s o r d e r . The f i r s t c h a p t e r i s d e v o t e d t o t h e u n d e r -s t a n d i n g o f t h e p a t h o g e n e s i s o f P a r k i n s o n ' s d i s e a s e ( P D ) . S e v e r a l s t u d i e s w i t h l i v i n g o r d e a d p a t i e n t s w i t h PD w e r e p e r f o r m e d . A n i m a l e x p e r i m e n t s r e l i e d h e a v i l y on t h e u s e of N - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e (MPTP) t o c r e a t e an a n i m a l model o f PD. Two m a j o r c o n c l u s i o n s o f t h i s c h a p -t e r a r e f i r s t l y , t h a t p a t i e n t s w i t h PD may be e x p o s e d up t o t h e t i m e o f d e a t h t o . .one o r more n e u r o t o x i n s t h a t may a c t v i a r e a c t i v e f r e e r a d i c a l s , , and s e c o n d l y , t h a t a n t i o x i d a n t compounds s u c h a s a - t o c o p h e r o l may be u s e f u l i n s l o w i n g t h e p r o g r e s s i o n o f n e u r o n a l l o s s i n P D . The s e c o n d c h a p t e r i n t h i s t h e s i s t e s t e d t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e p r e m a -t u r e n e u r o n a l d e a t h t h a t o c c u r s i n H u n t i n g t o n ' s c h o r e a (HC) may be t h e r e s u l t of a g e n e t i c a l l y - d e t e r m i n e d e n z y m a t i c f a i l u r e i n t h e d e g r a d a t i o n of a c i r c u l a t i n g n e u r o t o x i n of e i t h e r e n d o g e n o u s o r e x o g e n o u s o r i g i n . Two m a i n t y p e s of s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d : an i n v i v o e x p e r i m e n t i n w h i c h r a t s w e r e i n j e c t e d r e p e a t e d l y w i t h s e r u m o r s e r u m u l t r a f i U r a t e f r o m HC p a t i e n t s o r c o n t r o l s u b j e c t s , a n d , an i n v i t r o s t u d y i n w h i c h r a t s t r i a t a l e x p l a n t s w e r e e x p o s e d i n t i s s u e c u l t u r e t o s e r u m o r CSF f r o m p a t i e n t s o r c o n t r o l s . The r e s u l t s f r o m b o t h t y p e s of e x p e r i m e n t s a r e s u g g e s t i v e f o r t h e p r e s e n c e of a n e u r o t o x i n i n t h e s e r u m of p a t i e n t s w i t h H C . T h i s p u t a t i v e n e u r o t o x i n may e i t h e r be a s m a l l m o l e c u l e i r r e v e r s i b l y b o u n d t o s e r u m p r o t e i n s , o r , a m o l e -c u l e l a r g e r t h a n 1 0 0 0 0 d a l t o n s . The i d e n t i t y of t h e p u t a t i v e n e u r o t o x i n i s p r e s e n t l y u n c l e a r . I n t h e t h i r d c h a p t e r o f t h i s t h e s i s , we e x a m i n e d f o r n e u r o c h e m i c a l a b -n o r m a l i t i e s t h a t m i g h t be p r e s e n t i n t h e a u t o p s i e d b r a i n s o f p a t i e n t s who d i e d w i t h d i a l y s i s e n c e p h a l o p a t h y ( D E ) . A m a j o r f i n d i n g was a d e f i c i e n c y o f GABA c o n t e n t s i n s e v e r a l r e g i o n s o f a u t o p s i e d b r a i n s of DE p a t i e n t s . A l u m -inum l e v e l s w e r e a b n o r m a l l y h i g h i n t h e f r o n t a l c o r t i c a l g r a y m a t t e r o f DE p a t i e n t s . A n i m a l e x p e r i m e n t s w e r e u n s u c c e s s f u l i n c l a r i f y i n g w h e t h e r o r n o t a l u m i n u m i s t h e c a u s a t i v e f a c t o r i n D E , p r i n c i p a l l y b e c a u s e we f a i l e d t o p r o d u c e e l e v a t i o n o f a l u m i n u m c o n t e n t i n t h e b r a i n s o f r a t s i n j e c t e d w i t h a l u m i n u m h y d r o x i d e . T h e l a t t e r was t h e c a s e e v e n t h o u g h we e m p l o y e d h e m i -n e p h r e c t o m y , 5/6 n e p h r e c t o m y , a n d / o r c h r o n i c l i t h i u m a d m i n i s t r a t i o n i n a t t e m p t s t o d e c r e a s e t h e r e n a l e x c r e t i o n o f a l u m i n u m . F i n a l l y , i n t h e f o u r t h c h a p t e r , we s e a r c h e d f o r n e u r o c h e m i c a l a b n o r m a l i -t i e s i n t h e a u t o p s i e d b r a i n o f 2 p a t i e n t s who d i e d w i t h a r a r e d i s e a s e , H a l l e r v o r d e n - S p a t z s y n d r o m e ( H S S ) . I n one p a t i e n t , c o n t e n t s o f c y s t i n e a n d of g l u t a t h i o n e - c y s t e i n e m i x e d d i s u l f i d e i n t h e g l o b u s p a l l i d u s w e r e e l e v a t e d 2 SD a b o v e t h o s e of c o n t r o l s . On t h e o t h e r h a n d , a c t i v i t y of c y s t e i n e d i o x y g e n a s e , t h e enzyme t h a t c o n v e r t s c y s t e i n e t o c y s t e i n e s u l f i n a t e , was r e d u c e d i n t h e g l o b u s p a l l i d u s of b o t h p a t i e n t s . We p r o p o s e t h e h y p o t h e s i s t h a t c y s t e i n e a c c u m u l a t e s l o c a l l y i n t h e g l o b u s p a l l i d u s i n HSS as a r e s u l t of d e c r e a s e d a c t i v i t y of c y s t e i n e d i o x y g e n a s e . A c c u m u l a t e d c y s t e i n e may s e r v e t o c h e l a t e i r o n , a c c o u n t i n g f o r t h e l o c a l i n c r e a s e i n i r o n c o n t e n t i n t h e 1 g l o b u s p a l l i d u s of H S S . The c o m b i n a t i o n of i r o n and c y s t e i n e may g e n e r -a t e f r e e r a d i c a l s t h a t damage n e u r o n a l membranes t o c a u s e t h e t y p i c a l m o r p h o l o g i c a l c h a n g e s o b s e r v e d i n H S S . - i v -TABLE OF CONTENTS P a g e A b s t r a c t . . . i i T a b l e o f c o n t e n t s i v L i s t o f T a b l e s v i L i s t o f F i g u r e s x L i s t o f A p p e n d i c e s x i A c k n o w l e d g e m e n t s x i i D e d i c a t i o n x i i i CHAPTER 1 : P A R K I N S O N ' S DISEASE . A b s t r a c t i I . I n t r o d u c t i o n . . . . . . . 4 I I . O u t l i n e o f e x p e r i m e n t s and m e t h o d s . 14 I I I . R e s u l t s and D i s c u s s i o n i . S e a r c h f o r an a n i m a l model o f P a r k i n s o n ' s d i s e a s e 17 i i . S t u d i e s o f t h e n e u r o t o x i c e f f e c t s o f MPTP i n C57 b l a c k m i c e . . . 25 i i i . P o s s i b l e m e c h a n i s m o f MPTP t o x i c i t y 32 i v . E x p e r i m e n t s u s i n g b u t y l a t e d h y d r o x y a n i s o l e , g l u t a t h i o n e m o n o e t h y l e s t e r , b u t h i o n i n e s u l f o x i m i n e , a n d d i e t h y l m a l e a t e . . 41 v . E x p e r i m e n t s t h a t s e e k t o i d e n t i f y t h e n a t u r a l n e u r o t o x i n ( s ) • r e s p o n s i b l e f o r m o s t c a s e s o f i d i o p a t h i c P a r k i n s o n ' s d i s e a s e . . 5 0 v i . S m o k i n g and P a r k i n s o n ' s d i s e a s e 59 v i i . S t a t u s o f MAO-B i n r e l a t i o n t o P a r k i n s o n ' s d i s e a s e 6 4 v i i i . G l u t a t h i o n e c o n t e n t and g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e a c t i v i t y i n t h e a u t o p s i e d b r a i n s o f P a r k i n s o n ' s d i s e a s e p a t i e n t s 67 I V . C o n c l u s i o n s 75 V . R e f e r e n c e s 76 CHAPTER 2 : HUNTINGTON'S CHOREA A b s t r a c t 8 5 I . I n t r o d u c t i o n i . P e r s p e c t i v e s 8 7 i i . P a t h o g e n e s i s o f n e u r o n a l d e a t h i n H u n t i n g t o n ' s c h o r e a 92 I I . O u t l i n e o f e x p e r i m e n t s 101 I I I . I n v i v o s t u d i e s 103 I V . T i s s u e c u l t u r e s t u d i e s . . . 107 i . M e t h o d s 108 i i . R e s u l t s and D i s c u s s i o n 112 V . C o n c l u s i o n s 125 V I . R e f e r e n c e s 126 - V -CHAPTER 3 : D I A L Y S I S ENCEPHALOPATHY P a g e A b s t r a c t • 133 I . I n t r o d u c t i o n i . P e r s p e c t i v e s 134 i i . E t i o l o g y o f d i a l y s i s e n c e p h a l o p a t h y : The p o s s i b l e r o l e o f a l u m i n u m 137 I I . O u t l i n e o f e x p e r i m e n t s -142 I I I . Human s t u d i e s i . M e t h o d 143 i i . R e s u l t s and D i s c u s s i o n 143 I V . A n i m a l e x p e r i m e n t s i . M e t h o d 149 i i . R e s u l t s and D i s c u s s i o n 151 V . C o n c l u s i o n s . . . . . . • 158 V I . R e f e r e n c e s 160 CHAPTER 4 : HALLERVQRDEN-SPATZ SYNDROME A b s t r a c t . . 165 I . I n t r o d u c t i o n 166 I I . O u t l i n e o f e x p e r i m e n t s 169 I I I . R e s u l t s 171 I V . D i s c u s s i o n 177 V . C o n c l u s i o n s 182 • V I . R e f e r e n c e s 183 - v i -L I S T OF TABLES CHAPTER 1 : PARKINSON'S DISEASE  T a b l e P a g e • 1 . T y r o s i n e h y d r o x y l a s e (TH) a c t i v i t y and c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s i n r a t s t r i a t u m a f t e r c h r o n i c L-DOPA a n d c a r b i d o p a t r e a t m e n t 19 2 . E f f e c t s o f BSO on t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t s o f b r a i n and l i v e r o f r a t s 20 3 . M a n g a n e s e c o n t e n t s o f r a t b r a i n a f t e r MMT t r e a t m e n t . . . . . 21 4 . T y r o s i n e h y d r o x y l a s e a c t i v i t y and c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s i n r a t s t r i a t u m a f t e r MMT t r e a t m e n t 22 5 . S t r i a t a l p a r a m e t e r s o f n o n - s c o r b u t i c g u i n e a p i g s i n j e c t e d w i t h MPTP ( 8 mg/kg) f o r 10 d a y s 24 6 . E f f e c t s o f 15 d a i l y i n j e c t i o n s o f MPTP (8 m g / k g ) on n e u r o c h e m i c a l p a r a m e t e r s o f s c o r b u t i c g u i n e a p i g s 2 5 7 . T i m e c o u r s e o f n e u r o c h e m i c a l c h a n g e s i n s t r i a t u m o f C57 b l a c k m i c e a f t e r an i n j e c t i o n o f 4 0 m g / k g MPTP 2 8 8 . C o m p a r i s o n o f d i f f e r e n t d o s a g e s c h e d u l e s o f MPTP on t h e s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s , i n m i c e s a c r i f i c e d 1 month a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n 29 9 . C o m p a r i s o n o f d i f f e r e n t d o s a g e s c h e d u l e s o f MPTP on t h e s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s , i n m i c e s a c r i f i c e d 24 h a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n 3 0 1 0 . S t r i a t a l n e u r o c h e m i c a l p a r a m e t e r s o f m i c e s a c r i f i c e d a t v a r i o u s t i m e s a f t e r a s i n g l e i n j e c t i o n o f 4 0 mg/kg MPTP 31 1 1 . C o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s i n t h e s t r i a t u m o f m i c e t r e a t e d w i t h MPTP a n d p r o t e c t i v e a g e n t s 34 1 2 . E f f e c t s o f MPTP i n j e c t i o n s on t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t o f s t r i a t u m and b r a i n s t e m o f m i c e 35 1 3 . T o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t s o f b r a i n s t e m and s t r i a t u m o f m i c e i n j e c t e d w i t h 4 0 m g / k g MPTP, w i t h o r w i t h o u t a n t i o x i d a n t p r e t r e a t m e n t 37 1 4 . E f f e c t s o f L-DOPA a n d c a r b i d o p a t r e a t m e n t o n s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s o f t h e mouse 38 1 5 . S t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e a n d i t s m e t a b o l i t e s i n m i c e g i v e n 2 0 mg/kg MPTP, w i t h o r w i t h o u t L-DOPA and c a r b i d o p a p r e t r e a t m e n t . 38 - v i i -1 6 . S t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s i n m i c e g i v e n 2 d i f f e r e n t d o s a g e r e g i m e n s o f M P P + 4 0 1 7 . E f f e c t s o f BHA on t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t and g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e a c t i v i t y o f l i v e r and b r a i n s t e m o f t h e mouse 43 1 8 . E f f e c t s o f BHA p r e t r e a t m e n t on t h e n e u r o c h e m i c a l e f f e c t s o f MPTP i n m i c e . . . . . 44 1 9 . C o n t e n t o f a m i n o a c i d s i n l i v e r o f mouse s a c r i f i c e d 2 h a f t e r 10 m m o l / k g g l u t a t h i o n e m o n o e t h y l e s t e r 47 2 0 . E f f e c t s o f BSO p r e t r e a t m e n t on t h e n e u r o c h e m i c a l e f f e c t s o f 20 mg/kg MPTP i n C57 b l a c k m i c e . . . 4 8 2 1 . L i v e r and b r a i n s t e m t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t s o f m i c e i n j e c t e d w i t h DEM 4 9 2 2 . C o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s i n s t r i a t u m o f m i c e t r e a t e d w i t h DEM, DEM p l u s 2 0 m g / k g MPTP, o r 2 0 mg/kg MPTP o n l y 5 0 2 3 . E f f e c t s o f MPTP a n a l o g s on s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s o f C57 b l a c k m i c e 54 2 4 . E f f e c t s o f p a r a q u a t and r e d u c e d p a r a q u a t on s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s o f C57 b l a c k m i c e 57 2 5 . E f f e c t s o f p r e t r e a t m e n t w i t h t h i o c y a n a t e o r h y d r a z i n e on MPTP-i n d u c e d d e p l e t i o n o f s t r i a t a l d o p a m i n e a n d i t s m e t a b o l i t e s i n m i c e . 61 2 6 . F a i l u r e o f h y d r a z i n e t o i n h i b i t MAO-B a c t i v i t y i n l i v e r and s t r i a t u m o f m i c e 61 2 7 . Monoamine o x i d a s e B a c t i v i t y i n p l a t e l e t s o f human s m o k e r s and n o n - s m o k e r s 6 3 2 8 . I n h i b i t i o n o f r a t l i v e r monoamine o x i d a s e B a c t i v i t y b y human u r i n e 65 2 9 . Monoamine o x i d a s e B a c t i v i t y i n b r a i n o f c o n t r o l s a n d P a r k i n s o n ' s d i s e a s e p a t i e n t s 66 3 0 . T o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t s i n v a r i o u s r e g i o n s o f r a p i d l y f r o z e n human b r a i n s 69 3 1 . G l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e a c t i v i t y i n t h e f r o n t a l c o r t e x a n d s u b s t a n t i a n i g r a o f PD p a t i e n t s 74 - v i i i -CHAPTER 2 : HUNTINGTON'S CHOREA  T a b l e P a g e 1 . S t r i a t a l GABA c o n t e n t i n r a t s i n j e c t e d w i t h w h o l e s e r u m 105 2 . GABA c o n t e n t and CAT a c t i v i t y i n s t r i a t u m o f r a t s i n j e c t e d w i t h c o n c e n t r a t e d s e r u m f i l t r a t e s 105 3 . C h a r a c t e r i s t i c s o f HC p a t i e n t s w h o s e s e r a w e r e u s e d i n t i s s u e c u l t u r e e x p e r i m e n t s 108 4 . C h a r a c t e r i s t i c s o f t i s s u e c u l t u r e e x p e r i m e n t s 109 5 . I n d i v i d u a l v a l u e s o f GAD a c t i v i t y and GABA c o n t e n t o f r a t s t r i a t a l e x p l a n t s e x p o s e d t o 3 0 % w h o l e . s e r u m o r 15 % d e p r o t e i n i z e d s e r u m o f , E x p e r i m e n t 8 113 6 . E f f e c t s o f 1 5 % w h o l e s e r u m f r o m HC p a t i e n t s on GAD a c t i v i t y o f r a t s t r i a t a l e x p l a n t s 119 7 . E f f e c t s o f 15 % d e p r o t e i n i z e d s e r u m f r o m HC p a t i e n t s on GAD a c t i v i t y o f r a t s t r i a t a l e x p l a n t s 119 8 . E f f e c t s o f 15 %CSF f r o m HC p a t i e n t s on GAD a c t i v i t y o f r a t s t r i a t a l e x p l a n t s 120 CHAPTER 3 : D I A L Y S I S ENCEPHALOPATHY  T a b l e P a g e 1 . R e g i o n a l GABA c o n t e n t s o f a u t o p s i e d b r a i n i n DE and c o n t r o l ; p a t i e n t s 144 2 . P y r i d o x a l p h o s p h a t e c o n t e n t o f a u t o p s i e d b r a i n o f DE p a t i e n t s 146 3 . C o n t e n t s o f m o n o a m i n e m e t a b o l i t e s i n a u t o p s i e d b r a i n o f DE p a t i e n t s 146 4 . C h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e a c t i v i t y i n c e r e b r a l c o r t e x o f DE p a t i e n t s 147 5 . T r e a t m e n t s g i v e n t o a l u m i n u m - i n j e c t e d a n i m a l s 149 6 . N e u r o c h e m i c a l p a r a m e t e r s i n G r o u p A r a t s a f t e r c h r o n i c A l e x p o s u r e . 153 7 . E v i d e n c e f o r c i r c u l a t o r y a b s o r p t i o n o f s u b c u t a n e o u s l y - i n j e c t e d A 1 ( 0 H ) 3 154 8 . E f f e c t s o f A l ( 0 H ) 3 o r s a l i n e i n j e c t i o n s s t a r t e d 24 h a f t e r 5 / 6 n e p h r e c t o m y i n L i C l - p r e t r e a t e d r a t s 156 - i x -CHAPTER 4 : HALLERVORDEN-SPATZ SYNDROME T a b l e P a g e 1 . B r a i n c y s t i n e and g l u t a t h i o n e - c y s t e i n e m i x e d d i s u l f i d e i n H a l l e r v o r d e n - S p a t z s y n d r o m e 172 2 . B r a i n GABA c o n t e n t i n H a l l e r v o r d e n - S p a t z s y n d r o m e 173 3 . C h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e a c t i v i t y i n H a l l e r v o r d e n - S p a t z s y n d r o m e . . 176 4 . Dopamine and m e t a b o l i t e s i n t h e s t r i a t u m o f HSS C a s e 1 176 - X -L I S T OF FIGURES CHAPTER 1 : PARKINSON'S DISEASE  F i g u r e P a g e 1 . C h a n g e s r e l a t i v e t o c o n t r o l s o f t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t o f l i v e r s o f C57 b l a c k o r C D l S w i s s a l b i n o m i c e , a t v a r i o u s t i m e i n t e r v a l s a f t e r an i n j e c t i o n o f 10 m m o l / k g g l u t a t h i o n e m o n o e t h y l e s t e r . . . . . . . 45 2 . S t r u c t u r a l f o r m u l a e o f M P T P , M P P + , and t h e i r a n a l o g s 52 CHAPTER 2 : HUNTINGTON'S CHOREA 1 . C h e m i c a l s t r u c t u r e s o f g l u t a m i c a c i d , k a i n i c a c i d , a n d q u i n o l i n i c a c i d 96 2 . GAD a c t i v i t i e s o f e x p l a n t s e x p o s e d t o 30% w h o l e s e r u m f r o m HC p a t i e n t s f o r 1 and 3 w e e k s , e x p r e s s e d as % o f t h e i r r e s p e c t i v e c o n t r o l s 116 3 . GAD a c t i v i t i e s o f e x p l a n t s e x p o s e d t o v a r i o u s f o r m s o f HC s e r u m f o r 1 w e e k , e x p r e s s e d a s °l° o f t h e i r r e s p e c t i v e c o n t r o l s 122 CHAPTER 4 : HALLERVORDEN-SPATZ SYNDROME 1 . Enzyme a c t i v i t y o f c y s t e i n e d i o x y g e n a s e i n t i s s u e h o m o g e n a t e s f r o m , 3 r e g i o n s o f a u t o p s i e d b r a i n o f c o n t r o l a d u l t s and HSS p a t i e n t s . . . . 174 2 . % c h a n g e i n c y s t e i n e d i o x y g e n a s e enzyme a c t i v i t y a s a f u n c t i o n o f i n c r e a s i n g b r a i n i r o n c o n t e n t 175 - x i -A p p e n d i x L I S T OF APPENDICES P e r r y , T . L . , Y o n g , V . W., I t o , M . , F o u l k s , J . G . , W a l l , R. A . , G o d i n , D. V . , C l a v i e r , R. M. N i g r o s t r i a t a l d o p a m i n e r g i c n e u r o n s r e m a i n undamaged i n r a t s g i v e n h i g h d o s e s o f L-DOPA a n d c a r b i d o p a c h r o n i c a l l y . J . N e u r o c h e m . 4 3 : 9 9 0 - 9 9 3 , 1 9 8 4 . Y o n g , V . W . , P e r r y , T . L . , G o d o l p h i n , W. J . , J o n e s , K. A . , C l a v i e r , R. M . , I t o , M . , F o u l k s , J . G . C h r o n i c o r g a n i c manganese a d m i n i s t r a t i o n i n t h e r a t d o e s n o t damage d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s . N e u r o t o x i c o l o g y 7 : 1 9 - 2 4 , 1 9 8 6 . P e r r y , T . L . , Y o n g , V . W . , I t o , M . , J o n e s , K . , W a l l , R. A . , F o u l k s , J . G . , W r i g h t , J . M . , K i s h , S . J . l - M e t h y l - 4 - p h e n y l -1 , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e (MPTP) d o e s n o t d e s t r o y n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s i n t h e s c o r b u t i c g u i n e a p i g . L i f e S c i . , 3 6 : 1 2 3 3 - 1 2 3 8 , 1 9 8 5 . P e r r y , T . L . , Y o n g , V . W . , J o n e s , K . , W a l l , R. A . , C l a v i e r , R. M . , F o u l k s , J . G . , W r i g h t , J . M. E f f e c t s o f N - M e t h y l - 4 - p h e n y l -1 , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e , and i t s m e t a b o l i t e , N - m e t h y l - 4 - p h e n y l - p y r i d i n i u m i o n , on d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s i n t h e m o u s e . N e u r o s c i e n c e L e t t e r s 5 8 : 3 2 1 - 3 2 6 , 1 9 8 5 . P e r r y , T . L . , Y o n g , V . W . , C l a v i e r , R. M . , J o n e s , K . , W r i g h t , J . M . , F o u l k s , J . G . , W a l l , R. A . P a r t i a l p r o t e c t i o n f r o m t h e d o p a m i n e r g i c n e u r o t o x i c i t y o f N - M e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 -t e t r a h y d r o p y r i d i n e b y 4 d i f f e r e n t a n t i o x i d a n t s i n t h e m o u s e . N e u r o s c i e n c e L e t t e r s 6 0 : 1 0 9 - 1 1 4 , 1 9 8 5 . Y o n g , V . W . , P e r r y , T . L . , K r i s m a n , A . A . D e p l e t i o n o f g l u t a t h i o n e i n b r a i n s t e m o f m i c e c a u s e d b y N - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e i s p r e v e n t e d b y a n t i o x i d a n t p r e t r e a t m e n t . N e u r o s c i e n c e L e t t e r s 6 3 : 5 6 - 6 0 , 1 9 8 6 . Y o n g , V . W . , P e r r y , T . L . M o n o a m i n e o x i d a s e B , s m o k i n g , a n d P a r k i n s o n ' s d i s e a s e . J . N e u r o l . S c i . 7 2 : 2 6 5 - 2 7 2 , 1 9 8 6 . P e r r y , T . L . , Y o n g , V . W . , H a n s e n , S . , F o u l k s , J . G . , K i s h , S . J . I s a c i r c u l a t i n g n e u r o t o x i n i n v o l v e d i n t h e p a t h o g e n e s i s o f H u n t i n g t o n ' s c h o r e a ? . J . N e u r o l . S c i . 6 7 : 3 5 1 - 3 5 8 , 1 9 8 5 . P e r r y , T . L . , Y o n g , V . W . , K i s h , S . J . , I t o , M . , F o u l k s , J . G . , G o d o l p h i n , W. J . , S w e e n e y , V . P . N e u r o c h e m i c a l a b n o r m a l i t i e s i n b r a i n s o f r e n a l f a i l u r e p a t i e n t s t r e a t e d b y r e p e a t e d h e m o d i a l y s i s . J . N e u r o c h e m . 4 5 : 1 0 4 3 - 1 0 4 8 , 1 9 8 5 . P e r r y , T . L . , N o r m a n , M. G . , Y o n g , V . W . , W h i t i n g , S . , C r i c h t o n , J . U . , H a n s e n , S . , K i s h , S . J . H a l l e r v o r d e n - S p a t z d i s e a s e : C y s t e i n e a c c u m u l a t i o n and c y s t e i n e d i o x y g e n a s e d e f i c i e n c y i n t h e g l o b u s p a l l i d u s . A n n . N e u r o l . 1 8 : 4 8 2 - 4 8 9 , 1 9 8 5 . - x i i -AKNOWLEDGEMENTS I w i s h t o t h a n k my s u p e r v i s o r , D r . Thomas L . P e r r y , f o r h i s g u i d a n c e and e n c o u r a g e m e n t t h r o u g h o u t t h e c o u r s e o f t h i s w o r k , a n d f o r p r o v i d i n g a s u p e r b e x a m p l e o f s c i e n t i f i c d e d i c a t i o n and e x c e l l e n c e . I am g r a t e f u l t o my f r i e n d s and c o l l e a g u e s i n r e s e a r c h , S h i r l e y H a n s e n and K a r e n J o n e s , who g e n e r o u s l y h e l p e d me w i t h s k i l l e d t e c h n i c a l a s s i s t a n c e . I am d e e p l y a p p r e c i a t i v e o f D r . James F o u l k s , D r . D a v i d . G o d i n , D r . R i c h a r d W a l l , and D r . James W r i g h t f o r t h e i r v a l u a b l e and c o n s t r u c t i v e comments and c r i t i c i s m s . D r . Seung U . K i m d e s e r v e s s p e c i a l m e n t i o n f o r p r o v i d i n g e x p e r t i s e and e q u i p m e n t t h a t made p o s s i b l e t h e i n v i t r o e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d i n C h a p t e r 2. A s p e c i a l t h a n k s s h o u l d go t o my w i f e , F i o n a , f o r h e r c h a l l e n g i n g q u e s t i o n s and h e l p i n e d i t i n g t h i s t h e s i s . T h i s s t u d y was s u p p o r t e d by g r a n t s t o D r . Thomas L . P e r r y f r o m t h e M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l o f C a n a d a , t h e P a r k i n s o n F o u n d a t i o n o f C a n a d a , and t h e H u n t i n g t o n S o c i e t y o f C a n a d a . To t h e s e g r a n t i n g a g e n c i e s , I g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e t h e i r f i n a n c i a l c o n t r i b u t i o n s . L a s t b u t n o t l e a s t , I am e x t r e m e l y g r a t e f u l t o t h e H u n t i n g t o n S o c i e t y o f C a n a d a f o r i t s award o f a p r e d o c t o r a l s c h o l a r s h i p t o me. - x i i i -DEDICATION T h i s t h e s i s i s d e d i c a t e d t o my w i f e , F i o n a , and o u r f a m i l i e s . - 1 -CHAPTER 1 . PARKINSON'S DISEASE  ABSTRACT S p e c u l a t i o n s as t o t h e e t i o l o g y o f i d i o p a t h i c P a r k i n s o n ' s d i s e a s e (PD) a b o u n d . A p r e v a i l i n g h y p o t h e s i s i s t h a t t h e d i s o r d e r a r i s e s as a r e s u l t o f e x p o s u r e t o one o r more e n d o g e n o u s o r e n v i r o n m e n t a l n e u r o t o x i n s . One s u p -p o r t f o r t h i s c o n t e n t i o n i s t h e o b s e r v a t i o n t h a t N - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 -t e t r a h y d r o p y r i d i n e ( M P T P ) , a c o n t a m i n a n t f o r m e d i n t h e s y n t h e s i s o f a m e p e r -i d i n e a n a l o g , c a n damage d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s i n h u m a n s , monkeys and m i c e . MPTP i t s e l f i s n o t n e u r o t o x i c , b u t r e q u i r e s c o n v e r s i o n by t h e enzyme monoamine o x i d a s e B (MAO-B) t o f o r m o n e o r more t o x i c m e t a b o l i t e s . An u n d e r s t a n d i n g o f t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m ( s ) o f t h e n e u r o t o x i c p r o p e r t y o f MPTP m i g h t w e l l l e a d t o c l u e s as t o t h e p a t h o g e n e s i s o f P D . I n C57 b l a c k m i c e , a s i n g l e s u b c u t a n e o u s i n j e c t i o n o f 4 0 m g / k g o f MPJP p r o d u c e d a l o s s o f 33% o f n e u r o n a l c e l l b o d i e s i n t h e z o n a c o m p a c t a o f t h e s u b s t a n t i a n i g r a ( S N ) . T h i s was a c c o m p a n i e d b y a l o n g - l a s t i n g r e d u c t i o n (90%) o f c o n t e n t s o f d o p a m i n e a n d i t s m e t a b o l i t e s i n t h e s t r i a t u m . The t o x i c i t y o f MPTP c o u l d be p a r t i a l l y p r e v e n t e d b y p r e t r e a t m e n t o f m i c e w i t h a n y o n e o f f o u r d i f f e r e n t a n t i o x i d a n t s , o - t o c o p h e r o l , e - c a r o t e n e , a s c o r b a t e o r N - a c e t y l c y s t e i n e , s u g g e s t i n g t h e i n v o l v e m e n t o f f r e e r a d i c a l s i n t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f MPTP t o x i c i t y . T w e n t y - f o u r h a f t e r an i n j e c t i o n o f 4 0 mg/kg o f M P T P , t h e c o n t e n t i n t h e b r a i n s t e m o f t h e e n d o g e n o u s f r e e r a d i -c a l s c a v e n g e r , g l u t a t h i o n e , was s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d . F u r t h e r m o r e , t h i s l o s s o f g l u t a t h i o n e c o u l d be p r e v e n t e d b y p r e t r e a t m e n t o f m i c e w i t h t h e a n t i o x i d a n t s a - t o c o p h e r o l o r e - c a r o t e n e . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t e d t h a t g l u -t a t h i o n e m i g h t be c r i t i c a l l y i m p o r t a n t i n t h e d e t o x i f i c a t i o n o f f r e e r a d i -c a l s t h a t m i g h t b e f o r m e d f r o m MPTP. H o w e v e r , p r i o r t r e a t m e n t o f m i c e w i t h - 2 -d i e t h y l m a l e a t e , a compound t h a t d e p l e t e d b r a i n s t e m t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t b y 70%, d i d n o t p o t e n t i a t e t h e s t r i a t a l d o p a m i n e r g i c t o x i c i t y o f s u b s e q u e n t l y a d m i n i s t e r e d MPTP. T h i s d i s c r e p a n c y r e m a i n s u n e x p l a i n e d . A l t h o u g h MPTP c a n p r o d u c e a p a r k i n s o n i a n l e s i o n , i t i s c e r t a i n l y n o t t h e n e u r o t o x i n r e s p o n s i b l e f o r m o s t c a s e s o f i d i o p a t h i c P D . To i d e n t i f y a more commonly o c c u r r i n g a g e n t t h a t m i g h t be i n v o l v e d i n t h e p a t h o g e n e s i s o f P D , v a r i o u s a n a l o g s o f MPTP w e r e t e s t e d i n C57 b l a c k m i c e f o r p o s s i b l e n e u r o t o x -i c e f f e c t s on t h e d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l s y s t e m . H o w e v e r , n o n e o f t h e compounds t r i e d , w h i c h i n c l u d e d p a r a q u a t , d e c r e a s e d s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e . S e v e r a l e p i d e m i o l o g i c a l s t u d i e s h a v e r e p o r t e d t h a t PD o c c u r s l e s s f r e -q u e n t l y among c i g a r e t t e s m o k e r s t h a n among n o n - s m o k e r s . The a p p p a r e n t p r o -t e c t i v e e f f e c t o f s m o k i n g r e m a i n s u n e x p l a i n e d . I f c o m p o u n d ( s ) r e s p o n s i b l e f o r c a u s i n g PD r e s e m b l e MPTP i n f i r s t r e q u i r i n g c o n v e r s i o n o f an i n a c t i v e p r e c u r s o r t o n e u r o t o x i c m e t a b o l i t e ( s ) b y MAO-B, a n d i f c i g a r e t t e s m o k i n g i n h i b i t s t h i s e n z y m e , t h e n t h e p r o t e c t i v e m e c h a n i s m o f c i g a r e t t e ! s m o k i n g m i g h t be e x p l a i n e d . U s i n g p l a t e l e t s as t h e s o u r c e o f MAO-B, we f o u n d t h a t h e a v y c i g a r e t t e s m o k e r s h a v e a mean d e c r e a s e o f 25% o f MAO-B a c t i v i t y when c o m p a r e d t o n o n - s m o k e r s . A l t h o u g h i n t e r e s t i n g , t h i s d e c r e a s e m i g h t n o t b e f u n c t i o n a l l y l a r g e e n o u g h t o a c c o u n t f o r t h e p r o t e c t i o n t h a t i s a f f o r d e d b y c i g a r e t t e s m o k i n g . U s i n g a n o t h e r a p p r o a c h t o d i s c e r n t h e m e c h a n i s m o f p r o t e c t i o n a g a i n s t t h e d e v e l o p m e n t o f PD t h a t a p p e a r s t o be c o n f e r r e d b y c i g a r e t t e s m o k i n g , we p r e t r e a t e d m i c e w i t h one o f 3 compounds ( h y d r a z i n e , t h i o c y a n a t e and n i c o -t i n e ) known t o a c c u m u l a t e i n t h e p h y s i o l o g i c a l f l u i d s and t i s s u e s o f c i g a r -e t t e s m o k e r s , a n d t h e n g a v e them an i n j e c t i o n o f M P T P . We f o u n d t h a t h y d r a -z i n e p r e t r e a t m e n t s u b s t a n t i a l l y r e d u c e d t h e t o x i c i t y o f MPTP, s u g g e s t i n g - 3 -t h a t t h e l o w e r i n c i d e n c e o f PD among s m o k e r s m i g h t be due i n p a r t t o c h r o n i c p r e s e n c e o f h y d r a z i n e i n t h e i r b o d i e s . M e a s u r e m e n t s o f MAO-B a c t i v i t y w e r e made i n t h e a u t o p s i e d b r a i n s (SN and f r o n t a l c o r t e x ) o f p a t i e n t s who d i e d w i t h P D . No s i g n i f i c a n t c h a n g e s w e r e f o u n d when c o m p a r e d t o c o n t r o l s . I t a p p e a r s u n l i k e l y t h a t an o v e r a c t i v e MAO-B a c t i v i t y i n b r a i n c a u s e s e x c e s s i v e c o n v e r s i o n o f an i n a c t i v e p r e c u r s o r t o n e u r o t o x i c m e t a b o l i t e ( s ) , t h e r e b y p r e d i s p o s i n g c e r t a i n i n d i v i d u a l s t o t h e d e v e l o p m e n t o f P D . F i n a l l y , by t h e i n c l u s i o n o f more PD p a t i e n t s and c o n t r o l s u b j e c t s , t h i s c h a p t e r u p d a t e s t h e r e p o r t b y P e r r y e t a l . ( 1 9 8 2 ) t h a t g l u t a t h i o n e c o n t e n t was d e c r e a s e d i n t h e SN o f p a t i e n t s who d i e w i t h P D . Of 6 r e g i o n s m e a s u r e d , o n l y t h e SN i n PD b r a i n s showed s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t when c o m p a r e d t o c o n t r o l s . We s u g g e s t t h e p o s s i b i l i t i e s t h a t t h e d e c r e a s e d c o n t e n t o f g l u t a t h i o n e i n t h e SN o f PD b r a i n s may be t h e r e s u l t o f i t s c o n t i n u e d c o n s u m p t i o n i n t h e d e t o x i f i c a t i o n o f p o t e n t i a l l y n e u r o t o x i c r a d i c a l s , and t h a t PD p a t i e n t s m i g h t w e l l be e x p o s e d t o s u c h n e u r o t o x i n s up t o t h e t i m e o f d e a t h . The r e s u l t s a l s o s u g g e s t t h a t a n t i o x i d a n t c o m p o u n d s s u c h a s a - t o c o p h e r o l o r 3 - c a r o t e n e m i g h t be u s e f u l i n s l o w i n g t h e p r o g r e s -s i o n o f n e u r o n a l d e a t h i n P D . - 4 -I ) INTRODUCTION I d i o p a t h i c P a r k i n s o n ' s d i s e a s e (PD) was f i r s t d e s c r i b e d i n 1817 by James P a r k i n s o n . C h a r a c t e r i s t i c symptoms i n c l u d e b r a d y k i n e s i a , r i g i d i t y , t r e m o r , and a d i s t u r b a n c e o f p o s t u r e . I n a d d i t i o n , as many a s 3 0 % o f p a t i e n t s may h a v e an a c c o m p a n y i n g d e m e n t i a ( B i a n c h i n e 1 9 8 5 ) . PD a f f e c t s a b o u t 200 o f 1 0 0 , 0 0 0 p e o p l e i n t h e g e n e r a l p o p u l a t i o n ( K u r t z k e 1 9 8 2 ) ; h o w e v e r , t h e i n c i -d e n c e i n c r e a s e s w i t h a g e s u c h t h a t a p r e v a l e n c e r a t e h e a r i n g - 1 i n 4 0 h a s b e e n r e p o r t e d i n p e r s o n s a b o v e t h e age o f 65 y e a r s ( B a r b e a u 1 9 8 4 ) . I n more t h a n 9 0 ^ o f c a s e s , t h e d i s e a s e h a s i t s o n s e t a f t e r t h e a g e o f 55 y e a r s ( B i a n c h i n e 1 9 8 5 ) . The f u n d a m e n t a l p a t h o l o g y o f PD a p p e a r s w e l l - d e f i n e d : d e g e n e r a t i o n . o f t h e d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l p a t h w a y , w h i c h o r i g i n a t e s f r o m n e u r o m e l a n i n -c o n t a i n i n g n e u r o n s i n t h e p a r s c o m p a c t a o f t h e s u b s t a n t i a n i g r a ( S N ) . A c o n s e q u e n c e o f t h i s d e g e n e r a t i o n i s a m a r k e d d e c r e a s e i n d o p a m i n e c o n t e n t i n t h e t e r m i n u s o f t h e n i g r o s t r i a t a l p a t h w a y , t h e s t r i a t u m ( c o m p r i s e d o f t h e c a u d a t e n u c l e u s and p u t a m e n ) ( E h r i n g e r e t a l . 1 9 6 0 ; H o r n y k i e w i c z 1 9 7 3 ) . Symptoms o f PD a p p e a r o n l y when a p p r o x i m a t e l y 8 0 % o f n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s h a v e been l o s t . L o s s e s o f p e r i k a r y a a r e a l s o c o n s i s t e n t l y o b s e r v e d , a l t h o u g h t o a l e s s e r e x t e n t , i n o t h e r n e u r o m e l a n i n - c o n t a i n i n g n u c l e i s u c h a s t h e l o c u s c o e r u l e u s and t h e d o r s a l m o t o r n u c l e u s o f t h e v a g u s ( F o r n o 1 9 8 2 ) . Many n e u r o c h e m i c a l c h a n g e s h a v e b e e n d e s c r i b e d f o r t h e p a r k i n s o n i a n b r a i n . T h e s e h a v e b e e n s u c c i n c t l y s u m m a r i s e d b y M a r s d e n ( 1 9 8 2 ) and H o r n y k i e w i c z ( 1 9 8 2 ) . The s i g n i f i c a n c e o f some o f t h e c h a n g e s i s u n c e r t a i n . Many m i g h t n o t be due t o d e a t h o f s p e c i f i c n e u r o n s , b u t m i g h t m e r e l y be f u n c t i o n a l c h a n g e s t o c o m p e n s a t e f o r t h e l o s s o f d o p a m i n e r g i c i n f l u e n c e upon t h e s t r i a t u m ( M a r s d e n 1 9 8 2 ) . P e r h a p s t h e a b n o r m a l i t i e s o f t h e n i g r o s t r i a t a l p a t h w a y a r e t h e o n l y i m p o r t a n t o n e s f o r t h e c l i n i c a l e x p r e s s i o n o f t h e d i s -- . 5 -e a s e . E v i d e n c e s u p p o r t i n g t h i s c o n t e n t i o n i s s u p p l i e d b y a r e c e n t l y d i s -c o v e r e d n e u r o t o x i n , N - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e ( M P T P ) , w h i c h s e l e c t i v e l y d e s t r o y s n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s w i t h a r e s u l t a n t l o s s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s i n t h e s t r i a t u m . I n s u f f i c i e n t d o s e s , MPTP c a n p r o d u c e n e a r l y a l l t h e symptoms o f PD i n humans and m o n k e y s ( D a v i e s e t a l . 1 9 7 9 ; L a n g s t o n e t a l . 1 9 8 3 ; B u r n s e t a l . 1 9 8 3 ) . An i m p o r t a n t a p p l i c a t i o n o f t h e r a t h e r e x t e n s i v e n e u r o c h e m i c a l s t u d i e s !.on a u t o p s i e d b r a i n s o f PD p a t i e n t s i s t h a t t h e d e m o n s t r a t i o n Of d o p a m i n e d e f i c i e n c y i n t h e s t r i a t u m h a s l e d t o t h e r a t i o n a l t r e a t m e n t o f p a t i e n t s w i t h t h e d i s e a s e . Dopamine . i t s e l f d o e s n o t r e a d i l y c r o s s t h e b l o o d - b r a i n b a r r i e r , b u t i t s i m m e d i a t e p r e c u r s o r L-DOPA ( L - 3 , 4 - d i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e ) d o e s . S i n c e a b o u t 9 5 % o f an . ' . o r a l - d o s e o f L-DOPA i s m e t a b o l i z e d o u t s i d e t h e b r a i n ( B i a n c h i n e 1 9 8 5 ) , c o m b i n e d : a d m i n i s t r a t i o n o f L-DOPA w i t h a p e r i p h e r a l DOPA d e c a r b o x y l a s e i n h i b i t o r s u c h as c a r b i d o p a o r b e n s e r a z i d e i s b e n e f i c i a l . T h i s c o m b i n a t i o n i s now t h e t r e a t m e n t o f c h o i c e f o r PD ( B i a n c h i n e 1 9 8 5 ) . T h e o t h e r d r u g s u s e d t o t r e a t PD, a c t v i a o t h e r d o p a m i n e r g i c m e c h a n i s m s ( t h e s e i n c l u d e d i r e c t d o p a m i n e r g i c a g o n i s t s s u c h a s b r o m o c r i p t i n e ) o r by i n h i b i t i n g c h o l i n e r g i c a c t i v i t y . T h e l a t t e r c l a s s o f d r u g s i s u s e f u l b e c a u s e i n t h e n o r m a l b r a i n t h e c h o l i n e r g i c i n t e r n e u r o n s o f t h e s t r i a t u m a r e i n h i b i t e d b y t h e d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l p a t h w a y ( B a r t h o l i n i e t a l . 1 9 7 5 ) . T h u s , i n P D , t h e s t r i a t a l d o p a m i n e d e f i c i e n c y r e s u l t s i n a r e l a t i v e o v e r -a c t i v i t y o f c h o l i n e r g i c n e u r o n s . The b e n e f i t s r e s u l t i n g f r o m t h e i n t r o d u c t i o n o f t h e r a p y w i t h L-DOPA ( p l u s c a r b i d o p a o r b e n s e r a z i d e ) a r e r e m a r k a b l e . 9 0 % o f p a t i e n t s r e s p o n d , o f t e n d r a m a t i c a l l y , w i t h a r e s t o r a t i o n o f m o b i l i t y . H o w e v e r , t h i s r e s p o n s e i s n o t m a i n t a i n e d i n d e f i n i t e l y . A f t e r a b o u t 3 y e a r s o f t r e a t m e n t , f o r m e r - 6 -d i s a b i l i t i e s b e g i n t o r e e m e r g e i n many p a t i e n t s . A f t e r 6 y e a r s o f t r e a t -m e n t , m o s t p a t i e n t s h a v e r e t u r n e d t o t h e i r p r e t r e a t m e n t l e v e l o f d i s a b i l i t y (Shaw e t a l . 1 9 8 0 ; C u r t i s e t a l . 1 9 8 4 ) . I n f a c t , some s t u d i e s show t h a t t h e c o n d i t i o n o f t h e m a j o r i t y o f p a t i e n t s a f t e r s e v e r a l y e a r s o f t r e a t m e n t i s w o r s e t h a n b e f o r e L-DOPA t r e a t m e n t . C l e a r l y , t h e l o s s o f n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s c o n t i n u e s u n a b a t e d e v e n w i t h L-DOPA t h e r a p y ( L u d i n e t a l . 1 9 7 6 ; M a r s d e n e t a l . 1 9 7 7 ) . T h u s , t h e c l i n i c a l e f f e c t s o f t h e d r u g s p r e s e n t l y u s e d i n t h e t r e a t m e n t o f PD a r e s y m p t o m a t i c i n n a t u r e and do n o t c u r e t h e u n d e r l y i n g d i s o r d e r . I n r e c e n t y e a r s , much r e s e a r c h h a s c e n t e r e d on t h e e t i o l o g y o f i d i o p a t h -i c P D . The e x p e c t a t i o n i s t h a t i f t h e c a u s e o f t h e n i g r o s t r i a t a l n e u r o n a l l o s s c a n be f o u n d , p r e v e n t i o n o f t h e d i s e a s e may b e p o s s i b l e b y d e v i s i n g a p p r o p r i a t e p h a r m a c o l o g i c a l s t r a t e g i e s . I n a f f l i c t e d p a t i e n t s , t h e p r o g r e s -s i o n o f symptoms m i g h t be h a l t e d o r s l o w e d i f t h e m o l e c u l a r b a s i s o f n i g r a l c e l l d e a t h c o u l d be d i s c e r n e d . H y p o t h e s e s as t o t h e e t i o l o g y o f i d i o p a t h i c PD a b o u n d : h e r e d i t y , v i r a l i n f e c t i o n , a c c e l e r a t e d a g i n g o f t h e n e r v o u s s y s t e m , d o p a m i n e t o x i c i t y , i n -a d e q u a t e f r e e r a d i c a l s c a v e n g i n g m e c h a n i s m s , and e n v i r o n m e n t a l n e u r o t o x i n s . T h e s e h y p o t h e s e s h a v e r e l e v a n c e f o r t h i s t h e s i s and m e r i t d i s c u s s i o n . The p o s s i b l e c o n t r i b u t i o n o f h e r e d i t y t o t h e p a t h o g e n e s i s o f PD h a s b e e n d e b a t e d f o r many y e a r s . An e a r l y s t u d y by G o w e r s i n 1 9 0 3 ( c i t e d i n D u v o i s i n 1 9 8 4 ) n o t e d t h a t 15% o f 123 p a t i e n t s r e p o r t e d h a v i n g a p o s i t i v e f a m i l y h i s -t o r y f o r t h e d i s e a s e . K u r l a n d ( 1 9 5 8 ) r e p o r t e d a f a m i l i a l f r e q u e n c y o f 16%. Kondo ( 1 9 7 2 ) c o n c l u d e d t h a t PD f o l l o w s t h e m u l t i f a c t o r i a l - t h r e s h o l d m o d e l o f s u s c e p t i b i l t y , w i t h t h e g e n e t i c c o m p o n e n t b e i n g g r e a t e r t h a n t h a t o f t h e e n v i r o n m e n t . M o r e r e c e n t l y , 2 f a m i l i a l s u b g r o u p s o f PD h a v e been r e p o r t e d : an a k i n e t o - r i g i d s u b t y p e t r a n s m i t t e d as an a u t o s o m a l r e c e s s i v e t r a i t , and a - 7 -s u b t y p e w i t h p r o m i n e n t t r e m o r , d o m i n a n t i n h e r i t a n c e , and a h i g h p r e v a l e n c e o f f a m i l y members w i t h e s s e n t i a l t r e m o r ( B a r b e a u e t a l . 1 9 8 2 ) . H o w e v e r , o t h e r a u t h o r s h a v e n o t f o u n d s u c h f a m i l i a l s u b g r o u p s when o t h e r d i s o r d e r s t h a t p r e s e n t w i t h r a t h e r s i m i l a r s i g n s and symptoms t o PD ( f o r e x a m p l e , ' m u l t i s y s t e m a t r o p h i e s ' and b e n i g n e s s e n t i a l t r e m o r ) w e r e e x c l u d e d f r o m t h e s t u d y ( D u v o i s i n 1 9 8 2 ) . P e r h a p s t h e s t r o n g e s t a r g u m e n t a g a i n s t a s i g n i f i c a n t g e n e t i c c o n t r i b u t i o n comes f r o m a r e c e n t s t u d y o f t w i n s . Among 43 m o n o z y g o -t i c and 19 d i z y g o t i c t w i n p a i r s i n w h i c h t h e i n d e x c a s e h a d d e f i n i t e P D , o n l y 1 m o n o z y g o t i c p a i r was c o n c o r d a n t f o r t h e d i s e a s e (Ward e t a l . 1 9 8 3 ) . G e n e t i c i n h e r i t a n c e i s t h u s u n l i k e l y t o be an i m p o r t a n t f a c t o r i n t h e d e v e l -opment o f most c a s e s o f P D . Between t h e y e a r s 1916 a n d 1 9 2 6 , t h e r e was an e p i d e m i c o f e n c e p h a l i t i s l e t h a r g i c a . Many a f f e c t e d i n d i v i d u a l s l a t e r d e v e l o p e d a c o n d i t i o n c a l l e d p o s t e n c e p h a l i t i c p a r k i n s o n i s m ( Z e i g l e r 1 9 2 8 ; H a r r i s e t a l . 1 9 3 7 ) . T h e s e p a t i e n t s d i s p l a y e d c l i n i c a l f e a t u r e s r e s e m b l i n g t h o s e o f i d i o p a t h i c P D . N e u r o p a t h o l o g i c a l e x a m i n a t i o n o f 12 p a t i e n t s (8 o f t h e m h a d a p o s i t i v e h i s -t o r y o f e n c e p h a l i t i s b e t w e e n t h e y e a r s 1 9 2 0 and 1 9 2 6 ) showed s e v e r e n e u r o n a l l o s s i n t h e p a r s c o m p a c t a o f t h e S N , a n d n e u r o c h e m i c a l r e s u l t s i n d i c a t e d o v e r 9 0 % l o s s o f s t r i a t a l d o p a m i n e c o n t e n t ( B e r n h e i m e r e t a l . 1 9 7 3 ) . I n f a c t , t h e d e g r e e o f n e u r o n a l l o s s and t h e d o p a m i n e d e p l e t i o n was e v e n more s e v e r e t h a n t h a t o f t h e i d i o p a t h i c d i s o r d e r ( B e r n h e i m e r e t a l . 1 9 7 3 ) . A l t h o u g h some d i f f e r e n c e s e x i s t b e t w e e n p o s t e n c e p h a l i t i c p a r k i n s o n i s m and i d i o p a t h i c PD ( f o r e x a m p l e , i n s t e a d o f Lewy b o d y i n c l u s i o n s w h i c h a r e f o u n d i n a b o u t 9 5 % o f a u t o p s i e d i d i o p a t h i c PD b r a i n s , p o s t e n c e p h a l i t i c p a r k i n s o n -i s m showed n e u r o f i b r i l l a r y t a n g l e s ) ( B e r n h e i m e r e t a l . 1 9 7 3 ; F o r n o 1 9 8 2 ) , t h i s s u g g e s t s t h a t some f o r m s o f t h e i d i o p a t h i c d i s o r d e r m i g h t be c a u s e d b y a v i r u s . M a r t t i l a e t a l . ( 1 9 7 7 , 1 9 7 8 ) s u p p o r t e d t h i s c o n t e n t i o n b y r e p o r t -- 8 -i n g t h a t v i r a l a n t i b o d i e s h a v e b e e n f o u n d i n t h e s e r a o f p a t i e n t s w i t h i d i o -p a t h i c PD who w e r e n o t e x p o s e d t o e n c e p h a l i t i s l e t h a r g i c a i n t h e d e c a d e b e t w e e n 1916 and 1 9 2 6 . H o w e v e r , a l l i n d i v i d u a l s s h o u l d h a v e v a r i o u s t y p e s o f v i r a l a n t i b o d i e s i n t h e i r s e r a , r e g a r d l e s s o f w h e t h e r o r n o t t h e y h a v e P D . A l s o , t h e b r a i n s o f PD p a t i e n t s do n o t show t h e h i s t o l o g i c a l f i n d i n g s c h a r a c t e r i s t i c o f i n f e c t i o n by e i t h e r a c o n v e n t i o n a l o r a s l o w v i r u s , and a t t e m p t e d v i r a l i s o l a t i o n s f r o m them h a v e b e e n u n s u c c e s s f u l ( C a l n e e t a l . 1 9 8 3 ) . I t w o u l d a p p e a r t h a t m o s t c a s e s o f i d i o p a t h i c PD c a n n o t be a t t r i b u t e d t o a v i r a l i n f e c t i o n . A n o t h e r h y p o t h e s i s i s t h a t PD i s due t o a c c e l e r a t e d a g i n g o f t h e n e r v o u s s y s t e m . I n n o r m a l i n d i v i d u a l s , t h e number o f p i g m e n t e d n e u r o n s i n t h e p a r s c o m p a c t a o f t h e SN o r d i n a r i l y d e c l i n e s w i t h a g e . I n t h e c a s e o f p a t i e n t s w i t h P D , t h i s r e d u c t i o n e x c e e d s t h a t o f a g e - m a t c h e d c o n t r o l s ( M c G e e r e t a l . 1 9 7 7 ) . S i m i l a r l y , t h e c o n t e n t o f d o p a m i n e i n t h e s t r i a t u m f a l l s w i t h a g e , and a g a i n t h i s d e c l i n e i s much s h a r p e r i n PD ( H o r n y k i e w i c z 1 9 6 6 ) . S t u d i e s o f n e u r a l f u n c t i o n r e v e a l t h e same r e l a t i o n s h i p : r e a c t i o n t i m e a n d s p e e d o f movement n o r m a l l y become s l o w e r w i t h a d v a n c i n g a g e , b u t b o t h t r e n d s a r e more p r o n o u n c e d i n PD ( E v a r t s e t - a l . 1 9 8 1 ) . T h u s , PD a p p e a r s t o be an e x a g g e r -a t e d f o r m o f a g i n g . C a l n e e t . ; a l . ( 1 9 8 3 ) h a v e p u t f o r t h 2 a r g u m e n t s a g a i n s t t h i s . F i r s t l y , t h e y r e a s o n e d , i d e n t i c a l t w i n s s h o u l d age a t t h e same r a t e , and t h u s s h o u l d show a h i g h c o n c o r d a n c e f o r t h e d i s e a s e . H o w e v e r , t h i s was n o t t h e c a s e (Ward e t a l . 1 9 8 3 ) . S e c o n d l y , t h e f a i l u r e o f L-DOPA t o c o r r e c t t h e d e c l i n i n g m o t o r f u n c t i o n o f n o r m a l a g i n g as i t d o e s f o r p a t i e n t s w i t h P D , was t a k e n by C a l n e e t a l . ( 1 9 8 3 ) as a p h a r m a c o l o g i c a l s e p a r a t i o n o f a g -i n g and PD. The p o s s i b l e t o x i c i t y o f d o p a m i n e , t h e n e u r o t r a n s m i t t e r o f t h e n i g r o -s t r i a t a l t r a c t , i s t h e b a s i s o f y e t a n o t h e r h y p o t h e s i s . I n v i v o and vn - 9 -v i t r o , d o p a m i n e i s c y t o t o x i c t o human and m u r i n e c a n c e r c e l l s ( W i c k 1 9 7 8 ) , and c a n i n d u c e DNA s t r a n d b r e a k a g e i n human f i b r o b l a s t s ( M o l d e u s e t a l . 1 9 8 3 ) . The m e c h a n i s m o f t o x i c i t y h a s b e e n a t t r i b u t e d t o r e a c t i v e f r e e r a d i -c a l s p r o d u c e d d u r i n g t h e o x i d a t i v e m e t a b o l i s m ( a u t o x i d a t i o n , o r v i a t h e enzyme monoamine o x i d a s e ) o f d o p a m i n e ( T s e e t a l . 1 9 7 6 ; Graham e t a l . 1 9 7 8 ; S i n e t e t a l . 1 9 8 0 ; M a k e r e t a l . 1 9 8 1 ; G r a h a m 1 9 8 4 ) , t o s p e c i e s s u c h as h y d r o g e n p e r o x i d e (H2O2), s u p e r o x i d e a n i o n (Op, s i n g l e t o x y g e n ( u ^ ) * h y d r o x y l r a d i c a l (HO" ) , and d o p a m i n e s e m i q u i n o n e s . P o s s e s s i n g an u n p a i r e d e l e c t r o n , w h i c h c o n f e r s on t h e m g r e a t r e a c t i v i t y ( M c C o r d e t a l . 1 9 7 8 ; H a l l i w e l l e t a l . 1 9 8 5 ) , t h e s e r a d i c a l s c a n d i s r u p t a v a r i e t y o f b i o -m o l e c u l e s , e s p e c i a l l y t h e p o l y u n s a t u r a t e d p h o s p h o l i p i d s o f c e l l m e m b r a n e s , b y t h e p r o c e s s o f l i p i d p e r o x i d a t i o n ( T a p p e l 1 9 7 3 ; D e n e k e e t a l . 1 9 8 0 ; S l a t e r 1 9 8 2 ) . The r e s u l t c a n be l o s s o f membrane i n t e g r i t y and s u b s e q u e n t c e l l d e a t h . I n d e e d , t h e n e u r o m e l a n i n p i g m e n t s i n t h e SN a r e t h o u g h t t o be a w a s t e p r o d u c t d e r i v e d f r o m t h e o x i d a t i o n o f d o p a m i n e ( G r a h a m 1 9 7 9 ) . The p o t e n t i a l t o x i c i t y o f d o p a m i n e h a s l e d s e v e r a l g r o u p s t o s u g g e s t t h a t PD i s a d i s o r d e r o f t r a n s p o r t , c o m p a r t m e n t a l i s a t i o n , o r m e t a b o l i s m o f d o p a m i n e , r e s u l t i n g i n i n c r e a s e d s h u n t i n g o f d o p a m i n e i n t o t h e o x i d a t i v e p a t h w a y a n d t h u s e x c e s s i v e f o r m a t i o n o f r e a c t i v e f r e e r a d i c a l s ( C o h e n e t a l . 1 9 7 6 ; Graham 1 9 7 9 ; Cohen 1 9 8 2 ) . S u p p o r t f o r t h i s h y p o t h e s i s comes f r o m e v i d e n c e t h a t t h e n e u r o t o x i n 6 - h y d r o x y d o p a m i n e , w h i c h d e s t r o y s n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s when i n j e c t e d i n t o t h e SN o f a n i m a l s ( T h o e n e n e t a l . 1 9 7 3 ) , may a c t v i a t h e f o r m a t i o n o f f r e e r a d i c a l s , i n c l u d i n g 6 - h y d r o x y d o p a m i n e s e m i q u i n o n e , w h i c h c h e m i c a l l y r e s e m b l e s d o p a m i n e s e m i q u i n o n e s ( C o h e n e t - a l . 1 9 7 4 ; H e i k k i l a e t a l . 1 9 7 3 ; S a c h s e t a l . 1 9 7 5 ) . A n o t h e r l i n e o f s u p p o r t comes f r o m s t u d i e s o f m a n g a n e s e t o x i c i t y w h i c h , i n m a n , c a n p r o d u c e a p e r m a n e n t n e u r o l o g i c a l d i s o r d e r w i t h c l i n i c a l symptoms and n e u r o p a t h o l o g i c a l and - 10 -n e u r o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s s i m i l a r t o i d i o p a t h i c PD (Mena e t a l . 1 9 6 7 ; B e r n h e i m e r e t a l . 1 9 7 3 ) . . D o n a l d s o n e t a l . ( 1 9 8 0 ) h a v e r e p o r t e d t h a t t h e 2+ a u t o x i d a t i o n o f d o p a m i n e was e n h a n c e d c o n s i d e r a b l y more b y Mn i o n s t h a n 2+ 2+ b y o t h e r b i o l o g i c a l l y - i m p o r t a n t d i v a l e n t c a t i o n s s u c h a s Cu , Zn , 2 + 2 + 2+ N i , Ca , and Mg . T h i s m a n g a n e s e - e n h a n c e d a u t o x i d a t i o n o f d o p a -m i n e was a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d g e n e r a t i o n o f t h e f r e e r a d i c a l s 0,f and HO- ( D o n a l d s o n e t a l . 1 9 8 0 ) . I f d o p a m i n e , an e n d o g e n o u s n e u r o t r a n s m i t t e r , i s a p o t e n t i a l s o u r c e o f r e a c t i v e f r e e r a d i c a l s , t h e n i t i s l i k e l y t h a t t h e b o d y w o u l d be e q u i p p e d w i t h d e f e n c e m e c h a n i s m s t h a t c a n d e t o x i f y o r s c a v e n g e t h e s e s p e c i e s . S u c h n a t u r a l d e f e n c e m e c h a n i s m s e x i s t , a n d i n c l u d e t h e e n z y m e s s u p e r o x i d e d i s m u -t a s e ( M c C o r d e t a l . 1 9 6 9 ) and c a t a l a s e ( B r a n n a n e t a l . 1 9 8 1 ) w h i c h i n a c t i -v a t e and H2O2 r e s p e c t i v e l y . A n o t h e r e n z y m e , g l u t a t h i o n e p e r o x i -d a s e , d e t o x i f i e s H2O2 a n d o t h e r p e r o x i d e s b y r e a c t i o n w i t h r e d u c e d g l u -t a t h i o n e ( G S H ) , w h i c h becomes o x i d i s e d t o i t s d i s u l f i d e G S S G , d u r i n g t h e p r o c e s s ( D e n e k e e t a l . 1 9 8 0 ; - S i n e t e t a l . 1 9 8 0 ) . I n t h i s r e a c t i o n , t h e l e v e l s o f GSH a r e b e l i e v e d t o be r a t e - l i m i t i n g . GSH i s a l s o an i m p o r t a n t c o m p o n e n t o f t h e g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e s y s t e m w h i c h c o n j u g a t e s GSH w i t h a w i d e v a r i e t y o f e l e c t r o p h i l e s , i n c l u d i n g d o p a m i n e s e m i q u i n o n e ( H a b i g e t a l . 1 9 7 4 ; J a k o b y e t a l . 1 9 8 0 ) . I n a d d i t i o n t o t h e s e e n z y m a t i c m e c h a n i s m s , a n t i o x i d a n t s s u c h as a s c o r b a t e : and a - t o c o p h e r o l p r o b a b l y a l s o may a c t a s r a d i c a l q u e n c h e r s i n v i v o ( T a p p e l 1 9 6 5 ; Hafeman e t a l . 1 9 7 7 ; S e r e g i e t a l . 1 9 7 8 ) . I n a c c o r d a n c e w i t h t h e a b o v e , i t i s s i g n i f i c a n t t h a t P e r r y , e t a l . ( 1 9 8 2 ) h a v e shown t h a t i n t h e n o r m a l a u t o p s i e d human b r a i n , t h e c o n t e n t o f GSH i n t h e SN i s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n i n o t h e r b r a i n r e g i o n s a n a l y s e d , a n d t h a t i n p a t i e n t s w i t h P D , t h e GSH c o n t e n t o f t h e SN i s s i g n i f i c a n t l y d e c r e a s e d - 11 -f r o m t h a t o f n o r m a l c o n t r o l s . T h i s o b s e r v a t i o n p r o m p t e d P e r r y e t a l . ( 1 9 8 2 ) t o p u t f o r t h t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e l o s s o f n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s i n PD r e s u l t s f r o m a r e g i o n a l GSH d e f i c i e n c y r e n d e r i n g t h i s r e g i o n v u l n e r a b l e t o o x i d a t i v e i n j u r y . A s we s h a l l s e e l a t e r , t h i s o b s e r v a t i o n was t h e i n i t i a l p o i n t o f much o f t h e work r e p o r t e d i n t h i s t h e s i s . P e r h a p s t h e m o s t p o p u l a r c u r r e n t h y p o t h e s i s as t o t h e e t i o l o g y o f PD i s t h a t t h e d i s e a s e o c c u r s as a r e s u l t o f e x p o s u r e t o e n v i r o n m e n t a l n e u r o t o x i n s . E a r l i e r , s u p p o r t f o r t h i s h y p o t h e s i s came f r o m t h e a b i l i t y o f c h r o n i c m a n -g a n e s e i n t o x i c a t i o n t o i n d u c e p a r k i n s o n i a n symptoms i n man (Mena e t a l . 1 9 6 7 ) . M o r e r e c e n t l y , M P T P , a c o n t a m i n a n t f o r m e d i n t h e s y n t h e s i s o f a m e p e r i d i n e a n a l o g , h a s b e e n f o u n d t o . damage d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r -o n s i n humans ( D a v i e s e t a l . 1 9 7 9 ; L a n g s t o n e t a l . 1 9 8 3 ; W r i g h t e t a l . 1 9 8 4 ) , s e v e r a l s p e c i e s o f monkeys ( B u r n s e t a l . 1 9 8 3 ; L a n g s t o n e t a l . 1 9 8 4 a ; J e n n e r e t a l . 1 9 8 4 ) , and m i c e ( H e i k k i l a e t a l . 1 9 8 4 a ) . T h e s e r e p o r t s s u g -g e s t t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e e n v i r o n m e n t may c o n t a i n a s e l e c t i v e n e u r o t o x i c s u b s t a n c e ( s ) s u c h t h a t e x p o s u r e c a n l e a d t o i r r e v e r s i b l e n e u r o n a l damage t o t h e n i g r o s t r i a t a l p a t h w a y . I n d e e d , C a l n e and L a n g s t o n ( 1 9 8 3 ) h a v e s u g g e s t e d t h a t PD i s due t o e x p o s u r e , t o one o r more e n v i r o n m e n t a l n e u r o t o x i n s many y e a r s b e f o r e t h e o n s e t o f s y m p t o m s * T h i s t h e n r e s u l t s i n a s i g n i f i c a n t l o s s o f n e u r o n s i n t h e p a r s c o m p a c t a o f t h e SN and p a r a l l e l d e c r e a s e s i n s t r i a t a l d o p a m i n e c o n t e n t , b u t n o t t o t h e e x t e n t t h a t i s n e c e s s a r y f o r symptoms t o b e g i n t o be m a n i f e s t e d . W i t h n o r m a l a g i n g , and t h e a s s o c i a t e d l o s s o f f u r -t h e r n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s , t h e c r i t i c a l t h r e s h o l d w o u l d be r e a c h e d and symptoms w o u l d a p p e a r . I n o t h e r w o r d s , a f t e r an e n v i r o n m e n t a l i n s u l t t o t h e n e r v o u s s y s t e m , n o r m a l a g i n g p r o v i d e s t h e ' c o u p de g r a c e ' . I n s u m m a r y , t h e r e f o r e , t h e e t i o l o g y o f i d i o p a t h i c PD r e m a i n s p r e s e n t l y a m a t t e r o f s p e c u l a t i o n . The o b s e r v a t i o n s t h a t MPTP c a n i n d u c e a s e l e c t i v e - 12 -l e s i o n o f t h e n i g r o s t r i a t a l p a t h w a y and p r o d u c e n e a r l y a l l o f t h e symptoms o f PD have l e n t s t r o n g s u p p o r t t o t h e h y p o t h e s i s t h a t e n v i r o n m e n t a l ( o r p o s -s i b l y e n d o g e n o u s ) n e u r o t o x i c f a c t o r s a r e i m p o r t a n t i n t h e p a t h o g e n e s i s o f P D . MPTP c o u l d w e l l a c t v i a f r e e r a d i c a l m e c h a n i s m s , a n d t h e amount o f GSH o r o t h e r s c a v e n g i n g s y s t e m s m i g h t be c r i t i c a l l y i m p o r t a n t i n a f f o r d i n g r e s i s t a n c e o r s u s c e p t i b i l i t y . Some o f t h e e x p e r i m e n t s t o be d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s u t i l i s e MPTP t o c r e a t e an a n i m a l m o d e l o f P D , and f o r t h i s r e a s -o n , an i n t r o d u c t i o n t o some o f t h e h i g h l i g h t s o f MPTP r e s e a r c h done b y o t h e r s i s i n o r d e r . MPTP i t s e l f i s n o t n e u r o t o x i c , b u t r e q u i r e s c o n v e r s i o n by t h e enzyme monoamine o x i d a s e B (MAO-B) t o one o r more t o x i c m e t a b o l i t e s ( M a r k e y e t a l . 1 9 8 4 ; H e i k k i l a e t a l . 1 9 8 4 b ; L a n g s t o n e t a l . 1 9 8 4 b ) . P r e t r e a t m e n t o f a n i -m a l s w i t h MAO-B i n h i b i t o r s s u c h as p a r g y l i n e and d e p r e n y l , b u t n o t t h e MAO-A i n h i b i t o r c l o r g y l i n e , c o m p l e t e l y p r e v e n t s t h e t o x i c i t y o f MPTP ( M a r k e y e t a l _ . 1 9 8 4 ; H e i k k i l a e t a l . 1 9 8 4 b , L a n g s t o n e t a l . 1 9 8 4 b ) . The t e r m i n a l m e t a b o l i t e o f MPTP, a f t e r o x i d a t i o n b y MAO-B, i s t h e p o s i t i v e l y c h a r g e d N - m e t h y l - 4 - p h e n y l p y r i d i n i u m i o n ( M P P + ) ( C a s t a g n o l i e t a l . 1 9 8 5 ) , w h i c h h a s b e e n shown t o d e s t r o y d o p a m i n e r g i c n e u r o n s when i n j e c t e d i n t o t h e b r a i n o f r a t s ( H e i k k i l a e t a l . 1 9 8 5 ) o r when a d d e d t o e x p l a n t s o f r a t e m b r y o n i c s u b -s t a n t i a n i g r a i n t i s s u e c u l t u r e ( C o h e n e t a l . 1 9 8 5 ) . I n t h e l a t t e r e x p e r i -m e n t , t h e n e u r o t o x i c i t y o f M P P + h a s b e e n r e p o r t e d t o be p r e v e n t e d b y d e -p r e n y l p r e t r e a t m e n t ( M y t i l i n e o u e t a l . 1 9 8 5 ) . I n c o n t r a s t t o t h i s , B r a d b u r y e t a l . ( 1 9 8 5 ) f o u n d t h a t i n t r a c e r e b r o v e n t r i c u l a r i n j e c t i o n s o f M P P + t o m i c e p r o d u c e d a more e x t e n s i v e n e u r o t o x i c i t y a f t e r d e p r e n y l a d m i n i s t r a t i o n . I n a d d i t i o n t o MAO-B i n h i b i t o r s , d o p a m i n e u p t a k e b l o c k e r s s u c h as m a z i n -d o l ( J a v i t c h e t a l . 1 9 8 5 a ) , a m f o l e n i c a c i d ( S u n d s t r o m e t a l . 1 9 8 5 ) , c o c a i n e ( M a y e r e t a l . 1 9 8 5 ) and GBR 1 3 0 9 8 ( P i l e b l a d e t a l . 1 9 8 5 ) c a n c o m p l e t e l y o r - 13 -p a r t i a l l y p r e v e n t t h e t o x i c i t y o f MPTP, s u g g e s t i n g t h e p o s s i b i l i t y o f an a c t i v e u p t a k e s y s t e m f o r MPTP i n t o d o p a m i n e r g i c n e u r o n s . H o w e v e r , MPTP i s f o u n d t o be a p o o r s u b s t r a t e f o r t h e d o p a m i n e u p t a k e s y s t e m o f r a t s t r i a t a l s y n a p t o s o m a l p r e p a r a t i o n s ( J a v i t c h e t a l . 1 9 8 5 b ) . M P P + on t h e o t h e r h a n d , i s t a k e n up a t t h e same r a t e as d o p a m i n e i t s e l f . T h i s s u g g e s t s t h a t MPTP may be c o n v e r t e d e x t r a n e u r o n a l l y ( p o s s i b l y i n g l i a l c e l l s w h i c h h a v e h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f MAO-B) t o M P P + , w h i c h t h e n g a i n s a c c e s s i n t o t h e d o p a -m i n e r g i c n e u r o n s w h e r e c e l l d e s t r u c t i o n o c c u r s . A r e c e n t p u b l i c a t i o n by H a d j i c o n s t a n t i n o u e t a l . ( 1 9 8 5 ) showed MPTP t o i n c r e a s e t h e a c e t y l c h o l i n e and d e c r e a s e t h e d o p a m i n e c o n t e n t s o f mouse s t r i -a t u m . B o t h r e s p o n s e s w e r e b l o c k e d b y p r e t r e a t m e n t w i t h t h e a n t i c h o l i n e r g i c s a t r o p i n e and t r i h e x y p h e n i d y l . S i n c e a t r o p i n e was n o t t h o u g h t t o be an i n h i -b i t o r e i t h e r o f MAO-B o r o f t h e d o p a m i n e u p t a k e s y s t e m , t h e s e a u t h o r s s u g -g e s t e d t h a t e x t e n s i v e a c t i v a t i o n o f c h o l i n e r g i c r e c e p t o r s m i g h t c o n t r i b u t e t o t h e d e g e n e r a t i o n o f d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s a f t e r MPTP a d m i n i -s t r a t i o n . To d a t e , , t h e r e f o r e , t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f MPTP t o x i c i t y i s unknown and u n c e r t a i n t i e s e x i s t as t o t h e p r e c i s e i d e n t i t y o f t h e n e u r o t o x i c m e t a b o l i t e ( s ) o f MPTP. - 14 -I I ) OUTLINE OF EXPERIMENTS AND METHODS The f o l l o w i n g e x p e r i m e n t s , t h e r a t i o n a l e o f w h i c h w i l l be d i s c u s s e d i n t h e i r r e s p e c t i v e s e c t i o n s o f RESULTS AND D I S C U S S I O N , w e r e p e r f o r m e d . T h e y d e a l t w i t h : i . The s e a r c h f o r an a n i m a l model o f P D . i i . The n e u r o t o x i c e f f e c t s o f MPTP i n C57 b l a c k m i c e , i i i . The p o s s i b l e m e c h a n i s m ( s ) o f MPTP n e u r o t o x i c i t y , i v . A t t e m p t s t o c h a n g e b r a i n t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t and t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e t o x i c i t y o f MPTP i s a l t e r e d u n d e r s u c h c o n d i t i o n s , v . The s e a r c h f o r t h e n a t u r a l n e u r o t o x i n ( s ) t h a t m i g h t be r e s p o n s i b l e f o r m o s t c a s e s o f i d i o p a t h i c P D . v i . The p o s s i b l e c a u s e ( s ) o f t h e p r o t e c t i v e e f f e c t o f s m o k i n g a g a i n s t t h e d e v e l o p m e n t o f P D . v i i . The l i k e l i h o o d t h a t i n c r e a s e d MAO-B a c t i v i t y i n t i s s u e s m i g h t be a f a c t o r i n t h e d e v e l o p m e n t o f P D . v i i i . The s t a t u s o f t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t a n d g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e a c t i v i t y i n t h e a u t o p s i e d b r a i n s o f . PD p a t i e n t s . S i n c e much o f t h i s w o r k h a s a l r e a d y b e e n p u b l i s h e d o r i s i n p r e s s , i t w o u l d be r e d u n d a n t t o r e p e a t t h e m e t h o d o l o g i e s i n d e t a i l h e r e . A s e r i e s o f a p p e n d i c e s a r e a t t a c h e d t o t h e end o f t h i s t h e s i s t o w h i c h t h e i n t e r e s t e d r e a d e r c a n r e f e r f o r e x p e r i m e n t a l d e t a i l s . I n g e n e r a l , t h e f o l l o w i n g p r o c e d u r e s w e r e common t o m o s t e x p e r i m e n t s : A n i m a l s w e r e s a c r i f i c e d b y c e r v i c a l d i s l o c a t i o n . R e l e v a n t b r a i n r e g i o n s w e r e t h e n d i s s e c t e d a c c o r d i n g t o t h e i n s t r u c t i o n s o f G l o w i n s k i e t a l . ( 1 9 6 6 ) . T h o s e b r a i n a r e a s t o be u s e d f o r t h e v a r i o u s n e u r o c h e m i c a l a n a l y s e s w e r e o w e i g h e d , and t h e n k e p t f r o z e n a t - 7 0 C p r i o r t o a n a l y s i s . B r a i n s t e m s f o r h i s t o l o g i c a l e x a m i n a t i o n w e r e i m m e r s e d i n b u f f e r e d 10% f o r m a l i n u p o n - 15 -e x c i s i o n . A n a l y s e s o f s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s h o m o v a n i l -l i c a c i d (HVA) and 3 , 4 - d i h y d r o x y p h e n y l a c e t i c a c i d ( D O P A C ) , n o r a d r e n a l i n e and i t s m e t a b o l i t e 3 - m e t h o x y - 4 - h y d r o x y - p h e n y l e t h y l e n e g l y c o l ( M H P G ) , and s e r o t o n -i n and i t s m e t a b o l i t e 5 - h y d r o x y i n d o l e a c e t i c a c i d ( 5 - H I A A ) , w e r e c a r r i e d o u t by HPLC w i t h e l e c t r o c h e m i c a l d e t e c t i o n as d e s c r i b e d i n A p p e n d i x C ( P e r r y e_t a H . , L i f e S c i . 3 6 : 1 2 3 3 - 1 2 3 8 , 1 9 8 5 ) . I n b r i e f , 25 y l o f e a c h s t r i a t a l s u p e r -n a t a n t was i n j e c t e d i n t o t h e HPLC s y s t e m , w h i c h i n c l u d e d a r e v e r s e - p h a s e c h r o m a t o g r a p h i c c o l u m n (ODS H y p e r s i l ) and an a m p e r o m e t r i c d e t e c t o r w i t h a g l a s s y c a r b o n e l e c t r o d e . The p o t e n t i a l was s e t a t + 0 . 7 V w i t h r e s p e c t t o an A g / A g C l r e f e r e n c e e l e c t r o d e . The m o b i l e p h a s e was an a q u e o u s s o l u t i o n o f 0 . 1 M NaH^PO^ c o n t a i n i n g 6 0 mg Na 2 EDTA and 100 mg s o d i u m o c t y l s u l f a t e p e r l i t e r . T h i s was a t pH 3 . 6 ± 0 . 0 1 . The f l o w r a t e o f t h e m o b i l e p h a s e was 1 m l / m i n . E x t e r n a l s t a n d a r d s w e r e i n j e c t e d a f t e r e v e r y s e c o n d t o f o u r t h s a m p l e o f s t r i a t u m t o c o m p e n s a t e f o r s l i g h t d e c r e a s e s i n s e n s i t i v i t y d u e t o e l e c t r o d e and c o l u m n c h a n g e s . The b r a i n c o n t e n t s o f t h e compounds w e r e c a l -c u l a t e d f r o m t h e a m p l i t u d e o f t h e p e a k . d e f 1 e c t i o n s t h e y p r o d u c e d on c h r o m a -t o g r a m s . M e a s u r e m e n t s o f t y r o s i n e h y d r o x y l a s e a c t i v i t y ( t h e r a t e - l i m i t i n g e n z y m e f o r t h e s y n t h e s i s o f d o p a m i n e ) w e r e b y a m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d o f Waymire e t - a l . ( 1 9 7 1 ) , i n w h i c h d i t h i o t h r e i t o l r e p l a c e d t h e 2 - m e r c a p t o e t h a n -0 1 . T o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t was d e t e r m i n e d e i t h e r b y t h e s p e c t r o p h o t o m e -t r y t e c h n i q u e o f T i e t z e ( 1 9 6 9 ) , o r on an a m i n o a c i d a n a l y s e r u s i n g t h e p r o -c e d u r e o f P e r r y e t a l . ( 1 9 6 8 , 1 9 8 1 ) . The l a t t e r was u s e d o n l y f o r s p e c i m e n s o f human b r a i n and o f r a t b r a i n i n t h e b u t h i o n i n e s u l f o x i m i n e e x p e r i m e n t , and f o r mouse l i v e r s i n t h e g l u t a t h i o n e m o n o e t h y l e s t e r e x p e r i m e n t . W h i l e t h e method o f T i e t z e ( 1 9 6 9 ) a l l o w e d m u l t i p l e a n a l y s e s , t h e a m i n o a c i d - 16 -a n a l y s e r t e c h n i q u e g a v e o n l y 1 r e s u l t p e r d a y . The m e t h o d o f L o w r y ( 1 9 6 1 ) was u s e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f p r o t e i n c o n t e n t , u s i n g b o v i n e s e r u m a l b u m i n as s t a n d a r d . F o r h i s t o l o g i c a l a n a l y s e s , s e r i a l c y r o s t a t s e c t i o n s o f 20 vim i n t h i c k -n e s s w e r e c u t f r o m t h e b r a i n s t e m s f i x e d i n f o r m a l i n . T h e s e s e c t i o n s w e r e t h e n s t a i n e d w i t h C r e s y l v i o l e t , and t h e number o f p e r i k a r y a i n t h e z o n a c o m p a c t a o f t h e SN was c o u n t e d a t 2 l e v e l s : i ) a t t h e l e v e l o f t h e i n t e r -p e d u n c u l a r n u c l e u s , and i i ) a t t h e l e v e l o f e m e r g e n c e o f t h e t h i r d c r a n i a l n e r v e . C e l l b o d i e s o f a b o u t 20 um i n l e n g t h , m o d e r a t e l y s t a i n e d and f u s i -f o r m i n s h a p e , w e r e c o u n t e d i n e a c h o f t h e 2 s e c t i o n s , and t h e c e l l c o u n t was a v e r a g e d f o r e a c h m o u s e . T h e s e a n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d b l i n d . A l l o t h e r m e t h o d s ( f o r e x a m p l e , a s s a y s o f MAO-B and g l u t a t h i o n e t r a n s -f e r a s e a c t i v i t i e s ) w i l l e i t h e r be d e s c r i b e d i n RESULTS AND D I S C U S S I O N , o r w i l l be r e f e r r e d t o i n t h e i r r e s p e c t i v e a p p e n d i c e s . U n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d , a l l s t a t i s t i c a l a n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d u s i n g t h e t w o - t a i l e d S t u d e n t ' s t - t e s t (P = 0 . 0 5 ) . - 17 -I I I ) RESULTS AND DISCUSSION I l l . i ) S e a r c h f o r an a n i m a l model o f P a r k i n s o n ' s d i s e a s e As d e s c r i b e d e a r l i e r , P e r r y e t a l . ( 1 9 8 2 ) f o u n d t h a t t h e mean c o n t e n t o f r e d u c e d g l u t a t h i o n e (GSH) was s i g n i f i c a n t l y l o w e r i n t h e SN o f a u t o p s i e d PD b r a i n s when c o m p a r e d t o c o n t r o l s . S i n c e GSH i s a k e y s c a v e n g e r o f r e a c t i v e o x i d a n t s , P e r r y e t a l . ( 1 9 8 2 ) a d v a n c e d t h e h y p o t h e s i s t h a t d e p l e t i o n o f GSH i n t h e SN makes t h i s r e g i o n s u s c e p t i b l e t o o x i d a t i v e i n j u r y . The r e s u l t c o u l d be m a r k e d n e u r o n a l l o s s and c o n s e q u e n t symptoms o f P D . I f n i g r a l GSH d e f i c i e n c y i s a c o n t r i b u t i n g f a c t o r i n t h e d e v e l o p m e n t o f P D , t h e n t r e a t m e n t w i t h a n t i o x i d a n t d r u g s s u c h as a - t o c o p h e r o l o r a s c o r b i c a c i d m i g h t h a v e v a l u e i n t h e p r e v e n t i o n o f n i g r o s t r i a t a l n e u r o n a l l o s s and s u b s e q u e n t o n s e t o f p a r k i n s o n i a n s y m p t o m s . Compounds t h a t c a n e l e v a t e b r a i n GSH c o n t e n t m i g h t a l s o be u s e f u l . In p a t i e n t s a l r e a d y a f f l i c t e d w i t h t h e d i s e a s e , a n t i o x i d a n t d r u g s m i g h t s t o p f u r t h e r l o s s o f n e u r o n s ( a s s u m i n g t h a t t h e e x p o s u r e t o n e u r o t o x i c f a c t o r ( s ) c o n t i n u e s e v e n a f t e r t h e symptoms a p p e a r ) , and t h e r e f o r e m i g h t s l o w t h e p r o g r e s s i o n o f t h e d i s e a s e . T h e s e p o t e n t i a l t r e a t m e n t s t r a t e g i e s a r e o f i m p o r t a n c e , s i n c e t h e d r u g s p r e s e n t l y u s e d t o t r e a t PD e v e n t u a l l y f a i l . To t e s t t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e l o s s o f n i g r a l GSH c o n t r i b u t e s t o t h e d e v e l o p m e n t o f P D , an a n i m a l model . t h a t r e s e m b l e s t h e d i s e a s e i n n e u r o p a t h o -l o g i c a l , n e u r o c h e m i c a l , p h a r m a c o l o g i c a l , and p e r h a p s b e h a v i o r a l c h a r a c t e r i s -t i c s , i s f i r s t r e q u i r e d . By m a n i p u l a t i n g n i g r a l GSH c o n t e n t ( d e p l e t i n g o r r e p l e n i s h i n g ) i n s u c h a m o d e l , t h e e t i o l o g i c a l i m p o r t a n c e o f t h i s e n d o g e n o u s compound i n PD m i g h t be d e t e r m i n e d . B e f o r e t h e t o x i c i t y o f MPTP was d i s c o v e r e d , t h e n e u r o t o x i n 6 - h y d r o x y -d o p a m i n e was u s e d q u i t e w i d e l y t o p r o d u c e a n i m a l m o d e l s o f PD ( T h o e n e n e t a l . 1 9 7 3 ; S c h u l t z 1 9 8 2 ) . H o w e v e r , we d e c i d e d n o t t o u s e t h i s n e u r o t o x i n - 18 -b e c a u s e o f t h e f o l l o w i n g p r o b l e m s w i t h i t s u s e . I n j e c t e d p e r i p h e r a l l y , i t does n o t p e n e t r a t e t h e b l o o d - b r a i n b a r r i e r ( T h o e n e n e t a l . 1 9 7 3 ; S c h u l t z 1 9 8 2 ) . I n j e c t i o n s m u s t be made d i r e c t l y i n t o t h e b r a i n . I n t r a c e r e b r o v e n -t r i c u l a r i n j e c t i o n s , w h i c h a r e r e l a t i v e l y s i m p l e t o p e r f o r m , p r o d u c e d e g e n -e r a t i v e e f f e c t s on a l l c a t e c h o l a m i n e - c o n t a i n i n g n e u r o n s i n a d d i t i o n t o t h e p a t h w a y o f i n t e r e s t , t h e d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l t r a c t . I n d e e d , d o p a -m i n e r g i c n e u r o n s a p p e a r l e s s s u s c e p t i b l e t o damage t h a n t h o s e c o n t a i n i n g n o r a d r e n a l i n e ( U r e t s k y e t a l . 1 9 7 0 ; S a c h s e t a l . 1 9 7 2 ) . To a c h i e v e g r e a t e r s e l e c t i v i t y w i t h 6 - h y d r o x y d o p a m i n e , l o c a l i n t r a c e r e b r a l i n j e c t i o n s ( t h a t i s , i n t o s p e c i f i c b r a i n n u c l e i ) a r e n e c e s s a r y . H o w e v e r , t h e s e a r e d i f f i c u l t t o p e r f o r m r e l i a b l y and a c c u r a t e l y i n s m a l l a n i m a l s . S i n c e d o p a m i n e may be n e u r o t o x i c v i a t h e m e t a b o l i c g e n e r a t i o n o f r e a c t -i v e f r e e r a d i c a l s ( T s e e t a l . 1 9 7 6 ; W i c k 1 9 7 8 ; Graham e t a l . 1 9 7 8 ; S i n e t e t a l . 1 9 8 0 ; M a k e r e t a l . 1 9 8 1 ; M o l d e u s e t a l . 1 9 8 3 ; G r a h a m 1 9 8 4 ) , i t seemed p o s s i b l e t h a t i f r a t s w e r e c h r o n i c a l l y f e d l a r g e a m o u n t s o f L-DOPA and c a r b i d o p a t o p r o d u c e a s u s t a i n e d e l e v a t i o n o f d o p a m i n e c o n t e n t i n t h e b r a i n , d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s m i g h t be d e s t r o y e d . I n a d d i t i o n , D L - b u t h i o n i n e - S , R , - s u l f o x i m i n e ( B S O ) , a compound w h i c h b l o c k s GSH s y n t h e s i s b y s p e c i f i c a l l y i n h i b i t i n g y - g l u t a m y l - c y s t e i n e s y n t h e t a s e , t h e r a t e - l i m i t i n g enzyme f o r GSH s y n t h e s i s ( G r i f f i t h e t a l . 1 9 7 9 b ) , was u s e d t o t e s t w h e t h e r o r n o t t h e p r i o r d e p l e t i o n o f GSH c o u l d p o t e n t i a t e t h e t o x i c i t y o f L - D O P A . T a b l e 1 shows t h a t t r e a t m e n t f o r 120 d a y s w i t h a m a x i m a l l y - t o l e r a t e d o r a l d o s e o f L-DOPA ( a p p r o x i m a t e l y 0 . 9 4 g / k g / d a y ) and c a r b i d o p a , w i t h o r w i t h o u t BSO p r e t r e a t m e n t , f a i l e d t o p r o d u c e n e u r o c h e m i c a l e v i d e n c e o f damage t o t h e n i g r o s t r i a t a l d o p a m i n e r g i c t r a c t i n r a t s . N o r m a l r e s u l t s w e r e a l s o o b t a i n e d f r o m b e h a v i o r a l and h i s t o l o g i c a l e x a m i n a t i o n s . T h e m e t h o d s u s e d a r e d e s c r i b e d i n d e t a i l i n A p p e n d i x A ( P e r r y e t a l . , J . N e u r o c h e m . 4 3 : 9 9 0 -9 9 3 , 1 9 8 4 ) . - 19 -T a b l e 1 . T y r o s i n e h y d r o x y l a s e (TH) a c t i v i t y and c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s i n r a t s t r i a t u m a f t e r c h r o n i c L-DOPA and c a r b i d o p a t r e a t m e n t D r u g t r e a t m e n t TH D o p a m i n e DOPAC HVA o f a n i m a l s a c t i v i t y , , , . . x ( u q / q w e t w e i q h t ) ( n m o l / h / m g p r o t e i n ) ^ 3 a 3 ' L -DOPA, c a r b i d o p a , 2 . 7 7 ± 0 . 1 1 1 5 . 0 ± 0 . 5 BSO ( 1 5 ) ( 1 5 ) L-DOPA, c a r b i d o p a 2 . 6 3 ± 0 . 1 4 1 6 . 4 ± 0 . 3 1 . 9 6 ± 0 . 2 6 0 . 8 2 ± 0 . 0 5 (19) ( 1 9 ) ( 8 ) ( 8 ) BSO 2 . 8 5 ± 0 . 0 8 1 6 . 7 ± 0 . 6 ( 1 0 ) ( 1 0 ) U n t r e a t e d c o n t r o l s 2 . 7 0 ± 0 . 1 0 1 6 . 5 ± 0 . 6 1 . 7 9 ± 0 . 1 1 0 . 8 5 ± 0 . 0 5 ( 1 5 ) ( 1 5 ) ( 8 ) ( 8 ) V a l u e s a r e mean ± S E M , w i t h number o f a n i m a l s i n b r a c k e t s . None o f t h e means d i f f e r s i g n i f i c a n t l y . T a b l e 2 shows t h a t a l t h o u g h a d m i n i s t r a t i o n o f o r a l 2 0 mM BSO t o r a t s f o r up t o 14 weeks d i d c a u s e a s u b s t a n t i a l d e c r e a s e i n t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t i n t h e l i v e r , t h e b r a i n l e v e l s w e r e n o t d i f f e r e n t f r o m t h o s e o f c o n t r o l s . T h u s , i n t h e B S O - p r e t r e a t e d r a t s , t h e f a i l u r e o f L-DOPA and c a r b i d o p a a d m i n -i s t r a t i o n t o p r o d u c e a d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l l e s i o n may r e f l e c t t h e i n a b i l i t y o f BSO t o d e c r e a s e b r a i n GSH c o n t e n t . The r e s u l t s shown i n T a b l e 2 a r e p o o l e d d a t a f r o m a n i m a l s s a c r i f i c e d a t 2 , 4 , 7 , 10 o r 14 w e e k s a f t e r BSO a d m i n i s t r a t i o n had s t a r t e d . T h e y w e r e p o o l e d b e c a u s e t h e v a l u e s o b t a i n -ed a t e a c h p o i n t o f s a c r i f i c e d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m o n e a n o t h e r . - 2 0 -T a b l e 2 . E f f e c t s o f BSO on t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t s o f b r a i n and l i v e r o f r a t s C o n t r o l BSO W h o l e b r a i n 2 . 2 ± 0 . 1 2 . 1 ± 0 . 1 ( 1 0 ) ( 1 0 ) L i v e r 2 . 8 ± 0 . 7 0 . 3 ± 0 . 1 J (5) (6) V a l u e s a r e u m o l / g w e t w e i g h t , mean ± S E M , w i t h t h e number o f a n i -m a l s a n a l y s e d shown i n p a r e n t h e s e s . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i f i -. c a n t l y f r o m c o n t r o l s : < 0 . 0 1 . Why was BSO i n e f f e c t i v e a s a b r a i n g l u t a t h i o n e - d e p l e t i n g a g e n t ? P o s s i b l y , t h i s compound was u n a b l e t o p e n e t r a t e t h e b l o o d - b r a i n b a r r i e r . H o w e v e r , a c o n g e n e r o f BSO t h a t l a c k s a m e t h y l e n e g r o u p , p r o t h i o n i n e s u l f o x -i m i n e , was r e p o r t e d t o r e g u l a r l y e l i c i t c o n v u l s i o n s i n m i c e ( G r i f f i t h e t a l . 1 9 7 9 a ) , i m p l y i n g t h a t t h e l a t t e r compound was a b l e t o g a i n a c c e s s i n t o t h e b r a i n . BSO, w i t h g r e a t e r l i p i d s o l u b i l i t y c o n f e r r e d b y t h e a d d i t i o n a l m e t h y l e n e g r o u p , s h o u l d h a v e e n t e r e d t h e b r a i n more r e a d i l y . U n f o r t u n a t e l y , a t e c h n i q u e t o d e t e r m i n e BSO c o n c e n t r a t i o n s i n t h e r a t b r a i n a f t e r a d m i n i -s t r a t i o n o f t h i s d r u g was n o t a v a i l a b l e s o t h a t t h e i s s u e c a n n o t be r e s o l v e d c o n c l u s i v e l y a t t h i s t i m e . In a n o t h e r a t t e m p t t o p r o d u c e an a n i m a l m o d e l o f P D , r a t s w e r e i n j e c t e d r e p e a t e d l y w i t h h i g h d o s e s o f m e t h y l c y c l o p e n t a d i e n y l m a n g a n e s e t r i c a r b o n y l (MMT), a compound w h i c h h a s b e e n r e p o r t e d t o d e c r e a s e t h e s t r i a t a l c o n t e n t o f d o p a m i n e i n m i c e a f t e r o n l y 11 i n j e c t i o n s o v e r a 21 d a y p e r i o d ( G i a n u t s o s e t a l . 1 9 8 2 ) . T h i s e x p e r i m e n t was o f a d d i t i o n a l i n t e r e s t b e c a u s e i n m a n , c h r o n i c m a n g a n e s e a d m i n i s t r a t i o n p r o d u c e s an i n i t i a l p h a s e o f p y s c h i a t r i c d i s t u r b a n c e r e m i n i s c e n t o f s c h i z o p h r e n i a ; t h e p y s c h o s i s t h e n s u b s i d e s , t o be f o l l o w e d b y a p e r m a n e n t n e u r o l o g i c a l d i s o r d e r w i t h symptoms and n e u r o -- 21 -p a t h o l o g i c a l and n e u r o c h e m i c a l f i n d i n g s s i m i l a r t o t h o s e s e e n i n i d i o p a t h i c PD ( B e r n h e i m e r e t a l . 1 9 7 3 ; Mena e t a l . 1 9 6 7 ) . F o r t h e e x p e r i m e n t a l d e s i g n , r e f e r t o A p p e n d i x B ( Y o n g e t a l . , N e u r o t o x - i c o l o g y 7 : 1 9 - 2 4 , 1 9 8 6 ) . T a b l e 3 shows t h a t i m m e d i a t e l y a f t e r t h e p e r i o d o f o r g a n i c manganese a d m i n i s t r a t i o n (24 i n j e c t i o n s o v e r 48 d a y s ) , c e r e b e l l a r manganese c o n t e n t was e l e v a t e d more t h a n 2 - f o l d . H o w e v e r , 1 month a f t e r t h e l a s t o f 75 i n j e c t i o n s g i v e n o v e r a 5 - m o n t h p e r i o d , t h e b r a i n o f m a n g a n e s e -t r e a t e d a n i m a l s had a mean m a n g a n e s e c o n t e n t o n l y s l i g h t l y h i g h e r t h a n t h o s e o f c o n t r o l s . P r e s u m a b l y , t h i s was due t o r a p i d c l e a r i n g o f t h e m a n g a n e s e compound f r o m t h e b r a i n . T a b l e 3 . M a n g a n e s e c o n t e n t s o f r a t b r a i n a f t e r MMT t r e a t m e n t A n i m a l s C u m u l a t i v e MMT d o s e . . O g / k g ) . . M a n g a n e s e % i n c r e a s e o v e r c o n t e n t c o r r e s p o n d i n g U g / g d r y w t ) c o n t r o l s . . G r o u p 1 : C o n t r o l s , 24 i n j e c t i o n s , k i l l e d 24 h a f t e r l a s t i n j e c t i o n ( 8 ) G r o u p 3 : MMT, 1055 24 i n j e c t i o n s , k i l l e d 24 h a f t e r l a s t i n j e c t i o n ( 1 3 ) G r o u p 2 : C o n t r o l s , 75 i n j e c t i o n s , k i l l e d 1 mo a f t e r l a s t i n j e c t i o n ( 1 0 ) G r o u p 4 : MMT, 3 6 0 5 75 i n j e c t i o n s , k i l l e d 1 mo a f t e r l a s t i n j e c t i o n ( 1 1 ) 1 . 7 1 ± 0 . 0 3 4 . 5 9 ± 0 . 1 8 2 . 4 4 ± 0 . 1 5 2 . 8 8 ± 0 . 1 1 § 168 18 V a l u e s a r e mean ± S E M , w i t h number o f a n i m a l s shown i n p a r e n -t h e s e s . B r a i n r e g i o n u s e d f o r a n a l y s i s o f G r o u p s 1 and 3 r a t s was t h e c e r e b e l l u m , whj^le t h a t f o r G r o u p s 2 and 4 a n i -m a l s was o c c i p i t a l c o r t e x . P < 0 . 0 0 1 ; § P < 0 . 0 5 . - 22 -The n e u r o c h e m i c a l r e s u l t s , t a b u l a t e d i n T a b l e 4 , i n d i c a t e t h a t t h e r e was no r e d u c t i o n i n s t r i a t a l d o p a m i n e c o n t e n t o r i n t y r o s i n e h y d r o x y l a s e a c t i v -i t y , e i t h e r i m m e d i a t e l y o r 1 month a f t e r t h e MMT i n j e c t i o n s had e n d e d . The l a t t e r g r o u p o f a n i m a l s was u s e d i n o r d e r t o a s s e s s w h e t h e r a n y c h a n g e s w h i c h m i g h t h a v e o c c u r r e d d u r i n g t h e p e r i o d o f e x p o s u r e w e r e r e v e r s i b l e upon d r u g w i t h d r a w a l . P e r i k a r y a i n t h e S N , o b s e r v e d h i s t o l o g i c a l l y , w e r e a l s o n o r m a l . T h u s , c h r o n i c a d m i n i s t r a t i o n o f l a r g e a m o u n t s o f o r g a n i c m a n g a n e s e was n o t t o x i c t o d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s o f r a t s . T a b l e 4 . T y r o s i n e h y d r o x y l a s e a c t i v i t y and c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s i n r a t s t r i a t u m a f t e r MMT t r e a t m e n t A n i m a l s T y r o s i n e h y d r o x y l a s e ( n m p l / h / m g p r o t e i n ) Dopamine DOPAC HVA ( y g / 9 w e t w e i g h t ) G r o u p 1 ( 8 ) G r o u p 3 ( 1 3 ) G r o u p 2 ( 1 0 ) G r o u p 4 (11) 2 . 5 ± 0 . 1 2 . 5 ± 0 . 1 2 . 7 ± 0 . 2 2 . 8 ± 0 . 2 1 1 . 2 ± 0 . 4 1 1 . 4 ± 0 . 4 8 . 5 ± 0 . 4 8 . 2 ± 0 . 3 1 . 4 ± 0 . 1 0 . 9 ± 0 . 0 1 . 2 ± O.f 0 . 8 = 0 . 0 3 . 3 ± 0 . 1 1 . 2 ± 0 . 0 3 . 2 ± 0 . 1 1 . 2 ± 0 . 0 V a l u e s a r e mean ± S E M , w i t h number o f a n i m a l s i n b r a c k e t s . SEM l e s s t h a n 0 . 0 5 i s shown as 0 . 0 . The e x p e r i m e n t a l c h a r a c -t e r i s t i c s o f t h e v a r i o u s g r o u p s a r e t h e same a s t h o s e shown on T a b l e 3 . . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m t h e i r r e -s p e c t i v e c o n t r o l s : § P < 0 . 0 5 . P o s s i b l e r e a s o n s f o r t h e f a i l u r e t o p r o d u c e a m o d e l o f PD i n t h e r a t b y c h r o n i c a d m i n i s t r a t i o n o f MMT h a v e b e e n d i s c u s s e d i n A p p e n d i x B . H e r e , my c o l l e a g u e s and I s u g g e s t t h a t t h e e l e v a t e d m a n g a n e s e c o n t e n t i n t h e b r a i n s o f t r e a t e d r a t s was o f t h e o r g a n i c r a t h e r t h a n t h e i n o r g a n i c f o r m , a l t h o u g h o u r t e c h n i q u e o f m e a s u r e m e n t c o u l d n o t d i f f e r e n t i a t e b e t w e e n t h e m . T h e n e u r o t o x i c i t y o f m a n g a n e s e h a s b e e n s u g g e s t e d t o r e s i d e i n t h e a b i l i t y o f i n o r g a n i c Mn t o o x i d i s e t o Mn (Graham 1 9 8 4 ; D o n a l d s o n e t a l . 1 9 8 2 ) . - 2 3 -The l a t t e r m i g h t t h e n o x i d i s e d o p a m i n e by o n e - e l e c t r o n t r a n s f e r r e a c t i o n s , g e n e r a t i n g d o p a m i n e s e m i q u i n o n e s and o t h e r f r e e r a d i c a l s t h a t h a v e t h e p o t e n t i a l t o damage n e u r o n s . O r g a n i c m a n g a n e s e m i g h t n o t h a v e t h e c a p a b i l -i t y t o g e n e r a t e f r e e r a d i c a l s as- h a s been s u g g e s t e d f o r i n o r g a n i c m a n g a n e s e . As an e x t e n s i o n o f t h e a b o v e e x p e r i m e n t s , i t w o u l d be i n t e r e s t i n g t o t e s t t h e p o s s i b i l i t y t h a t s i m u l t a n e o u s a d m i n i s t r a t i o n o f L - D O P A / c a r b i d o p a w i t h an i n o r g a n i c m a n g a n e s e compound m i g h t p r o d u c e d e g e n e r a t i o n o f t h e n i g r o s t r i a t a l p a t h w a y i n r a t s . T h e r e p o r t s t h a t MPTP was t o x i c t o d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s o f humans and l o w e r p r i m a t e s p r o m p t e d t h e n e x t s e r i e s o f e x p e r i m e n t s . E a r l y i n t h e MPTP s a g a , b e f o r e i t was d e m o n s t r a t e d t h a t MPTP was t o x i c t o n i g r o s t r i -a t a l n e u r o n s i n m i c e ( H e i k k i l a e t a l • 1 9 8 4 a ) , e f f o r t s t o p r o d u c e a m o d e l o f PD i n s m a l l l a b o r a t o r y r o d e n t s had b e e n g e n e r a l l y u n s u c c e s s f u l ( K o l a t a 1 9 8 3 ; C h i u e h e t a l . 1 9 8 3 ; S a h g a l e t a l . 1 9 8 4 ) . A p o s s i b l e e x c e p t i o n was t h e r e -p o r t e d - 5 0 % r e d u c t i o n o f s t r i a t a l d o p a m i n e c o n t e n t i n g u i n e a p i g s c h r o n i c a l l y t r e a t e d w i t h MPTP ( C h i u e h e t a l . 1 9 8 3 ) . S i n c e a s m a l l e r , n o n - p r i m a t e a n i m a l m o d e l w o u l d o f f e r many a d v a n t a g e s , p a r t i c u l a r l y i n t e r m s o f c o s t and e a s e o f h a n d l i n g , I a t t e m p t e d t o p r o d u c e a model o f PD i n g u i n e a p i g s made s c o r b u t i c ( l i k e p r i m a t e s , g u i n e a p i g s c a n n o t s y n t h e s i z e t h e i r own a s c o r b a t e ) a n d t h e n t r e a t e d w i t h MPTP. The hope was t h a t t h e l a c k o f a s c o r b i c a c i d , an a n t i o x i -d a n t , m i g h t r e n d e r t h i s s p e c i e s more s u s c e p t i b l e t o t h e n e u r o t o x i c e f f e c t s o f MPTP. The e x p e r i m e n t a l p r o t o c o l s a r e d e s c r i b e d i n d e t a i l i n A p p e n d i x C ( P e r r y e t a l . L i f e S c i . 3 6 : 1 2 3 3 - 1 2 3 8 , 1 9 8 5 ) . A n i m a l s l o s t a b o u t 10% o f t h e i r i n i t i a l b o d y w e i g h t w h i l e on t h e a s c o r -b a t e - d e f i c i e n t d i e t . The r a t e o f w e i g h t l o s s was s i m i l a r f o r t h e MPTP-t r e a t e d and c o n t r o l s c o r b u t i c a n i m a l s . T h e i r w e i g h t s b e g a n t o s t a b i l i z e o r i n c r e a s e o n l y a f t e r a r e s c u e a s c o r b a t e i n j e c t i o n ( 2 0 m g / a n i m a l ) was g i v e n . - 24 -C l e a r l y , t h e a n i m a l s w e r e r e n d e r e d s e v e r e l y s c o r b u t i c d u r i n g t h e i r p e r i o d on t h e a s c o r b a t e - f r e e d i e t . B o t h n o r m a l and s c o r b u t i c a n i m a l s i n j e c t e d w i t h 8 mg/kg MPTP f a i l e d t o show a n y n e u r o l o g i c a l s i g n s o t h e r t h a n s e d a t i o n and h y p o t o n i a , w h i c h l a s t e d f o r a b o u t 4 h a f t e r e a c h i n j e c t i o n . The n e u r o c h e m i c a l r e s u l t s i n T a b l e s 5 and 6 i n d i c a t e t h a t g u i n e a p i g s , s c o r b u t i c o r n o t , a r e n o t h i g h l y s u s c e p t i b l e t o t h e n e u r o t o x i c e f f e c t s o f MPTP. T a b l e 5 . S t r i a t a l p a r a m e t e r s o f n o n - s c o r b u t i c g u i n e a p i g s i n j e c t e d w i t h MPTP (8 m g / k g ) f o r 10 d a y s P a r a m e t e r C o n t r o l MPTP MPTP ( k i l l e d 2 h a f t e r ( k i l l e d 30 d a f t e r l a s t i n j e c t i o n ) l a s t i n j e c t i o n ) ( 8 ) ( 4 ) ( 9 ) T y r o s i n e 7 . 5 ± 0 . 3 6 . 7 ± 0 . 3 6 . 6 ± 0 . 3 h y d r o x y l a s e Dopamine 4 . 8 ± 0 . 6 6 . 1 ± 0 . 6 5 . 3 ± 0 . 6 DOPAC 3 . 4 ± 0 . 3 1 . 5 ± 0 . 3 * 2 . 9 ± 0 . 3 HVA 3 . 0 ± 0 . 2 2 . 4 ± 0 . 5 3 . 0 ± 0 . 3 N o r a d r e n a l i n e 0 . 0 8 ± 0 . 0 2 0 . 0 7 ± 0 . 0 0 0 . 0 7 ± 0 . 0 2 5 - H I A A 0 . 2 1 ± 0 . 0 2 0 . 3 6 ± 0 . 1 0 0 . 2 7 ± 0 . 0 4 T y r o s i n e h y d r o x y l a s e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d i n n m o l / h / m g p r o -t e i n , w h i l e c o n t e n t s o f n e u r o t r a n s m i t t e r s and m e t a b o l i t e s a r e i n y g / g w e t w e i g h t . A l l v a l u e s a r e mean ± S E M , w i t h number o f a n i m a l s i n d i c a t e d i n p a r e n t h e s e s . SEM l e s s t h a n 0 . 0 0 5 a r e shown as 0 . 0 . S i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l s : + P < 0 . 0 1 . - 25 -T a b l e 6 . E f f e c t s o f 15 d a i l y i n j e c t i o n s o f MPTP (8 mg/kg) on n e u r o c h e m i c a l p a r a m e t e r s o f s c o r b u t i c g u i n e a p i g s P a r a m e t e r A n i m a l s k i l l e d 24 h a f t e r MPTP i n j e c t i o n s A n i m a l s k i l l e d 60 d a f t e r MPTP i n j e c t i o n s C o n t r o l MPTP C o n t r o l MPTP . . . ( 8 ) ( 8 ) . ( 1 5 ) . . ( 1 5 ) . CAT T y r o s i n e h y d r o x y l a s e Dopamine DOPAC HVA N o r a d r e n a l i n e 5-HIAA 6 . 3 ± 0 . 2 9 . 0 ± 0 . 4 1 . 4 ± 0 . 1 1 . 9 ± 0 . 2 0 . 2 8 ± 0 . 0 3 0 . 1 1 ± 0 . 0 2 4 . 9 ± 0 . 2 * 7 . 6 ± 0 . 6 § 1 . 3 ± 0 . 1 2 . 1 ± 0 . 3 0 . 1 9 ± 0 . 0 2 § 0 . 1 3 ± 0 . 0 2 1 1 . 2 ± 0 . 5 5 . 5 ± 0 . 1 6 . 1 ± 0 . 7 3 . 4 ± 0 . 1 4 . 2 ± 0 . 3 0 . 1 4 ± 0 . 0 3 0 . 1 7 ± 0 . 0 2 1 1 . 0 ± 0 . 5 4 . 3 ± 0 . 1 § 5 . 0 ± 0 . 3 2 . 6 ± 0 . 1 § 2 . 9 ± 0 . 2 § 0 . 1 7 ± 0 . 0 2 0 . 1 3 ± 0 . 0 2 C h o i i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e (CAT) a c t i v i t y ( n m o l / 1 0 min/mg p r o t e i n ) was m e a s u r e d i n t h e f r o n t a l c o r t e x w h i l e a l l o t h e r a n a l y s e s w e r e o f t h e s t r i a t u m . T y r o s i n e h y d r o x y l a s e a c t i v i t y i s i n n m o l / h / m g p r o t e i n . N e u r o t r a n s m i t t e r s and m e t a b o l i t e s a r e e x p r e s s e d i n y g / g w e t w e i g h t . V a l u e s a r e mean ± SEM w i t h t h e number o f a n i m a l s shown i n p a r e n t h e s e s . V a l u e s t h a t d i f f e r f r o m c o n t r o l s k i l l e d a t t h e same t i m e : * P < 0 . 0 0 1 ; § P < 0 . 0 5 . The a p p a r e n t r e s i s t a n c e o f g u i n e a p i g s ( r e l a t i v e t o p r i m a t e s , f o r e x a m -p l e ) t o t h e n e u r o t o x i c e f f e c t s o f MPTP r e m a i n s p r e s e n t l y u n e x p l a i n e d . I t c o u l d be t h a t t h e m e t a b o l i c p a t h w a y ( s ) o r t h e l o c a l i s a t i o n and p e r s i s t e n c e o f MPTP a r e d i f f e r e n t i n g u i n e a p i g s . In a n y e v e n t , t h e g u i n e a p i g d o e s n o t a p p e a r t o be a s u i t a b l e s m a l l a n i m a l f o r M P T P - i n d u c e d p a r k i n s o n i s m . 1 1 1 . i i ) S t u d i e s o f t h e n e u r o t o x i c e f f e c t s o f MPTP  i n C57 b l a c k m i c e F o l l o w i n g t h e r e p o r t b y H e i k k i l a e t a l . ( 1 9 8 4 a ) t h a t C57 b l a c k m i c e w e r e s u s c e p t i b l e t o t h e n e u r o t o x i c e f f e c t s o f MPTP, v a r i o u s e x p e r i m e n t s u s i n g t h i s s t r a i n o f m i c e w e r e p u r s u e d . T h e s e b e g a n w i t h an e x a m i n a t i o n o f t h e e f f e c t s o f MPTP on t h e d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s o f t h e s e m i c e . - 26 -E x p e r i m e n t s w e r e d e s i g n e d t o a s s e s s : 1) t h e t i m e c o u r s e o f s t r i a t a l d o p a -m i n e d e p l e t i o n a f t e r a s i n g l e i n j e c t i o n o f MPTP, 2) t h e e x t e n t o f n e u r o n a l l o s s i n t h e z o n a c o m p a c t a o f t h e S N , 3 ) t h e d e g r e e o f s t r i a t a l d o p a m i n e d e -p l e t i o n c a u s e d by d i f f e r e n t d o s a g e r e g i m e n s o f MPTP, and 4 ) t h e s e l e c t i v i t y o f MPTP f o r t h e d e p l e t i o n o f s t r i a t a l d o p a m i n e c o n t e n t as o p p o s e d t o o t h e r n e u r o t r a n s m i t t e r . a m i n e s . A l l a d m i n i s t r a t i o n s o f MPTP w e r e b y t h e s u b c u t a n e -o u s ( s c ) r o u t e . The e x p e r i m e n t a l p r o t o c o l s u s e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f 1 , 2 , a n d 3 a b o v e a r e d e s c r i b e d i n A p p e n d i x D ( P e r r y e t a l . N e u r o s c i ; L e t t . 1 2 : 3 2 1 — 3 2 6 , - 1 9 8 5 ) . To a s s e s s t h e s e l e c t i v i t y o f a c t i o n o f MPTP, C57 b l a c k m i c e w e r e g i v e n a s i n g l e s c i n j e c t i o n o f 4 0 m g / k g , and t h e n w e r e s a c r i f i c e d a t 3 0 m i n , 2 . 5 h and 1 month a f t e r t h e i n j e c t i o n . In a d d i t i o n t o c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s 2 m e t a b o l i t e s DOPAC and HVA, s t r i a t a l c o n t e n t s o f s e r o t o n i n and i t s m e t a b o l i t e 5 - H I A A , a n d o f n o r a d r e n a l i n e a n d i t s m e t a b o l i t e MHPG, w e r e m e a s u r e d . B e h a v i o r a l o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e d s i g n s o f m o t o r i m p a i r m e n t as e a r l y a s 2 0 m i n u t e s a f t e r an i n j e c t i o n o f 4 0 mg/kg MPTP. T h e s e c o n s i s t e d o f s e d a t i o n ( t h o u g h a n i m a l s moved when d i s t u r b e d ) , s l i g h t t r e m o r s , a n d d i f f i c u l t y i n r e t r a c t i n g e x t e n d e d h i n d l i m b s . M a x i m a l i m p a i r m e n t o c c u r r e d b e t w e e n 2 and 2 . 5 h a f t e r t h e i n j e c t i o n . A t t h i s t i m e , t r e m o r s c o u l d be r e a d i l y o b s e r v e d and m i c e had d i s t i n c t d i f f i c u l t y i n i n i t i a t i n g movements e v e n when d i s t u r b e d . R e t r a c t i o n o f e x t e n d e d h i n d l i m b s was a b s e n t . 24 h a f t e r t h e i n j e c t i o n , m o s t m i c e w e r e s t i l l s e d a t e d , d i s p l a y i n g m a r k e d h y p o k i n e s i a and o f t e n t r e m o r s . Body p o s t u r e was h u n c h e d , r e s e m b l i n g t h e k y p h o t i c p o s t u r e t h a t i s o f t e n s e e n i n PD p a t i e n t s . T h e r e a f t e r , a n i m a l s g r a d u a l l y r e c o v e r e d , and b y 3 o r 4 d a y s a f t e r r e c e i v i n g M P T P , t h e y a p p e a r e d n o r m a l . I n j e c t i o n s o f 2 0 o r 3 0 mg/kg MPTP c a u s e d v e r y l i t t l e b e h a v i o r a l c h a n g e . S e d a t i o n , when o b s e r v e d , - 27 -l a s t e d f o r o n l y 0 . 5 t o 1 h . 60 mg/kg MPTP, h o w e v e r , was r a p i d l y l e t h a l t o 2 o f 2 a n i m a l s so t r e a t e d . Our r e s u l t s s u g g e s t t h a t a s i n g l e s c i n j e c t i o n o f 40 mg/kg o f MPTP i s t h e h i g h e s t d o s e c o m p a t i b l e w i t h s u r v i v a l o f m o s t a n i m a l s . A b o u t 10% o f a n i m a l s g e n e r a l l y d i e a f t e r s u c h a d o s e . The r e s u l t s g i v e n i n T a b l e 7 show t h e t i m e c o u r s e o f n e u r o c h e m i c a l c h a n g e s i n t h e s t r i a t u m o f m i c e a f t e r a s i n g l e i n j e c t i o n o f 4 0 mg/kg M P T P . A t 30 and 6 0 m i n u t e s , d o p a m i n e c o n t e n t was m o d e s t l y i n c r e a s e d , and DOPAC content comparably r e d u c e d . By 2 . 5 h a f t e r t h e MPTP i n j e c t i o n , s t r i a t a l d o p a m i n e c o n t e n t was m a r k e d l y r e d u c e d , and b y 24 h , i t was a l m o s t as s e v e r e -l y r e d u c e d a s a t one m o n t h . T h u s , 4 0 mg/kg MPTP i n C57 b l a c k m i c e p r o d u c e d l o n g - l a s t i n g d e c r e m e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s i n t h e s t r i a t u m . H o w e v e r , i n m i c e a l l o w e d t o l i v e f o r 4 . 5 m o n t h s a f t e r t h e MPTP i n j e c t i o n , t h e r e was c l e a r e v i d e n c e o f p a r t i a l r e c o v e r y o f d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s . The t u r n o v e r o f d o p a m i n e r e l e a s e d i n t h e s t r i a t u m , a s j u d g e d b y t h e . (DOPAC + H V A ) / d o p a m i n e m o l a r r a t i o , was i n c r e a s e d a t 24 h and a t one m o n t h , b u t had r e t u r n e d t o w a r d s n o r m a l a t 4 . 5 m o n t h s . H i s t o l o g i c a l e x a m i n a t i o n s o f 6 c o n t r o l m i c e s h o w e d t h e p a r s c o m p a c t a o f t h e SN t o c o n t a i n 206 ± 5 (mean ± SEM) p e r i k a r y a p e r u n i t a r e a . T h o s e o f 7 m i c e k i l l e d 1 month a f t e r a s i n g l e i n j e c t i o n o f 4 0 mg/kg MPTP c o n t a i n e d o n l y 139 ± 11 p e r i k a r y a ( P < 0 . 0 0 1 ) . Why i s t h e r e s u c h d i s p a r i t y b e t w e e n t h e m a g n i t u d e o f d o p a m i n e r e d u c t i o n (90%) and t h e l o s s o f n e u r o n s (33%) a t 1 month a f t e r an i n j e c t i o n o f 4 0 mg/kg MPTP? T h e p r o b a b l e r e a s o n i s t h a t t h e MPTP i n j e c t i o n i m p a i r e d t h e f u n c t i o n o f many d o p a m i n e r g i c n e u r o n s , b u t d i d n o t k i l l t h e m . F o r i n s t a n c e , t h e r a t e - l i m i t i n g enzyme f o r t h e s y n t h e s i s o f d o p a m i n e , t y r o s i n e h y d r o x y -l a s e , m i g h t h a v e b e e n c h r o n i c a l l y i n h i b i t e d by MPTP. T h i s a p p e a r s l i k e l y - 28 -s i n c e H i r a t a e t a l . ( 1 9 8 5 ) h a v e shown l a s e a c t i v i t y i n t i s s u e s l i c e s o f t h e t h e i n h i b i t e d n e u r o n s w o u l d r e c o v e r , as t h a t MPTP i n h i b i t s t y r o s i n e h y d r o x y -r a t s t r i a t u m . G i v e n t i m e , h o w e v e r , b o r n e o u t b y t h e d o p a m i n e c o n t e n t a t T a b l e 7 . Time c o u r s e o f n e u r o c h e m i c a l c h a n g e s i n s t r i a t u m o f C57 b l a c k m i c e a f t e r an i n j e c t i o n o f 4 0 mg/kg MPTP C o n t r o l s 3 0 m i n 6 0 m i n 2 . 5 h . ( 2 6 ) (9) ( 9 ) ( 5 ) Dopamine 1 1 . 8 ± 0 . 4 1 3 . 8 ± 0 . 6 § 1 4 . 1 ± 1.1 6 . 4 ± 0 . 5 DOPAC 0 . 9 6 ± 0 . 0 4 0 . 4 2 ± 0 . 0 4 0 . 5 5 ± 0 . 0 9 0 . 4 6 ± 0 . 0 5 HVA 1 . 2 2 ± 0 . 0 7 1 . 3 2 ± 0 . 0 6 . 1 . 2 2 ± 0 . 0 6 . 2 . 1 1 ± 0 . 0 7 (DOPAC + HVA)/ 0 . 1 6 ± 0 . 0 1 0 . 1 1 ± 0 . 0 1 0 . 1 1 ± 0 . 0 1 0 . 3 5 ± 0 . 0 4 Dopamine 24 h . ( 5 ) . Dopamine DOPAC HVA (DOPAC + HVA)/ Dopamine 1 . 5 ± 0 . 4 „ 0 . 2 0 ± 0 . 0 3 0 . 6 3 ± O.IO" 0 . 5 4 ± 0 . 0 8 ' 1 month . .(141. 4 . 5 m o n t h s ( 8 ) . 1 . 1 ± 0 . 1 0 . 2 2 0 . 3 9 0 . 0 4 0 . 0 2 " 0 . 5 2 ± 0 . 0 6 4 . 4 ± 1 . 1 0 . 3 4 0 . 7 4 0 . 0 6 0 . 1 0 ' 0 . 2 4 ± 0 . 0 2 V a l u e s shown (mean ± SEM) a r e i n p g / g w e t w e i g h t , e x c e p t t h a t (DOPAC + H V A ) / D o p a m i n e r a t i o s a r e m o l a r . M i c e w e r e s a c r i -f i c e d a t t h e t i m e i n t e r v a l s s p e c i f i e d a f t e r a s i n g l e i n j e c -t i o n o f 4 0 mg/kg o f MPTP. The number o f a n i m a l s a r e shown i n ^ p a r e n t h e s e s . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m c o n t r o l s : P < 0 . 0 0 1 ; § P < 0 . 0 5 . 4 . 5 months a f t e r t h e s i n g l e 4 0 mg/kg i n j e c t i o n ( T a b l e 7 ) , w h i c h was h i g h e r t h a n t h a t a t 1 m o n t h . T a b l e 8 c o m p a r e s t h e s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e a n d i t s m e t a b o l i t e s i n a n i m a l s g i v e n e i t h e r a s i n g l e 4 0 mg/kg i n j e c t i o n , o r 5 i n j e c t i o n s o f 2 0 m g / k g . B o t h g r o u p s o f a n i m a l s w e r e s a c r i f i c e d a month a f t e r t h e s i n g l e o r l a s t i n j e c t i o n . The r e s u l t s show t h a t a s i n g l e i n s u l t r e s u l t i n g f r o m a - 29 -l a r g e d o s e o f MPTP i s more d a m a g i n g t o d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s t h a n m u l t i p l e i n j e c t i o n s o f l o w e r d o s e s . T h i s i s s u p p o r t e d b y t h e d a t a i n T a b l e 9 , w h i c h show t h a t a c u m u l a t i v e d o s e o f 3 9 0 m g / k g (13 x 30 m g / k g ) was s t i l l s i g n i f i c a n t l y l e s s e f f e c t i v e , a t 24 h a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n , i n l o w e r i n g s t r i a t a l d o p a m i n e c o n t e n t s t h a n t h a t o f a s i n g l e i n j e c t i o n o f 4 0 m g / k g . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t a t h r e s h o l d e f f e c t s u c h t h a t i n j u r y i s a c h i e v e d o n l y when a c r i t i c a l c o n c e n t r a t i o n o f t h e n e u r o t o x i c s p e c i e s i s r e a c h e d . A t s u b - t h r e s h o l d c o n c e n t r a t i o n s o f MPTP ( a n d t h u s o f t h e n e u r o t o x -i c s p e c i e s t h a t a r e f o r m e d f r o m M P T P ) , d e t o x i f y i n g a g e n t s may be p r e s e n t i n amounts s u f f i c i e n t t o r e d u c e t h e t o x i c i t y . T a b l e 8 . C o m p a r i s o n o f d i f f e r e n t d o s a g e s c h e d u l e s o f MPTP on t h e s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s , i n m i c e s a c r i f i c e d 1 - m o n t h a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n S t r i a t a l p a r a m e t e r s 1 x 4 0 mg/kg ( 1 0 ) 5 x 20 mg/kg ( 1 0 ) L e v e l o f s i g n i f i c a n c e Dopamine 1 . 1 ± 0 . 1 4 . 6 ± 0 . 4 P < 0 . 0 0 1 DOPAC 0 . 2 1 ± 0 . 0 5 0 . 3 9 ± 0 . 0 3 P < 0 . 0 1 HVA 0 . 3 9 ± 0 . 0 6 0 . 8 3 ± 0 . 0 7 P < 0 . 0 0 1 V a l u e s a r e e x p r e s s e d i n u g / g w e t w e i g h t , mean ± S E M , w i t h number o f m i c e a n a l y s e d shown i n p a r e n t h e s e s . S t u d e n t ' s t w o - t a i l e d t - t e s t was u s e d t o d e t e r m i n e l e v e l o f s i g n i f i c a n c e . C o n t r o l v a l u e s , i n u g / g w e t w e i g h t (mean ± S E M ) , a r e : d o p a -m i n e , 1 1 . 8 ± 0 . 4 ; DOPAC, 0 . 9 6 ± 0 . 0 4 ; HVA, 1 . 2 2 ± 0 . 0 7 . - 30 -T a b l e 9 . C o m p a r i s o n o f d i f f e r e n t d o s a g e s c h e d u l e s o f MPTP on t h e s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s , i n m i c e s a c r i f i c e d 24 h a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n S t r i a t a l 1 x 40 mg/kg 13 x 30 mg/kg L e v e l o f p a r a m e t e r s (5) . d o ) s i g n i f i c a n c e Dopamine 1 . 5 ± 0 . 4 2 . 4 ± 0 . 2 P< 0 . 0 5 DOPAC 0 . 2 0 ± 0 . 0 3 0 . 2 3 ± 0 . 0 2 ns HVA 0 . 6 3 ± 0 . 1 0 0 . 4 8 ± 0 . 0 3 ns R e f e r t o T a b l e 8 f o r l e g e n d . N o t s i g n i f i c a n t : n s . T a b l e 10 shows t h e s e l e c t i v i t y o f a c t i o n o f MPTP on s t r i a t a l c o n t e n t o f v a r i o u s n e u r o t r a n s m i t t e r a m i n e s . A t 30 m i n u t e s a f t e r 40 mg/kg MPTP, s e r o -t o n i n and n o r a d r e n a l i n e c o n t e n t s , as w i t h d o p a m i n e , w e r e i n c r e a s e d r e l a t i v e t o t h o s e o f c o n t r o l s . T h e s e c h a n g e s m i g h t h a v e b e e n due t o M P T P ' s h a v i n g a c t e d as a weak MAO i n h i b i t o r ( F r i t z e t a l . 1985; S i n g e r e t a l . 1 9 8 5 ) . A t t h e 1 h o r t h e 1 month m a r k , o n l y d o p a m i n e r g i c p a r a m e t e r s w e r e s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l s . T h u s , a c u t e l y , MPTP n o n - s e l e c t i v e l y a f f e c t s v a r i -o u s 1 a m i n e s . A t 1 m o n t h , o n l y t h e d o p a m i n e s y s t e m r e m a i n s s e l e c t i v e l y a f f e c t e d . - 31 -T a b l e 1 0 . S t r i a t a l n e u r o c h e m i c a l p a r a m e t e r s o f m i c e s a c r i f i c e d a t v a r i o u s t i m e s a f t e r a s i n g l e i n j e c t i o n o f 4 0 mg/kg MPTP MPTP C o n t r o l s '• 30 m i n 2 . 5 h 1 mo Dopamine DOPAC HVA S e r o t o n i n 5 - H I A A N o r a d r e n a l i n e MHPG 1 1 . 8 ± 0 . 4 ( 2 6 ) 0 . 9 6 ± 0 . 0 4 ( 2 6 ) 1 . 2 2 ± 0 . 0 7 ( 2 6 ) 0 . 3 7 ± 0 . 0 3 ( 2 1 ) 0 . 2 4 ± 0 . 0 4 ( 2 6 ) 0 . 2 6 ± 0 . 0 4 (7) 0 . 0 8 ± 0 . 0 1 ( 1 0 ) 1 3 . 8 ± 0 . 6 § ( 9 ) 0 . 4 2 ± 0 . 0 4 * ( 9 ) 1 . 3 2 ± 0 . 0 6 (9) 0 . 5 5 ± 0 . 0 9 § ( 9 ) 0 . 2 5 ± 0 . 0 2 ( 9 ) 0 . 4 9 ± 0 . 0 6 + ( 4 ) 0 . 0 9 ± 0 . 0 2 ( 5 ) 6 . 4 ± 0 . 5 * ( 5 ) 0 . 4 6 ± 0 . 0 5 * ( 5 ) 2 . 1 1 ± 0 . 0 7 * ( 5 ) 0 . 7 2 ± 0 . 0 7 * ( 5 ) 0 . 1 9 ± 0 . 0 3 ( 5 ) 0 . 3 4 ± 0 . 0 6 ( 5 ) 0 . 0 5 ± 0 . 0 0 ( 5 ) 1 . 1 ± 0 . 1 * ( 1 4 ) 0 . 2 2 ± 0 . 0 4 * ( 1 4 ) 0 . 3 9 ± 0 . 0 2 * ( 1 4 ) 0 . 3 3 ± 0 . 0 4 ( 1 4 ) 0 . 2 2 ± 0 . 0 3 ( 1 3 ) 0 . 1 7 ± 0 . 0 3 ( 8 ) 0 . 0 7 ± 0 . 0 2 ( 8 ) V a l u e s (mean ± SEM) a r e i n y g / g w e t w e i g h t , w i t h t h e number o f a n i m a l s a n a l y s e d shown i n p a r e n t h e s e s . SEM l e s s t h a n 0 . 0 0 5 a r e g i v e n as 0 . 0 0 . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m c o n t r o l s : P < 0 . 0 0 1 ; + P < 0 . 0 1 ; § P < 0 . 0 5 . I n s u m m a r y , t h e e f f e c t s o f MPTP i n C57 b l a c k m i c e a r e a s f o l l o w s : a s i n g l e i n j e c t i o n o f 4 0 mg/kg MPTP p r o d u c e s a l o s s o f a b o u t 3 3 % o f d o p a m i n e r -g i c n e u r o n s i n t h e z o n a c o m p a c t a o f t h e S N . T h i s i s a c c o m p a n i e d b y a l o n g -l a s t i n g r e d u c t i o n o f s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s , b u t n o t t h o s e o f s e r o t o n i n o r n o r a d r e n a l i n e . B e h a v i o r a l i m p a i r m e n t i s r e a d i l y s e e n i n t h e f i r s t s e v e r a l d a y s , b u t t h i s d o e s n o t p e r s i s t i n d e f i n i t e l y . T h u s , a s i n g l e 4 0 mg/kg d o s e o f MPTP a p p e a r s t o p r o d u c e i n m i c e t h e n e u r o -c h e m i c a l and n e u r o p a t h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f human P D , a l t h o u g h t h e m a g n i t u d e o f t h e n e u r o p a t h o l o g i c a l c h a n g e s i s l e s s t h a n t h a t s e e n i n t h e - 32 -human c o n d i t i o n . 1 1 1 . i i i ) P o s s i b l e m e c h a n i s m o f MPTP t o x i c i t y A q u e s t i o n t h a t h a s r e m a i n e d u n a n s w e r e d i s w h e t h e r t h e damage t o d o p a -m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s c a u s e d b y MPTP i s e x e r t e d d i r e c t l y b y m e t a b -o l i t e s o f MPTP, s u c h as t h e N - m e t h y l - 4 - p h e n y l p y r i d i n i u m i o n ( M P P + ) , o r by r e a c t i v e f r e e r a d i c a l s ( f o r e x a m p l e , d o p a m i n e s e m i q u i n o n e s , w h o s e f o r m a t i o n f r o m d o p a m i n e m i g h t be i n c r e a s e d i n t h e p r e s e n c e o f MPTP m e t a b o l i t e s ) . T h i s s e c t i o n d e a l s w i t h t h e p o s s i b l e m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f MPTP n e u r o t o x i c i t y . E x p e r i m e n t s w e r e f i r s t p e r f o r m e d t o a s s e s s w h e t h e r a n y o n e o f 4 d i f f e r -e n t a n t i o x i d a n t s c o u l d p r e v e n t t h e n e u r o t o x i c i t y o f MPTP. D e t a i l s o f t h i s e x p e r i m e n t h a v e been d e s c r i b e d i n A p p e n d i x E ( P e r r y e t a l . N e u r o s c i . L e t t . 6 0 : 1 0 9 - 1 1 4 , 1 9 8 5 ) . I n b r i e f , C57 b l a c k m i c e w e r e i n j e c t e d w i t h one o f 4 d i f f e r e n t a n t i o x i d a n t s ( o - t o c o p h e r o l , e - c a r o t e n e , a s c o r b a t e o r N - a c e t y l c y s -t e i n e ) o r s a l i n e o n c e d a i l y f o r 5 d a y s , w i t h 4 0 m g / k g MPTP a d m i n i s t e r e d s c on t h e t h i r d d a y t o a l l g r o u p s . M i c e w e r e s a c r i f i c e d 1 month a f t e r t h e i n j e c t i o n o f MPTP. The s t r i a t u m was a n a l y s e d f o r c o n t e n t s o f d o p a m i n e a n d i t s m e t a b o l i t e s . H i s t o l o g i c a l e x a m i n a t i o n s w e r e p e r f o r m e d b l i n d i n MPTP m i c e p r e t r e a t e d w i t h a - t o c o p h e r o l o r s a l i n e . T a b l e 11 shows t h a t a l t h o u g h s t r i a t a l d o p a m i n e c o n t e n t s w e r e r e d u c e d i n . M P T P - i n j e c t e d m i c e p r e t r e a t e d w i t h a n y o n e o f t h e 4 a n t i o x i d a n t s , when c o m -p a r e d t o c o n t r o l m i c e n o t g i v e n MPTP, t h e s e w e r e s t i l l s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e o f m i c e g i v e n MPTP w i t h o u t a s i m u l t a n e o u s a n t i o x i d a n t . T h u s , t h e a n t i o x i d a n t - p r e t r e a t e d m i c e w e r e p a r t i a l l y p r o t e c t e d f r o m t h e t o x i c i t y o f MPTP. S i n c e t h e a n t i o x i d a n t s s h a r e a common p r o p e r t y o f d e t o x i f y i n g f r e e r a d i c a l s , t h e i n v o l v e m e n t o f t h e l a t t e r i n t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f MPTP t o x i c i t y a p p e a r e d l i k e l y . - 33 -H i s t o l o g i c a l e x a m i n a t i o n s i n d i c a t e d an e v e n more i m p r e s s i v e r e s u l t . W h i l e 7 m i c e a d m i n i s t e r e d 4 0 mg/kg MPTP had 139 ± 11 p e r i k a r y a p e r u n i t a r e a (mean ± S E M ) , t h o s e ( n = 7) i n j e c t e d w i t h b o t h MPTP and o - t o c o p h e r o l had 215 ± 2 p e r i k a r y a ( P < 0 . 0 0 1 ) . C o n t r o l a n i m a l s g i v e n no MPTP showed 206 ± 5 p e r i -k a r y a p e r u n i t a r e a . T h e r e f o r e , w h e r e a s t h e r e was a 3 3 % l o s s o f d o p a m i n e r -g i c n e u r o n a l c e l l b o d i e s 1 month a f t e r a s i n g l e MPTP i n j e c t i o n , t h i s n e u r o n -a l l o s s was c o m p l e t e l y p r e v e n t e d b y a - t o c o p h e r o l . A d d i t i o n a l e v i d e n c e f o r t h e i n v o l v e m e n t o f f r e e r a d i c a l s i n MPTP t o x i c -i t y came f r o m o u r s t u d i e s o f M P T P - i n d u c e d c h a n g e s i n t o t a l g l u t a t h i o n e c o n -t e n t o f t h e b r a i n s t e m . The r a t i o n a l e h e r e was t h a t i n a s m u c h as g l u t a t h i o n e i s an e n d o g e n o u s f r e e r a d i c a l s c a v e n g e r , t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t m i g h t be r e d u c e d , i f MPTP w o r k s v i a f r e e r a d i c a l s . A p p e n d i x F ( Y o n g e t a l . N e u r o s c i .  L e t t . 6 3 _ : 5 6 - 6 0 , 1 9 8 6 ) p r o v i d e s d e t a i l s o f t h i s e x p e r i m e n t . B r i e f l y , a t . v a r i o u s t i m e i n t e r v a l s a f t e r an i n j e c t i o n o f 4 0 m g / k g M P T P , C57 b l a c k m i c e w e r e s a c r i f i c e d . T o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t s w e r e m e a s u r e d b y t h e m e t h o d o f T i e t z e ( 1 9 6 9 ) i n t h e b r a i n s t e m a n d s t r i a t u m . T a b l e 12 g i v e s t h e r e s u l t s o b t a i n e d . No c h a n g e s w e r e o b s e r v e d i n t h e t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t o f t h e s t r i a t u m . I n t h e b r a i n s t e m , h o w e v e r , a b i p h a s i c r e s p o n s e was s e e n . An i n i t i a l i n c r e a s e a t 1 h was f o l l o w e d b y a s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n t o t a l T a b l e 11. C o n t e n t s o f d o p a m i n e a n d i t s m e t a b o l i t e s i n t h e s t r i a t u m o f m i c e t r e a t e d w i t h MPTP a n d p r o t e c t i v e a g e n t s C o n t r o l s MPTP a l o n e MPTP + a - t o c o p h e r o l MPTP + B - c a r o t e n e MPTP + a s c o r b a t e MPTP + N - a c e t y l -c y s t e i ne (26) (14) (12) (4) (7) (7) D o p a m i n e 11.8 ± 0.4* 1.1 ± 0.1 4.5 ± 0.4* 3.5 ± 0.4* 3.9 ± 0.8* 4.4 ± 0.6* DOPAC 1.0 ± 0.0* 0.2 ± 0.0 0.4 ± 0 .0 + 0.3 ± 0.0 0.6 ± 0 .2 + 0.7 ± 0.2+ HVA 1.2 ± 0.1* 0.4 ± 0.0 0.8 ± 0.0* 0.6 ± 0.0* 0.8 ± 0.1* 0.8 ± 0.1* V a l u e s (mean ± SEM) a r e e x p r e s s e d i n y g / g w e t w e i g h t , w i t h SEM l e s s t h a n 0.05 l i s t e d a s 0.0. Number o f a n i m a l s a n a l y s e d a r e shown i n b r a c k e t s . E x c e p t f o r c o n t r o l s , a l l m i c e w e r e g i v e n a s i n g l e s c i n j e c t i o n o f 40 mg/kg M P T P , a n d k i l l e d 1 mo a f t e r . P r o t e c t i v e a g e n t s w e r e i n j e c t e d s c d a i l y f o r 5 d a y s , s t a r t i n g 48 h b e f o r e MPTP. D a i l y d o s e s w e r e : a - t o c o p h e r o l , 2.35 g / k g ; e - c a r o t e n e , 100 m g / k g ; L - a s c o r b a t e , 100 m g / k g ; and N - a c e t y l c y s -t e i n e 500 m g / k g . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m MPTP a l o n e : * P < 0.001; + P < 0.01. - 35 -T a b l e 1 2 . E f f e c t s o f .MPTP i n j e c t i o n s on t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t o f s t r i a t u m and b r a i n s t e m o f m i c e C o n t r o l s MPTP 30 m i n 1 h 2 . 5 h 24 h 24h ( a f t e r 3 r d i n j e c t i o n ) S t r i a t u m 1 . 0 8 ± 0 . 0 7 0 . 9 3 ± 0 . 1 2 1 . 0 1 ± 0 . 0 5 1 . 0 6 ± 0 . 0 5 1 . 0 1 ± 0 . 0 3 1 . 1 0 ± 0 . 0 4 ( 1 9 ) ( 1 0 ) ( 1 4 ) ( 1 5 ) ( 1 8 ) ( 1 5 ) B r a i n s t e m 1 . 0 1 ± 0 . 0 4 1 . 0 2 ± 0 . 0 6 1 . 1 6 ± 0 . 0 6 § 1 . 1 2 ± 0 . 0 7 0 . 7 5 ± 0 . 0 5 * 0 . 7 6 ± 0 . 0 4 * ( 2 2 ) ( 1 0 ) ( 1 6 ) ( 1 4 ) ( 1 8 ) ( 1 5 ) T o t a l g l u t a t h i o n e . v a l u e s (mean ± SEM) a r e e x p r e s s e d i n y m o l / g w e t w e i g h t , w i t h t h e number o f a n i m a l s shown i n p a r e n t h e s e s . M i c e w e r e g i v e n a s i n g l e s c i n j e c t i o n o f 4 0 mg/kg o f MPTP and k i l l e d a t t h e t i m e i n t e r v a l s i n d i c a t e d , e x c e p t f o r a n i m a l s i n t h e l a s t c o l u m n , w h i c h w e r e k i l l e d 24 h a f t e r t h e l a s t o f 3 d a i l y MPTP ( 4 0 m g / k g ) i n j e c t i o n s . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m c o n t r o l s : P < 0 . 0 0 1 ; § P < 0 . 0 5 . g l u t a t h i o n e c o n t e n t a t 24 h . T h i s l a t t e r r e d u c t i o n was n o t more p r o n o u n c e d i n m i c e w h i c h had b e e n g i v e n 3 d a i l y i n j e c t i o n s o f 4 0 mg/kg MPTP and w h i c h w e r e k i l l e d 24 h a f t e r t h e t h i r d i n j e c t i o n . B e c a u s e o f t h e m i n u t e s i z e o f t h e S N , I was u n a b l e t o r e l i a b l y d i s s e c t o u t t h i s a r e a f r o m f r o z e n b r a i n f r e e o f c o n t a m i n a t i n g s t r u c t u r e s . I was t h e r e f o r e f o r c e d t o s t u d y a much l a r g e r t i s s u e m a s s , t h e b r a i n s t e m , w h i c h i n c l u d e d t h e S N , and f o r w h i c h d i s s e c t i o n was e a s y and r e p r o d u c i b l e . I f t h e g l u t a t h i o n e c h a n g e s o b s e r v e d i n t h e b r a i n s t e m w e r e o c c u r r i n g o n l y i n t h e S N , and n o t i n t h e s u r r o u n d i n g n o n - n i g r a l t i s s u e s , t h e n t h e a c t u a l m a g n i t u d e o f c h a n g e i n t h i s s t r u c t u r e w o u l d p r o b a b l y h a v e b e e n g r e a t e r t h a n t h a t shown i n T a b l e 12 f o r b r a i n s t e m . - 3 6 -One p l a u s i b l e i n t e p r e t a t i o n o f t h e r e s u l t s i s as f o l l o w s . The p r e s e n c e o f M P T P - i n d u c e d f r e e r a d i c a l s may l e a d t o an i n i t i a l i n c r e a s e i n g l u t a t h i o n e s y n t h e s i s and h e n c e o f i t s c o n t e n t i n t h e b r a i n s t e m . T h i s r i s e i s t h e n f o l l o w e d by g l u t a t h i o n e d e p l e t i o n , as i t i s c o n s u m e d i n t h e p r o c e s s o f d e -t o x i f i c a t i o n . The o b s e r v a t i o n t h a t s t r i a t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t d i d n o t c h a n g e a f t e r t h e MPTP i n j e c t i o n s u g g e s t s t h a t t h e f r e e r a d i c a l s , i f a n y , w e r e f o r m e d i n t h e c e l l b o d i e s o f t h e n i g r o s t r i a t a l t r a c t , and n o t i n t h e n e u r o n a l t e r m i n a l s i n t h e s t r i a t u m . S i n c e t h e a n t i o x i d a n t s a - t o c o p h e r o l and e - c a r o t e n e had e a c h o f f e r e d p r o -t e c t i o n a g a i n s t t h e t o x i c i t y o f MPTP, t h e e f f e c t s o f p r e t r e a t m e n t w i t h them on M P T P - i n d u c e d c h a n g e s o f b r a i n s t e m t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t w e r e d e t e r -m i n e d . A n i m a l s w e r e g i v e n 3 d a i l y i n j e c t i o n s o f e i t h e r o f t h e s e a n t i o x i -d a n t s . 4 0 mg/kg MPTP was i n j e c t e d i m m e d i a t e l y a f t e r t h e t h i r d i n j e c t i o n . 24 h l a t e r t h e m i c e w e r e s a c r i f i c e d . A p p e n d i x F p r o v i d e s f u r t h e r d e t a i l s o f t h e e x p e r i m e n t a l d e s i g n , i n c l u d i n g t h e d o s e s o f a n t i o x i d a n t s u s e d . The r e s u l t s i n T a b l e 13 show t h a t t h e M P T P - i n d u c e d l o s s o f t o t a l g l u t a -t h i o n e c o n t e n t i n t h e b r a i n s t e m was p r e v e n t e d b y e a c h o f t h e s e a n t i o x i d a n t s . An i n t e r p r e t a t i o n o f t h e s e d a t a i s t h a t b y s h a r i n g t h e same f r e e r a d i c a l -s c a v e n g i n g p r o p e r t y , t h e s e e x o g e n o u s a n t i o x i d a n t s h a d s u b s t i t u t e d f o r , o r a i d e d , g l u t a t h i o n e i n t h e d e t o x i f i c a t i o n o f M P T P - d e r i v e d f r e e r a d i c a l s . I n t h e p r o c e s s , t h e t o x i c i t y o f MPTP was a t t e n u a t e d ( T a b l e 1 1 ) . - 37 -T a b l e 1 3 . T o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t s o f b r a i n s t e m and s t r i a t u m o f m i c e i n j e c t e d w i t h 4 0 mg/kg MPTP, w i t h o r w i t h o u t a n t i o x i d a n t p r e t r e a t m e n t C o n t r o l s No p r e t r e a t m e n t s - c a r o t e n e a - t o c o p h e r o l ( S a l i n e ) ( M P T P - a l o n e ) and MPTP and MPTP B r a i n s t e m 1 . 0 1 ± 0 . 0 4 * 0 . 7 4 ± 0 . 0 5 1 . 0 7 ± 0 . 0 6 * 0 . 9 8 ± 0 . 0 4 + ( 2 2 ) ( 1 8 ) ( 1 0 ) ( 1 0 ) S t r i a t u m 1 . 0 8 ± 0 . 0 7 1 . 0 1 ± 0 . 0 3 1 . 0 4 ± 0 . 0 5 1 . 0 8 ± 0 . 0 4 ( 1 9 ) ( 1 8 ) ( 1 0 ) ( 1 0 ) V a l u e s a r e i n y m o l / g w e t w e i g h t , mean ± S E M , w i t h number o f s a m p l e s a n a l y s e d shown i n b r a c k e t s . D a i l y d o s e s o f a - t o c o -p h e r o l and s - c a r o t e n e w e r e 2 . 3 5 g / k g and 100 mg/kg r e s p e c t i v e -l y . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m M P T P - a l o n e a n i m a l s : * P < 0.001; t p < 0 . 0 1 . I f f r e e r a d i c a l s a r e i n v o l v e d i n t h e m e c h a n i s m o f MPTP t o x i c i t y , w h a t t h e n i s t h e i r i d e n t i t y ? C a s t a g n o l i e t a l . ( 1 9 8 5 ) s u g g e s t e d t h a t f r e e r a d i -c a l s d e r i v e d f r o m d o p a m i n e m i g h t be i n v o l v e d . To t e s t t h i s , I f e d C57 b l a c k m i c e e i t h e r a n o r m a l d i e t o r a d i e t c o n t a i n i n g L-DOPA and c a r b i d o p a f o r 3 d a y s . S a l i n e o r 2 0 m g / k g MPTP was t h e n i n j e c t e d s c . A p p e n d i x F g i v e s t h e p a r t i c u l a r s o f t h e e x p e r i m e n t . The L-DOPA t r e a t m e n t , w h i c h c a u s e d m i c e t o be u n u s u a l l y a c t i v e a n d a g g r e s s i v e , s u b s t a n t i a l l y i n c r e a s e d d o p a m i n e r g i c t u r n o v e r [(DOPAC + H V A ) / d o p a m i n e m o l a r r a t i o ] i n t h e s t r i a t u m ( T a b l e 1 4 ) . D e s p i t e t h i s , h o w e v e r , t h e t o x i c i t y o f MPTP was n o t p o t e n t i a t e d . T h i s i s shown i n T a b l e 1 5 , w h e r e i t c a n be s e e n t h a t t h e d o p a m i n e r g i c p a r a m e t e r s i n t h e s t r i a t a o f M P T P - t r e a t e d a n i m a l s f e d a n o r m a l d i e t w e r e n o t s t a t i s t i c a l l y d i f f e r e n t f r o m t h o s e g i v e n t h e L-DOPA and c a r b i d o p a d i e t . A p p a r e n t l y , t h e n e u r o t o x i c i t y o f MPTP i s i n d e p e n d e n t o f f r e e r a d i c a l f o r m a t i o n f r o m d o p a m i n e . - 38 -T a b l e 1 4 . E f f e c t s o f L-DOPA and c a r b i d o p a t r e a t m e n t o n s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e a n d i t s m e t a b o l i t e s i n t h e mouse C o n t r o l s L-DOPA and c a r b i d o p a d i e t ( n o r m a l d i e t ) 1 s t g r o u p 3 2nd g r o u p k ( 2 6 ) ( 1 3 ) ( 1 0 ) Dopamine DOPAC HVA (HVA + DOPAC)/ d o p a m i n e 1 1 . 8 ± 0 . 4 : 0 . 9 6 ± 0 . 0 4 1 . 2 2 ± 0 . 0 7 0 . 1 6 ± 0 . 0 1 1 1 . 1 ± 0 . 7 4 . 9 2 ± 0 . 7 3 * 6 . 6 8 ± 0 . 2 9 * 1 . 0 0 ± 0 . 1 3 * 1 2 . 0 ± 0 . 8 0 . 8 0 ± 0 . 0 7 1 . 2 6 ± 0 . 0 7 0 . 1 5 ± 0 . 0 1 V a l u e s f o r d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s a r e e x p r e s s e d i n u g / g w e t w e i g h t , w h i l e (DOPAC + H V A ) / d o p a m i n e v a l u e s a r e m o l a r r a t i o s . A l l v a l u e s a r e mean ± S E M , w i t h number o f s a m p l e s shown i n b r a c k e t s . a M i c e s a c r i f i c e d i m m e d i a t e l y a f t e r 3 d a y s o f t h e L-DOPA and c a r b i d o p a d i e t , a t t h e t i m e when o t h e r s i m i -l a r l y - t r e a t e d m i c e w e r e g i v e n 2 0 mg/kg MPTP ( T a b l e 1 5 ) . ^ M i c e s a c r i f i c e d 3 weeks a f t e r c e s s a t i o n o f 11 d a y s o f t h e s p e c i a l d i e t , when m i c e g i v e n 2 0 mg/kg MPTP p l u s L-DOPA and c a r b i d o p a d i e t , w e r e s a c r i f i c e d ( T a b l e 1 5 ) . V a l u e s t h a t d i f -f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m c o n t r o l s : * P < 0 . 0 0 1 . T a b l e 1 5 . S t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s i n m i c e g i v e n 20 mg/kg MPTP, w i t h o r w i t h o u t L-DOPA and c a r b i d o p a p r e t r e a t m e n t Normal d i e t L-DOPA + c a r b i d o p a C o n t r o l s MPTP and MPTP ( 2 6 ) ( 9 ) ( 9 ) Dopamine DOPAC HVA 1 1 . 8 ± 0 . 4 * 0 . 9 6 ± 0 . 0 4 1 . 2 2 ± 0 . 0 7 § 6 . 9 ± 0 . 5 9 ± 1 . 0 2 ± 0 . 4 0 . 0 4 0 . 0 6 7 . 0 ± 0 . 8 0 . 5 8 ± 0 . 0 5 0 . 9 8 ± 0 . 0 7 V a l u e s a r e mean ± S E M , u g / g w e t w e i g h t . Number o f a n i m a l s a n a l y s e d a r e shown i n p a r e n t h e s e s . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i -f i c a n t l y f r o m 2 0 mg/kg MPTP m i c e on n o r m a l d i e t : P< 0 . 0 0 1 ; § P < 0 . 0 5 . - 39 -To d e t e r m i n e w h e t h e r M P P + was r e s p o n s i b l e f o r t h e n e u r o t o x i c ' e f f e c t s o f i t s p a r e n t c o m p o u n d , C57 b l a c k m i c e w e r e i n j e c t e d s c w i t h v a r i o u s d o s e s o f M P P + . B e h a v i o r a l o b s e r v a t i o n s w e r e a s f o l l o w s . As e a r l y a s 15 m i n u t e s a f t e r an i n j e c t i o n o f 10 mg/kg M P P + , t h e m i c e a p p e a r e d s e d a t e d and t h e i r b o d y p o s t u r e was a l t e r e d ( ' s t r e t c h e d o u t ' ) . T h i s d i f f e r e d f r o m t h e h u n c h e d -up k y p h o t i c p o s t u r e t h a t i s s e e n a t 24 h a f t e r 4 0 mg/kg MPTP. H o w e v e r , a l l a n i m a l s a p p e a r e d n o r m a l 2 h a f t e r t h e i n j e c t i o n . D o s e s o f 20 mg/kg o r h i g h -e r k i l l e d a l l m i c e r a p i d l y ( w i t h i n 2 . 5 h ) , w i t h a n i m a l s u s u a l l y e x h i b i t i n g a g e n e r a l i z e d s e i z u r e j u s t b e f o r e d e a t h . I n o n e g r o u p o f m i c e g i v e n 4 0 m g / k g M P P + , p r e t r e a t m e n t w i t h p a r g y l i n e ( w h i c h p r e v e n t s t h e t o x i c i t y o f MPTP) f a i l e d t o p r e v e n t d e a t h . T h u s , M P P + i s h i g h l y t o x i c , e v e n more s o t h a n i t s p a r e n t compound MPTP. I n 3 a n i m a l s , M P P + c o n t e n t o f t h e p o o l e d w h o l e b r a i n 1 h a f t e r 100 mg/kg M P P + was 1 4 . 5 n m o l / g w e t w e i g h t . I n t h e s t r i a t u m t h e c o n t e n t was 6 1 . 2 n m o l / g , w h i l e t h e c a l c u l a t e d v a l u e o f MPP + i n b l o o d t r a p p e d i n t h e b r a i n was 10 n m o l / g . The m e t h o d f o r a n a l y s e s o f M P P + c o n t e n t i s d e s c r i b e d i n d e t a i l i n A p p e n d i x 0 . H e n c e , when i n j e c t e d s u b c u t a n e o u s l y , MPP + p e n e -t r a t e d t h e b l o o d - b r a i n b a r r i e r and was p r e f e r e n t i a l l y a c c u m u l a t e d i n t h e s t r i a t u m . A l t h o u g h M P P + p e n e t r a t e d t h e b r a i n , m i c e g i v e n 10 i n j e c t i o n s o f 10 mg/kg d i d n o t s u f f e r a n y damage t o d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s . T h i s i s shown by t h e n e u r o c h e m i c a l d a t a i n T a b l e 1 6 . H i s t o l o g i c a l e x a m i n a t i o n s c o n f i r m e d t h i s b y i n d i c a t i n g t h a t w h i l e c o n t r o l m i c e ( n = 6 ) h a d 2 0 6 ± 5 (mean ± SEM) d o p a m i n e r g i c p e r i k a r y a p e r u n i t a r e a , t h e M P P + - t r e a t e d m i c e ( n = 5 ) had 236 ± 3 p e r i k a r y a . T h u s , u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f t h e s e e x p e r i -m e n t s , M P P + was n o t n e u r o t o x i c t o n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s , a l t h o u g h i t p r o v e d t o be more l e t h a l t h a n MPTP. - 4 0 -T a b l e 1 6 . S t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s i n m i c e g i v e n 2 d i f f e r e n t d o s a g e r e g i m e n s o f M P P + C o n t r o l s 1 x 4 0 mg/kg 10 x 10 mg/kg M P P + M P P + ( 2 6 ) . ( 5 ) . ( 7 ) . Dopamine DOPAC HVA 1 1 . 8 ± 0 . 4 0 . 9 6 ± 0 . 0 4 1 . 2 2 ± 0 . 0 7 1 0 . 9 ± 0 . 6 0 . 8 2 ± 0 . 0 9 1 . 2 0 ± 0 . 0 4 1 1 . 8 ± 0 . 6 0 . 7 3 ± 0 . 0 3 § 1 . 2 0 ± 0 . 0 4 V a l u e s a r e e x p r e s s e d i n y g / g w e t w e i g h t , mean ± SEM, w i t h number o f s a m p l e s a n a l y s e d i n p a r e n t h e s e s . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m c o n t r o l s : § P < 0 . 0 5 . T h i s e x p e r i m e n t ; h a s 2 p o s s i b l e i n t e r p r e t a t i o n s . E i t h e r M P P + i s n o t t h e n e u r o t o x i c m e t a b o l i t e o f MPTP; o r , t h e c o n c e n t r a t i o n s o f M P P + a c h i e v e d i n t h e SN o r s t r i a t u m a f t e r t h e i n j e c t i o n ( a s s u m i n g t h a t M P P + i s t a k e n i n t o n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s b y n e u r o n a l t e r m i n a l s i n t h i s l a t t e r r e g i o n ) w e r e s t i l l b e l o w t h o s e r e q u i r e d t o p r o d u c e d a m a g e . The l a t t e r a p p e a r s p o s s i b l e , s i n c e t h e s t r i a t a l M P P + c o n t e n t an h o u r a f t e r an i n j e c t i o n o f 100 mg/kg M P P + was 6 1 . 2 n m o l / g w e t w e i g h t . T h i s was an o r d e r o f m a g n i t u d e l o w e r t h a n t h e MPP + c o n t e n t ( 8 7 0 n m o l / g w e t w e i g h t ) f o u n d b y M a r k e y e t a l . ( 1 9 8 4 ) 10 m i n u t e s a f t e r m i c e w e r e i n j e c t e d w i t h 10 mg/kg MPTP. A n o t h e r p i e c e o f e v i d e n c e w h i c h s u g g e s t s t h a t t h e l a c k o f M P P + n e u r o t o x i c i t y m i g h t be due t o i n s u f f i c i e n t c o n c e n t r a t i o n s a t t h e s i t e o f a c t i o n comes f r o m r e s u l t s t h a t u t i l i z e d d i f f e r e n t d o s a g e s c h e d u l e s o f MPTP. T a b l e s 8 and 9 show t h a t a s i n g l e MPTP i n j e c t i o n o f 4 0 mg/kg was more n e u r o t o x i c t o d o p a -m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s t h a n m u l t i p l e i n j e c t i o n s o f l o w e r d o s e s . As a l r e a d y d i s c u s s e d a b o v e , t h i s s u g g e s t s t h a t a t h r e s h o l d c o n c e n t r a t i o n m u s t be r e a c h e d b e f o r e damage c a n be a c h e i v e d . M P P + i s w i d e l y b e l i e v e d t o be t h e n e u r o t o x i c m e t a b o l i t e o f M P T P . - 41 -M P P + i s r e p o r t e d l y t o x i c t o n i g r a l e x p l a n t s i n t i s s u e c u l t u r e ( C o h e n e_t a l . 1 9 8 5 ) , a n d , when i n j e c t e d c e n t r a l l y t o r a t s ( H e i k k i l a e t a l . 1 9 8 5 ) . How m i g h t t h i s be r e c o n c i l e d w i t h t h e i n v o l v e m e n t o f f r e e r a d i c a l s i n MPTP t o x i -c i t y , as my r e s u l t s s u g g e s t ? One p o s s i b i l i t y i s t h a t t h e f r e e r a d i c a l ( s ) i s d e r i v e d f r o m M P P + , p e r h a p s an •MPP r a d i c a l . I t w o u l d be i m p o r t a n t t o e x -p l o r e t h e p o s s i b i l i t y t h a t a n t i o x i d a n t s m i g h t p r e v e n t damage t o n i g r o s t r i -a t a l n e u r o n s u s i n g t h e c o n d i t i o n s u n d e r w h i c h o t h e r s (Cohen e t a l . 1 9 8 5 ; H e i k k i l a e t a l . 1 9 8 5 ) h a v e r e p o r t e d MPP + t o be n e u r o t o x i c . S i n c e t h e t o x i c i t y o f M P P + i n , t i s s u e c u l t u r e : was r e p o r t e d l y p r e v e n t e d b y d e p r e n y l p r e t r e a t m e n t ( M y t i l i n e o u * e t a l . 1 9 8 5 ) , i t w o u l d be o f i n t e r e s t t o d e t e r m i n e w h e t h e r o r . n o t d e p r e n y l h a s a n t i o x i d a n t p r o p e r t i e s . I l l . i v ) E x p e r i m e n t s , u s i n g b u t y l a t e d h y d r o x y a n i s o l e , g l u t a t h i o n e  m o n o e t h y l e s t e r , - b u t h i o n i n e - s u l f o x i m i n e , and d i e t h y l - m a l e a t e A s d i s c u s s e d e a r l i e r , t h e m e c h a n i s m o f t o x i c i t y o f MPTP may i n v o l v e f r e e r a d i c a l s . G l u t a t h i o n e a p p e a r s t o be c r i t i c a l l y i m p o r t a n t i n t h e d e t o x i f i c a -t i o n o f t h e s e r e a c t i v e s p e c i e s . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t an i n c r e a s e i n n o r m a l . g l u t a t h i o n e c o n t e n t s m i g h t r e d u c e t h e n e u r o t o x i c i t y o f MPTP. B u t y l a t e d h y d r o x y a n i s o l e (BHA) h a s b e e n r e p o r t e d t o h a v e s u c h a g l u t a t h i o n e -e l e v a t i n g e f f e c t i n p e r i p h e r a l t i s s u e s . The e f f e c t on t h e b r a i n was n o t p r e v i o u s l y d e t e r m i n e d ( I p 1 9 8 4 ; J a e s c h k e e t a l . 1 9 8 5 ) . A n o t h e r c o m p o u n d , g l u t a t h i o n e m o n o e t h y l e s t e r , h a s b e e n shown t o i n c r e a s e l i v e r ( b u t n o t b r a i n ) t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t i n m i c e p r e v i o u s l y t r e a t e d w i t h b u t h i o n i n e s u l f o x i m i n e ( B S O ) , an i n h i b i t o r o f t h e r a t e - l i m i t i n g enzyme i n g l u t a t h i o n e b i o s y n t h e s i s , Y - g l u t a m y l c y s t e i n e s y n t h e t a s e ( P u r i e t a l . 1 9 8 3 ) . E x p e r i m e n t s d e s c r i b e d b e l o w u t i l i z e d t h e s e compounds i n an a t t e m p t t o p r o d u c e a s u s t a i n -e d i n c r e a s e i n b r a i n t o t a l g l u t a t h i o n e l e v e l s . The o b j e c t i v e was t o d e t e r -- 42 -m i n e w h e t h e r MPTP was s t i l l t o x i c u n d e r s u c h c o n d i t i o n s . I n a d d i t i o n , a n o t h e r g r o u p o f m i c e was g i v e n BSO t o d e t e r m i n e i f t h e p r i o r d e p l e t i o n o f l i v e r ( b u t n o t b r a i n ) t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t ( T a b l e 2 ) c o u l d a c c e n t u a t e t h e t o x i c i t y o f MPTP. BHA ( S i g m a ) was i n j e c t e d s u b c u t a n e o u s l y i n 2 g r o u p s o f C57 b l a c k m i c e . The f i r s t g r o u p (BHA + MPTP) r e c e i v e d a t o t a l o f 8 d a i l y i n j e c t i o n s o f 5 0 0 mg/kg BHA, w i t h 4 0 mg/kg MPTP i n j e c t e d i m m e d i a t e l y a f t e r t h e 5 t h BHA i n j e c -t i o n . T h e s e a n i m a l s w e r e s a c r i f i c e d a m o n t h a f t e r t h e s i n g l e MPTP i n j e c t i o n . The s e c o n d g r o u p o f m i c e (BHA a l o n e ) r e c e i v e d t h e same d a i l y d o s e o f BHA f o r a t o t a l o f 5 d a y s , and w e r e s a c r i f i c e d 1 , 2 , 3 , o r 5 d a y s a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n . T h i s s e c o n d g r o u p o f m i c e s e r v e d t o d o c u m e n t t h e e f f e c t s o f BHA on t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t and g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e a c t i v i t y i n t h e l i v e r and t h e b r a i n s t e m . T o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t was a n a l y s e d u s i n g t h e T i e t z e p r o t o c o l ( 1 9 6 9 ) , w h i l e g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e a c t i v i t y was m e a s u r e d u s i n g t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d i n S e c t i o n 1 1 1 . v i i i . A s shown i n T a b l e 1 7 , BHA p r o d u c e d a s u b s t a n t i a l e l e v a t i o n o f t o t a l g l u -t a t h i o n e c o n t e n t and o f g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e a c t i v i t y i n mouse l i v e r 24 h a f t e r t h e l a s t o f 5 d a i l y i n j e c t i o n s . H o w e v e r , b o t h p a r a m e t e r s r e m a i n e d u n c h a n g e d f r o m c o n t r o l s i n t h e b r a i n s t e m . The i n c r e a s e s i n b o t h t o t a l g l u -t a t h i o n e c o n t e n t and i n g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e a c t i v i t y i n t h e l i v e r w e r e s t i l l e v i d e n t 120 h a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n ( t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t was 1 5 6 2 o f c o n t r o l s , g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e a c t i v i t y was 173 % o f c o n t r o l s ) . I f BHA had p e n e t r a t e d t h e b l o o d - b r a i n b a r r i e r , a n d t h i s i s l i k e l y s i n c e i t i s a v e r y l i p i d s o l u b l e c o m p o u n d , t h e r e s u l t s w o u l d s u g g e s t t h a t t h e g l u t a -t h i o n e c o n t e n t o f t h e b r a i n i s r a t h e r r e s i s t a n t t o m a n i p u l a t i o n w i t h a s i g -n i f i c a n t c h a n g e o f i t s c o n t e n t r e q u i r i n g a v e r y p o t e n t s t i m u l u s . T h i s 1 m i g h t h a v e r e l e v a n c e t o human i d i o p a t h i c P D , a s w i l l b e d i s c u s s e d i n S e c t i o n 1 1 1 . v i i i . - 43 -T a b l e 1 7 . E f f e c t s o f BHA on t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t and g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e a c t i v i t y o f l i v e r and b r a i n s t e m o f t h e mouse T o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t s ( y m o l / g w e t w e i g h t ) GSH t r a n s f e r a s e a c t i v i t y ( y m o l / m i n / m g p r o t e i n ) C o n t r o l BHA C o n t r o l BHA L i v e r 8 . 8 ± 0 . 4 6 1 7 . 6 ± 0 . 7 3 * ( 1 0 ) ( 1 0 ) 1 . 8 4 ± 0 . 0 9 ( 1 7 ) 4 . 8 4 ± 0 . 2 0 ( 1 0 ) B r a i n s t e m 1 . 0 6 ± 0 . 0 4 1 . 0 4 ± 0 . 0 5 ( 5 ) ( 5 ) 0 . 1 6 ± 0 . 0 0 ( 4 ) 0 . 1 7 ± 0 . 0 1 ( 5 ) V a l u e s a r e mean ± SEM, w i t h number o f s a m p l e s a n a l y s e d shown i n b r a c k e t s . BHA m i c e w e r e s a c r i f i c e d 24 h a f t e r t h e l a s t o f 5 d a i l y i n j e c t i o n s o f 5 0 0 m g / k g . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i f i -c a n t l y f r o m t h e i r r e s p e c t i v e c o n t r o l s : P < 0 . 0 0 1 . SEM l e s s t h a n 0 . 0 0 5 a r e shown as 0 . 0 0 . I n T a b l e 1 8 , HPLC a n a l y s i s o f t h e s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e a n d i t s m e t a b o l i t e s showed t h a t p r e t r e a t m e n t w i t h BHA d i d n o t o f f e r any p r o t e c t i o n f r o m t h e t o x i c i t y o f MPTP. T h i s may be a r e f l e c t i o n o f t h e f a i l u r e o f BHA t o p r o d u c e an e l e v a t i o n o f t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t and o f g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e a c t i v i t y i n t h e b r a i n s t e m . The s u b s t a n t i a l and l o n g - t e r m i n -c r e a s e i n b o t h p a r a m e t e r s i n t h e l i v e r o n l y , b u t n o t i n t h e b r a i n , a p p e a r e d an i n s u f f i c i e n t c o n d i t i o n t o p r o t e c t m i c e a g a i n s t t h e n e u r o t o x i c i t y o f M P T P . T a b l e 1 8 . E f f e c t s o f BHA p r e t r e a t m e n t on t h e n e u r o c h e m i c a l e f f e c t s o f MPTP i n m i c e M P T P - a l o n e ( 2 2 ) BHA and MPTP ( 6 ) Dopamine 1 . 4 3 ± 0 . 1 9 1 . 5 1 ± 0 . 2 2 DOPAC 0 . 1 7 ± 0 . 0 2 0.14 ± 0 . 0 1 HVA 0 . 4 3 ± 0 . 0 3 0 . 4 8 ± 0 . 0 2 V a l u e s a r e mean ± S E M , i n u g / g w e t w e i g h t . Number o f s a m p l e s i n p a r e n t h e s e s . None o f t h e means d i f f e r s i g n i f i c a n t l y . - 44 -The n e x t s e r i e s o f e x p e r i m e n t s i n v o l v e d t h e u s e o f g l u t a t h i o n e m o n o e t h y l e s t e r , w h i c h was s y n t h e s i z e d b y t h e p r o c e d u r e o f A n d e r s o n e t a l . ( 1 9 8 5 ) . To c o n f i r m t h a t i t c o u l d i n d e e d e l e v a t e t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t o f t h e l i v e r , as r e p o r t e d by P u r i e t a l . ( 1 9 8 3 ) , C57 b l a c k m i c e w e r e i n j e c t e d s c w i t h 10 mmol/kg o f t h e c o m p o u n d , and w e r e s a c r i f i c e d a t 15 and 30 m i n u t e s , 1 , 1 . 5 and 2 h a f t e r t h e s i n g l e i n j e c t i o n . C o n t r o l s a l i n e - i n j e c t e d m i c e a l s o w e r e k i l l e d a t t h e same t i m e i n t e r v a l s . F i g u r e 1 i n d i c a t e s t h e r e s u l t s o b t a i n e d u s i n g t h e T i e t z e m e t h o d o f a n a l y s i s ( T i e t z e 1 9 6 9 ) . A s m a l l i n c r e a s e i n t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t o f t h e l i v e r was n o t e d a t 15 and 30 m i n u t e s . T h e r e a f t e r , t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t o f t h e l i v e r r e m a i n e d u n c h a n g e d , o r d e c r e a s e d , f r o m c o n t r o l s . T h u s , t h e r e s u l t s do n o t r e p l i c a t e t h o s e o f P u r i e t a l . ( 1 9 8 3 ) who r e p o r t e d , a m a r k e d i n c r e a s e (2 f o l d ) i n t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t o f t h e l i v e r a t 2 h a f t e r a s i n g l e i n j e c t i o n o f t h e same d o s e , w i t h a r e t u r n t o c o n t r o l l e v e l s a t 8 h p o s t - i n j e c t i o n . S i n c e t h e s e a u t h o r s u s e d a l b i n o m i c e ( S w i s s - W e b s t e r ) , t h e e x p e r i m e n t was r e p e a t e d on CD1 S w i s s a l b i n o m i c e . A g a i n , o n l y a s m a l l i n c r e a s e i n t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t o f t h e l i v e r was o b s e r v e d a t 15 and 3 0 m i n u t e s ( f i g u r e 1 ) . - 45 -c CU +-> c o u CO o C i -O -t-> •r- C -ET o •«-) (J (TJ 4-> 4-_=J O o>»« i — to <3 n j O -o 4-> Ol </> C (0 • r - QJ i . 10 CL CU X c n co c ro JC o 140 — 120 100 80 6 0 40 1 1 \~ + 15 3 0 m i n m i n 1 h 1 . 5 h H 2 h T i m e p e r i o d s a f t e r i n j e c t i o n o f g l u t a t h i o n e m o n o e t h y l e s t e r F i g u r e 1 . C h a n g e s r e l a t i v e t o c o n t r o l s o f t o t a l g l u t a -t h i o n e c o n t e n t o f l i v e r s o f C57 b l a c k o r CD1 S w i s s a l b i n o m i c e , a t v a r i o u s t i m e i n t e r v a l s a f t e r an i n j e c t i o n o f 10 m m o l / k g g l u t a t h i o n e m o n o e t h y l e s t e r . % mean + ( o r - ) SEM a r e s h o w n . E a c h p o i n t i s t h e a v e r a g e o f 3 t o 5 m i c e i n -j e c t e d and a n a l y s e d . Open t r i a n g l e s a r e o f C57 b l a c k m i c e , w h i l e c l o s e d t r i a n g l e s a r e o f CD1 S w i s s a l b i n o m i c e . - 46 -T h e r e i s one i m p o r t a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e p r o t o c o l t h a t I e m p l o y e d , a n d t h e m e t h o d t h a t P u r i e t a l . ( 1 9 8 3 ) u s e d . T h e s e a u t h o r s p r e t r e a t e d t h e i r m i c e w i t h BSO. T h u s , t h e i n c r e a s e i n t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t c a u s e d b y t h e e s t e r i n t h e i r e x p e r i m e n t p r o b a b l y o c c u r r e d b e c a u s e t h e r a t e - l i m i t i n g enzyme f o r g l u t a t h i o n e s y n t h e s i s was i n h i b i t e d and t h e l i v e r g l u t a t h i o n e c o n t e n t was s u b n o r m a l . In my e x p e r i m e n t w h e r e g l u t a t h i o n e c o n t e n t a n d i t s b i o s y n t h e t i c and d e g r a d a t i v e e n z y m e s w e r e i n i t i a l l y n o r m a l , h o m e o s t a t i c m e c h a n i s m s m i g h t h a v e b e e n s o e f f e c t i v e t h a t a n y i n c r e a s e i n t o t a l g l u t a -t h i o n e c o n t e n t was r a p i d l y r e t u r n e d t o n o r m a l . A m i n o a c i d a n a l y s i s u s i n g t h e p r o c e d u r e o f P e r r y e t a l . ( 1 9 6 8 , 1 9 8 1 ) was p e r f o r m e d on t h e l i v e r o f a c o n t r o l m o u s e , and o f a C57 b l a c k mouse i n j e c t e d w i t h 10 m m o l / k g o f g l u t a t h i o n e m o n o e t h y l e s t e r and s a c r i f i c e d 2 h a f t e r t h e i n j e c t i o n . T h i s was done t o a s s e s s w h e t h e r r a p i d c a t a b o l i s m o f g l u t a t h i o n e c o u l d e x p l a i n my i n a b i l i t y t o d o c u m e n t i t s i n c r e a s e . T a b l e 19 l i s t s l i v e r c o n t e n t s o f t o t a l g l u t a t h i o n e ( Y - g l u t a m y l c y s t e i n y l -g l y c i n e ) and o f i t s c o m p o n e n t a m i n o a c i d s i n t h e 2 mouse l i v e r s . C y s t e i n e and i t s d i s u l f i d e , c y s t i n e , w e r e n e t d e t e c t e d i n t h e 2 s a m p l e s , and a r e n o t t a b u l a t e d . H o w e v e r , 2 p r o d u c t s o f c y s t e i n e m e t a b o l i s m , v i a t h e c y s t e i n e d i o x y g e n a s e p a t h w a y ( S c h n e i d e r e t a l . 1 9 8 3 ) , a r e s h o w n . T h e s e a r e h y p o t a u r -i n e and t a u r i n e . The t a b l e shows i n c r e a s e d c o n t e n t s o f t a u r i n e , h y p o t a u r -i n e , and g l y c i n e i n t h e l i v e r o f t h e mouse g i v e n t h e e s t e r . T o t a l g l u t a -t h i o n e c o n t e n t was u n c h a n g e d , c o n f i r m i n g r e s u l t s o b t a i n e d u s i n g t h e T i e t z e t e c h n i q u e . A n o t h e r b r e a k d o w n p r o d u c t o f g l u t a t h i o n e , g l u t a m i c a c i d , was n o t i n c r e a s e d , p r o b a b l y b e c a u s e t r a n s a m i n a t i o n t o a - k e t o g l u t a r a t e h a d o c c u r r e d . S i n c e t h e l a t t e r i s n o t an a m i n o a c i d , i t c o u l d n o t be d e t e c t e d b y a m i n o a c i d a n a l y s i s . The r e s u l t s l i s t e d i n T a b l e 19 i n d i c a t e t h a t l i v e r g l u t a -t h i o n e c o n t e n t was i n c r e a s e d i n i t i a l l y i n t h e mouse g i v e n t h e e s t e r , b u t - 47 -g l u t a t h i o n e was t h e n r a p i d l y h y d r o l y s e d i n t o i t s c o m p o n e n t a m i n o a c i d s . T a b l e 1 9 . C o n t e n t o f a m i n o a c i d s i n l i v e r o f mouse s a c r i f i c e d 2 h a f t e r 10 m m o l / k g g l u t a t h i o n e m o n o e t h y l e s t e r A n i m a l T o t a l T a u r i n e H y p o t a u r i n e G l u t a m i c G l u t a m i n e G l y c i n e g l u t a t h i o n e a c i d C o n t r o l 8 . 4 4 1 5 . 0 5 0 . 5 8 1 . 6 0 0 . 9 9 2 . 1 6 E s t e r 7 . 9 7 1 8 . 0 2 4 . 0 3 1 . 0 3 1 . 1 8 4 . 1 8 A l l v a l u e s a r e i n y m o l / g w e t w e i g h t . D e s p i t e t h e f a i l u r e o f . g l u t a t h i o n e m o n o e t h y l e s t e r t o p r o d u c e a s u s t a i n -e d i n c r e a s e i n t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t o f t h e l i v e r , and p r e s u m a b l y o f t h e b r a i n , I i n j e c t e d a g r o u p o f C57 b l a c k m i c e w i t h 4 0 mg/kg MPTP ( s c ) , one h o u r a f t e r a s c i n j e c t i o n o f 10 m m o l / k g g l u t a t h i o n e m o n o e t h y l e s t e r . 9 o f 10 m i c e d i e d a f t e r t h e MPTP i n j e c t i o n , and n e u r o c h e m i c a l o r h i s t o l o g i c a l a n a l y s e s o f t h e i n t e g r i t y o f t h e d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l p a t h w a y o f t h e s e m i c e was t h e r e f o r e n o t p o s s i b l e . H o w e v e r , t h e l e t h a l i t y r a t e s e e n i n t h e g l u t a t h i o n e m o n o e t h y l e s t e r p r e t r e a t e d g r o u p d o e s n o t s u g g e s t a p r o t e c t i v e r o l e o f t h i s compound a g a i n s t t h e t o x i c i t y o f MPTP. A n o t h e r g r o u p o f C57 b l a c k m i c e w e r e f e d BSO (20mM) i n t h e i r d r i n k i n g w a t e r f o r 7 d a y s , w i t h 2 0 m g / k g o f MPTP i n j e c t e d s c o n t h e f o u r t h d a y . When s a c r i f i c e d a month a f t e r t h e MPTP i n j e c t i o n , t h e s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a -m i n e and i t s m e t a b o l i t e s i n t h e s e a n i m a l s w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h o s e o f m i c e f e d o r d i n a r y t a p w a t e r and i n j e c t e d w i t h 2 0 mg/kg MPTP ( T a b l e 2 0 ) . To s u m m a r i s e t h e e x p e r i m e n t s a b o v e , t h e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e c o n t e n t o f t o t a l g l u t a t h i o n e i n t h e b r a i n i s d i f f i c u l t t o a l t e r . T h a t i n t h e l i v e r i s more s u s c e p t i b l e t o c h a n g e , b u t i n t h e c a s e o f g l u t a t h i o n e m o n o e t h y l - 4 8 -e s t e r , an i n i t i a l i n c r e a s e i s r a p i d l y r e t u r n e d t o n o r m a l . The p r i o r a l t e r a -t i o n o f t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t o f t h e 1 i v e r d o e s n o t a p p e a r t o be a s u f -f i c i e n t c o n d i t i o n t o m o d i f y t h e n e u r o t o x i c i t y o f MPTP. T a b l e 2 0 . E f f e c t s o f BSO p r e t r e a t m e n t on t h e e f f e c t s o f 20 mg/kg MPTP i n C57 b l a c k n e u r o c h e m i c a l m i c e 20 mg/kg MPTP BSO a n d 2 0 mg/kg MPTP ( 1 0 ) ( 5 ) Dopamine DOPAC HVA 7 . 3 ± 0 . 6 0 . 5 0 ± 0 . 0 3 1 . 0 4 ± 0 . 0 5 8 . 4 ± 0 . 5 0 . 4 4 ± 0 . 0 2 1 . 0 3 ± 0 . 0 6 V a l u e s a r e mean ± S E M , y g / g w e t w e i g h t , w i t h t h e number o f s a m p l e s a n a l y s e d shown i n p a r e n t h e s e s . None o f t h e means d i f f e r s i g n i f i c a n t l y . More r e c e n t l y , we u s e d d i e t h y l m a l e a t e (DEM) ( S i g m a ) i n an a t t e m p t t o d e p l e t e t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t s o f l i v e r and b r a i n o f C57 b l a c k m i c e . DEM i s an e l e c t r o p h i l e t h a t r e a c t s w i t h g l u t a t h i o n e i n t h e p r e s e n c e o f g l u -t a t h i o n e t r a n s f e r a s e ( P l u m m e r e t a l . 1 9 8 1 ) . Two g r o u p s o f m i c e w e r e i n j e c t -ed s c w i t h 2 i n j e c t i o n s , s p a c e d 24 h a p a r t , o f 0 . 8 ml D E M / k g . One g r o u p was s a c r i f i c e d 1 h a f t e r t h e s e c o n d i n j e c t i o n , and t h e l i v e r and b r a i n s t e m w e r e o b t a i n e d f o r a n a l y s i s o f t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t by t h e m e t h o d o f T i e t z e ( 1 9 6 9 ) . As shown i n T a b l e 2 1 , t h e 2 i n j e c t i o n s o f DEM p r o d u c e d a p p r o x i m a t e -l y 9 0 % d e p l e t i o n o f t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t o f b o t h t h e l i v e r and t h e b r a i n s t e m . I n t h e s e c o n d g r o u p o f m i c e t h a t w e r e a l l o w e d t o s u r v i v e a f t e r t h e s e c o n d i n j e c t i o n , r a p i d l o s s i n b o d y w e i g h t was o b s e r v e d o v e r t h e e n s u -i n g few d a y s . B e h a v i o r a l c h a n g e s c o n s i s t i n g o f s e d a t i o n and t r e m o r s w e r e o b v i o u s and l o n g - l a s t i n g , o c c u r r i n g f o r a t l e a s t 7 d a y s a f t e r t h e s e c o n d i n j e c t i o n o f DEM. S e v e n o f 10 m i c e d i e d . We t h e r e f o r e e l e c t e d t o t r e a t - 49 -m i c e w i t h o n l y 1 i n j e c t i o n o f DEM, t o a s s e s s w h e t h e r o r n o t t h e t o x i c i t y o f MPTP c o u l d be p o t e n t i a t e d a f t e r DEM p r e t r e a t m e n t . T a b l e 2 1 . L i v e r and b r a i n s t e m t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t s o f m i c e i n j e c t e d w i t h DEM C o n t r o l DEM Two i n j e c t i o n s One i n j e c t i o n L i v e r 9 . 0 5 ± 0 . 5 4 ( 1 4 ) B r a i n s t e m 1 . 1 4 ± 0 . 0 3 ( 1 2 ) 1 . 6 3 ± 0 . 3 2 ' ( 1 0 ) 0 . 2 2 ± 0 . 0 2 ' ( 1 0 ) 3 . 1 3 ± 0 . 1 9 (5) 0 . 3 2 ± 0 . 0 3 ' ( 5 ) V a l u e s a r e mean ± S E M , y m o l / g w e t w e i g h t . DEM m i c e w e r e s a c r i f i c e d 1 h a f t e r 1 o r 2 i n j e c t i o n s o f 0 . 8 ml D E M / k g . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m c o n t r o l s : * P < 0 . 0 0 1 . T o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t s o f b o t h t h e l i v e r a n d b r a i n s t e m o f DEM m i c e g i v e n 1 i n j e c t i o n , d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m t h o s e o f DEM m i c e i n j e c t e d w i t h 2 d o s e s o f DEM (P < 0 . 0 1 , S t u d e n t ' s t - t e s t ) . F o u r g r o u p s o f C57 b l a c k m i c e w e r e u s e d . The f i r s t g r o u p r e c e i v e d an i n j e c t i o n o f 0 . 8 ml DEM/kg and was s a c i f i c e d 1 h l a t e r f o r a n a l y s i s o f t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t i n t h e l i v e r and b r a i n s t e m b y t h e T i e t z e m e t h o d ( 1 9 6 9 ) . As shown i n T a b l e 2 1 , t h e s e a n i m a l s h a d s u b s t a n t i a l ( a b o u t 70%) d e p l e t i o n s o f t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t o f t h e l i v e r and b r a i n s t e m . A s e c o n d g r o u p o f a n i m a l s r e c e i v e d t h e same d o s e o f DEM, and was s a c r i f i c e d a month a f t e r w a r d s f o r a n a l y s i s o f c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s i n t h e s t r i a t u m ( T a b l e 2 2 ) . A t h i r d g r o u p o f m i c e was a d m i n i s t e r e d 0 . 8 ml D E M / k g , f o l l o w e d 1 h l a t e r by an i n j e c t i o n o f 20 mg/kg MPTP. T h e s e a n i m a l s , t o g e t h e r w i t h a f o u r t h g r o u p t h a t r e c e i v e d o n l y 20 m g / k g o f MPTP, w e r e k i l l e d 1 mo a f t e r t h e MPTP i n j e c t i o n . As shown i n T a b l e 2 2 , t h e mean s t r i a t a l c o n t e n t o f d o p a m i n e i n D E M - p r e t r e a t e d m i c e g i v e n MPTP, was n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h a t - 50 -o f m i c e t h a t w e r e g i v e n o n l y MPTP. H o w e v e r , c o n t e n t s o f DOPAC and HVA w e r e s l i g h t l y e l e v a t e d i n t h e f o r m e r g r o u p . T a b l e 2 2 . C o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s i n s t r i a t u m o f m i c e t r e a t e d w i t h DEM, DEM p l u s 2 0 m g / k g MPTP, o r 2 0 mg/kg MPTP o n l y A n i m a l s Dopamine DOPAC HVA DEM o n l y ( 1 3 ) 1 1 . 2 ± 0 . 7 * 0 . 5 8 ± 0 . 0 3 § 1 . 0 8 ± 0 . 0 6 + 2 0 mg/kg MPTP ( 1 8 ) 7 . 3 ± 0 . 3 0 . 4 9 ± 0 . 0 2 0 . 8 8 ± 0 . 0 3 DEM p l u s 20 mg/kg 8 . 4 ± 0 . 5 0 . 6 1 ± 0 . 0 2 * 0 . 9 9 ± 0 . 0 5 s MPTP ( 1 0 ) V a l u e s a r e mean ± S E M , u g / g w e t w e i g h t , w i t h t h e number o f s a m p l e s shown i n p a r e n t h e s e s . DEM p l u s 20 mg/kg MPTP m i c e w e r e g i v e n an i n j e c t i o n o f 0 . 8 ml DEM/kg 1 h b e f o r e an i n j e c -t i o n o f 20 mg/kg MPTP. A l l a n i m a l s w e r e s a c r i f i c e d 1 month a f t e r t h e i n j e c t i o n o f MPTP o r ^ D E M . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g -n i f i c a n t l y f r o m 20 mg/kg MPTP: P < 0 . 0 0 1 ; § P < 0 . 0 5 ; + P < 0 . 0 1 . T h u s , d e s p i t e a s u b s t a n t i a l d e p l e t i o n o f b r a i n s t e m t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t i n D E M - p r e t r e a t e d m i c e , t h e t o x i c i t y o f MPTP was n o t p o t e n t i a t e d . I t i s d i f f i c u l t t o r e c o n c i l e t h e p r e s e n t r e s u l t s w i t h t h o s e o f S e c t i o n I I I . i i i w h i c h s u g g e s t a r o l e f o r g l u t a t h i o n e i n t h e d e t o x i f i c a t i o n o f n e u r o -t o x i c s p e c i e s t h a t m i g h t be f o r m e d f r o m MPTP. T h i s d i s c r e p a n c y c a n n o t be e x p l a i n e d p r e s e n t l y . I l l . v ) E x p e r i m e n t s t h a t s e e k t o i d e n t i f y t h e n a t u r a l n e u r o t o x i n ( s )  r e s p o n s i b l e f o r m o s t c a s e s o f i d i o p a t h i c P a r k i n s o n ' s d i s e a s e As n o t e d i n t h e i n t r o d u c t o r y s e c t i o n , t h e c u r r e n t l y p r e v a i l i n g h y p o t h e -s i s i s t h a t PD i s t h e r e s u l t o f e x p o s u r e t o one o r more e n v i r o n m e n t a l t o x i n s . T h e s e t o x i n s h a v e y e t t o be i d e n t i f i e d . A l t h o u g h MPTP p r o d u c e s a p a r k i n s o n -- 51 -i a n s y n d r o m e , i t i s u n l i k e l y t o be t h e a g e n t r e s p o n s i b l e f o r m o s t c a s e s o f i d i o p a t h i c P D . T h i s i s b e c a u s e t h e r e a r e no known e n v i r o n m e n t a l s o u r c e s o f MPTP, o t h e r t h a n i t s f o r m a t i o n as a c o n t a m i n a n t d u r i n g t h e s y n t h e s i s o f a m e p e r i d i n e a n a l o g t o w h i c h r e l a t i v e l y few p e o p l e h a v e b e e n e x p o s e d . I f an e n v i r o n m e n t a l ( o r p o s s i b l y e n d o g e n o u s ) p a r k i n s o n i s m - c a u s i n g t o x i n w e r e i d e n -t i f i e d , i t m i g h t be p o s s i b l e t o d e v i s e s t r a t e g i e s t o a v o i d o r d e t o x i f y i t and p e r h a p s p r e v e n t t h e o c c u r r e n c e o f PD. F o r e x a m p l e , i f i t o c c u r r e d i n c e r t a i n f o o d s , t h e n s i m p l y e x c l u d i n g t h e s e f r o m t h e d i e t m i g h t d e c r e a s e t h e i n c i d e n c e o f t h e d i s e a s e . F o r t h i s r e a s o n , I a t t e m p t e d t o c r e a t e a m o d e l o f PD b y i n j e c t i n g C57 b l a c k m i c e w i t h c h e m i c a l a n a l o g s o f MPTP o r M P P + , some o f w h i c h a r e c o m -m o n l y f o u n d i n n a t u r e . T h e s e i n c l u d e d c i n n a m a l d e h y d e ( w h i c h m i g h t be c o n -v e r t e d b y S c h i f f b a s e f o r m a t i o n i n t o an MPTP a n a l o g i n v i v o ) ; a r e c o l i n e , a c h o l i n o m i m e t i c a l k a l o i d f r o m s e e d s o f t h e b e t e l n u t p a l m ; N , N - d i m e t h y l c i n -n a m y l a m i n e , an MPTP a n a l o g w i t h o u t a c o m p l e t e p y r i d i n e r i n g s t r u c t u r e ; p a r a q u a t , a h e r b i c i d e t h a t b e a r s a s t r u c t u r a l r e s e m b l a n c e t o M P P + ; r e -d u c e d p a r a q u a t [ 4 , 4 ' - b i s ( l - m e t h y l - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e ) ] w h i c h b e a r s 2 N - m e t h y l - t e t r a h y d r o p y r i d i n e m o i e t i e s ; 2 - m e t h y l - l , 2 , 3 , 4 - t e t r a h y d r o - B - c a r b o l -i n e , a t r a c e e n d o g e n o u s compound ( B a r k e r e t a l . 1 9 8 1 ) w h i c h i s f o r m e d b y i n t r a c e l l u l a r c o n d e n s a t i o n o f c a r b o n y l c o m p o u n d s w i t h n e u r o a c t i v e i n d o l e -a m i n e s ( C o l 1 i n s e t a l . 1 9 8 5 ) ; N - m e t h y l - l , 2 , 3 , 4 - t e t r a h y d r o - 6 , 7 - i s o q u i n o l i n e -d i o l and N - m e t h y l - l , 2 , 3 , 4 - t e t r a h y d r o i s o q u i n o l i n e , c o m p o u n d s w h i c h m i g h t be f o r m e d i n v i v o f r o m t h e c o n d e n s a t i o n o f p h e n y l e t h y l a m i n e s w i t h c a r b o n y l c o m -pounds ( T e s t a e t a l . 1 9 8 5 ) . The s t r u c t u r a l f o r m u l a e o f t h e s e compounds and t h e i r c h e m i c a l s i m i l a r i t y t o MPTP and M P P + , a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 2 . I n j e c t i o n s o f a l l t h e a n a l o g s w e r e b y t h e s c r o u t e . - 52 -I i! Ill VI VII VIII IX X F i g u r e 2 . S t r u c t u r a l f o r m u l a e o f MPTP, M P P + , and t h e i r a n a l o g s . The c o m -p o u n d s a r e : I ) N - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e ( M P T P ) , I I ) N , N - d i m e t h y l c i n n a m y l a m i n e , I I I ) C i n n a m a l d e h y d e , I V ) A r e c o l i n e , V) 2 - m e t h y l - l , 2 , 3 , 4 - t e t r a h y d r o - 6 - c a r b o l i n e , V I ) N - m e t h y l - l , 2 , 3 , 4 - t e t r a h y d r o - 6 , 7 - i s o q u i n o l i n e d i o l , V I I ) N - m e t h y l - l , 2 , 3 , 4 - t e t r a h y d r o i s o q u i n o l i n e ( M T I Q ) , V I I I ) N - m e t h y l - 4 - p h e n y l p y r i d i n i u m i o n ( M P P + ) , I X ) P a r a q u a t , X) R e d u c e d p a r a q u a t [ 4 , 4 ' - b i s ( l - m e t h y l - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e ) ] . - 53 -C i n n a m a l d e h y d e ( F i s h e r ) , d i s s o l v e d i n 10% e t h a n o l , was g i v e n o v e r a 30 d a y p e r i o d i n a t o t a l o f 20 i n j e c t i o n s . The s t a r t i n g d o s e was 4 0 mg/kg and t h i s was i n c r e a s e d a t e a c h i n j e c t i o n u n t i l a d o s e o f 9 0 0 mg/kg was r e a c h e d . The l a s t 9 i n j e c t i o n s w e r e o f t h i s l a t t e r d o s e . The t o t a l c u m u l a t i v e d o s e t h a t e a c h a n i m a l r e c e i v e d was 12 g / k g . M i c e w e r e s a c r i f i c e d 1 h a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n , when i t a p p e a r e d t h a t t h e y m i g h t n o t s u r v i v e a n y l o n g e r . D u r i n g t h e c o u r s e o f t h e c i n n a m a l d e h y d e i n j e c t i o n s , no a d v e r s e e f f e c t s w e r e o b s e r v e d when t h e d o s a g e was 700 mg/kg o r l o w e r . H o w e v e r , when t h e h i g h e s t d o s e ( 9 0 0 mg/kg f o r t h e l a s t 9 d a i l y i n j e c t i o n s ) was i n j e c t e d , p a r k i n s o n i a n - 1 i k e symptoms c o n s i s t i n g o f a k i n e s i a , t r e m o r and k y p h o s i s w e r e s e e n . T h e s e p e r s i s t e d f o r a t l e a s t 24 h a f t e r e a c h i n j e c t i o n . C o n v u l s i o n s w e r e s o m e t i m e s e l i c i t e d . 6 o f 10 m i c e d i e d d u r i n g t h e p e r i o d o f i n j e c t i o n o f t h i s h i g h e s t d o s e . D e s p i t e t h e o b v i o u s b e h a v i o r a l c h a n g e s , t h e 4 r e m a i n -i n g m i c e s a c r i f i c e d 1 h a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n d i d n o t show a n y r e d u c t i o n i n t h e s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e o r DOPAC, a l t h o u g h HVA l e v e l s w e r e s l i g h t l y h i g h e r t h a n c o n t r o l s ( T a b l e 2 3 ) . A n o t h e r g r o u p o f m i c e w e r e g i v e n 29 d a i l y i n j e c t i o n s o f a r e c o l i n e h y d r o -b r o m i d e ( S i g m a ) d i s s o l v e d i n 0 . 9 % N a C l . D o s a g e was i n c r e a s e d p r o g r e s s i v e l y f r o m 5 t o 2 0 0 mg/kg ( e x p r e s s e d as t h e s a l t ) . The l a s t 6 i n j e c t i o n s w e r e o f 200 m g / k g . The t o t a l c u m u l a t i v e d o s e p e r mouse was 1 3 6 0 m g / k g . P r i o r t o e a c h a r e c o l i n e i n j e c t i o n t h e m i c e w e r e i n j e c t e d w i t h a t r o p i n e ( S i g m a ) , w h i c h was a l s o p r o g r e s s i v e l y i n c r e a s e d f r o m 2 t o 14 m g / k g . T h i s a t r o p i n e c o v e r was n e c e s s a r y t o p r e v e n t m a n i f e s t a t i o n s o f e x c e s s i v e m u s c a r i n i c a c t i v i t y , i n c l u d i n g e x c e s s i v e s a l i v a t i o n and i n t e n s e t r e m o r s . N i n e d a y s a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n o f a r e c o l i n e t h e m i c e w e r e s a c r i f i c e d . S t r i a t a l d o p a m i n e and HVA c o n t e n t s d i d n o t d i f f e r f r o m c o n t r o l s ( T a b l e 2 3 ) . I n v i e w o f t h e r e c e n t r e p o r t t h a t a n t i c h o l i n e r g i c p r e t r e a t m e n t p r e v e n t e d t h e t o x i c i t y o f MPTP ( H a d j i c o n s t a n t i n o u e t a l . 1 9 8 5 ) , i t i s p o s s i b l e t h a t i f a r e c o l i n e h a d an - 54 -T a b l e 2 3 . E f f e c t s o f MPTP a n a l o g s on s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s o f C57 b l a c k m i c e A n a l o g Dopamine DOPAC HVA S a l i n e c o n t r o l s ( 4 4 ) 1 1 . 3 ± 0 . 4 0 . 9 5 ± 0 . 0 4 1 . 2 7 ± 0 . 0 5 C i n n a m a l d e h y d e (4) 1 1 . 6 ± 1 . 2 0 . 8 4 ± 0 . 3 2 . 1 . 9 4 ± 0 . 5 4 + A r e c o l i n e ( 8 ) 1 1 . 8 ± 0 . 9 0 . 6 6 ± 0 . 0 4 1 . 0 4 ± 0 . 0 8 N , N - d i m e t h y l - 1 1 . 2 ± 1 . 3 0 . 8 0 ± 0 . 1 1 1 . 4 1 ± 0 . 1 8 c i n n a m y l a m i n e ( 7 ) N - m e t h y l - 1 , 2 , 3 , 4 - 1 3 . 1 ± 0 . 6 0 . 8 4 ± 0 . 0 3 1 . 3 1 ± 0 . 0 7 t e t r a h y d r o - 6 , 7 -i s o q u i n o l i n e d i o l ( 1 0 ) * N - m e t h y l - 1 , 2 , 3 , 4 - 1 4 . 3 ± 0 . 3 0 . 7 6 ± 0 . 0 1 § 1 . 2 4 ± 0 . 0 3 t e t r a h y d r o -i s o q u i n o l i n e ( 9 ) 2 - m e t h y l - l , 2 , 3 , 4 - 1 3 . 8 ± 0 . 8 § 0 . 8 4 ± 0 . 0 7 1 . 3 2 ± 0 . 0 7 t e t r a h y d r o - 3 -c a r b o l i n e ( 6 ) V a l u e s a r e mean ± S E M , i n y g / g w e t w e i g h t , w i t h t h e number o f m i c e shown i n p a r e n t h e s e s . D o s a g e s a r e d e s c r i b e d i n t h e t e x t . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m c o n t r o l s : "P < 0 . 0 0 1 ; T P < 0 . 0 1 ; 5 P < 0 . 0 5 . M P T P - l i k e m e c h a n i s m o f a c t i o n and s i m i l a r n e u r o t o x i c i t y , t h e a t r o p i n e p r o -t e c t i o n i n my e x p e r i m e n t m i g h t h a v e p r e v e n t e d i t s m a n i f e s t a t i o n . H o w e v e r , o u r a t t e m p t s t o p r o t e c t m i c e f r o m MPTP w i t h a t r o p i n e , u s i n g t h e c o n d i t i o n s d e s c r i b e d b y H a d j i c o n s t a n t i n o u e t a l . ( 1 9 8 5 ) , f a i l e d . T h u s , a r e c o l i n e i s u n l i k e l y t o h a v e n e u r o t o x i c e f f e c t s on t h e n i g r o s t r i a t a l s y s t e m . N , N - d i m e t h y l c i n n a m y l a m i n e ( s y n t h e s i z e d as d e s c r i b e d i n A p p e n d i x E) was i n j e c t e d d a i l y f o r 7 d a y s , i n d o s e s i n c r e a s i n g f r o m 4 0 t o 2 0 0 m g / k g . T o t a l c u m u l a t i v e d o s e p e r mouse was 8 9 0 m g / k g . A n i m a l s s h o w e d no s i g n s o f d r u g t o x i c i t y when t h e d o s e was 4 0 , 8 0 o r 1 2 0 m g / k g . H o w e v e r , a t 1 5 0 o r 200 m g / k g , a p a r t i c u l a r s y n d r o m e was o b s e r v e d . F i v e m i n u t e s a f t e r t h e i n -j e c t i o n , m i c e b e g a n t o move c o n t i n o u s l y a r o u n d t h e i r c a g e . A t a x i a a n d t r e m -o r s t h e n d e v e l o p e d , b u t t h e a n i m a l s c o n t i n u e d t o m o v e . A t 1 . 5 h p o s t - i n j e c -t i o n , t h e c o n s t a n t m o t i o n d i s a p p e a r e d and was r e p l a c e d b y r e p e t i t i v e c h e w i n g - 55 -on w o o d - s h a v i n g s w h i l e s t a n d i n g i n one s p o t . 4 h a f t e r t h e i n j e c t i o n , t h e a n i m a l s a p p e a r e d n o r m a l a g a i n . A t s a c r i f i c e ( 1 0 d a y s a f t e r t h e l a s t i n j e c -t i o n ) , s t r i a t a l d o p a m i n e r g i c p a r a m e t e r s w e r e u n c h a n g e d f r o m c o n t r o l v a l u e s ( T a b l e 2 3 ) . N - m e t h y l - l , 2 , 3 , 4 - t e t r a h y d r o - 6 , 7 - i s o q u i n o l i n e d i o l HC1 ( S i g m a ) , d i s s o l v e d i n 0 . 9 % N a C l , was a d m i n i s t e r e d t o a n o t h e r g r o u p o f m i c e . 5 d a i l y i n j e c t i o n s o f 4 0 mg/kg ( e x p r e s s e d as t h e HC 1 s a l t ) w e r e g i v e n , and a n i m a l s . w e r e s a c r i -f i c e d 20 d a y s a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n . No a b n o r m a l b e h a v i o r was o b s e r v e d , a n d , as shown i n T a b l e 2 3 , c o n t e n t s o f s t r i a t a l d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s r e m a i n e d u n c h a n g e d f r o m c o n t r o l s . S i n c e t h e p r e s e n c e o f 2 h y d r o x y ! g r o u p s i n N - m e t h y l - 1 , 2 , 3 , 4 - t e t r a -h y d r o - 6 , 7 - i s o q u i n o l i n e d i o l m i g h t h i n d e r t h e p a s s a g e o f t h i s compound i n t o t h e b r a i n , an a n a l o g t h a t l a c k s t h e h y d r o x y l g r o u p s , N - m e t h y l - l , 2 , 3 , 4 - t e t r a -h y d r o i s o q u i n o l i n e ( M T I Q ) , was t e s t e d f o r p o s s i b l e n e u r o t o x i c e f f e c t s i n m i c e . MTIQ was s y n t h e s i z e d b y r e a c t i n g i s o q u i n o l i n e w i t h m e t h y l i o d i d e and i s o p r o -p a n o l . The p r o d u c t , N - m e t h y l i s o q u i n o l i n i u m i o d i d e ( o b t a i n e d i n 70% y i e l d ) . , was d i s s o l v e d i n w a t e r , and 4 m o l e s o f e x c e s s s o d i u m b o r o h y d r i d e w e r e a d d e d . N i t r o g e n gas was b u b b l e d t h r o u g h t h e s o l u t i o n t o e x c l u d e o x y g e n . MTIQ f o r m -e d a s an o i l y l a y e r and was e x t r a c t e d w i t h e t h e r . The e t h e r s o l u t i o n was d r i e d , a s m a l l amount o f HC1 a d d e d , and t h e h y d r o c h l o r i d e s a l t was e v a p o r -a t e d t o d r y n e s s and r e c r y s t a l l i z e d . I d e n t i t y o f t h e h y d r o c h l o r i d e s a l t o f MTIQ was c o n f i r m e d u s i n g a p r o t o n NMR s p e c t r o m e t e r . E i g h t d a i l y i n j e c t i o n s o f MTIQ w e r e a d m i n i s t e r e d s c t o a g r o u p o f C57 b l a c k m i c e . The d o s a g e was i n c r e a s e d p r o g r e s s i v e l y f r o m 4 0 t o 160 m g / k g ( d o s a g e e x p r e s s e d a s t h e HC1 s a l t ) . The l a s t 5 i n j e c t i o n s w e r e o f 160 m g / k g , g i v i n g a t o t a l c u m u l a t i v e d o s e o f 1 0 4 0 m g / k g . A f t e r e a c h i n j e c -t i o n o f 160 m g / k g ( b u t n o t o f l o w e r d o s e s ) , m i c e became r a p i d l y s e d a t e d . T h i s l a s t e d f o r a p e r i o d o f 3 h , a f t e r w h i c h a n i m a l s a p p e a r e d n o r m a l . A - 56 -s i n g l e mouse i n j e c t e d w i t h 2 0 0 mg/kg o f MTIQ d e v e l o p e d g e n e r a l i s e d s e i z u r e s and d i e d w i t h i n 15 m i n u t e s . T h u s , 160 mg/kg a p p e a r e d t o be t h e h i g h e s t d o s e c o m p a t i b l e w i t h s u r v i v a l . MTIQ a n i m a l s w e r e s a c r i f i c e d a month a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n . S t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and DOPAC w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e o f c o n -t r o l s ( T a b l e 2 3 ) . A l t h o u g h t h e r e s u l t s a r e d i f f i c u l t t o e x p l a i n , t h e y n o n e -t h e l e s s i n d i c a t e t h a t MTIQ h a d no n e u r o d e g e n e r a t i v e e f f e c t s on t h e n i g r o -s t r i a t a l s y s t e m o f m i c e . A n o t h e r g r o u p o f m i c e was i n j e c t e d d a i l y f o r 4 d a y s w i t h 2 - m e t h y l -l , 2 , 3 , 4 - t e t r a h y d r o - 3 - c a r b o l i h e (MTHBC) d i s s o l v e d i n 0 . 9 % N a C l . . MTHBC was s y n t h e s i z e d b y r e a c t i n g n o r h a r m a n ( S i g m a ) w i t h e x c e s s m e t h y l i o d i d e i n b o i l -i n g i s o p r o p a n o l . The y e l l o w p r e c i p i t a t e was f i l t e r e d , w a s h e d , and r e c r y s -t a l l i z e d f r o m i s o p r o p a n o l . The c o m p o u n d , d i s s o l v e d i n a w a t e r - m e t h a n o l s o l u t i o n t h r o u g h w h i c h n i t r o g e n was b u b b l e d , was t r e a t e d w i t h an e x c e s s o f s o d i u m b o r o h y d r i d e . T h e c o l o r l e s s p r o d u c t f o r m e d was f i l t e r e d , w a s h e d , a n d r e c r y s t a l l i z e d f r o m w a t e r - m e t h a n o l , and i t s i d e n t i t y as MHTBC was c o n f i r m e d by mass s p e c t r o m e t r y a n d n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e . The f i r s t i n j e c t i o n o f MHTBC was o f 4 0 m g / k g , w h i c h d i d n o t c a u s e a n y b e h a v i o r a l c h a n g e . S u b s e -q u e n t i n j e c t i o n s w e r e o f 8 0 m g / k g , w h i c h p r o d u c e d s e d a t i o n , a t a x i a , t r e m o r s and o c c a s i o n a l c l o n i c c o n v u l s i o n s . T h e s e l a s t e d f o r 2 h . When s a c r i f i c e d 1 month a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n , s t r i a t a l d o p a m i n e r g i c p a r a m e t e r s w e r e n o r m a l ( T a b l e 2 3 ) . A n o t h e r t r e a t m e n t was o f p a r a q u a t i n 0 . 9 % N a C l . T h r e e d o s a g e s c h e d u l e s w e r e u s e d . The f i r s t u t i l i z e d 5 d a i l y i n j e c t i o n s o f t h e d i i o d i d e s a l t , s t a r t i n g w i t h 6 . 3 m g / k g , t h e n 8 . 5 m g / k g , and f i n a l l y 3 i n j e c t i o n s o f 1 2 . 7 mg/kg ( d o s e s a r e e x p r e s s e d h e r e as t h e f r e e b a s e ) . A l t h o u g h no a b n o r m a l i t -i e s i n b e h a v i o r w e r e o b s e r v e d , t h e m i c e l o s t w e i g h t r a p i d l y a n d 7 o f 10 m i c e - 57 -d i e d w i t h i n 24 h a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n . The r e m a i n i n g m i c e w e r e s a c r i -f i c e d a t t h i s 24 h m a r k , and t h e y had n o r m a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e a n d HVA i n t h e s t r i a t u m , a l t h o u g h DOPAC l e v e l s w e r e s l i g h t l y d e c r e a s e d ( T a b l e 2 4 ) . T a b l e 2 4 . E f f e c t s o f p a r a q u a t a n d r e d u c e d p a r a q u a t on s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s o f C57 b l a c k m i c e C u m u l a t i v e D o p a m i n e DOPAC HVA d o s e s ( u g / g w e t w e i g h t ) ( m g / k g ) C o n t r o l s ( 4 4 ) 1 1 . 3 ± 0 . 4 0 . 9 5 ± 0 . 0 5 1 . 2 7 ± 0 . 0 5 P a r a q u a t (3) 5 2 . 9 , o v e r 5 1 3 . 1 ± 0 . 7 1 . 0 3 ± 0 . 1 2 0 . 8 9 ± 0 . 1 4 i n j e c t i o n s P a r a q u a t ( 9 ) . 1 2 . 7 , s i n g l e 1 2 . 5 ± 0 . 7 0 . 7 2 ± 0 . 0 4 § 1 . 2 0 ± 0 . 0 6 i n j e c t i o n P a r a q u a t ( 7 ) 4 3 . 5 , o v e r 3 1 4 . 5 ± 0 . 4 * 0 . 7 6 ± 0 . 0 4 1 . 3 0 ± 0 . 0 7 i n j e c t i o n s R e d u c e d ( 1 0 ) 3 4 1 . 6 , o v e r 6 1 2 . 7 ± 0 . 7 0 . 8 0 ± 0 . 0 3 1 . 2 8 ± 0 . 0 6 p a r a q u a t i n j e c t i o n s V a l u e s f o r d o p a m i n e a n d i t s m e t a b o l i t e s a r e mean ± SEM. The number o f a n i m a l s a n a l y s e d i s shown i n b r a c k e t s . C u m u l a t i v e d o s e s f o r p a r a q u a t a n d r e d u c e d p a r a q u a t a r e e x p r e s s e d a s t h e f r e e b a s e . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m c o n t r o l s : P < 0 . 0 0 1 ; § P < 0 . 0 5 . The s e c o n d d o s a g e s c h e d u l e o f p a r a q u a t d i i o d i d e e m p l o y e d a s i n g l e i n j e c -t i o n o f 1 2 . 7 mg/kg ( e x p r e s s e d as t h e f r e e b a s e ) , a n d s a c r i f i c e was a f t e r 1 m o n t h . No m o r t a l i t y was e n c o u n t e r e d . T a b l e 24 s h o w s t h a t t h e s e m i c e h a d no d e f i c i t s i n s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s when c o m p a r e d - 58 -t o n o r m a l s . The t h i r d d o s a g e s c h e d u l e o f p a r a q u a t i n v o l v e d 3 i n j e c t i o n s o f p a r a q u a t d i c h l o r i d e . I n j e c t i o n s w e r e o f 1 4 . 5 mg/kg e a c h ( e x p r e s s e d as t h e f r e e b a s e ) and w e r e s p a c e d 3 d a y s a p a r t . The l a t t e r t i m i n g was n e c e s s a r y b e c a u s e i n a n o t h e r e x p e r i m e n t , 10 o f 10 m i c e g i v e n 3 d a i l y i n j e c t i o n s o f t h e same d o s e d i e d s o o n a f t e r t h e t h i r d i n j e c t i o n . D e s p i t e t h e p r e s e n t d e s i g n , 3 o f 10 a n i m a l s d i e d . S t r i a t a l c o n t e n t s o f DOPAC and HVA w e r e n o r m a l 1 month a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n , a l t h o u g h d o p a m i n e c o n t e n t was i n c r e a s e d ( T a b l e 2 4 ) . The l a s t t r e a t m e n t g r o u p r e c e i v e d t h e d i h y d r o c h l o r i d e s a l t o f r e d u c e d p a r a q u a t . T h i s compound was s y n t h e s i z e d b y f i r s t d i s s o l v i n g p a r a q u a t i n w a t e r , t h e n w h i l e n i t r o g e n g a s was b u b b l e d t h r o u g h t h e s o l u t i o n t o . e x c l u d e o x y g e n , e x c e s s amounts o f s o d i u m b o r o h y d r i d e w e r e a d d e d . R e d u c e d p a r a q u a t f o r m e d as an o i l y l a y e r and was e x t r a c t e d w i t h e t h e r . The e t h e r s o l u t i o n was d r i e d , a s m a l l amount o f HC1 was a d d e d , a n d t h e d i h y d r o c h l o r i d e s a l t o f r e d u c e d p a r a q u a t was e v a p o r a t e d t o d r y n e s s and r e c r y s t a l l i z e d . I d e n t i t y o f t h e p r o d u c t as t h e d i h y d r o c h l o r i d e s a l t o f r e d u c e d p a r a q u a t was c o n f i r m e d b y n u c l e a r m a g n e t i c r e s o n a n c e and mass s p e c t r o m e t r y . Ten C57 b l a c k m i c e r e c e i v e d 6 d a i l y i n j e c t i o n s o f r e d u c e d p a r a q u a t d i H C l , i n s u c c e s s i v e d o s e s o f 7 . 3 , 1 4 . 5 , 2 9 . 1 , 5 8 . 1 , 1 1 6 . 3 and 1 1 6 . 3 m g / k g ( d o s e s e x p r e s s e d a s t h e f r e e b a s e ) . T h r o u g h o u t t h e e x p e r i m e n t a l p e r i o d , no b e h a v i o r a l a b n o r m a l i t i e s w e r e e v i d e n t . When s a c r i f i c e d 1 month a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n , s t r i a t a l c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s w e r e n o r -mal ( T a b l e 2 4 ) . + I n s u m m a r y , t h e r e f o r e , t h e v a r i o u s a n a l o g s o f MPTP o r MPP t e s t e d w e r e i n e f f e c t i v e i n d a m a g i n g t h e d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l p a t h w a y o f C57 b l a c k m i c e . T h i s i s i n s p i t e o f some i n t e r e s t i n g b e h a v i o r a l c h a n g e s o b s e r v e d d u r -i n g t h e c o u r s e o f i n j e c t i o n s o f d r u g s s u c h as c i n n a m a l d e h y d e a n d N , N - d i -- 59 -m e t h y l c i n n a m y l a m i n e . The f a i l u r e t o p r o d u c e p a r k i n s o n i a n c h a n g e s i n m i c e d o e s n o t mean t h a t t h e s e compounds m i g h t n o t be n e u r o t o x i c t o n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s o f p r i m a t e s and m a n . MPTP i t s e l f i s t o x i c t o p r i m a t e s a t v e r y l o w d o s e s , b u t i n m i c e , much h i g h e r d o s e s a r e r e q u i r e d ( L a n g s t o n e t a l . 1 9 8 4 a ; H e i k k i l a e t a l . 1 9 8 4 a ) . To o b t a i n a l e s s e q u i v o c a l a n s w e r as t o t h e p o s s -i b l e t o x i c i t y o f t h e s e M P T P - a n a l o g s i n m a n , t h e y s h o u l d be t e s t e d i n p r i m -a t e s . T h i s i s e s p e c i a l l y i m p o r t a n t w i t h r e g a r d t o t h e h e r b i c i d e p a r a q u a t . B a r b e a u e t a l . ( c i t e d i n L e w i n , 1 9 8 5 a ) h a v e f o u n d an e x c e l l e n t c o r r e l a t i o n ( r = 0 . 9 6 7 ) b e t w e e n t h e i n c i d e n c e o f PD and t h e l e v e l o f p e s t i c i d e u s e i n s e v e r a l r e g i o n s o f Q u e b e c , C a n a d a . I n a d d i t i o n , t h e same i n v e s t i g a t o r s ( B a r b e a u e t a l . 1 9 8 5 ) h a v e r e p o r t e d r e s u l t s s h o w i n g t h a t p a r a q u a t c o u l d r e d u c e b r a i n d o p a m i n e c o n c e n t r a t i o n s i n f r o g s , R a n a p i p i e n s , a l t h o u g h t h i s r e d u c t i o n was more m a r k e d w i t h MPTP. C l e a r l y , t h e p o s s i b l e n e u r o t o x i c i t y o f p a r a q u a t s h o u l d be i n v e s t i g a t e d more t h o r o u g h l y i n p r i m a t e s , s i n c e t h i s h e r -b i c i d e i s i n common u s e . I n my e x p e r i m e n t s , v a r i o u s d o s a g e s c h e d u l e s o f p a r a q u a t i n d o s e s c o m p a t i b l e w i t h s u r v i v a l , a s w e l l as t h e r e d u c e d f o r m o f p a r a q u a t w h i c h m i g h t more r e a d i l y e n t e r t h e b r a i n , d i d n o t damage d o p a m i n e r -g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s o f t h e m o u s e . I l l . v i ) S m o k i n g and P a r k i n s o n ' s d i s e a s e An i n t e r e s t i n g o b s e r v a t i o n i n PD r e s e a r c h i s t h a t t h e d i s e a s e h a s b e e n shown by s e v e r a l e p i d e m i o l o g i c a l s t u d i e s t o o c c u r l e s s f r e q u e n t l y among c i g a r e t t e s m o k e r s t h a n among n o n - s m o k e r s ( N e f z g e r e t a l . 1 9 6 8 ; K e s s l e r e t a l _ . 1 9 7 1 ; Baumann e t a l . 1 9 8 0 ; G o d w i n - A u s t e n e t a l . 1 9 8 2 ) . A l t h o u g h t h e p r o t e c t i v e m e c h a n i s m o f s m o k i n g r e m a i n s u n k n o w n , s e v e r a l t h e o r i e s h a v e b e e n p u t f o r t h . P e r r y e t a l . ( 1 9 8 2 ) s u g g e s t e d t h a t t h e i n c r e a s e d p a r t i a l p r e s -s u r e o f c a r b o n m o n o x i d e i n b r a i n c e l l s o f c i g a r e t t e s m o k e r s m i g h t p r o v i d e a - 60 -r e d u c i n g e n v i r o n m e n t w h i c h c o u l d p a r t i a l l y p r o t e c t n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s f r o m o x i d a n t d a m a g e . S n y d e r ( 1 9 8 5 ) p o s t u l a t e d t h a t t h e many p y r i d i n e c o m -pounds i n c i g a r e t t e smoke m i g h t i n h i b i t t h e u p t a k e o f MPTP ( o r M P P + ) , a l s o a p y r i d i n e m o l e c u l e , i n t o n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s . T h i s h y p o t h e s i s a s s u m e s t h a t t h e n e u r o t o x i n r e s p o n s i b l e f o r i d i o p a t h i c PD i s an M P T P - l i k e m o l e c u l e . I t i s p o s s i b l e t o f o r m u l a t e a t l e a s t 3 o t h e r h y p o t h e s e s t o e x p l a i n t h e p r o t e c t i v e e f f e c t a f f o r d e d b y c i g a r e t t e s m o k i n g . The f i r s t i s t h a t one o r more o f t h e compounds p r e s e n t i n t o b a c c o smoke c a n d e t o x i f y M P T P - l i k e m o l e -c u l e s . To t e s t t h i s , we u s e d t h e MPTP mouse m o d e l t o a s c e r t a i n i f a n y one o f 3 compounds known t o a c c u m u l a t e i n t h e p h y s i o l o g i c a l f l u i d s and t i s s u e s o f c i g a r e t t e s m o k e r s c a n p r e v e n t t h e t o x i c i t y o f MPTP. The compounds t e s t e d w e r e n i c o t i n e , s o d i u m t h i o c y a n a t e , and h y d r a z i n e ( L i u e t a l . 1 9 7 4 ; V o g h t e t ^1_. 1 9 7 7 ) . D e t a i l s o f t h i s e x p e r i m e n t a r e d e s c r i b e d i n A p p e n d i x G ( Y o n g e_t a l . J . N e u r o l . S c i . 7 2 ^ 2 6 5 - 2 7 2 , 1 9 8 6 ) . I n b r i e f , m i c e w e r e p r e t r e a t e d w i t h one o f t h e s e 3 compounds f o r s e v e r a l d a y s b e f o r e an i n j e c t i o n o f 4 0 mg/kg MPTP was g i v e n . One month l a t e r , m i c e w e r e s a c r i f i c e d a n d t h e s t r i a t u m a n a l y s e d f o r c o n t e n t s o f d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s . The r e s u l t s a r e d i s p l a y e d i n T a b l e 2 5 . W h i l e t h i o c y a n a t e o f f e r e d v e r y s l i g h t p r o t e c t i o n f r o m M P T P - i n d u c e d damage t o d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l n e u r o n s , h y d r a z i n e p r e t r e a t m e n t o f f e r e d c o n s i d e r a b l e p r o t e c t i o n , c o m p a r a b l e t o t h a t f o u n d w i t h a n t i o x i d a n t p r e t r e a t m e n t p r i o r t o an MPTP i n j e c t i o n ( T a b l e 1 1 ) . The m e c h a n i s m o f t h e p r o t e c t i v e e f f e c t o f h y d r a z i n e c a n n o t be a t t r i b u t e d t o MAO-B i n h i b i t i o n s i n c e i t was n o t an i n h i b i t o r o f MAO-B a c t i -v i t y i n t h e l i v e r o r s t r i a t u m ( T a b l e 2 6 ) . M i c e p r e t r e a t e d f o r 10 d a y s w i t h n i c o t i n e a l l d i e d w i t h i n 5 d a y s f o l l o w i n g t h e MPTP i n j e c t i o n s u g g e s t i n g t h a t , i f a n y t h i n g , n i c o t i n e i n t e n s i f i e d t h e n e u r o t o x i c e f f e c t s o f MPTP. - 61 -T a b l e 2 5 . E f f e c t s o f p r e t r e a t m e n t w i t h t h i o c y a n a t e o r h y d r a z i n e on M P T P - i n d u c e d d e p l e t i o n o f s t r i a t a l d o p a m i n e and i t s m e t a b o l i t e s i n m i c e C o n t r o l s MPTP T h i o c y a n a t e H y d r a z i n e ( 3 9 ) ( 2 3 ) ( 8 ) ( 1 6 ) Dopamine 1 1 . 3 ± 0 . 4 1 . 3 ± 0 . 2 2 . 7 ± 0 . 7 + 5 . 7 ± 0 . 5 DOPAC 0 . 9 7 ± 0 . 0 5 * 0 . 2 1 ± 0 . 0 3 0 . 3 1 ± 0 . 0 6 0 . 5 1 ± 0 . 0 7 * HVA 1 . 2 2 ± 0 . 0 5 * 0 . 4 3 ± 0 . 0 3 0 . 6 2 ± 0 . 0 9 + 0 . 8 9 ± 0 . 0 4 * V a l u e s a r e mean ± S E M , i n y g / g w e t w e i g h t , w i t h number o f s a m p l e s i n d i c a t e d i n p a r e n t h e s e s . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i -f i c a n t l y f r o m m i c e i n j e c t e d w i t h MPTP a l o n e : P < 0 . 0 0 1 ; + P < 0 . 0 1 . T a b l e 2 6 . F a i l u r e o f h y d r a z i n e t o i n h i b i t MAO-B a c t i v i t y i n l i v e r and s t r i a t u m o f m i c e C o n t r o l s H y d r a z i n e L i v e r 6 5 . 1 ± 3 . 4 6 7 . 1 ± 5 . 0 ( 1 0 ) ( 7 ) S t r i a t u m 2 8 . 0 ± 2 . 1 3 2 . 7 ± 1 . 6 ( 1 5 ) ( 7 ) V a l u e s a r e mean ± S E M , n m o l e s / h / m g p r o t e i n , w i t h number o f s a m p l e s i n d i c a t e d i n p a r e n t h e s e s . H y d r a z i n e - t r e a t e d m i c e w e r e s a c r i f i c e d 1 h a f t e r t h e l a s t o f 8 d a i l y i n j e c t i o n s o f 11 m g / k g . None o f t h e means a r e s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t . T h u s , i f t h e n e u r o t o x i n r e s p o n s i b l e f o r m o s t c a s e s o f i d i o p a t h i c PD i s an M P T P - l i k e m o l e c u l e w h o s e t o x i c i t y c a n s i m i l a r l y be r e d u c e d b y h y d r a z i n e , t h e n t h e a p p a r e n t p r o t e c t i v e e f f e c t o f s m o k i n g m i g h t be a t t r i b u t a b l e t o t h i s c o m p o u n d . Of c o u r s e , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e r e a r e o t h e r s u b s t a n c e s i n c i g a r e t t e smoke w h i c h m i g h t be more p o t e n t t h a n h y d r a z i n e i n p a r t i a l l y p r e -v e n t i n g t h e t o x i c i t y o f M P T P . - 6 2 -The s e c o n d h y p o t h e s i s r e g a r d i n g t h e p r o t e c t i v e r o l e o f s m o k i n g r e l i e s on t h e o b s e r v a t i o n t h a t MPTP r e q u i r e s c o n v e r s i o n by MAO-B t o become n e u r o t o x i c ( M a r k e y e t a l . 1 9 8 4 ; H e i k k i l a e t a l . 1 9 8 4 b ; L a n g s t o n e t a l 1 9 8 4 b ) . I t i s p o s s i b l e t h a t i f t h e a g e n t ( s ) r e s p o n s i b l e f o r m o s t c a s e s o f i d i o p a t h i c PD r e q u i r e s c o n v e r s i o n b y MAO-B t o become n e u r o t o x i c , and i f c i g a r e t t e s m o k i n g i n h i b i t s t h i s enzyme s o t h a t t h e c o n v e r s i o n o f an i n a c t i v e p r e c u r s o r ( s ) t o a n e u r o t o x i c s p e c i e s i s p r e v e n t e d o r r e d u c e d , t h e n t h e a p p p a r e n t p r o t e c t i v e e f f e c t o f s m o k i n g m i g h t be e x p l a i n e d . To e v a l u a t e t h i s s e c o n d p o s s i b i l i t y , t h e p l a t e l e t MAO-B a c t i v i t y o f h e a v y c i g a r e t t e s m o k e r s (who e a c h smoked more t h a n 2 0 c i g a r e t t e s a d a y ) was c o m p a r e d w i t h t h a t o f n o n - s m o k e r s . D e t a i l s o f t h e enzyme m e a s u r e m e n t s h a v e b e e n d e s c r i b e d i n A p p e n d i x G . P l a t e l e t s w e r e c h o s e n as t h e s o u r c e o f M A O - B , s i n c e t h e y c o n t a i n o n l y t h e B i s o z y m e and a r e t h e o n l y r e a d i l y a c c e s s i b l e s o u r c e o f t h e enzyme f o r r o u t i n e s t u d i e s i n l i v i n g p e r s o n s . W h e t h e r o r n o t MAO-B a c t i v i t y i n p l a t e l e t s i s a r e l i a b l e i n d e x o f i t s a c t i v i t y i n t h e human b r a i n o r o t h e r t i s s u e s i s u n c e r t a i n ( S a n d l e r e t a l . 1 9 8 1 ) . T a b l e 27 shows t h a t t h e mean a c t i v i t y o f MAO-B i n p l a t e l e t s was s i g n i f i -c a n t l y l o w e r i n c i g a r e t t e s m o k e r s t h a n i n n o n - s m o k e r s . T h i s c o n f i r m s t h e r e s u l t s o f O r e l a n d e t a l . ( 1 9 8 1 ) who s t u d i e d a much s m a l l e r p o p u l a t i o n . A l t h o u g h i n t e r e s t i n g , t h e r e d u c t i o n (25 ) m i g h t n o t be f u n c t i o n a l l y l a r g e e n o u g h t o a c c o u n t f o r t h e p r o t e c t i o n a f f o r d e d b y s m o k i n g . I n t h e t r e a t m e n t o f d e p r e s s i o n , a n t i d e p r e s s a n t s t h a t a r e MAO i n h i b i t o r s must i n h i b i t p l a t e l e t MAO-B i n e x c e s s o f 8 0 % b e f o r e c l i n i c a l i m p r o v e m e n t i s s e e n ( Y o u d i m e t a l . 1 9 8 0 ) . - 63 -T a b l e 2 7 . Monoamine o x i d a s e B a c t i v i t y i n p l a t e l e t s o f human s m o k e r s and n o n - s m o k e r s S u b j e c t s Mean age ( y e a r s ) M o n o a m i n e o x i d a s e B a c t i v i t y ( n m o l / h / m g p r o t e i n ) C i g a r e t t e s m o k e r s ( 3 2 ) 37 ± 2 4 . 0 8 ± 0 . 2 6 * N o n - s m o k e r s 34 ± 2 5 . 4 6 ± 0 . 2 4 ( 4 1 ) V a l u e s a r e mean ± S E M , w i t h number o f s u b j e c t s shown i n p a r e n t h e s e s . * P < 0 . 0 0 1 . What c o m p o n e n t o f c i g a r e t t e smoke i n h i b i t s MAO-B ? To a t t e m p t t o a n s w e r t h i s , I m e a s u r e d r a t l i v e r MAO-B a c t i v i t y , u s i n g an i n v i t r o s y s t e m d e s -c r i b e d i n A p p e n d i x G , i n t h e p r e s e n c e o f o n e o f 4 c o n s t i t u e n t s o f c i g a r e t t e s m o k e . T h e s e w e r e c o t i n i n e ( t h e m a j o r m e t a b o l i t e o f n i c o t i n e ) , t h i o c y a n a t e , — f i —3 c y a n i d e , o r h y d r a z i n e . A l l 4 c o m p o u n d s , ; t e s t e d a t 10 t o 10 M , w e r e t o t a l l y i n e f f e c t i v e i n i n h i b i t i n g MAO-B a c t i v i t y . A l t h o u g h t h e c a u s e o f t h e l o w e r e d p l a t e l e t MAO-B a c t i v i t y i n c i g a r e t t e s m o k e r s a p p e a r s n o t t o be d u e t o t h e s e c o m p o u n d s , i t i s c e r t a i n l y p o s s i b l e t h a t i n v i v o , o n e o f t h e s e c o m -pounds m i g h t a c t as i n h i b i t o r s o f t h e s y n t h e s i s o f m o l e c u l e s o f M A O - B , r e s u l t i n g i n d e c r e a s e d a c t i v i t y o f t h e e n z y m e . A t h i r d p o s s i b l e e x p l a n a t i o n o f t h e p r o t e c t i v e r o l e o f s m o k i n g i s t h a t an i n g r e d i e n t i n c i g a r e t t e smoke i n d u c e s t h e p r o d u c t i o n o f o t h e r e n z y m e s , p e r h a p s i n t h e l i v e r , w h i c h d e s t r o y t h e n e u r o t o x i n p r e c u r s o r b e f o r e i t c a n be c o n v e r t e d i n t o t h e a c t i v e m e t a b o l i t e b y MAO-B. No e x p e r i m e n t s t o t e s t t h i s h y p o t h e s i s h a v e y e t b e e n p e r f o r m e d . - 64 -I I I . v i i ) S t a t u s o f MAO-B i n r e l a t i o n t o P a r k i n s o n ' s d i s e a s e An i m p o r t a n t f i n d i n g i n MPTP r e s e a r c h i s t h a t MPTP i t s e l f i s n o t n e u r o -t o x i c , b u t r e q u i r e s c o n v e r s i o n b y MAO-B t o one o r more t o x i c m e t a b o l i t e s . I f t h e n e i i r o t o x i n ( s ) r e s p o n s i b l e f o r m o s t c a s e s o f i d i o p a t h i c PD r e q u i r e s s u c h a t r a n s f o r m a t i o n b y t h e same e n z y m e , t h e n v a r i a t i o n s i n MAO-B a c t i v i t y i n t i s s u e s m i g h t be a c r u c i a l f a c t o r i n t h e d e v e l o p m e n t o f t h e d i s e a s e . The p r e s e n c e o f an u n i d e n t i f i e d e n d o g e n o u s MAO i n h i b i t o r h a s . b e e n d e m o n -s t r a t e d i n human u r i n e ( G l o v e r e t a l . 1 9 8 0 ; G l o v e r e t a l . 1 9 8 2 ; B h a t t a -c h a r y a e t a l . 1 9 8 2 ) . I f an e n d o g e n o u s i n h i b i t o r w e r e r e s p o n s i b l e f o r r e g u l -a t i n g t h e a c t i v i t y o f MAO-B i n human s u b j e c t s , t h e n a f a i l u r e t o p r o d u c e i t m i g h t r e s u l t i n i n c r e a s e d MAO-B a c t i v i t y , and t h u s f a c i l i t a t e c o n v e r s i o n o f i n a c t i v e p r e c u r s o r s t o n e u r o t o x i c s p e c i e s , r e s u l t i n g i n P D . To t e s t t h i s , t h e amount o f t h e e n d o g e n o u s MAO i n h i b i t o r ( s ) i n t h e u r i n e o f PD p a t i e n t s and c o n t r o l s u b j e c t s was m e a s u r e d . P l a t e l e t s w e r e a l s o o b t a i n e d f r o m some c o n t r o l s u b j e c t s t o a s c e r t a i n w h e t h e r o r n o t t h e r e was a c o r r e l a t i o n b e t w e e n u r i n a r y MAO-B i n h i b i t o r y p o t e n c y and p l a t e l e t MAO-B a c t i v i t y . A p p e n d i x G ( Y o n g e t a l . J . - N e u r o l . S c i . 7 2 : 2 6 5 - 2 7 2 , 1 9 8 6 ) g i v e s d e t a i l s o f t h e m e t h o d e m p l o y e d , as w e l l as a d e s c r i p t i o n o f t h e s u b j e c t s , PD a n d c o n t r o l s , who s u p p l i e d u r i n e s and p l a t e l e t s . T a b l e 28 shows t h a t i n h i b i t i o n o f r a t l i v e r MAO-B b y u r i n e was s i g n i f i -c a n t l y g r e a t e r f o r t h e PD p a t i e n t s t h a n f o r c o n t r o l s u b j e c t s . H o w e v e r , e x -c l u s i o n o f PD p a t i e n t s c u r r e n t l y b e i n g t r e a t e d w i t h a n t i c h o l i n e r g i c d r u g s r e d u c e d t h i s d i f f e r e n c e . A l l b u t one o f t h e PD p a t i e n t s w e r e r e c e i v i n g some f o r m o f d r u g t r e a t m e n t , w h i l e f e w o f t h e c o n t r o l s w e r e t a k i n g a n y d r u g s . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e p r e s e n c e o f v a r i o u s d r u g s and t h e i r m e t a b o l i t e s i n t h e u r i n e o f PD p a t i e n t s m i g h t h a v e a c c o u n t e d f o r t h e i r g r e a t e r i n h i b i t i o n o f MAO-B. The d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e c o n t r o l and PD p a t i e n t s i s u n l i k e l y t o be - 65 -due t o d i f f e r i n g mean a g e s , s i n c e l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s f o r t h e c o n t r o l s u b j e c t s showed no c o r r e l a t i o n b e t w e e n age a n d u r i n a r y i n h i b i t i o n o f MAO-B ( r = 0 . 2 6 , l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s ) . I n any c a s e , t h e r e was no e v i d e n c e o f a d e c r e a s e d u r i n a r y e x c r e t i o n o f t h e MAO-B i n h i b i t o r ( s ) b y t h e PD p a t i e n t s , as m i g h t h a v e been e x p e c t e d h a d t h e y f a i l e d t o s y n t h e s i z e a d e q u a t e amounts o f an e n d o g e n o u s MAO-B i n h i b i t o r . A l s o , t h e p o o r c o r r e l a t i o n b e -t w e e n t h e u r i n a r y MAO-B i n h i b i t o r ( s ) and p l a t e l e t MAO-B a c t i v i t y ( r = 0 . 1 3 ) i n 21 c o n t r o l s u b j e c t s s u g g e s t s t h a t t h e f o r m e r , w h o s e i d e n t i t y i s u n k n o w n , m i g h t n o t be an i m p o r t a n t e n d o g e n o u s r e g u l a t o r o f MAO-B a c t i v i t y o f t i s s u e s . T h i s a r g u e m e n t a s s u m e s t h a t p l a t e l e t MAO-B a c t i v i t y i s an a c c u r a t e r e f l e c t -i o n o f MAO-B a c t i v i t y o f o t h e r t i s s u e s s u c h as t h e b r a i n . D i r e c t m e a s u r e m e n t s o f MAO-B a c t i v i t y i n a u t o p s i e d b r a i n r e g i o n s (SN a n d f r o n t a l c o r t e x ) f r o m PD p a t i e n t s and c o n t r o l s u b j e c t s was a l s o p e r f o r m e d . The e x p e r i m e n t a l d e t a i l s , as w e l l as d e s c r i p t i o n s o f t h e PD and c o n t r o l s u b -j e c t s whose p o s t - m o r t e m b r a i n s w e r e u s e d , a r e d e s c r i b e d i n A p p e n d i x G. T a b l e 2 8 . I n h i b i t i o n o f r a t l i v e r monoamine o x i d a s e B a c t i v i t y b y human u r i n e S u b j e c t s p r o v i d i n g u r i n e Mean age % Enzyme i n h i b i t i o n o f s u b j e c t s b y u r i n e C o n t r o l s u b j e c t s 47 ± 3 2 0 . 9 ± 1 . 3 (49) A l l P a r k i n s o n ' s d i s e a s e 62 ± 2 * 3 4 . 5 ± 4 . 0 * p a t i e n t s ( 3 1 ) P a r k i n s o n ' s d i s e a s e p a t i e n t s 63 ± 2 * 2 7 . 7 ± 3 . 4 § n o t r e c e i v i n g a n t i c h o l i n e r g i c d r u g s ( 2 1 ) Mean ± SEM a r e shown f o r age i n y e a r s , a n d f o r u r i n a r y MAO-B i n h i b i t i o n i n . Number o f s u b j e c t s a n a l y s e d i s shown i n p a r e n t h e s e s . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m t h a t o f c o n t r o l s u b j e c t s : * P < 0 . 0 0 1 , P < 0 . 0 5 . - 66 -In T a b l e 2 9 , i t c a n be s e e n t h a t MAO-B a c t i v i t y was n o t s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d i n t h e f r o n t a l c o r t e x o r SN o f PD b r a i n s when c o m p a r e d t o c o n t r o l . MAO-B a c t i v i t y i n c r e a s e s w i t h age i n m o s t b r a i n r e g i o n s ( F o w l e r e t a l _ . 1 9 8 0 ) , a n d t h e somewhat h i g h e r a c t i v i t y i n t h e SN o f t h e PD p a t i e n t s may b e due t o t h e i r g r e a t e r mean age a t d e a t h . In s u m m a r y , t h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d showed no s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n b r a i n MAO-B a c t i v i t y i n t h e a u t o p s i e d b r a i n s o f PD p a t i e n t s . T h e r e was no e v i d e n c e o f a d e c r e a s e d e x c r e t i o n o f u r i n a r y MAO-B i n h i b i t o r ( s ) i n l i v i n g p a t i e n t s . I t a p p e a r s u n l i k e l y t h a t an o v e r a c t i v e MAO-B a c t i v i t y i n t i s s u e s c a u s e s t h e e x c e s s i v e c o n v e r s i o n o f an i n a c t i v e p r e c u r s o r t o a n e u r o t o x i c m e t a b o l i t e ( s ) i n P D . T a b l e 2 9 . Monoamine o x i d a s e B a c t i v i t y i n b r a i n o f c o n t r o l s and P a r k i n s o n ' s d i s e a s e p a t i e n t s S u b j e c t s Mean age MAO-B a c t i v i t y ( y e a r s ) ( n m o l / h / m g p r o t e i n ) F r o n t a l - c o r t e x C o n t r o l s ( 2 0 ) P a r k i n s o n ' s d i s e a s e (11) C o n t r o l s ( 1 1 ) P a r k i n s o n ' s d i s e a s e ( 7 ) 63 ± 2 78 ± 2 * S u b s t a n t i a n i g r a 6 0 ± 2 79 ± 3 * 2 4 . 7 ± 2 5 . 2 ± 4 1 . 2 ± 5 2 . 9 ± 1 . 8 1 . 4 5 . 2 8 . 1 V a l u e s a r e i n mean ± S E M , w i t h t h e number o f s u b j e c t s a n a l y s e d i n p a r e n t h e s e s . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i f i c a n t -l y f r o m c o n t r o l s : P < 0 . 0 0 1 . - 67 -111. v i i i ) G l u t a t h i o n e c o n t e n t and g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e a c t i v i t y  i n t h e a u t o p s i e d b r a i n s o f P a r k i n s o n ' s d i s e a s e p a t i e n t s T h i s r e s e a r c h was i n i t i a t e d b y t h e o b s e r v a t i o n o f P e r r y e t a l . ( 1 9 8 2 ) t h a t g l u t a t h i o n e c o n t e n t was r e d u c e d i n t h e SN o f p a t i e n t s w i t h P D . A s m a l l s a m p l e o f SN ( 6 ) f r o m PD b r a i n s was u s e d i n t h a t s t u d y . S i n c e t h e n , t h e r e h a s been o p p o r t u n i t y t o s t u d y more p a r k i n s o n i a n b r a i n s . P a r t o f t h i s s e c -t i o n u p d a t e s t h e o b s e r v a t i o n o f P e r r y e t a l . ( 1 9 8 2 ) . ' M e a s u r e m e n t s o f r e d u c e d (GSH) and o x i d i s e d (GSSG) f o r m s o f g l u t a t h i o n e , a s w e l l as o f t h e m i x e d d i s u l f i d e o f GSH and c y s t e i n e , G S - S C y , w e r e d o n e o n an a m i n o a c i d a n a l y s e r b y t h e p r o c e d u r e o f P e r r y e t a l . ( 1 9 6 8 , 1 9 8 1 ) . T o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t was t a k e n as t h e sum o f G S H , 2 x G S S G , and G S - S C y . T h e i n c l u s i o n o f G S - S C y e n a b l e s a more a c c u r a t e r e p r e s e n t a t i o n o f t o t a l g l u t a -t h i o n e c o n t e n t p r e s e n t d u r i n g l i f e s i n c e t h i s compound i s n o t n o r m a l l y d e -t e c t a b l e i n r a p i d l y f r o z e n b i o p s i e s . Upon d e a t h , and u n l e s s t h e b r a i n i s f r o z e n i m m e d i a t e l y , G S - S C y a c c u m u l a t e s , m a i n l y f r o m t h e a u t o l y s i s o f g l u t a -t h i o n e . B r a i n s u s e d f o r c o n t r o l d a t a w e r e f r o m a h e t e r o g e n e o u s g r o u p o f s u b j e c t s c o n s i s t i n g o f p e r s o n s who d i e d w i t h o u t a n y s i g n s o f n e u r o l o g i c a l d i s e a s e , a n d o f p a t i e n t s d y i n g w i t h H u n t i n g t o n ' s c h o r e a ( H C ) , d i a l y s i s e n c e p h a l o p a t h y ( D E ) , o l i v o p o n t o c e r e b e l l a r a t r o p h y ( O P C A ) , a m y o t r o p h i c l a t e r a l s c l e r o s i s , o r s c h i z o p h r e n i a . In n o n e o f t h e s e d i s o r d e r s i s t h e r e a n y known a b n o r m a l i t y o f g l u t a t h i o n e m e t a b o l i s m . A l l o f t h e b r a i n s s t u d i e d had a d e a t h - t o - f r e e z i n g i n t e r v a l o f 8 h o r l e s s . F o r l o n g e r i n t e r v a l s , a u t o l y s i s o f g l u t a t h i o n e w o u l d h a v e b e e n s o e x t e n s i v e t h a t q u a n t i t a t i o n w o u l d h a v e become u n r e l i a b l e ( P e r r y e t a l . 1 9 8 1 ) . W i t h r e s p e c t t o t h e age o f s u b j e c t s a t d e a t h , c o n t r o l b r a i n s d i d n o t m a t c h t h e PD b r a i n s ( c o n t r o l s = 57 ± 2 y e a r s , PD = 75 ± 3 , mean ± SEM, P< 0 . 0 0 1 ) . H o w e v e r , l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s i n t h e c o n t r o l - 6 8 -g r o u p showed no c o r r e l a t i o n o f t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t w i t h age ( S N , r = 0 . 0 2 ; f r o n t a l c o r t e x , r = 0 . 0 5 ) . To c o n f i r m t h i s , we a n a l y s e d 19 c o r -t i c a l b i o p s i e d s p e c i m e n s t h a t w e r e f r o z e n i m m e d i a t e l y a f t e r e x c i s i o n . The t o t a l g l u t a t h i o n e i n p r o m p t l y - f r o z e n b i o p s i e s o f c o u r s e g i v e s a more a c c u r -a t e r e p r e s e n t a t i o n o f t h e c o n t e n t p r e s e n t d u r i n g l i f e . T h e s e s p e c i m e n s o f b i o p s i e d m a t e r i a l w e r e f r o m s u b j e c t s who u n d e r w e n t s u r g i c a l r e m o v a l o f a d e e p - s e a t e d b r a i n t u m o u r o r b r a i n a b s c e s s . The s u r g e r y r e q u i r e d s a c r i f i c e o f a s m a l l a r e a o f a p p a r e n t l y n o r m a l c e r e b r a l c o r t e x i n o r d e r t o r e a c h t h e d e e p e r p a t h o l o g i c a l l e s i o n . The age o f s u b j e c t s r a n g e d f r o m 16 t o 6 4 . A g a i n , no l i n e a r c o r r e l a t i o n was f o u n d b e t w e e n age and t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t ( r = 0 . 3 6 ) . T a b l e 3 0 p r e s e n t s t h e t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t s o f 6 b r a i n r e g i o n s f o r PD p a t i e n t s , and f o r a l a r g e g r o u p o f c o n t r o l s u b j e c t s . T o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t was s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d o n l y i n t h e SN o f PD p a t i e n t s . A l t h o u g h g l u t a t h i o n e c o n t e n t was somewhat l o w e r i n PD p a t i e n t s t h a n i n c o n t r o l s f o r t h e o t h e r 5 b r a i n r e g i o n s e x a m i n e d , t h e s e r e d u c t i o n s d i d n o t r e a c h s t a t i s t i -c a l s i g n i f i c a n c e ( a n a l y s e d b y 2 - t a i l e d t - t e s t , P = 0 . 0 5 ) . S i n c e t h e mean d e a t h - t o - f r e e z i n g i n t e r v a l s w e r e a l m o s t i d e n t i c a l f o r t h e c o n t r o l a n d PD p a t i e n t s ( 3 . 9 ± 0 . 3 a n d 4 . 0 ± 0 . 5 h r e s p e c t i v e l y , mean ± S E M ) , t h e g l u t a -t h i o n e r e d u c t i o n i n t h e SN o f PD p a t i e n t s a t a u t o p s y p r o b a b l y r e p r e s e n t s a n i g r a l g l u t a t h i o n e d e f i c i e n c y t h a t was p r e s e n t d u r i n g l i f e . - 69 -T a b l e 3 0 . T o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t s i n v a r i o u s r e g i o n s o f r a p i d l y f r o z e n human b r a i n s B r a i n r e g i o n C o n t r o l s P a r k i n s o n ' s D i s e a s e F r o n t a l c o r t e x 1 . 7 9 ± 0 . 0 7 1 . 5 4 ± 0 . 1 2 ( 5 3 ) (15) O c c i p i t a l c o r t e x 1 . 6 7 ± 0 . 0 7 1 . 4 4 ± 0 . 1 2 ( 5 3 ) (12) C e r e b e l l a r c o r t e x 1 . 9 8 ± 0 . 0 8 1 . 6 6 ± 0 . 1 8 ( 5 2 ) ( 8 ) C a u d a t e n u c l e u s 2 . 2 3 ± 0 . 0 9 1 . 8 5 ± 0 . 2 1 ( 5 6 ) (10) Putamen 2 . 1 3 ± 0 . 1 1 1 . 7 2 ± 0 . 1 9 ( 3 0 ) (10) S u b s t a n t i a n i g r a 1 . 6 1 ± 0 . 0 7 1 . 1 6 ± 0 . 1 1 + ( 5 3 ) ( 1 5 ) V a l u e s a r e mean ± S E M , u m o l / g w e t w e i g h t , w i t h number o f s u b -j e c t s shown i n p a r e n t h e s e s . + P < 0 . 0 1 , a s c o m p a r e d t o c o n -t r o l mean f o r t h e same b r a i n r e g i o n . A n i m a l e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s ( B S O , g l u t a t h i o n e m o n o e t h y l e s t e r , BHA) h a v e i n d i c a t e d t h a t t h e t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t o f t h e b r a i n i s r a t h e r r e s i s t a n t t o m a n i p u l a t i o n . Why t h e n i s t h e t o t a l g l u t a t h i o n e c o n -t e n t o f t h e SN much l o w e r , i n PD b r a i n s when c o m p a r e d t o c o n t r o l s ? T h e r e a r e a t l e a s t 4 p o s s i b l e i n t e r p r e t a t i o n s . The f i r s t i s t h a t t h e l o w e r amount i s a r e f l e c t i o n o f a t r o p h y o f t h i s b r a i n r e g i o n . H o w e v e r , t h i s a p p p e a r s u n l i k e l y s i n c e g l i a , w h i c h r e p l a c e s l o s t n e u r o n s , a l s o c o n t a i n g l u t a t h i o n e . I n a d d i t i o n , t h e r e i s no g l u t a t h i o n e d e f i c i e n c y i n t h e s t r i a t u m i n HC o r i n t h e c e r e b e l l a r c o r t e x i n OPCA. L a r g e n u m b e r s o f n e u r o n s a r e l o s t f r o m t h e s e a r e a s i n t h e s e 2 d i s o r d e r s . The s e c o n d p o s s i b i l i t y i s t h a t t h e r e d u c e d t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t i n - 70 -t h e SN o f PD p a t i e n t s i s a r e s u l t o f d r u g t r e a t m e n t . M o s t o r a l l o f t h e p a t i e n t s we s t u d i e d w e r e p r o b a b l y b e i n g t r e a t e d w i t h L-DOPA up t o t h e t i m e o f d e a t h (we h a v e no c l e a r r e c o r d s o f t h i s ) . S i n c e d o p a m i n e o r L-DOPA t h e m -s e l v e s c a n a u t o x i d i s e t o p r o d u c e f r e e r a d i c a l s ( G r a h a m e t a l . 1 9 7 8 ; T s e e t a l . 1 9 7 6 ) , i t i s c o n c e i v a b l e t h a t t h e l o w e r l e v e l s o f g l u t a t h i o n e r e p r e s e n t an a t t e m p t b y t h e SN t o d e t o x i f y t h e s e r a d i c a l s . H o w e v e r , t h i s p o s s i b i l i t y a p p e a r s u n t e n a b l e b e c a u s e t h e s t r i a t u m o f PD p a t i e n t s s h o u l d s i m i l a r l y show a s i g n i f i c a n t d e c r e a s e o f t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t . The s t r i a t u m , b e i n g t h e t e r m i n u s o f t h e d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l p a t h w a y , w o u l d s u r e l y h a v e b e e n e x p o s e d t o ^ h i g h l e v e l s o f L-DOPA o r d o p a m i n e . O b v i o u s l y , one means o f c o n f i r m i n g t h a t t h e r e d u c t i o n o f t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t i n t h e SN o f PD p a t i e n t s was n o t due t o L-DCPA t r e a t m e n t , w o u l d be t o s t u d y a u t o p s i e d SN o f p a t i e n t s who w e r e n e v e r t r e a t e d w i t h t h i s d r u g . H o w e v e r , s u c h p a t i e n t s a r e now f e w and f a r b e t w e e n . A t h i r d p o s s i b i l i t y i s t h a t t h e g l u t a t h i o n e d e f i c i e n c y o f t h e SN i n PD p a t i e n t s i s due t o d e c r e a s e d s y n t h e s i s o r a c c e l e r a t e d b r e a k d o w n o f g l u t a -t h i o n e . F o r e x a m p l e , t h e a c t i v i t y o f y - g l u t a m y l c y s t e i n e s y n t h e t a s e , t h e r a t e - l i m i t i n g enzyme f o r t h e : s y n t h e s i s o f g l u t a t h i o n e , m i g h t be r e d u c e d . I f t h i s w e r e an i n h e r e n t e n z y m a t i c f a i l u r e i n h e r i t e d i n c e r t a i n i n d i v i d u a l s w h i c h p r e d i s p o s e s them t o t h e d e v e l o p m e n t o f P D , t h e n t h e g e n e t i c m e c h a n i s m m u s t be a v e r y c o m p l e x o n e , i n a s m u c h a s s i m p l e g e n e t i c p r e d i s p o s i t i o n d o e s n o t a p p e a r t o be a f a c t o r i n t h e s u s c e p t i b i l i t y o f i n d i v i d u a l s t o PD (Ward e t a l . 1 9 8 3 ) . A l s o , t h e l a c k o f s i g n i f i c a n t d e p l e t i o n o f g l u t a t h i o n e i n o t h e r b r a i n a r e a s a r g u e s a g a i n s t a g e n e r a l i s e d e n z y m a t i c d e f e c t . A f o u r t h p o s s i b i l i t y w h i c h m i g h t e x p l a i n t h e l o w e r t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t i n t h e SN o f PD p a t i e n t s r e l i e s on r e s u l t s f r o m o u r a n i m a l e x p e r i -m e n t s w h i c h i n d i c a t e t h a t f r e e r a d i c a l s m i g h t be i n v o l v e d i n t h e m o l e c u l a r - 71 -m e c h a n i s m o f MPTP t o x i c i t y , and t h a t g l u t a t h i o n e a p p e a r s t o be c r i t i c a l l y i m p o r t a n t i n t h e d e t o x i f i c a t i o n o f t h e s e r a d i c a l s . I f t h e c a u s e o f n i g r o -s t r i a t a l n e u r o n a l l o s s i n i d i o p a t h i c ,PD i s a n e u r o t o x i n t h a t f o r m s f r e e r a d i c a l s , t h e n e x c e s s i v e c o n s u m p t i o n o f g l u t a t h i o n e i n t h e p r o c e s s o f d e t o x -i f i c a t i o n , w i t h a c o n s e q u e n t d e c r e a s e i n i t s l e v e l s , w o u l d be t h e r e s u l t . The l o c a l i s e d d e f i c i e n c y i n t h e SN a s o p p o s e d t o o t h e r b r a i n a r e a s m i g h t be a r e f l e c t i o n o f t h e l o c a l i s a t i o n o f a n e u r o t o x i n i n t h i s a r e a . Would t h e p a t i e n t s t i l l be e x p o s e d t o t h e n e u r o t o x i n ( s ) a t d e a t h ? T h i s a p p e a r s l i k e l y s i n c e , o t h e r w i s e , r e s t o r a t i o n o f g l u t a t h i o n e l e v e l s p r o b a b l y w o u l d h a v e o c c u r r e d . T h i s h y p o t h e s i s t h u s d i f f e r s f r o m t h a t o f C a l n e a n d L a n g s t o n ( C a l n e e t a l . 1 9 8 3 ; C a l n e e t a l . 1 9 8 5 ) who s u g g e s t e d t h a t e x p o s u r e t o t h e n e u r o t o x i n o c c u r s b r i e f l y many y e a r s b e f o r e t h e a p p e a r a n c e o f s y m p -t o m s . What i s t h e r e l e v a n c e o f t h e t i m e and d u r a t i o n o f e x p o s u r e t o t h e p u t a -t i v e n e u r o t o x i n ? A r e c e n t r e v i e w ( L e w i n 1 9 8 5 b ) r e p o r t e d t h a t a m u l t i - c e n t r e c l i n i c a l t r i a l was b e i n g p l a n n e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r o r n o t a - t o c o p h e r o l o r d e p r e n y l ( a n MAO-B i n h i b i t o r ) c o u l d s l o w t h e p r o g r e s s i o n o f symptoms i n PD p a t i e n t s a t t h e e a r l y s t a g e o f t h e d i s e a s e . I f i d i o p a t h i c PD i s c a u s e d b y an M P T P - l i k e n e u r o t o x i n w h i c h d e s t r o y s n e u r o n s p o s s i b l y v i a f r e e r a d i c a l s , and i f e x p o s u r e t o i t i s c o n t i n o u s a s we s p e c u l a t e , t h e n a - t o c o p h e r o l o r d e p r e n y l w o u l d be p r o m i s i n g p o t e n t i a l c a n d i d a t e s t o s l o w o r s t o p t h e p r o -g r e s s i o n o f t h e d i s e a s e , an e f f e c t t h a t n o n e o f t h e d r u g s c u r r e n t l y u s e d c a n a c h i e v e . S i m i l a r l y , a g e n t s t h a t c a n r a i s e t h e c o n t e n t o f b r a i n g l u t a t h i o n e m i g h t a l s o be o f b e n e f i t , a l t h o u g h my r e s u l t s f r o m a n i m a l e x p e r i m e n t s i n d i -c a t e t h a t t h i s i s i n d e e d a d i f f i c u l t t a s k . On t h e o t h e r h a n d , i f e x p o s u r e t o t h e n e u r o t o x i n o c c u r r e d many y e a r s b e f o r e t h e a p p e a r a n c e o f s y m p t o m s , t h e n t h e s e p o t e n t i a l t r e a t m e n t s t r a t e g i e s a r e u n l i k e l y t o be o f b e n e f i t . - 72 -A s s u m i n g t h a t t h e d e c r e a s e d t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t i n t h e SN o f PD b r a i n s was due t o an i n t e r a c t i o n b e t w e e n a n e u r o t o x i n ( o r i t s d e r i v a t i v e s ) and G S H , t h e q u e s t i o n t h a t r e m a i n s i s t h e n a t u r e o f t h e r e a c t i o n . I s i t e n z y m a t i c i n n a t u r e , a n d i f s o , w h a t i s t h e enzyme i n v o l v e d ? One p o s s i b i l i -t y i s t h e g l u t a t h i o n e p e r o x i d a s e s y s t e m , w h i c h i n a c t i v a t e s H , ^ o r o t h e r p e r o x i d e s b y r e a c t i n g w i t h GSH. In t h e p r o c e s s , GSH becomes o x i d i s e d t o GSSG ( D e n e k e e t a l . 1 9 8 0 ; S i n e t e t a l . 1 9 8 0 ) . H o w e v e r , t h e l a t t e r i s e f f i -c i e n t l y r e d u c e d b a c k t o GSH b y t h e g l u t a t h i o n e r e d u c t a s e s y s t e m . A t a n y r a t e , t h e o v e r a l l t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t i s u n l i k e l y t o b e a l t e r e d b y t h e a c t i o n o f t h e s e e n z y m e s . A n o t h e r d e t o x i f y i n g enzyme s y s t e m i n v o l v e s g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e , w h i c h c o n j u g a t e s GSH w i t h a w i d e v a r i e t y o f e l e c t r o p h i l e s ( H a b i g e t a l . 1 9 7 4 ; J a k o b y e t a l . 1 9 8 0 ) . I n t h e p r o c e s s o f d e t o x i f i c a t i o n , t h e l e v e l s o f GSH a r e l o w e r e d b y a p r o c e s s t h a t p r o d u c e s d e r i v a t i v e s w h i c h c a n n o t be r e a d i l y t r a n s f o r m e d b a c k t o G S H . I t t h e r e f o r e seemed p o s s i b l e t h a t t h i s enzyme c o u l d be r e s p o n s i b l e f o r t h e r e d u c e d c o n t e n t o f t o t a l g l u t a t h i o n e i n t h e SN o f PD p a t i e n t s . We m e a s u r e d t h e a c t i v i t y o f g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e i n t h e f r o n t a l c o r -t e x and SN o f p a t i e n t s who had d i e d w i t h a p a t h o l o g i c a l l y - c o n f i r m e d d i a g n o -s i s o f PD. B r a i n s t h a t s e r v e d a s c o n t r o l s w e r e m a i n l y f r o m s u b j e c t s who d i e d w i t h o u t any e v i d e n c e o f n e u r o l o g i c a l d i s e a s e ; h o w e v e r , some w e r e f r o m p a t i e n t s who d i e d w i t h o l i v o p o n t o c e r e b e l l a r a t r o p h i e s (OPCA) o r d i a l y s i s e n c e p h a l o p a t h y ( D E ) . I t was n e c e s s a r y t o i n c l u d e t h e s e among t h e c o n t r o l s b e c a u s e i n s u f f i c i e n t n o n - n e u r o l o g i c a l b r a i n s w e r e a v a i l a b l e f o r t h e enzyme a s s a y . The OPCA o r DE p a t i e n t s had no e v i d e n c e o f a n y a b n o r m a l i t y o f g l u t a -t h i o n e m e t a b o l i s m . T h e c o n t r o l b r a i n s u s e d f o r g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e a s s a y s m a t c h e d PD b r a i n s w i t h r e s p e c t t o d e a t h - t o - f r e e z i n g i n t e r v a l s o f t h e - 73 -b r a i n , as w e l l as t h e d u r a t i o n o f s t o r a g e a t - 7 0 ° C . H o w e v e r , t h e y w e r e n o t age m a t c h e d ( T a b l e 3 1 ) . A n a l y s i s o f g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e was d o n e b y t h e m o d i f i c a t i o n o f Spearman e t a l . ( 1 9 8 4 ) o f t h e m e t h o d o f H a b i g e t a l . ( 1 9 7 4 ) . B r a i n s a m p l e s w e r e h o m o g e n i s e d i n 5 0 v o l u m e s ( w / v ) o f 0 . 2 5 M s u c r o s e . The h o m o g e n a t e s w e r e c e n t r i f u g e d a t 1 0 , 0 0 0 g f o r 15 m i n u t e s , and t h e s u p e r n a t a n t s t h e n c o l -l e c t e d f o r a n a l y s i s . I n t o a r e a c t i o n c u v e t c o n t a i n i n g 5 mM G S H , 1 mM l - c h l o r o - 2 , 4 - d i n i t r o b e n z e n e and 100 mM s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r a t pH 6 . 5 , 100 u l o f b r a i n s u p e r n a t a n t was a d d e d . The f i n a l v o l u m e o f t h e m i x t u r e was 1 . 0 m l . The r e a c t i o n was c a r r i e d o u t a t r o o m t e m p e r a t u r e and i t s p r o g r e s s was f o l l o w e d s p e c t r o p h o t o m e t r i c a l l y a t 3 4 0 nm e v e r y 15 s e c o n d s f o r 9 0 s e c o n d s . The a v e r a g e c h a n g e i n a b s o r b a n c e / 1 5 s e c o n d s was c o r r e c t e d f o r a b l a n k (when no t i s s u e was p r e s e n t ) , a n d u s i n g a m o l a r a b s o r p t i v i t y v a l u e o f 9 . 6 m M ~ * c m - * , g l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e a c t i v i t y was c a l c u l a t e d a n d e x -p r e s s e d as nmol c o n j u g a t e f o r m e d / m i n / m g p r o t e i n . A n a l y s i s o f e a c h s a m p l e was done i n d u p l i c a t e a n d i n a b l i n d f a s h i o n . P r o t e i n c o n t e n t was d e t e r -m i n e d b y t h e method o f L o w r y ( 1 9 5 1 ) . The r e s u l t s a r e shown i n T a b l e 3 1 . Mean enzyme a c t i v i t i e s i n t h e SN a n d f r o n t a l c o r t e x o f PD p a t i e n t s d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m t h o s e o f c o n t r o l s . The s l i g h t l y h i g h e r a c t i v i t y i n b o t h r e g i o n s o f PD b r a i n s c o u l d be due t o t h e i r g r e a t e r mean a g e a t d e a t h . L i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s e s o f f r o n t a l c o r t e x and SN o f c o n t r o l s r e v e a l e d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n enzyme a c t i v i t y w i t h t h e age o f s u b j e c t a t d e a t h ( r = 0 . 8 1 f o r f r o n t a l c o r t e x , and 0 . 7 4 f o r S N ) . - 74 -T a b l e 3 1 . G l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e a c t i v i t y i n t h e f r o n t a l c o r t e x a n d s u b s t a n t i a n i g r a o f PD p a t i e n t s S u b j e c t s Mean a g e a t d e a t h ( y e a r s ) . GSH t r a n s f e r a s e a c t i v i t y ( n m o l / m i n / m g p r o t e i n ) F r o n t a l c o r t e x C o n t r o l s ( 2 3 ) P a r k i n s o n ' s d i s e a s e ( 1 7 ) S u b s t a n t i a n i g r a C o n t r o l s ( 1 6 ) P a r k i n s o n ' s d i s e a s e ( 1 2 ) 60 ± 3 77 ± 2 * 63 ± 4 . 77 ± 2-1 8 3 . 1 ± 1 0 . 6 2 0 2 . 3 ± 1 3 . 5 2 0 4 . 2 ± 1 2 . 9 2 2 1 . 2 ± 1 5 . 7 V a l u e s (mean ± SEM) t h a t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m c o n -t r o l s : P < 0 . 0 5 ; * P < 0 . 0 0 1 . Th-us, t h e r e s u l t s p r e s e n t l y a v a i l a b l e do n o t c l a r i f y t h e n a t u r e o f t h e i n t e r a c t i o n ( s ) l e a d i n g t o t h e d e c r e a s e d t o t a l g l u t a t h i o n e c o n t e n t i n t h e SN o f PD p a t i e n t s . A p e r s i s t e n t n o n - e n z y m a t i c i n t e r a c t i o n o f g l u t a t h i o n e w i t h o x i d a n t s , a k i n t o t h e d i r e c t r e a c t i o n o f a - t o c o p h e r o l w i t h o x i d a n t s ( W i t t i n g 1 9 8 0 ) , c a n n o t be e x c l u d e d . - 75 -I V ) CONCLUSIONS S e v e r a l a n i m a l and human e x p e r i m e n t s h a v e b e e n d e s c r i b e d i n t h i s c h a p -t e r . How h a v e t h e s e a i d e d i n t h e u n d e r s t a n d i n g o f t h e p a t h o g e n e s i s o f i d i o -p a t h i c P D ? My r e s u l t s s u g g e s t t h e f o l l o w i n g i m p o r t a n t p o i n t s a b o u t i d i o -p a t h i c PD: 1. I f n e u r o t o x i n ( s ) a r e r e s p o n s i b l e f o r m o s t c a s e s o f i d i o p a t h i c P D , t h e y m i g h t a c t , as i s p o s s i b l e i n t h e c a s e o f MPTP, v i a a f r e e r a d i c a l m e c h -a n i s m . D e c r e a s e d c o n t e n t o f g l u t a t h i o n e i n t h e SN o f PD b r a i n s may be t h e r e s u l t o f i t s c o n t i n u e d c o n s u m p t i o n i n t h e d e t o x i f i c a t i o n o f p o t e n -t i a l l y n e u r o t o x i c r a d i c a l s . 2. PD p a t i e n t s m i g h t w e l l be e x p o s e d t o s u c h n e u r o t o x i n ( s ) on many o c c a -s i o n s t h r o u g h o u t l i f e , e v e n a f t e r symptoms o f PD h a v e a p p e a r e d , and p e r -h a p s u n t i l t h e t i m e o f d e a t h . 3. A n t i o x i d a n t s s u c h as a - t o c o p h e r o T o r e - c a r o t e n e m i g h t h a v e v a l u e f o r t h e t h e r a p e u t i c p r e v e n t i o n o f f u r t h e r n i g r a l n e u r o n a l l o s s . 4. I t a p p e a r s u n l i k e l y t h a t h i g h a c t i v i t y o f MAO-B i s a p r e d i s p o s i n g f a c t o r i n t h e d e v e l o p m e n t o f P D . - 76 -V) REFERENCES A n d e r s o n ME, P o w r i e F , P u r i R N , M e i s t e r A , G l u t a t h i o n e m o n o e t h y l e s t e r : •' P r e p a r a t i o n , u p t a k e b y t i s s u e s , and c o n v e r s i o n t o g l u t a t h i o n e , A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 3 9 : 5 3 8 - 5 4 8 , 1 9 8 5 . B a r b e a u A , P o u r c h e r E , New d a t a on t h e g e n e t i c s o f P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , C a n . J . N e u r o l . S c i . 9 : 5 3 - 6 0 , 1 9 8 2 . B a r b e a u A , E t i o l o g y o f P a r k i n s o n ' s d i s e a s e : A r e s e a r c h s t r a t e g y , C a n . J . N e u r o l . S c i . 1 1 : 2 4 - 2 8 , 1984 B a r b e a u A , D a l l a i r e L , Buu NT, P o i r i e r J , R u d i n s k a E , C o m p a r a t i v e b e h a v i o r a l b i o c h e m i c a l and p i g m e n t a r y e f f e c t s o f MPTP, M P P + and p a r a q u a t i n R a n a P i p i e n s , L i f e S c i . 3 7 : 1 5 2 9 - 1 5 3 8 , 1 9 8 5 . B a r k e r S A , H a r r i s o n REW, M o n t i J A , Brown G B , C h r i s t i a n S T , I d e n t i f i c a t i o n and q u a n t i f i c a t i o n o f 1 , 2 , 3 , 4 - t e t r a h y d r o - B - c a r b o l i n e , 2 - m e t h y l - l , 2 , 3 , 4 -t e t r a h y d r o - B - c a r b o l i n e , and 6 - m e t h o x y - l , 2 , 3 , 4 - t e t r a h y d r o - B - c a r b o l i n e as i n v i v o c o n s t i t u e n t s o f r a t b r a i n and a d r e n a l g l a n d , B i o c h e m P h a r m a c o l . 30 : 9 - 1 7 , 1 9 8 1 . B a r t h o l i n ! " G , S t a d l e r H , L l o y d K G , C h o l i n e r g i c - d o p a m i n e r g i c i n t e r r e g u l a t i o n s w i t h i n t h e e x t r a p y r a m i d a l s y s t e m , I n : C h o l i n e r g i c m e c h a n i s m s , W a s e r PG ( e d i t o r ) , 4 1 1 - 4 1 8 , 1 9 7 5 . j Baumann R J , J a m e s o n HD, M c k e a n H E , Haack DG, W e i s b e r g L M , C i g a r e t t e s m o k i n g and P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , I . A c o m p a r i s o n o f c a s e s w i t h m a t c h e d n e i g h -b o r s , N e u r o l . 3 0 : 8 3 9 - 8 4 3 , 1 9 8 0 . B e r n h e i m e r H , B i r k m a y e r W, H o r n y k i e w i c z 0 , J e l l i n g e r K , S e i t e l b e r g e r F , B r a i n d o p a m i n e and t h e s y n d r o m e s o f P a r k i n s o n and H u n t i n g t o n : C l i n i c a l , m o r p h o l o g i c a l and n e u r o c h e m i c a l c o r r e l a t i o n s , J . N e u r o l . S c i . 2 0 : 4 1 5 - 4 5 5 , 1 9 7 3 . B h a t t a c h a r y a S K , G l o v e r V , S a n d l e r M, C l o w A , Topham A , B e r n a d t M, M u r r a y R, R a i s e d e n d o g e n o u s monoamine o x i d a s e i n h i b i t o r o u t p u t i n p o s t w i t h d r a w a l a l c o h o l i c s : E f f e c t s o f L-DOPA and e t h a n o l , B i o l . P s y c h i a t . 1 7 : 8 2 9 - 8 3 6 , 1 9 8 2 . B i a n c h i n e J R , D r u g s f o r P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , s p a s t i c i t y , and a c u t e m u s c l e s p a s m s , I n : The P h a r m a c o l o g i c a l B a s i s o f T h e r a p e u t i c s , 7 t h e d i t i o n , G i l m a n A G , Goodman L S , R a i l TW, M u r a d F ( e d i t o r s ) 4 7 3 - 4 9 0 , 1 9 8 5 . B r a d b u r y A J , C o s t a l ! B , J e n n e r P G , K e l l y ME, M a r s d e n C D , N a y l o r R J , The n e u r o t o x i c a c t i o n s o f l - m e t h y l - 4 - p h e n y l p y r i d i n e ( M P P + ) a r e n o t p r e v e n t -ed by d e p r e n y l p r e t r e a t m e n t , N e u r o s c i . L e t t . 5 8 : 1 7 7 - 1 8 1 , 1 9 8 5 . B r a n n a n T S , M a k e r H S , R a e s I P , R e g i o n a l d i s t r i b u t i o n o f c a t a l a s e i n t h e a d u l t r a t b r a i n , J . N e u r o c h e m . 3 6 : 3 0 7 - 3 0 9 , 1 9 8 1 . - 77 -B u r n s R S , C h i u e h C C , M a r k e y S P , E b e . r t MH, J a c o b o w i t z DM, K o p i n I J , A p r i m a t e model , o f p a r k i n s o n i s m : S e l e c t i v e d e s t r u c t i o n o f d o p a m i n e r g i c n e u r o n s i n t h e p a r s c o m p a c t a o f t h e s u b s t a n t i a n i g r a b y N - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 -t e t r a h y d r o p y r i d i n e , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . (USA) 8 0 : 4 5 4 6 - 4 5 5 0 , 1 9 8 3 . C a l n e DB, L a n g s t o n JW, A e t i o l o g y o f P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , L a n c e t i i : 1 4 5 7 -1 4 5 9 , 1 9 8 3 . C a l n e DB, L a n g s t o n JW, M a r t i n WRW, S t o e s s l A J , R u t h T J , Adam M J , P a t e BD, S c h u l z e r M, P o s i t r o n e m i s s i o n t o m o g r a p h y a f t e r MPTP: O b s e r v a t i o n s r e l a t -i n g t o t h e c a u s e o f P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , N a t u r e 3 1 7 : 2 4 6 - 2 4 8 , 1 9 8 5 . C a s t a g n o l i N J r . , C h i b a K , T r e v o r A J , P o t e n t i a l b i o a c t i v a t i o n p a t h w a y s f o r t h e n e u r o t o x i n l - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e ( M P T P ) , L i f e S c i . 3 6 : 2 2 5 - 2 3 0 , 1 9 8 5 . C h i u e h C C , M a r k e y S P , B u r n s R S , J o h a n n e s s e n J , J a c o b o w i t z DM, K o p i n I J , N - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e , a p a r k i n s o n i a n s y n d r o m e c a u s i n g a g e n t i n man and m o n k e y , p r o d u c e s d i f f e r e n t e f f e c t s i n g u i n e a p i g and r a t , P h a r m a c o l o g i s t 2 5 : 1 3 1 ( a b s t r a c t 1 0 9 ) , 1 9 8 3 . : C o h e n G , H e i k k i l a R E , The g e n e r a t i o n o f h y d r o g e n p e r o x i d e , s u p e r o x i d e r a d i c a l , and h y d r o x y l r a d i c a l b y 6 - h y d r o x y d o p a m i n e , d i a l u r i c a c i d , and r e l a t e d c y t o t o x i c a g e n t s , J . B i o l . Chem. 2 4 9 : 2 4 4 7 - 2 4 5 2 , 1 9 7 4 . Cohen G , Dembiec D, M y t i l i n e o u C , H e i k k i l a R E , Oxygen r a d i c a l s and t h e i n t e g r i t y o f t h e n i g r o s t r i a t a l t r a c t , I n : A d v a n c e s i n P a r k i n s o n i s m , B i r k m a y e r W, H o r n y k i e w i c z 0 ( e d i t o r s ) , 2 5 1 - 2 5 7 , 1 9 / 6 . Cohen G , Oxygen r a d i c a l s , h y d r o g e n p e r o x i d e , a n d P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , I n : P a t h o l o g y o f O x y g e n , A u t o r AP ( e d i t o r ) , 1 1 5 - 1 2 5 , 1 9 8 2 . C o h e n G , M y t i l i n e o u C , S t u d i e s on t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f 1 - m e t h y l -4 - p h e n y 1 - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e ( M P T P ) , L i f e S c i . 3 6 : 2 3 7 - 2 4 2 , 1 9 8 5 . C o l l i n s MA, N e a f s e y E J , e - c a r b o l i n e a n a l o g u e s o f N - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 5 , 6 -t e t r a h y r o p y r i d i n e ( M P T P ) : E n d o g e n o u s f a c t o r s u n d e r l y i n g i d i o p a t h i c p a r k i n s o n i s m ^ N e u r o s c i . L e t t . 5 5 : 1 7 9 - 1 8 4 , 1 9 8 5 . C u r t i s L , L e e s A J , S t e r n GM, M a r m o t MG, E f f e c t o f L-DOPA on c o u r s e o f P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , L a n c e t i i . 2 1 1 - 2 1 2 , 1 9 8 4 . D a v i e s G C , W i l l i a m s A C , M a r k e y S P , E b e r t MH, C a i n e E D , R e i c h e r t C M , K o p i n I J , C h r o n i c p a r k i n s o n i s m s e c o n d a r y t o i n t r a v e n o u s i n j e c t i o n o f m e p e r i d i n e a n a l o g u e s , P s y c h i a t . R e s . 1 : 2 4 9 - 2 5 4 , 1 9 7 9 . Deneke S M , F a n b u r g B L , N o r m o b a r i c o x y g e n t o x i c i t y o f t h e l u n g , New E n g l . J . M e d . 3 0 3 : 7 6 - 8 6 , 1 9 8 0 . D o n a l d s o n J , L a B e l l a F S , G e s s e r D, E n h a n c e d a u t o x i d a t i o n o f d o p a m i n e as a p o s s i b l e b a s i s o f m a n g a n e s e n e u r o t o x i c i t y , N e u r o t o x i c o l . 2 : 5 3 - 6 4 , 1 9 8 0 . - 78 -D o n a l d s o n J , M c G r e g o r D, L a B e l - l a F , M a n g a n e s e n e u r o t o x i c i t y : A model f o r f r e e r a d i c a l m e d i a t e d n e u r o d e q e n e r a t i o n , C a n . J . P h y s i o l . P h a r m a c o l . 6 0 : 1 3 9 8 - 1 4 0 5 , 1 9 8 2 . D u v o i s i n R C , The c a u s e o f P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , I n : Movement D i s o r d e r s , M a r s d e n CD, Fahn S ( e d i t o r s ) , 8 - 2 4 , 1 9 8 2 . D u v o i s i n R C , I s P a r k i n s o n ' s d i s e a s e a c q u i r e d o r i n h e r i t e d , C a n . J . N e u r o l . S c i . 1 1 : 1 5 1 - 1 5 5 , 1 9 8 4 . E h r i n g e r H , H o r n y k i e w i c z 0 , V e r t e i l u n g v o n n o r a d r e n a l i n und d o p a m i n ( 3 - h y d r o x y t y r a m i n ) im g e h i r n d e s m e n s c h e n und i h r v e r h a l t e n b e i e r k r a n -k u n g e n d e s e x t r a p y r a m i d a l e n s y s t e m s , K l i n i s c h e W o c h e n s c h r i f t 3 8 : 1 2 3 6 -1 2 3 9 , 1 9 6 0 . E v a r t s E V , T e r a v a i n e n H , C a l n e DB, R e a c t i o n t i m e i n P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , B r a i n 1 0 4 : 1 6 7 - 1 8 6 , 1 9 8 1 . F o r n o L S , P a t h o l o g y o f P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , I n : Movement D i s o r d e r s , M a r s d e n C D , Fahn S ( e d i t o r s ) , 2 5 - 4 0 , 1 9 8 2 . F r i t z RR, A b e l l CW, P a t e l NT, G e s s n e r W, B r o s s i A , M e t a b o l i s m o f t h e n e u r o -t o x i n MPTP b y human l i v e r monoamine o x i d a s e 8 , FEBS 1 8 6 : 2 2 4 - 2 2 8 , 1 9 8 5 . G i a n u t s o s G , M u r r a y MT, A l t e r a t i o n s i n b r a i n d o p a m i n e and GABA f o l l o w i n g i n o r g a n i c o r o r g a n i c m a n g a n e s e a d m i n i s t r a t i o n , N e u r o t o x i c o l . 3 : 7 5 - 8 1 , 1 9 8 2 . G l o v e r V , R e v e l e y MA, S a n d l e r M, A monoamine o x i d a s e i n h i b i t o r i n human u r i n e , B i o c h e m . P h a r m a c o l . 2 9 : 4 6 7 - 4 7 0 , 1 9 8 0 . G l o v e r V , L i e b o w i t z J , Armando I , S a n d l e r M , 6 - c a r b o l i n e s a s s e l e c t i v e monoamine o x i d a s e i n h i b i t o r s : I n v i v o i m p l i c a t i o n s , J . N e u r a l T r a n s m . 5 4 : 2 0 9 - 2 1 8 , 1 9 8 2 . G l o w i n s k i J , I v e r s e n L L , R e g i o n a l s t u d i e s o f . c a t e c h o l a m i n e s i n t h e r a t b r a i n , J . N e u r o c h e m . , 1 3 : 6 5 5 - 6 6 9 , 1 9 6 6 . G o d w i n - A u s t e n R B , L e e P N , Marmot MG, S t e r n GM, S m o k i n g a n d P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , J . N e u r o l . N e u r o s u r g . P s y c h i a t . 4 5 : 5 7 7 - 5 8 1 , 1 9 8 2 . Graham DG, T i f f a n y SM, B e l l WR J r . , G u t k n e c h t N F , A u t o x i d a t i o n v e r s u s c o v a l e n t b i n d i n g o f q u i n o n e s as t h e m e c h a n i s m o f t o x i c i t y o f d o p a m i n e , 6 - h y d r o x y d o p a m i n e , a n d r e l a t e d compounds t o w a r d C1300 n e u r o b l a s t o m a c e l l s i n v i t r o , M o l . P h a r m a c o l . 1 4 : 6 4 4 - 6 5 3 , 1 9 7 8 . Graham DG, On t h e o r i g i n and s i g n i f i c a n c e o f n e u r o m e l a n i n , A r c h . P a t h o l . L a b . M e d . 1 0 3 : 3 5 9 - 3 6 2 , 1 9 7 9 . Graham DG, C a t e c h o l a m i n e t o x i c i t y : A p r o p o s a l f o r t h e m o l e c u l a r p a t h o g e n e s i s o f manganese n e u r o t o x i c i t y and P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , N e u r o t o x i c o l . 5 : 8 3 -9 5 , 1 9 8 4 . - 79 -G r i f f i t h OW, A n d e r s o n ME, M e i s t e r A , I n h i b i t i o n o f g l u t a t h i o n e b i o s y n t h e s i s by p r o t h i o n i n e s u l f o x i m i n e ( S - n - p r o p y l h o m o c y s t e i n e s u l f o x i m i n e ) , a s e l e c t i v e i n h i b i t o r o f Y - g l u t a m y l c y s t e i n e s y n t h e t a s e , J . B i o l . Chem. 2 5 4 : 1 2 0 5 - 1 2 1 0 , 1 9 7 9 a . G r i f f i t h OW, M e i s t e r A , . G l u t a t h i o n e : I n t e r o r g a n t r a n s l o c a t i o n , t u r n o v e r , a n d m e t a b o l i s m , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . (USA) 7 6 : 5 6 0 6 - 5 6 1 0 , 1 9 7 9 b . H a b i g WH, P a b s t M J , J a k o b y WB, G l u t a t h i o n e S - t r a n s f e r a s e s , J . B i o l . Chem. 2 4 9 : 7 1 3 0 - 7 1 3 9 , 1 9 7 4 . H a d j i c o n s t a n t i n o u M, C a v a l l a D, A n t h O u p o u l o u E , L a i r d HE I I , N e f f NH, N - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e i n c r e a s e s a c e t y l c h o l i n e and d e c r e a s e s d o p a m i n e i n mouse s t r i a t u m : B o t h r e s p o n s e s a r e b l o c k e d b y a n t i c h o l i n e r g i c d r u g s , J . N e u r o c h e m . 4 5 : 1 9 5 7 - 1 9 5 9 , 1 9 8 5 . Hafeman DG, H o e k s t r a WG, L i p i d p e r o x i d a t i o n i n v i v o d u r i n g v i t a m i n E and s e l e n i u m d e f i c i e n c y i n t h e r a t as m o n i t o r e d b y e t h a n e e v o l u t i o n , J . N u t r . 1 0 7 : 6 6 6 - 6 7 2 , 1 9 7 7 . H a l l i w e l l B , ; G u t t e r i d g e J M C , Oxygen r a d i c a l s a n d t h e n e r v o u s s y s t e m , T r e n d s i n N e u r o s c i . 8 : 2 2 - 2 6 , 1 9 8 5 . H a r r i s J S , C o o p e r H A , L a t e r e s u l t s o f e n c e p h a l i t i s l e t h a r g i c a , M e d . P r e s s C i r c u l a r 1 9 4 : 1 2 - 1 4 , 1 9 3 7 . H e i k k i l a R E , M y t i l i n e o u C , C o t e L , Cohen G , E v i d e n c e f o r d e g e n e r a t i o n o f s y m p a t h e t i c n e r v e t e r m i n a l s c a u s e d b y t h e o r t h o and p a r a - q u i n o n e s o f 6 - h y d r o x d o p a m i n e , J . N e u r o c h e m . 2 0 : 1 3 4 5 - 1 3 5 0 , 1 9 7 3 . H e i k k i l a R E , H e s s A , D u v o i s i n R C , D o p a m i n e r g i c n e u r o t o x i c i t y o f l - m e t h y l - 4 -p h e n y l - l , 2 , 5 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e i n m i c e , S c i e n c e 2 2 4 : 1 4 5 1 - 1 4 5 3 , 1 9 8 4 a . H e i k k i l a R E , M a n z i n o L , C a b b a t F S , D u v o i s i n R C , P r o t e c t i o n a g a i n s t t h e d o p a m i n e r g i c n e u r o t o x i c i t y o f l - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 5 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i -d i n e b y monoamine o x i d a s e i n h i b i t o r s , N a t u r e 3 1 1 : 4 6 7 - 4 6 9 , 1 9 8 4 b . H e i k k i l a R E , N i c k l a s W J , D u v o i s i n R C , D o p a m i n e r g i c t o x i c i t y a f t e r t h e s t e r e o t a x i c a d m i n i s t r a t i o n o f t h e l - m e t h y l - 4 - p h e n y l p y r i d i n i u m i o n (MPP ) t o r a t s , N e u r o s c i . L e t t . 5 9 : 1 3 5 - 1 4 0 , 1 9 8 5 . H i r a t a Y , N a g a t s u T , I n h i b i t i o n o f t y r o s i n e h y d r o x y l a t i o n i n t i s s u e s l i c e s o f t h e r a t s t r i a t u m b y l - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e , B r a i n R e s . 3 3 7 : 1 9 3 - 1 9 6 , 1 9 8 5 . H o r n y k i e w i c z 0 , Dopamine ( 3 - h y d r o x y t y r a m i n e ) a n d b r a i n f u n c t i o n , P h a r m a c o l . R e v . 1 8 : 9 2 5 - 9 6 4 , 1 9 6 6 . H o r n y k i e w i c z 0 , P a r k i n s o n ' s d i s e a s e : From b r a i n h o m o g e n a t e t o t r e a t m e n t , F e d . P r o c . 3 2 : 1 8 3 - 1 9 0 , 1 9 7 3 . H o r n y k i e w i c z 0 , B r a i n n e u r o t r a n s m i t t e r c h a n g e s i n P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , I n : Movement D i s o r d e r s , M a r s d e n CD, F a h n S ( e d i t o r s ) , 4 1 - 5 8 , 1 9 8 2 . - 8 0 -l p C , C o m p a r a t i v e e f f e c t s o f a n t i o x i d a n t s on e n z y m e s i n v o l v e d i n g l u t a t h i o n e m e t a b o l i s m , L i f e S c i . 3 4 : 2 5 0 1 - 2 5 0 6 , 1 9 8 4 . J a e s c h k e H , Wendel A , M a n i p u l a t i o n o f mouse o r g a n g l u t a t h i o n e c o n t e n t s , I . E n h a n c e m e n t by o r a l a d m i n i s t r a t i o n o f b u t y l a t e d h y d r o x y a n i s o l e and b u t y l -a t e d h y d r o x y t o l u e n e , T o x i c o l . 3 6 : 7 7 - 8 5 , 1 9 8 5 . J a k o b y WB, H a b i g WH, G l u t a t h i o n e t r a n s f e r a s e s , I n : E n z y m a t i c B a s i s o f D e - t o x i f i c a t i o n , 2 : 6 3 - 9 4 , 1 9 8 0 . J a v i t c h J A , D'Amato R J , S t r i t t m a t t e r S M , S n y d e r S H , P a r k i n s o n i s m - i n d u c i n g n e u r o t o x i n , N - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e : U p t a k e o f t h e m e t a b o l i t e N - m e t h y l - 4 - p h e n y l p y r i d i n e by d o p a m i n e n e u r o n s e x p l a i n s s e l e c -t i v e t o x i c i t y , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . (USA) 8 2 : 2 1 7 3 - 2 1 7 7 , 1 9 8 5 a . J a v i t c h . J A , S n y d e r S H , U p t a k e o f MPP + by d o p a m i n e n e u r o n s e x p l a i n s s e l e c t i v i t y o f p a r k i n s o n i s m - i n d u c i n g n e u r o t o x i n , M P T P , E u r . J . P h a r m a c o l . 1 0 6 : 4 5 5 - 4 5 6 , 1 9 8 5 b . J e n n e r P , R u p n i a k N M J , R o s e S , K e l l y E , K i l p a t r i c k G , L e e s A , M a r s d e n C D , l - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e - i n d u c e d p a r k i n s o n i s m i n t h e common m a r m o s e t , N e u r o s c i . L e t t s . 5 0 : 8 5 - 9 0 , 1 9 8 4 . K e s s l e r I I , Diamond E L , E p i d e m i o l o g i c s t u d i e s o f P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , Am. J . E p i d e m i o l . 9 4 : 1 6 - 2 5 , 1 9 7 1 . K o l a t a G , Monkey model o f P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , S c i e n c e 2 2 0 : 7 0 5 , 1 9 8 3 . Kondo K , A g e n e t i c a n a l y s i s o f P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , T r a n s . Am. N e u r o l . A s s o c . 9 6 : 2 6 1 - 2 6 2 , 1 9 7 2 . K u r l a n d L T , E p i d e m i o l o g y : I n c i d e n c e , g e o g r a p h i c a l d i s t r i b u t i o n and g e n e t i c c o n s i d e r a t i o n , I n : P a t h o g e n e s i s and T r e a t m e n t o f P a r k i n s o n i s m , F i e l d W ( e d i t o r ) , 5 - 4 9 , 1 9 5 8 . K u r t z k e J F , The c u r r e n t n e u r o l o g i c b u r d e n o f i l l n e s s a n d i n j u r y i n t h e U n i t e d S t a t e s , N e u r o l . 3 2 : 1 2 0 7 - 1 2 1 4 , 1 9 8 2 . L a n g s t o n JW, B a l l a r d P , T e t r u d JW, I r w i n I , C h r o n i c p a r k i n s o n i s m i n humans due t o a p r o d u c t o f m e p e r i d i n e - a n a l o g s y n t h e s i s , S c i e n c e 2 1 9 : 9 7 9 - 9 8 0 , 1 9 8 3 . L a n g s t o n JW, F o r n o L S , R e b e r t C S , I r w i n I , S e l e c t i v e n i g r a l t o x i c i t y a f t e r s y s t e m i c a d m i n i s t r a t i o n o f l - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 5 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e (MPTP) i n t h e s q u i r r e l m o n k e y , B r a i n R e s . 2 9 2 : 3 9 0 - 3 9 4 , 1 9 8 4 a . L a n g s t o n JW, I r w i n I , L a n g s t o n E B , F o r n o L S , P a r g y l i n e p r e v e n t s MPTP-i n d u c e d p a r k i n s o n i s m i n p r i m a t e s , S c i e n c e 2 2 5 : 1 4 8 0 - 1 4 8 2 , 1 9 8 4 b . L e w i n R, P a r k i n s o n ' s d i s e a s e : An e n v i r o n m e n t a l c a u s e , S c i e n c e 2 2 9 : 2 5 7 - 2 5 8 , 1 9 8 5 a . L e w i n R, C l i n i c a l t r i a l f o r P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , S c i e n c e 2 3 0 : 5 2 7 - 5 2 8 , 1 9 8 5 b . - 81 -L i u YY, S c h m e l t z I , H o f f m a n D, C h e m i c a l s t u d i e s on t o b a c c o s m o k e : Q u a n t i -t a t i v e a n a l y s i s o f h y d r a z i n e i n t o b a c c o and c i g a r e t t e s m o k e , A n a l . C h e m . 4 6 : 8 8 5 - 8 8 9 , 1 9 7 4 . L o w r y OH, R o s e b r o u g h N J , F a r r A L , R a n d a l l R J , P r o t e i n m e a s u r e m e n t w i t h t h e F o l i n p h e n o l r e a g e n t , J . B i o l . Chem. 1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 5 , 1 9 5 1 . L u d i n H P , B a s s - V e r r y F , S t u d y o f d e t e r i o r a t i o n i n l o n g - t e r m t r e a t m e n t o f p a r k i n s o n i s m w i t h L-DOPA p l u s d e c a r b o x y l a s e i n h i b i t o r , J . N e u r a l T r a n s m . 3 8 : 2 4 9 - 2 5 8 , 1 9 7 6 . M a k e r H S , W e i s s C , S i 1 i d e s D J , Cohen G , C o u p l i n g o f d o p a m i n e o x i d a t i o n (monoamine o x i d a s e a c t i v i t y ) t o g l u t a t h i o n e o x i d a t i o n v i a t h e g e n e r a t i o n o f h y d r o g e n p e r o x i d e i n r a t b r a i n h o m o g e n a t e s , J . N e u r o c h e m . 3 6 : 5 8 9 - 5 9 3 , 1 9 8 1 . M a r k e y S P , J o h a n n e s s e n J N , C h i u e h C C , B u r n s R S , H e r k e n h a m MA, I n t r a n e u r o n a l g e n e r a t i o n o f a p y r i d i n i u m m e t a b o l i t e may c a u s e d r u g - i n d u c e d p a r k i n s o n -i s m , N a t u r e 3 1 1 : 4 6 4 - 4 6 7 , 1 9 8 4 . M a r s d e n C D , P a r k e s J D , S u c c e s s and p r o b l e m s o f l o n g - t e r m l e v o d o p a t h e r a p y i n P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , L a n c e t i i : 3 4 5 - 3 4 9 , 1 9 7 7 . M a r s d e n C D , B a s a l g a n g l i a d i s e a s e , L a n c e t i i : 1 1 4 1 - 1 1 4 7 , 1 9 8 2 . M a r t t i l a R J , A r s t i l a P , N i k o s k e l a i n e n J , H a l o n e n P E , R i n n e UK, V i r a l a n t i b o d i e s i n t h e s e r a f r o m p a t i e n t s w i t h P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , E u r . N e u r o l . 1 5 : 2 5 - 3 3 , 1 9 7 7 . M a r t t i l a R J , R i n n e UK, H e r p e s s i m p l e x v i r u s a n t i b o d i e s i n p a t i e n t s w i t h P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , J . N e u r o l . S c i . 3 5 : 3 7 5 - 3 7 9 , 1 9 7 8 . M a y e r RA, J a r v i s MF, Wagner G C , C o c a i n e b l o c k s t h e d o p a m i n e d e p l e t i o n i n d u c e d b y MPTP, R e s . Commun. Chem. P a t h o l . P h a r m a c o l . 4 9 : 1 4 5 - 1 4 8 , 1 9 8 5 . M c C o r d J M , F r i d o v i c h I , S u p e r o x i d e d i s m u t a s e , J . B i o l . Chem. 2 4 4 : 6 0 4 9 - 6 0 5 5 , 1 9 6 9 . M c C o r d J M , F r i d o v i c h I , The b i o l o g y and p a t h o l o g y o f o x y g e n r a d i c a l s , A n n . I n t e r n . M e d . 8 9 : 1 2 2 - 1 2 7 , 1 9 7 8 . M c G e e r P L , McGeer E G , S u z u k i J S , A g i n g a n d e x t r a p y r a m i d a l f u n c t i o n , A r c h . N e u r o l . 3 4 : 3 3 - 3 8 , 1 9 7 7 . M e i s t e r A , S e l e c t i v e m o d i f i c a t i o n o f g l u t a t h i o n e m e t a b o l i s m , S c i e n c e 2 2 0 : 4 7 2 - 4 7 7 , 1 9 8 3 . Mena I , M a r i n 0 , F u e n z a l i d a S , C o t z i a s G C , C h r o n i c m a n g a n e s e p o i s o n i n g : C l i n i c a l p i c t u r e and manganese t u r n o v e r , N e u r o l . 1 7 : 1 2 8 - 1 3 6 , 1 9 6 7 . M o l d e u s P , N o r d e n s k j o l d M, B o l c s f o l d i G , E i c h e A , H a g l u n d U , L a m b e r t B , G e n e t i c t o x i c i t y o f d o p a m i n e , M u t a t i o n R e s . 1 2 4 : 9 - 2 4 , 1 9 8 3 . - 82 -M y t i l i n e o u C , Cohen G , D e p r e n y l p r o t e c t s d o p a m i n e n e u r o n s f r o m t h e n e u r o -t o x i c e f f e c t o f l - m e t h y l - 4 - p h e n y l p y r i d i n i u m i o n , J . N e u r o c h e m . 4 5 : 1 9 5 1 -1 9 5 3 , 1 9 8 5 . N e f z g e r MD, Q u a d f a s e l F A , K a r l V C , A r e t r o s p e c t i v e s t u d y o f s m o k i n g and P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , Am. J . E p i d e m i o l . 8 8 : 1 4 9 - 1 5 8 , 1968 O r e l a n d L , F o w l e r C J , S c h a l l i n g D, Low p l a t e l e t m o n o a m i n e o x i d a s e a c t i v i t y i n c i g a r e t t e s m o k e r s , L i f e S c i . 2 9 : 2 5 1 1 - 2 5 1 8 , 1 9 8 1 . P e r r y T L , Stedman D, H a n s e n S , A v e r s a t i l e 1 i t h i u m b u f f e r e l u t i o n s y s t e m f o r s i n g l e c o l u m n a u t o m a t i c a m i n o a c i d c h r o m a t o g r a p h y , J . C h r o m a t o g r . 3 8 : 4 6 0 -4 6 6 , 1 9 6 8 . P e r r y T L , B e r r y K , H a n s e n S , Diamond S , Mok C , R e g i o n a l d i s t r i b u t i o n o f a m i n o a c i d s i n human b r a i n o b t a i n e d a t a u t o p s y , J . N e u r o c h e m . 1 8 : 5 1 3 - 5 1 9 , 1 9 7 1 . P e r r y T L , H a n s e n S , Gandham S S , P o s t m o r t e m c h a n g e s o f a m i n o compounds i n human and r a t b r a i n , J . N e u r o c h e m . 3 6 : 4 0 6 - 4 1 2 , 1 9 8 1 . P e r r y T L , G o d i n DV, H a n s e n S , P a r k i n s o n ' s d i s e a s e : A d i s o r d e r due t o n i g r a l g l u t a t h i o n e d e f i c i e n c y ^ , N e u r o s c i . L e t t s . 3 3 : 3 0 5 - 3 1 0 , 1 9 8 2 . P i l e b l a d E , C a r l s s o n A , C a t e c h o l a m i n e - u p t a k e i n h i b i t o r s p r e v e n t t h e n e u r o -t o x i c i t y o f l - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e (MPTP) i n mouse b r a i n , N e u r o p h a r m a c o l . 2 4 : 6 8 9 - 6 9 2 , 1 9 8 5 . Plummer J L , S m i t h B R , S i e s H , Bend J R , C h e m i c a l d e p l e t i o n o f g l u t a t h i o n e i n v i v o , M e t h o d s E n z y m o l . 7 7 : 5 0 - 5 9 , 1 9 8 1 . P u r i R N , M e i s t e r A , T r a n s p o r t o f g l u t a t h i o n e , as y - g l u t a m y l c y s t e i n y l g l y c y l e s t e r , i n t o l i v e r and k i d n e y , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . (USA) 8 0 : 5 2 5 8 - 5 2 6 0 , 1 9 8 3 . S a c h s C , J o n s s o n G , D e g e n e r a t i o n o f c e n t r a l and p e r i p h e r a l n o r a d r e n a l i n e n e u r o n s p r o d u c e d b y 6 - h y d r o x y - d o p a , J . N e u r o c h e m . 1 9 : 1 5 6 1 - 1 5 7 5 , 1 9 7 2 . S a c h s C , J o n s s o n G , M e c h a n i s m s o f a c t i o n o f 6 - h y d r o x y d o p a m i n e , B i o c h e m . P h a r m a c o l . 2 4 : 1 - 8 , 1 9 7 5 . S a h g a l A , A n d r e w s J S , B i g g i n s J A , C a n d y J M , E d w a r d s o n J A , K e i t h A B , T u r n e r J D , W r i g h t C , N - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e (MPTP) a f f e c t s l o c o m o t o r a c t i v i t y w i t h o u t p r o d u c i n g a n i g r o s t r i a t a l l e s i o n i n t h e r a t , N e u r o s c i . L e t t . 4 8 : 1 7 9 - 1 8 4 , 1 9 8 4 . S a n d l e r M, R e v e l e y MA, G l o v e r V , Human p l a t e l e t m o n o a m i n e o x i d a s e a c t i v i t y i n h e a l t h and d i s e a s e : A r e v i e w , J . C l i n . P a t h o l . 3 4 : 2 9 2 - 3 0 2 , 1 9 8 1 . S c h n e i d e r J A , S c h u l m a n , C y s t i n o s i s , I n : T h e M e t a b o l i c B a s i s o f I n h e r i t e d  D i s e a s e s , 5 t h e d i t i o n , S t a n b u r y J B , W y n g a a r d e n J B , F r e d r i c k s o n D S , G o l d s t e i n J L , Brown MS ( e d i t o r s ) , 1 8 4 4 - 1 8 6 6 , 1 9 8 3 . - 83 -S c h u l t z W, D e p l e t i o n o f d o p a m i n e i n t h e s t r i a t u m as an e x p e r i m e n t a l model o f p a r k i n s o n i s m : D i r e c t e f f e c t s and a d a p t i v e m e c h a n i s m s , P r o g . N e u r o b i o l . 1 8 : 1 2 1 - 1 6 6 , 1 9 8 2 . S e r e g i A , S c h a e f e r A , K o m l o s M, P r o t e c t i v e r o l e o f b r a i n a s c o r b i c a c i d c o n -t e n t a g a i n s t l i p i d p e r o x i d a t i o n , E x p e r i e n t i a . 3 4 : 1 0 5 6 - 1 0 5 7 , 1 9 7 8 . Shaw KM, L e e s A J , S t e r n GM, The i m p a c t o f t r e a t m e n t w i t h l e v o d o p a on • P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , Q u a r t . J . M e d . 4 9 : 2 8 3 - 2 9 3 , 1 9 8 0 . S i n e t P M , H e i k k i l a R E , Cohen G , H y d r o g e n p e r o x i d e p r o d u c t i o n b y r a t b r a i n i n v i v o , J . N e u r o c h e m . 3 4 : 1 4 2 1 - 1 4 2 8 , 1 9 8 0 . S i n g e r T P , S a l a c h J I , C r a b t r e e , R e v e r s i b l e i n h i b i t i o n a n d m e c h a n i s m - b a s e d i r r e v e r s i b l e i n a c t i v a t i o n o f monoamine o x i d a s e s b y l - m e t h y l - 4 - p h e n y l -1 , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e ( M P T P ) , B i o c h i m . B i o p h y s . R e s . Commun. 1 2 7 : 7 0 7 - 7 1 2 , 1 9 8 5 . S l a t e r T F , L i p i d p e r o x i d a t i o n , B i o c h e m . S o c . T r a n s . 1 0 : 7 0 - 7 1 , 1 9 8 2 . S n y d e r S H , D ' A m a t o R J , P r e d i c t i n g P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , N a t u r e 3 1 7 : 1 9 8 - 1 9 9 , 1 9 8 5 . Spearman ME, L e i b m a n K C , E f f e c t s o f a g i n g on h e p a t i c a n d p u l m o n a r y g l u t a -t h i o n e S - t r a n s f e r a s e a c t i v i t i e s i n m a l e and f e m a l e F i s c h e r 344 r a t s , B i o c h e m . P h a r m a c o l . 3 3 : 1 3 0 9 - 1 3 1 3 , 1 9 8 4 . S u n d s t r o m E , J o n s s o n G , P h a r m a c o l o g i c a l i n t e r f e r e n c e w i t h t h e n e u r o t o x i c a c t i o n o f l - m e t h y l - 4 - p h e n y l - l , 2 , 3 , 6 - t e t r a h y d r o p y r i d i n e (MPTP) on c e n t r a l c a t e c h o l a m i n e n e u r o n s i n t h e m o u s e , E u r . J . P h a r m a c o l . 1 1 0 : 2 9 3 - 2 9 9 , 1 9 8 5 . T a p p e l A L , F r e e - r a d i c a l l i p i d p e r o x i d a t i o n damage and i t s i n h i b i t i o n b y v i t a m i n E and s e l e n i u m , F e d . P r o c . 2 4 : 7 3 - 7 8 , 1 9 6 5 . T a p p e l A L , L i p i d p e r o x i d a t i o n damage t o c e l l c o m p o n e n t s , F e d . P r o c . 3 2 : 1 8 7 0 -1 8 7 4 , 1 9 7 3 . T e s t a B , N a y l o r R, C o s t a l l B , J e n n e r P , M a r s d e n CD, Does an e n d o g e n o u s m e t h y l p y r i d i n i u m a n a l o g u e c a u s e P a r k i n s o n ' s d i s e a s e , J . P h a r m . P h a r m a c o l . 3 7 : 6 7 9 - 6 8 0 , 1 9 8 5 . T h o e n e n H , T r a n z e r J P , The p h a r m a c o l o g y o f 6 - h y d r o x y d o p a m i n e , A n n . R e v . P h a r m a c o l . 1 3 : 1 6 9 - 1 8 0 , 1 9 7 3 . T i e t z e F , E n z y m i c m e t h o d f o r q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f n a n o g r a m a m o u n t s o f t o t a l and o x i d i s e d g l u t a t h i o n e , A n a l . B i o c h e m . 2 7 : 5 0 2 - 5 2 2 , 1 9 6 9 . T s e DCS, M c C r e e r y R L , Adams R N , P o t e n t i a l o x i d a t i v e p a t h w a y s o f b r a i n c a t e c h o l a m i n e s , J . M e d . Chem. 1 9 : 3 7 - 4 0 , 1 9 7 6 . U r e t s k y N J , I v e r s e n L L , E f f e c t s o f 6 - h y r o x y d o p a m i n e on c a t e c h o l a m i n e c o n t a i n i n g n e u r o n e s i n t h e r a t b r a i n , J . N e u r o c h e m . 1 7 : 2 6 9 - 2 7 8 , 1 9 7 0 . - 84 -V o g h t T M , S e l v i n S , W i d d o w s o n G , H u l l e y S B , E x p i r e d a i r c a r b o n m o n o x i d e and s e r u m t h i o c y a n a t e a s o b j e c t i v e m e a s u r e s o f c i g a r e t t e e x p o s u r e , Am. J . P u b l i c H e a l t h 7 : 5 4 5 - 5 4 8 , 1 9 7 7 . Ward C D , D u v o i s i n R C , I n c e S E , N u t t J D , E l d r i d g e R, C a l n e DB, P a r k i n s o n ' s d i s e a s e i n 65 p a i r s o f t w i n s and i n a s e t o f q u a d r u p l e t s , N e u r o l . 3 3 : 8 1 5 -8 2 4 , 1 9 8 3 . W a y m i r e J C , B j u r R, W e i n e r N , A s s a y o f t y r o s i n e h y d r o x y l a s e b y c o u p l e d d e c a r b o x y l a t i o n o f DOPA f o r m e d f r o m 1 - 1 4 C - L - t y r o s i n e , A n a l . B i o c h e m . 4 3 : 5 8 8 - 6 0 0 , 1 9 7 1 . W i c k MM, D o p a m i n e : A n o v e l a n t i t u m o u r a g e n t a c t i v e a g a i n s t B - 1 6 melanoma l i n e 6 1 0 0 , J . I n v e s t . D e r m a t o l . 7 1 : 1 6 3 - 1 6 4 , 1 9 7 8 . W i t t i n g L A , V i t a m i n E and l i p i d a n t i o x i d a n t s i n f r e e - r a d i c a l - i n i t i a t e d r e a c t i o n s , I n : F r e e r a d i c a l s i n B i o l o g y 4 : 2 9 5 - 3 1 9 , 1 9 8 0 . W r i g h t J M , W a l l R A , P e r r y T L , P a t y DW, C h r o n i c p a r k i n s o n i s m s e c o n d a r y t o t h e i n t r a n a s a l a d m i n i s t r a t i o n o f a p r o d u c t o f m e p e r i d i n e - a n a l o g u e s y n t h e s i s , New E n g l . J . M e d . 3 1 0 : 3 2 5 , 1 9 8 4 . Y o u d i m MBH, H e f e z A , P l a t e l e t f u n c t i o n and monoamine o x i d a s e a c t i v i t y i n p s y c h i a t r i c d i s o r d e r s , I n : P l a t e l e t s : C e l l u l a r R e s p o n s e M e c h a n i s m s and T h e i r B i o l o g i c a l S i g n i f i c a n c e , Rotman A , M e y e r F A , G i t l e r C , S i l b e r b e r g A ( e d i t o r s ) , 2 8 9 - 3 0 6 , 1 9 8 0 . Z e i g l e r L H , F o l l o w - u p s t u d i e s on p e r s o n s who h a v e h a d e p i d e m i c e n c e p h a l i t i s , J . Am. M e d . A s s o c . 9 1 : 1 3 8 - 1 4 0 , 1 9 2 8 . - 8 5 -C h a p t e r 2 : HUNTINGTON'S CHOREA  ABSTRACT We t e s t e d t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e p r e m a t u r e n e u r o n a l d e a t h t h a t o c c u r s i n H u n t i n g t o n ' s c h o r e a (HC) m i g h t be t h e r e s u l t o f a g e n e t i c a l l y - d e t e r m i n e d e n z y m a t i c f a i l u r e i n t h e d e g r a d a t i o n o f a c i r c u l a t i n g n e u r o t o x i n o f e i t h e r e n d o g e n o u s o r e x o g e n o u s o r i g i n . Two t y p e s o f s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d : an i n  v i v o s t u d y i n w h i c h r a t s w e r e i n j e c t e d r e p e a t e d l y w i t h s e r u m o r s e r u m u l t r a -f i l t r a t e f r o m HC p a t i e n t s o r c o n t r o l s u b j e c t s , a n d an i n v i t r o s t u d y i n w h i c h r a t s t r i a t a l e x p l a n t s w e r e e x p o s e d i n t i s s u e c u l t u r e t o s e r u m o r CSF f r o m p a t i e n t s o r c o n t r o l s . I n t h e i n v i v o s t u d y , t h e r e was a s m a l l b u t s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n t h e mean s t r i a t a l c o n t e n t o f GABA i n r a t s t r e a t e d w i t h w h o l e s e r u m f r o m HC p a t i e n t s , b u t no s t r i a t a l GABA d e f i c i e n c y was o b s e r v e d i n r a t s t r e a t e d w i t h s e r u m u l t r a f i l t r a t e f r o m HC p a t i e n t s . The r e s u l t s s u g g e s t e d t h a t v f a c i r -c u l a t i n g n e u r o t o x i n c o n t r i b u t e s t o t h e p a t h o g e n e s i s o f H C , i t m u s t e i t h e r be a s m a l l m o l e c u l e t h a t i s t i g h t l y b o u n d t o s e r u m p r o t e i n s , o r a l a r g e c o m -pound w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t g r e a t e r t h a n 1 0 , 0 0 0 d a l t o n s . I n t h e i n v i t r o s t u d y , s t r i a t a l e x p l a n t s e x p o s e d t o 3 0 % w h o l e s e r u m f r o m a d u l t - o n s e t HC p a t i e n t s c o n s i s t e n t l y showed d e f i c i e n c y o f t h e a c t i v i t y o f g l u t a m i c a c i d d e c a r b o x y l a s e , t h e s y n t h e t i c enzyme f o r GABA. A t t e m p t s t o e x a m i n e some c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e p u t a t i v e n e u r o t o x i n i n t i s s u e c u l t u r e i n d i c a t e , as w i t h t h e i n v i v o e x p e r i m e n t s , t h a t t h e d e t r i m e n t a l m a t e r i a l may be e i t h e r a s m a l l m o l e c u l e t i g h t l y b o u n d t o p l a s m a p r o t e i n s , o r a m o l e c u l e l a r g e r t h a n 1 0 0 0 0 d a l t o n s . E x p e r i m e n t s t o d e l i n e a t e t h e s e p o s s i b i l i t i e s f u r t h e r met w i t h e q u i v o c a l r e s u l t s , a s d i d e x p e r i m e n t s t h a t u t i l i z e d CSF f r o m HC p a t i e n t s . P o s s i b l e r e a s o n s f o r t h e d i s c r e p a n c i e s a r e d i s c u s s e d . - 86 -The r e s u l t s o b t a i n e d f r o m b o t h t h e i n v i v o and i n v i t r o e x p e r i m e n t s p r o -v i d e s u g g e s t i v e b u t n o t c o n c l u s i v e e v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f a n e u r o t o x i n i n t h e s e r u m o f p a t i e n t s w i t h H C . - 87 -I ) INTRODUCTION I . i ) P e r s p e c t i v e s H u n t i n g t o n ' s c h o r e a ( H C ) , a l s o known as H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , i s a r e l e n t l e s s l y p r o g r e s s i v e n e u r o d e g e n e r a t i v e d i s o r d e r t h a t i s i n h e r i t e d i n an a u t o s o m a l d o m i n a n t f a s h i o n w i t h c o m p l e t e p e n e t r a n c e . The c a u s a t i v e gene h a s r e c e n t l y been shown t o r e s i d e on c h r o m o s o m e 4 ( G u s e l l a e t a l . 1 9 8 3 ) . I n t h e N o r t h A m e r i c a n p o p u l a t i o n , t h e i n c i d e n c e o f HC i s a b o u t 10 i n 1 0 0 , 0 0 0 . I n t h e m a j o r i t y o f p a t i e n t s , t h e o n s e t o f symptoms o c c u r s b e t w e e n t h e a g e s o f 30 and 5 0 ( M a r t i n 1 9 8 4 ) . A b o u t 10% o f c a s e s m a n i f e s t symptoms b e f o r e t h e age o f 15 and f o r m a d i s t i n c t c l i n i c a l s u b g r o u p c a l l e d ' j u v e n i l e c h o r e a ' o r t h e W e s t p h a l v a r i a n t o f HC ( B y e r s e t a l . 1 9 7 3 ; B i r d 1 9 8 0 ) . R e m a r k a b l y , i n m o s t j u v e n i l e c a s e s , t h e d i s e a s e i s t r a n s m i t t e d b y t h e f a t h e r (Went e t a l . . 1 9 8 4 ) . I n c o n t r a s t , M y e r s e t a l . ( 1 9 8 3 ) f o u n d t h a t more t h a n t w i c e a s many o f t h e l a t e - o n s e t c a s e s t h e y s t u d i e d i n h e r i t e d t h e c a u s a t i v e gene f r o m an a f f e c t e d m o t h e r . T h u s , t h e r e a p p e a r s t o be a s e x - r e l a t e d m o d i f y i n g f a c t o r t h a t i n f l u e n c e s t h e a g e o f o n s e t o f t h e d i s o r d e r . C l i n i c a l l y , HC i s c h a r a c t e r i z e d b y a c o m b i n a t i o n o f p h y s i c a l and m e n t a l s y m p t o m s . C h o r e i f o r m movements e s p e c i a l l y o f t h e f a c e , f i n g e r s and t o e s a r e common s i g n s e a r l y i n t h e c o u r s e o f a d u l t - o n s e t p a t i e n t s . As t h e d i s e a s e p r o g r e s s e s , o t h e r p a r t s o f t h e b o d y become a f f e c t e d . L a t e i n t h e c o u r s e o f HC, d y s t o n i a and p a r k i n s o n i a n f e a t u r e s e m e r g e , a n d p a t i e n t s a r e t r o u b l e d b y d y s a r t h r i a and d i f f i c u l t y i n s w a l l o w i n g . In c o n t r a s t , j u v e n i l e o n s e t c a s e s t y p i c a l l y e x h i b i t m u s c l e r i g i d i t y , a n d c h o r e a i s m i n i m a l o r a b s e n t ( B y e r s e t a l . 1 9 7 3 ; S p o k e s 1 9 8 1 ) . T h e y may a l s o h a v e m u s c l e s p a s m s , t r e m o r , d i s t u r b a n c e o f e y e m o v e m e n t s , and e p i l e p s y . I n a d d i t i o n t o t h e m o t o r d i s a b i l i t y , m e n t a l and e m o t i o n a l p r o b l e m s a r e o b s e r v e d i n b o t h t h e j u v e n i l e and a d u l t - o n s e t v a r i e t i e s o f HC. A g r a d u a l - 8 8 -,* i n t e l l e c t u a l d e c l i n e , p r o g r e s s i n g t o f u l l - b l o w n d e m e n t i a , i s a r e g u l a r f e a -t u r e o f t h e d i s e a s e . Memory d e t e r i o r a t e s , and p a t i e n t s h a v e i n c r e a s i n g d i f -f i c u l t y d o i n g a r i t h m e t i c a l p r o b l e m s and c a r r y i n g o u t o r g a n i z a t i o n a l t a s k s ( C a i n e e t a l . 1 9 7 8 ) . Many p a t i e n t s become s e r i o u s l y d e p r e s s e d a t some p o i n t d u r i n g t h e c o u r s e o f t h e d i s e a s e , and t h e r i s k o f t h e i r c o m m i t t i n g s u i c i d e i s h i g h . A b o u t 10% o f p a t i e n t s become f r a n k l y p s y c h o t i c , a n d s u c h p a t i e n t s a r e f r e q u e n t l y m i s d i a g n o s e d as s c h i z o p h r e n i c s . The p r o g r e s s i o n o f symptoms i s i n e x o r a b l y d o w n h i l l . The d u r a t i o n o f t h e d i s e a s e f r o m o n s e t o f symptoms t o d e a t h ( u n l e s s s u i c i d e o r a c c i d e n t a l d e a t h i n t e r v e n e s ) u s u a l l y i s a b o u t 15 y e a r s . S h o u l s o n ( 1 9 8 1 ) h a s d e v i s e d a f u n c -t i o n a l c a p a c i t y r a t i n g s c a l e f o r HG p a t i e n t s . I t a l l o t s u n i t s r a n g i n g f r o m a maximum o f 13 f o r p a t i e n t s s t i l l r e t a i n i n g , f u l l a b i l i t i e s t o z e r o f o r b e d -r i d d e n o n e s . I n a l a r g e g r o u p o f HC p a t i e n t s r e c e i v i n g c o n v e n t i o n a l d r u g t r e a t m e n t ( s e e b e l o w ) , he o b s e r v e d a mean l o s s o f 1 . 8 f u n c t i o n a l u n i t s p e r y e a r . P a t i e n t s whose symptoms a p p e a r e d b e f o r e t h e a g e o f 35 y e a r s t e n d e d t o d e t e r i o r a t e more r a p i d l y ( S h o u l s o n 1 9 8 1 ) . The n e u r o p a t h o l o g i c a l s t a t u s o f many a r e a s o f t h e HC b r a i n h a s b e e n s u m -m a r i z e d b y B r u y n e t a l . ( 1 9 7 9 ) . A l t h o u g h r a t h e r w i d e s p r e a d d e g e n e r a t i o n i s o b s e r v e d , n e u r o n a l l o s s e s a r e c o n s i s t e n t l y m o s t m a r k e d i n t h e c a u d a t e n u c l e u s , p u t a m e n , and c e r e b r a l c o r t e x . D e t e r i o r a t i o n o f t h e c a u d a t e n u c l e u s and p u t a m e n , t h e s e s t r u c t u r e s b e i n g c o l l e c t i v e l y c a l l e d t h e s t r i a t u m , r e -s u l t s i n a c h a r a c t e r i s t i c e n l a r g e m e n t o f t h e l a t e r a l v e n t r i c l e s . I n t h e s t r i a t u m , t h e r e i s a d i s p r o p o r t i o n a t e l o s s o f s m a l l n e u r o n s ( w h i c h a v e r a g e 8 . 5 pm i n d i a m e t e r ) a s c o m p a r e d t o l a r g e n e u r o n s ( L a n g e 1 9 8 1 ) . L o s s o f t h e s e s m a l l n e u r o n s may r e a c h 70 o r 8 0 % D e n d r i t e s o f T y p e I I n e u r o n s o f t h e s t r i a t u m , as s t u d i e d by G o l g i s t a i n i n g t e c h n i q u e s , a r e m a r k e d l y a l t e r e d i n a p p e a r a n c e , s h o w i n g r e c u r v e d e n d i n g s and a p p e n d a g e s ( G r a v e l a n d e t a l . - 89 -1 9 8 5 ) . I n t h e s u b s t a n t i a n i g r a , t h e d e g e n e r a t i o n o f n e u r o n s i s u s u a l l y , c o n -f i n e d t o t h e more v e n t r a l p a r s r e t i c u l a t a ( B i r d 1 9 8 0 ) . The d o p a m i n e r g i c n i g r o s t r i a t a l t r a c t , w h i c h o r i g i n a t e s i n t h e p a r s c o m p a c t a o f t h e s u b s t a n t i a n i g r a and t e r m i n a t e s i n t h e s t r i a t u m , i s r e l a t i v e l y i n t a c t i n HC ( C r o s s e t a l • 1 9 8 3 ) . I t i s u n c l e a r w h e t h e r o r n o t t h e c o r t i c o s t r i a t a l g l u t a m a t e r g i c p a t h w a y , a n o t h e r m a j o r p r o j e c t i o n t o t h e s t r i a t u m , i s a t r o p h i e d ( S h o u l s o n 1 9 8 4 ) . The n u c l e u s b a s a l i s o f M e y n e r t , w h i c h p r o v i d e s m o s t o f t h e c h o l i n e r -g i c i n p u t t o t h e c e r e b r a l c o r t e x , i s r e p o r t e d t o be n o r m a l i n HC ( C l a r k e t a l . 1 9 8 3 ) . T h i s c o n t r a s t s w i t h w h a t i s s e e n i n A l z h e i m e r ' s d i s e a s e . I n g e n e r a l , the b r a i n s o f j u v e n i l e HC p a t i e n t s may h a v e a g r e a t e r d e g r e e o f a t r o p h y t h a n t h a t o b s e r v e d i n a d u l t - o n s e t c a s e s ( C a m p b e l l e t a l . 1 9 5 1 ) . Many n e u r o c h e m i c a l c h a n g e s h a v e b e e n r e p o r t e d i n t h e a u t o p s i e d b r a i n s o f HC p a t i e n t s . A m a r k e d d e f i c i e n c y o f y - a m i n o b u t y r i c a c i d (GABA) i s p r e s e n t i n many b r a i n a r e a s ( P e r r y e t a l . 1 9 7 3 ; U r q u h a r t e t a l . 1 9 7 5 ; P e r r y 1 9 8 2 a ) . T h e s e i n c l u d e t h e c a u d a t e n u c l e u s , p u t a m e n , g l o b u s p a l l i d u s and s u b s t a n t i a n i g r a . A c t i v i t y o f g l u t a m i c a c i d d e c a r b o x y l a s e ( G A D ) , t h e enzyme w h i c h s y n -t h e s i s e s GABA, i s d e c r e a s e d i n t h e c a u d a t e n u c l e u s , p u t a m e n , and g l o b u s p a l -l i d u s ( B i r d e t a l . 1973 and 1 9 7 4 ; U r q u h a r t e t a l . 1 9 7 5 ) . I t i s l i k e l y t h a t b o t h t h e GABA and GAD d e f i c i e n c i e s o f t h e a f o r e - m e n t i o n e d a r e a s r e p r e s e n t a l o s s o f s t r i a t a l G A B A e r g i c i n t e r n e u r o n s , a s w e l l as G A B A e r g i c n e u r o n s i n t h e s t r i a t o p a l 1 i d a l and s t r i a t o n i g r a l p a t h w a y s . A n o t h e r n e u r o c h e m i c a l f i n d i n g i n HC b r a i n s i s a d e c r e a s e i n t h e s t r i a t a l a c t i v i t y o f c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e ( C A T ) , t h e enzyme t h a t s y n t h e s i s e s a c e t y l c h o l i n e . T h i s o c c u r s i n a b o u t 5 0 % o f p a t i e n t s ( B i r d e t a l . 1 9 7 3 ; 1 9 7 4 ) . S u b s t a n c e P c o n t e n t s a r e r e d u c e d i n t h e s t r i a t u m , g l o b u s p a l l i d u s and s u b s t a n t i a n i g r a ( K a n a z a w a e t a l . 1 9 7 7 ; Emson e t a l . 1 9 8 0 ) . T h e r e i s a l s o e v i d e n c e s u g g e s t i n g s u b n o r m a l c o n c e n t r a t i o n s o f m e t h i o n i n e - e n k e p h a l i n - 9 0 -i n t h e s t r i a t o p a l 1 i d a l and s t r i a t o n i g r a l p a t h w a y s (Emson e t a l . 1 9 8 0 ) . On t h e o t h e r h a n d , t h e c o n t e n t o f t h e n e u r o p e p t i d e s o m a t o s t a t i n i s i n c r e a s e d i n t h e s t r i a t u m and g l o b u s p a l l i d u s o f HC b r a i n s ( A r o n i n e t a l . 1 9 8 3 ) . In g e n e r a l , t h e o v e r a l l p a t t e r n o f n e u r o p a t h o l o g i c a l and n e u r o c h e m i c a l c h a n g e s s u g g e s t s t h a t c e r t a i n p o p u l a t i o n s o f n e u r o n s w i t h i n t h e c e r e b r a l c o r t e x and t h e s t r i a t u m , and t h o s e t h a t e x t e n d f r o m t h e s t r i a t u m , b e a r t h e m a j o r b r u n t o f p a t h o l o g y i n H C . C o n v e n t i o n a l d r u g t h e r a p i e s o f HC p a t i e n t s u s e a n t i d e p r e s s a n t d r u g s t o t r e a t symptoms o f d e p r e s s i o n , and a n t i p s y c h o t i c d r u g s , s u c h as t h i o r i d a z i n e o r h a l o p e r i d o l , t o r e d u c e c h o r e i f o r m movements ( S h o u l s o n 1 9 8 4 ) . The a n t i -c h o r e i c e f f e c t s o f a n t i p s y c h o t i c d r u g s p r o b a b l y d e r i v e f r o m a r e d u c t i o n o f n i g r o s t r i a t a l d o p a m i n e r g i c t r a n s m i s s i o n w h i c h may be i n a s t a t e o f r e l a t i v e e x c e s s due t o t h e l o s s o f s t r i a t o n i g r a l G A B A e r g i c i n h i b i t o r y i n f l u e n c e ( S h o u l s o n 1 9 8 4 ) . A l t h o u g h u s e f u l , a n t i p s y c h o t i c and a n t i d e p r e s s a n t d r u g s h a v e no e f f i c a c y i n s l o w i n g t h e p r o g r e s s i v e n e u r o n a l l o s s i n HC ( S h o u l s o n 1 9 8 1 ) . A d d i t i o n a l e v i d e n c e s u p p o r t i n g t h i s c o n t e n t i o n i s d e r i v e d f r o m t h e e x p e r i e n c e o f HC p a t i e n t s b e l o n g i n g t o : a l a r g e k i n d r e d l i v i n g n e a r L a k e M a r a c a i b o i n V e n e -z u e l a . : Of 65 u n t r e a t e d HC p a t i e n t s s t u d i e d , t h e mean r a t e o f d e c l i n e o b -s e r v e d was s i m i l a r t o t h a t o f N o r t h A m e r i c a n d r u g - t r e a t e d p a t i e n t s ( Y o u n g e_t a l . 1 9 8 6 ) . T h u s , c o n v e n t i o n a l d r u g t h e r a p i e s a r e p a l l i a t i v e i n n a t u r e , s i n c e t h e y t r e a t o n l y t h e s y m p t o m s . I n a t t e m p t s t o p r o v i d e more e f f e c t i v e t h e r a p e u t i c m a n a g e m e n t , e f f o r t s h a v e b e e n made t o c o r r e c t t h e d e f i c i e n c y o f GABA c o n t e n t o b s e r v e d i n many a r e a s o f t h e HC b r a i n . A d m i n i s t r a t i o n o f GABA i t s e l f i s i n e f f e c t i v e s i n c e t h i s amino a c i d d o e s n o t r e a d i l y c r o s s t h e b l o o d - b r a i n b a r r i e r ( R o b e r t s e t a l . 1 9 6 8 ) . A t t e m p t s h a v e b e e n made t o s l o w t h e e n z y m a t i c d e g r a d a t i o n o f - 91 -GABA w i t h i n h i b i t o r s o f GABA t r a n s a m i n a s e s u c h as a m i n o o x y a c e t i c a c i d ( P e r r y e t a l . 1 9 8 0 ) o r y - v i n y l - G A B A ( S c i g l i a n o e t a l . 1 9 8 4 ) , b u t t h i s a p p r o a c h h a s f a i l e d t o p r o d u c e i m p r o v e m e n t i n p h y s i c a l o r m e n t a l s y m p t o m s . GABA r e c e p t o r a g o n i s t s s u c h as m u s c i m o l ( S h o u l s o n e t a l . 1 9 7 8 ) o r i m i d a z o l e - 4 - a c e t i c a c i d ( S h o u l s o n e t a l . 1 9 7 5 ) h a v e a l s o b e e n t r i e d , b u t p r o d u c e d no i m p r o v e m e n t s i n m o t o r o r c o g n i t i v e f u n c t i o n s . The r e s u l t s o f t r e a t m e n t w i t h a n o t h e r b r a i n G A B A - e l e v a t i n g a g e n t , i s o n i -a z i d ( I N H ) , d e s e r v e m e n t i o n , b e c a u s e some HC p a t i e n t s may r e s p o n d f a v o r a b l y t o t h i s d r u g . INH i t s e l f i s n o t a G A B A - t r a n s a m i n a s e i n h i b i t o r , b u t i s m e t a b o l i z e d i n t h e l i v e r , i n t o many m e t a b o l i t e s , o n e o f w h i c h i s h y d r a z i n e , a p o t e n t G A B A - t r a n s a m i n a s e i n h i b i t o r ( P e r r y e t a l . 1 9 8 1 ) . E l e v a t i o n o f b r a i n GABA was r e c e n t l y d e m o n s t r a t e d i n t h e a u t o p s i e d b r a i n o f an HC p a t i e n t who d i e d w h i l e u n d e r t r e a t m e n t w i t h INH ( P e r r y e t a l . 1 9 8 5 ) . I n a n o n - b l i n d c l i n i c a l t r i a l o f I N H , 3 o f 5 p a t i e n t s showed s i g n i f i c a n t i m p r o v e m e n t i n m e n t a l symptoms ( P e r r y e t - a l . 1 9 7 9 a ) . H o w e v e r , a l a t e r d o u b l e - b l i n d a n d p l a c e b o - c o n t r o l l e d c r o s s o v e r t r i a l b y t h e same i n v e s t i g a t o r s ( P e r r y e t a l . 1 9 8 2 b ) showed t h a t o n l y 1 o f 9 p a t i e n t s b e n e f i t e d f r o m INH t h e r a p y . N e g a -t i v e r e s u l t s w e r e o b t a i n e d by M c L e a n ( 1 9 8 2 ) , who c o n d u c t e d a d o u b l e - b l i n d INH t r i a l i n 6 p a t i e n t s ; a l t h o u g h a n o t h e r t r i a l o f t h e same a g e n t ( n o n -b l i n d ) b y S t o b e r e t a l . . - ( 1 9 8 3 ) showed t h a t 4 o f 11 p a t i e n t s w e r e i m p r o v e d m a r k e d l y i n t h e i r f u n c t i o n a l c a p a c i t y . T h u s , t h e r e s u l t s a r e e q u i v o c a l a s t o t h e b e n e f i c i a l e f f e c t s o f INH i n t h e t h e r a p y o f p a t i e n t s w i t h HC. C l e a r -l y , a l a r g e s c a l e p l a c e b o - c o n t r o l l e d t r i a l e x t e n d i n g o v e r a l o n g p e r i o d o f t i m e i s n e e d e d t o c l a r i f y t h e r o l e o f INH i n t h e t r e a t m e n t o f HC. A t r i a l o f t h i s s o r t m i g h t a n s w e r t h e q u e s t i o n as t o w h e t h e r o r n o t c h r o n i c e l e v a -t i o n o f b r a i n GABA c o n t e n t c a n p r e v e n t o r s l o w t h e n e u r o l o g i c a l and p s y c h i -a t r i c d e t e r i o r a t i o n i n H C . A n o t h e r a g e n t w i t h p o t e n t i a l f o r t r e a t m e n t o f - 92 -HC, b a c l o f e n , w i l l be d i s c u s s e d i n t h e n e x t s e c t i o n . T h u s , a l t h o u g h much i s known a b o u t t h e n e u r o p a t h o l o g i c a l and n e u r o c h e m i -c a l c h a n g e s i n H C , t r e a t m e n t o f p a t i e n t s r e m a i n s u n s a t i s f a c t o r y a t t h e p r e s -e n t t i m e . C u r r e n t l y a v a i l a b l e t h e r a p i e s do n o t h a l t o r s l o w t h e p r o g r e s s i v e d e t e r i o r a t i o n c h a r a c t e r i s t i c o f t h e d i s e a s e . I m p r o v e m e n t o f t h e t h e r a p e u t i c management o f p a t i e n t s w i t h H C , o r p r e v e n t i o n o f t h e o n s e t o f symptoms i n i n d i v i d u a l s a t r i s k f o r t h e d i s e a s e , r e q u i r e s a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e p a t h o g e n e s i s o f t h e n e u r o n a l d e a t h w h i c h o c c u r s m o s t m a r k e d l y i n t h e s t r i -atum and cerebral c o r t e x . I . i i ) P a t h o g e n e s i s o f n e u r o n a l d e a t h i n H u n t i n g t o n ' s c h o r e a A k e y q u e s t i o n w h i c h n e e d s t o be a n s w e r e d i s how t h e m u t a n t gene f o r HC c a u s e s t h e d e a t h o f c e r t a i n p o p u l a t i o n s o f n e u r o n s . T h r e e m a i n h y p o t h e s e s h a v e b e e n a d v a n c e d . The f i r s t s u g g e s t s t h a t t h e m u t a n t gene may c o d e f o r an a b n o r m a l p r o t e i n w h i c h i s p r e s e n t i n a l l c e l l m e m b r a n e s . The s e c o n d i n v o l v e s a d e f e c t i v e DNA r e p a i r m e c h a n i s m t h e r e b y p r e d i s p o s i n g c e l l s t o p r e m a t u r e d e a t h . The t h i r d h y p o t h e s i s p o s t u l a t e s t h e p r e s e n c e o f a n e u r o t o x i n w h i c h d e s t r o y s n e u r o n s . B e c a u s e t h i s c h a p t e r d e a l s p r i n c i p a l l y w i t h t h e e t i o l o g y o f H C , t h e s e p o s s i b i l i t i e s m e r i t d i s c u s s i o n . The s u g g e s t i o n t h a t a g e n e r a l i z e d c e l l membrane d e f e c t may be i n v o l v e d i n t h e p a t h o g e n e s i s o f HC i s b a s e d on a s e r i e s o f p u b l i c a t i o n s i n t h e 1 9 7 0 s , a l l c l a i m i n g t o h a v e f o u n d membrane a b n o r m a l i t i e s i n c e l l s o b t a i n e d f r o m p e r i p h e r a l t i s s u e s o f HC p a t i e n t s . S i n c e b r a i n c e l l s a r e r e l a t i v e l y i n a c -c e s i b l e f o r s t u d y , p e r i p h e r a l t i s s u e s w e r e u s e d w i t h t h e hope t h a t t h e HC gene m i g h t be e x p r e s s e d i n t h e s e c e l l s . E a r l y a c c o u n t s i n t h e l i t e r a t u r e d e a l t w i t h t h e g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s o f s k i n f i b r o b l a s t s i n t i s s u e c u l t u r e . Menkes e t a l . ( 1 9 7 3 ) r e p o r t e d t h a t c u l t u r e d f i b r o b l a s t s f r o m HC p a t i e n t s had - 93 -a r e d u c e d g r o w t h p o t e n t i a l and d e c r e a s e d l i f e s p a n when c o m p a r e d t o t h o s e d e r i v e d f r o m n o r m a l c o n t r o l s * I n c o n t r a s t , G o e t z e t a l . ( 1 9 7 5 ) c l a i m e d t h a t c u l t u r e d HC f i b r o b l a s t s grew t o a g r e a t e r c o n f l u e n t d e n s i t y and had a l o n g e r r e p l i c a t i v e l i f e s p a n t h a n c o n t r o l f i b r o b l a s t s . S h o r t l y t h e r e a f t e r , Menkes and c o - w o r k e r s ( B a r k l e y e t a l . 1 9 7 7 ) , u s i n g a d i f f e r e n t c u l t u r e medium f r o m t h a t o f t h e i r p r e v i o u s e x p e r i m e n t , r e t r a c t e d t h e i r o r i g i n a l c l a i m and c o n -f i r m e d t h e o b s e r v a t i o n s o f G o e t z e t a l . ( 1 9 7 5 ) t h a t HC s k i n f i b r o b l a s t s d i d i n d e e d grow t o a g r e a t e r c e l l d e n s i t y . T h i s was l a t e r c o r r o b o r a t e d b y s e v e r a l groups ( K i r k e t a l . 1 9 7 7 ; L e o n a r d i e t a l . 1 9 7 8 ; G o e t z e t a l . 1 9 7 9 ) . On t h e o t h e r h a n d , G r a y e t a l . ( 1 9 7 9 ) w e r e u n a b l e t o d e t e c t a n y d i f f e r e n c e , e i t h e r i n g e n e r a t i o n t i m e o r i n maximum p o p u l a t i o n d e n s i t y , b e t w e e n c u l t u r e d f i b r o b l a s t s o f HC p a t i e n t s and c o n t r o l s a m p l e s . C a s s i m a n e t a l . ( 1 9 7 9 ) , i n a t h o r o u g h l y b l i n d - c o d e d s t u d y o f 22 c o n t r o l s , 22 ' a t - r i s k ' i n d i v i d u a l s , and 25 HC p a t i e n t s , p r o v i d e d p e r h a p s t h e m o s t c o n v i n c i n g r e s u l t s . E l e v e n p a r a -m e t e r s w e r e . t e s t e d : and s t a t i s t i c a l d i s c r i m i n a n t a n a l y s e s o f t h e r e s u l t i n g d a t a w e r e a n a l y s e d b y c o m p u t e r . No s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e 3 g r o u p s c o u l d be d e t e c t e d f o r a n y o f t h e p a r a m e t e r s m e a s u r e d . M e a n w h i l e , G o e t z e t a l . ( 1 9 8 1 ) r e p e a t e d t h e i r o r i g i n a l s t u d y , t h i s t i m e u s i n g b l i n d -c o d e d s a m p l e s , and f o u n d no s t a t i s t i c a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n c u l t u r e d f i b r o -b l a s t s d e r i v e d f r o m HC p a t i e n t s and c o n t r o l s . T h u s , t h e g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s o f HC f i b r o b l a s t s i n t i s s u e c u l t u r e a p p e a r t o be s i m i l a r t o t h o s e o f c o n t r o l s . E a r l y r e p o r t s o f a d i f f e r e n c e came f r o m s t u d i e s t h a t w e r e e i t h e r n o t p e r f o r m e d b l i n d , o r s a m p l e n u m b e r s w e r e s m a l l i n b l i n d s t u d i e s ( t w o p a t i e n t s i n t h e r e p o r t o f K i r k e t a l . 1 9 7 7 ) . Many f a c t o r s c a n i n f l u e n c e d i f f e r e n t i a l g r o w t h o f c e l l s i n t i s s u e c u l t u r e . Among t h e s e a r e t h e medium u s e d , t h e s i t e and s i z e o f t h e s k i n b i o p s y , t h e t y p e o f l o c a l a n e s t h e t i c u s e d t o o b t a i n t h e s k i n b i o p s y , and t h e m e t h o d u s e d - 94 -t o r e p l e n i s h t h e c u l t u r e m e d i u m . T h e s e h a v e b e e n t h o r o u g h l y r e v i e w e d by B e v e r s t o c k ( 1 9 8 5 ) . Membrane d e f e c t s i n e r y t h r o c y t e s o f HC p a t i e n t s h a v e a l s o b e e n d e s c r i b e d . E r y t h r o c y t e membrane g h o s t s f r o m HC p a t i e n t s h a v e b e e n r e p o r t e d t o h a v e d i f -f e r e n t e l e c t r o n s p i n r e s o n a n c e (ESR) c h a r a c t e r i s t i c s f r o m t h o s e o f c o n t r o l s u b j e c t s ( B u t t e r f i e l d e t a l . 1 9 7 7 ; 1 9 7 9 ) , a l t h o u g h t h i s h a s b e e n d i s p u t e d by a t l e a s t 3 i n d e p e n d e n t l a b o r a t o r i e s ( C o m i n g s e t a l . 1 9 8 1 ; B e v e r s t o c k e t a l _ . 1 9 8 2 ; F u n g e t a l . 1 9 8 2 ) . O t h e r t e c h n i q u e s h a v e a l s o l e d t o c l a i m s o f a membrane d e f e c t i n H C . C u l t u r e d f i b r o b l a s t s f r o m HC p a t i e n t s r e p o r t e d l y d i f f e r e d f r o m c o n t r o l s i n t h e i r f l u o r e s c e n c e s p e c t r a a f t e r l a b e l l i n g w i t h a f l u o r e s c e n t p r o b e ( P e t t e -grew e t a l . 1 9 7 9 ; 1 9 8 1 ) . T h i s c o u l d n o t be c o n f i r m e d b y o t h e r i n v e s t i g a -t o r s ( L a k o w i c z e t a l . 1 9 8 1 ; S u m b i l l a e t a l . 1 9 8 2 ) . L y m p h o c y t e s f r o m HC p a t i e n t s h a v e b e e n r e p o r t e d t o show d e c r e a s e d c o n c a n a v a l i n A - i n d u c e d c a p p i n g when c o m p a r e d t o c o n t r o l l y m p h o c y t e s ( M o r o n h a e t a l . 1 9 7 9 ) . T h i s o b s e r v a -t i o n h a s y e t t o be t e s t e d b y an i n d e p e n d e n t l a b o r a t o r y ( B e v e r s t o c k 1 9 8 5 ) . I n s u m m a r y , p r e s e n t e v i d e n c e d o e s n o t s u p p o r t a g e n e r a l i z e d s t r u c t u r a l a n d / o r f u n c t i o n a l d e f e c t i n t h e c e l l membranes o f p e r i p h e r a l t i s s u e s f r o m HC p a t i e n t s . C l a i m s h a v e e i t h e r b e e n r e t r a c t e d b y t h e i r o r i g i n a l a u t h o r s , o r h a v e b e e n c h a l l e n g e d b y o t h e r s . A t a n y r a t e , t h e d e t e c t i o n o f an a b n o r m a l membrane p r o t e i n i n p e r i p h e r a l t i s s u e s w o u l d n o t h e l p t o e x p l a i n why t h e m u t a n t gene i n HC a f f e c t s c o n s i s t e n t l y and m a r k e d l y o n l y c e r t a i n p o p u l a t i o n s o f n e u r o n s . The s e c o n d h y p o t h e s i s r e g a r d i n g t h e e t i o l o g y o f HC i s t h a t t h e m u t a n t gene c o d e s f o r an a b n o r m a l DNA r e p a i r m e c h a n i s m . The i n h e r i t e d n e u r o n a l d e g e n e r a t i v e c o n d i t i o n s a t a x i a - t e l a n g i e c t a s i a and x e r o d e r m a p i g m e n t o s u m h a v e b e e n shown t o h a v e a s s o c i a t e d d e f e c t s i n t h e i r DNA r e p a i r m e c h a n i s m s . C e l l s - 95 -f r o m t h e s e p a t i e n t s h a v e an i n c r e a s e d m o r t a l i t y r a t e i n r e s p o n s e t o l o w d o s e s o f r a d i a t i o n o r c h e m i c a l m u t a g e n s ( T a y l o r e t a l . 1 9 7 5 ; A n d r e w s e t a l . 1 9 7 8 ; P a t e r s o n e t a l . 1 9 7 9 ) . I n t h e c a s e o f H C , A r l e t t e t a l . ( 1 9 7 9 ) r e p o r t e d t h a t 4 p e r i p h e r a l c e l l l i n e s f r o m HC p a t i e n t s w e r e more s e n s i t i v e t o g a m m a - i r r a d i a t i o n t h a n c e l l s d e r i v e d f r o m n o r m a l c o n t r o l s . I n a n o t h e r p u b l i c a t i o n ( A r l e t t 1 9 7 9 ) , 9 o u t o f 11 HC c e l l l i n e s t e s t e d showed v a r y i n g d e g r e e s o f s e n s i t i v i t y t o g a m m a - r a d i a t i o n . T h e s e f i n d i n g s . w e r e l a t e r r e t r a c t e d , when a s i m i l a r e x p e r i m e n t was r e p e a t e d w i t h b l i n d - c o d e d s a m p l e s and no e v i d e n c e o f a n y e x c e s s i r r a d i a t i o n damage c o u l d be d e t e c t e d i n t h e HC c u l t u r e d f i b r o b l a s t s ( A r l e t t 1 9 8 0 ) . The l a t t e r n e g a t i v e r e s u l t was a l s o o b t a i n e d by o t h e r i n v e s t i g a t o r s ( B e v e r s t o c k e t a l . 1 9 8 2 ; E v a n e t a l . 1 9 8 2 ) . T h u s , t h e b u l k o f t h e e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t t h e r e i s no s p e c i f i c d e f e c t i n DNA r e p a i r m e c h a n i s m s i n HC c e l l s w h i c h m i g h t r e n d e r them m o r e s e n s i t i v e t o D N A - d a m a g i n g a g e n t s . A g a i n , e v e n i f t h e r e w e r e a s p e c i f i c d e f e c t i n DNA r e p a i r , i t w o u l d be d i f f i c u l t t o r e c o n c i l e t h i s i n f o r m a t i o n w i t h t h e o b s e r -v a t i o n t h a t t h e m u t a n t gene i n HC a f f e c t s m a r k e d l y o n l y c e r t a i n p o p u l a t i o n s o f n e u r o n s . P e r h a p s t h e m o s t l i k e l y h y p o t h e s i s f o r n e u r o n a l l o s s i n HC i s t h a t i t o c c u r s as a r e s u l t o f e x p o s u r e t o a n e u r o t o x i n ( s ) , e i t h e r e n d o g e n o u s l y f o r m -e d , o r f r o m e x o g e n o u s s o u r c e s . . The n o r m a l a l l e l e t o t h e HC g e n e m i g h t c o d e f o r an enzyme c a p a b l e o f m e t a b o l i z i n g and t h u s d e t o x i f y i n g t h e p u t a t i v e n e u r o t o x i n ( s ) . HC h e t e r o z y g o t e s , w i t h one n o r m a l a n d o n e m u t a n t a l l e l e , m i g h t h a v e s u b n o r m a l enzyme a c t i v i t y , r e n d e r i n g t h e m i n c a p a b l e o f c o m p l e t e l y r e m o v i n g t h e n e u r o t o x i n ( s ) . R e p e a t e d e x p o s u r e o f s u s c e p t i b l e n e u r o n s t o s m a l l amounts o f t h e n e u r o t o x i n ( s ) o v e r many y e a r s m i g h t e v e n t u a l l y c a u s e s u f f i c i e n t n e u r o n a l l o s s t o p r o d u c e t h e symptoms o f H C . T h e s e l e c t i v i t y o f n e u r o n a l l o s s m i g h t be e x p l a i n e d b y an e x c l u s i v e l o c a l i z a t i o n o f r e c e p t o r s f o r s u c h t o x i n s on c e r t a i n t y p e s o f n e u r o n s . - 96 -CH9-CH2-COOH I CH-COOH G l u t a m i c a c i d / NH2 CH3 H.C = C HC-CH - CH2-COOH K a i n i c a c i d H0C CH-COOH 2 s / N H "^^ V^ COOH \N^COOH Q u i n o l i n i c a c i d F i g u r e 1. C h e m i c a l s t r u c t u r e s o f g l u t a m i c a c i d , k a i n i c a c i d , and q u i n o l i n i c a c i d . - 97 -The n e u r o t o x i n h y p o t h e s i s i s s u p p o r t e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t a t l e a s t 3 compounds a r e c a p a b l e o f p r o d u c i n g n e u r o c h e m i c a l a n d n e u r o p a t h o l o g i c a l c h a n g e s t h a t r e s e m b l e t h o s e o f HC when i n j e c t e d i n t o t h e s t r i a t u m o f a n i m a l s . T h e s e a r e k a i n i c a c i d ( K A ) , g l u t a m i c a c i d , and q u i n o l i n i c a c i d ( F i g u r e 1 ) . K A , a s t r u c t u r a l a n a l o g o f g l u t a m i c a c i d , i s a p r o d u c t o f t h e J a p a n e s e s e a w e e d D i g e n e a s i m p l e x . When i n j e c t e d i n t o t h e s t r i a t u m o f r a t s , KA p r o -d u c e s n e u r o t o x i c e f f e c t s c l o s e l y r e s e m b l i n g t h o s e f o u n d i n HC s t r i a t u m ( C o y l e e t a l . 1 9 7 6 ; C o y l e e t a l . 1 9 7 8 a ; M c G e e r e t a l . 1 9 7 6 ; M c G e e r e t a l . 1 9 7 9 ; C o y l e 1 9 8 3 ) . I n t r i n s i c G A B A e r g i c and c h o l i n e r g i c n e u r o n s a r e d e s -t r o y e d , e f f e r e n t a x o n s o f s t r i a t a l n e u r o n s d e g e n e r a t e , w h i l e a f f e r e n t s t o t h e s t r i a t u m , s u c h a s t h e n i g r o s t r i a t a l t r a c t , a r e s p a r e d . A l t h o u g h KA i s n o t f o u n d i n t h e b o d y ( B e u t l e r e t a l . 1 9 8 1 ) , t h e m e c h a n -i s m o f i t s t o x i c i t y h a s r e c e i v e d much a t t e n t i o n i n t h e hope t h a t s u c h s t u d -i e s w o u l d h e l p t o e l u c i d a t e t h e p o s s i b l e c a u s e o f n e u r o n a l d e a t h i n H C . KA i s an e x c i t a n t o f m o s t m a m m a l i a n CNS n e u r o n s , as i s g l u t a m i c a c i d , b u t i t h a s a p o t e n c y 300 t i m e s g r e a t e r t h a n t h a t o f t h e l a t t e r a m i n o a c i d ( M c G e e r e t a l . 1 9 7 9 ) . KA d e r i v a t i v e s d e v o i d o f n e u r o e x c i t a t o r y e f f e c t s l a c k n e u r o -t o x i c p r o p e r t i e s when- t e s t e d on r a t s t r i a t u m ( S c h w a r c z e t a l . 1 9 7 8 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t e x c e s s i v e n e u r o e x c i t a t i o n m i g h t be i n v o l v e d i n t h e m e c h a n i s m o f t o x i c i t y o f K A . KA i s b e l i e v e d t o b i n d t o a s u b s e t o f g l u t a -mate r e c e p t o r s ( C o y l e e t a l . 1 9 7 9 ) , and i t d o e s n o t a p p e a r t o be t r a n s p o r t e d by t h e h i g h - a f f i n i t y u p t a k e s y s t e m t h a t t e r m i n a t e s t h e s y n a p t i c a c t i o n s o f g l u t a m a t e ( J o h n s t o n e t a l . 1 9 7 9 ) . T h u s , KA may p e r s i s t a t r e c e p t o r s i t e s f o r a l o n g e r p e r i o d o f t i m e t h a n g l u t a m a t e . T h e s e o b s e r v a t i o n s h a v e l e d O l n e y t o p r o p o s e an ' e x c i t o t o x i c ' m e c h a n i s m f o r n e u r o n a l d e a t h ( O l n e y e t - a l . 1 9 7 1 ; O l n e y 1 9 7 4 ; O l n e y e t a l . 1 9 7 9 ) . A c c o r d i n g t o t h i s c o n c e p t , no p a r -t i c u l a r t o x i c a c t i o n w o u l d be n e c e s s a r y , o t h e r t h a n a p e r s i s t e n t a c t i v a t i o n - 98 -o f e x c i t a t o r y r e c e p t o r s . Damage w o u l d r e s u l t f r o m i o n i c s h i f t s e x c e e d i n g t h e c a p a c i t y o f membrane pumps t o r e s t o r e and m a i n t a i n t h e r e s t i n g membrane p o t e n t i a l . The r e s u l t i n g i o n i c i m b a l a n c e w o u l d l e a d t o a s t a t e i n c o m p a t i b l e w i t h c o n t i n u e d s u r v i v a l o f t h e n e u r o n . I t i s now. known t h a t f o r t h e n e u r o t o x i c i t y o f KA t o become m a n i f e s t , an i n t a c t g l u t a m a t e r g i c c o r t i c o s t r i a t a l p a t h w a y i s r e q u i r e d . L e s i o n s o f t h i s p a t h w a y i n a n i m a l s r e d u c e t h e t o x i c i t y o f KA by a t l e a s t 2 o r d e r s o f m a g n i -t u d e (McGeer e t a l . 1 9 7 8 ) . I n t h e d e c o r t i c a t e s t r i a t u m , c o - a d m i n i s t r a t i o n o f g l u t a m i c a c i d and K A , n e i t h e r o f w h i c h i s n e u r o t o x i c a l o n e u n d e r s u c h a c o n d i t i o n , p a r t i a l l y r e s t o r e s t o x i c i t y ( C o y l e e t a l . 1 9 7 9 ) . I n a d d i t i o n , t h e r a t s t r i a t u m becomes s e n s i t i v e t o . t h e d e g e n e r a t i v e e f f e c t s o f KA o n l y when t h e g l u t a m a t e r g i c i n n e r v a t i o n h a s m a t u r e d ( C a m p o c h i a r o e t a l . 1 9 7 8 ) . K A - i n d u c e d m o r p h o l o g i c d i s t u r b a n c e s a r e o b s e r v e d i n t i s s u e c u l t u r e o f s t r i -a t a l c e l l s o n l y i n t h e p r e s e n c e o f g l u t a m a t e - c o n t a i n i n g c o r t i c a l n e u r o n s ( W h e t s e l l 1 9 7 9 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s h a v e l e d t o s p e c u l a t i o n t h a t g l u t a m a t e i t s e l f may be i n v o l v e d i n t h e p a t h o g e n e s i s o f HC ( O l n e y e t a l . 1 9 7 8 ; O l n e y 1 9 7 9 ; S a n d -b e r g e t _ a l _ . 1 9 8 1 ; S h o u l s o n 1 9 8 3 ) . I n s u p p o r t o f t h i s c o n t e n t i o n i s t h e f i n d i n g t h a t c h r o n i c i n f u s i o n o f L - g l u t a m a t e p r o d u c e s n e u r o t o x i c e f f e c t s i n t h e r a t s t r i a t u m n o t u n l i k e t h a t s e e n i n HC ( M a n g a n o e t a l . 1 9 8 3 ; McBean e t a l _ . 1 9 8 4 ; 1 9 8 5 ) . To t e s t t h e g l u t a m a t e h y p o t h e s i s , S h o u l s o n a n d h i s c o l l e a g u e s ( 1 9 8 3 ) h a v e o r g a n i z e d a d o u b l e - b l i n d and p l a c e b o - c o n t r o l l e d t r i a l o f b a c l o f e n i n a l a r g e g r o u p o f HC p a t i e n t s . B a c l o f e n p r e f e r e n t i a l l y b l o c k s t h e n e u r o n a l r e l e a s e o f e x c i t a t o r y a m i n o a c i d s , i n c l u d i n g g l u t a m a t e ( P o t a s h n e r 1 9 7 8 ; 1 9 7 9 ) , and i t s l o n g - t e r m a d m i n i s t r a t i o n m i g h t p r o v i d e c h r o n i c p h a r m a c o l o g i -c a l a t t e n u a t i o n o f t h e g l u t a m a t e r g i c c o r t i c o s t r i a t a l f u n c t i o n . S h o u l s o n ' s - 99 -g r o u p i n t e n d s t o c o n t i n u e t h e r a p y w i t h e i t h e r a p l a c e b o o r b a c l o f e n f o r 3 y e a r s i n a p p r o x i m a t e l y 60 HC p a t i e n t s who w i l l n o t be p e r m i t t e d t o t a k e a n y o t h e r f o r m o f a n t i - c h o r e i c d r u g s d u r i n g t h i s p e r i o d . I t w i l l be s e v e r a l y e a r s (when t h e c o d e i s b r o k e n ) b e f o r e i t i s known w h e t h e r o r n o t b a c l o f e n h a s h e l p e d t o s l o w o r p r e v e n t t h e p r o g r e s s i o n o f symptoms o f HC. A w e a k n e s s o f t h e g l u t a m a t e h y p o t h e s i s i s t h a t i t f a i l s t o e x p l a i n why t h e n e u r o d e g e n e r a t i v e p r o c e s s i n HC i s s e e n m o s t m a r k e d l y i n o n l y c e r t a i n n e u r o n s . One o f t h e m o s t s e n s i t i v e a r e a s o f t h e CNS t o t h e n e u r o t o x i c e f f e c t s o f g l u t a m a t e i s t h e n e u r a l r e t i n a ( C o y l e e t a l . 1 9 7 8 b ) . Y e t t h e r e a p p e a r t o be no r e p o r t s o f r e t i n a l damage i n H C . H o w e v e r , i t i s p o s s i b l e t h a t s u s c e p t i b l e n e u r o n s c o n t a i n a s u b s e t o f g l u t a m a t e r e c e p t o r s n o t f o u n d i n h i g h q u a n t i t i e s e l s e w h e r e a n d t h a t t h e s e a r e s p e c i f i c a l l y i n v o l v e d i n H C . A n o t h e r p r o b l e m w i t h t h e g l u t a m a t e h y p o t h e s i s i s t h a t t h e c o n t e n t s o f g l u t a m a t e i n t h e s t r i a t u m and c e r e b r a l c o r t e x o f HC p a t i e n t s a r e n o t i n -c r e a s e d f r o m t h a t o f c o n t r o l s ( P e r r y e t a l . 1 9 7 3 ) . H o w e v e r , i t i s c o n c e i v -a b l e t h a t a g l u t a m a t e a b n o r m a l i t y u n r e l a t e d t o t h e a b s o l u t e l e v e l s o f t h e n e u r o t r a n s m i t t e r m i g h t be i n v o l v e d . F o r i n s t a n c e , a d e f e c t i v e u p t a k e m e c h -a n i s m , an i n c r e a s e d r e l e a s e o f g l u t a m a t e f r o m s y n a p t i c e n d i n g s , h e i g h t e n e d s e n s i t i v i t y o f g l u t a m a t e r e c e p t o r s , o r a c o m b i n a t i o n o f t h e s e , m i g h t be p r e s e n t i n s u s c e p t i b l e n e u r o n s o f p a t i e n t s w i t h t h e d i s e a s e . As m e n t i o n e d e a r l i e r , t h e r e i s a n o t h e r a g e n t w h i c h c a n d e s t r o y s t r i a t a l n e u r o n s o f a n i m a l s . T h i s i s q u i n o l i n i c a c i d (QA) ( F i g u r e 1 ) , an e n d o g e n o u s m e t a b o l i t e o f t r y p t o p h a n f o r m e d i n t h e k y n u r e n i n e p a t h w a y ( S t o n e e t a l . 1 9 8 5 ) . QA h a s b e e n i d e n t i f i e d i n t h e b r a i n s o f s e v e r a l mammalian s p e c i e s , i n c l u d i n g man ( W o l f e n s b e r g e r e t a l . 1 9 8 3 ; M o r o n i e t a l . 1 9 8 4 ) , and when i n j e c t e d i n t o t h e s t r i a t u m o f r a t s , i t p r o d u c e s a k a i n a t e - l i k e l e s i o n ( S c h w a r c z e t a l . 1 9 8 3 a ; 1 9 8 4 ) . R a t b r a i n shows d i f f e r e n c e s i n s u s c e p t i b i l -- 100 -i t y t o t h e n e u r o t o x i c e f f e c t s o f QA, w i t h t h e s t r i a t u m b e i n g one o f t h e m o s t s u s c e p t i b l e a r e a s ( S c h w a r c z e t a l . 1 9 8 3 b ) . The p h y s i o l o g i c a l a c t i o n o f QA i s n e u r o e x c i t a t o r y . I n t h i s r e g a r d , t h e r a t CNS shows r e g i o n a l v a r i a t i o n i n i t s s e n s i t i v i t y t o QA, w i t h t h e s t r i a t u m a g a i n b e i n g o n e o f t h e more s e n s i -t i v e a r e a s ( P e r k i n s e t a l . 1 9 8 3 ) . T h u s , as i s p r o b a b l y t h e c a s e f o r K A , t h e n e u r o t o x i c e f f e c t o f QA a p p e a r s t o be r e l a t e d t o i t s n e u r o e x c i t a t o r y a c t i o n . I t i s c o n c e i v a b l e t h a t e x c e s s i v e a c c u m u l a t i o n o f QA i n t h e b r a i n c o u l d r e s u l t i n t h e n e u r o n a l l o s s e s s e e n i n HC p a t i e n t s . H o w e v e r , t h i s a p p e a r s u n l i k e l y , b e c a u s e a c t i v i t y o f QA p h o s p h o r i b o s y l t r a n s f e r a s e , t h e d e g r a d a t i v e enzyme f o r QA, i s n o r m a l i n t h e putamen and i s e v e n s l i g h t l y e l e v a t e d i n t h e c a u d a t e n u c l e u s o f a u t o p s i e d b r a i n s o f HC p a t i e n t s when c o m p a r e d t o c o n t r o l s ( F o s t e r e t a l . 1 9 8 5 ) . C o n t e n t o f QA i t s e l f n e e d s t o be m e a s u r e d i n t h e b r a i n s o f HC p a t i e n t s b e f o r e a n y f u r t h e r c o n c l u s i o n s c a n be d r a w n . Our p r e -l i m i n a r y a t t e m p t , u s i n g a h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h i c s y s t e m , a t q u a n t i f y i n g t h e a m o u n t s o f QA i n human b r a i n h a s b e e n c o m p l i c a t e d b y t h e s m a l l amounts o f QA p r e s e n t , a s w e l l as b y t h e c o - e l u t i o n o f QA w i t h s e v e r a l o t h e r c o m p o u n d s . S u m m a r i z i n g t h e o r i e s o f t h e e t i o l o g y o f H C , t h e n e u r o t o x i n h y p o t h e s i s a p p e a r s l e s s e q u i v o c a l t h a n t h o s e o f a g e n e r a l i z e d membrane d e f e c t , o r o f a b n o r m a l DNA r e p a i r . The e x a m p l e s o f KA and QA s e r v e t o h i g h l i g h t t h e p o s -s i b i l i t y t h a t t h e r e may e x i s t an a s y e t u n i d e n t i f i e d n e u r o t o x i n ( s ) t h a t m i g h t be r e s p o n s i b l e f o r s e l e c t i v e n e u r o n a l d e a t h a n d t h e c o n s e q u e n t s y m p -toms o f HC. - 101 -I I ) OUTLINE OF EXPERIMENTS The p r e c e d i n g s e c t i o n s u g g e s t s t h a t HC m i g h t r e s u l t f r o m t h e e x p o s u r e t o a n e u r o t o x i n ( s ) , e i t h e r e n d o g e n o u s l y f o r m e d o r o f e x o g e n o u s o r i g i n . D i r e c t e v i d e n c e f o r t h e i n v o l v e m e n t o f t h i s n e u r o t o x i n ( s ) , a s w e l l as i t s i d e n t i f i -c a t i o n , w o u l d be u s e f u l . I f t h e s e c o u l d be a c h i e v e d , t h e t h e r a p e u t i c m a n -agement o f HC p a t i e n t s m i g h t be g r e a t l y i m p r o v e d . F o r i n s t a n c e , i f t h e p u t a t i v e n e u r o t o x i n p r o v e d t o be f r o m an e x o g e n o u s s o u r c e and was p r e s e n t i n c e r t a i n f o o d s , t h e n s i m p l e e x c l u s i o n o f t h e p a r t i c u l a r d i e t a r y s u b s t a n c e ( s ) m i g h t h a l t o r s l o w t h e p r o g r e s s i o n o f t h e d i s e a s e i n HC p a t i e n t s . F o r i n d i -v i d u a l s g e n e t i c a l l y a t r i s k , t h i s d i e t - e x c l u s i o n t h e r a p y m i g h t h e l p t o d e l a y t h e o n s e t o f symptoms f o r s e v e r a l y e a r s , o r m i g h t e v e n p r e v e n t t h e d i s e a s e e n t i r e l y . I f t h e p u t a t i v e n e u r o t o x i n t u r n e d o u t t o be e n d o g e n o u s l y p r o d u c e d , v a r i -o u s p h a r m a c o l o g i c a l s t r a t e g i e s f o r p r e v e n t i n g i t s f o r m a t i o n , o r h a s t e n i n g i t s r e m o v a l , m i g h t become p o s s i b l e . T h e i m m i n e n t a v a i l a b i l i t y o f t h e r e s t r i c t i o n f r a g m e n t p o l y m o r p h i c DNA m a r k e r f o r p r e c l i n i c a l i d e n t i f i c a t i o n o f c a r r i e r s o f t h e HC g e n e ( G u s e l l a e t a l . 1 9 8 3 ) makes i t e s p e c i a l l y i m p o r -t a n t t o make r a p i d p r o g r e s s i n d e v e l o p i n g a p r e v e n t i v e t h e r a p y f o r H C . I t w o u l d be h e l p f u l t o h a v e a p r a c t i c a l t r e a t m e n t t o o f f e r i n d i v i d u a l s a t r i s k f o r t h e d i s e a s e , a b o u t 50% o f whom when t e s t e d w i l l r e c e i v e v e r y b a d n e w s . The f i r s t r e q u i r e m e n t , h o w e v e r , m u s t be p r o o f o f t h e i n v o l v e m e n t o f a n e u r o t o x i n ( s ) i n t h e p a t h o g e n e s i s o f H C . D u r i n g q u a n t i t a t i v e a m i n o a c i d a n a l y s e s o f f a s t i n g p l a s m a , P e r r y e t a l . ( A p p e n d i x H , P e r r y e t a l . J .  N e u r o l . S c i . 6 7 : 3 5 1 - 3 5 8 , 1 9 8 5 ) o b s e r v e d i n 7 o f 2 8 HC p a t i e n t s t r a c e a m o u n t s o f an unknown compound n o t p r e v i o u s l y f o u n d i n n o r m a l s u b j e c t s . T h i s unknown compound y i e l d e d a y e l l o w c o l o r when r e a c t e d w i t h n i n h y d r i n , s u g g e s t i n g t h a t i t m i g h t be an i m i n o a c i d . I t e l u t e d f r o m t h e c h r o m a t o g r a p h i c s y s t e m v e r y - 102 -c l o s e t o p r o l i n e and k a i n i c a c i d , b u t was c l e a r l y n o t i d e n t i c a l w i t h e i t h e r o f t h e m . I t seemed p o s s i b l e t h a t i t m i g h t r e p r e s e n t a n e u r o t o x i n t h a t was c i r c u l a t i n g i n t h e b l o o d o f HC p a t i e n t s . The i n v i v o r a t s t u d y i n S e c t i o n I I I , i n w h i c h r a t s w e r e i n j e c t e d r e p e a t e d l y w i t h c o n t r o l s e r u m o r s e r u m o b -t a i n e d f r o m HC p a t i e n t s , r e p r e s e n t s o u r i n i t i a l a t t e m p t t o i n v e s t i g a t e t h i s p o s s i b i l i t y . The n e x t s e r i e s o f e x p e r i m e n t s ( S e c t i o n I V ) i n v o l v e d t h e u s e o f t i s s u e c u l t u r e t e c h n i q u e s . I n b r i e f , s t r i a t a l e x p l a n t s f r o m n e o n a t a l r a t s w e r e c u l t u r e d i n a medium t h a t c o n t a i n e d e i t h e r HC o r c o n t r o l . s e r u m . A f t e r a p e r i o d o f i n c u b a t i o n , t h e s e e x p l a n t s w e r e a n a l y s e d n e u r o c h e m i c a l ^ . The r a t i o n a l e o f b o t h t h e i n v i v o a n d t n v i t r o e x p e r i m e n t s was t h a t i f t h e s t r i a t u m o f r a t s , as w e l l as t h e c u l t u r e d s t r i a t a l e x p l a n t s , when e x -p o s e d t o HC s e r u m s h o w e d n e u r o c h e m i c a l c h a n g e s t h a t r e s e m b l e d t h o s e s e e n i n t h e same b r a i n a r e a i n a u t o p s i e d b r a i n o f HC p a t i e n t s , t h e n t h e r e s u l t s m i g h t i n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f a c i r c u l a t i n g n e u r o t o x i n i n t h e b l o o d o f HC p a t i e n t s . N e u r o c h e m i c a l m e a s u r e m e n t s i n v o l v e d p r i n c i p a l l y t h a t o f GABA c o n -t e n t and GAD a c t i v i t y . M a r k e d r e d u c t i o n s o f b o t h G A B A e r g i c i n d i c e s a r e w e l l d o c u m e n t e d i n t h e s t r i a t u m o f p a t i e n t s who d i e w i t h HC ( P e r r y e t a l . 1 9 7 3 ; U r q u h a r t e t a l . 1 9 7 5 ; P e r r y 1 9 8 2 a ; B i r d e t - a l . 1973 and 1 9 7 4 ) . - 103 -I I I ) IN VIVO STUDIES The p r o t o c o l s f o r t h i s e x p e r i m e n t a r e d e t a i l e d i n A p p e n d i x H ( P e r r y e t a l . J . N e u r o l . S c i . 6 _ 7 : 3 5 1 - 3 5 8 , 1 9 8 5 ) and w i l l be p r e s e n t e d b r i e f l y h e r e . N o n - f a s t i n g v e n o u s b l o o d was o b t a i n e d f r o m c o n t r o l s u b j e c t s o r f r o m HC p a t i e n t s w i t h c l a s s i c a l symptoms and a p r o v e n f a m i l y h i s t o r y o f t h e d i s o r d e r . I n an e f f o r t t o a v o i d a n y d r u g e f f e c t s , n o n e o f t h e p a t i e n t s o r c o n t r o l s u b -j e c t s had t a k e n any d r u g s d u r i n g t h e 96 h p r i o r t o b l o o d c o l l e c t i o n . The b l o o d was c e n t r i f u g e d t o o b t a i n s e r u m . The l a t t e r was l e f t e i t h e r u n t r e a t e d ( h e n c e f o r t h , s e r u m t h a t h a s n o t u n d e r g o n e a n y a l t e r a t i o n w i l l be r e f e r r e d t o as w h o l e s e r u m ) f o r E x p e r i m e n t 1 , c r was p a s s e d t h r o u g h a f i l t r a t i o n mem-b r a n e o f e x c l u s i o n l i m i t 1 0 , 0 0 0 d a l t o n s , t o o b t a i n a s e r u m u l t r a f i l t r a t e f o r E x p e r i m e n t 2 . The v o l u m e o f t h e f i l t r a t e o b t a i n e d was a p p r o x i m a t e l y 8 0 % o f t h e v o l u m e o f t h e o r i g i n a l s e r u m s p e c i m e n . Some o f t h e HC o r c o n t r o l s e r u m f i l t r a t e s w e r e l y o p h i l i z e d , and w e r e t h e n r e c o n s t i t u t e d w i t h c o r r e s p o n d i n g u n l y o p h i l i z e d f i l t r a t e s s o t h a t t h e f i n a l p r o t e i n - f r e e f i l t r a t e u s e d f o r a n i m a l i n j e c t i o n was c o n c e n t r a t e d 2 - f o l d o v e r t h a t o f t h e o r i g i n a l f i l t r a t e . F o r . i n j e c t i o n s i n E x p e r i m e n t 1 , r a n d o m l y - a s s i g n e d 6 d a y o l d l i t t e r - m a t e W i s t a r r a t s w e r e i n j e c t e d s u b c u t a n e o u s l y ( s c ) w i t h w h o l e s e r u m f r o m e i t h e r HC p a t i e n t s o r c o n t r o l s u b j e c t s . I n j e c t i o n s w e r e a d m i n i s t e r e d o n c e d a i l y f o r 24 c o n s e c u t i v e d a y s , i n i n j e c t i o n v o l u m e s o f 7 t o 9 % o f b o d y w e i g h t . The t o t a l v o l u m e o f HC o r c o n t r o l s e r u m i n j e c t e d i n t o e a c h a n i m a l was 52 m l . I n E x p e r i m e n t 2 , r a n d o m l y - a s s i g n e d 1 d a y o l d l i t t e r - m a t e W i s t a r r a t s w e r e i n j e c t e d s c w i t h a c o n c e n t r a t e d s e r u m f i l t r a t e f r o m e i t h e r HC p a t i e n t s o r c o n t r o l s u b j e c t s o n c e d a i l y f o r 37 c o n s e c u t i v e d a y s . The t o t a l v o l u m e o f c o n c e n t r a t e d s e r u m f i l t r a t e t h a t e a c h a n i m a l r e c e i v e d was 7 6 . 5 ml ( t h e e q u i -v a l e n t o f 191 ml o f o r i g i n a l s e r u m ) . An a d d i t i o n a l c o n t r o l g r o u p o f r a t s was g i v e n 1.8% N a C l , w i t h t h e i n j e c t i o n s c h e d u l e and v o l u m e b e i n g i d e n t i c a l - 104 -t o t h a t o f t h e c o n c e n t r a t e d s e r u m f i l t r a t e s . T h i s g r o u p o f a n i m a l s s e r v e d as h y p e r o s m o l a r c o n t r o l s f o r t h e s e r u m f i l t r a t e - i n j e c t e d r a t s . A f t e r t h e f i n a l i n j e c t i o n , r a t s f r o m b o t h e x p e r i m e n t s w e r e l e f t u n d i s -t u r b e d u n t i l t h e y w e r e 5 m o n t h s o l d . O b s e r v a t i o n s d u r i n g t h i s p e r i o d r e v e a l e d no b e h a v i o r a l o r movement d i s o r d e r s i n t h e r a t s i n j e c t e d w i t h HC s e r u m o r u l t r a f i l t r a t e . S a c r i f i c e was b y c e r v i c a l d i s l o c a t i o n , a n d t h e b r a i n s w e r e r a p i d l y r e m o v e d and f r o z e n i n l i q u i d n i t r o g e n . T h i s r a p i d f r e e z i n g p r o c e d u r e , w i t h i n 4 0 s o f d e a t h , was n e c e s s a r y t o p r e v e n t a n y p o s t -mortem i n c r e a s e s i n GABA c o n t e n t ( P e r r y e t a l . 1 9 8 1 b ) . A f t e r 2 0 s i m m e r s i o n i n l i q u i d n i t r o g e n , t h e b r a i n s w e r e g r a d u a l l y warmed t o - 1 0 ° C t o a l l o w f o r d i s s e c t i o n o f b o t h h a l v e s o f t h e s t r i a t u m . S t r i a t a l GABA c o n t e n t was m e a s u r e d on an a m i n o a c i d a n a l y s e r u s i n g a c h r o m a t o g r a p h i c s y s t e m p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( P e r r y e t a l . 1 9 8 1 b ) . I n E x p e r -i m e n t 1 , t h e e n t i r e r a t s t r i a t u m was u s e d f o r GABA a n a l y s i s . I n E x p e r i m e n t 2 , o n l y o n e - h a l f o f t h e s t r i a t u m was u s e d f o r GABA d e t e r m i n a t i o n , w h i l e t h e o t h e r h a l f was u s e d f o r m e a s u r e m e n t s o f c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e (CAT) a c t -i v i t y b y t h e method o f Fonnum ( 1 9 7 5 ) . The r e s u l t s o f E x p e r i m e n t s 1 and 2 a r e shown i n T a b l e s 1 and 2 r e s p e c t -i v e l y . As shown i n T a b l e 1 , t h e mean GABA c o n t e n t was s l i g h t l y b u t s i g n i f i -c a n t l y d e c r e a s e d (16%) i n r a t s i n j e c t e d w i t h w h o l e s e r u m f r o m HC p a t i e n t s . In E x p e r i m e n t 2 , h o w e v e r , mean s t r i a t a l GABA c o n t e n t and CAT a c t i v i t y o f HC and c o n t r o l s e r u m f i l t r a t e - i n j e c t e d g r o u p s w e r e s i m i l a r . T h e s e v a l u e s d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m t h o s e o f t h e h y p e r o s m o l a r N a C l g r o u p . - 105 -T a b l e 1 . S t r i a t a l GABA c o n t e n t i n r a t s i n j e c t e d w i t h w h o l e s e r u m S o u r c e o f w h o l e s e r u m Age o f r a t s GABA c o n t e n t d u r i n g d a i l y ( y m o l / g w e t w e i g h t ) i n j e c t i o n s ( d a y s ) 8 HC p a t i e n t s 5 t o 29 2 . 4 4 ± 0 . 0 9 + ( 1 8 ) 8 c o n t r o l s u b j e c t s 5 t o 29 2 . 9 0 ± 0 . 1 6 ( 1 2 ) GABA v a l u e s a r e i n mean ± S E M , w i t h t h e number o f a n i m a l s e x a m i n e d n e u r o c h e m i c a l l y i n d i c a t e d i n b r a c k e t s . P < 0 . 0 2 . T a b l e 2 . GABA c o n t e n t and CAT a c t i v i t y i n s t r i a t u m o f r a t s i n j e c t e d w i t h c o n c e n t r a t e d s e r u m f i l t r a t e s S o u r c e o f s e r u m Age o f r a t s GABA c o n t e n t CAT a c t i v i t y d u r i n g d a i l y ( y m o l / g w e t w e i g h t ) ( n m o l / 1 0 m i n / i n j e c t i o n s ( d a y s ) . . mg p r o t e i n ) 14 HC p a t i e n t s 1 t o 37 2 . 5 1 ± 0 . 1 3 3 8 . 0 ± 2 . 1 ( 1 6 ) ( 1 5 ) 19 c o n t r o l s u b j e c t s 1 t o 37 2 . 2 7 ± 0 . 0 9 4 0 . 0 ± 2 . 9 ( 1 5 ) ( 1 3 ) 1 . 8 % N a C l 1 t o 37 2 . 5 5 ± 0 . 1 5 4 4 . 4 ± 2 . 9 - .. . . • . . ( 1 6 ) ( 1 4 ) N e u r o c h e m i c a l v a l u e s a r e shown as mean ± SEM. The number o f a n i m a l s e x a m i n e d i s i n d i c a t e d i n b r a c k e t s . None o f t h e means d i f f e r s i g n i f i c a n t l y (P = 0 . 0 5 ) . T h e r e a r e 2 p o s s i b l e i n t e r p r e t a t i o n s o f t h e r e s u l t s shown i n T a b l e s 1 and 2 . F i r s t l y , t h e r e may h a v e b e e n no n e u r o t o x i n p r e s e n t i n HC s e r u m . S e c o n d l y , i f a n e u r o t o x i n was p r e s e n t , i t may h a v e b e e n e i t h e r a l a r g e m o l e -c u l e o f o v e r 1 0 , 0 0 0 d a l t o n s ( a n d t h e r e f o r e r e m o v e d b y t h e u l t r a f i l t r a t i o n ) , o r i t may h a v e b e e n a s m a l l m o l e c u l e t h a t was s o t i g h t l y b o u n d t o s e r u m p r o -t e i n s t h a t i t d i d n o t r e a c h t h e u l t r a f i l t r a t e . The s e c o n d i n t e r p r e t a t i o n - 106 -m i g h t e x p l a i n t h e f i n d i n g o f a s m a l l b u t s i g n i f i c a n t d e c r e a s e i n GABA c o n -t e n t when w h o l e s e r u m was u s e d ( E x p e r i m e n t 1 ) , b u t no d i f f e r e n c e when s e r u m u l t r a f i U r a t e c o n t a i n i n g o n l y m o l e c u l e s l e s s t h a n 1 0 , 0 0 0 d a l t o n s was u s e d ( E x p e r i m e n t 2 ) . I n E x p e r i m e n t 1 , i t i s p o s s i b l e t h a t i f t h e r a t s h a d b e e n t r e a t e d w i t h a l a r g e r d a i l y d o s e o f w h o l e s e r u m , o r i f i n j e c t i o n s h a d been c o n t i n u e d f o r a l o n g e r p e r i o d o f t i m e , a more i m p r e s s i v e r e d u c t i o n i n s t r i a t a l GABA c o n t e n t m i g h t h a v e b e e n o b t a i n e d i n a n i m a l s g i v e n t h e HC s e r u m . H o w e v e r , i t was i m p r a c t i c a l t o t r e a t r a t s f o r l o n g e r p e r i o d s w i t h w h o l e s e r u m (HC o r c o n -t r o l ) b e c a u s e many d e a t h s o c c u r r e d . G r o w t h r a t e was s l o w e r i n w h o l e s e r u m -e x p o s e d r a t s when c o m p a r e d t o u n i n j e c t e d c o n t r o l s , a n d l o s s o f b o d y f u r was e x t e n s i v e . Once t h e i n j e c t i o n s w e r e d i s c o n t i n u e d , a n i m a l s r e c o v e r e d r a p i d l y and g a i n e d w e i g h t n o r m a l l y . A n i m a l s i n E x p e r i m e n t 2 d i d n o t show a n y s i d e e f f e c t s f r o m t h e p r o t e i n - f r e e u l t r a f i U r a t e i n j e c t i o n s . The a d v e r s e e f f e c t s e n c o u n t e r e d w i t h w h o l e s e r u m i n o u r i n v i v o e x p e r i -m e n t , t h e s e b e i n g p r e s u m a b l y i m m u n o l o g i c a l i n n a t u r e , p r o m p t e d us t o i n i t i -a t e e x p e r i m e n t s w i t h t i s s u e c u l t u r e s i n v i t r o . - 107 -I V ) TISSUE CULTURE STUDIES T h e r e a r e s e v e r a l a d v a n t a g e s t o d o i n g s t r i a t a l t i s s u e c u l t u r e e x p e r i -m e n t s as o p p o s e d t o i n v i v o i n j e c t i o n s o f s e r u m . A h i g h e r c o n c e n t r a t i o n o f s e r u m c a n be u s e d i n v i t r o w i t h o u t e n c o u n t e r i n g t h e p r e s u m e d i m m u n o l o g i c a l t o x i c i t i e s e n c o u n t e r e d i n v i v o ( S e c t i o n I I I ) . The b l o o d - b r a i n b a r r i e r , w h i c h i s known t o h i n d e r t h e p a s s a g e o f some p e r i p h e r a l l y - i n j e c t e d s u b s t a n c e s i n t o t h e b r a i n , i s n o t p r e s e n t i n t h e s e i n v i t r o e x p e r i m e n t s . D i r e c t e x p o s -u r e o f t h e s t r i a t u m t o l a r g e a m o u n t s o f t h e p u t a t i v e n e u r o t o x i n a l s o i s p o s s i b l e i n v i t r o . The e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d b e l o w w e r e d e s i g n e d t o t e s t w h e t h e r o r n o t e x p o s u r e t o s e r u m o r CSF f r o m l i v i n g HC p a t i e n t s w o u l d r e d u c e GABA c o n t e n t and GAD a c t i v i t y o f r a t s t r i a t a l e x p l a n t s . A d e c r e a s e ( o r i n c r e a s e ) i n GAD a c t i v i t y o r GABA c o n t e n t o f H C - e x p o s e d e x p l a n t s was deemed t o be p r e s e n t when t h e s e v a l u e s w e r e r e d u c e d ( o r i n c r e a s e d ) by a t l e a s t 2 5 % f r o m t h o s e o f t h e r e s p e c t i v e c o n t r o l v a l u e s . V a l u e s t h a t d i d n o t d i f f e r b y more t h a n 25% f r o m c o n t r o l s w e r e deemed u n c h a n g e d . F u r t h e r , some e x p e r i m e n t s w e r e d e s i g n e d t o e l u c i d a t e t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e p u t a t i v e n e u r o t o x i n . E a c h e x p e r i m e n t c o m p a r e d a s p e c i m e n o b t a i n e d f r o m a n o n - m e d i c a t e d HC p a t i e n t w i t h one f r o m a n o n - m e d i c a t e d a g e and s e x - m a t c h e d c o n t r o l s u b j e c t . A l l o f t h e HC p a t i e n t s t e s t e d had a p o s i t i v e f a m i l y h i s t o r y o f t h e d i s o r d e r , and a l l had symptoms f o r s e v e r a l y e a r s . R e l e v a n t d e s c r i p t i o n s o f p a t i e n t s who s u p p l i e d s e r a a r e shown i n T a b l e 3 , w h i l e t h e p a t i e n t s who s u p p l i e d CSF s p e c i m e n s a r e d e s c r i b e d i n T a b l e 8 . E x c e p t f o r two j u v e n i l e HC p a t i e n t s , a l l t h e HC s u b j e c t s w e r e a d u l t - o n s e t c a s e s . E x p e r i m e n t s w e r e a l w a y s p e r -f o r m e d b l i n d e d w i t h t h e s a m p l e s c o d e d . - 108 -T a b l e 3 . C h a r a c t e r i s t i c s o f HC p a t i e n t s w h o s e s e r a w e r e u s e d i n t i s s u e c u l t u r e e x p e r i m e n t s ; i e n t J u v e n i l e o r Age D u r a t i o n o f E x p e r i m e n t a d u l t - o n s e t ( y e a r s ) symptoms ( y e a r s ) number GW A d u l t 48 7 1 , 9 , 14 LB A d u l t 32 9 . 5 2 , 5 JT A d u l t 38 8 . 5 3 , 16 JC A d u l t 45 5 6 DE A d u l t 58 3 8 JW A d u l t 35 2 . 5 11 BX J u v e n i l e 13 v 12 J S J u v e n i l e 28 9 15 A l l t h e p a t i e n t s l i s t e d a b o v e a r e m a l e s . C h a r a c t e r i s t i c s o f HC p a t i e n t s who s u p p l i e d CSF s p e c i m e n s a r e shown i n T a b l e 8 . I V . i ) M e t h o d s B r a i n s w e r e r e m o v e d f r o m n e w b o r n W i s t a r r a t s l e s s t h a n 24 h o l d a n d w e r e p l a c e d i n a P e t r i d i s h c o n t a i n i n g H a n k s ' b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n . U n d e r t h e d i s s e c t i n g m i c r o s c o p e , t h e r i g h t and l e f t s t r i a t a w e r e e x c i s e d . From e a c h h a l f - s t r i a t u m , a b o u t 7 t o 10 p i e c e s o f t i s s u e w e r e c u t , e a c h m e a s u r i n g 3 a p p r o x i m a t e l y 1 mm . H e n c e f o r t h , t h e s e t i s s u e s w i l l be r e f e r r e d t o a s e x p l a n t s . T h r e e e x p l a n t s w e r e p l a c e d on a g l a s s c o v e r s l i p p r e v i o u s l y c o a t -e d w i t h r a t t a i l c o l l a g e n ( B o r n s t e i n 1 9 5 8 ) . The c o v e r s l i p was t h e n i n s e r t -e d i n t o a K i m a x g l a s s t e s t - t u b e (15 x 160 mm). 0 . 7 ml o f g r o w t h medium ( s e e b e l o w ) was i n t r o d u c e d i n t o e a c h t e s t - t u b e , and t h e u n i t was c a p p e d w i t h a r u b b e r s t o p p e r . A l l c u l t u r e t u b e s w e r e p l a c e d s t a t i o n a r y a t an a n g l e o f 5 d e g r e e s f r o m t h e h o r i z o n t a l p l a n e f o r t h e f i r s t 24 h , a n d s u b s e q u e n t l y w e r e p l a c e d on a r o t a t i n g drum w h e r e t h e y r e m a i n e d a t t h e same a n g l e . I n c u b a t i o n t e m p e r a t u r e was m a i n t a i n e d a t 3 7 ° C . F i f t e e n t o 2 0 n e o n a t a l r a t s w e r e t y p i c a l l y u s e d i n e a c h e x p e r i m e n t shown i n T a b l e 4 . T h i s p r o v i d e d e n o u g h e x p l a n t s f o r 60 t o 8 0 c u l t u r e t u b e s . The - 109 -T a b l e 4 . C h a r a c t e r i s t i c s o f t i s s u e c u l t u r e e x p e r i m e n t s P r o p o r t i o n ( v / v ) and E x p t Name o f D u r a t i o n o f e x p o s u r e t y p e o f human s e r u m number p a t i e n t o f e x p l a n t s t o o r CSF i n medium medium ( w e e k s ) 15% w h o l e s e r u m 1 GW 1 , 2 , 5 3 JT 1 , 3 15 J S 1 16 JT 1 , 3 3 0 % w h o l e s e r u m 2 LB 1 , 2 , 3 3 JT 1 , 3 5 LB 1 , 3 6 JC 1 , 3 8 DE 1 , 3 9 GW 1 , 3 11 JW 1 , 3 12 BX 1 , 3 15 J S 1 , 3 16 JT 1 , 3 15% d e p r o t e i n i z e d s e r u m 8 DE 1 , 3 9 GW 1 , 3 11 JW 1 , 3 15 J S 1 , 3 16 • , JT 1 , 3 15% d e p r o t e i n i z e d and 12 BX 1 , 3 f i l t e r e d s e r u m 15% CSF 7 M 1 10 X 2 10 Y 2 13 Z 2 E x p e r i m e n t 14 i s n o t shown on t h i s T a b l e w h i l e E x p e r i m e n t s 5 and 16 a r e d e s c r i b e d f u r t h e r i n t h e t e x t . P a t i e n t GW was t e s t e d 3 t i m e s ( E x p e r i m e n t s 1 , 9 and 1 4 ) , e a c h t i m e a g a i n s t a d i f f e r e n t c o n t r o l . P a t i e n t s LB ( E x p e r i m e n t s 2 and 5) and J T ( E x p e r i m e n t s 3 and 1 6 ) w e r e t e s t e d t w i c e a g a i n s t d i f f e r e n t c o n t r o l s . T h e r e i s no E x p e r i m e n t 4 . e x p e r i m e n t s l i s t e d i n T a b l e 4 a r e n u m b e r e d a c c o r d i n g t o t h e c h r o n o l o g i c a l o r d e r i n w h i c h t h e y w e r e p e r f o r m e d . F o r t h e f i r s t 7 d a y s o f i n c u b a t i o n , t h e n u t r i e n t f l u i d u s e d f o r a l l e x -p e r i m e n t s c o n t a i n e d 70% b y v o l u m e o f a m i x t u r e o f E a g l e ' s minimum e s s e n t i a l - 110 -medium ( w i t h E a r l e ' s s a l t , b u t w i t h o u t g l u t a m i n e ) , 0 . 5 % g l u c o s e , 20 y g / m l g e n t a m i c i n , and was 2 mM i n a d d e d g l u t a m i c a c i d . The r e m a i n i n g 3 0 % o f t h e medium ( v / v ) was c o m p o s e d o f h o r s e s e r u m . The c h e m i c a l s and h o r s e s e r u m u s e d w e r e p u r c h a s e d f r o m G i b c o L a b o r a t o r i e s . A f t e r i n c u b a t i o n f o r 7 d a y s , t h e s t a t e o f t h e e x p l a n t s was d e t e r m i n e d u s i n g a p h a s e - c o n t r a s t m i c r o s c o p e a t l O x m a g n i f i c a t i o n . O n l y e x p l a n t s w i t h e x t e n d e d g r o w t h p r o c e s s e s and i n s i g n i f i c a n t d a r k n e c r o t i c a r e a s w e r e u s e d f o r t h e n e x t s t a g e d f t h e e x p e r i m e n t . C u l t u r e t u b e s c o n t a i n i n g h e a l t h y and g r o w i n g e x p l a n t s w e r e d i v i d e d i n t o a number o f s e t s , d e p e n d i n g on t h e d e s i g n o f t h e e x p e r i m e n t ( T a b l e 4 ) . E a c h s e t was t h e n i n c u b a t e d w i t h an a p p r o p r i a t e medium c o n t a i n i n g s e r u m o r CSF f r o m HC p a t i e n t s o r c o n t r o l s u b j e c t s . I n a l l c a s e s , t h e n u t r i e n t f l u i d c o n -s i s t e d o f 70% by v o l u m e o f a m i x t u r e o f E a g l e ' s minimum e s s e n t i a l medium ( w i t h E a r l e ' s s a l t , b u t w i t h o u t g l u t a m i n e ) , 0 . 5 % g l u c o s e , 20 y g / m l g e n t a m i -c i n , and was 2 mM i n a d d e d g l u t a m i c a c i d . Where 3 0 % by v o l u m e o f human s e r -um was u s e d , h o r s e s e r u m was e x c l u d e d f r o m t h e m e d i u m . I n e x p e r i m e n t s t h a t u t i l i s e d 1 5 % ( v / v ) o f human s e r u m o r C S F , t h e r e m a i n i n g 15% was made up b y h o r s e s e r u m . A f t e r a f u r t h e r 7 d a y s o f i n c u b a t i o n , e x p l a n t s w e r e e i t h e r h a r v e s t e d o r w e r e i n c u b a t e d w i t h a f r e s h s o l u t i o n o f t h e i r r e s p e c t i v e m e d i a o n c e a week u n t i l t h e y w e r e r e a d y f o r h a r v e s t i n g . H a r v e s t i n g c o n s i s t e d o f s c r a p i n g o f f e a c h e x p l a n t w i t h f i n e f o r c e p s f r o m i t s c o l l a g e n - c o a t e d c o v e r s l i p , and p l a c i n g i t i n H a n k s ' b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n f o r 5 m i n u t e s . E x p l a n t s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d t o a f r e s h H a n k s ' b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n f o r a n o t h e r 5 m i n -u t e s . T h e s e ' w a s h e s ' w e r e d e s i g n e d t o r i d t h e e x p l a n t s o f a d h e r i n g m e d i u m . E x p l a n t s f o r GABA a n a l y s i s w e r e t h e n t r a n s f e r r e d i n t o a h o m o g e n i z a t i o n t u b e c o n t a i n i n g 0 . 4 M p e r c h l o r i c a c i d . T h o s e t o be u s e d f o r GAD a n a l y s i s w e r e - I l l -f r o z e n and s t o r e d a t - 7 0 C . S e v e n t o 11 e x p l a n t s w e r e p o o l e d f o r e a c h m e a s -u r e m e n t o f GABA c o n t e n t , and 10 t o 15 e x p l a n t s w e r e p o o l e d f o r d e t e r m i n a t i o n o f GAD a c t i v i t y . A l l t h e t i s s u e c u l t u r e p r o c e d u r e s , w i t h t h e e x c e p t i o n o f h a r v e s t i n g , w e r e p e r f o r m e d u n d e r s t e r i l e c o n d i t i o n s . Some e x p e r i m e n t s ( T a b l e 4 ) w e r e d o n e w i t h d e p r o t e i n i z e d s e r u m i n t h e h o p e t h a t d e p r o t e i n i z a t i o n w o u l d r e m o v e m o s t l a r g e m o l e c u l e s f r o m s e r u m s a m -p l e s , o r w o u l d d i s l o d g e s m a l l m o l e c u l e s t i g h t l y b o u n d t o s e r u m p r o t e i n s . To d e p r o t e i n i z e s e r u m , 0 . 2 9 ml o f 10 N p e r c h l o r i c a c i d was a d d e d i n a d r o p w i s e ma nner t o 10 ml o f s e r u m w h i c h was s t i r r e d c o n t i n u o u s l y i n an i c e - b a t h . The r e s u l t i n g t h i c k homogeneous s o l u t i o n was c e n t r i f u g e d a t lOOOOg f o r 15 m i n -u t e s a t 4 ° C . P o t a s s i u m b i c a r b o n a t e c r y s t a l s w e r e t h e n a d d e d t o t h e s t i r r e d s u p e r n a t a n t u n t i l t h e pH was 7 . 0 . T h i s r e m o v e d e x c e s s p e r c h l o r a t e i o n s ( a s i n s o l u b l e p o t a s s i u m p e r c h l o r a t e ) i n o r d e r t o a v o i d d e t r i m e n t a l e f f e c t s on e x p l a n t s i n c u l t u r e . A f t e r a n o t h e r c e n t r i f u g a t i o n , t h e s u p e r n a t a n t o f t h e d e p r o t e i n i z e d s e r u m was m i x e d w i t h t h e o t h e r i n g r e d i e n t s o f t h e c u l t u r e medium and s t e r i l i z e d b y p a s s i n g i t t h r o u g h a N a l g e n e f i l t e r u n i t ( 0 . 2 0 u m ) . The s e r a o r C S F ' s u s e d i n t h e o t h e r t y p e s o f e x p e r i m e n t w e r e s i m i l a r l y s t e r i l i z e d . O t h e r t y p e s o f e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d w i l l be d e t a i l e d i n t h e n e x t s e c t i o n . A n a l y s i s o f GABA c o n t e n t was as d e s c r i b e d i n P e r r y e t a l . ( 1 9 8 2 c ) , b y means o f a m o d i f i e d a m i n o a c i d a n a l y s e r t h a t u s e s t h e f l u o r e s c e n c e o f t h e r e a c t i o n p r o d u c t s o f a m i n o a c i d s w i t h o - p h t h a l a l d e h y d e f o r d e t e c t i o n o f v e r y s m a l l amounts o f GABA. GAD a c t i v i t y was d e t e r m i n e d as d e s c r i b e d b y P e r r y e t r 14 -i aj_. ( 1 9 7 9 b ) , e x c e p t t h a t t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f L - [ l - C J - g l u t a m i c a c i d was i n c r e a s e d t o 0 . 1 u C i / v i m o l e . GAD a c t i v i t y o f e x p l a n t s was e x p r e s s e d a s - 112 -v i m o l / h / g p r o t e i n , w h i l e GABA c o n t e n t was c a l c u l a t e d as n m o l / e x p l a n t . I t was n o t p o s s i b l e t o e x p r e s s GABA c o n t e n t i n t e r m s o f t h e amount o f p r o t e i n p r e s -e n t i n e x p l a n t s b e c a u s e s a m p l e s u s e d f o r GABA a n a l y s i s had f i r s t t o be d e -p r o t e i n i z e d . I t was h o p e d t h a t t h e m e a s u r e m e n t o f GABA c o n t e n t f r o m a p o o l o f e x p l a n t s (7 t o 11) s i m i l a r l y e x p o s e d t o a p a r t i c u l a r c u l t u r e medium w o u l d o f f s e t t h e d i f f e r e n c e i n s i z e s b e t w e e n t h e e x p l a n t s . I V . i i ) R e s u l t s and D i s c u s s i o n T a b l e 5 shows t h e i n d i v i d u a l v a l u e s o f GAD a c t i v i t y and GABA c o n t e n t o f s t r i a t a l e x p l a n t s o b t a i n e d i n E x p e r i m e n t 8 . GAD a c t i v i t i e s o f e x p l a n t s e x -p o s e d t o 15 % d e p r o t e i n i z e d o r 30% w h o l e s e r u m f r o m t h e c o n t r o l s u b j e c t w e r e h i g h e r a f t e r t h r e e w e e k s o f e x p o s u r e t h a n a f t e r o n e w e e k . T h i s was i n d i c a -t i v e o f s u r v i v a l and c o n t i n u e d g r o w t h o f t h e e x p l a n t s , e v e n t h o u g h human m a t e r i a l had been a d d e d t o t h e g r o w t h m e d i u m . On t h e o t h e r h a n d , GABA c o n -t e n t s w e r e t h e same i n e x p l a n t s e x p o s e d t o 30% c o n t r o l s e r u m f o r o n e o r t h r e e w e e k s , and a c t u a l l y d e c l i n e d a f t e r t h r e e w e e k s o f t r e a t m e n t i n e x -p l a n t s t h a t had b e e n e x p o s e d t o 15% d e p r o t e i n i z e d c o n t r o l s e r u m . I n o t h e r e x p e r i m e n t s , t h e GABA c o n t e n t s o f d i f f e r e n t s e t s o f e x p l a n t s e x p o s e d t o t h e same c o n t r o l s e r u m s i m i l a r l y v a r i e d r a n d o m l y . - 113 -T a b l e 5 . I n d i v i d u a l v a l u e s o f GAD a c t i v i t y and GABA c o n t e n t o f r a t s t r i a t a l e x p l a n t s e x p o s e d t o 3 0 % w h o l e s e r u m o r 15 % d e p r o t e i n i z e d s e r u m o f E x p e r i m e n t 8 S e r u m u s e d GAD a c t i v i t y GABA c o n t e n t ( y m o l / h / g p r o t e i n ) ( n m o l / e x p l a n t ) E x p o s u r e : 1 week C o n t r o l ( 3 0 % w h o l e ) 4 7 . 3 0 . 1 0 2 HC ( 3 0 % w h o l e ) 2 6 . 6 0 . 1 7 5 C o n t r o l (15% d e p r o t e i n i z e d ) 5 0 . 5 0 . 1 9 7 HC ( 1 5 % d e p r o t e i n i z e d ) 3 5 . 1 0 . 1 2 7 E x p o s u r e : 3 w e e k s C o n t r o l ( 3 0 % w h o l e ) 6 6 . 1 0 . 1 0 2 HC ( 3 0 % w h o l e ) 3 7 . 0 0 . 0 4 0 C o n t r o l (15% d e p r o t e i n i z e d ) 5 8 . 3 0 . 0 5 0 HC (15% d e p r o t e i n i z e d ) 3 9 . 8 0 . 0 1 6 - 114 -I t s h o u l d be e m p h a s i z e d t h a t t h e GABA c o n t e n t o f e x p l a n t s was e x p r e s s e d as n m o l / e x p l a n t . The hope was t h a t m e a s u r e m e n t o f GABA f r o m a p o o l o f e x -p l a n t s w o u l d o f f s e t t h e d i f f e r e n c e s i n s i z e b e t w e e n i n d i v i d u a l e x p l a n t s . H o w e v e r , i f e x p l a n t s f r o m a p a r t i c u l a r p o o l d i f f e r e d s i g n i f i c a n t l y i n s i z e f r o m t h a t o f a n o t h e r , t h i s w o u l d h a v e r e s u l t e d i n e r r o n e o u s q u a n t i t a t i o n s o f GABA v a l u e s . A n o t h e r p o s s i b l e s o u r c e o f e r r o r i n u s i n g GABA c o n t e n t s as i n d i c a t i v e o f t h e v i a b i l i t y o f G A B A e r g i c n e u r o n s i n e x p l a n t s i s t h a t t h e a b s o l u t e l e v e l o f . G A B A i s s u b j e c t t o a v a r i e t y o f i n f l u e n c e s . The a c t i v i t y o f t h e c a t a b o l i c enzyme GABA t r a n s a m i n a s e , as w e l l a s t h e f o r m a t i o n o f GABA f r o m p u t r e s c i n e ( S e i l e r 1 9 8 0 ) , a r e two f a c t o r s t h a t c o u l d a f f e c t t h e c o n t e n t o f GABA i n e x p l a n t s . V e r y r e c e n t l y ( E x p e r i m e n t 1 5 ) , . we d i s c o v e r e d a n o t h e r p o s s i b l e s o u r c e o f e r r o r i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f GABA c o n t e n t s o f e x p l a n t s . F o r t h e h a r v e s t i n g p r o c e d u r e , e a r l i e r e x p e r i m e n t s had i n v o l v e d two f i v e - m i n u t e s w a s h e s b e f o r e t h e e x p l a n t s w e r e p l a c e d i n p e r c h l o r a t e . I n E x p e r i m e n t 1 5 , two d i f f e r e n t d u r a t i o n s o f w a s h i n g p r o c e d u r e w e r e u s e d f o r e x p l a n t s e x p o s e d t o t h e same m e d i u m . One was o f t e n m i n u t e s t o t a l d u r a t i o n ( a s was t h e c a s e f o r E x p e r i -m e n t s 1 t o 1 4 ) , w h i l e t h e o t h e r c o n s i s t e d o f o n l y a q u i c k r i n s e , s u c h t h a t t h e t i m e e l a p s e d b e t w e e n s c r a p i n g t h e e x p l a n t s o f f t h e c o v e r s l i p t o when t h e y w e r e p l a c e d i n t o p e r c h l o r a t e was l e s s t h a n a m i n u t e . I t was f o u n d t h a t t h e r e was an i n c r e a s e i n GABA c o n t e n t o f b e t w e e n 1 . 5 t o 3 f o l d ( n = 2) i n e x p l a n t s t h a t had u n d e r g o n e t h e t e n m i n u t e s w a s h i n g p r o c e s s , when c o m p a r e d t o t h o s e e x p l a n t s t h a t had b e e n r i n s e d q u i c k l y . T h i s r e s e m b l e s t h e s i t u a -t i o n f o r p o s t m o r t e m b r a i n s , w h e r e GABA c o n t e n t r i s e s r a p i d l y w i t h i n c r e a s i n g d e a t h - t o - f r e e z i n g i n t e r v a l s , r e a c h i n g a s t a b l e maximum 2 h a f t e r d e a t h ( P e r r y e t a l . 1 9 8 1 b ) . T h u s , one o f t h e c o n t r i b u t i n g f a c t o r s t o t h e v a r i -a b i l i t y i n GABA c o n t e n t s o f e x p l a n t s c o u l d w e l l h a v e b e e n d i f f e r e n c e s i n t h e d u r a t i o n o f t h e w a s h i n g p r o c e s s o f e x p l a n t s . - 115 -The r a n d o m v a r i a b i l i t y i n GABA c o n t e n t o f d i f f e r e n t p o o l s o f c o n t r o l e x p l a n t s p r e c l u d e d a n y m e a n i n g f u l c o m p a r i s o n s o f GABA c o n t e n t s b e t w e e n e x -p l a n t s e x p o s e d t o HC o r c o n t r o l s e r u m . F o r t h i s r e a s o n , t h e r e s u l t s and d i s c u s s i o n t o f o l l o w w i l l c o n s i s t o n l y o f t h e GAD a c t i v i t y o f e x p l a n t s . F i g u r e 2 i n d i c a t e s t h e GAD a c t i v i t i e s o f s t r i a t a l e x p l a n t s e x p o s e d t o 3 0 % w h o l e s e r a f r o m HC p a t i e n t s , when c o m p a r e d a n d e x p r e s s e d a s % o f GAD a c t i v i t i e s o f e x p l a n t s e x p o s e d t o t h e a p p r o p r i a t e c o n t r o l s e r a . The r e s u l t s show t h a t 3 0 % HC s e r u m p r o d u c e d a r e d u c t i o n i n GAD a c t i v i t y a f t e r 1 o r 3 w e e k s o f e x p o s u r e i n 10 o f 11 e x p e r i m e n t s . One i n t e r p r e t a t i o n o f t h e s e r e s u l t s i s t h a t s e r u m f r o m HC p a t i e n t s c o n t a i n s a s u b s t a n c e ( s ) t h a t i m p a i r s t h e v i a b i l i t y o f c u l t u r e d s t r i a t a l G A B A e r g i c n e u r o n s o f r a t s ( a s e c o n d p o s -s i b l e i n t e r p r e t a t i o n i s d i s c u s s e d b e l o w ) . T h e GAD r e s u l t s o b t a i n e d i n E x p e r i m e n t 12 ( a j u v e n i l e - o n s e t p a t i e n t ) w e r e n o t c o n s i s t e n t w i t h t h o s e o f t h e o t h e r 10 e x p e r i m e n t s . The r e a s o n i s n o t i m m e d i a t e l y a p p a r e n t and i s u n l i k e l y t o be due t o t h e p a t i e n t ' s h a v i n g a j u v e n i l e o n s e t , s i n c e s e r u m f r o m a n o t h e r j u v e n i l e - o n s e t p a t i e n t ( E x p e r i m e n t 1 5 ) a p p e a r e d t o c o n t a i n t h e p u t a t i v e n e u r o t o x i n . I t may be t h a t t h e d i a g n o s i s o f HC was i n a c c u r a t e f o r t h e p a t i e n t i n E x p e r i m e n t 1 2 . 3 0 % s e r a f r o m p a t i e n t s L B , JT and GW w e r e t e s t e d t w i c e , e a c h t i m e a g a i n s t a d i f f e r e n t c o n t r o l ( s e e T a b l e 4 f o r t h e r e s p e c t i v e e x p e r i m e n t s ) . F i g u r e 2 shows t h a t GAD a c t i v i t i e s o f e x p l a n t s e x p o s e d t o t h e i r s e r a w e r e r e d u c e d c o m p a r e d t o c o n t r o l s a t a l l t i m e p e r i o d s ( o n e o r t h r e e w e e k s ) t e s t e d . T a b l e 6 shows t h e c o n s e q u e n c e o f t r e a t i n g e x p l a n t s w i t h 15% w h o l e s e r u m f r o m HC p a t i e n t s when c o m p a r e d w i t h a p p r o p r i a t e c o n t r o l s . In E x p e r i m e n t s 1 and 3 , GAD a c t i v i t y was i n i t i a l l y i n c r e a s e d i n e x p l a n t s e x p o s e d t o HC s e r u m , b u t s u b s e q u e n t l y r e t u r n e d t o n o r m a l , o r was d e c r e a s e d r e l a t i v e t o c o n t r o l s . The r e s u l t s o f t h e s e two e a r l y e x p e r i m e n t s w e r e i n t e r e s t i n g , b e c a u s e t h e y w e r e r e m i n i s c e n t o f t h e ' e x c i t o t o x i c ' h y p o t h e s i s o f O l n e y ( s e e S e c t i o n I . i i ) . - 116 -F i g u r e 2 . GAD a c t i v i t i e s o f e x p l a n t s e x p o s e d t o 3 0 % w h o l e s e r u m f r o m HC p a t i e n t s f o r 1 and 3 w e e k s , e x p r e s s e d a s % o f t h e i r r e s p e c -t i v e c o n t r o l s . E a c h t r i a n g l e r e p r e s e n t s one c o m p a r i s o n . The number a b o v e e a c h t r i a n g l e r e f e r s t o t h e number o f t h e e x p e r i m e n t . T h e r e i s no 3 weeks e x p o s u r e f o r E x p e r i m e n t 1 4 . None o f t h e c o m p a r i s o n s i n t h i s s e c t i o n h a s b e e n a n a l y s e d f o r s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n c e , s i n c e t h e s a m p l i n g e r r o r f o r e a c h d e t e r m i n a t i o n o f GAD a c t i v i t y i s u n k n o w n . H o w e v e r , f r o m p r e v i o u s work u n r e l a t e d t o t h i s t h e s i s , d a t a e x i s t f o r t h e c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n o f t h e a n a l y t i c a l t e c h n i q u e u s e d . T h u s , t h e c o e f f i c i e n t o f v a r i a t i o n f o r GAD a n a l y s e s i s 4 . 3 % ( n = 1 7 ) . 200 150 12 - 117 % o f c o n t r o l s 12 N o r m a l c o n t r o l s 50 14 1 8 11 15 A 1 6 A 1 6 A 6 A 11 2 A 15 A 9 A 1 week 3 w e e k s Duration o f e x p o s u r e - 118 -I t was as t h o u g h i n i t i a l e x p o s u r e t o low c o n c e n t r a t i o n s o f t h e p u t a t i v e n e u r o t o x i n i n HC s e r u m s t i m u l a t e d GAD a c t i v i t y o f s t r i a t a l e x p l a n t s , w h i l e more p r o l o n g e d e x p o s u r e r e s u l t e d i n d e p r e s s e d G A B A e r g i c n e u r o n a l a c t i v i t y . F u r t h e r e x p e r i m e n t s w i t h 15% w h o l e s e r u m ( T a b l e 6 ) , a s w e l l as w i t h 15% s e r u m t h a t h a d been d e p r o t e i n i z e d ( T a b l e 7 ) , s i m i l a r l y s o m e t i m e s r e s u l t e d i n i n c r e a s e d GAD a c t i v i t y . H o w e v e r , v a l u e s t h a t w e r e u n c h a n g e d o r d e c r e a s e d f r o m c o n t r o l s w e r e a l s o e n c o u n t e r e d a f t e r one week o f i n c u b a t i o n . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e s e s e e m i n g l y r a n d o m r e s u l t s r e p r e s e n t e d a c o n c e n t r a t i o n e f f e c t , w i t h 15% s e r u m f r o m p a t i e n t s w i t h h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h e p u t a -t i v e n e u r o t o x i n s u p p r e s s i n g GAD a c t i v i t y o f e x p l a n t s , w h i l e s e r u m f r o m t h o s e p a t i e n t s w i t h l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f t h e d e t r i m e n t a l m a t e r i a l e i t h e r p r o -d u c e d no c h a n g e o r an i n i t i a l i n c r e a s e i n GAD a c t i v i t y o f e x p l a n t s . The e f f e c t s o f CSF f r o m HC p a t i e n t s , as 15% b y v o l u m e o f t h e m e d i u m , a r e shown i n T a b l e 8 . The CSF f r o m 3 o f 4 p a t i e n t s h a d no e f f e c t on t h e GAD a c t i v i t y o f e x p l a n t s . I t was n o t p o s s i b l e t o u s e 30 % b y v o l u m e o f CSF ( o r , f o r t h a t m a t t e r , o f 30% by v o l u m e o f d e p r o t e i n i z e d s e r u m ) i n t h e c u l t u r e m e d i u m , b e c a u s e t h i s e n t a i l e d t h e c o m p l e t e e x c l u s i o n o f s e r u m p r o t e i n s w h i c h a r e a p p a r e n t l y r e q u i r e d f o r t h e g r o w t h o f e x p l a n t s i n t i s s u e c u l t u r e . I f a n e u r o t o x i n i s p r e s e n t i n H C , t h e GAD r e s u l t s i n T a b l e 8 w o u l d s u g g e s t t h a t t h i s p u t a t i v e n e u r o t o x i n i s a b s e n t f r o m C S F , o r a l t e r n a t i v e l y , t h a t i t was p r e s e n t i n s u c h l o w c o n c e n t r a t i o n s i n 3 o f t h e 4 p a t i e n t s t h a t e x p o s u r e o f e x p l a n t s f o r a p e r i o d o f up t o 2 w e e k s was i n a d e q u a t e t o a f f e c t GAD a c t i v i t y . - 119 -T a b l e 6 . E f f e c t s o f 15% w h o l e s e r u m f r o m HC p a t i e n t s on GAD a c t i v i t y o f r a t s t r i a t a l e x p l a n t s E x p e r i m e n t HC p a t i e n t D u r a t i o n o f GAD number e x p o s u r e o f e x p l a n t s ( w e e k s ) 1 GW 1 2 t 5 3 JT 1 ' + 3 + 15 JS 1 + 3 n . d . 16 JT 1 + 3 + A d e c r e a s e i n GAD a c t i v i t y o f e x p l a n t s e x p o s e d t o HC s e r u m o f a t l e a s t 25 % f r o m t h a t o f c o n t r o l v a l u e s i s shown as+ , w h i l e an i n c r e a s e o f a t l e a s t 2 5 % i s i n d i c a t e d a s + . V a l u e s t h a t d i d n o t d i f f e r by more t h a n 2 5 % a r e shown a s = . N o n - d e t e r -m i n e d s a m p l e s a r e r e p r e s e n t e d b y n . d . T a b l e 7 . E f f e c t s o f 15 % d e p r o t e i n i z e d s e r u m f r o m HC p a t i e n t s on GAD a c t i v i t y o f r a t s t r i a t a l e x p l a n t s E x p e r i m e n t HC p a t i e n t D u r a t i o n o f GAD number e x p o s u r e o f e x p l a n t s ( w e e k s ) 8 DE 1 + 3 + 9 GW 1 + 3 + 11 JW 1 = 3 15 J S 1 3 -t-16 JT 1 + 3 4. R e f e r t o T a b l e 6 f o r l e g e n d . - 120 -T a b l e 8 . E f f e c t s . o f 15% CSF f r o m HC p a t i e n t s on GAD a c t i v i t y o f r a t s t r i a t a l e x p l a n t s E x p e r i m e n t number HC P a t i e n t , Age ( y e a r s ) D u r a t i o n o f symptoms . ( y e a r s ) D u r a t i o n o f GAD e x p o s u r e o f e x p l a n t s ( w e e k s ) 7 M, 49 6 1 + 10 X , 48 S t a g e I 2 ' 10 Y , 29 S t a g e I 2 = 13 Z , 34 S t a g e I I 2 R e f e r t o T a b l e 6 f o r t h e l e g e n d . I h a v e no i n f o r m a t i o n o f t h e d u r a t i o n o f symptoms o f p a t i e n t s X , Y and Z , e x c e p t f o r t h e i r s t a g e o f t h e d i s e a s e . P a t i e n t s M, Y a n d Z a r e f e m a l e s , w h i l e p a t i e n t X i s a m a l e . E x p e r i m e n t s 5 and 16 r e p r e s e n t o u r a t t e m p t s t o e x a m i n e f u r t h e r some c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e p u t a t i v e n e u r o t o x i n i n s e r u m f r o m HC p a t i e n t s . F o r o e x p e r i m e n t 5 , some o f t h e s e r u m c o l l e c t e d was d i a l y s e d a t 4 C f o r 4 8 h a g a i n s t a d i a l y s a t e medium o f 0 . 9 % N a C l , c o n t a i n i n g 5% ( v / v ) o f b o v i n e s e r u m a l b u m i n . F o u r c h a n g e s a t 12 h i n t e r v a l s o f t h e d i a l y s a t e medium w e r e m a d e . A n o t h e r p o r t i o n o f t h e o r i g i n a l s e r u m was p a s s e d t h r o u g h t h e f i l t e r u n i t d e s c r i b e d i n A p p e n d i x H . The f i l t r a t e was s t o r e d a t - 7 0 ° C p r i o r t o u s e . The p r o t e i n f r a c t i o n l e f t b e h i n d on t h e f i l t e r was r e c o n s t i t u t e d t o o r i g i n a l v o l u m e i n 0 . 9 % N a C l . The d i a l y s e d s e r u m , a s w e l l a s t h e f i l t r a t e and r e c o n -s t i t u t e d p r o t e i n f r a c t i o n s , w e r e a p p l i e d t o e x p l a n t s a t a 15% ( v / v ) c o n c e n -t r a t i o n i n t h e m e d i u m . I n E x p e r i m e n t 1 6 , t h e f i l t r a t e and r e c o n s t i t u t e d p r o t e i n f r a c t i o n s f r o m t h e s e r u m o f p a t i e n t J T w e r e a l s o t e s t e d a t 15% ( v / v ) c o n c e n t r a t i o n i n t h e medium ( d i a l y s e d s e r u m was n o t t e s t e d ) . F i g u r e 3 shows t h e r e s u l t s . W h o l e s e r u m , d i a l y s e d s e r u m , and t h e r e c o n -s t i t u t e d p r o t e i n f r a c t i o n w h i c h f a i l e d t o p a s s t h e f i l t e r , c o l l e c t e d f r o m HC p a t i e n t s , a l l r e d u c e d GAD a c t i v i t i e s o f e x p l a n t s , w h i l e HC s e r u m f i l t r a t e - 121 -had no e f f e c t . T h u s , i t w o u l d a p p e a r t h a t t h e p u t a t i v e n e u r o t o x i n p r e s e n t i n w h o l e s e r u m f r o m HC p a t i e n t s was a b s e n t i n t h e s e r u m f i l t r a t e . T h i s r e -s u l t i s i n a c c o r d w i t h t h a t o f t h e i n v i v o r a t e x p e r i m e n t s ( S e c t i o n I I I ) . I t s u g g e s t s t h a t i f a n e u r o t o x i n i s p r e s e n t i n HC s e r u m , i t i s e i t h e r a l a r g e m o l e c u l e o f o v e r 1 0 , 0 0 0 d a l t o n s , o r i t i s a s m a l l m o l e c u l e t h a t i s s o t i g h t l y b o u n d t o s e r u m p r o t e i n t h a t d i a l y s i s c a n n o t e a s i l y d i s l o d g e i t . A p o s s i b l e means o f d i f f e r e n t i a t i n g b e t w e e n t h e s e two a l t e r n a t i v e s . w o u l d be t o d e p r o t e i n i z e s e r u m by c h e m i c a l d e n a t u r a t i o n , a n d t o d e t e r m i n e w h e t h e r o r n o t t h e p u t a t i v e n e u r o t o x i n i s s t i l l p r e s e n t i n t h e d e p r o t e i n i z e d s u p e r n a t a n t f r o m HC p a t i e n t s . T h i s p r o c e d u r e s h o u l d r e m o v e m o s t l a r g e m o l e c u l e s , a n d a l s o f r e e p r o t e i n - b o u n d s m a l l m o l e c u l e s . I f GAD a c t i v i t y o f e x p l a n t s e x -p o s e d t o d e p r o t e i n i z e d s e r u m f r o m HC p a t i e n t s w e r e d e c r e a s e d c o m p a r e d t o t h a t o f c o n t r o l s , t h e p o s s i b i l i t y o f t h e p u t a t i v e n e u r o t o x i n b e i n g a l a r g e m o l e c u l e , o r a p r o t e i n t h a t was p e r c h l o r a t e - i n s o l u b l e , w o u l d be r e d u c e d . A s shown i n T a b l e 7 , t h e u s e o f d e p r o t e i n i z e d s e r u m a s 1 5 % b y v o l u m e o f t h e medium r e s u l t e d i n GAD a c t i v i t i e s t h a t w e r e e i t h e r i n c r e a s e d , d e c r e a s e d , o r u n c h a n g e d f r o m c o n t r o l s . I f t h e s e r e s u l t s w e r e due t o a c o n c e n t r a t i o n e f f e c t o f t h e p u t a t i v e n e u r o t o x i n , t h e n i t w o u l d a p p e a r u n l i k e l y t h a t t h e n e u r o t o x i n was a l a r g e m o l e c u l e , o r a p r o t e i n t h a t was p e r c h l o r a t e - i n s o l u b l e . - 122 " 120 T <u •-• <u B i - •— o s-<+- co o. •o X II LU I/) o c O-T-tn s_ -•-> cy c IT) TJ o Q.JZ X CO M— o O irt E cn S_ Co O •r- (/> > 3 •r- O 4 J -f o s-irj rO > a < o 5 1 0 0 V. +-> C o u £ 80 cu o fO T3 CO (/) (/I cu s_ a. X 0) LO •o c <0 LO 60 40 - -20 A • 6 3 S-cu l/l a> o JC X o <r> E 3 i _ 4) V) CU w> >^> E 3 i _ CU •(-> OJ •M O i . O . •a QJ t/1 C o u F i g u r e 3 . GAD a c t i v i t i e s o f e x p l a n t s e x p o s e d t o v a r i o u s f o r m s o f HC s e r u m f o r 1 w e e k , e x p r e s s e d as % o f t h e i r r e s p e c t i v e c o n t r o l s . C l o s e d t r i a n g l e s a r e v a l u e s f r o m E x p e r i m e n t 5 , w h i l e o p e n t r i a n g l e s a r e v a l u e s f r o m E x p e r i -ment 1 6 . D i a l y s e d s e r u m was n o t t e s t e d i n E x p e r i m e n t 1 6 . - 123 -F i n a l l y , two e x p e r i m e n t s (14 and 16) w e r e d e s i g n e d t o t e s t p o s s i b l e d o s e - r e s p o n s e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n HC s e r u m i n t h e m e d i u m , and GAD a c t i v i t y o f e x p l a n t s . F o r e x p e r i m e n t 1 4 , s e r u m f r o m an HC p a t i e n t o r c o n t r o l s u b j e c t was f i l t e r e d as d e s c r i b e d i n A p p e n d i x H. The p r o t e i n f r a c t i o n l e f t b e h i n d on t h e f i l t e r was r e c o n s t i t u t e d t o h a l f i t s o r i g i n a l v o l u m e w i t h w a t e r , and t h e n d e p r o t e i n i z e d a s m e n t i o n e d a b o v e w i t h p e r c h l o r i c a c i d . A f t e r c e n t r i -f u g a t i o n , t h e pH o f t h e s u p e r n a t a n t was b r o u g h t up t o 7 . 0 w i t h p o t a s s i u m b i c a r b o n a t e . A n o t h e r c e n t r i f u g a t i o n r e m o v e d t h e p o t a s s i u m p e r c h l o r a t e p r o -d u c e d . The s u p e r n a t a n t was t h e n l y o p h i l i z e d t o 1/12 t h e v o l u m e o f t h e o r i g i n a l s e r u m and r e c o n s t i t u t e d w i t h 0 . 9 3 » N a C l . R e c o n s t i t u t i o n was done i n s u c h a manner as t o a l l o w f i n a l c o n c e n t r a t i o n s ( v / v ) o f o r i g i n a l s e r u m i n t h e n u t r i e n t medium o f 1 0 , 2 0 , 3 0 , 5 0 , 8 0 and 1 2 0 % . E x p l a n t s w e r e e x p o s e d t o t h e s e m e d i a f o r 1 w e e k , a f t e r w h i c h t h e e x p l a n t s w e r e h a r v e s t e d . How-e v e r , a l l t h e s e t s o f e x p l a n t s t r e a t e d w i t h t h e s e s e r a f r o m e i t h e r t h e c o n -t r o l o r HC p a t i e n t h a d v e r y l o w GAD a c t i v i t y ( t h e y w e r e a l l a r o u n d 7 ± 1 p m o l / h / g p r o t e i n , c o m p a r e d t o a mean o f a b o u t 5 0 y m o l / h / g p r o t e i n i n c o n t r o l e x p . l a n t s o f o t h e r e x p e r i m e n t s ) . The e x t e n s i v e t r e a t m e n t o f t h e o r i g i n a l s e r u m had p r e s u m a b l y a l t e r e d i t s p r o p e r t i e s i n s u c h a manner t h a t i t was no l o n g e r c a p a b l e o f s u s t a i n i n g GAD a c t i v i t y o f e x p l a n t s . C o m p a r i s o n s b e t w e e n e x p l a n t s e x p o s e d t o HC a n d c o n t r o l s e r u m t r e a t e d i n t h i s way w e r e t h e r e f o r e n o t u s e f u l . I n E x p e r i m e n t 1 6 , i n s t e a d o f u s i n g s e r a t h a t had u n d e r g o n e a l t e r a t i o n , w h o l e s e r u m was added t o t h e medium as e i t h e r 7 . 5 % , 1 5 % , o r 3 0 % ( v / v ) c o n -c e n t r a t i o n s . I t was f o u n d t h a t t h e GAD a c t i v i t i e s o f e x p l a n t s e x p o s e d t o HC s e r u m w e r e e q u a l l y r e d u c e d ( o v e r 60%) a t one o r t h r e e w e e k s o f i n c u b a t i o n a t a l l t h r e e c o n c e n t r a t i o n s , when c o m p a r e d t o t h e c o r r e s p o n d i n g c o n t r o l s e r u m m e d i a . - 124 -I n s u m m a r y , t h e r e s u l t s o f t h e v a r i o u s e x p e r i m e n t s s u g g e s t t h e f o l l o w i n g . F i r s t l y , 3 0 % w h o l e s e r u m f r o m HC p a t i e n t s a p p e a r s t o c o n t a i n a m a t e r i a l t h a t i s d e t r i m e n t a l t o G A B A e r g i c n e u r o n s i n c u l t u r e d r a t s t r i a t a l e x p l a n t s . The p u t a t i v e n e u r o t o x i n may be e i t h e r a s m a l l m o l e c u l e t i g h t l y b o u n d t o p r o t e i n , o r , f a r - l e s s - l i k e l y , a m o l e c u l e l a r g e r t h a n 1 0 , 0 0 0 d a l t o n s w h i c h i s p e r c h l o r -a t e - s o l u b l e . A s b r i e f l y a l l u d e d t o a b o v e , t h e r e i s a n o t h e r p o s s i b l e i n t e r p r e t a t i o n o f o u r r e s u l t s , e s p e c i a l l y t h o s e o b t a i n e d w i t h 30% HC s e r u m . I n s t e a d o f a n e u r o t o x i n b e i n g p r e s e n t , i t i s p o s s i b l e t h a t an e s s e n t i a l g r o w t h f a c t o r f o r G A B A e r g i c n e u r o n s may b e a b s e n t f r o m HC s e r u m . As a r e s u l t , t h e v i a b i l i t y o f G A B A e r g i c n e u r o n s o f r a t s t r i a t a l e x p l a n t s m i g h t h a v e b e e n i m p a i r e d , r e -s u l t i n g i n r e d u c e d GAD a c t i v i t y when c o m p a r e d t o c o n t r o l s . A l t h o u g h a t t r a c -t i v e , t h i s a p p e a r s u n l i k e l y , s i n c e e x p e r i m e n t s w i t h 15 % HC s e r u m ( w h o l e o r d e p r o t e i n i z e d ) s o m e t i m e s p r o d u c e d i n c r e a s e s i n GAD a c t i v i t y o f H C - s e r u m e x -p o s e d e x p l a n t s . The l a c k o f a g r o w t h f a c t o r w o u l d c e r t a i n l y n o t h a v e a c c o u n t e d f o r s u c h i n c r e a s e s . F u r t h e r e x p e r i m e n t s on e x p l a n t s e x p o s e d t o HC s e r u m m i g h t l o g i c a l l y i n -c l u d e m o r p h o l o g i c a l s t u d i e s u s i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y o r G o l g i s t a i n i n g ( G r a v e l a n d e t a l . 1 9 8 5 ) t o i d e n t i f y a c t u a l n e u r o n a l d e t e r i o r a t i o n . T h e s e p r o c e d u r e s w e r e n o t a v a i l a b l e t o u s . E x p e r i m e n t s s h o u l d a l s o be p e r f o r m e d u s i n g s e r u m f r o m p a t i e n t s w i t h o t h e r n e u r o d e g e n e r a t i v e d i s o r d e r s ( f o r e x a m -p l e , A l z h e i m e r ' s ) t o e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e GAD r e d u c t i o n i n e x -p l a n t s e x p o s e d t o HC s e r u m was due t o a f a c t o r r e l e a s e d i n t o t h e b l o o d a f t e r n e u r o n s had u n d e r g o n e d e g e n e r a t i o n . H o w e v e r , t h e a b s e n c e o f t h e i n h i b i t o r s u b s t a n c e i n CSF o f HC p a t i e n t s p r o b a b l y a r g u e s a g a i n s t t h i s p o s s i b i l i t y . - 125 -V) CONCLUSIONS The r e s u l t s o b t a i n e d i n t h e i n v i v o a n d t i s s u e c u l t u r e e x p e r i m e n t s p r o -v i d e s u g g e s t i v e b u t n o t c o n c l u s i v e e v i d e n c e f o r t h e p r e s e n c e o f a n e u r o t o x i n i n t h e s e r u m o f HC p a t i e n t s . The u s e o f r a t s t r i a t a l t i s s u e s i n - v i t r o a p p e a r s t o be a u s e f u l t e c h n i q u e f o r d e s i g n i n g f u r t h e r e x p e r i m e n t s , p a r t i c u -l a r l y i f t h e r e c o m m e n d a t i o n s i n t h e l a s t p a r a g r a p h o f S e c t i o n IV c a n be i n -c o r p o r a t e d . - 126 -V I ) REFERENCES A r l e t t C F , M u r i e l W J , R a d i o s e n s i t i v i t y i n H u n t i n g t o n ' s c h o r e a c e l l s t r a i n s : A p o s s i b l e p r e - c l i n i c a l d i a g n o s i s , H e r e d i t y 4 2 : 2 7 6 , 1 9 7 9 . A r l e t t C F , S u r v i v a l a n d m u t a t i o n r a t e i n g a m m a - i r r a d i a t e d human c e l l s t r a i n s f r o m n o r m a l o r c a n c e r p r o n e i n d i v i d u a l s , P r o c . VI I n t . C o n g r e s s R a d . R e s . 5 9 6 - 6 0 2 , 1 9 7 9 . A r l e t t C F , P r e s y m p t o m a t i c d i a g n o s i s o f H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , L a n c e t i : 5 4 0 , 1 9 8 0 . A r o n i n N, C o o p e r P E , L o r e n z L J , B i r d ED, S a g a r S M , Leeman S E , M a r t i n J B , S o m a t o s t a t i n i s i n c r e a s e d i n t h e b a s a l g a n g l i a i n H u n t i n g t o n d i s e a s e , A n n . N e u r o l . 1 3 : 5 1 9 - 5 2 6 , 1 9 8 3 . B a r k l e y DS, H a r d i w i d j a j a S , Menkes J H , A b n o r m a l i t i e s i n g r o w t h o f s k i n f i b r o b l a s t s o f p a t i e n t s w i t h H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , A n n . N e u r o l . 1 : 4 2 6 -4 3 0 , 1 9 7 7 . B e u t l e r BA, N o r o n h a A B C , Poon MM, A r n a s o n BGW, The a b s e n c e o f u n i q u e k a i n i c a c i d - l i k e m o l e c u l e s i n u r i n e , s e r u m , and CSF f r o m H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e . • p a t i e n t s , J . N e u r o l . S c i . 5 1 : 3 5 5 - 3 6 0 , 1 9 8 1 . B e v e r s t o c k G C , P e a r s o n P L , E l e c t r o n s p i n r e s o n a n c e s t u d i e s o f e r y t h r o c y t e g h o s t c e l l s i n H u n t i n g t o n ' s c h o r e a , A c t a N e u r o l . S c a n d . 6 5 : 4 1 3 - 4 2 3 , 1 9 8 2 . B e v e r s t o c k G C , S i m o n s J W I M , S t u d y on t h e v a r i a t i o n i n X - r a y s e n s i t i v i t y o f human d i p l o i d s k i n f i b r o b l a s t s : N o r m a l r a d i o s e n s i t i v i t y o f c e l l s d e r i v e d f r o m p a t i e n t s w i t h H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , M u t . R e s . 9 6 : 7 5 - 8 7 , 1 9 8 2 . B e v e r s t o c k G C , S o m a t i c c e l l s t u d i e s i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , T h e s i s f o r D o c t o r o f M e d i c i n e , U n i v e r s i t y o f L e i d e n , The N e t h e r l a n d s , 1 9 8 5 . B i r d ED, M a c k a y A V P , R a y n e r C N , I v e r s e n L L , R e d u c e d g l u t a m i c - a c i d d e c a r b o x y -l a s e a c t i v i t y o f p o s t - m o r t e m b r a i n i n H u n t i n g t o n ' s c h o r e a , L a n c e t i : 1 0 9 0 -1 0 9 2 , 1 9 7 3 . B i r d ED, I v e r s e n L L , H u n t i n g t o n ' s c h o r e a : P o s t - m o r t e m m e a s u r e m e n t o f g l u t a m i c a c i d d e c a r b o x y l a s e , c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e and d o p a m i n e i n b a s a l g a n g l i a , B r a i n 9 7 : 4 5 7 - 4 7 2 , 1 9 7 4 . B i r d ED, C h e m i c a l p a t h o l o g y o f H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , A n n . R e v . P h a r m a c o l . T o x i c o l . 2 0 : 5 3 3 - 5 5 1 , 1 9 8 0 . B o r n s t e i n MB, R e c o n s t i t u t e d r a t - t a i l c o l l a g e n u s e d a s s u b s t r a t e f o r t i s s u e c u l t u r e s on c o v e r s l i p s i n maximow s l i d e s and r o l l e r t u b e s , L a b . I n v e s t . 7 : 1 3 4 - 1 3 7 , 1 9 5 8 . B r u y n GW, B a r o F , M y r i a n t h o p o u l o u s NC, A C e n t e n n i a l B i b l i o g r a p h y o f H u n t i n g -t o n ' s C h o r e a 1 8 7 2 - 1 9 7 2 , L e u v a n U n i . P r e s s , L e u v a n and M a r t i n u s N i j h o f f , Ihe H a g u e , i y / 4 . - 127 -B r u y n GW, B o t s GTAM, Oom R, H u n t i n g t o n ' s c h o r e a : C u r r e n t n e u r o p a t h o l o g i c a l s t a t u s , A d v . N e u r o l . 2 3 : 8 3 - 9 3 , 1 9 7 9 . B u t t e r f i e l d DA, O e s w e i n J Q , M a r k e s b e r y WR, E l e c t r o n s p i n r e s o n a n c e s t u d y o f membrane p r o t e i n a l t e r a t i o n s i n e r y t h r o c y t e s i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , N a t u r e 2 6 7 : 4 5 3 - 4 5 5 , 1 9 7 7 . B u t t e r f i e l d DA, M a r k e s b e r y WR, E r y t h r o c y t e membrane a l t e r a t i o n s i n H u n t i n g -t o n ' s d i s e a s e , A d v . N e u r o l . 2 3 : 3 9 7 - 4 0 8 , 1 9 7 9 . B y e r s R K , G i 1 l e s FH, Fung C , H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e i n c h i l d r e n : N e u r o p a t h o l -o g y s t u d y o f 4 c a s e s , N e u r o l . 2 3 : 5 6 1 - 5 6 9 , 1 9 7 3 . C a i n e ED, Hunt RD, W e i n g a r t n e r H , E b e r t MH, H u n t i n g t o n ' s d e m e n t i a : C l i n i c a l and n e u r o p s y c h o l o g i c a l f e a t u r e s , A r c h . G e n . P s y c h i a t . 3 5 : 3 7 7 - 3 8 4 , 1 9 7 8 . C a m p b e l l AMG, C o r n e r B , Norman RM, U r i c h H , A r i g i d f o r m o f Huntington's d i s e a s e , J . N e u r o l . N e u r o s u r g . P s y c h i a t . 2 4 : 7 1 - 7 7 , 1 9 6 1 . : C a m p o c h i a r o P , C o y l e J T , O n t o g e n e t i c d e v e l o p m e n t o f k a i n a t e n e u r o t o x i c i t y : C o r r e l a t e s w i t h g l u t a m a t e r g i c i n n e r v a t i o n , P r o c . N a t l . A c a d . S c i . (USA) 7 5 : 2 0 2 5 - 2 0 2 9 , 1 9 7 8 . C a s s i m a n J J , V e r l i n d e n J , V l i e t i n k R F , B e l l e m a n s J , v a n L e u v e n F , D e r o o v e r J , B a r o F , B e r g h e H , Q u a l i t a t i v e and q u a n t i t a t i v e s t u d y o f t h e g r o w t h and c e l l s u r f a c e p r o p e r t y o f H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e f i b r o b l a s t s and a g e - m a t c h e d c o n t r o l s : L a c k o f s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s , Human G e n e t . 5 3 : 7 5 - 8 6 , 1 9 7 9 . C l a r k AW, P a r h a d I M , F o l s t e i n S E , W h i t e h o u s e P J , H e d r e e n J C , P r i c e D L , C h a s e GA, The n u c l e u s b a s a l i s i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , N e u r o l . 3 3 : 1 2 6 2 - 1 2 6 7 , 1 9 8 3 . C o m i n g s DE, P e k k a l a A , S c h u h J R , Kuo P C , Chan S I , H u n t i n g t o n d i s e a s e a n d T o u r e t t e s y n d r o m e . I . E l e c t r o n s p i n r e s o n a n c e o f r e d b l o o d c e l l g h o s t s , Am J . Human G e n e t . 3 3 : 1 6 6 - 1 7 4 , 1 9 8 1 . C o m i n g s DE, The u p s and downs o f H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e r e s e a r c h , Am. J . Human G e n e t . 3 3 : 3 1 4 - 3 1 7 , 1 9 8 1 . C o y l e J T , S c h w a r c z R, L e s i o n o f s t r i a t a l n e u r o n e s w i t h k a i n i c a c i d p r o v i d e s a model f o r H u n t i n g t o n ' s c h o r e a , N a t u r e 2 6 3 : 2 4 4 - 2 4 6 , 1 9 7 6 . C o y l e J T , B i z i e r e K , C a m p o c h i a r o P , S c h w a r c z R, Z a c z e k R, K a i n i c a c i d -i n d u c e d l e s i o n o f t h e s t r i a t u m as an a n i m a l model f o r H u n t i n g t o n ' s d i s -e a s e , I n : GABA N e u r o t r a n s m i t t e r s , A l f r e d B e n z o n S y m p o s i u m , 4 1 9 - 4 3 1 , 1 9 7 8 a . C o y l e J T , B i z i e r e K , S c h w a r c z R, N e u r o t o x i c i t y o f e x c i t a t o r y a m i n o a c i d s i n t h e n e u r a l r e t i n a , I n : K a i n i c a c i d as a t o o l i n N e u r o b i o l o g y , M c G e e r E G , O l n e y JW, McGeer PL ( e d i t o r s ) , 1 7 7 - 1 8 8 , 1 9 7 8 b . C o y l e J T , L o n d o n ED, B i z i e r e K , Z a c z e k R, K a i n i c a c i d n e u r o t o x i c i t y : I n s i g h t s i n t o t h e p a t h o p h y s i o l o g y o f H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , A d v . N e u r o l . 2 3 : 5 9 3 - 6 0 8 , 1 9 7 9 . - 128 -C o y l e J T , N e u r o t o x i c a c t i o n o f k a i n i c a c i d , J. N e u r o c h e m . 4 1 : 1 - 1 1 , 1 9 8 3 . C r o s s A , R o s s o r M, Dopamine D - l and D-2 r e c e p t o r s i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , E u r . J . P h a r m a c o l . 8 8 : 2 2 3 - 2 2 9 , 1 9 8 3 . Emson P C , A r r e g u i . A , C l e m e n t - J o n e s V , S a n d b e r g B E 8 , R o s s o r M, R e g i o n a l d i s -t r i b u t i o n o f m e t h i o n i n e - e n k e p h a l i n and s u b s t a n c e P - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y i n n o r m a l human b r a i n and i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , B r a i n R e s . 1 9 9 : 1 4 7 -1 6 0 , 1 9 8 0 . E v a n s H J , V i j a y a l a x m i , Newton MS, The r e s p o n s e o f c e l l s f r o m p a t i e n t s w i t h H u n t i n g t o n ' s c h o r e a t o m u t a g e n i n d u c e d c h r o m o s o m e d a m a g e , A n n . Human G e n e t . 4 6 : 1 7 7 - 1 8 5 , 1 9 8 2 . F o s t e r A C , W h e t s e l l WO J r . , B i r d ED, S c h w a r c z R, Q u i n o l i n i c a c i d p h o s p h o -r i b o s y l t r a n s f e r a s e i n human and r a t b r a i n : A c t i v i t y i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e and i n q u i n o l i n a t e - l e s i o n e d r a t s t r i a t u m , B r a i n R e s . 3 3 6 : 2 0 7 - 2 1 4 , 1 9 8 5 . Fonnum F , A r a p i d r a d i o c h e m i c a l m e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e , J . N e u r o c h e m . 2 4 : 4 0 7 - 4 0 9 , 1 9 7 5 . Fung LWM, O s t r o w s k i . MS, S p i n l a b e l e l e c t r o n p a r a m a g n e t i c r e s o n a n c e (EPR) s t u d i e s o f H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e e r y t h r o c y t e m e m b r a n e , Am. J . Human G e n e t . 3 4 : 4 6 9 - 4 8 0 , 1 9 8 2 . G o e t z I , R o b e r t s E , C o m i n g s DE, F i b r o b l a s t s i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , New E n g l . J . M e d . 2 9 3 : 1 2 2 5 - 1 2 2 7 , 1 9 7 5 . G o e t z I , R o b e r t s E , W a r r e n I , Commings D E , G r o w t h o f H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e f i b r o b l a s t s d u r i n g t h e i r i n v i t r o l i f e s p a n , A d v . N e u r o l . 2 3 : 3 5 1 - 3 5 9 , 1 9 7 9 . G o e t z I E , R o b e r t s E, W a r r e n J , S k i n f i b r o b l a s t s i n H u n t i n g t o n d i s e a s e , Am. J . Human G e n e t . 3 3 : 1 8 7 - 1 9 6 , 1 9 8 1 . G r a v e l a n d GA, W i l l i a m s R S , D i F i g l i a M, E v i d e n c e f o r d e g e n e r a t i v e and r e g e n e r -a t i v e c h a n g e s i n n e o s t r i a t a l s p i n y n e u r o n s i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , S c i e n c e 2 2 7 : 7 7 0 - 7 7 3 , 1 9 8 5 . G r a y P N , Dana S L , GABA s y n t h e s i s b y c u l t u r e d f i b r o b l a s t s o b t a i n e d f r o m p e r s o n s w i t h H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , J . N e u r o c h e m . 3 3 : 9 8 5 - 9 9 2 , 1 9 7 9 . G u s e l l a J F , W e x l e r N S , C o n n e a l l y P M , N a y l o r S L , A n d e r s o n MA, T a n z i R E , W a t k i n s P C , O t t i n a K , W a l l a c e MR, S a k a g u c h i A Y , Y o u n g A B , S h o u l s o n I , Bon i l i a E , M a r t i n J B , A p o l y m o r p h i c DNA m a r k e r g e n e t i c a l l y l i n k e d t o H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , N a t u r e 3 0 6 : 2 3 4 - 2 3 8 , 1 9 8 3 . J o h n s t o n GAR, K e n n e d y SME, T w i t c h i n B , A c t i o n o f t h e n e u r o t o x i n k a i n i c a c i d on h i g h a f f i n i t y u p t a k e o f L - g l u t a m i c a c i d i n r a t b r a i n s l i c e s , J . N e u r o -c h e m . 3 2 : 1 2 1 - 1 2 7 , 1 9 7 9 . K a n a z a w a I , B i r d E , O ' C o n n e l l R, P o w e l l D, E v i d e n c e f o r a d e c r e a s e i n s u b -s t a n c e P c o n t e n t o f s u b s t a n t i a n i g r a i n H u n t i n g t o n ' s c h o r e a , B r a i n R e s . 1 2 0 : 3 8 7 - 3 9 2 , 1 9 7 7 . - 129 -K i r k D, P a r r i n g t o n J M , C o r n e y G , B o l t JMW, A n a m o l o u s c e l l u l a r p r o l i f e r a t i o n i n v i t r o a s s o c i a t e d w i t h H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , Human G e n e t . 3 6 : 1 4 3 - 1 5 4 , wrr.— L a k o w i c z J R , S h e p p a r d J R , F l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p i c s t u d i e s o f H u n t i n g t o n f i b r o b l a s t m e m b r a n e s , Am. J . Human G e n e t . 3 3 : 1 5 5 - 1 6 5 , 1 9 8 1 . L a n g e HW, Q u a n t i t a t i v e c h a n g e s o f t e l e n c e p h a l o n , d i e n c e p h a l o n , and m e s e n -c e p h a l o n i n H u n t i n g t o n ' s c h o r e a , p o s t e n c e p h a l i t i c and i d i o p a t h i c p a r k i n -s o n i s m , V e r h . A n a t . G e s . 7 5 : 9 2 3 - 9 2 5 , 1 9 8 1 . L e o n a r d i A , de M a r t i n i I S , P e r d e l . l t F , M a n c a r d i G L , S a l v a r i n i s , B u g i a n i 0 , S k i n f i b r o b l a s t s i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , Mew E n g l . J . M e d . 2 9 8 ; 6 3 2 , 1 9 7 8 . Mangano RM, S c h w a r c z R, C h r o n i c i n f u s i o n o f e n d o g e n o u s e x c i t a t o r y a m i n o a c i d s i n t o r a t s t r i a t u m and h i p p o c a m p u s , B r a i n R e s . B u l l . 1 0 : 4 7 - 5 1 , 1 9 8 3 . M a r t i n J B , H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e : New a p p r o a c h e s t o an o l d p r o b l e m , N e u r o l . 3 4 : 1 0 5 9 - 1 0 7 2 , 1 9 8 4 . McBean G J , R o b e r t s P J , C h r o n i c i n f u s i o n s o f L - g l u t a m a t e c a u s e s n e u r o t o x i c i t y i n r a t s t r i a t u m , B r a i n R e s . 2 9 0 : 3 7 2 - 3 7 5 , 1 9 8 4 . McBean G J , R o b e r t s . P J , N e u r o t o x i c i t y o f L - g l u t a m a t e a n d D L - t h r e o - 3 - h y d r o x y -a s p a r t a t e i n t h e r a t s t r i a t u m , J . N e u r o c h e m . 4 4 : 2 4 7 - 2 5 4 , 1 9 8 5 . M c G e e r E G , McGeer P L , D u p l i c a t i o n o f b i o c h e m i c a l c h a n g e s o f H u n t i n g t o n ' s c h o r e a b y i n t r a s t r i a t a l i n j e c t i o n s o f g l u t a m i c and k a i n i c a c i d s , N a t u r e 2 6 3 : 5 1 7 - 5 1 9 , 1 9 7 6 . M c G e e r E G , McGeer P L , . S i n g h K , K a i n a t e - i n d u c e d d e g e n e r a t i o n o f n e o s t r i a t a l n e u r o n s : D e p e n d e n c y upon c o r t i c o s t r i a t a l t r a c t , B r a i n R e s . 1 3 9 : 3 8 1 - 3 8 3 , 1 9 7 8 . M c G e e r E G , McGeer P L , H a t t o r i T , V i n c e n t SR, K a i n i c a c i d n e u r o t o x i c i t y a n d . H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , A d v . N e u r o l . 2 3 : 5 7 7 - 5 9 1 , 1 9 7 9 . M c L e a n DR, F a i l u r e o f i s o n i a z i d t h e r a p y i n H u n t i n g t o n d i s e a s e , N e u r o l . 3 2 : 1 1 8 9 - 1 1 9 1 , 1 9 8 2 . Melamed E , H e f t i F , B i r d ED, H u n t i n g t o n c h o r e a i s n o t a s s o c i a t e d w i t h h y p e r -a c t i v i t y o f n i g r o s t r i a t a l d o p a m i n e r g i c n e u r o n s : S t u d i e s i n p o s t m o r t e m t i s s u e s and i n r a t s w i t h k a i n i c a c i d l e s i o n s , N e u r o l . 3 2 : 6 4 0 - 6 4 4 , 1 9 8 2 . M o r o n i F , L o m b a r d i G , M o n e t i G , A l d i n o C , The e x c i t o t o x i n q u i n o l i n i c a c i d i s p r e s e n t i n t h e b r a i n o f s e v e r a l mammals and i t s c o r t i c a l c o n t e n t i n c r e a s e s d u r i n g t h e a g i n g p r o c e s s , N e u r o s c i . L e t t . 4 7 : 5 1 - 5 5 , 1 9 8 4 . Menkes J H , S t e i n N , F i b r o b l a s t c u l t u r e s i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , New E n g l . J . M e d . 2 8 8 : 8 5 6 - 8 5 7 , 1 9 7 3 . M y e r s R H , Goldman D, B i r d ED, Sax D S , M e r r i l C R , S c h o e n f e l d M , W o l f P A , M a t e r n a l t r a n s m i s s i o n i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , L a n c e t i : 2 0 8 - 2 1 0 , 1 9 8 3 . - 130 -N a d l e r J V , K a i n i c a c i d : N e u r o p h y s i o l o g i c a l and n e u r o t o x i c a c t i o n s , L i f e S c i . 2 4 : 2 8 9 - 2 9 9 , 1 9 7 9 . N o r o n h a A B C , Roos R P , A n t e l J P , A r n a s o n BGW, C o n c a n a v a l i n A i n d u c e d l y m p h o -c y t e c a p p i n g i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , A d v . N e u r o l . 2 3 : 4 1 9 - 4 2 8 , 1 9 7 9 . O l n e y JW, G l u t a m a t e - i n d u c e d n e u r o n a l n e c r o s i s i n t h e i n f a n t mouse h y p o -t h a l a m u s . An e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d y , J . N e u r o p a t h . E x p . N e u r o l . 3 0 : 7 5 - 9 0 , 1 9 7 1 . O l n e y JW, Rhee V , Ho OL, K a i n i c a c i d : A p o w e r f u l n e u r o t o x i c a n a l o g u e o f g l u t a m a t e , B r a i n R e s . 7 7 : 5 0 7 - 5 1 2 , 1 9 7 4 . O l n e y JW, de G u b a r e f f T, G l u t a m a t e n e u r o t o x i c i t y a n d H u n t i n g t o n ' s c h o r e a , N a t u r e 2 7 1 : 5 5 7 - 5 5 9 , 1 9 7 8 . O l n e y JW, E x c i t o t o x i c a m i n o a c i d s and H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , A d v . N e u r o l . 2 3 : 6 0 9 - 6 2 4 , 1 9 7 9 . P a t e r s o n MC, A n d e r s o n A K , S m i t h B P , S m i t h P J , E n h a n c e d r a d i o s e n s i t i s a t i o n o f c u l t u r e d f i b r o b l a s t s f r o m a t a x i a t e l a n g i e c t a s i a h e t e r o z y g o t e s m a n i f e s t e d by d e f e c t i v e c o l o n y f o r m i n g a b i l i t y a n d r e d u c e d DNA r e p a i r r e p l i c a t i o n a f t e r h y p o x i c g a m m a - i r r a d i a t i o n , C a n c e r R e s . 3 9 : 3 7 2 5 - 3 7 2 4 , 1 9 7 9 . P e r k i n s MN, S t o n e TW, Q u i n o l i n i c a c i d : R e g i o n a l v a r i a t i o n s i n n e u r o n a l s e n s i t i v i t y , B r a i n R e s . 2 5 9 : 1 7 2 - 1 7 6 , 1 9 8 3 . P e r r y T L , Hansen S , K l o s t e r M, H u n t i n g t o n ' s c h o r e a : D e f i c i e n c y o f y - a m i n o -b u t y r i c a c i d i n b r a i n , New E n g l . J . M e d . 2 8 8 : 3 3 7 - 3 4 2 , 1 9 7 3 . P e r r y T L , W r i g h t J M , H a n s e n S , M a c L e o d P M , I s o n i a z i d t h e r a p y o f H u n t i n g t o n d i s e a s e , N e u r o l . 2 9 : 3 7 0 - 3 7 5 , 1 9 7 9 a . P e r r y T L , K i s h S J , H a n s e n S , y - v i n y l GABA: E f f e c t s o f c h r o n i c a d m i n i s t r a t i o n on t h e m e t a b o l i s m o f GABA and o t h e r a m i n o compounds i n r a t b r a i n , J . N e u r o c h e m . 3 2 : 1 6 4 1 - 1 6 4 5 , 1 9 7 9 b . P e r r y T L , W r i g h t J M , H a n s e n S , A l l a n BM, B a i r d P A , M a c L e o d P M , F a i l u r e o f a m i n o o x y a c e t i c a c i d t h e r a p y i n H u n t i n g t o n d i s e a s e , N e u r o l . 3 0 : 7 7 2 - 7 7 5 , 1 9 8 0 . P e r r y T L , K i s h S J , H a n s e n S , W r i g h t J M , W a l l R A , Dunn WL, B e l l w a r d GD, E l e v a -t i o n o f b r a i n GABA c o n t e n t b y c h r o n i c l o w - d o s a g e a d m i n i s t r a t i o n o f h y d r a -z i n e , a m e t a b o l i t e o f i s o n i a z i d , J . N e u r o c h e m . 3 7 : 3 2 - 3 9 , 1 9 8 1 a . P e r r y T L , Hansen S , Gandham S S , P o s t m o r t e m c h a n g e s o f a m i n o compounds i n human and r a t b r a i n , J . N e u r o c h e m . 3 6 : 4 0 6 - 4 1 2 , 1 9 3 1 b . P e r r y T L , C e r e b r a l a m i n o a c i d p o o l s , I n : Handbook o f N e u r o c h e m i s t r y , L a j t h a A ( e d i t o r ) , S e c o n d e d i t i o n , 1 : 1 5 1 - 1 8 0 , 1 9 8 2 a . P e r r y T L , W r i g h t J M , H a n s e n S , Thomas SMB, A l l a n B M , B a i r d P A , D i e w o l d P A , A d o u b l e - b l i n d c l i n i c a l t r i a l o f i s o n i a z i d i n H u n t i n g t o n d i s e a s e , N e u r o l . 3 2 : 3 5 4 - 3 5 8 , 1 9 8 2 b . - 131 -P e r r y T L , Hansen S , W a l l RA, G a u t h i e r S G , Human CSF GABA c o n c e n t r a t i o n s : R e v i s e d downward f o r c o n t r o l s , b u t n o t d e c r e a s e d i n H u n t i n g t o n ' s c h o r e a , J . N e u r o c h e m . 3 8 : 7 6 6 - 7 7 3 , 1 9 8 2 c . P e r r y T L , W a l l R A , H a n s e n S , B r a i n a m i n o compounds i n a H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e p a t i e n t on i s o n i a z i d t h e r a p y , N e u r o l . 3 5 : 7 5 5 - 7 5 8 , 1 9 8 5 . P e t t e g r e w JW, N i c h o l s J S , S t e w a r t RM, S t u d i e s o f t h e f l u o r e s c e n c e o f f i b r o -b l a s t s f r o m H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e : E v i d e n c e o f a membrane a b n o r m a l i t y , New E n g l . J . M e d . 3 0 0 : 6 7 8 , 1 9 7 9 . P e t t e g r e w JW, N i c h o l s J S , S t e w a r t RM, Membrane s t u d i e s i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e : S t e a d y s t a t e and t i m e d e p e n d e n t f l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y o f i n t a c t l y m p h o c y t e s , J . N e u r o c h e m . 3 6 : 1 9 6 6 - 1 9 7 6 , 1 9 8 1 . P o t a s h n e r S J , B a c l o f e n : E f f e c t s on a m i n o a c i d r e l e a s e , C a n . J . P h y s i o l . P h a r m a c o l . 5 6 : 1 5 0 - 1 5 4 , 1 9 7 8 . P o t a s h n e r S J , B a c l o f e n : E f f e c t s on a m i n o a c i d r e l e a s e and m e t a b o l i s m i n s l i c e s o f g u i n e a p i g c e r e b r a l c o r t e x , J . N e u r o c h e m . 3 2 : 1 0 3 - 1 0 9 , 1 9 7 9 . R o b e r t s E , K u r i y a m a K , B i o c h e m i c a l - p h y s i o l o g i c a l c o r r e l a t i o n s i n s t u d i e s o f t h e y - a m i n o b u t y r i c a c i d s y s t e m , B r a i n R e s . 8 : 1 - 3 5 , 1 9 6 8 . S a n b e r g P R , J o h n s t o n G A , G l u t a m a t e and H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , M e d . J . A u s t . 2 : 4 6 0 - 4 6 5 , 1 9 8 1 . S c h w a r c z R, S c h o l z D, C o y l e J T , S t r u c t u r e - a c t i v i t y r e l a t i o n s f o r t h e n e u r o -t o x i c i t y o f k a i n i c a c i d d e r i v a t i v e s and g l u t a m a t e a n a l o g u e s , N e u r o p h a r m a -c o l . 1 7 : 1 4 5 - 1 5 1 , 1 9 7 8 . S c h w a r c z R, W h e t s e l l WO J r . , Mangano RM, Q u i n o l i n i c a c i d : An e n d o g e n o u s m e t a b o l i t e t h a t p r o d u c e s a x o n - s p a r i n g l e s i o n s i n r a t b r a i n , S c i e n c e 2 1 9 : 3 1 6 - 3 1 8 , 1 9 8 3 a . S c h w a r c z R, K o h l e r C , D i f f e r e n t i a l v u l n e r a b i l i t y o f c e n t r a l n e u r o n s o f t h e r a t t o q u i n o l i n i c a c i d , N e u r o s c i . L e t t . 3 8 : 8 5 - 9 0 , 1 9 8 3 b . S c h w a r c z R, F o s t e r A C , F r e n c h E D , W h e t s e l l WO, K o h l e r C , E x c i t o t o x i c m o d e l s f o r n e u r o d e g e n e r a t i v e d i s o r d e r s , L i f e S c i . 3 5 : 1 9 - 3 2 , 1984 S c i g l i a n o G , G i o v a n n i n i P , G i r o t t i F , G r a s s i M P , C a r a c e n i T , S c h e c h t e r P J , G a m m a - v i n y l GABA t r e a t m e n t o f H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , N e u r o l . 3 4 : 9 4 - 9 6 , 1 9 8 4 . S e i l e r N , On t h e r o l e o f GABA i n v e r t e b r a t e p o l y a m i n e m e t a b o l i s m , P h y s i o l . Chem. P h y s i c s 1 2 : 4 1 1 - 4 2 9 , 1 9 8 0 . S h o u l s o n I , C h a s e T N , R o b e r t s E , van B a l g o o y J N A , H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e : T r e a t m e n t w i t h i m i d a z o l e - 4 - a c e t i c a c i d , New E n g l . J . M e d . 2 9 3 : 5 0 4 - 5 0 5 , 1 9 7 5 . S h o u l s o n I , G o l d b l a t t D, C h a r l t o n M, J o y n t R J , H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e : T r e a t m e n t w i t h m u s c i m o l , a G A B A - m i m e t i c d r u g , A n n . N e u r o l . 4 : 2 7 9 - 2 8 4 , 1 9 7 8 . - 132 -S h o u l s o n I , H u n t i n g t o n d i s e a s e : F u n c t i o n a l c a p a c i t i e s i n p a t i e n t s t r e a t e d w i t h n e u r o l e p t i c a n d a n t i d e p r e s s a n t d r u g s , N e u r o l . 3 1 : 1 3 3 3 - 1 3 3 5 , 1 9 8 1 . S h o u l s o n I , H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e : A n t i - n e u r o t o x i c t h e r a p e u t i c s t r a t e g i e s , I n : E x c i t o t o x i n s , F u x e K, R o b e r t s P , S c h w a r c z R ( e d i t o r s , 3 9 : 3 4 3 - 3 5 3 , 1 9 8 3 . S h o u l s o n I , H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e : A d e c a d e o f p r o g r e s s , N e u r o l . C l i n i c s 2 : 5 1 5 - 5 2 6 , 1 9 8 4 . S p o k e s EGS, Dopamine i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e : A s t u d y o f p o s t m o r t e m b r a i n t i s s u e , A d v . N e u r o l . 2 3 : 4 8 1 - 4 9 3 , 1 9 7 9 . S p o k e s EGS, The n e u r o c h e m i s t r y o f H u n t i n g t o n ' s c h o r e a , T r e n d s N e u r o s c i . 7 : 1 1 5 - 1 1 8 , 1 9 8 1 . S t o b e r T , S c h i m r i g k K , H o l z e r G , Z i e g l e r B , Q u a n t i t a t i v e e v a l u a t i o n o f f u n c t i o n a l c a p a c i t y d u r i n g i s o n i a z i d t h e r a p y i n H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , J . N e u r o l . 2 2 9 : 2 3 7 - 2 4 5 , 1 9 8 3 . S t o n e TW, C o n n i c k J H , Q u i n o l i n i c a c i d and o t h e r k y n u r e n i n e s i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m , N e u r o s c i . 1 5 : 5 9 7 - 6 1 7 , 1 9 8 5 . S u m b i l l a C , L a k o w i c z J R , F l u o r e s c e n c e s t u d i e s o f r e d b l o o d c e l l membranes f r o m i n d i v i d u a l s w i t h H u n t i n g t o n ' s d i s e a s e , J . N e u r o c h e m . 3 8 : 1 6 9 9 - 1 7 0 8 , 1 9 8 2 . T a y l o r A M , H a r d e n DG, A r l e t t C F , H a r c o u r t S A , Lehmann A R , S t e v e n s S , B r i d g e s BA, A t a x i a t e l a n g i e c t a s i a : A human m u t a t i o n w i t h a b n o r m a l r a d i a t i o n s e n s i t i v i t y , N a t u r e 2 5 8 : 4 2 7 - 4 2 9 , 1 9 7 5 . U r q u h a r t N , P e r r y T L , H a n s e n S , K e n n e d y J , GABA c o n t e n t and g l u t a m i c a c i d d e c a r b o x y l a s e a c t i v i t y i n b r a i n o f H u n t i n g t o n ' s c h o r e a p a t i e n t s and c o n -t r o l s u b j e c t s , J . N e u r o c h e m . 2 4 : 1 0 7 1 - 1 0 7 5 , 1 9 7 5 . Went L N , Der V I i s MV, B r u y n GW, P a r e n t a l t r a n s m i s s i o n i n H u n t i n g t o n ' s d i s -e a s e , L a n c e t i : 1 1 0 0 - 1 1 0 2 , 1 9 8 4 . W o l f e n s b e r g e r M, A m s l e r U , C u e n o d M, F o s t e r A C , W h e t s e l l WO J r . , S c h w a r c z R, I d e n t i f i c a t i o n o f q u i n o l i n i c a c i d i n r a t and human b r a i n t i s s u e , N e u r o -s c i . L e t t . 4 1 : 2 4 7 - 2 5 2 , 1 9 8 3 . Young A B , S h o u l s o n I , P e n n e y J B , S t a r o s t a - R u b i n s t e i n S , Gomez F , T r a v e r s H , R a m o s - A r r o y o MA, S n o d g r a s s R, B o n i l l a E , M o r e n o H , W e x l e r N S , H u n t i n g -t o n ' s d i s e a s e i n V e n e z u e l a : N e u r o l o g i c f e a t u r e s and f u n c t i o n a l d e c l i n e , N e u r o l . 3 6 : 2 4 4 - 2 4 9 , 1 9 8 6 . - 133 -CHAPTER 3 : D I A L Y S I S ENCEPHALOPATHY  ABSTRACT The a b s e n c e o f s p e c i f i c n e u r o p a t h o l o g i c a l a b n o r m a l i t i e s i n d i a l y s i s e n -c e p h a l o p a t h y (DE) s u g g e s t s t h e p o s s i b i l i t y t h a t n e u r o c h e m i c a l c h a n g e s , u n a s -s o c i a t e d w i t h t h e l o s s o f n e u r o n a l p o p u l a t i o n s , m i g h t be p r e s e n t i n t h e b r a i n o f p a t i e n t s who d i e w i t h t h e d i s e a s e . We l o o k e d f o r n e u r o c h e m i c a l a b n o r m a l i t i e s i n t h e a u t o p s i e d b r a i n s o f 10 p a t i e n t s who d i e d w i t h symptoms o f DE. Mean GABA c o n t e n t s w e r e s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d i n f r o n t a l a n d o c c i p i -t a l c o r t e x , c e r e b e l l a r c o r t e x , d e n t a t e n u c l e u s , c a u d a t e n u c l e u s , and m e d i a l -d o r s a l t h a l a m u s o f DE p a t i e n t s . C h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e a c t i v i t y was d e -c r e a s e d b y 2 5 - 3 5 % i n 3 c o r t i c a l r e g i o n s . P y r i d o x a l p h o s p h a t e c o n t e n t s w e r e s u b s t a n t i a l l y r e d u c e d i n b r a i n s o f t h e DE p a t i e n t s , b u t m e t a b o l i t e s o f n o r -a d r e n a l i n e , d o p a m i n e and s e r o t o n i n w e r e p r e s e n t i n n o r m a l a m o u n t s . A l u m i n u m l e v e l s w e r e a b n o r m a l l y h i g h i n t h e f r o n t a l c o r t i c a l g r a y m a t t e r o f p a t i e n t s w i t h DE. I n an e f f o r t t o c l a r i f y t h e c a u s a t i v e r o l e o f a l u m i n u m i n DE, we a t -t e m p t e d t o p r o d u c e a model o f t h e d i s e a s e i n r a t s , u s i n g A l f O H ) ^ t o e x p l o r e t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h i s m e t a l m i g h t p r o d u c e t h e same n e u r o c h e m i c a l c h a n g e s i n r a t s as t h o s e o b s e r v e d i n human p a t i e n t s . H o w e v e r , we f a i l e d t o p r o d u c e e l e v a t i o n o f a l u m i n u m i n t h e b r a i n s o f r a t s t r e a t e d w i t h A U O H ) ^ , e v e n t h o u g h we e m p l o y e d h e m i n e p h r e c t o m y , 5 / 6 n e p h r e c t o m y , a n d / o r c h r o n i c l i t h i u m a d m i n i s t r a t i o n i n a t t e m p t s t o d e c r e a s e t h e r e n a l e x c r e t i o n . o f a l u m i n u m . T h u s , t h e q u e s t i o n as t o w h e t h e r o r n o t a l u m i n u m i s t h e c a u s a t i v e f a c t o r i n DE was n o t c l a r i f i e d b y o u r e x p e r i m e n t s . - 134 -I ) INTRODUCTION I . i ) P e r s p e c t i v e s I n 1 9 7 2 , A l f r e y e t a l . d e s c r i b e d a d i s t i n c t c l i n i c a l s y n d r o m e o f a p r o -g r e s s i v e , f a t a l e n c e p h a l o p a t h y i n 5 c h r o n i c a l l y h e m o d i a l y s e d p a t i e n t s . T h i s s y n d r o m e , t e r m e d d i a l y s i s e n c e p h a l o p a t h y (DE) o r d i a l y s i s d e m e n t i a , h a s s i n c e been o b s e r v e d i n many r e n a l c e n t r e s t h r o u g h o u t t h e w o r l d w h e r e i t c o n -s t i t u t e s a s i g n i f i c a n t c a u s e o f d e a t h f o r c h r o n i c a l l y d i a l y s e d p a t i e n t s w i t h e n d - s t a g e r e n a l f a i l u r e ( P I a t t s e t a l . 1 9 7 3 ; M a h u r k a r e t a l . 1 9 7 3 ; F l e n d r i g e t a l . 1 9 7 6 a ; C h o k r o v e r t y e t a l . 1 9 7 6 ; S i d e m a n 1 9 8 2 ; P r i o r e t a l . 1 9 8 2 ) . The f i r s t n o t i c e a b l e symptom o f DE i s u s u a l l y a m i l d s p e e c h a b n o r m a l i t y c h a r a c t e r i z e d by. s t a m m e r i n g , h e s i s t a n c y , a n d a t t i m e s , s p e e c h a r r e s t . I n c o n j u n c t i o n w i t h t h e s p e e c h d e f e c t , e l e c t r o e n c e p h a l o g r a p h ^ (EEG) c h a n g e s o c c u r w h i c h i n c l u d e . p a r o x y s m a l s l o w w a v e s and s h a r p and s p i k e a c t i v i t y , e s p e c i a l l y p r o m i n e n t o v e r t h e f r o n t a l l o b e s ( A l f r e y 1 9 7 8 ; Hughes e t a l . 1 9 8 0 ) . I n i t i a l l y , t h e s e symptoms a r e i n t e r m i t t e n t a n d t y p i c a l l y more a p p a r -e n t d u r i n g o r i m m e d i a t e l y f o l l o w i n g d i a l y s i s ( A l f r e y e t a l . 1 9 7 2 ; F l e n d r i g e t a l . 1 9 7 6 a ; B u r k s e t a l . 1 9 7 6 ) . As t h e d i s e a s e p r o g r e s s e s , t h e s p e e c h d i s t u r b a n c e s become c o n t i n o u s and i n c r e a s i n g l y s e v e r e , m a n i f e s t i n g as a c o m -b i n a t i o n o f d y s a r t h r i a , d y s p r a x i a and d y s p h a s i a . T h e EEG a b n o r m a l i t i e s p e r -s i s t . A p r o g r e s s i v e d e m e n t i a d e v e l o p s , and p e r s o n a l i t y c h a n g e s s u c h a s p a r a n o i d t h i n k i n g , p s y c h o s e s , and d e l i r i u m a r e s e e n . I n a d d i t i o n , p a t i e n t s d i s p l a y s e i z u r e s , a s t e r i x i s , t w i t c h i n g , m o t o r a p r a x i a , and m y o c l o n i c j e r k s . D e a t h s o o n e n s u e s , o c c u r r i n g u s u a l l y a f e w m o n t h s a f t e r t h e o n s e t o f s y m p -t o m s ; a mean o f 6 . 3 m o n t h s was r e p o r t e d f o r 6 0 c a s e s ( C h u i e t a l . 1 9 8 0 ) . The i n c i d e n c e o f DE a p p e a r s t o be b e t w e e n 0 . 6 t o 0 . 7 5 % o f t h e c h r o n i c r e n a l f a i l u r e p o p u l a t i o n u n d e r g o i n g d i a l y s i s ( L a n g e t a l . 1 9 7 9 ) , and m i g h t be r e l a t e d t o t h e d u r a t i o n o f d i a l y s i s ( A l f r e y e t a l . 1 9 7 6 ; S c h r e e d e r e t - 135 -a l . 1 9 7 7 ; B e r s e t h e t a l . 1 9 7 8 ) . An a n a l y s i s o f 6 0 c a s e s r e v e a l e d t h a t t h e d u r a t i o n o f h e m o d i a l y s i s p r i o r t o t h e o n s e t o f symptoms r a n g e d f r o m 6 m o n t h s t o 7 . 5 y e a r s , w i t h a mean o f 2 . 5 y e a r s ( C h u i e t a l . 1 9 8 0 ) . A l t h o u g h u s u a l l y c o n f i n e d t o p a t i e n t s on l o n g - t e r m h e m o d i a l y s i s , DE h a s a l s o b e e n r e p o r t e d i n p a t i e n t s v e r y e a r l y i n t h e c o u r s e o f c h r o n i c h e m o -d i a l y s i s , as w e l l as i n p a t i e n t s on p e r i t o n e a l d i a l y s i s ( S i d e m a n e t a l . 1 9 8 0 ) . I n t h e more r e c e n t DE l i t e r a t u r e , t h e s y n d r o m e h a s a l s o , b e e n r e p o r t -ed i n p a t i e n t s w i t h r e n a l f a i l u r e who h a v e n e v e r b e e n h e m o d i a l y s e d , b u t t o whom l a r g e amounts o f o r a l a l u m i n u m h y d r o x i d e g e l s h a v e b e e n a d m i n i s t e r e d t o r e d u c e i n t e s t i n a l p h o s p h a t e a b s o r p t i o n ( E t h e r i d g e e t a l . 1 9 7 8 ; N a t h a n e_t a_h 1 9 8 0 ; G r i s w o l d e t a l . 1 9 8 3 ) . I n s p i t e o f t h e s e v e r i t y o f t h e c l i n i c a l f e a t u r e s , n e u r o p a t h o l o g i c a l s t u d i e s o f DE h a v e b e e n u n r e w a r d i n g . I n t h e i r o r i g i n a l p u b l i c a t i o n , A l f r e y e t a l ( 1 9 7 2 ) commented on t h e a b s e n c e o f n e u r o p a t h o l o g i c a l a b n o r m a l i t i e s i n t h e b r a i n s o f 4 p a t i e n t s . The s t u d y i n c l u d e d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c o b s e r v a -t i o n s . Of t h e 6 0 c a s e s s u r v e y e d b y C h u i e t a l . ( 1 9 8 0 ) , 32 had b e e n s u b j e c t e d t o a u t o p s y . D i f f u s e n e u r o n a l d e g e n e r a t i o n a n d / o r g l i o s i s was d e m o n s t r a t e d i n o n l y 4 c a s e s , b u t t h i s was c o n s i d e r e d n o n - s p e c i f i c f o r t h e d i s e a s e , s i n c e t h e y w e r e a l s o o b s e r v e d i n u r e m i c p a t i e n t s who h a d n e v e r b e e n h e m o d i a l y s e d , and who d i d n o t h a v e DE. S i m i l a r l y , t h e n e u r o n a l c h a n g e s ( e . g . c y t o p l a s m i c and n u c l e a r s h r i n k a g e ) and a s t r o c y t e p r o l i f e r a t i o n r e p o r t e d b y B u r k s e t a l . ( 1 9 7 6 ) w e r e a l s o c o n s i d e r e d n o n - s p e c i f i c c h a n g e s . To d a t e , h i s t o l o g i c a l s t u d i e s h a v e n o t d i s c e r n e d a n y d i s t i n c t i v e l e s i o n s , and h a v e n o t c l a r i f i e d t h e o r i g i n o f t h e c l i n i c a l f e a t u r e s o f DE. I n l i v i n g DE p a t i e n t s , c o m p u t e d a x i a l t o m o g r a p h y s c a n s h a v e b e e n d e s c r i b e d as n o r m a l ( P a r k i n s o n e t a l . 1 9 8 1 ) . R o u t i n e b l o o d a n d c e r e b r o s p i n a l f l u i d a n a l y s e s ( e . g . g l u c o s e , p r o t e i n and u r e a c o n t e n t s , c e l l c o u n t s , e t c . ) h a v e n o t y i e l d e d r e s u l t s t h a t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m t h o s e o f o t h e r c h r o n i c a l l y h e m o d i a l y s e d p a t i e n t s who d i d - 136 -n o t h a v e DE ( A l f r e y e t a l . 1 9 7 2 ; B a r r a t t e t a l . 1 9 7 5 ; A l f r e y 1 9 7 8 ) . B r a i n n e u r o c h e m i c a l s t u d i e s i n D E , o t h e r t h a n a l u m i n u m c o n t e n t s ( s e e S e c t i o n I . i i ) , h a v e b e e n l a c k i n g . A s i n g l e r e p o r t ( P e r r y e t a l . 1 9 7 7 ) f o u n d a c t i v i t i e s o f g l u t a m i c a c i d d e c a r b o x y l a s e and c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e , t h e s y n t h e t i c enzymes f o r y - a m i n o b u t y r i c a c i d (GABA) and a c e t y l c h o l i n e r e s p e c -t i v e l y , t o be l o w i n c e r e b r a l c o r t e x a n d c a u d a t e n u c l e u s o f 4 DE p a t i e n t s . H o w e v e r , t h e s e p a t i e n t s w e r e c o m a t o s e and had s l o w a n o x i c d e a t h s , w h i c h c a n d e c r e a s e t h e a c t i v i t y o f b o t h enzymes i n t h e b r a i n ( M c G e e r e t a l . 1 9 7 6 ) . The t r e a t m e n t o f DE i s g e n e r a l l y u n s a t i s f a c t o r y . E a r l y i n t h e c o u r s e o f t h e d i s e a s e , t h e s p e e c h d e f e c t c a n be r a p i d l y , a l b e i t t e m p o r a r i l y , i m p r o v e d b y i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f b e n z o d i a z e p i n e s ( N a d e l e t a l . 1 9 7 6 ; S w e e n e y e t a l . 1 9 8 5 ) . As t h e . d i s e a s e p r o g r e s s e s , a d m i n i s t r a t i o n o f d i m e r c a p r o l , p e n i c i l l a m i n e , d e x a m e t h a s o n e , l e v o d o p a , a n t i c o n v u l s a n t s , and v i t a m i n s , h a v e a l l f a i l e d t o a l t e r t h e c o u r s e o f t h e d i s e a s e ( E d i t o r i a l , B . M e d . J . 1 9 7 6 ) . M o r e r e c e n t l y , r e m i s s i o n o f symptoms h a s b e e n a c h i e v e d b y t h e i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f d e s f e r o x a m i n e ( A c k r i 11 e t a l . 1 9 8 0 ; P o g g l i t s c h e t - a l . 1 9 8 1 ) , a l t h o u g h n o t a l l p a t i e n t s b e n e f i t f r o m t h e u s e o f t h i s c h e l a t i n g a g e n t ( M i l n e e t a l . 1 9 8 2 ) . R e n a l t r a n s p l a n t a t i o n h a s b e e n r e p o r t e d t o a r r e s t t h e p r o g r e s s i o n o f s y m p t o m s , o r e v e n t o a f f o r d s u b s t a n t i a l o r c o m -p l e t e r e c o v e r y ( P a r k i n s o n e t a l . 1 9 8 1 ) . H o w e v e r , i n t e r v e n t i o n must o c c u r a t a v e r y e a r l y s t a g e o f t h e d i s o r d e r . DE a p p e a r s t o be e a s i e r t o p r e v e n t t h a n t o t r e a t . A number o f r e n a l c e n t r e s h a v e r e p o r t e d a l o w e r i n g o f t h e i n c i d e n c e o f DE when e f f o r t s w e r e made t o d e c r e a s e t h e c o n c e n t r a t i o n o f a l u m i n u m i n t h e d i a l y s a t e f l u i d ( F l e n d r i g e t a l . 1 9 7 6 a ; P l a t t s e t a l . 1 9 7 7 ; B e r k s e t h e t a l . 1 9 7 8 ; R o z a s e t a l . 1 9 7 8 ) . T h i s o b s e r v a t i o n , a s w e l l as o t h e r s ( s e e s e c t i o n I . i i ) , h a s l e d t o a l u m i n u m b e i n g i m p l i c a t e d as t h e c a u s a t i v e a g e n t o f DE. - 1 3 7 -I . i i ) E t i o l o g y o f DE : The p o s s i b l e r o l e o f a l u m i n u m E a r l i e r o b s e r v a t i o n s ( P a r s o n s e t a l _ . 1 9 7 1 ; C l a r k s o n e t a l _ . 1 9 7 2 ; T h u r s t o n e t a l . 1972) t h a t s e r u m a n d / o r bone c o n c e n t r a t i o n s o f a l u m i n u m ( A l ) w e r e i n c r e a s e d i n r e n a l p a t i e n t s r e c e i v i n g p h o s p h a t e - b i n d i n g A l g e l s o r a l l y , l e d A l f r e y e t a l . ( 1 9 7 6 ) t o e x a m i n e t h e A l c o n t e n t s i n t h e b r a i n s o f p a t i e n t s d y i n g w i t h DE. T h e y f o u n d t h a t t h e A l c o n t e n t o f g r a y m a t t e r o f DE p a t i e n t s was 4 t i m e s g r e a t e r t h a n t h a t o f n o n - d e m e n t e d d i a l y s e d p a t i e n t s , a n d 10 t i m e s t h a t o f n o r m a l c o n t r o l s . T h e s e a u t h o r s a l s o d e m o n s t r a t e d a c o r r e l a t i o n b e t w e e n d i a l y s i s d u r a t i o n and t h e A l c o n t e n t o f b r a i n g r a y m a t -t e r , m u s c l e and bone i n t h e DE p a t i e n t s . S i m i l a r f i n d i n g s o f A l a c c u m u l a -t i o n w e r e s o o n r e p o r t e d by o t h e r s ( F l e n d r i g e t a l . 1 9 7 6 b ; C a r t i e r e t - a l . 1 9 7 8 ; D e w b e r r y e t a l . 1 9 8 0 ) , l e a d i n g t o t h e s u g g e s t i o n t h a t A l i n t o x i c a t i o n m i g h t be t h e c a u s e o f DE. T h i s p o s s i b i l i t y was i m m e d i a t e l y s u p p o r t e d b y a p r e v i o u s r e p o r t o f an i n d i v i d u a l who had w o r k e d i n an A l powder f a c t o r y f o r more t h a n 13 y e a r s ( M c L a u g h l i n e t a l . 1 9 6 2 ) , l a t e r d e v e l o p i n g a r a p i d l y p r o -g r e s s i v e e n c e p h a l o p a t h y w i t h symptoms n o t u n l i k e t h o s e s i n c e r e p o r t e d f o r DE. A l i s t h e most a b u n d a n t m e t a l and t h e t h i r d m o s t common e l e m e n t . I t c o m p r i s e s a p p r o x i m a t e l y 8% o f t h e e a r t h ' s c r u s t (Boegman e t a l . 1 9 8 4 ) . D e s p i t e i t s p r e v a l e n c e , i t h a s n o t b e e n c o n s i d e r e d an e n v i r o n m e n t a l h a z a r d , p r i m a r i l y b e c a u s e m o s t o f t h e n a t u r a l l y o c c u r i n g A l compounds w e r e t h o u g h t t o be i n e r t . A l s o , t h e i n t e s t i n a l t r a c t h a s b e e n r e p o r t e d t o p r e s e n t a r a t h e r f o r m i d a b l e b a r r i e r t o i t s a b s o r p t i o n ( C a m p b e l l e t a l . 1 9 5 7 ; P o o l e et a l . 1 9 6 5 ) . I n a d d i t i o n , any e x c e s s A l i n t h e b l o o d a p p e a r s t o be p r o m p t l y e x c r e t e d b y t h e n o r m a l k i d n e y ( K a e h n y et- - a l . 1 9 7 7 a ) . H o w e v e r , i t i s now known t h a t t h e i n t e s t i n a l b a r r i e r i s b y no means i m p e r v i o u s t o t h e a b s o r p -t i o n o f A l ( K a e h n y e t a l . 1 9 7 7 a ; R e c k e r e t a l . 1 9 7 7 ) , and more s i g n i f i c a n t -l y , t h a t i n p a t i e n t s w i t h a l r e a d y c o m p r o m i s e d r e n a l f u n c t i o n who a r e o n h e m o d i a l y s i s , A l c a n e n t e r t h e c i r c u l a t i o n f r o m t h e d i a l y s a t e ( K a e h n y e t a l . - 138 -1 9 7 7 b ; K o v a l c h i k e t a l . 1 9 7 8 ; K i n g e t a l . 1 9 8 2 ) . I n d e e d , K a e h n y e t a l . ( 1 9 7 7 b ) h a v e m e a s u r e d t h e r a t e o f A l t r a n s f e r a c r o s s t h e d i a l y s i s m e m b r a n e , and h a v e e s t i m a t e d t h a t an a v e r a g e o f 6 mg o f A l i s t a k e n i n t o t h e b o d y p e r d i a l y s i s s e s s i o n . T h a t A l c a n t r a v e r s e t h e d i a l y s i s membrane h a s f u r n i s h e d s t r o n g s u p p o r t f o r t h e c a u s a t i v e r o l e o f A l i n DE. E p i d e m i o l o g i c a l s t u d i e s r e v e a l a m a r k -e d l y u n e v e n g e o g r a p h i c a l d i s t r i b u t i o n o f c a s e s o f DE t h a t a p p e a r s t o c o r r e l -a t e w i t h w a t e r A l c o n t e n t . I n t h o s e r e n a l c e n t r e s w i t h a h i g h i n c i d e n c e o f D E , p a t i e n t s h a v e b e e n f o u n d t o be e x p o s e d t o d i a l y s a t e c o n t a i n i n g a h i g h c o n c e n t r a t i o n o f A l , u s u a l l y i n e x c e s s o f 200 u g / L ( F l e n d r i g e t a l . 1 9 7 6 a ; B e r s e t h e t a l . 1 9 7 8 ; E l l i o t e t a l . 1 9 7 8 ) . A s u r v e y i n t h e U n i t e d K i n g d o m showed t h a t DE was a l m o s t unknown i n t h o s e r e n a l c e n t r e s w h e r e t h e A l c o n -c e n t r a t i o n o f t h e d i a l y s i s f l u i d was l e s s t h a n 5 0 u g / L , w h i l e t h e i n c i d e n c e i n c r e a s e d p r o g r e s s i v e l y w i t h h i g h e r w a t e r c o n c e n t r a t i o n o f t h e m e t a l ( P a r k -i n s o n e t a l . 1 9 8 1 ) . A f a s c i n a t i n g a r t i c l e b y F l e n d r i g e t a l . ( 1 9 7 6 a ) r e p o r t e d 6 p a t i e n t s d e v e l o p i n g DE i n an a r e a o f o r d i n a r i l y l o w w a t e r Al c o n t e n t . When t h e d i a l y s a t e was a n a l y s e d , A l c o n c e n t r a t i o n was f o u n d t o b e g r e a t l y e l e v a t e d . The s o u r c e o f c o n t a m i n a t i o n was t r a c e d t o t h e g r a d u a l d i s s o l u t i o n o f 2 A l a n o d e s w h i c h w e r e p a r t o f a c a t h o d i c p r o t e c t i o n s y s t e m a g a i n s t c o r r o s i o n i n t h e d i a l y s a t e h e a t i n g t a n k . A l i s commonly u s e d a s a f l o c c u l a t i n g a g e n t i n w a t e r p u r i f i c a t i o n p l a n t s and i s n o t r e l i a b l y r e m o v e d b y c o n v e n t i o n a l w a t e r s o f t e n i n g m e t h o d s ( P l a t t s e t a l . 1 9 7 7 ) . I n a number o f c e n t r e s w h e r e o u t b r e a k s o f DE h a v e o c c u r r e d , t h e i n c i d e n c e o f t h e s y n d r o m e h a s b e e n r e d u c e d o r e l i m i n a t e d when p r e c a u -t i o n s h a v e b e e n t a k e n t o r e s t r i c t o r a l A l i n t a k e and t o r e m o v e t r a c e m e t a l s f r o m t h e d i a l y s i s f l u i d b y means o f d e i o n i s e r s o r ' r e v e r s e o s m o s i s ' ( F l e n d r i g e t a l . 1 9 7 6 a ; P l a t t s e t a l . 1 9 7 7 ; B e r k s e t h e t a l . 1 9 7 8 ) , a l t h o u g h t h i s h a s - 139 -n o t been e v i d e n t i n e v e r y i n s t a n c e ( B u r k s e t a l , 1 9 7 6 ; D e w b e r r y e t a l . 1 9 8 0 ) . O r a l A l i n t a k e i s g e n e r a l l y c o n s i d e r e d t o be a l e s s i m p o r t a n t s o u r c e o f i n t o x i c a t i o n t h a n i s d i a l y s i s f l u i d . T h i s i s m a i n l y b e c a u s e t h e u n i v e r s a l u s e o f A l g e l s c o n t r a s t s w i t h t h e u n e v e n i n c i d e n c e o f DE. N e v e r t h e l e s s , DE h a s b e e n r e p o r t e d i n i n d i v i d u a l s w i t h i m p a i r e d r e n a l f u n c t i o n who h a v e n e v e r been h e m o d i a l y s e d , b u t who c o n s u m e l a r g e a m o u n t s o f A l g e l s ( E t h e r i d g e e t a l . 1 9 7 8 ; G r i s w o l d e t a l . 1 9 8 3 ) . The i n c i d e n c e o f DE was r e p o r t e d t o be reduced in centres where oral A l usage was discontinued ( M c K i n n e y e t a l . 1 9 8 2 ) . A t o t h e r c e n t r e s , DE symptoms d i s a p p e a r e d when t h e d i a l y s i s A l c o n -c e n t r a t i o n was r e d u c e d and o r a l A l u s a g e d i s c o n t i n u e d ( B u g e e t a l . 1 9 7 8 ) . H o w e v e r , when o r a l A l was r e i n t r o d u c e d , symptoms r e s u m e d a n d a g a i n a b a t e d when t h i s p r a c t i c e was s t o p p e d ( B u g e e t a l . 1 9 7 8 ; M a s s e l o t e t a l . 1 9 7 8 ) . D e s p i t e much e v i d e n c e i n d i c a t i n g a r o l e o f A l i n D E , t h e r e i s s t i l l some u n c e r t a i n t y a s t o i t s e t i o l o g i c a l i m p o r t a n c e . A l t h o u g h many s t u d i e s h a v e shown t h e c o n t e n t o f b r a i n A l t o be e l e v a t e d i n D E , t h e same f i n d i n g , b u t w i t h o u t t h e symptoms o f D E , i s a l s o p r e s e n t i n A l z h e i m e r ' s d i s e a s e ( C r a p p e r e t a l . 1 9 7 6 ) , and i n p a t i e n t s w i t h r e n a l f a i l u r e , h e p a t i c c o m a , o r m e t a s t a -t i c c a n c e r ( A r i e f f e t a l . 1 9 7 9 ) . S i n c e t h e b l o o d - b r a i n b a r r i e r m i g h t be a b n o r m a l i n p a t i e n t s w i t h t h e l a s t t h r e e c o n d i t i o n s , i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e e l e v a t e d b r a i n A l c o n t e n t s e e n i n DE m i g h t b e t h e r e s u l t o f i n -c r e a s e d p e r m e a b i l i t y o f t h e b l o o d - b r a i n b a r r i e r i n t h i s c o n d i t i o n , r a t h e r t h a n t h e c a u s e o f DE ( A r i e f f e t a l . 1 9 7 9 ) . I n v i e w o f t h e e p i d e m i o l o g i c a l e v i d e n c e c o r r e l a t i n g h i g h i n c i d e n c e o f DE t o h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f A l i n t h e d i a l y s a t e , a n d t h e s t r i k i n g r e d u c t i o n i n t h e i n c i d e n c e o f DE when t h e d i a l y s i s f l u i d h a s b e e n d e i o n i s e d , A r i e f f ( 1 9 8 1 ) h a s s u g g e s t e d t h a t h e a v y m e t a l s m i g h t p l a y a r o l e , b u t p o i n t e d o u t t h a t m e t a l s o t h e r t h a n A l h a v e n o t been e x c l u d e d as t h e c a u s a t i v e f a c t o r . O t h e r s - 140 -( G a c e k e t a l . 1 9 7 9 ) h a v e c a u t i o n e d t h a t f a c t o r s s u c h a s t h e pH o f t h e d i a l y -s a t e m i g h t be i m p o r t a n t . A n i m a l e x p e r i m e n t s h a v e been p e r f o r m e d t o d e m o n s t r a t e CNS t o x i c i t y o f A l and i t s r o l e i n DE. B e r l y n e e t a l . ( 1 9 7 2 ) r e p o r t e d t h a t f a t a l i n t o x i c a t i o n c a n be p r o d u c e d w i t h i n 3 t o 8 d a y s i n p a r t i a l l y ( 5 / 6 ) n e p h r e c t o m i s e d r a t s when 1 t o 2% A l s a l t s w e r e a d d e d t o t h e d r i n k i n g w a t e r . P r i o r t o d e a t h , t h e s e r a t s d e v e l o p e d p e r i o r b i t a l b l e e d i n g , l e t h a r g y , and a n o r e x i a . S i m i l a r -l y , f a t a l i n t o x i c a t i o n was o b s e r v e d i n 5 / 6 n e p h r e c t o m i s e d r a t s , as w e l l as i n r a t s w i t h n o r m a l r e n a l f u n c t i o n , when A l s a l t s ( 1 5 0 mg/kg as e l e m e n t a l A l ) w e r e i n j e c t e d i n t r a p e r i t o n e a l l y , b u t n o t s u b c u t a n e o u s l y ( B e r l y n e e t a l . 1 9 7 2 ) . I n a n o t h e r s t u d y , r a t s w i t h i n t a c t r e n a l f u n c t i o n a d m i n i s t e r e d o r a l a l u m i n i u m c h l o r i d e o r a l u m i n i u m h y d r o x i d e ( A 1 ( 0 H ) 3 ) by g a s t r i c i n t u b a t i o n t w i c e d a i l y i n d o s e s o f 200 t o 1650 m g / k g / d a y , h a d a h i g h m o r t a l i t y a t t h e h i g h e r d o s e l e v e l s , o f t e n a s s o c i a t e d w i t h g a s t r i c d i s t e n s i o n ( B o w d l e r e t a l . 1 9 7 9 ) . A t t h e l o w e r d o s e s , t h e same a u t h o r s r e p o r t e d m o d e s t e l e v a t i o n s i n s e r u m and b r a i n A l , and s t a t e d t h a t t h e r a t s s h o w e d ' r a p i d g e n e r a l a c t i v i t y ' , d e c r e a s e d a b i l i t y t o m a i n t a i n r o t o r o d a c t i v i t y , and i n c r e a s e d s e n s i t i v i t y t o f l i c k e r . No i l l e f f e c t s w e r e n o t e d b y A r i e f f e t a l . ( 1 9 7 9 ) when s u b t o t a l l y ( 1 5 / 1 6 ) n e p h r e c t o m i s e d r a t s w e r e f e d f o r 5 m o n t h s a d i e t c o n t a i n i n g 300 mg/kg A l f O H j g , a l t h o u g h b r a i n g r a y m a t t e r A l c o n t e n t i n c r e a s e d f r o m l e s s t h a n 1 u g / g d r y w e i g h t t o more t h a n 4 p g / g d r y w e i g h t . M a y o r e t a l . ( 1 9 8 0 ) d e m o n s t r a t e d t h a t h i g h e r a m o u n t s o f A l w e r e r e t a i n e d i n t h e b r a i n s o f r a t s f e d chow s u p p l e m e n t e d w i t h a l u m i n u m c h l o r i d e a n d g i v e n p a r a t h y r o i d i n -j e c t i o n s , when c o m p a r e d t o r a t s f e d t h e A l compound a l o n e . O v e r a 25 d a y p e r i o d o f i n j e c t i o n s , t h e s e a u t h o r s o b s e r v e d no b e h a v i o r a l c h a n g e s i n t h e r a t s o f e i t h e r g r o u p . I n g e n e r a l , t h e a n i m a l e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d a b o v e h a v e n o t c l a r i f i e d t h e r o l e o f A l i n DE. Where b e h a v i o r a l t e s t s w e r e p e r f o r m e d on a n i m a l s - 141 -i n t o x i c a t e d w i t h A l c o m p o u n d s , a l t e r a t i o n s i n b e h a v i o r w e r e e i t h e r a b s e n t , n o t c o n s p i c u o u s , o r w e r e n o t c l e a r l y r e l a t e d t o t h o s e s e e n i n DE p a t i e n t s . I t i s p o s s i b l e t h a t s t u d i e s r e l y i n g on b e h a v i o r a l a l t e r a t i o n s , i n c o n j u n c -t i o n w i t h b r a i n A l a c c u m u l a t i o n , w o u l d n o t be h e l p f u l i n e l u c i d a t i n g t h e r o l e o f t h i s m e t a l i n DE, s i n c e b e h a v i o r a l c h a n g e s i n a n i m a l s m i g h t n o t be r e a d i l y r e c o n c i l e d w i t h t h e s y m p t o m a t o l o g y o f DE p a t i e n t s . - 142 -I I ) OUTLINE OF EXPERIMENTS T h e a b s e n c e o f s p e c i f i c n e u r o p a t h o l o g i c a l a b n o r m a l i t i e s i n DE ( A l f r e y e t aj_. 1 9 7 2 ; B u r k s e t a l . 1 9 7 6 ; C h u i e t a l . 1 9 8 0 ) s u g g e s t s t h a t n e u r o c h e m i c a l c h a n g e s u n a s s o c i a t e d w i t h t h e l o s s o f m a j o r n e u r o n a l p o p u l a t i o n s m i g h t be p r e s e n t i n t h e b r a i n s o f DE p a t i e n t s . S i n c e n e u r o c h e m i c a l s t u d i e s ( o t h e r t h a n m e a s u r e m e n t o f A l c o n t e n t ) h a v e b e e n l a c k i n g i n t h i s c o n d i t i o n , we d e c i d e d t o e x a m i n e n e u r o c h e m i c a l ^ t h e a u t o p s i e d b r a i n s o f DE p a t i e n t s i n t h e hope t h a t some a b n o r m a l i t i e s m i g h t be f o u n d . I t was a p o s s i b i l i t y t h a t f i n d i n g s o f a s p e c i f i c c h a n g e ( s ) m i g h t l e a d t o t h e d e v e l o p m e n t o f more e f f e c t i v e t r e a t m e n t s f o r p a t i e n t s w i t h DE. A f t e r d e t e r m i n i n g some o f t h e n e u r o c h e m i c a l c h a n g e s o f D E , we a t t e m p t e d t o p r o d u c e a r a t m o d e l o f t h e d i s e a s e u s i n g A H O H ) ^ , t o e x p l o r e t h e p o s s i -b i l i t y t h a t t h i s compound m i g h t p r o d u c e t h e same n e u r o c h e m i c a l c h a n g e s i n r a t s . I t seemed l i k e l y t h a t n e u r o c h e m i c a l r a t h e r t h a n b e h a v i o r a l e n d - p o i n t s m i g h t f u r n i s h b e t t e r e v i d e n c e f o r o r a g a i n s t a c a u s a t i v e r o l e o f A l i n D E . T h i s q u e s t i o n i s c r i t i c a l s i n c e many r e n a l f a i l u r e p a t i e n t s a r e c u r r e n t l y t r e a t e d b y r e p e a t e d h e m o d i a l y s i s and a r e g i v e n l a r g e a m o u n t s o f p h o s p h a t e -b i n d i n g A l g e l s . - 143 -I I I ) HUMAN STUDIES I l l . i ) M e t h o d T h e m e t h o d o l o g i e s u s e d f o r t h e n e u r o c h e m i c a l e x a m i n a t i o n o f t h e b r a i n s o f DE p a t i e n t s a r e d e t a i l e d i n A p p e n d i x I ( P e r r y e t a l . J . N e u r o c h e m . 4 5 : 1 0 4 3 - 1 0 4 8 , 1 9 8 5 ) . Ten p a t i e n t s w e r e s t u d i e d : 8 had c l e a r - c u t symptoms o f DE w i t h s e i z u r e s , m y o c l o n u s , t y p i c a l EEG c h a n g e s , d e m e n t i a , d y s p r a x i a , and t h e c h a r a c t e r i s t i c l a n g u a g e d i s o r d e r . The r e m a i n i n g 2 p a t i e n t s d i e d w i t h n e u r o l o g i c a l symptoms h i g h l y s u g g e s t i v e o f D E , b u t t h e y l a c k e d t h e c h a r a c -t e r i s t i c l a n g u a g e d i s o r d e r . A l l 10 s u b j e c t s h a d d i e d w i t h c h r o n i c r e n a l f a i l u r e a f t e r t r e a t m e n t b y r e p e a t e d h e m o d i a l y s i s , and a l l h a d i n g e s t e d A l p h o s p h a t e - b i n d i n g g e l s . F u r t h e r i n f o r m a t i o n on t h e p a t i e n t s , a s w e l l a s on t h e c o n t r o l s u b j e c t s , a r e a v a i l a b l e i n A p p e n d i x I . The v a r i o u s m e a s u r e m e n t s p e r f o r m e d i n c l u d e d c o n t e n t s o f GABA, m e t a b o l -i t e s o f d o p a m i n e , n o r a d r e n a l i n e and s e r o t o n i n , and c o n t e n t s o f p y r i d o x a l - 5 -p h o s p h a t e ( P L P ) , t h e c o f a c t o r f o r s e v e r a l e n z y m e s , i n c l u d i n g t h e s y n t h e t i c enzyme f o r GABA, g l u t a m i c a c i d d e c a r b o x y l a s e ( G A D ) . Enzyme a c t i v i t y o f c h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e , t h e b i o s y n t h e t i c enzyme f o r a c e t y l c h o l i n e , was d e t e r m i n e d . B r a i n A l c o n t e n t was a l s o e x a m i n e d . 1 1 1 . i i ) R e s u l t s and D i s c u s s i o n Mean GABA c o n t e n t s w e r e s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d i n 6 r e g i o n s o f DE b r a i n s when c o m p a r e d t o c o n t r o l s u b j e c t s ( T a b l e 1 ) , t h e r e d u c t i o n b e i n g a t l e a s t 4 0 % i n f r o n t a l a n d o c c i p i t a l c o r t e x and i n t h e t h a l a m u s . T h i s o b s e r v a t i o n i s i n t e r e s t i n g , s i n c e t h e l a n g u a g e d i s o r d e r a s w e l l as t h e EEG c h a n g e s i n DE c a n o f t e n be r e v e r s e d t e m p o r a r i l y b y i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f b e n z o d i a z e p i n e s , w h i c h h a v e r e c o g n i t i o n s i t e s l i n k e d f u n c t i o n a l l y t o GABA r e c e p t o r s ( B a e s t r u p e t a l . 1 9 8 2 ) . - 144 -T a b l e 1 . R e g i o n a l GABA c o n t e n t s o f a u t o p s i e d b r a i n i n DE and c o n t r o l p a t i e n t s P a t i e n t s F r o n t a l O c c i p i t a l C e r e b e l l a r C a u d a t e P u t a m e n c o r t e x c o r t e x c o r t e x n u c l e u s C o n t r o l s 1 . 6 7 * 0 . 0 9 1 . 8 3 * 0 . 1 1 ( 2 6 ) ( 2 5 ) DE 0 . 9 6 * 0 . 0 4 * 0 . 9 9 * 0 . 0 6 * ( 1 0 ) ( 1 0 ) G l o b u s S u b s t a n t i a P a l l i d u s n i g r a C o n t r o l s 7 . 3 2 * 0 . 4 0 6 . 0 5 * 0 . 2 6 ( 1 6 ) ( 2 8 ) DE 6 . 4 0 * 0 . 3 5 5 . 5 3 * 0 . 3 7 ( 1 0 ) ( 1 0 ) 1 . 6 5 * 0 . 0 8 2 . 9 0 * 0 . 1 4 2 . 9 1 * 0 . 2 0 ( 2 6 ) ( 3 2 ) ( 1 9 ) 1 . 1 8 ± 0 . 1 0 f 1 . 9 1 * 0 . 1 1 * 2 . 3 5 * 0 . 2 0 ( 1 0 ) ( 1 0 ) ( 1 0 ) N u c l e u s T h a l a m u s D e n t a t e A c c u m b e n s N u c l e u s 4 . 1 5 * 0 . 2 9 2 . 0 5 * 0 . 1 2 4 . 7 7 * 0 . 2 3 ( 2 3 ) ( 3 5 ) ( 1 8 ) 3 . 3 5 * 0 . 3 0 1 . 2 0 * 0 . 1 0 * 3 . 8 6 ± 0 . 2 8 § ( 9 ) ( 1 0 ) ( 1 0 ) V a l u e s (mean * SEM) a r e e x p r e s s e d i n y m o l / g w e t w e i g h t , w i t h number o f b r a i n s e x a m i n e d shown i n p a r e n t h e s e s . M e d i a l - d o r s a l r e g i o n o f t h e t h a l a m u s was a n a l y s e d . V a l u e s t h a t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m t h o s e o f c o n t r o l s : * P < 0 . 0 0 1 ; + P < 0 . 0 1 ; 5 P < 0 . 0 5 . Why a r e GABA c o n t e n t s r e d u c e d i n s e v e r a l b r a i n r e g i o n s i n DE ? One p o s -s i b i l i t y i s t h a t t h i s n e u r o c h e m i c a l f i n d i n g i s a r e s u l t o f s e l e c t i v e l o s s o f G A B A e r g i c n e u r o n s , as i s t h e c a s e i n H u n t i n g t o n ' s c h o r e a ( P e r r y e t a l . 1 9 7 3 ) . H o w e v e r , e x a m i n a t i o n s o f t h e a u t o p s i e d b r a i n s o f DE p a t i e n t s h a v e g e n e r a l l y n o t shown a n y n e u r o p a t h o l o g i c a l c h a n g e s . A n o t h e r p o s s i b l e e x p l a n a t i o n i s t h a t t h e r e d u c t i o n i n GABA c o n t e n t i s due t o u r e m i a , s i n c e 8 o f t h e 10 DE p a t i e n t s h a d e l e v a t e d b r a i n u r e a c o n t e n t s a t d e a t h . U r e a c o n t e n t s c a n be r e l i a b l y m e a s u r e d on o u r a m i n o a c i d a n a l y s e r . Our r e s u l t s show t h a t i n t h e two DE p a t i e n t s who d i e d w i t h n o r m a l b r a i n u r e a l e v e l s , t h e r e d u c t i o n o f GABA c o n t e n t s w e r e as m a r k e d as t h a t o f t h e r e m a i n i n g 8 p a t i e n t s . In a d d i -t i o n , we c o m p a r e d GABA c o n t e n t s o f t h e f r o n t a l c o r t e x i n a g r o u p o f 10 c o n -t r o l p a t i e n t s who d i e d s e v e r e l y u r e m i c ( b r a i n u r e a c o n t e n t s g r e a t e r t h a n 10 - 145 -t i m e s n o r m a l ) w i t h a g r o u p o f 26 p a t i e n t s who d i e d w i t h l o w t o n o r m a l b r a i n u r e a c o n t e n t s . Mean GABA c o n t e n t s i n t h e 2 g r o u p s , n e i t h e r o f w h i c h had DE, w e r e a l m o s t i d e n t i c a l ( 1 . 6 4 ± 0 . 0 9 y . m o l / g w e t w e i g h t i n u r e m i c b r a i n s , c o m -p a r e d t o 1 . 6 7 ± 0 . 0 9 i n n o n - u r e m i c b r a i n s , mean ± S E M ) . I t t h u s a p p e a r e d t h a t t h e r e d u c t i o n i n GABA c o n t e n t i n t h e b r a i n s o f DE p a t i e n t s was n o t due t o u r e m i a . Y e t a n o t h e r p o s s i b i l i t y f o r t h e r e d u c t i o n i n GABA c o n t e n t i n DE i s t h a t t h e a c t i v i t y o f GAD, t h e s y n t h e t i c enzyme f o r G A B A , i s r e d u c e d . T h i s p o s s i -b i l i t y c a n n o t be r e a d i l y t e s t e d , s i n c e GAD a c t i v i t y i s o f t e n m a r k e d l y r e -d u c e d i n b r a i n a f t e r p r o l o n g e d a n o x i c d y i n g ( M c G e e r e t a l . 1 9 7 6 ) . A f u r t h e r l i k e l i h o o d f o r t h e d e c r e a s e i n GABA c o n t e n t i n t h e b r a i n s o f DE p a t i e n t s i s t h a t P L P , t h e c o f a c t o r o f GAD, i s p r e s e n t i n d e f i c i e n t a m o u n t s i n t h e b r a i n o f DE p a t i e n t s . P l a s m a PLP c o n c e n t r a t i o n s h a v e b e e n r e p o r t e d t o be r e d u c e d b y a b o u t 5 0 % i n u r e m i c p a t i e n t s , w h e t h e r o r n o t t h e y h a v e b e e n h e m o d i a l y s e d ( S t o n e e t a l . 1 9 7 5 ; L a c o u r e t a l . 1 9 8 3 ) . I f b r a i n P L P c o n t e n t s w e r e r e d u c e d i n D E , and i f g r e a t e r a m o u n t s o f t h i s c o f a c t o r w e r e r e q u i r e d f o r t h e o p t i m a l a c t i v i t y o f GAD t h a n f o r GABA a m i n o t r a n s f e r a s e ( t h e c a t a b o l i c enzyme f o r GABA t h a t a l s o r e q u i r e s PLP as a c o f a c t o r ) , t h i s c o u l d a c c o u n t f o r t h e r e -d u c e d GABA c o n t e n t s . We d i d f i n d b r a i n P L P c o n t e n t s t o be r e d u c e d ( T a b l e 2 ) , b u t t h i s i s u n l i k e l y t o be an e x p l a n a t i o n f o r t h e GABA d e f i c i e n c y , s i n c e PLP l e v e l s w e r e r e d u c e d i n b o t h t h e f r o n t a l c o r t e x a n d p u t a m e n , w h i l e GABA c o n t e n t was m a r k e d l y r e d u c e d o n l y i n t h e c o r t e x . A l s o , t h e n o r m a l c o n t e n t s o f t h e m e t a b o l i t e s o f n o r a d r e n a l i n e , d o p a m i n e a n d s e r o t o n i n i n 3 r e g i o n s o f DE b r a i n s ( T a b l e 3 ) i m p l y t h a t t h e DE b r a i n c o n t a i n s r e a s o n a b l e a m o u n t s o f P L P , s i n c e PLP a l s o s e r v e s as t h e c o f a c t o r f o r a r o m a t i c L - a m i n o a c i d d e c a r -b o x y l a s e , t h e enzyme e s s e n t i a l f o r t h e p r o d u c t i o n o f t h e s e 3 b i o g e n i c a m i n e s . - 1 4 6 -T a b l e 2 . P y r i d o x a l p h o s p h a t e c o n t e n t o f a u t o p s i e d b r a i n o f DE p a t i e n t s S u b j e c t s F r o n t a l c o r t e x Putamen C o n t r o l s 2 . 9 6 ± 0 . 2 4 2 . 1 0 ± 0 . 2 4 ( H ) (10) DE 1 . 5 3 ± 0 . 1 0 * 1 . 4 1 ± 0 . 2 8 § ( 1 0 ) (10) V a l u e s (mean ± SEM) a r e e x p r e s s e d i n n m o l / g w e t w e i g h t , w i t h t h e number o f s a m p l e s a n a l y s e d i n d i c a t e d i n b r a c k e t s . V a l u e s t h a t d i f f e r f r o m c o n t r o l v a l u e s : * P < 0 . 0 0 1 ; § P < 0 . 0 5 . T a b l e 3 . C o n t e n t s o f m o n o a m i n e m e t a b o l i t e s i n a u t o p s i e d b r a i n o f DE p a t i e n t s P a t i e n t s F r o n t a l C a u d a t e Putamen c o r t e x n u c l e u s MHPG C o n t r o l s 0 . 3 9 ± 0 . 0 7 0 . 4 7 ± 0 . 1 0 0 . 5 2 ± 0 . 1 2 ( 1 3 ) ( 8 ) ( 1 3 ) DE 0 . 3 7 ± 0 . 1 7 0 . 6 6 ± 0 . 1 4 0 . 7 1 ± 0 . 1 4 ( 1 0 ) ( 1 0 ) ( 9 ) HVA C o n t r o l s 0 . 7 9 ± 0 . 3 1 2 2 . 3 ± 2 . 4 8 3 1 . 5 ± 3 . 6 3 ( 1 3 ) ( 8 ) ( 1 5 ) DE 0 . 9 5 ± 0 . 0 9 2 3 . 4 ± 2 . 1 4 3 0 . 8 ± 2 . 0 2 ( 1 0 ) ( 1 0 ) ( 1 0 ) 5 - H I A A C o n t r o l s 0 . 6 1 ± 0 . 1 0 3 . 3 5 ± 0 . 6 9 4 . 8 8 ± 0 . 5 9 ' ( 1 3 ) ( 8 ) ( 1 5 ) DE 0 . 8 9 ± 0 . 1 3 3 . 5 6 ± 0 . 5 3 5 . 0 7 ± 0 . 6 7 ( 1 0 ) ( 1 0 ) ( 1 0 ) V a l u e s (mean ± SEM) a r e i n n m o l / g w e t w e i g h t , w i t h t h e number o f b r a i n s e x a m i n e d i n d i c a t e d i n b r a c k e t s . None o f t h e DE v a l -u e s d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m t h o s e o f c o n t r o l s . MHPG ( 3 - m e t h o x y - 4 - h y d r o x y p h e n y l e t h y l e n e g l y c o l ) i s t h e m e t a b o l i t e o f n o r a d r e n a l i n e , HVA ( h o m o v a n i l l i c a c i d ) i s t h e m e t a b o l i t e o f o f d o p a m i n e , w h i l e 5 - H I A A ( 5 - h y d r o x y - i n d o l e a c e t i c a c i d ) i s t h e m e t a b o l i t e o f s e r o t o n i n . - 147 -T a b l e 4 shows a s m a l l d e c r e a s e (25 t o 35%) i n mean CAT a c t i v i t y i n 3 a r e a s o f c e r e b r a l c o r t e x i n t h e 10 DE p a t i e n t s . The r e d u c t i o n i n enzyme a c t i v i t y was o f e q u a l m a g n i t u d e i n t h e 2 p a t i e n t s w i t h some symptoms o f D E , and i n t h e 8 w i t h t h e c l e a r - c u t s y n d r o m e . H o w e v e r , t h e d e c r e a s e d CAT a c t i v -i t y i n t h e DE p a t i e n t s was l e s s m a r k e d t h a n t h a t o b s e r v e d i n A l z h e i m e r ' s d i s e a s e ( P e r r y e t a l . 1 9 8 0 ; 1 9 8 3 ) , o r i n d e m e n t e d p a t i e n t s w i t h P a r k i n s o n ' s d i s e a s e ( P e r r y e t a l . 1 9 8 3 ) . T a b l e 4 . C h o l i n e a c e t y l t r a n s f e r a s e a c t i v i t y i n c e r e b r a l c o r t e x o f DE p a t i e n t s P a t i e n t s F r o n t a l c o r t e x T e m p o r a l c o r t e x O c c i p i t a l c o r t e x C o n t r o l s 1 . 0 7 ± 0 . 0 5 1 . 0 1 ± 0 . 0 8 0 . 6 4 ± 0 . 0 8 ( 1 6 ) ( 1 5 ) ( 1 2 ) DE 0 . 7 3 ± 0 . 0 9 + 0 . 7 6 ± 0 . 1 5 0 . 4 2 ± 0 . 0 7 ( 1 0 ) ( 9 ) ( 1 0 ) V a l u e s (mean ± SEM) a r e e x p r e s s e d a s n m o l / 1 0 min/mg p r o t e i n . F i g u r e s i n b r a c k e t s i n d i c a t e t h e number o f b r a i n s e x a m i n e d . V a l u e s t h a t d i f f e r f r o m c o n t r o l s : 5 P < 0 . 0 5 ; + P < 0 . 0 1 . The A l c o n t e n t o f t h e g r a y m a t t e r o f t h e f r o n t a l c o r t e x o f 15 c o n t r o l s u b j e c t s was 5 . 6 ± 0 . 6 y g / g d r y w e i g h t , w i t h a r a n g e o f 2 . 0 t o 9 . 9 y g / g . F o r t h e 10 DE p a t i e n t s , t h e same b r a i n a r e a had a mean A l c o n t e n t o f 2 1 . 8 ± 4 . 2 y g / g d r y w e i g h t (P< 0 . 0 0 1 c o m p a r e d t o c o n t r o l s , S t u d e n t ' s t - t e s t ) , r a n g -i n g f r o m 11 t o 5 6 . 2 y g / g . T h i s i n c r e a s e i n t h e DE p a t i e n t s was o f t h e same m a g n i t u d e a s t h a t f o u n d b y o t h e r i n v e s t i g a t o r s ( F l e n d r i g e t a l . 1 9 7 6 ; C a r t i e r e t a l . 1 9 7 8 ) . T h u s , A l a c c u m u l a t i o n i n b r a i n s o f DE p a t i e n t s seems t o be a f e a t u r e o f t h e d i s e a s e , a l t h o u g h n o t n e c e s s a r i l y an e t i o l o g i c a l o n e . - 148 -I n s u m m a r y , we f o u n d mean GABA c o n t e n t s t o be r e d u c e d i n s e v e r a l b r a i n r e g i o n s o f DE p a t i e n t s . A s m a l l d e c r e a s e i n t h e e n z y m i c a c t i v i t y o f CAT was a l s o o b s e r v e d i n 3 c o r t i c a l a r e a s . N o r m a l c o n t e n t s o f t h e m e t a b o l i t e s o f n o r a d r e n a l i n e , d o p a m i n e and s e r o t o n i n , s u g g e s t t h a t t h e s y n t h e s i s and t u r n -o v e r o f t h e s e b i o g e n i c a m i n e s i n t h e DE b r a i n a r e n o t d i f f e r e n t f r o m n o r m a l . - 149 -I V ) ANIMAL EXPERIMENTS I V . i ) M e t h o d 5 g r o u p s o f y o u n g a d u l t W i s t a r r a t s o f e i t h e r s e x w e r e i n j e c t e d s u b c u -t a n e o u s l y o n c e d a i l y f o r v a r y i n g p e r i o d s o f t i m e w i t h a c o n t i n u o u s l y a g i -t a t e d s u s p e n s i o n o f A 1 ( 0 H ) 3 i n w a t e r . The r a t i o n a l e f o r h a v i n g 5 g r o u p s o f A l - t r e a t e d r a t s , i n w h i c h t h e v a r i o u s e x p e r i m e n t a l c h a r a c t e r i s t i c s a r e shown on T a b l e 5 , w i l l be c l a r i f i e d i n t h e R e s u l t s and D i s c u s s i o n s e c t i o n . T a b l e 5 . T r e a t m e n t s g i v e n t o a l u m i n u m - i n j e c t e d a n i m a l s E x p e r i m e n t a l A 1 ( 0 H ) 3 E x t e n t o f D u r a t i o n o f L i C l g r o u p d o s a g e n e p h r e c t o m y p r e t r e a t m e n t 150 mg e l e m e n t a l A l / k g None None d a i l y f o r 49 d a y s 200 mg e l e m e n t a l A l / k g None None d a i l y f o r 14 d a y s 200 mg e l e m e n t a l A l / k g 5 / 6 None d a i l y f o r 14 d a y s , s t a r t i n g 14 d a y s a f t e r n e p h r e c t o m y 200 mg e l e m e n t a l A l / k g 5 / 6 16 w e e k s d a i l y f o r 3 o r 5 d a y s , s t a r t i n g 24 h a f t e r n e p h r e c t o m y E 200 mg e l e m e n t a l A l / k g 1 / 2 16 w e e k s d a i l y f o r 30 d a y s , s t a r t i n g 24 h a f t e r n e p h r e c t o m y P r i o r t o i n j e c t i o n s , some r a t s u n d e r w e n t s u r g i c a l n e p h r e c t o m i e s , i n w h i c h o n l y t h e r i g h t k i d n e y ( G r o u p E ) , o r t h e r i g h t k i d n e y as w e l l as 2 / 3 o f t h e l e f t k i d n e y ( P i a t t e t a l . 1 9 5 2 ) w e r e r e m o v e d ( G r o u p s C and D; h e n c e -f o r t h , t h i s e x t e n t o f n e p h r e c t o m y w i l l be r e f e r r e d t o a s 5 / 6 ) . The v o l u m e o f s u s p e n s i o n i n j e c t e d ( 2 0 m l / k g ) was s u f f i c i e n t t o p r o v i d e a d a i l y d o s e o f - 150 -e l e m e n t a l A l o f 150 m g / k g i n G r o u p A r a t s , and o f 2 0 0 mg/kg i n G r o u p s B , C , D, o r E r a t s . A p p r o p r i a t e g r o u p s o f c o n t r o l r a t s , s i m i l a r l y n e p h r e c t o m i s e d o r n o n - o p e r a t e d , w e r e i n j e c t e d s u b c u t a n e o u s l y w i t h e q u a l v o l u m e s o f 0 . 9 % NaCl f o r t h e same p e r i o d s o f t i m e . A f t e r t h e l a s t A l ( 0 H ) . j o r s a l i n e i n j e c t i o n , r a t s w e r e s a c r i f i c e d b y c e r v i c a l d i s l o c a t i o n , and t h e i r b r a i n s w e r e r e m o v e d and i m m e r s e d i n l i q u i d n i t r o g e n w i t h i n 4 0 s . B r a i n s w e r e f r o z e n i m m e d i a t e l y t o p r e v e n t o r m i n i m i z e a n y p o s t m o r t e m i n c r e a s e i n GABA c o n t e n t s ( P e r r y e t a l . 1 9 8 1 ) . B r a i n s w e r e t h e n a l l o w e d t o thaw t o - 1 0 C t o a l l o w f o r a c c u r a t e d i s s e c t i o n i n t o d i s c r e t e a r e a s . The e n t i r e c e r e b e l l u m and b r a i n s t e m f r o m e a c h s p e c i m e n w e r e f i r s t r e -moved f o r a s s a y o f A l c o n t e n t . The r e m a i n i n g b r a i n was t h e n b i s e c t e d m i d -s a g i t a l l y , and one h a l f was s t o r e d a t - 7 0 C f o r s u b s e q u e n t GABA a n a l y s i s . From t h e o t h e r h a l f , s t r i a t u m was d i s s e c t e d f o r m e a s u r e m e n t o f i t s d o p a m i n e c o n t e n t , p o r t i o n s o f f r o n t a l c o r t e x w e r e r e m o v e d f o r GAD a s s a y , a n d p o r t i o n s o f o c c i p i t a l c o r t e x f o r CAT a s s a y . A t t h e t i m e r a t s w e r e s a c r i f i c e d , b l o o d was a l s o c o l l e c t e d f o r m e a s u r e -ment o f s e r u m u r e a and A l c o n c e n t r a t i o n s . A l l t h e d i s s e c t i n g i n s t r u m e n t s and c o n t a i n e r s f o r s t o r a g e o f s a m p l e s f o r s u b s e q u e n t A l a n a l y s e s h a d b e e n p r e v i o u s l y s o a k e d ( f o r 24 h o u r s ) i n 0 . 6 % ( w / v ) d i s o d i u m EDTA t o r e m o v e a n y c o n t a m i n a t i n g A l . M e a s u r e m e n t s o f GABA c o n t e n t and CAT enzyme a c t i v i t y w e r e p e r f o r m e d as d e s c r i b e d f o r human b r a i n s i n A p p e n d i x I . D o p a m i n e c o n t e n t was d e t e r m i n e d u s i n g t h e m e t h o d e m p l o y e d f o r r a t b r a i n d e s c r i b e d b y P e r r y e t a l . ( 1 9 8 4 ) . GAD enzyme a c t i v i t y o f r a t f r o n t a l c o r t i c e s was m e a s u r e d u s i n g a m e t h o d w h i c h a n a l y s e d t h e r a t e o f f o r m a t i o n o f ^ C 0 2 f r o m L - [ 1 - ^ C ] g l u t a m i c a c i d ( P e r r y e t a l . 1 9 7 9 ) . - 151 -Two d i f f e r e n t m e t h o d s w e r e u s e d t o m e a s u r e A l c o n t e n t s o f r a t b r a i n . The f i r s t ( u s e d f o r G r o u p s A , B and C r a t s ) was as d e s c r i b e d a b o v e f o r human b r a i n s ( A p p e n d i x I ) . H o w e v e r , t h i s m e t h o d y i e l d e d a r e l a t i v e l y h i g h b l a n k v a l u e , w h i c h i n c r e a s e d w i t h t i m e a f t e r r e c o n s t i t u t i o n o f t h e b r a i n , p r o b a b l y due t o d i s s o l u t i o n o f g l a s s w h i c h c o n t a i n s r e l a t i v e l y l a r g e amounts o f A l ( S a n s o n i e t a l . . 1 9 8 0 ) . To. a v o i d t h i s p r o b l e m , a s e c o n d m e t h o d was e m p l o y e d f o r l a t e r b r a i n s p e c i m e n s ( G r o u p D and E r a t s ) . S a m p l e s w e r e d r i e d t o c o n -s t a n t w e i g h t i n p l a s t i c v i a l s ( F i s h e r l i n e a r p o l y e t h y l e n e l i q u i d s c i n t i l l a -t i o n v i a l s ) and w e r e t h e n d i s s o l v e d i n 2 ml o f 5 % ( w / v ) t e t r a m e t h y l a m m o n i u m o h y d r o x i d e b y h e a t i n g a t 9 0 C f o r 1 o r 2 h . T h u s , i n s t e a d o f d r y - a s h i n g f o r 16 h , a t i s s u e d i s s o l u t i o n method w h i c h e m p l o y e d an a l k a l i and w h i c h t o o k a r e l a t i v e l y s h o r t e r t i m e , was u s e d . The r e s u l t i n g s o l u t i o n s w e r e t h e n d i l u t e d b y a d d i n g 4 v o l u m e s o f e t h a n o l and w e r e a n a l y s e d f o r A l as done w i t h t h e human s p e c i m e n s . R e p e a t e d a n a l y s e s o f B o v i n e L i v e r S t a n d a r d R e f e r e n c e M a t e r i a l N o . 1 5 7 7 a f r o m t h e U . S . N a t i o n a l B u r e a u o f S t a n d a r d s w i t h t h i s t e c h n i q u e y i e l d e d an A l v a l u e o f 2 . 8 ± 0 . 9 p g / g (mean ± S D ) . A n o n - c e r t i -f i e d A l v a l u e o f 2 p.g/g i s g i v e n f o r t h i s m a t e r i a l b y t h e N a t i o n a l B u r e a u o f S t a n d a r d s . A l m e a s u r e m e n t s o f r a t f r o n t a l c o r t i c e s b y e i t h e r m e t h o d w e r e done i n d u p l i c a t e . Serum u r e a n i t r o g e n c o n c e n t r a t i o n s w e r e d e t e r m i n e d on a r o u t i n e c l i n i c a l a n a l y s e r ( A s t r a 8 , Beckman I n s t r u m e n t s ) w i t h an e n z y m a t i c u r e a s e - c o n d u c t i v -i t y r a t e m e t h o d . I V . i i ) R e s u l t s - a n d D i s c u s s i o n  L a c k o f n e u r o c h e m i c a l c h a n g e s i n r a t s w i t h n o r m a l r e n a l f u n c t i o n i n j e c t e d  c h r o n i c a l l y w i t h A 1 ( 0 H ) 3 ( G r o u p A r a t s ) I n p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s , t h e s u b c u t a n e o u s i n j e c t i o n o f a c i d i c s o l u -t i o n s o f A l C l ^ i n r a t s was f o l l o w e d b y s e v e r e t i s s u e n e c r o s i s . We t h u s e l e c t e d t o t r e a t r a t s w i t h d a i l y s u b c u t a n e o u s i n j e c t i o n s o f a n e u t r a l s u s -- 152 -p e n s i o n . o f t h e r e l a t i v e l y i n s o l u b l e A H O H ) ^ . T h i s o f f e r e d t h e a d v a n t a g e o f a d e p o t o f A l t o p r o v i d e c o n t i n o u s e x p o s u r e t o l a r g e a m o u n t s o f t h e m e t a l . Young l i t t e r - m a t e f e m a l e r a t s w e r e i n j e c t e d s u b c u t a n e o u s l y w i t h 150 mg e l e m e n t a l A l / k g as A1(OH)3 ( T a b l e 5 , G r o u p A ) , o r w i t h s a l i n e s o l u t i o n , o n c e d a i l y f o r 49 d a y s . A l t h o u g h t h e A l - i n j e c t e d r a t s d e v e l o p e d s u b c u t a n e -o u s s c a r r i n g a t t h e i n j e c t i o n s i t e s on t h e i r b a c k s , t h e y grew n o r m a l l y , t h e i r mean w e i g h t i n c r e a s i n g f r o m 68 t o 186 g o v e r 49 d a y s . The s a l i n e - i n -j e c t e d c o n t r o l s had a c o r r e s p o n d i n g mean w e i g h t g a i n f r o m 70 t o 175 g . A f t e r 3 0 d a y s o f i n j e c t i o n s , A l r a t s became a g g r e s s i v e , and f r e q u e n t l y a d o p t e d a b o x i n g s t a n c e t h a t l a s t e d f o r a b o u t an h o u r a f t e r i n j e c t i o n s . S a l i n e - i n j e c t e d r a t s showed no c h a n g e s i n b e h a v i o r . B e f o r e b e i n g s a c r i -f i c e d , 24 h a f t e r t h e l a s t o f t h e 49 i n j e c t i o n s , a l l r a t s w e r e o b s e r v e d f o r g r o s s m o t o r a b n o r m a l i t i e s i n an open f i e l d a p p a r a t u s , a n d t e s t e d on a r o t a t -i n g drum f o r m o t o r i n c o o r d i n a t i o n . No d i f f e r e n c e s w e r e o b s e r v e d b e t w e e n A l - t r e a t e d and c o n t r o l r a t s . T a b l e 6 shows t h a t i n G r o u p A r a t s , t h e c h r o n i c a d m i n i s t r a t i o n o f A 1 ( 0 H ) 3 d i d n o t e l e v a t e b r a i n A l c o n t e n t , and t h a t b r a i n GABA c o n t e n t r e -m a i n e d u n a l t e r e d . Q u a n t i t a t i o n o f o t h e r a m i n o a c i d s i n t h e b r a i n a l s o r e -v e a l e d no d i f f e r e n c e s b e t w e e n A l - t r e a t e d and c o n t r o l r a t s . C o r t i c a l a c t i v i -t i e s o f GAD and C A T , a s w e l l as o f s t r i a t a l d o p a m i n e c o n t e n t , s i m i l a r l y d i d n o t d i f f e r b e t w e e n t h e A l and c o n t r o l g r o u p s . - 153 -T a b l e 6 . N e u r o c h e m i c a l p a r a m e t e r s i n G r o u p A r a t s a f t e r c h r o n i c A l e x p o s u r e A n i m a l s A l c o n t e n t GABA c o n t e n t GAD a c t i v i t y CAT D o p a m i n e ( u g / g d r y ( u m o l / g w e t ( p m o l / h / g ( n m o l / l O m i n / ( u g / g w e t w e i g h t ) w e i g h t ) p r o t e i n ) mg w e t w e i g h t w e i g h t ) C o n t r o l s 6 . 1 ± 1 . 3 2 . 6 2 ± 0 . 0 8 239 ± 13 1 . 1 3 ± 0 . 0 7 1 2 . 7 ± 0 . 8 ( 1 2 ) ( 1 2 ) ( 1 2 ) ( 1 0 ) ( 1 2 ) A l u m i n u m - 5 . 0 ± 0 . 9 2 . 5 2 ± 0 . 0 9 2 5 2 ± 11 1 . 1 1 ± 0 . 0 6 1 2 . 6 ± 0 . 7 i n j e c t e d ( H ) ( 1 6 ) ( 1 6 ) ( 1 0 ) ( 1 2 ) V a l u e s a r e mean ± SEM, w i t h number o f a n i m a l s i n b r a c k e t s . R a t s w e r e k i l l e d 24 h a f t e r t h e l a s t o f 4 9 d a i l y s c i n j e c t i o n s o f A 1 ( 0 H ) 3 i n a d o s a g e p r o v i d i n g 150 m g / k g / d a y o f e l e m e n t a l A l . None o f t h e means f o r t h e 2 g r o u p s d i f f e r s i g n i f i c a n t l y ( t w o - t a i l e d S t u d e n t ' s t - t e s t , P = 0 . 0 5 ) . A l c o n t e n t was m e a s u r e d i n t h e c e r e -b e l l u m , GABA c o n t e n t was d e t e r m i n e d i n w h o l e b r a i n m i n u s t h e c e r e -b e l l u m , d o p a m i n e c o n c e n t r a t i o n was a n a l y s e d i n t h e s t r i a t u m , and GAD and CAT a c t i v i t i e s w e r e a s s a y e d i n t h e f r o n t a l a n d o c c i p i t a l c o r t i c e s r e s p e c t i v e l y . B r a i n a l u m i n u m was d e t e r m i n e d b y t h e d r y -a s h i n g EDTA m e t h o d . A b s o r p t i o n o f • A1(OH)3 s u s p e n s i o n I n v i e w o f t h e f a i l u r e t o o b t a i n A l a c c u m u l a t i o n i n t h e b r a i n s o f r a t s t r e a t e d w i t h t h e r e l a t i v e l y i n s o l u b l e A H O H ) ^ ( G r o u p A r a t s , T a b l e 5 ) , i t was i m p o r t a n t t o p r o v e t h a t A l was i n d e e d a b s o r b e d f r o m s u b c u t a n e o u s d e p o t s . The l a c k o f a b s o r p t i o n o f A l m i g h t h a v e a c c o u n t e d f o r o u r i n a b i l i t y t o p r o -d u c e n e u r o c h e m i c a l c h a n g e s i n t h e s e r a t s . E i g h t e e n r a t s w e r e g i v e n d a i l y s u b c u t a n e o u s i n j e c t i o n s o f e i t h e r A1(OH)3 e q u i v a l e n t t o 2 0 0 mg/kg o f e l e m e n t a l A l ( T a b l e 5 , G r o u p s B and C ) , o r o f s a l i n e , f o r 14 c o n s e c u t i v e d a y s . No m o r t a l i t y was e n c o u n t e r e d . The d o s e o f e l e m e n t a l A l was i n c r e a s e d f r o m 150 t o 2 0 0 mg/kg i n t h e h o p e o f e l e -v a t i n g t h e b o d y l o a d o f A l f o r t h i s and s u b s e q u e n t p l a n n e d e x p e r i m e n t s . I n a d d i t i o n , G r o u p C r a t s h a d a l s o u n d e r g o n e 5 / 6 n e p h r e c t o m i e s 14 d a y s b e f o r e A l ( O H ) 3 i n j e c t i o n s w e r e s t a r t e d . T a b l e 7 shows t h a t s e r u m A l c o n c e n t r a t i o n s w e r e m a r k e d l y e l e v a t e d i n r a t s i n j e c t e d w i t h A 1 ( 0 H K , r e g a r d l e s s o f w h e t h e r o r n o t t h e y h a d b e e n - 154 -n e p h r e c t o m i s e d . A t a u t o p s y , v i s u a l i n s p e c t i o n s h o w e d t h a t o n l y s m a l l a m o u n t s o f t h e A 1 ( 0 H ) ^ i n j e c t e d r e m a i n e d u n a b s o r b e d i n t h e s u b c u t a n e o u s s p a c e a t i n j e c t i o n s i t e s . A l s o , o n e month a f t e r s u r g e r y , t h e r e m a i n i n g 1/3 o f t h e l e f t k i d n e y had h y p e r t r o p h i e d t o a s i z e a s l a r g e as an undamaged k i d n e y . P r e s u m a b l y , r e l a t i v e l y n o r m a l r e n a l f u n c t i o n had b e e n r e g a i n e d b y t h i s t i m e , t h i s p o s s i b i l i t y b e i n g s t r e n g h t e n e d by t h e o b s e r v a t i o n t h a t s e r u m u r e a c o n -c e n t r a t i o n s w e r e e l e v a t e d o n l y 2 f o l d i n t h e 5 / 6 n e p h r e c t o m i s e d r a t s ( T a b l e 7) a t t h e t i m e o f s a c r i f i c e ( T a b l e 8 shows t h a t 4 - 6 d a y s a f t e r 5 / 6 n e p h r e c -t o m y , s e r u m u r e a i s a b o u t 4 - 6 t i m e s h i g h e r t h a n i n c o n t r o l r a t s ) . T a b l e 7 . E v i d e n c e f o r c i r c u l a t o r y a b s o r p t i o n o f s u b c u t a n e o u s l y -i n j e c t e d A 1 ( 0 H ) 3 E x p e r i m e n t a l S u r g i c a l E l e m e n t a l S e r u m S e r u m B r a i n g r o u p p r e t r e a t m e n t a l u m i n u m a l u m i n u m u r e a a l u m i n u m d o s e , 14 ( u g / L ) ( m m o l / L ) ( y g / g d r y i n j e c t i o n s w e i g h t C o n t r o l s ( 6 ) None None 5 . 8 * 4 . 2 9 . 2 * 0 . 6 1 0 . 1 * 1 . 1 G r o u p B ( 6 ) None 2 0 0 mg/kg 6 9 . 3 * 4 . 6 7 . 0 * 0 . 2 9 . 5 * 1 . 1 G r o u p C (6) 5 / 6 2 0 0 m g / k g 6 0 . 8 * 1 0 . 7 * 1 7 . 3 * 1 . 4 * 1 1 . 5 * 1 . 2 n e p h r e c t o m y V a l u e s shown a r e mean ± S E M . The number o f r a t s a n a l y s e d a r e i n d i -c a t e d i n p a r e n t h e s e s . B r a i n a l u m i n u m c o n t e n t was m e a s u r e d i n c e r e -b e l l u m u s i n g t h e d r y - a s h i n g EDTA m e t h o d . V a l u e s t h a t d i f f e r f r o m c o n t r o l s : * P < 0 . 0 0 1 . A b s e n c e o f l a s t i n g n e p h r o t o x i c i t y i n 1 i t h i u m - t r e a t e d r a t s B e f o r e c o m m e n c i n g A l i n j e c t i o n s , some r a t s ( G r o u p s D a n d E i n T a b l e 5 , and t h e i r c o r r e s p o n d i n g c o n t r o l s ) w e r e f e d l a r g e a m o u n t s o f l i t h i u m c h l o r i d e ( L i C l ) c h r o n i c a l l y . C h r i s t e n s e n e t a l . ( 1 9 8 3 ) h a d r e p o r t e d t h e p r o d u c t i o n o f i r r e v e r s i b l e c h r o n i c r e n a l f a i l u r e i n r a t s f e d L i C l ( 4 0 m m o l / k g o f g r o u n d chow) f r o m b i r t h u n t i l 16 w e e k s . S i n c e t h i s p r o c e d u r e a p p e a r e d t o o f f e r a means o f i m p a i r i n g r e n a l f u n c t i o n , we r e p e a t e d t h e s e i n v e s t i g a t o r s * p r o c e -- 155 -d u r e , g i v i n g L i C l t o n e w b o r n r a t pups i n t h e d o s a g e u s e d b y t h e f o r e g o i n g i n v e s t i g a t o r s , f o r t h e f i r s t 10 w e e k s , and i n c o n s i d e r a b l y h i g h e r d o s a g e f o r t h e l a s t 6 weeks ( r a t s w e r e f e d chow c o n t a i n i n g 60 mmol L i C l / k g f r o m age 10 t o 12 w e e k s , and 8 0 m m o l / k g f o r t h e n e x t 4 w e e k s ) . N o r m a l r a t chow was r e -i n s t i t u t e d a t 16 w e e k s . T h e r e w e r e no d e a t h s d u r i n g t h e l i t h i u m t r e a t m e n t and t h e g r o w t h o f t h e s e a n i m a l s was u n i m p a i r e d . A t t h e end o f 10 and 16 weeks o f t r e a t m e n t , b l o o d was c o l l e c t e d f r o m t h e t a i l v e i n o f r a t s t o m e a s -u r e s e r u m u r e a c o n t e n t as an i n d i c a t i o n o f t h e d e g r e e o f r e n a l i m p a i r m e n t . The mean s e r u m u r e a c o n c e n t r a t i o n s i n t h e s e r a t s w e r e 1 0 . 1 and 7 . 7 mmol/1 a t t h e end o f 10 and 16 w e e k s o f L i C l t r e a t m e n t r e s p e c t i v e l y , w h i l e c o n t r o l r a t s had a mean s e r u m u r e a c o n c e n t r a t i o n o f 7 . 9 mmol/1. T h u s , t h e h o p e d - f o r r e n a l i m p a i r m e n t had n o t b e e n a c h i e v e d . We t h e n d e c i d e d t o n e p h r e c t o m i s e a g r o u p o f l i t h i u m - t r e a t e d r a t s f o r A1(0H) 3 i n j e c t i o n s . R a t s i n j e c t e d w i t h A1(0H) 3 p r o m p t l y a f t e r n e p h r e c t o m y S i x t y f o u r l i t t e r - m a t e r a t s o f b o t h s e x e s , a l l o f w h i c h had b e e n g i v e n h i g h d o s e s o f L i C l o r a l l y f o r t h e f i r s t 4 m o n t h s o f l i f e , w e r e p l a c e d on a l i t h i u m - f r e e d i e t f o r 7 t o 24 d a y s , a n d t h e n u n d e r w e n t 5 / 6 n e p h r e c t o m i e s ( T a b l e 5 , g r o u p D r a t s ) . The r a p i d i t y o f t h e c o m p e n s a t o r y r e n a l h y p e r t r o p h y w h i c h we had o b s e r v e d i n G r o u p C r a t s l e d us t o c o n c l u d e t h a t l i t t l e a d v a n -t a g e was l i k e l y t o be a c h i e v e d b y a l l o w i n g a s u b s t a n t i a l p e r i o d o f t i m e t o e l a p s e b e t w e e n p a r t i a l n e p h r e c t o m y and t h e i n i t i a t i o n o f A l i n j e c t i o n s . T h u s , b e g i n n i n g 24 h a f t e r s u r g e r y , a n i m a l s w e r e i n j e c t e d s u b c u t a n e o u s l y o n c e d a i l y w i t h e i t h e r an A1(0H) 3 s u s p e n s i o n p r o v i d i n g 2 0 0 mg/kg o f e l e -m e n t a l A l , o r w i t h s a l i n e . I n j e c t i o n s c o n t i n u e d f o r o n l y 3 o r 5 d a y s . I t was n o t p o s s i b l e t o c o n t i n u e f u r t h e r , due t o t h e number o f d e a t h s o c c u r i n g i n b o t h g r o u p s . The m o r t a l i t y r a t e i n t h i s p e r i o d was much h i g h e r f o r t h e - 156 -A l - t r e a t e d r a t s ( 5 8 % , 22 o f 3 8 ) t h a n i n s a l i n e c o n t r o l s (27%, 7 o f 2 6 ) , D e a t h i n t h e l a t t e r g r o u p was p r e s u m a b l y due t o u r e m i a , w h i l e d e a t h i n t h e A l g r o u p was p r e s u m a b l y due t o c o m b i n e d u r e m i a and A l t o x i c i t y . S e v e n s u r v i v i n g r a t s w e r e s a c r i f i c e d 24h a f t e r t h e t h i r d A H O H ) ^ i n -j e c t i o n ( i . e . 4 d a y s p o s t - n e p h r e c t o m y ) , w h i l e 9 w e r e s a c r i f i c e d 24 h a f t e r t h e f i f t h i n j e c t i o n ( i . e . 6 d a y s p o s t - n e p h r e c t o m y ) . B e c a u s e no s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s w e r e f o u n d b e t w e e n t h e s e 2 s u b - g r o u p s , n e u r o c h e m i c a l d a t a f o r t h e 2 g r o u p s h a v e b e e n c o m b i n e d i n T a b l e 8 . The r e s u l t s show t h a t r e l a t i v e -l y b r i e f e x p o s u r e t o A l i m m e d i a t e l y a f t e r t h e 5 / 6 n e p h r e c t o m y d i d n o t e l e -v a t e A l c o n t e n t i n t h e b r a i n , n o r d i d i t h a v e a n y e f f e c t on b r a i n GABA c o n -t e n t , e v e n t h o u g h t h e b r a i n u r e a c o n t e n t i n n e p h r e c t o m i s e d r a t s t r e a t e d e i t h e r w i t h A l o r s a l i n e was more t h a n 14 t i m e s t h a t o f n o n - n e p h r e c t o m i s e d r a t s . T a b l e 8 . E f f e c t s o f A 1 ( 0 H ) 2 o r s a l i n e i n j e c t i o n s s t a r t e d 24 h a f t e r 5 / 6 n e p h r e c t o m y i n L i C l - p r e t r e a t e d r a t s A n i m a l s Serum B r a i n S e r u m B r a i n B r a i n a l u m i n u m a l u m i n u m u r e a u r e a GABA ( u g / L ) ( u g / g d r y ( m m o l / L ) ( p m o l / g w e t ( p m o l / g w e t w e i g h t ) _ w e i g h t ) w e i g h t ) . S a l i n e i n j e c t e d c o n t r o l s 19.8*5.2 ( 5 ) 1 . 8 5 * 0 . 1 9 ( 1 2 ) 5 7 . 4 * 1 3 . 4 ( 1 2 ) 7 6 . 1 * 1 7 . 5 ( 1 2 ) 2 . 5 3 * 0 . 0 7 ( 1 2 ) A l u m i n u m G r o u p D r a t s 7 5 . 2 * 6 . 9 ( 9 ) 1 . 6 3 * 0 . 1 4 ( 1 6 ) 3 6 . 8 * 7 . 1 ( 1 6 ) 5 6 . 0 * 1 1 . 4 ( 1 6 ) 2 . 6 1 * 0 . 0 7 ( 1 6 ) V a l u e s shown a r e mean * S E M , w i t h number o f a n i m a l s i n b r a c k e t s . R a t s w e r e k i l l e d 24 h a f t e r t h e l a s t o f 3 s c i n j e c t i o n s o f s a l -i n e , o r o f A 1 ( 0 H ) 3 i n a d o s a g e p r o v i d i n g 200 m g / k g / d a y o f e l e -m e n t a l A l . B r a i n a l u m i n u m c o n t e n t was m e a s u r e d b y t h e t e t r a -m e t h y l a m m o n i u m h y d r o x i d e m e t h o d . B r a i n u r e a c o n t e n t i n n o n -n e p h r e c t o m i s e d r a t s i s < 4 p m o l / g w e t w e i g h t , w h i l e s e r u m u r e a l e v e l f o r n o n - n e p h r e c t o m i s e d r a t s i s 9 . 2 * 0 . 6 mmol/L ( n = 6 ) . V a l u e s t h a t d i f f e r f r o m c o n t r o l s : * P < 0 . 0 0 1 . - 157 -I t seemed p o s s i b l e t h a t A l t r e a t m e n t m i g h t be l e s s l e t h a l i n a n i m a l s w i t h l e s s s e v e r e r e n a l i m p a i r m e n t a n d t h u s make i t p o s s i b l e t o d e t e r m i n e w h e t h e r o r n o t l o n g e r e x p o s u r e t o h i g h s e r u m A l c o n c e n t r a t i o n s m i g h t l e a d t o s u b s t a n t i a l b r a i n u p t a k e o f t h e m e t a l . The r e m a i n i n g 1 i t h i u m - p r e t r e a t e d r a t s ( n = 3 0 ) t h e r e f o r e u n d e r w e n t u n i l a t e r a l n e p h r e c t o m y and w e r e i n j e c t e d s u b c u t a n e o u s l y w i t h e i t h e r A 1 ( 0 H ) 3 s u s p e n s i o n s u f f i c i e n t t o p r o v i d e 2 0 0 m g / k g / d a y • o f e l e m e n t a l A l ( T a b l e 5 , G r o u p E , n = 1 6 ) , o r w i t h s a l i n e ( n = 1 4 ) . I n j e c t i o n s s t a r t e d 24 h a f t e r n e p h r e c t o m y , c o n t i n u e d d a i l y f o r 3 0 d a y s , and t h e a n i m a l s w e r e s a c r i f i c e d 24 h a f t e r t h e l a s t i n j e c t i o n . T h e s e h e m i n e p h r e c t o m i s e d r a t s t h r i v e d , and t h e r e was no p o s t - o p e r a t i v e m o r t a l i t y . Mean c e r e b e l l a r A l c o n t e n t was o n l y s l i g h t l y i n c r e a s e d (P< 0 . 0 5 , S t u d e n t ' s t - t e s t ) i n t h e A l - t r e a t e d g r o u p ( 3 . 2 0 ± 0 . 3 1 u g / g d r y w e i g h t ) when c o m p a r e d t o c o n t r o l s ( 2 . 2 4 ± 0 . 2 5 ) (mean ± S E M ) . No GABA d e f i c i e n c y was e v i d e n t i n t h e b r a i n s o f t h e A l - t r e a t e d g r o u p . - 158 -V) CONCLUSIONS T h e q u e s t i o n as t o w h e t h e r o r n o t A l i s t h e c a u s a t i v e f a c t o r i n DE was n o t a n s w e r e d b y o u r a n i m a l e x p e r i m e n t s . We f a i l e d t o p r o d u c e e l e v a t i o n o f A l i n t h e b r a i n s o f r a t s t r e a t e d w i t h A l ( 0 H ) - j , . e v e n t h o u g h we e m p l o y e d h e m i n e p h r e c t o m y , 5 / 6 n e p h r e c t o m y , a n d / o r c h r o n i c l i t h i u m a d m i n i s t r a t i o n i n a t t e m p t s t o d e c r e a s e t h e r e n a l e x c r e t i o n o f A l . T h i s f a i l u r e was c l e a r l y n o t due t o t h e l a c k o f a b s o r p t i o n o f t h e A H O H ) ^ s u s p e n s i o n d e p o s i t e d • s u b -c u t a n e o u s l y . I n f a c t , b l o o d A l c o n c e n t r a t i o n was e l e v a t e d o n e o r d e r o f m a g -n i t u d e i n r a t s i n j e c t e d s u b c u t a n e o u s l y w i t h t h i s A l c o m p o u n d , w h e t h e r o r n o t t h e s e r a t s w e r e n e p h r e c t o m i s e d ( T a b l e 7 ) . O t h e r i n v e s t i g a t o r s c l a i m t o h a v e b e e n more s u c c e s s f u l i n p r o d u c i n g A l a c c u m u l a t i o n i n t h e b r a i n s o f r a t s t r e a t e d w i t h A l c o m p o u n d s . F o r e x a m p l e , t h e r e p o r t by B e r l y n e e t a l . ( 1 9 7 2 ) c l a i m s t h a t r a t s w i t h n o r m a l r e n a l f u n c -t i o n , and g i v e n an u n s p e c i f i e d number o f s u b c u t a n e o u s i n j e c t i o n s o f A 1 ( 0 H ) 3 ( 1 5 0 m g / k g / d a y a s e l e m e n t a l A l ) , d e v e l o p e d a m a r k e d l y e l e v a t e d b r a i n A l c o n t e n t ( 3 4 0 ug/ g d r y w e i g h t ) , a l t h o u g h c o n t r o l v a l u e s w e r e n o t g i v e n i n t h i s s t u d y . M o r e m o d e s t A l e l e v a t i o n s , g e n e r a l l y l e s s t h a n 4 ug/ g d r y w e i g h t ( f r o m c o n t r o l v a l u e s o f a b o u t 1 ug/ g d r y w e i g h t ) , w e r e r e p o r t e d b y o t h e r s ( A r i e f f e t a l . 1 9 7 9 ; B o w d l e r e t a l . 1 9 7 9 ; M a y o r e t a l . 1 9 8 0 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t a t l e a s t o n e o f t h e s e s t u d i e s e n c o u n t e r e d t e c h n i c a l d i f -f i c u l t i e s w h i c h r e s u l t e d i n u n r e l i a b l e m e a s u r e m e n t s o f t i s s u e A l l e v e l s . A c c u r a t e m e a s u r e m e n t s o f A l i n b i o l o g i c a l m a t e r i a l s a r e made d i f f i c u l t b y s o u r c e s o f c o n t a m i n a t i o n , a n a l y t i c a l i n t e r f e r e n c e s , and l a c k o f a p p r o p r i a t e s t a n d a r d s . I m p o r t a n t s o u r c e s o f c o n t a m i n a t i o n i n c l u d e l e a c h i n g o f A l f r o m g l a s s o r p l a s t i c v i a l s ( d e s p i t e c a r e f u l c l e a n i n g w i t h d i s o d i u m E D T A ) , A l c o n t a m i n a t i o n o f r e a g e n t s , and A l d u s t i n a m b i e n t a i r ( M i n c z e w s k i e t a l . 1 9 8 2 ) . A n a l y t i c a l i n t e r f e r e n c e s a r e b o t h s p e c t r a l and c h e m i c a l (Goode e t - 159 -a l . 1 9 7 7 ; , S l a v i n e t a l . 1 9 8 3 ) . The s u b s t a n t i a l l y h i g h e r mean b r a i n A l c o n -t e n t o f c o n t r o l a n i m a l s w h i c h we o b t a i n e d when A l was d e t e r m i n e d by t h e d r y -a s h i n g EDTA m e t h o d ( T a b l e 6 ) , as c o m p a r e d t o t h a t o b t a i n e d w i t h t h e t e t r a -m e t h y l a m m o n i u m h y d r o x i d e m e t h o d ( T a b l e 8 ) , was p r o b a b l y due t o l e a c h i n g o f A l f r o m h e a t - a c t i v a t e d g l a s s i n t h e v i a l s . T h i s e x p l a n a t i o n i s s u p p o r t e d by o u r f i n d i n g i n B o v i n e L i v e r S t a n d a r d R e f e r e n c e M a t e r i a l , N o . 1 5 7 7 a , o f an A l c o n t e n t o f 8 t o 10 y g / g u s i n g t h e d r y - a s h i n g EDTA m e t h o d , b u t o f o n l y 3 t o 5 u g / g w i t h t h e t e t r a m e t h y l a m m o n i u m h y d r o x i d e m e t h o d . We assume t h a t we f a i l e d t o p r o d u c e A l a c c u m u l a t i o n i n r a t b r a i n e i t h e r b e c a u s e r e n a l f u n c t i o n was s t i l l a d e q u a t e t o e x c r e t e t h e l a r g e a m o u n t s o f A l i n j e c t e d , o r b e c a u s e A l f a i l e d t o c r o s s t h e b l o o d - b r a i n b a r r i e r and was p r e -f e r e n t i a l l y d e p o s i t e d i n some o t h e r t i s s u e , s u c h as b o n e . C h r o n i c e l e v a t i o n o f b l o o d A l c o n c e n t r a t i o n s i n t h e s e r a t s was c l e a r l y i n s u f f i c i e n t t o a l t e r a n y o f t h e n e u r o c h e m i c a l p a r a m e t e r s we m e a s u r e d . I t w i l l b e n e c e s s a r y t o e s t a b l i s h p e r m a n e n t r e n a l f a i l u r e i n t h e r a t , o r t o u s e some o t h e r l a b o r a -t o r y a n i m a l , f o r e x a m p l e t h e r a b b i t ( Y a t e s e t a l . 1 9 8 0 ; K o s i k e t a l . 1 9 8 3 ; Y o k e l e t a l . 1 9 8 3 ) , t o a n s w e r t h e q u e s t i o n as t o w h e t h e r o r n o t b r a i n A l a c c u m u l a t i o n i n DE p a t i e n t s c a u s e s t h e d e f i c i e n c i e s o f GABA c o n t e n t a n d CAT a c t i v i t y , as w e l l as t h e symptoms o f DE. T h i s a n s w e r i s u r g e n t l y n e e d e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e t r e a t m e n t o f h e m o d i a l y s e d r e n a l f a i l u r e p a t i e n t s s h o u l d be m o d i f i e d , e s p e c i a l l y w i t h r e g a r d t o t h e o r a l a d m i n i s t r a t i o n o f p h o s p h a t e - b i n d i n g A l g e l s . A l s o , i f A l p r o v e d t o be t o x i c , t h e n n o r m a l i n -d i v i d u a l s who consume A l - c o n t a i n i n g g e l s as a n t a c i d s s h o u l d p e r h a p s be c a u -t i o u s , a l t h o u g h i t g e n e r a l l y i s a s s u m e d t h a t t h e n o r m a l r e n a l f u n c t i o n i n t h e s e s u b j e c t s c a n o f f s e t o r p r e v e n t t h e a c c u m u l a t i o n o f A l i n t h e b o d y . - 160 -V I ) REFERENCES A c k r i H P , R a l s t o n A J , Day J P , Hodge K C , S u c c e s s f u l r e m o v a l o f a l u m i n i u m f r o m p a t i e n t w i t h d i a l y s i s e n c e p h a l o p a t h y , L a n c e t i i : 6 9 2 — 6 9 3 , 1 9 8 0 . A l f r e y A C , D i a l y s i s e n c e p h a l o p a t h y s y n d r o m e , A n n . R e v . M e d . 2 9 : 9 3 - 9 8 , 1 9 7 8 . A l f r e y A C , L e G r e n d r e GR, K a e h n y WD, The d i a l y s i s e n c e p h a l o p a t h y s y n d r o m e : P o s s i b l e a l u m i n u m i n t o x i c a t i o n , New E n g l . J . M e d . 2 9 4 : 1 8 4 - 1 8 8 , 1 9 7 6 . A l f r e y A C , M i s h e l l J M , B u r k s J , C o n t i g u g l i a S R , R u d o l p h H , L e w i n E , Holmes , J H , S y n d r o m e o f d y s p r a x i a a n d m u l t i f o c a l s e i z u r e s a s s o c i a t e d w i t h c h r o n i c h e m o d i a l y s i s , T r a n s . Am. S o c . A r t i f . I n t e r n . O r g a n s 1 8 : 2 5 7 - 2 6 1 , 1 9 7 2 . A r i e f f A I , C o o p e r J D , A r m s t r o n g D, L a r a r o w i t z V G , D e m e n t i a , r e n a l f a i l u r e , and b r a i n a l u m i n u m , A n n . I n t . M e d , 9 0 : 7 4 1 - 7 4 7 , 1 9 7 9 . A r i e f f A I , N e u r o l o g i c a l c o m p l i c a t i o n s o f u r e m i a , I n : T h e K i d n e y , B r e u n e r BM ( e d i t o r ) , 2 3 0 6 - 2 3 4 3 , 1 9 8 1 . B a e s t r u p C , N i e l s e n M , A n x i e t y , L a n c e t i i : 1 0 3 0 - 1 0 3 4 , 1 9 8 2 . B a r r a t t L J , L a w r e n c e J R , D i a l y s i s - a s s o c i a t e d d e m e n t i a , A u s t . N . Z . J . M e d . 5 : 6 2 - 6 5 , 1 9 7 5 . B e r k s e t h R, M a h o w a l d M, A n d e r s o n D, S h a p i r o F , D i a l y s i s e n c e p h a l o p a t h y ( D E ) : D i a g n o s t i c c r i t e r i a and e p i d e m i o l o g y o f 39 p a t i e n t s , K i d n e y I n t . 1 4 : 6 7 0 , 1 9 7 8 . B e r l y n e GM, Y a g i l R, Ben A r i J , W e i n b e r g e r G , K n o f f E , D a n o v i t c h GM, A l u -m i n i u m t o x i c i t y i n r a t s , L a n c e t i : 5 6 4 - 5 6 8 , 1 9 7 2 . Boegman R J , B a t e s L A , N e u r o t o x i c i t y o f a l u m i n u m , C a n . J . P h y s i o l . P h a r m a c o l . 6 2 : 1 0 1 0 - 1 0 1 4 , 1 9 8 4 . B o w d l e r N C , B e a s l e y D S , F r i t z e EC^ G o u T e t t e A M , H a t t o n J D , H e s s i o n J , Ostman D L , Rugg D J , S c h m i t t d i e l C J , B e h a v i o r a l e f f e c t s o f a l u m i n u m i n g e s t i o n on a n i m a l and human s u b j e c t s , P h a r m a c o l . B i o c h e m . B e h a v i o r 1 0 : 5 0 5 - 5 1 2 , 1 9 7 9 . Buge A , P o i s s o n M, M a s s o n S , B l e i b a l J M , L a f f o r g u e B , Raymond P , J a u d o n MC, E n c e p h a l o p a t h i e p r o l o n g e e e t r e v e r s i b l e c h e z un d i a l y s e c h r o n i q u e : R e s p o n s a b i l i t e p r o b a b l e d e s s e l s d ' a l u m i n i u m , N o u v . P r e s s e M e d . 7 : 2 0 5 3 -2 0 5 9 , 1 9 7 8 . B u r k s J S , A l f r e y A C , H u d d l e s t o n e J , N o r e n b e r g MD, L e w i n E , A f a t a l e n c e p h a -l o p a t h y i n c h r o n i c h a e m o d i a l y s i s p a t i e n t s , L a n c e t i : 7 6 4 - 7 6 8 , 1 9 7 6 . C a m p b e l l I R , C a s s J S , C h o l a k J , K e h o e R A , A l u m i n u m i n t h e e n v i r o n m e n t o f m a n : A r e v i e w o f i t s h y g i e n i c s t a t u s , AMA A r c h . I n d u s t r . H e a l t h 1 5 : 3 5 9 -4 4 8 , 1 9 5 7 . C a r t i e r F , A l l a i n P , C h e v e t D, G a r r e M , H e r v e J P , P e c k e r S, P r o g r e s s i v e d i a l y s i s m y o c l o n i c e n c e p h a l o p a t h y : R e s p o n s i b i l i t y o f t a p w a t e r , K i d n e y I n t . 1 3 : 4 3 4 - 4 3 5 , 1 9 7 8 . - 161 -C h o k r o v e r t y S , B r u e t m a n ME, B e r g e r V , R e y e s MG, P r o g r e s s i v e d i a l y t i c e n c e -p h a l o p a t h y , J . N e u r o l . N e u r o s u r g . P s y c h i a t r y 3 9 : 4 1 1 - 4 1 9 , 1 9 7 6 . C h r i s t e n s e n S , O t t o s e n P D , L i t h i u m - i n d u c e d u r e m i a i n r a t s - A new model o f c h r o n i c r e n a l f a i l u r e , P f l u g e r s A r c h . 3 9 9 : 2 0 8 - 2 1 2 , 1 9 8 3 . C h u i H C , D a m a s i o A R , P r o g r e s s i v e d i a l y s i s e n c e p h a l o p a t h y ( ' d i a l y s i s d e m e n -t i a ' ) , J . N e u r o l . 2 2 2 : 1 4 5 - 1 5 7 , 1 9 8 0 . C l a r k s o n E M , L u c k V A , H y n s o n WV, B a i l e y RR, E a s t w o o d J B , Woodhead J S , C l e -m e n t s V R , O &#