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A kinetic analysis of transcription initiation by the Bacillus subtilis sigma-43 RNA polymerase : the.. Dobinson, Katherine Frances 1986

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A K I N E T I C A N A L Y S I S OF T R A N S C R I P T I O N I N I T I A T I O N BY THE B A C I L L U S S U B T I L I S S I G M A - 4 3 RNA P O L Y M E R A S E . THE E F F E C T OF THE DELTA SUBUNIT by KATHERINE FRANCES DOBINSON B . S c . The U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1980 A T H E S I S SUBMITTED IN P A R T I A L F U L F I L L M E N T OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY i n THE FACULTY OF GRADUATE S T U D I E S D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H COLUMBIA © K a t h e r i n e D o b i n s o n , 1986 In presenting this thesis in partial fulfilment of the requirements for an advanced degree at the University of British Columbia, I agree that the Library shall make it freely available for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of this thesis for scholarly purposes may be granted by the head of my department or by his or her representatives. It is understood that copying or publication of this thesis for financial gain shall not be allowed without my written permission. Department The University of British Columbia 1956 Main Mall Vancouver, Canada V6T 1Y3 Date t\W-ftk DE-6(3/81) ABSTRACT The i n i t i a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n by t h e B a c i l l u s s u b t i l i s s i g m a - M 3 RNA p o l y m e r a s e a t two B a c i l l u s phage 029 p r o m o t e r s and t h e e f f e c t o f t h e d e l t a s u b u n i t on i n i t i a t i o n have b e e n i n v e s t i g a t e d by an i r i v i t r o k i n e t i c a n a l y s i s . The t e m p l a t e s f o r t h e a n a l y s i s w e r e p l a s m i d s w h i c h c a r r i e d t h e 4>29 A2 o r G2 p r o m o t e r . The c l o n i n g and l o c a l i z a t i o n o f t h e A2 p r o m o t e r a r e r e p o r t e d h e r e . The k i n e t i c s o f RNA s y n t h e s i s i n i t i a t i o n we re e x a m i n e d u s i n g a s i n g l e - r o u n d r u n - o f f t r a n s c r i p t i o n a s s a y i n w h i c h m u l t i p l e i n i t i a t i o n e v e n t s a t a s i n g l e p r o m o t e r w e r e i n h i b i t e d w i t h h e p a r i n . I t was o b s e r v e d t h a t t h e f o r m a t i o n o f h e p a r i n - r e s i s t a n t c o m p l e x e s a t t h e A2 p r o m o t e r r e q u i r e d t h e p r e s e n c e o f t h e i n i t i a t i n g n u c l e o t i d e s , w h i l e t h e RNA p o l y m e r a s e a l o n e was a b l e t o f o r m h e p a r i n - r e s i s t a n t , n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s a t t h e G2 p r o m o t e r . The G2 p r o m o t e r was a l s o shown by a c o m p e t i t i o n a s s a y t o be a s t r o n g e r p r o m o t e r t h a n A 2 . The e f f e c t o f t h e d e l t a s u b u n i t on c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e two p r o m o t e r s was i n v e s t i g a t e d w i t h t h e s i n g l e - r o u n d t r a n s c r i p t i o n a s s a y . D e l t a had no e f f e c t on t h e f o r m a t i o n o f i n i t i a t i o n c o m p l e x e s a t t h e G2 p r o m o t e r b u t l o w e r e d t h e r a t e and e x t e n t o f c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 p r o m o t e r . The e f f e c t o f d e l t a on t h e k i n e t i c p a r a m e t e r s o f c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 p r o m o t e r was a l s o i n v e s t i g a t e d . The d a t a s u g g e s t e d t h a t d e l t a a f f e c t s t h e e f f i c i e n c y w i t h w h i c h t h e e n z y m e / p r o m o t e r c o m p l e x e s u n d e r g o t h e i i t r a n s i t i o n ( s ) t o a c o m p l e x f r o m w h i c h RNA s y n t h e s i s c a n be i n i t i a t e d , a l t h o u g h o t h e r i n t e r p r e t a t i o n s w e r e p o s s i b l e . A m o d e l f o r t h e e f f e c t o f d e l t a i s p r o p o s e d , i n w h i c h i t i s p o s t u l a t e d t h a t t h e r e l e a s e o f d e l t a f r o m t h e e n z y m e / p r o m o t e r c o m p l e x i s e s s e n t i a l f o r i n i t i a t i o n . E n z y m e w h i c h i s a s s o c i a t e d w i t h d e l t a c a n i n t e r a c t w i t h b o t h t h e A2 and G2 p r o m o t e r s b u t c o m p l e x e s a t t h e w e a k e r A2 p r o m o t e r do n o t e f f i c i e n t l y r e l e a s e d e l t a , t h u s s l o w i n g t h e f o r m a t i o n o f i n i t i a t i o n c o m p l e x e s . i i i TABLE OF CONTENTS A b s t r a c t i i T a b l e o f C o n t e n t s i v L i s t o f F i g u r e s v i L i s t o f T a b l e s v i i i L i s t o f A b b r e v i a t i o n s i x A c k n o w l e d g e m e n t s x 1 . INTRODUCTION 1 I I . MATERIALS AND METHODS A . Phage and P l a s m i d DNA 12 B . M e d i a 13 C . C o n s t r u c t i o n o f p 3 2 8 - 5 13 D. DNA-RNA H y b r i d i z a t i o n A n a l y s i s 14 E . RNA P o l y m e r a s e P u r i f i c a t i o n 15 F . I s o l a t i o n o f C o r e / s i g m a 18 G. P u r i f i c a t i o n o f t h e D e l t a S u b u n i t 19 H. I n v i t r o T r a n s c r i p t i o n A s s a y s 20 I I I . RESULTS 1 . C l o n i n g and L o c a l i z a t i o n o f t h e 029 A2 P r o m o t e r 23 2 . P u r i f i c a t i o n o f t h e RNA P o l y m e r a s e and D e l t a F a c t o r 31 3 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e C o n d i t i o n s f o r t h e I n v i t r o S i n g l e Round T r a n s c r i p t i o n A s s a y 3 8 4 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e I n i t i a t i o n R e a c t i o n and t h e E f f e c t o f D e l t a on I n i t i a t i o n a t t h e A2 and G2 P r o m o t e r s A . I n i t i a t i o n a t t h e A2 P r o m o t e r 54 i v B . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e I n i t i a t i o n R e a c t i o n a t t h e G2 P r o m o t e r 89 I V . D I S C U S S I O N A . M e t h o d s f o r M e a s u r i n g I n i t i a t i o n R a t e s 96 B . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e I n v i t r o T r a n s c r i p t i o n A s s a y 98 C . C h a r a c t e r i s t i c s o f H e p a r i n - r e s i s t a n t C o m p l e x F o r m a t i o n a t t h e A2 P r o m o t e r 100 D. C h a r a c t e r i s t i c s o f H e p a r i n - r e s i s t a n t C o m p l e x F o r m a t i o n a t t h e G2 P r o m o t e r 105 E . The E f f e c t o f t h e D e l t a S u b u n i t on C o m p l e x F o r m a t i o n a t t h e A2 and G2 P r o m o t e r s 106 F . M o d e l f o r C o m p l e x F o r m a t i o n a t t h e A2 and G2 P r o m o t e r s 115 G . C o m p a r i s o n o f t h e S e q u e n c e s o f t h e A2 and G2 P r o m o t e r s 119 R E F E R E N C E S 122 v LIST OF TABLES Table I. Assay f o r RNase and DNase a c t i v i t y i n the d e l t a p r e p a r a t i o n 41 Table I I . Template c o m p e t i t i o n assay 79 Table I I I . K i n e t i c parameters observed f o r d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s of B a c i l l u s s u b t i l i s RNA polymerase . .88 v i L I S T OF F I G U R E S F i g u r e 1 . R e s t r i c t i o n a n a l y s i s o f t h e p l a s m i d P 3 2 8 - 5 26 F i g u r e 2 . R e s t r i c t i o n map o f p l a s m i d p 3 2 8 - 5 . 27 F i g u r e 3 . H y b r i d i z a t i o n o f p 3 2 8 - 5 t r a n s c r i p t s t o P 3 2 8 - 5 and $29 DNA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s 30 F i g u r e 4 . A s s a y f o r DNase a c t i v i t y i n t h e RNA p o l y m e r a s e p r e p a r a t i o n 33 F i g u r e 5 . S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f p u r i f i e d B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e 37 F i g u r e 6 . S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f p u r i f i e d d e l t a 40 F i g u r e 7 . A s s a y f o r p r o t e o l y t i c a c t i v i t y i n t h e d e l t a p r e p a r a t i o n 43 F i g u r e 8 . E f f e c t o f h e p a r i n c o n c e n t r a t i o n on t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r 47 F i g u r e 9 . The e f f e c t o f enzyme c o n c e n t r a t i o n on t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r 50 F i g u r e 1 0 . E f f e c t o f t h e i n i t i a t i o n t i m e i n t e r v a l on t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r 53 F i g u r e 11 . The e f f e c t o f t h e e l o n g a t i o n t i m e i n t e r v a l on t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r 56 F i g u r e 1 2 . N u c l e o t i d e r e q u i r e m e n t s f o r h e p a r i n - r e s i s t a n t c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 p r o m o t e r 59 F i g u r e 1 3 . E f f e c t o f d e l t a on t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r 65 F i g u r e 1 4 . E f f e c t o f d e l t a on c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 p r o m o t e r 68 F i g u r e 1 5 . S e m i l o g a r i t h m i c p l o t o f t h e d a t a f r o m A G - i n i t i a t i o n t i m e c o u r s e s i n F i g u r e 12a and b 71 v i i F i g u r e 1 6 . E f f e c t o f d e l t a on t h e maximum l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r a t d i f f e r e n t enzyme c o n c e n t r a t i o n s 73 F i g u r e 1 7 . E f f e c t o f d e l t a on t h e s t a b i l i t y o f i n i t i a t e d c o m p l e x e s 76 F i g u r e 1 8 . E x a m p l e o f d a t a o b t a i n e d f r o m i n i t i a t i o n t i m e c o u r s e s f o r u s e i n t a u p l o t a n a l y s i s 85 F i g u r e 1 9 . Tau p l o t f r o m a n a l y s i s o f c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 p r o m o t e r 87 F i g u r e 2 0 . N u c l e o t i d e r e q u i r e m e n t s f o r s t a b l e c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e G2 p r o m o t e r . . . . 92 F i g u r e 2 1 . E f f e c t o f d e l t a on i n i t i a t i o n f r o m t h e A2 and G2 p r o m o t e r s 95 F i g u r e 2 2 . M o d e l f o r t h e e f f e c t o f d e l t a on i n i t i a t i o n a t t h e A2 and G2 p r o m o t e r s 116 F i g u r e 23. P r o m o t e r s e q u e n c e s o f t h e A2 and G2 p r o m o t e r s 120 v i i i L I S T OF A B B R E V I A T I O N S b . p . B a s e p a i r BSA B o v i n e s e r u m a l b u m i n cpm C o u n t s p e r m i n u t e EDTA E t h y l e n e d i a m i n e t e t r a - a c e t i c a c i d kb K i l o b a s e p a i r s kd K i l o d a l t o n PEG P o l y e t h y l e n e g l y c o l PMSF P h e n y l m e t h y l s u l f o n y l f l u o r i d e r N T P R i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e SDS S o d i u m d o d e c y l s u l p h a t e SSC S t a n d a r d s a l i n e c i t r a t e TCA T r i c h l o r o a c e t i c a c i d i x ACKNOWLEDGMENTS I w o u l d l i k e t o g i v e s p e c i a l t h a n k s t o G e o r g e S p i e g e l m a n f o r h i s c o n s t a n t e n c o u r a g e m e n t , i n v a l u a b l e a d v i c e and g u i d a n c e . To my f r i e n d s i n t h e l a b , and i n p a r t i c u l a r my o t h e r two c o h o r t s on t h e B a c i l l u s p r o j e c t , V e r a Webb and H a r r y D e n e e r , t h a n k y o u f o r y o u r many h e l p f u l d i s c u s s i o n s and g o o d h u m o u r . I w o u l d a l s o l i k e t o t h a n k J a m e s , f o r w i t h s t a n d i n g t h e o n s l a u g h t o f b a k i n g i n t i m e s o f s t r e s s , and f o r a l w a y s b e i n g t h e r e . F i n a l l y , t o my p a r e n t s , t h a n k y o u f o r y o u r u n f a i l i n g l o v e , s u p p o r t and e n c o u r a g e m e n t . I w o u l d a l s o l i k e t o a c k n o w l e d g e t h e f i n a n c i a l s u p p o r t o f an NSERC p o s t g r a d u a t e s c h o l a r s h i p and U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a W e s b r o o k F e l l o w s h i p . x INTRODUCTION I n E s c h e r i c h i a c o l i and o t h e r p r o k a r y o t e s t r a n s c r i p t i o n i s m e d i a t e d by a D N A - d e p e n d e n t RNA p o l y m e r a s e w h i c h i s r e s p o n s i b l e f o r t h e t r a n s c r i p t i o n o f m e s s e n g e r , r i b o s o m a l and t r a n s f e r R N A . Much o f t h e i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g b a c t e r i a l RNA p o l y m e r a s e s and RNA s y n t h e s i s h a s b e e n o b t a i n e d f r o m s t u d i e s o f t r a n s c r i p t i o n i n E . c o l i . The E.. c o l i RNA p o l y m e r a s e i s a m u l t i - s u b u n i t c o m p l e x c o m p o s e d o f a /3 and y 3 ' s u b u n i t ( o f a p p r o x i m a t e l y 1 5 0 , 0 0 0 and 1 6 0 , 0 0 0 k i l o d a l t o n s , r e s p e c t i v e l y ) , two 43 k i l o d a l t o n cx s u b u n i t s and one t o two omega s u b u n i t s a p p r o x i m a t e l y 11 k d i n s i z e ( B u r g e s s , 1 9 6 9 ; B e r g e t a l . , 1 9 7 1 ) . The c o r e p o l y m e r a s e c a t a l y z e s s y n t h e s i s o f t r a n s c r i p t s b u t c a n n o t a c c u r a t e l y i n i t i a t e t r a n s c r i p t i o n on n a t u r a l DNA t e m p l a t e s ( B u r g e s s e t a l . , 1 9 6 9 ; S u g i u r a e t a l . , 1 9 6 9 ; T r a v e r s and B u r g e s s , 1 9 6 9 ; B a u t z and B a u t z , 1 9 7 1 ) . An a d d i t i o n a l 7 0 , 0 0 0 d a l t o n s i g m a s u b u n i t w h i c h i s a s s o c i a t e d w i t h t h e c o r e enzyme i s e s s e n t i a l f o r s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n f r o m many E . c o l i p r o m o t e r s i t e s . R e c e n t l y , G r o s s m a n e_t a l . ( 1 9 8 4 ) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e h p t R g e n e p r o d u c t , w h i c h i s r e s p o n s i b l e f o r i n d u c i n g a number o f p r o t e i n s d u r i n g t h e h e a t s h o c k r e s p o n s e ( N e i d h a r d t e t a _ l . , 1 9 8 4 ) , a l s o f u n c t i o n s a s a s i g m a f a c t o r t o d i r e c t t r a n s c r i p t i o n f r o m p r o m o t e r s t h a t a r e n o t r e c o g n i z e d b y t h e s i g m a - 7 0 e n z y m e . The t r a n s c r i p t i o n p r o c e s s i n v o l v e s s e v e r a l s e q u e n t i a l s t e p s a t w h i c h RNA s y n t h e s i s c a n be c o n t r o l l e d : p r o m o t e r b i n d i n g and i n i t i a t i o n o f RNA s y n t h e s i s , e l o n g a t i o n and 1 t e r m i n a t i o n . I n p r o k a r y o t e s t h e s e q u e n c e o f e v e n t s i n v o l v e d i n t h e i n i t i a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n p l a y s an i m p o r t a n t r o l e i n t h e r e g u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n . The m e c h a n i s m o f p r o m o t e r b i n d i n g , t h e s u b s e q u e n t f o r m a t i o n o f i n i t i a t i o n c o m p l e x e s and t h e r e g u l a t i o n o f t h e s e e v e n t s h a v e t h e r e f o r e b e e n s t u d i e d i n t e n s i v e l y i n E . c o l i . The c u r r e n t m o d e l f o r t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n h a s e v o l v e d f r o m t h e r e l a t i v e l y s i m p l e s c h e m e , s u g g e s t e d by t h e work o f W a l t e r e t a_l . ( 1967 ) , i n v o l v i n g : 1) a b i n d i n g r e a c t i o n i n w h i c h t h e RNA p o l y m e r a s e i n t e r a c t e d s p e c i f i c a l l y ( a n d r e v e r s i b l y ) i n a " c l o s e d " c o m p l e x w i t h t h e DNA, 2 ) a m e l t i n g r e a c t i o n w h e r e b y t h e enzyme e f f e c t e d a l o c a l i z e d u n w i n d i n g o f t h e DNA a t t h e b i n d i n g s i t e t o f o r m an " o p e n " c o m p l e x and 3 ) RNA s y n t h e s i s f r o m t h e c o m p l e x f o r m e d i n s t e p 2 . H i n k l e and C h a m b e r l i n ( 1 9 7 2 b ) i n v e s t i g a t e d t h e k i n e t i c s o f f o r m a t i o n o f p h a g e T7 DNA/RNA p o l y m e r a s e c o m p l e x e s u s i n g a membrane f i l t e r b i n d i n g a s s a y i n w h i c h DNA t h a t h a s f o r m e d a s t a b l e a s s o c i a t i o n w i t h RNA p o l y m e r a s e c a n be d e t e c t e d by i t s r e t e n t i o n on n i t r o c e l l u l o s e membrane f i l t e r s . T h e i r d a t a showed t h a t t h e b i n d i n g r e a c t i o n f o l l o w e d f i r s t - o r d e r k i n e t i c s , s i n c e t h e r a t e o f t h e r e a c t i o n was d e p e n d e n t o n l y on t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e RNA p o l y m e r a s e . They a l s o o b s e r v e d t h a t t h e r a t e o f c o m p l e x f o r m a t i o n was s l o w e r t h a n w o u l d be e x p e c t e d f o r a r e a c t i o n w h i c h d e p e n d e d u p o n t h e d i f f u s i o n - c o n t r o l l e d i n t e r a c t i o n o f t h e c o m p o n e n t s . I t was t h e r e f o r e h y p o t h e s i z e d t h a t t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p i n RNA 2 s y n t h e s i s was t h e b i n d i n g and s u b s e q u e n t r e l e a s e o f p o l y m e r a s e f r o m n o n s p e c i f i c s i t e s on t h e DNA, p r i o r t o l o c a t i o n o f t h e p r o m o t e r s i t e . The m o d e l f o r t h e t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n p a t h w a y was t h u s m o d i f i e d , as f o l l o w s , t o i n c l u d e a p r e l i m i n a r y s t e p i n w h i c h t h e enzyme a s s o c i a t e s w i t h n o n - s p e c i f i c s i t e s on t h e DNA: E + D ^ E - D ^ E ^ = E - P C ^ = - E - P 0 w h e r e E - D ^ r e p r e s e n t s t h e n o n - s p e c i f i c e n z y m e / D N A c o m p l e x , and E - P c and E - P Q a r e t h e s p e c i f i c c l o s e d and o p e n p r o m o t e r c o m p l e x e s h y p o t h e s i z e d by W a l t e r e t a l . ( 1 9 6 7 ) . W h i l e t h e r e i s c o n s i d e r a b l e e v i d e n c e t o s u p p o r t t h e e x i s t e n c e o f p r o m o t e r - s p e c i f i c c l o s e d and o p e n c o m p l e x e s ( f o r r e v i e w s s e e C h a m b e r l i n , 1 9 7 4 ; v o n H i p p e l e t a l . , 1 9 8 2 ; M c C l u r e , 1 9 8 5 ) t h e r e i s a t t h e p r e s e n t t i m e no e v i d e n c e t h a t t r a n s i e n t i n t e r a c t i o n s o f t h e p o l y m e r a s e w i t h n o n - p r o m o t e r DNA i m p e d e s p r o m o t e r l o c a t i o n ( M c C l u r e , 1 9 8 5 ) . S t e f a n o and G r a l l a ( 1 9 7 9 ) o b s e r v e d t h a t t h e f o r m a t i o n o f s t a b l e p o l y m e r a s e / D N A c o m p l e x e s on a r e s t r i c t i o n f r a g m e n t w h i c h c a r r i e d t h e l a c U V 5 p r o m o t e r ( m e a s u r e d i n a f i l t e r b i n d i n g a s s a y , a s d e s c r i b e d a b o v e ) p r o c e e d e d w i t h a h a l f - t i m e o f a p p r o x i m a t e l y 0 . 2 m i n u t e s . H o w e v e r , o n c e f o r m e d , p o l y m e r a s e / l a e U V 5 p r o m o t e r c o m p l e x e s d i d n o t r a p i d l y s y n t h e s i z e RNA u p o n t h e a d d i t i o n o f n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e s s i n c e t h e h a l f - t i m e f o r i n i t i a t i o n f r o m p r e - f o r m e d c o m p l e x e s was a p p r o x i m a t e l y 1 m i n u t e . T h e s e d a t a s u g g e s t e d t h a t t h e i n i t i a t i o n o f RNA s y n t h e s i s was r a t e - l i m i t e d a t a s t e p s u b s e q u e n t t o t h e f o r m a t i o n o f p r o m o t e r - s p e c i f i c c o m p l e x e s . 3 S t e f a n o and G r a l l a ( 1 9 8 0 ) f u r t h e r i n v e s t i g a t e d t h e f o r m a t i o n o f c o m p l e x e s w i t h s e v e r a l m u t a n t l a c p r o m o t e r s . The r e a c t i o n r a t e s a t t h e d i f f e r e n t p r o m o t e r s showed a f i r s t o r d e r d e p e n d e n c e on t h e p o l y m e r a s e c o n c e n t r a t i o n and t h e r a t e v a r i e d by up t o two o r d e r s o f m a g n i t u d e b e t w e e n p r o m o t e r s . A m o d e l was t h e r e f o r e p r o p o s e d , i n w h i c h t h e f o r m a t i o n o f c o m p l e x e s a t t h e p r o m o t e r p r o c e e d e d t h r o u g h a k i n e t i c a l l y u n s t a b l e i n t e r m e d i a t e ( e q u i v a l e n t t o a c l o s e d c o m p l e x ) . The r a t e a t w h i c h f u n c t i o n a l c o m p l e x e s w e r e f o r m e d w o u l d d e p e n d u p o n t h e s t a b i l i t y o f t h e i n t e r m e d i a t e and t h e r a t e a t w h i c h i t was c o n v e r t e d t o a f u n c t i o n a l c o m p l e x . The t e r m f u n c t i o n a l r e f e r s h e r e t o t h e a b i l i t y o f t h e c o m p l e x e s t o d i r e c t l y i n i t i a t e t r a n s c r i p t i o n . O p e r a t i o n a l l y , f u n c t i o n a l c o m p l e x e s c a n be c o n s i d e r e d t o be o p e n c o m p l e x e s . M c C l u r e ( 1 9 8 0 ) i n d e p e n d e n t l y d e m o n s t r a t e d t h a t t h e b i n d i n g o f enzyme t o p r o m o t e r s and s u b s e q u e n t s t e p s c o u l d be s e p a r a t e l y q u a n t i t a t e d . S t u d i e s by C h a m b e r l i n and h i s c o l l e a g u e s ( K a d e s c h e t a l . , 1982 ; R o s e n b e r g e t a_l . , 1982 ) h a v e shown t h a t t e m p l a t e a s s o c i a t i o n and t h e f o r m a t i o n o f o p e n c o m p l e x e s a t t h e phage T7 A1 p r o m o t e r a r e i n s e n s i t i v e t o c h a n g e s i n t e m p e r a t u r e ( b e t w e e n 25 and 3 7 ° C ) and N a C l c o n c e n t r a t i o n , s u g g e s t i n g t h a t t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p i n t h e r e a c t i o n o c c u r s p r i o r t o o p e n c o m p l e x f o r m a t i o n ( i_e. i s n o t a DNA m e l t i n g r e a c t i o n ) . B a s e d on t h i s i n f o r m a t i o n , i n a d d i t i o n t o t h e wo rk o f S t e f a n o and G r a l l a ( 1 9 7 9 , 1 9 8 0 ) and M c C l u r e ( 1 9 8 0 ) , K a d e s c h e t a l . ( 1 9 8 2 ) p o s t u l a t e d t h e e x i s t e n c e o f a " p r e - c l o s e d " 4 p r o m o t e r c o m p l e x ( p o s s i b l y a n a l o g o u s t o DNA/RNA p o l y m e r a s e c o m p l e x e s a t n o n - p r o m o t e r s i t e s ) w h i c h i s o m e r i z e s t o f o r m a c l o s e d c o m p l e x . F i n a l l y , r e c e n t work by Buc and M c C l u r e (1985) and Roe e t a l . (1984) h a s a l s o s u g g e s t e d t h e p r e s e n c e o f an i n t e r m e d i a t e , o b s e r v e d o n l y a t l o w t e m p e r a t u r e s o r h i g h i o n i c s t r e n g t h s , b e t w e e n t h e c l o s e d and o p e n c o m p l e x e s . B a s e d on t h e a b o v e d a t a , M c C l u r e (1985) h a s p r o p o s e d t h e f o l l o w i n g m o d e l f o r c o m p l e x f o r m a t i o n : E + P ^ F = ^ E - P C ^ = ^ E - P ' c v - . E - P J ^ F ^ ^ E - P Q The c o m p l e x e s E - P E - P ' and E - P . a r e a l l c l o s e d c o m p l e x e s i n w h i c h t h e enzyme i s a s s o c i a t e d s p e c i f i c a l l y w i t h t h e p r o m o t e r b u t t h e DNA h e l i x a t t h e p r o m o t e r s i t e i s n o t u n w o u n d . I n t h e o p e n c o m p l e x E - P t h e DNA s t r a n d s a t t h e o p r o m o t e r a r e s e p a r a t e d . I t i s t h i s c o m p l e x w h i c h c a n i m m e d i a t e l y i n i t i a t e RNA s y n t h e s i s i n t h e p r e s e n c e o f r i b o n u c l e o t i d e s . The s e q u e n c e o f e v e n t s w h i c h l e a d t o t h e f o r m a t i o n o f p r o m o t e r - s p e c i f i c , f u n c t i o n a l c o m p l e x e s i s t h u s q u i t e c o m p l e x and i t i s c o n c e i v a b l e t h a t t h e e f f i c i e n c y o f t r a n s c r i p t i o n c a n be c h a n g e d by a l t e r i n g o n e , o r s e v e r a l s t e p s i n t h e p a t h w a y . T r a n s c r i p t i o n f r o m many E . c o l i p r o m o t e r s r e q u i r e s o n l y t h e RNA p o l y m e r a s e h o l o e n z y m e (/3/1 ' o ^ c r ) . P r o m o t e r s t r u c t u r e ( a s w e l l a s s t r u c t u r e o f t h e DNA w h i c h s u r r o u n d s t h e p r o m o t e r ) mus t t h e r e f o r e i n f l u e n c e t h e e n z y m e / D N A i n t e r a c t i o n s t h a t d e t e r m i n e t h e r a t e a t w h i c h t r a n s c r i p t i o n i s i n i t i a t e d f r o m t h o s e p r o m o t e r s ( s e e R o s e n b e r g and C o u r t , 1979; H a w l e y and M c C l u r e , 1983 f o r r e v i e w s ) . 5 E_. c o l i p r o m o t e r s h a v e two r e g i o n s o f h o m o l o g y c e n t r e d a p p r o x i m a t e l y 35 and 10 b a s e p a i r s u p s t r e a m o f t h e t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e . The c o n s e n s u s s e q u e n c e s a t t h e s e s i t e s a r e TTGACA and T A T A A T , r e s p e c t i v e l y ( R o s e n b e r g and C o u r t , 1 9 7 9 ; S i e b e n l i s t e t a l . , 1980 ) . M u t a t i o n s w h i c h a l t e r p r o m o t e r s e q u e n c e s s u c h t h a t t h e s e q u e n c e more c l o s e l y r e s e m b l e s t h e c o n s e n s u s s e q u e n c e h a v e b e e n shown t o e n h a n c e t r a n s c r i p t i o n . The l a c o p e r o n p r o m o t e r f o r e x a m p l e , w h i c h i s o n l y w e a k l y t r a n s c r i b e d i n v i v o i n t h e a b s e n c e o f t h e C A P / c y c l i c AMP c o m p l e x , h a s t h e - 1 0 s e q u e n c e TATGTT ( D i c k s o n ejt a l . , 1 9 7 5 , 1 9 7 7 ) . The m u t a n t l a c U V 5 p r o m o t e r i s a l t e r e d a t two s i t e s i n t h e - 1 0 r e g i o n s u c h t h a t t h e s e q u e n c e i s c h a n g e d t o t h e TATAAT c o n s e n s u s s e q u e n c e ( G i l b e r t , 1 9 7 6 ) . T h i s p r o m o t e r i s a b l e t o d i r e c t RNA s y n t h e s i s , i n , v i v o and i n v i t r o . i n t h e a b s e n c e o f t h e CAP p r o t e i n ( S i l v e r s t o n e e t a l . , 1 9 7 0 ; G i l b e r t , 1 9 7 6 ; S t e f a n o and G r a l l a , 1 9 7 9 ) . The r a t e s o f c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e l a c U V 5 and s e v e r a l o t h e r m u t a n t l a c p r o m o t e r s w h i c h d i f f e r by s i n g l e b a s e p a i r c h a n g e s ( S t e f a n o and G r a l l a , 1 9 8 0 , 1 9 8 2 ) h a v e b e e n shown t o v a r y c o n s i d e r a b l y . The d i f f e r e n c e s i n t h e r e a c t i o n r a t e s c o u l d be a t t r i b u t e d s o l e l y t o t h e d i f f e r e n c e s i n p r o m o t e r s t r u c t u r e s i n c e a l l o f t h e p r o m o t e r s w e r e c o n t a i n e d on i d e n t i c a l f r a g m e n t s o f DNA. A l t e r a t i o n s i n p r o m o t e r s e q u e n c e s c a n t h e r e f o r e l e a d t o p r o f o u n d c h a n g e s i n t r a n s c r i p t i o n c a p a c i t y . T r a n s c r i p t i o n i n B a c i l l u s s u b t i l i s h a s s e v e r a l f e a t u r e s i n common w i t h J!_. c o l i , b u t t h e r e a r e s e v e r a l s i g n i f i c a n t 6 d i f f e r e n c e s as w e l l . The B.. s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e h a s a c o r e a s s e m b l y , s i m i l a r t o t h e E . c o l i c o r e , t h a t c o n s i s t s o f a (1 and £>' s u b u n i t ( a p p r o x i m a t e l y 140 and 130 kd , r e s p e c t i v e l y ) , two 43 k i l o d a l t o n a l p h a s u b u n i t s and two s m a l l (11 and 9 . 5 k i l o d a l t o n ) omega p e p t i d e s w h i c h a r e a s s o c i a t e d w i t h t h e c o r e b u t a r e o f u n c e r t a i n f u n c t i o n ( s e e D o i , 1982 f o r r e v i e w ) . A p a r t f r o m s i z e , t h e c o r e s u b u n i t s d i f f e r i n o t h e r r e s p e c t s f r o m t h e E . c o l i s u b u n i t s . F o r e x a m p l e , t h e s e n s i t i v i t y o f t h e enzyme t o t h e i n h i b i t o r s s t r e p t o l y d i g i n ( w h i c h i n h i b i t s e l o n g a t i o n ) and r i f a m p i c i n ( an i n i t i a t i o n i n h i b i t o r ) a r e d e t e r m i n e d by t h e b e t a s u b u n i t o f t h e E_. c o l i enzyme ( R a b u s s a y and Z i l l i g , 1969 ; I w a k u r a e t a l . , 1 9 7 3 ) . I n B_. s u b t i l i s t h e b e t a and b e t a ' s u b u n i t s a r e r e s p o n s i b l e f o r r i f a m p i c i n and s t r e p t o l y d i g i n s e n s i t i v i t y , r e s p e c t i v e l y ( H a i l i n g e t a l . , 1 9 7 7 , 1 9 7 8 ) . The f u n c t i o n s o f t h e s e s u b u n i t s a r e t h e r e f o r e l i k e l y t o be d i f f e r e n t f r o m t h e a n a l o g o u s E_. c o l i s u b u n i t s . B a c i l l u s s u b t i l i s h a s a number o f s i g m a f a c t o r s t h a t d e t e r m i n e t h e t r a n s c r i p t i o n a l s p e c i f i c i t y o f t h e c o r e e n z y m e , s e v e r a l o f w h i c h a r e n e c e s s a r y f o r t h e t r a n s c r i p t i o n o f g e n e s i n v o l v e d i n t h e p r o c e s s o f s p o r u l a t i o n ( s e e L o s i c k and P e r o , 1981 ; D o i , 1982 f o r r e v i e w s ) . I n v e g e t a t i v e c e l l s t h e p r e d o m i n a n t f o r m o f RNA p o l y m e r a s e i s a s s o c i a t e d w i t h a s i g m a f a c t o r ( f o r m e r l y d e s i g n a t e d s i g m a - 5 5 ) o f o n l y 43 k i l o d a l t o n s . S i g m a - 4 3 i s c o n s i d e r a b l y s m a l l e r t h a n t h e 70 k d E . c o l i s i g m a f a c t o r b u t h a s s e v e r a l r e g i o n s t h a t a r e h o m o l o g o u s w i t h t h e E . c o l i s u b u n i t (Wong and D o i , 1 9 8 2 ; 7 G i t t e t a l . , 1 9 8 5 ) . The s i g m a - 4 3 RNA p o l y m e r a s e d i r e c t s t r a n s c r i p t i o n f r o m p r o m o t e r s t h a t h a v e t h e same c o n s e n s u s s e q u e n c e as t h e E_. c o l i p r o m o t e r s ( M o r a n et_ a j . . , 1 9 8 2 ) . I t h a s b e e n o b s e r v e d t h a t some p r o m o t e r s w h i c h a r e t r a n s c r i b e d by t h e E_. c o l i enzyme a r e n o t t r a n s c r i b e d v e r y e f f i c i e n t l y by t h e B a c i l l u s p o l y m e r a s e ( D a v i s o n e_t a_ l . , 1 9 7 9 , 1980 ; M o r a n e t a l . , 1 9 8 2 ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e B a c i l l u s enzyme m i g h t h a v e more s t r i n g e n t r e q u i r e m e n t s f o r p r o m o t e r s t r u c t u r e t h a n t h e E_. c o l i e n z y m e . A 2 1 , 0 0 0 d a l t o n p r o t e i n , f i r s t d e s c r i b e d by P e r o e_t a l . ( 1 9 7 5 ) , i s a l s o a s s o c i a t e d w i t h t h e B a c i l l u s s u b t i l i s s i g m a - 43 RNA p o l y m e r a s e . T h i s s u b u n i t , d e s i g n a t e d d e l t a , h a s b e e n shown t o be d i s t i n c t , b o t h i m m u n o l o g i c a l l y and by p e p t i d e m a p p i n g a n a l y s i s , f r o m s i g m a - 4 3 (Wong and D o i , 1 9 8 2 ) . D e l t a h a s no known c o u n t e r p a r t i n E_. c o l i and i t s r o l e i n t r a n s c r i p t i o n h a s t h e r e f o r e b e e n s t u d i e d e x t e n s i v e l y . C o r e / d e l t a h a s b e e n shown t o h a v e v e r y l o w a c t i v i t y i n v i t r o w i t h v a r i o u s p h a g e , c h r o m o s o m a l o r p l a s m i d t e m p l a t e s ( T j i a n e t a l . , 1 9 7 7 ; W i l l i a m s o n and D o i , 1 9 7 8 ; S p i e g e l m a n e t a l . , 1 9 7 8 ) s u g g e s t i n g t h a t d e l t a d o e s n o t c o n f e r i n i t i a t i o n a c t i v i t y u p o n t h e e n z y m e . The p r o t e i n n e v e r t h e l e s s d o e s i n f l u e n c e t r a n s c r i p t i o n a l s p e c i f i c i t y . P e r o and h e r c o l l e a g u e s f o u n d t h a t s p e c i f i c i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n o f p h a g e SP01 m i d d l e g e n e s r e q u i r e d t h e h o s t d e l t a p r o t e i n ( P e r o e t a l . , 1 9 7 5 ) . S i m i l a r d a t a w e r e r e p o r t e d f o r t r a n s c r i p t i o n f r o m SP82 DNA by p h a g e - m o d i f i e d and h o s t c e l l RNA p o l y m e r a s e ( S p i e g e l m a n e t a l . , 1 9 7 8 ; A c h b e r g e r and 8 W h i t e l e y , 1 9 8 1 ) . The o v e r a l l e f f e c t o f d e l t a , h o w e v e r , seems t o be d e p e n d e n t u p o n t h e t e m p l a t e . D i c k e l e t a l . ( 1 9 8 0 ) o b s e r v e d t h a t t h e a c t i v i t y o f c o r e / s i g m a - 4 3 on B a c i l l u s c h r o m o s o m a l DNA was v e r y s e n s i t i v e t o i n h i b i t i o n by d e l t a . I n c o n t r a s t , t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e B a c i l l u s p h a g e t e m p l a t e s 0e and 029 was e s s e n t i a l l y u n a f f e c t e d by a d d e d d e l t a . S p i e g e l m a n e t a_ l . ( 1978 ) u s e d a f i l t e r b i n d i n g a s s a y t o s t u d y t h e e f f e c t o f d e l t a on t h e f o r m a t i o n o f e n z y m e / D N A c o m p l e x e s w i t h SP82 DNA. T h e y o b s e r v e d t h a t i n t h e p r e s e n c e o f d e l t a , l e s s DNA was bound t o t h e f i l t e r s , a t a l l c o n c e n t r a t i o n s o f enzyme t e s t e d . D e l t a a p p e a r e d t o i n h i b i t c o m p l e x f o r m a t i o n by d e s t a b i l i z i n g t h e e n z y m e / D N A c o m p l e x e s , p r e s u m a b l y a t n o n - s p e c i f i c s i t e s on t h e DNA. Mo re d i r e c t s t u d i e s on c o m p l e x f o r m a t i o n by t h e s i g m a - 4 3 RNA p o l y m e r a s e h a v e e m p l o y e d a m o d i f i e d f i l t e r b i n d i n g a s s a y i n w h i c h DNA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s t h a t f o r m n o n - f i l t e r a b l e c o m p l e x e s w i t h t h e enzyme a r e e l u t e d f r o m t h e f i l t e r s and a n a l y z e d by g e l e l e c t r o p h o r e s i s . The r e s u l t s o f s u c h a s s a y s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t d e l t a r e s t r i c t s c o m p l e x f o r m a t i o n t o phage $29 DNA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s w h i c h c a r r y p r o m o t e r s t h a t a r e r e c o g n i z e d by t h e s i g m a - 4 3 enzyme ( D i c k e l e t a_l . , 1980 ) . A c h b e r g e r and W h i t e l e y ( 1 9 8 1 ) h a v e r e p o r t e d s i m i l a r f i n d i n g s f o r c o m p l e x f o r m a t i o n on phage SP82 DNA. I t h a s b e e n p r o p o s e d t h a t t h e B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e r e q u i r e s b o t h s i g m a and d e l t a f o r e f f i c i e n t p r o m o t e r r e c o g n i t i o n and t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n 9 ( W i l l i a m s o n and D o i , 1 9 7 8 ; D i c k e l e t a l . , 1 9 8 0 ; A c h b e r g e r and W h i t e l e y , 1 9 8 1 ) ; t h e f u n c t i o n s w h i c h a r e c a r r i e d o u t s o l e l y by t h e c o l i s i g m a f a c t o r a r e a s s o c i a t e d w i t h e i t h e r s i g m a - 4 3 o r d e l t a i n B a c i l l u s . A c h b e r g e r and W h i t e l e y ( 1 9 8 1 ) h a v e f u r t h e r s u g g e s t e d t h a t s i g m a i s r e q u i r e d f o r p r o m o t e r r e c o g n i t i o n and i n i t i a t i o n , w h i l e d e l t a f u n c t i o n s t o r e d u c e b i n d i n g a t n o n - s p e c i f i c s i t e s on t h e DNA by d e s t a b i l i z i n g s u c h n o n - s p e c i f i c c o m p l e x e s . W i l l i a m s o n and D o i ( 1 9 7 8 ) h a v e p r o p o s e d a m o d e l i n r e g a r d t o t h e d e l t a - s i g m a i n t e r a c t i o n s w h i c h r e g u l a t e p r o m o t e r a c t i v i t y . The d e t a i l s o f t h i s m o d e l w i l l be c o n s i d e r e d i n t h e D i s c u s s i o n . The e f f e c t o f d e l t a u p o n s p e c i f i c p o l y m e r a s e i n t e r a c t i o n s w i t h an e a r l y g e n e p r o m o t e r o f p h a g e S P 8 2 h a s b e e n i n v e s t i g a t e d b y m e t h y l a t i o n p r o t e c t i o n and DNase I f o o t p r i n t i n g a n a l y s i s ( A c h b e r g e r e t aJL. , 1 9 8 2 ) . T h e s e s t u d i e s r e v e a l e d t h a t t h e p r e s e n c e o f d e l t a d i d n o t a f f e c t t h e r e g i o n o f DNA w h i c h was p r o t e c t e d b y t h e RNA p o l y m e r a s e b u t d i d c a u s e a d e c r e a s e i n t h e number o f c o n t a c t s b e t w e e n t h e enzyme and p r o m o t e r , i n n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s . D e l t a d i d n o t h o w e v e r , s i g n i f i c a n t l y a l t e r t h e p a t t e r n o f c o n t a c t s f o r m e d i n i n i t i a t e d c o m p l e x e s , s u g g e s t i n g t h a t i t a c t e d p r i o r t o i n i t i a t i o n . T h i s l a t t e r r e s u l t s u p p o r t e d a p r e v i o u s r e p o r t by S p i e g e l m a n and W h i t e l e y ( 1 9 7 9 ) t h a t d e l t a was r e l e a s e d f r o m e n z y m e / D N A c o m p l e x e s p r i o r t o i n i t i a t i o n . I t was a l s o o b s e r v e d t h a t 11 o u t o f 15 c o n t a c t s p r e s e n t i n c o r e / s i g m a n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s w e r e p r e s e n t i n 10 f o r m e d c o n t a c t s w i t h t h e p r o m o t e r t h a t a r e n o r m a l l y s e e n o n l y i n i n i t i a t e d c o m p l e x e s . I t was t h e r e f o r e p r o p o s e d by A c h b e r g e r e t a l . ( 1 9 8 2 ) t h a t d e l t a a l t e r e d t h e c o n f o r m a t i o n o f t h e RNA p o l y m e r a s e t o p r e v e n t p r e m a t u r e f o r m a t i o n o f i n i t i a t i o n - s p e c i f i c c o n t a c t s , r e s u l t i n g i n l e s s e f f i c i e n t c o m p l e x f o r m a t i o n a t n o n p r o m o t e r s o r weak p r o m o t e r s . The m e c h a n i s m o f RNA s y n t h e s i s i n i t i a t i o n by t h e B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e h a s n o t p r e v i o u s l y b e e n i n v e s t i g a t e d . The i n f o r m a t i o n a b o u t t h e e f f e c t o f d e l t a on t r a n s c r i p t i o n and p o l y m e r a s e / p r o m o t e r i n t e r a c t i o n s s u g g e s t e d t h a t a k i n e t i c a p p r o a c h c o u l d be u s e d t o a n a l y z e t h e m e c h a n i s m by w h i c h d e l t a a f f e c t s t r a n s c r i p t i o n and p r o m o t e r s e l e c t i v i t y . The i n i t i a l wo rk p r e s e n t e d i n t h i s t h e s i s t h e r e f o r e f o c u s s e d u p o n t h e d e v e l o p m e n t o f an a s s a y , a n a l o g o u s t o t h o s e u s e d i n s t u d i e s o f E . c o l i t r a n s c r i p t i o n k i n e t i c s , w h i c h w o u l d be a p p r o p r i a t e f o r t h e a n a l y s i s o f t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n by t h e B . s u b t i l i s s i g m a - 4 3 RNA p o l y m e r a s e . The o t h e r g o a l o f t h i s wo rk was t o u s e t h e a s s a y t o i n v e s t i g a t e t h e manner i n w h i c h d e l t a a f f e c t e d t h e k i n e t i c s o f p r o m o t e r - s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s . 11 M A T E R I A L S AND METHODS P h a g e and P l a s m i d DNA B a c t e r i o p h a g e 029 was g r o w n i n JB_. s u b t i l i s SR22 o r L15 ( b o t h t h e p h a g e and t h e h o s t s w e r e o b t a i n e d f r o m H . R . W h i t e l e y , U n i v e r s i t y o f W a s h i n g t o n ) and p h a g e was p u r i f i e d as d e s c r i b e d p r e v i o u s l y by Kawamura and I t o ( 1 9 7 7 ) . P u r i f i e d p h a g e w e r e t r e a t e d w i t h 1$ S D S , 20 mM EDTA and h e a t e d a t 65°C f o r 10 m i n u t e s . The r u p t u r e d p a r t i c l e s w e r e t h e n t r e a t e d w i t h 50 u g / m l P r o t e i n a s e K f o r 2 h o u r s a t room t e m p e r a t u r e . The DNA was p u r i f i e d by p h e n o l e x t r a c t i o n and p r e c i p i t a t e d i n t h e p r e s e n c e o f 3% s o d i u m a c e t a t e . The DNA was d i s s o l v e d i n s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r , d i a l y z e d a t 4°C o v e r n i g h t a g a i n s t O . l x S S C (SSC i s 0 . 1 5 M N a C l , 0 . 0 1 5 M s o d i u m c i t r a t e , pH 7 . 0 ) . and s t o r e d o v e r c h l o r o f o r m . P l a s m i d b e a r i n g s t r a i n s w e r e g r o w n as d e s c r i b e d by Dunn e t a_ l . ( 1 979 ) . C l e a r e d l y s a t e s w e r e p r e p a r e d by t h e p r o c e d u r e o f C l e w e l l and H e l i n s k i ( 1 9 7 2 ) w i t h s e v e r a l m o d i f i c a t i o n s as d e s c r i b e d by D o b i n s o n and S p i e g e l m a n ( 1 9 8 5 ) . P l a s m i d DNA was p u r i f i e d f r o m t h e c l e a r e d l y s a t e by c e n t r i f u g a t i o n i n C s C l / e t h i d i u m b r o m i d e . The i s o l a t e d p l a s m i d DNA was t r e a t e d w i t h b u t a n o l t o r e m o v e t h e e t h i d i u m b r o m i d e , e t h a n o l p r e c i p i t a t e d and r e d i s s o l v e d i n d i s t i l l e d w a t e r o r O . l x S S C . S m a l l s c a l e p l a s m i d p r e p a r a t i o n s , u s e d t o s c r e e n t r a n s f o r m a n t s , w e r e made a s d e s c r i b e d by C r o s a and F a l k o w ( 1 9 8 1 ) . 12 M e d i a B a c i l l u s s u b t i l i s was g r o w n i n M med ium ( Y e h l e and D o i , 1 9 6 7 ) . P l a s m i d b e a r i n g E s c h e r i c h i a c o l i s t r a i n s w e r e g r o w n i n M9 med ium (Champe and B e n z e r , 1962) m o d i f i e d a s f o l l o w s : t h e g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n was 0 .2555, c a s a m i n o a c i d s w e r e a d d e d t o 0.2%, and F e C l 3 and C a C l 2 w e r e a d d e d t o a c o n c e n t r a t i o n o f 0.01 mM and 0.1 mM r e s p e c t i v e l y . The med ium was s u p p l e m e n t e d w i t h u r i d i n e ( t o 200 u g / m l ) , t h y m i d i n e ( t o 10 u g / m l ) and t h i a m i n e ( t o 20 u g / m l ) . LB ( L u r i a - B e r t a n i ) p l a t e s u s e d i n t h e c l o n i n g p r o c e d u r e w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d by M a n i a t i s e t a l . ( 1 9 8 2 ) . C o n s t r u c t i o n o f P328-5 The p l a s m i d p328-5 c o n t a i n s s e q u e n c e s f r o m t h e B a c i l l u s p h a g e 029 . P h a g e 029 was c l e a v e d w i t h H i n d l l l and t h e 2.4 kb f r a g m e n t ( B a n d C) was i s o l a t e d by e l e c t r o e l u t i o n f r o m a ^% p o l y a c r y l a m i d e g e l . The v e c t o r , pBR322, was c u t w i t h H i n d l l l , t r e a t e d w i t h c a l f i n t e s t i n a l p h o s p h a t a s e , and l i g a t e d t o t h e 2.4 kb f r a g m e n t . E . c o l i SF8 ( o b t a i n e d f r o m R . C . M i l l e r , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a ) was t r a n s f o r m e d w i t h t h e l i g a t i o n m i x t u r e and and s p r e a d o n t o LB p l a t e s c o n t a i n i n g 50 u g / m l a m p i c i l l i n . C o l o n i e s f r o m t h e a m p i c i l l i n p l a t e s w e r e p i c k e d and t e s t e d f o r g r o w t h on LB p l a t e s c o n t a i n i n g 20 u g / m l t e t r a c y c l i n e . S e v e r a l c o l o n i e s w h i c h w e r e r e s i s t a n t t o a m p i c i l l i n b u t s e n s i t i v e t o 13 t e t r a c y c l i n e w e r e s c r e e n e d f o r t h e p r e s e n c e o f p l a s m i d s w h i c h w e r e l a r g e r t h a n t h e o r i g i n a l v e c t o r . P l a s m i d p328-5 was shown t o h a v e t h e c o r r e c t DNA s e q u e n c e by r e s t r i c t i o n a n a l y s i s and by RNA-DNA h y b r i d i z a t i o n a n a l y s i s ( s e e R e s u l t s ) . R e s t r i c t i o n e n z y m e s and T4 DNA l i g a s e w e r e o b t a i n e d f r o m New E n g l a n d B i o l a b s , a l k a l i n e p h o s p h a t a s e was s u p p l i e d by B o e h r i n g e r / M a n n h e i m and a l l w e r e u s e d a c c o r d i n g t o t h e s u p p l i e r s ' r e c o m m e n d a t i o n s . M a n i p u l a t i o n o f p l a s m i d DNA, g e l e l e c t r o p h o r e s i s and c l o n i n g p r o c e d u r e s w e r e a l l c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o M a n i a t i s e t a l . ( 1 9 8 2 ) . DNA-RNA H y b r i d i z a t i o n A n a l y s i s H y b r i d i z a t i o n a n a l y s i s was u s e d t o c o n f i r m t h a t t h e m a j o r i n v i t r o t r a n s c r i p t s y n t h e s i z e d f r o m p328-5 was i n i t i a t e d f r o m t h e 029 p r o m o t e r . The [ e * - 3 2 P ] U T P l a b e l l e d p r o d u c t s o f a s t a n d a r d t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n w e r e s e p a r a t e d by e l e c t r o p h o r e s i s t h r o u g h a 7 M u r e a , 8% p o l y a c r y l a m i d e g e l (40$ a c r y l a m i d e : 1 . 3 8 $ b i s a c r y l a m i d e ) and t h e r u n - o f f t r a n s c r i p t e l u t e d f r o m t h e g e l a s d e s c r i b e d by M a n i a t i s e_t a l . ( 1 9 8 2 ) , e x c e p t t h a t t h e e l u t i o n b u f f e r was a s d e s c r i b e d by Maxam and G i l b e r t ( 1 9 7 7 ) . P l a s m i d and 029 DNA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s w e r e s e p a r a t e d by e l e c t r o p h o r e s i s t h r o u g h 0 . 7 $ a g a r o s e g e l s and t r a n s f e r r e d t o a n i t r o c e l l u l o s e membrane f i l t e r a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d by Dunn and S a m b r o o k (1980) e x c e p t t h a t 14 t h e n e u t r a l i z a t i o n b u f f e r c o n t a i n e d 1 M T r i s - H C l pH 7 . 4 , 1 .5 M N a C l . The DNA was b a k e d o n t o t h e f i l t e r s a t 6 5 ° C , o v e r n i g h t . The n i t r o c e l l u l o s e membrane was p r e - s o a k e d f o r 3 h o u r s a t 65°C i n 6 x S S C , 0 . 0 2 ? B S A . The membrane was t h e n t r a n s f e r r e d t o h y b r i d i z a t i o n b u f f e r c o n t a i n i n g 6 x S S C , 0 . 0 2 ? B S A , 1 mM EDTA and 0 . 5 ? S D S . The l a b e l l e d RNA was a d d e d , and h y b r i d i z a t i o n c a r r i e d o u t f o r 18 t o 24 h o u r s a t 6 5 ° C . The membrane was w a s h e d a t 65°C i n 2 x S S C , 0 . 5 ? SDS f o r 40 m i n u t e s , t h e n i n 2 x S S C f o r 40 m i n u t e s . H y b r i d i z a t i o n was d e t e c t e d by a u t o r a d i o g r a p h y u s i n g 3M H i L i t e f i l m ( K o d a k ) a t - 7 0 ° C . RNA P o l y m e r a s e P u r i f i c a t i o n P u r i f i c a t i o n o f H o l o e n z y m e ( c o r e / s i g m a / d e l t a ) . RNA P o l y m e r a s e ( s i g m a - 4 3 ) was p u r i f i e d f r o m B a c i l l u s s u b t i l i s 168 ( I o w a G r a i n P r o c e s s i n g C o r p . ) a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d by S p i e g e l m a n e t a l . ( 1 9 7 8 ) b y : 1) P E G / d e x t r a n p h a s e p a r t i t i o n i n g , 2 ) c h r o m a t o g r a p h y on B i o - G e l A 1 . 5 m , 3 ) c h r o m a t o g r a p h y o v e r D N A - c e l l u l o s e , 4 ) s e d i m e n t a t i o n t h r o u g h a g l y c e r o l g r a d i e n t . The a b o v e p r o c e d u r e was m o d i f i e d i n s e v e r a l w a y s . 1) The D N A - c e l l u l o s e was p r e p a r e d as d e s c r i b e d by L i t m a n ( 1 9 6 8 ) w i t h c a l f t h y m u s o r s a l m o n s p e r m DNA. 2 ) The g l y c e r o l g r a d i e n t was 15 t o 30? and c o n t a i n e d 0 . 5 M N a C l . 3 ) The f r a c t i o n s f r o m t h e f a s t e s t s e d i m e n t i n g p o r t i o n o f t h e t h e g l y c e r o l g r a d i e n t enzyme a c t i v i t y band w e r e p o o l e d and c h r o m a t o g r a p h e d o v e r h e p a r i n - 15 a g a r o s e ( S i g m a C h e m i c a l C o . ) o r h e p a r i n - s e p h a r o s e ( p r e p a r e d w i t h S e p h a r o s e 4B ( P h a r m a c i a ) a s d e s c r i b e d by D a v i s o n e t a l . , 1 9 7 9 ) t o r e m o v e a c o n t a m i n a t i n g DNase a c t i v i t y . The g r a d i e n t f r a c t i o n s w e r e d i l u t e d w i t h b u f f e r t o a c o n d u c t i v i t y e q u a l t o t h a t o f b u f f e r c o n t a i n i n g 0 .1 M N a C l ( c o n d u c t i v i t y was m e a s u r e d w i t h a R a d i o m e t e r CDM 2 f c o n d u c t i v i t y m e t e r ) . The d i l u t e d s a m p l e was a p p l i e d t o t h e h e p a r i n - a g a r o s e c o l u m n w h i c h had b e e n e q u i l i b r a t e d w i t h b u f f e r c o n t a i n i n g 0 .1 M N a C l and t h e c o l u m n was w a s h e d w i t h b u f f e r c o n t a i n i n g 0 .1 M N a C l , t h e n w i t h 8 t o 10 v o l u m e s o f 0 . 3 5 M N a C l - c o n t a i n i n g b u f f e r . The enzyme was e l u t e d i n a s i n g l e s t e p w i t h b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 6 M N a C l . A l l t h e b u f f e r s f o r t h e a b o v e c h r o m a t o g r a p h y s t e p s , as w e l l a s f o r t h o s e p r o c e d u r e s d e s c r i b e d b e l o w f o r t h e i s o l a t i o n o f c o r e / s i g m a and d e l t a , c o n t a i n e d 10 mM T r i s - H C l pH 7 . 9 , 10 mM M g C l 2 f 1 m M E D T A , 50 u g / m l P M S F , 20 mM 2 - m e r c a p t o e t h a n o l and 10$ g l y c e r o l . I t s h o u l d be n o t e d h e r e t h a t t h e enzyme seemed t o be p a r t i c u l a r l y s e n s i t i v e t o t h e t y p e o f g l y c e r o l u s e d i n t h e b u f f e r s . I n p a r t i c u l a r , when S i g m a g r a d e g l y c e r o l ( S i g m a C h e m i c a l C o . ) was u s e d d u r i n g t h e i s o l a t i o n p r o c e d u r e t h e p u r i f i e d enzyme was v e r y u n s t a b l e and l o s t 50 t o 90$ o f i t s a c t i v i t y i n one t o two w e e k s . T h e r e f o r e , a n a l y t i c a l g r a d e g l y c e r o l ( o b t a i n e d f r o m BDH C h e m i c a l s ) was u s e d i n t h e p u r i f i c a t i o n o f b o t h enzyme and d e l t a . The enzyme was s t o r e d a t - 1 2 ° C i n b u f f e r , d e s c r i b e d a b o v e , c o n t a i n i n g 30$ g l y c e r o l and 0 . 4 6 M N a C l . 16 Enzyme a c t i v i t y was a s s a y e d a s d e s c r i b e d by S p i e g e l m a n and W h i t e l e y ( 1 9 7 4 ) , w i t h s e v e r a l m o d i f i c a t i o n s . A s s a y s w e r e c a r r i e d o u t i n 0 . 0 4 M T r i s - H C l pH 7 . 9 , 0 . 0 2 M M g C l 2 , 0 . 0 5 M N a C l , w i t h 0 . 8 mM G T P , ATP and C T P , 8 uM UTP and 0 . 2 5 u C i [ H]UTP u s i n g 029 DNA a s t h e t e m p l a t e . The r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e p r e c i p i t a t e d w i t h TCA i n t h e p r e s e n c e o f 100 u g / m l y e a s t RNA ( T y p e I I - S f r o m T o r u l a y e a s t , S i g m a C h e m i c a l C o . ) . U n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d enzyme c o n c e n t r a t i o n s i n t h e t e x t a r e i n t e r m s o f p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n ( d e t e r m i n e d b y a L o w r y a s s a y , a s m o d i f i e d b y S a n d e r m a n n and S t r o m i n g e r , 1 9 7 2 ) u s i n g BSA ( F r a c t i o n V , S i g m a C h e m i c a l C o . ) a s t h e s t a n d a r d . The p r o p o r t i o n o f a c t i v e enzyme i n a p r e p a r a t i o n was e s t i m a t e d on t h e b a s i s o f t h e s i g m a c o n t e n t i n t h e p r e p a r a t i o n . The enzyme was e l e c t r o p h o r e s e d on S D S - p o l y a c r y l a m i d e s l a b g e l s a s d e s c r i b e d b y L e d u c e t _ a l . ( 1 9 8 2 ) e x c e p t t h a t t h e s e p a r a t i o n g e l s c o n t a i n e d a 1 4 - 2 0 $ e x p o n e n t i a l g r a d i e n t o f a c r y l a m i d e ( M c G u i r e e t a l ^ . , 1 9 7 4 ) . The g e l s w e r e s t a i n e d f o r 48 h o u r s w i t h C o o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e R ( S i g m a C h e m i c a l C o . ) i n a s o l u t i o n o f 10? a c e t i c a c i d / 2 5 ? e t h a n o l . The g e l s w e r e t h e n d e s t a i n e d w i t h 7 - 5 ? a c e t i c a c i d / 2 5 ? e t h a n o l , r i n s e d b r i e f l y i n 7 . 5 ? a c e t i c a c i d and s c a n n e d w i t h a Q u i c k S c a n d e n s i t o m e t e r ( H e l e n a I n s t r u m e n t s ) . The a r e a s u n d e r t h e p e a k s w h i c h c o r r e s p o n d e d t o t h e s i g m a , d e l t a and a l p h a s u b u n i t s w e r e d e t e r m i n e d by w e i g h t . The s i g m a : a l p h a r a t i o was c a l c u l a t e d u s i n g an e s t i m a t e d m o l e c u l a r w e i g h t o f 4 5 , 0 0 0 d a l t o n s f o r t h e a l p h a 17 s u b u n i t ( D o i , 1 9 8 2 ) and a m o l e c u l a r w e i g h t o f 4 3 , 0 0 0 d a l t o n s f o r t h e s i g m a s u b u n i t ( G i t t e t a_ l . , 1985 ) . The amount o f a l p h a s u b u n i t , w h i c h i s a c o m p o n e n t o f t h e c o r e e n z y m e , was c o n s i d e r e d t o be r e p r e s e n t a t i v e o f t h e amoun t o f c o r e i n t h e enzyme p r e p a r a t i o n . I t s h o u l d be n o t e d t h a t t h e amoun t o f a c t i v e enzyme i n t h e p r e p a r a t i o n s may be o v e r e s t i m a t e d by t h i s m e t h o d s i n c e i t was n o t p o s s i b l e t o d e t e r m i n e i f a l l o f t h e enzyme w h i c h was a s s o c i a t e d w i t h s i g m a was i n f a c t a c t i v e . I s o l a t i o n o f C o r e / s i g m a . H o l o e n z y m e ( c o r e / s i g m a / d e l t a ) was d e p l e t e d o f d e l t a by D N A - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y o f g l y c e r o l g r a d i e n t p u r i f i e d enzyme ( A c h b e r g e r and W h i t e l e y , 1 9 8 1 ) o r by D E A E - S e p h a d e x c h r o m a t o g r a p h y ( S p i e g e l m a n e_t a l . , 1 9 7 8 ) o f h e p a r i n - a g a r o s e p u r i f i e d e n z y m e . The D N A - c e l l u l o s e p u r i f i c a t i o n was c a r r i e d o u t a s f o l l o w s : g l y c e r o l g r a d i e n t f r a c t i o n s w e r e c o m b i n e d and d i l u t e d a s d e s c r i b e d a b o v e and a p p l i e d t o a D N A - c e l l u l o s e c o l u m n ( 2 . 5 cm x 8 c m ) . E l u t i o n w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o f N a C l ( 0 . 1 M t o 0 . 6 M) s e p a r a t e d c o r e / s i g m a f r o m d e l t a , t h e c o r e / s i g m a a c t i v i t y e l u t i n g b e t w e e n 0 . 3 5 and 0 . 5 5 M N a C l . The enzyme f r a c t i o n was t h e n c o n c e n t r a t e d i n an A m i c o n a p p a r a t u s p r i o r t o c h r o m a t o g r a p h y o v e r a h e p a r i n - a g a r o s e c o l u m n ( d e s c r i b e d a b o v e ) . H o l o e n z y m e w h i c h had b e e n p u r i f i e d t h r o u g h t h e h e p a r i n - a g a r o s e s t e p was d i l u t e d w i t h b u f f e r t o g i v e a c o n d u c t i v i t y 18 e q u i v a l e n t t o t h a t o f b u f f e r c o n t a i n i n g 0 .1 M N a C l and a p p l i e d t o a D E A E - S e p h a d e x c o l u m n w h i c h had b e e n e q u i l i b r a t e d w i t h b u f f e r c o n t a i n i n g 0 .1 M N a C l . The c o l u m n was t h e n w a s h e d w i t h b u f f e r c o n t a i n i n g 0 .1 M N a C l , and c o r e / s i g m a was e l u t e d i n a s i n g l e s t e p w i t h b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 3 2 M N a C l . The amoun t o f d e l t a p r e s e n t i n t h e c o r e / s i g m a and h o l o e n z y m e p r e p a r a t i o n s was d e t e r m i n e d by t h e m e t h o d d e s c r i b e d a b o v e f o r d e t e r m i n g t h e s i g m a c o n t e n t o f t h e e n z y m e . C o r e / s i g m a was r e c o n s t i t u t e d w i t h d e l t a by i n c u b a t i n g d e l t a w i t h c o r e / s i g m a f o r two m i n u t e s a t 37°C p r i o r t o a d d i n g t h e enzyme t o t h e t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n s . The p r e - i n c u b a t i o n was n o t c r i t i c a l h o w e v e r , s i n c e t h e r e s u l t s o f t h e e x p e r i m e n t s w e r e n o t a f f e c t e d i f t h a t s t e p was o m i t t e d . P u r i f i c a t i o n o f t h e D e l t a S u b u n i t D e l t a was p u r i f i e d f r o m p o o l e d d e l t a - c o n t a i n i n g f r a c t i o n s o f g l y c e r o l g r a d i e n t s ( f r o m s t e p 4 o f t h e h o l o e n z y m e p u r i f i c a t i o n ) . The c o m b i n e d f r a c t i o n s w e r e h e a t e d a t 65°C u n t i l t h e s o l u t i o n became f l o c c u l e n t (30 t o 60 m i n u t e s ) and c e n t r i f u g e d a t l o w s p e e d t o r e m o v e t h e r e s u l t i n g p r e c i p i t a t e . The s u p e r n a t a n t c o n t a i n e d d e l t a , w h i c h i s h e a t s t a b l e ( M . H i l t o n , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) , t h a t c o u l d be f u r t h e r p u r i f i e d by c h r o m a t o g r a p h y o v e r D E A E - S e p h a d e x ( S p i e g e l m a n e t a l . , 1 9 7 8 ) . 19 The amount o f d e l t a i n t h e p r e p a r a t i o n s was e s t i m a t e d by r u n n i n g s a m p l e s on S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l s , w i t h known a m o u n t s o f BSA as s t a n d a r d s . The g e l s we re s t a i n e d w i t h C o o m a s s i e b l u e , s c a n n e d and t h e a r e a s u n d e r t h e p e a k s w h i c h c o r r e s p o n d e d t o BSA and d e l t a w e r e q u a n t i t a t e d as d e s c r i b e d a b o v e . The w e i g h t s o f t h e BSA p e a k s w e r e u s e d t o g e n e r a t e a s t a n d a r d c u r v e and t h e amount o f d e l t a p r e s e n t i n t h e d e l t a p r e p a r a t i o n s was e s t i m a t e d by c o m p a r i s o n o f t h e d e l t a p e a k w e i g h t w i t h t h e s t a n d a r d c u r v e . The m o l a r c o n c e n t r a t i o n o f d e l t a was s u b s e q u e n t l y c a l c u l a t e d u s i n g an e s t i m a t e d m o l e c u l a r w e i g h t o f 2 1 , 0 0 0 d a l t o n s f o r t h e d e l t a s u b u n i t ( D o i , 1 9 8 2 ) . I n v i t r o T r a n s c r i p t i o n A s s a y s R u n - o f f t r a n s c r i p t i o n s w e r e d o n e i n 40 o r 100 u l v o l u m e s i n b u f f e r c o n t a i n i n g 40 mM T r i s - H C l pH 7 . 9 , 20 mM M g C l 2 , 1 mM E D T A , 4 8 . 5 mM N a C l and 3% g l y c e r o l . The A T P , GTP and CTP c o n c e n t r a t i o n s w e r e 400 uM and t h e UTP c o n c e n t r a t i o n was 10 u M . A l l n u c l e o t i d e s w e r e o b t a i n e d f r o m S i g m a C h e m i c a l C o . The s t a n d a r d ( m u l t i p l e r o u n d ) t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n s w e r e i n i t i a t e d by t h e a d d i t i o n o f RNA p o l y m e r a s e t o a s o l u t i o n c o n t a i n i n g D N A , A T P , G T P , CTP and UTP w h i c h had b e e n p r e w a r m e d f o r 2 m i n u t e s a t 3 7 ° C . T r a n s c r i p t i o n was c a r r i e d o u t f o r 10 t o 15 m i n u t e s a t 37°C and t h e r e a c t i o n s w e r e s t o p p e d b y t h e a d d i t i o n o f EDTA ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n 20 25 mM) o r e l e c t r o p h o r e s i s s a m p l e b u f f e r (10 M u r e a , 0 .1 M T r i s - B o r a t e , 2 mM EDTA) and c h i l l e d on i c e . U n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d t h e k i n e t i c ( p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n ) a s s a y s w e r e c a r r i e d o u t a s f o l l o w s : a s o l u t i o n c o n t a i n i n g DNA, ATP and GTP was p r e w a r m e d f o r 2 m i n u t e s a t 3 7 ° C , RNA p o l y m e r a s e ( w h i c h had a l s o b e e n p r e w a r m e d ) was a d d e d and a t v a r i o u s t i m e s a f t e r t h e a d d i t i o n o f t h e e n z y m e , s a m p l e s w e r e r e m o v e d and a d d e d t o a m i x t u r e o f h e p a r i n ( G r a d e I, S i g m a C h e m i c a l C o . ) , CTP and [ o c - 3 2 p ] U T P (1 t o 5 u C i / r e a c t i o n ; A m e r s h a m , 410 C i / m m o l ) t o a l l o w e l o n g a t i o n o f i n i t i a t e d t r a n s c r i p t s . H e p a r i n was u s e d a t a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 5 u g / m l , t o p r e v e n t m u l t i p l e i n i t i a t i o n e v e n t s a t one p r o m o t e r . The e l o n g a t i o n r e a c t i o n was c o n t i n u e d f o r 10 m i n u t e s , t h e n t h e r e a c t i o n s w e r e s t o p p e d w i t h EDTA o r e l e c t r o p h o r e s i s s a m p l e b u f f e r and c h i l l e d on i c e o r f r o z e n a t - 2 0 ° C . A l i q u o t s o f t h e t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n s w e r e e l e c t r o p h o r e s e d t h r o u g h 8% a c r y l a m i d e , 7M u r e a g e l s . The r u n - o f f t r a n s c r i p t s w e r e l o c a l i z e d by a u t o r a d i o g r a p h y , c u t f r o m t h e g e l and t h e r a d i o a c t i v i t y i n t h e g e l s l i c e s q u a n t i t a t e d by C e r e n k o v c o u n t i n g . The s e q u e n c e s o f t h e 029 p r o m o t e r - s p e c i f i c r u n - o f f RNAs and number o f U r e s i d u e s i n them was known (66 i n t h e A2 t r a n s c r i p t and 22 i n t h e G2 t r a n s c r i p t ) . The number o f t r a n s c r i p t s s y n t h e s i z e d f r o m t h e p r o m o t e r s c o u l d t h e r e f o r e 21 be c a l c u l a t e d f r o m t h e amoun t o f r a d i o a c t i v i t y w h i c h was i n c o r p o r a t e d i n t o t h e r u n - o f f t r a n s c r i p t s . 22 RESULTS CLONING AND L O C A L I Z A T I O N OF THE 029 A2 PROMOTER The b a c t e r i o p h a g e 029 , a d o u b l e s t r a n d e d DNA p h a g e w h i c h i s a b l e t o i n f e c t s e v e r a l B a c i l l u s s p e c i e s ( H e m p h i l l and W h i t e l e y , 1975; G e i d u s c h e k and I t o , 1 9 8 2 ) , i s one o f t h e mos t e x t e n s i v e l y c h a r a c t e r i z e d B a c i l l u s g e n e t i c s y s t e m s ( f o r r e v i e w s e e G e i d u s c h e k and I t o , 1 9 8 2 ) . T r a n s c r i p t i o n o f t h e 029 genome h a s b e e n s t u d i e d i n d e t a i l . R i b o n u c l e i c a c i d w h i c h i s s y n t h e s i z e d d u r i n g t h e l y t i c c y c l e c a n be d i v i d e d t e m p o r a l l y i n t o two c l a s s e s ; e a r l y RNA i s t r a n s c r i b e d f r o m t h e l i g h t s t r a n d o f t h e p h a g e DNA t h r o u g h o u t t h e p h a g e i n f e c t i o n , w h e r e a s l a t e RNA i s t r a n s c r i b e d f r o m t h e h e a v y s t r a n d ( M o s h a r a f f a e t a l . , 1970; L o s k u t o f f e t a l . , 1 9 7 3 ; S c h a c h t e l e e t a l . , 1 9 7 3 ) . I n v i t r o t r a n s c r i p t i o n by t h e B . s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e c a n o n l y be i n i t i a t e d f r o m p r o m o t e r s f o r e a r l y RNA. T h e s e p r o m o t e r s a p p e a r t o be r e c o g n i z e d by t h e p r e d o m i n a n t s i g m a - 4 3 a s s o c i a t e d B a c i l l u s p o l y m e r a s e ( D u f f y and G e i d u s c h e k , 1 9 7 6 ) . D e t a i l e d i n v i v o and i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n maps o f $29 DNA h a v e b e e n c o n s t r u c t e d ( L o s k u t o f f e t a l . , 1 973 ; I n c i a r t e et_ a_ l . , 1976; Kawamura and I t o , 1977; D a v i s o n e t a_ l . , 1980) and t h e a p p r o x i m a t e l o c a t i o n s o f t h e e a r l y p r o m o t e r s h a v e b e e n d e t e r m i n e d ( S o g o e t a l , , 1 979 ; D a v i s o n ^ t a l . , 1980 ; D i c k e l e t a l . , 1980 ) . S e v e r a l p r o m o t e r s i t e s h a v e a l s o b e e n t e n t a t i v e l y l o c a t e d by 23 n u c l e o t i d e s e q u e n c e a n a l y s i s o f t h e $29 genome ( Y o s h i k a w a e_t a l . , 1 9 8 1 ; Y o s h i k a w a and I t o , 1 9 8 2 ) . One o f t h e $29 e a r l y p r o m o t e r s , w h i c h had b e e n l o c a l i z e d t o t h e 029 H i n d l l l - C r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e f r a g m e n t ( S o g o e t a l . , 1979; D a v i s o n e t a l . , 1979, 1 9 8 0 ) , was c l o n e d i n t o p B R 3 2 2 , c h a r a c t e r i z e d and u s e d i n t h e t r a n s c r i p t i o n s t u d i e s d e s c r i b e d b e l o w . P l a s m i d P 3 2 8 - 5 C a r r i e s t h e H i n d l l l - C R e s t r i c t i o n F r a g m e n t f r o m 029 . The 2 . 4 kb H i n d l l l - C f r a g m e n t o f $29 c o n t a i n s a s i n g l e E c o R I r e s t r i c t i o n s i t e n e a r one end o f t h e f r a g m e n t ( I t o , 1 9 7 8 ) . R e s t r i c t i o n a n a l y s i s w i t h H i n d l l l and E c o R I ( s e e F i g u r e 1) was t h e r e f o r e c a r r i e d o u t on p 3 2 8 - 5 t o v e r i f y t h a t t h e H i n d l l l - C f r a g m e n t had b e e n c l o n e d i n t o p B R 3 2 2 and t o d e t e r m i n e t h e o r i e n t a t i o n o f t h e c l o n e d i n s e r t . T r e a t i n g t h e p l a s m i d p 3 2 8 - 5 w i t h t h e r e s t r i c t i o n enzyme H i n d l l l ( F i g u r e s 1 and 3 , l a n e 2 ) y i e l d e d two f r a g m e n t s . The s m a l l f r a g m e n t m i g r a t e d a t t h e p o s i t i o n o f 029 H i n d l l l - C f r a g m e n t ( s e e F i g u r e 3 ) , i n d i c a t i n g t h a t t h e H i n d l l l - C f r a g m e n t had b e e n c l o n e d , i n t a c t , i n t o t h e v e c t o r p l a s m i d . When p 3 2 8 - 5 was t r e a t e d w i t h E c o R I ( F i g u r e 1, l a n e 1) a s m a l l b a n d o f a p p r o x i m a t e l y 0 .8 kb ( e s t i m a t e d by c o m p a r i s o n w i t h $29 H i n d l l l r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s ) was r e l e a s e d . S i n c e t h e c l o n e d f r a g m e n t had a s i n g l e , a s y m m e t r i c E c o R I s i t e and t h e v e c t o r ( p B R 3 2 2 ) a l s o had one E c o R I s i t e t h e o r i e n t a t i o n o f t h e c l o n e d DNA mus t be a s shown i n F i g u r e 2 . 24 F i g u r e 1 . R e s t r i c t i o n a n a l y s i s o f t h e p l a s m i d p 3 2 8 - 5 . The p l a s m i d was d i g e s t e d w i t h E c o R I ( l a n e 1 ) , H i n d l l l ( l a n e 2 ) o r E c o R I and H i n d l l l ( l a n e 3 ) , r u n on a 1 . 0 ? a g a r o s e g e l and s t a i n e d w i t h e t h i d i u m b r o m i d e . The s i z e s o f t h e c l o n e d DNA f r a g m e n t s and t h e o r i g i n o f e l e c t r o p h o r e s i s ( 0 ) a r e i n d i c a t e d . 25 1 2 3 kb o - 2 . 4 "^1.6 -0.8 26 E H E H B 1 1 pBR322 0.8 kb 1.6 kb *1 p F i g u r e 2 . P l a s m i d p 3 2 8 - 5 . A 2 . 4 kb f r a g m e n t f r o m 029 DNA, d e l i n e a t e d by H i n d l l l r e s t r i c t i o n s i t e s , was i s o l a t e d and c l o n e d i n t o t h e H i n d l l l s i t e o f p B R 3 2 2 . R e s t r i c t i o n s i t e s a r e d e s i g n a t e d a s f o l l o w s : E - E c o R I , H - H i n d l l l , B - E a m H I . The p o s i t i o n and o r i e n t a t i o n o f t h e p r o m o t e r ( p ) a r e i n d i c a t e d . 2 7 L o c a t i o n o f t h e 029 P r o m o t e r on P 3 2 8 - 5 . The l o c a t i o n o f a ^ p r o m o t e r on t h e H i n d l l l - C f r a g m e n t o f 029 had b e e n p r e d i c t e d f r o m t h e work o f D a v i s o n e t a l . ( 1 9 8 0 ) and Sogo e_t a l . ( 1 9 7 9 ) . When p 3 2 8 - 5 was t r e a t e d w i t h E c o R I and t r a n s c r i b e d i n v i t r o ( i n a s t a n d a r d a s s a y , a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s ) w i t h t h e B a c i l l u s s u b t i l i s s i g m a - 4 3 RNA p o l y m e r a s e a d i s c r e t e RNA t r a n s c r i p t was o b s e r v e d ( f o r e x a m p l e s e e F i g u r e s 12a and b ) . The s i z e o f t h e RNA was a p p r o x i m a t e l y 200 b a s e s l o n g a s e s t i m a t e d by c o m p a r i s o n t o t h e x y l e n e c y a n o l t r a c k i n g d y e . The t r a n s c r i p t was h y b r i d i z e d t o r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s o f P 3 2 8 - 5 and ^29 DNA w h i c h had b e e n e l e c t r o p h o r e s e d t h r o u g h an a g a r o s e g e l and bound t o n i t r o c e l l u l o s e , as d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s . The i n v i t r o RNA h y b r i d i z e d e x c l u s i v e l y t o t h e 1.6 kb H i n d l l l - E c o R I f r a g m e n t f r o m p 3 2 8 - 5 and t o b a n d C f r o m a H i n d l l l d i g e s t o f 029 DNA ( F i g u r e 3 ) . The t r a n s c r i p t s y n t h e s i z e d f r o m E c o R I - t r e a t e d p 3 2 8 - 5 t h u s had no h o m o l o g y w i t h o t h e r 029 s e q u e n c e s o r p B R 3 2 2 . The s i z e o f t h e RNA s u g g e s t e d t h a t e i t h e r t h e p r o m o t e r was l o c a t e d n e a r t h e E c o R I s i t e on t h e 1.6 kb E c o R I - H i n d l l l f r a g m e n t w i t h t r a n s c r i p t i o n d i r e c t e d t o w a r d s t h e E c o R I s i t e a s shown i n F i g u r e 2 o r t h a t t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t e d and t e r m i n a t e d w i t h i n t h e 1.6 kb f r a g m e n t . The f o r m e r c o n c l u s i o n was c o n s i s t e n t w i t h p r e v i o u s d a t a ( L o s k u t o f f e_t a l . , 1973 ; S c h a c t e l e e t a l . , 1 973 ; D a v i s o n e t a l . , 1979 , 1 9 8 0 ) . The p r o m o t e r ( A 2 ) was s u b s e q u e n t l y s e q u e n c e d and t h e i n v i v o and i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n s i t e s 28 I' F i g u r e 3 . H y b r i d i z a t i o n o f p328-5 t r a n s c r i p t s t o p328-5 and $29 DNA r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s . ( L e f t ) E t h i d i u m b r o m i d e s t a i n e d 0 .7$ a g a r o s e g e l p r i o r t o b l o t t i n g . L a n e 1, 029 DNA d i g e s t e d w i t h H i n d l l l . L a n e 2 , p328-5 d i g e s t e d w i t h H i n d l l l . L a n e 3> P328-5 d i g e s t e d w i t h E c o R I and H i n d l l l . S i z e s o f t h e c l o n e d DNA f r a g m e n t s ( e s t i m a t e d by c o m p a r i s o n w i t h t h e 029 H i n d l l l f r a g m e n t s ) a r e i n d i c a t e d . ( R i g h t ) A u t o r a d i o g r a m o f t h e n i t r o c e l l u l o s e b l o t a f t e r h y b r i d i z a t i o n t o t h e p328-5 t r a n s c r i p t . The l a n e s a r e t h e same a s i n ( L e f t ) . The o r i g i n o f e l e c t r o p h o r e s i s (0) and t h e p o s i t i o n o f t h e H i n d l l l - C band a r e i n d i c a t e d . 29 1 2 3 kb 1 2 3 30 d e t e r m i n e d by S1 n u c l e a s e m a p p i n g ( D o b i n s o n and S p i e g e l m a n , 1 9 8 5 ) . P U R I F I C A T I O N OF THE RNA POLYMERASE AND DELTA FACTOR H o l o e n z y m e w h i c h had b e e n p u r i f i e d t h r o u g h g l y c e r o l g r a d i e n t s ( a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s ) c o u l d be u s e d f o r q u a l i t a t i v e i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n s . H o w e v e r , q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f t r a n s c r i p t i o n was h a m p e r e d due t o t h e p r e s e n c e o f a c o n t a m i n a t i n g DNase a c t i v i t y i n t h e enzyme p r e p a r a t i o n s . The g l y c e r o l g r a d i e n t e n z y m e , p o o l e d f r o m t h e peak a c t i v i t y f r a c t i o n s , was f u r t h e r p u r i f i e d o v e r h e p a r i n - a g a r o s e a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s i n an a t t e m p t t o r e m o v e t h e DNase a c t i v i t y . The a u t o r a d i o g r a m p r e s e n t e d i n F i g u r e 4 shows t h e r e s u l t s o f one e x p e r i m e n t i n w h i c h g l y c e r o l g r a d i e n t - p u r i f i e d enzyme and enzyme w h i c h had b e e n s u b s e q u e n t l y p u r i f i e d by h e p a r i n - a g a r o s e c h r o m a t o g r a p h y w e r e t e s t e d f o r DNase a c t i v i t y . The two e n z y m e s w e r e i n c u b a t e d i n t h e p r e s e n c e o f A T P , GTP and CTP u n d e r t h e same c o n d i t i o n s u s e d f o r i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n s , w i t h a 273 b a s e H i n d l l l r e s t r i c t i o n f r a g m e n t , f r o m p h a g e 029 DNA, w h i c h had b e e n l a b e l l e d a t t h e H i n d l l l s i t e w i t h [ o i ? 2 P ] - d A T P . E a c h r e a c t i o n c o n t a i n e d a p p r o x i m a t e l y 4 , 0 0 0 cpm DNA. The r e a c t i o n s w e r e p r e c i p i t a t e d w i t h e t h a n o l p r i o r t o e l e c t r o p h o r e s i s t h r o u g h a 5% p o l y a c r y l a m i d e , n o n d e n a t u r i n g g e l and t h e b a n d s on t h e g e l w e r e q u a n t i t a t e d by C e r e n k o v c o u n t i n g . A f t e r i n c u b a t i n g t h e g l y c e r o l g r a d i e n t enzyme 31 F i g u r e 4 . A s s a y f o r DNase a c t i v i t y i n t h e RNA p o l y m e r a s e p r e p a r a t i o n s . A 3 2 p e n d _ i a b e n e ( j r e s t r i c t i o n f r a g m e n t o f 029 DNA was i n c u b a t e d w i t h g l y c e r o l g r a d i e n t p u r i f i e d enzyme ( l a n e 1 ) , o r H e p a r i n - a g a r o s e p u r i f i e d enzyme ( l a n e 2 ) u n d e r c o n d i t i o n s t h a t w e r e u s e d f o r i r i v i t r o t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n s . The r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e e l e c t r o p h o r e s e d t h r o u g h a n o n d e n a t u r i n g p o l y a c r y l a m i d e g e l and t h e r e m a i n i n g r a d i o a c t i v i t y i n t h e DNA b a n d s q u a n t i t a t e d a s d e s c r i b e d i n t h e t e x t . The l o w e r band c o r r e s p o n d s t o t h e $29 r e s t r i c t i o n f r a g m e n t i s o l a t e d p r i o r t o e n d - l a b e l l i n g . 32 1 2 1 33 w i t h t h e DNA f o r 10 m i n u t e s t h e DNA was no l o n g e r d e t e c t a b l e on t h e g e l ( l a n e 1 ) . The amount o f r a d i o a c t i v i t y r e c o v e r e d f r o m t h e g e l a t t h e p o s i t i o n w h e r e t h e DNA w o u l d h a v e b a n d e d was 264 cpm. When t h e h e p a r i n - a g a r o s e p u r i f i e d enzyme was i n c u b a t e d w i t h t h e DNA t h e amoun t o f r a d i o a c t i v i t y i n t h e g e l s l i c e s c o r r e s p o n d i n g t o t h e DNA b a n d s was 4 , 0 2 4 cpm ( l a n e 2 ) . A l t h o u g h t h e DNA was i s o l a t e d a s a s i n g l e band p r i o r t o l a b e l l i n g , two b a n d s w e r e d e t e c t e d on t h e g e l s u b s e q u e n t t o i n c u b a t i o n w i t h t h e e n z y m e . The r e a s o n f o r t h e a n o m o l o u s e l e c t r o p h o r e s i s o f t h e DNA i s n o t c l e a r . D u r i n g t h e c o u r s e o f t h i s work i t was o b s e r v e d t h a t when t h e e n t i r e enzyme band f r o m t h e g l y c e r o l g r a d i e n t was c o m b i n e d and p u r i f i e d o v e r h e p a r i n - a g a r o s e , t h e r e s u l t i n g enzyme a p p e a r e d t o l o s e a c t i v i t y when t h e i n i t i a t i o n r e a c t i o n o f t h e p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n a s s a y ( d e s c r i b e d a b o v e i n M a t e r i a l s and M e t h o d s ) was c a r r i e d o u t f o r 10 t o 20 m i n u t e s . A l t h o u g h t h e DNase a c t i v i t y had b e e n r e m o v e d f r o m t h e enzyme t h e r e a p p e a r e d t o be some o t h e r i n h i b i t o r y a c t i v i t y i n t h e p r e p a r a t i o n . A n o t h e r o b s e r v a t i o n was t h a t t h e a c t i v i t y p r o f i l e f r o m t h e g l y c e r o l g r a d i e n t d i d n o t c o r r e l a t e w e l l w i t h t h e amount o f enzyme i n e a c h f r a c t i o n ( s e e F i g u r e 5 ) . Some f r a c t i o n s f r o m t h e l e a d i n g edge o f t h e band had more a c t i v i t y , b u t l e s s p r o t e i n , t h a n f r a c t i o n s f r o m t h e l a t t e r p a r t o f t h e b a n d . A l t h o u g h t h i s d i s c r e p a n c y c o u l d i n p a r t be a c c o u n t e d f o r by t h e p r e s e n c e o f t h e DNase i n some o f t h e f r a c t i o n s i t was p o s s i b l e t h a t t h e r e was some o t h e r i n h i b i t o r i n t h e l a t t e r f r a c t i o n s a s w e l l . 34 I n an a t t e m p t t o s o l v e t h e p r o b l e m t h e f r a c t i o n s o f enzyme f r o m t h e l e a d i n g edge o f t h e band w e r e t a k e n f o r s u b s e q u e n t p u r i f i c a t i o n . F o r e x a m p l e , f r a c t i o n s 1 0 - 1 3 f r o m t h e g l y c e r o l g r a d i e n t shown i n F i g u r e 5 w e r e c o m b i n e d and p u r i f i e d o v e r h e p a r i n - a g a r o s e , a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s . The enzyme t h a t was l o a d e d o n t o t h e c o l u m n had a t o t a l a c t i v i t y o f 2 x 1 0 7 cpm (^H i n c o r p o r a t e d i n t o TCA p r e c i p i t a b l e m a t e r i a l i n an i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n a s s a y , a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s ) and t h e enzyme t h a t was e l u t e d f r o m t h e c o l u m n by b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 6 M N a C l had an a c t i v i t y o f 1 . 5 x 1 0 ? c p m . The r e c o v e r y ( 7 5 $ ) was t y p i c a l o f t h e r e c o v e r y f r o m t h i s s t a g e o f t h e p u r i f i c a t i o n , w h i c h r a n g e d b e t w e e n 60 and 7 5 $ . The r e s u l t i n g enzyme r e t a i n e d a c t i v i t y a f t e r a 10 m i n u t e i n c u b a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f DNA, ATP and GTP and c o u l d be u s e d i n t h e p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n a s s a y s and t a u p l o t a n a l y s i s . A t t h e p r e s e n t t i m e i t i s n o t c l e a r why t h e r e s h o u l d be a d i f f e r e n c e b e t w e e n enzyme w h i c h i s i n t h e d i f f e r e n t f r a c t i o n s o f t h e g l y c e r o l g r a d i e n t p e a k . D e l t a was r e m o v e d f r o m h o l o e n z y m e ( c o r e / s i g m a / d e l t a ) by p u r i f i c a t i o n o v e r D N A - c e l l u l o s e o r by D E A E - s e p h a d e x c h r o m a t o g r a p h y a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s . The two e n z y m e s w e r e n o t d e t e c t a b l y d i f f e r e n t s i n c e b o t h e n z y m e s r e s p o n d e d i n t h e same manne r i n a p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n a s s a y when r e c o n s t i t u t e d w i t h d e l t a ( f o r an e x a m p l e o f t h e r e s p o n s e s e e F i g u r e s 13 and 1 4 ) . N e i t h e r p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e r e m o v e d a l l t h e d e l t a p e p t i d e f r o m h o l o e n z y m e . I n 35 F i g u r e 5 . (A ) S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f p u r i f i e d B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e . F r a c t i o n s 8 t o 17 f r o m a g l y c e r o l g r a d i e n t w e r e e l e c t r o p h o r e s e d t h r o u g h a 1 4 - 2 0 $ g r a d i e n t g e l , a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s . Enzyme p u r i f i e d f r o m t h e g l y c e r o l g r a d i e n t f r a c t i o n s 10 t o 1 3 , by h e p a r i n - a g a r o s e c h r o m a t o g r a p h y i s shown i n t h e l a n e d e s i g n a t e d s t d . The p o s i t i o n s o f t h e s u b u n i t s (/3 ,/3 «. ,v, £ ) a r e i n d i c a t e d . ( B ) A c t i v i t y p r o f i l e f r o m t h e g l y c e r o l g r a d i e n t f r a c t i o n s shown i n ( A ) . The enzyme a c t i v i t y i n t h e g l y c e r o l g r a d i e n t f r a c t i o n s was a s s a y e d u s i n g [ ^ H j U T P a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s . 36 std 37 c o m p a r i s o n t o h o l o e n z y m e t h e amoun t o f d e l t a p r e s e n t i n t h e c o r e / s i g m a p r e p a r a t i o n s was r e d u c e d by a p p r o x i m a t e l y 50$ ( f o r e x a m p l e s e e T a b l e I I I ) . F o r t h e s a k e o f c l a r i t y , enzyme w h i c h h a s b e e n d e p l e t e d o f d e l t a w i l l be s u b s e q u e n t l y d e s i g n a t e d c o r e / s i g m a . When d e l t a was p u r i f i e d f r o m g l y c e r o l g r a d i e n t f r a c t i o n s by D E A E - s e p h a d e x c h r o m a t o g r a p h y a p r o t e i n w i t h an a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t o f 55 t o 66 k i l o d a l t o n s was o f t e n d e t e c t e d by S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f t h e c o l u m n f r a c t i o n s w h i c h c o n t a i n e d d e l t a . T h i s b a n d d i d n o t c o n s i s t e n t l y m i g r a t e t o t h e same p o s i t i o n i n t h e g e l s i n r e l a t i o n t o t h e RNA p o l y m e r a s e s u b u n i t s and t h e amoun t o f c o n t a m i n a n t r e l a t i v e t o t h e d e l t a band a l s o v a r i e d f r o m d a y t o d a y . The c o n t a m i n a n t was n o t v i s i b l e on n o n d e n a t u r i n g g e l s and i t was c o n c l u d e d t h a t t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n was p r o b a b l y an a g g r e g a t e o f d e l t a . No o t h e r c o n t a m i n a t i n g p r o t e i n s w e r e e v i d e n t i n t h e d e l t a p r e p a r a t i o n s ( s e e F i g u r e 6 ) and a s shown i n T a b l e I and F i g u r e 7 d e l t a was f r e e o f R N a s e , DNase and p r o t e o l y t i c a c t i v i t y . C H A R A C T E R I Z A T I O N OF THE CONDITIONS FOR THE I N V ITRO S I N G L E ROUND T R A N S C R I P T I O N ASSAY S t u d i e s o f t h e E . c o l i RNA p o l y m e r a s e h a v e shown t h a t , i n g e n e r a l , enzyme w h i c h a s s o c i a t e s w i t h a p r o m o t e r p r o c e e d s t h r o u g h a " c l o s e d " s t a t e t o an " o p e n " c o m p l e x s t a t e w h i c h 38 F i g u r e 6 . S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f p u r i f i e d d e l t a . The s a m p l e s w e r e e l e c t r o p h o r e s e d t h r o u g h a 1 4 - 2 0 $ g r a d i e n t g e l , as d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s . L a n e 1 , H e p a r i n - a g a r o s e p u r i f i e d e n z y m e . L a n e 2 , p u r i f i e d d e l t a p r e p a r a t i o n . The p o s i t i o n s o f t h e s u b u n i t s a r e i n d i c a t e d . 39 1 2 40 T A B L E I A s s a y for RNase and DNase a c t i v i t y i n t h e d e l t a p r e p a r a t i o n D e l t a A v e r a g e cpm ( x l O - 5 ) DNA A v e r a g e cpm ( x 1 0 ~ ) RNA + 1 .75 + 0 . 0 5 3 . 0 1 + 0 . 3 4 1 .65 + 0 . 0 5 2 . 2 8 + 0 . 6 6 32 P - l a b e l l e d DNA o r i n v i t r o RNA s y n t h e s i z e d f r o m E c o R I - t r e a t e d p 3 2 8 - 5 was i n c u b a t e d a t 3 7 °C f o r 10 m i n u t e s w i t h d e l t a ( 1 3 - 1 5 p m o l ) o r enzyme s t o r a g e b u f f e r ( d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s ) u n d e r t h e same c o n d i t i o n s u s e d f o r i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n s . The RNA o r DNA s a m p l e s w e r e t h e n e l e c t r o p h o r e s e d on p o l y a c r y l a m i d e g e l s , and t h e b a n d s i n t h e g e l w e r e e x c i s e d and q u a n t i t a t e d f o r r a d i o a c t i v i t y by C e r e n k o v c o u n t i n g . The v a l u e s a r e a v e r a g e s o f t r i p l i c a t e DNA and d u p l i c a t e RNA s a m p l e s + t h e s t a n d a r d d e v i a t i o n . 41 F i g u r e 7 . A s s a y f o r p r o t e o l y t i c a c t i v i t y i n t h e d e l t a p r e p a r a t i o n . Core /<r was i n c u b a t e d a t 3 7^C i n t h e p r e s e n c e ( • ) o r - a b s e n c e ( • ) o f d e l t a f o r 1 t o 40 m i n u t e s b e f o r e b e i n g a d d e d t o a s t a n d a r d t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n . The t r a n s c r i p t i o n s we re i n i t i a t e d by t h e a d d i t i o n o f 80 nM enzyme t o t h e t e m p l a t e DNA ( a t 1 .7 nM) and r i b o n u c l e o t i d e s and c a r r i e d o u t f o r 10 m i n u t e s a t 3 7 ° C . D e l t a was a d d e d t o c o r e / s i g m a a t a r a t i o o f 0 . 5 m o l . d e l t a : 1 m o l . e n z y m e . 42 8 O 6 oc Q. 10 20 30 40 TIME (min) 43 i s s t a b l e and r e l a t i v e l y r e s i s t a n t t o i n a c t i v a t i o n by h e p a r i n ( W a l t e r e t a l . , 1 9 6 7 ; C h a m b e r l i n , 1 9 7 4 ; M c C l u r e , 1 9 8 0 ; S t e f a n o and G r a l l a , . 1 980 ) . Enzyme w h i c h i s f r e e i n s o l u t i o n , b o u n d a t n o n - s p e c i f i c s i t e s on t h e DNA o r i n " c l o s e d " c o m p l e x e s a t p r o m o t e r s i s i n a c t i v a t e d by h e p a r i n . I n t h e p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n r a t e a s s a y d e v e l o p e d by S t e f a n o and G r a l l a ( 1 9 8 0 ) t o s t u d y JE. c o l i RNA p o l y m e r a s e i n t e r a c t i o n s a t m u t a n t l a c p r o m o t e r s , RNA p o l y m e r a s e and p r o m o t e r - c o n t a i n i n g r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s a r e a l l o w e d t o f o r m c o m p l e x e s f o r v a r y i n g l e n g t h s o f t i m e b e f o r e n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e s and h e p a r i n a r e a d d e d t o t h e r e a c t i o n . Enzyme w h i c h i s i n an o p e n c o m p l e x a t t h e t i m e o f h e p a r i n a d d i t i o n w i l l p r o c e e d t o s y n t h e s i z e a r u n - o f f t r a n s c r i p t w h i c h t e r m i n a t e s a t t h e end o f t h e r e s t r i c t i o n f r a g m e n t . The r u n - o f f t r a n s c r i p t s a r e t h e p r o d u c t s o f a s i n g l e r o u n d o f i n i t i a t i o n and t h e i n c o r p o r a t i o n o f r a d i o a c t i v i t y i n t o t h e t r a n s c r i p t s c a n be u s e d t o q u a n t i t a t e t h e number o f o p e n c o m p l e x e s f o r m e d p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f h e p a r i n . The k i n e t i c s o f f o r m a t i o n o f s u c h c o m p l e x e s c a n t h e r e f o r e be s t u d i e d u s i n g a s i n g l e r o u n d t r a n s c r i p t i o n a s s a y . The p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n r a t e a s s a y was m o d i f i e d i n t h i s work t o i n v e s t i g a t e t h e i n i t i a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n a t t h e 029 A2 and G2 p r o m o t e r s by t h e B_. s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e . The c o n d i t i o n s f o r t h e a s s a y d i f f e r f r o m t h o s e o f t h e S t e f a n o and G r a l l a me thod i n t h r e e w a y s . F i r s t , i n s t e a d o f u s i n g p r o m o t e r - c o n t a i n i n g r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s , r u n - o f f t r a n s c r i p t s w e r e s y n t h e s i z e d f r o m p l a s m i d w h i c h had 44 b e e n c l e a v e d a t a r e s t r i c t i o n s i t e d o w n s t r e a m f r o m t h e p r o m o t e r o f i n t e r e s t . T h e r e was t h u s more n o n - s p e c i f i c DNA i n my a s s a y s t h a n i n t h e a s s a y s c a r r i e d o u t by S t e f a n o and G r a l l a ( 1 9 8 0 , 1 9 8 2 ) . S e c o n d l y , p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s w i t h t h e 029 A2 p r o m o t e r showed t h a t t h e s i m u l t a n e o u s a d d i t i o n o f h e p a r i n and r i b o n u c l e o t i d e s t o p r o m o t e r / p o l y m e r a s e b i n a r y c o m p l e x e s r e s u l t e d i n a v e r y l o w l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n ( s e e F i g u r e s 12 a , b ) . T h e s e d a t a s u g g e s t e d t h a t t h e RNA p o l y m e r a s e d i d n o t f o r m h e p a r i n - r e s i s t a n t , n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s w i t h t h e A2 p r o m o t e r . S i n c e t h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e t r a n s c r i p t i n i t i a t e d f r o m t h e A2 p r o m o t e r s i t e b e g i n s w i t h pppAGA ( D o b i n s o n and S p i e g e l m a n , 1 9 8 5 ) , ATP and GTP w e r e i n c l u d e d i n t h e r e a c t i o n s t o a l l o w t h e enzyme t o f o r m i n i t i a t e d c o m p l e x e s a t t h e p r o m o t e r . The m o d i f i e d c o m p o s i t e r a t e a s s a y u s e d i n t h i s wo rk t h u s m e a s u r e d t h e r a t e o f f o r m a t i o n o f h e p a r i n - r e s i s t a n t , i n i t i a t e d c o m p l e x e s , r a t h e r t h a n t h e f o r m a t i o n o f h e p a r i n - r e s i s t a n t , n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s . F i n a l l y , t h e c o n c e n t r a t i o n o f h e p a r i n u s e d i n t h e a s s a y s was 5 u g / m l , a s o p p o s e d t o 100 u g / m l u s e d by S t e f a n o and G r a l l a ( s e e F i g u r e 8 ) . The e f f e c t o f h e p a r i n c o n c e n t r a t i o n on t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r . The c o n c e n t r a t i o n o f h e p a r i n w h i c h w o u l d p r e v e n t m u l t i p l e i n i t i a t i o n e v e n t s a t t h e A2 p r o m o t e r was d e t e r m i n e d by m e a s u r i n g t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e p r o m o t e r a t d i f f e r e n t h e p a r i n c o n c e n t r a t i o n s . F i g u r e 8 shows t h e r e s u l t s o f an e x p e r i m e n t i n w h i c h e n z y m e / p r o m o t e r c o m p l e x e s w e r e f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f ATP and GTP f o r t e n 45 F i g u r e 8 . E f f e c t o f h e p a r i n c o n c e n t r a t i o n on t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r . H o l o e n z y m e ( c o r e / s i g m a / d e l t a ) was i n c u b a t e d w i t h t h e A2 p r o m o t e r t e m p l a t e , ATP and GTP f o r 10 m i n u t e s . Then h e p a r i n ( a t t h e i n d i c a t e d c o n c e n t r a t i o n s ) , CTP and UTP" w e r e a d d e d t o t h e r e a c t i o n s t o a l l o w s y n t h e s i s o f r u n - o f f t r a n s c r i p t s f r o m t h e c o m p l e x e s f o r m e d d u r i n g t h e i n i t i a t i o n i n t e r v a l . T r a n s c r i p t s w e r e s e p a r a t e d on d e n a t u r i n g g e l s and t h e r a d i o a c t i v i t y i n t h e A 2 - s p e c i f i c RNA q u a n t i t a t e d and c o n v e r t e d t o t h e number o f t r a n s c r i p t s s y n t h e s i z e d p e r A2 p r o m o t e r , as d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s . The enzyme c o n c e n t r a t i o n was 50 nM and t h e DNA c o n c e n t r a t i o n 1 .7 n M . 46 HEPARIN CONCENTRATION ug/ml 47 m i n u t e s . I n i t i a t i o n was t e r m i n a t e d by t h e a d d i t i o n o f U T P , CTP and h e p a r i n ( a t t h e c o n c e n t r a t i o n s i n d i c a t e d i n t h e f i g u r e ) t o t h e r e a c t i o n and e l o n g a t i o n o f i n i t i a t e d t r a n s c r i p t s was c a r r i e d o u t f o r 10 m i n u t e s . The number o f t r a n s c r i p t s s y n t h e s i z e d p e r A2 p r o m o t e r was d e t e r m i n e d a s a f u n c t i o n o f t h e h e p a r i n c o n c e n t r a t i o n i n t h e e l o n g a t i o n r e a c t i o n . I n t h e a b s e n c e o f h e p a r i n , a t 50 nM e n z y m e , a p p r o x i m a t e l y 2 . 4 t r a n s c r i p t s / p r o m o t e r w e r e s y n t h e s i z e d i n a s t a n d a r d t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n . As t h e h e p a r i n c o n c e n t r a t i o n was i n c r e a s e d f r o m 0 t o 1 u g / m l t h e number o f t r a n s c r i p t s d e c r e a s e d by a p p r o x i m a t e l y 65% and t h e n l e v e l e d o f f . I n t h e e x p e r i m e n t shown i n F i g u r e 8 t h e p l a t e a u o c c u r r e d a t a p p r o x i m a t e l y 0 . 8 t r a n s c r i p t s p e r p r o m o t e r . B a s e d on t h e a b o v e d a t a t h e h e p a r i n c o n c e n t r a t i o n c h o s e n f o r s u b s e q u e n t e x p e r i m e n t s was 5 u g / m l , 10 t o 20 f o l d l o w e r t h a n c o n c e n t r a t i o n s r o u t i n e l y u s e d i n s t u d i e s o f E . c o l i p r o m o t e r s ( M i l l e r and B u r g e s s , 1 9 7 8 ; S t e f a n o and G r a l l a , 1 9 8 0 ; Roe e t a l . , 1 9 8 5 ) . I The e f f e c t o f enzyme c o n c e n t r a t i o n on t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r . The amoun t o f h e p a r i n t o be u s e d i n t h e k i n e t i c a s s a y s was d e t e r m i n e d a t an enzyme c o n c e n t r a t i o n o f 50 n M . S i n g l e r o u n d t r a n s c r i p t i o n a s s a y s w e r e s u b s e q u e n t l y c a r r i e d o u t a t d i f f e r e n t enzyme i n p u t s t o show t h a t 5 ug h e p a r i n / m l was s u f f i c i e n t t o p r e v e n t m u l t i p l e r o u n d s o f t r a n s c r i p t i o n a t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f e n z y m e . I n t h e e x p e r i m e n t shown i n F i g u r e 9 t h e r e a c t i o n s c o n t a i n e d f r o m 5 t o 80 nM e n z y m e . The DNA was i n c u b a t e d w i t h t h e 48 F i g u r e 9 . The e f f e c t o f enzyme c o n c e n t r a t i o n on t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r . C o r e / s i g m a / d e l t a ( a t t h e i n d i c a t e d c o n c e n t r a t i o n s ) was i n c u b a t e d w i t h E c o R I - t r e a t e d p 3 2 8 - 5 DNA ( 1 . 7 n M ) , ATP and GTP f o r 10 m i n u t e s t o a l l o w t h e f o r m a t i o n o f i n i t i a t i o n c o m p l e x e s . H e p a r i n , (5 u g / m l ) , CTP and UTP w e r e t h e n a d d e d t o a l l o w e l o n g a t i o n f r o m i n i t i a t e d c o m p l e x e s . The l e v e l o f c o m p l e x f o r m a t i o n ( a c t i v i t y ) i s e x p r e s s e d a s t h e i n c o r p o r a t i o n o f [ P ] U T P i n t o A2 t r a n s c r i p t s . 49 50 e n z y m e , ATP a n d GTP f o r 10 m i n u t e s b e f o r e t h e C T P , UTP and h e p a r i n (5 u g / m l ) w e r e a d d e d t o t h e r e a c t i o n s . As t h e enzyme c o n c e n t r a t i o n was i n c r e a s e d f r o m 5 t o 30 nM t h e amoun t o f t r a n s c r i p t i o n s t e a d i l y i n c r e a s e d . A t enzyme c o n c e n t r a t i o n s g r e a t e r t h a n 30 nM t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n a p p r o a c h e d a maximum v a l u e . I n t h i s p a r t i c u l a r e x p e r i m e n t t h e maximum l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n , o b t a i n e d a t an enzyme c o n c e n t r a t i o n o f 80 n M , was 0 . 7 t r a n s c r i p t s / p r o m o t e r I n i t i a t i o n and E l o n g a t i o n o f T r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 P r o m o t e r . I n o r d e r t o c a r r y o u t t h e k i n e t i c a n a l y s e s i n t h i s w o r k i t was n e c e s s a r y t o d e t e r m i n e t h e t i m e i n t e r v a l s w h i c h w o u l d be s u f f i c i e n t t o a l l o w 1) m a x i m a l f o r m a t i o n o f i n i t i a t e d c o m p l e x e s and 2 ) c o m p l e t i o n o f r u n - o f f t r a n s c r i p t s . The e n d p o i n t o f t h e i n i t i a t i o n r e a c t i o n f o r t h e s i n g l e r o u n d t r a n s c r i p t i o n a s s a y was d e t e r m i n e d by i n c u b a t i n g t h e A2 p r o m o t e r t e m p l a t e w i t h t h e RNA p o l y m e r a s e , ATP and GTP f o r v a r y i n g l e n g t h s o f t i m e (1 t o 20 m i n u t e s ) , t h e n a d d i n g h e p a r i n , CTP and UTP t o a l l o w e l o n g a t i o n f r o m t h e c o m p l e x e s w h i c h had f o r m e d d u r i n g t h e i n i t i a t i o n r e a c t i o n . The e l o n g a t i o n r e a c t i o n was c o n t i n u e d f o r 10 m i n u t e s . A t an enzyme c o n c e n t r a t i o n o f 10 nM t h e i n i t i a t i o n r e a c t i o n was n o t r a p i d b u t was e s s e n t i a l l y c o m p l e t e a f t e r f i v e m i n u t e s ( F i g u r e 1 0 ) . T h e r e f o r e a 10 m i n u t e i n i t i a t i o n t i m e was c h o s e n a s a c o n v e n i e n t e n d p o i n t f o r t h e i n i t i a t i o n r e a c t i o n . The t i m e c o u r s e o f t h e e l o n g a t i o n r e a c t i o n was a l s o i n v e s t i g a t e d . I n i t i a t i o n c o m p l e x e s w e r e f o r m e d f o r 10 51 F i g u r e 1 0 . E f f e c t o f t h e i n i t i a t i o n t i m e i n t e r v a l on t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r . C o r e / s i g m a / d e l t a (10 nM) was i n c u b a t e d w i t h E c o R I - t r e a t e d p 3 2 8 - 5 DNA ( 1 . 7 n M ) , ATP and GTP f o r v a r i o u s l e n g t h s o f t i m e b e f o r e h e p a r i n , CTP and UTP were a d d e d t o t h e r e a c t i o n . The e l o n g a t i o n r e a c t i o n was c a r r i e d o u t f o r 10 m i n u t e s . - T h e o r d i n a t e r e p r e s e n t s t h e i n c o r p o r a t i o n o f [ 3 P ] U T P i n t o A2 t r a n s c r i p t s ( a c t i v i t y ) . 52 53 m i n u t e s p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f h e p a r i n , CTP and U T P . The t i m e a l l o w e d f o r t h e s u b s e q u e n t e l o n g a t i o n r e a c t i o n was v a r i e d b e t w e e n 1 and 20 m i n u t e s . F i g u r e 11 shows t h a t t h e e l o n g a t i o n r e a c t i o n was v e r y r a p i d . T r a n s c r i p t i o n was c o m p l e t e w i t h i n 1 m i n u t e and s i n c e t h e number o f t r a n s c r i p t s s y n t h e s i z e d d i d n o t c h a n g e a s t h e i n c u b a t i o n t i m e was i n c r e a s e d t h e e l o n g a t i o n r e a c t i o n was c a r r i e d o u t f o r 10 m i n u t e s i n a l l o f t h e e x p e r i m e n t s s u b s e q u e n t l y d e s c r i b e d . C H A R A C T E R I Z A T I O N OF THE I N I T I A T I O N REACTION AT THE A2 AND G2 PROMOTERS A . I n i t i a t i o n a t t h e A2 P r o m o t e r N u c l e o t i d e r e q u i r e m e n t s f o r s t a b l e c o m p l e x f o r m a t i o n a t A 2 . The o b s e r v a t i o n t h a t h e p a r i n - r e s i s t a n t c o m p l e x e s w e r e n o t f o r m e d when RNA p o l y m e r a s e was i n c u b a t e d w i t h t h e A2 p r o m o t e r s u g g e s t e d t h a t t h e f o r m a t i o n o f s t a b l e ( h e p a r i n - r e s i s t a n t ) c o m p l e x e s a t A2 m i g h t r e q u i r e t h e p r e s e n c e o f t h e i n i t i a t i n g r i b o n u c l e o t i d e ( s ) . The d a t a a l s o s u g g e s t e d t h a t t h e t r a n s i t i o n t o a h e p a r i n - r e s i s t a n t i n i t i a t i o n c o m p l e x m i g h t be s l o w r e l a t i v e t o t h e r a t e a t w h i c h h e p a r i n c a n i n a c t i v a t e t h e e n z y m e . The k i n e t i c s and e x t e n t o f c o m p l e x f o r m a t i o n i n t h e a b s e n c e o f n u c l e o t i d e s w e r e t h e r e f o r e c o m p a r e d t o c o m p l e x f o r m a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 1) A T P , 2 ) ATP a n d GTP o r 3 ) A T P , GTP and C T P . The r a t e o f c o m p l e x f o r m a t i o n was f o l l o w e d w i t h a p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n r a t e a s s a y ( d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s ) i n w h i c h t h e 54 F i g u r e 1 1 . The e f f e c t o f t h e e l o n g a t i o n t i m e i n t e r v a l on t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r . RNA p o l y m e r a s e and t h e A2 p r o m o t e r t e m p l a t e w e r e i n c u b a t e d f o r 10 m i n u t e s w i t h ATP and GTP t o f o r m i n i t i a t i o n c o m p l e x e s , p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f h e p a r i n , CTP and U T P . The e l o n g a t i o n r e a c t i o n was t h e n c a r r i e d o u t f o r v a r i o u s l e n g t h s o f t i m e ( i n d i c a t e d on t h e f i g u r e ) . The i n c o r p o r a t i o n o f [o*32 p - | U T p i n t o A 2 t r a n s c r i p t s was p l o t t e d a s a f u n c t i o n o f t h e l e n g t h o f t i m e a l l o w e d f o r e l o n g a t i o n . The p r o m o t e r c o n c e n t r a t i o n was 1 .7 nM and t h e enzyme c o n c e n t r a t i o n 50 n M . 55  l e v e l o f c o m p l e x f o r m a t i o n ( a s m e a s u r e d by t h e i n c o r p o r a t i o n o f [ o t 3 2 p - ] n T p i n t 0 r u n - o f f t r a n s c r i p t s ) was q u a n t i t a t e d a s a f u n c t i o n o f t h e t i m e b e t w e e n t h e a d d i t i o n o f t h e p o l y m e r a s e t o t h e r e a c t i o n and t h e a d d i t i o n o f h e p a r i n and r e m a i n i n g n u c l e o t i d e s . F i g u r e 12 shows t h e a u t o r a d i o g r a m s o f t h e g e l s o f p r o d u c t s s y n t h e s i z e d f r o m c o m p l e x e s f o r m e d by ( a ) c o r e / s i g m a o r ( b ) c o r e / s i g m a + d e l t a i n t h e p r e s e n c e o f t h e c o m b i n a t i o n s o f n u c l e o t i d e s l i s t e d a b o v e . The c o m p l e x f o r m a t i o n r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t f o r t h e t i m e s i n d i c a t e d i n t h e F i g u r e l e g e n d . When c o m p l e x f o r m a t i o n was c a r r i e d o u t i n t h e a b s e n c e o f n u c l e o t i d e s o r i n t h e p r e s e n c e o f ATP t h e A2 t r a n s c r i p t ( i n d i c a t e d by an a r r o w ) was s y n t h e s i z e d a t v e r y l o w l e v e l s , i m p l y i n g t h a t u n d e r t h o s e c o n d i t i o n s t h e RNA p o l y m e r a s e r e m a i n s i n a s t a t e w h i c h i s s e n s i t i v e t o i n a c t i v a t i o n by h e p a r i n . I n c u b a t i n g t h e enzyme w i t h ATP and t h e t e m p l a t e f o r 10 m i n u t e s ( F i g u r e s 12a and b , l a n e B5 ) d i d n o t y i e l d a n y more t r a n s c r i p t s t h a n when t h e enzyme and t e m p l a t e w e r e i n c u b a t e d t o g e t h e r . T h i s r e s u l t showed t h a t t e r n a r y c o m p l e x e s , c o m p o s e d o f t h e e n z y m e , A2 p r o m o t e r and A T P , w e r e n o t h e p a r i n - r e s i s t a n t . I t i s a s s u m e d h e r e t h a t i n t h e p r e s e n c e o f ATP t h e enzyme i s a b l e t o p r o c e e d t h r o u g h t h e i n i t i a t i o n p a t h w a y t o f o r m t e r n a r y c o m p l e x e s a t t h e A2 p r o m o t e r . C o m p l e x e s f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f ATP and t h e p r o m o t e r w i l l be s u b s e q u e n t l y d e s i g n a t e d A - i n i t i a t e d c o m p l e x e s . S i m i l a r l y , c o m p l e x e s w h i c h a r e f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f ATP and GTP w i l l be c a l l e d A G - i n i t i a t e d c o m p l e x e s . 57 F i g u r e 1 2 . N u c l e o t i d e r e q u i r e m e n t s f o r h e p a r i n - r e s i s t a n t c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 p r o m o t e r , ( a ) A u t o r a d i o g r a m o f a p o l y a c r y l a m i d e g e l o f t h e t r a n s c r i p t i o n p r o d u c t s f r o m t h e a s s a y f o r c o m p l e x f o r m a t i o n . C o r e / s i g m a (9nM) was i n c u b a t e d w i t h DNA ( 1 . 7 nM) and t h e f o l l o w i n g r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e s : A) no n u c l e o t i d e s , B) A T P , C) ATP and G T P , D) A T P , CTP and G T P , and i n i t i a t i o n a l l o w e d f o r 15 s ( l a n e 1 ) , 30 s ( l a n e 2 ) , 45 s ( l a n e 3 ) , 60 s ( l a n e 4 ) o r 10 m i n ( l a n e 5 ) . H e p a r i n and t h e r i b o n u c l e o t i d e s w h i c h w e r e n o t p r e s e n t d u r i n g c o m p l e x f o r m a t i o n w e r e a d d e d t o a l l o w s y n t h e s i s o f t r a n s c r i p t s . T r a n s c r i p t s w e r e s e p a r a t e d on d e n a t u r i n g g e l s a c c o r d i n g t o M a t e r i a l s and M e t h o d s . ( b ) C o m p l e x f o r m a t i o n w i t h c o r e / s i g m a + d e l t a (9nM) and 1 . 7 nM p 3 2 8 - 5 . L a n e s a r e t h e same a s i n ( a ) . ( c ) P l o t o f d a t a f r o m i n i t i a t i o n t i m e c o u r s e (15 t o 60 s e c o n d t i m e p o i n t s ) shown i n ( a ) . ( • ) c o m p l e x f o r m a t i o n i n t h e a b s e n c e o f n u c l e o t i d e s o r p r e s e n c e o f A T P . ( A ) c o m p l e x f o r m a t i o n w i t h ATP and G T P . ( • ) c o m p l e x f o r m a t i o n w i t h A T P , GTP and C T P . The o r d i n a t e r e p r e s e n t s t h e amoun t o f [ O < 3 2 P ] T J T P i n c o r p o r a t e d i n t o t h e A2 t r a n s c r i p t s . 5 8 a B 1 2 3 4 5 3 4 5 1 2 3 4 1 2 3 4  The t r a n s c r i p t s shown i n F i g u r e 12a w e r e c u t f r o m t h e g e l and q u a n t i t a t e d a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s . The amoun t o f r a d i o a c t i v i t y i n c o r p o r a t e d i n t o t h e t r a n s c r i p t s was p l o t t e d a g a i n s t t h e amoun t o f t i m e a l l o w e d f o r c o m p l e x f o r m a t i o n ( F i g u r e 1 2 c ) . T h e s e d a t a showed t h a t t h e number o f h e p a r i n - r e s i s t a n t n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s and A - i n i t i a t e d c o m p l e x e s f o r m e d d u r i n g a 60 s e c o n d r e a c t i o n was v e r y l o w ( e q u i v a l e n t t o 0 . 0 5 t r a n s c r i p t s p e r p r o m o t e r i n t h i s e x p e r i m e n t ) . The a d d i t i o n o f GTP t o t h e i n i t i a t i o n r e a c t i o n r e s u l t e d i n a 1 0 - f o l d i n c r e a s e i n t h e maximum y i e l d o f h e p a r i n - r e s i s t a n t c o m p l e x e s ( s e e F i g u r e 1 2 c ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e A G - i n i t i a t e d c o m p l e x e s w e r e much more r e s i s t a n t t o h e p a r i n i n a c t i v a t i o n t h a n w e r e c o m p l e x e s f o r m e d i n t h e a b s e n c e o f n u c l e o t i d e s o r i n t h e p r e s e n c e o f A T P . The i m p l i c a t i o n o f t h e s e r e s u l t s i s t h a t t h e e x t e n t t o w h i c h n o n - i n i t i a t e d o r A - i n i t i a t e d c o m p l e x e s a r e c o n v e r t e d t o h e p a r i n - r e s i s t a n t , A G - i n i t i a t e d c o m p l e x e s a f t e r h e p a r i n i s a d d e d t o t h e r e a c t i o n i s n o t s i g n i f i c a n t , a l t h o u g h i t i s p r o b a b l y r e s p o n s i b l e f o r t h e l o w l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n o b s e r v e d f r o m t h e n o n - i n i t i a t e d o r A - i n i t i a t e d c o m p l e x e s . The a d d i t i o n o f CTP t o t h e i n i t i a t i o n r e a c t i o n r e s u l t e d i n a f u r t h e r i n c r e a s e i n a c t i v i t y o v e r t h e a c t i v i t y o b s e r v e d i n t h e p r e s e n c e o f ATP and G T P . The i n c r e a s e was c o n s i s t e n t l y o b s e r v e d w i t h d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s , a l t h o u g h t h e e x t e n t o f t h e i n c r e a s e v a r i e d b e t w e e n a p p r o x i m a t e l y 10 and 20%. I t i s n o t c l e a r i f c o m p l e x e s f o r m e d i n t h e 61 p r e s e n c e o f A T P , GTP and CTP a r e more r e s i s t a n t t o h e p a r i n t h a n a r e A G - i n i t i a t e d c o m p l e x e s o r w h e t h e r more o f t h e c o m p l e x e s a r e f o r m e d . I n t h e p r e s e n c e o f A T P , CTP and GTP t h e RNA p o l y m e r a s e i s a b l e t o s y n t h e s i z e a 14 b a s e t r a n s c r i p t f r o m t h e A2 p r o m o t e r ( D o b i n s o n and S p i e g e l m a n , 1 9 8 5 ) . H a n s e n and M c C l u r e ( 1 9 8 0 ) h a v e s h o w n , u s i n g a p o l y d ( A - T ) t e m p l a t e , t h a t s i g m a d i s s o c i a t e s f r o m t h e E . c o l i RNA p o l y m e r a s e a f t e r a p p r o x i m a t e l y 8 o r 9 n u c l e o t i d e s h a v e b e e n i n c o r p o r a t e d i n t o t h e RNA. I t h a s b e e n f u r t h e r h y p o t h e s i z e d by v o n H i p p e l e t a l . ( 1 9 8 2 ) t h a t a t t h i s p o i n t t h e enzyme m o v e s , e s s e n t i a l l y i r r e v e r s i b l y , i n t o an e l o n g a t i o n s t a t e . I t i s p o s s i b l e t h a t by t h e t i m e a 14 b a s e t r a n s c r i p t h a s b e e n s y n t h e s i z e d f r o m t h e A2 p r o m o t e r t h e enzyme w o u l d h a v e moved t h r o u g h i n i t i a t i o n i n t o an e l o n g a t i o n p h a s e . CTP was t h e r e f o r e o m i t t e d f r o m s u b s e q u e n t i n i t i a t i o n r e a c t i o n s t o a v o i d i n t r o d u c i n g a n y r a t e - l i m i t i n g s t e p s w h i c h m i g h t be i n v o l v e d i n t h e t r a n s i t i o n f r o m an i n i t i a t i o n t o an e l o n g a t i o n s t a t e . The E f f e c t o f D e l t a on I n i t i a t i o n a t t h e A2 P r o m o t e r . The p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n r a t e a s s a y was u s e d t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o f d e l t a on c o m p l e x f o r m a t i o n a t A 2 . To e n s u r e t h a t a n y d i f f e r e n c e s i n t h e t r a n s c r i p t i o n k i n e t i c s c o u l d n o t be a t t r i b u t e d t o v a r i a b i l i t y b e t w e e n d i f f e r e n t enzyme p r e p a r a t i o n s , t r a n s c r i p t i o n by enzyme w h i c h had b e e n d e p l e t e d o f d e l t a ( c o r e / s i g m a ) by D N A - c e l l u l o s e o r D E A E - s e p h a d e x c h r o m a t o g r a p h y , a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and 62 M e t h o d s , was c o m p a r e d w i t h t r a n s c r i p t i o n f r o m c o r e / s i g m a w h i c h had b e e n r e c o n s t i t u t e d w i t h p u r i f i e d d e l t a . S t a n d a r d , m u l t i p l e r o u n d t r a n s c r i p t i o n s w e r e c a r r i e d o u t , a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s , w i t h c o r e / s i g m a and c o r e / s i g m a + d e l t a f o r v a r y i n g l e n g t h s o f t i m e t o d e t e r m i n e i f t h e a d d i t i o n o f d e l t a a f f e c t e d t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r . The amoun t o f A2 t r a n s c r i p t p r o d u c e d i n t h e p r e s e n c e o f d e l t a was c o n s i d e r a b l y l o w e r t h a n i n t h e a b s e n c e o f d e l t a and t h e r a t e a t w h i c h t r a n s c r i p t s w e r e made was a l s o s l o w e r ( s e e F i g u r e 1 3 ) , i n d i c a t i n g t h a t a t t h i s p a r t i c u l a r p r o m o t e r d e l t a i n h i b i t e d some s t e p i n t h e t r a n s c r i p t i o n p a t h w a y . A l t h o u g h t r a n s c r i p t i o n was d e p r e s s e d i n t h e p r e s e n c e o f d e l t a i t was n o t p o s s i b l e t o d e t e r m i n e f r o m t h e e x p e r i m e n t d e s c r i b e d a b o v e w h i c h s t e p ( s ) i n t h e t r a n s c r i p t i o n p a t h w a y w e r e b e i n g i n h i b i t e d . D e l t a h a s b e e n shown t o i n h i b i t t h e f o r m a t i o n o f s t a b l e n o n - s p e c i f i c e n z y m e / D N A c o m p l e x e s ( D i c k e l , e t a l . , 1 9 8 0 ; A c h b e r g e r and W h i t e l e y , 1 9 8 1 ) and i t was p o s s i b l e t h a t t r a n s c r i p t i o n f r o m A2 was b e i n g i n h i b i t e d i n t h e same w a y . The e f f e c t o f d e l t a on c o m p l e x f o r m a t i o n a t A2 was t h e r e f o r e i n v e s t i g a t e d t o d e t e r m i n e i f d e l t a was i n h i b i t i n g t r a n s c r i p t i o n by i n h i b i t i n g t h e f o r m a t i o n o f i n i t i a t i o n c o m p l e x e s . C o m p l e x f o r m a t i o n was m e a s u r e d a s a f u n c t i o n o f t h e t i m e a l l o w e d f o r i n i t i a t i o n , p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f h e p a r i n t o t h e r e a c t i o n . I n t h i s p a r t i c u l a r e x p e r i m e n t ( s e e F i g u r e 14) a p p r o x i m a t e l y 0 . 8 t r a n s c r i p t s p e r p r o m o t e r w e r e s y n t h e s i z e d by c o r e / s i g m a f o l l o w i n g a 60 63 F i g u r e 1 3 . E f f e c t o f d e l t a on t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r . S t a n d a r d , m u l t i p l e r o u n d t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t w i t h c o r e / s i g m a ( • ) and c o r e / s i g m a + d e l t a ( • ) a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s , e x c e p t t h a t t h e t i m e s a l l o w e d f o r t h e r e a c t i o n s was v a r i e d b e t w e e n 1 and 20 m i n u t e s . D e l t a was a d d e d t o c o r e / s i g m a a t a r a t i o o f 0 . 4 m o l d e l t a : 1 m o l e n z y m e . The i n c o r p o r a t i o n o f [ c < 3 2 p ] n x p i n t o t h e A2 t r a n s c r i p t s i s e x p r e s s e d a s a c t i v i t y . 64  s e c o n d i n i t i a t i o n . When c o r e / s i g m a was r e c o n s t i t u t e d w i t h d e l t a t h e l e v e l o f c o m p l e x e s f o r m e d d u r i n g a 1 m i n u t e i n i t i a t i o n d r o p p e d by 50$ t o a p p r o x i m a t e l y 0 . 4 t r a n s c r i p t s / p r o m o t e r . The i n h i b i t o r y e f f e c t o f d e l t a was v e r y s p e c i f i c w i t h r e s p e c t t o t h e t i m e a t w h i c h d e l t a was a d d e d t o t h e t r a n s c r i p t i o n . When a d d e d s u b s e q u e n t t o c o m p l e x f o r m a t i o n ( w i t h t h e h e p a r i n , CTP and UTP) d e l t a had no e f f e c t on t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n . To i n h i b i t t r a n s c r i p t i o n f r o m A2 d e l t a mus t t h e r e f o r e be p r e s e n t a t some p o i n t d u r i n g t h e f o r m a t i o n o f i n i t i a t i o n c o m p l e x e s , a l t h o u g h t h e p r e c i s e s t e p i n t h e i n i t i a t i o n p a t h w a y w h i c h was a f f e c t e d c o u l d n o t be d e t e r m i n e d f r o m t h e a s s a y d e s c r i b e d a b o v e . K i n e t i c s t u d i e s o f p r o m o t e r - s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s by t h e E . c o l i RNA p o l y m e r a s e h a v e l e d t o t h e p r o p o s a l t h a t t h e f o r m a t i o n o f some p o l y m e r a s e / p r o m o t e r o p e n c o m p l e x e s p r o c e e d s t h r o u g h an u n s t a b l e i n t e r m e d i a t e and t h a t t h e f o r m a t i o n o f o p e n c o m p l e x e s a t s u c h p r o m o t e r s i t e s e x h i b i t s p s e u d o - f i r s t o r d e r k i n e t i c s u n d e r c o n d i t i o n s o f enzyme e x c e s s ( S t e f a n o and G r a l l a , 1 9 8 0 ; H a w l e y and M c C l u r e , 1 9 8 0 ; M c C l u r e , 1 9 8 0 ) . S t e f a n o and G r a l l a ( 1 9 8 0 ) h a v e f u r t h e r shown t h a t t h e i n i t i a l r a t e o f o p e n c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e s e p r o m o t e r s c a n be m e a s u r e d by q u a n t i t a t i n g t h e amount o f r a d i o a c t i v i t y w h i c h i s i n c o r p o r a t e d i n t o r u n - o f f t r a n s c r i p t s a f t e r a l l o w i n g c o m p l e x f o r m a t i o n f o r v a r y i n g l e n g t h s o f t i m e ( a s d e s c r i b e d a b o v e ) . The f r a c t i o n o f u n o c c u p i e d p r o m o t e r s i t e s ( C C E _ c t ] / C E ) r e m a i n i n g a f t e r a 66 F i g u r e 1 4 . E f f e c t o f d e l t a on c o m p l e x f o r m a t i o n a t A2 . RNA p o l y m e r a s e was i n c u b a t e d w i t h t h e A2 p r o m o t e r t e m p l a t e , ATP and GTP f o r t h e i n d i c a t e d t i m e i n t e r v a l s . A l i q u o t s o f t h e r e a c t i o n w e r e t h e n a d d e d t o h e p a r i n , CTP and UTP t o a l l o w e l o n g a t i o n o f t r a n s c r i p t s f r o m c o m p l e x e s f o r m e d d u r i n g t h e i n i t i a t i o n r e a c t i o n . ( • ) c o r e / s i g m a ; ( • ) c o r e / s i g m a + d e l t a ; ( A ) c o r e / s i g m a p r e s e n t d u r i n g f o r m a t i o n o f i n i t i a t i o n c o m p l e x e s , d e l t a a d d e d t o t h e r e a c t i o n w i t h t h e h e p a r i n , CTP and U T P . The t e m p l a t e DNA was 1.7 nM and t h e enzyme c o n c e n t r a t i o n 30 n M . D e l t a was a d d e d t o c o r e / s i g m a a t a r a t i o o f 0 . 8 m o l d e l t a : 1 m o l c o r e / s i g m a . 67 A TIME (sec) 68 b i n d i n g t i m e o f t s e c o n d s c a n be c a l c u l a t e d f r o m t h e amount o f r a d i o a c t i v i t y i n c o r p o r a t e d i n t o t h e r u n - o f f t r a n s c r i p t s s y n t h e s i z e d f r o m c o m p l e x e s f o r m e d d u r i n g t h e b i n d i n g r e a c t i o n ( C f c ) a n c j t h e maximum amount o f r a d i o a c t i v i t y ( C E ) i n c o r p o r a t e d i n t o t h e RNA a f t e r an e x t e n d e d b i n d i n g r e a c t i o n . S i n c e t h e l o s s o f a v a i l a b l e p r o m o t e r s i t e s f o l l o w s f i r s t o r d e r k i n e t i c s t h e t i m e c o u r s e o f t h e b i n d i n g r e a c t i o n i s l i n e a r when g r a p h e d on a s e m i l o g a r i t h m i c p l o t ( S t e f a n o and G r a l l a , 1 9 8 2 ) . The d a t a p r e s e n t e d i n F i g u r e 1 5 , t a k e n f r o m F i g u r e 1 2 , show t h a t t h e f o r m a t i o n o f A G - i n i t i a t e d c o m p l e x e s a t A2 f o l l o w e d p s e u d o - f i r s t o r d e r k i n e t i c s . The d a t a a l s o show t h a t t h e a d d i t i o n o f d e l t a t o c o r e / s i g m a i n h i b i t e d t h e r a t e a t w h i c h i n i t i a t i o n c o m p l e x e s f o r m e d a t A 2 . The p s e u d o - f i r s t o r d e r r a t e c o n s t a n t s ( k o b s ) f o r t h e i n i t i a t i o n r e a c t i o n s c o u l d be c a l c u l a t e d f r o m t h e s l o p e s o f t h e l i n e s ( S t e f a n o and G r a l l a , 1 9 8 2 ) i n F i g u r e 1 5 . K o b s i s , i n t u i t i v e l y , a m e a s u r e o f t h e v e l o c i t y o f t h e r e a c t i o n . I n t h i s p a r t i c u l a r e x p e r i m e n t 3 . 6 p m o l e d e l t a was a d d e d p e r p m o l e c o r e / s i g m a . K 0 b S was 0 . 0 1 9 s ~ ^ f o r c o r e / s i g m a and 0 . 0 0 6 s~ f o r c o r e / s i g m a + d e l t a , i n d i c a t i n g t h a t a s w e l l a s d e p r e s s i n g t h e f i n a l number o f c o m p l e x e s f o r m e d , d e l t a d e p r e s s e d t h e r a t e o f c o m p l e x f o r m a t i o n . The e f f e c t o f d e l t a on t h e l e v e l o f A2 t r a n s c r i p t s y n t h e s i z e d i n a p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n a s s a y was a l s o m e a s u r e d a t v a r i o u s enzyme c o n c e n t r a t i o n s . The r e s u l t s o f t h i s e x p e r i m e n t a r e shown i n F i g u r e 1 6 . I n t h e a b s e n c e o f 69 F i g u r e 1 5 . S e m i l o g a r i t h m i c p l o t o f t h e d a t a f r o m t h e A G - i n i t i a t i o n t i m e c o u r s e s shown i n f i g u r e s 12a and b . The o r d i n a t e r e p r e s e n t s t h e f r a c t i o n o f u n o c c u p i e d p r o m o t e r s i t e s r e m a i n i n g a f t e r t h e p e r i o d o f i n i t i a t i o n i n d i c a t e d , c a l c u l a t e d f r o m t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n (Cj . ) o b t a i n e d a f t e r i n i t i a t i o n t i m e = t , and t h e maximum l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n ( C _ ) o b t a i n e d a f t e r 10 m i n u t e s o f i n i t i a t i o n . The p r o m o t e r c o n c e n t r a t i o n was 1.7 nM and t h e RNA p o l y m e r a s e was 9 n M . ( • ) c o r e / s i g m a , ( • ) c o r e / s i g m a + d e l t a (3.6 m o l e d e l t a / m o l e e n z y m e ) . 70 71 F i g u r e 1 6 . E f f e c t o f d e l t a on t h e maximum l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r a t v a r i o u s enzyme c o n c e n t r a t i o n s . C o r e / s i g m a ( a t t h e i n d i c a t e d c o n c e n t r a t i o n s ) was i n c u b a t e d i n t h e p r e s e n c e ( • ) o r a b s e n c e o f d e l t a ( • ) u n d e r t h e c o n d i t i o n s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y f o r f i g u r e 9 . D e l t a was a d d e d t o c o r e / s i g m a a t a r a t i o o f 0 . 5 m o l . d e l t a : 1 m o l . e n z y m e . The l e v e l o f c o m p l e x f o r m a t i o n ( a c t i v i t y ) i s e x p r e s s e d a s t h e i n c o r p o r a t i o n o f [ < * 3 2 P ] U T P i n t o A2 t r a n s c r i p t s . 72 ENZYME CONCENTRATION (nM) 73 a d d e d d e l t a t h e amoun t o f t r a n s c r i p t i o n i n c r e a s e d a s t h e enzyme c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d , t o a maximum o f a p p r o x i m a t e l y 0.9 t r a n s c r i p t s / p r o m o t e r a t an enzyme c o n c e n t r a t i o n o f 36 n M . I n t h e p r e s e n c e o f a d d e d d e l t a t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n was l o w e r a t a l l o f t h e enzyme c o n c e n t r a t i o n s t e s t e d and t h e maximum l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n o b t a i n e d ( a t an enzyme c o n c e n t r a t i o n o f 36 nM) was a p p r o x i m a t e l y 0.6 t r a n s c r i p t s / p r o m o t e r . The E f f e c t o f D e l t a on t h e S t a b i l i t y o f I n i t i a t e d C o m p l e x e s . One m e c h a n i s m by w h i c h d e l t a c o u l d i n h i b i t c o m p l e x f o r m a t i o n w o u l d be by d e s t a b i l i z i n g t h e i n i t i a t e d c o m p l e x e s . The s t a b i l i t y o f t h e i n i t i a t e d c o m p l e x e s was t h e r e f o r e t e s t e d by i n c u b a t i n g A G - i n i t i a t e d c o m p l e x e s i n t h e p r e s e n c e o f h e p a r i n f o r v a r y i n g l e n g t h s o f t i m e b e f o r e a l l o w i n g t h e e l o n g a t i o n r e a c t i o n t o o c c u r . Enzyme w h i c h d i s s o c i a t e d f r o m t h e i n i t i a t e d c o m p l e x e s d u r i n g t h e i n c u b a t i o n w o u l d be i n a c t i v a t e d by h e p a r i n and t h e l o s s o f f u n c t i o n a l i n i t i a t i o n c o m p l e x e s w o u l d be o b s e r v e d as a c o r r e s p o n d i n g d e c r e a s e i n t h e number o f t r a n s c r i p t s p e r p r o m o t e r . An e x a m p l e o f a t i m e c o u r s e o f l o s s o f i n i t i a t e d c o m p l e x e s i n t h e p r e s e n c e o f h e p a r i n i s shown i n F i g u r e 1 7 . When p r e - f o r m e d i n i t i a t i o n c o m p l e x e s w e r e i n c u b a t e d i n t h e p r e s e n c e o f h e p a r i n t h e f r a c t i o n o f c o r e / c r and c o r e / c r + c o m p l e x e s d e c r e a s e d w i t h i n c r e a s e d i n c u b a t i o n t i m e . W h i l e d e l t a r e d u c e d t h e l e v e l o f c o m p l e x e s f o r m e d , t h e a d d i t i o n o f d e l t a t o t h e enzyme d i d n o t a p p e a r t o a l t e r t h e s t a b i l i t y o f 74 F i g u r e 1 7 . E f f e c t o f d e l t a on t h e s t a b i l i t y o f i n i t i a t e d c o m p l e x e s . C o r e / o - ( • ) o r c o r e / c r + <J ( • ) was i n c u b a t e d w i t h E c o R I - t r e a t e d p 3 2 8 - 5 DNA ( 1 . 7 n M ) , ATP and GTP f o r 10 m i n u t e s t o a l l o w t h e f o r m a t i o n o f i n i t i a t e d c o m p l e x e s . H e p a r i n was t h e n a d d e d and a t t h e t i m e s i n d i c a t e d s a m p l e s w e r e r e m o v e d t o a l l o w e l o n g a t i o n f r o m i n i t i a t e d c o m p l e x e s w h i c h had n o t d i s s o c i a t e d d u r i n g t h e h e p a r i n t r e a t m e n t . P r o m o t e r c o n c e n t r a t i o n was 1.7 nM and t h e enzyme c o n c e n t r a t i o n was 20 n M . D e l t a was a d d e d t o c o r e / s i g m a a t a r a t i o o f 0 . 5 m o l . : 1 m o l . e n z y m e . C o m p l e x f o r m a t i o n was q u a n t i t a t e d a s t h e number o f A2 t r a n s c r i p t s s y n t h e s i z e d p e r p r o m o t e r . The s o l i d l i n e r e p r e s e n t s t h e l o s s o f a c t i v i t y d e t e c t e d i n t h e p r e s e n c e o f h e p a r i n and t h e d a s h e d l i n e r e p r e s e n t s t h e l o s s o f a c t i v i t y d e t e c t e d i n t h e a b s e n c e o f h e p a r i n . 75 TIME (min) t h e c o m p l e x e s o r t h e i r s e n s i t i v i t y t o d i r e c t i n a c t i v a t i o n by h e p a r i n . T h e r e f o r e d e l t a mus t a f f e c t some o t h e r p a r a m e t e r i n t h e i n i t i a t i o n r e a c t i o n . I n t h e e x p e r i m e n t p r e s e n t e d i n F i g u r e 17 t h e c o r e / s i g m a c o m p l e x e s seemed t o be s l i g h t l y l e s s s t a b l e t h a n c o r e / s i g m a + d e l t a c o m p l e x e s . H o w e v e r , t h i s r e s u l t was n o t c o n s i s t e n t l y o b s e r v e d i n r e p e a t e x p e r i m e n t s and t h e d i f f e r e n c e was t h e r e f o r e n o t c o n s i d e r e d t o be s i g n i f i c a n t . The S t a b i l i t y o f N o n - i n i t i a t e d C o m p l e x e s a t t h e A2 P r o m o t e r . C o m p e t i t i o n a s s a y s w e r e c a r r i e d o u t i n an a t t e m p t t o m e a s u r e t h e s t a b i l i t y o f n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s a t t h e A2 p r o m o t e r , w i t h t h e i n t e n t i o n o f u s i n g t h e a s s a y t o d e t e r m i n e i f d e l t a i n h i b i t e d s t a b l e c o m p l e x f o r m a t i o n by i n c r e a s i n g t h e d i s s o c i a t i o n r a t e o f n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s . The e x p e r i m e n t was c a r r i e d o u t a s f o l l o w s : c o r e / s i g m a was f i r s t i n c u b a t e d w i t h p 3 2 8 - 5 DNA f o r f i v e m i n u t e s . To e n s u r e t h a t t h e r e w e r e s u f f i c i e n t p r o m o t e r s i t e s t o b i n d a l l t h e a v a i l a b l e e n z y m e , t h e e x p e r i m e n t was c a r r i e d o u t u n d e r c o n d i t i o n s o f DNA e x c e s s , w i t h t h e A2 p r o m o t e r c o n c e n t r a t i o n a t 8 . 5 nM and an a c t i v e enzyme c o n c e n t r a t i o n o f 5 n M . The c o m p e t i t o r DNA ( w h i c h a l s o c a r r i e d a p r o m o t e r r e c o g n i z e d by t h e s i g m a - 4 3 RNA p o l y m e r a s e ) was a d d e d t o t h e A2 t e m p l a t e and RNA p o l y m e r a s e , a f t e r t h e f i v e m i n u t e b i n d i n g r e a c t i o n , t o b i n d enzyme w h i c h d i s s o c i a t e d f r o m t h e A2 p r o m o t e r . The c o n c e n t r a t i o n o f t h e c o m p e t i t o r t e m p l a t e i n t h e r e a c t i o n was a l s o 8 . 5 n M . A t 15 s e c o n d i n t e r v a l s a f t e r t h e c o m p e t i t o r was a d d e d s a m p l e s w e r e r e m o v e d and a d d e d t o ATP and GTP t o 77 a l l o w enzyme w h i c h was b o u n d t o e i t h e r o f t h e p r o m o t e r s t o f o r m i n i t i a t i o n c o m p l e x e s , t h u s t r a p p i n g t h e enzyme a t t h e p r o m o t e r s . The i n i t i a t i o n r e a c t i o n was c a r r i e d o u t f o r t e n m i n u t e s b e f o r e h e p a r i n , CTP and UTP w e r e a d d e d t o a l l o w e l o n g a t i o n f r o m t h e i n i t i a t e d c o m p l e x e s . The l o s s o f A2 c o m p l e x e s d u r i n g t h e c o m p e t i t i o n r e a c t i o n w o u l d be d e t e c t e d a s a d e c r e a s e i n t h e number o f A2 t r a n s c r i p t s and a c o r r e s p o n d i n g i n c r e a s e i n t h e number o f G2 t r a n s c r i p t s . The c o m p e t i t o r DNA was a p l a s m i d c o n s t r u c t ( o b t a i n e d f r o m G . B . S p i e g e l m a n , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a ) c a r r y i n g t h e 029 G2 p r o m o t e r ( S o g o e t a l . , 1 9 7 9 ; D a v i s o n e t a l . , 1 9 7 9 , 1 9 8 0 ; G a r v e y e t a l . , 1 9 8 5 ) c l o n e d i n t o p E M B L . T h i s p l a s m i d c a n be l i n e a r i z e d d o w n s t r e a m o f t h e G2 p r o m o t e r u s i n g t h e r e s t r i c t i o n enzyme H i n d l l l . T r a n s c r i p t i o n o f t h e l i n e a r i z e d p l a s m i d w i t h t h e s i g m a - 4 3 RNA p o l y m e r a s e y i e l d s a r u n - o f f RNA o f a p p r o x i m a t e l y 120 b a s e s , w h i c h c a n be e a s i l y d i s t i n g u i s h e d f r o m t h e A2 t r a n s c r i p t on p o l y a c r y l a m i d e g e l s . The r e s u l t s o f one c o m p e t i t i o n e x p e r i m e n t a r e shown i n T a b l e I I . When t h e enzyme ( c o r e / s i g m a ) was i n c u b a t e d w i t h t h e A2 t e m p l a t e f o r f i v e m i n u t e s p r i o r t o t h e 10 m i n u t e i n i t i a t i o n r e a c t i o n , 0 . 0 8 t r a n s c r i p t s / e n z y m e w e r e s y n t h e s i z e d f r o m A 2 . When t h e c o m p e t i t o r and A2 t e m p l a t e s w e r e i n c u b a t e d t o g e t h e r f o r f i v e m i n u t e s t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m A2 d r o p p e d t o 0 . 0 2 t r a n s c r i p t s / e n z y m e w h e r e a s 0 . 2 t r a n s c r i p t s w e r e s y n t h e s i z e d f r o m G 2 . I t s h o u l d be n o t e d t h a t a l t h o u g h t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r was v e r y l o w t h e o b s e r v e d d e c r e a s e was 78 T A B L E I I T e m p l a t e c o m p e t i t i o n a s s a y A s s a y T e m p l a t e P r e - b i n d i n g T r a n s c r i p t s / e n z y m e C o n d i t i o n s A2 G2 1 A2 - 0 . 21 A 2 / G 2 - 0 . 0 5 0 . 3 8 2 A2 + 0 . 0 8 A 2 / G 2 + 0 . 0 2 0 . 2 9 3 A 2 / G 2 + 0 . 0 2 0 . 2 1 The e f f e c t o f a c o m p e t i t o r (G2) t e m p l a t e on t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 t e m p l a t e i n a s i n g l e r o u n d t r a n s c r i p t i o n a s s a y , was m e a s u r e d u n d e r t h e f o l l o w i n g c o n d i t i o n s : 1) S t a n d a r d p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n c o n d i t i o n s (10 m i n u t e AG i n i t i a t i o n f o l l o w e d by a 10 m i n u t e e l o n g a t i o n r e a c t i o n ) w i t h A2 a l o n e o r A2 and G 2 . 2 ) The i n i t i a t i o n r e a c t i o n was p r e c e d e d by a 5 ' 1 5 " b i n d i n g r e a c t i o n d u r i n g w h i c h t i m e A2 o r A2 and G2 w e r e i n c u b a t e d w i t h t h e RNA p o l y m e r a s e . 3 ) A2 was i n c u b a t e d w i t h t h e RNA p o l y m e r a s e f o r 5 m i n u t e s , t h e n G2 was a d d e d and t h e b i n d i n g r e a c t i o n c o n t i n u e d f o r an a d d i t i o n a l 15 s e c o n d s b e f o r e a l l o w i n g i n i t i a t i o n t o o c c u r . 79 r e p r o d u c i b l e . The G2 t e m p l a t e t h u s seemed t o c o m p e t e v e r y e f f e c t i v e l y w i t h t h e A2 p r o m o t e r f o r t h e a v a i l a b l e enzyme when t h e two t e m p l a t e s w e r e a d d e d s i m u l t a n e o u s l y t o t h e r e a c t i o n . The G2 p r o m o t e r a l s o a c t e d a s an e f f i c i e n t c o m p e t i t o r when i t was a d d e d t o p r e f o r m e d A 2 / R N A p o l y m e r a s e c o m p l e x e s . W i t h i n 15 s e c o n d s a f t e r t h e G2 t e m p l a t e was a d d e d t o t h e A2 c o m p l e x e s t h e d i s t r i b u t i o n o f c o m p l e x e s a t t h e two p r o m o t e r s was t h e same as when t h e two t e m p l a t e s w e r e s i m u l t a n e o u s l y i n c u b a t e d w i t h t h e e n z y m e . T h i s r e s u l t i n d i c a t e d t h a t enzyme b o u n d a t t h e A2 p r o m o t e r s d i s s o c i a t e d v e r y r a p i d l y . I n f a c t , c o r e / s i g m a d i s s o c i a t e d f r o m A2 s o r a p i d l y t h a t a d i s s o c i a t i o n r a t e c o u l d n o t be a s c e r t a i n e d . W h i l e i t i s p o s s i b l e t h a t n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s w o u l d be more u n s t a b l e i n t h e p r e s e n c e o f d e l t a , due t o t h e l i m i t a t i o n s o f t h e a s s a y ( i t was n o t p o s s i b l e t o s a m p l e a t t i m e i n t e r v a l s o f l e s s t h a n 15 s e c o n d s ) an i n c r e a s e d d i s s o c i a t i o n r a t e w o u l d n o t be d e t e c t a b l e . A l t h o u g h t h i s p a r t i c u l a r a s s a y was n o t s e n s i t i v e e n o u g h t o d e t e r m i n e i f d e l t a a f f e c t e d c o m p l e x f o r m a t i o n by i n c r e a s i n g t h e i n s t a b i l i t y o f t h e A 2 - p o l y m e r a s e b i n a r y c o m p l e x e s i t d i d d e m o n s t r a t e t h e r a p i d e q u i l i b r i u m s t a t e o f t h e n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s a t t h e A2 p r o m o t e r . The c o m p e t i t i o n a s s a y r e v e a l e d two a d d i t i o n a l p i e c e s o f i n f o r m a t i o n a b o u t c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 and G2 p r o m o t e r s . When t h e RNA p o l y m e r a s e was n o t i n c u b a t e d w i t h t h e A2 t e m p l a t e p r i o r t o i n i t i a t i o n , a p p r o x i m a t e l y 0 . 2 A2 t r a n s c r i p t s w e r e s y n t h e s i z e d p e r enzyme ( i n t h e a b s e n c e o f 80 t h e G2 c o m p e t i t o r ) . The enzyme a c t i v i t y t h u s d e c r e a s e d by 60$ ( t o 0 . 0 8 t r a n s c r i p t s / e n z y m e ) when t h e t e m p l a t e and enzyme w e r e p r e - i n c u b a t e d t o g e t h e r f o r o n l y f i v e m i n u t e s , s u g g e s t i n g t h a t t h e enzyme was i n a c t i v a t e d v e r y r a p i d l y u n d e r c o n d i t i o n s w h e r e h e p a r i n - r e s i s t a n t i n i t i a t i o n c o m p l e x e s c o u l d n o t be f o r m e d . I t was a l s o o b s e r v e d t h a t more t r a n s c r i p t s w e r e s y n t h e s i z e d f r o m t h e G2 p r o m o t e r t h a n f r o m t h e A2 p r o m o t e r ( s e e T a b l e I I ) . T h i s o b s e r v a t i o n s u p p o r t s a p r e v i o u s r e p o r t by D a v i s o n e t a l . ( 1 9 8 0 ) t h a t i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e G2 p r o m o t e r was much more e f f i c i e n t t h a n t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r a t l o w enzyme c o n c e n t r a t i o n s . K i n e t i c s o f RNA s y n t h e s i s i n i t i a t i o n a t t h e A2 p r o m o t e r ( T a u p l o t a n a l y s i s ) . As d e s c r i b e d a b o v e , a p r e l i m i n a r y k i n e t i c a n a l y s i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 15 showed t h a t t h e f o r m a t i o n o f i n i t i a t i o n c o m p l e x e s a t A2 f o l l o w e d p s e u d o - f i r s t o r d e r k i n e t i c s , a n a l o g o u s t o o p e n c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e E_. c o l i l a c U V 5 p r o m o t e r . S t e f a n o and G r a l l a ( 1 9 8 0 ) and M c C l u r e ( 1 9 8 0 ) h a v e p r o p o s e d t h a t t h e f o r m a t i o n o f o p e n c o m p l e x e s a t some E.. c o l i p r o m o t e r s ( s u c h a s l a c U V 5 ) p r o c e e d s a s f o l l o w s : E + P ^ = ^ E - P c ^ = f r E _ p o w h e r e E _ p c i s an u n s t a b l e ( c l o s e d ) i n t e r m e d i a t e , E - P Q i s t h e o p e n p o l y m e r a s e / p r o m o t e r c o m p l e x and t h e t r a n s i t i o n f r o m t h e c l o s e d t o t h e o p e n c o m p l e x i s t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p i n t h e p a t h w a y . 81 Based on the above model S t e f a n o and G r a l l a (1982) used a composite r a t e assay to i n v e s t i g a t e open complex f o r m a t i o n at mutant l a c promoters. T h i s assay combines the p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n r a t e a s s a y , i n which the r a t e of complex f o r m a t i o n i s measured a t d i f f e r e n t enzyme i n p u t s , w i t h the tau p l o t a n a l y s i s of McClure (1980) to c a l c u l a t e the r a t e and e q u i l i b r i u m c o n s t a n t s which c h a r a c t e r i z e the f o r m a t i o n of polymerase/promoter open complexes. The S t e f a n o and G r a l l a model now appears to be o v e r s i m p l i f i e d w i t h r e s p e c t to the c u r r e n t model ( M c C l u r e , 1985). Recent d a t a s u p p o r t the h y p o t h e s i s t h a t the f o r m a t i o n of open complexes proceeds through a minimum of t h r e e k i n e t i c a l l y s i g n i f i c a n t s t e p s (Roe et a l . , 1984; Buc and M c C l u r e , 1985; Spassky et a l , 1985). I t s h o u l d be noted however t h a t the a d d i t i o n a l i n t e r m e d i a t e r e p o r t e d by those a u t h o r s was o n l y d e t e c t a b l e a t extremes of i o n i c s t r e n g t h and t e m p e r a t u r e . For the purposes of the k i n e t i c a n a l y s i s c a r r i e d out by S t e f a n o and G r a l l a (1982) the two-step model i s t h e r e f o r e s u f f i c i e n t . By analogy w i t h the S t e f a n o and G r a l l a model f o r open complex f o r m a t i o n a t mutant l a c pro m o t e r s , the i n i t i a t i o n pathway, as measured by the A G - i n i t i a t i o n a s s a y , a t the A2 promoter can be w r i t t e n as f o l l o w s : E+p^=^E-P f i *E-P ± where E-P^ i s the A G - i n i t i a t i o n complex. The i n t e r m e d i a t e ( E - P # ) m a y not be comparable to the c l o s e d complex t h a t i s formed at the lacUV5 promoter ( i t c o u l d f o r example be an 8 2 o p e n c o m p l e x i n w h i c h t h e enzyme r e a d i l y d i s s o c i a t e s f r o m t h e p r o m o t e r ) . E - P a i s d e f i n e d a s t h e u n s t a b l e i n t e r m e d i a t e whose c o n v e r s i o n t o E - P ± i s r a t e - l i m i t i n g . The t r a n s i t i o n f r o m t h e u n s t a b l e i n t e r m e d i a t e t o t h e i n i t i a t e d c o m p l e x i s a s s u m e d t o be e s s e n t i a l l y i r r e v e r s i b l e and i s w r i t t e n a s a s i n g l e s t e p b e c a u s e t h e f o r m a t i o n o f o t h e r p o s s i b l e i n t e r m e d i a t e s was n o t m e a s u r e d . I t i s u n l i k e l y t h a t t h e b i n d i n g o f t h e i n i t i a t i n g n u c l e o t i d e and s y n t h e s i s o f t h e f i r s t p h o s p h o d i e s t e r bond i s r a t e - l i m i t i n g ( M c C l u r e , 1 9 8 0 ; S t e f a n o and G r a l l a , 1980 , 1 9 8 2 ) . The a s s u m p t i o n t h e r e f o r e , i s t h a t a l t h o u g h t h e e n d p o i n t o f t h e A G - i n i t i a t i o n r e a c t i o n i s an i n i t i a t e d c o m p l e x r a t h e r t h a n a n o n - i n i t i a t e d o p e n c o m p l e x , a d d i n g ATP and GTP t o t h e r e a c t i o n s h o u l d n o t i n t r o d u c e a d d i t i o n a l s t e p s w h i c h a r e p o t e n t i a l l y r a t e - l i m i t i n g . I t i s a l s o a s s u m e d t h a t t h e A G - i n i t i a t i o n a s s a y r e v e a l s t h e same b a s i c m e c h a n i s m a s t h e r a t e a s s a y u s e d i n t h e w o r k o f S t e f a n o and G r a l l a ( 1 9 8 2 ) . The i n i t i a t i o n k i n e t i c s a t t h e A2 p r o m o t e r and t h e e f f e c t o f d e l t a on t h e k i n e t i c p a r a m e t e r s w e r e t h e r e f o r e i n v e s t i g a t e d u s i n g t h e t a u p l o t a n a l y s i s . An e x a m p l e o f t h e d a t a f o r t h e m e a s u r e m e n t o f t h e i n i t i a l r a t e o f i n i t i a t i o n c o m p l e x f o r m a t i o n , a t d i f f e r e n t p o l y m e r a s e i n p u t s , i s shown i n F i g u r e 1 8 . The f r a c t i o n o f u n o c c u p i e d p r o m o t e r s i t e s ( { C E _ c t } / c E ) was p l o t t e d on a l o g a r i t h m i c s c a l e a s a f u n c t i o n o f t h e t i m e a l l o w e d f o r c o m p l e x f o r m a t i o n . The t a u p l o t a n a l y s i s was c a r r i e d o u t by c a l c u l a t i n g t h e p s e u d o - f i r s t o r d e r r a t e c o n s t a n t s ( k 0 f o S ) 83 F i g u r e 1 8 . ( a ) A u t o r a d i o g r a m o f a p o l y a c r y l a m i d e g e l o f t h e p r o d u c t s f r o m t h e a s s a y f o r i n i t i a t i o n c o m p l e x f o r m a t i o n , a t t h r e e RNA p o l y m e r a s e c o n c e n t r a t i o n s . Enzyme was a d d e d t o DNA, ATP and GTP and i n i t i a t i o n a l l o w e d f o r 15 s ( l a n e 1 ) , 30 s ( l a n e 2 ) , 45 s ( l a n e 3 ) , 60 s ( l a n e 4 ) o r 10 m i n ( l a n e 5 ) . H e p a r i n , CTP and UTP w e r e a d d e d t o a l l o w s y n t h e s i s o f r u n - o f f t r a n s c r i p t s f r o m t h e c o m p l e x e s f o r m e d a t t h e A2 p r o m o t e r d u r i n g t h e i n i t i a t i o n i n t e r v a l . T r a n s c r i p t s w e r e s e p a r a t e d on g e l s as d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s . ( b ) S e m i l o g a r i t h m i c p l o t o f d a t a f r o m an i n i t i a t i o n t i m e c o u r s e . The o r d i n a t e r e p r e s e n t s t h e f r a c t i o n o f a v a i l a b l e p r o m o t e r s i t e s ( t C E - C t ] / C E ) r e m a i n i n g a f t e r t h e p e r i o d o f i n i t i a t i o n , c a l c u l a t e d as i n f i g u r e 1 5 . The p r o m o t e r c o n c e n t r a t i o n was 1.7 n M . RNA p o l y m e r a s e ( a c t i v e e n z y m e ) c o n c e n t r a t i o n s w e r e : 2 2 . 9 nM ( • ) , 1 9 . 4 nM ( A ) , 1 5 . 8 nM ( A ) , 1 0 . 6 nM ( • ) , 9 . 7 nM ( O ) . 84 9.7nM 10.6nM 12.3nM 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 I5 30 45 60 Time (sec.) 85 f r o m t h e s l o p e s o f t h e l i n e s o b t a i n e d a t e a c h enzyme c o n c e n t r a t i o n , as d e s c r i b e d a b o v e . Tau v a l u e s ( t a u = 1 / k N o b s i w e r e p l o t t e d a g a i n s t 1 / e n z y m e c o n c e n t r a t i o n t o g e n e r a t e p l o t s s u c h a s t h e one shown i n F i g u r e 19 and t h e r a t e c o n s t a n t s w e r e d e r i v e d a s d e f i n e d by S t e f a n o and G r a l l a ( 1 9 8 2 ) . The y i n t e r c e p t on t h e t a u p l o t i s 1 / k 2 and t h e x i n t e r c e p t i s - 1 / K ^ f w h e r e k 2 i s t h e f o r w a r d r a t e c o n s t a n t f o r t h e c o n v e r s i o n o f t h e i n t e r m e d i a t e t o t h e s t a b l e c o m p l e x ( E - P # E - P j _ ) , K A « i s t h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r t h e i n t e r m e d i a t e ( M c C l u r e , 1980 ; S t e f a n o and G r a l l a , .1982) and t h e o v e r a l l f o r w a r d r a t e c o n s t a n t (K ) f o r t h e r e a c t i o n E + P * - E - P ± i s k 2 / K A « . Tau p l o t s w e r e g e n e r a t e d f o r f i v e d i f f e r e n t enzyme p r e p a r a t i o n s . T a b l e I I I shows t h e c a l c u l a t e d k 2 > K a « and K Q n v a l u e s f o r e a c h e n z y m e . The c o n t e n t o f s i g m a i n t h e v a r i o u s p r e p a r a t i o n s was u s e d t o e s t i m a t e t h e f r a c t i o n o f a c t i v e enzyme i n e a c h p r e p a r a t i o n t o f a c i l i t a t e c o m p a r i s o n b e t w e e n t h e p r e p a r a t i o n s . The v a l u e s h a v e t h e r e f o r e b e e n n o r m a l i z e d w i t h r e s p e c t t o t h e s i g m a c o n t e n t o f e a c h e n z y m e . The d e l t a c o n t e n t was a l s o d e t e r m i n e d f o r f o u r o f t h e f i v e e n z y m e s , a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s . A l t h o u g h t h e d e l t a c o n t e n t o f #4 was n o t d e t e r m i n e d , e x a m i n a t i o n o f t h e enzyme on an S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l s t a i n e d w i t h c o o m a s s i e b l u e s h o w e d t h a t t h e enzyme had a p p r o x i m a t e l y t h e same amoun t o f d e l t a a s #5 . The d a t a p r e s e n t e d i n T a b l e I I I show t h a t a l l p r e p a r a t i o n s ( w i t h t h e e x c e p t i o n o f # 3 ) , had s i m i l a r K^^ 8(6 -40 -20 0 20 40 60 1/ [ENZYME] (>iM-1) F i g u r e 1 9 . Tau p l o t a n a l y s i s o f i n i t i a t i o n c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 p r o m o t e r f o r one o f t h e enzyme p r e p a r a t i o n s (#1) shown i n T a b l e I I I . E a c h p o i n t r e p r e s e n t s a t a u v a l u e , c a l c u l a t e d f r o m t h e i n i t i a l r a t e o f c o m p l e x f o r m a t i o n f o r t h e c o r r e s p o n d i n g enzyme c o n c e n t r a t i o n , a s d e t e r m i n e d by t h e r u n - o f f t r a n s c r i p t i o n a s s a y . The l i n e was c a l c u l a t e d by l i n e a r r e g r e s s i o n . 87 TABLE I I I K i n e t i c p a r a m e t e r s o b s e r v e d f o r d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s o f B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e k „ K. „ . K . on Enzyme S i g m a D e l t a -2 A * C o n t e n t C o n t e n t ( s " 1 ) (nM) ( x 1 0 6 M " 1 s " 1 {%) (%) 1 88 66 0 . 0 4 9 47 1.0 2 48 57 0 . 0 8 3 21 4 . 0 3 48 60 0 . 0 3 5 6 5 . 8 4« 66 ND 0 . 2 3 8 55 4 . 3 5» 73 31 0 . 1 0 4 62 1 .7 A t a u p l o t a n a l y s i s ( d e s c r i b e d i n t e x t ) was c a r r i e d o u t f o r f i v e d i f f e r e n t enzyme p r e p a r a t i o n s . The k i n e t i c p a r a m a t e r s k 2 > K A * > a n d K o n w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e t a u p l o t s a s d e s c r i b e d i n t e x t . P r e p a r a t i o n s i n d i c a t e d by t h e a s t e r i s k s w e r e d e p l e t e d o f d e l t a a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s . The d e l t a c o n t e n t o f #4 was n o t d e t e r m i n e d . 88 v a l u e s w h e r e a s K Q n r a n g e d f r o m 1 t o 5 . 8 x 10 M " 1 s " 1 . The k 2 v a l u e s r a n g e d f r o m . 0 3 5 t o . 2 3 8 s " 1 • A l l o f t h e s e v a l u e s a r e w i t h i n t h e r a n g e o f v a l u e s c a l c u l a t e d by S t e f a n o and G r a l l a ( 1 9 8 2 ) f o r s e v e r a l m u t a n t l a c p r o m o t e r s , s u g g e s t i n g t h a t t h e m o d i f i c a t i o n s t o t h e a s s a y h a v e n o t i n t r o d u c e d a n y s i g n i f i c a n t l y s l o w k i n e t i c s t e p s . The c o n t e n t o f d e l t a d i d n o t seem t o a f f e c t K Q n 0 r K A » . The r e l a t i o n s h i p b e t w e e n k 2 and d e l t a c o n t e n t i s l e s s c l e a r . The d a t a p r e s e n t e d i n T a b l e I I I s u g g e s t t h a t t h e r a t e c o n s t a n t k 2 m i g h t i n c r e a s e as t h e c o n t e n t o f d e l t a d e c r e a s e s . B . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e I n i t i a t i o n R e a c t i o n a t t h e G2 P r o m o t e r The G2 p r o m o t e r h a s n o t b e e n a s e x t e n s i v e l y c h a r a c t e r i z e d a s t h e A2 p r o m o t e r i n t h e i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n s y s t e m , n o r h a s t h e s p e c i f i c i n i t i a t i o n s i t e o f t h e i n v i t r o t r a n s c r i p t b e e n m a p p e d . The s i z e o f t h e G 2 - s p e c i f i c t r a n s c r i p t ( a p p r o x i m a t e l y 120 b a s e s ) d i d s u g g e s t t h a t t r a n s c r i p t i o n was b e i n g i n i t i a t e d a c c u r a t e l y f r o m t h e G2 p r o m o t e r s i t e w h i c h i s l o c a t e d 130 b a s e p a i r s u p s t r e a m o f t h e H i n d l l l r e s t r i c t i o n s i t e ( G . B . S p i e g e l m a n , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ; G a r v e y e t a l , 1 9 8 5 ) . I t was t h e r e f o r e d e c i d e d t o c a r r y o u t an a n a l y s i s o f c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e G2 p r o m o t e r . N u c l e o t i d e r e q u i r e m e n t s f o r s t a b l e c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e G2 p r o m o t e r . C o m p l e x f o r m a t i o n a t G2 was a n a l y z e d w i t h t h e same a s s a y u s e d t o d e f i n e t h e r e q u i r e m e n t s f o r s t a b l e 89 c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 p r o m o t e r . C o m p l e x f o r m a t i o n i n t h e a b s e n c e o f n u c l e o t i d e s was c o m p a r e d t o c o m p l e x f o r m a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 1) G T P , t h e i n i t i a t i n g r N T P ( D a v i s o n et_ a l . , 1 9 8 0 ; G . B . S p i e g e l m a n , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) o r 2 ) ATP and G T P . The l e v e l o f c o m p l e x f o r m a t i o n ( t r a n s c r i p t s p e r p r o m o t e r ) was m e a s u r e d a s a f u n c t i o n o f t h e t i m e b e t w e e n t h e a d d i t i o n s o f t h e RNA p o l y m e r a s e and h e p a r i n and t h e r e m a i n i n g n u c l e o t i d e s t o t h e r e a c t i o n . When h o l o e n z y m e was i n c u b a t e d w i t h t h e G2 t e m p l a t e ( p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f h e p a r i n , A T P , C T P , GTP and UTP) t h e r a t e o f c o m p l e x f o r m a t i o n and t h e f i n a l number o f c o m p l e x e s o b s e r v e d w e r e e s s e n t i a l l y t h e same as when GTP o r ATP and GTP w e r e i n c l u d e d i n t h e b i n d i n g s t e p , a s shown i n F i g u r e 2 0 . U n l i k e A 2 , t h e f o r m a t i o n o f h e p a r i n - r e s i s t a n t c o m p l e x e s a t G2 a p p a r e n t l y d o e s n o t r e q u i r e i n i t i a t i o n . The E f f e c t o f D e l t a on I n i t i a t i o n a t t h e G2 P r o m o t e r . The i n i t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e (j>29 02 p r o m o t e r s u g g e s t e d t h a t t h e k i n e t i c s o f c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e G2 and A2 p r o m o t e r s w e r e d i f f e r e n t . The e f f e c t o f d e l t a on t h e f o r m a t i o n o f i n i t i a t i o n c o m p l e x e s a t G2 was t h e r e f o r e i n v e s t i g a t e d w i t h t h e c o m p o s i t e r a t e a s s a y , d e s c r i b e d a b o v e , w h i c h had b e e n u s e d t o i n v e s t i g a t e c o m p l e x f o r m a t i o n a t A 2 . I n o r d e r t o d i r e c t l y c o m p a r e t h e d a t a w i t h t h o s e f r o m t h e A2 p r o m o t e r ATP and GTP w e r e i n c l u d e d i n t h e i n i t i a t i o n s t e p . S i n c e t h e RNA s y n t h e s i z e d f r o m G2 b e g i n s w i t h t h e s e q u e n c e pppGAAG ( G . B . S p i e g e l m a n , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) t h e RNA p o l y m e r a s e i s a b l e t o f o r m a t e r n a r y c o m p l e x a t t h e G2 90 F i g u r e 2 0 . N u c l e o t i d e r e q u i r e m e n t s f o r s t a b l e c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e G2 p r o m o t e r . The RNA p o l y m e r a s e ( c o r e / s i g m a / d e l t a ) was i n c u b a t e d w i t h H i n d l l l - t r e a t e d G2 p r o m o t e r t e m p l a t e ( 1 . 7 nM) i n t h e a b s e n c e o f n u c l e o t i d e s ( • ) , i n t h e p r e s e n c e o f GTP ( A ) , o r w i t h ATP and GTP ( • ) , f o r t h e t i m e s i n d i c a t e d . H e p a r i n and t h e r e m a i n i n g n u c l e o t i d e s w e r e t h e n a d d e d t o a l l o w t h e s y n t h e s i s o f t r a n s c r i p t s f r o m c o m p l e x e s w h i c h had f o r m e d d u r i n g t h e c o m p l e x f o r m a t i o n r e a c t i o n . C o m p l e x f o r m a t i o n i s e x p r e s s e d a s t h e number o f t r a n s c r i p t s s y n t h e s i z e d p e r G2 p r o m o t e r . The enzyme c o n c e n t r a t i o n was 11 n M . 91 15 30 45 60 TIME (sec) 92 p r o m o t e r , s i m i l a r t o t h e t e r n a r y c o m p l e x f o r m e d a t A2 , i n t h e p r e s e n c e o f ATP and G T P . The e f f e c t o f d e l t a on c o m p l e x f o r m a t i o n a t G2 i s shown i n F i g u r e 2 1 . As a c o n t r o l t h e e f f e c t o f d e l t a was m e a s u r e d s i m u l t a n e o u s l y w i t h t h e A2 p r o m o t e r . The number o f t r a n s c r i p t s p e r p r o m o t e r was m e a s u r e d a s a f u n c t i o n o f t h e t i m e a l l o w e d f o r i n i t i a t i o n , p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f h e p a r i n . D e l t a had no e f f e c t on c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e G2 p r o m o t e r , w h e r e a s t h e f i n a l l e v e l o f c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 p r o m o t e r was i n h i b i t e d by a p p r o x i m a t e l y 5 0 $ . 9 3 F i g u r e 2 1 . E f f e c t o f d e l t a on i n i t i a t i o n f r o m t h e 029 A2 and G2 p r o m o t e r s . C o r e / c r was i n c u b a t e d w i t h ( o p e n s y m b o l s ) o r w i t h o u t ( c l o s e d s y m b o l s ) d e l t a ( a t a r a t i o o f 0 . 9 m o l . d e l t a : 1 m o l . e n z y m e ) i n t h e p r e s e n c e o f A T P , GTP and t h e A2 o r G2 p r o m o t e r f o r 15 t o 60 s e c o n d s p r i o r t o e l o n g a t i o n . F o r m a t i o n o f A G - i n i t i a t e d c o m p l e x e s i s e x p r e s s e d a s t h e number o f t r a n s c r i p t s s y n t h e s i z e d p e r A2 o r G2 p r o m o t e r . ( A ) G2 p r o m o t e r , ( • ) A2 p r o m o t e r . P r o m o t e r c o n c e n t r a t i o n s w e r e 1 .7 n M . Enzyme c o n c e n t r a t i o n was 49 n M . 94 95 D I S C U S S I O N M e t h o d s f o r m e a s u r i n g i n i t i a t i o n r a t e s . The m u l t i - s t e p n a t u r e o f t h e RNA s y n t h e t i c p a t h w a y p r e c l u d e s a s t r a i g h t f o r w a r d a n a l y s i s o f t h e t r a n s c r i p t i o n p r o c e s s . F o r e x a m p l e , i n o r d e r t o i n v e s t i g a t e t h e m e c h a n i s m by w h i c h RNA p o l y m e r a s e f o r m s s p e c i f i c c o m p l e x e s a t p r o m o t e r s i t i s n e c e s s a r y t o h a v e an a s s a y s y s t e m w h i c h c a n q u a n t i t a t e t h e c o m p l e x f o r m a t i o n r e a c t i o n i n d e p e n d e n t l y o f t h e e l o n g a t i o n r e a c t i o n . T h r e e m e t h o d s w h i c h h a v e b e e n d e v i s e d f o r t h i s p u r p o s e a r e t h e f i l t e r b i n d i n g a s s a y ( H i n k l e and C h a m b e r l i n , v 1 9 7 2 a ) , t h e a b o r t i v e i n i t i a t i o n a s s a y ( J o h n s t o n and M c C l u r e , 1 9 7 6 : M c C l u r e e t a l . , 1 9 7 8 ) and t h e p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n r a t e a s s a y ( S t e f a n o and G r a l l a , 1 9 8 0 ) . The f i l t e r - b i n d i n g t e c h n i q u e i s b a s e d on t h e o b s e r v a t i o n t h a t h i g h l y s t a b l e RNA p o l y m e r a s e / D N A c o m p l e x e s a r e r e t a i n e d on membrane f i l t e r s w h e r e a s u n c o m p l e x e d DNA d o e s n o t b i n d t o t h e f i l t e r s . The f o r m a t i o n o f b i n a r y ( n o n - i n i t i a t e d ) o r t e r n a r y ( i n i t i a t e d ) c o m p l e x e s a t p r o m o t e r s c a n t h e r e f o r e be m e a s u r e d i n t h e a b s e n c e o f e l o n g a t i o n . T h i s p a r t i c u l a r m e t h o d h a s b e e n u s e d e x t e n s i v e l y f o r a n a l y s i s o f c o m p l e x f o r m a t i o n a t E . c o l i p h a g e T7 p r o m o t e r s ( H i n k l e and C h a m b e r l i n , 1 9 7 2 a , b ) and a t some J3. s u b t i l i s p h a g e p r o m o t e r s ( f o r r e v i e w s e e D o i , 1 9 8 2 ) . Work by M c C l u r e and h i s c o l l e a g u e s ( J o h n s o n and M c C l u r e , 1976 ; M c C l u r e e_t a l . , 1978 ) h a s shown t h a t a t some E . c o l i p r o m o t e r s t h e RNA p o l y m e r a s e w i l l r e i t e r a t i v e l y 96 s y n t h e s i z e and r e l e a s e d i - o r t r i - n u c l e o t i d e s ( a b o r t i v e i n i t i a t i o n p r o d u c t s ) , w i t h o u t c o n c o m i t a n t r e l e a s e o f t h e e n z y m e . A b o r t i v e i n i t i a t i o n i s f a v o u r e d i n t h e p r e s e n c e o f r i f a m p i c i n o r a b s e n c e o f r i b o n u c l e o t i d e s w h i c h w o u l d a l l o w e l o n g a t i o n o f i n i t i a t e d t r a n s c r i p t s , a l t h o u g h a b o r t i v e t r a n s c r i p t s c a n be s y n t h e s i z e d e v e n when a l l f o u r r i b o n u c l e o t i d e s a r e p r e s e n t ( M c C l u r e and C e c h , 1 9 7 8 ; C a r p o u s i s and G r a l l a , 1 9 8 0 ; Munson and R e z n i k o f f , 1 9 8 1 ) . The a b o r t i v e t r a n s c r i p t i o n p r o d u c t s c a n be q u a n t i t a t e d and u s e d t o m e a s u r e t h e s t e a d y - s t a t e r a t e a t w h i c h i n i t i a t i o n o c c u r s . T h i s phenomenon h a s b e e n e x p l o i t e d t o s t u d y t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p s i n t h e t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n p a t h w a y ( M c C l u r e , 1 9 8 0 ) and t o i d e n t i f y p r o m o t e r - c o n t a i n i n g DNA f r a g m e n t s ( C e c h e t a l . , 1 9 8 0 ) . W h i l e t h e two m e t h o d s o u t l i n e d a b o v e do a l l o w t h e m e a s u r e m e n t o f c o m p l e x f o r m a t i o n , t h e y do n o t n e c e s s a r i l y q u a n t i t a t e c o m p l e x e s w h i c h c a n p r o d u c e c o m p l e t e t r a n s c r i p t s , a l t h o u g h i t i s a s s u m e d w i t h t h e a b o r t i v e i n i t i a t i o n a s s a y t h a t t h e RNA p o l y m e r a s e w o u l d , u n d e r t h e a p p r o p r i a t e c o n d i t i o n s , be a b l e t o s y n t h e s i z e f u l l - l e n g t h t r a n s c r i p t s . The p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n r a t e a s s a y h o w e v e r , d o e s m e a s u r e f u n c t i o n a l c o m p l e x f o r m a t i o n b e c a u s e , as d e s c r i b e d a b o v e ( s e e R e s u l t s ) , o n l y s p e c i f i c p r o m o t e r / p o l y m e r a s e i n t e r a c t i o n s w h i c h y i e l d r u n - o f f t r a n s c r i p t s a r e q u a n t i t a t e d . T h i s a s s a y was t h e r e f o r e c o n s i d e r e d t o be a s i m p l e and u s e f u l me thod w h i c h c o u l d be a d a p t e d f o r t h e 97 s t u d y o f f u n c t i o n a l c o m p l e x f o r m a t i o n a t B a c i l l u s p r o m o t e r s . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n a s s a y c o n d i t i o n s . The 029 A2 p r o m o t e r w h i c h was c l o n e d i n t o pBR322 d i r e c t s t h e s y n t h e s i s o f a d i s c r e t e t r a n s c r i p t , f r o m E c o R I - t r e a t e d p 3 2 8 - 5 , u n d e r t h e s t a n d a r d c o n d i t i o n s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s and M e t h o d s . T h i s RNA h a s b e e n shown t o be 237 b a s e s i n l e n g t h and t o be i n i t i a t e d f r o m t h e A2 p r o m o t e r a t t h e same s i t e f r o m w h i c h i n v i v o t r a n s c r i p t i o n i s i n i t i a t e d ( D o b i n s o n and S p i e g e l m a n , 1 9 8 5 ) . S i n c e t h e 1 . s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e i s c a p a b l e o f i n i t i a t i n g s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n f r o m A 2 , t h e p r o m o t e r was u s e d t o d e f i n e t h e g e n e r a l c o n d i t i o n s f o r t h e p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n r a t e a s s a y and t o s t u d y t h e e f f e c t o f t h e d e l t a p e p t i d e on s p e c i f i c p o l y m e r a s e / p r o m o t e r i n t e r a c t i o n s . When h e p a r i n was a d d e d t o p r e f o r m e d 13. s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e / A 2 p r o m o t e r c o m p l e x e s v e r y l i t t l e t r a n s c r i p t i o n was d e t e c t e d ( a p p r o x i m a t e l y 0 . 0 5 t r a n s c r i p t s / p r o m o t e r ) , e v e n a t h e p a r i n c o n c e n t r a t i o n s as l o w a s 5 u g / m l ( s e e F i g u r e 12a and b , l a n e s A1 t o A 5 ) . When c o m p l e x e s w e r e f o r m e d i n t h e p r e s e n c e o f ATP and GTP and t h e n a d d e d t o U T P , CTP and i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n s o f h e p a r i n , t r a n s c r i p t i o n was m a x i m a l l y i n h i b i t e d a t a h e p a r i n c o n c e n t r a t i o n o f 1 u g / m l . The l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n o b s e r v e d i n t h e e x p e r i m e n t shown i n F i g u r e 8 ( 0 . 8 t r a n s c r i p t s p e r p r o m o t e r ) was s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d by S t e f a n o and G r a l l a ( 1 9 8 0 , 1 9 8 2 ) and was m a i n t a i n e d a t h e p a r i n c o n c e n t r a t i o n s up t o 20 u g / m l . 98 B e c a u s e v e r y l i t t l e t r a n s c r i p t i o n was o b s e r v e d f r o m c o m p l e x e s f o r m e d i n t h e a b s e n c e o f n u c l e o t i d e s i t a p p e a r e d t h a t f r e e RNA p o l y m e r a s e and enzyme w h i c h was i n a n o n - i n i t i a t e d s t a t e a t A2 w e r e b o t h v e r y s e n s i t i v e t o i n a c t i v a t i o n by h e p a r i n . The p l a t e a u r e g i o n i n t h e h e p a r i n c o n c e n t r a t i o n c u r v e a l s o s u g g e s t e d t h a t t h e A G - i n i t i a t e d c o m p l e x e s a r e v e r y s t a b l e and t h a t RNA p o l y m e r a s e w h i c h i s i n s u c h c o m p l e x e s a t A2 i s t h e r e f o r e i n s e n s i t i v e t o a t t a c k by h e p a r i n . A l t h o u g h t h e h i g h e s t h e p a r i n c o n c e n t r a t i o n t e s t e d was 20 u g / m l i t i s p o s s i b l e t h a t A G - i n i t i a t e d c o m p l e x e s a t A2 a r e a s i n s e n s i t i v e t o h e p a r i n a s a r e o p e n c o m p l e x e s a t many E. c o l i p r o m o t e r s , w h i c h c a n be r e s i s t a n t t o 100 u g / m l h e p a r i n ( S t e f a n o and G r a l l a , 19 8 0 , 1982 ) . The h e p a r i n c o n c e n t r a t i o n (5 u g / m l ) f o r t h e s u b s e q u e n t a s s a y s was d e t e r m i n e d f r o m an e x p e r i m e n t i n w h i c h t h e enzyme c o n c e n t r a t i o n was 50 nM ( F i g u r e 8 ) . T h i s c o n c e n t r a t i o n o f h e p a r i n i s s u f f i c i e n t t o p r e v e n t m u l t i p l e i n i t i a t i o n e v e n t s a t enzyme c o n c e n t r a t i o n s up t o 80 nM ( s e e F i g u r e 9 ) . The i n i t i a t i o n t i m e c o u r s e d e s c r i b e d i n F i g u r e 10 was c a r r i e d o u t a t an enzyme c o n c e n t r a t i o n o f 10 n M , t h e l o w e s t c o n c e n t r a t i o n u s e d i n mos t e x p e r i m e n t s . The r a t e o f i n i t i a t i o n , a s d e m o n s t r a t e d by t h e t a u p l o t a n a l y s i s i n F i g u r e s 18 and 1 9 , i s d e p e n d e n t on t h e enzyme c o n c e n t r a t i o n . I t was t h e r e f o r e i m p o r t a n t f o r some e x p e r i m e n t s t h a t t h e t i m e i n t e r v a l c h o s e n a s t h e e n d p o i n t f o r t h e i n i t i a t i o n r e a c t i o n was s u f f i c i e n t l y l o n g t o e n s u r e t h a t c o m p l e x f o r m a t i o n , e v e n a t l o w enzyme c o n c e n t r a t i o n s , had gone t o 99 c o m p l e t i o n . The r e a c t i o n was e s s e n t i a l l y c o m p l e t e by 5 m i n u t e s , a s shown i n F i g u r e 1 0 , t h e r e f o r e a 10 m i n u t e i n t e r v a l was c o n s i d e r e d t o be a s u i t a b l e e n d p o i n t . The t i m e c o u r s e o f t h e e l o n g a t i o n r e a c t i o n was a l s o i n v e s t i g a t e d f o r t h e f o l l o w i n g r e a s o n . The UTP c o n c e n t r a t i o n u s e d i n t h e a s s a y was o n l y 10 uM and a l t h o u g h t h e e l o n g a t i o n r e a c t i o n d o e s n o t r e q u i r e h i g h n u c l e o t i d e c o n c e n t r a t i o n s ( B r e m e r , 1 9 6 7 ) i t h a s b e e n shown t h a t a t l o w c o n c e n t r a t i o n s t h e RNA p o l y m e r a s e t e n d s t o p a u s e a t p a r t i c u l a r s i t e s on t h e DNA t e m p l a t e ( G i l b e r t e t a l . . , 1 9 7 4 ) , s l o w i n g t h e o v e r a l l e l o n g a t i o n r e a c t i o n . As s e e n i n F i g u r e 1 1 , e l o n g a t i o n o f i n i t i a t e d t r a n s c r i p t s was v e r y r a p i d . The 10 m i n u t e e l o n g a t i o n p e r i o d u s e d i n t h e k i n e t i c a s s a y s was t h e r e f o r e s u f f i c i e n t t o a l l o w a l l i n i t i a t e d t r a n s c r i p t s t o be c o m p l e t e d . C h a r a c t e r i s t i c s o f h e p a r i n - r e s i s t a n t c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 p r o m o t e r . T r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r , e v e n i n t h e a b s e n c e o f h e p a r i n , d i d n o t seem t o be v e r y e f f i c i e n t . I n t h e e x p e r i m e n t shown i n F i g u r e 8 o n l y 2 . 4 t r a n s c r i p t s p e r p r o m o t e r w e r e s y n t h e s i z e d d u r i n g a 10 m i n u t e s t a n d a r d r e a c t i o n ( a n a v e r a g e r a t e o f 1 b a s e / s e c o n d ) when h e p a r i n was o m i t t e d f r o m t h e r e a c t i o n . T h i s r e s u l t was r a t h e r s u r p r i s i n g s i n c e e l o n g a t i o n f r o m i n i t i a t e d t r a n s c r i p t s seemed t o be r a p i d ( F i g u r e 1 1 ) . I t w o u l d a p p e a r t h a t e i t h e r t h e f o r m a t i o n o f i n i t i a t e d c o m p l e x e s i s s l o w o r t h a t a l a r g e f r a c t i o n o f enzyme d o e s n o t s y n t h e s i z e c o m p l e t e t r a n s c r i p t s . The o b s e r v a t i o n t h a t i n t h e p r e s e n c e o f 100 h e p a r i n 0 . 8 t r a n s c r i p t s / p r o m o t e r w e r e s y n t h e s i z e d d o e s s u g g e s t t h a t mos t o f t h e i n i t i a t e d t r a n s c r i p t s w e r e c o m p l e t e d , i m p l y i n g t h a t t h e s l o w r a t e o f t r a n s c r i p t i o n was due t o a s l o w r a t e o f i n i t i a t i o n . S t e f a n o and G r a l l a ( 1 9 7 9 ) o b s e r v e d t h a t t r a n s c r i p t i o n f r o m p r e - f o r m e d c o m p l e x e s a t t h e E . c o l i l a c U V 5 p r o m o t e r d u r i n g a s i n g l e r o u n d t r a n s c r i p t i o n r e a c t i o n p r o c e e d e d s l o w l y , w i t h a o f a p p r o x i m a t e l y one m i n u t e . T h e y a l s o o b s e r v e d t h a t t h e s y n t h e s i s o f RNA f r o m t h e p r e - f o r m e d c o m p l e x e s was i n h i b i t e d by r i f a m p i c i n , w h i c h i n a c t i v a t e s enzyme t h a t h a s n o t i n i t i a t e d RNA s y n t h e s i s ( S i p p e l and H a r t m a n n , 1 9 6 8 ) . S t e f a n o and G r a l l a p r o p o s e d t h a t t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p i n t h e r e a c t i o n mus t t h e r e f o r e be t h e f o r m a t i o n o f c o m p l e x e s w h i c h c o u l d i n i t i a t e t r a n s c r i p t i o n . By a n a l o g y , t h e s l o w r a t e o f t r a n s c r i p t i o n o b s e r v e d f o r t h e A2 p r o m o t e r c o u l d be due t o t h e s l o w f o r m a t i o n o f i n i t i a t i o n c o m p l e x e s a t t h e p r o m o t e r . The b a s i c p r o c e s s l e a d i n g t o t h e i n i t i a t i o n o f RNA s y n t h e s i s i n v o l v e s : 1) r e c o g n i t i o n o f t h e p r o m o t e r s i t e by t h e RNA p o l y m e r a s e , 2 ) b i n d i n g a t t h e p r o m o t e r s i t e i n a c l o s e d c o m p l e x , 3 ) t r a n s i t i o n f r o m t h e c l o s e d c o m p l e x t o an o p e n c o m p l e x i n w h i c h t h e DNA h e l i x a t t h e p r o m o t e r s i t e i s unwound and 4 ) t r a n s i t i o n t o an i n i t i a t i o n s t a t e , u p o n a d d i t i o n o f r i b o n u c l e o t i d e s ( f o r r e v i e w s e e C h a m b e r l i n , 1 9 7 6 ; v o n H i p p e l e t _ a l . , 1 9 8 2 , M c C l u r e , 1 9 8 5 ) The o p e n c o m p l e x e s w h i c h a r e f o r m e d a t many E__. c o l i p r o m o t e r s a r e v e r y s t a b l e ; t h e r e l e a s e o f RNA p o l y m e r a s e f r o m t h e s e 101 c o m p l e x e s i s s l o w , and t h e enzyme i n t h e c o m p l e x e s i s q u i t e r e s i s t a n t t o a t t a c k by h e p a r i n e v e n i n t h e a b s e n c e o f r i b o n u c l e o t i d e s ( M i l l e r and B u r g e s s , 1 9 7 8 ) . H o w e v e r , t h e s e p r o p e r t i e s a r e n o t c h a r a c t e r i s t i c o f a l l E_. c o l i p o l y m e r a s e / p r o m o t e r c o m p l e x e s . K u p p e r e t a l . . ( 1976 ) h a v e r e p o r t e d t h a t t h e 12. c o l i RNA p o l y m e r a s e d o e s n o t f o r m h e p a r i n - r e s i s t a n t b i n a r y c o m p l e x e s a t a t y r o s i n e tRNA p r o m o t e r . F u r t h e r m o r e , some B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e / p r o m o t e r c o m p l e x e s c a n be d e s t r o y e d by a s l i t t l e a s 2 . 5 u g / m l h e p a r i n ( T a l k i n g t o n and P e r o , 1 9 7 8 ) . The i n i t i a l o b s e r v a t i o n t h a t h e p a r i n i n h i b i t e d t r a n s c r i p t i o n f r o m (j)29 A2 p r o m o t e r / p o l y m e r a s e b i n a r y c o m p l e x e s t h e r e f o r e l e d t o an i n v e s t i g a t i o n i n t o t h e r e q u i r e m e n t s f o r h e p a r i n - r e s i s t a n t c o m p l e x f o r m a t i o n a t A 2 . The p r e f e r r e d i n i t i a t i n g n u c l e o t i d e f o r t h e A2 p r o m o t e r i s ATP ( D o b i n s o n and S p i e g e l m a n , 1 9 8 5 ) . I n c u b a t i n g t h e enzyme w i t h t h e A2 p r o m o t e r t e m p l a t e and ATP s h o u l d t h e r e f o r e e n a b l e t h e enzyme t o f o r m a h e p a r i n - r e s i s t a n t t e r n a r y c o m p l e x i n w h i c h t h e DNA i s unwound and t h e enzyme i s a s s o c i a t e d w i t h ATP and t h e p r o m o t e r . As shown i n F i g u r e 12 c o m p l e x e s f o r m e d a t t h e A2 p r o m o t e r when t h e enzyme was i n c u b a t e d w i t h ATP w e r e a s s e n s i t i v e t o h e p a r i n a s w e r e n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s . I n t h e p r e s e n c e o f ATP and GTP t h e RNA p o l y m e r a s e i s a b l e t o s y n t h e s i z e t h e t r i m e r pppAGA ( D o b i n s o n and S p i e g e l m a n , 1 9 8 5 ) and u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s h e p a r i n - r e s i s t a n t c o m p l e x e s w e r e f o r m e d ( s e e F i g u r e 1 2 ) . Thus i t 1 0 2 w o u l d a p p e a r t h a t t h e f o r m a t i o n o f h e p a r i n - r e s i s t a n t c o m p l e x e s a t A2 r e q u i r e s a t l e a s t t h e f o r m a t i o n o f t h e f i r s t p h o s p h o d i e s t e r l i n k a g e and m i g h t r e q u i r e t h e s y n t h e s i s o f two p h o s p h o d i e s t e r b o n d s . T h i s c h a r a c t e r i s t i c may be u n u s u a l b u t i t i s n o t u n i q u e ; t h e f o r m a t i o n o f h e p a r i n - r e s i s t a n t c o m p l e x e s a t t h e t y r o s i n e tRNA p r o m o t e r c h a r a c t e r i z e d by K u p p e r e t a_ l . ( 1 9 7 6 ) a l s o r e q u i r e s t h e s y n t h e s i s o f a d i n u c l e o t i d e . I t h a s a l s o b e e n r e c e n t l y d e m o n s t r a t e d t h a t t h e f o r m a t i o n o f h e p a r i n - r e s i s t a n t c o m p l e x e s a t t h e B . s u b t i l i s r r n B p r o m o t e r r e q u i r e s n u c l e o t i d e s ( V . Webb , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . T h e r e a r e t h r e e p o s s i b l e e x p l a n a t i o n s f o r t h e o b s e r v a t i o n t h a t n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s a t t h e A2 p r o m o t e r a r e n o t r e s i s t a n t t o h e p a r i n . The f i r s t p o s s i b i l i t y i s t h a t t h e enzyme d o e s n o t f o r m o p e n c o m p l e x e s a t t h e p r o m o t e r . The o b s e r v a t i o n t h a t A - i n i t i a t e d c o m p l e x e s a r e a l s o s e n s i t i v e t o h e p a r i n w o u l d s u g g e s t , h o w e v e r , t h a t t h e s e n s i t i v i t y o f t h e n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s i s n o t s i m p l y a m a t t e r o f w h e t h e r t h e c o m p l e x i s c l o s e d o r o p e n . The u n u s u a l s e n s i t i v i t y o f t h e b i n a r y c o m p l e x e s t o h e p a r i n c o u l d a l s o o c c u r i f : 1) t h e enzyme f o r m s o p e n c o m p l e x e s w h i c h r e a d i l y d i s s o c i a t e s o t h a t t h e enzyme i s n o t p r o t e c t e d f r o m h e p a r i n a t t a c k o r 2 ) t h e enzyme i n t h e c o m p l e x e s i s s u s c e p t i b l e t o d i r e c t a t t a c k by h e p a r i n and c a n n o t r a p i d l y i n i t i a t e t r a n s c r i p t i o n i n t h e p r e s e n c e o f r i b o n u c l e o t i d e s . P f e f f e r e_t al. ( 1 9 7 7 ) , f o r e x a m p l e , h a v e shown t h a t t h e E . c o l i RNA p o l y m e r a s e i n o p e n c o m p l e x e s a t 103 t h e p h a g e T7 A1 p r o m o t e r i s s u s c e p t i b l e t o d i r e c t a t t a c k by h e p a r i n . The l o w l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m b i n a r y o r A - i n i t i a t e d c o m p l e x e s a t t h e A2 p r o m o t e r w o u l d t h e r e f o r e be a c c o u n t e d f o r i f t h e enzyme i n o p e n c o m p l e x e s was r a p i d l y i n a c t i v a t e d when h e p a r i n was a d d e d w i t h t h e n u c l e o t i d e s w h i c h a l l o w t h e p o l y m e r a s e t o i n i t i a t e t r a n s c r i p t i o n . I t was c o n s i s t e n t l y o b s e r v e d t h a t t h e number o f c o m p l e x e s d e t e c t e d a f t e r a 10 m i n u t e r e a c t i o n i n w h i c h t h e enzyme and t e m p l a t e w e r e i n c u b a t e d i n t h e a b s e n c e o f n u c l e o t i d e s o r i n t h e p r e s e n c e o f ATP was l o w e r i n c o m p a r i s o n w i t h a 1 m i n u t e c o m p l e x f o r m a t i o n t i m e ( s e e F i g u r e 12a and b ) . T h i s r e s u l t s u g g e s t e d t h a t t h e enzyme was l o s i n g a c t i v i t y d u r i n g i n c u b a t i o n i n t h e c o m p l e x f o r m a t i o n r e a c t i o n . I t h a s p r e v i o u s l y b e e n r e p o r t e d ( H i n k l e and C h a m b e r l i n , 1 9 7 2 b , S t e f a n o , 1 9 8 1 ) t h a t t h e E_. c o l i RNA p o l y m e r a s e l o s e s a c t i v i t y d u r i n g i n v i t r o a s s a y s , p r o b a b l y due t o d e n a t u r a t i o n o f t h e e n z y m e . The p r e s e n c e o f DNA h a s b e e n shown t o p r o t e c t t h e e n z y m e , a l t h o u g h o n l y i f t h e enzyme c a n f o r m s t a b l e c o m p l e x e s w i t h t h e DNA, s u c h a s t h e h e p a r i n - r e s i s t a n t o p e n c o m p l e x e s f o r m e d by t h e E_. c o l i RNA p o l y m e r a s e a t t h e l a c U V 5 p r o m o t e r ( S t e f a n o , 1 9 8 1 ) . The o b s e r v a t i o n t h a t t h e _B_. s u b t i l i s enzyme l o s t a c t i v i t y when i n c u b a t e d w i t h t h e A2 t e m p l a t e i s t h u s c o n s i s t e n t w i t h t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e d o e s n o t f o r m s t a b l e c o m p l e x e s , a s d e f i n e d a b o v e , w i t h t h e 029 A2 p r o m o t e r u n l e s s b o t h ATP and GTP a r e i n c l u d e d i n t h e c o m p l e x f o r m a t i o n r e a c t i o n . 104, The s t a b i l i t y o f t h e n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s was i n v e s t i g a t e d w i t h a c o m p e t i t i o n a s s a y ( s e e T a b l e I I ) . I t was o b s e r v e d t h a t t h e n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s a t t h e A2 p r o m o t e r d i s s o c i a t e d so r a p i d l y t h a t a d i s s o c i a t i o n r a t e c o u l d n o t be d e t e r m i n e d . T h e s e d a t a f u r t h e r s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s f o r m e d a t t h e p r o m o t e r a r e u n s t a b l e . C h a r a c t e r i s t i c s o f h e p a r i n - r e s i s t a n t c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e G2 p r o m o t e r . The c o m p e t i t i o n a s s a y ( T a b l e I I ) p r o v i d e d i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e <J>29 G2 p r o m o t e r . When t h e G2 t e m p l a t e was a d d e d t o p r e - f o r m e d A 2 / p o l y m e r a s e c o m p l e x e s , t r a n s c r i p t i o n f r o m A2 d e c r e a s e d f r o m 0 . 0 8 t o 0 . 0 2 t r a n s c r i p t s / e n z y m e ( s e e T a b l e I I ) . I t was t h e r e f o r e e x p e c t e d t h a t 0 . 0 6 G2 t r a n s c r i p t s / e n z y m e w o u l d be s y n t h e s i z e d i f t h e d e c r e a s e i n t h e number o f A2 t r a n s c r i p t s r e f l e c t e d enzyme w h i c h had d i s s o c i a t e d f r o m A2 and s u b s e q u e n t l y bound t o G 2 . H o w e v e r , 0 . 2 G2 t r a n s c r i p t s we re a c t u a l l y s y n t h e s i z e d . S i m i l a r l y , u n d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h A2 was n o t p r e - i n c u b a t e d w i t h t h e RNA p o l y m e r a s e p r i o r t o i n i t i a t i o n 0 . 2 A2 t r a n s c r i p t s w e r e s y n t h e s i z e d , y e t t w i c e a s many G2 t r a n s c r i p t s w e r e s y n t h e s i z e d , u n d e r t h e same c o n d i t i o n s , e v e n when b o t h t e m p l a t e s w e r e i n c u b a t e d t o g e t h e r . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t e d t h a t t h e G2 p r o m o t e r i s c o n s i d e r a b l y s t r o n g e r t h a n t h e A2 p r o m o t e r . The RNA p o l y m e r a s e d o e s n o t seem t o e f f i c i e n t l y r e c o g n i z e t h e A2 p r o m o t e r , a t l e a s t u n d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h t h e e n z y m e : D N A r a t i o i s l o w . 105 I t h a s b e e n h y p o t h e s i z e d t h a t d e l t a w o u l d i n h i b i t t r a n s c r i p t i o n f r o m weak p r o m o t e r s , as w e l l a s f r o m n o n - s p e c i f i c s i t e s on t h e D N A , b u t h a v e l i t t l e e f f e c t on t r a n s c r i p t i o n f r o m s t r o n g p r o m o t e r s ( A c h b e r g e r e t a l . , 1 9 8 2 ) . The r e s u l t s o f t h e c o m p e t i t i o n a s s a y i n d i c a t e d t h a t t h e G2 p r o m o t e r was s t r o n g e r t h a n t h e A2 p r o m o t e r . I t was t h e r e f o r e o f i n t e r e s t t o c h a r a c t e r i z e i n i t i a t i o n a t t h e G2 p r o m o t e r and t o d e t e r m i n e i f , u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f o u r a s s a y s y s t e m , d e l t a w o u l d i n h i b i t c o m p l e x f o r m a t i o n a t G 2 . The number o f c o m p l e x e s o b s e r v e d when t h e RNA p o l y m e r a s e was i n c u b a t e d w i t h t h e G2 t e m p l a t e i n t h e a b s e n c e o f n u c l e o t i d e s was e s s e n t i a l l y t h e same a s when t h e enzyme and DNA w e r e i n c u b a t e d w i t h GTP o r w i t h GTP and ATP ( F i g u r e 2 0 ) . Thus i t a p p e a r e d t h a t , u n l i k e t h e A2 p r o m o t e r , t h e n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s a t t h e G2 p r o m o t e r w e r e as r e s i s t a n t t o h e p a r i n as we re i n i t i a t e d c o m p l e x e s . T h e r e i s t h e n , a d i s t i n c t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e b i n a r y c o m p l e x e s w h i c h a r e f o r m e d a t t h e A2 and G2 p r o m o t e r s . I t c o u l d be s p e c u l a t e d t h a t t h e s t r e n g t h o f t h e G2 p r o m o t e r c o u l d be d u e , i n p a r t , t o t h e a b i l i t y o f t h e B_. s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e t o a s s o c i a t e w i t h t h a t p r o m o t e r i n b i n a r y c o m p l e x e s w h i c h a r e n o t r e a d i l y d i s s o c i a t e d and a r e t h e r e f o r e r e s i s t a n t t o h e p a r i n . The e f f e c t o f t h e d e l t a s u b u n i t on c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 and G2 p r o m o t e r s . T r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r was shown t o be i n h i b i t e d by d e l t a i n an i n v i t r o m u l t i p l e r o u n d t r a n s c r i p t i o n a s s a y ( s e e F i g u r e 1 3 ) . T h e r e i s no 106 r o u n d t r a n s c r i p t i o n a s s a y ( s e e F i g u r e 1 3 ) . T h e r e i s no t r i v i a l e x p l a n a t i o n f o r t h e i n h i b i t i o n s i n c e t h e d e l t a p r e p a r a t i o n was shown t o be f r e e o f D N a s e , RNase and p r o t e o l y t i c a c t i v i t y ( s e e T a b l e I and F i g u r e 7 ) . T h i s e x p e r i m e n t d i d n o t p r o v i d e i n f o r m a t i o n a s t o w h i c h s t e p i n t h e t r a n s c r i p t i o n p a t h w a y was b e i n g i n h i b i t e d , h o w e v e r t h e r e i s c o n s i d e r a b l e e v i d e n c e t h a t d e l t a a c t s p r i o r t o i n i t i a t i o n ( S p i e g e l m a n e t a_l . , 1 9 7 8 ; A c h b e r g e r e t a l . , 1 9 8 2 ) . I t was t h e r e f o r e mos t l i k e l y t h a t d e l t a a f f e c t e d t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r by i n h i b i t i n g f o r m a t i o n o f A G - i n i t i a t e d c o m p l e x e s a t A 2 . The d a t a p r e s e n t e d i n F i g u r e 12 showed t h a t b o t h c o r e / s i g m a and c o r e / s i g m a + d e l t a r e q u i r e d ATP and GTP t o f o r m h e p a r i n - r e s i s t a n t c o m p l e x e s a t A 2 , s u g g e s t i n g t h a t i f d e l t a a f f e c t e d t h e p r o c e s s o f i n i t i a t i o n i t was i n a q u a n t i t a t i v e , r a t h e r t h a n q u a l i t a t i v e m a n n e r . The d a t a f r o m t h e p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n r a t e a s s a y shown i n F i g u r e 14 d e m o n s t r a t e d t h a t c o m p l e x f o r m a t i o n a t A2 was i n h i b i t e d by d e l t a b u t n o t i f i t was a d d e d t o t h e r e a c t i o n a f t e r i n i t i a t i o n c o m p l e x e s had b e e n f o r m e d , i n d i c a t i n g t h a t d e l t a d i r e c t l y a f f e c t s some s t e p i n t h e i n i t i a t i o n p a t h w a y . An a l t e r n a t i v e e x p l a n a t i o n f o r t h e d a t a i n F i g u r e 14 c o u l d be t h a t enzyme w h i c h i s a s s o c i a t e d w i t h d e l t a d u r i n g i n i t i a t i o n e l o n g a t e s RNA c h a i n s l e s s e f f i c i e n t l y , r e s u l t i n g i n t h e s y n t h e s i s o f f e w e r c o m p l e t e t r a n s c r i p t s by c o r e / s i g m a + d e l t a d u r i n g t h e 10 m i n u t e e l o n g a t i o n r e a c t i o n . T h i s e x p l a n a t i o n seems i m p l a u s i b l e f o r s e v e r a l r e a s o n s . 107 F i r s t , t h e A2 t r a n s c r i p t i s o n l y 237 b a s e s l o n g and s h o u l d e a s i l y be c o m p l e t e d d u r i n g t h e e l o n g a t i o n i n t e r v a l . T h e r e was a l s o no d e t e c t a b l e i n c r e a s e i n RNA p r o d u c t s s m a l l e r t h a n 237 b a s e s (on p o l y a c r y l a m i d e g e l s ) , a l t h o u g h i t i s p o s s i b l e t h a t s u c h a c h a n g e m i g h t n o t be n o t i c e a b l e i f t h e enzyme p a u s e d o r t e r m i n a t e d t r a n s c r i p t i o n a t r a n d o m a l o n g t h e t e m p l a t e . I t h a s a l s o b e e n r e p o r t e d t h a t c o r e / s i g m a / d e l t a s y n t h e s i z e s more l a r g e t r a n s c r i p t s i n v i t r o f r o m p h a g e SP82 DNA t h a n d o e s c o r e / s i g m a ( S p i e g e l m a n e t a_l . , 1 9 7 8 ) . The l a t t e r d a t a s u g g e s t e d t h a t , r a t h e r t h a n i n h i b i t i n g e l o n g a t i o n , d e l t a e i t h e r s t i m u l a t e d e l o n g a t i o n d i r e c t l y o r e n h a n c e d s e l e c t i o n o f s t r o n g p r o m o t e r s i t e s f r o m w h i c h f u l l - l e n g t h t r a n s c r i p t s c o u l d be s y n t h e s i z e d . T h e r e i s t h u s no p r i o r e v i d e n c e t o s u p p o r t t h e h y p o t h e s i s t h a t d e l t a m i g h t d i r e c t l y i n h i b i t t h e e l o n g a t i o n r e a c t i o n . A l t h o u g h t h e a d d i t i o n o f d e l t a t o c o r e / s i g m a c l e a r l y d e c r e a s e d t h e r a t e a t w h i c h i n i t i a t i o n c o m p l e x e s w e r e f o r m e d a t t h e A2 p r o m o t e r ( s e e F i g u r e 1 5 ) , i t was n o t o b v i o u s w h i c h s t e p ( s ) i n t h e i n i t i a t i o n p a t h w a y w e r e a l t e r e d . One p o s s i b i l i t y was t h a t d e l t a i n h i b i t e d t h e i n i t i a t i o n r a t e by d e s t a b i l i z i n g i n i t i a t e d o r n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s . As d e s c r i b e d i n R e s u l t s , t h e s t a b i l i t y o f t h e i n i t i a t i o n c o m p l e x e s was t e s t e d d i r e c t l y ( s e e F i g u r e 17) and t h e r e was no e v i d e n c e t h a t d e l t a a l t e r e d t h e s t a b i l i t y o f t h o s e c o m p l e x e s . S p i e g e l m a n and W h i t e l e y ( 1 9 7 9 ) s t u d i e d t h e s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f t h e B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e d u r i n g 1 0 8 t r a n s c r i p t i o n , u s i n g g l y c e r o l g r a d i e n t s e d i m e n t a t i o n a n a l y s i s , and o b s e r v e d t h a t d e l t a was r e l e a s e d f r o m t h e enzyme p r i o r t o i n i t i a t i o n . I t h a s a l s o b e e n shown t h a t t h e n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s f o r m e d by c o r e / s i g m a / d e l t a a t an S P 8 2 e a r l y g e n e p r o m o t e r a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o r e / s i g m a c o m p l e x e s w i t h r e s p e c t t o t h e number o f s i t e s a t w h i c h t h e enzyme c o n t a c t s t h e p r o m o t e r . The i n i t i a t e d c o m p l e x e s f o r m e d by t h e c o r e / s i g m a and c o r e / s i g m a / d e l t a e n z y m e s a r e v i r t u a l l y t h e same ( A c h b e r g e r e t a l . , 1 9 8 2 ) . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t d e l t a a c t s p r i o r t o t h e f o r m a t i o n o f i n i t i a t e d c o m p l e x e s , and t h e o b s e r v a t i o n t h a t d e l t a d i d n o t a f f e c t t h e s t a b i l i t y o f i n i t i a t e d c o m p l e x e s a t t h e A2 p r o m o t e r i s c o n s i s t e n t w i t h t h a t h y p o t h e s i s . The e f f e c t o f d e l t a on t h e o v e r a l l l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r ( s e e F i g u r e 14 f o r e x a m p l e ) was u n e x p e c t e d . The enzyme c o n c e n t r a t i o n c u r v e s i n F i g u r e 16 show t h a t a d d i n g d e l t a l o w e r e d t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n and c h a n g e d t h e p o i n t a t w h i c h t h e enzyme s a t u r a t e d t h e p r o m o t e r . The l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e A2 p r o m o t e r h a s b e e n shown t o be a f f e c t e d by t h e enzyme c o n c e n t r a t i o n , a l t h o u g h a t h i g h enzyme c o n c e n t r a t i o n s t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n a p p r o a c h e s a p l a t e a u v a l u e ( s e e F i g u r e 9 ) . I t was a l s o o b s e r v e d t h r o u g h o u t t h e c o u r s e o f t h i s wo rk t h a t t h e maximum y i e l d o f A2 t r a n s c r i p t s f r o m a p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n a s s a y o n l y r a r e l y a t t a i n e d t h e t h e o r e t i c a l v a l u e o f one t r a n s c r i p t / p r o m o t e r . I n g e n e r a l , t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m h o l o e n z y m e , a t h i g h 109 c o n c e n t r a t i o n s o f e n z y m e , r a n g e d b e t w e e n 0 . 5 and 0 . 8 t r a n s c r i p t s / p r o m o t e r , w h e r e a s t r a n s c r i p t i o n f r o m c o r e / s i g m a was somewha t h i g h e r , u s u a l l y f r o m 0 . 7 t o 1 .0 t r a n s c r i p t / p r o m o t e r . I t a p p e a r e d t h e r e f o r e t h a t d e l t a m i g h t c h a n g e t h e e f f e c t i v e enzyme c o n c e n t r a t i o n i n t h e r e a c t i o n , t h a t i s , t h e enzyme t h a t i s c a p a b l e o f s y n t h e s i z i n g RNA f r o m t h e A2 p r o m o t e r . T h i s p o s s i b i l i t y i s c o n s i s t e n t w i t h t h e d a t a shown i n F i g u r e s 15 and 1 8 ; a d d i n g d e l t a t o t h e r e a c t i o n h a s t h e same e f f e c t as l o w e r i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f enzyme i n t h e r e a c t i o n ; t h e r a t e o f c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 p r o m o t e r d e c r e a s e s . D e l t a c o u l d i n h i b i t b o t h t h e e x t e n t and r a t e o f c o m p l e x f o r m a t i o n i n one o f t h r e e w a y s : 1) c o r e / s i g m a / d e l t a c o u l d i n t e r a c t w i t h t h e p r o m o t e r b u t n o t i n i t i a t e t r a n s c r i p t i o n , 2 ) enzyme w h i c h i s a s s o c i a t e d w i t h d e l t a m i g h t be u n a b l e t o i n t e r a c t w i t h t h e p r o m o t e r , o r 3 ) d e l t a c o u l d a c t by d e c r e a s i n g t h e r a t e o f t h e r e a c t i o n , t h e r e b y i n t e r f e r i n g w i t h t h e f o r m a t i o n o f A G - i n i t i a t e d c o m p l e x e s . The d a t a f r o m t h e t a u p l o t a n a l y s i s p r e s e n t e d i n T a b l e I I I s u g g e s t e d t h a t d e l t a d i d n o t a f f e c t t h e r a t e o f i n i t i a t i o n c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 p r o m o t e r by a l t e r i n g t h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t , K ^ S ) as t h e r e was no c o r r e l a t i o n b e t w e e n and d e l t a c o n t e n t . I t t h e r e f o r e a p p e a r e d u n l i k e l y t h a t c o r e / s i g m a / d e l t a i n t e r a c t e d w i t h t h e A2 p r o m o t e r b u t was u n a b l e t o i n i t i a t e t r a n s c r i p t i o n o r t h a t c o r e / s i g m a / d e l t a was n o t a b l e t o i n t e r a c t w i t h t h e p r o m o t e r . A l t h o u g h e i t h e r m e c h a n i s m w o u l d e x p l a i n t h e o b s e r v a t i o n t h a t 110 d e l t a a l t e r s t h e r a t e o f f o r m a t i o n o f A G - i n i t i a t e d c o m p l e x e s and t h e number o f c o m p l e x e s f o r m e d a t t h e A2 p r o m o t e r , one w o u l d e x p e c t t h a t i f d e l t a i n h i b i t e d c o m p l e x f o r m a t i o n i n s u c h a m a n n e r , enzyme w h i c h had a h i g h d e l t a c o n t e n t w o u l d h a v e a h i g h e r K A # t h a n enzyme w h i c h had b e e n d e p l e t e d o f d e l t a . The d a t a p r e s e n t e d i n T a b l e I I I a r e t h e r e f o r e n o t c o n s i s t e n t w i t h t h e a b o v e i n t e r p r e t a t i o n . T h e r e a p p e a r e d t o be a c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e v a l u e s and t h e d e l t a c o n t e n t , a l t h o u g h t h e d a t a w e r e n o t d e f i n i t i v e . W i t h t h e e x c e p t i o n o f enzyme p r e p a r a t i o n #3, w h i c h a l s o had a l o w i n c o m p a r i s o n t o t h e o t h e r e n z y m e s , t h e kg v a l u e was l o w e r f o r t h o s e e n z y m e s w h i c h had a p p r o x i m a t e l y 60% d e l t a t h a n f o r t h e e n z y m e s w h i c h had b e e n d e p l e t e d o f d e l t a . I t i s t h e r e f o r e p o s s i b l e t h a t d e l t a s l o w s t h e r a t e o f c o m p l e x f o r m a t i o n t o s u c h an e x t e n t t h a t p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n i s i n t e r f e r e d w i t h a t t h e A2 p r o m o t e r s . The i n t e r p r e t a t i o n t h a t d e l t a a f f e c t s c o m p l e x f o r m a t i o n by a l t e r i n g t h e r a t e a t w h i c h n o n - i n i t i a t e d c o m p l e x e s a r e c o n v e r t e d t o A G - i n i t i a t e d c o m p l e x e s mus t be made c a u t i o u s l y . The t a u p l o t a n a l y s i s h a s p r e v i o u s l y b e e n u s e d o n l y f o r i n v e s t i g a t i o n s i n t o t h e i n t e r a c t i o n s o f t h e E_. c o l i RNA p o l y m e r a s e a t d i f f e r e n t p r o m o t e r s . I t i s q u i t e p o s s i b l e t h a t t h e s i g m a c o n t e n t o r s i g m a / d e l t a r a t i o , a s w e l l a s t h e d e l t a c o n t e n t o f t h e d i f f e r e n t B_. s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e p r e p a r a t i o n s , w o u l d a f f e c t t h e k i n e t i c p a r a m e t e r s . As a 111 c o n s e q u e n c e , t h e t a u p l o t a n a l y s i s may be i n a d e q u a t e f o r c o m p a r i s o n s b e t w e e n d i f f e r e n t enzyme p r e p a r a t i o n s . I t s h o u l d be n o t e d t h a t a n o t h e r p o t e n t i a l p r o b l e m w i t h t h e t a u p l o t a n a l y s i s i s t h a t i t i s a s s u m e d t h a t a l l o f t h e a c t i v e enzyme w h i c h i s a d d e d t o t h e r e a c t i o n i s a v a i l a b l e f o r i n t e r a c t i o n w i t h t h e p r o m o t e r o f i n t e r e s t . I n t h i s a s s a y n o n - s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n c o u l d t h e r e f o r e a f f e c t v a l u e s f o r k i n e t i c p a r a m e t e r s w h i c h h a v e c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t t e r m s , s p e c i f i c a l l y a n d K Q n . The d a t a p r e s e n t e d i n F i g u r e 12a and b show t h a t t h e r e i s i n d e e d some n o n - A 2 RNA w h i c h m i g r a t e s a b o v e t h e A2 t r a n s c r i p t on p o l y a c r y l a m i d e g e l s . The c a l c u l a t e d v a l u e s f o r K # a n ( j £ A on may t h e r e f o r e be o v e r e s t i m a t e d and u n d e r e s t i m a t e d , r e s p e c t i v e l y . D e l t a i s o b v i o u s l y n o t a g e n e r a l i n h i b i t o r o f p r o m o t e r - s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n . C o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e G2 p r o m o t e r was s h o w n , i n c o n t r a s t w i t h c o m p l e x f o r m a t i o n a t A 2 , t o be u n a f f e c t e d by t h e p r e s e n c e o f d e l t a ( s e e F i g u r e 2 1 ) . T h i s r e s u l t s u p p o r t s t h e h y p o t h e s i s t h a t d e l t a w o u l d n o t i n h i b i t c o m p l e x f o r m a t i o n a t s t r o n g p r o m o t e r s ( A c h b e r g e r e t a l . , 1 982 ) . The c h r o m o s o m a l DNA o f _B. s u b t i l i s h a s a r e l a t i v e l y h i g h A+T c o n t e n t o f a p p r o x i m a t e l y 51% ( G e i d u s c h e k and I t o , 1 9 8 2 ) and a l s o c o n t a i n s s i n g l e - s t r a n d e d r e g i o n s and n i c k s w h i c h c o u l d b i n d RNA p o l y m e r a s e n o n - s p e c i f i c a l l y ( D o i , 1 9 8 2 ) . D e l t a h a s b e e n p r o p o s e d t o p l a y a r o l e i n e n h a n c i n g t h e s p e c i f i c i t y o f t h e B_. s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e by 112 p r e v e n t i n g t r a n s c r i p t i o n , o r a t l e a s t t h e f o r m a t i o n o f s t a b l e c o m p l e x e s , a t n o n - s p e c i f i c s i t e s on t h e B a c i l l u s c h r o m o s o m a l DNA ( A c h b e r g e r e t . a l . , 1 9 8 2 ; D o i , 1 9 8 2 ) . The i m p l i c a t i o n o f t h i s h y p o t h e s i s i s t h a t n o n - s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s w i t h n i c k e d DNA o r A - T r i c h s e q u e n c e s i n t e r f e r e i n some way w i t h p r o m o t e r l o c a t i o n . I t w o u l d t h e r e f o r e be e x p e c t e d t h a t enzyme w h i c h i s a s s o c i a t e d w i t h d e l t a w o u l d t r a n s c r i b e p r o m o t e r s more e f f i c i e n t l y , w h i l e n o n - s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n w o u l d be r e d u c e d . The e f f e c t o f d e l t a on n o n - s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n was o b s e r v e d i n t h e a s s a y u s e d i n t h i s w o r k . A l t h o u g h m o s t o f t h e RNA w h i c h was s y n t h e s i z e d o r i g i n a t e d f r o m t h e A2 p r o m o t e r t h e r e w a s , a s d i s c u s s e d a b o v e , some n o n - s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n t h a t p r o b a b l y o r i g i n a t e d f r o m t h e p l a s m i d v e c t o r . I t was o b s e r v e d t h a t when c o r e / s i g m a was r e c o n s t i t u t e d w i t h d e l t a t h e o v e r a l l l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n , b o t h s p e c i f i c and n o n - s p e c i f i c , f r o m t h e A2 p r o m o t e r t e m p l a t e d e c r e a s e d . Thus d e l t a a p p e a r s t o i n h i b i t n o n - s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s a n d A2 p r o m o t e r - s p e c i f i c i n t e r a c t i o n s e q u a l l y w e l l . I t was a l s o o b s e r v e d t h a t c o r e / s i g m a + d e l t a d i d n o t f o r m i n i t i a t i o n c o m p l e x e s a n y more r a p i d l y a t t h e G2 p r o m o t e r t h a n d i d c o r e / s i g m a . T h i s r e s u l t w o u l d s u g g e s t t h a t n o n - s p e c i f i c c o m p l e x e s f o r m e d w i t h t h e p l a s m i d by c o r e / s i g m a a r e n o t k i n e t i c a l l y i m p o r t a n t a t l e a s t w i t h r e s p e c t t o t h e a b i l i t y o f t h e enzyme t o l o c a t e a v a i l a b l e p r o m o t e r s i t e s . T h i s r e s u l t d o e s n o t , h o w e v e r , r u l e o u t t h e p o s s i b i l i t y t h a t 113 a l t e r t h e k i n e t i c s o f p r o m o t e r a s s o c i a t i o n i f a n o t h e r t e m p l a t e we re u s e d . W i l l i a m s o n and D o i ( 1 9 7 8 ) i n v e s t i g a t e d t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n c o r e , s i g m a and d e l t a and were a b l e t o d e m o n s t r a t e t h a t d e l t a had a g r e a t e r a f f i n i t y f o r c o r e t h a n d i d s i g m a and c o u l d a c t u a l l y d i s p l a c e s i g m a f r o m a c o r e / s i g m a c o m p l e x . T h e y a l s o o b s e r v e d t h a t c o r e / d e l t a c o u l d b i n d t o DNA w i t h t h e c o n c o m i t a n t r e l e a s e o f d e l t a . B a s e d on t h e s e d a t a i t was p r o p o s e d t h a t d e l t a d i r e c t e d t h e c o r e enzyme t o o r n e a r t h e p r o m o t e r and t h a t s i g m a b o u n d t o t h e c o m p l e x , a f t e r d e l t a was r e l e a s e d , t o a l l o w i n i t i a t i o n o f RNA s y n t h e s i s ( W i l l i a m s o n and D o i , 1 9 7 8 ) . Some o f t h e d a t a p r e s e n t e d h e r e r e g a r d i n g t h e e f f e c t o f d e l t a on c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 p r o m o t e r a r e c o n s i s t e n t w i t h t h a t m o d e l . I f d e l t a c o m p e t e s w i t h s i g m a f o r a b i n d i n g s i t e on c o r e and c o r e / d e l t a b i n d s t o t h e A2 p r o m o t e r l e s s e f f e c t i v e l y t h a n d o e s c o r e / s i g m a , t h e n a d d i n g d e l t a t o c o r e / s i g m a w o u l d i n h i b i t t h e r a t e o f c o m p l e x f o r m a t i o n a t A 2 . The d a t a o b t a i n e d f o r c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e G2 p r o m o t e r , h o w e v e r , w o u l d s u g g e s t t h a t s u c h a m e c h a n i s m w o u l d p e r t a i n o n l y t o c e r t a i n p r o m o t e r s . An a l t e r n a t i v e m e c h a n i s m t o e x p l a i n t h e e f f e c t o f d e l t a c o u l d be t h a t d e l t a i s n o t r e l e a s e d e f f i c i e n t l y f r o m c o r e / d e l t a c o m p l e x e s a t A2 b u t i s r a p i d l y r e l e a s e d f r o m G2 p r o m o t e r c o m p l e x e s . The e f f i c i e n c y o f d e l t a r e l e a s e w o u l d t h e r e f o r e d e t e r m i n e t h e r a t e a t w h i c h s i g m a c o u l d b i n d t o t h e c o r e / p r o m o t e r c o m p l e x e s t o a l l o w i n i t i a t i o n o f RNA s y n t h e s i s . T h i s p a r t i c u l a r m e c h a n i s m w o u l d be c o n s i s t e n t 114 s y n t h e s i s . T h i s p a r t i c u l a r m e c h a n i s m w o u l d be c o n s i s t e n t w i t h t h e o b s e r v e d e f f e c t o f d e l t a on c o m p l e x f o r m a t i o n a t b o t h t h e A2 and G2 p r o m o t e r s . I t i s n e v e r t h e l e s s d i f f i c u l t t o r e c o n c i l e t h e m o d e l w i t h t h e o b s e r v a t i o n s t h a t i t i s d i f f e r e n t s i g m a f a c t o r s w h i c h c o n f e r p r o m o t e r s e l e c t i v i t y on t h e B a c i l l u s RNA p o l y m e r a s e ( L o s i c k and P e r o , 1 9 8 1 ) . The s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f p r o m o t e r - b o u n d enzyme i s t h e r e f o r e u n c e r t a i n and w i l l o n l y be r e s o l v e d by an i n v e s t i g a t i o n o f t h e s t r u c t u r e o f t h e p o l y m e r a s e a t t h e p r o m o t e r s . M o d e l f o r c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 and G2 p r o m o t e r s . B a s e d on t h e d a t a p r e s e n t e d a b o v e and p r e v i o u s i n f o r m a t i o n a b o u t d e l t a , t h e r o l e o f d e l t a c a n be c o n s i d e r e d t o i n c l u d e a m o d u l a t i n g f u n c t i o n t o a i d t h e RNA p o l y m e r a s e i n d i s c r i m i n a t i n g b e t w e e n s p e c i f i c p r o m o t e r s , a s h a s b e e n p o s t u l a t e d by W i l l i a m s o n and D o i ( 1978 ) and A c h b e r g e r e_t a l . ( 1 9 8 2 ) . A m o d e l f o r t h e e f f e c t o f d e l t a on c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e A2 and G2 p r o m o t e r s i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 2 2 . F o r t h e s a k e o f s i m p l i c i t y i t i s a s s u m e d t h a t c o r e / s i g m a and c o r e / s i g m a / d e l t a i n t e r a c t w i t h t h e A2 and G2 p r o m o t e r s . I n t h e c a s e o f t h e G2 p r o m o t e r t h e f o r m a t i o n o f i n i t i a t i o n c o m p l e x e s c a n be i n t e r p r e t e d t o be a n a l o g o u s t o t h e m o d e l p r e s e n t e d by M c C l u r e ( 1 9 8 5 ) . RNA p o l y m e r a s e a s s o c i a t e s w i t h t h e p r o m o t e r and u n d e r g o e s a s e r i e s o f c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n v o l v i n g one o r more c l o s e d c o m p l e x i n t e r m e d i a t e s . The c l o s e d c o m p l e x i s t h e n c o n v e r t e d t o an o p e n c o m p l e x t h a t d o e s n o t r e a d i l y d i s s o c i a t e . D e l t a i s .1-15 G2 1) E / c r / i + p ^ ^ E / c r / ^ - P c _ ^ E / c r / J - P Q > E / C T - P 0 F i g u r e 2 2 . M o d e l f o r t h e e f f e c t o f d e l t a on i n i t i a t i o n a t t h e A2 and G2 p r o m o t e r s . The p r o m o t e r s and c o r e enzyme a r e d e s i g n a t e d P and E , r e s p e c t i v e l y . P C > P q and P I r e p r e s e n t t h e c l o s e d , o p e n and i n i t i a t e d c o m p l e x e s . The s t e p s i n t h e r e a c t i o n s w h i c h a r e h y p o t h e s i z e d t o be e s s e n t i a l l y i r r e v e r s i b l e a r e i n d i c a t e d ( >) and t h e p o t e n t i a l p o i n t s a t w h i c h d e l t a c o u l d a c t t o s l o w t h e r e a c t i o n a t t h e A2 p r o m o t e r a r e i n d i c a t e d by an a s t e r i s k . 116 r e l e a s e d f r o m t h e c o m p l e x a t some p o i n t d u r i n g t h i s s e q u e n c e o f e v e n t s and i n t h e p r e s e n c e o f t h e a p p r o p r i a t e n u c l e o t i d e s t h e enzyme i s a b l e t o i n i t i a t e t r a n s c r i p t i o n . I t h a s b e e n shown by A c h b e r g e r e_t j a l . ( 1 9 8 2 ) t h a t o p e n c o m p l e x e s f o r m e d b y c o r e / s i g m a / d e l t a a t an S P 8 2 p r o m o t e r a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m c o r e / s i g m a o p e n c o m p l e x e s w i t h r e s p e c t t o t h e s i t e s a t w h i c h t h e enzyme c o n t a c t s t h e DNA. T h i s r e s u l t shows t h a t a t some p o i n t i n t h e p a t h w a y enzyme t h a t i s a s s o c i a t e d w i t h d e l t a i s b o u n d t o t h e p r o m o t e r . An a d d i t i o n a l o p e n c o m p l e x i n t e r m e d i a t e h a s t h e r e f o r e b e e n i n c l u d e d i n t h e p a t h w a y t o a c c o u n t f o r t h o s e o b s e r v a t i o n s . I t c o u l d f u r t h e r be p o s t u l a t e d t h a t t h e r e l e a s e o f d e l t a , w h i c h i s a s s o c i a t e d w i t h one o f t h e t r a n s i t i o n s t e p s , i s n e c e s s a r y f o r i n i t i a t i o n . Enzyme w h i c h i s n o t a s s o c i a t e d w i t h d e l t a w o u l d a l s o b i n d e f f i c i e n t l y t o t h e " s t r o n g " G2 p r o m o t e r and i n i t i a t i o n w o u l d p r o c e e d b y p a t h w a y 2 ) shown i n F i g u r e 2 2 . A l t h o u g h i t i s n o t p o s s i b l e t o d e f i n e t h e p r e c i s e s e q u e n c e o f e v e n t s a t t h e G2 p r o m o t e r o r how t h e y m i g h t c o m p a r e t o t h e s i t u a t i o n w i t h E_. c o l i i t d o e s a p p e a r t h a t t h e b a s i c p r o c e s s i s n o t u n l i k e c o m p l e x f o r m a t i o n a t t h e l a c U V 5 p r o m o t e r , f o r e x a m p l e . The p r o p o s e d s e q u e n c e o f e v e n t s a t t h e A2 p r o m o t e r i s a l s o shown i n F i g u r e 2 2 . I n t h e c a s e o f c o r e / s i g m a t h e enzyme i n t e r a c t s w i t h t h e A2 p r o m o t e r t o f o r m a c l o s e d c o m p l e x w h i c h u n d e r g o e s a t r a n s i t i o n t o an o p e n c o m p l e x . The c l o s e d and o p e n c o m p l e x e s a r e k i n e t i c a l l y u n s t a b l e b u t 1 1 7 t h e f i n a l o p e n c o m p l e x c a n f o r m a s t a b l e ( h e p a r i n - r e s i s t a n t ) i n i t i a t i o n c o m p l e x i n t h e p r e s e n c e o f ATP and G T P . C o r e / s i g m a / d e l t a i s a b l e t o b i n d t o t h e A2 p r o m o t e r b u t t h e r a t e a t w h i c h c o r e / s i g m a / d e l t a c o m p l e x e s i n i t i a t e t r a n s c r i p t i o n i s c o n s i d e r a b l y s l o w e r t h a n t h e r a t e a t w h i c h c o r e / s i g m a f o r m s i n i t i a t i o n c o m p l e x e s . I t i s p o s t u l a t e d t h a t enzyme w h i c h i s a s s o c i a t e d w i t h d e l t a f o r m s c o m p l e x e s w i t h t h e p r o m o t e r t h a t a r e n o t e a s i l y c o n v e r t e d t o o p e n c o m p l e x e s t h a t c a n i n i t i a t e t r a n s c r i p t i o n . T h e r e a r e two p o s s i b l e m e c h a n i s m s by w h i c h d e l t a c o u l d a l t e r t h e r a t e o f t h e r e a c t i o n . I n t h e f i r s t c a s e t h e u n s t a b l e i n t e r m e d i a t e i n t h e p r o d u c t i v e t r a n s c r i p t i o n r a t e a s s a y , a n a l o g o u s t o t h a t p r o p o s e d by S t e f a n o and G r a l l a ( 1 9 8 0 , 1 9 8 2 ) , i s p o s t u l a t e d t o be a c l o s e d c o m p l e x . The t r a n s i t i o n f r o m t h a t c o m p l e x t o an u n s t a b l e o p e n c o m p l e x w o u l d t h e r e f o r e be t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p i n t h e r e a c t i o n . The k i n e t i c p a r a m e t e r s K ^ t t a n d k 2 , f o r c o r e / s i g m a / d e l t a w o u l d t h u s r e f e r t o t h e c o r e / c r / J - P _ c o m p l e x and t h e t r a n s i t i o n f r o m c o r e / t o c o r e / c r / d - P „ , c o r e s p e c t i v e l y . The o t h e r p o s s i b i l i t y i s t h a t t h e r e l e a s e o f d e l t a i s a s s o c i a t e d w i t h t h e r a t e - l i m i t i n g s t e p i n t h e r e a c t i o n . I n t h i s c a s e t h e u n s t a b l e i n t e r m e d i a t e m i g h t be d i f f e r e n t f r o m t h e i n t e r m e d i a t e i n t h e c o r e / s i g m a i n i t i a t i o n p a t h w a y . The k i n e t i c p a r a m e t e r s and k £ w o u l d r e f e r t o c o r e / c r / J - P Q and t h e c o n v e r s i o n o f c o r e / c r / c 5 - P t o c o r e / C 3 ~ - P r t 11 8 C o m p a r i s o n o f t h e s e q u e n c e s o f t h e A2 and G2 p r o m o t e r s . T h e r e w e r e two d i f f e r e n c e s i n t h e way t h a t t h e RNA p o l y m e r a s e i n t e r a c t e d w i t h t h e A2 and G2 p r o m o t e r s : 1) t h e n u c l e o t i d e r e q u i r e m e n t s f o r h e p a r i n - r e s i s t a n t c o m p l e x f o r m a t i o n and 2 ) t h e e f f e c t o f d e l t a on c o m p l e x f o r m a t i o n . The s e q u e n c e s o f t h e two p r o m o t e r s w e r e c o m p a r e d t o s e e i f d i f f e r e n c e s i n t h e s t r u c t u r e s o f t h e p r o m o t e r s c o u l d a c c o u n t f o r t h e d i f f e r e n c e s i n t h e way i n w h i c h t h e RNA p o l y m e r a s e i n t e r a c t s w i t h t h e A2 and G2 p r o m o t e r s . The s e q u e n c e s o f t h e two p r o m o t e r s and t h e E_. c o l i / B . s u b t i l i s c o n s e n s u s s e q u e n c e ( R o s e n b e r g and C o u r t , 1 9 7 9 ; M o r a n e t _ a l . , 1 9 8 2 ; H a w l e y and M c C l u r e , 1 9 8 3 ) a r e shown i n F i g u r e 2 3 . The A2 p r o m o t e r d i f f e r s f r o m c o n s e n s u s a t t h r e e s i t e s . One o f t h e b a s e a l t e r a t i o n s i s a t t h e h i g h l y c o n s e r v e d G r e s i d u e a t p o s i t i o n 3 i n t h e - 3 5 r e g i o n . Of t h e known ( E . c o l i ) p r o m o t e r m u t a t i o n s , a l l o f t h e p r o m o t e r s i n w h i c h t h e G r e s i d u e o f t h e - 3 5 r e g i o n h a s b e e n a l t e r e d a r e " d o w n " m u t a t i o n s ( H a w l e y and M c C l u r e , 1 9 8 3 ) . F u r t h e r m o r e , t h e s e q u e n c e s o f n i n e B a c i l l u s p r o m o t e r s , c o m p i l e d by M o r a n e_t a l . , ( 1 9 8 2 ) , a l l had a G r e s i d u e a t p o s i t i o n 3 i n t h e - 3 5 r e g i o n . The b a s e a l t e r a t i o n i n t h e - 3 5 r e g i o n o f t h e A2 p r o m o t e r c o u l d t h e r e f o r e d i m i n i s h p r o m o t e r a c t i v i t y . The G2 p r o m o t e r h a s o n l y two c h a n g e s f r o m c o n s e n s u s . One o f t h e s e c h a n g e s o c c u r s a t t h e s e c o n d T r e s i d u e i n t h e - 3 5 r e g i o n . T h i s b a s e i s v e r y h i g h l y c o n s e r v e d i n b o t h t h e JL* c o l i and B a c i l l u s p r o m o t e r s ( M o r a n e t a l . , 1 9 8 2 ; H a w l e y and M c C l u r e , 1 9 8 3 ) b u t i t i s n o t c l e a r how a b a s e c h a n g e a t 119 A2 T T T A C A 17 b . p . A A V cfi G2 T A G A C A 18 b . p . T A T A C T C o n s e n s u s [T {^G (kjc^k - 1 6 + 1 b . p . - i T ^ A T ( T ) A { T - 3 5 - 1 0 P o s i t i o n 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 F i g u r e 2 3 . P r o m o t e r s e q u e n c e s o f t h e A2 and G2 p r o m o t e r s ( t a k e n f r o m D o b i n s o n and S p i e g e l m a n , 1985 and G a r v e y e t a l . , 1 9 8 5 ) . The s e q u e n c e s a r e c o m p a r e d w i t h t h e c o n s e n s u s s e q u e n c e ( R o s e n b e r g and C o u r t , 1 9 7 9 ; M o r a n e t a l . , 1 9 8 2 ; H a w l e y and M c C l u r e , 19 8 3 ) f o r t h e p r o m o t e r s r e c o g n i z e d by t h e B a c i l l u s s u b t i l i s s i g m a - 4 3 and E . c o l i RNA p o l y m e r a s e . The b a s e s w h i c h a r e u n d e r l i n e d i n t h e c o n s e n s u s s e q u e n c e a r e t h o s e w h i c h a p p e a r t o be h i g h l y c o n s e r v e d i n B_. s u b t i l i s ( M o r a n e_t a_^. , 1 9 8 2 ) , and t h e b a s e s i n t h e A2 and G2 p r o m o t e r s w h i c h a r e c h a n g e d f r o m c o n s e n s u s a r e b o x e d . 1 2 0 t h i s s i t e w o u l d a l t e r t h e p r o m o t e r s t r e n g t h . The G2 p r o m o t e r , w h i c h h a s an A r e s i d u e a t t h i s p o s i t i o n , i s a f a i r l y s t r o n g p r o m o t e r and m u t a t i o n s a t t h i s s i t e i n E . c o l i p r o m o t e r s may e i t h e r e n h a n c e o r d i m i n i s h p r o m o t e r a c t i v i t y ( H a w l e y and M c C l u r e , 1 9 8 3 ) . The - 1 0 r e g i o n s o f t h e two p r o m o t e r s a r e i d e n t i c a l e x c e p t f o r p o s i t i o n 3 . T h i s s i t e i s o n l y w e a k l y c o n s e r v e d i n E_. c o l i b u t e i g h t o f t h e n i n e B a c i l l u s p r o m o t e r s a n a l y z e d by M o r a n e t _ a l . ( 1 9 8 2 ) had a T r e s i d u e a t t h a t p o s i t i o n . The A2 p r o m o t e r h a s an A r e s i d u e a t t h a t s i t e . T h i s b a s e p a i r a l t e r a t i o n c o u l d t h e r e f o r e be a n o t h e r f a c t o r i n d e t e r m i n i n g t h e r e l a t i v e s t r e n g t h s o f t h e two p r o m o t e r s . The two p r o m o t e r s a l s o d i f f e r w i t h r e s p e c t t o t h e l e n g t h o f t h e s p a c e r s e q u e n c e b e t w e e n t h e - 1 0 and - 3 5 r e g i o n s . The s p a c e r r e g i o n o f A2 i s 17 b a s e p a i r s l o n g and t h e G2 s p a c e r i s 18 b a s e p a i r s b u t , i t i s n o t c l e a r how s u c h a d i f f e r e n c e w o u l d a l t e r t h e p r o m o t e r f u n c t i o n s o p r o f o u n d l y . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e B a c i l l u s RNA p o l y m e r a s e i n t e r a c t s more e f f i c i e n t l y w i t h p r o m o t e r s w h i c h h a v e t h e l o n g e r s p a c e r r e g i o n , b u t s u c h a c o n c l u s i o n c a n n o t be made on t h e b a s i s o f o n l y two p r o m o t e r s . F u r t h e r m o r e , t h e s t r u c t u r e o f t h e DNA w h i c h s u r r o u n d s t h e p r o m o t e r may a l s o be i m p o r t a n t f o r p r o m o t e r f u n c t i o n . 121 R E F E R E N C E S A c h b e r g e r . E . C . , H i l t o n , M . D . , and W h i t e l e y , H . R . ( 1 9 8 2 ) . The e f f e c t o f t h e d e l t a s u b u n i t on t h e i n t e r a c t i o n o f B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e w i t h b a s e s i n a S P 8 2 e a r l y g e n e p r o m o t e r . N u c l . A c i d s . R e s . 1 0 ; 2 8 9 3 - 2 9 1 0 . A c h b e r g e r , E . C . and W h i t e l e y , H . R . ( 1 9 8 1 ) . The r o l e o f t h e d e l t a p e p t i d e o f t h e B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e i n p r o m o t e r s e l e c t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 5 6 : 7 4 2 4 - 7 4 3 2 . B a u t z , E . and B a u t z , F . ( 1 9 7 1 ) . S t u d i e s on t h e f u n c t i o n o f t h e RNA p o l y m e r a s e s i g m a f a c t o r i n s i t e s e l e c t i o n . C o l d S p r i n g H a r b o r . S y m p . Q u a n t . B i o l . 3 5 : 2 2 7 - 2 3 2 . B e r g , D . , B a r r e t t , K . and C h a m b e r l i n , M . J . ( 1 9 7 1 ) . P u r i f i c a t i o n o f two f o r m s o f E_. c o l i RNA p o l y m e r a s e and o f s i g m a c o m p o n e n t . M e t h o d s i n E n z y m o l o g y . 2 1 D : 5 0 6 - 5 1 9 . B r e m e r , H . ( 1 9 6 7 ) . C h a i n g r o w t h and l e n g t h o f e n z y m a t i c a l l y s y n t h e s i z e d RNA m o l e c u l e s . M o l . G e n . G e n e t . 9 9 : 3 6 2 - 3 7 1 . B u c , H . and M c C l u r e , W . R . ( 1 9 8 5 ) . K i n e t i c s o f o p e n c o m p l e x f o r m a t i o n b e t w e e n E s c h e r i c h i a c o l i RNA p o l y m e r a s e and t h e l a c U V 5 p r o m o t e r . E v i d e n c e f o r a s e q u e n t i a l m e c h a n i s m i n v o l v i n g 3 s t e p s . B i o c h e m i s t r y . 2 4 : 2 7 1 2 - 2723 . B u r g e s s , R. ( 1 9 6 9 ) . S e p a r a t i o n and c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e s u b u n i t s o f RNA p o l y m e r a s e . J . B i o l . Chem. 2 4 4 : 6 1 6 8 - 6176 . B u r g e s s , R . , T r a v e r s , A . , D u n n , J . and B a u t z , E . ( 1 9 6 9 ) . F a c t o r s t i m u l a t i n g t r a n s c r i p t i o n by RNA p o l y m e r a s e . N a t u r e . 2 2 1 : 4 3 - 4 6 . C a r p o u s i s , A . J . and G r a l l a , J . D . ( 1 9 8 0 ) . C y c l i n g o f r i b o n u c l e i c a c i d p o l y m e r a s e t o p r o d u c e o l i g o n u c l e o t i d e s d u r i n g i n i t i a t i o n in_ v i t r o a t t h e l a c U V 5 p r o m o t e r . B i o c h e m i s t r y . 19.: 3 2 4 5 - 3 2 5 3 C e c h , C . L . , L i c h y , J . and M c C l u r e , W . L . ( 1 9 8 0 ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o m o t e r c o n t a i n i n g DNA f r a g m e n t s b a s e d on t h e a b o r t i v e i n i t i a t i o n o f E s c h e r i c h i a c o l i RNA p o l y m e r a s e . J . B i o l . Chem. 255 1 1 7 6 3 - 1 7 6 6 . C h a m b e r l i n , M . J . ( 1 9 7 4 ) . The s e l e c t i v i t y o f t r a n s c r i p t i o n . A n n . R e v . B i o c h e m . 43 : 7 2 1 - 7 7 5 . 122 C h a m p e , S . P . , and B e n z e r , S . ( 1 9 6 2 ) . R e v e r s a l o f m u t a n t p h e n o t y p e s by 5 - f l u o r o - u r a c i l : An a p p r o a c h t o n u c l e o t i d e s e q u e n c e s i n m e s s e n g e r - R N A . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 4 8 : 5 3 2 - 5 4 6 . C l e w e l l , D . B . , and H e l i n s k i , D . R . ( 1 9 7 2 ) . E f f e c t o f g r o w t h c o n d i t i o n s on t h e f o r m a t i o n o f t h e r e l a x a t i o n c o m p l e x o f s u p e r c o i l e d c o l E 1 d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d and p r o t e i n i n E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i o l . 1 1 0 : 1 1 3 5 - 1 1 4 6 . C r o s a , J . H . and F a l k o w , S . ( 1 9 8 1 ) . I s o l a t i o n o f p l a s m i d DNA o f l a r g e m o l e c u l a r w e i g h t i n M a n u a l o f M e t h o d s f o r G e n e r a l M i c r o b i o l o g y ( e d . N e s t e r , E . ) p p . 2 6 9 - 2 7 0 . A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y . W a s h i n g t o n , D . C . D a v i s o n , B . L . , L e i g h t o n , T . , and R a b i n o w i t z , J . C . ( 1 9 7 9 ) . P u r i f i c a t i o n o f B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e w i t h H e p a r i n - A g a r o s e . J . B i o l . C h e m . 254 : 9 2 2 0 - 9 2 2 6 . D a v i s o n , B . L . , M u r r a y , C . L . and R a b i n o w i t z , J . C . ( 1 9 8 0 ) . S p e c i f i c i t y o f p r o m o t e r u t i l i z a t i o n i n v i t r o by b a c t e r i a l RNA p o l y m e r a s e s on B a c i l l u s p h a g e 029 DNA. J . B i o l . C h e m . 2 5 5 : 8 8 1 9 - 8 8 3 0 . D i c k e l , C D . , B u r t i s , K . C . and D o i , R . H . (1980). D e l t a f a c t o r i n c r e a s e s p r o m o t e r s e l e c t i v i t y by B a c i l l u s s u b t i l i s v e g e t a t i v e c e l l RNA p o l y m e r a s e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 95 : 1789-1795 . D i c k s o n , R . C . , A b e l s o n , J . , B a r n e s , W . M . and R e z n i k o f f , W . S . (1975). G e n e t i c r e g u l a t i o n : t h e l a c c o n t r o l r e g i o n . S c i e n c e 187:27-35. D i c k s o n , R . C . , A b e l s o n , J . , J o h n s o n , P . , R e z n i k o f f , W . S . and B a r n e s , W . M . ( 1 9 7 7 ) . N u c l e o t i d e s e q u e n c e c h a n g e s p r o d u c e d by m u t a t i o n s i n t h e l a c p r o m o t e r o f E s c h e r i c h i a c o l i . J . M o l . B i o l . 1 1 1 : 6 5 - 7 5 . D o b i n s o n , K . F . , and S p i e g e l m a n , G . B . ( 1 9 8 5 ) . N u c l e o t i d e s e q u e n c e and t r a n s c r i p t i o n o f a b a c t e r i o p h a g e 029 e a r l y p r o m o t e r . J . B i o l . Chem. 2 6 0 : 5 9 5 0 - 5 9 5 5 . D o i , R . H . ( 1 9 8 2 ) . RNA p o l y m e r a s e o f B a c i l l u s s u b t i l i s i n The M o l e c u l a r B i o l o g y o f t h e B a c i l l i v o l u m e I. B a c i l l u s s u b t i l i s ( e d . D u b n a u , D . A . ) p p . 7 2 - 1 1 0 . A c a d e m i c P r e s s , N . Y . D u f f y , J . J . and G e i d u s c h e k , E . P . ( 1 9 7 6 ) . The v i r u s - s p e c i f i e d s u b u n i t s o f a m o d i f i e d B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e a r e d e t e r m i n a n t s o f DNA b i n d i n g and RNA c h a i n i n i t i a t i o n . C e l l 8 . : 5 9 5 - 6 0 4 . 123 D u n n , R . , D e l a n e y , A . D . , G i l l a m , I . C . , H a y a s h i , S . , T e n e r , G . M . , G r i g l i a t t i , T . , M i s r a , V . , S p u r r , M . G . , T a y l o r , D . M . , and M i l l e r , R . C . , J r . ( 1 9 7 9 ) I s o l a t i o n and c h a r a c t e r i z a t i o n o f r e c o m b i n a n t DNA p l a s m i d s c a r r y i n g D r o s o p h i l a tRNA g e n e s . Gene (Amst . ) 7 . : 1 9 7 - 2 1 5 . D u n n , A . R . and S a m b r o o k , J . ( 1 9 8 0 ) M a p p i n g v i r a l mRNAs by s a n d w i c h h y b r i d i z a t i o n . M e t h o d s i n E n z y m o l o g y 6 5 : 4 6 8 - 4 7 8 . G a r v e y , K . J . , Y o s h i k a w a , H . and I t o , J . ( 1 9 8 5 ) . The c o m p l e t e s e q u e n c e o f t h e B a c i l l u s p h a g e ,0*29 r i g h t e a r l y r e g i o n . Gene 4 0 : 3 0 1 - 3 0 9 . G e i d u s c h e k , E . P . and I t o , J . ( 1 9 8 2 ) . R e g u l a t o r y m e c h a n i s m s i n t h e d e v e l o p m e n t o f l y t i c b a c t e r i o p h a g e s i n B a c i l l u s s u b t i l i s . i n The M o l e c u l a r B i o l o g y o f t h e B a c i l l i . v o l u m e I. B a c i l l u s s u b t i l i s . (ed . Dubnau , D . A . ) p p . 2 0 3 - 2 4 5 . A c a d e m i c P r e s s , N . Y . G i l b e r t , W. ( 1 9 7 6 ) . S t a r t i n g and s t o p p i n g s e q u e n c e s f o r t h e RNA p o l y m e r a s e , i n RNA p o l y m e r a s e ( e d s . L o s i c k , R . and C h a m b e r l i n , M . J . ) p p . 1 9 3 - 2 0 5 . C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n g H a r b o r , New Y o r k . G i l b e r t , ¥ . , M a i z e l s , N . and M a x a m , A . ( 1 9 7 4 ) . S e q u e n c e s o f c o n t r o l l i n g r e g i o n s o f t h e l a c t o s e o p e r o n . C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p o s i u m o f Q u a n t i t a t i v e B i o l o g y 3 8 : 8 4 5 - 8 5 5 . G i t t , M . A . , W a n g , L - F . and D o i , R . H . ( 1 9 8 5 ) . A s t r o n g s e q u e n c e h o m o l o g y e x i s t s b e t w e e n t h e m a j o r RNA p o l y m e r a s e s i g m a f a c t o r s o f B a c i l l u s s u b t i l i s and E s c h e r i c h i a c o l i . J . B i o l . C h e m . 2 6 0 : 7 1 7 8 - 7 1 8 5 . G r o s s m a n , A . D . , E r i c k s o n , J . W . and G r o s s , C . A . ( 1 9 8 4 ) . The h p t R g e n e p r o d u c t o f E . c o l i i s a s i g m a f a c t o r f o r h e a t s h o c k p r o m o t e r s . C e l l ~ ~ 3 8 : 3 8 3 - 3 9 0 . H a i l i n g , S . M . , B u r t i s , K . C . and D o i , R . H . ( 1 9 7 7 ) . R e c o n s t i t u t i o n s t u d i e s show t h a t r i f a m p i c i n r e s i s t a n c e i s d e t e r m i n e d b y t h e l a r g e s t p o l y p e p t i d e o f B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e . J . B i o l . C h e m . 2 5 2 : 9 0 2 4 - 9 0 3 1 . H a i l i n g , S . M . , B u r t i s , K . C . and D o i , R . H . (1 978 ) . / 3 ' - s u b u n i t o f b a c t e r i a l RNA p o l y m e r a s e i s r e s p o n s i b l e f o r s t r e p t o l y d i g i n r e s i s t a n c e i n B a c i l l u s s u b t i l i s . N a t u r e 2 7 2 : 8 3 7 - 8 3 9 . H a n s e n , U . M . and M c C l u r e , W . R . ( 1 9 8 0 ) . R o l e o f t h e s i g m a s u b u n i t o f E s c h e r i c h i a c o l l RNA p o l y m e r a s e i n i n i t i a t i o n . I I . R e l e a s e o f s i g m a f r o m t e r n a r y c o m p l e x e s . J . B i o l . C h e m . 2 5 5 : 9 5 6 4 - 9 5 7 0 . 124 H a w l e y , D . K . a n d M c C l u r e , W . R . ( 1 9 8 0 ) . I n . v i t r o c o m p a r i s o n o f i n i t i a t i o n p r o p e r t i e s o f b a c t e r i o p h a g e X w i l d - t y p e P R a n d x3 m u t a n t p r o m o t e r s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 7 : 6 3 8 1 - 6 3 8 5 . H a w l e y , D . K . a n d M c C l u r e , W . R . ( 1 9 8 3 ) . C o m p i l a t i o n a n d a n a l y s i s o f E s c h e r i c h i a c o l i p r o m o t e r DNA s e q u e n c e s . N u c l . A c i d s R e s . 1 1 : 2 2 3 7 - 2 2 5 5 . H e m p h i l l , H . E . a n d W h i t e l e y , H . R . ( 1 9 7 5 ) . B a c t e r i o p h a g e s o f B a c i l l u s s u b t i l i s . B a c t e r i o l . R e v . 3 9 : 2 5 7 - 3 1 5 . H i n k l e , D . , a n d C h a m b e r l i n , M . J . ( 1 9 7 2 a ) . S t u d i e s o f t h e b i n d i n g o f E s c h e r i c h i a c o l i RNA p o l y m e r a s e t o D N A . I T h e r o l e o f t h e s i g m a s u b u n i t . J . M o l . B i o l . 7 0 : 1 5 7 - 1 8 7 . H i n k l e , D . C . a n d C h a m b e r l i n , M . J . ( 1 9 7 2 b ) . S t u d i e s o f t h e b i n d i n g o f E s c h e r i c h i a c o l i RNA p o l y m e r a s e t o D N A . I I . T h e k i n e t i c s o f t h e b i n d i n g r e a c t i o n . J . M o l . B i o l . 7_0 :1 8 7 - 1 95 . I n c i a r t e , M . R . , V i n u e l a , E . a n d S a l a s , M . ( 1 9 7 6 ) . T r a n s c r i p t i o n i n v i t r o o f 029 DNA a n d E c o R I f r a g m e n t s b y B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e . E u r . J . B i o c h e m . 1 1 : 7 7 - 8 3 . I t o , J . ( 1 9 7 8 ) . B a c t e r i o p h a g e 029 t e r m i n a l p r o t e i n : i t s a s s o c i a t i o n w i t h t h e 5 ' t e r m i n i o f t h e 029 g e n o m e . J . V i r o l . 2 8 : 8 9 5 - 9 0 4 . I w a k u r a , Y . , I s h i h a m a , A . a n d Y u r a , T . ( 1 9 7 3 ) . RNA p o l y m e r a s e m u t a n t s o f E s c h e r i c h i a c o l i . I I . S t r e p t o l y d i g i n r e s i s t a n c e a n d i t s r e l a t i o n t o r i f a m p i c i n r e s i s t a n c e . M o l . G e n . G e n e t . 121 : 1 8 1 - 1 9 6 . J o h n s t o n , D . E . and M c C l u r e , W . R . ( 1 9 7 6 ) A b o r t i v e i n i t i a t i o n o f i n v i t r o RNA s y n t h e s i s on b a c t e r i o p h a g e l a m b d a DNA. i n RNA P o l y m e r a s e ( e d s . L o s i c k , R. and C h a m b e r l i n , M . ) C o l d S p r i n g H a r b o r P r e s s , C o l d S p r i n g H a r b o r , N . Y . p p . 4 1 3 - 4 2 8 . K a d e s c h , T . R . , R o s e n b e r g , S . and C h a m b e r l i n , M . J . ( 1 9 8 2 ) . B i n d i n g o f E s c h e r i c h i a c o l i RNA p o l y m e r a s e h o l o e n z y m e t o b a c t e r i o p h a g e T7 DNA. M e a s u r e m e n t s o f b i n d i n g a t b a c t e r i o p h a g e T7 p r o m o t e r A1 u s i n g a t e m p l a t e c o m p e t i t i o n a s s a y . J . M o l . B i o . 1 5 5 : 1 - 2 9 . K a w a m u r a , F . , and I t o , J . ( 1 9 7 7 ) . T r a n s c r i p t i o n o f t h e genome o f b a c t e r i o p h a g e 0 2 9 : I s o l a t i o n and m a p p i n g o f t h e m a j o r e a r l y mRNAs s y n t h e s i z e d i n v i v o and i n v i t r o . J . V i r o l . 2 1 : 5 6 2 - 5 7 7 . 1 2 5 K u p p e r , H . , C o n t r e r a s , R . , K h o r a n a , H . G . and L a n d y , A . ( 1 976 ) . The t y r o s i n e tRNA p r o m o t e r , iri^ RNA P o l y m e r a s e ( e d s . L o s i c k , R. and C h a m b e r l i n , M . ) C o l d S p r i n g H a r b o r P r e s s , C o l d S p r i n g H a r b o r , N . Y . p p . 4 7 3 - 4 8 4 . L e d u c , E . , H o e k s t r a , M . and S p i e g e l m a n , G . B . ( 1 9 8 2 ) . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n s y n t h e s i s o f r i b o s o m e s and RNA p o l y m e r a s e i n B a c i l l u s s u b t i l i s . C a n . J o u r n a l . M i c b . 2 8 : 1 2 8 0 - 1 2 8 8 . L i t m a n , R . M . ( 1 9 6 8 ) . A d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d p o l y m e r a s e f r o m M i c r o c o c c a l l u t e u s ( M i c r o c o c c u s l y s o d e i k t i c u s ) i s o l a t e d on d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d - c e l l u l o s e . J . B i o l . C h e m . 2 4 3 : 6 2 2 2 - 6 2 3 3 . L o s i c k , R. and P e r o , J . ( 1 9 8 1 ) . C a s c a d e s o f s i g m a f a c t o r s . C e l l 2 5 _ : 5 8 2 - 5 8 4 . L o s k u t o f f , D . J . , P e n e , J . J . and A n d r e w s , D . P . ( 1 9 7 3 ) . Gene e x p r e s s i o n d u r i n g t h e d e v e l o p m e n t o f B a c i l l u s s u b t i l i s b a c t e r i o p h a g e ,#29• I . A n a l y s i s o f v i r a l - s p e c i f i c t r a n s c r i p t i o n b y d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d - r i b o n u c l e i c a c i d c o m p e t i t i o n h y b r i d i z a t i o n . J . V i r o l . 1 1 : 7 8 - 8 6 . M c C l u r e , W . R . ( 1 9 8 0 ) R a t e - l i m i t i n g s t e p s i n RNA c h a i n i n i t i a t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 7 : 5 6 3 4 - 5 6 3 8 . M c C l u r e , W . R . ( 1 9 8 5 ) . M e c h a n i s m and c o n t r o l o f t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n i n p r o k a r y o t e s . A n n . R e v . B i o c h e m . 5 4 : 1 7 1 - 204 . M c C l u r e , W . R . and C e c h , C . L . ( 1 9 7 8 ) . On t h e m e c h a n i s m o f r i f a m p i e i n i n h i b i t i o n o f RNA s y n t h e s i s . J . B i o l . C h e m . , 2 5 3 : 8 9 4 9 . M c C l u r e , W . R . , C e c h , C . L . and J o h n s t o n , D . E . ( 1 9 7 8 ) . A s t e a d y s t a t e a s s a y f o r t h e RNA p o l y m e r a s e i n i t i a t i o n r e a c t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 5 3 : 8 9 4 1 - 8 9 4 8 . M c G u i r e , J . C . , P e n e , J . J . and B a r r o w - C a r r a w a y , J . ( 1 9 7 4 ) . Gene e x p r e s s i o n d u r i n g t h e d e v e l o p m e n t o f p h a g e 0 2 9 . I I I . A n a l y s i s o f v i r a l - s p e c i f i c p r o t e i n s y n t h e s i s w i t h s u p p r e s s i b l e m u t a n t s . J . V i r o l . 1 3 : 6 9 0 - 6 9 8 . M a n i a t i s , T . , F r i t s c h , E . F . , and S a m b r o o k , J . ( 1 9 8 2 ) . M o l e c u l a r C l o n i n g : A L a b o r a t o r y M a n u a l , C o l d S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , C o l d S p r i n g H a r b o r , N . Y . M a x a m , A . M . and G i l b e r t , W. ( 1 9 7 7 ) . A new me thod f o r s e q u e n c i n g DNA . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 7 4 : 5 6 0 - 5 6 4 . 126 M i l l e r , J . S . and B u r g e s s , R . R . ( 1 9 7 8 ) . S e l e c t i v i t y o f RNA c h a i n i n i t i a t i o n i n v i t r o . 3 . V a r i a b l e s a f f e c t i n g i n i t i a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n . B i o c h e m i s t r y . 1 7 : 2 0 6 4 - 2 0 6 9 . M o r a n , C P . J r . , L a n g , N . , L e G r i c e , S . F . J . , L e e , G . , S t e p h e n s , M . , S o n e n s h e i n , A . L . , P e r o , J . and L o s i c k , R. ( 1 9 8 2 ) . N u c l e o t i d e s e q u e n c e s t h a t s i g n a l t h e i n i t i a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n and t r a n s l a t i o n i n B a c i l l u s s u b t i l i s . M o l . G e n . G e n e t . 1 8 6 : 3 3 9 - 3 4 6 . M o s h a r a f f a , E . T . , S c h a c h t e l e , C . F . , R e i l l y , B . E . and A n d e r s o n , D . L . ( 1 9 7 0 ) . C o m p l e m e n t a r y s t r a n d s o f b a c t e r i o p h a g e 029 d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d : p r e p a r a t i v e s e p a r a t i o n and t r a n s c r i p t i o n s t u d i e s . J . V i r o l . 6^ :855- 8 6 4 . N e i d h a r d t , F . C . , Van B o g e l e n , R . A . and V a u g h n , V . ( 1 9 8 4 ) . The g e n e t i c s and r e g u l a t i o n o f h e a t - s h o c k p r o t e i n s . A n n u . R e v . G e n e t . 1 8 : 2 9 5 - 3 2 9 . M u n s o n , L . M . and R e z n i k o f f , W . S . ( 1 9 8 1 ) . A b o r t i v e i n i t i a t i o n and l o n g r i b o n u c l e i c a c i d s y n t h e s i s . B i o c h e m i s t r y . 2 0 _ : 2 0 8 l - 2 0 8 5 . P e r o , J . N e l s o n , J . and F o x , T . D . ( 1 9 7 5 ) . H i g h l y a s y m m e t r i c t r a n s c r i p t i o n by RNA p o l y m e r a s e c o n t a i n i n g p h a g e S P 0 1 - i n d u c e d p o l y p e p t i d e s and a hew h o s t p r o t e i n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 72 : 1 5 8 9 - 1 5 9 3 . P f e f f e r , S . R . , S t a h l , S . J . and C h a m b e r l i n , M . J . ( 1 9 7 7 ) . B i n d i n g o f E s c h e r i c h i a c o l i RNA p o l y m e r a s e t o T7 DNA: d i s p l a c e m e n t o f h o l o e n z y m e f r o m p r o m o t e r c o m p l e x e s by h e p a r i n . J . B i o l . C h e m . 2 5 2 : 5 4 0 3 - 5 4 0 7 . R a b u s s a y , D. and Z i l l i g , W. ( 1 9 6 9 ) . A r i f a m p i c i n r e s i s t a n t RNA p o l y m e r a s e f r o m E . c o l i a l t e r e d i n t h e j8 - s u b u n i t . F E B S L e t t e r s 5 : 1 0 4 - 1 0 6 . R o e , J - H . , B u r g e s s , R . R . and R e c o r d , T . M . J r . ( 1 9 8 4 ) . K i n e t i c s and m e c h a n i s m o f t h e i n t e r a c t i o n o f E s c h e r i c h i a c o l i RNA p o l y m e r a s e w i t h t h e ?v P R p r o m o t e r . J . M o l . B i o l . 1 7 6 : 4 9 5 - 5 2 1 . R o e , J - H . , B u r g e s s , R . R . and R e c o r d , T . M . J r . ( 1 9 8 5 ) . T e m p e r a t u r e d e p e n d e n c e o f t h e r a t e c o n s t a n t s o f t h e E s c h e r i c h i a c o l i RNA p o l y m e r a s e - A. P_ p r o m o t e r i n t e r a c t i o n . A s s i g n m e n t o f t h e k i n e t i c s t e p s c o r r e s p o n d i n g t o p r o t e i n c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e and DNA o p e n i n g . R o s e n b e r g , M. and C o u r t , D. ( 1 9 7 9 ) . R e g u l a t o r y s e q u e n c e s i n v o l v e d i n t h e p r o m o t i o n and t e r m i n a t i o n o f RNA t r a n s c r i p t i o n . A n n u . R e v . G e n e t . 1_3_: 31 9 - 3 5 3 . 127 R o s e n b e r g , S . , K a d e s c h , T . T . and C h a m b e r l i n , M . J . ( 1 9 8 2 ) . B i n d i n g o f E s c h e r i c h i a c o l i RNA p o l y m e r a s e h o l o e n z y m e t o b a c t e r i o p h a g e T7 DNA. M e a s u r e m e n t s o f t h e r a t e o f o p e n c o m p l e x f o r m a t i o n a t T7 p r o m o t e r A 1 . J . M o l . B i o l . 1 5 5 : 3 1 - 5 1 . S a n d e r m a n n , H . J r . , and S t r o m i n g e r , J . L . ( 1 9 7 2 ) . P u r i f i c a t i o n and p r o p e r t i e s o f C 5 5 - i s o p r e n o i d a l c o h o l p h o s p h o k i n a s e f r o m S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s . J . B i o l . Chem. 2 4 1 : 5 1 2 3 - 5 1 3 1 . S c h a c h t e l e , C . F . , D e S a i n , C . V . and A n d e r s o n , D . L . ( 1 9 7 3 ) . T r a n s c r i p t i o n d u r i n g t h e d e v e l o p m e n t o f b a c t e r i o p h a g e 0 2 9 : d e f i n i t i o n o f " e a r l y " and " l a t e " 0 2 9 r i b o n u c l e i c a c i d . J . V i r o l . 1 1 : 9 - 1 6 . S i e b e n l i s t , U . , S i m p s o n , R . B . and G i l b e r t , W. ( 1 9 8 0 ) . E . c o l i RNA p o l y m e r a s e i n t e r a c t s h o m o l o g o u s l y w i t h two d i f f e r e n t p r o m o t e r s . C e l l 20 : 2 6 9 - 2 8 1 . S i l v e r s t o n e , A . E . , A r d i t t i , R . R . , and M a g a s a n i k , B . ( 1 9 7 0 ) . C a t a b o l i t e - i n s e n s i t i v e r e v e r t a n t s o f l a c p r o m o t e r m u t a n t s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 6 6 : 7 7 3 - 7 7 9 . S i p p e l , A . and H a r t m a n n , G . ( 1 9 6 8 ) . Mode o f a c t i o n o f r i f a m y c i n on t h e RNA p o l y m e r a s e r e a c t i o n . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 1 5 7 : 2 1 8 - 2 1 9 . S o g o , J . M . , I n c i a r t e , M . R . , C o r r a l , J . , V i n u e l a , E . , and S a l a s , M. ( 1 9 7 9 ) RNA p o l y m e r a s e b i n d i n g s i t e s and t r a n s c r i p t i o n map o f t h e DNA o f B a c i l l u s s u b t i l i s p h a g e 0 2 9 . J . M o l . B i o l . 127 :41 1 -436 . S p a s s k y , A . , K i r k e g a a r d , K . and B u c , H . ( 1 9 8 5 ) . C h a n g e s i n t h e DNA s t r u c t u r e o f t h e l a c U V 5 p r o m o t e r d u r i n g f o r m a t i o n o f an o p e n c o m p l e x w i t h E s c h e r i c h i a c o l i RNA p o l y m e r a s e . B i o c h e m i s t r y . 2 4 : 2 7 2 3 - 2 7 3 1 . S p i e g e l m a n , G . B . , H i a t t , W . R . and W h i t e l e y , H . R . ( 1 9 7 8 ) . R o l e o f t h e 2 1 , 0 0 0 m o l e c u l a r w e i g h t p o l y p e p t i d e o f B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e i n RNA s y n t h e s i s . J . B i o l . C h e m . 2 5 3 : 1 7 5 6 - 1 7 6 5 . S p i e g e l m a n , G . B . and W h i t e l e y , H . R . ( 1 9 7 4 ) . P u r i f i c a t i o n o f R i b o n u c l e i c A c i d P o l y m e r a s e f r o m S P 8 2 - i n f e c t e d B a c i l l u s s u b t i l i s . J . B i o l . Chem. 249 : 1 4 7 6 - 1 4 8 2 . S p i e g e l m a n , G . B . and W h i t e l e y , H . R . ( 1 9 7 9 ) . S u b u n i t c o m p o s i t i o n o f B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e d u r i n g t r a n s c r i p t i o n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 8 7 : 8 1 1 - 8 1 7 . 128 S t e f a n o , J . E . ( 1 9 8 1 ) . The e f f e c t s o f m u t a t i o n on t h e s t e p s i n l a c p r o m o t e r u t i l i z a t i o n by E s c h e r i c h i a c o l i RNA p o l y m e r a s e . PhD d i s s e r t a t i o n . U C L A . S t e f a n o , J . E . and G r a l l a , J . D . ( 1 9 7 9 ) . L a c U V 5 t r a n s c r i p t i o n i n v i t r o . R a t e l i m i t a t i o n s u b s e q u e n t t o f o r m a t i o n o f an RNA p o l y m e r a s e - D N A c o m p l e x . B i o c h e m i s t r y 1 8 : 1 0 6 3 - 1 0 6 7 . S t e f a n o , J . E . and G r a l l a , J . D . ( 1 9 8 0 ) . K i n e t i c i n v e s t i g a t i o n o f t h e m e c h a n i s m o f RNA p o l y m e r a s e b i n d i n g t o m u t a n t l a c p r o m o t e r s . J . B i o l . Chem. 255. : 1 0 4 2 3 - 1 0430 . S t e f a n o , J . E . , and G r a l l a , J . D . ( 1 9 8 2 ) . M u t a t i o n - i n d u c e d c h a n g e s i n RNA p o l y m e r a s e - l a c p 3 p r o m o t e r i n t e r a c t i o n s . J . B i o l . Chem. 2 5 7 : 1 3 9 2 4 - 1 3 9 2 9 . S u g i u r a , M . , O k a m o t o , T . and T a k a n a m i , M. ( 1 9 6 9 ) . S t a r t i n g n u c l e o t i d e s e q u e n c e s o f RNA s y n t h e s i z e d on t h e RF DNA o f c o l i p h a g e f d . J . M o l . B i o l . 4 ^ : 2 9 9 - 3 1 5 . T a l k i n g t o n , C , and P e r o . J . ( 1 9 7 8 ) . P r o m o t e r r e c o g n i t i o n by p h a g e S P 0 1 - m o d i f i e d RNA p o l y m e r a s e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A . 1 5 : 1 1 8 5 - 1 1 8 9 . T j i a n , R . , L o s i c k , R . , P e r o , J . and H i n n e b u s h , A . ( 1 9 7 7 ) . P u r i f i c a t i o n and c o m p a r a t i v e p r o p e r t i e s o f t h e d e l t a and s i g m a s u b u n i t s o f RNA p o l y m e r a s e f r o m B a c i l l u s s u b t i l i s . E u r . J . B i o c h e m . 74 : 1 4 9 - 1 5 4 . T r a v e r s , A . and B u r g e s s , R. ( 1 9 6 9 ) . C y c l i c r e u s e o f t h e RNA p o l y m e r a s e s i g m a f a c t o r . N a t u r e 2 2 2 : 5 3 7 - 5 4 0 . v o n H i p p e l , P . H . , B e a r , D . B . , W i n t e r , R . B . and B e r g , O . G . ( 1 9 8 2 ) . M o l e c u l a r a s p e c t s o f p r o m o t e r f u n c t i o n : an o v e r v i e w , i n P r o m o t e r s : S t r u c t u r e and F u n c t i o n ( e d s . R o d r i g u e z , R . L . and C h a m b e r l i n , M . J . ) p p . 3 - 3 3 . P r a e g e r , New Y o r k . W a l t e r , G . , Z i l l i g , W . , P a l m , P . and F u c h s , E . (1967) . I n i t i a t i o n o f D N A - d e p e n d e n t RNA s y n t h e s i s and t h e e f f e c t o f h e p a r i n on RNA p o l y m e r a s e . E u r . J . B i o c h e m . 1 : 1 9 4 - 2 0 1 . W i l l i a m s o n , V . M . and D o i , R . H . ( 1 9 7 8 ) . D e l t a f a c t o r c a n d i s p l a c e s i g m a f a c t o r f r o m B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e h o l o e n z y m e and r e g u l a t e i t s i n i t i a t i o n a c t i v i t y . M o l G e n . G e n e t . 161 : 1 3 5 - 1 4 1 . Wong , S - L , and D o i , R . H . ( 1 9 8 2 ) . P e p t i d e m a p p i n g o f B a c i l l u s s u b t i l i s RNA p o l y m e r a s e s i g m a f a c t o r s and c o r e - a s s o c i a t e d p o l y p e p t i d e s . J . B i o l . Chem. 2 5 7 : 1 1 9 3 2 - 1 1 9 3 6 . 129 Y e h l e , C O . , and D o i , R . H . ( 1 9 6 7 ) . D i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f b a c t e r i o p h a g e genomes i n v e g e t a t i v e and s p o r u l a t i n g c e l l s o f B a c i l l u s s u b t i l i s . J . V i r o l . 1 : 9 3 5 - 9 4 7 . Y o s h i k a w a H . , F r i e d m a n , T . and I t o , J . ( 1 9 8 1 ) . N u c l e o t i d e s e q u e n c e s a t t h e t e r m i n i o f 029 DNA. P r o c N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 1 8 : 1 3 3 6 - 1 3 4 0 Y o s h i k a w a H . and I t o , J . ( 1 9 8 2 ) . N u c l e o t i d e s e q u e n c e o f t h e m a j o r e a r l y r e g i o n o f b a c t e r i o p h a g e ^ 2 9 . Gene 1 7 : 3 2 3 - 3 3 5 . 1 3 0

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