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Characterization of immediate-early and early proteins of murine cytomegalovirus synthesized in permissive… Walker, Douglas Gordon 1985

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831-UBC_1985_A1 W34.pdf [ 15.01MB ]
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C H A R A C T E R I Z A T I O N OF I M M E D I A T E - E A R L Y AND E A R L Y P R O T E I N S OF M U R I N E C Y T O M E G A L O V I R U S S Y N T H E S I Z E D I N P E R M I S S I V E AND N O N P E R M I S S I V E C E L L S . bv DOUGLAS GORDON WALKER B . T e c h . ( H o n s ) , B r u n e i U n i v e r s i t y , 1 9 7 8 A T H E S I S S U B M I T T E D I N P A R T I A L F U L F I L M E N T OF THE R E Q U I R E M E N T S FOR THE D E G R E E OF DOCTOR OF P H I L O S O P H Y i n THE F A C U L T Y OF G R A D U A T E S T U D I E S ( D i v i s i o n o f M e d i c a l M i c r o b i o l o g y , D e p a r t m e n t o f P a t h o l o g y F a c u l t y o f M e d i c i n e ) . We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H C O L U M B I A J u n e , 1 9 8 5 Q ) D o u g l a s G o r d o n W a l k e r In presenting t h i s thesis i n p a r t i a l f u l f i l m e n t of the requirements for an advanced degree at the University of B r i t i s h Columbia, I agree that the Library s h a l l make i t f r e e l y available for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of t h i s thesis for scholarly purposes may be granted by the head of my department or by h i s or her representatives. I t i s understood that copying or publication of t h i s thesis for f i n a n c i a l gain s h a l l not be allowed without my written permission. Department of PfiTHQlQfr-^ The University of B r i t i s h Columbia 1956 Main M a l l Vancouver, Canada V6T 1Y3 DE -6 0/81) i i . A B S T R A C T . T h e g e n e p r o d u c t s p r o d u c e d b y m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s ( M C M V ) i n i n f e c t e d c e l l s p r i o r t o v i r a l DNA s y n t h e s i s a r e b e l i e v e d t o c o n t r o l t h e i n t e r a c t i o n o f t h e v i r u s w i t h t h e c e l l s , d e t e r m i n i n g w h e t h e r a p e r m i s s i v e i n f e c t i o n r e s u l t s , w i t h v i r u s r e p l i c a t i o n , o r w h e t h e r f u r t h e r v i r u s g e n e e x p r e s s i o n i s i n h i b i t e d , r e s u l t i n g i n a l a t e n t o r a b o r t i v e i n f e c t i o n . T h e a i m o f t h i s s t u d y w a s t o c h a r a c t e r i z e t h e e a r l y v i r a l g e n e p r o d u c t s t h a t a r e p r o d u c e d i n p e r m i s s i v e a n d n o n p e r m i s s i v e c e l l s . T h e p r o t e i n s p r o d u c e d i n 3 T 3 - L 1 c e l l s , p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d w i t h M C M V , d u r i n g t h e f i r s t s i x h o u r s o f i n f e c t i o n ( t h e p e r i o d p r i o r t o v i r a l DNA r e p l i c a t i o n ) w e r e c h a r a c t e r i z e d b y p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . T e n o f t h e p r o t e i n s w e r e c l a s s i f i e d a s i m m e d i a t e - e a r l y ( I E ) a n d s e v e n a s e a r l y a c c o r d i n g t o t h e i r t i m e o f s y n t h e s i s a n d a l s o a c c o r d i n g t o t h e i r s y n t h e s i s i n t h e p r e s e n c e o f a c t i n o m y c i n D f o l l o w i n g t h e r e v e r s a l o f a c y c l o h e x i m i d e m e d i a t e d b l o c k i n p r o t e i n s y n t h e s i s . T h e e s t i m a t e d m o l e c u l a r w e i g h t s r a n g e d f r o m 2 8 K - TOOK. T h e s y n t h e s i s o f a d o m i n a n t I E p r o t e i n o f 1 0 0 K w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d , a f t e r t h e r e v e r s a l o f a c y c l o h e x i m i d e b l o c k , c o m p a r e d t o u n e n h a n c e d c o n d i t i o n s . T h e s y n t h e s i s o f t w o o t h e r m a j o r I E p r o t e i n s o f 9 6 K a n d 8 9 K w e r e a l s o s i g n i f i c a n t l y e n h a n c e d b y t h i s t r e a t m e n t . T h e 1 0 0 K a n d 8 9 K p r o t e i n s p a r t i t i o n e d w i t h t h e n u c l e a r , c y t o p l a s m i c a n d c y t o s k e l e t a l f r a c t i o n s , w h i l e t h e 9 6 K p r o t e i n p a r t i t i o n e d m o r e s t r o n g l y w i t h t h e n u c l e i . T h e s e p r o t e i n s w e r e p h o s p h o r y l a t e d . T h e o t h e r I E p r o t e i n s w e r e s y n t h e s i z e d i n l e s s e r a m o u n t s . T h e m a j o r e a r l y p r o t e i n s , w h i c h h a d m o l e c u l a r w e i g h t s o f 3 9 K a n d 3 6 K , w e r e a l s o p h o s p h o r y l a t e d a n d w e r e e x c l u s i v e l y n u c l e u s - a s s o c i a t e d . A n u m b e r o f t h e I E a n d e a r l y p r o t e i n s h a d a f f i n i t y f o r n a t i v e a n d d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e . T h e s a m e m a j o r I E a n d e a r l y p r o t e i n s w e r e i d e n t i f i e d i n n o n p e r m i s s i v e l y i i i . i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 m a c r o p h a g e c e l l s . A l t h o u g h 0 . 6 % o f t h e s e c e l l s b e c a m e p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d w i t h MCMV a n d t h e r e s t a p p e a r e d t o b e n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d , v i r a l DNA a n d l a t e p r o t e i n s y n t h e s i s w a s n o t d e t e c t e d . T h e m a j o r d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e p r o t e i n s p r o d u c e d i n 3 T 3 - L 1 c e l l s a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s w a s t h e a f f i n i t y o f t h e 9 6 K p r o t e i n f o r d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e , w h i c h w a s o n l y o b s e r v e d w h e n t h e p r o t e i n w a s s y n t h e s i z e d i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s . T h e m a i n I E a n d e a r l y MCMV i n d u c e d p r o t e i n s w e r e a l s o s y n t h e s i z e d i n n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s . T h e o n l y d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e p r o t e i n s p r o d u c e d i n t h e s e c e l l s a n d 3 T 3 - L 1 c e l l s w a s t h a t t h e 1 0 0 K I E p r o t e i n a p p e a r e d t o h a v e a g r e a t e r n u c l e a r - a f f i n i t y , w h e n p r o d u c e d i n t h e h u m a n f i b r o b l a s t s , t h a n w a s f o u n d w h e n s y n t h e s i z e d i n i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s . I n c o n c l u s i o n , a l a r g e r n u m b e r o f I E a n d e a r l y M C M V - i n d u c e d p r o t e i n s w e r e i d e n t i f i e d i n i n f e c t e d c e l l s t h a n h a d b e e n p r e v i o u s l y c h a r a c t e r i z e d . T h e r e w a s n o e v i d e n c e o f r e s t r i c t e d MCMV g e n e e x p r e s s i o n o c c u r r i n g i n t w o d i f f e r e n t c e l l t y p e s t h a t w e r e n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d . T h i s a p p e a r e d t o i n d i c a t e t h a t , i n t h e n o n p e r m i s s i v e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d , MCMV r e p l i c a t i o n w a s i n h i b i t e d a t t h e s t a g e o f v i r a l DNA s y n t h e s i s . i v . T A B L E OF C O N T E N T S P a g e A B S T R A C T i i L I S T OF T A B L E S v i i L I S T OF F I G U R E S v i i i A C K N O W L E D G E M E N T S x i I N T R O D U C T I O N 1 L I T E R A T U R E R E V I E W 3 C l a s s i f i c a t i o n 3 H i s t o r i c a l a s p e c t s 3 HCMV i n f e c t i o n s : s i g n i f i c a n c e o f r e a c t i v a t i o n 3 A . B i o l o g y o f HCMV a n d MCMV 5 1 . I n v i t r o r e p l i c a t i o n c y c l e s 5 2 . I n f e c t i o n o f c u l t u r e d c e l l s 6 3 . M a c r o p h a g e i n f e c t i o n s b y MCMV 9 4 . L a t e n t i_n v i v o i n f e c t i o n s b y HCMV a n d MCMV 1 0 B . M o l e c u l a r b i o l o g y o f HCMV a n d MCMV 1 4 1 . S t r u c t u r e o f DNA 1 4 2 . V i r i o n p r o t e i n c o m p o s i t i o n 1 6 3 . E a r l y v i r a l e f f e c t s o n i n f e c t e d c e l l s 1 6 4 . H e r p e s v i r u s g e n e e x p r e s s i o n i n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s 1 8 a ) HCMV t r a n s c r i p t i o n 1 9 b ) MCMV t r a n s c r i p t i o n 2 0 c ) V i r u s p r o t e i n s y n t h e s i s i n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s 2 2 i ) H e r p e s s i m p l e x v i r u s 2 2 i i ) Human c y t o m e g a l o v i r u s 2 6 i i i ) M u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s 2 8 5 . H e r p e s v i r u s g e n e e x p r e s s i o n i n n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s 2 9 6 . P e r s i s t e n t i n f e c t i o n s o f HCMV a n d M C M V : I n . v i t r o m o d e l s 31 V T A B L E OF C O N T E N T S P a g e S E C T I O N 1 . C H A R A C T E R I Z A T I O N OF I M M E D I A T E - E A R L Y AND E A R L Y P R O T E I N S  OF M U R I N E C Y T O M E G A L O V I R U S S Y N T H E S I Z E D I N P E R M I S S I V E AND  N O N P E R M I S S I V E C E L L S I N T R O D U C T I O N 3 4 M A T E R I A L S AND METHODS 3 6 R E S U L T S 4 9 1 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s o f MCMV 4 9 2 . G r o w t h o f MCMV i n 3 T 3 - L 1 , J 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s 4 9 3 . D e t e c t i o n o f i n f e c t i o u s c e n t e r s 51 4 . MCMV DNA s y n t h e s i s i n 3 T 3 - L 1 , J 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s 51 5 . I d e n t i f i c a t i o n o f l a t e i n f e c t e d c e l l s p e c i f i c p r o t e i n s 5 6 6 . E a r l y p r o t e i n s y n t h e s i s o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s 5 9 7 . T i m e c o u r s e o f s y n t h e s i s o f e a r l y i n f e c t e d c e l l p r o t e i n s 5 9 8 . D e f i n i t i o n o f i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y p r o t e i n s 6 6 9 . I m m u n o p r e c i p i t a t i o n 7 2 1 0 . T w o - d i m e n s i o n a l a n a l y s i s o f i n f e c t e d c e l l p r o t e i n s 7 3 1 1 . S t a b i l i t y a n d p r o c e s s i n g o f I E p r o t e i n s 8 2 1 2 . D i s t r i b u t i o n o f I E a n d e a r l y p r o t e i n s w i t h i n i n f e c t e d c e l l s 8 2 1 3 . I E a n d e a r l y p r o t e i n d i s t r i b u t i o n u n d e r u n e n h a n c e d c o n d i t i o n s 9 4 1 4 . T w o - d i m e n s i o n a l a n a l y s i s o f f r a c t i o n a t e d s a m p l e s 9 9 1 5 . I d e n t i f i c a t i o n o f i n f e c t e d c e l l p h o s p h o p r o t e i n s 1 0 8 1 6 . MCMV i n d u c e d I E a n d e a r l y p r o t e i n s i n h u m a n f i b r o b l a s t s 1 0 8 1 7 . I d e n t i f i c a t i o n o f v i r u s - i n d u c e d D N A - b i n d i n g p r o t e i n s a . E x t r a c t i o n p r o c e d u r e 121 b . D N A - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y : w h o l e c e l l e x t r a c t s 121 v i T A B L E OF C O N T E N T S PAGE R E S U L T S ( C o n t ' d ) c . D N A - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y : n u c l e a r e x t r a c t s 1 3 0 d . D N A - b i n d i n g p r o t e i n s d e t e c t e d b y f i l t e r a f f i n i t y 1 3 3 1 8 . A t t e m p t s t o d e t e c t v i r a l - i n d u c e d I E g l y c o p r o t e i n s 1 3 6 1 9 . M C M V - i n f e c t i o n o f P 3 8 8 0 . 1 m a c r o p h a g e a n d N S - 1 m y e l o m a c e l l s 1 4 2 D I S C U S S I O N 1 4 7 S E C T I O N 2 . C O M P A R I S O N OF THE P R O T E I N S OF M U R I N E C Y T O M E G A L O V I R U S  S T R A I N S S M I T H AND K I 8 1 I N T R O D U C T I O N M A T E R I A L S AND METHODS R E S U L T S AND D I S C U S S I O N 1 . C o m p a r i s o n o f i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y p r o t e i n s 2 . C o m p a r i s o n o f l a t e i n f e c t e d c e l l p r o t e i n s 3 . C o m p a r i s o n o f v i r i o n p r o t e i n s S E C T I O N 3 . I N V E S T I G A T I O N OF M U R I N E C Y T O M E G A L O V I R U S L A T E N C Y I N T R O D U C T I O N 1 7 9 M A T E R I A L S AND METHODS 181 R E S U L T S AND D I S C U S S I O N 1 8 6 1 . E s t a b l i s h m e n t o f l a t e n t MCMV i n f e c t i o n s i n m i c e 1 8 6 2 . R e a c t i v a t i o n o f MCMV b y c e l l c u l t i v a t i o n m e t h o d s 1 8 8 3 . R e p l i c a t i o n o f MCMV i n p r i m a r y c u l t u r e s 191 R E F E R E N C E S 1 9 6 1 6 5 1 6 6 1 6 8 1 6 8 1 6 8 1 6 8 v i i . L I S T OF T A B L E S . P a g e I . I n f e c t i o u s c e n t e r s p r o d u c e d i n M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 a n d H F F c e l l s 5 2 3 ? I I . CPM o f P l a b e l e d M C M V - D N A h y b r i d i z e d t o d o t s o f m o c k , 2 a n d 2 4 h r MCMV i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 , J 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s 5 5 ^ I I I . R e c o v e r y o f r a d i o a c t i v i t y f o l l o w i n g D N A - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y 1 2 2 I V . P r o p e r t i e s o f M C M V - i n d u c e d i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y p r o t e i n s 1 3 9 V . O u t c o m e o f i n f e c t i o n o f m i c e o f d i f f e r e n t a g e s w i t h MCMV 1 8 7 V I . R e a c t i v a t i o n o f MCMV f r o m l a t e n t l y i n f e c t e d t i s s u e s u s i n g c e l l c u l t i v a t i o n m e t h o d s 1 8 9 V I I . R e p l i c a t i o n o f MCMV i n p r i m a r y c e l l c u l t u r e s 1 9 3 v i i i . L I S T OF F I G U R E S . PAGE 1 . G r o w t h c u r v e s o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s r e p l i c a t i o n i n 3 T 3 - L 1 c e l l s , 0 7 7 4 A . 1 c e l l s a n d h u m a n f i b r o b l a s t s 5 0 2 . MCMV DNA r e p l i c a t i o n i n 3 T 3 - L 1 , J 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s 5 4 3 . P r o t e i n s i n m o c k a n d i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s l a b e l e d 2 8 - 3 2 h r p i . 5 8 4 . P r o t e i n s s y n t h e s i z e d 0 - 6 h r p i . i n 3 T 3 - L 1 c e l l s 6 2 5 . P r o t e i n s s y n t h e s i z e d 0 - 6 h r p i . i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s 6 5 6 . T i m e c o u r s e o f s y n t h e s i s o f M C M V - i n d u c e d p r o t e i n s d e t e c t e d i n i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s 6 7 7 . I d e n t i f i c a t i o n a n d l o c a t i o n o f I E a n d e a r l y MCMV p r o t e i n s 7 0 8 . P r o t e i n s i m m u n o p r e c i p i t a t e d f r o m M C M V - i n f e c t e d c e l l s w i t h i m m u n e m o u s e s e r u m 7 5 9 . T w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n o f p r o t e i n s i n M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s a t i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y t i m e s a n d m o c k i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s 77 1 0 . T w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n o f p r o t e i n s i n M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s a t i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y t i m e s 8 0 1 1 . S t a b i l i t y a n d p r o c e s s i n g o f MCMV p r o t e i n s i n 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s a t i m m e d i a t e - e a r l y t i m e s 8 4 1 2 . L o c a t i o n o f I E p r o t e i n s o f MCMV f r o m 3 T 3 - L 1 c e l l s a f t e r p u l s e a n d c h a s e p e r i o d s 8 7 1 3 . L o c a t i o n o f e a r l y p r o t e i n s o f MCMV f r o m 3 T 3 - L 1 c e l l s a f t e r p u l s e a n d c h a s e p e r i o d s 9 0 i x . PAGE 1 4 . L o c a t i o n o f I E a n d e a r l y p r o t e i n s o f MCMV f r o m J 7 7 4 A . 1 c e l l s a f t e r p u l s e a n d c h a s e p e r i o d s 9 2 1 5 . L o c a t i o n o f I E a n d e a r l y p r o t e i n s o f MCMV f r o m 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s p r o d u c e d u n d e r u n e n h a n c e d c o n d i t i o n s 9 6 1 6 . L o c a t i o n o f I E a n d e a r l y p r o t e i n s o f MCMV f r o m 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s p r o d u c e d u n d e r u n e n h a n c e d c o n d i t i o n s 9 8 1 7 . T w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n o f p r o t e i n s f r o m n u c l e u s a n d c y t o p l a s m o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s a t I E a n d e a r l y t i m e s 101 1 8 . T w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n o f p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s a t I E a n d e a r l y t i m e s 1 0 5 1 9 . T w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n o f p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s l a b e l e d f r o m 1 - 4 h r p i 1 0 7 2 0 . T w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n o f p h o s p h a t e - l a b e l e d p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 a n d MCMV - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s l a b e l e d a t e a r l y t i m e s a f t e r i n f e c t i o n 1 1 0 2 1 . P r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d h u m a n f i b r o b l a s t ( H F F ) c e l l s l a b e l e d a t I E a n d e a r l y t i m e s a f t e r i n f e c t i o n 1 1 3 2 2 . L o c a t i o n o f I E a n d e a r l y p r o t e i n s o f MCMV f r o m H F F c e l l s p r o d u c e d u n d e r u n e n h a n c e d c o n d i t i o n s 1 1 6 2 3 . T w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n s o f p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d H F F c e l l s l a b e l e d f r o m 1 - 4 h r p i 1 1 8 2 4 . L o c a t i o n o f I E a n d e a r l y p r o t e i n s o f MCMV f r o m H F F c e l l s p r o d u c e d u n d e r u n e n h a n c e d c o n d i t i o n s 1 2 0 2 5 . P r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s w i t h a f f i n i t y f o r n a t i v e D N A - c e l l u l o s e 1 2 5 PAGE 2 6 . P r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s w i t h a f f i n i t y f o r d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e 1 2 7 2 7 . P r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s w i t h a f f i n i t y f o r d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e 1 2 9 2 8 . I n s o l u b l e p r o t e i n s f r o m e x t r a c t s o f n u c l e a r f r a c t i o n s o f MCMV a n d m o c k - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s 1 3 2 2 9 . P r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s w i t h a f f i n i t y f o r d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e 1 3 5 3 0 . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s , e l e c t r o b l o t t e d o n t o n i t r o c e l l u l o s e a n d p r o b e d f o r a f f i n i t y f o r a f f i n i t y t o l a b e l e d d e n a t u r e d M C M V - D N A 1 3 8 3 1 . I d e n t i f i c a t i o n o f g l y c o s y l a t e d p r o t e i n s i n n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s l a b e l e d a t I E t i m e s 141 3 2 . P r o t e i n s i n n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d P 3 3 8 D . 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s , l a b e l e d a t I E t i m e s 1 4 4 3 3 . P r o t e i n s i n n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d N S - 1 c e l l s , l a b e l e d a t I E a n d e a r l y t i m e s 1 4 6 3 4 . I E a n d e a r l y p r o t e i n s o f MCMV s t r a i n S m i t h a n d MCMV s t r a i n K 1 8 1 1 7 0 3 5 . L a t e p r o t e i n s o f MCMV s t r a i n S m i t h a n d MCMV s t r a i n K 1 8 1 1 7 3 3 6 . E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f n u c l e o c a p s i d p a r t i c l e s p u r i f i e d f r o m t h e c y t o p l a s m o f M C M V ( S m i t h ) - i n f e c t e d c e l l s 1 7 5 3 7 . P r o t e i n s o f p u r i f i e d v i r i o n s a n d n u c l e o c a p s i d s o f M C M V ( S m i t h ) a n d M C M V ( K 1 8 1 ) 1 7 7 x i A C K N O W L E D G E M E N T S . I am i n d e b t e d t o D r . J . B . H u d s o n f o r p r o v i d i n g t h e o p p o r t u n i t y t o p u r s u e t h e s e s t u d i e s i n h i s l a b o r a t o r y a n d f o r s u p p o r t a n d a d v i c e t h r o u g h o u t t h i s p e r i o d . T h e a d v i c e o f t h e s u p e r v i s o r y c o m m i t t e e i s a l s o a c k n o w l e d g e d . I t h a n k M s . R. M o r g a n a n d M s . J . N i x o n f o r a s s i s t a n c e i n t h e p r e p a r a t i o n o f t h i s t h e s i s a n d i n s t r u c t i o n i n w o r d p r o c e s s i n g . 1 I N T R O D U C T I O N T h e h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s ( H C M V ) i s u b i q u i t o u s i n h u m a n p o p u l a t i o n s . I t h a s b e e n s h o w n t h a t m o s t p e o p l e a c q u i r e HCMV a n t i b o d i e s d u r i n g t h e i r l i f e t i m e b u t a t v a r y i n g a g e s a c c o r d i n g t o l o c a l e ( A l f o r d e t a l _ . , 1 9 8 1 ) . I n d e v e l o p i n g c o u n t r i e s , HCMV i n f e c t i o n i s u s u a l l y a c q u i r e d d u r i n g t h e f i r s t 2 - 3 y e a r s o f l i f e , w h i l e i n i n d u s t r i a l i z e d c o u n t r i e s p r i m a r y HCMV i n f e c t i o n i s m o r e c o m m o n b e t w e e n 1 4 - 3 5 y e a r s o f a g e . W h i l e t h e v a s t m a j o r i t y o f c a s e s o f HCMV i n f e c t i o n s a r e s u b c l i n i c a l , t h i s v i r u s c a n b e a s e r i o u s p a t h o g e n i n h o s t s w h o a r e c o m p r o m i s e d i m m u n o l o g i c a l l y . HCMV i s n o w k n o w n t o b e r e s p o n s i b l e f o r a w i d e s p e c t r u m o f d i s e a s e s t h a t c a n b e c o n s i d e r e d i n t h r e e c a t e g o r i e s ; 1 ) c o n g e n i t a l i n f e c t i o n s , 2 ) p o s t n a t a l i n f e c t i o n s a n d 3 ) i a t r o g e n i c i n f e c t i o n s . I n t h e f i r s t 1 0 - 1 5 y e a r s o f HCMV s t u d y , i t h a d b e e n w i d e l y c h a r a c t e r i z e d i n i t s r o l e a s t h e c a u s a t i v e a g e n t f o r c o n g e n i t a l c a s e s o f c y t o m e g a l i c i n c l u s i o n d i s e a s e ( W e l l e r , 1 9 7 1 ) . S i n c e 1 9 7 1 , t h e r o l e o f HCMV i n f e c t i o n h a s b e e n r e c o g n i z e d i n l e s s s e v e r e b u t s e r i o u s c o n g e n i t a l c o m p l i c a t i o n s , s u c h a s a u d i t o r y d e f e c t s a n d d i m i n i s h e d i n t e l l i g e n c e q u o t i e n t s ( R e y n o l d s e t aj_., 1 9 7 4 ) . A l s o i t i s n o w r e c o g n i z e d a s t h e p r i m a r y d e t e r m i n a n t i n s u c c e s s o r f a i l u r e o f o r g a n t r a n s p l a n t a t i o n p r o c e d u r e s ( R u b i n e t a l . , 1 9 7 7 ) . A n o t h e r c h a r a c t e r i s t i c w i t h p r i m a r y HCMV i n f e c t i o n h a s b e e n t h e o b s e r v e d p r o f o u n d t r a n s i e n t i m m u n o s u p p r e s s i v e e f f e c t i t h a s o n i t s h o s t . I n c a s e s o f HCMV m o n o n u c l e o s i s , l y m p h o c y t e p r o l i f e r a t i v e r e s p o n s e s t o T a n d B c e l l s a r e d e p r e s s e d ( R i n a l d o e t a l . , 1 9 8 0 ) . T h i s i s b e l i e v e d t o b e a p r e d i s p o s i n g f a c t o r f o r t h e o b s e r v e d i n c r e a s e d i n c i d e n c e o f o p p o r t u n i s t i c b a c t e r i a l a n d f u n g a l i n f e c t i o n s t h a t a r e a s s o c i a t e d w i t h p r i m a r y HCMV 2 i n f e c t i o n , p a r t i c u l a r l y i n t r a n s p l a n t p a t i e n t s w h o a r e i m m u n o s u p p r e s s e d ( C h a t t e r j e e e t a l _ . , 1 9 7 8 ) . W i t h t h i s r a n g e o f e f f e c t s o f HCMV o n i t s h u m a n h o s t , m u c h e m p h a s i s h a s b e e n p l a c e d o n u n d e r s t a n d i n g t h e m e c h a n i s m s o f HCMV i n f e c t i o n s . I n m a n y c a s e s , i n v e s t i g a t i o n s h a v e b e e n d o n e w i t h t h e u s e o f a n i m a l m o d e l s . A s t h e c y t o m e g a l o v i r u s e s h a v e e v o l v e d i n a s p e c i e s s p e c i f i c m a n n e r , m o d e l s y s t e m s h a v e i n v o l v e d t h e u s e o f h o m o l o g o u s v i r u s e s a s w e l l a s a n i m a l h o s t s y s t e m s . T h e m o u s e c y t o m e g a l o v i r u s ( M C M V ) m o d e l h a s b e e n u s e d o v e r t h e y e a r s b y m a n y i n v e s t i g a t o r s a n d h a s p r o v e n t o b e a g o o d m o d e l s y s t e m f o r m a n y o f t h e d i s e a s e s y n d r o m e s t h a t a r e a s s o c i a t e d w i t h HCMV i n f e c t i o n s ( H u d s o n , 1 9 7 9 ) . T h e a i m o f t h i s t h e s i s h a s b e e n t o u n d e r s t a n d s o m e a s p e c t s o f t h e b i o l o g y a n d m o l e c u l a r b i o l o g y o f l a t e n t MCMV i n f e c t i o n s . I n . v i v o a n d i n  v i t r o s y s t e m s w e r e e s t a b l i s h e d t o i n v e s t i g a t e a s p e c t s o f l a t e n t ( o r n o n p e r m i s s i v e ) i n f e c t i o n s b y MCMV o f a n i m a l s a n d c u l t u r e d c e l l s . T h e m a i n a s p e c t o f t h e w o r k w a s a s t u d y o f t h e M C M V - i n d u c e d p r o t e i n s t h a t a r e s y n t h e s i z e d p r i o r t o v i r u s DNA r e p l i c a t i o n a n d t h a t a r e b e l i e v e d t o f u n c t i o n i n c o n t r o l l i n g t h e o u t c o m e o f v i r u s - c e l l i n t e r a c t i o n s . T h e f o l l o w i n g l i t e r a t u r e r e v i e w w i l l d e a l m a i n l y w i t h s t u d i e s o f HCMV a n d MCMV ( a n d o t h e r h e r p e s v i r u s e s , w h e r e r e l e v a n t ) t h a t i n v o l v e d t h e b i o l o g y a n d s i g n i f i c a n c e o f l a t e n c y , i n . v i v o , a n d t h e r e g u l a t i o n o f v i r u s r e p l i c a t i o n , i n . v i t r o , i n p a r t i c u l a r t o e m p h a s i z e a n y s i m i l a r i t i e s a n d d i f f e r e n c e s b e t w e e n MCMV a n d H C M V . 3 L I T E R A T U R E R E V I E W C l a s s i f i c a t i o n . Human c y t o m e g a l o v i r u s ( H C M V ) a n d m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s ( M C M V ) w e r e c l a s s i f i e d a s m e m b e r s o f t h e h e r p e s g r o u p o f v i r u s e s , o n t h e b a s i s o f s i m i l a r m o r p h o l o g y , a s r e v e a l e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y o f n e g a t i v e l y s t a i n e d s p e c i m e n s ( W r i g h t e t a l _ . , 1 9 6 4 ) . T h e HCMV a n d MCMV a r e g r o u p e d t a x o n o m i c a l l y a s m e m b e r s o f t h e f a m i l y H E R P E S V I R I D A E , s u b f a m i l y B e t a h e r p e s v i r i n a e . HCMV i s c o n s i d e r e d a s t y p e s p e c i e s Human ( b e t a ) h e r p e s v i r u s 5 a n d MCMV a s M u r i d ( b e t a ) h e r p e s v i r u s 1 ( M a t t h e w s , 1 9 7 8 ) . H i s t o r i c a l a s p e c t s . HCMV w a s f i r s t i s o l a t e d b y t h r e e d i f f e r e n t g r o u p s a t a r o u n d t h e s a m e t i m e . T h e i s o l a t i o n o f t h e HCMV a g e n t , a s w i t h m o s t o t h e r h u m a n v i r u s e s , w a s n o t p o s s i b l e u n t i l h u m a n c e l l s c o u l d b e g r o w n r o u t i n e l y i n c u l t u r e . HCMV w a s f i r s t i s o l a t e d i n d e p e n d e n t l y f r o m s a l i v a r y g l a n d , k i d n e y a n d u r i n e a n d a l s o g r e w o u t f r o m e x p l a n t e d h u m a n a d e n o i d t i s s u e ( S m i t h , 1 9 5 6 , ; W e l l e r e t a l _ . , 1 9 5 7 ; Rowe e t a l _ . , 1 9 5 6 ) . MCMV w a s f i r s t i s o l a t e d i n v i t r o t w o y e a r s b e f o r e HCMV ( S m i t h , 1 9 5 4 ) . S m i t h s h o w e d t h a t m o u s e e m b r y o n i c e x p l a n t t i s s u e c u l t u r e s d e v e l o p e d t h e c h a r a c t e r i s t i c i n t r a n u c l e a r i n c l u s i o n s f o l l o w i n g i n o c u l a t i o n w i t h s a l i v a r y g l a n d h o m o g e n a t e s f r o m m i c e w i t h i n t r a n u c l e a r i n c l u s i o n s i n t h e s e o r g a n s . HCMV i n f e c t i o n s : s i g n i f i c a n c e o f r e a c t i v a t i o n . T h e r o l e o f HCMV l a t e n c y a n d r e a c t i v a t i o n a s a c a u s e o f s i g n i f i c a n t m o r b i d i t y c a n b e c o n s i d e r e d u n d e r t w o c a t e g o r i e s : D i s e a s e t h a t i s o b s e r v e d i n a p r e v i o u s s e r o p o s i t i v e p a t i e n t , a s a r e s u l t o f r e a c t i v a t i o n o f e n d o g e n o u s HCMV a n d d i s e a s e t h a t i s p r o d u c e d i n a s e r o n e g a t i v e p a t i e n t a s a r e s u l t o f r e a c t i v a t i o n o f HCMV f r o m t r a n s p l a n t e d c e l l u l a r m a t e r i a l ( e g . f r o m b l o o d o r o r g a n s c a r r y i n g l a t e n t H C M V ) . 4 C o n g e n i t a l r e a c t i v a t e d i n f e c t i o n s : E p i d e m i o l o g i c a l s t u d i e s , i n a h i g h l y i m m u n e p o p u l a t i o n , s h o w e d t h a t c o n g e n i t a l l y i n f e c t e d b a b i e s ( a s d e m o n s t r a t e d b y v i r u s e x c r e t i o n ) w e r e b o r n t o 3 . 4 % o f m o t h e r s w h o h a d b e e n s h o w n t o h a v e HCMV a n t i b o d i e s b e f o r e o r d u r i n g t h e p r e g n a n c y ( S t a g n o e t a l _ . , 1 9 7 7 ) . R e s t r i c t i o n e n z y m e a n a l y s i s o f DNA o f HCMV i s o l a t e s s h o w e d t h a t m o s t i n f a n t s h a d b e e n i n f e c t e d w i t h t h e s a m e HCMV s t r a i n a s t h e m o t h e r ( H u a n g e t a l . . , 1 9 8 0 ) . T h i s i n d i c a t e d t h a t a n e n d o g e n o u s l y r e a c t i v a t e d HCMV s t r a i n i s a b l e t o c a u s e i n t r a u t e r i n e i n f e c t i o n . I a t r o g e n i c r e a c t i v a t e d i n f e c t i o n s : HCMV i n f e c t i o n s f o l l o w i n g r e n a l t r a n s p l a n t a t i o n o c c u r r e d i n 71% o f p a t i e n t s ( r e s u l t s o f s t u d i e s s u m m a r i z e d b y H o , 1 9 8 2 ) w i t h 5 3 % b e i n g p r i m a r y i n f e c t i o n s a n d 8 5 % b e i n g r e a c t i v a t e d i n f e c t i o n s . T h e s e v e r i t y o f r e a c t i v a t e d i n f e c t i o n s a p p e a r e d t o b e r e l a t e d t o t h e s e v e r i t y o f t h e i m m u n o s u p p r e s s i v e r e g i m e n u s e d t o p r e v e n t g r a f t r e j e c t i o n , i n p a r t i c u l a r t h e u s e o f a n t i l y m p h o c y t e o r a n t i t h y m o c y t e g l o b u l i n ( P a s s e t a l _ . , 1 9 7 8 ; M a r k e r e t a l _ . , 1 9 8 1 ) . A s u m m a r y o f o b s e r v a t i o n s f r o m f o u r g r o u p s ( H o , 1 9 8 2 ) s h o w e d t h a t s y m p t o m a t i c r e a c t i v a t e d i n f e c t i o n s o c c u r r e d i n 4 4 % o f c a s e s , w h i l e s y m p t o m a t i c p r i m a r y i n f e c t i o n s o c c u r r e d i n 8 3 % o f c a s e s . F o r t y - f o u r p e r c e n t o f t r a n s p l a n t p a t i e n t s r e c e i v i n g o r g a n s f r o m a n t i b o d y p o s i t i v e d o n o r s d e v e l o p e d l e t h a l , s e v e r e o r m o d e r a t e HCMV r e l a t e d d i s e a s e s , w h i l e t r a n s p l a n t p a t i e n t s r e c e i v i n g o r g a n s f r o m a n t i b o d y n e g a t i v e d o n o r s o n l y d e v e l o p e d m o d e r a t e i n f e c t i o n s ( P e t e r s o n e t a l _ . , 1 9 8 0 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t HCMV i n f e c t i o n s i n s o m e a n t i b o d y p o s i t i v e r e c i p i e n t s a r e m a n i f e s t a t i o n s o f e n d o g e n o u s r e a c t i v a t i o n o f HCMV a n d i n t h e m o r e s e v e r e c a s e s r e p r e s e n t t h e r e i n f e c t i o n w i t h a d i f f e r e n t s t r a i n o f v i r u s f r o m t h e t r a n s p l a n t e d k i d n e y . I m p l i c a t i o n o f t h e t r a n s p l a n t e d k i d n e y a s a s o u r c e o f v i r u s c a m e f r o m a c o m p i l a t i o n o f r e s u l t s ( H o , 1 9 8 2 ) , w h i c h s h o w e d t h a t 57% 5 o f s e r o n e g a t i v e r e c i p i e n t s h a d p r i m a r y HCMV i n f e c t i o n s w h e n t r a n s p l a n t e d w i t h k i d n e y s f r o m p o s i t i v e d o n o r s , w h i l e a n 8% i n f e c t i o n r a t e o c c u r r e d i n s e r o n e g a t i v e r e c i p i e n t s r e c e i v i n g k i d n e y s f r o m s e r o n e g a t i v e d o n o r s . A h i g h e r p e r c e n t a g e o f b o n e m a r r o w t r a n s p l a n t p a t i e n t s w h o h a d l o w l e v e l s o f HCMV a n t i b o d i e s b e f o r e t r a n s p l a n t a t i o n d e v e l o p e d H C M V - r e l a t e d l e t h a l p n e u m o n i t i s t h a n t h o s e w h o w e r e HCMV a n t i b o d y n e g a t i v e o r w h o h a d HCMV c o m p l e m e n t f i x a t i o n a n t i b o d y t i t e r s o f m o r e t h a t 1 : 6 4 ( N e i m a n e t a j [ . , 1 9 7 7 ) . A . B i o l o g y o f HCMV a n d MCMV 1 . I n v i t r o r e p l i c a t i o n c y c l e s . T h e c y t o m e g a l o v i r u s e s a r e c h a r a c t e r i z e d b y t h e i r s l o w r e p l i c a t i o n c y c l e c o m p a r e d t o h e r p e s s i m p l e x v i r u s ( H S V ) . W i t h H S V , i n f e c t i o u s v i r u s w a s f i r s t r e l e a s e d f r o m c e l l s w i t h i n 8 h o u r s o f i n f e c t i o n a n d p e a k e d a t 1 4 h o u r s a f t e r i n f e c t i o n . W i t h H C M V , v i r u s w a s f i r s t d e t e c t e d a p p r o x i m a t e l y 4 d a y s a f t e r i n f e c t i o n w i t h a p e a k r e l e a s e o f i n f e c t i o u s v i r u s a t a p p r o x i m a t e l y 5 d a y s ( S m i t h a n d D e H a r v e n , 1 9 7 3 ) . T h e r e p l i c a t i o n c y c l e o f MCMV i s s h o r t e r t h a n t h a t o f H C M V . V i r a l DNA s y n t h e s i s c a n b e d e t e c t e d b y 8 h o u r s a f t e r i n f e c t i o n i n s y n c h r o n i z e d c e l l c u l t u r e s ( M i s r a e t a l . . , 1 9 7 8 ) . I t p e a k s a t a p p r o x i m a t e l y 2 4 - 2 8 h o u r s a f t e r i n f e c t i o n a n d r e m a i n s c o n s t a n t u p t o 3 6 - 3 8 h o u r s ( M o o n e t a l _ . , 1 9 7 6 ) . T h e i n i t i a t i o n o f HCMV s t r a i n T o w n e DNA s y n t h e s i s w a s d e t e c t e d b y DNA h y b r i d i z a t i o n a n a l y s i s b y a p p r o x i m a t e l y 1 2 h o u r s a f t e r i n f e c t i o n ( S t i n s k i , 1 9 7 8 ) , b u t m a x i m u m v i r a l DNA r e p l i c a t i o n d o e s n o t o c c u r u n t i l 7 2 - 9 6 h o u r s a f t e r i n f e c t i o n . M u r i n e CMV r e p l i c a t i o n w a s s h o w n t o b e c e l l c y c l e d e p e n d e n t ( M u l l e r a n d H u d s o n , 1 9 7 7 a ) . MCMV DNA s y n t h e s i s a p p e a r e d t o r e q u i r e f a c t o r s a s s o c i a t e d 6 w i t h h o s t c e l l DNA s y n t h e s i s . V i r a l DNA s y n t h e s i s c o u l d b e d e t e c t e d i n a s y n c h r o n o u s l y i n f e c t e d c e l l s a t 1 0 - 1 2 h o u r s , b u t i n c e l l s i n f e c t e d l a t e i n t h e G-j p e r i o d ( 1 1 h o u r s a f t e r s u b c u l t u r e ) v i r u s DNA r e p l i c a t i o n w a s d e t e c t e d a f t e r 8 h o u r s ( M u l l e r a n d H u d s o n , 1 9 7 7 a ; M i s r a e t a l _ . , 1 9 7 8 ) . I n c o m p a r i s o n , HCMV d i d n o t r e q u i r e t h e c e l l t o e n t e r S p h a s e f o r s u c c e s s f u l r e p l i c a t i o n o f t h e v i r a l g e n o m e ( D e M a r c h i a n d K a p l a n , 1 9 7 6 ) . A t 9 6 h o u r s a f t e r i n f e c t i o n , o n l y 0 . 7 % o f f l u o r o u r a c i l t r e a t e d c e l l s s h o w e d e v i d e n c e o f c e l l u l a r DNA s y n t h e s i s , w h i l e 2 0 . 2 % o f t h e s e c e l l s s h o w e d e v i d e n c e o f v i r a l DNA s y n t h e s i s . H o w e v e r t h e y a l s o s h o w e d t h a t t h e p h y s i o l o g i c a l s t a t e o f t h e c e l l a f f e c t e d i t s s u s c e p t i b i l i t y t o H C M V . A t 4 8 h o u r s a f t e r i n f e c t i o n , l e s s t h a n 5 0 % o f c o n f l u e n t c e l l s s h o w e d t h e p r e s e n c e o f HCMV a n t i g e n s , w h i l e 9 0 % o f s u b c o n f l u e n t c e l l s a t t h a t t i m e w e r e p o s i t i v e f o r HCMV a n t i g e n s . HCMV a n d MCMV d o n o t c o d e f o r t h e i r o w n t h y m i d i n e k i n a s e e n z y m e s ( Z a v a d a e t a l . , 1 9 7 6 ; M u l l e r a n d H u d s o n , 1 9 7 7 b ) . H o w e v e r , MCMV h a s b e e n s h o w n t o m u l t i p l y i n T K ~ 3 T 3 c e l l s , w h i l e HCMV c a n s t i m u l a t e t h e l e v e l s o f c e l l u l a r t h y m i d i n e k i n a s e ( M u l l e r a n d H u d s o n , 1 9 7 7 b , E s t e s a n d H u a n g , 1 9 7 7 ) . 2 . I n f e c t i o n o f c u l t u r e d c e l l s A n u m b e r o f r e s e a r c h e r s h a v e s t u d i e d HCMV a n d MCMV i n f e c t i o n s o f d i f f e r e n t t y p e s o f c e l l s i n . v i t r o a s m o d e l s f o r t h e e v e n t s i_n v i v o . I n v i t r o s t u d i e s h a v e s h o w n a n u m b e r o f d i f f e r e n c e s i n t h e b e h a v i o u r o f HCMV c o m p a r e d w i t h M C M V . HCMV w i l l o n l y r e p l i c a t e f u l l y i n h u m a n d i p l o i d f i b r o b l a s t s i n . v i t r o . T h e s p e c i e s s p e c i f i c i t y o b s e r v e d f o r t h i s v i r u s i s a l m o s t a b s o l u t e , t h o u g h i n o n e c a s e ( W a n e r a n d W e l l e r , 1 9 7 4 ) , HCMV w a s r e p o r t e d t o r e p l i c a t e i n V e r o ( m o n k e y ) c e l l s a n d t o p r o d u c e i n f e c t i o u s , c e l l - a s s o c i a t e d v i r u s . I n t h e s e i n f e c t e d c e l l s , h e r p e s - l i k e v i r u s c a p s i d s w e r e o b s e r v e d i n t h e n u c l e i , 1 4 d a y s a f t e r i n f e c t i o n , b u t t h e t i t e r s o f r e l e a s e d v i r u s d i d n o t e x c e e d 1 0 0 7 i n f e c t i o u s u n i t s / m l . I n c o m p a r i s o n , s t r i n g e n t s p e c i e s s p e c i f i c i t y o f MCMV r e p l i c a t i o n i n . v i t r o i s n o t o b s e r v e d . MCMV r e p l i c a t e d p e r m i s s i v e l y i n t h e f o l l o w i n g n o n - m u r i n e c e l l s : B S C - 1 ( A f r i c a n g r e e n m o n k e y k i d n e y ) , B H K - 2 1 ( b a b y h a m s t e r k i d n e y ) , R K - 1 3 ( r a b b i t k i d n e y ) l i n e s a n d p r i m a r y r a b b i t k i d n e y a n d f e t a l s h e e p b r a i n . No MCMV r e p l i c a t i o n o c c u r r e d a f t e r i n f e c t i o n o f H e L a ( h u m a n e p i t h e l i a l c a r c i n o m a ) , W I - 3 8 ( h u m a n f i b r o b l a s t s ) o r h u m a n e m b r y o n i c b r a i n a n d k i d n e y c e l l s ( K i m a n d C a r p , 1 9 7 1 ) . T h e i n t e r a c t i o n o f MCMV w i t h h u m a n d i p l o i d f i b r o b l a s t s ( W I - 3 8 ) w a s f u r t h e r s t u d i e d ( K i m a n d C a r p , 1 9 7 2 ) . A l t h o u g h n o i n f e c t i o u s v i r u s w a s p r o d u c e d i n t h e s e c e l l s , e a r l y m o r p h o l o g i c a l e f f e c t s o f i n f e c t i o n w e r e o b s e r v e d w i t h i n 1 2 h o u r s o f i n f e c t i o n . A r o u n d i n g o f t h e c e l l s o c c u r r e d w i t h t h e f o r m a t i o n o f i n t r a n u c l e a r i n c l u s i o n s . T h e s e e f f e c t s w e r e i n h i b i t e d i f a c t i n o m y c i n D w a s i n c l u d e d i n t h e m e d i u m a t t h e t i m e o f i n f e c t i o n . I t i n d i c a t e d t h a t s o m e v i r a l g e n e e x p r e s s i o n o c c u r r e d i n t h e n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d c e l l s . A s i m i l a r c y t o p a t h i c e f f e c t w a s s e e n a f t e r a b o r t i v e i n f e c t i o n o f g u i n e a p i g ( F i o r e t t i e t a l _ . , 1 9 7 3 ) a n d b o v i n e e m b r y o n i c f i b r o b l a s t s ( W a n e r a n d W e l l e r , 1 9 7 4 ) b y H C M V . I n b o t h c a s e s , HCMV s p e c i f i c a n t i g e n s w e r e d e t e c t e d i n t h e s e c e l l s b y i m m u n o f l u o r e s c e n c e . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s i n d i c a t e d t h a t t h e HCMV g e n o m e c o u l d p e r s i s t i n a b o r t i v e l y i n f e c t e d c e l l s . A t 2 8 d a y s a f t e r i n f e c t i o n , H C M V - i n d u c e d a n t i g e n s c o u l d s t i l l b e d e t e c t e d i n r a b b i t l u n g f i b r o b l a s t s a n d i n f e c t i o u s HCMV c o u l d b e r e s c u e d i f t h e r a b b i t c e l l s w e r e c o c u l t i v a t e d w i t h h u m a n f i b r o b l a s t s ( F a r b e r e t a l _ . , 1 9 7 9 ) . S i m i l a r l y , i n f e c t i o n o f m o u s e f i b r o b l a s t s w i t h HCMV i n d u c e d v i r u s s p e c i f i c a n t i g e n s . T h e s e a n t i g e n s c o u l d b e d e t e c t e d a s l o n g a s 2 w e e k s a f t e r i n f e c t i o n . F u s i o n o f i n f e c t e d m o u s e c e l l s w i t h h u m a n f i b r o b l a s t s , 2 0 , 3 0 , 4 0 a n d 5 0 d a y s a f t e r i n f e c t i o n , l e a d t o t h e r e i n d u c t i o n o f v i r u s - s p e c i f i c a n t i g e n s b y 1 2 h o u r s . I f t h e m o u s e 8 c e l l s w e r e p r e t r e a t e d f o r 3 d a y s w i t h 5 - I o d o 2 ' - d e o x y u r i d i n e ( I U d R ) p r i o r t o f u s i o n o r f o r 3 d a y s s u b s e q u e n t t o f u s i o n , i n f e c t i o u s v i r u s w a s r e c o v e r e d ( B o l d o g h e t a l _ . , 1 9 7 7 ) . T h i s e f f e c t o c c u r r e d e v e n i f t h e h e t e r o k a r y o n s f o r m e d w e r e g r o w n f o r 4 0 d a y s b e f o r e I U d R t r e a t m e n t . I t w a s s u g g e s t e d t h a t I U d R t r e a t m e n t may c a u s e r e p r e s s i o n o f a c e l l u l a r p r o d u c t i n c e l l s , w h i c h n o r m a l l y w o u l d i n t e r f e r e o r i n h i b i t v i r u s r e p l i c a t i o n ( S t J e o r a n d R a p p , 1 9 7 3 ) . I n o t h e r s t u d i e s , HCMV a n d MCMV i n f e c t i o n o f e p i t h e l i a l c e l l s h a s b e e n s h o w n t o f o l l o w a p r o l o n g e d c h r o n i c i n f e c t i o u s c y c l e . HCMV i n f e c t i o n o f BAMB e p i t h e l i a l c e l l s ( d e r i v e d f r o m h u m a n a m n i o n ) r e s u l t e d i n t h e f o r m a t i o n o f s y n c y t i a , w i t h v i r u s t i t e r s r i s i n g s l o w l y a n d p e a k i n g a t 2 5 d a y s a f t e r i n f e c t i o n ( V o n k a e t a l _ . , 1 9 7 6 ) . MCMV i n f e c t i o n o f t r a c h e a l o r g a n c u l t u r e s i n f e c t e d m a i n l y e p i t h e l i a l t y p e c e l l s a n d a l s o r e s u l t e d i n a p r o t r a c t e d r e p l i c a t i o n c y c l e ( N e d r u d e t a l _ . , 1 9 8 2 ) . W i t h t h i s s y s t e m , v i r u s w a s s h o w n t o b e p r o d u c e d f o r u p t o 1 8 0 d a y s . A p e r s i s t e n t f o r m o f i n f e c t i o n r e s u l t e d f r o m HCMV i n f e c t i o n o f l y m p h o b l a s t o i d c e l l s . I n f e c t i o n w i t h HCMV o f a l i n e o f B l y m p h o c y t e c e l l s , t h a t h a d o r i g i n a t e d f r o m a l e u k e m i c p a t i e n t , r e s u l t e d i n a c h r o n i c p e r s i s t e n t i n f e c t i o n ( F u r u k a w a , 1 9 7 9 ) . I n f e c t e d c u l t u r e s p e r s i s t e n t l y y i e l d e d HCMV f o r o v e r a y e a r . I n f e c t i o u s c e n t e r a s s a y s s h o w e d t h a t 1 - 1 0 % o f t h e c e l l s w e r e i n f e c t e d . I n t h i s c a s e , p e r s i s t e n t i n f e c t i o n a r o s e a s a r e s u l t o f a b a l a n c e b e t w e e n r e l e a s e o f v i r u s a n d g r o w t h o f u n i n f e c t e d c e l l s . A s i m i l a r s t u d y , u s i n g s e v e r a l h u m a n l y m p h o b l a s t o i d c e l l l i n e s ( o f B a n d T c e l l o r i g i n ) i n f e c t e d w i t h H C M V , a l s o s h o w e d t h a t a p e r s i s t e n t i n f e c t i o n o c c u r r e d ( T o c c i a n d S t J e o r , 1 9 7 9 ) . T c e l l l i n e s a p p e a r e d l e s s s u s c e p t i b l e t o i n f e c t i o n t h a n B c e l l l i n e s . T h e p e r c e n t a g e o f i n f e c t i o u s c e n t e r s r a n g e d f r o m 0 . 0 6 % - 0 . 5 % , t h o u g h i n f e c t i o u s v i r u s w a s r e l e a s e d f o r u p 9 t o 2 8 d a y s a f t e r i n f e c t i o n , a l t h o u g h a t v e r y l o w t i t e r s . HCMV e a r l y a n t i g e n s ( e x p e c t e d i n n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d c e l l s ) w e r e n o t d e t e c t e d i n a n y o f t h e i n f e c t e d c e l l l i n e s . 3 . M a c r o p h a g e i n f e c t i o n s b y M C M V . S t u d i e s o f t h e r o l e o f m a c r o p h a g e s i n t h e p e r s i s t e n c e o f MCMV i n t h e m o u s e h a v e p r o d u c e d s o m e c o n t r a d i c t o r y r e p o r t s ; s o m e i n d i c a t e d t h e m a c r o p h a g e t o b e a p e r m i s s i v e c e l l a n d o t h e r s a n o n -p e r m i s s i v e c e l l . T e g t m e y e r a n d C r a i g h e a d ( 1 9 6 8 ) i n f e c t e d a d u l t p e r i t o n e a l m a c r o p h a g e s i n v i t r o w i t h t i s s u e c u l t u r e a d a p t e d M C M V . A l t h o u g h t h e i n f e c t i o u s c y c l e w a s s l o w , b y 1 6 d a y s t h e m a c r o p h a g e s h a d p r o d u c e d e q u i v a l e n t a m o u n t s o f v i r u s t o i n f e c t e d m o u s e e m b r y o f i b r o b l a s t c e l l s . A c o m p a r a t i v e i_n v i v o s t u d y o f t h e e f f e c t s o f e a r l y s p l e n i c v i r a l r e p l i c a t i o n o f MCMV o n d i s e a s e p a t h o g e n e s i s a l s o s h o w e d s p l e e n m a c r o p h a g e s t o b e r e l a t i v e l y p e r m i s s i v e t o i n f e c t i o n ( K a t z e n s t e i n e t a l _ . , 1 9 8 3 ) . I n f e c t i o n o f m i c e w i t h v i r u l e n t MCMV l e d t o h i g h t i t e r s o f d e t e c t a b l e v i r u s i n t h e s p l e e n a t 9 6 h o u r s a f t e r i n f e c t i o n . E l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e s o f s p l e e n , a f t e r a d m i n i s t r a t i o n o f m a r k e r s t o d e t e c t p h a g o c y t i c c e l l s , s h o w e d t h a t MCMV r e p l i c a t i o n w a s o n l y d e t e c t e d i n m a c r o p h a g e - l i k e c e l l s . I n c o m p a r i s o n , S e l g r a d e a n d O s b o r n ( 1 9 7 4 ) f o u n d t h a t o n l y a s m a l l p e r c e n t a g e o f m a c r o p h a g e s f r o m s u s c e p t i b l e a n d r e s i s t a n t s t r a i n s o f m i c e f o r m e d i n f e c t i o u s c e n t e r s u p o n i n f e c t i o n b y M C M V , a n d o n l y s m a l l a m o u n t s o f i n f e c t i o u s v i r u s w e r e r e l e a s e d f r o m t h e c e l l s o f t h e c u l t u r e s . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d u s i n g v i r u l e n t o r a t t e n u a t e d M C M V . M i m s a n d G o u l d ( 1 9 7 8 ) a l s o f o u n d t h a t t h e e f f i c i e n c y o f MCMV i n f e c t i o n o f p e r i t o n e a l m a c r o p h a g e s w a s l o w . L e s s t h a n 5% o f t h e c e l l s b e c a m e i n f e c t e d w i t h s a l i v a r y g l a n d p a s s a g e d v i r u s , w h i l e v i r u s t h a t h a d b e e n a t t e n u a t e d b y p a s s a g e i n t i s s u e c u l t u r e w a s a b l e t o i n f e c t m a c r o p h a g e s a t a 10 5-15 fold greater efficiency. Yields of virus were also reported to be low, whether virulent or attenuated virus had been used. Macrophages that became infected were able to prevent the spread of virus, either in an in. v i t r o or in vivo assay, while macrophages that did not become infected were less successful in preventing spread of virus to underlying c e l l s . Loh and Hudson (1979) infected separated spleen c e l l populations with MCMV. Most of the virus was taken up by the macrophages. They formed infectious centers but were r e l a t i v e l y r e s t r i c t i v e to virus growth. Only a small percentage of macrophages formed infectious centers. The splenic macrophages were not a l l permissive for virus uptake; even with infection at 100 PFU/cell, only 7.7% of tot a l spleen c e l l s were positive, while macrophages constitute 10-15% of tot a l spleen c e l l population. Brautigam et al_. (1979) compared thioglycollate-stimulated with unstimulated peritoneal macrophages for permissiveness to MCMV infections. Virus was able to replicate in stimulated macrophages from different strains of mice, forming infectious centers in 45-56% of c e l l s . Unstimulated macrophages could form infectious centers in 12-18% of c e l l s . In. s i t u hybridization showed genomes to be present in approximately 90% of both unstimulated and stimulated c e l l s . Thus i t appears that, depending on the state of activation of the c e l l s , macrophages may be important for disseminating virus within the infected host and also have the potential to harbor the v i r a l genome in a latent fashion. 4. Latent in vivo infections by HCMV and MCMV . The establishment of latent infection in tissues of the host i s a hallmark of infection with herpesviruses. In contrast to herpes simplex virus (Stevens and Cook, 1971) and Epstein Barr virus (Pattengale et §_1., 1974), the sit e ( s ) of latency of 11 b o t h HCMV a n d MCMV r e m a i n a m y s t e r y ( J o r d a n , 1 9 8 3 ) . I n a d d i t i o n , t h e t r u e s t a t e o f t h e p e r s i s t e n t i n f e c t i o n i n t h e h o s t h a s n o t b e e n e l u c i d a t e d . I t i s a s s u m e d t h a t t h e CMV g e n o m e i s h e l d i n a s t a t i c s t a t e a n d t h e v i r u s i s s t i m u l a t e d t o r e p l i c a t e b y s o m e m e c h a n i s m . T h i s h a s b e e n t h e a p p r o a c h i n t h e d e s i g n o f m o s t e x p e r i m e n t s , b u t t h e f a c t t h a t t h e i n f e c t i o n m a y b e a l o w l e v e l c h r o n i c t y p e c a n n o t b e r u l e d o u t . M o s t o f t h e e v i d e n c e t h a t HCMV c a n p e r s i s t i n h u m a n s i n a l a t e n t f o r m c o m e s m o s t l y f r o m i n d i r e c t e v i d e n c e . E p i d e m i o l o g i c a l e v i d e n c e h a s i n d i c a t e d t h a t HCMV c a n p e r s i s t a n d b e t r a n s m i t t e d i n t h e b l o o d . I t w a s s h o w n t h a t t h e r e w a s a p p r o x i m a t e l y a 7% r i s k o f i n f e c t i o n f o l l o w i n g t r a n s f u s i o n o f a s i n g l e u n i t o f b l o o d ( P r i n c e e t a l . , 1 9 7 1 ) . T h e r e i s a l s o e p i d e m i o l o g i c a l e v i d e n c e t h a t HCMV c a n b e t r a n s m i t t e d t h r o u g h l e u c o c y t e t r a n s f u s i o n s ( W i n s t o n e t a l _ . , 1 9 8 0 ) a n d c a n b e t r a n s m i t t e d b y t h e k i d n e y o f a HCMV s e r o p o s i t i v e d o n o r ( N a r a q i e t a l _ . , 1 9 7 7 ) . HCMV w a s s h o w n b y d i r e c t m e t h o d s t o b e l a t e n t i n f i b r o b l a s t s f r o m s o m e p a t i e n t s w i t h C h a r c o t - M a r i e - T o o t h d i s e a s e ( W i l l i a m s e t a l _ . , 1 9 8 0 a ) . V i r u s w a s r e a c t i v a t e d f r o m a f i b r o b l a s t c e l l l i n e f r o m o n e o f t h e s e p a t i e n t s , a n d t w o o t h e r c e l l l i n e s w e r e s h o w n t o c o n t a i n HCMV DNA ( W i l l i a m s e t a l _ . , 1 9 8 0 b ) . S e v e r a l c e l l a n d t i s s u e t y p e s h a v e b e e n i m p l i c a t e d a s s i t e s o f l a t e n c y o f t h e M C M V . T h e s e i n c l u d e B l y m p h o c y t e s , p e r i t o n e a l m a c r o p h a g e s , s a l i v a r y g l a n d , p r o s t a t e , o v a r i e s a n d t e s t e s . MCMV w a s i s o l a t e d , b y c o c u l t i v a t i o n , f r o m B l y m p h o c y t e p o p u l a t i o n s f r o m s p l e e n s o f s e v e r a l s t r a i n s o f m i c e t h a t h a d b e e n i n f e c t e d ( i n u t e r o o r w i t h i n 2 4 h o u r s o f b i r t h ) w i t h t i s s u e c u l t u r e p a s s a g e d ( a t t e n u a t e d ) MCMV ( O l d i n g e t a l _ . , 1 9 7 5 ) . MCMV w a s o n l y r e c o v e r e d b y c o c u l t i v a t i o n o f i s o l a t e d B l y m p h o c y t e s w i t h f i b r o b l a s t s f r o m a l l o g e n e i c s t r a i n s o f m i c e . Two f a c t o r s i n d i c a t e d t h a t v i r u s w a s b e i n g r e a c t i v a t e d f r o m a l a t e n t i n f e c t i o n . 1 2 F i r s t l y , v i r u s c o u l d n o t b e r e c o v e r e d f r o m s o n i c a t e d l y m p h o i d c e l l s , a n d s e c o n d l y , t h e t i m e t a k e n t o d e t e c t v i r u s c y t o p a t h i c e f f e c t s ( 2 - 5 w e e k s ) w a s m u c h l o n g e r t h a n i f f r e e v i r u s h a d b e e n p r e s e n t i n t h e s p l e e n c e l l s . T h e s e i n v e s t i g a t o r s a l s o s h o w e d t h a t ' a c t i v a t i o n ' o f t h e B l y m p h o c y t e s w a s n e c e s s a r y f o r r e a c t i v a t i o n o f t h e v i r u s t o o c c u r . I t w a s n o t e d t h a t v i r u s d i d n o t r e a c t i v a t e i f s p l e e n c e l l s w e r e c o c u l t i v a t e d o n f i b r o b l a s t s f r o m m i c e o f t h e s a m e h a p l o t y p e a s t h e s p l e e n c e l l s . T h i s o b s e r v a t i o n h a s n e v e r b e e n c o n f i r m e d b y o t h e r i n v e s t i g a t o r s . B l y m p h o c y t e s w e r e a l s o i m p l i c a t e d b y J o r d a n a n d M a r ( 1 9 8 2 ) a s b e i n g t h e c e l l s f r o m w h i c h v i r u s w a s r e a c t i v a t e d . S p l e e n c e l l s f r o m 3 3 o f 3 4 m i c e , c u l t u r e d u s i n g a n e x p l a n t t e c h n i q u e , p r o d u c e d MCMV s p o n t a n e o u s l y a f t e r 1 2 - 1 8 d a y s . T h e m i c e u s e d h a d b e e n i n f e c t e d a t l e a s t 4 m o n t h s p r e v i o u s l y . O n c e v i r u s h a d b e e n r e a c t i v a t e d , a p r o l o n g e d i n f e c t i o u s c y c l e o c c u r r e d i n t h e c u l t u r e s . E l e c t r o n m i c r o s c o p i c e v i d e n c e s h o w e d t h a t MCMV r e p l i c a t e d i n s p l e n i c m a c r o p h a g e s ( n u c l e o c a p s i d s w e r e i d e n t i f i e d i n m a c r o p h a g e s b u t n o t l y m p h o c y t e s ) . S e p a r a t e d m a c r o p h a g e a n d l y m p h o c y t e p o p u l a t i o n s w e r e c o c u l t i v a t e d w i t h f i b r o b l a s t s a n d MCMV w a s i s o l a t e d i n 1 4 / 1 9 c a s e s f r o m l y m p h o c y t e c u l t u r e s , b u t i n n o c a s e w a s l a t e n t MCMV a c t i v a t e d f r o m t h e m a c r o p h a g e s . I n a d d i t i o n , a f t e r s e p a r a t i o n o f l y m p h o c y t e s i n t o B a n d T c e l l e n r i c h e d p o p u l a t i o n s , v i r u s w a s o n l y a c t i v a t e d f r o m B c e l l e n r i c h e d c u l t u r e s . A s e p a r a t e s y s t e m f o r i n v e s t i g a t i n g MCMV l a t e n c y w a s d e v e l o p e d t h a t i n v o l v e d i n f e c t i o n o f a n i m a l s b y s u b c u t a n e o u s i n o c u l a t i o n . T h i s s y s t e m h a s b e e n u s e d t o m i m i c t h e c l i n i c a l s i t u a t i o n w i t h HCMV t h a t i s f o u n d i n o r g a n t r a n s p l a n t p a t i e n t s ( J o r d a n e t a l . . , 1 9 7 7 ) . A f t e r 4 m o n t h s , w h e n m o s t o f t h e a n i m a l s w e r e s h o w n t o b e f r e e o f i n f e c t i o u s v i r u s , a n i m a l s w e r e i m m u n o s u p p r e s s e d w i t h a n t i l y m p h o c y t e s e r u m ( A L S ) . W i t h i n 2 w e e k s , 4 5 . 8 % d e v e l o p e d a c t i v e MCMV i n f e c t i o n s i n s a l i v a r y g l a n d s a n d 2 5 % d e v e l o p e d MCMV 1 3 i n f e c t i o n s i n s p l e e n s . W i t h m o r e p o t e n t i m m u n o s u p p r e s s i o n ( A L S a n d c o r t i s o n e ) , t h e r a t e o f s a l i v a r y g l a n d r e a c t i v a t i o n i n c r e a s e d t o 9 6 % . V i r u s w a s r a r e l y i s o l a t e d f r o m s a l i v a r y g l a n d h o m o g e n a t e s o f m i c e g i v e n n o i m m u n o s u p p r e s s i o n ( 6 . 6 % ) . T o c o r r e l a t e t h e f i n d i n g s f r o m s o m e o f t h e s y s t e m s f o r MCMV l a t e n c y , s e v e r a l o f t h e v a r i a b l e p a r a m e t e r s w e r e i n v e s t i g a t e d ( J o r d a n e t a _ L , 1 9 8 2 ) . L a t e n t MCMV i n f e c t i o n s w e r e e s t a b l i s h e d w i t h v i r u l e n t a n d a t t e n u a t e d s t r a i n s o f t h e v i r u s . T h e e f f e c t o f s u b c u t a n e o u s ( s c ) v e r s u s i n t r a p e r i t o n e a l ( i p ) m o d e s o f i n f e c t i o n o n t h e a b i l i t y t o r e a c t i v a t e v i r u s b y c o c u l t i v a t i o n a n d i m m u n o s u p p r e s s i o n , a s w e l l a s t h e s t r a i n o f m i c e , t h e a g e a t t i m e o f i n f e c t i o n a n d t h e n e e d t o u s e a l l o g e n e i c f i b r o b l a s t s f o r c o c u l t i v a t i o n w a s e x a m i n e d . I n m o s t c a s e s , MCMV c o u l d b e r e a c t i v a t e d a n d d i s s e m i n a t e d f o l l o w i n g A L S a n d c o r t i s o n e t r e a t m e n t i n a l l s t r a i n s o f m i c e , w h e t h e r i n o c u l a t e d s c o r i p w i t h v i r u l e n t o r a t t e n u a t e d v i r u s . H o w e v e r 4 6 - 6 2 % o f m i c e i n o c u l a t e d b e f o r e 1 w e e k o f a g e d e v e l o p e d l o n g t e r m c h r o n i c s a l i v a r y g l a n d i n f e c t i o n . V i r u s w a s o n l y r e a c t i v a t e d , b y c o c u l t i v a t i o n , f r o m s p l e e n c e l l s o f a n i m a l s t h a t h a d b e e n i n o c u l a t e d i p a n d n e v e r f r o m a n i m a l s i n o c u l a t e d s c . A f t e r i p i n o c u l a t i o n , v i r u l e n t v i r u s w a s r e a c t i v a t e d m o r e o f t e n t h a n a t t e n u a t e d MCMV ( 6 9 v s 2 0 % o f c u l t u r e s r e s p e c t i v e l y ) . T h e a b i l i t y t o d e t e c t MCMV b y c o c u l t i v a t i o n o f s p l e e n c e l l s s e e m e d t o b e r e l a t e d t o t h e a m o u n t o f v i r u s r e p l i c a t i o n t h a t h a d o c c u r r e d i n t h e s p l e e n d u r i n g t h e a c u t e s t a g e o f t h e i n f e c t i o n . I n a c o m p a r a t i v e s t u d y , O l d i n g e t a j _ . ( 1 9 7 6 ) w e r e a b l e t o r e c o v e r MCMV f r o m v i a b l e s p l e e n c e l l s b u t n o t f r o m c o c u l t i v a t e d k i d n e y , l i v e r , s a l i v a r y g l a n d a n d b r a i n t i s s u e . MCMV ONA w a s p r e s e n t a t 4 g e n o m e e q u i v a l e n t s p e r 1 0 0 c e l l s i n s p l e e n c e l l s f r o m t h e s e m i c e a n d a t 2 g e n o m e s p e r 1 0 0 c e l l s i n s a l i v a r y g l a n d s . T h e s a m e g r o u p ( B r a u t i g a m e t a l _ . , 1 9 7 9 ) a l s o s h o w e d t h a t 1 4 p e r i t o n e a l m a c r o p h a g e s m a y h a r b o r l a t e n t MCMV f o r p r o l o n g e d p e r i o d s a f t e r i n f e c t i o n . V i r u s c o u l d b e q u i c k l y r e a c t i v a t e d i f m a c r o p h a g e s w e r e s t i m u l a t e d b y t h i o g l y c o l l a t e t r e a t m e n t , b u t w a s r a r e l y r e a c t i v a t e d f r o m u n s t i m u l a t e d m a c r o p h a g e s . MCMV w a s a p p a r e n t l y r e a c t i v a t e d f r o m e x p l a n t s o f s a l i v a r y g l a n d s a n d p r o s t a t e t i s s u e ( a n d c e l l l i n e s d e r i v e d f r o m t h e m ) t a k e n f r o m m i c e l a t e n t l y i n f e c t e d w i t h MCMV ( C h e u n g a n d L a n g , 1 9 7 7 ) . A s u b s e q u e n t r e p o r t i n d i c a t e d t h a t MCMV DNA c o u l d b e d e t e c t e d i n t h e s e o r g a n s b y DNA h y b r i d i z a t i o n a n a l y s i s , e v e n w h e n v i r u s c o u l d n o t b e a c t i v a t e d b y g r o w t h i n . v i t r o ( C h e u n g e t a l . , 1 9 8 0 ) . MCMV DNA w a s s h o w n t o b e p r e s e n t i n t e s t e s a n d o v a r i e s o f 5 - 6 m o n t h o l d m i c e t h a t h a d b e e n i n f e c t e d a t b i r t h ( B r a u t i g a m a n d O l d s t o n e , 1 9 8 0 ) . I n s u m m a r y , t h e r e s u l t s f r o m a n u m b e r o f i n v e s t i g a t i o n s i n d i c a t e t h a t CMVs c a n b e c o m e l a t e n t i n s e v e r a l d i f f e r e n t c e l l t y p e s . B . M o l e c u l a r B i o l o g y o f HCMV a n d MCMV A c o m p a r i s o n o f t h e s i m i l a r i t i e s a n d d i f f e r e n c e s i n t h e m o l e c u l a r b i o l o g y o f HCMV a n d MCMV w i l l a i d i n c o m p a r i n g t h e t w o v i r u s e s i n a n y m o d e l e x p e r i m e n t a l s y s t e m s . I n a d d i t i o n , c e r t a i n e x p e r i m e n t s w i t h HSV w i l l b e c o n s i d e r e d , w h e r e n o e q u i v a l e n t e x p e r i m e n t s h a v e b e e n p e r f o r m e d w i t h t h e c y t o m e g a l o v i r u s e s . 1 . S t r u c t u r e o f D N A . R e c e n t a n a l y s e s o f t h e g e n o m e s o f HCMV a n d M C M V , b y r e s t r i c t i o n e n z y m e d i g e s t i o n a n d s e p a r a t i o n b y a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s , h a v e s h o w n t h e m t o b e a l m o s t i d e n t i c a l i n s i z e . HCMV s t r a i n A D 1 6 9 h a s a g e n o m e o f 2 4 0 k i l o b a s e p a i r s ( k b p ) , c o r r e s p o n d i n g t o a m o l e c u l a r w e i g h t o f 1 5 1 5 8 M e g a d a l t o n s ( M d ) ( T a m a s h i r o e t a j _ . , 1 9 8 2 ) . MCMV h a s a g e n o m e o f 2 3 5 k b p , c o r r e s p o n d i n g t o a m o l e c u l a r w e i g h t o f 1 5 5 Md ( E b e l i n g e t a l _ . , 1 9 8 3 ) . S i m i l a r r e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d f o r t h e o t h e r s t r a i n s o f HCMV u s e d i n m o s t r e s e a r c h l a b o r a t o r i e s ( L a F e m i n a a n d H a y w a r d , 1 9 8 0 ; D e m a r c h i , 1 9 8 1 ) . T h e CMV g e n o m e s a r e 5 0 % l a r g e r t h a n t h o s e o f h e r p e s s i m p l e x v i r u s ( H S V - 1 , H S V - 2 ) , h o w e v e r t h e g e n o m e s o f HCMV a n d HSV s h a r e t h e s a m e s t r u c t u r e , w h i c h i s d i f f e r e n t f r o m t h a t o f M C M V . T h e HCMV a n d HSV g e n o m e s c o n s i s t o f a l o n g ( L ) u n i q u e r e g i o n a n d a s h o r t ( S ) u n i q u e r e g i o n f l a n k e d b y d i f f e r e n t r e p e a t s e q u e n c e s t h a t a r e i n v e r t e d r e l a t i v e t o e a c h o t h e r ( L a F e m i n a a n d H a y w a r d , 1 9 8 0 ; S h e l d r i c k a n d B e r t h e l o t , 1 9 7 4 ) . A s t h e L a n d S r e g i o n s c a n i n v e r t r e l a t i v e t o e a c h o t h e r , f o u r g e n o m e a r r a n g e m e n t s a r e p o s s i b l e f o r HSV a n d HCMV DNA ( L o c k e r a n d F r e n k e l , 1 9 7 9 ; S p e c t o r e t a l _ . , 1 9 8 2 ) . I n c o m p a r i s o n , t h e MCMV g e n o m e c o n s i s t s o f a s i n g l e l o n g u n i q u e s e q u e n c e w i t h o u t d e t e c t a b l e t e r m i n a l o r i n t e r n a l r e p e a t s e q u e n c e s ( E b e l i n g e t a J L , 1 9 8 3 ; M e r c e r e t a l _ . , 1 9 8 3 ) , t h u s o n l y o n e a r r a n g e m e n t o f t h e g e n o m e i s p o s s i b l e . T h e s i g n i f i c a n c e o f t h e s e d i f f e r e n c e s , a s t h e y r e l a t e t o t h e r e p l i c a t i o n o f t h e v i r u s e s , i s n o t k n o w n . T h e c o m m o n l y u s e d l a b o r a t o r y s t r a i n s o f HCMV w e r e s h o w n b y DNA r e a s s o c i a t i o n k i n e t i c s t o s h a r e a p p r o x i m a t e l y 8 0 % g e n o m e h o m o l o g y ( H u a n g e t a j . , 1 9 7 6 ) , w h i l e HCMV ( T o w n e ) a n d HCMV ( A D 1 6 9 ) s h a r e a p p r o x i m a t e l y 9 0 % o f t h e i r n u c l e o t i d e s e q u e n c e s ( P r i t c h e t t , 1 9 8 0 ) . No d e t e c t a b l e h o m o l o g y w a s f o u n d b e t w e e n HCMV DNA a n d H S V - 1 , H S V - 2 , E p s t e i n - B a r r v i r u s , s i m i a n a n d m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s DNA ( H u a n g a n d P a g a n o , 1 9 7 4 ) . T h e r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e p a t t e r n o f DNA f r o m a v i r u l e n t i s o l a t e o f MCMV ( K 1 8 1 ) w a s s h o w n t o d i f f e r s l i g h t l y f r o m t h a t o f t h e S m i t h s t r a i n o f MCMV ( M i s r a a n d H u d s o n , 1 9 8 0 ) . A l t h o u g h DNA f r o m t h e t w o s t r a i n s o f MCMV e x h i b i t e d t h e s a m e r e a s s o c i a t i o n k i n e t i c s , a l t e r a t i o n s o f s o m e o f t h e 1 6 r e s t r i c t i o n f r a g m e n t s i n d i c a t e d a p o s s i b l e g e n e t i c b a s i s f o r t h e e n h a n c e d v i r u l e n c e o f t h e K 1 8 1 s t r a i n . 2 . V i r i o n p r o t e i n c o m p o s i t i o n : A n a l y s i s o f p u r i f i e d HCMV v i r i o n s h a v e b e e n c o m p l i c a t e d a s p r e p a r a t i o n s b y m o s t p u r i f i c a t i o n m e t h o d s a r e c o n t a m i n a t e d w i t h d e n s e b o d i e s ( S t i n s k i , 1 9 7 6 ) . I n c o n t r a s t , d e n s e b o d i e s a r e n o t s e e n i n p r e p a r a t i o n s o f MCMV v i r i o n s , b u t i n s t e a d , m u l t i c a p s i d v i r i o n s a r e p r e s e n t ( H u d s o n e t a l _ . , 1 9 7 6 ) . A n a l y s i s o f v i r i o n s a n d d e n s e b o d i e s o f HCMV ( T o w n e ) , p u r i f i e d o n D - s o r b i t o l g r a d i e n t s , i d e n t i f i e d 3 5 d i s t i n c t p r o t e i n s ( S t i n s k i , 1 9 7 6 ) , o f w h i c h 9 c o u l d b e i d e n t i f i e d a s g l y c o p r o t e i n s . V a r i o u s o t h e r s t u d i e s h a v e e s t i m a t e d t h a t 3 3 - 3 5 p r o t e i n s a r e v i r i o n - a s s o c i a t e d ( F i a l a e t a j _ . , 1 9 7 6 ; K i m e t a l _ . , 1 9 7 6 a ; G u p t a e t a l . , 1 9 7 7 ) . C o m p a r i s o n o f v i r i o n p r o t e i n s o f a n u m b e r o f s t r a i n s o f HCMV h a v e s h o w n t h e m t o b e s i m i l a r ( G u p t a e t a j . . , 1 9 7 7 ) Two s t u d i e s h a v e b e e n d o n e o n t h e v i r i o n p r o t e i n s o f MCMV ( K i m e t a l . , 1 9 7 6 b ; C h a n t l e r a n d H u d s o n , 1 9 7 8 ) . I n b o t h c a s e s , t h e v i r i o n s w e r e p u r i f i e d b y c e n t r i f u g a t i o n t h r o u g h g r a d i e n t s o f p o t a s s i u m t a r t r a t e . K i m e t a j _ . ( 1 9 7 6 b ) f o u n d 3 3 p r o t e i n s a s s o c i a t e d w i t h t h e v i r i o n , s i x o f w h i c h w e r e i d e n t i f i e d a s g l y c o p r o t e i n s . C h a n t l e r a n d H u d s o n ( 1 9 7 8 ) i d e n t i f i e d 2 9 v i r i o n p r o t e i n s . I d e n t i f i c a t i o n o f p h o s p h o r y l a t e d v i r i o n p r o t e i n s i n a n u m b e r o f CMV s t r a i n s ( h u m a n a n d s i m i a n ) s h o w e d t h a t t h e r e w e r e f o u r m a i n p r o t e i n s i n e a c h c a s e , t w o o f w h i c h w e r e m o r e h i g h l y l a b e l e d t h a n t h e o t h e r s . T h e t w o h i g h l y p h o s p h o r y l a t e d p r o t e i n s h a d b e e n i d e n t i f i e d a s t e g u m e n t p r o t e i n s f o r C o l b u r n s t r a i n CMV ( G i b s o n , 1 9 8 3 ) . 3 . E a r l y v i r a l e f f e c t s o n i n f e c t e d c e l l s : S e v e r a l n o n - s t r u c t u r a l p r o t e i n s 17 o f h e r p e s s i m p l e x v i r u s h a v e b e e n i d e n t i f i e d w i t h k n o w n f u n c t i o n s . T h e t h y m i d i n e k i n a s e w a s i d e n t i f i e d a s a 4 4 K e a r l y p r o t e i n ( S u m m e r s e t a j _ . , 1 9 7 5 ) , t h e v i r a l DNA p o l y m e r a s e a s a 1 5 0 K e a r l y p r o t e i n ( P o w e l l a n d P u r i f o y , 1 9 7 7 ) a n d I C P 2 2 a s t h e a l k a l i n e e x o n u c l e a s e ( B a n k s e t a l _ . , 1 9 8 3 ) I n c o m p a r i s o n , f o r H C M V , o n l y t h e v i r u s - i n d u c e d DNA p o l y m e r a s e h a s b e e n i d e n t i f i e d ( H u a n g , 1 9 7 5 ) . H o w e v e r , a n u m b e r o f s t u d i e s h a v e p r o v i d e d i n f o r m a t i o n a b o u t e f f e c t s o f v a r i o u s v i r u s - i n d u c e d e a r l y f u n c t i o n s o n t h e i n f e c t e d c e l l . S t i m u l a t i o n o f h o s t c e l l DNA s y n t h e s i s o c c u r s a f t e r i n f e c t i o n , b u t v a r i a b l e r e s u l t s h a v e b e e n o b t a i n e d a s t o w h e t h e r t h i s f u n c t i o n i s a c t i v e i n u . v . i n a c t i v a t e d v i r u s . S t J e o r e t a l _ . ( 1 9 7 4 ) f o u n d n o s t i m u l a t i o n o c c u r r e d u s i n g u . v . i n a c t i v a t e d H C M V . I n c o m p a r i s o n , F u r u k a w a e t a l ( 1 9 7 5 ) , B o l d o g h e t a j _ . ( 1 9 7 8 ) a n d O e M a r c h i a n d K a p l a n ( 1 9 7 7 b ) s h o w e d t h a t u . v . i n a c t i v a t e d HCMV c o u l d s t i l l s t i m u l a t e c e l l u l a r DNA s y n t h e s i s a n d i n t h e l a t t e r c a s e , s t i m u l a t i o n w a s g r e a t e r w i t h t h e u s e o f u . v . i r r a d i a t e d v i r u s . T h e s e r e s u l t s w o u l d s e e m t o i n d i c a t e t h a t t h e s t i m u l a t i o n w a s c a u s e d b y a v i r i o n c o m p o n e n t . A p r o t e i n i n d u c e d b y MCMV e a r l y i n t h e r e p l i c a t i o n c y c l e w a s s h o w n t o c a u s e t h e i n h i b i t i o n o f c e l l u l a r DNA s y n t h e s i s b y 1 2 h o u r s a f t e r i n f e c t i o n ( M o o n e t a _ l . , 1 9 7 6 ) . T a n a k a e t a l . ( 1 9 7 5 ) s h o w e d t h a t s t i m u l a t i o n o f h o s t c e l l RNA s y n t h e s i s i n HCMV i n f e c t e d c e l l s w a s d e p e n d e n t o n a p r o t e i n s y n t h e s i s e d e a r l y i n t h e i n f e c t i o u s c y c l e . F u r t h e r c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h i s , s h o w e d t h a t e n d o g e n o u s RNA p o l y m e r a s e a c t i v i t y w a s e n h a n c e d 3 - f o l d a t 4 8 h o u r s a f t e r i n f e c t i o n i n c e l l s i n f e c t e d w i t h HCMV ( T a n a k a e t a j . . , 1 9 7 8 ) . E n h a n c e m e n t w a s a b o l i s h e d i f i n f e c t e d c e l l s w e r e t r e a t e d d u r i n g t h e f i r s t 6 h o u r s w i t h a c t i n o m y c i n D o r c y c l o h e x i m i d e . T h i s i n d i c a t e d t h a t a HCMV i m m e d i a t e - e a r l y o r e a r l y f u n c t i o n w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e s t i m u l a t i o n . I n a d d i t i o n , t h i s g r o u p ( K a m a t a e t a j _ . , 1 9 7 8 ; 1 9 7 9 ) c h a r a c t e r i z e d t w o H C M V - i n d u c e d c h r o m a t i n f a c t o r s , 1 8 t h a t a r e r e s p o n s i b l e f o r c h a n g e s i n c h r o m a t i n t e m p l a t e t r a n s c r i p t i o n a c t i v i t y a n d c h a n g e s i n t h e s t r u c t u r e o f i n f e c t e d c e l l c h r o m a t i n , a s HCMV e a r l y g e n e p r o d u c t s . T h e s e f a c t o r s w e r e s e p a r a t e d f r o m e a c h o t h e r o n D N A - c e l l u l o s e c o l u m n s . C h r o m a t i n f a c t o r ( 1 ) w a s r e s p o n s i b l e f o r a r a p i d i n c r e a s e i n c h r o m a t i n t e m p l a t e a c t i v i t y , w h i l e c h r o m a t i n f a c t o r ( 2 ) w a s r e s p o n s i b l e f o r t h e c h r o m a t i n c o n f o r m a t i o n c h a n g e . S y n t h e s i s o f b o t h f a c t o r s , w h o s e a p p e a r a n c e c o r r e l a t e d w i t h t h e a p p e a r a n c e o f i m m e d i a t e - e a r l y n u c l e a r a n t i g e n s , w a s s e n s i t i v e t o u . v . i n a c t i v a t i o n o f v i r u s o r t r e a t m e n t o f c e l l s w i t h c y c l o h e x i m i d e ( K a m a t a e t a l _ . , 1 9 7 9 ) . T h e r o l e t h a t t h e s e f a c t o r s h a v e i n v i r u s r e p l i c a t i o n i s n o t k n o w n . HCMV e a r l y f u n c t i o n s h a v e a l s o b e e n s h o w n t o c a u s e s u p p r e s s i o n o f f i b r o n e c t i n s y n t h e s i s i n c e l l s ( I h a r a e t a j . . , 1 9 8 2 ) . T h i s s e e m s t o b e a s p e c i f i c e f f e c t a s m o s t m a c r o m o l e c u l a r s y n t h e s i s i s e n h a n c e d d u r i n g t h e e a r l y s t a g e s o f HCMV i n f e c t i o n . T h i s e f f e c t o c c u r r e d i f c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h DNA r e p l i c a t i o n d e f i c i e n t t e m p e r a t u r e s e n s i t i v e m u t a n t s ( a t t h e n o n - p e r m i s s i v e t e m p e r a t u r e ) b u t n o t w i t h u . v . - i r r a d i a t e d v i r u s . T h i s f e a t u r e m a y b e r e s p o n s i b l e f o r t h e e a r l y c y t o p a t h i c e f f e c t s e e n i n i n f e c t e d c e l l s . 4 . H e r p e s v i r u s g e n e e x p r e s s i o n i n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s . T h e c o n c e p t o f c o o r d i n a t e d r e g u l a t i o n o f t h r e e p h a s e s o f g e n e e x p r e s s i o n f o r h e r p e s v i r u s e s w a s o r i g i n a t e d b y H o n e s s a n d R o i z m a n ( 1 9 7 4 ) w o r k i n g w i t h H S V - 1 . T h e f i r s t v i r a l g e n e p r o d u c t s s y n t h e s i z e d i n i n f e c t e d c e l l s a r e t e r m e d i m m e d i a t e - e a r l y p r o t e i n s . T h e s e a r e d e f i n e d o p e r a t i o n a l l y a s t h o s e e n c o d e d b y g e n e s w h i c h a r e t r a n s c r i b e d a n d t r a n s l a t e d i n t h e a b s e n c e o f p r i o r v i r a l p r o t e i n s y n t h e s i s . T h e t r a n s c r i p t i o n o f e a r l y g e n e s r e q u i r e s d e - n o v o v i r a l p r o t e i n s y n t h e s i s a n d o c c u r s p r i o r t o v i r a l DNA 1 9 s y n t h e s i s . L a t e g e n e s a r e t r a n s c r i b e d s u b s e q u e n t t o v i r a l DNA s y n t h e s i s . T h i s c o o r d i n a t e d r e g u l a t i o n o f v i r a l g e n e e x p r e s s i o n h a s b e e n s h o w n t o o c c u r i n a n u m b e r o f h e r p e s v i r u s e s ; HSV ( C l e m e n t s e t a l _ . , 1 9 7 7 ; H o n e s s a n d R o i z m a n , 1 9 7 4 ) HCMV ( S t i n s k i , 1 9 7 8 ; W a t h e n a n d S t i n s k i , 1 9 8 2 ) , p s e u d o r a b i e s v i r u s ( F e l d m a n e t a l . . , 1 9 7 9 ) a n d i n f e c t i o u s b o v i n e r h i n o t r a c h e i t i s v i r u s ( M i s r a e t a l . . , 1 9 8 1 ) . a ) HCMV t r a n s c r i p t i o n : A n u m b e r o f s t u d i e s o f HCMV t r a n s c r i p t i o n i n v o l v e d t h e i m m e d i a t e - e a r l y ( I E ) g e n e s . A n u n d e r s t a n d i n g o f h o w I E g e n e s r e g u l a t e s u b s e q u e n t v i r a l g e n e e x p r e s s i o n i s n e c e s s a r y f o r u n d e r s t a n d i n g t h e u n d e r l y i n g m e c h a n i s m s o f l a t e n c y a n d r e a c t i v a t i o n . D i f f e r e n c e s a r e n o t i c e d i n t h e l o c a t i o n a n d o r i e n t a t i o n o f I E c l a s s R N A s o n t h e HSV g e n o m e a s c o m p a r e d t o HCMV ( W a t h e n a n d S t i n s k i , 1 9 8 2 ) . F o u r o f t h e s i x HSV I E t r a n s c r i p t s o r i g i n a t e f r o m t h e l o n g a n d s h o r t r e p e a t s e q u e n c e s a n d a d j a c e n t s e q u e n c e s ( C l e m e n t s e t a ] . . , 1 9 7 7 ) , w h e r e a s f o r HCMV ( T o w n e ) , t h e t r a n s c r i p t s o r i g i n a t e m a i n l y f r o m t h e l o n g u n i q u e r e g i o n . 8 8 % o f w h o l e c e l l RNA h y b r i d i z e d t o t h e r e g i o n o f 0 . 6 6 0 - 0 . 7 7 0 map u n i t s , w h i l e o n l y 6% h y b r i d i z e d t o t h e l o n g r e p e a t s e q u e n c e s ( W a t h e n e t a l . . , 1 9 8 1 ) . A c h a r a c t e r i s t i c o f I E t r a n s c r i p t i o n o f HCMV ( o b s e r v e d i n a l l s t r a i n s s t u d i e d ) i s t h e p r e s e n c e o f a p r e d o m i n a n t I E t r a n s c r i p t i o n s i t e . T h e s t r o n g I E t r a n s c r i p t i o n s i t e o f HCMV ( A D 1 6 9 ) a t 0 . 0 6 1 - 0 . 1 1 0 map u n i t s ( M c D o n o u g h a n d S p e c t o r , 1 9 8 3 ) i s a n a l o g o u s t o t h e I E t r a n s c r i p t i o n r e g i o n o f HCMV ( T o w n e ) a t 0 . 6 6 0 - 0 . 7 7 0 map u n i t s ( W a t h e n a n d S t i n s k i , 1 9 8 2 ) a n d t o t h e r e g i o n o f HCMV ( D a v i s ) a t 0 . 6 8 6 - 0 . 7 3 3 map u n i t s ( D e M a r c h i , 1 9 8 1 ) . A n a l y s i s o f t h e t r a n s c r i p t s o f d i f f e r e n t s t r a i n s o f HCMV p r o d u c e d a t I E t i m e s s h o w e d s i m i l a r f e a t u r e s . T h r e e p r e d o m i n a n t p o l y A + t r a n s c r i p t s o f HCMV ( A D 1 6 9 ) ( 2 . 3 , 2 . 2 a n d 1 . 9 k b ) w e r e d e t e c t e d t h a t h y b r i d i z e d t o t h e a r e a 2 0 s t a t e d , w i t h t h e 1 . 9 k b t r a n s c r i p t p r e s e n t i n m o s t a b u n d a n c e ( J a h n e t a l . . , 1 9 8 4 ) . T h e s e a p p e a r a n a l o g o u s t o t h e 1 . 9 5 a n d 2 . 2 5 k b I E t r a n s c r i p t s o f HCMV ( T o w n e ) ( S t i n s k i e t a j [ . , 1 9 8 3 ) . A f t e r a 2 h r p e r i o d o f d e - n o v o p r o t e i n s y n t h e s i s i n H C M V - i n f e c t e d c e l l s , a s w i t c h t o e a r l y t r a n s c r i p t i o n o c c u r r e d w i t h t r a n s c r i p t s o r i g i n a t i n g f r o m m o r e e x t e n s i v e r e g i o n s o f t h e g e n o m e . W a t h e n a n d S t i n s k i ( 1 9 8 2 ) f o u n d t h a t a l a r g e a m o u n t o f t h e w h o l e c e l l RNA e x t r a c t e d a t e a r l y t i m e s a f t e r i n f e c t i o n , t h a t h y b r i d i z e d t o a r e a s o f t h e l o n g u n i q u e s e c t i o n ( X b a l B 0 . 3 2 4 - 0 . 4 6 0 map u n i t s ) , w a s p r e f e r e n t i a l l y r e t a i n e d i n t h e n u c l e u s . I n c o n t r a s t , t h e m o s t a b u n d a n t p o l y s o m e - a s s o c i a t e d RNA c o n t a i n e d f i v e s i z e s o f RNA t h a t h y b r i d i z e d t o t h e l o n g t e r m i n a l a n d i n t e r n a l r e p e a t s e q u e n c e s o f t h e g e n o m e . A f t e r t h e i n i t i a t i o n o f v i r a l DNA s y n t h e s i s , t h e m o s t a b u n d a n t p o l y s o m e - a s s o c i a t e d RNA s i z e c l a s s e s o r i g i n a t e d f r o m t h e l o n g r e p e a t s e q u e n c e s ( W a t h e n a n d S t i n s k i , 1 9 8 2 ) . A c e r t a i n l e v e l o f p o s t - t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l i s e x e r t e d b y HCMV o n g e n e e x p r e s s i o n . D e M a r c h i ( 1 9 8 3 a ) s h o w e d t h a t p o s t - t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l i n H C M V - i n f e c t e d c e l l s e x i s t e d a t t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t a c c u m u l a t i o n , r e t e n t i o n o f t r a n s c r i p t s i n t h e n u c l e u s , p r e f e r e n t i a l a s s o c i a t i o n o f t r a n s c r i p t s w i t h p o l y s o m e s a n d s t a b i l i t y o f R N A s . b ) MCMV t r a n s c r i p t i o n . A n a l y s i s o f MCMV t r a n s c r i p t i o n h a s i n d i c a t e d t h a t i t i s u n d e r t h e s a m e t e m p o r a l , a b u n d a n c e a n d p o s t - t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l s a s o t h e r h e r p e s v i r u s e s . T w e n t y - f i v e p e r c e n t o f t h e MCMV DNA w a s t r a n s c r i b e d p r i o r t o v i r a l DNA r e p l i c a t i o n , a s s h o w n b y r e a s s o c i a t i o n k i n e t i c a n a l y s i s w i t h w h o l e g e n o m e DNA p r o b e s , a n d 3 8 % o f t h e g e n o m e s u b s e q u e n t t o DNA r e p l i c a t i o n ( M i s r a e t a l _ . , 1 9 7 8 ) . I n b o t h c a s e s , s l i g h t l y l e s s t h a n h a l f o f t h e t o t a l t r a n s c r i p t s w e r e t r a n s p o r t e d t o t h e c y t o p l a s m . 21 R e c e n t t r a n s c r i p t i o n a n a l y s e s h a v e u s e d c l o n e d s u b g e n o m i c p i e c e s o f MCMV D N A . S i m i l a r t o t h a t f o u n d w i t h a l l s t r a i n s o f H C M V , t r a n s c r i p t s f o u n d a t I E t i m e s o r i g i n a t e d f r o m a n a r r o w p o r t i o n o f t h e g e n o m e ( 0 . 7 7 0 - 0 . 8 1 6 map u n i t s ) ( M a r k s e t a l . . , 1 9 8 3 ; K e i l e t a l _ - , 1 9 8 4 ) . T h i s l o c a t i o n i s i n c l o s e p r o x i m i t y t o t h e c o n s e n s u s s i t e f o r I E t r a n s c r i p t i o n o f o t h e r s t r a i n s o f C M V . T h e s w i t c h t o e a r l y t r a n s c r i p t i o n r e s u l t e d i n t h e d e t e c t i o n o f RNA c o r r e s p o n d i n g t o a l l a r e a s o f t h e g e n o m e e x c e p t 0 . 2 7 8 - 0 . 3 0 5 map u n i t s . T h e m o s t a b u n d a n t t r a n s c r i p t i o n o c c u r r e d i n t w o s m a l l a r e a s o f t h e g e n o m e , 0 . 8 2 4 - 0 . 8 6 1 map u n i t s a n d t h e t w o t e r m i n a l p i e c e s o f t h e g e n o m e t h a t a r e d e t e c t e d f u s e d d u r i n g DNA r e p l i c a t i o n ( M a r k s a n d S p e c t o r , 1 9 8 4 ) . S e q u e n t i a l r e g u l a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n c a n b e o b s e r v e d i n t h a t R N A , t h a t o r i g i n a t e d f r o m t h e a r e a o f m o s t a b u n d a n t I E t r a n s c r i p t i o n ( 0 . 7 7 0 - 0 . 8 1 6 m a p u n i t s ) , h a s d e c r e a s e d 1 0 - f o l d a t e a r l y t i m e s . S i m i l a r l y , RNA f r o m t h e a b u n d a n t t r a n s c r i p t i o n s i t e a t e a r l y t i m e s w a s r e d u c e d 2 - 5 f o l d a t t h e l a t e t i m e p e r i o d . MCMV t r a n s c r i p t i o n w a s a l s o s t u d i e d b y N o r t h e r n b l o t a n a l y s i s ( K e i l e t a j . . , 1 9 8 4 ) . S i x p o l y A + I E t r a n s c r i p t s ( 5 . 1 , 2 . 7 5 , 2 . 0 , 1 . 7 5 , 1 . 6 5 a n d 1 . 0 5 k b ) w e r e d e t e c t e d . S i m i l a r t o HCMV ( S t i n s k i e t a l _ . , 1 9 8 3 ) , o n e MCMV I E t r a n s c r i p t ( 2 . 7 5 k b ) w a s p r e s e n t i n g r e a t e r a b u n d a n c e t h a n t h e o t h e r s . L o w a m o u n t s o f I E t r a n s c r i p t i o n w e r e a l s o d e t e c t a b l e f r o m t h e e n d f r a g m e n t s o f t h e g e n o m e , s i m i l a r t o t h a t s e e n f o r HCMV ( W a t h e n a n d S t i n s k i , 1 9 8 2 ) . C h a n g e s i n t r a n s c r i p t i o n p a t t e r n s w e r e s t u d i e d b y a n a l y s i s o f t r a n s c r i p t s a t v a r i o u s t i m e s a f t e r i n f e c t i o n a n d w e r e r e l a t e d t o c h a n g e s i n p r o t e i n s s y n t h e s i z e d ( K e i l e t a l _ . , 1 9 8 4 ) . I n . v i t r o t r a n s l a t i o n o f R N A , i s o l a t e d a t I E t i m e s , g a v e t h r e e p r o t e i n s . New s p e c i e s o f RNA w e r e d e t e c t e d a t 2 h o u r s a f t e r i n f e c t i o n a n d t h e s e c o r r e l a t e d w i t h t h e a p p e a r a n c e o f t h r e e n e w v i r u s s p e c i f i c p r o t e i n s . No f u r t h e r n e w t r a n s c r i p t s w e r e d e t e c t e d u n t i l 22 1 6 h o u r s a f t e r i n f e c t i o n . T h i s c o r r e s p o n d e d t o t h e o n s e t o f v i r a l DNA r e p l i c a t i o n i n t h i s s y s t e m . T h e a p p e a r a n c e o f n e w t r a n s c r i p t s c o r r e l a t e d w i t h t h e s y n t h e s i s o f n e w s p e c i e s o f p r o t e i n s . c ) V i r u s p r o t e i n s y n t h e s i s i n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s . M o s t u n d e r s t a n d i n g o f h e r p e s v i r u s p r o t e i n s y n t h e s i s r e g u l a t i o n h a s c o m e f r o m e x p e r i m e n t s w i t h h e r p e s s i m p l e x v i r u s . T h e r o l e s o f v i r a l p r o t e i n s s y n t h e s i z e d e a r l y i n t h e i n f e c t i o u s c y c l e h a v e b e e n e l u c i d a t e d t h r o u g h t h e u s e o f a n u m b e r o f HSV m u t a n t s w i t h t e m p e r a t u r e s e n s i t i v e ( t s ) l e s i o n s i n v a r i o u s g e n e s . S i m i l a r e x p e r i m e n t s h a v e n o t b e e n p e r f o r m e d w i t h HCMV o r MCMV d u e t o t h e u n a v a i l a b i l i t y o f s u c h m u t a n t s . S o m e o f t h e f i n d i n g s w i t h HSV c a n b e a p p l i e d t o t h e C M V s , b u t a n y c o m p a r i s o n s h a v e t o b e i n t e r p r e t e d w i t h c a u t i o n . i ) H e r p e s s i m p l e x v i r u s : H o n e s s a n d R o i z m a n ( 1 9 7 4 ) i d e n t i f i e d t h r e e c l a s s e s o f H S V - 1 p r o t e i n s p r o d u c e d a t v a r i o u s t i m e s i n H S V - 1 i n f e c t e d c e l l s . T h e n o m e n c l a t u r e o f i m m e d i a t e - e a r l y , e a r l y a n d l a t e w i l l b e u s e d h e r e t o r e f e r t o t h e c l a s s e s o f HSV p r o t e i n s ( i n s t e a d o f a, G a n d y) t o c o n f o r m t o t h e n o m e n c l a t u r e m o s t c o m m o n l y u s e d t o d e s c r i b e CMV p r o t e i n s . A h i g h l e v e l o f I E p r o t e i n s y n t h e s i s w a s s e e n a f t e r t h e r e m o v a l o f a p r o t e i n s y n t h e s i s i n h i b i t o r , b u t t h e s y n t h e s i s o f a f u r t h e r c l a s s o f p r o t e i n s ( e a r l y ) w a s i n h i b i t e d i f t h e t r a n s c r i p t i o n i n h i b i t o r a c t i n o m y c i n D w a s a d d e d t o t h e c u l t u r e s a t t h i s s t a g e . I f e a r l y p r o t e i n s y n t h e s i s w a s a l l o w e d t o o c c u r , t h e l e v e l s o f I E p r o t e i n s y n t h e s i s d e c l i n e d . T h i s i n d i c a t e d a n e g a t i v e r e g u l a t o r y r o l e o f t h e e a r l y p r o t e i n ( s ) o n I E mRNA t r a n s l a t i o n o r RNA s t a b i l i t y ( H o n e s s a n d R o i z m a n , 1 9 7 4 ) . T h e r e g u l a t o r y r o l e o f t h e e a r l y p r o t e i n s w a s a l s o a p p a r e n t a s p r o l o n g e d s y n t h e s i s o f I E p r o t e i n s o c c u r r e d i f e a r l y p r o t e i n s y n t h e s i s w a s i n h i b i t e d . T h e p r e s e n c e o f e a r l y p r o t e i n s w a s 2 3 n e c e s s a r y f o r l a t e p r o t e i n s y n t h e s i s t o o c c u r . H o n e s s a n d R o i z m a n ( 1 9 7 4 ) f o u n d t h a t l a t e p r o t e i n s y n t h e s i s c o u l d s t i l l o c c u r i n t h e p r e s e n c e o f v i r a l DNA s y n t h e s i s i n h i b i t o r s , e v e n t h o u g h a t r e d u c e d a m o u n t s . T h e t r a n s i t i o n f r o m I E t o e a r l y g e n e e x p r e s s i o n r e q u i r e d f u n c t i o n i n g I E p r o t e i n s . A d d i t i o n o f t h e a m i n o a c i d a n a l o g u e s c a n a v a n i n e o r a z e t a d i n e t o m e d i u m o f H S V - 1 i n f e c t e d c e l l s r e s u l t e d i n p r o l o n g e d s y n t h e s i s o f I E p r o t e i n s , w i t h o n l y a l i m i t e d a m o u n t o f e a r l y p r o t e i n s y n t h e s i s ( H o n e s s a n d R o i z m a n , 1 9 7 5 ) . A l s o , a f u n c t i o n a l e a r l y g e n e p r o d u c t w a s r e q u i r e d t o s h u t o f f t h e s y n t h e s i s o f I E p r o t e i n s . S i m i l a r l y , t h e c e s s a t i o n o f e a r l y p r o t e i n s y n t h e s i s r e q u i r e d t h e p r e s e n c e o f f u n c t i o n a l l a t e p r o t e i n s ( H o n e s s a n d R o i z m a n , 1 9 7 5 ) . T h e I E p r o t e i n s p r o d u c e d i n t h e p r e s e n c e o f t h e a n a l o g u e s s t i l l u n d e r w e n t n o r m a l p a t t e r n s o f p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s a n d w e r e a l s o a b l e t o c a u s e i n h i b i t i o n o f h o s t c e l l p r o t e i n s y n t h e s i s . T h e r o l e o f t h e I E p r o t e i n o f m o l e c u l a r w e i g h t o f 1 7 5 , 0 0 0 ( d e s i g n a t e d I C P 4 o r V P 1 7 5 , H o n e s s a n d R o i z m a n , 1 9 7 4 ; C o u r t n e y a n d B e n y e s h - M e l n i c k , 1 9 7 4 ) i n t h e r e g u l a t i o n o f e a r l y t r a n s c r i p t i o n w a s i d e n t i f i e d b y t h e u s e o f a c l a s s o f t s m u t a n t s . P r e s t o n ( 1 9 7 9 a ) s h o w e d t h a t , a t t h e n o n - p e r m i s s i v e t e m p e r a t u r e ( 3 8 . 5 ° C ) , t h e t s m u t a n t t s K f a i l e d t o p r o d u c e t h e e a r l y c l a s s mRNA t h a t c o d e s f o r t h e t h y m i d i n e k i n a s e e n z y m e . A f u r t h e r s t u d y i d e n t i f i e d I C P 4 a s t h e p r o t e i n t h a t w a s a f f e c t e d b y t h i s t e m p e r a t u r e s e n s i t i v e l e s i o n ( P r e s t o n , 1 9 7 9 b ) . Two p r o p e r t i e s o f I C P 4 s y n t h e s i z e d a t 3 8 . 5 ° C w e r e a b n o r m a l . A n a l y s i s o f t h e i n t r a c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f t h e m u t a n t I C P 4 s h o w e d t h a t m o s t w a s f o u n d i n t h e c y t o p l a s m o f t h e c e l l c o m p a r e d t o a n o r m a l n u c l e a r l o c a t i o n . I n a d d i t i o n , t h e m u t a n t p r o t e i n w a s n o t p r o c e s s e d n o r m a l l y i n t o t h e h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t f o r m s f o u n d i n t h e n u c l e i o f w i l d t y p e H S V - i n f e c t e d c e l l s . S h i f t f r o m 3 8 . 5 t o 3 1 ° C r e s u l t e d i n t h i s p r o t e i n b e i n g p r o c e s s e d a n d t r a n s p o r t e d n o r m a l l y . A n a l y s i s o f t w o o t h e r I E p r o t e i n s 2 4 o f t h e t s K m u t a n t s h o w e d t h a t t h e y b e h a v e d i n t h e s a m e m a n n e r a t 31 ° C a s a t 3 8 . 5 ° C . V a r i o u s s t u d i e s h a v e b e e n m a d e o n p r o p e r t i e s o f I C P 4 a s w e l l a s t h e f o u r o t h e r HSV I E p r o t e i n s . I C P 4 h a s b e e n s h o w n t o e x i s t i n 3 o r 4 f o r m s . T h e m o l e c u l a r w e i g h t i n c r e a s e s a f t e r s y n t h e s i s f r o m 1 6 9 , 0 0 0 t o 1 7 7 , 0 0 0 ( B o o k o u t a n d L e v y , 1 9 8 0 ) . P u l s e - c h a s e a n a l y s i s o f t h i s p r o t e i n s h o w e d t h a t t h e l o w e r m o l e c u l a r w e i g h t f o r m w a s m o r e a b u n d a n t i n t h e c y t o p l a s m o f i n f e c t e d c e l l s a n d t h e h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t f o r m s a p p e a r e d i n t h e n u c l e i 3 2 a f t e r a c h a s e p e r i o d . A l l f o r m s o f t h i s p r o t e i n l a b e l e d w i t h P b u t l a b e l i n g w a s m o r e i n t e n s e i n p r o t e i n s l o c a l i z e d i n t h e n u c l e i ( P e r e i r a e t a j _ . , 1 9 7 7 ) . Two s t u d i e s a n a l y z e d D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s o f HSV I E p r o t e i n s . I C P 4 , 6 , 0 a n d 27 h a d a f f i n i t y f o r d o u b l e - s t r a n d e d DNA i n v i t r o ( H a y a n d H a y , 1 9 8 0 ) . T h e s a m e r e s u l t w a s o b t a i n e d w i t h c o l u m n s o f s i n g l e - s t r a n d e d D N A - c e l l u l o s e ( B o o k o u t a n d L e v y , 1 9 8 0 ) . I C P 0 , 2 2 a n d 27 w e r e f o u n d t o p a r t i t i o n m o r e s t r o n g l y w i t h n u c l e i , w h i l e I C P 6 p a r t i t i o n e d m o r e s t r o n g l y w i t h t h e c y t o p l a s m ( H a y a n d H a y , 1 9 8 0 ) . H o w e v e r , s o m e w o r k e r s c o n s i d e r I C P 6 t o b e a n e a r l y p r o t e i n ( W i l c o x e t a j . . , 1 9 8 0 ) . A d e t a i l e d s t u d y w a s m a d e o f t h e e f f e c t s o f p h o s p h o r y l a t i o n o f H S V - 1 a n d H S V - 2 p r o t e i n s o n t h e i r c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n a n d a f f i n i t y f o r d o u b l e - s t r a n d e d DNA ( W i l c o x e t a l _ . , 1 9 8 0 ) . I t w a s f o u n d t h a t t h e b o u n d p h o s p h a t e o f m a n y p r o t e i n s c y c l e d o n a n d o f f a t s u b s e q u e n t p e r i o d s a f t e r s y n t h e s i s . T h e p h o s p h a t e c y c l e d o n a n d o f f t h e l o w e r a n d h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t f o r m s o f I C P 4 ( t e r m e d I C P 4 a a n d 4 c ) , w h i l e i t r e m a i n e d s t a b l y a t t a c h e d t o I C P 4 b , t h e i n t e r m e d i a t e m o l e c u l a r w e i g h t f o r m . I t w a s n o t i c e d t h a t I C P 4 a a n d 4 c c o u l d b e p h o s p h o r y l a t e d a s l a t e a s 2 4 h o u r s a f t e r i n f e c t i o n , w h i c h i n d i c a t e d t h a t t h i s p r o t e i n h a s a f u n c t i o n t h r o u g h o u t t h e i n f e c t i o u s c y c l e . T h e s i t e o f l o c a l i z a t i o n o f p r o t e i n s w a s n o t a f f e c t e d b y 2 5 t h e i r p h o s p h o r y l a t i o n , w h i l e i t h a d a v a r y i n g e f f e c t o n t h e i r a f f i n i t y f o r d o u b l e - s t r a n d e d D N A . O f t h e s e v e n v i r u s - s p e c i f i c p r o t e i n s s t u d i e d ( I C P 5 , 6 , 1 1 , 1 9 , 2 0 a n d 2 9 ) ( I C P 4 w a s n o t s o l u b i l i z e d b y t h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r e u s e d ) , D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s w e r e o b s e r v e d f o r t h e m w h e t h e r t h e y w e r e i s o l a t e d f r o m n u c l e a r o r c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f i n f e c t e d c e l l s . P h o s p h o r y l a t e d f o r m s o f I C P 6 , 11 a n d 2 0 w e r e p r e f e r e n t i a l l y f o u n d i n n o n - b o u n d f r a c t i o n s o f m a t e r i a l a p p l i e d t o a D N A - c e l l u l o s e c o l u m n , w h i l e p h o s p h o r y l a t e d f o r m s o f I C P 1 9 a n d 2 9 w e r e p r e f e r e n t i a l l y b o u n d ( W i l c o x e t a l . , 1 9 8 0 ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o f I C P 4 , 0 a n d 27 b y m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a n d t w o - d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s s h o w e d t h a t m u l t i p l e f o r m s o f e a c h o f t h e s e p r o t e i n s e x i s t ( A c k e r m a n n e t a j _ . , 1 9 8 4 ) . I C P 4 , I C P 0 a n d 27 f o r m e d a s e r i e s o f f i v e s p o t s t h a t d i f f e r e d i n c h a r g e r a t h e r t h a n m o l e c u l a r w e i g h t . A l l t h r e e p r o t e i n s w e r e p o o r l y s o l u b l e i n t w o - d i m e n s i o n a l l y s i s b u f f e r a n d I C P 4 p r e c i p i t a t e d c o m p l e t e l y w h e n r u n f r o m a c i d t o b a s e o n a n e l e c t r o f o c u s i n g g e l . A n o t h e r w e l l c h a r a c t e r i z e d HSV r e g u l a t o r y p r o t e i n i s t h e m a j o r D N A - b i n d i n g p r o t e i n , d e s i g n a t e d I C P 8 f o r H S V - 1 ( K n i p e e t a j _ . , 1 9 8 2 ) . T h i s p r o t e i n i s a m e m b e r o f t h e e a r l y c l a s s o f v i r u s - s p e c i f i c p r o t e i n s a n d h a s a m u l t i f u n c t i o n a l r o l e i n r e g u l a t i n g v i r u s DNA s y n t h e s i s a n d g e n e e x p r e s s i o n . T h i s p r o t e i n b i n d s t o s i n g l e - s t r a n d e d DNA m o r e t i g h t l y t h a n d o u b l e - s t r a n d e d DNA ( P u r i f o y a n d P o w e l l , 1 9 7 6 ) a n d m u t a n t s d e f e c t i v e f o r I C P 8 c a n n o t r e p l i c a t e v i r a l DNA ( P o w e l l e t a ] _ . , 1 9 8 1 ) . P r e c i p i t a t i o n o f I C P 8 f r o m s o n i c a t e d n u c l e a r p r e p a r a t i o n s ( L e e a n d K n i p e , 1 9 8 3 ) o r f r o m i s o l a t e d d e o x y r i b o n u c l e o p r o t e i n c o m p l e x e s ( L e i n b a c h a n d C a s t o , 1 9 8 3 ) , s h o w e d t h a t t h e p r o t e i n w a s a s s o c i a t e d w i t h v i r u s DNA d u r i n g p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s . E v i d e n c e i n d i c a t e d t h a t I C P 8 b o u n d t o t h e c o m p l e t e v i r a l g e n o m e a n d n o t t o 2 6 s p e c i f i c s e q u e n c e s . I C P 8 a l s o h a s a r o l e i n r e g u l a t i n g v i r a l g e n e e x p r e s s i o n t h a t a p p e a r s t o b e i n d e p e n d e n t o f i t s v i r a l DNA r e p l i c a t i o n f u n c t i o n ( G o d o w s k i a n d K n i p e , 1 9 8 3 ) . H i g h e r l e v e l s o f I C P 4 ( I E ) , I C P 8 ( e a r l y ) a n d I C P 5 ( l a t e ) w e r e p r e s e n t i n c e l l s i n f e c t e d w i t h a n I C P 8 t s m u t a n t , a t t h e n o n - p e r m i s s i v e t e m p e r a t u r e , t h a n i n c e l l s i n f e c t e d w i t h w i l d t y p e H S V - 1 a n d t r e a t e d w i t h P A A . T h e d e f e c t i v e I C P 8 p r o t e i n w a s n o t a b l e t o r e g u l a t e g e n e e x p r e s s i o n . I n p a r t i c u l a r , t h e I C P 8 m u t a n t s d i d n o t c o n t r o l l a t e g e n e e x p r e s s i o n e v e n t h o u g h v i r a l DNA r e p l i c a t i o n w a s b l o c k e d . T h i s w o u l d s e e m t o i n d i c a t e t h a t t h e s e t w o e v e n t s w e r e u n d e r i n d e p e n d e n t l e v e l s o f c o n t r o l . T h e p r o p o s e d m e c h a n i s m o f a c t i o n o f t h i s p r o t e i n w a s t h r o u g h b i n d i n g t o v i r a l D N A . I n c e l l s i n f e c t e d w i t h I C P 8 t s m u t a n t s , r e l e a s e o f t h i s b i n d i n g c o u l d l e a d t o s i m u l t a n e o u s e x p r e s s i o n o f s e v e r a l c l a s s e s o f g e n e s ( G o d o w s k i a n d K n i p e , 1 9 8 3 ) . i i ) Human c y t o m e g a l o v i r u s : A n a l y s i s o f t h e s e q u e n c e o f p r o t e i n s y n t h e s i s o f HCMV ( T o w n e ) s h o w e d t h a t t h e s a m e c l a s s e s c o u l d b e i d e n t i f i e d a s w e r e f o u n d f o r H S V - 1 ( S t i n s k i , 1 9 7 8 ) . W i t h i n s i x h o u r s o f i n f e c t i o n , 3 I E a n d 7 e a r l y p r o t e i n s w e r e i d e n t i f i e d . S u b s e q u e n t w o r k , t h a t u t i l i z e d i n v i t r o t r a n s l a t i o n a n d i m m u n o p r e c i p i t a t i o n t e c h n i q u e s , a d d e d s o m e o t h e r p r o t e i n s t o t h e t w o g r o u p s ( W a t h e n e t a l _ . , 1 9 8 1 ; S t i n s k i e t a J L , 1 9 8 3 ) . T h e m a j o r I E p r o t e i n o f HCMV ( T o w n e ) i n i n f e c t e d c e l l s i s a p r o t e i n o f 7 2 K , w h i c h i s s y n t h e s i z e d i n . v i t r o f r o m h y b r i d - s e l e c t e d RNA a s a 7 5 K p r o t e i n . I t c a n b e d e t e c t e d i n . v i v o a s a b r o a d b a n d o f 7 5 K t o 6 8 K b u t m a i n l y o f 7 2 K . T h i s i n d i c a t e d t h a t s o m e p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n o c c u r r e d ( S t i n s k i e t a l . . 1 9 8 3 ) . I t a p p e a r e d t h a t m o s t o f t h e e a r l y p r o t e i n s o b s e r v e d i n t h e e a r l i e r p a p e r ( S t i n s k i , 1 9 7 8 ) m a y b e o f t h e I E c l a s s a s t h e y w e r e s y n t h e s i z e d b y i n v i t r o t r a n s l a t i o n o f h y b r i d - s e l e c t e d I E R N A . A l s o , w i t h 27 t h e e x c e p t i o n o f t h e e a r l y p r o t e i n o f 2 7 K , a l l p r o t e i n s s y n t h e s i z e d i n v i t r o f r o m e a r l y RNA ( W a t h e n e t a j _ . , 1 9 8 1 ) w e r e n o t i c e a b l y d i f f e r e n t i n m o b i l i t y f r o m t h o s e p r e v i o u s l y c l a s s i f i e d a s b e i n g e a r l y c l a s s . I n c o n f i r m a t i o n o f t h e r e s u l t s o f H o n e s s a n d R o i z m a n ( 1 9 7 5 ) w i t h H S V , i t w a s s h o w n t h a t f u n c t i o n a l e a r l y p r o t e i n s w e r e r e q u i r e d f o r v i r a l DNA s y n t h e s i s . T h e a d d i t i o n o f c a n a v a n i n e a n d a z e t a d i n e t o t h e m e d i u m e a r l y i n t h e i n f e c t i o u s c y c l e s u p p r e s s e d t h e l e v e l s o f v i r a l DNA s y n t h e s i s ( S t i n s k i , 1 9 7 8 ) . M i c h e l s o n e t a J L ( 1 9 7 9 ) i d e n t i f i e d t w o m a j o r I E p r o t e i n s ( o f 7 6 K a n d 8 2 K ) i n H C M V - i n f e c t e d c e l l s b y i m m u n o p r e c i p i t a t i o n . T h e a p p e a r a n c e o f t h e s e p r o t e i n s c o r r e l a t e d w i t h a p p e a r a n c e o f n u c l e a r a n t i g e n s i n i n f e c t e d c e l l s . T h e 7 6 K p r o t e i n w a s f o u n d i n n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f p a r t i t i o n e d c e l l s , w h i l e t h e 8 2 K p r o t e i n w a s o n l y f o u n d i n n u c l e a r f r a c t i o n s . T w e n t y HCMV ( A D I 6 9 ) - i n d u c e d I E a n d e a r l y p r o t e i n s w e r e i d e n t i f i e d d u r i n g t h e f i r s t 6 h o u r s o f i n f e c t i o n b y i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( B l a n t o n a n d T e v e t h i a , 1 9 8 1 ) . F o u r o f t h e s e b a n d s w e r e i d e n t i f i e d a s I E p r o t e i n s b y t h e i r s y n t h e s i s i n t h e p r e s e n c e o f a c t i n o m y c i n D , f o l l o w i n g t h e r e v e r s a l o f a c y c l o h e x i m i d e b l o c k . D e t a i l e d a n a l y s e s o f t h e m a j o r I E p r o t e i n s o f s e v e r a l s t r a i n s o f CMVs h a v e b e e n m a d e ( J e a n g a n d G i b s o n , 1 9 8 0 ; G i b s o n , 1 9 8 1 ) . T h e m a j o r p r o t e i n s y n t h e s i z e d f o l l o w i n g c y c l o h e x i m i d e t r e a t m e n t o f CMV ( C o l b u r n ) - i n f e c t e d c e l l s w a s o n e o f 9 4 K . T w o - d i m e n s i o n a l a n a l y s i s s h o w e d i t t o h a v e a d i s t i n c t l y a c i d i c n e t c h a r g e . T h e l e v e l o f t h i s p r o t e i n w a s c o n s i d e r a b l y e l e v a t e d b y t h e c y c l o h e x i m i d e p r e t r e a t m e n t , b u t t h e s a m e p r o t e i n w a s d e t e c t e d i n ' u n e n h a n c e d ' i n f e c t e d c e l l s . U n d e r e n h a n c e d c o n d i t i o n s o f s y n t h e s i s , t h i s p r o t e i n w a s f o u n d t o p a r t i t i o n a b o u t e q u a l l y b e t w e e n n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f N P 4 0 s o l u b i l i z e d c e l l s . U n d e r d i f f e r e n t 2 8 e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s , T w e e n 4 0 / d e o x y c h o l a t e t r e a t m e n t o f N P 4 0 r e l e a s e d n u c l e i r e m o v e d a l l t h e I E 9 4 K p r o t e i n f r o m t h e n u c l e i . T h i s w a s t a k e n t o i n d i c a t e t h a t n u c l e u s - a s s o c i a t e d p r o t e i n w a s i n f a c t a s s o c i a t e d w i t h t h e c y t o s k e l e t a l f r a m e w o r k . P u l s e / c h a s e s t u d i e s i n d i c a t e d t h i s p r o t e i n t o b e r e l a t i v e l y s t a b l e i n i n f e c t e d c e l l s . T h e d o m i n a n t I E p r o t e i n s o f HCMV s t r a i n s A D I 6 9 , D a v i s a n d T o w n e h a d m o l e c u l a r w e i g h t s o f 7 9 K , 7 8 K a n d 7 6 K r e s p e c t i v e l y a n d w e r e d i s t i n c t l y d i f f e r e n t f r o m t h e I E 9 4 K o f CMV ( C o l b u r n ) . T h e m a i n I E p r o t e i n s o f A D I 6 9 a n d T o w n e m i g r a t e d a s b r o a d h e t e r o g e n e o u s b a n d s o n t h e g e l w h i l e t h o s e o f s t r a i n s D a v i s a n d C o l b u r n a p p e a r e d a s n a r r o w b a n d s . T r a n s l a t i o n o f mRNA i n . v i t r o i n d i c a t e d t h a t d i f f e r e n c e s i n s i z e o f t h e p r o t e i n s w e r e d u e t o i n h e r e n t g e n e t i c d i f f e r e n c e s r a t h e r t h a n d i f f e r e n c e s i n p o s t - t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n . P h o s p h o r y l a t i o n w a s o b s e r v e d i n t h e 7 6 K I E p r o t e i n o f HCMV ( T o w n e ) a n d 9 4 K I E p r o t e i n o f CMV ( C o l b u r n ) . O t h e r I E p r o t e i n s w e r e o b s e r v e d b y G i b s o n ( 1 9 8 1 ) i n H C M V - i n f e c t e d c e l l s . M i n o r b a n d s o f 5 7 K , 5 3 K a n d 3 8 K w e r e o b s e r v e d i n HCMV ( T o w n e ) - i n f e c t e d c e l l s . W h i l e s t u d y i n g a l a t e CMV ( C o l b u r n ) p r o t e i n w i t h D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s , G i b s o n e t a l _ . ( 1 9 8 1 ) o b s e r v e d t h a t t h e I E 9 4 K p r o t e i n d i d n o t h a v e t h i s p r o p e r t y . T h i s i s i n c o m p a r i s o n t o i n i t i a l r e p o r t s t h a t HCMV s t r a i n s T o w n e a n d A D 1 6 9 I E p r o t e i n s h a d D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s ( S t i n s k i e t a l _ . , 1 9 8 1 ; G e r g e l y e t a l _ . , 1 9 8 0 ; M u s i a n i e t a l _ . , 1 9 7 9 ) . i i i ) M u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s : S t u d i e s o f p r o t e i n s y n t h e s i s o f MCMV i n d i c a t e d a c l e a r d e l i n e a t i o n e x i s t e d b e t w e e n e a r l y a n d l a t e p r o t e i n s y n t h e s i s ( C h a n t i e r a n d H u d s o n , 1 9 7 8 ) . T h r e e e a r l y p r o t e i n s w e r e d e t e c t e d b y 4 h o u r s a f t e r i n f e c t i o n . T h i s w a s f o l l o w e d b y a l a g p e r i o d u n t i l a f t e r i n i t i a t i o n o f v i r a l DNA s y n t h e s i s , w h e n s t r u c t u r a l p r o t e i n s w e r e s y n t h e s i z e d . T h e i d e n t i f i c a t i o n o f o n l y t h r e e e a r l y p r o t e i n s w a s c o n f i r m e d a s a n 2 9 u n d e r e s t i m a t i o n . I n a f u r t h e r s t u d y , a t o t a l o f 8 v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w e r e d e t e c t e d d u r i n g t h e f i r s t t h r e e h o u r s o f i n f e c t i o n w i t h t h e u s e o f h y p e r t o n i c l a b e l i n g c o n d i t i o n s ( C h a n t l e r , 1 9 7 8 ) . H o w e v e r , d u e t o t h e d e s i g n o f t h e e x p e r i m e n t s , i t w a s n o t p o s s i b l e t o d e l i n e a t e t h e s e p r o t e i n s i n t o I E a n d e a r l y c l a s s e s . A s i m i l a r s t u d y i d e n t i f i e d 11 M C M V - i n d u c e d p r o t e i n s d u r i n g t h e f i r s t 4 h o u r s o f i n f e c t i o n , o f w h i c h s i x w e r e p r e s e n t i n r e l a t i v e a b u n d a n c e ( M o o n e t a l _ . , 1 9 7 9 ) . T h e t h r e e m a j o r MCMV I E p r o t e i n s w e r e r e c e n t l y c h a r a c t e r i z e d ( K e i l e t a l _ . , 1 9 8 5 ) . T h e t h r e e p r o t e i n s ( 8 9 K , 8 4 K a n d 7 6 K ) w e r e p r e c i p i t a t e d b y t h e s a m e m o n o c l o n a l a n t i b o d y . T h e 8 4 K a n d 7 6 K p r o t e i n s r e p r e s e n t e d p o s t - t r a n s l a t i o n a l p r o c e s s e d f o r m s o f t h e 8 9 K p r o t e i n . H y b r i d s e l e c t i o n o f I E RNA f o l l o w e d b y i n . v i t r o t r a n s l a t i o n p r o d u c e d o n l y t h e 8 9 K p r o t e i n . 5 . H e r p e s v i r u s g e n e e x p r e s s i o n i n n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s . S e v e r a l n o n p e r m i s s i v e c u l t u r e s y s t e m s f o r HSV h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d b u t t h e c o n t r o l l i n g f a c t o r s s e e m t o b e s p e c i f i c f o r e a c h c a s e . F o r e x a m p l e , H S V - 1 i n f e c t i o n o f XC c e l l s r e s u l t e d i n a n a b o r t i v e i n f e c t i o n ( J a c q u e m o n t e t a l . , 1 9 8 4 ) . A s m a l l a m o u n t o f HSV g e n e e x p r e s s i o n o c c u r r e d w i t h t h e p r o d u c t i o n o f s o m e p r o t e i n s o f a l l t h r e e c l a s s e s , b u t v i r a l DNA s y n t h e s i s w a s n o t d e t e c t e d ( E p s t e i n a n d J a c q u e m o n t , 1 9 8 3 ) . T h e t r a n s l a t i o n o f t h e RNA f o r t h e I E p r o t e i n I C P 2 2 d i d n o t h a p p e n e v e n t h o u g h t h e RNA f o r I C P 2 2 w a s d e t e c t e d i n t h e n u c l e i a n d c y t o p l a s m o f i n f e c t e d c e l l s . T h e o t h e r I E p r o t e i n s w e r e d e t e c t e d i n i n f e c t e d XC c e l l s . N o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s b y HCMV o f c u l t u r e d c e l l s o f n o n h u m a n o r i g i n h a v e a l l b e e n c h a r a c t e r i z e d b y a r e s t r i c t i o n o f e a r l y v i r a l g e n e e x p r e s s i o n , a b s e n c e o f v i r a l DNA s y n t h e s i s a n d a b s e n c e o f l a t e p r o t e i n s y n t h e s i s . I n f e c t i o n o f g u i n e a p i g f i b r o b l a s t s w i t h HCMV ( T o w n e ) r e s u l t e d i n t h e 3 0 s y n t h e s i s o f t h e s a m e I E p r o t e i n s a s p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d c e l l s e x c e p t t h a t t w o o f t h e e a r l y d e s i g n a t e d p r o t e i n s w e r e a b s e n t ( 5 9 K a n d 2 1 K ) ( S t i n s k i , 1 9 7 8 ) . HCMV s t r u c t u r a l p r o t e i n s w e r e n o t d e t e c t e d . A h i g h e r d e g r e e o f r e s t r i c t i o n o f e a r l y g e n e e x p r e s s i o n o c c u r r e d f o l l o w i n g CMV i n f e c t i o n o f B a l b / c - 3 T 3 c e l l s o r R a t - 1 c e l l s ( J e a n g e t a l _ . , 1 9 8 2 ) . CMV i n f e c t i o n o f t h e s e c e l l s d i d n o t p r o d u c e a c y t o p a t h i c e f f e c t , i n c o n t r a s t t o HCMV i n f e c t i o n o f g u i n e a p i g c e l l s ( F i o r e t t i e t a l _ . , 1 9 7 3 ) . CMV ( C o l b u r n ) i n f e c t i o n o f R a t - 1 c e l l s d i d n o t r e s u l t i n v i r a l DNA r e p l i c a t i o n a n d o n l y a 9 4 K I E p r o t e i n w a s s y n t h e s i z e d . T h i s p r o t e i n w a s p h o s p h o r y l a t e d , s i m i l a r t o t h a t p r o d u c e d i n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d c e l l s ( J e a n g a n d G i b s o n , 1 9 8 0 ) . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n o f t h i s s y s t e m (HCMV s t r a i n T o w n e i n f e c t i o n o f B a l b / c - 3 T 3 c e l l s ) c o n f i r m e d t h a t v i r u s g e n e e x p r e s s i o n w a s r e s t r i c t e d t o a m a j o r I E p r o t e i n ( i n t h i s c a s e I E 6 8 K ) a n d n o v i r a l DNA s y n t h e s i s o c c u r r e d ( L a F e m i n a a n d H a y w a r d , 1 9 8 3 ) . I n a d d i t i o n , t h e v i r a l DNA i n t h e i n f e c t e d B a l b / c - 3 T 3 c e l l s d i d n o t a p p e a r t o f o r m t h e c i r c u l a r o r c o n c a t o m e r i c r e p l i c a t i v e f o r m s t h a t a r e s e e n i n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d c e l l s . T h e e f f e c t o f n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n o f r a b b i t k i d n e y ( R K ) c e l l s , b y HCMV ( D a v i s ) , o n h o s t c e l l DNA s y n t h e s i s w a s c o m p a r e d t o i n f e c t i o n o f p e r m i s s i v e h u m a n ( H E L ) c e l l s ( D e M a r c h i , 1 9 8 3 b ) . I n f e c t i o n o f b o t h c e l l s b y HCMV r e s u l t e d i n a s t i m u l a t i o n o f h o s t c e l l DNA s y n t h e s i s , b u t t h i s h a d p r e v i o u s l y b e e n c a t e g o r i z e d a s t h e r e s u l t o f a n a b o r t i v e i n f e c t i o n ( D e M a r c h i a n d K a p l a n , 1 9 7 7 b ) . I n H E L c e l l s , t h i s e f f e c t w a s s e e n i n n o n - p r o d u c t i v e l y i n f e c t e d c e l l s w h e n v i r u s a n t i g e n e x p r e s s i o n d i d n o t o c c u r . I n RK c e l l s , w h i c h w e r e a l l n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d , h o s t c e l l DNA s t i m u l a t i o n a n d v i r u s a n t i g e n s w e r e d e t e c t e d i n t h e s a m e c e l l s . P e r m i s s i v e i n f e c t i o n o f HEL c e l l s , w i t h a n t i g e n e x p r e s s i o n , r e s u l t e d i n a n i n h i b i t i o n o f h o s t c e l l DNA s y n t h e s i s e v e n w h e n t h e i n f e c t e d c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h p h o s p h o n o a c e t i c a c i d 31 T h i s ' e a r l y ' f u n c t i o n w a s t h u s n o t e x p r e s s e d i n i n f e c t e d RK c e l l s . T h e v i r u s - i n d u c e d DNA p o l y m e r a s e w a s a l s o n o t e x p r e s s e d i n RK c e l l s . A n a l y s i s o f t h e t r a n s c r i p t i o n o f e a r l y HCMV g e n e s i n i n f e c t e d RK c e l l s s h o w e d t h a t s o m e h a d b e e n r e s t r i c t e d i n t h e i r e x p r e s s i o n ( D e M a r c h i , 1 9 8 3 c ) . T r a n s c r i p t s p r e s e n t i n i n f e c t e d HEL c e l l s t h a t h y b r i d i z e d t o t h r e e E c o R l a r e a s o f t h e g e n o m e w e r e n o t d e t e c t e d i n i n f e c t e d RK c e l l s . I n a d d i t i o n , t w o o t h e r t r a n s c r i p t s w e r e u n d e r r e p r e s e n t e d o n t h e p o l y s o m e s f r o m i n f e c t e d RK c e l l s c o m p a r e d t o t h o s e f r o m H E L c e l l s . R i c e e t a l . . ( 1 9 8 4 ) r e p o r t e d t h a t HCMV i n f e c t i o n s o f h u m a n p e r i p h e r a l b l o o d m o n o n u c l e a r c e l l s w e r e n o n p e r m i s s i v e . T h i s i s t h e o n l y r e p o r t e d i n v e s t i g a t i o n o f a n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n w h e r e t h e r e a c t i v i t y o f t h e a n t i b o d y u s e d w a s r e s t r i c t e d t o a s i n g l e c l a s s o f p r o t e i n s . T h e c e l l s s h o w e d p o s i t i v e f l u o r e s c e n c e w i t h a m o n o c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t t h e m a j o r HCMV I E p r o t e i n ( 7 2 K ) b u t n o r e a c t i v i t y w a s d e t e c t e d w i t h a m o n o c l o n a l a n t i b o d y a g a i n s t a l a t e p r o t e i n . T h e h i g h e s t p e r c e n t a g e o f c e l l s s h o w i n g e v i d e n c e o f i n f e c t i o n w e r e m o n o c y t e s ( 1 0 % ) , a l t h o u g h , B a n d T l y m p h o c y t e s a n d NK c e l l s w e r e a l s o i n f e c t e d . H o w e v e r , i t s t i l l c a n n o t b e d e t e r m i n e d f r o m t h e s e r e s u l t s a t w h i c h s t a g e a b l o c k t o g e n e e x p r e s s i o n h a p p e n e d , a s i t w a s n o t d e t e r m i n e d i f t h e r e w a s s y n t h e s i s o f a n y o f t h e e a r l y p r o t e i n s . T h i s w a s t h e f i r s t v n v i t r o s y s t e m t h a t m i g h t b e c l o s e l y m o d e l l i n g t h e e v e n t s t h a t o c c u r a f t e r n o n p e r m i s s i v e HCMV i n f e c t i o n s Vn v i v o . 6 . P e r s i s t e n t i n f e c t i o n s o f HCMV a n d M C M V : I n v i t r o m o d e l s . T h e m o l e c u l a r e v e n t s t h a t l e a d t o l a t e n c y o f CMVs i n c e l l s a r e p o o r l y u n d e r s t o o d b e c a u s e o f t h e l a c k o f c e l l c u l t u r e s y s t e m s t h a t c a n b e u s e d t o m i m i c t h e e v e n t s i n v i v o . S e v e r a l h a v e b e e n d e v e l o p e d t o i n v e s t i g a t e c e r t a i n a s p e c t s o f l a t e n t i n f e c t i o n s . 3 2 A c o n t i n u o u s c e l l l i n e o f h u m a n f i b r o b l a s t s , d e r i v e d b y M o c a r s k i a n d S t i n s k i ( 1 9 7 9 ) , t h a t w a s p e r s i s t e n t l y i n f e c t e d w i t h H C M V , c o n t a i n e d a m i x t u r e o f c e l l s t h a t w e r e p e r m i s s i v e l y a n d n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d w i t h H C M V . S e p a r a t i o n o f t h e t w o t y p e s r e v e a l e d t h a t n o n p e r m i s s i v e c e l l s h a r b o r e d HCMV g e n o m e s a n d e x p r e s s e d e a r l y a n t i g e n s o n l y . A n a l y s i s o f t h e p r o t e i n s s u g g e s t e d t h a t t h e r e w a s a r e s t r i c t i o n i n t h e n u m b e r o f e a r l y p r o t e i n s . P r o l o n g e d t r e a t m e n t o f t h e c e l l s w i t h HCMV a n t i s e r u m r e s u l t e d i n e l i m i n a t i o n o f i n f e c t i o u s v i r u s , r e p r e s s i o n o f e a r l y a n t i g e n s a n d a l s o , t h e c e l l s r e s u m e d a n o r m a l f i b r o b l a s t i c s h a p e . H o w e v e r , e v e n t h o u g h g e n e e x p r e s s i o n w a s c o m p l e t e l y i n h i b i t e d , t h e HCMV g e n o m e p e r s i s t e d a t t h e l e v e l o f 4 5 c o p i e s / c e l l . R e m o v a l o f a n t i s e r u m a f t e r a f u r t h e r 3 w e e k p e r i o d r e s u l t e d i n t h e i m m e d i a t e r e a p p e a r a n c e o f v i r u s . T h e r e p l i c a t i o n o f MCMV w a s i n h i b i t e d w h e n i n f e c t i o n w a s c a r r i e d o u t i n n o n - r e p l i c a t i n g , s e r u m s t a r v e d , G Q p h a s e 3 T 3 c e l l s ( M u l l e r e t a _ l . , 1 9 7 8 ) . I n c e l l s m a i n t a i n e d u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , n o v i r a l DNA r e p l i c a t i o n o c c u r r e d a n d t h e a m o u n t o f t r a n s c r i p t i o n a t e a r l y a n d l a t e t i m e s w a s r e d u c e d . A c o m p a r i s o n o f p r o t e i n s y n t h e s i s i n G Q c e l l s w i t h t h a t f o u n d i n p r o d u c t i v e l y i n f e c t e d c e l l s , s h o w e d t h a t 5 o f 6 e a r l y p r o t e i n s w e r e s y n t h e s i z e d i n G Q c e l l s b u t n o s t r u c t u r a l p r o t e i n s w e r e d e t e c t e d . T h e v i r u s r e m a i n e d i n a v i a b l e s t a t e w h i l e t h e c e l l s w e r e b e i n g h e l d i n t h e G Q p h a s e , s i n c e t h e n u m b e r s o f i n f e c t i o u s c e n t e r s r e m a i n e d c o n s t a n t . V i r a l DNA s y n t h e s i s o c c u r r e d a n d v i r u s c o u l d b e ' r e a c t i v a t e d ' i f t h e c e l l s w e r e e x p o s e d t o s e r u m a n d f r e s h m e d i u m . Two o t h e r s y s t e m s h a v e i n v o l v e d t h e e s t a b l i s h m e n t o f l a t e n c y o f MCMV a n d HCMV i n u n d i f f e r e n t i a t e d e m b r y o n a l c a r c i n o m a c e l l s ( D u t k o a n d O l d s t o n e , 1 9 8 1 : G o n c z o l e t a l . , 1 9 8 4 ) . MCMV c o u l d n o t r e p l i c a t e i n u n d i f f e r e n t i a t e d c e l l s . T h e r e w a s n o s i g n i f i c a n t a m o u n t o f i n f e c t i o u s v i r u s r e p l i c a t i o n a n d 3 3 n o M C M V - s p e c i f i c mRNA w a s p r o d u c e d . H o w e v e r , t h e v i r a l DNA c o n t e n t r e m a i n e d c o n s t a n t a n d t h e r e w a s r e s t r i c t e d a m o u n t s o f n u c l e a r RNA p r o d u c t i o n . U p o n d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e c e l l s , v i r a l DNA c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e d a n d i n f e c t i o u s v i r u s w a s p r o d u c e d . I n a s i m i l a r s y s t e m , MCMV t r a n s c r i p t s p r o d u c e d i n u n d i f f e r e n t i a t e d c e l l s w e r e s h o w n t o c o m e f r o m t h e I E r e g i o n o f t h e g e n o m e ( F i b i e t a l _ . , 1 9 8 4 ) . P r e l i m i n a r y s t u d i e s a l s o s h o w e d t h a t HCMV d i d n o t r e p l i c a t e i n u n d i f f e r e n t i a t e d h u m a n e m b r y o n a l c a r c i n o m a c e l l s , a n d n o v i r a l a n t i g e n s w e r e e x p r e s s e d . H o w e v e r , c e l l s t h a t w e r e t r e a t e d w i t h r e t i n o i c a c i d t o i n d u c e d i f f e r e n t i a t i o n b e c a m e p e r m i s s i v e f o r v i r u s p r o d u c t i o n ( G o n c z o l e t a l _ . , 1 9 8 4 ) . A n o t h e r p o t e n t i a l m e c h a n i s m o f t h e l a t e n c y o f HCMV w a s d e m o n s t r a t e d i n . v i t r o u s i n g i n t e r f e r o n t r e a t e d c e l l s ( R o d r i g u e z e t a j _ . , 1 9 8 3 ) . C e l l s p r e t r e a t e d w i t h i n t e r f e r o n , i n f e c t e d a t a l o w m u l t i p l i c i t y o f i n f e c t i o n w i t h HCMV a n d m a i n t a i n e d i n t h e p r e s e n c e o f i n t e r f e r o n o v e r 1 6 d a y s , d i d n o t p r o d u c e i n f e c t i o u s v i r u s . R e m o v a l o f i n t e r f e r o n r e s u l t e d i n g r o w t h o f HCMV i n t h e c u l t u r e s . T h u s i n t e r f e r o n t r e a t m e n t i n h i b i t e d t h e r e p l i c a t i o n o f H C M V , b u t t h e g e n o m e w a s a b l e t o r e m a i n i n a l a t e n t s t a t e w i t h r e a c t i v a t i o n o c c u r r i n g o n c e i n t e r f e r o n w a s r e m o v e d . 3 4 S E C T I O N 1 C H A R A C T E R I Z A T I O N OF I M M E D I A T E - E A R L Y AND E A R L Y P R O T E I N S OF M U R I N E  C Y T O M E G A L O V I R U S S Y N T H E S I Z E D I N P E R M I S S I V E AND N O N P E R M I S S I V E C E L L S . I N T R O D U C T I O N . G e n e r a l c o n s e n s u s h a s b e e n t h a t a n u n d e r s t a n d i n g o f h o w i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y g e n e p r o d u c t s r e g u l a t e s u b s e q u e n t v i r a l g e n e e x p r e s s i o n i s n e c e s s a r y i n o r d e r t o u n d e r s t a n d t h e u n d e r l y i n g m e c h a n i s m s o f v i r a l l a t e n c y ( S t e n b e r g e t a l . . , 1 9 8 4 ) . N o n p e r m i s s i v e i n t e r a c t i o n s o f CMVs w i t h c e l l s , m a i n l y o f a d i f f e r e n t s p e c i e s t o t h e v i r u s , h a v e a l l b e e n c h a r a c t e r i z e d b y s o m e r e s t r i c t i o n o f i m m e d i a t e - e a r l y o r e a r l y g e n e e x p r e s s i o n ( d i s c u s s e d i n l i t e r a t u r e r e v i e w ) . T h e d e g r e e o f r e s t r i c t i o n h a s v a r i e d b e t w e e n d i f f e r e n t c e l l t y p e s . T h i s i n d i c a t e d t h a t CMV r e p l i c a t i o n c a n b e c o n t r o l l e d a t a n u m b e r o f s t a g e s d u r i n g t h e e a r l y p h a s e o f t h e r e p l i c a t i o n c y c l e . T h e a i m o f t h e w o r k d e s c r i b e d i n t h i s s e c t i o n w a s t o a n a l y s e t h e r e p l i c a t i o n a n d ' e a r l y ' p r o t e i n s y n t h e s i s o f MCMV i n n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d c e l l s , i n o r d e r t o i d e n t i f y a n y r e s t r i c t i o n i n e a r l y g e n e e x p r e s s i o n , w i t h t h e a i m o f i d e n t i f y i n g a n d c h a r a c t e r i z i n g t h e i m p o r t a n t r e g u l a t o r y p r o t e i n ( s ) . T h i s a l s o n e c e s s i t a t e d t h e i d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o t e i n s i n d u c e d d u r i n g t h e i m m e d i a t e - e a r l y ( I E ) a n d e a r l y s t a g e s o f p e r m i s s i v e MCMV i n f e c t i o n s . P r e v i o u s p u b l i s h e d w o r k ( C h a n t l e r a n d H u d s o n , 1 9 7 8 ; C h a n t l e r , 1 9 7 8 ; M o o n e t a l _ . , 1 9 7 9 ) h a d n o t f u l l y d e f i n e d t h e ' e a r l y ' p r o t e i n s i d e n t i f i e d i n t o c l a s s e s a n d , a s 1 7 - 2 0 I E a n d e a r l y p r o t e i n s h a v e b e e n i d e n t i f i e d f o r t w o s t r a i n s o f HCMV ( W a t h e n e t 35 a l . , 1 9 8 1 ; B l a n t o n a n d T e v e t h i a , 1 9 8 1 ) , i t s e e m e d t h a t p r e v i o u s e s t i m a t i o n s m a y h a v e u n d e r r e p r e s e n t e d t h e t r u e n u m b e r s o f MCMV ' e a r l y ' p r o t e i n s . I n a d d i t i o n , i t w a s c o n s i d e r e d t h a t t h e r e s u l t s w o u l d b e o f g r e a t e r r e l e v a n c e t o i n . v i v o l a t e n c y i f n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s w e r e s t u d i e d i n m u r i n e c e l l s a n d i n a c e l l t y p e t h a t h a s b e e n i m p l i c a t e d a s a p o s s i b l e s i t e o f l a t e n c y i n t h e m o u s e . A m u r i n e m a c r o p h a g e c e l l l i n e ( J 7 7 4 A . 1 ) w a s u s e d i n m o s t e x p e r i m e n t s a n d t h e r e s u l t s w e r e a l s o c o m p a r e d w i t h t h o s e f r o m n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s . T h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d c a n b e c o n s i d e r e d i n t w o p a r t s . F i r s t l y , t h e p a r a m e t e r s d e s c r i b i n g n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s ( y i e l d s o f i n f e c t i o u s v i r u s , i n f e c t i o u s c e n t e r s , v i r a l UNA s y n t h e s i s a n d t h e p r e s e n c e o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s ) w e r e i n v e s t i g a t e d t o d e t e r m i n e t h e i r s i m i l a r i t i e s t o p r e v i o u s o b s e r v a t i o n s w i t h H C M V . S e c o n d l y , t h e M C M V - i n d u c e d p r o t e i n s s y n t h e s i z e d d u r i n g t h e f i r s t s i x h o u r s o f i n f e c t i o n , i n p e r m i s s i v e a n d n o n p e r m i s s i v e c e l l s w e r e i d e n t i f i e d , u s i n g d i f f e r e n t f o r m s o f g e l e l e c t r o p h o r e s i s . I n a d d i t i o n , p r o p e r t i e s o f t h e s e p r o t e i n s w e r e c h a r a c t e r i z e d i n t e r m s o f t h e i r l o c a t i o n s w i t h i n i n f e c t e d c e l l s , a f f i n i t y f o r d o u b l e a n d s i n g l e s t r a n d e d - D N A c e l l u l o s e a n d t h e i r p h o s p h o r y l a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s . 3 6 M A T E R I A L S AND M E T H O D S . V i r u s . T h e S m i t h s t r a i n o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s ( M C M V ) u s e d i n t h i s s t u d y w a s o r i g i n a l l y o b t a i n e d f r o m t h e A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n , R o c k v i l l e , M d . S t o c k s o f v i r u s w e r e p r e p a r e d b y l o w m u l t i p l i c i t y p a s s a g e ( 0 . 0 1 p l a q u e f o r m i n g u n i t ( P F U ) / c e l l ) i n r o l l e r b o t t l e c u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 c e l l s . H i g h t i t e r e d s t o c k s o f MCMV w e r e p r e p a r e d b y c o n c e n t r a t i n g v i r u s f r o m t h e t i s s u e c u l t u r e m e d i a b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 1 , 0 0 0 r . p . m f o r 3 . 5 h r ( G S A r o t o r , S o r v a l l c e n t r i f u g e ) . C e l l s . 3 T 3 - L 1 c e l l s ( A T C C C C L 9 2 . 1 ) , a c o n t i n u o u s l i n e o f 3 T 3 ( S w i s s a l b i n o ) m o u s e e m b r y o f i b r o b l a s t , J 7 7 4 A . 1 c e l l s ( A T C C T I B 6 7 ) , a t r a n s f o r m e d m a c r o p h a g e t y p e c e l l l i n e d e r i v e d f r o m B a l b / c m i c e a n d P 3 8 8 D . 1 c e l l s ( A T C C T I B 6 3 ) , a t r a n s f o r m e d m a c r o p h a g e t y p e c e l l l i n e d e r i v e d f r o m D B A / 2 m i c e , w e r e o b t a i n e d f r o m t h e A m e r i c a n T y p e C u l t u r e C o l l e c t i o n . Human f i b r o b l a s t s w e r e p r o p a g a t e d f r o m c o l l a g e n a s e d i s s o c i a t e d h u m a n f o r e s k i n s a n d u s e d b e t w e e n p a s s a g e s 5 a n d 1 5 . N S - 1 c e l l s , a B a l b / c d e r i v e d B c e l l m y e l o m a l i n e , w e r e o b t a i n e d f r o m D r . J . K . C h a n t i e r , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a . A l l c e l l s ( e x c e p t P 3 8 8 D . 1 ) w e r e g r o w n i n D u l b e c c o ' s m o d i f i e d E a g l e ' s m e d i u m ( D M E M , G I B C 0 L a b o r a t o r i e s , G r a n d I s l a n d , N . Y . ) s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % ( v o l / v o l ) f e t a l b o v i n e s e r u m ( F B S , G I B C O ) , 0 . 3 7 % s o d i u m b i c a r b o n a t e a n d g e n t a m i c i n s u l f a t e ( 5 0 y g / m l ) ( S i g m a C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , M o . ) . P 3 8 8 D . 1 c e l l s w e r e g r o w n i n R P M I 1 6 4 0 m e d i u m ( G I B C O ) w i t h 1 0 % ( v o l / v o l ) F B S . C e l l s w e r e g r o w n i n p l a s t i c p e t r i d i s h e s ( N u n c ) i n a h u m i d i f i e d 5% C 0 o a t m o s p h e r e a t 3 7 ° C . 3 7 A s s a y s o f i n f e c t i v i t v o f MCMV i n 3 T 3 - L 1 . J 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f i b r o b l a s t  c e l l s . C o n f l u e n t c u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 , J 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f o r e s k i n f i b r o b l a s t ( H F F ) c e l l s w e r e i n f e c t e d , i n s e t s o f 6 c u l t u r e s , w i t h MCMV a t a m u l t i p l i c i t y o f i n f e c t i o n ( m . o . i . ) o f 1 P F U / c e l l . V i r u s , i n 1 m l o f DMEM w i t h 5% F 8 S , w a s a d d e d t o t h e c e l l s f o r 1 h r a t 3 7 ° C . T h i s w a s r e m o v e d , c e l l s w e r e r i n s e d o n c e a n d r e f e d w i t h f r e s h m a i n t e n a n c e m e d i u m (DMEM w i t h 5% F B S ) . M a i n t e n a n c e m e d i u m w a s c h a n g e d a t 4 8 a n d 9 6 h r a f t e r i n f e c t i o n . C e l l s w e r e h a r v e s t e d , a t 4 , 2 4 , 4 8 , 7 2 , 9 6 a n d 1 2 0 h r a f t e r i n f e c t i o n , b y s c r a p i n g i n t o t h e m e d i u m a n d b o t h w e r e c o l l e c t e d a n d s t o r e d a t - 7 0 ° C u n t i l a s s a y e d . V i r u s w a s t i t r a t e d f o r P F U o n m o n o l a y e r s o f 3 T 3 - L 1 c e l l s i n 3 5 mm p e t r i d i s h e s . C e l l s a n d s u p e r n a t a n t m i x t u r e s w e r e f r o z e n a n d t h a w e d t w i c e a n d t h e n b r i e f l y s o n i c a t e d . E a c h s a m p l e w a s s e r i a l l y d i l u t e d i n m a i n t e n a n c e m e d i u m a n d 1 m l o f e a c h d i l u t i o n w a s a d d e d t o a p e t r i d i s h . A b s o r p t i o n w a s c a r r i e d o u t a t 3 7 ° C f o r 3 0 m i n . T h e i n o c u l u m w a s t h e n d e c a n t e d a n d 2 m l o f o v e r l a y m e d i u m (DMEM c o n t a i n i n g 5% F B S a n d 0 . 5 % a g a r o s e ( S e a k e m , M a r i n e C o l l o i d s , R o c k l a n d , M e . ) ) w a s a d d e d t o e a c h d i s h . P l a q u e s w e r e c o u n t e d , w i t h o u t s t a i n i n g , a f t e r 4 - 7 d a y s i n c u b a t i o n a t 3 7 ° C . R e s u l t s w e r e e x p r e s s e d a s t o t a l P F U / 1 0 6 c e l l s . I n f e c t i o u s c e n t e r a s s a y s . C o n f l u e n t c u l t u r e s o f J 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV a t a m . o . i . o f 1 , a s d e s c r i b e d i n t h e p r e v i o u s s e c t i o n . A t 2 4 , 4 8 , 7 2 a n d 1 2 0 h r a f t e r i n f e c t i o n , c e l l s w e r e h a r v e s t e d i n t a c t , b y t r y p s i n i z a t i o n o f h u m a n f i b r o b l a s t s , o r b y g e n t l e s c r a p i n g o f J 7 7 4 A . 1 c e l l s . T h e y w e r e p e l l e t e d , w a s h e d o n c e a n d c o u n t e d . 5 T h e i r n u m b e r s w e r e a d j u s t e d b y d i l u t i o n w i t h m e d i a t o 1 0 c e l l s / m l a n d 4 1 0 c e l l s / m l r e s p e c t i v e l y a n d 2 m l o f e a c h d i l u t i o n w e r e a d d e d t o 3 8 c o n f l u e n t c u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 c e l l s . E a c h e s t i m a t i o n w a s p e r f o r m e d i n d u p l i c a t e . P e t r i d i s h e s w e r e i n c u b a t e d 2 - 4 h r a t 3 7 ° C t o a l l o w c e l l s t o a d h e r e , t h e n t h e m e d i u m w a s d e c a n t e d g e n t l y a n d r e p l a c e d b y a n o v e r l a y o f DMEM w i t h 5% F B S a n d 0 . 5 % a g a r o s e . T h e c e l l s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C u n t i l p l a q u e s c o u l d b e c o u n t e d ( 4 - 7 d a y s ) . P u r i f i c a t i o n o f MCMV D N A . MCMV DNA u s e d i n h y b r i d i z a t i o n e x p e r i m e n t s w a s p r e p a r e d f r o m e x t r a c e l l u l a r v i r i o n s t h a t h a d b e e n p a r t i a l l y p u r i f i e d f r o m c e l l - f r e e c u l t u r e s u p e r n a t a n t . M e d i u m w a s c e n t r i f u g e d a t 5 0 0 0 r . p . m . i n a S o r v a l l c e n t r i f u g e ( G S A r o t o r ) f o r 1 0 m i n , t o r e m o v e c e l l u l a r d e b r i s , a n d v i r i o n s w e r e p e l l e t e d ( 1 1 , 0 0 0 r . p . m . f o r 3 . 5 h r u s i n g a GSA r o t o r ) . T h e p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n a s m a l l v o l u m e o f P B S w i t h 2% F B S a n d c e n t r i f u g e d a t 1 8 , 0 0 0 r . p . m . f o r 9 0 m i n u s i n g t h e S S 3 4 S o r v a l l r o t o r . T h e p e l l e t w a s s u s p e n d e d i n 1 0 mM T r i s - H C l , pH 8 . 0 , 1 0 0 mM N a C l , 1 mM E D T A , t o w h i c h p r o t e i n a s e K ( B e t h e s d a R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s ( B . R . L . ) , G a i t h e r s b u r g , M d . ) w a s a d d e d t o 1 0 0 n g / m l a n d s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ( S D S ) t o 1 % . T h e m i x t u r e w a s d i g e s t e d a t 6 5 ° C f o r 2 h r a n d t h e n o v e r n i g h t a t 3 7 ° C . C e s i u m c h l o r i d e ( o p t i c a l g r a d e : B . R . L . ) a n d w a t e r w a s a d d e d t o t h e s o l u t i o n t o b r i n g t h e v o l u m e t o 1 1 . 5 m l a n d d e n s i t y t o 1 . 7 1 g / m l o f C s C l a n d t h i s w a s s p u n i n t h e T i 7 5 r o t o r ( B e c k m a n I n s t r u m e n t s , I n c . , F u l l e r t o n , C a l i f . ) ( 3 5 , 0 0 0 r . p . m . f o r 6 5 h r a t 2 0 ° C ) . F r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d d r o p w i s e f r o m t h e b o t t o m o f t h e s p u n g r a d i e n t s a n d f r a c t i o n s o f 1 . 7 1 8 g / c c C s C l ( c o n t a i n i n g v i r a l DNA) w e r e i d e n t i f i e d b y r e f r a c t o m e t r y . T h e DNA w a s d i a l y s e d a g a i n s t 1 0 mM T r i s - H C l , pH 8 . 0 , 1 mM EDTA ( T E , pH 8 . 0 ) , p r e c i p i t a t e d w i t h 2 v o l o f 9 5 % e t h a n o l , r e c o v e r e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d r e d i s s o l v e d i n s t e r i l e T E ( p H 8 . 0 ) . C o n c e n t r a t i o n a n d p u r i t y w a s e s t i m a t e d b y m e a s u r i n g a b s o r b a n c e a t 2 6 0 a n d 2 8 0 n m . 39 A s s a y o f v i r a l DNA s y n t h e s i s . V i r a l DNA s y n t h e s i s w a s m e a s u r e d b y d o t h y b r i d i z a t i o n . C u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 , J 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s ( 5 x 5 1 0 c e l l s ) w e r e m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d i n d u p l i c a t e s a t a m . o . i . o f 1 0 . C e l l s w e r e h a r v e s t e d a t 2 h r p i . a n d 2 4 h r p i . a n d s t o r e d a t - 7 0 ° C a s p e l l e t s . C e l l s f r o m e a c h p e t r i d i s h w e r e r e s u s p e n d e d i n 2 0 y l H^O a n d h a l f w a s s p o t t e d o n t o e a c h o f t w o s t r i p s o f n i t r o c e l l u l o s e ( S c h l e i c h e r a n d S c h u e l l , I n c . , K e e n e , N . H . ) ( e a c h e s t i m a t i o n p e r f o r m e d i n q u a d r u p l i c a t e ) . P r i o r t o u s e , n i t r o c e l l u l o s e s t r i p s h a d b e e n s o a k e d i n 1 0 X s t a n d a r d s a l i n e c i t r a t e ( S S C ) s o l u t i o n ( I X S S C i s 1 5 0 mM N a C l , 1 5 mM s o d i u m c i t r a t e , p H 6 . 8 ) a n d r i n s e d i n d i s t i l l e d w a t e r . N i t r o c e l l u l o s e s t r i p s w e r e t r e a t e d a s d e s c r i b e d b y B r a n d s m a a n d M i l l e r ( 1 9 8 0 ) , w i t h m o d i f i c a t i o n s . T h e s t r i p s w e r e s o a k e d c o n s e c u t i v e l y i n 0 . 5 M NaOH f o r 7 m i n , t w i c e i n 0 . 6 M N a C l , 1 M T r i s - H C l ( p H 6 . 8 ) f o r 1 m i n a n d o n c e i n 1 . 5 M N a C l , 0 . 5 M T r i s - H C l ( p H 7 . 4 ) f o r 5 m i n . T h e s e o p e r a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t b y p l a c i n g s t r i p s ( c e l l s i d e u p ) o n p i e c e s o f 3MM f i l t e r p a p e r ( W h a t m a n L t d . , E n g l a n d ) , t h a t h a d b e e n s a t u r a t e d w i t h t h e a p p r o p r i a t e s o l u t i o n s . F i l t e r s w e r e t h e n a i r d r i e d a n d b a k e d a t 8 0 ° C f o r 2 - 4 h r . H y b r i d i z a t i o n r e a c t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n m a d e t o m e a s u r e b o i l a b l e b a g s ( S e a l o b a g s , S e a r s ) . P r e h y b r i d i z a t i o n w a s p e r f o r m e d i n 5 0 % f o r m a m i d e , 5X D e n h a r d t ' s r e a g e n t ( I X D e n h a r d t ' s r e a g e n t i s 0 . 0 2 % w / v e a c h o f b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( S i g m a ) , p o l y v i n y l p y r r o l i d o n e ( S i g m a ) a n d F i c o l l [ M w 4 0 0 , 0 0 0 ] ( P h a r m a c i a F i n e C h e m i c a l s A B , S w e d e n ) , 5X S S C , 5 0 mM s o d i u m p h o s p h a t e ( p H 6 . 8 ) a n d 0 . 1 % S D S , w i t h 2 5 0 y g / m l s o n i c a t e d d e n a t u r e d s a l m o n s p e r m DNA ( S i g m a ) , f o r 4 h r a t 4 2 ° C . T h e s a m e b u f f e r w a s u s e d f o r h y b r i d i z a t i o n e x c e p t I X D e n h a r d t ' s a n d 1 0 0 y g / m l s a l m o n s p e r m DNA w e r e u s e d a s s u b s t i t u t i o n s . H y b r i d i z a t i o n w a s c a r r i e d o u t w i t h 1 0 ^ c . p . m . o f w h o l e g e n o m e MCMV DNA f o r 1 8 h r . V i r a l DNA w a s n i c k t r a n s l a t e d w i t h 4 0 (a P ) d A T P ( N e w E n g l a n d N u c l e a r C o r p . , B o s t o n , M a s s . ) u s i n g a B . R . L . n i c k t r a n s l a t i o n k i t , a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ' s i n s t r u c t i o n s . S t r i p s w e r e w a s h e d t w i c e i n 2X S S C / 0 . 1 % S D S ( 3 m i n a t r o o m t e m p . ) , t w i c e i n 0 . 2 X S S C / 0 . 1 % S D S ( 3 m i n a t r o o m t e m p . ) , t w i c e i n 0 . 1 6 X S S C / 0 . 1 % S D S ( 1 5 m i n a t 5 0 ° C ) , a n d r i n s e d i n 2 X S S C a n d t h e n e x p o s e d t o X - O M A T AR f i l m ( E a s t m a n K o d a k C o . , R o c h e s t e r , N . Y . ) . E a c h s p o t w a s t h e n c u t o u t a n d c o u n t e d b y l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g ( L S C ) u s i n g a S e a r l e I s o c a p 3 0 0 m a c h i n e . I n f e c t i o n a n d l a b e l i n g o f c e l l s . C o n f l u e n t c u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 o r 0 7 7 4 A . 1 c e l l s w e r e s u b c u l t u r e d i n t o 6 0 mm p e t r i d i s h e s , 1 6 - 2 0 h r b e f o r e i n f e c t i o n . S u b c o n f l u e n t c u l t u r e s o f c e l l s w e r e i n f e c t e d a t a m . o . i . o f 2 5 P F U / c e l l , i n 2 m l o f DMEM w i t h 5 % F B S , a t 3 7 ° C f o r 3 0 m i n i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f c y c l o h e x i m i d e ( 6 I B C 0 ) . C e l l s w e r e l a b e l e d i n m i n i m a l e s s e n t i a l m e d i u m ( M E M ) ( S e l e c t - a m i n e k i t w i t h E a r l e ' s s a l t s , G I B C 0 ) l a c k i n g m e t h i o n i n e , 3 5 3 5 s u p p l e m e n t e d w i t h 2% F B S a n d 2 5 - 5 0 u C i / m l ( S ) m e t h i o n i n e . L - ( S ) m e t h i o n i n e ( s p e c i f i c a c t i v i t y 1 0 0 0 - 1 2 0 0 C i / m m o l ) w a s o b t a i n e d f r o m New E n g l a n d N u c l e a r C o r p . , B o s t o n , M a s s . S p e c i f i c c o n d i t i o n s o f r a d i o l a b e l i n g v a r i e d w i t h e x p e r i m e n t s a n d a r e d e s c r i b e d i n t h e t e x t o r f i g u r e l e g e n d s . T o d e t e c t p h o s p h o r y l a t i o n o f p r o t e i n s , c e l l s w e r e l a b e l e d i n p h o s p h a t e - f r e e MEM w i t h 2% F B S a n d 2 0 0 u C i / m l ( 3 2 P ) o r t h o p h o s p h a t e ( c a r r i e r f r e e ) ( N e w E n g l a n d N u c l e a r ) . T o d e t e c t g l y c o s y l a t e d p r o t e i n s , c e l l s w e r e l a b e l e d i n 3 g l u c o s e - f r e e MEM w i t h 2% F B S a n d 2 0 u C i / m l ( H) g l u c o s a m i n e h y d r o c h l o r i d e ( N e w E n g l a n d N u c l e a r ) . U s e o f m e t a b o l i c i n h i b i t o r s . I n c e r t a i n e x p e r i m e n t s , c y c l o h e x i m i d e w a s i n c l u d e d i n t h e t i s s u e c u l t u r e m e d i u m ( 5 0 v g / m l ) , a t t h e t i m e o f i n f e c t i o n ( t o d e t e c t i m m e d i a t e - e a r l y p r o t e i n s ) o r a t l a t e r t i m e s , t o a m p l i f y l e v e l s o f 41 viral-induced proteins. The cycloheximide-containing medium was removed and cells were rinsed three times in complete medium prior to radiolabeling. Actinomycin D (Sigma), in 95% ethanol, was stored at 5 mg/ml and used at a final concentration of 10 ug/ml. Viral DNA synthesis was inhibited with sodium phosphonoacetate (PAA: Abbott Laboratories, N. Chicago, 111.) at 100 yg/ml. Processing of cells for gel electrophoresis. After the labeling period, cells were rinsed with cold phosphate buffered saline (PBS), scraped from the petri dish and collected by brief centrifugation in an Eppendorf bench centrifuge. Whole cell pellets were resuspended in 100 u l buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 0.15 M NaCl, 5 mM MgCl2) and frozen at -70°C until processed for gel analysis. Cells to be fractionated were treated as described by Jeang and Gibson (1980), with minor modifications. To separate into nuclear and cytoplasmic fractions, cells were resuspended in 200 u l of 1% NP40 (in 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 M NaCl, 5 mM MgCl2) and incubated at 4°C for 10 min. This method leaves the insoluble cytoskeletal framework adhering to the nuclei. Nuclear and cytoplasmic fractions were separated by brief centrifugation. Phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF)(Sigma) was added to all samples to 0.5 mM. In certain experiments, the cytoskeletal framework was removed from nuclear fractions by the method of Penman (1966). Each nuclear fraction, isolated as described above, was resuspended in 100 pi buffer (50 mM NaCl, 100 mM HEPES, 2.5 mM MgCl2> 0.3 M sucrose, pH 7.4) to which was added 10 u l of a mixture containing 10% Tween 40 and 5% sodium deoxycholate (DOC) (v/v and w/v respectively). The nuclear pellet was vigorously vortexed for 30 s and then the fractions were separated after brief centrifugation. 4 2 P r i o r t o e l e c t r o p h o r e s i s i n t h e p r e s e n c e o f S D S , w h o l e c e l l e x t r a c t s a n d n u c l e a r p r e p a r a t i o n s w e r e s o n i c a t e d t o s h e a r n u c l e a r DNA a n d t h e n a l l s a m p l e s w e r e d i l u t e d w i t h e q u a l v o l u m e s o f 2X S D S - s a m p l e b u f f e r ( 4 . 6 % ( w / v ) S D S , 1 0 % ( v / v ) 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , 2 0 % ( w / v ) g l y c e r o l , 0 . 1 % B r o m o p h e n o l b l u e i n 0 . 1 2 5 M T r i s - H C l pH 6 . 8 ) , a n d h e a t e d f o r 5 m i n a t 1 0 0 ° C . I m m u n o p r e c i p i t a t i o n p r o c e d u r e . C e l l e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d a n d i m m u n o p r e c i p i t a t i o n s c a r r i e d o u t a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e o f B l a n t o n a n d T e v e t h i a ( 1 9 8 1 ) , w i t h m i n o r m o d i f i c a t i o n s . MCMV a n t i s e r a u s e d w e r e d e r i v e d f r o m p o o l e d s e r u m s a m p l e s t a k e n f r o m a ) a c u t e l y i n f e c t e d m i c e ( 2 8 d a y s a f t e r i n f e c t i o n ) , o r b ) c h r o n i c a l l y i n f e c t e d m i c e ( 6 - 8 m o n t h s a f t e r i n f e c t i o n ) . C u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 c e l l s ( 1 . 5 - 2 x 1 0 6 c e l l s ) w e r e i n f e c t e d a n d l a b e l e d a s d e s c r i b e d a b o v e . A t t h e e n d o f t h e l a b e l i n g p e r i o d , c e l l s w e r e r i n s e d w i t h c o l d P B S a n d l y s e d i n s i t u w i t h 1 m l o f c o l d e x t r a c t i o n b u f f e r ( E B ) . E B c o n s i s t e d o f 0 . 5 % N P 4 0 ( v / v ) i n 2 0 mM T r i s , pH 9 . 0 , 0 . 3 M N a C l , 1 0 % g l y c e r o l ( v / v ) , 1 mM C a C l 2 > 0 . 5 mM M g C l 2 > 2 mM EDTA w i t h 3 0 0 y g / m l P M S F . C u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d i n EB f o r 2 0 m i n o n i c e a n d l y s a t e s h a r v e s t e d f o r i m m u n o p r e c i p i t a t i o n . E x t r a c t s w e r e s p u n a t 2 5 , 0 0 0 r . p . m . f o r 3 0 m i n i n a B e c k m a n SW27 r o t o r a n d p r e a b s o r p t i o n w a s c a r r i e d o u t o n t h e m t o r e d u c e n o n s p e c i f i c r e a c t i o n s : C l a r i f i e d s u p e r n a t a n t s w e r e m i x e d w i t h 5% M C M V - n e g a t i v e m o u s e s e r u m f o r 1 h r a t 4 ° C a n d t h e n e a c h w a s t r a n s f e r r e d t o a n o t h e r t u b e t h a t c o n t a i n e d t h e p e l l e t o f 4 0 0 y l o f a 1 0 % s u s p e n s i o n ( w / v ) o f p r o t e i n A c o n t a i n i n g S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s c e l l s ( P a n s o r b i n : C a l b i o c h e m - B e h r i n g C o r p . , L a J o l l a , C a l i f . ) . T h e c e l l s w e r e r e s u s p e n d e d , a g i t a t e d f o r 1 0 m i n a n d c e n t r i f u g e d i n a n E p p e n d o r f c e n t r i f u g e . T h e s u p e r n a t a n t s w e r e u s e d a s s t a r t i n g m a t e r i a l f o r i m m u n o p r e c i p i t a t i o n s t u d i e s . 4 3 5 0 0 u l o f e a c h e x t r a c t w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 0 - 2 0 u l o f MCMV a n t i b o d y p o s i t i v e o r n e g a t i v e s e r u m f o r 1 8 h r a t 4 ° C . 1 0 0 u l o f a 10% ( w / v ) s u s p e n s i o n o f S_^ a u r e u s c e l l s w e r e a d d e d t o e a c h s a m p l e a n d t h e y w e r e i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n a t r o o m t e m p . C e l l s w i t h t r a p p e d i m m u n e c o m p l e x e s w e r e w a s h e d f i v e t i m e s i n w a s h i n g b u f f e r ( 5 0 mM T r i s - H C l , p H 7 . 4 , 0 . 5 M L i C l , 0 . 1 M N a C l a n d 1% N P 4 0 ) , b y p e l l e t i n g a n d r e s u s p e n s i o n . I m m u n e c o m p l e x e s w e r e f r e e d b y b o i l i n g t h e c e l l s i n S O S - s a m p l e b u f f e r a t 1 0 0 ° C f o r 5 m i n a n d p e l l e t i n g o u t t h e c e l l s . T h e s u p e r n a t a n t s w e r e a n a l y s e d b y S D S - P A G E a n d a u t o r a d i o g r a p h y . A n a l y s i s o f p r o t e i n s b y S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s  ( S D S - P A G E ) a n d a u t o r a d i o g r a p h y . S D S - P A G E w a s p e r f o r m e d a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e o f L a e m m l i ( 1 9 7 0 ) i n a d i s c o n t i n u o u s b u f f e r s y s t e m i n s l a b g e l s , i n e i t h e r g r a d i e n t g e l s o f 1 0 - 3 0 % a c r y l a m i d e , u s i n g a m o d e l 221 g e l e l e c t r o p h o r e s i s c e l l ( B i o - R a d L a b o r a t o r i e s , R i c h m o n d , C a l i f . ) o r i n l i n e a r g e l s o f 7 . 5 % o r 1 0 % a c r y l a m i d e , u s i n g a B i o - R a d P r o t e a n M u l t i p l e g e l a p p a r a t u s . T h e l i n e a r g e l s w e r e u s e d i n l a t e r e x p e r i m e n t s a s t h e y g a v e m o r e r e p r o d u c i b l e m i g r a t i o n p a t t e r n s t h a n t h e g r a d i e n t g e l s . A l l e l e c t r o p h o r e s i s c h e m i c a l s w e r e o b t a i n e d f r o m B i o - R a d L a b o r a t o r i e s . I n t h e f o r m e r c a s e , t h e r e s o l v i n g g e l w a s a l i n e a r a c r y l a m i d e g r a d i e n t ( 1 0 - 3 0 % ) c r o s s - l i n k e d w i t h 0 . 0 5 - 0 . 1 5 % N . N ' - m e t h y l e n e - b i s - a c r y l a m i d e ( B i s ) , a n d 0 . 1 % S D S , 0 . 3 7 5 M T r i s - H C l pH 8 . 6 ; t h e g e l l e n g t h w a s 3 0 c m . L i n e a r g e l s c o n s i s t e d o f 7 . 5 % a c r y l a m i d e , 0 . 2 % B i s o r 1 0 % a c r y l a m i d e , 0 . 2 6 % B i s a n d 0 . 1 % S D S , 0 . 3 7 5 M T r i s - H C l pH 8 . 8 ; t h e g e l l e n g t h w a s 1 6 c m . S t a c k i n g g e l s c o n s i s t e d o f 4 . 5 % a c r y l a m i d e , 0 . 1 2 % B i s , 0 . 1 % S D S a n d 0 . 1 2 5 M T r i s - H C l pH 6 . 8 . P o l y m e r i z a t i o n w a s i n i t i a t e d b y a d d i t i o n o f a m m o n i u m p e r s u l p h a t e ( A P S ) t o 0 . 0 0 0 3 % a n d N , N , N 1 , N ' - t e t r a - m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e ( T E M E D ) t o 0 . 0 2 5 % . R u n n i n g b u f f e r 4 4 c o n t a i n e d 0 . 0 2 5 M T r i s , 0 . 1 9 2 M g l y c i n e a n d 0 . 1 % S D S , pH 8 . 3 - 8 . 5 . S a m p l e s w e r e e l e c t r o p h o r e s e d t h r o u g h t h e s t a c k i n g g e l a t 2 0 mA c o n s t a n t c u r r e n t a n d t h r o u g h t h e s e p a r a t i n g g e l a t 3 0 mA c o n s t a n t c u r r e n t . G e l s w e r e f i x e d a n d s t a i n e d f o r 3 0 m i n i n w a t e r r a c e t i c a c i d r m e t h a n o l ( 5 : 1 : 4 , b y v o l u m e ) c o n t a i n i n g 0 . 2 % C o o m a s s i e b r i l l i a n t b l u e , d e s t a i n e d i n w a t e r : a c e t i c a c i d : m e t h a n o l ( 7 : 1 : 2 , b y v o l u m e ) a n d d r i e d o n t o f i l t e r p a p e r u n d e r v a c u u m . I n c e r t a i n c a s e s , g e l s w e r e p r e p a r e d f o r f l u o r o g r a p h y a t t h i s s t a g e b y 3 i m p r e g n a t i o n w i t h En H a n c e o r E n l i g h t n i n g ( N e w E n g l a n d N u c l e a r ) , a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ' s i n s t r u c t i o n s . G e l s w e r e e x p o s e d f o r v a r i o u s t i m e s t o K o d a k X - 0 M A T AR f i l m a n d t h e s e w e r e d e v e l o p e d i n a K o d a k a u t o m a t e d d e v e l o p e r . H i g h a n d l o w m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d m a r k e r s ( B i o - R a d ) w e r e c o e l e c t r o p h o r e s e d o n e a c h g e l . T h e i d e n t i t i e s a n d m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e s t a n d a r d m a r k e r s w e r e a s f o l l o w s : l y s o z y m e , 1 4 , 4 0 0 ; s o y b e a n t r y p s i n i n h i b i t o r , 2 1 , 5 0 0 ; c a r b o n i c a n h y d r a s e , 3 1 , 0 0 0 ; o v a l b u m i n , 4 5 , 0 0 0 ; b o v i n e s e r u m a l b u m i n , 6 6 , 2 0 0 ; p h o s p h o r y l a s e B , 9 2 , 5 0 0 ; 3 g a l a c t o s i d a s e , 1 1 6 , 2 5 0 ; m y o s i n , 2 0 0 , 0 0 0 . M o l e c u l a r w e i g h t s o f r a d i o a c t i v e b a n d s w e r e d e t e r m i n e d u s i n g a l i n e a r r e g r e s s i o n p r o g r a m f o r t h e H e w l e t t - P a c k a r d 2 5 C c a l c u l a t o r , a f t e r c o m p a r i n g r e l a t i v e m o b i l i t i e s ( R f v a l u e s ) o f t h e s e b a n d s w i t h R f v a l u e s o f t h e m a r k e r s , a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f W e b e r & O s b o r n ( 1 9 6 9 ) f o r l i n e a r g e l s o r t h e m e t h o d o f P o d u s l o & R o d b a r d ( 1 9 8 0 ) f o r g r a d i e n t g e l s . T w o - d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s . C h a r g e - s i z e s e p a r a t i o n s i n p o l y a c r y l a m i d e g e l s w e r e p e r f o r m e d e s s e n t i a l l y a s d e s c r i b e d b y 0 ' F a r r e l l e t a j . ( 1 9 7 7 ) . N o n - e q u i l i b r i u m pH g e l e l e c t r o p h o r e s i s c h a r g e s e p a r a t i o n s ( t h e f i r s t d i m e n s i o n ) w e r e d o n e i n 1 2 . 5 cm x 1 mm g l a s s t u b e s c u t f r o m d i s p o s a b l e 1 m l s e r o l o g i c a l p i p e t t e s . T h e g e l s o l u t i o n c o n s i s t e d o f 9 M U r e a , 2% N P 4 0 ( B D H C h e m i c a l s , T o r o n t o , O n t . ) , 4% a c r y l a m i d e c r o s s - l i n k e d w i t h 0 . 1 7 % B i s 45 a n d 2% pH 3 - 1 0 a m p h o l y t e ( B i o - l y t e : B i o - R a d L a b o r a t o r i e s ) . P o l y m e r i z a t i o n w a s i n i t i a t e d b y a d d i t i o n o f 0 . 0 1 4 % A P S a n d 0 . 0 8 % T E M E D . W h o l e c e l l p e l l e t s a n d n u c l e a r p e l l e t s w e r e s o n i c a t e d t o s h e a r D N A , s a m p l e s w e r e i n c u b a t e d w i t h D N a s e a n d R N a s e ( S i g m a : 5 0 p g / m l e a c h ) f o r 2 0 m i n o n i c e a n d t h e n c o m p o n e n t s o f t h e s a m p l e b u f f e r w e r e a d d e d s e p a r a t e l y t o e a c h s a m p l e ( 9 M U r e a , 2% N P 4 0 ( w / v ) , 2% a m p h o l y t e s m i x e d i n t h e r a t i o 4 : 1 pH 5 - 7 : p H 3 - 1 0 a n d 5% 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ) . A f t e r p o l y m e r i z a t i o n , g e l s w e r e o v e r l a i d w i t h 2 0 p i o f s a m p l e b u f f e r a n d l e f t o v e r n i g h t . B e f o r e s a m p l e s w e r e r u n , t h e o v e r l a y w a s r e m o v e d , s a m p l e s w e r e l o a d e d o n t h e g e l s a n d o v e r l a i d w i t h 1 0 p i o f o v e r l a y s o l u t i o n ( 9 M u r e a , 1% a m p h o l y t e s ( 0 . 5 % pH 5 - 7 a n d 0 . 2 % pH 3 - 1 0 ) ) . U p p e r e l e c t r o d e b u f f e r w a s 0 . 0 1 M p h o s p h o r i c a c i d a n d l o w e r e l e c t r o d e b u f f e r w a s 0 . 0 2 M N a O H . G e l s w e r e r u n i n t h e f i r s t d i m e n s i o n f o r 6 h r a t 5 0 0 V a n d e q u i l i b r a t e d i n t w o c h a n g e s o f S D S - s a m p l e b u f f e r f o r 1 h r b e f o r e b e i n g e m b e d d e d h o r i z o n t a l l y i n 1% a g a r o s e a l o n g t h e t o p s o f 1 0 % S D S p o l y a c r y l a m i d e g e l s . S a m p l e s w e r e r u n i n t h e s e c o n d d i m e n s i o n , s t a i n e d , d r i e d a n d e x p o s e d t o X r a y f i l m a s d e s c r i b e d a b o v e . P r e p a r a t i o n o f p r o t e i n s f o r D N A - a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y . C e l l e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d f o r D N A - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y a n d s a m p l e s r u n a s d e s c r i b e d b y P u r i f o y a n d P o w e l l ( 1 9 7 6 ) . N u c l e a r e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d a s d e s c r i b e d b y B l a i r a n d H o n e s s ( 1 9 8 3 ) . 3 T 3 - L 1 o r 0 7 7 4 A . 1 c e l l s , g r o w n i n 1 0 0 mm p e t r i d i s h e s , w e r e m o c k o r M C M V - i n f e c t e d ( m . o . i . o f 2 5 ) a n d m a i n t a i n e d i n c y c l o h e x i m i d e c o n t a i n i n g m e d i u m ( 5 0 p g / m l ) f o r 3 h r . C e l l s w e r e r i n s e d t h r e e t i m e s a n d t h e n 3 5 l a b e l e d 6 h r w i t h 2 5 p C i / m l ( S ) m e t h i o n i n e i n m e t h i o n i n e - f r e e MEM w i t h 2% F B S . C e l l s w e r e d i s r u p t e d b y s o n i c a t i o n i n l o w s a l t b u f f e r ( 2 0 mM T r i s - H C l , pH 7 . 4 , b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) 5 0 0 p g / m l , 2 mM 2 4 6 m e r c a p t o e t h a n o l , 0 . 5 mM P M S F ) a t 2 x 1 0 c e l l s / m l . A n e q u a l v o l u m e o f h i g h s a l t b u f f e r ( 2 0 mM T r i s - H C l , pH 7 . 4 , 3 . 4 M N a C l 2 mM 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , 1 0 mM E D T A , 0 . 5 mM P M S F ) w a s a d d e d , s a m p l e s i n c u b a t e d o n i c e 1 h r a n d t h e n s p u n a t 3 0 , 0 0 0 g f o r 3 0 m i n . T h e s u p e r n a t a n t s w e r e d i a l y s e d a g a i n s t t h r e e c h a n g e s o f c o l u m n b u f f e r ( 2 0 mM T r i s - H C l , pH 7 . 4 , 1 0 % ( w / v ) g l y c e r o l , 5 0 mM N a C l , 1 mM E D T A , 2 mM 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , 0 . 5 mM P M S F ) , s p u n a t l O O . O O O g f o r 1 h r t o r e m o v e i n s o l u b l e m a t e r i a l a n d a p p l i e d t o D N A - c e l l u l o s e c o l u m n s . T o p r e p a r e p r o t e i n s f r o m n u c l e a r e x t r a c t s , c e l l s w e r e i n f e c t e d a n d l a b e l e d a s d e s c r i b e d a b o v e . C e l l s w e r e l y s e d b y s u s p e n s i o n i n b u f f e r c o n t a i n i n g 1% N P 4 0 i n 1 0 mM T r i s - H C l , pH 7 . 4 , 1 5 0 mM N a C l , 5 mM M g C l 2 , 0 . 5 mM P M S F . S a m p l e s w e r e h e l d o n i c e w i t h o c c a s i o n a l v o r t e x i n g f o r 1 0 m i n a n d n u c l e i w e r e s e d i m e n t e d b y l o w s p e e d c e n t r i f u g a t i o n . N u c l e a r f r a c t i o n s w e r e r e s u s p e n d e d i n b u f f e r c o n t a i n i n g 2 0 mM T r i s - H C l , pH 7 . 4 , 1 5 0 mM N a C l , 2 mM P M S F , 5 mM E D T A , 2 mM 2 - m e r c a p t o e t h a n o l a n d 2 0 % g l y c e r o l a n d l y s e d b y a d d i t i o n o f s o l i d N a C l t o 2 . 0 M . S a m p l e s w e r e s o n i c a t e d t o s h e a r DNA a n d h e l d o n i c e 1 h r . I n s o l u b l e m a t e r i a l w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( 1 0 0 , 0 0 0 g f o r 1 h r ) a n d s u p e r n a t a n t s m a d e t o 5 mM s p e r m i n e a n d d i a l y s e d a g a i n s t b u f f e r c o n t a i n i n g 5 mM s p e r m i n e ( S i g m a ) i n 1 0 mM T r i s - H C l , p H 7 . 4 , 5 0 mM N a C l , 5 mM E D T A , 1 mM P M S F , 1 mM 2 - m e r c a p t o e t h a n o l a n d 1 0 % g l y c e r o l . T h e p r e c i p i t a t e s w e r e s e d i m e n t e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( l l , 0 0 0 g f o r 1 5 m i n ) a n d t h e s u p e r n a t a n t s w e r e d i a l y s e d a g a i n s t 1 0 mM T r i s - H C l , p H 7 . 4 , 5 0 mM N a C l , 5 mM E D T A , 1 mM P M S F , 1 mM 2 - m e r c a p t o e t h a n o l a n d 1 0 % g l y c e r o l . T h i s r e p r e s e n t e d t h e s t a r t i n g m a t e r i a l f o r D N A - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y . P r e p a r a t i o n o f D N A - c e l l u l o s e . DNA w a s a d s o r b e d t o c e l l u l o s e a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d s o f A l b e r t s a n d H e r r i c k ( 1 9 7 1 ) . P r i o r t o u s e , c e l l u l o s e ( C e l l e x 4 1 0 , B i o - R a d ) w a s w a s h e d t h r e e t i m e s (1 h r e a c h ) i n 9 5 % e t h a n o l a t 4 7 8 0 ° C . I t w a s t h e n f i l t e r w a s h e d s u c c e s s i v e l y i n 0 . 1 M N a O H , 1 mM EDTA a n d 1 0 mM H C l a n d s e v e r a l c h a n g e s o f d i s t i l l e d w a t e r . T h e c e l l u l o s e w a s t h e n l y o p h i l i z e d a n d s t o r e d a s p o w d e r . N a t i v e D N A - c e l l u l o s e w a s p r e p a r e d b y m i x i n g c e l l u l o s e w i t h c a l f t h y m u s DNA ( S i g m a ) ( 2 m g / m l s o l u t i o n ) i n t h e r a t i o o f c e l l u l o s e : D N A s o l u t i o n a t 1 g : 3 m l . T h e m i x t u r e w a s s p r e a d o v e r a n e v a p o r a t i n g d i s h a n d l e f t o v e r n i g h t t o d r y a t 3 7 ° C . I t w a s t h e n g r o u n d i n t o a p o w d e r a n d l y o p h i l i z e d t o c o m p l e t e d r y n e s s . T h i s p o w d e r w a s r e s u s p e n d e d a n d w a s h e d t h r e e t i m e s i n 1 0 mM T r i s - H C l , pH 7 . 4 , 1 mM EDTA a n d t h e n s t o r e d a t - 2 0 ° C i n 1 0 mM T r i s - H C l , pH 7 . 4 , 1 5 0 mM N a C l , 1 mM E D T A . D e n a t u r e d ( s i n g l e - s t r a n d e d ) D N A - c e l l u l o s e w a s p r e p a r e d b y m i x i n g c e l l u l o s e w i t h c a l f t h y m u s DNA i n t h e s t a t e d r a t i o s . T h i s t i m e t h e DNA ( 2 m g / m l s o l u t i o n i n 1 0 mM K 2 H P 0 4 > 1 mM E D T A ) w a s f i r s t d e n a t u r e d b y t r e a t m e n t f o r 2 0 m i n a t 1 0 0 ° C . I t w a s t h e n r a p i d l y c o o l e d , m a d e 2 0 mM i n T r i s - H C l , pH 7 . 4 , a n d m i x e d w i t h c e l l u l o s e . I t w a s t h e n p r o c e s s e d a s s t a t e d . D N A - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y . D N A - c e l l u l o s e w a s p o u r e d i n t o c o l u m n s (1 x 4 c m , 1 . 5 m l o f D N A - c e l l u l o s e ) a n d e q u i l i b r a t e d 1 h r w i t h c o l u m n b u f f e r b e f o r e s a m p l e s w e r e a p p l i e d . A l l p r o c e d u r e s w e r e c a r r i e d o u t a t 4 ° C . E a c h s a m p l e w a s w a s h e d t h r o u g h t h e c o l u m n w i t h 5 0 m l o f c o l u m n b u f f e r a n d D N A - b i n d i n g p r o t e i n s w e r e e l u t e d s t e p w i s e w i t h t h e s a m e b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 1 , 0 . 3 , 0 . 5 a n d 1 . 0 M N a C l r e s p e c t i v e l y . 5 0 y l a l i q u o t s o f e a c h f r a c t i o n w e r e p r e c i p i t a t e d w i t h 1 0 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d ( T C A ) a n d c o u n t e d b y L S C . F r a c t i o n s t h a t c o n t a i n e d t h e p e a k c o u n t s o f a c i d - p r e c i p i t a b l e 3 5 ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s , f o r e a c h c o n c e n t r a t i o n o f e l u t i o n b u f f e r , w e r e p r e c i p i t a t e d w i t h 10% T C A , w a s h e d i n 9 5 % e t h a n o l , d i s s o l v e d i n S D S - s a m p l e b u f f e r a n d s e p a r a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s o n 1 0 - 3 0 % g r a d i e n t S D S -4 8 S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l s o r 7 . 5 % l i n e a r g e l s . D e t e c t i o n o f D N A - b i n d i n g p r o t e i n s b y p r o t e i n b l o t t i n g . T o d e t e c t D N A -b i n d i n g o f p r o t e i n s t h a t m a y b e i n s o l u b l e b y t h e p r e v i o u s m e t h o d , t h e p r o t e i n b l o t t i n g m e t h o d o f B o w e n e t a l _ . ( 1 9 8 0 ) w a s u s e d w i t h m o d i f i c a t i o n s . P r o t e i n s w e r e e l e c t r o b l o t t e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f T o w b i n e t a l _ . ( 1 9 7 9 ) . U n l a b e l e d p r o t e i n s w e r e s e p a r a t e d b y S D S - P A G E , a s d e s c r i b e d b e f o r e . L a b e l e d s a m p l e s , t h a t h a d b e e n p r e p a r e d i n t h e s a m e m a n n e r , w e r e r u n i n p a r a l l e l o n t h e s a m e e l e c t r o p h o r e s i s a p p a r a t u s . A f t e r t h e c o m p l e t i o n o f e l e c t r o p h o r e s i s , t h e p o l y a c r y l a m i d e g e l w a s m o u n t e d n e x t t o a s h e e t o f n i t r o c e l l u l o s e i n a B i o - R a d T r a n s b l o t c e l l . T h e s a m p l e s w e r e e l e c t r o b l o t t e d f o r 4 h r a t 3 0 0 mA i n 2 0 mM T r i s , pH 8 . 3 , 0 . 1 9 2 M g l y c i n e a n d 2 0 % m e t h a n o l . F i l t e r s w e r e s o a k e d i n I X S S C s o l u t i o n , c o n t a i n i n g I X D e n h a r d t ' s 3 2 r e a g e n t , f o r 2 0 m i n a t r o o m t e m p , a n d t h e n i n c u b a t e d f o r 1 h r w i t h P l a b e l l e d d e n a t u r e d M C M V - D N A i n I X S S C s o l u t i o n , c o n t a i n i n g I X D e n h a r d t ' s r e a g e n t , w i t h c o n s t a n t a g i t a t i o n . M C M V - D N A w a s n i c k t r a n s l a t e d w i t h ( o T 3 2 P ) d A T P , u s i n g a B . R . L . n i c k t r a n s l a t i o n k i t . 1 0 6 - 2 X 1 0 6 c . p . m . o f D N A , d e n a t u r e d b y i n c u b a t i o n a t 1 0 0 ° C f o r 2 0 m i n a n d t h e n r a p i d l y c h i l l e d , w a s u s e d f o r e a c h f i l t e r . F i l t e r s w e r e w a s h e d f o r 1 h r i n f o u r c h a n g e s o f I X S S C , d r i e d a n d a u t o r a d i o g r a p h e d . 4 9 R E S U L T S . 1 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s o f M C M V . P r e l i m i n a r y s t u d i e s i n o u r l a b o r a t o r y h a d s h o w n t h a t MCMV d i d n o t r e p l i c a t e f u l l y i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s c o m p a r e d t o 3 T 3 - L 1 c e l l s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e s e e x p e r i m e n t s a l s o s h o w e d t h a t MCMV d i d n o t r e p l i c a t e a t a l l i n h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s . T h e i n i t i a l e x p e r i m e n t s w e r e d e s i g n e d t o c o m p a r e t h e y i e l d s o f v i r u s f r o m M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 , J 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s . F u r t h e r t o t h a t , i t w a s n e c e s s a r y t o d e t e r m i n e , b y i n f e c t i o u s c e n t e r a s s a y , t h e t y p e o f i n f e c t i o n t h a t o c c u r r e d i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s . N a m e l y , i f m o s t o f t h e c e l l s w e r e p r o d u c i n g l o w a m o u n t s o f v i r u s ( s e m i p e r m i s s i v e i n f e c t i o n ) o r i f v i r u s w a s b e i n g p r o d u c e d b y a s m a l l p e r c e n t a g e o f c e l l s a n d t h e r e s t w e r e n o n p r o d u c t i v e ( n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n ) . I t h a d b e e n d e c i d e d t h a t t h e s e c e l l s w o u l d o n l y b e s u i t a b l e f o r g e n e e x p r e s s i o n e x p e r i m e n t s i f m o s t w e r e n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d . T h i s w o u l d m e a n t h a t t h e y w e r e b e h a v i n g i n a s i m i l a r m a n n e r t o HCMV i n f e c t i o n o f n o n h u m a n c e l l s . 2 . G r o w t h o f MCMV i n 3 T 3 - L 1 , 3 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s . T h e c u r v e s o f MCMV r e p l i c a t i o n i n 3 T 3 - L 1 , 0 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s a r e s h o w n i n F i g . 1 . A c o m p a r i s o n o f t h e m a x i m u m t i t e r s o b t a i n e d , s h o w e d t h a t t h e r e w a s o v e r a 2 0 0 0 - f o l d d i f f e r e n c e i n t h e y i e l d s o f v i r u s b e t w e e n t h e t w o t y p e s o f c e l l s . T h e l i m i t e d a m o u n t o f r e p l i c a t i o n o f MCMV i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s r e p r e s e n t e d a y i e l d o f a p p r o x i m a t e l y 1 P F U p e r 1 0 0 c e l l s , c o m p a r e d t o 2 0 P F U p e r i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l . T h e s e r e s u l t s a l s o c o n f i r m e d t h a t n o r e p l i c a t i o n o f MCMV o c c u r r e d i n h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s . 50 F i g . 1 G r o w t h c u r v e s o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s ( M C M V ) r e p l i c a t i o n i n 3 T 3 - L 1 c e l l s ( • ) , J 7 7 4 A . 1 c e l l s ( Q ) a n d h u m a n f i b r o b l a s t s ( • ) . T i t e r s o f c e l l - a s s o c i a t e d p l u s s u p e r n a t a n t v i r u s w e r e a s s a y e d o n 3 T 3 - L 1 c e l l s . E a c h p o i n t r e p r e s e n t s t h e m e a n o f t h r e e e s t i m a t i o n s . T tt O 3 a' be o 24 48 72 96 Time post-infection (hours) 120 51 3 . D e t e c t i o n o f i n f e c t i o u s c e n t e r s . C u l t u r e s o f J 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s ( H F F ) w e r e i n f e c t e d a s d e s c r i b e d a n d t h e n u m b e r o f v i r u s p r o d u c i n g c e l l s ( i n f e c t i o u s c e n t e r s ) w a s a s s a y e d . T a b l e I s h o w s t h a t a p p r o x i m a t e l y 0 . 5 % o f t h e J 7 7 4 A . 1 c e l l s w e r e p e r m i s s i v e t o v i r u s r e p l i c a t i o n . T h e g r o w t h o f MCMV i n o n l y a s m a l l p e r c e n t a g e o f J 7 7 4 A . 1 c e l l s f o l l o w e d t h e s a m e p a t t e r n t h a t w a s s e e n w i t h t h e i n f e c t i o n o f m a c r o p h a g e s t h a t h a d b e e n i s o l a t e d f r o m m o u s e s p l e e n s ( H u d s o n e t a l _ . , 1 9 7 8 ) . B e c a u s e t h e r e w a s a n a b s e n c e o f a g r o w t h p h a s e ( a s s e e n i n F i g . 1 ) , t h e l o w n u m b e r s o f i n f e c t i o u s c e n t e r s f o r H F F c e l l s p r o b a b l y r e p r e s e n t r e s i d u a l v i r u s f r o m t h e i n o c u l u m . T h i s s h o w s t h e l i m i t a t i o n s o f u s i n g H F F c e l l s f o r s t u d y i n g l a t e n c y , a s a n a b o r t i v e t y p e o f i n f e c t i o n o c c u r s . 4 . MCMV DNA s y n t h e s i s i n 3 T 3 - L 1 . J 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s . T o d e t e r m i n e i f MCMV DNA r e p l i c a t i o n i n J 7 7 4 A . 1 a n d H F F c e l l s w a s i n h i b i t e d d u r i n g t h e s e n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s , s i m i l a r t o t h a t s e e n i n a l l o t h e r n o n p e r m i s s i v e CMV i n f e c t i o n s , i n c r e a s e i n v i r a l DNA c o n c e n t r a t i o n i n i n f e c t e d c e l l s w a s m e a s u r e d b y a u t o r a d i o g r a p h y a n d l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g ( L S C ) o f ( 3 2 P ) l a b e l e d M C M V - D N A , t h a t h a d h y b r i d i z e d t o m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d c e l l D N A . T h e a u t o r a d i o g r a m ( F i g . 2 ) s h o w s a c o n s i d e r a b l e i n c r e a s e i n v i r a l DNA a t 2 4 h r p i . i n i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s . I n c o m p a r i s o n , t h e r e a p p e a r e d t o b e n o s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n t h e a m o u n t o f v i r a l DNA i n i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s a t 2 4 h r p i . . A s i m i l a r f i n d i n g w a s s e e n f o r i n f e c t e d H F F c e l l s . T h e s e r e s u l t s w e r e q u a n t i f i e d b y L S C o f e a c h s e p a r a t e s p o t ( T a b l e I I ) . T h e r e w a s a 3 0 - f o l d i n c r e a s e i n v i r a l DNA c o n t e n t a t 2 4 h r p i . i n i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s , w h i l e t h e i n c r e a s e o b s e r v e d f o r t h e o t h e r t w o c e l l t y p e s w a s l e s s t h a n 1 . 5 - f o l d . T h i s w a s c a l c u l a t e d b y d i v i d i n g t h e m e a n c . p . m . h y b r i d i z e d a t 2 4 h r p i . b y t h e m e a n c . p . m . h y b r i d i z e d a t 2 h r p i . , 5 2 T a b l e I : I n f e c t i o u s c e n t e r s / 1 0 5 c e l l s (%) p r o d u c e d i n M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 a n d H F F  c e l l s . C e l l T y p e T i m e p o s t - i n f e c t i o n c e l l s h a r v e s t e d ( d a y s ) 1 2 3 5 J 7 7 4 A . 1 5 0 8 6 4 2 1 9 8 4 9 % ( 0 . 5 0 8 ) ( 0 . 6 4 2 ) ( 0 . 1 9 8 ) ( 0 . 0 4 9 ) H F F 5 3 0 0 % ( 0 . 0 0 5 ) ( 0 . 0 0 3 ) ( 0 ) ( 0 ) E a c h r e s u l t r e p r e s e n t s t h e m e a n o f f o u r e s t i m a t i o n s . 5 3 F i g - 2 : MCMV DNA r e p l i c a t i o n i n 3 T 3 - L 1 , J 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f i b r o b l a s t 3 2 ( H F F ) c e i l s . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( P ) l a b e l e d MCMV DNA h y b r i d i z e d t o c e l l d o t s . C e l l s w e r e m o c k o r M C M V - i n f e c t e d a t 1 0 P F U / c e l l . T h e y w e r e h a r v e s t e d a t 2 a n d 2 4 h r p i . , s p o t t e d o n t o n i t r o c e l l u l o s e , d e n a t u r e d i n . s i t u a n d h y b r i d i z e d w i t h 1 0 6 c . p . m . ( 3 2 P ) l a b e l e d MCMV D N A . 2 - c e l l s h a r v e s t e d 2 h r p i . m - m o c k - i n f e c t e d c e l l s . 2 4 - c e l l s h a r v e s t e d 2 4 h r p i . 5 4 F i g . 2 : MCMV DNA r e p l i c a t i o n i n 3 T 3 - L 1 , J 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f i b r o b l a s t 3 2 c e l l s . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( P ) l a b e l e d MCMV DNA h y b r i d i z e d t o c e l l d o t s . cell types 3T3-L1 % 0 J 7 7 4 A - l H F F 2 m 24 5 5 T a b l e I I : 3? CPM o f P l a b e l e d MCMV DNA h y b r i d i z e d t o d o t s o f m o c k , 2 a n d 2 4 h r M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 , J 7 7 4 A . 1 a n d h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s . C e l l T y p e T i m e ( h r ) p o s t - i n f e c t i o n c e l l s h a r v e s t e d M ( 2 ) 2 2 4 3 T 3 - L 1 1 3 1 1 2 0 9 3 2 4 7 0 5 J 7 7 4 A . 1 1 5 8 4 4 1 3 8 5 5 1 9 H F F 8 5 4 1 6 6 5 1 7 9 7 C e l l d o t s w e r e h y b r i d i z e d w i t h 1 0 c p m P MCMV D N A . C o u n t s w e r e n o r m a l i z e d t o n u m b e r s o f 3 T 3 - L 1 c e l l s . E a c h r e s u l t i s a m e a n o f f o u r e s t i m a t i o n s . 5 6 a f t e r t h e m e a n c . p . m . t h a t h y b r i d i z e d t o m o c k - i n f e c t e d c e l l s h a d b e e n s u b t r a c t e d f r o m b o t h f i g u r e s . T h e p o s i t i v e r e a c t i o n b e t w e e n m o c k - i n f e c t e d m u r i n e c e l l s a n d MCMV DNA a r o s e b e c a u s e t h e r e i s c r o s s h y b r i d i z a t i o n b e t w e e n MCMV DNA s e q u e n c e s a n d m u r i n e c e l l u l a r DNA ( u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n s ) . T h i s w a s n o t s e e n b e t w e e n MCMV DNA a n d h u m a n c e l l u l a r D N A . 5 . I d e n t i f i c a t i o n o f l a t e i n f e c t e d c e l l s p e c i f i c p r o t e i n s . T o c o n f i r m t h e a b s e n c e o f s i g n i f i c a n t a m o u n t s o f l a t e g e n e e x p r e s s i o n i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s , M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l p r o t e i n s w e r e l a b e l e d f r o m 2 8 - 3 2 h r p i . , t h e p e r i o d w h e n p e a k a m o u n t s o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s a r e k n o w n t o b e s y n t h e s i z e d ( C h a n t i e r a n d H u d s o n , 1 9 7 8 ) . T h e r i g h t s i d e o f t h e p h o t o g r a p h o f F i g . 3 , s h o w i n g t h e p r o t e i n s i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s , w a s o v e r e x p o s e d c o m p a r e d t o t h e l e f t s i d e , i n o r d e r t h a t t h e b a n d s c o u l d b e m o r e c l e a r l y s e e n . A l t h o u g h t h e s a m e n u m b e r s o f c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h t h e s a m e a m o u n t o f v i r u s i n 3 5 b o t h s a m p l e s , t h e a m o u n t o f ( S ) m e t h i o n i n e i n c o r p o r a t i o n w a s n o t i c a b l y l e s s i n t h e J 7 7 4 A . 1 c e l l s . On t h e g e l , e x t r a c t s f r o m e q u i v a l e n t n u m b e r s o f c e l l s w e r e e l e c t r o p h o r e s e d i n e a c h l a n e . F i g . 3 s h o w s t h a t a t l e a s t 1 0 d i s t i n c t i n f e c t e d c e l l p r o t e i n s w e r e d e t e c t e d i n n u c l e a r f r a c t i o n s o f i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s ( l a n e 3 ) , w h i l e n o n e o f t h e s e b a n d s w e r e p r e s e n t i n t h e e q u i v a l e n t s a m p l e f r o m i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s ( l a n e 7 ) . 57 Fig . 3: A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s , l a b e l e d t o d e t e c t l a t e p r o t e i n s , a n d s e p a r a t e d i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . C u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 c e l l s a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s w e r e m o c k ( M ) a n d M C M V - i n f e c t e d ( V ) ( m . o . i . 1 0 ) a n d l a b e l e d 2 8 - 3 2 h r p i . w i t h 3 5 ( S ) m e t h i o n i n e ( 2 5 p C i / m l ) . C e l l s w e r e s e p a r a t e d i n t o n u c l e a r ( n ) a n d c y t o p l a s m i c ( c ) f r a c t i o n s . L a n e s : 1 , 2 : M o c k - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l p r o t e i n s . 3 , 4 : V i r u s - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l p r o t e i n s . 5 , 6 : M o c k - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l p r o t e i n s . 7 , 8 : V i r u s - i n f e c t e d 0 7 7 4 A . 1 c e l l p r o t e i n s . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s . R i g h t _ 3 h a n d m a r g i n - p o s i t i o n s a n d m o l . w t . ( x 1 0 ) o f m a r k e r p r o t e i n s : 2 0 0 - m y o s i n ; 1 1 6 . 2 - 13 g a l a c t o s i d a s e ; 9 2 . 5 -p h o s p h o r y l a s e B ; 6 6 . 2 - b o v i n e s e r u m a l b u m i n ; 4 5 -o v a l b u m i n . 58 F i g . 3 : P r o t e i n s i n m o c k a n d i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s l a b e l e d  2 8 - 3 2 h r . p i . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f m o c k a n d i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l p r o t e i n s s e p a r a t e d i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . 5 9 6 . E a r l y p r o t e i n s y n t h e s i s o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s . I t h a d b e e n p r e v i o u s l y s h o w n t h a t s o m e v i r a l g e n e s w e r e e x p r e s s e d d u r i n g t h e f i r s t 4 h r o f i n f e c t i o n o f m u r i n e f i b r o b l a s t s b y M C M V , e v e n t h o u g h v i r i o n p r o t e i n s w e r e n o t d e t e c t e d u n t i l a p p r o x i m a t e l y 1 2 - 1 6 h r a f t e r i n f e c t i o n ( M i s r a e t a l _ . , 1 9 7 8 ; C h a n t i e r a n d H u d s o n , 1 9 7 8 ) . A s h o s t p r o t e i n s y n t h e s i s c o n t i n u e s a t a h i g h l e v e l d u r i n g t h e p e r i o d t h a t MCMV ' e a r l y ' p r o t e i n s a r e p r o d u c e d , t h e s t u d y o f t h e s e v i r a l p r o t e i n s h a s r e q u i r e d a t e c h n i q u e t h a t i n c r e a s e s t h e i r l e v e l s r e l a t i v e t o t h e h o s t p r o t e i n s . T h e t e c h n i q u e o f c y c l o h e x i m i d e b l o c k r e v e r s a l a l l o w e d e n h a n c e d l e v e l s o f v i r a l - i n d u c e d p r o t e i n s t o b e s y n t h e s i z e d . T r e a t m e n t o f i n f e c t e d c e l l s w i t h t h i s p r o t e i n s y n t h e s i s i n h i b i t o r i s b e l i e v e d t o c a u s e s e l e c t i v e e n r i c h m e n t o f s o m e c l a s s e s o f v i r a l mRNA o v e r h o s t c e l l mRNA ( J e a n g a n d G i b s o n , 1 9 8 0 ) . R e m o v a l o f c y c l o h e x i m i d e l e a d s t o t h e t r a n s l a t i o n o f t h e mRNA w i t h s y n t h e s i s o f h i g h e r a m o u n t s o f c e r t a i n v i r a l p r o t e i n s t h a n w o u l d n o r m a l l y b e f o u n d . T h i s t e c h n i q u e p e r m i t t e d d e t e c t i o n o f a d d i t i o n a l v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s a n d a v o i d e d t h e d i s a d v a n t a g e s o f i m m u n o p r e c i p i t a t i o n , w h e r e t h e r e i s a d a n g e r o f n o t d e t e c t i n g s o m e v i r a l p r o t e i n s . I n a d d i t i o n , v i r a l - i n d u c e d p r o t e i n s , s y n t h e s i z e d u p t o 6 h r a f t e r i n f e c t i o n , w e r e c h a r a c t e r i z e d w i t h t h e u s e o f t h r e e d i f f e r e n t g e l e l e c t r o p h o r e s i s s y s t e m s : 1 ) g r a d i e n t S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S O S - P A G E ) o f w h o l e c e l l l y s a t e s , 2 ) l i n e a r S D S - P A G E o f f r a c t i o n a t e d c e l l s a n d 3 ) n o n - e q u i l i b r i u m pH g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( N E P H G E ) - S D S - P A G E ( 2 D g e l e l e c t r o p h o r e s i s ) o f b o t h w h o l e c e l l a n d f r a c t i o n a t e d c e l l l y s a t e s . 7 . T i m e c o u r s e o f s y n t h e s i s o f e a r l y i n f e c t e d c e l l p r o t e i n s . C u l t u r e s 3 5 o f 3 T 3 - L 1 , m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d , w e r e l a b e l e d w i t h ( S ) m e t h i o n i n e f o r 1 h r a t 1 h r i n t e r v a l s f o l l o w i n g r e m o v a l o f a 3 h r c y c l o h e x i m i d e b l o c k ( w i t h 6 0 t h e e x c e p t i o n o f t h e 4 - 5 h r p i . p e r i o d ) . T h e t i m e p e r i o d s t u d i e d i s c o n s i d e r e d t o b e e q u i v a l e n t t o t h e f i r s t s i x h r a f t e r i n f e c t i o n . T h i s may b e a n o v e r s i m p l i f i c a t i o n , b u t a s p r o t e i n s y n t h e s i s d u r i n g c y c l o h e x i m i d e 35 t r e a t m e n t w a s r e d u c e d t o 0 . 3 - 0 . 7 % o f n o r m a l l e v e l s ( a s m e a s u r e d b y ( S ) m e t h i o n i n e i n c o r p o r a t i o n , d a t a n o t s h o w n ) , t h e c y c l o h e x i m i d e t r e a t m e n t w a s e f f e c t i v e i n i n h i b i t i n g m o s t p r o t e i n s y n t h e s i s . F i g . 4 s h o w s t h a t 1 4 v i r a l - i n d u c e d p r o t e i n s w e r e d e t e c t e d i n 3 T 3 - L 1 c e l l s o v e r t h e p e r i o d s t u d i e d . W i t h t h e o n e h r p u l s e l a b e l i n g o f c e l l s , i t c a n b e s e e n t h a t t h e v i r a l - i n d u c e d p r o t e i n s w e r e s y n t h e s i z e d i n t w o p h a s e s . T h e f i r s t g r o u p o f p r o t e i n s ( p r e l i m i n a r i l y d e s i g n a t e d i m m e d i a t e - e a r l y ( I E ) ) w e r e a l l d e t e c t e d w i t h i n 1 h r a f t e r t h e r e v e r s a l o f t h e c y c l o h e x i m i d e b l o c k a n d h a d e s t i m a t e d m o l . w t s . o f 1 0 0 K , 9 6 K , 8 9 K , 8 6 K , 8 3 . 5 K , 6 3 . 5 K , 5 2 . 5 K a n d 3 0 K . T h e 1 0 0 K a n d 8 9 K p r o t e i n s w e r e d r a m a t i c a l l y e n h a n c e d b y t h e c y c l o h e x i m i d e p r e t r e a t m e n t , w h i l e t h e o t h e r s w e r e e n h a n c e d t o a l e s s e r e x t e n t . T h e p e a k p e r i o d o f s y n t h e s i s o f t h e s e p r o t e i n s w a s d u r i n g t h e f i r s t 2 h r o f i n f e c t i o n . A s e c o n d g r o u p o f p r o t e i n s ( p r e l i m i n a r i l y d e s i g n a t e d e a r l y ) w e r e d e t e c t e d f o l l o w i n g 1 - 2 h r o f d e - n o v o p r o t e i n s y n t h e s i s , w i t h t h e i r p e a k p e r i o d o f s y n t h e s i s b e i n g d u r i n g t h e t h i r d h o u r o f i n f e c t i o n . T h e s e h a d e s t i m a t e d m o l . w t s . o f 6 0 K , 5 4 K , 5 1 . 5 K , 5 1 K , 3 9 K a n d 3 6 K . T h e i n i t i a l d e s i g n a t i o n o f v i r a l - i n d u c e d p r o t e i n s i n t o I E a n d e a r l y c l a s s e s o n t h e b a s i s o f t i m e o f a p p e a r a n c e c o u l d b e c o n s i d e r e d s o m e w h a t a r b i t r a r y a s t h e s w i t c h t o e a r l y g e n e e x p r e s s i o n a n d p r o t e i n s y n t h e s i s may b e o c c u r r i n g i n t h e f i r s t h r o f i n f e c t i o n . H o w e v e r , t h e p r o t e i n s i n l a n e s 1 a n d 2 ( F i g . 4 ) , w h i c h s h o w t h e s a m e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s , w e r e l a b e l e d a t t h e s a m e t i m e a n d i n t h e s a m e m a n n e r , e x c e p t t h a t s a m p l e s s h o w n i n l a n e 1 w e r e l a b e l e d i n t h e p r e s e n c e o f 1 0 u g / m l o f a c t i n o m y c i n D . T h i s w o u l d i n h i b i t e a r l y g e n e t r a n s c r i p t i o n f r o m o c c u r r i n g d u r i n g t h e l a b e l i n g p e r i o d . 61 Fig. 4: 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s s e p a r a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s i n a 1 0 - 3 0 % g r a d i e n t p o l y a c r y l a m i d e g e l . R e p l i c a t e c u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h M C M V , i n c u b a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e f o r 3 h r a t v a r i o u s t i m e s i n d i c a t e d a f t e r 3 5 i n f e c t i o n ( C H ) a n d t h e n l a b e l e d f o r 1 h r w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 y C i / m l ) a t t h e t i m e s i n d i c a t e d ( P U L S E ) . C l o s e d a r r o w h e a d s d e s i g n a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h t h e i r a p p a r e n t m o l . w t . ( x l O ) o n t h e l e f t s i d e . L a n e 1 : p r o t e i n s i n M C M V - i n f e c t e d c e l l s l a b e l e d i n t h e p r e s e n c e o f 1 0 y g / m l a c t i n o m y c i n D. L a n e s 2 . t h r o u g h 6 : p r o t e i n s i n M C M V - i n f e c t e d c e l l s l a b e l e d a t t h e t i m e s i n d i c a t e d . L a n e 7 . p r o t e i n s i n m o c k - i n f e c t e d c e l l s . 62 EliL 4: Proteins synthesized n A h~ a.Y"inesi7eq 0 ^ hr p i . in 3T3-L1 c e l l s A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f l a o e l e d p r o t e i n , f n m m c k a n d H C M V . 1 n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c . l l s s e p a r a t e d i n a 1 0 - 3 0 * g r a d i e n t p o l y a c r y l a m i d e g e l . CH Q-3 0-3 1-4 2-5 3-6 5-8 5-8 PULSE 3-4u3-4 4-5 5~6 6-7 8-9 8-9 1 2 3 4 5 6 7 6 3 T h i s i n d i c a t e d t h a t t h e r e w a s n o t a n i m m e d i a t e o v e r l a p b e t w e e n s y n t h e s i s o f t h e t w o g r o u p s o f p r o t e i n s a n d d e l i n e a t i o n i n t o I E a n d e a r l y p r o t e i n c l a s s e s o n t h e b a s i s o f t i m e o f a p p e a r a n c e i s p o s s i b l e . S i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d w i t h o t h e r CMVs ( G i b s o n , 1 9 8 1 ) , l a r g e a m o u n t s o f a d o m i n a n t ' I E ' p r o t e i n ( 1 0 0 K ) w e r e s y n t h e s i z e d i n M C M V - i n f e c t e d c e l l s i m m e d i a t e l y a f t e r t h e r e v e r s a l o f a c y c l o h e x i m i d e b l o c k t h a t w a s p r e s e n t a t t h e t i m e o f i n f e c t i o n . H o w e v e r , t h e p r e s e n c e o f a s e c o n d a r y m a j o r MCMV ' I E 1 p r o t e i n ( 8 9 K ) , s e p a r a t e f r o m t h e o t h e r p r o t e i n b a n d , i s a f e a t u r e t h a t h a s n o t b e e n o b s e r v e d w i t h t h e h u m a n a n d s i m i a n CMV s t r a i n s . T h e p r e s e n c e o f a p r o t e i n i n t e r m e d i a t e b e t w e e n t h e m a j o r ' I E ' p r o t e i n s i s a l s o d i s t i n c t l y d i f f e r e n t f r o m w h a t h a s b e e n o b s e r v e d w i t h H C M V . E v i d e n c e w i l l b e s h o w n t h a t t h i s p r o t e i n h a s d i f f e r e n t p r o p e r t i e s f r o m t h e TOOK a n d 8 9 K p r o t e i n s . T h e p r e s e n c e o f a n u m b e r o f m i n o r ' I E ' p r o t e i n s ( 6 3 . 5 K , 5 2 . 5 K a n d 3 0 K ) w a s s i m i l a r t o t h a t s e e n w i t h HCMV ( G i b s o n , 1 9 8 1 ) . T h e p r o t e i n s o f 8 6 K a n d 8 3 . 5 K m a y r e p r e s e n t p r o t e o l y t i c b r e a k d o w n p r o d u c t s o f t h e m a j o r ' I E ' p r o t e i n s , t h o u g h t h e s e b a n d s w e r e d e t e c t e d c o n s i s t e n t l y i n a n u m b e r o f e x p e r i m e n t s , a n d i n a d d i t i o n , l a b e l e d s a m p l e s w e r e p r o c e s s e d i n t h e p r e s e n c e o f P M S F , a n i n h i b i t o r o f p r o t e o l y t i c e n z y m e s . F i g . 5 s h o w s t h e p r o t e i n s t h a t w e r e i n d u c e d i n M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s u n d e r t h e s a m e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s a s F i g . 4 . I t c a n b e s e e n t h a t t h e s a m e n u m b e r o f ' I E ' a n d ' e a r l y ' p r o t e i n s , w i t h t h e s a m e e s t i m a t e d m o l . w t s . , w e r e s y n t h e s i z e d i n t h e s e c e l l s a s i n 3 T 3 - L 1 c e l l s . T h e s e q u e n c e o f p r o t e i n s y n t h e s i s a p p e a r e d t o b e t h e s a m e i n t h e s e c e l l s , n a m e l y t h e p r e s e n c e o f t w o p h a s e s o f i n d u c e d p r o t e i n s y n t h e s i s , e x c e p t t h a t t h e p r o t e i n s d e s i g n a t e d a s e a r l y c o u l d b e d e t e c t e d d u r i n g t h e s e c o n d h r o f i n f e c t i o n . T h i s i s f e l t t o r e p r e s e n t a n e x p e r i m e n t a l v a r i a t i o n r a t h e r t h a n o n e o f b i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e . T h e t i m e t a k e n t o h a n d l e t h e s e c e l l s , 6 4 F i g . 5 : 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k ( M ) a n d MCMV ( V ) - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s s e p a r a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s i n a 1 0 - 3 0 % g r a d i e n t p o l y a c r y l a m i d e g e l . R e p l i c a t e c u l t u r e s o f J 7 7 4 A . 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h M C M V , i n c u b a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e f o r 3 h r a t v a r i o u s t i m e s i n d i c a t e d a f t e r i n f e c t i o n ( C H ) a n d t h e n l a b e l e d f o r 1 h r w i t h 3 5 ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 p C i / m l ) a t t h e t i m e s i n d i c a t e d ( P U L S E ) . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s _ 3 w i t h t h e i r a p p a r e n t m o l . w t . ( x l O ) o n t h e l e f t s i d e . L a n e s 1 t h r o u g h 5 : p r o t e i n s i n M C M V - i n f e c t e d c e l l s l a b e l e d a s i n d i c a t e d . L a n e 6 : p r o t e i n s o f m o c k - i n f e c t e d c e l l s . 6 5 F i g . 5 : P r o t e i n s s y n t h e s i z e d 0 - 6 h r p i . i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k ( M ) a n d MCMV ( V ) - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s s e p a r a t e d i n a 1 0 - 3 0 % g r a d i e n t p o l y a c r y l a m i d e g e l . V M _ CH 3-6 0-3 1-4 2-5 5-8 5-8 PULSE 6-7 3-4 4-5 5-6 8-9 8-9 100 • 96 30 4 1 2 3 5 6 6 6 c o m p a r e d t o t h e 3 T 3 - L 1 c e l l s , w h e n r i n s i n g t o r e m o v e t h e c y c l o h e x i m i d e , w a s l o n g e r . T h i s w a s b e c a u s e t h e i n f e c t e d c e l l s d i d n o t a d h e r e s t r o n g l y t o t h e p e t r i d i s h e s . T h e y h a d t o b e r i n s e d s l o w l y a n d t h e c e l l s t h a t h a d b e e n d i s l o d g e d h a d t o b e r e c o v e r e d b y c e n t r i f u g a t i o n . D u r i n g t h e r i n s i n g t i m e ( 1 0 - 1 5 m i n ) , t h e c e l l s w i l l h a v e r e s t a r t e d p r o t e i n s y n t h e s i s . T h i s t i m e w a s n o t a c c o u n t e d f o r i n t h e l a b e l i n g p e r i o d . I t c a n a l s o b e s e e n t h a t t h e m o l . w t . o f t h e 9 6 K p r o t e i n i n c r e a s e d s l i g h t l y f r o m l a n e s 1 t o 3 i n F i g . 5 . T h i s w a s a l s o s e e n i n s o m e e x p e r i m e n t s w i t h 3 T 3 - L 1 c e l l s , a l t h o u g h n o t e v i d e n t i n F i g . 4 . T h e p r o c e s s i n g o f t h i s p r o t e i n w i l l b e d i s c u s s e d i n a n o t h e r s e c t i o n . B y 6 h r a f t e r i n f e c t i o n , t h e t o t a l a m o u n t o f v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s y n t h e s i s h a d d e c l i n e d t o a l o w l e v e l . F i g . ' 6 s h o w s t h e t i m e c o u r s e o f s y n t h e s i s o f v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s t h a t w e r e d e t e c t e d i n b o t h c e l l t y p e s , b y g r a d i e n t g e l e l e c t r o p h o r e s i s . 8 . D e f i n i t i o n o f i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y p r o t e i n s . H e r p e s v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s h a v e t r a d i t i o n a l l y b e e n c l a s s i f i e d i n t o i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y c l a s s e s a c c o r d i n g t o t h e i r s y n t h e s i s i n t h e p r e s e n c e o f c e r t a i n m e t a b o l i c i n h i b i t o r s ( H o n e s s a n d R o i z m a n , 1 9 7 4 ) . I n t h e s e e x p e r i m e n t s , MCMV I E p r o t e i n s w e r e d e f i n e d a s t h o s e s y n t h e s i z e d i n c e l l s t h a t h a d b e e n i n f e c t e d a n d m a i n t a i n e d i n t h e p r e s e n c e o f c y c l o h e x i m i d e 3 5 a n d t h e n l a b e l e d w i t h ( S ) m e t h i o n i n e i n t h e p r e s e n c e o f a c t i n o m y c i n D. E a r l y p r o t e i n s w e r e d e f i n e d a s t h o s e s y n t h e s i z e d i n c e l l s t h a t h a d b e e n i n f e c t e d a n d l a b e l e d f r o m 2 - 5 h r p i . w h i l e m a i n t a i n e d i n t h e p r e s e n c e o f t h e v i r a l DNA s y n t h e s i s i n h i b i t o r p h o s p h o n o a c e t i c a c i d ( 1 0 0 ug / m l ) a n d s e p a r a t e f r o m t h o s e d e f i n e d a s I E p r o t e i n s ( t h i s p r o c e d u r e a l s o d e t e c t e d s y n t h e s i s o f s o m e I E p r o t e i n s ) . F i g s . 7 A a n d 7 B s h o w t h e p r o t e i n s i n d u c e d u n d e r t h e c o n d i t i o n s 6 7 . 6 : T i m e c o u r s e o f s y n t h e s i s o f M C M V - i n d u c e d p r o t e i n s d e t e c t e d i n i n f e c t e d 3 I 3 _ z k ] a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s . ( d a t a t a k e n f r o m F i g . 4 a n d 5 r e s p e c t i v e l y ) . T h e t i m e o f c y c l o h e x i m i d e t r e a t m e n t i s n o t i n c l u d e d . B l a c k b a r s d e s i g n a t e t i m e p r o t e i n s w e r e d e t e c t e d i n b o t h c e l l t y p e s ; b r o k e n b a r s d e s i g n a t e t i m e p r o t e i n s w e r e d e t e c t e d i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s o n l y . TIME/hrs. 2 3 4 5 6 100 96 89 86 83-5 655 60 54 5£5 515 51 39 36 30 Mol o wt.xlO""1 1 6 8 d e s c r i b e d a n d s e p a r a t e d o n g e l s o f t w o d i f f e r e n t a c r y l a m i d e c o n c e n t r a t i o n s ( F i g . 7 A - 7 . 5 % ; 7 B - 1 0 % ) ( N o t a l l t h e v i r u s - i n d u c e d b a n d s a r e m a r k e d i n e a c h l a n e ) . T h e 1 0 0 K a n d 9 6 K I E p r o t e i n s w e r e o n l y c l e a r l y r e s o l v e d a s s e p a r a t e b a n d s b y e l e c t r o p h o r e s i s o n t h e 7 . 5 % p o l y a c r y l a m i d e g e l ( F i g . 7 A ) . B y t h e s e p r o c e d u r e s , t e n n e w l y s y n t h e s i z e d p r o t e i n s w i t h m o l . w t s . o f 1 0 0 K , 9 6 K , 8 9 K , 8 6 K , 8 3 . 5 K , 8 0 K , 6 3 . 5 K , 5 2 . 5 K , 3 0 K a n d 2 8 K c o u l d b e c l a s s i f i e d a s I E a n d t h r e e w i t h m o l . w t s . o f 9 1 K , 3 9 K a n d 3 6 K a s e a r l y c l a s s . T h e e a r l y p r o t e i n s o f 6 0 K , 5 4 K , 5 1 . 5 K a n d 5 1 K , w h i c h h a d b e e n d e t e c t e d o n g r a d i e n t g e l s , w e r e n o t d e t e c t e d u s i n g t h e s e p r o c e d u r e s . T h e I E p r o t e i n s o f m o l . w t s . o f 8 0 K a n d 2 8 K a n d t h e e a r l y p r o t e i n o f 9 1 K h a d n o t b e e n d e t e c t e d i n t h e p r e v i o u s e x p e r i m e n t s t h a t h a d a n a l y z e d w h o l e c e l l l y s a t e s b y g r a d i e n t P A G E . T h e e x p e r i m e n t s t h a t i n d i c a t e t h e 9 1 K p r o t e i n t o b e a s e p a r a t e e a r l y g e n e p r o d u c t w i l l b e d i s c u s s e d i n a l a t e r s e c t i o n . I n i t i a l o b s e r v a t i o n s c a n b e m a d e o n t h e p a r t i t i o n i n g o f t h e s e p r o t e i n s w i t h i n t h e i n f e c t e d c e l l . W i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e 8 0 K p r o t e i n , w h i c h w a s o n l y f o u n d i n c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s , t h e o t h e r p r o t e i n s w e r e a s s o c i a t e d w i t h t h e n u c l e a r ( a n d / o r c y t o s k e l e t a l f r a m e w o r k ) f r a c t i o n s . T h e e f f i c i e n c y w i t h w h i c h t h e y p a r t i t i o n e d o u t o f t h e s o l u b l e c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s v a r i e d b e t w e e n p r o t e i n s . T h e 9 1 K , 3 9 K a n d 3 6 K p r o t e i n s p a r t i t i o n e d c o m p l e t e l y w i t h t h e n u c l e a r f r a c t i o n s a n d w e r e n o t d e t e c t e d i n t h e c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s . T h e 1 0 0 K , 8 9 K , 8 3 . 5 K , 6 3 . 5 K , 5 2 . 5 K , 3 0 K a n d 2 8 K w e r e p r e s e n t i n a h i g h e r p r o p o r t i o n i n t h e c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s , w h i l e t h e 9 6 K a n d 8 6 K p r o t e i n s w e r e p r e s e n t i n a h i g h e r p r o p o r t i o n i n t h e n u c l e a r f r a c t i o n s . I t w a s n o t i c e d t h a t M C M V - i n f e c t e d c e l l s t h a t h a d b e e n t r e a t e d w i t h a c t i n o m y c i n D t o p r e v e n t e a r l y g e n e e x p r e s s i o n d i d n o t e x h i b i t a t y p i c a l e a r l y c y t o p a t h i c e f f e c t , e v e n t h o u g h t h e a m o u n t s o f I E p r o t e i n s w e r e s u f f i c i e n t l y e l e v a t e d s u c h t h a t t h e 1 0 0 K a n d 8 9 K I E p r o t e i n s c o u l d b e 69 F i g . 7 : 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e s o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s s e p a r a t e d i n 7 . 5 % ( A ) a n d 1 0 % ( B ) p o l y a c r y l a m i d e g e l s . T o i d e n t i f y i m m e d i a t e - e a r l y ( I E ) p r o t e i n s , r e p l i c a t e c u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV a n d t r e a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e 0 - 3 h r p i . C e l l s 3 5 w e r e l a b e l e d 3 h r w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 y C i / m l ) i n t h e p r e s e n c e o f a c t i n o m y c i n D. T o i d e n t i f y e a r l y ( E ) p r o t e i n s , r e p l i c a t e c u l t u r e s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV i n t h e p r e s e n c e o f p h o s p h o n o a c e t a t e a n d l a b e l e d 2 - 5 h r p i . w i t h 3 5 ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 p C i / m l ) i n t h e p r e s e n c e o f p h o s p h o n o a c e t a t e . L a n e s : 1 - 4 : p r o t e i n s i n n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k ( m ) a n d v i r u s - i n f e c t e d ( v ) c e l l s l a b e l e d u n d e r I E a n d E c o n d i t i o n s . 5 - 8 : p r o t e i n s i n c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f m o c k ( m ) a n d v i r u s - i n f e c t e d ( v ) c e l l s l a b e l e d u n d e r I E a n d E c o n d i t i o n s . V i r u s - i n d u c e d I E p r o t e i n s a r e d e s i g n a t e d b y c l o s e d a r r o w h e a d s a n d e a r l y p r o t e i n s b y o p e n _ 3 a r r o w h e a d s w i t h t h e i r a p p a r e n t m o l . w t . ( x l O ) o n t h e s i d e s . 7 0 F i g . 7 : I d e n t i f i c a t i o n a n d l o c a t i o n o f I E a n d e a r l y MCMV p r o t e i n s . P r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s s e p a r a t e d i n 7 . 5 % ( A ) a n d 1 0 % ( B ) p o l y a c r y l a m i d e g e l s . 71 F i g - 7 ( B ) . 7 2 d e t e c t e d o n C o o m a s s i e b l u e s t a i n e d g e l s ( n o t s h o w n ) . T h e s e e x p e r i m e n t s c o n f i r m e d t h e p r e v i o u s c l a s s i f i c a t i o n o f t h e p r o t e i n s i n t o I E a n d e a r l y c l a s s e s o n t h e b a s i s o f t i m e o f s y n t h e s i s . T h e s e d e s i g n a t i o n s w i l l b e u s e d e v e n f o r p r o t e i n s t h a t w e r e n o t d e t e c t e d i n t h i s s e t o f e x p e r i m e n t s ( 6 0 K , 5 4 K , 5 1 . 5 K a n d 5 1 K ) . We h a v e n o t i c e d , i n t h i s a n d a l s o l a t e r e x p e r i m e n t s , t h a t t h e 6 3 . 5 K p r o t e i n m i g r a t e d i n a n a n o m a l o u s m a n n e r o n d i f f e r e n t g e l s . T h i s w a s s e e n i n F i g . 7 A ( l a n e 2 ) w h e r e i t h a d a p o s i t i o n a b o v e t h e h o s t n u c l e a r p r o t e i n a n d i n F i g . 7 B ( l a n e 2 ) , w h e r e i t s p o s i t i o n w a s b e l o w t h i s b a n d . I n o t h e r s a m p l e s , i t s m o l . w t . h a s v a r i e d f r o m 5 6 K t o 6 3 . 5 K . T h e 6 3 . 5 K e s t i m a t i o n ( o b t a i n e d f r o m g r a d i e n t g e l e s t i m a t i o n s , w h e r e m i g r a t i o n p a t t e r n s r e m a i n e d c o n s t a n t ) w i l l b e u s e d t o d e s i g n a t e t h i s p r o t e i n e v e n t h o u g h t h i s w i l l a p p e a r a n o m a l o u s i n s o m e c a s e s . I t w a s n o t p o s s i b l e t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e r e w e r e d i f f e r e n t p r o t e i n s b e i n g d e t e c t e d o r w h e t h e r t h e s a m e p r o t e i n c o u l d m i g r a t e d i f f e r e n t l y . 9 . I m m u n o p r e c i p i t a t i o n . T o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e p r o t e i n s b e i n g s t u d i e d w e r e v i r u s - s p e c i f i c , p r o t e i n s f r o m i n f e c t e d c e l l s w e r e p r e c i p i t a t e d w i t h s e r u m d e r i v e d f r o m M C M V - i n f e c t e d m i c e . A s t h e s e p r o t e i n s a r e o n l y p r o d u c e d i n s m a l l a m o u n t s d u r i n g t h e n o r m a l i n f e c t i o u s c y c l e , h i g h t i t e r s o f a n t i b o d i e s t o t h e m d o n o t a r i s e i n i n f e c t e d m i c e . A n t i b o d i e s o b t a i n e d f r o m m i c e f o l l o w i n g a c u t e MCMV i n f e c t i o n ( t a k e n 2 8 d a y s p i . ) c o u l d o n l y p r e c i p i t a t e t h e 1 0 0 K I E p r o t e i n ( d a t a n o t s h o w n ) . M o r e ' p o t e n t ' a n t i s e r a w e r e o b t a i n e d f r o m m i c e t h a t w e r e c h r o n i c a l l y i n f e c t e d w i t h MCMV ( t a k e n 6 m o n t h s p i . ) . A l t h o u g h i t s t i l l d i d n o t h a v e s t r o n g a c t i v i t y , a n u m b e r o f c h a r a c t e r i z e d I E a n d e a r l y p r o t e i n s w e r e p r e c i p i t a t e d w i t h t h e s e a n t i s e r a . F i g . 8 A s h o w s t h e p r e c i p i t a t i o n o f p r o t e i n s d e r i v e d f r o m c e l l s l a b e l e d 7 3 t o d e t e c t I E p r o t e i n s ( l a n e s 1 a n d 2 ) a n d e a r l y p r o t e i n s ( l a n e s 3 a n d 4 ) T h e p r o t e i n s w e r e o n l y p r e c i p i t a t e d w i t h s e r u m f r o m M C M V - i n f e c t e d a n i m a l s . 3 D u e t o l o w a m o u n t s o f r a d i o a c t i v i t y , t h e g e l w a s t r e a t e d w i t h E n H a n c e t o s h o r t e n t h e e x p o s u r e t i m e n e c e s s a r y . T h i s a c c o u n t s f o r t h e d i f f u s e n e s s o f t h e b a n d s o n t h e a u t o r a d i o g r a m . T w o s t r o n g b a n d s c o v e r i n g t h e p o s i t i o n s o f t h e 1 0 0 K a n d 9 6 K p r o t e i n s a n d 8 9 K a n d 8 6 K p r o t e i n s , r e s p e c t i v e l y , a n d f a i n t b a n d s c o r r e s p o n d i n g t o t h e 3 0 K a n d 2 8 K w e r e d e t e c t e d ( l a n e 2 ) . T h e u n l a b e l e d b a n d ( l a n e 2 ) d o e s n o t c o r r e s p o n d t o a n i d e n t i f i e d v i r a l - i n d u c e d p r o t e i n , b u t h a s a n e s t i m a t e d m o l . w t . o f 4 3 - 4 4 K ( e q u i v a l e n t t o a c t i n ) . A d i f f u s e b a n d c o r r e s p o n d i n g t o t h e p o s i t i o n s o f p r o t e i n s o f 5 4 K , 5 1 . 5 K a n d 5 1 K w a s d e t e c t e d , a s w e r e b a n d s c o r r e s p o n d i n g t o t h e e a r l y p r o t e i n s 3 9 K a n d 3 6 K . I n F i g . 8 B , t h e a u t o r a d i o g r a m s h o w e d t h a t t h e 1 0 0 K , 9 6 K , 8 9 K a n d 8 6 K c o u l d b e s e p a r a t e l y i d e n t i f i e d a f t e r p r e c i p i t a t i o n . T h e 3 9 K a n d 3 6 K p r o t e i n s w e r e n o t d e t e c t e d , b u t a d i f f e r e n t a n t i s e r a p o o l h a d b e e n u s e d i n t h i s e x p e r i m e n t f r o m t h a t u s e d i n F i g . 8 A . 1 0 . T w o - d i m e n s i o n a l a n a l y s i s o f i n f e c t e d c e l l p r o t e i n s . T o m o r e c l e a r l y r e s o l v e t h e c o m p l e x m i x t u r e s o f p r o t e i n s , t w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n s o f i n f e c t e d c e l l l y s a t e s , l a b e l e d a t I E a n d e a r l y t i m e s ( d e t a i l s i n F i g . 9 l e g e n d ) , w e r e c a r r i e d o u t . A u t o r a d i o g r a m s o f t w o - d i m e n s i o n a l g e l s o f MCMV i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s , s h o w n i n F i g s . 9 a n d 1 0 r e s p e c t i v e l y , i l l u s t r a t e a n u m b e r o f s p o t s t h a t i d e n t i f i e d w i t h v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s . T h e y w e r e i d e n t i f i e d b y t h e i r a b s e n c e o n c o r r e s p o n d i n g g e l s o f l y s a t e s p r e p a r e d f r o m m o c k - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s ( F i g . 9 C ) a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s ( n o t s h o w n ) a n d b y h a v i n g a s e c o n d d i m e n s i o n a l m o b i l i t y e q u i v a l e n t t o t h a t o f v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s o n o n e d i m e n s i o n a l g e l s . 7 4 Fig. 8: 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e s o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s i m m u n o p r e c i p i t a t e d f r o m M C M V - i n f e c t e d c e l l s a n d s e p a r a t e d i n 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l s . A : C u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV a n d t r e a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e 0 - 3 h r p i . ( l a n e s 1 , 2 ) o r 2 - 5 h r p i . ( l a n e s 3 , 4 ) a n d t h e n l a b e l e d 1 h r 3 5 w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 y C i / m l ) . C e l l e x t r a c t s w e r e p r e c i p i t a t e d w i t h MCMV a n t i b o d y p o s i t i v e ( + ) a n d n e g a t i v e ( - ) s e r u m a s d e s c r i b e d i n t e x t . B : C u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV o r 3 5 m o c k - i n f e c t e d a n d l a b e l e d 1 - 4 h r p i . w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 y C i / m l ) . L a n e s : 1 , p r o t e i n s f r o m v i r u s - i n f e c t e d c e l l e x t r a c t p r e c i p i t a t e d w i t h MCMV a n t i b o d y n e g a t i v e s e r u m ( - ) ; 2 , p r o t e i n s f r o m m o c k - i n f e c t e d c e l l e x t r a c t p r e c i p i t a t e d w i t h MCMV a n t i b o d y p o s i t i v e s e r u m ( + ) ; 3 - 5 , p r o t e i n s f r o m M C M V - i n f e c t e d c e l l e x t r a c t s p r e c i p i t a t e d w i t h MCMV a n t i b o d y p o s i t i v e s e r u m ( + ) ( 5 , 1 0 a n d 2 0 y l r e s p e c t i v e l y ) . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h c o r r e s p o n d i n g _ 3 m o l . w t . ( x l O ) 75 F i g . 8: P r o t e i n s i m m u n o p r e c i p i t a t e d f r o m M C M V - i n f e c t e d c e l l s w i t h i m m u n e  m o u s e s e r u m . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e s o f l a b e l e d p r o t e i n s i m m u n o p r e c i p i t a t e d f r o m M C M V - i n f e c t e d c e l l s a n d s e p a r a t e d i n 10% p o l y a c r y l a m i d e g e l s . » 30 • 28 76 F i g . 9: 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e s o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s s e p a r a t e d i n t w o d i m e n s i o n s b y e l e c t r o p h o r e s i s . 3 T 3 - L 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV a n d i n c u b a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e f r o m : A ) 0 - 3 h r a n d B ) 2 - 5 h r 3 5 p i . , a n d t h e n l a b e l e d 1 h r w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 u C i / m l ) . F i r s t d i m e n s i o n w a s r u n f r o m a c i d i c t o b a s i c e n d s f o r 3 0 0 0 V . h . . A r r o w s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h _ 3 t h e i r a p p a r e n t m o l . w t . ( x l O ) . P r o m i n e n t c e l l u l a r p r o t e i n s a r e i n d i c a t e d ( h ^ , a c t i n ) . C ) 3 T 3 - L 1 c e l l s w e r e m o c k - i n f e c t e d a n d i n c u b a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e f r o m 0 - 3 h r 3 5 p i . a n d t h e n l a b e l e d 1 h r w i t h ( S ) m e t h i o n i n e . 77 F i g - 9 : T w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n o f p r o t e i n s i n M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1  c e l l s a t i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y t i m e s a n d m o c k - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s . c acidic basic 7 9 IP.: 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e s o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s s e p a r a t e d i n t w o d i m e n s i o n s b y e l e c t r o p h o r e s i s . J 7 7 4 A . 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV a n d i n c u b a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e f r o m : A ) 0 - 3 h r a n d B ) 2 - 5 h r 3 5 p i . , t h e n l a b e l e d 1 h r w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 u C i / m l ) . C ) w a s p r e p a r e d a s B ) b u t w a s t a k e n f r o m a d i f f e r e n t g e l . F i r s t d i m e n s i o n w a s r u n f r o m a c i d i c t o b a s i c e n d s f o r 3 0 0 0 V . h . . A r r o w s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h t h e i r _ 3 a p p a r e n t m o l . w t . ( x l O ) . 8 0 F i g . 1 0 : T w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n o f p r o t e i n s i n M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1  c e l l s a t i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y t i m e s . c 81 S o m e p r o t e i n s d e t e c t e d b y S D S - P A G E a r e n o t a p p a r e n t o n t h e s e a u t o r a d i o g r a m s . T h i s w a s p r o b a b l y d u e t o t h e i r i n s o l u b i l i t y i n t h e u r e a l y s i s b u f f e r . T h e I E p r o t e i n s o f 1 0 0 K a n d 8 9 K w e r e p o o r l y s o l u b l e i n t h e f i r s t d i m e n s i o n l y s i s b u f f e r a s t h e y c o n s i s t e n t l y a p p e a r e d a s s t r e a k s o n t h e 2D g e l s ( F i g s . 9 A a n d 1 0 A ) . H o w e v e r , t h e m a i n p o s i t i o n o f t h e s e s p o t s c a n b e s e e n ( F i g . a r r o w h e a d s ) o n t h e a c i d i c s i d e o f t h e g e l s . T h e 9 6 K p r o t e i n c a n b e s e e n i n e a c h c a s e a s a d i f f u s e , b a s i c s p o t . T h e 8 6 K I E p r o t e i n h a d a s i m i l a r t w o d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n p a t t e r n t o t h e 1 0 0 K a n d 8 9 K p r o t e i n s . T h e 6 3 . 5 K I E p r o t e i n w a s s h o w n t o h a v e a n a c i d i c n e t c h a r g e ( F i g . 1 0 A ) . A l t h o u g h n o t d e t e c t a b l e i n F i g . 9 A , t h i s p r o t e i n h a s b e e n s e e n i n o t h e r g e l s o f i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l p r o t e i n s . Two s p o t s , m a r k e d ' a ' a n d ' b ' , w e r e s e e n o n g e l s o f i n f e c t e d c e l l p r o t e i n s o n l y ( F i g . 9 A a n d 1 0 A ) , b u t b e c a u s e o f t h e i r c l o s e n e s s i n s i z e t o a c t i n , t h e y w e r e n e v e r d e t e c t e d b y S D S - P A G E a l o n e . A t p r e s e n t , i t i s n o t p o s s i b l e t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e y a r e I E v i r a l - c o d e d p r o t e i n s o r i n d u c e d c e l l u l a r p r o t e i n s , a l t h o u g h a b a n d o f a p p r o x i m a t e l y t h i s s i z e w a s d e t e c t e d b y i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( F i g . 8 A , l a n e 2 ) . S p o t s c o r r e s p o n d i n g t o t h e 8 3 . 5 K a n d 8 0 K I E p r o t e i n s c o u l d n o t b e i d e n t i f i e d i n e i t h e r c a s e o n t h e s e g e l s . T h e 9 1 K e a r l y p r o t e i n w a s i d e n t i f i e d a s a h o r i z o n t a l s t r e a k o n t h e b a s i c s i d e o f t h e g e l s ( F i g s . 9 B a n d 1 0 B ) . T h i s p r o b a b l y i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f s e v e r a l c h a r g e i s o m e r s t h a t w e r e n o t b e i n g f u l l y r e s o l v e d . T h e r e a p p e a r e d t o b e t w o c h a r g e i s o m e r s i n p o s i t i o n s e q u i v a l e n t t o t h e 3 9 K e a r l y p r o t e i n a n d t h r e e c o r r e s p o n d i n g t o t h e 3 6 K e a r l y p r o t e i n ( F i g s . 9 B a n d 1 0 B ) . S p o t s m a r k e d ' e ' o n F i g . 9 A r e f e r t o e a r l y p r o t e i n s w h o s e s y n t h e s i s h a s p a r t i a l l y o v e r l a p p e d w i t h t h e I E t i m e p e r i o d . T h e 5 4 K e a r l y p r o t e i n a p p e a r e d a s a d i f f u s e s p o t o n t h e b a s i c s i d e o f t h e g e l s i n b o t h c a s e s , w h i l e t h e r e w e r e t w o s e t s o f t w i n s p o t s t h a t c o r r e s p o n d e d t o t h e 8 2 5 1 . 5 K a n d 5 1 K e a r l y p r o t e i n s ( F i g s . 9 B a n d 1 0 B ) . T h i s i s s e e n m o r e c l e a r l y i n F i g . 1 0 C t h a t w a s t a k e n f r o m t h e a p p r o p r i a t e s e c t i o n o f a n o t h e r g e l . I n s u m m a r y , i t c a n b e s e e n t h a t t h e r e w a s n o d i f f e r e n c e , b e t w e e n t h e t w o c e l l t y p e s , i n t h e t w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n o f t h e m a j o r i n d u c e d p r o t e i n s . 1 1 . S t a b i l i t y a n d p r o c e s s i n g o f t h e I E p r o t e i n s . A s e r i e s o f e x p e r i m e n t s w a s p e r f o r m e d t o s t u d y t h e p r o p e r t i e s o f t h e i d e n t i f i e d v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s . T h e f i r s t e x p e r i m e n t w a s d e s i g n e d t o s t u d y t h e s t a b i l i t y a n d p r o c e s s i n g o f t h e m a i n I E p r o t e i n s . F i g . 11 s h o w s a p u l s e / c h a s e e x p e r i m e n t p e r f o r m e d w i t h 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s t h a t h a d b e e n t r e a t e d s o a s t o p r o d u c e e n h a n c e d a m o u n t s o f l a b e l e d I E p r o t e i n s ( d e t a i l s i n F i g . l e g e n d ) . T h e I n t e n s i t i e s o f t h e b a n d s w e r e m e a s u r e d b y s c a n n i n g d e n s i t o m e t r y a n d t h e a r e a s u n d e r e a c h p e a k w e r e c a l c u l a t e d . T h e i n t e n s i t i e s o f t h e 9 6 K p r o t e i n i n t h e 3 T 3 - L 1 s a m p l e d e c r e a s e d b y 6 9 . 7 % a f t e r t h e c h a s e p e r i o d a n d b y 77% i n s a m p l e s f r o m J 7 7 4 A . 1 c e l l s . T h e i n t e n s i t i e s o f t h e TOOK a n d 8 9 K r e m a i n e d w i t h i n 1 5 % o f i n i t i a l v a l u e s w h i l e t h e i n t e n s i t i e s o f t h e 8 6 K p r o t e i n s i n c r e a s e d b y 2 2 . 8 % i n 3 T 3 - L 1 c e l l s a n d b y 3 3 % i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s . I t i s n o t k n o w n i f t h e 9 6 K p r o t e i n s w e r e d e g r a d e d o r p r o c e s s e d t o t h e 8 6 K f o r m . A s w a s s e e n , t h e 8 6 K p r o t e i n h a d a n a c i d i c n e t c h a r g e ( F i g . 9 A ) , s i m i l a r t o t h e TOOK a n d 8 9 K p r o t e i n , w h i l e t h e 9 6 K p r o t e i n h a d a b a s i c n e t c h a r g e . T h e r e w a s n o a p p e a r a n c e o f n e w b a n d s d u r i n g t h e c h a s e p e r i o d . 1 2 . D i s t r i b u t i o n o f I E a n d e a r l y p r o t e i n s w i t h i n i n f e c t e d c e l l s . T h e d i s t r i b u t i o n o f v i r a l - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h i n i n f e c t e d c e l l s , p a r t i c u l a r l y t h e i r d i s t r i b u t i o n a t t h e t i m e o f i n i t i a t i o n o f v i r a l DNA s y n t h e s i s , m i g h t 8 3 11: 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d MCMV i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s s e p a r a t e d i n a 1 0 - 3 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . R e p l i c a t e c u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV ( V ) o r m o c k - i n f e c t e d ( M ) , i n c u b a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e 0 - 3 h r p i . a n d t h e n l a b e l e d 3 5 1 h r w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 p C i / m l ) . A t 4 h r p i , o n e c u l t u r e w a s h a r v e s t e d . A d u p l i c a t e w a s w a s h e d a n d i n c u b a t e d f o r a f u r t h e r 5 h r . L a n e s : 1 : p r o t e i n s i n m o c k - i n f e c t e d , p u l s e d 3 T 3 - L 1 c e l l s ; 2 : p r o t e i n s i n v i r u s - i n f e c t e d , p u l s e d 3 T 3 - L 1 c e l l s ; 3 : p r o t e i n s i n m o c k - i n f e c t e d , c h a s e d 3 T 3 - L 1 c e l l s ; 4 : p r o t e i n s i n v i r u s - i n f e c t e d , c h a s e d 3 T 3 - L 1 c e l l s ; 5 : p r o t e i n s i n m o c k - i n f e c t e d , p u l s e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s ; 6 : p r o t e i n s i n v i r u s - i n f e c t e d , p u l s e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s ; 7 : p r o t e i n s i n m o c k - i n f e c t e d , c h a s e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s ; 8 : p r o t e i n s i n v i r u s - i n f e c t e d , c h a s e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e p o s i t i o n s o f v i r u s - i n d u c e d _ 3 p r o t e i n s w i t h m o l . w t . ( x l O ) o n t h e l e f t s i d e 8 4 F i f l - UJ S t a b i l i t y a n d p r o c e s s i n g o f M C M V p r o t e i n s i n 3T3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1  c e l l s a t i m m e d i a t e - e a r l y t i m e s . 3T3-L1 J 7 7 4 A 1 M V M V M V M V 1 2 3 4 5 6 7 8 8 5 g i v e a n i n d i c a t i o n o f t h e i r f u n c t i o n i n t h e r e p l i c a t i o n o f t h e v i r u s . I n a d d i t i o n , a d e f e c t i n c e l l u l a r t r a n s p o r t o f a p r o t e i n , i n n o n p e r m i s s i v e c e l l s , c o u l d i n d i c a t e a r e a s o n f o r t h e f a i l u r e o f t h e v i r u s t o r e p l i c a t e ( P r e s t o n , 1 9 7 9 b ) . I t h a d b e e n n o t i c e d t h a t t h e r e w a s a n o v e r a l l s t i m u l a t i o n o f s y n t h e s i s o f c e l l u l a r n u c l e a r p r o t e i n s i n i n f e c t e d s a m p l e s ( s e e n i n F i g . 1 2 , l a n e 5 a n d 7 c o m p a r e d t o 1 a n d 3 ) . T h i s f e a t u r e w i l l b e n o t i c e d o n a n u m b e r o f o t h e r g e l s , p a r t i c u l a r l y a t I E t i m e s . T h e f r a c t i o n a t i o n t e c h n i q u e w a s d e s i g n e d t o h a n d l e a n u m b e r o f s a m p l e s q u i c k l y , a s p r o t e i n s c a n l e a k f r o m t h e n u c l e i i f s e p a r a t i o n t a k e s t o o l o n g . I n a d d i t i o n , t h e t e c h n i q u e w a s r e l a t i v e l y g e n t l e s o a s n o t t o c a u s e d a m a g e t o n u c l e i . F i g . 1 2 s h o w s a n a l t e r a t i o n i n t h e d i s t r i b u t i o n o f s o m e o f t h e I E v i r a l p r o t e i n s i n 3 T 3 - L 1 c e l l s , a t t h e e n d o f t h e c h a s e p e r i o d . A t t h e e n d o f t h e l a b e l i n g p e r i o d , a l l t h e I E p r o t e i n s a p p e a r e d e v e n l y d i s t r i b u t e d b e t w e e n n u c l e i a n d c y t o p l a s m ( F i g . 1 2 , l a n e s 5 a n d 6 ) , w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e 9 6 K p r o t e i n . A l t h o u g h t h e 9 6 K p r o t e i n w a s n o t c l e a r l y s e p a r a t e d f r o m t h e 1 0 0 K p r o t e i n i n t h i s g e l , i t a p p e a r e d o n l y t o b e a s s o c i a t e d w i t h t h e n u c l e a r f r a c t i o n ( l a n e 5 ) . A t t h e e n d o f t h e 5 h r c h a s e p e r i o d , t h e 1 0 0 K p r o t e i n w a s p r e s e n t i n t h e n u c l e a r f r a c t i o n ( l a n e 7 ) a n d a f o r m w i t h a s l i g h t l y i n c r e a s e d e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y w a s i n t h e c y t o p l a s m i c f r a c t i o n ( l a n e 8 ) . T h e 9 6 K p r o t e i n b a n d h a d d i m i n i s h e d o v e r t h e c h a s e p e r i o d , s i m i l a r t o w h a t w a s s h o w n i n F i g . 1 1 . B e c a u s e o f t h e o b s e r v e d t u r n o v e r o f t h e 9 6 K p r o t e i n t h a t w a s s e e n i n F i g . 1 1 , i t c o u l d b e s u g g e s t e d t h a t t h e h i g h e s t m o l . w t . v i r u s - i n d u c e d b a n d i n t h e c y t o p l a s m ( l a n e 8 ) r e p r e s e n t e d a f o r m o f t h e 1 0 0 K p r o t e i n , r a t h e r t h a n t h e 9 6 K p r o t e i n . A t t h e e n d o f t h e c h a s e p e r i o d , t h e 8 9 K a n d 8 3 . 5 K I E p r o t e i n s p a r t i t i o n e d a l m o s t e x c l u s i v e l y w i t h t h e c y t o p l a s m i c f r a c t i o n , w h i l e t h e 8 6 K I E p r o t e i n w a s 8 6 12: 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d " MCMV i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s s e p a r a t e d i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . R e p l i c a t e c u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV ( v ) o r m o c k - i n f e c t e d ( m ) a n d i n c u b a t e d 3 5 w i t h c y c l o h e x i m i d e 0 - 3 h r p i . , t h e n l a b e l e d 1 h r w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 u C i / m l ) . A t 4 h r p i . , o n e c u l t u r e w a s h a r v e s t e d ( p ) a n d s e p a r a t e d i n t o n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s . A d u p l i c a t e w a s w a s h e d a n d f u r t h e r i n c u b a t e d f o r 5 h r . ( c ) . L a n e s : 1 a n d 2 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d , p u l s e d c e l l s ; 3 a n d 4 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d , c h a s e d c e l l s ; 5 a n d 6 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d p u l s e d c e l l s ; 7 a n d 8 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d c h a s e d c e l l s . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e p o s i t i o n s o f v i r u s - i n d u c e d - 3 p r o t e i n s w i t h m o l . w t . ( x l O ) o n t h e r i g h t s i d e . 87 F i g . 1 2 : L o c a t i o n o f I E p r o t e i n s o f MCMV f r o m 3 T 3 - L 1 c e l l s a f t e r p u l s e a n d  c h a s e p e r i o d s . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d MCMV i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s s e p a r a t e d i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . 8 8 m a i n l y n u c l e a r . I n a d d i t i o n , t h e 6 3 . 5 K p r o t e i n b e c a m e e x c l u s i v e l y n u c l e a r , w h i l e t h e 5 2 . 5 K , 3 0 K a n d 2 8 K p r o t e i n s r e m a i n e d e q u a l l y d i s t r i b u t e d b e t w e e n t h e n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s . I t c a n b e s e e n t h a t n o n e w b a n d a p p e a r e d , e q u i v a l e n t t o t h e 9 1 K p r o t e i n , d u r i n g t h e c h a s e p e r i o d . T h i s i n d i c a t e d t h a t t h e 9 1 K p r o t e i n w a s n o t a p r o c e s s e d f o r m o f o n e o f t h e I E p r o t e i n s . T h e r e s u l t s f o r t h e e q u i v a l e n t e x p e r i m e n t s c o v e r i n g t h e m a i n t i m e p e r i o d f o r e a r l y p r o t e i n s y n t h e s i s a r e s h o w n i n F i g . 1 3 . T h e e a r l y p r o t e i n s ( 9 1 K , 3 9 K a n d 3 6 K ) w e r e d e t e c t e d s o l e l y w i t h i n t h e n u c l e a r f r a c t i o n a t t h e e n d o f t h e p u l s e l a b e l i n g p e r i o d ( l a n e 3 ) . T h i s a s s o c i a t i o n r e m a i n e d s t a b l e d u r i n g t h e c h a s e p e r i o d ( l a n e 7 ) . T h e m i n o r e a r l y p r o t e i n s ( 6 0 K , 5 4 K , 5 1 . 5 K a n d 5 1 K ) w e r e n o t d e t e c t e d i n t h e s e - e x p e r i m e n t s . T h e s e s a m e e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d u s i n g M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s . T h e p a r t i t i o n i n g o f s o m e o f t h e I E v i r a l p r o t e i n s a f t e r t h e c h a s e p e r i o d w a s n o t a s d i s t i n c t a s t h a t o b s e r v e d i n i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s ( F i g . 1 4 A ) . T h e 1 0 0 K p r o t e i n w a s p r e s e n t i n t h e n u c l e u s a n d c y t o p l a s m a f t e r t h e c h a s e p e r i o d . I n t h e s e e x p e r i m e n t s , t h e 9 6 K I E p r o t e i n w a s m o r e c l e a r l y s e p a r a t e d f r o m t h e TOOK p r o t e i n . A l t h o u g h t h e i n t e n s i t y o f t h e b a n d h a d d e c r e a s e d , t h e g e l s h o w e d t h a t t h e 9 6 K p r o t e i n h a d r e m a i n e d a s s o c i a t e d w i t h t h e n u c l e i a f t e r t h e c h a s e p e r i o d . T h e 8 9 K , 8 6 K , 8 3 . 5 K a n d 6 3 . 5 K p r o t e i n s d i d n o t p a r t i t i o n , a f t e r t h e c h a s e p e r i o d , i n t h e d i s t i n c t m a n n e r d e s c r i b e d f o r 3 T 3 - L 1 c e l l s . I n l a n e 7 a n d 8 ( F i g . 1 4 ) , t h e s e b a n d s a p p e a r e d t o r e m a i n e v e n l y d i s t r i b u t e d b e t w e e n t h e n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s . T h e s i g n i f i c a n c e o f t h i s i s u n c e r t a i n . T h e 5 2 . 5 K , 3 0 K a n d 2 8 K m a i n t a i n e d a n e q u a l d i s t r i b u t i o n b e t w e e n n u c l e u s a n d c y t o p l a s m . I n t h e e q u i v a l e n t g e l f o r e a r l y p r o t e i n s ( F i g . 1 4 B ) , t h e 9 1 K , 3 9 K a n d 3 6 K p r o t e i n s w e r e p r e s e n t s o l e l y i n t h e n u c l e a r f r a c t i o n s d u r i n g b o t h p e r i o d s s t u d i e d . 8 9 1 3 : 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s s e p a r a t e d i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . R e p l i c a t e c u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV ( v ) o r m o c k - i n f e c t e d (m) a n d i n c u b a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e f r o m 2 - 5 h r p i . , t h e n l a b e l e d 1 h r w i t h 3 5 ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 y C i / m l ) . A t 6 h r p i . , o n e c u l t u r e w a s h a r v e s t e d ( p ) a n d s e p a r a t e d i n t o n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s . A d u p l i c a t e w a s w a s h e d a n d f u r t h e r i n c u b a t e d f o r 5 h r ( c ) . L a n e s : 1 a n d 2 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d , p u l s e d c e l l s ; 3 a n d 4 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d , p u l s e d c e l l s ; 5 a n d 6 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d , c h a s e d c e l l s ; 7 a n d 8 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d , c h a s e d c e l l s . V i r u s - i n d u c e d I E p r o t e i n s a r e i n d i c a t e d b y c l o s e d a r r o w h e a d s a n d e a r l y p r o t e i n s b y o p e n a r r o w h e a d s , w i t h a p p a r e n t m o l . w t . ( x l O - 3 ) . 9 0 F i g . 1 3 : L o c a t i o n o f e a r l y p r o t e i n s o f MCMV f r o m 3 T 3 - L 1 c e l l s a f t e r p u l s e  a n d c h a s e p e r i o d s . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s s e p a r a t e d i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . 91 1 4 : 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s s e p a r a t e d i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . R e p l i c a t e c u l t u r e s o f J 7 7 4 A . 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d ( V ) o r m o c k - i n f e c t e d ( M ) a n d i n c u b a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e f r o m 0 - 3 h r p i . ( A ) o r 2 - 5 h r p i . ( B ) t h e n 3 5 l a b e l e d 1 h r w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 u C i / m l ) . A t 4 h r p i . ( A ) o r 6 h r p i . ( B ) , o n e c u l t u r e w a s h a r v e s t e d ( p ) a n d s e p a r a t e d i n t o n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s . A d u p l i c a t e w a s w a s h e d a n d f u r t h e r i n c u b a t e d f o r 5 h r ( c ) . L a n e s : 1 a n d 2 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d , p u l s e d c e l l s ; 3 a n d 4 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d , c h a s e d c e l l s ; 5 a n d 6 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d , p u l s e d c e l l s ; 7 a n d 8 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d , c h a s e d c e l l s . V i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s i n d i c a t e d b y c l o s e d a r r o w h e a d s w i t h _ 3 a p p a r e n t m o l . w t . ( x l O ) o n r i g h t s i d e . 92 F i g . 1 4 : L o c a t i o n o f I E a n d e a r l y p r o t e i n s o f MCMV f r o m J 7 7 4 A . 1 c e l l s a f t e r  p u l s e a n d c h a s e p e r i o d s . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d MCMV i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s s e p a r a t e d i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . F i g . 1 4 ( A ) . mp mc vp A 1 2 3 4 5 6 7 N C N C N C N 93 ig. 14 (BK 9 4 1 3 . I E a n d e a r l y p r o t e i n d i s t r i b u t i o n u n d e r u n e n h a n c e d c o n d i t i o n s . T o d e t e r m i n e i f c y c l o h e x i m i d e - e n h a n c e m e n t h a d a n e f f e c t o n t h e s y n t h e s i s o r l o c a l i z a t i o n o f a n y o f t h e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s , c u l t u r e s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s w e r e l a b e l e d , w i t h o u t c y c l o h e x i m i d e p r e t r e a t m e n t , f r o m 1 - 4 h r p i . T h i s t i m e p e r i o d c o v e r e d t h e m a i n p e r i o d o f s y n t h e s i s o f t h e I E a n d e a r l y p r o t e i n s . F i g 1 5 s h o w s t h a t 8 / 1 0 o f t h e I E a n d 4 / 6 o f t h e e a r l y p r o t e i n s c o u l d b e i d e n t i f i e d i n n u c l e a r f r a c t i o n s o f u n e n h a n c e d i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s , w i t h t h e s a m e e s t i m a t e d m o l . w t s . a s d e t e r m i n e d p r e v i o u s l y . T h e 8 3 . 5 K a n d 8 0 K I E a n d t h e 5 4 K , 5 1 . 5 K a n d 5 1 K e a r l y p r o t e i n s w e r e n o t d e t e c t e d u s i n g t h e s e l a b e l i n g c o n d i t i o n s . T h e m a i n f e a t u r e t o n o t e f r o m t h i s e x p e r i m e n t w a s t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e i n d u c e d p r o t e i n s u n d e r u n e n h a n c e d c o n d i t i o n s . I n p r e v i o u s e x p e r i m e n t s ( s h o w n i n F i g . 7 A a n d 1 2 A ) , w h e r e e n h a n c e m e n t o f t h e v i r a l p r o t e i n s h a d o c c u r r e d d u e t o c y c l o h e x i m i d e p r e t r e a t m e n t , a h i g h e r o r e q u a l p r o p o r t i o n o f t h e 1 0 0 K , 8 9 K , 8 3 . 5 K , 5 2 . 5 K , 3 0 K a n d 2 8 K p r o t e i n s p a r t i t i o n e d w i t h t h e c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s . U s i n g u n e n h a n c e d c o n d i t i o n s , t h e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s a d o p t e d a p r e d o m i n a n t l y n u c l e a r a s s o c i a t i o n a n d o n l y a s m a l l p r o p o r t i o n o f t h e 1 0 0 K , 8 9 K a n d 3 0 K I E p r o t e i n s w e r e d e t e c t e d i n c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f i n f e c t e d c e l l s . T h e s a m e n u m b e r s o f v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s , w i t h t h e s a m e d i s t r i b u t i o n , w e r e o b s e r v e d i n 3 T 3 - L 1 c e l l s a s i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s i n t h e s e e x p e r i m e n t s . T o s t u d y f u r t h e r t h e d i s t r i b u t i o n o f v i r a l - i n d u c e d p r o t e i n s , n u c l e i f r o m N P 4 0 - s o l u b i l i z e d c e l l s w e r e t r e a t e d t o r e m o v e t h e c y t o s k e l e t a l f r a m e w o r k m a t e r i a l t h a t a d h e r e s t o t h e n u c l e a r m e m b r a n e ( P e n m a n , 1 9 6 6 ) . T r e a t m e n t w i t h a T w e e n 4 0 / D 0 C d e t e r g e n t m i x t u r e r e m o v e s t h e c y t o p l a s m i c ' t a g s ' w i t h o u t d i s r u p t i n g t h e n u c l e i . F i g . 1 6 A a n d B s h o w s t h e d i s t r i b u t i o n o f p r o t e i n s i n 3 T 3 - L 1 a n d 9 5 15: 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e s o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m M C M V - i n f e c t e d ( v ) a n d m o c k - i n f e c t e d (m) 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s s e p a r a t e d i n t o n u c l e a r ( A ) a n d c y t o p l a s m i c ( B ) f r a c t i o n s a n d s e p a r a t e d i n 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l s . C u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A - 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV o r 3 5 m o c k - i n f e c t e d a n d l a b e l e d w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 2 5 u C i / m l ) f r o m 1 - 4 h r p i . . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e _ 3 v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h a p p a r e n t m o l . w t . ( x l O ) o n l e f t s i d e . 96 F i g . 1 5 : L o c a t i o n o f I E a n d e a r l y p r o t e i n s o f MCMV f r o m 3T3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1  c e l l s p r o d u c e d u n d e r u n e n h a n c e d c o n d i t i o n s . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d MCMV i n f e c t e d 3T3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s s e p a r a t e d i n 10% p o l y a c r y l a m i d e g e l s . 3T3 J 7 7 4 3T3 J 7 7 4 9 7 1 6 : 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e s o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 ( A ) a n d J 7 7 4 A . 1 (B) c e l l s s e p a r a t e d i n t o n u c l e a r ( N ) , c y t o s k e l e t a l ' t a g ' ( T ) a n d c y t o p l a s m i c (C) f r a c t i o n s a n d s e p a r a t e d i n 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l s . D u p l i c a t e s e t s o f c u l t u r e s w e r e MCMV o r m o c k - i n f e c t e d a n d 3 5 l a b e l e d 1 - 4 h r p i . w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 2 5 u C i / m l ) . O n e s e t w a s h a r v e s t e d a t 4 h r p i . a n d f r a c t i o n a t e d , w h i l e t h e o t h e r s e t w a s r i n s e d a n d i n c u b a t e d f o r a f u r t h e r 5 h r b e f o r e f r a c t i o n a t i o n . L a n e s : 1 : m o c k - i n f e c t e d c y t o p l a s m i c p r o t e i n s ( 4 h r ) ; 2 : m o c k - i n f e c t e d c y t o p l a s m i c p r o t e i n s ( 9 h r ) ; 3 : m o c k - i n f e c t e d ' t a g s ' p r o t e i n s ( 4 h r ) ; 4 : m o c k - i n f e c t e d n u c l e a r p r o t e i n s ( 4 h r ) ; 5 : m o c k - i n f e c t e d ' t a g s ' p r o t e i n s ( 9 h r ) ; 6 : m o c k - i n f e c t e d n u c l e a r p r o t e i n s ( 9 h r ) ; 7 : v i r u s - i n f e c t e d c y t o p l a s m i c p r o t e i n s ( 4 h r ) ; 8 : v i r u s - i n f e c t e d c y t o p l a s m i c p r o t e i n s ( 9 h r ) ; 9 : v i r u s - i n f e c t e d ' t a g s ' p r o t e i n s ( 4 h r ) ; 1 0 : v i r u s - i n f e c t e d n u c l e a r p r o t e i n s ( 4 h r ) ; 1 1 : v i r u s - i n f e c t e d ' t a g s ' p r o t e i n s ( 9 h r ) ; 1 2 : v i r u s - i n f e c t e d n u c l e a r p r o t e i n s ( 9 h r ) . S p o t s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h a p p a r e n t m o l . w t . _ 3 ( x l O ) i n c e n t e r . T h e 9 6 K I E p r o t e i n i s d e s i g n a t e d b y a c l o s e d a r r o w h e a d . 98 F i g - 1 6 : L o c a t i o n o f I E a n d e a r l y p r o t e i n s o f MCMV f r o m 3T3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1  c e l l s p r o d u c e d u n d e r u n e n h a n c e d c o n d i t i o n s . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d MCMV i n f e c t e d 3T3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s f r a c t i o n a t e d i n t o n u c l e a r , c y t o p l a s m i c ' t a g s ' a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s a n d s e p a r a t e d i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . M O C K V I R U S V I R U S M O C K 9 9 J 7 7 4 A . 1 c e l l s a t 4 h r a n d 9 h r p i . T h e e x p e r i m e n t a l d e t a i l s a r e d e s c r i b e d i n F i g . 1 6 l e g e n d . T h e s e a u t o r a d i o g r a m s s h o w e d t h a t v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s f r o m b o t h t y p e s o f c e l l s p a r t i t i o n e d i n t o t h e t h r e e f r a c t i o n s i n t h e s a m e m a n n e r . O f p a r t i c u l a r i n t e r e s t w a s t h e b e h a v i o u r o f t h e m a j o r I E p r o t e i n s . T h e 1 0 0 K a n d 8 9 K p r o t e i n s w e r e s h o w n t o b e p r e s e n t i n e a c h f r a c t i o n i n b o t h p u l s e a n d c h a s e s a m p l e s . T h e d i s t r i b u t i o n d i d n o t a p p e a r t o c h a n g e o v e r t h e 5 h r c h a s e p e r i o d . T h i s e x p e r i m e n t d o e s n o t g i v e a n y i n d i c a t i o n a s t o t h e s i t e o f a c t i o n o f t h e s e p r o t e i n s . T h e e f f i c i e n c y o f t h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r e w a s c h e c k e d b y p h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p y . F o l l o w i n g T w e e n 4 0 / D O C t r e a t m e n t , t h e n u c l e i a p p e a r e d ' c l e a n 1 , w i t h o n l y a s m a l l p e r c e n t a g e h a v i n g a n y a d h e r i n g m a t e r i a l v i s i b l e . T h i s m e a n s t h a t t h e l o c a t i o n o f t h e 1 0 0 K a n d 8 9 K p r o t e i n s , a t t a c h e d t o t h e c y t o s k e l e t a l f r a m e w o r k a n d a l s o i n t h e n u c l e i w o u l d b e r e l a t e d t o t h e i r f u n c t i o n w i t h i n t h e i n f e c t e d c e l l . T h e 9 6 K p r o t e i n w a s p r e s e n t o n l y i n t h e n u c l e a r f r a c t i o n a f t e r t h e p u l s e l a b e l i n g a n d t h i s b a n d h a d b e c o m e u n d e t e c t a b l e a t t h e e n d o f t h e c h a s e p e r i o d . T h e 6 3 . 5 K I E a n d 9 1 K , 3 9 K a n d 3 6 K e a r l y p r o t e i n s h a d a s t a b l e a s s o c i a t i o n w i t h t h e n u c l e i . T h e 5 2 . 5 K , 3 0 K a n d 2 8 K p r o t e i n s c o u l d b e d e t e c t e d m a i n l y i n t h e n u c l e a r f r a c t i o n s , b u t s m a l l a m o u n t s a l s o a p p e a r e d i n t h e c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s . 1 4 . T w o - d i m e n s i o n a l a n a l y s i s o f f r a c t i o n a t e d s a m p l e s . T w o - d i m e n s i o n a l a n a l y s i s o f f r a c t i o n a t e d s a m p l e s i d e n t i f i e d s o m e p r o p e r t i e s o f t h e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s n o t s h o w n b y t h e o t h e r e x p e r i m e n t s . I n t h e 2D g e l s o f p r o t e i n s f r o m t h e n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s ( F i g . 17 A a n d B ) , l a b e l e d t o d e t e c t I E p r o t e i n s , o n l y t h e m a j o r I E v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w e r e d e t e c t e d . I n F i g . 17 A , t h e p o s i t i o n s o f t h e I E p r o t e i n s o f T O O K , 8 9 K a n d 8 6 K a r e n o w s h o w n c l e a r l y a s s p o t s o n 1 0 0 21-3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e s o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s o f l y s a t e s o f n u c l e a r A ) , C ) a n d E ) a n d c y t o p l a s m i c B ) , D ) , a n d F ) f r a c t i o n s o f MCMV ( A - D ) a n d m o c k - i n f e c t e d ( E , F ) 3 T 3 - L 1 c e l l s s e p a r a t e d i n t w o d i m e n s i o n s b y e l e c t r o p h o r e s i s . R e p l i c a t e c u l t u r e s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV a n d i n c u b a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e 0 - 3 h r p i . ( A a n d B ) o r 2 - 5 h r p i . ( C a n d D) 3 5 a n d l a b e l e d w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 u C i / m l ) f o r 1 h r . M o c k - i n f e c t e d c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e 0 - 3 3 5 h r p i . a n d l a b e l e d w i t h ( S ) m e t h i o n i n e f o r 1 h r . C e l l s w e r e f r a c t i o n a t e d i n t o n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s , d i s s o l v e d i n u r e a l y s i s b u f f e r a n d s e p a r a t e d i n t h e f i r s t d i m e n s i o n ( l e f t t o r i g h t ) ( a c i d ( + ) t o b a s e ( - ) ) f o r 3 0 0 0 V . h . . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h _ 3 a p p a r e n t m o l . w t . ( x l O ) . 101 Ei£L_L7_: T w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n o f p r o t e i n s f r o m n u c l e u s a n d c y t o p l a s m  o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s a t i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y t i m e s . a c t i n •'^ -A 9 r actinr 30». ft. . 1 0 2 F i g . 17 ( c o n t . ) 1 0 3 t h e a c i d i c s i d e o f t h e g e l , a s c o m p a r e d t o p r e v i o u s e x a m p l e s ( F i g s . 9 a n d 1 0 ) w h e r e e x t e n s i v e s t r e a k i n g o f t h e s e p r o t e i n s i n t h e f i r s t d i m e n s i o n w a s o b s e r v e d . T h e p o o r s o l u b i l i t y o f t h e 1 0 0 K a n d 8 9 K p r o t e i n s i s s t i l l s e e n a s d e m o n s t r a t e d b y s o m e s t r e a k i n g i n t h e f i r s t d i m e n s i o n . T h e r e w a s n o e v i d e n c e o f t h e 9 6 K I E p r o t e i n b e i n g p r e s e n t i n t h e c y t o p l a s m i c f r a c t i o n ( F i g 17 B ) . F i g s . 17 C a n d D s h o w t h e a u t o r a d i o g r a m s f o r c e l l s l a b e l e d t o d e t e c t e a r l y v i r a l - i n d u c e d p r o t e i n s l A h o r i z o n t a l s t r e a k o n t h e b a s i c s i d e o f t h e g e l a p p e a r s t o c o r r e s p o n d t o t h e 9 1 K p r o t e i n ( t h i s w a s r e s o l v e d m o r e c l e a r l y i n F i g . 1 9 B i n t o t h r e e o r f o u r c h a r g e i s o m e r s ) . Two s p o t s , t h a t a p p e a r e d t o c o r r e s p o n d t o t h e 3 9 K p r o t e i n , a n d t h r e e s p o t s , t h a t a p p e a r e d t o c o r r e s p o n d t o t h e 3 6 K e a r l y p r o t e i n , w e r e o n l y d e t e c t e d i n t h e n u c l e a r f r a c t i o n s . W i t h o u t a n y f u r t h e r e v i d e n c e , i t i s b e i n g a s s u m e d t h a t e a c h s e t o f s p o t s r e p r e s e n t c h a r g e i s o m e r s o f t h e s a m e p r o t e i n . A l s o s h o w n a r e t w o s p o t s c o r r e s p o n d i n g t o t h e 3 0 K I E p r o t e i n . F i g . 1 9 B h a s t w o s p o t s e a c h , t h a t a p p e a r t o c o r r e s p o n d t o t h e 3 0 K a n d 2 8 K I E p r o t e i n s . T h e m i n o r e a r l y p r o t e i n s ( 5 4 K , 5 1 . 5 K a n d 5 1 K ) , t h a t c o u l d n o t b e d e t e c t e d b y o n e - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s o n g e l s o f u n i f o r m a c r y l a m i d e c o m p o s i t i o n ( F i g . 7 ) , w e r e s h o w n t o b e e x c l u s i v e l y c y t o p l a s m i c ( F i g . 17 D ) . T h e p r o f i l e s o f n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s f r o m m o c k - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s a r e s h o w n i n F i g . 17 E a n d F . T h e s e r e p r e s e n t f r a c t i o n s f r o m c e l l s l a b e l e d a t I E t i m e s , b u t t h e s a m e p r o t e i n s w e r e s h o w n i n m o c k - i n f e c t e d c e l l s l a b e l e d a t e a r l y t i m e s ( d a t a n o t s h o w n ) . F i g s . 1 8 A a n d B s h o w s t h a t t h e s a m e m a j o r I E a n d e a r l y p r o t e i n s w e r e d e t e c t e d i n n u c l e a r f r a c t i o n s o f M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 a s i n 3 T 3 - L 1 c e l l s . T h e s e p r o t e i n s a l l h a d t h e s a m e t w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n a s t h o s e s y n t h e s i z e d i n p e r m i s s i v e 3 T 3 - L 1 c e l l s . F i g . 1 9 s h o w s t h e t w o - d i m e n s i o n a l p r o f i l e o f p r o t e i n s f r o m n u c l e a r 1 0 4 1 8 : 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e s o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s o f l y s a t e s o f n u c l e a r f r a c t i o n s o f M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s s e p a r a t e d i n t w o d i m e n s i o n s b y e l e c t r o p h o r e s i s . C u l t u r e s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV a n d i n c u b a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e f r o m 0 - 3 h r p i . ( A ) o r 2 - 5 h r p i . ( B ) a n d l a b e l e d w i t h ( 3 5 S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 y C i / m l ) f o r 1 h r . C e l l s w e r e f r a c t i o n a t e d i n t o n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s b y t r e a t m e n t w i t h N P 4 0 b u f f e r , a n d n u c l e a r f r a c t i o n s w e r e d i s s o l v e d i n u r e a l y s i s b u f f e r a n d s e p a r a t e d i n t h e f i r s t d i m e n s i o n ( l e f t t o r i g h t ) ( a c i d ( + ) t o b a s e ( - ) ) f o r 3 0 0 0 V . h . . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h a p p a r e n t m o l . w t . ( x l O - 3 ) . 105 F i g - 18: T w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n o f p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f  M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s a t i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y t i m e s . A B 1 0 6 1 9 : 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e s o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s o f l y s a t e s o f n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k ( A ) a n d MCMV ( B ) - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s s e p a r a t e d i n t w o d i m e n s i o n s b y e l e c t r o p h o r e s i s . C u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h 3 5 MCMV o r m o c k - i n f e c t e d a n d l a b e l e d w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 2 5 u C i / m l ) f r o m 1 - 4 h r p i . T h e f i r s t d i m e n s i o n w a s r u n f r o m l e f t t o r i g h t ( a c i d ( + ) t o b a s e ( - ) ) f o r 3 0 0 0 V . h . . C l o s e d a r r o w h e a d s d e n o t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h a p p a r e n t m o l . _ 3 w t . ( x l O ) . h - j , h 2 a n d a c t i n d e s i g n a t e m a j o r c e l l u l a r p r o t e i n s . 1 0 7 F i g . 1 9 : T w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n o f p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f  m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s l a b e l e d f r o m 1-4 h r . p i . ac t ! i B 1 0 8 f r a c t i o n s o f m o c k ( A ) a n d M C M V - i n f e c t e d ( B ) 3 T 3 - L 1 c e l l s , t h a t w e r e l a b e l e d f r o m 1 - 4 h r p i . w i t h o u t c y c l o h e x i m i d e t r e a t m e n t . T h i s g e l s h o w e d t h a t c y c l o h e x i m i d e p r e t r e a t m e n t d i d n o t a f f e c t t h e m i g r a t i o n p r o p e r t i e s o f t h e p r o t e i n s s y n t h e s i z e d . I n a d d i t i o n t o t h e f e a t u r e s r e f e r r e d t o , t w o s p o t s t h a t a p p e a r e d t o c o r r e s p o n d t o t h e 5 2 . 5 K p r o t e i n w e r e i d e n t i f i e d . 1 5 . I d e n t i f i c a t i o n o f i n f e c t e d c e l l p h o s p h o p r o t e i n s . T h e m a j o r I E p r o t e i n s o f s e v e r a l s t r a i n s o f h u m a n a n d s i m i a n c y t o m e g a l o v i r u s h a v e b e e n s h o w n t o b e p h o s p h o p r o t e i n s ( G i b s o n , 1 9 8 1 ) , a s h a v e t h e m a i n I E p r o t e i n s o f h e r p e s s i m p l e x v i r u s ( P e r e i r a e t a l _ . , 1 9 7 7 ) . T h e 1 0 0 K , 9 6 K , 8 9 K ( a n d 8 6 K ) I E p r o t e i n s a n d t h e 3 9 a n d 3 6 K e a r l y p r o t e i n s w e r e b i o s y n t h e t i c a l l y l a b e l e d w h e n M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s w e r e 3 2 i n c u b a t e d w i t h ( P ) o r t h o p h o s p h a t e ( F i g . 2 0 B ) . O n e o f t h e i s o m e r s o f t h e 3 0 K p r o t e i n w a s a l s o p h o s p h o r y l a t e d . T h e s a m e p r o t e i n s w e r e a l s o p h o s p h o r y l a t e d w h e n s y n t h e s i z e d i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s , e x c e p t f o r t h e 3 0 K i s o m e r ( F i g . 2 0 C ) . T h i s m a y o n l y r e p r e s e n t a d i f f e r e n c e i n s e n s i t i v i t y b e t w e e n t h e t w o c e l l t y p e s i n d e t e c t i n g m i n o r l a b e l e d p r o t e i n s . I n a d d i t i o n , a s p o t ( m a r k e d ' a ' o n t h e g e l s ) o f a r o u n d 1 5 K m o l . w t . w a s o b s e r v e d o n l y i n i n f e c t e d e x t r a c t s o f b o t h c e l l t y p e s . T h i s d i d n o t c o i n c i d e w i t h a n y o f t h e i d e n t i f i e d v i r a l p r o t e i n s . T h e i n d i c a t e d p o s i t i o n o f t h e 8 6 K p h o s p h o p r o t e i n 3 5 i n F i g . 2 0 B a n d C w a s d i f f e r e n t f r o m i t s p o s i t i o n o n g e l s o f ( S ) m e t h i o n i n e l a b e l e d p r o t e i n s ( e . g . F i g . 1 9 B ) . I t c a n b e s u g g e s t e d t h a t t h i s m a y r e p r e s e n t a m i n o r i s o m e r o f t h e 8 6 K p r o t e i n , w h i c h i s n o t e a s i l y d e t e c t a b l e o n t h e g e l s o f t o t a l p r o t e i n s , o r t h i s m a y r e p r e s e n t a c e l l u l a r p r o t e i n t h a t b e c o m e s p h o s p h o r y l a t e d a s a c o n s e q u e n c e o f v i r u s i n f e c t i o n . 1 6 . M C M V - i n d u c e d I E a n d e a r l y p r o t e i n s i n h u m a n f i b r o b l a s t s . I t h a s 1 0 9 2 0 : 3 2 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( P ) l a b e l e d p r o t e i n s o f n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d ( A ) a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 ( B ) a n d M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 (C) c e l l s t r e a t e d u n d e r t h e f o l l o w i n g c o n d i t i o n s a n d s e p a r a t e d i n t w o d i m e n s i o n s b y e l e c t r o p h o r e s i s . C u l t u r e s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV a n d i n c u b a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e 2 - 5 h r p i . a n d t h e n l a b e l e d w i t h 3 2 ( P ) o r t h o p h o s p h a t e ( 2 0 0 u C i / m l ) f o r 2 h r i n t h e p r e s e n c e o f 1 0 ug/ m l a c t i n o m y c i n D. C e l l s w e r e s e p a r a t e d i n t o n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s . T h e f i r s t d i m e n s i o n w a s r u n f r o m l e f t t o r i g h t ( a c i d t o b a s e ) f o r 3 0 0 0 V . h . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h - 3 c o r r e s p o n d i n g m o l . w t . ( x 1 0 ) . no F i g . 2 0 : T w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n o f p h o s p h a t e - l a b e l e d p r o t e i n s f r o m  n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 a n d M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1  c e l l s l a b e l e d a t e a r l y t i m e s a f t e r i n f e c t i o n . I l l b e e n s h o w n t h a t a s m a l l a m o u n t o f MCMV r e p l i c a t i o n o c c u r r e d f o l l o w i n g i n f e c t i o n o f J 7 7 4 A . 1 c e l l s , w h i l e h u m a n f i b r o b l a s t s w e r e t o t a l l y n o n p e r m i s s i v e t o M C M V . A s t h e i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y p r o t e i n s a p p e a r e d t o b e s y n t h e s i z e d i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s i n t h e s a m e p a t t e r n a s t h o s e s e e n i n 3 T 3 - L 1 c e l l s , i t w a s n e c e s s a r y t o a n s w e r t h e q u e s t i o n a s t o w h e t h e r MCMV g e n e e x p r e s s i o n i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s w a s d i f f e r e n t f r o m t h a t s e e n i n a f u l l y n o n p e r m i s s i v e c e l l s y s t e m . T h e I E a n d e a r l y p r o t e i n s s y n t h e s i z e d i n i n f e c t e d h u m a n f o r e s k i n f i b r o b l a s t s ( H F F ) c e l l s w e r e c o m p a r e d w i t h t h o s e f r o m 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s . I n f e c t i o n o f H F F c e l l s w i t h MCMV p r o d u c e d , w i t h i n 4 h r s , t h e c h a r a c t e r i s t i c e a r l y c y t o p a t h i c e f f e c t t h a t w a s s e e n i n i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s . T h i s i n d i c a t e d t h a t s o m e v i r a l g e n e e x p r e s s i o n o c c u r r e d i n t h e s e c e l l s . T h e p r e v i o u s t y p e s o f e x p e r i m e n t s w e r e r e p e a t e d w i t h M C M V - i n f e c t e d H F F c e l l s . A f t e r t h e r e v e r s a l o f a c y c l o h e x i m i d e b l o c k , t h e m a j o r I E p r o t e i n s ( 1 0 0 K , 9 6 K a n d 8 9 K ) w e r e s y n t h e s i z e d i n e l e v a t e d a m o u n t s ( F i g . 2 1 , l a n e 3 ) . T h e o t h e r p r e v i o u s l y i d e n t i f i e d MCMV I E p r o t e i n s o f 8 6 K , 8 3 . 5 K , 6 3 . 5 , 5 2 . 5 K , 3 0 K a n d 2 8 K w e r e a l s o d e t e c t e d i n n u c l e a r f r a c t i o n s o f t h e s e c e l l s . T h e s w i t c h t o e a r l y p r o t e i n s y n t h e s i s o c c u r r e d i n t h e s e c e l l s . T h e 9 1 K a n d 3 6 K c o u l d b e d e t e c t e d b y 3 h r p i . ( F i g . 2 1 , l a n e s 7 ) , b u t t h e i n i t i a l a p p e a r a n c e o f t h e 3 9 K e a r l y p r o t e i n w a s n o t d e t e c t e d , a s h u m a n f i b r o b l a s t s h a v e a c e l l u l a r p r o t e i n o f t h e s a m e m o l . w t . . H i g h e r l e v e l s o f t h e 9 1 K , 3 9 K a n d 3 6 K p r o t e i n s w e r e d e t e c t e d i n l a n e 1 1 , w h i c h d e t e c t e d p r o t e i n s l a b e l e d o v e r t h e p e r i o d e q u i v a l e n t t o 3 - 4 h r p i . . T h e s y n t h e s i s o f t h e s e e a r l y p r o t e i n s a p p e a r e d t o b e s l i g h t l y d e l a y e d i n t h e s e s a m p l e s c o m p a r e d w i t h M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s . H o w e v e r , t h e s i g n i f i c a n c e o f t h i s i s u n c e r t a i n a s i t s e e m e d t o h a v e a v a r i a b l e p a t t e r n , p e r h a p s r e l a t e d t o t h e p h y s i o l o g i c a l s t a t e o f t h e c e l l s . 1 1 2 21: 35 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d h u m a n f i b r o b l a s t ( H F F ) c e l l s s e p a r a t e d i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . C u l t u r e s o f H F F c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV o r m o c k - i n f e c t e d a n d i n c u b a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e 0 - 3 h r p i . ( l a n e s 1 - 4 ) , 2 - 5 h r p i . ( l a n e s 5 - 8 ) o r 3 - 6 h r p i . 3 5 ( l a n e s 9 - 1 2 ) a n d t h e n l a b e l e d 1 h r w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 y C i / m l ) . A f t e r l a b e l i n g , c e l l s w e r e s e p a r a t e d i n t o n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s . L a n e s : 1 , 5 a n d 9 : p r o t e i n s i n m o c k - i n f e c t e d n u c l e a r f r a c t i o n s ; 2 , 6 a n d 1 0 : p r o t e i n s i n m o c k - i n f e c t e d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s ; 3 , 7 a n d 1 1 : p r o t e i n s i n v i r u s - i n f e c t e d n u c l e a r f r a c t i o n s ; 4 , 8 a n d 1 2 : p r o t e i n s i n v i r u s - i n f e c t e d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e p o s i t i o n s o f v i r u s - i n d u c e d I E p r o t e i n s a n d o p e n a r r o w h e a d s i n d i c a t e p o s i t i o n s o f v i r u s - i n d u c e d e a r l y p r o t e i n s , w i t h a p p a r e n t m o l . w t s . ( x l O - 3 ) . 1 1 3 F i g - 2 1 : P r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d h u m a n f i b r o b l a s t ( H F F ) c e l l s  l a b e l e d a t I E a n d e a r l y t i m e s a f t e r i n f e c t i o n . B 1 3 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 1 4 T h e s a m e n u m b e r o f n u c l e a r I E a n d e a r l y p r o t e i n s , w i t h t h e s a m e m o l . w t s . , w e r e s y n t h e s i z e d i n M C M V - i n f e c t e d H F F c e l l s a s w e r e s y n t h e s i z e d i n 3 T 3 - L 1 c e l l s u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s . . I n a d d i t i o n , t h e o n e a n d t w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n s o f t h e p r o t e i n s , t h a t h a d b e e n s y n t h e s i z e d w i t h o u t c y c l o h e x i m i d e t r e a t m e n t ( F i g s . 2 2 a n d 2 3 ) , s h o w e d t h e s a m e n u m b e r o f b a n d s ( s p o t s ) a s e q u i v a l e n t s a m p l e s f r o m 3 T 3 - L 1 c e l l s ( F i g s . 1 5 a n d 1 9 ) . O n e f e a t u r e s e e n i n F i g s . 21 a n d 2 2 ( c o m p a r e d t o F i g s . 1 2 a n d 1 5 ) w a s t h e s t r o n g e r p a r t i t i o n i n g o f t h e 1 0 0 K p r o t e i n w i t h t h e n u c l e u s . T h e s e c o n d e x p e r i m e n t s h o w e d t h a t t h e a b n o r m a l p a r t i t i o n i n g w a s n o t c a u s e d b y t h e c y c l o h e x i m i d e t r e a t m e n t o f H F F c e l l s . I n a s i m i l a r e x p e r i m e n t t o t h a t s h o w n i n F i g . 1 6 f o r 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s , M C M V - i n f e c t e d H F F c e l l s w e r e f r a c t i o n a t e d i n t o n u c l e a r , c y t o s k e l e t a l ' t a g s ' a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s ( F i g . 2 4 ) . T h e n u m b e r s o f p r o t e i n s d e t e c t e d w e r e t h e s a m e a s o b s e r v e d w i t h 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s ( F i g . 1 6 ) , b u t t h e r e w a s a g a i n a d i f f e r e n c e i n t h e p a r t i t i o n i n g o f t h e 1 0 0 K p r o t e i n a n d a l s o 8 9 K p r o t e i n . T h e TOOK I E p r o t e i n r e m a i n e d m a i n l y w i t h t h e n u c l e u s ( l a n e s 1 0 a n d 1 2 ) , w i t h o n l y a s m a l l p r o p o r t i o n b e i n g a s s o c i a t e d w i t h t h e c y t o s k e l e t a l f r a m e w o r k ( T ) ( l a n e s 9 a n d 1 1 ) a n d n o n e d e t e c t e d i n t h e c y t o p l a s m ( l a n e s 7 a n d 8 ) . T h i s p a r t i t i o n i n g r e m a i n e d t h e s a m e o v e r t h e 5 h r c h a s e p e r i o d . I t c o u l d b e s e e n t h a t t h e 8 9 K p r o t e i n a l s o p a r t i t i o n e d m a i n l y w i t h t h e n u c l e u s , b u t t h e p r o p o r t i o n i n t h e c y t o p l a s m i n c r e a s e d o v e r t h e 5 h r c h a s e p e r i o d ( F i g . 2 4 , l a n e 8 ) . T h i s w a s i n c o n t r a s t t o w h a t w a s s e e n w i t h 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s ( F i g 1 6 A a n d B ) w h e r e a s i g n i f i c a n t p r o p o r t i o n o f t h e 1 0 0 K a n d 8 9 K p r o t e i n s p a r t i t i o n e d w i t h t h e c y t o p l a s m a n d t h e c y t o s k e l e t a l f r a m e w o r k . T h e s e r e s u l t s g i v e a n i n d i r e c t i n d i c a t i o n o f a c y t o p l a s m i c s i t e o f a c t i o n f o r t h e m a j o r I E p r o t e i n s o r o f a r e p r e s s o r f u n c t i o n w h e n l o c a l i z e d i n t h e n u c l e u s . 1 1 5 2 2 : 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e s o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m M C M V - i n f e c t e d a n d m o c k - i n f e c t e d H F F c e l l s s e p a r a t e d i n t o n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s a n d s e p a r a t e d i n 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l s . C u l t u r e s o f H F F c e l l s w e r e m o c k o r M C M V - i n f e c t e d a n d l a b e l e d w i t h ( 3 5 S ) m e t h i o n i n e ( 2 5 y C i / m l ) f r o m 1 - 4 h r p i . L a n e s : 1 , p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n o f m o c k - i n f e c t e d c e l l s ; 2 , p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n o f v i r u s - i n f e c t e d c e l l s ; 3 , p r o t e i n s f r o m c y t o p l a s m i c f r a c t i o n o f m o c k - i n f e c t e d c e l l s ; 4 , p r o t e i n s f r o m c y t o p l a s m i c f r a c t i o n o f v i r u s - i n f e c t e d c e l l s . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e p o s i t i o n s o f v i r u s - i n d u c e d I E p r o t e i n s a n d o p e n a r r o w h e a d s i n d i c a t e p o s i t i o n s o f v i r u s - i n d u c e d e a r l y p r o t e i n s , w i t h a p p a r e n t m o l . w t . ( x l O - 3 ) . 1 1 6 F i g . 2 2 : L o c a t i o n o f I E a n d e a r l y p r o t e i n s o f MCMV f r o m H F F c e l l s p r o d u c e d  u n d e r u n e n h a n c e d c o n d i t i o n s . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d MCMV i n f e c t e d H F F c e l l s s e p a r a t e d i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . 1 1 7 2 3 : 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e s o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s i n l y s a t e s o f n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k ( A ) a n d MCMV ( B ) - i n f e c t e d H F F c e l l s s e p a r a t e d i n t w o d i m e n s i o n s b y e l e c t r o p h o r e s i s . C u l t u r e s o f H F F c e l l s w e r e MCMV o r 3 5 m o c k - i n f e c t e d a n d l a b e l e d w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 2 5 y C i / m l ) f r o m 1 - 4 h r p i . T h e f i r s t d i m e n s i o n w a s r u n f r o m l e f t t o r i g h t ( a c i d ( + ) t o b a s e ( - ) ) f o r 3 0 0 0 V . h . . C l o s e d a r r o w h e a d s d e n o t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h a p p a r e n t m o l . w t . ( x l O - 3 ) . 118 F i g - 2 3 : T w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n o f p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f  m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d H F F c e l l s l a b e l e d f r o m 1 - 4 h r . p i . A B 1 1 9 2 4 : 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d H F F c e l l s s e p a r a t e d i n t o n u c l e a r ( N ) , c y t o s k e l e t a l ' t a g ' ( T ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s a n d s e p a r a t e d i n 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l s . D u p l i c a t e s e t s o f c u l t u r e s w e r e MCMV o r m o c k - i n f e c t e d a n d l a b e l e d 1 - 4 h r p i . 3 5 w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 2 5 y C i / m l ) . O n e s e t w a s h a r v e s t e d a t 4 h r p i . a n d f r a c t i o n a t e d , w h i l e t h e o t h e r s e t w a s r i n s e d a n d i n c u b a t e d a f u r t h e r 5 h r b e f o r e f r a c t i o n a t i o n . L a n e s : 1 , m o c k - i n f e c t e d c y t o p l a s m i c p r o t e i n s ( 4 h r ) ; 2 , m o c k - i n f e c t e d c y t o p l a s m i c p r o t e i n s ( 9 h r ) ; 3 , m o c k - i n f e c t e d ' t a g s ' p r o t e i n s ( 4 h r ) ; 4 , m o c k - i n f e c t e d n u c l e a r p r o t e i n s ( 4 h r ) ; 5 , m o c k - i n f e c t e d ' t a g s ' p r o t e i n s ( 9 h r ) ; 6 , m o c k - i n f e c t e d n u c l e a r p r o t e i n s ( 9 h r ) ; 7 , v i r u s - i n f e c t e d c y t o p l a s m i c p r o t e i n s ( 4 h r ) ; 8 , v i r u s - i n f e c t e d c y t o p l a s m i c p r o t e i n s ( 9 h r ) ; 9 , v i r u s - i n f e c t e d ' t a g s ' p r o t e i n s ( 4 h r ) ; 1 0 , v i r u s - i n f e c t e d n u c l e a r p r o t e i n s ( 4 h r ) ; 1 1 , v i r u s - i n f e c t e d ' t a g s ' p r o t e i n s ( 9 h r ) ; 1 2 , v i r u s - i n f e c t e d n u c l e a r p r o t e i n s ( 9 h r ) ; S p o t s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h a p p a r e n t m o l . w t . _ 3 ( x l O ) o n r i g h t s i d e . T h e 9 6 K I E p r o t e i n i s d e s i g n a t e d b y a c l o s e d a r r o w h e a d . 1 2 0 F i g . 2 4 : L o c a t i o n o f I E a n d e a r l y p r o t e i n s o f MCMV f r o m H F F c e l l s p r o d u c e d  u n d e r u n e n h a n c e d c o n d i t i o n s . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d MCMV i n f e c t e d H F F c e l l s f r a c t i o n a t e d i n t o n u c l e a r , c y t o p l a s m i c ' t a g s ' a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s a n d s e p a r a t e d i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . MOCK VIRUS C C T N T N C C T N T N 121 1 7 . I d e n t i f i c a t i o n o f v i r u s - i n d u c e d D N A - b i n d i n g p r o t e i n s . a ) E x t r a c t i o n p r o c e d u r e . T h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r e u s e d t o i s o l a t e p r o t e i n s h a d b e e n r e p o r t e d t o b e s u p e r i o r t o o t h e r s ( P u r i f o y a n d P o w e l l , 1 9 7 6 ) f o r p r o d u c i n g t h e b e s t y i e l d s o f s o l u b l e p r o t e i n s t h a t a r e e s s e n t i a l l y D N A - f r e e . T h e e f f i c i e n c y o f r e c o v e r y o f h i g h - s a l t e x t r a c t e d t o t a l p r o t e i n s f o l l o w i n g d i a l y s i s t o 5 0 mM N a C l w a s o n a v e r a g e 2 6 % ( d a t a n o t s h o w n ) . b ) D N A - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y : w h o l e c e l l e x t r a c t s . P r o t e i n s w e r e p r e p a r e d f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d c e l l s t h a t h a d b e e n t r e a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e f r o m 0 - 3 h r p i . a n d t h e n l a b e l e d f o r 6 h r t o i n c l u d e t h e s y n t h e s i s o f a l l I E a n d e a r l y p r o t e i n s . S a m p l e s w e r e p r e p a r e d a n d DNA a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . T h e e l u t i o n p r o c e d u r e w a s t h e s a m e a s t h a t u s e d b y P u r i f o y a n d P o w e l l ( 1 9 7 6 ) . T a b l e I I I s h o w s t h e r e c o v e r y o f r a d i o a c t i v i t y d u r i n g D N A - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y o f p r o t e i n e x t r a c t s f r o m 3 T 3 - L 1 c e l l s . S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d f o r J 7 7 4 A . 1 c e l l s . A p p r o x i m a t e l y 2 0 % o f i n p u t c . p . m . b o u n d t o d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e w h i l e 6% b o u n d t o n a t i v e D N A - c e l l u l o s e . T h e s e r e s u l t s w e r e a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e f o r b o t h m o c k a n d v i r u s - i n f e c t e d s a m p l e s . T h e b o u n d p r o t e i n s w e r e e f f i c i e n t l y r e t a i n e d b y t h e D N A - c e l l u l o s e , a s t h e c o l u m n s w e r e w a s h e d e a c h t i m e w i t h 3 0 b e d v o l u m e s o f l o w s a l t c o l u m n b u f f e r p r i o r t o e l u t i o n w i t h c o l u m n b u f f e r o f i n c r e a s i n g N a C l m o l a r i t y . A p p r o x i m a t e l y 5 0 % o f t h e b o u n d r a d i o a c t i v i t y f r o m t h e d e n a t u r e d DNA c o l u m n s a n d 6 0 % f r o m t h e n a t i v e DNA c o l u m n s w a s e l u t e d b y t h e 0 . 3 M N a C l b u f f e r . T h e g e l s s h o w n ( F i g s . 2 5 , 2 6 a n d 2 7 ) h a v e c o m p l e x p a t t e r n s d u e t o c o n t i n u e d h o s t p r o t e i n s y n t h e s i s t h r o u g h o u t t h e s i x h o u r l a b e l i n g p e r i o d . T h i s h a s h a m p e r e d c l e a r i n t e r p r e t a t i o n o f t h e r e s u l t s a s t h e r e a r e s e v e r a l 1 2 2 T a b l e I I I R e c o v e r y o f r a d i o a c t i v i t y f o l l o w i n g D N A - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y  H O C K - I N F E C T E D V I R U S - I N F E C T E D P r e p a r a t i o n . % o f t o t a l  c p m r e c o v e r e d % o f b o u n d  c p m % o f t o t a l  c p m r e c o v e r e d % o f b o u n d  c p m D e n a t u r e d DNA c o l u m n C o l u m n l o a d 0 . 0 5 M N a C l 0 . 1 M N a C l 0 . 3 M N a C l 0 . 5 M N a C l 1 . 0 M N a C l T o t a l b o u n d 1 0 0 8 1 . 8 3 . 9 9 . 1 4 . 2 1 . 0 1 8 . 2 0 21 . 5 5 0 . 7 2 3 . 9 5 . 2 1 0 0 7 8 . 4 4 . 9 1 0 . 2 3 . 4 1 .1 21 . 6 0 2 4 . 7 5 0 . 9 1 7 . 4 5 . 8 N a t i v e DNA c o l u m n C o l u m n l o a d 0 . 0 5 M N a C l 0 . 1 M N a C l 0 . 3 M N a C l 0 . 5 M N a C l 1 . 0 M N a C l T o t a l b o u n d 1 0 0 9 4 . 2 2 . 1 3 . 1 0 . 2 0 . 4 5 . 8 0 2 7 . 5 6 0 . 0 5 . 6 6 . 8 1 0 0 9 4 . 3 1 . 3 3 . 7 0 . 5 0 . 2 5 . 7 0 2 3 . 8 6 6 . 5 7 . 2 2 . 4 1 2 3 b a n d s i n t h e l a n e s c o n t a i n i n g s a m p l e s f r o m m o c k - i n f e c t e d c e l l s t h a t h a v e t h e s a m e e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y a s s e v e r a l i n f e c t e d - c e l l - s p e c i f i c D N A - b i n d i n g p r o t e i n s . A s we d i d n o t h a v e MCMV a n t i s e r u m t h a t c o u l d p r e c i p i t a t e o u t p r o t e i n s f r o m d i l u t e s o l u t i o n s , i d e n t i f i c a t i o n o f v i r u s s p e c i f i c D N A - b i n d i n g p r o t e i n s w a s b a s e d o n t h e p r e s e n c e i n v i r a l - i n f e c t e d e x t r a c t s o f a b a n d o f g r e a t e r i n t e n s i t y t h a n a n e q u i v a l e n t b a n d i n m o c k - i n f e c t e d e x t r a c t s , a n d w h i c h h a d t h e s a m e m o l . w t . a s t h e v i r a l p r o t e i n s a l r e a d y c h a r a c t e r i z e d . F i g . 2 5 s h o w s t h e v i r a l - i n d u c e d p r o t e i n s e x t r a c t e d f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s w i t h a f f i n i t y f o r n a t i v e D N A - c e l l u l o s e . S e v e n o f e i g h t I E p r o t e i n s p r e v i o u s l y d e t e c t e d o n g r a d i e n t g e l s w e r e s h o w n t o h a v e a f f i n i t y f o r n a t i v e D N A - c e l l u l o s e a n d 3 / 6 e a r l y p r o t e i n s a l s o h a d D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e r e w e r e a t l e a s t 3 l o w m o l . w t . p r o t e i n b a n d s w i t h a f f i n i t y f o r DNA t h a t w e r e p r e s e n t i n v i r a l - i n f e c t e d c e l l e x t r a c t s o n l y ( F i g . 2 5 , l a n e 8 m a r k e d w i t h o p e n a r r o w h e a d a n d d o t s ) . T h e s e h a d n o t b e e n i d e n t i f i e d p r e v i o u s l y a s v i r a l p r o t e i n s a n d w e r e n o t f u r t h e r i n v e s t i g a t e d . T h e h e t e r o g e n e o u s n a t u r e o f s o m e o f t h e s e p r o t e i n s ( 1 0 0 K , 8 9 K , 6 3 . 5 K , 5 2 . 5 K a n d 3 0 K ) c a n b e s e e n i n t h a t t h e y a r e e l u t e d a t c o n c e n t r a t i o n s r a n g i n g f r o m 0 . 0 5 M N a C l ( u n b o u n d ) t o 0 . 3 M N a C l . T h e s a m e v i r a l - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h a f f i n i t y f o r n a t i v e D N A - c e l l u l o s e w e r e d e t e c t e d f r o m i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s a s f r o m 3 T 3 - L 1 c e l l s ( n o t s h o w n ) . T h e v i r a l - i n d u c e d p r o t e i n s e x t r a c t e d f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s a n d c h r o m a t o g r a p h e d o n d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e c o l u m n s a r e s h o w n i n F i g s . 2 6 a n d 27 r e s p e c t i v e l y . T h e n u m b e r o f p r o t e i n s t h a t h a d a f f i n i t y f o r d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e w a s l e s s t h a n f o r n a t i v e D N A , b u t a s w a s s h o w n , t h e t o t a l a m o u n t o f b o u n d p r o t e i n w a s a b o u t 3 f o l d m o r e ( F i g . 2 5 w a s e x p o s e d f o r 3 7 d a y s c o m p a r e d t o 1 5 d a y s f o r F i g s . 2 6 a n d 2 7 ) . T h e m a j o r 1 2 4 2 5 : D N A - b i n d i n g p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 3 5 c e l l s . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m h i g h s a l t e x t r a c t s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s , w h i c h w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a n a t i v e D N A - c e l l u l o s e c o l u m n a n d s e p a r a t e d i n a 1 0 - 3 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . M o c k a n d M C M V - i n f e c t e d c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e 0 - 3 3 5 h r p i . , l a b e l e d 6 h r w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 2 5 y C i / m l ) , e x t r a c t e d w i t h 1 . 7 M N a C l a n d t h e s o l u b l e f r a c t i o n , a f t e r d i a l y s i s w i t h 0 . 0 5 M N a C l , w a s a p p l i e d t o a c o l u m n o f d o u b l e s t r a n d e d D N A - c e l l u l o s e . L a n e s : 1 , 2 : I n p u t m o c k ( 1 ) a n d v i r u s - i n f e c t e d ( 2 ) p r o t e i n s a p p l i e d t o c o l u m n . 3 , 4 : U n b o u n d f r a c t i o n s o f m o c k ( 3 ) a n d v i r u s ( 4 ) p r o t e i n s e l u t e d f r o m c o l u m n . 5 , 6 : M o c k ( 5 ) a n d v i r u s ( 6 ) p r o t e i n s e l u t e d w i t h 0 . 1 M N a C l . 7 , 8 : M o c k ( 7 ) a n d v i r u s ( 8 ) p r o t e i n s e l u t e d w i t h 0 . 3 M N a C l . 9 , 1 0 : M o c k ( 9 ) a n d v i r u s ( 1 0 ) p r o t e i n s , e l u t e d w i t h 0 . 5 M N a C l . 1 1 , 1 2 : M o c k ( 1 1 ) a n d v i r u s ( 1 2 ) p r o t e i n s e l u t e d w i t h 1 . 0 M N a C l . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h - 3 c o r r e s p o n d i n g m o l . w t . ( x 1 0 ) i n l e f t m a r g i n . L a n e 2 h a s a p p r o x i m a t e l y f o u r t i m e s t h e a m o u n t o f p r o t e i n a s l a n e 1 . 1 2 5 F i g . 2 5 : P r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s w i t h a f f i n i t y f o r n a t i v e D N A - c e l l u l o s e . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s , w h i c h w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a n a t i v e D N A - c e l l u l o s e c o l u m n a n d s e p a r a t e d i n a 1 0 - 3 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . i 4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 1 2 6 2 6 : D N A - b i n d i n g p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 3 5 c e l l s . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m h i g h s a l t e x t r a c t s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s , w h i c h w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e c o l u m n a n d s e p a r a t e d i n a 1 0 - 3 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . M o c k a n d M C M V - i n f e c t e d c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h 35 c y c l o h e x i m i d e 0 - 3 h r p i . , l a b e l e d 6 h r w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 2 5 u C i / m l ) , e x t r a c t e d w i t h 1 . 7 M N a C l a n d t h e s o l u b l e f r a c t i o n , a f t e r d i a l y s i s w i t h 0 . 0 5 M N a C l , w a s a p p l i e d t o a c o l u m n o f s i n g l e s t r a n d e d D N A - c e l l u l o s e . L a n e s : 1 , 2 : I n p u t m o c k ( 1 ) a n d v i r u s i n f e c t e d ( 2 ) p r o t e i n s a p p l i e d t o c o l u m n . 3 , 4 : U n b o u n d f r a c t i o n s o f m o c k ( 3 ) a n d v i r u s ( 4 ) p r o t e i n s . 5 , 6 : M o c k ( 5 ) a n d v i r u s ( 6 ) p r o t e i n s , e l u t e d w i t h 0 . 1 M N a C l . 7 , 8 : M o c k ( 7 ) a n d v i r u s ( 8 ) p r o t e i n s , e l u t e d w i t h 0 . 3 M N a C l . 9 , 1 0 : M o c k ( 9 ) a n d v i r u s ( 1 0 ) p r o t e i n s , e l u t e d w i t h 0 . 5 M N a C l . 1 1 , 1 2 : M o c k ( 1 1 ) a n d v i r u s ( 1 2 ) p r o t e i n s e l u t e d w i t h 1 . 0 M N a C l . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h _ 3 c o r r e s p o n d i n g m o l . w t . ( x 1 0 ) i n l e f t m a r g i n . R i g h t - 3 m a r g i n s h o w s p o s i t i o n s a n d m o l . w t . ( x 1 0 ) o f m a r k e r p r o t e i n s . L a n e s 3 a n d 4 w e r e a c c i d e n t a l l y o v e r l o a d e d , t h e y h a v e 6 - 8 f o l d m o r e p r o t e i n t h a n l a n e s 1 a n d 2 . 1 2 7 F i g . 2 6 : P r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s w i t h a f f i n i t y  f o r d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s , w h i c h w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e c o l u m n a n d s e p a r a t e d i n a 1 0 - 3 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 2 8 27. : D N A - b i n d i n g p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f l a b e l e d p r o t e i n s f r o m h i g h s a l t e x t r a c t s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s , w h i c h w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e c o l u m n a n d s e p a r a t e d i n a 1 0 - 3 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . M o c k a n d M C M V - i n f e c t e d c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e 0 - 3 h r 3 5 p i . , l a b e l e d 6 h r w i t h ( S) m e t h i o n i n e ( 2 5 u C i / m l ) , e x t r a c t e d w i t h 1 . 7 M N a C l a n d t h e s o l u b l e f r a c t i o n , a f t e r d i a l y s i s w i t h 0 . 0 5 M N a C l , w a s a p p l i e d t o a c o l u m n o f s i n g l e - s t r a n d e d D N A - c e l l u l o s e . L a n e s : 1 , 2 : I n p u t m o c k ( 1 ) a n d v i r u s i n f e c t e d ( 2 ) p r o t e i n s a p p l i e d t o c o l u m n . 3 , 4 : U n b o u n d f r a c t i o n s o f m o c k ( 3 ) a n d v i r u s ( 4 ) p r o t e i n s . 5 , 6 : M o c k ( 5 ) a n d v i r u s ( 6 ) p r o t e i n s e l u t e d w i t h 0 . 1 M N a C l . 7 , 8 : M o c k ( 7 ) a n d v i r u s ( 8 ) p r o t e i n s e l u t e d w i t h 0 . 3 M N a C l . 9 , 1 0 : M o c k ( 9 ) a n d v i r u s ( 1 0 ) p r o t e i n s e l u t e d w i t h 0 . 5 M N a C l . 1 1 , 1 2 : M o c k ( 1 1 ) a n d v i r u s ( 1 2 ) p r o t e i n s e l u t e d w i t h 1 . 0 M N a C l . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h c o r r e s p o n d i n g m o l . w t . ( x l O ) i n l e f t m a r g i n . R i g h t - 3 m a r g i n s h o w s p o s i t i o n s a n d m o l . w t . ( x l O ) o f m a r k e r p r o t e i n s . 1 2 9 F i g . 2 7 : P r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s w i t h a f f i n i t y  f o r d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s , w h i c h w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e c o l u m n a n d s e p a r a t e d i n a 1 0 - 3 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . H j ! 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 1 3 0 I E p r o t e i n s ( 1 0 0 K a n d 8 9 K ) h a d a f f i n i t y f o r b o t h n a t i v e a n d d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e b u t a g r e a t e r a f f i n i t y f o r d e n a t u r e d DNA c a n b e o b s e r v e d ( F i g s . 2 6 a n d 2 7 , l a n e s 8 ) . D i f f e r e n c e s w e r e s e e n w h e n a f f i n i t y f o r d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e w a s c o m p a r e d . I n p a r t i c u l a r , t h e 9 6 K p r o t e i n h a d a f f i n i t y f o r d e n a t u r e d DNA w h e n s y n t h e s i z e d i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s ( F i g . 2 7 , l a n e 8 ) b u t n o t w h e n p r o d u c e d i n 3 T 3 - L 1 c e l l s ( F i g . 2 6 , l a n e 4 ) . T h i s p r o t e i n h a d b e e n s h o w n t o h a v e a f f i n i t y f o r n a t i v e DNA i n b o t h c a s e s . T h e 8 3 . 5 K I E p r o t e i n d i d n o t a p p e a r t o h a v e a f f i n i t y f o r d e n a t u r e d DNA w h e n s y n t h e s i z e d i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s ( F i g . 2 7 , l a n e 4 ) . T h e 5 2 . 5 K I E p r o t e i n w a s o b s e r v e d t o h a v e a f f i n i t y f o r n a t i v e DNA ( F i g . 2 5 ) , h o w e v e r t h i s p r o t e i n c o u l d n o t b e d e t e c t e d i n F i g . 2 6 a n d o n l y i n t h e u n b o u n d f r a c t i o n i n F i g . 27 ( l a n e 4 ) . T h e 9 1 K e a r l y p r o t e i n w a s o n l y o b s e r v e d t o h a v e a f f i n i t y f o r d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e . T h e m a j o r e a r l y p r o t e i n s ( 3 9 K a n d 3 6 K ) h a d a f f i n i t y f o r b o t h n a t i v e a n d d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e . c ) D N A - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y : n u c l e a r e x t r a c t s . T o f u r t h e r a n a l y z e t h e d i f f e r e n c e s o b s e r v e d w i t h t h e 9 6 K I E p r o t e i n , p r o t e i n e x t r a c t s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f i n f e c t e d c e l l s w e r e p r e p a r e d . T h e o r i g i n a l h i g h s a l t p r o c e d u r e u s e d d i d n o t s o l u b i l i z e t h e n u c l e a r v i r a l p r o t e i n s e f f i c i e n t l y . F i g . 2 8 s h o w s t h a t a p r o p o r t i o n o f t h e c h a r a c t e r i z e d v i r a l - i n d u c e d p r o t e i n s r e m a i n e d w i t h t h e i n s o l u b l e n u c l e a r f r a c t i o n a f t e r h i g h s a l t t r e a t m e n t ( l a n e 2 ) . T h i s c o u l d i n d i c a t e t h a t a p r o p o r t i o n o f t h e v i r a l p r o t e i n s w e r e a t t a c h e d t o t h e n u c l e a r m a t r i x . S t u d i e s h a v e s h o w n t h a t s o m e h e r p e s s i m p l e x v i r u s p r o t e i n s w e r e r e s i s t a n t t o h i g h s a l t e x t r a c t i o n w h e n a t t a c h e d t o t h e n u c l e a r m a t r i x ( B i b o r - H a r d y e t a l - , 1 9 8 2 ; B i b o r - H a r d y e t a l - , 1 9 8 5 ) . I n a d d i t i o n , a n o t h e r p o r t i o n o f t h e v i r a l p r o t e i n s p r e c i p i t a t e d , f o l l o w i n g d i a l y s i s o f t h e e x t r a c t i o n s o l u t i o n t o 0 . 0 5 M N a C l ( F i g . 2 8 , l a n e 4 ) . A s a n 131 F i g . 2 8 : A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f i n s o l u b l e p r o t e i n s f r o m e x t r a c t s o f n u c l e a r f r a c t i o n s o f MCMV a n d m o c k - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s s e p a r a t e d , b y e l e c t r o p h o r e s i s . C e l l s w e r e M C M V - i n f e c t e d a n d m o c k - i n f e c t e d , t r e a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e 0 - 3 h r p i . a n d t h e n 3 5 l a b e l e d 6 h r w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 1 0 y C i / m l ) . N u c l e i w e r e r e l e a s e d b y t r e a t m e n t o f i n f e c t e d c e l l s w i t h 1% N P 4 0 . E x t r a c t s w e r e p r e p a r e d f r o m n u c l e i b y e x t r a c t i o n i n b u f f e r c o n t a i n i n g 1 . 7 M N a C l . T h e i n s o l u b l e m a t e r i a l ( f r a c t i o n A ) w a s s e d i m e n t e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( 3 0 , 0 0 0 g / 3 0 m i n ) a n d t h e s u p e r n a t a n t d i a l y s e d a g a i n s t b u f f e r c o n t a i n i n g 5 0 mM N a C l . T h e p r e c i p i t a t e ( f r a c t i o n B ) w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( 1 0 0 , 0 0 0 g / 1 h r ) . F r a c t i o n s A ) a n d B ) w e r e d i s s o l v e d i n S D S - s a m p l e b u f f e r a n d s e p a r a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . L a n e s : 1 , 2 ; p r o t e i n s f r o m f r a c t i o n A ) f r o m m o c k - i n f e c t e d a n d v i r u s - i n f e c t e d n u c l e a r f r a c t i o n s . 3 , 4 ; p r o t e i n s f r o m f r a c t i o n B ) f r o m m o c k - i n f e c t e d a n d v i r u s - i n f e c t e d n u c l e a r f r a c t i o n s . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s - 3 w i t h c o r r e s p o n d i n g m o l . w t . ( x 1 0 ) i n l e f t m a r g i n . 1 3 2 F i f l - 2 8 : I n s o l u b l e p r o t e i n s f r o m e x t r a c t s o f n u c l e a r f r a c t i o n s o f MCMV a n d  m o c k - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s . 1 3 3 a l t e r n a t i v e , e x t r a c t i o n w i t h h i g h s a l t a n d s p e r m i n e ( d e s c r i b e d b y B l a i r a n d H o n e s s , 1 9 8 3 ) w a s u s e d a s i t h a d b e e n r e p o r t e d t o s o l u b i l i z e e f f i c i e n t l y t h e e a r l y p r o t e i n s o f H e r p e s v i r u s s a i m i r i f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f i n f e c t e d c e l l s . P r o t e i n e x t r a c t s w e r e p r e p a r e d f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k a n d MCMV i n f e c t e d c e l l s a n d u s e d a s s t a r t i n g m a t e r i a l f o r d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y . T h e p e a k f r a c t i o n s e l u t e d f r o m t h e c o l u m n s w e r e p r e c i p i t a t e d a n d r u n o n 7 . 5 % p o l y a c r y l a m i d e g e l s . T h i s c o n c e n t r a t i o n o f a c r y l a m i d e m o r e c l e a r l y s e p a r a t e d t h e 1 0 0 K a n d 9 6 K p r o t e i n s . T h i s e x t r a c t i o n m e t h o d p r o d u c e d s o m e d i f f e r e n c e s i n t h e D N A - b i n d i n g p r o t e i n s d e t e c t e d , p r e s u m a b l y a s a r e s u l t o f d i f f e r e n c e s i n t h e p o p u l a t i o n o f p r o t e i n s t h a t w e r e s o l u b i l i z e d . I n p a r t i c u l a r , i t c a n b e s e e n t h a t t h e m a j o r e a r l y p r o t e i n s ( 3 9 K a n d 3 6 K ) d i d n o t a d h e r e t o D N A - c e l l u l o s e i n e i t h e r c a s e ( F i g . 2 9 A a n d B , l a n e s 4 ) . H o w e v e r , t h e 1 0 0 K a n d 8 9 K p r o t e i n s f r o m b o t h c e l l t y p e s h a d D N A - a f f i n i t y . I n a d d i t i o n , t h i s e x p e r i m e n t c o n f i r m e d t h e p r e v i o u s o b s e r v a t i o n t h a t t h e 9 6 K p r o t e i n o n l y h a d D N A - b i n d i n g p r o p e r t y w h e n s y n t h e s i z e d i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s , b u t n o t w h e n s y n t h e s i z e d i n 3 T 3 - L 1 c e l l s ( F i g . 2 9 B , l a n e s 6 a n d 8 ) . d ) D N A - b i n d i n g p r o t e i n s d e t e c t e d b y f i l t e r a f f i n i t y . A n a l t e r n a t i v e m e t h o d w a s u s e d t o a n a l y z e p r o t e i n s w i t h D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s . T h e d i f f e r e n c e i n t h i s m e t h o d i s t h a t p r o t e i n s c a n b e a n a l y z e d t h a t a r e i n s o l u b l e u n d e r t h e h i g h s a l t e x t r a c t i o n / d i a l y s i s c o n d i t i o n s u s e d i n p r e v i o u s e x p e r i m e n t s . H o w e v e r t h i s m e t h o d a n a l y z e s p r o t e i n s t h a t h a v e b e e n d e n a t u r e d a n d w h i c h h a v e o n l y p a r t i a l l y r e n a t u r e d a f t e r b l o t t i n g . D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s o f s o m e p r o t e i n s m a y n o t b e d e t e c t e d i f t h e p r o t e i n s t r u c t u r e n e c e s s a r y f o r t h i s p r o p e r t y r e m a i n e d d e n a t u r e d . 1 3 4 2 9 : A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e s o f D N A - b i n d i n g p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 ( A ) a n d J 7 7 4 A . 1 ( B ) c e l l s s e p a r a t e d i n 7 . 5 % p o l y a c r y l a m i d e g e l s . M o c k a n d M C M V - i n f e c t e d c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e 0 - 3 h r 3 5 p i . , l a b e l e d 6 h r w i t h ( S) m e t h i o n i n e ( 2 0 y C i / m l ) a n d r e l e a s e d n u c l e i w e r e e x t r a c t e d w i t h 2 . 0 M N a C l a n d 5 mM s p e r m i n e . T h e s o l u b l e f r a c t i o n s , a f t e r d i a l y s i s w i t h 0 . 0 5 M N a C l a n d 5 mM s p e r m i n e , w e r e a p p l i e d t o c o l u m n s o f s i n g l e s t r a n d e d D N A - c e l l u l o s e . L a n e s : 1 , 2 : I n p u t m o c k ( 1 ) a n d v i r u s i n f e c t e d ( 2 ) p r o t e i n s a p p l i e d t o c o l u m n . 3 , 4 : U n b o u n d f r a c t i o n s o f m o c k ( 3 ) a n d v i r u s ( 4 ) p r o t e i n s . 5 , 6 : M o c k ( 5 ) a n d v i r u s ( 6 ) p r o t e i n s e l u t e d w i t h 0 . 1 M N a C l . 7 , 8 : M o c k ( 7 ) a n d v i r u s ( 8 ) p r o t e i n s e l u t e d w i t h 0 . 3 M N a C l . 9 , 1 0 : M o c k ( 9 ) a n d v i r u s ( 1 0 ) p r o t e i n s e l u t e d w i t h 0 . 5 M N a C l . 1 1 , 1 2 : C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h - 3 c o r r e s p o n d i n g m o l . w t . ( x 1 0 ) . 1 3 5 F i g . 2 9 : P r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1  a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s w i t h a f f i n i t y f o r d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f l a b e l e d p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s , w h i c h w e r e c h r o m a t o g r a p h e d o n a d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e c o l u m n a n d s e p a r a t e d i n 7 . 5 % p o l y a c r y l a m i d e g e l s . 1 3 6 T h e p r o t e i n s w e r e p r o b e d w i t h l a b e l e d M C M V - D N A , a s o p p o s e d t o c a l f t h y m u s D N A , w h i c h h a d b e e n u s e d f o r m a k i n g t h e D N A - c e l l u l o s e u s e d i n t h e c o l u m n s . T h i s m e t h o d s e e m s t o h a v e l i m i t e d s e n s i t i v i t y . F i g . 3 0 ( l a n e 2 ) s h o w s t h e p r o t e i n s w i t h D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s f r o m t h e n u c l e a r f r a c t i o n s o f i n f e c t e d c e l l s t h a t w e r e s y n t h e s i z e d u n d e r I E c o n d i t i o n s ( d e s c r i b e d i n F i g 4 ) . T h e 1 0 0 K p r o t e i n h a s D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s b y t h i s m e t h o d . T h e e q u i v a l e n t c y t o p l a s m i c s a m p l e i s s h o w n i n l a n e 6 . T h e 1 0 0 K p r o t e i n w a s d e t e c t e d h e r e a l o n g w i t h t h e 8 9 K a n d 8 0 K I E p r o t e i n s . T h e 3 9 K a n d 3 6 K p r o t e i n s c o u l d n o t b e a s s e s s e d b y t h i s m e t h o d a s t h e y c o m i g r a t e d w i t h a n d w e r e m a s k e d b y s t r o n g l y b i n d i n g n u c l e a r c e l l u l a r p r o t e i n s w h i c h w i l l i n c l u d e h i s t o n e s a n d n o n - h i s t o n e c h r o m o s o m a l p r o t e i n s . T h e m o l . w t s . o f t h e v i r u s - i n d u c e d D N A - b i n d i n g p r o t e i n s w e r e d e t e r m i n e d b y c o m p a r i s o n w i t h a g e l , 3 5 r u n i n p a r a l l e l , o f s a m p l e s o f ( S ) m e t h i o n i n e l a b e l e d p r o t e i n s f r o m c e l l s i n f e c t e d u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s a s d e s c r i b e d i n F i g . 3 0 l e g e n d ( n o t s h o w n ) . O f i n t e r e s t w a s t h e f a c t t h a t t h e m a j o r D N A - b i n d i n g p r o t e i n p r e s e n t i n p u r i f i e d v i r i o n s ( F i g . 3 0 - V I R ) a l s o h a d a m o l . w t . o f a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 K . A t p r e s e n t , i t i s n o t k n o w n i f i t i s t h e s a m e p r o t e i n a s t h e 1 0 0 K I E p r o t e i n . A s u m m a r y o f t h e p r e c e d i n g e x p e r i m e n t s i s l i s t e d i n T a b l e I V . T h i s l i s t s t h e c o m p l e t e n u m b e r o f M C M V - i n d u c e d p r o t e i n s , w i t h t h e i r k i n e t i c c l a s s , c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n , p h o s p h o r y l a t i o n a n d D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s . 1 8 . A t t e m p t s t o d e t e c t v i r a l - i n d u c e d I E g l y c o p r o t e i n s . I t h a d b e e n r e p o r t e d t h a t a c y t o t o x i c T c e l l r e s p o n s e d e v e l o p e d i n M C M V - i n f e c t e d m i c e t h a t w a s r e a c t i v e i n . v i t r o a g a i n s t M C M V - i n f e c t e d c e l l s e x p r e s s i n g o n l y I E p r o t e i n s ( R e d d e h a s s e a n d K o z i n o w s k i , 1 9 8 4 ) . T h i s l e d t o t h e s p e c u l a t i o n 1 3 7 3 0 : A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f p r o t e i n s w i t h a f f i n i t y f o r d e n a t u r e d M C M V - D N A . MCMV o r m o c k - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s w e r e t r e a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e 0 - 3 h r p i . a n d t h e n i n c u b a t e d 3 h r i n m e d i u m w i t h 1 0 u g / m l a c t i n o m y c i n D ( 1 , 2 , 5 , 6 ) ( I E ) o r i n f e c t e d a n d m a i n t a i n e d i n t h e p r e s e n c e o f PAA ( 1 0 0 u g / m l ) u n t i l 5 h r p i . ( 3 , 4 , 7 , 8 ) ( E a r l y ) . C e l l s w e r e h a r v e s t e d , s e p a r a t e d i n t o n u c l e a r ( N U C ) a n d c y t o p l a s m i c ( C Y T ) f r a c t i o n s , s e p a r a t e d i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l a n d e l e c t r o b l o t t e d o n t o a n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e . T h e f i l t e r s w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 0 6 c . p . m . o f d e n a t u r e d M C M V - D N A l a b e l e d w i t h ( c f 3 2 P ) d A T P b y n i c k t r a n s l a t i o n . L a n e s : 1 , p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d c e l l s ( I E ) . 2 , p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d c e l l s ( I E ) . 3 , p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d c e l l s ( E a r l y ) . 4, p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d c e l l s ( E a r l y ) . 5 , p r o t e i n s f r o m c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d c e l l s ( I E ) . 6 , p r o t e i n s f r o m c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d c e l l s ( I E ) . 7 , p r o t e i n s f r o m c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d c e l l s ( E a r l y ) . 8 , p r o t e i n s f r o m c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d c e l l s ( E a r l y ) . V I R . D N A - b i n d i n g t o s e p a r a t e d p r o t e i n s f r o m g r a d i e n t p u r i f i e d MCMV v i r i o n s . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h _ 3 c o r r e s p o n d i n g m o l . w t . ( x 1 0 ) o n l e f t s i d e . 1 3 8 F i g . 3 0 : A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f p r o t e i n s f r o m m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d  3 T 3 - L 1 c e l l s , e l e c t r o b l o t t e d o n t o n i t r o c e l l u l o s e a n d p r o b e d f o r a f f i n i t y t o  l a b e l e d d e n a t u r e d M C M V - D N A . 1 3 9 T a b l e I V : P r o p e r t i e s o f M C M V - i n d u c e d I m m e d i a t e E a r l y a n d E a r l y P r o t e i n s M O L E C U L A R W E I G H T K I N E T I C DNA P H O S P H O R Y L A T E D C E L L ( X 1 0 ~ 3 ) C L A S S A F F I N I T Y L O C A T I O N 1 0 0 I E d s & s s + N u c l e u s & c y t o p l a s m . 9 6 I E d s & s s 1 + N u c l e u s . 91 E s s N u c l e u s . 8 9 I E d s & s s + N u c l e u s & c y t o p l a s m . 8 6 I E +(?) M a i n l y n u c l e u s . 8 3 . 5 I E d s & s s 2 N u c l e u s & c y t o p l a s m . 8 0 I E C y t o p l a s m . 6 3 . 5 I E d s & s s M a i n l y n u c l e u s . 6 0 E d s & s s N . D . 5 4 E - C y t o p l a s m . 5 2 . 5 I E d s N u c l e u s & c y t o p l a s m . 51 . 5 E - C y t o p l a s m . 51 E - C y t o p l a s m . 3 9 E d s & s s + N u c l e u s . 3 6 E d s & s s + N u c l e u s . 3 0 I E d s & s s + ( ? ) N u c l e u s & c y t o p l a s m . 2 8 I E N . D . N u c l e u s & c y t o p l a s m . I E i m m e d i a t e e a r l y ; N . D . : n o t d e t e r m i n e d E e a r l y d s d o u b l e s t r a n d e d c a l f t h y m u s D N A - c e l l u l o s e s s s i n g l e s t r a n d e d c a l f t h y m u s D N A - c e l l u l o s e 1 . 9 6 K I E p r o t e i n - n o s s a f f i n i t y f r o m 3 T 3 - L 1 c e l l s . 2 . 8 3 . 5 K I E p r o t e i n - n o s s a f f i n i t y f r o m J 7 7 4 A . 1 c e l l s 3 . M e a s u r e d b y D N A - a f f i n i t y t o e l e c t r o b l o t t e d p r o t e i n s o n NC m e m b r a n e . 140 31: 3 Autoradiographic image of ( H) glucosamine labeled glycoproteins of nuclear and cytoplasmic fractions from mock infected and MCMV-infected 3T3-L1 cells separated by electrophoresis in a 10% polyacrylamide gel. Cultures of 3T3-L1 cells were mock and MCMV-infected, treated with cycloheximide from 0-3 hr pi. and then labeled with 3 ( H)glucosamine (20 uCi/ml) for 5 hr in presence of 10 3 ug/ml actinomycin 0. The gel was treated with En Hance prior to drying. Lanes: 1, proteins in nuclear fraction of mock-infected cells. 2, proteins in cytoplasmic fraction of mock-infected cells. 3, proteins in nuclear fraction of virus-infected cells. 4, proteins in cytoplasmic fraction of virus-infected cells. 141 F i g . 3 1 : I d e n t i f i c a t i o n o f g l y c o s y l a t e d p r o t e i n s i n n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c  f r a c t i o n s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s , l a b e l e d a t I E t i m e s . MOCK VIRUS N C N C 1 4 2 t h a t o n e o f t h e I E p r o t e i n s m a y a l s o b e l o c a t e d i n t h e c e l l m e m b r a n e . A s m o s t m e m b r a n e p r o t e i n s a r e g l y c o s y l a t e d , a t t e m p t s w e r e m a d e t o d e t e c t I E 3 p r o t e i n s l a b e l e d w i t h ( H) g l u c o s a m i n e . F i g . 31 s h o w s t h a t n o v i r a l - i n d u c e d I E g l y c o p r o t e i n s o f a n y m o l . w t . w e r e d e t e c t e d u s i n g t h e l a b e l i n g c o n d i t i o n s d e s c r i b e d ( s e e F i g . l e g e n d ) . T h i s w a s c o n f i r m e d b y K e i l e t a l _ . ( 1 9 8 5 ) , b u t c o n t r a r y t o t h e f i n d i n g s o f V . M i s r a ( p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n s ) . 1 9 . M C M V - i n f e c t i o n o f P 3 8 8 D . 1 m a c r o p h a g e a n d N S - 1 m y e l o m a c e l l s . MCMV i n f e c t i o n s o f t w o o t h e r m u r i n e l y m p h o i d c e l l l i n e s w e r e s t u d i e d . P 3 8 8 D . 1 c e l l s a r e a l i n e o f i n t e r l e u k i n - 1 s e c r e t i n g m a c r o p h a g e - 1 i k e c e l l s a n d N S - 1 c e l l s a r e a l i n e . o f B l y m p h o c y t e m y e l o m a c e l l s . T h e c e l l s w e r e i n f e c t e d u n d e r s t a n d a r d c o n d i t i o n s u s i n g c y c l o h e x i m i d e p r e t r e a t m e n t . F i g . 3 2 s h o w s a c o m p a r i s o n o f p r o t e i n s s y n t h e s i z e d i n P 3 3 8 D . 1 ( l a n e s 1 - 4 ) a n d J 7 7 4 A . 1 ( l a n e s 5 - 8 ) c e l l s u s i n g l a b e l i n g c o n d i t i o n s s p e c i f i c f o r I E p r o t e i n s . I n t h i s g e l , 8 o f t h e MCMV I E p r o t e i n s c a n b e d e t e c t e d i n n u c l e a r f r a c t i o n s o f i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s , b u t n o v i r a l - i n d u c e d p r o t e i n s w e r e i d e n t i f i e d i n i n f e c t e d P 3 8 8 D . 1 c e l l s . S o m e M C M V - i n d u c e d I E a n d e a r l y p r o t e i n s w e r e s y n t h e s i z e d i n N S - 1 c e l l s ( F i g . 3 3 ) . T h e h i g h d e g r e e o f h o s t p r o t e i n s y n t h e s i s , e v e n o f p r o t e i n s t h a t p a r t i t i o n e d w i t h t h e n u c l e a r f r a c t i o n s o f c e l l s , m a y h a v e h i n d e r e d d e t e c t i o n o f m i n o r b a n d s . H o w e v e r , t h e m a j o r I E p r o t e i n s o f 1 0 0 K , 9 6 K a n d 8 9 K w e r e d e t e c t e d . I n a d d i t i o n , t h e s w i t c h t o e a r l y p r o t e i n s y n t h e s i s o c c u r r e d i n t h e s e c e l l s a s t h e 9 1 K , 3 9 K a n d 3 6 K e a r l y n u c l e a r p r o t e i n s w e r e d e t e c t e d . 1 4 3 3 2 : 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( S ) m e t h i o n i n e l a b e l e d p r o t e i n s o f n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s f r o m m o c k i n f e c t e d a n d M C M V - i n f e c t e d P 3 3 8 D . 1 ( l a n e s 1 - 4 ) a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s ( l a n e s 5 - 8 ) s e p a r a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . C e l l s w e r e m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d , t r e a t e d w i t h 35 c y c l o h e x i m i d e 0 - 3 hr p i . a n d t h e n l a b e l e d 1 h r w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 p C i / m l ) . T h e g e l w a s t r e a t e d w i t h 3 En H a n c e p r i o r t o d r y i n g . L a n e s ; 1 , p r o t e i n s i n n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d P 3 8 8 0 . 1 c e l l s . 2 , p r o t e i n s i n c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d P 3 8 8 D . 1 c e l l s . 3 , p r o t e i n s i n n u c l e a r f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d P 3 8 8 D . 1 c e l l s . 4 , p r o t e i n s i n c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d P 3 8 8 D . 1 c e l l s . 5 , p r o t e i n s i n n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s . 6 , p r o t e i n s i n c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s . 7 , p r o t e i n s i n n u c l e a r f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s . 8 , p r o t e i n s i n c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h _3 a p p a r e n t m o l . w t . ( x l O ) i n r i g h t c o l u m n . 1 4 4 E i S L — P r o t e i n s i n n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d P 3 3 8 D . 1 a n d J 7 7 4 A . 1 c e l l s , l a b e l e d a t I E t i m e s -pass D J 7 7 4 A 1 N C N C N C N C 1 4 5 3 3 : 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( S ) m e t h i o n i n e l a b e l e d p r o t e i n s o f n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s f r o m m o c k i n f e c t e d a n d M C M V - i n f e c t e d N S - 1 c e l l s s e p a r a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . C e l l s w e r e m o c k a n d M C M V - i n f e c t e d , t r e a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e 0 - 3 h r p i . ( l a n e s 1 - 4 ) o r 2 - 5 h r 3 5 p i . ( l a n e s 5 - 8 ) a n d t h e n l a b e l e d 1 h r w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 u C i / m l ) . L a n e s : 1 , 5 ; p r o t e i n s i n n u c l e a r f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d N S - 1 c e l l s . 2 , 6 ; p r o t e i n s i n c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d N S - 1 c e l l s . 3 , 7 ; p r o t e i n s i n n u c l e a r f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d N S - 1 c e l l s . 4 , 8 ; p r o t e i n s i n c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d N S - 1 c e l l s . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h a p p a r e n t m o l . w t . ( x l O ) i n l e f t c o l u m n . 1 4 6 F i g . 3 3 : P r o t e i n s i n n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s o f m o c k a n d  M C M V - i n f e c t e d N S - 1 c e l l s , l a b e l e d a t I E a n d e a r l y t i m e s . 1 2 3 4 5 6 7 8 1 4 7 D I S C U S S I O N . T h e d e t a i l e d a n a l y s i s o f p r o t e i n s i n d u c e d b y MCMV d u r i n g t h e e a r l y p h a s e o f i n f e c t i o n ( p r i o r t o DNA s y n t h e s i s ) h a s b e e n d e s c r i b e d . T h e s e p r o t e i n s w e r e c h a r a c t e r i z e d a c c o r d i n g t o t h e i r t e m p o r a l o r d e r o f s y n t h e s i s , s y n t h e s i s i n t h e p r e s e n c e o f t r a n s c r i p t i o n a l a n d v i r a l DNA s y n t h e s i s i n h i b i t o r s , t w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n , l o c a l i z a t i o n i n c e l l s u n d e r e n h a n c e d a n d u n e n h a n c e d s y n t h e s i s c o n d i t i o n s , p h o s p h o r y l a t i o n a n d D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s . I n a d d i t i o n , t h e s y n t h e s i s o f t h e s e p r o t e i n s i n t w o n o n p e r m i s s i v e c e l l t y p e s w a s a n a l y z e d a n d t h e f e a t u r e s o f t h e s e n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s w e r e a l s o i n v e s t i g a t e d . A n u m b e r o f s i g n i f i c a n t f i n d i n g s w e r e m a d e d u r i n g t h i s s t u d y . F i r s t l y , a t o t a l o f 1 0 i m m e d i a t e - e a r l y ( I E ) a n d 7 e a r l y M C M V - i n d u c e d p r o t e i n s w e r e i d e n t i f i e d i n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d c e l l s , d u r i n g t h e p e r i o d s t u d i e d , w i t h e s t i m a t e d m o l . w t s . r a n g i n g f r o m 2 8 K - 1 0 0 K . T h i s w a s a g r e a t e r n u m b e r t h a n h a d p r e v i o u s l y b e e n d e t e c t e d ( C h a n t l e r a n d H u d s o n , 1 9 7 8 ; C h a n t l e r , 1 9 7 8 ; M o o n e t a l _ . , 1 9 7 9 ) . T h e s e r e s u l t s d o n o t i m p l y t h e s y n t h e s i s o f 17 s e p a r a t e g e n e p r o d u c t s . T h i r t e e n o f 17 o f t h e p r o t e i n s w e r e s h o w n t o p a r t i t i o n e x c l u s i v e l y o r p a r t l y w i t h t h e n u c l e i d u r i n g t h e i n f e c t i o u s c y c l e a n d 1 2 o f t h e m h a d a f f i n i t y f o r D N A . S e c o n d l y , a n a l y s i s o f n o n p e r m i s s i v e MCMV i n f e c t i o n s i n d i c a t e d t h a t t h e y h a v e d i f f e r e n t c h a r a c t e r i s t i c s t o t h o s e d e s c r i b e d f o r HCMV ( J e a n g e t a l . , 1 9 8 2 ; D e M a r c h i , 1 9 8 3 b ) . S i x t e e n o f 17 p r o t e i n s f o u n d i n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s w e r e a l s o f o u n d i n n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d 0 7 7 4 A . 1 c e l l s ( t h e e q u i v a l e n t e x p e r i m e n t t o i d e n t i f y t h e 8 0 K c y t o p l a s m i c I E p r o t e i n w a s n o t p e r f o r m e d ) . T h e r e w a s n o e v i d e n c e o f a r e s t r i c t i o n o f e a r l y g e n e e x p r e s s i o n o c c u r r i n g a t a n y s t a g e p r i o r t o v i r a l DNA s y n t h e s i s . I n a d d i t i o n , 1 4 8 a l l t h e n u c l e u s - a s s o c i a t e d p r o t e i n s f o u n d i n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d c e l l s w e r e i d e n t i f i e d f o l l o w i n g MCMV i n f e c t i o n o f J 7 7 4 A . 1 c e l l s a n d h u m a n f i b r o b l a s t c e l l s . T h i r d l y , t w o p r o p e r t i e s o f m a j o r I E p r o t e i n s w e r e o b s e r v e d t o b e d i f f e r e n t i n t h e n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d c e l l s . I n o n e c a s e , t h e 9 6 K I E p r o t e i n p r o d u c e d i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s w a s s e e n t o h a v e a f f i n i t y f o r d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e , w h i l e t h e s a m e p r o t e i n p r o d u c e d i n 3 T 3 - L 1 c e l l s d i d n o t h a v e t h i s p r o p e r t y . I n t h e o t h e r c a s e , a h i g h e r p r o p o r t i o n o f t h e 1 0 0 K I E p r o t e i n i n H F F c e l l s r e m a i n e d n u c l e u s - a s s o c i a t e d c o m p a r e d t o t h a t i n 3 T 3 - L 1 c e l l s . T h e m a j o r l i m i t a t i o n o f t h e s e e x p e r i m e n t s h a s b e e n t h e a l m o s t e x c l u s i v e s t u d y o f v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s i n t o t a l c e l l o r f r a c t i o n a t e d c e l l l y s a t e s a n d t h e a b s e n c e o f i m m u n o p r e c i p i t a t i o n s t u d i e s w i t h d e f i n e d a n t i s e r u m . A l t h o u g h 9 - 1 1 o f t h e 17 p r o t e i n s c o u l d b e p r e c i p i t a t e d w i t h s e r u m f r o m MCMV i n f e c t e d m i c e , i t w a s n o t p o s s i b l e t o p r o v e t h a t t h e y w e r e v i r u s c o d e d . H o w e v e r , t h i s w o r k h a s i d e n t i f i e d a n d p r o v i d e d a d e t a i l e d d e s c r i p t i o n o f s o m e o f t h e p r o p e r t i e s o f t h e p r o t e i n s t h a t a r e p r e s e n t i n i n f e c t e d c e l l s d u r i n g t h e e a r l y s t a g e o f i n f e c t i o n . A c o m p a r i s o n o f t h e s e r e s u l t s w i t h t h o s e p u b l i s h e d f o r t h e s a m e s t r a i n o f MCMV s h o w e d t h e f o l l o w i n g . I n t h i s w o r k , we h a v e f o u n d t h a t t h r e e m a j o r I E p r o t e i n s ( 1 0 0 K , 9 6 K a n d 8 9 K ) w e r e p r o d u c e d i n g r e a t e s t a b u n d a n c e a f t e r t h e r e v e r s a l o f a c y c l o h e x i m i d e b l o c k . P r e s e n t w i t h t h e s e , i n l e s s a b u n d a n c e , w e r e t w o o t h e r I E p r o t e i n s ( 8 6 K a n d 8 3 . 5 K ) . C h a n t l e r a n d H u d s o n ( 1 9 7 8 ) i d e n t i f i e d t h r e e ' I E ' p r o t e i n s o f 8 6 . 5 K , 7 4 K a n d 6 9 K m o l . w t . a n d f o u r m a j o r p r o t e i n s i n a l a t e r s t u d y ( C h a n t l e r , 1 9 7 8 ) . M o o n e t a l _ . ( 1 9 7 9 ) d e t e c t e d f o u r a b u n d a n t MCMV I E p r o t e i n s a n d o n e m i n o r s p e c i e s , w h o s e m o l . w t s . m o r e c l o s e l y m a t c h e d t h o s e o f t h e p r o t e i n s i d e n t i f i e d i n t h i s t h e s i s . 1 4 9 D u r i n g t h e p r e p a r a t i o n o f t h i s t h e s i s , a r e p o r t d e s c r i b i n g t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e m a j o r I E p r o t e i n s o f MCMV w a s p u b l i s h e d ( K e i l e t a l _ . , 1 9 8 5 ) . T h e t w o w o r k s w i l l b e c o m p a r e d i n d e t a i l a s , a l t h o u g h t h e r e w e r e a n u m b e r o f s i m i l a r i t i e s w i t h t h e p r o t e i n s we h a v e i d e n t i f i e d , t h e r e w e r e a l s o a n u m b e r o f d i f f e r e n c e s . T h e y i d e n t i f i e d t h r e e m a j o r I E p r o t e i n s o f 8 9 K , 8 4 K a n d 7 6 K e s t i m a t e d m o l . w t s . T h e s e p r o t e i n s h a d s o m e o f t h e p r o p e r t i e s o f t h e 1 0 0 K , 9 6 K a n d 8 9 K p r o t e i n s t h a t h a d b e e n i d e n t i f i e d i n t h i s t h e s i s , i n t h a t t h e y w e r e h i g h l y e n h a n c e d b y c y c l o h e x i m i d e p r e t r e a t m e n t o f i n f e c t e d c e l l s . F o r t h e p u r p o s e s o f c o m p a r i s o n , i t w i l l b e a s s u m e d t h a t t h e s e t w o g r o u p s o f p r o t e i n s a r e t h e s a m e . O n e m i g h t c o n c l u d e t h a t t h e d i f f e r e n c e s i n m o l . w t . e s t i m a t i o n s o c c u r r e d b e c a u s e o f t h e u s e o f d i f f e r e n t P A G E p r o c e d u r e s . H o w e v e r , i t c a n b e s u g g e s t e d t h a t t h e r e i s a g e n e t i c b a s i s f o r t h e d i f f e r e n c e s . I n t h e i r r e s u l t s a n d t h o s e r e p o r t e d h e r e , t h e s a m e e a r l y p r o t e i n o f 9 1 K e s t i m a t e d m o l . w t . h a s b e e n i d e n t i f i e d w h i c h c a n b e u s e d a s a m a r k e r f o r c o m p a r i s o n . I n t h e f i r s t c a s e , i t w a s l a r g e r t h a n t h e m a j o r I E p r o t e i n s t h e y h a d c h a r a c t e r i z e d ( K e i l e t a l _ . , 1 9 8 5 ) , w h i l e t h e s a m e p r o t e i n i d e n t i f i e d i n t h i s t h e s i s h a d a f a s t e r e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y t h a n t w o o f t h e m a j o r I E p r o t e i n s ( F i g . 7 ) . I t c a n b e s u g g e s t e d t h a t t h e I E p r o t e i n s o f t h e MCMV s t r a i n u s e d i n t h i s t h e s i s w e r e a c t u a l l y l a r g e r t h a n t h o s e d e s c r i b e d b y K e i l e t a l _ . ( 1 9 8 5 ) . A s u r p r i s i n g d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o s t u d i e s w a s t h e n u m b e r a n d a b u n d a n c e o f t h e o t h e r I E p r o t e i n s . We h a v e f o u n d a l a r g e r n u m b e r o f a b u n d a n t I E p r o t e i n s t h a n r e p o r t e d b y K e i l e t a l . . ( 1 9 8 5 ) . T h e m i n o r I E p r o t e i n s t h e y i d e n t i f i e d ( 3 1 K a n d 1 5 K ) , w e r e p r e s e n t i n v e r y s m a l l a m o u n t s i n c e l l l y s a t e s a n d t w o o t h e r s ( 6 9 K a n d 5 1 K ) w e r e o n l y f o u n d a f t e r i n . v i t r o t r a n s l a t i o n o f w h o l e c e l l R N A . T h e I E p r o t e i n s o f 3 0 K a n d 5 2 . 5 K i d e n t i f i e d i n t h i s t h e s i s w o u l d b e e q u i v a l e n t t o t h e 3 1 K a n d 5 1 K p r o t e i n s . T h e s e 1 5 0 p r o t e i n s w e r e r e a d i l y d e t e c t a b l e i n l y s a t e s o f i n f e c t e d c e l l s . T h e y h a d n o e q u i v a l e n t t o t h e 8 6 K a n d 8 3 . 5 K p r o t e i n s we h a v e i d e n t i f i e d . T h e s e p r o t e i n s w e r e c h a r a c t e r i z e d i n s e v e r a l d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s . T h e d i s t i n c t l y d i f f e r e n t l o c a l i z a t i o n o f t h e 8 6 K a n d 8 3 . 5 K p r o t e i n s f r o m t h e 1 0 0 K a n d 8 9 K p r o t e i n s , u n d e r e n h a n c i n g c o n d i t i o n s , w o u l d s e e m t o i n d i c a t e t h a t t h e y w e r e n o t n o n - s p e c i f i c p r o t e o l y t i c c l e a v a g e p r o d u c t s o f t h e m a j o r I E p r o t e i n s . I n a d d i t i o n , t h e y w e r e r e g u l a r l y d e t e c t e d i n g e l s o f p r o t e i n s f r o m t h r e e d i f f e r e n t i n f e c t e d c e l l t y p e s . D i f f e r e n c e s w e r e a l s o s e e n b e t w e e n t h i s w o r k a n d t h a t r e p o r t e d b y K e i l e t a l _ . ( 1 9 8 5 ) i n t h e e a r l y p r o t e i n s i d e n t i f i e d . A u n i f y i n g f e a t u r e w a s t h e p r e s e n c e o f a p r o t e i n o f a r o u n d 9 1 K . H o w e v e r , we h a v e n o o b v i o u s c o u n t e r p a r t s t o t h e 4 6 K a n d 6 5 K e a r l y p r o t e i n s t h e y h a v e i d e n t i f i e d , a n d t h e y h a v e n o e q u i v a l e n t s t o t h e e a r l y p r o t e i n s o f 3 9 K a n d 3 6 K d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s . P r o t e i n s w i t h s i m i l a r m o l . w t s . a n d t i m e o f s y n t h e s i s ( M o o n e t a l . , 1 9 7 9 ) a n d m i g r a t i o n p a t t e r n s ( C h a n t l e r , 1 9 7 8 ) a s t h e 3 9 K a n d 3 6 K p r o t e i n s h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n t h e s e o t h e r r e p o r t s . T h e 4 6 K e a r l y p r o t e i n w a s r e p o r t e d t o b e e x c l u s i v e l y c y t o p l a s m i c ( U . H . K o s z i n o w s k i , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n s ) , w h i l e t h e 3 9 K a n d 3 6 K p r o t e i n s w e r e e x c l u s i v e l y n u c l e a r . A s t h e s e p r o t e i n s a r e l i k e l y t o b e t h e c o m p o n e n t s o f t h e MCMV DNA p o l y m e r a s e a n d t h u s a p a r t o f t h e v i r a l D N A - r e p l i c a t i o n c o m p l e x , a n u c l e a r a s s o c i a t i o n w o u l d b e e x p e c t e d . I n a d d i t i o n , a g r o u p o f c y t o p l a s m i c p r o t e i n s o f 5 4 K , 5 1 . 5 K a n d 5 1 K m o l . w t . w a s i d e n t i f i e d i n t h i s t h e s i s . I t w a s n o t i c e a b l e t h a t , w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e 9 6 K p r o t e i n , t h e r e w a s a n a b s e n c e o f d e t e c t a b l e p o s t - t r a n s l a t i o n a l p r o c e s s i n g o f t h e s e p r o t e i n s . A l t h o u g h i n s o m e c a s e s t h e r e w a s a c h a n g e i n t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e p r o t e i n s w i t h i n t h e i n f e c t e d c e l l s ( 8 6 K a n d 6 3 . 5 K p r o t e i n s ) , t h e r e w a s n o e v i d e n c e o f p o s t s y n t h e t i c m o d i f i c a t i o n o f a n y o f t h e b a n d s o n t h e g e l s . 1 5 1 In each case, the bands remained the same mol. wts. during the chase periods. This does not take into account processing that has taken place during the labeling period. This was shown to occur with the proteins that appear to be equivalent to the TOOK and 89K proteins (89K and 76K, Keil et al., 1985). The apparent differences in partitioning of the IE proteins, depending on whether they had been synthesized under enhanced or unenhanced conditions can be explained in the following manner. Under unenhanced (normal) conditions, functional amounts of each protein are synthesized and transported to the nucleus. With enhancement, 'redundant* amounts of each protein are produced and only a portion of these can be accomodated by the nucleus. The amounts of the remaining proteins in the cytoplasmic fraction would depend on the degree of enhancement. This may give the appearance of a higher proportion being in the cytoplasm. This should be interpreted as an experimental artifact as no functional significance can be attached to the greater cytoplasmic localization. This feature was seen with the 96K protein. Under unenhanced conditions or with moderate degrees of enhancement (Fig. 15 and Figs. 17 A and B), this protein was exclusively nuclear, but with greater amounts of enhancement (Fig. 7 A , lanes 6), a portion was found in the cytoplasm. Similarly, with prolonged enhancement, the TOOK and 89K proteins were present in much larger amounts in the cytoplasm, while with no enhancement (normal amounts of proteins synthesized), a higher proportion of each protein was found in the nucleus. Recent detailed analyses of the transcription of MCMV and HCMV have shown them to have the same patterns of gene expression (Marks et §_1., 1983; Keil et aj_., 1984; McDonough and Spector, 1983; Stinski et aj_., 1983). It is on this basis that one would expect the patterns of early protein 1 5 2 s y n t h e s i s t o b e t h e s a m e . H o w e v e r , i t h a s b e e n d i f f i c u l t t o d i r e c t l y c o r r e l a t e t h e f i n d i n g o f 1 0 i m m e d i a t e - e a r l y a n d 7 e a r l y p r o t e i n s o f MCMV w i t h s i m i l a r r e s u l t s o b t a i n e d f o r H C M V , p a r t i c u l a r l y a s t h e e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n s . T h e m a j o r I E p r o t e i n o f HCMV ( T o w n e ) m i g r a t e d a s a h e t e r o g e n e o u s b a n d o n g e l s , h a v i n g a m o l . w t . o f a r o u n d 7 2 K ( S t i n s k i e t a l _ . , 1 9 8 3 ) . T h i s p r o t e i n m i g h t b e a n a l o g o u s t o t h e 1 0 0 K p r o t e i n i d e n t i f i e d f o r M C M V . T h e m a j o r MCMV I E p r o t e i n s h a v e d i f f e r e n t f e a t u r e s t o t h o s e o f H C M V . Two d i s t i n c t b a n d s , o f 1 0 0 K a n d 8 9 K , w e r e i d e n t i f i e d i n M C M V - i n f e c t e d c e l l s r a t h e r t h a n a s i n g l e b a n d . T h e s e t w o p r o t e i n s h a d f e a t u r e s i n c o m m o n a s i d e n t i f i e d b y c e l l f r a c t i o n a t i o n , t w o - d i m e n s i o n a l g e l s e p a r a t i o n a n d d e g r e e o f e n h a n c e d s y n t h e s i s f o l l o w i n g c y c l o h e x i m i d e p r e t r e a t m e n t o f i n f e c t e d c e l l s . I n a d d i t i o n , a p p a r e n t l y e q u i v a l e n t p r o t e i n s ( d e s c r i b e d b y K e i l e t a l . 1 9 8 5 ) w e r e r e p o r t e d t o b e p r e c i p i t a t e d b y t h e s a m e m o n o c l o n a l a n t i b o d y , t h u s i n d i c a t i n g a n t i g e n i c r e l a t e d n e s s , a n d a l s o , i n . v i t r o t r a n s l a t i o n d a t a h a s s h o w n t h a t t h e l o w e r m o l . w t . p r o t e i n w a s d e r i v e d f r o m t h e h i g h e r m o l . w t . p r o t e i n b y p r o t e o l y t i c c l e a v a g e ( K e i l e t a j _ . , 1 9 8 5 ) . T h e t w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n o f t h e m a i n MCMV I E p r o t e i n s w a s s i m i l a r t o t h o s e o f t w o s t r a i n s o f HCMV a n d t w o s t r a i n s o f s i m i a n C M V . T h e m a j o r I E p r o t e i n s o f t h e h u m a n a n d s i m i a n s t r a i n s h a d a c i d i c n e t c h a r g e s ( G i b s o n , 1 9 8 3 ) . T h e MCMV 1 0 0 K I E p r o t e i n m i g r a t e d t o a p o s i t i o n j u s t o n t h e a c i d i c s i d e o f a c t i n , s i m i l a r t o t h e HCMV I E p r o t e i n , w h i l e t h e MCMV 8 9 K I E p r o t e i n h a d a c o n s i s t e n t l y m o r e n e g a t i v e c h a r g e , s i m i l a r t o t h e m a j o r I E p r o t e i n o f s i m i a n C M V s . A p r o m i n e n t f e a t u r e o f MCMV I E p r o t e i n s w a s t h e p r e s e n c e o f t h e 9 6 K I E p r o t e i n i n t e r m e d i a t e b e t w e e n t h e t w o m a j o r I E b a n d s . T h i s p r o t e i n w a s a c o n s i s t e n t f e a t u r e a t I E t i m e s i n M C M V - i n f e c t e d c e l l s , w h e t h e r p e r m i s s i v e l y 1 5 3 o r n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d . I t h a d d i s t i n c t l y d i f f e r e n t p r o p e r t i e s f r o m t h e 1 0 0 K a n d 8 9 K p r o t e i n s . U p o n t w o - d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n , i t m i g r a t e d a s a d i f f u s e s p o t w i t h a n e t b a s i c c h a r g e . I n a d d i t i o n , i t w a s s h o w n t o b e n u c l e a r e x c e p t w h e n p r o d u c e d u n d e r c o n d i t i o n s t h a t g r e a t l y e n h a n c e d t h e a m o u n t o f p r o t e i n s y n t h e s i z e d ( F i g . 7 ) . H o w e v e r , r e c e n t l y p u b l i s h e d d a t a i n d i c a t e d t h a t a n e q u i v a l e n t p r o t e i n w a s p r e c i p i t a t e d b y a m o n o c l o n a l a n t i b o d y t h a t r e c o g n i z e d t h e o t h e r t w o e q u i v a l e n t m a j o r I E p r o t e i n s ( K e i l e t a j . . , 1 9 8 5 ) . I t w a s r e p o r t e d t h a t p r o t e a s e s p r e s e n t i n n o r m a l m o u s e s e r u m c o u l d p r o c e s s t h e m a j o r I E p r o t e i n ( i n t h e i r c a s e 8 9 K ) t o t h e i n t e r m e d i a t e f o r m ( 8 4 K ) . T h e s e t w o p r o t e i n s a p p e a r t o b e e q u i v a l e n t t o t h e 1 0 0 K a n d 9 6 K p r o t e i n s we h a v e r e f e r r e d t o . T h e f a c t t h a t t h e 9 6 K p r o t e i n may b e r e l a t e d t o t h e 1 0 0 K a n d 8 9 K p r o t e i n s s e e m s s u r p r i s i n g c o n s i d e r i n g t h e d i f f e r e n c e s i n c h a r g e . D i s t i n c t l y d i f f e r e n t f r a g m e n t s o f t h e p o l y p e p t i d e w o u l d h a v e t o b e c l e a v e d i n o r d e r t o c a u s e a l a r g e i n c r e a s e i n p o s i t i v e c h a r g e i n o n e c a s e ( 1 0 0 K t o 9 6 K ) a n d a s m a l l i n c r e a s e i n n e g a t i v e c h a r g e i n t h e o t h e r ( 1 0 0 K t o 8 9 K ) . E x p e r i m e n t s w i l l b e n e e d e d t o d e t e r m i n e i f a l l t h e s e I E p r o t e i n s a r e f u n c t i o n a l . V a r i o u s t y p e s o f e x p e r i m e n t s h a v e b e e n d o n e t o s t u d y HCMV I E p r o t e i n s b u t e m p h a s i s h a s a l w a y s b e e n o n a s i n g l e m a j o r p r o t e i n o r r e l a t e d g r o u p o f p r o t e i n s ( G i b s o n , 1 9 8 1 ; S t i n s k i e t a j . , 1 9 8 3 ) . A l t h o u g h t h i s w a s s i m i l a r t o t h e r e s u l t s f o r MCMV p u b l i s h e d b y K e i l e t a j _ . ( 1 9 8 5 ) , t h i s a p p r o a c h d i d n o t f i t t h e r e s u l t s o b t a i n e d i n t h i s t h e s i s . T h e o b s e r v a t i o n o f t e n MCMV I E p r o t e i n s c o u l d l e a d t o s e v e r a l c o n c l u s i o n s w h e n c o m p a r i s o n i s m a d e w i t h H C M V . 1 ) MCMV I E g e n e e x p r e s s i o n w a s a c t u a l l y d i f f e r e n t f r o m t h a t o f H C M V ; 2 ) s o m e o f t h e o b s e r v e d MCMV I E b a n d s r e p r e s e n t e d e a r l y p r o t e i n s ; o r 3 ) s o m e o f t h e o b s e r v e d b a n d s r e p r e s e n t e d i n d u c e d c e l l u l a r p r o t e i n s . T o t a k e t h e f i r s t p o i n t , i t c a n b e s u g g e s t e d t h a t t h e n u m b e r o f HCMV I E 1 5 4 p r o t e i n s r e p o r t e d h a s b e e n u n d e r e s t i m a t e d . I f o n e c o m p a r e s t h e r e s u l t s f r o m w o r k d o n e w i t h HCMV ( T o w n e ) b y i n . v i v o i n f e c t i o n o f c e l l s a n d i n v i t r o t r a n s l a t i o n o f RNA ( S t i n s k i , 1 9 7 8 ; S t i n s k i e t a j . . , 1 9 8 3 ) , a l a r g e r n u m b e r o f HCMV I E p r o t e i n s c a n b e i d e n t i f i e d . M o s t o f t h e p r o t e i n s p r o d u c e d b y i n v i t r o t r a n s l a t i o n o f h y b r i d - s e l e c t e d I E R N A , ( W a t h e n a n d S t i n s k i , 1 9 8 1 ; S t i n s k i e t a j _ . , 1 9 8 3 ) , e x c e p t f o r t h e m a j o r I E p r o t e i n s , c o u l d b e i d e n t i f i e d w i t h t h o s e t h a t h a d b e e n b e e n c h a r a c t e r i z e d a s e a r l y p r o t e i n s i n t h e p r e v i o u s i n v i v o s t u d y ( S t i n s k i , 1 9 7 8 ) . T h u s , m o s t o f t h e e a r l y p r o t e i n s l i s t e d d o i n f a c t a p p e a r t o b e I E p r o t e i n s . I n a d d i t i o n , t h e p r o t e i n s p r o d u c e d b y i n . v i t r o t r a n s l a t i o n o f e a r l y mRNA r e p r e s e n t e d a d i f f e r e n t p o p u l a t i o n f r o m t h o s e p r e v i o u s l y c h a r a c t e r i z e d a s e a r l y p r o t e i n s ( W a t h e n a n d S t i n s k i , 1 9 8 1 ) . F r o m t h e s e r e s u l t s o n e c a n t h e n c o n c l u d e t h a t 9 HCMV I E p r o t e i n s a r e s y n t h e s i z e d . I n a d d i t i o n , t h e s i x I E p r o t e i n s d e t e c t e d b y G i b s o n ( 1 9 8 1 ) p a r t l y c o n f i r m e d t h e s e r e a s s e s s e d r e s u l t s o f S t i n s k i . T h u s i t c a n b e s u g g e s t e d t h a t t h e t o t a l n u m b e r o f HCMV a n d MCMV I E p r o t e i n s a r e s i m i l a r . T h e r e d o e s n o t a p p e a r t o b e a r e a s o n f o r t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n s t u d i e s , w i t h b o t h MCMV a n d H C M V , i n t h e n u m b e r s a n d a b u n d a n c e o f I E p r o t e i n s . T a k i n g t h e s e c o n d p o i n t , t h e p r o o f t h a t s o m e o f t h e I E MCMV p r o t e i n s i d e n t i f i e d w e r e n o t e a r l y p r o t e i n s w i l l o n l y b e a n s w e r e d d e f i n i t e l y o n c e i n  v i t r o t r a n s l a t i o n e x p e r i m e n t s c a n b e p e r f o r m e d u s i n g h y b r i d - s e l e c t e d I E m R N A . H o w e v e r , t h e r e p e a t a b i l i t y o f d e t e c t i o n o f t h e s e p r o t e i n s i n t h e f i r s t h o u r o f p r o t e i n s y n t h e s i s i n i n f e c t e d c e l l s , a n d a l s o t h e i r s y n t h e s i s f o l l o w i n g t h e u s e o f a c o m b i n a t i o n o f c y c l o h e x i m i d e a n d a c t i n o m y c i n 0 , w o u l d s e e m t o i n d i c a t e o t h e r w i s e . T a k i n g t h e t h i r d p o i n t , a s t h e r e w a s c o o r d i n a t e d s y n t h e s i s o f t h e d e s i g n a t e d I E p r o t e i n s t h a t f o l l o w e d a s i m i l a r p a t t e r n , w i t h m o s t o f t h e i r 1 5 5 s y n t h e s e s d e c l i n i n g b y 2 h r p i . , a n d l i k e w i s e o n l y a t r a n s i e n t p e r i o d o f s y n t h e s i s o f t h e d e s i g n a t e d e a r l y p r o t e i n s , i t w o u l d s e e m t o a r g u e a g a i n s t t h e s e b e i n g c e l l u l a r p r o t e i n s t h a t w e r e i n d u c e d f o l l o w i n g MCMV i n f e c t i o n . S e p a r a t i o n o f t h e s e p r o t e i n s i n t w o d i m e n s i o n s s h o w e d e a c h i n d u c e d p r o t e i n t o b e a n e w s p e c i e s . I n a d d i t i o n , i m m u n o p r e c i p i t a t i o n s t u d i e s s h o w e d t h a t m o s t o f t h e p r o t e i n s d e s i g n a t e d a s v i r u s - i n d u c e d w e r e o n l y p r e c i p i t a t e d f r o m M C M V - i n f e c t e d c e l l e x t r a c t s w i t h s e r u m f r o m M C M V - i n f e c t e d m i c e . H e a t s h o c k p r o t e i n s h a v e b e e n s h o w n t o b e i n d u c e d i n c e l l s f o l l o w i n g i n f e c t i o n b y a n u m b e r o f d i f f e r e n t v i r u s e s , i n c l u d i n g h e r p e s s i m p l e x v i r u s t s m u t a n t ( N o t a r i a n n i a n d P r e s t o n , 1 9 8 3 ) . A t t e m p t s w e r e m a d e t o i n d u c e h e a t s h o c k p r o t e i n s b y i n c u b a t i o n o f c u l t u r e s o f 3 T 3 - L 1 c e l l s a t e l e v a t e d t e m p e r a t u r e s , 3 5 f o l l o w e d b y l a b e l i n g w i t h ( S ) m e t h i o n i n e . H o w e v e r , c e l l u l a r p r o t e i n s y n t h e s i s w a s a l m o s t t o t a l l y i n h i b i t e d . T h u s i t w a s n o t p o s s i b l e t o d e t e r m i n e w h e t h e r a n y o f t h e p r o t e i n s c h a r a c t e r i z e d m i g h t b e i n d u c e d c e l l u l a r s t r e s s p r o t e i n s . I n c o m p a r i s o n t o t h e i d e n t i f i c a t i o n o f 7 e a r l y p r o t e i n s d e t e c t e d f o r M C M V , 1 0 e a r l y p r o t e i n b a n d s w e r e d e t e c t e d a f t e r i n v i t r o t r a n s l a t i o n o f HCMV mRNA ( W a t h e n a n d S t i n s k i , 1 9 8 1 ) a n d 1 6 e a r l y p r o t e i n s w e r e i d e n t i f i e d b y i m m u n o p r e c i p i t a t i o n ( B l a n t o n a n d T e v e t h i a , 1 9 8 1 ) , a l t h o u g h o n l y 6 - 8 w e r e p r e s e n t i n a b u n d a n c e . F o r u n d e r s t a n d i n g t h e r o l e o f I E p r o t e i n s i n c o n t r o l l i n g v i r a l g e n e e x p r e s s i o n , m o s t o f t h e i n f o r m a t i o n h a s c o m e f r o m e x p e r i m e n t s w i t h H S V , i n p a r t i c u l a r w i t h HSV m u t a n t s o f t h e p r o t e i n I C P 4 ( P r e s t o n , 1 9 7 9 a , b ) . I t i s n o t c l e a r t h o u g h h o w m u c h r e l e v a n c e t h e s e h a v e f o r u n d e r s t a n d i n g CMV g e n e r e g u l a t i o n . T h e r e a r e n o t m a n y s i m i l a r i t i e s i n t h e p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t h e I E p r o t e i n s o f HSV c o m p a r e d t o MCMV ( a n d o t h e r s t r a i n s o f C M V ) . I C P 4 , 0 a n d 27 w e r e e a c h s h o w n t o h a v e f i v e c h a r g e i s o m e r s ( o f n e u t r a l t o b a s i c 1 5 6 n e t c h a r g e ) , a l s o I C P 4 w a s p r o c e s s e d t o t w o h i g h e r m o l . w t . n u c l e a r f o r m s ( w h i c h a l s o e a c h h a d s e v e r a l c h a r g e i s o m e r s ) ( A c k e r m a n n e t a l _ . , 1 9 8 4 ) . T h e m a j o r I E p r o t e i n s o f MCMV a n d HCMV w e r e o n l y d e t e c t e d i n o n e f o r m b y t w o -d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s a n d w e r e p r o c e s s e d i n a d i f f e r e n t m a n n e r , n a m e l y f r o m h i g h e r t o l o w e r m o l . w t . f o r m s . T h i s s t u d y h a s n o t b e e n a b l e t o i n d i c a t e a f u n c t i o n f o r a n y o f t h e m a j o r MCMV I E p r o t e i n s . T h e f a c t t h a t t h e y w e r e p h o s p h o r y l a t e d , w e r e s i m i l a r i n c h a r g e a n d a l s o p a r t i t i o n e d t o s o m e e x t e n t l i k e t h o s e o f HCMV ( G i b s o n , 1 9 8 1 ) w o u l d s u g g e s t t h a t t h e y m i g h t h a v e t h e s a m e f u n c t i o n w i t h i n t h e i n f e c t e d c e l l . H o w e v e r , t h e MCMV m a j o r I E p r o t e i n s o f 1 0 0 K a n d 8 9 K r e m a i n e d p a r t l y n u c l e u s - a s s o c i a t e d f o l l o w i n g t r e a t m e n t o f n u c l e i t o r e m o v e t h e a d h e r i n g c y t o s k e l e t a l ' t a g s ' . T r e a t m e n t o f CMV ( C o l b u r n ) - i n f e c t e d c e l l s b y t h i s m e t h o d c o u l d c o m p l e t e l y r e m o v e t h e 9 4 K I E p r o t e i n f r o m t h e n u c l e i ( J e a n g a n d G i b s o n , 1 9 8 0 ) . T h e s i g n i f i c a n c e o f t h i s d i f f e r e n c e i s n o t k n o w n . T h e r e s u l t s o b t a i n e d w i t h h u m a n f i b r o b l a s t s s h o w e d t h a t t h e 1 0 0 K p r o t e i n h a d a s t r o n g e r a f f i n i t y f o r t h e n u c l e u s i n t h e s e c e l l s , c o m p a r e d t o 3 T 3 - L 1 c e l l s , w i t h m u c h l e s s o f t h e p r o t e i n b e i n g p r e s e n t i n t h e c y t o p l a s m i c f r a c t i o n . T h i s c o u l d s u g g e s t t h a t t h i s p r o t e i n h a d e i t h e r a c y t o p l a s m i c s i t e o f a c t i o n , o r e l s e a r e p r e s s o r f u n c t i o n i n t h e n u c l e u s w h i c h i s r e v e r s i b l e i n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d c e l l s . H o w e v e r , r e c e n t r e s u l t s h a v e s h o w n t h a t I C P 4 o f HSV c a n t r a n s a c t i v a t e t h e e a r l y HSV g e n e s ( O ' H a r e a n d H a y w a r d , 1 9 8 5 ; P e r s s o n e t a l _ . , 1 9 8 5 ) . A l t h o u g h t h i s p r o t e i n a n d t h e m a j o r CMV I E p r o t e i n s h a v e d i f f e r e n t p h y s i c a l p r o p e r t i e s , b a s e d o n t h e s i m i l a r i t i e s i n p a t t e r n s o f g e n e e x p r e s s i o n , a s i m i l a r f u n c t i o n m i g h t b e a n t i c i p a t e d f o r t h e m a j o r CMV I E p r o t e i n s . I f t h i s p r o v e s t o b e c o r r e c t , a n u c l e a r s i t e o f a c t i o n w o u l d b e e x p e c t e d . D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s w e r e o b s e r v e d f o r 7 I E p r o t e i n s b y a f f i n i t y t o 1 5 7 D N A - c e l l u l o s e a n d f o r a n o t h e r o n e ( 8 0 K I E p r o t e i n ) b y D N A - a f f i n i t y t o e l e c t r o b l o t t e d p r o t e i n s . F o u r o f 6 e a r l y p r o t e i n s a l s o h a d a f f i n i t y f o r D N A - c e l l u l o s e . N o n e o f t h e s e p r o t e i n s a p p e a r e d t o h a v e a t i g h t a f f i n i t y f o r D N A , a s s h o w n b y t h e f a c t t h a t m o s t o f e a c h o f t h e p r o t e i n s w a s e l u t e d w i t h 0 . 3 M N a C l c o n t a i n i n g b u f f e r . D i f f i c u l t i e s i n i n t e r p r e t i n g t h e s e r e s u l t s a r o s e b e c a u s e o f t h e h e t e r o g e n e i t y i n b i n d i n g o f m o s t p r o t e i n s . A p r o p o r t i o n o f s e v e r a l o f t h e I E p r o t e i n s ( 1 0 0 K , 8 9 K , 8 3 . 5 K , 6 3 . 5 K a n d 3 0 K ) w a s p r e s e n t i n t h e u n b o u n d a s w e l l a s t h e b o u n d f r a c t i o n s f r o m D N A - c e l l u l o s e c o l u m n s . T h e a m o u n t s o f I E p r o t e i n s p r o d u c e d i n t h e c e l l s h a d b e e n e l e v a t e d b y c y c l o h e x i m i d e t r e a t m e n t p r i o r t o l a b e l i n g , a n d o n l y a p r o p o r t i o n o f t h e s e m i g h t b e ' a c t i v e ' b i n d i n g f o r m s . T h i s p r o b l e m o f h e t e r o g e n e i t y w a s i n d i c a t e d f o l l o w i n g a t t e m p t s t o e x t r a c t v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s o f c e l l s . T h e s e p r o t e i n s a p p e a r e d t o b e p o o r l y s o l u b l e ( F i g . 2 8 ) o r e l s e a p r o p o r t i o n o f t h e p r o t e i n s w e r e a t t a c h e d t o t h e n u c l e a r m a t r i x , r e n d e r i n g t h e m r e s i s t a n t t o e x t r a c t i o n p r o c e d u r e s . A s i m i l a r c h a r a c t e r i s t i c h a d b e e n o b s e r v e d w i t h H S V - i n f e c t e d c e l l s ( W i l c o x e t a±., 1 9 8 0 ) . S e v e r a l HSV p r o t e i n s w e r e i n s o l u b l e u n d e r s t a n d a r d c o n d i t i o n s , w h i l e s o m e o t h e r s ( e g . I C P 4 a , 4 c , 27 a n d 2 9 ) w e r e s h o w n t o b e s o l u b l e w h e n e x t r a c t e d f r o m c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s b u t i n s o l u b l e w h e n e x t r a c t e d f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s . T h e s e d i f f e r e n c e s , w h i c h we a l s o s e e m t o h a v e e n c o u n t e r e d w i t h n u c l e u s - a s s o c i a t e d MCMV p r o t e i n s , c o m p a r e d t o p r o t e i n s e x t r a c t e d f r o m w h o l e c e l l s , m a y r e p r e s e n t a f u r t h e r m o d i f i c a t i o n o f t h e p r o t e i n s l o c a t e d i n t h e n u c l e i ( o r t h e y m a y b e c o m e a g g r e g a t e d w i t h o t h e r p r o t e i n s o r n u c l e i c a c i d , r e n d e r i n g t h e m l e s s s o l u b l e ) . T h u s o n e m u s t c o n s i d e r t h a t t h e D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s o b s e r v e d m a y o n l y r e p r e s e n t a n a l y s i s o f a s u b s e t o f e a c h t y p e o f p r o t e i n , w h i c h m a y o r m a y n o t b e t h e a c t i v e f o r m . T h i s w a s n o t i c e a b l e o n a n a l y s i s o f p r o t e i n s o f n u c l e a r f r a c t i o n s e x t r a c t e d b y h i g h s a l t / s p e r m i n e 158 t r e a t m e n t . I t a p p e a r e d t h a t a s u b s e t o f t h e m a j o r e a r l y p r o t e i n s ( 3 9 K a n d 3 6 K ) w a s e x t r a c t e d t h a t d i d n o t h a v e D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s , w h e r e p r e v i o u s l y D N A - a f f i n i t y h a d b e e n o b s e r v e d f o r t h e s e p r o t e i n s . D i f f e r e n c e s i n t h e b e h a v i o u r o f t h e m a j o r I E p r o t e i n s o f MCMV ( 1 0 0 K ) a n d CMV ( C o l b u r n ) ( 9 4 K ) w e r e o b s e r v e d i n t h a t D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s w e r e s e e n i n t h e f o r m e r b u t n o t t h e l a t t e r c a s e ( G i b s o n e t a l _ . , 1 9 8 1 ) . I n a d d i t i o n , t h e MCMV 1 0 0 K p r o t e i n w a s s h o w n t o b i n d DNA i n t h e f i l t e r a f f i n i t y a s s a y , w h i c h w o u l d o n l y d e t e c t d i r e c t p r o t e i n - D N A i n t e r a c t i o n s . T h i s w a s d i f f e r e n t f r o m I E 1 7 5 ( I C P 4 ) o f H S V - 1 w h i c h r e q u i r e d a n i n t e r m e d i a t e c e l l u l a r p r o t e i n t o m e d i a t e i t s b i n d i n g t o D N A ; t h e p u r i f i e d f o r m w a s s h o w n n o t t o b i n d t o D N A - c e l l u l o s e ( F r e e m a n a n d P o w e l l , 1 9 8 2 ) . A n u n e x p l a i n e d p h e n o m e n o n w a s t h e d i f f e r e n t i a l a f f i n i t y f o r d e n a t u r e d DNA o f t h e 9 6 K I E p r o t e i n , d e p e n d i n g o n w h e t h e r i t w a s s y n t h e s i z e d i n 3 T 3 - L 1 o r J 7 7 4 A . 1 c e l l s . T h i s o b s e r v a t i o n w a s r e p e a t a b l e u n d e r t h e c o n d i t i o n s u s e d a n d a l s o s h o w n o n t h e g e l s o f D N A - b i n d i n g p r o t e i n s f r o m n u c l e a r f r a c t i o n s e x t r a c t e d b y h i g h s a l t s p e r m i n e t r e a t m e n t . No a l t e r a t i o n s i n t h e p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t h i s p r o t e i n w e r e o b s e r v e d i n o t h e r e x p e r i m e n t s t o e x p l a i n t h i s d i f f e r e n c e i n D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s . T h e p r o t e i n h a d t h e s a m e t w o d i m e n s i o n a l s e p a r a t i o n , t h e s a m e p a r t i t i o n i n g c h a r a c t e r i s t i c s a n d w a s p h o s p h o r y l a t e d w h e n s y n t h e s i z e d i n e i t h e r t y p e o f c e l l s . T h e s i g n i f i c a n c e o f t h i s i s u n c e r t a i n , a s i t m a y o r m a y n o t b e r e l a t e d t o t h e n o n p e r m i s s i v e n a t u r e o f MCMV i n f e c t i o n s i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s . A t p r e s e n t , i t i s n o t k n o w n i f t h e 9 6 K p r o t e i n i s a f u n c t i o n a l d e r i v a t i v e o f t h e 1 0 0 K p r o t e i n . I t c a n b e s u g g e s t e d t h a t b i n d i n g o f t h i s p r o t e i n t o s i n g l e - s t r a n d e d ( r e p l i c a t i n g ) v i r a l DNA i n . v i v o m a y h a v e t h e e f f e c t o f i n h i b i t i n g DNA r e p l i c a t i o n . I n 3 T 3 - L 1 c e l l s , t h i s p r o t e i n m a y i n i t i a l l y b i n d t o v i r a l DNA b u t a t a l a t e r t i m e b e r e l e a s e d ( d u e t o s o m e m o d i f i c a t i o n ) . I n J 7 7 4 A . 1 ( a n d o t h e r 1 5 9 n o n p e r m i s s i v e ) c e l l s , t h i s p r o t e i n m a y r e m a i n b o u n d t o v i r a l DNA t h u s i n h i b i t i n g DNA r e p l i c a t i o n . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n o f t h i s o b s e r v a t i o n w i l l r e q u i r e t h e p u r i f i c a t i o n o f t h i s p r o t e i n f r o m b o t h c e l l t y p e s . A n o t i c e a b l e f e a t u r e f o r MCMV w a s t h e a b s e n c e o f a h i g h m o l . w t . ( e a r l y ) m a j o r D N A - b i n d i n g p r o t e i n e q u i v a l e n t t o t h e HSV a n d p s e u d o r a b i e s p r o t e i n s , o f 1 3 0 K ( I C P 8 ) a n d 1 3 6 K r e s p e c t i v e l y , t h a t h a v e m u l t i f u n c t i o n a l r o l e s i n r e g u l a t i n g v i r a l DNA r e p l i c a t i o n a n d v a r i o u s s t a g e s o f g e n e e x p r e s s i o n ( P o w e l l e t a l _ . , 1 9 8 1 ; B e n - P o r a t e t a l _ . , 1 9 8 3 ; G o d o w s k i a n d K n i p e , 1 9 8 3 ) . I n a d d i t i o n , p r e l i m i n a r y c h a r a c t e r i z a t i o n o f a 1 4 0 K e a r l y D N A - b i n d i n g p r o t e i n o f HCMV h a s i n d i c a t e d t h a t i t m a y b e e q u i v a l e n t t o t h e m a j o r D N A - b i n d i n g p r o t e i n o f HSV ( A n d e r s a n d G i b s o n , 1 9 8 4 ) . T h e c l o s e s t e q u i v a l e n t p r o t e i n f o r MCMV w a s t h e 9 1 K e a r l y p r o t e i n . T h i s p r o t e i n w a s n o t s t u d i e d i n d e t a i l a s i t w a s n o t p r o d u c e d i n a b u n d a n c e . I t w a s i d e n t i f i e d i n f o u r d i f f e r e n t c e l l t y p e s a n d s h o w n t o h a v e a n u c l e a r a s s o c i a t i o n . I t w a s o b s e r v e d t o h a v e a f f i n i t y f o r d e n a t u r e d D N A - c e l l u l o s e b u t n o t f o r n a t i v e D N A - c e l l u l o s e . T h i s w a s s i m i l a r t o t h e b e h a v i o u r o f HSV ( I C P 8 ) w h i c h h a s a m u c h w e a k e r a f f i n i t y f o r n a t i v e DNA c o m p a r e d t o d e n a t u r e d DNA ( P o w e l l e t a l . , 1 9 8 1 ) . T h e n a t u r e o f n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s b y MCMV w o u l d s e e m t o f o l l o w a d i f f e r e n t p a t t e r n t o t h o s e s t u d i e d p r e v i o u s l y w i t h H C M V . W h i l e s o m e o f t h e M C M V - i n f e c t e d J 7 7 4 A . 1 c e l l s w e r e p e r m i s s i v e f o r v i r u s r e p l i c a t i o n , t h e o v e r a l l p o p u l a t i o n a p p e a r e d t o b e h a v e i n t h e s a m e m a n n e r a s t h e n o n p e r m i s s i v e H F F c e l l s . T h e s e i n f e c t i o n s h a d s o m e o f t h e s a m e c h a r a c t e r i s t i c s a s o t h e r n o n p e r m i s s i v e CMV i n f e c t i o n s i n t h a t t h e r e w a s a b s e n c e o f d e t e c t a b l e v i r a l DNA a n d s t r u c t u r a l p r o t e i n s y n t h e s i s a n d n o v i r a l r e p l i c a t i o n o c c u r r e d ( o r a s m a l l a m o u n t i n J 7 7 4 A . 1 c e l l s ) . H o w e v e r , e x a m i n a t i o n o f t h e p r o d u c t s o f e a r l y g e n e e x p r e s s i o n d i d n o t p r o v i d e a n y 1 6 0 e v i d e n c e t h a t r e s t r i c t i o n o f MCMV e a r l y g e n e e x p r e s s i o n w a s o c c u r r i n g , t h u s p r o v i d i n g a r e a s o n f o r t h e i n h i b i t i o n o f v i r a l r e p l i c a t i o n . N o n e o f t h e e a r l y g e n e p r o d u c t s a p p e a r e d t o b e a b s e n t . T h e r e s u l t s f r o m o t h e r n o n p e r m i s s i v e CMV s y s t e m s h a d a l l s h o w n e v i d e n c e o f a c e r t a i n d e g r e e o f r e s t r i c t i o n o f e a r l y g e n e e x p r e s s i o n , t h o u g h t h i s h a d v a r i e d d e p e n d i n g o n t h e c e l l s y s t e m u s e d . H o w e v e r , t h e r e w a s a l s o o t h e r e v i d e n c e , f r o m t h e r e s u l t s o f t h e n o n p e r m i s s i v e MCMV c e l l s y s t e m d e s c r i b e d b y M u l l e r e t a l . . ( 1 9 7 8 ) , t h a t MCMV b e h a v e s i n a d i f f e r e n t m a n n e r t o H C M V . I t h a d b e e n s h o w n t h a t t h e r e w a s r e s t r i c t i o n i n t h e a m o u n t o f MCMV t r a n s c r i p t i o n o c c u r r i n g a t e a r l y t i m e s i n i n f e c t e d G Q p h a s e 3 T 3 c e l l s . T h e u n i q u e f e a t u r e o f t h i s s y s t e m w a s t h a t t h e r e w a s n o s y n t h e s i s o f t h e m a i n MCMV I E p r o t e i n , e q u i v a l e n t t o t h e 1 0 0 K I E p r o t e i n . H o w e v e r , t h e m a i n e a r l y p r o t e i n s ( e q u i v a l e n t t o t h e 3 9 K a n d 3 6 K p r o t e i n s ) w e r e s t i l l s y n t h e s i z e d i n G Q p h a s e c e l l s a n d v i r a l DNA p o l y m e r a s e a c t i v i t y w a s d e t e c t e d i n . v i t r o , a l t h o u g h i t s a c t i v i t y w a s r e p r e s s e d i n t h e c e l l s ( M u l l e r a n d H u d s o n , 1 9 7 8 ) . D i f f e r e n t c h a r a c t e r i s t i c s w e r e s e e n i n c e l l s n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d w i t h H C M V . T h e r e w a s e v i d e n c e o f r e s t r i c t e d e a r l y p r o t e i n e x p r e s s i o n i n H C M V - i n f e c t e d g u i n e a p i g ( G P ) c e l l s ( S t i n s k i , 1 9 7 8 ) a n d a n a b s e n c e o f HCMV DNA p o l y m e r a s e a c t i v i t y ( H i r a i e t a l _ . , 1 9 7 6 ) . HCMV a n d CMV ( C o l b u r n ) i n f e c t i o n o f B A L B / C - 3 T 3 a n d R a t - 1 c e l l s r e s u l t e d i n t h e s y n t h e s i s o f o n l y t h e m a j o r I E p r o t e i n i n e a c h c e l l t y p e . T h e p r o t e i n s n e c e s s a r y f o r a c t i v a t i o n o f e a r l y g e n e e x p r e s s i o n w e r e n o t e x p r e s s e d o r w e r e n o t f u n c t i o n a l ( J e a n g e t a l _ . , 1 9 8 2 ; L a F e m i n a a n d H a y w a r d , 1 9 8 3 ) . A d e g r e e o f r e s t r i c t i o n o f e a r l y g e n e t r a n s c r i p t i o n a n d a b s e n c e o f v i r a l DNA p o l y m e r a s e a c t i v i t y w a s s e e n i n H C M V - i n f e c t e d r a b b i t k i d n e y ( R K ) c e l l s ( D e M a r c h i , 1 9 8 3 b , c ) . T h e a p p r o p r i a t e n e s s o f a n y o f t h e s e m o d e l s y s t e m s f o r d e s c r i b i n g t h e 161 e v e n t s o c c u r r i n g i n v i v o i s s t i l l u n c e r t a i n . R i c e e t a j _ . ( 1 9 8 4 ) d e s c r i b e d n o n p e r m i s s i v e t y p e s o f i n f e c t i o n s b y HCMV o f h u m a n p e r i p h e r a l b l o o d m o n o n u c l e a r c e l l s . A l t h o u g h i t w a s s h o w n t h a t I E a n t i g e n s w e r e p r o d u c e d b u t n o t l a t e a n t i g e n s , t h e s t a g e o f t h e b l o c k t o r e p l i c a t i o n w a s n o t f u r t h e r d e s c r i b e d . I t w a s n o t d e t e r m i n e d i f t h e r e w a s s y n t h e s i s o f a n y o f t h e e a r l y p r o t e i n s . T h i s w a s t h e f i r s t i n v i t r o s y s t e m t h a t c o u l d c l o s e l y m o d e l t h e e v e n t s o c c u r r i n g f o l l o w i n g n o n p e r m i s s i v e HCMV i n f e c t i o n s i n v i v o . H o w e v e r , i t i s s t i l l n o t k n o w n w h e t h e r HCMV g e n e e x p r e s s i o n i n v i v o i s b l o c k e d a t t h e I E s t a g e , w h e t h e r t h e r e i s a r e s t r i c t i o n a t t h e e a r l y s t a g e o f g e n e e x p r e s s i o n o r w h e t h e r t h e b l o c k c o m e s a t t h e s t a g e o f v i r a l DNA s y n t h e s i s a s m o d e l l e d b y t h e MCMV s y s t e m s we h a v e d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s . F r o m t h i s w o r k ( a n d o t h e r p u b l i s h e d r e p o r t s ) , s e v e r a l s u g g e s t i o n s c a n b e m a d e o n t h e p o t e n t i a l m e c h a n i s m s o f n o n p e r m i s s i v e i n t e r a c t i o n s o f CMVs w i t h c e l l s . F i r s t l y , e v i d e n c e d o e s s e e m t o s u g g e s t t h a t s o m e o f t h e m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n r e g u l a t i n g MCMV a n d HCMV r e p l i c a t i o n a r e d i f f e r e n t . A f u n d a m e n t a l d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o v i r u s e s i n t h e c o n t r o l o f DNA r e p l i c a t i o n h a s b e e n i d e n t i f i e d . MCMV i s v e r y s e n s i t i v e t o t h e a n t i v i r a l a g e n t a c y c l o v i r ( A C V ) w h i l e HCMV i s m u c h l e s s s o ( S a n d f o r d e t a j _ . , 1 9 8 5 ) . T h e r e a s o n f o r MCMV s e n s i t i v i t y t o ACV i s n o t k n o w n , b u t i t i s b e l i e v e d t o b e d u e t o t h e e x t r e m e s e n s i t i v i t y o f t h e MCMV DNA p o l y m e r a s e t o A C V t h a t h a s b e e n p h o s p h o r y l a t e d b y c e l l u l a r e n z y m e s . M u t a t i o n s i n o n e g e n e ( b e l i e v e d t o b e t h e M C M V - D N A p o l y m e r a s e ) r e n d e r e d t h e v i r u s r e s i s t a n t t o A C V ( S a n d f o r d e t a j _ . , 1 9 8 5 ) . T h e l a c k o f s e n s i t i v i t y o f HCMV t o ACV c o u l d i n d i c a t e t h a t t h e MCMV a n d HCMV DNA p o l y m e r a s e s h a v e f u n d a m e n t a l l y d i f f e r e n t p r o p e r t i e s . A n o t h e r d i f f e r e n c e a p p e a r e d t o b e t h e a m o u n t o f r e s t r i c t e d g e n e e x p r e s s i o n f o l l o w i n g n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s b y MCMV a n d H C M V . T h i s i s 1 6 2 b e s t i l l u s t r a t e d i f o n e c o m p a r e s t h e a m o u n t o f g e n e e x p r e s s i o n t h a t o c c u r r e d f o l l o w i n g n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n b y MCMV o f h u m a n f i b r o b l a s t s ( d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s ) a n d n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n b y HCMV o f m o u s e f i b r o b l a s t s ( L a F e m i n a a n d H a y w a r d , 1 9 8 3 ) . I n t h e f o r m e r c a s e , t h e r e w a s n o e v i d e n c e f o r r e s t r i c t e d e a r l y g e n e e x p r e s s i o n , w h i l e i n t h e l a t t e r c a s e , v i r a l g e n e e x p r e s s i o n w a s l i m i t e d t o t h e s y n t h e s i s o f t h e m a j o r I E p r o t e i n . T h i s c o u l d i n d i c a t e t h a t HCMV n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s o c c u r f o r d i f f e r e n t r e a s o n s t o t h o s e w i t h M C M V . A p o s s i b l e m e c h a n i s m f o r r e s t r i c t e d MCMV r e p l i c a t i o n w i l l b e s u g g e s t e d a n d i s b a s e d o n t h e a s s u m p t i o n t h a t t h e v i r a l DNA p o l y m e r a s e i s p r e s e n t i n n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d c e l l s . MCMV h a s b e e n s h o w n t o b e m o r e d e p e n d e n t o n c e l l c y c l e f a c t o r s f o r i t s r e p l i c a t i o n t h a n H C M V . V i r a l DNA r e p l i c a t i o n m a y r e q u i r e t h e p a r t i c i p a t i o n o f c e l l u l a r f a c t o r s . R e c e n t l y , t w o c e l l u l a r f a c t o r s h a v e b e e n i s o l a t e d f r o m u n i n f e c t e d h u m a n c e l l s t h a t w e r e r e q u i r e d f o r a d e n o v i r u s DNA r e p l i c a t i o n t o o c c u r vn v i t r o ( N a g a t a e t a l _ . , 1 9 8 3 ; F r i e f e l d e t a l _ . , 1 9 8 4 ) . N u c l e a r f a c t o r 1 , a 4 7 K p r o t e i n , w a s r e q u i r e d f o r t h e i n i t i a t i o n a n d p a r t i a l e l o n g a t i o n o f r e p l i c a t i n g a d e n o v i r u s DNA ijn v i t r o . N u c l e a r f a c t o r I I w a s r e q u i r e d f o r t h e f o r m a t i o n o f f u l l l e n g t h a d e n o v i r u s g e n o m e s . T h e s e p r o t e i n s i n t e r a c t e d w i t h t h r e e v i r a l p r o t e i n s a n d v i r a l D N A . N u c l e a r f a c t o r I w a s s h o w n t o b e a s e q u e n c e s p e c i f i c D N A - b i n d i n g p r o t e i n t h a t r e c o g n i z e d a p a r t i c u l a r s e q u e n c e o f a d e n o v i r u s DNA w i t h i n t h e o r i g i n o f r e p l i c a t i o n s i t e . I n a d d i t i o n , s i m i l a r s p e c i f i c DNA s e q u e n c e s f o r n u c l e a r f a c t o r I w e r e i d e n t i f i e d i n t h e h u m a n c e l l u l a r g e n o m e ( G r o n o s t a j s k i e t a l . , 1 9 8 4 ) . I t c a n b e s u g g e s t e d t h a t MCMV DNA r e p l i c a t i o n m a y a l s o d e p e n d o n t h e p r e s e n c e o f t h i s o r a s i m i l a r p r o t e i n . I n n o n p e r m i s s i v e i n f e c t i o n s o f c e l l s o f t h e s a m e s p e c i e s , r e p l i c a t i o n m a y b e l i m i t e d b y t h e a m o u n t o f n u c l e a r f a c t o r I o r a s i m i l a r p r o t e i n , r e q u i r e d f o r i n i t i a t i n g DNA r e p l i c a t i o n . I n n o n p e r m i s s i v e 1 6 3 i n f e c t i o n s o f c e l l s o f a d i f f e r e n t s p e c i e s , r e p l i c a t i o n m a y b e i n h i b i t e d b e c a u s e o f t h e i n a b i l i t y o f t h e p a r t i c u l a r n u c l e a r f a c t o r o f t h a t s p e c i e s t o r e c o g n i z e t h e o r i g i n o f r e p l i c a t i o n o f a d i f f e r e n t s p e c i e s o f C M V . O r i g i n s o f r e p l i c a t i o n h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n t h e g e n o m e s o f HSV ( S t o w e t a±., 1 9 8 2 ) a n d E B V ( Y a t e s e t a l . . , 1 9 8 5 ) , s o o n e m a y a s s u m e t h a t CMVs a l s o h a v e s i m i l a r s e q u e n c e s . T h e o r i g i n s o f r e p l i c a t i o n o f e a c h s p e c i e s o f CMV m a y v a r y s u c h t h a t t h e y a r e o n l y r e c o g n i z e d b y n u c l e a r f a c t o r ( s ) s p e c i f i c f o r e a c h s p e c i e s o f h o s t . T h i s m i g h t o c c u r i f e a c h s p e c i e s o f CMV h a d a c q u i r e d i t s o r i g i n o f r e p l i c a t i o n s e q u e n c e s d u r i n g s o m e s t a g e o f i t s e v o l u t i o n , b y i n c o r p o r a t i o n o f c o r r e s p o n d i n g c e l l u l a r r e p l i c a t i o n s e q u e n c e s . HCMV d o e s n o t a p p e a r t o b e s o d e p e n d e n t o n t h e c e l l c y c l e f o r i t s r e p l i c a t i o n ( D e M a r c h i a n d K a p l a n , 1 9 7 6 ) a n d a l s o t h e v i r u s c a n s t i m u l a t e h o s t c e l l DNA s y n t h e s i s ( D e M a r c h i a n d K a p l a n , 1 9 7 7 b : D e M a r c h i , 1 9 8 3 b ) . O n e c a n s u g g e s t t h a t i n n o n p e r m i s s i v e HCMV i n f e c t i o n s , d i f f e r e n t h o s t c e l l f a c t o r s ( o r v i r a l p r o t e i n s ) i n h i b i t a s t a g e o f e a r l y g e n e e x p r e s s i o n , p e r h a p s b y b i n d i n g t o t h e p r o m o t e r s e c t i o n o f c e r t a i n g e n e s . T h i s w o u l d a c c o u n t f o r t h e o b s e r v e d r e s t r i c t e d e a r l y g e n e e x p r e s s i o n . S o m e e v i d e n c e f o r t h i s c a m e f r o m t h e s t u d i e s o f S t J e o r a n d R a p p ( 1 9 7 3 ) , w h e r e p r e t r e a t m e n t o f n o n p e r m i s s i v e h u m a n k i d n e y c e l l s w i t h I U d R m a d e t h e m p a r t i a l l y p e r m i s s i v e t o HCMV r e p l i c a t i o n . I t w a s s u g g e s t e d t h a t t h e I U d R t r e a t m e n t c a u s e d t h e i n h i b i t i o n o f s y n t h e s i s o f a c e l l u l a r p r o t e i n ( s ) t h a t r e g u l a t e d g e n e e x p r e s s i o n . I n s u m m a r y , a g e n e r a l d e s c r i p t i o n o f t h e n u m b e r a n d p r o p e r t i e s o f t h e m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s p r o t e i n s t h a t w e r e d e t e c t e d d u r i n g t h e e a r l y p h a s e o f t h e r e p l i c a t i o n c y c l e i n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d c e l l s h a s b e e n p r o v i d e d , a s w e l l a s a d e s c r i p t i o n o f t h e s y n t h e s i s o f t h e s e p r o t e i n s i n n o n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d c e l l s . T h i s w o r k h a s p r o v i d e d s u f f i c i e n t i n f o r m a t i o n t o p e r m i t 1 6 4 d e t a i l e d i n v e s t i g a t i o n o f i n d i v i d u a l p r o t e i n s , i n s u b s e q u e n t s t u d i e s o f t h e i r r o l e i n v i r u s r e p l i c a t i o n . A n y f u r t h e r s t u d i e s w i l l r e q u i r e t h e p r e p a r a t i o n o f m o n o s p e c i f i c a n t i b o d i e s i n o r d e r t o b e a b l e t o a n a l y s e t h e r o l e o f e a c h p r o t e i n w i t h i n t h e c o m p l e x o f p r o t e i n s i n d u c e d b y t h i s v i r u s . S t u d i e s a r e i n d i c a t e d t o i n v e s t i g a t e t h e i n t e r a c t i o n o f t h e m a j o r I E p r o t e i n s ( p a r t i c u l a r l y t h e 9 6 K p r o t e i n ) w i t h v i r u s DNA w i t h i n t h e i n f e c t e d c e l l . A l s o , i t s h o u l d b e d e t e r m i n e d i f t h e 9 1 K p r o t e i n p e r f o r m s f u n c t i o n s s i m i l a r t o t h e m a j o r D N A - b i n d i n g p r o t e i n o f H S V . I n a d d i t i o n , i d e n t i f i c a t i o n o f t h e p r o t e i n s o f t h e v i r a l D N A - p o l y m e r a s e w i l l p r o v i d e a b a s i s f o r c o m p a r i n g t h i s e n z y m e i n p e r m i s s i v e a n d n o n p e r m i s s i v e c e l l t y p e s . 1 6 5 S E C T I O N 2 . C O M P A R I S O N OF THE P R O T E I N S OF M U R I N E C Y T O M E G A L O V I R U S S T R A I N S S M I T H AND K I 8 1 . I N T R O D U C T I O N . E x p e r i m e n t s w i t h m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s ( M C M V ) h a v e m o s t l y b e e n p e r f o r m e d w i t h t w o p a r t i c u l a r l a b o r a t o r y s t r a i n s . T h e s e a r e t h e S m i t h s t r a i n a n d t h e K 1 8 1 s t r a i n . T h e l a t t e r w a s a d e r i v a t i v e o f t h e S m i t h s t r a i n , t h a t w a s s e l e c t e d f o l l o w i n g p r o l o n g e d p a s s a g e i n . v i v o . T h e K T 8 1 s t r a i n h a s b e e n s h o w n t o h a v e a g r e a t e r v i r u l e n c e ( O s b o r n , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) a n d a l s o r e p l i c a t e d t o s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t i t e r s i n t h e s u b m a x i l l a r y g l a n d s o f y o u n g m i c e ( M i s r a a n d H u d s o n , 1 9 8 0 ) . I n i t i a l s t u d i e s o f t h e r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e d i g e s t i o n p r o f i l e s o f t h e DNA o f t h e t w o s t r a i n s h a d s h o w n t h a t t h e r e w e r e m i n o r d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e g e n o m e s ( M i s r a a n d H u d s o n , 1 9 8 0 ; L o h a n d H u d s o n , u n p u b l i s h e d d a t a . ) , a s s e e n b y a n a l t e r a t i o n i n t h e m i g r a t i o n o f s e v e r a l o f t h e b a n d s . T h e a i m o f t h e w o r k i n t h i s s e c t i o n w a s t o c o m p a r e t h e p r o t e i n s p r o d u c e d b y b o t h s t r a i n s o f v i r u s , a t v a r i o u s s t a g e s o f t h e r e p l i c a t i o n c y c l e , t o d e t e r m i n e i f t h e s e d i f f e r e n c e s i n n u c l e o t i d e s e q u e n c e s a r e r e f l e c t e d i n c h a n g e s i n a n y o f t h e g e n e p r o d u c t s . 1 6 6 M A T E R I A L S AND M E T H O D S . V i r u s a n d c e l l s . T h e S m i t h a n d K I 8 1 s t r a i n s o f MCMV w e r e u s e d i n t h e s e s t u d i e s . T h e s e h a v e b e e n d e s c r i b e d i n s e c t i o n s 1 a n d 3 . V i r u s w a s g r o w n a n d p r o t e i n s l a b e l e d i n 3 T 3 - L 1 m o u s e f i b r o b l a s t c e l l s . I n f e c t i o n a n d l a b e l i n g o f c e l l s a n d S D S - P A G E . T o d e t e c t i m m e d i a t e e a r l y p r o t e i n s , c e l l s w e r e i n f e c t e d ( m . o . i . 2 5 ) a n d m a i n t a i n e d i n t h e p r e s e n c e o f c y c l o h e x i m i d e ( 5 0 y g / m l ) f r o m 0 - 3 h r p i . T h e c e l l s w e r e 35 r i n s e d t h r e e t i m e s a n d l a b e l e d 1 h r w i t h 5 0 y C i / m l ( S ) m e t h i o n i n e . T o d e t e c t e a r l y p r o t e i n s a l s o , c e l l s w e r e i n f e c t e d ( m . o . i . 2 5 ) a n d t r e a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e f r o m 2 - 5 h r p i . a n d l a b e l e d 1 h r a s d e s c r i b e d . T o d e t e c t l a t e p r o t e i n s , c e l l s w e r e i n f e c t e d ( m . o . i . 1 0 ) a n d l a b e l e d f r o m 2 8 - 3 2 h r p i . . I n e a c h e x p e r i m e n t , i n f e c t e d c e l l s w e r e s e p a r a t e d i n t o n u c l e a r a n d c y t o p l a s m i c f r a c t i o n s b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d i n s e c t i o n 1 ( M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . T h e s a m p l e s w e r e s e p a r a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s i n 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l s a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 1 ( M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . P u r i f i c a t i o n o f v i r i o n s a n d n u c l o c a p s i d s . V i r i o n s w e r e p u r i f i e d f r o m t h e t i s s u e c u l t u r e m e d i a o f M C M V - i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s . T h e p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e o f C h a n t i e r a n d H u d s o n ( 1 9 7 8 ) w a s u s e d , w i t h s o m e m o d i f i c a t i o n s . 3 T 3 - L 1 c e l l s w e r e g r o w n i n r o l l e r b o t t l e c u l t u r e s ( 8 5 0 c m - F a l c o n L a b w a r e , B e c t o n - D i c k i n s o n , O x n a r d , C a l i f . ) a n d i n f e c t e d w i t h MCMV a t a n m . o . i . o f 0 . 1 . F o r e a c h p r e p a r a t i o n , t h e m e d i a f r o m t w o r o l l e r c u l t u r e b o t t l e s w e r e u s e d . T h e c e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h m e t h i o n i n e - f r e e MEM 1 6 7 s u p p l e m e n t e d w i t h 2% F B S a n d 2 0 u C i / m l ( S ) m e t h i o n i n e w h e n t h e y s h o w e d 9 0 - 1 0 0 % c y t o p a t h i c e f f e c t ( d a y s 2 - 3 p i . ) - T h e c e l l s w e r e l a b e l e d f o r 2 d a y s . C e l l u l a r d e b r i s w a s r e m o v e d f r o m t h e m e d i a b y l o w s p e e d c e n t r i f u g a t i o n ( 5 , 0 0 0 r . p . m . f o r 1 0 m i n a t 4 ° C i n a n S S 3 4 S o r v a l l r o t o r ) . T h e v i r i o n s w e r e p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 6 , 0 0 0 r . p . m . f o r 9 0 m i n u s i n g a n S S 3 4 S o r v a l l r o t o r . T h e v i r i o n s w e r e s u s p e n d e d i n 3 m l o f p h o s p h a t e b u f f e r e d - s a l i n e ( P B S ) , w i t h t h e u s e o f a g r o u n d g l a s s h o m o g e n i z e r t o p r o d u c e a h o m o g e n e o u s p r e p a r a t i o n . T h i s w a s l a y e r e d o n t o a p r e f o r m e d 2 0 - 5 0 % p o t a s s i u m t a r t r a t e g r a d i e n t ( d i s s o l v e d i n 0 . 1 5 M N a C l / 0 . 0 1 5 M N a C i t r a t e ) a n d c e n t r i f u g e d a t 2 5 , 0 0 0 r . p . m . f o r 2 h r u s i n g a B e c k m a n SW 27 r o t o r . T h e v i r u s b a n d e d a s a w i d e w h i t e b a n d . T h i s w a s h a r v e s t e d b y s i d e p u n c t u r e o f t h e c e n t r i f u g e t u b e . T h e v i r u s w a s s u s p e n d e d i n 1 5 m l P B S , p e l l e t e d ( 2 0 , 0 0 0 r . p . m . f o r 1 h r i n a B e c k m a n SW 27 r o t o r ) , r e s u s p e n d e d i n 3 m l o f P B S a n d c e n t r i f u g e d t h r o u g h a s e c o n d 2 0 - 5 0 % p o t a s s i u m t a r t r a t e g r a d i e n t . T h e v i r i o n s w e r e h a r v e s t e d f r o m t h e g r a d i e n t a n d p e l l e t e d a s b e f o r e . A p o r t i o n w a s r e m o v e d f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a l e x a m i n a t i o n a n d t h e r e s t w a s d i s s o l v e d i n SOS s a m p l e b u f f e r . N u c l e o c a p s i d s w e r e e x t r a c t e d f r o m v i r i o n s f r o m t h e c y t o p l a s m o f i n f e c t e d c e l l s . T h e c e l l s w e r e s c r a p e d f r o m t h e r o l l e r b o t t l e s i n t o P B S a n d h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( 3 , 0 0 0 r . p . m . f o r 1 0 m i n , i n a n S S 3 4 S o r v a l l g r o t o r ) . T h e p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n 1% N P 4 0 i n P B S ( 5 m l / 1 0 c e l l s ) a n d i n c u b a t e d o n i c e , w i t h o c c a s i o n a l v o r t e x i n g , f o r 1 0 m i n . T h e n u c l e i a n d c e l l u l a r d e b r i s w e r e r e m o v e d ( 9 , 0 0 0 r . p . m . f o r 1 5 m i n ) a n d t h e s u p e r n a t a n t s p u n t h r o u g h a 3 0 % g l y c e r o l c u s h i o n ( 2 3 , 0 0 0 r . p . m . f o r 1 h r i n a B e c k m a n SW 27 r o t o r ) . T h i s p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n 3 m l o f 1% N P 4 0 i n P B S b y h o m o g e n i z a t i o n a n d t h e n b a n d e d b y c e n t r i f u g a t i o n t h r o u g h a 2 0 - 5 0 % p o t a s s i u m t a r t r a t e g r a d i e n t , a s d e s c r i b e d f o r t h e v i r i o n s . 1 6 8 R E S U L T S AND D I S C U S S I O N . 1 . C o m p a r i s o n o f i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y p r o t e i n s . T h e I E a n d e a r l y p r o t e i n s i n d u c e d b y MCMV ( S m i t h ) a n d MCMV ( K 1 8 1 ) a r e i l l u s t r a t e d i n F i g s . 3 4 A a n d 3 4 B r e s p e c t i v e l y . E l e v e n o f 17 p r o t e i n s t h a t h a d p r e v i o u s l y b e e n c h a r a c t e r i z e d ( s e c t i o n 1 ) w e r e i d e n t i f i e d i n t h i s e x p e r i m e n t . T h e m a i n f e a t u r e o f t h i s e x p e r i m e n t w a s t h a t t h e s a m e n u m b e r o f m a j o r n u c l e a r I E a n d e a r l y p r o t e i n s , w i t h t h e s a m e m o l . w t s . , w e r e s y n t h e s i z e d i n c e l l s i n f e c t e d w i t h t h e d i f f e r e n t s t r a i n s o f M C M V . I n p a r t i c u l a r , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e m o l . w t s . o f t h e m a j o r I E p r o t e i n s o f t h e t w o s t r a i n s w e r e t h e s a m e . T h i s w a s d i f f e r e n t f r o m w h a t h a d b e e n f o u n d w i t h s o m e HCMV s t r a i n s , w h e r e t h e m o l . w t s o f t h e m a j o r I E p r o t e i n s w e r e s h o w n t o d i f f e r ( G i b s o n , 1 9 8 1 ; C a m e r o n a n d P r e s t o n , 1 9 8 1 ) . T h e 8 0 K I E a n d 6 0 K , 5 4 K , 5 1 . 5 K a n d 5 1 K e a r l y p r o t e i n s w e r e n o t i d e n t i f i e d o n t h e s e g e l s b e c a u s e t h e l a b e l i n g a n d e l e c t r o p h o r e t i c c o n d i t i o n s u s e d w e r e n o t s u i t a b l e f o r t h e d e t e c t i o n o f t h e s e b a n d s ( d i s c u s s e d i n s e c t i o n 1 ) . 2 . C o m p a r i s o n o f l a t e i n f e c t e d c e l l p r o t e i n s . F i g . 3 5 s h o w s t h e p r o t e i n s s y n t h e s i z e d i n MCMV ( S m i t h ) ( l a n e s 3 a n d 4 ) a n d MCMV ( K I 8 1 ) ( l a n e s 7 a n d 8 ) i n f e c t e d c e l l s f r o m 2 8 - 3 2 h r p i . T h e v i r a l - i n d u c e d p r o t e i n s w e r e d e s i g n a t e d a c c o r d i n g t o t h e i r s y n t h e s i s i n i n f e c t e d c e l l s w i t h n o e q u i v a l e n t b a n d i n m o c k - i n f e c t e d s a m p l e s , o r a b a n d o f l e s s e r i n t e n s i t y . T w e l v e v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w e r e i d e n t i f i e d a c c o r d i n g t o t h e s e c r i t e r i a . T h e s a m e b a n d s c o u l d b e i d e n t i f i e d i n b o t h S m i t h a n d K 1 8 1 i n f e c t e d c e l l s . 3 . C o m p a r i s o n o f v i r i o n p r o t e i n s . A c o m p a r i s o n o f t h e p r o t e i n s o f t h e p u r i f i e d v i r i o n s o f t h e t w o s t r a i n s o f MCMV w a s m a d e . T h e p r o t e i n s p r e s e n t 1 6 9 3 4 : 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e s o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d MCMV ( S m i t h ) a n d MCMV ( K 1 8 1 ) i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s s e p a r a t e d i n 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l s . 3 T 3 - L 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV ( S m i t h o r K 1 8 1 ) ( v ) ( m . o . i . 2 5 ) o r m o c k - i n f e c t e d ( m ) a n d i n c u b a t e d w i t h c y c l o h e x i m i d e f r o m 0 - 3 h r p i . ( l a n e s 1 - 4 ) o r f r o m 2 - 5 h r p i . ( l a n e s 5 - 8 ) a n d t h e n 3 5 l a b e l e d 1 h r w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 5 0 u C i / m l ) . L a n e s : 1 a n d 2 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d c e l l s ; 3 a n d 4 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d c e l l s ; 5 a n d 6 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d c e l l s ; 7 a n d 8 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f v i r u s - i n f e c t e d c e l l s . A r r o w h e a d s i n d i c a t e p o s i t i o n s o f v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h _ 3 m o l . w t s . ( x l O ) b y t h e s i d e . 1 7 0 F i g . 3 4 : I E a n d e a r l y p r o t e i n s o f MCMV s t r a i n S m i t h a n d MCMV s t r a i n K I 8 1 . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e s o f l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d MCMV ( S m i t h ) a n d MCMV ( K 1 8 1 ) i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s , a t I E a n d e a r l y t i m e s p i . , s e p a r a t e d i n 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l s . m v m v 39 36 Smith 171 34 (cont.) 1 7 2 F i g 3 5 : 3 5 A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( S ) l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d MCMV ( S m i t h ) a n d MCMV ( K 1 8 1 ) i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s s e p a r a t e d i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . 3 T 3 - L 1 c e l l s w e r e i n f e c t e d w i t h MCMV ( S m i t h o r K 1 8 1 ) ( v ) ( m . o . i . 1 0 ) o r 35 m o c k - i n f e c t e d ( m ) a n d l a b e l e d f r o m 2 8 - 3 2 h r p i . w i t h ( S ) m e t h i o n i n e ( 2 5 y C i / m l ) . L a n e s : 1 a n d 2 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d c e l l s ; 3 a n d 4 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f MCMV ( S m i t h ) i n f e c t e d c e l l s ; 5 a n d 6 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f m o c k - i n f e c t e d c e l l s ; 7 a n d 8 : p r o t e i n s i n n u c l e a r ( N ) a n d c y t o p l a s m i c ( C ) f r a c t i o n s o f MCMV ( K 1 8 1 ) i n f e c t e d c e l l s . C l o s e d a r r o w h e a d s i n d i c a t e p o s i t i o n s o f v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s w i t h m o l . w t s . ( x l O ) o n t h e l e f t s i d e . 1 7 3 F i g . 3 5 : L a t e p r o t e i n s o f MCMV s t r a i n S m i t h a n d MCMV s t r a i n K 1 8 1 . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f l a b e l e d p r o t e i n s f r o m m o c k a n d MCMV ( S m i t h ) a n d MCMV ( K 1 8 1 ) i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s l a b e l e d f r o m 2 8 - 3 2 h r . p i a n d s e p a r a t e d i n a 1 0 % p o l y a c r y l a m i d e g e l . Smith K181 1 2 3 4 5 6 7 8 1 7 4 i n t h e n u c l e o c a p s i d s w e r e a l s o a n a l y s e d i n p a r a l l e l . T h e m a i n a i m o f t h e e x p e r i m e n t w a s t o c o m p a r e t h e p r o t e i n s p r e s e n t i n t h e v i r i o n e n v e l o p e o f t h e t w o s t r a i n s . T h e a b s e n c e o f a n e n v e l o p e g l y c o p r o t e i n h a d b e e n f o u n d i n a n a t t e n u a t e d s t r a i n o f p s e u d o r a b i e s v i r u s ( B e n - P o r a t e t a l _ . , 1 9 8 4 ) . T h e e n v e l o p e w i l l b e a b s e n t f r o m t h e n u c l e o c a p s i d s e x t r a c t e d f r o m t h e c y t o p l a s m o f N P 4 0 - t r e a t e d c e l l s . A n e l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e n u c l e o c a p s i d s , p u r i f i e d f r o m MCMV ( S m i t h ) i n f e c t e d c e l l s , i s s h o w n i n F i g . 3 6 . S a m p l e s f r o m MCMV ( K 1 8 1 ) i n f e c t e d c e l l s w e r e t h e s a m e . A l l p a r t i c l e s s e e n w e r e l a c k i n g t h e c h a r a c t e r i s t i c h e r p e s v i r u s e n v e l o p e . T h e p r o t e i n s p r e s e n t i n t h e v i r i o n s a n d n u c l e o c a p s i d s o f t h e t w o s t r a i n s o f MCMV a r e s h o w n i n F i g . 3 7 . T h e s a m e p r o t e i n s w i t h t h e s a m e m o l . w t s . w e r e d e t e c t e d i n S m i t h a n d K T 8 1 v i r i o n s . I n t h i s e x p e r i m e n t , 2 3 v i r i o n p r o t e i n s w e r e i d e n t i f i e d . D u e t o t h e l o w e r y i e l d o f K 1 8 1 v i r i o n s , s o m e o f t h e m i n o r p r o t e i n s i d e n t i f i e d i n t h e S m i t h v i r i o n s ( F i g . 3 7 , l a n e 1 ) c o u l d n o t b e s e e n c l e a r l y i n t h e g e l o f t h e K 1 8 1 v i r i o n p r o t e i n s ( F i g . 3 7 , l a n e 3 ) . T h e s e h a d a l l b e e n i d e n t i f i e d i n o t h e r g e l s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e m o l e c u l a r w e i g h t s o b t a i n e d i n t h i s e x p e r i m e n t w e r e , w i t h e x p e c t e d e x p e r i m e n t a l v a r i a t i o n , s i m i l a r t o t h o s e p r e v i o u s l y r e p o r t e d f o r t h e S m i t h s t r a i n o f MCMV ( C h a n t i e r a n d H u d s o n , 1 9 7 8 ) . I n b o t h s t r a i n s , a p r o t e i n o f 2 0 5 K w a s p r e s e n t i n t h e C o o m a s s i e b r i l l i a n t b l u e s t a i n e d g e l s t h a t d i d n o t s h o w o n t h e a u t o r a d i o g r a m s ( n o t s h o w n ) . A h i g h m o l . w t . p r o t e i n h a s p r e v i o u s l y b e e n c h a r a c t e r i z e d a s a v i r i o n c o m p o n e n t ( C h a n t i e r a n d H u d s o n , 1 9 7 8 ; M o o n e t a l _ . , 1 9 7 6 b ) . I t c a n b e s e e n t h a t t h e n u c l e o c a p s i d p r e p a r a t i o n s ( l a n e s 2 a n d 4 ) w e r e c o n t a m i n a t e d w i t h h o s t c e l l p r o t e i n s . H o w e v e r , t h e r e w e r e s i x b a n d s p r e s e n t i n t h e v i r i o n p r e p a r a t i o n s o f e a c h s t r a i n t h a t w e r e c l e a r l y a b s e n t o r g r e a t l y r e d u c e d i n t h e n u c l e o c a p s i d p r e p a r a t i o n s . T h e s e c a n b e c o n s i d e r e d 1 7 5 3 6 : E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f n u c l e o c a p s i d p a r t i c l e s p u r i f i e d f r o m t h e c y t o p l a s m o f MCMV ( S m i t h ) - i n f e c t e d c e l l s b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d . M a g n i f i c a t i o n a p p r o x i m a t e l y 7 1 , 0 0 0 x . B a r r e p r e s e n t s 1 0 0 n m . 1 7 6 3 7 : 3 5 A . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( S ) m e t h i o n i n e l a b e l e d p r o t e i n s o f p u r i f i e d v i r i o n s a n d n u c l e o c a p s i d s o f MCMV ( S m i t h ) a n d MCMV ( K 1 8 1 ) . V i r i o n s a n d n u c l e o c a p s i d s w e r e p u r i f i e d f r o m t h e t i s s u e c u l t u r e m e d i a a n d c y t o p l a s m o f i n f e c t e d 3 T 3 - L 1 c e l l s ( d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . L a n e s : 1 , p r o t e i n s i n v i r i o n s o f MCMV ( S m i t h ) . 2 , p r o t e i n s i n n u c l e o c a p s i d s o f MCMV ( S m i t h ) . 3 , p r o t e i n s i n v i r i o n s o f MCMV) ( K 1 8 1 ) . 4 , p r o t e i n s i n n u c l e o c a p s i d s o f MCMV ( K 1 8 1 ) . N u m b e r s r e p r e s e n t d e s i g n a t i o n o f v i r i o n p r o t e i n s . S u g g e s t e d v i r i o n e n v e l o p e p r o t e i n s i n d i c a t e d b y s p o t s . 3 5 B . A u t o r a d i o g r a p h i c i m a g e o f ( S ) m e t h i o n i n e l a b e l e d p r o t e i n s o f p u r i f i e d MCMV ( S m i t h ) v i r i o n s ( d i f f e r e n t p r e p a r a t i o n t o t h a t s h o w n i n A . ) . V i r i o n p r o t e i n 3 ( 1 2 5 K ) i n d i c a t e d . 1 7 7 £ l S ^ _ 3 7 : P r o t e i n s o f p u r i f i e d v i r i o n s a n d n u c l e o c a p s i d s o f MCMV ( S m i t h ) a n d  MCMV ( K 1 8 1 ) . Smith K181 1 7 8 a s p u t a t i v e e n v e l o p e p r o t e i n s , a l t h o u g h i t m u s t b e c o n s i d e r e d t h a t t h e y m a y i n c l u d e r e l e a s e d t e g u m e n t p r o t e i n s . T h e s e w e r e t h e p r o t e i n s n u m b e r e d 3 , 4 , 5 , 8 , 1 2 a n d 1 3 w h i c h h a d m o l . w t s . o f 1 2 5 K , 1 2 2 K , 1 0 7 K , 8 7 K , 6 3 K a n d 5 0 K r e s p e c t i v e l y . T h e i n s e t ( F i g . 3 7 B ) s h o w s t h e 1 2 5 K b a n d o f t h e S m i t h v i r i o n s t h a t w a s n o t c l e a r l y s e e n i n t h e v i r i o n s p r e p a r a t i o n s h o w n i n l a n e 1 ( F i g . 3 7 ) . P r o t e i n s o f 1 0 6 K , 8 7 K , 6 2 K a n d 5 1 K h a d p r e v i o u s l y b e e n i d e n t i f i e d a s g l y c o p r o t e i n s b y M o o n e t a]_. ( 1 9 7 6 b ) . T h e r e w e r e n o g l y c o s y l a t e d p r o t e i n s i n t h a t r e p o r t t h a t m i g h t b e e q u i v a l e n t t o t h e m a j o r p r o t e i n s ( 1 2 5 K , 1 2 2 K ) s h o w n i n t h i s s t u d y , t h a t a p p e a r t o b e p a r t o f t h e e n v e l o p e o r t e g u m e n t . T h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d i n t h i s s e c t i o n s h o w t h a t t h e t w o s t r a i n s o f MCMV s h a r e t h e s a m e m a j o r I E a n d e a r l y p r o t e i n s , t h e s a m e m a j o r l a t e p r o t e i n s a n d t h e s a m e m a j o r v i r i o n p r o t e i n s ( o n t h e b a s i s o f m o l . w t . ) . T h u s t h e r e w a s n o c l e a r d i f f e r e n c e f o u n d b e t w e e n t h e p r o t e i n s p r o d u c e d b y t h e S m i t h a n d K 1 8 1 s t r a i n s o f M C M V , a t a n y s t a g e o f i n f e c t i o n . T h e m i n o r d i f f e r e n c e s i n t h e r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e p r o f i l e s o f t h e g e n o m e s m a y r e s u l t f r o m b a s e p a i r s u b s t i t u t i o n s . T h e r e i s n o i n d i c a t i o n o f d e l e t i o n s i n t h e K 1 8 1 g e n o m e ( L o h a n d H u d s o n , u n p u b l i s h e d o b s e r v a t i o n s ) . T h e s u b s t i t u t i o n s r e s u l t i n a n a l t e r a t i o n o f s o m e r e s t r i c t i o n e n z y m e r e c o g n i t i o n s i t e s a n d m a y a l s o r e s u l t i n a m i n o a c i d s u b s t i t u t i o n s i n p r o t e i n ( s ) . T h i s c o u l d a l t e r t h e p r o p e r t i e s o f a p a r t i c u l a r p r o t e i n , b u t t h i s c h a n g e m i g h t n o t b e d e t e c t a b l e b y S D S - P A G E . F u r t h e r a n a l y s e s b y t w o - d i m e n s i o n a l g e l e l e c t r o p h o r e s i s a r e i n d i c a t e d . A l t h o u g h t h i s a p p r o a c h t o u n d e r s t a n d i n g t h e n a t u r e o f v i r u l e n c e o f K I 8 1 w a s a n i n i t i a l e f f o r t , i t m a y p r o v e t o b e s o m e w h a t s i m p l i s t i c . T h e m e c h a n i s m s w i l l p r o b a b l y b e m u c h m o r e c o m p l e x . P r e v i o u s s t u d i e s w i t h h e r p e s v i r u s e s ( L o m n i c z i e t a l _ . , 1 9 8 4 ) , r e o v i r u s e s ( W e i n e r e t a l _ . , 1 9 7 7 ) a n d m y x o v i r u s e s ( R o t t , 1 9 7 9 ) h a v e s h o w n v i r u l e n c e t o b e a p o l y g e n i c a l l y c o n t r o l l e d p h e n o m e n o n . 1 7 9 S E C T I O N 3 . I N V E S T I G A T I O N OF M U R I N E C Y T O M E G A L O V I R U S L A T E N C Y . I N T R O D U C T I O N . M u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s h a s p r o v e n t o b e a v a l u a b l e m o d e l f o r HCMV i n f e c t i o n s i n . v i v o . H o w e v e r , i n c o n t r a s t t o h e r p e s s i m p l e x v i r u s a n d E p s t e i n B a r r v i r u s , t h e s i t e ( s ) o f l a t e n c y o f MCMV ( a n d HCMV) a r e n o t k n o w n . T h e m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n c a u s i n g r e a c t i v a t i o n a r e a l s o n o t k n o w n . V a r i o u s i n . v i t r o s t u d i e s h a v e b e e n m a d e o f p o p u l a t i o n s o f c e l l s f r o m l a t e n t l y i n f e c t e d m i c e t o d e f i n e s o m e o f t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f l a t e n c y . M o s t o f t h e i n v e s t i g a t i o n s h a v e b e e n d o n e w i t h m o n o n u c l e a r l y m p h o i d c e l l s f r o m t h e s p l e e n o r p e r i t o n e a l c a v i t y ( O l d i n g e t a J L , 1 9 7 5 ; B r a u t i g a m e t a l _ . , 1 9 7 9 ; J o r d a n a n d M a r , 1 9 8 2 ; J o r d a n e t a l _ . , 1 9 8 2 ) . I t a p p e a r e d t h a t v i r u s c o u l d b e r e a c t i v a t e d f r o m s p l e n i c B l y m p h o c y t e s a n d a l s o p e r i t o n e a l m a c r o p h a g e c e l l s . H o w e v e r , e v i d e n c e i s a v a i l a b l e t h a t MCMV c a n a l s o r e m a i n l a t e n t a t a n o t h e r s i t e , a s i n . v i v o r e a c t i v a t i o n , c a u s e d b y t r e a t m e n t w i t h i m m u n o s u p p r e s s i v e a g e n t s , s h o w e d t h a t MCMV c o u l d b e r e a c t i v a t e d f r o m s p l e n e c t o m i z e d m i c e . I n a d d i t i o n , v i r u s c o u l d b e r e a c t i v a t e d in v i v o f r o m m i c e i n f e c t e d s u b c u t a n e o u s l y ( s c ) , b u t n o t b y i n v i t r o c o c u l t i v a t i o n o f s p l e e n c e l l s ( J o r d a n e t a j _ . , 1 9 8 2 ) . O t h e r t i s s u e s t h a t h a v e b e e n i m p l i c a t e d a s s i t e s o f l a t e n c y w e r e t h e s a l i v a r y a n d p r o s t a t e g l a n d s ( C h e u n g a n d L a n g , 1 9 7 7 ) , k i d n e y s , o v a r i e s a n d t e s t e s ( B r a u t i g a m a n d O l d s t o n e , 1 9 8 0 ) a n d l i v e r ( S h a n l e y e t a j _ . , 1 9 7 9 ) . S t u d i e s t h a t s h o w e d t h a t MCMV r e p l i c a t i o n w a s c e l l c y c l e r e g u l a t e d p r o v i d e d a p o t e n t i a l m e c h a n i s m f o r l a t e n c y a n d r e a c t i v a t i o n i n . v i v o ( H u d s o n 1 8 0 e t a l _ . , 1 9 7 9 ) . I t c a n b e s u g g e s t e d t h a t i f MCMV c a n n o t r e p l i c a t e i n n o n d i v i d i n g c e l l s , l a t e n c y m a y a r i s e w h e n t h e v i r u s i n f e c t e d t h e s e t y p e s o f c e l l s i n v i v o . I n a d d i t i o n , r e a c t i v a t i o n m a y o c c u r a f t e r l a t e n t l y i n f e c t e d c e l l s r e c e i v e s o m e ' s t i m u l u s ' t o d i v i d e . T h e m a i n a i m o f t h i s i n v e s t i g a t i o n w a s t o e s t a b l i s h a p o p u l a t i o n o f l a t e n t l y i n f e c t e d m i c e a n d t o s t u d y r e a c t i v a t i o n i n v i t r o t h r o u g h t h e c u l t u r e o f c e l l s f r o m v a r i o u s t i s s u e s o f t h e s e a n i m a l s , w i t h t h e i n t e n t i o n o f d e v e l o p i n g a s y s t e m t h a t c o u l d b e u s e d t o t e s t t h e e f f e c t o f v a r i o u s b i o l o g i c a l l y a c t i v e c o m p o u n d s o n p r o m o t i n g r e a c t i v a t i o n . I n a d d i t i o n , r e p l i c a t i o n o f MCMV i n s o m e p r i m a r y c e l l c u l t u r e s w a s s t u d i e d . 1 8 1 M A T E R I A L S AND M E T H O D S . V i r u s . T h e K 1 8 1 s t r a i n o f MCMV w a s u s e d t h r o u g h o u t t h i s s t u d y . T h e K 1 8 1 s t r a i n o f M C M V , a d e r i v a t i v e o f t h e S m i t h s t r a i n , w a s o r i g i n a l l y o b t a i n e d f r o m D r . J u n e O s b o r n , U n i v e r s i t y o f W i s c o n s i n . A l l a n i m a l i n f e c t i o n s w e r e p e r f o r m e d w i t h K 1 8 1 s t r a i n MCMV t h a t h a d b e e n p a s s a g e d i n s a l i v a r y g l a n d s o f m i c e . A s t o c k o f v i r u s w a s p r e p a r e d b y i n f e c t i o n o f 1 2 5 S W R / J m i c e w i t h 1 0 P F U o f K 1 8 1 b y i n t r a p e r i t o n e a l ( i p ) i n j e c t i o n . F o u r t e e n d a y s a f t e r i n f e c t i o n , t h e a n i m a l s w e r e s a c r i f i c e d , t h e s u b m a x i l l a r y g l a n d s w e r e r e m o v e d a n d 1 0 % ( w / v ) s u s p e n s i o n s o f t h e s e o r g a n s w e r e m a d e b y h o m o g e n i z a t i o n . T h e c e l l u l a r d e b r i s w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( 5 0 0 0 r . p . m . f o r 1 5 m i n , G . S . A . S o r v a l l r o t o r ) . T h e v i r u s c o n t a i n i n g s u p e r n a t a n t w a s a l i q u o t e d i n t o 1 m l a m o u n t s a n d f r o z e n ( - 7 0 ° C ) . T h e t i t e r o f t h e s t o c k v i r u s w a s e s t i m a t e d b y p l a q u e a s s a y ( p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n 1 ) . C e l 1 s . T e r t i a r y m o u s e e m b r y o c e l l s w e r e u s e d i n a l l e x p e r i m e n t s f o r a s s a y i n g a n d g r o w i n g v i r u s . T h e c e l l s w e r e d e r i v e d f r o m e m b r y o s , f r o m 1 2 - 1 7 d a y p r e g n a n t m i c e , t h a t h a d b e e n d i s s o c i a t e d b y s u c c e s s i v e t r y p s i n t r e a t m e n t s . T h e y w e r e u s e d i n a s s a y s a f t e r t w o s u b c u l t u r e s . T h e s e c e l l s w e r e g r o w n i n D u l b e c c o ' s m o d i f i e d E a g l e s M e d i u m ( D M E M , G I B C 0 ) s u p p l e m e n t e d w i t h 1 0 % f e t a l b o v i n e s e r u m ( F B S ) a n d m a i n t a i n e d i n DMEM w i t h 5% F B S . M i c e . M a l e a n d f e m a l e S W R / J m i c e , p u r c h a s e d o r i g i n a l l y f r o m J a c k s o n L a b o r a t o r i e s ( B a r H a r b o r , M e ) , w e r e b r e d i n t h e U . B . C . A n i m a l C a r e U n i t . I n o c u l a t i o n r e g i m e s . S e v e r a l i n o c u l a t i o n r e g i m e s w e r e t e s t e d f o r u s e i n e s t a b l i s h i n g l a t e n t i n f e c t i o n s . A l l i n f e c t i o n s w e r e m a d e b y i p 1 8 2 i n j e c t i o n . A n i m a l s w e r e i n f e c t e d a t : 1 . 2 4 h r a f t e r b i r t h w i t h 1 0 0 P F U ; 2 . a t 1 4 d a y s a f t e r b i r t h w i t h 1 0 0 P F U ; 3 : a t 4 - 6 w e e k s a f t e r b i r t h w i t h 1 0 4 P F U . I n a c c o r d a n c e w i t h c r i t e r i a e s t a b l i s h e d b y J o r d a n e t a l . . ( 1 9 7 7 ) , a n i m a l s w e r e n o t u s e d i n r e a c t i v a t i o n e x p e r i m e n t s u n t i l a t l e a s t 4 m o n t h s a f t e r i n f e c t i o n . A s s a y s f o r f r e e v i r u s . T o d e t e r m i n e t h a t l a t e n t , r a t h e r t h a n c h r o n i c , i n f e c t i o n s h a d b e e n e s t a b l i s h e d i n t h e a n i m a l s , t i s s u e s f r o m a s a m p l e o f e a c h g r o u p o f a n i m a l s w e r e t e s t e d f o r f r e e v i r u s , p r i o r t o p e r f o r m i n g r e a c t i v a t i o n e x p e r i m e n t s . S u b m a x i l l a r y g l a n d s , k i d n e y s a n d s p l e e n s w e r e e x c i s e d f r o m t h e a n i m a l s a n d 1 0 % ( w / v ) h o m o g e n a t e s m a d e b y g r i n d i n g t h e t i s s u e s w i t h s t e r i l e s a n d i n DMEM w i t h 5% F B S . T h e d e b r i s w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( 2 0 0 0 g f o r 1 5 m i n ) a n d 0 . 5 m l o f a 1 : 1 0 d i l u t i o n o f e a c h e x t r a c t w a s a d d e d t o 3 ° m o u s e e m b r y o c e l l s g r o w n i n 2 4 w e l l p l a t e s ( F a l c o n , B - D ) . T h e v i r u s w a s a d s o r b e d f o r 1 h r , t h e n t h e c e l l s w e r e r i n s e d a n d 1 . 0 m l o f m a i n t e n a n c e m e d i a a d d e d t o e a c h w e l l . C e l l s w e r e o b s e r v e d f o r c y t o p a t h i c e f f e c t s ( c . p . e . ) f o r u p t o 1 4 d a y s . M e d i a w e r e c h a n g e d e v e r y 4 d a y s . I n v i t r o c u l t i v a t i o n o f o r g a n s , a ) S a l i v a r y g l a n d s . T h e m e t h o d u s e d w a s a m o d i f i c a t i o n o f t h a t d e s c r i b e d b y O w e n s e t a l _ . ( 1 9 7 4 ) . E a c h t i s s u e s a m p l e w a s p r o c e s s e d s e p a r a t e l y . T h e s u b m a x i l l a r y g l a n d s w e r e r e m o v e d f r o m m i c e b y s t e r i l e p r o c e d u r e s , p l a c e d i n d i s h e s o f w a r m H a n k s B a l a n c e d s a l t s o l u t i o n ( H B S S ) a n d t r i m m e d o f f a t . T h e t i s s u e s w e r e c u t i n t o s m a l l p i e c e s a n d i n c u b a t e d 1 8 h r a t 3 7 ° C i n g r o w t h m e d i u m (DMEM w i t h 1 0 % F B S ) c o n t a i n i n g 1 0 0 U / m l o f c o l l a g e n a s e ( S i g m a ) . 1 8 3 A f t e r t h e i n c u b a t i o n p e r i o d , t h e p i e c e s d i s s o c i a t e d e a s i l y b y g e n t l e p i p e t t i n g . T h e c e l l m a t e r i a l w a s t r a n s f e r r e d t o c e n t r i f u g e t u b e s a n d s t o o d v e r t i c a l l y f o r 5 - 1 0 m i n . C e l l c l u s t e r s s e d i m e n t e d m o r e r a p i d l y u n d e r g r a v i t y t h a n i s o l a t e d c e l l s a n d d e b r i s . T h e s u p e r n a t a n t s w e r e r e m o v e d a n d d i s g a r d e d a n d t h e s e d i m e n t e d c e l l s r e s u s p e n d e d i n DMEM. T h i s p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d t h r e e t i m e s i n t o t a l . T h e s e d i m e n t e d c e l l s w e r e r e s u s p e n d e d i n g r o w t h m e d i a (DMEM w i t h 1 0 % F B S , 1 0 % h o r s e s e r u m ( G I B C O ) a n d 1 0 u g / m l 2 i n s u l i n ( S i g m a ) ) a n d t r a n s f e r r e d t o 2 5 cm c u l t u r e f l a s k s . T h e e p i t h e l i a l - l i k e c e l l s g r e w i n t i g h t l y a d h e r e n t c l u s t e r s . C o n t a m i n a t i n g f i b r o b l a s t s w e r e r e m o v e d b y s e l e c t i v e t r y p s i n i z a t i o n . T r e a t m e n t o f c u l t u r e s w i t h 0 . 0 5 % t r y p s i n , 0 . 0 0 2 % EDTA i n c a l c i u m - m a g n e s i u m f r e e s a l i n e ( S T V ) f o r 1 - 2 m i n w o u l d r e m o v e m o s t o f t h e f i b r o b l a s t s . T h e e p i t h e l i a l c e l l s w e r e v e r y a d h e r e n t a n d r e q u i r e d 1 0 - 1 5 m i n t r e a t m e n t w i t h S T V b e f o r e r e l e a s i n g f r o m t h e f l a s k s . b ) S p l e e n s . S t a n d a r d d i s s o c i a t i o n t e c h n i q u e s w e r e u s e d t o i s o l a t e s p l e e n c e l l s ( H u d s o n e t a j . . , 1 9 7 8 ) . I n b r i e f , t h e s p l e e n w a s t e a s e d a p a r t w i t h f o r c e p s i n t o H a n k s b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n ( H B S S ) a n d t h e c l u m p s b r o k e n u p b y g e n t l e r e p e t i t i v e p i p e t t i n g t h r o u g h a h y p o d e r m i c s y r i n g e . T h e c e l l s w e r e c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t l O O O g f o r 5 m i n . R e d b l o o d c e l l s w e r e l y s e d b y r e s u s p e n s i o n a n d t r e a t m e n t w i t h 0 . 1 6 M N H ^ C l f o r 4 m i n . C e l l s w e r e w a s h e d t w i c e w i t h m e d i a ( R P M I 1 6 4 0 w i t h 1 0 % F B S ) a n d v i a b i l i t y e s t i m a t e d b y c o u n t i n g t r y p a n b l u e e x c l u d i n g c e l l s i n a h e m o c y t o m e t e r . C o c u l t i v a t i o n a s s a y s w e r e p e r f o r m e d b y m i x i n g s p l e e n c e l l s a n d m o u s e e m b r y o c e l l s i n R P M I 1 6 4 0 w i t h 1 0 % F B S a n d a l l o w i n g t h e m t o s e t t l e a n d a d h e r e t o 6 0 mm p e t r i d i s h e s . C u l t u r e s w e r e o b s e r v e d r e g u l a r l y f o r t y p i c a l MCMV c y t o p a t h i c e f f e c t . H a l f t h e m e d i a o f e a c h c u l t u r e w a s c h a n g e d e v e r y 3 - 4 d a y s a n d s t o r e d a t - 7 0 ° C f o r s u b s e q u e n t p l a q u e a s s a y . 1 8 4 c ) K i d n e y s . K i d n e y s w e r e d i s s o c i a t e d b y t r e a t m e n t w i t h 0 . 2 5 % t r y p s i n i n H B S S . T h e k i d n e y s w e r e c u t i n t o s m a l l f r a g m e n t s a n d s u s p e n d e d i n 5 0 m l t r y p s i n s o l u t i o n . T h i s w a s s t i r r e d f o r 3 0 m i n , t h e n t h e f r a g m e n t s w e r e a l l o w e d t o s e t t l e f o r 1 0 m i n a n d t h e r e l e a s e d c e l l s w e r e h a r v e s t e d f r o m t h e s u p e r n a t a n t . T h i s w a s r e p e a t e d 2 - 3 t i m e s u n t i l t h e f r a g m e n t s h a d b e e n c o m p l e t e l y d i s s o c i a t e d . T h e r e l e a s e d c e l l s w e r e p o o l e d , w a s h e d o n c e a n d r e s u s p e n d e d i n g r o w t h m e d i a (DMEM w i t h 1 0 % F B S ) a n d p l a t e d i n p e t r i d i s h e s . d ) L i v e r . I s o l a t e d h e p a t o c y t e s w e r e p r e p a r e d f r o m m i c e l i v e r s b y t h e t e c h n i q u e o f . A r n h e i t e r ( 1 9 8 0 ) . A d u l t m i c e w e r e a n e s t h e t i z e d w i t h s o d i u m p e n t o b a r b i t a l s o l u t i o n ( 1 0 0 m g / k g ) c o n t a i n i n g 1 0 0 0 U / k g h e p a r i n , t h e a b d o m e n w a s o p e n e d , i n t e s t i n e s d i s p l a c e d a n d t h e p o r t a l v e i n e x p o s e d . T h e p o r t a l v e i n w a s c a n u l a t e d w i t h a 21 g a u g e n e e d l e a n d t h e i n f e r i o r v e n a c a v a w a s c u t . T h e l i v e r w a s p e r f u s e d i n s i t u v i a t h e p o r t a l v e i n , w i t h 1 2 . 5 m l o f p e r f u s i o n b u f f e r , h e l d a t 3 7 ° C ( 8 . 4 N a C l , 1 . 2 g N a 2 H P 0 4 . 2 H 2 0 a n d 0 . 1 3 g K H 2 P 0 4 p e r l i t e r o f w a t e r , pH 7 . 5 ) a n d t h e n w i t h 5 0 m l o f a e r a t e d p e r f u s i o n b u f f e r c o n t a i n i n g 0 . 0 5 % c o l l a g e n a s e . T h e l i v e r w a s t h e n e x c i s e d , t r a n s f e r r e d t o a p e t r i d i s h c o n t a i n i n g DMEM w i t h 1 0 7 M i n s u l i n a n d t e a s e d a p a r t b y g e n t l y f o r c i n g t h r o u g h a c e l l s i e v e . T h e c e l l s u s p e n s i o n w a s w a s h e d f o u r t i m e s i n DMEM w i t h 1 0 7 M i n s u l i n b y c e n t r i f u g a t i o n ( 3 0 g f o r 2 m i n ) a n d r e s u s p e n s i o n . C e l l v i a b i l i t y w a s d e t e r m i n e d b y t r y p a n b l u e e x c l u s i o n . C e l l s w e r e d i l u t e d i n DMEM w i t h 1 5 % F B S a n d 1 0 ~ 7 M i n s u l i n a n d 5 p l a t e d a t 3 - 5 x 1 0 c e l l s / m l i n 3 5 o r 6 0 mm p e t r i d i s h e s . A f t e r 2 - 4 h r , t h e c u l t u r e s w e r e r i n s e d , t o r e m o v e n o n v i a b l e c e l l s , a n d r e f e d w i t h g r o w t h m e d i u m . e ) M u s c l e . M u s c l e f i b r o b l a s t c u l t u r e s w e r e i n i t i a t e d b y e x p l a n t c u l t u r e o f f r a g m e n t s o f m u s c l e . A s e c t i o n o f m u s c l e w a s e x c i s e d f r o m a h i n d l e g a n d 3 c u t w i t h a p a i r o f s c a l p e l s i n t o 1 - 2 mm f r a g m e n t s . T h e f r a g m e n t s w e r e 1 8 5 p l a c e d i n d i v i d u a l l y o n t o p e t r i d i s h e s , a n d t h e n a s m a l l a m o u n t o f g r o w t h m e d i a w a s a d d e d . A d h e s i o n o f t h e f r a g m e n t s w a s i m p r o v e d i f t h e s u r f a c e s o f t h e p e t r i d i s h e s w e r e s c o r e d b e f o r e t h e f r a g m e n t s w e r e a d d e d . A d d i t i o n a l m e d i u m w a s a d d e d a f t e r 2 4 h r w h e n a d h e s i o n h a d o c c u r r e d . C e l l s c o u l d u s u a l l y b e o b s e r v e d g r o w i n g o u t f r o m t h e f r a g m e n t s a f t e r 4 - 7 d a y s . I n v i t r o r e p l i c a t i o n o f M C M V . T o d e t e r m i n e i f MCMV r e p l i c a t e d i n c e r t a i n c e l l t y p e s i n . v i t r o , c u l t u r e s w e r e p r e p a r e d f r o m t i s s u e s o f u n i n f e c t e d m i c e b y t h e m e t h o d s d e s c r i b e d . C u l t u r e s w e r e i n f e c t e d a t v a r i o u s m u l t i p l i c i t i e s o f i n f e c t i o n ( m . o . i . ) w i t h t i s s u e c u l t u r e p a s s a g e d MCMV ( K 1 8 1 ) . T h e t i t e r s o f v i r u s c o n t a i n i n g s u p e r n a t a n t s f r o m t h e c u l t u r e s w e r e m e a s u r e d b y p l a q u e a s s a y , b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d i n s e c t i o n 1 . 1 8 6 R E S U L T S AND D I S C U S S I O N . 1 . E s t a b l i s h m e n t o f l a t e n t MCMV i n f e c t i o n s i n m i c e . G r e a t d i f f i c u l t y w a s e n c o u n t e r e d i n e s t a b l i s h i n g l a t e n t MCMV i n f e c t i o n s i n S W R / J s t r a i n m i c e . T h r e e d i f f e r e n t i n f e c t i o n r e g i m e s w e r e t e s t e d b e f o r e s u c c e s s f u l e s t a b l i s h m e n t o f l a t e n c y c o u l d b e d e m o n s t r a t e d i n t h e m a j o r i t y o f a n i m a l s . T h i s w a s a s s e s s e d a s t h e a b s e n c e o f i n f e c t i o u s v i r u s i n h o m o g e n a t e s o f s a l i v a r y g l a n d s , k i d n e y s a n d s p l e e n s o f m i c e i n f e c t e d a t l e a s t 4 m o n t h s p r e v i o u s l y . I n f e c t i o n o f m i c e a t 2 4 h r a f t e r b i r t h w i t h 1 0 0 P F U o f v i r u s ( a s u s e d b y O l d i n g e t a l _ . , 1 9 7 5 ) r e s u l t e d i n a 9 6 % m o r t a l i t y ( 8 0 / 8 3 ) w i t h i n t w o w e e k s o f i n f e c t i o n . I n f e c t i o n o f m i c e a t 1 4 d a y s a f t e r b i r t h w i t h 1 0 0 P F U o f v i r u s a l s o r e s u l t e d i n a h i g h m o r t a l i t y r a t e ( 3 7 % ) . 4 I n f e c t i o n o f m i c e a t 4 - 6 w e e k s a f t e r b i r t h w i t h 1 0 P F U o f v i r u s d i d n o t p r o d u c e a n y o b s e r v a b l e d e a t h s d u e t o MCMV i n f e c t i o n . T h e o t h e r p r o b l e m e n c o u n t e r e d w a s t h e t e n d e n c y o f t h e v i r u s t o e s t a b l i s h p r o l o n g e d i n f e c t i o n s i n c e r t a i n t i s s u e s o f t h e a n i m a l s . T h i s w a s p a r t i c u l a r l y s e e n i n a n i m a l s i n o c u l a t e d b y m e t h o d 2 , w h e r e n e a r l y a l l t h e a n i m a l s d e v e l o p e d l o n g s t a n d i n g c h r o n i c i n f e c t i o n s a n d v i r u s w a s e v e n d e t e c t e d 9 m o n t h s a f t e r i n f e c t i o n i n t h e k i d n e y s o f 2 / 3 a n i m a l s a n d 11 m o n t h s a f t e r i n f e c t i o n i n t h e s a l i v a r y g l a n d s o f 1 / 2 a n i m a l s . A s u m m a r y o f t h e o u t c o m e o f MCMV i n f e c t i o n i n t h e g r o u p s o f m i c e , a t v a r i o u s t i m e s a f t e r i n f e c t i o n , i s s h o w n i n T a b l e V . W i t h t h e u s e o f i n o c u l a t i o n r e g i m e 3 , 8 8 % o f a n i m a l s w e r e v i r u s f r e e a f t e r f i v e m o n t h s . T h e s e r e s u l t s a p p e a r t o i l l u s t r a t e t h e i m p o r t a n c e o f a f u n c t i o n a l i m m u n e s y s t e m f o r l i m i t i n g MCMV i n f e c t i o n o f t i s s u e s , 1 8 7 T a b l e V : O u t c o m e o f i n f e c t i o n o f m i c e o f d i f f e r e n t a g e s w i t h M C M V . I n o c u l a t i o n % S u r v i v o r s . D a t e p o s t P r e s e n c e a n d r e g i m e . i n f e c t i o n / m o n t h s . l o c a t i o n o f v i r u s . 1 . 4 4 . 5 3 / 3 a 1 k i d n e y 1 / 3 s . g . 2 . 6 3 4 . 5 2 / 2 k i d n e y 2 / 2 s . g . 2 / 2 s p l e e n 2 . 5 . 5 2 / 2 k i d n e y 1 / 2 s . g . 2 . 5 . 0 1/1 s . g . 2 . 4 . 0 2 / 2 k i d n e y 1 / 2 s . g . 2 . 7 . 5 2 / 2 k i d n e y 2 . 7 . 0 1/1 n e g . 2 . 9 . 0 2 / 3 k i d n e y 1 / 3 s . g . 1 / 3 n e g . 2 . 11 . 0 1 / 2 s . g . 1 / 2 n e g . 3 . 1 0 0 5 . 0 1 5 / 1 7 n e g . 2 / 1 7 ' k i d n e y 3 . 5 . 5 6 / 7 n e g . 1 / 7 s . g . N o t e s : a - n o . o f m i c e w i t h d e t e c t a b l e f r e e v i r u s / n o . o f m i c e t e s t e d s . g . - s a l i v a r y g l a n d s . n e g . - n o v i r u s d e t e c t e d . i n o c u l a t i o n r e g i m e 1 . M i c e i n o c u l a t e d a t 2 4 h r w i t h 1 0 0 P F U v i r u s . i n o c u l a t i o n r e g i m e 2 . M i c e i n o c u l a t e d a t 1 4 d a y s w i t h 1 0 0 P F U v i r u s . i n o c u l a t i o n r e g i m e 3 . M i c e i n o c u l a t e d a t 4 - 6 w e e k s w i t h 1 0 4 P F U v i r u s . V i r u s u s e d w a s s a l i v a r y g l a n d p a s s a g e d MCMV ( K 1 8 1 ) . 1 8 8 p a r t i c u l a r l y w h e n t h e v i r u l e n t s t r a i n o f MCMV i s u s e d . I t a p p e a r e d t h a t o n c e i n f e c t i o n h a d b e c o m e e s t a b l i s h e d i n t h e s a l i v a r y g l a n d s a n d k i d n e y s , t h e v i r u s w a s n o t r e a d i l y a c c e s s i b l e t o i m m u n e c l e a r a n c e . T h e s e r e s u l t s h a v e s i m i l a r i t i e s t o s o m e p u b l i s h e d a f t e r t h e t e r m i n a t i o n o f t h i s s t u d y ( J o r d a n e t a l _ . , 1 9 8 2 ) . T h e y s h o w e d t h a t 4 6 % o f C 3 H a n d 6 2 % o f DBA m i c e 3 i n f e c t e d ( i p ) b e f o r e 1 w e e k o f a g e w i t h 1 0 P F U o f a t t e n u a t e d MCMV w e r e v i r u s p o s i t i v e i n t h e s a l i v a r y g l a n d s 4 m o n t h s a f t e r i n f e c t i o n . T h e h i g h i n c i d e n c e o f c h r o n i c i n f e c t i o n o b s e r v e d i n t h i s s t u d y m a y b e a c h a r a c t e r i s t i c o f t h e S W R / J r e s i s t a n c e t o MCMV i n f e c t i o n ( H u d s o n , 1 9 8 4 ) . 2 . R e a c t i v a t i o n o f MCMV b y c e l l c u l t i v a t i o n m e t h o d s . A s d i f f i c u l t i e s w e r e e n c o u n t e r e d i n r e p e a t a b l y o b t a i n i n g v i a b l e m u r i n e h e p a t o c y t e s f o r c u l t u r e , b y i n . s i t u p e r f u s i o n , t h i s o r g a n w a s n o t i n c l u d e d i n t h e g r o u p s t u d i e d f o r t h e d e t e c t i o n o f r e a c t i v a t e d v i r u s . A s u m m a r y o f t h e r e s u l t s o f a n u m b e r o f r e a c t i v a t i o n e x p e r i m e n t s i s l i s t e d i n T a b l e V I . I t c a n b e s e e n t h a t i n t h e f i r s t g r o u p o f e x p e r i m e n t s ( 1 - 5 ) , r e a c t i v a t i o n w a s d e t e c t e d i n s p l e e n s f r o m m i c e t h a t h a d f r e e v i r u s i n o t h e r t i s s u e s . A p o r t i o n o f t h e s p l e e n s u s e d i n e a c h o f t h e s e e x p e r i m e n t s w a s a l s o t e s t e d f o r t h e p r e s e n c e o f f r e e v i r u s a n d s h o w n t o b e n e g a t i v e . T h e r e s u l t s i n e x p t s . 2 a n d 3 i n d i c a t e d t h a t v i r u s c o u l d b e r e a c t i v a t e d f r o m s p l e e n c e l l s o f S W R / J m i c e . T h i s w a s f i r s t i d e n t i f i e d i n t h e c u l t u r e s a f t e r 8 a n d 1 0 d a y s , r e s p e c t i v e l y , o f c o c u l t i v a t i o n . T h i s p e r i o d w a s s l i g h t l y s h o r t e r t h a n t h e c o c u l t i v a t i o n p e r i o d s o f 2 - 3 w e e k s r e p o r t e d b y O l d i n g e t a l . . ( 1 9 7 5 ) a n d J o r d a n e t a l . . ( 1 9 8 2 ) , b u t l o n g e r t h a n w h e n f r e e v i r u s h a d b e e n p r e s e n t i n t h e t i s s u e s . H o w e v e r , t h e p r e s e n c e o f i n f e c t i o u s v i r u s i n o t h e r t i s s u e s i n v a l i d a t e d a n y c o n c l u s i o n s t h a t c o u l d b e d r a w n f r o m t h e r e a c t i v a t i o n t h a t o c c u r r e d i n t h e s e s p l e e n c e l l s . 1 8 9 T a b l e V I : R e a c t i v a t i o n o f MCMV f r o m l a t e n t l y i n f e c t e d t i s s u e s u s i n g c e l l c u l t i v a t i o n m e t h o d s . E x p t . n o . 1 . 2 . 3 . 4. 5 . 6 . 7 . 8 . 9 . 1 0 . 1 1 . 1 2 . 1 3 . 1 4 . I n o c  r e g . 1 . 1 . 1 . 2 . 2 . 2 . 3 . 3 . 3 . 3 . 3 . 3 . 3 . 3 . ORGAN T Y P E . s p l e e n , + 8 d a + 1 0 d a _ d _ d 3 / 6 . 7 5 x l 0 7 e 2 / 1 . 2 x l 0 8 e + + + 2 / 6 . 5 x l 0 7 e k i d n e y . F . V b . F . V . F . V . F . V . F . V . F . V . m u s c l e . N . D C . N . D . N . D . N . D . N . D . 2 / 4 x 1 0 7 e N o t e s : a . n o . o f d a y s f o r v i r u s t o b e d e t e c t e d . b . F . V . = f r e e v i r u s . c . N . D . = n o t d o n e . d . s p l e e n c e l l s f r a c t i o n a t e d b e f o r e c o c u l t i v a t i o n . e . n o . o f r e a c t i v a t i o n f o c i / t o t a l n o . o f s p l e e n c e l l s a s s a y e d . - . n o v i r u s d e t e c t e d . + . v i r u s d e t e c t e d . 1 9 0 I n e x p t s . 4 a n d 5 , t h e s p l e e n c e l l s w e r e s e p a r a t e d i n t o p l a s t i c a d h e r e n t a n d n o n a d h e r e n t p o p u l a t i o n s p r i o r t o c o c u l t i v a t i o n . V i r u s w a s n o t d e t e c t e d i n t h e s e c a s e s . O n e w o u l d h a v e e x p e c t e d t o b e a b l e t o d e t e c t v i r u s i n o n e o f t h e p o p u l a t i o n s , h o w e v e r , J o r d a n a n d M a r ( 1 9 8 2 ) h a d s h o w n t h a t t h e f r e q u e n c y o f r e a c t i v a t i o n w a s n o t i c e a b l y l e s s w h e n u s i n g s p l e e n c e l l s t h a t h a d b e e n m a n i p u l a t e d . I n e x p t s , 6 , 7 , 11 a n d 1 4 , t h e f r e q u e n c y o f MCMV r e a c t i v a t i o n w a s d e t e r m i n e d b y c o c u l t i v a t i o n o f a l l t h e c e l l s p r e s e n t i n e a c h s p l e e n . T h e s p l e e n c e l l s a n d m o u s e e m b r y o c e l l s w e r e m i x e d i n a r a t i o o f 1 0 : 1 ( 5 x 1 0 ^ 5 s p l e e n c e l l s : 5 x 1 0 m o u s e e m b r y o c e l l s ) i n R P M I 1 6 4 0 w i t h 1 0 % F B S a n d a d d e d t o 6 0 mm p e t r i d i s h e s . I n a p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t , i t h a d b e e n s h o w n t h a t r e a c t i v a t i o n h a d n o t o c c u r r e d w h e n t h e c e l l s w e r e c u l t u r e d , i n t h e s a m e p r o p o r t i o n s , i n D u l b e c c o ' s m o d i f i e d E a g l e ' s m e d i u m . I t a p p e a r e d n e c e s s a r y t o a d j u s t t h e c u l t u r e c o n d i t i o n s t o e n s u r e o p t i m u m s u r v i v a l o f t h e s p l e e n c e l l s , r a t h e r t h a n o f t h e f i b r o b l a s t s . T h e d i s h e s w e r e e x a m i n e d e v e r y s e c o n d d a y f o r t h e p r e s e n c e o f MCMV c y t o p a t h o l o g y . T h e t i m e a f t e r i n f e c t i o n t h a t t h i s w a s o b s e r v e d w a s n o t e d . I n e x p t . 6 , v i r a l c y t o p a t h i c e f f e c t w a s o b s e r v e d i n t h r e e s e p a r a t e d i s h e s a f t e r 8 d a y s , 1 3 d a y s a n d 1 8 d a y s r e s p e c t i v e l y . T h e s p r e a d o f t h e c y t o p a t h i c e f f e c t w a s i n i t i a l l y s l o w a n d b y f r e q u e n t e x a m i n a t i o n o f t h e d i s h e s , t h e a p p e a r a n c e o f a n i n i t i a l ' r e a c t i v a t i o n f o c i ' c o u l d b e o b s e r v e d . A c y t o p a t h i c e f f e c t i n t h e o t h e r s p l e e n c u l t u r e s w a s f i r s t o b s e r v e d b e t w e e n 1 0 - 1 5 d a y s , w i t h t h e e x c e p t i o n o f o n e , w h e r e i t w a s n o t i c e d a f t e r 6 d a y s ( e x p t . 7 ) . T h i s d o e s r a i s e t h e q u e s t i o n a s t o w h e t h e r c h r o n i c i n f e c t i o n s c a n a l s o o c c u r i n t h e s p l e e n u n d e r c e r t a i n c i r c u m s t a n c e s . A m o s t n o t i c e a b l e f e a t u r e w a s t h e v e r y l o w f r e q u e n c y o f s e p a r a t e r e a c t i v a t i o n e v e n t s o c c u r r i n g i n e a c h a n i m a l . F r o m o u r f i g u r e s , i t a p p e a r e d 191 t h a t 1 s p l e e n c e l l i n 2 - 6 x 1 0 w a s c a r r y i n g MCMV i n a l a t e n t f o r m f r o m w h i c h i t c o u l d b e r e a c t i v a t e d . T h i s w a s c o n s i d e r a b a l y l e s s t h a n t h e 1 5 l y m p h o c y t e i n 1 . 2 x 1 0 e s t i m a t e d b y J o r d a n a n d M a r ( 1 9 8 2 ) . I t w a s n o t p o s s i b l e t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e s e d i f f e r e n c e s r e p r e s e n t a g e n e t i c d i f f e r e n c e i n i m m u n e r e s p o n s e t o t h e v i r u s b y t h e d i f f e r e n t s t r a i n s o f m i c e o r w e r e d u e t o t h e f a c t t h a t , i n t h e l a t t e r c a s e , t h e m i c e w e r e i n f e c t e d w i t h 1 0 t i m e s m o r e v i r u s . I n c o m p a r i s o n , 3 - 4 MCMV g e n o m e e q u i v a l e n t s p e r 1 0 0 s p l e e n c e l l s w e r e d e t e c t e d b y DNA r e a s s o c i a t i o n h y b r i d i z a t i o n ( O l d i n g e t a ] _ . , 1 9 7 6 ) . T h e v e r y l o w f r e q u e n c y o f r e a c t i v a t i o n i n d i c a t e d t h a t t h i s s y s t e m w a s n o t s u i t a b l e f o r s t u d y i n g t h e b i o c h e m i c a l m o d u l a t i o n o f r e a c t i v a t i o n . I n t w o e x p e r i m e n t s , MCMV w a s a p p a r e n t l y r e a c t i v a t e d f r o m c u l t u r e d s u b m a x i l l a r y g l a n d c e l l s . I n e x p t s . 6 a n d 1 1 , v i r u s w a s d e t e c t e d i n t h e s u p e r n a t a n t s t a k e n 9 a n d 1 5 d a y s , r e s p e c t i v e l y , a f t e r c u l t u r e . H o w e v e r , i t c a n n o t b e r u l e d o u t t h a t l o w l e v e l s o f MCMV h a d p e r s i s t e d i n t h e t i s s u e a n d h a d r e p l i c a t e d t o d e t e c t a b l e l e v e l s i n t h e f i b r o b l a s t s t h a t w e r e c o n t a m i n a t i n g t h e c u l t u r e s . I n n o c a s e w a s a c y t o p a t h i c e f f e c t o b s e r v e d i n t h e e p i t h e l i a l c e l l s o f t h e s e c u l t u r e s . V i r u s w a s n o t d e t e c t e d f r o m c u l t u r e s o f k i d n e y c e l l s o r m u s c l e f i b r o b l a s t s . T h e v i a b i l i t y o f t h e c u l t u r e s v a r i e d f r o m a n i m a l t o a n i m a l a n d i t w a s d i f f i c u l t t o k e e p t h e m i n a v i a b l e s t a t e p a s t 3 w e e k s . T h e k i d n e y c e l l s c o u l d n o t b e p a s s a g e d w i t h o u t l o s s o f a l a r g e p e r c e n t a g e o f t h e c e l l s . 3 . R e p l i c a t i o n o f MCMV i n p r i m a r y c u l t u r e s , a ) , m u r i n e h e p a t o c y t e s . A s s t a t e d e a r l i e r , e x t r e m e d i f f i c u l t y w a s e n c o u n t e r e d i n r e p e a t a b l y p r o d u c i n g v i a b l e c u l t u r e s o f m u r i n e h e p a t o c y t e s b y i n s i t u p e r f u s i o n . C o n s i d e r a b l e v a r i a b i l i t y i n t h e n u m b e r o f v i a b l e c e l l s a n d t h e e f f i c i e n c y w i t h w h i c h t h e y a d h e r e d t o t h e p e t r i d i s h e s w a s o b s e r v e d 1 9 2 b e t w e e n a n i m a l s . S e v e r a l f a c t o r s a r e k n o w n t o c o n t r o l t h e s u r v i v a l o f t h e s e c e l l s d u r i n g t h e d i s s o c i a t i o n s t a g e . T h e m o s t c r i t i c a l s t e p s i n v o l v e p r o c e d u r e s t o m i n i m i z e s h e a r i n g , a s t h e c e l l m e m b r a n e s a r e k n o w n t o b e r e v e r s i b l y d a m a g e d f o l l o w i n g t h e t w o p e r f u s i o n s t e p s . A s t u d y o f v a r i a b l e f a c t o r s i n t h e i s o l a t i o n p r o c e d u r e f o r p r o d u c i n g v i a b l e m u r i n e h e p a t o c y t e s w a s p u b l i s h e d a f t e r t h e t e r m i n a t i o n o f t h i s w o r k ( K l a u n i g e t a l _ . , 1 9 8 1 ) . T h i s l i s t e d f e a t u r e s t h a t v a r i e d f r o m t h e m e t h o d u s e d ( A r n h e i t e r , 1 9 8 0 ) , i n c l u d i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f c o l l a g e n a s e , m e t h o d o f p e r f u s i o n a n d r a t e s o f c e n t r i f u g a t i o n o f t h e s e p a r a t e d c e l l s . A l l t h e s e f a c t o r s c a n c o n t r i b u t e t o r e d u c e d y i e l d s o f v i a b l e c e l l s . T a b l e V i l a s h o w s t h e m e a n t i t e r s f r o m t w o s e p a r a t e e x p e r i m e n t s f o r t h e r e p l i c a t i o n o f MCMV i n m u r i n e h e p a t o c y t e s . I n t h e s e c u l t u r e s , t h e c e l l v i a b i l i t y a n d a t t a c h m e n t h a d b e e n h i g h . T h e c e l l s s h o w e d a p r o g r e s s i v e c y t o p a t h i c e f f e c t , c h a r a c t e r i s t i c o f MCMV i n f e c t i o n , t h a t e v e n t u a l l y i n v o l v e d a l l t h e c e l l s . T h i s i n d i c a t e d t h a t t h e MCMV w a s b e i n g r e p l i c a t e d . T h e r e s u l t s i n d i c a t e d a t y p i c a l o n e s t e p i n f e c t i o u s c y c l e , t h o u g h i t a p p e a r e d m o r e p r o t r a c t e d t h a n t h e MCMV r e p l i c a t i o n c y c l e i n f i b r o b l a s t c e l l s . A n i n t e r e s t i n g f e a t u r e w a s t h e f a c t t h a t MCMV a p p e a r e d t o r e p l i c a t e i n c e l l s t h a t d o n o t u n d e r g o r e p l i c a t i v e DNA s y n t h e s i s i n . v i t r o . A r n h e i t e r ( 1 9 8 0 ) h a d s h o w n t h a t o n l y 0 . 2 - 0 . 5 % o f u n s t i m u l a t e d h e p a t o c y t e c e l l s u n d e r w e n t DNA s y n t h e s i s . I n s o m e o f t h e o t h e r c u l t u r e s e s t a b l i s h e d , n o v i r u s r e p l i c a t i o n o c c u r r e d . T h e s e c e l l s d e g e n e r a t e d m o r e q u i c k l y t h a n t h e p r o d u c t i v e l y i n f e c t e d c u l t u r e s . b ) . m u r i n e k i d n e y c e l l s . T h e r e s u l t s f o r t h e r e p l i c a t i o n o f MCMV i n c u l t u r e d s e c o n d a r y m o u s e k i d n e y c e l l s a r e s h o w n i n T a b l e V I l b . T h e r e s u l t s a r e d i f f i c u l t t o i n t e r p r e t a s t h e c u l t u r e s w e r e c o n t a m i n a t e d w i t h a s m a l l 1 9 3 T A B L E V I I . R e p l i c a t i o n o f MCMV i n p r i m a r y c e l l c u l t u r e s , a ) R e p l i c a t i o n o f MCMV i n m u r i n e h e p a t o c y t e s . D a y s p o s t i n f e c t i o n . T i t e r : P F U / 1 0 6 c e l l s , 1 . 3 6 0 . 2 . 9 . 2 x 1 0 4 3 . 5 . 2 x 1 0 5 4 . 8 . 6 x 1 0 5 C e l l s w e r e i n f e c t e d a t a m . o . i . o f 1 b ) R e p l i c a t i o n o f MCMV i n m o u s e k i d n e y c e l l s . D a y s p o s t i n f e c t i o n . T i t e r : P F U / 1 0 6 c e l l s . 1 . 6 . 8 x 1 0 2 3 . 5 . 1 x 1 0 3 4 . 1 . 1 x 1 0 4 5 . 1 . 4 x 1 0 4 6 . 3 . 0 x 1 0 4 C e l l s w e r e i n f e c t e d a t a m . o . i . o f 1 c ) . R e p l i c a t i o n o f MCMV i n I U d R t r e a t e d a n d u n t r e a t e d m o u s e k i d n e y c e l l s . D a y s p o s t i n f e c t i o n . T i t e r : P F U / 1 0 ^ c e l l s . I U d R t r e a t e d . U n t r e a t e d . 1 . 4 . 8 x 1 0 2 1 . 6 x 1 0 3 3 . 1 . 4 x 1 0 4 1 . 8 x 1 0 4 4 . 1 . 0 x 1 0 4 2 . 6 x 1 0 4 5 . 6 . 2 x 1 0 3 3 . 4 x 1 0 4 7 . 7 . 1 x 1 0 4 4 . 1 x 1 0 4 C e l l s w e r e i n f e c t e d a t a m . o . i . o f 2 1 9 4 p e r c e n t a g e o f f i b r o b l a s t s . H o w e v e r , a c y t o p a t h i c e f f e c t w a s o b s e r v e d i n a s m a l l p e r c e n t a g e o f e p i t h e l i a l - l i k e c e l l s . P r e t r e a t m e n t o f m u r i n e k i d n e y c e l l s w i t h 5 - I o d o 2 1 - d e o x y u r i d i n e ( I U d R ) ( 1 0 0 y g / m l ) f o r t h r e e d a y s , i n a s i m i l a r m a n n e r t o t h a t d e s c r i b e d b y S t . J e o r a n d R a p p ( 1 9 7 3 ) a n d P l u m m e r a n d G o o d h e a r t ( 1 9 7 4 ) , d i d n o t h a v e t h e e f f e c t o f m a k i n g t h e m m o r e p e r m i s s i v e t o v i r u s r e p l i c a t i o n ( T a b l e . V I I c ) . I n t h e s e e x p e r i m e n t s , i t a p p e a r e d t h a t I U d R p r e t r e a t m e n t w a s h a v i n g a n i n h i b i t o r y e f f e c t . H o w e v e r , i n a s i m i l a r e x p e r i m e n t , c e l l s w e r e p r e t r e a t e d w i t h I U d R f o r 1 8 h r b e f o r e i n f e c t i o n w i t h MCMV a t a m . o . i . o f 1 0 - 2 0 . T h e a i m o f t h i s e x p e r i m e n t h a d b e e n t o d e t e c t i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y v i r a l p r o t e i n s b y 3 5 l a b e l i n g i n f e c t e d c e l l s w i t h ( S ) m e t h i o n i n e . T h e s e c o u l d n o t b e d e t e c t e d b y p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( d a t a n o t s h o w n ) . H o w e v e r , t h e t r e a t e d c e l l s a l l s h o w e d a v i r a l c y t o p a t h i c e f f e c t a t 2 4 h r p i . ( b o t h e p i t h e l i a l a n d f i b r o b l a s t c e l l s ) , w h i l e a b o u t 3 0 % o f t h e u n t r e a t e d c e l l s s h o w e d a c y t o p a t h i c e f f e c t . T h i s s e e m e d t o i n d i c a t e t h a t I U d R p r e t r e a t m e n t w a s i n c r e a s i n g t h e s u s c e p t i b i l i t y o f m u r i n e k i d n e y e p i t h e l i a l c e l l s , i n s o m e f a s h i o n , t o MCMV i n f e c t i o n . c ) . m u r i n e s a l i v a r y g l a n d c e l l s . I n f e c t i o n o f c u l t u r e s f r o m s u b m a x i l l a r y g l a n d s w i t h MCMV d i d n o t r e s u l t i n p r o d u c t i v e i n f e c t i o n o f t h e e p i t h e l i a l c e l l s . MCMV d i d n o t p r o d u c e a c y t o p a t h i c e f f e c t i n t h e s e c e l l s , e v e n w i t h a h i g h m . o . i . . T h e s e r e s u l t s s h o w e d t h a t i n v i t r o c u l t i v a t i o n o f c e l l s f r o m t i s s u e s o f S W R / J m i c e , l a t e n t l y i n f e c t e d w i t h M C M V , w a s n o t a s u i t a b l e s y s t e m f o r s t u d y i n g t h e m o d u l a t i o n o f r e a c t i v a t i o n . T h e v e r y l o w f r e q u e n c y o f r e a c t i v a t i o n o f MCMV f r o m s p l e e n c e l l s , t h e a p p a r e n t a b s e n c e o f r e a c t i v a t i o n 1 9 5 f r o m t h e o t h e r t i s s u e s c u l t u r e d , a l o n g w i t h t h e v a r i a b l e a b i l i t y t o c u l t u r e c e l l s f r o m t i s s u e s o f a d u l t a n i m a l s , e n t a i l e d t h e a b a n d o n m e n t o f t h i s s y s t e m a n d s t u d i e s w e r e p e r f o r m e d i n s t e a d w i t h c o n t i n u o u s c e l l l i n e s ( d e s c r i b e d i n s e c t i o n 1 ) . T h e m o s t i n t e r e s t i n g f e a t u r e f r o m t h i s s t u d y w a s t h a t f a c t t h a t MCMV c o u l d r e p l i c a t e i n h e p a t o c y t e c u l t u r e s . A s t h e s e c e l l s d o n o t u n d e r g o c e l l u l a r DNA s y n t h e s i s i n v i t r o , i t i l l u s t r a t e d t h a t MCMV r e p l i c a t i o n m a y n o t b e c e l l c y c l e r e g u l a t e d i n a l l c e l l t y p e s . I n a d d i t i o n , t h e f a c t t h a t MCMV r e p l i c a t e d i n e p i t h e l i a l t y p e s o f c e l l s w a s s u r p r i s i n g . W i t h t h e i m p r o v e d m u r i n e h e p a t o c y t e i s o l a t i o n t e c h n i q u e r e f e r r e d t o ( K l a u n i g e t a l _ . , 1 9 8 1 ) , i t w o u l d b e v a l u a b l e t o c o n t i n u e w i t h t h e p r e l i m i n a r y s t u d i e s r e p o r t e d h e r e . 196 R E F E R E N C E S . A C K E R M A N N , M . , B R A U N , O . K . , P E R E I R A , L . a n d R O I Z M A N , B . (1984). C h a r a c t e r i z a t i o n o f H e r p e s S i m p l e x v i r u s 1 a p r o t e i n s 0, 4, a n d 27 w i t h m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 52, 108-118. A L B E R T S , B . a n d H E R R I C K , G . (1970). D N A - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y . I n M e t h o d s i n E n z y m o l o g y ( N u c l e i c A c i d s ) , V o l . 23, pp.198-217. E d i t e d b y L . G r o s s m a n = & M . M o l d a v e . New Y o r k : A c a d e m i c P r e s s . A L F O R D , C . A . , S T A G N O , S . P A S S , R . F . a n d H U A N G , E . - S . (1981). E p i d e m i o l o g y o f C y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n s . I n T h e Human H e r p e s v i r u s e s - a n I n t e r d i s c i p l i n a r y A p p r o a c h , pp.159-172. E d i t e d b y A . J . N a h m i a s , W . R . D o w d l e & R . F . S c h i n a z i . A m s t e r d a m : E l s e v i e r B i o m e d i c a l . A N D E R S , D . G . a n d G I B S O N , W. (1984). I d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a m a j o r HCMV e a r l y DNA b i n d i n g p r o t e i n a p p a r e n t l y h o m o l o g o u s t o t h e m a j o r DNA b i n d i n g p r o t e i n o f H S V . A b s t r a c t s o f t h e n i n t h I n t e r n a t i o n a l H e r p e s v i r u s W o r k s h o p p p . 143. A R N H E I T E R , H . (1980). P r i m a r y m o n o l a y e r c u l t u r e o f a d u l t m o u s e h e p a t o c y t e s - A m o d e l f o r t h e s t u d y o f h e p a t o t r o p i c v i r u s e s . A r c h i v e s o f V i r o l o g y 63, 11-22. B A N K S . L . , P U R I F O Y , D . J . M . , H U R S T , P . F . , K I L L I N G T O N , R . A . a n d P O W E L L , K . L . (1983). H e r p e s s i m p l e x v i r u s n o n - s t r u c t u r a l p r o t e i n s . I V . P u r i f i c a t i o n o f t h e v i r u s - i n d u c e d d e o x y r i b o n u c l e a s e a n d c h a r a c t e r i s a t i o n o f t h e e n z y m e u s i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 64, 2249-2260. B E N - P O R A T , T . , V E O C H , R - A , a n d H A M P L , H . (1983). F u n c t i o n s o f t h e m a j o r n o n - s t r u c t u r a l D N A - b i n d i n g p r o t e i n o f a h e r p e s v i r u s ( P s e u d o r a b i e s ) . V i r o l o g y 124, 411-424. B E N - P O R A T , T . , L O M N I C Z I , B . , P E N D R Y S , J . a n d K A P L A N , A . S . (1984). N e u r o v i r u l e n c e o f p s e u d o r a b i e s v i r u s : G e n e t i c b a s i s f o r i t s e x p r e s s i o n . A b s t r a c t s o f t h e n i n t h I n t e r n a t i o n a l H e r p e s v i r u s W o r k s h o p p p . 22. B I B O R - H A R D Y , V . , B E R N A R D , M . a n d S I M A R D , R . (1985). N u c l e a r m a t r i x m o d i f i c a t i o n s a t d i f f e r e n t s t a g e s o f i n f e c t i o n b y h e r p e s s i m p l e x t y p e 1. J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 66, 1095-1103. B I B O R - H A R D Y , V . , P O U C H E L E T , M . , S T - P I E R R E , E . , H E R Z B E R G , M . a n d S I M A R D , R . (1982). T h e n u c l e a r m a t r i x i s i n v o l v e d i n h e r p e s s i m p l e x v i r o g e n e s i s . V i r o l o g y 121, 296-306. B L A I R , E . D . a n d H O N E S S , R . W . (1983). D N A - b i n d i n g p r o t e i n s s p e c i f i e d b y h e r p e s v i r u s s a i m i r i . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 64, 2697-2715. B L A N T O N , R . A . a n d T E V E T H I A , M . J . (1981). I m m u n o p r e c i p i t a t i o n o f v i r u s - s p e c i f i c i m m e d i a t e - e a r l y a n d e a r l y p o l y p e p t i d e s f r o m c e l l s l y t i c a l l y i n f e c t e d w i t h h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s s t r a i n AD 169. V i r o l o g y 112, 262-273. 1 9 7 B O L D O G H . I . , G O N C Z O L . E . , G A R T N E R . L . a n d V A C Z I . G . ( 1 9 7 7 ) . E x p r e s s i o n o f t h e h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s g e n o m e i n m o u s e c e l l s a n d i n h u m a n - m o u s e h e t e r o k a r y o n s . A r c h i v e s o f V i r o l o g y 5 3 , 1 0 1 - 1 0 8 . B O L D O G H . I . , G O N C Z O L . E . , G A R T N E R . L . a n d V A C Z I . G . ( 1 9 7 8 ) . S t i m u l a t i o n o f h o s t DNA s y n t h e s i s a n d i n d u c t i o n o f e a r l y a n t i g e n s b y u l t r a v i o l e t l i g h t i r r a d i a t e d h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s . A r c h i v e s o f V i r o l o g y 5 8 , 2 8 9 - 2 9 9 . B O O K O U T , J . B . a n d L E V Y , C C . ( 1 9 8 0 ) . C o m p a r a t i v e e x a m i n a t i o n o f t h e p o l y p e p t i d e s o f h e r p e s s i m p l e x v i r u s : T y p e s 1 a n d 2 . V i r o l o g y 1 0 1 , 1 9 8 - 2 1 6 . B O W E N , B . , S T E I N B E R G , J . , L A E M M L I , U . K . a n d W E I N T R A U B , H . ( 1 9 8 0 ) . T h e d e t e c t i o n o f D N A - b i n d i n g p r o t e i n s b y p r o t e i n b l o t t i n g . N u c l e i c a c i d R e s e a r c h 8 , 1 - 2 0 . B R A N D S M A , J . a n d M I L L E R , G . ( 1 9 8 0 ) . N u c l e i c a c i d s p o t h y b r i d i z a t i o n : R a p i d q u a n t i t a t i v e s c r e e n i n g o f l y m p h o i d c e l l l i n e s f o r E p s t e i n - B a r r v i r a l DNA. P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s , U . S . A . 7 7 , 6 8 5 1 - 6 8 5 5 . B R A U T I G A M , A . R . a n d O L D S T O N E , M . B . A . ( 1 9 8 0 ) . R e p l i c a t i o n o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s i n r e p r o d u c t i v e t i s s u e s . A m e r i c a n J o u r n a l o f P a t h o l o g y 9 8 , 2 1 3 - 2 2 0 . B R A U T I G A M , A . R . , D U T K O , F . J . , O L D I N G , L . B . a n d O L D S T O N E , M . B . A . ( 1 9 7 9 ) . P a t h o g e n e s i s o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n : t h e m a c r o p h a g e a s a p e r m i s s i v e c e l l f o r c y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n , r e p l i c a t i o n a n d l a t e n c y . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 4 4 , 3 4 9 - 3 5 9 . C A M E R O N , J . M . a n d P R E S T O N , C M . ( 1 9 8 1 ) . C o m p a r i s o n o f t h e i m m e d i a t e e a r l y p o l y p e p t i d e s o f h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s i s o l a t e s . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 5 4 , 4 2 1 - 4 2 4 . C H A N T L E R , J . K . ( 1 9 7 8 ) . T h e u s e o f h y p e r t o n i c i t y t o s e l e c t i v e l y i n h i b i t h o s t t r a n s l a t i o n i n m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s - i n f e c t e d c e l l s . V i r o l o g y 9 0 , 1 6 6 - 1 6 9 . C H A N T L E R , J . K . a n d H U D S O N , J . B . ( 1 9 7 8 ) . P r o t e i n s o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s : I d e n t i f i c a t i o n o f s t r u c t u r a l a n d n o n - s t r u c t u r a l a n t i g e n s i n i n f e c t e d c e l l s . V i r o l o g y 8 6 , 2 2 - 3 6 . C H A T T E R J E E , S . N . , F I A L A , M . , W E I N E R , J . , S T E W A R T , J . A . , S T A C E Y , B . a n d W A R N E R , N . ( 1 9 7 8 ) . P r i m a r y c y t o m e g a l o v i r u s a n d o p p o r t u n i s t i c i n f e c t i o n s . I n c i d e n c e i n r e n a l t r a n s p l a n t r e c i p i e n t s . J o u r n a l o f t h e A m e r i c a n M e d i c a l S o c i e t y 2 4 0 , 2 4 4 6 - 2 4 4 9 . C H E U N G , K . - S . a n d L A N G , D . J , ( 1 9 7 7 ) . D e t e c t i o n o f l a t e n t c y t o m e g a l o v i r u s i n m u r i n e s a l i v a r y a n d p r o s t a t e e x p l a n t c u l t u r e s a n d c e l l s . I n f e c t i o n a n d I m m u n i t y 1_5, 5 6 3 - 5 7 5 . C H E U N G , K . - S . , H U A N G , E . - S . a n d L A N G , D . J , ( 1 9 8 0 ) . M u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s : d e t e c t i o n o f l a t e n t i n f e c t i o n b y n u c l e i c a c i d h y b r i d i z a t i o n t e c h n i q u e . I n f e c t i o n a n d I m m u n i t y 2 7 , 8 5 1 - 8 5 4 . 1 9 8 C L E M E N T S , J . B . , W A T S O N , R . J . a n d W I L K I E , N . M . ( 1 9 7 7 ) . T e m p o r a l r e g u l a t i o n o f h e r p e s s i m p l e x v i r u s t y p e 1 t r a n s c r i p t i o n : L o c a t i o n o f t r a n s c r i p t s o n t h e v i r a l g e n o m e . C e l l 1_2, 2 7 5 - 2 8 5 . C O U R T N E Y , R . J . a n d B E N Y E S H - M E L N I C K , M . ( 1 9 7 4 ) . I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a l a r g e m o l e c u l a r w e i g h t p o l y p e p t i d e o f h e r p e s s i m p l e x v i r u s t y p e 1 . V i r o l o g y 7 5 , 3 0 6 - 3 1 8 . D E M A R C H I , J . M . ( 1 9 8 1 ) . Human c y t o m e g a l o v i r u s D N A : R e s t r i c t i o n e n z y m e c l e a v a g e m a p s a n d map l o c a t i o n s f o r i m m e d i a t e - e a r l y , e a r l y a n d l a t e R N A s . V i r o l o g y 1 1 4 , 2 3 - 3 8 D E M A R C H I , J . M . ( 1 9 8 3 a ) . P o s t - t r a n s c r i p t i o n a l c o n t r o l o f h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s g e n e e x p r e s s i o n . V i r o l o g y 1 2 4 , 3 9 0 - 4 0 2 . D E M A R C H I , J . M . ( 1 9 8 3 b ) . C o r r e l a t i o n b e t w e e n s t i m u l a t i o n o f h o s t c e l l DNA s y n t h e s i s b y h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s a n d l a c k o f e x p r e s s i o n o f a s u b s e t o f e a r l y v i r u s g e n e s . V i r o l o g y 1_J29, 2 7 4 - 2 8 6 . D E M A R C H I , J . M . ( 1 9 8 3 c ) . N a t u r e o f t h e b l o c k i n t h e e x p r e s s i o n o f s o m e e a r l y v i r u s g e n e s i n c e l l s a b o r t i v e l y i n f e c t e d w i t h H C M V . V i r o l o g y 1 2 9 , 2 8 7 - 2 9 7 . D E M A R C H I , J . M . a n d K A P L A N , A . S . ( 1 9 7 6 ) . R e p l i c a t i o n o f Human c y t o m e g a l o v i r u s D N A : L a c k o f d e p e n d e n c e o n c e l l DNA s y n t h e s i s . J o u r n a l o f V i r o l o g y ]_8, 1 0 6 3 - 1 0 7 0 . D E M A R C H I , J . M . a n d K A P L A N , A . S . ( 1 9 7 7 a ) . P h y s i c a l s t a t e o f h u m a n e m b r y o n i c l u n g c e l l s a f f e c t s t h e i r r e s p o n s e t o h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 2 3 , 1 2 6 - 1 3 2 . D E M A R C H I , J . M . a n d K A P L A N , A . S . ( 1 9 7 7 b ) . T h e r o l e o f d e f e c t i v e c y t o m e g a l o v i r u s p a r t i c l e s i n t h e i n d u c t i o n o f h o s t c e l l DNA s y n t h e s i s . V i r o l o g y 8 2 , 9 3 - 9 9 . D U T K O , F . J . a n d O L D S T O N E , M . B . A . ( 1 9 8 1 ) . C y t o m e g a l o v i r u s c a u s e s a l a t e n t i n f e c t i o n i n u n d i f f e r e n t i a t e d c e l l s a n d i s a c t i v a t e d b y i n d u c t i o n o f c e l l d i f f e r e n t i a t i o n . J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l M e d i c i n e 1 5 4 , 1 6 3 6 - 1 6 5 1 . E P S T E I N , A . L . a n d J A C Q U E M O N T , B . ( 1 9 8 3 ) . V i r u s p o l y p e p t i d e s y n t h e s i s i n d u c e d b y h e r p e s s i m p l e x v i r u s i n n o n - p e r m i s s i v e r a t XC c e l l s . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 6 4 . 1 4 9 9 - 1 5 0 8 . E S T E S , J . E . a n d H U A N G , E - S . ( 1 9 7 7 ) . S t i m u l a t i o n o f c e l l u l a r t h y m i d i n e k i n a s e b y h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 2 4 . 1 3 - 2 1 . F A R B E R , I . , W U T Z L E R , L . , S C H W E I Z E R , H . a n d S P R 0 S S I G , M . ( 1 9 7 9 ) . Human C y t o m e g a l o v i r u s i n d u c e d c h a n g e s i n r a b b i t c e l l s . A r c h i v e s o f V i r o l o g y 5 9 , 2 5 7 - 2 6 1 . F E L D M A N , L . T . , R I X 0 N , F . , J E A N , J . H . , B E N - P O R A T , T . a n d K A P L A N , A . S . ( 1 9 7 9 ) . T r a n s c r i p t i o n o f t h e g e n o m e o f p s e u d o r a b i e s v i r u s ( a h e r p e s v i r u s ) i s s t r i n g e n t l y c o n t r o l l e d . V i r o l o g y 9 7 . , 3 1 6 - 3 2 7 . 1 9 9 F I A L A , M . , H O N E S S , R .W. , H E I N E R , D . C , H E I N E , J . W . , M U R N A N E , J . , W A L L A C E , R. a n d G U Z E , L . B . ( 1 9 7 6 ) . C y t o m e g a l o v i r u s p r o t e i n s . I . P o l y p e p t i d e s o f v i r i o n s a n d d e n s e b o d i e s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 1_9, 2 4 3 - 2 5 4 . F I B I . M . , R I E H L E , H . , K E I L , G . , E B E L I N G - K E I L , A . a n d K O S Z I N O W S K I , U . ( 1 9 8 3 ) . I n v i t r o m o d e l o f a l a t e n t - h e r p e s v i r u s i n f e c t i o n . Z e n t r a l b l a t t f u r B a k t e r i o l o g i e , M i k r o b i o l o g i e u n d H y g i e n e . S e r i e A 25_7, 1 3 6 . F I O R E T T I , A . , F U R U K A W A , T . , S A N T O L I , D. a n d P L O T K I N , S . A . ( 1 9 7 3 ) . N o n - p r o d u c t i v e i n f e c t i o n o f g u i n e a p i g c e l l s w i t h h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s . J o u r n a l o f V i r o l o g y H. 9 9 8 - 1 0 0 3 . F R E E M A N , M . J . a n d P O W E L L , K . L . ( 1 9 8 2 ) . D N A - b i n d i n g p r o p e r t i e s o f a h e r p e s s i m p l e x v i r u s i m m e d i a t e e a r l y p r o t e i n . J o u r n a l o f V i r o l o g y 4 4 , 1 0 8 4 - 1 0 8 7 . F R I E F E L D , B . R . , L I C H Y , J . H . , F I E L O , J . , G R O N O S T A J K I , R . A . , G U G G E N H E I M E R , R . A . , K R E V O L I N , M . D . , N A G A T A , K . , H U R B W I T Z , J . a n d H O R W I T Z , M . S . ( 1 9 8 4 ) . T h e i n V i t r o r e p l i c a t i o n o f a d e n o v i r u s D N A . I n C u r r e n t t o p i c s i n M i c r o b i o l o g y a n d I m m u n o l o g y , V o l . 1 1 0 p p . 2 2 1 - 2 5 6 . E d i t e d b y W. D o e r f l e r . B e r l i n , S p r i n g e r - V e r l a g . F U R U K A W A , T . ( 1 9 7 9 ) . P e r s i s t e n t i n f e c t i o n w i t h h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s i n a l y m p h o b l a s t o i d c e l l l i n e . V i r o l o g y 9 4 , 2 1 4 - 2 1 8 . F U R U K A W A , T . , T A N A K A , S . a n d P L O T K I N , S . A . ( 1 9 7 5 ) . S t i m u l a t i o n o f m a c r o m o l e c u l a r s y n t h e s i s i n g u i n e a p i g c e l l s b y h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s . P r o c e e d i n g s o f t h e S o c i e t y o f E x p e r i m e n t a l B i o l o g y a n d M e d i c i n e 1 4 8 , 2 1 1 - 2 1 4 . G E R G E L Y , L . , C Z E G L E D Y , J . a n d V A C Z I , L . ( 1 9 8 0 ) . E a r l y n u c l e a r a n t i g e n a s D N A - b i n d i n g p r o t e i n s i n c y t o m e g a l o v i r u s - i n f e c t e d c e l l s . I n t e r v i r o l o g y 1 3 , 3 5 2 - 3 5 6 . G I B S O N , W. ( 1 9 8 1 ) . I m m e d i a t e - e a r l y p r o t e i n s o f h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s s t r a i n s AD 1 6 9 , D a v i s , a n d T o w n e d i f f e r i n e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y . V i r o l o g y V\2_, 3 5 0 - 3 5 4 . G I B S O N , W. ( 1 9 8 3 ) . P r o t e i n c o u n t e r p a r t s o f h u m a n a n d s i m i a n c y t o m e g a l o v i r u s e s . V i r o l o g y 1 2 8 , 3 9 1 - 4 0 6 . G I B S O N , W . , M U R P H Y , T . L . a n d R O B Y , C . ( 1 9 8 1 ) . C y t o m e g a l o v i r u s - i n f e c t e d c e l l s c o n t a i n a D N A - b i n d i n g p r o t e i n . V i r o l o g y 1 1 1 : 2 5 1 - 2 6 2 . G O D O W S K I , P . J . a n d K N I P E , D . M . ( 1 9 8 3 ) . M u t a t i o n s i n t h e m a j o r D N A - b i n d i n g p r o t e i n g e n e o f h e r p e s s i m p l e x v i r u s t y p e I r e s u l t i n i n c r e a s e d l e v e l s o f v i r a l g e n e e x p r e s s i o n . J o u r n a l o f V i r o l o g y 4 7 , 4 7 8 - 4 8 6 . G O N C Z O L , E . , A N D R E W S , P . W . a n d P L O T K I N , S . A . ( 1 9 8 4 ) . C y t o m e g a l o v i r u s r e p l i c a t e s i n d i f f e r e n t i a t e d b u t n o t i n u n d i f f e r e n t i a t e d h u m a n e m b r y o n a l c e l l s . S c i e n c e 2 2 4 , 1 5 9 - 1 6 1 . G R O N O S T A J S K I , R . M . , N A G A T A , K . a n d H U R W I T Z , J . ( 1 9 8 4 ) . I s o l a t i o n o f h u m a n DNA s e q u e n c e s t h a t b i n d t o n u c l e a r f a c t o r I , a h o s t p r o t e i n i n v o l v e d i n a d e n o v i r u s DNA r e p l i c a t i o n . P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s , U . S . A . 8J_, 4 0 1 3 - 4 0 1 7 . 2 0 0 G U P T A , P . , S T . J E O R , S . a n d R A P P , F . ( 1 9 7 7 ) . C o m p a r i s o n o f t h e p o l y p e p t i d e s o f s e v e r a l s t r a i n s o f h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 3 4 , 4 4 7 - 4 5 4 . H A Y , R . T . a n d H A Y , J . ( 1 9 8 0 ) . P r o p e r t i e s o f h e r p e s v i r u s - i n d u c e d i m m e d i a t e e a r l y p o l y p e p t i d e s . V i r o l o g y 1_04, 2 3 0 - 2 3 4 . H O , M . ( 1 9 8 2 ) . C y t o m e g a l o v i r u s , b i o l o g y a n d i n f e c t i o n p p . 3 0 9 . ( C u r r e n t t o p i c s i n i n f e c t i o u s d i s e a s e : s e r i e s e d i t o r s , G r e e n o u g h , W . B . a n d M e r i g a n , T . C . ) New Y o r k , P l e n u m P r e s s . H O N E S S , R . W . a n d R O I Z M A N , B . ( 1 9 7 4 ) . R e g u l a t i o n o f h e r p e s v i r u s m a c r o m o l e c u l a r s y n t h e s i s I . C a s c a d e r e g u l a t i o n o f t h e s y n t h e s i s o f t h r e e g r o u p s o f v i r a l p r o t e i n s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 1_4, 8 - 1 9 . H O N E S S , R . W . a n d R O I Z M A N , B . ( 1 9 7 5 ) . R e g u l a t i o n o f h e r p e s v i r u s m a c r o m o l e c u l a r s y n t h e s i s : s e q u e n t i a l t r a n s i t i o n o f p o l y p e p t i d e s y n t h e s i s r e q u i r e s f u n c t i o n a l v i r a l p o l y p e p t i d e s . P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s , U . S . A . , 7 2 , 1 2 7 6 - 1 2 8 0 . H U A N G , E . - S . ( 1 9 7 5 ) . Human c y t o m e g a l o v i r u s . I I I . V i r u s - i n d u c e d DNA p o l y m e r a s e . J o u r n a l o f V i r o l o g y 1_6, 2 9 8 - 3 1 0 . H U A N G , E . - S . a n d P A G A N 0 , J . S . ( 1 9 7 4 ) . Human c y t o m e g a l o v i r u s . I I . L a c k o f r e l a t e d n e s s t o DNA o f h e r p e s s i m p l e x I a n d I I , E p s t e i n - B a r r v i r u s a n d n o n h u m a n s t r a i n s o f c y t o m e g a l o v i r u s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 1_3, 6 4 2 - 6 4 5 . H U A N G , E . - S . , K I L P A T R I C K , B . A . , H U A N G , Y - T . a n d P A G A N 0 , J . S . ( 1 9 7 6 ) . D e t e c t i o n o f h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s a n d a n a l y s i s o f s t r a i n v a r i a t i o n . Y a l e J o u r n a l o f B i o l o g y a n d M e d i c i n e 4 9 , 2 9 - 4 3 . H U A N G . E . - S . , A L F 0 R D , C . A . , R E Y N O L D S , D . W . , S T A G N 0 , S . a n d P A S S , R . F . ( 1 9 8 0 ) . M o l e c u l a r e p i d e m i o l o g y o f c y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n s i n w o m e n a n d t h e i r i n f a n t s . New E n g l a n d J o u r n a l o f M e d i c i n e 3 0 3 , 9 5 8 - 9 6 2 . H U D S O N , J I B . ( 1 9 7 9 ) . T h e m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s a s a m o d e l f o r t h e s t u d y o f v i r a l p a t h o g e n e s i s a n d p e r s i s t e n t i n f e c t i o n s . A r c h i v e s o f V i r o l o g y 6 2 , 1 - 2 9 . H U D S O N , J . B . ( 1 9 8 4 ) . F a c t o r s i n v o l v e d i n p e r s i s t e n t m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n s - A r e v i e w . I n L a t e n t h e r p e s v i r u s i n f e c t i o n s i n v e t e r i n a r y m e d i c i n e , p p . 1 2 7 - 1 4 7 . E d i t e d b y G . W i t t m a n n , R . M . G a s k e l l & H . - J . R z i h a . T h e H a g u e : M a r t i n u s N i j h o f f . ' H U D S O N , J . B . , M I S R A , V . M . a n d M 0 S M A N N , T . R . ( 1 9 7 6 ) . P r o p e r t i e s o f t h e m u l t i c a p s i d v i r i o n s o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s . V i r o l o g y 7 2 , 2 3 5 - 2 4 3 . H U D S O N , J . B . , L 0 H , L . , M I S R A , V . M . , J U D D , B . a n d S U Z U K I , J . ( 1 9 7 8 ) . M u l t i p l e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s a n d l y m p h o i d c e l l s i n v i t r o . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 3 7 , 1 4 9 - 1 5 9 . H U D S O N , J . B . , C H A N T L E R , J . K . , L 0 H , L . , M I S R A , V . M . , a n d M U L L E R , M . T . ( 1 9 7 9 ) . M o d e l s y s t e m s f o r a n a l y s i s o f l a t e n t c y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n s . C a n a d i a n J o u r n a l o f M i c r o b i o l o g y 2 5 , 2 4 5 - 2 5 3 . 2 0 1 I H A R A , S . , S A I T O , S . a n d W A T A N A B E , Y . ( 1 9 8 2 ) . S u p p r e s s i o n o f f i b r o n e c t i n s y n t h e s i s b y a n e a r l y f u n c t i o n o f h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 5 9 , 4 0 9 - 4 1 3 . J A C Q U E M O N T , B . , V E R R I E R , B . E P S T E I N , A . L . a n d M A C H U C A , I . ( 1 9 8 4 ) . E x p r e s s i o n o f i m m e d i a t e - e a r l y g e n e s i n h e r p e s s i m p l e x v i r u s t y p e 1 - i n f e c t e d XC c e l l s : L a c k o f I C P 2 2 ( 6 8 K ) p o l y p e p t i d e . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 6 5 , 1 3 3 1 - 1 3 4 0 . J A H N , G . , K N U S T , E . , S C H M O L L A , H . , S A R R E , T . , N E L S O N , J . A . , M C D O U G A L L , J . K . a n d F L E C K E N S T E I N , B . ( 1 9 8 4 ) . P r e d o m i n a n t i m m e d i a t e - e a r l y t r a n s c r i p t s o f h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s AD 1 6 9 . J o u r n a l o f V i r o l o g y 4 9 , 3 6 3 - 3 7 0 . J E A N G , K - T . a n d G I B S O N , W. ( 1 9 8 0 ) . A c y c l o h e x i m i d e e n h a n c e d p r o t e i n i n c y t o m e g a l o v i r u s - i n f e c t e d c e l l s . V i r o l o g y 1 0 7 , 3 6 2 - 3 7 4 . J E A N G , K - H . , C H I N , G . a n d HAYWARO, G . S . ( 1 9 8 2 ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o f c y t o m e g a l o v i r u s i m m e d i a t e - e a r l y g e n e s . 1 . N o n - p e r m i s s i v e r o d e n t c e l l s o v e r p r o d u c e t h e I E 9 4 K p r o t e i n f r o m CMV ( C o l b u r n ) . V i r o l o g y 1 2 1 , 3 9 3 - 4 0 3 . J O R D A N , M . C . ( 1 9 8 3 ) . L a t e n t i n f e c t i o n a n d t h e e l u s i v e c y t o m e g a l o v i r u s . R e v i e w o f I n f e c t i o u s D i s e a s e s 5 , 2 0 5 - 2 1 5 . J O R D A N , M . C . a n d M A R , V . L . ( 1 9 8 2 ) . S p o n t a n e o u s a c t i v a t i o n o f l a t e n t c y t o m e g a l o v i r u s f r o m m u r i n e s p l e e n e x p l a n t s . R o l e o f l y m p h o c y t e s a n d m a c r o p h a g e s i n r e l e a s e a n d r e p l i c a t i o n o f v i r u s . J o u r n a l o f C l i n i c a l I n v e s t i g a t i o n 7 0 , 7 6 2 - 7 6 8 . J O R D A N , M . C . , S H A N L E Y , J . D . a n d S T E V E N S , J . G . ( 1 9 7 7 ) . I m m u n o s u p p r e s s i o n r e a c t i v a t e s a n d d i s s e m i n a t e s l a t e n t m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 3 7 , 4 1 9 - 4 2 3 . J O R D A N , M . C , T A K A G I , J . L . a n d S T E V E N S , J . G . ( 1 9 8 2 ) . A c t i v a t i o n o f l a t e n t m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s i_n v i v o a n d j_n v i t r o : a p a t h o g e n e t i c r o l e f o r a c u t e i n f e c t i o n . J o u r n a l o f I n f e c t i o u s D i s e a s e s 1 4 5 , 6 9 9 - 7 0 5 . K A M A T A , T . , T A N A K A , S . a n d W A T A N A B E , Y . ( 1 9 7 8 ) . Human c y t o m e g a l o v i r u s - i n d u c e d c h r o m a t i n f a c t o r s r e s p o n s i b l e f o r c h a n g e s i n t e m p l a t e a c t i v i t y a n d s t r u c t u r e o f i n f e c t e d c e l l c h r o m a t i n . V i r o l o g y 9 0 , 1 9 7 - 2 0 8 . K A M A T A , T . , T A N A K A , S . a n d W A T A N A B E , Y . ( 1 9 7 9 ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s - i n d u c e d c h r o m a t i n f a c t o r r e s p o n s i b l e f o r a c t i v a t i o n o f h o s t c e l l c h r o m a t i n t e m p l a t e . V i r o l o g y 9 7 , 2 2 4 - 2 2 8 . K A T Z E N S T E I N , D . A . , Y U , G . S . M . a n d J O R D A N , M . C . ( 1 9 8 3 ) . L e t h a l i n f e c t i o n w i t h m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s a f t e r e a r l y v i r a l r e p l i c a t i o n i n t h e s p l e e n . J o u r n a l o f I n f e c t i o u s D i s e a s e s 1 4 8 , 4 0 6 - 4 1 1 . K E I L , G . M . , E B E L I N G - K E I L , A . a n d K O S Z I N O W S K I , U . H . ( 1 9 8 4 ) . T e m p o r a l r e g u l a t i o n o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s t r a n s c r i p t i o n a n d m a p p i n g o f v i r a l RNA s y n t h e s i z e d a t i m m e d i a t e e a r l y t i m e s a f t e r i n f e c t i o n . J o u r n a l o f V i r o l o g y 5 0 , 7 8 4 - 7 9 5 . 2 0 2 K E I L , G . M . , F I B I , M . a n d K 0 S Z I N 0 W S K I , U . H . ( 1 9 8 5 ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e m a j o r i m m e d i a t e - e a r l y p o l y p e p t i d e s e n c o d e d b y m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 5 4 , 4 2 2 - 4 2 8 . K I M , K . S . a n d C A R P , R . I . ( 1 9 7 1 ) . G r o w t h o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s i n v a r i o u s c e l l l i n e s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 7 , 7 2 0 - 7 2 5 . K I M , K . S . a n d C A R P , R . I . ( 1 9 7 2 ) . A b o r t i v e i n f e c t i o n o f h u m a n d i p l o i d c e l l s b y m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s . I n f e c t i o n a n d I m m u n i t y 6 , 7 9 3 - 7 9 7 . K I M , K . S . , S A P I E N Z A , V . , C A R P , R . I . a n d MOON, H . M . ( 1 9 7 6 a ) . A n a l y s i s o f s t r u c t u r a l p o l y p e p t i d e s o f p u r i f i e d h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 2 0 , 6 0 4 - 6 1 1 . K I M , K . S . , S A P I E N Z A , V . , C A R P , R . I . a n d MOON, H . M . ( 1 9 7 6 b ) . A n a l y s i s o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s o f p u r i f i e d m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 1 7 , 9 0 6 - 9 1 5 . K L A U N I G , J . E . , G O L D B L A T T , P . J . , H I N T O N . D . E . , L I P S K Y . M . M . , C H A C K O , J . a n d T R U M P . B . F . ( 1 9 8 1 ) . M o u s e l i v e r c e l l c u l t u r e 1 . H e p a t o c y t e i s o l a t i o n . I n v i t r o 1 1 . 9 1 3 - 9 2 5 K N I P E , O . M . , Q U I N L A N , M . P . a n d S P A N G , A . E . ( 1 9 8 2 ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t w o c o n f o r m a t i o n a l f o r m s o f t h e m a j o r D N A - b i n d i n g p r o t e i n s e n c o d e d b y h e r p e s s i m p l e x v i r u s t y p e 1 . J o u r n a l o f V i r o l o g y 4 4 , 7 3 6 - 7 4 1 . L A E M M L I , U . K . ( 1 9 7 0 ) . C l e a v a g e o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s d u r i n g t h e a s s e m b l y o f t h e h e a d o f b a c t e r i o p h a g e T 4 . N a t u r e ( L o n d p n ) 2 2 7 , 6 8 0 - 6 8 5 . L A F E M I N A , R . L . a n d H A Y W A R D , G . S . ( 1 9 8 0 ) . S t r u c t u r a l o r g a n i z a t i o n o f t h e DNA m o l e c u l e s f r o m h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s . I n A n i m a l C e l 1 G e n e t i c s , p p . 3 9 - 5 5 . E d i t e d b y R . J a e n i s c h , C . F i e l d s a n d C F . F o x . I C N - U C L A S y m p o s i u m , A c a d e m i c P r e s s . L A F E M I N A , R . L . a n d H A Y W A R D , G . S . ( 1 9 8 3 ) . R e p l i c a t i v e f o r m s o f h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s DNA w i t h j o i n e d t e r m i n i a r e f o u n d i n p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d h u m a n c e l l s b u t n o t i n n o n - p e r m i s s i v e B a l b / c - 3 T 3 m o u s e c e l l s . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 6 4 , 3 7 3 - 3 8 9 . L E E , C K . AND K N I P E , D . M . ( 1 9 8 3 ) . T h e r m o l a b i l e i n v i v o D N A - b i n d i n g a c t i v i t y a s s o c i a t e d w i t h a p r o t e i n e n c o d e d b y m u t a n t s o f h e r p e s s i m p l e x v i r u s t y p e 1 . J o u r n a l o f V i r o l o g y 4 6 , 9 0 9 - 9 1 9 . L E I N B A C H , S . S . a n d C A S T O , J . F . ( 1 9 8 3 ) . I d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f d e o x y r i b o n u c l e o p r o t e i n c o m p l e x e s c o n t a i n i n g t h e m a j o r D N A - b i n d i n g p r o t e i n o f h e r p e s s i m p l e x v i r u s t y p e 1 . V i r o l o g y 1 3 1 , 2 7 4 - 2 8 6 . L I T T L E R , E . Y E O , J . , K I L L I N G T O N . R . A . , P U R I F O Y , D . J . M . a n d P O W E L L , K . L . ( 1 9 8 1 ) . A n t i g e n i c a n d s t r u c t u r a l c o n s e r v a t i o n o f h e r p e s v i r u s D N A - b i n d i n g p r o t e i n s . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 5 6 , 4 0 9 - 4 1 9 . L O C K E R , H.. a n d F R E N K E L , N . ( 1 9 7 9 ) . S t r u c t u r e a n d o r i g i n o f d e f e c t i v e g e n o m e s c o n t a i n e d i n s e r i a l l y p a s s a g e d h e r p e s s i m p l e x v i r u s t y p e 1 ( J u s t i n ) . J o u r n a l o f V i r o l o g y 2 9 , 1 0 6 5 - 1 0 7 7 . 2 0 3 L O H , L . a n d H U D S O N , J . B . ( 1 9 7 9 ) . I n t e r a c t i o n o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s w i t h s e p a r a t e d p o p u l a t i o n s o f s p l e e n c e l l s . I n f e c t i o n a n d I m m u n i t y 2 6 , 8 5 3 - 8 6 0 . L O M N I C Z I , B . , W A T A N A B E , S . , B E N - P O R A T , T . a n d K A P L A N , A . S . ( 1 9 8 4 ) . G e n e t i c b a s i s o f t h e n e u r o v i r u l e n c e o f p s e u d o r a b i e s v i r u s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 5 2 , 1 9 8 - 2 0 5 . M A R K E R , S . C , HOWARD, R . J . , S I M M O N S , R . L . , K A L I S , J . M . , C O N N E L L Y , D . P . , N A J A R I A N , J . S . a n d B A L F O U R , H . H . ( 1 9 8 1 ) . C y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n : A q u a n t i t a t i v e p r o s p e c t i v e s t u d y o f 3 2 0 c o n s e c u t i v e r e n a l t r a n s p l a n t s . S u r g e r y 8 9 , 6 6 0 - 6 7 1 . M A R K S , J . R . a n d S P E C T O R , D . H . ( 1 9 8 4 ) . F u s i o n o f t h e t e r m i n i o f t h e m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s g e n o m e a f t e r i n f e c t i o n . J o u r n a l o f V i r o l o g y 5 2 . , 2 4 - 2 8 . M A R K S , J . R . , M E R C E R , J . A . a n d S P E C T O R , D . H . ( 1 9 8 3 ) . T r a n s c r i p t i o n i n m o u s e e m b r y o c e l l s p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d b y m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s . V i r o l o g y 1 3 1 , 2 4 7 - 2 5 4 . M A T T H E W S , R . E . F . ( 1 9 8 2 ) . C l a s s i f i c a t i o n a n d n o m e n c l a t u r e o f v i r u s e s . I n t e r v i r o l o g y 17. , 1 - 1 8 1 . MCDONOUGH, S . H . a n d S P E C T O R , D . H . ( 1 9 8 3 ) . T r a n s c r i p t i o n i n h u m a n f i b r o b l a s t s p e r m i s s i v e l y i n f e c t e d b y h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s s t r a i n AD 1 6 9 . V i r o l o g y 1 2 5 , 3 1 - 4 6 . M E R C E R , J . A . , M A R K S , J . R . a n d S P E C T O R , D . H . ( 1 9 8 3 ) . M o l e c u l a r c l o n i n g a n d r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e m a p p i n g o f t h e m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s g e n o m e ( S m i t h s t r a i n ) . V i r o l o g y 1 2 9 , 9 4 - 1 0 6 . M I C H E L S O N , S . f H O R O D N I C E A N U , F . , K R E S S , M . a n d T A R D Y - P A N I T , M . ( 1 9 7 9 ) . Human c y t o m e g a l o v i r u s - i n d u c e d i m m e d i a t e - e a r l y a n t i g e n s : A n a l y s i s i n s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s a f t e r i m m u n o p r e c i p i t a t i o n . J o u r n a l o f V i r o l o g y 3 2 , 2 5 9 - 2 6 7 . M I M S , C A . a n d G O U L D , J . ( 1 9 7 8 ) . T h e r o l e o f m a c r o p h a g e s i n m i c e i n f e c t e d w i t h m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 4J_, 1 4 3 - 1 5 3 . M I S R A , V . a n d H U D S O N , J . B . ( 1 9 8 0 ) . M i n o r b a s e s e q u e n c e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e g e n o m e s o f t w o s t r a i n s o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s e s d i f f e r i n g i n v i r u l e n c e . A r c h i v e s o f V i r o l o g y 6 4 , 1 - 8 . M I S R A , V . , B L U M E N T H A L , R . M . a n d B A B I U K , L . A . ( 1 9 8 1 ) . P r o t e i n s s p e c i f i e d b y b o v i n e h e r p e s v i r u s 1 ( I n f e c t i o u s b o v i n e r h i n o t r a c h e i t i s v i r u s ) . J o u r n a l o f V i r o l o g y 4 0 , 3 6 7 - 3 7 8 . M I S R A , V . , M U L L E R , M . T . , C H A N T L E R , J . K . a n d H U D S O N , J . B . ( 1 9 7 8 ) R e g u l a t i o n o f m u r i n e C y t o m e g a l o v i r u s g e n e e x p r e s s i o n 1 . T r a n s c r i p t i o n d u r i n g p r o d u c t i v e i n f e c t i o n . J o u r n a l o f V i r o l o g y 2 7 , 2 6 3 - 2 6 8 M O C A R S K I , E . S . a n d S T I N S K I , M . F . ( 1 9 7 9 ) . P e r s i s t e n c e o f t h e c y t o m e g a l o v i r u s g e n o m e i n h u m a n c e l l s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 31_, 7 6 1 - 7 7 5 . 2 0 4 MOON, H . M . , S A P I E N Z A , V . J . , C A R P , R . I . a n d K I M , K . S . ( 1 9 7 6 ) . DNA s y n t h e s i s i n m o u s e e m b r y o f i b r o b l a s t c e l l s i n f e c t e d w i t h m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s . V i r o l o g y 7 5 , 3 7 6 - 3 8 3 . MOON, H . M . , S A P I E N Z A , V . J . , C A R P , R . I . a n d K I M , K . S . ( 1 9 7 9 ) . M u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s - i n d u c e d p r o t e i n s y n t h e s i s . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 4 2 , 1 5 9 - 1 6 9 . M O S M A N N , T . R . a n d H U D S O N , J . B . ( 1 9 7 3 ) . S o m e p r o p e r t i e s o f t h e g e n o m e o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s . V i r o l o g y 5 4 , 1 3 5 - 1 4 9 . M U L L E R , M . T . a n d H U D S O N , J . B . ( 1 9 7 7 a ) . C e l l c y c l e d e p e n d e n c y o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s r e p l i c a t i o n i n s y n c h r o n i z e d 3 T 3 c e l l s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 2 2 , 2 6 7 - 2 7 2 . M U L L E R , M . T . a n d H U D S O N , J . B . ( 1 9 7 7 b ) . T h y m i d i n e k i n a s e a c t i v i t y i n m o u s e 3 T 3 c e l l s i n f e c t e d b y m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s ( M C V ) . V i r o l o g y 8 0 , 4 3 0 - 4 3 3 . M U L L E R , M . T . a n d H U D S O N , J . B . ( 1 9 7 8 ) . M u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s DNA s y n t h e s i s i n n u c l e a r m o n o l a y e r s . V i r o l o g y 8 8 , 3 7 1 - 3 7 8 . M U L L E R , M . T . , M I S R A , V . , C H A N T L E R , J . K . a n d H U D S O N , J . B . ( 1 9 7 8 ) . M u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s g e n e e x p r e s s i o n d u r i n g n o n - p r o d u c t i v e i n f e c t i o n i n Go p h a s e 3 T 3 c e l l s . V i r o l o g y 9 0 , 2 7 9 - 2 8 7 . M U S I A N I , M . , Z E R B I N I , M . , L A N D I N I , M . P . a n d LA P L A C A , M . ( 1 9 7 9 ) . P r e l i m i n a r y e v i d e n c e t h a t c y t o m e g a l o v i r u s - i n d u c e d i m m e d i a t e e a r l y a n t i g e n s a r e D N A - b i n d i n g p r o t e i n s . M i c r o b i o l o g i c a 2 , 2 8 1 - 2 8 7 . N A G A T A , K . , G U G G E N H E I M E R , R . A . a n d H U R W I T Z , J . ( 1 9 8 3 ) . S p e c i f i c b i n d i n g o f a c e l l u l a r DNA r e p l i c a t i o n p r o t e i n t o t h e o r i g i n o f r e p l i c a t i o n o f a d e n o v i r u s D N A . P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s , U . S . A . 8 0 , 6 1 7 7 - 6 1 8 1 . N A R A Q I , S . , J A C K S O N , G . G . , J O N A S S O N , 0 . a n d Y A M A S H I R O Y A , H . M . ( 1 9 7 7 ) P r o s p e c t i v e s t u d y o f p r e v a l e n c e , i n c i d e n c e a n d s o u r c e o f h e r p e s v i r u s i n f e c t i o n s i n p a t i e n t s w i t h r e n a l a l l o g r a f t s . J o u r n a l o f I n f e c t i o u s D i s e a s e s 1 3 6 , 5 3 1 - 5 4 0 . N E D R U D , J . D . , P A G A N O , J . S . a n d C O L L I E R , A . M . ( 1 9 8 2 ) . L o n g t e r m m o u s e c y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n o f t r a c h e a l o r g a n c u l t u r e : R e l a t i o n t o h o s t c e l l r e p l i c a t i o n . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 6 0 , 2 4 7 - 2 5 9 . N E I M A N . P . E . , R E E V E S , W . , R A Y , G . , F L O U R N O Y , N . , L E R N E R , K . G . , S A L E , G . E . a n d T H O M A S , E . D . ( 1 9 7 7 ) . A p r o s p e c t i v e a n a l y s i s o f i n t e r s t i t i a l p n e u m o n i a a n d o p p o r t u n i s t i c v i r a l i n f e c t i o n a m o n g r e c i p i e n t s o f a l l o g e n e i c b o n e m a r r o w g r a f t s . J o u r n a l o f I n f e c t i o u s D i s e a s e s 1 3 6 , 7 5 4 - 7 6 7 . N O T A R I A N N I , E . L . , a n d P R E S T O N , C M . ( 1 9 8 2 ) . A c t i v a t i o n o f c e l l u l a r s t r e s s p r o t e i n g e n e s b y h e r p e s s i m p l e x v i r u s t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e m u t a n t s w h i c h o v e r p r o d u c e i m m e d i a t e e a r l y p o l y p e p t i d e s . V i r o l o g y 1_23, 1 1 3 - 1 2 2 . 2 0 5 O ' F A R R E L L , P . Z . , GOODMAN, H . M . a n d O ' F A R R E L L , P . H . ( 1 9 7 7 ) . H i g h r e s o l u t i o n t w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s o f b a s i c a s w e l l a s a c i d i c p r o t e i n s . C e l l 1 2 , 1 1 3 3 - 1 1 4 1 . O ' H A R E , P . a n d H A Y W A R D , G . S . ( 1 9 8 5 ) . E v i d e n c e f o r a d i r e c t r o l e f o r b o t h t h e 1 7 5 , 0 0 0 - a n d 1 1 0 , 0 0 0 - m o l e c u l a r w e i g h t i m m e d i a t e - e a r l y p r o t e i n s o f h e r p e s s i m p l e x v i r u s i n t h e t r a n s a c t i v a t i o n o f d e l a y e d - e a r l y p r o m o t e r s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 5 3 , 7 5 1 - 7 6 0 . O L D I N G , L . B . , J E N S E N , F . C . a n d O L D S T O N E , M . B . A . ( 1 9 7 5 ) . P a t h o g e n e s i s o f c y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n . I . A c t i v a t i o n o f v i r u s f r o m b o n e m a r r o w - d e r i v e d l y m p h o c y t e s b y i n . v i t r o a l l o g e n i c r e a c t i o n . J o u r n a l o f E x p e r i m e n t a l M e d i c i n e 1 4 1 , 5 6 1 - 5 7 2 . O L D I N G , L . B . , K I N G S B U R Y , D . T . a n d O L D S T O N E , M . B . A . ( 1 9 7 6 ) . P a t h o g e n e s i s o f c y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n . D i s t r i b u t i o n o f v i r a l p r o d u c t s , i m m u n e c o m p l e x e s a n d a u t o i m m u n i t y d u r i n g l a t e n t m u r i n e i n f e c t i o n . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 3 3 , 2 6 7 - 2 8 0 . O W E N S , R . B . , S M I T H , H . S . a n d H A C K E T T , A . J . ( 1 9 7 4 ) . E p i t h e l i a l c e l l c u l t u r e s f r o m n o r m a l g l a n d u l a r t i s s u e o f m i c e . J o u r n a l o f t h e N a t i o n a l C a n c e r I n s t i t u t e 5 3 , 2 6 1 - 2 6 7 . P A S S , R . F . , L O N G , W . K . , W H I T L E Y , R . J . , S O O N G , S . J . , D I E T H E L M , A . G . , R E Y N O L D S , D . W . a n d A L F O R D , C A . ( 1 9 7 5 ) P r o d u c t i v e i n f e c t i o n w i t h c y t o m e g a l o v i r u s a n d h e r p e s s i m p l e x v i r u s i n r e n a l t r a n s p l a n t r e c i p i e n t s : R o l e o f s o u r c e o f k i d n e y . J o u r n a l o f I n f e c t i o u s D i s e a s e s 1 3 7 , 5 5 6 - 5 6 3 . P A T T E N G A L E , P . K . , S M I T H , R . W . a n d G E R B E R . P . ( 1 9 7 4 ) . B - c e l l c h a r a c t e r i s t i c s o f h u m a n p e r i p h e r a l a n d c o r d b l o o d l y m p h o c y t e s t r a n s f o r m e d b y E p s t e i n - B a r r v i r u s . J o u r n a l o f t h e N a t i o n a l C a n c e r I n s t i t u t e 5J2, 1 0 8 1 - 1 0 8 6 . P E N M A N , S . ( 1 9 6 6 ) . RNA m e t a b o l i s m i n H e L a c e l l n u c l e u s . J o u r n a l o f M o l e c u l a r B i o l o g y 1_7, 1 1 7 - 1 3 4 . P E R E I R A , L . , W O L F F , M . , F E N W I C K , M . a n d R O I Z M A N , B . ( 1 9 7 7 ) . R e g u l a t i o n o f h e r p e s v i r u s s y n t h e s i s . V . P r o p e r t i e s o f a p o l y p e p t i d e s s p e c i f i e d b y H S V - 1 a n d H S V - 2 . V i r o l o g y 7 7 . 7 3 3 - 7 4 8 . P E R S S O N , R . H . , B A C C H E T T I , S . a n d S M I L E Y , J . R . ( 1 9 8 5 ) . C e l l s t h a t c o n s t i t u t i v e l y e x p r e s s t h e h e r p e s s i m p l e x v i r u s i m m e d i a t e - e a r l y p r o t e i n I C P 4 a l l o w e f f i c i e n t a c t i v a t i o n o f v i r a l d e l a y e d - e a r l y g e n e s i n t r a n s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 5 4 , 4 1 4 - 4 2 1 . P E T E R S O N , P . K . , B A L F O U R , H . H . , M A R K E R . S . C , F R Y D , D . S . , HOWARD, R . J . a n d S I M M O N S , R . L . ( 1 9 8 0 ) . C y t o m e g a l o v i r u s d i s e a s e i n r e n a l a l l o g r a f t r e c i p i e n t s : A p r o s p e c t i v e s t u d y o f t h e c l i n i c a l f e a t u r e s , r i s k f a c t o r s a n d i m p a c t o n r e n a l t r a n s p l a n t a t i o n . M e d i c i n e 5 9 , 2 8 3 - 3 0 0 . P L U M M E R , G . a n d G O O D H E A R T , C R . ( 1 9 7 4 ) . G r o w t h o f m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s i n a h e t e r o l o g o u s c e l l s y s t e m a n d i t s e n h a n c e m e n t b y 5 - I o d o - 2 - D e o x y r u r i d i n e . I n f e c t i o n a n d I m m u n i t y l f J , 2 5 1 - 2 5 6 . 2 0 6 P 0 D U S L 0 , J . F . a n d R O D B A R D , D. ( 1 9 8 0 ) . M o l e c u l a r w e i g h t e s t i m a t i o n u s i n g s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e - p o r e g r a d i e n t e l e c t r o p h o r e s i s . A n a l y t i c a l B i o c h e m i s t r y 1 0 1 , 3 9 1 - 4 0 6 . P O W E L L , K . L . a n d P U R I F O Y , O . J . M . ( 1 9 7 7 ) . N o n - s t r u c t u r a l p r o t e i n s o f h e r p e s s i m p l e x v i r u s . 1 . P u r i f i c a t i o n o f t h e i n d u c e d DNA p o l y m e r a s e . J o u r n a l o f V i r o l o g y 2 4 , 6 1 8 - 6 2 6 . P O W E L L , K . L . , L I T T L E R , E . a n d P U R I F O Y , D . J . M . ( 1 9 8 1 ) . N o n s t r u c t u r a l p r o t e i n s o f h e r p e s s i m p l e x v i r u s I I . M a j o r v i r u s - s p e c i f i c D N A - b i n d i n g p r o t e i n . J o u r n a l o f V i r o l o g y 3 9 , 8 9 4 - 9 0 2 . P R E S T O N , C M . ( 1 9 7 9 a ) . C o n t r o l o f h e r p e s s i m p l e x v i r u s t y p e 1 mRNA s y n t h e s i s i n c e l l s i n f e c t e d w i t h w i l d - t y p e v i r u s o r t h e t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e m u t a n t t s K . J o u r n a l o f V i r o l o g y 2 4 , 2 7 5 - 2 8 4 . P R E S T O N , C M . ( 1 9 7 9 b ) . A b n o r m a l p r o p e r t i e s o f a n i m m e d i a t e e a r l y p o l y p e p t i d e i n c e l l s i n f e c t e d w i t h h e r p e s s i m p l e x v i r u s t y p e 1 m u t a n t t s K . J o u r n a l o f V i r o l o g y 3 2 , 2 5 7 - 2 6 9 . P R I N C E , A . M . , S Z M U N E S S , W . , M I L L I A N , S . J . a n d D A V I D , D . S . ( 1 9 7 1 ) . A s e r o l o g i c s t u d y o f c y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n s a s s o c i a t e d w i t h b l o o d t r a n s f u s i o n s . New E n g l a n d J o u r n a l o f M e d i c i n e 2 8 4 , 1 1 2 5 - 1 1 3 1 . P R I T C H E T T , R . F . ( 1 9 8 0 ) . DNA n u c l e o t i d e s e q u e n c e h e t e r o g e n e i t y b e t w e e n t h e T o w n e a n d A D 1 6 9 s t r a i n s o f c y t o m e g a l o v i r u s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 3 6 , 1 5 2 - 1 6 1 . P U R I F O Y , D . J . M . a n d P O W E L L , K . L . ( 1 9 7 6 ) . D N A - b i n d i n g p r o t e i n s i n d u c e d b y h e r p e s s i m p l e x v i r u s t y p e 2 i n H e p - 2 c e l l s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 1_9, 7 1 7 - 7 3 1 . R E D D E H A S E , M . J . a n d K O S Z I N O W S K I , U . H . ( 1 9 8 4 ) . S i g n i f i c a n c e o f h e r p e s v i r u s i m m e d i a t e e a r l y g e n e e x p r e s s i o n i n c e l l u l a r i m m u n i t y t o c y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n . N a t u r e ( L o n d o n ) 3 1 2 , 3 6 9 - 3 7 1 . R E Y N O L D S , D . W . , S T A G N O , S . , S T U B B S . G . , D A H L E , A . J . , L I V I N G S T O N , M . M . , S A X O N , S . S . a n d A L F O R D , C A . ( 1 9 7 4 ) . I n a p p a r e n t c o n g e n i t a l c y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n w i t h e l e v a t e d c o r d I g M l e v e l s . New E n g l a n d J o u r n a l o f M e d i c i n e 2 9 0 , 2 9 1 - 2 9 6 . R I C E , G . P . A . , S C H R I E R , R . D . a n d O L D S T O N E , M . B . A . ( 1 9 8 4 ) . C y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t s h u m a n l y m p h o c y t e s a n d m o n o c y t e s : V i r u s e x p r e s s i o n i s r e s t r i c t e d t o i m m e d i a t e - e a r l y g e n e p r o d u c t s . P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s , U . S . A . 8J_, 6 1 3 4 - 6 1 3 8 . R I N A L D O , C . R . , C A R N E Y , W . P . , R I C H T E R , B . S , B L A C K , P . H . a n d H I R S C H , M . S . ( 1 9 8 0 ) . M e c h a n i s m s o f i m m u n o s u p p r e s s i o n i n c y t o m e g a l o v i r a l m o n o n u c l e o s i s . J o u r n a l o f I n f e c t i o u s D i s e a s e s 1 4 1 , 4 8 8 - 4 9 5 . R O D R I G U E Z , T . R . , L O E P F E , T . R . a n d S T I N S K I , M . F . ( 1 9 8 3 ) . Human c y t o m e g a l o v i r u s p e r s i s t s i n c e l l s t r e a t e d w i t h i n t e r f e r o n . A r c h i v e s o f V i r o l o g y 7 7 . 2 7 7 - 2 8 1 . R O T T , R . ( 1 9 7 9 ) . M o l e c u l a r b a s i s o f i n f e c t i v i t y o f m y x o v i r u s e s . A r c h i v e s o f V i r o l o g y 5 9 , 2 8 5 - 2 9 8 . 2 0 7 ROWE, W . P . , H A R T L E Y , J . W . , W A T E R M A N , S . , T U R N E R , H . C . a n d H U E 8 N E R , R . J . ( 1 9 5 6 ) . C y t o p a t h o g e n i c a g e n t r e s e m b l i n g h u m a n s a l i v a r y g l a n d v i r u s r e c o v e r e d f r o m t i s s u e c u l t u r e s o f h u m a n a d e n o i d s . P r o c e e d i n g s o f t h e S o c i e t y o f E x p e r i m e n t a l B i o l o g y a n d M e d i c i n e 9 2 , 4 1 8 - 4 2 4 . R U B I N , R . H . , C O S I M I , A . B . , T O L K O F F - R U B I N , N . E . , R U S S E L L , P . S . a n d H I R S C H , M . S . ( 1 9 7 7 ) . I n f e c t i o u s d i s e a s e s y n d r o m e s a t t r i b u t a b l e t o c y t o m e g a l o v i r u s a n d t h e i r s i g n i f i c a n c e a m o n g r e n a l t r a n s p l a n t r e c i p i e n t s . T r a n s p l a n t a t i o n 2 4 , 4 5 8 - 4 6 4 . S T . J E O R , S . a n d R A P P , F . ( 1 9 7 3 ) . C y t o m e g a l o v i r u s : C o n v e r s i o n o f n o n p e r m i s s i v e c e l l s t o a p e r m i s s i v e s t a t e f o r v i r u s r e p l i c a t i o n . S c i e n c e 1 8 1 . 1 0 6 0 - 1 0 6 1 . S T . J E O R , S . C , A L B R E C H T , T . B . , F U N K , F . O . a n d R A P P , F . ( 1 9 7 4 ) . S t i m u l a t i o n o f c e l l u l a r DNA s y n t h e s i s b y h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s . J o u r n a l o f V i r o l o g y ]_3, 3 5 3 - 3 6 2 . S E L G R A D E , M . F . a n d O S B O R N E , J . E . ( 1 9 7 4 ) . R o l e o f m a c r o p h a g e s i n r e s i s t a n c e t o m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n . I n f e c t i o n a n d I m m u n i t y 1_0, 1 3 8 3 - 1 3 9 0 . S H A N L E Y , J . D . , J O R D A N , M . C , C O O K , M . L . a n d S T E V E N S , J . G . ( 1 9 7 9 ) . P a t h o g e n e s i s o f r e a c t i v a t e d l a t e n t m u r i n e c y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n . A m e r i c a n J o u r n a l o f P a t h o l o g y 9 5 , 6 8 - 7 7 . S H E L D R I C K , P . a n d B E R T H E L O T , N . ( 1 9 7 4 ) . I n v e r t e d r e p e t i t i o n s i n t h e c h r o m o s o m e o f h e r p e s s i m p l e x v i r u s . C o l d S p r i n g H a r b o r S y m p o s i a o n Q u a n t i t a t i v e B i o l o g y 3 9 , 6 7 7 - 6 7 8 . S M I T H , J . D . a n d D E H A R V E N , E . ( 1 9 7 3 ) . H e r p e s s i m p l e x v i r u s a n d h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s r e p l i c a t i o n i n W I - 3 8 c e l l s . I . S e q u e n c e o f v i r a l r e p l i c a t i o n . J o u r n a l o f V i r o l o g y 1_2, 9 1 9 - 9 3 0 . S M I T H , M . G . ( 1 9 5 4 ) . P r o p a g a t i o n o f s a l i v a r y g l a n d v i r u s o f t h e m o u s e i n t i s s u e c u l t u r e s . P r o c e e d i n g s o f t h e S o c i e t y o f E x p e r i m e n t a l B i o l o g y a n d M e d i c i n e 8 6 , 4 3 5 - 4 4 0 . S M I T H , M . G . ( 1 9 5 6 ) . P r o p a g a t i o n i n t i s s u e c u l t u r e s o f a c y t o p a t h o g e n i c v i r u s f r o m h u m a n s a l i v a r y g l a n d v i r u s ( S G V ) d i s e a s e . P r o c e e d i n g s o f t h e S o c i e t y o f E x p e r i m e n t a l B i o l o g y a n d M e d i c i n e 9 2 , 4 2 4 - 4 3 0 . S P E C T O R , D . H . , H O C K , L . J . a n d T A M A S H I R O , J . C . ( 1 9 8 2 ) . C l e a v a g e m a p s f o r h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s DNA s t r a i n A D I 6 9 f o r r e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e s E c o R I , B g l l l a n d H i n d I I I . J o u r n a l o f V i r o l o g y 4 2 , 5 5 8 - 5 8 2 . S T A G N O , S . , R E Y N O L D S , D . W . , H U A N G , E . - S . , T H A M E S , S . D . , S M I T H , R . J . a n d A L F O R O , C A . ( 1 9 7 7 ) . C o n g e n i t a l c y t o m e g a l o v i r u s : O c c u r r e n c e i n a n i m m u n e p o p u l a t i o n . New E n g l a n d J o u r n a l o f M e d i c i n e 2 9 6 , 1 2 5 4 - 1 2 5 8 . S T E N B E R G , R . M . , T H O M S E N , D . R . a n d S T I N S K I , M . F . ( 1 9 8 4 ) . S t r u c t u r a l a n a l y s i s o f t h e m a j o r i m m e d i a t e e a r l y g e n e o f h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 4 9 , 1 9 0 - 1 9 9 . 2 0 8 S T E V E N S , J . G . a n d C O O K , M . L . ( 1 9 7 1 ) . L a t e n t h e r p e s s i m p l e x v i r u s i n s p i n a l g a n g l i a o f m i c e . S c i e n c e 1_73, 8 4 3 - 8 4 5 . S T I N S K I , M . F . ( 1 9 7 6 ) . Human c y t o m e g a l o v i r u s : G l y c o p r o t e i n s a s s o c i a t e d w i t h v i r i o n s a n d d e n s e b o d i e s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 19_, 5 9 4 - 6 0 9 . S T I N S K I , M . F . ( 1 9 7 8 ) . S e q u e n c e o f p r o t e i n s y n t h e s i s i n c e l l s i n f e c t e d b y h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s : e a r l y a n d l a t e v i r u s i n d u c e d p o l y p e p t i d e s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 2 6 , 6 8 6 - 7 0 1 . S T I N S K I , M . F . , T H O M S E N , O . R . a n d W A T H E N , M . W . ( 1 9 8 1 ) . S t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f t h e c y t o m e g a l o v i r u s g e n o m e . I n T h e Human H e r p e s v i r u s e s - a n I n t e r d i s c i p l i n a r y A p p r o a c h , p p . 7 2 - 8 4 . E d i t e d b y A . J . N a h m i a s , W . R . D o w d l e & R . F . S c h i n a z i . A m s t e r d a m : E l s e v i e r B i o m e d i c a l . S T I N S K I , M . F . , T H O M S E N , D . R . , S T E N B E R G , R . M . a n d G O L D S T E I N , L . C . ( 1 9 8 3 ) . O r g a n i z a t i o n a n d e x p r e s s i o n o f t h e i m m e d i a t e e a r l y g e n e s o f h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s . J o u r n a l o f V i r o l o g y 4 6 , 1 - 1 4 . S T O W , N . D . ( 1 9 8 2 ) . L o c a l i z a t i o n o f a n o r i g i n o f DNA r e p l i c a t i o n w i t h i n t h e T R S / I R S r e p e a t e d r e g i o n o f t h e h e r p e s s i m p l e x v i r u s t y p e 1 g e n o m e . E u r o p e a n M o l e c u l a r B i o l o g y O r g a n i z a t i o n J o u r n a l 1, 8 6 3 - 8 6 7 . S U M M E R S , W . P . , W A G N E R , M . a n d S U M M E R S , W . C . ( 1 9 7 5 ) . P o s s i b l e p e p t i d e c h a i n t e r m i n a t i o n m u t a n t s i n t h y m i d i n e k i n a s e g e n e o f a m a m m a l i a n v i r u s , h e r p e s s i m p l e x v i r u s . P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e , U . S . A . 6 0 , 4 0 8 1 - 4 0 8 4 . T A M A S H I R 0 , J . C , H O C K , L . J . a n d S P E C T O R , D . H . ( 1 9 8 2 ) . C o n s t r u c t i o n o f a c l o n e d l i b r a r y o f t h e E c o R I f r a g m e n t s f r o m t h e h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s g e n o m e ( s t r a i n A D I 6 9 ) . J o u r n a l o f V i r o l o g y 4 2 , 5 4 7 - 5 5 7 . T A N A K A , S . , F U R U K A W A , T . a n d P L 0 T K I N , S . A . ( 1 9 7 5 ) . Human c y t o m e g a l o v i r u s s t i m u l a t e s h o s t c e l l RNA s y n t h e s i s . J o u r n a l o f V i r o l o g y ]_5, 2 9 7 - 3 0 4 . T A N A K A , S . , I H A R A , S . a n d W A T A N A B E , Y . ( 1 9 7 8 ) . Human c y t o m e g a l o v i r u s i n d u c e s D N A - d e p e n d e n t RNA p o l y m e r a s e s i n h u m a n d i p l o i d c e l l s . V i r o l o g y 8 9 , 1 7 9 - 1 8 5 . T E G T M E Y E R , P . J . a n d C R A I G H E A D , J . E . ( 1 9 6 8 ) . I n f e c t i o n o f a d u l t m o u s e m a c r o p h a g e i n . v i t r o w i t h c y t o m e g a l o v i r u s . P r o c e e d i n g s o f t h e S o c i e t y o f E x p e r i m e n t a l B i o l o g y a n d M e d i c i n e 1 2 9 , 6 9 0 - 6 9 4 . T 0 C C I , M . J . , a n d S T . J E 0 R , S . C . ( 1 9 7 9 ) . P e r s i s t e n c e a n d r e p l i c a t i o n o f t h e h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s g e n o m e i n l y m p h o b l a s t o i d c e l l s o f B a n d T o r i g i n . V i r o l o g y 9 6 , 6 6 4 - 6 6 8 . T 0 W B I N , H . , S T A H E L I N , T . a n d G O R D O N , J . ( 1 9 7 9 ) . E l e c t r o p h o r e t i c t r a n s f e r o f p r o t e i n s f r o m p o l y a c r y l a m i d e g e l s t o n i t r o c e l l u l o s e s h e e t s . P r o c e d u r e a n d s o m e a p p l i c a t i o n s . P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e , U . S . A . 7 6 , 4 3 5 0 - 4 3 5 4 . 2 0 9 V O N K A , V . , A N I S I M O V A , E . a n d M A C E K , M . ( 1 9 7 6 ) . R e p l i c a t i o n o f c y t o m e g a l o v i r u s i n h u m a n e p i t h e l o i d d i p l o i d c e l l l i n e . A r c h i v e s o f V i r o l o g y 5 2 , 2 8 3 - 2 9 6 . W A N E R , J . L . , a n d W E L L E R , T . H . ( 1 9 7 4 ) . B e h a v i o u r o f h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s e s i n c e l l c u l t u r e s o f b o v i n e a n d s i m i a n o r i g i n . P r o c e e d i n g s o f t h e S o c i e t y o f E x p e r i m e n t a l B i o l o g y a n d M e d i c i n e 1 4 5 , 3 7 9 - 3 8 4 . W A T H E N , M . W . , T H O M S E N , D . R . a n d S T I N S K I , M . F . ( 1 9 8 1 ) . T e m p o r a l r e g u l a t i o n o f h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s t r a n s c r i p t i o n a t i m m e d i a t e e a r l y a n d e a r l y t i m e s a f t e r i n f e c t i o n . J o u r n a l o f V i r o l o g y 3 8 , 4 4 6 - 4 5 9 . W A T H E N , M . W . a n d S T I N S K I , M . F . ( 1 9 8 2 ) . T e m p o r a l p a t t e r n s o f h u m a n c y t o m e g a l o v i r u s t r a n s c r i p t i o n : m a p p i n g t h e v i r a l R N A s s y n t h e s i z e d a t i m m e d i a t e - e a r l y , e a r l y a n d l a t e t i m e s a f t e r i n f e c t i o n . J o u r n a l o f V i r o l o g y 41, 4 6 2 - 4 7 7 . W E B E R , K . a n d 0 S B 0 R N , M . ( 1 9 6 9 ) . T h e r e l i a b i l i t y o f m o l e c u l a r w e i g h t d e t e r m i n a t i o n b y d o d e c y l - s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . J o u r n a l o f B i o l o g i c a l C h e m i s t r y 2 4 4 , 4 4 0 6 - 4 4 1 2 . W E I N E R , H . L . , D R A Y N A , D . , A V E R I L L , D . R . a n d F I E L D S , B . N . ( 1 9 7 7 ) . M o l e c u l a r b a s i s o f r e o v i r u s v i r u l e n c e : t h e r o l e o f t h e S-\ g e n e . P r o c e e d i n g s o f t h e N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e , U . S . A . 7 4 , 5 7 4 4 - 5 7 4 8 . W E L L E R , T . H . ( 1 9 7 1 ) . T h e c y t o m e g a l o v i r u s e s : U b i q u i t o u s a g e n t s w i t h p r o t e a n c l i n i c a l m a n i f e s t a t i o n s . New E n g l a n d J o u r n a l o f M e d i c i n e 2 8 5 , 2 0 3 - 2 1 4 , 2 6 7 - 2 7 4 . W E L L E R , T . H . , M A C A U L E Y , J . C . , C R A I G , J . M . , a n d W I R T H , P . ( 1 9 5 7 ) . I s o l a t i o n o f i n t r a n u c l e a r i n c l u s i o n p r o d u c i n g a g e n t s f r o m i n f a n t s w i t h i l l n e s s e s r e s e m b l i n g c y t o m e g a l i c i n c l u s i o n d i s e a s e . P r o c e e d i n g s o f t h e S o c i e t y o f E x p e r i m e n t a l B i o l o g y a n d M e d i c i n e 9 4 , 4 - 1 2 . W I L C O X , K . W . , K O H N , A . , S K L Y A N S K A Y A , E . a n d R O I Z M A N , B . ( 1 9 8 0 ) . H e r p e s s i m p l e x v i r u s p h o s p h o p r o t e i n s . 1 . P h o s p h a t e c y c l e s o n a n d o f f s o m e v i r a l p o l y p e p t i d e s a n d c a n a l t e r t h e i r a f f i n i t y f o r D N A . J o u r n a l o f V i r o l o g y 3 3 , 1 6 7 - 1 8 2 . W I L L I A M S , L . L . , B L A K E S L E E , J . R . a n d H U A N G , E . S . ( 1 9 8 0 a ) . I s o l a t i o n o f a n e w c y t o m e g a l o v i r u s f r o m e x p l a n t e d n o r m a l s k i n . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 4 7 , 5 1 9 - 5 2 3 . W I L L I A M S , L . L . , B L A K E S L E E , J . R . , B 0 L D 0 G H , I . a n d H U A N G , E . S . ( 1 9 8 0 b ) . D e t e c t i o n o f c y t o m e g a l o v i r u s g e n o m e s i n h u m a n s k i n f i b r o b l a s t b y DNA h y b r i d i z a t i o n . J o u r n a l o f G e n e r a l V i r o l o g y 5_1, 4 3 5 - 4 3 8 . W I N S T O N , D . J . , H O , W . G . , H O W E L L , C . L . , M I L L E R , M . J . , M I C K E Y , R . , M A R T I N , W . J . , L I N , C . - H . a n d G A L E , R . P . ( 1 9 8 0 ) . C y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t i o n s a s s o c i a t e d w i t h l e u k o c y t e t r a n s f u s i o n s . A n n a l s o f I n t e r n a l M e d i c i n e 9 3 , 6 7 1 - 6 7 5 . W R I G H T , H . T . , J R . , G O O D H E A R T , C R . a n d L I E L A U S I S , A . ( 1 9 6 4 ) . Human c y t o m e g a l o v i r u s . M o r p h o l o g y b y n e g a t i v e s t a i n i n g . V i r o l o g y 2 3 , 4 1 9 - 4 2 4 . 2 1 0 Y A T E S , J . L . , W A R R E N , N . a n d S U G D E N , B . ( 1 9 8 5 ) . S t a b l e r e p l i c a t i o n o f p l a s m i d s d e r i v e d f r o m E p s t e i n - B a r r v i r u s i n v a r i o u s m a m m a l i a n c e l l s . N a t u r e ( L o n d o n ) 3 1 3 , 8 1 2 - 8 1 5 . Z A V A D A , V . , E R B A N , V . , R E C Z A C O V A , D. a n d V O N K A , V . ( 1 9 7 6 ) . T h y m i d i n e - k i n a s e i n c y t o m e g a l o v i r u s i n f e c t e d c e l l s . A r c h i v e s o f V i r o l o g y 5_2, 3 3 3 - 3 3 9 . 

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