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Gene expression in and development of trisomies of Drosophila melanogaster Devlin, Robert Harry 1984

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GENE E X P R E S S I O N IN AND DEVELOPMENT OF T R I S O M I E S OF DROSQPHILA MELANOGASTER b y ROBERT HARRY D E V L I N B . S c . p U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1978 A T H E S I S S U B M I T T E D IN P A R T I A L F U L F I L L M E N T OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF DOCTOR OF PHILOSOPHY In t h e D e p a r t m e n t o f Z o o l o g y We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H COLUMBIA D e c e m b e r , 1984 (c) R o b e r t H a r r y D e v l i n , 1984 In presenting this thesis in partial fulfilment of the requirements for an advanced degree at the University of British Columbia, I agree that the Library shall make i t freely available for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of this thesis for scholarly purposes may be granted by the head of my department or by his or her representatives. It is understood that copying or publication of this thesis for financial gain shall not be allowed without my written permission. Department of / The University of British Columbia 1956 Main Mall Vancouver, Canada V6T 1Y3 Date Ou^ 5-\ , IS %>^ T )E-6 (3/81) i i A B S T R A C T D r o s o p h i l a m e l a n o q a s t e r i n d i v i d u a l s t r i s o m i c f o r a n e n t i r e c h r o m o s o m e a r m c a n s u r v i v e t o l a t e s t a g e s o-f p u p a l d e v e l o p m e n t . T o e x a m i n e g e n e e x p r e s s i o n i n t h e s e h y p e r p l o i d s , t h e l e v e l s o-f - f i v e e n z y m e s w h o s e s t r u c t u r a l g e n e s a r e l o c a t e d o n t h e l e f t a rm o f c h r o m o s o m e t w o h a v e b e e n e x a m i n e d b o t h i n a n e u p l o i d a n d i n d i p l o i d s t r a i n s . E l e v a t e d l e v e l s o f e n z y m e a c t i v i t y w e r e o b s e r v e d i n l a r v a e p o s s e s s i n g s m a l l s e g m e n t a l d u p l i c a t i o n s f o r t h e s e g e n e s . H o w e v e r , i n 2I_ t r i s o m i e s , t h e t h r e e d i s t a l l y m a p p i n g l o c i s h o w e d c o m p e n s a t e d l e v e l s o f e x p r e s s i o n c l o s e t o t h a t o b s e r v e d i n t h e d i p l o i d s t r a i n s . A n a l y s i s o f e l e c t r o p h o r e t i c v a r i a n t s r e v e a l e d t h a t f o r o n e o f t h e s e c o m p e n s a t e d l o c i a l l t h r e e a l l e l e s w e r e e x p r e s s e d i n t r i s o m i e s . Two p r o x i m a l l y l o c a t e d g e n e s d i s p l a y e d d o s e - d e p e n d e n t l e v e l s o f e n z y m e a c t i v i t y . F o r m o s t g e n e s , a u t o s o m a l c o m p e n s a t i o n a p p e a r s t o b e v e r y d i s c r e t e : e i t h e r t h e e x p r e s s i o n o f t h e g e n e i s r e p r e s s e d o r i t i s n o t . T o e x t e n d t h e s e o b s e r v a t i o n s , a n d t o d e t e r m i n e i f a u t o s o m a l c o m p e n s a t i o n was p e c u l i a r t o t h e l e f t a rm o f c h r o m o s o m e t w o , t r i s o m i e s f o r t h e X, f o r 2R, a n d f o r 3 L a l s o w e r e e x a m i n e d . C o m p e n s a t i n g a n d n o n - c o m p e n s a t i n g l o c i w e r e a l s o f o u n d o n 3 L , w h e r e a s a l l l o c i e x a m i n e d i n X - c h r o m o s o m a l t r i s o m i e s w e r e d o s a g e c o m p e n s a t e d . T h i s s u g g e s t s t h a t X - c h r o m o s o m a l a n d a u t o s o m a l t r i s o m i e s a r e n o t n e c e s s a r i l y a n a l a g o u s . D o s a g e c o m p e n s a t i o n i n X - c h r o m o s o m a l t r i s o m i e s ( m e t a f e m a l e s ) may o c c u r e x c l u s i v e l y o r p a r t i a l l y b y t h e m e c h a n i s m t h a t o p e r a t e s b e t w e e n e u p l o i d m a l e s a n d f e m a l e s . H o w e v e r , some c o m p e n s a t i o n i n X t r i s o m i e s may o c c u r b y Ill r e g u l a t o r y c o n t r o l s d i s t i n c t f r o m m a l e - f e m a l e d o s a g e c o m p e n s a t i o n a s i n d i c a t e d b y t h e f o l l o w i n g r e s u l t s . T h e e x p r e s s i o n o f L S P - l a T a g e n e t h a t n o r m a l l y e s c a p e s c o m p l e t e d o s a g e c o m p e n s a t i o n i n d i p l o i d m a l e s , was f u l l y c o m p e n s a t e d i n t r i s o m i c - X l a r v a e . P o s s i b l y , c o m p e n s a t i o n o f t h i s g e n e i n t h e s e i n d i v i d u a l s was m e d i a t e d b y r e g u l a t o r y m e c h a n i s m s o t h e r t h a n t h o s e c o n t r o l l i n g m a l e - f e m a l e d o s a g e c o m p e n s a t i o n . A s s u c h , l o c i t h a t n o r m a l l y d o n o t r e s i d e o n t h e X c h r o m o s o m e , b u t w h i c h h a v e b e e n t r a n s p o s e d t o t h i s c h r o m o s o m e , m i g h t b e e x p e c t e d t o e s c a p e c o m p e n s a t i o n i n m e t a f e m a l e s . T h i s a p p e a r s t o b e t h e c a s e ; a n A d h g e n e t h a t h a d b e e n t r a n s p o s e d f r o m t h e s e c o n d t o t h e X c h r o m o s o m e was e x p r e s s e d a t a s i m i l a r l e v e l ( p e r g e n e ) i n m e t a f e m a l e s a n d f e m a l e s . I n a d d i t i o n , a n a t i v e X - c h r o m o s o m a l l o c u s a p p e a r e d t o b e c o m p e n s a t e d b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s , b u t was n o t c o m p e n s a t e d i n X - c h r o m o s o m a l t r i s o m i e s . T h u s , some X - l i n k e d l o c i e s c a p e r e g u l a t i o n b y d o s a g e c o m p e n s a t i o n i n m e t a f e m a l e s . I t i s p o s s i b l e t h a t some o f t h e r e g u l a t o r y s y s t e m s o p e r a t i n g i n X—chromosomal a n d a u t o s o m a l t r i s o m i e s a r e a n a l a g o u s , a n d r e f l e c t a common f o r m h y p e r p l o i d c o m p e n s a t i o n . T h e l e v e l a t w h i c h c o m p e n s a t i o n o c c u r e d was i n v e s t i g a t e d b y m e a s u r i n g t h e q u a n t i t i e s o f RNA p r o d u c e d b y s e v e r a l g e n e s i n w h o l e - a r m t r i s o m i e s . F o r t h e h e a t - s h o c k g e n e , h s p 8 5 . c o m p e n s a t i o n f o r p r o t e i n l e v e l s a p p e a r e d t o b e p o s t — t r a n s c r i p t i o n a l l y r e g u l a t e d . H o w e v e r , m e a s u r e m e n t s o f RNA s y n t h e s i s o n s a l i v a r y g l a n d p o l y t e n e c h r o m o s o m e s r e v e a l e d t h a t f o r most o f t h e g e n e s c o m p e n s a t i o n was t r a n s c r i p t i o n a l l y r e g u l a t e d . D o s a g e c o m p e n s a t i o n o n t h e a u t o s o m e s p r o b a b l y r e f l e c t s t h e e x i s t e n c e o f a s y s t e m t h a t n o r m a l l y o p e r a t e s i n d i p l o i d s t o c o n t r o l g e n e e x p r e s s i o n b y n e g a t i v e r e g u l a t i o n . V T A B L E OF CONTENTS PAGE-A B S T R A C T i i T A B L E OF C O N T E N T S v L I S T OF T A B L E S v i i L I S T OF F I G U R E S . « ACKNOWLEDGEMENTS x i i GENERAL INTRODUCTION 1 CHAPTER 1 . MEASUREMENTS OF GENE PRODUCT L E V E L S IN T R I S 0 M I C - 2 L L A R V A E I . I n t r o d u c t i o n • 19 I I . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 20 I I I . R e s u l t s 28 I V . D i s c u s s i o n 3 9 CHAPTER 2 . MEASUREMENTS OF GENE PRODUCT L E V E L S IN T R I S D M I C - 3 AND T R I S O M I C - X L A R V A E I . I n t r o d u c t i o n 47 I I . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 4 9 I I I . R e s u l t s 60 I V . D i s c u s s i o n 79 CHAPTER 3 . I N F L U E N C E OF TRISOMY ON T H E E X P R E S S I O N OF L O C I MAPPING O U T S I D E OF T H E D U P L I C A T E D REGIONS I . I n t r o d u c t i o n 93 I I . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 96 I I I . R e s u l t s 101 I V . D i s c u s s i o n 130 CHAPTER 4 . E F F E C T OF E X T E N S I V E A N E U P L O I D Y ON V I A B I L I T Y vi AND PHENOTYPE I . I n t r o d u c t i o n • 151 I I . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . . 155 I I I . R e s u l t s 158 I V . D i s c u s s i o n . . 217 CHAPTER 5 . COMPENSATION IN 2 L T R I S O M I E S I S T R A N S C R I P T I O N A L L Y R E G U L A T E D I . I n t r o d u c t i o n 228 I I . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 231 I I I . R e s u l t s 236 I V . D i s c u s s i o n . . . . . 258 CHAPTER 6 . R E G U L A T I O N OF DOSAGE COMPENSATION IN M E T A F E M A L E S I . I n t r o d u c t i o n 265 I I . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s 2 6 7 I I I . R e s u l t s 271 I V . D i s c u s s i o n 288 B I B L I O G R A P H Y 2 9 3 vii L I S T QF T A B L E S T A B L E P A G E 1 . B i o c h e m i c a l l o c i e x a m i n e d i n t h i s s t u d y 27 2 . E n z y m e l e v e l s f o r c o m p e n s a t i n g l o c i i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 2 L l a r v a e . 30 3 . E n z y m e l e v e l s f o r n o n c o m p e n s a t i n g l o c i i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 2 L l a r v a e . - » 31 4 . E n z y m e l e v e l s f o r t w o u n l i n k e d l o c i i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 2 L l a r v a e . . . . . . . 32 5 . D o s e d e p e n d e n c e o f e n z y m e l e v e l s i n s m a l l s e g m e n t a l a n e u p l o i d s i n l a t e t h i r d i n s t a r l a r v a e 36 6 . E n z y m e l e v e l s f o r c o m p e n s a t i n g l o c i i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 3 L l a r v a e • 62 7 . E n z y m e l e v e l s f o r n o n c o m p e n s a t i n g l o c i i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 3 L l a r v a e 63 B . E n z y m e l e v e l s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 2 R l a r v a e 64 9 . E n z y m e l e v e l s i n m a l e s , f e m a l e s , a n d m e t a f e m a l e s 6 9 10 . H e a t - s h o c k p r o t e i n 68 a n d 83 s y n t h e s i s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c — 3 L s a l i v a r y g l a n d s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73 1 1 . S m a l l h e a t - s h o c k p r o t e i n s y n t h e s i s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 3 L s a l i v a r y g l a n d s 75 12 . H e a t - s h o c k RNA 83 l e v e l s i n f a t b o d i e s a n d s a l i v a r y g l a n d s . 77 1 3 . A c t i v i t y o f t h i r d c h r o m o s o m e e n z y m e l o c i i n 2 L t r i s o m i e s 103 14 . E n z y m e a c t i v i t y f o r a 2 R - 1 i n k e d e n z y m e l o c u s i n 2 L t r i s o m i e s 104 1 5 . A c t i v i t y o f s e c o n d c h r o m o s o m e e n z y m e l o c i i n 3 L t r i s o m i e s 106 16 . A c t i v i t y o f t h i r d c h r o m o s o m e e n z y m e l o c i i n 3 L t r i s o m i e s 107 1 7 . A c t i v i t y o f a 2 L - 1 i n k e d e n z y m e l o c u s i n 2R t r i s o m i e s 108 18 . A c t i v i t y o f s e c o n d c h r o m o s o m e e n z y m e l o c i i n m e t a f e m a l e s 110 viii 1 9 . A c t i v i t y o f t h i r d c h r o m o s o m e e n z y m e l o c i i n m e t a f e m a l e s I l l 2 0 . X - l i n k e d e n z y m e l e v e l s i n O r e g o n R i s o - X s t r a i n s 113 2 1 . X - l i n k e d e n z y m e l e v e l s i n C<2L>1t ;F<2R>bw/F<2R>bwj i s o - X s t r a i n 113 2 2 . X - l i n k e d e n z y m e l e v e l s i n C ( 3 L ) r u s t * F < 3 R ) e r a / F ( 3 R > e e , j i s o - X s t r a i n 114 2 3 . X - l i n k e d e n z y m e l e v e l s i n C < 2 L > l t / + / F ( 2 R ) b w ; i s o - X t r i s o m i c - 2 L i n d i v i d u a l s 115 2 4 . X - l i n k e d e n z y m e l e v e l s i n C ( 3 L ) r u s t / + / F < 3 R > e s | i s o - X t r i s o m i c - 3 L i n d i v i d u a l s 115 2 5 . X - l i n k e d e n z y m e l e v e l s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 2 L l a r v a e 116 2 6 . X - l i n k e d e n z y m e l e v e l s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 3 L 1 a r v a e 117 2 7 . Q u a n t i t y o f L S P s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 3 L h e m o l y m p h f r o m f e m a l e l a r v a e . . . . . . . . . 120 2 8 . Q u a n t i t y o f L S P s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 2 L h e m o l y m p h f r o m f e m a l e l a r v a e . . 122 2 9 . Q u a n t i t y o f L S P s i n m a l e s , f e m a l e s , a n d m e t a f e m a l e s . 124 3 0 . E x p r e s s i o n o f A d h f r o m v a r i o u s c h r o m o s o m a l p o s i t i o n s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 2 L l a r v a e 126 3 1 . Summary o f r e g u l a t o r y e f f e c t s o n e n z y m e l o c i i n t r i s o m i e s 132 3 2 . E m b r y o n i c v i a b i l i t y o f w h o l e a r m t r i s o m i e s . . . 162 3 3 . I n f e r r e d v i a b i l i t y o f s e l e c t e d a n e u p l o i d s f r o m t h e c r o s s e s i n T a b l e 3 2 . . . . . . . . 163 3 4 . V i a b i l i t y o f d o u b l e t r i s o m i e s a n d t r i p l o i d s d e f i c i e n t f o r o n e a u t o s o m a l a r m 174 3 5 . I n f e r r e d v i a b i l i t i e s o f s e l e c t e d a n e u p l o i d s f r o m t h e c r o s s e s i n T a b l e 3 3 . . . 175 3 6 . S u r v i v a l o f a u t o s o m a l m o n o s o m i e s 177 3 7 . Number o f s e x - c o m b t e e t h i n n o r m a l a n d s e x - t r a n s f o r m e d t r i s o m i e s 182 3 8 . E f f e c t o f d a a n d F l o n t h e e m b r y o n i c v i a b i l i t y o f a u t o s o m a l t r i s o m i e s 187 ix 3 9 . S u r v i v a l t o l a t e p u p a e o f a u t o s o m a l t r i s o m i e s h e t e r o z y g o u s f o r F l a n d p o s s e s s i n g d i f f e r e n t d o s e s o f d a * 190 4 0 . E x p r e s s i o n o f d o m i n a n t m a r k e r s i n t r i s o m i e s . . . . . . . . . . . . 192 4 1 . E x p r e s s i o n o f B a r v a r i e g a t o r i n t r i s o m i c - 2 L m a l e s . 194 4 2 . E x p r e s s i o n o f s c v 2 i n a n e u p l o i d s f o r 2 L a n d 3 L 196 4 3 . E n z y m e l e v e l s i n f a t b o d i e s f r o m d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 2 R f e m a l e l a r v a e 198 4 4 . L i v e w e i g h t , p r o t e i n c o n t e n t a n d DNA c o n t e n t i n f e m a l e d i p l o i d a n d t r i s o m i c l a r v a e . . . . 212 4 5 . E s t i m a t e s o f c e l l s i z e i n d i p l o i d a n d t r i p l o i d , a n d t r i s o m i c p u p a e . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 216 4 6 . ^ H - u r i d i n e i n c o r p o r a t i o n i n t o r e g i o n s o f p o l y t e n e c h r o m o s o m e s f r o m d i p l o i d a n d t r i s o m i c l a r v a e 240 4 7 . R e p r e s s i o n o f g r a i n c o u n t s o v e r 2 L o r r e g i o n s o f 2 L o n g r a i n c o u n t s o v e r 6 1 A - 6 8 C 244 4 8 . Amount o f L S P - l b a n d ADH mRNAs r e l a t i v e t o L S P - l g 254 4 9 . X - 1 i n k e d A d h g e n e a c t i v i t y i n m a l e s , f e m a l e s , a n d m e t a f e m a l e s . . . 2 7 5 5 0 . R e l a t i v e a m o u n t s o f L S P s i n e u p l o i d s t r a i n s . . . . . . . . . . . . 278 5 1 . R e l a t i v e a m o u n t s o f L S P s i n a n e u p l o i d s t r a i n s 2 7 9 5 2 . F i l t e r h y b r i d i z a t i o n o f L S P - 1 RNA 281 5 3 . R e l a t i v e a m o u n t s o f L S P s i n L 8 2 s t r a i n 284 5 4 . M a p p i n g L S P - l 1 - 6 9 3 5 b y r e c o m b i n a t i o n . . . . . 286 X L I S T OF F I G U R E S F I G U R E PAGE 1 . M a t i n g p r o c e d u r e u t i l i z e d t o p r o d u c e t r i s o m i c l a r v a e . . . 22 2 . L e v e l s o f GPDH a n d ADH e n z y m e i n d i p l o i d s a n d t r i s o m i e s p o s s e s s i n g t h e same a c t i v e a l l e l e s f o r Gpdh a n d Adjh 34 3 . E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o f GPDH i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c — 2 L l a r v a e • • 38 4 . Summary b a r g r a p h o f e n z y m e q u a n t i t i e s i n 2 L t r i s o m i e s r e l a t i v e t o d i p l o i d s . 42 5 . S t r a t e g y e m p l o y e d t o p r o d u c e c o m p o u n d - f r e e c h r o m o s o m e s f o r t h e t h i r d c h r o m o s o m e 51 6 . C y t o l o g i c a l p r e p a r a t i o n s o f c h r o m o s o m e F ( 3 R ) V D l e e i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c l a r v a e . . . . . . . 52 7 . E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o f PGM i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 3 L p u p a e 6 7 8 . A u t o r a d i o g r a m s o f h e a t - s h o c k p r o t e i n a n d RNA f r o m s a l i v a r y g l a n d s 72 9 . Summary b a r g r a p h o f e n z y m e q u a n t i t i e s i n 3 L t r i s o m i e s r e l a t i v e t o d i p l o i d s . . . . . . . . . 82 10 . E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o f l a r v a l s e r u m p r o t e i n s o n c e l l u l o s e - a c e t a t e s t r i p s a n d i n S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l s 100 1 1 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n ADH e n z y m e a c t i v i t y i n d i p l o i d s a n d 2 L t r i s o m i e s b e a r i n g t r a n s f o r m e d A d h g e n e s . . . . 129 12 . Summary o f t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f g e n e s i n X - c h r o m o s o m a l a n d a u t o s o m a l t r i s o m i e s 135 13 . Number o f t r i s o m i e s a f f e c t i n g i n d i v i d u a l l o c i 138 14 . V i a b i l i t y t o l a t e t h i r d - i n s t a r l a r v a e o f p a r t i a l t r i s o m i e s f o r 2 L 160 1 5 . P o s t e m b r y o n i c v i a b i l i t i e s o f t h e f i v e m a j o r w h o l e arm t r i s o m i e s 166 16 . V i a b i l i t y o f 2 L a n d 3 L t r i s o m i e s a t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s 170 1 7 . Sex r a t i o o f a u t o s o m a l t r i s o m i e s a t d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s 173 18 . P h e n o t y p e s o f t r i s o m i e s 180 19 . S e x - c o m b m o r p h o l o g y o f d i p l o i d a n d t r i s o m i c p u p a e e i t h e r p o s s e s s i n g s e x t r a n s f o r m i n g m u t a t i o n s o r n o t . . . . 185 2 0 . C o m p a r i s o n o f e n z y m e q u a n t i t e s f r o m w h o l e l a r v a e a n d f r o m i s o l a t e d f a t b o d y 200 2 1 . K i n e t i c m e a s u r e m e n t s o n GPDH f r o m d i p l o i d s a n d 2 L t r i s o m i e s 2 0 3 2 2 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n P 6 I a c t i v i t y a n d l a r v a l s i z e i n f e m a l e a n d m a l e 2 L t r i s o m i e s 206 2 3 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n GPDH a c t i v i t y a n d l a r v a l s i z e i n f e m a l e a n d m a l e 2 L t r i s o m i e s 208 2 4 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n ADH a c t i v i t y a n d l a r v a l s i z e i n f e m a l e a n d m a l e 2 L t r i s o m i e s . . . . . . . . 210 2 5 . E l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f e y e f a c e t s f r o m d i p l o i d s , t r i p l o i d s , a n d t r i s o m i e s . . . . 214 2 6 . T r a n s c r i p t i o n a u t o r a d i o g r a m o f s a l i v a r y g l a n d p o l y t e n e c h r o m o s o m e s f r o m a t r i s o m i c - 2 L f e m a l e l a r v a e 238 2 7 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n i n c o r p o r a t i o n o f 3 H - u r i d i n e i n t o 2 L v s r e g i o n 6 1 A - 6 8 C o f 3 L i n d i p l o i d s a n d 2 L t r i s o m i e s . 2 4 3 2 8 . T r a n s c r i p t i o n i n f o u r a p p r o x i m a t e l y e q u a l s u b d i v i s i o n s o f 2 L i n d i p l o i d s a n d 2 L t r i s o m i e s 248 2 9 . Q u a n t i t e s o f L S P g e n e s a n d mRNA i n d i p l o i d s a n d t r i s o m i e s 2 5 2 3 0 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n ADH e n z y m e a c t i v i t y a n d ADH mRNA i n t h r e e s t r a i n s . . . . 256 3 1 . Q u a n t i t y o f M a l i c e n z y m e i n d i p l o i d m a l e s a n d f e m a l e s a n d i n m e t a f e m a l e s 2 7 3 3 2 . A n a l y s i s o f a m u t a t i o n t h a t r e d u c e s t h e amount o f L S P - l a p r o t e i n a n d RNA 2 8 3 XII ACKNOWLEDGEMENTS I w o u l d l i k e t o t h a n k my s u p e r v i s o r s , Tom G r i g l i a t i i a n d D a v e H o l m , f o r t h e i r s u p p o r t , e n c o u r a g e m e n t a n d a d v i c e , a n d f o r c a l m l y t o l e r a t i n g my i d i o s y n c r a c i e s . T h r o u g h o u t t h e c o u r s e o f t h i s s t u d y , t h e y , a n d Don S i n c l a i r , h a v e p r o v i d e d a s o u r c e o f k n o w l e d g e a n d w i s d o m f o r me t o d r a w f r o m . I m u s t e s p e c i a l l y t h a n k D o n , P e t e r C s e r j e s i a n d C a r e y J o h n s o n f o r p r o v i d i n g d a y - t o - d a y d i s c u s s i o n s a b o u t much o f t h i s r e s e a r c h . Many o t h e r s h a v e a l l o w e d t h i s r e s e a r c h t o u n f o l d , n o t e a b l y K a r e n M o r i n , Hugh B r o c k , Tom Mommson, G r a n t P o g s o n , a n d R u t h a n d B u d d D e v l i n , f o r w h i c h I am most a p p r e c i a t i v e . A s p e c i a l t h a n k y o u i s d e s e r v e d b y my w i f e , Drew D e v l i n . S h e h a s c o n t r i b u t e d t o t h i s work i m m e a s u r e a b l y b y p r o v i d i n g e m m o t i o n a l s u p p o r t a n d b y h e l p i n g w i t h t h e p r o d u c t i o n o f t h e m a n u s c r i p t s . I c o u l d n o t h a v e c o m p l e t e d t h i s work w i t h o u t h e r . G e n e r a l I n t r o d u c t i o n T h e n u m b e r o f c h r o m o s o m e s u s u a l l y d o e s n o t v a r y b e t w e e n members o f t h e same s e x w i t h i n a s p e c i e s o r b e t w e e n c e l l s o f t h e same o r g a n i s m . C o n s t a n c y o f g e n e t i c m a t e r i a l a p p e a r s t o b e a n i m p o r t a n t p r e r e q u i s i t e f o r d e v e l o p m e n t a l a n d e v o l u t i o n a r y s t a b i l i t y . R e m a r k a b l e m e i o t i c a n d m i t o t i c m a c h i n e r y e n s u r e s p r o p e r d i s j u n c t i o n o f c h r o m o s o m e s s u c h t h a t e q u i v a l e n t k a r y o t y p e s a r e m a i n t a i n e d . H o w e v e r , b e c a u s e c o n s i d e r a b l e k a r y o t y p i c v a r i a b i l i t y i s o b s e r v e d b e t w e e n s p e c i e s , c h a n g e s t o genome s t r u c t u r e a n d s i z e a p p e a r t o b e f u n d a m e n t a l e v e n t s a s s o c i a t e d w i t h t h e e v o l u t i o n a r y p r o c e s s . S e v e r a l p r o c e s s e s c a n i n t r o d u c e v a r i a t i o n i n g e n e c o n t e n t w i t h i n a s p e c i e s ; s u c h a l t e r a t i o n s i n t r o d u c e new p o t e n t i a l f o r g e n e t i c d i v e r s i t y i n t o a p o p u l a t i o n . C h a n g e s i n t h e number o f c h r o m o s o m e s e t s p e r n u c l e u s i s t e r m e d e u p l o i d y w h i l e c h a n g e s i n t h e number o f c h r o m o s o m e s o r p a r t s o f c h r o m o s o m e s i s t e r m e d a n e u p l o i d y . T h e l a t t e r c o n d i t i o n c h a n g e s t h e g e n e t i c b a l a n c e b y a d d i n g o r r e m o v i n g p a r t i c u l a r c h r o m o s o m e r e g i o n s . A l t e r a t i o n s t o t h e d o s e o f a s t r u c t u r a l g e n e i s u s u a l l y d i r e c t l y c o r r e l a t e d w i t h t h e q u a n t i t y o f g e n e p r o d u c t w h i c h a c c u m u l a t e s i n t h e c e l l . T h i s a p p e a r s t o b e t r u e i n a w i d e v a r i e t y o f o r g a n i s m s ( J a c o b a n d M o n o d , 1 9 6 1 ; G r e l l , 1 9 6 2 ; G a r e n a n d G a r e n , 1 9 6 3 ; P r i t t a r d a n d R a m a k r i s h n a n , 1964 ; S t e t s o n a n d S o m e r v i l l e , 1 9 7 1 ; F e r g u s o n - S m i t h e t a l . , 1 9 7 3 ; A l l e d i c e a n d T e d e s c o , 1 9 7 5 ; C h a n d l e r a n d P r i t t a r d , 1 9 7 5 ; O ' B r i e n a n d M c l n t y r e , 1976 ; h e t z e n b e r g a n d C h i a , 1 9 7 9 ; G e r b a u d a n d G u e r i n e a u , 1980 ; F a s i o l o e t a l . , 1 9 8 1 ) . T h u s , a v a i l a b i l i t y o f a g e n e f o r t r a n s c r i p t i o n a p p e a r s t o b e a l i m i t i n g - f a c t o r c o n t r o l l i n g g e n e e x p r e s s i o n . I n many s p e c i e s , f e m a l e s h a v e t w i c e a s many X c h r o m o s o m e s a s m a l e s . T h i s i m b a l a n c e i n g e n e c o n t e n t i s r e c t i f i e d b y d o s a g e c o m p e n s a t i o n , a r e g u l a t o r y m e c h a n i s m t h a t e q u a l i z e s g e n e e x p r e s s i o n b e t w e e n i n d i v i d u a l s p o s s e s s i n g o n e o r t w o X c h r o m o s o m e s . P r e v i o u s s t u d i e s o n a n e u p l o i d y i n m e t a z o a n s h a v e n o t r e v e a l e d t h e e x i s t e n c e o f a u t o s o m a l d o s a g e c o m p e n s a t i o n . I n d i v i d u a l s h e t e r o z y g o u s f o r e i t h e r a d e f i c i e n c y o r a d u p l i c a t i o n o f a p a r t i c u l a r a u t o s o m a l g e n e p r o d u c e , r e s p e c t i v e l y , 0 . 5 a n d 1 . 5 t i m e s t h e amount o f g e n e p r o d u c t f o u n d i n n o r m a l d i p l o i d i n d i v i d u a l s . T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y was t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f l a r g e d e g r e e s o f a n e u p l o i d y o n g e n e e x p r e s s i o n i n D r o s o p h i l a m e l a n o q a s t e r . T o t h i s e n d , t h e p r o d u c t s o f s e v e r a l b i o c h e m i c a l l o c i h a v e b e e n q u a n t i f i e d i n i n d i v i d u a l s t h a t a r e t r i s o m i c f o r a n e n t i r e c h r o m o s o m e a r m a n d i n d i p l o i d c o n t r o l s . T h e s e s t u d i e s s h o w e d t h a t , i n t r i s o m i e s , many g e n e p r o d u c t s a r e o b s e r v e d a t d i p l o i d q u a n t i t i e s d e s p i t e a n i n c r e a s e i n g e n e d o s a g e f r o m 2 t o 3 . T h u s , i n D r o s o p h i l a , d o s a g e c o m p e n s a t i o n i s n o t l i m i t e d t o t h e s e x c h r o m o s o m e s , b u t c a n a l s o o c c u r i n l a r g e a u t o s o m a l a n e u p l o i d s . A s s u c h , t h i s t h e s i s h a s a t t e m p t e d t o : 1) d o c u m e n t t h e e x t e n t t o w h i c h a u t o s o m a l c o m p e n s a t i o n o c c u r s , 2) d e t e r m i n e a t what l e v e l o f g e n e e x p r e s s i o n i t i s r e g u l a t e d a n d 3) e x a m i n e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n a u t o s o m a l a n d sex c h r o m o s o m a l d o s a g e c o m p e n s a t i o n . M a l e - f e m a l e d o s a g e c o m p e n s a t i o n i n D r o s o p h i l a h a s b e e n r e v i e w e d b y L u c c h e s i ( 1 9 7 3 ; 1978 ; 1 9 8 3 ) , S t e w a r t a n d M e r r i a m ( 1 9 8 0 ) , M u k h e r j e e ( 1 9 8 2 ) , a n d B a k e r a n d B e l o t e ( 1 9 8 3 ) . T h e 3 r e m a i n d e r o f t h i s i n t r o d u c t i o n s u m m a r i z e s some p e r t i n e n t o b s e r v a t i o n s made o n d o s a g e c o m p e n s a t i o n . Many a s p e c t s o f t h i s m a t e r i a l a r e d i s c u s s e d f u r t h e r i n r e l e v a n t p a r t s o f t h e t h e s i s . T h e r e a d e r f a m i l i a r w i t h D r o s o p h i l a g e n e t i c s c a n l e a v e t h e i n t r o d u c t i o n a t t h i s p o i n t a n d p r o c e e d d i r e c t l y t o t h e e x p e r i m e n t a l s e c t i o n o f c h a p t e r o n e . N a t u r a l l y o c c u r r i n g d i f f e r e n c e s i n g e n e d o s a g e a r e o b s e r v e d i n some o r g a n i s m s . I n m e a l y b u g s , a d i f f e r e n c e i n g e n e d o s a g e e x i s t s b u t i t i s o n l y f u n c t i o n a l : a n e n t i r e c h r o m o s o m e s e t i s i n a c t i v a t e d i n o n e sex ( C h a n d r a a n d B r o w n , 1 9 7 4 ) . C o n s e q u e n t l y , h a p l o i d c e l l s a r e r e d u c e d i n s i z e , a n d t o c o m p e n s a t e f o r t h i s d i f f e r e n c e , m o r e c e l l s a r e p r e s e n t p e r o r g a n i s m ( B e r l o w i t z e t a l . , 1 9 6 8 ) . In H a b r o b r a c o n ( w a s p s ) , h a p l o i d i n d i v i d u a l s a r e f e r t i l e m a l e s w h i l e d i p l o i d s a r e f e m a l e ( W h i t i n g , 1 9 4 3 ) . C o m p e n s a t i o n f o r d i f f e r e n c e s i n g e n e d o s e i n p o l y t e n i c n u c l e i o f t h e s e i n d i v i d u a l s i s a c c o m p l i s h e d b y a l l o w i n g a n e x t r a r o u n d o f DNA r e p l i c a t i o n t o o c c u r i n m a l e s ( R a s c h e t a l . , 1 9 7 7 ) . I t i s n o t s u r p r i s i n g t h a t o r g a n i s m s h a v e e v o l v e d s y s t e m s t o c o m p e n s a t e f o r d i f f e r e n c e s i n g e n e d o s e , s i n c e t h e c o n s e q u e n c e s o f a n e u p l o i d y a r e o f t e n s e v e r e . V a r i a t i o n i n c h r o m o s o m e number i s a s s o c i a t e d w i t h s e x d e t e r m i n a t i o n i n some o r g a n i s m s ( B u l l , 1 9 8 3 ) . B o t h i n man a n d i n D r o s o p h i l a , t h e f e m a l e p o s s e s s e s t w o X c h r o m o s o m e s , w h e r e a s t h e m a l e h a s o n l y o n e ( t h e m a l e a l s o p o s s e s s e s a Y c h r o m o s o m e w h i c h i n D r o s o p h i l a c o n t a i n s a p a u c i t y o f g e n e s , a n d i s n o t r e q u i r e d f o r s u r v i v a l ) . I n some D r o s o p h i l a s p e c i e s , t h i s c a n r e s u l t i n a p l o i d y d i f f e r e n c e f o r up t o s i x t y p e r c e n t o f t h e genome ( M c K n i g h t , 1 9 3 9 ) . N o n t h e l e s s , t h e l e v e l s o f g e n e products produced from most l o c i located on the sex chromosomes are equivalent between the sexes, a phenomenon termed dosage compensation. This p a r t i c u l a r condition,both i n terms of v i a b i l i t y and gene expression, appears to defy the normal responses to aneuploidy. One can r e a d i l y appreciate the importance of such a regulatory mechanism for maintaining the balance of gene expression within the c e l l . Presumably most metabolic processes are i d e n t i c a l between males and females and are optimum when a s p e c i f i c level of product i s present. Dosage compensation i s found i n several d i f f e r e n t phyla i n the animal kingdom (Lyon, 1972; Muller et a l . , 1931; C a s a r t e l l i , 1968; Meneely and Wood, 1984; Hodgkin, 1983; Arora and Rao, 1979; Rao and A l i , 1982) and occurs v i a d i f f e r e n t mechanisms. In eutherian mammals, the mechanism of dosage compensation involves i n a c t i v a t i o n of one of the X chromosomes i n the somatic c e l l s of the females (Gartler and Riggs, 1983). Random condensation of t h i s chromosome int o a heteropycnotic element occurs during early development (Kozak, 1975) and produces a mosaic of c l o n a l l y inherited t i s s u e with one or the other of the X chromosomes ina c t i v e i n gene expression. This e f f e c t i v e l y reduces the female c e l l to an X/0 condition, and equalizes the X-1inked expression between male and female c e l l s . What controls condensation i n eutherians i s not known. The use of X:Autosome translocations has revealed that, i n mouse, the mechanism acts subchromosomally since both pieces of such a translocation can condense (Cattanach, 1975). In man, a s i n g l e i n a c t i v a t i o n centre i s favoured (Gartler and Riggs, 1983). Maintenance of the inactivated state may be mediated p a r t l y by 5 m e t h y l a t i o n o f c y t o s i n e s i n c e t r e a t m e n t w i t h 5 - a z a c y t i d i n e c a n r e a c t i v a t e g e n e s f r o m a c o n d e n s e d X c h r o m o s o m e ( M o h a n d e s e t a l . , 1 9 8 1 ) . M a r s u p i a l s a l s o d i s p l a y d o s a g e c o m p e n s a t i o n , b u t a m a j o r d i f f e r e n c e f r o m t h e e u t h e r i a n s y s t e m i s t h a t t h e p a t e r n a l X i s p r e f e r e n t i a l l y i n a c t i v a t e d i n f e m a l e s <Cooper e t a l . , 1 9 7 5 ) . I t i s i n t e r e s t i n g t h a t n o n - r a n d o m i n a c t i v a t i o n a l s o o c c u r s i n t h o s e e u t h e r i a n e m b r y o n i c c e l l s t h a t d o n o t g i v e r i s e t o t h e f e t u s ( T a g a k i a n d S a s a k i , 1 9 7 5 ) . T h i s s u g g e s t s a n i m p r i n t i n g m e c h a n i s m may e x i s t i n t h e m a l e g e r m c e l l s t o mark X c h r o m o s o m e s a n d a c o u n t e r s y s t e m may e x i s t i n t h e e u t h e r i a n f e m a l e t o r e m o v e i t . I n m a m m a l i a n s p e r m a t o c y t e s t h e X c h r o m o s o m e i s f o u n d i n a c o m p l e t e l y i n a c t i v e f o r m ( L i f s c h y t z , 1 9 7 4 ) , somewhat a n a l a g o u s w i t h t h e B a r r b o d y i n t h e f e m a l e s o m a . I t i s e a s y t o i m a g i n e t h a t i n m a r s u p i a l e v o l u t i o n , s e l e c t i o n may h a v e f a v o r e d t h e c o n t i n u e d r e p r e s s i o n o f g e n e a c t i v i t y o f t h i s p a t e r n a l X a f t e r t r a n s m i s s i o n t o t h e z y g o t e . I n e u t h e r i a n s , t h e f a c t o r s r e s p o n s i b l e f o r c o n d e n s a t i o n p r e s u m a b l y c o u l d d i f f u s e r a n d o m l y b e t w e e n m a t e r n a l l y a n d p a t e r n a l l y d e r i v e d X ' s ( C h a n d r a a n d B r o w n , 1 9 7 4 ) . I n 1922 , B r i d g e s s u g g e s t e d t h a t t h e d i f f e r e n c e s i n f o r m a n d f u n c t i o n o b s e r v e d b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s a r e t h e d i r e c t r e s u l t o f d o s a g e d i f f e r e n c e s a r i s i n g f r o m t h e h a p l o - X c o n d i t i o n i n m a l e s . T h e X c h r o m o s o m e was c o n s i d e r e d t o c o n t a i n a n a b u n d a n c e o f f e m a l e d e t e r m i n i n g m o d i f i e r g e n e s , w h e r e a s t h e a u t o s o m e s c o n t a i n a p r e p o n d e r a n c e o f m a l e d e t e r m i n i n g l o c i . A s s u c h , a c e l l ' s d e t e r m i n e d f a t e t o b e c o m e m a l e o r f e m a l e w o u l d d e p e n d o n t h e r a t i o o f X c h r o m o s o m e m a t e r i a l t o t h a t o f t h e a u t o s o m e s . I n a 2X c o n d i t i o n t h e b a l a n c e i s t i p p e d i n f a v o r o f f e m a l e w h i l e i n t h e h a p l o X i t i s i n v a r i a b l y m a l e . He s u p p o r t e d h i s i d e a w i t h o b s e r v a t i o n s o n w h o l e c h r o m o s o m e h e t e r o p l o i d s ( B r i d g e s , 1 9 2 5 ) . A t r i p l o i d f e m a l e d e s i g n a t e d 3 X : 3 A ( t h i s d e n o t e s t h e number o f X c h r o m o s o m e s a n d t h e number o f a u t o s o m e s e t s , r a t i o X / A - 1 ) , was v i r t u a l l y i d e n t i c a l t o t h a t o f a d i p l o i d f e m a l e ( 2 X : 2 A , r a t i o • 1>. 1 X : 3 A i n d i v i d u a l s w e r e i n v a r i a b l y m a l e ( o f t e n t e r m e d m e t a m a l e s , r a t i o » . 3 3 ) a n d 3 X : 2 A i n d i v i d u a l s w e r e f e m a l e ( t e r m e d m e t a f e m a l e s , r a t i o = 1 . 5 ) . T h e X : A u t o s o m e r a t i o a p p e a r e d t o c o n t r o l t h e s e x d e t e r m i n a t i o n o f a c e l l — . 5 o r b e l o w y i e l d s a m a l e , 1 o r a b o v e y i e l d s a f e m a l e . I n d i v i d u a l s p o s s e s s i n g a 2 X : 3 A k a r y o t y p e h a v e a r a t i o o f . 6 6 , i n t e r m e d i a t e b e t w e e n t h e m a l e a n d f e m a l e l e v e l , a n d a c c o r d i n g l y , h a v e c e l l s t h a t a r e e i t h e r m a l e o r f e m a l e ( h e n c e t h e i r name, i n t e r s e x e s ) . I t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t t h e c e l l s c a n b e e i t h e r m a l e o r f e m a l e b u t n o t i n t e r m e d i a t e , w h i c h s u g g e s t s t h a t d e t e r m i n a t i o n a n d s u b s e q u e n t d i f f e r e n t i a t i o n i s l i m i t e d t o a b i n a r y mode o f a c t i o n . B r i d g e s s u g g e s t e d t h a t t h e c h a r a c t e r i s t i c m a l e p h e n o t y p e d i s p l a y e d b y h a p l o - X i n d i v i d u a l s was a n o r m a l c o n s e q u e n c e o f c h a n g i n g t h e b a l a n c e o f m o d i f i e r s w i t h i n t h e g e n o m e , a n d was n o d i f f e r e n t i n p r i n c i p l e t o t h e c h a r a c t e r i s t i c p h e n o t y p e d i s p l a y e d b y o t h e r c h r o m o s o m a l l y h a p l o i d i n d i v i d u a l s ( i e . h a p l o - 4 i n d i v i d u a l s ) . T h e m a j o r i t y o f c h a r a c t e r i s t i c s i n t h e m a l e a n d f e m a l e o r g a n i s m a r e s i m i l a r , b o t h a t t h e m o r p h o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l l e v e l s . B r i d g e s s u g g e s t e d t h a t n o n s e x - d e t e r m i n i n g l o c i o n t h e X c h r o m o s o m e h a d a v e r y h i g h l y b a l a n c e d s e t o f p o s i t i v e a n d n e g a t i v e m o d i f i e r s l o c a t e d o n t h e same c h r o m o s o m e , a n d t h u s v a r i a t i o n i n X - c h r o m o s o m e number w o u l d h a v e l i t t l e e f f e c t . 1 M u l l e r e t a l . (1931) p o s t u l a t e d t h a t d o s a g e c o m p e n s a t i o n i s b r o u g h t a b o u t b y X - l i n k e d m o d i f i e r s t h a t a r e d o s e d e p e n d e n t a n d i n h i b i t o r y i n n a t u r e . S i n c e t h e i n h i b i t o r y m o d i f i e r s v a r y d i r e c t l y w i t h t h e p l o i d y o f t h e X c h r o m o s o m e , m a l e s a n d f e m a l e s w o u l d d i s p l a y n o n e t d i f f e r e n c e i n X - l i n k e d g e n e e x p r e s s i o n . M u l l e r o r i g i n a t e d t h e t e r m " d o s a g e c o m p e n s a t i o n " t o d e s c r i b e t h i s p h e n o m e n o n . G o l d s c h m i d t (1956) h y p o t h e s i z e d t h a t d o s a g e c o m p e n s a t i o n n e e d n o t b e m e d i a t e d b y g e n e t i c m o d i f i e r s b u t i n s t e a d c o u l d r e s u l t f r o m d e v e l o p m e n t a l a n d p h y s i o l o g i c a l d i f f e r e n c e s t h a t n o r m a l l y e x i s t b e t w e e n t h e s e x e s . T h u s , m o d u l a t i o n o f X - l i n k e d g e n e e x p r e s s i o n w o u l d b e c o n t r o l l e d i n d i r e c t l y b y s e x - d e t e r m i n i n g l o c i l o c a t e d t h r o u g h o u t t h e g e n o m e . W i t h t h e s e h y p o t h e s e s i n m i n d , i t i s now p e r t i n e n t t o e x a m i n e t h e e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e c o n f i r m i n g t h e e x i s t e n c e o f d o s a g e c o m p e n s a t i o n i n D r o s o p h i l a . M u l l e r (1950) d e s c r i b e d some e a r l y work u t i l i z i n g t h e h y p o m o r p h i c e y e m u t a t i o n w_f^ . T h i s m u t a n t c o n t a i n s o n l y a s m a l l f r a c t i o n o f t h e w i l d - t y p e q u a n t i t y o f e y e p i g m e n t a n d e n a b l e s o n e t o v i s u a l l y d e t e r m i n e t h e l e v e l s o f p i g m e n t i n a h a p l o - X m a l e a n d d i p l o — X f e m a l e . No d i f f e r e n c e was o b s e r v e d b e t w e e n e u p l o i d m a l e s a n d f e m a l e s . A d u p l i c a t i o n f o r t h e w* l o c u s d o u b l e d p i g m e n t l e v e l s i n m a l e s , b u t r e s u l t e d i n o n l y a f i f t y p e r c e n t i n c r e a s e i n t h e f e m a l e . C l e a r l y t h e n , f o r e a c h a l l e l e , t h e m a l e p o s s e s s e s t w i c e a s much p i g m e n t a s d o e s t h e f e m a l e . T h e s e o b s e r v a t i o n s h a v e b e e n c o n f i r m e d u s i n g s p e c t r o p h o t o m e t r i c q u a n t i t a t i o n o f e x t r a c t e d e y e p i g m e n t s a n d h a v e b e e n e x t e n d e d w i t h m e a s u r e m e n t s u s i n g w i l d 8 t y p e a l l e l e s Df t h e w h i t e l o c u s ( S m i t h a n d L u c c h e s i , 1 9 6 9 ) . Komma ( 1 9 6 6 ) , S e e c o f e t a l . ( 1 9 6 9 ) , a n d Bowman a n d S i m p s o n (1973) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e t w o X - 1 i n k e d e n z y m e s G6PDH a n d 6PGDH d i s p l a y e d i d e n t i c a l maximum r e a c t i o n v e l o c i t i e s i n m a l e s a n d f e m a l e s . O b s e r v i n g t h e p h e n o t y p i c e n d p r o d u c t o r p r o t e i n p r o d u c t o f a g e n e i s s u b j e c t t o many i n t e r a c t i o n s w i t h o t h e r l o c i , a n d c o u l d b e m i s l e a d i n g . D o s a g e c o m p e n s a t i o n c o u l d b e m e d i a t e d b y p r o c e s s e s r a n g i n g f r o m DNA r e p l i c a t i o n t o p o s t t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s . M u k h e r j e e a n d B e e r m a n (1965) d e m o n s t r a t e d t h a t t o t a l RNA s y n t h e s i s o n l a r v a l s a l i v a r y g l a n d p o l y t e n e X c h r o m o s o m e s i s e q u i v a l e n t b e t w e e n m a l e a n d f e m a l e . O t h e r e v i d e n c e a l s o s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t t h e p h e n o m e n o n i s t r a n s c r i p t i o n a l l y r e g u l a t e d f R o e h r d a n z a n d L u c c h e s i , 1 9 7 7 ) . S i n c e e n z y m e a c t i v i t e s a p p e a r t o b e d o s e d e p e n d e n t i n s e g m e n t a l a n e u p l o i d s , i t s e e m s e v i d e n t t h a t a f a c t o r l i m i t i n g p r o d u c t l e v e l s a p p e a r s t o b e t h e a v a i l a b i l i t y o f a g e n e f o r t r a n s c r i p t i o n . O t h e r i n t e r m e d i a t e p r o c e s s e s a p p e a r n o t t o b e r a t e l i m i t i n g . T h u s , m e a s u r e m e n t s o f e n z y m e a c t i v i t i e s i n d i r e c t l y r e p r e s e n t t h e r a t e o f t r a n s c r i p t i o n o f t h e s t r u c t u r a l g e n e c o d i n g f o r i t . U s i n g e l e c t r o p h o r e t i c v a r i a n t s o f 6 P G D , K a z a z i a n e t a l . (1966) d e m o n s t r a t e d t h a t b o t h X c h r o m o s o m e s o f t h e f e m a l e w e r e a c t i v e s i m u l t a n e o u s l y a n d t h a t t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f e a c h was e q u i v a l e n t . ( T h i s was p r e v i o u s l y s u s p e c t e d o n g e n e t i c g r o u n d s ; i n d i v i d u a l s s i m u l t a n e o u s l y h e t e r o z y g o u s f o r m u t a n t a n d w i l d t y p e a l l e l e s a t t w o X - 1 i n k e d l o c i a r e p h e n o t y p i c a l l y w i l d t y p e . ) I f d o s a g e c o m p e n s a t i o n i s c o n t r o l l e d a t t h e t r a n s c r i p t i o n a l l e v e l , t h e n i t i s p o s s i b l e t h a t e i t h e r t h e m a l e X c h r o m o s o m e i s h y p e r a c t i v e d o r t h a t t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e f e m a l e X ' s i s b e i n g s u p r e s s e d . O f f e r m a n (1936) o b s e r v e d a d i f f e r e n c e i n t h e c y t o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f t h e m a l e a n d f e m a l e p o l y t e n e X c h r o m o s o m e s . T h e s i n g l e m a l e X a p p e a r e d t o b e p a l e r s t a i n i n g a n d s w o l l e n i n t h i c k n e s s t o a l m o s t t h e s i z e o f t h e p a i r e d a u t o s o m a l a r m s . I n c o n t r a s t , t h e f e m a l e X ' s a p p e a r e d c y t o l o g i c a l l y m o r e l i k e a u t o s o m a l r e g i o n s . I t was n o t known w h e t h e r t h i s d i f f e r e n c e was t h e r e s u l t o f c h r o m o s o m e s b e i n g i n a n u n p a i r e d c o n d i t i o n , o r i f i t r e f l e c t e d a n i m p o r t a n t a s p e c t o f m a l e X—chromosome s t r u c t u r e . D o b z h a n s k y (1957) o b s e r v e d t h a t i n i n s u l a r i s x D_j_ t r o p i c a l i s h y b r i d s , a l l c h r o m o s o m e a r m s r e m a i n i n t h e a s y n a p s e d c o n d i t i o n , a n d t h a t t h e m a l e X c h r o m o s o m e was i n v a r i a b l y l a r g e r a n d p a l e r s t a i n i n g t h a n e i t h e r t h e f e m a l e ' s X c h r o m o s o m e s o r t h e a u t o s o m e s . A r o n s o n e t a l . (1954) a n d L a i r d e t a l . (1980) h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t i n d e e d t h e m a l e p o l y t e n e X c o n t a i n s o n l y o n e h a l f t h e DNA o f t h e f e m a l e , b u t t h a t i t i s t e n p e r c e n t r i c h e r i n p r o t e i n s . K h e s i n (1973) a n d L e i b o v i t c h e t a l . (1976) f o u n d n o d i f f e r e n c e i n t h e c a p a c i t y o f t h e m a l e o r f e m a l e p o l y t e n e X c h r o m o s o m e s t o b i n d Ej_ c o l i RNA p o l y m e r a s e I . H o w e v e r , L e i b o v i t c h a n d B o g d a n o v a (1983) f o u n d t h a t t h e m a l e p o l y t e n e X p o s s e s s e s a h i g h e r a f f i n i t y t h a n t h e f e m a l e X f o r e x o g e n o u s h i s t o n e HI i n v i t r o . T e m p l a t e a c t i v i t y i n v i t r o f o r Ej_ c o l i p o l y m e r a s e I i s t w i c e a s h i g h o n a m a l e X t h a n o n a f e m a l e ' s ( K h e s i n e t a l . , 1974 ; L e i b o b v i t c h e t a l . , 1976 ; C h a t t e r j e e a n d M u k h e r j e e , 1 9 8 1 ) . T h i s d i f f e r e n c e c a n b e a b o l i s h e d b y t r e a t i n g t h e c h r o m o s o m e s w i t h a 1M s a l t wash p r i o r t o t r a n s c r i p t i o n a n a l y s i s ( C h a t t e r j e e e t a l . , 1981) s u g g e s t i n g t h a t a IO n o n - c o v a l e n t l y b o u n d c h r o m a t i n f a c t o r i s r e s p o n s i b l e f o r h y p e r a c t i v a t i o n . DNA r e p l i c a t i o n a l s o o c c u r s a t a f a s t e r r a t e o n t h e m a l e X c h r o m o s o m e ( B e r e n d e s , 1 9 6 6 ) . T a k e n t o g e t h e r , t h i s e v i d e n c e i m p l i e s t h a t a s t r u c t u r a l d i f f e r e n c e e x i s t s i n t h e c h r o m a t i n o f t h e m a l e X t h a t a l l o w s a n i n c r e a s e d r a t e o f t r a n s c r i p t i o n . C o n s i d e r i n g t h i s e f f e c t i s o b s e r v e d o n f i x e d c h r o m o s o m e s a n d n o t i n g t h e a b o v e m e n t i o n e d c y t o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e c h r o m a t i n o f t h e m a l e X i s l e s s t i g h t l y c o m p a c t e d , m a k i n g i t e a s i e r f o r p o l y m e r a s e t o g a i n a c c e s s o r t o a c t i v e l y t r a n s c r i b e a g e n e . T h e e f f e c t may b e m e d i a t e d b y n u c l e o s o m e p a c k i n g d e n s i t y , s i n c e a d e f i c i e n c y f o r t h e h i s t o n e g e n e c l u s t e r ( w h i c h p r e s u m a b l y r e s u l t s i n a n i n t r a c e l l u l a r d e f i c i e n c y o f h i s t o n e p r o t e i n s ) i n c r e a s e s t h e r a t e o f X—chromosome t r a n s c r i p t i o n i n v i v o ( K h e s i n a n d L e i b o v i t c h , 1 9 7 8 ) . H o w e v e r , i t s h o u l d b e n o t e d t h a t E i s s e n b e r g a n d L u c c h e s i (1983) d i d n o t d e t e c t a d i f f e r e n t i a l s e n s i t i v i t y o f t h e X - l i n k e d h e a t s h o c k g e n e s i n EJ_ p s e u d o o b s c u r a t o d i g e s t i o n b y D N A s e I . T h e c o m p e n s a t e d r e s p o n s e i s n o t a f f e c t e d when a n X - l i n k e d g e n e i n a s u r r o u n d i n g p i e c e o f X - c h r o m o s o m e i s i n s e r t e d i n t o a n o t h e r r e g i o n o f t h e genome ( S e e c o f e t a l . , 1 9 6 9 ; T o b l e r e t a l . , 1 9 7 1 ; B a i l l i e a n d C h o v n i c k , 1 9 7 1 ; Bowman a n d S i m p s o n , 1 9 7 3 ) . S i m i l a r l y , a l a r g e a u t o s o m a l s e g m e n t t r a n s p o s e d t o t h e X c h r o m o s o m e i s i n s e n s i t i v e t o t h e d o s a g e c o m p e n s a t i o n m e c h a n i s m ( R o e h r d a n z e t a l . , 1 9 7 7 ) . T o b l e r (1975) i n v e s t i g a t e d d o s a g e c o m p e n s a t i o n f o r t h e e n z y m e t r y p t o p h a n p y r o l a s e i n s t o c k s o f f l i e s t h a t h a d b e e n t r a n s f o r m e d w i t h w i l d - t y p e D N A . T h e s e II s t o c k s w e r e m u t a n t -for v e r m i l l i o n , t h e X - l i n k e d g e n e c o d i n g f o r t h e e n y z m e , b u t h a d t h e w i l d - t y p e g e n e s e q u e n c e i n s e r t e d i n a new c h r o m o s o m a l p o s i t i o n (Fox e t a l . ( 1 9 7 1 ) . T h e s e f l i e s d i s p l a y e d d o s a g e c o m p e n s a t i o n . M o r e r e c e n t l y , P - e l e m e n t m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n ( R u b i n a n d S p r a d l i n g , 1982) h a s a l l o w e d a c l o s e r e x a m i n a t i o n o f t h i s q u e s t i o n . A u t o s o m a l g e n e s t r a n s p o s e d t o t h e X c h r o m o s o m e c a n a c q u i r e t h e a b i l i t y t o d o s a g e c o m p e n s a t e ( S p r a d l i n g a n d R u b i n , 1 9 8 3 ; S c h o l n i c k e t a l . , 1 9 8 3 ; J . P o s a k o n y , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . H y p e r a c t i v a t i o n o f t h e s e g e n e s o c c u r s i n m a l e s , a l t h o u g h t h e m a g n i t u d e may b e somewhat l e s s t h a n t w o f o l d t h e f e m a l e l e v e l o f e x p r e s s i o n . H a z e l r i g g e t a l » , (19B4) h a s f o u n d t h a t s e q u e n c e s m e d i a t i n g h y p e r a c t i v a t i o n o f t h e X - l i n k e d w h i t e g e n e a r e l o c a t e d w i t h i n 12kb s u r r o u n d i n g t h e s t r u c t u r a l g e n e . M u t a t i o n s ( M u l l e r , 1950) a n d w i l d t y p e s g e n e s ( R o b e r t s a n d E v a n s - R o b e r t s , 1 9 7 9 ; O t a e t a l . , 1 9 8 1 ; B r o c k a n d R o b e r t s , 1982) a r e known w h i c h d o n o t d o s a g e c o m p e n s a t e . P r e s u m a b l y t h e s e e x c e p t i o n s r e p r e s e n t c a s e s w h e r e t h e r e g u l a t o r y e l e m e n t h a s b e e n damaged o r h a s n o t b e e n a c q u i r e d d u r i n g t h e c o u r s e o f e v o l u t i o n . K o r g e (1981) h a s d e m o n s t r a t e d t h a t a s i t e r e g u l a t i n g t h e a b i l i t y o f t h e X - l i n k e d g e n e S a s - 4 t o d o s a g e c o m p e n s a t e i s r e c o m b i n a t i o n a l l y s e p a r a b l e f r o m t h e s t r u c t u r a l g e n e . T h e s e r e s u l t s i m p l y t h a t c o m p e n s a t i o n i s p r o p a g a t e d f r o m many r e g u l a t o r y s i t e s d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t t h e X c h r o m o s o m e , a n d t h a t a c t i v a t i o n i s a c i s - a c t i n g a l t e r a t i o n t o c h r o m a t i n s t r u c t u r e . A s p r e v i o u s l y d i s c u s s e d , G o l d s c h m i d t f e l t t h a t d o s a g e c o m p e n s a t i o n c o u l d b e m e d i a t e d b y t h e n o r m a l p h y s i o l o g i c a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e s e x e s . H o w e v e r , M u l l e r ( 1 9 5 0 ) , Komma II ( 1 9 6 6 ) , a n d S m i t h a n d L u c c h e s i (1968) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e e x p r e s s i o n o f t h e X c h r o m o s o m e r e m a i n e d u n a f f e c t e d b y m u t a t i o n s w h i c h p h e n o t y p i c a l l y t r a n s f o r m f e m a l e s i n t o t h e o p p o s i t e s e x , o r m a l e s i n t o i n t e r s e x e s . G o l d s c h m i d t (1956) r e b u t t e d t h i s o b s e r v a t i o n b y c l a i m i n g t h a t t h e s e t r a n s f o r m e d i n d i v i d u a l s a c t u a l l y h a d n o t c h a n g e d s e x i n a p h y s i o l o g i c a l s e n s e , o n l y m o r p h o l o g i c a l l y . L a k h o t i a a n d M u k h e r j e e (1969) e x a m i n e d t r a n s c r i p t i o n i n f e m a l e i n d i v i d u a l s p o s s e s s i n g some h a p l o X c e l l s i n t h e i r s a l i v a r y g l a n d s , a n d f o u n d t h a t a l l c e l l t y p e s b e h a v e d a u t o n o m o u s l y . T h e sex o f t h e o r g a n i s m h a d n o e f f e c t o n d o s a g e c o m p e n s a t i o n , a n d i t was c o n c l u d e d t h a t t h e r e g u l a t i o n was a c e l l u l a r p h e n o m e n o n . I n d e e d , a n e u p l o i d D r o s o p h i l a t i s s u e c u l t u r e c e l l s w i t h f r o m o n e t o s i x X c h r o m o s o m e s a l l e x p r e s s i d e n t i c a l l e v e l s o f X - l i n k e d g e n e p r o d u c t ( K a k p a k o v e t a l . , 1969 ; G v o z d e v e t a l . , 1 9 7 1 ; N i k o s h k o v a n d K a k p a k o v , 1 9 8 1 ) . S t e w a r t a n d M e r r i a m ( 1 9 7 5 ) , a n d F a i z u l l i n a n d G v o z d e v (1973) d e s i g n e d e x p e r i m e n t s t o d e t e c t i n h i b i t o r y c o n t r o l l o c i o n t h e X c h r o m o s o m e , a s p r e d i c t e d b y M u l l e r * s h y p o t h e s i s . D o s a g e c o m p e n s a t i o n was o n l y r e p o r t e d w i t h c h a n g e s i n v o l v i n g a w h o l e X c h r o m o s o m e . I f a f r a c t i o n o f t h e c h r o m o s o m e was a d d e d , e x p r e s s i o n o f e n z y m e l o c i a p p e a r e d t o b e d o s e d e p e n d e n t . F u r t h e r m o r e , d u p l i c a t i o n o f a r e g i o n o u t s i d e t h e s t r u c t u r a l g e n e f o r a n e n z y m e h a d l i t t l e e f f e c t o n i t s e x p r e s s i o n . T h u s , t h e s e a u t h o r s c o n c l u d e d t h a t m o d i f i e r s w h i c h c o u l d i n h i b i t e x p r e s s i o n o f l o c i i n f e m a l e s t o t h e l e v e l f o u n d i n t h e m a l e w e r e n o t p r e s e n t o n t h e X c h r o m o s o m e . H o w e v e r , B i r c h l e r (1980) h a s r e c e n t l y d e s c r i b e d , i n a b s t r a c t f o r m o n l y , some p r e l i m i n a r y o b s e r v a t i o n s w h i c h d o s u p p o r t M u l l e r ' s h y p o t h e s i s . He f i n d s 13 s p e c i f i c r e g i o n s o f t h e X t h a t when v a r i e d i n d o s e , h a v e a n i n v e r s e e f f e c t o n e x p r e s s i o n o f l o c i o u t s i d e t h e a n e u p l a i d r e g i o n . A d e c i s i o n o n w h e t h e r t h e s e r e g i o n s r e f l e c t a c t u a l r e g u l a t o r y l o c i a w a i t s f u r t h e r e x p e r i m e n t a t i o n . I f d o s a g e c o m p e n s a t i o n i s c o n t r o l l e d b y m o d i f i e r s w i t h i n t h e X c h r o m o s o m e i t s e l f , a l t e r i n g a u t o s o m a l r e g i o n s s h o u l d h a v e n o e f f e c t . No d i f f e r e n c e i n X - l i n k e d g e n e p r o d u c t p e r u n i t o f DNA i s f o u n d b e t w e e n d i p l o i d a n d t r i p l o i d i n d i v i d u a l s , e i t h e r m o n i t o r i n g e n z y m e l e v e l s ( S e e c o f e t a l . , 1 9 6 9 ; L u c c h e s i a n d R a w l s , 1 9 7 3 a ; F a i z u l l i n a n d G v o z d e v , 1 9 7 3 ; M a r o n i a n d P l a u t , 1973a) o r t r a n s c r i p t i o n ( M a r o n i a n d P l a u t , 1 9 7 3 b ; A n a n i e v e t a l . , 1 9 7 4 ) . H o w e v e r , t r i p l o i d c e l l s (3X:3A> a r e l a r g e r ( D o b z h a n s k y , 1929) a n d c o n t a i n 1 . 5 t i m e s a s much g e n e p r o d u c t a s d i p l o i d c e l l s ( 2 X : 2 A ) . A u t o s o m a l t r i p l o i d s h a v e b e e n e x a m i n e d w i t h f r o m o n e t o t h r e e X c h r o m o s o m e s ; 3 X : 3 A i n d i v i d u a l s h a v e i d e n t i c a l l e v e l s o f p r o d u c t a s 2 X : 3 A i n t e r s e x e s ( S e e c o f e t a l . , 1969 ; A n a n i e v e t a l . , 1974 ; L u c c h e s i a n d R a w l s , 1973b) a n d b o t h h a v e o n l y s l i g h t l y m o r e p r o d u c t t h a n a t r i p l o i d m e t a m a l e ( 1 X : 3 A ) ( L u c c h e s i e t a l . , 1 9 7 7 ) . M o r e o v e r , m e t a f e m a l e s ( 3 X : 2 A ) d o s a g e c o m p e n s a t e ( L u c c h e s i e t a l . , 1974 ; S t e w a r t a n d M e r r i a m , 1 9 7 5 ) , w h e r e a s t r i p l o i d s ( 3 X : 3 A ) ( p o s s e s s i n g t h e same number o f X ' s ) h a v e a f i f t y p e r c e n t i n c r e a s e i n X - l i n k e d g e n e a c t i v i t y . I t i s c l e a r t h e n t h a t t h e p l o i d y o f t h e a u t o s o m e s h a s a p r o f o u n d e f f e c t o n X - l i n k e d g e n e e x p r e s s i o n . T h u s , t h e l e v e l o f X - l i n k e d p r o d u c t p e r e e l 1 i s n o t d e p e n d e n t o n t h e number o f X c h r o m o s o m e s p r e s e n t , b u t r a t h e r o n t h e p l o i d y o f t h e a u t o s o m e s . H o w e v e r , t h e t r a n s c r i p t i o n a l r a t e o f a n X - l i n k e d g e n e i s d e p e n d e n t b o t h o n t h e number o f a u t o s o m e s e t s a n d o n t h e number o f o t h e r X 14-c h r o m o s o m e s w i t h i n t h e c e l l . I n o t h e r w o r d s , X - l i n k e d g e n e t r a n s c r i p t i o n i s p r o p o r t i o n a l t o t h e r a t i o o-f a u t o s o m e s e t s t o X c h r o m o s o m e s . T h i s p r o m p t e d t h e h y p o t h e s i s t h a t X - c h r o m o s o m e t r a n s c r i p t i o n i s d e p e n d e n t o n a n a u t o s o m a l l y p r o d u c e d a c t i v a t o r w h i c h e x i s t s i n l i m i t e d q u a n t i t y w i t h i n t h e c e l l ( M a r o n i a n d P l a u t , 1 9 7 3 b ; S c h w a r t z , 1 9 7 3 ; L u c c h e s i , 1 9 7 7 ) . A r e q u i r e m e n t o f t h i s h y p o t h e s i s i s t h a t t h e a c t i v a t o r b e r e s t r i c t e d i n a c t i o n t o X - l i n k e d g e n e s . I n a d i p l o i d m a l e c e l l , t h e s i n g l e X w o u l d b e u t i l i z i n g a l l t h e a c t i v a t o r . I n t h e f e m a l e , t h e t w o X ' s w o u l d b e i n c o m p e t i t i o n f o r t h e same q u a n t i t y o f a c t i v a t o r a n d e a c h w o u l d e x p r e s s a t o n l y o n e — h a l f t h e r a t e o f t h e m a l e X . I n t r i p l o i d s , t h e t o t a l amount o f a c t i v a t o r w o u l d b e i n c r e a s e d p e r c e l l b y f i f t y p e r c e n t , w h i c h p r o d u c e s a p r o p o r t i o n a l i n c r e a s e i n X c h r o m o s o m e t r a n s c r i p t i o n r a t e . A c o m p l i c a t i o n e x i s t s when t h e X / A r a t i o i s a l t e r e d b y a d d i n g a n a d d i t i o n a l a u t o s o m e s e t . C e l l s i z e i s i n c r e a s e d a c c o r d i n g l y a n d t h e c o n c e n t r a t i o n o f r e g u l a t o r y m o l e c u l e s ( p e r g e n e ) w o u l d b e r e d u c e d . I f c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t X - l i n k e d r e p r e s s o r s o f X - c h r o m o s o m e t r a n s c r i p t i o n w e r e r e g u l a t i n g d o s a g e c o m p e n s a t i o n , t h e n t h e e x p r e s s i o n f r o m t h i s c h r o m o s o m e w o u l d b e d i r e c t l y c o r r e l a t e d w i t h n u c l e a r v o l u m e . F o r e x a m p l e , t h e same amount o f X - l i n k e d r e p r e s s o r w o u l d b e p r o d u c e d i n 2 X : 2 A a n d 2 X : 3 A i n d i v i d u a l s b u t s i n c e t h e n u c l e a r v o l u m e i s i n c r e a s e d b y 1 . 5 i n t h e l a t t e r , a c o n c o m i t a n t o n e - t h i r d r e d u c t i o n i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f r e g u l a t o r y m o l e c u l e s w o u l d r e s u l t . T h u s , b o t h p o s i t i v e a n d n e g a t i v e t h e o r i e s o f r e g u l a t i o n a r e c o m p a t i b l e w i t h t h e d a t a o b t a i n e d f o r X - c h r o m o s o m e t r a n s c r i p t i o n b e t w e e n d i p l o i d s a n d t r i p l o i d s . H o w e v e r , M a r o n i a n d L u c c h e s i (1980) 15 t e s t e d t h e a u t o s o m a l a c t i v a t i o n h y p o t h e s i s b y v a r y i n g t h e X / A r a t i o w i t h X - c h r o m o s o m e a n e u p l o i d s . A l l o f t h e s e i n d i v i d u a l s p o s s e s s e d a d i p l o i d s e t o f a u t o s o m e s . I n d i v i d u a l s p o s s e s s i n g t w o X ' s t r a n s c r i b e d a t . 5 t h e r a t e o f a m a l e , w h i l e t h o s e p . o s s e s s i n g 1 . 5 X ' s t r a n s c r i b e d a t . 6 6 t h e m a l e r a t e . T h u s , e v e n i n d i p l o i d s ( p r e s u m a b l y w i t h t h e same c e l l s i z e ) X—chromosome t r a n s c r i p t i o n was i n v e r s e l y d e p e n d e n t o n t h e X / A r a t i o . S i m i l a r o b s e r v a t i o n s h a v e b e e n made i n d i p l o i d f e m a l e s p o s s e s s i n g a d d i t i o n a l X - c h r o m o s o m e f r a g m e n t s ( W i l l i a m s o n a n d B e n t l e y , 1 9 8 3 ) . B a k e r a n d R i d g e (1980) h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t s e x d i f f e r e n t i a t i o n i n D r o s o p h i l a i s a c e l l u l a r , r a t h e r t h a n a n o r g a n i s m a l p r o c e s s . T h u s , t r i p l o i d i n t e r s e x e s ( 2 X : 3 A ) p o s s e s s c e l l s w h i c h a r e e i t h e r m a l e o r f e m a l e . T h e a v e r a g e e x p r e s s i o n o f t h e i r X c h r o m o s o m e s i s i n t e r m e d i a t e b e t w e e n m a l e a n d f e m a l e . I f c e l l s c a n t r a n s c r i b e t h e i r X - c h r o m o s o m e s o n l y a t e i t h e r t h e m a l e o r f e m a l e r a t e , t h e n b o t h h i g h a n d l o w e x p r e s s i n g n u c l e i a r e e x p e c t e d t o b e f o u n d . M a r o n i a n d P l a u t (1973b) m e a s u r e d X - c h r o m o s o m e t r a n s c r i p t i o n i n i n d i v i d u a l n u c l e i f r o m 2 X : 3 A i n t e r s e x e s , a n d f o u n d a u n i m o d a l d i s t r i b u t i o n o f a c t i v i t i e s . T h i s s u g g e s t s t h a t s e x d e t e r m i n a t i o n a n d d o s a g e c o m p e n s a t i o n may b e c o n t r o l l e d b y s e p a r a t e m e c h a n i s m s . M e a s u r e m e n t s o f t r a n s c r i p t i o n o n t h e p o l y t e n e X c h r o m o s o m e a v e r a g e s t h e e x p r e s s i o n o f many s e p a r a t e g e n e s a n d many c o p i e s o f e a c h g e n e . I t i s p o s s i b l e t h a t i n d i v i d u a l g e n e s o n e a c h c h r o m o s o m e , when s u b j e c t e d t o i n t e r m e d i a t e l e v e l s o f r e g u l a t i o n , a r e e x p r e s s e d a t e i t h e r t h e m a l e o r f e m a l e r a t e , t h e a v e r a g e o f w h i c h i s i n t e r m e d i a t e b e t w e e n t h e t w o . A l t e r n a t i v e l y , d o s a g e lb c o m p e n s a t i o n may b e a f l e x i b l e p h e n o m e n o n c a p a b l e o f m u l t i p l e l e v e l s o f e x p r e s s i o n , w h e r e a s t h e d i f f e r e n t i a t e d s e x u a l p h e n o t y p e i s l i m i t e d e i t h e r t o m a l e o r t o f e m a l e . H o w e v e r , g e n e t i c a n a l y s i s o f t h e Sex l e t h a l ( S x l ) l o c u s ( C l i n e 1978 , 1979 , 1 9 8 3 , 1984) h a s r e v e a l e d t h a t d o s a g e c o m p e n s a t i o n a n d s e x d e t e r m i n a t i o n d o h a v e a common r e g u l a t o r y f o u n d a t i o n . T h e e x p r e s s i o n o f t h i s g e n e i s r e q u i r e d i n f e m a l e s b o t h t o p r e v e n t h y p e r a c t i v a t i o n o f t h e X c h r o m o s o m e ( L u c c h e s i a n d S k r i p s k y , 1981) a n d t o m a i n t a i n t h e f e m a l e s t a t e o f s e x u a l d e v e l o p m e n t ( S a n c h e z a n d N o t h i g e r , 1982} 1 9 8 3 ) . N e c e s s a r i l y , t h i s g e n e m u s t b e r e p r e s s e d i n m a l e s ; c o n s t i t u t i v e m u t a n t s a t t h i s l o c u s a r e m a l e l e t h a l s , s i n c e t h e s e i n d i v i d u a l s d i e i f X - c h r o m o s o m e h y p e r a c t i v a t i o n c a n n o t o c c u r . T h e s i g n a l s w h i c h c o n t r o l t h e a c t i v i t y s t a t e o f 5x1 h a v e n o t b e e n i d e n t i f i e d , a l t h o u g h a u t o r e g u l a t i o n h a s b e e n i m p l i e d . I t i s c l e a r , h o w e v e r , t h a t t h e X / A r a t i o p l a y s a n i m p o r t a n t p a r t i n t h i s p r o c e s s i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e a c t i o n o f t h e d a u g h t e r l e s s g e n e , ( d a ) . T h e w i l d t y p e p r o d u c t f r o m t h e d a l o c u s , i n a d d i t i o n t o n o n s e x - s p e c i f i c r e q u i r e m e n t s , i s n e e d e d f o r t h e e x p r e s s i o n o f S x l . T h u s , d a u g h t e r s f r o m d a m o t h e r s d i e a s e m b r y o s f r o m a l a c k o f S x l " ~ p r o d u c t ( C l i n e , 1 9 7 8 ) . T h e c o m p o n e n t s w h i c h a r e r e s p o n s i b l e , i n p a r t , f o r h y p e r a c t i v a t i o n o f t h e X c h r o m o s o m e i n m a l e s h a v e b e e n i d e n t i f i e d a t t h e g e n e t i c l e v e l . S e v e r a l m a l e - s p e c i f i c l e t h a l m u t a t i o n s w h i c h r e d u c e t h e e x p r e s s i o n o f t h e X c h r o m o s o m e h a v e b e e n r e p o r t e d ( B e l o t e a n d L u c c h e s i , 1 9 8 0 a ; 1 9 8 0 b ) . P r e s u m a b l y t h e w i l d t y p e f u n c t i o n o f t h e s e g e n e s i s i n t i m a t e l y i n v o l v e d i n n a l l o w i n g h y p e r a c t i v a t i o n o f X - l i n k e d l o c i . T h e s e p r o d u c t s a r e r e q u i r e d t h r o u g h o u t m a l e d e v e l o p m e n t ( B e l o t e , 1 9 8 3 ) . T h e a b s e n c e o f t h e s e p r o d u c t s o n l y p a r t i a l l y r e s c u e s t h e f e m a l e l e t h a l i t y o f S x l n u l l m u t a t i o n s ( S k r i p s k y a n d L u c c h e s i * 1982 ; C I i n e , 1 9 8 4 ) . I? CHAPTER ONE MEASUREMENTS OF GENE PRODUCT L E V E L S IN TRISOMIC—2L L A R V A E I n t r o d u c t i o n I n t h i s c h a p t e r , t h e a m o u n t s o f p r o d u c t s s y n t h e s i z e d f r o m f i v e g e n e s w e r e e x a m i n e d i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c — 2 L l a r v a e . T h e s e g e n e s w e r e l o c a t e d w i t h i n t h e d u p l i c a t e d a r m a n d w e r e e x p e c t e d t o p r o d u c e a p p r o x i m a t e l y 1 .5 t i m e s t h e a m o u n t o f p r o d u c t i n t r i s o m i e s a s i n d i p l o i d s . W h i l e t w o o f t h e g e n e p r o d u c t s w e r e f o u n d t o b e d o s e d e p e n d e n t , t h e o t h e r t h r e e w e r e o b s e r v e d t o b e a t d i p l o i d ( c o m p e n s a t e d ) l e v e l s . S u b s e q u e n t e x p e r i m e n t s r e v e a l e d t h a t , f o r o n e l o c u s , c o m p e n s a t i o n o p e r a t e s i n d e p e n d e n t l y o f t h e number o f o t h e r a c t i v e a l l e l e s p r e s e n t . A l l t h r e e a l l e l e s o f a c o m p e n s a t e d l o c u s a r e e x p r e s s e d i n e a c h c e l l , a n d a s s u c h c o m p e n s a t i o n a p p e a r s t o o p e r a t e b y r e d u c i n g t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f e a c h g e n e b y o n e - t h i r d . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s G e n e t i c S t r a i n s a n d P r o c e d u r e s : A l i s t o f b i o c h e m i c a l l o c i e x a m i n e d i n t h i s a n d s u b s e q u e n t c h a p t e r s i s p r e s e n t e d i n T a b l e 1 . T h e f o l l o w i n g s t r a i n s o f D . m e l a n o q a s t e r w e r e u s e d : <i> O r e g o n R, ( i i ) C ( 2 L ) S H l + 8 F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w . ( i i i ) C ( 2 L ) V H 1 1 t ; F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w . <iv) C ( 2 L ) V D 4 . a l G p d h 1 3 B l / I n ( 2 L ) C v . a l C v O p d h ^ l F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w . (v) C ( 2 L ) P . b ; C ( 2 R ) 5 K l A c n bw. ( v i ) a l Gpdh** B l L / I n (2L+2R) C v . a l C v G p d h * * . ( v i i ) D f ( 2 L ) G d h A / I n ( 2 L R ) S M l . C v I t . ( v i i i ) G p d h t a ° - 1 - ^ / I n ( 2 L R ) S M l . C v I t . ( i x ) b A d h ' ^ QSP o r c n . (x) G p d h " , , ( x i ) G p d h B . ( x i i ) G p d h C ! T a n d ( x i i i ) s e v e r a l s t r a i n s w i t h t r a n s l o c a t i o n s b e t w e e n t h e Y a n d 2 L c h r o m o s o m e s ( L i n d s l e y e t a l . , 1 9 7 2 ) , w h i c h a r e l i s t e d i n T a b l e 5 . C h a r a c t e r i s t i c s o f t h e o t h e r m u t a n t a l l e l e s a n d c h r o m o s o m e s h a v e b e e n d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( O ' B r i e n a n d M a c l n t y r e , 1976$ L i n d s l e y a n d G r e l l , 1968J G r e l 1 , 1970J H o l m , 1 9 7 6 ) . I n d i v i d u a l s t r i s o m i c f o r t h e l e f t a r m o f c h r o m o s o m e 2 w e r e p r o d u c e d a s shown i n F i g u r e 1 ( s e e F i t z e - E a r l e a n d H o l m , 1 9 7 8 ) . G e n e t i c a n d c y t o l o g i c a l s t u d i e s r e v e a l e d t h a t w h e r e a s m o n o s o m i c p r o g e n y d i e d u r i n g e m b r y o g e n e s i s , a h i g h p r o p o r t i o n o f t h e h y b r i d p r o g e n y i n h e r i t i n g t h r e e e n t i r e l e f t a r m s o f c h r o m o s o m e 2 s u r v i v e t o p h a r a t e a d u l t s . I n f a c t , t h e v i a b i l i t y o f t r i s o m i c - 2 L a n d t r i s o m i c - X i n d i v i d u a l s i s c o m p a r a b l e . F i v e g e n e - e n z y m e s y s t e m s o n c h r o m o s o m e 2 L , o n e o n t h e X c h r o m o s o m e , a n d o n e o n c h r o m o s o m e 3 L h a v e b e e n a n a l y z e d i n t h i s 2\ F i g u r e 1 . M a t i n g p r o c e d u r e u t i l i z e d t o p r o d u c e t r i s o m i c l a r v a e . I n g e n e r a l a s t a n d a r d s t r a i n was c r o s s e d t o a s t r a i n b e a r i n g a c o m p o u n d c h r o m o s o m e a n d t w o f r e e c h r o m o s o m a l a r m s . Z y g o t e s a r e f o r m e d w h i c h a r e t r i s o m i c o r m o n o s o m i c f o r t h e arm a s s o c i a t e d w i t h t h e c o m p o u n d c h r o m o s o m e . X 2 . \c(2L);F(2R) \ a a m e t e s standard \ ^ gametes \ . 2R 2R 2L 2R m > • t r isomy 2L m o n o s o m y 2L 23 c h a p t e r . T h e i r c y t o l o g i c a l map p o s i t i o n s ( O ' B r i e n a n d M a c l n t y r e , 1976 ; V o e l k e r e t a l . , 1 9 7 9 a ; V o e l k e r e t a l . , 1 9 7 9 b ; W o o d r u f f a n d A s h b u r n e r , 1979) a r e l i s t e d i n T a b l e 1 . T o show t h a t t h e a c t i v i t y o f e a c h e n z y m e n o r m a l l y was p r o p o r t i o n a l t o t h e number o f g e n e c o p i e s , e n z y m e l e v e l s w e r e m e a s u r e d i n s t r a i n s w i t h s m a l l d u p l i c a t i o n s ( t h r e e d o s e s ) f o r e a c h o f t h e f i v e l o c i s t u d i e d o n c h r o m o s o m e 2 L . S e g m e n t a l a n e u p l o i d s w e r e g e n e r a t e d w i t h t h e T ( Y ; 2 ) c h r o m o s o m e s d e s c r i b e d b y L i n d s l e y e t a l . , ( 1 9 7 2 ) . F l i e s t r i s o m i c f o r c h r o m o s o m e 2 L , b u t c a r r y i n g e i t h e r a d e f i c i e n c y o r a n u l l a l l e l e f o r a s p e c i f i c l o c u s w e r e p r o d u c e d b y c r o s s i n g C ( 2 L ) 1 t 8 F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w f e m a l e s t o m a l e s t h a t w e r e h e t e r o z y g o u s f o r t h e i n v e r t e d c h r o m o s o m e I n ( 2 L R ) S M l . C v I t a n d e i t h e r G p d h " " " V " * (a n o n c o m p l e m e n t i n g n u l l a l l e l e f o r G p d h ) o r D f ( 2 L ) G d h A (a d e f i c i e n c y f o r t h e G p d h s t r u c t u r a l g e n e ) o r t o m a l e s h o m o z y g o u s f o r A d h ^ - (a n o n c o m p l e m e n t i n g n u l l a l l e l e f o r A d h ) . L a r v a e c a r r y i n g e i t h e r t h e n u l l a l l e l e o r d e f i c i e n c y w e r e d i s t i n g u i s h e d b y t h e p r e s e n c e o f p i g m e n t i n t h e l a r v a l M a l p i g h i a n t u b u l e s i n c o n t r a s t t o t h e i r n o n p i g m e n t e d < l ± / l t / l t > s i b s . A c o m p o u n d c h r o m o s o m e h e t e r o z y g o u s f o r t w o G p d h e l e c t r o p h o r e t i c v a r i a n t s was c o n s t r u c t e d b y m a t i n g C ( 2 L ) P . b ; C ( 2 R ) S K l A . c n bw m a l e s t o a l Gpdh** B l L / I n ( 2 L + 2 R ) C v . a l C v G p d h ^ f e m a l e s t h a t h a d b e e n t r e a t e d w i t h 2500 r a d s f r o m a 6 0 C o s o u r c e . A C ( 2 L ) V D 4 . a l G p d h * 3 B l / I n ( 2 L ) C v . a l C v 6 p d h " ; C ( 2 R ) S K l A . c n bw i n d i v i d u a l was r e c o v e r e d , a n d a s t o c k was e s t a b l i s h e d . F r o m a c r o s s o f a* f e m a l e s b e a r i n g t h i s c o m p o u n d 2 L c h r o m o s o m e w i t h C ( 2 L ) P . b ; F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w m a l e s , C ( 2 L ) V D 4 . a l Gpdh** B l / I n ( 2 L ) C v . a l C v G p d h " ; F<2R)bw/F<2R)bw n o n d i s j u n c t i o n a l p r o g e n y w e r e r e c o v e r e d . T h e s e i n d i v i d u a l s , when c r o s s e d t o f l i e s p o s s e s s i n g t h e G p d h 0 a l l e l e o n s t a n d a r d s e c o n d c h r o m o s o m e s , p r o d u c e t r i s o m i e s c o n t a i n i n g t h r e e d i f f e r e n t e l e c t r o p h o r e t i c v a r i a n t s . A l l s t r a i n s w e r e r e a r e d a t 2 5 d e g r e e s C o n s t a n d a r d c o r n m e a l s u c r o s e medium s u p p l e m e n t e d w i t h t h e m o l d i n h i b i t o r T e g o s e p t (0.22%) a n d w i t h t h e a n t i b i o t i c s t e t r a c y c l i n e a n d s t r e p t o m y c i n a t 10 m g / 1 i t e r e a c h . E n z y m e A s s a y s : A l l d e t e r m i n a t i o n s o f e n z y m e a c t i v i t y w e r e p e r f o r m e d o n 5 0 t o 150mg s a m p l e s o f l a t e t h i r d i n s t a r l a r v a e c o l l e c t e d f r o m t h e s i d e s o f u n c r o w d e d h a l f p i n t c u l t u r e b o t t l e s . H o m o g e n a t e s w e r e p r e p a r e d f r o m 25mg o f l a r v a e p e r ml o f lOmtl p h o s p h a t e b u f f e r (pH 8 . 2 ) f o r a l l e n z y m e s e x c e p t d i h y d r o x y p h e n y l a l a n i n e ( d o p a ) d e c a r b o x y l a s e <DDC), f o r w h i c h 0 . 1 M T r i s <pH 7 . 2 ) was u s e d . A f t e r c e n t r i f u g a t i o n , e n z y m e a c t i v i t y ( e x c e p t f o r DDC) was m o n i t o r e d b y t h e c h a n g e i n a b s o r p t i o n a t 340nm b y t h e p r o d u c t i o n o r u t i l i z a t i o n o f NADH o r N A D P H ; DDC a c t i v i t y was d e t e r m i n e d f r o m t h e a m o u n t o f 1 4 C 0 2 r e l e a s e d f r o m X " * C - 1 d o p a , c o r r e c t e d f o r s p o n t a n e o u s d e c a r b o x y l a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f h e a t - i n a c t i v a t e d e x t r a c t ( H o d g e t t s a n d K o n o p k a , 1 9 7 3 ) . A l l a s s a y s w e r e o p t i m i z e d w i t h r e s p e c t t o a l l 25 c o m p o n e n t s . T h e c o n d i t i o n s f o r e a c h a s s a y w e r e a s f o l l o w s : p h o s p h o g l y c e r a t e k i n a s e ( P G K ; E C 2 . 7 . 2 . 3 ) , 0 . I M T r i s , pH 7 . 6 / 0 . 9 m M E D T A / 1 5 m M N A D H / 2 . 2 m M A T P / 1 3 m M g l y c e r a t e - 3 - p h o s p h a t e / 3 . 2 m M M g S 0 * » / 2 . 5 u n i t s o f g l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e (EC 1 . 2 . 1 . 1 2 ) p e r ml 5 a - g l y c e r o l - 3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e (NAD) (GPDH E C 1 . 1 . 1 . 8 ) , 0 . 1 M g l y c i n e , p H 9 . 5 / 2 . 5 m M g l y c e r o l - 3 - p h o s p h a t e / 1 0 m M NAD+J c y t o p l a s m i c m a l a t e d e h y d r o g e n a s e ( cMDH; E C 1 . 1 . 1 . 3 7 ) , 50mM p h o s p h a t e , p H 7 . 3 / 0 . 2 5 m M NADH/5mM o x a l o a c e t i c a c i d ; a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ( A D H ; E C 1 . 1 . 1 . 1 ) , O . IM g l y c i n e p h o s p h a t e b u f f e r , 1 . 7 g / l i t e r , pH 9 . 0 / 2 . 5 mM N A D / 2 % e t h a n o l ; d o p a d e c a r b o x y l a s e ( D D C ; E C 4 . 1 . 1 . 2 6 ) , 0 . I M T r i s , pH 7 . 2 / 0 . 1 2 m M p y r i d o x a l - 5 ' - p h o s p h a t e / 2 5 mM p h e n y l t h i o u r e a / 0 . 2 u C i (1 C i = 3 . 7 x 1 0 * ° b e c q u e r e l s ) o f ( l - l J * C ) d o p a (New E n g l a n d N u c l e a r ; 3 C i / m m o l ; i s o c i t r a t e d e h y d r o g e n a s e ( I D H ; E C 1 . 1 . 1 . 4 2 ) , 0 . IM T r i s pH 8/5mM Mg=<V0.05mM N A D P / 0 . 5 m M i s o c i t r a t e ; a n d 6 - p h o s p h o g l u c o n a t e d e h y d r o g e n a s e ( 6 P G D ; E C 1 . 1 . 1 . 4 4 ) , 0 . I M T r i s , pH 7 . 5 / 1 . 3 mM NADP/20mM M g C l = i / 3 . ImM 6 - p h o s p h o g l u c o n a t e . A c t i v i t e s a r e e x p r e s s e d a s u n i t s p e r mg o f p r o t e i n i n t h e e x t r a c t , w h e r e o n e u n i t i s d e f i n e d a s t h e u t i l i z a t i o n o f 1 p m o l o f s u b s t r a t e p e r m i n . P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n was d e t e r m i n e d ( L o w r y , 1 9 5 2 ) , w i t h b o v i n e s e r u m a l b u m i n a s t h e s t a n d a r d . T h e e n z y m e l e v e l s e x p e c t e d i n t h e a b s e n c e o f d o s a g e c o m p e n s a t i o n w e r e e s t i m a t e d b y summing t h e a c t i v i t y f o u n d i n t h e c o m p o u n d - f r e e s t r a i n p l u s o n e h a l f o f t h e a c t i v i t y f o u n d i n t h e O r e g o n R s t r a i n . T h i s c o r r e s p o n d s t o t h e p a r e n t a l c o n t r i b u t i o n o f c h r o m o s o m e 2 L t o t h e k a r y o t y p e o f t h e t r i s o m i e s . T h e e n z y m e l e v e l s e x p e c t e d i n t h e p r e s e n c e o f a u t o s o m a l d o s a g e c o m p e n s a t i o n w e r e e s t i m a t e d a s s i m p l y t w o - t h i r d s o f t h e e x p e c t e d n o n c o m p e n s a t e d v a l u e . S t a n d a r d e r r o r e s t i m a t e s f o r t h e s e v a l u e s w e r e o b t a i n e d b y p a r t i t i o n i n g t h e v a r i a n c e f r o m t h e two d i p l o i d s t r a i n s i n a c c o r d a n c e b o t h w i t h t h e i r c o n t r i b u t i o n t o t h e e s t i m a t e d mean a n d w i t h t h e i r s a m p l e s i z e s . O b s e r v e d a n d e x p e c t e d v a l u e s w e r e c o m p a r e d u s i n g a t - t e s t w i t h c o r r e c t i o n , w e r e n e c e s s a r y , f o r d i f f e r e n c e s i n s a m p l e v a r i a n c e a s s u g g e s t e d b y W e l c h ( 1 9 7 4 ) . E l e c t r o p h o r e t i c P r o c e d u r e s E l e c t r o p h o r e s i s o f 6PDH i n t r i s o m i e s p o s s e s s i n g t h r e e v a r i a n t s was p e r f o r m e d i n a 12% < w t / v o l ) s t a r c h / 0 . 1 M T r i s c i t r a t e g e l s y s t e m , p H 6 . 9 r u n a t 300V ( 2 5 - 3 5 mA) f o r 3 2 h r . G e l s w e r e s t a i n e d f o r 6PDH (Shaw a n d P r a s a d , 1 9 7 0 ) . 27 T a b l e 1 B i o c h e m i c a l l o c i e x a m i n e d i n t h i s a n d s u b s e q u e n t c h a p t e r s (-from T r e a t - C l e m o n s a n d D o a n e , 1 9 8 4 ) . G e n e t i c Map G e n e P r o d u c t P o s i t i o n A d h a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e 2 L - 5 0 . 1 Ak a r g i n i n e k i n a s e 3 L - 2 5 . 2 A i d a l d o l a s e 3 R - 9 1 . 5 A l d o x a l d e h y d e o x i d a s e 3 R - 5 7 . 2 C a t c a t a l a s e 3 L - 4 4 . 3 cMdh c y t o p l a s m i c m a l a t e d e h y d r o g e n a s e 2 L - 3 7 . 0 D d c d o p a - d e c a r b o x y l a s e 2 L - 5 3 . 9 E s t - •6 e s t e r a s e — 6 3 L - 3 6 . 8 Fum -f u m a r a s e 1 - 1 9 . 9 G p d h a l p h a - g l y c e r o p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e 2 L - 2 0 . 5 G p t g l u t a m a t e - p y r o v a t e t r a n s a m i n a s e 1 - 4 2 . 6 Had b e t a - h y d r o x y a c i d d e h y d r o g e n a s e 1 - 5 4 . 4 h s p 22 22 kD h e a t s h o c k p r o t e i n 3 L - 6 7 B h s p 23 23 kD h e a t s h o c k p r o t e i n 3 L - 6 7 B h s p 26 26 kD h e a t s h o c k p r o t e i n 3 L - 6 7 B h s p 27 27 kD h e a t s h o c k p r o t e i n 3 L - 6 7 B h s p 68 68 kD h e a t s h o c k p r o t e i n 3 R - 9 5 D h s p 70 70 kD h e a t s h o c k p r o t e i n 3 R - 8 7 A a n d 8 7 C h s p 83 8 3 k D h e a t s h o c k p r o t e i n 3 L - 6 3 B C I d h i s o c i t r a t e d e h y d r o g e n a s e 3 L - 2 7 . 1 L S P - l a l a r v a l s e r u m p r o t e i n - 1 a l p h a 1 - 3 9 . 5 L S P - •lb l a r v a l s e r u m p r o t e i n — 1 b e t a 2 L - 1 . 9 L S P - i g l a r v a l s e r u m p r o t e i n - 1 gamma 3 L — 1 . 4 1 L S P - •2 l a r v a l s e r u m p r o t e i n - 2 3 L - 3 7 Men m a l i c e n z y m e 3 R - 5 1 . 7 P g d 6 - p h o s p h o g l u c o n a t e d e h y d r o g e n a s e 1 - 0 . 6 3 P g i p h o s p h o g l u c o i s e m e r a s e 2 R - 2 0 . 5 Pgk p h o s p h o g l y c e r a t e k i n a s e 2 L - 5 . 9 Pgm p h o s p h o g l u c o m u t a s e 3 L - 4 3 . 4 S o d s u p e r o x i d e d i s m u t a s e 3 L - 3 4 . 6 Zw g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e 1 - 6 2 . 9 22 R E S U L T S T h e e f f e c t o f a n e u p l o i d y f o r s m a l l g e n e t i c s e g m e n t s o n e n z y m e a c t i v i t y h a s b e e n e x t e n s i v e l y e x a m i n e d i n a number o f s p e c i e s . I n d e e d , c h a n g e s i n e n z y m e a c t i v i t y a s s o c i a t e d w i t h a n e u p l o i d s a r e o f t e n u s e d t o l o c a t e t h e s t r u c t u r a l g e n e o f a n e n z y m e o r a d o s e - d e p e n d e n t l o c u s r e g u l a t i n g i t s e x p r e s s i o n ' ( O ' B r i e n a n d M a c l n t y r e , 1 9 7 6 ; R a w l s a n d L u c c h e s i , 1 9 7 4 ) . H o w e v e r , i n D r o s o p h i l a t h e e f f e c t o f a u t o s o m a l t r i s o m y o n g e n e e x p r e s s i o n i s u n k n o w n . T h e r e f o r e , we e x a m i n e d t h e e x p r e s s i o n o f s e v e n g e n e - e n z y m e s y s t e m s l o c a t e d w i t h i n a n d o u t s i d e a t r i s o m i c r e g i o n , n a m e l y c h r o m o s o m e 2L. T h i s was a c c o m p l i s h e d b y c o m p a r i n g e n z y m e l e v e l s i n d i p l o i d p a r e n t a l s t o c k s a n d t h e i r t r i s o m i c o f f s p r i n g . T h e r e s u l t s f o r t h e t w o d i p l o i d p a r e n t a l s t o c k s , O r e g o n R a n d C(2L ) + ; F ((2R>b w / F(2R ) b w a n d f o r t h e i r t r i s o m i c - 2 L o f f s p r i n g a r e p r e s e n t e d i n T a b l e s 2 - 4 . E x p e c t e d e n z y m e l e v e l s a r e a l s o p r e s e n t e d . F r o m p r e v i o u s f i n d i n g s w i t h s e g m e n t a l a n e u p l o i d s f o r a u t o s o m a l r e g i o n s , a s i m p l e p r e d i c t i o n i s t h a t g e n e s d u p l i c a t e d i n t r i s o m i e s w o u l d show s t r i c t d o s e d e p e n d e n c e . A c c o r d i n g l y , t h e e x p e c t e d e n z y m e l e v e l w o u l d s i m p l y r e p r e s e n t t h e sum o f t h e a c t i v i t i e s o f e a c h o f t h e t h r e e g e n e c o p i e s . A l t e r n a t i v e l y , a c o m p e n s a t o r y m e c h a n i s m may e x i s t f o r c o n t r o l l i n g t h e e x p r e s s i o n o f t h e g e n e s i n t h i s t r i s o m i c a r m . T h e s i m p l e s t p r e d i c t i o n w o u l d b e t h a t c o m p e n s a t i o n a c t s o n a l l t h r e e a l l e l e s e q u a l l y , r e s u l t i n g i n a d i p l o i d l e v e l o f a c t i v i t y , a p p r o x i m a t e l y t w o - t h i r d s t h a t o f t h e n o n c o m p e n s a t e d l e v e l . T h e e n z y m e a c t i v i t i e s o f t h r e e l o c i , P q k t G p d h , a n d c M d h r a r e c l e a r l y a t t h e l e v e l 2^ e x p e c t e d i f c o m p e n s a t i o n o c c u r s ( T a b l e 2 ) . T h e s e l o c i a r e l o c a t e d i n a p p r o x i m a t e l y t h e d i s t a l t w o - t h i r d s o f t h e c h r o m o s o m e a r m . I n c o n t r a s t , t h e e n z y m e s p r o d u c e d b y t h e t w o p r o x i m a l l y l o c a t e d l o c i , A d h a n d D d c f show d o s e - d e p e n d e n t l e v e l s o f a c t i v i t y , i n d i c a t i n g a n a b s e n c e o f d o s a g e c o m p e n s a t i o n ( T a b l e 3 ) . ADH a c t i v i t y i s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n e x p e c t e d , e v e n f o r a n o n c o m p e n s a t e d g e n e . T h u s , i t a p p e a r s t h a t some l o c i i n t r i s o m i c i n d i v i d u a l s a r e c a p a b l e o f , o r a r e d i r e c t e d t o w a r d c o m p e n s a t i o n , w h e r e a s o t h e r s a r e n o t , a n d t h i s d i f f e r e n c e a p p e a r s t o b e r e g i o n a l l y d i s t r i b u t e d a l o n g t h e c h r o m o s o m e a r m . R e s u l t s f r o m r e c i p r o c a l c r o s s e s w e r e s t a t i s t i c a l l y i n d i s t i n g u i s h a b l e . T h e s t r u c t u a l g e n e s f o r IDH o n c h r o m o s o m e 3 L a n d 6P6D o n t h e X c h r o m o s o m e w e r e m o n i t o r e d t o o b s e r v e what e f f e c t , i f a n y , t r i s o m y 2 L m i g h t h a v e o n t h e a c t i v i t e s o f u n l i n k e d l o c i . T h e e n z y m e a c t i v i t i e s o f t h e s e l o c i i n t r i s o m i e s was a p p r o x i m a t e l y 15% b e l o w t h e e x p e c t e d d i p l o i d l e v e l ( T a b l e 4 ) . A d i r e c t a s s e s s m e n t o f t h e e f f e c t o f t r i s o m y o n t h e e x p r e s s i o n o f a g e n e c a n b e made b y c o m p a r i n g t h e a c t i v i t y o f t h e same t w o a l l e l e s i n b o t h d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 2 L s t r a i n s . T h i s was a c c o m p l i s h e d b y c o m p a r i n g t h e e n z y m e a c t i v i t y o f i n d i v i d u a l l o c i o n t h e same C ( 2 L ) c h r o m o s o m e i n C ( 2 L ) - b e a r i n g d i p l o i d s t r a i n s w i t h a t r i s o m i c s t r a i n i n w h i c h t h e s t a n d a r d c h r o m o s o m e c a r r i e d e i t h e r a n u l l a l l e l e o r a d e f i c i e n c y f o r t h e e n z y m e l o c u s i n q u e s t i o n . T h e r e s u l t s a r e shown i n F i g u r e 2 . F o r 6 p d h f t h e e x p r e s s i o n s o f t h e t w o a c t i v e a l l e l e s i s r e d u c e d b y a p p r o x i m a t e l y o n e - t h i r d i n t h e t r i s o m i c s t r a i n s c a r r y i n g e i t h e r a n u l l a l l e l e o r a d e f i c i e n c y 30 T a b l e 2 E n z y m e l e v e l s f o r c o m p e n s a t i n g l o c i i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 2 L l a r v a e . E n z y m e a n d c h r o m o s o m e p o s i t i o n Pgk G p d h cMdh G e n o t y p e 2 2 C - 2 3 E 2 5 F - 2 6 B 3 0 F - 3 1 D O r e g o n R 0 . 9 8 6 + 0 . 0 3 1 0 . 2 1 2 + 0 . 0 0 8 3 . 3 6 + 0 . 0 5 6 ( d i p l o i d ) ( IO) (14) (10) C ( 2 L ) + ; F ( 2 R ) b w / 0 . 8 3 1 + 0 . 0 1 9 O . 1 3 2 ± 0 . 0 0 8 3 . 7 1 ± 0 . 0 5 3 F ( 2 R ) b w ( d i p l o i d ) (11) (14) (10) C ( 2 L ) + / 0 . 9 7 3 + 0 . 0 4 9 0 . 1 5 4 + 0 . 0 0 5 3 . 9 1 + 0 . 2 9 4 + / F ( 2 R ) b w ( C F ? x O R * ) (10) (10) (4) ( t r i s o m i c - 2 L ) C ( 2 L ) + / 0 . 1 6 8 ± 0 . 0 1 9 3 . 7 3 + 0 . 1 0 2 + / F ( 2 R ) b w (0R<? x C F ? ) (3) (11) ( t r i s o m i c - 2 L ) N o n c o m p e n s a t e d 1 . 3 2 + 0 . 0 1 6 0 . 2 3 8 + 0 . 0 0 6 5 . 3 9 + 0 . 0 4 4 E s t i m a t e C o m p e n s a t e d 0 . 8 8 3 + 0 . 0 1 1 0 . 1 5 9 + 0 . 0 0 4 3 . 5 9 + 0 . 0 2 9 E s t i m a t e E n z y m e a c t i v i t i e s e x p r e s s e d a t t h e mean ± S E i n u n i t s / m g o f p r o t e i n . E s t i m a t e s o f e n z y m e a c t i v i t i e s e x p e c t e d i n t r i s o m i e s f o r d o s e — d e p e n d e n t ( n o n c o m p e n s a t e d ) a n d c o m p e n s a t e d g e n e e x p r e s s i o n a r e p r o v i d e d . N u m b e r s i n b r a c k e t s r e p r e s e n t t h e s a m p l e s i z e s . 31 T a b l e 3 E n z y m e l e v e l s f o r n o n c o m p e n s a t i n g l o c i i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 2 L l a r v a e . E n z y m e a n d c h r o m o s o m e p o s i t i o n A d h Ddc G e n o t y p e 3 5 B 2 3 7 B 1 0 - 3 7 C 7 O r e g o n R 6 7 . 6 + 2 . 4 8 . 6 1 + 1 . 0 2 ( d i p l o i d ) (14) (16) C ( 2 L ) + ? F ( 2 R ) b w / 4 0 . 9 + 1 . 7 1 0 . 9 + 0 . 7 8 F ( 2 R ) b w ( d i p l o i d ) (14) (18) C ( 2 L ) + / 8 9 . O + 1 . 9 1 6 . 7 + 0 . 7 1 4 + / F ( 2 R ) b w (CF x OR ) (10) (20) ( t r i s o m i c - 2 L ) C ( 2 L ) + / 8 8 . 1 + 1 . 7 +F(2R)bw (OR x C F ) (3) ( t r i s o m i c - 2 L N o n c o m p e n s a t e d 7 4 . 7 + 1 . 8 1 5 . 2 + 0 . 5 5 2 E s t i m a t e C o m p e n s a t e d 4 9 . 8 + 1 . 2 0 1 0 . 1 + 0 . 3 4 8 E s t i m a t e E n z y m e a c t i v i t i e s e x p r e s s e d a t t h e mean + S E i n u n i t s x 1 0 3 p e r mg o f p r o t e i n f o r A d h a n d i n u n i t s x 10** f o r D d c . E s t i m a t e s o f e n z y m e a c t i v i t i e s e x p e c t e d i n t r i s o m i e s f o r d o s e - d e p e n d e n t ( n o n c o m p e n s a t e d ) a n d c o m p e n s a t e d g e n e e x p r e s s i o n a r e p r o v i d e d . N u m b e r s i n b r a c k e t s r e p r e s e n t t h e s a m p l e s i z e s . 32 T a b l e 4 E n z y m e l e v e l s f o r t w o u n l i n k e d l o c i i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c — 2 L l a r v a e . E n z y m e a n d c h r o m o s o m e p o s i t i o n I d h 6 P g d G e n o t y p e 6 6 B - 6 7 C 2 D 3 - 2 D 6 O r e g o n R 1 1 0 + 4 . 3 3 6 . 8 + 1 . 2 ( d i p l o i d ) ( IO) (10) C ( 2 L ) + l F ( 2 R ) b w / 7 3 . 3 ± 2 . 8 5 4 . 0 ± 1 . 1 F ( 2 R ) b w ( d i p l o i d ) (7) (10) C ( 2 L > + / 7 4 . 9 ± 1 . 0 4 0 . 2 ± 1 . 6 + / F ( 2 R ) b w (CF x OR > (10) (10) ( t r i s o m i c - 2 L ) C ( 2 L ) + / 8 1 . 5 + 4 . 0 + / F ( 2 R ) b w (OR x C F ) (3) ( t r i s o m i c - 2 L ) E s t i m a t e d mean 9 1 . 7 ± 1 . 3 9 4 9 . 7 ± 0 . 5 7 6 R e p r e s s e d E s t i m a t e 6 0 . 6 ± 0 . 9 3 3 3 . 1 ± 0 . 3 8 E n z y m e a c t i v i t i e s e x p r e s s e d a t t h e mean ± S E i n u n i t s x 1 0 3 p e r mg o f p r o t e i n . E s t i m a t e s o f e n z y m e a c t i v i t i e s e x p e c t e d i n t r i s o m i e s f o r d o s e - d e p e n d e n t ( n o n c o m p e n s a t e d ) a n d c o m p e n s a t e d g e n e e x p r e s s i o n a r e p r o v i d e d . N u m b e r s i n b r a c k e t s r e p r e s e n t t h e s a m p l e s i z e s . 33 F i g u r e 2 . E x p r e s s i o n o f e n z y m e l o c i o n t h e C ( 2 L ) l t c h r o m o s o m e i n d i p l o i d s a n d i n t r i s o m i e s p o s s e s s i n g e i t h e r a n u l l a l l e l e o r a d e f i c i e n c y f o r t h e l o c i m e a s u r e d . O n l y t h e g e n o t y p e o f t h e l e f t a rm o f c h r o m o s o m e 2 i s g i v e n . A c t i v i t i e s f r o m l o c i o n t h e C ( 2 L ) l t c h r o m o s o m e a r e g r a p h e d r e l a t i v e t o t h e d i p l o i d l e v e l . A l l s t a n d a r d e r r o r s w e r e l e s s t h a n 5X o f t h e m e a n . ( L e f t ) G p d h . ( R i g h t ) A d h . 35 f o r t h e s t r u c t u r a l g e n e . T h i s c l e a r l y d e m o n s t r a t e s t h a t t h e e x p r e s s i o n o f t h i s g e n e - e n z y m e s y s t e m i s c o m p e n s a t e d i n t r i s o m i c — 2 L i n d i v i d u a l s . I n a n a n a l o g o u s e x p e r i m e n t i n v o l v i n g t h e n o n c o m p e n s a t i n g l o c u s , A d h , t h e e x p r e s s i o n o f t h e t w o a c t i v e a l l e l e s i n t h e C ( 2 L ) c h r o m o s o m e was u n a f f e c t e d i n t r i s o m i c i n d i v i d u a l s b e a r i n g a n A d h n u l l a l l e l e o n t h e s t a n d a r d s e c o n d c h r o m o s o m e . T h e s e r e s u l t s r e v e a l t h a t t h e r e s p o n s e o f c o m p e n s a t i n g a n d n o n c o m p e n s a t i n g g e n e s i s i n d e p e n d e n t o f t h e number o f a c t i v e a l l e l e s . F o r t h e o b s e r v e d a u t o s o m a l d o s a g e c o m p e n s a t i o n t o b e a v a l i d p h e n o m e n o n , c o m p e n s a t i n g l o c i must b e d o s e d e p e n d e n t i n d i p l o i d s t r a i n s w i t h s m a l l d u p l i c a t i o n s a t t h e same s t a g e o f d e v e l o p m e n t . S m a l l d u p l i c a t i o n s o f t h e s t r u c t u r a l g e n e s f o r a l l f i v e e n z y m e s w e r e made , a n d e n z y m e a s s a y s w e r e p e r f o r m e d o n m a t u r e t h i r d i n s t a r l a r v a e ( T a b l e 5 ) . T h e e n z y m e a c t i v i t i e s i n t h e s e a n e u p l o i d s s h o w e d d o s e d e p e n d e n c e ; t h a t i s , t h e l e v e l s i n t h e s t r a i n s w i t h t h r e e d o s e s w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t h a n t h o s e o f t h e i r d i p l o i d p a r e n t s . S i m p l i s t i c a l l y , c o m p e n s a t i o n may o c c u r b y o n e o f t w o m e c h a n i s m s : f i r s t , e a c h a l l e l e may b e e x p r e s s e d a t t w o - t h i r d s o f t h e n o r m a l d i p l o i d l e v e l o r , s e c o n d , o n e a l l e l e may b e c o m p l e t e l y r e p r e s s e d w h i l e t h e o t h e r t w o a r e f u l l y a c t i v e . T o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e s e t w o a l t e r n a t i v e s , t r i s o m i e s p o s s e s s i n g t h r e e e l e c t r o p h o r e t i c v a r i a n t s f o r G p d h w e r e p r o d u c e d . S t a r c h g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f t h i s e n z y m e f r o m t r i s o m i e s d e m o n s t r a t e d t h a t a l l t h r e e a l l e l e s o f t h i s c o m p e n s a t e d g e n e w e r e e x p r e s s e d ( F i g u r e 3 ) . 3b T a b l e 5 D o s e d e p e n d e n c e o f e n z y m e l e v e l s i n s m a l l s e g m e n t a l a n e u p l o i d s i n l a t e t h i r d i n s t a r l a r v a e . D u p l i — T r a n s l o — G e n e c a t i o n c a t i o n D o s e A c t i v i t y R a t i o Pgk 2 2 D - 2 4 A G120 2 0 . 5 5 9 + 0 . 0 1 8 (5) R136 2 0 . 5 3 5 + 0 . 0 0 9 (7) 1 . 3 1 D p G 1 2 0 - R 1 3 6 3 0 . 7 1 4 0 . 0 3 3 (8) G p d h 2 5 F - 2 6 B D106 2 0 . 113 + 0 . 0 0 8 (5) G105 2 0 . 136 + 0 . 0 0 B <5> 1 . 6 6 DpD106-6105 3 0 . 2 0 7 + 0 . 0 0 7 (5) cMdh 3 0 F - 3 1 E F L 5 2 2 1 . 5 3 + 0 . 0 9 8 (3) A 1 6 2 2 1 . 4 4 + 0 . 130 (3) 1 . 2 9 D p L 5 2 - A 1 6 2 3 1 . 9 1 + 0 . 0 4 0 (5) A d h 3 4 B - 3 5 D G74 2 3 9 . 1 + 0 . 6 7 (6) P 5 8 2 3 6 . 7 + 0 . 6 8 (6) 1 . 7 9 Dp G 7 4 - P 5 8 3 6 8 . 0 + 1 . 6 0 (6) Ddc 3 6 E F - 3 7 D D219 2 1 1 . 0 3 0 . 8 5 (4) H174 2 1 1 . 7 0 + 0 . 7 6 (4) 1 . 4 1 Dp D 2 1 9 - H 1 7 4 3 1 5 . 9 8 + 0 . 3 6 (4) A c t i v i t y u n i t s a r e t h e same a s i n T a b l e s 2 t o 4 . R a t i o r e p r e s e n t s t h e e n z y m e l e v e l s f o u n d i n d u p l i c a t i o n - b e a r i n g l a r v a e r e l a t i v e t o t h e mean o f t h a t f o u n d i n t h e i r p a r e n t s . 37 F i g u r e 3 . E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o f G p d h v a r i a n t s i n t r i s o m i e s . B , A , a n d C r e p r e s e n t m o b i l i t y v a r i a n t s o f G p d h . L a n e s B , A , a n d C a r e f r o m d i p l o i d h o m o z y g o u s i n d i v i d u a l s ; l a n e s A / B , A / C a n d B / C a r e f r o m d i p o i d h e t e r o z y g o t e s * l a n e s d e s i g n a t e d T a r e f r o m t r i s o m i e s p o s s e s s i n g a l l t h r e e v a r i a n t s p r o d u c e d f r o m r e c i p r o c a l c r o s s e s . T h e l e f t l a n e o f e a c h p a i r o f T r i s o m i c s a m p l e s w e r e d e r i v e d f r o m t r i s o m i c o f f s p r i n g p r o d u c e d f r o m c o m p o u n d - f r e e m a l e s , a n d t h e r i g h t l a n e f r o m c o m p o u n d - f r e e f e m a l e p a r e n t s . +ve , M o b i l i t y t o w a r d s a n o d e . 39 D I S C U S S I O N I n D r o s p h i l a , X - l i n k e d l o c i t r a n s c r i b e a t d i f f e r e n t a n d p r e d i c t a b l e r a t e s d e p e n d i n g o n t h e g e n o t y p e ( L u c c h e s i , 1 9 7 7 ; 1 9 8 3 ) . T h e t o t a l X - l i n k e d t r a n s c r i p t i o n w i t h i n a d i p l o i d n u c l e u s i s c o n s t a n t , r e g a r d l e s s o f t h e number o f X c h r o m o s o m e s . T h u s , t h e t r a n s c r i p t i o n a l r a t e o f a s i n g l e X - l i n k e d s t r u c t u r a l g e n e v a r i e s i n d i r e c t p r o p o r t i o n t o t h e number o f X - l i n k e d t e m p l a t e s p r e s e n t i n t h e n u c l e u s . F o r e x a m p l e , i n d i v i d u a l s w i t h o n e o r w i t h t h r e e X c h r o m o s o m e s t r a n s c r i b e X — l i n k e d l o c i a t t w i c e o r a t t w o - t h i r d s t h e r a t e o f d i p l o i d f e m a l e s , r e s p e c t i v e l y . I n a d d i t i o n , t h e t o t a l l e v e l o f X c h r o m o s o m e - l i n k e d t r a n s c r i p t i o n i s d i r e c t e d t o m a t c h t h a t o f t h e a u t o s o m e s a n d i s d i r e c t l y d e p e n d e n t o n t h e i r n u m b e r . F o r e x a m p l e , X - l i n k e d t r a n s c r i p t i o n i n i n d i v i d u a l s p o s s e s s i n g t w o X c h r o m o s o m e s a n d t h r e e s e t s o f a u t o s o m e s (a t r i p l o i d i n t e r s e x ) i s 50% g r e a t e r t h a n n o r m a l d i p l o i d f e m a l e s ( two X c h r o m o s o m e s a n d t w o s e t s o f a u t o s o m e s ) . T h e o b s e r v a t i o n t h a t i n d i v i d u a l s t r i s o m i c f o r t h e X c h r o m o s o m e show d o s a g e c o m p e n s a t i o n ( L u c c h e s i e t a l . , 1 9 7 4 ; S t e w a r t a n d M e r r i a m , 1975) i s o f p a r t i c u l a r r e l e v a n c e t o t h i s s t u d y . W h e r e a s d i p l o i d i n d i v i d u a l s w i t h o n e , t w o o r t h r e e X c h r o m o s o m e s e x p r e s s s e x - l i n k e d t r a i t s e q u a l l y , m a l e s o r f e m a l e s h a v i n g s m a l l d u p l i c a t i o n s o r d e l e t i o n s o f t h e X c h r o m o s o m e g e n e s d o show d o s e - d e p e n d e n t l e v e l s o f g e n e e x p r e s s i o n ( L u c c h e s i , 1978 ; M a r o n i a n d L u c c h e s i , 1 9 8 0 ) . I n c o n t r a s t t o X - l i n k e d l o c i , i t h a s b e e n o b s e r v e d t h a t a u t o s o m a l l o c i a r e d o s e d e p e n d e n t r e g a r d l e s s o f t h e c h r o m o s o m a l c o n s t i t u t i o n . G e n e s i n s m a l l d u p l i c a t e d s e g m e n t s o f t h e 4-0 a u t o s o m e s , l i k e t h e i r X - l i n k e d c o u n t e r p a r t s , p r o d u c e d o s e - d e p e n d e n t l e v e l s o f g e n e p r o d u c t ( T a b l e 2 ) . H o w e v e r , i n i n d i v i d u a l s t r i s o m i c f o r t h e e n t i r e l e f t a r m o f c h r o m o s o m e 2 , we h a v e o b s e r v e d t h a t t h r e e d i s t a l l y m a p p i n g e n z y m e l o c i (Pok ( 7 . 6 ) , G p d h ( 2 0 . 5 ) , a n d cMdh ( 3 7 . 2 ) ) show l e v e l s o f a c t i v i t y e x p e c t e d o f a d i p l o i d . T h u s , a c o m p e n s a t o r y m e c h a n i s m a p p e a r s t o b e a c t i n g . N o t a l l g e n e s o n t h e t r i s o m i c c h r o m o s o m e a r m a r e c o m p e n s a t e d s i n c e t w o p r o x i m a l l y l o c a t e d l o c i (Adh ( 5 0 . 1 ) a n d Ddc ( 5 3 . 9 ) ) r e m a i n d o s e d e p e n d e n t . S u p e r f i c i a l l y , a u t o s o m a l d o s a g e c o m p e n s a t i o n a p p e a r s t o b e an a l l - o r — n o n e p h e n o m e n o n a c t i n g a t t h e l e v e l o f t h e i n d i v i d u a l g e n e . T h e r e s u l t s o f t h e f i v e g e n e - e n z y m e s y s t e m s s t u d i e d s u g g e s t t h a t t h e d i s t a l t w o - t h i r d s o f t h e c h r o m o s o m e c o m p e n s a t e s w h i l e t h e p r o x i m a l o n e - t h i r d d o e s n o t ( F i g u r e 4 ) . O n e c a n s p e c u l a t e t h a t t h i s r e g i o n a l i t y i n t h e c o m p e n s a t o r y r e s p o n s e r e f l e c t s e i t h e r a d i f f e r e n c e i n g e n e o r g a n i z a t i o n o r a d i f f e r e n c e i n c h r o m o s o m e s t r u c t u r e c a p a b l e o f r e s p o n d i n g t o c o m p e n s a t i o n . A l t e r n a t i v e l y , t h i s r e g i o n a l i t y may b e s i m p l y a n a r t i f a c t o f t h e s m a l l number o f l o c i s a m p l e d . W h i l e two g e n e s i n D .  m e l a n o a a s t e r a r e n o t d o s a g e c o m p e n s a t e d , t h e y a r e n o t l o c a t e d i n d i s t i n c t r e g i o n s ( R o b e r t s a n d E v a n s - R o b e r t s , 1979aS O t a e t a l . , 1 9 8 1 ) . I n c o n t r a s t , r e g i o n a l i t y f o r s e x - l i n k e d d o s a g e c o m p e n s a t i o n h a s b e e n o b s e r v e d i n a r e l a t e d s p e c i e s , p .  m i r a n d a ( S t r o b e l , e t a l . , 1 9 7 8 ) . T o f u r t h e r e x a m i n e t h e r e s p o n s e o f c o m p e n s a t e d a n d n o n c o m p e n s a t e d l o c i i n t r i s o m i e s , t h e same t w o a c t i v e a l l e l e s f o r b o t h A d h a n d f o r Gtodh w e r e m e a s u r e d i n d i p l o i d F i g u r e 4 . Summary b a r g r a p h o-f e n z y m e q u a n t i t i e s i n 2 L t r i s o m i e s r e l a t i v e t o d i p l o i d s . L e v e l 2 g e n e - d o s e e x p r e s s e d r e p r e s e n t s t h e e x p e c t e d c o m p e n s a t e d l e v e l o f e x p r e s s i o n ; l e v e l 3 g e n e - d o s e e x p r e s s e d r e p r e s e n t s t h e e x p e c t e d n o n c o m p e n s a t e d e s t i m a t e . a a •o < a> E S LU o o (9 TJ a O a. pass aid x 3 asoQ-auag 4-3 a n d i n t r i s o m i c s t r a i n s ( F i g u r e 2 ) . I n t h e t r i s o m i c s t r a i n s , t h e s t a n d a r d c h r o m o s o m e p o s s e s s e d e i t h e r a n u l l a l l e l e o r a d e l e t i o n t h a t e l i m i n a t e d t h e a c t i v i t y o f t h e t h i r d a l l e l e . F o r A d h , t h e a c t i v i t y o f e a c h a l l e l e was i d e n t i c a l i n t r i s o m i c a n d d i p l o i d s t r a i n s , a s e x p e c t e d o f a n y n o n c o m p e n s a t e d l o c u s . T h e i d e n t i c a l e x p r e s s i o n o f A d h a l l e l e s i n t r i s o m i c a n d d i p l o i d s t r a i n s s u g g e s t s t h a t a n y p h y s i o l o g i c a l d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e m i s m i n i m a l . I n c o n t r a s t , t h e e x p r e s s i o n o f e a c h G p d h a l l e l e i n t h e t r i s o m i c s t r a i n was r e d u c e d b y o n e - t h i r d r e l a t i v e t o t h e e x p r e s s i o n o f t h i s same a l l e l e i n t h e d i p l o i d s t r a i n . A n a l y s i s o f t r i s o m i e s p o s s e s s i n g t h r e e e l e c t r o p h o r e t i c v a r i a n t s f o r GPDH d e m o n s t r a t e d t h a t a l l t h r e e l o c i w e r e e x p r e s s e d . T h e i m p l i c a t i o n s o f t h e s e r e s u l t s a r e d i s c u s s e d f u r t h e r i n c h a p t e r 2 . T o e x a m i n e t h e i n f l u e n c e o f t r i s o m y 2 L o n u n l i n k e d l o c i , t h e l e v e l s o f IDH f r o m c h r o m o s o m e 3 L a n d 6PGD f r o m t h e X c h r o m o s o m e w e r e m e a s u r e d . I n t h e t r i s o m i e s , e a c h d i s p l a y e d a l e v e l somewhat l o w e r t h a n e x p e c t e d ( a p p r o x i m a t e l y 15%). W h e t h e r t h i s r e f l e c t s a g e n e r a l e f f e c t o f t r i s o m y o n n o n l i n k e d g e n e s , d i f f e r e n c e s i n g e n d e r , o r s i m p l y g e n e t i c v a r i a t i o n ( L a u r i e - A h l b e r g e t a l . , I 9 6 0 ; B i j l s m a , 1980) ( i s o g e n i c s t r a i n s w e r e n o t u s e d ) a w a i t s a m o r e e x t e n s i v e s u r v e y o f o t h e r u n l i n k e d l o c i a n d o t h e r t r i s o m i e s . B e c a u s e we h a v e n o t e s t a b l i s h e d t h a t t h e d e c r e a s e s i n IDH a n d 6PGD a c t i v i t i e s a r e a s p e c i f i c e f f e c t o f t r i s o m y , we h e s i t a t e t o u s e t h e m a s i n t e r n a l s t a n d a r d s . T h e r e f o r e , i n d e a l i n g w i t h g r o s s l y a l t e r e d g e n o t y p e s s u c h a s -t r i s o m i e s , a n y c h a n g e s i n e n z y m e a c t i v i t y s h o u l d p e r h a p s b e i n t e r p r e t e d i n i t i a l l y a s l o c u s s p e c i f i c r a t h e r t h a n r e f l e c t i v e o f t o t a l g e n o m i c a c t i v i t y . T h e d a t a r a i s e s t w o q u e s t i o n s . F i r s t , b y what m e c h a n i s m d o e s a u t o s o m a l d o s a g e c o m p e n s a t i o n o c c u r a n d , s e c o n d , why s h o u l d i t e x i s t f o r a u t o s o m a l a n e u p l o i d s ? Two m e c h a n i s m s f o r s e x - l i n k e d d o s a g e c o m p e n s a t i o n h a v e b e e n h y p o t h e s i z e d , a n d b o t h a r e p r e s u m e d t o a c t a t t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n . O n e m o d e l i s b a s e d o n r e p r e s s i o n a n d t h e o t h e r i s b a s e d o n a c t i v a t i o n o f X - l i n k e d g e n e e x p r e s s i o n . T h e f i r s t m o d e l p o s t u l a t e s t h e e x i s t e n c e o f X - l i n k e d l o c i , t h e m s e l v e s n o t d o s a g e c o m p e n s a t e d , w h i c h m o d u l a t e t h e a c t i v i t y o f o t h e r - X - l i n k e d g e n e s b y p a r t i a l l y r e p r e s s i n g t r a n s c r i p t i o n ( M u l l e r , 1 9 5 0 ) . A s t h e number o f X c h r o m o s o m e s i n c r e a s e s , t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e r e p r e s s o r s u b s t a n c e i n c r e a s e s a n d t h e amount o f t r a n s c r i p t i o n f r o m e a c h X — l i n k e d t e m p l a t e d e c r e a s e s ( c o m p e n s a t i o n ) . E v i d e n c e h a s b e e n p r e s e n t e d f o r ( B i r c h l e r , 1980) a n d a g a i n s t ( S t e w a r t , a n d M e r r i a m , 1975) t h e e x i s t e n c e o f t h e s e r e p r e s s o r l o c i o n t h e X c h r o m o s o m e . T h e s e c o n d m o d e l s u g g e s t s t h a t t h e t r a n s c r i p t i o n i s m o d u l a t e d b y n o n l i n k e d l o c i t h a t p r o d u c e a l i m i t e d a m o u n t o f a d i f f u s i b l e a c t i v a t o r t h a t X - l i n k e d g e n e s c o m p e t e f o r t h e a c t i v a t o r ( M a r o n i a n d P l a u t , 1 9 7 3 ; S c h w a r t z , 1 9 7 3 ) . I n c r e a s e s o r d e c r e a s e s i n t h e number o f X c h r o m o s o m e s h a v e n o e f f e c t o n t h e t o t a l amount o f t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e X - l i n k e d g e n e s b e c a u s e t h e amount o f a c t i v a t o r s u b s t a n c e r e m a i n s c o n s t a n t . R e c e n t l y , e v i d e n c e h a s b e e n p r e s e n t e d f o r t h e l a t t e r m o d e l o f s e x - l i n k e d d o s a g e c o m p e n s a t i o n ( M a r o n i a n d L u c c h e s i , 1980 ; M a r o n i a n d P l a u t , 1 9 7 3 ) . E i t h e r m o d e l c a n a d e q u a t e l y a c c o u n t f o r t h e c o m p e n s a t i o n we f o u n d i n t r i s o m i c - 2 L s t r a i n s . I n d e e d , R a w l s a n d L u c c h e s i (1974) h a v e r e p o r t e d t h a t r e g i o n s o f c h r o m o s o m e 2 L a r e c a p a b l e H-5 o f r e d u c i n g t h e a c t i v i t y o f 6 P D H , i n d i c a t i n g t h a t n e g a t i v e r e g u l a t o r y l o c i may e x i s t o n c h r o m o s o m e 2 L . I t i s n o t s u r p r i s i n g t h a t a m e c h a n i s m e x i s t s t o c o m p e n s a t e f o r t h e i m b a l a n c e i n X - l i n k e d t e m p l a t e s w h i c h o c c u r s b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s i n many h i g h e r o r g a n i s m s . H o w e v e r , b e c a u s e a u t o s o m e s g e n e r a l l y d o n o t v a r y i n n u m b e r , i t i s n o t o b v i o u s why a u t o s o m a l d o s a g e c o m p e n s a t i o n s h o u l d e x i s t . T h e f a c t t h a t s u r v i v a l a n d c o m p e n s a t i o n c a n o c c u r f o r b o t h X c h r o m o s o m a l a n d a u t o s o m a l t r i s o m i e s a l l o w s t h e s p e c u l a t i o n t h a t i n D r o s o p h i l a , d o s a g e c o m p e n s a t i o n i n t h e s e i n d i v i d u a l s s i m p l y r e f l e c t s t h e e x i s t e n c e o f a h o m e o s t a t i c m e c h a n i s m . S u c h a c o n t r o l m e c h a n i s m w o u l d b e r e s p o n s i b l e f o r m o d u l a t i n g t h e o v e r a l l l e v e l o f g e n e e x p r e s s i o n , e v e n i n n o r m a l d i p l o i d s . What i s o b s e r v e d a s c o m p e n s a t i o n i n t r i s o m i e s may s i m p l y b e t h i s n o r m a l r e g u l a t o r y m e c h a n i s m f o r c e d t o c o p e w i t h e x t r e m e p e r t u r b a t i o n s w i t h i n t h e g e n o m e . CHAPTER TWO MEASUREMENT OF GENE PRODUCT L E V E L S IN T R I S O M I C — 3 L AND T R I S O M I C - X L A R V A E 4-1 I n t r o d u c t i o n When s m a l l d u p l i c a t i o n s o r d e f i c i e n c i e s a r e e x a m i n e d , t h e l e v e l o f m o s t g e n e p r o d u c t s v a r i e s d i r e c t l y w i t h t h e g e n e d o s e ( G r e l l , 1 9 6 2 ) . Many r e g u l a t o r y g e n e p r o d u c t s may i n f l u e n c e t h e a c c e s s i b i l i t y o f a g e n e t o t h e t r a n s c r i p t i o n a l a p p a r a t u s , w h i c h i n t u r n a p p e a r s t o b e a n i m p o r t a n t f a c t o r i n f l u e n c i n g t h e f i n a l l e v e l o f g e n e p r o d u c t ( C h a n d l e r e t a l . , 1 9 8 3 ; P a r k e r a n d T o p o l , 1 9 8 4 ) . I n t h e p r e v i o u s c h a p t e r we e x a m i n e d t h e e x p r e s s i o n o f s e v e r a l l o c i i n D r o s o p h i l a m e l a n o g a s t e r i n d i v i d u a l s p o s s e s s i n g v a r i o u s d u p l i c a t i o n s f o r t h e l e f t a r m o f c h r o m o s o m e t w o ( D e v l i n e t a l . , 1 9 8 2 ) . W h i l e a l l f i v e l o c i e x a m i n e d s h o w e d e l e v a t e d l e v e l s o f e n z y m e a c t i v i t y i n s m a l l d u p l i c a t i o n s , t h r e e o f t h e s e g e n e s s h o w e d c o m p e n s a t e d ( d i p l o i d ) l e v e l s o f e n z y m e a c t i v i t y when d u p l i c a t e d i n w h o l e - a r m t r i s o m i e s . T h i s a l t e r e d mode o f g e n e e x p r e s s i o n c o u l d b e c a u s e d b y r e g u l a t o r y g e n e s , w h i c h a r e p r e s e n t i n t h e d u p l i c a t e d a r m a n d c o n t r o l t h e c o m p e n s a t e d l o c i ( R a w l s a n d L u c c h e s i , 1 9 7 4 ) . C o m p e n s a t i o n i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s i s r e m i n i s c e n t o f t h e s i t u a t i o n o b s e r v e d f o r c o m p e n s a t i o n i n m e t a f e m a l e ( t r i s o m i c - X ) i n d i v i d u a l s . D o s a g e c o m p e n s a t i o n o f X - l i n k e d g e n e s may b e t h o u g h t o f a s a n e v o l u t i o n a r y s t r a t e g y r e q u i r e d t o e q u a l i z e g e n e e x p r e s s i o n b e t w e e n i n d i v i d u a l s p o s s e s s i n g d i f f e r e n t n u m b e r s o f X c h r o m o s o m e s f o r s e x d e t e r m i n a t i o n ( L u c c h e s i , 1 9 8 3 , B a k e r a n d B e l o t e , 1 9 8 3 ) . On t h e o t h e r h a n d , c o m p e n s a t i o n f o r a u t o s o m a l t r i s o m y i s n o t e x p e c t e d s i n c e t h e number o f a u t o s o m e s n o r m a l l y T8 d o e s n o t v a r y w i t h i n a s p e c i e s . We t h e r e f o r e p r o p o s e d t h a t c o m p e n s a t i o n o f a u t o s o m a l g e n e s i n w h o l e a r m t r i s o m i e s may r e f l e c t t h e e x i s t e n c e o f p r o c e s s e s w h i c h n o r m a l l y o p e r a t e t o c o n t r o l g e n e e x p r e s s i o n i n d i p l o i d s ( a l s o , s e e S e e c o f , 1 9 6 1 ) . T h i s c h a p t e r e x a m i n e s t h e e x t e n t t o w h i c h a u t o s o m a l c o m p e n s a t i o n o c c u r s , a n d t o d e t e r m i n e i f t h e r e s p o n s e i s s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d f o r X - c h r o m o s o m e d o s a g e c o m p e n s a t i o n . We h a v e f o u n d t h a t c o m p e n s a t i o n o f a u t o s o m a l l o c i c a n a l s o o c c u r i n t r i s o m i e s f o r t h e l e f t a rm o f c h r o m o s o m e t h r e e . F o u r o f s i x l o c i c o m p e n s a t e w h i l e t h e o t h e r t w o a r e d o s e d e p e n d e n t . I n c o n t r a s t , f i v e X - l i n k e d l o c i w e r e s t u d i e d i n m e t a f e m a l e s a n d a l l d o s a g e c o m p e n s a t e d . Two g e n e s l o c a t e d o n 3 L , w h i c h d o n o t c o m p e n s a t e i n 3 L t r i s o m i e s o f Dj_ m e l a n o o a s t e r r d o d o s a g e c o m p e n s a t e b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s i n D .  p s e u d o o b s c u r a ( A b r a h a m a n d L u c c h e s i . 1 9 7 4 ; P i e r c e a n d L u c c h e s i , 1 9 8 0 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t r e g u l a t i o n o f c o m p e n s a t i o n i n h y p e r p l o i d s may d i f f e r f r o m X c h r o m o s o m e d o s a g e c o m p e n s a t i o n b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s . M A T E R I A L S AND METHODS P r o d u c t i o n o f T r i s o m i e s G e n e t i c s y m b o l s a r e d e s c r i b e d i n L i n d s l e y a n d G r e l l ( 1 9 6 8 ) , a n d t h e n o m e n c l a t u r e o f i n d i v i d u a l c o m p o u n d c h r o m o s o m e s a n d f r e e a r m s i s b y t h e a l p h a n u m e r i c s y s t e m s u g g e s t e d b y H o l m ( 1 9 7 6 ) . T h e s t o c k C ( 3 L ) V G 1 . r u s t . F (3R) V D 1 . e e / F (5R) V D l 8 3 was c o n s t r u c t e d a s shown i n F i g u r e 5 : C ( 3 D V Z 1 . r i i C ( 3 R ) V K l . e 3 f e m a l e s w e r e t r e a t e d w i t h 2 5 0 0 r a d s o f g a m m a - i r r a d i a t i o n f r o m a 6 ° C o s o u r c e a n d c r o s s e d t o T ( 3 ; 4 ) e / T M 3 . S b S e r m a l e s . S u r v i v i n g ( r a d i u s  ftncompletus) r i m a l e s w e r e c r o s s e d t o T ( 3 ; 4) e / T M 3 f e m a l e s a n d i n d i v i d u a l r_J_ l i n e s w e r e e s t a b l i s h e d . One o f t h e s e l i n e s p o s s e s s e d F ( 3 R ) c h r o m o s o m e s w h i c h w e r e c y t o l o g i c a l l y n o r m a l i n t h a t n o o b v i o u s e u c h r o m a t i c b r e a k p o i n t s w e r e d e t e c t a b l e . W h i l e t h e h e t e r o c h r o m a t i c b r e a k p o i n t s o f t h i s h a l f t r a n s l o c a t i o n h a v e n o t b e e n c o n f i r m e d , we c a n e x c l u d e o n g e n e t i c g r o u n d s t h e l e f t a n d r i g h t a r m s o f t h e s e c o n d , p r o b a b l y t h e r i g h t a r m o f t h e t h i r d c h r o m o s o m e a n d t h e l e f t a r m o f t h e X . T h u s , we a r e c e r t a i n t h a t n o a d d i t i o n a l l a r g e d u p l i c a t i o n s o f e u c h r o m a t i c r e g i o n s w o u l d b e a s s o c i a t e d w i t h t h i s f r e e a r m ( s e e F i g u r e 6 ) . C ( 3 L ) V Z l . r i was r e p l a c e d w i t h C ( 3 D V G l . r u s t b y n o n d i s j u n c t i o n . T r i s o m i e s f o r t h e l e f t a rm o f c h r o m o s o m e t h r e e a r e p r o d u c e d b y c r o s s i n g C ( 3 D V G l . r u s t t F ( 3 R ) V D 1 . e a / F ( 3 R ) V D 1 . e B t o a n O r e g o n R s t a n d a r d s t r a i n . M o n o s o m i e s f o r 3 L a r e p o o r l y v i a b l e , 50 F i g u r e 5 . S t r a t e g y e m p l o y e d t o p r o d u c e c o m p o u n d — f r e e c h r o m o s o m e s f o r t h e t h i r d c h r o m o s o m e . Wavy l i n e s r e p r e s e n t t r e a t m e n t w i t h gamma r a d i a t i o n f r o m a A O C o s o u r c e . In t h e s e c o n d g e n o t y p e t h a t was t r e a t e d w i t h r a d i a t i o n , t h e s t a n d a r d c h r o m o s o m e was m a r k e d w i t h t h e m u t a t i o n s r i a n d p f J . G e n o t y p e s a t b o t t o m o f p a g e a r e : A) C ( 3 L ) V G l , r u s t ; F ( 3 R ) V D l , e s / F ( 3 R ) V D l , e ! 3 a n d B) F ( 3 L > V D l , r i / F < 3 L > V D l , r i ; C ( 3 R ) V K l , e e 5 2 , F i g u r e 6. C y t o l o g i c a l p r e p a r a t i o n s o f c h r o m o s o m e F ( 3 R ) V D l e E ! i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c l a r v a e . S a l i v a r y g l a n d p o l y t e n e c h r o m o s o m e p r e p a r a t i o n f r o m a f e m a l e t r i s o m i c - 3 L l a r v a e . N o t e t h e t h i c k e n e d 3 L e l e m e n t , a n d t h e a b s e n c e o f s m a l l c h r o m o c e n t r a l d u p l i c a t i o n s . B . M i t o t i c c h r o m o s o m e p r e p a r a t i o n f r o m t r i s o m i c - 3 L b r a i n t i s s u e . N o t e t h a t n i n e m a j o r a u t o s o m a l a r m s , two X ' s a n d t w o s m a l l f o u r t h c h r o m o s o m e s a r e p r e s e n t . C . C y t o l o g i c a l v e r i f i c a t i o n o f t h e o f C < 3 L > V Z l , r i S F < 3 R > V D l e r a / F ( 3 R ) V D l e f 3 s t o c k . 3 J 5t a n d a r e n o t r e c o v e r e d i n p o p u l a t i o n s o f t h i r d i n s t a r l a r v a e w i t h i n t e n d a y s d e v e l o p m e n t a t 2 5 d e g r e e s C . T h e s t r a i n F <3L) V D 1 . r i / F ( 3 D V D 1 . r i I C ( 3 R ) V K l . e 1 3 was c o n s t r u c t e d a s f o l l o w s : r i p P / T M 5 f e m a l e s w e r e t r e a t e d w i t h 2500 r a d s o f g a m m a - r a d i a t i o n a n d c r o s s e d t o C ( 3 D V 6 1 . r u s t i F ( 3 R ) V D l . e s / F ( 3 R ) V D l . e E ' m a l e s a n d F ( 3 D F (3R) / T M 5 h e t e r o z y g o u s i n d i v i d u a l s w e r e r e c o v e r e d . A v i a b l e c o m b i n a t i o n o f F ( 3 D a n d F ( 3 R ) c h r o m o s o m e s was e s t a b l i s h e d . T h e s e w e r e c r o s s e d t o C ( 3 D P 2 . r i i C ( 3 R ) V K l . e * * m a l e s , f r o m w h i c h F ( 3 L ) V D l . r i / F ( 3 R ) V D l . r i l C ( 3 R > V K l . e 1 3 n o n d i s j u c t i o n a l i n d i v i d u a l s w e r e r e c o v e r e d . By c r o s s i n g t h e s e i n d i v i d u a l s e i t h e r t o a s t a n d a r d s t r a i n o r t o D p ( 3 R ) 1 7 3 / D f ( 3 R ) a 7 4 (a s t r a i n b e a r i n g a d e f i c i e n c y f o r 8 3 D E ; K e p p y a n d D e n n e l , 1 9 7 9 ) , i n d i v i d u a l s t r i s o m i c f o r 3R a r e p r o d u c e d . T h e s t o c k yjf_/yjf| F ( 2 L ) p r / F ( 2 L ) p r ; C ( 2 R ) P . p x was c o n s t r u c t e d a s f o l l o w s : T h e F ( 2 L ) p r c h r o m o s o m e was d e r i v e d b y r e c o m b i n a t i o n b e t w e e n F ( 2 L ) n u b g b p r a n d a w i l d t y p e F ( 2 D + T a n d t h e C ( 2 R ) P . p x c h r o m o s o m e was i n t r o d u c e d b y n o n d i s j u n c t i o n . T h i s s t o c k , when c r o s s e d t o a s t a n d a r d O r e g o n R s t r a i n , r e s u l t e d i n f a i r s u r v i v a l o f t r i s o m i c - 2 R l a r v a e . M o n o s o m i e s f o r 2R f a i l t o h a t c h . T h e C ( 3 L ) V D 2 . L v P o m 2 / I n ( 3 D P . M e PgnrlJ F (3R) V D 1 . e ° / F (3R) VD1 e 6 3 s t r a i n was c o n s t r u c t e d a s f o l l o w s : A L v s t 55 c h r o m o s o m e was c o n s t r u c t e d a n d was u s e d t o r e c o v e r L y r e c o m b i n a n t s f r o m L v s t / P g n r - f e m a l e s . T h e s e w e r e t e s t e d f o r t h e Pom 1 2 m a r k e r a n d a L v  P q m a c h r o m o s o m e was b a l a n c e d o v e r I n < 3 L ) P . M e . P o ( i r » + I n < 3 R ) C . S b . F e m a l e s o f t h i s s t o c k w e r e i r r a d i a t e d a n d c r o s s e d t o C ( 3 D V G l . r u s t l C ( 3 R ) V D 1 . + m a l e s . A C ( 3 D V D 2 . L v P g m ^ / I n ( 3 D P . M e Pam^ c h r o m o s o m e was r e c o v e r e d a n d c r o s s e d t o C ( 3 D V G l . r u s t l F ( 3 R ) V D l . e e V F ( 3 R ) V D l . e ' 3 t o p r o d u c e t h e d e s i r e d s t o c k . When t h i s s t o c k i s c r o s s e d t o P a m 1 / T M 3 . S b S e r f p h e n o t y p i c a l l y S b * t r i s o m i c - 3 L p u p a e c a n b e r e c o v e r e d w h i c h p o s s e s s t h r e e d i f f e r e n t e l e c t r o p h o r e t i c v a r i a n t s f o r Pom. T r i s o m i e s f o r t h e X—chromosome w e r e p r o d u c e d b y c r o s s i n g C ( l ) R M . y p n v / 0 f e m a l e s t o O r e g o n R m a l e s . L a r v a e w e r e s e x e d ( K e r k i s , 1 9 3 1 ) , a n d m e t a f e m a l e s w e r e i d e n t i f i e d b y t h e i r b l a c k m o u t h p a r t s . S t r a i n s w e r e r a i s e d a t 25 d e g r e e s C o n s t a n d a r d c o r n m e a l - s u c r o s e f o o d c o n t a i n i n g 0.22% T e g o s e p t a n d 1 0 m g / l e a c h o f s t r e p t o m y c i n a n d t e t r a c y c l i n e . E n z y m e A s s a y s : W a n d e r i n g t h i r d i n s t a r l a r v a e w e r e c o l l e c t e d f r o m t h e s i d e o f 1 / 2 p i n t c u l t u r e b o t t l e s , w a s h e d i n d i s t i l l e d w a t e r a n d d r i e d o n a n i t e x s c r e e n . L a r v a e w e r e h o m o g e n i z e d a t 25mg p e r ml o f 5b lOmM P D 4 f linM p h e n y l t h i o u r e a , pH 8 . 2 , a l l o w e d t o s i t o n i c e f o r t e n m i n u t e s , a n d t h e n c e n t r i f u g e d a t 1 2 , O O O g f o r t e n m i n u t e s a t 4 d e g r e e s C . E n z y m e s w e r e m e a s u r e d f r o m a p p r o p r i a t e l y d i l u t e d e x t r a c t s t o g i v e m e a s u r e m e n t s d i r e c t l y d e p e n d e n t o n e x t r a c t v o l u m e . D u p l i c a t e m e a s u r e m e n t s w e r e made f r o m e a c h e x t r a c t , f r o m w h i c h was s u b s t r a c t e d a b l a n k v a l u e d e r i v e d f r o m a n a s s a y w i t h o u t s u b s t r a t e . T h e a s s a y c o n d i t i o n s w e r e a s f o l l o w s - A K : O . I M g l y c i n e , 0 . 2 M K C I , 20mM M g C l * , 0 .2mM N A D H , lOmM A T P , 2mM p h o s p h o e n o l - p y r u v a t e , 20mM a r g i n i n e , 2 0 u / m l p y r u v a t e k i n a s e , 2 0 u / m l l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e ; C A T : O . I M P C U , pH 7 . 5 , 20mM ^ 0 2 ; E S T - 6 : O . I M N a P C U , p H 6 . 8 , 10 * M b - n a p t h y l a c e t a t e , 10~* M e s e r i n e , 5 x 10-= M p — c h l o r o m e r c u r i b e n z o i c a c i d , s t o p r e a c t i o n w i t h 0.5% o - d i a n i s i d i n e + 57. S D S ; FUM: O . I M N a P C v , p H 7 . 8 , 50mM Na m a l a t e ; G P T : O . I M N a P 0 „ , p H 7 . 5 , IM a l a n i n e , l O u / m l l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e , 0 .2mM N A D H , lOmM a - k e t o g l u t a r a t e ; G 6 P D H : O . I M T r i s , pH 8 . 5 , 20mM MgCls,, 0 .52mM N A D P , 6 .6mM g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e ; b - H A D : O . I M T r i s , p H 8 . 5 , 30mM g l u c o n i c a c i d , lOmM N A D ; I D H : O . I M T r i s , p H 7 . 5 , 5mM M g C l 2 , 50uM N A D P , 2mM N a m a l a t e ; 6 P G D : O . I M T r i s , pH 7 . 5 , 1.3mM N A D P , 20mM M g C l - , 3 . I m M 6 - p h o s p h o g l u c o n a t e ; P G I : O . I M T r i s , p H 7 . 5 , 2mM f r u c t o s e - 6 - p h o s p h a t e , 5mM M g C l - . , 0 .5mM N A D P , l p / m l g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e ; P G M : O . I M T r i s , pH 7 . 5 , 5mM M g C l ? ; , O.SmM N A D P , l u / m l G l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e , 5mM g l u c o s e - l - p h o s p h a t e ; S O D : O . I M P O * , , pH 7 . 8 , ImM E D T A , i . 2 4 m g / m l c y t o c h r o m e - c , 1 0 - * M h y p o x a n t h i n e , 3 . 3 u / m l x a n t h i n e o x i d a s e . R a t e s w e r e d e t e r m i n e d 57 b y c h a n g e s i n a b s o r b a n c e a t : 340nm f o r A K , G P T , G 6 P D H , b - H A D , I D H , G 6 P D , P 6 I a n d P G M ; a t 240nm f o r C A T ; a t 550nm f o r E S T - 6 a n d S O D ; a n d a t 250nm f o r F U M . F o r S O D , t h e r a t e o f c y t o c h r o m e - c r e d u c t i o n ( m e a s u r e d a t 550nm) b e f o r e a n d a f t e r t h e a d d i t i o n o f e x t r a c t was u s e d t o c a l c u l a t e u n i t s o f e n z y m e a c t i v i t y ( M c C o r d a n d F r i d o v i t c h , 1 9 6 9 ) . A c t i v i t i e s a r e e x p r e s s e d a s c h a n g e s i n a b s o r b a n c e p e r m i n p e r mg s o l u a b l e p r o t e i n i n t h e e x t r a c t . P r o t e i n was a s s a y e d b y t h e m e t h o d o f L o w r y e t a l . (1952) o r B r a d f o r d ( 1 9 7 6 ) . E x p e c t e d l e v e l s o f e n z y m e a c t i v i t y i n t r i s o m i e s w e r e e s t i m a t e d f r o m t h e p a r e n t a l c o n t r i b u t i o n o f c h r o m o s o m e a r m s . T h u s , a n e x p e c t e d d o s e d e p e n d e n t l e v e l o f e n z y m e i s t h a t a c t i v i t y f o u n d i n t h e c o m p o u n d - f r e e s t r a i n p l u s o n e - h a l f t h e a c t i v i t y f o u n d i n O r e g o n R . A c o m p e n s a t e d e s t i m a t e i s t w o - t h i r d s t h e d o s e d e p e n d e n t e s t i m a t e . E n z y m e E l e c t r o p h o r e s i s E x t r a c t s o f p u p a e w e r e r u n i n 89mM T r i s , 8 9 mM b o r a t e , ImM E D T A , pH 8 . 2 o n C e l l o g e l ( K a l e x S c i e n t i f i c ) e l e c t r o p h o r e t i c m e m b r a n e s , a n d s t a i n e d f o r PGM a c t i v i t y a f t e r Shaw a n d P r a s a d ( 1 9 7 0 ) . Q u a n t i t a t i o n o f h e a t - s h o c k p r o t e i n s y n t h e s i s : F o r e a c h s a m p l e , s a l i v a r y g l a n d s w e r e d i s s e c t e d f r o m t e n f e m a l e t h i r d - i n s t a r l a r v a e a n d i n c u b a t e d a t 3 7 d e g r e e s C f o r 1 58 h o u r i n E p h r u s s i - B e a d l e s a l i n e c o n t a i n i n g lmM P C U , p H 6 . 8 ( P B E B S ) . T h e g l a n d s w e r e t h e n p l a c e d a t 25 d e g r e e s C a n d i n c u b a t e d i n 2 Q u l P B E B S c o n t a i n i n g 20 / tCi 3 K 5 S - m e t h i o n i n e (New E n g l a n d N u c l e a r 496 C i / m m o l ) . A f t e r a 30 m i n u t e i n c u b a t i o n , 2 Q u l o f L a e m l i (1970) SDS c o m p l e x i n g s o l u t i o n was a d d e d . T h e g l a n d s w e r e d i s r u p t e d b y s o n i c a t i o n , b o i l e d f o r 10 m i n u t e s a n d T C A p r e c i p i t a b l e c o u n t s d e t e r m i n e d . F r o m e a c h s a m p l e 2 5 , 0 0 0 cpm w e r e r u n o n a 28cm l o n g , 15V. S D S - a c r y l a m i d e g e l c r o s s - l i n k e d w i t h 0.38% D A T D , w i t h a 35i s t a c k i n g g e l . A f t e r e l e c t r o p h o r e s i s , t h e g e l s w e r e p r e p a r e d f o r f l u o r o g r a p h y ( B o n n e r a n d L a s k e y 1 9 7 4 ) , d r i e d a n d e x p o s e d t o X - r a y f i l m f o r s e v e n d a y s . A u t o r a d i o g r a m s w e r e l a i d o v e r t h e g e l s a n d a p p r o p r i a t e b a n d s w e r e e x c i s e d a n d c o u n t e d b y s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g . M e a s u r e m e n t o f h e a t — s h o c k R N A . F e m a l e , w a n d e r i n g , t h i r d - i n s t a r l a r v a e w e r e h e a t s h o c k e d a t 37 d e g r e e s C f o r o n e h o u r . F a t b o d y a n d s a l i v a r y g l a n d s w e r e d i s s e c t e d f r o m t h e s e i n d i v i d u a l s i n i c e - c o l d lOmM P 0 * , ImM p h e n y l t h i o c a r b i m i d e , p H 7 . 5 , s e p a r a t e d a n d f r o z e n a t - 7 0 d e g r e e s C . F o r e a c h s a m p l e , RNA was e x t r a c t e d f r o m t i s s u e f r o m 25 i n d i v i d u a l s i n 0 . 1 4 M N a O A c , p H 4 . 5 , 4 u g / m l p o l y v i n y l s u l p h a t e , 5 0 u g / m l h e p a r i n , 2mg/ml b e n t o n i t e , IV. S D S , 0 . IX d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e . A f t e r e x t r a c t i n g o n c e w i t h p h e n o l , o n c e w i t h p h e n o l : c h l o r o f o r m : i s o - a m y l a l c o h o l ( 5 0 : 5 0 : 1 ) , o n c e w i t h c h l o r f o r m : i s o - a m y l a l c o h o l ( 5 0 : 1 ) , t h e RNA was p r e c i p i t a t e d w i t h 1 / 1 0 v o l u m e o f a c e t a t e a n d 2 . 5 v o l u m e s o f e t h a n o l . T h e RNA 59 was d i s s o l v e d i n d i s t i l l e d w a t e r , made t o 2% f o r m a l d e h y d e , d e n a t u r e d f i v e m i n u t e s a t 65 d e g r e e s C , c o o l e d a n d r u n o n IX a g a r o s e g e l s c o n t a i n i n g f o r m a l d e h y d e ( R a v e e t a l . , 197*7). T h e RNA was b l o t t e d t o n i t r o c e l l u l o s e , p r e h y b r i d i z e d , a n d t h e n h y b r i d i z e d ( T h o m a s , 1980) s i m u l t a n e o u s l y w i t h c l o n e s f o r t h e h s p 83 g e n e (pPW244> a n d f o r t h e h s p 7Q g e n e (pPW229) ( H o l m g r e n e t a l . , 1 9 7 9 ) . T h e f i l t e r s w e r e w a s h e d f o r 3 0 m i n a t 25 d e g r e e s C i n t w o c h a n g e s o f 2 X S S C , 0 .1% S D S , a n d f o r o n e h o u r a t 65 d e g r e e s C i n t w o c h a n g e s o f 0 . 1 X S S C , 0 .1% S D S . T h e b l o t s w e r e e x p o s e d t o X - r a y f i l m f o r v a r i a b l e p e r i o d s o f t i m e t o a l l o w d e n s i t o m e t r i c s c a n n i n g o f t h e b a n d s i n t h e l i n e a r r a n g e o f t h e f i l m . DNA was l a b e l l e d w i t h ^ P b y n i c k t r a n s l a t i o n ( R i g b y e t a l . , 1 9 7 7 ) . to R E S U L T S In t h e p r e v i o u s c h a p t e r we o b s e r v e d d o s a g e c o m p e n s a t i o n o f s e v e r a l a u t o s o m a l l o c i i n i n d i v i d u a l s t r i s o m i c f o r t h e l e f t a r m o f c h r o m o s o m e t w o . T o e x a m i n e t h i s p h e n o m e n o n f u r t h e r , e n z y m e l e v e l s f r o m g e n e s w i t h i n t h r e e a d d i t i o n a l w h o l e a r m t r i s o m i e s o f D r o s o p h i l a m e l a n o o a s t e r h a v e b e e n m e a s u r e d . C o m p e n s a t i o n o f a u t o s o m a l l o c i i s n o t l i m i t e d t o 2 L . C o m p o u n d - f r e e s t r a i n s f o r t h e t h i r d c h r o m o s o m e w e r e g e n e r a t e d i n a n O r e g o n R b a c k g r o u n d a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . T h e s u r v i v a l o f t r i s o m i c — 3 L i n d i v i d u a l s was c y t o l o g i c a l l y v e r i f i e d ( F i g u r e 6 ) . T h e i r v i a b i l i t y t h r o u g h o u t d e v e l o p m e n t i s c o m p a r a b l e t o t h a t o b s e r v e d b o t h f o r t r i s o m i c - 2 L a n d f o r t r i s o m i c - X i n d i v i d u a l s . I n c o m p a r i s o n t r i s o m i e s f o r 3R ( w i t h o r w i t h o u t a d e f i c i e n c y f o r 83DE) a n d f o r 2R s u r v i v e v e r y p o o r l y . S i n c e c o n c l u s i o n s b a s e d o n m e a s u r e m e n t s f r o m i n d i v i d u a l s w i t h p o o r v i a b i l i t i e s may b e e r r o n e o u s , a n a n a l y s i s o f 3R was n o t d o n e , a n d o b s e r v a t i o n s f o r 2R w e r e l i m i t e d t o o n e l o c u s . A s i n o u r p r e v i o u s s t u d y , o u r a n a l y s i s was r e s t r i c t e d t o t h e t h i r d i n s t a r l a r v a l s t a g e ; t r i s o m i e s f o r a n y m a j o r c h r o m o s o m e a r m r a r e l y s u r v i v e t o t h e a d u l t s t a g e . T h e a c t i v i t y o f s i x e n z y m e s , w h o s e s t r u c t u r a l g e n e s a r e l o c a t e d o n 3 L a r e shown f o r i n d i v i d u a l s t r i s o m i c f o r 3 L a n d f o r t h e i r d i p l o i d p a r e n t s ( T a b l e s 6 a n d 7 ) . E s t i m a t e d v a l u e s c o r r e s p o n d i n g t o a d o s e d e p e n d e n t a n d t o a d o s a g e c o m p e n s a t e d ( d i p l o i d ) l e v e l o f e x p r e s s i o n a r e a l s o p r e s e n t e d ( s e e M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ) . F o u r o f t h e s i x l o c i ( I d h r AJk, S o d , Pqm) h a d l e v e l s o f a c t i v i t y i n t r i s o m i c - 3 L i n d i v i d u a l s c o n s i s t e n t w i t h c o m p e n s a t e d l e v e l s o f e x p r e s s i o n ( T a b l e 6 ) . Two l o c i , E s t - 6 a n d C a t , d i s p l a y e d d o s e d e p e n d e n t l e v e l s o f e n z y m e a c t i v i t y ( T a b l e 7 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s a r e s i m i l a r t o t h o s e f o u n d f o r t r i s o m y 2 L : a p p r o x i m a t e l y t w o - t h i r d s o f t h e l o c i c o m p e n s a t e i n t r i s o m i e s w h i l e t h e r e m a i n d e r a r e d o s e - d e p e n d e n t . T h e r e g i o n a l d i s t r i b u t i o n o f c o m p e n s a t i n g a n d n o n - c o m p e n s a t i n g l o c i i n t h e t r i s o m i c - 2 L c o n d i t i o n was n o n - r a n d o m . G e n e s l o c a t e d i n t h e d i s t a l t w o - t h i r d s o f t h e c h r o m o s o m e w e r e c o m p e n s a t e d , w h e r e a s t h e p r o x i m a l l o c i w e r e n o t . I n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n , t h e d i s t r i b u t i o n o f c o m p e n s a t i n g l o c i a p p e a r s l e s s o r d e r e d , a n d a r e g i o n a l s e p a r a t i o n o f d o s a g e - c o m p e n s a t e d f r o m d o s e - d e p e n d e n t l o c i was n o t o b s e r v e d . H o w e v e r , a s was t h e c a s e w i t h 2 L , b o t h n o n - c o m p e n s a t i n g l o c i ( E s t - 6 a n d C a t ) a r e l o c a t e d w i t h i n t h e p r o x i m a l o n e - t h i r d o f t h e c h r o m o s o m e a r m ( a l t h o u g h a l l l o c i m e a s u r e d o n 3 L w e r e l i m i t e d t o w i t h i n t h e p r o x i m a l t w o - t h i r d s o f 3 D . A s n o t e d a b o v e , t r i s o m i e s f o r 2R a n d f o r 3R s u r v i v e p o o r l y , a n d t h e y d i s p l a y p h e n o t y p e s t h a t c h a r a c t e r i s t i c a l l y a r e a s s o c i a t e d w i t h a n e u p l o i d y . N e v e r t h e l e s s , we w e r e a b l e t o m e a s u r e o n e l o c u s i n t r i s o m i c - 2 R i n d i v i d u a l s . T h i s g e n e ( P a i ) d i s p l a y e d a d o s e - d e p e n d e n t l e v e l o f g e n e p r o d u c t ( T a b l e 8 ) . C u r i o u s l y , i t t o o i s l o c a t e d i n t h e p r o x i m a l o n e - t h i r d o f 2 R . How d o e s d o s a g e c o m p e n s a t i o n o c c u r a t t h e l e v e l o f t h e i n d i v i d u a l g e n e ? S i m p l i s t i c a l l y , a l l t h r e e a l l e l e s o f a s i n g l e , T a b l e 6 E n z y m e l e v e l s f o r c o m p e n s a t i n g l o c i i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 3 L l a r v a e . G e n o t y p e I d h E n z y m e L o c u s Ak S o d Pgm O r e g o n R ( d i p l o i d ) 0 . 6 2 2 ± . 0 2 2 (6) 1 4 . 2 ± 0 . 6 (7) 0 . 1 7 2 ± . 0 0 9 (4) 1 . 2 9 : - 0 9 (6) C ( 3 L ) V G 1 , r u s t l F ( 3 R ) V D l , e s / F ( 3 R ) V D l , e s 0 . 5 2 9 ± . 0 2 2 (6) 1 3 . 2 : . 0 4 (6) 0 . 1 5 6 t . 0 0 6 (4) 1 . 12 ± -11 (6) C ( 3 L ) V G 1 , r u s t / + / F ( 3 R ) V D l , e s ( t r i s o m i c - 3 L ) 0 . 5 3 9 ± . 0 1 2 (6) 1 5 . 4 : 0 . 6 (7) 0 . 1 8 7 t . 0 0 7 (4) 0 . 9 7 ± . 1 1 (6) E s t i m a t e s d o s e - d e p e n d e n t 0 . 8 4 0 ± . 0 1 2 2 0 . 3 + . 2 0 . 107 ± . 0 0 1 1 . 7 7 + . 0 6 c o m p e n s a t e d 0 . 5 6 0 t . 0 0 8 1 3 . 5 ± . 1 0 . 161 ± . 0 0 2 1. IB • . 0 4 A c t i v i t i e s e x p r e s s e d a s t h e Mean ( ± s t a n d a r d e r r o r ) c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r mg p r o t e i n p e r m i n . e x c e p t f o r S o d w h e r e t h e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e c o n c e n t r a t i o n o f e x t r a c t p r o t e i n r e q u i r e d t o g i v e a 50% r e d u c t i o n i n r e a c t i o n v e l o c i t y . Number i n p a r e n t h e s i s i s t h e s a m p l e s i z e . fc3 T a b l e 7 E n z y m e l e v e l s f o r n o n c o m p e n s a t i n g l o c i i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 3 L l a r v a e . E n z y m e L o c u s G e n o t y p e E s t - 6 C a t O r e g o n R 0 . 6 6 3 + . 0 2 3 6 . 7 4 + . 4 5 ( d i p l o i d ) (10) (6) C ( 3 L ) V G 1 , r u s t ! 0 . 3 4 0 + . 0 1 0 6 . 1 8 ± . 2 5 F ( 3 R ) V D l , e s / ( d i p l o i d ) (10) (6) C ( 3 L ) V G 1 , r u s t / 0 . 7 3 7 + . 0 0 2 8 . 6 1 + . 6 1 + / F ( 3 R ) V D l , e s ( t r i s o m i c - 3 L > (10) (6) E s t i m a t e s d o s e - d e p e n d e n t 0 . 6 7 2 + . 0 0 8 9 . 5 5 + . 1 7 c o m p e n s a t e d 0 . 4 4 8 + . 0 0 5 6 . 3 7 + . 1 2 A c t i v i t i e s e x p r e s s e d a s t h e Mean ( + s t a n d a r d e r r o r ) c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r mg p r o t e i n p e r m i n . Number i n p a r e n t h e s i s i s t h e s a m p l e s i z e . t i -T a b l e 8 E n z y m e l e v e l s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 2 R l a r v a e . G e n o t y p e P G I O r e g o n R 2 . 0 4 + 0 . 0 8 ( d i p l o i d ) (6) F ( 2 L ) p r / F ( 2 L ) p r / C ( 2 R ) P , px 2 . 7 5 + 0 . 2 3 ( d i p l o i d ) (6) F ( 2 L ) p r / + / C ( 2 R ) P , px 3 . 7 6 + 0 .19 ( t r i s o m i c - 2 R ) (6) E s t i m a t e s d o s e - d e p e n d e n t 3 . 7 7 + . 1 2 c o m p e n s a t e d 2 . 5 1 + . 0 8 A c t i v i t y e x p r e s s e d a s i n T a b l e 6 . lo5 d o s a g e c o m p e n s a t e d g e n e c o u l d b e e x p r e s s e d a t t w o - t h i r d s o f t h e d i p l o i d l e v e l . A l t e r n a t i v e l y , t w o o f t h e t h r e e a l l e l e s c o u l d b e e x p r e s s e d p r e f e r e n t i a l l y . T h e e n z y m e e n c o d e d b y t h e c o m p e n s a t i n g g e n e , Pgm, e x i s t s i n a m o n o m e r i c f o r m a n d t h u s a l l o w s a s i m p l e t e s t t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n t h e s e t w o p o s s i b i l i t i e s . T r i s o m i c - 3 L i n d i v i d u a l s w i t h d i f f e r e n t e l e c t r o p h o r e t i c v a r i a n t s a t e a c h o f t h e 3 Pgm c i s t r o n s w e r e c o n s t r u c t e d . F i g u r e 7 c l e a r l y s h o w s t h a t e x t r a c t s f r o m t h e s e i n d i v i d u a l s p o s s e s s e d a l l t h r e e a l l o z y m e s i n a p p r o x i m a t e l y e q u i v a l e n t a m o u n t s . T h u s , i n t r i s o m i c - 3 L l a r v a e , a l l t h r e e g e n e s a p p a r e n t l y c o n t r i b u t e e q u a l l y t o t h e t o t a l l e v e l o f P G M . S i n c e m e a s u r e m e n t s o f t o t a l PGM a c t i v i t y i n t h e s e i n d i v i d u a l s s h o w e d d i p l o i d l e v e l s , o n e c a n i n f e r t h a t e a c h Pgm s t r u c t u r a l g e n e i n t r i s o m i c - 3 L l a r v a e p r o d u c e d o n l y t w o - t h i r d s t h e a m o u n t o f e n z y m e a s d o e s t h e same a l l e l e i n a d i p l o i d . X - l i n k e d g e n e a c t i v i t y i n m e t a f e m a l e s F o r m o s t g e n e s , m a l e s a n d f e m a l e s p r o d u c e e q u i v a l e n t a m o u n t o f g e n e p r o d u c t . T h i s i s t r u e f o r X - l i n k e d g e n e s a s w e l l , d e s p i t e t h e d i f f e r e n c e i n X— c h r o m o s o m e number b e t w e e n t h e s e x e s . S e v e r a l s t u d i e s ( L u c c h e s i e t a l . , 1974s S t e w a r t a n d M e r r i a m , 1975 ; G v o z d e v e t a l . , 1983) h a v e r e v e a l e d t h a t t r i s o m i c - X ( m e t a f e m a l e s ) i n d i v i d u a l s e x p r e s s d i p l o i d l e v e l s o f X - l i n k e d g e n e p r o d u c t s . H o w e v e r , c o n t r a d i c t o r y r e s u l t s a l s o e x i s t . F a i z u l l i n a n d G v o z d e v (1973) h a v e r e p o r t e d t h a t t w o X - l i n k e d l o c i ( 6 - P o d a n d ZJJ) p r o d u c e d o s e d e p e n d e n t l e v e l s o f 4fe F i g u r e 7 . E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o f PBM i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 3 L p u p a e . 1 . d i p l o i d , P o m 1 / T M 3 . S b S e r Pom* 2 . t r i s o m i c - 3 L , C < 3 L ) V D 2 . L v P a m - / / I n < 3 L ) . He P o m * / P o m V F ( 3 R ) V D l . e £ ; ' . 3 . d i p l o i d , C < 3 L ) V D 2 . L v P o m ^ / I n ( 3 D P . He P o m * ; F ( 3 R ) V D 1 . e m / F ( 3 R ) V P l . e 1 " enzyme i n metafemales. To examine gene expression i n metafemales, we measured the a c t i v i t y of f i v e X—linked gene—enzyme systems. In addition to 6-Pod and Zw (G6PD), we have examined the expression of FumT Bpt r Had, three l o c i that had not been investigated previously i n metafemales. The data for males, females and metafemales are presented i n Table 9 . In metafemales, 6-Pqd and Z_w_ show d i p l o i d l e v e l s of a c t i v i t y , although the former i s s l i g h t l y higher than expected. The three other l o c i (Fum. Opt. Had) were also compensated i n metafemales. The structural genes for these enzymes are widely d i s t r i b u t e d along much of the length of the X-chromosome. For b-HAD, despite a marked difference i n a c t i v i t y between males and females, an appropriate compensated response was s t i l l observed. Thus, i t would appear that many l o c i on the X-chromosome are capable of dosage compensating i n metafemales, as well as i n males and females. Heat-shock genes are d i f f e r e n t i a l l y expressed i n trisomies. The heat-shock genes comprise a group of coordinately controlled genes that are activated i n response to environmental stress. After heat shock, these genes display an altered chromatin structure and transcribe at very rapid rates. The f i n a l production of heat-shock proteins r e s u l t s from marked al t e r a t i o n s both i n the tr a n s c r i p t i o n a l and tr a n s l a t i o n a l processes. In Pj_ pseudoobscura r at least one of T a b l e 9 E n z y m e 1 e v e l s i n m a l e s , f e m a l e s a n d m e t a f e m a l e s . G e n o t y p e E n z y m e L o c u s P g d Fum G p t Had Zw +/0 0 . 1 5 8 0 . 2 5 8 1 . 5 0 0 . 2 4 3 0 . 141 ( m a l e ) ± . 0 1 2 ± . 0 0 3 ± - 1 7 ± . 0 1 1 + . 0 0 9 (6) (4) (6) (5) (6) C ( 1 ) R M , y p n v / Y 0 . 143 0 . 2 9 5 1 . 1 9 0 . 129 0 . 150 ( f e m a l e ) ± . 0 0 9 + . 0 1 8 + . 0 7 ± . 0 0 7 ± . 0 1 1 (6) (4) (6) (6) (6) C ( 1 ) R M , y p n v / + 0 . 175 0 . 3 1 8 1 . 4 5 0 . 158 0 . 147 ( m e t a f e m a l e ) ± . 0 1 9 ± . 0 1 4 + . 1 4 ± . 0 0 7 ± . 0 1 4 (6) (4) (6) (6) (6) E s t i m a t e s d o s e - d e p e n d e n t 0 . 2 2 2 0 . 4 2 4 1 . 9 4 0 . 2 5 1 0 . 2 2 1 ± . 0 0 5 ± . 0 0 9 ± . 0 6 ± . 0 0 5 ± . 0 0 6 c o m p e n s a t e d 0 . 148 0 . 2 8 3 1 . 2 9 0 . 1 6 7 0 . 147 ± . 0 0 3 ± . 0 0 6 ± . 0 4 ± . 0 0 3 + . 0 0 4 A c t i v i t y e x p r e s s e d a s i n T a b l e 6 . 10 t h e s e h e a t - s h o c k g e n e s i s X - l i n k e d ( h s p 8 3 o n XR) a n d d o s a g e c o m p e n s a t e s b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s ( P i e r c e a n d L u c c c h e s i p 1 9 8 0 ) . T h e h o m o l o g o u s g e n e i n P .  m e l a n o o a s t e r . h s p 8 3 f i s f o u n d o n t h e same c h r o m o s o m a l e l e m e n t , a t c y t o l o g i c a l p o s i t i o n 63BC o n c h r o m o s o m e 3 L . T h e s t r u c t u r a l g e n e s f o r t w o h e a t — s h o c k p r o t e i n s , h s p 6 8 a n d 7 0 , a r e l o c a t e d o n t h e r i g h t a r m o f c h r o m o s o m e 3 . T h e h s p 6 8 p r o t e i n i s e n c o d e d b y a s i n g l e g e n e l o c a t e d a t 9 5 0 w h i l e f i v e g e n e s a r e r e s p o n s i b l e f o r h s p 70 p r o d u c t i o n ! t h e s e a r e l o c a t e d i n t w o c l u s t e r s , w i t h t w o g e n e s a t 87A a n d t h r e e g e n e s a t 8 7 C . T o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e 3 L h e a t - s h o c k p r o t e i n s w e r e d o s a g e c o m p e n s a t e d i n 3 L t r i s o m i e s , we m e a s u r e d t h e a m o u n t o f e a c h h s p s y n t h e s i z e d i n s a l i v a r y g l a n d s a f t e r i n c u b a t i o n a t 37 d e g r e e s C f o r o n e h o u r ( s e e F i g u r e 8 a ) . S i n c e a l l o f t h e h s p 68 a n d 70 g e n e s a r e l o c a t e d o n t h e r i g h t a r m o f c h r o m o s o m e t h r e e , t h e y a r e f o u n d a t e q u i v a l e n t d o s a g e s i n a l l t h e s t r a i n s u s e d h e r e . T a b l e 10 s h o w s t h e r a t i o o f i n c o r p o r a t i o n o f 3 e 5 S - m e t h i o n i n e i n t o h s p 68 r e l a t i v e t o h s p 7 0 . Two p o i n t s a r e a p p a r e n t . F i r s t , t h e r a t i o s a r e q u i t e s i m i l a r b e t w e e n a l l t h r e e s t r a i n s e x a m i n e d . T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t t h e e x p r e s s i o n o f t h e s e t w o g e n e s a r e n o t d i f f e r e n t i a l l y a f f e c t e d b y a d u p l i c a t i o n o f 3 L . S e c o n d , t h e t o t a l i n c o r p o r a t i o n o f 3 = S - M e t i n t o h s p 68 i s a p p r o x i m a t e l y o n e — f i f t h o f t h e a m o u n t f o u n d f o r h s p 7 0 . T h e r e f o r e , t h e amount o f f i n a l p r o d u c t i s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e number o f t e m p l a t e s f o r e a c h o f t h e s e h e a t - s h o c k p r o t e i n s . T h i s v a l u e w o u l d b e e x p e c t e d o n l y i f e q u i v a l e n t l e v e l s o f t r a n s c r i p t i o n a n d s i m i l a r e f f i c i e n c i e s o f t r a n s l a t i o n w e r e i n v o l v e d i n t h e 11 F i g u r e 8 . A u t o r a d i o g r a m s o f h e a t - s h o c k p r o t e i n a n d RNA f r o m s a l i v a r y g l a n d s . A . H e a t - s h o c k p r o t e i n s 1 . d i p l o i d , c o m p o u n d -f r e e s t o c k 2 . d i p l o i d , O r e g o n R 3 . t r i s o m i c - 3 L B . H e a t - s h o c k RNA 1. t r i s o m i c - 3 L 2 . d i p l o i d , c o m p o u n d - f r e e 3 . d i p l o i d , O r e g o n R. 72, I 73 T a b l e 10 H e a t - s h o c k p r o t e i n 68 a n d 83 s y n t h e s i s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 3 L s a l i v a r y g l a n d s . H e a t S h o c k P r o t e i n G e n o t y p e 6 8 8 3 O r e g o n - R 0 . 2 2 2 + 0 . 1 1 0 . 0 3 0 + . 0 0 4 ( d i p l o i d ) (11) (10) C ( s l ) V G l , r u s t l 0 . 2 3 3 + . 0 1 6 0 . 0 4 2 + . 0 0 5 F (3R) V D 1 , e s / F (3R> V D 1 , e^ ( d i p l o i d ) (10) (10) C ( 3 L ) V G 1 , r u s t / + / 0 . 2 2 4 + . 0 1 2 0 . 0 3 9 + . 0 0 4 F ( 3 R ) V D l , e E I ( t r i s o m i c - 3 L ) (14) (14) E s t i m a t e s d o s e - d e p e n d e n t 0 . 0 5 7 + . 0 0 3 c o m p e n s a t e d 0 . 0 3 8 + . 0 0 1 T h e i n c o r p o r a t i o n i n t o h s p 68 i s e x p r e s s e d r e l a t i v e t o h s p 7 0 a l o n e w h i l e h s p 83 i s e x p r e s s e d r e l a t i v e t o t h e i n c o r p o r a t i o n i n t o h s p s 68 p l u s 7 0 . T h e v a l u e s g i v e n a r e t h e mean + s t a n d a r d e r r o r . N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e t h e s a m p l e s i z e s . p r o d u c t i o n o-f t h e s e t w o h e a t — s h o c k p r o t e i n s . B e c a u s e e q u i v a l e n t l e v e l s o-f p r o d u c t i o n a r e o b s e r v e d f o r h s p 6 8 a n d h s p 70 b e t w e e n t h e t h r e e s t r a i n s , a n d b e c a u s e a d i f f e r e n t i a l r e s p o n s e was n o t o b s e r v e d w i t h i n a s t r a i n , we f e l t t h a t t h e s e two p r o t e i n s c o u l d s e r v e a s i n t e r n a l s t a n d a r d s t o q u a n t i f y t h e r e l a t i v e a m o u n t s o f t h e h s p s e n c o d e d b y l o c i o n 3 L . T h e l e v e l o f a n o t h e r h s p i s a l s o s h o w n i n T a b l e 1 0 . H s p 83 i s e x p r e s s e d a t a d i p l o i d l e v e l i n t r i s o m i c - 3 L s t r a i n s . T h u s , i t a p p e a r s t h a t h s p 83 p r o d u c t i o n i n t h e s e t r i s o m i e s i s c o m p e n s a t i n g f o r t h e i n c r e a s e d g e n e d o s e . A n o t h e r h e a t - s h o c k p u f f , l o c a t e d a t 67B o n 3 L , c o n t a i n s g e n e s c o d i n g f o r t h e f o u r s m a l l h e a t - s h o c k p r o t e i n s ( h s p 2 7 , 2 6 , 23 a n d 2 2 ) . A l l f o u r a r e e n c o d e d w i t h i n a 12kb r e g i o n w i t h t r a n s c r i p t i o n o r i e n t e d i n b o t h d i r e c t i o n s ( C o r c e s e t a l . , 1 9 8 0 ) . A l t h o u g h t i g h t l y l i n k e d , t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t h s p g e n e s s h o w e d a d i f f e r e n t i a l r e s p o n s e t o t r i s o m y ( T a b l e 1 1 ) . T h e amount o f h s p 26 a n d h s p 2 7 f o r m e d i n s a l i v a r y g l a n d s was d o s e d e p e n d e n t i n t r i s o m i c — 3 L i n d i v i d u a l s . H o w e v e r , h s p 23 s h o w e d a n o v e r c o m p e n s a t e d l e v e l o f e x p r e s s i o n , a n d h s p 22 s h o w e d o n l y p a r t i a l c o m p e n s a t i o n . T h e s e d e v i a t i o n s f r o m a d i s c r e t e r e s p o n s e f o r h s p 22 a n d 23 may h a v e r e s u l t e d f r o m i m p r e c i s e r e c o v e r y o f t h e s e t w o h e a t - s h o c k p r o t e i n s d u e t o s i m i l a r m i g r a t i o n r a t e s o n t h e SDS g e l s . I f t h e e x p r e s s i o n o f h s p 2 2 a n d 23 a r e c o m b i n e d , a c l e a r l y c o m p e n s a t e d l e v e l o f e x p r e s s i o n i s o b s e r v e d . How t h e s m a l l h s p ' s show t h i s d i v e r s e r e s p o n s e i s n o t k n o w n . T h e c o m p l e x i t y o f t h e h e a t - s h o c k r e s p o n s e w o u l d make a n y o f a number o f m e c h a n i s m s p o s s i b l e . T o i n v e s t i g a t e w h e t h e r t h e r e g u l a t i o n o f h s p p r o d u c t i o n i n 15 T a b l e 11 S m a l l h e a t - s h o c k p r o t e i n s y n t h e s i s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c — 3 L s a l i v a r y g l a n d s . G e n o t y p e H e a t S h o c k P r o t e i n 27 2 6 2 3 22 Q r e g o n - R ( d i p l o i d ) 0 . 0 3 3 0 . 1 5 1 0 . 3 4 3 0 . 0 6 4 ± . 0 0 4 ± . 0 0 9 ± . 0 5 4 ± . 0 0 5 (11) (11) (11) (9) C ( s l ) V G l , r u s t ; F ( 3 R ) V D 1 , e * V F ( 3 R ) V D 1 , i ( d i p l o i d ) 0 . 0 6 1 ± . 0 1 8 (8) 0 . 2 6 5 fc . 0 2 1 (10) 0 . 3 2 7 ± . 0 3 7 (10) 0 . 0 8 8 t . 0 0 3 (10) C ( 3 D V Q 1 , r u s t / + / F < 3 R > V D l , aB ( t r i s o m i c - 3 L ) 0 . 0 9 3 0 . 3 1 6 0 . 2 4 4 0 . 1 0 2 ± . 0 2 6 + . 0 3 4 + . 0 2 3 + . 0 0 8 (14) (14) (14) (14) E s t i m a t e s d o s e - d e p e n d e n t 0 . 0 7 8 0 . 3 4 1 0 . 4 8 0 0 . 1 2 0 t . 0 0 8 ± . 0 1 0 + . 0 2 3 + . 0 0 2 c o m p e n s a t e d 0 . 0 5 2 0 . 2 2 7 t . 0 0 5 + . 0 0 6 0 . 3 3 2 0 . 0 8 0 ± . 0 1 5 + . 0 0 1 T h e i n c o r p o r a t i o n i n t o h s p 68 i s e x p r e s s e d r e l a t i v e t o h s p 68 p l u s 7 0 . lb 3 L t r i s o m i e s i s m e d i a t e d a t t h e l e v e l o-f g e n e t r a n s c r i p t i o n we m e a s u r e d t h e l e v e l s o f h s p 8 3 RNA i s o l a t e d f r o m s a l i v a r y g l a n d s a n d f r o m f a t b o d y . N o r t h e r n b l o t s o f t o t a l RNA f r o m t h e s e t i s s u e s w e r e h y b r i d i z e d s i m u l t a n e o u s l y t o p r o b e s c o r r e s p o n d i n g t o t h e h s p 85 a n d t h e h s p 70 g e n e s ( F i g u r e 8 b ) , a n d t h e r a t i o o f t h e t w o RNA l e v e l s was d e t e r m i n e d f r o m d e n s i t o m e t r i c s c a n s o f t h e a u t o r a d i o g r a m s . T a b l e 12 s h o w s t h e s e d a t a , a s w e l l a s e x p e c t e d c o m p e n s a t e d a n d d o s e - d e p e n d e n t v a l u e s . I t i s c l e a r t h a t t h e l e v e l o f h s p 83 RNA i n t r i s o m i e s , a l t h o u g h somewhat l o w e r t h a n e x p e c t e d , i s c o n s i s t e n t w i t h a d o s a g e - d e p e n d e n t l e v e l o f e x p r e s s i o n . E q u i v a l e n t r e s u l t s w e r e o b t a i n e d i n b o t h t r i s o m i e s e x a m i n e d . T h u s , d o s e - d e p e n d e n t l e v e l s o f h s p 8 3 RNA w e r e o b s e r v e d i n t r i s o m i e s w h i l e o n l y d i p l o i d l e v e l s o f t h e c o r r e s p o n d i n g p r o t e i n a r e f o u n d . T h e s e r e s u l t s i m p l y t h a t t h e h s p 83 g e n e i s t r a n s c r i b e d a t t h e same r a t e i n e a c h s t r a i n , r e g a r d l e s s o f t h e number o f t e m p l a t e s , a n d t h a t t h e p r o d u c t i o n o f h e a t - s h o c k p r o t e i n 8 3 i n t r i s o m i e s i s r e g u l a t e d a t t h e p o s t - t r a n s c r i p t i o n a l l e v e l . I t i s p o s s i b l e t h a t c o m p e n s a t i o n f o r t h e s m a l l h s p ' s (23 a n d 22) i s a l s o r e g u l a t e d p o s t - t r a n s c r i p t i o n a l l y , a l t h o u g h I h a v e n o t a t t e m p t e d t o d e t e r m i n e t h a t h e r e . A p o s s i b l e c o m p l i c a t i o n e x i s t s when m e a s u r i n g o n e p r o d u c t r e l a t i v e t o a n o t h e r . I f t h e t r a n s c r i p t i o n o f b o t h t h e h s p  83 g e n e a n d t h e i n t e r n a l s t a n d a r d ( h s p 70) g e n e s i s a f f e c t e d s i m i l a r l y b y t h e t r i s o m i c c o n d i t i o n ( e i t h e r b o t h i n c r e a s e d o r r e d u c e d ) a d o s e d e p e n d e n t l e v e l o f h s p 83 RNA s y n t h e s i s w o u l d b e o b s e r v e d . S i n c e t h i s e x p e r i m e n t d i d n o t m e a s u r e a b s o l u t e l e v e l s o f h s p 83 R N A , we c a n n o t r e s o l v e t h i s 17 T a b l e 12 H e a t - s h o c k RNA 83 l e v e l s i n -Fat b o d i e s a n d s a l i v a r y g l a n d s . T i s s u e G e n o t y p e F a t B o d y S a l i v a r y G l a n d O r e g o n - R 0 . 2 8 4 + 0 . 3 9 0 . 3 1 4 ± . 0 2 7 ( d i p l o i d ) <4) (4) C ( 3 L ) V G 1 , r u s t ! 0 . 3 1 6 ± . 0 5 6 0 . 3 3 3 ± . 0 3 4 F ( 3 R ) V D 1 , e * V F ( 3 R ) V D 1 , e r a ( d i p l o i d ) (4) (4) C ( 3 L ) V G 1 , r u s t / + / 0 . 4 2 8 ± . 0 6 2 0 . 4 5 7 + . 0 4 4 F ( 3 R ) V D l , e e i ( t r i s o m i c - 3 L ) (5) (6) E s t i m a t e s d o s e - d e p e n d e n t 0 . 4 5 8 + . 0 2 9 0 . 4 9 0 + . 0 1 8 c o m p e n s a t e d 0 . 3 0 5 + . 0 1 9 0 . 3 2 7 ± . 0 1 2 h s RNA 83 l e v e l s e x p r e s s e d r e l a t i v e t o h s RNA 7 0 . Mean + s t a n d a r d e r r o r N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e t h e s a m p l e s i z e s . IS d i f f i c u l t y . H o w e v e r , we c a n s a y t h a t t h e t r a n s c r i p t i o n o f t h e h s p 83 g e n e e i t h e r i s u n a f f e c t e d b y t h e t r i s o m i c c o n d i t i o n o r r e s p o n d s s i m i l a r l y t o t h e h s p 70 g e n e s . T h a t t h e h s p 70 g e n e s a r e u n a f f e c t e d b y t r i s o m y f o r 3 L i s s u p p o r t e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e amount o f h s p 68 p r o t e i n r e l a t i v e h s p 70 r e m a i n e d u n c h a n g e d b e t w e e n d i p l o i d s a n d t r i s o m i c — 3 L i n d i v i d u a l s . D I S C U S S I O N N o r m a l l y , a d i r e c t c o r r e l a t i o n i s o b s e r v e d b e t w e e n g e n e d o s a g e a n d g e n e p r o d u c t i n a w i d e v a r i e t y o-f o r g a n i s m s . I n v e s t i g a t i o n s o f e n z y m e l e v e l s h a v e b e e n made o n many s p e c i e s t h a t a r e a n e u p l o i d f o r w h o l e c h r o m o s o m e s o r c h r o m o s o m e a r m s . T h e d i f f e r e n c e i n p l o i d y t h a t e x i s t s f o r t h e s e x c h r o m o s o m e s o f b i r d s a n d L e p i d o p t e r a n s r e s u l t s i n a d o s a g e d e p e n d e n t d i f f e r e n c e i n Z - l i n k e d g e n e p r o d u c t s ( J o h n s o n a n d T u r n e r , 19791 B r a v e r s t o c k e t a l . , 1 9 8 2 ) . E l e v a t e d l e v e l s o f g e n e p r o d u c t h a v e b e e n o b s e r v e d i n t r i s o m i e s f r o m s e v e r a l p l a n t s ( M c D a n i e l a n d Ramage , 1 9 7 0 ; N i e l s o n a n d F r y d e n b e r g , 1 9 7 1 ; C a r l s o n , 1 9 7 2 ; N i e l s o n a n d S c a n d a l i o s , 1974 ; S m i t h a n d C o n k l i n , 1 9 7 5 ; F o b e s , 1980 ; T s a f t a r i s e t a l . , 1 9 8 1 ; B i r c h l e r a n d N e w t o n , 1 9 8 1 ; M c M i l l i n a n d S c a n d a l i o s , 1982 ; W i j s m a n a n d v a n d e n B e r g , 1982) a n d a n i m a l s ( M a r i m o a n d G i a n n e l l i , 1 9 7 5 ; M a g e n i s e t a l . , 1 9 7 5 ; G e o r g e a n d F r a n c k e , 1976 ; K u r n i t , 1 9 7 9 ; Cox e t a l . , 1 9 8 0 ; E p s t e i n e t a l . , 1982 ; K l o s e a n d P u t z , 1 9 8 3 ; S t e i n b a c k a n d B e n z , 1 9 8 3 ) . I n f a c t , many o f t h e s e s t u d i e s h a v e u s e d t h e d o s a g e d e p e n d e n t r e s p o n s e i n t r i s o m i e s f o r g e n e m a p p i n g . T h e s e o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e t h a t t h e a v a i l a b i l i t y o f a s t r u c t u r a l g e n e f o r t r a n s c r i p t i o n g e n e r a l l y s e t s l i m i t s o n t h e amount o f g e n e p r o d u c t s y n t h e s i z e d w i t h i n a c e l l . T h i s i m p l i e s t h a t f a c t o r s r e s p o n s i b l e f o r m a i n t a i n i n g p a r t i c u l a r l e v e l s o f g e n e e x p r e s s i o n a r e g e n e r a l l y i n e x c e s s , a n d t h a t s m a l l c h a n g e s i n t h e d o s e s o f t h e g e n e s t h e y c o n t r o l ( o n e t o t h r e e c o p i e s ) a r e n o t s u f f i c i e n t t o / c h a n g e t h e i r e f f e c t i v e c o n c e n t r a t i o n . 30 I n c o n t r a s t , t h i s s t u d y h a s c o n f i r m e d o u r p r e v i o u s f i n d i n g s t h a t , i n D r o s o p h i l a , d o s a g e c o m p e n s a t i o n i n w h o l e a r m t r i s o m i e s i s n o t r e s t r i c t e d t o t h e X—chromosome. Many a u t o s o m a l l o c i d i s p l a y d i p l o i d l e v e l s o f a c t i v i t y when d u p l i c a t e d i n w h o l e - a r m t r i s o m i e s . A p p r o x i m a t e l y t w o - t h i r d s o f t h e l o c i e x a m i n e d i n t r i s o m i c — 3 L ( s e e F i g u r e 9) o r i n t r i s o m i c — 2 L i n d i v i d u a l s show a c o m p e n s a t e d ( d i p l o i d ) l e v e l o f e x p r e s s i o n . I n d e p e n d e n c e o f g e n e - p r o d u c t l e v e l s o n g e n e d o s e ( d o s a g e c o m p e n s a t i o n ) h a s a l s o b e e n o b s e r v e d i n l o w e r ( O s l e y a n d H e r e f o r d , 1 9 8 1 ; P e a r s o n e t a l . , 1982) a n d h i g h e r e u k a r y o t e s ( S c h w a r t z , 1971 ; C a r l s o n , 1972 ; B i r c h l e r , 1 9 7 9 ; F o b e s , 1 9 8 0 ; B i r c h l e r a n d N e w t o n , 1 9 8 1 ; D e v l i n e t a l . , 1 9 8 2 ; M c M i l l i n a n d S c a n d a l i o s , 1 9 8 2 ) . C o m p e n s a t i o n o f g e n e s i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s o c c u r s b y a m e c h a n i s m t h a t o p e r a t e s o n a l l t h r e e c o p i e s o f a d u p l i c a t e d l o c u s . T h i s s t u d y r e v e a l e d t h a t c o m p e n s a t e d l e v e l s o f PGM e n z y m e a c t i v i t y a r e f o u n d i n t r i s o m i c - 3 L i n d i v i d u a l s . U s i n g e l e c t r o p h o r e t i c v a r i a n t s , i t i s c l e a r t h a t a l l t h r e e c o p i e s o f t h i s l o c u s w e r e t r a n s c r i p t i o n a l l y a c t i v e i n t r i s o m i c i n d i v i d u a l s . S i n c e PGM i s a m o n o m e r i c e n z y m e , i t i s n o t p o s s i b l e t o d e m o n s t r a t e t h a t a l l t h r e e a l l e l e s a r e a c t i v e i n a s i n g l e c e l l i n t h e s e i n d i v i d u a l s . T h i s i s s u e h a s b e e n r e s o l v e d b y e x a m i n i n g t h e a c t i v i t y o f t h e G p d h l o c u s w h i c h i s l o c a t e d o n t h e l e f t a r m o f c h r o m o s o m e 2 a n d i s d o s a g e c o m p e n s a t e d i n t r i s o m i c - 2 L s t r a i n s . GPDH i s a d i m e r i c m o l e c u l e , a n d i f a l l t h r e e a l l e l e s a r e e x p r e s s e d i n a s i n g l e c e l l , t h e r a t i o s o f m a t e r i a l i n t h e v a r i o u s b a n d s s h o u l d b e p r e d i c t a b l e ( 1 : 2 : 4 : 2 : 1 ) . R e a n a l y s e s o f a t r i s o m i c - 2 L s t r a i n w i t h t h r e e s e p a r a b l e e l e c t r o p h o r e t i c v a r i a n t s o f G p d h s h o w e d t h a t a l l t h r e e F i g u r e 9 . Summary b a r g r a p h o f e n z y m e q u a n t i t i e s i n 3L t r i s o m i e s r e l a t i v e t o d i p l o i d s . G e n e d o s e e x p r e s s e d 2 i n d i c a t e s a d i p l o i d l e v e l o f e n z y m e a c t i v i t y . G e n e d o s e e x p r e s s e d 3 i n d i c a t e s a d o s e - d e p e n d e n t q u a n t i t y . 92 Q) O V) V) tt Q. H UJ 2 tt CO o Q i tt c tt O IDH AK SOD EST-6 PGM CAT 83 s t r u c t u r a l g e n e s w e r e a c t i v e i n e a c h c e l l . We a l s o o b s e r v e d t h a t , e v e n t h o u g h t h e e x p r e s s i o n o f e a c h G p d h t e m p l a t e was r e d u c e d b y t w o t h i r d s i n t r i s o m i c i n d i v i d u a l s ( c o m p e n s a t i n g ) , t h e t o t a l a m o u n t o f e n z y m e p r o d u c e d r e m a i n e d d i r e c t l y s e n s i t i v e t o c h a n g e s i n t h e G p d h s t r u c t u r a l g e n e d o s e l i e . i f d e f i c i e n c i e s o r n u l l a c t i v i t y a l l e l e s w e r e u s e d i n t r i s o m i e s t h e amount o f GPDH a c t i v i t y was r e d u c e d f u r t h e r b y o n e t h i r d . T h e s e r e s u l t s e l i m i n a t e t h e p o s s i b i l i t y t h a t r e g u l a t i o n o c c u r s b y f e e d b a c k i n h i b i t i o n b y p r o d u c t l e v e l s f o r t h i s l o c u s . M o r e o v e r , t h e r e s u l t s w i t h t h e G p d h d e f i c i e n c y r e v e a l t h a t c o m p e n s a t i o n i n t r i s o m i e s d o e s n o t a r i s e f r o m c o m p e t i t i o n b e t w e e n i n d i v i d u a l c o p i e s o f a c o m p e n s a t e d g e n e f o r a l o c u s s p e c i f i c f a c t o r ( A r a g o n c i l l o e t a l . 1 9 7 8 ) . T h e r e g u l a t o r y e f f e c t a p p e a r s t o a c t e q u a l l y o n e a c h a l l e l e o f a p a r t i c u l a r g e n e a n d i n d e p e n d e n t l y o f t h e o t h e r s . I n d e e d l i m i t a t i o n s i n t h e n o r m a l s y n t h e t i c p a t h w a y a r e n o t o b s e r v e d i n d i p l o i d s ; t h a t i s , t h e a m o u n t o f GPDH e n z y m e i s d i r e c t l y d e p e n d e n t o n t h e s t r u c t u r a l g e n e d o s e ( O ' B r i e n a n d M c l n t y r e , 1972 ; B e w l e y e t a l . , 1 9 7 4 ) . T h u s , i t s e e m s l i k e l y t h a t c o m p e n s a t i o n i n w h o l e - a r m t r i s o m i e s a r i s e s f r o m a l t e r a t i o n s t o t r a n s c r i p t i o n a l p r o c e s s e s t h a t n o r m a l l y o c c u r i n d i p l o i d s . S i n c e o n e - t h i r d o f t h e . l o c i m e a s u r e d o n a n a u t o s o m a l a r m a r e n o t c o m p e n s a t e d i n t r i s o m i e s , t h e c o m p e n s a t o r y m e c h a n i s m d o e s n o t o p e r a t e o n t h e w h o l e c h r o m o s o m e a r m a s a u n i t . I n t r i s o m i e s f o r 2 L , c o m p e n s a t i n g a n d n o n — c o m p e n s a t i n g l o c i a p p e a r e d t o b e s e g r e g a t e d i n t o s e p a r a t e r e g i o n s o f t h e c h r o m o s o m e a n d t h u s c o u l d b e r e g u l a t e d a s l a r g e c h r o m o s o m a l s u b u n i t s . I n c o n t r a s t , i n 3 L t r i s o m i e s c o m p e n s a t i n g a n d 8f n o n - c o m p e n s a t i n g l o c i w e r e n o t s e g r e g a t e d i n t o s e p a r a t e r e g i o n s o-f t h e c h r o m o s o m e . M o r e i m p o r t a n t l y , m e a s u r e m e n t s o f t r a n s c r i p t i o n o n p o l y t e n e c h r o m o s o m e s f r o m s a l i v a r y g l a n d s o f 2 L t r i s o m i e s i n d i c a t e t h a t , f o r l a r g e c h r o m o s o m a l r e g i o n s , a r e g i o n a l d i s t r i b u t i o n o f c o m p e n s a t i n g a n d n o n c o m p e n s a t i n g l o c i d o e s n o t e x i s t ( s e e C h a p t e r 5 ) . I n a d d i t i o n , t h e d a t a o n t h e s m a l l h e a t s h o c k p r o t e i n s i n 3 L s u g g e s t t h a t e v e n w i t h i n a s m a l l c h r o m o s o m a l d o m a i n ( 1 2 k b ) , a d j a c e n t g e n e s may b e h a v e i n d e p e n d e n t l y . T h i B a r g u e s t h a t c o m p e n s a t i n g a n d n o n - c o m p e n s a t i n g l o c i a r e d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t t h e c h r o m o s o m e a r m . T h e r e f o r e n o s i m p l e m e c h a n i s m , s u c h a s p a r t i t i o n i n g b a s e d o n c h r o m o s o m a l l o c a t i o n , e x i s t s t o d i s t i n g u i s h b e t w e e n l o c i t h a t r e s p o n d t o c o m p e n s a t i o n a n d t h o s e t h a t d o n o t . T h e mRNA f o r h s p 83 i s f o u n d a t d o s e d e p e n d e n t l e v e l s i n 3 L t r i s o m i e s . H o w e v e r , s i n c e h e a t - s h o c k p r o t e i n 83 s y n t h e s i s o c c u r s a t a d i p l o i d r a t e , p o s t - t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n i s i m p l i e d . H e a t s h o c k p r o t e i n s y n t h e s i s o c c u r s b y a w e l l c h o r e o g r a p h e d i n t e r a c t i o n o f t r a n s c r i p t i o n a l a n d t r a n s l a t i o n a l p r o c e s s e s ( S c h l e s i n g e r e t a l . , 1 9 8 2 ) . D i D o m i n i c o e t a l . ( 1 9 8 2 a ) h a v e s u g g e s t e d t h a t t h e p r o d u c t i o n o f h e a t s h o c k p r o t e i n may b e c o n t r o l l e d b y a u t o r e g u l a t i o n . T h i s t y p e o f r e g u l a t i o n c o u l d a c c o u n t f o r c o m p e n s a t e d l e v e l s o f h s p 83 p r o d u c t i o n i n t r i s o m i c — 3 L i n d i v i d u a l s . No m a t t e r how much h s p mRNA i s p r o d u c e d f r o m a p a r t i c u l a r g e n e , t h e a m o u n t o f p r o t e i n a c c u m u l a t e d c o u l d b e r e s t r a i n e d b y a u t o g e n o u s ( P a r s o n s a n d M a c k i e , 1983) o r i n d e p e n d e n t c o n t r o l s . A f t e r h e a t s h o c k i n t r i s o m i e s , h s p 83 mRNA may h a v e b e e n d e g r a d e d m o r e r a p i d l y o r t r a n s l a t e d l e s s e f f i c i e n t l y t h a n h s p 70 R N A . F o r e x a m p l e , 85 D i D o m i n i c o e t a l . <1982b) h a v e shown t h a t r a p i d c e s s a t i o n o f h s p 70 s y n t h e s i s a f t e r h e a t s h o c k i s a c c o m p l i s h e d b y s e l e c t i v e d e g r a d a t i o n o f h s p 70 mRNA. I t i s t h e r e f o r e o f some i n t e r e s t t h a t d o s a g e c o m p e n s a t i o n i n y e a s t c a n o c c u r b y t r a n s l a t i o n a l c o n t r o l o r b y s e l e c t i v e RNA d e g r a d a t i o n ( O s l e y a n d H e r e f o r d , 1 9 8 1 ; P e a r s o n e t a l . , 1 9 8 2 ) . W h i l e c o m p e n s a t i o n f o r h s p 83 i n t r i s o m i c - 3 L i n d i v i d u a l s may i n v o l v e p o s t - t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n , t h i s s i t u a t i o n i s p r o b a b l y a t y p i c a l . M e a s u r e m e n t s o f o t h e r mRNA l e v e l s a n d o f t r a n s c r i p t i o n r a t e s o n t h e p o l y t e n e c h r o m o s o m e s s u g g e s t t h a t c o m p e n s a t i o n i s g e n e r a l l y m e d i a t e d a t t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n ( s e e c h a p t e r f i v e ) . I n v i e w o f t h e a u t o r e g u l a t o r y n a t u r e o f h s p p r o d u c t i o n i n D r o s o p h i l a i t i s p a r t i c u l a r l y n o t e w o r t h y t h a t t h e X - l i n k e d h s p 83 g e n e a c q u i r e d t h e a b i l i t y t o d o s a g e c o m p e n s a t e a t t h e t r a n s c r i p t i o n a l l e v e l i n EL. p s e u d o o b s c u r a ( P i e r c e a n d L u c c h e s i , 1 9 8 0 ) . T h e e v o l u t i o n a r y p r e s s u r e f o r t h i s may h a v e a r i s e n f r o m a r e q u i r e m e n t f o r t h i s p r o t e i n d u r i n g n o n - h e a t s h o c k c o n d i t i o n s . I n t h i s r e g a r d , h s p 83 c a n b e f o u n d i n t h e c y t o p l a s m u n d e r n o r m a l ( n o n - s t r e s s f u l ) c o n d i t i o n s ( L i n d q u i s t , 1 9 8 0 ) . What i s t h e m e c h a n i s m b y w h i c h c o m p e n s a t i o n i s b r o u g h t a b o u t i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s ? A s i m p l e h y p o t h e s i s , t h a t was o r i g i n a l l y p r o p o s e d t o e x p l a i n how s e x - l i n k e d d o s a g e c o m p e n s a t i o n c o u l d a p p l y t o d o s a g e c o m p e n s a t i o n i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s . T h i s h y p o t h e s i s p o s t u l a t e s t h e e x i s t a n c e o f t r a n s - a c t i n g r e p r e s s o r s e n c o d e d o n t h e same l i n k a g e g r o u p a s t h e g e n e s w h o s e e x p r e s s i o n t h e y i n f l u e n c e ( M u l l e r e t a l . , 1 9 3 1 ) . I t i s w e l l d o c u m e n t e d t h a t c h a n g e s i n t h e d o s e o f a r e g u l a t o r y g e n e c a n a f f e c t t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f t h e g e n e t h a t i t 8b c o n t r o l s . F o r e x a m p l e i n a s y s t e m a t i c s u r v e y o-f t h e D r o s o p h i l a g e n o m e , R a w l s 8c L u c c h e s i (1974) o b s e r v e d t h a t s e v e r a l c h r o m o s o m a l | r e g i o n s , when d u p l i c a t e d , r e p r e s s e d t h e a c t i v i t y o-f a g e n e e n z y m e s y s t e m l o c a t e d o n t h e same l i n k a g e g r o u p , a n d t h e m a g n i t u d e o f t h e s e c h a n g e s a p p r o a c h e d 33%. I t i s q u i t e c o n c e i v a b l e t h a t s t r u c t u r a l g e n e s a n d n e g a t i v e t r a n s — a c t i n g r e g u l a t o r y l o c i c o n t r o l l i n g t h e m o f t e n w o u l d b e l o c a t e d o n t h e same c h r o m o s o m e a r m . I n t h i s c a s e , d o s a g e c o m p e n s a t i o n w o u l d b e o b s e r v e d s i n c e t h e i n c r e a s e d r e p r e s s o r c o n c e n t r a t i o n w o u l d n u l l i f y t h e i n c r e a s e i n t e m p l a t e n u m b e r . I n c o r n , t h i s h y p o t h e s i s h a s b e e n p a r t i c u l a r l y w e l l t e s t e d . B i r c h l e r ( 1 9 7 9 , 19BI) o b s e r v e d t h a t t h e a c t i v i t y o f s e v e r a l e n z m y e s w e r e i n v e r s l e y r e l a t e d t o t h e d o s e o f c h r o m o s o m e I L . O n e o f t h e s e l o c i , A d h - 1 . i s l o c a t e d w i t h i n t h i s a r m a n d c o n s e q u e n t l y p r o d u c e s s i m i l a r l e v e l s o f p r o d u c t i n g e n o t y p e s w i t h v a r i o u s d o s e s o f I L ( S c h w a r t z , 1971S B i r c h l e r , 1 9 7 9 ) . An a l t e r n a t i v e h y p o t h e s i s f o r t h e r e g u l a t i o n o f d o s a g e c o m p e n s a t i o n s u g g e s t s t h a t r a t e - l i m i t i n g a c t i v a t o r s o f t r a n s c r i p t i o n a r e e n c o d e d b y g e n e s l o c a t e d o n c h r o m o s o m e s ( o r c h r o m o s o m e a r m s ) o t h e r t h a n t h o s e w h o s e t r a n s c r i p t i o n t h e y i n f l u e n c e ( S c h w a r t z , 1 9 7 1 ) . X - c h r o m o s o m e t r a n s c r i p t i o n a p p e a r s t o b e c o n t i n u a l l y a d j u s t a b l e i n s t r a i n s w i t h X / A r a t i o b e t w e e n 0 . 3 3 a n d 1 . 5 ( M a r o n i a n d P l a u t , 1 9 7 3 b ; M a r o n i a n d L u c c h e s i , 1 9 B 0 ; W i l l i a m s o n a n d B e n t l e y , 1 9 B 3 ) . A l t h o u g h t h e s e s t u d i e s d i d n o t m e a s u r e s i n g l e g e n e p r o d u c t s i n s i n g l e c e l l s , t h e y a r e c o m p a t i b l e w i t h t h e t h e o r y t h a t X - l i n k e d d o s a g e c o m p e n s a t i o n r e s u l t s f r o m c o m p e t i t i o n f o r l i m i t e d a c t i v a t o r s o f t r a n s c r i p t i o n e n c o d e d o n t h e a u t o s o m e s . T h e l i m i t i n g a c t i v a t o r t h e o r y a p p e a r s t o b e l e s s a t t r a c t i v e 87 f o r e x p l a i n i n g d o s a g e c o m p e n s a t i o n i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s b e c a u s e o f t h e s p e c i a l c o n t r i v a n c e s r e q u i r e d t o a c c o m m o d a t e i t . F o r e x a m p l e , s e v e r a l g e n e s w o u l d h a v e t o b e r e g u l a t e d b y t h e same a c t i v a t o r s o t h a t d o s a g e d e p e n d e n c e c o u l d b e o b s e r v e d i n s m a l l s e g m e n t a l a n e u p l o i d s . A l l g e n e s t h a t r e s p o n d t o a s i n g l e a c t i v a t o r m u s t r e s i d e i n t h e same c h r o m o s o m e a r m f o r a d i s c r e t e r e s p o n s e t o b e o b s e r v e d i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s . F u r t h e r m o r e , t h e l i m i t i n g a c t i v a t o r t h e o r y w o u l d p r e d i c t t h a t t r i s o m y f o r o n e a r m w o u l d i n c r e a s e t h e e x p r e s s i o n o f some g e n e s l o c a t e d e l s e w h e r e i n t h e g e n o m e ; a c t i v a t i o n o f u n l i n k e d l o c i i s v e r y r a r e i n t r i s o m i e s ( s e e c h a p t e r 3 ) . I n t h e p r e v i o u s c h a p t e r , we n o t e d s i m i l a r i t i e s b e t w e e n c o m p e n s a t i o n o b s e r v e d i n t r i s o m i c - X a n d t r i s o m i c - 2 L s t r a i n s . I t i s p o s s i b l e t h a t c o m p e n s a t i o n i n a l l t r i s o m i e s ( s e x - l i n k e d a n d a u t o s o m a l ) c o u l d b e c o n t r o l l e d b y s i m i l a r m e c h a n i s m s . H o w e v e r , t h e l i t e r a t u r e c o n t a i n s c o n f l i c t i n g r e p o r t s o n t h e l e v e l s o f 6 - P G D a n d G6PDH ( F a i z u l l i n a n d G v o z d e v , 1 9 7 3 ; L u c c h e s i e t a l . , 1974 ; S t e w a r t a n d M e r r i a m , 1 9 7 5 ; W i l l i a m s o n a n d B e n t l e y , 1 9 8 3 ; G v o z d e v e t a l . , 1 9 8 3 ) . F o r t h e s e r e a s o n s we e x a m i n e d t h e e x p r e s s i o n o f f i v e X - l i n k e d g e n e s i n m e t a f e m a l e s . T h e s e i n c l u d e d t h e two p r e v i o u s l y m e n t i o n e d g e n e - e n z y m e s a n d t h r e e o t h e r l o c i (Fum, G o t , Had) w h o s e e x p r e s s i o n h a d n o t b e e n e x a m i n e d i n m e t a f e m a l e s . T h e d a t a we o b t a i n e d f o r m e t a f e m a l e s i s c o n s i s t e n t w i t h a c o m p e n s a t e d l e v e l o f e x p r e s s i o n f o r f o u r o f f i v e l o c i m e a s u r e d . A f i f t h l o c u s , 6 - P q d f p r o d u c e d a p p r o x i m a t e l y 207. more p r o d u c t t h a n was e x p e c t e d f o r a c o m p e n s a t e d r e s p o n s e . I t i s n o t e w o r t h y t h a t w h i l e c o m p e n s a t e d l e v e l s o f X — l i n k e d p r o t e i n p r o d u c t s a r e o b s e r v e d i n m e t a f e m a l e s , 88 b o t h d o s e d e p e n d e n t a n d c o m p e n s a t e d l e v e l s o f t r a n s c r i p t i o n h a v e b e e n o b s e r v e d < A n a n i e v e t al.,1974s L u c c h e s i e t a l . , 1974). T h e s e o b s e r v a t i o n s may b e i n t e r p r e t e d a s a l a c k o f p r e c i s i o n i n t h e r e g u l a t o r y m e c h a n i s m i n v o l v e d . H o w e v e r , l a c k o f p r e c i s i o n i s n o t o b s e r v e d b e t w e e n e u p l o i d m a l e s a n d f e m a l e s , a n d t h e r e f o r e , i t i s p o s s i b l e t h a t d o s a g e c o m p e n s a t i o n i n m e t a f e m a l e s o c c u r s b y a m e c h a n i s m t h a t d i f f e r s f r o m m a l e - f e m a l e c o m p e n s a t i o n . C o n s i s t e n t w i t h t h i s v i e w , we h a v e r e c e n t l y f o u n d t h a t t h e e x p r e s s i o n o f L S P - l a T a n X - l i n k e d g e n e w h i c h d o e s n o t c o m p l e t e l y c o m p e n s a t e b e t w e e n e u p l o i d m a l e s a n d f e m a l e s , i s f u l l y c o m p e n s a t e d i n m e t a f e m a l e s ( s e e c h a p t e r s i x ) . C l e a r l y , a c o n c l u s i o n r e g a r d i n g t h e a n a l o g y b e t w e e n c o m p e n s a t i o n i n X a n d i n a u t o s o m a l h y p e r p l o i d s a w a i t s r e s o l u t i o n o f t h e t r a n s c r i p t i o n r a t e i n m e t a f e m a l e s . I t i s a p p a r e n t f r o m t h e s e i n v e s t i g a t i o n s t h a t d o s a g e c o m p e n s a t i o n f o r v a r i a t i o n s i n c h r o m o s o m e number i s a c o m p l e x p h e n o m e n o n a n d t h a t i t may b e i n f l u e n c e d b y s e v e r a l r e g u l a t o r y s y s t e m s . I n t h e f a m i l y D r o s o p h i l i d a e , d o s a g e c o m p e n s a t i o n f o r d i f f e r e n c e s i n c h r o m o s o m e number b e t w e e n t h e s e x e s i s o b s e r v e d f o r a t l e a s t t h r e e o f t h e m a j o r c h r o m o s o m a l e l e m e n t s ( c h r o m o s o m e a r m s ) . B e t w e e n s p e c i e s , a n e l e m e n t c a n e x i s t e i t h e r a s a n a u t o s o m e o r a s a n X - c h r o m o s o m e . F o r e x a m p l e , e l e m e n t D ( a f t e r P a t t e r s o n a n d S t o n e , 1952) c o m p r i s e s t h e l e f t a r m o f c h r o m o s o m e t h r e e i n D j . m e l a n o a a s t e r b u t i s t h e r i g h t a r m o f t h e X—chromosome i n Dj_ p s e u d o o b s c u r a . A n o t h e r c h r o m o s o m e e l e m e n t e x i s t s a s a s e c o n d X—chromosome i n D . m i r a n d a f X=». T h i s n e o - X c h r o m o s o m e a p p e a r s t o b e o n l y p a r t i a l l y c o m p e n s a t e d b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s ( S t r o b e i e t 89 a l , 1978 ; D a s e t a l . , 1982) a n d p e r h a p s a l l o w s a f o r t u i t o u s g l i m p s e a t a n e v o l u t i o n a r y i n t e r m e d i a t e o f d o s a g e c o m p e n s a t i o n . L u c c h e s i (1978) a n d C h a r l e s w o r t h (1978) h a v e d i s c u s s e d how d o s a g e c o m p e n s a t i o n may h a v e a r i s e n d u r i n g t h e e s t a b l i s h m e n t o f a h e t e r o m o r p h i c p a i r o f s e x c h r o m o s o m e s . I f c h r o m o s o m e a r m s b e h a v e i n h e r e n t l y a s i n d e p e n d e n t r e g u l a t o r y u n i t s , t h e n t h i s m i g h t f a c i l i t a t e t h e a c q u i s i t i o n o f s e x - l i n k e d d o s a g e c o m p e n s a t i o n when t h e s e a r m s b e c o m e X c h r o m s o m e s . I f s u c h a n h y p o t h e s i s w e r e c o r r e c t , t h e n X - l i n k e d d o s a g e c o m p e n s a t i o n c o u l d b e a s p e c i a l i z e d e x t e n s i o n o f a u t o s o m a l c o m p e n s a t i o n . A l t e r n a t i v e l y , i f t r i s o m y (X a n d a u t o s o m a l ) a n d m a l e - f e m a l e c o m p e n s a t i o n o p e r a t e a s t w o i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s , t h e n s e x - l i n k e d d o s a g e c o m p e n s a t i o n may e v o l v e b y t h e a c q u i s i t i o n o f t h e n e c e s s a r y r e g u l a t o r y e l e m e n t s o n t h e new X - c h r o m o s o m e . Some l i g h t c a n b e s h e d o n t h i s p r o b l e m b y e x a m i n i n g t h e r e s p o n s e o f t h e same g e n e t o a l t e r a t i o n s i n p l o i d y when i t i s p r e s e n t o n a n a u t o s o m e o r o n t h e X . T h r e e o f t h e g e n e s w h i c h h a v e b e e n m e a s u r e d i n t h i s s t u d y ( i n v o l v i n g t r i s o m i e s f o r e l e m e n t D i n j)^ m e l a n o a a s t e r ) a r e a l s o p r e s e n t o n t h e r i g h t a r m o f t h e X i n JL. p s e u d o o b s c u r a . One o f t h e s e g e n e s , I d h T c o m p e n s a t e s b o t h i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s o f P_JJ_ mel a n o a a s t e r a n d b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s o f D . p s e u d o o b s c u r a ( A b r a h a m a n d L u c c h e s i , 1 9 7 5 ) . H o w e v e r , t w o o t h e r g e n e s , E s t - 6 ( E s t - 5 i n D f p s e u d o o b s c u r a ; s e e W r i g h t , 1961 , a n d A b r a h a m a n d L u c c h e s i , 1974) a n d h s p 85 (RNA l e v e l s ) , d o n o t c o m p e n s a t e i n D . m e l a n o a a s t e r b u t d o i n D . p s e u d o o b s c u r a ( A b r a h a m a n d L u c c h e s i , 1 9 7 5 ; P i e r c e a n d 90 L u c c h e s i , 1 9 8 0 ) . S i n c e E s t - 6 p r o t e i n a n d h s p 85 mRNA s y n t h e s i s d o n o t r e g u l a t e i n Dj_ m e l a n o q a s t e r t r i s o m i e s , t h e s e g e n e s p r o b a b l y h a v e a q u i r e d new r e g u l a t o r y c o n t r o l s d u r i n g e v o l u t i o n t h a t a l l o w e d t h e m t o c o m p e n s a t e f o r c h r o m o s o m e number i n EL. p s e u d o o b s c u r a . T h e r e f o r e , t h e a b i l i t y o f a g e n e t o d o s a g e c o m p e n s a t e i n a u t o s o m e s i s n o t p r e r e q u i s i t e f o r d o s a g e c o m p e n s a t i o n i n s e x c h r o m o s o m e s . T h e a b i l i t y o f a g e n e t o d o s a g e c o m p e n s a t e o n t h e X a r i s e s f r o m s i g n a l s d i s t a n t f r o m t h e s t r u c t u r a l g e n e ( K o r g e , 1 9 8 1 ) , s i n c e a n a u t o s o m a l g e n e t r a n s p o s e d o n t o t h e X—chromosome c a n d o s a g e c o m p e n s a t e ( S p r a d l i n g a n d R u b i n , 1 9 8 3 ; S c h o l n i c k e t a l . , 1 9 8 3 ) . P r e s u m a b l y , s e q u e n c e s l o c a t e d n e a r t h e g e n e a r e i m p o r t a n t f o r m e d i a t i n g t h i s e f f e c t s i n c e a n X — l i n k e d g e n e ( w i t h f l a n k i n g s e q u e n c e s ) t r a n s p o s e d t o a n a u t o s o m e r e t a i n s i t s a b i l i t y t o d o s a g e c o m p e n s a t e ( H a z e l r i g g e t a l . , 1 9 8 4 ) . T h e e v o l v i n g X c h r o m o s o m e may a c q u i r e new s e q u e n c e s c a p a b l e o f c a u s i n g h y p e r — a c t i v e t r a n s c r i p t i o n i n m a l e s i n a f a s h i o n a n a l o g o u s t o o t h e r e u k a r y o t i c t r a n s c r i p t i o n e n h a n c e r s . I n a n y e v e n t , t h e s e s t u d i e s o n i n d i v i d u a l g e n e s i n d i f f e r e n t D r o s o p h i l i d s p e c i e s a r e c o n c o r d a n t w i t h t h e n o t i o n t h a t a u t o s o m a l a n d m a l e - f e m a l e s d o s a g e c o m p e n s a t i o n o c c u r s b y t w o s e p a r a t e m e c h a n i s m s . H o w e v e r , t h e y d o n o t c l a r i f y t h e i s s u e o f w h e t h e r o r n o t c o m p e n s a t i o n i n a l l t r i s o m i e s ( a u t o s o m a l a n d X - c h r o m o s o m a l ) o c c u r s b y a common m e c h a n i s m . O r g a n i s m s h a v e e x p l o i t e d s e v e r a l means t o m o d u l a t e g e n e e x p r e s s i o n f o r v a r i a t i o n s i n g e n e d o s e ( C a s a r t e l l i e t a l . , 1 9 6 9 ; R a s c h e t a l . , 1 9 7 7 ; F r a s e r a n d N u r s e , 1 9 7 9 ; B e r g e r , 1982 ; d e C . B i c u d o , 1 9 8 3 ; G a r t l e r a n d R i g g s , 1 9 8 3 ; B a k e r a n d B e l o t e , 1 9 8 3 ) . 91 T h i s d i v e r s i t y a l o n e i s t e s t i m o n y t o t h e c o m p l e x i t y o f e u k a r y o t i c r e g u l a t o r y s y s t e m s . C o m p e n s a t i o n i n w h o l e a r m t r i s o m i e s r e v e a l s c o n t r o l m e c h a n i s m s w h i c h h a v e c e r t a i n l y n o t e v o l v e d t o a c c o m o d a t e d i f f e r e n c e s i n g e n e d o s a g e . H o w e v e r , t h e e x t e n s i v e a n d w i d e s p r e a d e x i s t e n c e ( s e e c h a p t e r t h r e e ) o f t h i s r e s p o n s e s u g g e s t s t h a t i t i s a f u n d a m e n t a l p r o p e r t y o f g e n e c o n t r o l i n e u k a r y o t e s . A s i m p l e i n t e r p r e t a t i o n i s t h a t h y p e r p l o i d c o m p e n s a t i o n r e f l e c t s a h o m e o s t a t i c r e g u l a t o r y s y s t e m f o r m a i n t a i n i n g b a l a n c e d r a t e s o f g e n e e x p r e s s i o n i n d i p l o i d s ( D e v l i n e t a l . , 1 9 8 2 ) . I t w o u l d n o t b e s u r p r i s i n g t h o u g h t o f i n d t h a t some o r g a n i s m s h a v e e x p l o i t e d a n d p e r f e c t e d t h i s f o r m o f r e g u l a t i o n t o c o m p e n s a t e f o r n a t u r a l l y o c c u r r i n g d e v i a t i o n s f r o m e u p l o i d y . CHAPTER T H R E E I N F L U E N C E OF TRISOMY ON T H E E X P R E S S I O N OF L O C I MAPPING O U T S I D E OF T H E D U P L I C A T E D R E G I O N 0 °I3 I n t r o d u c t i o n T h e s y n t h e s i s o f f u n c t i o n a l g e n e p r o d u c t s i n v o l v e s a v a r i e t y o f i n t e r a c t i n g p r o c e s s e s . E a c h r e a c t i o n i n a s y n t h e t i c p a t h w a y h a s , t o v a r y i n g d e g r e e s , t h e p o t e n t i a l t o r e g u l a t e t h e q u a n t i t y o r q u a l i t y o f t h e g e n e p r o d u c t . Many o f t h e s e s t e p s r e q u i r e t h e a c t i o n o f e n z y m e s o r c o f a c t o r s c o d e d f o r e l s e w h e r e i n t h e g e n o m e . T h u s , t r a n s - a c t i n g g e n e t i c m o d i f i e r s w h i c h a f f e c t t h e f i n a l l e v e l s o f a c t i v e g e n e p r o d u c t a r e q u i t e common ( P a i g e n , 1 9 7 9 ; 1 9 8 0 ) . Some t r a n s - a c t i n g r e g u l a t o r y g e n e s c h a n g e t h e g e n e p r o d u c t b y d i r e c t m o d i f i c a t i o n o r b y a l t e r i n g t h e i n v i v o s t a b i l i t y ( G a n s c h o w a n d S c h i m k e , 1 9 6 9 ; T w a r d z i k e t a l . , 1 9 7 1 ; B e w l e y a n d L u c c h e s i , 1977 ; J o h n s o n e t a l , 1 9 8 1 ; K i n g a n d M c D o n a l d , 1 9 8 3 ) . O t h e r s d o n o t a p p e a r t o m o d i f y t h e f i n a l g e n e p r o d u c t ( R a w l s a n d L u c c h e s i , 1974a) a n d may t h e r e f o r e e x e r t t h e i r e f f e c t a t t h e t r a n s c r i p t i o n a l l e v e l . Where t h e q u a n t i t y o f a r e g u l a t o r y - g e n e p r o d u c t a f f e c t s t h e k i n e t i c s o f a b i o s y n t h e t i c s t e p , t h e p o t e n t i a l e x i s t s f o r e n d p r o d u c t r e g u l a t i o n ( K a c s e r a n d B u r n s , 1 9 8 1 ) . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h s u c h g e n e s a c t i s l i k e l y t o b e q u i t e v a r i e d , a n d s y s t e m s u t i l i z i n g " p o s i t i v e " o r " n e g a t i v e " c o n t r o l c a n b e e n v i s a g e d ( G o l d b e r g e r , 1 9 7 9 ) . R e g u l a t o r y s e q u e n c e s h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n e u k a r y o t e s w h i c h c o n f e r s p e c i a l i z e d e n h a n c e m e n t o f t r a n s c r i p t i o n i n r e s p o n s e t o v a r i o u s p h y s i o l o g i c a l o r d e v e l o p m e n t a l s t i m u l i ( B a n e r j i e t a l . , 1981 ; D i e r k s e t a l . , 1 9 8 1 ; P e l h a m , 1982 ; B a n e r j i e t a l . , 1 9 8 3 ; Q u e e n a n d B a l t i m o r e , 1 9 8 3 ; C h a n d l e r e t a l . , 1983 ; G i l l i e s e t a l . , 1 9 8 3 ) . 94-C i s - a c t i n g e n h a n c e m e n t o f t r a n s c r i p t i o n b y T y l t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s i n y e a s t h a s b e e n shown t o r e q u i r e p r o d u c t s i n t r a n s t o e x e r t i t s e f f e c t ( D u b o i s e t a l . , 1 9 8 2 ) . I n D r o s o p h i l a , X - c h r o m o s o m e d o s a g e c o m p e n s a t i o n a l s o i n v o l v e s a n a c t i v a t i o n o f t r a n s c r i p t i o n a n d r e q u i r e s t r a n s - a c t i n g g e n e f u n c t i o n ( B e l o t e a n d L u c c h e s i , 1 9 8 0 ) . Many e x a m p l e s o f r e g u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n i n e u k a r y o t e s i n v o l v e l a r g e c h a n g e s i n t r a n s c r i p t i o n a l a c t i v i t y ( f o r e x a m p l e s , s e e A s h b u r n e r a n d B o n n e r 1979 , o r S e a r l e a n d T a t a 1 9 8 1 ) , i n c o n t r a s t w i t h t h e r e g u l a t o r y e f f e c t s d e s c r i b e d i n t h e p r e v i o u s t w o c h a p t e r s , w h i c h w e r e much m o r e s u b t l e . R e d u c t i o n s i n g e n e e x p r e s s i o n o n t h e o r d e r o f o n e - t h i r d seem t r i v i a l c o m p a r e d t o t h e d r a m a t i c a l t e r a t i o n s d i s p l a y e d b y some g e n e s . P e r h a p s more p a r a d o x i c a l i s t h e o b s e r v a t i o n t h a t among s t r a i n s , a n d among i n d i v i d u a l s o f a s t r a i n , c o n s i d e r a b l e v a r i a b i l i t y i n g e n e a c t i v i t y c a n b e d e t e c t e d ( s e e c h a p t e r 4 ) . T h e p u r p o s e o f t h i s c h a p t e r i s t o e x p l o r e t h e e x t e n t t o w h i c h g e n e r e p r e s s i o n o c c u r s i n t r i s o m i e s , a n d t o d i s c u s s t h e i m p l i c a t i o n s o f t h i s r e g u l a t i o n f o r D r o s o p h i l a . T h e p r e v i o u s two c h a p t e r s e x a m i n e d t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s w i t h i n t h e d u p l i c a t e d a r m . H e r e we e x a m i n e t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s e l s e w h e r e i n t h e genome a s w e l l a s t h e e x p r e s s i o n o f two f a m i l i e s o f g e n e s , o n e o f n a t u r a l e v o l u t i o n a r y o r i g i n a n d t h e o t h e r a r t i f i c i a l l y c r e a t e d b y P - e l e m e n t m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n ( t r a n s f o r m a t i o n was p e r f o r m e d b y J . P o s a k o n y who k i n d l y p r o v i d e d t h e D r o s o p h i l a s t o c k s ) . We f i n d t h a t t h e m a j o r i t y o f l o c i c a n b e r e p r e s s e d b y a t r a n s - a c t i n g m e c h a n i s m i n a t l e a s t o n e a u t o s o m a l t r i s o m y , w h i l e f e w a c t i v a t i o n s o f e x p r e s s i o n a r e 35 o b s e r v e d . M o d u l a t i o n c a n o p e r a t e i n d e p e n d e n t l y o f o t h e r r e g u l a t o r y m e c h a n i s m s ( s u c h a s X—chromosome d o s a g e c o m p e n s a t i o n o r d e v e l o p m e n t a l c u e s ) a n d d o e s n o t o b l i g a t o r i l y a f f e c t s i m i l a r g e n e s i n s i m i l a r w a y s . M a t e r i a l s a n d M e t h o d s G e n e t i c s t o c k s a n d c r o s s e s T r i s o m i e s w e r e p r o d u c e d a s d e s c r i b e d i n p r e v i o u s c h a p t e r s . F o r t h e e x p e r i m e n t s c o n c e r n i n g X - l i n k e d e n z y m e a c t i v i t y i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s , a n d i s o g e n i c X c h r o m o s o m e ( i s o - X ) f r o m t h e O r e g o n R s t o c k was i n t r o d u c e d i n t o t h e c o m p o u n d - f r e e s t a c k s b y n o n d i s j u n c i o n , t o y i e l d t h e f o l l o w i n g s t o c k s : i s o - X / i s o - X ; C C 2 D V H 1 . I t ; F ( 2 R ) b w / F < 2 R ) w a n d i s o - X / i s o - X 8 C ( 5 L ) V G l . r u s t ; F < 5 R > V D l . e E ' / F < 3 R ) V D l . e e . T h i s l a t t e r s t o c k was a l s o u s e d i n t h e e x p e r i m e n t s i n v o l v i n g l a r v a l s e r u m p r o t e i n s i n 3 L t r i s o m i e s . T o m e a s u r e t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f i n d i v i d u a l A d h g e n e s i n 2 L t r i s o m i e s , a c o m p o u n d - f r e e s t o c k b e a r i n g n u l l m u t a t i o n s f o r A d h was c o n s t r u c t e d . b, A d h N : B O S P p r c n f e m a l e s t r e a t e d w i t h 2500 r a d s o f gamma i r r a d i a t i o n w e r e m a t e d t o a c o m p o u n d s e c o n d s t o c k . A n e w l y i n d u c e d C ( 2 L ) b  A d h N 2 ; o s p p r c h r o m o s o m e was i n t r o d u c e d i n t o a c o m p o u n d f r e e s t o c k b y n o n d i s j u n c t i o n t o p r o d u c e t h e f o l l o w i n g s t o c k : C ( 2 L ) b A d h " = o s p p r s F ( 2 R ) b w P i n / F ( 2 R ) b w P i n . F e m a l e s o f t h i s s t o c k w e r e c r o s s e d t o m a l e s b e a r i n g a n A d h g e n e t r a n s p o s e d t o a new c h r o m o s o m e p o s i t i o n , a n d n u l l m u t a t i o n s i n t h e n a t i v e A d h g e n e s . F r o m t h e s e c r o s s e s f e m a l e t r i s o m i c — 2 L l a r v a e w e r e s e l e c t e d i n w h i c h a l l ADH e n z y m e a c t i v i t y i s e n c o d e d b y t h e t r a n s p o s e d g e n e . E n z y m e A s s a y s : T h e a s s a y s f o r P G K , G P D H , A D H , IDH a n d 6 - P G D a r e d e s c r i b e d i n c h a p t e r 1 a n d f o r A K , P G M , C A T , A O , M E , P G 1 , F U M , GPT a n d G6PD i n c h a p t e r 2 . T h e a s s a y c o n d i t i o n s f o r A l d o l a s e (ALD) w e r e : 0 . 1 M T r i s , pH 7 . 5 , 0 .2mM N A D H , ImM f r u c t o s e - l - 6 - d i p h o s p h a t e , 1 u n i t g l u c o s e - 6 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e / m l , 10 u n i t s t r i o s e p h o s p h a t e i s o m e r a s e / m l . I n t h e e x p e r i m e n t i n v o l v i n g A d h t r a n s f o r m a n t s , ADH e n z y m e a c t i v i t y was a s s a y e d i n 0 . 5 M N a - - C 0 3 , 2mM N A D , 0 . 2 7 5 M b u t a n - 2 - o l , p H 9 . 0 ( S o f e r a n d U r s p r u n g , 1 9 6 8 ) . A n a l y s i s o f L a r v a l S e r u m P r o t e i n s . L a r v a l s e r u m p r o t e i n s w e r e a n a l y s e d i n t w o e l e c t r o p h o r e t i c s y s t e m s . F o r a n a l y s i s b y S D S - g e l e l e c t r o p h o r e s i s , s a m p l e s o f h e m o l y m p h f r o m w a n d e r i n g t h i r d - i n s t a r l a r v a e ( u s i n g f e m a l e s o n l y i n e x p e r i m e n t s w i t h a u t o s o m a l t r i s o m i e s ) w e r e c o l l e c t e d i n lOmM P O * , ImM P T U , pH 7 . 5 t o w h i c h was a d d e d a n e q u a l v o l u m e o f L a e m l i SDS c o m p l e x i n g b u f f e r . A f t e r b o i l i n g f o r 10 m i n u t e s , t h e s a m p l e s w e r e r u n o n 97. SDS g e l s ( c r o s s - l i n k e d w i t h DATD) w i t h a 37. s t a c k i n g g e l ( B r o c k a n d R o b e r t s , 1 9 8 0 ) . A f t e r s t a i n i n g w i t h c o o m a s i e b l u e R250 a n d d e s t a i n i n g , t h e g e l s w e r e s c a n n e d w i t h a Beckman D U - B s c a n n i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r . T h e a m o u n t s o f i n d i v i d u a l L S P ' s w e r e e x p r e s s e d a s t h e p e r c e n t a g e o f t o t a l L S P i n t h e s a m p l e . T h i s a n a l y s i s was s u c c e s s f u l o n l y f o r m e a s u r e m e n t s o f L S P - 2 a n d L S P - l g : L S P - l a a n d L S P - l b w e r e n o t s e p a r a t e d b y t h i s m e t h o d ( F i g u r e l O a ) . T o r e s o l v e t h e a a n d b s u b u n i t s o f L S P - 1 , h e m o l y m p h was c o l l e c t i n lOmM N a ? . B * 0 7 , ImM P T U , .01% b r o m o p h e n o l b l u e , pH 1 0 . 0 a n d e l e c t r o p h o r e s e d o n C e l l o g e l ( K a l e x S c i e n t i f i c ) c e l l u l o s e - a c e t a t e s t r i p s i n SOmM Na b a r b i t a l , p H 9 . 4 f o r 3 . 5 h o u r s ( R o b e r t s a n d E v a n s - R o b e r t s , 1 9 7 9 b ) . T h e s t r i p s w e r e s t a i n e d w i t h c o o m a s i e b l u e , d e s t a i n e d a n d t h e b a n d s o f i n t e r e s t w e r e e x c i s e d a n d d i s s o l v e d i n g l a c i a l a c e t i c a c i d f o r t w e l v e h o u r s ( a f t e r R o b e r t s a n d E v a n s - R o b e r t s , 1 9 7 9 a ) . T h e o p t i c a l d e n s i t y o f t h e s a m p l e s was m e a s u r e d a t 595nm. T o i d e n t i f y t h e p a r t i c u l a r L S P o n t h e s t r i p s ( F i g u r e 1 0 b ) , v a r i o u s b a n d s w e r e c u t o u t a n d e l u t e d i n t o S D S - c o m p l e x i n g b u f f e r a n d r u n o n a n SDS g e l ( F i g u r e 1 0 C ) . T h e o r d e r o f m i g r a t i o n i n SDS g e l s c r o s s l i n k e d w i t h DATD i s L S P - l g , L S P - l b , L S P - l a a n d L S P - 2 . On C e l l o g e l s t r i p s , m i g r a t i o n i s L S P - 2 , L S P - l a , L S P - l b , a n d L S P - l g , a l t h o u g h t h i s l a t t e r p r o t e i n was n o t r e p r o d u c i b l y r e s o l v e d a n d t h e r f o r e was n o t m e a s u r e d i n t h i s s y s t e m . 9<? F i g u r e 10 . E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o f l a r v a l s e r u m p r o t e i n s o n c e l l u l o s e - a c e t a t e s t r i p s a n d i n S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l s . A . S e p a r a t i o n o f L S P s u b u n i t s o n C e l l o g e l membranes B . S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l o f L S P s u b u n i t s . L a n e s 1 a n d 6 a r e t o t a l h e m o l y m p h s a m p l e s f r o m l a t e t h i r d i n s t a r l a r v a e . L a n e s 2 t o 5 c o n t a i n L S P s a m p l e s i s o l a t e d f r o m C e l l o g e l membranes b y e l u t i n g e x c i s e d b a n d s i n L a e m l i ' s SDS c o m p l e x i n g s o l u t i o n . C . SDS g e l o f t o t a l h e m o l y m p h f r o m : 1 . O r e g o n R; 2 . 2 L t r i s o m y ; 3 . c o m p o u n d - f r e e d i p l o i d ; 4 . O r e g o n R |00 101 R E S U L T S I E n z y m e l o c i P r e v i o u s i n v e s t i g a t i o n s h a v e shown t h a t g e n e s w i t h i n t h e d u p l i c a t e d r e g i o n s o-f w h o l e a r m a u t o s o m a l t r i s o m i e s c a n p r o d u c e c o m p e n s a t e d l e v e l s o f g e n e p r o d u c t s . T h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n c o n s t i t u t e s a c o m p r e h e n s i v e s u r v e y o f t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s o u t s i d e t h e t r i s o m i c a r m s . We h a v e e x a m i n e d t h e e x p r e s s i o n o f f i f t e e n e n z y m e l o c i i n l a r v a e t r i s o m i c f o r o n e o f 2 L , 2 R , 3 L a n d t h e X—chromosome. T h e r e s u l t s o f t h i s a n a l y s i s h a s r e v e a l e d s e v e r a l e f f e c t s o f a n e u p l o i d y o n g e n e e x p r e s s i o n i n D r o s o p h i l a . G e n e s o u t s i d e t h e d u p l i c a t e d r e g i o n c a n b e r e p r e s s e d T h e c o m p e n s a t o r y r e s p o n s e o b s e r v e d f o r g e n e s w i t h i n a d u p l i c a t e d a r m o p e r a t e s b y r e d u c i n g t h e t r a n s c r i p t i o n o f e a c h s t r u c t u r a l g e n e b y o n e t h i r d ( s e e c h a p t e r 5 ) . M a l e s a n d f e m a l e s p o s s e s s s i m i l a r l e v e l s o f m o s t g e n e p r o d u c t s s u g g e s t i n g t h a t v a r i a t i o n i n X - c h r o m o s o m e number d o e s n o t a f f e c t t h e e x p r e s s i o n o f a u t o s o m a l g e n e s . I f c o m p e n s a t i o n o f a u t o s o m a l g e n e s o c c u r s b y a s i m i l a r m e c h a n i s m a s t h a t o p e r a t i n g b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s , t h e n t r i s o m y f o r o n e a r m s h o u l d n o t a f f e c t g e n e s l o c a t e d e l s e w h e r e i n t h e g e n o m e . I n a d d i t i o n , a n o v e r a l l r e d u c t i o n i n e x p r e s s i o n o f a l l l o c i p r o p o r t i o n a l t o t h e s i z e o f 102 t h e d u p l i c a t i o n c o u l d a r i s e t h r o u g h c o m p e t i t i o n o f a l l g e n e s f o r t r a n s c r i p t i o n a l c o m p o n e n t s t h a t may b e p r e s e n t i n l i m i t i n g q u a n t i t i e s . T h e d a t a p r e s e n t e d i n t h i s a n d t h e n e x t c h a p t e r s u g g e s t s t h a t b o t h o f t h e s e h y p o t h e s e s a r e i n c o r r e c t . T h e a c t i v i t i e s o f s i x e n z y m e s i n t r i s o m i c - 2 L l a r v a e a n d t h e i r d i p l o i d p a r e n t a l s t r a i n s a r e p r e s e n t e d . T h e s e e n z y m e s a r e e n c o d e d b y g e n e s l o c a t e d o n 2R, 3 L a n d 3R, w h i c h a r e d i p l o i d i n a l l t h r e e s t r a i n s . A l s o s h o w n a r e e s t i m a t e s o f t h e e n z y m e a c t i v i t y e x p e c t e d i f : 1) n o a l t e r a t i o n o f a c t i v i t y was o c c u r i n g a n d 2) i f g e n e a c t i v i t y was r e p r e s s e d b y o n e - t h i r d . T h e r e a d e r i s d i r e c t e d t o F i g u r e 12 w h e r e t h e e x p r e s s i o n o f e a c h g e n e i n t r i s o m i e s , r e l a t i v e t o t h e e x p r e s s i o n i n d i p l o i d s , i s g r a p h i c a l l y r e p r e s e n t e d . I n 2 L t r i s o m i e s , f o u r o f t h e s i x e n z y m e s <AK, P G M , C A T , a n d MEN) w e r e p r e s e n t a t q u a n t i t i e s c l o s e t o t h a t o b s e r v e d i n t h e d i p l o i d c o n t r o l s ( T a b l e 1 3 ) . H o w e v e r , t w o o f t h e e n z y m e l o c i d i s p l a y e d a l t e r e d l e v e l s o f a c t i v i t y . A l d o x . l o c a t e d o n 3 R , p r o d u c e d a p p r o x i m a t e l y 30% m o r e e n z y m e i n 2 L t r i s o m i e s t h a n i n d i p l o i d s . T h i s i s s i g n i f i c a n t s i n c e i t r e p r e s e n t s o n e o f o n l y ^ t w o a c t i v a t i o n s o f g e n e e x p r e s s i o n b y a n a u t o s o m a l t r i s o m y t h a t we h a v e o b s e r v e d (ADH a c t i v i t y i n 2 L t r i s o m i e s was a l s o h i g h e r t h a n e x p e c t e d ) . T h e o t h e r u n l i n k e d l o c u s a f f e c t e d b y t h e t r i s o m i c - 2 L c o n d i t i o n was P a i f l o c a t e d o n 2R ( T a b l e 1 4 ) . T h e a c t i v i t y o f t h i s g e n e - e n z y m e was r e d u c e d b y c l o s e t o o n e - t h i r d i n t h e t r i s o m i e s . T h e r e f o r e , r e p r e s s i o n o f g e n e e x p r e s s i o n i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s i s n o t l i m i t e d t o g e n e s w i t h i n t h e d u p l i c a t e d a r m . A s i m i l a r a n a l y s i s was p e r f o r m e d w i t h t r i s o m i e s f o r 3 L . S e v e n e n z y m e - l o c i , l o c a t e d o n t h e o t h e r a u t o s o m a l a r m s , w e r e 103 T a b l e 13 A c t i v i t y o f t h i r d c h r o m o s o m e e n z y m e l o c i i n 2 L t r i s o m i e s . G e n o t y p e AK Pgm E n z y m e L o c u s C a t A l d o x Men y / y ( d i p l o i d ) 1 0 . 5 ± . 7 6 (5) 1 .41 ± . 1 0 (5) 7 . 7 0 + . 6 4 (5) 9 . 4 9 ± . 4 5 (5) . 4 7 0 . 0 5 2 (5) y / y 8 C ( 2 L ) l t , F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w ( d i p l o i d ) 1 1 . 4 ± . 9 1 (5) 1 . 3 6 . 0 8 (5) 7 . 0 6 t . 5 4 (5) 1 0 . 9 ± . 8 6 (5) . 3 9 5 ± . 0 6 3 (5) y / y ; C ( 2 1 ) l t / + / F ( 2 R ) b w ( d i p l o i d ) 1 0 . 6 ± . 6 2 (5) 1 . 2 7 ± . 1 1 (5) 8 . 0 6 t . 3 5 (5) 1 3 . 2 ± . 9 3 (5) . 4 3 2 ± . 0 5 0 (5) E s t i m a t e d Mean 1 0 . 9 ± . 4 9 (10) 1 . 3 9 : . 0 5 (10) 7 . 3 8 t -31 (10) 1 0 . 2 1 + . 4 4 (10) . 4 3 3 . 0 3 4 (10) R e p r e s s e d E s t i m a t e 7 . 2 7 t . 3 3 (10) . 9 2 7 . 0 3 (10) 4 . 9 2 t . 2 1 (10) 6 . 8 1 ± . 2 9 (10) . 2 8 9 ± . 0 2 3 (10) E n z y m e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r m i n . p e r mg o f p r o t e i n . N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e t h e s a m p l e s i z e s . R e p r e s s e d E s t i m a t e i s t w o - t h i r d s t h e e s t i m a t e d m e a n . F F 104-T a b l e 14 E n z y m e a c t i v i t y f o r a 2 R - 1 i n k e d e n z y m e l o c u s i n 2 L t r i s o m i e s . G e n o t y p e E n z y m e L o c u s P g i F ( 2 L ) b p r / F ( 2 R ) b p r l 7 . 5 9 + . 4 2 F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w ( d i p l o i d ) (6) C ( 2 L ) l t l F ( 2 R ) b w / 7 . 2 5 ± . 2 1 F ( 2 R ) b w ( d i p l o i d ) (6) C ( 2 L ) l t / F ( 2 L ) b p r » 5 . 3 5 + . 1 7 F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w ( t r i s o m i c - 2 L ) (A) E s t i m a t e d Mean 7 . 4 2 + . 12 R e p r e s s e d e s t i m a t e 4 . 9 5 + . 0 8 E n z y m e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r m i n p e r mg p r o t e i n . N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e t h e s a m p l e s i z e s . R e p r e s s e d e s t i m a t e i s t w o - t h i r d s t h e e s t i m a t e d m e a n . 105 e x a m i n e d . U n l i k e t h e s i t u a t i o n o b s e r v e d f o r 2 L , s i x o f t h e s e v e n g e n e - e n z y m e s s y s t e m s s h o w e d r e d u c e d l e v e l s o f a c t i v i t y i n 3 L t r i s o m i e s r e l a t i v e t o d i p l o i d s . F o u r o f t h e l o c i ( P g k . G p d h . A d h r a n d P a i ) p r o d u c e d a p p r o x i m a t e l y o n e - t h i r d o f t h e e n z y m e a c t i v i t y i n t h e s e t r i s o m i e s t h a n t h a t f o u n d i n d i p l o i d s ( T a b l e 1 5 ) . T h e t w o o t h e r l o c i (Men a n d A l d . b o t h o n 3R) d i s p l a y e d l e v e l s o f a c t i v i t y i n t e r m e d i a t e b e t w e e n t h e t w o e s t i m a t e d v a l u e s ( T a b l e 1 6 ) . T h e o t h e r a u t o s o m a l g e n e , A l d o x f was u n a f f e c t e d b y t h e d u p l i c a t i o n o f 3 L . T h u s , t r i s o m y f o r 3 L a p p e a r s t o r e p r e s s m o r e l o c i t h a n d o e s t r i s o m y f o r 2 L , a l t h o u g h n o t a l l l o c i a r e e q u a l l y a f f e c t e d . T h e l a s t a u t o s o m a l t r i s o m y e x a m i n e d was f o r t h e r i g h t a r m c h r o m o s o m e t w o . B e c a u s e t h e s e a n e u p l o i d s a r e p o o r l y v i a b l e we w e r e a b l e t o m e a s u r e t h e e x p r e s s i o n o f o n l y o n e g e n e l o c a t e d o u t s i d e o f 2 R . T h i s g e n e , G p d h o n 2 L , was r e p r e s s e d b y o n e - t h i r d i n t h i s t r i s o m i c - 2 L s t r a i n ( T a b l e 1 7 ) . C l e a r l y , t r i s o m y f o r t h e m a j o r a u t o s o m a l a r m s i n D .  m e l a n o q a s t e r c a n h a v e s t r i k i n g e f f e c t s o n g e n e e x p r e s s i o n , n o t o n l y o n t h o s e g e n e s l o c a t e d w i t h i n t h e d u p l i c a t e d a r m b u t a l s o o n o t h e r a r m s o r l i n k a g e g r o u p s . By f a r t h e m o s t common e f f e c t i s a r e d u c t i o n i n a c t i v i t y b y a p p r o x i m a t e l y o n e - t h i r d . T h i s t y p e o f r e p r e s s i o n w o u l d r e s u l t i f t r a n s - a c t i n g r e p r e s s o r s o f t h e s e g e n e s w e r e b e i n g d u p l i c a t e d b y t h e t r i s o m i c c o n d i t i o n . S i n c e M u l l e r ' s 1931 p r o p o s a l t h a t X - l i n k e d r e p r e s s o r s a r e r e s p o n s i b l e f o r X - c h r o m o s o m e d o s a g e c o m p e n s a t i o n , l i t t l e s u p p o r t i v e e v i d e n c e h a s b e e n o b t a i n e d . I t h a s b e e n i n f e r r e d t h a t t h e X - c h r o m o s o m e b e a r s f e w m o d i f i e r s o f a u t o s o m a l g e n e e x p r e s s i o n b e c a u s e m a l e s a n d f e m a l e s e x p r e s s m o s t g e n e s e q u a l l y . 10b T a b l e 15 A c t i v i t y o f s e c o n d c h r o m o s o m e e n z y m e l o c i i n 3 L t r i s o m i e s . G e n o t y p e Pgk a G p d h A d h P g i O r e g o n R 5 . 1 7 1 . 6 4 0 . 3 8 8 8 . 0 5 ( d i p l o i d ) ± . 3 5 + . 0 3 ± . 0 2 1 + . 5 2 (5) (6) (6) (6) C ( 3 1 _ ) V G l , r u s t / 4 . 3 9 . 9 6 7 . 3 4 4 6 . 2 8 F ( 3 R ) V D l , e e s / F ( 3 R ) V D l , e s + . 16 + . 0 2 1 + . 0 1 5 ± . 3 5 ( d i p l o i d ) (4) (6) (6) (6) C ( 3 L ) V G 1 , r u s t / 2 . 8 7 . 8 1 1 . 2 3 5 5 . 3 1 + / F ( 3 R ) V D l f e 6 5 ( t r i s o m i c - 3 L ) + . 1 0 + . 0 2 6 + . 0 1 5 + . 2 7 (5) (6) (6) (6) E s t i m a t e d 4 . 7 8 1 . 3 1 . 3 6 6 7 . 1 7 Mean ± . 1 0 + . 0 1 + . 0 0 6 + . 1 6 R e p r e s s e d 3 . 1 9 . 8 7 6 . 2 4 4 4 . 7 8 E s t i m a t e ± . 0 7 + . 0 0 6 + . 0 0 4 + . 1 0 E n z y m e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r m i n p e r mg o f p r o t e i n . N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e t h e s a m p l e s i z e s . R e p r e s s e d e s t i m a t e i s t w o - t h i r d s t h e e s t i m a t e d m e a n . 101 T a b l e 16 A c t i v i t y o-f t h i r d c h r o m o s o m e e n z y m e l o c i i n 3 L t r i s o m i e s . G e n o t y p e Men A l d o x A i d O r e g o n R . 4 5 2 5 . 1 4 1 . 1 4 ( d i p l o i d ) ± . 0 4 8 ± . 4 8 ± . 0 6 (7) (6) (4) C ( 3 L ) V G 1 , r u s t / . 3 6 4 5 . 9 3 1 . 2 5 F ( 3 R ) V D l , e e / F ( 3 R ) V D l , e S 3 + . 0 2 2 + . 4 6 ± . 0 4 ( d i p l o i d ) (6) (6) (4) C ( 3 L ) V G 1 , r u s t / . 3 3 0 5 . 6 1 . 9 8 3 + / F ( 3 R ) V D l , e B ( t r i s o m i c - 3 L ) + . 0 1 1 + . 1 9 + . 0 5 7 (7) (6) (5) E s t i m a t e d . 4 0 8 5 . 5 4 1 . 1 9 Mean ± - 0 1 4 ± . 1 7 + . 0 2 R e p r e s s e d . 2 7 2 3 . 6 9 . 7 9 7 E s t i m a t e ± . 0 0 9 + . 1 1 + . 0 1 1 E n z y m e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r m i n p e r mg o f p r o t e i n . N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e t h e s a m p l e s i z e s . R e p r e s s e d e s t i m a t e i s t w o - t h i r d s t h e e s t i m a t e d m e a n . 108 T a b l e 17 A c t i v i t y o f a 2 L - 1 i n k e d e n z y m e l o c u s i n 2R t r i s o m i e s . E n z y m e L o c u s G e n o t y p e G p d h O r e g o n R . 9 9 8 + . 0 2 8 ( d i p l o i d ) (4) F ( 2 L ) p r / F ( 2 L ) p r , . 6 4 6 ± . 0 5 9 C ( 2 R ) p x ( d i p l o i d ) (4) F ( 2 L ) p r / + / . 6 3 9 ± . 0 4 9 C ( 2 R ) p x ( t r i s o m i c - 2 R ) (6) E x p e c t e d Mean . 8 2 2 ± . 0 1 6 R e p r e s s e d E s t i m a t e . 5 4 8 ± . 0 1 0 E n z y m e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r m i n p e r mg p f p r o t e i n . N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e t h e s a m p l e s i z e s . R e p r e s s e d e s t i m a t e i s t w o - t h i r d s t h e e s t i m a t e d m e a n . I f X - c h r o m o s o m a l a n d a u t o s o m a l t r i s o m y a r e c o m p a r a b l e c o n d i t i o n s , t h e n t r i s o m y f o r t h e X c h r o m o s o m e c o u l d r e p r e s s t h e e x p r e s s i o n o f some a u t o s o m a l g e n e s . We h a v e m e a s u r e d e i g h t g e n e - e n z y m e s y s t e m s w i t h r e p r e s e n t a t i v e s f r o m t h e f o u r m a j o r a u t o s o m a l a r m s i n m a l e s , f e m a l e s a n d m e t a f e m a l e s ( T a b l e s 18 & 1 9 ) . A l l o f t h e s e l o c i p r o d u c e d s i m i l a r l e v e l s o f p r o d u c t b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s , d e s p i t e t h e i r n o n - i s o g e n i c c o n d i t i o n . I n m e t a f e m a l e s , s i x o f t h e s e a u t o s o m a l l o c i w e r e u n a f f e c t e d ( g p d h , Adh_, I d h , Pgm, C a t r A l d o x ) . H o w e v e r , t w o l o c i w e r e r e p r e s s e d , a l t h o u g h o n l y p a r t i a l l y ; P o k a n d P o i p r o d u c e d a b o u t 15% l e s s e n z y m e i n m e t a f e m a l e s t h a n e u p l o i d m a l e s o r f e m a l e s . I n m e t a f e m a l e s , f e w a u t o s o m a l l o c i show t h e s p e c i f i c r e p r e s s i o n ( o n e - t h i r d ) t h a t i s s e e n i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s . T h e r e f o r e , i t a p p e a r s t h a t t h e X a n d t h e a u t o s o m e s d o n o t p o s s e s s e q u i v a l e n t r e g u l a t o r y e f f e c t s o n a u t o s o m a l g e n e s . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t n o t a l l l o c i e s c a p e s u p p r e s s i o n i n m e t a f e m a l e s : many X - l i n k e d l o c i s y n t h e s i z e d i p l o i d l e v e l s o f p r o d u c t i n t h e s e h y p e r p l o i d s ( s e e c h a p t e r 2 ) . T h i s i n c l u d e s t h e g e n e e n c o d i n g f o r t h e a v a r i a n t o f l a r v a l s e r u m p r o t e i n ( L S P - l a ) . A r e l a t e d g e n e , L S P - l a , l o c a t e d o n 3 L , a l s o d i s p l a y s a o n e - t h i r d r e d u c t i o n i n e x p r e s s i o n i n m e t a f e m a l e s ( s e e s e c t i o n I I o f t h i s c h a p t e r ) . D e c r e a s i n g t h e X / A r a t i o i n t r i s o m i e s d o e s n o t r e s u l t i n i n c r e a s e d l e v e l s o f X - l i n k e d g e n e e x p r e s s i o n no T a b l e 18 A c t i v i t y o f s e c o n d c h r o m o s o m e e n z y m e l o c i i n m e t a f e m a l e s . G e n o t y p e E n z y m e L o c u s P g k G p d h A d h P g i O r e g o n R 3 . 4 8 + . 2 3 . 7 1 4 + . 0 4 3 . 1 2 5 + . 0 0 6 3 . 8 9 + . 2 2 +/0 ( m a l e ) (6) (5) (5) (6) C ( l ) R M f 3 . 2 4 + . 1 5 . 6 8 2 ± . 0 5 3 . 1 5 4 + . 0 1 2 3 . 5 7 + . 0 4 y p n v / Y ( f e m a l e ) (6) (6) (6) (6) C ( 1 ) R M 2 . 9 1 + . 0 8 . 6 6 8 + . 0 3 9 . 1 6 2 + . 0 1 8 3 . 1 4 ± . 4 0 y p n v / + (3X2A) (6) (6) (6) (6) E s t i m a t e d 3 . 3 6 ± . 0 7 . 6 9 8 + . 0 1 7 . 1 3 9 + . 0 0 4 3 . 7 3 + . 0 6 Mean R e p r e s s e d 2 . 2 4 + . 0 5 . 4 6 5 ± . 0 1 1 . 0 9 3 + . 0 0 3 2 . 4 9 + . 0 4 E s t i m a t e E n z y m e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r m i n p e r mg o f p r o t e i n . N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e t h e s a m p l e s i z e s . R e p r e s s e d e s t i m a t e i s t w o - t h i r d s t h e e s t i m a t e d m e a n . Ill T a b l e 19 A c t i v i t y o f t h i r d c h r o m o s o m e e n z y m e l o c i i n m e t a f e m a l e s . G e n o t y p e E n z y m e L o c u s O r e g o n R +/0 ( m a l e ) C ( 1 ) R M , y p n v / Y ( f e m a l e ) C ( 1 ) R M , y p n v / + ( m e t a f e m a l e ) E s t i m a t e d Mean R e p r e s s e d E s t i m a t e I d h . 3 6 9 ± . 0 1 3 (6) . 3 3 0 + . 0 1 4 (6) . 3 3 9 + . 0 2 6 (6) . 3 4 9 ± . 0 0 5 . 2 3 3 + . 0 0 3 Pgm . 6 3 3 + . 0 4 9 (4) . 7 8 4 ± . 1 1 5 (5) . 7 7 2 ± . 0 8 3 (6) . 7 0 9 + . 0 3 4 . 4 7 2 ± . 0 2 3 C a t 4 . 1 3 ± . 2 7 (6) 3 . 9 1 + . 3 2 (6) 3 . 9 5 + . 3 8 (6) 4 . 0 2 + . 1 0 2 . 6 8 ± . 0 6 A l d o x 6 . 19 + . 2 5 (5) 5 . 4 2 ± . 2 5 (5) 6 . 17 ± . 3 3 (5) 5 . B 1 + . 0 9 3 . 8 7 + . 0 6 E n z y m e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r m i n p e r mg o f p r o t e i n . N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e t h e s a m p l e s i z e s . R e p r e s s e d e s t i m a t e i s t w o - t h i r d s t h e e s t i m a t e d m e a n . 112. A f u n d a m e n t a l a s p e c t o f t h e c o n t r o l s y s t e m o p e r a t i n g i n m a l e - f e m a l e d o s a g e c o m p e n s a t i o n i s t h a t i n c r e a s e s i n X - l i n k e d g e n e e x p r e s s i o n a r e d i r e c t l y c o r r e l a t e d w i t h c h a n g e s i n t h e number o f a u t o s o m e s e t s . F o r e x a m p l e , t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n o f a n X - l i n k e d g e n e i n a t r i p l o i d i n t e r s e x (2X3A) i s 50X g r e a t e r t h a n i n a d i p l o i d f e m a l e ( 2 X 2 A ) . T h u s , t h i s e f f e c t i s c o n s i s t e n t w i t h t h e l i m i t i n g a c t i v a t o r m o d e l o f d o s a g e c o m p e n s a t i o n ; i e . f a c t o r ( s ) , c o d e d f o r b y a u t o s o m a l g e n e s , t h a t a r e s p e c i f i c a l l y r e q u i r e d f o r X - c h r o m o s o m e t r a n s c r i p t i o n . I t i s n o t known i f e n t i r e a u t o s o m e s e t s a r e r e q u i r e d t o m a n i f e s t t h i s e f f e c t . C o n c e i v a b l y , b y i n c r e a s i n g t h e a u t o s o m a l c o n t e n t o f t h e genome i n t r i s o m i e s , a c t i v a t i o n o f X — l i n k e d l o c i ( a t l e a s t i n m a l e s ) c o u l d o c c u r . T o t e s t t h i s p o s s i b i l i t y , t h e a c t i v i t y o f f o u r X — l i n k e d e n z y m e s was m o n i t o r e d i n i so—X c h r o m o s o m e s t o c k s b o t h f o r t r i s o m y 2 L a n d f o r t r i s o m y 3 L . M a r k e d v a r i a t i o n s i n e x p r e s s i o n was o b s e r v e d f r o m t h i s i s o - X - c h r o m o s o m e i n t h e d i f f e r e n t p a r e n t a l s t o c k s . ( F o r e x a m p l e s , s e e Fum b e t w e e n i s o - X a n d C F 2 s t r a i n s ( T a b l e s 20 8c 21) o r Zw b e t w e e n t h e t w o c o m p o u n d - f r e e s t r a i n s ( T a b l e 21 Sc 2 2 ) . H o w e v e r , d e s p i t e t h e s e d i f f e r e n c e s , t h e a c t i v i t y f o r t h e s e e n z y m e s w e r e d o s a g e c o m p e n s a t e d ( T a b l e s 2 1 - 2 4 ) . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t t h e amount o f 6 P T i s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i n m a l e s t h a n f e m a l e s i n t h r e e o f t h e f i v e s t o c k s . M a l e a n d f e m a l e d a t a w e r e p o o l e d f o r t h e a n a l y s i s o f e x p r e s s i o n b e t w e e n d i p l o i d s a n d t r i s o m i e s . When a c o m p a r i s o n i s made b e t w e e n g e n o t y p e s o f t h e p o o l e d m a l e a n d f e m a l e d a t a ( T a b l e s 25 Se 2 6 ) , t w o o b s e r v a t i o n s c a n b e m a d e . F i r s t , b o t h a u t o s o m a l t r i s o m i e s f a i l e d t o a c t i v a t e a n y o f t h e X - l i n k e d l o c i M3 T a b l e 2 0 X - l i n k e d e n z y m e l e v e l s i n O r e g o n R i s o - X s t r a i n . E n z y m e L o c u s G e n o t y p e P g d Fum O p t Zw f e m a l e . 1 6 3 + . 0 0 8 . 2 6 3 ± . 0 2 2 1 . 2 3 + . 0 5 . 1 4 3 ± . 0 0 5 (7) (7) (7) (7) m a l e . 1 5 3 ± . 0 0 7 . 2 5 3 + . 0 5 3 1 . 1 5 + . 0 5 . 1 1 8 ± . 0 0 9 <7> (7> <7> (13) m a l e / f e m a l e 1 . 1 2 . 9 6 2 . 9 3 5 . 8 2 6 r a t i o T a b l e 21 X - l i n k e d e n z y m e l e v e l s i n C ( 2 L > 1 1 J F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w ! i s o - X s t r a i n . E n z y m e L o c u s G e n o t y p e P g d Fum G p t Zw m a l e . 1 8 2 + . 0 0 8 . 1 5 6 + . 0 0 6 1 . 0 1 + . 0 3 . 1 6 2 ± . 0 0 9 (8) (8) (8) (8) f e m a l e . 1 8 5 + . 0 0 9 . 1 7 7 + . 0 0 8 1 . 2 2 + . 0 4 . 1 7 1 + . 0 0 6 (8) (8) (8) (8) m a l e / f e m a l e 1 . 0 2 1 . 1 3 1 . 2 1 1 . 0 6 r a t i o E n z y m e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r m i n p e r mg o f p r o t e i n . N u m b e r s i n p a r e n t h e s e a r e t h e s a m p l e s i z e s . U4-T a b l e 22 X - l i n k e d e n z y m e l e v e l s i n C ( 3 L ) r u s t l F ( 3 R > e e / F ( 3 R ) e e ; i s o - X s t r a i n . E n z y m e L o c u s G e n o t y p e P g d Fum G p t Zw f e m a l e . 1 9 8 ± . 0 0 5 . 2 3 2 + . 0 0 6 1 . 3 9 + . 0 4 . 2 2 4 + . 0 1 0 (7) (7) <7> (7) m a l e . 1 8 5 + . 0 0 6 . 2 4 9 + . 0 1 3 1 . 5 3 + . 0 4 . 2 2 5 + . 0 1 3 (7) (7> (7) (7) m a l e / f e m a l e . 9 3 4 1 . 0 7 1 . 1 0 1 . 0 0 r a t i o E n z y m e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r m i n p e r mg o f p r o t e i n . N u m b e r s i n p a r e n t h e s e a r e t h e s a m p l e s i z e s . 15 T a b l e 2 3 X - l i n k e d e n z y m e l e v e l s i n C ( 2 L > l t / + / F ( 2 R ) b w | i s o - X t r i s o m i c - 2 L i n d i v i d u a l s . E n z y m e L o c u s G e n o t y p e P g d Fum G p t Zw f e m a l e . 1 2 8 + . 0 0 4 . 2 2 3 + . 0 0 9 1 . 0 4 + . 0 3 . 0 8 2 ± . 0 0 2 (8) (8) (8) (8) m a l e . 1 1 9 ± . 0 0 4 . 2 3 2 + . 0 0 9 1 . 1 9 ± . 0 4 . 0 9 1 + . 0 0 3 (8) (8) (8) (8) m a l e / f e m a l e . 9 2 9 1 . 0 3 1 . 1 4 1 . 1 1 r a t i o T a b l e 24 X - l i n k e d e n z y m e l e v e l s i n C < 3 L ) r u s t / + / F ( 3 R ) e Q | i s o - X t r i s o m i c - 3 L i n d i v i d u a l s . E n z y m e L o c u s G e n o t y p e P g d Fum G p t Zw m a l e . 1 7 9 + . 0 0 6 . 1 9 4 + . 0 1 1 . 8 4 4 ± . 0 6 4 . 1 5 3 + . 0 0 7 (10) (10) (10) (10) f e m a l e . 1 3 9 + . 0 0 6 . 1 7 4 + . 0 1 8 . 8 1 6 + . 0 6 7 . 1 3 4 + . 0 0 7 (8) (8) (8) (8) m a l e / f e m a l e . 7 7 6 . 8 9 7 . 9 6 7 . 8 7 6 r a t i o E n z y m e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r m i n p e r mg o f p r o t e i n . N u m b e r s i n p a r e n t h e s e a r e t h e s a m p l e s i z e s . lib T a b l e 25 X - l i n k e d e n z y m e l e v e l s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 2 L l a r v a e . E n z y m e L o c u s G e n o t y p e P g d Fum G p t Zw i s o - X . 1 5 B + . 0 0 3 . 2 5 8 ± . 0 1 4 1 . 1 9 + . 0 2 . 1 3 1 ± . 0 0 3 O r e g o n R ( d i p l o i d ) (14) (14) (14) (26) i s o - X | . 1 8 4 + . 0 0 3 ; 1 6 7 + . 0 0 3 1 . 1 2 + . 0 1 . 1 6 7 + . 0 0 3 C ( 2 L ) l t F ( 2 R ) b w / (16) (16) (16) (16) F ( 2 R ) b w ( d i p l o i d ) i s o - X l . 1 2 4 + . 0 0 1 . 2 2 9 ± . 0 0 3 1 . 1 2 + . 0 1 . 0 8 7 + . 0 0 1 C ( 2 L ) l t / + / F ( 2 R ) b w (16) (16) (16) (16) ( t r i s o m i c - 2 L ) E s t i m a t e d . 1 7 1 + . 0 0 1 . 2 1 3 + . 0 0 3 1 . 1 6 + . 0 1 . 1 4 9 + . 0 0 1 Mean R e p r e s s e d . 1 1 4 + . 0 0 1 . 1 4 2 + . 0 0 2 . 7 7 0 ± . 0 0 3 . 0 9 9 + . 0 0 1 E s t i m a t e E n z y m e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r m i n p e r mg o f p r o t e i n . N u m b e r s i n p a r e n t h e s e a r e t h e s a m p l e s i z e s . R e p r e s s e d e s t i m a t e i s t w o - t h i r d s t h e c o m p e n s a t e d e s t i m a t e . Ul T a b l e 26 X - l i n k e d e n z y m e l e v e l s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 3 L 1 a r v a e . E n z y m e L o c u s G e n o t y p e P g d Fum G p t Zw i s o - X . 1 5 8 + . 0 0 3 . 2 5 8 + . 0 1 4 1 . 1 9 + . 0 1 9 . 1 3 1 + . 0 0 3 O r e g o n R ( d i p l o i d ) (14) (14) (14) (26) i s o - X ? . 1 9 2 + . 0 0 2 . 2 4 1 + . 0 0 4 1 . 4 6 + . 0 1 4 . 2 2 5 + . 0 0 4 C ( 3 L ) r u s t l F ( 3 R ) e r a / (14) (14) (14) (14) F ( 3 R ) e s ( d i p l o i d ) i s o - X l . 1 6 1 + . 0 0 2 - . 1 8 5 + . 0 0 5 . 8 5 6 + . 0 2 4 . 1 4 5 + . 0 0 3 C ( 3 L ) r u s t / + / F ( 3 R ) e ° (18) (18) (18) (18) ( t r i s o m i c - 3 L ) E s t i m a t e d . 1 7 5 + . 0 0 1 . 2 4 9 + . 0 0 4 1 . 3 3 + . 0 1 . 1 7 8 + . 0 0 1 Mean R e p r e s s e d . 1 2 2 + . 0 0 1 . 1 6 6 + . 0 0 3 . 8 8 3 + . 0 0 4 . 1 1 9 + -001 E s t i m a t e E n z y m e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r m i n p e r mg o f p r o t e i n . N u m b e r s i n p a r e n t h e s e a r e t h e s a m p l e s i z e s . R e p r e s s e d e s t i m a t e i s t w o - t h i r d s t h e c o m p e n s a t e d e s t i m a t e . e x a m i n e d . S u c h a f i n d i n g s u g g e s t s t h a t i f l o c i e n c o d i n g t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r s e x i s t f o r t h e X - l i n k e d l o c i e x a m i n e d , t h e y e i t h e r d o n o t r e s i d e o n t h e s e a u t o s o m a l a r m s o r i f t h e y d o , many o t h e r c o p i e s a r e a l s o p r e s e n t e l s e w h e r e i n t h e g e n o m e . S e c o n d , a l l f o u r l o c i w e r e r e p r e s s e d b y o n e - t h i r d i n a t l e a s t o n e o f t h e t r i s o m i e s . I t w o u l d a p p e a r t h a t X - l i n k e d l o c i c a n r e s p o n d t o a u t o s o m a l a n e u p l o i d y i n a s i m i l a r way a s d o a u t o s o m a l l o c i . T h i s e x p e r i m e n t h a d i n i t i a l l y b e e n p e r f o r m e d w i t h B a s e X c h r o m o s o m e s r a t h e r t h a n i s o - X c h r o m o s o m e s f r o m t h e O r e g o n R s t o c k . E s s e n t i a l l y t h e same r e s u l t s w e r e o b s e r v e d f o r 2 L t r i s o m i e s a s t h o s e r e p o r t e d h e r e ! h o w e v e r , 3 L t r i s o m i e s h o m o z y g o u s f o r t h e B a s e c h r o m o s o m e w e r e s o e x t r e m e l y i n v i a b l e t h a t f u r t h e r a n a l y s i s was p r e c l u d e d . I I . E x p r e s s i o n o f G e n e F a m i l i e s i n T r i s o m i e s L a r v a l s e r u m p r o t e i n g e n e s T h e r e s u l t s o f t h e p r e v i o u s s e c t i o n s u g g e s t t h a t e a c h g e n e r e s p o n d s t o t h e t r i s o m i c c o n d i t i o n i n d e p e n d e n t l y . B a s e d e i t h e r o n g e n e f u n c t i o n o r o n c h r o m o s o m a l p o s i t i o n , n o s i m p l e r u l e c a n b e a p p l i e d t o g r o u p g e n e s i n t o t h o s e w h i c h a r e u n a f f e c t e d , a c t i v a t e d , o r r e p r e s s e d . H o w e v e r , some p r o p e r t y o f e a c h g e n e o r c o n d i t i o n o f i t s e x p r e s s i o n m u s t r e n d e r i t s u s c e p t i b l e t o r e g u l a t i o n i n t r i s o m i e s . T o a d d r e s s t h i s q u e s t i o n , t h e e x p r e s s i o n o f a g r o u p o f g e n e s w h i c h h a v e o n l y r e c e n t l y d i v e r g e d ( B r o c k a n d R o b e r t s , 1983) h a s b e e n e x a m i n e d . T h e l a r v a l s e r u m p r o t e i n s a r e c o d e d f o r b y t w o m a j o r g r o u p s o f g e n e s : L S P - 2 i s e n c o d e d b y a s i n g l e g e n e l o c a t e d o n 3 L ( R o b e r t s a n d E v a n s - R o b e r t s , 1979b) w h e r e a s LSP—1 i s p r o d u c e d b y t h r e e g e n e s . T h i s l a t t e r g r o u p o f g e n e s i s o f i n t e r e s t . W h i l e e a c h g e n e i n t h i s g r o u p i s s i m i l a r i n s e q u e n c e c o m p o s i t i o n ( S m i t h e t a l . , 1 9 8 1 ) , a l l o f t h e m a r e l o c a t e d o n d i f f e r e n t c h r o m o s o m e a r m s ( L S P - l a o n t h e X, L S P - l b o n 2 L , a n d L S P - l o o n 3 D . M e a s u r e m e n t s o f L S P ' s w e r e made f r o m s a m p l e s o f h e m o l y m p h c o l l e c t e d f r o m w a n d e r i n g t h i r d - i n s t a r l a r v a e ( F i g u r e 1 0 ) . A a b s o l u t e q u a n t i t a t i o n o f t h e s e p r o t e i n s ( p e r l a r v a e o r p e r mg l i v e w e i g h t ) p r o v e d d i f f i c u l t o w i n g t o t e c h n i c a l p r o b l e m s i n v o l v e d i n q u a n t i t a t i v e l y e x t r a c t i n g h e m o l y m p h . A s a n a l t e r n a t i v e , t h e a m o u n t o f e a c h L S P - 1 was m e a s u r e d r e l a t i v e t o t h e o t h e r s , a n d t o L S P - 2 t o p r o v i d e a n i n t e r n a l s t a n d a r d f o r m e a s u r e m e n t . T h e r e f o r e , i t was i m p o r t n a t t o e x a m i n e t h e e x p r e s s i o n o f L S P - 2 i n t r i s o m i e s r e l a t i v e t o d i p l o i d s . T h e a b s o l u t e a m o u n t s o f t h i s p r o t e i n w e r e d e t e r m i n e d f r o m h e m o l y m p h s a m p l e s t a k e n f r o m t r i s o m i c - 3 L l a r v a e a n d t h e i r d i p l o i d p a r e n t a l s t a i n s a n d i s shown i n c o l u m n 5 o f T a b l e 2 7 . E l e v a t e d l e v e l s o f t h i s p r o t e i n w e r e o b s e r v e d i n t r i s o m i e s ( a b o u t 407. o v e r t h e e x p e c t e d c o m p e n s a t e d l e v e l ) s u g g e s t i n g t h a t L S P - 2 g e n e e x p r e s s i o n i s u n a f f e c t e d b y t h e d u p l i c a t i o n . T h e l e v e l o f t h i s p r o t e i n r e l a t i v e t o t h e L S P - 1 p r o t e i n s i s a l s o i n a g r e e m e n t s t h e r a t i o s L S P - 2 / L S P - l a a n d L S P - 2 / L S P - l b s u g g e s t t h a t L S P - 2 i s d o s e d e p e n d e n t i n 3 L t r i s o m i e s a n d t h a t t h e e x p r e s s i o n o f L S P - l a a n d L S P - l b g e n e s a r e u n a f f e c t e d . R e l a t i v e t o L S P - l g , e q u i v a l e n t 110 T a b l e 2 7 Q u a n t i t y o f L S P s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 3 L h e m o l y m p h f r o m f e m a l e l a r v a e . L S P R a t i o t o t a l L S P - 2 G e n o t y p e 2 / l a 2 / l b l g / 2 p r o t e i n i s o - X l . B B 1 . 3 5 1 . 0 3 0 . 7 3 9 O r e g o n R ( d i p l o i d ) + . 1 1 + . 0 9 ± . 0 9 ± . 0 5 2 (8) (8) (11) (8) i s o - X ; 1 . 5 9 1 . 5 4 0 . 9 0 5 1 . 0 1 C ( 3 L ) r u s t l F ( 3 R ) e e s / F ( 3 R ) e B + . 0 8 + . 0 9 + . 0 9 ± . 0 7 ( d i p l o i d ) (8) (8) (11) (8) i s o - X S 2 . 6 5 2 . 6 5 1 . 0 7 1 . 2 9 C ( 3 L ) r u s t / + / F ( 3 R ) e E S ± . 0 8 + . 16 ± . 0 9 ± . 0 3 ( t r i s o m i c—3L) (8) (8) (16) (8) D o s e - d e p e n d e n t E s t i m a t e 2 . 5 3 ± . 0 5 2 . 2 2 + . 0 5 1 . 3 8 ± . 0 4 C o m p e n s a t e d E s t i m a t e 1 . 6 9 + . 0 3 1 . 4 8 • . 0 3 0 . 9 2 t - 0 3 M e a s u r e m e n t s i n r i g h t - m o s t c o l u m n a r e i n u n i t s o f a b s o r b a n c e b y C o o m a s i e B l u e a t 595nm. m a m o u n t s o f L S P - 2 a r e o b s e r v e d i n t h e t w o d i p l o i d a n d i n t h e t r i s o m i c s t r a i n . S i n c e L S P - l o a n d L S P - 2 a r e b o t h l o c a t e d o n 3 L , we c a n d e d u c e t h a t L S P - l g p r o t e i n l e v e l s a r e a l s o e l e v a t e d i n t r i s o m i c - 3 L l a r v a e . T h u s , i n c o n c l u s i o n , t h e e x p r e s s i o n o f t h e f o u r L S P g e n e s o c c u r s a t t h e same r a t e i n 3 L t r i s o m i e s a s i n d i p l o i d s . T h e q u a n t i t i e s o f t h e t h r e e LSP—1 s u b u n i t s p r o d u c e d i n t r i s o m i c - 2 L l a r v a e a r e shown i n T a b l e 2 8 . T h e amount o f L S P - l g r e l a t i v e t o L S P - 2 was t h e same i n t h e s e t r i s o m i e s a s i n t h e i r d i p l o i d p a r e n t s . S i n c e b o t h o f t h e s e g e n e s a r e o n 3 L , a n d a r e p r e s e n t i n t w o d o s e s i n a l l t h r e e g e n o t y p e s , i t w o u l d a p p e a r t h a t n e i t h e r g e n e i s a f f e c t e d b y a d u p l i c a t i o n o f 2 L . H o w e v e r , t h e L S P - l b g e n e i s d u p l i c a t e d b y t h e t r i s o m i c c o n d i t i o n y e t a n e q i v a l e n t a m o u n t o f p r o t e i n i s o b s e r v e d a s i n d i p l o i d s . T h u s , t h i s g e n e i s c o m p e n s a t i n g i n t h e s e t r i s o m i e s f o r i t s i n c r e a s e d g e n e d o s e b y p r o d u c i n g o n e — t h i r d l e s s p r o d u c t p e r t e m p l a t e . T h e o t h e r L S P - 1 e x a m i n e d ( L S P - l a o n t h e X> a l s o p r o d u c e d o n e - t h i r d l e s s p r o d u c t i n 2 L t r i s o m i e s t h a n i n e u p l o i d s . T h u s , e v e n v e r y c l o s e l y r e l a t e d g e n e s may r e s p o n d d i f f e r e n t l y t o t h e r e g u l a t o r y e f f e c t s o f a n e u p l o i d y : t w o o f t h e L S P - 1 g e n e s a p p e a r t o d o w n — r e g u l a t e w h i l e t h e o t h e r i s u n a f f e c t e d . I t i s n o t e w o r t h y t h a t t h e t w o g e n e s w h i c h r e s p o n d e d s i m i l a r l y a r e m o r e c l o s e l y r e l a t e d t o e a c h o t h e r t h a n t h e y a r e t o t h e g e n e t h a t f a i l e d t o r e s p o n d ( S m i t h e t a l , 1 9 8 1 ) . W h i l e t h i s s e e m e d l i k e a p o s s i b l e e x p l a n a t i o n , t h e e x p r e s s i o n o f t h e s e g e n e s i n t r i s o m i e s f o r t h e X c h r o m o s o m e s u g g e s t s o t h e r w i s e . T h e e x p r e s s i o n o f LSP—1 g e n e s i n X—chromosomal t r i s o m i e s w i l l b e d i s c u s s e d i n m o r e d e t a i l i n c h a p t e r 6 . I n s u m m a r y , t h o s e I l l ( d i p l o i d ) T a b l e 28 Q u a n t i t y o f L S P s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 2 L h e m o l y m p h f r o m f e m a l e l a r v a e . L S P R a t i o G e n o t y p e l b / 2 l a / 2 l g / 2 O r e g o n R . 9 3 7 . 6 4 6 1 . 0 3 ( d i p l o i d ) + . 0 2 9 + . 0 4 6 + . 0 3 (8) (8) (16) C ( 2 L ) l t l . 8 3 3 . 6 6 4 . 8 2 7 F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w ± . 0 5 3 + . 0 2 3 + . 0 6 7 (9) (9) (6) C ( 2 L ) l t / . 8 1 3 . 4 2 4 1 . 0 2 + / F ( 2 R ) b w ( t r i s o m i c - 2 L > + . 0 2 4 + . 0 2 2 ± . 1 7 (9) (9) (6) D o s e d e p e n d e n t 1 . 3 0 . 6 5 5 . 9 2 9 E s t i m a t e ± . 0 3 + . 0 1 2 + . 0 3 2 R e p r e s s e d . 8 6 8 . 4 3 6 . 6 1 9 E s t i m a t e ± . 0 2 0 + . 0 0 8 + . 0 2 1 1X3 e x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t t h e X — l i n k e d L S P - l a g e n e was c o m p e n s a t e d i n m e t a f e m a l e s d e s p i t e t h e i n a b i l i t y o f t h i s g e n e t o c o m p l e t e l y d o s a g e c o m p e n s a t e b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s . T h e e x p r e s s i o n o f t h e c l o s e l y r e l a t e d g e n e o n 2 L , L S P 1 — b . was n o t a f f e c t e d i n t r i s o m i c - X l a r v a e . H o w e v e r , T a b l e 2 9 s h o w s t h a t L S P — l g p r o t e i n l e v e l s w e r e r e d u c e d d r a m a t i c a l l y i n m e t a f e m a l e s , e v e n b e y o n d t h e l e v e l e x p e c t e d f o r a d i s c r e t e o n e - t h i r d r e d u c t i o n . T h i s i s t h e o n l y a u t o s o m a l g e n e e x a m i n e d t o d a t e w h o s e p r o d u c t i s m a r k e d l y r e d u c e d i n q u a n t i t y i n m e t a f e m a l e s f r o m t h e l e v e l f o u n d i n d i p l o i d s . T h e q u a n t i t i e s o f L S P - 2 , r e l a t i v e t o t h e LSP—1 s u b u n i t s , a r e s i m i l a r i n m e t a f e m a l e s , f e m a l e s a n d m a l e s . T h u s , d u p l i c a t i o n o f t h e X c h r o m o s o m e d o e s n o t a p p e a r t o a l t e r t h e e x p r e s s i o n o f a l l L S P ' s i n s i m i l a r w a y s . I n d e e d , t h e t w o g e n e s t h a t d o r e s p o n d s i m i l a r l y ( L S P - l a a n d LSP1—o) a r e t h e l e a s t r e l a t e d i n t h e f a m i l y . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t g e n e s w h i c h a r e e v o l u t i o n a r i l y c l o s e l y r e l a t e d d o n o t n e c e s s a r i l y r e s p o n d s i m i l a r l y t o t h e r e g u l a t o r y e f f e c t s o f t r i s o m y . H o w e v e r , t h e c o n v e r s e i s o b v i o u s l y n o t t r u e s i n c e many d i f f e r e n t l o c i c a n show t h e same r e s p o n s e i n t r i s o m i e s . A d h t r a n s f o r m a n t s i n 2 L t r i s o m i e s T h e p r e c e d i n g s e c t i o n r e v e a l e d t h a t v e r y s i m i l a r g e n e s c a n r e s p o n d d i f f e r e n t l y t o t h e same w h o l e - a r m t r i s o m i c c o n d i t i o n . Two e x p l a n a t i o n s f o r t h i s r e s u l t s e e m p l a u s i b l e . I t i s p o s s i b l e t h a t members o f t h e L S P g e n e f a m i l y , w h i l e s i m i l a r a t t h e IZf T a b l e 2 9 Q u a n t i t y o f L S P B i n m a l e s , f e m a l e s a n d m e t a f e m a l e s . L S P R a t i o g e n o t y p e L S P - l b / L S P - 2 L S P - l g / L S P - 2 O r e g o n R 1 . 0 6 + . 0 7 1 . 0 4 + . 1 5 +/0 ( m a l e ) (8) (9) C ( l ) R M , y p n v / Y 0 . 7 5 6 + . 0 4 6 1 . 0 4 ± . 0 8 ( f e m a l e ) (8> (9) C ( l ) R M , y p n v / + 0 . 9 1 3 + . 0 8 8 0 . 5 2 1 ± . 0 8 0 ( m e t a f e m a l e ) (7) (9) E s t i m a t e d Mean 0 . 9 0 8 ± . 0 2 1 1 . 0 4 ± . 0 4 R e p r e s s e d E s t i m a t e 0 . 6 0 6 ± . 0 1 4 0 . 6 9 3 + . 0 3 0 1X5 s t r u c t u r a l g e n e l e v e l , c o u l d h a v e v e r y d i f f e r e n t r e g u l a t o r y s e q u e n c e s . A l t e r n a t i v e l y , t h e L S P - 1 g e n e s may b e c o n t r o l l e d b y s i m i l a r 5" s e q u e n c e s b u t l o c a l d i f f e r e n c e s i n t h e r e g u l a t i o n o f c h r o m a t i n d o m a i n s c o u l d a f f e c t t h e e x p r e s s i o n o f t h e s e t h r e e g e n e s . A n a l t e r e d mode o f g e n e e x p r e s s i o n c o u l d a r i s e i n t r i s o m i e s d e p e n d i n g o n w h e t h e r o r n o t t h e d u p l i c a t e d a r m e n c o d e d a r e g u l a t o r y g e n e c a p a b l e o f m o d i f y i n g t h e c h r o m a t i n d o m a i n c o n t a i n i n g t h e g e n e b e i n g e x a m i n e d . T o i n v e s t i g a t e t h i s p o s s i b i l i t y we h a v e c o n s t r u c t e d s i x t r i s o m i c - 2 L s t r a i n s w h i c h p o s s e s s f u n c t i o n a l A d h g e n e s i n d i f f e r e n t c h r o m o s o m a l l o c a t i o n s . T h e d i p l o i d s t r a i n s p o s s e s s i n g t r a n s p o s e d c o p i e s o f A d h w e r e s y n t h e s i z e d a n d p r o v i d e d b y D r s . J . P o s a k o n y a n d D . G o l d b e r g . T h e r e w e r e t w o o b j e c t i v e s t o t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t : f i r s t , t o s e e i f t h e e x p r e s s i o n o f t h e A d h g e n e c o u l d b e r e p r e s s e d w i t h i t r e s i d i n g i n n o n - n a t i v e c h r o m o s o m a l p o s i t i o n s a n d s e c o n d , i f n o t r e p r e s s e d , t o d e t e r m i n e i f t h e A d h g e n e , when l o c a t e d i n d i f f e r e n t c h r o m o s o m a l p o s i t i o n s , m a i n t a i n s t h e same l e v e l o f e x p r e s s i o n b e t w e e n d i p l o i d s a n d t r i s o m i e s . T o a c c o m p l i s h t h i s , t h e e x p r e s s i o n o f s i n g l e A d h s t r u c t u r a l g e n e s f r o m w i l d - t y p e ( t h e s t r a i n D . G o l d b e r g u s e d t o o r i g i n a l l y c l o n e A d h ; G o l d b e r g , 1980) a n d f i v e t r a n s f o r m e d s t r a i n s w e r e e x a m i n e d i n d i p l o i d s a n d i n 2 L t r i s o m i e s . A s shown i n C h a p t e r 1 , t h e e x p r e s s i o n o f t h e A d h g e n e was a c t i v a t e d i n 2 L t r i s o m i e s ; i e . , ADH e n z y m e a c t i v i t y was 19% h i g h e r t h a n a d o s e - d e p e n d e n t e s t i m a t e . T h e d a t a i n c o l u m n 2 o f T a b l e 30 s h o w s t h a t t h e e x p r e s s i o n o f t h e s i n g l e A d h g e n e s v a r i e s c o n s i d e r a b l y i n d i f f e r e n t c h r o m o s o m a l p o s i t i o n s . No a p p a r e n t c o r r e l a t i o n a p p e a r s t o e x i s t T a b l e 30 E x p r e s s i o n o f A d h f r o m v a r i o u s c h r o m o s o m a l p o s i t i o n s i n d i p l o i d a n d t r i s o m i c — 2 L l a r v a e . k a r y o t y p i c c o n d i t i o n c h r o m o s o m a l s t r a i n p o s i t i o n d i p l o i d t r i s o m i c - 2 L r a t i o wSAdh 35B 2 . 0 9 + . 1 6 2 . 3 6 + . 2 2 (4) (6) t A P - 1 19E 1 . 7 5 + . 1 0 2 . 0 2 ± . 1 7 (4) (6) t A P - 3 36A 0 . 8 9 3 ± . 0 8 1 . 1 9 + . 0 2 (4) (6) t A P - 5 17C 2 . 2 9 + . 1 1 2 . 2 9 + . 1 8 (4) (6) t A P - 1 4 89A 0 . 3 3 9 + . 0 4 3 0 . 4 9 3 + . 0 3 4 (4) (6) t A P - 1 7 12A 0 . 3 3 3 + . 0 1 6 0 . 4 6 3 + . 0 2 9 (4) (6) 1 . 13 1 . 1 5 1 . 3 3 1 . 0 0 1 . 4 5 1 . 3 9 E n z y m e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r m i n p e r ml o f e x t r a c t . N u m b e r s i n p a r e n t h e s e s a r e t h e s a m p l e s i z e s . i n b e t w e e n g e n e e x p r e s s i o n a n d t h e c h r o m o s o m e a r m o n w h i c h Adh r e s i d e s . H o w e v e r , t h e t w o s t r a i n s w h i c h d i s p l a y the l o w e s t a c t i v i t y ( a b o u t 15% w i l d t y p e ) a r e b o t h t r a n s p o s i t i o n s o f o n l y 4 . 8 k b o f A d h r e g i o n D N A . T h e a c t i v i t y o f t h e s e same g e n e s i n t h e t r i s o m i c - 2 L c o n d i t i o n i s a l s o shown i n T a b l e 3 0 . G e n e r a l l y , t h e g e n e s e x p r e s s e d s i m i l a r l y i n t r i s o m i e s a s i n d i p l o i d s ; t A P - 1 4 a n d t A P - 1 7 h a d t h e l o w e s t a m o u n t o f e n z y m e a c t i v i t y , t A P - 3 was i n t e r m e d i a t e , a n d t A P - 1 a n d t A P - 5 h a d n e a r l y d i p l o i d l e v e l s . T h e e x p r e s s i o n o f •the Adh1"" g e n e i n t h e s e e x p e r i m e n t s a g a i n s h o w e d t h a t a d u p l i c a t i o n o f 2 L r e s u l t s i n a n a c t i v a t i o n o f t h i s g e n e . T h e o t h e r A d h t r a n s f o r m a n t s w e r e a l s o a c t i v a t e d i n t r i s o m i e s t o v a r y i n g e x t e n t s . F i g u r e 11 d e p i c t s t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e amount o f e n z y m e p r e s e n t i n d i p l o i d s v e r s u s t h e l e v e l o f a c t i v a t i o n o f t h i s q u a n t i t y i n 2 L t r i s o m i e s . I t i s c l e a r t h a t t h e a b i l i t y o f t h e A d h g e n e t o b e a c t i v a t e d i n 2 L t r i s o m i e s i s n e g a t i v e l y c o r r e l a t e d w i t h i t s b a s a l l e v e l o f e x p r e s s i o n . I t i s n o t e w o r t h y t h a t t h e r e g r e s s i o n l i n e i n t e r c e p t s t h e X a x i s a t 1 . 4 9 ; t h i s w o u l d p r e d i c t t h a t a n A d h g e n e e x p r e s s i n g a t a n e a r z e r o l e v e l c o u l d b e a c t i v a t e d 50% b y t h e d u p l i c a t i o n o f 2 L . F i g u r e 1 1 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n ADH e n z y m e a c t i v i t y i n d i p l o i d s a n d 2 L t r i s o m i e s b e a r i n g t r a n s f o r m e d A d h g e n e s . T h e ADH e n z y m e a c t i v i t y i n d i p l o i d s i s p l o t t e d o n t h e Y a x i s . T h e r a t i o o f t h e a c t i v i t y o b s e r v e d i n 2 L t r i s o m i e s t o t h e a c t i v i t y o b s e r v e d i n d i p l o i d s i s p l o t t e d o n t h e X a x i s . R e g r e s s i o n p a r a m e t e r s : r = - . 9 7 9 , b= - . 1 9 5 , X i n t e r c e p t = 1 . 4 9 . AjM/joy HQV 130 D i s c u s s i o n I n t h i s c h a p t e r a n e x a m i n a t i o n h a s b e e n made o f how w i d e s p r e a d e f f e c t s o f t r i s o m y a r e , i n t e r m s o f n u m b e r s a n d t y p e s o f g e n e s t h a t a r e a f f e c t e d . T h e e x t e n t o f t h e s e e f f e c t s a r e s u m m a r i z e d i n F i g u r e 12 . Two p o i n t s a r e i m m e d i a t e l y o b v i o u s . F i r s t , n o t a l l g e n e s i n a g i v e n t r i s o m i c c o n d i t i o n a r e a f f e c t e d i n a s i m i l a r w a y . I f g e n e r a l p h y s i o l o g i c a l d i s t u r b a n c e s w e r e r e s p o n s i b l e f o r a l t e r e d modes o f g e n e e x p r e s s i o n ( e g . r e d u c e d p o l y m e r a s e , r i b o s o m e s e t c . ) t h e n a l l g e n e p r o d u c t s m i g h t b e e x p e c t e d t o b e a f f e c t e d t o a s i m i l a r d e g r e e . S i n c e d i s t i n c t e f f e c t s w e r e o b s e r v e d f o r some l o c i b u t n o t o t h e r s , s u g g e s t s t h a t d i s c r e t e r e g u l a t o r y m e c h a n i s m s o p e r a t e t o m o d i f y g e n e e x p r e s s i o n i n t r i s o m i e s . S e c o n d , a p a r t i c u l a r g e n e c a n b e a f f e c t e d d i f f e r e n t l y b y t h e t h r e e t r i s o m i e s . F o r e x a m p l e , w h e r e a s Cat, i s u n a f f e c t e d , Z_w_ i s r e p r e s s e d i n a l l t h r e e t r i s o m i e s . I n c o n t r a s t , G p d h i s r e p r e s s e d b y o n e - t h i r d i n 2 L a n d 3 L t r i s o m i e s , b u t n o t i n m e t a f e m a l e s . T h e i n d i v i d u a l i t y o f t h e e n z y m e p r o f i l e s f o r e a c h t r i s o m y a g a i n a r g u e s t h a t d i s c r e t e r e g u l a t o r y m e c h a n i s m s a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e o b s e r v e d d i f f e r e n c e s . T h e m o s t common r e g u l a t o r y e f f e c t o b s e r v e d i n t r i s o m i e s i s a o n e - t h i r d r e p r e s s i o n o f g e n e e x p r e s s i o n r e l a t i v e t o d i p l o i d s . R e d u c t i o n s i n t h e a m o u n t s o f g e n e p r o d u c t s i n t r i s o m i e s h a s a l s o b e e n o b s e r v e d f o r a f e w l o c i i n y e a s t ( G u l l o v a n d F r i i s , 1 9 8 0 ) , p l a n t s ( M c D a n i e l a n d Ramage , 1 9 7 0 ; C a r l s o n , 1 9 7 2 ; S m i t h a n d C o n k l i n , 1 9 7 5 ; B i r c h l e r a n d N e w t o n , 1981) a n d mammals ( K l o s e a n d 131 P u t z , 1 9 8 3 ) . T a b l e 31 s h o w s t h a t , o f t h e g e n e - t r i s o m y c o m b i n a t i o n s t h a t d i f f e r f r o m t h e d i p l o i d l e v e l , 70% a r e r e d u c e d b y o n e — t h i r d . T h i s i s t h e t y p e o f r e s p o n s e t h a t i s p r e d i c t e d f o r l o c i c o n t r o l l e d b y c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t r e p r e s s o r s whose s t r u c t u r a l g e n e r e s i d e s o n t h e d u p l i c a t e d a r m , a n d a r e e x p r e s s e d i n a d o s e — d e p e n d e n t m a n n e r . A l a r g e n u m b e r o f l o c i show t h i s t y p e o f r e g u l a t i o n ! o f t h i r t e e n l o c i t h a t w e r e m e a s u r e d i n a l l t h r e e t r i s o m i e s , o n l y t h r e e (23%) w e r e n o t r e p r e s s e d b y o n e - t h i r d i n a n y o f t h e t r i s o m i e s . S i n c e a p p r o x i m a t e l y 40% o f t h e genome was n o t d u p l i c a t e d i n a n y o f t h e t h r e e t r i s o m i e s , i t s e e m s l i k e l y t h a t t h e s e l o c i a r e n o t e x c e p t i o n a l a n d t h a t n e g a t i v e r e g u l a t o r s o f t h e i r e x p r e s s i o n may b e l o c a t e d o n e i t h e r 2R o r 3 R . A s i m p l e p r e d i c t i o n w o u l d b e t h a t a b o u t 4300 b a n d s (3 t r i s o m i e s x 1000 b a n d s / a r m d i v i d e d b y . 7 0 ) w o u l d n e e d t o b e e x a m i n e d i n t h e t r i s o m i c c o n d i t i o n t o r e p r e s s a l l l o c i t h a t w e r e e x a m i n e d . T h u s , i t w o u l d a p p e a r t h a t m o s t o f t h e e n z y m e - l o c i m e a s u r e d i n t h e s e s t u d i e s a r e u n d e r t h e c o n t r o l o f a t l e a s t o n e n e g a t i v e r e g u l a t o r y g e n e . A s s u c h , g e n e e x p r e s s i o n i n D r o s o p h i l a i s c o n t r o l l e d i n p a r t b y t h e q u a n t i t i e s o f r e p r e s s o r s w h i c h a r e p r o d u c e d . A c o m p a r i s o n o f t h e f u n c t i o n s o f t h e g e n e s t h a t w e r e s t u d i e d r e v e a l s t h a t many o f t h e i r r e s p e c t i v e e n z y m e s o p e r a t e i n a l l c e l l s a n d a r e p h y s i o l o g i c a l l y v i t a l . A l t h o u g h some o f t h e s e l o c i a r e d i s p o n s i b l e u n d e r l a b o r a t o r y c o n d i t i o n s ( V o e l k e r e t a l . , 1980) i t i s d o u b t f u l t h a t f l i e s b e a r i n g n u l l a c t i v i t y m u t a n t s w o u l d b e s u f f i c i e n t l y f i t t o s u r v i v e i n t h e w i l d . F o r e x a m p l e , h o m o z y g o u s Gpdh n u l l m u t a n t s c a n b e m a i n t a i n e d i n t h e l a b o r a t o r y b u t t h e y a r e i n c a p a b l e o f f l i g h t o w i n g t o t h e 132 T a b l e 31 Summary o f r e g u l a t o r y e f f e c t s o n e n z y m e l o c i i n t r i s o m i e s . T r i s o m i c C h r o m o s o m e R e g u l a t o r y E f f e c t 2 L 3 L X t o t a l u n a f f e c t e d 8 3 6 17 a c t i v a t e d 1 0 1 2 p a r t i a l l y r e p r e s s e d 1 3 3 7 r e p r e s s e d b y o n e t h i r d 6 11 4 21 number f u l l y r e p r e s s e d 3(507.) 4(36%) 4(100%) 11 o n same c h r o m o s o m e a r m t o t a l e x a m i n e d 16 17 14 4 7 133 i n e f f i c i e n t s h u t t l i n g o f NADH e q u i v a l e n t s a c r o s s t h e m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e . Many o f t h e e n z y m e s shown i n F i g u r e 12 show a c h a r a c t e r i s t i c e x p o n e n t i a l i n c r e a s e i n a c t i v i t y a s l a r v a l d e v e l o p m e n t p r o c e e d s a n d t h e n r e d u c t i o n s o f a c t i v i t y a t t h e o n s e t o f p u p a r i a t i o n ( O ' B r i e n a n d M c l n t y r e , 1 9 7 6 ) . T h e a m o u n t o f e a c h g e n e p r o d u c t i s r o u g h l y c o r r e l a t e d w i t h b o d y w e i g h t d u r i n g p e r i o d s o f h i g h m e t a b o l i c a c t i v i t y ( l a r v a l g r o w t h ) a n d t h u s c o u l d b e c o n s i d e r e d " h o u s e k e e p i n g " e n z y m e s . I t i s l i k e l y t h a t t h i s s e t o f g e n e s i s h i g h l y b i a s e d f o r h i s t o r i c a l r e a s o n s ( s t u d i e s o n m e t a b o l i c e n z y m e s a r e among t h e o l d e s t a n d t h e i r l o c i a r e among t h e f i r s t t o b e mapped b y e l e c t r o p h o r e s i s ) . T h u s , n e g a t i v e r e p r e s s i o n o f t h e t y p e o b s e r v e d h e r e may b e m o r e common f o r h o u s e k e e p i n g g e n e s t h a n i t i s f o r o t h e r t y p e s . H o w e v e r , s e v e r a l g e n e s m e a s u r e d i n t h i s s t u d y a r e i n d u c i b l e , o r a r e d e v e l o p m e n t a l l y r e g u l a t e d a n d a l s o a p p e a r t o b e n e g a t i v e l y r e g u l a t e d . T h u s , m o d u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n b y n e g a t i v e r e p r e s s o r s may a l s o o p e r a t e i n d e p e n d e n t l y o f d e v e l o p m e n t a l c u e s a n d i n c o n c e r t w i t h o t h e r r e g u l a t o r y m e c h a n i s m s . I n d e e d , s y s t e m s o f p o s i t i v e a n d n e g a t i v e c o n t r o l c o u l d b e o p e r a t i n g s i m u l t a n e o u s l y a n d t h e e x p r e s s i o n o f c o m p l e x l o c i s u c h a s s c u t e o r b i t h o r a x may a l s o b e r e p r e s s i b l e b y c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t m o d i f i e r s ( L e w i s , 1978 ; B o t a s e t a l . , 1 9 8 2 ) . T h e number o f n e g a t i v e r e g u l a t o r y l o c i o p e r a t i n g i n t r i s o m i e s i s n o t k n o w n . A o n e r e g u l a t o r t o o n e g e n e r e l a t i o n s h i p c l e a r l y d o e s n o t e x i s t , s i n c e s e v e r a l l o c i a r e m o d u l a t e d i n more t h a n o n e t r i s o m y . B e c a u s e t h e number o f l o c i w i t h i n a c h r o m o s o m e a r m i s l a r g e , i t i s q u i t e p o s s i b l e t h a t s e v e r a l r e g u l a t o r y l o c i a r e d u p l i c a t e d i n e a c h t r i s o m y . F i g u r e /3f F i g u r e 12 . Summary o-f t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f g e n e s i n X - c h r o m o s o m a l a n d a u t o s o m a l t r i s o m i e s . On e a c h X a x i s , a v a l u e o f 1 . 0 r e p r e s e n t s t h e d i p l o i d l e v e l o f e x p r e s s i o n p e r g e n e . 1 5 6 s C M o 5 U E a & Ul E 9 i 1 i t •o k N 8 0) Q. 72 SJ + - t •D a 13 i N Q. O E 3 U. u a a. * i t * t t I f f •1 t I l*s ll lm 11 11 HI JL i l *§* i i 6 f*-k N O E a u. I S * ! V Z X £ )3b 13 shows the d i s t r i b u t i o n of the number of l o c i which are affected by d i f f e r e n t numbers of trisomies. If the regulatory l o c i were extremely common then we might expect most l o c i to be affected by a l l trisomies. However, a mean number of 1.38 trisomies a f f e c t each locus for the three aneuploid conditions tested. If the whole genome were surveyed an average of 2.3 trisomies would be expected to a f f e c t each locus. Since there must be at least one regulatory locus on each trisomic arm for an affected locus, then on average, a minimum of between two and three such regulatory l o c i e x i s t for each gene. Unless the average st r u c t u r a l gene can also act as a regulatory gene, or there are more regulatory genes than s t r u c t u r a l genes, we can conclude that each regulatory gene a f f e c t s the expression of more than one genetic locus. At t h i s point, however, we cannot distinguish between many regulators operating on a few genes each or a few regulators each operating on many l o c i . Few l o c i appear to be activated i n the trisomic conditon. Table 31 shows that of the 47 gene—trisomy combinations examined only two resulted i n l e v e l s of product per template s i g n i f i c a n t l y above d i p l o i d . One of these, Men, w i l l be discussed i n d e t a i l i n chapter 6. The other locus, Aldox T belongs to a family of genes which code for enzymes that bind molybdenum as a cofactor. Several trans-acting genetic l o c i have been i d e n t i f i e d (mal. c i n . lxd. and lpo) that are required for the production of normal quantities of these enzymes (see Bentley and Williamson, 1979) and additional l o c i may e x i s t . If these or other l o c i synthesize 137 F i g u r e 1 3 . Number o-f t r i s o m i e s a f f e c t i n g i n d i v i d u a l l o c i . Mean number o f t r i s o m i e s a f f e c t i n g a n i n d i v i d u a l g e n e = 1 . 3 8 . |2>3 number of trisomies p r o d u c t s a t l e v e l s t h a t l i m i t t h e r a t e o-f s y n t h e s i s o f A O , t h e n c h a n g e s i n t h e i r c o n c e n t r a t i o n w o u l d r e g u l a t e t h e q u a n t i t y o f t h i s e n z y m e . I f o n e o f t h e s e g e n e s i s l o c a t e d o n 2 L a n d i f i t i s e x p r e s s e d a t a d o s e - d e p e n d e n t l e v e l , i n c r e a s e d q u a n t i t i e s o f AO s y n t h e s i s w o u l d r e s u l t . W h i l e s e v e r a l d i f f e r e n t l o c i e x i s t w h i c h p r o d u c e e n z y m e s c a p a b l e o f c o n v e r t i n g a c e t a l d e h y d e t o a c e t i c a c i d , ( D i c k i n s o n a n d G a u g h a n , 1981) s t r a i n s b e a r i n g n u l l m u t a t i o n s f o r AO ( D i c k i n s o n , 1970) p o s s e s s l e s s t h a n 2% o f t h e w i l d - t y p e a c t i v i t y . T h e r e f o r e t h e o v e r p r o d u c t i o n o f AO i n 2 L t r i s o m i e s i s c e r t a i n l y a r e g u l a t o r y e f f e c t a n d d o e s n o t a r i s e f r o m t h e d u p l i c a t i o n o f a s e c o n d AO l o c u s . S u c h r e g u l a t o r y g e n e s c o u l d c o n c e i v a b l y a c t a t a n y s t e p f r o m t h e e s t a b l i s h i n g t h e c o r r e c t c h r o m a t i n s t r u c t u r e f o r A l d o x e x p r e s s i o n t o t h e f i n a l m a t u r a t i o n o f t h e e n z y m e m o l e c u l e . T h e r e a r e r e l a t i v e l y f e w o t h e r c a s e s o f t r a n s - a c t i v a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n b y g e n e d u p l i c a t i o n ( W i l l i a m s o n a n d B e n t l e y , 1 9 8 3 ) , a l t h o u g h s e v e r a l r e p o r t s o f i n c r e a s e d l e v e l s o f u n l i n k e d e n z y m e s i n human t r i s o m y 21 h a v e a p p e a r e d (Mel1man e t a t . , 1964 ; M a t t e i , 1 9 8 2 ) . T h e p a u c i t y o f g e n e a c t i v a t i o n s i n t r i s o m i e s c o u l d a r i s e b e c a u s e l o c i c a p a b l e o f p o s i t i v e r e g u l a t i o n o f o t h e r g e n e s a r e t h e m s e l v e s s u b j e c t e d t o a u t o s o m a l d o s a g e c o m p e n s a t i o n . A l t e r n a t i v e l y , a n d m o r e l i k e l y , l o c i t h a t a r e c a p a b l e o f r e g u l a t i n g o t h e r g e n e s i n a p o s i t i v e a n d d i r e c t l y c o r r e l a t e d f a s h i o n a r e e x t r e m e l y r a r e . T h i s w o u l d i m p l y t h a t m o s t o f t h e c o m p o n e n t s r e q u i r e d f o r b i o s y t h e s i s a r e p r e s e n t i n e x c e s s q u a n t i t i e s . I n d e e d , t h i s p o s s i b i l i t y , w h i c h h a s b e e n s u g g e s t e d a s t h e b a s i s o f d o m i n a n c e a t t h e p h e n o t y p i c l e v e l ( M u l l e r , 1950 ; K a c s e r a n d B u r n s , 1 9 8 1 ) , i s f u r t h e r s t r e n g t h e n e d b y t h e f a c t t h a t most g e n e s p r o d u c e l e v e l s o f p r o d u c t t h a t a r e d i r e c t l y d e p e n d e n t o n t h e i r d o s e . T h u s , c o m p o n e n t s i n v o l v e d i n g e n e e x p r e s s i o n a p p e a r n o t t o b e r a t e l i m i t i n g a n d , a s s u c h , s u g g e s t s t h a t m o d u l a t i o n s ( n o t i n d u c t i o n o r i n a c t i v a t i o n s ) o f g e n e a c t i v i t y may n o t b e c o n t r o l l e d p o s i t i v e l y , b u t r a t h e r a r e m e d i a t e d b y c h a n g e s i n q u a n t i t i e s o f n e g a t i v e r e g u l a t o r s . T h e e x p r e s s i o n o f A d h i n v a r i o u s c h r o m o s o m e p o s i t i o n s h a s p r o v i d e d e v i d e n c e t h a t p o s i t i v e e f f e c t o r s o f g e n e m o d u l a t i o n d o e x i s t , b u t t h a t t h e i r l e v e l o f s y n t h e s i s i s s u f f i c i e n t i n w i l d t y p e c e l l s s o t h a t i n c r e a s e d q u a n t i t i e s a r e f u n c t i o n a l l y i r r e l e v a n t . I n d i p l o i d s t r a i n s , d i f f e r e n t c h r o m o s o m e p o s i t i o n s r e d u c e t h e e x p r e s s i o n o f A d h t o v a r y i n g d e g r e e s . T h i s may a r i s e b e c a u s e t h e c h r o m a t i n c o n f i g u r a t i o n i n t o w h i c h A d h h a s i n s e r t e d i s n o t a s i d e a l a s t h e n a t i v e p o s i t i o n ( i e p h a s i n g , d e g r e e o f c o n d e n s a t i o n ) . I t i s n o t e w o r t h y , i n t h i s r e g a r d , t h a t t h e t w o t r a n s f o r m a n t s d i s p l a y i n g t h e l o w e s t l e v e l o f e x p r e s s i o n p o s s e s s t h e l e a s t amount o f f l a n k i n g A d h r e g i o n DNA ( J . P o s a k o n y , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . P e r h a p s t h e s e p a r t i c u l a r A d h g e n e s a r e n o t a s w e l l b u f f e r e d f r o m l o c a l p e r t u r b a t i o n s a s a r e t h e l a r g e r i n s e r t i o n s . I n t r i s o m i e s f o r 2 L , t h e e x p r e s s i o n o f A d h i s a c t i v a t e d b y a n amount t h a t i s d e p e n d e n t o n t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e g e n e . A g e n e t h a t i s e x p r e s s e d a t t h e w i l d - t y p e l e v e l i n e u p l o i d s i s o n l y s l i g h t l y a c t i v a t e d b y h y p e r p l o i d y f o r 2 L . H o w e v e r , A d h g e n e s w h i c h h a v e t h e i r e x p r e s s i o n r e d u c e d b y c h r o m o s o m a l p o s i t i o n e f f e c t s a r e s u b j e c t e d t o a c t i v i t y i n c r e a s e s a s h i g h a s 45% i n 2 L t r i s o m i e s . T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n l e v e l o f e x p r e s s i o n a n d t h e amount o f a c t i v a t i o n s u g g e s t s t h a t a g e n e w h i c h i s o n l y s l i g h t l y 14-1 a c t i v e w o u l d b e a c t i v a t e d b y S O X . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t a l o c u s e x i s t s o n 2 L w h i c h p o s i t i v e l y r e g u l a t e s A d h . When t h i s g e n e i s d u p l i c a t e d i n t r i s o m i e s , 1 . 5 t i m e s m o r e r e g u l a t o r i s p r o d u c e d t h a n i n d i p l o i d s . When t h e A d h g e n e i s f u l l y a c t i v e ( i e . i n i t s n a t i v e c h r o m o s o m a l p o s i t i o n ) t h e a c t i v a t o r i s i n c a p a b l e o f i n c r e a s i n g t h e e x p r e s s i o n a n y f u r t h e r b e c a u s e a n u p p e r l i m i t may e x i s t f o r A d h e x p r e s s i o n . H o w e v e r , when t h e e x p r e s s i o n l e v e l i s l o w t h e a c t i v a t o r c a n i n c r e a s e t h e e x p r e s s i o n o f t h i s g e n e . O n l y a t v e r y l o w e x p r e s s i o n l e v e l s c a n t h e a c t i v a t o r a c t i n a c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t w a y ; a t i n t e r m e d i a t e l e v e l s o f e x p r e s s i o n , a c t i v a t i o n d o e s n o t v a r y d i r e c t l y w i t h t h e q u a n t i t y o f a c t i v a t o r . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e t w o p r o c e s s e s a f f e c t i n g t h e e x p r e s s i o n o f A d h a r e , t o some e x t e n t , c o m p e t i t i v e . F o r e x a m p l e , c h r o m o s o m a l p o s i t i o n c o u l d a l t e r c h r o m a t i n c o n d e n s a t i o n , w h i l e t h e a c t i v a t o r c o u l d a f f e c t t h e s t a b i l i t y o f RNA p o l y m e r a s e b i n d i n g . B o t h p r o c e s s e s c o u l d a l t e r t h e r a t e o f t r a n s c r i p t i o n i n i t i a t i o n . T h i s i s r e m i n i s c e n t o f a n e x p e r i m e n t d e s c r i b e d b y P e l h a m a n d B i e n z ( 1 9 8 2 ) . I n m o n i t o r i n g t h e e x p r e s s i o n o f t h e h e r p e s t h y m i d i n e k i n a s e g e n e i n COS c e l l s , t h e s e a u t h o r s o b s e r v e d t h a t TK a c t i v i t y c o u l d b e a c t i v a t e d b y p l a c i n g e i t h e r a v i r a l e n h a n c e r o r a h e a t s h o c k p r o m o t e r i n t h e v i c i n i t y o f t h e t k g e n e ( a n d g r o w i n g t h e c e l l s a t 42 d e g r e e s C ) . H o w e v e r , i f t h e h e a t - s h o c k p r o m o t e r was a d d e d t o t h e T K - e n h a n c e r e l e m e n t c o n s t r u c t , n o f u r t h e r a c t i v a t i o n o f e x p r e s s i o n was o b s e r v e d . T h e t w o p o s i t i v e r e g u l a t o r y e f f e c t s w e r e n o t a d d i t i v e a n d i t a p p e a r e d t h a t TK g e n e e x p r e s s i o n h a d a n u p p e r l i m i t u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s . T h e f a c t t h a t t h e t h r e e L S P - 1 g e n e s c a n r e s p o n d 14-Z d i f f e r e n t l y i n t h e d i f f e r e n t t r i s o m i e s s t u d i e d s u g g e s t s t h a t t h e r e g u l a t o r s d o n o t o p e r a t e o n a c o m p o n e n t o f g e n e e x p r e s s i o n t h a t i s common t o a l l t h r e e g e n e s . T h e s e g e n e s a r e v e r y s i m i l a r i n s e q u e n c e c o m p o s i t i o n a n d a r e c o o r d i n a t e l y r e g u l a t e d a t t h e RNA l e v e l ( P o w e l l e t a l l 1 9 8 4 ) . I n a d d i t i o n , t h e s t u d i e s o n A d h h a v e shown t h a t e x p r e s s i o n o f t h i s g e n e v a r i e s i n d i f f e r e n t c h r o m o s o m a l p o s i t i o n s . A p o s s i b l e m e c h a n i s m b y w h i c h r e g u l a t o r s c o u l d o p e r a t e i s t h r o u g h a l t e r a t i o n s o f t h e l o c a l c h r o m a t i n c o n f i g u r a t i o n . R e c e n t l y , s e v e r a l d i v e r s e DNA s e q u e n c e e l e m e n t s h a v e b e e n d e s c r i b e d w h i c h a r e c a p a b l e o f a f f e c t i n g t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f g e n e s l o c a t e d i n c i s o v e r a r a n g e o f s e v e r a l kb o f D N A . T h e s e e l e m e n t s e n t i t l e d e n h a n c e r s , w e r e f i r s t d i s c o v e r e d a s v i r a l p r o m o t e r e l e m e n t s b u t h a v e s i n c e b e e n d i s c o v e r e d a s n a t i v e s t r u c t u r e s i n t h e m a m m a l i a n g e n o m e . Some o f t h e s e e n h a n c e r s a p p a r e n t l y r e q u i r e t r a n s — a c t i n g g e n e t i c f u n c t i o n t o o p e r a t e ( s e e i n t r o d u c t i o n ) . W h i l e t h e w i l d - t y p e f u n c t i o n o f t h e s e e l e m e n t s i s t o a c t i v a t e t r a n s c r i p t i o n , a n d t h e y a r e t h e m s e l v e s u n d e r p o s i t i v e r e g u l a t i o n , e v i d e n c e d o e s e x i s t f o r t r a n s - a c t i n g r e p r e s s i o n o f t r a n s c r i p t i o n . T h e c a s s e t t e s t o r a g e g e n e s i n v o l v e d i n m a t i n g t y p e s w i t c h i n g i n S a c c h r o m v c e s c e r i v i s a e a r e n e g a t i v e l y c o n t r o l l e d b y t h e w i l d - t y p e f u n c t i o n o f S I R l o c i ( s i l e n t i n f o r m a t i o n r e p r e s s o r s ) ( N a s m y t h , 1 9 8 2 ) . E n h a n c e r e l e m e n t s a p p e a r t o a c t m o r e a s s w i t c h e s , e i t h e r e l i m i n a t i n g t r a n s c r i p t i o n o r g r e a t l y i n c r e a s i n g i t . S i m i l a r e l e m e n t s c o n c e i v a b l y e x i s t w h i c h r e s p o n d t o d i f f u s i b l e r e g u l a t o r y s i g n a l s i n a c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t m a n n e r . S t u d i e s o n h o r m o n e a c t i v a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n h a v e shown t h a t t h e l e v e l o f g e n e a c t i v i t y v a r i e s w i t h t h e d o s e o f 1+3 t h e i n d u c i n g a g e n t . H o r m o n e — r e c e p t o r m e d i a t e d i n d u c t i o n o f t r a n s c r i p t i o n o c c u r s b y t h e b i n d i n g o f t h i s c o m p l e x t o s p e c i f i c DNA s e q u e n c e s ( C h a n d l e r e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e f i n d i n g t h a t m o s t g e n e s i n D r o s o p h i l a a r e u n d e r a f o r m o f n e g a t i v e c o n t r o l a l l o w s t h e p o s s i b i l i t y t h a t g e n e m o d u l a t i o n d u r i n g d e v e l o p m e n t c o u l d b e c o n t r o l l e d b y v a r y i n g t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f r e p r e s s o r c o d i n g l o c i . A s d i s c u s s e d p r e v i o u s l y , i t i s l i k e l y t h a t m o r e t h a n o n e g e n e i s c o n t r o l l e d b y a g i v e n r e g u l a t o r y l o c u s . I f t h i s i s t h e c a s e , t h e n r e g u l a t i o n o f g e n e b a t t e r i e s i n a c o o r d i n a t e manner i s q u i t e c o n c e i v a b l e ( s e e D a v i d s o n a n d B r i t t e n , 1 9 7 9 ) . P o s i t i v e c o n t r o l h a s b e e n h y p o t h e s i z e d t o r e g u l a t e d o s a g e c o m p e n s a t i o n o f t h e X - c h r o m o s o m e i n D r o s o p h i l a ( S c h w a r t z , 19731 M a r o n i a n d P l a u t , 1 9 7 3 b ) . E v i d e n c e t o s u p p o r t t h i s h a s b e e n s u m m a r i z e d i n p r e v i o u s c h a p t e r s . T r a n s - a c t i n g , l i m i t i n g a c t i v a t o r s o f X - c h r o m o s o m e t r a n s c r i p t i o n c o u l d p r o v i d e a s y s t e m o f c o n t r o l w h e r e X - l i n k e d t e m p l a t e s c o m p e t e f o r t h e r e g u l a t o r y s u b s t a n c e . T h e s e a c t i v a t o r m o l e c u l e s s h o u l d b e a u t o s o m a l l y e n c o d e d t o m a i n t a i n e q u i v a l e n t l e v e l s b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s . I n s u r v e y i n g f o u r l o c i i n t w o o f t h e f o u r m a j o r a u t o s o m a l t r i s o m i e s , we d e t e c t e d n o i n c r e a s e i n X - l i n k e d a c t i v i t y . A u t o s o m a l t r i s o m i e s c h a n g e t h e X / A r a t i o i n f e m a l e s f r o m 1 . 0 t o 0 . 9 1 a n d i n m a l e s f r o m 0 . 5 t o 0 . 4 5 . W h i l e t h e s e c h a n g e s a r e s m a l l , t h e a n e u p l o i d c o n d i t i o n s t i l l p r o v i d e s a v a l i d a s s a y s y s t e m f o r c h a n g e s i n t h e X / A r a t i o b y m o d i f y i n g t h e a u t o s o m a l c o n t e n t , r a t h e r t h a n t h e X - c h r o m o s o m e c o n t e n t ( M a r o n i a n d L u c c h e s i , 1 9 8 0 ) . F o r e x a m p l e , i t i s c o n c e i v a b l e t h a t o n l y o n e o r a f e w a u t o s o m a l l y e n c o d e d a c t i v a t o r g e n e s a r e r e s p o n s i b l e f o r IH-H-c o n t r o l l i n g t h e l e v e l o-f X - l i n k e d t r a n s c r i p t i o n . A c t i v a t i o n s o f X - l i n k e d e n z y m e s w e r e n o t o b s e r v e d i n 2 L o r i n 3 L t r i s o m i e s . T h e r e f o r e , i f o n l y a f e w p o s i t i v e a c t i v a t o r g e n e s e x i s t , t h e y m u s t r e s i d e o n t h e o t h e r c h r o m o s o m e a r m s . A l t e r n a t i v e l y , s u c h a c t i v a t o r g e n e s c o u l d b e r e i t e r a t e d a n d d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t t h e g e n o m e . R a w l s a n d L u c c h e s i (1974a) e x a m i n e d t h e a c t i v i t y o f a n X — l i n k e d e n z y m e l o c u s i n s t r a i n s o f f l i e s b e a r i n g d i f f e r e n t d u p l i c a t i o n s f o r much o f t h e g e n o m e . T h e y d i d n o t o b s e r v e a n y o n e p a r t i c u l a r r e g i o n t h a t c o u l d a c t i v a t e t h e e x p r e s s i o n o f t h i s g e n e . T h i s f i n d i n g s u g g e s t e d t h a t e i t h e r t h e r e g u l a t o r y l o c i may b e r e d u n d a n t o r t h e y d o n o t e x i s t . I n t h e p r e s e n t s t u d y , a p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e a u t o s o m a l genome was d u p l i c a t e d i n t w o d i f f e r e n t a n e u p l o i d s . I f t h e s e a c t i v a t o r l o c i a r e r e d u n d a n t , t h e y d o n o t a p p e a r t o r e s i d e o n 2 L o r 3 L . R e c e n t e v i d e n c e s u g g e s t s t h a t d o s a g e c o m p e n s a t i o n o c c u r s b y i n c r e a s i n g t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n i n m a l e s r a t h e r t h a n b y d e c r e a s i n g t h e e x p r e s s i o n i n f e m a l e s ( S p r a d l i n g a n d R u b i n , 1 9 8 3 ) . T h i s r e g u l a t i o n d o e s n o t a p p e a r t o b e d i s r u p t e d i n t r i s o m i e s . F u r t h e r , s e v e r a l X - l i n k e d l o c i d i s p l a y e d o n e - t h i r d r e d u c t i o n s i n a c t i v i t y i n t r i s o m i e s f o r 2 L o r f o r 3 L , y e t t h e s e l o c i a r e d o s a g e c o m p e n s a t e d b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s . T h u s , t w o o p p o s i n g r e g u l a t o r y s y s t e m s a r e c a p a b l e o f a c t i n g i n c o n c e r t — t h a t i s , r e p r e s s i o n b y t h e a u t o s o m a l d u p l i c a t i o n a n d h y p e r a c t i v a t i o n b y m a l e - f e m a l e d o s a g e c o m p e n s a t i o n . T h i s r e s u l t , i m p l i e s t h a t t h e s e t w o r e g u l a t o r y s y s t e m s o p e r a t e b y i n d e p e n d e n t m e c h a n i s m s ( t h i s i s n o t t o s a y t h a t b o t h c o u l d n o t a f f e c t t h e same p r o c e s s , i e . RNA p o l y m e r a s e i n i t i a t i o n o r e l o n g a t i o n ) . If5 A p a r a l l e l c o n c l u s i o n c a n b e o b t a i n e d f o r t h e o b s e r v a t i o n s made o n X — l i n k e d g e n e e x p r e s s i o n b e t w e e n s t r a i n s . M a r k e d d i f f e r e n c e s i n t h e e x p r e s s i o n o f s e v e r a l X - l i n k e d g e n e s e x i s t b e t w e e n s t r a i n s . P r e s u m a b l y t h i s i s a c o n s e q u e n c e o f d i f f e r e n t m o d i f i e r l o c i p r e s e n t i n e a c h s t r a i n . H o w e v e r , d e s p i t e t h e d i f f e r e n t l e v e l s o f e x p r e s s i o n b e t w e e n t h e s t r a i n s , e q u a l l e v e l s o f a c t i v i t y a r e o b s e r v e d b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s . T h i s a r g u e s t h a t m a l e - f e m a l e d o s a g e c o m p e n s a t i o n a n d r e g u l a t i o n b y g e n e t i c m o d i f i e r s o p e r a t e b y i n d e p e n d e n t p r o c e s s e s . G e n e t i c m o d i f i e r s a r e known t o h a v e p r o n o u n c e d e f f e c t s o n g e n e e x p r e s s i o n . S e l e c t i o n f o r i n d i v i d u a l s d i s p l a y i n g t h e e x t r e m e s o f a p h e n o t y p e f r o m w i l d - t y p e s t r a i n s c a n a r i s e t h r o u g h d i f f e r e n t i a l a c c u m u l a t i o n a n d l o s s o f m o d i f i e r s . T h e p o t e n t i a l a d a p t i v e s i g n i f i c a n c e o f s u c h c h a n g e s h a s b e e n r e c o g n i z e d f o r many y e a r s a n d s u c c e s s f u l l y d e m o n s t r a t e d i n t h e l a b o r a t o r y ( M c D o n a l d e t a l . , 1 9 7 8 ) . A l a r g e number o f s t u d i e s h a v e r e c e n t l y r e p o r t e d t h e e x i s t e n c e o f t r a n s - a c t i n g m o d i f i e r s w h i c h a l t e r t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f a p a r t i c u l a r e n z y m e l o c u s ( P i p k i n a n d H e w i t t , 1972 ; M c D o n a l d a n d A y a l a , 1 9 7 8 ; B i j l s m a , 1980 ; L a u r i e - A h l b e r g e t a l . , 1 9 8 0 ; H o r i a n d T a n d a , 19811 L a u r i e - A h l b e r g e t a l . , 1 9 8 1 ; H o r i e t a l . , 1 9 8 2 ; L a u r i e - A h l b e r g e t a l . , 1982$ W i l t o n e t a l . , 1982 ; M a r o n i a n d L a u r i e - A h l b e r g , 1983 ; K i n g a n d M c D o n a l d , 1 9 8 3 ; B e w l e y a n d L a u r i e - A h l b e r g , 1984 ; M i y a s h i t a a n d L a u r i e - A h l b e r g , 1 9 8 4 ) . C o n s i d e r a b l e p o l y m o r p h i s m i n t h e a l l e l i c c o n d i t i o n o f t h e s e r e g u l a t o r s e x i s t s i n n a t u r e , a n d i n c o m b i n a t i o n w i t h d i f f e r e n t a l l e l i c s t a t e s o f t h e s t r u c t u r a l g e n e ( o r c l o s e l y m a p p i n g c i s r e g u l a t o r s ) l a r g e d i f f e r e n c e s o c c u r f o r t h e q u a n t i t i e s o f e n z y m e s s y n t h e s i z e d ( o v e r t e n f o l d f o r A d h T L a u r i e - A h l b e r g e t a l . , 1 9 8 0 ) . S e v e r a l o f t h e s e s t u d i e s h a v e shown t h a t t h e m o d i f i e r s c a n map t o r e g i o n s d i s t a n t f r o m t h e s t r u c t u r a l g e n e a n d t h a t t h e y a f f e c t t h e n u m b e r o f e n z y m e m o l e c u l e s s y n t h e s i z e d . A s s u c h , t h e s e m o d i f i e r l o c i may e n c o d e d i f f u s i b l e r e g u l a t o r s o f g e n e t r a n s c r i p t i o n . P r e s u m a b l y , a l t e r e d l e v e l s o f s t r u c t u r a l g e n e e x p r e s s i o n a r i s e f r o m d i f f e r e n t q u a n t i t i e s o f r e g u l a t o r b e i n g s y n t h e s i z e d f r o m d i s t i n c t a l l e l e s o f t h e m o d i f i e r g e n e . V a r i a t i o n s i n t h e d o s e o f t h e s e m o d i f i e r g e n e s c o u l d a l s o a f f e c t t h e q u a n t i t y o f r e g u l a t o r y p r o d u c t . T r a n s - a c t i n g m o d i f i c a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n i n t r i s o m i e s a n d i n s t r a i n s d i s p l a y i n g a l t e r e d e n z y m e l e v e l s c o u l d b e m e d i a t e d b y t h e same r e g u l a t o r y l o c i . I n t h e f o r m e r , t h e q u a n t i t y o f r e g u l a t o r y p r o d u c t i s a l t e r e d b y g e n e d o s a g e , w h i l e i n t h e l a t t e r t h i s a r i s e s f r o m a l l e l i c v a r i a t i o n . T h e d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f t h e s e r e g u l a t o r y l o c i h a s t h e p o t e n t i a l t o r e g u l a t e t h e e x p r e s s i o n o f g e n e s o r g r o u p s o f g e n e s , o n a d e v e l o p m e n t a l o r e v o l u t i o n a r y t i m e s c a l e ( B r i t t e n a n d D a v i d s o n , 19691 W i l s o n , 1976 ; D a v i d s o n a n d B r i t t e n , 1 9 7 9 ) . C o o r d i n a t e r e g u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n a l l o w s f u n c t i o n a l l y r e l a t e d p r o d u c t s t o b e s y n t h e s i z e d t o g e t h e r a t a p p r o p r i a t e t i m e s . P r e s u m a b l y , i t i s a common o c c u r a n c e i n t h e c o m p l e x i t y o f d i f f e r e n t i a t i o n a n d d e v e l o p m e n t . T h e X - c h r o m o s o m e o f D r o s o p h i l a i s a n e x t r a o r d i n a r y e x a m p l e o f a g r o u p o f f u n c t i o n a l l y u n r e l a t e d g e n e s t h a t a r e m o d u l a t e d b y a common m e c h a n i s m . D o s a g e c o m p e n s a t i o n o p e r a t e s a s a c o n s e q u e n c e o f e v o l u t i o n a r y c o n s t r a i n t s w h i c h a r e a p p l i e d t o t h e X—chromosome (monosomy v e r s u s d i s o m y f o r sex d e t e r m i n a t i o n p u r p o s e s ) r a t h e r 1*1 t h a n a s a s y s t e m w h i c h c o o r d i n a t e ! . y r e g u l a t e s d i f f e r e n t g e n e p r o d u c t s t h a t a r e f u n c t i o n a l l y o r d e v e l o p m e n t a l l y r e l a t e d . T h e m o d u l a t i o n s w h i c h o c c u r i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s h a v e n o t e v o l v e d t o c o p e w i t h v a r i a t i o n s i n g e n e d o s e , s i n c e n a t u r a l a n e u p l o i d y i s n o t a s s o c i a t e d w i t h a n y o f t h e s e c h r o m o s o m e a r m s . T h e r e w o u l d b e l i t t l e s e l e c t i v e p r e s s u r e f o r r e g u l a t o r y g e n e s a n d t h e l o c i t h e y c o n t r o l t o b e o n t h e same c h r o m o s o m e a r m . C l e a r l y , p e r i c e n t r i c i n v e r s i o n s , t r a n s l o c a t i o n s a n d t r a n s p o s i t i o n s , o v e r a l o n g e v o l u t i o n a r y " h i s t o r y , w o u l d d i s p e r s e s u c h r e g u l a t o r y l o c i . T h u s , we o b s e r v e t h a t o f t h e l o c i w h i c h show r e p r e s s i o n i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s , l e s s t h a n h a l f a r e l o c a t e d o n t h e a n e u p l o i d a r m . H o w e v e r , a l l o f t h e e n z y m e - l o c i t h a t w e r e r e p r e s s e d i n X - c h r o m o s o m a l t r i s o m i e s w e r e l o c a t e d o n t h i s a r m . I t s e e m s p a r a d o x i c a l t h a t a u t o s o m a l t r i s o m i e s c a n r e p r e s s t h e e x p r e s s i o n b o t h o f X - l i n k e d a n d o f a u t o s o m a l l o c i w h e r e a s X - c h r o m o s o m a l t r i s o m i e s a f f e c t X - l i n k e d g e n e s a l m o s t e x c l u s i v e l y (an e x c e p t i o n s h o u l d b e r e c a l l e d ; o n e a u t o s o m a l g e n e , L S P - 1 o . was r e p r e s s e d i n m e t a f e m a l e s ) . Two p o s s i b l e s i m p l e e x p l a n a t i o n s f o r t h i 6 e n i g m a s e e m p l a u s i b l e . I n e v o l u t i o n a r y t e r m s , i t may n o t b e a d v a n t a g e o u s t o h a v e r e g u l a t o r y g e n e s (whose p r o d u c t l e v e l s h a v e a d a p t i v e s i g n i f i c a n c e ) o n a c h r o m o s o m e w h i c h n o r m a l l y v a r i e s i n d o s e . W h i l e t h i s s h o u l d p r e s e n t n o p r o b l e m i f t h e s e g e n e s a r e d o s a g e c o m p e n s a t e d b e t w e e n m a l e s a n d f e m a l e s , e v i d e n c e h a s b e e n p r e s e n t e d w h i c h s u g g e s t s t h a t X—chromosome d o s a g e c o m p e n s a t i o n may b e i n c o m p l e t e i n some c e l l t y p e s ( M a r o n i e t a l . , 1 9 7 4 ) . F u r t h e r m o r e , t h e s e l e c t i v e p r e s s u r e f o r t h e s e m o d i f i e r l o c i t o a c q u i r e d o s a g e c o m p e n s a t i o n may b e l o w b e c a u s e t h e i r e f f e c t s may b e b u f f e r e d b y o t h e r a u t o s o m a l l y e n c o d e d r e g u l a t o r s w h i c h a c t o n t h e same g e n e s . A l t e r n a t i v e l y , m o d i f i e r s w h i c h r e g u l a t e a u t o s o m a l g e n e s may b e e q u a l l y a b u n d a n t o n t h e X c h r o m o s o m e a s o n t h e a u t o s o m e s . I n X - c h r o m o s o m a l t r i s o m i e s , u n l i k e t h e i r a u t o s o m a l c o u n t e r p a r t s , e l e v a t e d q u a n t i t i e s o f r e g u l a t o r y g e n e p r o d u c t may n o t b e s y n t h e s i z e d b e c a u s e t h e m a j o r i t y o f t h e s e g e n e s a r e t h e m s e l v e s d o s a g e c o m p e n s a t e d . C o m p e n s a t i o n o f s u c h r e g u l a t o r y g e n e s c o u l d o c c u r b y a n e x t e n s i o n o f r e g u l a r m a l e - f e m a l e d o s a g e c o m p e n s a t i o n o r b y h y p e r p l o i d c o m p e n s a t i o n o f t h e t y p e o b s e r v e d o n t h e a u t o s o m e s . T h e f e w a c t i v a t i o n s o f g e n e e x p r e s s i o n o b s e r v e d i n t r i s o m i e s o f f e r s i n d i r e c t e v i d e n c e t o s u g g e s t t h a t n e g a t i v e r e g u l a t o r y g e n e s d o n o t c o n t r o l o t h e r n e g a t i v e r e g u l a t o r s . T h e t y p e s o f r e g u l a t o r y m e c h a n i s m s t h a t may o p e r a t e i n m e t a f e m a l e s w i l l b e d i s c u s s e d f u r t h e r i n c h a p t e r 6 . P r e v i o u s r e p o r t s ( R a w l s a n d L u c c h e s i , 1 9 7 4 a , 1974b) h a v e d e t e c t e d t h e e x i s t e n c e o f t r a n s - a c t i n g r e g u l a t o r y e f f e c t s w h i c h a p p e a r t o m o d i f y t h e e x p r e s s i o n o f p a r t i c u l a r g e n e s . R e c e n t l y , B i r c h l e r ( p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) h a s made a n e x t e n s i v e s u r v e y o f t h e D r o s o p h i l a genome f o r d o s a g e - s e n s i t i v e m o d i f i e r s o f A d h e x p r e s s i o n , a n d M a r o n i a n d L a u r i e - A h l b e r g (1983) h a v e a n a l y z e d s e v e r a l g e n e t i c m o d i f i e r l o c i w h i c h a f f e c t t h e q u a n t i t y o f ADH p r o d u c e d . A c o m b i n a t i o n o f t h e s e t w o a p p r o a c h e s , a s w e l l a s a d e t a i l e d a n a l y s i s o f i n d i v i d u a l r e g u l a t o r y l o c i , s h o u l d i n f o r m u s o f t h e c o m p l e x i t y o f t r a n s - a c t i n g g e n e c o n t r o l . R e g u l a t o r y e l e m e n t s t h a t a l l o w a p a r t i c u l a r g e n e t o r e s p o n d t o t r a n s - a c t i n g m o d i f i e r s may b e f o u n d b y s t a n d a r d i n v i t r o m o d i f i c a t i o n o f t h e g e n e a n d i t s f l a n k i n g s e q u e n c e s , f o l l o w e d b y p—element m e d i a t e d t r a n s f o r m a t i o n a n d a n a l y s i s o f t h e r e s p o n s e t o s p e c i f i c g e n e t i c c o n d i t i o n s . I t w i l l b e p a r t i c u l a r l y i n t e r e s t i n g t o know w h e t h e r t h e c o n t r o l e l e m e n t s a r e i n t e g r a l p a r t s o f t h e i m m e d i a t e 5 ' p r o m o t e r , o r w h e t h e r t h e y a r e m o r e r e m o t e a n d p r o p o g a t e t h e i r e f f e c t o v e r r e l a t i v e l y l o n g d i s t a n c e s . In t h i s r e g a r d , i t w o u l d b e i n t e r e s t i n g t o know w h e t h e r t h e t r a n s p o s e d A d h g e n e s e x a m i n e d i n 2 L t r i s o m i e s i n t h i s c h a p t e r c a n b e r e p r e s s e d b y t r i s o m y f o r 3 L a s i s t h e A d h g e n e i n i t s n a t i v e p o s i t i o n . 150 CHAPTER FOUR E F F E C T OF E X T E N S I V E A N E U P L O I D Y ON V I A B I L I T Y AND PHENOTYPE 151 I n t r o d u c t i o n A n e u p l o i d s i n D r o s o p h i l a a n d o t h e r e u k a r y o t e s a r e l e s s v i a b l e t h a n t h e i r d i p l o i d c o u n t e r p a r t s . T h e p a r a l l e l o b s e r v a t i o n t h a t t h e k a r y o t y p e o f m o s t s p e c i e s , a n d m o s t c e l l t y p e s w i t h i n an i n d i v i d u a l a r e i n v a r i a n t , s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t a b a l a n c e d g e n o m i c c o n d i t i o n i s a n e c e s s a r y p r e r e q u i s i t e f o r f i t n e s s . I n t h o s e c a s e s w h e r e n a t u r a l v a r i a t i o n s i n g e n e d o s a g e e x i s t , a m e c h a n i s m o f t e n o p e r a t e s t o m i n i m i z e d e l e t e r i o u s c o n s e q u e n c e s ( L u c c h e s i , 1 9 7 8 ) . T h e p h y s i o l o g i c a l e f f e c t s o f a n e u p l o i d y a r e v a r i a b l e . F o r e x a m p l e , p r i m a r y t r i s o m i e s f o r a n y o f t h e c h r o m o s o m e s i n D a t u r a p r o d u c e c h a r a c t e r i s t i c c h a n g e s f r o m t h e d i p l o i d p h e n o t y p e ( B l a k e s l e e , 1 9 2 2 ) . I n m a i z e , h o w e v e r , o n l y t w o o f t h e t e n p o s s i b l e t r i s o m i e s a r e m o r p h o l o g i c a l l y d i s t i n g u i s h a b l e f r o m d i p l o i d s ( R h o a d e s a n d M c C l i n t o c k , 1 9 3 5 ) . O t h e r s p e c i e s a r e a f f e c t e d l i t t l e b y a n e u p l o i d y f o r m o d e s t a m o u n t s ( a b o u t 5X) o f t h e g e n o m e . H o w e v e r , many o f t h e o r g a n i s m s w h i c h a r e r e s i s t a n t t o c h a n g e s i n c h r o m o s o m e number a r e p o l y p l o i d ( K h u s h , 1973) a n d c o n s e q u e n t l y t h e o v e r a l l c h a n g e t o g e n e b a l a n c e i s l e s s . I n c o n t r a s t , c h a n g e s i n number o f c h r o m o s o m e s e t s i s q u i t e w e l l t o l e r a t e d i n many s p e c i e s . T h e p l a n t k i n g d o m i s a p a r t i c u l a r l y r i c h s o u r c e o f a u t o a n d a l l o p o l y p l o i d s , p e r h a p s b e c a u s e t h e s e o r g a n i s m s c a n r e p r o d u c e v e g e t a t i v e l y a n d a r e s u c c e p t i b l e t o h y b r i d i z a t i o n ( S t e b b i n s , 1 9 6 6 ) . I n D r o s o p h i l a , t h e d i p l o i d a n d t r i p l o i d c o n d i t i o n h a v e b e e n v e r i f i e d c y t o l o g i c a l l y ( B r i d g e s , 1921) a n d g e n e t i c e v i d e n c e e x i s t s f o r t h e s u r v i v a l o f h a p l o i d a n d t e t r a p l o i d f e m a l e s 151 ( M o r g a n , 1924 ; C l i n e , 1 9 8 3 ) . T h e work b y L i n d s l e y e t a l . (1972) a n d S t e w a r t a n d M e r r i a m (1973) h a s p r o v i d e d q u a n t i t a t i v e o b s e r v a t i o n s o n t h e e x t e n t t o w h i c h a d u l t D r o s o p h i l a c a n w i t h s t a n d a n e u p l o i d y , a n d e s t i m a t e s o f t h e number o f l o c i w h i c h a r e h a p l o o r t r i p l o a b n o r m a l . T h e y f o u n d t h a t o n l y o n e r e g i o n o f t h e genome must b e p r e s e n t i n t w o d o s e s i n d i p l o i d s f o r v i a b i l i t y , a n d t h a t a l l o t h e r a u t o s o m a l r e g i o n s c o u l d b e d u p l i c a t e d w i t h l i t t l e e f f e c t . T h e X c h r o m o s o m e h a s t w o h y p e r p l o i d s e n s i t i v e r e g i o n s (Bx a n d C o ) w h i c h c a u s e p h e n o t y p i c c h a n g e s a n d o n e r e g i o n w h i c h i s l e t h a l when d u p l i c a t e d i n m a l e s . T h e X c h r o m o s o m e a n d t h e a u t o s o m e s c o n t a i n a p p r o x i m a t e l y 58 r e g i o n s w h i c h , when t h e y a r e p r e s e n t i n a s i n g l e d o s e , a r e l e t h a l o r h a v e a p h e n o t y p i c e f f e c t . Many o f t h e s e l o c i f a l l i n t o a c l a s s o f m u t a t i o n s c a l l e d M i n u t e s w h i c h a r e c h a r a c t e r i z e d b y a b n o r m a l b r i s t l e m o r p h o l o g y a n d d e l a y e d g r o w t h . H y p e r p l o i d y i s b e t t e r t o l e r a t e d t h a n h y p o p l o i d y . W h i l e a d u l t h y p e r p l o i d s d u p l i c a t e d f o r a p p r o x i m a t e l y 107. o f t h e genome a r e r e c o v e r e d w i t h m o d e s t f r e q u e n c y , h y p o p l o i d s i n v o l v i n g m o r e t h a n 3% ( a n d c o m m o n l y n o t m o r e t h a n 17.) o f t h e genome a r e n o t r e c o v e r e d . T h e p h y s i o l o g i c a l d i s r u p t i o n s a s s o c i a t e d w i t h a n e u p l o i d y a p p e a r t o a r i s e f r o m r e d u c e d c e l l v i a b i l i t y . R i p o l l (1980) i n d u c e d m o s a i c p a t c h e s o f a n e u p l o i d t i s s u e i n a n o t h e r w i s e d i p l o i d i n d i v i d u a l a n d f o u n d t h a t t h e a n e u p l o i d c e l l s w e r e a t a c o m p e t i t i v e d i s a d v a n t a g e . I t i s r e a s o n a b l e t o a s s u m e t h a t a n e u p l o i d y e x e r t s i t s e f f e c t s b y d i s r u p t i n g t h e b a l a n c e o f g e n e e x p r e s s i o n w i t h i n t h e c e l l t h a t i n t u r n a f f e c t s o r g a n i s m a l d e v e l o p m e n t . A s t u d y c o m p a r i n g t h e a n a t o m y o f t h e v a r i o u s t r i s o m i e s o f D a t u r a r e v e a l e d t h a t d i f f e r e n t e f f e c t s w e r e 153 c o r r e l a t e d w i t h d i f f e r e n t a n e u p l o i d r e g i o n s ( S i n n o t e t a l . , 1 9 3 4 ) . T h i s c o n c l u s i o n i s c o n f i r m e d b y e x a m i n i n g t h e p a r a l l e l p h e n o t y p e s d i s p l a y e d b y p r i m a r y a n d t e r t i a r y t r i s o m i e s . T h u s , a l l o f t h e p r i m a r y t r i s o m i e s o f D a t u r a a r e m o r p h o l o g i c a l l y d i s t i n c t ( B l a k e s l e e , 1922) a n d t h e p h e n o t y p i c m o d i f i c a t i o n s o b s e r v e d i n a n e u p l o i d s r e f l e c t t h e a c t i o n o f g e n e s c o n t a i n e d i n t h e s e r e g i o n s . I n N i c o t i a n a ( G o o d s p e e d a n d A v e r y , 1939) a n d D a t u r a ( A v e r y e t a l . , 1959) d i f f e r e n t c h a r a c t e r i s t i c s may b e a f f e c t e d i n s i m i l a r w a y s ; f o r e x a m p l e , i f l e a v e s a r e e l o n g a t e d i n a p a r t i c u l a r t r i s o m i c t h e n s t e m , f l o w e r s a n d s e e d s w i l l a l s o b e e l o n g a t e d . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t , i n a d d i t i o n t o r e d u c e d c e l l v i a b i l i t y , d i s r u p t i o n s c a n a l s o o c c u r i n p r o c e s s e s d e t e r m i n i n g p o s i t i o n a l i n f o r m a t i o n , m o r p h o g e n e s i s o r d i f f e r e n t i a t i o n . B r i d g e s (1922) s u g g e s t e d t h a t t h e m o r p h o l o g i c a l d i f f e r e n c e s o b s e r v e d b e t w e e n d i p l o i d s a n d a n e u p l o i d s i n D r o s o p h i l a a r i s e f r o m t h e r e l a t i v e g e n e t i c i m b a l a n c e . T h u s , i n d i v i d u a l s t h a t a r e h a p l o i d f o r t h e f o u r t h c h r o m o s o m e d i s p l a y c h a r a c t e r i s t i c c u t i c u l a r d i f f e r e n c e s f r o m t h e d i p l o i d . I n d i v i d u a l s h a p l o i d f o r t h e X c h r o m o s o m e a r e a l s o p h e n o t y p i c a l l y d i s t i n c t f r o m d i p l o - X i n d i v i d u a l s ( m a l e s a n d f e m a l e s ) , a n d B r i d g e s a r g u e d t h a t t h i s was c a u s e d b y t h e q u a n t i t a t i v e d i f f e r e n c e i n t h e a c t i v i t y o f g e n e s o n t h i s c h r o m o s o m e . W h i l e t h e p h e n o t y p e o f m a l e s a n d f e m a l e s i s u n d o u b t e d l y t h e c o n s e q u e n c e o f t h e X - c h r o m o s o m e d o s a g e , i t i s u n l i k e l y t h a t t h e d i f f e r e n c e i n p r o d u c t l e v e l s f o r s e x - d e t e r m i n i n g g e n e s e n c o d e d o n t h i s c h r o m o s o m e i s s o l e l y r e s p o n s i b l e . I n d e e d , a u t o s o m a l l o c i a r e known t h a t c a n a l t e r o r r e v e r s e t h e s e x o f a n i n d i v i d u a l ( L i n d s l e y a n d G r e l 1 , 1 9 6 8 ) . I t /5f i s p r o b a b l y t h e f u n c t i o n a l s t a t e o f t h e s e a n d o t h e r g e n e s t h a t X - c h r o m o s o m e p l o i d y i n f l u e n c e s ( B a k e r a n d R i d g e , 1 9 8 0 ) . I n t h i s c h a p t e r , we e x a m i n e t h e p r e - a d u l t v i a b i l i t i e s o f i n d i v i d u a l s p o s s e s s i n g g r o s s l y a b n o r m a l a m o u n t s o f c h r o m o s o m a l m a t e r i a l . T h e r e s u l t s s u g g e s t t h a t i n v i a b i l i t y i s o b s e r v e d a t a l l s t a g e s o f d e v e l o p m e n t , b u t t h a t t h e e m b r y o n i c s t a g e i s l e a s t s e n s i t i v e a n d t h e p u p a l s t a g e i s m o s t s e n s i t i v e . P h e n o t y p i c e f f e c t s i n c l u d e d i s r u p t i o n s i n m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d p e r h a p s s e x u a l i t y . I n o n e c a s e , e v i d e n c e o f a c r y p t i c r e g u l a t o r y e f f e c t i s o b s e r v e d i n t r i s o m i c - 2 L f e m a l e s w h i c h a r e h e t e r o z y g o u s f o r a m u t a t i o n i n a g e n e w h i c h r e g u l a t e s b o t h s e x d e t e r m i n a t i o n a n d d o s a g e c o m p e n s a t i o n . 155 M a t e r i a l s a n d M e t h o d s A n e u p l o i d s p o s s e s s i n g d i f f e r e n t s i z e d d u p l i c a t i o n s o f chromosome—2L w e r e s y n t h e s i z e d w i t h t h e T ( Y l 2 ) c h r o m o s o m e s d e s c r i b e d b y L i n d s l e y e t a l . ( 1 9 7 2 ) . C r o s s i n g T ( Y ; 2 ) B 2 5 1 / I n ( 2 L R ) S M l . C v f e m a l e s t o m a l e s c a r r y i n g d i f f e r e n t T ( Y ; 2 ) s w i t h b r e a k p o i n t s i n v a r i o u s p o s i t i o n s o n 2 L p r o d u c e s i n d i v i d u a l s w h i c h p o s s e s s a d u p l i c a t i o n o f 2 L f r o m t h e h e t e r o c h r o m a t i n t o t h e b r e a k p o i n t o f t h e t r a n s l o c a t i o n . S e l e c t i o n o f a p p r o p r i a t e T ( Y S 2 ) s ( a l l b r o k e n i n t h e l o n g a r m o f t h e Y c h r o m o s o m e ) a l l o w e d a c c u r a t e i d e n t i f i c a t i o n o f t h e s e a n e u p l o i d s i n t h e l a r v a l s t a g e s ( y e l l o w m o u t h p a r t s ) r e l a t i v e t o t h e d i p l o i d c o n t r o l s ( b l a c k m o u t h p a r t s ) . F o r v i a b i l i t y a n d d e v e l o p m e n t s t u d i e s , e g g s w e r e c o l l e c t e d o v e r a t w o h o u r p e r i o d a f t e r t h e f e m a l e s h a d b e e n a c t i v e l y l a y i n g many e g g s . ( F o r t h e e x p e r i m e n t d e s i g n e d t o m e a s u r e t h e s e x r a t i o o f t r i s o m i e s , e g g s w e r e c o l l e c t e d o v e r a t w e n t y - f o u r h o u r p e r i o d . ) H a t c h i n g was m o n i t o r e d t h i r t y h o u r s a f t e r e g g l a y . S c o r i n g o f l a r v a l p h e n o t y p e s a n d s e x was d e t e r m i n e d e v e r y t w e l v e h o u r s a t t h e w a n d e r i n g t h i r d i n s t a r l a r v a l s t a g e , o r a s f i r s t i n s t a r s i f y e l l o w was s e r v i n g a s t h e m a r k e r a n d s u b s e q u e n t d e v e l o p m e n t was u n s u r e . P o s t - e m b r y o n i c v i a b i l i t y o f t r i s o m i e s was e s t i m a t e d b y c o l l e c t i n g s e v e r a l h u n d r e d l a r v a e a t d i f f e r e n t s t a g e s o f d e v e l o p m e n t a n d a l l o w i n g t h e m t o p u p a t e . T h e d i f f e r e n c e s i n p u p a t i o n f r e q u e n c i e s w e r e a s s u m e d t o a r i s e f r o m l e t h a l i t y . P u p a l d e v e l o p m e n t was s c o r e d d i r e c t l y . 2 L t r i s o m i e s b e a r i n g a d e f i c i e n c y f o r t h e G p d h r e g i o n 15b (-For k i n e t i c a n a l y s i s o-f GPDH e n z y m e ) w e r e p r o d u c e d b y c r o s s i n g y / v ; C ( 2 L ) V H l . l t . F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w f e m a l e s t o D f ( 2 L ) G d h A / B c E l p m a l e s . B e * p r o g e n y w e r e s e l e c t e d a t t h e w a n d e r i n g l a r v a l s t a g e . E n z y m e was e x t r a c t e d f r o m t h e s e i n d i v i d u a l s a n d c o m p a r e d t o t h a t o f t h e i r e u p l o i d , c o m p o u n d — f r e e p a r e n t s . T o d e t e r m i n e what e f f e c t o r g a n i s m s i z e h a d o n e n z y m e a c t i v i t y , i n d i v i d u a l w a n d e r i n g t h i r d — i n s t a r l a r v a e w e r e c o l l e c t e d , s e x e d a n d r i n s e d i n d i s t i l l e d w a t e r , a n d t h e n d r i e d a n d w e i g h e d . E a c h l a r v a was h o m o g e n i z e d i n 2 0 Q u l o f lOmM P O U , ImM P T U , pH 7 . 5 . T h e e x t r a c t was s p u n f o r 1 m i n u t e i n a n E p p e n d o r f m i c r o f u g e , a n d t h e s u p e r n a t e n t was a s s a y e d f o r A D H , G P D H , a n d PGI a c t i v i t i e s . F a t b o d i e s w e r e d i s s e c t e d f r o m f e m a l e t r i s o m i c - 2 L l a r v a e o r t h e i r d i p l o i d p a r e n t s , a n d s t o r e d f r o z e n i n g r o u p s o f f i f t y p e r g e n o t y p e . T h e s e s a m p l e s w e r e t h a w e d , s o n i c a t e d a n d c e n t r i f u g e d ; t h e s u p e r n a t e n t was a s s a y e d f o r P G K , G P D H , A D H , P G I , C A T a n d AO e n z y m e a c t i v i t i e s . T o m e a s u r e t h e e x t e n t o f v a r i e g a t i o n o f t h e B a r g e n e , t h e s i z e o f t h e p u p a l o r a d u l t e y e was m e a s u r e d b y t r a c i n g t h e e y e w i t h t h e a i d o f a m i c r o m e t e r e y e p i e c e . T h e t r a c i n g s w e r e c u t o u t a n d w e i g h e d t o p r o v i d e a n e s t i m a t e s i z e . T h e q u a n t i t y o f DNA was m e a s u r e d b y t h e d i p h e n y l a m i n e m e t h o d d e s c r i b e d b y B u r t o n ( 1 9 5 f i ) . P r o t e i n m e a s u r e m e n t s w e r e a s d e s c r i b e d i n p r e v i o u s c h a p t e r s . C e l l s i z e was e s t i m a t e d b y p h o t o g r a p h i n g a d u l t o r p u p a l e y e s i n a s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e ( C a m b r i d g e S t e r e o s c a n 250—T) . A t r a c i n g o u t l i n i n g a g r o u p o f t e n f a c e t s f r o m e a c h e y e was c u t o u t a n d w e i g h e d . 151 C o m p a r i s o n o f t h e s e v a l u e s b e t w e e n e y e s f r o m d i p l o i d a n d t r i p l o i d s t r a i n s s u g g e s t e d t h a t t h i s m e t h o d was r e l i a b l y q u a n t i t a t i v e . 158 R e s u l t s E f f e c t o f e x t e n s i v e a n e u p l o i d y o n v i a b i l i t y a n d d e v e l o p m e n t . T h e c u m u l a t i v e e f f e c t s o f i n c r e a s i n g t h e s i z e o f s e g m e n t a l a n e u p l o i d y a r e w e l l d o c u m e n t e d f o r a d u l t v i a b i l i t y i n D r o s o p h i l a ( L i n d s l e y e t a l . , 1 9 7 2 ) . W h e t h e r t h i s i s t h e c a s e f o r l a r v a l d e v e l o p m e n t ( w h e r e g r o w t h o c c u r s l a r g e l y b y i n c r e a s e s i n c e l l s i z e r a t h e r t h a n c e l l n u m b e r ) i s u n k n o w n . T h e r e f o r e , t h e v i a b i l i t i e s w e r e e x a m i n e d o f i n d i v i d u a l s p o s s e s s i n g v a r i o u s s i z e d d u p l i c a t i o n s f o r t h e l e f t a r m o f c h r o m o s o m e t w o t h r o u g h l a r v a l d e v e l o p m e n t . F i g u r e 14 s h o w s t h a t v i a b i l i t y i s i n v e r s e l y c o r r e l a t e d w i t h t h e e x t e n t o f a n e u p l o i d y , a n d t h a t d u p l i c a t i o n s w h i c h e x c e e d m o r e t h a n o n e — h a l f t h e c h r o m o s o m e a r m a r e a f f e c t e d m o s t s e v e r e l y . S i m i l a r e f f e c t s a n d c o n c l u s i o n s w e r e r e a c h e d b y L i n d s l e y e t a l (1972) when t h e y e x a m i n e d a d u l t v i a b i l i t y . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t a n e u p l o i d i n v i a b i l i t y a r i s e s f r o m e f f e c t s o n p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s e s t h a t a r e common t o a l l s t a g e s o f d e v e l o p m e n t . We h a v e s c r e e n e d o v e r 4 5 0 , 0 0 0 m o n o s o m i c - 2 L o r t r i s o m i c - 2 L a n d 2 0 0 , 0 0 0 m o n o s o m i c - 3 L o r t r i s o m i c - 3 L z y g o t e s f o r EMS i n d u c e d m u t a t i o n s t h a t w o u l d a l l o w s u c h i n d i v i d u a l s t o s u r v i v e t o a d u l t . N o n e w e r e r e c o v e r e d s u g g e s t i n g t h a t l e t h a l i t y o f t h e s e i n d i v i d u a l s d o e s n o t a r i s e f r o m t h e e x c e s s o f g e n e p r o d u c t e n c o d e d b y a s i n g l e g e n e . Compound c h r o m o s o m e s a l l o w s i m p l e m a n i p u l a t i o n o f l a r g e r e g i o n s o f t h e D r o s o p h i l a g e n o m e . B y c r o s s i n g v a r i o u s c o m b i n a t i o n s o f s t o c k s b e a r i n g c o m p o u n d o r c o m p o u n d — f r e e \51 F i g u r e 14 . V i a b i l i t y t o l a t e t h i r d - i n s t a r l a r v a e o f p a r t i a l t r i s o m i e s f o r 2 L . V i a b i l i t y m e a s u r e d r e l a t i v e t o d i p l o i d c o n t r o l s p r o d u c e d i n t h e same c r o s s e s . S a m p l e s i z e s a r e b e t w e e n 119 a n d 301 f o r e a c h p o i n t . T r a n s l o c a t i o n s u s e d w e r e : B 1 1 0 , A 6 2 , G 7 4 , B 9 2 , L 5 2 , A l l l , H 1 2 1 , H 1 1 6 , R136 ( L i n d s l e y e t a l . , 1 9 7 2 ) . D u p l i c a t i o n s e x t e n d f r o m t h e p r o x i m a l r e g i o n o f 2 L ( c h r o m o s o m e p o s i t i o n 40) o u t t o t h e m o r e d i s t a l c h r o m o s o m a l p o s i t i o n s , w h i c h a r e i n d i c a t e d on t h e X a x i s . Ibl c h r o m o s o m e s i t i s p o s s i b l e t o v a r y t h e d o s a g e ( f r o m o n e t o t h r e e ) o f a n y c h r o m o s o m e a r m i n d e p e n d e n t l y o f t h e d o s a g e o f a n y o t h e r a r m . T h e c r o s s e s u s e d i n t h i s i n v e s t i g a t i o n a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 3 2 . S i n c e s e v e r a l a n e u p l o i d t y p e s a r e p r o d u c e d f r o m some c r o s s e s , t h e v i a b i l i t y o f p a r t i c u l a r a n e u p l o i d c l a s s e s a r e p r e s e n t e d i n T a b l e 3 3 . A n e u p l o i d c l a s s e s a r e o f t e n i n f e r r e d ; f o r e x a m p l e , m o n o s o m i c p r o g e n y h a v e v e r y p o o r v i a b i l i t y a n d h a t c h i n g f r e q u e n c y . T h e r e f o r e , i t h a s b e e n a s s u m e d t h a t a l l i n d i v i d u a l s m o n o s o m i c f o r o n e a u t o s o m a l a r m b e h a v e s i m i l a r l y , i n d e p e n d e n t o f t h e p l o i d y o f a n y o t h e r a r m . S i m i l a r l y , a l l w h o l e a r m t r i s o m i e s c a n d e v e l o p a s f a r a s t h e l a r v a l s t a g e . T h e r e f o r e , when c r o s s e s a r e made w h e r e t h e f r e q u e n c y o f e g g h a t c h i s r e d u c e d , i t i s a s s u m e d t h a t t h e s u r v i v i n g l a r v a e r e p r e s e n t t h e c o m b i n a t i o n o f a n e u p l o i d c o n d i t i o n s w h i c h a r e m o s t v i a b l e b y t h e m s e l v e s ( i e . d o u b l e t r i s o m i e s h a v e b e e n a s s u m e d t o s u r v i v e b e t t e r t h a n d o u b l e m o n o s o m i e s ) . T h e s e c o n s i d e r a t i o n s a r e n o t t r i v i a l s i n c e b a l a n c e d a n e u p l o i d s p o s s e s s i n g r e d u c e d o r i n c r e a s e d n u m b e r s o f c h r o m o s o m e s e t s ( i e . h a p l o i d s , t r i p l o i d s , t e t r a p l o i d s ) h a v e b e e n d e s c r i b e d . C r o s s 1 s h o w s t h a t e v e n a s t a n d a r d w i l d - t y p e s t r a i n c a n d i s p l a y a r e d u c e d f r e q u e n c y o f e g g h a t c h . T h i s p r e s u m a b l y a r i s e s f r o m e m b r y o n i c l e t h a l i t y a s w e l l a s f r o m d e p o s i t i o n o f u n f e r t i l i z e d e g g s . C r o s s e s 2 t o 5 e x a m i n e t h e f o u r p o s s i b l e a u t o s o m a l c o m p o u n d - f r e e s t a i n s . T h e s e l i n e s d i s p l a y e g g - h a t c h f r e q u e n c i e s o f a b o u t 50% a n d s u g g e s t t h a t a l l p o s s e s s s i m i l a r m e i o t i c p r o p e r t i e s ; i n b o t h s e x e s , t h e t w o f r e e a r m s s e g r e g a t e a n d t h e c o m p o u n d m o v e s a t r a n d o m . I f t h e c o m p o u n d p a i r e d w i t h o n e o f t h e f r e e a r m s , t h e h a t c h w o u l d b e a b o u t 25%; i f t h e IbX T a b l e 32 E m b r y o n i c v i a b i l i t y o f w h o l e a r m t r i s o m i e s . E x p . P a r e n t F i r s t F e m a l e M a l e E g g s I n s t a r s h a t c h 1 O r e g o n R O r e g o n R 3 8 4 364 . 9 2 4 2 y / y ? C < 2 L ) l t ; F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w y / y ; C ( 2 L ) l t ; F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w 1812 8 9 7 . 4 9 5 3 y 2 / y 2 ; F < 2 L ) p r / F ( 2 L ) p r ; C ( 2 R ) p x y 2 / y ; F ( 2 L ) p r / F < 2 L ) p r ; C ( 2 R ) p x 1513 782 . 5 1 7 4 C ( 3 L ) r u s t ; F < 3 R ) e £ V F < 3 R ) e e C ( 3 L ) r u s t ; F<3R) e^/FiZVe* 1222 5 5 5 . 4 5 4 5 F ( 3 L ) r i / F < 3 L ) r i ; C < 3 R ) e e ' F ( 3 L ) r i / F ( 3 L ) r i ; C ( 3 R ) e B 1279 6 1 9 . 4 8 4 6 O r e g o n R C<4R)P1+ 112 101 . 9 0 1 7 C ( l ) R M y p n v / 0 O r e g o n R 992 6 9 3 . 6 9 9 S C < 2 L ) + ; F (2R>bw/F<2R)bw O r e g o n R 495 2 3 2 . 4 6 9 9 O r e g o n R C ( 3 L ) r u s t | F < 3 R ) e ! 3 / F < 3 R > e e j 12B2 5 8 3 . 4 5 5 10 F ( 3 L ) p r / F ( 2 L ) p r ; C < 2 R ) p x ; y / y O r e g o n R 1141 522 . 4 5 7 11 F < 3 L ) r i / F ( 3 L ) r i ; C ( 3 R ) e s O r e g o n R 1929 3 0 7 . 159 12 C < 3 R ) e 1 3 ; F ( 3 L ) r i / F ( 3 L ) r i X Y / 0 ? Dp T p l / D f T p l 1472 245 . 166 13 C < 2 L > V H 1 , i t ; C ( 2 R ) V H S 7 , P i n C ( 2 L ) V H l , l t ; < 2 R ) V H S 7 , P i n 1010 2 8 9 . 2 8 6 14 C ( 3 L ) S H 2 + ; C(3R>SH19+ C < 3 L ) S H 2 + ; C ( 3 R ) S H 1 9 + 2 4 6 7 6 4 5 . 2 6 1 15 y 2 / y 2 ; C < 2 R ) p x ; F < 2 L ) p r / F ( 2 L ) p r C ( 2 L ) l t ; C ( 2 R ) P i n + 1369 2 8 7 . 2 0 9 16 F < 3 L ) r i / F ( 3 L ) r i C < 3 R > « S C ( 3 L ) + ; C < 3 R > + 8 1 5 2 0 0 . 2 4 5 17 C ( 3 L ) r u s t ; C < 3 L ) + ; C ( 3 R > + 2 1 5 7 262 . 121 F ( 3 R ) V D l e s / F<3R>VDle G J /b3 T a b l e 33 c r o s s e s I n f e r r e d v i a b i l i t y i n T a b l e 3 2 . o f s e l e c t e d a n e u p l o i d s f r o m t h e E x p . k a r y o t y p i c c l a s s 7. v i a b i 1 i t y l a t e s t s t a g e o f d e v e l o p m e n t 1 d i p l o i d 9 2 . 4 a d u l t 2 d i p l o i d 9 9 . 0 a d u l t 3 d i p l o i d 1 0 3 . 4 a d u l t 4 d i p l o i d 9 0 . 8 a d u l t 5 d i p l o i d 9 6 . B a d u l t 6 T s 4 9 0 . 1 a d u l t 7 T s X 9 3 . 1 a d u l t 8 T s 2 L 9 3 . 7 a d u l t 9 T s 3 L 9 1 . 0 a d u l t 10 T s 2 R 9 1 . 4 p i g m e n t e d p u p a e 11 T s 3 R 3 1 . B s e c o n d i n s t a r 12 T s 3 R / D f <3R>Tpl 6 6 . 6 t a n p u p a e 13 d i p l o i d 1 . 0 0 a d u l t 14 d i p l o i d 1 . 0 0 a d u l t 15 T s 2 R 8 3 . 9 t h i r d i n s t a r 1 16 T s 3 L 9 8 . 2 p i g m e n t e d p u p a e 2 17 T s 3 R 4 8 . 6 f i r s t i n s t a r 3 N o n d i s j u n c t i o n a l a d u l t s a l s o r e c o v e r e d : 1) 16 ; 2) 9 ; 3) 7 T s 5 8 T r i s o m y t r i v a l e n t moved r a n d o m l y , a h a t c h o f l e s s t h a n 20% w o u l d b e e x p e c t e d . T h u s t h e p r i m a r y m e i o t i c p r o d u c t s f r o m t h e s e c o m p o u n d - f r e e l i n e s a r e g a m e t e s w h i c h a r e e i t h e r n u l l o s o m i c o r d i s o m i c f o r t h e a r m c o r r e s p o n d i n g t o t h e c o m p o u n d c h r o m o s o m e . C r o s s e s 13 t o 17 d e m o n s t r a t e t h a t f e w n o n d i s j u n c t i o n a l g a m e t e s a r e p r o d u c e d b y t h e c o m p o u n d - f r e e s t r a i n s a n d t h a t t h e y a r e s u i t a b l e f o r t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n s . C r o s s e s 6 t o 12 e x a m i n e t h e e m b r y o n i c v i a b i l i t i e s o f w h o l e - a r m t r i s o m i e s ( T a b l e s 32 a n d 3 3 ) . I t i s c l e a r t h a t a l l b u t o n e c h r o m o s o m e arm h a s l i t t l e e f f e c t o n e m b r y o n i c v i a b i l i t y when p r e s e n t i n t h e t r i s o m i c c o n d i t i o n . T r i s o m i e s f o r t h e r i g h t a r m o f c h r o m o s o m e t h r e e s u r v i v e v e r y p o o r l y . T h i s may a r i s e f r o m two c a u s e s : 1) t h i s a r m i s t h e l a r g e s t o f t h e f i v e m a j o r c h r o m o s o m e a r m s e x a m i n e d , a n d 2) i t b e a r s t h e h a p l o — t r i p l o l e t h a l l o c u s i n i t s p r o x i m a l r e g i o n ( c h r o m o s o m e r e g i o n 8 3 D E ) . C r o s s 12 s h o w s t h a t t h e v i a b i l i t y o f i n d i v i d u a l s w i t h a d e f i c i e n c y f o r t h e t r i p l o - l e t h a l r e g i o n , b u t a r e o t h e r w i s e t r i s o m i c f o r 3 R , h a v e e n c h a n c e d v i a b i l i t i e s r e l a t i v e t o c o m p l e t e 3R t r i s o m i e s . H o w e v e r , t h e v i a b i l i t y o f t h e s e i n d i v i d u a l s was l o w e r t h a n t h a t o b s e r v e d f o r o t h e r t r i s o m i e s s u g g e s t i n g t h a t s i z e a n d / o r o t h e r t r i p l o i n v i a b l e l o c i may e x i s t o n 3 R . F i g u r e 15 s h o w s t h e p o s t e m b r y o n i c v i a b i l i t i e s o f t h e f i v e m a j o r t r i s o m i e s o f D r o s o p h i l a . A s was d i s c u s s e d i n t h e p r e v i o u s s e c t i o n , t h e e g g s t a g e i s p a r t i c u l a r l y r e f r a c t o r y t o t h e d e t r i m e n t a l e f f e c t s o f t r i s o m y . H o w e v e r , a s l a r v a l d e v e l o p m e n t p r o c e e d s , t r i s o m i e s b e g i n t o d i e a n d c o n t i n u e t o d o s o u n t i l l a t e s t a g e s o f p u p a t i o n . T r i s o m i e s f o r 2 L , 3 L a n d t h e X c h r o m o s o m e c a n s u r v i v e t o t h e a d u l t s t a g e . F o r 2 L t r i s o m i e s F i g u r e 15 . P o s t e m b r y o n i c v i a b i l i t i e s o f t h e f i v e m a j o r w h o l e arm t r i s o m i e s . D e v e l o p m e n t a l t i m e s a r e shown f o r 2 L t r i s o m i e s . T h e v i a b i l i t y o f t r i s o m i c - 2 R s e c o n d a n d t h i r d i n s t a r l a r v a e was n o t m e a s u r e d . H o w e v e r , o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t f e w i n d i v i d u a l s p r o g r e s s p a s t t h e s e c o n d l a r v a l m o l t . IT Hours of development g r o w n a t 18 d e g r e e s C , t h i s f r e q u e n c y was e s t i m a t e d t o b e a b o u t o n e p e r 2 0 0 0 z y g o t e s . T h e v i a b i l i t y t o a d u l t s t a g e f o r 3 L t r i s o m i e s was n o t c a l c u l a t e d , b u t i s a l s o e x t r e m e l y l o w . T h e a d u l t v i a b i l i t y o f m e t a f e m a l e s v a r i e s c o n s i d e r a b l y ( B r e h m e , 19371 F r o s t , I 9 6 0 ; R o l f e s a n d H o l l a n d e r , 1 9 6 1 ) . F o r t h e s t r a i n u s e d i n t h i s s t u d y , a d u l t v i a b i l i t y was l e s s t h a n o n e i n 2 0 0 . H o w e v e r , f o r a n o t h e r g e n o t y p e , C C D R M . Y S . I n ( l ) E N . v / I n < l ) s c ^ T t h e a d u l t v i a b i l i t y e x c e e d e d S X . T h u s , X - c h r o m o s o m a l t r i s o m i e s h a v e v i a b i l i t i e s s i m i l a r t o 2 L a n d 3 L t r i s o m i e s t h r o u g h p r e - i m a g i n a l d e v e l o p m e n t a n d p u p a t i o n , b u t show somewhat b e t t e r s u r v i v a l t h r o u g h t h e f i n a l s t a g e s o f i m a g o d e v e l o p m e n t . T h e d e v e l o p m e n t a l r a t e was m e a s u r e d f o r 2 L a n d 3 L t r i s o m i e s a n d f o r t h e i r d i p l o i d p a r e n t s t r a i n s . T h e r a t e a t w h i c h d e v e l o p m e n t p r o c e e d s f o r t h e t r i s o m i c — 2 L s t r a i n i s p l o t t e d o n t h e X a x i s ( F i g u r e 1 5 ) . A c o m p a r i s o n o f t h e d e v e l o p m e n t a l r a t e s o f O r e g o n R a n d 2 L t r i s o m i e s s u g g e s t s t h a t t r i s o m i e s p o s s e s s r e t a r d e d d e v e l o p m e n t r e l a t i v e t o d i p l o i d s . T h e d e l a y i s l i n e a r t h r o u g h o u t d e v e l o p m e n t (r= .996> s u g g e s t i n g t h a t t h e t r i s o m i c c o n d i t i o n a f f e c t s m o s t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s s i m i l a r l y . T h e d a t a w e r e c o l l e c t e d o n t h e f i r s t i n d i v i d u a l s t o r e a c h a p a r t i c u l a r d e v e l o p m e n t a l s t a g e a n d t h u s l i k e l y r e p r e s e n t s a b i a s i n f a v o u r o f t h e h e a l t h i e r i n d i v i d u a l s i n t h e p o p u l a t i o n . I n d e e d , t h e d e l a y i n d e v e l o p m e n t e x p e r i e n c e d b y t h e a v e r a g e t r i s o m i c i n d i v i d u a l i s l i k e l y t o b e much l a r g e r s i n c e t h e r a n g e f o r t h e p o p u l a t i o n was f a r g r e a t e r i n t h e t r i s o m i c s t r a i n s t h a n i n d i p l o i d s . F o r e x a m p l e , l a t e t h i r d i n s t a r l a r v a e w e r e o b s e r v e d f o r a s l o n g a s 2 7 0 h o u r s f o r 2 L t r i s o m i e s a n d 290 h o u r s f o r 3 L Ib8 t r i s o m i e s , w h i l e i n t h e d i p l o i d s t r a i n t h e l a s t l a r v a e h a d p u p a t e d 180 h o u r s p o s t e g g d e p o s i t i o n . D o b z h a n s k y (1928) r e p o r t e d t h a t t h e v i a b i l i t y o f m e t a f e m a l e s c a n b e i n c r e a s e d b y g r o w t h a t l o w t e m p e r a t u r e . I n d e e d , t h e v i a b i l i t y o f t r i s o m i e s b o t h f o r t h e X a n d f o r t h e a u t o s o m e s i s n e g a t i v e l y r e l a t e d t o t e m p e r a t u r e . F i g u r e 16 s h o w s t h a t s u r v i v a l t h r o u g h t h e l a r v a l p e r i o d i s i n c r e a s e d b y m a i n t a i n i n g t h e c u l t u r e s a t 18 d e g r e e s C . S u r i v i v a l t h r o u g h t h e p u p a l s t a g e may a l s o b e i n c r e a s e d s l i g h t l y b y g r o w t h a t l o w t e m p e r a t u r e ; h i g h t e m p e r a t u r e m a r k e d l y r e d u c e s t h e number o f t r i s o m i e s t h a t s u r v i v e t o l a t e s t a g e s o f d e v e l o p m e n t . T e m p e r a t u r e c a n h a v e m a r k e d e f f e c t s o n t h e e x p r e s s i o n o f many g e n e s ( S u z u k i e t a l , 1976) a n d c a n r e s u l t i n e l e v a t e d l e v e l s o f g e n e p r o d u c t ( u n l e s s t h e p a r t i c u l a r g e n e p r o d u c e s a t e m p e r a t u r e - s e n s i t i v e a b n o r m a l p r o d u c t ) . Many p r o d u c t s a r e s y n t h e s i z e d a t e l e v a t e d l e v e l s i n t r i s o m i e s b y g e n e s p r e s e n t o n t h e d u p l i c a t e d a r m s . T h e r e f o r e , h i g h t e m p e r a t u r e may a c c e n t u a t e t h i s i m b a l a n c e . E l e v a t e d t e m p e r a t u r e a l s o i n c r e a s e s t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f g e n e s s u b j e c t e d t o p o s i t i o n - e f f e c t v a r i e g a t i o n ( S p o f f o r d , 1 9 7 6 ) . M o r e o v e r , a t l e a s t o n e s u p p r e s s o r o f v a r i e g a t i o n , Y t o t : > S u ( V a r ) - 5 T h a s b e e n s u g g e s t e d t o c a u s e e l e v a t e d l e v e l s o f t r a n s c r i p t i o n ( C l a r k a n d K i e f e r , 1 9 7 7 ) . H o w e v e r , t h i s s u p p r e s s o r , a n d t w o e n h a n c e r s o f v a r i e g a t i o n ( E n ( V a r ) 5 a n d E n ( V a r ) 7 ) • d i d n o t a f f e c t t h e v i a b i l i t y o f 2 L t r i s o m i e s . S i m i l a r l y , d e f i c i e n c i e s f o r l a r g e h e t e r o c h r o m a t i c b l o c k s s u p p r e s s v a r i e g a t i o n , b u t D f ( 2 R ) M S 2 1 0 T w h i c h r e m o v e s m o s t o f t h e h e t e r o c h r o m a t i n o f F i g u r e 16 . V i a b i l i t y o f 2 L a n d 3 L t r i s o m i e s a t d i f f e r e n t t e m p e r a t u r e s . 100 co 3 50 0 • 3L • 2L pupariation pharate adults i 1 r 18 25 29 Temperature (°C) I l l 2 L , d i d n o t r e d u c e t h e v i a b i l i t y o-f 2 L t r i s o m i e s . Of some i n t e r e s t , h o w e v e r , i s t h a t 2 L t r i s o m i e s w h i c h p o s s e s s a d e f i c i e n c y o f t h e 3 9 0 E r e g i o n o f 2 L w e r e f o u n d t o s u r v i v e t o t h e a d u l t s t a g e a t a f r e q u e n c y o f a b o u t 17.. T h i s c h r o m o s o m e r e g i o n c o n t a i n s t h e h i s t o n e g e n e c l u s t e r , a n d a d e l e t i o n o f t h i s r e g i o n h a s b e e n s h o w n t o s u p p r e s s p o s i t i o n e f f e c t v a r i e g a t i o n ( K h e s i n a n d L e i b o v i t c h , 1978 ; M o o r e e t a l . , 1 9 7 9 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t r e m o v a l o f h i s t o n e g e n e t e m p l a t e s c a u s e s a n e l e v a t i o n i n t h e o v e r a l l l e v e l o f g e n e e x p r e s s i o n . S i n c e t h i s m i g h t b e e x p e c t e d o t o r e d u c e t h e v i a b i l i t y o f 2 L t r i s o m i e s , a n a l t e r n a t i v e e x p l a n a t i o n i s w a r r a n t e d . T h e d e f i c i e n c y u s e d ( D f < 2 L ) 1 6 1 f W r i g h t , e t a l . , 1976) i s l a r g e a n d t r i s o m i e s p r o d u c e d w i t h t h i s c h r o m o s o m e a r e n o t a s s e v e r e l y a n e u p l o i d a s a r e w h o l e - a r m t r i s o m i e s . T h e v i a b i l i t i e s o f m a l e a n d f e m a l e t r i s o m i e s f o r 2 L a n d 3 L a r e shown i n F i g u r e 1 7 . W h i l e t r i s o m i c m a l e l a r v a e d e v e l o p s l o w e r t h a n d o f e m a l e s , t h e i r v i a b i l i t y t o t h e l a r v a l p u p a l b o u n d a r y i s s i m i l a r t o t h a t o f t h e i r s i s t e r s . H o w e v e r , m a l e s d o n o t s u r v i v e a s w e l l a s f e m a l e s t h r o u g h p u p a l d e v e l o p m e n t ( s e e t a b l e i n s e r t s i n F i g u r e s 17a a n d b ) . T h i s may i n d i c a t e t h a t t h e h a p l o - X c o n d i t i o n i s n o t e q u i v a l e n t t o t h a t o f t h e d i p l o i d f e m a l e ; i t may b e l e s s a b l e t o a c c o m m o d a t e t h e a d d i t i o n a l p h y s i o l o g i c a l s t r e s s c a u s e d b y a n e u p l o i d y . I f X - c h r o m o s o m e d o s a g e c o m p e n s a t i o n i s o p e r a t i n g f u l l y i n m e t a f e m a l e s t h e n t h e s e i n d i v i d u a l s m i g h t b e e x p e c t e d t o b e t t e r w i t h s t a n d a d d i t i o n a l d e g r e e s o f a n e u p l o i d y t h a n a u t o s o m a l t r i s o m i e s . T h i s was t e s t e d b y e x a m i n i n g t h e v i a b i l i t y o f d o u b l e t r i s o m i e s ( T a b l e s 34 8c 3 5 ) . Two p o i n t s a r e s t r i k i n g . F i r s t , 172-F i g u r e 17 . Sex r a t i o o f a u t o s o m a l t r i s o m i e s a t d i f f e r e n t d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . A . T r i s o m y 2 L B . T r i s o m y 3 L . Z e r o t i m e o n t h e X a x i s r e p r e s e n t s t h e t i m e when t h e f i r s t l a r v a e b e g a n t o p u p a t e . L a r v a e w e r e s e x e d a n d c o u n t e d a s t h e y d e v e l o p e d t o t h e w a n d e r i n g l a r v a l s t a g e o f d e v e l o p m e n t . T h e t a b l e i n s e r t s i n e a c h f i g u r e show t h e s e x r a t i o s o f t r i s o m i e s a t t h e f i r s t i n s t a r l a r v a l s t a g e i n A . , a n d a t t h e p h a r a t e a d u l t s t a g e i n A . a n d i n B . A 300-. 0 48 96 144 hours n+ T a b l e 34 V i a b i l i t y o f d o u b l e t r i s o m i e s a n d t r i p l o i d s d e f i c i e n t f o r o n e a u t o s o m a l a r m . P a r e n t E x p F e m a l e M a l e e g g s f i r s t i n s t a r s h a t c h 1 O r e g o n R C ( 2 L > l t ; C ( 2 R > P i n + 1834 165 . 0 8 9 2 O r e g o n R C<3L)+|C<3R> + 1999 2 4 9 . 125 3 y 2 / y 2 ; F < 2 L > p r / F ( 2 L ) p r l C ( 2 R ) p x F < 3 L ) r i / F < 3 1 ) r i | C ( 3 R ) e 1053 3 . 0 0 3 4 y 2 / y 2 ; F ( 2 L > p r / F<2L>pr|C<2R)px C ( 3 L ) r u s t | F ( 3 R ) e < 3 / F ( 3 R ) e s 2394 6 7 . 0 2 8 5 y / y ; C < 2 L ) l t ; F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w F < 3 L ) r i / F ( 3 L ) r i | C ( 3 R ) e « 3 1512 6 6 . 0 4 4 6 y / y | C ( 2 L > l t ; F ( 2 R ) b w / F < 2 R ) b w C ( 3 L ) r u s t l F < 3 R ) e s / F ( 3 R > e « 3 1517 55 . 0 3 6 7 C ( l ) R M y v p n / 0 C ( 3 L ) r u s t | F < 3 R > e e i / F ( 3 R ) e B 2 0 4 4 4 6 7 . 2 2 8 8 C ( l ) R M y v p n / 0 C ( 2 L > l t ; F ( 2 R ) b w / F ( 2 R > b w | y / y 2141 558 . 2 6 1 9 C ( l ) R M y v p n / 0 F ( 2 L ) p r / F ( 2 L ) p r | C ( 2 R ) p x | y 2 / y 981 183 . 186 10 C ( l ) R M y v p n / 0 F ( 3 L ) r i / F < 3 L ) r i ! C ( 3 R ) e s 666 10 . 0 1 5 11 C ( 3 L ) r u s t | F ( 3 R > e s / F ( 3 R > e ' 3 C ( 2 L > l t | C ( 2 R ) P i n + 2 4 8 5 3 9 . 0 1 6 12 F ( 3 L > r i / F < 3 L > r i | C ( 3 R ) e s C ( 2 L > l t | C ( 2 R ) P i n + 2 4 8 6 5 2 . 0 2 1 13 y / y l C ( 2 L ) l t ? F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w C ( 3 L ) + ; C < 3 R ) + 1510 31 . 0 2 1 14 y : 2 / y : 2 ; F ( 2 L > p r / F < 2 L ) p r | C < 2 R ) p x C(3L>+|C(3R>+ 7 8 9 5 129 . 0 1 6 15 C ( l > R M , y v p n / y | F < 2 L ) p r / F ( 2 L ) p r | C ( 3 L > P 2 , r i | C(3R)VMK1 1040 2 . 001* C ( 2 R ) p x 115 T a b l e 35 I n f e r r e d v i a b i l i t i e s o f s e l e c t e d a n e u p l o i d s f r o m t h e c r o s s e s i n T a b l e 3 4 . E x p . k a r y o t y p i c c l a s s y. v i a b i l i t y l a t e s t s t a g e o f d e v e l o p m e n t 1 T s 2 L ; T s 2 R 3 5 . 6 f i r s t i n s t a r 2 T s 3 L 5 T s 3 R 5 0 . 0 f i r s t i n s t a r 3 T s 2 R ; T s 3 R 1 . 14 f i r s t i n s t a r 4 T s 2 R ; T s 3 L 1 1 . 2 s e c o n d i n s t a r 5 T S 2 L ; T B 3 R 1 7 . 5 e a r l y t h i r d i n s t a r 6 T s 2 L ; T s 3 L 1 4 . 5 s e c o n d i n s t a r * 7 T s X ; T s 3 L 0 e g g 8 T S X ; T S 2 L 8 . 8 9 T s X i T s 2 R 0 e g g 10 T s X ; T s 3 R 0 e g g 11 2 X ; 3 N - 3 R 1 2 . 6 s e c o n d i n s t a r 12 2 X ; 3 N - 3 L 1 6 . 7 t h i r d i n s t a r 13 2 X I 3 N - 2 R 1 6 . 4 t h i r d i n s t a r 14 2 X ; 3 N - 2 L 1 3 . 1 f i r s t i n s t a r 15 3X5 3 N - 2 L 0 e g g * c o n f i r m e d c y t o l o g i c a l l y ; o n e l a t e s e c o n d i n s t a r l a r v a e c o n t a i n e d t e n l a r g e c h r o m o s o m e a r m s , t w o f o u r t h c h r o m o s o m e s , a n d a n X a n d a Y c h r o m o s o m e . T s = T r i s o m y . 3N «= t r i p l o i d f o r a u t o s o m a l a r m s e x c e p t f o r t h o s e i n d i c a t e d a s m i s s i n g b y a - s i g n . t h e e m b r y o n i c v i a b i l i t y o f d o u b l e t r i s o m i e s f o r b o t h a r m s o f a s i n g l e c h r o m o s o m e ( i e T s 2 L S T s 2 R i n c r o s s 1 o r T s 3 L l T s 3 R i n c r o s s 2) s u r v i v e much b e t t e r t h a n d o d o u b l e t r i s o m i e s i n v o l v i n g o n e a r m e a c h f r o m t h e s e c o n d a n d t h i r d c h r o m o s o m e s ( c r o s s e s 3 t o 6 ) . S e c o n d , d o u b l e t r i s o m i e s i n v o l v i n g t h e X c h r o m o s o m e a n d o n e a u t o s o m a l a r m ( c r o s s e s 7 t o 10) s u r v i v e w o r s e , o n a v e r a g e , t h a n t h e d o u b l e a u t o s o m a l t r i s o m i e s . T h i s i n c l u d e s s e v e r a l o f t h e c o m b i n a t i o n s t h a t i n v o l v e 3 R , t h e l a r g e s t c h r o m o s o m e a r m ( c r o s s e s 2 a n d 5 ) . T h u s , t h e X c h r o m o s o m e d o e s n o t a p p e a r t o b e c o m p a t i b l e w i t h a d d i t i o n a l a n e u p l o i d y a n y m o r e t h a n a n y o f t h e o t h e r c h r o m o s o m e a r m s . P r e v i o u s c h a p t e r s r e v e a l e d t h a t many g e n e s a r e c a p a b l e o f b e i n g d o s a g e c o m p e n s a t e d i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s . T h i s a p p a r e n t l y o c c u r s b y r e d u c i n g t h e l e v e l o f e x p r e s s i o n o f t h e s e g e n e s b y a f o r m o f n e g a t i v e r e g u l a t i o n a r i s i n g f r o m t h e h y p e r p l o i d c o n d i t i o n . A c o r o l l a r y t o t h e s e o b s e r v a t i o n s m i g h t b e t h a t p o s i t i v e r e g u l a t i o n w o u l d o c c u r i n t h e h y p o p l o i d c o n d i t i o n . Monosomy f o r t h e X c h r o m o s o m e i s a v i a b l e k a r y o t y p i c c o n d i t i o n b e c a u s e d o s a g e c o m p e n s a t i o n r e c t i f i e s t h e g e n i e i m b a l a n c e . H o w e v e r , m o n o s o m i e s f o r a u t o s o m a l a r m s d o n o t s u r v i v e w e l l ( T a b l e 3 6 ) , s u g g e s t i n g t h a t h y p e r a c t i v a t i o n d o e s n o t a r i s e a s a c o n s e q u e n c e o f t h e h a p l o i d c o n d i t i o n ( s e e a l s o D o b z h a n s k y , 1 9 5 7 ) . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t a h i g h p r o p o r t i o n o f t h e s e a u t o s o m a l m o n o s o m i e s d e v e l o p e d t h r o u g h t h e e g g s t a g e , o f t e n f o r m i n g u n h a t c h e d l a r v a e . T h e s e i n d i v i d u a l s h a t c h e d o n l y o c c a s i o n a l l y , a n d a s l a t e a s 48 h o u r s a f t e r f e r t i l i z a t i o n . I t i s p o s s i b l e t h a t many o f t h e g e n e s i n t h e m o n o s o m i c a r m a r e i n d e e d e x p r e s s e d a t d i p l o i d l e v e l s i n m o n o s o m i e s ( c o m p e n s a t e d ) m T a b l e 36 S u r v i v a l o f a u t o s o m a l m o n o s o m i e s . P a r e n t # o f 48 # w i t h 'A u n h a t c h e d m o n o s o m i c h r o l d m o u t h m o n o s o m i c f e m a l e m a l e p r o d u c e d e g g s p a r t s l a r v a e y / y ; C < 2 L ) l t ; O r e g o n 2 L 100 8 5 8 5 . 0 F ( 2 R ) b w / R F ( 2 R ) b w C ( 3 L ) r u s t ; O r e g o n 3 L 502 451 8 9 . 8 F ( 2 R ) e S 3 / R F < 2 R ) e ! 9 b u t t h e i n v i a b i l i t y a r i s e s a s a c o n s e q u e n c e o f a f e w u n r e g u l a t e d g e n e s . T h e t w o f o l d d i f f e r e n c e i n p r o d u c t l e v e l b e t w e e n m o n o s o m i e s a n d d i p l o i d s f o r t h e s e g e n e s may b e s u f f i c i e n t f o r t h i s e f f e c t . T o r e d u c e t h i s f a c t o r t o 1 . 5 , t r i p l o i d s w e r e p r o d u c e d w h i c h w e r e d e f i c i e n t f o r o n e a u t o s o m a l a r m ( T a b l e s 34 & 3 5 ) . T h e s e i n d i v i d u a l s s u r v i v e d b e t t e r t h a n d i d t h e d i p l o i d m o n o s o m i e s , b u t s t i l l p o s s e s s e d l i m i t e d d e v e l o p m e n t a l p o t e n t i a l r e l a t i v e t o t r i s o m i e s . T h e s e t r i p l o i d i n d i v i d u a l s p o s s e s s e d o n l y t w o X c h r o m o s o m e s . I f X - c h r o m o s o m e d o s a g e c o m p e n s a t i o n was i n c o m p l e t e i n t h e s e i n d i v i d u a l s ( s e e B a k e r a n d B e l o t e , 1983) i t may h a v e c o n t r i b u t e d t o t h e i r r e d u c e d v i a b i l i t y . T o t e s t t h i s , t w o c r o s s e s w e r e made t h a t s h o u l d h a v e y i e l d e d t r i p l o i d f e m a l e s d e f i c i e n t f o r o n l y o n e a u t o s o m a l a r m . H o w e v e r , i n c r o s s 15 o f T a b l e 34 a n d i n t h e c r o s s C ( 1 ) R M + / y f j C ( 2 L ) h o / + / C ( 2 R ) p x ; C ( 3 L ) r i / + / C ( 3 R ) c u t r i p l o i d f e m a l e s b y C ( 2 L ) P . b i F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w m a l e s n o s u c h i n d i v i d u a l s w e r e r e c o v e r e d . T h e s e e x p e r i m e n t s s u g g e s t t h a t , a t b e s t , l i m i t e d p o t e n t i a l e x i s t s f o r c o m p l e t e h y p o p l o i d c o m p e n s a t i o n a t t h e c h r o m o s o m e a r m l e v e l i n D r o s o p h i l a . P h e n o t y p e A n e u p l o i d i n d i v i d u a l s a r e p h e n o t y p i c a l l y d i s t i n c t f r o m d i p l o i d s ( s e e F i g u r e 1 8 ) . T h e a l t e r a t i o n s may b e v e r y s u b t l e ; f o r e x a m p l e m i s s i n g , d u p l i c a t e d o r m i s p o s i t i o n e d h a i r s b e t w e e n e y e f a c e t s ( F i g u r e 2 5 ) . T h e p r e v i o u s s e c t i o n o f t h i s c h a p t e r r e v e a l e d t h a t a l l t r i s o m i e s d i s p l a y common d e v e l o p m e n t a l 179 F i g u r e 18 . P h e n o t y p e s o f t r i s o m i e s . A . S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l s o f p r o t e i n s a m p l e s e x t r a c t e d f r o m p h a r a t e a d u l t s : l e f t , O r e g o n R; m i d d l e , 2 L t r i s o m y ; r i g h t , 3 L t r i s o m y . W h e r e a s q u a n t i t a t i v e d i f f e r e n c e s i n b a n d i n t e n s i t i e s a r e a p p a r e n t , n o b a n d s w e r e c o m p l e t e l y l o s t i n t r i s o m i e s , n o r w e r e a n y u n i q u e b a n d s o b s e r v e d . B . A l a t e h a t c h i n g l a r v a e p r e s u m e d t o b e m o n o s o m i c f o r t h e l e f t a r m o f c h r o m o s o m e t w o . D e v e l o p m e n t o f s p i r a c l e s , t r a c h e a , m a n d i b u l a r h o o k s , a n d d e n t i c l e b e l t s w e r e n o t e d i n t h e s e i n d i v i d u a l s . C . t o p l e f t a n d r i g h t , t r i s o m i c - 2 L f e m a l e s ; b o t t o m l e f t , d i p l o i d f e m a l e ; b o t t o m r i g h t , d i p l o i d m a l e . D . S a l i v a r y g l a n d p o l y t e n e c h r o m o s o m e s f r o m a t r i s o m i c - 3 R l a r v a e ( r a r e l y s u r v i v i n g ) , p r e s u m e d t o c a r r y a d e l e t i o n f o r t h e h a p l o - t r i p l o l e t h a l r e g i o n . C h r o m o s o m e 3R c a n b e s e e n a s t h e t h i c k a r m j o i n i n g t h e c h r o m o c e n t r e a t s i x o ' c l o c k . a b n o r m a l i t i e s s u c h a s s l o w g r o w t h a n d l e t h a l i t y . A d u l t a u t o s o m a l a n d X - c h r o m o s o m a l a n e u p l o i d s s h a r e p h e n o t y p i c d i s r u p t i o n s a s w e l l : g n a r l e d h i n d l e g s a n d m i s s h a p e n a b d o m e n s . T h e s e x u a l p h e n o t y p e o f D r o s o p h i l a i s c o r r e l a t e d w i t h t h e r a t i o o f X c h r o m o s o m e s t o t h e n u m b e r o f a u t o s o m e s e t s . When t h i s r a t i o i s 0 . 5 o r l e s s , m a l e d e v e l o p m e n t o c c u r s , a n d when i t i s e q u a l t o o r e x c e e d s 1 . 0 , f e m a l e d e v e l o p m e n t r e s u l t s . F l i e s w i t h a n X / A r a t i o o f . 6 6 ( i e . 2 X 3 A , t r i p l o i d i n t e r s e x e s ) d i s p l a y s e x u a l c h a r a c t e r i s t i c s o f m a l e s a n d f e m a l e s . A u t o s o m a l t r i s o m i e s p o s s e s s a l a r g e c h a n g e i n t h e a u t o s o m a l c o n t e n t o f a n o t h e r w i s e d i p l o i d g e n o m e . I n f e m a l e s t r i s o m i c f o r 2 L o r f o r 3 L t h e X / A r a t i o i s a p p r o x i m a t e l y . 8 9 a n d y e t n o e f f e c t o n f e m a l e d e v e l o p m e n t i s o b v i o u s . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e t h r e s h o l d f o r m a l e d e v e l o p m e n t l i e s s o m e w h e r e b e t w e e n a n X / A r a t i o o f . 6 6 a n d . 8 9 . An e x a m i n a t i o n o f t h e l a t e - p u p a l t r i s o m i c m a l e s r e v e a l e d t h a t , w h i l e 2 L t r i s o m i e s a p p e a r e d n o r m a l , 3 L t r i s o m i e s p o s s e s s e d r a t h e r r u d i m e n t a r y t e s t e s w h i c h f a i l e d t o e l o n g a t e i n many i n d i v i d u a l s (2L a n d 3I_ t r i s o m i c t e s t e s b o t h p o s s e s s e d b u n d l e s o f a p p r o x i m a t e l y s i x t y - f o u r s p e r m w i t h n o r m a l h e a d m o r p h o l o g y ) . P o o r d e v e l o p m e n t o f m a l e s e x u a l c h a r a c t e r i s t i c s was n o t e x p e c t e d s i n c e t h e X / A r a t i o i n t h e s e i n d i v i d u a l s was a p p r o x i m a t e l y . 4 4 , w h i c h i s l o w e r t h a n t h e r a t i o r e q u i r e d f o r c o m p l e t e m a l e d e v e l o p m e n t . T h e sex—comb t e e t h p r e s e n t o n t h e f o r e l e g s o f m a l e s p r o v i d e a c o n v e n i e n t m a r k e r f o r e x a m i n i n g s e x u a l d e v e l o p m e n t . F o r e x a m p l e , w h i l e d i p l o i d m a l e s p o s s e s s a b o u t t e n s e x - c o m b t e e t h o n e a c h l e g ( s e e g e n o t y p e 1 i n T a b l e 3 7 ) , f e m a l e s h a v e n o n e ( g e n o t y p e 2 ) . A m u t a t i o n w h i c h s h i f t s d e v e l o p m e n t t o w a r d s t h e T a b l e 3 7 Number o f s e x - c o m b t e e t h i n n o r m a l a n d s e x - t r a n s f o r m e d t r i s o m i e s . f o r e l e g G e n o t y p e # o f t e e t h 7. g a p n p h e n o t y p e 1 X / Y O r e g o n R 1 0 . 2 + 0 . 2 0 . 0 2 2 m a l e 2 XX O r e g o n R 0 . 0 + 0 . 0 10 f e m a l e 3 X / Y j C < 2 L > l t / + / F ( 2 R ) b w 1 1 . 8 + . 0 1 1 0 . 0 3 0 m a l e 4 X / X l C < 2 L ) l t / + / F ( 2 R ) b w 0 . 0 + 0 . 0 10 f e m a l e 5 X / Y » C ( 3 L ) r u s t / + / F < 3 R > V D l e s 6 . 9 + 0 . 1 3 . 3 3 0 r e d u c e d m a l e 6 X / X » C ( 3 L ) r u s t / + / F ( 3 R ) V D l e Q 0 . 0 + 0 . 0 10 f e m a l e 7 X / Y ; M a s / + 1 0 . 7 + 0 . 2 0 . 0 22 m a l e 8 X / X s M a s / + 7 . 0 + 0 . 1 0 . 0 30 i n t e r s e x u a l 9 X / Y « C < 2 L > l t / + / F < 2 R ) b w ; M a s / + 1 1 . 8 + 0 . 2 6 . 7 23 m a l e 10 X / X ; C ( 2 L ) l t / + / F < 2 R ) b w ; M a s / + 9 . 0 + 0 . 2 1 6 . 7 2 7 i n t e r s e x u a l 11 X / Y ; C ( 3 L ) r u s t / M a s / F < 3 R ) V D l e e » 6 . 8 + 0 . 3 2 5 . 0 12 r e d u c e d mal 12 X / X ; C < 3 L ) r u s t / M a s / F ( 3 R ) V D l e ( 3 3 . 9 + 0 . 2 0 . 0 3 0 i n t e r s e x u a l 13 X / Y ; B s d s x p P / d s x p P 4 . 8 + 0 . 1 26 i n t e r s e x u a l 14 X / X ; B s d s x p P / d s x p P 5 . 1 + 0 . 1 2 2 i n t e r s e x u a l 15 X / Y l B s C ( 3 L ) r u s t / d s x p P / F ( 3 R ) V D l l , d s x p P 4 . 5 + 0 . 2 10 i n t e r s e x u a l (1) 16 X / X ; B s ( C ( 3 L ) r u s t / 5 . 4 + 0 . 3 8 i n t e r s e x u a l d s x p P / F ( 3 R ) V D l l , d s x p P (1) b a s i t a r s i s o n e / h a l f n o r m a l l e n g t h w i t h g n a r l e d a p p e a r a n c e 133 m a l e mode o f e x p r e s s i o n ( M a s c u l i n i z e r , Mas) c a u s e s a n i n t e r m e d i a t e number o f s e x - c o m b t e e t h t o d e v e l o p i n t h e f e m a l e ( g e n o t y p e 8 ) . H o w e v e r , t h e s t r u c t u r e o f t h e s e t e e t h a r e i n t e r m e d i a t e b e t w e e n t h o s e o b s e r v e d i n t h e m a l e a n d t h e c o r r e s p o n d i n g f e m a l e b r i s t l e s ( F i g u r e 19 E ) . F u r t h e r m o r e , a m u t a t i o n w h i c h s h i f t s b o t h m a l e a n d f e m a l e t o a n i n t e r s e x u a l s t a t e r e d u c e s t h e number o f t e e t h i n m a l e s a n d i n c r e a s e s t h e m i n f e m a l e s ( g e n o t y p e 13 a n d 1 4 ) . T h e m o r p h o l o g y o f t h e b r i s t l e s i n b o t h s e x e s a r e s i m i l a r , a n d a r e o f i n t e r m e d i a t e s e x u a l c h a r a c t e r i s t i c ( F i g u r e 1 9 ) . T h e p h e n o t y p e o f t h e s e x - c o m b s i n t r i s o m i e s f o r 2 L a n d f o r 3 L a r e d i f f e r e n t f r o m e a c h o t h e r a n d f r o m d i p l o i d s ( g e n o t y p e 3 ) . T a b l e 3 7 s h o w s t h a t t r i s o m i c - 2 L m a l e s p o s s e s s o n a v e r a g e s l i g h t l y m o r e t e e t h t h a n d i p l o i d m a l e s . W h i l e m o r p h o l o g i c a l l y t h e s e t e e t h a r e t h e same a s d i p l o i d s ( F i g u r e s 19A a n d B ) , t h e d e v e l o p m e n t o f t h e comb a p p e a r s t o b e d i s r u p t e d s l i g h t l y s i n c e a g a p i s o f t e n o b s e r v e d b e t w e e n t w o r o w s o f t e e t h ( F i g u r e 1 9 F ) . A p p a r e n t l y i t i s n o t s i m p l y t h e X / A r a t i o w h i c h d e t e r m i n e s t h e s e x u a l p h e n o t y p e s i n c e i n m a l e s t r i s o m i c f o r 3 L t h e n u m b e r o f s e x - c o m b t e e t h i s d r a m a t i c a l l y r e d u c e d ( g e n o t y p e 5 , T a b l e 3 7 ) . T h e r e d u c t i o n i n s e x - c o m b t o o t h number i s c o n s i s t e n t w i t h t h e p o o r t e s t i c u l a r d e v e l o p m e n t o b s e r v e d i n t h e s e i n d i v i d u a l s . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e d u p l i c a t i o n o f 3 L p a r t i a l l y s h i f t s t h e d e v e l o p m e n t o f t h e s e i n d i v i d u a l s t o w a r d s f e m a l e . T o t e s t t h i s p o s s i b i l i t y f u r t h e r we e x a m i n e d t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n a s e x t r a n s f o r m i n g l o c u s a n d t h e t r i s o m i c c o n d i t i o n . T h e t r i s o m i c - 2 L c o n d i t i o n i n c r e a s e d t h e number o f s e x - c o m b t e e t h i n m a l e s a n d f e m a l e s b e a r i n g t h e Mas m u t a t i o n ( c o m p a r e I8t F i g u r e 1 9 . S e x - c o m b m o r p h o l o g y o f d i p l o i d a n d t r i s o m i c p u p a e e i t h e r p o s s e s s i n g s e x t r a n s f o r m i n g m u t a t i o n s o r n o t . A . T r i s o m i c - 2 L m a l e B . O r e g o n R d i p l o i d m a l e C . T r i s o m i c - 3 L m a l e D . d i p l o i d d s x pP f e m a l e E . d i p l o i d M a s / L y s t f e m a l e F . T r i s o m i c - 2 L m a l e w i t h c o m b - g a p p h e n o t y p e . m g e n o t y p e s 7 a n d 8 v e r s u s 9 a n d 1 0 ) . A s i m i l a r r e s u l t was o b t a i n e d i n w i l d - t y p e t r i s o m i e s a n d t h e r e f o r e s u g g e s t s t h a t d u p l i c a t i o n o f 2 L p r o m o t e s m a l e d e v e l o p m e n t s l i g h t l y . T h e t r i s o m i c — 3 L c o n d i t i o n a g a i n a p p e a r e d t o p r o m o t e f e m a l e d e v e l o p m e n t ! r e d u c t i o n i n s e x - c o m b t o o t h number i s o b s e r v e d i n t r i s o m i c - 3 L m a l e s o r f e m a l e s b e a r i n g t h e Mas m u t a t i o n ( g e n o t y p e 7 a n d 8 v e r s u s 11 a n d 1 2 ) . A n o t h e r m u t a t i o n ( a l l e l i c t o M a s ) r d s x . p r e v e n t e d t h e d u p l i c a t o n o f 3 L t o a f f e c t s e x - c o m b t o o t h number i n m a l e s a n d f e m l e s ( g e n o t y p e s 13 a n d 14 v e r s u s I S a n d 1 6 ) . T h i s m u t a t i o n i s t h e n u l l c o n d i t i o n o f d s x l o c u s , w h e r e a s Mas i s n e o m o r p h i c , s u g g e s t i n g t h a t t h e m o d i f i c a t i n o f s e x - c o m b p h e n o t y p e r e q u i r e s t h e a c t i v i t y o f t h e d s x w i l d — t y p e p r o d u c t . I t i s e n t i r e l y p o s s i b l e t h a t t h e m o d i f i c a t i o n s t o s e x u a l d e v e l o p m e n t o b s e r v e d i n 3 L t r i s o m i e s a r i s e s f r o m d i s r u p t i o n s t o p r o c e s s e s w h i c h a r e n o t d i r e c t l y i n v o l v e d i n s e x d i f f e r e n t i a t i o n . T h e e x p r e s s i o n o f a n X - l i n k e d g e n e , 8x1 ( S e x - l e t h a l ) , h a s b e e n shown t o b e r e q u i r e d f o r f e m a l e d e v e l o p m e n t t o p r o c e e d ( S a n c h e z a n d N o t h i n g e r , 1 9 8 2 ) . T h e e x p r e s s i o n o f S x l i n f e m a l e z y g o t e s i s d e p e n d e n t o n t h e a c t i v i t y o f t h e d_a ( d a u g h t e r l e s s ) l o c u s d u r i n g o o g e n e s i s . A s s u c h , d a , a s e x - s p e c i f i c m a t e r n a l - e f f e c t l e t h a l , i s r e q u i r e d f o r f e m a l e d e v e l o p m e n t . E x p e r i m e n t I ( s e e T a b l e 38) d e m o n s t r a t e s t h a t t h e e f f e c t o f d a was u n c h a n g e d i n 2 L t r i s o m i e s f r o m t h a t o b s e r v e d i n d i p l o i d s ; f e m a l e s d i d n o t h a t c h f r o m t h e e g g w h e r e a s m a l e s h a d e x c e l l e n t v i a b i l i t y . H o w e v e r , e x p e r i m e n t I I s h o w s t h a t t h i s was n o t t h e c a s e f o r 3 L t r i s o m i e s . T h e t r i s o m i c - 3 L f e m a l e s d e r i v e d f r o m d a m o t h e r s a r e s t i l l T a b l e 38 E f f e c t o f d a a n d F l o n t h e e m b r y o n i c v i a b i l i t y o f a u t o s o m a l t r i s o m i e s . P a r e n t s F e m a l e M a l e I y / y ; d a / d a I I y / y ; d a / d a I I I y / y ; C < 2 L ) l t ; F l o c p t g v / Y F < 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w F i r s t - i n s t a r l a r v a e # o f y+ y e g g s f e m a l e 7. m a l e X 0 0 170 9 3 0 0 25 20 510 12 9 100 78 C ( 2 L ) l t ; 7 3 3 F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w C ( 3 L ) r u s t ; 491 F ( 3 R ) e ! S i / F < 3 R ) e E 3 IS8 c o m p l e t e l y l e t h a l a s e x p e c t e d , b u t i n a d d i t i o n , t h e v i a b i l i t y o f t h e i r b r o t h e r s was a l s o s e v e r e l y r e d u c e d . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t a d u p l i c a t i o n o f 3 L m a k e s m a l e s s u c c e p t i b l e t o t h e s e x - s p e c i f i c k i l l i n g a c t i o n o f d a . One o f t h e p r i m a r y r o l e s o f t h e da-*- g e n e p r o d u c t i s t o a l l o w e x p r e s s i o n o f t h e S x l l o c u s i n f e m a l e s . A s m e n t i o n e d p r e v i o u s l y , S x l * i s r e q u i r e d f o r t h e e x p r e s s i o n o f f e m a l e c h a r a c t e r i s t i c s . S x l g e n e p r o d u c t , h o w e v e r , i s a l s o r e q u i r e d i n f e m a l e s t o p r e v e n t h y p e r a c t i v a t i o n o f X - c h r o m o s o m e t r a n s c r i p t i o n ( C l i n e , 1 9 7 8 ) . N e c e s s a r i l y , t h e S x l g e n e must n o t b e a c t i v e i n m a l e s , s i n c e h y p e r a c t i v i t y o f t h e X—chromosome i s r e q u i r e d f o r d o s a g e c o m p e n s a t i o n a n d m a l e v i a b i l i t y ( c o n s t i t u t i v e m u t a n t s f o r t h e S x l l o c u s a r e t h e r e f o r e m a l e l e t h a l a n d cja i n s e n s i t i v e ) . What d e t e r m i n e s t h e mode o f S x l e x p r e s s i o n i n t h e t w o s e x e s i s n o t k n o w n . T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n X - c h r o m o s o m a l a n d a u t o s o m a l p l o i d y i n t h e c o n t r o l o f d o s a g e c o m p e n s a t i o n p r o b a b l y a r i s e s f r o m t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n s p e c i f i c g e n e s i n t h e s e t w o r e g i o n s . T h i s p o s s i b i l i t y was t e s t e d b y e x a m i n i n g t h e v i a b i l i t y o f f e m a l e s t h a t w e r e h e t e r o z y g o u s f o r t h e f e m a l e l e t h a l a l l e l e o f S x l <F1) a n d t r i s o m i c e i t h e r f o r 2 L o r f o r 3 L . T h e r a t i o n a l f o r t h i s e x p e r i m e n t i s a s f o l l o w s . F e m a l e s r e q u i r e t h e S x l * p r o d u c t t o p r e v e n t X - c h r o m o s o m e h y p e r a c t i o n a n d a b s e n c e o f t h i s p r o d u c t i s e s s e n t i a l i n m a l e s . T h u s , r e d u c e d q u a n t i t i e s o f Sx1 * p r o d u c t a r e r e q u i r e d t o a l l o w h y p e r a c t i v a t i o n t o o c c u r . T h i s i n t e r p r e t a t i o n i s s u p p o r t e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t some c o m p l e m e n t i n g m u t a t i o n s 181 a t t h e 5x1 l o c u s a l l o w p a r t i a l s u r v i v a l o f f e m a l e s . Somehow, t h e q u a n t i t y o f S x l * p r o d u c t m u s t b e m o n i t o r e d t o m a n i f e s t t h i s r e g u l a t i o n . I t s e e m s l o g i c a l t h a t s u c h a g e n e p r o d u c t s h o u l d b e e n c o d e d b y a n a u t o s o m a l l o c u s . T h e r a t i o o f S x l * p r o d u c t t o t h e a u t o s o m a l g e n e p r o d u c t c o u l d b e r e d u c e d t o o n e - t h i r d t h e r a t i o o b s e r v e d i n w i l d - t y p e f e m a l e s b y d u p l i c a t i n g t h i s l o c u s a n d a t t h e same t i m e t h e S x l * p r o d u c t i s r e d u c e d (by m a k i n g t h e f e m a l e s h e t e r o z y g o u s ) . T h i s l e v e l c o u l d b e b e l o w t h e t h r e s h o l d r e q u i r e d t o e l i c i t h y p e r a c t i v a t i o n . T h e f o l l o w i n g e x p e r i m e n t s s u g g e s t t h a t t h i s m i g h t b e t h e c a s e . T r i s o m i c - 3 L f e m a l e s h e t e r o z y g o u s f o r £ 1 . a r e p e r f e c t l y v i a b l e . H o w e v e r t r i s o m i c — 2 L f e m a l e s o f t h e same S x l c o n s t i t u t i o n h a v e d r a s t i c a l l y r e d u c e d v i a b i l i t y ; t h e y a r e a b o u t 10% a s v i a b l e a s w i l d t y p e t h r o u g h t o t h e f i r s t i n s t a r l a r v a l s t a g e o f d e v e l o p m e n t ( c r o s s I I I , T a b l e 3 8 ) . T h u s , i t w o u l d a p p e a r t h a t a l o c u s e x i s t s o n 2 L w h i c h i n t e r a c t s w i t h S x l a n d r e s u l t s i n r e d u c e d v i a b i l i t y . S i n c e d a i s o n 2 L , t h e i n v i a b i l i t y may h a v e a r i s e n a s a c o n s e q u e n c e o f e l e v a t e d l e v e l s o f d a * p r o d u c t . T o t e s t t h i s , 2 L t r i s o m i e s w e r e p r o d u c e d w h i c h p o s s e s s e d o n l y two c o p i e s o f t h e w i l d t y p e a l l e l e o f t h i s g e n e . E x p e r i m e n t I i n T a b l e 39 s h o w s t h a t t h e v i a b i l i t y o f t h e s e f e m a l e s (+ c l a s s ) i s n o t r e s c u e d r e l a t i v e t o t h e f e m a l e s p o s s e s s i n g t h r e e c o p i e s o f d a * ( G l a c l a s s ) . C o n t r o l c r o s s e s s u g g e s t t h a t m a l e s , 3 L t r i s o m i e s a n d d i p l o i d s a r e u n a f f e c t e d ( E x p e r i m e n t s I , I I a n d I I I i n T a b l e 3 9 ) . T h e s e d a t a i m p l y t h a t a l o c u s o n 2 L o t h e r t h a n d a i s f u n d a m e n t a l l y i n v o l v e d w i t h S x l i n d e t e r m i n i n g t h e s t a t e \<\0 T a b l e 39 S u r v i v a l t o l a t e p u p a e o f a u t o s o m a l t r i s o m i e s h e t e r o z y g o u s f o r F l a n d p o s s e s s i n g d i f f e r e n t d o s e s o f da-*-. I P a r e n t s T r i s o m i c — 2 L P r o g e n y f e m a l e / m a l e f e m a l e m a l e r a t i o F e m a l e M a l e y ; 6 1 a y B l a + y / y ; C ( 2 L > l t ; F l o c p t g v / Y F ( 2 R ) b w / d a / 6 1 a 4 5 78 1 0 . 0 0 8 F ( 2 R ) b w I I P a r e n t s f e m a l e m a l e T r i s o m i c — 3 L P r o g e n y m a l e f e m a l e B l a + 6 1 a + f e m a l e / m a l e r a t i o C ( 3 L ) r u s t ; F l o c p t g v / Y F < 3 R ) e < s / d a / 6 1 a 7 2 15 3 2 . 0 F ( 3 R ) e s I I I P a r e n t s D i p l o i d P r o g e n y f e m a l e / m a l e f e m a l e m a l e : r a t i o f e m a l e m a l e B l a + B l a + +/+ F l o c p t g v / Y ( C a n t o n S) d a / 6 1 a 115 105 101 73 . 7 9 141 o f d o s a g e c o m p e n s a t i o n o f t h e X—chromosome. W h e t h e r t h i s l o c u s r e g u l a t e s t h e e x p r e s s i o n o f S x l g e n e o r i n t e r a c t s w i t h i t s g e n e p r o d u c t i s n o t k n o w n . I l l G e n e r a l P h y s i o l o g i c a l C o n s i d e r a t i o n s E x p r e s s i o n o f d o m i n a n t m u t a t i o n s a n d g e n e s s u b j e c t e d t o p o s i t i o n - e f f e c t v a r i e g a t i o n . T h e p h e n o t y p e o f s t r a i n s w i t h l o w o r new a c t i v i t y m u t a t i o n s c a n b e u s e d t o i n f e r t h e e x p r e s s i o n l e v e l o f t h e g e n e ( M u l l e r , 1 9 5 0 ) . I n a d d i t i o n , s u c h m u t a t i o n s c a n a l s o b e u s e d t o m o n i t o r a l t e r a t i o n s t o g e n e r a l m e t a b o l i c p r o c e s s e s ( S i n c l a i r e t a l . , 1984 ) . A s s u c h , t h e e x p r e s s i o n o f s e v e r a l m a r k e r s , w h i c h h a d p h e n o t y p e s w h i c h c a n b e o b s e r v e d i n l a t e p u p a e , w e r e e x a m i n e d ( T a b l e 4 0 ) . T h e d o m i n a n t p h e n o t y p e was s u p p r e s s e d i n t r i s o m i e s f o r t h r e e m u t a t i o n s , a l l o f w h i c h a r i s e a s a c o n s e q u e n c e o f h a p l o - i n s u f f i c i e n c y . A l l m u t a t i o n s w h i c h h a v e new f u n c t i o n s ( n e o m o r p h s ) w e r e u n a f f e c t e d i n t r i s o m i e s , a l t h o u g h t h e e x p r e s s i o n o f o n e w i l d - t y p e a l l e l e (ru+) may h a v e b e e n r e d u c e d . T h u s , a g e n e r a l e f f e c t w h i c h a l t e r s t h e e x p r e s s i o n o f m o s t g e n e s i n a s i m i l a r way was n o t o b s e r v e d . G e n e s j u x t a p o s e d t o h e t e r o c h r o m a t i n a r e s u b j e c t t o v a r i e g a t e d e x p r e s s i o n . A p o t e n t m o d i f i e r o f p o s i t i o n - e f f e c t v a r i e g a t i o n i s h e t e r o c h r o m a t i n . R e m o v a l o f l a r g e b l o c k s o f h e t e r o c h r o m a t i n ( s u c h a s t h e Y c h r o m o s o m e ) h a s l o n g b e e n known t o e n h a n c e t h e v a r i e g a t e d p h e n o t y p e ( i e . r e d u c e t h e number o f T a b l e 40 E x p r e s s i o n o f d o m i n a n t m a r k e r s i n t r i s o m i e s . D o m i n a n t t r i s o m y M u t a t i o n L o c a t i o n t y p e l e x a m i n e d E x p r e s s i o n s 2 L - 1 . 3 h a p l o i n s u f f i c i e n t T s 2 L f u l l y s u p p r e s s e d (2) Sp 2 L - 2 2 . 0 n e o m o r p h T s 2 L u n a f f e c t e d T f t 2 L - 5 3 . 2 n e o m o r p h T s 2 L u n a f f e c t e d F l 2 L - 5 4 . 8 n e o m o r p h T s 2 L u n a f f e c t e d (3) L 2 R - 7 2 . 0 n e o m o r p h T s 2 L u n a f f e c t e d G l a 2 L o r 2R n e o m o r p h T s 2 L u n a f f e c t e d r u + 3 L - 0 . 0 w i l d t y p e T s 3 L r e d u c e d R 3 L - 1 . 4 h a p l o i n s u f f i c i e n t T s 3 L s u p p r e s s e d L y 3 L - 4 0 . 5 h a p l o i n s u f f i c i e n t T s 3 L f u l l y s u p p r e s s e d (3) D 3 L - 4 0 . 7 n e o m o r p h T s 3 L v a r i a b l e ( 3 , 4 ) 61 3 L - 4 1 . 4 n e o m o r p h T s 3 L u n a f f e c t e d S b 3 R - 5 8 . 2 n e o m o r p h T s 3 L u n a f f e c t e d (2) 1 . Some n e o m o r p h s may b e a n t i m o r p h i c ( L i n d s l e y e t a l . , 1972)1 2 . e x p r e s s i o n r e c e s s i v e i n t r i p l o i d s ; 3 . e x p r e s s i o n d o m i n a n t i n t r i p l o i d s s 4 . i n o n e c r o s s a l l u l a w e r e p r e s e n t i n D b e a r i n g p u p a e , i n a n o t h e r t h e y w e r e a b s e n t . l°,3 c e l l s i n w h i c h t h e g e n e i s a c t i v e ) . C o n v e r s e l y , t h e a d d i t i o n o f h e t e r o c h r o m a t i n t o t h e genome t e n d s t o d e c r e a s e t h e i n f l u e n c e o f t h e p o s i t i o n e f f e c t . A t h e o r y h a s b e e n p r o p o s e d w h i c h s u g g e s t s t h a t t h e a d d i t i o n o f c h r o m a t i n t o t h e genome c a u s e s a n i n c r e a s e i n g e n e e x p r e s s i o n b y b i n d i n g i n a c t i v a t i n g ( h e t e r o c h r o m a t i n p r o m o t i n g ) f a c t o r s ( Z u c k e r k a n d l , 1 9 7 4 ) . A u t o s o m a l t r i s o m i e s p o s s e s s , a s a m i n i m u m , o n e a d d i t i o n a l b l o c k o f h e t e r o c h r o m a t i n ( c o r r e s p o n d i n g t o t h e d u p l i c a t e d arm) i n a d d i t i o n t o a 10% i n c r e a s e i n t o t a l c h r o m a t i n . T o m o n i t o r what e f f e c t t h i s c o n d i t i o n may h a v e o n v a r i e g a t i n g g e n e s , t h e e x p r e s s i o n o f t h e B a r g e n e when i t i s i n s e r t e d i n t o t h e Y c h r o m o s o m e was e x a m i n e d . . I n d i p l o i d s t h i s r e a r r a n g e m e n t (B""~) r e d u c e s t h e s i z e o f t h e e y e r e l a t i v e t o d i p l o i d s ( c o m p a r e 1 a n d 3 , T a b l e 4 1 ) . H o w e v e r , t r i s o m i c m a l e s p o s s e s s i n g t h i s Y c h r o m o s o m e h a v e e y e s i z e s s i m i l a r t o c o n t r o l s w i t h a n o r m a l Y c h r o m o s o m e ( c o m p a r e 2 a n d 4 ) . T h i s p r e s u m a b l y a r i s e s b e c a u s e t h e B™ g e n e i s l a r g e l y i n a c t i v a t e d i n t h e d e v e l o p i n g e y e . T h u s , i t w o u l d a p p e a r t h a t d u p l i c a t i o n s f o r t h e l e f t a rm o f c h r o m o s o m e t w o s t r o n g l y e n h a n c e p o s i t o n - e f f e c t v a r i e g a t i o n . T h i s o b s e r v a t i o n was e x a m i n e d m o r e t h o r o u g h l y u s i n g a r e a r r a n g e m e n t ( I n ( l ) s c v s ; ) w h i c h v a r i e g a t e s b o t h f o r t h e a c h a e t e (ajc) a n d f o r t h e s c u t e ( s c ) g e n e s ( T a b l e 4 2 ) . T h e w i l d t y p e f u n c t i o n s o f t h e s e g e n e s a r e r e q u i r e d f o r n o r m a l b r i s t l e a n d h a i r d e v e l o p m e n t . T h e s c V 2 m u t a t i o n r e d u c e s t h e number o f h a i r s p r e s e n t o n t h e a b d o m i n a l t e r g i t e s ( a c ' ' e x p r e s s i o n ) a n d t h e number o f t h o r a c i c d o r s o c e n t r a l a n d s c u t e l l a r b r i s t l e s ( s c * e x p r e s s i o n ) ( c o m p a r e g e n o t y p e s 1, B a n d 9 T a b l e 41 E x p r e s s i o n o f B a r v a r i e g a t o r i n t r i s o m i c - 2 L m a l e s . G e n o t y p e E y e S i z e C u m ^ ) n t r i s o m y / d i p l o i d O r e g o n R 424 ± 5 . 4 2 0 ( d i p l o i d ) 0 . 8 4 C ( 2 L ) + / + / F ( 2 R ) b w 354 ± 1 3 . 9 2 0 ( t r i s o m i c - 2 L ) 3 y s c / 148 ± 1 4 . 7 5 0 ( d i p l o i d ) 2 . 2 3 4 C ( 2 L ) + / + / F ( 2 R ) b w » 330 ± 7 . 9 5 0 + / B S V Y ( t r i s o m i c - 2 L ) B e c a u s e B a i s a d o m i n a n t m u t a t i o n , i n c r e a s e d e y e s i z e a r i s e s f r o m a r e d u c e d l e v e l o f e x p r e s s i o n . 195 v e r s u s 2 a n d 6 , T a b l e 4 2 ) . R e m o v a l o f t h e Y c h r o m o s o m e d e c r e a s e s t h e e x p r e s s i o n o f t h e s e g e n e s ( g e n o t y p e 3) c o n s i s t e n t w i t h t h e c l a s s i c r e s p o n s e f o r v a r i e g a t i n g g e n e s . I n c o n t r a s t , t h e t r i s o m i c - 3 L c o n d i t i o n s u p r e s s e s v a r i e g a t i o n ( g e n o t y p e 4 ) . S t r o n g e n h a n c e m e n t o f v a r i e g a t o n was a g a i n o b s e r v e d i n w h o l e - a r m t r i s o m i e s f o r 2 L ( g e n o t y p e 5) a n d i n i n d i v i d u a l s w h i c h p o s s e s s p r o x i m a l d u p l i c a t i o n s f o r t h i s a r m ( D p ( 2 L ) 3 8 C - 4 0 f o r g e n o t y p e 9 a n d D p ( 2 L ) 3 6 F - 4 0 f o r g e n o t y p e 10) T h e p r o x i m a l r e g i o n o f 2 L c o n t a i n s t h e h i s t o n e - g e n e c l u s t e r , a d e f i c i e n c y f o r w h i c h s u p p r e s s e s v a r i e g a t i o n ( K h e s i n a n d L e i b o v i t c h , 1978 ! M o o r e e t a l . , 1979 ! M o o r e e t a l . , 1 9 8 3 ) . T h e l e v e l s o f e n h a n c e m e n t b y t h e p r o x i m a l d u p l i c a t i o n s a r e n o t a s s t r o n g a s t h e w h o l e a r m t r i s o m i e s . I t i s q u i t e l i k e l y t h a t s p e c i f i c g e n e s a r e l o c a t e d e l s e w h e r e o n 2 L w h i c h a r e c a p a b l e o f e n h a n c i n g v a r i e g a t i o n when d u p l i c a t e d . T h i s h a s b e e n r e c e n t l y v e r i f i e d (Don S i n c l a i r p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) a n d i s c o n s i s t e n t w i t h t h e f i n d i n g t h a t a l a r g e number o f s u p p r e s s o r s o f v a r i e g a t i o n w e r e i n d u c e d b y e t h y l - m e t h a n e s u l f o n a t e ( w h i c h may b e a m o r p h i c i n n a t u r e ) t h a t map t o t h e c e n t r a l r e g i o n o f t h i s a r m ( S i n c l a i r e t a l . , 1 9 8 3 b ) . I n t e r e s t i n g l y , o f o v e r f i f t y s u p p r e s s o r o f v a r i e g a t i o n m u t a t i o n s i s o l a t e d , o n l y a f e w map t o t h e l e f t a rm o f c h r o m o s o m e t h r e e ( S i n c l a i r , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . T h i s may a c c o u n t f o r t h e l a c k o f e n h a n c e m e n t o b s e r v e d i n 3 L t r i s o m i e s . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t m o d i f i c a t i o n s t o t h e e x p r e s s i o n o f v a r i e g a t e d g e n e s i n t r i s o m i e s d o e s n o t a r i s e a s a c o n s e q u e n c e o f a l t e r e d c h r o m a t i n c o n t e n t i n t h e n u c l e u s , b u t r a t h e r f r o m i n c r e a s e d q u a n t i t i e s o f s p e c i f i c g e n e p r o d u c t s s y n t h e s i z e d f r o m t h e s e d u p l i c a t e d a r m s . 19 b T a b l e 42 E x p r e s s i o n o f s c v Z i n a n e u p l o i d s f o r 2 L a n d 3 L . t e r g i t e t e r g i t e d o r s o — # g e n o t y p e n 3 2 c e n t r a l s s c u t e l l a r 1 O r e g o n R 10 1 1 9 . 7 1 0 4 . 5 4 + 0 4 + O + 3 . 0 + 2 . 4 2 V 2 / Y 25 4 2 . 8 4 1 . 5 1 . 2 3 . 8 0 + 1 . 8 6 + 1 . 8 4 + . 1 6 + . 3 8 3 V 2 / 0 25 1 2 . 4 1 3 . 5 0 . 8 4 2 . 4 4 + 1 . 3 6 + 1 . 2 2 + . 1 5 + . 1 9 4 V 2 / Y 26 6 9 . 5 5 6 . 1 2 . 9 2 2 . 9 6 C ( 3 L ) r u s t / + 2 . 0 4 + 2 . 0 2 + . 14 + . 1 7 + / F ( 3 R ) e s 5 V 2 / Y 25 1 . 4 8 2 . 6 8 1 . 3 6 1 . 6 0 C ( 2 L ) l t / + / + . 4 0 + . 8 2 + . 1 9 + . 8 2 F ( 2 R ) b w 6 C ( 2 L ) S H l l t ; 50 4 4 . 8 3 7 . 6 3 . 1 6 2 . 8 2 F ( 2 R ) b w / + 1 . 3 6 + 1 . 2 3 + . 1 4 + . 1 6 F ( 2 R ) b w / Y 7 C ( 2 L > l t S 25 1 9 . 2 1 5 . 3 3 . 0 8 1 . 4 8 F ( 2 R ) b w / + 1 . 5 ± 1 . 2 ± . 7 3 ± . 2 5 T ( Y , 2 ) B 1 1 0 R B S V 2 / Y 8 +/Y;C<2L>+5 10 1 1 3 . 4 9 6 . 4 4 . 0 4 . 0 F ( 2 R ) b w / + 4 . 5 ± 1 . 9 + 0 + 0 F ( 2 R ) b w 9 + / Y , C ( 2 L ) l t ; 10 1 1 5 . 8 1 0 1 . 4 3 . 8 4 . 0 F ( 2 R > b w / + 3 . 2 + 2 . 4 ± . 1 0 ± 0 T < Y , 2 ) B 1 1 0 R B S 10 V 2 / Y C < 2 L > l t S 18 1 0 . 8 6 . 6 1 3 . 1 7 1 . 5 F ( 2 R ) b w ? ± 1 . 2 ± . 8 8 ± . 1 7 ± . 3 5 T ( 2 ? 3 ) V Z 1 R / F < 3 R ) V D l e C 3 V a l u e s g i v e n a r e means + s t a n d a r d e r r o r s . m R e p r e s s i o n o-f e n z y m e a c t i v i t y i s a c e l l u l a r p h e n o m e n o n . C o m p e n s a t i o n o f l o c i i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s c o u l d r e s u l t a t t h e o r g a n i s m a l l e v e l f r o m a l t e r a t i o n s i n t i s s u e q u a n t i t y o r c h a n g e s i n t i s s u e s p e c i f i c i t y o f g e n e e x p r e s s i o n . S u c h e f f e c t s s h o u l d n o t b e o b s e r v e d i n s p e c i f i c t i s s u e s . S e v e r a l e n z y m e s , w h i c h a l l d i s p l a y c h a r a c t e r i s t i c r e s p o n s e s i n t r i s o m i c —2L t h i r d i n s t a r l a r v a e , w e r e m e a s u r e d i n e x t r a c t s made f r o m f a t b o d i e s d i s s e c t e d f r o m t r i s o m i e s a n d d i p l o i d s . T h i s t i s s u e i s o n e o f t h e m a j o r p r o d u c e r s o f t h e e n z y m e s l i s t e d i n T a b l e 4 3 . A s i m i l a r p a t t e r n i s o b s e r v e d i n m e a s u r e m e n t s made f r o m f a t b o d i e s d i s s e c t e d f r o m l a r v a e o f t h e same d e v e l o p m e n t a l s t a g e ( T a b l e 4 3 ) . O f t h e g e n e s l o c a t e d o n 2L, o n l y ADH s h o w e d d o s e - d e p e n d e n t l e v e l s o f a c t i v i t y . T h e a c t i v i t i e s o f PSK a n d a—GPDH w e r e c l e a r l y n o t d o s e - d e p e n d e n t , a n d i n f a c t w e r e l o w e r t h a n e x p e c t e d f o r a c o m p e n s a t e d l e v e l o f e x p r e s s i o n . O f t h e t e s t e d l o c i n o t l o c a t e d o n 2L, P a i was r e p r e s s e d , A l d o x was a c t i v a t e d a n d C a t r e m a i n e d u n a f f e c t e d . T h u s , t h e p a t t e r n o f e n z y m e a c t i v i t y o b s e r v e d i n f a t b o d y was v e r y s i m i l a r t o t h a t s e e n i n w h o l e l a r v a e ( F i g u r e 20). H o w e v e r , t h e o v e r a l l l e v e l o f a l l e n z y m e s ( b o t h o n a l i v e w e i g h t a n d mg p r o t e i n b a s i s ) i n t r i s o m i c —2L f a t b o d y p r e p a r a t i o n s w e r e l o w e r t h a n e x p e c t e d . T h i s may h a v e r e s u l t e d f r o m l e s s f a t b o d y b e i n g r e c o v e r e d f r o m t h e s e i n d i v i d u a l s , s i n c e t h i s t i s s u e i s much m o r e f r a g i l e i n t r i s o m i e s t h a n i n d i p l o i d s . T h i s c a n n o t a c c o u n t f o r t h e c o m p e n s a t e d l e v e l s o f a c t i v i t y f o u n d i n l a r v a l e x t r a c t s . I f i t h a d , we w o u l d n o t h a v e o b s e r v e d d o s e d e p e n d e n t v a l u e s f o r e n z y m e s s u c h a s A D H , w h i c h i s l a r g e l y p r o d u c e d i n t h e f a t b o d y . T a b l e 43 E n z y m e l e v e l s i n f a t b o d i e s f r o m d i p l o i d a n d t r i s o m i c — 2 L f e m a l e l a r v a e . E n z y m e L o c u s G e n o t y p e Pgk a G p d h A d h P Q i C a t A l d o x O r e g o n R 1 . B 4 1 . 4 9 . 3 2 4 3 . 9 3 3 . 19 1 .36 ( d i p l o i d ) ± . 2 3 ± - 1 7 ± . 0 3 1 ± . 2 3 ± - 2 7 ± . 0 9 (11) (11) (11) (11) (11) (11) y / y ; C ( 2 L ) l t / 1 . 8 4 1 . 5 6 . 2 1 2 5 . 5 7 3 . 9 6 2 . 4 9 F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w ± . 0 9 ± . 0 9 ± . 0 0 9 ± . 4 6 ± . 3 9 ± . 3 7 ( d i p l o i d ) (11) (11) (11) (11) (11) (11) y / + ; C ( 2 L ) l t / . 9 9 5 . 9 9 1 . 3 4 8 2 . 1 2 2 . 8 9 2 . 4 9 + / F ( 2 R ) b w ( t r i s o m i c — ± . 0 5 6 ± . 0 3 1 + . 0 1 9 ± . 1 3 ± . 2 0 ± . 2 0 2 L ) (11) (11) (11) (11) (11) (11) E s t i m a t e 2 . 7 6 2 . 3 1 . 3 7 4 4 . 7 5 3 . 5 8 1 . 9 3 + . 0 7 + . 0 6 + . 0 0 9 ± . 1 3 + . 12 ± . 0 9 R e p r e s s e d 1 . 8 4 1 . 5 4 . 2 4 9 3 . 16 2 . 3 8 1 . 2 8 + . 0 5 ± . 0 1 + . 0 0 6 ± . 0 9 ± . 0 8 ± . 0 6 E n z y m e a c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e p e r m i n p e r mg o f p r o t e i n . F i g u r e 20. C o m p a r i s o n o f e n z y m e q u a n t i t e s ( i n 2L t r i s o m i e s r e l a t i v e t o d i p l o i d s ) f r o m w h o l e l a r v a e a n d f r o m i s o l a t e d f a t b o d i e s . L e f t b a r f o r e a c h e n z y m e r e p r e s e n t s d a t a f r o m w h o l e l a r v a e , r i g h t b a r f o r f a t b o d i e s . E x p r e s s i o n l e v e l o f 1 . 0 r e p r e s e n t s t h e d i p l o i d amount p e r g e n e . Expression Level o 5 b Larvae I '—J : o 3 b Fat Body i I I QO~C 201 S i n c e b o t h d o s e - d e p e n d e n t a n d r e p r e s s e d l o c i ( b a s e d o n l a r v a l m e a s u r e m e n t s ) w e r e a f f e c t e d i n s i m i l a r w a y s i n e x t r a c t s f r o m t h e f a t - b o d y , t h e o v e r a l l r e d u c t i o n o f a c t i v i t y i n f a t - b o d y e x t r a c t s was p r o b a b l y e x p e r i m e n t a l i n o r i g i n . H o w e v e r , t h e i n c o n s i s t e n c y b e t w e e n t h e r e s u l t s o b t a i n e d f o r a s p e c i f i c t i s s u e a n d f o r t h e w h o l e o r g a n i s m i s a s e r i o u s d i s c r e p e n c y t h a t w a r r a n t s f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n . M o d i f i c a t i o n t o t h e e n z y m e m o l e c u l e s w h i c h w o u l d a c c o u n t f o r r e d u c e d c a t a l y t i c a c t i v i t y i n t h e e x t r a c t s h a v e n o t b e e n d e t e c t e d . T r i s o m i e s f o r 2 L w e r e p r o d u c e d w h i c h c o n t a i n e d a d e f i c i e n c y f o r t h e Gpdh l o c u s a n d t h u s p o s s e s s e d o n l y t h e same t w o a l l e l e s f o r t h i s g e n e a s t h e p a r e n t a l c o m p o u n d - f r e e s t r a i n . E n z y m e was e x t r a c t e d f r o m l a t e t h i r d - i n s t a r l a r v a e f r o m b o t h g e n o t y p e s a n d k i n e t i c a s p e c t s w e r e e x a m i n e d f o r t h e s u b s t r a t e s a - g l y c e r o p h o s p h a t e a n d N A D . T h e K m ' s f o r t h e s e t w o s u b s t r a t e s ( F i g u r e 21) w e r e n o t s u f f i c i e n t l y d i f f e r e n t t o s u g g e s t t h a t p o s t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s o f t h i s e n z y m e a r e o c c u r r i n g . I n a d d i t i o n , t h e e l e c t r o p h o r e t i c p r o p e r t i e s o f t h i s e n z y m e d o n o t a p p e a r t o b e a l t e r e d s u b s t a n t i a l l y ( C h a p t e r 1 ) . T h e s e r e s u l t s d i f f e r f r o m t h o s e o f R a w l s a n d L u c c h e s i ( 1 9 7 4 b ) . T h e s e a u t h o r s f o u n d t h a t a d u p l i c a t i o n f o r r e g i o n 21A t o 25CD ( t h e d i s t a l q u a r t e r o f 2L) s i g n i f i c a n t l y r e d u c e d t h e a p p a r e n t Km o f GPDH f o r a — g l y c e r o p h o s p h a t e . Two e x p l a n a t i o n s seem p o s s i b l e . T h e p r e s e n t s t u d y was n o t a s t h o r o u g h * a s t h a t p e r f o r m e d b y R a w l s a n d L u c c h e s i , a n d t h e r e s u l t s c o u l d b e f o r t u i t o u s . A l t e r n a t i v e l y , t h e m e a s u r e m e n t s made b y R a w l s a n d L u c c h e s i w e r e made o n e n z y m e s f r o m a d u l t f l i e s , w h e r e a s t h o s e i n t h i s s t u d y w e r e o b t a i n e d f r o m l a r v a l e n z y m e s . P e r h a p s d i f f e r e n t r e g u l a t o r y 2 0 2 F i g u r e 2 1 . K i n e t i c m m e a s u r e m e n t s o n GPDH -from d i p l o i d s a n d 2 L t r i s o m i e s . L i n e w e a v e r — B u r k e p l o t s - for A . NAD a n d B . a l p h a -g l y c e r o p h o s p h a t e . -XJOT3 204-a f f e c t s a r e o p e r a t i n g b e t w e e n t h e s e t w o d e v e l o p m e n t a l s t a g e s . M o d u l a t i o n s o f e n z y m e a c t i v i t i e s a r e n o t c o r r e l a t e d w i t h c h a n g e s i n o r g a n i s m o r c e l l s i z e , n o r w i t h c h a n g e s i n t o t a l p r o t e i n o r DNA l e v e l s . S e v e r a l o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t r e p r e s s i o n o f a c t i v i t y i s n o t t h e r e s u l t o f g e n e r a l p h y s i o l o g i c a l d i s r u p t i o n s . F i r s t , t h e r e s p o n s e i s f a i r l y d i s c r e t e . I f a l o c u s i s p r o d u c i n g s i g n i f i c a n t l y l e s s p r o d u c t i n a t r i s o m y , t h e n i n o v e r 85% o f t h e c a s e s t h e r e d u c t i o n i s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m o n e - t h i r d . I f m o d u l a t i o n s i n e n z y m e a c t i v i t y i n t r i s o m i e s w e r e b r o u g h t a b o u t b y d i s r u p t i o n s i n i n t e r n a l m e t a b o l i c p r o c e s s e s ( s u c h a s p r o t e o l y s i s ) , t h e n s u c h d i s c r e t e e f f e c t s a n d l o c u s s p e c i f i c i t y w o u l d n o t b e e x p e c t e d . T r i s o m i c t h i r d i n s t a r l a r v a e a r e some 10-15% s m a l l e r t h a n t h e i r d i p l o i d p a r e n t a l l a r v a e ( T a b l e 4 4 ) . I t h a s b e e n r e p o r t e d p r e v i o u s l y t h a t some e n z y m e s show a n o n — l i n e a r r e l a t i o n s h i p o f a c t i v i t y w i t h c h a n g e s i n t h e s i z e o f t h e a d u l t f l y ( C l a r k e e t a l . , 1 9 7 9 ) . T o t e s t w h e t h e r s u c h a n e f f e c t i s r e s p o n s i b l e f o r t h e r e d u c e d l e v e l s o b s e r v e d i n t r i s o m i e s , t h e a c t i v i t i e s o f t h r e e l o c i ( two w h i c h a r e m o d u l a t e d (Gpdh a n d P a i ) a n d o n e w h i c h i s n o t A d h ) w e r e e x a m i n e d i n e x t r a c t s f r o m s i n g l e l a r v a e t r i s o m i c f o r 2 L . T h e r e g r e s s i o n l i n e s o b t a i n e d f r o m t h e s e t e s t s a r e shown i n F i g u r e s 2 2 - 2 4 . T h e e n z y m e a c t i v i t i e s o f t h e two m o d u l a t e d l o c i (Gjsdh, P g i ) show a r e l a t i o n s h i p t h a t i s c l o s e l y p r o p o r t i o n a l t o s i z e . E s t i m a t e s o f t h i s d a t a s u g g e s t t h a t t h e 205 F i g u r e 2 2 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n P S I a c t i v i t y a n d l a r v a l s i z e i n f e m a l e (A) a n d m a l e (B) 2 L t r i s o m i e s . E n z y m e a c t i v i t y u n i t s a r e t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e a t 340nm p e r m i n p e r l O u l o f e x t r a c t . Z07 F i g u r e 2 3 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n BPDH a c t i v i t y a n d l a r v a l s i z e i n f e m a l e (A) a n d m a l e <B> 2 L t r i s o m i e s . E n z y m e a c t i v i t y u n i t s a r e t h e c h a n g e i n a b s o r b a n c e a t 340nm p e r m i n p e r 5 0 u l o f e x t r a c t . F i g u r e 2 4 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n ADH a c t i v i t y a n d l a r v a l s i z e i n - f e m a l e (A) a n d m a l e (B) 2 L t r i s o m i e s . E n z y m e a c t i v i t y u n i t s : c h a n g e i n a b s o r b a n c e a t 340nm p e r m i n p e r 5 0 u l o f e x t r a c t . x\o A .02-weight (mg) B .02-0 .9 1.8 weight (mg) d i f f e r e n c e s i n a c t i v i t y ( p e r u n i t w e i g h t ) r e s u l t i n g f r o m d i f f e r e n c e s i n l a r v a l s i z e b e t w e e n d i p l o i d s a n d t r i s o m i e s a r e l e s s t h a n 25i f o r b o t h e n z y m e s . T h e o t h e r e n z y m e ( A d h ) i s c l e a r l y n o n - l i n e a r a n d s h o w s a n a c t i v i t y c u r v e w h o s e s l o p e i n c r e a s e s w i t h i n c r e a s i n g s i z e o f t h e l a r v a e . I n t e r p o l a t i o n o f t h i s d a t a s u g g e s t s t h a t t h e s i z e d i f f e r e n c e o f t r i s o m i e s s h o u l d r e s u l t i n a n ADH a c t i v i t y a p p r o x i m a t e l y 9% l o w e r t h a n t h e e x p e c t e d n o n c o m p e n s a t e d l e v e l . ADH a c t i v i t y , h o w e v e r , was f o u n d a t d o s e d e p e n d e n t l e v e l s i n t h e s e i n d i v i d u a l s . C l e a r l y t h e s e r e l a t i o n s h i p s a r e n o t s t r i k i n g e n o u g h t o r e s u l t i n t h e o b s e r v e d c h a n g e s i n e n z y m e a c t i v i t y i n t r i s o m i e s . T a b l e 44 g i v e s v a l u e s f o r p r o t e i n a n d DNA c o n t e n t i n t r i s o m i e s a n d d i p l o i d s . A l t h o u g h l e v e l s o f DNA a n d p r o t e i n a r e r e d u c e d o n a l i v e w e i g h t b a s i s , DNA p e r mg s o l u b l e p r o t e i n was n o t d i f f e r e n t b e t w e e n t h e s t r a i n s . C h a n g e s i n c e l l number o r i n l e v e l s o f p o l y t e n i z a t i o n c o u l d a c c o u n t f o r r e d u c e d l e v e l s o f D N A . H o w e v e r t h e m a g n i t u d e o f t h e c h a n g e s u g g e s t s t h a t t h i s c o u l d n o t b e r e s p o n s i b l e f o r t h e o b s e r v e d c h a n g e s i n e n z y m e a c t i v i t y . O f c o u r s e , c h a n g e s i n p o l y t e n y o f i n d i v i d u a l g e n e s w o u l d n o t b e d e t e c t e d b y s u c h c r u d e m e a s u r e m e n t s a s t h e s e . I n c h a p t e r 5 a m o r e c r i t i c a l t e s t o f t h i s p o s s i b l i t y i s d e s c r i b e d . A l t e r a t i o n o f c e l l u l a r v o l u m e c o u l d c h a n g e t h e c o n c e n t r a t i o n o f r e g u l a t o r y m o l e c u l e s a n d r e s u l t i n a l t e r e d l e v e l s o f g e n e e x p r e s s i o n . A s a n e s t i m a t e o f c e l l s i z e we m e a s u r e d t h e s i z e o f e y e f a c e t s i n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f p h a r a t e a d u l t s ( F i g u r e 2 5 ) . T h e r a t i o o f f a c e t s i z e i n a d u l t t r i p l o i d f e m a l e s t o d i p l o i d f e m a l e s i s 1 . 4 7 ( T a b l e 4 5 ) , a n d i s c o n s i s t e n t w i t h t h e o b s e r v a t i o n t h a t c e l l s i z e i s p r o p o r t i o n a l 2\2. T a b l e 44 L i v e w e i g h t , p r o t e i n c o n t e n t a n d DNA c o n t e n t i n f e m a l e d i p l o i d a n d t r i s o m i c l a r v a e . G e n o t y p e u g p r o t e i n / u g D N A / s i z e mg l i v e mg l i v e (mg) w e i g h t w e i g h t u g D N A / mg p r o t e i n O r e g o n R ( d i p l o i d ) 1 . 7 8 ± . 0 5 (10) 9 7 . 6 ± 2 . 2 9 (7) . 3 4 7 . 0 1 2 (5) 3 . 5 6 C ( 2 L ) l t ; F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w / ( d i p l o i d ) 1 . 9 0 ± . 0 5 (10) 106 ± 1 . 8 (8) 3 1 9 020 (3) 3 . 0 1 C ( 2 L ) l t / + / F ( 2 R ) b w ( t r i s o m i c — 2 L ) 1 . 5 9 + . 0 9 (10) 9 9 . 1 ± 1 . 3 (8) ,349 ,013 (3) 3 . 5 2 C ( 3 L ) r u s t ; F ( 3 R ) V D l e B F ( 3 R ) v D i e s ( d i p l o i d ) 1 . 8 9 ± . 0 2 (10) 9 0 . 9 + 1 . 6 (8) ,306 0 1 2 (3) 3 . 3 7 C ( 3 L ) r u s t / 1 . 6 9 +/ F ( 3 R ) V D l e e J + . 0 7 ( t r i s o m i c - 3 L ) (10) 8 6 . 2 ± 1 - 9 (10) . 289 ,007 (3) 3 . 3 5 2i3 F i g u r e 2 5 . E l e c t r o n m i c r o g r a p h s o f e y e f a c e t s f r o m d i p l o i d s , t r i p l o i d s , a n d t r i s o m i e s . a . d i p l o i d a d u l t b . t r i p l o i d a d u l t c . d i p l o i d p u p a e d . t r i s o m i c - 2 L p u p a e e . t r i s o m i c - 3 L p u p a e . 2 \ 5 t o t h e l e v e l o-f p l o i d y i n many o r g a n i s m s . B o t h t r i s o m i e s e x a m i n e d h a d e s t i m a t e d c e l l s i z e s o n l y 10% l o w e r t h a n d i p l o i d s , a n d t h e r a t i o o f c e l l s i z e t o o r g a n i s m s i z e was r e m a r k a b l y s i m i l a r i n a l l t h e g e n o t y p e s ( T a b l e 4 5 ) . T h e e x t r a DNA c o n t e n t ( a p p r o x i m a t e l y 10'/. i n e a c h t r i s o m y ) d i d n o t r e s u l t i n a n i n c r e a s e i n c e l l s i z e . I t w o u l d a p p e a r t h a t r e l a t i v e t o d i p l o i d s , t r i s o m i c i n d i v i d u a l s a r e s m a l l e r , a n d h a v e l e s s s o l u b l e p r o t e i n , b e c a u s e t h e i r c e l l s a r e s m a l l e r . lit) T a b l e 45 E s t i m a t e s o f c e l l s i z e i n d i p l o i d a n d t r i p l o i d , a n d t r i s o m i c p u p a e . f e m a l e g e n o t y p e s t a g e s i z e ( a r b i t r a r y u n i t s ) (n) s i z e r e l a t i v e t o O r e g o n R c e l l s i z e l a r v a e s i z e O r e g o n R ( d i p l o i d ) a d u l t 167 + 5 10 1 . 0 0 C ( l ) R M y w~a m / B a s e 3N ( t r i p l o i d ) a d u l t 246 + 7 12 1 . 4 7 O r e g o n R ( d i p l o i d ) p u p a e 180 ± 3 10 l . O O l O l y / y ; C ( 2 L ) l t ; F ( 2 R ) b w / F ( 2 R ) b w ( d i p l o i d ) p u p a e 199 + 3 10 1 . 1 0 105 y / + ! C ( 2 L ) l t / + / F ( 2 R ) b w ( t r i s o m i c - 2 L ) p u p a e 167 + 6 10 . 9 3 1 106 C ( 3 L ) S H 2 + 1 F ( 3 R ) V D l e 3 / F ( 3 R ) V D l e r a ( d i p l o i d ) p u p a e 194 + 5 12 1 . 0 8 103 C ( 3 L ) S H 2 + / + / p u p a e 171 + 5 12 . 9 5 3 102 F ( 3 R ) V D l e < 3 ( t r i s o m i c - 3 L ) 211 D i s c u s s i o n T h i s c h a p t e r h a s e x p l o r e d t h e e f f e c t s o f a n e u p l o i d y f o r l a r g e r e g i o n s o f t h e genome o n v i a b i l i t y a n d p h e n o t y p e o f p r e - a d u l t D r o s o p h i l a . T h e c o n c l u s i o n s d e r i v e d f r o m t h i s s t u d y a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e b o d y o f l i t e r a t u r e t h a t p r e v i o u s l y h a s e x a m i n e d t h i s p r o b l e m i n a d u l t D r o s o p h i l a a s w e l l a s o t h e r s p e c i e s . S i n c e we a l s o h a v e e x a m i n e d t h e l e v e l s o f s e v e r a l g e n e p r o d u c t s i n some o f t h e s e a n e u p l o i d s ( s e e p r e v i o u s c h a p t e r s ) , i t i s p o s s i b l e t o s p e c u l a t e o n t h e g e n e t i c b a s i s o f t h e s e s y n d r o m e s . T h e l a r g e r t h e d e g r e e o f a n e u p l o i d y , t h e g r e a t e r w i l l b e t h e d i s r u p t i o n o b s e r v e d . A s i n c r e a s e d n u m b e r s o f l o c i a r e d u p l i c a t e d , m o r e g e n e p r o d u c t s a r e s y n t h e s i z e d a t e l e v a t e d ( a n d t h u s u n b a l a n c e d ) l e v e l s r e l a t i v e t o t h e m a j o r i t y o f l o c i i n t h e g e n o m e . A s t h i s c o n d i t i o n i s e x a g g e r a t e d , i n c r e a s e d d i s r u p t i o n s t o p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s e s e n s u e a n d v i a b i l i t y a n d p h e n o t y p e a r e a l t e r e d . W h i l e d i s r u p t i o n s t o p h y s i o l o g i c a l a n d d e v e l o p m e n t a l p a t h w a y s a r e u n d o u b t e d l y t h e c a u s e o f i n v i a b i l i t y , t h e r e s u l t s p r e s e n t e d i n t h e p r e v i o u s c h a p t e r s u g g e s t t h a t i t i s n o t i n c r e a s e d p r o d u c t l e v e l s a l o n e t h a t a r e r e s p o n s i b l e . T h e m o s t n o t a b l e e f f e c t , p a r t i c u l a r l y i n 3 L t r i s o m i e s , i s t h a t many p r o d u c t l e v e l s a r e p r e s e n t a t l e s s t h a n d i p l o i d l e v e l s . T h a t m o s t g e n e s a r e r e c e s s i v e s u g g e s t s t h a t h a l f t h e n o r m a l a m o u n t o f p r o d u c t i s s u f f i c i e n t t o m a i n t a i n t h e w i l d - t y p e p h e n o t y p e . H o w e v e r , a s s u g g e s t e d b y M u l l e r (1950) a n d e l a b o r a t e d f u r t h e r b y K a c s e r a n d B u r n s ( 1 9 8 0 ) , a p h y s i o l o g i c a l l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e e x i s t s b e t w e e n d i p l o i d a n d o n e - h a l f d i p l o i d l e v e l s o f 21? g e n e p r o d u c t . M u l l e r n o t e d t h a t c o n s i d e r a b l e v a r i a b i l i t y e x i s t s i n t h e e x p r e s s i o n o f p a r t i c u l a r g e n e s . We h a v e a l s o p r e s e n t e d d a t a c o n s i s t e n t w i t h t h i s v i e w . A t a d i s c r e t e d e v e l o p m e n t a l s t a g e , l a r g e v a r i a t i o n s i n t h e a m o u n t o f g e n e p r o d u c t c a n e x i s t f o r o r g a n i s m s o f s i m i l a r s i z e ( s e e F i g u r e 24 f o r e x a m p l e ) . I f t h e s e v a r i a t i o n s w e r e s u f f i c i e n t l y s e v e r e , t h e n some i n d i v i d u a l s w i t h h a l f t h e s y n t h e t i c p o t e n t i a l f o r a p a r t i c u l a r g e n e c o u l d h a v e p r o d u c t l e v e l s s o l o w t h a t n o r m a l p r o c e s s e s may b e c o m e l i m i t e d . T h u s , q u a n t i t i e s o f g e n e p r o d u c t a r e p r e s e n t t h a t , w h i l e u s u a l l y i n e x c e s s , c a n a c t a s a b u f f e r a g a i n s t n a t u r a l v a r i a t i o n i n g e n e e x p r e s s i o n . T h i s s u g g e s t s t h a t t h e d i p l o i d l e v e l o f g e n e p r o d u c t i s a d a p t i v e l y s i g n i f i c a n t a n d p r o b a b l y r e p r e s e n t s t h e o p t i m u m . R e d u c t i o n s f r o m t h i s l e v e l , e v e n a s l i t t l e a s o n e - t h i r d , may b e i m p o r t a n t . T h u s , t h e r e g u l a t o r y s y s t e m c o n t r o l l i n g c o m p e n s a t i o n o f a u t o s o m a l g e n e s may n o t b e r e s p o n s i b l e f o r t h e s u r v i v a l o f t h e s e l a r g e a n e u p l o i d s . I n f a c t , s u c h n e g a t i v e r e g u l a t i o n , when o p e r a t i n g o n g e n e s o u t s i d e t h e t r i s o m i c a r m , may b e p a r t i a l l y r e s p o n s i b l e f o r t h e i n v i a b i l i t y . T h e o v e r a l l s u r v i v a l a n d p h e n o t y p e o f a n a n e u p l o i d i n d i v i d u a l w o u l d d e p e n d o n what p r o p o r t i o n o f t h e l i n k e d g e n e s a r e c o m p e n s a t e d v e r s u s a c o m b i n a t i o n o f t h e number t h a t a r e l i n k e d a n d r e m a i n d o s e - d e p e n d e n t , p l u s t h e number t h a t a r e u n l i n k e d a n d h a v e r e d u c e d e x p r e s s i o n . T h i s c o n c l u s i o n h a s a l s o b e e n d e r i v e d f r o m s i m i l a r s t u d i e s o n a n e u p l o i d s o f c o r n ( B i r c h l e r a n d N e w t o n , 1 9 8 2 ) . T h e a b i l i t y t o t o l e r a t e a n e u p l o i d y v a r i e s w i t h d e v e l o p m e n t a l s t a g e . Many o f t h e g r o s s a n e u p l o i d s o b s e r v e d i n t h i s s t u d y ( s u c h a s d o u b l e t r i s o m i e s ) w e r e a b l e t o d e v e l o p t h r o u g h e m b r y o g e n e s i s a n d e m e r g e f r o m t h e e g g . b u t s o o n b e c a m e m o r i b u n d a n d d i e d ( s e e a l s o W u r g l e r , 1 9 7 2 ) . S i m i l a r l y , a u t o s o m a l m o n o s o m i e s w e r e a b l e t o d e v e l o p t o l a t e s t a g e s o f o r g a n o g e n e s i s a n d o c c a s i o n a l l y t o f i r s t i n s t a r l a r v a e . ( T h i s i s i n c o n t r a s t t o t h e c o n c l u s i o n d r a w n b y H e r s k o w i t z a n d S c h a l e t , 1 9 5 7 ) . T h u s , t h e p r o c e s s e s i n v o l v e d i n e a r l y d e v e l o p m e n t i n D r o s o p h i l a a p p e a r t o b e r e l a t i v e l y i n s e n s i t i v e t o a n e u p l o i d y . M a t e r n a l l y s y n t h e s i z e d p r o d u c t s d e p o s i t e d i n t h e e g g d u r i n g o o g e n e s i s may b e a b l e t o t e m p o r a r i l y b u f f e r d e v e l o p m e n t a g a i n s t a b n o r m a l g e n e e x p r e s s i o n . T h i s c o n c l u s i o n h a s a l s o b e e n d r a w n f r o m t h e o b s e r v a t i o n s o n t h e v i a b i l i t y o f D r o s o p h i l a p o s s e s s i n g l a r g e d e l e t i o n s ( G a r c i a - B e l l i d o e t a l . , 1 9 8 3 ) . L a r v a l d e v e l o p m e n t p r o c e e d s l a r g e l y b y a m i t o t i c g r o w t h e x c e p t f o r t h e i m a g i n a l d i s c s w h i c h a r e n o t r e q u i r e d d u r i n g t h i s p e r i o d ( S h e a r n e t a l . , 1971) a n d , a s s u c h , a n e u p l o i d l e t h a l i t y d u r i n g t h i s p e r i o d p r o b a b l y a r i s e s f r o m m e t a b o l i c d i s r u p t i o n s . H o w e v e r , i t i s d u r i n g p u p a l d e v e l o p m e n t t h a t t r i s o m i e s b e c o m e m o s t s e n s i t i v e t o e l e v a t e d t e m p e r a t u r e a n d when m a l e s a r e l e s s v i a b l e t h a n f e m a l e s . T h e s e c o n d i t i o n s p e r h a p s o v e r t a x a n a l r e a d y s t r a i n e d s y s t e m a n d r e d u c e v i a b i l i t y f u r t h e r . H o w e v e r , i t i s p o s s i b l e t h a t l e t h a l i t y i n p u p a l d e v e l o p m e n t i s a l s o c a u s e d b y s p e c i f i c d e v e l o p m e n t a l d e f e c t s . P u p a l d e v e l o p m e n t i n v o l v e s c e l l d i v i s i o n a n d c o m p l e x m o r p h o g e n e t i c m o v e m e n t s . T h e s t u d i e s t h a t e x a m i n e d t h e v i a b i l i t i e s o f d o u b l e t r i s o m i e s r e v e a l e d t h a t t h e c o n d i t i o n i n v o l v i n g t h e X p l u s a n a u t o s o m e w e r e n o m o r e v i a b l e t h a n d o u b l e a u t o s o m a l t r i s o m i e s . I n a d d i t i o n , a u t o s o m a l t r i s o m i e s w h i c h w e r e a l s o t r i s o m i c f o r t h e X - c h r o m o s o m e s u r v i v e d p o o r l y c o m p a r e d t o a u t o s o m a l t r i s o m i c 220 m a l e s a n d f e m a l e s . T h i s s u g g e s t e d t h a t , d e s p i t e t h e e x i s t e n c e o f X - c h r o m o s o m e d o s a g e c o m p e n s a t i o n b e t w e e n h a p l o , d i p l o a n d t r i p l o - X d i p l o i d s , t h e X - c h r o m o s o m a l t r i s o m i c c o n d i t i o n t o a l a r g e d e g r e e p a r a l l e l e d t h e a u t o s o m a l t r i s o m i c c o n d i t i o n s . T h i s p o s s i b i l i t y i s d e a l t w i t h f u r t h e r i n c h a p t e r s i x . H o w e v e r , w h e r e a s p r e - i m a g i n a l v i a b i l i t y i s c o m p a r a b l e , t h e v i a b i l i t y o f m e t a f e m a l e s f r o m p u p a t i o n t o a d u l t i s b e t t e r t h a n f o r a u t o s o m a l t r i s o m i e s . Two r e a s o n s may a c c o u n t f o r t h i s . F i r s t , some g e n e s r e m a i n d o s e d e p e n d e n t i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s ; o n t h e X c h r o m o s o m e s u c h g e n e s may b e c o m p e n s a t e d b y t h e m a l e - f e m a l e d o s a g e c o m p e n s a t i o n m e c h a n i s m . I t a p p e a r s t h a t d o s a g e c o m p e n s a t i o n o p e r a t e s t h r o u g h o u t d e v e l o p m e n t a n d i s p a r t i c u l a r l y i m p o r t a n t d u r i n g t h e p u p a l p e r i o d . T h i s i s s u g g e s t e d f r o m s t u d i e s w h i c h e x a m i n e t h e v i a b i l i t y o f m a l e c e l l s p r o d u c e d i n f e m a l e s b y s o m a t i c c r o s s i n g o v e r . T h e s e c e l l s h a v e p o o r v i a b i l i t y i n l a r v a e a n d a r e i n v i a b l e i n p u p a e ( S a n c h e z a n d N o h t i n g e r , 1 9 8 2 ) . T h u s , d o s a g e c o m p e n s a t i o n o f X - l i n k e d g e n e s d u r i n g p u p a l d e v e l o p m e n t may e n h a n c e t h e v i a b i l i t y o f m e t a f e m a l e s r e l a t i v e t o a u t o s o m a l t r i s o m i e s . S e c o n d , m e t a f e m a l e s may s u r v i v e b e t t e r t h a n a u t o s o m a l t r i s o m i e s b e c a u s e m o s t o f t h e l o c i t h a t a r e r e p r e s s e d i n t h e t r i s o m i c - X c o n d i t i o n a r e o n t h e X c h r o m o s o m e . I n c o n t r a s t , a u t o s o m a l t r i s o m i e s a f f e c t l o c i t h r o u g h o u t t h e genome ( F i g u r e 1 2 ) . T h u s , t h e n e t i m b a l a n c e o f g e n e p r o d u c t s i n X - c h r o m o s o m a l t r i s o m i e s i s much l e s s t h a n t h a t f o u n d i n t h e i r a u t o s o m a l c o u n t e r p a r t s . T h i s s t u d y h a s r e v e a l e d t h a t m o n o s o m i e s f o r a l l f o u r m a j o r a u t o s o m a l a r m s d i e a s e m b r y o s o r f i r s t i n s t a r l a r v a e . T h u s , t h e s e i n d i v i d u a l s a r e i n c a p a b l e o f f u l l y c o m p e n s a t i n g t h e 211 e x p r e s s i o n o f a l l o f t h e i r h a p l o i d g e n e s b a c k t o t h e d i p l o i d l e v e l . T h i s i s c l e a r l y n o t t h e c a s e f o r t h e X c h r o m o s o m e . H o w e v e r , a s e r i e s o f m u t a t i o n s a r e known ( m a l e - s p e c i f i c l e t h a l s ) w h i c h p r e v e n t t h e X - c h r o m o s o m e f r o m b e i n g h y p e r a c t i v a t e d i n m a l e s . T h i s c o n d i t i o n r e n d e r s t h e s e i n d i v i d u a l s f u n c t i o n a l l y a s w e l l a s k a r y o t y p i c a l l y m o n o s o m i c f o r t h i s c h r o m o s o m e . T h e v i a b i l i t y o f t h e s e i n d i v i d u a l s i s c o n s i d e r a b l y b e t t e r (up t o t h e p u p a l s t a g e ) t h a n f o r a u t o s o m a l m o n o s o m i e s ( s e e B e l o t e , 1 9 8 3 ) . P e r h a p s t h e m a l e s p e c i f i c l e t h a l m u t a t i o n s a r e n o t a b o l i s h i n g a l l c o m p e n s a t o r y a c t i v i t y i n m a l e s . I n d e e d , t h e l e v e l s o f s e v e r a l X - l i n k e d e n z y m e s i n t h e s e m u t a n t m a l e s a r e a b o u t s i x t y p e r c e n t o f t h e d i p l o i d f e m a l e l e v e l ( B e l o t e a n d L u c c h e s i , 1 9 8 0 ) . I t i s a l s o p o s s i b l e t h a t monosomy f o r t h e X c h r o m o s o m e d o e s n o t a f f e c t t h e e x p r e s s i o n o f u n l i n k e d g e n e s a s much a s a u t o s o m a l m o n o s o m i e s . T h i s p o s s i b i l i t y c a n b e i n f e r r e d o n l y f r o m t h e l e s s e r a b i l i t y o f t h e X c h r o m o s o m e , when i t i s t r i s o m i c , t o a f f e c t u n l i n k e d l o c i ( r e l a t i v e t o t h e a u t o s o m a l t r i s o m i e s ) . T h e o b s e r v a t i o n t h a t t r i s o m i c - 3 L m a l e s may p o s s e s s some f e m a l e c h a r a c t e r i s t i c s w h e r e a s t r i s o m i c - 2 L m a l e s d o n o t , s u g g e s t s t h a t f a c t o r s d e t e r m i n i n g s e x u a l i t y a r e n o t e v e n l y d i s t r i b u t e d t h r o u g h o u t t h e g e n o m e . T h e b a l a n c e t h e o r y o f s e x d e t e r m i n a t i o n s u g g e s t s t h a t m a l e d e t e r m i n i n g a n d f e m a l e d e t e r m i n i n g g e n e s e x i s t a n d t h a t t h e r e l a t i v e d i s t r i b u t i o n o f t h e s e f a c t o r s a f f e c t s t h e s e x u a l p h e n o t y p e o f t h e z y g o t e . I n s p e c i e s w i t h sex c h r o m o s o m e s , t h e e x p r e s s i o n o f o n e s e x u a l p h e n o t y p e may b e d e t e r m i n e d b y o n e o f t h e s e x c h r o m o s o m e s ( e g , m a l e n e s s b y t h e m a m m a l i a n Y c h r o m o s o m e ) a n d d e t e r m i n a n t s f o r t h e o t h e r sex p r e s u m a b l y a r e l o c a t e d o n t h e a u t o s o m e s . I n 1VL D r o s o p h i l a , m a l e d e t e r m i n a n t s a r e h y p o t h e s i z e d t o e x i s t o n t h e a u t o s o m e s b e c a u s e g e n o t y p e s p o s s e s s i n g t w o X c h r o m o s o m e s a r e s h i f t e d t o w a r d s m a l e n e s s when a n a d d i t i o n a l a u t o s o m e s e t i s p r e s e n t i n t r i p l o i d s . I n D r o s o p h i l a , t r i p l o i d i n t e r s e x e s p o s s e s s i n g a d d i t i o n a l p i e c e s o f X c h r o m o s o m e s h a v e b e e n e x a m i n e d ( D o b z h a n s k y a n d S c h u l t z , 19311 P a t t e r s o n e t a l . , 1 9 3 7 s P i p k i n , 1940) a n d a s a g e n e r a l t r e n d , m o s t X - c h r o m o s o m e f r a g m e n t s w e r e c a p a b l e o f s h i f t i n g t h e s e x u a l p h e n o t y p e t o w a r d s f e m a l e n e s s . W h e t h e r t h i s a r i s e s f r o m a n i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f f e m a l e - d e t e r m i n i n g g e n e s o r f r o m e n h a n c e d v i a b i l i t y o f c e l l s t h a t a r e s e t a t t h e f e m a l e r a t h e r t h a n t h e m a l e m o d e , i s n o t known ( B a k e r a n d B e l o t e , 1 9 8 3 ) . I n d i p l o i d s , l a r g e d u p l i c a t i o n s o f a u t o s o m a l m a t e r i a l d i d n o t i n f l u e n c e t h e s e x o f a d u l t f l i e s ( P a t t e r s o n e t a l . , 1 9 3 7 ) . I n i n t e r s e x e s , e x t e n s i v e s t u d i e s b y P i p k i n (1947$ 1 9 5 9 ; 1960) r e v e a l e d t h a t d u p l i c a t i o n o f a u t o s o m a l r e g i o n s d i d n o t s h i f t d e v e l o p m e n t t o w a r d s m a l e p h e n o t y p e s . B o t h s e t s o f e x p e r i m e n t s a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e h y p o t h e s i s t h a t o n l y f e m a l e d e t e r m i n a n t s e x i s t , a n d t h a t t h e s e a r e l o c a t e d e x c l u s i v e l y o n t h e X c h r o m o s o m e . H o w e v e r , t h e p h e n o t y p e o f i n d i v i d u a l s p o s s e s s i n g a d u p l i c a t i o n f o r t h e l e f t a r m o f c h r o m o s o m e t h r e e s u g g e s t s t h a t f e m a l e d e t e r m i n a n t s may a l s o e x i s t o n t h e a u t o s o m e s . I t i s p o s s i b l e t h a t i n D r o s o p h i l a s e x i s n o t d e t e r m i n e d b y a b a l a n c e b e t w e e n m a l e a n d f e m a l e d e t e r m i n a n t s b u t , i n s t e a d , i t i s c o n t r o l l e d b y t h e r e l a t i v e a m o u n t s o f f e m a l e d e t e r m i n a n t s a l o n e . T h u s m a l e s , w i t h o n l y o n e X—chromosome, w o u l d h a v e l e s s f e m a l e d e t e r m i n a n t s t h a n f e m a l e s w i t h t w o X c h r o m o s o m e s . T r i p l o i d i n t e r s e x e s may b e s h i f t e d t o w a r d s m a l e d e v e l o p m e n t , n o t b e c a u s e t h e y h a v e a n a d d i t i o n a l 223 s e t o f a u t o s o m a l d e t e r m i n a n t s , b u t b e c a u s e t h e c o n c e n t r a t i o n o f f e m a l e d e t e r m i n a n t s h a s b e e n r e d u c e d o n e - t h i r d b y t h e i n c r e a s e i n c e l l s i z e . I t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t 3 L h a s b e c o m e a n X c h r o m o s o m e i n o t h e r D r o s o p h i l a s p e c i e s . I f a u t o s o m a l r e g i o n s p o s s e s s e d m a l e d e t e r m i n a n t s , t h e n when t h i s c h r o m o s o m e b e c a m e a s e x c h r o m o s o m e (by t r a n s l o c a t i o n t o t h e e x i s t i n g X c h r o m o s o m e ) t h e i n d i v i d u a l s r e c e i v i n g a s i n g l e d o s e ( m a l e s ) w o u l d h a v e t h e i r s e x d e t e r m i n i n g g e n e b a l a n c e s h i f t e d t o w a r d s f e m a l e n e s s . A l t e r n a t i v e l y , i f t h i s c h r o m o s o m e a r m p o s s e s s e d f e m a l e d e t e r m i n i n g g e n e s , t h e n m a i n t e n a n c e o f c o r r e c t s e x u a l i t y w i t h t h e o r i g i n a l X a n d Y c h r o m o s o m e s w o u l d b e f a c i l i t a t e d b y a r e d u c e d a b i l i t y o f t h i s e l e m e n t t o p r o m o t e f e m a l e d e v e l o p m e n t when h e m i z y g o u s . T h a t t r i s o m i c - 3 L m a l e s a r e s e n s i t i z e d t o t h e l e t h a l a c t i o n o f t h e m u t a t i o n d a u g h t e r l e s s a g a i n s u g g e s t s t h a t t h e y a r e m o r e f e m a l e - l i k e t h a n d i p l o i d m a l e s . T h e l e t h a l e f f e c t o f d_a o n f e m a l e s p r e s u m a b l y r e s u l t s f r o m l a c k o f e x p r e s s i o n o f t h e S x l l o c u s ( C I i n e , 1 9 8 3 ; S k r i p s k y a n d L u c c h e s i , 1 9 8 2 ) . H o w e v e r , s i n c e t h e S x l l o c u s n o r m a l l y i s n o t e x p r e s s e d i n h a p l o - X i n d i v i d u a l s , t h e i n a b i l i t y o f t h i s l o c u s t o b e a c t i v a t e d i n z y g o t e s f r o m da. m o t h e r s w o u l d b e i n c o n s e q u e n t i a l . S h i f t i n g t o f e m a l e n e s s w o u l d o n l y s t r e n g t h e n t h e a b o v e c o n t r o l s , a n d d i p l o i d a n d t r i s o m i c - 3 L m a l e s s h o u l d h a v e s i m i l a r v i a b i l i t i e s . M o s a i c a n a l y s i s h a s shown t h a t c e l l s i n w h i c h t h e Sx1 g e n e i s r e m o v e d b y s o m a t i c c r o s s i n g o v e r d e v e l o p p h e n o t y p i c a l l y a s m a l e . F r o m t h e s e e x p e r i m e n t s , i t h a s b e e n i n t e r p r e t e d t h a t t h e S x l * p r o d u c t i s r e q u i r e d t o s u s t a i n f e m a l e d e v e l o p m e n t , a s w e l l a s r e g u l a t i n g d o s a g e 22H-c o m p e n s a t i o n . S i n c e X - l i n k e d g e n e s a r e d o s a g e c o m p e n s a t e d i n t r i s o m i c — 3 L m a l e s i t - F o l l o w s t h a t t h e S x l l o c u s i s n o t a c t i v e . T h u s , t h e a b s e n c e o f S x l * p r o d u c t c o u l d r e d u c e v i a b i l i t y i f t h e p h y s i o l o g y o f t h e s e i n d i v i d u a l s i s p a r t l y f e m a l e . C l i n e (1983S 1984) h a s s u g g e s t e d t h a t t h e i n t e r a c t i o n s o b e t w e e n c£a a n d S x l d o n o t a r i s e f r o m d i s c r e t e a l t e r a t i o n s i n t h e e x p r e s s i o n s t a t e s o f t h e s e g e n e s . I n d e e d , s p e c i f i c e f f e c t s a p p e a r t o d e p e n d o n t h r e s h o l d s o f g e n e p r o d u c t l e v e l s . D u r i n g t h e c o u r s e o f t h e s e s t u d i e s we n o t e d t h a t t r i s o m i c — 2 L f e m a l e s h e t e r o z y g o u s f o r F_l_ (a f e m a l e - s p e c i f i c l e t h a l a l l e l e o f S x l > d i e e a r l y d u r i n g d e v e l o p m e n t . T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t t h e l e v e l o f S x l p r o d u c t i s m e a s u r e d r e l a t i v e t o a n o t h e r g e n e p r o d u c t w h i c h a c t s a s a r e f e r e n c e . I f , a s C l i n e p r o p o s e s , S x l i s n o t t r a n s c r i b e d i n m a l e s t h e r a t i o o f Sx1 * p r o d u c t t o t h e r e f e r e n c e p r o d u c t w o u l d b e z e r o . I n a f e m a l e t h i s r a t i o w o u l d b e a c h a r a c t e r i s t i c o f t h e t r a n s c r i p t i o n r a t e o f t h e t w o g e n e s . T h e p r e s e n t d a t a w o u l d s u g g e s t t h a t t h i s r a t i o n e e d s o n l y t o f a l l t o o n e - t h i r d o f t h a t f o u n d i n t h e d i p l o i d f e m a l e t o e l i c i t t h e m a l e mode o f d o s a g e c o m p e n s a t i o n a n d / o r s e x u a l d e v e l o p m e n t . I t i s l i k e l y t h a t a c t i v a t i o n o f d o s a g e c o m p e n s a t i o n i s r e s p o n s i b l e f o r t h e o b s e r v e d l e t h a l i t y , s i n c e m u t a t i o n s a r e known w h i c h t r a n s f o r m f e m a l e s i n t o h e a l t h y ( a l b e i t s t e r i l e ) m a l e s ( L i n d s l e y a n d G r e l l , 196BS C l i n e , 1 9 8 4 ) . Two s i m p l e p o s s i b i l i t i e s f o r t h i s r e g u l a t i o n seem l i k e l y . F i r s t , a l o c u s o n 2 L c o u l d c o d e f o r a g e n e p r o d u c t t h a t i s u s e d t o d e t e r m i n e t h e number o f a u t o s o m e s e t s p r e s e n t . 1 . 5 t i m e s 225 m o r e p r o d u c t w o u l d b e p r o d u c e d i n 2 L t r i s o m i e s i f t h i s g e n e i s n o t c o m p e n s a t e d . A l t e r n a t i v e l y , a r e g u l a t o r y l o c u s o n t h i s a r m may r e p r e s s t h e e x p r e s s i o n o f t h e S x l g e n e i n a way a n a l a g o u s t o r e p r e s s i o n o f t h e e n z y m e l o c i shown i n F i g u r e 12 . By e i t h e r m e c h a n i s m , S x l * p r o d u c t r e l a t i v e t o t h e a u t o s o m a l s t a n d a r d i n F 1 / + h e t e r o z y g o t e s w o u l d b e r e d u c e d t o o n e - t h i r d . H o w e v e r , i n t h e s e c o n d p o s s i b i l i t y , t h e a u t o s o m a l r e f e r e n c e g e n e s n e e d n o t r e s i d e o n 2 L . D i p l o i d f e m a l e s t h a t a r e h e t e r o z y g o u s f o r F_J_ a r e v i a b l e , s u g g e s t i n g t h a t t h e t h r e s h o l d r a t i o f o r a c t i v a t i o n o f d o s a g e c o m p e n s a t i o n l i e s b e t w e e n 0 . 5 a n d 0 . 3 3 . H o w e v e r , i t i s a l s o p o s s i b l e t h a t d o s a g e c o m p e n s a t i o n may b e a c t i v a t e d i n some c e l l s o f F 1 / + h e t e r o z y g o t e s , b u t t h e s e c e l l s n o r m a l l y d i e , a n d a r e n o t o b s e r v e d . H o w e v e r , i n t h e a b s e n c e o f t h e w i l d — t y p e p r o d u c t s o f m a l e s p e c i f i c l e t h a l l o c i ( r e q u i r e d f o r h y p e r a c t i v a t i o n ) t h e s e c e l l s may s u r v i v e a n d d e v e l o p a s m a l e t i s s u e ( S k r i p s k y a n d L u c c h e s i , 1 9 8 2 ) . I t i s n o t e w o r t h y t h a t m e t a m a l e s ( 1 X : 3 A ) , w h i c h h a v e o n e S x l g e n e p e r t h r e e a u t o s o m e s e t s , a r e a l s o c a p a b l e o f h y p e r a c t i v a t i n g t h e i r X - c h r o m o s o m e s ( L u c c h e s i , e t a l t 1977 , C l i n e , 1 9 8 3 ) . S i n c e p o l y p l o i d c e l l s a r e l a r g e r t h a n d i p l o i d s , p o s s i b l y t h e s y n t h e t i c a c t i v i t y o f m o s t g e n e s h a s n o t b e e n a l t e r e d . T h i s h a s b e e n d e m o n s t r a t e d i n y e a s t ( C i f f e r i e t a l . , 1 9 6 9 ) , i n p l a n t s ( D e M a g g i o a n d L a m b r u k o s , 1974 ; R o o s e a n d G o t t l i e b , 1980 ; T i m k o e t a l . , 1 9 8 0 ) , i n D r o s o p h i l a ( L u c c h e s i a n d R a w l s , 1973) a n d i n mammals ( P r i e s t a n d P r i e s t , 1 9 6 9 ; W e s t e r v e l d e t a l . , 1972 ; C h a n g e t a l . , 1 9 8 3 ) . H o w e v e r , we d i d n o t o b s e r v e a n i n c r e a s e d c e l l s i z e i n a u t o s o m a l t r i s o m i e s s u g g e s t i n g t h a t t h i s r e l a t i o n s h i p may n o t h o l d f o r f r a c t i o n s o f a g e n o m e . E x c e p t i o n s d o e x i s t w h e r e t h e e x p r e s s i o n o f v a r i o u s g e n e s a r e e i t h e r i n c r e a s e d ( T i m k o e t a l . , 1980) o r d e c r e a s e d ( A u d i t e t a l . , 1976 ; T i m k o e t a l . , 1980) w i t h i n c r e a s i n g p l o i d y . I t i s p o s s i b l e t h a t e f f e c t s a r i s i n g f r o m i n c r e a s e d q u a n t i t i e s o f r e g u l a t o r y m o l e c u l e s c o u l d a c c o u n t f o r e x a m p l e s o f m o d i f i e d g e n e e x p r e s s i o n i n a p o l y p l o i d s e r i e s . T h e s e w o u l d h a v e t o a c t i n a c o n c e n t r a t i o n - i n d e p e n d e n t f a s h i o n s i n c e t h e n u c l e a r v o l u m e u s u a l l y v a r i e s d i r e c t l y w i t h DNA c o n t e n t . I n t r i s o m i e s , a l t e r a t i o n s t o c e l l s i z e , o r g a n i s m s i z e , p r o t e i n a n d DNA c o n t e n t c a n n o t b y t h e m s e l v e s a c c o u n t f o r t h e o b s e r v e d c h a n g e s i n g e n e p r o d u c t l e v e l s . G e n e r a l m o d i f i e r s o f g e n e e x p r e s s i o n a l s o d o n o t a p p e a r t o b e r e s p o n s i b l e . T h e n e x t c h a p t e r i n v e s t i g a t e s t h e l e v e l a t w h i c h a u t o s o m a l t r i s o m i e s e x e r t t h e i r e f f e c t o n g e n e e x p r e s s i o n . 221 CHAPTER F I V E COMPENSATION IN 2 L T R I S O M I E S IS T R A N S C R I P T I O N A L L Y R E G U L A T E D 21$ I n t r o d u c t i o n D o s a g e c o m p e n s a t i o n f o r X - l i n k e d g e n e s i n D r o s o p h i l a i s o n e o f t h e b e t t e r d e s c r i b e d e x a m p l e s o f m o d u l a t i o n o f g e n e e x p r e s s i o n i n e u k a r y o t e s . D i p l o i d i n d i v i d u a l s p o s s e s s i n g f r o m o n e t o t h r e e X - c h r o m o s o m e s t r a n s c r i b e t h i s c h r o m o s o m e a t d i f f e r e n t r a t e s r e l a t i v e t o t h e a u t o s o m e s ( r e v i e w e d b y B a k e r a n d B e l o t e , 1 9 8 3 ) . T h e t o t a l amount o f X - c h r o m o s o m e t r a n s c r i p t i o n i n e a c h s t r a i n r e m a i n s c o n s t a n t s h e n c e , e q u i v a l e n t l e v e l s o f g e n e p r o d u c t s a c c u m u l a t e i n t h e d i f f e r e n t g e n o t y p e s . O f p a r t i c u l a r i n t e r e s t t o t h e p r e s e n t s t u d y i s t h e o b s e r v a t i o n t h a t i n d i v i d u a l s t r i s o m i c f o r t h e X - c h r o m o s o m e d i s p l a y d i p l o i d l e v e l s o f g e n e p r o d u c t s ( L u c c h e s i e t a l . , 1 9 7 4 ; S t e w a r t a n d M e r r i a m , 1 9 7 5 ) . W h i l e s e x - l i n k e d d o s a g e c o m p e n s a t i o n o p e r a t e s a t t h e l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n ( M u k h e r j e e a n d B e e r m a n , 1 9 6 5 ) , t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m s i n v o l v e d r e m a i n o b s c u r e . A f u n d a m e n t a l , y e t u n r e s o l v e d , q u e s t i o n i s w h e t h e r t r a n s c r i p t i o n r a t e s f o r X - l i n k e d t e m p l a t e s a r e d e t e r m i n e d a t t h e m a l e o r a t t h e f e m a l e r a t e , o r w h e t h e r a c o n t i n u o u s a d j u s t m e n t o f t r a n s c r i p t i o n r a t e i s p o s s i b l e i n r e s p o n s e t o a v a r i e d a m o u n t o f X — c h r o m a t i n p r e s e n t i n t h e n u c l e u s . I n m e t a f e m a l e s ( 3 X 2 A ) , t h e f o r m e r p o s s i b i l i t y w o u l d p r e d i c t n o n c o m p e n s a t e d l e v e l s o f t r a n s c r i p t i o n , w h