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The effect of litter size on the developmental pattern of cholesterol synthesis in intestinal and white… Kroeger, Steven Hugh 1984

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831-UBC_1985_A6_7 K76.pdf [ 4.84MB ]
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THE E F F E C T OF L I T T E R S I Z E ON THE D E V E L O P M E N T A L P A T T E R N OF C H O L E S T E R O L S Y N T H E S I S I N I N T E S T I N A L AND WHITE A D I P O S E T I S S U E OF NEONATAL RATS b y S T E V E N HUGH KROEGER B . S c , T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1 9 7 6 A T H E S I S S U B M I T T E D I N P A R T I A L F U L F I L M E N T OF THE R E Q U I R E M E N T FOR THE DEGREE OF MASTER OF S C I E N C E i n THE SCHOOL OF F A M I L Y AND N U T R I T I O N A L S C I E N C E S D I V I S I O N OF HUMAN N U T R I T I O N We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H C O L U M B I A NOVEMBER, 1 9 8 4 ©Stevem Hugh Kroeger, 1984 In presenting t h i s thesis i n p a r t i a l f u l f i l m e n t of the requirements for an advanced degree at the University of B r i t i s h Columbia, I agree that the Library s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of t h i s thesis for scholarly purposes may be granted by the head of my department or by h i s or her representatives. It i s understood that copying or p u b l i c a t i o n of t h i s thesis for f i n a n c i a l gain s h a l l not be allowed without my written permission. Department of Human N u t r i t i o n  The University of B r i t i s h Columbia 2075 Wesbrook Place Vancouver, Canada V6T 1W5 ) E - 6 ( 2 / 7 9 ) A B S T R A C T T h i s s t u d y wa s p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e t h e r a t e s o f 3 i n v i t r o c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s , a s m e a s u r e d b y H i n c o r p o r a -t i o n i n t o c h o l e s t e r o l , i n g l u t e a l w h i t e a d i p o s e t i s s u e a n d t h e i n t e s t i n e o f i n f a n t r a t s d u r i n g t h e e a r l y p o s t n a t a l p e r i o d . T h e r e a s o n f o r s t u d y i n g t h e s e p a r a m e t e r s wa s t o h o p e f u l l y f u r t h e r e l u c i d a t e t h e c a u s e o f t h e d i f f e r e n c e s i n b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s b e t w e e n r a t s r a i s e d i n d i f f e r e n t l i t t e r s i z e s . R a t s w e r e r a i s e d i n s m a l l ( 4 / d a m ) , m e d i u m ( 8 / d a m ) a n d l a r g e ( 1 4 / d a m ) l i t t e r s . T h e r a t e o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n t h e p r o x i m a l a n d d i s t a l r e g i o n o f t h e s m a l l i n -t e s t i n e d e c r e a s e d f r o m b i r t h t o a l o w 14 d a y s l a t e r a n d t h e n i n c r e a s e d a g a i n b y d a y 2 1 . T h e r a t e o f t h e d e c r e a s e s i n c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s , f r o m b i r t h t o t h e l o w o n d a y 1 4 , v a r i e d a m o n g s t t h e t h r e e l i t t e r s i z e s ; t h e r a t e o f s y n t h e s i s i n b o t h r e g i o n s o f t h e i n t e s t i n e o n d a y 7 w a s l o w e s t i n t h e l a r g e r l i t t e r , a n d w a s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e v a l u e s s e e n o n d a y 1 4 . P r e v i o u s w o r k h a s s h o w n t h a t p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s w e r e l o w i n r a t s f r o m l a r g e l i t t e r s o n d a y 7, t h u s i n t h e e a r l y p o s t n a t a l p e r i o d l o w r a t e s o f i n -t e s t i n a l c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s c o r r e l a t e w i t h l o w p l a s m a c h o l e s t e r o l v a l u e s . A f t e r w e a n i n g , o n d a y 2 1 , t h e r a t e o f s y n t h e s i s i n d i s t a l i n t e s t i n e w a s h i g h e r t h a n t h a t o f p r o x i m a l i n t e s t i n e i n t h e m e d i u m a n d s m a l l l i t t e r s , w h e r e a s t h e o p p o s i t e w a s f o u n d i n t h e l a r g e r l i t t e r . i i i C h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n g l u t e a l w h i t e a d i p o s e t i s s u e r e m a i n e d a t a v e r y l o w r a t e up t o 2 1 d a y s i n t h e s m a l l a n d m e d i u m s i z e d l i t t e r s . I n c o n t r a s t , t h e r a t e o f s y n t h e s i s i n c r e a s e d c o n t i n u o u s l y i n t h e l a r g e l i t t e r t o n e a r l y t h r e e -f o l d t h e r a t e o f t h a t i n t h e o t h e r t w o l i t t e r s i z e s o n d a y 2 1 . T h i s s t u d y h a s s h o w n t h a t t h e r a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n i n t e s t i n a l a n d a d i p o s e t i s s u e c a n b e a l t e r e d d u r i n g t h e e a r l y p o s t n a t a l p e r i o d b y r a i s i n g t h e r a t s i n d i f f e r e n t l i t t e r s i z e s . A l s o , t h e p a t t e r n o f d e v e l o p m e n t i n 3 t h e r a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s a s m e a s u r e d b y H i n -c o r p o r a t i o n i n t o c h o l e s t e r o l a r e i n g e n e r a l a g r e e m e n t w i t h r e s u l t s r e p o r t e d f o r t h e a c t i v i t y o f 3 - h y d r o x y - 3 - m e t h y l -g l u t a r y l c o e n z y m e A r e d u c t a s e f o r t h i s same p e r i o d i n d e v e l o p m e n t . i v T A B L E OF CONTENTS P a g e A B S T R A C T i i L I S T OF T A B L E S v i L I S T OF F I G U R E S v i i ACKNOWLEDGEMENTS v i i i C h a p t e r I . I N T R O D U C T I O N 1 I I . R E VIEW OF THE L I T E R A T U R E 4 A. T h e R o l e o f C h o l e s t e r o l i n t h e B o d y 4 B. D i s o r d e r s A s s o c i a t e d w i t h A l t e r e d 8 C h o l e s t e r o l M e t a b o l i s m C. D e v e l o p m e n t a l P a t t e r n s o f C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s i n O v e r - a n d U n d e r - n u t r i t i o n , 12 D. C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s i n t h e I n t e s t i n e 18 E. C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s i n A d i p o s e T i s s u e 2 1 F. M e t h o d o l o g i c a l C o n s i d e r a t i o n s 23 I I I . METHODS AND M A T E R I A L S 30 A. E x p e r i m e n t a l D e s i g n 30 B. A n i m a l s 3 1 C. T i s s u e P r e p a r a t i o n s a n d C u l t u r e C o n d i t i o n s 32 D. A n a l y t i c a l P r o c e d u r e s 34 E. T h i n L a y e r C h r o m a t o g r a p h y 36 F. C a l c u l a t i o n s 37 G. S t a t i s t i c a l A n a l y s e s 38 I V . R E S U L T S 40 A. P r e l i m i n a r y S t u d i e s 40 1. C e l l V i a b i l i t y 40 2. E x t r a c t i o n E f f i c i e n c y 40 B. B o d y W e i g h t D i f f e r e n c e s 40 C. C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s 44 1. I n t e s t i n a l S y n t h e s i s 44 2. A d i p o s e T i s s u e a n d C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s 53 V P a g e V. A. B. C. D. E. V I . D I S C U S S I O N O v e r n u t r i t i o n a n d U n d e r n u t r i t i o n M e t h o d o l o g i c a l P r o c e d u r e I n t e s t i n a l S y n t h e s i s o f C h o l e s t e r o l D e v e l o p m e n t a l P a t t e r n o f C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s i n A d i p o s e T i s s u e C O N C L U S I O N S B I B L I O G R A P H Y A P P E N D I X A -A P P E N D I X B -A P P E N D I X C -A P P E N D I X D -A P P E N D I X E -A P P E N D I X F -A P P E N D I X G -A P P E N D I X H -A P P E N D I X I -L i s t o f A b b r e v i a t i o n s C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s W e i g h t s o f R a t s R a i s e d o f 8 C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s W e i g h t s o f R a t s R a i s e d o f 4 C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s W e i g h t s o f R a t s R a i s e d o f 14 S t a t i s t i c a l C o m p a r i s o n C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s C o n s e c u t i v e W e e k s S t a t i s t i c a l C o m p a r i s o n C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s P r o x i m a l :and D i s t a l I n t S t a t i s t i c a l C o m p a r i s o n C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s R a t s R a i s e d i n L i t t e r s 14 f o r V a r i o u s T i s s u e s S t a t i s t i c a l C o m p a r i s o n A m o n g s t L i t t e r S i z e s A n a l y s i s o f V a r i a n c e C F a c t o r a n d I n t e r a c t i o n T i m e F a c t o r f o r i C h o l e s S y n t h e s i s i n P r o x i m a l D i s t a l I n t e s t i n e i n a n d B o d y i n L i t t e r s i n a n d B o d y i n L i t t e r s i n a n d B o d y i n L i t t e r s s o f R a t e s o f B e t w e e n 2 s o f R a t e s o f B e t w e e n e s t i n e s o f R a t e s o f B e t w e e n o f 4 a n d s o f B o d y W e i g h t 58 58 59 6 1 67 68 7/1 1 0 1 74 77 78 79 86 8 7 93 o n t r a s t t o t h e T i m e 99 s w i t h t h e t e r o l I n t e s t i n e a n d v i L I S T OF T A B L E S T a b l e P a g e I B a s e l i n e V a l u e s f o r t h e I n c o r p o r a t i o n 45 o f H W a t e r i n t o C h o l e s t e r o l i n V a r i o u s T i s s u e s C u l t u r e d o n I c e . I I M e a n V a l u e s f o r t h e I n c o r p o r a t i o n o f 54 H W a t e r i n t o C h o l e s t e r o l i n I n t e s t i n e a n d A d i p o s e T i s s u e o f R a t s b y L i t t e r S i z e . I l l M e a n V a l u e s f o r t h e W e i g h t o f G l u t e a l 56 A d i p o s e T i s s u e o f R a t s b y L i t t e r S i z e v i i L I S T OF F I G U R E S F i g u r e P a g e 1 P a t h w a y o f O x i d a t i o n o f C h o l e s t e r o l 9 t o B i l e A c i d s 2 P a t h w a y o f M e t a b o l i t e s f o r t h e 25 S y n t h e s i s o f C h o l e s t e r o l a n d i t s P r o d u c t s 3 P e r c e n t C e l l V i a b i l i t y o f I n t e s t i n a l 4 1 a n d A d i p o s e T i s s u e 3 4 I r i v i t r o I n c o r p o r a t i o n o f H W a t e r 42 i n t o C h o l e s t e r o l i n V a r i o u s T i s s u e s O v e r T i m e 5 B o d y W e i g h t s o f R a t s R a i s e d i n 43 D i f f e r e n t L i t t e r S i z e s 3 6 I n c o r p o r a t i o n o f H W a t e r i n t o 46 C h o l e s t e r o l i n I n t e s t i n e a n d A d i p o s e T i s s u e o f R a t s R a i s e d i n L i t t e r s o f E i g h t 7 C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s i n I n t e s t i n e o f 48 R a t s R a i s e d i n S m a l l L i t t e r s 8 C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s i n I n t e s t i n e o f 50 R a t s R a i s e d i n L a r g e L i t t e r s 9 C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s i n D i s t a l I n - 5 1 t e s t i n e i n R a t s R a i s e d i n S m a l l a n d L a r g e L i t t e r s 10 C o m p a r i s o n o f t h e R a t e s o f C h o l e s t e r o l 52 S y n t h e s i s i n P r o x i m a l I n t e s t i n e B e t w e e n R a t s R a i s e d i n S m a l l a n d L a r g e L i t t e r s 1 1 C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s i n A d i p o s e T i s s u e 55 o f R a t s R a i s e d i n S m a l l a n d L a r g e L i t t e r s v i i i ACKNOWLEDGEMENTS A c k n o w l e d g e m e n t i s d u e t o t h e B.C. H e a r t F o u n d a -t i o n f o r g e n e r o u s l y p r o v i d i n g a G r a d u a t e R e s e a r c h A s s i s t a n t F e l l o w s h i p f o r p a r t i a l s u p p o r t o f t h i s s t u d y . I n c o n s i d e r a t i o n o f t h e n u m b e r o f s e t b a c k s , r e -s u l t i n g f r o m b o t h p e r s o n a l a n d e x p e r i m e n t a l t r a g e d i e s e n c o u n t e r e d d u r i n g t h e p a s t t h r e e y e a r s I w o u l d l i k e t o e x p r e s s my g r a t i t u d e t o D r . P e t e r H a h n f o r h i s p a t i e n c e a n d e x p e r t g u i d a n c e . I am i n d e b t e d t o D r s . S u s a n B a r r , J i r i F r o h l i c h a n d Dan R u r a k f o r t h e i r a d v i c e o n e x p e r i -m e n t a l p r o c e d u r e s a n d t h e i r h e l p i n t h e p r e p a r a t i o n o f t h i s m a n u s c r i p t . F o r t h e u s e o f e q u i p m e n t a n d t h e i r c o -o p e r a t i o n I t h a n k a l l t h e p e o p l e who h a v e w o r k e d a t t h e C e n t r e f o r D e v e l o p m e n t a l M e d i c i n e , e s p e c i a l l y M r s . F r e d a A n n e S m a l e a n d M r . S a l i m H a s s i n a l i . I a l s o e x p r e s s my g r a t i t u d e t o D r . J a m e s A x e l s o n o f t h e F a c u l t y o f P h a r m a c e u t i c a l S c i e n c e s a t U.B.C. a n d h i s s t a f f f o r t h e u s e o f t h e i r r e s e a r c h f a c i l i t i e s a n d t h e i r w i l l i n g c o -o p e r a t i o n a n d i n s t r u c t i o n . 1 C H A P E R I I N T R O D U C T I O N W i t h i n t h e l a s t t h i r t y y e a r s e m p h a s i s h a s b e e n p l a c e d o n s t u d y i n g t h e d e v e l o p m e n t o f m e t a b o l i c p r o c e s s e s i n a n i m a l s a n d h u m a n s d u r i n g t h e g e s t a t i o n a l a n d e a r l y p o s t n a t a l p e r i o d . M a n y s t u d i e s h a v e b e e n c a r r i e d o u t t o d e t e r m i n e t h e t i m e w h e n c e r t a i n b i o s y n t h e t i c a n d c a t a b o l i c p a t h w a y s b e c o m e f u n c t i o n a l . T h e r e i s e v i d e n c e w h i c h s u g g e s t s t h a t t h e d e v -e l o p m e n t o f m e t a b o l i c p r o c e s s e s a n d t h e a d u l t p a t t e r n o f m e t a b o l i c r e s p o n s e s may b e a l t e r e d b y t h e d i e t , f e d d u r i n g t h e e a r l y p e r i o d o f l i f e ( 1 - 7 ) . S t u d i e s w h i c h w i l l b e d e t a i l e d i n t h e d i s c u s s i o n h a v e d e m o n s t r a t e d l a s t i n g c o n s e -q u e n c e s o f e a r l y n u t r i t i o n a l c h a n g e s ( 8 - 1 0 ) . M a l n u t r i t i o n i n e a r l y l i f e , w h e t h e r i t b e u n d e r - o r o v e r - n u t r i t i o n o r a n i m b a l a n c e i n t h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f n u t r i e n t s , h a s b e e n s h o w n t o r e s u l t i n p e r m a n e n t a l t e r a t i o n s i n g r o w t h , b r a i n s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n ( 1 1 , 1 2 ) , b e h a v i o r ( 1 3 - 1 8 ) , a n d t h e a b i l i t y t o c o p e w i t h m e t a b o l i c s t r e s s e s ( 8 , 9 0 . H e n c e , t h e c o n d i t i o n s a n d e v e n t s s u r r o u n d i n g t h e p e r i n a t a l p e r i o d a r e now r e c o g n i z e d a s b e i n g c a p a b l e o f i n f l u e n c i n g t h e c o u r s e o f d e v e l o p m e n t t h r o u g h t o a d u l t h o o d . I n c l u d e d i n t h i s l i s t o f p r o c e s s e s w h i c h may b e p e r -m a n e n t l y a f f e c t e d b y t h e c o n d i t i o n s d u r i n g e a r l y l i f e i s t h e m e t a b o l i s m o f c h o l e s t e r o l . T h e human b o d y s y n t h e s i z e s 2 a b o u t 7 5 % o f t h e t o t a l c h o l e s t e r o l p o o l , a l t h o u g h t h i s a m o u n t d e p e n d s o n d i e t a r y c o m p o n e n t s w h i c h e x e r t a f e e d b a c k c o n t r o l o n c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s . T i s s u e s r e s p o n s i b l e f o r c o n t r i b u t i n g t h e g r e a t e s t a m o u n t o f c h o l e s t e r o l t o t h e b o d y p o o l b y w a y o f s y n t h e s i s a r e m o s t l i k e l y t h e l i v e r a n d i n t e s t i n e ( 1 9 - 2 1 ) . E v i d e n c e p r o d u c e d f r o m a n i m a l s t u d i e s h a s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e i n t e s t i n e p l a y s a m a j o r r o l e i n t h e o v e r a l l m e t a b o l i s m o f c h o l e s t e r o l , a f u n c t i o n t h a t p r e v i o u s l y h a d b e e n a s c r i b e d a l m o s t e n t i r e l y t o l i v e r ( 2 0 ) . D e v e l o p m e n t a l p a t t e r n s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s d u r i n g g e s t a t i o n a n d t h e e a r l y p o s t -n a t a l p e r i o d h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d u n d e r a v a r i e t y o f n u t r i t i o n a l s t a t e s f o r t h e l i v e r b u t n o t f o r t h e i n t e s t i n e o r f o r a d i p o s e t i s s u e . P r e v i o u s w o r k h a s s h o w n t h a t t h e r a t e o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s , a s j u d g e d f r o m t h e a c t i v i t y o f t h e r a t e l i m i t i n g e n z y m e 3 - h y d r o x y - 3 - m e t h y l g l u y a r y l Co. A r e d u c t a s e (HMGR:EC 1 . 1 . 1 . 3 4 ) d e c r e a s e s a f t e r b i r t h a n d r e m a i n s l o w d u r i n g t h e s u c k l i n g p e r i o d i n r a t s . T h i s i s t r u e f o r l i v e r ( 2 , 2 2 ) a n d a l s o f o r t h e i n t e s t i n a l m u c o s a a n d b r o w n a d i p o s e t i s s u e ( 2 3 ) . R e d u c i n g t h e n u m b e r o f p u p s i n a l i t t e r t o 3 o r 4 s o o n a f t e r b i r t h c a u s e s b o t h a r i s e i n p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s a n d a d e c r e a s e i n h e p a t i c HMGR a c t i v i t y ( 2 ) . T h e b i o c h e m i c a l m e c h a n i s m ( s ) t h a t i s r e s p o n s i b l e f o r t h e h i g h b l o o d c h o l e s t e r o l i n t h e s e a n i m a l s h a s n o t b e e n c l e a r l y d e f i n e d . I n t h e o r y , t h r e e f a c t o r s a c t i n g i n d i v i d u a l l y o r i n c o m b i n a t i o n c o u l d c o n t r i b u e t o t h e e l e v a t e d l e v e l s : i n c r e a s e d s y n t h e s i s , d e c r e a s e d t u r n -o v e r a n d e l i m i n a t i o n , a n d c h o l e s t e r o l i n t h e d i e t . 3. HMGR- i s t h e r a t e l i m i t i n g e n z y m e o f a t l e a s t t w o o t h e r p a t h w a y s : u b i q u i o n e ( 2 4 ) a n d d o l i c h o l ( 2 5 ) s y n t h e s i s . H i g h l e v e l s o f a c t i v i t y o f HMGR d o n o t , t h e r e f o r e , n e c e s s a r -i l y i n d i c a t e i n c r e a s e d c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s ( 2 6 , 2 7 ) . I n v i e w o f t h e s e f a c t s t h e p r e s e n t s t u d y w a s d e s i g n e d 3 3 t o e x a m i n e t h e i n c o r p o r a t i o n o f H f r o m H2O i n t o c h o l e s t e r o l i n t h e i n t e s t i n a l w a l l a n d w h i t e a d i p o s e t i s s u e o f i n f a n t r a t s r e a r e d i n l i t t e r s o f d i f f e r e n t s i z e s . T h e d a t a w o u l d make i t p o s s i b l e : ( a ) t o c o m p a r e p u b l i s h e d d a t a o n HMGR a c t i v i t y w i t h t h e a c t u a l r a t e o f s y n t h e s i s o f c h o l e s t e r o l i n t h e i n t e s t i n e , a n d ( b ) t o d e t e r m i n e t h e r a t e o f c h o l e s t e r -o l s y n t h e s i s i n w h i t e a d i p o s e t i s s u e d u r i n g d e v e l o p m e n t w h e r e HMGR a c t i v i t y i s v e r y l o w a n d d i f f i c u l t t o a s s a y . 4 C H A P T E R I I REVIEW OF THE L I T E R A T U R E Th e f o l l o w i n g p r e s e n t a t i o n r e v i e w s t o p i c s r e l a t e d t o c h o l e s t e r o l m e t a b o l i s m a n d t o c h a n g e s i n c e l l m o r p h o l o g y a n d m e t a b o l i s m r e s u l t i n g f r o m m a l n u t r i t i o n . N o r m a l f u n c -t i o n s o f c h o l e s t e r o l a n d some d i s o r d e r s a s s o c i a t e d w i t h a l t e r e d d i e t a r y a n d p l a s m a l e v e l s o f c h o l e s t e r o l a r e a l s o p r e s e n t e d . T h e l a s t s u b j e c t d i s c u s s e d c o n c e r n s t h e p r o b -l e m s a s s o c i a t e d w i t h d e t e r m i n i n g t h e a b s o l u t e r a t e o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s . A. T h e R o l e o f C h o l e s t e r o l i n t h e B o d y C h o l e s t e r o l i s a c o m p o n e n t o f a l l a n i m a l c e l l m e m b r a n e s a n d t h e q u a n t i t y i n w h i c h i t i s p r e s e n t a f f e c t s t h e f l u i d -i t y o f t h e m e m b r a n e s t r u c t u r e ( 2 8 ) . F u n c t i o n a l p r o p e r t i e s o f p r o t e i n s a n d a c c e s s i b i l i t y o f m e t a b o l i t e s t o e n z y m e s ( 2 9 , 3 0 ) a n d r e c e p t o r s ( 3 1 , 3 2 ) c o n t a i n e d w i t h i n t h e m e m b r a n e l a t t i c e a r e a l t e r e d w h e n m e m b r a n e f l u i d i t y i s c h a n g e d . F o r e x a m p l e , e p i n e p h r i n e - i n d u c e d a g g r e g a t i o n o f human p l a t e l e t s i s a f f e c t e d b y t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e i r m e m b r a n e c h o l e s t e r o l ( 3 3 ) , a n d e n z y m e s s u c h a s c y t o c h r o m e o x i d a s e ( 2 9 ) a n d A T P - a s e ( 3 0 ) a l s o b e h a v e d i f f e r e n t l y i n m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s f r o m y e a s t w h i c h h a v e a l o w o r h i g h c h o l e s t e r o l c o n t e n t . A n h y p o t h e s i s p r o p o s e d b y R o m a n - F r a n c o a n d S a n t i a g o - D e l p h i n ( 3 4 ) s t a t e s t h a t h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a w i l l r e d u c e . • • ' 5 i m m u n o c o m p e t e n c e b y a l t e r i n g m e m b r a n e s t r u c t u r e a n d f l u i d i t y a n d c o n s e q u e n t l y t h e a b i l i t y o f l y m p h o c y t e s t o r e c o g n i z e a n t i g e n s a n d h e n c e t a r g e t c e l l s . H e i n i g e r e t a l . ( 3 5 ) h a v e s h o w n t h a t i m m u n o c o m p e t e n c e i s a l s o r e d u c e ' d b y l o w e r i n g t h e c e l l u l a r c h o -l e s t e r o l c o n t e n t . I n t h e i r e x p e r i m e n t t h e r e w a s d e c r e a s e d c y t o l y t i c a c t i v i t y b y T l y m p h o c y t e s i n c u b a t e d w i t h a n i n h i b i t o r o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s , 2 5 - h y d r o x y c h o l e s t e r o l , f o r 24 h o u r s ( 3 5 ) . T h e e f f e c t o f t h i s i n h i b i t i o n w a s r e v e r s e d b y t h e a d d i t i o n o f c h o l e s t e r o l o r o f m e v a l o n i c a c i d d u r i n g t h e p r e i n c u b a t i o n p e r i o d . B l o c k i n g DNA s y n t h e s i s d i d n o t a l t e r t h e c y t o t o x i c a b i l i t y o f t h e l y m p h o c y t e s s u g g e s t i n g t h a t t h e e f f e c t s o f 2 5 - h y d r o x y c h o l e s t e r o l a r e r e l a t e d t o i t s i n h i b i t o r y e f f e c t o n s t e r o l s y n t h e s i s r a t h e r t h a n t o i n h i b i t i o n o f t h e - c e l l s ' p r o l i f e r a t i o n . U s i n g t h i s same a p p r o a c h C h e n e t a l . ( 3 6 ) h a v e s h o w n t h a t i n h i b i t i n g d e n o v o s y n t h e s i s o f c h o l e s t e r o l r e s u l t s i n a n i n c r e a s e d f l u x o f K+ a n d Na+, d e c r e a s e d e n d o c y t o s i s , a n d c e s s a t i o n o f c e l l p r o l i f e r a t i o n . C h a n g e s i n t h e m o r p h o l o g y o f r e d b l o o d c e l l s o f d o g s h a v e b e e n i n d u c e d b y f e e d i n g a d i e t s u p p l e m e n t e d w i t h c h o l e s t e r o l a n d " c o c o n u t o i l ( 3 7 ) . W i t h i n t h r e e d a y s a f t e r t h e s t a r t o f t h e d i e t t h e r e d c e l l c h o l e s t e r o l / p h o s p h o l i p i d r a t i o i n c r e a s e d a n d m e m b r a n e f l u i d i t y d e c r e a s e d . B e g i n n i n g a t s i x w e e k s , t h e h e m a t o c r i t d e c l i n e d w i t h a p a r a l l e l i n c r e a s e , i n o s m o t i c f r a g i l i t y , a n d t h e r e d c e l l s m o r p h o l o g i c a l l y r e s e m b l e d a c a n t h o c y t e s o r s p u r c e l l s . F o u r w e e k s a f t e r t h e 6 d i e t w a s d i s c o n t i n u e d , a l l r e d c e l l p a r a m e t e r s h a d r e t u r n e d t o n o r m a l . S i m i l a r c h a n g e s i n r e d c e l l m o r p h o l o g y a n d l i p i d c o n t e n t h a v e , m o r e r e c e n t l y b e e n r e p o r t e d i n a 4^ y e a r o l d g i r l p r e s e n t i n g w i t h f a m i l i a l i n t r a h e p a t i c , c h o l e s t a s i s ( 3 8 ) . F r o m t h e s e a n d o t h e r s t u d i e s ( 3 9 - 4 1 ) t h e r e i s s u b -s t a n t i a l e v i d e n c e i n d i c a t i n g t h a t t h e r o l e o f c h o l e s t e r o l i n m e m b r a n e s i s t o m a i n t a i n c e l l u l a r a n d s u b c e l l u l a r f u n c t i o n -a l i n t e g r i t y a n d t h a t c h o l e s t e r o l a l t e r s m e m b r a n e f l u i d i t y . N u m e r o u s i m p o r t a n t c o m p o u n d s a r e s y n t h e s i z e d f r o m c h o -l e s t e r o l . V i t a l t o t h e h o m e o s t a s i s o f c a l c i u m a n d p h o s -p h o r u s m e t a b o l i s m i s t h e s y n t h e s i s o f v i t a m i n D f r o m c h o l e s t e r o l ( 4 2 ) . V i t a m i n D, i n i t s s e v e r a l f o r m s o f v a r y -i n g a c t i v i t y , i s a v a i l a b l e f r o m e x o g e n o u s d i e t a r y s o u r c e s a n d c a n a l s o b e s y n t h e s i z e d i n t h e b o d y . P r o v i t a m i n D^, 7 - d e h y d r o c h o l e s t e r o l , w h i c h y i e l d s v i t a m i n a f t e r u l t r a -v i o l e t i r r a d i a t i o n , i s s y n t h e s i z e d i n t h e s t r a t u m g r a n u -l o s u m o f t h e s k i n a n d t h e i n t e s t i n e ( 4 2 ) . D i e t a r y c h o -l e s t e r o l c a n a l s o b e m e t a b o l i z e d i n t h e i n t e s t i n a l w a l l t o p r o d u c e 7 - d e h y d r o c h o l e s t e r o l ( 2 8 ) . A n o t h e r g r o u p o f c o m p o u n d s w h i c h a r e d e r i v e d f r o m c h o l e s t e r o l a r e t h e s t e r o i d s . P r e g n e n o l o n e i s p r o d u c e d . , f r o m c h o l e s t e r o l b y t h e e n z y m a t i c c l e a v a g e o f t h e s i d e c h a i n t o y i e l d a 2 1 c a r b o n c o m p o u n d f o l l o w e d b y o x i d a t i o n o f t h e s i d e c h a i n b e t w e e n C-20 a n d C - 2 2 . F u r t h e r o x i d a t i o n o f t h e v a r i o u s s i t e s c a n , d e p e n d i n g o n t h e t y p e o f t i s s u e , y i e l d d e h y d r o e p i a n d r o s t e r o n e , p r o g e s t e r o n e a n d i t s a n a l o g s , a n d a l s o t h e c o r t i c o s t e r o i d s ( 4 3 ) . A l t h o u g h c h o l e s t e r o l i s a l s o p r o d u c e d w i t h i n t h e c e l l s w h i c h s y n t h e s i z e t h e s t e r o i d s t h e r e a r e c o n d i t i o n s w h i c h n e c e s s i t a t e t h e u p t a k e o f e x o g e n o u s c h o l e s t e r o l f r o m l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s ( L D L ) f o r i n c r e a s e d s t e r o i d s y n -t h e s i s ( 4 4 ) . I n f a c t , t h e a d r e n a l c o r t e x u s e s p r e d o m i n a n t l y c h o l e s t e r o l d e l i v e r e d t o i t v i a L D L . I l l i n g w o r t h a n d O r w o l l ( 4 4 ) h a v e f o u n d t h a t a d d i t i o n o f c o r t i c o t r o p i n t o a d r e n a l g l a n d c e l l s c u l t u r e d i n t h e p r e s e n c e o f L D L r e s u l t s i n a 2-3 f o l d i n c r e a s e i n t h e n u m b e r o f L D L r e c e p t o r s a n d a c o n c o m i t a n t 3 0 - 5 0 f o l d i n c r e a s e i n s y n t h e s i s o f s t e r o i d h o r m o n e s . I n t h e a b s e n c e o f t h e L D L t h e m a g n i t u d e o f t h e i n c r e a s e i n s t e r o i d h o r m o n e s y n t h e s i s s t i m u l a t e d b y c o r t i -c o t r o p i n i s 3 f o l d l o w e r t h a n t h a t s e e n m a x i m a l l y i n t h e p r e s e n c e o f L D L . P a t i e n t s w i t h a b e t a l i p o p r o t e i n e m i a , a r a r e d i s o r d e r c h a r a c t e r i z e d b y t h e c o m p l e t e a b s e n c e o f a l l a p o p r o t e i n B - c o n t a i n i n g l i p o p r o t e i n s ( c h y l o m i c r o n s , V L D L , L D L ) f r o m p l a s m a , a r e a b l e t o s y n t h e s i z e c h o l e s t e r o l a d e q u a t e l y f o r u n s t i m u l a t e d a d r e n a l s t e r o i d h o r m o n e p r o d u c t i o n a n d f o r t h e i n i t i a l i n c r e a s e i n s t e r o i d p r o d u c t i o n i n r e s p o n s e t o c o r t i c o t r o p i n s t i m u l a t i o n ( 4 4 ) . H o w e v e r , c h r o n i c s t i m u l a -t i o n b y c o r t i c o t r o p i n r e s u l t s i n s u b n o r m a l s t e r o i d h o r m o n e p r o d u c t i o n w h i c h i s p r o b a b l y d u e t o a l a c k o f l i p o p r o t e i n 8 and. hence c h o l e s t e r o l a v a i l a b i l i t y (44). I l l i n g w o r t h and O r w o l l (44) have p r o p o s e d t h a t t h e i n i t i a l s t i m u l a t i o n o f s t e r o i d s y n t h e s i s i s d e pendent on s t o r e d i n t r a - c e l l u l a r c h o l e s t e r o l and t h a t c h r o n i c s t i m u l a t i o n r e q u i r e s t h e i n f l u x o f l i p o p r o t e i n c h o l e s t e r o l r e s u l t i n g f r o m i n c r e a s e s i n LDL r e c e p t o r s and i n c r e a s e d u p t a k e o f LDL. O x i d a t i o n o f c h o l e s t e r o l i n t h e l i v e r p r o d u c e s t h e b i l e a c i d s , c h o l i c a c i d and c h e n o d e o x y c h o l i c a c i d ( F i g u r e 1). T h e s e b i l e a c i d s a r e t r a n s p o r t e d t o t h e s m a l l i n t e s t i n e where t h e y f a c i l i t a t e t h e d i g e s t i o n and a b s o r p t i o n o f f a t s . N e a r l y a l l o f t h e b i l e a c i d s a r e r e a b s o r b e d and c i r c u l a t e d b ack t o t h e l i v e r where t h e y s u p p r e s s s y n t h e s i s o f c h o -l e s t e r o l by t h e l i v e r (45). In summary, c h o l e s t e r o l has m u l t i p l e r o l e s i n t h e body: C h o l e s t e r o l i s i n v o l v e d i n membrane s t r u c t u r e and f u n c t i o n , c e l l p r o l i f e r a t i o n , immunocompetence o f T l y m p h o c y t e s , and as a p r e c u r s o r t o v i t a m i n D, a d r e n a l and s e x s t e r o i d s , and b i l e a c i d s . B. D i s o r d e r s A s s o c i a t e d w i t h A l t e r e d C h o l e s t e r o l M e t a b o l i s m O n l y a v e r y b r i e f i n t r o d u c t i o n w i l l be g i v e n t o t h i s t o p i c b e c a u s e t h e c o n t r o v e r s y s t i l l c o n t i n u e s o v e r t h e - e t i o -l o g y o f d i s e a s e s s u c h as a t h e r o s c l e r o s i s , g a l l s t o n e s , c o l o n i c c a n c e r and o t h e r c a n c e r s w h i c h a r e f o u n d t o be a s s o c i a t e d w i t h d i e t a r y i n t a k e and p l a s m a l e v e l s o f c h o l e s t e r o l . I t i s s a f e t o s a y t h a t d i e t a r y c h o l e s t e r o l i s n o t t h e o n l y c a u s e C h e n o d e o x y c h o l i c a c i d F i g u r e 1 . P a t h w a y o f O x i d a t i o n o f C h o l e s t e r o l t o B i l e A c i d s . A d a p t e d f r o m S a b i n e , J . R. i n C h o l e s t e r o l ( 2 8 ) -10 o f h e a r t d i s e a s e a n d a t h e r o s c l e r o s i s . D i e t a r y c h o l e s t e r o l p r o v i d e s f e e d b a c k i n h i b i t i o n o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s b y l i v e r a n d w i t h o u t t h i s f e e d b a c k t h e l i v e r w i l l i n e v i t a b l y p r o d u c e m o r e c h o l e s t e r o l ( 4 6 ) . A t t e m p t s t o l o w e r b l o o d c h o l e s t e r o l i n h y p e r c h o l e s t e r o l e m i c s u b j e c t s b y d i e t a r y m a n i p u l a t i o n s a l o n e , h a v e b e e n m e t w i t h v a r i e d s u c c e s s ( 4 7 , 4 8 , 4 9 ) a l t h o u g h a 2 0 - 3 0 % r e d u c t i o n h a s b e e n a c h i e v e d ( 5 0 ) . L i p i d c o m p o s i t i o n o f t h e d i e t d o e s , h o w e v e r , a f f e c t t h e s e r u m c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n a n d t h e r i s k o f c o r o n a r y d e a t h i n m i d d l e a g e d A m e r i c a n men ( 5 1 ) , a l t h o u g h e x c e p t i o n s t o t h i s d o e x i s t a n d n o t a l l p o p u l a t i o n s c o n s u m i n g l a r g e q u a n t i t i e s o f b o t h s a t u r a t e d f a t s a n d c h o l e s t e r o l h a v e h i g h b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s ( 5 2 , 5 3 ) . E x a m p l e s o f t h i s a r e t h e S o m a l i h e r d s m e n ( 5 2 ) w h o s e d a i l y d i e t i n c l u d e s f i v e q u a r t s o f c a m e l ' s m i l k , a n d t h e M a s a i o f T a n g a n y i k a ( 5 3 ) who c o n s u m e l a r g e q u a n t i t i e s o f m e a t a n d m i l k . N e i t h e r o f t h e s e g r o u p s h a v e a v e r a g e b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s g r e a t e r t h a n 1 6 0 mg% a n d t h e r e - i s . v i r t u a l l y n o h e a r t d i s e a s e . W h i l e i t i s g e n e r a l l y a c c e p t e d t h a t r a i s e d s e r u m c h o -l e s t e r o l l e v e l s p r o v i d e a n i m p o r t a n t p r e d i c t o r o f m o r b i d i t y a n d m o r t a l i t y f r o m c o r o n a r y h e a r t d i s e a s e i n W e s t e r n i n d u s -t r i a l p o p u l a t i o n s , s e r u m c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n s , u n l i k e b l o o d p r e s s u r e , a r e n o t d i r e c t l y c o r r e l a t e d w i t h o v e r a l l m o r t a l i t y . A n e l e v e n y e a r s t u d y o f 6 3 0 M a o r i s i n New Z e a l a n d i n v e s t i g a t e d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n s e r u m c h o l e s t e r o l 1 1 c o n c e n t r a t i o n a n d m o r t a l i t y ( 5 4 ) . An i n v e r s e r e l a t i o n s h i p w a s f o u n d b e t w e e n s e r u m c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n s a n d m o r t a l i t y d u e t o c a n c e r a n d o t h e r c a u s e s . T h e h i g h i n c i d e n c e o f d e a t h f r o m c a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e i n t h e M a o r i s w a s n o t r e l a t e d t o s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s w h i c h m a k e s t h i s p o p u l a t i o n d i f f e r e n t f r o m W e s t e r n i n d u s t r i a l i z e d p o p u l a t i o n s . T o t a l b l o o d c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n i s , b y i t s e l f , n o t a r e l i a b l e f a c t o r f o r p r e d i c t i n g t h e r i s k o f c o r o n a r y a r t e r i a l d i s e a s e . A n e p i d e m i o l o g i c a l s t u d y w h i c h s e p a r a t e l y c o n s i d e r e d L D L c h o l e s t e r o l a n d h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n ( H D L ) c h o l e s t e r o l a s f a c t o r s f o r t h e p r e d i c t i o n o f r i s k d e t e r m i n e d t h a t L D L c h o l e s t e r o l w a s a b e t t e r p r e d i c t o r t h a n HDL c h o l e s t e r o l ( 5 5 ) . K a n n e l e t a l . (55) h a v e s t a t e d t h a t " T h e r i s k i s m o d u l a t e d b y HDL: i f HDL a r e h i g h , t h e r i s k i s l o w e r , - i f HDL a r e l o w t h e r i s k i s h i g h e r . On t h e o t h e r h a n d p e r s o n s w i t h l o w L D L h a v e l o w e r r i s k s t h a n t h o s e w i t h h i g h L D L a t a l l l e v e l s o f HDL. K n o w l e d g e o f HDL i m p r o v e s t h e p r e c i s i o n o f p r e d i c t i o n , b u t e v e n v e r y h i g h HDL c a n n o t r e m o v e t h e r i s k r e s u l t i n g f r o m h i g h L D L . " I t i s c l e a r t h a t d i e t a r y c h o l e s t e r o l i s o n l y o n e o f s e v e r a l f a c t o r s r e s p o n s i b l e i n t h e p a t h o g e n e s i s o f a t h e r o -s c l e r o s i s a n d t h a t i t i s n o t t h e o n l y d i e t a r y f a c t o r w h i c h a f f e c t s s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s . O t h e r f a c t o r s , i n c l u d i n g g e n e t i c i n f l u e n c e s o r t h e i n f l u e n c e o f some o t h e r d i e t a r y c o m p o n e n t s , may c o n t r i b u t e t o t h e e t i o l o g y o f t h e p a t h o -l o g i c a l c o n d i t i o n s . I t i s p o s s i b l e t h a t c h o l e s t e r o l i s r e -l a t e d t o a t h e r o s c l e r o s i s v i a o t h e r m e c h a n i s m s , s u c h a s i n -c r e a s e d t u r n o v e r o f l i p o p r o t e i n s a n d a l t e r a t i o n s i n s t r u c -t u r e o r c o m p o s i t i o n o f p l a s m a l i p o p r o t e i n s ( 5 1 ) o r t h a t t h e L D L - r e c e p t o r s a r e d e f e c t i v e o r m i s s i n g a s i s t h e c a s e i n f a m i l i a l h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a ( 5 6 ) . E v i d e n c e t o s u g g e s t t h a t d i e t a r y c h o l e s t e r o l i s a c o c a r c i n o g e n f o r c o l o n i c c a n c e r c o m e s f r o m e x p e r i m e n t s p e r -f o r m e d b y C r u s e e t a l . ( 5 7 ) . C o l o n i c c a n c e r w a s i n d u c e d w i t h d i m e t h y l h y d r a z i n e (DMH) a n d t h e e f f e c t s o f a s i n g l e d i e t a r y v a r i a b l e c o m p o n e n t , c h o l e s t e r o l , w e r e e x a m i n e d . T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t c h o l e s t e r o l b y i t s e l f w a s n o t a b l e t o i n d u c e c o l o n i c c a n c e r , a l t h o u g h i t d i d f a c i l i t a t e t h e d e v e l o p m e n t , g r o w t h , a n d s p r e a d o f e x p e r i m e n t a l c o l o n c a n c e r i n d u c e d b y DMH. S t u d i e s r e l a t i n g h i g h f a t d i e t s , w h i c h w e r e a d j u s t e d f o r c h o l e s t e r o l c o n t e n t , w i t h t h e g e o g r a p h i c a l i n c i d e n c e o f c o l o n i c c a n c e r h a s s u g g e s t e d a c a u s a l r e l a t i o n -s h i p o f d i e t a r y c h o l e s t e r o l w i t h c o l o n i c c a n c e r ( 5 8 - 6 0 ) a l t h o u g h n o m e c h a n i s m s h a v e b e e n p r o p o s e d . C. D e v e l o p m e n t a l P a t t e r n s i n O v e r - a n d U n d e r - n u t r i t i o n M a l n u t r i t i o n o f t h e f e t u s a n d n e w b o r n h a s b e e n s h o w n t o r e s u l t i n p e r m a n e n t c h a n g e s i n t h e a d u l t e v e n a f t e r n u t r i t i o n a l r e h a b i l i t a t i o n ( 1 1 , 5 4 , 6 1 ) . U n d e r n u t r i t i o n d u r i n g d e v e l o p m e n t w h i c h i s e v i d e n c e d b y a m o d e r a t e g r o w t h r e s t r i c t i o n n o t o n l y a f f e c t s t h e d e v e l o p m e n t o f t h e b r a i n a t t h a t t i m e , b u t l e a v e s p e r m a n e n t d i s t o r t i o n s o f g r o s s a n d 13 h i s t o l o g i c a l s t r u c t u r e , . c h e m i c a l c o m p o s i t i o n , m e t a b o l i c m e c h a n i s m s a n d b e h a v i o r a l c h a r a c t e r i s t i c s ( 1 1 , 1 2 ) . T h e r a t e a t w h i c h t h e n e r v o u s s y s t e m d e v e l o p s i s l i m i t e d b y t h e r a t e o f f a t t y a c i d a c c r e t i o n ( 6 2 ) . C l a n d i n i n e t a l . ( 6 2 ) h a v e d e m o n s t r a t e d i n t h e d e v e l o p i n g i n f a n t t h a t t h e r a t e o f f a t t y a c i d a c c r e t i o n i n t h e s p i n a l c o r d p a r a l l e l s t h e m y e l i n a -t i o n p r o c e s s a n d a p p e a r a n c e o f n e u r o - m o t o r a c t i v i t y . C h o l e s -t e r o l i s a l s o n e e d e d f o r p r o p e r m y e l i n a t i o n ( 6 3 ) , a n d t h e a v a i l a b i l i t y o f b o t h c h o l e s t e r o l a n d f a t t y a c i d s d u r i n g t h e a r a p i d m y e l i n a t i o n p e r i o d may a f f e c t t h e d e v e l o p m e n t o f n e u r o - m o t o r a c t i v i t y . D i f f e r e n c e s i n t h e g r i p p i n g a n d M o r o r e s p o n s e s , t w o t e s t s w h i c h a s s e s s n e u r o l o g i c a l d e v e l o p m e n t , b e t w e e n s m a l l f o r g e s t a t i o n a l a g e ( S G A ) a n d n o r m a l w e i g h t n e w b o r n s h a v e b e e n d e s c r i b e d ( 6 4 ) . L o n g t e r m f o l l o w - u p s t u d i e s w e r e a l s o c o n d u c t e d c o m p a r i n g SGA ( b o d y w e i g h t s w e r e 3 0 % u n d e r t h e n o r m a l e x p e c t e d ) a n d f u l l t e r m c o n t r o l s m a t c h e d f o r b i r t h d a t e , s e x , r a c e , e t h n i c i t y a n d s o c i o - e c o n o m i c s t a t u s ( 6 1 ) . P a i r e d s u b j e c t s who w e r e s t u d i e d a t a g e s 13 t o 19 y e a r s w e r e s e e n w i t h i n 3 m o n t h s o f e a c h o t h e r . S i g n i f i c a n t d e f i c i t s i n h e i g h t , w e i g h t , h e a d c i r c u m f e r e n c e , t r i c e p s s k i n f o l d a n d v e r b a l p e r f o r m a n c e I . Q ' s . w e r e f o u n d . No d i f f e r e n c e s w e r e f o u n d i n p u b e r t a l d e v e l o p m e n t , m o t o r f u n c t i o n , c r a n i a l n e r v e s , r e f l e x e s , g a i t a n d c o o r d i n a t i o n o r r e a d i n g a n d s p e l l -i n g t e s t s . T h e i r r e s u l t s s u g g e s t t h a t i n t r a u t e r i n e g r o w t h 14 r e t a r d a t i o n i s a s s o c i a t e d w i t h l o n g t e r m a n d p r o b a b l y p e r m a n e n t d e f i c i t s i n p h y s i c a l g r o w t h a n d c o g n i t i v e d e v e l o p m e n t . B e -h a v i o r p a t t e r n s i n r a t s , s u c h a s t a i l - p i n c h i n g r e s p o n s e s ( 1 3 ) , a g g r e s s i v e n e s s ( 1 4 ) , d o m i n a n c e ( 1 5 , 1 6 , 1 7 ) , a n d o p e r a n t c o n d i -t i o n e d r e s p o n s e s ( 1 8 ) c a n b e a l t e r e d b y u n d e r n u t r i t i o n i n t h e p o s t n a t a l s t a g e , b u t n o t d u r i n g t h e g e s t a t i o n a l p e r i o d . B y r n e e t a l . ( 1 4 ) h a v e f u r t h e r d e l i n e a t e d t h e s e n s i t i v e p e r i o d f o r t h e u n d e r - n u t r i t i o n e f f e c t t o j u s t t h e s u c k l i n g p e r i o d i n t h e r a t . T h e t i m e a t w h i c h t h e c r i t i c a l p e r i o d o f b r a i n d e v -e l o p m e n t o c c u r s , a s p r o p o s e d b y D o b b i n g , d i f f e r s i n v a r i o u s -s p e c i e s a n d a c c o u n t s f o r t h e d i f f e r i n g t i m e s o f b r a i n v u l n e r -a b i l i t y t o m a l n u t r i t i o n i n d i f f e r e n t s p e c i e s ( 1 1 ) . E n z y m e a n d h o r m o n e s y s t e m s a f f e c t e d b y t h e n u t r i t i o n a l s t a t u s o f t h e f e t u s a n d n e w b o r n h a v e b e e n c h a r a c t e r i z e d i n t h e b r a i n ( 1 ) , l i v e r ( 2 ) , p a n c r e a s ( 3 ) , o v a r y ( 4 ) , a n d i n t e s t i n e s ( 5 , 6, 7 ) . R a t s r a i s e d i n l i t t e r s o f 16 h a d mean w e i g h t s o f p a n c r e a t a d e c r e a s e t o a g r e a t e r e x t e n t t h a n b o d y w e i g h t d e -c r e a s e w h i c h w a s a t t r i b u t e d t o l o w e r DNA c o n t e n t a n d c e l l num-b e r ( 3 ) . A c t i v i t i e s o f p a n c r e a t i c e n z y m e s , i n c l u d i n g l i p a s e , t r y -p s i n , a m y l a s e , c h y m o t r y p s i n a n d c a r b o x y p e p t i d a s e s w e r e d i m i n i -s h e d w h e n e x p r e s s e d p e r t o t a l o r g a n w e i g h t ( 3 ) . A 3-4 d a y d e l a y i n t h e f a l l i n s e r u m f o l l i c l e s t i m u l a t i n g h o r m o n e l e v e l s n o r m a l l y s e e n a t t h r e e w e e k s o f a g e a n d i n o v a r i a n d e v -e l o p m e n t h a s b e e n d e s c r i b e d i n u n d e r n o u r i s h e d r a t s ( 4 ) . A l s o , b r a i n c o n c e n t r a t i o n s o f d o p a m i n e a n d n o r e p i n e p h r i n e , f a i l e d t o s h o w t h e s ame r a t e o f i n c r e a s e d u r i n g d e v e l o p m e n t i n p u p s f r o m l i t t e r s o f 18 c o m p a r e d w i t h c o n t r o l s ( 6 p u p s / l i t t e r ) ( 1 ) . I n c o n t r a s t , s e r o t o n i n c o n t e n t o f b r a i n w a s s i g n i f i c a n t l y 15 h i g h e r i n t h e m a l n o u r i s h e d t h a n c o n t r o l a n i m a l s . D i f f e r e n c e s i n c a t e c h o l a m i n e c o n c e n t r a t i o n b e t w e e n t h e m a l n o u r i s h e d a n d c o n t r o l a n i m a l s i s p r o b a b l y r e g u l a t e d b y e n z y m e a c t i v i t y r a t h -e r t h a n t h e a v a i l a b i l i t y o f p r e c u r s o r a m i n o a c i d s a s i s i n -d i c a t e d b y s i m i l a r l e v e l s o f t y r o s i n e a n d p h e n y l a l a n i n e i n b o t h g r o u p s ( 1 ) . T h e d i f f e r e n c e s i n m e t a b o l i s m r e s u l t i n g f r o m m a l -n u t r i t i o n d e s c r i b e d a b o v e , i n d i c a t e t h a t i t d o e s n o t s i m p l y r e s u l t i n t h e p r o d u c t i o n o f a l e s s e r a m o u n t o f a p r o d u c t o r l o w e r a n d h i g h e r e n z y m e a c t i v i t y , a s t h e c a s e may b e , b u t t h a t v e r y d i f f e r e n t p a t t e r n s o f m e t a b o l i s m e m e r g e . C h o l e s t e r o l s y n t h e s i s a n d m e t a b o l i s m d u r i n g d e v e l o p m e n t i s a n o t h e r e x a m p l e o f t h e c h a n g e s i n m e t a b o l i s m w h i c h r e s u l t f r o m m a l n u t r i t i o n . A t h e o r y h e l d b y s e v e r a l r e s e a r c h e r s i s t h a t a h i g h b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l t h r o u g h o u t t h e d u r a t i o n o f t h e n o r m a l s u c k l i n g p e r i o d w i l l r e s u l t i n l o w e r b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s a t m a t u r i t y a n d a b e t t e r a b i l i t y t o m a i n t a i n l o w p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s w h e n c h a l l e n g e d w i t h a n a t h e r o g e n i c d i e t ( 2 , 8 - 1 0 , 6 5 , 6 6 ) . A l t h o u g h t h i s e f f e c t h a s b e e n s h o w n i n r a t s ( 9 ) a n d p i g s ( 6 7 ) , i t h a s n o t b e e n e s t a b l i s h e d i n man. H o w e v e r , o n l y r e l a t i v e l y s h o r t - t e r m s t u d i e s , i n c o m p a r i s o n t o l i f e s p a n s , h a v e b e e n p e r f o r m e d o n h u m a n s . H o d g s o n e t a l . ( 6 8 ) f o u n d t h a t c h i l d r e n f e d a l o w c h o l e s t e r o l d i e t i n t h e f i r s t t h r e e m o n t h s o f l i f e h a d a l o w e r b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l a t a g e 7-12 y e a r s t h a n c h i l d r e n who w e r e 16 f e d a h i g h c h o l e s t e r o l d i e t ( i . e . b r e a s t o r c o w ' s m i l k ) . B u t i n t h e s t u d y b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s d u r i n g t h e i n i t i a l t h r e e m o n t h s o f l i f e w e r e n o t g i v e n . C a r r o l l a n d R o b e r t s ( 6 7 ) p o i n t o u t t h a t i n f a n t s ' c h o l e s t e r o l l e v e l s i n c r e a s e f r o m l e s s t h a n 1 0 0 mg% t o 1 5 0 - 1 8 0 mg% d u r i n g t h e s u c k l i n g p e r i o d o f i n f a n t s b r e a s t - f e d o r f e d o n c o w ' s m i l k , w h e r e a s t h e l e v e l o n l y r i s e s t o 1 0 0 - 1 3 0 mg% o n f o r m u l a w h i c h i s l o w i n c h o l e s t e r o l a n d c o n t a i n s p o l y u n s a t u r a t e d f a t s . A l s o , a m o d e r a t e t o m a r k e d h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a w a s o b s e r v e d d u r i n g t h e s u c k l i n g p e r i o d i n n i n e s p e c i e s o f a n i m a l s s t u d i e d i n t h e i r l a b o r a t o r y . T e l e o l o g i c a l l y , t h i s s u g g e s t s t h e r e may b e a g o o d p h y s i o l o g i c a l r e a s o n f o r e l e v a t e d p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s d u r i n g t h e i n i t i a l p o s t n a t a l d e v e l o p -m e n t a l s t a g e s . I t w o u l d t h e r e f o r e b e u n j u d i c i o u s a t t h i s t i m e t o make r e c o m m e n d a t i o n s f o r d i e t a r y r e g i m e n s b a s e d o n t h e r e s u l t s o f H o d g s o n e t a l . s i n c e t h e i m p o r t a n t e f f e c t s o f a p r o p e r p e r i n a t a l d i e t may n o t p r e s e n t u n t i l m i d d l e o r l a t e l i f e a n d p o s s i b l y o n l y w h e n t h e i n d i v i d u a l i s c h a l l e n g -e d w i t h a n a t h e r o g e n i c d i e t . R e c e n t l y , G r e e n e t a l . ( 6 9 ) h a v e c h a l l e n g e d t h e h y p o -t h e s i s o f R e i s e r a n d S i d e l m a n ( 6 5 ) t h a t c h o l e s t e r o l i n t a k e e a r l y i n l i f e i s i n v e r s e l y r e l a t e d t o a d u l t b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s w h e n c h a l l e n g e d w i t h a h i g h f a t - h i g h c h o l e s t e r o l d i e t . G r e e n e t a l . ( 6 9 ) f e d m o t h e r r a t s o n e o f t h r e e d i e t s : a s t o c k d i e t ( G r o u p I ) , a s e m i s y n t h e t i c d i e t w i t h 1 5 % l a r d ( G r o u p I I ) , o r a s e m i s y n t h e t i c d i e t w i t h 1 5 % l a r d a n d 1 . 5 % c h o l e s t e r o l ( G r o u p I I I ) f r o m d a y 18 o f g e s t a t i o n a n d d u r i n g l a c t a t i o n . A l t h o u g h p l a s m a c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n s w e r e h i g h e r i n G r o u p I I I dams t h e r e w e r e n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n m i l k c h o l e s t e r o l o r t r i g l y c e r i d e c o n c e n t r a t i o n . P u p s h a d a c c e s s t o t h e d a m s ' d i e t u n t i l w e a n i n g a t 30 d a y s o f a g e . P l a s m a a n d l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s o f G r o u p I I I p u p s w e r e h i g h e r t h a n i n t h e o t h e r t w o g r o u p s a t w e a n i n g , m o s t l i k e l y b e c a u s e o f c o n s u m p t i o n o f t h e d a m s ' d i e t . F r o m d a y 60 t o d a y 1 6 1 a l l p u p s w e r e f e d a d i e t c o n t a i n i n g 1 0 % l a r d a n d 0 . 5 % c h o l e s t e r o l . S i n c e p l a s m a c h o l e s t e r o l w a s s i g n i f i c a n t l y l o w e r o n l y i n p u p s f r o m t h e G r o u p I d a m s , t h e a u t h o r s c o n c l u d e d t h e i r s t u d y d i d n o t s u p p o r t t h e i d e a t h a t t h e a m o u n t o f c h o l e s t e r o l f e d e a r l y i n l i f e i s i n v e r s e l y c o r r e l a t e d w i t h a s u b s e q u e n t r e s p o n s e t o d i e t a r i l y i n d u c e d h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a . H o w e v e r , t h i s w a s n o t d e m o n s t r a t e d i n t h e i r e x p e r i m e n t b e c a u s e t h e p u p s w e r e n o t e x p o s e d t o a h i g h e r c h o l e s t e r o l d i e t a t t h e b e g i n n i n g o f l a c t a t i o n a s w a s i n d i c a t e d b y t h e l a c k o f a n y e f f e c t o f t h e m a t e r n a l d i e t o n m i l k c h o l e s t e r o l c o n t e n t . P u p s w o u l d n o t b e e a t i n g s o l i d f o o d u n t i l p e r h a p s d a y 14 o r 15 a n d t h e r e f o r e a l l t h r e e g r o u p s o f p u p s w e r e c o n s u m i n g e s s e n t i a l l y t h e same d i e t u n t i l t h a t t i m e . A n o t h e r s t u d y , p e r f o r m e d b y H u l b r o n e t a l . ( 7 0 ) , h a s , h o w e v e r , d e m o n s t r a t e d t h a t " c h o l e s t e r o l g i v e n e a r l y i n l i f e d o e s n o t p r o t e c t a g a i n s t d i e t - i n d u c e d h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a i n a d u l t r a t s . " T h e s e f i n d i n g s d o n o t n e c e s s a r i l y n e g a t e t h e 18 p o s s i b i l i t y t h a t a p r o t e c t i v e e f f e c t a g a i n s t d i e t - i n d u c e d h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a c a n b e i n v o k e d b y t h e d i e t f e d i n e a r l y l i f e . A l t h o u g h c h o l e s t e r o l i n t h e d i e t d o e s e x e r t a n e g a -t i v e f e e d b a c k c o n t r o l o n i t s own s y n t h e s i s a n d c a n i n f l u e n c e t h e s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s , i t i s n o t t h e o n l y f a c t o r t h a t g o v e r n s t h e r a t e o f s y n t h e s i s i n t h e b o d y o r t h e s o l e f a c t o r r e s p o n s i b l e f o r a l t e r i n g s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s . D. C h o l e s t e r o l l S y n t h e s i s i n t h e I n t e s t i n e R e s u l t s f r o m i n v i v o s t u d i e s i n r a t s h a v e c h a l l e n g e d t h e t r a d i t i o n a l t h e o r y t h a t l i v e r i s t h e m a i n s i t e o f c h o -l e s t e r o l s y n t h e s i s ( 7 1 ) a n d i n d i c a t e d t h a t t h e i n t e s t i n e c o n t r i b u t e s 5 5 - 5 6 % , w h i l e t h e l i v e r s u p p l i e s a b o u t 1 4 % o f t h e t o t a l b o d y c h o l e s t e r o l ( 1 9 ) . R e s u l t s w h i c h c o n f i r m t h a t t h e i n t e s t i n e i s a m a j o r s i t e o f s y n t h e s i s h a v e b e e n r e p o r t e d m o r e r e c e n t l y ( 2 0 , 2 1 ) a l t h o u g h T u r l e y e t a l . ( 7 2 ) f o u n d t h a t t h e l i v e r p r o d u c e d 5 0 % o f t h e t o t a l a m o u n t o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i z e d , w h i l e t h e s m a l l b o w e l p r o d u c e d o n l y 2 4 % ; t h e s k i n c o n t r i b u t e d 8% a n d 1 8 % w a s p r o d u c e d i n t h e r e m a i n i n g t i s s u e s o f t h e c a r c a s s c o m b i n e d . S i m i l a r f i n d i n g s h a v e b e e n r e p o r t e d f o r t h e r a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n t h e s q u i r r e l m o n k e y ( 7 3 ) , i n w h i c h c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s o c c u r s t o a m u c h g r e a t e r d e g r e e i n t h e l i v e r t h a n i n t h e i n t e s t i n e . R e g u l a t i o n o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n t h e s m a l l i n -t e s t i n e a p p a r e n t l y d i f f e r s f r o m t h a t i n t h e l i v e r . B i l e d i v e r s i o n w a s s h o w n t o r e s u l t i n i n c r e a s e d i n t e s t i n a l 19 c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n r a t s . T h i s f i n d i n g s u g g e s t s ' / - a r o l e f o r b i l e a c i d i n t h e r e g u l a t i o n o f c h o l e s t e r o l s y n t h e -s i s ( 7 4 ) . . S h e f e r e t a l . ( 7 5 ) h a v e s i n c e f o u n d t h a t b i l e a c i d s w e r e e f f e c t i v e o n l y i n i n h i b i t i n g c h o l e s t e r o l s y n t h e -s i s w h i c h wa s f i r s t e n h a n c e d b y b i l i a r y o b s t r u c t i o n o r s i t o s t e r o l f e e d i n g , a n d i n e i t h e r c a s e d i d n o t d e c r e a s e t h e s y n t h e t i c r a t e b e l o w b a s a l c i r c a d i a n l e v e l s . C h o l e s t e r o l w a s a l s o i n e f f e c t i v e b y i t s e l f a s a n i n h i b i t o r o f s y n t h e -s i s , b u t i n c o m b i n a t i o n w i t h b i l e a c i d s a m a r k e d r e d u c t i o n ( 6 0 % ) o f . HMGR a c t i v i t y w a s o b s e r v e d . I n c o n t r a s t , l i v e r c h o -l e s t e r o l s y n t h e s i s c a n b e 9 9 % i n h i b i t e d b y d i e t a r y c h o l e s t e r o l c i r c u l a t e d b y t h e h e p a t i c p o r t a l s y s t e m ( 7 6 ) a n d h a s b e e n s h o w n t o b e i n d e p e n d e n t o f b i l e s a l t f l u x ( 7 7 ) . R a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s b y t h e i n t e s t i n e a r e n o t u n i f o r m t h r o u g h o u t i t s l e n g t h . I n m o s t s p e c i e s s t u d i e d , t h e d i s t a l p o r t i o n o f t h e s m a l l i n t e s t i n e i s m o s t a c t i v e , d e c r e a s i n g i n a c t i v i t y t o w a r d t h e p r o x i m a l d u o d e n u m o f man ( 7 8 ) , r a t ( 7 9 ) , d o g ( 8 0 ) , a n d m o n k e y ( 7 3 ) . H a m s t e r s a r e a n e x c e p t i o n , s y n t h e s i z i n g e q u a l a m o u n t s i n l o w e r a n d u p p e r r e g i o n s o f t h e s m a l l i n t e s t i n e ( 8 1 ) . A l l o t h e r r e -g i o n s o f t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t a r e c a p a b l e o f s y n t h e s i z -i n g c h o l e s t e r o l ; h o w e v e r , t h e s y n t h e t i c r a t e s o f t h e e s o p h a g u s , p r o x i m a l s m a l l b o w e l a n d p r o x i m a l c o l o n a r e r e l a t i v e l y l o w w h e n c o m p a r e d t o t h e s y n t h e t i c r a t e s o f t h e s t o m a c h , d i s t a l c o l o n a n d i l e u m ( 7 4 ) . 20 E a r l y s t u d i e s i n d i c a t e d c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s w a s l o c a l -i z e d a l m o s t e n t i r e l y w i t h i n t h e c r y p t c e l l s ( 2 3 , 2 4 , 7 7 ) . V i l l i a n d t h e s m o o t h m u s c l e w a l l w e r e c o n s i d e r e d t o b e d e v o i d o f a n y s i g n i f i c a n t HMGR a c t i v i t y , t h e r a t e l i m i t i n g e n z y m e o f c h o -l e s t e r o l s y n t h e s i s . R e c e n t l y t e c h n i q u e s h a v e b e e n d e v e l o p e d t o y i e l d f o u r " c e l l f r a c t i o n s f r o m d i f f e r e n t l e v e l s o f t h e v i l l u s / c r y p t a x i s t h r o u g h i n c u b a t i o n o f t h e i n t e s t i n a l s e g m e n t s w i t h p h o s p h a t e b u f f e r c o n t a i n i n g c h e l a t i n g a g e n t s " ( 8 2 ) . I n t h e s e s y s t e m s 7 0 - 8 4 % o f t h e t o t a l s t e r o l s y n t h e t i c a c t i v i t y f o u n d i n t h e i n t e s t i n a l e p i t h e l i u m t a k e s p l a c e i n t h e l o w e r v i l l i - a n d c r y p t s i n b o t h t h e j e j u n u m a n d i l e u m . T h e r e m a i n i n g 1 6 - 3 0 % o f s t e r o l s y n t h e t i c a c t i v i t y i s f o u n d i n t h e m i d a n d u p p e r v i l l i ; w i t h t h e l a t t e r f r a c t i o n p o s s e s s i n g t h e l e a s t a c t i v i t y . D e t e r m i n i n g c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n t h e i n t e s t i n e i s c o m p l i c a t e d b y t h e f a c t t h a t t h e HMGR a c t i v i t y i n t h e j e j u n u m a n d i l e u m o f r a t s i s a f f e c t e d d i f f e r e n t l y b y v a r i o u s d i e t s ( 8 3 , 8 4 ) . I n r a t s f e d a d i e t c o n t a i n i n g b o t h p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s ( P U F A ) a n d c h o l e s t e r o l , HMGR a c t i v i t y w a s s u p p r e s s e d i n b o t h t h e i l e u m a n d j e j u n u m ; w h e r e a s w h e n a d i e t c o n t a i n i n g c h o l e s t e r o l a n d no P U F A w a s g i v e n , o n l y t h e e n z y m e o f t h e j e j u n u m w a s s u p p r e s s e d ( 8 4 ) . T h e d i s t r i b u t i o n o f m i c r o s o m a l HMGR i n t h e r a t . , s m a l l i n t e s ' t i r i e 'was__al's'o_modif l e d b y o t h e r d i e t a r y c h a n g e s . R a t s f e d a c o m m e r c i a l n o n - p u r i f i e d d i e t e x h i b i t e d m a r k e d l y h i g h e r e n z y m e a c t i v i t y i n t h e i l e u m t h a n t h e j e j u n u m , w h i l e t h i s p a t t e r n w a s r e v e r s e d i n r a t s f e d a p u r i f i e d d i e t . T h i s e f f e c t may b e d u e t o e a s e o f d i g e s t i o n o f t h e p u r i f i e d d i e t w h i c h c o u l d r e s u l t i n i n c r e a s e d a b s o r p t i o n a n d h e n c e g e n e r a l m e t a b o l i c a c t i v i t y i n t h e m o r e p r o x i m a l r e g i o n s o f t h e i n t e s t i n e . I n a d d i t i o n t o t h i s m o d i f i c a t i o n a l o n g t h e l e n g t h o f t h e g u t , a n a l t e r a t i o n o f t h e c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n w a s a l s o o b s e r v e d ; A s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n HMGR a c t i v i t y o f v i l l o u s c e l l s , c o m p a r e d w i t h c r y p t i c c e l l s , o c c u r r e d w h e n t h e a n i m a l s w e r e f e d a f a t - c o n t a i n i n g d i e t . ( 8 3 ) . E. C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s i n A d i p o s e T i s s u e T h e r a t e o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n a d i p o s e t i s s u e o f a n a d u l t r a t i s e s t i m a t e d t o b e a b o u t 4 % , p e r g r a m * o f t i s s u e , o f t h a t i n l i v e r ( 8 5 ) . A l t h o u g h t h e a m o u n t o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i z e d b y a d i p o s e t i s s u e a n d o t h e r o r g a n s s u c h a s k i d n e y , l u n g a n d s k i n i s r e l a t i v e l y s m a l l ( p o s s i b l y c o n -t r i b u t i n g a s l i t t l e a s 2% o f t o t a l s y n t h e s i s ) t h e r e may b e i m p o r t a n t f e e d b a c k r e g u l a t o r y m e c h a n i s m s o p e r a t i n g a m o n g s t t h e m a j o r a n d m i n o r s i t e s o f s y n t h e s i s . T h e c a p a c i t y o f m i n o r s i t e s t o s y n t h e s i z e c h o l e s t e r o l may b e g r e a t e r t h a n i s p r e s e n t l y k n o w n , a s i s s h o w n i n s t u d i e s p e r f o r m e d b y B a l a s u b r a m a n i a m e t a l . ( 8 6 ) . I n t h e s e s t u d i e s w h e n 4 - a m i n o p y r a z o l o p y r i m i d i n e , a n a d e n i n e a n a l o g u e w h i c h r e d u c e s h e p a t i c s e c r e t i o n o f p l a s m a l i p o p r o t e i n s , w a s a d m i n i s t e r e d t o r a t s t h e r e w a s a c o n c o m i t a n t l o w e r i n g o f t h e p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l a n d a 5-30 f o l d i n c r e a s e i n t h e a c t i v i t y o f HMGR i n l u n g a n d k i d n e y . C h o l e s t e r o l 14 14 s y n t h e s i s f r o m C - a c e t a t e a n d C - o c t a n o a t e i n b o t h t i s s u e s w a s a l s o i n c r e a s e d t h r e e f o l d , w h e r e a s 22 i n c r e a s e s i n t h e s y n t h e s i s o f s a p o n i f i a b l e l i p i d s w e r e n o t o b s e r v e d . P l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s i n c r e a s e d a n d HMGR a c t i v i t y i n l u n g a n d k i d n e y d e c r e a s e d o n c e t h e a d m i n i s t r a -t i o n o f 4 - a m i n o p y r a z o l o p y r i m i d i n e w a s d i s c o n t i n u e d . T h e a u t h o r s s t a t e t h a t t h e " . . . d a t a a r e c o n s i s t e n t w i t h t h e h y p o t h e s i s t h a t l o w l e v e l s o f HMGR a c t i v i t y a n d c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s t h a t a r e n o r m a l l y o b s e r v e d i n c e r t a i n n o n h e p a t i c t i s s u e s o f t h e r a t a r e d u e t o a n a c t i v e f o r m o f f e e d b a c k r e g u l a t i o n m e d i a t e d b y c h o l e s t e r o l c a r r i e d i n p l a s m a l i p o -p r o t e i n s " ( 8 6 ) . M o r e r e c e n t l y B r o w n a n d G o l d s t e i n ( 8 7 ) h a v e c o n f i r m e d t h e i r o r i g i n a l p r o p o s a l f o r a r e g u l a t o r y r o l e o f L D L d e r i v e d c h o l e s t e r o l . M o l e c u l e s o f L D L c i r c u l a t i n g i n t h e b l o o d e n t e r i n d e n t e d c o a t e d p i t s o n t h e c e l l s u r f a c e w h i c h c o n t a i n r e c e p t o r s f o r L D L . When t h e m o l e c u l e s b i n d t o t h e r e c e p t o r t h e c o a t e d p i t i n v a g i n a t e s t o f o r m a c o a t e d e n d o -c y t i c v e s c i c l e . W i t h i n t h e c e l l l y s o s o m a l h y d r o l y s i s d e g r a d e s t h e a p o p r o t e i n t o a m i n o a c i d s a n d r e l e a s e s t h e l i p i d f r a c t i o n . F r e e c h o l e s t e r o l i s p r o d u c e d w h i c h t h e n p r o v i d e s n e g a t i v e f e e d b a c k f o r t h e s y n t h e s i s o f b o t h L D L r e c e p t o r s , a n d c h o l e s t e r o l . ( 8 8 ) . I n v i t r o s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s w a s s t i m u l a t e d w h e n e p i d i d y m a l f a t p a d s w e r e c u l t u r e d i n t h e p r e s e n c e o f l i p o p r o t e i n - f r e e s e r u m ( 8 5 ) . A d d i t i o n o f V L D L o r L D L t o t h e m e d i u m s u p p r e s s e d s y n t h e s i s , w h e r e a s a d d i t i o n o f HDL d i d n o t ( 8 5 ) . F e a r s a n d U m p l e b y ( 2 1 ) 23-have, i n f a c t , p r o v i d e d e v i d e n c e f o r t h e e x i s t e n c e and o p e r a t i o n o f a l i p o p r o t e i n r e c e p t o r s y s t e m i n n o n h e p a t i c t i s s u e s i n t h e r a t w h i c h c o n t r o l s t h e change i n c h o l e s t e r o l b i o s y n t h e s i s . A n o t h e r s t u d y has been r e p o r t e d w h i c h d e m o n s t r a t e s t h e p o t e n t i a l c a p a c i t y o f n o n h e p a t i c t i s s u e s t o c o n t r i b u t e s i g n i f i c a n t l y t o t o t a l body c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n ob e s e mice ( 2 3 ) . G e n e t i c a l l y o bese mice have h i g h e r p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s t h a n t h e i r l e a n l i t t e r m ates. The a c t i v i t y o f HMGR i s t h e same o r h i g h e r i n w h i t e a d i p o s e t i s s u e i n t h e obese mice w h i l e i t i s l o w e r i n brown a d i p o s e t i s s u e and l i v e r ( 2 3 ) . S t a r v i n g t h e mice f o r 24 h o u r s r e s u l t e d i n a d e c r e a s e i n HMGR a c t i v i t y i n w h i t e a d i p o s e t i s s u e f r o m o b e s e mice o n l y , w h i c h was p a r a l l e l e d by a low-e r i n g o f p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s . T h i s s t u d y i n d i c a t e s t h a t w h i t e a d i p o s e t i s s u e i n obese mice p r o d u c e s p r o p o r t i o n -a t e l y more c h o l e s t e r o l p e r u n i t body w e i g h t t h a n t i s s u e i n t h e l e a n m i c e . The s t u d y a l s o shows t h a t t h e a c t i v i t y l e v e l o f HMGR i n w h i t e a d i p o s e t i s s u e p o s i t i v e l y c o r r e l a t e s w i t h c h o l e s t e r o l l e v e l s . T h e r e f o r e , i t seems q u i t e p l a u s i b l e t h a t n o n h e p a t i c t i s s u e s , u n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n s o r p a t h o l o g i c a l s t a t e s , c o u l d make a s i g n i f i c a n t c o n t r i -b u t i o n t o t h e t o t a l body c h o l e s t e r o l p o o l . F. M e t h o d o l o g i c a l C o n s i d e r a t i o n s B e f o r e t h e p r o b l e m s a s s o c i a t e d w i t h d e t e r m i n i n g a b s o l u t e r a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s a r e d i s c u s s e d , i t w i l l be i n s t r u c t i v e a t t h i s t i m e t o o u t l i n e a g e n e r a l s c h e m e o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s . T h e o r i g i n o f t h e c a r b o n a t o m s w h i c h a r e i n c o r p o r a t e d i n t h e 27 c a r b o n m o l e c u l e o f c h o l e s t e r o l i s d i v e r s e a n d s u b j e c t t o t h e a v a i l a b i l i t y o f t h e v a r i o u s p r e c u r s o r s u b s t r a t e s ( F i g u r e 2 ) . N e a r l y a l l t h e e n d o g e n o u s c h o l e s t e r o l i s s y n t h e s i z e d f r o m t w o c a r b o n u n i t s o f a c e t y l C o A w h i c h a r e d e r i v e d f r o m a c e t a t e a n d c a t a b o l i s m o f g l u c o s e , f a t t y a c i d s , a m i n o a c i d s a n d c i t r i c a c i d ( 2 8 ) . P a r t s o f t h e p a t h w a y l e a d i n g t o t h e s y n t h e s i s o f c h o l e s t e r o l s t a r t i n g w i t h a c e t y l C o A , a r e common t o t h e s y n t h e s i s o f o t h e r c o m p o u n d s ( F i g u r e 2 ) . T h e e n z y m e s r e q u i r e d f o r t h e i n i t i a l s t e p s o f c h o l e s t -e r o l s y n t h e s i s a r e l o c a t e d i n t h e c y t o s o l ; h e n c e , t h e a c e t y l C o A p r o d u c e d i n m i t o c h r o n d r i a f r o m t h e o x i d a t i o n o f f a t t y a c i d s m u s t b e t r a n s p o r t e d t h r o u g h t h e m i t o c h o n d r i a l mem-b r a n e t o t h e c y t o s o l . A c e t y l C o A d o e s n o t p a s s f r e e l y t h r o u g h t h e m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s ; t h e r e a r e , h o w e v e r , m e c h a n i s m s b y w h i c h t h e 2 c a r b o n u n i t i s t r a n s p o r t e d t h r o u g h t h e m e m b r a n e ( 2 5 ) . T h e f i r s t m e c h a n i s m i n v o l v e s c a r n i t i n e , a s m a l l m o l e c u l e p r o d u c e d f r o m t w o a m i n o a c i d s , w h i c h f a c i l i t a t e s t h e t r a n s p o r t o f a c y l c o m p o u n d s i n a n d o u t o f t h e m i t o c h o n d r i a ( 2 5 ) : A c e t y l C o A + C a r n i t i n e ^ A c e t y l C a r n i t i n e + C o A T h e o t h e r m e c h a n i s m r e q u i r e s o x a l o a c e t a t e f o r t h e r e a c t i o n w i t h a c e t y l C o A t o y i e l d c i t r a t e w h i c h e a s i l y p e r m e a t e s t h e Some Amino A c i d s 25 Glucose C i t r a t e jT A c e t y l CoA < >Acetate I A c e t o a c e t y l CoA *C Ketone bodies Acetone t Acetoacetate ^" HMG CoA<-.Malonyl C o A — > F a t t y a c i d s 'HMG Leucine Mevalonate \ M e t h y l g l u t a c o n y l CoA f D i m e t h y l a l l y l - P - P . t P r e n o i c acids' i l i e I I •Isopentenyl tRNA Geranyl-P-P I D o l i c h o K < Farnesyl-P-P • Ubiquinone Squalene I Squalene L a n o s t e r o l 2^-dehydro-c h o l e s t e r o l 7-aehydro-c h o l e s t e r o l 7-dehydro-c h o l e s t e r o l ^ if V i t a m i n C h o l e s t e r o l C h o l e s t e r o l esters* • C h o l e s t e r o l s u l f a t e 7-hydroxy c h o l e s t e r o l * B i l e a c i d s ' 2 0 - h y d r o x y c h o l e s t e r o l T * S t e r o i d Hormones F i g u r e 2 . P a t h w a y o f M e t a b o l i t e s f o r t h e S y n t h e s i s o f C h o l e s t e r o l a n d i t s P r o d u c t s . F i g u r e a d a p t e d f r o m S a b i n e , J . R. i n C h o l e s t e r o l ( 2 8 ) . 26 m e m b r a n e s . O n c e t h e c i t r a t e h a s e n t e r e d t h e c y t o s o l i t c a n b e c l e a v e d b y a n e n z y m e e x c l u s i v e t o t h e c y t o p l a s m , c i t r a t e c l e a v a g e e n z y m e ( 2 8 ) . I n t h e p r e s e n c e o f A T P a n d c o e n z y m e A t h e e n z y m i c r e a c t i o n r e g e n e r a t e s a c e t y l C o A a n d o x a l o -a c e t a t e ( 2 5 ) . I n M i t o c h o n d r i a : A c e t y l C o A + O x a l o a c e t a t e — > C i t r a t e + C o A I n C y t o s o l : ^ • 4 . a. Tvm^, ^ * c i t r a t e c l e a v a g e . . , , _ , , , C i t r a t e + A T P + C o A — > A c e t y l C o A + O x a l o a c e t a t e e n z y m e + ADP + P. l One o t h e r m e c h a n i s m f o r t h e t r a n s p o r t o f a c e t y l u n i t s o u t o f m i t o c h o n d r i a may i n v o l v e a c e t o a c e t a t e (89) e s p e c i a l l y i n t i s s u e s s u c h a s human a d i p o s e t i s s u e w h e r e t h e c i t r a t e c l e a -v a g e e n z y m e a c t i v i t y i s l o w ( 9 0 ) . A c e t y l C o A i s n o t t h e o n l y s u b s t r a t e u t i l i z e d f o r c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s ; F i g u r e 2 i n d i c a t e s w h e r e o t h e r c o m p o u n d s e n t e r a n d l e a v e t h e p a t h w a y . F r o m t h i s s c h e m e i t c a n b e s e e n t h a t t h e a m o u n t o f c h o l e s t e r o l p r o d u c e d may b e a l t e r e d i f s u b s t r a t e s a r e s h u n t e d a w a y f r o m t h e c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s p a t h w a y t o p r o d u c e o t h e r c o m p o u n d s s u c h a s v i t a m i n D^, •. d o l i c h o l , u b i q u i n o n e a n d k e t o n e b o d i e s . T h e a m o u n t o f c h o l e s t e r o l a v a i l a b l e f o r s t o r a g e a s c h o l e s t e r -o l e s t e r o r f o r p a c k a g i n g i n l i p o p r o t e i n s w i l l a l s o b e g o v e r n e d b y t h e m e t a b o l i c d e m a n d s f o r c o m p o u n d s s y n t h e s i z e d f r o m c h o l e s t e r o l ; f o r e x a m p l e , b i l e a c i d s a n d s t e r o i d s e x h o r m o n e s . I n v e s t i g a t i o n s i n t o t h e c o n t r o l o f c e l l u l a r 27 c h o l e s t e r o g e n e s i s h a v e c e n t e r e d a r o u n d t h e e n z y m e HMGR, t h e r a t e l i m i t i n g e n z y m e o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s t h a t c a t a l y z e s t h e r e d u c t i o n o f HMG C o A t o m e v a l o n a t e ( F i g u r e 2 ) . T h e r e f o r e , t h e m e c h a n i s m s b y w h i c h n u m e r o u s d i e t a r y , l i p o p r o t e i n , h o r m o n a l a n d t i m e - d e p e n d e n t f a c t o r s i n f l u e n c e t h e a c t i v i t y o f t h i s e n z y m e i n s e v e r a l t y p e s o f m a m m a l i a n c e l l s , h a v e b e e n t h e s u b j e c t o f i n t e n s e i n v e s t i g a t i o n . T h e k e y s u b s t r a t e i n t h e s e s t u d i e s , HMG C o A , i s p r o d u c e d i n t h e c e l l u l a r c y t o s o l f r o m a c e t y l C o A w h i c h i s d e r i v e d p r i n c i p a l l y f r o m c i t r a t e g e n e r a t e d i n t h e m i t o c h o n d r i a ( 2 5 ) . T h i s i s t h e r e f o r e a common b r a n c h i n g p o i n t f o r p a t h -w a y s w h i c h u t i l i z e a c e t y l C o A . T h e p r o v i s i o n o f a n a d e -q u a t e s u p p l y o f s u b s t r a t e f o r c h o l e s t e r o g e n e s i s may b e c l o s e l y l i n k e d t o t h e d e m a n d o f o t h e r m e t a b o l i c p r o c e s s e s t h a t a l t e r t h e a v a i l a b i l i t y o f c y t o s o l i c a c e t y l C o A . T h u s t h e e x t e n t t o w h i c h a n i n c r e a s e d d e m a n d f o r t h e p r o d u c t s o f a n y o f t h e s e p r o c e s s e s , i n c l u d i n g c h o l e s t e r o l , i s m e t , may d e p e n d o n t h e r e l a t i v e i m p o r t a n c e o f t h e c e l l ' s o t h e r m e t a b o l i c a c t i v i t i e s a t t h a t p a r t i c u l a r t i m e . HMGR i s t h e l i m i t i n g e n z y m e o f a t l e a s t t w o o t h e r p a t h -w a y s ; u b i q u i n o n e ( 2 4 ) a n d d o l i c h o l ( 2 5 ) s y n t h e s i s . H i g h l e v e l s o f a c t i v i t y o f HMGR d o n o t , t h e r e f o r e , n e c e s s a r i l y i n d i c a t e i n c r e a s e d c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s . T h i s p o i n t h a s b e e n e x e m p l i f i e d b y a s t u d y p e r f o r m e d b y J a m e s a n d K a n d u t s c h ( 8 9 ) o n m i c e a g e d 3-7 d a y s i n w h i c h t h e y o b -s e r v e d a s h a r p i n c r e a s e i n t h e p r o d u c t i o n o f d o l i c h o l , 28 a b r a n c h p r o d u c t i n t h e c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s p a t h w a y , i n b r a i n t i s s u e w i t h o u t a c o n c o m i t a n t i n c r e a s e i n s t e r o l s y n -t h e s i s . B e n s c h e t a l . ( 2 7 ) h a v e c o n f i r m e d t h e s e f i n d i n g s b y u s i n g a - c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r o f HMGR, ML 2 3 6 B, t o s t u d y t h e c o r r e l a t i o n b e t w e e n e n z y m e a c t i v i t y a n d t h e i n c o r p o r a -14 t i o n o f C - a c e t a t e i n t o s t e r o l i n r a t t i s s u e a n d f i b r o -b l a s t s ( 2 7 ) . A l a c k o f c o r r e l a t i o n b e t w e e n e n z y m e a c t i v i t y a n d s t e r o l s y n t h e s i s w a s d e m o n s t r a t e d w h i c h i n d i c a t e s t h a t c a u t i o n s h o u l d b e e x e r c i s e d i n r e l a t i n g HMGR a c t i v i t y t o c h o l e s t e r o l b i o s y n t h e s i s . 14 14 T h e u s e o f l a b e l l e d C - a c e t a t e , o r a n y C - l a b e l l e d s u b s t r a t e f o r c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i s c o n s i d e r e d a n u n r e l i a -b l e i n d i c a t o r o f a b s o l u t e r a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s . S y n t h e t i c r a t e s o f s t e r o l s may b e u n d e r e s t i m a t e d b e c a u s e o f s u b s t r a t e d i l u t i o n b y a n e n d o g e n o u s p o o l o r b e c a u s e o f a l i m i t e d r a t e o f e n t r y o f s u b s t r a t e i n t o t h e c e l l ( 9 1 ) . A n d e r s e n a n d D i e t s c h y ( 9 1 ) h a v e d e m o n s t r a t e d t r i t i a t e d 3 ( H) w a t e r t o b e a s u p e r i o r s u b s t r a t e f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e a b s o l u t e r a t e o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s . T h e i n t r a -3 c e l l u l a r c o m p a r t m e n t i s r e a d i l y a c c e s s i b l e t o t h e H w a t e r 3 a n d H w a t e r d o e s n o t r e q u i r e e x t e n s i v e m e t a b o l i s m t o b e i n c o r p o r a t e d i n t o t h e s t e r o l s . A l s o , t h e u s e o f a h i g h 3 s p e c i f i c r a d i o a c t i v i t y o f H w a t e r p r e v e n t s t h e p o s s i b i l i t y o f a d i l u t i o n a l e f f e c t b y t h e m e t a b o l i c g e n e r a t i o n o f u n -l a b e l l e d w a t e r ( 9 1 ) . S t u d i e s c o m p a r i n g t h e r a t e s o f a p p a r e n t > 29 s y n t h e s i s y i e l d e d b y t h e v a r i o u s l a b e l l e d s u b s t r a t e s s u g g e s t -e d t h a t t r i t i a t e d w a t e r i s t h e m o s t r e l i a b l e s u b s t r a t e t o u s e f o r t h i s p u r p o s e ( 9 1 , 9 2 ) . A s p r e v i o u s l y m e n t i o n e d i n C h a p t e r I , t h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y was t o d e t e r m i n e t h e r a t e o f c h o l e s t e r o l s y n t h e -s i s i n w h i t e a d i p o s e t i s s u e a n d i n t e s t i n e i n n e o n a t a l r a t s a n d t o d e t e r m i n e i f r a i s i n g p u p s i n d i f f e r e n t s i z e d l i t t e r s h a s a n e f f e c t o n t h e r a t e o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s d u r i n g t h e n e o n a t a l p e r i o d . A l s o o f i n t e r e s t , i s t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e i n t e s t i n e i s t h e s o u r c e o f t h e h i g h p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s ( 2 2 0 +_ 13 mg%) s e e n o n d a y 7 i n W i s t a r r a t s r a i s e d i n l i t t e r s o f 3 ( 2 ) . R a t s r a i s e d i n l i t t e r s o f 14 h a d m u c h l o w e r b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s ( 1 2 5 +_ 9 mg%) ( 2 ) . T h e r a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s t h r o u g h o u t t h e e a r l y p o s t n a t a l p e r i o d i n p r o x i m a l a n d d i s t a l i n t e s t i n e w e r e l o o k e d a t s e p a r a t e l y s i n c e t h e r e h a v e b e e n r e p o r t s ( 8 2 - 8 4 ) t h a t t h e i r s y n t h e t i c r a t e s a r e d i f f e r e n t i n t h e a d u l t s a n d t h a t t h e s i t e w h i c h i s s y n t h e s i z i n g c h o l e s t e r o l m o r e a c t i v e l y may c h a n g e w i t h a c h a n g e i n d i e t ( 8 2 ) . 30 C H A P T E R I I I METHODS AND M A T E R I A L A. E x p e r i m e n t a l D e s i g n T h r e e d i f f e r e n t l i t t e r s i z e s ( 4 , 8 a n d 14 p u p s / d a m ) w e r e e s t a b l i s h e d i n a m a n n e r d e s c r i b e d i n S e c t i o n I I I - B . L i t t e r s c o n t a i n i n g 8 p u p s w e r e u s e d t o e x a m i n e how t h e r a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s f l u c t u a t e d u r i n g t h e p o s t -n a t a l p e r i o d f r o m d a y 1 t o d a y 2 1 . F o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e r a t e o f s y n t h e s i s o n d a y 1 a l i t t e r s i z e o f 8 w a s c h o s e n b e c a u s e i t i s n e i t h e r e x c e e d i n g ^ l a r g e n o r s m a l l a n d a l s o , a dam n e a r l y a l w a y s d e l i v e r e d m o r e t h a n 8 p u p s , 1 2 - 1 3 o n a v e r a g e , s o t h a t i t w a s s i m p l y a m a t t e r o f r e m o v i n g e n o u g h p u p s f r o m t h e l i t t e r t o l e a v e h e r w i t h 8 p u p s f o r t h e i n i t i a l 24 h o u r s . U s i n g t h i s a p p r o a c h a v o i d e d h a v i n g t o t o u c h t h e o t h e r p u p s w h i c h s o m e t i m e s r e s u l t s i n t h e dam r e j e c t i n g t h e m . T h e l i t t e r s i z e s o f 4 a n d 14 w e r e e s t a b l i s h e d t o c o m p a r e p o s s i b l e m e t a b o l i c d i f f e r e n c e s t h a t may r e s u l t f r o m a s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n f o o d i n t a k e a n d t h e r e s u l t i n g w e i g h t g a i n . O t h e r s t u d i e s h a v e a l r e a d y d e m o n s t r a t e d t h a t s i g n i f i c a n t w e i g h t d i f f e r e n c e s a r e p r o d u c e d b e t w e e n r a t s r a i s e d i n l i t t e r s o f 3 t o 6 a n d t h o s e r a i s e d i n l i t t e r s o f 14 t o 1 8 . ( 2 , 3, 9 3 ) . L i v i n g c o n d i t i o n s f o r t h e a n i m a l s , w h i c h w i l l b e e l a b o r a t e d u p o n i n t h e f o l l o w i n g s e c t i o n , w e r e c o n t r o l l e d f o r t e m p e r a t u r e , t h e n u m b e r o f h o u r s o f e x p o s u r e t o l i g h t , a n d t h e s i z e o f l i t t e r s . Chow p e l l e t a n d w a t e r w e r e p r o -v i d e d a d l i b i t u m t o t h e d a m s ; f o o d i n t a k e b y t h e p u p s was n o t a r t i f i c i a l l y a u g m e n t e d a n d was l i m i t e d o n l y b y t h e a b i l i t o f t h e dam t o p r o d u c e m i l k . E x c e p t f o r c o n t r o l l i n g t h e n u m b e r o f h o u r s o f l i g h t e x p o s u r e , n o a t t e m p t w a s made t o i n f l u e n c e t h e a n i m a l s ' a c t i v i t y l e v e l s . T h e r a t e o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n t h e v a r i o u s t i s s u e s w a s m e a s u r e d i n v i t r o b y c u l t u r i n g a n a c c u r a t e l y 3 w e i g h e d p o r t i o n o f t i s s u e w i t h I^O a n d s u b s e q u e n t l y d e t e r -m i n i n g t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e f r e e c h o l e s t e r o l i s o l a t -e d b y a s o l v e n t l i p i d e x t r a c t i o n p r o c e d u r e a n d t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y . T h e s e t e c h n i q u e s a n d c u l t u r e c o n d i t i o n s a r e d e s c r i b e d i n d e t a i l i n S e c t i o n s I I I - C a n d I I I - D . I n a l l e x p e r i m e n t s t h e r a t s w e r e k i l l e d o n a p r e -d e t e r m i n e d d a y a n d a t t h e same t i m e i n t h e l i g h t c y c l e . T h e r a t s r a i s e d i n l i t t e r s o f 8 w e r e b r e d a n d t h e i r t i s s u e s a s s a y e d a t a n e a r l i e r d a t e t h a n t h o s e r e a r e d i n l i t t e r s o f 4 a n d 1 4 . B. A n i m a l s M a l e a n d f e m a l e W i s t a r r a t s ( C h a r l e s R i v e r , C a n a d a ) w e r e e x p o s e d t o a t w e l v e h o u r c y c l e o f l i g h t ( 1 8 0 0 - 0 6 0 0 h o u r s ) a n d d a r k ( 0 6 0 0 - 1 8 0 0 h o u r s ) i n a r o o m m a i n t a i n e d a t 2 0°C. S e v e r a l r a t s w e r e m a t e d o n t h e same d a y s o t h a t a m i n i m u m o f t h r e e l i t t e r s w o u l d b e b o r n o n t h e same d a y . A l l l i t t e r s w e r e r e d u c e d o r a u g m e n t e d t o t w e l v e p u p s p e r dam o n D a y 1. On D a y 3, t h e l i t t e r s w e r e r e d u c e d t o f o u r ( s m a l l l i t t e r ) a n d e i g h t ( m e d i u m l i t t e r ) p u p s p e r dam, o r a u g m e n t e d t o f o u r t e e n ( l a r g e l i t t e r ) p u p s p e r dam i n t h e f o l l o w i n g m a n n e r : H a l f t h e n u m b e r o f p u p s r e q u i r e d t o make up t h e d e s i r e d l i t t e r s i z e w e r e o b t a i n e d f r o m o n e o f t h e o t h e r l i t t e r s . F o r e x a m p l e , 7 p u p s w e r e t a k e n f r o m o n e l i t t e r a n d a d d e d t o 7 p u p s i n a n o t h e r l i t t e r t o make a t o t a l o f 14 p u p s . S i m i l a r l y , f o r t h e l i t t e r s w i t h f o u r p u p s , 2 p u p s w e r e o b t a i n e d f r o m o n e l i t t e r a n d a d d e d t o 2 p u p s o f a n o t h e r l i t t e r . S i n c e s i x p u p s w e r e r e q u i r e d f o r e a c h a s s a y , t w o l i t t e r s w i t h 4 p u p s i n e a c h w e r e e s t a b l i s h e d i n o r d e r t o p r o d u c e a p o o l o f 8 p u p s f r o m w h i c h 6 p u p s , 3 f r o m e a c h dam, w e r e r a n d o m l y c h o s e n t o a s s a y . S i x p u p s w e r e r a n d o m l y c h o s e n f o r a s s a y f r o m t h e l i t t e r o f 1 4 . R a t s w e r e n o t r e a r r a n g e d i n t o d i f f e r e n t s i z e d l i t t e r s u n t i l t h e t h i r d d a y b e c a u s e W u r t m a n a n d M i l l e r ( 9 3 ) h a v e s h o w n t h a t p u p s r a i s e d i n s m a l l e r l i t t e r s f r o m s i x h o u r s a f t e r b i r t h d o n o t n e c e s s a r i l y b e c o m e h e a v i e r t h a n p u p s r a i s e d i n l a r g e r l i t t e r s . C. T i s s u e P r e p a r a t i o n a n d C u l t u r e C o n d i t i o n s R a t s w e r e k i l l e d b y c e r v i c a l d i s l o c a t i o n a n d d e c a p i -t a t i o n m i d w a y t h r o u g h t h e d a r k c y c l e , s t a r t i n g a t 1 2 0 0 h o u r s . O n l y t w o r a t s w e r e s a c r i f i c e d a t o n e t i m e , s o t h a t t h e t i s s u e s w e r e o n i c e n o l o n g e r t h a n t e n m i n u t e s . A l s o , w h e n t h e s m a l l a n d l a r g e l i t t e r s w e r e a n a l y z e d , o n e p u p f r o m e a c h l i t t e r s i z e f o r m e d t h e p a i r t o b e k i l l e d ; a n d , i f a " s m a l l l i t t e r " p u p w a s f i r s t i n t h e p a i r t o b e k i l l e d , a " l a r g e l i t t e r " p u p w a s k i l l e d f i r s t i n t h e n e x t p a i r . T h i s , h o p e f u l l y , a v o i d e d d i f f e r e n c e s i n r e s u l t s w h i c h may a r i s e d u e t o t h e l e n g t h o f t i m e t h e t i s s u e s w e r e o n i c e . T h e i n t e s t i n e f r o m t h e m o s t p r o x i m a l d u o d e n u m t o t h e c a e c u m w a s e x c i s e d a n d t h e i n t r a - a b d o m i n a l f a t a n d p a n c r e a s w e r e r e m o v e d f r o m t h e o u t e r w a l l . I n t e s t i n e s w e r e s e c t i o n e d i n t o t h r e e e q u a l l e n g t h d i v i s i o n s : p r o x i m a l , m i d d l e a n d d i s t a l . T h e m i d d l e s e c t i o n w a s d i s c a r d e d . P r o x -i m a l a n d d i s t a l s e c t i o n s w e r e f l u s h e d t h r o u g h w i t h i c e -c o l d K r e b s - H e n s l e i t B i c a r b o n a t e b u f f e r ( p H 7 . 4 0 ) e q u i l i b r a t e d w i t h 0 2 - C 0 2 ( 9 5 % - 5 % ) ( 7 8 ) a n d c u t l o n g i t u d i n a l l y . G l u t e a l a d i p o s e t i s s u e w a s a l s o e x c i s e d a n d p l a c e d i n t h e i c e - c o l d K r e b s - H e n s l e i t b u f f e r . A f t e r a c c u r a t e l y w e i g h i n g t h e t i s s u e , u s u a l l y b e t w e e n 2 0 0 - 300 mg d e p e n d i n g o n t h e q u a n t i t y a v a i l a b l e , t h e i n -t e s t i n e w a s c u t i n t o 2mm s e c t i o n s a n d a d i p o s e t i s s u e i n t o 2 0 - 3 0 mg p i e c e s . When t h e a m o u n t o f a v a i l a b l e t i s s u e e x c e e d e d 3 00 mg, t h e m o s t p r o x i m a l p o r t i o n o f t h e p r o x i m a l s e g m e n t a n d t h e m o s t d i s t a l p o r t i o n o f t h e d i s t a l s e g m e n t w e r e i n c u b a t e d . T i s s u e s w e r e t h e n i n c u b a t e d f o r f i f t e e n m i n u t e s i n o x y g e n a t e d K r e b s - H e n s l e i t b u f f e r ( 1 . 0 m l / 1 0 0 mg t i s s u e ) , p l u s 5 mM g l u c o s e , a t 37°C i n a D u b n o f f m e t a b o l i c s h a k i n g i n c u b a t o r (CGA P r e c i s i o n S c i e n t i f i c ) a t 1 2 0 o s c i l l a t i o n s / m i n u t e p r i o r t o t h e a d d i t i o n o f 10 m C i i n 50 u l 3 H w a t e r ( A m e r s h a m , O a k v i l l e , O n t . ) ( 9 1 , 9 4 ) . A t t h e e n d o f a t w o h o u r i n c u b a t i o n p e r i o d t h e f l a s k s w e r e p l a c e d i n a n i c e - b a t h t o s t o p t h e r e a c t i o n . P r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s 3 w e r e p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e r a t e o f H w a t e r i n c o r p o r a t i o n i n t o c h o l e s t e r o l w a s l i n e a r o v e r a p e r i o d o f 3 h o u r s f o r l i v e r , p r o x i m a l i n t e s t i n e a n d a d i p o s e t i s s u e . E i g h t f l a s k s , e a c h c o n t a i n i n g 3 0 0 mg o f t i s s u e w e r e i n c u b a t -3 e d w i t h H w a t e r u n d e r t h e c o n d i t i o n s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . A t 0, 1, 2, a n d 3 h o u r s o f i n c u b a t i o n 2 f l a s k s w e r e r e m o v e d a n d t h e r e a c t i o n s t o p p e d b y p l a c i n g t h e f l a s k s i n a n i c e b a t h T h i s p r o c e d u r e w a s p e r f o r m e d f o r e a c h o f t h e t h r e e t i s s u e s m e n t i o n e d . C e l l v i a b i l i t y w a s d e t e r m i n e d d u r i n g t h e t h r e e h o u r c u l t u r e p e r i o d u s i n g t h e t r y p a n b l u e ( 0 . 0 5 % ) e x c l u s i o n m e t h o d ( 7 9 ) . P r i o r t o t h e d e t e r m i n a t i o n o f c e l l v i a b i l i t y t h e a d i p o s e t i s s u e w a s i n c u b a t e d w i t h c o l l a g e n a s e ( W o r t h i n g t o n B i o c h e m i c a l C o r p . , F r e e h o l d , N . J . ) ( 2 mg c o l l a g e n a s e / m l ) b y t h e m e t h o d p r e v i o u s l y d e s c r i b e d b y K r a u s e e t a l . ( 9 5 ) . S c r a p i n g s f r o m t h e i n t e s t i n a l w a l l w e r e s u s p e n d e d i n t h e t r y p a n b l u e s o l u t i o n f o r t h e d e t -e r m i n a t i o n o f c e l l v i a b i l i t y b y d r a w i n g t h e m i n t o a p i p e t t e a n d g e n t l y e x p e l l i n g t h r e e t i m e s . D. A n a l y t i c a l P r o c e d u r e s A s m a l l a l i q u o t o f c u l t u r e m e d i a w a s t a k e n t o d e t e r m i n e i t s s p e c i f i c r a d i o a c t i v i t y b y c o u n t i n g i n a B e c k m a n L S 9 0 0 0 s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r u s i n g ACS ( A m e r s h a m , A r l i n g t o n H e i g h t s 1 1 1 . ) s c i n t i l l a t i o n f l u i d . C o n t e n t s o f t h e c u l t u r e f l a s k s w e r e t r a n s f e r r e d t o g l a s s s c r e w c a p v i a l s a n d c e n t r i f u g e d ( B e c k m a n M o d e l J B 6 ) a t 3 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s a n d d e c a n t e d . T h e p e l l e t w a s w a s h e d w i t h s a l i n e , c e n t r i f u g e d a n d d e c a n t e d 3 t h r e e t i m e s t o r e m o v e t h e e x c e s s H w a t e r . A f t e r w a s h i n g , t h e t i s s u e w a s h o m o g e n i z e d i n 8.0 m l o f a c h l o r o f o r m -m e t h a n o l ( b o t h f r o m F i s h e r S c . C o . , N . J . ) ( 2 : 1 ) s o l u t i o n u s i n g a P o t t e r - E l v e j h e m h o m o g e n i z e r ( 5 0 s t r o k e s p e r s a m p l e ) ( 9 6 ) . T h e h o m o g e n a t e a n d r i n s e s o l u t i o n , f r o m c l e a n i n g t h e h o m o g e n i z e r s h a f t , w a s f i l t e r e d t h r o u g h a f l u t e W h a t m a n No. 1 f i l t e r i n t o s c r e w c a p v i a l s . F i l t e r s w e r e t h e n r i n s e d w i t h 2.0 m l o f t h e c h l o r o f o r m - m e t h a n o l s o l u t i o n t h r e e t i m e s . F i l t e r e d s o l u t i o n s w e r e p l a c e d i n a 40°C w a t e r b a t h a n d e v a p o r a t e d u n d e r a n i t r o g e n f l u s h ( M / e r N-E v a p , O r g a n o m a t i o n A s s o c i a t i o n I n c . , N o r t h b o r o u g h , Ma.) S a p o n i f i c a t i o n t o p r o d u c e f r e e c h o l e s t e r o l w a s p e r -f o r m e d b y a d d i n g 2.0 ml o f 5 N NaOH t o t h e r e s i d u e , a n d t h e t u b e w h i c h c o n t a i n e d a s m a l l g l a s s m i x i n g b a r w a s s h a k e n v i g o r o u s l y ( 9 6 ) . T h e s o l u t i o n w a s h e a t e d a t 70°C a n d s h a k e n v i g o r o u s l y f o r t h r e e h o u r s i n a m e t a b o l i c s h a k e r ( E v a p o - M i x , B u c h l e r I n s t r u m e n t s , F o r t L e e , N . J . ) ( 9 1 ) . S a p o n i f i e d m i x t u r e s w e r e e x t r a c t e d w i t h 8.0 m l o f p e t r o l e u m e t h e r ( F i s h e r S c i . C o . , N . J . ) t h r e e t i m e s b y s h a k i n g t h e t u b e s h o r i z o n t a l l y a t 1 0 0 o s c i l l a t i o n s p e r m i n u t e f o r 30 m i n u t e s . P h a s e s w e r e s e p a r a t e d b y c e n t r i -f u g i n g ( B e c k m a n , M o d e l J B 6 ) a t 2 0 0 0 r p m f o r 5 m i n u t e s . T h e o r g a n i c p h a s e w a s d e c a n t e d a n d e v a p o r a t e d i n 13 x 1 0 0 mm t e s t t u b e s u n d e r n i t r o g e n f l u s h . E . T h i n L a y e r C h r o m a t o g r a p h y T h e r e s i d u e s w e r e r e d i s s o l v e d i n a s m a l l v o l u m e o f a n h y d r o u s d i e t h y l e t h e r ( F i s h e r S c i . C o . , N . J . ) a n d c h r o m a t o g r a p h e d o n t o a s i l i c a G p l a t e ( P o l y g r a m S i l G, w i t h -o u t g y p s u m , 0.25 mm, B r i n k m a n n I n s t r u m e n t , I n c . , W e s t b u r y , N.Y.) 20- x 20 cm,., 5 s a m p l e s p e r p l a t e . A c h o l e s t e r o l s t a n d a r d (mp. 1 4 8 . 5 - 1 4 9 . 5 ° C , F i s h e r S c i . C o . , N . J . ) w a s a l s o r u n a l o n g w i t h t h e s a m p l e s . C h r o m a t o g r a p h y p l a t e s w e r e d e v e l o p e d i n a s y s t e m o f p e t r o l e u m e t h e r : d i e t h y l e t h e r : g l a c i a l a c e t i c a c i d ( 8 4 : 1 5 : 1 ) a n d , a f t e r d r y i n g , w e r e s p r a y e d w i t h R h o d a m i n e B ( G e l m a n I n s t r . C o . , A n n A r b o r . , M i c h . ) t o v i s u a l i z e t h e b a n d s ( 9 7 ) . B a n d i n g p a t t e r n s w e r e v i s u a l i z e d u n d e r a s h o r t U. V. s o u r c e l a m p . T h e b a n d s w e r e c u t o u t a n d p l a c e d i n s c i n t i l l a t i o n v i a l s c o n t a i n i n g 5.5 m l o f a 0 . 8 % 2, 5 , - d i p h e n y l o x a -z o l e ( P P O ) t o l u e n e s o l u t i o n . V i a l s w e r e s h a k e n v i g o r o u s l y a n d l e f t f o r o n e h o u r b e f o r e c o u n t i n g i n a B e c k m a n L S 9 0 0 0 14 s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r . ( 2 6 , 2 7 ) - C - c h o l e s t e r o l ( A m e r s h a m O a k v i l l e , O n t . ) ( 4 0 , 0 0 0 DPM) w a s a d d e d a s a n i n t e r n a l s t a n d a r d w h e n t h e t i s s u e w a s h o m o g e n i z e d t o d e t e r m i n e t h e e f f i c i e n c y o f l i p i d e x t r a c t i o n ( 7 9 ) . 37 F. C a l c u l a t i o n s 3 T h e c a l c u l a t i o n * f o r t h e i n c o r p o r a t i o n o f H w a t e r 3 i n t o c h o l e s t e r o l ( e x p r e s s e d a s n m o l e s H/g o f t i s s u e / h ) i s p e r f o r m e d a s f o l l o w s ( 9 8 ) : A. D e t e r m i n a t i o n o f t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f 3 ^ 0 i n t h e c u l t u r e m e d i a w a s d o n e b y c o u n t i n g a s m a l l a l i q u o t o f t h e m e d i a a f t e r a p p r o x i m a t e l y 10 m C i w a s a d d e d t o t h e m e d i a . F r o m t h e s e c o u n t s t h e s p e c i f i c a c t i v i t y w a s e x p r e s s e d a s : D P M / n m o l e H 2 0 3 B. T h e c a l c u l a t i o n o f n m o l e s 'of H i n c o r p o r a t e d i n t o t h e n e w l y s y n t h e s i z e d c h o l e s t e r o l w a s p e r f o r m e d b y d i v i d -i n g t h e DPM v a l u e , f o r t h e d e n o v o c h o l e s t e r o l , b y t h e 3 s p e c i f i c a c t i v i t y o f H^O. 3 DPM , n -r- D P M / n m o l e = n m o l e s H c h o l . E x a m p l e -9 M o l e c u l a r w e i g h t o f H^O = 1 8 . 0 g / n m o l e = 1 8 . 0 x 10 g / n m o l e V o l u m e o f c u l t u r e m e d i u m = 2.0 m l = 2.0 g N a n o m o l e s o f H 2 0 : 2.0 g o f H 2 0 = 2.0 g / 1 8 . 0 x 1 0 _ 9 g / n m o l e 9 i n 2 m l o f c u l t u r e = 0 . 1 1 x 10 n m o l e s S p e c i f i c A c t i v i t y o f t h e M e d i u m A r b i t r a r y t o t a l DPM c o u n t f o r 2.0 m l o f m e d i u m = 2.22 x 1 0 1 0 DPM 38 S p e c i f i c a c t i v i t y = T o t a l DPM-j- n m o l e s H^O 10 . 9 = 2.22 x 10 DPM -r- 0 . 1 1 x 10 n m o l e s = 2 0 0 D P M / n m o l e H^O 3 D e t e r m i n a t i o n o f t h e R a t e o f I n c o r p o r a t i o n o f H F o r a s a m p l e w h e r e : T i s s u e W e i g h t = 3 0 0 mg ( 0 . 3 g ) C u l t u r e t i m e = 2.0 h A r b i t r a r y DPM o f i s o l a t e d c h o l e s t e r o l = 3 0 0 0 DPM 3 N a n o m o l e s o f H i n c o r p o r a t e d i n t o i s o l a t e d c h o l e s t e r o l : 3 DPM . — ~ S p e c i f i c a c t i v i t y „ n = n m o l e s H s a m p l e H^O e . g . 3 0 0 0 DPM -H 2 0 0 D P M / n m o l e = 1 5 . 0 n m o l e s 3 H 3 R a t e o f I n c o r p o r a t i o n ( e x p r e s s e d a s n m o l e s H/g o f t i s s u e / h ) e . g . U s i n g t h e a b o v e t i s s u e w e i g h t , c u l t u r e , 3 p e r i o d a n d c a l c u l a t e d v a l u e s f o r n m o l e s H i n c o r p o r a t e d i n t o c h o l e s t e r o l . 1 5 . 0 n m o l e s 3 H - ^ - 0 . 3 0 g 4 - 2.0 h = R a t e o f I n c o r p o r a t i o n 3 = 2 5 . 0 n m o l e s H / g / h G. S t a t i s t i c a l A n a l y s e s T e s t s o f s i g n i f i c a n c e f o r d i f f e r e n c e s i n t h e r a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s , b o d y w e i g h t a n d a d i p o s e t i s s u e w e i g h t a m o n g s t t h e v a r i o u s l i t t e r s i z e s w e r e p e r f o r m e d u s i n g a n a n a l y s i s o f v a r i a n c e m e t h o d d u e t o S c h e f f e ( 9 9 ) . A t t e s t f o r s i n g l e p o o l e d s a m p l e s w a s p e r f o r m e d t o c o m p a r e d i f f e r e n c e s b e t w e e n p r o x i m a l a n d d i s t a l i n t e s t i n e o n i n d i v i d u a l d a y s w i t h i n e a c h l i t t e r s i z e ( 1 0 0 ) . T h e s e a n a l y s e s a r e p r e s e n t e d 39 i n A p p e n d i c e s E-H. T e s t i n g f o r t r e n d s was a c c o m p l i s h e d by u s i n g a n a l y s i s o f v a r i a n c e o r t h o g o n a l p o l y n o m i a l c o n t r a s t t o t h e t i m e f a c t o r and i n t e r a c t i o n s w i t h t h e t i m e f a c t o r ( 1 0 1 ) . These t e s t s d e t e r m i n e t h e f o r m o f t h e r e l a t i o n , i . e . , l i n e a r , q u a d r a t i c o r c u b i c " , e x i s t i n g between t h e t i m e f a c t o r and t h e r a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s . T e s t s o f s i g n i f i c a n c e f o r t h e s e a n a l y s e s were d e t e r m i n e d u s i n g u n i q u e sums o f s q u a r e s ( 1 0 1 ) . These a n a l y s e s a r e p r e s e n t e d i n A p p e n d i x I . In t h e g r a p h s p r e s e n t e d i n t h e r e s u l t s s e c t i o n t h e p o i n t s r e p r e s e n t t h e mean v a l u e s and t h e e r r o r b a r s r e -p r e s e n t t h e s t a n d a r d e r r o r o f t h e mean. 40 C H A P TER I V R E S U L T S A. P r e l i m i n a r y S t u d i e s 1. C e l l V i a b i l i t y C e l l v i a b i l i t y , a s i n d i c a t e d b y t h e c e l l s ' a b i l i t y t o e x c l u d e t r y p a n b l u e , i s s h o w n i n F i g u r e 3 f o r g l u t e a l a d i p o s e t i s s u e a n d p r o x i m a l i n t e s t i n e . A t t h e e n d o f a t h r e e h o u r i n c u b a t i o n p e r i o d a t 3 7 °C, c e l l v i a b i l i t y f o r a d i p o s e t i s s u e d e c r e a s e d f r o m 9 5 % t o 9 1 % w i t h m o s t o f t h e d e c r e a s e o c c u r r i n g d u r i n g t h e f i n a l h o u r . S i m i l a r l y , 9 8 % o f i n t e s t i n a l c e l l s e x c l u d e d t r y p a n b l u e a t t h e b e g i n n i n g o f t h e c u l t u r e p e r i o d , a n d v i a b i l i t y d e -c r e a s e d t o 8 9 % a t t h e e n d o f t h r e e h o u r s . S t e r o l s y n t h e s i s ( F i g . 4 ) w a s n e a r l y l i n e a r o v e r t h e t h r e e h o u r p e r i o d f o r a d i p o s e t i s s u e , i n t e s t i n e a n d l i v e r . 2. E x t r a c t i o n E f f i c i e n c y T h e a d d i t i o n o f ( 2 6 , 2 7 ) -14 C - c h o l e s t e r o l t o t h e h o m o g e n a t e a s a n i n t e r n a l s t a n d a r d i n d i c a t e d t h a t c h o l e s t e r o l e x t r a c t i o n f r o m t h e t i s s u e b y t h e m e t h o d d e s c r i b e d a b o v e w a s , o n a v e r a g e , 85+^ 3% e f f i c i e n t . B. B o d y W e i g h t D i f f e r e n c e s R a i s i n g t h e p u p s i n t h e d i f f e r e n t l i t t e r s i z e s r e -s u l t e d i n a s m a l l b u t s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n b o d y w e i g h t ( F i g . 5) b y d a y 7 b e t w e e n t h e p u p s r e a r e d i n s m a l l l i t t e r s a n d t h o s e r e a r e d i n t h e m e d i u m a n d l a r g e l i t t e r s 4 1 100 90 w H H C D O C D r H t80 o u 70 6o O G l u t e a l A d i p o s e T i s s u e * P r o x i m a l I n t e s t i n e 0 1 . 0 2.0 3.0 T i m e ( h ) F i g u r e 3. P e r c e n t C e l l V i a b i l i t y f o r P r o x i m a l I n t e s t i n e a n d G l u t e a l A d i p o s e T i s s u e . • T i s s u e s w e r e f r o m 2 1 d a y o l d r a t s r a i s e d i n l i t t e r s o f e i g h t 42 1-0 ' 2.0 3-0 T i m e ( h ) F i g u r e 4. I n V i t r o I n c o r p o r a t i o n o f T r i t i a t e d W a t e r a n d C h o l e s t e r o l O v e r T h r e e H o u r s . * L i v e r t i s s u e w a s f r o m a d u l t r a t s a g e d 43 d a y s . ** P r o x i m a l i n t e s t i n e a n d g l u t e a l a d i p o s e t i s s u e w e r e f r o m 2 1 d a y o l d r a t s . E a c h p o i n t r e p r e s e n t s t h e m e an ± S.E.M. o f 6 a s s a y s . fclD xi •H CD >5 O PQ 60 50 30 20 10 0 • k P u p s / L i t t e r ^ 8 P u p s / L i t t e r • l ^ P u p s / L i t t e r T 0 I 1^ A g e ( d ) 43 21 F i g u r e 5. B o d y W e i g h t s o f R a t s R a i s e d i n D i f f e r e n t L i t t e r S i z e s . a , b , c , M e a n s a t t h e s a m e a g e n o t s h a r i n g a common s u p e r -s c r i p t a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p < 0 . 0 5 ) . ( A p p e n d i x H ) . On d a y 14 t h e r e w a s a s m a l l s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n b o d y w e i g h t b e t w e e n p u p s o f s m a l l a n d t h o s e o f m e d i u m l i t t e r s , a s w e l l a s a m u c h l a r g e r d i f f e r -e n c e b e t w e e n p u p s o f t h e f o r m e r t w o l i t t e r s i z e s a n d t h e l a r g e l i t t e r s . B y d a y 2 1 t h e r e w e r e l a r g e s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s a m o n g s t t h e t h r e e l i t t e r s i z e s a n d t h e d i f -f e r e n c e s w e r e t h o s e e x p e c t e d , i . e . , t h e g r e a t e r t h e n u m b e r o f p u p s p e r l i t t e r , t h e l o w e r t h e b o d y w e i g h t . C. C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s C h o l e s t e r o l s y n t h e s i s w a s d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g t h e i n c o r p o r a t i o n r a t e o f t r i t i u m i n t o t h e T L C b a n d t h a t c o r r e s p o n d e d t o t h e s t a n d a r d f r e e c h o l e s t e r o l b a n d . U s i n g t h e d e v e l o p i n g s y s t e m d e s c r i b e d , t h e p h o s p h o l i p i d s r e m a i n -e d a t t h e o r i g i n , f o l l o w e d i n o r d e r b y f r e e c h o l e s t e r o l , f r e e f a t t y a c i d a n d g l y c e r o l . A s m a l l a m o u n t o f l a b e l w as f o u n d i n t h e c h o l e s t e r o l b a n d e v e n w h e n t h e c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d o n i c e ( T a b l e I ) . T h i s b a c k g r o u n d l e v e l , h o w e v e r , w a s o f s u c h l o w m a g n i t u d e t h a t i t w a s n o t n e c e s s a r y t o i n c l u d e i t i n a n y o f t h e c a l c u l a t i o n s . 1. I n t e s t i n a l S y n t h e s i s a . M e d i u m L i t t e r ( 8 p u p s / l i t t e r ) . T h e d e v e l o p m e n t a l p a t t e r n o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n b o t h s e c t i o n s o f t h e i n t e s t i n e i s s h o w n i n F i g u r e 6. S t e r o l s y n t h e s i s i n t h e p r o x i m a l t h i r d o f t h e i n t e s t i n e w a s h i g h a t b i r t h , a n d o n 45 T A B L E I 3 B a s e l i n e V a l u e s f o r t h e I n c o r p o r a t i o n o f H W a t e r i n t o C h o l e s t e r o l i n V a r i o u s T i s s u e s C u l t u r e d o n I c e . H I n c o r p o r a t i o n i n t o C h o l e s t e r o l T i s s u e * ( n m o l e s H/g/3.0 h ) P r o x i m a l I n t e s t i n e 0 . .40 + 0 . 0 1 * * D i s t a l I n t e s t i n e 0 . .40 + 0. 0 1 A d i p o s e T i s s u e 0 . .20 + 0 . 02 L i v e r 1. . 10 + 0 . 13 * T i s s u e s a r e f r o m r a t s a g e d 2 1 d a y s . ** V a l u e s a r e e x p r e s s e d a s t h e mean ± SEM o f 6 a s s a y s . o CD -P W CD O o o -p C •H ^ c ^ O \ •P 03 J-l O ft o o CD -P to 0 o S 60 50 i-l-0 — 30 -20 10 0 J 6 a 46 0 D i s t a l I n t e s t i n e • Proximal I n t e s t i n e O Adipose T i s s u e / / k \ //' 7 14 21 F i g u r e 6. A g e ( d ) 3 ( 8 / L i t t e r ) I n c o r p o r a t i o n o f H W a t e r i n t o C h o l e s t e r o l i n V a r i o u s T i s s u e s f r o m N e o n a t a l R a t s . a , b M e a n s a t t h e s a m e a g e n o t s h a r i n g a common s u p e r -s c r i p t l e t t e r a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p < 0.05 ) . d a y 7 w a s b e l o w 5 0 % o f t h e v a l u e o n d a y 1. On d a y 1 4 , t h e s y n t h e t i c r a t e i n p r o x i m a l i n t e s t i n e h a d d e c l i n e d f u r t h e r t o l e s s t h a n 2 0 % o f t h e v a l u e o f d a y 1. B y d a y 2 1 t h e s y n t h e t i c r a t e h a d r i s e n t o 8 0 % o f t h e d a y 1 v a l u e s . S y n t h e t i c r a t e s i n t h e d i s t a l i n t e s t i n e w e r e e l e -v a t e d a n d n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t o n d a y s 1 a n d 7, d r o p p e d t o l o w l e v e l s b y d a y 14 a n d , d u r i n g t h e t h i r d w e e k , i n c r e a s e d t o a l e v e l n e a r l y t w o f o l d h i g h e r t h a n t h o s e f o u n d a t b i r t h . D i s t a l i n t e s t i n e s y n t h e s i z e d c h o l e s t e r o l a t t w i c e t h e r a t e o f p r o x i m a l i n t e s t i n e o n d a y s 7 a n d 2 1 . No s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n s y n t h e t i c r a t e s f o r t h e s e r e -g i o n s o f i n t e s t i n e w e r e s e e n o n d a y s 1 a n d 1 4 . b . E x p e r i m e n t a l G r o u p s (4 a n d 14 p u p s / l i t t e r ) S i m i l a r t o t h e m e d i u m l i t t e r , s t e r o l s y n t h e s i s i n p u p s r a i s e d i n s m a l l l i t t e r s w a s h i g h o n d a y 7, l o w o n d a y 14 a n d o n c e a g a i n e l e v a t e d o n d a y 2 1 i n b o t h p r o x i m a l a n d d i s t a l i n t e s t i n e ( F i g . 7 ) . P u p s r e a r e d i n l a r g e l i t t e r s d i f f e r e d f r o m t h o s e o f s m a l l l i t t e r s i n t h a t t h e y h a d s y n t h e t i c r a t e s i n t h e d i s t a l a n d p r o x i m a l i n t e s t i n e o n d a y 7 w h i c h w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e l o w v a l u e s o n d a y 14 ( A p p e n d i x E ) , i . e . , s y n t h e s i s i n t h e r a t s f r o m l a r g e l i t t e r s w a s r e d u c e d i n b o t h p r o x i m a l a n d d i s t a l i n t e s t i n e o n d a y 7. T h e s y n t h e t i c r a t e , h o w e v e r , d i d i n c r e a s e , t h r e e f o l d a n d f i v e f o l d o n d a y 2 1 f o r d i s t a l 48 0 D i s t a l I n t e s t i n e % Proximal I n t e s t i n e b 1* i I I I 0 7 lk 21 A g e ( d ) 3 ( 4 / L i t t e r ) I n c o r p o r a t i o n o f H W a t e r i n t o C h o l e s t e r o l i n D i s t a l a n d P r o x i m a l I n t e s t i n e o f N e o n a t a l R a t s M e a n s a t t h e same a g e n o t s h a r i n g a common s u p e r -s c r i p t l e t t e r a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p < 0.05) . P o i n t s a t d a y 1 a r e f r o m t h e m e d i u m l i t t e r . 4 9 » a n d proximal i n t e s t i n e , r e s p e c t i v e l y ( F i g . 8 ) . T h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n s y n t h e t i c r a t e s i n r a t s r a i s e d i n l i t t e r s o f 4 o r 14 p u p s a r e s h o w n i n F i g u r e 9 f o r d i s t a l i n t e s t i n e a n d i n . F i g u r e 10 f o r p r o x i m a l i n t e s t i n e . Irt " t h e d i s t a l i n t e s t i n e , t h e r a t e s o f s t e r o l s y n t h e s i s w e r e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r i n a n i m a l s r a i s e d i n s m a l l l i t t e r s t h a n i n t h o s e r a i s e d i n l a r g e l i t t e r s o n d a y 7 o n l y , a t w h i c h t i m e t h e s y n t h e t i c r a t e w a s n e a r l y t h r e e f o l d h i g h e r . W h e r e a s t h e r a t e o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n d i s t a l i n t e s t i n e o n d a y 2 1 w a s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t b e t w e e n r a t s f r o m s m a l l l i t t e r s a n d t h o s e f r o m l a r g e l i t t e r s , t h e same w a s n o t t r u e o f p r o x i m a l i n t e s t i n e . On d a y 7, r a t s r a i s e d i n s m a l l l i t t e r s s y n t h e s i z e d c h o l e s t e r o l i n t h e p r o x i m a l i n t e s t i n e a t 1. 5.:f o l d ' t h e r a t e .of r a t s r e a r e d i n l a r g e l i t t e r s ( F i g . 1 0 ) . S y n t h e t i c r a t e s w e r e e q u a l f o r b o t h l i t t e r s i z e s o n d a y 1 4 . A c h a n g e o c c u r r e d s o t h a t o n d a y 2 1 , t h e r a t s f r o m t h e l a r g e l i t t e r w e r e s y n t h e s i z i n g c h o l e s t e r o l a t n e a r l y t h r e e f o l d t h e r a t e o f r a t s r a i s e d - i n s m a l l l i t t e r s . D i s t a l i n t e s t i n e s y n t h e s i z e d m o r e c h o l e s t e r o l t h a n p r o x i m a l i n t e s t i n e , o n d a y 7, i n r a t s f r o m t h e m e d i u m l i t t e r a n d , o n d a y 2 1 , i n b o t h t h e m e d i u m a n d t h e s m a l l l i t t e r s . No o t h e r s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n t h e r a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s w e r e f o u n d b e t w e e n p r o x i m a l a n d d i s t a l i n t e s t i n e w i t h i n t h e t h r e e l i t t e r s i z e s e x c e p t o n d a y 2 1 i n r a t s f r o m 0 D i s t a l I n t e s t i n e # P r o x i m a l I n t e s t i n e A g e ( d ) 3 ( 1 4 / L i t t e r ) I n c o r p o r a t i o n o f H W a t e r i n t o C h o l e s t e r o l i n D i s t a l a n d P r o x i m a l I n t e s t i n e o f N e o n a t a l R a t s R a i s e d i n L i t t e r s o f 14 M e a n s a t t h e s a m e a g e n o t s h a r i n g a common s u p e r -s c r i p t l e t t e r a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p < 0 . 0 5 ) P o i n t s a t d a y 1 a r e f r o m t h e m e d i u m l i t t e r . 5 1 k P u p s / L i t t e r lk P u p s / L i t t e r T A g e ( d ) 3 ( D i s t a l I n t e s t i n e ) C o m p a r i s o n o f t h e R a t e s o f H W a t e r I n c o r p o r a t i o n i n t o C h o l e s t e r o l i n P r o x i m a l I n t e s t i n e B e t w e e n R a t s R a i s e d i n L i t t e r s o f 4 a n d 14 M e a n s a t t h e s a m e a g e n o t s h a r i n g a common s u p e r -s c r i p t l e t t e r a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( P < 0 . 0 5 ) P o i n t a t d a y 1 i s f r o m t h e m e d i u m l i t t e r . k P u p s / L i t t e r lk P u p s / L i t t e r i l I 0 7 14 A g e ( d ) 3 ( P r o x i m a l I n t e s t i n e ) C o m p a r i s o n o f t h e R a t e s o f H W a t e r I n c o r p o r a t i o n i n t o C h o l e s t e r o l i n P r o x i m a l I n t e s t i n e B e t w e e n R a t s R a i s e d i n L i t t e r s o f 4 a n d 14 M e a n s a t t h e s a m e a g e n o t s h a r i n g a common s u p e r -s c r i p t l e t t e r a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p < 0 . 0 5 ) . P o i n t a t d a y 1 i s f r o m t h e m e d i u m l i t t e r . t h e l a r g e l i t t e r . I n t h i s i n s t a n c e , p r o x i m a l i n t e s t i n e w a s f o u n d t o s y n t h e s i z e a t 1.5 f o l d t h e r a t e o f d i s t a l i n t e s t i n e ( T a b l e I I ) . c . T r e n d A n a l y s i s F i n d i n g s r e p o r t e d f o r t h e r a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n t h e r a t l i v e r ( 2 , 2 2 ) d u r i n g t h e p o s t n a t a l d e v e l o p m e n t p e r i o d i n d i c a t e d a U - s h a p e d c u r v e w h i c h h a s a p r o n o u n c e d q u a d r a t i c t r e n d a m o n g t h e p o p u l a t i o n m e a n s . A s i m i l a r r e l a t i o n s h i p w a s a n t i c i p a t e d a n d c o n f i r m e d i n t h e i n t e s t i n e d u r i n g t h e s ame p e r i o d . A n a l y s i s o f v a r i a n c e f o r c o n t r a s t ( A p p e n d i x I ) i n d i c a t e d t h a t f o r s y n t h e s i s i n p r o x -i m a l i n t e s t i n e t h e d e v e l o p m e n t c u r v e wa s U - s h a p e d o r b e s t d e s c r i b e d b y q u a d r a t i c f u n c t i o n . T h e r e w e r e , h o w e v e r , s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n t h e c o n t o u r o f t h e U - s h a p e d c u r v e s . I n d i s t a l i n t e s t i n e , t h e a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t t h e d o m i n a n t f u n c t i o n w a s q u a d r a t i c b u t a l s o t h a t a c u b i c f u n c t i o n o r S - s h a p e d c u r v e w a s p r e s e n t . 2. A d i p o s e T i s s u e a n d C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s V a l u e s f o r 3 t h e i n c o r p o r a t i o n o f H i n t o c h o l e s t e r o l , f o r r a t s r a i s e d i n l i t t e r s o f 4 a n d 8 p u p s p e r dam, r e m a i n e d a t a v e r y l o w a n d c o n s t a n t l e v e l ( i . e . 6-9 f o l d l e s s t h a n t h e l o w e s t v a l u e s s e e n i n i n t e s t i n e o n d a y 1 4 ) ( F i g . 6 a n d 1 1 ) . T h e a m o u n t o f g l u t e a l a d i p o s e t i s s u e w a s n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t b e -t w e e n t h e s e two l i t t e r s i z e s ( T a b l e I I I ) . R a t s r a i s e d i n l a r g e l i t t e r s h a d o n l y 5 1 % a n d 4 0 % o f t h e w e i g h t o f a d i p o s e t i s s u e , o n d a y s 14 a n d 2 1 r e s p e c t i v e l y , o f t h e r a t s r a i s e d i n s m a l l l i t t e r s . A d i p o s e t i s s u e f r o m r a t s r a i s e d i n t h e l a r g e l i t t e r s d i d , h o w e v e r , e x h i b i t a n i n c r e a s e i n t h e T A B L E I I 3 I n V i t r o I n c o r p o r a t i o n o f H W a t e r i n t o C h o l e s t e r o l by-P r o x i m a l a n d D i s t a l I n t e s t i n e a n d G l u t e a l A d i p o s e T i s s u e A g e T i s s u e ( d ) C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s * 4 P u p s / L i t t e r 8 P u p s / L i t t e r 14 P u p s / L i t t e r P r o x . * * 1 4 5 . 0 ± 2 . 8 P r o x . 7 24 .8 ± 1 . 5 b 22 . 0 ± 5 . 3 b 16 . 3 + 2 . 8b P r o x . 14 10 .3 + 0 . 9 b 8. 4 ± 0 . 8 b 10 . 7 + 0.' 9 b P r o x . 2 1 20 .0 + 2 . 3 b 35 . 6 ± 6 . l a 48 . 6 + 8 . o a D i s t . * * 1 3 6 . 8 ± 4 . 1 D i s t . 7 32 . 6 ± 4 . 2 b 44 . 0 ± 6 . o b 1 1 . 5 + 1. 9 a D i s t . 14 1 1 .8 ± 1 . 6 b 7 . 2 ± 0 . 7 b 1 1 + 1. 6 b D i s t . 21 36 .0 + 2 . 7 b 65 . 0 ± 9 . 6 a 3 1 . 7 + 3 . o b A d i p . ** 7 1 ( 0 . .0 26 + + 0 0 . l b . 02° ) 1. * * * ( 0 . 1 ± 34 0 + l b 0 . 2 b ) i ( 0 . .5 2 1 + 0. 0 . . i b ' o i a ) A d i p . 14 0 .8 + 0 . l b 1. 2. ± 0 2 b 1 .8 + 0 . l a ( 0 . 17 + 0 .01°) ( 0 . 2 1 + 0.02 ) ( 0 . 28 + 0 . 0 2 a ) A d i p . 2 1 0 ( 0. . 9 16 + + 0 0 . l b . 0 1 C ) 1. ( 0 . i . ± 2 1 0 . 2 b 0 . 0 2 b ) 2 ( 0 . .8 30 + 0 . 0 . 5 a 0 3 a ) V a l u e s a r e e x p r e s s e d a s n m o l e s H / g / h ± SEM P r o x . = p r o x i m a l i n t e s t i n e D i s t . = d i s t a l i n t e s t i n e A d i p . = g l u t e a l a d i p o s e t i s s u e V a l u e s i n e a c h r o w w i t h t h e same s u p e r s c r i p t a r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p < : 0 . 0 5 ) V a l u e s i n p a r e n t h e s e s a r e e x p r e s s e d a s n m o l e s / g b o d y w t / d ± SEM * ** a , b , c * * * I I i 1 0 7 14 21 ( A g e (d) 3 F i g u r e 1 1 . ( A d i p o s e T i s s u e ) C o m p a r i s o n o f t h e R a t e s o f H W a t e r I n c o r p o r a t i o n i n t o C h o l e s t e r o l i n W h i t e A d i p o s e T i s s u e B e t w e e n R a t s R a i s e d i n L i t t e r s o f 4 a n d 14 M e a n s a t t h e s a m e a g e n o t s h a r i n g t h e s a m e s u p e r -s c r i p t l e t t e r a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p < 0 . 0 5 ) . 56 T A B L E I I I W e i g h t o f G l u t e a l A d i p o s e T i s s u e o f R a t s f r o m T h r e e L i t t e r S i z e s A g e ( d ) W e i g h t o f G l u t e a l A d i p o s e T i s s u e * (mg) N u m b e r 4 o f P u p s / L i t t e r 8 14 7 1 9 2 . 0 ± 7 . 6 b 1 8 7 . 5 ± 8 . 0 b 8 6 . 2 ± 8 . 4 a 14 2 6 7 . 0 + 8 . 2 b 2 9 6 . 3 ± 1 3 . 6 b 1 3 7 . 0 ± 12 . 3 a 2 1 4 1 2 . 3 ± 8 . 3 b 4 0 2 . 5 ± 9 . 2 b 1 6 4 . 0 ± 1 6 . 0 a * E a c h v a l u e i s t h e mean +_ SEM o f 6 p u p s a,b V a l u e s i n e a c h r o w w i t h t h e same s u p e r s c r i p t a r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p < 0 . 0 5 ) . s y n t h e t i c r a t e o f s t e r o l o n e a c h d a y t e s t e d ( F i g . 1 1 ) . A s t h e r a t s i n c r e a s e d i n a g e t h e d i f f e r e n c e s i n t h e r a t e s o f s y n t h e s i s b e t w e e n t h e s m a l l a n d l a r g e l i t t e r s a l s o p r o g r e s s i v e l y i n c r e a s e d ( D a y 7, 1.5 f o l d g r e a t e r ; d a y 1 4 , 2.3 f o l d g r e a t e r ; a n d d a y 2 1 , 2.9 f o l d g r e a t e r ) . 58 C H A P T E R V D I S C U S S I O N I n t r o d u c t i o n T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y w a s t o d e t e r m i n e t h e p a t t e r n o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s d u r i n g d e v e l o p m e n t i n i n t e s t i n e a n d a d i p o s e t i s s u e a s w e l l a s t o a s c e r t a i n w h e t h e r o r n o t a d i f f e r e n t p a t t e r n w o u l d e m e r g e w h e n t h e p u p s w e r e r a i s e d e i t h e r o v e r n o u r i s h e d o r u n d e r n o u r i s h e d . I n a n e f f o r t t o p r o d u c e a s t a t e o f o v e r - a n d u n d e r - e a t i n g , t h e p u p s w e r e r a i s e d i n l i t t e r s w i t h 4 o r 14 p u p s p e r dam, a p r o c e d u r e w h i c h h a s b e e n u s e d i n s e v e r a l s t u d i e s ( 2 , 1 0 1 , 1 0 2 ) . A. O v e r n u t r i t i o n a n d U n d e r n u t r i t i o n R a i s i n g t h e p u p s i n l i t t e r s i z e s o f 4 a n d 14 p u p s dam p r o d u c e d a s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n b o d y w e i g h t s . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e a m o u n t o f f o o d a v a i l a b l e o r a b s o r b e d i s m u c h l e s s f o r t h e p u p s r a i s e d i n t h e l a r g e l i t t e r s a n d p r o b a b l y c o n s t i t u t e s a s t a t e o f u n d e r n u t r i t i o n . A s t a t e o f o v e r n u t r i t i o n , h o w e v e r , i s n o t s o o b v i o u s i n t h e r a t s r a i s e d i n l i t t e r s o f 4, a s i s i n d i c a t e d b y t h e l a c k o f a s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n b o d y w e i g h t b e t w e e n t h e s m a l l a n d t h e m e d i u m l i t t e r o n d a y 7, a n d f u r t h e r , b y t h e s m a l l b u t s i g n i f i c a n t p o s i t i v e d i f f e r e n c e i n f a v o u r o f t h e m e d i u m l i t t e r o n d a y 1 4 . H a h n a n d W a l k e r ( 2 ) h a v e o b s e r v e d t h e same t r e n d i n w e i g h t d i f f e r e n c e f o r r a t s r a i s e d i n l i t t e r s o f 3 a n d 8. H o w e v e r , a s t a t e o f o v e r n u t r i t i o n s e e m s t o b e e v i d e n t b y d a y 2 1 i n t h e r a t s r a i s e d i n l i t t e r s o f 4. T h e f a c t t h a t w e i g h t d i f f e r e n c e s w e r e s m a l l o n d a y 14 b e t w e e n t h e r a t s r a i s e d i n l i t t e r s o f 8 a n d 4 p r o b a b l y i n d i c a t e s t h a t t h e dams c o u l d p r o d u c e e n o u g h m i l k t o s u p p o r t m a x i m a l g r o w t h r a t e s f o r e i t h e r s i z e l i t t e r u n t i l d a y 1 4 , b u t a f t e r d a y 14 t h e a m o u n t o f m i l k p r o d u c e d b e c a m e l i m i t i n g f o r t h e g r o w t h r a t e o f r a t s r a i s e d i n t h e l a r g e r l i t t e r . R a t s f r o m s m a l l l i t t e r s h a d a c c e s s t o a g r e a t e r q u a n t i t y o f m i l k a n d i t i s l i k e l y t h a t t h e y c o n s u m e d b e y o n d t h e a m o u n t r e q u i r e d f o r n o r m a l g r o w t h b e c a u s e c o n t r o l s f o r v o l u m e i n t a k e a r e n o t f u l l y d e v e l o p e d b e f o r e t h e t h i r d w e e k p o s t p a r t u m ( 1 0 5 ) . I n s u m m a r y , i t i s a p p a r e n t t h a t r a t s r a i s e d i n l i t t e r s o f 14 w e r e u n d e r n o u r i s h e d w h i l e t h e p u p s r a i s e d i n l i t t e r s o f 4 d i d n o t a p p e a r t o b e o v e r n o u r i s h e d u n t i l d a y 2 1 . B. M e t h o d o l o g i c a l P r o c e d u r e C u l t u r e c o n d i t i o n s w e r e a d e q u a t e t o c o n t i n u e w i t h t h e e x p e r i m e n t s a s i n d i c a t e d b y t h e l i n e a r i n c o r p o r a t i o n 3 r a t e o f H w a t e r i n t o c h o l e s t e r o l o v e r t h e 3 h o u r p e r i o d ( F i g . 4 ) , c o m b i n e d w i t h r e s u l t s w h i c h s h o w e d 9 5 % o f t h e a d i p o s e c e l l s a n d 9 2 % o f i n t e s t i n a l c e l l s r e m a i n e d v i a b l e a f t e r t w o h o u r s o f i n c u b a t i o n ( F i g . 3 ) . M o s t o f t h e i n t e s t i n a l c e l l d e a t h wa s p r o b a b l y e x p e r i e n c e d b y t h e 6 0 v i l l i c e l l s w h i c h , a l t h o u g h t h e y p r o d u c e 1.5 f o l d more c h o l e s t e r o l , a r e l e s s r o b u s t t h a n t h e c r y p t c e l l s ( 7 9 ) . A n d e r s e n and D i e t s c h y (91) have shown t h a t t r i t i a t e d w a t e r i s t h e s u b s t r a t e b e s t s u i t e d f o r s t u d y i n g s t e r o l s y n t h e s i s i n most mammalian t i s s u e s . T h e i r method u s e s d i g i t o n i n f o r p r e c i p i t a t i n g t h e s t e r o l s , w h i c h p r e s e n t s a p r o b l e m o f h a v i n g i n o r d i n a t e l y h i g h b a c k g r o u n d i n c o r p o r a -3 t x o n o f H w a t e r i n t o s t e r o l s . T i s s u e s w h i c h a r e c u l t u r e d on i c e s t i l l a p p a r e n t l y i n c o r p o r a t e s u b s t a n t i a l q u a n t i -3 t i e s o f H w a t e r when a s s a y e d u s i n g t h e d i g i t o n i n - p r e c i -p i t a t e d s t e r o l method ( 9 1 ) . I f , however, t h e f r e e s t e r o l i s r e g e n e r a t e d by c l e a v i n g i t f r o m t h e d i g i t o n i n t h e s e b a c k g r o u n d c o u n t s a r e no l o n g e r d e t e c t a b l e ( 9 1 ) . 3 A p p a r e n t l y , H w a t e r b i n d s n o n s p e c i f i c a l l y t o t h e d i g -i t o n i n and i s t h e s o u r c e o f t h e h i g h l e v e l o f b a c k g r o u n d c o u n t s . The method u s e d i n t h e p r e s e n t s t u d y a v o i d s e n t i r e l y t h e p r o b l e m o f r e g e n e r a t i n g f r e e s t e r o l f r o m t h e d i g i t o n i n - p r e c i p i t a t e d s t e r o l by s i m p l y chroma-t o g r a p h i n g t h e s a p o n i f i e d l i p i d s on a s i l i c a G TLC p l a t e and r u n n i n g i t i n a s y s t e m w h i c h s e p a r a t e s t h e f r e e c h o l e s t e r o l f r o m f a t t y a c i d t r i g l y c e r i d e s and p h o s p h o l i p i d s A l t h o u g h chromatography o f t h e l i p i d s o n t o t h e s i l i c a p l a t e i s t e d i o u s and t i m e - c o n s u m i n g , t h i s method i s p r o b a b l y no more- time.-consuming t h a n t h e d i g i t o n i n -p r e c i p i t a t e d s t e r o l method. ,61 C. I n t e s t i n a l S y n t h e s i s o f C h o l e s t e r o l S e v e r a l s t u d i e s h a v e r e p o r t e d t h a t i n t h e a d u l t , d i s t a l i n t e s t i n e s y n t h e s i z e s m o r e c h o l e s t e r o l t h a n p r o x i m a l i n t e s t i n e i n man ( 7 8 ) , s q u i r r e l m o n k e y s ( 7 3 ) , a n d r a t s ( 7 5 , 8 2 , 8 4 ) . T h e p r e s e n t s t u d y c o n f i r m s t h e s e f i n d i n g s f o r p u p s r a i s e d i n l i t t e r s o f 4 a n d 8 o n d a y 2 1 , i . e . , w e a n e d p u p s . C o n v e r s e l y , o n d a y 2 1 , t h e p r o x i m a l i n -t e s t i n e o f p u p s o f t h e l a r g e l i t t e r s y n t h e s i z e d c h o l e s t e r o l a t a r a t e o f 1.5 f o l d g r e a t e r t h a n t h e d i s t a l i n t e s t i n e . T h i s w a s d u e t o a n a c t u a l i n c r e a s e i n t h e r a t e o f s y n -t h e s i s i n t h e p r o x i m a l i n t e s t i n e o v e r t h e d i s t a l i n t e s t i n e . R a t e s o f s y n t h e s i s , o n d a y 2 1 , i n t h e d i s t a l i n t e s t i n e w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t b e t w e e n t h e l a r g e a n d s m a l l l i t t e r s . P r i o r t o d a y 2 1 t h e r e w e r e n o s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s , w i t h i n e a c h o f t h e t h r e e l i t t e r s i z e s , b e t w e e n t h e t w o r e g i o n s o f i n t e s t i n e , e x c e p t o n d a y 7 f o r p u p s i n t h e m e d i u m l i t t e r . t C h a n g e s i n d i s t r i b u t i o n o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s a l o n g t h e i n t e s t i n e h a v e p r e v i o u s l y b e e n p r o d u c e d b y d i e t a r y m o d i f i c a t i o n ( 8 2 ) . F e e d i n g a p u r i f i e d d i e t o f c a s e i n , m i n e r a l m i x , s u c r o s e a n d v i t a m i n s t o r a t s , S u g a n o e t a l . ( 8 2 ) d e m o n s t r a t e d a h i g h e r r a t e o f s y n t h e s i s o f d i g i t o n i n -p r e c i p i t a b l e s t e r o l s i n t h e p r o x i m a l i n t e s t i n e t h a n t h e d i s t a l i n t e s t i n e . R a t s f e d o n a r a t c h o w d i e t h a d s y n t h e t i c r a t e s h i g h e r i n t h e d i s t a l t h a n t h e p r o x i m a l i n t e s t i n e . 62 A p p a r e n t l y f o o d i n t a k e a n d w e i g h t g a i n w e r e n o t a l t e r e d b y t h e t w o t y p e s o f d i e t . I f c a l o r i c i n t a k e i s a s s u m e d t o b e e q u a l , t h e n o n e o r m o r e d i e t a r y c o m p o n e n t s c o u l d b e r e -s p o n s i b l e f o r t h e c h a n g e s o b s e r v e d . A l t e r n a t i v e l y , s i n c e t h e p u r i f i e d d i e t r e q u i r e s l e s s d i g e s t i o n t h e p r o x i m a l c e l l s c o u l d b e m o r e a c t i v e t h a n t h e d i s t a l c e l l s w i t h r e -s p e c t t o a b s o r p t i o n a n d p o s s i b l y g e n e r a l m e t a b o l i c a c t i v i t y . T h e d i s c u s s i o n w h i c h f o l l o w s o u t l i n e s t h e d i f f e r e n c e s a m o n g s t t h e t h r e e g r o u p s o n t h e d a y s w h e r e t h e r e a p p e a r t o be. d i s c r e p a n c i e s i n t h e d a t a , n a m e l y d a y s 7 a n d 2 1 . On d a y 7 t h e d i f f e r e n c e s i n t h e r a t e s o f s y n t h e s i s i n p r o x i m a l i n t e s -t i n e b e t w e e n t h e m e d i u m a n d s m a l l l i t t e r s a n d t h e d i f f e r e n c e s i n t h e r a t e s i n d i s t a l i n t e s t i n e b e t w e e n t h e s e s ame t w o l i t t e r s i z e s a r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t . T h e l a c k o f s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e s e t w o g r o u p s i s n o t u n e x p e c t e d s i n c e a t t h i s a g e t h e d i f f e r e n c e i n b o d y w e i g h t i s s m a l l . C o m p a r e d w i t h t h o s e o f t h e s m a l l l i t t e r , t h e r a t e s o f s y n t h e s i s a r e s i g n i f i c a n t l y l o w e r i n t h e d i s t a l b u t - n o t p r o x i m a l i n i t e s t i n e - i n t h e l a r g e l i t t e r o n d a y 7. A l a c k o f s u b s t r a t e c o m b i n e d w i t h t h e e f f e c t s o f n o n - c h o l e s t e r o l i n -h i b i t o r s . o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s c o u l d .be t h e c a u s e o f t h e l o w e r r a t e s o f s y n t h e s i s s e e n i n t h e l a r g e l i t t e r . I n t h e d i s t a l i n t e s t i n e o n d a y 2 1 t h e s y n t h e t i c r a t e i n t h e m e d i u m l i t t e r d o e s a p p e a r t o b e o f a m u c h g r e a t e r m a g n i t u d e t h a n m i g h t b e e x p e c t e d , p a r t i c u l a r l y w h e n c o m p a r e d w i t h t h e s y n t h e t i c r a t e s i n t h e s m a l l l i t t e r . One m i g h t p r e s u m e t h a t t h e v a l u e s f o r t h e r a t e s o f s y n t h e s i s i n t h e m e d i u m l i t t e r w o u l d r a n g e s o m e w h e r e b e t w e e n t h e v a l u e s o f t h e s m a l l a n d l a r g e l i t t e r s . T h i s m i g h t b e t h e c a s e i f , i n a l l l i t t e r s i z e s , t h e d i e t c o n s u m e d b y t h e p u p s c o n t a i n e d t h e same p r o p o r t i o n o f n u t r i e n t s a n d v a r i e d i n q u a n t i t y o n l y . T h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s o f t h e p r e s e n t s t u d y c a n n o t , how-e v e r , b e d e s c r i b e d a s s i m p l y a s t h e a f o r e m e n t i o n e d c o n d i t i o n s . F o r t h i s r e a s o n , a n a t t e m p t f o l l o w s t o r e l a t e t h e v a r i e d c o n -s u m p t i o n p a t t e r n s a n d m a t u r i t y l e v e l s w i t h t h e s e e m i n g l y u n u s u a l r e s u l t s s e e n o n d a y 2 1 . C h o l e s t e r o l s y n t h e s i s o n d a y 2 1 i n t h e p r o x i m a l i n -3 t e s t i n e i n t h e s m a l l l i t t e r ( 2 0 . 0 ± 2.3 n m o l e s H / g /h) i s o n l y s l i g h t l y m o r e t h a n h a l f t h e r a t e o f t h a t i n t h e m e d i u m 3 l i t t e r ( 3 5 . 6 ± 6.1 n m o l e s H / g /h) a n d , s i m i l a r l y , t h e r a t e i n t h e d i s t a l i n t e s t i n e i n t h e s m a l l l i t t e r ( 3 6 . 0 ± 2.7 n m o l e s 3 H / g/h) i s o n l y a l i t t l e m o r e t h a n h a l f o f t h a t i n t h e m e d i u m 3 l i t t e r ( 6 5 . 0 ± 9 . 6 n m o l e s H / g / h ) . T h e l o w e r s y n t h e t i c r a t e s i n t h e s m a l l l i t t e r a r e p r o b a b l y r e l a t e d t o t h e c o n s u m p t i o n o f a g r e a t e r q u a n t i t y o f m i l k w h i c h c o n t a i n s i n h i b i t o r s o f c h o l e s t e r o g e n e s i s ( 2 2 ) . E n h a n c e d c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n t h e g u t o c c u r s b e t w e e n d a y s 14 a n d 2 1 i n a l l t h r e e g r o u p s a n d may b e a t t r i b u t e d t o t h e f a c t t h a t w e a n i n g c o m m e n c e s o n d a y 15 p o s t n a t a l l y a n d a f t e r t h a t d a y i n f a n t r a t s c o n s u m e i n c r e a s i n g a m o u n t s o f P u r i n a Chow a v a i l a b l e t o t h e m a n d t h e i r m o t h e r a n d h e n c e c o n s u m e d e c r e a s i n g a m o u n t s o f i n h i b i t o r s c o n t a i n e d i n m i l k . 64 I f t h e d e c r e a s e d c o n s u m p t i o n o f m i l k i s t h e o n l y f a c t o r r e s p o n s i b l e f o r t h e r i s e i n s y n t h e t i c r a t e s b e t w e e n d a y s 14 a n d 2 1 o n e w o u l d e x p e c t t h a t t h e l a r g e l i t t e r w o u l d h a v e h i g h e r r a t e s t h a n b o t h t h e m e d i u m a n d s m a l l l i t t e r s o n d a y 2 1 . T h i s , h o w e v e r , i s n o t t h e c a s e a n d i n f a c t t h e 3 u p p e r v a l u e ( 4 8 . 6 ± 8.0 n m o l e s H / h / g , p r o x i m a l i n t e s t i n e ) a t t a i n e d i n t h e l a r g e r l i t t e r i s l e s s t h a n t h e u p p e r v a l u e 3 ( 6 5 . 0 ± 9.6 n m o l e s H / g / h , d i s t a l i n t e s t i n e ) a t t a i n e d i n t h e m e d i u m l i t t e r . A l s o , t h e t w o l o w e r v a l u e s a t t a i n e d i n 3 t h e m e d i u m ( 3 5 . 6 ± 6.1 n m o l e s H / g / h , p r o x i m a l i n t e s t i n e ) 3 a n d l a r g e 3 1 . 7 ± 3.0 n m o l e s H / g / h , d i s t a l i n t e s t i n e ) l i t t e r s a r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t . C o m p a r e d w i t h t h e s m a l l 3 l i t t e r ( 2 0 . 2 ± 2.3 n m o l e s H / g /h) t h e r a t e s o f s y n t h e s i s i n t h e p r o x i m a l i n t e s t i n e a r e g r e a t e r i n t h e l a r g e l i t t e r 3 ( 4 8 . 6 ± 8.0 n m o l e s H / g / h ; h o w e v e r , t h e r a t e s o f s y n t h e s i s i n t h e d i s t a l i n t e s t i n e a r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t 3 b e t w e e n t h e s e t w o g r o u p s ( 3 6 . 0 ± 2.7 n m o l e s H / g / h 4 / l i t t e r a n d 3 1 . 7 ± 3.0 n m o l e s 3 H / g / h , 1 4 l i t t e r ) . C l e a r l y t h e n t h e r a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n t h e i n t e s t i n e i n t h e l a r g e l i t t e r a r e l o w e r t h a n r a t e s t h a t m i g h t b e p r e d i c t e d s o l e l y o n t h e b a s i s o f t h e e f f e c t s p r o d u c e d b y t h e r e m o v a l o f s t e r o l s y n t h e s i s i n h i b i t o r s . P u p s f r o m t h e l a r g e l i t t e r w e r e u n d e r n o u r i s h e d a n d t h i s c o n d i t i o n may h a v e h a d t h e e f f e c t o f p a r t i a l l y i n c a p a c i t a t i n g t h e i n t e s t i n e i n i t s a b i l i t y t o s y n t h e s i z e 65 c h o l e s t e r o l ; s o t h a t a l t h o u g h t h e r e w a s a r i s e i n t h e r a t e o f s y n t h e s i s i n d i s t a l i n t e s t i n e b e t w e e n d a y 14 a n d 2 1 3 ( 1 1 . 8 ± 1.6 t o 3 1 . 7 ± 3.0 n m o l e s H/g/h) t r e r i s e w a s n o t a s p r o n o u n c e d a s t h a t o f t h e m e d i u m l i t t e r ( 7 . 2 ± 0.7 t o 6 5 . 0 3 ± 9.6 n m o l e s H / g / h ) . T h e m a r k e d r i s e i n c h o l e s t e r o l s y n -t h e s i s i n t h e p r o x i m a l i n t e s t i n e o f t h e u n d e r n o u r i s h e d p u p s s e e n b e t w e e n d a y s 14 a n d 2 1 ( 1 0 . 7 ± 0.9 t o 4 8 . 6 ± 8.0 n m o l e s 3 H / g /h) may b e d u e t o a c a t c h u p p h e n o m e n o n i n w h i c h t h e r e c o u l d b e a n a t t e m p t t o m e e t c e l l u l a r g r o w t h r e q u i r e m e n t s . A l s o , t h i s m a r k e d r i s e i n t h e p r o x i m a l i n t e s t i n e c o u l d b e d u e t o a r e l e a s e f r o m t h e i n h i b i t i o n o f c h o l e s t e r o l s y n -t h e s i s c a u s e d b y m i l k c o m p o n e n t s w h i c h , i n a l i t t e r o f t h i s s i z e a n d a g e , w o u l d b e o n l y a s m a l l p r o p o r t i o n o f t h e d i e t a s w a s d e m o n s t r a t e d b y B a b i c k y e t a l . ( 1 0 6 ) . A l o g i c a l q u e s t i o n t o a s k a t t h i s t i m e i s w h y c h o -l e s t e r o l s y n t h e s i s i n t h e d i s t a l i n t e s t i n e i n t h e l a r g e l i t t e r d i d n o t i n c r e a s e a s d r a m a t i c a l l y a s i t d i d i n t h e p r o x i m a l i n t e s t i n e . T h e r e a s o n f o r t h i s may b e r e l a t e d t o t h e f a c t t h a t a b s o r p t i o n o f c h o l e s t e r o l o c c u r s a l m o s t e x c l u s i v e l y i n t h e p r o x i m a l i n t e s t i n e ( 8 2 ) a n d h e n c e m i l k c o n s u m p t i o n i s m o r e l i k e l y t o a f f e c t t h e r a t e o f s y n t h e s i s , b y w a y o f n e g a t i v e f e e d b a c k i n h i b i t i o n b y c h o l e s t e r o l , i n t h e p r o x i m a l r e g i o n o f i n t e s t i n e t h a n i n t h e d i s t a l s e g m e n t . F u r t h e r m o r e , S t a n g e a n d D i e t s c h y ( 8 2 ) h a v e s h o w n t h a t t h e r a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n t h e i n t e s t i n e c a n i n c r e a s e b y s e v e n f o l d w h e n t h e c h o l e s t e r o l c o n t e n t o f t h e d i e t i s a l t e r e d . 66 Once a g a i n , t h e l a r g e f l u c t u a t i o n s i n t h e r a t e s o f s y n t h e s i s a r e s e e n i n t h e p r o x i m a l i n t e s t i n e and t h i s c o u l d g i v e t h e i m p r e s s i o n t h a t t h e s y n t h e t i c r a t e s i n t h e d i s t a l i n t e s t i n e a r e a b n o r m a l l y low, when i n a l l p r o b a b i l i t y t h e r a t e s i n t h e p r o x i m a l i n t e s t i n e a r e e x c e p t i o n a l l y h i g h . T h e r e f o r e , t h e d i f f e r e n c e s i n t h e r a t e s o f s y n t h e s i s i n t h e i n t e s t i n e amongst t h e t h r e e l i t t e r s i z e s a r e / l i k e l y - ' due t o t h e e f f e c t s o f u n d e r n u t r i t i o n and t h e s u p p r e s s i o n o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s by i n h i b i t o r s . Even t h o u g h t h e m e t a b o l i c d i f f e r e n c e s were v e r y l a r g e and s i g n i f i c a n t on day 7, t h e d i f f e r e n c e s i n body w e i g h t r e m a i n e d s m a l l between t h e s m a l l and l a r g e l i t t e r s . A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n o f t h i s s i t u a t i o n i s t h a t t h e amount o f m i l k a v a i l a b l e t o e a c h pup had become l i m i t e d o n l y w i t h i n t h e p r e v i o u s c o u p l e o f d a y s , so t h a t m e t a b o l i c d i f f e r e n c e s were a l r e a d y v e r y e v i d e n t b u t w e i g h t g a i n d i f f e r e n c e s were j u s t b e g i n n i n g t o a p p e a r . In C h a p t e r I I , t h e i n t e s t i n e was s u g g e s t e d as a p o s s i b l e c o n t r i b u t o r t o t h e h i g h b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s t h a t have been r e p o r t e d f o r pups f r o m s m a l l l i t t e r s (2) on day 7. T h i s i d e a a p p e a r s t o be s u p p o r t e d by t h e r e s u l t s o f t h e p r e s e n t s t u d y . D u r i n g t h e f i r s t week, r a t s f r o m t h e s m a l l l i t t e r s p r o d u c e d c h o l e s t e r o l a t a much g r e a t e r r a t e i n d i s t a l b.ut, not.: p r o x i m a l i n t e s t i n e , t h a n r a t s f r o m l a r g e l i t t e r s . W i t h i n t h e same t i m e p e r i o d , t h e d i f f e r e n c e s i n t h e l e v e l s o f b l o o d c h o l e s t e r o l - a r e p e r h a p s t h e i r g r e a t e s t between r a t s r a i s e d i n t h e s m a l l a n d l a r g e l i t t e r s ( 2 ) . A f t e r w e a n -i n g t o a c h o w d i e t , s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s i n t h e s e t w o g r o u p s a r e n o l o n g e r a p p a r e n t o n d a y 40 ( 2 ) . F u r t h e r s t u d i e s w i l l h a v e t o v e r i f y w h e t h e r t h e c h o l e s t e r o l s y n t h e s i z e d b y t h e i n t e s t i n e d u r i n g t h i s t i m e p e r i o d a c t u a l l y b e c o m e s p a r t o f t h e b l o o d c h o l e s t e r o l p o o l . D. D e v e l o p m e n t a l P a t t e r n o f C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s F i g u r e 6 s h o w s t h e d e v e l o p m e n t a l p a t t e r n o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s f o r r a t s r a i s e d i n l i t t e r s o f 8 p u p s . I n i n t e s t i n e t h e o b s e r v e d p a t t e r n , w i t h t h e h i g h l e v e l s o f s y n t h e s i s a t b i r t h d e c l i n i n g t o v e r y l o w l e v e l s b y d a y 14 f o l l o w e d b y a r i s e b y d a y 2 1 i s s i m i l a r t o t h e d e v e l o p m e n t a l p a t t e r n o f HMGR a c t i v i t y i n l i v e r ( 2 , 2 2 ) . HMGR i s t h e m a i n r e g u l a -t o r y e n z y m e i n t h e c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s p a t h w a y w h i c h c a t a l y s e s t h e r e d u c t i o n o f HMG C o A t o m e v a l o n i c a c i d ( F i g . 2 ) . I n t h e l i v e r , t h e e n z y m e a c t i v i t y i s h i g h e s t " . . . . j u s t p r i o r t o b i r t h , a p p r o x i m a t e s a d u l t v a l u e s d u r i n g t h e f i r s t p o s t n a t a l w e e k a n d o v e r s h o o t s a n d t h e n d r o p s t o a d u l t v a l u e s f o l l o w i n g w e a n i n g " ( 2 2 ) . M c N a m a r a ' s ( 2 2 ) e x p e r i m e n t s h o w s t h a t t h e s y n t h e t i c r a t e d o e s n o t i n -c r e a s e f r o m t h e l o w l e v e l s o b s e r v e d d u r i n g t h e t h i r d w e e k i f w e a n i n g i s d e l a y e d . A l t h o u g h t h e r a t s i n t h e p r e -s e n t s t u d y w e r e n o t a c t i v e l y w e a n e d t h e y d i d h a v e a c c e s s t o s o l i d f o o d a n d i n s p e c t i o n o f t h e i n t e s t i n a l c o n t e n t s o n d a y 2 1 i n d i c a t e d t h e y h a d b e e n c o n s u m i n g t h e f o o d p e l l e t s . 68 I t i s n o t u n e x p e c t e d t h e n , t h a t t h e r a t e o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n c r e a s e d t o t h e l e v e l s s e e n o n d a y 2 1 . T h e r e a s o n f o r t h e d e v e l o p m e n t a l p a t t e r n i n l i v e r h a s n o t b e e n p o s i t i v e l y d e t e r m i n e d , b u t t h e p r e s e n c e o f a n i n h i b i t o r i n m i l k h a s b e e n p o s t u l a t e d a n d t e s t e d ( 2 2 , 1 0 5 ) . T h i s d o e s s e e m t o b e a r e a s o n a b l e e x p l a n a t i o n s i n c e s y n t h e t i c r a t e s d o n o t d e c r e a s e u n t i l a f t e r b i r t h a n d d o n o t i n c r e a s e a g a i n u n t i l w e a n i n g c o m m e n c e s . A l s o , t w o i n h i b i t o r s o f HMGR h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d i n r a t m i l k ( 2 2 ) a n d human m i l k ( 1 0 5 ) ; o n e h a s b e e n i d e n t i f i e d a s u r i c a c i d w h i c h b l o c k s b e f o r e m e v a l o n i c a c i d a n d t h e o t h e r h a s n o t y e t b e e n i d e n t i f i e d . B o v i n e m i l k ( 1 0 5 ) a l s o c o n t a i n s t w o i n h i b i t o r s , o n e b e i n g o r o t i c a c i d w h i c h b l o c k s t h e f o r m a -t i o n o f m e v a l o n i c a c i d , a n d a n u n i d e n t i f i e d f a c t o r t h a t b l o c k s b e y o n d m e v a l o n i c a c i d . E . C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s i n A d i p o s e T i s s u e A s t h e p r e s e n t r e s u l t s d e m o n s t r a t e , c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n g l u t e a l a d i p o s e t i s s u e d o e s n o t e x h i b i t t h e s ame d e v e l o p m e n t a l p a t t e r n f o u n d i n t h e i n t e s t i n e a n d l i v e r . V e r y l o w l e v e l s o f s y n t h e s i s w e r e e v i d e n t t h r o u g h -o u t t h e p o s t n a t a l p e r i o d t o d a y 2 1 i n p u p s r a i s e d i n l i t t e r s o f 4 a n d 8. A d i p o s e t i s s u e o f p u p s f r o m t h e l a r g e l i t t e r s d i d r e v e a l a n i n c r e a s e i n t h e r a t e s o f s y n t h e s i s s o t h a t b y d a y 2 1 t h e l e v e l w a s n e a r l y 3 t i m e s t h a t o f t h e o t h e r t w o l i t t e r s i z e s . I t i s n o t a b l e t h a t o n d a y 14 w h e n t h e s y n t h -e t i c r a t e i n t h e l a r g e l i t t e r s w e r e d o u b l e t h e r a t e i n t h e s m a l l l i t t e r s , t h e r e w a s 5 0 % l e s s a d i p o s e t i s s u e i n t h e p u p s f r o m l a r g e l i t t e r s c o m p a r e d w i t h t h e p u p s f r o m t h e s m a l l l i t t e r s ( T a b l e I I I ) . A n d , w h e n o n d a y 2 1 t h e s y n t h e t i c r a t e w a s 3 t i m e s a s g r e a t t h e r e w a s o n l y 4 0 % a s m u c h a d i p o s e t i s s u e i n t h e p u p s f r o m l a r g e l i t t e r s . A l s o , p u p s f r o m t h e m e d i u m a n d s m a l l l i t t e r s h a d a n e q u a l a m o u n t o f a d i p o s e t i s s u e , a n d t h e r a t e s o f s y n t h e s i s w e r e s i m i l a r . I t a p p e a r s t h e n , t h a t t h e l e s s a d i p o s e t i s s u e p r e s e n t , t h e h i g h e r t h e r a t e o f s y n t h e s i s b y t h a t t i s s u e , a l t h o u g h t h e r e g u l a t i n g f a c t o r i s p r o b a b l y t h e n e g a t i v e - f e e d b a c k c o n t r o l o n s y n t h e s i s e x e r t e d b y p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s v i a t h e L D L r e c e p t o r s . A n o t h e r p o s s i b i l i t y i s t h a t t h e a d i p o s e t i s s u e i n p u p s f r o m t h e l a r g e l i t t e r s c o n t a i n e d n e a r l y a n e q u a l n u m b e r o f c e l l s a s t h e f a t t i s s u e f r o m t h e s m a l l l i t t e r p u p s , o n l y t h e y w e r e m u c h s m a l l e r c e l l s a n d c o n s e q u e n t l y w e i g h e d l e s s . A l t h o u g h t h i s h a s y e t t o b e d e t e r m i n e d , t h e r e e x i s t s t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e same a m o u n t o f c h o l e s t e r o l w a s s y n t h e s i z e d b y e a c h f a t c e l l r e g a r d l e s s o f i t s s i z e , w h i c h w o u l d i m p l y t h a t s y n t h e s i s o f c h o l e s t e r o l w a s o c c u r r i n g a t t h e same r a t e i n r a t s f r o m b o t h l i t t e r s i z e s w h e n e x p r e s s e d a s a f u n c t i o n o f c e l l n u m b e r r a t h e r t h a n t i s s u e w e i g h t . T h e s e r e s u l t s c o n f o r m t o t h e u s u a l i n v e r s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s , a s j u d g e d b y HMGR a c t i v i t y , a n d s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s ( 2 7 ) . T h a t i s , r a t s f r o m l a r g e l i t t e r s h a d h i g h e r r a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n a d i p o s e t i s s u e a n d , a s o t h e r w o r k h a s s h o w n ( 2 ) , c o n c u r r e n t l o w s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s ( 1 2 5 m g % ) , w h i l e p u p s f r o m s m a l l l i t t e r s h a d l o w e r s y n t h e t i c r a t e s a n d c o n c u r r e n t h i g h s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s ( 2 2 0 mg%) ( 2 ) . C H A P T E R V I C O N C L U S I O N A l t e r a t i o n s i n t h e d e v e l o p m e n t a l p a t t e r n o f c h o -l e s t e r o l s y n t h e s i s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d i n r a t s w h i c h w e r e r a i s e d i n l i t t e r s o f 4 a n d 14 p u p s p e r dam. T h e m o s t a c t i v e s i t e o f s y n t h e s i s , a f t e r w e a n i n g , i n t h e i n t e s t i n e o f p u p s r a i s e d i n s m a l l a n d m e d i u m l i t t e r s w a s t h e d i s t a l t h i r d ; a f i n d i n g w h i c h c o n f i r m s p r e v i o u s r e p o r t s o n t h e a d u l t r a t ( 7 9 ) , d o g ( 8 0 ) , m o n k e y ( 7 3 ) , a n d man ( 7 8 ) . I n c o n t r a s t , t h e p r o x i m a l i n t e s t i n e w a s s h o w n t o b e t h e s i t e o f g r e a t e r s y n t h e s i s o n d a y 2 1 i n r a t s r e a r e d i n l a r g e l i t t e r s . T h i s r e v e r s e s i t u a t i o n i s p r o b a b l y d u e t o t h e c o m b i n e d e f f e c t s o f f r e e d o m f r o m c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n h i b i t i o n b y c h o l e s t e r o l a n d n o n - c h o l e s t e r o l i n h i b i t o r s a n d a c a t c h u p p h e n o m e n o n i n c e l l g r o w t h w h e n i n c r e a s i n g a m o u n t s o f f o o d a r e c o n s u m e d . I n a n y c a s e , t h e r e a l s i g n i -f i c a n c e o f t h i s d i f f e r e n c e may b e s e e n i n r a t s w h i c h a r e a l l o w e d t o m a t u r e t o a d u l t s , s i n c e s e v e r a l s t u d i e s h a v e s h o w n l o n g - l a s t i n g e f f e c t s o f e a r l y n u t r i t i o n a l c h a n g e s ( 1 0 7,- 1 0 9 ) . T h e p a t t e r n o f d e v e l o p m e n t o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n i n t e s t i n e o f p u p s f r o m m e d i u m l i t t e r s r e s e m b l e s t h e d e v e l o p m e n t a l p a t t e r n o f HMGR a c t i v i t y r e p o r t e d f o r l i v e r ( 2 2 ) . I n b o t h o f t h e s e t i s s u e s t h e r a t e o f s y n t h e s i s d e c r e a s e s f r o m b i r t h t o a l o w 14 d a y s l a t e r a n d t h e n i n c r e a s e s a g a i n b y 2 1 . I t i s s p e c u l a t e d t h a t t h e f i r s t 1 72 h a l f o f t h i s t r e n d w h e r e r a t e s d e c r e a s e i s t h e r e s u l t o f i n h i b i t i o n b y c h o l e s t e r o l a n d n o n - c h o l e s t e r o l i n h i b i t o r s w h i c h a r e c o n t a i n e d i n m i l k . T h e s u b s e q u e n t i n c r e a s e i n r a t e s may p o s s i b l y b e a t t r i b u t e d t o a d e c r e a s e d c o n s u m p t i o n o f m i l k a n d h e n c e l e s s i n g e s t i o n o f i n h i b i t o r s . T h e p a t t e r n w a s a l t e r e d i n t h e l a r g e l i t t e r i n w h i c h t h e l o w r a t e o f s y n t h e s i s n o r m a l l y s e e n o n d a y 14 w a s r e a c h e d b y d a y ' 7 i n b o t h r e g i o n s o f t h e i n t e s t i n e . T h e s e l o w r a t e s o f s y n t h e s i s c o r r e l a t e w i t h t h e l o w p l a s m a c h o l e s t e r o l v a l u e s ( 2 ) r e p o r t e d f o r t h e e a r l y p o s t n a t a l p e r i o d o f r a t s r a i s e d i n l a r g e l i t t e r s . T h e r e f o r e , t h e d a t a s u g g e s t , b u t d o n o t p r o v e , t h a t t h e h i g h e r r a t e o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n t h e i n t e s t i n e o f r a t s f r o m s m a l l l i t t e r s may b e r e l a t e d t o t h e h i g h e r p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s f o u n d i n t h e s e r a t s c o m p a r e d t o r a t s f r o m l a r g e l i t t e r s ( 2 ) . W h i t e a d i p o s e t i s s u e s y n t h e s i z e d c h o l e s t e r o l a t a n u n a l t e r e d a n d l o w r a t e d u r i n g t h e 2 1 d a y p o s t n a t a l p e r i o d i n r a t s f r o m m e d i u m a n d s m a l l l i t t e r s . H o w e v e r , i n r a t s f r o m t h e l a r g e l i t t e r s y n t h e s i s i n c r e a s e d c o n t i n u o u s l y u p t o d a y 2 1 t o n e a r l y t h r e e f o l d t h e r a t e o f t h a t i n t h e o t h e r t w o l i t t e r s i z e s . E v e n t h o u g h r a t s f r o m t h e l a r g e l i t t e r h a d 4 0 % l e s s a d i p o s e t i s s u e o n d a y 2 1 t h a n t h o s e f r o m s m a l l l i t t e r s , t h e y n e v e r t h e l e s s p r o d u c e d n e a r l y t w i c e a s m u c h c h o l e s t e r o l p e r g r a m o f b o d y w e i g h t ( 0 . 3 0 3 3 n m o l e s H/g b o d y w t / d ) ( 1 4 / l i t t e r ) a n d 0.16 n m o l e s H/g b o d y w t / d ( 4 / l i t t e r ) . One c o u l d s p e c u l a t e t h a t t h e r a t e o f a d i p o s e t i s s u e c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n t h e 2 1 - d a y - o l d r a t s f r o m l a r g e l i t t e r s r e p r e s e n t s a n a t t e m p t t o i n -c r e a s e t h e n u m b e r o f a d i p o c y t e s w h e n s u f f i c i e n t f o o d i s a v a i l a b l e . 7 4 A P P E N D I X A L i s t o f A b b r e v i a t i o n s DPM d i s i n t e g r a t i o n s p e r m i n u t e HDL h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n HMGR 3 - h y d r o x y - 3 - m e t h y l g l u t a r y l c o e n z y m e A r e d u c t a s e 3 H w a t e r t r i t i a t e d w a t e r L D L l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n m C i m i l l i c u r i e ( 2 2 . 2 x 1 0 9 DPM) - 9 n m o l e n a n o m o l e (10 . m o l e s ) P U F A p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d . . S E M s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n SGA s m a l l f o r g e s t a t i o n a l a g e T L C t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y V L D L v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n 75. A P P E N D I X B C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s i n a n d B o d y W e i g h t s o f R a t s R a i s e d i n L i t t e r s , o f t 8 A g e P r o x i m a l ( d ) I n t e s t i n e * D i s t a l I n t e s t i n e * A d i p o s e T i s s u e * B o d y W e i g h t ( g ) M e a n 39 . 2 57 . 3 4 0 . 0 43 .1 48 .1 4 2 . 4 4 5.0 + 2 34 . 6 2 5 . 8 5 5 . 2 31.4 4 0 . 0 33 . 8 3 6 . 8 + 4 8 7 0 0 0 4.1 7.0 + 0.1 M e a n 1 5 . 3 1 5 . 4 42 . 9 1 8 . 7 1 7 . 6 22 . 0 + 5.3 52 . 5 27 . 5 6 1 . 9 37 .6 4 0 . 4 4 4 . 0 + 6.0 1.1 1.5 0.9 0 . 7 1.2 1.1 + 0.1 16.4 12 . 7 : 10 . 7 17 . 0 1 5 . 7 1 4 . 5 + 1.2 14 8.5 9.5 0.2 3 2 . 6 8.8 7.8 0.4 3 5 . 1 8.6 5.4 1.6 3 2 . 7 1 1 . 2 7.2 1.3 3 5 . 2 5.2 5.1 1.6 3 5 . 6 7.7 8.0 1.2 3 4 . 7 M e a n 8 . 4 + 0 . 8 7 . 2 + 0 . 7 1 . 1 + 0 . 2 3 4 . 3 + 0 . 5 7,6. A p p e n d i x B c o n t i n u e d A g e P r o x i m a l D i s t a l A d i p o s e B o d y ( d ) I n t e s t i n e * I n t e s t i n e * T i s s u e * W e i g h t ( g ) 2 1 1 6 . 8 9 3 . 3 1.2 4 6 . 4 17 . 0 2 9 . 0 1.1 4 6 . 7 4 6 . 5 - 0.8 4 7 . 3 5 1 . 5 59 .4 1.8 4 6 . 8 3 9 . 5 6 9 . 0 0.5 4 6 . 3 42 . 3 74 .4 0.9 4 7 . 0 M e a n 3 5 . 6 + 6.1 6 5 . 0 + 9.6 1.1 + 0.2 4 6 . 8 + 0.2 V a l u e s a r e e x p r e s s e d a s n m o l e s H / g / h +_ SEM 77. A P P E N D I X C C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s i n a n d B o d y W e i g h t s o f R a t s R a i s e d i n L i t t e r s o f 4 A g e P r o x i m a l D i s t a l A d i p o s e B o d y ( d ) I n t e s t i n e * I n t e s t i n e * T i s s u e * W e i g h t ( g ) 7 22 . 9 2 7 . 9 0.7 17 . 7 1 8 . 8 1 7 . 0 0.9 1 7 . 0 26 . 7 3 0 . 2 1.1 1 7 . 8 2 9 . 4 4 6.9 1.0 1 6 . 4 24 . 6 3 9 . 8 1.2 1 7 . 2 2 6 . 3 3 3 . 7 1.1 17 .4 M e a n 2 4 . 8 + 1.5 3 2 . 6 + 4.2 1.0 + 0. 1 1 7 . 3 + 0.2 14 7.7 1 8 . 1 0.9 32 . 8 10 . 3 7 . 3 0.4 32 . 6 1 1 . 9 9.9 0.7 3 1 . 1 13 . 7 14 . 4 1.4 • 28 . 5 8.6 12 .1 0.8 29 . 8 9.7 1 0 . 2 0.7 3 1 . 4 M e a n 1 0 . 3 + 0.9 1 1 . 8 + 1.6 0.8 + 0. 1 3 1 . 0 + 0.7 2 1 1 1 . 7 44 . 9 1.4 52 . 6 1 8 . 2 27 . 6 0.9 5 6 . 6 2 9 . 4 3 6 . 2 0 . 7 5 6 . 5 2 1 . 3 2 9 . 4 0.6 5 1 . 5 1 8 . 6 3 9 . 7 1.1 53.4 2 0 . 6 3 7 . 8 0.9 54 . 7 M e a n 2 0 . 0 + 2.3 3 6 . 0 + 2.7 0.9 + 0. 1 5 4 . 2 + 0.9 * V a l u e s a r e e x p r e s s e d a s n m o l e s H/g/h +_ SEM 78 A P P E N D I X D C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s i n a n d B o d y W e i g h t s o f R a t s R a i s e d i n L i t t e r s o f 14 A g e P r o x i m a l D i s t a l A d i p o s e B o d y ( d ) I n t e s t i n e * I n t e s t i n e * T i s s u e * W e i g h t ( g ) 7 1 6 . 5 7.2 1.4 1 5 . 9 10 . 5 5.8 1.6 1 5 . 1 14 . 9 1 8 . 3 1.5 1 5 . 3 2 9 . 4 1 0 . 0 1.6 1 4 . 4 1 0 . 8 14 . 3 1.8 15 . 6 1 5 . 4 1 3 . 1 1.3 14 . 3 M e a n 1 6 . 3 + 2 . 8 1 1 . 5 + 1.9 1.5 + 0. 1 1 5 . 1 + 0. 3 14 4 . 5 14 . 7 2 . 2 24 . 0 10 . 6 1 1 . 5 1.7 2 1 . 2 9 . 9 10 . 6 2 . 0 22 .8 1 1 . 1 8.5 1.8 22 . 6 1 9 . 6 1 8 . 4 2 . 2 2 1 . 7 8.2 8.2 1.5 2 3 . 2 M e a n 1 0 . 7 + 0.9 1 1 . 8 + 1.6 1.8 + 0. 1 2 2 . 6 + 0. 4 2 1 77.4 3 3 . 6 1.6 3 8 . 8 6 1 . 1 3 1 . 1 4 . 7 34 . 7 44 . 0 4 1 . 4 3.4 3 8 . 7 2 0 . 2 19 . 6 1.7 34 . 3 3 8 . 7 27 . 9 2.2 3 6 . 2 5 0 . 3 3 6 . 5 2.9 3 8 . 8 M e a n 4 8 . 6 + 8.0 3 1 . 7 + 3.0 2.8 + 0. 5 3 6 . 9 + 0. 9 V a l u e s a r e e x p r e s s e d a s n m o l e s H / g / h +_ SEM APPENDIX E S t a t i s t i c a l C o m p a r i s o n s o f R a t e s o f C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s Between Two C o n s e c u t i v e Weeks T i s s u e * C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s * * 4 P u p s / L i t t e r 8 P u p s / L i t t e r 14 P u p s / L i t t e r Day 1 Day 7 Day 1 Day 7 Day 1 Day 7 P r o x . 45.0 ± 2.8 b 22 . 0 ± 5. 3 a D i s t . 36.8 ± 4 .1 b 44 . 0 ± 6. o b" A d i p . - - 1.1 ± 0. 1 Day 7 Day 14 Day 7 Day 14 Day 7 Day 14 P r o x . 24 .8 + 1 5 b 10. 3 ± 0. 9 a 22.0 ± 5 .3 b 8.4 ± 0. 8 b 16.3 + 2.8 b 10.7 ± 0 9 b D i s t . 32.. 6 + 4 2 b 11.8 ± 1. 6 a 44 . 0 ± 6.0 b 7.2 + 0. 7 a 11. 5 + 1.9 b 11.8 ± 1 6 b A d i p . 1.0 + 0 l b 0.8 ± 0. l b 1.1 ± 0 .1 b 1.1 ± 0. 2 b 1.5 0 .1 b 1.8 ± 0 l b Day 14 Day 21 Day 14 Day 21 Day 14 Day 21 P r o x . 10. 3 + 0 9 b 20.1 ± 2. 3 a 8.4 ± 0.8 b 35.6 ± 6. l a 10. 7 + 0.9 b 48.6 ± 8 o a D i s t . 11.8 + 1 6 b 36.0 ± 2 . 7 a 7 . 2 ± 0.7 b 65.0 ± 9. 6 a 11. 8 + 1.6 b 31.7 + 3 . o a A d i p . 0.8 + 0 l b 0.9 ± 0. l b 1.1 ± 0 .2 b 1.1 + 0. 2 b 1.8 + 0 .1 b 2.8 ± 0 5 b P r o x . = p r o x i m a l i n t e s t i n e ** V a l u e s a r e e x p r e s s e d as n m o l e s H/g/h ± SEM D i s t . = d i s t a l i n t e s t i n e a, b P a i r e d v a l u e s i n e a c h row w i t h t h e same A d i p . = g l u t e a l a d i p o s e t i s s u e s u p e r s c r i p t a r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t (p < 0.05 ) . « 80 A p p e n d i x E S t a t i s t i c a l T e s t s U s e d i n t h e P r e c e d i n g S u m m a r y T a b l e 1. C o m p a r i s o n s Amongst D i f f e r e n t A g e s i n L i t t e r s o f 4 f o r P r o x i m a l I n t e s t i n e S o u r c e *SS * d f *MS F cX.= 0-05 B e t w e e n g r o u p s 6 5 4 . 8 2 3 2 7 . 4 2 0 . 1 3.68 E r r o r ( w i t h i n 2 4 4 . 6 15 1 6 . 3 g r o u p s ) T o t a l s 8 9 9 . 4 17 G r o u p M e a n D a y 14 D a y 2 1 M e a n 1 0 . 3 2 0 . 0 G r o u p D a y 7 2 4 . 8 - 1 4 . 5 4.8 D a y 14 1 0 . 3 - 9 . 7 3 -6-32 zi fa < fa +.6.32 8 1 A p p e n d i x E c o n t i n u e d 2. C o m p a r i s o n s A m o n g s t D i f f e r e n t A g e s i n L i t t e r s o f 4 f o r D i s t a l I n t e s t i n e . S o u r c e SS d f MS F oC= 0.05 B e t w e e n g r o u p s 2 0 5 9 . 7 2 1 0 2 9 .9 1 9 . 2 3.68 E r r o r ( w i t h i n 8 0 5 . 3 15 53 . 7 g r o u p s ) T o t a l s 2 8 6 5 . 0 17 G r o u p M e a n M e a n D a y 14 1 1 . 8 D a y 2 1 3 6 . 0 G r o u p D a y 7 3 2 . 6 2 0 . 8 -3 . 4 D a y 14 1 1 . 8 - 2 4 . 2 f - 1 1 . 5 < t ± & .+ 11...5. 3. C o m p a r i s o n s A m o n g s t D i f f e r e n t A g e s i n L i t t e r s o f 4 f o r A d i p o s e T i s s u e • S o u r c e SS d f MS F O C = 0 . 0 5 B e t w e e n g r o u p s 0.1 2 0 . 05 0.5 3.68 E r r o r ( w i t h i n 1.6 15 0 .10 g r o u p s ) T o t a l s 1.7 17 A p p e n d i x E c o n t i n u e d 4. C o m p a r i s o n s A m o n g s t D i f f e r e n t A g e s i n L i t t e r s o f 8 f o r P r o x i m a l I n t e s t i n e S o u r c e SS d f MS F °C=0.05 B e t w e e n g r o u p s 4 6 0 0 . . 0 3 1 5 3 3 . . 3 2 0 . 0 3.13 E r r o r ( w i t h i n c 1 4 4 9 . .4 19 76 . .3 g r o u p s ) T o t a l s 6 0 4 9 . . 4 22 G r o u p M e a n D a y 7 D a y 14 D a y 2 1 M e a n 2 2 . 0 8.4 3 5 . 6 G r o u p D a y 1 4 5.0 2 3 . 0 3 6 . 0 9.4 D a y 7 2 2.0 1 3 . 6 - 1 3 . 6 D a y 14 8.4 - 2 7 . 2 5. C o m p a r i s o n s A m o n g s t D i f f e r e n t A g e s i n L i t t e r s o f 8 f o r D i s t a l I n t e s t i n e . S o u r c e SS d f MS F oC=0. 05 B e t w e e n g r o u p s 1 0 2 8 9 . 0 3 3 4 2 9 . 7 1 8 . 7 3. 13 E r r o r ( w i t h i n 3 4 8 0 . 7 19 1 8 3 . 2 g r o u p s ) T o t a l s 1 3 7 6 9 . 7 22 A p p e n d i x E c o n t i n u e d 83 G r o u p M e a n D a y 7 D a y 14 D a y 2 1 M e a n 4 4 . 0 7.2 6 5 . 0 D a y 1 3 6 . 8 - 7.2 2 9 . 6 - 2 9 . 2 D a y 7 4 4 . 0 3 6 . 8 - 2 1 . 0 D a y 14 7.2 - 5 7 . 8 1 - 2 3 . 9 < $ * -fs + 2 3-.-9 6. C o m p a r i s o n s A m o n g s t D i f f e r e n t A g e s i n L i t t e r s o f 8 f o r A d i p o s e T i s s u e . S o u r c e SS d f MS F cC=o. 05 B e t w e e n g r o u p s 0.05 2 0 .03 0.3 3 . 68 E r r o r ( w i t h i n 1.67 15 0.1 g r o u p s ) T o t a l s 1.72 17 7. C o m p a r i s o n s A m o n g s t D i f f e r e n t A g e s i n L i t t e r s o f 14 f o r P r o x i m a l I n t e s t i n e . S o u r c e SS d f MS F oC=0.05 B e t w e e n g r o u p s 5 0 2 2 . 1 2 2 5 1 1 . 1 1 6 . 5 3.68 E r r o r ( w i t h i n 2 2 7 9 . 6 15 1 5 1 . 9 g r o u p s ) T o t a l s 7 3 0 1 . 7 17 A p p e n d i x E c o n t i n u e d * ; 84 G r o u p M e a n D a y 14 D a y 2 1 M e a n 10 . 7 4 8 . 6 G r o u p D a y 7 1 6 . 3 5.6 - 3 2 . 3 D a y 14 1 0 . 7 - 3 7 . 9 + 1 9 . 3 8. C o m p a r i s o n s A m o n g s t D i f f e r e n t A g e s i n L i t t e r s o f 14 f o r D i s t a l I n t e s t i n e S o u r c e SS d f MS F o£=0.05 B e t w e e n g r o u p s 7 6 5 8 . 3 2 3 8 2 9 . 2 1 1 9 . 1 3.68 E r r o r w i t h 4 8 2 . 1 15 3 2 . 1 g r o u p s T o t a l s 2 0 9 0 . 4 17 G r o u p M e a n D a y 14 D a y 2 1 M e a n 1 1 . 8 3 1 . 7 G r o u p D a y 7 1 1 . 5 - 0.3 - 2 0 . 2 D a y 14 1 1 . 8 -1 9 . 9 + 8 . 9 A p p e n d i x E c o n t i n u e d 9. C o m p a r i s o n s A m o n g s t D i f f e r e n t A g e s i n L i t t e r s o f 14 f o r A d i p o s e T i s s u e . S o u r c e SS d f MS F oC=0. 05 B e t w e e n g r o u p s 5.6 2 2 . 8 4 ..6 6 3. 68 E r r o r ( w i t h i n 9.7 15 0.6 g r o u p s ) T o t a l s 1 5 . 3 17 G r o u p M e a n D a y 14 D a y 2 1 M e a n 1.8 2.8 G r o u p D a y 7 1.5 - 0 . 3 - 1 . 3 D a y 14 1.8 - 1 . 0 + 1 . 2 1 *SS = Sum o f s q u a r e s d f = d e g r e e s o f f r e e d o m MS = mean s q u a r e 86 A P P E N D I X F S t a t i s t i c a l C o m p a r i s o n s o f R a t e s o f C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s B e t w e e n P r o x i m a l a n d D i s t a l I n t e s t i n e C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s * P u p s / L i t t e r A g e P r o x i m a l D i s t a l d f ** ( d ) I n t e s t i n e I n t e s t i n e 4 7 24 .8 + 1. 5b 32, 6 + 4 . 2b 10 4 14 10 .3 + 0. 9 b 11. 8 + 1. 6b 10 4 21 20 .0 + 2 . 3b 36. 0 + i • 7 a 10 8 1 45 .0 + 2 . 8b 36. 8 + 4 . l b 10 8 7 22 .0 + 5 . 3b 44 . 0 + 6. o a 8 8 14 8 .4 + 0 . 8b 7. 2 + 0. 7b 10 8 21 35 . 6 ± 6. l b 65 . 0 + 9 . 6 a 9 14 7 16 . 3 + 2 . 8b 11. 5 + 1. 9 b 10 14 14 10 . 7 + 0 . 9 b 11. 8 + 1. 6b 10 14 21 48 . 6 + 8. o b 31. 7 ± 3. o a 10 V a l u e s a r e e x p r e s s e d a s n m o l e s H/g/h ± SEM d f = d e g r e e s o f f r e e d o m V a l u e s i n e a c h r o w w i t h t h e s ame s u p e r s c r i p t a r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p < 0.05). * ** a , b 87 A p p e n d i x G S t a t i s t i c a l C o m p a r i s o n s o f R a t e s o f C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s A m o n g s t R a t s R a i s e d i n L i t t e r s o f 4,8 a n d 14 f o r V a r i o u s T i s s u e s . T i s s u e * A g e C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s ' ** ( d ) 4 P u p s / L i t t e r 8 P u p s / L i t t e r 14 P u p s / L i t t e : P r o x . 7 24 .8 + 1 . 5 b 22 . 0 + 5 . 3 b 1 6 . 3 ± 2 . 8 b P r o x . 14 1 0 . 3 + 0 . 9 b 8.4 + 0 . 8 b 10 . 7 + 0 . 9 b P r o x . 2 1 20 . 0 + 2 . 3 b 35 . 6 + 6 . 1 b 4 8 . 6 + 8 . 0 a D i s t . 7 32 . 6 + 4 . 2 b 44 . 0 + 6 . 0 b 1 1 . 5 + 1 . 9 a D i s t . 14 1 1 . 8 + 1 . 6 b 7 . 2 ± 0 . 7 b 1 1 . 8 + 1 . 6 b D i s t . 2 1 3 6 . 0 ± 2 . 7 b 65 . 0 + 9 . 6 a 3 1 . 7 + 3 . 0 b A d i p . 7 1.0 + o . i b 1.1 ± o . i b 1.5 + a 0 .1 A d i p . 14 0 . 8 + o . i b 1.1 ± o . i b a 1.8 + o . i a A d i p . 2 1 0.9 + o . i b 1.1 + o . i b 2.8 + 0 . 5 a * P r o x . = p r o x i m a l i n t e s t i n e D i s t . = d i s t a l i n t e s t i n e A d i p . = g l u t e a l a d i p o s e t i s s u e 3 ** V a l u e s a r e e x p r e s s e d a s n m o l e s H / g / h ± SEM a b V a l u e s i n e a c h r o w w i t h t h e same s u p e r s c r i p t a r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p 0 . 0 5 ) . 88 A p p e n d i x G S t a t i s t i c a l T e s t s U s e d i n t h e P r e c e d i n g S u m m a r y T a b l e 1. C o m p a r i s o n s A m o n g s t L i t t e r s o f 4, 8 a n d 14 f o r P r o x i m a l a n d D i s t a l I n t e s t i n e o n D a y 7. S o u r c e *SS * d f *MS F OC = 0.05 B e t w e e n g r o u p s 4 1 1 3 . 0 5 8 2 2 . 6 10 . 6 2 . 56 E r r o r ( w i t h i n 2 1 7 8 . 3 28 g r o u p s ) T o t a l s 6 2 9 1 . 3 33 G r o u p M e a n M e a n I I 32 . 6 I I I I V 2 2 . 0 4 4 . 0 V 1 6 . 3 V I 1 1 . 5 * * G r o u p - T • ' . 24 . 8 - 7 . 8 2.8 - 1 9 . 2 8.5 13 . 3 I I 32 . 6 1 0 . 6 - 1 1 . 4 1 6 . 3 2 1 . 1 I I I 22 . 0 -22 . 0 -5 . 7 1 0 . 5 I V 44 . 0 27 . 7 32 . 5 V 1 6 . 3 4 . 8 C o n f i d e n c e i n t e r v a l s f o r p a i r w i s e c o m p a r i s o n s w i t h : 6 s u b j e c t s p e r c e l l : 6 s u b j e c t s i n o n e c e l l , 5 s u b j e c t s i n t h e o t h e r : . 0 A p p e n d i x G c o n t i n u e d 2. C o m p a r i s o n s A m o n g s t L i t t e r s o f 4, 8 a n d 14 f o r P r o x i m a l a n d D i s t a l I n t e s t i n e o n D a y 1 4 . 89 S o u r c e SS d f MS F oC= 0.05 B e t w e e n g r o u p s 1 0 4 . 8 5 2 1 . 0 1.6 2.55 E r r o r ( w i t h i n 3 8 0 . 9 29 1 3 . 1 g r o u p s ) T o t a l s 4 8 5 . 7 34 3. C o m p a r i s o n s A m o n g s t L i t t e r s o f 4, 8 a n d 14 f o r P r o x i m a l a n d D i s t a l I n t e s t i n e o n D a y 2 1 . S o u r c e SS d f MS F oC = 0.05 B e t w e e n g r o u p s 7 2 0 9 . 7 5 1 4 4 1 . 9 7.1 2.55 E r r o r ( w i t h i n 5 9 1 4 . 8 29 2 0 4 . 0 g r o u p s ) T o t a l s 1 3 1 2 4 . 5 34 A p p e n d i x G c o n t i n u e d 90 G r o u p M e a n I I I I I I V V V I M e a n 3 6 . 0 3 5 . 6 6 5 . 0 4 8 . 6 3 1 . 7 G r o u p I 2 0 . 0 -16.0 -15.6 - 4 5 . 0 - 2 8 . 6 - 1 1 . 7 I I 3 6 . 0 0.4 - 2 9 . 0 - 1 2 . 6 4.3 I I I 3 5 . 6 - 2 9 . 4 - 1 3 . 0 3.9 I V 6 5 . 0 1 6 . 4 3 3 : 3 V 4 8 . 6 1 6 . 9 C o n f i d e n c e i n t e r v a l s f o r p a i r w i s e c o m p a r i s o n s w i t h : 6 s u b j e c t s p e r c e l l : 6 s u b j e c t s i n o n e c e l l , 5 s u b j e c t s i n t h e o t h e r s > 4. C o m p a r i s o n s Amongst L i t t e r s o f 4, 8 a n d 14 f o r A d i p o s e T i s s u e o n D a y 7. S o u r c e SS d f MS F oC= 0.05 B e t w e e n g r o u p s 0.84 2 0.40 6 3.68 E r r o r ( w i t h i n 1.06 15 0.07 g r o u p s ) T o t a l s 1.90 17 A p p e n d i x G c o n t i n u e d 9 1 G r o u p M e a n M e a n 8 / l i t t e r 1.1 1 4 / l i t t e r 1.5 G r o u p 4 / l i t t e r 8 / l i t t e r 1.0 1.1 - 0 . 1 •0 . 5 •0.4 ; - 0 - 4 < t < ft + 0 . 4 5. C o m p a r i s o n s A m o n g s t L i t t e r s o f 4, 8 a n d 14 f o r A d i p o s e T i s s u e o n D a y 1 4 . S o u r c e SS d f MS F o£=0.05 B e t w e e n g r o u p s E r r o r ( w i t h i n g r o u p s ) 5.09 2 5.52 15 2.55 6.87 0 .37 3 . 68 T o t a l s 1 0 . 6 1 17 G r o u p M e a n 8 / l i t t e r 1 4 / l i t t e r M e a n 1.1 1.8 G r o u p 4 / l i t t e r 0.8 - 0 . 3 - 1 . 0 8 / l i t t e r 1.1 - 0 . 7 fa- -0.9 — jfc A p p e n d i x G c o n t i n u e d 6. C o m p a r i s o n s A m o n g s t L i t t e r s o f 4, 8 a n d 14 f o r A d i p o s e T i s s u e o n D a y 2 1 . S o u r c e SS d f MS F oC=0.05 B e t w e e n g r o u p s 1 3 . 1 2 6.6 1 5 . 2 3.68 E r r o r ( w i t h i n 6.4 15 0.4 g r o u p s ) T o t a l s 1 9 . 5 17 G r o u p M e a n 8 / l i t t e r 1 4 / l i t t e r M e a n 1.1 2.8 G r o u p 4 / l i t t e r 0.9 - 0 . 2 - 1 . 9 8 / l i t t e r 1.1 - 1 . 7 *SS = sum o f s q u a r e s d f = d e g r e e s o f f r e e d o m MS = mean s q u a r e * * G r o u p I = P r o x i m a l i n t e s t i n e , 4 / l i t t e r I I = D i s t a l i n t e s t i n e , 4 / l i t t e r I I I = P r o x i m a l i n t e s t i n e , 8 / l i t t e r I V = D i s t a l i n t e s t i n e , 8 / l i t t e r V = P r o x i m a l i n t e s t i n e , 1 4 / l i t t e r V I = D i s t a l i n t e s t i n e , 1 4 / l i t t e r 9-3, A P P E N D I X H S t a t i s t i c a l C o m p a r i s o n s o f B o d y W e i g h t A m o n g s t L i t t e r S i z e s A g e B o d y W e i g h t ( g )  ( d ) 4 P u p s / L i t t e r 8 P u p s / L i t i e r 14 P u p s / L i t t e r 7 1 7 . 3 ± 0 . 2 x 1 4 . 5 ± 1 . 2 x 1 5 . 1 ± 0 . 3 x 14 3 1 . 0 ± 0 . 7 y 3 4 . 3 ± 0 . 5 y 2 2 . 6 ± 0 . 4 y 2 1 5 4 . 2 ± 0 . 9 z 4 6 . 8 ± 0 . 2 b 3 6 . 9 ± 0.9% a , b , c V a l u e s i n e a c h r o w w i t h t h e same s u p e r s c r i p t a r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p < 0 . 0 5 ) . x , y , z V a l u e s i n e a c h c o l u m n w i t h t h e same s u b s c r i p t a r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( P ^ 0 . 0 5 ) . A p p e n d i x H S t a t i s t i c a l C o m p a r i s o n s f o r Body,, W e i g h t s A m o n g s t L i t t e r s o f 4, 8 a n d 14 f o r D i f f e r e n t A g e s u s e d i n t h e P r e c e d i n g S u m m a r y T a b l e . 1. C o m p a r i s o n s A m o n g s t L i t t e r s o f 4, 8 a n d 14 o n D a y 7. S o u r c e SS d f MS F c£=0.05 B e t w e e n g r o u p s 24 .8 2 12 .4 7 . 7 5 3.74 E r r o r ( w i t h i n 22 . 1 14 1 . 6 g r o u p s ) T o t a l s 46 .9 16 G r o u p M e a n 8 / l i t t e r 1 4 / l i t t e r M e a n 1 4 . 5 1 5 . 1 G r o u p 4 / l i t t e r 1 7 . 3 2.8 2.2 8 / l i t t e r 1 4 . 5 - 0 . 6 C o n f i d e n c e i n t e r v a l s f o r p a i r w i s e c o m p a r i s o n s w i t h : 6 s u b j e c t s p e r c e l l : 6 s u b j e c t s i n o n e c e l l , 5 s u b j e c t s i n t h e o t h e r : 0 A p p e n d i x H c o n t i n u e d 2. C o m p a r i s o n s A m o n g s t L i t t e r s o f 4, 8 a n d 14 o n D a y 1 4 . 95 S o u r c e SS d f MS F oC=0. 05 B e t w e e n g r o u p s 4 3 6 . . 7 2 2 1 8 . 4 7 8 . 0 3. 68 E r r o r ( w i t h i n 4 2 . . 3 15 2.8 g r o u p s ) T o t a l s 4 7 9 . . 0 17 G r o u p M e a n 8 / l i t t e r 1 4 / l i t t e r M e a n 3 4 . 3 2 2 . 6 G r o u p 4 / l i t t e r 3 1 . 0 - 3.3 8.4 8 / l i t t e r 3 4 . 3 1 1 . 7 - 2 . 6 < < fa + 2 . 6 3. C o m p a r i s o n s A m o n g s t l i t t e r s o f 4, 8 a n d 14 o n D a y 2 1 . S o u r c e SS d f MS 'F CC=0.05 B e t w e e n g r o u p s 9 0 4 . 1 2 4 5 2 . 0 1 9 6 . 5 3.68 E r r o r ( w i t h i n 3 5 . 4 15 2.3 g r o u p s ) T o t a l s 9 3 9 . 5 17 A p p e n d i x H c o n t i n u e d 96 G r o u p M e a n 8 / l i t t e r 1 4 / l i t t e r M e a n 46 . 8 36 . 9 G r o u p 4 / l i t t e r 5 4 . 2 7.4 1 7 . 3 8 / l i t t e r 4 6 . 8 9.9 f3 -2-4 <f< fj . 2 . 4 4. C o m p a r i s o n s A m o n g s t D i f f e r e n t A g e s i n L i t t e r s o f 4. S o u r c e SS d f MS F oC=0.05 B e t w e e n g r o u p s 4 1 7 5 . 0 2 2 0 8 7 . 5 6 2 6 . 3 3.68 E r r o r ( w i t h i n 5 0 . 0 15 3.3 g r o u p s ) T o t a l s 4 2 2 5 . 0 17 M e a n G r o u p D a y 7 D a y 14 M e a n 1 7 . 3 3 1 . 0 G r o u p D a y 14 3 1 . 0 - 1 3 . 7 D a y 2 1 54 . 2 -36 . 9 - 2 3 . 2 A p p e n d i x H c o n t i n u e d 97 5. C o m p a r i s o n s A m o n g s t D i f f e r e n t A g e s i n L i t t e r s o f 8. S o u r c e SS d f MS F oC=0.05 B e t w e e n g r o u p s 5 8 3 5 . 9 3 1 9 4 5 . 3 2 2 5 4 .1 3.13 E r r o r ( w i t h i n 1 6 . 4 19 0.9 g r o u p s ) T o t a l s 5 8 5 2 . 3 22 G r o u p M e a n M e a n D a y 7 14 .5 D a y 34 14 . 3 D a y 2 1 4 6 . 8 G r o u p D a y 1 7.0 -7 . 5 -27 . 3 - 3 9 . 8 D a y 7 14 . 5 -19 . 8 -32 . 3 D a y 14 34 . 3 -12 . 5 < f, + 1.7 6. C o m p a r i s o n s A m o n g s t D i f f e r e n t A g e s i n L i t t e r s o f 1 4 . S o u r c e SS d f MS F OC=0.05 B e t w e e n g r o u p s 1 4 7 2 . 0 2 7 3 6 . 0 339 .7 3 . 68 E r r o r ( w i t h i n 32 .5: 15 2 . 2 g r o u p s ) T o t a l s 1 5 0 4 . 5 • 1 7 . A p p e n d i x H c o n t i n u e d 98 G r o u p M e a n D a y 14 D a y 2 1 M e a n 2 2.6 3 6.9 G r o u p D a y 7 1 5 . 1 - 7 . 5 - 2 1 . 8 D a y 14 2 2 . 6 - 1 4 . 3 f, "2-3 * $ ± f, 99-A P P E N D I X I ANOVA O r t h o g o n a l P o l y n o m i a l C o n t r a s t t o t h e T i m e F a c t o r a n d I n t e r a c t i o n s w i t h t h e T i m e F a c t o r f o r C h o l e s t e r o l S y n t h e s i s i n P r o x i m a l I n t e s t i n e a n d D i s t a l I n t e s t i n e P r o x i m a l I n t e s t i n e C o m b i n e d O b s e r v e d M e a n s F o r C o m b i n e d O b s e r v e d M e a n s f o r L i t t e r 3 ( n m o l e s H/g/h) 3 T i m e ( n m o l e s H / g /h) L i t t e r S i z e A g e ( g ) 1 W e i g h t e d 4 5 . 0 1 U n w e i g h t e d 4 5 . 0 1 8 W e i g h t e d 2 7 . 98 7 W e i g h t e d 20 . 94 U n w e i g h t e d 27 . 73 U n w e i g h t e d 2 1 . 0 0 4 W e i g h t e d 2 5 . 02 14 W e i g h t e d 9 . 79 U n w e i g h t e d 25 . 02 U n w e i g h t e d 9 . 79 14 W e i g h t e d 30 . 15 2 1 W e i g h t e d 34 . 72 U n w e i g h t e d 30 . 15 U n w e i g h t e d 34 . 72 T e s t s o f S i g n i f i c a n c e f o r P r o x i m a l I n t e s t i n e u s i n g U n i q u e Sums o f S q u a r e s S o u r c e o f V a r i a t i o n Sum o f S q u a r e d f M e a n S q u a r e F S i g . o f F. W i t h i n C e l l s 4 9 2 5 . 4 5 59 C o n s t a n t 5 4 0 8 7 . 7 4 1 5 4 0 8 7 . 8 9 647 . 89 0 . 0 0 1 L i t t e r 3 1 6 . 5 3 2 1 5 8 . 2 6 1. 89 0 .159 T i m e ( 1 ) 1 5 8 8 . 1 0 1 1 5 8 8 . 1 0 19 . 02 0 . 0 0 0 T i m e (2) 1 0 6 0 3 . 7 7 1 1 0 6 0 3 . 7 7 1 2 7 . 0 1 0 . 0 0 0 T i m e ( 3 ) 4 7 6 . 0 4 1 4 7 6 . 0 4 5 . 70 0 . 0 2 0 L i t t e r B y T i m e ( 1 ) 1 3 5 0 . 9 1 2 6 7 5 . 4 5 8 . 09 0 . 0 0 1 L i t t e r B y T i m e ( 2 ) 1 0 1 7 . 8 5 2 5 0 8 . 9 2 6. 09 0,004 L i t t e r B y T i m e ( 3 ) 28 . 90 2 14 .45 0 . 17 0 . 8 4 1 1 GO-A P P E N D I X I ( C o n t i n u e d ) D i s t a l I n t e s t i n e C o m b i n e d O b s e r v e d M e a n s f o r C o m b i n e d O b s e r v e d M e a n s f o r 3 3 L i t t e r ( n m o l e s H / g /h) T i m e ( n m o l e s H / g /h) L i t t e r S i z e A g e ( d ) 1 W e i g h t e d 3 6 . 79 U n w e i g h t e d 3 6 . 79 8 W e i g h t e d 36 .76 7 W e i g h t e d 2 8 . 47 U n w e i g h t e d 38 . 24 U n w e i g h t e d 29 . 33 4 W e i g h t e d 29 .32 14 W e i g h t e d 1 0 . 38 U n w e i g h t e d 29 .32 U n w e i g h t e d 1 0 . 38 14 W e i g h t e d 22 .97 2 1 W e i g h t e d 42 . 98 U n w e i g h t e d 22 .97 U n w e i g h t e d 44 . 2 1 T e s t o f S i g n i f i c a n c e f o r D i s t a l I n t e s t i n e u s i n g U n i q u e Sums o f S q u a r e s S o u r c e o f V a r i a t i o n Sum o f S q u a r e d f M e a n S q u a r e F S i g . o f F W i t h i n C e l l s 5 7 8 4 . 4 6 58 9 9 . 7 3 C o n s t a n t 6 3 4 7 8 . 4 5 1 6 3 4 7 8 . 4 5 6 3 6 .48 0 . 0 0 1 L i t t e r 2 6 7 5 . 4 8 2 1 3 3 7 . 7 4 13 .41 0 . 0 0 0 T i m e ( 1 ) 9 . 38 1 9 . 38 0 .09 0 . 7 6 0 T i m e ( 2 ) 7 4 2 4 . 8 0 1 7 4 2 4 . 80 74 .44 0 . 0 0 1 T i m e ( 3 ) 3 5 9 8 . 2 6 1 3 5 9 8 . 2 6 36 .07 0 . 0 0 1 L i t t e r B y T i m e ( 1 ) 8 4 8 . 3 3 2 4 2 4 . 1 6 4 .25 0 . 0 1 9 L i t t e r B y T i m e ( 2 ) 3 9 9 . 8 8 2 1 9 9 . 9 4 2 .00 0.144 L i t t e r B y T i m e ( 3 ) 3 0 1 9 . 7 1 2 1 5 0 9 . 8 5 15 . 13 0 . 0 0 1 10;]> B I B L I O G R A P H Y H i s a t o m i , K. a n d N i i y a m a , Y. E f f e c t s o f p o s t n a t a l u n d e r n u t r i t i o n o n t h e s e r o t o n i n c o n t e n t s o f s u c k l i n g r a t b r a i n . J . N u t r . S c i . V i t a m i n o l . 2 6 ( 3 ) : 2 7 9 - 2 9 2 , 1 9 8 0 . H a h n , P. a n d W a l k e r , B . L . H e p a t i c 3 - h y d r o x y - 3 -m e t h y l g l u t a r y l C o A r e d u c t a s e r e s p o n s e t o l i t t e r s i z e i n s u c k l i n g r a t s . C a n . J . B i o c h e m 5 7 : 1 2 1 6 - 1 2 1 9 , 1 9 7 9 . H a t c h , T. F., L e b e n t h a l , E . , K r a s n e r , J . a n d B r a n s k i , D. E f f e c t s o f p o s t n a t a l m a l n u t r i t i o n o n p a n -c r e a t i c z y m o g e n e n z y m e s i n t h e r a t . Am. J . C l i n . N u t r . 3 2 : 1 2 2 4 - 1 2 3 0 , 1 9 7 9 . S c h e n c k , P. E . , K o o s S l o b , A., U i l e n b r o e k , J . TH. J . a n d V a n d e r W e r f f t e n B o s c h , J . J . E f f e c t o f n e o -n a t a l u n d e r n u t r i t i o n . , o n s e r u m f o l l i c l e - s t i m u l a t i n g h o r m o n e l e v e l s a n d o v a r i a n d e v e l o p m e n t i n t h e f e m a l e r a t . B r . J . N u t r . 4 4 ( 2 ) : 1 7 9 - 1 8 2 , 1 9 8 0 . H a t c h , T. F., L e b e n t h a l , E . , B r a n s k i , D. a n d K r a s n e r , J . T h e e f f e c t o f e a r l y p o s t n a t a l a c q u i r e d m a l n u t r i -t i o n o n i n t e s t i n a l g r o w t h , d i s a c c h a r i d a s e s and' e n t e r o k i n a s e . J . N u t r . 1 0 9 ( 1 1 ) : 1 8 7 4 - 1 8 7 9 , 1 9 7 9 . B a k s i , K. E f f e c t s o n n e o n a t a l u n d e r n u t r i t i o n o n s m a l l i n t e s t i n a l d i p e p t i d a s e ( s ) a c t i v i t y . I n d i a n J . o f E x p . B i o l . 1 7 ( 1 0 ) : 1 1 0 7 - 1 1 1 1 , 1 9 7 9 . 1 0 2 7. G u i r a l d e s , E. a n d H a m i l t o n , R. J . E f f e c t s o f e a r l y m a l n u t r i t i o n o n d e v e l o p i n g s m a l l i n t e s t i n e . P e d i a t r . R e s . 1 4 ( 4 I I ) : 4 5 6 , 1 9 8 0 . 8. R e i s e r , R. C o n t r o l o f a d u l t s e r u m c h o l e s t e r o l b y t h e n u t r i t i o n o f t h e s u c k l i n g : A p r o g r e s s r e p o r t . C i r c u -l a t i o n 4 4 : S u p p l . I I - 3 , 7, 1 9 7 1 . 9. H a h n , P. a n d K i r b y , L . I m m e d i a t e a n d l a t e e f f e c t s o f p r e m a t u r e w e a n i n g a n d o f f e e d i n g a h i g h f a t o r h i g h c a r b o h y d r a t e d i e t t o w e a n l i n g r a t s . J . N u t r . 1 0 3 ( 5 ) : 6 9 0 - 6 9 6 , 1 9 7 3 . 1 0 . S u b b i a h , M. T. R. N e o n a t a l m a n i p u l a t i o n o f c h o l e s t e r o l m e t a b o l i s m : A p o t e n t i a l m a n e u v e r t o i m p r o v e t h e h a n d l i n g o f c h o l e s t e r o l i n a d u l t l i f e . A r t e r y 6 ( 2 ) : 8 2 - 8 8 , 1 9 7 9 . 1 1 . D o b b i n g , J . T h e l a t e r d e v e l o p m e n t o f t h e b r a i n a n d i t s v u l n e r a b i l i t y . I n : S c i e n t i f i c F o u n d a t i o n s o f  P e d i a t r i c s , 2 n d E d i t i o n , E d i t o r s J . A. D a n i s a n d J . D o b b i n g , H e i n e m a n n , L o n d o n , 1 9 8 1 . 1 2 . D o b b i n g , J . N u t r i t i o n a l g r o w t h r e s t r i c t i o n a n d t h e n e r v o u s s y s t e m . I n : T h e M o l e c u l a r B a s i s o f N e u r o p a t h -o l o g y . E d i t o r s : R.H.S. T h o m s o n a n d A. N. D a v i s o n . E d w a r d A r n o l d , L o n d o n ., 1 9 8 1 . 1 3 . P i c o n e , T. A. a n d H a l l , R. D. E f f e c t s o f e a r l y m a l -n u t r i t i o n o n t a i l p i n c h - i n d u c e d b e h a v i o r o f t h e r a t . P h y s i o l . B e h a v . 2 2 ( 1 ) : 1 4 9 - 1 5 5 , 1 9 7 9 . 14. B y r n e , E.A. and Smart, J . L . D e l i m i t a t i o n o f a s e n s i -t i v e p e r i o d f o r t h e e f f e c t s o f e a r l y l i f e u n d e r -n u t r i t i o n on s o c i a l b e h a v i o r o f a d u l t male r a t s . P h y s i o l . Behav. 2 4 ( 1 ) : 131-133, 1980. 15. Whatson, T. S., Smart, J . L., and D o b b i n g , J . S o c i a l i n t e r a c t i o n s among a d u l t male r a t s a f t e r e a r l y u n d e r -n u t r i t i o n . B r . J . N u t r . 32:413-419, 1974. 16. Whatson, T. S., Smart, J . L. and D o b b i n g , J . Dominance r e l a t i o n s h i p s among p r e v i o u s l y u n d e r n o u r i s h e d and w e l l f e d m a l e r a t s . P h y s i o l . Behav. 14:425-429, 1975. 17. Watson, T. S., Smart, J . L. and D o b b i n g , J . U n d e r -n u t r i t i o n i n e a r l y l i f e : L a s t i n g e f f e c t s on a c t i v i t y o f s o c i a l b e h a v i o r o f male and f e m a l e r a t s . Dev. P s y c h o b i o l . 9:529-538, 1976. 18. N e a l , H. J . , Wearden, J . H. and Smart, J . L. R e a c t i o n t o o m i s s i o n o f r e w a r d i n an o p e r a n t c o n d i t i o n i n g s i t u a t i o n i n a d u l t r a t s a f t e r u n d e r n u t r i t i o n e a r l y i n l i f e . P h y s i o l . Behav. 2 4 ( 5 ) : 875-880, 1980. 19. C h e v e l l i e r , F. and Magot, T. E v i d e n c e o f • a ^ m a j o r r o l e o f t h e i n t e s t i n e i n c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n t h e a d u l t m ale r a t . E x p e r i e n t i a 31: 627-629, 1975. 20. L u t t o n , C. The r o l e o f t h e d i g e s t i v e t r a c t i n c h o l e s t e r o l m e t a b o l i s m . D i g e s t i o n 14:342-356, 1976. 21. F e a r s , R. and Umpleby, M. E v i d e n c e f o r t h e o p e r a t i o n o f t h e e x t r a h e p a t i c l i p o p r o t e i n r e c e p t o r s y s t e m i n v i v o i n r a t s . B i o c h e m . J . 182:803-809, 1979. 104;- ... 2 2 . M c N a m a r a , D. J . , Q u a c k e n b u c h , F. W. a n d R o d w e l l , V. W. R e g u l a t i o n o f HMG C o A r e d u c t a s e : D e v e l o p m e n t a l p a t t e r n . J . B i o l . Chem. 2 4 7 ( 1 3 ) : 5 8 0 5 - 5 8 1 0 , 1 9 7 2 . 2 3 . H a h n , P. C h o l e s t e r o l m e t a b o l i s m i n o b e s e m i c e . C a n . J . B i o c h e m . 5 8 ( 1 1 ) : 1 2 5 8 - 1 2 6 0 , 1 9 8 0 . 2 4 . N a m b u d i r i , A. M., R a n g a n a t h a n , S. a n d R u d n e y , H. T h e r o l e o f HMG C o A r e d u c t a s e a c t i v i t y i n t h e r e g u l a t i o n o f u b i q u i n o n e s y n t h e s i s i n human f i b r o b l a s t s . J . B i o l . Chem. 2 5 5 ( 1 2 ) : 5 8 9 4 - 5 8 9 9 , 1 9 8 0 . 2 5 . W h i t e , A., H a n d l e r , P. a n d S m i t h , E. L . I n : P r i n c i p l e s  o f B i o c h e m i s t r y ' 6 t h e d i t i o n , M c G r a w B o o k C o . , New Y o r k , N. Y., 1 9 7 8 . 2 6 . J a m e s , M. J . a n d K a n d u t s c h , A. A. E v i d e n c e f o r i n d e -p e n d e n t r e g u l a t i o n o f d o l i c h o l a n d c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n d e v e l o p i n g m o u s e b r a i n . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 6 1 9 : 4 3 2 - 4 3 5 , 1 9 8 0 . 2 7 . B e n s c h , W. R., I n g e b r i t s i n , T. S. a n d D i l l e r , E. R. L a c k o f c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e r a t e o f c h o l e s t e r o l b i o s y n t h e s i s a n d t h e a c t i v i t y o f HMG C o A r e d u c t a s e i n r a t s a n d i n f i b r o b l a s t s t r e a t e d w i t h ML 2 3 6 B. B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 8 2 ( 1 ) : 2 4 7 - 2 5 4 , 1 9 7 8 . 2 8 . S a b i n e , J . R. I n : C h o l e s t e r o l , ° M a r c e l D e k k e r , I n c . , New Y o r k , N. Y., 1 9 7 7 . 2 9 . T h o m p s o n , E. D. a n d P a r k s , L . W. T h e e f f e c t o f a l t e r -e d s t e r o l c o m p o s i t i o n o n c y t o c h r o m e o x i d a s e a n d S-24 a d e n o s y l m e t h i o n m e : - s t e r o l m e t h y l t r a n s f e r a s e 1 0 5 2 9 . e n z y m e s o f y e a s t m i t o c h o n d r i a . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 5 7 : 1 2 0 7 - 1 2 1 3 , 1 9 7 4 . 3 0 . C o b o n , G. S. a n d H a s l a m , J . M. T h e e f f e c t o f a l t e r e d m e m b r a n e s t e r o l c o m p o s i t i o n o n t h e t e m p e r a t u r e d e p e n d e n c e o f y e a s t m i t o c h o n d r i a l A T P a s e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 5 2 : 3 2 0 - 3 2 6 , 1 9 7 3 . 3 1 . C h e n , H. W., H e i n i g e r , H. J . a n d W a y m o u t h , C. I n h i b i t i o n o f c e l l g r o w t h b y o x y g e n a t e d d e r i v a t i v e s o f c h o l e s t e r o l . N a t u r e 2 5 1 : 4 1 9 - 4 2 1 , 1 9 7 4 . 3 2 . E d e l m a n , G. M., Y a h a r a , I . a n d Wang, J . L . R e c e p t o r m o b i l i t y a n d r e c e p t o r - c y t o p l a s m i c i n t e r a c t i o n s i n l y m p h o c y t e s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . ( U S A ) 7 0 : 1 1 4 2 -1 1 4 6 , 1 9 7 3 . 3 3 . C u a t r e c a s a s , P. I n s u l i n r e c e p t o r s , c e l l m e m b r a n e s a n d h o r m o n e a c t i o n . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 2 3 : 2 3 5 2 -2 3 6 1 , 1 9 7 4 . 3 4 . R o m a n - F r a n c o , A. A. a n d S a n t i a g o - D e l p h i n , E. A. T h e i m m u n o r e g u l a t o - r y r o l e o f c h o l e s t e r o l a n d o t h e r l i p i d s : A H y p o t h e s i s . M e d i c a l H y p o t h e s e s 3 ( 6 ) : 2 3 5 - 2 4 0 , 1 9 7 7 . 3 5 . H e i n i g e r , J . J . , B r u n n e r , K. T. a n d C e r o t t i n i , J . C. C h o l e s t e r o l i s a c r i t i c a l c e l l u l a r c o m p o n e n t f o r T l y m p h o c y t e c y t o t o x i c i t y . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 7 5 ( 1 1 ) : 5 6 8 3 - 5 6 8 7 , 1 9 7 8 . 1 0 6 3 6 . C h e n , H. W., H e i n i g e r , H. J . a n d K a n d u t c h , A. A. 8 6 A l t e r a t i o n o f Rb+ i n f l u x a n d e f f l u x f o l l o w i n g d e p -l e t i o n o f m e m b r a n e s t e r o l i n L - c e l l s . J . B i o l . Chem. 2 5 3 : 3 1 8 0 - 3 1 8 5 , 1 9 7 8 . 3 7 . C o o p e r , R. A., L e s l i e , M. H., K n i g h t , D. a n d D i e t w e i l e r , D. K. R e d c e l l c h o l e s t e r o l e n r i c h m e n t a n d s p u r c e l l a n e m i a i n d o g s f e d a c h o l e s t e r o l - e n r i c h e d a t h e r o g e n i c d i e t . J . L i p i d R e s . 2 1 ( 8 ) : 1 0 8 2 - 1 0 8 9 , 1 9 8 0 . 3 8 . B a l i s t r e r i , W. F., L e s l i e , M. H., a n d C o o p e r , R. A. I n c r e a s e d c h o l e s t e r o l a n d d e c r e a s e d f l u i d i t y o f r e d c e l l m e m b r a n e s ( s p u r c e l l a n e m i a ) i n p r o g r e s s i v e i n t r a h e p a t i c c h o l e s t a s i s . P e d i a t r i c s 6 7 ( 4 ) : 4 6 1 -4 6 6 , 1 9 8 1 . 3 9 . B i t t m a n , R., C h e n , W. C. a n d A n d e r s o n , O. R. I n t e r -a c t i o n o f f i l i p i n I I I a n d a m p h o t e r i c i n B w i t h l e c i t h i n , s t e r o l v e s i c l e s a n d c e l l u l a r m e m b r a n e s : S p e c t r a l a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p e s t u d i e s . B i o -c h e m i s t r y 1 3 : 1 3 6 4 - 1 3 7 3 , 1 9 7 4 . 4 0 . M a n z o l i , F. A., M u c h m o r e , J . H., B o n o r a , B., C a p i t a n i , S. a n d B a r t o l i , S. L i p i d - D N A i n t e r a c t i o n s . I I . P h o s p h o l i p i d s , c h o l e s t e r o l g l y c e r o p h o s p h o r y l -c h l o r i n e , s p h i n g o s i n e a n d f a t t y a c i d s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 3 4 0 : 1 - 1 5 , 1 9 7 4 . 4 1 . S a b i n e , J . R. a n d J a m e s , M. J . T h e i n t r a c e l l u l a r m e c h a n i s m r e s p o n s i b l e f o r d i e t a r y f e e d b a c k c o n t r o l o f h e p a t i c c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s . L i f e S c i . 1 8 : 1 1 8 5 -1 1 9 2 , 1 9 7 6 . 1 0 7 4 2 . H a u s s l e r , M. R. I n : P r e s e n t K n o w l e d g e i n N u t r i t i o n , t h 4 e d i t i o n . T h e N u t r i t i o n F o u n d a t i o n I n c . , New Y o r k , N. Y., 1 9 7 6 . 4 3 . G o o d m a n , L . S. a n d G i l m a n , A. I n : T h e P h a r m a c o l o g i c a l r d -B a s i s o f T h e r a p e u t i c s , 3 e d i t i o n , C o l l i e r M a c M i l l a n C a n a d a L t d . , T o r o n t o , 1 9 6 9 . 4 4 . I l l i n g w o r t h , D. R. a n d O r w o l l , E. L o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s a n d a d r e n a l C o r t i s o l p r o d u c t i o n : S t u d i e s i n a b e t a l i p o p r o t e i n e m i a a n d h y p o b e t a l i p o p r o t e i n a e m i a . B i o c h e m . S o c . T r a n s . 9 ( 1 ) : 5 0 , 1 9 8 1 . 4 5 . D i e t s c h y , J . M. a n d W i l s o n , J . D. R e g u l a t i o n o f c h o -l e s t e r o l m e t a b o l i s m . New E n g . J . o f M e d . 2 8 2 ( 2 0 ) : 1 1 2 8 - 1 1 3 8 , 1 9 7 0 . 4 6 . P i n c k n e y , E. R. a n d P i n c k n e y , C. I n : T h e C h o l e s t e r o l  C o n t r o v e r s y , S h e r b o u r n e P r e s s , L o s A n g e l e s , 1 9 7 3 . 4 7 . P a g e , I . H. N a t i o n a l d i e t - h e a r t s t u d y : F i n a l r e p o r t . C i r c u l a t i o n 3 7 : S u p p l . 1 : 1 - 4 2 8 , 1 9 6 8 . 4 8 . L e r e n , P. T h e O s l o - d i e t - h e a r t s t u d y e l e v e n y e a r r e -p o r t . C i r c u l a t i o n 4 2 : 9 3 5 - 9 4 2 , 1 9 7 0 . 4 9 . S t e i n , E. A., S h a p e r o , J . , M c N e r n e y , C. G l u e c k , C . J . T r a c y , T. a n d G a r t s i d e , P. C h a n g e s i n p l a s m a l i p i d a n d l i p o p r o t e i n f r a c t i o n s a f t e r a l t e r a t i o n s i n d i e t a r y c h o l e s t e r o l , p o l y u n s a t u r a t e d , s a t u r a t e d , a n d t o t a l f a t i n f r e e - l i v i n g n o r m a l a n d h y p e r c h o l e s t e r o l e m i c c h i l d r e n . Am. J . C l i n . N u t r . 3 5 : 1 3 7 5 - 1 3 9 0 , 1 9 8 2 . 108 5 0 . S c h a e f e r , E . , L e v y , R . I . , E r n s t , N. D., V a n S a n t , F.D., a n d B r e w e r H. B. T h e e f f e c t s o f l o w c h o l e s t e r o l , h i g h p o l y u n s a t u r a t e d f a t , a n d l o w f a t d i e t s o n p l a s m a l i p i d a n d l i p o p r o t e i n c h o l e s t e r o l l e v e l s i n n o r m a l a n d h y p e r c h o l e s t e r o l e m i c s u b j e c t s . Am. J . C l i n . N u t r . 3 4 : 1 7 5 8 - 1 7 6 3 , 1 9 8 1 . 5 1 . S h e k e l l e , R. B., M a c M i l l a n S h r y o c k , A., P a u l , O., L e p p e r , M., S t a m l e r , J . , L i u , S. a n d R a y n o r J r . , W. J . D i e t , s e r u m c h o l e s t e r o l a n d d e a t h f r o m c o r o n a r y h e a r t d i s -e a s e . T h e W e s t e r n E l e c t r i c S t u d y . N. E n g . J . Med. 3 0 4 : 6 5 - 7 0 , 1 9 8 1 . 5 2 . B r u h n , J . G. a n d W o l f , S. S t u d i e s r e p o r t i n g " l o w r a t e o f i s c h a e m i c h e a r t d i s e a s e " : A c r i t i c a l r e v i e w . Am. J . P u b l i c H e a l t h 6 0 : 1 4 7 7 - 1 4 9 5 , 1 9 7 0 . 5 3 . M a n n , G. V., S h a f f e r , R. D., A n d e r s o n , R. S. a n d S a n d s t e a d , H. H. C a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e i n t h e M a s a i . J . A t h e r . R e s . 4 : 2 8 9 - 3 1 2 , 1 9 6 4 . 5 4 . B e a g l e h o l e , R., F o u l k e s , M. A., P r i o r , I . A. a n d E y l e s , E. F. C h o l e s t e r o l a n d m o r t a l i t y i n New Z e a l a n d M a o r i s . B r . Med. J . . . 2 8 0 : 2 8 5 - 2 8 7 , 1 9 8 0 . 5 5 . K a n n e l , W. G., C a s t e l l i , W. P. a n d G o r d o n T. C h o l e s t e r o l i n t h e p r e d i c t i o n o f a t h e r o s c l e r o t i c d i s e a s e : New p e r s p e c t i v e s b a s e d o n t h e F r a m i n g h a m S t u d y . A n n . I n t e r n . M e d . 9 0 : 8 5 - 9 1 , 1 9 7 9 . 1 0 9 5 6 . I l l i n g w o r t h , D. R., M c C l u n g , M. R., C o n o r , W. E. a n d A l a u p o v i c , P. F a m i l i a l h y p e r c h o l e s t e r o l a e m i a a n d p r i m a r y h y p o t h y r o i d i s m : C o e x i s t e n c e o f b o t h d i s o r d e r s i n a y o u n g woman w i t h s e v e r e h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a . C l i n . E n d o c r i n o l . 1 4 : 1 4 5 - 1 5 2 , 1 9 8 1 . 5 7 . C r u s e , J . P., L e w i n , M. R., F e r u l a n o , G. P. a n d C l a r k , C. G. C o - c a r c i n o g e n i c e f f e c t s o f d i e t a r y c h o l e s t e r o l i n e x p e r i m e n t a l c o l o n c a n c e r . N a t u r e 2 7 6 : 8 2 2 - 8 2 5 , 1 9 7 8 . 5 8 . W e i s b e r g e r , J . H., R e d d y , B. S. a n d W y n d e r , E. L . C o l o n c a n c e r : I t s e p i d e m i o l o g y a n d e x p e r i m e n t a l p r o d u c t i o n . . C a n c e r 4 0 : 2 4 1 4 - 2 4 2 0 , 1 9 7 7 . 5 9 . D r a s e r , B. S. a n d I r v i n g , D. E n v i r o n m e n t a l f a c t o r s . a r i d c a n c e r o f t h e c o l o n a n d b r e a s t . B r . J . C a n c e r 2 7 : 1 6 7 - 1 7 2 , 1 9 7 3 . 6 0 . L i u , K., M o s s , D., P e r s k y , B., S t a m l e r , J . , G a r s i d e , J . a n d S o l t e r o , I . D i e t a r y c h o l e s t e r o l , f a t a n d f i b r e , a n d c o l o n - c a n c e r m o r t a l i t y . L a n c e t i i ( 8 1 4 6 ) : 7 8 2 -7 8 5 , 1 9 7 9 . 6 1 . W e s t w o o d , M., K r a m e r , M. S., M u n z , D. L o v e t t , J . M. a n d W a t t e r s , G. V. G r o w t h a n d d e v e l o p m e n t o f s m a l l f o r g e s t a t i o n a l a g e ( S G A ) n e w b o r n s : A f o l l o w - u p o f m a t c h e d p a i r s i n a d o l e s c e n c e . P e d i a t r . R e s . 1 4 ( 4 1 1 ) : 4 3 0 , 1 9 8 0 . 1 1 0 6 2 . C l a n d i n i n , M. T., C h a p p e l l , J . E . , H e i m , T., S w y e r , P. R. a n d C h a n c e , G. W. F a t t y a c i d a c c r e t i o n i n t h e d e v e l o p m e n t o f human s p i n a l c o r d . E a r l y Hum. D e v . 5 ( 1 ) : 1-6, 1 9 8 1 . 6 3 . O ' B r i e n , J . S. S t a b i l i t y o f t h e m y e l i n m e m b r a n e . S c i e n c e 1 4 7 : 1 0 9 9 - 1 1 0 7 , 1 9 6 5 . 6 4 . F r e d r i c k s o n , W. T. a n d B r o w n , J . V. G r i p p i n g a n d M o r o r e s p o n s e s : d i f f e r e n c e s b e t w e e n s m a l l f o r g e s t a t i o n a l a g e a n d n o r m a l w e i g h t t e r m n e w b o r n s . E a r l y Hum. D e v . 4 ( 1 ) : 6 9 - 7 7 , 1 9 8 0 . 6 5 . R e i s e r , R. a n d S i d e l m a n , Z. C o n t r o l o f s e r u m c h o -l e s t e r o l h o m e o s t a s i s b y m i l k o f t h e s u c k l i n g r a t , J . N u t r . 1 0 2 : 1 0 0 9 - 1 0 1 6 , 1 9 7 2 . 6 6 . C a r r o l l , K. K. a n d R o b e r t s , D. C. K. I n f l u e n c e o f d i e t o n p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s i n w e a n l i n g r a b b i t s . A b s t r a c t s p r e s e n t e d a t t h e W e s t e r n H e m i s p h e r e N u t r i -t i o n C o n g r e s s V, h e l d a t Q u e b e c , Q u e . , 1 9 7 7 . 6 7 . R e i s e r , R., O ' B r i e n , B. C , H e n d e r s o n , G. R. a n d M o o r e , R. W. S t u d i e s o n a p o s s i b l e f u n c t i o n f o r c h o -l e s t e r o l i n m i l k . N u t r . R e p t . I n t . 1 9 ( 6 ) : 8 3 5 -8 4 9 , 1 9 7 9 . 6 8 . H o d g s o n , P.A., E l l e f s o n , R. D., E l v e b a c k , L. R., H a r r i s , L. E . , N e l s o n , R. A. a n d W e i d m a n , W. G. C o m p a r i s o n o f s e r u m c h o l e s t e r o l i n c h i l d r e n f e d h i g h , m o d e r a t e o r l o w c h o l e s t e r o l m i l k d i e t s d u r i n g n e o -n a t a l p e r i o d . M e t a b o l i s m 2 5 ( 7 ) : 7 3 9 - 7 4 6 , 1 9 7 6 . I l l 6 9 . G r e e n , M. H., D o h n e r , E. L . a n d G r e e n J . B. I n f l u e n c e o f d i e t a r y f a t a n d c h o l e s t e r o l o n m i l k l i p i d s a n d o n c h o l e s t e r o l m e t a b o l i s m i n t h e r a t . J . N u t r . I l l : 2 7 6 - 2 8 6 , 1 9 8 1 . 7 0 . H u l b r o n , G. A u b e r t , R., B o u r g e o i s , F. a n d L e m m o n i e r , D. E a r l y c h o l e s t e r o l f e e d i n g : A r e t h e r e l o n g - t e r m e f f e c t s i n t h e r a t ? J . N u t r . 1 1 2 : 1 2 9 6 - 1 3 0 5 , 1 9 8 2 . 7 1 . H o t t a , S. a n d C h a i k o f f , I . L . T h e r o l e o f l i v e r i n t h e t u r n o v e r o f p l a s m a c h o l e s t e r o l . A r c h . B i o c h e m . 5 6 : 2 8 - 3 7 , 1 9 5 5 . 7 2 . T u r l e y , S. D., A n d e r s o n , J . M., a n d D i e t s c h y , J . M. R a t e s o f s t e r o l s y n t h e s i s a n d u p t a k e i n t h e m a j o r o r g a n s o f t h e r a t i n v i v o . J . L i p i d R e s . 2 2 ( 4 ) : 5 5 1 - 5 6 9 , 1 9 8 1 . 7 3 . D i e t s c h y , J . M. a n d W i l s o n , J . D. C h o l e s t e r o l s y n t h e -s i s i n t h e S q u i r r e l m o n k e y : R e l a t i v e r a t e s o f s y n t h e -s i s i n v a r i o u s t i s s u e s a n d m e c h a n i s m s o f c o n t r o l . J . C l i n . I n v e s t . 4 7 : 1 6 6 - 1 7 4 , 1 9 6 8 . 7 4 . D i e t s c h y , J . M. a n d S i p e r s t e i n , M. D. C h o l e s t e r o l s y n t h e s i s b y t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t : L o c a l i z a -t i o n a n d m e c h a n i s m s o f c o n t r o l . J . C l i n . I n v e s t . 4 4 ( 8 ) : 1 3 1 1 - 1 3 2 7 , 1 9 6 5 . 7 5 . S h e f e r , S., H a u s e r , S., L a p e r , V. a n d M o s b a c h , E. H. R e g u l a t o r y e f f e c t s o f d i e t a r y s t e r o l s a n d b i l e a c i d s o n r a t i n t e s t i n a l HMG C o A r e d u c t a s e . J . L i p i d R e s . 1 4 : 4 0 0 - 4 0 5 , 1 9 7 3 . 1 1 2 7 6 . D i e t s c h y , J . M. T h e r o l e o f b i l e s a l t s i n c o n t r o l l i n g t h e r a t e o f i n t e s t i n a l c h o l e s t e r o g e n e s i s . J . C l i n . I n v e s t . 4 7 : 2 8 6 - 3 0 0 , 1 9 6 8 . 7 7 . S h e f e r , S., H a u s e r , S., L a p e r , V. a n d M o s b a c h , E. H. D i u r n a l v a r i a t i o n o f HMG C o A r e d u c t a s e i n t h e r a t i n t e s t i n e . J . L i p i d R e s . 1 3 : 5 7 1 - 5 7 3 , 1 9 7 3 . 7 8 . D i e t s c h y , J . M. a n d G a m e l , W. G. C h o l e s t e r o l s y n t h e -s i s i n t h e i n t e s t i n e o f man: R e g i o n a l d i f f e r e n c e s a n d c o n t r o l m e c h a n i s m . J . C l i n . I n v e s t . 5 0 : 8 7 2 - 8 8 0 , 1 9 7 1 . 7 9 . M e r c h a n t , J . L . a n d H e l l e r , R. A. 3 - h y d r o x y - 3 -m e t h y l g l u t a r y l C o A r e d u c t a s e i n i s o l a t e d v i l l o u s a n d c r y p t c e l l s o f t h e r a t i l e u m . J . L i p i d R e s . 1 8 : 7 2 2 - 7 3 3 , 1 9 7 7 . 8 0 . G e b b a r d , R. L . a n d C o o p e r , A. D. R e g u l a t i o n o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n c u l t u r e d c a n i n e i n t e s t i n a l m u c o s a . J . B i o l . Chem. 2 5 3 ( 8 ) : 2 7 9 0 - 2 7 9 6 , 1 9 7 8 . 8 1 . C h e n g , C. Y. a n d F e l d m a n , E. B. C l o f i b r a t e , i n h i b i t o r o f i n t e s t i n a l c h o l e s t e r o g e n e s i s . B i o c h e m . P h a r m a c o l . 2 0 : 3 5 0 9 - 3 5 1 9 , 1 9 7 1 . 8 2 . S t a n g e ,, E. F. a n d D i e t s c h y , J . M. C h o l e s t e r o l s y n t h e s i s a n d l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n a r e r e g u l a t e d i n d e p e n d e n t l y i n r a t s m a l l i n t e s t i n e e p i t h e l i u m . P r o c . N a t l . A c a d . S c . 8 0 : 5 7 3 9 - 5 7 4 3 , 1 9 8 3 . 1 1 3 8 3 . S u g a n o , M., I d e , T., O k a m a t s u , H., F u j i s a k i , Y. a n d T a k a h a r a , H. D i e t a r y m o d i f i c a t i o n o f t h e d i s t r i b u t i o n o f HMG C o A " r e d u c t a s e a n d s t e r o l s y n t h e s i z i n g a c t i v i t i e s i n t h e r a t s m a l l i n t e s t i n e . J . N u t r . 1 1 0 : 3 6 0 - 3 7 0 , 1 9 8 0 . 8 4 . B o c h e n e k , W. J . a n d R o d g e r s , J . B. D i e t a r y r e g u l a t i o n o f HMG C o A r e d u c t a s e f r o m r a t i n t e s t i n e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 5 7 5 : 5 7 - 6 2 , 1 9 7 9 . 8 5 . K o v a n e n , P. T., N i k k i l a , E. A. a n d M i e t t i n e n , T. A. R e g u l a t i o n o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s a n d s t o r a g e i n f a t c e l l s . J . L i p i d R e s . 1 6 : 2 1 1 - 2 2 3 , 1 9 7 5 . 8 6 . B a l a s u b r a m a n i a m , S., G o l d s t e i n , J . L . , F a u s t , J . R. a n d B r o w n , M. S. E v i d e n c e o f r e g u l a t i o n o f HMG C o A r e d u c t a s e a c t i v i t y a n d c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n n o n - h e p a t i c t i s s u e s o f r a t . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . ( U S A ) 7 3 ( 8 ) : 2 5 6 4 - 2 5 6 8 , 1 9 7 6 . 8 7 . B r o w n , M. S. a n d G o l d s t e i n , J . L . M u l t i v a l e n t f e e d b a c k r e g u l a t i o n o f HMG C o A r e d u c t a s e , a n d c o n t r o l m e c h a n i s m c o o r d i n a t i n g i s o p r e n o i d s y n t h e s i s a n d c e l l g r o w t h . J . L i p i d R e s . 2 1 ( 5 ) : 5 0 5 - 5 1 7 , 1 9 8 0 . 8 8 . G o l d s t e i n , J . L . , a n d B r o w n M. S. L i p o p r o t e i n r e c e p t o r s : G e n e t i c d e f e n s e a g a i n s t a t h e r o s c l e r o s i s . C l i n . R e s . 3 0 ( 5 ) : 4 1 7 - 4 2 6 , 1 9 8 2 . 8 9 . R o u s - , S., a n d F a v a r g e r , P. T h e r o l e o f a c e t o a c e t a t e i n t h e t r a n s f e r o f a c e t y l u n i t s o u t s i d e t h e m i t o c h o n d r i a i n l i v e r a n d a d i p o s e t i s s u e o f r a t s a n d m i c e . F E B S L e t t . 3 7 : 2 3 1 - 2 3 3 , 1 9 7 3 . 114 9 0 . S h r a g o , E . , S p e n n e t t a , T. a n d G o r d o n , E. F a t t y a c i d s y n t h e s i s i n human a d i p o s e t i s s u e . J . B i o l . Chem. 2 4 4 : 2 7 6 1 - 2 7 6 6 , 1 9 6 9 . 9 1 . A n d e r s e n , J . M. a n d D i e t s c h y , J . M. A b s o l u t e r a t e s o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n e x t r a h e p a t i c t i s s u e s m e a s u r e d 3 14 w i t h H - l a b e l l e d w a t e r a n d C - l a b e l l e d s u b s t r a t e s . J . L i p i d R e s . 2 0 : 7 4 0 - 7 5 2 , 1 9 7 9 . 9 2 . L o w e n s t e i n , J . M., B r u n e n g r a b e r , H. a n d W a d k e , M. M e a s u r e m e n t o f r a t e s o f l i p o g e n e s i s w i t h d e u t e r a t e d a n d t r i t i a t e d w a t e r . M e t h o d s E n z y m o l . 3 5 : 2 7 9 - 2 8 7 , 1 9 7 5 . 9 3 . W u r t m a n , J . J . a n d M i l l e r , S. A. E f f e c t o f l i t t e r s i z e o n w e i g h t g a i n i n r a t s . J . N u t r . 1 0 6 : 6 9 7 - 7 0 1 , 1 9 7 6 . 9 4 . D i e t s c h y , J . M. a n d M c G a r r y , J . D. L i m i t a t i o n s o f a c e t a t e a s a s u b s t r a t e o f m e a s u r i n g c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n l i v e r . J . B i o l . Chem. 2 4 9 ( 1 ) : 5 2 - 5 8 , 1 9 7 4 . 9 5 . K r a u s e , B. R., P h a r e s , F., S e r b i n , V., K r a u s e , L . a n d H a r t m a n , A. D. A d i p o c y t e c h o l e s t e r o l s t o r a g e : E f f e c t o f e x p e r i m e n t a l h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a i n t h e r a t . J . N u t r . 1 0 9 : 2 2 1 3 - 2 2 2 5 , 1 9 7 9 . 9 6 . B r u n e n g r a b e r , H., B o u t r y , M. a n d L o w e n s t e i n , J . M. F a t t y a c i d a n d - h y d r o x y - s t e r o l s y n t h e s i s i n t h e p e r f u s e d r a t l i v e r . J . B i o l . Chem. 2 4 8 ( 8 ) : 2 6 5 6 -2 6 6 9 , 1 9 7 3 . 1 1 5 H e i m b e r g , J . a n d W i l c o x , H. G. T h e e f f e c t o f p a l m i t i c a n d o l e i c a c i d s o n t h e p r o p e r t i e s a n d c o m p o s i t i o n o f t h e v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s e c r e t e d b y t h e l i v e r . J . B i o l . Chem. 2 4 7 : 8 7 5 , 1 9 7 2 . C h a p m a n , J . M. a n d A y r e y , G. I n : T h e U s e o f R a d i o -a c t i v e I s o t o p e s i n t h e L i f e S c i e n c e s , G e o r g e A l l e n a n d U n w i n L t d . L o n d o n , 1 9 8 1 . H a y s , W. L . S t a t i s t i c s f o r P s y c h o l o g i s t s , H o l t , R i n e h a r t a n d W i n s t o n N.Y., N.Y., 1 9 6 3 . D u n c a n , R. C , K n a p p , R. G. a n d M i l l e r I I I , M.C. I n : I n t r o d u c t o r y B i o s t a t i s t i c s f o r t h e H e a l t h S c i e n c e s , J o h n W i l e y , a n d S o n s , N.Y., N.Y., 1 9 7 7 . H u l l , C. H. a n d N i e , N.H. S e r i e s E d i t o r s , I n : S P S S U p d a t e 7-9, M c G r a w - H i l l B o o k C o . , N.Y., N.Y., 1 9 8 1 . T s u j i k a w a , M. a n d K i m u r a , S. E f f e c t o f e a r l y f e e d i n g o n c e l l u l a r i t y o f r a t a d i p o s e t i s s u e . J . N u t r i . S c i . V i t a m i n o l . 2 6 ( 5 ) : 4 7 5 - 4 8 2 , 1 9 8 0 . F a u s t , I . M., J o h n s o n , P. R. a n d H i r s c h , J . L o n g t e r m e f f e c t s o n e a r l y n u t r i t i o n a l e x p e r i e n c e o n t h e d e v e l o p -m e n t o f o b e s i t y i n t h e r a t . J . N u t r . 1 1 0 ( 1 0 ) : 2 0 2 7 -2 0 3 4 , 1 9 8 0 . B l a s s , E. M., K e n n y , J . T., S t o l o f f , M., B r u n o , J . P., T e i c h e r , M. H. a n d H a l l , W. G. M o t i v a t i o n , L e a r n i n g , a n d M e m o r y i n t h e O n t o g e n y o f S u c k l i n g A l b i n o R a t s . I n : O n t o g e n y o f L e a r n i n g a n d M e m o r y , S p e a r , N. E. a n d C a m p b e l l , B.A. E d s . H a l s t e d P r e s s D i v i s i o n o f J o h n 116 1 0 4 . W i l e y a n d S o n s , N.Y., N.Y., 1 9 7 9 . 1 0 5 . W a r d , P. C , M c C a r t h y , R. D. a n d K i l a r a , A. I s o l a t i o n o f a n i n h i b i t o r o f h e p a t i c c h o l e s t e r o g e n e s i s f r o m human m i l k . A t h e r o s c l e r o s i s 4 1 : 1 8 5 - 1 9 2 , 1 9 8 1 . 1 0 6 . B a b i c k y , A., P a r i z e k , J . , O s t a d a l o v a , I . a n d K o l a r , J . I n i t i a l s o l i d f o o d i n t a k e a n d g r o w t h o f y o u n g r a t s i n n e s t s o f d i f f e r e n t s i z e s . P h y s i o l . B o h e m o s l a v . 2 2 : 5 5 7 - 5 6 6 , 1 9 7 3 . 10 7. K r i s , P. M., L a y m a n , D. L . , Y o r k , P. V. a n d F r a n t z , J r . , I . D. T h e i n f l u e n c e o f e a r l y n u t r i t i o n o n t h e s e r u m c h o l e s t e r o l o f t h e a d u l t r a t . J . N u t r . 1 0 9 : 9 8 9 - 9 9 8 , 1 9 7 8 . 1 0 8 . A u b e t , R., S u q u e t , J . P., a n d L e m o n n i e r , D. L o n g t e r m m o r p h o l o g i c a l a n d m e t a b o l i c e f f e c t s o f e a r l y u n d e r -a n d o y e r n u t r i t i o n i n m i c e . J . N u t r . 1 1 0 ( 4 ) : 6 4 9 -6 6 1 , 1 9 8 0 . 1 0 9 . B a r n e s , R . ' H . , C u n n o l d , S. R., Z i m m e r m a n , R. R., S i m m o n s , H . , M c L e o d , R. B. a n d K r o o k , L . I n f l u e n c e s o f n u t r i t i o n a l d e p r i v a t i o n s i n e a r l y l i f e o n l e a r n -i n g b e h a v i o r o f r a t s a s m e a s u r e d b y p e r f o r m a n c e i n a w a t e r m a z e . J . N u t r . 8 9 : 3 9 9 - 4 1 0 , 1 9 6 6 . 

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