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6-mercaptopurine induced cleft palate in the hamster : morphological and cellular aspects 1985

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6-MERCAPTOPURINE INDUCED CLEFT PALATE IN THE HAMSTER: MORPHOLOGICAL AND CELLULAR ASPECTS BY DAVID NORMAN BURDETT B . S c , The U n i v e r s i t y o f B r i t i s h Columbia, 1975 D.M.D., The U n i v e r s i t y o f B r i t i s h Columbia, 1979 A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF MASTER OF SCIENCE IN THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES (Department o f Pathology) We accept t h i s t h e s i s as conforming to the r e q u i r e d standard D r . G. S c u d d e r D r . D. K a l o u s e k D r . W . L . Dunn ( D r . R. S h a h ( S u p e r v i s o r ) " D r . J . S p o u g e The U n i v e r s i t y o f B r i t i s h Columbia A p r i l 1985 ©DAVID NORMAN BURDETT, 1985 I n p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r an advanced degree a t t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , I agree t h a t t h e L i b r a r y s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e and s t u d y . I f u r t h e r agree t h a t p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e c o p y i n g o f t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y purposes may be g r a n t e d by t h e head o f my department o r by h i s o r h e r r e p r e s e n t a t i v e s . I t i s u n d e r s t o o d t h a t c o p y i n g o r p u b l i c a t i o n o f t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l n o t be a l l o w e d w i t h o u t my w r i t t e n p e r m i s s i o n . Department o f \ a M v o t o ^ ^ The U n i v e r s i t y o f B r i t i s h Columbia 1956 Main Mall Vancouver, Canada V6T 1Y3 Date trLly AM / I*; - i i - ABSTRACT A s t u d y on t h e p a t h o g e n e s i s o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e i n d u c e d c l e f t p a l a t e was u n d e r t a k e n u s i n g l i g h t and e l e c t r o n m i c r o s c o p i c , a n d enzyme a c i d p h o s p h a t a s e c y t o c h e m i c a l t e c h n i q u e s . P a l a t a l d e v e l o p m e n t i n c o n t r o l f e t u s e s was o b s e r v e d i n s i x s t a g e s a t t h e g r o s s l e v e l a n d f i v e s t a g e s a t t h e h i s t o l o g i c a l l e v e l . B e t w e e n d a y s 9 : 1 8 ( 9 d a y s : 1 8 h o u r s ) a n d 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n p a l a t a l p r i m o r d i a a p p e a r e d f r o m t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y , a n d d e v e l o p e d i n t h e v e r t i c a l d i r e c t i o n u n t i l d a y 1 2 : 0 0 o f g e s t a t i o n . B e t w e e n d a y s 1 2 : 0 0 a n d 1 3 : 0 0 o f g e s t a t i o n t h e p a l a t a l s h e l v e s became h o r i z o n t a l a n d f u s e d w i t h one a n o t h e r . D u r i n g c l o s u r e t h e t i m e l y a p p e a r a n c e o f l y s o s o m e s was r e s p o n s i b l e f o r e l i m i n a t i o n o f t h e i n t e r v e n i n g e p i t h e l i a o f t h e o p p o s i n g p a l a t a l s h e l v e s t h r o u g h a n i n t r a c e l l u l a r p r o c e s s o f a u t o l y s i s . G r o s s o b s e r v a t i o n s showed t h a t 6 - m e r c a p t o p u r i n e a f f e c t e d t h e v e r t i c a l d e v e l o p m e n t o f p a l a t a l s h e l v e s . I n c o n t r a s t t o n o r m a l d e v e l o p m e n t , v e r t i c a l l y d e v e l o p i n g p a l a t a l s h e l v e s on d a y 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n s h o w e d s u b l e t h a l i n j u r y o f t h e m e s e n c h y m a l c e l l s c h a r a c t e r i z e d by s w e l l i n g o f t h e p e r i n u c l e a r s p a c e a n d l y s o s o m a l d e v e l o p m e n t . S u b s e q u e n t l y t h e e p i t h e l i a l c e l l s w e r e d a m a g e d , a n d t h e b a s a l l a m i n a f r a g m e n t e d a n d d i s a p p e a r e d . The e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c e l l s c o m m u n i c a t e d w i t h o n e a n o t h e r . E v e n t u a l l y , h o w e v e r , t h e e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c e l l s r e c o v e r e d a n d t h e b a s a l l a m i n a r e - e s t a b l i s h e d i t s c o n t i n u i t y . - i i i - It was concluded that sublethal injury of the mesenchymal and e p i t h e l i a l c e l l s following 6-mercaptopurine treatment disturbed the controlled process of c y t o d i f f e r e n t i a t i o n , and thus affected v e r t i c a l development of the palatal shelves to develop a c l e f t palate. - IV - TABLE OF CONTENTS ABSTRACT i i TABLE OF CONTENTS ' . . * ' i v L I S T OF T A B L E S ' ' V 1 - L I S T OF FIGURES * v ^ ACKNOWLEDGEMENT x i INTRODUCTION 1 B i r t h D e f e c t s 1 C l e f t P a l a t e 2 N o r m a l D e v e l o p m e n t o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e 4 A b n o r m a l D e v e l o p m e n t o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e 10 6 - M e r c a p t o p u r i n e 11 PURPOSE OF STUDY 20 MATERIALS AND METHODS 21 B r e e d i n g o f A n i m a l s 21 D r u g T r e a t m e n t a n d P r o c u r e m e n t o f T i s s u e s 21 F o r G r o s s a n d L i g h t M i c r o s c o p i c S t u d i e s 22 F o r E l e c t r o n M i c r o s c o p i c S t u d i e s 22 F o r A c i d P h o s p h a t a s e Enzyme C y t o c h e m i s t r y 2 3 S t a t i s t i c a l A n a l y s i s 24 RESULTS 26 M o r p h o g e n e s i s o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e i n C o n t r o l H a m s t e r F e t u s e s 26 M o r p h o g e n e s i s o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e i n 6MP T r e a t e d H a m s t e r F e t u s e s 32 M o r p h o g e n e s i s o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e i n C o n t r o l H a m s t e r F e t u s e s i n R e l a t i o n t o F e t a l W e i g h t 34 M o r p h o g e n e s i s o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e i n 6MP T r e a t e d H a m s t e r F e t u s e s i n R e l a t i o n t o F e t a l W e i g h t 37 V - PAGE M o r p h o g e n e s i s o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e i n C o n t r o l H a m s t e r F e t u s e s i n R e l a t i o n t o F e t a l Crown-Rump L e n g t h ( C R L ) 37 M o r p h o g e n e s i s o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e i n 6MP T r e a t e d H a m s t e r F e t u s e s i n R e l a t i o n t o F e t a l Crown-Rump L e n g t h 40 L i g h t M i c r o s c o p i c O b s e r v a t i o n s o f t h e D e v e l o p i n g S e c o n d a r y P a l a t e i n C o n t r o l H a m s t e r F e t u s e s 4 3 L i g h t M i c r o s c o p i c O b s e r v a t i o n s o f t h e D e v e l o p i n g S e c o n d a r y P a l a t e i n H a m s t e r F e t u s e s F o l l o w i n g 6MP T r e a t m e n t 46 E l e c t r o n M i c r o s c o p i c O b s e r v a t i o n s o f t h e D e v e l o p i n g S e c o n d a r y P a l a t e i n C o n t r o l H a m s t e r F e t u s e s 50 E l e c t r o n M i c r o s c o p i c O b s e r v a t i o n s o f t h e D e v e l o p i n g S e c o n d a r y P a l a t e F o l l o w i n g 6MP T r e a t m e n t 59 L i g h t M i c r o s c o p i c O b s e r v a t i o n s o f Enzyme A c i d P h o s p h a t a s e i n t h e D e v e l o p i n g S e c o n d a r y P a l a t e o f C o n t r o l H a m s t e r F e t u s e s 75 L i g h t M i c r o s c o p i c O b s e r v a t i o n s o f Enzyme A c i d P h o s p h a t a s e i n t h e D e v e l o p i n g S e c o n d a r y P a l a t e o f 6MP T r e a t e d H a m s t e r F e t u s e s 78 D I S C U S S I O N 79 N o r m a l P a l a t a l D e v e l o p m e n t 7 9 6 - M e r c a p t o p u r i n e I n d u c e d C l e f t P a l a t e 84 SUMMARY AND CONCLUSIONS 9 9 REFERENCES 101 APPENDIX 128 - v i - LIST OF TABLES PAGE Table I F a c t o r s S u s p e c t e d t o be I n v o l v e d i n P a l a t a l S h e l f R e o r i e n t a t i o n 6 Table II A Summary o f U l t r a s t r u c t u r a l and B i o c h e m i c a l S t u d i e s o f T e r a t o g e n I n d u c e d C l e f t P a l a t e D e v e l o p m e n t 12 Table III S t a g e d D e v e l o p m e n t o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e i n C o n t r o l H a m s t e r F e t u s e s 31 Table IV S t a g e d D e v e l o p m e n t o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e i n 6 - M e r c a p t o p u r i n e T r e a t e d H a m s t e r F e t u s e s 3 3 Table Y The Mean W e i g h t s o f C o n t r o l and 6 - M e r c a p t o p u r i n e (6MP) T r e a t e d H a m s t e r F e t u s e s a t D i f f e r e n t T i m e s D u r i n g G e s t a t i o n 35 Table VI S t a g e d D e v e l o p m e n t o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e i n R e l a t i o n t o C o n t r o l H a m s t e r F e t a l W e i g h t 36 Table VII S t a g e d D e v e l o p m e n t o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e i n R e l a t i o n t o 6 - M e r c a p t o p u r i n e T r e a t e d H a m s t e r F e t a l W e i g h t 38 Table VIII The Mean Crown-Rump L e n g t h ( C R L ) o f C o n t r o l a n d 6 - M e r c a p t o p u r i n e (6MP) T r e a t e d F e t u s e s a t D i f f e r e n t T i m e s D u r i n g G e s t a t i o n 39 Table IX S t a g e d D e v e l o p m e n t o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e i n R e l a t i o n t o C o n t r o l F e t a l H a m s t e r Crown-Rump L e n g t h (CRL) 41 Table X S t a g e d D e v e l o p m e n t o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e i n R e l a t i o n t o 6 - M e r c a p t o p u r i n e T r e a t e d F e t a l H a m s t e r C r o w n - R u m p L e n g t h ( C R L ) 42 - v i i - LIST OF FIGURES PAGE Figure 1 C a t a b o l i s m o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e a n d h y p o x a n t h i n e 15 F i g u r e 2 P r o p o s e d s i t e s o f a c t i o n o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e (6MP) a n d i t s a n a b o l i t e s on p u r i n e m e t a b o l i s m 16 F i g u r e 3 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n 28 F i g u r e 4 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e r e g i o n i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n . . . 28 F i g u r e 5 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r on day 1 1 : 1 8 o f g e s t a t i o n 28 F i g u r e 6 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e r e g i o n i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 1 : 1 8 o f g e s t a t i o n . . . 28 F i g u r e 7 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r on day 1 2 : 0 0 o f g e s t a t i o n 28 F i g u r e 8 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e r e g i o n i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 2 : 0 0 o f g e s t a t i o n . . . 2 8 F i g u r e 9 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r on day 1 2 : 0 0 o f g e s t a t i o n 2 8 F i g u r e 10 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e r e g i o n i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 2 : 0 0 o f g e s t a t i o n . . . 28 F i g u r e 11 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r on day 1 2 : 1 8 o f g e s t a t i o n 30 F i g u r e 12 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r on day 1 3 : 0 0 o f g e s t a t i o n 30 F i g u r e 13 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d h a m s t e r on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n 30 F i g u r e 14 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e r e g i o n i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n 30 F i g u r e 15 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d h a m s t e r on day 1 1 : 1 8 o f g e s t a t i o n 30 Figure 16 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 1 : 1 8 o f g e s t a t i o n 3 0 - v i i i - PAGE F i g u r e 17 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d h a m s t e r o n day 1 5 : 0 0 o f g e s t a t i o n 30 F i g u r e 18 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 5 : 0 0 o f g e s t a t i o n 30 F i g u r e 19 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e r e g i o n o f a c o n t r o l h a m s t e r on day 9 : 0 6 o f g e s t a t i o n 4 5 F i g u r e 20 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e r e g i o n o f a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n s h o w i n g t h e b i l a m i n a r e p i t h e l i u m o f t h e p a l a t a l p r i m o r d i a 45 F i g u r e 21 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 1 : 1 8 o f g e s t a t i o n s h o w i n g t h e two t o t h r e e c e l l l a y e r e d e p i t h e l i u m o f t h e m e d i a l a s p e c t o f t h e v e r t i c a l p a l a t a l s h e l f 4 5 F i g u r e 22 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 2 : 0 0 o f g e s t a t i o n 4 5 F i g u r e 23 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 2 : 0 0 o f g e s t a t i o n 45 F i g u r e 24 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 2 : 0 6 o f g e s t a t i o n s h o w i n g a f r a g m e n t i n g ( S t a g e V) e p i t h e l i a l seam 45 F i g u r e 25 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 12:12 o f g e s t a t i o n s h o w i n g m e s e n c h y m a l c o n t i n u i t y b e t w e e n o p p o s i n g p a l a t a l s h e l v e s 4 8 F i g u r e 26 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n s h o w i n g t h e p r i m o r d i a l e p i t h e l i u m 48 F i g u r e 27 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 6 o f g e s t a t i o n 4 8 F i g u r e 28 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 1 : 0 0 o f g e s t a t i o n 4 8 F i g u r e 29 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 2 : 1 8 o f g e s t a t i o n 4 8 - i x - PAGE F i g u r e 30 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 5 : 0 0 o f g e s t a t i o n 48 F i g u r e 31 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 9 : 1 2 o f g e s t a t i o n 52 F i g u r e 32 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e p r i m o r d i a i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n s h o w i n g a c o n t i n u o u s b a s a l l a m i n a s e p a r a t i n g t h e b i l a m i n a r e p i t h e l i u m f r o m t h e mesenchyme 52 F i g u r e 33 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 2 : 0 6 o f g e s t a t i o n s h o w i n g t h e e p i t h e l i u m o f t h e h o r i z o n t a l p a l a t a l s h e l f 55 F i g u r e 34 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 2 : 0 6 o f g e s t a t i o n s h o w i n g t h e m e s e n c h y m a l c e l l s o f t h e h o r i z o n t a l p a l a t a l s h e l f 55 F i g u r e 35 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 2 : 0 6 o f g e s t a t i o n s h o w i n g t h e e p i t h e l i a l seam 58 F i g u r e 36 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 2 : 0 6 o f g e s t a t i o n s h o w i n g a f r a g m e n t o f a n e p i t h e l i a l seam a n d a m a c r o p h a g e 58 F i g u r e 37 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 9 : 0 6 o f g e s t a t i o n 61 F i g u r e 38 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n 61 F i g u r e 39 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n 6 3 F i g u r e 40 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n 6 3 F i g u r e 41 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 6 o f g e s t a t i o n 66 - X - PAGE F i g u r e 42 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 1 2 o f g e s t a t i o n s h o w i n g c y t o p l a s m i c f e a t u r e s o f t h e e p i t h e l i a l c e l l s 68 F i g u r e 43 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 1 2 o f g e s t a t i o n s h o w i n g u n a f f e c t e d e p i t h e l i a l c e l l s 68 F i g u r e 44 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 1 : 1 8 o f g e s t a t i o n s h o w i n g a b i l a m i n a r e p i t h e l i u m 71 F i g u r e 45 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 2 : 1 8 o f g e s t a t i o n s h o w i n g d i s c o n t i n u i t y i n t h e b a s a l l a m i n a 71 F i g u r e 46 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 2 : 1 8 o f g e s t a t i o n s h o w i n g a f r e e c y t o p l a s m i c e x t e n s i o n o f t h e b a s a l e p i t h e l i a l c e l l 74 F i g u r e 47 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 3 : 1 8 o f g e s t a t i o n 74 F i g u r e 48 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 4 : 0 0 o f g e s t a t i o n s h o w i n g a s t r a t i f i e d e p i t h e l i u m 77 » - x i - ACKNOWLEDGEMENTS I am v e r y much o b l i g e d t o D r . R. S h a h f o r h i s p a t i e n c e , s u g g e s t i o n s , g u i d a n c e , f e e d b a c k , i d e a s , a n d f o r t h e u s e o f h i s l a b o r a t o r y f a c i l i t i e s and m a t e r i a l s f o r t h e e x p e r i m e n t a l w o r k , a n d i n t h e p r e p a r a t i o n o f t h i s t h e s i s . My t h a n k s t o t h e m e m b e r s o f my c o m m i t t e e f o r t h e i r f e e d b a c k a n d p e r c e p t i o n s . My g r a t i t u d e g o e s t o M r . R o g e r S u e n a n d M r . A n d r e Wong f o r t h e i r t e c h n i c a l a s s i s t a n c e i n t h e e x p e r i m e n t a l w o r k . I m u s t a l s o t h a n k M r . B r u c e M a C a u g h e y f o r h i s p h o t o g r a p h i c a s s i s t a n c e a n d s u g g e s t i o n s , M s . L i n d a S k i b o f o r h e r s e c r e t a r i a l a s s i s t a n c e , a n d t h e O r a l B i o l o g y D e p a r t m e n t o f t h e F a c u l t y o f D e n t i s t r y f o r t h e t o l e r a n t u s e o f t h e i r f a c i l i t i e s . The M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l o f C a n a d a m u s t a l s o be a c k n o w l e d g e d f o r t h e f u n d i n g o f t h i s r e s e a r c h t h r o u g h D r . S h a h ' s g r a n t . F i n a l l y , my s i n c e r e s t t h a n k s t o my f a m i l y f o r p u t t i n g up w i t h me. - 1 - INTRODUCTION B i r t h D e f e c t s S i n c e t h e t u r n o f t h e c e n t u r y i t h a s b e e n i n c r e a s i n g l y r e c o g n i z e d t h a t c h e m i c a l s p r e s e n t i n t h e e n v i r o n m e n t , o r a d m i n i s t e r e d t h e r a p e u t i c a l l y may be h a z a r d o u s t o t h e e m b r y o / f e t u s . The m o s t o v e r t l y i d e n t i f i a b l e a d v e r s e e f f e c t o f e x p o s u r e t o a c h e m i c a l i n t h i s f a s h i o n i s i n t r a u t e r i n e d e a t h . A l t e r n a t i v e l y t h e e x p o s e d f e t u s may d e v e l o p a n a t o m i c a l d e f e c t s o r f u n c t i o n a l a b e r r a t i o n s , i n c l u d i n g s u b t l e b e h a v i o u r a l o r b i o c h e m i c a l a b n o r m a l i t i e s , some o f w h i c h may r e m a i n l a t e n t b e f o r e b e i n g e x p r e s s e d a t l a t e r s t a g e s o f d e v e l o p m e n t . The r e c o g n i t i o n o f s u c h " t e r a t o g e n i c " e f f e c t s ( b o t h a n a t o m i c a l a n d f u n c t i o n a l ) g a i n e d f u r t h e r i m p e t u s t h r o u g h t h e t r a g i c e v e n t s o f t h e e a r l y 1 9 6 0 ' s , when d r a m a t i c i n c r e a s e s i n t h e f r e q u e n c y o f p h o c o m e l i a i n t h e n e w b o r n i n f a n t s w e r e t r a c e d t o t h e u s e o f t h a l i d o m i d e by p r e g n a n t women ( L e n z , 1 9 6 1 ; M c B r i d e , 1 9 6 1 ) . S i n c e t h e n b o t h t h e s c i e n t i s t a n d s o c i e t y h a v e b e e n b r o u g h t f a c e t o f a c e w i t h t h e d e v a s t a t i n g p o s s i b i l i t y o f c h e m i c a l l y i n d u c e d b i r t h d e f e c t s i n h u m a n s . The s t u d y o f b i r t h d e f e c t s h a s a s s u m e d more s i g n i f i c a n c e now t h a n i n t h e p a s t b e c a u s e m o r t a l i t y a n d m o r b i d i t y due t o c o n g e n i t a l a n o m a l i e s h a s d e c l i n e d f a r l e s s t h a n t h o s e f o r o t h e r c a u s e s o f d e a t h s u c h a s i n f e c t i o n s a n d n u t r i t i o n a l i r r e g u l a r i t i e s ( S m i t h e l l s , 1 9 6 6 ; S a x e n a n d R a p o l a , 1 9 6 9 ; P e r s a u d , 1 9 7 9 ) . I t i s e s t i m a t e d t h a t a p p r o x i m a t e l y 40% o f a l l p r e g n a n c i e s t e r m i n a t e a s m i s c a r r i a g e s , m a i n l y due t o f a u l t y p r e n a t a l d e v e l o p m e n t ( S a x e n a n d R a p o l a , 1 9 6 9 ) . A p p r o x i m a t e l y 2 0 - 4 0 % o f a l l s t i l l b i r t h s a n d i n f a n t d e a t h s a r e a s s o c i a t e d w i t h s e v e r e c o n g e n i t a l a n o m a l i e s ( E l w o o d a n d R o g e r s 1 9 7 5 ; - 2 - F a i r w e a t h e r 1 9 8 2 ) . In a d d i t i o n , m a j o r b i r t h d e f e c t s a r e f o u n d i n a t l e a s t 2-7% o f a l l l i v e b o r n ( F a i r w e a t h e r , 1 9 8 2 ; B o w e r a n d S t a n l e y , 1 9 8 3 ; F a b r o , 1 9 8 3 ; H e m m i n k i e t a l . , 1 9 8 3 ; L e v i n , 1 9 8 3 ; T u c h m a n n - D u p l e s s i s , 1 9 8 3 ) . As p a i n a n d s u f f e r i n g c a u s e d by b i r t h d e f e c t s t o b o t h t h e v i c t i m a n d h i s / h e r f a m i l y a r e i m m e a s u r a b l e , b i r t h d e f e c t s h a v e b e e n c o n s i d e r e d among t h e m o s t s e r i o u s o f human h e a l t h p r o b l e m s ( P r u z a n s k i , 1 9 6 1 ; P a u l a n d P i a z z a , 1 9 7 9 ) . C l e f t P a l a t e C l e f t p a l a t e i s one o f t h e m a j o r b i r t h d e f e c t s o f humans ( E l w o o d and R o g e r s , 1 9 7 5 ; P a u l a n d P i a z z a , 1 9 7 9 ; B o w e r and S t a n l e y , 1 9 8 3 ) . As i t i s a s t r u c t u r a l d e f e c t i n t h e r o o f o f t h e o r a l c a v i t y , a c l e f t p a l a t e a l s o a f f e c t s t h e f u n c t i o n s o f m a s t i c a t i o n , d e g l u t i t i o n , r e s p i r a t i o n a n d p h o n a t i o n . A c h i l d b o r n w i t h c l e f t p a l a t e w i l l a l s o p r e s e n t a s s o c i a t e d d e n t a l , e m o t i o n a l a n d v o c a t i o n a l p r o b l e m s . Some o f t h e s e f u n c t i o n a l a n d a s s o c i a t e d p r o b l e m s may be p a r t i a l l y a l l e v i a t e d by s u r g e r y a n d / o r a p r o s t h e s i s , b u t t h e e c o n o m i c a n d s o c i a l b u r d e n f o r t h e r e h a b i l i t a t i o n o f t h e c l e f t p a l a t e i n d i v i d u a l r e m a i n s v e r y h i g h ( P a u l and P i a z z a , 1 9 7 9 ) . The f r e q u e n c y o f c l e f t p a l a t e i s r e p o r t e d t o b e , v a r i e d among d i f f e r e n t p o p u l a t i o n s , f r o m 0 . 0 5 t o 1 . 8 7 p e r 1 , 0 0 0 b i r t h s ( L o w r y a n d T r i m b l e , 1 9 7 7 ; C h u n g e t a l . , 1 9 8 0 ; C z e i z e l , 1 9 8 0 ; K o g u c h i , 1 9 8 0 ; M e l n i c k e t a l . , 1 9 8 0 ; S h i e l d s e t a l . , 1 9 8 1 ; I r e g b u l e m , 1 9 8 2 ; B o n a i t i e t a l . , 1 9 8 2 ; C h a p m a n , 1 9 8 3 ) . A r e c e n t s u r v e y by S h i e l d s e t a l . ( 1 9 8 1 ) h a s i n d i c a t e d t h a t h e r i t a b l e f a c t o r s c a n be t r a c e d o n l y i n 1 0 - 2 0 % of c a s e s o f c l e f t p a l a t e . I t i s p l a u s i b l e t h a t e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s , i n c l u d i n g t e r a t o g e n s , may a c c o u n t e i t h e r d i r e c t l y o r - 3 - j o i n t l y f o r a l a r g e p r o p o r t i o n o f c l e f t p a l a t e ( C z e i z e l , 1 9 8 0 ; K o g u c h i , 1 9 8 0 ; M e l n i c k e t a l . , 1 9 8 0 ; S h i e l d s , e t a l . , 1 9 8 1 ; T y a n , 1 9 8 2 ) . The r o l e o f e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s i n c l e f t p a l a t e f o r m a t i o n had b e e n i m p l i c a t e d t o some d e g r e e by e x p e r i m e n t a l s t u d i e s i n a n i m a l s . A s e r i e s o f e x p e r i m e n t s by H a l e ( 1 9 3 3 , 1 9 3 5 , 1937) and by W a r k a n y a n d a s s o c i a t e s ( 1 9 4 1 , 1 9 4 3 , 1 9 4 8 ) s h o w e d t h a t n u m e r o u s c o n g e n i t a l m a l f o r m a t i o n s , i n c l u d i n g c l e f t p a l a t e , o c c u r r e d i n t h e o f f s p r i n g o f r o d e n t s who w e r e f e d n u t r i t i o n a l l y d e f i c i e n t d i e t s d u r i n g p r e g n a n c y . S u b s e q u e n t l y , h o w e v e r , when B a x t e r and F r a s e r ( 1 9 5 0 ) o b s e r v e d t h a t c o r t i s o n e t r e a t m e n t o f p r e g n a n t m i c e p r o d u c e d c l e f t p a l a t e i n t h e e m b r y o , an i m p e t u s was r e c e i v e d i n t h e s c i e n t i f i c c o m m u n i t y t o i d e n t i f y o t h e r a g e n t s w h i c h m i g h t i n d u c e c l e f t p a l a t e i n a n i m a l s a n d i n m a n . D u r i n g t h e p a s t t h r e e d e c a d e s numerous t e r a t o g e n i c a g e n t s w h i c h i n d u c e c l e f t p a l a t e i n l a b o r a t o r y a n i m a l s h a v e b e e n i d e n t i f i e d , a n d a r e s u m m a r i z e d by K a l t e r a n d W a r k a n y ( 1 9 5 9 ) , Dagg ( 1 9 6 6 ) , S c h a r d e i n ( 1 9 7 6 ) , a n d Shah ( 1 9 7 9 d ) . W h i l e t h e s e a r c h f o r e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s r e s p o n s i b l e f o r c l e f t p a l a t e f o r m a t i o n c o n t i n u e s , r e c e n t e m p h a s i s h a s b e e n t o w a r d i d e n t i f i c a t i o n o f a b n o r m a l m e c h a n i s m s by w h i c h c l e f t p a l a t e may d e v e l o p i n an e m b r y o . The u s e o f t e r a t o g e n i c a g e n t s as a t o o l f o r t h e s t u d y o f c l e f t p a l a t e d e v e l o p m e n t h a s b e g u n t o c o n t r i b u t e t o a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f n o r m a l d e v e l o p m e n t a l m e c h a n i s m s , a n d t h e i r f a i l u r e s . M o r e s i g n i f i c a n t l y , t h e i r u s e i n l a b o r a t o r y a n i m a l s h a s h e l p e d t o d e f i n e and i m p r o v e t h e u n d e r s t a n d i n g o f t h e f a c t o r s i n v o l v e d i n b o t h n o r m a l and c l e f t p a l a t e d e v e l o p m e n t . - 4 - I n t h e e n s u i n g l i t e r a t u r e a n a l y s i s b o t h t h e i s s u e s i n v o l v e d i n n o r m a l a n d a b n o r m a l p a l a t e d e v e l o p m e n t , and v a r i o u s e x p e r i m e n t a l a p p r o a c h e s t o e v a l u a t e t h e m , a r e r e v i e w e d . N o r m a l D e v e l o p m e n t o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e T h e f i r s t d e s c r i p t i v e s t u d y on t h e n o r m a l d e v e l o p m e n t o f s e c o n d a r y p a l a t e was p u b l i s h e d by D u r s y i n 1 8 6 9 . On t h e b a s i s o f o b s e r v a t i o n s i n human e m b r y o s , he i n d i c a t e d t h a t t h e s e c o n d a r y p a l a t e d e v e l o p s a s two v e r t i c a l p r o j e c t i o n s ( s h e l v e s ) f r o m t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y l a t e r a l t o t h e t o n g u e . T h e v e r t i c a l s h e l v e s t h e n move t o a h o r i z o n t a l p o s i t i o n o v e r t h e d o r s a l s u r f a c e o f t h e t o n g u e . S u b s e q u e n t l y t h e m e d i a l e d g e s o f t h e h o r i z o n t a l s h e l v e s u n i t e w i t h one a n o t h e r t o s e p a r a t e t h e o r a l a n d n a s a l c a v i t i e s . F o l l o w i n g p u b l i c a t i o n o f D u r s y ' s w o r k , n u m e r o u s s t u d i e s h a v e b e e n r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e a n a l y z i n g b o t h i n v i v o a n d i n v i t r o m o r p h o l o g i c a l , c e l l u l a r a n d b i o c h e m i c a l a s p e c t s o f m a m m a l i a n s e c o n d a r y p a l a t e d e v e l o p m e n t ( W a l k e r a n d F r a s e r , 1 9 5 6 ; F u l t o n , 1 9 5 7 ; A s l i n g e t a l . , 1 9 6 0 ; Wood a n d K r a u s , 1 9 6 2 ; L a r s s o n , 1 9 6 2 a ; C o l e m a n , 1 9 6 5 ; P o u r t o i s , 1 9 6 6 , 1 9 / 2 ; Ma t o e t a l . , 1 9 6 6 ; B u r d i a n d F a i s t , 1 9 6 7 ; A n d e r s e n a n d M a t t h i e s s e n , 1 9 6 7 ; F a r b m a n , 1 9 6 8 , 1 9 6 9 ; De A n g e l i s a n d N a l b a n d i a n , 1 9 6 8 ; W a l k e r , 1 9 6 9 , 1 9 7 1 ; B r u s a t i , 1 9 6 9 ; H a y w a r d , 1 9 6 9 ; H u m p h r e y , 1 9 6 9 ; D o s t a l and J e l n i c k , 1 9 7 0 ; S m i l e y , 1 9 7 0 , B o l l e r t a n d H e n d r i c k x , 1 9 7 1 ; A n d r e w a n d Z i m m e r m a n , 1 9 7 1 ; S m i l e y a n d K o c h , 1 9 7 1 , 1 9 7 5 ; C h a u d h r y a n d S h a h , 1 9 7 3 , 1 9 7 9 ; Shah and C h a u d h r y , 1 9 7 4 a , b ; T y l e r a n d K o c h , 1 9 7 5 , 1 9 7 7 a , b ; G o s s , 1 9 7 5 ; B a b i a r z e t a l . , 1 9 / 5 ; Nanda a n d Romeo, 1 9 / 5 ; L u k e , 1 9 7 6 ; S h a h a n d T r a v i l l , 1 9 7 6 a ; C l e a t o n - J o n e s , 1 9 / 6 ; G r e e n e a n d P r a t t , - 5 - 1 9 7 6 ; H o l m s t e d t a n d B a g w e l l , 1 9 7 7 ; F e r g u s o n , 1 9 7 7 ; I n n e s , 1 9 7 8 , 1 9 8 1 ; Wee e t a l . , 1 9 7 9 ; Z i m m e r m a n , 1 9 7 9 ; S h a h , 1 9 7 9 a , b , 1 9 8 0 , 1 9 8 4 ; M e l l e r e t a l . , 1 9 8 0 ; T a s s i n a n d W e i l l , 1 9 8 0 ; Zimmerman e t a l . , 1 9 8 0 ; G r e e n e e t a l . , 1 9 8 1 , 1 9 8 2 ; G u l a m h u s e i n and E n g l a n d , 1 9 8 2 ; G r e e n e , 1 9 8 3 ; S c h u p b a c h , 1 9 8 3 ; S c h u p b a c h a n d S c h r o e d e r , 1 9 8 3 ; S c h u p b a c h e t a l . , 1 9 8 3 ; B r i n k l e y , 1 9 8 4 ) . One may i n f e r f r o m t h e s e s t u d i e s t h a t a t l e a s t t h r e e c r i t i c a l e v e n t s m u s t o c c u r f o r n o r m a l c l o s u r e o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e : 1 . a c h a n g e i n t h e d i r e c t i o n o f p a l a t a l s h e l f d e v e l o p m e n t f r o m a v e r t i c a l p o s i t i o n on t h e s i d e o f t h e t o n g u e , t o a h o r i z o n t a l p o s i t i o n d o r s a l t o i t , i . e . , r e o r i e n t a t i o n o f t h e p a l a t a l s h e l f ; 2 . u n i o n b e t w e e n t h e e p i t h e l i a o f t h e o p p o s i n g h o r i z o n t a l p a l a t a l s h e l v e s t o f o r m a s e a m ; a n d 3 . r e m o v a l o f t h e e p i t h e l i a l seam and e s t a b l i s h m e n t o f m e s e n c h y m a l c o n t i n u i t y . On t h e b a s i s o f o b s e r v a t i o n s i n m a m m a l i a n e m b r y o s s e v e r a l f a c t o r s h a v e b e e n s u g g e s t e d i n t h e l i t e r a t u r e t o be r e s p o n s i b l e f o r t h e r e o r i e n t a t i o n o f p a l a t a l s h e l f . F o r t h e s a k e o f s i m p l i c i t y a n d b r e v i t y t h e p r o p o s e d f a c t o r s may be g r o u p e d u n d e r t h e h e a d i n g s " e x t r i n s i c " a n d " i n t r i n s i c " , a n d a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e I . R e c e n t r e v i e w s i n d i c a t e t h a t a l t h o u g h e x t r i n s i c f a c t o r s may p l a y a r o l e i n f o s t e r i n g an i n t r a o r a l e n v i r o n m e n t f o r p a l a t a l s h e l v e s t o u n d e r g o r e o r i e n t a t i o n , t h e y a r e p r o b a b l y n o t r e s p o n s i b l e f o r t h e a c t u a l movement o f t h e s h e l v e s ( B a b i a r z e t a l . , 1 9 7 5 ; F e r g u s o n , 1 9 7 8 ; Wee e t a l . , 1 9 7 9 ; S h a h , 1 9 7 9 a ; Z i m m e r m a n , 1 9 7 9 ; Zimmerman e t a l . , 1 9 8 0 ; G r e e n e , 1 9 8 3 ) . The - 6 - Table I. F a c t o r s Suspected to be Involved In P a l a t a l S h e l f R e o r i e n t a t i o n (References) E x t r i n s i c A . I n v o l v i n g d e s c e n t , d e p r e s s i o n o r movement o f t h e t o n g u e ( A s l i n g e t a l . , 1 9 6 0 ; C o l e m a n , 1 9 6 5 ; H u m p h r e y , 1 9 6 9 ; B u r d i a n d S i l v e y , 1 9 6 9 ; W a l k e r , 1 9 6 9 , 1 9 7 1 ; W a l k e r a n d R o s s , 1 9 7 2 ; Wragg e t a l . , 1 9 7 2 ; D i e w e r t , 1 9 7 4 ; T a y l o r , 1 9 7 8 ) . B . I n v o l v i n g c h a n g e s i n c r a n i a l b a s e a n g u l a t i o n ( V e r r u s i o , 1 9 7 0 ; B r i n k l e y a n d V i c k e r m a n , 1 9 7 8 ) . ' I n t r i n s i c A . C e l l p r o l i f e r a t i o n (Wood a n d K r a u s , 1 9 6 2 ; M o t t e t a l . , 1 9 6 9 ; J e l n i c k a n d D o s t a l , 1 9 7 3 ; Nanda a n d Romeo, 1 9 7 5 ) . B . S y n t h e s i s o f e x t r a c e l l u l a r m a t r i x ( W a l k e r , 1 9 6 1 ; L a r s s o n , 1 9 6 2 a ; J a c o b s , 1 9 6 4 a , b , 1 9 6 6 ; A n d e r s o n a n d M a t t h i e s s e n , 1 9 6 7 ; A n d r e w a n d Z i m m e r m a n , 1 9 7 1 ; F e r g u s o n , 1 9 7 7 , 1 9 7 8 ; B r i n k l e y , 1 9 8 0 ; J a c o b s o n , 1 9 8 2 ) . C . C e l l movement ( B a b i a r z e t a l . , 1 9 7 5 ; Wee e t a l . , 1 9 7 9 ; S h a h , 1 9 7 9 a ; I n n e s , 1 9 8 1 ) . - 7 - r e o r i e n t a t i o n o f t h e p a l a t a l s h e l f i n mammals seems t o o c c u r v i a a r e m o d e l l i n g p r o c e s s i n v o l v i n g d e v e l o p m e n t o f a b u l g e f r o m t h e m e d i a l a s p e c t o f t h e v e r t i c a l s h e l f o v e r t h e d o r s a l s u r f a c e o f t h e t o n g u e , w i t h a s i m u l t a n e o u s r e t r a c t i o n o f t h e v e r t i c a l s h e l f ( W a l k e r a n d F r a s e r , 1 9 5 6 ; K o c h h a r a n d J o h n s o n , 1 9 6 5 ; G r e e n e and K o c h h a r , 1 9 7 3 ; S h a h a n d T r a v i l l , 1 9 7 6 a ; S h a h , 1 9 7 9 a ) , r a t h e r t h a n by r o t a t i o n ( C o l e m a n , 1 9 6 5 ; W a l k e r and R o s s , 1 9 7 2 ; D i e w e r t , 1 9 7 4 ; B a b i a r z e t a l . , 1 9 7 5 ) . In 1 9 5 6 , W a l k e r a n d F r a s e r s u g g e s t e d t h a t an " i n t r i n s i c f o r c e " may b e r e s p o n s i b l e f o r t h e r e o r i e n t a t i o n o f t h e p a l a t a l s h e l v e s v i a a r e m o d e l l i n g p r o c e s s . S i n c e t h e n , u s i n g b o t h i n v i v o a n d i_n v i t r o t e c h n i q u e s , s e v e r a l i n t r i n s i c c e l l u l a r a n d b i o c h e m i c a l e v e n t s h a v e b e e n a n a l y z e d ( T a b l e I ) t o d e t e r m i n e t h e n a t u r e o f " i n t r i n s i c f o r c e " ( L a r s s o n , 1 9 6 2 a ; A n d e r s o n a n d M a t t h i e s s e n , 1 9 6 7 ; M o t t e t a l . , 1 9 6 9 ; B a b i a r z e t a l . , 1 9 7 5 ; Nanda a n d Romeo, 1 9 7 5 ; F e r g u s o n , 1 9 7 8 ; S h a h , 1 9 7 9 a ; Wee e t a l . , 1 9 7 9 ; B r i n k l e y , 1 9 8 0 ) . The p r e c i s e n a t u r e o f t h e i n t r i n s i c f o r c e d u r i n g p a l a t a l s h e l f r e o r i e n t a t i o n , h o w e v e r , s t i l l r e m a i n s o b s c u r e . As t h e p a l a t a l s h e l v e s r e o r i e n t f r o m a v e r t i c a l t o a h o r i z o n t a l p l a n e , a n d t h e n a p p r o x i m a t e , t h e b i l a m i n a r e p i t h e l i u m o f t h e i r p r o s p e c t i v e m e d i a l e d g e s u n d e r g o e s c y t o d i f f e r e n t i a t i o n . The m e d i a l e d g e e p i t h e l i a l c e l l s (MEE) ( 1 ) s t o p p r o l i f e r a t i n g , a s c o n f i r m e d by an a b s e n c e o f 3 H - t h y m i d i n e i n c o r p o r a t i o n ( H u d s o n a n d S h a p i r o , 1 9 7 3 ; P r a t t a n d M a r t i n , 1 9 7 5 ; S h a h e t a l . , 1 9 8 5 ) ; ( 2 ) f o r m i n c r e a s i n g numbers o f l y s o s o m e s a s p a l a t o g e n e s i s p r o g r e s s e s ( M a t o e t a l . , 1 9 6 6 ; B r u s a t l , 1 9 6 9 ; C h a u d h r y and S h a h , 1 9 7 3 , 1 9 7 9 ; S h a h a n d C h a u d h r y , 1 9 7 4 a , b ; L o r e n t e e t a l . , 1 9 7 4 ; H o i s t a n d M i l l s , 1 9 7 5 ; Im a n d M u l l i k e n , 1 9 8 3 ) , a n d ( 3 ) show an i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n o f c y c l i c AMP w i t h - 8 - p r o g r e s s i v e d i f f e r e n t i a t i o n ( P r a t t a n d M a r t i n , 1 9 / 5 ; O l s o n a n d M a s s a r o , 1 9 7 7 ; G r e e n e a n d P r a t t , 1 9 7 9 ; G r e e n e e t a l . , 1 9 8 0 ; S h a h e t a l . , 1 9 8 5 ) . S i m u l t a n e o u s l y t h e m e s e n c h y m a l c e l l s e l o n g a t e a n d d e v e l o p i n t r a c y t o p l a s m i c f i l a m e n t s ( B a b i a r z e t a l . , 1 9 / 5 ; S h a h , 1 9 / 9 a ; I n n e s , 1 9 8 1 ) . T h e f i l a m e n t s a p p e a r t o be c o n t r a c t i l e i n n a t u r e ( K r a w c z y k a n d G i l I o n , 1 9 7 6 ) , a n d t h u s may a l l o w c e l l s t o move d u r i n g r e o r i e n t a t i o n . A l s o t h e r e i s a c o n c u r r e n t i n c r e a s e i n t h e s y n t h e s i s o f g l y c o s a m i n o g l y c a n s , e s p e c i a l l y h y a l u r o n i c a c i d , i n t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x o f t h e mesenchyme ( L a r s s o n , 1 9 6 2 a ; J a c o b s , 1 9 6 4 a , b ; 1 9 6 6 ; P r a t t e t a l . , 1 9 7 3 ; F e r g u s o n , 1 9 / 8 ; B r i n k l e y , 1 9 8 0 ; J a c o b s o n a n d S h a h , 1 9 8 1 ; J a c o b s o n , 1 9 8 2 ) . I t h a s b e e n i m p l i e d t h a t g l y c o s a m i n o g l y c a n s f a c i l i t a t e t h e movement o f c e l l s d u r i n g p a l a t a l s h e l f r e o r i e n t a t i o n ( S h a h , 1 9 / 9 a , c ; J a c o b s o n , 1 9 8 2 ; B r i n k l e y a n d V i c k e r m a n , 1 9 8 2 ) . W h i l e t h e d e b a t e on m e c h a n i s m s o f p a l a t a l s h e l f r e o r i e n t a t i o n s t i l l c o n t i n u e s , i t i s o n l y r e c e n t l y t h a t some a t t e n t i o n h a s b e e n d i r e c t e d t o w a r d s c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p r o c e s s by w h i c h t h e o p p o s i n g p a l a t a l s h e l v e s u n i t e w i t h o n e a n o t h e r . The u n i o n b e t w e e n t h e o p p o s i n g p a l a t a l s h e l v e s i s a m u l t i s t e p p r o c e s s w h i c h i n i t i a l l y i n v o l v e s " a d h e s i o n " b e t w e e n o p p o s i n g e p i t h e l i a , f o l l o w e d by t h e i r f u s i o n t o f o r m a s e a m , a n d f i n a l l y r e p l a c e m e n t o f t h e seam by m e s e n c h y m e ( B a r r y , 1 9 6 1 ; P o u r t o i s , 1 9 7 2 ) . O r i g i n a l l y F a r b m a n ( 1 9 6 8 , 1 9 6 9 ) , H a y w a r d ( 1 9 6 9 ) , G r e e n e a n d K o c h h a r ( 1 9 7 4 ) , H i n r i c h s e n a n d S t e v e n s ( 1 9 / 4 ) , S o u c h o n ( 1 9 / 5 ) , P r a t t a n d H a s s e l 1 ( 1 9 7 5 ) , De P a o l a e t a l . , ( 1 9 / 5 ) , M e l l e r and B a r t o n ( 1 9 / 8 ) a l l u d e d t o t h e p o s s i b i l i t y t h a t a s t i c k y s u b s t a n c e , p r o b a b l y o f a c o m p l e x c a r b o h y d r a t e n a t u r e , may be r e s p o n s i b l e f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e e p i t h e l i a l s e a m . R e c e n t - 9 - e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e , h o w e v e r , s u g g e s t s t h a t c a r b o h y d r a t e s a r e p r o b a b l y o n l y i n v o l v e d i n t h e i n i t i a l a d h e s i o n ( S h a h , 1 9 7 9 b ; S h a h a n d C r a w f o r d , 1 9 8 0 ; H e i n e n e t a l . , 1 9 8 2 ; B a e c k e l a n d e t a l . , 1 9 8 2 ; P r a t t , 1 9 8 3 ; G r e e n e , 1 9 8 3 ) . F u s i o n o f t h e s h e l v e s t o f o r m a seam may i n v o l v e e l i m i n a t i o n o f t h e s u p e r f i c i a l e p i t h e l i a l c e l l s v i a an a u t o l y s o s o m a l p r o c e s s o r d e s q u a m a t i o n ( P o u r t o i s , 1 9 6 6 ; C h a u d h r y a n d S h a h , 1 9 7 3 , 1 9 7 9 ; S h a h a n d C h a u d h r y , 1 9 7 4 a , b ; S h a h , 1 9 7 9 b , B a e c k e l a n d e t a l . , 1 9 8 2 ; H e i n e n e t a l . , 1 9 8 2 ; S c h u p b a c h e t a l . , 1 9 8 3 ; S c h u p b a c h a n d S c h r o e d e r , 1 9 8 3 ) , f o l l o w e d by t h e f o r m a t i o n o f desmosomes b e t w e e n d e e p e r e p i t h e l i a l c e l l s o f t h e o p p o s i n g p a l a t a l s h e l v e s (De A n g e l i s a n d N a l b a n d i a n , 1 9 6 8 ; B r u s a t i , 1 9 6 9 ; S m i l e y a n d K o c h , 1 9 7 1 ; C h a u d h r y a n d S h a h , 1 9 7 3 , 1 9 7 9 ; S h a h a n d C h a u d h r y , 1 9 7 4 b ; S h a h , 1 9 7 9 b ; P r a t t , 1 9 8 3 ; G r e e n e , 1 9 8 3 ) . Once t h e seam i s f o r m e d , t h e n t h e r e m a i n i n g e p i t h e l i a l c e l l s m u s t b e e l i m i n a t e d t o a c h i e v e a m e s e n c h y m a l u n i o n . I t i s g e n e r a l l y a c c e p t e d i n t h e l i t e r a t u r e t h a t e l i m i n a t i o n o f c e l l s f r o m t h e e p i t h e l i a l seam c a n o c c u r t h r o u g h t w o p a t h w a y s , i . e . , i n t r a c e l l u l a r l y s o s o m a l a u t o p h a g y , a n d / o r e x f o l i a t i o n o f d e g e n e r a t i n g c e l l s i n t o t h e a m n i o t i c f l u i d o r i n t o mesenchyme ( M a t o e t a l . , 1 9 6 6 , 1 9 6 7 a , b ; De A n g e l i s a n d N a l b a n d i a n , 1 9 6 8 ; B r u s a t i , 1 9 6 9 ; H a y w a r d , 1 9 6 9 ; C h a u d h r y a n d S h a h , 1 9 7 3 , 1 9 7 9 ; S h a h a n d C h a u d h r y , 1 9 7 4 a , b ; G r e e n e and P r a t t , 1 9 7 6 ; G r e e n e , 1 9 8 3 ) . In t h e l a t t e r i n s t a n c e , t h e d e b r i s o f d e g e n e r a t e d e p i t h e l i a l c e l l s a r e p h a g o c y t o s e d by m a c r o p h a g e s . - 10 - A b n o r m a l D e v e l o p m e n t o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e I t i s g e n e r a l l y a c c e p t e d i n t h e l i t e r a t u r e t h a t c l e f t p a l a t e f o l l o w i n g t e r a t o g e n i c t r e a t m e n t c a n be i n d u c e d i n l a b o r a t o r y a n i m a l s by a f f e c t i n g any o n e o f t h e t h r e e c r i t i c a l e v e n t s o f n o r m a l p a l a t e m o r p h o g e n e s i s . F o r e x a m p l e , s t u d i e s i n m i c e , r a t s a n d h a m s t e r s h a v e shown t h a t c o r t i s o n e , t r i a m c i n o l o n e , r a d i a t i o n , h i g h d o s e s o f v i t a m i n A , f o l i c a c i d d e f i c i e n c y , d i a z o - o x o - n o r l e u c i n e , 5 - f l u o r o u r a c i 1 , and b - f l u o r o - 2 - d e s o x y u r i d i n e i n d u c e c l e f t p a l a t e by d e l a y i n g r e o r i e n t a t i o n o f t h e p a l a t a l s h e l v e s f r o m a v e r t i c a l t o a h o r i z o n t a l p l a n e ( W a l k e r a n d F r a s e r , 1 9 5 / ; W a l k e r a n d G r a i n , 1 9 6 0 ; A s l i n g e t a l . , 1 9 6 0 ; C a l l a s a n d W a l k e r , 1 9 6 3 ; K o c h h a r a n d J o h n s o n , 1 9 6 5 ; C o l e m a n , 1 9 6 5 ; R o s s a n d W a l k e r , 1 9 6 / ; D o s t a l a n d J e l i n e k , 1 9 / 2 ; F e r g u s o n , 1 9 7 / ; S h a h , 1 9 / 9 e ; D i e w e r t , 1 9 7 9 ; D i e w e r t a n d P r a t t , 1 9 7 9 ; S h a h a n d Wong, 1 9 8 0 ) . H y d r o c o r t i s o n e t r e a t m e n t o f p r e g n a n t h a m s t e r s a f f e c t s t h e f u s i o n p r o c e s s i n f e t u s e s ( S h a h a n d T r a v i l l , 1 9 / 6 a , b ) . I n d i r e c t e v i d e n c e h a s b e e n p r e s e n t e d t o s u g g e s t t h a t a c l e f t p a l a t e may d e v e l o p by t h e r u p t u r e o f a p r e v i o u s l y f o r m e d e p i t h e l i a l s e a m , o r by t h e r u p t u r e o f a m e s e n c h y m a l l y u n i t e d p a l a t e ( K i t a m u r a , 1 9 6 6 ; A n g e l i c i , 1 9 6 8 ) . W h i l e s t u d i e s on a n a l y s i n g m o r p h o l o g i c a l a s p e c t s o f p a l a t e d e v e l o p m e n t f o l l o w i n g t e r a t o g e n i c t r e a t m e n t c o n t i n u e , e f f o r t s h a v e a l s o b e e n d i r e c t e d t o w a r d e x p l o r i n g c e l l u l a r a n d b i o c h e m i c a l a l t e r a t i o n s a s s o c i a t e d w i t h c l e f t p a l a t e d e v e l o p m e n t . C o n s i d e r a b l e e f f o r t s i n c e l l u l a r and b i o c h e m i c a l a s p e c t s o f c l e f t p a l a t e d e v e l o p m e n t h a v e b e e n d i r e c t e d t o w a r d u n d e r s t a n d i n g t h e m e c h a n i s m o f g l u c o c o r t i c o i d i n d u c e d c l e f t p a l a t e . The s u g g e s t i o n t h a t g l u c o c o r t i c o i d - 11 - t r e a t m e n t i n d u c e d c l e f t p a l a t e b y i n h i b i t i n g t h e s y n t h e s i s o f g l y c o s a m i n o g l y c a n s , m a i n l y h y a l u r o n i c a c i d ( W a l k e r , 1 9 6 1 ; L a r s s o n , 1 9 6 2 b ; J a c o b s , 1 9 6 4 a , b ; P r a t t e t a l . , 1 9 7 3 ; F e r g u s o n , 1 9 7 8 ) h a s b e e n d i s p u t e d ( N a n d a , 1 9 7 1 ; A n d r e w a n d Z i m m e r m a n , 1 9 7 1 ) . R e c e n t l y i n c o n c l u s i v e e v i d e n c e h a s i n d i c a t e d t h a t g l u c o c o r t i c o i d a c t i o n may be m e d i a t e d v i a i t s b i n d i n g t o r e c e p t o r s i n t h e p a l a t a l t i s s u e ( G o l d m a n e t a l . , 1 9 7 7 , 1 9 7 8 ; B e k h o r e t a l . , 1 9 7 8 ; S a l o m o n a n d P r a t t , 1 9 7 9 ; S h a h and B u r t o n , 1 9 8 0 ) , w h i c h may s u b s e q u e n t l y l e a d t o i n h i b i t i o n o f i n t r a c e l l u l a r p r o t e i n s y n t h e s i s (Zimmerman e t a l . , 1 9 7 0 ) and e v e n t u a l l y t o p r e m a t u r e n e c r o s i s o f p a l a t a l c e l l s ( S h a h and T r a v i l l , 1 9 7 6 b ; S h a h , 1 9 8 0 ; K u r i s u e t a l . , 1 9 8 1 ) . M e c h a n i s m s r e g u l a t i n g t h e b i n d i n g o f g l u c o c o r t i c o i d m o l e c u l e s t o t h e r e c e p t o r s a n d t h e i n h i b i t i o n o f p r o t e i n s y n t h e s i s , h o w e v e r , h a v e n o t y e t b e e n c l a r i f i e d . In r e c e n t y e a r s a t t e m p t s h a v e b e e n made a t a n a l y z i n g t h e u l t r a s t r u c t u r a l a n d b i o c h e m i c a l e f f e c t s o f t e r a t o g e n s o t h e r t h a n g l u c o c o r t i c o i d s on p a l a t a l t i s s u e s d u r i n g d e v e l o p m e n t ( T a b l e I I ) . One may d e d u c e f r o m T a b l e I I t h a t d e p e n d i n g on t h e c h e m i c a l n a t u r e o f t h e t e r a t o g e n i c a g e n t , d i f f e r e n t a s p e c t s o f g r o w t h a n d d i f f e r e n t i a t i o n o f e i t h e r e p i t h e l i a l , o r m e s e n c h y m a l o r b o t h t i s s u e s may be a f f e c t e d . 6-Mercaptopurine I n 1952 E l i o n a n d a s s o c i a t e s r e p o r t e d t h e s y n t h e s i s o f a p u r i n e a n a l o g u e , 6 - m e r c a p t o p u r i n e ( 6 M P ) . The c h e m i c a l i s a y e l l o w i s h , o d o u r l e s s , c r y s t a l l i n e p o w d e r , i n s o l u b l e i n w a t e r , a c e t o n e , c h l o r o f o r m a n d d i e t h y l - 12 - Table I I . A Summary of U l t r a s t r u c t u r a l and Biochemical Studies of Teratogen Induced C l e f t Palate Development Agent ( s p e c i e s ) U l t r a s t r u c t u r a l S t udies Vincristine Sulfate & acridine orange (rat) Meclozine (rat) 3-aminopropri oni tri 1 e (rat) Hydrocortisone (hamster) Diazo-oxo-norleucine (rat) Triamcinolone (hamster) (mouse) Phenylbutazone (mouse) 5-fluorouracil (hamster) Mechanism Inhibition of cell death Effect on the epithelial cell piasmamembrane permeability Factors extrinsic to shelves; did not observe any cellular effects Retarded differentiation in epithelium Premature necrosis of the basal epithelial cells Alteration in intracellular distribution of lysosomal enzymes Alterations at the epithelial-mesenchymal interface Inhibition of cell proliferation Alterations at the epithelial-mesenchymal interface Premature, sublethal injury of the mesenchymal cells References Mato & Uchiyama, 1972 Mato et al., 1975a Mato & Uchiyama, 1975 Morgan, 1976 Mato et al., 1975b Shah & Travill, 1976b Greene & Pratt, 1978 Shah, 1980 Kurisu et al., 1981 Montenegro & Paz de la Vega, 1982 Shah et al., 1984a - 13 - T a b l e I I . ( c o n t i n u e d ) A g e n t ( s p e c i e s ) M e c h a n i s m R e f e r e n c e s B i o c h e m i c a l S t u d i e s H y p e r v i t a m i n o s i s A ( r a t ) I n c r e a s e d s y n t h e s i s o f DNA L o r e n t e & M i l l e r , a n d g l y c o p r o t e i n 1978 ( r a t ) I n h i b i t i o n o f DNA, c o l l a g e n S a u e r & E v a n s , 1980 a n d g l y c o s a m i n o g l y c a n s y n t h e s i s ( r a t ) I n h i b i t i o n o f DNA s y n t h e s i s P i c k & E v a n s , 1981 B - a m i n o p r o p r i o n i t r i l e I n h i b t i o n o f c o l l a g e n P r a t t & K i n g , 1972 ( r a t ) s y n t h e s i s ( r a t ) S t i m u l a t i o n o f D e l B a l s o & K a u f f m a n , g l y c o s a m i n o g l y c a n c a t a b o l i s m 1975 D i a z o - o x o - n o r l e u c i n e I n h i b i t i o n o f P r a t t e t a l . , 1973 ( r a t ) m u c o p o l y s a c c h a r i d e s y n t h e s i s ( r a t ) B l o c k g l u c o s a m i n e f o r m a t i o n P r a t t & G r e e n e , 1976 ( r a t ) I n h i b i t g l y c o p r o t e i n G r e e n e & P r a t t , 1977 s y n t h e s i s S a l i c y l a t e ( m o u s e ) I n h i b i t m u c o p o l y s a c c h a r i d e L a r s s o n & B o s t r o m , s y n t h e s i s 1965 2 - d e o x y g l u c o s e ( r a t ) D e c r e a s e d s y n t h e s i s o f P r a t t & G r e e n e , 1976 l y s o s o m a l e n z y m e s E p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r R e d u c e d l e v e l s o f cAMP H a s s e l & P r a t t , 1977 ( r a t ) M e t h y l m e r c u r y ( m o u s e ) I m p a i r e d p l a c e n t a l t r a n s f e r O l s o n & M a s s a r o , 1977 o f a m i n o a c i d s 5 - f l u o r o - 2 - d e s o x y u r i d i n e R e d u c e d s y n t h e s i s o f F e r g u s o n , 1977 ( r a t ) m u c o p o l y s a c c h a r i d e C h l o r c y c l i z i n e ( r a t ) D e g r a d a t i o n o f W i l k e t a l . , 1978 g l y c o s a m i n o g l y c a n s P h e n y t o i n ( m o u s e ) R e d u c e d p r o t e i n a n d RNA S o n a w a n e & G o l d m a n , s y n t h e s i s 1981 - 14 - e t h e r , b u t s o l u b l e i n b o i l i n g w a t e r , a l k a l i n e s o l u t i o n s , a n d warm e t h a n o l ( W i n d h o l z , 1 9 7 6 ) . I t h a s a m o l e c u l a r w e i g h t o f 1 5 2 . 1 9 a n d a m e l t i n g p o i n t o f 3 1 3 ° C . When a d m i n i s t e r e d i n t r a p e r i t o n e a l l y t o mammals a l a r g e p r o p o r t i o n ( 2 1 . 4 % ) o f 6MP i s e x c r e t e d u n c h a n g e d i n t h e u r i n e d u r i n g t h e f o l l o w i n g 24 h o u r s , a n d t h e r e m a i n d e r a s c a t a b o l i t e s ( F i g . 1 ) , m a i n l y 6 - t h i o u r i c a c i d ( 1 8 . 9 % ) a n d i n o r g a n i c s u l p h a t e ( 2 9 . 5 % ) ( E l i o n e t a l . , 1 9 6 3 ) . A f t e r i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n , t h e d r u g c o n c e n t r a t i o n r a p i d l y b e c o m e s h i g h w i t h i n many o r g a n s . In l i v e r t h e c o n c e n t r a t i o n r e a c h e s f o u r t i m e s t h a t o f p l a s m a w i t h i n m i n u t e s , b u t f a l l s r a p i d l y t h e r e a f t e r i n b o t h t h e o r g a n s a n d p l a s m a ( T t e r l i k k i s e t a l . , 1 9 7 7 ) . The h a l f l i f e o f 6MP a p p e a r s t o b e v e r y s h o r t . A f t e r i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o n o f 6MP, t h e p l a s m a h a l f l i f e o f t h e d r u g was 14 m i n u t e s i n m i c e , 9 m i n u t e s i n r a t s ( D o n e l l i e t a l . , 1 9 7 2 ) , a n d 1 . 5 h o u r s i n humans ( H a m i l t o n and E l i o n , 1 9 5 4 ) . A l t h o u g h t h e p r e c i s e m e c h a n i s m by w h i c h 6MP e x e r t s i t s e f f e c t i s u n c e r t a i n , i t i s g e n e r a l l y a g r e e d t h a t t h e d r u g e v e n t u a l l y i n h i b i t s t h e s y n t h e s i s o f p u r i n e . S e v e r a l p o s s i b l e b i o c h e m i c a l s i t e s o f a c t i o n f o r i n h i b i t i o n o f p u r i n e s y n t h e s i s by 6MP h a v e b e e n s u g g e s t e d ( E l i o n , 1 9 6 7 ; P a t e r s o n a n d T i d d , 1 9 7 5 ; T i d d and D e d h a r , 1 9 7 8 ; G r i n g a u z , 1 9 7 8 ; D i n g a n d B e n e t , 1 9 7 9 ; B r e t e r a n d Z a h n , 1 9 7 9 ; P l a g e m a n n e t a l . , 1 9 8 1 ; L e n n a r d a n d M a d d o c k s , 1 9 8 3 ) , b u t t h e e x a c t m e c h a n i s m o f i t s a c t i o n i s n o t y e t c l e a r . A c t i n g i n v i t r o a s a f r e e b a s e , t h e c h e m i c a l c o m p e t i t i v e l y i n h i b i t s x a n t h i n e o x i d a s e a n d h y p o x a n t h i n e - g u a n i n e p h o s p h o r i b o s y l t r a n s f e r a s e w h i c h c o n v e r t h y p o x a n t h i n e t o x a n t h i n e and i n o s i n a t e r e s p e c t i v e l y ( F i g . 2 ) . H o w e v e r , i n v i v o t h e d r u g i s a n a b o l i s e d t o 6 - m e t h y l t h i o i n o s i n a t e a n d t h i o i n o s i n a t e , w h i c h 1 Catabolism of 6-Mercaptopurine and Hypoxanthine Co 6-Mercaptopurine N Hypoxanthine Uric Acid A d a p t e d from Gr ingauz ( 1 9 7 8 ) Fig. 2 Proposed Sites of Action of 6-Mercaptopurine (6MP) and its Anabolites on •H Purine Metabol ism 6MP, X a n t h i n e 1) T i d d a n d D e d h a r ( 1 9 7 8 ) 2 ) P l a g e m a n n e t a l . ( 1 9 8 1 ) 3 ) D i n g a n d B e n e t ( 1 9 7 9 ) 4 ) B r e t e r a n d Z a h n ( 1 9 7 9 ) 5 ) P a t e r s o n a n d T i d d ( 1 9 7 5 ) 6 ) G r i n g a u z ( 1 9 7 8 ) 7 ) L e o n a r d a n d M a d d o c k s ( 1 9 8 2 ) P u r i n e D e n o v o s y n t h e s i s U f g ) X a n t h y l a t e ( X M P ) G M P I G D P G T P A M P A D P A T P N u c l e i c a c i d 6 - T h i o i n o s i n e T h i o i n o s i n a t e 6 - M e t h y l t h i o i n o s i n a t e * • * 6 - T h i o x a n t h y l a t e ( 4 > i! I 6 - M e t h y l t h i o i n o s i n e 6 - T h i o g u a n y l a t e (1A4) T h i o G D P (4) T h i o n u c i e i c a c i d s - 17 - may a c t t o i n h i b i t de n o v o s y n t h e s i s o f p u r i n e s ( P a t e r s o n a n d T i d d , 1 9 7 5 ; B r e t e r a n d Z a h n , 1 9 7 9 ) . P a t e r s o n and T i d d ( 1 9 7 5 ) , G r i n g a u z ( 1 9 7 8 ) , a n d B r e t e r and Z a h n ( 1 9 7 9 ) h a v e i n d i c a t e d t h a t t h i o i n o s i n a t e may a l s o a c t t o i n h i b i t p u r i n e r i b o n u c l e o t i d e m e t a b o l i s m a n d i t s t r a n s c o n v e r s i o n s ( F i g . 2 ) . O t h e r s ( T i d d a n d D e d h a r , 1 9 7 8 ; D i n g and B e n e t , 1 9 7 9 ; B r e t e r and Z a h n , 1 9 7 9 ; L e n n a r d a n d M a d d o c k s , 1 9 8 3 ) , h o w e v e r , s t r e s s t h a t t h e d r u g a c t s v i a t h e c o n v e r s i o n o f 6 - t h i o i n o s i n a t e i n t o 6 - t h i o x a n t h y l a t e , l e a d i n g t o t h e f o r m a t i o n o f t h i o n u c l e i c a c i d s ( F i g . 2 ) . S e v e r a l r e s e a r c h e r s h a v e a l s o i n d i c a t e d t h a t t h e e f f e c t o f 6MP may be m e d i a t e d v i a d i r e c t l y a f f e c t i n g mRNA s y n t h e s i s ( R o y - B u r m a n , 1 9 7 0 ; N e u b e r t e t a l . , 1 9 7 0 ; Mewes e t a l . , 1 9 7 1 ) . R e c e n t l y K a w a h a t a e t a l . ( 1 9 8 0 ) s u g g e s t e d t h a t 6MP may i n h i b i t D N A - d e p e n d a n t RNA p o l y m e r a s e a c t i v i t y w h i c h i n t u r n r e d u c e s RNA s y n t h e s i s . I t a p p e a r s t h a t e v e n t u a l l y t h e i n t e r f e r e n c e w i t h one o r more o f t h e s e a f o r e m e n t i o n e d p a t h w a y s i s p e r h a p s r e s p o n s i b l e f o r t h e g r o w t h s u p p r e s s i v e e f f e c t w h i c h h a s made 6MP u s e f u l i n t h e t r e a t m e n t o f v a r i o u s f o r m s o f l e u k e m i a ( C a l a b r e s i a n d P a r k s , 1 9 7 5 ) . The c h e m i c a l a l s o h a s i m m u n o s u p r e s s i v e p r o p e r t i e s , a n d i s c o n s i d e r e d u s e f u l i n t h e t r e a t m e n t o f u l c e r a t i v e c o l i t i s ( I A R C , 1 9 8 1 ) . The e m b r y o t o x i c a n d t e r a t o l o g i c a l e f f e c t s o f 6MP a r e w e l l d o c u m e n t e d i n e c h i n o d e r m s a n d v e r t e b r a t e s ( t a d p o l e , c h i c k , r a t , m o u s e , r a b b i t , h a r e a n d h a m s t e r ) ( B i e b e r e t a l . , 1 9 5 2 ; T h i e r s c h , 1 9 5 4 ; Z u n i n a n d B o r r o n e , 1 9 5 5 ; D i d c o c k e t a l . , 1 9 5 6 ; T u c h m a n n - D u p l e s s i s a n d M e r c i e r - P a r o t , 1 9 5 8 , 1 9 6 6 , 1 9 6 8 ; K a r n o f s k y , 1 9 6 0 ; M u r p h y , 1 9 6 0 , 1 9 6 2 ; B l a t t n e r e t a l . , 1 9 6 0 ; Adams e t a l . , 1 9 6 1 ; M e r c i e r - P a r o t a n d T u c h m a n n - D u p l e s s i s , 1 9 6 7 ; V T s h n i a k o v , 1 9 6 8 , 1 9 6 9 ; B r a g o n i e r and C a r v e r , 1 9 6 8 ; K u r y e t a l . , 1 9 6 8 ; Adham ti a n d N o a c k , 1 9 7 5 ; A s i s i a n d M e r k e r , 1 9 7 5 ; M e r k e r e t a l . , 1 9 7 5 ; P u g e t e t a l . , 1 9 7 5 ; G r u b b a n d - 18 - M o n t i e g e l , 1 9 7 5 ; N e u b e r t e t a l . , 1 9 7 7 ; A d h a m i , 1 9 7 9 ; S h a h a n d B u r d e t t , 1 9 7 9 ) . I n mammals t h e e m b r y o t o x i c a n d t e r a t o l o g i c a l e f f e c t s a r e m a n i f e s t e d o n l y a f t e r t h e 6MP h a s c r o s s e d t h e p l a c e n t a t o t h e f e t u s , w h e r e i t i s t h e n a n a b o l i z e d by t h e f e t u s i n t o an a c t i v e f o r m ( N e u b e r t e t a l . , 1 9 8 0 ) . The t e r a t o g e n i c e f f e c t s w e r e c h a r a c t e r i z e d by m a l f o r m a t i o n s o f l i m b s , b e a k , e y e , b r a i n , p a l a t e , t e e t h , s a l i v a r y g l a n d s , t o n g u e , m a n d i b l e , r e s p i r a t o r y t r a c t , a l i m e n t a r y t r a c t , l i v e r , k i d n e y a n d t a i l . I n a d d i t i o n , s t e r i l i t y h a s b e e n o b s e r v e d d u r i n g p o s t n a t a l l i f e i n b o t h m a l e a n d f e m a l e a n i m a l s w h i c h w e r e e x p o s e d t o ' s u b - t e r a t o l o g i c a l ' d o s e s o f 6MP d u r i n g g e s t a t i o n ( R e i m e r s a n d S l u s s , 1 9 7 8 ; R e i m e r s e t a l . , 1 9 8 0 ) . R e v i e w o f t h e l i t e r a t u r e i n d i c a t e s t h a t i n a t l e a s t 21 human p r e g n a n c i e s 6MP was a d m i n i s t e r e d d u r i n g t h e f i r s t t r i m e s t e r . Of t h e t w e n t y - o n e , t h r e e m o t h e r s d i e d u n d e l i v e r e d ( R a i c h s , 1 9 6 2 ; N i c h o l s o n , 1 9 6 8 a ) , e i g h t a b o r t e d f e t u s e s ( T h i e r s c h , 1 9 5 6 ; R o t h b e r g e t a l . , 1 9 b 9 ; B o g g s e t a l . , 1 9 6 2 ; R a i c h s , 1 9 6 2 ; B i l s k i - P a s q u i e r e t a l . , 1 9 6 2 ; H o o v e r and S c h u m a c h e r , 1 9 6 6 ) , one d e l i v e r e d a ' d y s m a t u r e ' i n f a n t who d i e d s h o r t l y a f t e r b i r t h ( M e r s k e y a n d R i g a l , 1 9 5 6 ) , o n e d e l i v e r e d an a n a e m i c i n f a n t ( M c C o n n e l l a n d B h o o l a , 1 9 7 3 ) , s e v e n d e l i v e r e d n o r m a l i n f a n t s ( D i a m o n d e t a l . , 1 9 6 0 ; F r e n k e l a n d M e y e r s , 1 9 6 0 ; M a n g i a m e l i , 1 9 6 1 ; S i n y k i n and K a p l a n , 1 9 6 2 ; B i 1 s k i - P a s q u i e r e t a l . , 1 9 6 2 ; R a v e n n a a n d S t e i n , 1 9 6 3 ; N i c h o l s o n , 1 9 6 8 a ) , a n d one d e l i v e r e d a m a l f o r m e d i n f a n t who d i e d a t 10 w e e k s o f a g e ( D i a m o n d e t a l . , 1 9 6 0 ) . The m a l f o r m e d i n f a n t h a d m u l t i p l e d e f e c t s i n c l u d i n g a l o w b i r t h w e i g h t , c l o u d y c o r n e a , p o o r l y d e v e l o p e d g e n t a l i a , a n d a c l e f t o f t h e s o f t a n d p o s t e r i o r h a r d p a l a t e . The m o t h e r o f t h e m a l f o r m e d i n f a n t h a d c h r o n i c g r a n u l o c y t i c l e u k e u m i a . F o r t h e t r e a t m e n t o f h e r d i s e a s e s h e r e c e i v e d 100 mg bMP p e r day - 19 - o r a l l y d u r i n g t h e f i r s t s i x w e e k s o f g e s t a t i o n , a n d a s i n g l e t r e a t m e n t o f 2 0 0 r o f r a d i a t i o n d u r i n g t h e f i r s t m o n t h o f g e s t a t i o n . A f t e r s i x w e e k s 6MP a d m i n i s t r a t i o n was s t o p p e d i n f a v o u r o f 4 t o 6 mg B u s u l f a n p e r d a y f o r an a d d i t i o n a l t h i r t y w e e k s o f g e s t a t i o n , f o l l o w e d by 125 mg 6MP p e r day t i l l t e r m . I n a d d i t i o n , t w e n t y - e i g h t m o t h e r s h a v e b e e n r e p o r t e d t o h a v e r e c e i v e d 6MP t r e a t m e n t d u r i n g t h e s e c o n d a n d t h i r d t r i m e s t e r s o f p r e g n a n c y . Of t h e s e t w e n t y - e i g h t c a s e s , t h r e e m o t h e r s d i e d u n d e l i v e r e d ( N i c h o l s o n , 1 9 6 8 a , b ) , o n e a b o r t e d ( O ' L e a r y a n d B e p k o , 1 9 6 3 ) , one h a d a s t i l l b i r t h ( P a r e k h e t a l . , 1 9 5 9 ) , a n d t w e n t y - t h r e e d e l i v e r e d n o r m a l i n f a n t s ( S c h u m a c h e r , 1 9 5 / ; H i l l , 1 9 5 8 ; R o t h b e r g e t a l . , 1 9 5 9 ; F r e n k e l and M e y e r s , 1 9 6 0 ; H i l l a n d L o e b , 1 9 6 0 ; S a n d b e r g , I 9 6 0 ; L o y d , 1961,; L e e e t a l . , 1 9 6 2 ; E l i z a r o v a a n d S t u p n i t s k a y a , 1 9 6 2 ; O l m e r a n d C a r c a s s o n n e , 1 9 6 2 ; R a i c h s , 1 9 6 2 ; N e u , 1 9 6 2 ; B i 1 s k i - P a s q u i e r e t a l . , 1 9 6 2 ; S t e w a r t , 1 9 6 4 ; R i g b y e t a l . , 1 9 6 4 ; R e z e n d e e t a l . , 1 9 6 5 ; N i c h o l s o n , 1 9 6 8 b ) . A h i g h i n c i d e n c e o f f e t a l l o s s a n d a b n o r m a l i t i e s ( 1 1 / 2 1 ) f o l l o w i n g 6MP a d m i n i s t r a t i o n d u r i n g t h e f i r s t t r i m e s t e r s u g g e s t s t h a t p e r h a p s t h e d r u g may a l s o be f e t o t o x i c a n d t e r a t o g e n i c i n h u m a n s . - 20 - PURPOSE OF THE STUDY The aforegoing analysis of the l i t e r a t u r e indicates that the sequence of events during morphogenesis and histogenesis of the secondary palate have been repeatedly studied in different mammals. These studies were mainly concerned with events and issues involved during the reorientation of palatal shelves from a ve r t i c a l to a horizontal position, and their subsequent fusion. No attention, however, was paid to the events leading to the development of palatal shelves in the vertical direction in any species. One of the purposes of this investigation, therefore, was to describe the ver t i c a l development of hamster palatal shelves using both l i g h t and electron microscopy. C l e f t palate i s one of the major malformations induced by 6MP in mammals. When 70 mg/kg body weight of 6MP was administered intraperitoneally into hamsters on day 9:00 of gestation, a l l the fetuses at term showed c l e f t palate without an appreciable embryotoxic effect (Shah and Burdett, 1979). Another purpose of the present study was, therefore, to analyze hitherto unreported aspects of the pathogenesis of 6MP induced c l e f t palate using l i g h t and electron microscopy, and enzyme cytochemistry. - 21 - MATERIALS AND METHODS Breeding of Animals S e v e n - w e e k - o l d m a l e and f e m a l e G o l d e n S y r i a n h a m s t e r s w e r e o b t a i n e d f r o m S i m o n s e n L a b o r a t o r i e s , C a l i f o r n i a , U . S . A . The a n i m a l s w e r e c a g e d s i n g l y a n d m a i n t a i n e d i n an e n v i r o n m e n t o f t e m p e r a t u r e (24 ± 1 ° C ) , h u m i d i t y ( 5 0 ± 5 % ) , a n d an a l t e r n a t e c y c l e o f l i g h t (6 a . m . - 6 p . m . ) a n d d a r k . F o o d and w a t e r w e r e a v a i l a b l e ad l i b i t u m . In t h e p r e s e n t s t u d y 2 0 0 f e m a l e h a m s t e r s w e r e u t i l i z e d . F o l l o w i n g a t l e a s t one week o f e n v i r o n m e n t a l a c c l i m a t i z a t i o n , e a c h f e m a l e ( 8 0 ± 5 g r a m s ) was p l a c e d w i t h a m a l e i n t h e b r e e d i n g c a g e , a n d c o p u l a t i o n was o b s e r v e d . The m a t i n g was a l l o w e d t o c o n t i n u e f r o m 7 p . m . t o 9 p . m . The m i d p o i n t o f t h e m a t i n g p e r i o d , 8 p . m . , was c o n s i d e r e d as day 0 (0 d a y s : 0 h o u r s ) o f g e s t a t i o n . Drug Treatment and Procurement of T i s s u e s On day 9 : 0 0 o f g e s t a t i o n , e a c h f e m a l e was g i v e n an i n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o n o f e i t h e r 70 mg/kg 6MP ( S i g m a C h e m i c a l s , S t . L o u i s , M 0 , C a l a l o g #M7000, L o t # 8 2 C - 1 1 3 0 ) s u s p e n d e d i n 1 ml d i s t i l l e d w a t e r , o r 1 ml d i s t i l l e d w a t e r . The l a t t e r a n i m a l s s e r v e d a s c o n t r o l s . A g r o u p o f d r u g t r e a t e d a n d c o n t r o l a n i m a l s w e r e k i l l e d a t s i x h o u r i n t e r v a l s b e t w e e n d a y s 9 : 0 0 and 1 4 : 0 0 , a n d t h e n on day 1 5 : 0 0 o f g e s t a t i o n . The f e t u s e s w e r e d e l i v e r e d by c a e s a r i a n s e c t i o n a n d i m m e d i a t e l y i m m e r s e d i n t h e a p p r o p r i a t e f i x a t i v e a s d e s c r i b e d b e ! o w . - 22 - F o r G r o s s a n d L i g h t M i c r o s c o p i c S t u d i e s F o r m a c r o s c o p i c a n d l i g h t m i c r o s c o p i c s t u d i e s t h e f e t u s e s w e r e i m m e r s e d i n B o u i n ' s s o l u t i o n f o r 48 h o u r s . They w e r e t h e n d e h y d r a t e d t h r o u g h an a s c e n d i n g c o n c e n t r a t i o n o f e t h a n o l , s t a r t i n g a t 3 0 % . Upon r e a c h i n g a 70% c o n c e n t r a t i o n o f e t h a n o l , e a c h f e t u s was w e i g h e d , a n d m e a s u r e d f o r c r o w n - r u m p l e n g t h ( C R L ) . The s t a t u s o f p a l a t e d e v e l o p m e n t was a s c e r t a i n e d and r e c o r d e d . The f e t u s e s w e r e t h e n f u r t h e r p r o c e s s e d t h r o u g h h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f e t h a n o l ( 8 0 % - 1 0 0 % ) , a n d t h e n t h r o u g h t h r e e c h a n g e s o f c h l o r o f o r m , a n d embedded i n p a r a f f i n t o p r o c u r e f r o n t a l s e c t i o n s . S i x m i c r o n s e r i a l s e c t i o n s w e r e s t a i n e d w i t h H e m a t o x y l i n and E o s i n . F o r E l e c t r o n M i c r o s c o p i c S t u d i e s F o r e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e s t h e f e t a l h e a d s w e r e i m m e r s e d i n 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r e d 2 . 5 % g l u t e r a l d e h y d e (pH 7 . 3 ) a t 0 - 4 ° C ( S a b a t i n i e t a l . , 1 9 6 3 ) f o r 8 - 1 2 h o u r s . T h e y w e r e t h e n g i v e n f o u r 10 m i n u t e r i n s e s o f 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r (pH 7 . 3 ) a t 0 - 4 ° C . The t o n g u e a n d m a n d i b l e w e r e d i s s e c t e d f r o m t h e f e t a l h e a d s a n d d i s c a r d e d . The f e t a l h e a d s w e r e t h e n i m m e r s e d i n 1% p h o s p h a t e b u f f e r e d osmium t e t r o x i d e f o r 9 0 - 1 2 0 m i n u t e s i n t h e d a r k a t 0 - 4 ° C . The h e a d s w e r e t h e n q u i c k l y w a s h e d w i t h 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r (pH 7 . 3 ; 0 - 4 ° C ) f o l l o w e d by a r i n s e w i t h d i s t i l l e d w a t e r ( 0 - 4 ° C ) . S u b s e q u e n t l y t h e t i s s u e s w e r e d e h y d r a t e d t h r o u g h a s c e n d i n g c o n c e n t r a t i o n s o f e t h a n o l s t a r t i n g f r o m 3 0 % . Upon r e a c h i n g 100% e t h a n o l , t h e t i s s u e s w e r e p r o c e s s e d t h r o u g h two c h a n g e s o f p r o p y l e n e o x i d e . The h e a d s w e r e t h e n i m m e r s e d i n a 3 : 1 , a n d t h e n a 1 : 1 m i x t u r e o f p r o p y l e n e o x i d e : E p o n - A r a l d i t e f o r a t l e a s t 30 m i n u t e s e a c h , a n d l e f t o v e r n i g h t i n 1 : 3 p r o p y l e n e o x i d e : E p o n - A r a l d i t e m i x t u r e f o r - 23 - i n f i l t r a t i o n . The n e x t m o r n i n g t h e t i s s u e s w e r e t r a n s f e r r e d i n t o f r e s h l y p r e p a r e d E p o n - A r a l d i t e e m b e d d i n g medium and p l a c e d u n d e r 2 5 l b . vacuum f o r t h i r t y m i n u t e s . P r i o r t o e m b e d d i n g d i m e t h y l a m i n o m e t h y l p h e n o l ( D M P - 3 0 ) was a d d e d as an a c c e l e r a t o r t o t h e E p o n - A r a l d i t e e m b e d d i n g medium t o a c h i e v e a 2% c o n c e n t r a t i o n a n d t h e n t h o r o u g h l y m i x e d ( M o l l e n b a u e r , 1 9 6 4 ) . The p a l a t e s w e r e t r i m m e d by r e m o v i n g e x t r a n e o u s t i s s u e s a n d t h e n c u t i n t o a n t e r i o r and p o s t e r i o r h a l v e s . The c u t p a l a t e s w e r e p l a c e d i n t h e Beem c a p s u l e t o p r o c u r e f r o n t a l s e c t i o n s , embedded i n E p o n - A r a l d i t e c o n t a i n i n g 2% a c c e l e r a t o r , a n d p l a c e d i n a d r y h e a t o v e n a t 3 7 ° C f o r 2 h o u r s t o e l i m i n a t e g a s e s a n d t o p e r m i t i n i t i a l p o l y m e r i z a t i o n . S u b s e q u e n t l y t h e c a p s u l e s w e r e t r a n s f e r r e d t o a 6 0 ° C d r y h e a t oven f o r 3 - 4 d a y s . F r a n t h e p o l y m e r i z e d b l o c k s one m i c r o n s e c t i o n s w e r e s t a i n e d w i t h I X T o l u i d i n e B l u e , a n d e x a m i n e d f o r i d e n t i f i c a t i o n a n d o r i e n t a t i o n p u r p o s e s . T h i n s e c t i o n s ( 6 0 nm) w e r e o b t a i n e d f r o m a p p r o p r i a t e b l o c k s a n d t r a n s f e r r e d t o 300 mesh c o p p e r g r i d s . They w e r e t h e n s t a i n e d w i t h m e t h a n o l i c u r a n y l a c e t a t e ( S t e m p a k a n d W a r d , 1 9 6 4 ) f o r f i f t e e n m i n u t e s , f o l l o w e d by l e a d c i t r a t e ( R e y n o l d s , 1 9 6 3 ) f o r f i v e m i n u t e s . The g r i d s w e r e e x a m i n e d i n a P h i l i p s 300 E l e c t r o n M i c r o s c o p e o p e r a t i n g a t an a c c e l e r a t i n g p o t e n t i a l o f 60 KV. For Acid Phosphatase Enzyme Cytochemistry F o r a c i d p h o s p h a t a s e enzyme c y t o c h e m i s t r y , f e t a l h e a d s w e r e i m m e r s e d i n f o r m o l - c a l c i u m ( 0 - 4 ° C ) f o r 2 4 - 3 6 h o u r s . The h e a d s w e r e p l a c e d on a c r y o s t a t t i s s u e h o l d e r ( I n t e r n a t i o n a l H a r r i s C r y o s t a t m o d e l C T D , I n t e r n a t i o n a l E q u i p m e n t C o r p . , Needham H e i g h t s , M a s s . ) i n a p o o l o f T i s s u e Tek ( L a b - T e k P r o d u c t s , N a p e r v i l l e , 1 1 1 . ) a n d q u i c k l y f r o z e n i n a - 3 0 ° C c r y o s t a t . E i g h t - 24 - m i c r o n s e r i a l s e c t i o n s w e r e c u t and t r a n s f e r r e d t o c o l d p r e - c l e a n e d g l a s s s l i d e s . The s e c t i o n s w e r e a i r d r i e d f o r one h o u r , a n d t h e n i n c u b a t e d i n a m i x t u r e ( A p p e n d i x I ) c o n t a i n i n g n a p h t h o l A S - T R p h o s p h o r i c a c i d , p a r a r o s a n i l i n e h y d r o c h l o r i d e , s o d i u m n i t r i t e , a n d v e r o n a l a c e t a t e b u f f e r a t 3 7 ° C f o r 90 m i n u t e s i n a d r y h e a t o v e n ( B a r k a a n d A n d e r s o n , 1 9 6 2 ) . A f t e r i n c u b a t i o n t h e s l i d e s w e r e q u i c k l y w a s h e d i n d i s t i l l e d w a t e r , s t a i n e d f o r 30 s e c o n d s i n m e t h y l g r e e n (pH 4 . 0 ) , a n d w a s h e d a g a i n i n d i s t i l l e d w a t e r . They w e r e t h e n q u i c k l y d e h y d r a t e d by i m m e r s i o n i n 5 0 % , 70%, 9 5 % , a n d a b s o l u t e e t h a n o l , c l e a r e d i n x y l e n e , a n d m o u n t e d i n DPX (BDH c h e m i c a l s , V a n c o u v e r , P r o d u c t C o d e 3 3 0 3 , L o t # 5 0 5 3 0 9 ) . The enzyme a c t i v i t y was i n d i c a t e d by a v i v i d r e d a z o d y e . Two c o n t r o l s w e r e u s e d f o r t h e i n c u b a t i o n r e a c t i o n : f o r a n e g a t i v e c o n t r o l s e c t i o n s f r o m e a c h f e t a l h e a d w e r e i n c u b a t e d i n a s u b s t r a t e - f r e e m e d i u m , w h i c h was o t h e r w i s e i d e n t i c a l ; f o r a p o s i t i v e c o n t r o l s e c t i o n s o f n o r m a l r a t l i v e r w e r e i n c l u d e d i n e a c h i n c u b a t i o n j a r w i t h t h e f e t a l h e a d s e c t i o n s . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s F o r s t a t i s t i c a l a n a l y s i s t h e d a t a w e r e s u b j e c t e d t o t h e f o l l o w i n g m e t h o d s . The c o r r e l a t i o n s b e t w e e n g e s t a t i o n a l a g e , CRL a n d f e t a l w e i g h t w e r e e v a l u a t e d by a l i n e a r r e g r e s s i o n a n d e x p o n e n t i a l r e g r e s s i o n ( S o k a l a n d R o h l f , 1 9 6 9 ) . The r e g r e s s i o n l i n e s f o r t r e a t e d and c o n t r o l d a t a w e r e c o m p a r e d t o a s s e s s s i g n i f i c a n c e . The p a l a t a l s t a g i n g was t a b u l a t e d a g a i n s t g e s t a t i o n a l a g e , CRL a n d f e t a l w e i g h t a n d e v a l u a t e d by c o n t i n g e n c y t a b l e a n a l y s i s ( Z a r , - 25 - 1 9 7 4 ) . S t a n d a r d c u r v e s i l l u s t r a t i n g t h e p r o b a b i l i t y o f e a c h p a l a t a l s t a g e i n r e l a t i o n t o g e s t a t i o n a l a g e , CRL and f e t a l w e i g h t w e r e o b t a i n e d a n d e v a l u a t e d f o r s i g n i f i c a n c e by t h e c h i - s q u a r e m e t h o d ( B e r k s o h , 1 9 5 7 ) . - 26 - RESULTS Morphogenesis of the Secondary Palate 1n Control Hamster Fetuses Based on gross observations, which were l a t e r confirmed h i s t o l o g i c a l l y , the morphogenesis of control secondary palate can be categorized within one or another of the following stages: Stage 1. The appearance of the palatal primordia from the roof of the oronasal cavity toward i t s floor (Figs. 3,4). The tongue i s absent (Fig. 4). Stage 2. The palatal shelves are v e r t i c a l on the sides of the tongue, which originates from the f l o o r of the oronasal cavity (Figs, b, 6). Stage 3. The p a l a t a l . shelves are horizontal above the tongue (Figs. 7, 8). Stage 4. The palatal shelves unite in the middle t h i r d , but remain open in the anterior and posterior thirds of the secondary palate (Figs. 9, 10) . Stage 5. The palatal shelves unite in the posterior t h i r d of the secondary palate. The anterior t h i r d remains open ( F i g . 11) . Stage 6 . The palatal shelves unite in the anterior t h i r d of the secondary palate, and with t h i s event the closure of the palate i s complete (Fig. 12). The data on gross observations of normal palate development in r e l a t i o n to gestational age of the fetus are presented in Table I I I . One may deduce from the table that:  - 2 8 - F1g. 3 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n . The m a n d i b l e h a s b e e n r e m o v e d . S t a g e 1 . The p a l a t a l p r i m o r d i a ( a s t e r i s k ) a p p e a r f r o m t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y . 1 6 . 5 X . F1g. 4 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e r e g i o n i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n . S t a g e 1 . The p a l a t a l p r i m o r d i a ( a r r o w s ) d e v e l o p f r o m t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y t o w a r d s t h e f l o o r ( F ) . T h e t o n g u e i s a b s e n t . P a r a f f i n s e c t i o n . H e m a t o x y l i n a n d E o s i n s t a i n . 5 8 X . F1g. 5 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r on day 1 1 : 1 8 o f g e s t a t i o n . The m a n d i b l e and t o n g u e h a v e b e e n r e m o v e d . S t a g e 2 . The p a l a t a l s h e l v e s ( P ) a r e i n v e r t i c a l p o s i t i o n . 8 . 5 X . F1g. 6 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e r e g i o n i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 1 : 1 8 o f g e s t a t i o n . S t a g e 2 . T h e p a l a t a l s h e l v e s ( P ) a r e v e r t i c a l on t h e s i d e s o f t h e t o n g u e ( T ) . P a r a f f i n s e c t i o n . H e m a t o x y l i n a n d E o s i n s t a i n . 7 5 X . F1g. 7 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r on day 1 2 : 0 0 o f g e s t a t i o n . The m a n d i b l e a n d t o n g u e h a v e b e e n r e m o v e d . S t a g e 3 . The p a l a t a l s h e l v e s ( P ) a r e h o r i z o n t a l . 8 . 5 X . F i g . 8 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e r e g i o n i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 2 : 0 0 o f g e s t a t i o n . S t a g e 3 . The p a l a t a l s h e l v e s ( P ) a r e h o r i z o n t a l a b o v e t h e t o n g u e ( T ) . P a r a f f i n s e c t i o n . H e m a t o x y l i n a n d E o s i n s t a i n . 2 5 8 X . F1g. 9 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r on day 1 2 : 0 0 o f g e s t a t i o n . The m a n d i b l e a n d t o n g u e h a v e b e e n r e m o v e d . S t a g e 4 . The p a l a t a l s h e l v e s u n i t e i n t h e m i d d l e t h i r d ( a r r o w h e a d ) , b u t r e m a i n o p e n i n t h e a n t e r i o r ( a ) a n d p o s t e r i o r ( b ) t h i r d s o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e . 8 . 5 X . F i g . 10 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e r e g i o n i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 2 : 0 0 o f g e s t a t i o n . S t a g e 4 . The o p p o s i n g p a l a t a l s h e l v e s ( P ) a r e f u s e d w i t h one a n o t h e r . NC - n a s a l c a v i t y . OC - o r a l c a v i t y . P a r a f f i n s e c t i o n . H e m a t o x y l i n and E o s i n s t a i n . 2 5 5 X .  - 30 - F i g . 11 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r on day 1 2 : 1 8 o f g e s t a t i o n . T h e m a n d i b l e a n d t o n g u e h a v e b e e n r e m o v e d . S t a g e 5 . The p a l a t a l s h e l v e s u n i t e i n t h e p o s t e r i o r t h i r d ( b ) o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e . The a n t e r i o r t h i r d ( a r r o w h e a d ) r e m a i n s o p e n . 6 X . F1g. 12 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a c o n t r o l h a m s t e r on day 1 3 : 0 0 o f g e s t a t i o n . The m a n d i b l e and t o n g u e h a v e b e e n r e m o v e d . S t a g e 6 . The p a l a t a l s h e l v e s a r e u n i t e d i n t h e a n t e r i o r t h i r d , t h u s m a r k i n g a c o m p l e t e c l o s u r e o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e . 6 X . F i g . 13 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d h a m s t e r on d a y 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n . The m a n d i b l e h a s b e e n r e m o v e d . S t a g e 1. The p a l a t a l p r i m o r d i a ( a s t e r i s k ) a p p e a r f r o m t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y . 1 6 . 5 X . F1g. 14 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e r e g i o n i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n . S t a g e 1 . The p a l a t a l p r i m o r d i a ( a r r o w s ) d e v e l o p f r o m t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y t o w a r d s t h e f l o o r ( F ) . E p o n - a r a l d i t e s e c t i o n . M e t h y l e n e b l u e s t a i n . 9 2 X . F1g. 15 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d h a m s t e r on day 1 1 : 1 8 o f g e s t a t i o n . The m a n d i b l e a n d t o n g u e h a v e b e e n r e m o v e d . S t a g e 2 . T h e p a l a t a l s h e l v e s ( P ) a r e v e r t i c a l . 9 X . F1g. 16 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 1 : 1 8 o f g e s t a t i o n . S t a g e 2 . The p a l a t a l s h e l v e s ( P ) a r e v e r t i c a l on t h e s i d e s o f t h e t o n g u e ( T ) . E p o n - a r a l d i t e s e c t i o n . M e t h y l e n e b l u e s t a i n . 7 5 X . F1g. 17 V e n t r a l v i e w o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d h a m s t e r on day 1 5 : 0 0 o f g e s t a t i o n . The m a n d i b l e a n d t o n g u e h a v e b e e n r e m o v e d . S t a g e 2 . The p a l a t a l s h e l v e s ( P ) a r e v e r t i c a l . 5 X . F i g . 18 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 5 : 0 0 o f g e s t a t i o n . S t a g e 2 . The p a l a t a l s h e l v e s ( P ) a r e r u d i m e n t a r y . T - t o n g u e . Bone f o r m a t i o n ( B ) i s p r e s e n t w i t h i n t h e s h e l v e s . P a r a f f i n s e c t i o n . H e m a t o x y l i n and E o s i n s t a i n . 4 0 X . - 31 - Table I I I . Staged Development of the Secondary P a l a t e In Control Hamster Fetuses G e s t a t i o n a l Number Number of Fetuses a t Each Stage of Age of P a l a t a l Development lys: hours) U t t e r s 1 2 3 4 5 6 9:06 5 51* 9:12 5 61* 9:18 5 47* 10:00 6 65 10:06 5 44 10:12 6 68 10:18 5 55 11:00 5 55 11:06 5 41 11:12 5 5/ 11:18 5 58 1 12:00 5 23 13 15 12:06 5 2 10 33 1 12:12 5 5 50 8 12:18 4 32 11 13:00 4 8 38 14:00 3 41 15:00 4 45 *Palatal primordia are absent - 32 - 1. The i n i t i a t i o n of the palatal primordia occur between days 9:18 and 10:00 of gestation (Stage 1). 2. The v e r t i c a l development of the p a l a t a l shelves (Stage 2) i s accomplished in a l l fetuses between days 10:06 and 12:00 of gestation. 3. In almost 95% of the fetuses Stages 3 (horizontal shelves), and Stage 4 (closure of the shelves in the middle th i r d of the secondary palate) are achieved between days 12:00 and 12:06 of gestation. 4. In 92% of the fetuses Stage 5 (closure of the shelves in the posterior t h i r d of the secondary palate) i s completed by day 12:12 of gestation. 5. In over 83% of fetuses Stage 6 (complete closure of the secondary palate) i s accomplished by day 13:00 of gestation. Morphogenesis of the Secondary Palate In 6MP Treated Hamster Fetuses The observations of 6MP treated fetal palatal development are summarized in Table IV. From the table, one may suggest that, l i k e the controls, the i n i t i a t i o n of the drug treated palatal primordia (Stage 1) occurs between days 9:18 and 10:00 of gestation (Figs. 13, 14). The palatal shelves are oriented v e r t i c a l l y on the sides of the tongue (Stage 2) between days 10:06 and 12:00 of gestation (Figs. 15, 16). Subsequently, however, approximately 98% of the drug treated fetuses remained in Stage 2 of palatal development. In these fetuses Stages 3-6 were never accomplished. At term, the palatal - 33 - Table IV. Staged Development of the Secondary Palate 1n 6-Mercaptopurine Treated Hamster Fetuses Gestational Number Number of Fetuses at Each Stage of Age of Palatal lys: hours) L i t t e r s 1 2 3 9:06 3 29* 9:12 3 24* 9:18 3 27* 10:00 5 49 10:06 3 30 10:12 3 32 10:18 3 30 11:00 4 36 11:06 5 56 11:12 3 31 11:18 3 26 12:00 4 34 12:06 4 39 4 12:12 5 41 12:18 5 45 6 13:00 6 48 3 14:00 4 36 15:00 4 35 *Palatal primordia are absent - 34 - s h e l v e s a r e r u d i m e n t a r y a n d o r i e n t e d v e r t i c a l l y on t h e s i d e s o f t h e t o n g u e ( F i g s . 1 7 , 1 8 ) . Morphogenesis of the Secondary Pa l a t e i n Control Hamster Fetuses i n R e l a t i o n t o F e t a l Weight T h e mean w e i g h t o f c o n t r o l f e t u s e s i n c r e a s e s g r a d u a l l y f r o m 1 1 . 7 mg t o 3 4 5 . 7 mg b e t w e e n d a y s 9 : 1 8 a n d 1 3 : 0 0 o f g e s t a t i o n ( T a b l e V ) . T h e r e a f t e r t h e f e t a l w e i g h t i n c r e a s e s r a p i d l y a n d a t day 1 5 : 0 0 o f g e s t a t i o n t h e mean f e t a l w e i g h t was 1 9 0 1 . 6 mg. S i n c e a t d i f f e r e n t t i m e s d u r i n g g e s t a t i o n t h e f e t u s e s v a r i e d i n t h e i r s t a g e o f p a l a t a l d e v e l o p m e n t ( T a b l e I I I ) , and i n w e i g h t ( T a b l e V ) , an a t t e m p t was made t o s e e i f t h e r e was a r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e f e t a l w e i g h t a n d t h e s t a g e o f p a l a t a l d e v e l o p m e n t . F e t u s e s w e r e g r o u p e d by w e i g h t a s shown i n T a b l e V I . The p a l a t e s w e r e e x a m i n e d f o r t h e i r m o r p h o l o g i c s t a g e o f d e v e l o p m e n t . The o b s e r v a t i o n s i n t h e c o n t r o l g r o u p r e v e a l e d : 1 . M o r p h o l o g i c S t a g e 2 i s a c h i e v e d i n a l l f e t u s e s w e i g h i n g 51 m g . 2 . S t a g e s 3 - 4 a r e c o m p l e t e d i n a l l f e t u s e s w e i g h i n g 2 5 1 - 3 0 0 mg. 3 . S t a g e 5 i s r e a c h e d i n 90% f e t u s e s w e i g h i n g 301 m g . 4 . In f e t u s e s w e i g h i n g 551 m g , m o r p h o l o g i c S t a g e 6 o f p a l a t a l d e v e l o p m e n t i s c o m p l e t e d . - 35 - Table V. The Mean Weights o f Control and 6-Mercaptopur1ne (6MP) Treated Hamster Fetuses a t D i f f e r e n t Times During G e s t a t i o n G e s t a t i o n a l Mean F e t a l Weight In M i l l i g r a m s +_ Standard D e v i a t i o n Age days:hours Control 6MP Treated 9:06 7.8 + 2.6 8.9 + 4.1 9:12 12.6 + 2.8 11.6 + 3.7 9:18 12.0 + 2.7 15.7 + 5.5 10:00 21.2 + 6.5 22.7 + 6.5 10:06 31.4 + 9.0 26.0 + 7.6 10:12 35.4 + 4.1 32.7 + 5.6 10:18 52.1 + 10.8 31.2 + 5.1 11:00 75.1 + 14.4 60.6 + 14.0 11:06 80.5 + 20.1 67.8 + 26.2 11:12 96.2 + 14.2 54.3 + 13.6 11:18 138.5 + 21.0 75.0 + 26.5 12:00 142.3 + 21.9 90.2 + 32.0 12:06 261.3 + 39.5 128.3 + 35.6 12:12 271.1 + 29.5 135.1 + 41.9 12:18 300.0 + 44.4 182.3 + 67.6 13:00 345.7 + 108.5 181.0 + 115.4 14:00 1061.4 + 320.3 583.8 + 210.7 15:00 1901.6 + 470.6 732.1 + 309.9 - 36 - Table VI. Staged Development of the Secondary P a l a t e 1n R e l a t i o n t o Control Hamster F e t a l Weight F e t a l Weight Number of Fetuses at Each Stage of P a l a t a l Development (mg) 1 2 3 4 5 6 1 - 50 2 2 4 * 101 51 - 100 161 101 - 150 8 5 1 151 - 2 0 0 46 19 3 2 201 - 2 5 0 10 4 30 17 1 251 - 3 0 0 12 3 3 2 301 - 3 5 0 3 21 6 351 - 4 0 0 9 18 4 0 1 - 4 5 0 5 14 451 - 5 0 0 3 13 501 - 5 5 0 1 4 551 - 2 7 5 0 85 * F o r 159 f e t u s e s t h e p a l a t a l p r i m o r d i a w e r e a b s e n t - 37 - M o r p h o g e n e s i s o f t h e Secondary P a l a t e i n 6HP T r e a t e d Hamster F e t u s e s i n R e l a t i o n t o F e t a l H e i g h t Following 6MP treatment, the mean fetal weight increased from 18.5 mg at day 9:18 to 181 mg at day 13:00 of gestation (Table V). On day 15:00 of gestation, the average fetal weight was 732.1 mg. S t a t i s t i c a l evaluation of the data from Table V indicate that there was no difference in the mean fetal weight between control and 6MP treated fetuses from day 9:06 to 10:00 of gestation, i . e . , during the period of i n i t i a l shelf development. In the ensuing 12 hours the mean weight of 6MP treated fetuses was lower than that of the controls. Subsequently on day 10:18 of gestation, however, a pronounced difference in the mean fetal weight was observed between the control and treated groups, and i t persisted u n t i l day 15:00 (PO.001). In Table VII the data on staged palatal development following 6MP treatment are arranged in relation to the fetal weight. One may infer that, as in the controls, the morphologic Stage 2 of palate development i s reached in 6MP treated fetuses weighing 51 mg. Thereafter, even though the fetal weight continues to increase, the palatal shelves remained v e r t i c a l . M o r p h o g e n e s i s of t h e Secondary P a l a t e i n C o n t r o l Hamster F e t u s e s i n R e l a t i o n t o F e t a l Crown-Rump L e n g t h (CRL) During normal development, the mean fetal CRL increases progressively from 5.1 mm to 14.1 mm between days 9:18 and 13:00 of gestation (Table VIII). Subsequent increase in the fetal CRL i s rapid and at day 15:00 of gestation i t was 26.8 mm. - 38 - T a b l e V I I . Staged Development o f the Secondary P a l a t e 1n R e l a t i o n to 6-Mercaptopur1ne Treated Hamster F e t a l Weight F e t a l Weight Number o f Fetuses at Each Stage of P a l a t a l Development 4 5 6 (mg) 1 2 3 1 - 50 129* 142 51 - 100 146 101 - 150 • 86 151 - 200 43 3 201 - 250 25 1 251 - 300 10 4 301 - 350 5 * 2 351 - 400 3 1 401 - 450 9 1 451 - 500 5 1 501 - 550 3 551 -2750 42 *For 80 fetuses the palatal primordia were absent - 39 - Table V I I I . The Mean Crown-Rump Length (CRL) of Co n t r o l and 6-Mercaptopurine ( 6 M P ) T r e a t e d Fetuses a t D i f f e r e n t Times During G e s t a t i o n G e s t a t i o n a l Mean CRL In M i l l i m e t e r s + Standard D e v i a t i o n Age days:hours Control 6 M P Treated 9 : 0 6 4 . 1 + 0 . 6 4 . 0 + 0 . 6 9 : 1 2 5 . 2 + 0 . 4 4 . 9 + 0 . 6 9 : 1 8 5 . 1 + 0 . 4 5 . 5 + 0 . 7 1 0 : 0 0 5 . 7 + 0 . 6 6 . 0 + 0 . 6 1 0 : 0 6 7 . 3 + 0 . 4 6 . 7 + 0 . 5 1 0 : 1 2 7 . 1 + 0 . 8 7 . 2 + 0 . 3 1 0 : 1 8 7 . 9 + 0 . 5 6 . 8 + 0 . 3 1 1 : 0 0 8 . 5 + 0 . 6 8 . 1 + 0 . 7 1 1 : 0 6 9 . 6 + 0 . 7 8 . 1 + 0 . 9 1 1 : 1 2 9 . 2 + 0 . 4 8 . 0 + 0 . 6 1 1 : 1 8 1 0 . 6 + 0 . 6 8 . 8 + 1 . 0 1 2 : 0 0 1 0 . 7 + 0 . 7 9 . 5 + 0 . 8 1 2 : 0 6 1 2 . 4 + 0 . 6 1 0 . 6 + 1 . 1 1 2 : 1 2 1 2 . 7 + 0 . 6 1 0 . 7 + 0 . 9 1 2 : 1 8 1 3 . 6 + 0 . 8 1 1 . 5 + 1 . 4 1 3 : 0 0 1 4 . 1 + 1 . 7 1 1 . 5 + 2 . 5 1 4 : 0 0 2 1 . 5 + 1 . 8 1 6 . 5 + 2 . 5 1 5 : 0 0 2 6 . 8 + 2 . 2 1 9 . 3 + 3 . 0 - 40 - T a b l e IX shows g r o u p i n g o f f e t u s e s by C R L . The p a l a t e s w e r e e x a m i n e d f o r m o r p h o l o g i c s t a g e o f d e v e l o p m e n t . One may d e d u c e f r o m t h e t a b l e t h a t : 1 . S t a g e 2 o f p a l a t e d e v e l o p m e n t i s r e a c h e d i n a l l f e t u s e s m e a s u r i n g 7 mm C R L , a n d i s c o m p l e t e d i n a l l f e t u s e s m e a s u r i n g 12 mm C R L . 2 . S t a g e s 3 - 4 a r e a c c o m p l i s h e d i n a l l f e t u s e s m e a s u r i n g 13 mm C R L . 3 . S t a g e 5 i s a c h i e v e d i n a l l f e t u s e s m e a s u r i n g 15 mm, a n d s t a g e 6 by 16 mm C R L . M o r p h o g e n e s i s o f t h e S e c o n d a r y P a l a t e i n 6MP T r e a t e d H a m s t e r F e t u s e s 1n R e l a t i o n t o F e t a l C r o w n - R u m p L e n g t h The mean f e t a l CRL i n c r e a s e d f r o m 5 . 8 mm t o 1 1 . 5 mm b e t w e e n d a y s 9 : 1 8 a n d 1 3 : 0 0 o f g e s t a t i o n ( T a b l e V I I I ) . S u b s e q u e n t l y on day 1 5 : 0 0 t h e a v e r a g e f e t a l CRL was 1 9 . 3 mm. S t a t i s t i c a l a n a l y s e s o f t h e d a t a f r o m T a b l e V I I I i n d i c a t e t h a t t h e mean f e t a l CRL o f b o t h t h e t r e a t e d a n d c o n t r o l g r o u p s w e r e s i m i l a r b e t w e e n d a y s 9 : 0 6 and 1 1 : 0 0 o f g e s t a t i o n . D u r i n g n e x t 48 h o u r s , i . e . , u n t i l day 1 3 : 0 0 of g e s t a t i o n , t h e mean CRL i n t h e t r e a t e d g r o u p r e m a i n e d l o w e r t h a n t h a t i n t h e c o n t r o l s . T h e r e a f t e r , a p r o n o u n c e d d i f f e r e n c e i n t h e mean f e t a l CRL was o b s e r v e d b e t w e e n t h e c o n t r o l a n d t r e a t e d g r o u p s w h i c h p e r s i s t e d on day 1 5 : 0 0 o f g e s t a t i o n ( P < 0 . 0 0 1 ) . In T a b l e X t h e d a t a on s t a g e d p a l a t a l d e v e l o p m e n t a r e a r r a n g e d i n r e l a t i o n t o t h e 6MP t r e a t e d mean f e t a l C R L . The o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t , a s i n t h e c o n t r o l s , S t a g e 2 o f p a l a t e d e v e l o p m e n t i s r e a c h e d i n a l l f e t u s e s m e a s u r i n g 7 mm C R L . T h e r e a f t e r , e v e n t h o u g h t h e f e t a l CRL c o n t i n u e d t o i n c r e a s e , t h e p a l a t a l s h e l v e s r e m a i n e d v e r t i c a l . - 41 - Table IX. Staged Development of the Secondary P a l a t e 1n R e l a t i o n t o Control F e t a l Hamster Crown-Rump Length (CRL) CRL Number of Fetuses at Each Stage of P a l a t a l Development (mm) 1 2 3 4 5 6 0 - 1.9 2.0 - 2.9 2* 3.0 - 3.9 6* 4.0 - 4.9 6 5 * 5.0 - 5.9 1 0 5 * * 6.0 - 6.9 46 31 7.0 - 7.9 89 8.0 - 8.9 83 9.0 - 9.9 69 10.0 - 10.9 71 1 11.0 - 11.9 •48 20 16 4 12.0 - 12.9 12 3 23 26 3 13.0 - 13.9 9 31 3 14.0 - 14.9 5 23 17 15.0 - 15.9 7 19 16.0 - 16.9 15 17.0 - 30.0 86 * P a l a t a l p r i m o r d i a a r e a b s e n t * * F o r 86 f e t u s e s t h e p a l a t a l p r i m o r d i a a r e a b s e n t - 42 - Table X. Staged Development of the Secondary Palate 1n Relation to 6-Mercaptopurine Treated Fetal Hamster Crown-Rump Length (CRL) CRL Number of Fetuses at Each Stage of Palatal Development (mm) 1 2 3 4 5 6 0 - 1.9 2.0 - 2.9 3.0 - 3.9 8* 4.0 - 4.9 3 7 * 5.0 - 5.9 4 1 * * 6.0 - 6.9 43 49 7.0 - 7.9 102 8.0 - 8.9 81 9.0 - 9.9 62 10.0 - 10.9 73 11.0 - 1 1 . 9 46 2 12.0 - 12.9 24 2 13.0 - 13.9 11 3 14.0 - 14.9 7 4 15.0 - 15.9 16 16.0 - 16.9 6 2 17.0 30.0 42 * P a l a t a l p r i m o r d i a a r e a b s e n t * * F o r 3 5 f e t u s e s t h e p a l a t a l p r i m o r d i a a r e a b s e n t - 43 - L i g h t M i c r o s c o p i c Observations of the Developing Secondary P a l a t e In Control Hamster Fetuses On day 9 : 0 6 o f g e s t a t i o n t h e p a l a t a l p r i m o r d i a a r e n o t f o r m e d . The r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y i s f l a t a n d made o f l o o s e mesenchyme c o v e r e d by a s i n g l e l a y e r o f e p i t h e l i a l c e l l s ( F i g . 1 9 ) . The e p i t h e l i a l c e l l s a r e c u b o i d a l , a n d c o n t a i n a l a r g e s p h e r i c a l n u c l e u s s u r r o u n d e d by a t h i n r i m o f c y t o p l a s m . The m e s e n c h y m a l c e l l s a r e s t e l l a t e a n d c o n t a i n a l a r g e n u c l e u s . M i t o s i s i s o c c a s i o n a l l y o b s e r v e d i n c e l l s o f b o t h t h e e p i t h e l i u m and m e s e n c h y m e . D u r i n g n e x t 18 h o u r s , i . e . , u n t i l day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n , t h e m o r p h o l o g y o f b o t h t h e e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c e l l s r e m a i n s u n c h a n g e d . H i s t o l o g i c a l l y , f r o m day 1 0 : 0 0 o n w a r d , h o w e v e r , t h e n o r m a l p a l a t a l d e v e l o p m e n t c a n be o b s e r v e d i n f i v e s t a g e s . Stage I . The p a l a t a l p r i m o r d i a a p p e a r f r o m t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y . A p a l a t a l p r i m o r d i u m i s c o m p o s e d o f m e s e n c h y m a l t i s s u e c o v e r e d by a b i l a m i n a r e p i t h e l i u m ( F i g . 2 0 ) . The m e s e n c h y m a l c e l l s a r e s t e l l a t e and c l o s e l y p a c k e d . The s u p e r f i c i a l e p i t h e l i a l c e l l s a r e f l a t a n d c o n t a i n an e l o n g a t e d n u c l e u s . The b a s a l e p i t h e l i a l c e l l s a r e c u b o i d a l a n d c o n t a i n a l a r g e s p h e r i c a l n u c l e u s . Stage I I . The e p i t h e l i u m on t h e m e d i a l a s p e c t o f t h e v e r t i c a l p a l a t a l s h e l f , t h e p r o s p e c t i v e f u s i o n e p i t h e l i u m ( S h a h , 1 9 7 9 a ) , i s t w o t o t h r e e c e l l l a y e r s t h i c k ( F i g . 2 1 ) . The a p p e a r a n c e o f b o t h t h e e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c e l l s , h o w e v e r , r e m a i n e d u n a l t e r e d . Few c e l l s u n d e r g o i n g m i t o s i s a r e o b s e r v e d i n t h e e p i t h e l i u m and m e s e n c h y m e . In t h e e p i t h e l i a l c e l l s , m i t o s i s i s s e e n o n l y i n t h e b a s a l l a y e r .  - 45 - F1g. 19 F r o n t a l s e c t i o n through the secondary p a l a t e r e g i o n of a c o n t r o l hamster on day 9 : 0 6 of g e s t a t i o n . The r o o f (R) o f the o r o n a s a l c a v i t y i s c o v e r e d by a s i n g l e l a y e r o f c u b o i d a l e p i t h e l i a l (E) c e l l s . The mesenchymal c e l l s a r e s t e l l a t e . E p o n - a r a l d i t e s e c t i o n . M e t h y l e n e b l u e s t a i n . 920X. F i g . 20 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h the secondary p a l a t e r e g i o n o f a c o n t r o l hamster f e t u s on day 10:00 of g e s t a t i o n showing the b i l a m i n a r e p i t h e l i u m o f the p a l a t a l p r i m o r d i a ( S t a g e I ) . The b i l a m i n a r e p i t h e l i u m i s made o f f l a t s u p e r f i c i a l (S) and c u b o i d a l b a s a l (B) c e l l s . The mesenchymal c e l l s a r e s t e l l a t e . E p o n - a r a l d i t e s e c t i o n . M e t h y l e n e b l u e s t a i n . 980X. F1g. 21 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h the secondary p a l a t e o f a c o n t r o l hamster f e t u s on day 11:18 o f g e s t a t i o n showing the two t o t h r e e c e l l l a y e r e d e p i t h e l i u m (arrow) o f the m e d i a l a s p e c t o f the v e r t i c a l p a l a t a l (P) s h e l f ( S t a g e I I ) . 1 - t o n g u e . E p o n - a r a l d i t e s e c t i o n . M e t h y l e n e b l u e s t a i n . 360X. F1g. 22 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h the secondary p a l a t e o f a c o n t r o l hamster f e t u s on day 12:00 of g e s t a t i o n . The m e d i a l edge e p i t h e l i u m (arrow heads) o f the h o r i z o n t a l p a l a t a l s h e l v e s (P) i s b i l a m i n a r ( S t a g e I I I ) . The m e s e n c h y m a l c e l l s a r e s t e l l a t e o r e l o n g a t e d . E p o n - a r a l d i t e s e c t i o n . Methylene b l u e s t a i n . 410X. F1g. 23 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h the secondary p a l a t e of a c o n t r o l hamster f e t u s on day 12:00 of g e s t a t i o n . The m e d i a l edge e p i t h e l i a o f t h e o p p o s i n g h o r i z o n t a l p a l a t a l s h e l v e s (P) have c o n t a c t e d to form a seam (arrow) (Stage I V ) . P a r a f f i n s e c t i o n . H e m a t o x y l i n and E o s i n s t a i n . 410X. F1g. 24 F r o n t a l s e c t i o n t h r o u g h the secondary p a l a t e o f a c o n t r o l hamster f e t u s on day 12:06 of g e s t a t i o n showing a f r a g m e n t i n g (arrows) ( S t a g e V) e p i t h e l i a l seam. E p o n - a r a l d i t e s e c t i o n . M e t h y l e n e b l u e s t a i n . 504X. - 46 - S t a g e I I I . The p a l a t a l s h e l v e s a r e h o r i z o n t a l a b o v e t h e t o n g u e ( F i g . 2 2 ) . The p r o s p e c t i v e f u s i o n e p i t h e l i u m on t h e m e d i a l e d g e (MEE) o f t h e h o r i z o n t a l s h e l f shows no h i s t o l o g i c a l c h a n g e f r o m t h e p r e v i o u s s t a g e . The m e s e n c h y m a l c e l l s a r e s t e l l a t e o r e l o n g a t e d i n s h a p e ( F i g . 2 2 ) . M i t o s i s i s a b s e n t i n t h e MEE, b u t i s o c c a s i o n a l l y s e e n i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l s . S t a g e I V . The MEE o f t h e o p p o s i n g h o r i z o n t a l s h e l v e s a r e i n c o n t a c t w i t h one a n o t h e r . The e p i t h e l i a l c o n t a c t r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f a seam ( F i g . 2 3 ) . The seam i s two t o t h r e e c e l l l a y e r s t h i c k . The c e l l s a r e i r r e g u l a r i n s h a p e a n d c o n t a i n an o v a l n u c l e u s . The m e s e n c h y m a l c e l l s d i d n o t show any a l t e r a t i o n i n t h e i r m o r p h o l o g y . S t a g e V . The e p i t h e l i a l seam i s b r o k e n i n t o f r a g m e n t s ( F i g . 2 4 ) . The s p a c e b e t w e e n t h e f r a g m e n t s i s o c c u p i e d by m e s e n c h y m a l c e l l s . The e p i t h e l i a l f r a g m e n t s e v e n t u a l l y d i s a p p e a r , a n d mesenchyme o f t h e t w o p a l a t a l s h e l v e s b e c o m e s c o n t i n u o u s ( F i g . 2 5 ) . L i g h t M i c r o s c o p i c O b s e r v a t i o n s o f t h e D e v e l o p i n g S e c o n d a r y P a l a t e I n H a m s t e r F e t u s e s F o l l o w i n g 6MP T r e a t m e n t D u r i n g f i r s t 18 h o u r s , i . e . , b e t w e e n d a y s 9 : 0 6 a n d 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n , t h e h i s t o l o g i c a l a p p e a r a n c e o f b o t h t h e e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c e l l s i n t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y o f 6MP t r e a t e d f e t u s e s i s s i m i l a r t o t h a t o f t h e c o n t r o l s . S t a g e I . The p a l a t a l p r i m o r d i a d e v e l o p f r o m t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n . D u r i n g t h e f i r s t s i x h o u r s o f p r i m o r d i a l d e v e l o p m e n t t h e h i s t o l o g i c a l a p p e a r a n c e o f t h e b i l a m i n a r e p i t h e l i a l c e l l s r e s e m b l e s t h a t o f t h e c o n t r o l s . An o c c a s i o n a l m e s e n c h y m a l c e l l shows a s m a l l  - 48 - F i g . 2 5 F r o n t a l s e c t i o n through the secondary p a l a t e o f a c o n t r o l hamster f e t u s on day 12:12 of g e s t a t i o n showing mesenchymal c o n t i n u i t y between o p p o s i n g p a l a t a l s h e l v e s ( P ) . 0 - o r a l e p i t h e l i u m . N - n a s a l e p i t h e l i u m . P a r a f f i n s e c t i o n . H e m a t o x y l i n and E o s i n s t a i n . 410X. F 1 g . 26 F r o n t a l s e c t i o n through the secondary p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d hamster f e t u s on day 10:00 of g e s t a t i o n showing the p r i m o r d i a l e p i t h e l i u m (Stage I ) . The e p i t h e l i u m i s b i l a m i n a r w i t h f l a t s u p e r f i c i a l (S ) c e l l s and c u b o i d a l b a s a l (B) c e l l s . An o c c a s i o n a l mesenchymal c e l l shows a s m a l l d a r k l y s t a i n e d dense body (arrow h e a d s ) . E p o n - a r a l d i t e s e c t i o n . M e t h y l e n e b l u e s t a i n . 980X. F i g . 27 F r o n t a l s e c t i o n through the secondary p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d hamster f e t u s on day 10:06 of g e s t a t i o n . The h i s t o l o g i c a l appearance o f the e p i t h e l i a l and mesenchymal c e l l s of the v e r t i c a l l y d e v e l o p i n g s h e l f (Stage I I ) . Dense b o d i e s are p r e s e n t i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l s ( a r r o w h e a d s ) , e p i t h e l i a l c e l l s ( a r r o w s ) and i n the c e l l fragments ( f ) . E p o n - a r a l d i t e s e c t i o n . M e t h y l e n e b l u e s t a i n . 980X. F i g . 28 F r o n t a l s e c t i o n through the secondary p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d hamster f e t u s on day 11:00 of g e s t a t i o n . The dense b o d i e s are a b s e n t i n the mesenchymal and e p i t h e l i a l c e l l s o f the v e r t i c a l p a l a t a l s h e l f (Stage I I ) . E p o n - a r a l d i t e s e c t i o n . M e t h y l e n e b l u e s t a i n . 510X. F i g . 2 9 F r o n t a l s e c t i o n through the secondary p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d hamster f e t u s on day 12:18 of g e s t a t i o n . The b a s a l e p i t h e l i a l c e l l s a r e l i g h t i n appearance (arrow h e a d ) . E p o n - a r a l d i t e s e c t i o n . M e t h y l e n e b l u e s t a i n . 280X. F 1 g . 3 0 F r o n t a l s e c t i o n through the secondary p a l a t e o f a 6MP t r e a t e d hamster f e t u s on day 15:00 of g e s t a t i o n . The e p i t h e l i u m o f the s t u n t e d p a l a t a l s h e l f i s s t r a t i f i e d squamous (arrow h e a d ) . Bone f o r m a t i o n (B) i s o b s e r v e d i n the mesenchyme. P a r a f f i n s e c t i o n . H e m a t o x y l i n and E o s i n s t a i n . 2U8X. - 49 - darkly stained dense body in i t s cytoplasm {Fig. 26). Such c e l l s with dense bodies are not present at the corresponding stage during normal development. S t a g e I I . In the next 12 hours, i . e . , between days 10:00 and 10:12 of gestation, the hi s t o l o g i c a l appearance of both the mesenchyme and e p i t h e l i a l c e l l s changes, and on day 10:12 of gestation they are s t r i k i n g l y different from that of the controls. The dense bodies are present in many mesenchymal c e l l s (Fig. 27) of the treated palatal shelf. Also small fragments of c e l l s containing dense bodies are present in the e x t r a c e l l u l a r matrix of the mesenchyme. A few e p i t h e l i a l c e l l s , in addition, show dense bodies in their cytoplasm (Fig. 27). Subsequently, during next the 12 hours, only a few e p i t h e l i a l and mesenchymal c e l l s show dense bodies. On day 11:00 of gestation none of the e p i t h e l i a l and mesenchymal c e l l s show dense bodies (Fig. 28). Hi s t o l o g i c a l l y both the e p i t h e l i a l and mesenchymal c e l l s of the treated v e r t i c a l palatal shelf resemble those of the controls. Between days 11:00 and 12:18 of gestation the e p i t h e l i a l and mesenchymal c e l l s of 6MP treated palatal shelves appear unaltered. Unlike those of the controls, some basal c e l l s in the epithelium, on day 12:18 of gestation, are r e l a t i v e l y l i g h t in appearance (Fig. 29). The mesenchymal c e l l s , however, appear unchanged. The treated ve r t i c a l palatal shelves appear smaller than those of the controls (cf. Figs. 6, 16). The l i g h t c e l l s persist in the epithelium during the ensuing 24 hours, i . e . , u n t i l day 13:18 of gestation. On day 14:00 of gestation, and thereafter, the l i g h t c e l l s are absent. The epithelium on the stunted - 50 - v e r t i c a l s h e l f u n d e r g o e s s t r a t i f i c a t i o n . On day 1 5 : 0 0 o f g e s t a t i o n , t h e e p i t h e l i u m i s s t r a t i f i e d squamous ( F i g . 3 0 ) . The mesenchyme shows e v i d e n c e o f b o n e f o r m a t i o n ( F i g s . 1 8 , 3 0 ) . S t a g e s I I I - I V . H i s t o l o g i c S t a g e s I I I ( h o r i z o n t a l s h e l v e s ) , IV ( f o r m a t i o n o f an e p i t h e l i a l s e a m ) , a n d V ( f r a g m e n t a t i o n o f e p i t h e l i a l seam) o f t h e n o r m a l p a l a t a l d e v e l o p m e n t a r e n o t s e e n i n t h e 6MP t r e a t e d f e t u s e s a t a n y t i m e d u r i n g g e s t a t i o n . The p a l a t a l s h e l v e s i n s t e a d r e m a i n v e r t i c a l and a p p e a r s t u n t e d a t t e r m ( F i g . 1 8 ) . E l e c t r o n M i c r o s c o p i c O b s e r v a t i o n s o f t h e D e v e l o p i n g S e c o n d a r y P a l a t e i n C o n t r o l H a m s t e r F e t u s e s P r i o r t o t h e a p p e a r a n c e o f p a l a t a l p r i m o r d i a , t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y i s l i n e d by s i m p l e c u b o i d a l e p i t h e l i u m . The e p i t h e l i u m i s s e p a r a t e d f r o m t h e u n d e r l y i n g mesenchyme by a c o n t i n u o u s b a s a l l a m i n a ( F i g . 3 1 ) . S p a c e s a r e p r e s e n t b e t w e e n t h e e p i t h e l i a l c e l l s w h i c h a r e o t h e r w i s e a t t a c h e d t o one a n o t h e r by d e s m o s o m e s . The e p i t h e l i a l c e l l s ( F i g . 3 1 ) c o n t a i n a l a r g e n u c l e u s s u r r o u n d e d by p o l y r i b o s o m e s , a few m i t o c h o n d r i a , a n d o c c a s i o n a l c i s t e r n a e o f r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . The m e s e n c h y m a l c e l l s ( F i g . 3 1 ) c o n t a i n a r o u n d t o o v a l n u c l e u s s u r r o u n d e d by o r g a n e l l e s s i m i l a r t o t h e e p i t h e l i a l c e l l s . W i t h t h e a p p e a r a n c e o f p a l a t a l p r i m o r d i a h i s t o l o g i c a l S t a g e s I t h r o u g h V o f p a l a t o g e n e s i s w e r e s t u d i e d a t t h e u l t r a s t r u c t u r a l l e v e l .  - 52 - F i g . 31 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 9 : 1 2 o f g e s t a t i o n . T h e e p i t h e l i u m i s s e p a r a t e d f r o m t h e mesenchyme by a c o n t i n u o u s b a s a l l a m i n a ( B L ) . T h e m e s e n c h y m a l c e l l (NIC) c o n t a i n s a r o u n d t o o v a l n u c l e u s s u r r o u n d e d by o r g a n e l l e s s i m i l a r t o t h e e p i t h e l i a l c e l l s . ICS - i n t e r c e l l u l a r s p a c e . N - n u c l e u s . M - m i t o c h o n d r i o n . D - d e s m o s o m e . RER - r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . 8 6 6 4 X . F 1 g . 32 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e p r i m o r d i a i n a c o n t r o l h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n s h o w i n g a c o n t i n u o u s b a s a l l a m i n a ( B L ) s e p a r a t i n g t h e b i l a m i n a r e p i t h e l i u m f r o m t h e m e s e n c h y m e . A s m a l l g o l g i c o m p l e x (GC) a p p e a r s i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l . B - b a s a l c e l l . S - s u p e r f i c i a l c e l l . Nl - m i t o c h o n d r i o n . I C S - i n t e r c e l l u l a r s p a c e . N - n u c l e u s . RER - r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . D - desmosome. 10180X. - 53 - S t a g e I. The p a l a t a l p r i m o r d i u m i s c o v e r e d by a b i l a m i n a r e p i t h e l i u m ( F i g . 3 2 ) . The b a s a l c e l l s a r e c u b o i d a l a n d t h e s u p e r f i c i a l c e l l s f l a t . B o t h c e l l t y p e s c o n t a i n a l a r g e n u c l e u s s u r r o u n d e d by p o l y r i b o s o m e s , m i t o c h o n d r i a , c i s t e r n a e o f r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m a n d a s m a l l G o l g i c o m p l e x . Numerous l a r g e s p a c e s a r e p r e s e n t b e t w e e n c e l l s o f t h e e p i t h e l i u m . B o t h t h e s u p e r f i c i a l a n d b a s a l c e l l s a r e a t t a c h e d t o one a n o t h e r by d e s m o s o m e s . The b a s a l l a m i n a s e p a r a t i n g t h e e p i t h e l i u m f r o m t h e mesenchyme i s c o n t i n u o u s . The m e s e n c h y m a l c e l l s o f t h e v e r t i c a l l y d e v e l o p i n g p a l a t a l p r i m o r d i a ( F i g . 3 2 ) c o n t a i n more o r g a n e l l e s t h a n t h o s e o b s e r v e d i n t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y . I n a d d i t i o n , a s m a l l G o l g i c o m p l e x a p p e a r s i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l s o f t h e v e r t i c a l l y d e v e l o p i n g p a l a t a l p r i m o r d i a ( F i g . 3 2 ) . S t a g e I I . The m o r p h o l o g y a n d c o n t e n t s o f b o t h t h e e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c e l l s s e e n d u r i n g S t a g e I r e m a i n u n c h a n g e d i n t h e v e r t i c a l p a l a t a l s h e l f . S t a g e I I I . The e p i t h e l i u m o f t h e h o r i z o n t a l p a l a t a l s h e l f i s s e p a r a t e d f r o m t h e mesenchyme by a c o n t i n u o u s b a s a l l a m i n a ( F i g s . 3 3 , 3 4 ) . In c o m p a r i s o n t o l a r g e i n t e r c e l l u l a r s p a c e s s e e n a t S t a g e s I a n d I I , t h e i n t e r c e l l u l a r s p a c e s i n t h e e p i t h e l i u m o f t h e h o r i z o n t a l p a l a t a l s h e l f a r e s m a l l e r . The c y t o p l a s m o f t h e e p i t h e l i a l c e l l s show m e m b r a n e - b o u n d a n d m e m b r a n e - f r e e a r e a s c o n t a i n i n g a g g r e g a t i o n s o f e l e c t r o n d e n s e g r a n u l e s , a n d d e n s e b o d i e s ( F i g s . 3 3 , 3 4 ) . On a m o r p h o l o g i c a l b a s i s , t h e s e a r e a s a r e i n t e r p r e t e d a s l y s o s o m e s ( D e D u v e , 1 9 6 3 ; E r i c k s o n , 1 9 6 9 ) . O t h e r c y t o p l a s m i c c o n t e n t s o f t h e e p i t h e l i a l c e l l s r e m a i n u n c h a n g e d f r o m S t a g e I I .  - 55 - F i g . 33 Electron micrograph of the secondary palate in a control hamster fetus on day 12:06 of gestation showing the epithelium of the horizontal palatal shelf, lysosomes (L) are present in both the su p e r f i c i a l and basal e p i t h e l i a l c e l l s . BL - basal lamina. N - nucleus. 6412X. F1g. 34 Electron micrograph of the secondary palate in a control hamster fetus on day 12:06 of gestation showing the mesenchymal c e l l s of the horizontal palatal shelf. H - nucleus. M - mitochondrion. BL - basal lamina, L - lysosome. 8000X. - 56 - W i t h t h e e x c e p t i o n o f l y s o s o m e s , t h e m e s e n c h y m a l c e l l s c o n t a i n o r g a n e l l e s ( F i g . 3 4 ) s i m i l a r t o t h o s e o f t h e e p i t h e l i a l c e l l s . S t a g e I V . D u r i n g t h i s s t a g e t h e e p i t h e l i a o f t h e o p p o s i n g s h e l v e s come i n t o c o n t a c t w i t h one a n o t h e r t h u s f o r m i n g a seam ( F i g s . 2 3 , 2 4 ) . The e p i t h e l i a l seam i s t w o t o f o u r l a y e r s i n w i d t h ( F i g . 3 5 ) . The c e l l s i n t h e seam a r e a t t a c h e d t o one a n o t h e r by d e s m o s o m e s . A c o n t i n u o u s b a s a l l a m i n a s e p a r a t e s t h e e p i t h e l i a l seam f r o m t h e s u r r o u n d i n g m e s e n c h y m e . The c e l l s o f t h e e p i t h e l i a l seam show c o n s i d e r a b l e v a r i a t i o n i n s i z e , s h a p e and c o n t e n t s ( F i g . 3 5 ) . They a r e c u b o i d a l t o i r r e g u l a r i n s h a p e and c o n t a i n an o v a l o r i r r e g u l a r n u c l e u s s u r r o u n d e d by n u m e r o u s p o l y r i b o s o m e s , G o l g i c o m p l e x , a n d a few c i s t e r n a e o f r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . The m i t o c h o n d r i a show d i s r u p t i o n i n t h e i r c r i s t a e . L y s o s o m e s a r e more n u m e r o u s t h a n t h o s e o b s e r v e d a t S t a g e I I I . The m e s e n c h y m a l c e l l s a r e s t e l l a t e and r e s e m b l e t h o s e o f S t a g e I I I . S t a g e V. In c o n t r a s t t o p r e v i o u s s t a g e s , t h e b a s a l l a m i n a s e p a r a t i n g t h e f r a g m e n t s o f e p i t h e l i a l seam f r o m mesenchyme i s n o t c o n t i n u o u s ( F i g . 3 6 ) . The c e l l s o f f r a g m e n t e d seam c o n t a i n l a r g e l y s o s o m e s w h i c h a p p e a r t o d i s s o l v e t h e c y t o p l a s m i c c o n t e n t . The m e s e n c h y m a l c e l l s , n e a r t h e e p i t h e l i a l f r a g m e n t s , c o n t a i n a few v a c u o l e s a n d l y s o s o m e s ( F i g . 3 6 ) . T h e s e c e l l s a r e i n t e r p r e t e d a s m a c r o p h a g e s . T h e y a p p e a r t o c a r r y away t h e d e b r i s o f a u t o l y s e d e p i t h e l i a l c e l l s , t h u s c l e a r i n g t h e a r e a f o r m e s e n c h y m a l u n i o n .  - 58 - F1g. 35 Electron micrograph of the secondary palate in a control hamster fetus on day 12:06 of gestation showing the epithelial seam. The cells of the seam are attached to one another by desmosomes (D). A basal lamina (BL) separates the epithelial cells from the surrounding mesenchyme on both sides of the seam. N - nucleus. L - lysosomes. 8330X. F i g . 36 Electron micrograph of the secondary palate in a control hamster fetus on day 12:06 of gestation showing a fragment of an epithelial seam (e) and a macrophage (m). A discontinuous basal lamina (BL) surrounds the cells of the epithelial fragment. Lysosomes (L) are present in both the epithelial cells and the macrophage. 6125X. - 59 - E l e c t r o n M i c r o s c o p i c O b s e r v a t i o n s o f t h e D e v e l o p i n g S e c o n d a r y P a l a t e F o l l o w i n g 6MP T r e a t m e n t D u r i n g f i r s t 18 h o u r s f o l l o w i n g d r u g a d m i n i s t r a t i o n , i . e . , u n t i l day 9 : 1 8 o f g e s t a t i o n , t h e m o r p h o l o g y a n d c o n t e n t s o f b o t h t h e e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c e l l s o f t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y ( F i g . 3 7 ) r e s e m b l e t h o s e o f t h e c o n t r o l s . The e p i t h e l i u m i s s i m p l e and made o f c u b o i d a l c e l l s w h i c h a r e s e p a r a t e d f r o m t h e s u b j a c e n t s t e l l a t e m e s e n c h y m a l c e l l s by a c o n t i n o u s b a s a l l a m i n a ( F i g . 3 7 ) . The c y t o p l a s m o f b o t h t h e e p i t h e l i a l and m e s e n c h y m a l c e l l s c o n t a i n s a n u c l e u s s u r r o u n d e d by p o l y r i b o s o m e s , m i t o c h o n d r i a , a n d r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . S u b s e q u e n t l y , h i s t o l o g i c a l S t a g e s I a n d I I o f p a l a t a l d e v e l o p m e n t f o l l o w i n g 6MP t r e a t m e n t w e r e e x a m i n e d a t t h e u l t r a s t r u c t u r a l l e v e l . S t a g e I . On day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n , t h e u l t r a s t r u c t u r a l a p p e a r a n c e o f t h e e p i t h e l i a l c e l l s o f t h e 6MP t r e a t e d p a l a t a l p r i m o r d i a r e m a i n s i d e n t i c a l t o t h a t o f t h e c o n t r o l . The b a s a l l a m i n a s e p a r a t i n g t h e e p i t h e l i u m a n d mesenchyme i s c o n t i n u o u s ( F i g . 3 8 ) . A l t e r a t i o n s a r e , h o w e v e r , s e e n i n t h e mesenchyme o f t h e 6MP t r e a t e d , p a l a t a l p r i m o r d i a . Some o f t h e m e s e n c h y m a l c e l l s ( F i g . 3 8 ) a p p e a r i r r e g u l a r , a n d c o n t a i n an o v a l n u c l e u s s u r r o u n d e d by p o l y r i b o s o m e s , few m i t o c h o n d r i a , a n d an o c c a s i o n a l d e n s e b o d y . The p e r i n u c l e a r s p a c e o f t h e n u c l e a r e n v e l o p e i s s w o l l e n , a n d t h e n u c l e o p l a s m a p p e a r s c l e a r due t o c l u m p i n g o f c h r o m a t i n ( F i g . 3 8 ) . O t h e r m e s e n c h y m a l c e l l s ( F i g . 3 9 ) a r e s t e l l a t e . They c o n t a i n an o v a l o r i n d e n t e d n u c l e u s s u r r o u n d e d by p o l y r i b o s o m e s , m i t o c h o n d r i a , a f e w c i s t e r n a e o f r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m , a n d a w e l l d e v e l o p e d G o l g i c o m p l e x . An  - 61 - F i g . 37 Electron micrograph of the secondary palate in a 6MP treated hamster fetus on day 9:06 of gestation. The epithelium i s separated from the mesenchyme by a continuous basal lamina (BL). N - nucleus. M - mitochondrion. RER - rough endoplasmic reticulum. 5897X. F1g. 38 Electron micrograph of the secondary palate in a 6MP treated hamster fetus on day 10:00 of gestation. The basal lamina (BL) separating the epithelium and mesenchyme i s continuous. The perinuclear space of the mesenchymal c e l l nuclear envelope i s swollen (arrow heads), and the nucleoplasm appears clear due to clumping of chromatin. N - nucleus. M - mitochondrion. db - dense body. E - epithelium. 5783X. - 62 - - 63 - F i g . 3 9 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n . The m e s e n c h y m a l c e l l s show a n u c l e u s (N) s u r r o u n d e d by p o l y r i b o s o m e s , m i t o c h o n d r i a ( M ) , a f e w c i s t e r n a e o f r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( R E R ) , a n d a w e l l d e v e l o p e d G o l g i c o m p l e x ( G C ) . BL - b a s a l l a m i n a . 5 8 8 0 X . F 1 g . 4 0 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n . The m e s e n c h y m a l c e l l shows a membrane b o u n d l y s o s o m e ( L ) . N - n u c l e u s . M - m i t o c h o n d r i o n . 5 9 2 7 X . - 64 - occasional c e l l also shows, in addition, membrane-bound and membrane-free structures of varying electron densities containing granular material and cytoplasmic organelles such as mitochondria (Fig. 40). On a morphological basis, these structures were interpreted as lysosomes (DeDuve, 1963; Erickson, 1969). The lysosomes were absent at a comparable time during normal development. Stage 11. On day 10:06 of gestation, a few mesenchymal c e l l s show massive disruption of th e i r cytoplasmic morphology (Fig. 41). The cytoplasm appears vacuolated, and shows numerous lysosomes. The lysosomes vary in si z e , and contain dense granules, dense bodies and vacuoles. The nucleus i s indented, and, along with other cytoplasmic organelles, pushed to the side. These mesenchymal c e l l s are interpreted as macrophages. Small membrane-bound structures containing dense bodies and cytoplasmic organelles (Fig. 41) are also found in the i n t e r c e l l u l a r space near the macrophages. Presumably these structures represent fragments of expelled material from the mesenchymal c e l l s , and are in the process of being phagocytosed by the macrophages. Subsequently, on day 10:12 of gestation, the mesenchymal c e l l s continue to show disruptive changes in their cytoplasm. In addition, alterations are also seen for the f i r s t time in the epithelium. Some c e l l s of the bilaminar ep i t h e l i a are altered, and show a nucleus surrounded by polyribosomes, a few mitochondria, cisternae of rough endoplasmic reticulum, l i p i d droplets, and lysosomes (Fig. 42). Other e p i t h e l i a l c e l l s are not altered (Fig. 43), and resemble thei r control counterpart. The basal lamina beneath both the  - 66 - F1g. 41 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 0 : 0 6 o f g e s t a t i o n . A m e s e n c h y m a l c e l l s h o w i n g m a s s i v e d i s r u p t i o n o f i t s c y t o p l a s m i c m o r p h o l o g y , and i n t e r p r e t t e d a s a m a c r o p h a g e . The c y t o p l a s m a p p e a r s v a c u o l a t e d , a n d shows n u m e r o u s l y s o s o m e s ( L ) . The n u c l e u s (N) i s i n d e n t e d and i s p u s h e d t o t h e s i d e . S m a l l membrane b o u n d s t r u c t u r e s ( a r r o w h e a d s ) c o n t a i n i n g d e n s e b o d i e s a n d c y t o p l a s m i c o r g a n e l l e s a r e p r e s e n t n e a r t h e m a c r o p h a g e . M - m i t o c h o n d r i a . 7 5 9 4 X .  - 68 - Fig. 42 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s o n day 10:12 o f g e s t a t i o n s h o w i n g c y t o p l a s m i c f e a t u r e s o f t h e e p i t h e l i a l c e l l s . The n u c l e u s ( N ) i s s u r r o u n d e d by p o l y r i b o s o m e s , m i t o c h o n d r i a ( M ) , c i s t e r n a e o f r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( R E R ) , l i p i d d r o p l e t s (1), a n d l y s o s o m e s ( l ) . The b a s a l l a m i n a ( B L ) i s c o n t i n u o u s . 5789X. Fig. 43 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s o n day 10:12 o f g e s t a t i o n s h o w i n g u n a f f e c t e d e p i t h e l i a l c e l l s ( c f . F i g . 42). The b a s a l l a m i n a ( B L ) i s c o n t i n u o u s . N - n u c l e u s . M - m i t o c h o n d r i o n . 5894X. - 69 - a l t e r e d and u n a l t e r e d e p i t h e l i a l c e l l s , h o w e v e r , i s c o n t i n u o u s ( F i g s . 4 2 , 4 3 ) . In t h e e n s u i n g 24 h o u r s , i . e . , b e t w e e n d a y s 1 0 : 1 8 a n d 1 1 : 1 8 o f g e s t a t i o n , t h e e p i t h e l i a l and m e s e n c h y m a l c h a n g e s i n t h e 6MP t r e a t e d p a l a t e a r e g r a d u a l l y r e d u c e d . On day 1 1 : 1 8 o f g e s t a t i o n , t h e e p i t h e l i u m on t h e m e d i a l a s p e c t o f t h e v e r t i c a l p a l a t a l s h e l f i s b i l a m i n a r ( F i g . 4 4 ) . B o t h t h e s u p e r f i c i a l a n d b a s a l e p i t h e l i a l c e l l s a r e i r r e g u l a r i n a p p e a r a n c e . They c o n t a i n an i r r e g u l a r n u c l e u s s u r r o u n d e d by p o l y r i b o s o m e s , a few m i t o c h o n d r i a , an o c c a s i o n a l c i s t e r n a o f r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m a n d l i p i d d r o p l e t s . The b a s a l c e l l s a r e a t t a c h e d w i t h one a n o t h e r , a n d w i t h t h e s u p e r f i c i a l c e l l s by d e s m o s o m e s . Numerous s p a c e s o t h e r w i s e i n t e r v e n e b e t w e e n c e l l s o f t h e e p i t h e l i u m . The b a s a l l a m i n a s e p a r a t i n g t h e e p i t h e l i u m a n d mesenchyme i s c o n t i n u o u s . The m e s e n c h y m a l c e l l s a r e s t e l l a t e and c o n t a i n o r g a n e l l e s s i m i l a r t o t h o s e d e s c r i b e d f o r e p i t h e l i a l c e l l s ( F i g . 4 4 ) . S u b s e q u e n t l y , u n l i k e t h o s e o f t h e c o n t r o l p a l a t e s , t h e e p i t h e l i a l c e l l s o f 6MP t r e a t e d d i d n o t show any a p p r e c i a b l e a l t e r a t i o n s b e t w e e n d a y s 1 1 : 1 8 a n d 1 2 : 1 8 o f g e s t a t i o n . On day 1 2 : 1 8 o f g e s t a t i o n , t h e e p i t h e l i u m on t h e m e d i a l a s p e c t o f t h e v e r t i c a l p a l a t a l s h e l f i s b i l a m i n a r ( F i g . 4 5 ) . B o t h t h e s u p e r f i c i a l a n d b a s a l c e l l s c o n t a i n a l a r g e n u c l e u s s u r r o u n d e d by f e w c y t o p l a s m i c o r g a n e l l e s . In c o m p a r i s o n t o 6MP t r e a t e d p a l a t a l e p i t h e l i u m on day 1 1 : 1 8 , h o w e v e r , t h e e p i t h e l i a l c e l l s a r e c l o s e l y p a c k e d a n d i n t e r c e l l u l a r s p a c e s a r e s m a l l o r a b s e n t on day 1 2 : 1 8 of g e s t a t i o n ( F i g . 4 5 ) . The m e s e n c h y m a l c e l l s on day 1 2 : 1 8 o f g e s t a t i o n a r e i r r e g u l a r i n a p p e a r a n c e ( F i g . 4 5 ) . T h e i r c y t o p l a s m i c c o n t e n t s r e m a i n u n c h a n g e d .  - 71 - F 1 g . 44 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 1 : 1 8 o f g e s t a t i o n s h o w i n g a b i l a m i n a r e p i t h e l i u m . B o t h t h e s u p e r f i c i a l a n d b a s a l e p i t h e l i a l c e l l s c o n t a i n a n u c l e u s (N) s u r r o u n d e d by p o l y r i b o s o m e s , m i t o c h o n d r i a ( M ) , a n d r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( R E R ) . The e p i t h e l i a l c e l l s a r e a t t a c h e d t o one a n o t h e r by desmosomes ( D ) . A m e s e n c h y m a l c e l l s h o w s a n u c l e u s (N) s u r r o u n d e d by p o l y r i b o s o m e s , m i t o c h o n d r i a (M) a n d r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( R E R ) . ICS - i n t e r c e l l u l a r s p a c e . BL - b a s a l l a m i n a . 6 8 9 2 X . F 1 g . 45 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s o n day 1 2 : 1 8 o f g e s t a t i o n s h o w i n g d i s c o n t i n u i t y i n t h e b a s a l l a m i n a ( B L ) . A t h i n c y t o p l a s m i c e x t e n s i o n ( a r r o w h e a d ) o f t h e b a s a l e p i t h e l i a l c e l l e x t e n d s t h r o u g h t h e b a s a l l a m i n a a n d c o n t a c t s a m e s e n c h y m l c e l l ( M C ) . I n t e r c e l l u l a r s p a c e s a r e m i s s i n g ( c f . F i g . 4 4 ) . N - n u c l e u s . M - m i t o c h o n d r i o n . RER - r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . 6 1 0 5 X . - 72 - A t t h e e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l i n t e r f a c e , s t r i k i n g c h a n g e s a r e v i s i b l e on day 1 2 : 1 8 o f g e s t a t i o n . A t v a r i o u s p l a c e s t h e b a s a l l a m i n a i s d i s c o n t i n u o u s ( F i g . 4 5 ) . A t h i n c y t o p l a s m i c e x t e n s i o n o f t h e b a s a l e p i t h e l i a l c e l l e x t e n d s t h r o u g h t h e b a s a l l a m i n a , a n d e i t h e r c o n t a c t s a m e s e n c h y m a l c e l l ( F i g . 4 5 ) , o r r e m a i n s f r e e ( F i g . 4 6 ) . D u r i n g t h e e n s u i n g 24 h o u r s , i . e . , b e t w e e n d a y s 1 2 : 1 8 and 1 3 : 1 8 o f g e s t a t i o n , t h e b a s a l l a m i n a c h a n g e s become p r o g r e s s i v e l y more s e v e r e i n t h e 6MP t r e a t e d p a l a t e s . On day 1 3 : 1 8 o f g e s t a t i o n , when p a l a t e s o f c o n t r o l f e t u s e s a r e a l r e a d y c l o s e d , c h a n g e s a r e o b s e r v e d i n t h e e p i t h e l i u m , t h e mesenchyme and t h e b a s a l l a m i n a o f t h e 6MP t r e a t e d v e r t i c a l p a l a t a l s h e l f . In c o m p a r i s o n t o t h e s u p e r f i c i a l e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c e l l s , t h e b a s a l e p i t h e l i a l c e l l s a p p e a r l i g h t due t o r e d u c e d p o l y r i b o s o m e c o n t e n t ( F i g . 4 7 ) . In a d d i t i o n , t h e i r c y t o p l a s m c o n t a i n s a few m i t o c h o n d r i a , c i s t e r n a e o f r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m , a n d a s m a l l G o l g i C o m p l e x ( F i g . 4 7 ) . In c o n t r a s t t o t h o s e o b s e r v e d a t day 1 2 : 1 8 o f g e s t a t i o n , t h e m e s e n c h y m a l c e l l s on day 1 3 : 1 8 o f g e s t a t i o n v a r y i n s h a p e f r o m s t e l l a t e t o e l o n g a t e d ( F i g . 4 7 ) . They c o n t a i n a f l a t n u c l e u s s u r r o u n d e d by p o l y r i b o s o m e s , n u m e r o u s c i s t e r n a e o f r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m , f e w m i t o c h o n d r i a and a w e l l d e v e l o p e d G o l g i C o m p l e x . The b a s a l l a m i n a a t t h e i n t e r f a c e o f t h e e p i t h e l i u m and mesenchyme i s a l m o s t m i s s i n g ( F i g . 4 7 ) . In many i n s t a n c e s a c y t o p l a s m i c e x t e n s i o n o f t h e m e s e n c h y m a l c e l l a p p e a r s t o h a v e p e n e t r a t e d t h e d i s a p p e a r i n g b a s a l l a m i n a t o c o n t a c t t h e e p i t h e l i a l c e l l ( F i g . 4 7 ) . E v e n t u a l l y , h o w e v e r , t h e a l t e r a t i o n s i n t h e e p i t h e l i a l c e l l s become l e s s s e v e r e . B e t w e e n d a y s 1 4 : 0 0 and 1 5 : 0 0 o f g e s t a t i o n , t h e e p i t h e l i u m on t h e 6MP  - 74 - F i g . 46 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 2 : 1 8 o f g e s t a t i o n s h o w i n g a c y t o p l a s m i c e x t e n s i o n ( a r r o w h e a d ) o f t h e b a s a l e p i t h e l i a l c e l l . BL - b a s a l l a m i n a . 4 2 3 2 5 X . F1g. 47 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 1 3 : 1 8 o f g e s t a t i o n s h o w i n g a l i g h t b a s a l c e l l ( B C ) . The c y t o p l a s m o f t h e l i g h t b a s a l c e l l c o n t a i n s a r e d u c e d p o l y r i b o s o m e c o n t e n t , m i t o c h o n d r i a ( M ) , r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( R E R ) , a n d a G o l g i c o m p l e x ( G C ) . The e l o n g a t e d m e s e n c h y m a l c e l l s c o n t a i n a n u c l e u s ( N ) s u r r o u n d e d by p o l y r i b o s o m e s , r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( R E R ) , m i t o c h o n d r i a (M) a n d a G o l g i c o m p l e x ( G C ) . T h e b a s a l l a m i n a ( B L ) i s a l m o s t m i s s i n g . A c y t o p l a s m i c e x t e n s i o n ( a r r o w h e a d ) o f t h e m e s e n c h y m a l c e l l c o n t a c t s t h e e p i t h e l i a l c e l l . N - n u c l e u s . D - d e s m o s o m e . 7 5 6 5 X . - 75 - t r e a t e d c l e f t p a l a t a l s h e l f i s made o f 3 - 5 c e l l l a y e r s ( F i g . 4 8 ) . The b a s a l c e l l s a r e r o u g h l y c u b o i d a l , a n d c o n t a i n an i r r e g u l a r n u c l e u s s u r r o u n d e d by p o l y r i b o s o m e s , m i t o c h o n d r i a , few c i s t e r n a e o f r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m , a n d t o n o f i l a m e n t s . The o u t e r 2 - 4 l a y e r s o f c e l l s a r e f l a t , and c o n t a i n o r g a n e l l e s s i m i l a r t o t h o s e i n t h e b a s a l e p i t h e l i a l c e l l s . S p a c e s a r e n u m e r o u s b e t w e e n t h e b a s a l , a n d b e t w e e n t h e b a s a l a n d s u p r a b a s a l e p i t h e l i a l c e l l s ( F i g . 4 8 ) . B o t h t h e b a s a l a n d o u t e r f l a t c e l l s a r e a t t a c h e d t o t h e i r n e i g h b o u r s by d e s m o s o m e s . The b a s a l l a m i n a s e p a r a t i n g t h e e p i t h e l i u m f r o m t h e mesenchyme i s c o n t i n u o u s ( F i g . 4 8 ) . Numerous h e m i d e s m o s o m e s a r e s e e n f o r t h e f i r s t t i m e b e t w e e n t h e p l a s m a membrane o f t h e b a s a l c e l l a n d t h e b a s a l l a m i n a ( F i g . 4 8 ) . The m e s e n c h y m a l c e l l s o f t h e c l e f t p a l a t a l s h e l v e s r e m a i n u n a l t e r e d . L i g h t M i c r o s c o p i c O b s e r v a t i o n s o f Enzyme A c i d P h o s p h a t a s e i n t h e D e v e l o p i n g S e c o n d a r y P a l a t e o f C o n t r o l H a m s t e r F e t u s e s P r i o r t o day 1 2 : 0 0 o f g e s t a t i o n , i . e . , h i s t o l o g i c a l S t a g e s I a n d I I o f p a l a t a l d e v e l o p m e n t , t h e r e a c t i o n p r o d u c t o f e n z y m e a c i d p h o s p h a t a s e i s a b s e n t i n b o t h t h e e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c e l l s . A m i l d r e a c t i o n p r o d u c t o f t h e enzyme i s o b s e r v a b l e i n c e l l s o f t h e m e d i a l e d g e e p i t h e l i u m o f t h e h o r i z o n t a l p a l a t a l s h e l v e s ( S t a g e I I I ) , a n d e p i t h e l i a l seam ( S t a g e I V ) . A t h i s t o l o g i c a l S t a g e V , t h e a c i d p h o s p h a t a s e r e a c t i o n p r o d u c t i s s e e n i n t h e e p i t h e l i a l c e l l s o f t h e f r a g m e n t e d s e a m , and i n t h e n e a r b y m e s e n c h y m a l c e l l s .  - 77 - F 1 g . 4 8 E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n a 6MP t r e a t e d h a m s t e r f e t u s on day 14:00 o f g e s t a t i o n s h o w i n g a s t r a t i f i e d e p i t h e l i u m . T h e b a s a l c e l l s c o n t a i n i r r e g u l a r n u c l e i (N) s u r r o u n d e d by p o l y r i b o s o m e s , m i t o c h o n d r i a ( M ) , c i s t e r n a e o f r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( R E R ) , a n d t o n o f i l a m e n t s ( t f ) . The o u t e r 3 t o 4 l a y e r s o f c e l l s a r e f l a t t e r , a n d c o n t a i n o r g a n e l l e s s i m i l a r t o t h o s e i n t h e b a s a l e p i t h e l i a l c e l l s . N u m e r o u s s p a c e s ( I C S ) i n t e r v e n e b e t w e e n e p i t h e l i a l c e l l s . D - d e s m o s o m e . HD - h e m i d e s m o s o m e . BL - b a s a l l a m i n a . 8 3 7 3 X . - 78 - L i g h t M i c r o s c o p i c O b s e r v a t i o n s o f Enzyme A c i d P h o s p h a t a s e i n t h e D e v e l o p i n g Secondary P a l a t e o f 6MP T r e a t e d Hamster F e t u s e s U n l i k e c o n t r o l s , t h e enzyme a c i d p h o s p h a t a s e r e a c t i o n p r o d u c t i n t h e 6MP t r e a t e d p a l a t e i s f i r s t v i s i b l e i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l s o n day 1 0 : 0 6 , a n d t h e n i n b o t h t h e e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c e l l s on d a y 10:12 o f g e s t a t i o n ( h i s t o l o g i c a l S t a g e I I ) . S u b s e q u e n t l y , t h e enzyme a c t i v i t y i s n o t s e e n a t any t i m e i n 6MP t r e a t e d p a l a t e s d u r i n g d e v e l o p m e n t . T h e a p p e a r a n c e o f i n t r a c y t o p l a s m i c a r e a s c o n t a i n i n g d e n s e g r a n u l e s a n d d e n s e b o d i e s a t u l t r a s t r u c t u r a l l e v e l , a n d c o r r e s p o n d i n g l o c a l i z a t i o n o f enzyme a c i d p h o s p h a t a s e r e a c t i o n p r o d u c t a t l i g h t m i c r o s c o p i c l e v e l s , i n b o t h t h e c o n t r o l a n d 6MP t r e a t e d p a l a t a l t i s s u e s , c o n f i r m s t h e l y s o s o m a l n a t u r e o f t h e d e n s e g r a n u l e s a n d d e n s e , b o d i e s ( N o v i k o f f , 1 9 6 3 ; E r i c k s o n , 1 9 6 9 ) . - 79 - DISCUSSION N o r m a l P a l a t a l D e v e l o p m e n t R e s u l t s o f t h e p r e s e n t s t u d y h a v e shown t h a t t h e n o r m a l p a l a t a l d e v e l o p m e n t i n h a m s t e r i s c o m p l e t e d b e t w e e n d a y s 1 0 : 0 0 a n d 1 3 : 0 0 o f g e s t a t i o n . D u r i n g t h i s p e r i o d t h e p a l a t a l s h e l v e s i n i t i a t e v e r t i c a l l y f r o m t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y t o w a r d i t s f l o o r . The s h e l v e s t h e n c h a n g e t h e d i r e c t i o n o f t h e i r d e v e l o p m e n t f r o m v e r t i c a l t o h o r i z o n t a l . S u b s e q u e n t l y , o p p o s i n g e p i t h e l i a o f t h e h o r i z o n t a l s h e l v e s f u s e w i t h one a n o t h e r t o f o r m a s e a m . The e p i t h e l i a l s e a m , t h e r e a f t e r , u n d e r g o e s f r a g m e n t a t i o n t o a l l o w t h e mesenchyme o f t h e t w o s h e l v e s t o become c o n t i n u o u s . T h e s e s e q u e n t i a l e v e n t s o f h a m s t e r p a l a t a l d e v e l o p m e n t , w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e i n i t i a l f o r m a t i o n o f p a l a t a l s h e l v e s ( S t a g e 1 ) , h a v e a l s o b e e n d e s c r i b e d i n o t h e r mammals s u c h a s m i c e ( W a l k e r a n d F r a s e r , 1 9 5 6 ; D o s t a l a n d J e l n i c k , 1 9 7 0 ; W a t e r m a n e t a l . , 1 9 7 3 ) , r a t s ( A s l i n g e t a l . , 1 9 6 0 ; Z e i l e r e t a l . , 1 9 6 4 ; C o l e m a n , 1 9 6 5 ; F e r g u s o n , 1 9 7 8 ; S c h u p b a c h e t a l . , 1 9 8 3 ) , monkeys ( A s l i n g and Van W a g e n e n , 1 9 6 7 ; S t e f f e k e t a l . , 1 9 6 8 ; B o l l e r t a n d H e n d r i c k x , 1 9 7 1 ) , g e r b i l s ( H o l m s t e d t a n d B a g w e l l , 1 9 7 7 ) , r a b b i t s ( W a l k e r , 1 9 7 1 ; M e l l e r e t a l . , 1 9 8 0 ) , f e r r e t s ( G u l a m h u s e i n a n d E n g l a n d , 1 9 8 2 ) , a n d human ( F u l t o n , 1 9 5 7 ; Wood and K r a u s , 1 9 6 2 ; K i t a m u r a , 1 9 6 6 ; B u r d i a n d F a i s t , 1 9 6 7 ; A n d e r s o n and M a t t h i e s s e n , 1 9 6 7 ; L u k e , 1 9 7 6 ) . F u r t h e r m o r e , o b s e r v a t i o n s b e t w e e n d a y s 1 2 : 0 0 a n d 1 3 : 0 0 o f g e s t a t i o n h a v e shown t h a t t h e r e o r i e n t a t i o n o f t h e p a l a t a l s h e l v e s f r o m v e r t i c a l t o h o r i z o n t a l p l a n e was c o m p l e t e d i n a l l f e t u s e s by day 1 2 : 0 6 o f p r e g n a n c y . S u b s e q u e n t l y , t h e c l o s u r e o f t h e m i d d l e t h i r d o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e was - 80 - c o m p l e t e d i n a l l f e t u s e s by day 1 2 : 1 2 a n d t h a t o f t h e p o s t e r i o r t h i r d and a n t e r i o r t h i r d by d a y s 1 2 : 1 8 a n d 1 3 : 0 0 o f g e s t a t i o n , r e s p e c t i v e l y . S i m i l a r c h r o n o l o g i c a l o b s e r v a t i o n s on p a l a t a l c l o s u r e i n h a m s t e r h a v e b e e n made i n o t h e r s t u d i e s ( S h a h a n d C h a u d h r y , 1 9 7 4 a ; S h a h a n d T r a v i l l , 1 9 7 6 a ; S h a h , 1 9 7 9 a , b ; S h a h a n d Wong 1 9 8 0 ) . I n a d d i t i o n , t h e p r e s e n t s t u d y a l s o r e c o n f i r m e d t h e o b s e r v a t i o n s made i n t h e s e s t u d i e s t h a t n o t o n l y t h e a g e , b u t a l s o t h e w e i g h t a n d CRL o f t h e f e t u s a r e r e l i a b l e i n d i c a t o r s o f s t a g e s o f n o r m a l p a l a t a l d e v e l o p m e n t i n h a m s t e r . I n t h e i r s t u d i e s on mouse p a l a t o g e n e s i s W a l k e r a n d C r a i n ( 1 9 6 0 ) a n d D o s t a l a n d J e l n i c k ( 1 9 7 2 ) a l s o n o t e d a g o o d c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e s t a g e s o f p a l a t a l d e v e l o p m e n t a n d f e t a l w e i g h t , b u t n o t b e t w e e n t h e s t a g e s o f p a l a t a l d e v e l o p m e n t a n d f e t a l a g e . The r e l i a b i l i t y o f c h r o n o l o g i c • age a s an i n d i c a t o r o f t h e s t a g e s o f n o r m a l p a l a t a l d e v e l o p m e n t i n h a m s t e r may be due t o a r e l a t i v e l y s h o r t e r p e r i o d o f o r g a n o g e n e s i s a n d a c o r r e s p o n d i n g s m a l l e r p e r i o d o f p a l a t o g e n e s i s i n h a m s t e r a s c o m p a r e d w i t h m i c e . I t i s a n t i c i p a t e d t h a t t h e r e p r o d u c i b i l i t y o f t h e a c c u r a t e t i m i n g s , f e t a l w e i g h t s , a n d f e t a l CRL f o r t h e i m p o r t a n t e v e n t s o f p a l a t o g e n e s i s i n h a m s t e r s h o u l d s t r e n g t h e n i t s u s e f u l n e s s a s a b i o l o g i c a l s y s t e m f o r f u r t h e r e m b r y o l o g i c a l a n d t e r a t o l o g i c a l s t u d i e s . I n c o n t r a s t t o m a m m a l s , t h e p a l a t a l s h e l v e s i n t h e o t h e r v e r t e b r a t e s s u c h a s c h i c k ( S h a h a n d C r a w f o r d , 1 9 8 0 ; K o c h a n d S m i l e y , 1 9 8 1 ) , q u a i l ( S h a h e t a l . , 1 9 8 4 b ) , a n d a l l i g a t o r ( F e r g u s o n , 1 9 8 1 ) o r i g i n a t e h o r i z o n t a l l y o v e r t h e d o r s a l s u r f a c e o f t h e t o n g u e . S u b s e q u e n t l y t h e h o r i z o n t a l s h e l v e s n e v e r f u s e . One m a y , t h e r e f o r e , s u g g e s t t h a t C l a s s d i f f e r e n c e s e x i s t among v e r t e b r a t e s w i t h r e g a r d t o t h e s e q u e n c e o f p a l a t a l d e v e l o p m e n t . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n o f d i f f e r e n c e i n p a l a t o g e n e s i s b e t w e e n v a r i o u s v e r t e b r a t e - 81 - c l a s s e s may p r o v e u s e f u l i n u n d e r s t a n d i n g n o r m a l a n d a b n o r m a l b i o l o g y o f t h e p a l a t e . T h e r e i s a p a u c i t y o f l i t e r a t u r e on t h e i s s u e o f why t h e m a m m a l i a n p a l a t a l s h e l v e s f i r s t d e v e l o p i n a v e r t i c a l d i r e c t i o n when t h e i r e v e n t u a l p o s i t i o n i s h o r i z o n t a l . I t h a s b e e n p r e s u m e d t h a t a l a r g e t o n g u e o c c u p i e s t h e o r o n a s a l c a v i t y b e f o r e t h e a p p e a r a n c e o f t h e p a l a t a l p r i m o r d i a . A l a c k o f r o o m o v e r t h e t o n g u e w o u l d c o n s e q u e n t l y d i r e c t t h e p a l a t a l s h e l v e s t o grow v e r t i c a l l y a l o n g t h e s i d e s o f t h e t o n g u e ( K e i b e l a n d M a l l , 1 9 1 2 ; F r a s e r , 1 9 4 7 ; H a y w a r d a n d A v e r y , 1 9 5 7 ; P a t t e n , 1 9 7 1 ; T u c h m a n n - D u p l e s s i s a n d H a e g e l , 1 9 7 4 ; D r y d e n , 1 9 7 7 ) . The r e s u l t s o f t h e p r e s e n t s t u d y , h o w e v e r , show t h a t t h e p a l a t a l s h e l v e s a p p e a r p r i o r t o t h e d e v e l o p m e n t o f t h e t o n g u e . By t h e t i m e a l a r g e t o n g u e o c c u p i e s t h e s p a c e i n t h e o r o n a s a l c a v i t y , t h e v e r t i c a l p a l a t a l s h e l v e s a r e a l r e a d y w e l l d e v e l o p e d . One m a y , t h e r e f o r e , s u g g e s t t h a t i n i t i a l f o r m a t i o n o f p a l a t a l p r i m o r d i a i s n o t r e l a t e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f t h e t o n g u e . F u r t h e r c r e d e n c e t o t h i s s u g g e s t i o n c o m e s f r o m an a n a l y s i s o f human c l e f t p a l a t e c a s e s w h e r e i t was n o t e d t h a t i n many i n s t a n c e s o f a g l o s s i a a s s o c i a t e d w i t h c l e f t p a l a t e i n e m b r y o s , t h e s h e l v e s w e r e v e r t i c a l ( S h a h , 1 9 7 7 b ) . R e c e n t l y F l i n t ( 1 9 8 0 ) o b s e r v e d t h e i n i t i a t i o n o f mouse p a l a t a l p r i m o r d i a f r o m t h e r o o f o f t h e o r o n a s a l c a v i t y , b u t he d i d n o t i n d i c a t e t h e s t a t u s o f t o n g u e d e v e l o p m e n t a t t h e t i m e o f p a l a t a l i n i t i a t i o n . H o w e v e r , o b s e r v a t i o n s on e m b r y o n i c p a l a t a l d e v e l o p m e n t i n c h i c k ( S h a h a n d C r a w f o r d , 1 9 8 0 ; K o c h a n d S m i l e y , 1 9 8 1 ) , a l l i g a t o r ( F e r g u s o n , 1981) and q u a i l ( S h a h e t a l . , 1 9 8 4 b ) h a v e shown t h a t , d e s p i t e t h e p r e s e n c e o f a l a r g e t o n g u e , t h e p a l a t a l s h e l v e s a p p e a r h o r i z o n t a l f r o m t h e b e g i n n i n g . T h u s t h e s e o b s e r v a t i o n s i n l o w e r - 82 - v e r t e b r a t e s w o u l d a l s o a r g u e a g a i n s t a n a c t i v e r o l e o f t o n g u e i n g u i d i n g t h e i n i t i a l d e v e l o p m e n t o f t h e p a l a t e i n a v e r t i c a l d i r e c t i o n . E a r l i e r S h a h ( 1 9 7 7 b ) a n d F e r g u s o n ( 1 9 8 1 ) h a d h y p o t h e s i z e d t h a t t h e i n i t i a t i o n o f m a m m a l i a n e m b r y o n i c p a l a t e i n t h e v e r t i c a l d i r e c t i o n may be d e t e r m i n e d g e n e t i c a l l y , a n d i s p r o b a b l y n o t d e p e n d a n t o n t h e p h y s i c a l p r e s e n c e o f s u r r o u n d i n g s t r u c t u r e s s u c h a s t h e t o n g u e . T h e o b s e r v a t i o n s o f t h e p r e s e n t s t u d y , a l o n g w i t h t h o s e made f r o m l o w e r v e r t e b r a t e s , l e n d s s u p p o r t t o t h i s h y p o t h e s i s . I t seems t h a t a l t h o u g h t h e b a s i c s e q u e n c e o f p a l a t a l d e v e l o p m e n t i n mammals i s s i m i l a r , t h e r e a r e s p e c i e s d i f f e r e n c e s i n t h e p a t t e r n o f p a l a t a l c l o s u r e . F o r e x a m p l e , i n m i c e ( W a l k e r a n d F r a s e r , 1 9 5 6 ) , r a t s ( Z e i l e r e t a l . , 1 9 6 4 ; C o l e m a n , 1 9 6 5 ; S c h u p b a c h e t a l . , 1 9 8 3 ) , g e r b i l s ( H o l m s t e d t a n d B a g w e l l , 1 9 7 7 ) , f e r r e t s ( G u l a m h u s e i n a n d E n g l a n d , 1 9 8 2 ) , a n d humans ( F u l t o n , 1 9 5 7 ; K i t a m u r a , 1 9 6 6 ; B u r d i a n d F a i s t , 1 9 6 7 ; W a t e r m a n a n d M e l l e r , 1 9 7 4 ; L u k e , 1 9 7 6 ) t h e c l o s u r e s t a r t s i n t h e m i d d l e t h i r d o f t h e p a l a t e a n d t h e n s i m u l t a n e o u s l y e x t e n d s a n t e r i o r l y a n d p o s t e r i o r l y , w h e r e a s i n r a b b i t s ( W a l k e r , 1 9 7 1 ; M e l l e r e t a l . , 1980) a n d m o n k e y s ( A s l i n g a n d v a n W a g e n e n , 1 9 6 7 ; S t e f f e k e t a l . , 1 9 6 8 ; B o l l e r t a n d H e n d r i c k x , 1971) t h e c l o s u r e b e g i n s a n t e r i o r l y a n d p r o c e e d s p o s t e r i o r l y . T h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n s h o w e d t h a t i n h a m s t e r s c l o s u r e s t a r t s i n t h e m i d d l e t h i r d o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e , e x t e n d s p o s t e r i o r l y , a n d f i n a l l y a n t e r i o r l y i n t h a t o r d e r . T h u s i t seems t h a t e v e n t h o u g h t h e b a s i c s e q u e n c e o f m a m m a l i a n p a l a t o g e n e s i s i s s i m i l a r , s p e c i e s d i f f e r e n c e s i n t h e p a t t e r n s o f p a l a t a l c l o s u r e may b e r e f l e c t e d d u r i n g a b n o r m a l p a l a t o g e n e s i s a n d r e s u l t i n t h e m o r p h o l o g i c a l l y d i f f e r e n t t y p e s o f p a l a t a l c l e f t s s e e n i n humans ( V e a u , 1 9 3 1 ; L y n c h e t a l . , 1 9 6 6 ; F a r a , - 8 3 - 1 9 7 1 ; S m i l e y , 1 9 7 2 ; M i t t s e t a l . , 1 9 8 1 ) , a n d i n l a b o r a t o r y a n i m a l s a f t e r e x p e r i m e n t a l m a n i p u l a t i o n ( G i r o u d and M a r t i n e t , 1 9 5 6 ; B u r e s h a n d U r b a n , 1 9 6 4 ; W a l k e r , 1 9 6 7 ; D o s t a l a n d J e l i n e k , 1 9 7 1 ; S h a h a n d T r a v i l l , 1 9 7 6 a ; S h a h a n d K i l i s t o f f , 1 9 7 6 ; S h a h , 1 9 7 7 a , b ; S h a h a n d M a c k a y , 1 9 7 8 ; S h a h a n d B u r d e t t , 1 9 7 9 ; S h a h e t a l . , 1 9 7 9 ; K u s a n a g i , 1 9 8 3 ; S c h u p b a c h , 1 9 8 3 ) . L y s o s o m e s w e r e o b s e r v e d i n t h e e p i t h e l i a l c e l l s a n d m e t t h e m o r p h o l o g i c f e a t u r e s o f s e c o n d a r y l y s o s o m e s a n d a u t o p h a g i c v a c u o l e s o r c y t o s e g r e s o m e s ( D e D u v e , 1 9 6 3 ; E r i c k s o n , 1 9 6 9 ) . The l y s o s o m e s w e r e f i r s t s e e n i n t h e m e d i a l e d g e e p i t h e l i a l c e l l s o f t h e h o r i z o n t a l p a l a t a l s h e l v e s . A f t e r t h e f o r m a t i o n o f t h e e p i t h e l i a l s e a m , t h e number a n d s i z e o f l y s o s o m e s had i n c r e a s e d i n t h e c e l l s o f t h e seam u n t i l t h e y w e r e l o s t . T h e s e o b s e r v a t i o n s a r e i n a c c o r d a n c e w i t h t h o s e r e p o r t e d e a r l i e r by C h a u d h r y a n d S h a h ( 1 9 7 3 , 1 9 7 9 ) a n d S h a h a n d C h a u d h r y ( 1 9 7 4 a , b ) . H o w e v e r , De A n g e l i s a n d N a l b a n d i a n ( 1 9 6 8 ) , F a r b m a n ( 1 9 6 8 , 1 9 6 9 ) a n d B r u s a t i ( 1 9 6 9 ) d i d n o t o b s e r v e a n y l y s o s o m e s i n t h e p r e f u s e d e p i t h e l i a . M a t o e t a l . ( 1 9 6 6 , 1 9 6 7 a ) , H a y w a r d ( 1 9 6 9 ) , M o r g a n ( 1 9 6 9 ) a n d S m i l e y ( 1 9 7 0 ) o b s e r v e d them i n t h e b a s a l c e l l s p r i o r t o f u s i o n b u t d i d n o t a t t a c h any s i g n i f i c a n c e t o t h e t i m i n g s o f l y s o s o m a l a p p e a r a n c e . In t h e i r s t u d i e s A n g e l i c i a n d P o u r t o i s ( 1 9 6 8 ) , K o z i o l a n d S t e f f e k ( 1 9 6 9 ) , V a r g a s e t a l . ( 1 9 7 2 ) , S h a h a n d C h a u d h r y ( 1 9 7 4 a ) , L o r e n t e e t a l . ( 1 9 7 4 ) , H o i s t a n d M i l l s ( 1 9 7 5 ) , a n d Im a n d M u l l i k e n ( 1 9 8 3 ) h a v e n o t e d t h a t d u r i n g a n d a f t e r t h e f u s i o n o f o p p o s i n g e p i t h e l i a t h e r e i s a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n t h e a c i d h y d r o l y t i c a c t i v i t y w h i c h r e a c h e s i t s maximum when t h e e p i t h e l i a l seam s t a r t s t o u n d e r g o f r a g m e n t a t i o n . As a c o r r e s p o n d i n g i n c r e a s e i n t h e number a n d s i z e o f l y s o s o m e s was o b s e r v e d d u r i n g t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n , t h e o b s e r v a t i o n s g i v e f u r t h e r c r e d e n c e t o t h e p r o p o s i t i o n t h a t t h e t i m e l y a p p e a r a n c e a n d - 84 - s u b s e q u e n t i n c r e a s e i n number o f l y s o s o m e s p l a y an i m p o r t a n t r o l e i n t h e a u t o p h a g i c d e g e n e r a t i o n o f c e l l s ( M a t o e t a l . , 1 9 6 6 ; S m i l e y , 1 9 7 0 ; C h a u d h r y a n d S h a h , 1 9 7 3 , 1 9 7 9 ; S h a h a n d C h a u d h r y , 1 9 7 4 a , b ; G r e e n e , 1 9 8 3 ; S h a h , 1 9 8 4 ) . W i t h r e g a r d t o t h e r o l e o f m a c r o p h a g e s d u r i n g p a l a t a l d e v e l o p m e n t , t h e o b s e r v a t i o n s i n t h e p r e s e n t s t u d y a r e i n harmony w i t h t h o s e r e p o r t e d by M a t o e t a l . ( 1 9 6 7 a ) , C h a u d h r y a n d Shah ( 1 9 7 3 , 1 9 7 9 ) a n d S h a h a n d C h a u d h r y ( 1 9 7 4 b ) . A t no t i m e was one a b l e t o o b s e r v e t h e m a c r o p h a g e p e n e t r a t i n g t h e b a s a l l a m i n a t o d e s t r o y t h e e p i t h e l i a l c e l l s , a s h a s b e e n p r e v i o u s l y s u g g e s t e d by A n d e r s o n a n d M a t t h i e s s e n ( 1 9 6 7 ) . I t w o u l d , t h e r e f o r e , a p p e a r t h a t m a c r o p h a g e s a r e m a i n l y c o n c e r n e d w i t h t h e r e m o v a l o f c e l l u l a r d e b r i s , r a t h e r t h a n t h e d e s t r u c t i o n o f c e l l s d u r i n g p a l a t a l c l o s u r e . 6-Mercaptopurine Induced C l e f t P a l a t e I n 1 9 7 9 , S h a h a n d B u r d e t t r e p o r t e d t h a t 6MP i s a p o t e n t t e r a t o g e n when i n j e c t e d i n t o p r e g n a n t h a m s t e r s , a n d t h a t i t p r o d u c e s c l e f t p a l a t e i n t h e f e t u s e s . An e x t e n s i v e r e v i e w o f t h e l i t e r a t u r e i n d i c a t e s t h a t t h i s i s t h e f i r s t c o m p r e h e n s i v e i n v e s t i g a t i o n w h i c h shows t h a t a t e r a t o g e n , 6MP, i n d u c e s c l e f t p a l a t e by a f f e c t i n g v e r t i c a l d e v e l o p m e n t o f t h e p a l a t a l s h e l v e s . F l i n t ( 1 9 8 0 ) o b s e r v e d t h a t i n t h e CBA/101 m u t a n t m o u s e , c l e f t p a l a t e a r i s e s due t o a f a i l u r e o f t h e p r i m o r d i a t o g r o w f r o m t h e b e g i n n i n g . M o r p h o l o g i c a l o b s e r v a t i o n s o f p a l a t o g e n e s i s i n m i c e a n d r a t s f o l l o w i n g t e r a t o g e n i c t r e a t m e n t h a v e shown t h a t c o r t i s o n e , h i g h d o s e s o f v i t a m i n A , r a d i a t i o n , f o l i c a c i d d e f i c i e n c y , 5 - f l u o r o - 2 - d e s o x y u r i d i n e , a n d - 85 - d i a z o - o x o - n o r l e u c i n e d e l a y r e o r i e n t a t i o n o f t h e p a l a t a l s h e l v e s f r o m a v e r t i c a l t o h o r i z o n t a l p l a n e ( W a l k e r a n d F r a s e r , 1 9 5 7 ; W a l k e r a n d C r a i n , 1 9 6 0 ; A s l i n g e t a l . , 1 9 6 0 ; C a l l a s a n d W a l k e r , 1 9 6 3 ; K o c h h a r and J o h n s o n , 1 9 6 5 ; C o l e m a n , 1 9 6 5 ; R o s s and W a l k e r , 1 9 6 7 ; N a n d a , 1 9 7 1 ; D o s t a l a n d J e l n i c k , 1 9 7 2 ; F e r g u s o n , 1 9 7 7 ; D i e w e r t , 1 9 7 9 ; D i e w e r t a n d P r a t t , 1 9 7 9 ) . S i m i l a r o b s e r v a t i o n s i n h a m s t e r h a v e shown t h a t t r i a m c i n o l o n e a n d 5 - f l u o r o u r a c i l t r e a t m e n t r e t a r d t h e p a l a t a l s h e l f r e o r i e n t a t i o n ( S h a h , 1 9 7 9 e ; S h a h a n d W o n g , 1 9 8 0 ) , w h e r e a s h y d r o c o r t i s o n e t r e a t m e n t p r e v e n t s t h e f u s i o n b e t w e e n o p p o s i n g h o r i z o n t a l s h e l v e s ( S h a h a n d T r a v i l l , 1 9 7 6 a , b ) . D u r i n g t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n t h e t i m i n g o f t h e i n i t i a l a p p e a r a n c e o f p a l a t a l p r i m o r d i a i n t h e t r e a t e d f e t u s e s r e s e m b l e d t h a t o f t h e c o n t r o l s . T h e r e a f t e r , t h e v e r t i c a l d e v e l o p m e n t o f t h e p a l a t a l s h e l v e s was a f f e c t e d . The r e o r i e n t a t i o n o f t h e p a l a t a l s h e l v e s f r o m v e r t i c a l t o h o r i z o n t a l , a n d t h e i r s u b s e q u e n t f u s i o n n e v e r o c c u r e d . One m u s t be c a u t i o u s i n c o m p a r i n g t h e r e s u l t s r e p o r t e d i n t h e p r e s e n t s t u d y w i t h t h o s e n o t e d e a r l i e r i n t h e p a r a g r a p h . The c a u t i o n i s i n p a r t due t o t h e s p e c i e s d i f f e r e n c e s i n v o l v e d , a n d p a r t l y due t o t h e c h e m i c a l n a t u r e s o f t e r a t o g e n s a n d d i f f e r e n t s c h e d u l e s o f t r e a t m e n t u s e d . F o r e x a m p l e , t r i a m c i n o l o n e , 5 - f l u o r o u r a c i l and h y d r o c o r t i s o n e w e r e a d m i n i s t e r e d i n t r a m u s c u l a r l y on day 1 1 : 0 0 o f g e s t a t i o n i n t o t h e p r e g n a n t h a m s t e r ( S h a h a n d T r a v i l l , 1 9 7 4 ; S h a h , 1 9 7 9 e ; S h a h a n d W o n g , 1 9 8 0 ) a s c o m p a r e d t o i n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o n o f 6MP g i v e n t o t h e h a m s t e r s on day 9 : 0 0 o f g e s t a t i o n i n t h e p r e s e n t s t u d y . I t was shown d u r i n g t h e p r e s e n t s t u d y t h a t b o t h f e t a l w e i g h t a n d CRL p r o v i d e r e l i a b l e i n d i c a t o r s f o r t h e s t a g e s o f n o r m a l p a l a t a l d e v e l o p m e n t . F o l l o w i n g 6MP t r e a t m e n t , h o w e v e r , o n l y t h e f i r s t s t a g e o f p a l a t a l d e v e l o p m e n t - 86 - c o u l d be p r e d i c t e d on t h e b a s i s o f b o t h f e t a l w e i g h t a n d C R L . The p a l a t a l c l o s u r e was c o m p l e t e d i n n o r m a l f e t u s e s w e i g h i n g 551 mg a n d m e a s u r i n g 16 mm ( T a b l e s V I , I X ) , b u t i n t h e t r e a t e d ones w i t h s i m i l a r w e i g h t a n d CRL ( T a b l e s V I I , X ) , t h e p a l a t a l s h e l v e s w e r e v e r t i c a l . A t b i r t h , h o w e v e r , t h e t r e a t e d f e t u s e s w e r e s i g n i f i c a n t l y l i g h t e r t h a n t h e c o n t r o l s . One m a y , t h e r e f o r e , s u g g e s t t h a t f o l l o w i n g 6MP t r e a t m e n t ( a ) b o t h f e t a l w e i g h t a n d CRL a r e p o o r i n d i c a t o r s t o d e t e r m i n e t h e s t a g e s of p a l a t a l d e v e l o p m e n t , a n d ( b ) t h e r e i s an a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e c l e f t p a l a t e and t h e r e d u c t i o n i n f e t a l C R L , a n d i n f e t a l w e i g h t . S i m i l a r o b s e r v a t i o n s w e r e made e a r l i e r by F r a s e r and F a i n s t a t ( 1 9 5 1 ) , C h a u d h r y e t a l . ( 1 9 6 7 ) , Shah and T r a v i l l ( 1 9 7 4 ) a n d S h a h a n d Wong ( 1 9 8 0 ) f o l l o w i n g t r e a t m e n t o f m i c e a n d h a m s t e r s w i t h d i f f e r e n t t e r a t o g e n s . A t c e l l u l a r a n d s u b c e l l u l a r l e v e l s , f o u r m a i n d i f f e r e n c e s w e r e o b s e r v e d d u r i n g p a l a t a l d e v e l o p m e n t b e t w e e n 6MP t r e a t e d f e t u s e s a n d c o n t r o l s . T h e s e w e r e ( a ) n u c l e a r a l t e r a t i o n s , ( b ) p r e m a t u r e a p p e a r a n c e o f l y s o s o m e s , i n i t i a l l y i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l s and t h e n i n t h e e p i t h e l i a l c e l l s , ( c ) s u b s e q u e n t c h a n g e s i n t h e e p i t h e l i a l c e l l s , a n d ( d ) a l t e r a t i o n s i n t h e b a s a l l a m i n a . F o l l o w i n g 6MP t r e a t m e n t i n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e i n i t i a l u l t r a s t r u c t u r a l a l t e r a t i o n o b s e r v e d was s w e l l i n g o f t h e p e r i n u c l e a r s p a c e i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l s o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t a l p r i m o r d i a . S i m i l a r a l t e r a t i o n s h a v e b e e n o b s e r v e d i n t h e n e u r a l e p i t h e l i u m o f d e v e l o p i n g r a t s a n d m i c e f e t u s e s e x p o s e d t o t r y p a n b l u e ( P e t e r s e t a l . , 1 9 7 9 ) , h i g h d o s e s o f v i t a m i n A ( M o r r i s s , 1 9 7 3 ; T h e o d o s i s a n d F r a s e r , 1 9 7 8 ) , a n d f l u o r o - d e o x y u r i d i n e (Langman a n d C a r d e l l , 1 9 7 8 ) , human e p i t h e l i a l c e l l s - 87 - m a i n t a i n e d i n v i t r o a f t e r cadmium e x p o s u r e ( R e e e t a l . , 1 9 8 2 ) , r a b b i t e r y t h r o c y t e ( G l a u e r t , 1 9 6 3 ) and r a t d e r m a l f i b r o b l a s t ( D a n i e l e t a l . , 1 9 6 6 ) a f t e r r e t i n o l e x p o s u r e , l e u k e m i c m o n o c y t e s ( S m e t a n a a n d H e r m a n s k y , 1 9 6 6 ) , c a t m u s c l e f i b r e s d e g e n e r a t i n g a f t e r l o n g t e r m i m m o b i l i z a t i o n ( C o o p e r , 1 9 7 2 ) , a n d i n p o r c i n e m u s c l e a f f e c t e d w i t h c o n g e n i t a l m y o f i b r i l l a r h y p o p l a s i a ( Z e l e n a e t a l . , 1 9 7 8 ) . The s w e l l i n g o f t h e p e r i n u c l e a r s p a c e i s , h o w e v e r , n o t r e p o r t e d i n o t h e r u l t r a s t r u c t u r a l s t u d i e s o f c l e f t p a l a t e ( T a b l e I I ) , o r f o l l o w i n g 6MP i n d u c e d l i m b m a l f o r m a t i o n s i n r a t s ( M e r k e r e t a l . , 1 9 7 5 ) . The p r e c i s e n a t u r e o f t h e d e f e c t o f t h e n u c l e a r e n v e l o p e i s n o t c l e a r . M o s t i n v e s t i g a t o r s d i d n o t a t t a c h any s i g n i f i c a n c e t o t h e o b s e r v a t i o n . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e s w o l l e n n u c l e a r e n v e l o p e may r e f l e c t i t s a l t e r e d p e r m e a b i l i t y a s a s e q u e l a o f p r i m a r y i n j u r y t o t h e membrane s y s t e m o f t h e c e l l ( M o r r i s s , 1 9 7 3 ) , o r as p a r t o f a s e q u e l a o f c e l l d e a t h ( P e t e r s e t a l . , 1 9 7 9 ) . N o r m a l l y t h e p e r i n u c l e a r s p a c e c o n t a i n s s e v e r a l e n z y m e s ( W h a l e y e t a l . , 1971) w h i c h r e g u l a t e t h e i n t e r a c t i o n o f c h r o m o s o m e s w i t h t h e n u c l e a r e n v e l o p e ( F r a n k e e t a l . , 1 9 8 1 ) , a n d s u b s e q u e n t l y a l l o w n u c l e a r - c y t o p l a s m i c i n t e r a c t i o n ( B a u d , 1 9 6 3 ; G o l d s t e i n , 1 9 7 4 ; F r a n k e , 1 9 7 4 ) . I t i s p l a u s i b l e t h a t f o l l o w i n g 6MP a s s a u l t o f t h e m e s e n c h y m a l c e l l s , t h e enzyme s y s t e m s o f t h e n u c l e a r membrane may be a f f e c t e d , t h e r e b y a l t e r i n g i t s p e r m e a b i l i t y ( M o r r i s s , 1 9 7 3 ) , a n d s u b s e q u e n t l y d i s r u p t i n g n u c l e a r - c y t o p l a s m i c i n t e r a c t i o n a n d t h u s t h e c y t o p l a s m i c h o m e o s t a s i s . A t no t i m e i n t h e p r e s e n t s t u d y was d e g e n e r a t i o n o f m e s e n c h y m a l c e l l s o b s e r v e d t o f o l l o w s w e l l i n g o f t h e p e r i n u c l e a r s p a c e , a s was o b s e r v e d by P e t e r s e t a l . ( 1 9 7 9 ) . In t h e t r e a t e d e m b r y o s l y s o s o m e s w e r e f i r s t r e c o g n i z e d i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l s o f t h e v e r t i c a l l y d e v e l o p i n g p a l a t a l p r i m o r d i a a t a v e r y - 8 8 - e a r l y a g e ( i . e . , d a y 1 0 : 0 0 o f g e s t a t i o n ) . The number o f a f f e c t e d m e s e n c h y m a l c e l l s i n c r e a s e d f o r a p p r o x i m a t e l y 12 h o u r s , a n d t h e n d e c r e a s e d . On day 1 0 : 1 2 o f g e s t a t i o n , l y s o s o m e s a l s o a p p e a r e d i n t h e s u p e r f i c i a l a n d b a s a l e p i t h e l i a l c e l l s o f t h e v e r t i c a l l y d e v e l o p i n g p a l a t a l s h e l v e s . L y s o s o m a l l y a f f e c t e d c e l l s i n t h e m e s e n c h y m e , h o w e v e r , w e r e a l w a y s more t h a n i n t h e e p i t h e l i u m . On d a y 1 1 : 0 0 o f g e s t a t i o n , a n d t h e r e a f t e r , l y s o s o m e s w e r e a b s e n t i n b o t h t h e e p i t h e l i a l and m e s e n c h y m a l c e l l s o f t h e c l e f t p a l a t a l s h e l v e s . The a p p e a r a n c e o f l y s o s o m e s i n t h e e p i t h e l i a l c e l l s o f d e v e l o p i n g v e r t i c a l p a l a t a l s h e l v e s i s t e m p o r a l l y a b n o r m a l , a n d t h u s n o t r e l a t e d t o t h e p h y s i o l o g i c a l c e l l d e a t h o b s e r v e d d u r i n g n o r m a l p a l a t a l d e v e l o p m e n t . On t h e o t h e r h a n d , d u r i n g n o r m a l p a l a t o g e n e s i s l y s o s o m e s do n o t a p p e a r i n d i f f e r e n t i a t i n g m e s e n c h y m a l . c e l l s , e x c e p t i n m a c r o p h a g e s . The a p p e a r a n c e o f l y s o s o m e s i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l s f o l l o w i n g 6MP t r e a t m e n t i s , t h e r e f o r e , a b n o r m a l . A s i m i l a r a b n o r m a l l y s o s o m a l r e s p o n s e i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l s f o l l o w i n g 6MP t r e a t m e n t h a s b e e n o b s e r v e d i n d e v e l o p i n g l i m b bud ( M e r k e r e t a l . , 1 9 7 5 ) , a n d i n c l e f t p a l a t e i n d u c e d by o t h e r c h e m i c a l s ( F e r g u s o n , 1 9 7 8 ; S h a h e t a l . , 1 9 8 4 a ) . S e v e r a l i n v e s t i g a t o r s h a v e o b s e r v e d a t r a n s i e n t a p p e a r a n c e o f l y s o s o m e s i n a v a r i e t y o f e m b r y o n i c t i s s u e s f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h n u m e r o u s t e r a t o g e n s ( J u r a n d , 1 9 6 6 , 1 9 6 8 ; C r a w f o r d e t a l . , 1 9 7 2 ; S c h w e i c h e l a n d M e r k e r , 1 9 7 3 ; M o r r i s s , 1 9 7 3 ; M e r k e r e t a l . , 1 9 7 5 ; S a d l e r a n d C o r d e l l , 1 9 7 7 ; K o c h h a r e t a l . , 1 9 7 8 ; H e r k e n e t a l . , 1 9 7 8 ; Langman a n d C a r d e l l , 1 9 7 8 ; F e r g u s o n , 1 9 7 8 ; M e r c h a n t - L a r i o s a n d C o e l l o , 1 9 7 8 ; P e t e r s e t a l . , 1 9 7 9 ; A b r a m o v i c i e t a l . , 1 9 8 0 ; D e s e s s o , 1 9 8 1 ) . They a s s u m e d t h a t t h e a p p e a r a n c e o f l y s o s o m e s a n d t h e i r m o r p h o l o g i c a l v a r i a n t s was an e x p r e s s i o n o f c e l l d e a t h . - 89 - I t h a s b e e n , h o w e v e r , r e p e a t e d l y s u g g e s t e d t h a t a u t o p h a g o c y t o s i s w i l l be f o l l o w e d by c e l l d e a t h , o n l y i f t h e p r o c e s s e s o f s e q u e s t r a t i o n a n d s u b s e q u e n t d i g e s t i o n o f t h e damaged p o r t i o n s o f t h e c e l l c a n n o t c o p e w i t h t h e t o x i c s t r e s s ( S w i f t a n d H r u b a n , 1 9 6 4 ; E r i c k s o n , 1 9 6 9 ; K e r r , 1 9 7 1 ; W y l l i e , 1 9 8 1 ; Trump e t a l . , 1 9 8 3 ) . S i n c e , i n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e c y t o p l a s m i c f e a t u r e s o f t h e m e s e n c h y m a l c e l l s c o n t a i n i n g l y s o s o m e s a p p e a r e d o t h e r w i s e n o r m a l , one may s u g g e s t t h a t s u c h c e l l s w e r e a b l e t o o v e r c o m e t h e e f f e c t s o f 6MP. A s i m i l a r d e d u c t i o n was a l s o r e a c h e d by T h e o d o s i s a n d F r a s e r ( 1 9 7 8 ) i n t h e i r s t u d y on h y p e r v i t a m i n o s i s A i n d u c e d l i m b d e f e c t s i n m i c e a n d by S h a h e t a l . ( 1 9 8 4 a ) i n t h e i r s t u d y on 5 - f l u o r o u r a c i l i n d u c e d c l e f t p a l a t e d e v e l o p m e n t i n h a m s t e r . I t seems t h a t t h e d i f f e r e n t i a t i n g p a l a t a l m e s e n c h y m a l c e l l s a r e c a p a b l e o f e i t h e r n e u t r a l i z i n g a n d / o r d e t o x i f y i n g t h e e x o g e n o u s s u b s t r a t e , 6MP, o r i t s m e t a b o l i c p r o d u c t t h r o u g h t h e s y n t h e s i s o f l y s o s o m a l e n z y m e s ( K e r r , 1 9 7 1 ; A r s t i l a e t a l . , 1 9 7 4 ; Trump e t a l . , 1 9 8 3 ; G e d i g k a n d T o t o v i c , 1 9 8 3 ) . T h u s t h e p r e m a t u r e a p p e a r a n c e o f l y s o s o m e s i n t h e p r e s e n t s t u d y may b e i n t e r p r e t e d a s a s u b l e t h a l , a n d p r o t e c t i v e r e s p o n s e . The i n t e r p r e t a t i o n i s f u r t h e r s t r e n g t h e n e d by o b s e r v a t i o n s t h a t , u n l i k e a d y i n g c e l l w h e r e c y t o p l a s m i c o r g a n e l l e s u n d e r g o p r o f o u n d c h a n g e s ( M o r r i s s , 1 9 7 3 ; P e t e r s e t a l . , 1 9 7 9 ; Trump e t a l . , 1 9 8 3 ; C o n s t a n t i n i d i s , 1 9 8 4 ) , t h e g e n e r a l a p p e a r a n c e o f c y t o p l a s m i c o r g a n e l l e s i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l s r e m a i n e d h e a l t h y . T h e s u b l e t h a l i n j u r y t o t h e m e s e n c h y m a l c e l l s , h o w e v e r , seems t o h a v e i r r e v e r s i b l y a l t e r e d t h e i r p a t h o f d i f f e r e n t i a t i o n . D a t a o n t h e r a t e o f m e s e n c h y m a l c e l l p r o l i f e r a t i o n , a n d t h e s y n t h e s i s o f e x t r a c e l l u l a r m a t r i x m o l e c u l e s by m e s e n c h y m a l c e l l s a t t h e t i m e o f d e v e l o p m e n t o f p a l a t a l - 90 - p r i m o r d i a i s l a c k i n g . T h e s e i s s u e s a r e , h o w e v e r , c o n s i d e r e d t o be i m p o r t a n t d u r i n g s u b s e q u e n t p a l a t a l d e v e l o p m e n t ( T a b l e I I ) . I t i s n o t c l e a r w h e t h e r t h e s t u n t e d v e r t i c a l p a l a t a l s h e l v e s s e e n a t t e r m r e f l e c t a r e d u c t i o n i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l p o p u l a t i o n , o r s y n t h e s i s o f e x t r a c e l l u l a r m a t r i x , o r b o t h . The p r e m a t u r e a p p e a r a n c e o f l y s o s o m e s i n t h e p a l a t a l e p i t h e l i a l c e l l s may b e t h e r e s u l t o f e i t h e r a d i r e c t s u b l e t h a l r e s p o n s e t o 6MP t r e a t m e n t o r i t s m e t a b o l i c p r o d u c t , o r an i n d i r e c t r e s p o n s e t o t h e p r e c e d i n g m e s e n c h y m a l c e l l u l a r i n j u r y . T h e r e i s no d i r e c t e v i d e n c e i n t h e p r e s e n t s t u d y t o s u p p o r t e i t h e r v i e w . As d i s c u s s e d f o r t h e m e s e n c h y m a l c e l l s i n t h e e a r l i e r p a r a g r a p h s , p r e m a t u r e l y s o s o m a l f o r m a t i o n i n t h e e p i t h e l i a l c e l l s may a l s o i n d i c a t e a s u b l e t h a l r e s p o n s e t o n e u t r a l i z e a n d / o r d e t o x i f y t h e h a r m f u l c y t o t o x i c e f f e c t s o f 6MP o r i t s m e t a b o l i c p r o d u c t . The p l a u s i b i l i t y o f t h i s e x p l a n a t i o n i s f u r t h e r e n h a n c e d by t h e f a c t t h a t t h e m o r p h o l o g y o f c y t o p l a s m i c o r g a n e l l e s o f t h e e p i t h e l i a l c e l l s a p p e a r e d h e a l t h y . On t h e o t h e r h a n d , a l t h o u g h an e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l i n t e r a c t i o n i s c o n s i d e r e d t o b e i m p o r t a n t f o r t e r m i n a l d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e p a l a t a l e p i t h e l i a l c e l l s ( P o u r t o i s , 1 9 7 2 ; T y l e r a n d K o c h , 1 9 7 5 , 1 9 7 7 a , b ; S h a h e t a l . , 1 9 8 3 ; S h a h , 1 9 8 4 ) , t h e r e i s no e v i d e n c e i n t h e p r e s e n t s t u d y o r i n t h e l i t e r a t u r e , t h a t t h e mesenchyme may a f f e c t d i f f e r e n t i a t i o n o f e p i t h e l i a l c e l l s a t t h e t i m e o f p a l a t a l p r i m o r d i a l d e v e l o p m e n t . F u r t h e r m o r e , t h e b a s a l l a m i n a s e p a r a t i n g t h e i n j u r e d e p i t h e l i a l and m e s e n c h y m a l c e l l s was i n t a c t ( F i g . 4 2 ) . An e x c h a n g e o f i n f o r m a t i o n , i f a n y , b e t w e e n them may s t i l l o c c u r a t t h e m o l e c u l a r l e v e l t h r o u g h t h e b a s a l l a m i n a . U n d e r s u c h c i r c u m s t a n c e s t h e a p p e a r a n c e o f l y s o s o m e s i n t h e e p i t h e l i a l c e l l may r e f l e c t a r e s p o n s e t o i n j u r y i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l . Thus t h i s p o s s i b i l i t y c a n n o t b e r u l e d o u t . - 91 - T h e i n j u r y t o e p i t h e l i a l c e l l s , l i k e t h e m e s e n c h y m a l c e l l s , a l s o a p p e a r s t o h a v e i r r e v e r s i b l y a l t e r e d t h e i r p a t h o f d i f f e r e n t i a t i o n . C o n s e q u e n t l y b e t w e e n d a y s 1 2 : 0 0 a n d 1 3 : 0 0 o f g e s t a t i o n t h e 6MP t r e a t e d p a l a t a l e p i t h e l i a do n o t e x h i b i t a n y s i g n s o f l y s o s o m a l l y m e d i a t e d p r o g r a m m e d c e l l d e a t h o b s e r v e d d u r i n g n o r m a l d e v e l o p m e n t ( M a t o e t a l . , 1 9 6 6 ; S m i l e y , 1 9 7 0 ; C h a u d h r y a n d S h a h , 1 9 7 3 ; S h a h a n d C h a u d h r y , 1 9 7 4 a , b ; G r e e n e , 1 9 8 3 ; S h a h , 1 9 8 4 ) . T h e r e a f t e r , h o w e v e r , t h e b a s a l e p i t h e l i a l c e l l s show t r a n s i e n t c y t o p l a s m i c a l t e r a t i o n s on day 1 3 : 1 8 o f g e s t a t i o n ( F i g . 4 7 ) . The a l t e r a t i o n s seem t o be r e v e r s i b l e b e c a u s e s u b s e q u e n t l y on day 1 4 : 0 0 o f g e s t a t i o n t h e e p i t h e l i a l c e l l s a p p e a r h e a l t h y ( F i g . 4 8 ) . A s i m i l a r l a t e n t r e s p o n s e o f t h e e p i t h e l i a l c e l l s h a s n o t b e e n n o t e d i n o t h e r u l t r a s t r u c t u r a l s t u d i e s on c h e m i c a l l y i n d u c e d c l e f t p a l a t e ( T a b l e I I ) . One may p e r h a p s s u g g e s t t h a t t h e e p i t h e l i a l c e l l s , h a v i n g c h a n g e d t h e i r p a t h o f d i f f e r e n t i a t i o n , w e r e d i s c a r d i n g o r g a n e l l e s w h i c h a r e n o r m a l l y i n v o l v e d i n p r o g r a m m e d e l i m i n a t i o n . D u r i n g t h e p r e s e n t s t u d y no l o s s o f e p i t h e l i a l c e l l s was e v i d e n t a t any t i m e . The l y s o s o m a l l y - m e d i a t e d s u b l e t h a l r e s p o n s e i n 6 M P - i n d u c e d c l e f t p a l a t e i s d i f f e r e n t f r o m t h e e f f e c t o f o t h e r t e r a t o g e n s ( T a b l e I I ) . The a u t o l y t i c d e g e n e r a t i o n i n t h e p a l a t a l e p i t h e l i u m o f m i c e a n d r a t s was e i t h e r r e d u c e d o r p r e v e n t e d f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h B - a m i n o p r o p r i o n i t r i l e ( M a t o e t a l . , 1 9 7 5 b ) , m e c l o z i n e ( M o r g a n , 1 9 7 6 ) , e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r ( H a s s e l l , 1 9 7 5 ; H a s s e l l a n d P r a t t , 1 9 7 7 ) , d i a z o - o x o - n o r l e u c i n e ( P r a t t a n d G r e e n e , 1 9 7 6 ; M o r g a n a n d P r a t t , 1 9 7 7 ) , t r i a m c i n o l o n e ( K u r i s u e t a l . , 1981 p h e n y l b u t a z o n e ( M o n t e n e g r o a n d P a z de l a V e g a , 1 9 8 2 ) , a n d C o r t i s o l ( G o l d m a n e t a l . , 1 9 8 3 ) . The r e s p o n s e o f t h e mesenchyme was n o t r e p o r t e d i n t h e s e s t u d i e s . In - 92 - h a m s t e r , f o l l o w i n g h y d r o c o r t i s o n e a n d t r i a m c i n o l o n e t r e a t m e n t ( S h a h a n d T r a v i l l , 1 9 7 6 b ; S h a h , 1 9 8 0 ) a p r e m a t u r e n o n l y s o s o m a l n e c r o s i s o f t h e e p i t h e l i u m was o b s e r v e d b u t t h e m e s e n c h y m a l c e l l s a p p e a r e d u n a f f e c t e d . Shah e t a l . ( 1 9 8 4 a ) o b s e r v e d a l y s o s o m a l l y - m e d i a t e d s u b l e t h a l r e s p o n s e f i r s t i n t h e e p i t h e l i a l , a n d t h e n i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l s o f d e v e l o p i n g h a m s t e r p a l a t e f o l l o w i n g 5 - f l u o r o u r a c i l t r e a t m e n t . F e r g u s o n ( 1 9 7 8 ) r e p o r t e d c e l l d e a t h i n t h e d e v e l o p i n g r a t p a l a t a l m e s e n c h y m e f o l l o w i n g 5 - f l u o r o - 2 - d e s o x y u r i d i n e t r e a t m e n t . I t seems t h a t t h e c h e m i c a l n a t u r e o f t h e d r u g , i t s s p e c i e s s p e c i f i c e f f e c t , a n d t h e m e t a b o l i c s t a t e o f t h e d e v e l o p i n g t i s s u e s a t t h e t i m e o f t r e a t m e n t , among o t h e r f a c t o r s , may d e t e r m i n e t h e n a t u r e o f t h e t i s s u e r e s p o n s e . I n t h e p r e s e n t s t u d y , e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c y t o p l a s m i c e x t e n s i o n s i n t o e a c h o t h e r s t e r r i t o r y , a n d t h e i r c o n t a c t s w i t h one a n o t h e r w e r e o b s e r v e d f o l l o w i n g s u b l e t h a l i n j u r y . C y t o p l a s m i c e x t e n s i o n s o f t h e e p i t h e l i a l c e l l s a n d e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c o n t a c t s h a v e a l s o b e e n o b s e r v e d i n o t h e r s t u d i e s on t e r a t o g e n i n d u c e d c l e f t p a l a t e ( S h a h , 1 9 8 0 ; S h a h e t a l . , 1 9 8 4 a ) . I t was s u g g e s t e d t h a t t h e e x t e n s i o n o f e p i t h e l i a l c e l l p r o c e s s e s i n t o t h e mesenchyme i n c r e a s e d t h e s u r f a c e a r e a o f t h e c e l l t o r e c e i v e n u t r i e n t s f o l l o w i n g i n j u r y ( S h a h , 1 9 8 0 ) . In t h e p r e s e n t s t u d y t h e c e l l u l a r p r o j e c t i o n s a n d c o n t a c t s w e r e s e e n l a t e d u r i n g c l e f t p a l a t e d e v e l o p m e n t , i . e . , on day 1 2 : 1 8 o f g e s t a t i o n . A f t e r day 1 1 : 0 0 o f g e s t a t i o n t h e i n j u r e d e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c e l l s a p p e a r e d t o h a v e b e e n r e p a i r e d , a n d s t r u c t u r a l l y r e s e m b l e d t h e i r n o r m a l c o u n t e r p a r t s . F u r t h e r m o r e , m e s e n c h y m a l c y t o p l a s m i c e x t e n s i o n s a l s o e x t e n d e d i n t o t h e e p i t h e l i u m ( F i g . 4 7 ) . Thus i t i s u n l i k e l y t h a t t h e e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c y t o p l a s m i c p r o j e c t i o n s a n d c o n t a c t b e t w e e n t h e m , - 93 - a s o b s e r v e d i n t h e p r e s e n t s t u d y , d e v e l o p f o r n u t r i t i o n a l p u r p o s e s . E p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l c o m m u n i c a t i o n s h a v e b e e n c o n s i d e r e d t o p l a y an i m p o r t a n t r o l e d u r i n g n o r m a l d e v e l o p m e n t i n d e t e r m i n i n g t h e d i f f e r e n t i a t i o n a n d f a t e o f t h e p a l a t a l e p i t h e l i u m ( P o u r t o i s , 1 9 7 2 ; T y l e r a n d K o c h , 1977b; T y l e r a n d P r a t t , 1 9 8 0 ; S h a h e t a l . , 1 9 8 3 ; S h a h , 1 9 8 4 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t , f o l l o w i n g 6MP t r e a t m e n t , s i n c e t h e i n j u r e d e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c e l l s may h a v e d e v i a t e d f r o m t h e n o r m a l p a t h o f d i f f e r e n t i a t i o n , t h e y p r e p a r e d t h e m s e l v e s f o r • a new r o l e i n t h e c l e f t p a l a t e by c o m m u n i c a t i n g w i t h one a n o t h e r . The o b s e r v a t i o n s o f l i g h t c e l l s on day 1 3 : 1 8 o f g e s t a t i o n ( F i g . 4 7 ) may i n d e e d be t h e r e s p o n s e t o an e p i t h e l i a l - m e s e n c h y m a l i n t e r a c t i o n . A l t e r a t i o n s i n t h e c o n f i g u r a t i o n o f t h e b a s a l l a m i n a h a v e b e e n o b s e r v e d i n many p a t h o l o g i c a l a n d e x p e r i m e n t a l s i t u a t i o n s ( P e a r s o n a n d S p a r g o , 1 9 6 1 ; C a u l f i e l d a n d W i l g r a m , 1 9 6 2 ; J o h n s o n a n d F r y , 1 9 6 7 ; F r i t h i o f , 1 9 6 9 ; Woods a n d S m i t h , 1 9 6 9 , 1 9 7 0 ; V r a c k o , 1 9 7 2 , 1 9 7 9 ; T a r i n , 1 9 7 2 ; Y a m a n i s h i e t a l . , 1 9 7 2 ; S u g i m o t o e t a l . , 1 9 7 3 ; T a k a r a d a e t a l . , 1 9 7 4 ; M a r t i n e z - H e r n a n d e z e t a l . , 1 9 7 6 ; J a o e t a l . , 1 9 7 8 ; F r e i , 1 9 7 8 ; I n g b e r e t a l . , 1 9 8 1 ; W h i t e a n d G o h a r i , 1 9 8 1 ; O t s u b o a n d K a m e y a m a , 1 9 8 2 ; Y a s u z u m i e t a l . , 1 9 8 3 ) . The a l t e r a t i o n s i n c l u d e i r r e g u l a r i t i e s i n t h i c k n e s s , r e d u p l i c a t i o n , d e t a c h m e n t f r o m t h e b a s a l c e l l s , f r a g m e n t a t i o n a n d c o m p l e t e d i s a p p e a r a n c e . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e a l t e r a t i o n s i n t h e b a s a l l a m i n a w e r e s e e n l o n g a f t e r i n j u r y t o t h e e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c e l l s . The c h a n g e s w e r e c h a r a c t e r i z e d i n i t i a l l y by b r e a k s i n t h e c o n t i n u i t y o f t h e b a s a l l a m i n a f o l l o w e d by i t s t o t a l l o s s . S i m i l a r o b s e r v a t i o n s on t h e b a s a l l a m i n a c o n f i g u r a t i o n h a v e b e e n made f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h s e v e r a l t e r a t o g e n s ( M a t o e t a l . , 1 9 7 5 a , b ; S h a h a n d T r a v i l l , 1 9 7 6 b ; M o r g a n , 1 9 7 6 ; F e r g u s o n , 1 9 7 8 ; S h a h , 1 9 8 0 , 1 9 8 4 ; S h a h e t a l . , 1 9 8 4 a ) . - 94 - I n p a t h o l o g i c a l c i r c u m s t a n c e s , t h e f r a g m e n t a t i o n and l o s s o f b a s a l l a m i n a h a s b e e n r e l a t e d e i t h e r t o i t s d e s t r u c t i o n by e n z y m e s , o r t o a f a i l u r e o f e p i t h e l i a l c e l l s t o f o r m i t (Woods a n d S m i t h , 1 9 6 9 , 1 9 7 0 ; T a r i n , 1 9 7 2 ; Y a m a n i s h i e t a l . , 1 9 7 2 ; T a k a r a d a e t a l . , 1 9 7 4 ; M a r t i n e z - H e r n a n d e z e t a l . , 1 9 7 6 ; F r e i , 1 9 7 8 ; W h i t e a n d G o h a r i , 1 9 8 1 ) . A l t h o u g h t h e p r e s e n t s t u d y l a c k s e v i d e n c e t o s u p p o r t e i t h e r v i e w , t h e l a t t e r seems more p l a u s i b l e . A t t h e u l t r a s t r u c t u r a l l e v e l t h e r e was no e v i d e n c e t h a t l y s o s o m a l e n z y m e s e s c a p e d t h e e p i t h e l i a l a n d / o r m e s e n c h y m a l c e l l s t o a f f e c t t h e b a s a l l a m i n a . F r a g m e n t s o f c e l l u l a r m a t e r i a l , w h i c h a p p e a r e d t o b e e x p e l l e d f r o m t h e m e s e n c h y m a l c e l l s on day 1 0 : 0 6 o f g e s t a t i o n ( F i g . 4 1 ) w e r e membrane b o u n d , a n d i t i s d o u b t f u l t h a t e n z y m e s w o u l d e s c a p e d u r i n g t h e i r p h a g o c y t o s i s by m a c r o p h a g e s . F u r t h e r m o r e , f r o m a c h r o n o l o g i c a l v i e w p o i n t , t h e l y s o s o m e - m e d i a t e d c e l l u l a r i n j u r y s u b s i d e d by day 1 1 : 0 0 o f g e s t a t i o n , w h i l e e a r l y b a s a l l a m i n a c h a n g e s w e r e v i s i b l e f i r s t on day 1 2 : 1 8 o f g e s t a t i o n , i . e . , a f t e r 42 h o u r s . I t i s h i g h l y u n l i k e l y t h a t e n z y m e s w o u l d p e r s i s t e x t r a c e l l u l a r l y o v e r s u c h a l o n g d u r a t i o n . On t h e o t h e r h a n d , i t i s g e n e r a l l y a g r e e d t h a t t h e b a s a l l a m i n a i s an e p i t h e l i a l p r o d u c t ( K u r t z a n d F e l d m a n , 1 9 6 2 ; P e a r c e e t a l . , 1 9 6 3 ; B r i g g m a n e t a l . , 1 9 7 1 ; T i m p l e t a l . , 1 9 7 9 ; S t a n l e y e t a l . , 1 9 8 2 ) . A l t e r e d d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e e p i t h e l i a l c e l l s due t o s u b l e t h a l i n j u r y , a s i m p l i c a t e d i n t h e e a r l i e r p a r a g r a p h s , c o u l d a f f e c t t h e s y n t h e s i s o f m o l e c u l e s r e q u i r e d f o r b a s a l l a m i n a f o r m a t i o n and m a i n t e n a n c e , t h u s c a u s i n g t h e d e f e c t . M e r k e r e t a l . ( 1 9 7 5 ) i n d i c a t e d t h a t , f o l l o w i n g 6MP t r e a t m e n t , t h e m e s e n c h y m a l c e l l damage i n t h e d e v e l o p i n g r a t e m b r y o n i c l i m b bud o c c u r r e d a f t e r 5 h o u r s . T h e y f u r t h e r i n d i c a t e d t h a t t h e e p i t h e l i a l c e l l s w e r e n o t - 95 - a f f e c t e d . S c o t t e t a l . ( 1 9 8 0 ) , on t h e o t h e r h a n d , n o t e d t h a t t h e e f f e c t o f 6MP t r e a t m e n t on t h e r a t e m b r y o l i m b bud was o b s e r v e d i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l s , a n d t h e n i n t h e e p i t h e l i a l c e l l s , a f t e r 24 h o u r s . Adhami and Noack ( 1 9 7 5 ) , a n d Adhami ( 1 9 7 9 ) a l s o n o t e d a d u r a t i o n o f 24 h o u r s f o r 6MP t o a f f e c t t h e r a t e m b r y o n i c b r a i n t i s s u e s . O b s e r v a t i o n s o f t h e p r e s e n t s t u d y i n h a m s t e r show t h a t t h e i n i t i a l a d v e r s e e f f e c t o f 6MP i s s e e n a f t e r 24 h o u r s i n t h e m e s e n c h y m a l c e l l s , a n d l a t e r on i n t h e e p i t h e l i a l c e l l s . The d i f f e r e n c e i n t h e i n t e r v a l f o r c e l l u l a r r e s p o n s e o b s e r v e d by M e r k e r e t a l . ( 1 9 7 5 ) and o t h e r s may p o s s i b l y be a t t r i b u t e d t o t h e v e h i c l e u s e d t o i n j e c t t h e d r u g . M e r k e r e t a l . ( 1 9 7 5 ) u s e d 0 . 9 % NaCl and 2 . 5 % p r o p y l e n e g l y c o l t o a d m i n i s t e r 6MP, w h e r e a s Adhami a n d Noack ( 1 9 7 5 ) , Adhami ( 1 9 7 9 ) , S c o t t e t a l . ( 1 9 8 0 ) , and i n t h e p r e s e n t s t u d y w a t e r was u s e d a s a v e h i c l e f o r 6MP i n j e c t i o n . F u r t h e r m o r e S c o t t e t a l . ( 1 9 8 0 ) i n j e c t e d 6MP on day 1 1 : 0 0 w h e r e a s M e r k e r e t a l . ( 1 9 7 5 ) i n j e c t e d on day 1 2 : 0 0 o f g e s t a t i o n t o i n d u c e l i m b m a l f o r m a t i o n s . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e s e d i f f e r e n c e s i n v e h i c l e may a f f e c t t h e d u r a t i o n o f p l a c e n t a l t r a n s f e r , a n d t h a t o f m e t a b o l i s m o f 6MP i n t h e m a t e r n a l , p l a c e n t a l a n d f e t a l t i s s u e s , a n d h e n c e i n t h e e v e n t u a l t i m i n g s o f t h e t i s s u e r e s p o n s e . I t i s a l s o p o s s i b l e t h a t c e l l s a t t h e i n i t i a l s t a g e s o f d i f f e r e n t i a t i o n a r e h i g h l y s u s c e p t i b l e t o 6MP i n d u c e d i n j u r y ( M e r k e r e t a l . 1 9 7 5 ) . The p r o p o s i t i o n i s f u r t h e r s t r e n g t h e n e d by t h e o b s e r v a t i o n s t h a t 6MP a f f e c t e d t h e p r i m o r d i a l s t a g e o f t h e d e v e l o p m e n t o f l i m b ( M e r k e r e t a l . , 1 9 7 5 ; S c o t t e t a l . , 1 9 8 0 ) , a n d p a l a t e ( P r e s e n t s t u d y ) t o i n d u c e t h e m a l f o r m a t i o n s . As i n d i c a t e d i n t h e INTRODUCTION, s e v e r a l b i o c h e m i c a l p a t h w a y s h a v e b e e n s u g g e s t e d by w h i c h 6MP may e x e r t i t s a c t i o n . The m e c h a n i s m , h o w e v e r , by w h i c h 6MP a f f e c t s d i f f e r e n t i a t i n g c e l l s a n d t i s s u e s i n a d e v e l o p i n g e m b r y o i s - 96 - n o t k n o w n . I t i s s u g g e s t e d t h a t 6MP g o e s t h r o u g h t h e p l a c e n t a a n d i s a n a b o l i z e d by t h e f e t u s i n t o a c t i v e a n t i m e t a b o l i t e ( N e u b e r t e t a l . , 1 9 7 7 , 1 9 8 0 ) . The a c t i v a t e d a n t i m e t a b o l i t e t h e n may a f f e c t t h e c e l l u l a r f u n c t i o n s b y one o f t h e f o l l o w i n g m e c h a n i s m s : ( 1 ) d i r e c t l y a f f e c t i n g RNA s y n t h e s i s , e s p e c i a l l y t h a t o f mRNA a n d c o n s e q u e n t l y a f f e c t i n g p r o t e i n s y n t h e s i s ( R o y - B u r m a n , 1 9 7 0 ; N e u b e r t e t a l . , 1 9 7 0 ; Mewes e t a l . , 1 9 7 1 ; K a w a h a t a e t a l . , 1 9 8 0 ) , o r ( 2 ) i n t e r f e r e n c e w i t h DNA s y n t h e s i s e i t h e r v i a d i r e c t l y i n h i b i t i n g e n z y m e s s u c h a s a d e n y l o s u c c i n a t e s y n t h e t a s e , o r f e e d b a c k i n h i b i t i o n o f a m i n o t r a n s f e r a s e ( N e u b e r t e t a l . , 1 9 7 7 ) , t h u s a f f e c t i n g p u r i n e m e t a b o l i s m ( F i g . 2 ) ( E l i o n a n d H i t c h i n g s , 1 9 6 5 ; E l i o n , 1 9 6 7 ; R o y - B u r m a n , 1 9 7 0 ; M a l a m u d e t a l . , 1 9 7 2 ; P a t e r s o n a n d T i d d , 1 9 7 5 ; o r ( 3 ) by d i r e c t i n c o r p o r a t i o n i n t o DNA ( M a r t i n e t a l . , 1 9 7 2 ; T i d d and P a t e r s o n , 1 9 7 4 ; Zimmerman e t a l . , 1 9 7 4 ; B r e t e r a n d Z a h n , 1 9 7 9 ; D i n g and B e n e t , 1 9 7 9 ; L e n n a r d and M a d d o c k s , 1 9 8 3 ) . M e r k e r e t a l . ( 1 9 7 5 ) p r o p o s e d t h a t t h e r a p i d n e c r o s i s , w h i c h o c c u r s i n t h e l i m b mesenchyme w i t h i n 5 h o u r s a f t e r 6MP t r e a t m e n t c a n n o t be s o l e l y due t o r e d u c e d n u c l e i c a c i d s y n t h e s i s , b e c a u s e o t h e r r a p i d l y p r o l i f e r a t i n g t i s s u e s s u c h a s t h e e p i t h e l i u m a n d e n d o t h e l i u m w e r e n o t a f f e c t e d . They s u g g e s t e d t h a t t h e r a p i d e f f e c t o f 6MP may be due t o i n h i b i t i o n o f a s h o r t l i v e d s u b s t a n c e s u c h a s mRNA o r cAMP w h i c h p l a y a r o l e i n c a r r y i n g i n f o r m a t i o n f o r c y t o d i f f e r e n t i a t i o n . A l a c k o f a v a i l a b i l i t y o f s u c h a s u b s t a n c e , M e r k e r e t a l . ( 1 9 7 5 ) i n d i c a t e d , w o u l d n o t p r o d u c e i n f o r m a t i o n n e c e s s a r y f o r d i f f e r e n t i a t i o n a n d l e a d t o r e d u c e d p r o t e i n s y n t h e s i s a n d e v e n t u a l n e c r o s i s . I t i s u n l i k e l y , t h e r e f o r e , t h a t t h e i n i t i a l c e l l u l a r l e s i o n s o b s e r v e d i n t h e p r e s e n t s t u d y , a n d t h o s e o b s e r v e d e a r l i e r by Adhami a n d Noack ( 1 9 7 5 ) , Adhami ( 1 9 7 9 ) and S c o t t e t a l . ( 1 9 8 0 ) c o u l d be due t o r e d u c e d p r o t e i n s y n t h e s i s , - 97 - b e c a u s e t h e d u r a t i o n b e t w e e n d r u g a d m i n i s t r a t i o n a n d t h e i n i t i a l c e l l u l a r e f f e c t was l o n g (24 h o u r s ) . F u r t h e r m o r e , t h e r e was no e l e c t r o n m i c r o s c o p i c e v i d e n c e o f a l t e r a t i o n s i n t h e p r o t e i n s y n t h e t i c m a c h i n e r y o r i n t h e p o l y r i b o s o m a l c o n t e n t o f t h e e p i t h e l i a l and m e s e n c h y m a l c e l l s o f d e v e l o p i n g p a l a t a l p r i m o r d i a . H e n c e one may d e d u c e t h a t 1n t h e p r e s e n t s t u d y p e r h a p s 6MP d i d n o t d i r e c t l y a f f e c t mRNA a n d p r o t e i n s y n t h e s i s i n t h e p a l a t a l c e l l s , a s i m p l i c a t e d by M e r k e r e t a l . ( 1 9 7 5 ) f o r d i f f e r e n t i a t i n g l i m b m e s e n c h y m a l c e l l s . T a y l o r e t a l . ( 1 9 6 2 ) , W e b s t e r e t a l . ( 1 9 7 3 ) , S c o t t ( 1 9 7 7 ) and A d h a m i ( 1 9 7 9 ) s u g g e s t e d t h a t i f 6MP o r i t s m e t a b o l i t e s r a p i d l y i n h i b i t e d DNA s y n t h e s i s t h e f i r s t m o r p h o l o g i c a l l y d e m o n s t r a b l e l e s i o n c o u l d be e x p e c t e d w i t h i n a few h o u r s a f t e r d r u g a d m i n i s t r a t i o n . In t h e d e l a y e d c y t o t o x i c r e s p o n s e f o l l o w i n g 6MP a d m i n i s t r a t i o n , h o w e v e r , T i d d e t a l . ( 1 9 7 2 ) and H o r a k o v a e t a l . ( 1 9 7 4 ) s u g g e s t e d t h a t t h e c e l l s m u s t g o t h r o u g h t h e DNA s y n t h e s i s - p h a s e a t l e a s t o n c e . A l s o i n t h e i r s t u d y on t h e e f f e c t o f 6MP on HeLa c e l l s vn v i t r o H o r a k o v a e t a l . ( 1 9 7 4 ) o b s e r v e d t h a t f o l l o w i n g DNA s y n t h e s i s a n d m i t o s i s , HeLa c e l l s showed r e d u c e d DNA a n d RNA c o n t e n t p e r c e l l e v e n t u a l l y l e a d i n g t o c e l l damage o r n e c r o s i s . In t h e p r e s e n t s t u d y , t h e o b s e r v a t i o n t h a t a f t e r 6MP t r e a t m e n t t h e p a l a t a l p r i m o r d i a i n d e e d d e v e l o p e d , s u g g e s t s t h a t p e r h a p s a t l e a s t some o f i t s m e s e n c h y m a l a n d e p i t h e l i a l c e l l s may h a v e h a d t h e o p p o r t u n i t y t o u n d e r g o DNA s y n t h e s i s a n d m i t o s i s b e f o r e m a n i f e s t i n g i n j u r y c a u s e d by t h e d r u g o r i t s m e t a b o l i t e . The d e l a y e d c y t o t o x i c i t y t h u s may r e f l e c t i n c o r p o r a t i o n o f 6MP i n t o DNA a s p r o p o s e d by T i d d e t a l . ( 1 9 7 2 ) a n d T i d d a n d P a t e r s o n ( 1 9 7 4 ) . The m e c h a n i s m by w h i c h l y s o s o m e s d e v e l o p i n t h e m e s e n c h y m a l and e p i t h e l i a l c e l l s f o l l o w i n g 6MP a d m i n i s t r a t i o n , a n d how i t a f f e c t s - 98 - c y t o d i f f e r e n t i a t i o n i s n o t c l e a r . M e n k e s e t a l . ( 1 9 7 0 ) , S c o t t ( 1 9 7 7 ) , S c o t t e t a l . ( 1 9 8 0 ) a n d o t h e r s h a v e s u g g e s t e d t h a t t e r a t o g e n - i n d u c e d l y s o s o m a l a l t e r a t i o n s may a l t e r some p a t h w a y s i n v o l v e d i n c e l l u l a r d i f f e r e n t i a t i o n , w h i c h c o n s e q u e n t l y c a n d e l e t e o r i n j u r e one o r more c e l l u l a r f u n c t i o n s e s s e n t i a l f o r h i s t o - a n d m o r p h o d i f f e r e n t i a t i o n . I n f o r m a t i o n on m e t a b o l i c p a t h w a y s i n v o l v e d i n t h e e a r l y d i f f e r e n t i a t i o n o f p a l a t a l t i s s u e i s , h o w e v e r , v i r t u a l l y n o n - e x i s t e n t . I t i s p e r h a p s r e a s o n a b l e t o s u g g e s t t h a t 6MP i n d u c e d l y s o s o m e - m e d i a t e d s u b l e t h a l i n j u r y c o u l d p e r t u r b t h e i n t r a c e l l u l a r h o m e o s t a s i s , o r v i c e v e r s a , a n d s u b s e q u e n t l y a l t e r t h e p r o g r a m m e d d i f f e r e n t i a t i o n o f p a l a t a l mesenchyme and e p i t h e l i u m by a f f e c t i n g DNA s y n t h e s i s , e i t h e r by a f f e c t i n g p u r i n e m e t a b o l i s m , o r by d i r e c t i n c o r p o r a t i o n i n t o DNA ( F i g . 2 ) ( E l i o n and H i t c h i n g s , 1 9 6 5 ; E l i o n 1 9 6 7 ; T i d d and P a t e r s o n , 1 9 7 4 ) . E v e n t u a l l y t h e a s s a u l t e d c e l l s o f t h e p a l a t a l p r i m o r d i a , f o l l o w i n g t h e i r r e p a i r , may a d a p t t h e m s e l v e s f o r a d i f f e r e n t r o l e i n t h e c l e f t p a l a t e . F o r e g o i n g R E S U L T S a n d D I S C U S S I O N i n d i c a t e t h a t n o r m a l p a l a t a l d e v e l o p m e n t i n h a m s t e r c o n s i s t s o f an o r d e r l y s e q u e n c e o f e v e n t s i n v o l v i n g g r o w t h , d i f f e r e n t i a t i o n , a n d d e a t h a t b o t h c e l l u l a r and t i s s u e l e v e l s . 6MP t r e a t m e n t i n j u r e d f i r s t t h e m e s e n c h y m a l and t h e n t h e e p i t h e l i a l c e l l s o f t h e d e v e l o p i n g p a l a t a l p r i m o r d i a , w h i c h i n t u r n a p p e a r t o i r r e v e r s i b l y a l t e r t h e d i f f e r e n t i a t i o n o f c e l l s a n d t i s s u e s t o c a u s e t h e c l e f t p a l a t e . The r e g u l a t o r y m e c h a n i s m s o f c e l l and t i s s u e d i f f e r e n t i a t i o n d u r i n g n o r m a l p a l a t a l d e v e l o p m e n t , h o w e v e r , a r e o n l y p a r t i a l l y u n d e r s t o o d . A l s o , t h e b i o c h e m i c a l m e c h a n i s m ( s ) o f t h e a c t i o n o f 6MP on d e v e l o p i n g p a l a t a l t i s s u e s a n d c e l l s a r e s t i l l u n c l e a r . F u t u r e i n v e s t i g a t i o n s may b e d i r e c t e d t o w a r d u n d e r s t a n d i n g t h e s e m e c h a n i s m s b e f o r e t h e p a t h o g e n e s i s o f c l e f t p a l a t e f o l l o w i n g 6MP t r e a t m e n t c a n be c o m p l e t e l y d e f i n e d . - 99 - SUMMARY AND CONCLUSIONS 1. Formation of the secondary palate in hamster occurs in d i s t i n c t but sequential stages. 2. The age, weight, and crown-rump length of the fetus are r e l i a b l e indicators of stages of normal palatal development in hamster. 3. The i n i t i a l formation of the palatal shelves i s independent of tongue development. 4. The timely appearance of lysosomes play a crucial role in the autolytic elimination of medial edge e p i t h e l i a during palatal closure. 5. Macrophages are involved in removal of e p i t h e l i a l c e l l u l a r debris. 6. A single intraperitoneal i n j e c t i o n of 6-mercaptopurine on day 9:00 of gestation affects the v e r t i c a l development of palatal shelves, and thus produces c l e f t palate. 7. An association exists between the reduction in weight and crown-rump length of the fetus and the c l e f t palate. 8. At c e l l u l a r and subcellular l e v e l s , four main differences were observed which distinguished palatal development between the 6-mercaptopurine treated and control fetuses. In order of appearance in the treated palates, these were (a) alterations in the nuclear membrane, (b) premature appearance of lysosomes f i r s t in the mesenchymal, and then in the e p i t h e l i a l c e l l s , (c) subsequent changes in the e p i t h e l i a l c e l l s , and (d) alterations i n the basal lamina. - 100 - 9 . a d m i n i s t r a t i o n o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e i n d u c e s s u b l e t h a l i n j u r y i n t h e m e s e n c h y m a l and e p i t h e l i a l c e l l s d u r i n g v e r t i c a l d e v e l o p m e n t o f t h e p a l a t a l s h e l v e s . The i n j u r y a l t e r e d t h e p a t h o f c y t o d i f f e r e n t i a t i o n . 1 0 . The a l t e r a t i o n s i n t h e b a s a l l a m i n a w e r e s e c o n d a r y i n r e s p o n s e t o t h e e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l i n j u r y f o l l o w i n g 6 - m e r c a p t o p u r i n e t r e a t m e n t . 1 1 . I n h i b i t i o n o f DNA s y n t h e s i s f o l l o w i n g 6 - m e r c a p t o p u r i n e a d m i n i s t r a t i o n may h a v e d i s r u p t e d t h e p r o c e s s o f d i f f e r e n t i a t i o n i n b o t h t h e e p i t h e l i a l a n d m e s e n c h y m a l c e l l s a n d t h u s c a u s e d , c l e f t p a l a t e . - 101 - REFERENCES A b r a m o v i c i , A . , R a c h m u t h - F o r s c h m i d t , P . , L i b a n , E. a n d S a n d b a n k , U. 1 9 8 0 . E x p e r i m e n t a l l i m b d y s m o r p h o g e n e s i s a s a m o d e l o f c h e m i c a l i n j u r y r e s p o n s e i n u n d i f f e r e n t i a t e d e m b r y o n i c t i s s u e s : A l i g h t a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a l s t u d y . J . P a t h . 1 3 1 : 2 8 9 - 3 0 8 . A d a m s , C . E . , H a y , M . F . a n d L u t w a k - M a n n , C . 1 9 6 1 . The a c t i o n o f v a r i o u s a g e n t s u p o n t h e r a b b i t e m b r y o . J . E m b r y o l . e x p . M o r p h o l . 9 : 4 6 8 - 4 9 1 . A d h a m i , H. 1 9 7 9 . I n f l u e n c e o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e on t h e p r e n a t a l d e v e l o p m e n t o f t h e r a t c o r t e x . Z . m i k r o s k . a n a t . F o r s c h . , L e i p z i g 9 3 : 2 1 - 3 2 . A d h a m i , H. a n d N o a c k , W. 1 9 7 5 . H i s t o l o g i c a l e f f e c t s o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e on t h e f e t a l r a t c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m : A l i g h t m i c r o s c o p i c s t u d y . T e r a t o l o g y 1 1 : 2 9 7 - 3 1 2 . A n d e r s o n , H a n d M a t t h i e s s e n , M . 1 9 6 7 . H i s t o c h e m i s t r y o f t h e e a r l y d e v e l o p m e n t o f t h e human f a c e a n d n a s a l c a v i t y w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o t h e movement a n d f u s i o n o f t h e p a l a t i n e p r o c e s s e s . A c t a . A n a t . 6 8 : 4 7 3 - 5 0 8 . A n d r e w , F . D . a n d Z i m m e r m a n , E . F . 1 9 7 1 . G l u c o c o r t i c o i d i n d u c t i o n o f c l e f t p a l a t e i n m i c e ; no c o r r e l a t i o n w i t h i n h i b i t i o n o f m u c o p o l y s a c c h a r i d e s y n t h e s i s . T e r a t o l o g y 4 : 3 1 - 3 8 . A n g e l i c i , D . R . 1 9 6 8 . R e o p e n i n g o f f u s e d p a l a t a l s h e l v e s . C l e f t P a l a t e J . 5 : 2 0 5 - 2 1 0 . A n g e l i c i , D. a n d P o u r t o i s , M . 1 9 6 8 . The r o l e o f a c i d p h o s p h a t a s e i n t h e f u s i o n o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e . J . E m b r y o l . e x p . M o r p h o l . 2 0 : 1 5 - 2 3 . A r s t i l a , A . U . , H i r s i m a k i , P . a n d T r u m p , B . F . 1 9 7 4 . S t u d i e s on t h e s u b c e l l u l a r p a t h o p h y s i o l o g y o f s u b l e t h a l c h r o n i c c e l l i n j u r y . B e i t r . P a t h o l . 1 5 2 : 2 1 1 - 2 4 2 . A s i s i , A . a n d M e r k e r , H . J . 1 9 7 5 . A s p e c i f i c m a l f o r m a t i o n o f t h e e x t r e m i t i e s i n r a t s f o l l o w i n g a d m i n i s t r a t i o n o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e o n d a y 12 o f g e s t a t i o n ( G e r . ) . A r z n e i m i t t e l - F o r s c h . / D r u g R e s . 2 5 : 1 9 2 4 - 1 9 2 6 . A s l i n g , C . W . a n d V o n W a g e n e n , G. 1 9 6 7 . A n o t e o n d e v e l o p m e n t o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n r h e s u s monkey ( M a c a c a m u l a t t a ) . A r c h , o r a l B i o l . 1 2 : 9 0 9 - 9 1 0 . A s l i n g , C . W . , N e l s o n , M . M . , D o u g h e r t y , H . D . , W r i g h t , H . V . , E v a n s , H . M . 1 9 6 0 . The d e v e l o p m e n t o f c l e f t p a l a t e r e s u l t i n g f r o m m a t e r n a l p t e r o y l g l u t a m i c ( f o l i c ) a c i d d e f i c i e n c y d u r i n g t h e l a t t e r h a l f o f g e s t a t i o n i n r a t s . S u r g . G y n e c . O b s t . 1 1 1 : 1 9 - 2 8 . B a b i a r z , B . S . , A l l e n s p a c h , A . L . a n d Z i m m e r m a n , E . F . 1 9 7 5 . U l t r a s t r u c t u r a l e v i d e n c e o f c o n t r a c t i l e s y s t e m s i n mouse p a l a t e s p r i o r t o r o t a t i o n . D e v . B i o l . 4 7 : 3 2 - 4 4 . - 102 - B a e c k e l a n d , E, H e i n e n , E. a n d R e n a r d , A . M . 1 9 8 2 . M o b i l i t y o f Con A r e c e p t o r s a t t h e s u r f a c e o f p a l a t a l s h e l v e s b e f o r e c l o s u r e o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e . I n : l e c t i n s - B i o l o g y , B i o c h e m i s t r y , C l i n c i a l B i o c h e m i s t r y , V o l . I I , E d . T . C . B o g - H a n s e n , W a l t e r de G r u y t e r a n d C o . , B e r l i n , New Y o r k , p p . 2 9 5 - 3 0 4 B a r k a , T . a n d A n d e r s o n , P . J . 1 9 6 2 . H i s t o c h e m i c a l m e t h o d s f o r a c i d p h o s p h a t a s e u s i n g h e x a z o n i u m p a r a r o s a n i l i n a s a c o u p l e r . J . H i s t o e hem. C y t o . C h e m . 1 0 : 7 4 1 - 7 5 3 . B a r r y , A . 1 9 6 1 . D e v e l o p m e n t o f t h e b r a n c h i a l r e g i o n o f human e m b r y o s w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o t h e f a t e o f e p i t h e l i a . I n : C o n g e n i t a l A n o m a l i e s o f t h e F a c e a n d A s s o c i a t e d S t r u c t u r e s . E d . S . P r u z a n s k y , C C . T h o m a s , S p r i n g f i e l d , p p . 4 6 - 6 2 . B a u d , C . A . 1 9 6 3 . N u c l e a r membrane a n d p e r m e a b i l i t y . I n : I n t r a c e l l u l a r Membrane S t r u c t u r e . E d . S . S e n o a n d E . V . C o w d r y . Okayama P r e s s , O k a y a m a . B a x t e r , H . a n d F r a s e r , F . C . 1 9 5 0 . T h e p r o d u c t i o n o f c o n g e n i t a l d e f e c t s i n t h e o f f s p r i n g o f f e m a l e m i c e t r e a t e d w i t h c o r t i s o n e . M c G i l l M e d . J . 1 9 : 2 4 5 - 2 4 9 . B e k h o r , I . , M i r e l l , C . a n d A n n e , L . 1 9 7 8 . I n d u c t i o n o f c l e f t p a l a t e by t r i a m c i n o l o n e a c e t o n i d e : R e - e x a m i n a t i o n o f t h e p r o b l e m . C l e f t P a l a t e J . 1 5 : 2 2 0 - 2 3 2 . B e r k s o n , J . 1 9 5 7 . T a b l e s f o r u s e i n e s t i m a t i n g t h e n o r m a l d i s t r i b u t i o n f u n c t i o n by n o r m i t a n a l y s i s . B i o m e t r i k a 4 4 : 4 1 1 - 4 3 5 . B i e b e r , S . , N i g r e l l i , R . F . a n d H i t c h i n g s , G . H . 1 9 5 2 . E f f e c t s o f p u r i n e a n d p y r i m i d i n e a n a l o g u e s on d e v e l o p m e n t o f Rana p i p i e n s . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 7 9 : 4 3 0 - 4 3 2 . B i l s k i - P a s q u i e r , G . , C h a r o n , P . a n d B o u s s e r , J . 1 9 6 2 . L e u c o s e e t g r o s s e s s e . N o u v . R e v u e f r . H e m a t . 2 : 2 8 9 - 3 1 1 . B l a t t n e r , R . J . , W i l l i a m s o n , A . P . , S i m o n s e n , L. a n d R o b e r t s o n , G . G . 1 9 6 0 . T e r a t o g e n e s i s w i t h c a n c e r c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s . P e d i a t r i c s 5 6 : 2 8 5 - 2 9 3 . B o g g s , D . R . , W i n t r o b e , M . M . a n d C a r t w r i g h t , G . E . 1 9 6 2 . T h e a c u t e l e u k e m i a s . M e d i c i n e ( B a l t i m o r e ) 4 1 : 1 6 3 - 2 2 5 . B o l l e r t , J . A . a n d H e n d r i c k x , A . G . 1 9 7 1 . M o r p h o g e n e s i s o f t h e p a l a t e i n t h e b a b o o n ( P a p i o c y n o c e p h a l u s ) . T e r a t o l o g y 4 : 3 4 3 - 3 5 4 . B o n a i t i , C . , B r i a r d , M . L . , F e i n g o l d , J . , P a v y , B . , P s a u m e s , J . , M i g n e - T u f f e r a u d , G. a n d K a p l a n , J . 1 9 8 2 . An e p i d e m i o l o g i c a l a n d g e n e t i c s t u d y o f f a c i a l c l e f t i n g i n F r a n c e . I . E p i d e m i o l o g y a n d f r e q u e n c y i n r e l a t i v e s . J . M e d . G e n e t i c s 1 9 : 8 - 1 5 . - 103 - B o w e r , C . a n d S t a n l e y , F . J . 1 9 8 3 . W e s t e r n A u s t r a l i a n . c o n g e n i t a l m a l f o r m a t i o n s r e g i s t e r . M e d . J . A u s t . 2 : 1 8 9 - 1 9 1 . B r a g o n i e r , J . R . a n d C a r v e r , M . J . 1 9 6 8 . T h e i n f l u e n c e o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e on r a t p l a c e n t a a n d f e t u s . B i o c h e m . P h a r m o c o l . 1 7 : 1 6 8 9 - 1 6 9 7 . B r e t e r , H . J . a n d Z a h n , R . K . 1 9 7 9 . Q u a n t i t a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r m e t a b o l i t e s o f [ 3 5 S ] - 6 - m e r c a p t o p u r i n e i n L 5 1 7 8 4 c e l l s grown i n t i m e - c o u r s e i n c u b a t e s . C a n c e r R e s . 3 9 : 3 7 4 4 - 3 7 4 8 . B r i g g m a n , R . , D o l d o r f , F . G . a n d W h e e l e r , C F . 1 9 7 1 . F o r m a t i o n a n d o r i g i n o f b a s a l l a m i n a a n d a n c h o r i n g f i b r i l s i n a d u l t human s k i n . J . C e l l . B i o l . 5 1 : 3 8 4 - 3 9 5 . B r i n k l e y , L. 1 9 8 0 . I n v i t r o s t u d i e s on p a l a t a l e l e v a t i o n . I n : C u r r e n t R e s e a r c h T r e n d s i n P r e n a t a l C r a n i o f a c i a l D e v e l o p m e n t . E d . R . M . P r a t t a n d R . L . C h r i s t i a n s e n . E l s e v i e r - N o r t h H o l l a n d P r e s s , New Y o r k , p p . 2 0 1 - 2 2 0 . B r i n k l e y , L. 1 9 8 4 . R o l e o f e x t r a c e l l u l a r m a t r i x i n p a l a t a l d e v e l o p m e n t . C u r r . T o p i c s D e v . B i o l . 1 9 : 1 7 - 3 6 . B r i n k l e y , L . L . a n d V i c k e r m a n , M . M . 1 9 8 2 . T h e e f f e c t s o f c h l o r c y c l i z i n e - i n d u c e d a l t e r a t i o n s o f g l y c o s a m i n o g l y c a n s on mouse p a l a t a l s h e l f e l e v a t i o n i n v i v o a n d , i n v i t r o . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h o l . 6 9 : 1 9 3 - 2 1 3 . B r u s a t i , R. 1 9 6 9 . U l t r a s t r u c u t r a l s t u d y o f t h e p r o c e s s e s o f f o r m a t i o n a n d i n v o l u t i o n o f t h e e p i t h e l i a l s h e e t o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n t h e r a t . J . S u b m i c r . C y t o l . 1 : 2 1 5 - 2 3 4 . B u r d i , A . R . a n d F a i s t , K. 1 9 6 7 . M o r p h o g e n e s i s o f t h e p a l a t e i n n o r m a l human e m b r y o s w i t h s p e c i a l e m p h a s i s on t h e m e c h a n i s m s i n v o l v e d . Am. J . A n a t . 1 2 0 : 1 4 9 - 1 6 0 . B u r d i , A . R . a n d S i l v e y , R . G . 1 9 6 9 . S e x u a l d i f f e r e n c e s i n c l o s u r e o f t h e human p a l a t a l s h e l v e s . C l e f t p a l a t e J . 6 : 1 - 7 . B u r e s h , J . J . a n d U r b a n , T . J . 1 9 6 4 . The t e r a t o g e n i c e f f e c t o f t h e s t e r o i d n u c l e u s i n t h e r a t . J . D e n t . R e s . 4 3 : 5 4 8 - 5 5 4 . C a l a b r e s i , P. a n d P a r k s , R . E . J r . 1 9 7 5 . C h e m o t h e r a p y o f N e o p l a s t i c D i s e a s e s . I n : T h e P h a r m a c o l o g i c a l B a s i s o f T h e r a p e u t i c s . E d . L . S . G o o d m a n , a n d A . G i l m a n , 5 t h e d i t i o n , M a c M i l l a n , New Y o r k , p p . 1 2 5 4 - 1 3 0 7 . C a l l a s , G. a n d W a l k e r , B . E . 1 9 6 3 . P a l a t e m o r p h o g e n e s i s . i n mouse e m b r y o s a f t e r x - i r r a d i a t i o n . A n a t . R e c . 1 4 5 : 6 1 - 7 1 . C a u l f i e l d , J . B . a n d W i l g r a m , G . F . 1 9 6 2 . An e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d y o f b l i s t e r f o r m a t i o n i n e r y t h e m a m u l t i f o r m e . J . I n v e s t . D e r m a t o l . 3 9 : 3 0 7 - 3 1 6 . C h a p m a n , C . J . 1 9 8 3 . E t h n i c d i f f e r e n c e s i n t h e i n c i d e n c e o f c l e f t l i p a n d / o r c l e f t p a l a t e i n A u c k l a n d . 1 9 6 0 - 1 9 7 6 . New Z e a l a n d M e d . J . 9 6 : 3 2 7 - 3 2 9 . - 104 - C h a u d h r y , A . P . a n d S h a h , R . M . 1 9 7 3 . P a t h o g e n e s i s i n h a m s t e r I I . U l t r a s t r u c t u r a l o b s e r v a t i o n s o n t h e c l o s u r e o f p a l a t e . J . M o r p h . 1 3 9 : 3 2 9 - 3 5 0 . ' C h a u d h r y , A . P . a n d S h a h , R . M . 1 9 7 9 . L i g h t a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s on t h e c l o s u r e o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e w i t h t h e p r i m a r y p a l a t e a n d t h e n a s a l s e p t u m . A c t a A n a t . 1 0 3 : 3 8 4 - 3 9 4 . C h a u d h r y , A . P . , S c h w a r t z , D . , S c h w a r t z , S . a n d S c h m u t z J r . , J . A . 1 9 6 7 . Some a s p e c t s o f e x p e r i m e n t a l i n d u c t i o n o f c l e f t p a l a t e s . J . O r a l T h e r . 4 : 9 8 - 1 0 3 . C h u n g , C . S . , R a o , D . C . a n d C h i n g , G . H . S . 1 9 8 0 . P o p u l a t i o n a n d f a m i l y s t u d i e s o f c l e f t l i p a n d p a l a t e . P r o g . C l i n . B i o l . R e s . 4 6 : 3 2 5 - 3 5 2 . C l e a t o n - J o n e s , P . 1 9 7 6 . A s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e s t u d y o f t h e d e v e l o p i n g r a t s e c o n d a r y p a l a t e . S o u t h A f r i c a n J . M e d . S c i . 4 1 : 3 - 9 . C o l e m a n , R . D . 1 9 6 5 . D e v e l o p m e n t o f t h e r a t p a l a t e . A n a t . R e c . 1 5 1 : 1 0 7 - 1 1 7 . C o n s t a n t i n i d e s , P . 1 9 8 4 . U l t r a s t r u c t u r a l p a t h o b i o l o g y . E l s e v i e r , A m s t e r d a m . C o o p e r , R. 1 9 7 2 . A l t e r a t i o n s d u r i n g i m m o b i l i z a t i o n a n d r e g e n e r a t i o n o f s k e l e t a l m u s c l e i n c a t s . J . , B o n e J o i n t S u r g . 5 4 : 9 1 9 - 9 5 3 . C r a w f o r d , A . M . , K e r r , J . F . R . a n d C u r r i e , A . R . 1 9 7 2 . The r e l a t i o n s h i p o f a c u t e m e s o d e r m a l c e l l d e a t h t o t h e t e r a t o g e n i c e f f e c t s o f 7 - o h m - 1 2 - M B A i n t h e f o e t a l r a t . B r . J . C a n c e r 2 6 : 4 9 8 - 5 0 3 . C z e i z e l , A . 1 9 8 0 . S t u d i e s o f c l e f t l i p a n d c l e f t p a l a t e i n E a s t E u r o p e a n p o p u l a t i o n s . P r o g . C l i n . B i o l . R e s . 4 6 : 2 4 9 - 2 9 6 . D a g g , C P . 1 9 6 6 . T e r a t o g e n e s i s . I n : B i o l o g y o f t h e L a b o r a t o r y M o u s e . E d . E . L . G r e e n . M c G r a w - H i l l , New Y o r k , p p . 3 0 9 - 3 2 8 . D a n i e l , M . R . , D i n g l e , J . T . , - G l a u e r t , A . M . a n d L u c y , J . A . 1 9 6 6 . The a c t i o n o f e x c e s s v i t a m i n A a l c o h o l on t h e f i n e s t r u c t u r e o f r a t d e r m a l f i b r o b l a s t s . J . C e l l B i o l . 3 0 : 4 6 5 - 4 7 5 . De A n g e l i s , V . a n d N a l b a n d i a n , J . 1 9 6 8 . U l t r a s t r u c t u r e o f mouse a n d r a t p a l a t a l p r o c e s s e s p r i o r t o a n d d u r i n g s e c o n d a r y p a l a t e f o r m a t i o n . A r c h , o r a l B i o l . 1 3 : 6 0 1 - 6 0 8 . D e D u v e , C . 1 9 6 3 . The l y s o s o m e . S c i . Am. 2 0 8 : 6 4 - 7 2 . D e l B a l s o , A . M . a n d K a u f f m a n , F . C . 1 9 7 5 . The e f f e c t o f e - a m i n o p r o p i o n i t r i l e o n a c i d h y d r o l a s e s a n d s e l e c t e d m e t a b o l i t e s i n o r o - f a c i a l s t r u c t u r e o f f o e t a l r a t s . A r c h s . o r a l B i o l . 2 0 : 2 5 1 - 2 5 5 . - 105 - De P a o l a , D . , Drummond, J . , L o r e n t e , C , Z a r b o , R. a n d M i l l e r , S . A . 1 9 7 5 . G l y c o p r o t e i n b i o s y n t e h s i s a t t h e t i m e o f p a l a t e f u s i o n by r a b b i t p a l a t e a n d m a x i l l a c u l t u r e d i n v i t r o . J . D e n t . R e s . 5 4 : 1 0 4 9 - 1 0 5 5 . De S e s s o , J . M . 1 9 8 1 . C o m p a r a t i v e u l t r a s t r u c t u r a l a l t e r a t i o n s i n r a b b i t l i m b - b u d s a f t e r a t e r a t o g e n i c d o s e o f e i t h e r h y d r o x y u r e a o r m e t h o t r e x a t e . T e r a t o l o g y 2 3 : 1 9 7 - 2 1 5 . D i a m o n d , I . , A n d e r s o n , M . M . a n d M c C r e a d i e , S . 1 9 6 0 . T r a n s p l a c e n t a l t r a n s m i s s i o n o f b u s u l f a n ( M y l e r a n ) i n a m o t h e r w i t h l e u k e m i a . P e d i a t r i c s 2 5 : 8 5 - 9 0 . D i d c o c k , K . , J a c k s o n , D a n d R o b s o n , J . M . 1 9 5 6 . T h e - a c t i o n o f some n u c l e o t o x i c s u b s t a n c e s o n p r e g n a n c y . B r i t . J . P h a r m a c o l . 1 1 : 4 3 7 - 4 4 1 . D i e w e r t , V . M . 1 9 7 4 . A c e p h a l o m e t r i c s t u d y o f o r o f a c i a l s t r u c t u r e s d u r i n g s e c o n d a r y p a l a t e c l o s u r e i n t h e r a t . A r c h . O r a l B i o l . 1 9 : 3 0 3 - 3 1 5 . D i e w e r t , V . M . 1 9 7 9 . C o r r e l a t i o n b e t w e e n m a n d i b u l a r r e t r o g n a t h i a a n d i n d u c t i o n o f c l e f t p a l a t e w i t h 6 - a m i n o n i c o t i n a m i d e i n t h e r a t . T e r a t o l o g y , 1 9 : 2 1 3 - 2 2 8 . D i e w e r t , V . M . a n d P r a t t , R . M . 1 9 7 9 . S e l e c t i v e i n h i b i t i o n o f m a n d i b u l a r g r o w t h a n d i n d u c t i o n o f c l e f t p a l a t e by d i a z o - o x o - n o r l e u c i n e (DON) i n t h e r a t . T e r a t o l o g y 2 0 : 3 7 - 5 2 . D i n g , T . L . a n d B e n e t , L . Z . 1 9 7 9 . D e t e r m i n a t i o n o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e a n d a z a t h i o p r i n e i n p l a s m a by h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y . J . c h r o m a t o g r . 1 6 3 : 2 8 1 - 2 8 8 . D o n e l l i , M . G . , C o l o m b o , T . , F o r g i o n e , A . a n d G a r a t t i n i , S . 1 9 7 2 . D i s t r i b u t i o n o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e i n t u m o u r - b e a r i n g a n i m a l s . P h a r m a c o l o g y 8 : 3 1 1 - 3 2 0 . D o s t a l , M . a n d J e l i n e k , R. 1 9 7 0 . T h e m o r p h o g e n e s i s o f c l e f t p a l a t e i n d u c e d by e x o g e n o u s f a c t o r s . I I . I n d u c t i o n o f c l e f t by c o r t i s o n e i n r a n d o m b r e d m i c e . A c t a C h i r u r g i a e P l a s t i c a e 1 2 : 2 0 6 - 2 0 8 . D o s t a l , M . a n d J e l i n e k , R. 1 9 7 1 . I n d u c t i o n o f c l e f t p a l a t e i n r a t s w i t h i n t r a - a m n i o t i c c o r t i c o i d s . N a t u r e 2 3 0 : 4 6 4 . D o s t a l , M . a n d J e l i n e k , R. 1 9 7 2 . M o r p h o g e n e s i s o f c l e f t p a l a t e i n d u c e d by e x o g e n o u s f a c t o r s V . Q u a n t i t a t i v e s t u d y o f t h e p r o c e s s o f p a l a t a l c l o s u r e o f d i f f e r e n t s t r a i n s o f m i c e . F o l i a M o r p h . 2 0 : 3 6 2 - 3 7 4 . D r y d e n , R. 1 9 7 7 . B e f o r e B i r t h . H e i n e m a n n E d u c a t i o n a l B o o k s , L o n d o n , p p . 5 3 - 5 4 . D u r s y , E . 1 8 6 9 . Z u r e n t w i c k l u n g s g e s c h i c h t e d e s k o p f e s d e s menshen u n d d e r h o h e r e n w i r b e l t i e r e . V e r l a g d e r H. L a u p p s c h e n B u c h h a n d l u n g , T u b i g e n . - 106 - E l i o n , G . B . 1 9 6 7 . B i o c h e m i s t r y a n d p h a r m a c o l o g y o f p u r i n e a n a l o g u e s . F e d . P r o c . F e d . Am. S o c . E x p . B i o l . 2 6 : 8 9 8 - 9 0 3 . E l i o n , G . B . a n d H i t c h i n g s , G . H . 1 9 6 5 . M e t a b o l i c b a s i s f o r t h e a c t i o n o f a n a l o g s o f p u r i n e s a n d p y r i m i d i n e s . A d v . c h e m o t h e r a p . 2 : 9 1 - 1 7 7 . E l i o n , G . B . , B u r g i , E . a n d H i t c h i n g s , G . H . 1 9 5 2 . S t u d i e s on c o n d e n s e d p y r i m i d i n e s y s t e m s . I X . The s y n t h e s i s o f some 6 - s u b s t i t u t e d p u r i n e s . J . Am. Chem. S o c . 7 4 : 4 1 1 - 4 1 4 . E l i o n , G . B . , C a l l a h a n , S . , R u n d l e s , R . W . a n d H i t c h i n g s , G . H . 1 9 6 3 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n m e t a b o l i c r a t e s a n d a n t i t u m o r a c t i v i t i e s o f t h i o p u r i n e s . C a n c e r R e s . 2 3 : 1 2 0 7 - 1 2 1 7 . E l i z o r a v a , N . A . a n d S t u p n i t s k a y a , V . M . 1 9 6 2 . L e u k e m i a i n P r e g n a n c y ( R u s s . ) K l i n . M e d . ( M o s k . ) 4 0 : 1 0 4 - 1 0 6 . E l w o o d , J . M . a n d R o g e r s , J . R . 1 9 7 5 . The i n c i d e n c e o f c o n g e n i t a l a b n o r m a l i t i e s i n B r i t i s h C o l u m b i a , A l b e r t a , M a n i t o b a a n d New B r u n s w i c k , 1 9 6 6 - 1 9 6 9 . C a n . J . P u b l i c H e a l t h 6 6 : 4 7 1 - 4 7 6 . E r i c k s o n , J . L . E . 1 9 6 9 . M e c h a n i s m o f c e l l u l a r a u t o p h a g y . I n : L y s o s o m e s i n B i o l o g y a n d P a t h o l o g y . E d . J . T . D i n g l e a n d H . B . F e l l . N o r t h - H o l l a n d P u b l i s h i n g C o . , A m s t e r d a m p p . 3 4 5 - 3 9 4 . F a b r o , S . ( 1 9 8 3 ) R e p r o d u c t i v e t o x i c o l o g y : S t a t e o f t h e a r t , 1 9 8 2 . P r o g . C l i n . B i o l . R e s . 1 1 7 : 3 9 1 - 3 9 3 . F a i r w e a t h e r , D . V . I . 1 9 8 2 . S c r e e n i n g i n p r e g n a n c y f o r c o n g e n i t a l a b n o r m a l i t y . B r i t . J . H o s p . M e d . 2 7 : 6 0 1 - 6 0 7 . F a r a , M . 1 9 7 1 . C o n g e n i t a l d e f e c t s i n t h e h a r d p a l a t e . P l a s t . R e c o n s t r . S u r g . 4 8 : 4 4 - 4 7 . F a r b m a n , A . I . 1 9 6 8 . E l e c t r o n m i c r o s c o p e s t u d y o f p a l a t a l f u s i o n i n mouse e m b r y o s . D e v . B i o l . 1 8 : 9 3 - 1 1 6 . F a r b m a n , A . I . 1 9 6 9 . The e p i t h e l i u m - c o n n e c t i v e t i s s u e i n t e r f a c e d u r i n g c l o s u r e o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n r o d e n t e m b r y o s . J . D e n t . R e s . 4 8 : 6 1 7 - 6 2 4 . F e r g u s o n , M . W . J . 1 9 7 7 . The m e c h a n i s m o f p a l a t a l s h e l f e l e v a t i o n a n d t h e p a t h o g e n e s i s o f c l e f t p a l a t e . V i r c h o w s A r c h . A . p a t h . A n a t . H i s t o l . 3 7 5 : 9 7 - 1 1 3 . F e r g u s o n , M . W . J . 1 9 7 8 . P a l a t a l s h e l f e l e v a t i o n i n t h e W i s t a r r a t f e t u s . J . A n a t . 1 2 5 : 5 5 5 - 5 7 7 . F e r g u s o n , M . W . J . 1 9 8 1 . The s t r u c t u r e a n d d e v e l o p m e n t o f t h e p a l a t e i n A l l i g a t o r m i s s i s s i p p i e n s i s . A r c h s . o r a l B i o l . 2 6 : 4 2 7 - 4 4 3 . - 107 - F l i n t , O . P . 1 9 8 0 . C e l l b e h a v i o u r a n d c l e f t p a l a t e i n t h e m u t a n t m o u s e , a m p u t a t e d . J . E m b r y o l . e x p . M o r p h . 5 8 : 1 3 1 - 1 4 2 . F r a n k e , W.W. 1 9 7 4 . S t r u c t u r e , b i o c h e m i s t r y a n d f u n c t i o n s o f t h e n u c l e a r e n v e l o p e . I n t . R e v . C y t o l . S u p p l . 4 : 7 2 - 2 3 6 . F r a n k e , W. 1 9 7 4 . N u c l e a r e n v e l o p e s : S t r u c t u r e a n d b i o c h e m i s t r y o f t h e n u c l e a r e n v e l o p e . P h i l . T r a n s . R o y . S o c . ( L o n d o n ) S e r B 2 6 8 : 6 7 - 9 3 . F r a n k e , W.W. a n d S c h e e r , U. 1 9 7 4 . The C e l l N u c l e u s . I n : S t r u c t u r e s a n d f u n c t i o n s o f t h e n u c l e a r e n v e l o p e . E d . H. B u s c h , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k a n d L o n d o n , p p . 2 2 0 - 3 2 8 . F r a n k e , W . W . , S c h e e r , U . , K r o h n e , G. a n d J a r a s c h , E . D . 1 9 8 1 . T h e n u c l e a r e n v e l o p e a n d t h e a r c h i t e c t u r e o f t h e n u c l e a r p e r i p h e r y . J . C e l l B i o l . 9 1 : 3 9 3 - 5 0 3 . F r a s e r , F . C . a n d F a i n s t a t , T . D . 1 9 5 1 . P r o d u c t i o n o f c o n g e n i t a l d e f e c t s i n t h e o f f s p r i n g o f p r e g n a n t m i c e t r e a t e d w i t h c o r t i s o n e . P e d i a t r i c s 8 : 5 2 7 - 5 3 3 . F r a s e r , J . E . S . 1 9 4 7 . A m a n u a l o f e m b r y o l o g y : T h e d e v e l o p m e n t o f human b o d y . W i l l i a m s a n d W i l k i n s , B a l t i m o r e , p p . 2 8 3 - 2 8 5 . F r e i , J . V . 1 9 7 8 . O b j e c t i v e m e a s u r e m e n t o f b a s e m e n t membrane a b n o r m a l i t i e s i n human n e o p l a s m o f c o l o r e c t u m a n d o f b r e a s t . H i s t o p a t h o l o g y 2 : 1 0 7 - 1 1 5 . F r e n k e l , E . P . a n d M e y e r s , M . C . 1 9 6 0 . A c u t e l e u k a e m i a a n d p r e g n a n c y . A n n . I n t . M e d . 5 3 : 6 5 6 - 6 7 1 . F r i t h i o f , L . 1 9 6 9 . U l t r a s t r u c t u r e o f t h e b a s e m e n t membrane i n n o r m a l a n d h y p e r p l a s t i c human o r a l e p i t h e l i u m c o m p a r e d w i t h t h a t i n p r e i n v a s i v e a n d i n v a s i v e c a r c i n o m a . A c t a P a t h . M i c r o b i o l . S c a n d . ( S u p p l . ) 2 0 0 : 3 - 6 3 . F u l t o n , J . T . 1 9 5 7 . C l o s u r e o f t h e human p a l a t e i n e m b r y o . Am. J . o b s t . G y n e c . 7 4 : 1 7 9 - 1 8 2 . G e d i g k , P . a n d T o t o v i c , V . 1 9 8 3 . L y s o s o m e s a n d L i p o p i g m e n t s . I n : C e l l u l a r P a t h o b i o l o g y o f Human D i s e a s e . E d . B . F . T r u m p , A . L a u f e r , a n d R . T . J o n e s , G u s t a v F i s c h e r , New Y o r k . G i r o u d , A . a n d M a r t i n e t , M . 1 9 5 6 . M a l f o r m a t i o n s d e l a f a c e e t h y p e r v i t a m i n o s e A . R e v . S t o m a t o l . 5 7 : 4 5 4 - 4 6 3 . G l a u e r t , A . M . , D a n i e l , M . R . , L u c y , J . A . , D i n g l e , J . T . 1 9 6 3 . S t u d i e s on t h e mode o f a c t i o n o f e x c e s s v i t a m i n A . V I I . C h a n g e s i n t h e f i n e s t r u c t u r e o f e r y t h r o c y t e s d u r i n g h a e m o l y s i s . J . C e l l B i o l . 1 7 : 1 1 1 - 1 2 1 . G o l d m a n , A . , S h a p i r o , B . a n d K a t s u m a t a , M . 1 9 7 8 . Human f e t a l p a l a t a l c o r t i c o i d r e c e p t o r s a n d t e r a t o g e n s f o r c l e f t p a l a t e . N a t u r e ( L o n d o n ) 2 7 2 : 4 6 4 - 4 6 6 . - 108 - G o l d m a n , A . S . , B a k e r , M . A . , P i d d i n g t o n , R. a n d H e r o l d , R. 1 9 8 3 . I n h i b i t i o n o f p r o g r a m m e d c e l l d e a t h i n mouse e m b r y o n i c p a l a t e Jjn v i t r o by C o r t i s o l a n d p h e n y t o i n : R e c e p t o r i n v o l v e m e n t a n d r e q u i r e m e n t o f p r o t e i n s y n t h e s i s . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 1 7 4 : 2 3 9 - 2 4 3 . G o l d m a n , A . , K a t s u m a t a , M . , Y a f f e , S . a n d G a s s e r , D. 1 9 7 7 . P a l a t a l c y t o s o l c o r t l s o l - b i n d i n g p r o t e i n a s s o c i a t e d w i t h c l e f t p a l a t e s u s c e p t i b i l i t y a n d H-2 g e n o t y p e . N a t u r e ( L o n d o n ) , 2 6 5 : 6 4 3 - 6 4 5 . G o l d s t e i n , L . 1 9 7 4 . M o v e m e n t o f m o l e c u l e s b e t w e e n n u c l e u s a n d c y t o p l a s m . I n : T h e c e l l n u c l e u s V o l . 1 . E d . H. B u s c h , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k p p . 3 8 8 - 4 4 0 . G o s s , A . N . 1 9 7 5 . Human p a l a t a l d e v e l o p m e n t i n v i t r o . C l e f t P a l a t e J . 1 2 : 2 1 0 - 2 2 1 . G r e e n e , R . M . 1 9 8 3 . H o r m o n a l i n v o l v e m e n t i n p a l a t a l d i f f e r e n t i a t i o n . I n : H a n d b o o k o f E x p e r i m e n t a l P h a r m a c o l o g y V o l . 6 5 . T e r a t o g e n e s i s a n d R e p r o d u c t i v e T o x i c o l o g y . E d . E . M . J o h n s o n a n d D . M . K o c h h a r , S p r i n g e r - V e r l a g , B e r l i n , p p . 7 5 - 9 2 . G r e e n e , R . M . a n d K o c h h a r , D . M . 1 9 7 3 . P a l a t a l c l o s u r e i n t h e mouse a s d e m o n s t r a t e d i n f r o z e n s e c t i o n s . Am. J . A n a t . 1 3 7 : 4 7 7 - 4 8 2 . G r e e n e , R . M . a n d K o c h h a r , "D.M. 1 9 7 4 . S u r f a c e c o a t on t h e e p i t h e l i u m o f d e v e l o p i n g p a l a t i n e s h e l v e s i n t h e mouse a s r e v e a l e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h . 3 1 : 6 8 3 - 6 9 2 . G r e e n e , R . M . a n d P r a t t , R . M . 1 9 7 6 . D e v e l o p m e n t a l a s p e c t s o f s e c o n d a r y p a l a t e f o r m a t i o n . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h . 3 6 : 2 2 5 - 2 4 5 . G r e e n e , R . M . a n d P r a t t , R . M . 1 9 7 7 . I n h i b i t i o n b y d i a z o - o x o - n o r l e u c i n e (DON) o f r a t p a l a t a l g l y c o p r o t e i n s y n t h e s i s a n d e p i t h e l i a l c e l l a d h e s i o n i n v i t r o . E x p . C e l l R e s . 1 0 5 : 2 7 - 3 7 . G r e e n e , R . M . a n d P r a t t , R . M . 1 9 7 8 . I n h i b i t i o n o f e p i t h e l i a l c e l l d e a t h i n t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n v i t r o by a l t e r a t i o n o f l y s o s o m a l f u n c t i o n . J . H i s t o c h e m . C y t o c h e m . 2 6 T T 1 0 9 - 1 1 1 4 . G r e e n e , R . M . a n d P r a t t , R . M . 1 9 7 9 . C o r r e l a t i o n b e t w e e n c y c l i c AMP l e v e l s a n d c y t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f a d e n y l a t e c y c l a s e d u r i n g d e v e l o p m e n t o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e . J . H i s t o c h e m . C y t o c h e m . 2 7 : 9 2 4 - 9 3 1 . G r e e n e , R . M . , L l o y d , M . R . a n d N i c o l a o u , K . C . 1 9 8 1 . A g o n i s t - s p e c i f i c d e s e n s i t i z a t i o n o f p r o s t a g l a n d i n s t i m u l a t e d c y c l i c AMP a c c u m u l a t i o n i n p a l a t a l m e s e n c h y m a l c e l l s . J . C r a n i o f a c i a l G e n e t . D e v . B i o l . 1 : 2 6 1 - 2 7 2 . G r e e n e , R . M . , M a c A n d r e w , V . I a n d L l o y d , M . R . 1 9 8 2 . S t i m u l a t i o n o f p a l a t a l g l y c o s a m i n o g l y c a n s y n t h e s i s by c y c l i c AMP. B i o c . B i o p h . R e s . Comm. 1 0 7 : 2 3 2 - 2 3 8 . - 1 0 9 - G r e e n e , R . M . , S h a n f e l d , J . L . , D a v i d o v i t c h , Z . a n d P r a t t , R . M . 1 9 8 0 . I m m u n o h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f c y c l i c AMP i n t h e d e v e l o p i n g r o d e n t s e c o n d a r y p a l a t e . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h o l . 6 0 : 2 7 1 - 2 8 1 . G r e e n e , R . M . , G o l d m a n , A . S . , L l o y d , M . , B a k e r , M . , B r o w n , K . S . , S h a n f e l d , J . L . a n d D a v i d o v i t c h , Z . 1 9 8 1 . G l u c o c o r t i c o i d i n h i b i t i o n o f c y c l i c AMP i n t h e d e v e l o p i n g s e c o n d a r y p a l a t e . J . C r a n i o f a c i a l G e n e t . D e v . B i o l . 1 : 3 1 - 4 4 . G r i n g a u z , A . 1 9 7 8 . D r u g s : How t h e y a c t a n d w h y . C V . Mosby C o . , S t . L o u i s . G r u b b , R . B . a n d M o n t i e g e l , E . L . 1 9 7 5 . The t e r a t o g e n i c e f f e c t s o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e o n c h i c k e m b r y o i n o v o . T e r a t o l o g y 1 1 : 1 7 9 - 1 8 6 . G u l a m h u s e i n , A . P . a n d E n g l a n d , M . A . 1 9 8 2 . The d e v e l o p i n g f e r r e t p a l a t e - A s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e s t u d y : 1 . P r i m a r y p a l a t e a n d s e c o n d a r y p a l a t a l s h e l v e s . J . C r a n i o f a c i a l G e n e t . D e v . B i o l . 2 : 1 0 7 - 1 2 3 . H a l e , F . 1 9 3 3 . P i g s b o r n w i t h o u t e y e b a l l s . J . H e r e d . 2 4 : 1 0 5 - 1 0 6 . H a l e , F . 1 9 3 5 . The r e l a t i o n o f v i t a m i n A t o a n o p h t h a l m o s i n p i g s . Am. J . O p h t h . 1 8 : 1 0 8 7 - 1 0 9 3 . H a l e , F . 1 9 3 7 . The r e l a t i o n o f m a t e r n a l v i t a m i n A d e f i c i e n c y t o m i c r o p h t h a l m i a i n p i g s . T e x a s J . M e d . 3 3 : 2 2 8 - 2 3 2 . H a m i l t o n , L. a n d E l i o n , G . B . 1 9 5 4 . The f a t e o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e i n m a n . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 6 0 : 3 0 4 - 3 1 4 . H a s s e l , J . R . 1 9 7 5 . The d e v e l o p m e n t o f r a t p a l a t a l s h e l v e s i n v i t r o . An u l t r a s t r u c t u r a l a n a l y s i s o f t h e i n h i b i t i o n o f e p i t h e l i a l c e D d e a t h a n d p a l a t e f u s i o n by t h e e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r . D e v . B i o l . 4 5 , 9 0 - 1 0 2 . H a s s e l , J . R . a n d P r a t t , R . M . 1 9 7 7 . E l e v a t e d l e v e l s o f cAMP a l t e r s t h e e f f e c t o f e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r i n v i t r o on p r o g r a m m e d c e l l d e a t h i n t h e s e c o n d a r y p a l a t a l e p i t h e l i u m . E x p . T e l l R e s . 1 0 6 : 5 5 - 6 2 . H a y w a r d , A . F . 1 9 6 9 . U l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e s i n t h e e p i t h e l i u m d u r i n g f u s i o n o f t h e p a l a t a l p r o c e s s e s i n r a t s . A r c h s . o r a l B i o l . 1 4 : 6 6 1 - 6 7 8 . H a y w a r d , J . R . a n d A v e r y , J . 1 9 5 7 . A v a r i a t i o n i n c l e f t p a l a t e . J . O r a l S u r g . 1 5 : 3 2 0 - 3 2 6 . H e i n e n , E . , B a e c k e l a n d , E . a n d R e n a r d , A . M . 1 9 8 2 . The r o l e o f t h e c e l l c o a t i n p a l a t a l s h e l v e s a d h e s i o n . T h e a c t i o n o f n e u r a m i n i d a s e o r L i m u l u s p o l y p h e m u s l e c t i n on s h e l v e s c u l t i v a t e d i n v i t r o . I n : L e c t i n s - B i o l o g y , B i o c h e m i s t r y , C l i n i c a l B i o c h e m i s t r y , V o l . TT, E d . T . C . B o g - H a n s e n , W a l t e r de G r u y t e r a n d C o . , B e r l i n , New Y o r k , p p . 2 8 5 - 2 9 4 . - 110 - H e m m i n k i , K . , A x e l s o n , 0 . , N i e m i , M . L . a n d A h l b o r g , G. 1 9 8 3 . A s s e s s m e n t o f m e t h o d s a n d r e s u l t s o f r e p r o d u c t i v e o c c u p a t i o n a l e p i d e m i o l o g y : S p o n t a n e o u s a b o r t i o n s a n d m a l f o r m a t i o n s i n t h e o f f s p r i n g o f w o r k i n g women. P r o g . C l i n . B i o l . R e s . 1 1 7 : 2 9 3 - 3 0 7 . H e r k e n , R . , M e r k e r , H . J . a n d K r o w k e , R. 1 9 7 8 . I n v e s t i g a t i o n o f t h e e f f e c t o f h y d r o x y u r e a on t h e c e l l c y c l e a n d t h e d e v e l o p m e n t o f n e c r o s i s i n t h e e m b r y o n i c CNS o f m i c e . T e r a t o l o g y 1 8 : 1 0 3 - 1 1 8 . H i l l , J . M . c i t e d by Y a h i a , C , Hyman, G . A . a n d P h i l l i p s , L . L . 1 9 5 8 . A c u t e l e u k e m i a a n d p r e g n a n c y . O b s t e t . G y n e c . S u r v . 1 3 : 1 - 2 1 . H i l l , J . M . a n d L o e b , E. c i t e d by S o k a l a n d L e s s m a n n 1 9 6 0 . E f f e c t s o f c a n c e r c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s on t h e human f e t u s . JAMA 1 7 2 : 1 7 6 5 - 1 7 7 1 . H i n r i c h s e n , C . F . L . a n d S t e v e n s , G . S . 1 9 7 4 . E p i t h e l i a l m o r p h o l o g y d u r i n g c l o s u r e o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n t h e r a t . A r c h s . o r a l B i o l . 1 9 : 9 6 9 - 9 8 0 . H i r s c h , K. and H u r l e y , L . S . 1 9 7 8 . R e l a t i o n s h i p o f d i e t a r y z i n c t o 6 - m e r c a p t o p u r i n e t e r a t o g e n e s i s a n d DNA m e t a b o l i s m i n t h e r a t . T e r a t o l o g y 1 7 : 3 0 3 - 3 1 4 . H o l m s t e d t , J . O . V . and B a g w e l l , J . N . 1 9 7 7 . M o r p h o g e n e s i s o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n t h e m o n g o l i a n g e r b i l ( M e r i o n e s u n g u i c u l a t u s ) . A c t a A n a t . 9 7 : 4 4 3 - 4 4 9 . H o i s t , P . a n d M i l l s , B . 1 9 7 5 . T i s s u e p h o s p h a t a s e c h a n g e s f o l l o w i n g t r i a m c i n o l o n e a s s o c i a t e d w i t h c l e f t p a l a t e i n r a t s . T e r a t o l o g y 1 1 : 5 7 - 6 4 . H o o v e r , B . A . a n d S c h u m a c h e r 1 9 6 6 . A c u t e l e u k a e m i a i n p r e g n a n c y . Am. J . O b s t . G y n e c . 9 6 : 3 1 6 - 3 2 0 . H o r a k o v a , K . , N a v a r o v a , J . a n d P a t e r s o n , A . R . P . 1 9 7 4 . The d e l a y e d c y t o t o x i c e f f e c t of 6 - m e r c a p t o p u r i n e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 3 6 6 : 3 3 0 - 3 4 0 . H u d s o n , C . a n d S h a p i r o , B . L . 1 9 7 3 . A r a d i o a u t o g r a p h i c s t u d y o f d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d s y n t h e s i s i n e m b r y o n i c r a t p a l a t a l s h e l f e p i t h e l i u m w i t h r e f e r e n c e t o t h e c o n c e p t o f p r o g r a m m e d c e l l d e a t h . A r c h , o r a l B i o l . 1 8 : 7 7 - 8 1 . H u m p h r e y , T . 1 9 6 9 . The r e l a t i o n b e t w e e n human f e t a l m o u t h o p e n i n g r e f l e x e s a n d c l o s u r e o f t h e p a l a t e . Am. J . A n a t . 1 2 5 : 3 1 7 - 3 4 4 . IARC 1 9 8 1 . IARC m o n o g r a p h s on t h e e v a l u a t i o n o f c a r c i n o g e n i c r i s k o f c h e m i c a l s t o humans V o l . 2 6 . Some A n t i n e o p l a s t i c a n d I m m u n o s u p p r e s s i v e A g e n t s , L y o n , p p . 2 4 9 - 2 6 6 . I m , M . J . a n d M u l l i k e n , J . B . 1 9 8 3 . M i c r o a n a l y s i s o f e p i t h e l i a l and m e s e n c h y m a l a c i d h y d r o l a s e a c t i v i t i e s i n t h e d e v e l o p i n g p a l a t e . J . C r a n i o f a c i a l G e n e t . D e v . B i o l . 3 : 2 8 1 - 2 8 8 . - I l l - I n g b e r , D . E . , M a d r i , J . A . a n d J a m i e s o n , J . D . 19.81. R o l e o f b a s a l l a m i n a i n n e o p l a s t i c d i s o r g a n i z a t i o n o f t i s s u e a r c h i t e c t u r e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 8 : 3 9 0 1 - 3 9 0 5 . I n n e s , P . B . 1 9 7 8 . The u l t r a s t r u c t u r e o f t h e m e s e n c h y m a l e l e m e n t o f t h e p a l a t a l s h e l v e s o f t h e f e t a l m o u s e . J . E m b r y o l . e x p . m o r p h . 4 3 : 1 8 5 - 1 9 4 . I n n e s , P . B . 1 9 8 1 . The u l t r a s t r u c t u r e o f m u r i n e s e c o n d a r y p a l a t a l e c t o m e s e n c h y m e d u r i n g s h e l f r e o r i e n t a t i o n . J . C r a n i o f a c i a l G e n e t . D e v . B i o l . 1: 3 5 9 - 3 7 1 . I r e g b u l e m , L . M . 1 9 8 2 . The i n c i d e n c e o f c l e f t l i p a n d p a l a t e i n N i g e r i a . C l e f t P a l a t e J . 1 9 : 2 0 1 - 2 0 5 . J a c o b s , R . M . 1 9 6 4 a . H i s t o c h e m i c a l s t u d y o f m o r p h o g e n e s i s a n d t e r a t o g e n e s i s o f t h e p a l a t e i n mouse e m b r y o s . A n a t . R e c . 1 4 9 : 6 9 1 - 6 9 7 . J a c o b s , R . M . 1 9 6 4 b . 3 5 S - l i q u i d - s c i n t i 1 1 a t i o n c o u n t a n a l y s i s o f m o r p h o g e n e s i s a n d t e r a t o g e n e s i s o f t h e p a l a t e i n mouse e m b r y o s . A n a t . R e c . 1 5 0 : 2 7 1 - 2 7 8 . J a c o b s , R . M . 1 9 6 6 . E f f e c t s o f c o r t i s o n e a c e t a t e u p o n h y d r a t i o n o f e m b r y o n i c p a l a t e i n two i n b r e d s t r a i n s o f m i c e . A n a t . R e c . 1 5 6 : 1 - 4 . J a c o b s o n , B . 1 9 8 2 . E f f e c t ' o f t e r a t o g e n s on c o n n e c t i v e t i s s u e d e v e l o p m e n t . M o l e c . A s p e c t s . M e d . 5 : 4 0 1 - 4 5 9 . J a c o b s o n , B . a n d S h a h , R . M . 1 9 8 1 . The g l y c o s a m i n o g l y c a n c o m p o s i t o n o f f e t a l p a l a t e f r o m n o r m a l a n d h y d r o c o r t i s o n e t r e a t e d h a m s t e r . T e r a t o l o g y 2 3 : 4 2 A - 4 3 A . J a o , W . , V a z q u e z , L . T . , K e h , P . C . a n d G o u l d , V . E . 1 9 7 8 . M y o e p i t h e l i a l d i f f e r e n t i a t i o n a n d b a s a l l a m i n a d e p o s i t i o n i n f i b r o a d e n o m a a n d a d e n o s i s o f t h e b r e a s t . J . P a t h o l . 1 2 6 : 1 0 7 - 1 1 2 . J e l i n e k , R. a n d D o s t a l , M . 1 9 7 3 . The r o l e o f m i t o t i c a c t i v i t y i n t h e f o r m a t i o n o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e . A c t a . C h i r . P l a s t 1 5 : 2 1 6 - 2 2 2 . J o h n s o n , F . R . , a n d F r y , L. 1 9 6 7 . U l t r a s t r u c t u r a l o b s e r v a t i o n s on l i c h e n p l a n u s . A r c h . D e r m a t o l . 9 5 : 5 9 6 - 6 0 7 . J u r a n d , A . 1 9 6 6 . E a r l y c h a n g e s i n l i m b b u d s o f c h i c k e m b r y o s a f t e r t h a l i d o m i d e t r e a t m e n t . J . E m b r y o l . e x p . M o r p h . 1 6 : 2 8 9 - 3 0 0 . J u r a n d , A . 1 9 6 8 . The e f f e c t o f h y d r o c o r t i s o n e a c e t a t e on t h e d e v e l o p m e n t o f mouse e m b r y o s . J . E m b r y o l . e x p . M o r p h . 2 0 : 3 5 5 - 3 6 6 . K a l t e r , H. a n d W a r k a n y , J . 1 9 5 9 . E x p e r i m e n t a l p r o d u c t i o n o f c o n g e n i t a l m a l f o r m a t i o n s i n mammals by m e t a b o l i c p r o c e d u r e s . P h y s i o l . R e v . 3 9 : 6 9 - 1 1 5 . - 112 - K a r n o f s k y , D . A . 1 9 6 0 . I n f l u e n c e o f a n t i m e t a b i l i t e s i n h i b i t i n g n u c l e i c a c i d m e t a b o l i s m on e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t . T r a n s . A s s o c . A m e r . p h y s i c i a n s 7 3 : 3 3 4 - 3 4 7 . K a s p e r , C . B . 1 9 7 4 . The C e l l N u c l e u s . I n : C h e m i c a l a n d b i o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e n u c l e a r e n v e l o p e . E d . H B u s c h , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k a n d L o n d o n , p p . 3 4 9 - 3 8 2 . K a w a h a t a , R . T . , H o l m b e r g , C . A . , O s b u r n , B . I . , C h u a n g , L . F . a n d C h u a n g , R . Y . 1 9 8 0 . E f f e c t o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e r i b o n u c l e o t i d e s on D N A - d e p e n d a n t RNA p o l y m e r a s e a c t i v i t y . M o l . P h a r m a c o l o g y 1 8 : 5 0 3 - 5 0 6 . K e i b e l , K. a n d M a l l , F . P . 1 9 1 2 . M a n u a l o f Human E m b r y o l o g y . L i p p i n c o t t , P h i l a d e l p h i a , p p . 3 4 0 - 3 4 3 . K e r r , J . F . R . 1 9 7 1 . S h r i n k a g e n e c r o s i s . A d i s t i n c t mode o f c e l l u l a r d e a t h . J . P a t h o l . 1 0 5 : 1 3 - 2 0 . K i t a m u r a , H. 1 9 6 6 . E p i t h e l i a l r e m n a n t s a n d p e a r l s i n t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n t h e human a b o r t u s : A c o n t r i b u t i o n t o t h e s t u d y o f t h e m e c h a n i s m o f c l e f t p a l a t e f o r m a t i o n . C l e f t P a l a t e J . 3 : 2 4 0 - 2 5 6 . K o c h , W. a n d S m i l e y , G . R . 1 9 8 1 . I n v i v o a n d J_n v i t r o s t u d i e s o f t h e d e v e l o p m e n t o f t h e a v i a n s e c o n d a r y p a l a ~ t e . A T c h s . o r a l B i o l . 2 6 : 1 8 1 - 1 8 9 . K o c h h a r , D . M . a n d J o h n s o n , E . M . 1 9 6 5 . M o r p h o l o g i c a l a n d a u t o r a d i o g r a p h i c s t u d i e s o f c l e f t p a l a t e i n d u c e d i n r a t e m b r y o s by m a t e r n a l h y p e r v i t a m i n o s i s A . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h o l . 1 4 : 2 2 3 - 2 3 8 . K o c h h a r , D . M . , P e n n e r , J . D . a n d M c D a y , J . A . 1 9 7 8 . L i m b D e v e l o p m e n t i n mouse e m b r y o s I I . R e d u c t i o n d e f e c t s , c y t o t o x i c i t y a n d i n h i b i t i o n o f DNA s y n t h e s i s p r o d u c e d by c y t o s i n e a r a b i n o s i d e . T e r a t o l o g y 1 8 : 7 1 - 9 2 . K o g u c h i , H. 1 9 8 0 . P o p u l a t i o n d a t a on c l e f t l i p a n d c l e f t p a l a t e i n t h e J a p a n e s e . P r o g . C l i n . B i o l . R e s . 4 6 : 2 9 7 - 3 2 3 . K o z i o l , C . A . a n d S t e f f e k , A . 1 9 6 9 . A c i d p h o s p h a t a s e a c t i v i t y i n p a l a t e s o f d e v e l o p i n g n o r m a l a n d c h l o r c y c l i z i n e t r e a t e d r o d e n t s . A r c h , o r a l B i o l . 1 4 : 3 1 7 - 3 2 1 . K r a w c z y k , W. a n d G i 1 1 o n , D. 1 9 7 6 . I m m u n o f l u o r e s c e n t d e t e c t i o n o f a c t i n i n n o n - m u s c l e c e l l s o f t h e d e v e l o p i n g mouse p a l a t a l s h e l f . A r c h s . o r a l B i o l . 2 1 : 5 0 3 - 5 0 8 . K u r i s u , K . , S a s k a k i , S . , S h i m a z a k i , K . , O h s a k i , Y . , and W a d a , K. 1 9 8 1 . L i g h t a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e s on t h e e f f e c t o f t r i a m c i n o l o n e a c e t o n i d e o n t h e m e d i c a l e d g e e p i t h e l i a o f p a l a t a l s h e l v e s o f mouse f e t u s e s i n v i v o . J . C r a n i o f a c i a l G e n e t . D e v . B i o l . 1 : 2 7 3 - 2 8 4 . K u r t z , S . M . a n d F e l d m a n , J . D . 1 9 6 2 . E x p e r i m e n t a l s t u d i e s o n t h e f o r m a t i o n o f t h e g l o m e r u l a r b a s e m e n t m e m b r a n e . J . Ul t r a s t r u c t . R e s . 6 : 1 9 - 2 7 . - 113 - K u r y , G . , C h a u d e , S . a n d M u r p h y , M . L . 1 9 6 8 . T e r a t o g e n i c e f f e c t s o f some p u r i n e a n a l o g u e s o n f e t a l r a t s . A r c h . P a t h o l . 8 6 : 3 9 5 - 4 0 2 . K u s a n a g i , T . 1 9 8 3 . O c c u r a n c e o f c l e f t p a l a t e , p a l a t a l s l i t , a n d f e t a l d e a t h i n m i c e t r e a t e d w i t h a g l u c o c o r t i c o i d : An embryo t r a n s f e r e x p e r i m e n t . T e r a t o l o g y 2 7 : 3 9 5 - 4 0 0 . L a n g m a n , J . a n d C a r d e l l , E . L . 1 9 7 8 . U l t r a s t r u c t u r a l o b s e r v a t i o n s on F U d R - i n d u c e d c e l l d e a t h a n d s u b s e q u e n t e l i m i n a t i o n o f c e l l d e b r i s . T e r a t o l o g y 1 7 : 2 2 9 - 2 7 0 . L a r s s o n , K . S . 1 9 6 2 a . C l o s u r e o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e a n d i t s r e l a t i o n t o s u l f o - m u c o p o l y s a c c h a r i d e s . A c t a . O d o n t o l . S c a n d . 2 0 , S u p p l . 3 1 : 1 - 3 5 . L a r s s o n , K . S . 1 9 6 2 b . S t u d i e s on t h e c l o s u r e o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e I V . A u t o r a d i o g r a p h i c a n d h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s o f m o u s e e m b r y o s f r o m c o r t i s o n e - t r e a t e d m o t h e r s . A c t a . M o r p h . N e e r - S c a n d . 4 : 3 6 9 - 3 8 6 . L a r s s o n , K . S . a n d B o s t r o m , H. 1 9 6 5 . T e r a t o g e n i c a c t i o n o f s a l i c y l a t e s r e l a t e d t o t h e i n h i b i t i o n o f m u c o p o l y s a c c h a r i d e s y n t h e s i s . A c t a . P a e d i a t . S c a n d . 5 4 : 4 3 - 4 8 . L e e , R . A . , J o h n s o n , C . E . a n d H a n l o n , D . G . 1 9 6 2 . L e u k e m i a d u r i n g p r e g n a n c y . A m e r . J . O b s t e t . G y n e c . 8 4 : 4 5 5 - 4 5 8 . L e n n a r d a n d M a d d o c k s , J . L . 1 9 8 3 . A s s a y o f 6 - t h i o g u a n i n e n u c l e o t i d e , a m a j o r m e t a b o l i t e o f a z a t h i o p r i n e , 6 - m e r c a p t o p u r i n e a n d 6 - t h i o g u a n i n e i n human r e d b l o o d c e l l s . J . P h a r m . P h a r m a c o l . 3 5 : 1 5 - 1 8 . L e n z , W . V . 1 9 6 1 . D i e t h a i i d o m i d - e m b r y o p a t h i e . D t s c h m e d . W s c h r . 8 6 : 2 5 5 5 . L e v i n , S . M . 1 9 8 3 . P r o b l e m s and p i t f a l l s i n c o n d u c t i n g e p i d e m i o l o g i c a l r e s e a r c h i n t h e a r e a o f r e p r o d u c t i v e t o x i c o l o g y . P r o g . C l i n . B i o l . R e s . 1 1 7 : 3 4 9 - 3 6 4 . L o r e n t e a n d M i l l e r , S . A . 1 9 7 8 . The e f f e c t o f h y p e r v i t a m i n o s i s A on r a t p a l a t a l d e v e l o p m e n t . T e r a t o l o g y 1 8 : 2 7 7 - 2 8 4 . L o r e n t e , C . A . , D e P a o l a , D . P . , Drummond, J . F . a n d M i l l e r , S . A . ; 1 9 7 4 . L y s o s o m a l enzyme a c t i v i t y a s s o c i a t e d w i t h p a l a t a l d e v e l o p m e n t i n t h e r a b b i t . J . D e n t . R e s . 5 3 : 6 5 ( A b s t r a c t 4 3 ) . L o w r y , R . B . a n d T r i m b l e , B . K . 1 9 7 7 . I n c i d e n c e r a t e s f o r c l e f t l i p a n d p a l a t e i n B r i t i s h C o l u m b i a 1 9 5 2 - 7 1 f o r N o r t h A m e r i c a n I n d i a n , J a p a n e s e , C h i n e s e a n d t o t a l p o p u l a t i o n s : S e c u l a r t r e n d s o v e r t w e n t y y e a r s . T e r a t o l o g y 1 6 : 2 7 7 - 2 8 4 . L o y d , H . 0 . 1 9 6 1 . A c u t e l e u k e m i a c o m p l i c a t e d by p r e g n a n c y . J . A . M . A . 1 7 8 : 1 1 4 0 - 1 1 4 3 . L u k e , D. 1 9 7 6 . D e v e l o p m e n t o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n m a n . A c t a A n a t . 9 4 : 5 9 6 - 6 0 8 . - 114 - L y n c h , J . B . , L e w i s , S . R . a n d B l o c k e r , T . G . 1 9 6 6 . C l e f t p a l a t e n o t e x p l a i n e d by e m b r y o l o g y . P l a s t . R e c o n s t r . S u r g . 3 8 : 5 5 2 - 5 5 4 . M a l a m u d , D . , G o n z a l e s , C M . , C h i n , H. a n d M a l t , R . A . 1 9 7 2 . I n h i b i t i o n o f c e l l p r o l i f e r a t i o n by a z a t h i o p u r i n e . C a n c e r R e c . 3 2 : 1 2 2 6 - 1 2 2 9 . M a n g i a m e l i , S . 1 9 6 1 . L e u c o s i e g r a v i d a n z a . M i n e r v a g i n e c . ( T o r i n o ) 1 3 : 7 8 5 - 7 9 2 . M a r t i n , W . R . , C r i c h t o n , I . K . , Y a n g , R . C a n d E v a n s , A . E . 1 9 7 2 . T h e m e t a b o l i s m o f t h i o i n o s i n i c a c i d by 6 - m e r c a p t o p u r i n e s e n s i t i v e a n d r e s i s t a n t l e u c e m i c l e u c o c y t e s . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 1 4 0 : 4 2 3 - 4 2 8 . M a r t i n e z - H e r n a n d e z , A . , F i n k , L . M . a n d P i e r c e , G . B . 1 9 7 6 . Removal o f b a s e m e n t membrane i n t h e i n v o l u t i n g b r e a s t . L a b . I n v e s t . 3 4 : 4 5 5 - 4 6 1 . M a t o , M . a n d U c h i y a m a , Y . 1 9 7 2 . S p e c i f i c c h a n g e s i n t h e e p i t h e l i u m c o v e r i n g t h e p a l a t i n e s h e l v e s i n t h e t e r a t o g e n t r e a t e d e m b r y o s . Gunma R e p . M e d . S c . 3 : 3 7 7 - 3 8 0 . M a t o , M . a n d U c h i y a m a , Y . 1 9 7 5 . Ul t r a s t r u c t u r e s o f g l o s s o - p a l a t a l f u s i o n a f t e r t r e a t m e n t o f m e c l o z i n e - h y d r o c h l o r i d e . V i r c h o w s A r c h . A P a t h . A n a t . a n d H i s t . 3 6 9 : 7 - 1 7 . M a t o , M . , A i k a w a , E. a n d K a t a h i r a , M . 1 9 6 6 . A p p e a r a n c e o f v a r i o u s t y p e s o f l y s o s o m e s i n t h e e p i t h e l i u m c o v e r i n g l a t e r a l p a l a t i n e s h e l v e s d u r i n g a s e c o n d a r y p a l a t e f o r m a t i o n . Gunma J . Med S c . 1 5 : 4 6 - 5 6 . M a t o , M . , A i k a w a , E . a n d K a t a h i r a , M . 1 9 6 7 a . A l t e r a t i o n o f f i n e s t r u c t u r e o f t h e e p i t h e l i u m o n t h e l a t e r a l p a l a t i n e s h e l f d u r i n g t h e s e c o n d a r y p a l a t e f o r m a t i o n . Gunma, J . M e d . S c . 1 6 : 7 9 - 9 9 . i ' i a t o , M . , A i k a w a , E. a n d K a t a h i r a , M . 1 9 6 7 b . S t u d i e s on c e l l - r e a c t i o n o f t h e n a s a l e p i t h e l i u m d u r i n g t h e f u s i o n o f p a l a t i n e s h e l v e s . A n a t . A n z . 1 2 1 : 5 0 4 - 5 1 7 . M a t o , M . , U c h i y a m a , Y . a n d A i k a w a , E. 1 9 7 5 a . S t u d i e s on n o r m a l a n d h e t e r o t y p i c f u s i o n d u r i n g m o r p h o g e n e s i s . 1 0 t h I n t . C o n g . A n a t . , T o k y o , 3 9 6 . M a t o , M . , U c h i y a m a , Y . , A i k a w a , E . a n d S m i l e y , G . R . 1 9 7 5 b . U l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e s i n r a t p a l a t a l e p i t h e l i u m a f t e r 3 - a m 1 n o p r o p r i o n i t r i l e . T e r a t o l o g y 1 1 : 1 5 3 - 1 6 8 . M c B r i d e , W . G . 1 9 6 1 . T h a l i d o m i d e a n d c o n g e n i t a l a b n o r m a l i t i e s . L a n c e t . 2 : 1 3 5 8 . M c C o n n e l l , J . B . a n d B h o o l a , R. 1 9 7 3 . A n e o n a t a l c o m p l i c a t i o n o f m a t e r n a l l e u k a e m i a t r e a t e d w i t h 6 - m e r c a p t o p u r i n e . P o s t g r a d , m e d . J . 4 9 : 2 1 1 - 2 1 3 . M e l l e r , S . M . a n d B a r t o n , L . H . 1 9 7 8 . E x t r a c e l l u l a r c o a t i n d e v e l o p i n g human p a l a t a l p r o c e s s e s : E l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d r u t h e n i u m r e d b i n d i n g . A n a t . R e c . 1 9 0 : 2 2 3 - 2 3 2 . - 115 - M e l l e r , S . M . , D e P a o l a , D . P . , B a r t o n , L . H . and M a n d e l l a , R . D . 1 9 8 0 . S e c o n d a r y p a l a t a l d e v e l o p m e n t i n t h e New Z e a l a n d w h i t e r a b b i t : A s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d y . A n a t . R e c . 1 9 8 : 2 2 9 - 2 4 4 . M e l n i c k , M . , S h i e l d s , E . D . a n d B i x l e r , D. 1 9 8 0 . S t u d i e s o f c l e f t l i p a n d c l e f t p a l a t e i n t h e p o p u l a t i o n o f D e n m a r k . P r o g . C l i n . B i o l . R e s . 4 6 : 2 2 5 - 2 4 8 . M e n k e s , B . , S a n d o r , S . a n d H i e s , A . 1 9 7 0 . C e l l d e a t h i n t e r a t o g e n e s i s . A d v . T e r a t o l . 4 : 1 7 0 - 2 1 5 . M e r c h a n t - L a r i o s , H. and C o e l l o , J . 1 9 7 8 . The e f f e c t o f b u s u l f a n on r a t p r i m o r d i a l germ c e l l s a t t h e u l t r a s t r u c t u r a l l e v e l . C e l l D i f f e r e n t i a t i o n 8 : 1 4 5 - 1 5 5 . M e r c i e r - P a r o t , L. and T u c h m a n n - D u p l e s s i s , H . 1 9 6 7 . P r o d u c t i o n o f l i m b m a l f o r m a t i o n s by 6 - m e r c a p t o p u r i n e i n t h r e e s p e c i e s : r a b b i t , r a t and mouse ( F r . ) . C . R . S o c . B i o l . P a r i s 1 6 1 : 7 6 2 - 7 6 8 . M e r k e r , H . J . , P o s p i s i l , M . a n d M e w e s , P. 1 9 7 5 . C y t o t o x i c e f f e c t s o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e on t h e l i m b - b u d b l a s t e r n a l c e l l s o f r a t e m b r y o s . T e r a t o l o g y 1 1 : 1 9 9 - 2 1 8 . M e r s k e y , C . a n d R i g a l , W. 1 9 5 6 . P r e g n a n c y i n a c u t e l e u k e m i a t r e a t e d w i t h 6 - m e r c a p t o p u r i n e . L a n c e t 2 : 1 2 6 8 - 1 2 6 9 . M e w e s , P . , S i e b e r t , G. a n d N e u b e r t , D. 1 9 7 1 . E f f e c t o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e o n RNA m e t a b o l i s m o f r a t e m b r y o s . T e r a t o l o g y 4 : 4 9 5 ( a b s t r a c t ) . M i t t s , T . F . , G a r r e t t , W . S . a n d H u r w i t z , D . J . 1 9 8 1 . C l e f t o f t h e h a r d p a l a t e w i t h s o f t p a l a t e i n t e g r i t y . C l e f t P a l a t e J . 1 8 : 2 0 4 - 2 0 6 . M o l l e n b a u e r , H . 1 9 6 4 . P l a s t i c e m b e d d i n g m i x t u r e f o r u s e e l e c t r o n m i c r o s c o p y . S t a i n . T e c h n o l . 3 9 : 1 1 1 - 1 1 4 . M o n t e n e g r o , M . A . a n d P a z de l a V e g a , Y . 1 9 8 2 . L i g h t and e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d y o n t h e e f f e c t o f p h e n y l b u t a z o n e o n d e v e l o p i n g mouse p a l a t a l e p i t h e l i u m i n v i t r o . A r c h s . o r a l B i o l . 2 7 : 7 7 1 - 7 7 5 . M o r g a n , P . R . 1 9 6 9 . R e c e n t s t u d i e s on t h e f u s i o n o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e . L o n d o n H o s p . G a z . 7 2 : 6 - 1 9 . M o r g a n , P . R . 1 9 7 6 . The f a t e o f t h e e x p e c t e d f u s i o n z o n e i n r a t f e t u s e s w i t h e x p e r i m e n t a l l y - i n d u c e d c l e f t p a l a t e - a n u l t r a s t r u c t u r a l s t u d y . D e v . B i o l . 5 1 : 2 2 5 - 2 4 0 . M o r g a n , P . R . a n d P r a t t , R . M . 1 9 7 7 . U l t r a s t r u c t u r e o f t h e e x p e c t e d f u s i o n z o n e i n r a t f e t u s e s w i t h d i a z o - o x o - n o r l e u c i n e ( D O N ) - i n d u c e d c l e f t p a l a t e . T e r a t o l o g y 1 5 : 2 8 1 - 2 8 9 . M o r r i s s , G . M . 1 9 7 3 . The u l t r a s t r u c t u r a l e f f e c t s o f e x c e s s m a t e r n a l v i t a m i n A on t h e p r i m i t i v e s t r e a k s t a g e r a t e m b r y o s . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h o l . 3 0 : 2 1 9 - 2 4 2 . - 116 - M o t t , W . J . , T o t o , P . D . a n d H o l g e r s , D . C . 1 9 6 9 . L a b e l l i n g i n d e x a n d c e l l u l a r d e n s i t y i n p a l a t i v e s h e l v e s o f c l e f t - p a l a t e m i c e . J . D e n t . R e s . 4 8 : 2 6 3 - 2 6 5 . M u r p h y , M . L . 1 9 6 0 . T e r a t o g e n i c e f f e c t s o f t u m o u r - i n h i b i t i n g c h e m i c a l s i n t h e f e t a l r a t . I n : C i b a F o u n d a t i o n S y m p o s i u m on C o n g e n i t a l M a l f o r m a t i o n s . E d . W o l s t e n h o l m e , G . E . , L i t t l e , B r o w n a n d C o m p a n y , B o s t o n , p p . 7 8 - 1 0 7 . M u r p h y , M . L . 1 9 6 2 . T e r a t o g e n i c e f f e c t s i n r a t s o f g r o w t h i n h i b i t i n g c h e m i c a l s , i n c l u d i n g s t u d i e s on t h a l i d o m i d e . C h i l d . H o s p . D i s t . C o l u m b i a P r o c . 1 8 : 3 0 7 - 3 2 2 . N a n d a , R. 1 9 7 0 . The r o l e o f s u l f a t e d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s i n c l e f t p a l a t e p r o d u c t i o n . T e r a t o l o g y 3 : 2 3 7 - 2 4 4 . N a n d a , R. 1 9 7 1 . T r i t i a t e d t h y m i d i n e l a b e l l i n g o f t h e p a l a t a l p r o c e s s e s o f r a t e m b r y o s w i t h c l e f t p a l a t e i n d u c e d by h y p e r v i t a m i n o s i s A . A r c h s . o r a l B i o l . 1 6 : 4 3 5 - 4 4 4 . N a n d a , R. a n d Romeo, D. 1 9 7 5 . D i f f e r e n t i a l c e l l p r o l i f e r a t i o n o f e m b r y o n i c r a t p a l a t a l p r o c e s s e s a s d e t e r m i n e d by i n c o r p o r a t i o n o f t r i t i a t e d t h y m i d i n e . C l e f t P a l a t e J . 1 2 : 4 3 6 - 4 4 3 . N e u , L . T . J r . 1 9 6 2 . L e u k e m i a c o m p l i c a t i n g p r e g n a n c y . M i s s o u r i M e d . 5 9 : 2 2 0 - 2 2 1 . N e u b e r t , D . , B a r r a c h , H . J . a n d M e r k e r , H . J . 1 9 8 0 . D r u g - i n d u c e d damage t o t h e embryo o r f e t u s . I n : D r u g - I n d u c e d P a t h o l o g y . E d . E. G r u n d m a n n , S p r i n g e r - V e r l a g , B e r l i n , H e i d e l b e r g , New Y o r k , p p . 2 4 1 - 3 3 1 . N e u b e r t , D . , L e s s m o l l m a n n , U . , H i n z , N . , D i l l m a n n , I . a n d F u c h s , G. 1 9 7 7 . I n t e r f e r e n c e o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e r i b o s i d e , 6 - m e t h y l m e r c a p t o p u r i n e r i b o s i d e , a n d a z a t h i o p r i n e w i t h t h e m o r p h o g e n e t i c d i f f e r e n t i a t i o n o f mouse e x t r e m i t i e s i n v i v o a n d i n o r g a n c u l t u r e . N a u n y n - S c h m i e d e b e r g ' s A r c h . P h a r m a c o l . 2 9 8 : 9 3 - 1 0 5 . N e u b e r t , D . , M e r k e r , H . J . , K o h l e r , E . , K r o w e , R. a n d B a r r a c h , H . J . 1 9 7 0 . B i o c h e m i c a l a s p e c t s o f t e r a t o l o g y . I n : A d v a n c e s i n t h e B i o s c i e n c e s . E d . G. R a s p e , P e r g a m o n P r e s s , L o n d o n , p p . 5 7 5 - 6 2 2 . N i c h o l s o n , H . O . 1 9 6 8 a . C y t o t o x i c d r u g s i n p r e g n a n c y . J . O b s t . G y n a c o l . B r . Common. 7 5 : 3 0 7 - 3 1 2 . N i c h o l s o n , H . O . 1 9 6 8 b . L e u k e m i a a n d p r e g n a n c y . A r e p o r t o f f i v e c a s e s a n d d i s c u s s i o n o f m a n a g e m e n t . J . O b s t e t . G y n a e c . B r i t . Comm. 7 5 : 5 1 7 - 5 2 0 . N o v i k o f f , A . 1 9 6 3 . L y s o s o m e s i n p h y s i o l o g y a n d p a t h o l o g y o f c e l l s : C o n t r i b u t i o n o f s t a i n i n g m e t h o d s . I n : L y s o s o m e s . E d . A . V . S . De Reuk a n d M . P . C a m e r o n , C h u r c h i l l , L o n d o n , p p . 3 6 - 7 7 . O ' L e a r y , J . A . a n d B e p k o J r . , F . J . 1 9 6 3 . O b s t e t r i c a l c l i n i c s : A c u t e l e u k e m i a a n d p r e g n a n c y . G e o r g e t o w n M e d i c a l B u l l e t i n 1 6 : 1 6 2 - 1 6 4 . - 117 - O l t n e r , J . a n d C a r c a s s o n n e , Y . 1 9 6 2 . L e u c e n r i e e t g r o s s e s s e . M a r s e i l l e M e d . 9 9 : 3 1 - 3 6 . O l s o n , F . C . a n d M a s s a r o , E . J . 1 9 7 7 . E f f e c t s o f m e t h y l m e r c u r y on m u r i n e f e t a l a m i n o a c i d u p t a k e , p r o t e i n s y n t h e s i s a n d p a l a t e c l o s u r e . T e r a t o l o g y 1 6 : 1 8 7 - 1 9 4 . O t s u b o , Y . a n d K a m e y a m a , Y . 1 9 8 2 . U l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e s o f e p i t h e l i u m - c o n n e c t i v e t i s s u e j u n c t i o n i n e x p e r i m e n t a l l i n g u a l t u m o r s . J . o r a l P a t h o l . 11: 1 5 9 - 1 7 3 . P a r e k h , J . G . , H a n s o n , T . A . a n d S m i t h , R . S . 1 9 5 9 . A c u t e l e u k a e m i a a n d p r e g n a n c y . J . J . J . H o s p . G r a n t , m e d . C o l l . 4 : 4 9 . P a t e r s o n , A . R . P . a n d T i d d , D . M . 1 9 7 5 . 6 - t h i o p u r i n e s . I n : Handbook o f E x p e r i m e n t a l P h a r m a c o l o g y , V o l . 3 8 , E d . 0 . E i c h l e r , A . F a r a h , H. H e r k e n a n d A . D . W e l c h , S p r i n g e r , B e r l i n , p p . 3 8 4 - 4 0 3 . P a t t e n , B . M . 1 9 7 1 . E m b r y o l o g y o f t h e p a l a t e a n d m a x i l l o f a c i a l r e g i o n . I n : C l e f t L i p a n d C l e f t P a l a t e , E d s . W . C . G r a b b a n d S . W . R o s e n s t e i n a n d K . R . B z o c h , L i t t l e , B r o w n C o . , B o s t o n , p p . 2 1 - 5 3 . P a u l , M . A . a n d P i a z z a , F . 1 9 7 9 . C o s t o f t r e a t i n g b i r t h d e f e c t s i n s t a t e c r i p p l e d c h i l d r e n ' s s e r v i c e s , 1 9 7 5 . P u b . H e a l t h R e p . 9 4 : 4 2 0 - 4 2 4 . P e a r c e , G . B . , M i d g l e y , A . R . a n d S r i Ram, J . 1 9 6 3 . T h e h i s t o g e n e s i s o f b a s e m e n t m e m b r a n e s . J . E x p . M e d . 1 1 7 : 3 3 9 - 3 4 7 . P e a r s o n , R . W . a n d S p a r g o , B . 1 9 6 1 . E l e c t r o n m i c r o s c o p e s t u d i e s o f d e r m a l - e p i d e r m a l s e p a r a t i o n i n human s k i n . J . I n v e s t . D e r m a t o l . 3 6 : 2 1 3 - 2 2 5 . P e r s a u d , T . V . N . 1 9 7 9 . A d v a n c e s i n t h e s t u d y o f b i r t h d e f e c t s V o l . 3 . E d . T . V . N . P e r s a u d . MTP P r e s s L t d . , L a n c a s t e r . P e t e r s , P . W . J . , D o r m a n s , J . A . M . A . a n d G e e l e n , J . A . G . 1 9 7 9 . L i g h t m i c r o s c o p i c a n d u l t r a s t r u c t u r a l o b s e r v a t i o n s i n a d v a n c e d s t a g e s o f i n d u c e d e x e n c e p h a l y a n d s p i n a b i f i d a . T e r a t o l o g y 1 9 : 1 8 3 - 1 9 6 . P i c k , J . B . a n d E v a n s , C . A . 1 9 8 1 . G r o w t h i n h i b i t i t i o n a n d o c c u r r e n c e o f c l e f t p a l a t e s d u e t o h y p e r v i t a m i n o s i s A . E x p e r i e n t i a 3 7 : 1 1 8 9 - 1 1 9 1 . P l a g e m a n n , P . G . W . , M a r z , R . , W o h l h u e t e r , R . M . , G r a f f , J . C . a n d Z y l k a , J . M . 1 9 8 1 . F a c i l i t a t e d t r a n s p o r t o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e a n d 6 - t h i o g u a n i n e a n d n o n - m e d i a t e d p e r m e a t i o n o f 8 - a z a g u a n i n e i n n o v i k o f f r a t h e p a t o m a c e l l s a n d r e l a t i o n s h i p t o i n t r a c e l l u l a r p h o s p h o r i b o s y l a t i o n . B i o c h i m i c a e t B i o p h y s i c a A c t a 4 9 - 6 2 . P o u r t o i s , M . 1 9 6 6 . O n s e t o f t h e a c q u i r e d p o t e n t i a l i t y f o r f u s i o n i n t h e p a l a t a l s h e l v e s o f r a t s . J . E m b r y o l . e x p . M o r p h . 1 6 : 1 7 1 - 1 8 2 . - 118 - P o u r t o i s , M . 1 9 7 2 . M o r p h o g e n e s i s o f t h e p r i m a r y a n d s e c o n d a r y p a l a t e . I n : D e v e l o p m e n t a l A s p e c t s o f O r a l B i o l o g y . E d . H . C . S l a v k i n a n d L . A . B a v e t t a , A c a d e m i c P r e s s , L o n d o n , p p . 8 1 - 1 0 8 . P r a t t , R . M . 1 9 8 3 . M e c h a n i s m s o f c h e m i c a l l y - i n d u c e d c l e f t p a l a t e . T r e n d s P h a r m a c o l . S c i . 4 : 1 6 0 - 1 6 2 . P r a t t , R . M . a n d G r e e n e , R . M . 1 9 7 6 . I n h i b i t i o n o f p a l a t a l e p i t h e l i a l c e l l d e a t h b y a l t e r e d p r o t e i n s y n t h e s i s . D e v . B i o l . 5 4 : 1 3 5 - 1 4 5 . P r a t t , R . M . a n d H a s s e l , J . R . 1 9 7 5 . A p p e a r a n c e a n d d i s t r i b u t i o n o f c a r b o h y d r a t e - r i c h m a c r o m o l e c u l e s on t h e e p i t h e l i a l s u r f a c e o f t h e d e v e l o p i n g r a t p a l a t a l s h e l f . D e v . B i o l . 4 5 : 1 9 2 - 1 9 8 . P r a t t J r . , R . M . a n d K i n g , C . T . G . 1 9 7 2 . I n h i b i t i o n o f c o l l a g e n c r o s s - l i n k i n g a s s o c i a t e d w i t h 6 - a m i n o p r o p i o n i t r i l e - i n d u c e d c l e f t p a l a t e i n t h e r a t . D e v . B i o l . 2 7 : 3 2 2 - 3 2 8 . P r a t t , R . M . a n d M a r t i n , G . R . 1 9 7 5 . E p i t h e l i a l c e l l d e a t h a n d c y c l i c AMP i n c r e a s e d u r i n g p a l a t a l d e v e l o p m e n t . P r o c . N a t . A c a d . S c i . USA 7 2 : 8 7 4 - 8 7 7 . P r a t t J r . , R . M . , G o g g i n s , J . F . , W i l k , A . L . a n d K i n g , C . T . G . 1 9 7 3 . A c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s y n t h e s i s i n t h e s e c o n d a r y p a l a t e o f t h e d e v e l o p i n g r a t a t t h e t i m e o f r o t a t i o n a n d f u s i o n . D e v . B i o l . 3 2 : 2 3 0 - 2 3 7 . P r u z a n s k i , S . 1 9 6 1 . C o n g e n i t a l a n o m a l i e s o f t h e f a c e a n d a s s o c i a t e d s t r u c t u r e s . C . C . T h o m a s , S p r i n g f i e l d , I l l i n o i s , p p . 3 - 1 1 . P u g e t , A . , C r o s , S . , O r e g l i a , J . a n d T o l l o n , Y. 1 9 7 5 . S t u d y on t h e e m b r y o n a l s e n s i t i v i t y o f t h e A f g h a n p i k a ( O c h o t o n a r u f e s c e n s r u f e s c e n s ) t o two t e r a t o g e n i c a g e n t s , a z a t h i o p r i n e a n d 6 - m e r c a p t o p u r i n e ( F r . ) . Z b l . V e t e r i n a r m e d A 2 2 : 3 8 - 5 6 . R a i c h s , A . 1 9 6 2 . G e s t a c i o n y l e u c e m i a a g u n d a : D e s c r i p t i o n de c u a t r o o b s e r v a t i o n s . S a n g r e 7 : 1 9 4 - 2 1 2 . R a v e n n a , P . a n d S t e i n , P . J . 1 9 6 3 . A c u t e m o n o c y t i c l e u k e m i a i n p r e g n a n c y . A m e r . J . O b s t e t . G y n e c . 8 5 : 5 4 5 - 5 4 8 . R e e , K . , R u g s t a d , H . E . a n d B a k k a , A . 1 9 8 2 . U l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e s i n t h e n u c l e u s o f a human e p i t h e l i a l c e l l l i n e e x p o s e d t o c y t o t o x i c a g e n t s . A c t a p a t h , m i c r o b i o l . i m m u n o l . s c a n d . S e c t A 9 0 : 4 2 7 - 4 3 5 . R e i m e r s , T . J . a n d S l u s s , P . M . 1 9 7 8 . 6 - m e r c a p t o p u r i n e t r e a t m e n t o f p r e g n a n t m i c e : E f f e c t s o n s e c o n d a n d t h i r d g e n e r a t i o n . S c i e n c e 2 0 1 : 6 5 - 6 7 . R e i m e r s , T . J . , S l u s s , P . M . , G o o d w i n , J . a n d S e i d e l J r . , G . E . 1 9 8 0 . B i g e n e r a t i o n a l e f f e c t s o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e on r e p r o d u c t i o n i n m i c e . B i o l . R e p r o d . 2 2 : 3 6 7 - 3 7 5 . R e y n o l d s . E . S . 1 9 6 3 . T h e u s e o f l e a d c i t r a t e a t h i g h p H a s a n e l e c t r o n o p a q u e s t a i n i n e l e c t r o n m i c r o s c o p y . J . C e l l B i o l . 1 7 : 2 0 8 - 2 1 3 . - 119 - R e z e n d e , J . d e , C o s l o v s k y , S . a n d A g i n ' a r , P . B . d e . 1 9 6 5 . L e u k e m i a e g r a v i d e z . R e v . G i n e c . o b s t e t . ( R i o de J } 1 1 7 : 4 6 - 5 0 . R i g b y , P . G . , H a n s o n , T . A . a n d S m i t h , R . S . 1 9 6 4 . P a s s a g e o f l e u k a e m i c c e l l s a c r o s s t h e p l a c e n t a . New. E n g . J . M e d . 2 7 1 : 1 2 4 - 1 2 7 . R o s s , L . a n d W a l k e r , B . E . 1 9 6 7 . M o v e m e n t o f p a l a t i n e s h e l v e s i n u n t r e a t e d a n d t e r a t o g e n t r e a t e d mouse e m b r y o s . Am. J . A n a t . 1 2 1 : 5 0 9 - 5 2 1 . R o t h b e r g , H . , C o n r a d , M . E . a n d C o w l e y , R . G . 1 9 5 9 . A c u t e g r a n u l o c y t i c l e u k e m i a i n p r e g n a n c y : R e p o r t o f f o u r c a s e s , w i t h a p p a r e n t a c c e l e r a t i o n by p r e d n i s o n e i n o n e . A m e r . J . M e d . S c i . 2 3 7 : 1 9 4 - 2 0 4 . R o y - B u r m a n , P. 1 9 7 0 . R e c e n t r e s u l t s i n c a n c e r r e s e a r c h . I n : A n a l o g u e s o f N u c l e i c A c i d C o m p o n e n t s v o l . 2 5 . E d . R. R e n t c h n i c k , S p r i n g e r - V e r l a g , New Y o r k . , p p . 5 9 - 6 2 . S a b a t i n i , D . D . , B e n c h , K. and B a r n e t t , R . S . 1 9 6 3 . C y t o c h e m i s t r y a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p y . The p r e s e r v a t i o n o f c e l l u l a r u l t r a s t r u c t u r e a n d enzyme a c t i v i t y by a l d e h y d e f i x a t i o n . J . C e l l B i o l . 1 7 : 1 9 - 5 8 . S a d l e r , T . W . a n d C a r d e l l , R . R . 1 9 7 7 . U l t r a s t r u c t u r a l a l t e r a t i o n s i n n e u r o e p i t h e l i a l c e l l s o f mouse e m b r y o s e x p o s e d t o c y t o t o x i c d o s e s o f h y d r o x y u r e a . A n a t . R e c . 1 8 8 : 1 0 3 - 1 2 4 . S a l o m o n , D . S . a n d P r a t t , R . M . 1 9 7 9 . I n v o l v e m e n t o f g l u c o c o r t i c o i d s i n t h e d e v e l o p m e n t o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e : A r e v i e w . D i f f e r e n t i a t i o n 1 3 : 1 4 1 - 1 5 4 . S a n d b e r g , A . A . c i t e d by S o k a l a n d L e s s m a n n . 1 9 6 0 . E f f e c t s o f c a n c e r c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t s o n t h e human f e t u s . J . A . M . A . 1 7 2 : 1 7 6 5 - 1 7 7 1 . S a u e r , G . J . R . a n d E v a n s , C . A . 1 9 8 0 . H y p e r v i t a m i n o s i s A a n d m a t r i x a l t e r a t i o n s i n m a x i l l a r y e x p l a n t s f r o m 1 6 - d a y r a t e m b r y o s . T e r a t o l o g y 2 1 : 1 2 3 - 1 3 0 . S a x e n , L. a n d R a p o l a , J . 1 9 6 9 . M e t h o d s i n t e r a t o l o g y . I n : C o n g e n i t a l D e f e c t s . H o l t , R i n e h a r t a n d W i n s t o n I n c . , New Y o r k , p . 7 - 3 4 . S c h a r d e i n , J . L . 1 9 7 6 . D r u g s a s t e r a t o g e n s . CRC P r e s s , C l e v e l a n d , O h i o . S c h u m a c h e r , H . R . 1 9 5 7 . The u s e o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e 1n t r e a t m e n t o f a c u t e l e u k e m i a i n l a t e p r e g n a n c y . Am. J . O b s t . G y n e c . 7 4 : 1 3 6 1 - 1 3 6 2 . S c h u p b a c h , P . M . 1 9 8 3 . E x p e r i m e n t a l i n d u c t i o n o f an i n c o m p l e t e h a r d p a l a t e c l e f t i n t h e r a t . O r a l . S u r g . 5 5 : 2 - 9 . S c h u p b a c h , P . M . a n d S c h r o e d e r , H . E . 1 9 8 3 . C e l l r e l e a s e f r o m t h e p a l a t a l s h e l v e s a n d t h e f u s i o n l i n e . J . B i o l . B u c c . 1 1 : 2 2 7 - 2 4 1 . S c h u p b a c h , P . M . , C h a m b e r l a i n , J . G . a n d S c h r o e d e r , H . E . 1 9 8 3 . D e v e l o p m e n t o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n t h e r a t : A s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d y . J . C r a n i o f a c . G e n . D e v . B i o l . 3 : 1 5 9 - 1 7 7 . - 120 - S c h w e i c h e l , J . U . a n d M e r k e r , H . J . 1 9 7 3 . The m o r p h o l o g y o f v a r i o u s t y p e s o f c e l l d e a t h i n p r e n a t a l t i s s u e s . T e r a t o l o g y 7 : 2 5 3 - 2 6 6 . S c o t t J r . , W . J . 1 9 7 7 . C e l l d e a t h a n d r e d u c e d p r o l i f e r a t i v e r a t e . I n : Handbook o f T e r a t o l o g y , V o l . 2 . E d s . J . G . W i l s o n a n d F . C . F r a s e r , P l e n u m P r e s s , New Y o r k . S c o t t , W . J . , R i t t e r , E . J . a n d W i l s o n , J . G . 1 9 8 0 . E c t o d e r m a l a n d m e s o d e r m a l c e l l d e a t h p a t t e r n s i n 6 - m e r c a p t o p u r i n e r i b o s i d e - i n d u c e d d i g i t a l d e f o r m i t i e s . T e r a t o l o g y 2 1 : 2 7 1 - 2 7 9 . S h a h , R . M . 1 9 7 7 a . E f f e c t s o f p r e n a t a l a d m i n i s t r a t i o n o f h a d a c i d i n , a c a n c e r c h e m o t h e r a p e u t i c a g e n t , on t h e d e v e l o p m e n t o f h a m s t e r f e t u s e s . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h . 3 9 : 2 0 3 - 2 2 0 . S h a h , R . M . 1 9 7 7 b . P a l a t o m a n d i b u l a r and m a x i l l o - m a n d i b u l a r f u s i o n , p a r t i a l a g l o s s i a a n d c l e f t p a l a t e i n a human e m b r y o . R e p o r t o f a c a s e . T e r a t o l o g y 1 5 : 2 6 1 - 2 7 2 . S h a h , R . M . 1 9 7 9 a . A c e l l u l a r m e c h a n i s m f o r t h e p a l a t a l s h e l f r e o r i e n t a t i o n f r o m a v e r t i c a l t o a h o r i z o n t a l p l a n e i n h a m s t e r : l i g h t a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d y . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h . 5 3 : 1 - 1 3 . S h a h , R . M . 1 9 7 9 b . The d i s t r i b u t i o n o f desmosomes a n d r u t h e n i u m r e d - b o u n d c e l l s u r f a c e c a r b o h y d r a t e s d u r i n g p a l a t a l c l o s u r e i n t h e h a m s t e r . I n v e s t . C e l l P a t h o l . 2 : 3 1 9 - 3 3 1 . S h a h , R . M . 1 9 7 9 c . C u r r e n t c o n c e p t s o n t h e m e c h a n i s m s o f n o r m a l a n d a b n o r m a l s e c o n d a r y p a l a t e f o r m a t i o n . I n : A d v a n c e s i n t h e S t u d y o f B i r t h D e f e c t s , V o l . 1 , T e r a t o g e n i c M e c h a n i s m s . E d . T . V . N . P e r s a u d , MTP P r e s s L t d . , L a n c a s t e r , p p . 6 9 - 8 4 . S h a h , R . M . 1 9 7 9 d . U s e f u l n e s s o f g o l d e n S y r i a n h a m s t e r i n e x p e r i m e n t a l t e r a t o l o g y w i t h p a r t i c u l a r r e f e r e n c e t o t h e i n d u c t i o n o f o r o f a c i a l m a l f o r m a t i o n s . I n : A d v a n c e s i n t h e s t u d y o f b i r t h d e f e c t s , V o l . 2 , T e r a t o l o g i c a l t e s t i n g . E d . T . V . N . P e r s a u d , MTP P r e s s , L a n c a s t e r , p p . 2 5 - 3 9 . S h a h , R . M . 1 9 7 9 e . C l e f t p a l a t e d e v e l o p m e n t i n h a m s t e r e m b r y o s f o l l o w i n g t r i a m c i n o l o n e t r e a t m e n t . J . A n a t . 1 2 9 : 5 3 1 - 5 3 9 . S h a h , R . M . 1 9 8 0 . U l t r a s t r u c t u r a l o b s e r v a t i o n s o n t h e d e v e l o p m e n t o f t r i a m d n o l o n e - i n d u c e d c l e f t p a l a t e i n h a m s t e r s . I n v e s t . C e l l p a t h o l . 3 : 2 8 1 - 2 8 4 . S h a h , R . M . 1 9 8 4 . M o r p h o l o g i c a l , c e l l u l a r , a n d b i o c h e m i c a l a s p e c t s o f d i f f e r e n t i a t i o n o f n o r m a l a n d t e r a t o g e n - t r e a t e d p a l a t e i n h a m s t e r a n d c h i c k e m b r y o s . C u r r e n t T o p i c s i n D e v . B i o l . 1 9 : 1 0 3 - 1 3 5 . S h a h , R . M . a n d B u r d e t t , D . N . 1 9 7 9 . D e v e l o p m e n t a l a b n o r m a l i t i e s i n d u c e d by 6 - m e r c a p t o p u r i n e i n t h e h a m s t e r . C a n . J . P h y s i o l . P h a r m a c o l . 5 7 : 5 3 - 5 8 . - 121 - S h a h , R . M . a n d B u r t o n , A . F . 1 9 8 0 . M e t a b o l i s m a n d n u c l e a r - c y t o s o l b i n d i n g o f 1 4 C - g l u c o c o r t i c o i d s d u r i n g c l e f t p a l a t e d e v e l o p m e n t . J . D e n t . R e s . 5 9 ( S p e c i a l I s s u e A ) : 3 0 4 . S h a h , R . M . a n d C h a u d h r y , A . P . 1 9 7 4 a . L i g h t m i c r o s c o p i c a n d h i s t o c h e m i c a l o b s e r v a t i o n s on t h e d e v e l o p m e n t o f p a l a t e i n g o l d e n h a m s t e r s . J . A n a t . 1 1 7 : 1 - 1 5 . S h a h , R . M . a n d C h a u d h r y , A . P . 1 9 7 4 b . U l t r a s t r u c t u r a l o b s e r v a t i o n s on c l o s u r e o f t h e s o f t p a l a t e i n h a m s t e r s . T e r a t o l . 1 0 : 1 7 - 3 0 . S h a h , R . M . a n d C r a w f o r d , B . J . 1 9 8 0 . D e v e l o p m e n t o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n c h i c k e m b r y o : A l i g h t a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a n d h i s t o c h e m i c a l s t u d y . I n v e s t . C e l l P a t h o l . 3 : 3 1 9 - 3 2 8 . S h a h , R . M . a n d K i l i s t o f f , A . J . 1 9 7 6 . C l e f t p a l a t e i n d u c t i o n i n h a m s t e r by v a r i o u s g l u c o c o r t i c o i d h o r m o n e s a n d t h e i r s y n t h e t i c a n a l o g u e s . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h o l . 3 6 : 1 0 1 - 1 0 8 . S h a h , R . M . a n d M a c K a y , R . A . 1 9 7 8 . T e r a t o l o g i c a l e v a l u a t i o n o f 5 - f l u o r o u r a c i l a n d 5 - b r o m o - d e o x y u r i d i n e on h a m s t e r f e t u s e s . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h o l . 4 3 : 4 7 - 5 4 . S h a h , R . M . a n d T r a v i l l , A . . 1 9 7 4 . C e l l u l a r o r g a n i z a t i o n d u r i n g e a r l y p a l a t e f o r m a t i o n . T e r a t o l o g y 9 : A - 3 6 . S h a h , R . M . a n d T r a v i l l , A . A . 1 9 7 6 a . M o r p h o g e n e s i s o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n n o r m a l a n d h y d r o c o r t i s o n e - t r e a t e d h a m s t e r s . T e r a t o l o g y 1 3 : 7 1 - 8 4 . S h a h , R . M . a n d T r a v i l l , A . A . 1 9 7 6 b . L i g h t a n d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s o n h y d r o c o r t i s o n e i n d u c e d c l e f t p a l a t e i n h a m s t e r s . Am. J . A n a t . 1 4 5 : 1 4 9 - 1 6 6 . S h a h , R . M . a n d W o n g , D . T . W . 1 9 8 0 . M o r p h o l o g i c a l s t u d y o f c l e f t p a l a t e d e v e l o p m e n t i n 5 - f l u o r o u r a c i l - t r e a t e d h a m s t e r f e t u s e s . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h . 5 7 : 1 1 9 - 1 2 8 . S h a h , R . M . , C r a w f o r d , B . a n d S u e n , R. 1 9 8 3 . T i s s u e i n t e r a c t i o n and c y t o d i f f e r e n t i a t i o n d u r i n g p a l a t o g e n e s i s i n c h i c k a n d h a m s t e r . J . D e n t . R e s . 6 2 : 2 3 6 ( A b s t r a c t ) . S h a h , R . M . , D o n a l d s o n , D. a n d B u r d e t t , D. 1 9 7 9 . T e r a t o g e n i c e f f e c t s o f d i a z e p a m i n t h e h a m s t e r . C a n . J . P h y s i o l . P h a r m a c o l . 5 7 : 5 5 6 - 5 6 1 . S h a h , R . M . , W o n g , D . T . W . a n d S u e n , R . S . K . 1 9 8 4 a . U l t r a s t r u c t u r a l a n d c y t o c h e m i c a l o b s e r v a t i o n s o n 5 - f l u o r o u r a c i l i n d u c e d c l e f t - p a l a t e d e v e l o p m e n t i n h a m s t e r . Am. J . A n a t . 1 / 0 : 5 6 7 - 5 8 0 . S h a h , R . M . , C h e n g , K . M . , S u e n , R. a n d Wong, A . 1 9 8 4 b . An u l t r a s t r u c t u r a l a n d h i s t o c h e m i c a l s t u d y o f t h e d e v e l o p m e n t o f s e c o n d a r y p a l a t e i n J a p a n e s e q u a i l , C o t u r n i x c o t u r n i x j a p o n i c a . J . C r a n i o f a c i a l . G e n e t . D e v . B i o l , ( i n p r e s s ) . - 122 - S h a h , R . M . , C r a w f o r d , B . J . , G r e e n e , R . M . , S u e n , R . S . , B u r d e t t , D . N . , K i n g , K . O . a n d W o n g , D . T . W . 1 9 8 5 . I n v i t r o d e v e l o p m e n t o f t h e h a m s t e r a n d c h i c k s e c o n d a r y p a l a t e . J . C r a n i o f a c . G e n e t . D e v e l o p . B i o l . ( I n P r e s s ) . S h i e l d s , E . D . , B i x l e r , D. a n d F o g h - A n d e r s e n , P . 1 9 8 1 . C l e f t p a l a t e : A g e n e t i c a n d e p i d e m i o l o g i c i n v e s t i g a t i o n . C l i n i c a l G e n e t i c s 2 0 : 1 3 - 2 4 . S i n y k i n , M . B . a n d K a p l a n , H. 1 9 6 2 . L e u k e m i a i n p r e g n a n c y . A c a s e r e p o r t . A m e r . J . O b s t e t . G y n e c . 8 3 : 2 2 0 - 2 2 4 . S m e t a n a , K. a n d H e r m a n s k y , F . 1 9 6 6 . On t h e u l t r a s t r u c t u r e o f l e u k a e m i c m o n o c y t e s . F o l i a h e a m a t o l . 8 6 : 3 5 - 4 6 . S m i l e y , G . R . 1 9 7 0 . F i n e s t r u c t u r e o f mouse e m b r y o n i c p a l a t a l e p i t h e l i u m p r i o r t o a n d a f t e r m i d l i n e f u s i o n . A r c h , o r a l B i o l . 1 5 : 2 8 7 - 2 9 6 . S m i l e y , G . R . 1 9 7 2 . A p o s s i b l e g e n e s i s f o r c l e f t p a l a t e f o r m a t i o n . P l a s t . R e c o n s t r . S u r g . 5 0 : 3 9 0 - 3 9 4 . S m i l e y , G . R . a n d K o c h , W . E . 1 9 7 1 . F i n e s t r u c t u r e o f mouse s e c o n d a r y p a l a t e d e v e l o p m e n t i n v i t r o . J . D e n t . R e s . 5 0 : 1 6 / 1 - 1 6 7 7 . S m i l e y , G . R . a n d K o c h , W . E . 1 9 / 5 . A c o m p a r i s o n o f s e c o n d a r y p a l a t e d e v e l o p m e n t w i t h d i f f e r e n t i n v i t r o t e c h n i q u e s . A n a t . R e c . 1 8 1 : 7 1 1 - 7 2 4 . S m i t h e l l s , R . W . 1 9 6 6 . D r u g s a n d human m a l f o r m a t i o n s . I n : A d v a n c e s i n T e r a t o l o g y V o l . 1 , p p . 2 5 1 - 2 7 8 . S o k a l , R . R . a n d R o h l f , F . J . 1 9 6 9 . B i o m e t r y . The p r i n c i p l e s a n d p r a c t i c e o f s t a t i s t i c s i n b i o l o g i c a l r e s e a r c h . W i l t . F r e e m a n a n d c o m p a n y , San F r a n c i s c o . S o n a w a n e , B . R . a n d G o l d m a n , A . S . 1 9 8 1 . S u s c e p t i b i l i t y o f m i c e t o p h e n y t o i n - i n d u c e d c l e f t p a l a t e c o r r e l a t e d w i t h i n h i b i t i o n o f f e t a l p a l a t a l RNA a n d p r o t e i n s y n t h e s i s . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 1 6 8 : 1 7 5 - 1 7 9 . S o u c h o n , R. 1 9 7 5 . S u r f a c e c o a t o f t h e p a l a t a l s h e l f e p i t h e l i u m d u r i n g p a l a t o g e n e s i s i n mouse e m b r y o s . A n a t . E m b r y o l . 1 4 7 : 1 3 3 - 1 4 2 . S t a n l e y , J . R . , W o o d l e y , D . T . , K a t z , S . I . a n d M a r t i n , G . R . 1 9 8 2 . S t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f b a s e m e n t m e m b r a n e . J . I n v e s t . D e r m a t o l . ( S u p p l . ) 7 9 : 6 9 - 7 2 . S t e f f e k , A . J . , V e r r u c i o , A . C . a n d K i n g , C . T . G . 1 9 6 8 . The h i s t o l o g y o f p a l a t a l c l o s u r e i n t h e r h e s u s monkey ( M a c a c a m u l a t t a ) . T e r a t o l o g y 1 : 4 2 5 - 4 3 0 . S t e m p a k , J . G . a n d W a r d , R . T . 1 9 6 4 . An i m p r o v e d s t a i n i n g m e t h o d f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y . J . C e l l B i o l . 2 2 : 6 9 7 - 7 0 1 . S t e w a r t , J . O . 1 9 6 4 . L e u k e m i a i n p r e g n a n c y . A c a s e r e p o r t o f a c u t e l y m p h a t i c l e u k e m i a . J . N a t . M e d . A s s . INY) b b : 8 / - 8 9 . - 123 - S u g i m o t o , A . , R o s e , G . G . , T a k a r a d a , H. a n d C a t t o n i , M . 1 9 / 3 . U l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e s o f b a s a l l a m i n a a n d a n c h o r i n g f i b r i l s o f g i n g i v a i n v i t r o . J . P e r i o d o n t . R e s . / : 1 2 / - 1 4 2 . S w i f t , H. a n d H r u b a n , Z . 1 9 6 4 . F o c a l d e g e n e r a t i o n a s a b i o l o g i c a l p r o c e s s . F e d n . P r o c . F e d n . Am. S p c s . E x p . B i o l . 2 3 : 1 0 2 6 - 1 0 3 7 . T a k a r a d a , H . , C a t t o n i , M . , S u g i m o t o , A . a n d R o s e , G . G . 1 9 7 4 . U l t r a s t r u c t u r a l s t u d i e s o f human g i n g i v a . I I I . C h a n g e s o f t h e b a s a l l a m i n a i n c h r o n i c p e r i o d o n t i t i s . J . P e r i o d o n t o l . 4 5 : 2 8 8 - 3 0 2 . T a r i n , D. 1 9 7 2 . M o r p h o l o g i c a l s t u d i e s on t h e m e c h a n i s m o f c a r c i n o g e n e s i s . I n : T i s s u e I n t e r a c t i o n s i n C a r c i n o g e n e s i s . E d . D. T a r i n , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , p p . 2 2 7 - 2 9 0 . T a s s i n , M . T . a n d W e i l l , R. 1 9 8 0 . S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d y o f t h e m e d i o p a l a t a l e p i t h e l i u m : S i m u l t a n e o u s m o d i f i c a t i o n s c h a r a c t e r i z i n g f u s i o n a n d d e g e n e r e s c e n c e p r o c e s s e s . W i l h e l m R o u x ' s A r c h i v e s 1 8 8 : 1 3 - 2 1 . T a y l o r G . R . 1 9 7 8 . C r a n i o f a c i a l g r o w t h d u r i n g c l o s u r e o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e i n t h e h a m s t e r . J . A n a t . 1 2 5 : 3 6 1 - 3 / 0 . T a y l o r , J . H . , H a r t , W . F . a n d T u n g , J . 1 9 6 2 . E f f e c t s o f f l u o r o d e o x y u r i d i n e o n DNA r e p l i c a t i o n , c h r o m o s o m e b r e a k a g e a n d r e u n i o n . P r o c . N a t . A c a d . S c i . 4 8 : 1 9 0 - 1 9 8 . T h e o d o s i s , D . T . a n d F r a s e r , F . C . 1 9 7 8 . E a r l y c h a n g e s i n t h e mouse n e u r o e p i t h e l i u m p r e c e e d i n g e x e n c e p h a l y i n d u c e d by h y p e r v i t a m i n o s i s A . T e r a t o l o g y 1 8 : 2 1 9 - 2 3 2 . T h i e r s c h , J . B . 1 9 5 4 . The e f f e c t o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e on t h e r a t f e t u s a n d o n r e p r o d u c t i o n o f t h e r a t . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 6 0 : 2 2 0 - 2 2 7 . T h i e r s c h , J . B . 1 9 5 6 . The c o n t r o l o f r e p r o d u c t i o n i n r a t s w i t h t h e a i d o f a n t i m e t a b o l i t e s a n d e a r l y e x p e r i e n c e s w i t h a n t i m e t a b o l i t e s a s a b o r t i f a c i e n t a g e n t s i n m a n . A c t a , e n d o c r . ( K b h ) S u p p l . 2 8 : 3 7 - 4 5 . T i d d , D . M . a n d D e d h a r , S . 1 9 7 8 . S p e c i f i c a n d s e n s i t i v e c o m b i n e d h i g h - p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h i c - f l o w f l u o r o m e t r i c a s s a y f o r i n t r a c e l l u l a r b - t h i o g u a n i n e n u c l e o t i d e m e t a b o l i t e s o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e a n d 6 - t h i o g u a n i n e . J . C h r o m a t o g r . 1 4 5 : 2 3 7 - 2 4 6 . T i d d , D . M . a n d P a t e r s o n , A . R . P . 1 9 7 4 . A b i o c h e m i c a l m e c h a n i s m f o r t h e d e l a y e d c y t o t o x i c r e a c t i o n o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e . C a n c e r R e s . 3 4 : 7 3 8 - 7 4 6 . T i d d , D . M . , K i m , S . C , H o r a k o v a , K . , M o r i w a k i , A . a n d P a t e r s o n , A . R . P . 1 9 7 2 . A d e l a y e d c y t o t o x i c r e a c t i o n f o r b - m e r c a p t o p u r i n e . C a n c e r R e s . 3 2 : 3 1 7 - 3 2 2 . T i m p l , R . , R o h d e , H . , G e h r o n , R . P . , R e n n a r d , S . I . , F o i d a r t , J . M . a n d M a r t i n , G . R . 1 9 7 9 . L a m i n i n - A g l y c o p r o t e i n f r o m b a s e m e n t m e m b r a n e s . J . B i o l . Chem. 2 5 4 : 9 9 3 3 - 9 9 3 7 . - 124 - T r u m p , B . F . , B e r e z e s k y , I . K . , P h e l p s , P . C . a n d J o n e s , R . T . 1 9 8 3 . An o v e r v i e w o f t h e r o l e o f membranes i n human d i s e a s e . I n : C e l l u l a r P a t h o b i o l o g y o f Human D i s e a s e . E d . B . F . T r u m p , A . L a u f e r , R . T . J o n e s . G u s t a v F i s c h e r , New Y o r k . T t e r l i k k i s , L . , O r t e g a , E . , S o l o m a n , R. a n d D a y , J . L . 1 9 7 7 . P h a r m a c o k i n e t i c s o f m e r c a p t o p u r i n e . J . P h a r m . S c i . 6 6 : 1 4 5 4 - 1 4 5 7 . T u c h m a n n - D u p l e s s i s , H . 1 9 8 3 . The t e r a t o g e n i c r i s k . P r o g . C l i n . B i o l . R e s . 1 1 7 : 2 4 5 - 2 5 8 . T u c h m a n n - D u p l e s s i s , H . a n d H a e g e l , P. 1 9 7 4 . I l l u s t r a t e d human e m b r y o l o g y : V o l u m e 2 O r g a n o g e n e s i s . M a s s o n a n d C o . P a r i s , p p . 1 6 - 1 9 . T u c h m a n - D u p l e s s i s , H . a n d M e r c i e r - P a r o t , L . 1 9 5 8 . On t h e t e r a t o g e n i c a c t i o n o f s e v e r a l a n t i m i t o t i c s u b s t a n c e s i n t h e r a t ( F r . ) . C . R . H e b d . A c a d . S c i . 2 4 7 : 1 5 2 - 1 5 4 . T u c h m a n n - D u p l e s s i s , H. and M e r c i e r - P a r o t , L. 1 9 6 6 . P r o d u c t i o n o f l i m b m a l f o r m a t i o n s i n t h e r a b b i t by a d m i n i s t r a t i o n o f a z a t h i o p r i n e a n d 6 - m e r c a p t o p u r i n e ( F r . ) . C . R . S o c . B i o l . P a r i s 1 6 0 : 5 0 1 - 5 0 7 . T u c h m a n n - D u p l e s s i s , H. a n d M e r c i e r - P a r o t , L . 1 9 6 8 . E x p e r i m e n t a l p r o d u c t i o n o f l i m b m a l f o r m a t i o n s ( F r . ) . U n i o n m e d . C a n . 9 7 : 2 8 3 - 2 8 8 . T y a n , M . L . 1 9 8 2 . D i f f e r e n c e s i n t h e r e p o r t e d f r e q u e n c i e s o f c l e f t l i p p l u s c l e f t l i p a n d p a l a t e i n a s i a n s b o r n i n H a w a i i a n d t h e c o n t i n e n t a l U n i t e d S t a t e s . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 1 7 1 : 4 1 - 4 5 . T y l e r , M . S . a n d K o c h , W . E . 1 9 7 5 . I n v i t r o d e v e l o p m e n t o f p a l a t a l t i s s u e s f r o m e m b r y o n i c m i c e . I . D i f f e r e n t i a T T o n o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e f r o m 1 2 - d a y m o u s e e m b r y o s . A n a t . R e c . 1 8 2 : 2 9 7 - 3 0 3 . T y l e r , M . S . a n d K o c h , W . E . 1 9 7 7 a . I n v i t r o d e v e l o p m e n t o f p a l a t a l t i s s u e s f r o m e m b r y o n i c m i c e I I . T i s s u e i s o l a t i o n a n d r e c o m b i n a t i o n s t u d i e s . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h . 3 8 : 1 9 - 3 6 . T y l e r , M . S . a n d K o c h , W . E . 1 9 7 7 b . I n v i t r o d e v e l o p m e n t o f p a l a t a l t i s s u e s f r o m e m b r y o n i c m i c e I I I . I n t e r a c t i o n s b e t w e e n p a l a t a l e p i t h e l i u m a n d h e t e r o t y p i c o r a l m e s e n c h y m e . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h . 3 8 : 3 7 - 4 8 . T y l e r , M . S . a n d P r a t t , R . M . 1 9 8 0 . E f f e c t o f e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r on s e c o n d a r y p a l a t a l e p i t h e l i u m i n v i t r o : t i s s u e i s o l a t i o n a n d r e c o m b i n a t i o n s t u d i e s . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h - . 5 8 : 9 3 - 1 0 6 . V a r g a s , V . , N a s j l e t i , C . a n d A z c u r r a , J . 1 9 7 2 . C y t o d i f f e r e n t i a t i o n o f t h e m o u s e s e c o n d a r y p a l a t e i n v i t r o : m o r p h o l o g i c a l , b i o c h e m i c a l , a n d h i s t o c h e m i c a l a s p e c t s . J . E l i b r y o l . E x p . M o r p h o l . 2 7 : 4 1 3 - 4 3 0 . V e a u , V . 1 9 3 1 . D i v i s i o n p a l a t i n e . M a s s o n a n d C i e . , P a r i s . V e r r u s i o , A . C . 1 9 7 0 . A m e c h a n i s m f o r c l o s u r e o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e . T e r a t o l o g y 3 : 1 7 - 2 0 . - 125 - V i s c h n i a k o v , Y . S . 1 9 6 8 . The s p e c i f i c i t y o f t h e d a m a g i n g e f f e c t p r o d u c e d by 6 - m e r c a p t o p u r i n e a t d i f f e r e n t s t a g e s o f e m b r y o g e n e s i s i n r a t s ( R u s s ) . F a r m a k o l . T o k s i k o l . 3 1 : 4 8 0 - 4 8 1 . V i s h n i a k o v , Y . S . 1 9 6 9 . T e r a t o g e n o u s e f f e c t o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e on a l b i n o r a t e m b r y o s ( R u s s . ) . A r k h . A n a t . 5 7 : 3 7 - 4 1 . Y r a c k o , R. 1 9 7 2 . S i g n i f i c a n c e o f b a s a l l a m i n a f o r r e g e n e r a t i o n o f i n j u r e d l u n g . V i r c h o w s A r c h . ( P a t h o l . A n a t . ) 3 5 5 : 2 6 4 - 2 7 4 . V r a c k o , R. 1 9 7 9 . B a s a l l a m i n a s c a f f o l d . I t s r o l e i n m a i n t e n a n c e o f t i s s u e s t r u c t u r e a n d i n p a t h o g e n e s i s o f b a s a l l a m i n a t h i c k e n i n g . I n : B i o c h e m i s t r y a n d P a t h o l o g y o f B a s e m e n t M e m b r a n e . E d . A . M . R o b e r t s , R. B o n i f a c a a n d L. R o b e r t s , S . K a r g e r , New Y o r k , p p . 7 8 - 9 0 . W a l k e r , B . E . 1 9 6 1 . T h e a s s o c i a t i o n o f m u c o p o l y s a c c h a r i d e s w i t h m o r p h o g e n e s i s o f t h e p a l a t e a n d o t h e r s t r u c t u r e s i n mouse e m b r y o s . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h . 9 : 2 2 - 3 1 . W a l k e r , B . E . 1 9 6 7 . I n d u c t i o n o f c l e f t p a l a t e i n r a b b i t by s e v e r a l g l u c o c o r t i c o i d s . P r o c . S o c . e x p . B i o l . M e d . 1 2 5 : 1 2 8 1 - 1 2 8 4 . W a l k e r , B . E . 1 9 6 9 . C o r r e l a t i o n o f e m b r y o n i c movement w i t h p a l a t a l c l o s u r e i n m i c e . T e r a t o l o g y 2 : 1 9 1 - 1 9 8 . W a l k e r , B . E . 1 9 7 1 . P a l a t e m o r p h o g e n e s i s i n t h e r a b b i t . A r c h s . O r a l B i o l . 1 6 : 2 7 5 - 2 8 6 . W a l k e r , B . E . a n d C r a i n , B . 1 9 6 0 . E f f e c t s o f h y p e r v i t a m i n o s i s A on p a l a t e d e v e l o p m e n t i n two s t r a i n s o f m i c e . Am. J . A n a t . 1 0 7 : 4 9 - 5 8 . W a l k e r , B . E . a n d F r a s e r , F . C . 1 9 5 6 . C l o s u r e o f t h e s e c o n d a r y p a l a t e 1n t h r e e s t r a i n s o f m i c e . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h . 4 : 1 7 6 - 1 8 9 . W a l k e r , B . E . a n d F r a s e r , F . C . 1 9 5 7 . The e m b r y o l o g y o f c o r t i s o n e i n d u c e d c l e f t p a l a t e . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h o l . 5 : 2 0 1 - 2 0 9 . W a l k e r , B . E . a n d R o s s , L . M . 1 9 7 2 . O b s e r v a t i o n s o f p a l a t i n e s h e l v e s i n l i v i n g r a b b i t e m b r y o s . T e r a t o l o g y 5 : 9 7 - 1 0 2 . W a r k a n y J . a n d N e l s o n , R . C . 1 9 4 1 . S k e l e t a l a b n o r m a l i t i e s i n o f f s p r i n g o f r a t s r e a r e d o n d e f i c i e n t d i e t s . A n a t . R e c . 7 9 : 8 3 - 1 0 0 . W a r k a n y , J . a n d S c h r a f f e n b e r g e r , E . 1 9 4 3 . C o n g e n i t a l m a l f o r m a t i o n s i n d u c e d i n r a t s by m a t e r n a l n u t r i t i o n a l d e f i c i e n c y . V . E f f e c t s o f a p u r i f i e d d i e t l a c k i n g r i b o f l a v i n . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 5 4 : 9 2 . W a r k a n y , J . , R o t h , C . B . a n d W i l s o n , J . G . 1 9 4 8 . M u l t i p l e c o n g e n i t a l m a l f o r m a t i o n s : A c o n s i d e r a t i o n o f e t i o l o g i c f a c t o r s . P e d i a t r i c s 1 : 4 6 2 - 4 7 1 . W a t e r m a n , R. a n d M e l l e r , S . M . 1 9 7 4 . A l t e r a t i o n s i n t h e e p i t h e l i a l s u r f a c e o f human p a l a t a l s h e l v e s p r i o r t o a n d d u r i n g f u s i o n : A s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d y . A n a t . R e c . 1 8 0 : 1 1 1 - 1 3 6 . - 126 - W a t e r m a n , R . , R o s s , L. a n d M e l l e r , S . M . 1 9 7 3 . A l t e r a t i o n s i n t h e e p i t h e l i a l s u r f a c e o f A / J a x mouse p a l a t a l s h e l v e s p r i o r t o a n d d u r i n g f u s i o n : A s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d y . A n a t . R e c . 1 7 6 : 3 6 1 - 3 7 5 . W e b s t e r , W . , S h i m a d a , M . a n d L a n g m a n , J . 1 9 / 3 . E f f e c t o f 6 - f l u o r o d e o x y u r i d i n e , c o l c e m i d , a n d b r o m o d e o x y u r i d i n e o n d e v e l o p i n g n e o c o r t e x o f t h e m o u s e . Am. J . A n a t . 1 3 5 : 6 7 - 8 6 . Wee, E . L . , B a b i a r z , B . S . , Z i m m e r m a n , S . a n d Z i m m e r m a n , E . F . 1 9 7 9 . P a l a t e m o r p h o g e n e s i s I V . E f f e c t s o f s e r o t o n i n a n d i t s a n t a g o n i s t s on r o t a t i o n i n e m b r y o c u l t u r e . J . E m b r y o l . E x p . M o r p h . 5 3 : 7 5 - 9 U . W h a l e y , W . G . , D a u w a l d e r , M . a n d K e p h a r t , J . E . 1 9 7 1 . A s s e m b l y , c o n t i n u i t y , a n d e x c h a n g e s i n c e r t a i n c y t o p l a s m i c membrane s y s t e m s . I n : O r i g i n a n d c o n t i n u i t y o f c e l l o r g a n e l l e s . E d . J . R e i n e r t a n d H . U r s p r u n g . S p r i n g e r - V e r l a g , New Y o r k . W h i t e , F . H . a n d G o h a r i , K. 1 9 8 1 . A q u a n t i t a t i v e s t u d y o f l a m i n a d e n s a a l t e r a t i o n s i n h a m s t e r c h e e k p o u c h c a r c i n o g e n e s i s . J . P a t h o l . 1 3 5 : 2 7 7 - 2 9 4 . W i l k , A . L . , K i n g , C . T . G . a n d P r a t t , R . M . 1 9 7 8 . C h l o r o c y c l i z i n e i n d u c t i o n o f c l e f t p a l a t e i n t h e r a t : D e g r a d a t i o n o f p a l a t a l g l y c o s a m i n o g l y c a n s . T e r a t o l o g y 1 8 : 1 9 9 - 2 1 0 . W i n d h o l z , M . 1 9 7 6 . The m e r c k i n d e x , 9 t h e d . , E d . M . W i n d h o l z , M e r c k a n d C o . , R a h w a y , N . J . , p . 7 6 3 . W o o d , P . J . a n d K r a u s , B . S . 1 9 6 2 . P r e n a t a l d e v e l o p m e n t o f t h e human p a l a t e . Some h i s t o l o g i c a l o b s e r v a t i o n s . A r c h , o r a l B i o l . 7 : 1 3 7 - 1 5 0 . W o o d s , D . A . a n d S m i t h , C . J . 1 9 6 9 . U l t r a s t r u c t u r e o f t h e d e r m a l - e p i d e r m a l j u n c t i o n i n e x p e r i m e n t a l l y i n d u c e d t u m o r s a n d human o r a l l e s i o n s . J . I n v e s t . D e r m a t o l . 5 2 : 2 5 9 - 2 6 3 . W o o d s , D . A . a n d S m i t h , C . J . 1 9 7 0 . U l t r a s t r u c t u r e a n d d e v e l o p m e n t o f e p i t h e l i a l c e l l p s e u d o p o d i a i n c h e m i c a l l y i n d u c e d p r e m a l i g n a n t l e s i o n s o f t h e h a m s t e r c h e e k p o u c h . E x p . M o l . P a t h o l . 1 2 : 1 6 0 - 1 7 4 . W r a g g , L . , D i e w e r t , V . a n d K l e i n , M . 1 9 7 2 . S p a t i a l r e l a t i o n s i n t h e o r a l c a v i t y a n d t h e m e c h a n i s m s o f s e c o n d a r y p a l a t e c l o s u r e i n t h e r a t . A r c h , o r a l B i o l . 1 7 : 6 8 3 - 6 9 0 . W y l l i e , A . H . 1 9 8 1 . C e l l d e a t h : A new c l a s s i f i c a t i o n s e p a r a t i n g a p o p t o s i s f r o m n e c r o s i s . I n : C e l l d e a t h i n b i o l o g y a n d p a t h o l o g y . E d . I . D . Bowen a n d R . A . L o c k s h i n . Chapman a n d H a l l , L o n d o n , New Y o r k . Y a m a n i s h i , Y . , D a b b o u s , M . K . a n d H a s h i m o t o , K. 1 9 7 2 . E f f e c t o f c o l 1 a g e n o l y t i c a c t i v i t y i n b a s a l c e l l e p i t h e l i o m a o f t h e s k i n o n r e c o n s t i t u t e d c o l l a g e n a n d p h y s i c a l p r o p e r t i e s a n d k i n e t i c s o f t h e c r u d e e n z y m e . C a n c e r R e s . 3 2 : 2 5 5 1 - 2 5 5 5 . - 127 - Y a s u z u m i , G . , A o y a m a , N . a n d Y a b u m o t o , N. 1 9 8 3 . U l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e s o f b a s a l l a m i n a a n d p r o t o p l a s m i c a s t r o c y t e s i n c r a n i o s t e n o s i s w i t h e p i l e p s y . J . S u b m i c r o s c . C y t o l . 1 5 : 5 8 3 - 5 9 2 . Z a r , J . H . 1 9 7 4 . B i o s t a t i s t i c a l a n a l y s i s . P r e n t i c e - H a l l I n c . E n g l e w o o d C l i f f s , N . J . Z e i l e r , K . D . , W e i n s t e i n , S . a n d G i b s o n , R . D . 1 9 6 4 . A s t u d y o f t h e m o r p h o l o g y a n d t h e t i m e o f c l o s u r e o f t h e p a l a t e i n t h e a l b i n o r a t . A r c h , o r a l B i o l . 9 : 5 4 5 - 5 5 4 . Z e l e n a , J . , S m e t a n a , K. a n d J i r m a n o v a , I . 1 9 7 8 . A b n o r m a l i t i e s o f t h e n u c l e a r e n v e l o p e i n p o r c i n e m u s c l e a f f e c t e d w i t h c o n g e n i t a l m y o f i b r i l l a r h y p o p l a s i a . V i r c h o w s . A r c h . B . C e l l P a t h . 2 8 : 1 5 7 - 1 6 5 . Z i m m e r m a n , E . F . 1 9 7 9 . P a l a t e m o r p h o g e n e s i s : R o l e o f c o n t r a c t i l e p r o t e i n s a n d n e u r o t r a n s m i t t e r s . I n : A d v a n c e s i n t h e s t u d y o f b i r t h d e f e c t s . V o l . 3 . , E d . T . V . N . P e r s a u d , MTP P r e s s L i m i t e d , L a n c a s t e r , p p . 1 4 3 - 1 5 9 . Z i m m e r m a n , E . F . , A n d r e w , F . a n d K a l t e r , H. 1 9 7 0 . G l u c o c o r t i c o i d i n h i b i t i o n o f RNA s y n t h e s i s r e s p o n s i b l e f o r c l e f t p a l a t e i n m i c e : A m o d e l . P r o c . N a t . A c a d . S c . ( U S A ) 6 7 : 7 / 9 - 7 8 5 . Z i m m e r m a n , E . F . , Wee, E . L . , C l a r k , R . H . a n d V e n k a t a s u b r a m a n i a n , K. 1 9 8 0 . N e u r o t r a n s m i t t e r s a n d t e r a t o g e n i n v o l v e m e n t i n c e l l m e d i a t e d p a l a t a l e l e v a t i o n . I n : C u r r e n t R e s e a r c h T r e n d s i n C r a n i o f a c i a l D e v e l o p m e n t s . E d . R . M . P r a t t , a n d R . L . C h r i s t i a n s e n , E l s e v i e r N o r t h H o l l a n d , A m s t e r d a m , p p . 1 8 7 - 2 0 2 . Z i m m e r m a n n , T . P . , C h u , L . C . , B u g g e , C . J . L . , N e l s o n , D . J . , L y o n , G . M . a n d E l i o n , G . B . 1 9 7 4 . I d e n t i f i c a t i o n o f 6 - m e t h y l m e r c a p t o p u r i n e r i b o n u c l e o s i d e 5 ' - d i p h o s p h a t e a n d 5 ' - t r i p h o s p h a t e a s m e t a b o l i t e s o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e i n m a n . C a n c e r R e s . 3 4 : 2 2 1 - 2 2 4 . Z u n i n , C . a n d B o r r o n e , L . 1 9 5 5 . The t e r a t o g e n i c e f f e c t o f 6 - m e r c a p t o p u r i n e ( I t a l . ) . M i n e r v a P e d i a t r . 7 : 6 6 - 7 1 . - 128 - APPENDIX 1 P r e p a r a t i o n o f s o l u t i o n s f o r A c i d P h o s p h a t a s e C y t o c h e m i s t r y ( B a r k a a n d A n d e r s o n , 1 9 6 2 ) . F o r m o l - C a l c i u m : F r e s h f o r m o l - c a l c i u m was p r e p a r e d by d i s s o l v i n g one gram a n h y d r o u s c a l c i u m c h l o r i d e ( A l l i e d C h e m i c a l C a n a d a L t d . , c a t a l o g * 1 5 0 2 , Lot# X 0 7 0 ) i n 60 ml o f d i s t i l l e d w a t e r . To t h i s s o l u t i o n , 10 ml o f 40% f o r m a l d e h y d e was a d d e d , a n d a d j u s t e d t o pH 7 . 1 . The v o l u m e was t h e n b r o u g h t t o 100 ml w i t h d i s t i l l e d w a t e r . P a r a r o s a n l l 1 n : W i t h g e n t l e w a r m i n g , o n e g r a m o f p a r a r o s a n i l i n h y d r o c h l o r i d e ( J . T . B a k e r C h e m i c a l C o . , P h i l 1 i p s b u r g , N . J . , c a t a l o g # 2 9 0 3 , L o t # 5 0 8 5 1 2 ) was d i s s o l v e d i n 2 0 ml o f d i s t i l l e d w a t e r a n d 5 ml c o n c e n t r a t e d h y d r o c h l o r i c a c i d . A f t e r t h e s o l u t i o n c o o l e d , i t was f i l t e r e d and s t o r e d a t room t e m p e r a t u r e f o r f u t u r e u s e . 4% S o d i u m N i t r i t e : A f r e s h s o l u t i o n o f s o d i u m n i t r i t e ( F i s h e r S c i e n t i f i c C o . , F a i r L a w n , N . J . , c a t a l o g # S - 3 4 7 , L o t # 7 8 1 7 6 8 ) was p r e p a r e d by t h e a d d i t i o n o f 4 g s o d i u m n i t r i t e t o 100 ml o f w a t e r . M i c h a e l I s V e r o n a l A c e t a t e B u f f e r : 5 . 8 5 g a n h y d r o u s s o d i u m a c e t a t e ( F i s h e r S c i e n t i f i c C o . , F a i r L a w n , N . J . , c a t a l o g # S - 2 1 0 , L o t # 7 7 4 3 9 7 ) was a d d e d t o 1 4 . 7 1 4 g B a r b i t a l S o d i u m (BDH C h e m i c a l s C a n a d a L t d . , V a n c o u v e r ) . They w e r e t h e n d i s s o l v e d i n 500 ml o f d i s t i l l e d w a t e r . - 129 - N a p h t h o l A S - T R S o l u t i o n : 100 mg n a p h t h o l AS-TR p h o s p h a t e ( N u t r i t i o n a l B i o c h e m l c a l s C o . , C l e v e l a n d , O h i o , c a t a l o g # 4 3 0 8 ) was d i s s o l v e d i n 10 ml N, N - d i m e t h y l f o r m a m i d e ( F i s h e r S c i e n t i f i c C o . , F a i r L a w n , N . J . , c a t a l o g * D - 1 3 1 , L o t # 7 8 6 5 9 7 ) a n d t h e n q u i c k l y c h i l l e d i n t h e f r e e z e r t o p r e v e n t t h e f o r m a t i o n o f a p r e c i p i t a t e . The s o l u t i o n was f r e s h l y p r e p a r e d f o r e a c h i n c u b a t i o n . M e t h y l G r e e n S t a i n : 1 g o f m e t h y l g r e e n ( F i s h e r S c i e n t i f i c C o . , F a i r L a w n , N . J . , c a t a l o g # M - 2 9 5 , L o t # 7 7 3 0 9 9 ) was d i s s o l v e d i n 100 ml o f v e r o n a l a c e t a t e b u f f e r , a n d a d j u s t e d t o pH 4 . 0 . I n c u b a t i o n S o l u t i o n : The i n c u b a t i o n s o l u t i o n was p r e p a r e d i n two p a r t s . I n t h e f i r s t p a r t , 30 ml o f M i c h a e l i s v e r o n a l a c e t a t e b u f f e r was m i x e d w i t h 72 ml o f d i s t i l l e d w a t e r a n d 6 ml o f t h e s u b s t r a t e n a p h t h o l AS-TR s o l u t i o n . I n t h e s e c o n d p a r t 4 . 8 ml o f p a r a r o s a n i l i n s o l u t i o n was d i a z o t i z e d by m i x i n g w i t h 4 . 8 ml o f 4% s o d i u m n i t r i t e s o l u t i o n . The two p a r t s w e r e m i x e d a n d a d j u s t e d t o pH 5 . 0 w i t h 0 . 5 N NaOH. The s o l u t i o n w a s t h e n f i l t e r e d a n d u s e d a s t h e i n c u b a t i o n m e d i u m . .

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