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An immunochemical and immunocytochemical study of the S-100b protein Boyes, Barry Edward 1985

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AN IMMUNOCHEMICAL AND IMMUNOCYTOCHEMICAL STUDY OF THE S - l O O b PROTEIN By BARRY EDWARD BOYES B . S c . ( H o n s . ) . The U n i v e r s i t y o f A l b e r t a , 1982 A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF MASTER OF SCIENCE i n THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES ( D i v i s i o n o f N e u r o l o g i c a l S c i e n c e s , D e p a r t m e n t o f P s y c h i a t r y ) We a c c e p t t h i s t h e s i s as c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE UNIVERSITY OF B R I T I S H COLUMBIA May 1985 © Barry E d w a r d B o y e s , 1985 I n p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r an advanced degree a t t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , I agree t h a t t h e L i b r a r y s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e and s t u d y . I f u r t h e r agree t h a t p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e c o p y i n g o f t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y purposes may be g r a n t e d by t h e head o f my department o r by h i s o r h e r r e p r e s e n t a t i v e s . I t i s u n d e r s t o o d t h a t c o p y i n g o r p u b l i c a t i o n o f t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l n o t be a l l o w e d w i t h o u t my w r i t t e n p e r m i s s i o n . Department o f PSYCHIATRY  The U n i v e r s i t y o f B r i t i s h Columbia 1956 Main Mall V ancouver, Canada V6T 1Y3 Date MAY 15, 1985 DE-6 (3/81) i i A b s t r a c t . T h i s t h e s i s d e s c r i b e s an i m m u n o c h e m i c a l and i m m u n o c y t o c h e m i c a l s t u d y o f t h e b o v i n e b r a i n S - l O O b p r o t e i n . The t w o m a j o r f o r m s o f t h e S - 1 0 0 i s o p r o t e i n s ( S - l O O a and S - l O O b ) w e r e p u r i f i e d t o a p p a r e n t h o m o g e n e i t y f r o m b o v i n e b r a i n . A p o l y c l o n a l r a b b i t a n t i s e r u m t o t h e S - l O O b p r o t e i n was p r e p a r e d . The a n t i s e r u m was c h a r a c t e r i z e d by s o l i d p h a s e i m m u n o c h e m i c a l m e t h o d s . The S - l O O b d e r i v e d a n t i s e r u m d i s p l a y e d a h i g h d e g r e e o f s p e c i f i c i t y f o r S - l O O b , b u t a l s o c r o s s r e a c t e d w i t h t h e p u r i f i e d S - l O O a p r o t e i n . The c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e i m m u n o c h e m i c a l r e a c t i v i t y o f t h e a n t i s e r u m t o w a r d s t h e s e two i s o p r o t e i n s s u g g e s t s t h e a n t i s e r u m has s p e c i f i c i t y f o r t h e 6 - s u b u n i t o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s . An i m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i s o f t h e c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f S - l O O b i m m u n o r e a c t i v i t y was u n d e r t a k e n . I n t h e a d u l t r a t b r a i n o n l y t h e a s t r o c y t e s w e r e S - l O O b i m m u n o r e a c t i v e . T h i s c o n c l u s i o n i s s u p p o r t e d by t h e m o r p h o l o g i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e i m m u n o l a b e l l e d c e l l s , as w e l l as t h e o b s e r v e d c o - l o c a l i z a t i o n o f t h e i m m u n o r e a c t i v i t i e s f o r S - l O O b and t h e G l i a l F i b r i l l a r y A c i d i c p r o t e i n ( G F A P ) , t h e m a j o r p r o t e i n o f t h e a s t r o c y t e i n t e r m e d i a t e f i l a m e n t s . T h e s e t w o a n t i g e n s w e r e a l w a y s f o u n d t o c o e x i s t . The i m m u n o l a b e l 1 i n g o f r a t b r a i n a s t r o c y t e s by t h e S - l O O b d e r i v e d a n t i s e r u m s t a i n e d t h e e n t i r e c e l l , y i e l d i n g more c o m p l e t e m o r p h o l o g i c a l d e t a i l t h a n i s p o s s i b l e w i t h t h e GFAP i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , w h i c h o n l y l a b e l s t h e f i l a m e n t o u s g l i a l p r o c e s s e s . I t i s c o n c l u d e d t h a t S - l O O b i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y c o u l d be o f g e n e r a l u t i l i t y i n t h e i n v e s t i g a t i o n o f a s t r o c y t e m o r p h o l o g y . The p r e s e n t r e s u l t s a l s o d e t e r m i n e t h a t t h e as y e t unknown b i o l o g i c a l f u n c t i o n ( s ) o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s must be r e l a t e d t o a p r o p e r t y o f a s t r o c y t e s . TABLE OF CONTENTS i i i P a g e s A b s t r a c t i i T a b l e o f C o n t e n t s i i i L i s t o f T a b l e s i v L i s t o f F i g u r e s v A c k n o w l e d g m e n t s v i INTRODUCTION 1 - 2 0 P a r t 1 : P u r i f i c a t i o n o f t h e S - 1 0 0 P r o t e i n s and P r o d u c t i o n o f an A n t i s e r u m t o S - l O O b 2 1 - 4 9 I n t r o d u c t i o n 2 2 - 2 3 E x p e r i m e n t a l P r o c e d u r e s 2 3 - 3 1 R e s u l t s 3 1 - 4 4 D i s c u s s i o n 4 4 - 4 9 P a r t 2 : I m m u n o h i s t o c h e m i c a l E x p e r i m e n t s w i t h t h e S - l O O b D e r i v e d A n t i s e r u m 5 0 - 7 5 I n t r o d u c t i o n 5 1 - 5 2 E x p e r i m e n t a l P r o c e d u r e s 5 2 - 5 5 R e s u l t s 5 6 - 7 0 D i s c u s s i o n 7 0 - 7 5 CONCLUSIONS and GENERAL DISCUSSION 7 6 - 8 0 R e f e r e n c e s 8 1 - 8 7 L I S T OF TABLES i v T a b l e 1 . S u b u n i t c o m p o s i t i o n o f t h e S - 1 0 0 i s o p r o t e i n s 6 T a b l e 2 . The a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f t h e d i v a l e n t c a t i o n b i n d i n g l o o p s o f t h e S - 1 0 0 i s o p r o t e i n s and r e l a t e d C a + 2 - b i n d i n g p r o t e i n s 10 T a b l e 3 . I o n b i n d i n g d a t a f o r t h e S - 1 0 0 i s o p r o t e i n s 14 T a b l e 4 . D i s t r i b u t i o n o f S - l O O b and GFAP i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e r a t v e n t r a l h y p o t h a l a m u s 73 L I S T OF FIGURES v F i g u r e 1 . A p i c t o r a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e C a + 2 - b i n d i n g l o o p E F - H a n d 9 F i g u r e 2 . A s c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e S - 1 0 0 i s o p r o t e i n s 12 F i g u r e 3 . A p p l i c a t i o n o f C A P P - S e p a h a r o s e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y . . 32 F i g u r e 4 . A p p l i c a t i o n o f p h e n y l - S e p h a r o s e c h r o m a t o g r a p h y 35 F i g u r e 5 . E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o f t h e S - 1 0 0 i s o p r o t e i n s 36 F i g u r e 6 . A s s a y o f t h e p r o d u c t i o n o f S-lOOb a n t i s e r u m 39 F i g u r e 7 . E l e c t r o p h o r e t i c i m m u n o b l o t a n a l y s i s o f S-lOOb a n t i s e r u m . 40 F i g u r e 8 . C o m p e t i t i v e E L I S A a n a l y s i s o f t h e S-lOOb a n t i s e r u m 41 F i g u r e 9 . E f f e c t o f d i v a l e n t c a t i o n s on t h e S-lOOb E L I S A 42 F i g u r e 1 0 . D o u b l e i m m u n o f l u o r e s c e n t l a b e l l e d a s t r o c y t e s 58 F i g u r e 1 1 . D o u b l e i m m u n o f l u o r e s c e n t l a b e l l e d a s t r o c y t e s i n v a r i o u s r e g i o n s o f t h e r a t b r a i n 60 F i g u r e 1 2 . C o m p a r i s o n o f c e r e b e l l a r and s t r i a t a l a s t r o c y t e s d o u b l e i m m u n o l a b e l l e d f o r S-lOOb and GFAP 63 F i g u r e 1 3 . D o u b l e i m m u n o h i s t o f l u o r e s c e n t l a b e l l i n g o f a s t r o c y t e s i n t h e r a t v e n t r a l h y p o t h a l a m u s 66 F i g u r e 1 4 . D o u b l e i m m u n o p e r o x i d a s e l a b e l l i n g o f a s t r o c y t e s i n t h e r a t v e n t r a l h y p o t h a l a m u s 68 ACKNOWLEDGMENTS v i F o r e m e o s t , I w i s h t o a c k n o w l e d g e t h e p a t i e n c e o f s e v e r a l p e r s o n s who o f t e n f o u n d i t n e c e s s a r y t o i n s i s t t h a t I do some w r i t i n g , t h e s e i n c l u d e my w i f e and d a u g h t e r , my t h e s i s s u p e r v i s o r D r . S u n g , and n e x t t h e s i s s u p e r v i s o r (I h o p e ) , D r . E . G . M c G e e r . The a s s i s t a n c e o f D r s . K . S a t o h and W . ( W i l d B i l l ) S t a i n e s i n t h e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l e x p e r i m e n t s i s g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . Of c o u r s e , none o f t h e m a t e r i a l p r e s e n t e d h e r e i n w o u l d h a v e b e e n p o s s i b l e w i t h o u t t h e d i r e c t i o n s u p p l i e d by D r . S u n g . I p a r t i c u l a r l y t h a n k D r . S u n g f o r t h e i n d e p e n d e n c e g r a n t e d me d u r i n g t h e c o u r s e o f my s t u d y i n h i s l a b . The w o r k r e p o r t e d h e r e i n was s u p p o r t e d by g r a n t s t o D r . S u n g f r o m t h e MRC o f C a n a d a . 1 T h e s i s I n t r o d u c t i o n . The d e s c r i p t i o n o f t h e m o l e c u l a r and b i o l o g i c a l p r o p e r t i e s o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s c o n t i n u e s t o r e p r e s e n t a c h a l l e n g e t o m o l e c u l a r n e u r o b i o l o g y . The S - 1 0 0 p r o t e i n s h a v e a s p e c i a l h i s t o r i c a l r e l e v a n c e as t h e f i r s t p r o t e i n ( s ) t o be d e s c r i b e d as b r a i n s p e c i f i c . The h i s t o r y o f S - 1 0 0 d a t e s t o M o o r e ' s a t t e m p t t o d i s c o v e r gene p r o d u c t s p e c u l i a r t o t h e mammalian b r a i n ( M o o r e , 1 9 6 5 ) . The p r o t e i n d e s c r i b e d by M o o r e had t h e u n u s u a l p r o p e r t y o f r e m a i n i n g s o l u b l e i n a n e u t r a l pH s o l u t i o n o f s a t u r a t e d ammonium s u l f a t e , h e n c e t h e name S - 1 0 0 . The i n t e r e s t i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f a b r a i n s p e c i f i c p r o t e i n d e r i v e s f r o m t h e e x t r e m e b i o c h e m i c a l and m o r p h o l o g i c a l s p e c i a l i z a t i o n o f n e u r a l t i s s u e . I t was r e a s o n e d by M o o r e and c o n t e m p o r a r i e s t h a t a t i s s u e s p e c i f i c p r o t e i n w o u l d r e f l e c t some e q u a l l y u n i q u e f u n c t i o n a l p r o p e r t y o f t h e t i s s u e . I n r e t r o s p e c t , t h e s e a r c h f o r s u c h b r a i n s p e c i f i c e n t i t i e s by p r o t e i n c h e m i s t r y may seem somewhat l a b o r i o u s i n c o m p a r i s o n w i t h modern m o l e c u l a r g e n e t i c t e c h n i q u e s , b u t s e v e r a l t i s s u e s p e c i f i c e n z y m e s and p r o t e i n s w e r e s u b s e q u e n t l y d e s c r i b e d . T h a t t i s s u e s p e c i f i c g e n e p r o d u c t s e x i s t c a n no l o n g e r be d o u b t e d . T h i s i s c e r t a i n l y t h e c a s e f o r t h e m a m m a l i a n b r a i n , f o r w h i c h n u c l e i c a c i d h y b r i d i z a t i o n a n a l y s i s s u g g e s t s t h a t t h e b r a i n s p e c i f i c g e n e s may number i n t h e t e n s o f t h o u s a n d s ( K a p l a n , 1 9 8 3 , C h i k a r a i s h i , 1 9 7 9 ) . F o l l o w i n g t h e o r i g i n a l d e s c r i p t i o n o f S - 1 0 0 by M o o r e , more t h a n a d e c a d e o f c o n t r o v e r s y s u r r o u n d e d r e s e a r c h on t h e p r o t e i n s . D u r i n g t h e l a s t d e c a d e , some o f t h i s c o n t r o v e r s y has been e l i m i n a t e d by a c l e a r e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e c h e m i s t r y o f S - 1 0 0 . A d v a n c e s i n m e t h o d s f o r t h e f r a c t i o n a t i o n and a n a l y s i s o f c o m p l e x b i o p o l y m e r m i x t u r e s h a v e f i g u r e d 2 p r o m i n e n t l y i n t h e c u r r e n t u n d e r s t a n d i n g o f S-100. The most s i g n i f i c a n t a d v a n c e i n t h e f i e l d has come f r o m t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e m u l t i p l e m o l e c u l a r f o r m s o f S-100. E x a m i n a t i o n o f t h e r e s o l v e d S-100 i s o p r o t e i n s by p h y s i c o c h e m i c a l and i m m u n o c h e m i c a l m e t h o d s a l l o w s a more r a t i o n a l a p p r o a c h t o t h e i d e n t i f i c a t i o n o f t h e unknown b i o l o g i c a l f u n c t i o n ( s ) o f t h e S - l O O s . T h i s t h e s i s d e s c r i b e s an i n v e s t i g a t i o n o f t h e S-100 p r o t e i n s by i m m u n o c h e m i c a l m e t h o d s . I n l i g h t o f t h e p r e v i o u s c o n t r o v e r s y s u r r o u n d i n g S-100, and t h e l i k e l i h o o d t h a t t h i s r e s u l t e d f r o m p o o r l y c h a r a c t e r i z e d p r o t e i n p r e p a r a t i o n s , an i s o l a t e d S-100 i s o p r o t e i n h a s b e e n p r e p a r e d and e m p l o y e d f o r t h e p r o d u c t i o n o f a n t i s e r a . The r e s u l t i n g a n t i s e r a w e r e c h a r a c t e r i z e d by s o l i d p h a s e i m m u n o c h e m i c a l m e t h o d s , and t h e n e m p l o y e d f o r t h e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f t h e p r o t e i n i n b r a i n t i s s u e . C u r r e n t t h e o r i e s on t h e p o s s i b l e b i o l o g i c a l f u n c t i o n ( s ) o f t h e S-100 p r o t e i n s a r e d i s c u s s e d i n r e f e r e n c e t o t h e r e s u l t s o f t h e i n v e s t i g a t i o n s d e s c r i b e d i n t h i s w o r k . 3 P h y s i c a l and C h e m i c a l P r o p e r t i e s o f t h e S - 1 0 0 P r o t e i n s . H i s t o r i c a l l y , t h e l a c k o f a c o n s e n s u s s t r u c t u r e f o r S - 1 0 0 was t h e m a j o r p r o b l e m i n r e s e a r c h on t h i s s y s t e m . The o r i g i n a l d e s c r i p t i o n o f S - 1 0 0 by M o o r e ( 1 9 6 5 ) c o n t a i n e d t h e t o t a l i t y o f r e l i a b l e i n f o r m a t i o n u n t i l t h e l a t e r r e d e f i n i t i o n o f S - 1 0 0 by I s o b e and c o - w o r k e r s ( 1 9 7 7 ) . M o o r e ' s o r i g i n a l r e s u l t s a s c e r t a i n e d t h e r e l a t i v e l y s m a l l s i z e ( c i r c a 2 0 - 3 0 k i l o d a l t o n s [ k d a l ] ) , and v e r y a c i d i c n a t u r e o f S - 1 0 0 ( a m i n o a c i d a n a l y s i s o f t h e p r o t e i n p r e p a r a t i o n d e t e r m i n e d t h a t 30% o f t h e r e s i d u e s p o s s e s s e d a c i d i c s i d e c h a i n s [ a s p a r t a t e + g l u t a m a t e ] ) . T h e s e t w o p r o p e r t i e s p r o b a b l y e x p l a i n t h e u n u s u a l s o l u b i l i t y o f S - 1 0 0 i n ammonium s u l f a t e s o l u t i o n s . I n t h e d e c a d e f o l l o w i n g t h e o r i g i n a l e x p e r i m e n t s by M o o r e , a l a r g e number o f r e p o r t s a p p e a r e d on t h e f u r t h e r b i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f S - 1 0 0 . T h i s l a r g e and i n c o n s i s t a n t body o f l i t e r a t u r e w i l l n o t be r e v e i w e d h e r e i n , as l i t t l e o f i t has w i t h s t o o d t h e t e s t o f t i m e and c a n n o t be c o m p a r e d w i t h c o n t e m p o r a r y r e s u l t s o b t a i n e d u s i n g i m p r o v e d p r o t e i n c h e m i c a l m e t h o d s . The i d e n t i t y o f t h e p r o t e i n s u n d e r i n v e s t i g a t i o n i s f o r e m o s t i n any d i s c u s s i o n o f S - 1 0 0 . When I s o b e and c o l l e a g u e s c a r r i e d o u t t h e i r a n a l y s i s o f b o v i n e b r a i n a c i d i c p r o t e i n s by d i s c o n t i n u o u s b u f f e r p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s , t h r e e m a j o r p r o t e i n s w e r e r e s o l v e d . The t w o p r o t e i n s w h i c h m i g r a t e d most r a p i d l y ( t h e P A P - I f r a c t i o n o f I s o b e ) w e r e o b s e r v e d t o be p a r t i a l l y r e s o l v e d , w h e r e a s a t h i r d , l e s s m o b i l e p r o t e i n ( P A P - I I ) was w e l l , r e s o l v e d . The S - 1 0 0 p r o t e i n s w e r e shown t o c o r r e s p o n d t o t h e P A P - I f r a c t i o n , b a s e d on t h e i r i m m u n o r e a c t i v i t y t o w a r d s an S - 1 0 0 a n t i s e r u m s u p p l i e d by M o o r e . The t w o 4 S - 1 0 0 p r o t e i n s w e r e s u c c e s s f u l l y r e s o l v e d by a h i g h r e s o l u t i o n e q u i l i b r i u m i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d , and s u b s e q u e n t l y named t h e S - l O O a and S - l O O b p r o t e i n s . When a m i n o a c i d a n a l y s i s was p e r f o r m e d on t h e i s o l a t e d i s o p r o t e i n s , a h i g h d e g r e e o f h o m o l o g y was i m m e d i a t e l y a p p a r e n t . B o t h i s o p r o t e i n s p o s s e s s e d t w o t y r o s y l r e s i d u e s , s e v e r a l p h e n y l a l a n y l r e s i d u e s , and s i m i l a r numbers o f t h e o t h e r a m i n o a c i d r e s i d u e s . An i m p o r t a n t d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o i s o p r o t e i n s l i e s i n t h e s i n g l e t r y p t o p h a n y l r e s i d u e o f S - l O O a , a b s e n t i n S - l O O b . The P A P - I I p r o t e i n h a s s u b s e q u e n t l y b e e n i d e n t i f i e d as t h e u b i q u i t o u s c a l c i u m d e p e n d e n t r e g u l a t o r p r o t e i n , c a l m o d u l i n (Mani e t a l . , 1 9 8 2 ) . The b o v i n e b r a i n S - 1 0 0 p r o t e i n s h a v e b e e n t h e most e x t e n s i v e l y s t u d i e d , and a w e a l t h o f i n f o r m a t i o n i s c u r r e n t l y b e c o m i n g a v a i l a b l e on t h e m . The e x i s t e n c e o f two m a j o r f o r m s o f S - 1 0 0 i n b o v i n e b r a i n h a s now been c o n f i r m e d (Mani e t a l . , 1 9 8 2 , I s o b e e t a l . , 1 9 8 1 ) . The S - l O O b i s o p r o t e i n r e p r e s e n t s a p p r o x i m a t e l y h a l f o f t h e t o t a l b o v i n e b r a i n S - 1 0 0 and e x i s t s as a h o m o d i m e r o f t h e 10 k d a l 3 - s u b u n i t ( I s o b e e t a l . , 1 9 8 1 , Mani e t a l . , 1 9 8 2 ) . M o s t , i f n o t a l l , o f t h e r e s t o f t h e b o v i n e b r a i n S - 1 0 0 i s t h e S - l O O a p r o t e i n , an a3 h e t e r o d i m e r p o s s e s s i n g t h e t r y p t o p h a n c o n t a i n i n g a - s u b u n i t and t h e 3 - s u b u n i t o f S - l O O b ( I s o b e , e t a l . , 1 9 8 1 , Manabe e t a l . , 1 9 8 2 , M a n i e t a l . , 1 9 8 3 , Umekawa e t a l . , 1 9 8 3 ) . I n a d d i t i o n t o t h e s e m a j o r f o r m s , i t h a s r e c e n t l y b e e n s u g g e s t e d t h a t o t h e r f o r m s o f S - 1 0 0 e x i s t i n b o v i n e b r a i n . T h e s e i n c l u d e t h e S - 1 0 0 a 0 p r o t e i n , a h o m o d i m e r o f a - s u b u n i t s ( I s o b e e t a l . , 1 9 8 3 , 1 9 8 4 ) , and S - l O O a '(a 1 3 ) , w h i c h may p o s s e s s a m o d i f i e d a - s u b u n i t ( B a u d i e r e t a l . , 1 9 8 3 ) . The p o s s i b i l i t y t h a t t h e s e a l t e r n a t e f o r m s r e s u l t f r o m t h e r e l a t i v e l y h a r s h p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e s e m p l o y e d 5 c a n n o t be r u l e d o u t , b u t s i n c e b o t h t h e a and 3 s u b u n i t s h a v e now had t h e i r a m i n o a c i d s e q u e n c e s d e t e r m i n e d , i t i s c l e a r t h a t t h e y r e p r e s e n t d i s t i n c t p o l y p e p t i d e s . The s u b u n i t s t r u c t u r e o f t h e S - 1 0 0 i s o p r o t e i n s i s o l a t e d f r o m s e v e r a l s p e c i e s h a s r e c e n t l y been r e p o r t e d . The common s t r u c t u r a l m o t i f i s t h e same as t h a t o f t h e b o v i n e p r o t e i n s , a d i m e r o f 10 k d a l s u b u n i t s . T h e s t r u c t u r e o f S - 1 0 0 i n t h e s p e c i e s s t u d i e d i s g e n e r a l l y c o n s e r v e d , b u t d o e s show some i s o e l e c t r i c v a r i a n t s (Manabe e t a l . , 1 9 8 2 ) . The o n l y known e x c e p t i o n t o t h e r u l e may be t h e h a m s t e r b r a i n , f o r w h i c h 4 d i f f e r e n t s u b u n i t s h a v e been r e p o r t e d w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s r a n g i n g f r o m 5 . 2 - 7 . 8 k d a l ( P e r u m a l & M u r t h i , 1 9 8 1 ) . The v a r i e t y o f S - 1 0 0 p o l y p e p t i d e s and t h e i r r e l a t i v e p r o p o r t i o n s i n t h e s p e c i e s and t i s s u e s w h i c h h a v e b e e n s t u d i e d t o d a t e i s p r e s e n t e d i n T a b l e 1 . S p e c i a l n o t e s h o u l d be made o f t h e c o m p o s i t i o n o f r a t b r a i n S - 1 0 0 , as i t r e p r e s e n t s t h e s i m p l e s t c a s e w h i c h h a s been d e s c r i b e d f o r b r a i n t i s s u e . S i n c e a t l e a s t 90% o f t h e S - 1 0 0 i s t h e 3 - s u b u n i t , s i m p l e a r i t h m e t i c i n d i c a t e s t h a t a minimum o f 90% o f t h e i n t a c t S - 1 0 0 p o s s e s s e s t h i s s u b u n i t , a s s u m i n g o n l y h o m o d i m e r s e x i s t . I f any h e t e r o d i m e r i c p r o t e i n i s p r e s e n t , f o r e x a m p l e 3 3 ' , t h e t o t a l f r a c t i o n o f p r o t e i n p o s s e s s i n g t h e 3 - s u b u n i t w o u l d be p r o p o r t i o n a t e l y g r e a t e r . H o w e v e r , i n t h e c a s e o f many o f t h e p u t a t i v e S - 1 0 0 i s o p r o t e i n s , i n c l u d i n g t h o s e o f t h e r a t , no d i r e c t e v i d e n c e h a s been p r e s e n t e d f o r t h e i n v i v o e x i s t e n c e o f t h e m i n o r p o l y p e p t i d e s . C o n s i d e r a t i o n m u s t be g i v e n t o t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e a ' - o r 3 ' - s u b u n i t s a r e a r t e f a c t u a l l y d e r i v e d d u r i n g p u r i f i c a t i o n o r s u b s e q u e n t a n a l y s i s . A f u n c t i o n a l c o r r e l a t e o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s h a s r e c e n t l y been T a b l e 1 . S u b u n i t c o m p o s i t i o n o f t h e S - 1 0 0 i s o p r o t e i n s i n v a r i o u s t i s s u e s and s p e c i e s . D a t a i s p r e s e n t e d on n o n - n e u r a l t i s s u e s o n l y i n t h e s i n g l e c a s e w h e r e t h e r e i s d i r e c t c h e m i c a l e v i d e n c e o f i d e n t i t y w i t h S - 1 0 0 by p u r i f i c a t i o n and s u b s e q u e n t c o m p a r a t i v e a n a l y s e s w i t h a known S - 1 0 0 i s o t y p e . The numbers i n b r a c k e t s u n d e r t h e i s o t y p e & s u b u n i t h e a d i n g r e f e r t o t h e s u b u n i t m o l e c u l a r w e i g h t s i n k i l o d a l t o n s ( k d a l ) . M o l e c u l a r w e i g h t d a t a f o r s e v e r a l o t h e r s s p e c i e s i s a v a i l a b l e , and i s i n a g r e e m e n t w i t h t h e 10 k d a l d i m e r s t r u c t u r e (Manabe e t a l . , 1 9 8 2 ) . C o m p o s i t i o n i s e x p r e s s e d as % t o t a l o f t h e S - 1 0 0 i n t h e s p e c i f i e d t i s s u e . S P E C I E S TISSUE ISOTYPE & SUBUNITS % COMPOSITION REFERENCE B o v i ne b r a i n S - l O O a S - l O O b a, 3 3 , 3 ( 1 0 , 1 0 ) ( 1 0 ) - 5 0 , 50 * Mani & K a y , 1983b II S - l O O a a , 3 ( 1 0 , 1 0 ) 35 S - l O O b 3 , 3 ( 1 0 ) 50 , 3 - 4 * I s o b e e t a l . , 1983 S - 1 0 0 a 0 a, a ( 1 0 ) I s o b e e t a l . , 1984 S - l O O a ' a ' ,? ( ? ) <15 H II S - l O O a a, 3 ( 1 0 , 1 0 ) 30 S - l O O b 3 , 3 ( 1 0 ) 42 } B a u d i e r e t a l . , 1983 S - l O O a 1 a' , 3 ; ( 1 0 , 1 0 ) 28 H a m s t e r n S - 1 0 0 ( 3 , 8 , 2 4 , 6 6 ) ( 7 . 8 , 6 . 8 , 6 . 1 , 5 . 2 ) } P e r u m a l & M u r t h i , 1981 G u i n e a P i g " S - 1 0 0 ( 2 , 1 6 , 8 2 , 0 ) Human S - l O O a S - l O O b a, 3 3 , 3 ( 1 0 , 1 0 ) ( 1 0 ) 20 80 ; B a u d i e r e t a l . , 1984 II II S - 1 0 0 a ( ? ) - 2 0 3 ( ? ) - 7 0 } I s o b e e t a l . , 1983 II a' ( ? ) - 1 0 R a t II S - 1 0 0 11 3 3 ' ( ? ) ( ? ) 90 10 ; I s o b e e t a l . , 1983 B o v i n e a d i p o s e S - l O O b 3 , 3 ( 1 0 ) 100 H i d a k a e t a l . , 1983 7 s u g g e s t e d on t h e b a s i s o f t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f t h e b o v i n e b r a i n S - 1 0 0 a - and e - s u b u n i t p o l y p e p t i d e s ( I s o b e e t a l . , 1 9 7 8 , 1 9 8 1 ) . A c o m p a r i s o n o f t h e p r i m a r y s t r u c t u r e s o f t h e S - 1 0 0 p o l y p e p t i d e s w i t h t h o s e o f t h e c a l c i u m b i n d i n g p r o t e i n s i n d i c a t e s a s t r o n g s e q u e n c e h o m o l o g y . C a l c i u m m o d u l a t e d p r o t e i n s s h a r e a h i g h l y c o n s e r v e d s t r u c t u r a l d o m a i n w h i c h i s b e l i e v e d t o r e p r e s e n t t h e C a + 2 - b i n d i n g r e g i o n . The most w i d e l y a c c e p t e d v i e w o f t h e s t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p o f t h e C a + 2 - b i n d i n g p r o t e i n s has been a d v a n c e d by K r e t s i n g e r ( 1 9 8 0 ) . The f e a t u r e s o f t h i s p o i n t o f v i e w on t h e b i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e o f t h e C a + 2 / C a + 2 - b i n d i n g p r o t e i n c o u p l e h a v e b e e n c l e a r l y d e l i n e a t e d : 1 . A l l r e s t i n g e u k a r y o t i c c e l l s m a i n t a i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f f r e e C a + 2 w i t h i n t h e c y t o s o l b e t w e e n 1 0 ~ 7 and 1 0 ~ 8 m o l a r . 2 . The s o l e f u n c t i o n o f C a + 2 w i t h i n t h e c y t o s o l i s t o t r a n s m i t i n f o r m a t i o n . 3 . The t a r g e t o f C a + 2 , f u n c t i o n i n g as a s e c o n d m e s s e n g e r , i s a p r o t e i n i n t h e c y t o s o l . 4 . C a l c i u m - m o d u l a t e d p r o t e i n s c o n t a i n C a + 2 - b i n d i n g E F - h a n d d o m a i n s . 5 . C e l l s i n i t i a l l y e x t r u d e d c a l c i u m s o t h a t t h e y c o u l d u s e p h o s p h a t e as t h e i r b a s i c e n e r g y c u r r e n c y : C a 3 ( P 0 l t ) 2 i s i n s o l u b l e . The s t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s o f t h e C a + 2 - b i n d i n g p r o t e i n s h a v e b e e n a n a l y z e d on t h e b a s i s o f t h e 3 - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e o f p a r v a l b u m i n , i t ' s a m i n o a c i d s e q u e n c e , i t ' s C a + 2 - b i n d i n g p r o p e r t i e s , and t h e c o r r e l a t i o n o f t h e r e s u l t i n g i n f o r m a t i o n w i t h t h e s e q u e n c e s and 8 b i n d i n g p r o p e r t i e s o f s e v e r a l h u n d r e d o t h e r C a + 2 - b i n d i n g p r o t e i n s . T h i s c o r r e l a t i o n a l a n a l y s i s has r e s u l t e d i n t h e f o r m a t i o n o f t h e c o n c e p t o f t h e E F - h a n d . The E F - h a n d i s a t e r m w h i c h r e s u l t e d f r o m t h e c r y s t a l l o g r a p h i c a n a l y s i s o f p a r v a l b u m i n , and r e f e r s t o t h e two E and F a - h e l i c a l s e g m e n t s w h i c h s u r r o u n d t h e 12 a m i n o a c i d r e s i d u e C a + 2 c o o r d i n a t i o n l o o p . The E F - h a n d s t r u c t u r a l d o m a i n i s s o named b e c a u s e o f i t ' s r e s e m b l a n c e t o a r i g h t hand w i t h t h e i n d e x f i n g e r and thumb e x t e n d e d t o m i m i c t h e h e l i c a l s e g m e n t s s u r r o u n d i n g t h e c o o r d i n a t i o n l o o p w h i c h l i e s i n t h e c r o o k f o r m e d b e t w e e n them ( s e e F i g u r e 1 ) . T h e a r r a n g e m e n t o f t h e l o o p i s s u c h t h a t t h e c o o r d i n a t i o n r e s i d u e s , p a r t i c u l a r l y t h o s e w i t h a c i d i c s i d e c h a i n s , a r e i n t h e p r o p e r t o p o g r a p h i c a l a r r a n g e m e n t t o a l l o w t h e h e x a d e n t a t e c h e l a t i o n o f t h e h y d r a t e d C a + 2 i o n . I n T a b l e 2 t h e s e q u e n c e s o f t h e t w o p u t a t i v e C a + 2 -b i n d i n g l o o p s o f e a c h o f t h e b o v i n e b r a i n S - 1 0 0 a - and 3 - s u b u n i t s and t h e r a t S - 1 0 0 3 - s u b u n i t a r e p r e s e n t e d f o r c o m p a r i s o n w i t h t h e c o n s e n s u s s t r u c t u r e as w e l l as t h e s e q u e n c e s f o r t h e " a r c h e t y p i c a l " C a + 2 - b i n d i n g p r o t e i n s ; i n t e s t i n a l C a + 2 - b i n d i n g p r o t e i n ( I C a B P ) , p a r v a l b u m i n , and c a l m o d u l i n . E x a m i n a t i o n o f t h e s e s e q u e n c e s a r e i n f o r m a t i v e b e c a u s e o f t h e f a i r l y o b v i o u s p r e s e n c e o f C a + 2 - b i n d i n g l o o p s i n t h e S - l O O s . H o w e v e r , t h i s d a t a may be more i n t e r e s t i n g i n c o n s i d e r a t i o n o f t h e d e g r e e t o w h i c h t h e p u t a t i v e S - 1 0 0 b i n d i n g l o o p s h a v e d i v e r g e d f r o m t h e a r c h e t y p e . A c o m p a r i s o n o f t h e s e s e q u e n c e s i n d i c a t e s t h e much g r e a t e r d i v e r g e n c e o f t h e 31 and al s i t e s i n c o m p a r i s o n t o t h e all and 311 s i t e s . The all and 31I s i t e s a r e i n c l o s e f i t t o t h e t e s t s e q u e n c e , t h e most n o t a b l e d i v e r g e n c e i s t h e p r e s e n c e o f e x t r a a c i d i c r e s i d u e s a t t h e -X p o s i t i o n , a A s p 7 0 and 3 A s p 6 9 . T h e s e a c i d i c r e s i d u e s s h o u l d r e s u l t 9 F i g u r e 1 . A p i c t o r a l r e p r e s e n t a t i o n o f t h e E F - h a n d C a + 2 - b i n d i n g r e g i o n o f c a r p p a r v a l b u m i n , b a s e d on t h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f p a r v a l b u m i n (Moews and K r e t s i n g e r , 1 9 7 5 ) . The c o o r d i n a t i o n r e s i d u e s a r e d e s i g n a t e d b y ; x , y , z , - x , - y , - z , ( s e e r e v i e w by K r e t s i n g e r , 1 9 8 0 ) . The a - c a r b o n b a c k b o n e o f t h e s t r u c t u r e i s s h o w n , p r o c e e d i n g f r o m t h e N- t o t h e C - t e r m i n a l end r e g i o n s , f o r m i n g t h e E t h e n F h e l i c e s . The 12 r e s i d u e c o o r d i n a t i o n l o o p i s l o c a t e d b e t w e e n t h e s e t w o h e l i c e s . T a b l e 2 . T h e a m i n o a c i d s e q u e n c e s o f t h e p u t a t i v e E F - h a n d s o f t h e b o v i n e S - 1 0 0 a- and 3 - s u b u n i t ( I s o b e e t a l . , 1 9 7 8 , 1 9 8 1 ) . The r a t 3 - s u b u n i t ( b a s e d on t h e n u c l e i c a c i d s e q u e n c e , Kuwano e t a l . , 1 9 8 4 ) d i f f e r s i n t h e l o o p r e g i o n o f b o v i n e el I o n l y a t p o s i t i o n 62 w i t h a S e r - - > G l u s u b s t i t u t i o n . The s e q u e n c e s o f s e v e r a l " a r c h e t y p i c a l " C a + 2 - b i n d i n g p r o t e i n s a r e p r e s e n t e d f o r c o m p a r i s o n ; i n t e s t i n a l C a + 2 - b i n d i n g p r o t e i n ( I C a B P , F u l l m e r and W a s s e r m a n , 1 9 8 1 ) , p a r v a l b u m i n ( s i t e I I , N o c k o l d s e t a l . , 1 9 7 2 ) , and b o v i n e c a l m o d u l i n ( s i t e I , K a s a i e t a l . , 1 9 8 0 ) . The t e s t s e q u e n c e f o r t h e b i n d i n g l o o p i s p r e s e n t e d a t t h e t o p o f t h e d i a g r a m ( T u f t y and K r e t s i n g e r , 1 9 7 5 ) , t h e c o o r d i n a t i o n r e s i d u e s a r e i d e n t i f i e d ( r e f e r t o F i g u r e 1 ) . The s y m b o l s o f t h e t e s t s e q u e n c e a r e ; G i s g l y c i n e , I i s h y d r o p h o b i c w i t h i s o l e u c i n e p r e f e r r e d , * d e n o t e s a r e s i d u e w i t h o x y g e n i n t h e s i d e c h a i n , t h e u n d e r s c o r e d p o s i t i o n s show no a p p a r e n t p r e f e r e n c e f o r any r e s i d u e . X Y Z -Y -X -Z TEST SEQUENCE: * _ * G * G _ I * _ _ * T y r B o v i n e S - 1 0 0 al: 2 0 G l y - L y s - G l u - G l y - A s p - L y s L y s - L e u - S e r - L y s - L y s - G l u 3 2 a l l : 6 2 A s p - G l u - A s p - G l y - A s p - G l y - G l u - A r g - A s p - P h e - G l n - G l u 7 3 H i s 3 1 : 1 9 G l y - A r g - G l u - G l y - A s p - L y s L y s - L e u - L y s - L y s - S e r - G l u 3 1 3 1 1 : 6 1 A s p - S e r - A s p - G l y - A s p - G l y - G l u - C y s - A s p - P h e - G l n - G l u 7 2 A s n ICaBP I : 1 6 A l a - L y s - G l u - G l y - A s p - P r o G l n - L e u - S e r - L y s - G l u - G l u 2 8 I I : 5 4 A s p - L y s - A s n - G l y - A s p - G l y - G l u - V a l - S e r - P h e - G l u - G l u 6 5 P a r v a l b u m i n E F : 9 0 A s p - G l n - A s p - G l y - A s p - G l y - L y s - I l e - G l y - V a l - A s p - G l u 1 0 1 C a l m o d u l i n I : 2 0 A s p - L y s - A s p - G l y - A s p - G l y - T h r - I l e - T h r - T h r - L y s - G l u 3 1 i n a d e c r e a s e d C a + 2 b i n d i n g a f f i n i t y o f t h e a l l a n d 311 s i t e s , r e l a t i v e t o o t h e r C a + 2 - b i n d i n g p r o t e i n s ( R e i d and H o d g e s , 1 9 8 0 ) . I t c o u l d be q u e s t i o n e d w h e t h e r t h e a l and 31 s i t e s a r e o f t h e E F - h a n d t y p e a t a l l , c o n s i d e r i n g t h e a d d i t i o n a l r e s i d u e i n t h e m i d d l e o f t h e l o o p s t r u c t u r e . H o w e v e r , a c o m p a r i s o n o f t h e ICaBP I s i t e w i t h t h e s e s e q u e n c e s i s f a v o u r a b l e ( s e e T a b l e 2 ) , and t h e ICaBP I s i t e has r e c e n t l y been shown by c r y s t a l l o g r a p h y t o be o f t h e E F - h a n d t y p e ( S z e b e n y i e t a l . , 1 9 8 1 ) . The s t r u c t u r a l d i v e r g e n c e o f t h e S - 1 0 0 b i n d i n g l o o p s , as w e l l as t h e m e t a l b i n d i n g d a t a d i s c u s s e d b e l o w , s u g g e s t t h a t t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s may r e p r e s e n t a s p e c i a l i z e d f a m i l y member o f t h e C a + 2 - b i n d i n g p r o t e i n s u p e r f a m i l y ( s e e a l s o G a r i e p y and H o d g e s , 1 9 8 3 ) . The s e q u e n c e s t r u c t u r e o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s a l s o s u g g e s t s t h e p o s s i b i l i t y o f a n o t h e r k i n d o f f u n c t i o n a l d o m a i n . I n b o t h t h e a - a n d 3 - s u b u n i t s two s t r e t c h e s o f h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s p r e d o m i n a t e i n r e g i o n s n e a r t h e N and C t e r m i n a l s . T h i s p a t t e r n i s d i a g r a m a t i c a l l y i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 2 , a l o n g w i t h t h e r e l a t i o n s h i p o f t h e s e r e g i o n s t o t h e p u t a t i v e C a + 2 - b i n d i n g E F - h a n d s . T h e s e h y d r o p h o b i c r e g i o n s may h a v e a p u r p o s e i f , f o r e x a m p l e , a p r o c e s s s u c h as membrane a s s o c i a t i o n i s i n v o l v e d w i t h t h e b i o l o g i c a l f u n c t i o n o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s . The a s s o c i a t i o n o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s w i t h b o t h b i o l o g i c a l and a r t i f i c i a l membranes h a s b e e n s u g g e s t e d by t h e b i n d i n g s t u d i e s c a r r i e d o u t by D o n a t o ( 1 9 8 1 ) , as w e l l as by a s e r i e s o f e x p e r i m e n t s w h i c h d e t e r m i n e d a C a + 2 d e p e n d e n t S - 1 0 0 s t i m u l a t i o n o f r u b i d i u m l e a k a g e f r o m l i p o s o m e s ( C a l l i s a n o , 1 9 7 5 ) . H o w e v e r , f o r s e v e r a l t e c h n i c a l r e a s o n s i t i s v e r y d i f f i c u l t t o e v a l u a t e t h e s e e x p e r i m e n t s on t h e S - 1 0 0 / m e m b r a n e a s s o c i a t i o n , p a r t i c u l a r l y b e c a u s e o f t h e p o o r d e g r e e o f F i g u r e 2. A s h e m a t i c o f t h e b o v i n e b r a i n S - l O O a and S - l O O b p r o t e i n s . T h e p u t a t i v e d i v a l e n t c a t i o n b i n d i n g l o o p s a r e i l l u s t r a t e d g e o m e t r i c a l l y . The h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d r e s i d u e r i c h r e g i o n s a r e i n d i c a t e d by t h e s h a d e d p o r t i o n s i n t h e p o l y p e p t i d e c h a i n s . The o r i e n t a t i o n o f t h e s u b u n i t s w i t h r e s p e c t t o one a n o t h e r i s n o t k n o w n , t h a t p r e s e n t e d i n t h i s d i a g r a m i s f o r c o n v e n i e n c e o n l y . S-IOOb S-IOOa 13 c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e i r p r o t e i n p r e p a r a t i o n s . O t h e r p o s s i b l e f u n c t i o n s f o r t h e h y d r o p h o b i c d o m a i n s c o u l d i n v o l v e t h e a s s o c i a t i o n o f t h e s u b u n i t s o f S - 1 0 0 , w h i c h has b e e n shown t o be n o n - c o v a l e n t ( M a n i , e t a l . , 1 9 8 2 , I s o b e , e t a l . , 1 9 8 1 ) , o r t h e a s s o c i a t i o n o f S - 1 0 0 w i t h o t h e r p r o t e i n s i n t h e c e l l u l a r m i l l e a u . The u n u s u a l C a + 2 - b i n d i n g l o o p s e q u e n c e s t r u c t u r e o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s h a s c a u s e d g r e a t i n t e r e s t i n t h e n a t u r e o f t h e i r a s s o c i a t i o n w i t h C a + 2 i o n . V e r y r e c e n t l y , a number o f g r o u p s h a v e c a r r i e d o u t d e t a i l e d a n a l y s e s on t h e b i n d i n g o f d i v a l e n t c a t i o n s t o t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s , i n p a r t i c u l a r , on t h e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h t h e i n t e r a c t i o n o f t h e s e i o n s w i t h t h e p r o t e i n s . A d e t a i l e d s p e c t r o s c o p i c a n a l y s i s o f t h e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s e l i c t e d by C a + 2 i n d i c a t e d a v e r y s i g n i f i c a n t a l t e r a t i o n i n t h e t e r t i a r y s t r u c t u r e o f b o v i n e b r a i n S - l O O b (Mani e t a l . , 1 9 8 2 ) . The r e s u l t s o f t h i s s t u d y h a v e r e c e n t l y b e e n r e p l i c a t e d and e x t e n d e d t o t h e S - l O O a p r o t e i n o f b o v i n e b r a i n (Mani e t a l . , 1 9 8 3 a , Mani & K a y , 1 9 8 3 a , 1 9 8 3 b , Umekawa e t a l . , 1 9 8 3 , B a u d i e r & G e r a r d , 1 9 8 3 ) , as w e l l as t h e S - l O O b p r o t e i n o f human b r a i n ( B a u d i e r e t a l , 1 9 8 4 ) . A summary o f t h e i o n b i n d i n g p r o p e r t i e s o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s i s p r e s e n t e d i n T a b l e 3 . A p a r t i c u l a r l y i n t e r e s t i n g r e s u l t has been o b s e r v e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s ; K + was n o t e d t o be an e f f e c t a n t a g o n i s t o f t h e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s e l i c t e d by C a + 2 . The K + a n t o g o n i s m i s o b s e r v e d a t p h y s i o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n s o f t h e i o n ( 9 0 - 1 2 0 mM), u n l i k e t h e c a s e f o r o t h e r C a + 2 - b i n d i n g p r o t e i n s w h i c h a r e n o t i n h i b i t e d by K + u n t i l c o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 3 - 0 . 5 M a r e a c h e i v e d . A n o t h e r s u r p r i s i n g r e s u l t f r o m t h e p h y s i c o c h e m i c a l a n a l y s i s o f t h e S - 1 0 0 i o n b i n d i n g p r o p e r t i e s was o b s e r v e d upon t h e a d d i t i o n o f i o n i c T a b l e 3 . The e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d p a r a m e t e r s o f C a + 2 and Z n + 2 a s s o c i a t i o n w i t h t h e S - 1 0 0 i s o p r o t e i n s . The d a t a t a b u l a t e d i s i n m o l a r c o n c e n t r a t i o n and i s e i t h e r a p p a r e n t d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s • when d e t e r m i n e d by s p e c t r o s c o p i c t i t r a t i o n ( b o v i n e S - l O O s ) , o r K n when d e t e r m i n e d by f l o w d i a l y s i s (human S - l O O b ) . M u l t i p l e e n t r i e s i n a c o l u m n , a t t h e s p e c i f i e d p H , i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f more t h a n one c l a s s o f b i n d i n g s i t e . C a ^ Z n + 2 £ H ^ + K f + Z n + 2 ± K + B o v i n e S - l O O a B a u d i e r & G e r a r d , 7 . 3 2 . 0 x 1 0 " * 1 . 5 x l 0 " 3 2 . 0 X 1 0 " * <10~ 6 1983 8 . 3 2.0x10-* M a n i & K a y , 1983b 7 . 5 1 . 2 x 1 0 - * 5 . 5 x l 0 ~ 5  8 . 3 { 2 . 5 x 1 0 - * Umekawa e t a l , 7 . 5 1 . 3 x l 0 - 5  1983 B o v i n e S - l O O b B a u d i e r & G e r a r d , 7 . 3 3 . 0 x 1 0 - * 1 . 5 x l 0 " 3 5 . 5 x l 0 " 5 < 1 0 " 6 1983 8 . 3 1 . 4 x 1 0 - * M a n i e t a l , 1982 7 . 5 2 . 0 x 1 0 " * 8 . 0 x 1 0 " * M a n i e t a l , 1983 Q , - r 6 . 0 x l 0 " 5 i a t- 1 n _ i t 8 * 5 t 2 . 0 x 1 0 " * ' 8 * 5 x 1 0 Umekawa e t a l , 7 . 5 9 x l 0 ~ 6 - 5 . 0 x 1 0 " * 1983 Human S - l O O b B a u d i e r e t a l , 1984 2 . 3 x l 0 " 5 2 . 3 x l 0 " 6 2 . 2 x l 0 " 8 7 . 5 { 1 . 0 x 1 0 " * } i n c r e a s e d 1 . 8 x l 0 - 5 l . O x l O " 6 1 . 7 x 1 0 " * 4 . 3 x 1 0 " * z i n c . T h i s i o n was shown t o b i n d t o t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s w i t h a h i g h a f f i n i t y , and t o e l i c i t c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s o f t h e same m a g n i t u d e as t h o s e a s s o c i a t e d w i t h C a + 2 b i n d i n g ( B a u d i e r & G e r a r d , 1 9 8 3 , B a u d i e r e t a l . , 1 9 8 4 , M a n i & K a y , 1 9 8 3 a , 1 9 8 3 b ) . S i g n i f i c a n t l y , K + was w i t h o u t e f f e c t on t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n Z n + 2 and t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s . I t was o b s e r v e d , h o w e v e r , t h a t Z n + 2 b o u n d t o S - l O O b m a r k e d l y i n c r e a s e d t h e C a + 2 b i n d i n g a f f i n i t y . I n a d d i t i o n t o Z n + 2 and K + , t h e pH was a l s o shown t o h a v e a s i g n i f i c a n t e f f e c t on t h e b i n d i n g o f C a + 2 ( s e e T a b l e 3 ) . I t i s n o t c l e a r how w e l l t h e p r e s e n t s t a t e o f k n o w l e d g e o f t h e i o n b i n d i n g p r o p e r t i e s o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s c a n be r e l a t e d t o t h e b i o l o g i c a l f u n c t i o n s o f t h e s e i o n s i n n e u r a l t i s s u e . C o n s i d e r i n g S - 1 0 0 as a member o f t h e f a m i l y o f h o m o l o g o u s C a + 2 - b i n d i n g p r o t e i n s h a s g r e a t a p p e a l , as i t w o u l d s u g g e s t t h a t t h e b i o l o g i c a l f u n c t i o n o f S - 1 0 0 s h o u l d be r e l a t e d t o t h e f u n c t i o n s o f o t h e r members o f t h e f a m i l y , some o f w h i c h a r e k n o w n . T h i s w o u l d n a r r o w t h e p o s s i b i l i t i e s , and s u g g e s t a r e s e a r c h s t r a t e g y . H o w e v e r , t w o f a c t o r s c o m p l i c a t e t h i s p o i n t o f v i e w : 1) e x a m i n a t i o n o f t h e e x p e r i m e n t a l l y d e t e r m i n e d a s s o c i a t i o n c o n s t a n t s f o r C a + 2 w i t h t h e p r o t e i n s ( s e e T a b l e 2) s u g g e s t s t h a t t h e p r o t e i n s w o u l d r e q u i r e an i n t r a c e l l u l a r C a + 2 c o n c e n t r a t i o n i n t h e r a n g e o f I O - 1 * t o I O - 5 m o l a r t o be f u n c t i o n a l l y r e l e v a n t , t h i s i s s i g n i f i c a n t l y a b o v e t h e c o n c e n t r a t i o n n o r m a l l y a s s o c i a t e d w i t h C a + 2 a c t i n g as a s e c o n d m e s s e n g e r ; and 2) u n l i k e o t h e r C a + 2 - b i n d i n g p r o t e i n s , S - 1 0 0 c l e a r l y h a s a h i g h e r a f f i n i t y f o r Z n + 2 t h a n f o r C a + 2 . I n c o n t r a s t t o t h e c a s e w i t h C a + 2 , v e r y l i t t l e i s known a b o u t t h e p o s s i b l e f u n c t i o n ( s ) o f Z n + 2 i n n e u r a l t i s s u e , o r on t h e b i o c h e m i s t r y o f Z n + 2 - b i n d i n g p r o t e i n s . I n an a t t e m p t t o r e l a t e t h e u n u s u a l C a + 2 - b i n d i n g l o o p s o f S - 1 0 0 w i t h t h e Z n + 2 b i n d i n g p r o p e r t i e s o f t h e p r o t e i n s , i t c o u l d be h y p o t h e s i z e d t h a t t h e s e s i t e s a r e p h y s i o l o g i c a l l y r e l e v a n t f o r Z n + 2 b i n d i n g , and p e r h a p s n o t f o r C a + 2 b i n d i n g . A v a r i a t i o n on t h i s t h e m e p l a c e s t h e Z n + 2 b i n d i n g s i t e s a t t h e al a n d el S - 1 0 0 s i t e s and t h e C a + 2 - b i n d i n g s i t e s a t all and 311 ( B a u d i e r & G e r a r d , 1 9 8 3 ) . C e l l u l a r L o c a l i z a t i o n o f t h e S - 1 0 0 P r o t e i n s . The i m p a c t t h a t t h e d e f i n i t i o n o f t h e m o l e c u l a r h e t o r o g e n e i t y o f S - 1 0 0 has had on t h e b i o c h e m i c a l s t u d y o f t h e p r o t e i n s i s o n l y v e r y r e c e n t l y b e i n g t r a n s m i t t e d t o a s t u d y o f t h e i r c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n . The b r a i n - s p e c i f i c i t y o f t h e S - l O O s , as o r i g i n a l l y r e p o r t e d by M o o r e ( 1 9 6 5 ) , was b a s e d on a c o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f o r g a n e x t r a c t s u s i n g " p e p t i d e m a p p i n g " . A l m o s t a l l o f t h e s u b s e q u e n t i n v e s t i g a t i o n s o f t h e c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f t h e p r o t e i n s h a v e been c a r r i e d o u t by i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d s . The e a r l y i m m u n o c y t o c h e m i c a l a n a l y s i s o f S - 1 0 0 i s as e q u i v o c a l as t h e e a r l i e r s t r u c t u r a l s t u d i e s . The c o n t r o v e r s y s u r r o u n d i n g t h e l o c a l i z a t i o n o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s i s u n d o u b t e d l y due t o t h e p o o r l y c h a r a c t e r i z e d a n t i g e n ( s ) e m p l o y e d f o r t h e p r o d u c t i o n o f t h e a n t i s e r a . T h e a n t i s e r a e m p l o y e d w e r e o n l y as s p e c i f i c as t h e S - 1 0 0 p r e p a r a t i o n s u s e d i n t h e i r p r o d u c t i o n . The i m m u n o c y t o c h e m i c a l l i t e r a t u r e p r e - d a t i n g t h e d e f i n i t i o n o f t h e m o l e c u l a r h e t e r o g e n e i t y o f S - 1 0 0 has b e e n t h e s u b j e c t o f s e v e r a l r e v i e w s (Eng & B i g b e e , 1 9 7 8 , Z o m e z e l y - N e u r a t h & W a l k e r , 1 9 8 0 ) . I n g e n e r a l , t o s u m m a r i z e t h e e a r l y l i t e r a t u r e , t h e S - 1 0 0 p r o t e i n ( s ) w e r e l o c a l i z e d t o a s t r o c y t e s , p r o b a b l y o l i g o d e n d r o c y t e s , b u t 17 a s i g n i f i c a n t number o f r e p o r t s c l a i m e d m o d e r a t e t o weak s t a i n i n g o f n e u r o n s , p a r t i c u l a r l y i n t h e n u c l e a r r e g i o n . The p r o p e r i m m u n o c h e m i c a l c o n t r o l s w e r e r a r e l y , i f e v e r , c a r r i e d o u t . M o s t o f t h e a n t i s e r a w e r e c h a r a c t e r i z e d by p r e c i p i t a t i o n m e t h o d s , w h i c h o n l y s e r v e d t o show t h a t t h e a n t i s e r u m was r e a c t i v e t o t h e p o o r l y c h a r a c t e r i z e d a n t i g e n . One o f t h e few s t u d i e s t h a t h a s been c a r r i e d o u t w i t h t h e p r o p e r i m m u n o c h e m i c a l and h i s t o l o g i c a l c o n t r o l s was t h a t o f G h a n d o u r e t a l . ( 1 9 8 1 a ) . The a n t i s e r u m u s e d i n t h i s s t u d y was d e r i v e d f r o m a p a r t i a l l y c h a r a c t e r i z e d b o v i n e b r a i n S - 1 0 0 p r e p a r a t i o n , p r o b a b l y r e p r e s e n t i n g a m i x t u r e o f S - l O O a and S - l O O b . The i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y was p e r f o r m e d on t h e c e r e b e l l u m o f a d u l t and d e v e l o p i n g ( G h a n d o u r e t a l . , 1981b) r a t b r a i n . The l a b e l l i n g was f o u n d o n l y i n c e l l s w h i c h a p p e a r e d t o be a s t r o c y t e s . When d o u b l e l a b e l l i n g e x p e r i m e n t s w e r e c a r r i e d o u t by m i x e d i m m u n o p e r o x i d a s e / i m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g f o r t h e o l i g o d e n d r o c y t e s p e c i f i c m a r k e r c a r b o n i c a n h y d r a s e I I and S - 1 0 0 , no l a b e l l i n g o f o l i g o d e n d r o c y t e s w i t h t h i s S - 1 0 0 a n t i s e r u m was o b s e r v e d . T h e i m m u n o l a b e l 1 i n g o f c e r e b e l l a r a s t r o c y t e s w i t h t h e S - 1 0 0 a n t i s e r u m was shown t o be b l o c k e d by p r e i n c u b a t i o n o f t h e a n t i s e r u m w i t h t h e S - 1 0 0 p r o t e i n p r e p a r a t i o n . P e r h a p s t h e most i n t e r e s t i n g a s p e c t o f t h i s r e p o r t , i n c o n s i d e r a t i o n o f t h e p o o r c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e a n t i g e n , was t h e s e n s i t i v i t y o f t h e i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t o t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s . E v i d e n c e was p r e s e n t e d t h a t t h e a r t e f a c t u a l n e u r o n a l n u c l e a r s t a i n i n g c o u l d be e l i m i n a t e d by c a r e f u l p r o c e s s i n g f o r t h e i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y . The a p p r o p r i a t e f i x a t i o n p r o c e d u r e was s u g g e s t e d t o be t r a n s c a r d i a l p e r f u s i o n u s i n g m i x e d a l d e h y d e s . A c o m p a n i o n s t u d y t o t h e s e l i g h t m i c r o s c o p i c e x p e r i m e n t s was c a r r i e d o u t on t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e by L e g r a n d e t a l . ( 1 9 8 1 ) . A t t h e u l t r a s t r u c t u r a l l e v e l , t h e i m m u n o s t a i n i n g was o b s e r v e d t o be c y t o s o l i c , b e i n g o b s e r v e d i n t h e p e r i k a r y o n and t h r o u g h o u t t h e p r o c e s s e s . A l t h o u g h t h e s e s t u d i e s w e r e c a r r i e d o u t i n a r e a s o n a b l e m a n n e r , q u e s t i o n s s t i l l r e m a i n a b o u t t h e n a t u r e o f t h e a n t i s e r u m p r e p a r a t i o n e m p l o y e d . An a l t e r n a t i v e t o t h e p r o d u c t i o n o f a s p e c i f i c a n t i s e r u m t o a h i g h l y p u r i f i e d a n t i g e n i s t o p r e p a r e a m o n o c l o n a l a n t i b o d y , w i t h i t s b u i l t i n s p e c i f i c i t y t o t h e i n d i v i d u a l c o m p o n e n t s o f t h e s t i m u l a t i n g a n t i g e n m i x t u r e . T h i s a p p r o a c h has r e c e n t l y b e e n a p p l i e d t o S - 1 0 0 by Haan e t a l . , ( 1 9 8 2 ) . T h e s e a u t h o r s d e s c r i b e t h e p r o d u c t i o n o f a m o n o c l o n a l a n t i b o d y t o t h e S - 1 0 0 m i x t u r e o f p r o t e i n s , a s p r e p a r e d by M o o r e . T h i s s t u d y was r e s t r i c t e d t o o b s e r v a t i o n s i n t h e h i p p o c a m p u s and c e r e b e l l u m a n d , i n a g r e e m e n t w i t h t h e f i n d i n g s o f G h a n d o u r e t a l . , ( 1 9 8 1 a ) , o n l y a s t r o c y t e s w e r e l a b e l l e d . The s t a i n i n g p a t t e r n o b s e r v e d was c o n s o n a n t w i t h a c y t o s o l i c l o c a l i z a t i o n o f t h e a n t i g e n , i n s o f a r as t h e l a b e l l i n g was a p p a r e n t t h r o u g h o u t t h e c e l l body and e x t e n d e d i n t o t h e p r o c e s s e s . T h e i m m u n o c h e m i c a l d e f i n i t i o n o f t h i s a n t i b o d y w a s , u n f o r t u n a t e l y , somewhat l a c k i n g . No c l e a r e v i d e n c e has been p r e s e n t e d on t h e i d e n t i t y o f t h e p o l y p e p t i d e ( s ) w i t h w h i c h t h e a n t i b o d y r e a c t s . E v e n i f i t i s a c c e p t e d t h a t t h i s a n t i b o d y i s o r i e n t e d t o S - 1 0 0 , i t i s s t i l l unknown w h i c h o f t h e S - 1 0 0 i s o t y p e s a r e r e a c t i v e . T h e o n l y o t h e r s t u d y , o t h e r t h a n t h a t p r e s e n t e d i n t h i s t h e s i s , i n w h i c h an S - 1 0 0 i s o t y p e a n t i b o d y h a s been p r e p a r e d , h a s r e c e n t l y b e e n r e p o r t e d by I s o b e and c o l l e a g u e s ( 1 9 8 4 ) . I n t h i s s t u d y an a n t i s e r a p r e p a r e d t o a m i x t u r e o f S - 1 0 0 p r o t e i n s f r o m b o v i n e b r a i n was f r a c t i o n a t e d by i m m u n o a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y on s e p a r a t e S - l O O a - and 19 S - l O O b - S e p h a r o s e c o l u m n s . The r e s u l t i n g a n t i s e r a w e r e shown t o be a - S - 1 0 0 and 3 - S - 1 0 0 s p e c i f i c . When t h e 3 - S - 1 0 0 a n t i s e r u m was e m p l o y e d f o r i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y on human b r a i n t i s s u e s e c t i o n s , o l i g o d e n d r o -g l i a w e r e m o d e r a t e l y s t a i n e d and a s t r o c y t e s w e r e s t r o n g l y s t a i n e d . The a - S - 1 0 0 a n t i s e r a s t a i n e d a l i m i t e d number o f h i p p o c a m p a l n e u r o n s , as w e l l as g l i a l c e l l s ( c l a s s n o t d e t e r m i n e d ) . A l t h o u g h p r e l i m i n a r y , s e v e r a l a s p e c t s o f t h i s r e p o r t make i t p a r t i c u l a r l y i m p o r t a n t . F o r e m o s t a m o n g s t t h e m i s t h e d e m o n s t r a t i o n o f t h e i n h e r e n t d i s a d v a n t a g e o f u s i n g w h o l e S - 1 0 0 as a s t i m u l a t i n g a n t i g e n f o r t h e p r o d u c t i o n o f p o l y c l o n a l a n t i s e r a . The n e u r o n a l l a b e l l i n g w i t h t h e a - S - 1 0 0 a n t i s e r u m goes a l o n g way t o w a r d s e x p l a i n i n g t h e c o n t r o v e r s i a l n e u r o n a l l o c a l i z a t i o n o f S - 1 0 0 r e p o r t e d i n e a r l i e r s t u d i e s . I t i s p r o b a b l e t h a t t h e p r e v i o u s i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s w e r e d e t e c t i n g t h e weak n e u r o n a l s t a i n i n g o f a - S - 1 0 0 a g a i n s t a much g r e a t e r 3 - S - 1 0 0 a s t r o c y t i c l a b e l l i n g . The a p p a r e n t p r e s e n c e o f 3 - S - 1 0 0 i n t h e o l i g o d e n d r o c y t e i s q u i t e i n t e r e s t i n g i n l i g h t o f t h e p r e v i o u s s t u d i e s o f G h a n d o u r e t a l . ( 1 9 8 1 a ) and Hann e t a l . ( 1 9 8 2 ) who r e p o r t e d an e x c l u s i v e l o c a l i z a t i o n o f S - 1 0 0 i m m u n o r e a c t i v i t y t o t h e a s t r o c y t e o f t h e r a t b r a i n c e r e b e l l u m and h i p p o c a m p u s . E i t h e r t h e s e s t u d i e s a r e w r o n g , o r t h e r e i s an a p p a r e n t s p e c i e s s p e c i f i c i t y i n t h e c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f S - 1 0 0 i s o t y p e s . U n f o r t u n a t e l y , i t i s h a r d t o d i r e c t l y c o m p a r e t h e s e v a r i o u s s t u d i e s b e c a u s e o f t h e d i f f e r e n c e s i n s p e c i e s , and t h e r e s t r i c t i o n o f t h e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s e s t o p a r t i c u l a r b r a i n r e g i o n s . T h e b r a i n s p e c i f i c i t y o f S - 1 0 0 has r e c e n t l y b e e n e f f e c t i v e l y c h a l l a n g e d . A number o f i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t u d i e s h a v e shown t h a t S - 1 0 0 i s p r e s e n t i n o t h e r o r g a n s a n d , w i t h i n t h o s e o r g a n s , i s d i s t r i b u t e d i n c e l l t y p e s n o t f o u n d i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m . Some q u e s t i o n s c o u l d be r a i s e d c o n c e r n i n g t h e s p e c i f i c i t y o f t h e a n t i s e r a u s e d by t h e v a r i o u s a u t h o r s . H o w e v e r , a t l e a s t i n t h e c a s e o f a d i p o s e t i s s u e , t h e i m m u n o r e a c t i v e p r o t e i n has been p u r i f i e d and shown t o be i d e n t i c a l t o t h e S - l O O b p r o t e i n o f b r a i n ( H i d a k a e t a l . , 1 9 8 3 ) . An i n t e r e s t i n g f e a t u r e o f t h i s r e p o r t i s t h e a p p a r e n t c y t o s o l i c d i s t r i b u t i o n o f t h e S - l O O b p r o t e i n i n t h e a d i p o c y t e . T h i s i s i n a g r e e m e n t w i t h t h e s u b c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f S - 1 0 0 r e p o r t e d f o r t h e a s t r o c y t e ( L e g r a n d e t a l . , 1 9 8 1 ) , and s u g g e s t s t h a t t h e r e i s no g r o s s d i f f e r e n c e i n t h e s i t e o f a c t i o n o f t h e p r o t e i n w i t h i n t h e s e t w o v e r y d i f f e r e n t c e l l t y p e s . The c y t o s o l i c d i s t r i b u t i o n o f S - 1 0 0 i s w h a t one w o u l d e x p e c t f o r a C a + 2 m o d u l a t e d p r o t e i n . 21 PART 1: PURIFICATION OF THE S-lOO PROTEINS AND PRODUCTION OF AN ANTISERUM TO S-lOOb The i m m u n o c h e m i c a l and i m m u n o h i s t o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e i s o l a t e d S - 1 0 0 p r o t e i n i s o t y p e s h a v e n o t been s t u d i e d i n any d e t a i l . A l t h o u g h t h e m o l e c u l a r h e t e r o g e n e i t y o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s h a s b e e n known f o r some t i m e , a l m o s t a l l i m m u n o c h e m i c a l s t u d i e s h a v e e m p l o y e d a n t i s e r a r a i s e d t o a m i x t u r e o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s , and t h e r e s t h a v e u s e d an u n c h a r a c t e r i z e d m i x t u r e o f . a c i d i c p r o t e i n s as t h e a n t i g e n . A s i n g l e p r e l i m i n a r y r e p o r t has r e c e n t l y a p p e a r e d w h i c h d e a l s w i t h t h e i m m u n o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f a f r a c t i o n a t i o n a t e d " w h o l e S - 1 0 0 " a n t i s e r a ( I s o b e e t a l . , 1 9 8 4 ) . The p r e p a r a t i o n o f S - 1 0 0 a- and g - s u b u n i t d i r e c t e d c o m p o n e n t s by t h e s e a u t h o r s r e s u l t e d i n t h e i m p o r t a n t o b s e r v a t i o n o f t h e d i f f e r e n t i a l c e l l u l a r d i s t r i b u t i o n o f t h e s u b u n i t i m m u n o r e a c t i v i t i e s i n human b r a i n t i s s u e . By t h i s a c c o u n t t h e a - s u b u n i t i s i n " g l i a " and n e u r o n s , and t h e 3 - s u b u n i t i s i s b o t h o l i g o d e n d r o c y t e s and a s t r o c y t e s . T h i s i s c l e a r l y n o t i n a g r e e m e n t w i t h o b s e r v a t i o n s made i n t h e r a t b r a i n , w h i c h r e p o r t a b s o l u t e a s t r o g l i a l s p e c i f i c i t y (Hann e t a l . , 1 9 8 2 , G h a n d o u r e t a l . , 1 9 8 1 a ) . T h e s e c o n f l i c t i n g r e p o r t s s e r v e t o r e i t e r a t e t h e i m p o r t a n c e o f e m p l o y i n g a n t i s e r a o f known S - 1 0 0 i s o t y p e and s u b u n i t s p e c i f i c i t y f o r any i n v e s t i g a t i o n o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s . S e v e r a l g r o u p s o f i n v e s t i g a t o r s h a v e r e p o r t e d t h e s u c c e s s f u l f r a c t i o n a t i o n o f S - 1 0 0 i s o t y p e s f r o m t h e b o v i n e b r a i n . Some d i s a g r e e m e n t e x i s t s i n t h e l i t e r a t u r e as t o t h e number o f d i f f e r e n t i s o t y p e s o f S - 1 0 0 i n t h e b o v i n e b r a i n . F o r e x a m p l e , M a n i e t a l . ( 1 9 8 2 ) r e p o r t t h e e x i s t a n c e o f two" t y p e s o f S - 1 0 0 s u b u n i t s , a and 3 , w h e r e a s b o t h I s o b e e t a l . ( 1 9 8 3 , 1 9 8 4 ) , and B a u d i e r e t a l . ( 1 9 8 3 ) h a v e o b s e r v e d t h e same a- and 3 - s u b u n i t s , b u t c l a i m t h e e x i s t e n c e o f a t h i r d s u b u n i t , a'. I t i s n o t p o s s i b l e t o a c c e p t o r r e f u t e t h e e x i s t e n c e o f t h e p u t a t i v e a' - s u b u n i t on t h e b a s i s o f t h e s e r e p o r t s , as v e r y d i f f e r e n t p r e p a r a t i v e m e t h o d s w e r e e m p l o y e d . B o t h o f t h e r e p o r t s i n w h i c h t h e a ' - s u b u n i t s w e r e o b s e r v e d e m p l o y e d t h e same p r e p a r a t i v e m e t h o d , w h e r e a s t h e m e t h o d o f Mani e t a l . ( 1 9 8 2 , 1 9 8 3 a , 1 9 8 3 b ) was d i s t i n c t . B o t h o f t h e s e p r e p a r a t i v e m e t h o d s i n v o l v e r e l a t i v e l y h a r s h t r e a t m e n t s , i n t h e f i r s t , l o n g t e r m e x p o s u r e o f t h e p r o t e i n s t o an i o n e x c h a n g e c o l u m n i n t h e p r e s e n c e o f e t h a n o l , w h e r e a s t h e m e t h o d o f M a n i e t a l . e m p l o y s a h e a t t r e a t m e n t s t e p . I n t h i s r e p o r t an a l t e r n a t e m e t h o d i s e x p l o r e d . The a p p a r e n t c o n t r o v e r s y s u r r o u n d i n g t h e l o c a l i z a t i o n o f S - 1 0 0 p r o t e i n s i n t h e b r a i n , as w e l l as t h e p a u c i t y o f i n f o r m a t i o n on t h e i m m u n o c h e m i c a l and i m m u n o h i s t o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e i s o l a t e d S - 1 0 0 i s o t y p e s , c a l l s f o r t h e e x a m i n a t i o n o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s i n i s o l a t i o n . U n l i k e t h e s t r a t e g y o f I s o b e e t a l . ( 1 9 8 4 ) who f r a c t i o n a t e d a " w h o l e S - 1 0 0 " a n t i s e r u m , I h a v e a t t e m p t e d t o o b t a i n a s e l e c t i v e a n t i s e r u m by u s e o f t h e i s o l a t e d S - l O O b ( 3 3 ) i s o t y p e . EXPERIMENTAL PROCEDURES P r e p a r a t i o n o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s . S e v e r a l p r o c e d u r e s h a v e b e e n e v a l u a t e d f o r t h e p u r i f i c a t i o n o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s . A m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d o f M a n i e t a l . ( 1 9 8 2 ) has b e e n e m p l o y e d f o r much o f t h e work d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s . I n a d d i t i o n , a m o d i f i c a t i o n o f t h e h y d r o p h o b i c c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d o f B a u d i e r e t a l . ( 1 9 8 2 ) has b e e n u s e d i n t h e f i n a l p u r i f i c a t i o n o f t h e S - 1 0 0 i s o p r o t e i n s . I n o r d e r t o s p e e d t h e p r e p a r a t i v e p r o c e d u r e , and t o r e d u c e s u b j e c t i o n o f t h e p r o t e i n s t o h a r s h c o n d i t i o n s , an a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d e m p l o y i n g 2 - c h l o r o - 1 0 - ( 3 - a m i n o p r o p y l ) p h e n o t h i a z i n e ( C A P P , s e e F i g u r e 3a) was e m p l o y e d . The CAPP ( g e n e r o u s l y s u p p l i e d by D r . B . R o u f o g a l i s ) was c o v a l e n t l y l i n k e d t o S e p h a r o s e C L - 6 B u s i n g c y a n o g e n b r o m i d e a c t i v a t i o n , as d e s c r i b e d by J a m i e s o n & Vanaman ( 1 9 7 9 ) . F o r t h e p r e p a r a t i o n o f t h e b o v i n e S - 1 0 0 p r o t e i n s , b r a i n s w e r e o b t a i n e d f r o m a l o c a l s l a u g h t e r h o u s e (J & L M e a t s , S u r r e y , B . C . ) , p l a c e d on i c e d u r i n g t r a n s p o r t a t i o n t o t h e l a b o r a t o r y , t h e n e i t h e r f r o z e n and s t o r e d f o r l e s s t h a n 2 weeks a t - 2 0 ° C , o r u s e d i m m e d i a t e l y . A l l s u b s e q u e n t s t e p s w e r e c a r r i e d o u t a t 4 ° C i n t h e c o l d room u s i n g p r e c h i l l e d b u f f e r s , e x c e p t w h e r e n o t e d o t h e r w i s e . B o v i n e b r a i n s ( 0 . 1 - 1 . 0 Kg) w e r e d i s s e c t e d i n t o 5 g p i e c e s b e f o r e h o m o g e n i z a t i o n i n e i t h e r a W a r i n g b l e n d e r o r t h e S o r v a l O m n i m i x e r w i t h l g t i s s u e / 3 m l o f t h e h o m o g e n i z a t i o n b u f f e r ( 5 0 mM T r i s - H C l / 5 mM EDTA, p H = 7 . 8 ) . The h o m o g e n a t e was c e n t r i f u g e d i n t h e S o r v a l GSA r o t o r a t 7500 x g f o r 1 h o u r and t h e s u p e r n a t a n t c o l l e c t e d . T h e s u p e r n a t a n t was c h e c k e d t o be i n t h e pH r a n g e o f 7 . 5 - 8 . 0 , t h e n was b r o u g h t t o 65% s a t u r a t i o n i n ( N H t t ) 2 S 0 1 + w i t h t h e g r a d u a l a d d i t i o n o f t h e s o l i d s a l t . The r e s u l t i n g m i x t u r e was s t i r r e d f o r 4 h o u r s and t h e n c e n t r i f u g e d a t 7500 x g f o r 45 m i n u t e s ; t h e p r e c i p i t a t e d i s c a r d e d . The s u p e r n a t a n t was b r o u g h t t o 75% s a t u r a t i o n i n ( N H l f ) 2 S 0 l t , made 1 mM i n M g C l 2 by t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 M M g C l 2 , t h e n t i t r a t e d t o pH=4.1 w i t h g l a c i a l a c e t i c a c i d and g e n t l y s t i r r e d f o r s e v e r a l h o u r s . T h i s m i x t u r e was c e n t r i f u g e d a t 7500 x g f o r 1 h o u r and t h e s u p e r n a t a n t d i s c a r d e d . The p e l l e t f r o m t h e 75% ( N H t + ) 2 S 0 l t c u t was e i t h e r b r o u g h t i n t o s o l u t i o n w i t h t h e minimum v o l u m e o f 50 mM T r i s - H C l / 0 . 3 M NaCl ( p H = 7 . 6 ) f o r t h e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y , o r p r o c e s s e d f o r h e a t t r e a t m e n t and D E A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y , e x a c t l y as p r e v i o u s l y d e s c r i b e d (Mani e t a l . , 1 9 8 2 ) . F o r t h e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h i c p r e p a r a t i o n o f S - 1 0 0 , t h e a b o v e " a c i d i c p r o t e i n " m i x t u r e was a d j u s t e d t o 10 mM C a C l 2 w i t h t h e a d d i t i o n o f 1 . 0 M C a C l 2 and l o a d e d o n t o a 2 x 10 cm c o l u m n o f C A P P - S e p h a r o s e w h i c h had b e e n p r e v i o u s l y e q u i l i b r a t e d i n 50 mM T r i s - H C l / 0 . 3 M N a C l / 1 0 mM C a C l 2 , p H = 7 . 6 . The l o a d e d c o l u m n was w a s h e d w i t h t h e e q u i l i b r a t i o n b u f f e r u n t i l t h e a b s o r b a n c e a t 278 nm was b e l o w 0 . 1 , and t h e n was e l u t e d w i t h B u f f e r B (50 mM T r i s - H C l / 0 . 3 M N a C l / 1 0 mM EDTA, p H = 7 . 6 ) , w h i l e c o l l e c t i n g 10 ml f r a c t i o n s . E l u t i o n o f t h e m i x t u r e o f b o u n d p r o t e i n s was m o n i t o r e d by t h e a b s o r b a n c e a t 278 nm, and t h e a p p r o p r i a t e peak f r a c t i o n s w e r e a s s a y e d f o r t h e p r e s e n c e o f p h e n y l a l a n i n e r i c h p r o t e i n s on t h e b a s i s o f t h e i r c h a r a c t e r i s t i c UV s p e c t r a l p r o p e r t i e s ( M a n i e t a l . , 1 9 8 2 ) . F o r t h e r e s o l u t i o n o f t h e S - l O O s / c a l m o d u l i n m i x t u r e e l u t e d f r o m t h e C A P P - S e p h a r o s e a f f i n i t y c o l u m n , o r f r o m t h e g e l f i l t r a t i o n s t e p o f M a n i e t a l ( 1 9 8 2 ) , t w o a p p r o a c h e s h a v e b e e n e m p l o y e d ; t h e h y d r o x y l a p a t i t e c h r o m a t o g r a p h y e x a c t l y as p r e v i o u s l y d e s c r i b e d (Mani e t a l , 1 9 8 2 ) , o r a m o d i f i c a t i o n o f t h e p h e n y l - S e p h a r o s e h y d r o p h o b i c c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d o f B a u d i e r e t a l . ( 1 9 8 2 ) . F o r t h e p h e n y l - S e p h a r o s e c h r o m a t o g r a p h y , a c o l u m n m e a s u r i n g 0 . 7 5 x 15 cm was p a c k e d w i t h t h e r e s i n and e q u i l i b r a t e d w i t h B u f f e r A ( 5 0 mM T r i s - H C l / 0 . 1 3 M N a C l / 0 . 0 2 M K C 1 / 0 . 2 5 mM Z n S O ^ , p H = 7 . 4 ) . The s a m p l e o f l y o p h i l i z e d p r o t e i n was d i s s o l v e d i n t h i s b u f f e r and l o a d e d o n t o t h e c o l u m n by g r a v i t y f l o w . The c o l u m n was w a s h e d w i t h 45 ml o f B u f f e r A , 30 ml o f B u f f e r B ( 5 0 mM T r i s - H C l / 0 . 2 5 mM Z n S O J , f o l l o w e d by a f u r t h e r 20 ml o f B u f f e r C (50 mM T r i s - H C l / 2 . 0 mM E D T A ) , a l l a t 30 m l / h r w i t h t h e a i d o f a p e r i s t a l t i c pump. F r a c t i o n s o f ~4 ml w e r e c o l l e c t e d , and t h e e l u t i o n p r o f i l e m o n i t o r e d by a b s o r b a n c e a t 278nm. P o l y a c r y l a m i d e G e l E l e c t r o p h o r e s i s . F o r t h e a n a l y s i s o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s two d i s c o n t i n u o u s b u f f e r e d e l e c t r o p h o r e t i c s y s t e m s h a v e been u s e f u l . The d i s c o n t i n u o u s b u f f e r s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( d i s c SDS-PAGE) was c a r r i e d o u t on t h e s l a b g e l a p p a r a t u s u s i n g t h e T r i s - g l y c i n e s y s t e m o f L a m m e l i ( 1 9 7 0 ) . The r e s o l v i n g g e l was 15% a c r y l a m i d e / 0 . 1 % N , N ' - m e t h y l e n e - b i s - a c r y l a m i d e ( b i s ) on w h i c h a 5% a c r y l a m i d e / 0 . 0 6 6 % b i s s t a c k i n g g e l was p o u r e d . The e l e c t r o p h o r e s i s was c a r r i e d o u t a t room t e m p e r a t u r e o v e r n i g h t a t a c o n s t a n t v o l t a g e o f 80 V , w h i c h was i n c r e a s e d t h e n e x t m o r n i n g t o 120 v o l t s and r u n u n t i l t h e b r o m o p h e n o l b l u e t r a c k i n g d y e l e f t t h e g e l . The g e l s w e r e s t a i n e d f o r p r o t e i n w i t h C o o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e R - 2 5 0 by s t a n d a r d m e t h o d s , o r w i t h t h e s i l v e r s t a i n i n g p r o t o c o l d e s c r i b e d by M o r r i s o n ( 1 9 8 1 ) , m o d i f i e d by t h e s u b s t i t u t i o n o f 37% f o r m a l d e h y d e i n f a v o u r o f 10% g l u t a r a l d e h y d e as f i x a t i v e . The a l t e r n a t e f i x a t i v e was e m p l o y e d t o a l l o w c o n s e c u t i v e C o o m a s s i e B l u e and s i l v e r s t a i n i n g as s u g g e s t e d by Btirk e t a l . ( 1 9 8 3 ) . T h i s was s o m e t i m e s n e c e s s a r y f o r t h e s e m i - q u a n t i t a t i v e d e t e r m i n a t i o n o f t h e c o n t a m i n a t i o n o f S - 1 0 0 p r e p a r a t i o n s w i t h c a l m o d u l i n , w h i c h was o b s e r v e d t o p o s s e s s an u n d e s i r a b l e s i l v e r s t a i n i n g p r o p e r t y ( s e e R e s u l t s ) . The r e s o l u t i o n o f S - l O O a and S - l O O b c a n be a c h e i v e d on a n o n - d e n a t u r i n g d i s c o n t i n u o u s b u f f e r s y s t e m ( I s o b e e t a l . , 1 9 7 7 ) . T h e 27 t u b e g e l s w e r e c o m p o s e d o f a 20 % a c r y l a m i d e / 0 . 1 2 % b i s r e s o l v i n g g e l on a 5 % a c r y l a m i d e / 0 . 2 % b i s s t a c k i n g g e l , and w e r e made up i n t h e b u f f e r s y s t e m o f O r n s t e i n ( 1 9 6 4 ) and D a v i s ( 1 9 6 4 ) . S a m p l e s w e r e made up t o c o n t a i n 1 mM EDTA i n o r d e r t o c i r c u m v e n t t h e band s p l i t t i n g s e e n d u r i n g t h e e l e c t r o p h o r e s i s o f C a + 2 - b i n d i n g p r o t e i n s and a l s o c o n t a i n e d 0 . 1 % t h i o g l y c o l i c a c i d t o m a i n t a i n t h e s u l f h y d r y l s i d e c h a i n o f c y s t e i n e r e s i d u e s ( I s o b e e t a l , 1 9 7 7 ) . E l e c t r o p h o r e s i s was c a r r i e d o u t a t 2 . 0 m A / g e l c o l u m n f o r 4 - 6 h o u r s i n an e l e c t r o p h o r e s i s t a n k c o o l e d by r e c i r c u l a t e d i c e w a t e r ( B i o - R a d M o d e l 1 5 5 ) . B r o m o p h e n o l b l u e was o b s e r v e d t o m i g r a t e a p p r o x i m a t e l y 10 cm d u r i n g t h e e l e c t r o p h o r e s i s . The t u b e g e l s w e r e p r o c e s s e d f o r p r o t e i n s t a i n i n g w i t h C o o m a s s i e B l u e R - 2 5 0 by s t a n d a r d m e t h o d s . I m m u n i z a t i o n o f R a b b i t s and C o l l e c t i o n o f S e r u m : The i m m u n i z a t i o n scheme e m p l o y e d t h e u n m o d i f i e d S - l O O b p r o t e i n b e i n g p r e s e n t e d i n l a r g e d o s e s t o a d u l t r a b b i t s . L a r g e h e a l t h y m a l e a l b i n o r a b b i t s ( 3 - 4 Kg) w e r e i n i t i a l l y i n j e c t e d on t h e f l a n k s s u b c u t a n e o u s l y i n 8 - 1 0 l o c a t i o n s w i t h a t o t a l o f 150 o r 350 yg o f S - l O O b ( r a b b i t s H and L , r e s p e c t i v e l y ) i n 1 ml o f p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) e m u l s i f i e d w i t h an e q u i v a l e n t v o l u m e o f F r e u n d ' s C o m p l e t e A d j u v a n t ( F C A ) . T h r e e and s i x w e e k s . f o l l o w i n g t h e i n i t a l i m m u n i z a t i o n , i n j e c t i o n s o f 150 o r 350 y g o f t h e p r o t e i n i n 1 : 1 F r e u n d ' s I n c o m p l e t e A d j u v a n t ( F I A ) : P B S w e r e g i v e n t o t h e r a b b i t s . A f t e r a one month h o l i d a y , t h e r a b b i t s w e r e c h a l l e n g e d w i t h an i n j e c t i o n o f 500 o r 1000 yg o f t h e p r o t e i n i n P B S . B l o o d was c o l l e c t e d f r o m t h e r a b b i t s v i a t h e m a r g i n a l e a r v e i n and a l l o w e d t o c l o t ; t h e s e r u m was o b t a i n e d by c e n t r i f u g a t i o n and s t o r e d a t - 7 0 ° C . 28 S o l i d P h a s e A s s a y f o r A n t i b o d i e s t o S-lOOb: A n t i b o d i e s t o t h e S-lOOb p r o t e i n w e r e d e t e c t e d i n t h e r a b b i t s e r a by a s o l i d p h a s e i m m u n o s o r b a n t a s s a y . I n i t i a l l y , t h e a s s a y e m p l o y e d [ 1 2 5 I ] - P r o t e i n A f r o m S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s f o r t h e d e t e c t i o n o f i m m u n o r e a c t i v i t y ; t h i s was s u b s e q u e n t l y r e p l a c e d w i t h an a l k a l i n e p h o s p h a t a s e g o a t - a n t i r a b b i t c o n j u g a t e f o r an e n z y m a t i c d e t e c t i o n m e t h o d . The p r o c e d u r e f o r t h e e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b a n t a s s a y ( E L I S A ) i s p r e s e n t e d ; t h e immuno-r a d i o m e t r i c a s s a y i s s i m i l a r , d i f f e r i n g o n l y i n t h e d e t e c t i o n s t e p . 1 . 100 y l o f 1 0 - 0 . 1 pg/ml s o l u t i o n o f S-lOOb i n 0 . 1 M N a H C 0 3 , ( p H = 9 . 5 ) was p a s s i v e l y a d s o r b e d o n t o D y n a t e c h Immunlon 1 96 w e l l p o l y s t y r e n e m i c r o t i t r e p l a t e s by i n c u b a t i o n a t room t e m p e r a t u r e f o r 2 h o u r s , o r by i n c u b a t i o n i n t h e c o l d o v e r n i g h t . 2 . The p l a t e s w e r e r i n s e d t h r e e t i m e s w i t h a P B S / 0 . 2 5 % Tween 20 s o l u t i o n . E x t r a n e o u s p r o t e i n b i n d i n g s i t e s w e r e b l o c k e d by i n c u b a t i o n f o r 1 h o u r a t room t e m p e r a t u r e w i t h 150 u l o f 2 % b o v i n e s e r u m a l b u m i n i n t h e b i c a r b o n a t e a d s o r p t i o n b u f f e r . 3 . The p l a t e s w e r e r i n s e d t h r e e t i m e s i n P B S - T w e e n . 4 . The t e s t a n t i s e r a s o l u t i o n was a d d e d (100 u l ) , t h e n i n c u b a t e d i n t h e c o l d room o v e r n i g h t , o r f o r 2 h o u r s a t room t e m p e r a t u r e . 5 . The p l a t e s w e r e r i n s e d t h r e e t i m e s i n P B S - T w e e n . 6 . T h e G o a t A n t i r a b b i t IgG c o n j u g a t e d t o a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( G A R - A P , Tago L t d . ) was a d d e d t o t h e w e l l s . A v o l u m e o f 1 0 0 u l o f a 1 / 2 0 0 0 d i l u t i o n o f t h e c o n j u g a t e i n P B S - T w e e n was a d d e d t o e a c h w e l l . The p l a t e s w e r e i n c u b a t e d f o r 1 . 5 h o u r s i n t h e d a r k a t room t e m p e r a t u r e . 7 . The p l a t e s w e r e r i n s e d t h r e e t i m e s w i t h P B S - T w e e n . 29 8 . The b o u n d a l k a l i n e p h o s p h a t a s e was a s s a y e d as d e s c r i b e d by B u t l e r e t a l ( 1 9 8 3 ) , u s i n g p - n i t r o p h e n y l p h o s p h a t e as t h e s u b s t r a t e w i t h s p e c t r o p h o t o m e t r y d e t e r m i n a t i o n o f t h e p r o d u c t a t 4 0 5 nm w i t h t h e T i t r e - T e k I I p l a t e r e a d e r ( F l o w L a b s ) . F o r t h e i n i t i a l d e t e r m i n a t i o n o f t h e b i n d i n g c a p a c i t y o f t h e t e s t r a b b i t s e r a , t h e [ 1 2 5 I ] - P r o t e i n A r a d i o m e t r i c i m m u n o s o r b a n t a s s a y ( P A - R I S A ) was e m p l o y e d . The t i t r e o f a p a r t i c u l a r t e s t s e r a was e x p r e s s e d as t h a t d i l u t i o n o f s e r a w h i c h r e s u l t e d i n 50% o f t h e m a x i m a l b i n d i n g t o p o l y s t y r e n e t u b e s c o a t e d w i t h 1 . 0 yg o f S-lOOb. F o r a l l o t h e r e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d h e r e i n , t h e E L I S A m e t h o d o u t l i n e d a b o v e was e m p l o y e d . F o r t h e e x p e r i m e n t s e x a m i n i n g t h e m e t a l i o n e f f e c t s on t h e S-lOOb a n t i b o d y i n t e r a c t i o n , a s w e l l a s f o r t h e c o m p e t i t i v e E L I S A , t h e a n t i s e r a was a p p l i e d t o t h e p l a t e s f o l l o w i n g t h e a d d i t i o n o f t h e a p p r o p r i a t e i o n s o r c o m p e t i t o r p r o t e i n , t h e n p r o c e s s e d as a b o v e . I n t h e i o n i c i n t e r a c t i o n e x p e r i m e n t s , t h e a n t i s e r u m s o l u t i o n s w e r e made up a t 1 / 1 0 , 0 0 0 d i l u t i o n i n P B S - T w e e n . A f t e r 50mg o f C h e l l e x ( B i o r a d ) was a d d e d f o r e a c h ml o f s o l u t i o n , t h e m i x t u r e was s t i r r e d f o r 1 h o u r i n t h e c o l d room i n o r d e r t o remove e n d o g e n o u s m e t a l i o n s . I n one c a s e t h e a n t i s e r u m was d i l u t e d i n a P B S - T w e e n s o l u t i o n i n w h i c h t h e K + s a l t s w e r e s u b s t i t u t e d f o r a l l t h e N a + s a l t s . The b i n d i n g o f t h e a n t i b o d y t o t h e a d s o r b e d S-lOOb i n t h e i o n e x p e r i m e n t s i s e x p r e s s e d as t h e % a c t i v i t y o f t h e a l k a l i n e p h o s p h a t a s e o b s e r v e d when t h e c h e l l e x e d a n t i s e r u m was a d d e d a l o n g w i t h t h e v a r i o u s d i l u t i o n s o f i o n s o l u t i o n s , r e l a t i v e t o t h a t o b s e r v e d when no e x o g e n o u s i o n s w e r e a d d e d t o t h e c h e l l e x e d a n t i s e r u m . F o r t h e c o m p e t i t i v e E L I S A t h e m i c r o t i t r e p l a t e w e l l s w e r e c o a t e d w i t h 10 ng o f S-lOOb, and an a n t i s e r u m d i l u t i o n o f 1 / 2 0 , 0 0 0 was e m p l o y e d . B i n d i n g o f t h e a n t i b o d y t o t h e a d s o r b e d S-lOOb was e x p r e s s e d as t h e % I n h i b i t i o n , d e f i n e d by t h e e x p r e s s i o n ; % I=(l - B / B 0 ) x 1 0 0 , i n w h i c h B r e p r e s e n t s t h e a p p a r e n t b i n d i n g i n t h e p r e s e n c e o f t h e a d d e d i n h i b i t o r ( c o m p e t i t o r ) p r o t e i n , and B 0 i s t h e a p p a r e n t a c t i v i t y i n t h e a b s e n c e o f any e x o g e n o u s i n h i b i t o r . I m m u n o b l o t A n a l y s i s o f t h e S-lOOb D e r i v e d A n t i s e r u m : To d e t e r m i n e t h e i m m u n o c h e m i c a l s p e c i f i c i t y o f t h e a n t i s e r u m , an e l e c t r o p h o r e t i c i m m u n o b l o t was c a r r i e d o u t on s o l u b l e b r a i n p r o t e i n s . The d i s c SDS-PAGE was c a r r i e d o u t as d e s c r i b e d e a r l i e r , a f t e r w h i c h t h e s l a b g e l s w e r e p r o c e s s e d f o r e l e c t r o p h o r e t i c t r a n s f e r t o n i t r o c e l l u l o s e s h e e t s (13 x 13 c m , M i l l i p o r e HAWP, 0 . 4 5 y m ) . The e l e c t r o p h o r e s i s was p e r f o r m e d i n a B i o r a d T r a n s - B l o t c e l l a t a c u r r e n t o f 85 mA f o r 12 h o u r s u s i n g t h e b u f f e r s y s t e m d e s c r i b e d by L e e e t a l . ( 1 9 8 2 ) , m o d i f i e d by t h e a d d i t i o n o f 0 . 1 mM C a C l 2 . The n i t r o c e l l u l o s e s h e e t was removed f r o m t h e a p p a r a t u s and p l a c e d i n t h e B l o c k i n g b u f f e r (10 mM T r i s - H C l / 1 5 0 mM NaCl/2mM E D T A / 0 . 0 5 % N P - 4 0 / 0 . 5 % b o v i n e s e r u m a l b u m i n , p H = 7 . 6 ) , i n w h i c h i t was i n c u b a t e d a t room t e m p e r a t u r e f o r 3 h o u r s w i t h a g i t a t i o n . The b l o c k i n g b u f f e r was r e m o v e d , and a 1 / 1 0 0 0 d i l u t i o n o f t h e a n t i s e r u m i n b l o c k i n g b u f f e r was a d d e d . The s h e e t s w e r e i n c u b a t e d i n t h e a n t i s e r u m s o l u t i o n . f o r 2 h o u r s a t room t e m p e r a t u r e w i t h a g i t a t i o n . T h e s h e e t s w e r e removed f r o m t h e a n t i s e r u m s o l u t i o n and w a s h e d f o r 2 h o u r s a t 3 7 ° C w i t h 5 c h a n g e s o f 50 mM T r i s - H C l / 1 5 0 mM N a C l , pH=7.6 ( T r i s / N a C l ) . A f t e r w a s h i n g , a 1 / 1 0 0 0 d i l u t i o n o f G o a t A n t i r a b b i t c o n j u g a t e d t o h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ( Z y m e d ) , made up i n t h e b l o c k i n g b u f f e r , was a d d e d t o t h e b l o t s . The b l o t s w e r e i n c u b a t e d i n t h e c o n j u g a t e s o l u t i o n f o r 1 h o u r a t room t e m p e r a t u r e , t h e n w a s h e d 5 t i m e s i n T r i s / N a C l / 0 . 2 5 % T w e e n , and p r o c e s s e d f o r p e r o x i d a s e h i s t o c h e m i s t r y . The h i s t o c h e m i c a l r e a c t i o n t o o k p l a c e f o r 10 m i n u t e s i n t h e d a r k a t room t e m p e r a t u r e i n a medium c o m p o s e d o f 50 mM T r i s - H C l / 1 0 mM i m i d a z o l e / 0 . 2 5 mg/ml d i a m i n o b e n z i d i n e / 0 . 0 0 7 5 % H 2 0 2 ( v / v ) , p H = 7 . 4 . The s h e e t s w e r e w a s h e d e x t e n s i v e l y w i t h T r i s / N a C l , f o l l o w e d by T r i s - H C l and d i s t i l l e d w a t e r . The s h e e t s w e r e a l l o w e d t o d r y and w e r e s t o r e d i n t h e d a r k u n t i l t o p h o t o g r a p h e d . RESULTS P u r i f i c a t i o n o f t h e S - 1 0 0 P r o t e i n s . The p u r i f i c a t i o n o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n i s o t y p e s r e p r e s e n t s a c h a l l a n g e t o p r o t e i n c h e m i s t r y due t o t h e e x t e n s i v e s i m i l a r i t i e s i n t h e s e q u e n c e s and p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f t h e S - l O O a and S - l O O b p r o t e i n s . The m a j o r c o n t a m i n a n t w h i c h p e r s i s t s d u r i n g t h e p u r i f i c a t i o n o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s i s a s m a l l a c i d i c p r o t e i n t h a t i s a l w a y s o b s e r v e d t o c o - p u r i f y . The c o - p u r i f y i n g p r o t e i n has a m o l e c u l a r w e i g h t o f 1 6 - 1 8 k d a l on SDS PAGE g e l s , and h a s b e e n i d e n t i f i e d as t h e u b i q u i t o u s c a l m o d u l i n (Mani e t a l , 1 9 8 2 ) . The e l u t i o n p r o f i l e f o r t h e C A P P - S e p h a r o s e C a + 2 - d e p e n d e n t a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h i c p r e p a r a t i o n o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s i s shown i n F i g u r e 3 b . The C A P P - S e p h a r o s e c o l u m n was o b s e r v e d t o b i n d a m i x t u r e o f p r o t e i n s i n t h e p r e s e n c e o f C a + 2 , and t o r e l e a s e t h e m upon t h e a d d i t i o n o f an EDTA c o n t a i n i n g b u f f e r ( B u f f e r B , s e e F i g u r e 3 b ) . The p r o t e i n s r e l e a s e d upon t h e a d d i t i o n o f EDTA d i s p l a y e d a UV s p e c t r u m w h i c h i d e n t i f i e d t h e m as p h e n y l a l a n i n e r i c h , d i s p l a y i n g s e v e r a l p e a k s i n t h e F i g u r e 3 . The u s e o f C A P P - S e p h a r o s e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y f o r t h e p r e p a r a t i o n o f an S - 1 0 0 i s o p r o t e i n / c a l m o d u l i n m i x t u r e . The a f f i n i t y r e s i n i s p r o d u c e d by t h e r e a c t i o n o f 2 - c h l o r o - 1 0 - ( 3 - a m i n o p r o p y l ) p h e n o -t h i a z i n e (CAPP) w i t h c y a n o g e n b r o m i d e a c t i v a t e d S e p h a r o s e C L - 4 B ( C N B r -S e p h a r o s e ) , as i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 3 a . A c h r o m a t o g r a m i l l u s t r a t i n g t h e a p p l i c a t i o n o f t h i s m a t e r i a l t o t h e C a + 2 - d e p e n d e n t a f f i n i t y s e p a r a t i o n o f t h e S - 1 0 0 / c a l m o d u l i n m i x t u r e f r o m t h e m i x t u r e o f a c i d i c p r o t e i n f r a c t i o n i s shown i n F i g u r e 3 b . The c r u d e m a t e r i a l i s l o a d e d o n t o t h e c o l u m n i n t h e p r e s e n c e o f C a + 2 , and t h e S - 1 0 0 / c a l m o d u l i n m i x t u r e e l u t e d by t h e a d d i t i o n o f an EDTA c o n t a i n i n g b u f f e r ( B u f f e r B , a r r o w i n F i g u r e 3 b ) , as d e s c r i b e d i n t h e t e x t . F i g u r e 3a _ F i g u r e 3b F r a c t i o n 33 r a n g e o f 2 7 0 - 2 5 5 nm. When t h e s e p r o t e i n s w e r e e l e c t r o p h o r e s e d on a 15 % d i s c SDS-PAGE s y s t e m , two m a j o r bands w e r e o b s e r v e d c o r r e s p o n d i n g t o a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t s o f 17 and 10 k d a l ( s e e F i g u r e 5 a , l a n e 3 ) . A s i m i l a r m i x t u r e o f p r o t e i n s e l u t e d f r o m a C A P P - S e p h a r o s e c o l u m n was o b s e r v e d by J a m i e s o n & Vanaman ( 1 9 7 9 ) , who i n t r o d u c e d t h e r e s i n f o r t h e r a p i d p u r i f i c a t i o n o f c a l m o d u l i n . The UV s p e c t r a l p r o p e r t i e s and m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e e l u t e d p r o t e i n s i d e n t i f y t h e m as a m i x t u r e o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s ( s u b u n i t m o l e c u l a r w e i g h t 10 k d a l ) and c a l m o d u l i n ( m o l e c u l a r w e i g h t 1 6 . 5 k d a l ) . One u n u s u a l p r o p e r t y o b s e r v e d c o n c e r n i n g c a l m o d u l i n was i t s s i l v e r s t a i n i n g c h a r a c t e r i s t i c s . M a s s i v e l o a d i n g o f c a l m o d u l i n on t h e g e l r e s u l t e d i n t h e i n t e r i o r o f t h e c o r r e s p o n d i n g band d i s p l a y i n g a p a l e s t a i n i n g ( F i g u r e 5 a , l a n e s 1 & 3 ) , w h e r e a s a t l o w e r mass l o a d i n g , a more homogeneous p a t t e r n o f s t a i n i n g was o b s e r v e d ( F i g u r e 5 a , l a n e s 2 & 4 ) . As a r e s u l t o f t h i s p e c u l i a r i t y i n t h e s i l v e r s t a i n i n g , t h e g e l s w e r e f r e q u e n t l y p r o c e s s e d f o r b o t h C o o m a s s i e B l u e and s i l v e r s t a i n i n g , and S - 1 0 0 p r e p a r a t i o n s w e r e c h e c k e d f o r c a l m o d u l i n c o n t a m i n a t i o n by l o a d i n g s a m p l e s o f a p p r o x i m a t e l y 0 . 1 and 5 yg o f p r o t e i n . The u s e o f t h e s i l v e r s t a i n was r e t a i n e d b e c a u s e o f i t s s u p e r i o r d e t e c t i o n c a p a b i l i t i e s f o r o t h e r t r a c e p r o t e i n c o n t a m i n a n t s . F o r t h e f r a c t i o n a t i o n o f t h e S - 1 0 0 / c a l m o d u l i n m i x t u r e t h e h y d r o x y l a p a t i t e c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d o f M a n i e t a l . ( 1 9 8 2 ) h a s p r o v e n s u c c e s s f u l f o r t h e p u r i f i c a t i o n o f S - l O O b ( F i g u r e 5 a , l a n e s 5 and 6 ) and c a l m o d u l i n ( F i g u r e 5 a , l a n e 4 ) , b u t h a s n o t b e e n u s e f u l f o r t h e i s o l a t i o n o f S - l O O a f r e e o f S - l O O b . F o r t h e p r e p a r a t i o n o f S - l O O a , a m o d i f i c a t i o n o f t h e p h e n y l - S e p h a r o s e h y d r o p h o b i c c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d o f B a u d i e r e t a l . ( 1 9 8 2 ) was s u c c e s s f u l . The e l u t i o n p r o f i l e f r o m a 34 p h e n y l - S e p h a r o s e c o l u m n f o r a m i x t u r e o f t h e S-lOOs and c a l m o d u l i n i s shown i n F i g u r e 4 . The f i r s t p e a k , P I , i s a m i x t u r e o f b o t h o f t h e S - 1 0 0 i s o t y p e s p l u s c a l m o d u l i n , w h e r e a s t h e s e c o n d and t h i r d p e a k s ( P 2 and P3 o f F i g u r e 4 , r e s p e c t i v e l y ) r e s p r e s e n t p u r i f i e d S-lOOa and S-lOOb. The i d e n t i t i e s o f t h e i s o l a t e d S-lOOa and S-lOOb p r o t e i n s w e r e d e t e r m i n e d by t h e i r c h a r a c t e r i s t i c UV s p e c t r a l p r o p e r t i e s ( s e e M a n i e t a l . 1 9 8 2 , 1 9 8 3 c ) , as w e l l as by t h e i r m o b i l i t i e s on 20% d i s c P A G E , as shown i n F i g u r e 5 b . The g r e a t e r m o b i l i t y o f S-lOOb, r e l a t i v e t o S-lOOa, i s i n a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u s r e p o r t s ( I s o b e e t a l . , 1 9 7 7 ) . An i n t e r e s t i n g p r o p e r t y o b s e r v e d f o r t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s c o n c e r n s t h e e f f e c t s o f " a g i n g " t h e p r o t e i n s . When a f r e s h l y p r e p a r e d S - 1 0 0 s o l u t i o n was e x a m i n e d by d i s c S D S - P A G E , o n l y t h e 10 k d a l band a p p e a r e d , as e x p e c t e d . H o w e v e r , i f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s a r e l e f t i n s o l u t i o n f o r more t h a n a c o u p l e o f d a y s , a s e c o n d band a t 22 k d a l a p p e a r s . T h i s c o m p o n e n t was p r e s e n t i n v e r y s m a l l amounts and was o n l y a p p a r e n t i n g e l s p r o c e s s e d f o r t h e s i l v e r s t a i n i n g ( F i g u r e 5 a , l a n e 6 ) . No e x t r a n e o u s band was o b s e r v e d on t h e n o n - d e n a t u r i n g g e l s . The 22 k d a l c o m p o n e n t a p p e a r s t o r e p r e s e n t a f o r m o f S - 1 0 0 w h i c h c a n n o t be d i s s o c i a t e d i n t o t h e 10 k d a l s u b u n i t s . T h i s e f f e c t was o n l y n o t i c e d i n p r e p a r a t i o n s l e f t i n s o l u t i o n f o r some t i m e . A l t h o u g h t h i s e f f e c t has n o t b e e n s t u d i e d i n any d e t a i l , i t may r e l a t e t o a r e p o r t by C a l l i s a n o e t a l . ( 1 9 7 5 ) , i n w h i c h p o l y m e r i z e d f o r m s o f S - 1 0 0 w e r e c l a i m e d ; i t was h y p o t h e s i z e d t h a t t h e p o l y m e r i z a t i o n was m e d i a t e d by t h e s u l f h y d r y l g r o u p s o f t h e p r o t e i n . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e S-lOOb A n t i s e r u m : When t h e s e r a f r o m t h e F i g u r e 4 . The e l u t i o n p r o f i l e o f an S - 1 0 0 / c a l m o d u l i n m i x t u r e c h r o m a t o g r a p h e d on a 0 . 7 5 x 15 cm p h e n y l - S e p h a r o s e c o l u m n . E l u t i o n o f t h e p r o t e i n c o m p o n e n t s was a c h e i v e d by s t e p g r a d i e n t c h a n g e o f t h e e l u e n t , as i n d i c a t e d i n t h e d i a g r a m and d e t a i l e d i n t h e t e x t . F r a c t i o n F i g u r e 5 . ( f o l l o w i n g p a g e ) An e l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o f t h e v a r i o u s p r o t e i n f r a c t i o n s . I n F i g u r e 5a t h e s a m p l e s w e r e s u b j e c t e d t o 15% d i s c SDS-PAGE on a s l a b g e l . The p r o t e i n s w e r e v i s u a l i z e d by s i l v e r s t a i n i n g . The s a m p l e s a r e as f o l l o w s ; l a n e 1 , 10 y g o f a c r u d e b r a i n h o m o g e n a t e ; l a n e 2 , 2 yg o f t h e c r u d e " a c i d i c p r o t e i n " f r a c t i o n ; l a n e 3 , C A P P - S e p h a r o s e EDTA r e l e a s e d f r a c t i o n ; l a n e 4 , 50 ng o f b o v i n e b r a i n c a l m o d u l i n ; l a n e 5 , 0 . 2 yg o f S - l O O b ; l a n e 6 , 2 yg o f " a g e d " S - l O O b . On t h e l e f t o f l a n e 1 t h e m o b i l i t i e s o f m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s e x p r e s s e e d i n k i l o d a l t o n s a r e i n d i c a t e d . I n F i g u r e 5b t h e e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t i e s o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s on t h e 20% d i s c PAGE t u b e g e l s a r e s h o w n . A p r o x i m a t e l y 10 y g o f t h e p r o t e i n s w e r e e l e c t r o p h o r e s e d , s t a i n i n g was c a r r i e d o u t w i t h C o o m a s s i e B l u e . The a r r o w h e a d s a r e a l i g n e d w i t h t h e B r o m o p h e n o l B l u e m a r k e r d y e . T h e numbers a t t h e b o t t o m o f e a c h g e l r e f e r s t o t h e m o b i l i t i e s o f t h e c o m p o n e n t s o f t h e s a m p l e , r e l a t i v e t o t h e t r a c k i n g d y e ( R f ) . S-100a S-100b a + b 0.74 0.80 0.74, 0.80 i m m u n i z e d r a b b i t s w e r e a s s a y e d f o r S-lOOb i m m u n o r e a c t i v i t y by s e v e r a l i m m u n o p r e c i p i t a t i o n m e t h o d s , no r e a c t i v i t y was a p p a r e n t . T h e r e f o r e , a s o l i d p h a s e i m m u n o a s s a y m e t h o d was a t t e m p t e d i n o r d e r t o d e t e r m i n e i f t h e i m m u n i z a t i o n p r o t o c o l was h a v i n g any e f f e c t . A l l o f t h e s e r a f r o m t h e i m m u n i z e d r a b b i t s w e r e f o u n d t o d i s p l a y s p e c i f i c i m m u n o r e a c t i v i t y t o w a r d s t h e a d s o r b e d S-lOOb when t h e s o l i d p h a s e a s s a y was e m p l o y e d . The c o u r s e o f t h e d e v e l o p m e n t o f t h e immune r e a c t i o n t o S-lOOb i s shown i n F i g u r e 6 . A l t h o u g h o n l y 2 a n i m a l s w e r e u s e d , b o t h p r o d u c e d a n t i b o d i e s t o t h e p r o t e i n , and t h e a n i m a l r e c e i v i n g t h e l a r g e r d o s e p r o d u c e d a h i g h e r t i t r e a n t i s e r u m . I n l a t e r a n t i g e n p r e s e n t a t i o n s t o t h e s e a n i m a l s , a n t i s e r a c o l l e c t e d a t 5 d a y s p o s t - s t i m u l a t i o n was f o u n d t o be o f somewhat h i g h e r t i t r e by t h e RIA t h a n t h a t c o l l e c t e d a t 2 w e e k s p o s t - s t i m u l a t i o n . I m m u n o h i s t o c h e m i c a l l y , t h e 5 day a n t i s e r a was s i g i f i c a n t l y s u p e r i o r t o t h a t c o l l e c t e d a t 2 w e e k s . One o f t h e a n t i s e r a p r o d u c e d t o S-lOOb was s e l e c t e d f o r f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n . When t h i s a n t i s e r u m was e x a m i n e d by t h e i m m u n o b l o t , a s i n g l e i m m u n o r e a c t i v e s p e c i e s was o b s e r v e d t o m i g r a t e w i t h an a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t o f 10 k d a l on 15% d i s c SDS-PAGE ( s e e F i g u r e 7 ) . T h i s r e s u l t was o b s e r v e d f o r b o t h t h e p u r i f i e d S-lOOb p r o t e i n , o r a c r u d e m i x t u r e o f s o l u b l e b r a i n p r o t e i n s . O c c a s i o n a l l y , w i t h o l d e r p r e p a r a t i o n s o f p u r i f i e d S-lOOb p r o t e i n , a m i n o r i m m u n o r e a c t i v e s p e c i e s w i t h an a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t o f 22 k d a l was o b s e r v e d . The 22 k d a l i m m u n o r e a c t i v e b a n d c o r r e s p o n d s t o t h e c o m p o n e n t o b s e r v e d by t h e s i l v e r s t a i n i n g m e t h o d , as p r e v i o u s l y d i s c u s s e d . The 22 k d a l i m m u n o r e a c t i v e band was n o t o b s e r v e d i n " f r e s h " c r u d e b r a i n e x t r a c t s . I n a d d i t i o n t o t h e b o v i n e b r a i n e x t r a c t , human and r a t b r a i n p r o t e i n e x t r a c t s w e r e 39 F i g u r e 6 . I m m u n o s o r b a n t a s s a y o f t h e p r o d u c t i o n o f t h e a n t i b o d y t o S-lOOb i n r e s p o n s e t o t h e i m m u n i z a t i o n p r o t o c o l . The r a b b i t s w e r e g i v e n e i t h e r a h i g h o r l o w d o s e o f t h e p u r i f i e d S-lOOb ( r a b b i t s H and L , r e s p e c t i v e l y ) . R e s p o n s e t o t h e a n t i g e n p r e s e n t a t i o n i s e x p r e s s e d as t h e T i t r e , i e . t h e l o g 1 0 o f t h e a n t i s e r u m d i l u t i o n w h i c h r e s u l t e d i n 50% o f t h e m a x i m a l b i n d i n g t o 1 yg o f S-lOOb. T i m e 0 on t h e a b c i s s a r e p r e s e n t s t h e i n i t i a l p r e s e n t a t i o n o f t h e a n t i g e n . A b b r e v i a t i o n s a r e as d e s c r i b e d i n t h e t e x t . Antisera T i t re -acH ( l o g d i l u t i o n w i t h S O 7. m a x . b i n d i n g ) -2.0--1.0-0 Week m g i n j e c t e d I FCA L 0.15 H 0.35 ~T 2 — r 4 FIA 0.15 0.35 T 6 FIA 0.15 0.35 8 — I — 10 PBS 0.5 1.0 — I 12 t PBS 0.5 1.0 —I 14 40 F i g u r e 7. The r e s u l t s an e l e c t r o p h o r e t i c immunoblot experiment u s i n g t h e S-lOOb d e r i v e d a n t i s e r u m . Samples of e i t h e r a crude b r a i n homogenate ( l a n e s 1 & 3) or t h e p u r i f i e d S-lOOb p r o t e i n ( l a n e s 2 & 4) were s u b j e c t e d t o 15% d i s c SDS-PAGE. The samples i n l a n e s 1 and 2 were p r o c e s s e d f o r s i l v e r s t a i n i n g f o r t h e v i s u a l i z a t i o n of p r o t e i n , whereas p a r a l l e l samples i n l a n e s 3 and 4 were e l e c t r o p h o r e t i c a l l y t r a n s f e r r e d t o n i t r o c e l l u l o s e and p r o c e s s e d f o r t h e enzymatic d e t e c t i o n of immunoreactive components. Note t h a t t h e immunoblot of t h e crude sample ( l a n e 3) d e t e c t e d a s i n g l e immunoreactive s p e c i e s which d i s p l a y e d t h e same m o b i l i t y as p u r i f i e d S-lOOb ( d e t e c t e d immunochemically i n l a n e 4 , and by s i l v e r s t a i n i n g i n l a n e 2 ) . The m o b i l i t i e s of m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s run i n p a r a l l e l are shown t o t h e l e f t of l a n e 1 . 9 2 . 5 - * 66 , 2 - * -45.0-* 31 21.5—* 4 14.4-(10>-* \ 41 F i g u r e 8. A c o m p e t i t i v e E L I S A a n a l y s i s o f t h e S - l O O b d e r i v e d a n t i s e r u m . I n h i b i t i o n o f t h e a n t i b o d y b i n d i n g t o p o l y s t y r e n e a d s o r b e d S - l O O b i s p r e s e n t e d as % I , as d e s c r i b e d i n t h e t e x t . C o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n w i t h S - l O O a and S - l O O b was a p p a r e n t , w h e r e a s c a l m o d u l i n was n o t s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t o r y . The e f f i c i e n c y o f S - l O O a i n h i b i t i o n , r e l a t i v e t o S - l O O b , was g r a p h i c a l l y d e t e r m i n e d u s i n g t h e p o i n t s on t h e l i n e a r p o r t i o n o f e a c h c u r v e . E a c h p o i n t r e p r e s e n t s t h e a v e r a g e o f d u p l i c a t e d e t e r m i n a t i o n s . % I n g p r o t e i n 42 F i g u r e 9. E f f e c t s o f d i v a l e n t c a t i o n s on t h e S - l O O b E L I S A . The d a t a a r e p l o t t e d as t h e % A c t i v i t y o f t h e a p p a r e n t a n t i b o d y b i n d i n g i n t h e p r e s e n c e o f t h e d i v a l e n t c a t i o n s o r EDTA, r e l a t i v e t o t h a t o b s e r v e d w i t h no a d d i t i o n s t o t h e c h e l l e x e d a n t i s e r u m . The f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f d i v a l e n t c a t i o n i n t h e a n t i s e r a s o l u t i o n i s p r e s e n t e d as p [ M + 2 ] ( i . e . , - l o g 1 0 [ M + 2 j ) . 43 e x a m i n e d w i t h t h e same r e s u l t s . The r e s u l t s o f t h e c o m p e t i t i v e E L I S A a n a l y s i s o f t h e S-lOOb d e r i v e d a n t i s e r u m a r e p r e s e n t e d i n F i g u r e 8 . The d a t a f r o m t h e E L I S A was f o u n d t o be q u i t e r e p r o d u c i b l e , and t h e r e l a t i v e s t a n d a r d d e v i a t i o n was r e l i a b l y < 10%. The c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n by S-lOOb o f a n t i b o d y b i n d i n g t o t h e p o l y s t y r e n e a d s o r b e d S-lOOb was o b s e r v e d t o o c c u r i n a m o n o t o n i c f a s h i o n . When S-lOOa i s a d d e d t o t h e a n t i s e r u m s o l u t i o n , a s i m i l a r c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n was a l s o o b s e r v e d . The S-lOOa p r o t e i n i s l e s s e f f e c t i v e t h a n S-lOOb on a w e i g h t b a s i s i n t h e i n h i b i t i o n o f b i n d i n g by a f a c t o r o f 0 . 5 6 ± 0 . 0 5 ( a v e r a g e o f 4 d e t e r m i n a t i o n s ± S . D . ) . T h i s w o u l d s u g g e s t t h a t t h e a n t i s e r u m i s o n l y w e a k l y r e a c t i v e t o t h e S-lOOa a - s u b u n i t , b u t i n t e r a c t s p r e f e r e n t i a l l y w i t h t h e S-lOOa 3 - s u b u n i t . F u r t h e r e v i d e n c e t h a t t h e a n t i b o d y p r e f e r e n t i a l l y i n t e r a c t s w i t h t h e S - 1 0 0 B - s u b u n i t was o b t a i n e d when S-lOOa was a d s o r b e d t o t h e p o l y s t y r e n e ; no b i n d i n g a c t i v i t y o f t h e s e r u m was o b s e r v e d . The v e r y weak c r o s s r e a c t i v i t y o f t h e a n t i s e r u m w i t h c a l m o d u l i n i s i n d i c a t e d by t h e r e s u l t s o f a c o m p e t i t i v e E L I S A e x p e r i m e n t i n w h i c h b o v i n e b r a i n c a l m o d u l i n was a d d e d as t h e c o m p e t i t i v e i n h i b i t o r . A d d i t i o n o f up t o 1 pg o f c a l m o d u l i n d i d n o t c a u s e a s i g n i f i c a n t i n h i b i t i o n o f a n t i b o d y b i n d i n g t o a d s o r b e d S-lOOb. The w e l l c h a r a c t e r i z e d d i v a l e n t c a t i o n e f f e c t s on t h e c o n f o r m a t i o n o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s s u g g e s t e d a s e r i e s o f e x p e r i m e n t s t o i n v e s t i g a t e t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e s e i o n s w o u l d i n f l u e n c e t h e S-lOOb a n t i b o d y - a n t i g e n i n t e r a c t i o n . F i g u r e 9 i l l u s t r a t e s t h e e f f e c t s t h a t i n c r e a s i n g a m o u n t s o f s e v e r a l d i v a l e n t c a t i o n s h a v e on t h e E L I S A . A t 10 mM a l l o f t h e i o n s w e r e o b s e r v e d t o h a v e an i n h i b i t o r y e f f e c t on 44 a n t i b o d y b i n d i n g . A l t h o u g h EDTA had a s l i g h t s t i m u l a t o r y e f f e c t , i t i s n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t . C a + 2 l i k e w i s e was n o t o b s e r v e d t o e f f e c t t h e i n t e r a c t i o n s i g n i f i c a n t l y , n o r was t h e e f f e c t o f M g + 2 o r M n + 2 s i g n i f i c a n t u n t i l h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s e i o n s w e r e a d d e d . The most s t r i k i n g r e s u l t i s t h e s t r o n g i n h i b i t o r y e f f e c t o f Z n + 2 o v e r t h e r a n g e o f 1 0 " 5 - 1 0 - l + M . A t 0 . 1 mM Zn was o b s e r v e d t o p r o d u c e a 40 % i n h i b i t i o n o f b i n d i n g a c t i v i t y . I n a manner s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d f o r t h e o t h e r d i v a l e n t c a t i o n s , Z n + 2 was i n c r e a s i n g l y i n h i b i t o r y a t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s . When t h e E L I S A t i t r a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t w i t h t h e s u b s t i t u t i o n o f K + f o r N a + as t h e m o n o v a l e n t s a l t , no d i f f e r e n c e was o b s e r v e d b e t w e e n t h e t i t r a t i o n c u r v e s g e n e r a t e d i n t h e p r e s e n c e o f e i t h e r i o n . S i m i l a r M + 2 t i t r a t i o n c u r v e s w e r e o b t a i n e d w h e t h e r t h e r e a c t i o n was c a r r i e d o u t a t 4 °C o r a t room t e m p e r a t u r e ( - 2 0 ° C ) . When t h e r e a c t i o n was c a r r i e d o u t i n t h e c o l d room o v e r a 60 h o u r p e r i o d , t h e r e l a t i v e i n h i b i t o r y p r o p e r t i e s o f t h e v a r i o u s d i v a l e n t c a t i o n s w e r e m a i n t a i n e d o v e r t h e c o u r s e o f t h e r e a c t i o n , and w e r e t h e same as t h a t o b s e r v e d a t room t e m p e r a t u r e . DISCUSSION S e v e r a l comments s h o u l d be made on t h e p r e p a r a t i v e p r o c e d u r e s u s e d i n t h i s s t u d y . The i n t e n t i o n o f any p r o t e i n p u r i f i c a t i o n scheme i s t o o b t a i n t h e d e s i r e d p r o t e i n ( s ) r a p i d l y , i n a homogeneous s t a t e , i n h i g h y i e l d and i n t h e m i l d e s t p o s s i b l e m a n n e r . The p r e p a r a t i v e p r o c e d u r e e m p l o y e d i n t h i s work f u l f i l l s s e v e r a l o f t h e s e i d e a l s , b u t n o t a l l . T h e u s e o f C A P P - S e p h a r o s e i s v e r y r a p i d a n d , f o r a s i n g l e c h r o m a t o -g r a p h i c s t e p , p r o d u c e s a s i m p l e p r o t e i n m i x t u r e . The method i t r e p l a c e s , t h a t o f Mani e t a l . ( 1 9 8 2 ) , r e q u i r e s two c h r o m a t o g r a p h i c s t e p s , a h e a t t r e a t m e n t , and a l y o p h i 1 i z a t i o n , a l l o f w h i c h t a k e s a t o t a l o f 5 - 7 d a y s . The C A P P - S e p h a r o s e c h r o m a t o g r a p h y r e q u i r e s a s i n g l e a f t e r n o o n t o r u n . The y i e l d s f r o m t h e t w o p r o c e d u r e s a r e r o u g h l y e q u i v a l e n t . P r o d u c i n g t h e S - 1 0 0 / c a l m o d u l i n m i x t u r e by t h e a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d i s t h e method o f c h o i c e , b e i n g b o t h r e l i a b l e and r a p i d . F r a c t i o n a t i n g t h e r e s u l t i n g m i x t u r e i n t o t h e S - 1 0 0 i s o p r o t e i n s i s a n o t h e r m a t t e r . I t i s t h e e x p e r i e n c e o f t h e a u t h o r t h a t n e i t h e r o f t h e c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d s e m p l o y e d i s s a t i s f a c t o r y . The h y d r o x y l a p a t i t e c h r o m a t o g r a p h y i s p a r t i c u l a r l y u n r e l i a b l e , w i t h s u c c e s s r a t e s o f a b o u t 1 i n 3 p r e p a r a t i o n s y i e l d i n g homogeneous S-lOOb, and a b o u t 1 i n 2 y i e l d i n g homogeneous c a l m o d u l i n . T h i s h y d r o x y l a p a t i t e m e t h o d has n o t been s u c c e s s f u l i n my h a n d s f o r t h e p r e p a r a t i o n o f homogeneous S-lOOa. The m a j o r d i s a d v a n t a g e o f t h e p h e n y l - S e p h a r o s e m e t h o d i s l o w y i e l d . From a p p r o x i m a t e l y 1 k g o f b o v i n e b r a i n , o n l y a f e w h u n d r e d m i c r o g r a m s o f S-lOOa w e r e a c q u i r e d , and a b o u t 1 mg o f S-lOOb. The o t h e r a l t e r n a t i v e , t h e e q u i l i b r i u m i o n e x c h a n g e m e t h o d o f I s o b e e t a l . ( 1 9 7 7 ) , p r o d u c e s t h e homogeneous S - 1 0 0 i s o t y p e s and c a l m o d u l i n b u t r e q u i r e s 3 weeks on t h e c o l u m n . The c o n s e q u e n c e s o f e x p o s i n g t h e s e p r o t e i n s t o s u c h a v i g o r o u s t r e a t m e n t h a s n o t b e e n e v a l u a t e d . T h u s , a l t h o u g h t h r e e a l t e r n a t i v e m e t h o d s a r e a v a i l a b l e , e a c h h a s i t s p r o b l e m s . The h i g h e f f i c i e n c y i o n e x c h a n g e and h y d r o x y l a p a t i t e HPLC c o l u m n s w h i c h h a v e r e c e n t l y become a v a i l a b l e may p r o v e p a r t i c u l a r l y v a l u a b l e i n t h i s a p p l i c a t i o n . I n t h e c o u r s e o f t h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d , no e v i d e n c e was o b t a i n e d t o s u p p o r t t h e e x i s t e n c e o f t h e S-lOOa1 (a 13) o r S - 1 0 0 a 0 (aa) p r o t e i n s d e s c r i b e d by o t h e r s ( s e e I n t r o d u c t i o n ) . The f a i l u r e t o o b s e r v e t h e s e a l t e r n a t e S - 1 0 0 i s o p r o t e i n s may be a r e f l e c t i o n o f t h e m i l d p u r i f i c a t i o n s c h e m e , o r c o u l d r e p r e s e n t i n s u f f i c i e n t r e s o l v i n g c a p a b i l i t i e s o f t h e e l e c t r o p h o r e t i c m e t h o d ( 2 0 % d i s c PAGE) i n t h e m a n n e r a p p l i e d i n t h i s s t u d y . U s i n g t h e m e t h o d s d e s c r i b e d i n t h i s w o r k , s u f f i c i e n t m a t e r i a l was o b t a i n e d f o r t h e p r o d u c t i o n o f an S-lOOb a n t i b o d y i n r a b b i t s . B o t h t h e i m m u n o b l o t as w e l l as t h e c o m p e t i t i v e E L I S A e x p e r i m e n t s i n d i c a t e t h a t t h i s a n t i b o d y i s r e a c t i v e t o t h e S-lOOb p r o t e i n . T h e i m m u n o b l o t e x p e r i m e n t a on c r u d e b r a i n h o m o g e n a t e s s u g g e s t t h a t t h e a n t i b o d y i s s p e c i f i c t o a 10 k d a l p o l y p e p t i d e , p r e s u m a b l y t h e S - 1 0 0 s u b u n i t . T h e i m m u n o b l o t and E L I S A e x p e r i m e n t s b o t h s e r v e t o g i v e e v i d e n c e t o t h e a p p a r e n t i n a c t i v i t y o f t h i s a n t i s e r u m t o c a l m o d u l i n , a l i k e l y c o n t a m i n a n t o f a n t i s e r a p r o d u c e d by s e v e r a l o t h e r i n v e s t i g a t o r s . The l e s s e r i m m u n o r e a c t i v i t y o f t h e S-lOOa (a3) p r o t e i n i n t h e c o m p e t i t i v e E L I S A s u g g e s t s t h a t t h e a n t i b o d y i s p r e d o m i n a t e l y , i f n o t e x c l u s i v e l y , o r i e n t e d t o t h e 3 - s u b u n i t o f S - 1 0 0 . T h e e x c l u s i v e r e a c t i v i t y o f t h i s a n t i b o d y t o t h e 3 - s u b u m ' t has n o t b e e n r i g o r o u s l y p r o v e n by t h e d a t a p r e s e n t e d h e r e i n . D e t e r m i n a t i o n o f t h e e x t e n t t o w h i c h t h e a n t i s e r u m w i l l r e a c t t o w a r d s t h e a - s u b u n i t w i l l r e q u i r e a m e t h o d o f a n a l y s i s w h i c h s e p a r a t e s t h e a a n d 3 s u b u n i t s b e f o r e i m m u n o a s s a y . A g e l e l e c t r o p h o r e t i c m e t h o d e x i s t s f o r t h i s s e p a r a t i o n , t h e S D S / u r e a - P A G E s y s t e m o r i g i n a t e d by Swanke and M u n k r e s ( 1 9 7 1 ) , b u t , a t t e m p t s t o a p p l y t h i s g e l s y s t e m t o t h e p r e s e n t p r o b l e m h a v e n o t p r o v e n s u c c e s s f u l due t o e x c e s s i v e band s p r e a d i n g d u r i n g t h e e l e c t r o p h o r e s i s . An a l t e r n a t e 47 s t r a t e g y was e m p l o y e d by I s o b e e t a l . ( 1 9 8 4 ) , n a m e l y , t h e u s e o f S - 1 0 0 a 0 a n d S-lOOb a f f i n i t y c o l u m n s . I n t h e E L I S A e x p e r i m e n t s , i t was o b s e r v e d t h a t t h e a n t i s e r u m i s n o t r e a c t i v e t o w a r d s S-lOOa p a s s i v e l y a d s o r b e d t o p o l y s t y r e n e . One h y p o t h e s i s t o e x p l a i n t h i s r e s u l t i s t h a t t h e S-lOOa was a d s o r b e d t o t h e s u r f a c e i n s u c h a manner as t o o c c l u d e t h e S-lOOa B - s u b u n i t , a p o s s i b i l i t y s u p p o r t e d by t h e o b s e r v a t i o n t h a t S-lOOa p o s s e s s e s h y d r o p h o b i c s u r f a c e p r o p e r t i e s d i s t i n c t f r o m t h o s e o f S-lOOb ( B a u d i e r & G e r a r d , 1 9 8 3 ) . I n o r d e r f o r t h e s e two p r o t e i n s t o d i s p l a y d i f f e r e n t s u r f a c e p r o p e r t i e s , t h e d i f f e r e n c e s must be a r e f l e c t i o n o f t h e S-lOOa a - s u b u n i t . An e x p l a n a t i o n f o r t h e p r e s e n t o b s e r v a t i o n w o u l d r e q u i r e t h e 3 - s u b u n i t o f S-lOOa t o be p r e f e r e n t i a l l y a d s o r b e d t o t h e p o l y s t y r e n e , t h u s e x p o s i n g o n l y t h e ( n o n - i m m u n o r e a c t i v e ) a - s u b u n i t . I n c o m p a r i s o n , S-lOOb ( B B ) c o u l d h a v e one B - s u b u n i t a d s o r b e d t o t h e p o l y s t y r e n e w h i l e s t i l l a l l o w i n g e x p o s u r e o f t h e o t h e r B - s u b u n i t . The d i v a l e n t c a t i o n e f f e c t s on S-lOOb i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e E L I S A a r e r a t h e r i n t e r e s t i n g . P r e v i o u s r e p o r t s h a v e i n d i c a t e d a s t r o n g e r e f f e c t o f C a + 2 on t h e i m m u n o c h e m i c a l r e a c t i o n ( S i n d i c e t a l . , 1 9 8 2 , M i l e s e t a l . , 1 9 7 7 ) , b u t h a v e r e p o r t e d a p a t t e r n q u a l i t a t i v l y s i m i l a r t o t h a t o b t a i n e d i n t h i s s e r i e s o f e x p e r i m e n t s . B o t h o f t h e s e a u t h o r s d e t e r m i n e d t h a t C a + 2 i n h i b i t s t h e i n t e r a c t i o n i n c o n c e n t r a t i o n s e x c e e d i n g 1 mM. The m a r k e d i n h i b i t i o n o f t h e i n t e r a c t i o n by Z n + 2 i s a n o v e l f i n d i n g . T h i s o b s e r v a t i o n must be i n t e r p r e t e d w i t h c a u t i o n due t o t h e n o n - s p e c i f i c e f f e c t s t h a t a r e a s s o c i a t e d w i t h Z n + 2 a t c o n c e n t r a t i o n s i n e x c e s s o f 1 mM, i . e . i t becomes a r e l a t i v e l y n o n - s p e c i f i c p r o t e i n p r e c i p i t a n t . T h i s n o n - s p e c i f i c e f f e c t i s p r o b a b l y n o t o f g r e a t c o n c e r n i n t h i s c a s e , s i n c e t h e i o n i s s i g n i f i c a n t l y ( -35%) i n h i b i t i n g t h e a n t i b o d y - a n t i g e n i n t e r a c t i o n a t 50 pM. I n t h e o n l y c a s e w h e r e a r e a s o n a b l y c o m p l e t e a n a l y s i s o f t h e Z n + 2 b i n d i n g t o an S - 1 0 0 p r o t e i n has been c a r r i e d o u t (human S-lOOb, B a u d i e r & G e r a r d , 1 9 8 4 ) , i t i s c l e a r t h a t t h e r e a r e s e v e r a l s i t e s w i t h v a r y i n g Z n + 2 b i n d i n g a f f i n i t i e s , r a n g i n g f r o m s u b - p M t o sub-mM l e v e l . I t i s n o t c l e a r how t h e i m m u n o c h e m i c a l l y d e f i n e d i n h i b i t o r y c o n c e n t r a t i o n o f Z n + 2 c a n be c o r r e l a t e d w i t h t h e a p p a r e n t a s s o c i a t i o n c o n s t a n t s . From t h e d a t a a v a i l a b l e on t h e S - 1 0 0 b / Z n + 2 i n t e r a c t i o n , i t i s a p p a r e n t t h a t m o s t o f t h e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s a r e e l i c i t e d by < 20 pM Z n + 2 . One c o u l d h y p o t h e s i z e t h a t c o m p l e t e Z n + 2 o c c u p a t i o n o f a l l a v a i l a b l e b i n d i n g s i t e s i s n e c e s s a r y t o p l a c e t h e p r o t e i n i n a c o n f o r m a t i o n a l s t a t e i n w h i c h t h e a n t i g e n i c s i t e ( s ) i s ( a r e ) m a s k e d . I n any c a s e , t h e Z n + 2 i n h i b i t i o n i s an i n t e r e s t i n g f i n d i n g , b u t n o t one r e a d i l y u n d e r s t o o d . I n c o n c l u s i o n , e v i d e n c e h a s b e e n p r e s e n t e d t h a t t h e u s e o f t h e S - 1 0 0 i s o t y p e s i s a v i a b l e a p p r o a c h f o r t h e p r o d u c t i o n o f an i s o t y p e s e l e c t i v e a n t i s e r u m . The d e f i n i t i o n o f t h e a n t i s e r u m as b e i n g a b s o l u t e l y s p e c i f i c t o t h e S - 1 0 0 3 - s u b u n i t w o u l d r e q u i r e f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n . The a n t i b o d y p r o d u c e d by t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d h e r e i n i s a p p a r e n t l y o f h i g h t i t r e , and i s c a p a b l e o f b e i n g u s e d i n t h e c o m p e t i t i v e E L I S A t o d e t e r m i n e S-lOOb i m m u n o r e a c t i v e m a t e r i a l i n t h e r a n g e o f 2 0 - 2 0 0 n g . W i t h s u i t a b l e m o d i f i c a t i o n t h e a n a l y t i c a l s e n s i t i v i t y o f t h e E L I S A c o u l d u n d o u b t e d l y be i n c r e a s e d . A t t h e p r e s e n t l e v e l o f s e n s i t i v i t y , t h e c o m p e t i t i v e E L I S A c o u l d be u s e d i n t h e a n a l y s i s o f b r a i n t i s s u e l e v e l s o f S-lOOb i m m u n o r e a c t i v i t y ( ~ 0 . 1 p g / m g t i s s u e ) . The s p e c i f i c i t y o f t h e a n t i s e r u m a p p e a r e d s u f f i c i e n t t o w a r r a n t i t s t r i a l as an i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m a r k e r f o r t h e c e l l u l d i s t r i b u t i o n o f S - l O O b i m m u n o r e a c t i v i t y i n b r a i n t i s s u e . 50 PART 2: IMMUNOHISTOCHEMICAL EXPERIMENTS WITH AN S - l O O b DERIVED ANTISERUM 51 W i t h r e s p e c t t o t h e f u n c t i o n a l a t t r i b u t e s o f S - 1 0 0 , t h e p a r t i c u l a r c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n w i t h i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m may be i n s t r u c t i v e . The i m m u n o h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f S - 1 0 0 i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m has been t h e s u b j e c t o f a v a s t and c o n t r o v e r s i a l l i t e r a t u r e ( a s d i s c u s s e d i n t h e I n t r o d u c t i o n t o t h i s t h e s i s ) . I n g e n e r a l , t h e m a j o r i t y o f s u p p o r t p r e f e r s an a s t r o g l i a l l o c a t i o n , h o w e v e r o t h e r s h a v e f a v o u r e d n e u r o n s (Hyden & R o n n b a c k , 1 9 7 5 , I s o b e e t a l . , 1 9 8 4 , L i n s e r & M o s c o n a , 1 9 8 1 , T a b u c h i & K i r s c h , 1 9 7 5 ) , o l i g o d e n d r o c y t e s ( T a b u c h i e t a l . , 1 9 8 3 , I s o b e e t a l . , 1 9 8 4 ) , a n d e p e n d y m a l c e l l s (de V i t r y e t a l . , 1 9 8 0 ) , u s u a l l y i n a d d i t i o n t o a s t r o c y t e s . As p r e v i o u s l y d i s c u s s e d , i t i s v e r y d i f f i c u l t t o c o m p a r e t h e s e e a r l i e r s t u d i e s b e c a u s e o f t h e numerous d i f f e r e n c e s i n t h e c h o i c e o f t h e s o u r c e and m e t h o d o f p u r i f i c a t i o n o f t h e a n t i g e n , a s w e l l as t h e s u b s e q u e n t a s s e s s m e n t o f i m m u n o c h e m i c a l and i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s p e c i f i c i t y . A l s o , i t w o u l d seem t h a t t h e r e p o r t s o f s p e c i e s v a r i a b i l i t y o f c o m p o s i t i o n o f t h e p r o t e i n s m e r i t c o n s i d e r a t i o n and r e s u l t s o b t a i n e d w i t h t i s s u e s f r o m v a r y i n g s p e c i e s may n o t be d i r e c t l y c o m p a r a b l e . R e c e n t r e s u l t s o b t a i n e d i n t h e r a t b r a i n h a v e s u g g e s t e d a s t r i c t l y a s t r o g l i a l l o c a l i z a t i o n o f S - 1 0 0 i m m u n o r e a c t i v i t y i n b o t h t h e c e r e b e l l u m ( G h a n d o u r e t a l . , 1 9 8 1 a ) and h i p p o c a m p u s (Haan e t a l . , 1 9 8 2 ) . I n c o n t r a s t , i n t h e human c e r e b r a l c o r t e x S - l O O b (33) i m m u n o r e a c t i v i t y has r e c e n t l y b e e n r e p o r t e d t o r e s i d e i n b o t h a s t r o c y t e s and o l i g o d e n d r o c y t e s ( I s o b e e t a l . , 1 9 8 4 ) . I n a d d i t i o n t o t h e a p p a r e n t s p e c i e s v a r i a t i o n , t h e r e may a l s o be r e g i o n a l d i f f e r e n c e s w i t h i n t h e n e r v o u s s y s t e m o f a g i v e n s p e c i e s , t h i s q u e s t i o n h a s n o t 52 been a p p r o a c h e d . I n l i g h t o f t h e i m p o r t a n c e o f d e t e r m i n i n g t h e c e l l u l a r s p e c i f i c i t y o f S - 1 0 0 t o t h e o r i e s o f i t s b i o l o g i c a l f u n c t i o n , an i m m u n o h i s t o -c h e m i c a l a n a l y s i s o f S - 1 0 0 d i s p o s i t i o n w i t h i n t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m i s j u s t i f i e d . I n t h i s w o r k , t h e l o c a l i z a t i o n o f S - l O O b i m m u n o r e a c t i v i t y has been e x a m i n e d by u s e o f t h e b o v i n e S - l O O b d e r i v e d a n t i s e r u m , p r e p a r e d as d e s c r i b e d i n t h e f i r s t p a r t o f t h i s t h e s i s . I n o r d e r t o a s s e s s a c c u r a t e l y t h e c e l l u l a r s p e c i f i c i t y o f S - l O O b i m m u n o r e a c t i v i t y t o t h e a s t r o c y t e , a c o m p a r a t i v e a n a l y s i s was u n d e r t a k e n . The l o c a l i z a t i o n o f S - l O O b i m m u n o r e a c t i v i t y was d e t e r m i n e d i n r e f e r e n c e t o t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e G l i a l F i b r i l l a r y A c i d i c p r o t e i n ( G F A P ) , a w i d e l y a c c e p t e d c e l l s p e c i f i c m a r k e r f o r a s t r o c y t e s ( B i g n a m i e t a l . , 1 9 8 0 , Eng & B i g b e e , 1 9 7 8 ) . T h e c o m p a r a t i v e a n a l y s i s was i n i t i a l l y c a r r i e d o u t w i t h i m m u n o p e r o x i d a s e s t a i n i n g o f a d j a c e n t s e r i a l s e c t i o n s , t h i s m e t h o d was s u b s e q u e n t l y r e p l a c e d by c o m b i n e d d o u b l e i m m u n o h i s t o f l u o r e s c e n t s t a i n i n g . The r a t b r a i n was c h o s e n t o a s s e s s t h e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s p e c i f i c i t y o f t h e S - l O O b a n t i s e r u m , b o t h f o r c o n v e n i e n c e o f t i s s u e p r e p a r a t i o n and i n c o n s i d e r a t i o n o f t h e r e l a t i v e s i m p l i c i t y o f r a t S - 1 0 0 c o m p o s i t i o n . EXPERIMENTAL PROCEDURES A n t i b o d i e s . T h e S - l O O b d e r i v e d a n t i s e r u m e m p l o y e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s i s t h a t d e s c r i b e d i n t h e f i r s t p a r t o f t h i s t h e s i s . The a n t i s e r u m p r e p a r a t i o n was o b t a i n e d f r o m r a b b i t H a t 5 d a y s f o l l o w i n g an a n t i g e n i c s t i m u l a t i o n . The s e r u m o b t a i n e d a t 1 2 - 1 6 d a y s f o l l o w i n g s u c h a s t i m u l a t i o n was f o u n d t o p e r f o r m p o o r l y i n i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y . The GFAP r a t m o n o c l o n a l a n t i b o d y e m p l o y e d i n t h i s s t u d y f o r t h e d o u b l e i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y has b e e n c h a r a c t e r i z e d and d e s c r i b e d r e c e n t l y ( L e e e t a l . , 1 9 8 4 ) ; t h e GFAP r a b b i t a n t i b o d y e m p l o y e d f o r t h e i m m u n o p e r o x i d a s e p r o c e d u r e was c o m m e r c i a l l y o b t a i n e d ( D a k o ) . T i s s u e P r e p a r a t i o n f o r I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y . S e v e r a l p e r f u s i o n f i x a t i o n m e t h o d s w e r e c o m p a r e d f o r t h e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g w i t h t h e S-lOOb d e r i v e d a n t i s e r u m ; t h e t w o m e t h o d s p r e f e r r e d f o r t h e i m m u n o p e r o x i d a s e and i m m u n o f 1 u o r e s c e n t h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n s o f S-lOOb i m m u n o r e a c t i v i t y a r e p r e s e n t e d b e l o w . F o r t h e i m m u n o p e r o x i d a s e l o c a l i z a t i o n o f S-lOOb i m m u n o r e a c t i v i t y , m a l e W i s t a r r a t s w e i g h i n g 1 7 5 - 2 0 0 g w e r e a n e s t h e t i z e d w i t h p e n t o b a r b i t a l and p a c k e d i n i c e . The r a t ' s u p p e r body was p e r f u s e d t r a n s c a r d i a l l y w i t h 150 ml o f c o l d PBS ( p H = 7 . 4 ) o v e r 10 m i n u t e s , f o l l o w e d by 250 ml o f t h e c o l d p r i m a r y f i x a t i v e c o m p o s e d o f 4% p a r a f o r m a l d e h y d e ( w / v ) , 0 . 2 5 % g l u t a r a l d e h y d e ( v / v ) i n PBS o v e r a p e r i o d o f 30 m i n u t e s . T h e b r a i n was c a r e f u l l y r e m o v e d , c u t i n t o 3 p i e c e s , and p o s t f i x e d i n 4% p a r a f o r m a l d e h y d e a t 4 ° C f o r 3 - 6 h o u r s . The f i x e d b r a i n p i e c e s w e r e w a s h e d t w i c e i n s m a l l v o l u m e s o f 15% s u c r o s e (w/v) i n P B S , t h e n l e f t i n a l a r g e v o l u m e o f t h e same b u f f e r a t 4 ° C f o r a t l e a s t 36 h r s . I n d i v i d u a l b r a i n p i e c e s w e r e r a p i d l y f r o z e n and s e c t i o n e d on a c r y o s t a t a t 14 um t h i c k n e s s , c o l l e c t e d i n c o l d 0 . 1 % T X / P B S , and l e f t i n t h e same s o l u t i o n o v e r n i g h t a t 4 ° C . F o r t h e i m m u n o f 1 u o r e s c e n t e x p e r i m e n t s a s i m i l a r p e r f u s i o n p r o t o c o l was e m p l o y e d , m o d i f i e d by o m i t t i n g t h e g l u t a r a l d e h y d e f r o m t h e p r i m a r y f i x a t i v e , w h i l e e x t e n d i n g 54 t h e p o s t f i x a t i o n t o 6 - 1 2 h o u r s . I m m u n o h i s t o c h e m i c a l M e t h o d s . F o r t h e d o u b l e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l e x p e r i m e n t s , a m i x t u r e o f S-lOOb a n t i s e r u m d i l u t e d 1 / 6 0 and a n t i - G F A P h y b r i d o m a c u l t u r e medium d i l u t e d  1/LLQ, t ) o t n ^ n n o r m a l 9 ° a t s e r u m / 0 . 1 % TX/PBS ( N G S / T X / P B S ) , was p r e p a r e d . T h e s e c t i o n s w e r e i n c u b a t e d i n t h e a n t i s e r a m i x t u r e o v e r n i g h t a t 4 ° C , t h e n w a s h e d t w i c e f o r 20 m i n u t e s i n NGS/TX/PBS and t r a n s f e r r e d t o a Vi+o d i l u t i o n o f anti-S-lOOb c o n t a i n i n g a 1 / 2 5 d i l u t i o n o f a n t i - G F A P , b o t h i n N G S / T X / P B S , f o r 90 m i n u t e s a t room t e m p e r a t u r e . S u b s e q u e n t l y , t h e s e c t i o n s w e r e w a s h e d t h r e e t i m e s f o r 5 m i n u t e s e a c h i n N G S / T X / P B S , a n d t h e n i n c u b a t e d i n t h e s e c o n d a r y a n t i s e r a s o l u t i o n o f G o a t A n t i r a t IgG c o n j u g a t e d t o f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e ( F I T C ) and G o a t A n t i r a b b i t IgG R h o d a m i n e c o n j u g a t e , b o t h d i l u t e d l / k Q i n N G S / T X / P B S , f o r 40 m i n u t e s a t room t e m p e r a t u r e . The s e c t i o n s w e r e w a s h e d w i t h t w o c h a n g e s o f T X / P B S f o r 10 m i n u t e s , o n c e i n PBS f o r 5 m i n u t e s , and m o u n t e d on c h r o m - a l u m s u b b e d s l i d e s . The d r i e d s e c t i o n s w e r e c o v e r s l i p p e d w i t h a m o d i f i e d f l u o r e s c e n t m o u n t i n g medium ( J o h n s o n & de N o g n e i r e A r a n g o , 1981) w h i c h a p p r e c i a b l y s t a b i l i z e d t h e FITC f l u o r e s c e n c e o v e r t h e c o u r s e o f t h e d o u b l e e x p o s u r e s e m p l o y e d f o r p h o t o m i c r o s c o p y . The i m m u n o p e r o x i d a s e h i s t o c h e m i c a l p r o t o c o l was c a r r i e d o u t on a d j a c e n t s e r i a l s e c t i o n s . The p r i m a r y a n t i s e r u m s o l u t i o n s w e r e made up a t 1 / 7 5 0 d i l u t i o n o f S-lOOb a n t i s e r u m , o r 1 / 1 2 5 0 r a b b i t a n t i - G F A P a n t i s e r u m , b o t h i n N G S / T X / P B S . The p r i m a r y a n t i b o d y i n c u b a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a t 4 ° C f o r 3 6 - 4 8 h o u r s . A f t e r i n c u b a t i o n i n t h e p r i m a r y a n t i s e r u m , t h e s e c t i o n s w e r e w a s h e d t h r e e t i m e s f o r 20 m i n u t e s a t 4 ° C , 55 t h e n o n c e f o r 10 m i n u t e s a t room t e m p e r a t u r e i n N G S / T X / T r i s - H C l b u f f e r e d s a l i n e ( p H = 7 . 6 ) . The s e c t i o n s w e r e t r a n s f e r r e d t o a b i o t i n y l a t e d G o a t A n t i r a b b i t s e c o n d a r y a n t i b o d y ( i n T B S ) , and p r o c e s s e d f o r t h e r e m a i n d e r o f t h e A v i d i n - B i o t i n P e r o x i d a s e C o m p l e x (ABC) p r o t o c o l as d e s c r i b e d by t h e m a n u f a c t u r e r o f t h e k i t ( V e c t o r ) . F o r t h e h i s t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f t h e p e r o x i d a s e , t h e s e c t i o n s w e r e t r a n s f e r r e d t o a s o l u t i o n o f 50mM T r i s - H C l / 2 0 mM i m i d a z o l e / 0 . 2 5 mg/ml d i a m i n o b e n z i d i n e / 0 . 0 0 7 5 % H 2 0 2 ( p H = 7 . 4 ) , and a l l o w e d t o r e a c t f o r 20 m i n u t e s i n t h e d a r k . A f t e r t h e s e c t i o n s w e r e w a s h e d e x t e n s i v e l y i n T r i s - H C l ( p H = 7 . 4 ) , t h e y w e r e m o u n t e d on c h r o m - a l u m s u b b e d s l i d e s and a l l o w e d t o d r y . They w e r e t h e n d e h y d r a t e d i n g r a d e d a l c o h o l s , c l e a r e d w i t h x y l e n e and c o v e r s l i p p e d w i t h P e r m o u n t ( F i s h e r ) . The m i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t on an O l y m p u s BH m i c r o s c o p e e q u i p p e d f o r e p i f l u o r e s c e n c e o r on a L e i t z D i a l u x m i c r o s c o p e e q u i p e d w i t h N o m a r s k y i n t e r f e r e n c e p h a s e c o n t r a s t o p t i c s . B l a c k and w h i t e p h o t o g r a p h y e m p l o y e d Kodak T e c h n i c a l Pan f i l m (ASA 2 5 - 2 0 0 ) . P h o t o g r a p h y o f t h e d o u b l e i m m u n o f l u o r e s c e n c e was c a r r i e d o u t w i t h b o t h b l a c k and w h i t e as w e l l as c o l o u r f i l m ( F u j i c h r o m e ASA 4 0 0 , p u s h e d t o 8 0 0 ) . The p r o c e d u r e f o r t h e d o u b l e i m m u n o f l u o r e s c e n c e was t o p h o t o g r a p h s e q u e n t i a l l y t h e same f i e l d w i t h e x c i t a t i o n f i r s t f o r F I T C , t h e n f o r R h o d a m i n e . T h e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l c o n t r o l s f o r t h e S - l O O b a n t i s e r u m i n c l u d e d i n c u b a t i o n o f t h e s e c t i o n s i n R a b b i t H p r e - i m m u n e s e r u m o r i n an a n t i s e r u m s o l u t i o n w h i c h was t r e a t e d by t h e a d d i t i o n o f t h e p u r i f i e d S - l O O b p r o t e i n ( 1 , 5 , o r 10 yg/mL) f o r 1 h o u r b e f o r e i n c u b a t i o n w i t h t h e t i s s u e s e c t i o n s . RESULTS I m m u n o h i s t o c h e m i c a l S p e c i f i c i t y o f t h e S-lOOb A n t i s e r u m . I n c u b a t i o n o f t h e t i s s u e s e c t i o n s i n t h e p r e - i m m u n e s e r u m r e s u l t e d i n t h e a b s e n c e o f s p e c i f i c i m m u n o s t a i n i n g when e i t h e r t h e p e r o x i d a s e o r FITC d e t e c t i o n m e t h o d was e m p l o y e d . I n c o n t r a s t , s p e c i f i c c e l l u l a r c o m p o n e n t s w e r e i m m u n o l a b e l l e d by t h e S-lOOb a n t i s e r u m ( s e e b e l o w ) . A d d i t i o n o f t h e p u r i f i e d S-lOOb p r o t e i n t o t h e p r i m a r y a n t i s e r u m m i x t u r e r e s u l t e d i n a c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t i n h i b i t i o n o f t h e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l r e a c t i o n . T h e a d d i t i o n o f lug / m l o f S-lOOb was o n l y m o d e r a t e l y e f f e c t i v e i n i n h i b i t i n g s p e c i f i c r e a c t i o n p r o d u c t i n t h e t i s s u e , w h e r e a s lOug / m l e n t i r e l y removed any s p e c i f i c s t a i n i n g . A t 5ug/ml S-lOOb a d d i t i o n t o t h e a n t i s e r u m s o l u t i o n , o n l y t h e Bergman g l i a l f i b r e s o f t h e c e r e b e l l u m showed s p e c i f i c , b u t v e r y w e a k , i m m u n o s t a i n i n g . I n a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u s r e p o r t s , t h e q u a l i t y o f t h e i m m u n o s t a i n i n g w i t h t h e S-lOOb a n t i b o d y was o b s e r v e d t o be d e p e n d e n t on t h e f i x a t i o n o f t h e t i s s u e . P o o r l y f i x e d t i s s u e was o b s e r v e d t o e x h i b i t a d i f f u s e s t a i n i n g p a t t e r n ; c o n v e r s e l y , t h e b e s t r e s o l u t i o n was o b t a i n e d i n s u p e r f i c i a l r e g i o n s o f t h e c e r e b e l l a r and c e r e b r a l c o r t i c e s , i n w h i c h t h e b e s t f i x a t i v e p e n e t r a t i o n w o u l d be e x p e c t e d . C o m p a r i s o n o f t h e S-lOOb and GFAP I m m u n o h i s t o c h e m i s t r i e s . When t h e p a t t e r n o f t i s s u e o f S-lOOb i m m u n o r e a c t i v i t y was c o m p a r e d t o t h a t f o r GFAP by an i m m u n o p e r o x i d a s e m e t h o d , a s t r i k i n g c o r r e s p o n d e n c e o f t h e t w o was a p p a r e n t i n t e r m s o f t h e d i s t r i b u t i o n and r e l a t i v e number o f c e l l s . I n o r d e r t o e x a m i n e f u r t h e r t h e p o s s i b l e c o - l o c a l i z a t i o n o f 57 t h e s e two a n t i g e n s , a d o u b l e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d was e m p l o y e d . I n t h e s e c t i o n s t r e a t e d f o r t h e d o u b l e l a b e l l i n g , i t was a p p a r e n t t h a t c e l l s l a b e l l e d f o r GFAP w e r e a l s o S-lOOb i m m u n o r e a c t i v e . T h e i m m u n o f l u o r e s c e n t l a b e l l i n g o f i d e n t i c a l c e l l s i s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 1 0 , d e m o n s t r a t i n g t h e r e d R h o d a m i n e f l u o r e s c e n c e (S-lOOb) and g r e e n FITC f l u o r e s c e n c e (GFAP) c o e x i s t i n g i n t h e same c e l l s w i t h i n t h e . g r a n u l e c e l l l a y e r o f t h e c e r e b e l l u m . T h e s e c e l l s d i s p l a y t y p i c a l a s t r o c y t i c m o r p h o l o g y . N o t e t h a t i n F i g u r e 10 t h o s e r e g i o n s o f t h e c e l l s w h i c h h a v e s t r o n g i m m u n o s t a i n i n g f o r b o t h a n t i g e n s d i s p l a y a y e l l o w c o l o u r due t o t h e m i x i n g o f r e d and g r e e n f l u o r e s c e n c e . The c o n t r o l f o r t h e d o u b l e i m m u n o f l u o r e s c e n c e h i s t o c h e m i s t r y was c a r r i e d o u t by t h e o m i s s i o n o f e i t h e r a n t i b o d y f r o m t h e p r i m a r y a n t i b o d y m i x t u r e , f o l l o w e d by e x a m i n a t i o n o f t h e t i s s u e u n d e r t h e c o n d i t i o n s f o r t h e v i s u a l i z a t i o n o f t h a t a n t i b o d y , i e . , d e l e t i o n o f t h e S-lOOb a n t i s e r u m f r o m t h e p r i m a r y i n c u b a t i o n , f o l l o w e d by e x a m i n a t i o n o f t h e s e c t i o n s w i t h t h e R h o d a m i n e o p t i c s . E x a m i n a t i o n o f t h e s e c t i o n u n d e r t h e s e c o n t r o l c o n d i t i o n s c o n f i r m e d t h a t t h e r e was no o b s e r v a b l e c r o s s o v e r o f t h e i m m u n o l a b e l l i n g o f c e l l s by t h e d o u b l e i m m u n o f l u o r e s c e n c e h i s t o c h e m i s t r y . The d o u b l e i m m u n o f l u o r e s c e n t h i s t o c h e m i c a l m e t h o d was a p p l i e d t o v a r i o u s r e g i o n s o f t h e r a t b r a i n . I t was o b s e r v e d t h a t a l l c e l l s e x h i b i t i n g GFAP i m m u n o r e a c t i v i t y a l s o d i s p l a y e d S-lOOb i m m u n o r e a c t i v i t y . The c o n v e r s e was a l s o t r u e ; t h a t i s , t h a t a l l c e l l s e x h i b i t i n g S-lOOb i m m u n o r e a c t i v i t y w e r e a l s o GFAP i m m u n o r e a c t i v e . F i g u r e 11 i l l u s t r a t e s t h e r e s u l t s o f t h e d o u b l e i m m u n o f l u o r e s c e n t h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g o f t h e same c e l l s i n s e v e r a l r e p r e s e n t a t i v e F i g u r e 1 0 . ( O v e r ) A p h o t o m i c r o g r a p h o f t h e d o u b l e i m m u n o f 1 u o r e s c e n t l a b e l l i n g o f a s t r o c y t e s o f t h e g r a n u l e c e l l l a y e r o f t h e r a t c e r e b e l l u m . The r e d f l u o r e s c e n c e i n d i c a t e s t h e p r e s e n c e o f S - 1 0 0 b - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y , t h e g r e e n f l u o r e s c e n c e i s p r e s e n t a t t h e s i t e o f G F A P - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y . N o t e t h a t t h e c o l o c a l i z a t i o n o f t h e s e t w o f l u o r e s c e n c e s i g n a l s w i l l l e a d t o t h e a p p a r e n t y e l l o w c o l o u r . S e v e r a l a s t r o c y t e s a r e p r e s e n t i n t h i s f i e l d w i t h i n t e n s e r e d l a b e l l i n g o f t h e c e l l b o d i e s ( S - l O O b ) , and y e l l o w l a b e l l i n g (GFAP + S - l O O b ) i n t h e p r o c e s s e s . M a g n i f i c a t i o n , a p p r o x i m a t e l y 1 2 0 0 X . F i g u r e 1 1 . ( O v e r ) P h o t o m i c r o g r a p h s o f t h e f r o n t o - p a r i e t a l c o r t e x ( a , b ) , h i p p o c a m p u s ( c , d ) , c o r p u s c a l l o s u m ( e , f ) , and v e n t r a l m e s e n c e p h a l o n a t t h e l e v e l o f t h e s u b s t a n t i a n i g r a ( g , h ) , f o l l o w i n g d o u b l e i m m u n o f l u o r e s c e n t s t a i n i n g f o r S-lOOb a n d G F A P . The same s e c t i o n was p h o t o g r a p h e d by s e l e c t i n g t h e a p p r o p r i a t e f i l t e r s y s t e m f o r t h e i m m u n o f l u o r e s c e n c e s o f S-lOOb ( R h o d a m i n e o p t i c s ; a , c , e , g ) o r GFAP (FITC o p t i c s ; b , d , f , h ) . A c o m p a r i s o n o f t h e two s e t s o f p h o t o g r a p h s i n d i c a t e s t h e c o r r e s p o n d e n c e o f S-lOOb and GFAP i m m u n o r e a c t i v e c e l l s s h a r i n g t h e same d i s t r i b u t i o n p a t t e r n and s i m i l a r m o r p h o l o g y . S u c h a h i g h c o r r e s p o n d e n c e i n r e g a r d s t o t h e m o r p h o l o g y o f t h e c e l l s s t a i n e d i s a l s o o b s e r v e d i n t h e c o r p u s c a l l o s u m ( C C , F i g . l l e , f ) and c e r e b r a l p e d u n c l e s ( P C , F i g . l l g , h ) . N o t e t h e p o s i t i v e s t a i n i n g o f a s t r o c y t e s a t t h e b a s a l s u r f a c e o f t h e m i d b r a i n by t h e S-lOOb i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y ( a r r o w , F i g . llg). T h e s e c e l l b o d i e s c a n n o t be r e s o l v e d by t h e GFAP i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y , due t o t h e d e n s e f i b r i l l a r y i m m u n o r e a c t i v i t y o f t h e r e g i o n ( F i g . llh). The o r i e n t a t i o n o f t h e h i p p o c a m p a l and m e s e n c e p h a l i c s e c t i o n s ( F i g . l l c , d , g , h ) a r e r e p r e s e n t e d i n t h e t o p r i g h t h a n d c o r n e r s ; t h e b o l d a r r o w h e a d i n d i c a t e s m e d i a l d i r e c t i o n and t h e s m a l l a r r o w t h e d o r s a l a s p e c t . A b b r e v i a t i o n s : C C , c o r p u s c a l l o s u m ; G L , g r a n u l a r l a y e r ; M L , m o l e c u l a r l a y e r ; P C , c e r e b r a l p e d u n c l e ; P L , p o l y m o r p h o n u c l e a r l a y e r ; SNR, s u b s t a n t i a n i g r a p a r s r e t i c u l a t a . The s c a l e o f t h e s e p h o t o m i c r o g r a p h s a r e a l l i d e n t i c a l ; t h e c a l i b r a t i o n b a r r e p r e s e n t s 50 um. 62 r e g i o n s o f t h e r a t b r a i n , i n c l u d i n g ; c e r e b r a l c o r t e x , h i p p o c a m p u s , c o r p u s c o l l o s u m , and t h e v e n t r a l s u r f a c e and a s s o c i a t e d s t r u c t u r e s o f t h e m i d b r a i n . A c l o s e e x a m i n a t i o n o f t h e p h o t o m i c r o g r a p h s i n F i g u r e 11 r e v e a l s s e v e r a l d i f f e r e n c e s i n t h e s t a i n i n g c h a r a c t e r i s t i c s o f e a c h a n t i s e r a . The d i f f e r e n c e i n t h e a p p e a r a n c e o f t h e s e c e l l s s e e m i n g l y a r i s e s f r o m a d i f f e r e n c e i n t h e c e l l u l a r c o m p o n e n t s i n w h i c h e a c h a n t i g e n i s c o n c e n t r a t e d . B o t h F i g u r e llg , h and F i g u r e 12 d r a m a t i c a l l y i l l u s t r a t e t h i s p o i n t . F o r e x a m p l e , i n F i g u r e llg t h e r e a r e s t r o n g l y f l u o r e s c e n t S-lOOb l a b e l l e d c e l l b o d i e s a d j a c e n t t o t h e b a s a l s u r f a c e o f t h e b r a i n , w h e r e a s t h e c o r r e s p o n d i n g GFAP i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y o f F i g u r e llh d e t e r m i n e s a d e n s e f i b r i l l a r y n e t w o r k i n w h i c h no i n d i v i d u a l c e l l s a r e r e s o l v e d . The d i f f e r e n t i a l d i s t r i b u t i o n o f t h e i m m u n o r e a c t i v i t i e s i s a l s o r e a d i l y a p p a r e n t i n F i g u r e 1 2 , i l l u s t r a t i n g l a b e l l e d c e l l s i n t h e s t r i a t u m and c e r e b e l l a r c o r t e x . I n t h e s t r i a t a l c e l l s S-lOOb i m m u n o r e a c t i v i t y i s a p p e a r s f a i r l y h o m o g e n e o u s l y t h r o u g h o u t t h e c e l l s , i n c l u d i n g t h e f i n e p r o c e s s e s ( a r r o w s , F i g u r e 1 2 a ) . By c o m p a r i s o n , t h e r e i s l i t t l e GFAP i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e c o r r e s p o n d i n g c e l l b o d i e s ( F i g u r e 1 2 b ) . The c e r e b e l l a r Bergman g l i a l c e l l s show i n t e n s e GFAP i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e a p i c a l p r o j e c t i o n s , h o w e v e r t h e c e l l b o d i e s a g a i n c a n n o t be d e t e r m i n e d ( F i g u r e 1 2 d ) . H o w e v e r , t h e s e c e l l b o d i e s a r e r e a d i l y a p p a r e n t u n d e r t h e c o n d i t i o n s e m p l o y e d f o r v i s u a l i z a t i o n o f t h e S-lOOb i m m u n o r e a c t i v i t y ( F i g u r e 1 2 c ) . T h i s p a t t e r n o f d i f f e r e n t i a l s t a i n i n g i s a l s o a p p a r e n t i n t h e c o l o u r p h o t o m i c r o g r a p h ( F i g u r e 1 0 ) . A l t h o u g h t h e d o u b l e i m m u n o h i s t o f l u o r e s c e n t m e t h o d a l l o w e d t h e r e a d y d e t e r m i n a t i o n o f t h e GFAP/S-lOOb c o - l o c a l i z a t i o n i n most b r a i n 63 F i g u r e 1 2 . (Over) Photomicrographs of a s t r o c y t e s l a b e l l e d by t h e double immunofluorescent p r o c e d u r e i n t h e r a t s t r i a t u m ( a , b ) and c e r e b e l l u m ( e , d ) . The p a i r s of p h o t o m i c r o g r a p h s ( e . g . F i g . 12a and F i g . 12b) r e p r e s e n t t h e i m m u n o l a b e l 1 i n g of s t r i a t a l c e l l s by t h e a n t i s e r u m t o S-lOOb (rhodamine) and GFAP ( F I T C ) , r e s p e c t i v e l y . The S-lOOb i m m u n o r e a c t i v i t y i s observed i n t h e p e r i k a r y a and f i n e p r o c e s s e s ( a r r o w , F i g . 1 2 a ) ; by comparison GFAP i m m u n o r e a c t i v i t y i s l o c a l i z e d p r e d o m i n a n t l y i n t h e p r o c e s s e s of a s t r o c y t e s ( F i g . 1 2 b ) . In t h e c e r e b e l l u m , t h e S-lOOb i m m u n o r e a c t i v i t y o c c u r s i n t h e Bergman g l i a l f i b e r s t r a n s v e r s i n g t h e m o l e c u l a r l a y e r (ML). The c e l l b o d i e s of t h e G o l g i e p i t h e l i a l c e l l s , from which t h e s e f i b e r s o r i g i n a t e , a r e f o r t h e most p a r t a l i g n e d at t h e P u r k i n j e c e l l l a y e r (P) and a l s o e x h i b i t S-lOOb i m m u n o r e a c t i v i t y ( F i g . 1 2 c , a r r o w ) . In c o n t r a s t , no apparent GFAP i m m u n o r e a c t i v i t y was observed w i t h i n t h e s e c e l l bodies ( F i g . 1 2 d , a r r o w ) , a l t h o u g h t h e a p i c a l p r o c e s s e s a r e s t r o n g l y l a b e l l e d . A b b r e v i a t i o n s : GL, g r a n u l a r l a y e r ; ML, m o l e c u l a r l a y e r ; P , p u r k i n j e c e l l l a y e r . In both p h o t o m i c r o g r a p h s t h e c a l i b r a t i o n bar r e p r e s e n t s 10 um. 65 regions, certain circumventricular regions were more problematic. For r d the analysis of the 3 ventricle and associated structures, i t was found necessary to use both the double immunofluorescence and ser i a l immunoperoxidase histochemical methods. By the double immunofluorescence staining, fine f i b r i l l a r y processes coursing through the arcuate nucleus were observed to display both GFAP and S-lOOb immunoreactivities (Figure 13). Moderate S-lOOb and weak GFAP immunoreactivites were also apparent in c e l l bodies present in the regions surrounding the ven t r i c l e . Some of these c e l l s appeared to be typical astrocytes, displaying the same morphological appearance and d i f f e r e n t i a l GFAP/S-lOOb staining pattern observed in other brain regions, whereas others were observed to bear long bipolar processes oriented in an arciform orientation, ventrolaterally to the basal surface of the diencephalon and dorsomedially to the ventricular surface (arrow, Figure 13). The orientation of these processes pa r a l l e l s that of the larger number of processes, many of which appeared to have one end within, or subjacent to, the ependymal layer. The other ends of the ependymal processes progressed varying distances towards the basal surface. The intense, diffuse, S-lOOb immunofluorescent staining of the ventricular surface did not allow evaluation of the individual c e l l bodies connected to these long processes, or of th e i r positioning with respect to the ventricular surface. When the hypothalamic ventricular region was examined by immunoperoxidase staining of s e r i a l sections, a clearer impression of the c e l l u l a r elements resulted. In Figure 14 the fine f i b r i l l a r y 66 F i g u r e 1 3 . ( O v e r ) P h o t o m i c r o g r a p h s o f t h e d o u b l e i m m u n o f l u o r e s c e n t l a b e l l i n g o f c e l l s o f t h e v e n t r a l h y p o t h a l a m u s . The p h o t o m i c r o g r a p h s i l l u s t r a t e t h e l o c a l i z a t i o n o f S - l O O b i m m u n o r e a c t i v i t y ( F i g . 13a) and GFAP i m m u n o r e a c t i v i t y ( F i g . 1 3 b ) . The c o r r e s p o n d e n c e o f t h e i m m u n o r e a c t i v e c e l l s i s a p p a r e n t by a c o m p a r i s o n o f t h e t w o m i c r o g r a p h s . The a r r o w s i d e n t i f y a c e l l w i t h a p r o m i n a n t l y S - l O O b i m m u n o r e a c t i v e p e r i k a r y o n , p o s s e s s i n g b i p o l a r p r o c e s s e s t h a t t r a v e l t o w a r d s t h e v e n t r i c u l a r s u r f a c e a t one e x t e n t , and t h e b a s a l s u r f a c e o f t h e h y p o t h a l a m u s a t t h e o t h e r . I n t e n s e l y S - l O O b i m m u n o r e a c t i v e e l e m e n t s a r e p r e s e n t a t t h e v e n t r i c u l a r s u r f a c e . The o r i e n t a t i o n o f t h e s e c t i o n i s i n d i c a t e d i n t h e b o t t o m l e f t h a n d c o r n e r o f F i g . 1 3 a ; t h e b o l d a r r o w h e a d p o i n t s m e d i a l l y , t h e s m a l l a r r o w d o r s a l l y . A b b r e v i a t i o n s : V I I I , t h i r d v e n t r i c l e . F i g u r e 1 4 . ( O v e r ) P h o t o m i c r o g r a p h s o f i m m u n o p e r o x i d a s e s t a i n i n g f o r S - l O O b ( F i g . 1 4 a ) and GFAP ( F i g . 1 4 b ) , c a r r i e d o u t on s e r i a l s e c t i o n s i n t h e v e n t r a l h y p o t h a l a m u s . I n F i g . 14a i n t e n s e l y S - l O O b i m m u n o -r e a c t i ve a s t r o c y t e s a r e o b s e r v e d i n t h e h y p o t h a l a m u s and a d j a c e n t t o t h e v e n t r i c u l a r s u r f a c e . The a r e a l i m i t e d by t h e b r o k e n l i n e s i n F i g . 14a i s shown a t h i g h e r m a g n i f i c a t i o n i n t h e l o w e r p a n e l . A t h i g h e r m a g n i f i c a t i o n , t h e p e r i k a r y a o f t h e s e S - l O O b i m m u n o r e a c t i v e c e l l s c a n be o b s e r v e d t o be c o n t i n u o u s w i t h t h e v e n t r i c u l a r s u r f a c e ( F i g . 1 4 a , l o w e r p a n e l , a s t e n ' k ) , and t o r e s i d e n e x t t o u n l a b e l l e d c e l l s . P r o c e s s e s o f t h e s e e p e n d y m a l c e l l s a r e o n l y l i g h t l y S - l O O b i m m i m o r e a c t i v e , i n c o m p a r i s o n t o t h e i n t e n s e GFAP i m m u n o r e a c t i o n , i l l u s t r a t e d i n F i g . 1 4 b . A b b r e v i a t i o n s : M E , m e d i a n e m i n a n c e ; V I I I , t h i r d v e n t r i c l e . The c a l i b r a t i o n b a r s a r e i n u n i t s o f pm. 69 70 s t r u c t u r e s w e r e a g a i n i n t e n s e l y s t a i n e d f o r G F A P , b u t showed o n l y weak S - l O O b i m m u n o r e a c t i v i t y ( c o m p a r e F i g u r e 1 4 a , b ) . V e r y i n t e n s e GFAP i m m u n o s t a i n i n g was a p p a r e n t i n t h e m e d i a n e m i n a n c e , w h e r e a s o n l y a f e w S - l O O b l a b e l l e d c e l l s w e r e o b s e r v e d . A t t h e v e n t r i c u l a r s u r f a c e i t was p o s s i b l e t o d i s t i n g u i s h i n d i v i d u a l S - l O O b i m m u n o r e a c t i v e c e l l s a p p e a r i n g t o f o r m p a r t o f t h e s u r f a c e s t r u c t u r e ( F i g u r e 1 4 b , i n s e t ) . T h e S - l O O b l a b e l l e d c e l l s w e r e o f t e n o b s e r v e d t o r e s i d e n e x t t o c e l l s n o t e x h i b i t i n g any d e t e c t a b l e i m m u n o r e a c t i v i t y , p r e s u m a b l y r e p r e s e n t i n g t h e common e p e n d y m a l c e l l s . M a n y , b u t n o t a l l , o f t h e S - l O O b i m m u n o r e a c t i v e c e l l s w e r e a l s o n o t e d t o h a v e d i s c e r n a b l e p e r i p h e r a l p r o c e s s e s , some o f w h i c h w e n t a v a r y i n g d i s t a n c e i n t o t h e h y p o t h a l a m i c n e u r o p i l e t o end on b l o o d v e s s e l s w h i l e o t h e r s a p p e a r e d t o t e r m i n a t e a b r u p t l y , o r t a k e a more s u p e r f i c i a l c o u r s e c o n t i n u o u s w i t h t h e s u b e p e n d y m a l l a y e r . By. c o m p a r i s o n o f t h e r e l a t i v e number and p o s i t i o n i n g o f G F A P + e l e m e n t s i n t h e s e r i a l s e c t i o n , and i n c o n s i d e r a t i o n t h a t t h e s e f i b r e s a r e S - 1 0 0 b + (by i m m u n o f l u o r e s c e n c e s t a i n i n g ) , i t i s c l e a r t h a t t h e m a j o r i t y , i f n o t a l l , o f t h e S - l O O b i m m u n o r e a c t i v e c e l l b o d i e s a t t h e v e n t r i c u l a r s u r f a c e c o r r e s p o n d t o c e l l s b e a r i n g GFAP i m m u n o r e a c t i v e p r o c e s s e s . DISCUSSION The r e s u l t s o f t h e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l e x p e r i m e n t s u n d e r t a k e n w i t h t h e S - l O O b d e r i v e d a n t i s e r u m a l l o w t h e c o n c l u s i o n t h a t S - l O O b i m m u n o r e a c t i v i t y i s r e s t r i c t e d t o a s t r o c y t e s ( a n d r e l a t e d e p e n d y m a l c e l l t y p e s ) w i t h i n t h e a d u l t r a t b r a i n . T h i s c o n c l u s i o n r e s t s on t h e c o l o c a l i z a t i o n o f S-lOOb and GFAP i m m u n o r e a c t i v i t i e s w i t h i n t h i s t i s s u e . I t was o b s e r v e d t h a t t h e i m m u n o l a b e l l i n g c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e S-lOOb and GFAP i m m u n o h i s t o c h e m i s t r i e s f o r a g i v e n c e l l s a r e d i f f e r e n t . T h i s i s a r e f l e c t i o n o f t h e d i f f e r e n c e i n t h e s u b c e l l u l a r c o m p o n e n t s w i t h i n w h i c h t h e s e t w o a n t i g e n s a r e r e s i d e n t . GFAP h a s b e e n d e t e r m i n e d t o be t h e m a j o r c o m p o n e n t o f a s t r o c y t e i n t e r m e d i a t e f i l a m e n t s and i s t h e r e f o r e i n s o l u b i l i z e d i n m a t u r e a s t r o c y t e s ( R a s m u s s e n e t a l . , 1 9 8 1 , T r i m m e r e t a l . , 1 9 8 2 ) , w h e r e a s S-lOOb i s a h i g h l y s o l u b l e p r o t e i n . A p r e v i o u s i m m u n o - e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a n a l y s i s o f r a t S - 1 0 0 d i s t r i b u t i o n has s u g g e s t e d i t s c y t o s o l i c l o c a l i z a t i o n ( L e g r a n d e t a l . , 1 9 8 1 ) . The p r e s e n t r e s u l t s w o u l d f a v o u r t h e c y t o s o l i c l o c a l i z a t i o n o f S-lOOb, i n s o f a r as i m m u n o r e a c t i v i t y was d e t e c t e d t h r o u g h o u t t h e c e l l s . T h e s i n g u l a r e x c e p t i o n may be t h e v e n t r i c u l a r c e l l s , w h i c h w e r e o n l y w e a k l y i m m u n o r e a c t i v e i n t h e i r p r o c e s s e s . C o n c e r n i n g t h e v e n t r i c u l a r r e g i o n , c e l l t y p e s a n t i g e n i c a l l y r e l a t e d t o t h e a s t r o c y t e w e r e d e s c r i b e d . The e x i s t e n c e o f v e n t r i c u l a r e p e n d y m a l c e l l s r e l a t e d t o g l i a l e l e m e n t s h a s b e e n r e p o r t e d by o t h e r s , v a r i o u s l y d e s c r i b i n g t h e m as t a n y c y t e s ( M i l l h o u s e , 1 9 7 1 , H o r s t m a n , 1 9 5 4 , B a s c o e t a l . , 1 9 8 1 ) , e p e n d y m a l a s t r o c y t e s ( H o r s t m a n n , 1 9 5 4 , P e t e r s e t a l . , 1 9 7 6 , S e r e s s , 1 9 8 0 ) , o r t a n y c y t e e p e n d y m a l c e l l s ( B r u n i e t a l . , 1 9 8 3 ) . On t h e b a s i s o f t h e i r common m o r p h o l o g i c a l p r o p e r t i e s a t t h e l i g h t m i c r o s c o p i c l e v e l u s i n g m e t a l i m p r e g n a t i o n , b o t h S e r e s s ( 1 9 8 0 ) and R a k i c ( 1 9 7 1 , 1972) h a v e recommended t h e g e n e r a l t e r m " r a d i a l g l i a " t o d e s c r i b e a l l p r o c e s s - b e a r i n g e p e n d y m a l c e l l s . B e c a u s e a l l p r o c e s s - b e a r i n g c e l l s i n t h i s r e g i o n a r e on t h e v e n t r i c u l a r s u r f a c e ( S e r e s s , 1 9 8 0 , B r u n i e t a l . , 1 9 8 3 ) , i t has been s t a t e d t h a t any c e l l on t h e v e n t r i c u l a r s u r f a c e n o t b e a r i n g a p r o c e s s i s a common ( m u r a l , c u b o i d a l ) e p e n d y m a l c e l l ( B r u n i e t a l . , 1 9 8 3 ) . A d i s t i n c t i o n h a s been made f o r e p e n d y m a l c e l l s b e a r i n g s h o r t p r o c e s s e s n o t o r i e n t e d i n t o t h e s u b e p e n d y m a l l a y e r , w h i c h h a v e been c a l l e d " a t y p i c a l e p e n d y m a " ( t h r e e m o r p h o l o g i c a l s u b t y p e s , B r u n i e t a l . , 1 9 8 3 ) . P r e v i o u s GFAP i m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s e s o f b o t h r a t and mouse h y p o t h a l a m u s h a v e d e t e r m i n e d t h e " r a d i a l g l i a l " p r o c e s s e s ; h o w e v e r , i n one s t u d y ( O n t e n i e n t e e t a l . , 1 9 8 3 ) , no GFAP i m m u n o r e a c t i v i t y was f o u n d i n t h e v e n t r i c u l a r s u r f a c e c e l l s b u t , i n t w o o t h e r s , t a n y c y t e c e l l b o d i e s w e r e o b s e r v e d t o s t a i n i n t h i s l a y e r ( B a s c o e t a l . , 1 9 8 1 , de V i t r y e t a l . , 1 9 8 1 ) . The s i n g l e r e p o r t on S - 1 0 0 i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y i n t h i s r e g i o n c l a i m e d t h a t a l l e p e n d y m a l c e l l s w e r e s t a i n e d , b u t n e i t h e r t a n y c y t e s , n o r a s t r o c y t e s w e r e l a b e l l e d ( d e V i t r y e t a l . , 1 9 8 0 ) . B a s e d on t h e p r e s e n t d o u b l e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l r e s u l t s , i t i s p o s s i b l e t o c l a s s i f y f o u r c e l l t y p e s i n t h e h y p o t h a l a m i c / v e n t r i c u l a r r e g i o n ; t h e i r c h a r a c t e r i s t i c s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 4 . The r e s u l t s p r e s e n t e d h e r e i n s u g g e s t t h a t t h e r e i s no f u n d a m e n t a l d i f f e r e n c e i n t h e a n t i g e n i c i d e n t i t y o f t h e s e v a r i o u s c e l l t y p e s , and t h a t t h e c l a s s i f i c a t i o n o f t h e s e c e l l s i n t o v a r i o u s s u b t y p e s i s somewhat a r b i t r a r y i f t h e y a r e c o n s i d e r e d t o be m o r p h o l o g i c a l v a r i a n t s o f t h e a s t r o c y t e . The l o c a l i z a t i o n o f S - l O O b i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e a s t r o c y t e i s i n a g r e e m e n t w i t h r e s u l t s o b t a i n e d i n t h e r a t h i p p o c a m p u s e m p l o y i n g a m o n o c l o n a l a n t i b o d y t o " w h o l e " S - 1 0 0 (Haan e t a l . , 1 9 8 2 ) . H o w e v e r , c o n s i d e r a t i o n must be g i v e n t o t h e p o s s s i b i l i t y t h a t t h e r e a r e S - 1 0 0 s p e c i e s t o w h i c h t h i s S - l O O b d e r i v e d ( 3 s u b u n i t d i r e c t e d ) a n t i s e r a i s n o t i m m u n o r e a c t i v e . I n t h e r a t b r a i n t h e 3 s u b u n i t i s t h e p r e d o m i n a n t , 73 T a b l e 4 . I m m u n o r e a c t i v e c e l l t y p e s i n t h e r a t v e n t r a l h y p o t h a l a m u s . The d i s t r i b u t i o n o f S - l O O b and GFAP i m m u n o r e a c t i v i t i e s w i t h i n t h e v a r i o u s c e l l s a r e d e s c r i b e d i n t h e c o l u m n s as S - 1 0 0 b + and G F A P + . C e l l T y p e S - 1 0 0 b + GFAP+ T y p i c a l A s t r o c y t e s M o d e r a t e l y l a b e l l e d c e l l W e a k l y o r u n l a b e l l e d b o d i e s , s h o r t p r o c e s s e s c e l l b o d i e s , i n t e n s e -l y l a b e l l e d p r o c e s s e s T y p i c a l T a n y c y t e s I n t e n s e l y l a b e l l e d c e l l W e a k l y o r u n l a b e l l e d b o d i e s a t t h e v e n t r i c - c e l l b o d i e s , i n t e n s e -u l a r s u r f a c e , w e a k l y l y l a b e l l e d l o n g p r o -l a b e l l e d p r o c e s s e s . c e s s e s . A t y p i c a l A s t r o c y t e s M o d e r a t e l y l a b e l l e d c e l l b o d i e s d i s t a n t f r o m t h e v e n t r i c u l a r s u r f a c e , m o d e r a t e l y t o w e a k l y l a b e l l e d p r o c e s s e s W e a k l y o r u n l a b e l l e d c e l l b o d i e s , i n t e n s e -l y l a b e l l e d b i p o l a r p r o c e s s e s p a r a l l e l i n g t h e t a n y c y t e s ' o r i e n t a t i o n A t y p i c a l T a n y c y t e s o r A t y p i c a l E p e n d y m a l A s t r o c y t e s I n t e n s e l y l a b e l l e d c e l l b o d i e s a t t h e v e n t r i c u l a r s u r f a c e , w e a k l y l a b e l l e d p r o c e s s e s when o b s e r v a b l e W e a k l y o r u n l a b e l l e d c e l l b o d i e s , i n t e n s e -l y l a b e l l e d s h o r t p r o -c e s s e s when o b s e r v a b l e i f n o t t h e o n l y , f o r m o f S - 1 0 0 . R e c e n t e s t i m a t e s s u g g e s t t h a t a t most a p p r o x i m a t e l y 10% o f r a t b r a i n S - 1 0 0 s u b u n i t s a r e t h e 3 ' f o r m , w h i c h has a c o m p o s i t i o n s i m i l a r t o 3 ( I s o b e e t a l . , 1 9 8 3 ) . The s t r u c t u r a l d i s t i n c t i o n o f 3 and 3 ' has y e t t o be d e t e r m i n e d , and i t may be t h e c a s e t h a t 3 ' r e p r e s e n t s a d e g r a d a t i o n p r o d u c t o f 3 . H o w e v e r , u n t i l t h e e x a c t n a t u r e o f t h e p u t a t i v e 3 ' s u b u n i t o f r a t b r a i n S - 1 0 0 i s d e t e r m i n e d , t h e u n l i k e l y p o s s i b i l i t y t h a t a n o n i m m u n o r e a c t i v e 3 ' 3 ' f o r m e x i s t s o u t s i d e o f a s t r o c y t e s c a n n o t be e x c l u d e d . S i n c e n e i t h e r t h i s w o r k , n o r t h a t o f Haan e t a l . ( 1 9 8 2 ) , has d e t e r m i n e d t h e p o l y p e p t i d e t h a t i s t h e i m m u n o r e a c t i v e s p e c i e s o f t h e r a t , t h e e x c l u s i v i t y o f " S - 1 0 0 " i n t h e a s t r o c y t e must be v i e w e d w i t h c a u t i o n . I n c o n c l u s i o n , i t i s a p p a r e n t t h a t t h e S-lOOb d e r i v e d a n t i s e r u m s p e c i f i c a l l y l a b e l s a s t r o c y t e s i n t h e r a t b r a i n , and c o u l d s e r v e a s a c e l l t y p e s p e c i f i c m a r k e r . I t may be q u e s t i o n e d w h e t h e r a l l a s t r o c y t e s a r e i m m u n o l a b e l l e d by t h e t w o i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m a r k e r s e m p l o y e d . I t i s n o t p o s s i b l e t o d i r e c t l y a n s w e r t h i s q u e s t i o n , h o w e v e r , i t was o b s e r v e d i n t h e e x p e r i m e n t s p r e s e n t e d t h a t a c e r t a i n d e g r e e o f d i f f e r e n t i a l d i s t r i b u t i o n o f S-lOOb and GFAP i m m u n o r e a c t i v i t i e s o c c u r e d a c r o s s b r a i n r e g i o n s . F o r e x a m p l e , c e r t a i n c e l l s o f t h e s t r i a t u m w e r e v e r y w e a k l y l a b e l l e d f o r G F A P , w i t h i m m u n o r e a c t i v i t y a p p a r e n t o n l y i n v e r y f i n e f i b r i l l a r c o m p o n e n t s i n t h e c e l l b o d y , w h e r e a s t h e s e same c e l l s d i s p l a y e d s t r o n g S-lOOb i m m u n o r e a c t i v i t y . I n any c a s e , a l l c e l l s w h i c h a r e a s t r o c y t e s w o u l d p r e s u m a b l y h a v e some i n t e r m e d i a t e f i l a m e n t s and e v e n t h o s e w h i c h h a v e v e r y f e w , s u c h as t h e s u b c l a s s o f s t r i a t a l c e l l s , do e x h i b i t S-lOOb i m m u n o r e a c t i v i t y . T h e u s e o f t h e S-lOOb i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d i s a d v a n t a g e o u s , as i t a l l o w s a more c o m p l e t e m o r p h o l o g i c a l d e s c r i p t i o n o f t h e a s t r o c y t e t h a n i s a s s o c i a t e d w i t h t h e GFAP i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d . The r e s t r i c t i o n o f GFAP i m m u n o r e a c t i v i t y t o t h e i n t e r m e d i a t e f i l a m e n t s o f t h e m a t u r e a s t r o c y t e d o e s n o t l e a d t o r e a d y i d e n t i f i c a t i o n o f t h e c e l l b o d y . T h e u s e o f t h e d o u b l e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d c o u l d be o f g r e a t h e l p i n t h e i n v e s t i g a t i o n o f t h e a s t r o g l i a l r e s p o n s e t o n e u r a l t i s s u e p a t h o l o g i c a l i n s u l t ( f o r e x a m p l e , s e e Kahn e t a l . , 1 9 8 3 ) , and may a l s o be c e n t r a l t o a c q u i r i n g a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f g l i a l o n t o g e n e s i s , p a r t i c u l a r l y i n l i g h t o f t h e s u g g e s t i o n t h a t S - 1 0 0 i m m u n o r e a c t i v i t y may a p p e a r e a r l i e r i n p r e n a t a l d e v e l o p e m e n t t h a n d o e s GFAP (Haan e t a l . , 1 9 8 2 ) . CONCLUSIONS and GENERAL DISCUSSION 77 T h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y was t o i n v e s t i g a t e t h e " b r a i n s p e c i f i c " S - 1 0 0 p r o t e i n s by i m m u n o c h e m i c a l m e t h o d s . T h e s e p r o t e i n s r e p r e s e n t a s y s t e m w h i c h d i s p l a y s m o l e c u l a r h e t e r o g e n e i t y ; i n many s p e c i e s S - 1 0 0 e x i s t s as a v a r i e t y o f i s o p r o t e i n s h a v i n g d i s t i n c t p r i m a r y s t r u c t u r e s . The b o v i n e b r a i n S - l O O b p r o t e i n i s a h o m o d i m e r o f 3 - s u b u n i t s , and t h u s r e p r e s e n t s a l o g i c a l s u b s t r a t e t o a t t e m p t t h e p r o d u c t i o n o f an i s o t y p e s p e c i f i c a n t i b o d y . I t p r o v e d p o s s i b l e t o a c h i e v e t h i s g o a l ; t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f s u c h an a n t i b o d y i s d e s c r i b e d i n t h e f i r s t p a r t o f t h i s t h e s i s . By s o l i d p h a s e i m m u n o c h e m i c a l m e t h o d s , t h e a n t i s e r u m t o S - l O O b was o b s e r v e d t o p o s s e s s h i g h a v i d i t y f o r , and t o b i n d s p e c i f i c a l l y t o , t h e b o v i n e S - l O O b p r o t e i n . A c o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f i m m u n o r e a c t i v i t y t o w a r d s t h e b o v i n e S - l O O a ( a 3 ) p r o t e i n , s u g g e s t s a s p e c i f i c i t y o f t h e a n t i s e r u m t o t h e 3 - s u b u n i t . A g r o s s e s t i m a t e o f t h e r e a c t i v i t y o f t h e a n t i b o d y t o w a r d s t h e a - s u b u n i t o f S - l O O a w o u l d be no g r e a t e r t h a n 10%, r e l a t i v e t o t h e r e a c t i v i t y t o w a r d s t h e 3 - s u b u n i t o f t h a t p r o t e i n . T h e a v a i l a b i l i t y o f t h e c h a r a c t e r i z e d a n t i s e r u m t o S - l O O b p r o t e i n a l l o w e d a c a r e f u l a n a l y s i s o f t h e l o c a l i z a t i o n o f t h e p r o t e i n i n b r a i n t i s s u e by i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d s . F o r e x p e d i e n c e , t h e r a t b r a i n was c h o s e n ; t h i s may h a v e b e e n t h e b e s t p o s s i b l e s p e c i e s , as r e c e n t r e s u l t s f r o m o t h e r l a b o r a t o r i e s h a v e s u g g e s t e d t h a t t h i s t i s s u e may o n l y e x p r e s s t h e 3 - s u b u n i t . The u s e o f t h e S - l O O b a n t i b o d y i n t h e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i s o f t h e r a t b r a i n i n d i c a t e d t h a t t h e p r o t e i n i s r e s t r i c t e d t o a s t r o c y t e s i n t h a t s p e c i e s . P r e l i m i n a r y d a t a f o r t h e human b r a i n u s i n g t h i s a n t i b o d y a r e i n c o n c o r d a n c e w i t h a 78 r e c e n t l y p u b l i s h e d a c c o u n t o f g - s u b u n i t i m m u n o r e a c t i v i t y b e i n g d e t e c t e d i n o l i g o d e n d r o c y t e s as w e l l ( I s o b e e t a l . , 1 9 8 4 ) . N o n e t h e l e s s , t h e p r e s e n t r e s u l t s f a v o u r t h e u s e o f t h e S - l O O b d e r i v e d a n t i s e r u m as a c e l l t y p e s p e c i f i c m a r k e r o f a s t r o c y t e s i n t h e r a t c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m . Two a p p l i c a t i o n s o f t h e S - l O O b i m m u n o h i s t o c h e m i c a l m e t h o d i m m e d i a t e l y p r e s e n t t h e m s e l v e s , d i a g n o s t i c p a t h o l o g y and t h e a n a l y s i s o f g l i a l o n t o g e n e s i s . The a p p l i c a t i o n o f S - 1 0 0 i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t o d i a g n o s t i c p a t h o l o g y has b e e n r e c e n t l y r e v i e w e d (Kahn e t a l . , 1 9 8 3 ) , t h e a p p l i c a t i o n o f an i s o t y p e s p e c i f i c a n t i s e r u m may a d d s p e c i f i c i t y t o t h e a t t e m p t s t o d i f f e r e n t i a t e t u m o r s o f n e u r o e n d o d e r m a l v e r s u s n e u r o e c t o d e r m a l o r i g i n . The a p p l i c a t i o n o f t h e S - l O O b d e r i v e d a t i s e r u m t o t h e i n v e s t i g a t i o n o f g l i a l o n t o g e n e s i s i s p a r t i c u l a r l y p r o m i s i n g . A t p r e s e n t , t h e i m m u n o h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i s o f t h e e a r l y g l i o g e n e t i c e v e n t s i s l i m i t e d t o t h e t i m e o f t h e e x p r e s s i o n o f G F A P , l i k e l y t o be a r e l a t i v e l y l a t e s t e p d u r i n g t h e m a t u r a t i o n o f t h e c e l l . The a p p l i c a t i o n o f GFAP i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y h a s a l l o w e d d e s c r i p t i o n o f t h e p r o p e r t i e s o f n e u r o n a l i n t e r a c t i o n w i t h t h e " r a d i a l g l i a l " f i b r e s , as d e s c r i b e d i n t h e d e v e l o p i n g f e t a l monkey c o r t e x by L e v i t t and R a k i c ( 1 9 8 0 ) . A m a j o r u n s o l v e d p r o b l e m i s t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e h i s t o r y o f t h e r a d i a l g l i a l f i b r e s , e s p e c i a l l y t h e i r p o i n t o f o r i g i n and a n c e s t r a l c e l l u l a r e l e m e n t . V a r i o u s m o d e l s h a v e been a d o p t e d f o r t h e d i v e r g e n c e o f c e l l l i n e a g e s i n t h e b r a i n p r i m o r d i u m , b u t f e w d a t a a r e a v a i l a b l e f o r t h e d i s c r i m i n a t i o n o f t h e p o t e n t i a l i t y o f t h e p r e c u r s o r c e l l s . The p o t e n t i a l u t i l i t y o f S - l O O b i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y t o a p p r o a c h t h i s p r o b l e m h a s been s u g g e s t e d on t h e b a s i s o f i t s a p p e a r a n c e b e f o r e G F A P . S - 1 0 0 i m m u n o r e a c t i v i t y has been c l a i m e d t o be d e t e r m i n a b l e as e a r l y as day 14 i n t h e r a t f e t u s (Haan e t a l . , 1 9 8 2 , Masuda e t a l . , 1 9 8 3 ) ; f o r c o m p a r i s o n , GFAP i m m u n o r e a c t i v i t y c a n b a r e l y be d e t e c t e d a t b i r t h i n t h e r a t . T h e a s t r o c y t i c l o c a l i z a t i o n o f S - 1 0 0 has s e v e r a l i m p l i c a t i o n s w i t h r e s p e c t t o i t s b i o l o g i c a l f u n c t i o n . T h i s e f f e c t i v e l y e x c l u d e s any t h e o r y w h i c h p o s t u l a t e s a d i r e c t r o l e i n n e u r o n a l f u n c t i o n . The C a + 2 b i n d i n g p r o p e r t y o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s has b e e n known f o r some t i m e a n d i n c o n s i d e r a t i o n o f t h i s p r o p e r t y and t h e c a l c i u m d e p e n d e n c e o f n e u r o t r a n s m i s s i o n , a r o l e f o r S - 1 0 0 i n n e u r o t r a n s m i s s i o n h a s b e e n a d v a n c e d ( H y d e n , 1 9 7 4 ) . The l a c k o f d e t e c t a b l e S - l O O b i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e n e u r o n makes i t u n l i k e l y t h a t t h e s e p r o t e i n s w o u l d h a v e a d i r e c t r o l e i n n e u r o s e c r e t i o n . T h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e i n t e r a c t i o n o f t h e i s o l a t e d S - 1 0 0 i s o t y p e s w i t h i o n s h a v e now been d e t e r m i n e d i n d e t a i l by s e v e r a l g r o u p s . A p p l i c a t i o n o f a v a r i e t y o f p h y s i c o c h e m i c a l m e t h o d s s u g g e s t s c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n d u c e d by t h e b i n d i n g o f e i t h e r C a + 2 o r Z n + 2 , t h e e f f e c t s o f w h i c h a r e d e p e n d e n t on t h e p r e s e n c e o f K + ( s e e I n t r o d u c t i o n f o r a r e v i e w ) . M o s t r e c e n t l y , a d i r e c t e f f e c t o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s on m i c r o t u b u l a r p o l y m e r i z a t i o n has been d e t e r m i n e d ( D e i n u m e t a l . , 1 9 8 3 , D o n a t o , 1 9 8 3 , Endo & H i d a k a , 1 9 8 3 ) . By t h e s e a c c o u n t s t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s c a n b i n d t u b u l i n and c a n i n h i b i t t h e p o l y m e r i z a t i o n o f m i c r o t u b u l e s , i n a manner d e p e n d e n t on t h e same i o n s known t o e f f e c t c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n t h e i s o l a t e d p r o t e i n s , i . e . C a + 2 , Z n + 2 and K + . T h e s e r e c e n t r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s may h a v e a f u n c t i o n i n c o n t r o l l i n g t h e s t a t e o f m i c r o t u b u l e o r g a n i z a t i o n , and t h e p r e s e n t r e s u l t s d e t e r m i n e t h a t t h i s f u n c t i o n w o u l d s p e c i f i c a l l y be e x p r e s s e d i n t h e a s t r o c y t e . S i n c e t h e a s t r o c y t e i s m o r p h o l o g i c a l l y d y n a m i c i n c u l t u r e and e x h i b i t s m i c r o t u b u l a r r e a r r a n g e m e n t s d u r i n g m a t u r a t i o n ( T r i m m e r e t a l . , 1 9 8 2 ) , i t may p r o v e i n t e r e s t i n g t o e x a m i n e t h e p o s s i b l e r o l e o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n s i n s u c h a p r o c e s s . I t i s n o t known i f t h e a s t r o g l i a l m o t i l i t y i s C a + 2 - d e p e n d e n t , as i n a l l o t h e r c e l l s b u t , i f i t i s , S - 1 0 0 w o u l d be a l i k e l y c a n d i d a t e f o r t h e c o n t r o l o f t h e p r o c e s s . REFERENCES 81 B a s c o , E . , Woodhams, P . L . H a j o s , F . & B a l a z s , R. ( 1 9 8 1 ) I m m u n o c y t o c h e m i c a l d e m o n s t r a t i o n o f g l i a l f i b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n i n mouse t a n y c y t e s . A n a t . E m b r y o l . 1 6 2 , 2 1 7 - 2 2 2 . B a u d i e r , J . & G e r a r d , D . , ( 1 9 8 3 ) I o n s b i n d i n g t o S 1 0 0 p r o t e i n s : s t r u c t u r a l c h a n g e s i n d u c e d by c a l c i u m and z i n c on SlOOa and SlOOb p r o t e i n s . B i o c h e m . 2 2 , 3 3 6 0 - 3 3 6 9 . B a u d i e r , J . , G l a s s e r , N . , H a g l i d , K. & G e r a r d , D. ( 1 9 8 4 ) P u r i f i c a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o n and i o n b i n d i n g p r o p e r t i e s o f human b r a i n S - l O O b p r o t e i n . B i o c h . e t B i o p h y s . A c t a 790 , 1 6 4 - 1 7 3 . B a u d i e r , J . , H o l t z s c h e r e r , C , & G e r a r d , D. ( 1 9 8 2 ) Z i n c - d e p e n d e n t a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f t h e SlOOb p r o t e i n on p h e n y l - S e p h a r o s e . FEBS L e t t e r s 1 4 8 , 2 3 1 - 2 3 4 . B a u d i e r , J . M a n d e l , P . & G e r a r d , D. ( 1 9 8 3 ) B o v i n e b r a i n S 1 0 0 p r o t e i n s : s e p a r a t i o n and c h a r a c t e r i z a t i o n o f a new S100 p r o t e i n s p e c i e s . J . N e u r o c h e m . , 4 0 , 1 4 5 - 1 5 2 . B i g n a m i e , A . , D a h l , D & R u e g e r , D . C . ( 1 9 8 0 ) G l i a l f i b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n (GFA) i n n o r m a l n e u r a l c e l l s and i n p a t h o l o g i c a l c o n d i t i o n s . A d v . C e l l . N e u r o b i o l . ^ , 2 8 5 - 3 1 0 . B r u n i , J . E . , C l a t t e n b u r g , R . E . & M i l l a r , E . ( 1 9 8 3 ) T a n y c y t e e p e n d y m a l c e l l s i n t h e t h i r d v e n t r i c l e o f y o u n g and a d u l t r a t s : a G o l g i s t u d y . A n a t . A n z . J e n a 1 5 3 , 5 3 - 6 8 . B u r k , R . R . , E s c h e n b r u c h , M . , L e u t h a r d , P . , & S t e c k , G . ( 1 9 8 3 ) S e n s i t i v e d e t e c t i o n o f p r o t e i n s and p e p t i d e s i n p o l y a c r y l a m i d e g e l s a f t e r f o r m a l d e h y d e f i x a t i o n . I n M e t h o d s i n E n z y m o l o g y 9l_ ( e d s . H i r s , C . H . W . & T i m a s h e f f , S . N . ) p p . 2 4 7 - 2 5 9 , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k . B u t l e r , J . E . ( 1 9 8 1 ) The a m p l i f i e d E L I S A : P r i n c i p l e s o f and a p p l i c a t i o n f o r t h e c o m p a r a t i v e q u a n t i t a t i o n o f c l a s s and s u b c l a s s a n t i b o d i e s and t h e d i s t r i b u t i o n o f a n t i b o d i e s and a n t i g e n s i n b i o c h e m i c a l s e p a r a t e s . I n M e t h o d s i n E n z y m o l o g y 7_3 ( e d s . L a n g o n e J . J . & Van V u n a k i s , H . ) p p . 4 8 2 - 5 2 3 , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k . C a l i s s a n o , P . , A l e m a , S & F a s e l l a , P . ( 1 9 7 5 ) C a l c i u m and m o n o v a l e n t c a t i o n s as c o n f o r m a t i o n a l e f f e c t o r s o f t h e b r a i n s p e c i f i c p r o t e i n S - 1 0 0 . P r o c e e d i n g s o f t h e 1 0 t h FEBS M e e t i n g , 1 9 7 5 . C a l i s s a n o , P . , M e r c e n t i , D & L e v i , A ( 1 9 7 6 ) C a + 2 , K+- R e g u l a t e d i n t r a m o l e c u l a r c r o s s l i n k i n g o f S - 1 0 0 p r o t e i n v i a d i s u l f i d e bond f o r m a t i o n . E u r . J . B i o c h e m . 7_1, 4 5 - 5 2 . C a l i s s a n o , P . , M o o r e , B . W . & F r i e s e n , A . ( 1 9 6 9 ) E f f e c t o f C a l c i u m i o n on S - 1 0 0 , a p r o t e i n o f t h e n e r v o u s s y s t e m . B i o c h e m . 8, 4 3 1 8 - 4 3 2 6 . 82 C h i k a r a i s h i , D . M . ( 1 9 7 9 ) C o m p l e x i t y o f c y t o p l a s m i c p o l y a d e n y l a t e d and non p o l y a d e n y l a t e d r a t b r a i n r i b o n u c l e i c a c i d s . B i o c h e m . 1 8 , 3 2 4 9 - 3 2 5 6 . ~~~ D a v i s , B . J . ( 1 9 6 4 ) D i s c e l e c t r o p h o r e s i s I I : M e t h o d and a p p l i c a t i o n t o human s e r u m p r o t e i n s . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 1 2 1 , 4 0 4 - 4 2 7 de V i t r y , F . , P i c a r t , R . , J a c q u e , C , L e q u a l t , L . , D u p o u e y , P . & T i x i e r - V i d a l , A . ( 1 9 8 0 ) P r e s u m p t i v e common p r e c u r s o r f o r n e u r o n a l and g l i a l c e l l l i n e a g e s i n mouse h y p o t h a l a m u s . P r o c . N a t n . A c a d . S c i . USA 7 7 , 4 1 6 5 - 4 1 6 9 . de V i t r y , F . , P i c a r t , R . , J a c q u e , C . & T i x i e r - V i d a l , A . , ( 1 9 8 1 ) G l i a l f i b r i l l a r y a c i d p r o t e i n : a c e l l u l a r m a r k e r o f t a n y c y t e s i n t h e mouse h y p o t h a l a m u s . D e v . N e u r o s c i . 4_, 4 5 7 - 4 6 0 . D e i n u m , J . , B a u d i e r , J . , B r i v i n g , C , R o s e n g r e n , L . , W a l l i n , M . , G e r a r d , D. & H a g l i d , K. ( 1 9 8 3 ) . T h e e f f e c t o f S - l O O a and S - l O O b p r o t e i n s and Z n + 2 on t h e a s s e m b l y o f b r a i n m i c r o t u b u l e p r o t e i n s i n v i t r o . FEBS L e t t e r s 1 6 3 , 2 8 7 - 2 9 1 . D o n a t o , R. ( 1 9 8 1 ) The s p e c i f c i n t e r a c t i o n o f S - 1 0 0 p r o t e i n w i t h s y n a p t o s o m a l p a r t i c u l a t e f r a c t i o n s . E v i d e n c e f o r t h e f o r m a t i o n o f a t i g h t c o m p l e x b e t w e e n S - 1 0 0 and i t s b i n d i n g s i t e s . J . N e u r o c h e m . 3 6 , 5 3 2 - 5 3 7 . D o n a t o , R. ( 1 9 8 3 ) E f f e c t o f S - 1 0 0 p r o t e i n on a s s e m b l y o f b r a i n m i c r o t u b u l e p r o t e i n s i n v i t r o . FEBS L e t t e r s 1 6 2 , 3 1 0 - 3 1 3 . E n d o , T . & H i d a k a , H . ( 1 9 8 3 ) E f f e c t o f S - 1 0 0 on m i c r o t u b u l e a s s e m b l y -d i s a s s e m b l y . FEBS L e t t e r s 1 6 1 , 2 3 5 - 2 3 8 . E n g , L . F . & B i g b e e , J . W . ( 1 9 7 8 ) I m m u n o h i s t o c h e m i s t r y o f n e r v o u s s y s t e m s p e c i f i c a n t i g e n s . I n A d v a n c e s i n N e u r o c h e m i s t r y V o l u m e 3 ( e d s A g r a n o f f - B . W . & A p r i s o n M . H . ) p p . 4 3 - 9 8 . P l e n u m P r e s s , New Y o r k . F i l i p o w i c z , W . , V i n c e n d o n , G . , M a n d e l , P . , & G o m b o s , G . ( 1 9 6 8 ) T o p o g r a p h i c a l d i s t r i b u t i o n o f f a s t and s l o w m i g r a t i n g f r a c t i o n s o f b e e f b r a i n S - 1 0 0 p r o t e i n f r a c t i o n . L i f e S c i e n c e s 7_, 1 2 4 3 - 1 2 5 0 . G a r i e p y , J & H o d g e s , R . S . ( 1 9 8 3 ) P r i m a r y s e q u e n c e a n a l y s i s and f o l d i n g b e h a v i o u r o f EF h a n d s i n r e l a t i o n t o t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f t r o p o n i n C and c a l m o d u l i n . FEBS L e t t e r s 1 6 0 , 1 - 6 . G h a n d o u r , M . S . , L a b o u r d e t t e , G . , V i n c i n d o n , G. & Gombos , G . ( 1 9 8 1 ) A b i o c h e m i c a l and i m m u n o h i s t o l o g i c a l s t u d y o f S100 p r o t e i n i n d e v e l o p i n g r a t c e r e b e l l u m . D e v e l . N e u r o s c i . £ , 9 8 - 1 0 9 . G h a n d o u r , M . S . , L a n g l e y , O . K . , L a b o u r d e t t e , G . , V i n c e n d o n , G . & G o m b o s , G . ( 1 9 8 1 ) S p e c i f i c and a r t e f a c t u a l c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n s o f S - 1 0 0 p r o t e i n : an a s t r o c y t e m a r k e r i n r a t c e r e b e l l u m . D e v . N e u r o s c i . 4_, 83 6 6 - 7 8 . H a a n , E . A . , B o s s , B . D . & C o w a n , W . M . ( 1 9 8 2 ) P r o d u c t i o n and c h a r a c t e r i z a t i o n o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t t h e " b r a i n - s p e c i f i c " p r o t e i n s 1 4 - 3 - 2 and S - 1 0 0 . P r o c . N a t . A c a d . S c i . (USA) _79, 7 5 8 5 - 7 5 8 9 . H i d a k a , H . , E n d o , T . , K a w a m o t o , S . , Y a m a d a , E . , Umekawa, H . , T a n a b e , K. & H a r a , K. ( 1 9 8 3 ) P u r i f i c a t i o n and c h a r a c t e r i z a t i o n o f a d i p o s e t i s s u e S - l O O b p r o t e i n . J . B i o l . C h e m . 2 5 8 , 2 7 0 5 - 2 7 0 9 . H o r s t m a n n , E . ( 1 9 5 4 ) D i e F a s e r g l i a d e s S e l a c h i e r g e h i r n s . A n a t . & E m b r y o l . B e r l i n ( W e s t ) 3 9 , 5 8 8 - 6 1 7 . H y d e n , H . ( 1 9 7 4 ) A c a l c i u m - d e p e n d e n t m e c h a n i s m f o r s y n a p s e and n e r v e c e l l membrane m o d u l a t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . (USA) 71_, 2 9 6 5 - 2 9 6 8 . H y d e n , H . & R o n n b a c k , L . ( 1 9 7 5 ) M e m b r a n e - b o u n d S - 1 0 0 p r o t e i n on n e r v e c e l l s and i t s d i s t r i b u t i o n . B r a i n R e s . 1 0 0 , 6 1 5 - 6 2 8 . I s o b e , T . , I s h i o k a , N . , M a s u d a , T . , T a k a h a s h i , Y . , G a n o , S . & O k u y a m a , T . ( 1 9 8 3 ) . A r a p i d s e p a r a t i o n o f S - 1 0 0 s u b u n i t s by h i g h p e r f o r m a n c e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y : t h e s u b u n i t c o m p o s i t i o n s o f S - 1 0 0 p r o t e i n s . B i o c h e m . I n t . 6 ,^ 4 1 9 - 4 2 6 . I s o b e , T . , I s h i o k a , N & O k u y a m a , T . ( 1 9 8 1 ) S t r u c t u r a l r e l a t i o n o f t w o S - 1 0 0 p r o t e i n s i n b o v i n e b r a i n ; s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f S - l O O a p r o t e i n . E u r . J . B i o c h e m . 1 1 5 , 4 6 9 - 4 7 4 . I s o b e , T . , N a k a j i m a , T . & O k u y a m a , T . ( 1 9 7 7 ) R e i n v e s t i g a t i o n o f e x t r e m e l y a c i d i c p r o t e i n s i n b o v i n e b r a i n . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a 4 9 4 , 2 2 2 - 2 3 1 . I s o b e , T . & O k u y a m a , T . ( 1 9 7 8 ) The ami n o - a c i d i c s e q u e n c e o f S - 1 0 0 p r o t e i n (PAP I - b p r o t e i n ) and i t ' s r e l a t i o n t o t h e c a l c i u m - b i n d i n g p r o t e i n s . E u r . J . B i o c h e m 89_, 3 7 9 - 3 8 8 . I s o b e , T . , T a k a h a s h i , K. & O k u y a m a , T . ( 1 9 8 4 ) S 1 0 0 a 0(<xa) P r o t e i n i s p r e s e n t i n n e u r o n s o f t h e c e n t r a l and p e r i p h e r a l n e r v o u s s y s t e m . J . N e u r o c h e m . 4 3 , 1 4 9 4 - 1 4 9 6 . J a m i e s o n , G . A . & V a n a m a n , T . C . ( 1 9 7 9 ) C a l c i u m - d e p e n d e n t a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f c a l m o d u l i n on an i m m o b i l i z e d p h e n o t h i a z i n e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . C o m m . , 9 0 , 1 0 4 8 - 1 0 5 6 . J o h n s o n , G . D . & de N o g n e i r e A r a n j o , G . M . ( 1 9 8 1 ) A s i m p l e m e t h o d o f r e d u c i n g t h e f a d i n g o f i m m u n o f l u o r e s c e n c e d u r i n g m i c r o s c o p y . J . Immun. M e t h o d s 4 3 , 3 4 9 - 3 5 0 . K a h n , H . J . , M a r k s , A . , Thorn, H . & B a u m a l , R. ( 1 9 8 3 ) R o l e o f a n t i b o d y t o S100 p r o t e i n i n d i a g n o s t i c p a t h o l o g y . A m e r . J . C l i n . P a t h o l . _79, 84 3 4 1 - 3 4 7 . K a p l a n , B . B . ( 1 9 8 2 ) RNA-DNA h y b r i d i z a t i o n a n a l y s i s o f gene e x p r e s s i o n . I n Hand Book o f N e u r o c h e m i s t r y , V o l u m e 2 ( e d s . L a j t h a , A . ) p p . 1 - 2 6 , P l e n u m P r e s s , New Y o r k . K r e t s i n g e r , R . H . ( 1 9 8 0 ) S t r u c t u r e and e v o l u t i o n o f c a l c i u m - m o d u l a t e d p r o t e i n s . C . R . C . C r i t . R e v . B i o c h e m . 8 , 1 1 9 - 1 7 4 . K u w a n o , R . , U s u i , H . , M a e d a , T . , F u k u i . , Y a m a h a r i , N . , O h t s u k a , E . , I k e h a r a , M . & T a k a h a s h i , Y . ( 1 9 8 4 ) M o l e c u l a r c l o n i n g and t h e c o m p l e t e n u c l e o t i d e s e q u e n c e o f cDNA t o mRNA f o r S - 1 0 0 p r o t e i n o f r a t b r i a n . N u c l e i c A c i d s R e s . 1 2 , 7 4 5 5 - 7 4 6 5 . L e e , C . Y . , H u a n g , Y . S . , H u , P . C , G r o m e l , V . & M e n g e , A . C . ( 1 9 8 2 ) A n a l y s i s o f s p e r m a n t i g e n s by SDS g e l / p r o t e i n b l o t r a d i o i m m u n o - b i n d i n g . A n a l . B i o c h e m . 1 2 3 , 1 4 - 2 2 . L e e , V . M . - Y . , P a g e , C D . , Wu, H . L . & S c h l a e p f e r , W.W. ( 1 9 8 4 ) M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o g e l - e x i s e d g l i a l f i l a m e n t p r o t e i n and t h e i r r e a c t i v i t i e s w i t h o t h e r i n t e r m e d i a t e f i l a m e n t p r o t e i n s . J . N e u r o c h e m . 4 1 , 2 5 - 3 2 . L e g r a n d , C h . , C l o s , J . , L e g r a n d , J . , L a n g l e y , O . K . , G h a n d o u r , M . S . , L a b o u r d e t t e , G . , G o m b o s , G. & V i n c e n d o n , G. ( 1 9 8 1 ) L o c a l i z a t i o n o f S 1 0 0 p r o t e i n i n t h e r a t c e r e b e l l u m : an i m m u n o e l e c t r o n m i c r o s c o p e s t u d y . N e u r o p a t h . A p p l . N e u r o b i o l . 7_, 2 9 9 - 3 0 6 . L e v i t t , P . & R a k i c , P . ( 1 9 8 0 ) I m m u n o p e r o x i d a s e l o c a l i z a t i o n o f g l i a l f i b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n i n r a d i a l g l i a l c e l l s and a s t r o c y t e s o f t h e d e v e l o p i n g r h e s u s monkey b r a i n . J . Comp. N e u r o l . 1 9 3 , 8 1 5 - 8 4 0 . L i n s e r , P . & M o s c o n a , A . A . ( 1 9 8 1 ) D e v e l o p m e n t a l c h a n g e s i n t h e d i s t r i b u t i o n o f S - 1 0 0 i n a v i a n n e u r a l r e t i n a . D e v . N e u r o s c i . 4_, 4 3 3 - 4 4 1 . M a n a b e , T . , J i t z u k a w a , S . , I s h i o k a , N . , I s o b e , T . & O k u y a m a , T . ( 1 9 8 2 ) S e p a r a t i o n o f e x t r e m e l y a c i d i c p r o t e i n s , S - 1 0 0 p r o t e i n s and c a l m o d u l i n , i n some b o v i n e t i s s u e s and mammalian b r a i n s by t w o - d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h o r e s i s i n t h e a b s e n c e o f d e n a t u r i n g a g e n t s . J . B i o c h e m . 9 ^ , 1 0 0 9 - 1 0 1 5 . M a n i , R . S . , B o y e s , B . E . & K a y , C M . ( 1 9 8 2 ) P h y s i o c h e m i c a l and o p t i c a l s t u d i e s on c a l c i u m - and p o t a s s i u m - i n d u c e d c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n b o v i n e b r a i n S - l O O b p r o t e i n . B i o c h e m . 2 1 , 2 6 0 7 - 2 6 1 2 . M a n i , R . S . & K a y , C M . ( 1 9 8 3 a ) C i r c u l a r d i c h r o i s m s t u d i e s on t h e z i n c - i n d u c e d c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n S - l O O a and S - l O O b p r o t e i n s . FEBS L e t t e r s 1 6 3 , 2 8 2 - 2 8 6 . M a n i , R . S . & K a y , C M . ( 1 9 8 3 b ) I s o l a t i o n and s p e c t r a l s t u d i e s on t h e c a l c i u m b i n d i n g p r o p e r t i e s o f b o v i n e b r a i n S - l O O a p r o t e i n . B i o c h e m . 22_, 85 3 9 0 2 - 3 9 0 7 . M a n i , R . S . & K a y , C M . ( 1 9 8 4 ) H y d r o d y n a m i c p r o p e r t i e s o f b o v i n e b r a i n S - 1 0 0 p r o t e i n s . FEBS L e t t e r s 1 6 6 , 2 5 8 - 2 6 2 . M a n i , R . S . , S h e l l i n g , J . G . , S y k e s , B . D . & K a y , C M . ( 1 9 8 3 ) S p e c t r a l s t u d i e s on t h e c a l c i u m b i n d i n g p r o p e r t i e s o f b o v i n e b r a i n S - l O O b p r o t e i n . B i o c h e m . 2 2 , 1 7 3 4 - 1 7 4 1 . M a s u d a , T . , S a k i m u r a , K . , Y o s h i d a , Y . , K u w a n o , R . , I s o b e , T . O k u y a m a , T . , & T a k a h a s h i , Y . ( 1 9 8 3 ) D e v e l o p m e n t a l c h a n g e s i n t h e t r a n s l a t a b l e RNA f o r 3 s u b u n i t o f S - 1 0 0 i n r a t b r a i n . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a 7 4 0 , 2 4 9 - 2 5 4 . M c E w a n , B . S . & H y d e n , H . ( 1 9 6 6 ) A s t u d y o f b r a i n s p e c i f i c p r o t e i n s on t h e s e m i - m i c r o s c a l e . J . N e u r o c h e m . 13_, 8 2 3 - 8 3 3 . M e a n s , A . R . , T a s h , J . S . & C h a f o u l e a s , J . G . ( 1 9 8 2 ) P h y s i o l o g i c a l i m p l i c a t i o n s o f t h e p r e s e n c e , d i s t r i b u t i o n and r e g u l a t i o n o f c a l m o d u l i n i n e u k a r y o t i c c e l l s . P h y s i o l . R e v s . 6 2 , 1 - 3 9 . M i l e s , L . E . M . , L e e , Y . L . & E n g . L . F ( 1 9 7 7 ) C a l c i u m i o n d e p e n d e n c e o f t h e 2 - s i t e i m m u n o r a d i o m e t r i c a s s a y o f M o o r e ' s S - 1 0 0 p r o t e i n . J . N e u r o c h e m . 2 8 , 1 2 0 1 - 1 2 0 5 . M i l l h o u s e , O . E . ( 1 9 7 1 ) A G o l g i s t u d y o f t h i r d v e n t r i c l e t a n y c y t e s i n t h e r a t . A n a t & E m b r y o l . B e r l i n ( W e s t ) 1 2 1 , 1 - 1 3 . M o e w s , P . C & K r e t s i n g e r , R . H . ( 1 9 7 5 ) R e f i n e m e n t o f t h e s t r u c t u r e o f c a r p m u s c l e c a l c i u m - b i n d i n g p a r v a l b u m i n by model b u i l d i n g and d i f f e r e n c e f o u r i e r a n a l y s i s . J . M o l . B i o l . 9 1 , 2 0 1 - 2 1 3 . M o o r e , B . W . ( 1 9 6 5 ) A s o l u b l e p r o t e i n c h a r a c t e r i s t i c o f t h e n e r v o u s s y s t e m . • B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun, _19, 7 3 9 - 7 4 4 . M o o r e , B . W . ( 1 9 8 2 ) C h e m i s t r y and b i o l o g y o f t h e S - 1 0 0 p r o t e i n . S c a n d . J . I m m u n o l . 15_ ( S u p p l . 9 ) , 7 5 - 9 6 . M o r r i s o n , J . H . ( 1 9 8 1 ) S i l v e r s t a i n f o r p r o t e i n s i n p o l y a c r y l a m i d e g e l s : a m o d i f i e d p r o c e d u r e w i t h e n h a n c e d u n i f o r m s e n s i t i v i t y . A n a l . B i o c h . 1 1 7 , 3 0 7 - 3 1 0 . N i k a , H . , H a g l i d , K . G . , W r o n s k i , A . .& H a n s s o n , H . - A . ( 1 9 8 2 ) I d e n t i f i c a t i o n and c h a r a c t e r i z a t i o n o f s u ' l f h y d r y l - c o n t a i n i n g p r o t e o l y t i c f r a g m e n t s i n v o l v e d i n t h e C a + 2 - i n d u c e d c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e o f b e e f b r a i n S - 1 0 0 . J . N e u r o c h e m . 3 9 , 6 0 1 - 6 1 2 . O n t e n i e n t e , B . , K i m u r a , H . & M a e d a , T . ( 1 9 8 3 ) C o m p a r a t i v e s t u d y o f t h e g l i a l f i b r i l l a r y a c i d i c p r o t e i n i n v e r t e b r a t e s by PAP i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y . J . Comp. N e u r o l . 2 1 5 , 4 2 7 - 4 3 6 . 86 O r n s t e i n , L . ( 1 9 6 4 ) D i s c e l e c t r o p h o r e s i s I . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 1 2 1 , 3 2 1 - 3 7 9 . P e r u m a l . A . S . & M u r t h i , V . K . ( 1 9 8 1 ) H e t e r o g e n e i t y o f S - 1 0 0 p r o t e i n : c o m p a r i s o n o f b o v i n e and g u i n e a - p i g S - 1 0 0 p r o t e i n s . I n t . J . B i o c h e m . 13_, 7 9 9 - 8 0 4 . P e t e r s , A . , P a l a y , S . L . & W e b s t e r , S . L . ( 1 9 7 6 ) . The f i n e s t r u c t u r e o f t h e N e r v o u s S y s t e m . The n e u r o n s and s u p p o r t i n g c e l l s . W. B . S a u n d e r s , P h i l a d e l p h i a . R a k i c , P . ( 1 9 7 1 ) N e u r o n - g l i a r e l a t i o n s h i p d u r i n g g r a n u l e c e l l m i g r a t i o n i n t h e d e v e l o p i n g c e r e b e l l a r c o r t e x . A G o l g i and e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d y i n M a c a c u s r h e s u s . J . Comp. N e u r o l . 1 4 1 , 2 8 3 - 3 1 2 . R a k i c , P . ( 1 9 7 2 ) Mode o f c e l l m i g r a t i o n t o t h e s u p e r f i c i a l l a y e r s o f f e t a l monkey n e o c o r t e x . J . Comp. N e u r o l . 1 4 5 , 6 1 - 8 4 . R a s m u s s e n , S . , S e n s e n b r e n n e r , M . , D e v i l l i e r s , G . , S c h o u s b o e , A , & B o c k , E . ( 1 9 8 1 ) I s o l a t i o n o f i n t e r m e d i a t e f i l a m e n t s f r o m r a t a s t r o c y t e s i n c u l t u r e . N e u r o s c i . L e t t e r s 25_, 1 1 9 - 1 2 4 . S e r e s s , L . ( 1 9 8 0 ) D e v e l o p m e n t and s t r u c t u r e o f t h e r a d i a l g l i a i n t h e p o s t n a t a l r a t b r a i n . A n a t and E m b r y o l . 1 6 0 , 2 1 3 - 2 2 6 . S i n d i c , C . M . J . , C h a m b o n , M . P . , C a m b i a s o , C . L . , L a t e r r e , E . C , & M a s s o n , P . L . ( 1 9 8 2 ) A s s e s s m e n t o f damage t o t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m by d e t e r m i n a t i o n o f S - 1 0 0 p r o t e i n i n t h e c e r e b r o s p i n a l f l u i d . J . N e u r o l . , N e u r o s u r g . and P s y c h . 45_, 1 1 3 0 - 1 1 3 5 . Sommer, I . , L a g e n a u r , C . & S c h a c h n e r , M ( 1 9 8 1 ) R e c o g n i t i o n o f B e r g m a n n g l i a l and e p e n d y m a l c e l l s i n t h e mouse n e r v o u s s y s t e m by m o n o c l o n a l a n t i b o d y . J . C e l l B i o l . 9 0 , 4 4 8 - 4 5 8 . S t e w a r t , J . A . ( 1 9 7 2 ) S u b u n i t c o m p o s i t i o n o f t h e t i s s u e s p e c i f i c b o v i n e b r a i n S - 1 0 0 p r o t e i n . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Commun. 4 6 , 1 4 0 5 - 1 4 1 0 . S t e w a r t , J . A . ( 1 9 7 2 ) T i s s u e s p e c i f i c b r a i n S - 1 0 0 . A d e m o n s t r a t i o n o f m u l t i p l e p r o t e i n s . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a 2 6 3 , 1 7 8 - 1 9 2 . S w a n k e , R . T . & M u n k r e s , K . D . ( 1 9 7 1 ) M o l e c u l a r w e i g h t a n a l y s i s o f o l i g o p e p t i d e s by e l e c t r o p h o r e s i s i n p o l y a c r y l a m i d e g e l w i t h s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e . A n a l . B i o c h e m . 3 9 , 4 6 2 - 4 7 7 . S z e b e n y i , D . M . E . , O b e n d o r f , S . K . , & M o f f a t , K . ( 1 9 8 1 ) S t r u c t u r e o f v i t a m i n D - d e p e n d e n t c a l c i u m - b i n d i n g p r o t e i n f r o m b o v i n e i n t e s t i n e . N a t u r e 2 9 4 , 3 2 7 - 3 3 7 . T a b u c h i , K . & K i r s c h , W . M . ( 1 9 7 5 ) I m m u n o - c y t o c h e m i c a l l o c a l i z a t i o n o f S - 1 0 0 p r o t e i n i n n e u r o n s and g l i a o f h a m s t e r c e r e b e l l u m . B r a i n R e s . 9 2 , 1 7 5 - 1 8 0 . 87 T a b u c h i , K . O h n i s h i , R. F u r u t a , T . & N i s h i m o t o , A . ( 1 9 8 3 ) . I m m u n o h i s t o c h e m i -c a l l o c a l i z a t i o n o f S - 1 0 0 p r o t e i n i n human c e r e b r a l and c e r e b e l l a r c o r t i c e s . E x p e r i m e n t i a 39. ' 3 3 5 - 3 3 7 . T r i m m e r , P . A . R e i e r , P . J . , OH, T . A . , & E n g , L . F . ( 1 9 8 2 ) . An u l t r a s t r u c t u r a l and i m m u n o c y t o c h e m i c a l s t u d y o f a s t r o c y t i c d i f f e r e n t i a t i o n i n v i t r o . J . N e u r o i m m u n o l . 2 ,^ 2 3 5 - 2 6 0 . T u f t y , R. M . & K r e t s i n g e r , R. H . ( 1 9 7 5 ) T r o p o n i n and p a r v a l b u m i n c a l c i u m b i n d i n g r e g i o n s p r e d i c t e d i n m y o s i n l i g h t c h a i n and T4 l y s o z y m e . S c i e n c e 1 8 7 , 1 6 7 - 1 6 9 . Umekawa, H . , E n d o , T . , & H i d a k a , H . ( 1 9 8 3 ) A r a p i d s e p r a t i o n o f b o v i n e b r a i n S - l O O a and S - l O O b p r o t e i n s and r e l a t e d c o n f o r m a t i o n a l s t u d i e s . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 2 7 , 1 4 7 - 1 5 3 . U y e m u r a , K . , V i n c e n d o n , G . , G o m b o s , G . , & M a n d e l , P . ( 1 9 7 1 ) P u r i f i c a t i o n and some p r o p e r t i e s o f S - 1 0 0 p r o t e i n f r a c t i o n f r o m s h e e p a n d p i g b r a i n s . J . N e u r o c h e m . 1 8 , 4 2 9 - 4 3 8 . Z o m z e l y - N e u r a t h , C . E . & W a l k e r , W . A . ( 1 9 8 0 ) The S - 1 0 0 p r o t e i n . I n P r o t e i n s o f t h e N e r v o u s S y s t e m ( e d s . B r a d s h a w , R . A . & S c h n e i d e r , D.M) p p . 1 - 5 7 , R a v e n P r e s s , New Y o r k . 

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