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On the mechanism of action of glucose-dependent insulinotropic polypeptide Dahl, Marshall Andrew 1983

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ON T H E M E C H A N I S M OF A C T I O N OF G L U C O S E - D E P E N D E N T I N S U L I N O T R O P I C P O L Y P E P T I D E b y M A R S H A L L ANDREW DAHL B . S c , T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1 9 7 9 A T H E S I S S U B M I T T E D I N P A R T I A L F U L F I L M E N T OF T H E R E Q U I R E M E N T S FOR T H E D E G R E E OF D O CTOR OF P H I L O S O P H Y i n T H E F A C U L T Y OF G R A D U A T E S T U D I E S ( D e p a r t m e n t o f P h y s i o l o g y , F a c u l t y o f M e d i c i n e ) We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g ,, t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d S U P E R V I S O R E X T E R N A L E X A M I N E R T H E U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H C O L U M B I A J a n u a r y 1 9 8 3 (T) M a r s h a l l A n d r e w D a h l , 1 9 8 3 In presenting t h i s thesis i n p a r t i a l f u l f i l m e n t of the requirements for an advanced degree at the University of B r i t i s h Columbia, I agree that the Library s h a l l make i t f r e e l y available for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of t h i s thesis for scholarly purposes may be granted by the head of my department or by his or her representatives. It i s understood that copying or publication of t h i s thesis for f i n a n c i a l gain s h a l l not be allowed without my written permission. Department of Ph\j<?o ^ 0<^XJ  The University of B r i t i s h Columbia 1956 Main Mall Vancouver, Canada V6T 1Y3 Date 9 Rpn'l if& DE-6 (3/81) i i A B S T R A C T T h e i n t e r a c t i o n o f t h e i n t e s t i n a l i n s u l i n o t r o p i c h o r m o n e G I P ( G l u c o s e - d e p e n d e n t I n s u l i n o t r o p i c P o l y p e p t i d e o r G a s t r i c I n h i b i t o r y P o l y p e p t i d e ) w i t h t h e s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g m e c h a n i s m o f g 1 u c o s e - i n d u c e d i n s u 1 i n s e c r e t i o n w a s i n v e s t i g a t e d u s i n g t h e i s o l a t e d , p e r f u s e d , r a t p a n c r e a s t e c h n i q u e . T h e a c t i o n o f G I P i n p o t e n t i a t i n g i n s u l i n s e c r e t i o n w h i c h h a d b e e n i n i t i a t e d b y a n u m b e r o f m e t a b o l i c c o m p o u n d s o t h e r t h a n g 1 u c o s e ( D - g l y c e r -a l d e h y d e , 2 - k e t o i s o c a p r o a t e , L - l e u c i n e + L - g l u t a m i n e ) a n d t h e c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t n a t u r e o f t h i s a c t i o n l e d t o t h e f o r m u l a -t i o n o f t h e h y p o t h e s i s t h a t t h e i n s u 1 i n o t r o p i c e f f e c t o f G I P r e q u i r e d p r i o r o x i d a t i o n o f t h e s e i n s u 1 i n - s t i m u 1 a t i n g m e t a b o 1 i t e s . I t w a s t h e r e f o r e l i k e l y t h a t t h e m e c h a n i s m w h e r e b y G I P p o t e n t i a t e d g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n s e c r e t i o n r e q u i r e d a n i n t e r a c t i o n l o c a t e d a t a l e v e l i n v o l v i n g e f f e c t s s e c o n d a r y t o g l u c o s e d e g r a d a t i o n i n t h e B - c e l l . T h i s e f f e c t may h a v e r e q u i r e d a n i n t a c t N - t e r m i n u s o n t h e G I P m o l e c u l e s i n c e a G I P ^ 42 h o m o l o g u e , w h i c h l a c k e d t h e N - t e r m i n a l T y r o s i n e - A l a n i n e , p o s s e s s e d g r e a t l y d i m i n i s h e d i n s u l i n o -t r o p i c a c t i v i t y . A d d i t i o n a 1 b i 0 1 o g i c a 1 a c t i o n s o f G I P w e r e s u g g e s t e d b y t h e s t i m u l a t i o n b y t h e h o r m o n e o f p a n c r e a t i c s o m a t o -s t a t i n r e l e a s e a n d o f t h e r e l e a s e o f l i p o p r o t e i n l i p a s e - l i k e a c t i v i t y f r o m i s o l a t e d r a t a d i p o c y t e s . A t e c h n i q u e u s i n g r e v e r s e d p h a s e h i g h p r e s s u r e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) w a s d e v e l o p e d a l l o w i n g t h e p u r i f i c a t i o n a n d 1 2 5 f o d i n a t i o n - s t a t e a n a l y s i s o f a p u r e b i o a c t i v e I - G I P m o l e c u l e . P r e l i m i n a r y i n v e s t i g a t i o n s o f r e c e p t o r b i n d i n g a c t i v i t y o f t h i s 12 5 p u r i f i e d I - G I P t o i s o l a t e d r a t a d i p o c y t e s w e r e a l s o p e r f o r m e d . i i i TABLE OF CONTENTS ABSTRACT i LIST OF TABLES . ' . . . . ' . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 * LIST OF FIGURES . . . . . . . . . . . . . . . . . . x i LIST OF ABBREVIATIONS . . . . . . . . . . . . . . x v i STATISTICAL ANALYSIS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . x v i i i ACKNOWLEDGEMENTS . . . . . . . x i x INTRODUCTION 1 METHODS . . • 21 1. PEPTIDE ANALYSIS AND QUANTITATION . 21 A. Radi oimmunoassay 21 1 . R a t i o n a l e 21 2. I n s u l i n 2 2 a ) I o d i n a t i o n o f i n s u 1 i n . . . 2 2 b) Assay bu f f e r 24 c) A n t i se rum 24 d) S tanda rd s 25 e) C o n t r o l s 25 f ) N o n - s p e c i f i c b i n d i n g . . . . . . 25 g) P e r f u s a t e samples 26 h) Assay p r o t o c o l 27 i ) Cha r coa l S e p a r a t i o n . 27 j ) C a l c u l a t i o n s 27 3. S o m a t o s t a t i n . . . . . 27 a) I o d i n a t i o n o f s o m a t o s t a t i n . . . . . . . . . . 27 b) Assay b u f f e r . . . . . . 29 c) An t i s e r um . . . . . . . .-. . . 30 d) S tanda rd s . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 e) C o n t r o l s . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 f ) Assay P r o t o c o l . . . . . . . . •.- . . . . . . . 31 g) P e r f u s a t e samples . . . . . . . . . . . . . . 31 h) Cha r coa l s e p a r a t i o n 32 B. Adsorpt i on Chromatography 32 1. R a t i o n a l e 32 2. P r o t ea se D i g e s t i o n . . . . . . . . . . . . . . . 33 a) Radi o i od i nated GIP f r a c t i o n s from r a d i o - •• . immunoassay p u r i f i c a t i o n s . . . . 34 i v P a 9 e b) R a d i o i o d i n a t e d GIP f r a c t i o n s from HPLC p u r i f i c a t i o n . ' 34 3. Column Chromatography 34 a) B u f f e r 34 b) Column p r e p a r a t i o n . . . . . . . . . . . . . . 35 c) P r o t o c o l . . . . . . 35 C. High P r e s s u r e L i q u i d Chromatography (HPLC) 36 1. Theory . . . . . . . . . . . . . . 36 2. HPLC Equipment and P rocedu re 37 3. A n a l y s i s o f p e p t i d e p r e p a r a t i o n s . 39 a) Approach 39 i ) P r e l i m i n a r y " d e t e r m i n a t i o n o f ' e l u t i o n range . 39 i i ) P r e c i s e d e t e r m i n a t i o n o f - e l u t i o n range . . 39 i i i ) A c h i e v i n g r e s o l u t i o n 40 4. P u r i f i c a t i o n of p e p t i d e p r e p a r a t i o n s . . . . . . .41 a) P u r i f i c a t i o n p r o t o c o l 42 b) Y i e l d 42 I I . PRODUCTION OF RADI0-IODINATED GIP . . . . . 43 A. I o d i n a t i o n 43 12 7 1. I - i o d i n a t i o n f o r use i n HPLC a n a l y s e s . . . . 43 2. 1 2 5 / 1 2 7 l - i 0 d i n a t i o n f o r use i n HPLC a n a l y s e s . . . 44 3. 1 2 51 - i o d i n a t i o n 44 B. HPLC P u r i f i c a t i o n . . . . . . . 44 I I I . COLOURIMETRIC DETERMINATION OF LI POP ROTE IN-LI PAS E LIKE ACTIVITY (LPLA) . '. . . . . . . . . . . . . . . . 46 A. S o l u t i o n s and Reagents . . . . . . . . . . . . . . . 46 1. D o l e ' s s o l u t i o n . .'• . . . .'• . . . . . . . . .' . 46 2. Reagent A . . . . . . . . . . . . . . . 46 3. Reagent B : . . . . . . . . . . . . . 46 4. C o b a l t Reagent . . . . . . . . . . . 47 5. I n d i c a t o r c o n c e n t r a t e 47 6. I n d i c a t o r s o l u t i o n . . . . . . . . 47 V Page 7. C h l o r o f o r m - h e p t a n e S o l u t i o n 47 8. F r e e Fat ty A c i d ( F F A ) S t a n d a r d s 47 9. A c t i v a t e d S u b s t r a t e . . . 47 1 0 . Rat Serum 47 B. P r o c e d u r e . 48 I V . EXPERIMENTAL PROCEDURES - ANIMAL STUDIES 49 A. I s o l a t e d P e r f u s e d R a t P a n c r e a s 49 1. S o l u t i o n s and R e a g e n t s 49 a) K r e b s ' c o n c e n t r a t e - - 49 b) P e r f u s a t e 50 c ) S i de - arm i n f u s a t e s . 50 2 . P r o c e d u r e 50 a) S u r g i c a l p r e p a r a t i o n . . . 50 b) A p p a r a t u s 52 i ) S q u a r e - w a v e c o n c e n t r a t i o n c h a n g e s 52 i i ) L i n e a r g r a d i e n t c o n c e n t r a t i o n c h a n g e s . . . 53 c ) E q u i l i b r a t i o n 53 B. . E x p e r i m e n t s U s i n g I s o l a t e d Ra t F a t C e l l s 53 1. I n c u b a t i o n o r W a s h i n g Medium 53 2 . I s o l a t i o n o f Rat F a t C e l l s 54 3 . L i p o p r o t e i n - 1 i p a s e S t u d i e s . . . . 55 4 . B i n d i n g S t u d i e s . . . . . . . 56 a) V a c u u m ' f i l t r a t i o n . -.- . . . . -.- . . -.- . . . . 57 b) Oi1 f l o t a t i o n . . . . . . . . . . 57 APPENDIX TO METHODS - CHEMICAL SOURCES . . . 59 RESULTS •• . . . . . . . .' . . . . . .' . . . . . . . . . . . . 61 I. ISOLATED PERFUSED RAT PANCREAS EXPERIMENTS . . . . . . 61 A. I n s u l i n R e l e a s e . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61 1. M e t a b o l i c Compounds and GIP . . . . . . . . . . 61 a) E f f e c t o f D - g l y c e r a l d e h y d e and GIP . . . . . . 61 b) E f f e c t o f 2 - k e t o i s o c a p r o a t e and GIP . . . . . 61 c ) E f f e c t o f 2 - k e t o c a p r o a t e and GIP . . . . . . . 65 d) E f f e c t o f L - l e u c i n e , L - g l u t a m i n e and GIP . . . 69 v i P a g e i ) L - l e u c i n e 6 9 i i ) L - g l u t a m i n e . 6 9 i i i ) L - l e u c i n e a n d L - g l u t a m i n e . . . . . . . . . 6 9 e ) E f f e c t o f L - 1 e.u c i n e , L - g l u t a m i n e a n d d i b u t y r y l c A M P . . . . . 7 6 f ) E f f e c t o f p y r u v a t e , g l u c o s e a n d G I P 76 i ) I n f u s i o n o f 8 0 m g / d l g l u c o s e , p y r u v a t e a n d G I P 7 6 i i ) I n f u s i o n o f 1 6 0 m g / d l g l u c o s e , p y r u v a t e a n d G I P 81 g ) O t h e r m e t a b o l i t e s .81 2. H P L C - p u r i f i e d G I P C o m p o n e n t s 8 8 a ) G I P , , ? . . , . 8 8 b) G I P ™ 8 8 c ) E G I I + I I I , F r a c t i o n A a . 9 3 d) I o d i n a t e d E G I I I c o m p o n e n t s 93 i ) 1 2 7 I - E G I I I 9 3 i i ) O x i d i z e d E G I I I . 97 3 . . I n t e r a c t i o n o f G I P a n d D - g l y c e r a l d e h y d e i n t r i - i o d o t h y r o n i n e - t r e a t e d r a t s 97 B. S o m a t o s t a t i n R e l e a s e 101 1. T h e o p h y l l i n e , g l u c o s e a n d G I P 101 I I . H P L C . . . . . '. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 5 A. G r a d i e n t F o r m a n d T e r m i n o l o g y . . . . . . . . . . . 1 1 5 1 . T e r m i n o l o g y 1 1 5 2. I n t r i n s i c A r t e f a c t s . 1 1 5 a ) L a g t i m e . . . . . . . . . . . . 1 1 6 b) B a c k g r o u n d a b s o r b a n c e . . . . . . . . . . . . 1 1 6 c ) S o l v e n t P e a k s . . . . . . . . . . . . . . . . 1 1 6 d) I n j e c t i o n A r t e f a c t s . . . 1 1 8 B. P u r i f i c a t i o n S t a g e s o f G I P 1 1 8 1 . P u r i f i c a t i o n S t a g e s . . . . . . . . 1 1 8 2. P u r i f i c a t i o n P r o c e s s f o r G I P 1 _ 4 2 1 2 4 a ) E l u t i o n C o n d i t i o n s . . . . . . . . . . . . . 1 2 4 b) P u r i f i c a t i o n . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 4 c ) Y i e l d . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 2 4 3. S i d e F r a c t i o n s f r o m t h e P u r i f i c a t i o n o f G I P . . 1 2 7 v i i P a 9 e a ) E G I + I I , F r a c t i o n C . , 1 2 7 b) E G I I + I I I , F r a c t i o n A 1 2 7 C. L - C C K 1 2 7 1. P u r i f i c a t i o n S t a g e s . . 1 3 2 a) E G I + I I , F r a c t i o n C 1 3 2 b) A f t e r C M - S e p h a d e x a n d G - 2 5 . 1 3 2 2. H P L C P u r i f i c a t i o n o f L - C C K 1 3 2 a ) R e s o l u t i o n o f c o m p o n e n t : p e a k s 1 3 2 b) P u r i f i c a t i o n . . 1 3 2 c ) P r o p e r t i e s o f L - C C K 1 4 0 d ) H P L C u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y . . . . . . . . . . . . . . . 1 4 0 e ) M o d i f i c a t i o n s o f L - C C K . 1 4 2 i ) T r y p t i c d i g e s t i o n . 1 4 2 i i ) N - c h l o r o s u c c i n i m i d e d i g e s t i o n 1 4 2 D. M o d i f i c a t i o n o f G I P 1 4 2 1. C y a n o g e n B r o m i d e ^ ( C N B R ) 1 4 2 2. N - c h i o r o s u c c t n i m i d e 1 5 2 3. P r o n a s e . 1 5 2 4. T r y p s i n 1 5 8 5. S t o r a g e d e g r a d a t i o n . . . . . . 1 5 8 E . I o d i n a t e d G I P C o m p o n e n t s . . . . . . . . . . . . . 1 6 4 1. E l u t i o n C h a r a c t e r i s t i c s 1 6 4 2. I d e n t i f i c a t i o n o f C o m p o n e n t s . . . . . . . . . . 1 7 2 a) I d e n t i f i c a t i o n o f o x - E G I I I p e a k s 1 7 9 b) I d e n t i f i c a t i o n o f i o d i n a t e d E G I I I . . . . . 1 7 9 c ) O t h e r a s p e c t s . . . . . 1 8 3 3. P u r i f i c a t i o n o f C o m p o n e n t s . . . . . . . . . . . 1 8 7 a ) P u r i f i c a t i o n s y s t e m . . . . . . . . . . . . 1 8 7 b) P u r i f i c a t i o n f o r b i o a s s a y . 1 8 7 c ) P u r i f i c a t i o n f o r a n a l y s i s o f i o d i n a t i o n s t a t e 1 8 7 d) P u r i f i c a t i o n f o r u s e i n b i n d i n g e x p e r i m e n t s . 191 I I I . L I P R O P R O T E I N L I P A S E S T U D I E S . . . . . . . . . . . . . 1 9 5 I V . C H A R A C T E R I Z A T I O N O F I O D I N A T E D G I P . . . . . . . . . . 2 0 4 v i i i * Page A. Adso rp t i on Chromatography of HPLC 1 2 5 / 1 2 7 I -E > GI TI . 204 1. C a l i b r a t i o n of Column 204 2. Chromatography of p rona se -d i ge s ted HPLC samples 204 B. A d s o r p t i o n C h r o m a t o g r a p hy of P r 6 n a s e - d i q e s t e d Fra ct i on s From . t he . Pi ir 1 f i cat i on of 1 z a I - EG111 f o r Use in Radioimmunoassay . . . . . . . . . 2 08 V. BINDING STUDIES 219 A. N o n - s: p e c i f i c Bind i n g . . . . . . . .' .' . . . . . . .219 1. F i l t r a t i o n System . . . . . . 219 2. O i l F l o t a t i o n System 219 3. Adherence to Incubat ion Vesse l s . . . . . . . . 219 B. Attempts to Demonstrate D i s p l a c e a b l e B ind ing . . . 220 1. F i l t r a t i o n System 220 a) HPLC p u r i f i e d I^I-GIP 220 b) QUS0 p u r i f i e d '^ 5 I -GIP . . . 222 2. O i l F l o t a t i o n System 222 C. Summary . . . 226 DISCUSSION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . 226 REFERENCES . . . . . . . . . . 258 i x L I S T OF T A B L E S T a b l e P a g e 1 I n s u l i n r e l e a s e i n r e s p o n s e t o g l y c e r a l d e h y d e a n d G I P 63 2 I n s u l i n r e l e a s e i n r e s p o n s e t o 2 - k e t o i s o c a p r o a t e a n d G I P 67 3 I n s u l i n r e l e a s e i n r e s p o n s e t o 2 - k e t o c a p r o a t e a n d G I P 71 4 I n s u l i n s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o L - l e u c i n e a n d G I P . . . 74 5 I n s u l i n s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o L - l e u c i n e , L - g l u t a m i n e , d b c A M P a n d G I P . 7 8 6 I n s u l i n s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o 8 0 r a g / d l g l u c o s e , 30mM p y r u v a t e a n d G I P 82 7 I n s u l i n s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o 8 0 m g / d l a n d 1 6 0 m g / d T g l u c o s e a n d G I P . . 84 8 I n s u l i n s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o 8 0 m g / d l a n d 1 6 0 m g / d l g l u c o s e , 30mM p y r u v a t e a n d G I P 86 9 E f f e c t o f v a r i o u s m e t a b o l i c c o m p o u n d s o n i n s u l i n s e c r e t i o n . . . . 89 10 I n s u l i n s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o 8 0 m g / d l a n d 1 6 0 m g / d l g l u c o s e ; w i t h 0 + l O n g / m l GI P -j ^ a n d G I P 3 42 l i n e a r g r a d i e n t s . . . . . . 7 91 11 I n s u 1 i n s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o 8 0 m g / d l a n d 1 6 0 m g / d l g l u c o s e a n d a O-H OOng/mT l i n e a r E G I I + I I I , F r a c t i o n A a g r a d i e n t 95 12 E f f e c t o f H P L C - p u r i f i e d 1 2 7 1 - E G111 a n d o x i d i z e d E G ' I I I o n i n s u l i n s e c r e t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 3 0 0 m g / d l g l u c o s e 99 13 E f f e c t o f D - g l y c e r a l d e h y d e on i n s u l i n s e c r e t i o n f r o m n o r m a l a r id T g - t r e a t e d p a n c r e a t a . 1 0 3 14 E f f e c t o f G I P a n d D - g l y c e r a l d e h y d e on i n s u l i n s e c r e t i o n f r o m n o r m a l a n d T g - t r e a t e d p a n c r e a t a . 1 0 5 15 E f f e c t o f g l u c o s e , G I P a n d 5.OmM t h e o p h y l ! i n e on s o m a t o s t a t i n s e c r e t i o n 1 1 0 16 E f f e c t o f g l u c o s e , G I P a n d 2 .5mM t h e o p h y l 1 i n e on s o m a t o s t a t i n s e c r e t i o n . . . . . . 1 1 3 X Tabl e Page 17 E f f e c t o f GIP on LPLA i n the p resence o f ImU/ml i n s u l i n 197 18 E f f e c t of GIP on LPLA i n the absence o f i n s u l i n . . . . . . 200 19 ALPLA . V 202 20 R a d i o a c t i v i t y i n peak f r a c t i o n s from a d s o r p t i o n chromatography of p r o n a s e - d i g e s t e d GIP m o l e c u l e s . 209 21 R a d i o a c t i v i t y i n peak f r a c t i o n s from a d s o r p t i o n chromatography o f p r o n a s e - d i g e s t e d , H P L C - p u r i f i e d 1 25/1 2 7 I _ E G r I J . . f r a c t i o n S i 211 X 1 L I S T O F F I G U R E S F i g u r e P a g e 1 A n i d e a l i z e d s c h e m e o f t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f a h o r m o n e 2 2 S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f a n H P L C s y s t e m . . . .38 3 E f f e c t o f D - G l y c e r a l d e h y d e a n d G I P o n i n s u l i n r e l e a s e 62 4 E f f e c t o f 2 - k e t o i s o c a p r o a t e a n d G I P o n i n s u l i n r e l e a s e . 66 5 E f f e c t o f 2 - k e t o c a p r o a t e a n d G I P o n i n s u l i n r e l e a s e . . . . . 70 6 I n s u l i n r e l e a s e d b y 2 - - k e t o i s o c a p r o a t e o r 2-' .... k e t o c a p r o a t e i n t e g r a t e d o v e r 4 0 m i n u t e s . . . . . 7 3 7 E f f e c t o f G I P a n d g l u t a m i n e • + 1 e u c i n e o n i n s u 1 i n s e c r e t i o n 7 7 8 E f f e c t - o f d b c A M P a n d L - l e u c i n e + L - g l u t a m i n e o n i n s u l i n s e c r e t i o n . . 80 9 E f f e c t o f 1 6 0 m g / d l g l u c o s e a n d 0 + 1 0 n g / m l GIP-j ^2 a n ^ ^ ^ 3 _ 4 ' 2 o n i n s u ^ i n s e c r e t i o n . . . . 90 10 E f f e c t o f 1 6 0 m g / d l g l u c o s e a n d 0 > 1 O O n g / n l E G I I + I I I , F r a c t i o n A a o n i n s u l i n . s e c r e t ! o n • • 9 4 I T E f f e c t o f H P L C - p u r i f i e d - E G I I I c o m p o n e n t s o n i n s u l i n r e l e a s e i n t h e p r e s e n c e o f 30 0 m g / d l g l u c o s e . . 9 8 12 E f f e c t o f D - g l y c e r a 1 d e h y d e o n i n s u l i n s e c r e t i o n f r o m n o r m a l a n d T ^ - t r e a t e d p a i r c r e a t a 1 0 2 13 E f f e c t o f D - g 1 y c e r a 1 d e n y d e a n d G I P o n i n s u l i n s e c r e t i o n f r o m n o r m a l a n d T ^ - t r e a t e d p a n c r e a t a . 1 0 7 14 E f f e c t o f g l u c o s e , G I P a n d 5.0mM t h e o p h y l l i n e o n s o m a t o s t a t i n s e c r e t i o n . . . . . . 1 0 9 15 E f f e c t o f g l u c o s e , G I P a n d 2.5mM t h e o p h y l 1 i n e o n s o m a t o s t a t i n s e c r e t i o n . . . . . . 1 1 2 16 A r t e f a c t s a n d b a c k g r o u n d . . . . . . . . . . . . 1 1 7 x i i F i g u r e P a g e 17 P u r i f i c a t i o n s c h e m e f o r G I P 1 1 9 1 8 E G I 1 2 0 19 E G I I 1 2 1 2 0 E G I I I . . . . . 12 2 21 G I P l - 4 2 • • 1 2 3 22 E G I I I a t t w o d i f f e r e n t a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n s 1 2 5 23 P u r i f i c a t i o n o f G I P 1 _ 4 2 f r o m E G I I I . . . . . . . 1 2 6 24 E G I + I I , f r a c t i o n C 1 2 8 25 C o m p a r i s o n o f t h e e l u t i o n p r o f i l e s o f E G I I I a n d E G I I + I I I , f r a c t i o n A 1 2 9 2 6 P u r i f i c a t i o n o f E G I I + I I I A f r o m E G I I + I I I , f r a c t i o n A 13 0 2 7 P u r i f i c a t i o n s c h e m e f o r L - C C K 131 2 8 L - C C K P u r i f i c a t i o n S t a g e s - a f t e r C M - S e p h a d e x : _ 2 5 . 1 3 3 2 9 L - C C K P u r i f i c a t i o n S t a g e s - a f t e r S e p h a d e x G - 2 5 . 1 3 4 30 R e s o l u t i o n o f L - C C K c o m p o n e n t p e a k s 1 3 5 31 C C K - 8 1 3 6 32 C C K - 3 3 1 3 7 33 C C K - 3 9 . . . . . 1 3 8 34 H P L C p u r i f i c a t i o n o f L - C C K . . 1 3 9 35 L - C C K a f t e r H P L C p u r i f i c a t i o n 141 36 E l u t i o n p r o f i l e o f a " p o s t - G 2 5 " f r a c t i o n B . . . 1 4 3 37 A n a l y s i s o f f r a c t i o n 21 f r o m f i g u r e 36 1 4 4 3 8 A n a l y s i s o f f r a c t i o n 2 5 f r o m f i g u r e 36 1 4 5 39 A n a l y s i s o f f r a c t i o n 3 0 f r o m f i g u r e 3 6 . . . . . 1 4 6 40 T r y p t i c d i g e s t o f L - C C K " I 4 7 41 B a c k g r o u n d f o r f i g u r e s 4 0 a n d 42 1 4 8 42 T r y p t i c d i g e s t o f L - C C K a f t e r G - 2 5 1 4 9 X 1 1 1 F i g u r e Page 43 N - c h l o r o s u c c i n i m i d e d i g e s t o f L-CCK 150 44 N - c h l o r o s u c c i n i m i d e d i g e s t o f L-CCK a f t e r G-25 . . 151 45 C N B r - c l e a v e d GIP: C - t e r m i n a l f ragment . . . . . . 153 46 C N B r - c l e a v e d GIP: N - t e r m i n a l f ragment 153 47 EGI I I 153 48 NCS - reagent s . . . . . . . . . 154 49 NCS- reagent s . . . . . . 155 50 NCS - reagent s . 156 51 NCS - c l eaved GIP . 157 52 Pronase b l a n k : 10 seconds a f t e r pronase a d d i t i o n . 159 53 E G I I I ; 10 seconds a f t e r pronase a d d i t i o n 160 54 T r y p s i n - c l e a v e d GIP 161 55 S t o r a g e - d e g r a d e d EGI I I a f t e r 3 days 162 56 S t o r a g e - d e g r a d e d EGI I I " a f t e r one week . . . . . . 163 57 EGI I I 164 58 1 2 7 I - E G I I I 166 59 Ch l o r am ine -T . . . . . . . . . . . . . 167 60 O x i d i z e d , n o n - i o d i n a t e d EGI I I . . . . . 168 61 EGI I I w i t h r e v e r s e d - o r d e r , o x i d i z i n g and r e d u c i n g agents . . . . . . . . . 169 62 1 2 7 1 - EGI11 170 63 EGI I I 171 64 ox-EGI 11 : 15 seconds exposure 173 65 o x - E G I 1 1 : 30 seconds exposure . . . . . . . . . . . 174 66 o x - E G i r i 45 second exposure . . . . . . . 175 67 EGI I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 176 68 1 2 7 I - E G I I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 177 69 ox -EG I I I . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 178 x i v F i gure Page 70 ox-EGIIT and EGI I I 180 71 ox-EGIII and 1 2 7 1 - EG111 181 72 1 2 5 / 1 2 7 I - E G I I I . . . . . . . . . 182 73 oxidized GIP -, _ 4 2 184 74 1 2 7 I - E G I I I 185 7 5 EGI I I 186 127/127 75b Two s tage i s o c r a t i c s e p a r a t i o n o f •• • I - E G111 components 188 12 7 76 P u r i f i c a t i o n o f I-E G111 components 189 7 7 B a s e l i n e f o r F i g u r e 76 190 12 7/127 78 1 I -EGI I I p u r i f i c a t i o n f o r a n a l y s i s of . i o d i n a t i o n s t a t e 192 79 1 2 5 / 1 2 7 I - E G I I I components . . . . . . . 193 1 ? 5 80 I - EG I I I : r a d i o a c t i v e e l u t i o n p r o f i l e s 194 81 E f f e c t o f GIP on LPLA i n t he p re sence o f Imll/ml i n s u l i n . 196 82 E f f e c t o f GIP on LPLA i n the absence o f i n s u l i n . 199 83 E l u t i o n p r o f i l e o f MIT and DIT s t anda rd s 205 127 84 A d s o r p t i o n chromatography of Na I on Sephadex G-10 206 85 A d s o r p t i o n chromatography o f pronase d i g e s t e d HPLC f r a c t i o n A on Sephadex G-10 . . . . 213 86 A d s o r p t i o n chromatography o f p r o n a s e - d i g e s t e d HPLC f r a c t i o n B on Sephadex G-10 214 87 A d s o r p t i o n chromatography o f p r o n a s e - d i g e s t e d HPLC f r a c t i o n C on Sephadex G-10 .„ 215 125 88 CM-Sephadex 52 chromatography of I-GIP . . . . 216 89 A d s o r p t i o n chromatography o f p r o n a s e - d i g e s t e d CM52 f r a c t i o n I on Sephadex G-10 . 217 90 A d s o r p t i o n chromatography of p r o n a s e - d i g e s t e d CM52 f r a c t i o n IT on Sephadex G-10 218 12 5 91 B i n d i n g of I-GIP to a d i p o c y t e s i n the p re sence o f n o n i o d i n a t e d GIP . . . . . . . 221 XV F i g u r e : P a g e 12 5 92 B i n d i n g o f I - G I P t o a d i p o c y t e s i n t h e p r e s e n c e o f u n i o d i n a t e d G I P . ... . . 2 2 3 12 5 9 3 D i s p l a c e m e n t o f I - i n s u l i n b y u n i o d i n a t e d i n s u l i n . . . . . . 2 2 4 94 S o m e p o t e n t i a l d e r i v a t i z a t i o n s o f a m i n o a c i d s 'to i n r e s p o n s e t o o x i d a t i o n 2 5 2 x v i L I S T OF A B B R E V I A T I O N S AUFS A r b i t r a r y U n i t s F u l l S c a l e ( a m e a s u r e m e n t o f s p e c t r o p h o t o m e t r y a b s o r b a n c e p r o v i d e d by t h e H P L C s y s t e m c o n s i s t e n t t h r o u g h o u t a l l H P L C t r a c e s b u t n o t n e c e s s a r i l y c o r r e s p o n d i n g w i t h a c t u a l a b s o r b a n c e ) . B SA B o v i n e S e r u m A l b u m i n B S A - B S S B a l a n c e d S a l t S o l u t i o n w i t h 4% BSA BSS B a l a n c e d S a l t S o l u t i o n cAMP A d e n o s i n e 3 ' , 5 ' - c y c l i c m o n o p h o s p h a t e CCK C h o l e c y s t o k i n i n - p a n c r e o z y m i n CT C h l o r a m i n e - T 6 2 1 d b c A M P N , 0 - D i b u t y r y l A d e n o s i n e 3 ' - 5 ' c y c l i c m o n o p h o s p h a t e D IT D i i o d o t y r o s i n e E G I , I I , I I I F r a c t i o n s f r o m t h e p u r i f i c a t i o n o f G I P ( s e e p a g e 1 3 1 ) FFA F r e e F a t t y A c i d s GEP G a s t r o - E n t e r o - P a n c r e a t i c G I P G l u c o s e - d e p e n d e n t I n s u l i n o t r o p i c P o l y p e p t i d e ( G a s t r i c I n h i b i t o r y P e p t i d e ) H P L C H i g h P r e s s u r e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y I R - G I P . Immunoreact i ve ' PIP . i I RI I m m u n o r e a c t i v e I n s u l i n L P L A L i p o p r o t e i n L i p a s e - l i k e A c t i v i t y M IT M o n o i o d o t y r o s i n e N A D ( P ) + N i c o t i n a m i d e A d e n i n e D i n u c 1 e o t i d e ( P h o s p h a t e ) - o x i d i z e d f o r m N A D ( P ) H N i c o t i n a m i d e A d e n i n e D i n u c l e o t i d e ( p h o s p h a t e ) - r e d u c e d f o r m N a M e t S o d i u m M e t a b i s u l p h i t e x v i i N C S N - c h 1 o r o s u c c i n a m i d e NSB N o n - s p e c i f i c B i n d i n g o x - E G I I I O x i d i z e d , n o n i o d i n a t e d E G I I I PSI Pounds p e r S q u a r e I n c h SL I S o m a t o s t a t i n - 1 i k e I m m u n o r e a c t i v i t y T , T r i i o d o t h y r o n i n e -x v i i i S T A T I S T I C A L A N A L Y S I S W i t h o u t e x c e p t i o n , s t a t i s t i c a l a n a l y s e s o f r e s u l t s p r e s e n t e d i n t h i s t h e s i s w e r e p e r f o r m e d u s i n g t h e t w o - t a i l e d , u n - p a i r e d S t u d e n t ' s t - T e s t v i a a H e w l e t t - P a c k a r d HP 11-C c a l c u l a t o r p r o g r a m . x i x A C K N O W L E D G E M E N T S I w i s h t o t h a n k my s u p e r v i s o r , D r . J o h n C. B r o w n , f o r h i s g u i d a n c e a n d s u p p o r t t h r o u g h o u t my p e r i o d o f s t u d y . I am a l s o i n d e b t e d t o D r s . C . H . S . M c i n t o s h a n d R.A. P e d e r s o n f o r t h e i r h e l p a n d f r i e n d s h i p , a n d t o t h e n u m e r o u s p e o p l e , p a r t i c u l a r l y M r s . S . C . O t t e , D r . Y i n - N a m Kwok a n d D r . E . K a m i n s k a , w i t h whom I h a v e h a d e i t h e r t h e p l e a s u r e o f c o l l a b o r a t i n g o r t h e o p p o r t u n i t y t o e x c h a n g e i d e a s . I m u s t a l s o t h a n k M r . K u r t H e n z e a n d M r . R a l p h A s s i n a f o r t h e i r a s s i s t a n c e i n p r e p a r i n g m a n y o f t h e d i a g r a m s i n t h i s t h e s i s . F i n a n c i a l s u p p o r t i n t h e f o r m o f a n H.R. M a c M i l l a n F a m i l y F e l l o w s h i p i s g r a t e f u l l y a c k n o w l e d g e d . 1 . I N T R O D U C T I O N T h e a c t i o n o f a h o r m o n e , w i t h i n t h e c o n t e x t o f a p h y s i o -l o g i c a l s y s t e m , m a y b e s u b d i v i d e d i n t o s e v e r a l c o m p o n e n t s ( f i g u r e 1). T h e p r i m a r y s t a g e o f t h e i n v e s t i g a t i o n o f m o s t e n d o c r i n e s u b s t a n c e s h a s t r a d i t i o n a l l y i n v o l v e d t h e c o r r e l a t i o n o f t h r e e o f t h e s e c o m p o n e n t s : a p h y s i o l o g i c a l s t i m u l u s , a b i o l o g i c a l r e s p o n s a n d t h e s e c r e t i o n o f a b l o o d - b o r n e m e d i a t o r c o n n e c t i n g t h e t w o e v e n t s . T h i s c o r r e l a t i o n c a n b e r e c o g n i z e d - o n l y a f t e r p u r i f i c a t -i o n a n d s t r u c t u r a l i d e n t i f i c a t i o n o f t h e a c t i v e p r i n c i p l e i s a c h i e v e d , s i n c e t h e p r o d u c t i o n o f a b i o l o g i c a l r e s p o n s e m u s t b e s h o w n t o b e a n e f f e c t o f t h e a d m i n i s t r a t i o n o f e x o g e n o u s h o r m o n e a n d s i n c e t h e d e v e l o p m e n t o f t e c h n i q u e s f o r m e a s u r i n g e n d o g e n o u s h o r m o n a l s e c r e t i o n a l s o r e q u i r e t h e p u r i f i e d s u b s t a n c e . T h e d e mo s t r a t i o n o f a n e n d o c r i n e - m e d i a t e d b i o l o g i c a l r e s p o n s e t h e n a l l o w s e x a m i n a t i o n o f o t h e r c o m p o n e n t s o f t h e s y s t e m . I n t h e p h y s i o l o g i c s t a t e , h o r m o n a l s e c r e t i o n o f t e n s e r v e s a n a d a p t i v e o r h o m e o s t a t i c f u n c t i o n . A p e r t u r b a t i o n f r o m s o m e h o m e o s t a t i c i d e a l i s o f t e n a s t i m u l u s l e a d i n g t o t h e c o r r e c t i v e s e c r e t i o n o f a n a p p r o p r i a t e h o r m o n e . T h e s u b s e q u e n t r e s t o r a t i o n o f h o m e o s t a t i s d u e t o t h i s s e c r e t i o n i n h i b i t s f u r t h e r r e l e a s e o f t h e h o r m o n e i n s o m e m a n n e r - t h i s " n e g a t i v e - f e e d b a c k " b e i n g a n e s s e n t i a l f e a t u r e o f a n y r e g u l a t o r y s y s t e m . T o b e e f f e c t i v e , t h i s f e e d b a c k m u s t b e a c c o m p a n i e d b y t h e c l e a r a n c e o f ' p r e v i o u s l y s e c r e t e d h o r m o n e f r o m t h e c i r c u l a t i o n t h r o u g h e n z y m a t i c i n a c t i v a t i o n a n d / o r r e m o v a l o f t h e s u b s t a n c e b y t h e l i v e r o r k i d n e y s . A g e n e r a l m e c h a n i s m a p p e a r s t o e x i s t b y w h i c h p e p t i d e h o r m o n e s e x e r t t h e i r e f f e c t s u p o n t a r g e t c e l l s . T h e i n i t i a l s t e p i n t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f a b i o - a c t i v e p e p t i d e i n v o l v e s 2 Receptor binding FIGURE 1 : An i d e a l i z e d s c h e m e o f t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f a h o r m o n e 3 a r e v e r s i b l e b i n d i n g i n t e r a c t i o n w i t h a c e l l s u r f a c e r e c e p t o r . S u c h a r e c e p t o r w o u l d p o s s e s s a h i g h s t r u c t u r a l s p e c i f i c i t y a n d a f f i n i t y f o r t h e p e p t i d e a n d w o u l d s e r v e t o t r i g g e r a s e q u e n c e o f i n t r a c e l l u l a r e v e n t s ( p o s s i b l y t h r o u g h c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s i n t h e r e c e p t o r o r s o m e n e a r b y m o l e c u l e ) l e a d i n g t o a r e s p o n s e i n t h e t a r g e t c e l l . T h e s e i n t r a c e l l u l a r e v e n t s m a y v a r y w i d e l y i n t y p e : e n z y m a t i c , s y n t h e t i c , i o n i c , m o t i l e , e l e c t r i c - a n d o f t e n a c o m b i n a t i o n o f a l l o f t h e s e a c t i v i t i e s w o u l d b e e x p e c t e d . T h e i n v e s t i g a t i o n o f t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f a p e p t i d e h o r m o n e c a n t h e r e f o r e i n c l u d e t h e s t u d y o f a w i d e r a n g e o f i n t r a c e l l u l a r e v e n t s i n m a n y t y p e s o f t a r g e t c e l l s a s w e l l a s 1 i g a n d - r e c e p t o r i n t e r a c t i o n s o n t h e s u r f a c e s o f t h e s e c e l l s . T h e d i s c o v e r y , d u r i n g t h e 1 9 7 0 s , o f m o r e t h a n a d o z e n b i o l o g i c a l l y a c t i v e p e p t i d e s l o c a l i z e d i n t h e d i f f u s e e n d o c r i n e c e l l s a n d n e r v e t e r m i n a l s o f t h e g a s t r o - i n t e s t i n a l t r a c t a n d p a n c r e a t i c i s l e t s ( R e h f e l d , 1 9 8 1 ) p r e s e n t s t h e r e s e a r c h e r w i t h m a n y p u t a t i v e p h y s i o l o g i c a l s y s t e m s i n n e e d o f i n v e s t i g a t i o n . S o m e o f t h e s e p e p t i d e s a r e w e l l c h a r a c t e r i z e d i n t e r m s o f l o c a t i o n a n d b i o l o g i c a c t i v i t y w h i l e o t h e r s a r e o f y e t u n k n o w n s i g n i f i c a n c e a n d s t r u c t u r e . I n a d d i t i o n i t h a s b e c o m e e v i d e n t t h a t t h e r e g u l a t o r y p e p t i d e s o f t h e g a s t r o - e n t e r o - p a n c r e a t i c ( G E P ) s y s t e m m a y e x e r t t h e i r e f f e c t s t h r o u g h a v a r i e t y o f t r a n s -p o r t a t i o n m e c h a n i s m s w h i c h a r e d i s t i n c t f r o m t h e " e n d o c r i n e " m o d e o f t r a n s m i s s i o n . T h e i m m u n o l o g i c a l i d e n t i f i c a t i o n o f m a n y o f t h e s e p e p t i d e s i n c e n t r a l , a u t o n o m i c a n d p e r i p h e r a l n e u r o n e s a d d s f u r t h e r c o m p l e x i t y t o t h e i r s t u d y . A n u n d e r s t a n d i n g o f t h e m a n y i n t e r a c t i o n s o f t h e G E P p e p t i d e s i n a p h y s i o l o g i c s e t t i n g w i l l r e q u i r e a k n o w l e d g e o f t h e s t i m u l i , a c t i o n s , c h e m i s t r y , l o c a l i z a t i o n s a n d m e c h a n i s m s o f a c t i o n of t h e s e s u b s t a n c e s b o t h . . i n 4 i s o l a t i o n a n d i n c o m b i n a t i o n . G l u c o s e - d e p e n d e n t i n s u l i n o t r o p i c p o l y p e p t i d e ( G I P ) i s a 4 2 a m i n o a c i d g u t h o r m o n e o f s e q u e n c e : N H ^ T J r - A l a - G l u - G l y - T n V - P h e - I l e - S e r - A s p - T y r 1 -S e r - I l e - A l a - M e t - A ^ - L y s - I l e - A r g - G ? 8 - G l n - A s p -P h e - V a l - A s n - T 2 ^ - L e u - L e u - A l a - G i n - L y ^ - G l y - L y s -L y s - S e r - A ^ - T r p - L y s - H i s - A s n - l f O - T h r - G l n ( J ' o r n v a l l e t a l , 1 9 8 1 ) . T h e i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f t h i s p e p t i d e f r o m p o r c i n e d u o d e n o - j e j u n a ! m u c o s a ( B r o w n , M u t t a n d P e d e r s o n , 1 9 7 0 ; B r o w n e t a l , 1 9 6 9 ) , w a s :\f. i r s t a c c o m p l i s h e d b y c o n c e n t r a t i n g a c o m p o n e n t o f t h o s e i m p u r e c h o l e c y s t o k i n i n -p a n c r e o z y m i n ( C C K ) p r e p a r a t i o n s w h i c h w e r e c a p a b l e o f i n h i b i t i n g a c i d s e c r e t i o n i n d u c e d b y e x o g e n o u s g a s t r i n i n a s u r g i c a l l y p r e p a r e d d o g m o d e l ( B r o w n a n d P e d e r s o n , 1 9 7 0 ) . I t w a s f o r t u n a t e , t h a t t h i s m o d e l u s e d a v a g a l l y a n d s y m p a t h e t i c a l l y d e n e r v a t e d p o u c h o f t h e s t o m a c h o f t h e d o g f o r t h e m e a s u r e m e n t o f a c i d s e c r e t i o n , s i n c e t h e a c i d - i n h i b i t o r y e f f e c t o f G I P h a s s i n c e b e e n f o u n d t o b e w e a k o r n o n e x i s t e n t i n b o t h d o g a n d man w h e n i n n e r v a t i o n i s l e f t i n t a c t ( S o o n - S h i o n g e t a l , 1 9 7 9 a ; M a x w e l l e t a l , 1 979.) o r w h e n c h o l i n o m i m e t i c s a r e p r e s e n t ( S o o n - S h i o n g e t a l , 1 9 7 9 b ) . A n e x p l a n a t i o n o f t h i s p h e n o m e n o n h a s b e e n p r o p o s e d b y M c i n t o s h e t a l ( 1 9 7 9 ) . T h e y d e m o n s t r a t e d t h a t a n i n f u s i o n o f p o r c i n e G I P a t d o s e s o f 5 n g / m l a n d 5 0 n g / m l p r o d u c e d d o s e - r e l a t e d i n c r e a s e s i n s o m a t o s t a t i n - 1 i k e i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e e f f l u e n t f r o m t h e i s o l a t e d p e r f u s e d s t o m a c h o f t h e r a t . T h i s i n c r e a s e _7 c o u l d b e b l o c k e d b y a d m i n i s t r a t i o n o f 10 M a c e t y l c h o l i n e t o t h e p e r f u s a t e o r b y v a g a l s t i m u l a t i o n ( 7 v . , 1 0 H z , 5 m s e c d u r a t i o n ) a p p l i e d a t t h e l e v e l o f t h e o e s o p h a g u s . B o t h t h e s e e f f e c t s w e r e n e g a t e d b y t h e a p p l i c a t i o n o f 10;pM a t r o p i n e . S i n c e e x o g e n o u s 5 s o m a t o s t a t i n i s k n o w n t o b e a p o t e n t i n h i b i t o r o f g a s t r i c a c i d s e c r e t i o n t h e y s u g g e s t e d t h a t " a s o m a t o s t a t i n - 1 i k e p e p t i d e r e l e a s e d f r o m t h e D - c e l l m a y b e a n i n t e r m e d i a t e i n t h e i n h i b i t o r y a c t i o n o f G I P " a n d t h a t t h e w e a k o r a b s e n t a c i d - i n h i b i t o r y a c t i o n o f G I P i n t h e n o r m a l l y i n n e r v a t e d s t o m a c h m a y r e s u l t f r o m c h o l i n e r g i c i n t e r f e r e n c e w i t h G I P - s t i m u l a t e d s o m a t o s t a t i n s e c r e t i o n . T h e w e a k a c i d i n h i b i t o r y e f f e c t o f G I P i n t h e i n t a c t s t o m a c h l e a d t o s o m e d i f f i c u l t y i n a s c r i b i n g a g a s t r i c s u p p r e s s i v e r o l e t o t h e p e p t i d e i n t h e p h y s i o l o g i c a l s t a t e . K o s a k a a n d L i m ( 1 9 3 0 ) f o r m u l a t e d t h e i d e a o f a n " e n t e r o g a s t r o n e " - a h o r m o n e r e l e a s e d f r o m t h e e n t e r i c m u c o s a w h i c h w o u l d i n h i b i t g a s t r i c s e c r e t i o n a n d m o t i l i t y i n t h e H e i d e n h a i n p o u c h i n t h e d o g w h i c h h a d b e e n s t i m u l a t e d b y a m e a l o r b y h i s t a m i n e . T h e e n t e r o g a s -t r o n e a c t i o n o f i n g e s t e d f a t o n t h e t r a n s p l a n t e d g a s t r i c p o u c h o f t h e d o g h a d p r e v i o u s l y b e e n n o t e d b y F a r r e l a n d I v y ( 1 9 2 6 ) , a f i n d i n g w h i c h i n d i c a t e d t h a t a h u m o r a l m e c h a n i s m m u s t b e i n v o l v e d . P u r i f i c a t i o n o f G I P l e d t o t h e d e v e l o p m e n t o f a r a d i o -i m m u n o a s s a y b y K u z i o e t a l ( 1 9 7 4 ) c a p a b l e o f m e a s u r i n g p l a s m a l e v e l s o f t h e p e p t i d e . T h e y r e p o r t e d a n i n c r e a s e i n s e r u m G I P -1 i k e i m m u n o r e a c t i v i t y ( I R - G I P ) i n h u m a n s f o l l o w i n g a m i x e d m e a l a n d b o t h B r o w n ( 1 9 7 4 ) a n d F a l k o e t a l ( 1 9 7 5 ) d e m o n s t r a t e d a r i s e i n s e r u m I R - G I P l e v e l s a f t e r t r i g l y c e r i d e i n g e s t i o n i n h u m a n s . O ' D o r i s i o e t a l ( 1 9 7 6 ) w e r e a b l e t o d e m o n s t r a t e a s i m i l a r e f f e c t o f i n t r a d u o d e n a l t r i g l y c e r i d e i n f u s i o n i n d o g s . B e c a u s e G I P was r e l e a s e d i n t o t h e c i r c u l a t i o n b y t h e p r e s e n c e o f i n t r a d u o d e n a l f a t d i g e s t i o n p r o d u c t s a n d s i n c e i t a l s o p o s s e s s e d g a s t r i c a c i d i n h i b i t o r y p r o p e r t i e s i t m a y b e a c o m p o n e n t o f t h e e n t e r o g a s t r o n e a c t i o n o f i n g e s t e d f a t s . A n u n d e r s t a n d i n g o f s u c h a r o l e i n a p h y s i o l o g i c a l c o n t e x t i s c o m p l i c a t e d b y • .?. 6 p o s s i b l e i n t e r a c t i o n s w i t h , a t l e a s t , s o m a t o s t a t i n a n d c h o l i n e r g i c i n f l u e n c e s . S p e c u l a t i o n a b o u t t h e r e l e v a n c e o f G I P ' s e n t e r o g a s t r -o n e e f f e c t w i l l c e r t a i n l y c a u s e f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n o f t h i s a c t -i o n . I t i s n o t u n u s u a l f o r a g a s t r o i n t e s t i n a l p e p t i d e t o e x e r t s e v e r a l q u i t e d i f f e r e n t b i o l o g i c a l e f f e c t s . F o r e x a m p l e , C C K s t i m u l a t e d g a l l b l a d d e r c o n t r a c t i o n " , p a n c r e a t i c e n z y m e s e c r e t i o n a n d m a y h a v e h a d a t r o p h i c e f f e c t o n a c i n a r t i s s u e ( R o t h m a n a n d W e l l s , 1 9 6 7 ) . When R a b i n o v i t c h a n d D u p r e ( 1 9 7 2 ) f o u n d t h a t i m p u r e CCK p r e p a r a t i o n s w e r e m o r e p o t e n t t h a n p u r e CCK p r e p a r a t i o n s i n e l i c i t i n g i n s u l i n r e l e a s e i n h u m a n s a n d i n t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s i t s u g g e s t e d t h e p o s s i b i l i t y t h a t c o n t a m i n a t i o n o f t h e p r e p a r a t i o n w i t h G I P m i g h t b e p r o d u c i n g a n i n s u T i n o t r o p i c e f f e c t . T h e p o s s i b i l i t y t h a t a n e n t e r i c s u b s t a n c e c o u l d a f f e c t p h y s i o l o g i c a l g l u c o s e m a n a g e m e n t w a s n o t e d b y M o o r e e t a l ( 1 9 0 6 ) who f o u n d t h a t e x t r a c t s o f p o r c i n e d u o d e n a l - j e j u n a l m u c o s a , a d m i n -i s t e r e d o r a l l y , i m p r o v e d t h e g l y c o s u r i a o f d i a b e t i c s . I m p l i c a t -i o n s o f i n s u l i n a s a c o m p o n e n t o f t h i s e f f e c t c a m e w h e n E l r i c k e t a l ( 1 9 6 4 ) s h o w e d t h a t o r a l l y . a d m i n i s t e r e d g l u c o s e i n d u c e d a l a r g e r r i s e i n p l a s m a i n s u l i n l e v e l s t h a n t h e s a m e d o s e o f g l u c o s e a d m i n -i s t e r e d i n t r a v e n o u s l y . M c l n t y r e e t a l ( 1 9 6 4 ) u s i n g a d i r e c t j e j u n a l i n f u s i o n o f g l u c o s e w e r e a b l e t o a t t r i b u t e t h i s e f f e c t t o a n e n t e r i c s o u r c e . D u p r e e t a l ( 1 9 7 3 ) d e m o n s t r a t e d t h e i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t o f p u r i f i e d p o r c i n e G I P i n n o r m a l h u m a n s . T h i s s t u d y , a n d s u b -s e q u e n t s t u d i e s i n d o g ( P e d e r s o n e t a 1 , 1 9 7 5 ) a n d r a t ( P e d e r s o n a n d B r o w n , 1 9 7 6 ) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e ' i n s u - 1 i n o t r o p t c a c t i o n o f G I P r e q u i r e d t h a t h y p e r g l y c a e m i a f i r s t b e p r e s e n t . No 7 i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t o f G I P w a s o b s e r v e d i n m a n i n t h e e u g l y -c a e m i c e s t a t e , ( E l a h i e t : a l , . 1 9 7 9 ) . L a b a r r e ( 1 9 3 2 ) i n t r o d u c e d t h e t e r m " i n c r e t i n " t o d e s c r i b e a h u m o r a l f a c t o r w i t h h y p o g l y c a e m i c p r o p e r t i e s r e l e a s e d f r o m t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t . T h e c o n c e p t w a s f u r t h e r r e f i n e d b y U n g e r a n d E i s e n t r a u t ( 1 9 6 9 ) who p r o p o s e d t h a t s o m e r e g u l a t i o n o f p a n c r e a t i c h o r m o n a l s e c r e t i o n c o u l d b e e x e r t e d b y h o r m o n e s o f t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t . T h i s m e c h a n i s m w o u l d r e p r e s e n t a n e l e g a n t d e v i c e f o r m a i n t a i n i n g t h e " c o n s t a n c y o f t h e i n t e r n a l m i l i e u " s i n c e i t c o n s i s t e d o f a h o r m o n e ( i n c r e t i n ) b e i n g r e l e a s e d i n a n t i c i p a t i o n o f a d i s r u p t i o n o f h o m e o s t a s i s ( h y p e r g 1 y c a e m i a ) r e s u l t i n g i n a r a p i d a d j u s t m e n t i n t h e a p p r o p r i a t e c o n t r o l s y s t e m ( i n s u l i n s e c r e t i o n ) . A n o t h e r e x a m p l e o f s u c h a m e c h a n i s m i s t h e r e l e a s e o f g a s t r i n b y i n t r a g a s t r i c c a l c i u m - a n e f f e c t w h i c h i n t u r n w o u l d e l i c i t t h e r e l e a s e o f c a l c i t o n i n ( C o o p e r e t a l , 1 9 7 1 ) , a h o r m o n e w h i c h w o u l d t e n d t o c o u n t e r a c t t h e p o t e n t i a l h y p e r c a 1 c a e m i c e f f e c t o f i m m i n e n t c a l c i u m a b s o r p t i o n f r o m t h e s m a l l i n t e s t i n e . S t u d i e s o f t h e l o c a l i z a t i o n a n d c a r b o h y d r a t e - i n d u c e d r e l e a s e o f G I P h a v e c o n f i r m e d t h e p h y s i o l o g i c a l r e l e v a n c e o f G I P ' s i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t . T h e s i t u a t i o n o f G l P - p r o d u c i n g e n d o c r i n e c e l l s i n t h e s m a l l i n t e s t i n e w a s s h o w n u s i n g i n d i r e c t i m m u n o f l u o r e s c e n c e b y P o l a k e t a l ( 1 9 7 3 ) . T h e c e l l s w e r e e v e n t u a l l y i d e n t i f i e d ( B u f f a e t a l , 1 9 7 5 ) . a s " K c e l l s " ( S o l c i a e t a l , 1 9 7 4 ) a n d w e r e f o u n d p r e d o m i n a n t l y i n t h e m i d - z o n e o f t h e d u o d e n u m a n d i n t h e u p p e r j e j u n u m o f d o g a n d man ( P o l a k e t a l , 1 9 7 3 ) . T h o m a s e t a l ( 1 9 7 7 ) m e a s u r e d G I P r e l e a s e i n t o t h e c i r c u l a t i o n i n r e s p o n s e t o g l u c o s e s t i m u l a t i o n o f s m a l l , i s o l a t e d a r e a s o f h u m a n i n t e s t i n e i n s i t u . T h e y c o n c l u d e d t h a t 8 t h e I R - G I P w a s r e l e a s e d p r i m a r i l y f r o m t h e p r o x i m a l s m a l l i n t e s -t i n e , t h o u g h s m a l l a m o u n t s w e r e r e l e a s e d f r o m t h e d i s t a l s m a l l i n t e s t i n e . C e r t a i n l y G I P - p r o d u c i n g x e l .1 s w e r e s i t u a t e d : i n a f a v o u r a b l e p o s i t i o n t o m e d i a t e a n i n c r e t i n - 1 i k e e f f e c t . S i m u l t a n e o u s m e a s u r e m e n t b y C a t a l a n d e t a l ( 1 9 7 4 ) , o f s e r u m g l u c o s e , I R - G I P , a n d i m m u n o r e a c t i v e i n s u l i n ( I R I ) a f t e r g l u c o s e i n g e s t i o n ' d e m o n s t r a t e d : t h a t : t h e ^ r i s e \ n.n p o r t a 1 v v e n o u s I R - G I P p r e c e d e d t h a t o f I R I b y s e v e r a l m i n u t e s , w h e r e a s i n t r a -v e n o u s g l u c o s e w o u l d n o t p r o d u c e a n e l e v a t i o n o f s e r u m I R - G I P . T h e c a u s a l l i n k b e t w e e n G I P , h y p e r g l y c a e m i a a n d i n s u l i n s e c r e t i o n i n a p h y s i o l o g i c a l s e t t i n g w a s t h e n e s t a b l i s h e d b y A n d e r s e n e t a l ( 1 9 7 8 ) , u s i n g t h e t e c h n i q u e o f t h e h y p e r g l y c a e m i c c l a m p . T h i s t e c h n i q u e a l l o w e d t h e m a i n t e n a n c e o f a s t e a d y h y p e r g l y -c a e m i a t h a t w o u l d b e b o t h u n a f f e c t e d b y e n d o g e n o u s i n s u l i n s e c r e t i o n a n d w h i c h c o n s i s t e n t l y s t i m u l a t e d i n s u l i n s e c r e t i o n i n a p r e d i c t a b l e p a t t e r n . I n g e s t i o n o f g l u c o s e p r o d u c e d a n i n c r e a s e i n s e r u m i n s u l i n a b o v e t h a t p r o d u c e d b y i n t r a v e n o u s g l u c o s e , a n d t h e t i m e c o u r s e o f t h e i n c r e a s e i n s e r u m I R - G I P m a t c h e d t h a t o f t h e I R - i n s u l i n . I n a e u g l y c a e m i c c l a m p n o e n d o g e n o u s i n s u l i n r e l e a s e c o u l d b e o b s e r v e d i n r e s p o n s e t o a G I P i n f u s i o n . T o g e t h e r w i t h t h e r e s u l t s o f D u p r e . e t a l ( 1 9 7 3 ) i n w h i c h p h y s i o l o g i c a l d o s e s o f G I P a n d i n t r a v e n o u s g l u c o s e p r o d u c e d a n i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t , t h e s e r e s u l t s e s t a b l i s h e d a r o l e f o r G I P a s a p h y s i o l o g i c a l p o t e n t i a t o r o f g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e . A l t h o u g h t h e i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t o f G I P i s w e l l s u b -s t a n t i a t e d , t h e m e c h a n i s m b y w h i c h G I P e x e r t s t h i s e f f e c t o n t h e B c e l l i s n o t u n d e r s t o o d . S i n c e t h e a c t i o n o f G I P o n t h i s t a r g e t c e l l i s g l u c o s e - c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n t i t c a n b e 9 p o s t u l a t e d t h a t t h e c e l l u l a r m e c h a n i s m s b y . w h i c h g l u c o s e i n i t i a t e s i n s u l i n r e l e a s e a n d b y w h i c h G I P p o t e n t i a t e s t h i s r e l e a s e c o u l d b e i n t i m a t e l y a s s o c i a t e d . Two m o d e l s h a v e b e e n p r o p o s e d t o e x p l a i n g l u c o s e - s t i m u 1 a t -e d i n s u l i n r e l e a s e . T h e f i r s t o f t h e s e , t h e " r e g u 1 a t o r - s i t e h y p o -t h e s i s " p o s t u l a t e d a b i n d i n g o f g l u c o s e t o a " g l u c o r e c e p t o r " -p r e s u m a b l y a p r o t e i n l o c a t e d o n t h e B c e l l m e m b r a n e . T h i s i n t e r -a c t i o n w o u l d t h e n t r i g g e r t h e s e c r e t i o n a n d b i o s y n t h e s i s ' o f i n s u l i n w h i c h i s o b s e r v e d i n i s l e t t i s s u e u n d e r ' s t i m u l a t e d c o n d i t i o n s . L i t t l e c o n c r e t e e v i d e n c e h a s b e e n a d v a n c e d t o s u b s t a n t i a t e t h i s m o d e l . A l t h o u g h a m o l e c u l e , w h i c h b i n d s D - g l u c o s e , s t e r e o s p e c i f i c -a l l y , e x i s t s i n t h e B c e l l m e m b r a n e i n t h e f o r m o f t h e c a r r i e r r e s p o n s i b l e f o r g l u c o s e t r a n s p o r t ( P r i c e , 1 9 7 3 ; H e l l m a n e t a l , 1 9 7 1 ) i t i s u n l i k e l y t h a t t h i s s y s t e m s i g n a l s i n s u l i n r e l e a s e s i n c e s o m e n o n s t i m u l a t o r y s u g a r s w e r e t r a n s p o r t e d b y t h e s a m e s y s t e m ( M c D a n i e l e t a l , 1 9 7 4 ; H e l l m a n e t a l , 1 9 7 3 a , 1 9 7 3 b ) . A d d -i t i o n a l l y , t h e a c c u m u l a t i n g e v i d e n c e i n s u p p o r t o f t h e s e c o n d m o d e l o f g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e h a s l e d m o s t r e s e a r c h e r s t o a b a n d o n t h e " r e g u l a t o r - s i t e h y p o t h e s i s " . R e c e n t l y , i n h i s r e v i e w o f t h e d a t a s u p p o r t i n g t h e t w o m o d e l s , H e d e s k o v ( 1 9 8 0 ) c o n -c l u d e d t h a t " t h e e v i d e n c e f o r t h e r e g u 1 a t o r - s i t e m o d e l s e e m s w e a k , f r a g m e n t a r y a n d c o n t r a d i c t o r y " . T h e s e c o n d m o d e l w a s t h e " s u b s t r a t e - s i t e h y p o t h e s i s " ( t o u s e t h e t e r m i n o l o g y o f R a n d l e e t a l ( 1 9 6 8 ) ) . T h i s m o d e l t h e o r i z e d t h a t a r e l a t i o n s h i p e x i s t e d b e t w e e n s u g a r m e t a b o l i s m a n d i n s u l i n r e l e a s e - t h a t t h e c a t a b o l i s m o f g l u c o s e o r o t h e r n u t r i e n t s s i g n a l l e d a n d p r o v i d e d t h e e n e r g y f o r i n s u l i n s e c r e t i o n a n d b i o s y n t h e s i s . T h i s t h e o r y a r o s e o u t o f t h e o b s e r v a t i o n s 10 t h a t n o n - m e t a b o l i z a b l e s u g a r s d i d n o t s t i m u l a t e i n s u l i n r e l e a s e ( G r o d s k y e t a l , 1 9 6 3 ) , t h a t t h e r e l a t i v e i n s u l i n o t r o p i c c a p a c i t y o f d i f f e r e n t s u g a r s w a s p r o p o r t i o n a l t o t h e i r a b i l i t y t o b e m e t a b o l i z e d i n t h e B - c e l l ( M a l a i s s e e t a l , 1 9 7 4 , 1 9 7 6 ; S e n e r e t a l 1 9 7 6 , 1 9 7 7 ) a n d t h a t g l y c o g e n o l y s i s f r o m e n d o g e n o u s B - c e l l g l y c o g e n s t o r e s e v o k e d i n s u l i n r e l e a s e i n t h e a b s e n c e o f e x t r a -c e l l u l a r g l u c o s e ( M a l a i s s e e t a l , 1 9 7 7 ) . I n t h i s m o d e l , t h e " g l u c o r e c e p t o r " w o u l d b e i d e n t i f i e d w i t h t h e r a t e - l i m i t e d s t e p o f g l u c o s e u t i l i z a t i o n - t h e p h o s p h o r y l a t i o n o f g l u c o s e , p e r h a p s b y o n e o f t h e i d e n t i f i e d i s l e t p h o s p h o r y 1 a t i n g e n z y m e s ( A s h c r o f t , 1 9 8 0 ) . T h o s e e v e n t s i n t h e s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g m e c h a n i s m , o f i n s u l i n r e l e a s e s u b s e q u e n t t o t h e e n t r y o f g l u c o s e i n t o g l y -c o l y s i s h a v e b e e n s u b j e c t e d t o i n t e n s e i n v e s t i g a t i o n b y m a n y r e s e a r c h e r s d u r i n g t h e l a s t f i f t e e n y e a r s . T h e f o l l o w i n g g e n e r a l o u t l i n e o f e v e n t s c a n b e s u g g e s t e d w i t h i n t h e f r a m e w o r k o f t h e " s u b s t r a t e - s i t e h y p o t h e s i s " . A . r i s i n g i n t r a c e l l u l a r g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n r e s u l t s i n a n i n c r e a s e d c a t a b o l i c f l u x t h r o u g h t h e g l y c o l y t i c p a t h w a y . T h i s c a u s e s , p o s s i b l y t h r o u g h a l t e r a t i o n s o f t h e c e l l u l a r N A D ( P ) H / N A D ( P ) v r a t i o , p h o s p h a t e p o t e n t i a l a n d p H , a c h a n g e i n t h e i o n o p h o r e t i c t r a n s p o r t o f K + a n d C a + + a c r o s s t h e c e l l m e m b r a n e , a n e f f e c t w h i c h a p p e a r s t o b e c o n t e m p o r a n e o u s w i t h a m e m b r a n e p o t e n t i a l d e p o l a r i z a t i o n . A s u b s e q u e n t r e d i s t r i b u t i o n o f o r g a n e l 1 e - b o u n d c a l c i u m r e s u l t s i n a n a c c u m u l a t i o n o f C a i n a c r i t i c a l l o c a t i o n i n t h e B - c e l l , a c t i v a t i n g a n e n e r g y - r e q u i r i n g e f f e c t o r s y s t e m w h i c h c o n t r o l s t h e t r a n s l o c a t i o n a n d e x o c y t o s i s o f i n s u l i n - c o n t a i n i n g s e c r e t o r y g r a n u l e s . E n e r g y f o r t h i s p r o e . c e s s w o u l d b e s u p p l i e d b y t h e o x i d a t i o n o f g l u c o s e a n d t h e 11 p r o c e s s i t s e l f p r o b a b l y o c c u r s t h r o u g h the p a r t i c i p a t i o n o f a m i c r o t u b u l a r - m i c r o f i 1 a m e n t o u s s y s t e m . O t h e r i n s u l i n o t r o p i c s u b -s t r a t e s wou ld s t i m u l a t e i n s u l i n s e c r e t i o n t h r o u g h d i r e c t or i n d i r e c t i n c r e a s e s i n the m e t a b o l i c f l u x o f t he B - c e l l , w h i l e m o d u l a t i o n o f t h i s b a s i c e f f e c t c o u l d o c c u r i n r e s p o n s e to a v a r i e t y o f d r u g s , hormones and a g e n t s such as 3 ' , 5 ' a d e n o s i n e c y c l t c m o n o p h o s p h a t e .(cAMP) I t w i l l no t be p o s s i b l e to u n e q u i v o c a l l y d e m o n s t r a t e t he t r u t h o f the s u b s t r a t e - s i t e h y p o t h e s i s , s i n c e e v i d e n c e i s a v a i l a b l e o n l y i n the fo rm o f p a r a l l e l s be tween c a t a b o l i c f l u x e s and i n s u l i n s e c r e t i o n ( A s h c r o f t 1 9 8 1 ) . The model c o u l d be d i s -c a r d e d i n the f a c e o f any i n d i s p u t a b l e r e p o r t o f a d i s s o c i a t i o n between m e t a b o l i c and i n s u l i n - s e c r e t o r y a c t i v i t i e s . N e v e r t h e l e s s , -r e g a r d l e s s o f the a c c u r a c y o f the m o d e l , Z a w a l i c h e t a l (1978) have n o t e d the v a l u e o f a f r amework t h a t p r o v i d e s a b a s i s f o r e x p e r i m e n t a t i o n and u n d e r s t a n d i n g o f t he s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p -l i n g mechan i sm o f g 1 u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e . M a t s c h i n s k y e t a l (1975) d i v i d e d i n s u 1 i n o t r o p i c a g e n t s i n t o two c l a s s e s and drew a t t e n t i o n to t he two s e p a r a t e ways i n w h i c h i n s u l i n s e c r e t i o n i s s t i m u l a t e d . Group a^  s e c r e t a g o g u e s were t h o s e w h i c h , l i k e g l u c o s e , ^ . i n d e p e n d e n t l y i n i t i a t e d i n s u l i n r e l e a s e . Group b_ s e c r e t a g o g u e s were t h o s e w h i c h r e q u i r e d " t h e p r e s e n c e o f one o r s e v e r a l o t h e r e f f e c t o r m o l e c u l e s " i n o r d e r t o e x e r t an i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t . T h e s e s e c r e t a g o g u e s p o t e n t i a t e d the i n s u l i n r e l e a s e w h i c h had' been i n i t i a t e d by t he m e t a b o l i s m o f a g r o u p a^  s e c r e t a g o g u e . C l e a r l y t he g l u c o s e - d e p e n d e n t i n s u l i n o -t r o p i c a c t i o n o f GIP wou ld i n d i c a t e t h a t t h e hormone must be c l a s s i f i e d as a g r oup b_ s e c r e t a g o g u e . 12 Of i n t e r e s t i s the l o c a t i o n o f the i n t e r a c t i o n between the p o t e n t i a t i v e e f f e c t s o f GIP and the i n i t i a t i v e e f f e c t s of g l u c o s e . The systems c o u l d i n t e r a c t at some s p e c i f i c m e t a b o l i c s i t e , such as i n f l u e n c i n g the l e v e l o f one or more c r i t i c a l m e t a b o l i t e s , or the e f f e c t c o u l d be at some more d i s t a l l o c a t i o n i n the s t i m u l u s -s e c r e t i o n c o u p l i n g scheme o u t l i n e d e a r l i e r . Even a p o s s i b l e i n -d i r e c t i n t e r c e l l u l a r i n t e r a c t i o n has been proposed by Brown et a l ( 1 980 ) , who s p e c u l a t e d t h a t the b i p h a s i c n a t u r e of t h e i n s u l i n re sponse to a square wave GIP i n f u s i o n i n the i s o l a t e d p e r f u s e d r a t pancreas may r e s u l t from a G I P - s t i m u l a t e d s o m a t o s t a t i n surge from i s l e t D - c e l l s . Th i s surge c o u l d produce the t r a n s i e n t i n h i b i -t i o n of i n s u l i n r e l e a s e which causes a b i p h a s i c p r o f i l e . The measurement of changes of membrane p o t e n t i a l , i on f l u x , and i n t r a c e l l u l a r m e t a b o l i t e and c y c l i c n u c l e o t i d e l e v e l s i n re sponse to GIP i s not p o s s i b l e because of the r e l a t i v e i n s e n -s i t i v i t y of i s o l a t e d i s l e t p r e p a r a t i o n s to the p e p t i d e . E x p l a n a -t i o n s of t h i s phenomenon have been proposed by Brown et a l (1980) which d e a l t c h i e f l y w i t h the n o n - p h y s i o l o g i c c o n d i t i o n s e x p e r -i e n c e d by c o l l a g e n a s e - d i g e s t e d , s t a t i c a l l y i n c u b a t e d , compact t i s s u e s where hormone d e l i v e r y i s a c c o m p l i s h e d by d i f f u s i o n , r a t h e r than v i a the m i c r o - c i r c u l a t i o n . I n v e s t i g a t i o n of the i n t e r a c t i o n of the e f f e c t s of GIP w i t h i n t e r m e d i a r y metabolism i s p o s s i b l e th rough the examination of the p o t e n t i a t i v e a b i l i t y o f GIP i n combination w i t h i n i t i a t o r s of i n -s u l i n secretion.other than glucose. In t h i s manner, some i d e a of the m e t a b o l i c s i t e o f such an i n t e r a c t i o n can be o b t a i n e d . The d i f -f e r e n t catabol ic routes through which these nutrients are oxidized provides a method whereby i n t r a c e l l u l a r l e v e l s o f d i f f e r e n t m e t a b o l i t e s may be manipulated. Compar ison of the p r o f i l e of p o t e n t i a t i o n 13 p r o d u c e d b y G I P a n d t h e s e i n i t i a t o r s w i t h t h a t o f o t h e r k n o w n p h y s i o l o g i c a l p o t e n t i a t o r s , s u c h a s c A M P , m a y p r o v i d e s o m e c i r -c u m s t a n t i a l e v i d e n c e o f t h e i d e n t i t y o f t h e e n h a n c i n g m e c h a n i s m . E a r l i e r , r e f e r e n c e w a s m a d e t o t h e o f t e n v a r i e d b i o l o g i c a l e f f e c t s w h i c h m a y b e e x e r t e d b y a g a s t r o i n t e s t i n a l p e p t i d e . S e v -e r a l a c t i o n s o f G I P d i s t i n c t f r o m t h e i n s u 1 i n o t r o p i c a n d a c i d -i n h i b i t o r y h a v e b e e n s u g g e s t e d . I n h i b i t i o n o f g a s t r i n ( V i l l a r e t a l , 1 9 7 6 ) a n d p e p s i n r e l e a s e i n H e i d e n h a i n p o u c h a n d v a g a l l y d e n e r v a t e d g a s t r i c p o u c h d o g s ( P e d e r s o n a n d B r o w n , 1 9 7 2 ) , r e s p e c -t i v e l y , i n r e s p o n s e t o a G I P i n f u s i o n h a v e b e e n r e p o r t e d . D e -c r e a s e d i n t e s t i n a l w a t e r a b s o r p t i o n ( H e l m a n a n d B a r b e z a t , 1 9 7 7 ) a n d e f f e c t s o n s a l i v a r y e l e c t r o l y t e c o m p o s i t i o n ( D e n n i s s a n d Y o u n g , 1 9 7 8 ) h a v e b e e n n o t e d w i t h p h y s i o l o g i c a l d o s e s o f G I P , t h o u g h l i t t l e i n t e r e s t h a s b e e n s h o w n i n p u r s u i n g t h e s e p h e n o m e n a . T h e k n o w l e d g e t h a t t h e i n c r e t i n e f f e c t o f G I P r e p r e s e n t s a n i n t e s t i n a l " e a r l y w a r n i n g d e v i c e " ( T e p p e r m a n , 1 9 8 0 ) f o r a n i m m i n e n t t h r e a t t o h o m e o s t a s i s s u g g e s t s t h a t t h e t r i g l y c e r i d e -i n d u c e d r e l e a s e o f G I P m a y s e r v e a s i m i l a r f u n c t i o n . I n t e s t i n a l u p t a k e o f l i p o l y t i c d i g e s t i o n p r o d u c t s ( 2 - m o n o g l y c e r i d e s a n d f a t t y a c i d s ) i s f o l l o w e d b y i n t r a c e l l u l a r r e s y n t h e s i s o f t r i a c y l -g l y c e r o l s a l o n g w i t h c h o l e s t e r o l , p h o s p h o l i p i d s a n d a p o p r o t e i n s t o f o r m l i p o p r o t e i n s d e s i g n a t e d a s " c h y l o m i e r a " . T h e s e c h y l o -m i c r a a r e r e l e a s e d i n t o t h e i n t e r c e l l u l a r s p a c e b y r e v e r s e d p i n o -c y t o s i s , a n d e n t e r t h e s y s t e m i c c i r c u l a t i o n v i a t h e t h o r a c i c d u c t . C h y l o m i c r a a r e r a p i d l y c l e a r e d f r o m t h e c i r c u l a t i o n , t h e h a l f -l i f e o f a - : c h y ] o m i c r o n b e i n g a p p r o x i m a t e l y t e n m i n u t e s w i t h t o t a l d i s a p p e a r a n c e o f p o s t - p r a n d i a l c h y l o m i c r a b e i n g c o m p l e t e i n a b o u t t w o h o u r s . T h e r a p i d s t o r a g e o f c h y l o m i c r o n - d e r i v e d t r i a c y l -g l y c e r o l i n a d i p o s e t i s s u e i s a c c o m p l i s h e d b y t h e h y d r o l y s i s o f 14 t h e l i p o p r o t e i n c o m p l e x b y t h e e n z y m e l i p o p r o t e i n l i p a s e ( E C 3.1.1. 3 4 ) , w i t h a s u b s e q u e n t c e l l u l a r a b s o r p t i o n o f ^ t h e r e s u l t i n g f r e e f a t t y a c i d s a n d g l y c e r o l a l l o w i n g r e s y n t h e s i s a n d s t o r a g e o f t r i a c y 1 g l y c e r o 1 w i t h i n t h e a d i p o c y t e . A c t i v e l i p o p r o t e i n l i p a s e a p p e a r s t o b e l o c a t e d a t , o r n e a r , t h e l u m i n a l s u r f a c e o f c a p i l l -a r y e n d o t h e l i a l c e l l s ( K o m p i a n g e t a l , 1 9 7 6 ; S c h o t z e t a l , 1 9 7 7 ) a n d a p r o b a b l y i n a c t i v e f o r m o f t h e g l y c o p r o t e i n i s f o u n d i n s i d e a n u m b e r o f c e l l t y p e s - n o t a b l y i n a d i p o c y t e s ( R o d b e l l , 1 9 6 4 ) a n d c a r d i a c m u s c l e c e l l s ( B a g b y e t a l , 1 9 7 7 ) . S t u d i e s o f t h e r e l e a s e o f G I P i n t h e . p r e s e n c e o f i n t r a -l u m i n a l f a t d i g e s t i o n p r o d u c t s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t t r i g l y c e r i d e h y d r o l y s i s w a s a n e c e s s a r y p r e r e q u i s i t e ( R o s s a n d S h a f f e r , 1 9 8 1 ) a n d t h a t l o n g c h a i n f a t t y a c i d s r e p r e s e n t e d t h e p r i m e s t i m u l i ( R o s s a n d S h a f f e r , 1 9 8 1 ; O ' D o r i s i o e t a l , 1 9 7 6 ) o f f a t - i n d u c e d G I P s e c r e t i o n . I f t h i s G I P s e c r e t i o n c o u l d i n t u r n i n c r e a s e l i p o -p r o t e i n l i p a s e a c t i v i t y a r o l e a n a l a g o u s t o t h e i n c r e t i n e f f e c t o f G I P o n c a r b o h y d r a t e s t o r a g e v i a i n s u l i n w o u l d e x i s t . C e r t a i n l y l i p o p r o t e i n l i p a s e w a s s e n s i t i v e t o b o t h s t i m u l a t o r y ( i n s u l i n a n d g 1 u c o c o r t o c o i d s - ( C r y e r e t a l , 1 9 7 6 ; d e G a s q u e t e t a l , 1 97 5 ) a n d i n h i b i t o r y h o r m o n a l e f f e c t s ( g l u c a g o n , c a t e c h o l a m i n e s , a d r e n o -c o r t i c o t r o p i c c h o r m o n e a n d t h y r o i d s t i m u l a t i n g h o r m o n e - W i n g a n d R o b i n s o n , 1 9 6 8 ; D a v i e s e t a l , 1 9 7 4 ; N e s t e l a n d A u s t i n , 1 9 6 9 ) . E c k e l e t a l ( 1 9 7 9 ) d e m o n s t r a t e d a d o s e - r e l a t e d i n c r e a s e i n l i p o -p r o t e i n l i p a s e - l i k e a c t i v i t y i n c u l t u r e d r a t p r e - a d i p o c y t e s i n r e s p o n s e t o p o r c i n e G I P . O n e c o n s e q u e n c e o f t h e a b s e n c e o f a n i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t o f G I P o n i s o l a t e d i s l e t s o f L a n g e r h a n s h a s b e e n t h e d i f f i c u l t y o f o b t a i n i n g a s u i t a b l e t i s s u e f o r e x p l o r i n g t h e p o s s i b l e n a t u r e o f a n i n t e r a c t i o n b e t w e e n G I P a n d a c e l l - s u r f a c e r e c e p t o r . I f 1 5 G I P e x e r t e d a b i o l o g i c a l e f f e c t o n a d i p o s e t i s s u e , n a m e l y s t i m u -l a t i o n o f l i p o p r o t e i n l i p a s e a c t i v i t y , t h e n t h e i s o l a t e d f a t c e l l p r e p a r a t i o n o f R o d b e l l a n d K r i s h n a ( 1 9 7 4 ) s h o u l d p r o v i d e a s y s t e m s u i t a b l e f o r t h e s t u d y o f s p e c i f i c b i n d i n g o f G I P t o t a r g e t c e l l s . S e v e r a l t e c h n i c a l d i f f i c u l t i e s m u s t b e o v e r c o m e b e f o r e s u c h s t u d i e s c a n b e i n i t i a t e d . I f t h e s t u d y o f b i n d i n g o f a r a d i o -l i g a n d t o a t a r g e t c e l l i s t o b e p h y s i o l o g i c a l l y r e l e v a n t t h e n t h e t r a c e r u s e d m u s t b e b i o l o g i c a l l y a c t i v e . I t s h o u l d a l s o p o s s e s s a s u f f i c i e n t l y h i g h s p e c i f i c a c t i v i t y t o a l l o w d i s c r i m -i n a t i o n b e t w e e n c e l l u l a r b i n d i n g l e v e l s o f o n l y a f e w p e r c e n t d i f f e r e n c e . R a d i o i o d i n a t i o n o f t y r o s i n e r e s i d u e s h a s b e e n a common m e t h o d o f p r o d u c i n g r a d i o a c t i v e l y " l a b e l l e d " p e p t i d e s , a n d t h i s h a s u n f o r t u n a t e l y b e e n a c c o m p a n i e d b y p o t e n t i a l l y d i s r u p t i v e d e r i v a -t i z a t i o n o f s e v e r a l a m i n o a c i d s . T h e s e d e r i v a t i z a t i o n s m a y a f f e c t t h e a v i d i t y w i t h w h i c h a " r e c e p t o r " m o l e c u l e b i n d s a p e p t i d e , p e r h a p s r e n d e r i n g t h e p e p t i d e b i o l o g i c a l l y i n a c t i v e . U n d e r s t a n d a b l y , t h e p u r i t y o f t h e r a d i o l i g a n d m u s t b e h i g h . H e t e r o g e n e i t y o f t h e t r a c e r c a n a r i s e f r o m s e v e r a l s o u r c e s : t h e r e a c t i o n o f i o d i n e w i t h t y r o s i n e c a n r e s u l t i n m o n o - o r d i -i o d i n a t e d f o r m s o f t h e a m i n o a c i d , d e p e n d i n g o n t h e r e a c t i o n c o n -d i t i o n s w h i c h a r e u s e d . A d d i t i o n a l l y a l l , n o n e , o r s e v e r a l o f t h e t y r o s i n e s i n a p e p t i d e m a y b e i o d i n a t e d ( t h e r e a r e t w o t y r o -s i n e r e s i d u e s i n G I P ) . E a c h d i f f e r i n g c o m b i n a t i o n o f s i t e s o f i o d i n a t i o n o r - m u l t i p l e i o d i n a t i o n c a n p o t e n t i a l l y a l t e r t h e t e r t i a r y s t r u c t u r e - a n d h e n c e t h e r e c e p t o r a f f i n i t y - o f t h e m o l e c u l e . I f a b i o l o g i c a l e f f e c t i s t o b e a t t r i b u t e d t o a n i o d i n a t e d t r a c e r , t h e n i t m u s t b e c o n c l u s i v e l y d e m o n s t r a t e d t h a t t h e p r e p a r a t i o n d o e s n o t c o n t a i n u n l a b e l l e d p e p t i d e m o l e c u l e s 16 w h i c h m i g h t b e r e s p o n s i b l e f o r t h e b i o - a c t i v i t y - a r e q u i r e m e n t w h i c h h a s o f t e n b e e n e x p e r i m e n t a l l y i g n o r e d . A n o t h e r o b v i o u s s o u r c e o f i m p u r i t y l i e s i n t h e p e p t i d e p r e p a r a t i o n s t h e m s e l v e s . H i g h p r e s s u r e l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) h a s r a r e l y d e m o n s t r a t e d a n h o m o g e n o u s m o n o - c o m p o n e n t p r o -t e i n p r o f i l e u n l e s s H P L C p u r i f i c a t i o n o f t h e p e p t i d e h a s b e e n p r e v i o u s l y p e r f o r m e d . T h i s h e t e r o g e n e i t y m a y b e a t t r i b u t a b l e , i n p a r t , t o t h e p h y s i o 1 o g i c a 1 1 y o c c u r r i n g d i v e r s i t y o f f o r m s o f p o l y p e p t i d e s . A n a l y s i s o f G I P p e p t i d e s b y r a d i o i m m u n o a s s a y r e v e a l s t h a t t h e y a r e p r e s e n t b o t h i n c i r c u l a t i o n a n d i n t i s s u e s o f o r i g i n i n a v a r i e t y o f m o l e c u l a r f o r m s ( I r v i n e a n d M u r p h y , 1 9 8 1 ) . I n d e e d , i t h a s o f t e n b e e n d i f f i c u l t t o d e f i n i t e l y a s c r i b e t h e p h y s i o l o g i c a l a c t i o n o f a p e p t i d e t o a p a r t i c u l a r m o l e c u l a r f o r m s i n c e v a r y i n g b i o l o g i c a l p o t e n c i e s a n d c i r c u l a t i n g h a l f - l i v e s a r e p r e s e n t f o r e a c h f o r m . D e t e c t a b l e c i r c u l a t i n g p e p t i d e ' s p e c i e s g e n e r a l l y d i f f e r i n c h a i n l e n g t h . F o r e x a m p l e , a 34 a m i n o a c i d g a s t r i n m o l e c u l e ( G - 3 4 ) o f m o d e r a t e b i o l o g i c a l a c t i v i t y c o e x i s t e d i n p l a s m a o f man a n d d o g ' w i t h t h e p o t e n t 17 C - t e r m i n a l a m i n o a c i d f o r m ( G - 1 7 ) a n d w i t h a 14 C - t e r m i n a l a m i n o a c i d f o r m ( G - 1 4 ) ( R e h f e l d a n d U v n a s -W a l l e n s t e n , 1 9 7 8 ) . T e t r i n , t h e C - t e r m i n a l t e t r a d e c a p e p t i d e a m i d e o f b o t h C C K a n d g a s t r i n , i t s e l f e x h i b i t e d g a s t r i n - l i k e a c t i v i t y . I t h a s n o t b e e n p o s s i b l e t o s t a t e u n e q u i v o c a l l y t h a t t h e s e f o r m s a r o s e f r o m l i m i t e d p r o t e o l y s i s i n c i r c u l a t i o n , a l t h o u g h s o m e o f t h i s h e t e r o g e n e i t y r e s u l t e d f r o m p o s t - s e c r e t o r y c l e a v a g e o f t h e m o l e c u l e s . A n u m b e r o f h o r m o n e s a r e now k n o w n t o e x i s t i n e x t e n d e d p r e c u r s o r f o r m w i t h i n t h e i r c e l l s o f s y n t h e s i s . T h i s e x t e n s i o n t a k e s t h e f o r m o f s o - c a l l e d p r e - a n d p r o - s e q u e n c e s . P r e -17 s e q u e n c e s w e r e ( w i t h t h e e x c e p t i o n o f o v a l b u m i n • (. L i n g a p p a e t a l , 1 9 7 9 ) ) l o c a t e d a t t h e N - t e r m i n a l e n d o f a s e c r e t o r y p e p t i d e m o l e -c u l e a n d c o n t a i n e d a h y d r o p h o b i c a r e a c a p a b l e o f b i n d i n g t o a " r e c e p t o r " l o c a t e d o n t h e m e m b r a n e o f t h e r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i -c u l u m . T h e s i g n a l h y p o t h e s i s o f B l o b e l a n d S a b a t i n i ( 1 9 7 1 ) t h e o r -i z e d t h a t t h i s c o n n e c t i o n f a c i l i t a t e d t r a n s p o r t o f a n a s c e n t p e p t i d e c h a i n i n t o t h e c i s t e r n a l s p a c e o f t h e r o u g h e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m . D u r i n g t h i s t r a n s p o r t t h e p r e - s e q u e n c e w o u l d b e c l e a v e d f r o m t h e n e w l y s y n t h e s i z e d m o l e c u l e b y a n e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m m e m b r a n e - b o u n d e n z y m e . T h e l i s t o f s e c r e t o r y p r o t e i n s w i t h i d e n t i f i e d p r e s e q u e n c e s i s q u i c k l y e x p a n d i n g ( s e e S c h e e l e , 1 9 8 0 ; I r v i n e a n d M u r p h y , 1 9 8 1 ) . P r o - s e q u e n c e s , i n c o n t r a s t , m a y b e e x t e n s i o n s a t N- o r C-t e r m i n a l o r m a y b e i n t e r n a l l y l o c a t e d ( a s i s t h e c o n n e c t i n g p e p -t i d e o f i n s u l i n ) . T h e y a r e g e n e r a l l y , t h o u g h n o t i n e v i t a b l y , r e m o v e d b y t r y p s i n - l i k e c l e a v a g e a t p a i r s o f b a s i c a m i n o a c i d s w h i c h l i n k t h e m w i t h t h e a c t i v e p r o t e i n - a c l e a v a g e w h i c h p r o b a b l y o c c u r s ' w i t h i n t h e G o l g i - a p p a r a t u s . a n d s e c r e t o r y g r a n u l e s . T h e f u n c t i o n o f p r o - s e q u e n c e s i s n o t a l w a y s e v i d e n t t h o u g h i n a t l e a s t o n e i n s t a n c e , t h a t o f i n s u l i n , t h e p r e s e n c e o f t h e c o n n e c t -i n g p e p t i d e w a s n e c e s s a r y i n o r d e r t o a l i g n t h e m o l e c u l e p r o p e r l y s o t h a t d i s u l p h i d e b o n d f o r m a t i o n m a y o c c u r c o r r e c t l y . Two f o r m s o f h e t e r o g e n e i t y h a v e b e e n o b s e r v e d i n a s s o c i a t -i o n w i t h G I P . T h e p r e s e n c e o f a m i n o r c o n t a m i n a n t i n " p u r e s t " G I P p r e p a r a t i o n s ( B r o w n e t a l , 1 9 8 1 ) p r o m p t e d J o r n v a l l e t a l ( 1 9 8 1 ) t o r e i n v e s t i g a t e t h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f G I P . I n t h e p r o c e s s o f s e q u e n c i n g G I P , t h e s e q u e n c e o f t h e m i n o r c o m p o n e n t w a s a l s o a r r i v e d a t a n d w a s s h o w n t o b e i d e n t i c a l i n s t r u c t u r e 18 t o GIP-j 4,, b u t l a c k i n g t h e f i r s t t w o N - t e r m i n a l a m i n o a c i d s . T h e s o u r c e o f t h i s " m i c r o h e t e r o g e n e i t y " r e m a i n s s p e c u l a t i v e . I f i t w a s n o t a n a r t e f a c t o f t h e p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e t h e n i t c o u l d h a v e r e s u l t e d f r o m i n t r a c e T l u l a r e n z y m a t i c d e g r a d a t i o n ( t h e T y r - A l a i s s u s c e p t i b l e t o e l a s t a s e ) p a r t i c u l a r l y s i n c e t h e m i s s i n g a m i n o a c i d s w e r e a d j a c e n t t o t h e s i t e o f r e m o v a l o f p r o - a n d / o r p r e -s e q u e n c e s . A l t e r n a t i v e l y ' t h e t w o G I P m o l e c u l e s c o u l d h a v e a r i s e n f r o m t h e e x i s t e n c e o f t w o s e p a r a t e b u t h o m o l o g o u s g e n e s a s h a s b e e n r e c e n t l y i n d i c a t e d i n t h e c a s e o f p a n c r e a t i c i s l e t p r e p r o -g l u c a g o n f r o m a n g l e r f i s h ( L u n d e t a l , 1 9 8 1 ) . I n v e s t i g a t i o n o f t h e g e n e t i c o r i g i n s , s y n t h e s i s , a n d p r e - s e c r e t o r y p r o c e s s i n g o f GEP p e p t i d e s s h o u l d p r o v i d e f r e s h i n s i g h t s i n t o t h e s o u r c e a n d r e l e -v a n c e o f h e t e r o g e n e i t y o f m o l e c u l a r f o r m . T h e s e c o n d t y p e o f h e t e r o g e n e i t y o b s e r v e d i n c o n n e c t i o n w i t h G I P i s t h a t - o f t h e v a r i o u s m o l e c u l a r w e i g h t s o f c i r c u l a t i n g a n d t i s s u e G I P - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y . B r o w n e t a l ( 1 9 7 5 a , b ) h a v e r e p o r t e d t h e p r e s e n c e o f G I P - l i k e i m m u n o r e a c t i v i t y i n t h e 5 , 0 0 0 a n d 8 , 0 0 0 d a l t o n m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e a s w e l l a s a n i m m u n o -r e a c t i v e c o m p o n e n t l a t e r t o b e i d e n t i f i e d a s a c o m p l e x p o s s i b l y f o r m e d b y t h e n o n - s p e c i f i c b i n d i n g o f G I P t o a s e r u m p r o t e i n ( D r y b u r g h , 1 9 7 7 ) . A s i m i l a r m o l e c u l a r w e i g h t p r o f i l e o f i m m u n o -r e a c t i v e s p e c i e s i n t i s s u e e x t r a c t s w a s a l s o r e p o r t e d b y D r y b u r g h . S e v e r a l a t t e m p t s h a v e b e e n m a d e t o c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e G I P ( C a m b l e e t a l , 1 9 7 3 ; Y a j i m a e t a l , 1 9 7 5 ; Y . a n a i h a r a e t a l , 1 9 7 8 ; M o r o d e r e t a l , 1 9 7 8 ) . T h e s y n t h e t i c p r o d u c t s a l l p o s s e s s e d l e s s t h a n c o m p l e t e b i o l o g i c a l a c t i v i t y , w h i c h c o u l d h a v e r e s u l t e d f r o m t h e f a c t t h a t t h e s y n t h e s e s w e r e m o d e l l e d o n t h e e r r o n e o u s s e q u e n c e l a t e r c o r r e c t e d b y J o r n v a T l e t a l ( 1 9 8 1 ) . H o w e v e r , l i t t l e k n o w l e d g e o f t h e p u r i t y o f t h e s y n t h e t i c p r o d u c t s w a s 19 o b t a i n e d s o i t i s d i f f i c u l t t o s p e c u 1 a t e t h a t a l a c k o f b i o l o g i c a l e f f e c t c o u l d h a v e r e s u l t e d f r o m t h e p r e s e n c e o f a n e x t r a g l u t a m i n e r e s i d u e a f t e r p o s i t i o n 2 9 . A p r o m i s i n g , i f p r e l i m i n a r y , a p p r o a c h t o t h e s y n t h e s i s o f G I P h a s b e e n m a d e b y ( H o r n e t a l , 1 9 8 2 ) who u n d e r t o o k t h e p r o d u c t i o n o f G I P b y t h e u s e o f r e c o m b i n a n t DNA t e c h n o l o g y . R e s e a r c h i n t o t h e p h y s i o l o g i c a l a c t i o n s o f G I P h a s e x p a n d e d a n d c h a n g e d i n c h a r a c t e r s i n c e t h e i n i t i a l i d e n t i f i c a t i o n o f a g a s t r i c a c i d i n h i b i t o r y a g e n t i n a 1 0 % p u r e C C K p r e p a r a t i o n ( B r o w n a n d P e d e r s o n , 1 9 7 0 ) . E x p e r i m e n t s w h i c h a l l o w e d c o n f i r m a t i o n o f t h e h o r m o n a l s t a t u s o f G I P a s a n i n s u l i n o t r o p i c a g e n t l e d d i r e c t l y t o t h o s e s t u d i e s p r e s e n t e d i n t h i s t h e s i s w h i c h a r e c o n c e r n e d w i t h i n v e s t i g a t i n g t h e m e c h a n i s m o f t h i s e f f e c t a t a c e l l u l a r l e v e l . T h e f o c u s o f r e s e a r c h i n t o t h i s a c t i o n o f G I P h a s now c h a n g e d f r o m e s t a b l i s h i n g t h e e x i s t e n c e o f a p h y s i o l o g i c a l e f f e c t t o i n v e s t i g a t -i n g t h e m e c h a n i s m t h r o u g h w h i c h t h i s e f f e c t o c c u r s . T h e i n t e r a c t -i o n o f t h e p o t e n t i a t i v e e f f e c t s o f G I P w i t h t h e s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g m e c h a n i s m o f t h e B c e l l i s s t u d i e d u s i n g k n o w l e d g e r e c e n t -l y o b t a i n e d a b o u t t h e m e t a b o l i c n a t u r e o f g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e . I n c o n t r a s t w i t h t h e e s t a b l i s h e d a c t i o n o f G I P i n c o n t r o l l -i n g p o s t - p r a n d i a 1 h y p e r g l y c a e m i a , t h e p o s s i b i l i t y o f a r o l e f o r G I P i n m o d e r a t i n g p o s t - p r a n d i a l h y p e r t r i g 1 y c e r ' i d a e m i a i s s t i l l i n t h e i n i t i a l ' s t a g e s o f i n v e s t i g a t i o n . S t u d i e s w i l l b e p r e s e n t e d i n t h i s t h e s i s w h i c h a r e c o n c e r n e d w i t h d e m o n s t r a t i n g t h e a b i l i t y o f G I P t o e l e v a t e l i p o p r o t e i n l i p a s e - l i k e a c t i v i t y i n a n i n v i t r o r a t a d i p o c y t e p r e p a r a t i o n . 20 T h e v e r s a t i 1 i t y o f r e v e r s e d - p h a s e H P L C a s a t o o l f o r t h e p u r i f i c a t i o n a n d a n a l y s i s o f p e p t i d e p r e p a r a t i o n s w i l l a l s o b e d e m o n s t r a t e d . T h e u s e o f ' H P L C t o p r e p a r e p u r e b i o a c t i v e r a d i o -i o d i n a t e d G I P f o r e v e n t u a l u s e i n s t u d i e s o f t h e p o s s i b l e r e c e p t o r -m e d i a t e d m e c h a n i s m o f a c t i o n o f G I P i s o n e e x a m p l e o f how t h i s c h r o m a t o g r a p h i c m e t h o d may be a p p l i e d t o p h y s i o l o g i c a l r e s e a r c h . O t h e r a p p l i c a t i o n s o f H P L C i n t h e s t u d y o f GEP p e p t i d e s w i l l b e e x a m i n e d . T h e s t u d i e s t o be p r e s e n t e d i n t h i s t h e s i s a r e t h e r e f o r e t o be r e v i e w e d a s e x t e n s i o n s o f p r e v i o u s r e s e a r c h i n t o t h e p h y s i o l o g i c a l a c t i o n s o f G I P . I t i s t o be h o p e d t h a t t h e y w i l l i n t u r n s e r v e t o i n i t i a t e f u r t h e r e x a m i n a t i o n o f t h e e f f e c t s a n d m e c h a n i s m s o f a c t i o n o f t h i s p e p t i d e h o r m o n e . 21 M e t h o d s 1. P e p t i d e A n a l y s i s a n d Q u a n t i t a t i o n A . R a d i o i m m u n o a s s a y  1. R a t i o n a l e T h e b a s i s o f r a d i o i m m u n o a s s a y i s t h e c o m p e t i t i o n o f a n t i g e n m o l e c u l e s f o r b i n d i n g s i t e s o n s p e c i f i c a n t i b o d y m o l e c u l e s . A f i x e d a m o u n t o f " t r a c e r " a n t i g e n m o l e c u l e s - w h i c h h a v e b e e n " l a b e l l e d " , u s u a l l y t h r o u g h i n c o r p o r a t i o n o f r a d i o i s o t o p e s -c o m p e t e s w i t h a n u n k n o w n a m o u n t o f a n t i g e n f o r a l i m i t e d n u m b e r o f a n t i b o d y b i n d i n g s i t e s . T h e q u a n t i t y o f t r a c e r m o l e c u l e s b i n d i n g t o a n t i b o d y t h e n p r o v i d e s a n i n d e x o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f n o n r a d i o a c t i v e a n t i g e n i n t h e m i x t u r e . T h i s c o n c e n t r a t i o n c a n t h e n b e d e t e r m i n e d b y c o m p a r i n g t h e d i s p l a c e m e n t o f t r a c e r m o l e c u l e s f r o m a n t i b o d y w i t h t h a t p r o d u c e d b y a s e t o f s t a n d a r d a n t i g e n s o l u t i o n s o f k n o w n c o n c e n t r a t i o n . P r o d u c t i o n o f t r a c e r m o l e c u l e s w i t h a h i g h r a t i o o f i s o t o p e t o p o l y p e p t i d e ( h i g h " s p e c i f i c a c t i v i t y " ) i s o n e r e q u i r e m e n t f o r d e v e l o p m e n t o f a s u c c e s s f u l p o l y p e p t i d e r a d i o i m m u n o a s s a y . I n c o r p o r a t i o n o f r a d i o -12 5 131 n u c l i d e s o f i o d i n e , I o r I i n t o t y r o s y l r e s i d u e s h a s b e e n a c o m m o n m e t h o d o f a c h i e v i n g h i g h s p e c i f i c a c t i v i t y . A s e c o n d r e q u i r e m e n t i s t h e p o s s e s s i o n o f a n a n t i b o d y w i t h h i g h a f f i n i t y a n d s p e c i f i t y f o r t h e p o l y p e p t i d e t o b e m e a s u r e d . T h e a f f i n i t y o f t h e a n t i b o d y s h o u l d i n t h e o r y b e i d e n t i c a l f o r b o t h t h e r a d i o a c t i v e a n d n o n r a d i o a c t i v e f o r m o f t h e m o l e c u l e . I n p r a c t i c e , t h i s l a s t c o n d i t i o n m a y n o t a l w a y s b e m e t . H o w e v e r , 22 o p t i m i z a t i o n o f t h e s e c o n d i t i o n s c a n r e s u l t i n a r a d i o i m m u n o a s s a y s e n s i t i v e e n o u g h t o m e a s u r e b i o l o g i c a l l e v e l s o f p o l y p e p t i d e s . R a d i o i m m u n o a s s a y s f o r s o m a t o s t a t i n a n d i n s u l i n w e r e p e r f o r m -1 2 5 e d u s i n g f o r m s o f t h e p e p t i d e s i n t o w h i c h t h e i o d i n e i s o t o p e I h a d b e e n i n c o r p o r a t e d . 2. I n s u l i n a ) I o d i n a t i o n o f I n s u l i n P h o s p h a t e b u f f e r w a s p r e p a r e d f r o m a p r e v i o u s l y m i x e d 0.4M s t o c k s o l u t i o n . T h i s s o l u t i o n w a s p r e p a r e d t h r o u g h t h e t i t r a t i o n o f 1 L o f 0.8M N a H 2 P 0 4 - H 2 0 w i t h IM KOH t o a pH o f 7.5 a n d a f i n a l v o l u m e o f 2 L . T h i s m i x t u r e p r e v e n t e d t h e f o r m a t i o n o f c r y s t a l s d u r i n g s u b s e q u e n t s t o r a g e o f t h e . s t o c k s o l u t i o n a t 4 ° C . T h e f o l l o w i n g r e a g e n t s w e r e p r e p a r e d j u s t p r i o r t o u s e : i ) 4 0 m g C h l o r a m i n e T i n 1 0 m l o f 0.2M p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 . 5 i i ) 2 5 m g S o d i u m m e t a b i s u 1 p h i t e i n 1 0 m l o f 0.2M p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 . 5 i i i ) l O O m g P o t a s s i u m i o d i d e i n 1 0 m l o f 0.2M p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 . 5 i v ) I n s u l i n ( p o r c i n e ) f r e s h l y w e i g h e d , o n a C a h n m i c r o b a l a n c e , i n t o a g l a s s s c i n t i l l a t i o n v i a l a n d d i s s o l v e d i n 2 0 m l o f 0 . 0 1 N H C 1 . I t w a s t h e n b r o u g h t t o a c o n c e n t r a t i o n o f 5 u g / l O u l w i t h 0.2M p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 . 5 T h e r e a g e n t s w e r e t h e n m i x e d t o g e t h e r i n a 12 x 7 5mm g l a s s t e s t - t u b e a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g p r o t o c o l : 23 ImCi Na I i n 10p i NaOH s o l u t i o n ( p H 7 - l l ) l O y l p o r c i n e i n s u l i n ( 5 y g) 10y l phosphate b u f f e r , pH7.5 25y l Ch l o r am ine -T ( lOOyg) 10 s e c . exposure w i t h g e n t l e v o r t e x m i x i n g lOOy l sodium m e t a b i s u l p h i t e (240yg) 45 s e c . exposure w i t h g e n t l e v o r t e x m i x i n g 50y l po ta s s i um i o d i d e (1%) 125 P u r i f i c a t i o n o f the I - i n s u l i n was by a d s o r p t i o n onto lOmg m i c r o f i n e s i l i c a (QUSO) i n a t o t a l volume of 2mls of .04M phos-phate b u f f e r . Th i s m i x t u r e was v o r t e x - m i x e d and c e n t r i f u g e d i n a d e s k - t o p c e n t r i f u g e . The s u p e r n a t a n t c o n t a i n i n g the f r e e i o d i n e was d i s c a r d e d . A f t e r t h r e e a d d i t i o n a l washes w i t h d i s t i l l e d wate r the s i l i c a was washed w i t h 5.0mls H C l - e t h a n o l (J 500ml e t h a n o l ; 500mls H2O; 30ml c o n c e n t r a t e d H C 1 ) , c e n t r i f u g e d , and the I - i n s u l i n - c o n t a i n i n g s u p e r n a t a n t was s t o r e d at -20°C a f t e r a d d i t i o n o f 1.5mls H^O. I n c o r p o r a t i o n of i o d i n e i n t o the i n s u l i n was c a l c u l a t e d by c o u n t i n g the gamma em i s s i o n s from 10 y l a l i q u o t s of the pho spha te , water and a c i d - e t h a n o l wastes and from the s i l i c a p e l l e t and then e x p r e s s i n g pe r cen tage i n c o r p o r a t i o n as the r a d i o a c t i v i t y p r e sen t i n the p e l l e t and a c i d - e t h a n o l wash, d i v i d e d by t o t a l r a d i o a c t i v i t y i n a l l f r a c t i o n s and m u l t i p l i e d by 100 a f t e r volume c o r r e c t i o n s were made. The s p e c i f i c a c t i v i t y of the l a b e l was not r o u t i n e l y c a l c u l -a ted s i n c e the pe r cen t i n c o r p o r a t i o n o f i o d i n e i n t o i n s u l i n gave 1 2 5 a rough i n d e x , e . g . , a 75% i n c o r p o r a t i o n of I i n t o the p o l y -24 p e p t i d e r e p r e s e n t i n g a n a p p r o x i m a t e s p e c i f i c a c t i v i t y o f 1 5 0 m C i / m g . F r e s h i o d i n a t i o n s w e r e p e r f o r m e d e v e r y m o n t h , o r a s r e q u i r e d . b ) A s s a y b u f f e r T h e d i l u e n t b u f f e r u s e d i n t h e i n s u l i n r a d i o i m m u n o a s s a y c o n -s i s t e d o f 0 . 0 4 M p h o s p h a t e b u f f e r ( m a d e b y d i l u t i o n o f t h e 0.4M s t o c k s o l u t i o n , t h e c o m p o s i t i o n o f w h i c h w a s d e t a i l e d i n t h e p r e -v i o u s s e c t i o n ) w i t h 5% c h a r c o a l e x t r a c t e d p l a s m a . T h i s p l a s m a w a s p r e p a r e d i n t h e f o l l o w i n g m a n n e r : i ) O u t d a t e d b l o o d b a n k p l a s m a w a s f i l t e r e d t h r o u g h s h a r k s k i n p a p e r , t h e n m i x e d w i t h 1% C a r b o n D e c o l o u r i z i n g N o r i t f o r 1 h o u r . i i ) T h e m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d a t 4 ° C , 1 0 , 0 0 0 r p m f o r 30 m i n u t e s i i i ) T h e s u p e r n a t a n t w a s f i 1 t e r e d , a 1 i q u o t e d a n d s t o r e d a t - 2 0 ° C . c ) A n t i s e r u m T h e a n t i s e r u m u s e d , G P 0 I , w a s o b t a i n e d f r o m D r . R . A . P e d e r s o n . I t w a s r o u t i n e l y u s e d i n h i s 1 a b o r a t o r y f o r t h e m e a s u r e m e n t o f r a t i n s u l i n i n p e r f u s a t e o r p l a s m a . T h e a n t i s e r u m h a d b e e n r a i s -e d i n g u i n e a p i g s a g a i n s t u n c o n j u g a t e d p o r c i n e i n s u l i n i n F r e u n d ' s a d j u v a n t . T h e a n t i s e r u m w a s s t o r e d i n 1ml ( 1 : 5 0 0 0 d i l u t i o n ) a l i q u o t s . T h e f i n a l d i l u t i o n o f t h e a n t i s e r u m u s e d i n t h e r a d i o -6 12 5 i m m u n o a s s a y w a s 1 i n 10 a n d y i e l d e d 4 0 % - 5 5 % b i n d i n g o f I - i n -s u l i n i n t h e a b s e n c e o f n o n r a d i o a c t i v e i n s u l i n . T h e a n t i s e r u m a t t h i s d i l u t i o n w a s s e n s i t i v e t o r a t i n s u l i n i n c o n c e n t r a t i o n s b e t w e e n 5 p U / m l a n d 1 6 0 u U / m l . 25 d ) S t a n d a r d s R a t i n s u l i n w a s d i l u t e d i n d i l u e n t b u f f e r t o a c o n c e n t r a t i o n o f 2 n g / m l a n d s t o r e d a t - 2 0 ° C i n 1 m l a l i q u o t s . D i l u t i o n o f o n e a l i q u o t t o 2 6 . 6 m l s w i t h d i l u e n t b u f f e r y i e l d e d 26 a l i q u o t s e a c h c o n t a i n i n g 1 6 0 y U / m l r a t i n s u l i n . S e r i a l d i l u t i o n w i t h d i l u e n t b u f f e r o f o n e o f t h e s e s t a n d a r d a l i q u o t s t h e n p r o d u c e d i n s u l i n s t a n d a r d s o f 1 6 0 , 8 0 , 4 0 , 2 0 , 1 0 , 2 n d 5 y U / m l f o r u s e i n t h e r a d i o -i m m u n o a s s a y . e ) C o n t r o 1 s S t a n d a r d i z e d r a t i n s u l i n c o n t r o l t u b e s f o r i n c l u s i o n i n e v e r y a s s a y w e r e p r e p a r e d i n t h e f o l l o w i n g m a n n e r : T h e p o o l e d e f f l u e n t f r o m a r a t p e r f u s e d p a n c r e a s ( s e e R e s u l t s , S e c t i o n : I V , A ) w h i c h h a d b e e n e x p o s e d t o 3 0 0 m g % g l u c o s e a n d 1 OroM a r g i n i n e w a s a s s a y e d f o r i n s u l i n c o n t e n t . T h e e f f l u e n t was: t h e n d i l a t e d t o a c o n c e n t r a t i o n o f 4 0 p U / m l o f i n s u l i n , a l i ' q u o t e d i n t o E p p e n d o r f p l a s t i c m i c r o t e s t - t u b e s a n d s t o r e d a t - 2 0 ° C . C o n t r o l t u b e s w e r e i n c l u d e d a t t w o p o i n t s i n e v e r y a s s a y ; f o l l o w i n g t h e s t a n d a r d c u r v e a n d f o l l o w i n g t h e l a s t s a m p l e . I n t e r - a s s a y a n d i n t r a - a s s a y v a r i a b i l i t y o f t h e m e a s u r e m e n t o f i n s u l i n c o n t e n t i n t h e s e t u b e s w a s n o t e d . D e v i a t i o n f r o m t h e o r i g i n a l a v e r a g e (~n = 1 4 ) c o n t r o l v a l u e o f 4 l p U / m l b y m o r e t h a n -l O p U / m l r e s u l t e d i n i n v a l i d a t i o n o f t h e a s s a y r e s u l t s . No s u b -s t a n t i a l d r i f t a w a y f r o m t h e 4 1 y U / m l c o n t r o l v a l u e w a s n o t e d o v e r t h e e i g h t e e n m o n t h p e r i o d d u r i n g w h i c h t h e a s s a y s w e r e p e r f o r m e d , f ) N o n - s p e c i f i c b i n d i n g N o n - s p e c i f i c " b i n d i n g " ( N S B ) o f r a d i o l i g a n d i n t h e a b s e n c e 26 o f a n t i s e r u m w a s c h e c k e d a t f o u r p o i n t s i n e a c h a s s a y . I n e a c h c a s e t h e a n t i s e r u m w a s r e p l a c e d w i t h d i l u e n t b u f f e r . A t t h e b e g i n n i n g o f e a c h a s s a y . t r i p i i c a t e NSB t u b e s p r e c e d e d t h e s t a - . n d a r d c u r v e . D i l u e n t b u f f e r r e p l a c e d t h e i n s u l i n - c o n t a i n i n g s t a -n d a r d s . P r e c e d i n g t h e c o n t r o l t u b e s , NSB t u b e s w e r e p l a c e d c o n -t a i n i n g l O O u l c o n t r o l s a m p l e s ( i n p e r f u s a t e ) . P r e c e d i n g t h e p e r f u s a t e s a m p l e s a d u p l i c a t e s e t o f NSB t u b e s w e r e p l a c e d c o n -t a i n i n g l O O u l o f s a m p l e f r o m m i n u t e #4 o f t h e p e r f u s i o n . NSB o f s t a n d a r d c u r v e s r a n g e d b e t w e e n a p p r o x i m a t e l y 4% a n d 1 0 % , d e p e n d -i n g o n t h e a g e o f t h e r a d i o t r a c e r . NSB o f p e r f u s a t e - c o n t a i n i n g s a m p l e s w a s u s u a l l y 2 - 3 % h i g h e r t h a n t h a t o f t h e s t a n d a r d c u r v e . g ) P e r f u s a t e s a m p l e s S a m p l e s f r o m p e r f u s e d r a t p a n c r e a s f o r i n s u l i n a n a l y s i s h a d b e e n s t o r e d a t - 2 0 ° C . T h e y w e r e t h a w e d p r i o r t o t h e a s s a y a n d d i l u t e d w i t h d i l u e n t b u f f e r a c c o r d i n g t o e x p e c t e d i n s u l i n c o n t e n t . T h e y s u b s e q u e n t l y w e r e r e f r o z e n a n d s t o r e d a t - 2 0 ° C i n c a s e r e p e a t a n a l y s i s w a s r e q u i r e d . h) A s s a y p r o t o c o l C o m p o s i t i o n o f t h e 1 . 0 m l i n c u b a t i o n v o l u m e w a s : l O O y l a n t i s e r u m a t a f i n a l d i l u t i o n o f 1 : 1 0 ^ l O O u l d i l u t e d s a m p l e o r s t a n d a r d o r c o n t r o l 7 0 0 u l d i l u e n t b u f f e r 2 4 h o u r i n c u b a t i o n a t 4 ° C 12 5 l O O u l I - i n s u l i n c o n t a i n i n g a p p r o x i m a t e l y 1 0 , 0 0 0 c p m 2 4 h o u r i n c u b a t i o n a t 4 ° C T h e c o m p o s i t i o n o f t h e NSB a n d z e r o - b i n d i n g t u b e s w a s d e t a i l e d 27 p r e v i o u s l y . 1 2 5 Tubes c o n t a i n i n g lOOul o f I - i n s u l i n a l one were s t o r e d f o r use as t o t a l c o u n t s . i ) Cha r coa l s e p a r a t i o n » S e p a r a t i o n o f r a d i o a c t i v i t y bound to the a n t i b o d y / a n t i g e n complex was a c c o m p l i s h e d by a d s o r p t i o n o f f r e e and damaged a n t i g e n onto 200ul o f d e x t r a n - c o a t e d c h a r c o a l (5% Carbon d e c o l o u r i z i n g N o r i t , 0.5% d e x t r a n T-70 i n 0.04M phosphate b u f f e r - p H 7 . 5 and s t o r e d at 4°C) w i t h subsequent c e n t r i f u g a t i o n at 3,000rpm, 4°C f o r 30 m i n u t e s . The s u p e r n a t a n t was d i s c a r d e d and the f r e e p e l l e t -bound) r a d i o a c t i v i t y was counted u s i n g a S e a r l e 1285 y - c o u n t e r . The r e s u l t s were exp re s sed as % Bound o f t o t a l r a d i o a c t i v i t y . j ) C a l c u l a t i o n s C a l c u l a t i o n s of pe r cen t bound were per fo rmed by computer . The f o rmu l a u s e d : %B = T o t a l C o u n t s - F r e e cpm(sample), - T o t a l C o u n t s - F r e e cpm(NSB) T o t a l Counts T o t a l Counts S t anda rd cu rve s were p repa red by p l o t t i n g %B y_s. l o g a r i t h m i c s t a n d a r d c o n c e n t r a t i o n . C o n t r o l and sample i n s u T i n" c o n c e n t r a t i o n s were found by r e a d i n g the i n s u l i n c o n c e n t r a t i o n from the s t a n d a r d cu rve c o r r e s p o n d i n g to the %B o f the sample . 3. S o m a t o s t a t i n a) I o d i n a t i o n of s o m a t o s t a t i n S tock s o l u t i o n s were made j u s t p r i o r to u s e : i ) 20mg c h l o r a m l n e - T i n 10ml 0.05M phosphate b u f f e r , pH7.5 28 i i ) 5 0mg s o d i u m m e t a b i s u l p h i t e i n 1 0 m l 0 . 0 5 M p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 . 5 . P r o c e d u r e : T o a 5 y g l y o p h i l i z e d a l i q u o t o f s y n t h e t i c T y r - 1 - s o m a t o s t a t i n w e r e a d d e d i n s e q u e n c e : i ) l O y l d i s t i l l e d H 2 0 i i ) l O y l 0.5M p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 . 5 i i i ) l O y l o f t h e c h l o r a m i n e - T s o l u t i o n m i x e d f o r 3 0 s e c o n d s i v ) l O y l o f t h e s o d i u m m e t a b i s u l p h i t e s o l u t i o n m i x e d b y t a p p i n g v ) 1ml h o r m o n e - f r e e p l a s m a ( c h a r c o a l e x t r a c t e d ) v i ) 2 0 m g Q U S O G 3 2 m i x e d b y t a p p i n g T h e m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d f o r 2 - 3 m i n . i n a d e s k - t o p c e n t r i f u g e a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s d i s c a r d e d . T h e p e l l e t w a s t h e n t w i c e r e s u s p e n d e d w i t h w a t e r , c e n t r i f u g e d a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s d i s -c a r d e d . T h e p e l l e t w a s t h e n r e s u s p e n d e d i n 1 m l a c e t i c a c i d / •: a c e t o n e s o l u t i o n ( l O O y l g l a c i a l a c e t i c a c i d , 3 . 9 m l a c e t o n e , 4 m l 12 5 H 2 0 ) a n d t h e I - s o m a t o s t a t i n - c o n t a i n i n g s u p e r n a t a n t w a s d i l u t e d t o 5 0 0 , 0 0 0 c p m / l O y l w i t h 0.1M a c e t i c a c i d c o n t a i n i n g 0 . 5 % b o v i n e s e r u m a l b u m i n . I n c o r p o r a t i o n o f t h e i o d i n e i n t o t h e s o m a t o s t a t i n w a s d e t e r m i n e d b y c o u n t i n g l O y l a l i q u o t s o f a l l t h e s u p e r n a t a n t s a n d t h e p e l l e t a n d d e t e r m i n i n g t h e p e r c e n t a g e o f r a d i o a c t i v i t y p r e s e n t i n t h e a c e t o n e / a c e t i c a c i d s u p e r n a t a n t a n d i n t h e p e l l e t . T h e 5 0 0 , 0 0 0 c p m / l O y l s u p e r n a t a n t w a s a l i q u o t e d i n t o 1 0 0 y l f r a c t i o n s , l y o p h i l i z e d , a n d s t o r e d a t - 2 0 ° C . 29 For use i n the rad io immunoassay a l y o p h i l i z e d a l i q u o t was d i s s o l v e d on the day o f the as say i n 0.002M ammonium a c e t a t e , pH4.6, and a p p l i e d to a column o f C M - c e l l u l o s e (CM52) e q u i -l i b r a t e d i n the same b u f f e r . The column was washed w i t h *30ml o f 0.002M ammonium a c e t a t e and the t r a c e r e l u t e d w i t h 0.2M ammonium a c e t a t e , pH4.6. B u f f e r was pumped th rough the column at the r a t e o f 1ml/min. R a d i o a c t i v i t y i n the e l u a t e f r a c t i o n s was de te rm ined u s i n g a S e a r l e 1285 y- c o u n t e r . The apex and de s cend i ng l imb f r a c t i o n s o f the r a d i o a c t i v e peak were poo led and n e u t r a l i z e d ' w i t h IM NaOH. Th i s t r a c e r s o l u t i o n was then d i l u t e d to - 3 ,000 cpm/lOOul f o r use i n the a s s a y . b) Assay b u f f e r S tock s o l u t i o n : Sodium b a r b i t a l 4. 9 g Sodium a c e t a t e 0.32g Sodium c h l o r i d e 2.55g M e r t h i o l a t e 0.10g - d i s s o l v e d i n 700mls d i s t i l l e d H 2 0 - b rought to pH7.4 w i t h IM HC1 - made up to IL w i t h d i s t i l l e d H 2 0 - s t o r e d at 4°C - made f r e s h eve ry seven days For the a s s a y : - to the s t o c k s o l u t i o n was added 0.5% bov ine serum a lbumin (BSA-S igma, RIA grade) and 1% T r a s y l o l 30 - s t o r e d a t 4 ° C c ) A n t i s e r u m T h e a n t i s o m a t o s t a t i i i a n t i s e r u m ( G o V I . 3 . 2 ) ' u s e d i n t h e r a d i o -i m m u n o a s s a y w a s p r o d u c e d b y M c i n t o s h e t a l ( 1 9 7 8 ) . T h e a n t i s e r u m w a s r a i s e d i n New Z e a l a n d w h i t e r a b b i t s t o s y n t h e t i c c y c l i c s o m a t o s t a t i n w h i c h h a d b e e n c o n j u g a t e d t o B S A i n t h e p r e s e n c e o f 1 - e t h y l 3 ( 3 - d i m e t h y l - a m i n o - p r o p y 1 ) - c a r b o d i i m i d e H C 1 . T h e a n t i -s e r u m s h o w e d no c r o s s - r e a c t i v i t y w i t h a n u m b e r o f o t h e r p e p t i d e s ( M c i n t o s h e t a l , 1 9 7 8 ) a n d was u s e d i n r a d i o i m m u n o a s s a y a t a 1 2 5 f i n a l d i l u t i o n o f 1 :1 2 , 0 0 0 - y i e l d i n g a b i n d i n g o f 3 5 - 4 5 % o f J I -l a b e l l e d s o m a t o s t a t i n i n t h e a b s e n c e o f u n l a b e l l e d s o m a t o s t a t i n . d ) S t a n d a r d s l m g s o m a t o s t a t i n ( s y n t h e t i c c y c l i c , K a b i ) w a s d i s s o l v e d i n 5ml 0.1M a c e t i c a c i d c o n t a i n i n g 0 . 0 5 % B S A . F i f t y m i c r o l i t r e ( l O u g ) a l i q u o t s w e r e l y o p h i l y z e d i n g l a s s t u b e s a n d s t o r e d a t - 2 0 ° C . On t h e d a y o f a n a s s a y , a n a l i q u o t w a s d i s s o l v e d i n 1 m l d i l u e n t b u f f e r a n d t h e r e s u l t i n g l O u g / m l s o l u t i o n w a s s e r i a l l y d i l u t e d t o g i v e a s s a y s t a n d a r d s o f 5 0 0 , 2 5 0 , 1 2 5 , 6 2 . 5 , 3 1 . 2 5 , 1 5 . 6 2 5 , 7.8 a n d 3 . 9 p g/m1.,, e ) Co n t r o 1 s C o n t r o l t u b e s w e r e p r e p a r e d t o a c o n c e n t r a t i o n o f l O O p g / m l b y t h e s a m e m e t h o d u s e d f o r s t a n d a r d s . T r i p l i c a t e c o n t r o l t u b e s w e r e l o c a t e d a t t h e e n d o f t h e s t a n d a r d c u r v e a n d a t t h e e n d o f t h e a s s a y . I n t e r - a s s a y a n d i n t r a - a s s a y v a r i a b i l i t y o f t h e m e a s u r e m e n t o f s o m a t o s t a t i n c o n t e n t i n t h e s e t u b e s w a s n o t e d . D e v i a t i o n f r o m t h e e x p e c t e d l O O p g / m l c o n t r o l v a l v e o f m o r e t h a n 31 - 1 5 p g / m l r e s u l t e d i n i n v a l i d a t i o n o f t h e a s s a y . f ) A s s a y p r o t o c o l A s t a n d a r d a s s a y f o r m a t w a s u s e d f o r t h e m e a s u r e m e n t o f u n -d i l u t e d s o m a t o s t a t i n s a m p l e s . T h e n u m b e r s i n t h e c o l u m n s r e -p r e s e n t v o l u m e s e x p r e s s e d i n m i c r o l i t r e s . S T D o r S a m p l e A n t i b o d y B u f f e r T r a c e r 1. NSB 0 0 3 0 0 1 00 2. Z e r o b i n d i n g 0 1 0 0 2 0 0 1 00 3. S t a n d a r d s 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 4. C o n t r o l 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 5. N S B ( S a m p l e #4) 1 0 0 0 2 0 0 1 0 0 6. S a m p l e s 1 00 1 00 1 00 1 0 0 7. NSB 0 0 3 0 0 1 0 0 8. C o n t r o l 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 00 I n c u b a t e d a t 4 ° C f o r 4 8 h o u r s g ) P e r f u s a t e s a m p l e s S a m p l e s f r o m p e r f u s e d r a t p a n c r e a s f o r s o m a t o s t a t i n a n a l y s i s h a d b e e n c o l l e c t e d i n 1ml v o l u m e s t o w h i c h l O O u l o f T r a s y l o l w e r e a d d e d . T h e y w e r e s t o r e d a t - 2 0 ° C a n d w e r e t h a w e d a n d u s e d u n -d i l u t e d i n t h e r a d i o i m m u n o a s s a y . T h e y w e r e s u b s e q u e n t l y r e f r o z e n a n d s t o r e d a t - 2 0 ° C i n c a s e r e p e a t a n a l y s i s w a s r e q u i r e d . S e v e r a l 1 0 0 y l a l i q u o t s o f t r a c e r w e r e s a v e d t o a c t a s " t o t a l c o u n t s " t u b e s . 32 h ) C h a r c o a l s e p a r a t i o n On t h e d a y o f t h e s e p a r a t i o n o f b o u n d a n d f r e e r a d i o a c t i v i t y , 0 . 2 5 % D e x t r a n T - 7 0 w a s d i s s o l v e d i n 0 . 0 5 M p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 . 5 . A c t i v a t e d c h a r c o a l ( 1 . 2 5 % ) a n d c h a r c o a l - e x t r a c t e d p l a s m a ( 0 . 1 % ) w e r e a d d e d a n d t h e m i x t u r e s t i r r e d f o r 1 h o u r a t 4 ° C . O n e m i l l i -l i t r e a l i q u o t s o f t h i s c h a r c o a l w e r e a d d e d t o a l l b u t t h e t o t a l c o u n t s , m i x e d , a n d c e n t r i f u g e d f o r 3 0 m i n . a t 4 ° C . A f t e r d i s -c a r d i n g t h e s u p e r n a t a n t a n t i b o d y - " b o u n d " r a d i o a c t i v i t y , t h e c h a r c o a l - p e l 1 e t " f r e e " r a d i o a c t i v i t y w a s d e t e r m i n e d b y a u t o m a t e d g a m m a c o u n t i n g . , C a l c u l a t i o n o f s o m a t o s t a t i n c o n t e n t i n t h e s a m p l e s w a s d e t e r m i n e d i n t h e s a m e m a n n e r a s h a s b e e n d e t a i l e d f o r t h e i n s u l i n r a d i o i m m u n o a s s a y ( s e e I n s u l i n R a d i o i m m u n o a s s a y , p a r t j ) . B . A d s o r p t i o n C h r o m a t o g r a p h y 1. R a t i o n a l e S e p a r a t i o n o f m o n o - a n d . d i - i o d i n a t e d t y r o s i n e m o l e c u l e s w a s p o s s i b l e t h r o u g h a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f e n z y m a t i c a l l y d i g e s t e d G I P . E x p o s u r e o f G I P t o a m i x t u r e o f p r o t e a s e s r e s u l t e d i n l i b e r a t i o n o f f r e e a m i n o a c i d s , i n c l u d i n g m o n o - a n d d i - r a d i o -i o d i n a t e d t y r o s i n e s w h i c h w e r e t h e n q u a n t i t a t e d b y t h e a d s o r p t i v e c h r o m a t o g r a p h y t e c h n i q u e . I n a d s o r p t i v e c h r o m a t o g r a p h y t h e s o l u t e i s r e t a i n e d b y h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e s o l u t e a n d t h e s u r f a c e o f t h e s o l i d a d s o r b e n t m a t r i x . S i n c e t h e s o l v e n t a l s o i n t e r a c t s w i t h t h e s u r f a c e , t h e p r o c e s s i s a c t u a l l y a c o m p e t i t i o n b e t w e e n s o l u t e a n d s o l v e n t f o r s u r f a c e i n t e r a c t i o n s i t e s , T h e d i f f e r i n g s t r e n g t h s o f h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n o f 33 t h e m o n o - a n d d i - i o d i n a t e d t y r o s i n e m o l e c u l e s p r o v i d e s t h e b a s i s f o r s e p a r a t i o n o f t h e t w o l a b e l l e d a m i n o a c i d s . 2 . P r o t e a s e d i g e s t i o n a ) R a d i o i o d i n a t e d G I P f r a c t i o n s f r o m r a d i o i m m u n o a s s a y  p u r i f i c a t i o n s T h e s e f r a c t i o n s w e r e p r o d u c t s o f t h e p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e u s e d i n p r e p a r i n g r a d i o i o d i n a t e d G I P f o r u s e i n G I B r a d i o i m m u n o -a s s a y . T o a s c e r t a i n i f t h e p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e ( v i a C M - c e l l -u l o s e ( C M - 5 2 ) c o l u m n ) r e s u l t e d i n a s i g n i f i c a n t s e p a r a t i o n o f m o n o - a n d . d i - i o d i n a t e d t y r o s i n e - c o n t a i n i n g f o r m s o f G I P , t h e i. f r a c t i o n s w e r e f i r s t p r o t e a s e - d i g e s t e d a n d t h e n s u b j e c t t o a d -s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y . S i n c e t h e f r a c t i o n s w e r e s t o r e d i n a n a c i d - e t h a n o l m i x t u r e , l O O u l a l i q u o t s ( ^ 1 0 7 c p m ) w e r e f i r s t d r i e d i n a s t r e a m o f n i t r o g e n g a s . T h e y w e r e t h e n s u b j e c t e d t o t h e f o l l o w i n g p r o c e d u r e : i ) d i s s o l v e d i n 2 0 0 u l d i s t i l l e d H^O a n d 5 0 0 u l 0.1M a m m o n i u m b i c a r b o n a t e i i ) l O O u l o f l O m g / m l p r o n a s e w a s a d d e d a t t i m e z e r o i i i ) p l a c e d i n a 3 7 ° C s h a k e r - w a t e r b a t h s e t a t 60 c y c l e s / m i n i v ) l O O u l o f l O m g / m l p r o n a s e w a s a d d e d a f t e r 2 h v ) 1 m l o f i c e - c o l d d i s t i l l e d h^O w a s a d d e d a f t e r a n o t h e r 2 h v i ) m i x t u r e w a s b o i l e d i n a w a t e r b a t h f o r 6 m i n v i i ) m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d f o r 1 5 m i n . a t 3 , 0 0 0 r p m v i i i ) 1 m l o f t h e s u p e r n a t a n t w a s m i x e d w i t h 1ml o f t r i s - m a l e a t e b u f f e r i n p r e p a r a t i o n f o r a p p l i c a t i o n t o a n a d s o r p t i o n 34 c h r o m a t o g r a p h y c o l u m n b ) R a d i o i o d i n a t e d G I P f r a c t i o n s f r o m H P L C p u r i f i c a t i o n T h e s e f r a c t i o n s w e r e p r o d u c t s o f t h e p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e u s e d i n p r e p a r i n g r a d i o i o d i n a t e d G I P f o r u s e i n b i n d i n g e x p e r i -m e n t s . T o a s c e r t a i n i f t h e p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e ( v i a H P L C ) r e s u l t e d i n a s i g n i f i c a n t s e p a r a t i o n o f m o n o - a n d d i - i o d i n a t e d t y r o s i n e - c o n t a i n i n g f o r m s o f G I P t h e s e f r a c t i o n s w e r e t r e a t e d i n a s i m i l a r f a s h i o n t o t h e r a d i o i m m u n o a s s a y p u r i f i c a t i o n G I P f r a c t -i o n s ( d e t a i l e d i n t h e p r e c e d i n g s e c t i o n ) . T h e s o l e d i f f e r e n c e i n t h e t r e a t m e n t o f t h e t w o f r a c t i o n s w a s i n t h e i n i t i a l p r e p a r a t i o n o f t h e s a m p l e s : T h e H P L C - d e r i v e d f r a c t i o n s w e r e o r i g i n a l l y c o n t a i n e d i n a r o u g h l y 2 9 . 8 % a c e t o n i t r i l e 6 9 . 8 % w a t e r , 0 . 1 % t r i - f 1 u o r o a c e t i c a c i d s o l v e n t . T h e a c e t o n i t r i l e w a s e v a p o r a t e d b y p a s s i n g a . s t r e a m o f n i t r o g e n g a s o v e r t h e s u r f a c e o f t h e m i x t u r e a n d t h e r e m a i n i n g s o l v e n t was l y o p h i l i z e d a n d t h e s a m p l e s t o r e d a t - 2 0 ° C . S a m p l e s w e r e t h e n s u b j e c t e d t o p r o t e a s e d i g e s t i o n i n a m a n n e r i d e n t i c a l t o t h a t u s e d t o d i g e s t t h e r a d i o i m m u n o a s s a y G I P p u r i f i c a t i o n f r a c t i o n s a s d e s c r i b e d i n t h e p r e v i o u s s e c t i o n . 3. C o l u m n c h r o m a t o g r a p h y  a ) B u f f e r 1 L o f 0 . 0 5 M t r i z m a b a s e w a s t i t r a t e d t o p H 5 . 9 w i t h 0 . 0 5 M m a ' l e i c a c i d . 0 . 1 % Na A z i d e w a s a d d e d . T h i s t r i s - m a l e a t e b u f f e r w a s u s e d i n a l l s u b s e q u e n t s t e p s . 35 b) Column p r e p a r a t i o n An a p p r o p r i a t e weight of Sephadex G -1 0 , f i n e , c r o s s - l i n k e d dextran ( p a r t i c l e s i z e 40-120ym) was s t i r r e d i n t o t r i s - m a l e a t e b u f f e r and allowed to swell overnight at room temperature. The gel was de-aerated under vacuum f o r 30 min. The supernatant was removed and the remaining s l u r r y was used to f i l l a 1cm diameter glass column to a height of 59cm. The s l u r r y was poured g e n t l y down the side of the column. The r e s u l t i n g matrix was supported by a s i n t e r e d glass d i s c placed near the o u t l e t of the column. Packing of the gel occurred under g r a v i t y u n t i l the s e t t l e d height of the matrix was with i n several cm of the top of the column. The column was then stored in t r i s - m a l e a t e b u f f e r and e q u i l i b r a t e d in the same b u f f e r p r i o r to use. c) Protocol E q u i l i b r a t i o n of the column was achieved through washing the column with t r i s - m a l e a t e b u f f e r from a g r a v i t y - f e e d r e s e r v o i r f o r 8 hours p r i o r to sample a p p l i c a t i o n . The b u f f e r above the l e v e l of the gel was then removed and the pro t e a s e - d i g e s t e d sample d i s s o l v e d in 1ml of t r i s - m a l e a t e b u f f e r (see Protease d i g e s t i o n ) , was a p p l i e d to the gel and allowed to sink to the l e v e l of the gel s u r f a c e . Another 1ml of t r i s - m a l e a t e b u f f e r was then added in a s i m i l a r manner, washing the sample well i n t o the body of the column. Four m i l l i l i t r e f r a c t i o n s were c o l l e c t e d at a flow rat e of 16ml/h v i a automated f r a c t i o n c o l l e c t o r and b u f f e r flow through the column continued o v e r n i g h t . 36 E l u t i o n t i m e s o f m o n o - a n d d i - i o d i n a t e d t y r o s i n e w e r e m o n i t o r -e d b y s p e c t r o p h o t o m e t r i c a n a l y s i s a t 2 9 5 r i m - o f " c o m m e r c i a l l y a v a i l -a b l e p u r e m o n o - o r d i - i o d i n a t e d t y r o s i n e m i x t u r e s . C o m p a r i s o n o f t h e s e e l u t i o n t i m e s w i t h t h o s e o f t h e r a d i o a c t i v e p e a k s e l u t e d f r o m p r o n a s e - c l e a v e d G I P a l l o w e d q u a n t i t a t i o n o f t h e r e l a t i v e a m o u n t s o f m o n o - a n d d i - i o d i n a t e d t y r o s i n e s i n t h e o r i g i n a l u n -c l e a v e d G I P f r a c t i o n s . C. H i g h P r e s s u r e L i q u i d C h r o m a t o g r a p h y ( H P L C ) 1. T h e o r y R e v e r s e d p h a s e H P L C s e p a r a t e s p r o t e i n s o n t h e b a s i s o f t h e i r i n d i v i d u a l h y d r o p h o b i c p r o p e r t i e s . T h e t e r m " r e v e r s e d p h a s e " r e f e r s t o t h e f a c t t h a t , i n c o n t r a s t t o " n o r m a l " c h r o m a t o g r a p h y , a s t a t i o n a r y n o n p o l a r ( h y d r o p h o b i c ) p h a s e i s u s e d i n c o m b i n a t i o n w i t h a m o b i l e l i q u i d p h a s e o f v a r y i n g p o l a r i t y . T h e m o s t p o l a r e l u e n t , w a t e r , r e s u l t s i n t h e s t r o n g e s t s o r p t i o n o f p r o t e i n t o t h e s t a t i o n a r y n o n p o l a r p h a s e , w h i l e i n c r e a s i n g t h e n o n p o l a r i t y o f e l u e n t w i l l r e s u l t i n d e s o r p t i o n o f p r o t e i n f r o m t h e s o l i d p h a s e a c c o r d i n g t o t h e i n d i v i d u a l c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s o l u t e p e p t i d e s . T h e p r e p a r a t i o n o f r e p r o d u c i b l e , s t a b l e , c h e m i c a l l y b o n d e d : , n o n p o l a r s t a t i o n a r y p h a s e s h a s l e d t o a r e c e n t i n c r e a s e i n t h e u s e o f s u c h H P L C s y s t e m s i n t h e a n a l y s i s a n d p u r i f i c a t i o n o f p r o t e i n s . T h e h i g h r e s o l u t i o n r e s u l t i n g f r o m H P L C i s c a p a b l e o f s e p a r a t i n g p r o t e i n s d i f f e r i n g i n o n l y o n e o r t w o a m i n o a c i d r e s i d u e s , a l l o w i n g v e r y h i g h s t a n d a r d s o f p e p t i d e p u r i t y t o b e 37 a c h i e v e d . T h e r a p i d f l o w r a t e s a c h i e v a b l e w i t h h i g h p r e s s u r e s y s t e m s a l l o w e d a c o n v e n i e n t f a s t e l u t i o n o f i s o l a t e d p r o t e i n s u s u a l l y w i t h i n a 10 t o 2 0 m i n u t e p e r i o d . 2. H P L C E q u i p m e n t a n d P r o c e d u r e A l l t h e H P L C e q u i p m e n t u s e d was p u r c h a s e d f r o m W a t e r s A s s o c i a t e s I n c . * W a t e r a n d a n o n p o l a r s o l u t e ( C H g C N ) , e a c h w i t h 0 . 1 % t r i f 1 u o r o a c e t i c a c i d , w e r e s e p a r a t e l y d e g a s s e d b y s t i r r i n g u n d e r v a c u u m f o r 1 0 m i n s . E a c h s o l u t i o n w a s t h e n p l a c e d i n a c l e a n E r l e n m e y e r f l a s k w h i c h w a s u s e d o n l y f o r h i g h - p u r i t y H P L C s o l v e n t s . M i x i n g o f t h e t w o s o l v e n t s t o f o r m g r a d i e n t s o f d e -c r e a s i n g p o l a r i t y w a s r e g u l a t e d t h r o u g h c o n t r o l o f t h e p u m p i n g s p e e d s o f t h e t w o p u m p s ( H ^ O - "Pump A " , W a t e r s M o d e l M - 4 5 ; C H 3 C N - "Pump B " , W a t e r s m o d e l 6 0 0 0 A ) s o t h a t a c o n s t a n t t o t a l f l o w r a t e o f s o l v e n t w a s m a i n t a i n e d a l t h o u g h t h e s o l v e n t c o m p o s i t -i o n v a r i e d . T h i s w a s a c c o m p l i s h e d t h r o u g h u s e o f a W a t e r s M o d e l 6 6 0 s o l v e n t p r o g r a m m e r . S a m p l e a p p l i c a t i o n w a s m a d e t h r o u g h t h e u s e o f a W a t e r s U6K i n j e c t i o n s y s t e m , w h i c h a l l o w e d a p p l i c a t i o n o f t h e s a m p l e t o t h e m i x e d s o l v e n t s j u s t p r i o r t o t h e ' p o i n t w h e r e t h e s o l v e n t f l o w r e a c h e d t h e s e p a r a t i o n c o l u m n . S e p a r a t i o n o f s a m p l e p r o t e i n s w a s a c c o m p l i s h e d u s i n g a y - B o n d a p a k C - 1 8 c o l u m n , w h i c h h a d a s i l i c a m a t r i x w i t h a t t a c h e d h y d r o c a r b o n c h a i n s w i t h a l e n g t h o f e i g h t e e n c a r b o n a t o m s . O u t -f l o w f r o m t h e c o l u m n p a s s e d t h r o u g h a W a t e r s M o d e l 4 5 0 V a r i a b l e W a v e l e n g t h D e t e c t o r a n d w a s d i s c a r d e d o r c o l l e c t e d d i s t a l t o t h e 38 CH 3 CN Pump A Pump B mixed solvent flow Sample injection Column Pump Control Detector Chart | Recorder 1 outflow F I G U R E S c h e m a t i c r e p r e s e n t a t i o n o f a n - H P L C s y s t e m 39 d e t e c t o r . A F i s h e r R e c o r d a l l C h a r t R e c o r d e r p l o t t e d t h e a b s o r b -a n c e o f t h e e l u a t e a s i t f l o w e d t h r o u g h t h e d e t e c t o r . 3. A n a l y s i s o f p e p t i d e p r e p a r a t i o n s  a ) A p p r o a c h A g e n e r a l p r o t o c o l w a s u s e d i n d e v e l o p i n g s y s t e m s w h i c h w e r e o p t i m a l f o r r e s o l v i n g i n d i v i d u a l p e p t i d e s c o n t a i n e d i n h e t e r o -g e n o u s m i x t u r e s : i ) P r e l i m i n a r y d e t e r m i n a t i o n o f e l u t i o n r a n g e T o d e t e r m i n e t h e a p p r o x i m a t e a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n a t w h i c h p e p t i d e s i n t h e m i x t u r e e l u t e d , a l i n e a r 0 % t 9 0 % a c e t o n i -t r i l e g r a d i e n t w a s u s e d o v e r 3 0 m i n s . A l t h o u g h r e s o l u t i o n o f p r o t e i n p e a k s o n t h i s g r a d i e n t w a s g e n e r a l l y n o t h i g h , c o m p a r i s o n o f s p e c t r o p h o t o m e t r i c p r o f i l e s v e r s u s t h e b a c k g r o u n d p e a k s u s u a l l y o b t a i n e d w i t h t h i s g r a d i e n t a l l o w e d d e t e r m i n a t i o n o f t h e a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n r a n g e ( u s u a l l y 2 8 % - 4 0 % ) i n w h i c h s a m p l e p r o t e i n s e l u t e d . I m p o r t a n t l y , t h i s p r o c e d u r e a l s o e s t a b l i s h e d w h e t h e r a l l t h e c o n t a i n e d p r o t e i n s i n a s a m p l e e l u t e d w i t h i n a r e l a t i v e l y n a r r o w a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n r a n g e , a l l o w i n g s u b s e q u e n t m a n i p u l a t i o n s t o b e p e r f o r m e d w i t h i n t h i s r a n g e . i i ) P r e c i s e d e t e r m i n a t i o n o f e l u t i o n r a n g e O n c e a l l t h e s a m p l e p r o t e i n s h a d b e e n d e m o n s t r a t e d t o e l u t e w i t h i n a r e l a t i v e l y n a r r o w r a n g e o f a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n s i t w a s p o s s i b l e t o p r o g r e s s i v e l y r a i s e t h e i n i t i a l a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n s a n d l o w e r t h e f i n a l a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n s o f 40 t h e g r a d i e n t s u n t i l a p r e c i s e know ledge o f t he e l u t i o n c h a r a c t e r -i s t i c s o f t he p e p t i d e p r e p a r a t i o n was g a i n e d . U s u a l l y t h i s man-i p u l a t i o n i n v o l v e d o n l y a change i n t h e s t a r t i n g and e n d i n g a c e t o -n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e g r a d i e n t w h i l e t h e t i m e o v e r w h i c h t h e g r a d i e n t was run was p r o g r e s s i v e l y s h o r t e n e d so t h a t a 1% CH^CN r i s e / m i n . wou ld be m a i n t a i n e d r e g a r d l e s s o f t h e i n i t i a l and f i n a l g r a d i e n t c o n d i t i o n s . The p r e c i s e a c e t o n i t r i l e c o n -c e n t r a t i o n r ange v a r i e d s l i g h t l y f o r each t y p e o f p e p t i d e p r e - ' p a r a t i o n examined and v a r i e d s l i g h t l y w i t h co lumn a g e , so t h a t r e d e t e r m i n a t i o n o f e l u t i o n p a r a m e t e r s was n e c e s s a r y e v e r y few months . i i i ) A c h i e v i n g r e s o l u t i o n Once i t had been d e t e r m i n e d at what p r e c i s e a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n r a n g e a p e p t i d e m i x t u r e wou ld e l u t e i t was p o s s i b l e to enhance t h e r e s o l u t i o n o f t h e p e p t i d e peaks by l e n g t h e n i n g t h e t i m e o f t h e l i n e a r g r a d i e n t between the i n i t i a l and f i n a l a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n s . U s u a l l y an o p t i m a l t i m e was a r r i v e d a t by t r i a l - a n d - e r r o r - a t i m e r e s u l t i n g i n a r i s e i n a c e t o -n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n s l ow enough to r e s u l t i n peak- s e p a r a t i o n , but no t so s l ow as to b r o a d e n and f l a t t e n the peaks p a s t t h e p o i n t o f ea sy s p e c t r o p h o t o m e t r i c r e s o l u t i o n . S a t i s f a c t o r y r e s o l u t i o n o f p e p t i d e s was a c h i e v e d by t h e s e methods w i t h o u t t h e n e c e s s i t y o f a l t e r i n g t h e p a r a m e t e r s o f g r a d i e n t c u r v i l i n e a r i t y o r s o l v e n t f l o w r a t e . T y p i c a l l y t h e a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t s a r r i v e d a t by t h e s e methods r a n o v e r a 3% to 9% c o n c e n t r a t i o n d i f f e r e n c e w i t h i n t he 28% to 41 40% a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n r a n g e , o v e r an a p p r o x i m a t e 10 m i n u t e p e r i o d no m a t t e r what t h e s o u r c e o f t h e v a r i o u s p e p t i d e p r e p a r a t i o n s . The e x a c t p a r a m e t e r s u s e d f o r r e s o l u t i o n o f t h e v a r i o u s p e p t i d e p r e p a r a t i o n s a n a l y z e d by HPLC a r e i n c l u d e d i n t h e " R e s u l t s " s e c t i o n o f t h i s t h e s i s . HPLC t e c h n i q u e s u s ed i n t h e 125 p r e p a r a t i o n o f p u r e I -G IP a r e d i s c u s s e d i n a s e p a r a t i o n s e c t i o n ( s e e M e t h o d s I I , 2 ) . 4. P u r i f i c a t i o n o f p e p t i d e p r e p a r a t i o n s A f t e r c o n d i t i o n s f o r r e s o l v i n g t h e v a r i o u s s p e c t r o p h o t o -m e t r y " p e a k s " o f a p r o t e i n p r e p a r a t i o n we re known ( s e e p r e -c e d i n g s e c t i o n ) p u r i f i c a t i o n o f t h o s e peak s c o u l d be p e r f o r m e d i f d e s i r e d . P r o t e i n s a m p l e s u s ed f o r a n a l y t i c a l p u r p o s e s we re g e n e r a l l y i n t h e lOug - 50ug w e i g h t r a n g e w h e r e a s p r o t e i n s a m p l e s u s e d i n p u r i f i c a t i o n we re i n t h e 200ug - l , 000ug w e i g h t r a n g e . Some a d j u s t m e n t s we re n e c e s s a r y i n o r d e r t o use t h e s e h i g h e r amount s o f p r o t e i n : i ) S e n s i t i v i t y S e n s i t i v i t y o f t h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c d e t e c t o r and c h a r t r e c o r d e r was l e s s e n e d t o 2.0 A r b i t r a r y U n i t s F u l l S c a l e (AUFS) i n o r d e r t h a t t h e r e l a t i v e l y l a r g e amount s o f p r o t e i n p r e s e n t d i d n o t e x c e e d t h e m a x i m a l d e t e c t i o n l i m i t . i i ) G r a d i e n t a d j u s t m e n t s S i n c e t h e h i g h e r p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s g e n e r a l l y r e s u l t e d i n p e a k - b r o a d e n i n g , even a t l o w e r d e t e c t i o n s e n s i t i v i t y , a d j u s t -men t s we re made t o t h e g r a d i e n t s y s t e m a r r i v e d a t t h r o u g h t h e u se 42 o f l o w e r w e i g h t s o f s a m p l e s . T h o s e a d j u s t m e n t s . g e n e r a l l y t o o k t h e fo rm o f p r o l o n g i n g t h e t i m e between t h e i n i t i a l and f i n a l a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n s o f t he g r a d i e n t , r e s u l t i n g i n b e t t e r r e s o l u t i o n o f t h e p r o t e i n p e a k s . a) P u r i f i c a t i o n p r o t o c o l O u t f l o w f rom t h e co lumn was s i m u l t a n e o u s w i t h s p e c t r o p h o t o -m e t r y d e t e c t i o n o f p r o t e i n and g r a p h i n g o f s p e c t r o p h o t o m e t r y peaks v i a c h a r t r e c o r d e r . S e p a r a t i o n o f r e s o l v e d p r o t e i n s was a c c o m p l i s h e d ' t h r o u g h p o o l i n g t h e co lumn o u t f l o w d u r i n g each s p e c t r o p h o t o m e t r i c peak and d i s c a r d i n g t he o u t f l o w between p e a k s . The p r o c e d u r e was r e p e a t e d as o f t e n as d e s i r e d , and the r e s u l t i n g f r a c t i o n s c o n t a i n i n g c o r r e s p o n d i n g peaks p o o l e d a p p r o p r i a t e l y . The r o u g h l y 30% a c e t o n i t r i l e c o n t a i n e d i n t h e s e f r a c t i o n s was removed by p a s s i n g a s t r e a m o f n i t r o g e n gas o v e r t h e s u r f a c e o f t h e f r a c t i o n s . The r e m a i n i n g aqueous s o l u t i o n s were f r o z e n i n t h i n s h e l l s v i a i m m e r s i o n o f t h e i r c o n t a i n i n g v e s s e l s i n C O 2 - i c e -c o o l e d a c e t o n e and t h e n l y o p h i l i z e d u n t i l a d r y powder was e v i d e n t . S u b s e q u e n t r e l y o p h i 1 i z a t i o n o f t h e p r o d u c t f rom a 0.1M a c e t i c a c i d s o l u t i o n was u s u a l l y p e r f o r m e d . R e c h r o m a t o g r a p h y on HPLC o f a s amp le o f t h e p u r i f i e d p r o t e i n was p e r f o r m e d to c h e c k t h e p u r i t y o f t h e f i n a l p r e p a r a t i o n . b) Y i e l d The amount o f p r o t e i n i n each f r a c t i o n r e g a i n e d a f t e r i n i t i a l l y o p h i 1 i z a t i o n was d e t e r m i n e d by w e i g h t and compared to t h e w e i g h t o f t h e i n i t i a l p r e - p u r i f i c a t i on s a m p l e s . The " y i e l d " o f a p a r t i c u l a r p r o t e i n was c a l c u l a t e d as t h e amount o f p r o t e i n p r e -43 s e n t i n t h e a p p r o p r i a t e f r a c t i o n d i v i d e d b y t h e t o t a l a m o u n t o f p r e p u r i f i c a t i o n p r o t e i n . S i n c e l y o p h i 1 i z a t i o n f r o m a c e t i c a c i d r e s u l t e d i n a n i n c r e a s e d m a s s o f p r o d u c t d u e t o a c e t a t e s a l t f o r m -a t i o n , s a m p l e s w h i c h h a d b e e n r e l y o p h i 1 i z e d f r o m a c e t i c a c i d c o u l d n o t b e u s e d i n y i e l d d e t e r m i n a t i o n s . I I . P r o d u c t i o n o f - R a d i o - i o d i n a t e d G I P A . I o d i n a t i o n 1 2 7 1 . I - i o d i n a t i o n f o r u s e i n H P L C a n a l y s e s S o l u t i o n s : 4 0 m g c h l o r a m i n e - T i n ' 1 0 m l p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 . 5 12 6mg s o d i u m m e t a b i s u l p h i t e i n 1 0 m l p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 . 5 79mg s o d i u m i o d i d e i n 1 0 m l p h o s p h a t e b u f f e r , p H 7 . 5 l O O u l o f t h e a b o v e s o d i u m i o d i d e s o l u t i o n i n 1 0 0 m l p h o s p h a t e b u f f e r ( 1 : 1 0 0 0 d i 1 u t i o n ) l y g / y l G I P i n d i s t i l l e d H £ 0 T h e c o m p o s i t i o n o f t h e " p h o s p h a t e b u f f e r , pH 7 . 5 " i s d i s c u s s e d i n t h e s e c t i o n d e a l i n g w i t h i n s u l i n i o d i n a t i o n ( M e t h o d s , S e c t i o n : I , A , 2 , a ) . T h e r e a g e n t s w e r e m i x e d t o g e t h e r i n a p l a s t i c E p p e n d o r f m i c r o - t e s t - t u b e i n s e q u e n c e a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g p r o t o c o l : l O y l G I P l O y l 1 : 1 0 0 0 d i l u t e d s o d i u m i o d i d e l O y l c h l o r a m i n e T 44 15 s e c . e x p o s u r e w i t h g e n t l e m i x i n g b y t a p p i n g t u b e 2 0 y 1 s o d i u m m e t a b i s u l p h i t e g e n t l e m i x i n g a s a b o v e T h e r e s u l t i n g 5 0 y l m i x t u r e c o u l d b e r e m o v e d f r o m t h e t e s t - t u b e v i a s y r i n g e a n d i n j e c t e d d i r e c t l y i n t o t h e H P L C a p p a r a t u s . 12 5 / 1 2 7 2. I - i o d i n a t i o n f o r u s e i n H P L C a n a l y s e s T r a c e r a d i o a c t i v e i o d i n e ( ^ 1 0 c p m ) w a s s o m e t i m e s a d d e d t o t h e d i l u t e d s o d i u m i o d i d e r e a g e n t u s e d t o i o d i n a t e G I P i n o r d e r t h a t i d e n t i f i c a t i o n o f r a d i o a c t i v e - c o n t a i n i n g p r o t e i n p e a k s c o u l d b e o b t a i n e d . T h e i o d i n a t i o n p r o t o c o l w a s i d e n t i c a l t o t h a t 12 7 u s e d f o r I - i o.di n a t i o n , e x c e p t t h a t t o 1 0 m l o f 1 : 1 0 0 0 d i l u t e d 12 5 s o d i u m i o d i d e s o l u t i o n w a s a d d e d l y l ( 0 . 1 m C i ) o f I . T e n m i c r o -l i t r e s o f t"he r e s u l t a n t ; s o l u t i o n w a s u s e d d u r i n g i o d i n a t i o n i n 12 7 p l a c e o f t h e s o d i u m i o d i d e ( I ) s o l u t i o n . o 1 2 5 T ...... 3. I - v o d i n a t i o n 1 2 5 H P L C p u r i f i c a t i o n o f I - G I P w a s p e r f o r m e d o n G I P w h i c h h a d 12 5 b e e n i o d i n a t e d w i t h l O y l ( l m C i ) o f I . T h e p r o t o c o l w a s a s d i s c u s s e d a b o v e w i t h t h e s u b s t i t u t i o n o f r a d i o a c t i v e i o d i n e f o r n o n r a d i o a c t i v e i o d i n e . T h e r e s u l t i n g m i x t u r e w a s s e p a r a t e d i n t o 3 0 y l ('vlO c p m ) a l i q u o t s , f r o z e n i n l i q u i d n i t r o g e n a n d s t o r e d a t - 2 0 ° C t o a w a i t H P L C p u r i f i c a t i o n . H P L C p u r i f i c a t i o n 1 ? 7 D e t e r m i n a t i o n o f t h e e l u t i o n p r o f i l e o f I - G I P w a s a c h i e v e d b y f o l l o w i n g t h e g e n e r a l a p p r o a c h o u t l i n e d i n s e c t i o n I : C . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e v a r i o u s p e a k s w a s a c c o m p l i s h e d i n t w o 45 m a n n e r s : 12 7 i ) C o m p a r i s o n o f t h e I - G I P p r o f i l e w i t h t h a t o b t a i n e d f r o m e a c h o f t h e v a r i o u s r e a g e n t s , f r o m G I P , a n d f r o m G I P w h i c h h a d b e e n c h l o r a m i n e - T o x i d i z e d i n t h e a b s e n c e o f i o d i n e , i i ) C o r r e l a t i o n o f e l u a t e r a d i o a c t i v i t y ' w i t h s i m u l t a n e o u s a b s o r b a n c e a t 2 2 5 n m a l l o w e d i d e n t i f i c a t i o n o f i o d i n e - c o n -t a i n i n g p r o t e i n s . 1 2 5 P u r i f i c a t i o n o f I - G I P f r o m t h e o t h e r c o m p o n e n t s o f t h e i o d i n a t i o n m i x t u r e w a s t h e n p o s s i b l e . B e c a u s e o f t h e h i g h r a d i o -a c t i v i t y u s e d a n d t h e r e l a t i v e l y s m a l l a m o u n t o f p r o t e i n p r e s e n t , t h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c d e t e c t o r w a s r e m o v e d a n d o u t f l o w c o l l e c t e d d i r e c t l y f r o m t h e c o l u m n b y a u t o m a t e d f r a c t i o n c o l l e c t o r . 12 5 8 P u r i f i c a t i o n o f t h e I - G I P a l i q u o t s ( ^ 1 0 c p m ) ( s e e M e t h o d s , S e c t i o n : I I , A , 3 ) w a s p e r f o r m e d v i a H P L C a n d t h e r e s u l t i n g r a d i o -a c t i v e p r o f i l e c o m p a r e d w i t h t h e s p e c t r o p h o t o m e t r i c / r a d i o a c t i v e 12 5 / 1 2 7 p r o f i l e s o b t a i n e d w i t h ' I - G I P . T h e r a d i o a c t i v e f r a c t i o n s 1 2 5 c o r r e s p o n d i n g i n e l u t i o n t i m e t o I - G I P w e r e p o o l e d . T h e a c e t o -n i t r i l e w a s r e m o v e d b y p a s s i n g a n i t r o g e n g a s s t r e a m o v e r t h e s u r f a c e o f t h e s o l u t i o n . O n e p e r c e n t b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) w a s a d d e d t o t h e f r a c t i o n p r i o r t o n e u t r a l i z a t i o n w i t h a s m a l l v o l u m e o f 2M N a O H . T h i s a l b u m i n p r e v e n t e d t h e a d h e s i o n - o f ;. 1 2 5 n e u t r a l i z e d I - G I P t o g l a s s w a r e , p r e s u m a b l y b y s a t u r a t i n g p o t e n t i a l b i n d i n g s i t e s o n t h e g l a s s . T h e r a d i o a c t i v e s o l u t i o n w a s t h e n f r o z e n b y i m m e r s i o n o f t h e v e s s e l i n C O 2 - i c e - c o o l e d a c e t o n e a n d s t o r e d a t - 2 0 ° C b e h i n d l e a d s h i e l d i n g . 46 I I I . C o l o u r i m e t r i c D e t e r m i n a t i o n o f L i po p r o t e i n - L i p a s e - L i k e  A c t i v i t y T h e p r e s e n c e o f 1 i p o p r o t e i n - 1 i p a s e - 1 i k e e n z y m a t i c a c t i v i t y ( L P L A ) p r e s e n t i n f a t c e l l s o l u t i o n s ( s e e M e t h o d s , S e c t i o n : I V , B , 3 ) w a s a s s a y e d b y t h e c o l o u r i m e t r i c p r o c e d u r e o f N o v a k ( 1 9 6 5 ) . T h i s m e t h o d q u a n t i t a t e d t h e a m o u n t o f f r e e - f a t t y - a c i d s ( F F A ) l i b e r a t e d f r o m a t r i g l y c e r i d e m i x t u r e a s a n i n d e x o f L P L A . A . S o l u t i o n s a n d r e a g e n t s 1. D o l e ' s s o l u t i o n : 4 0 p a r t s i s o p r o p y l a l c o h o l 10 p a r t s h e p t a n e 1 p a r t 1 N H 2 S 0 4 O f h i g h e s t a v a i l a b l e c o m m e r c i a l p u r i t y . ?.. R e a g e n t A 6 g C o ( N 0 3 ) 2 . 6 H 2 0 + 0 . 8 m l g l a c i a l a c e t i c a c i d - m a d e t o l O O m l s w i t h f i l t e r e d , s a t u r a t e d K 2 S 0 ^ - s t o r e d a t 3 7 ° C 3. R e a g e n t B - a s a t u r a t e d N a ^ O ^ s o l u t i o n - s t o r e d i n c o n t a c t w i t h ex c e s s . s o l i d N a ^ O ^ a t 3 7 ° C 4. C o b a l t r e a g e n t 1 . 3 5 m l t r i e t h a n o l a m i n e 8 . 6 5 m l r e a g e n t A 47 7 . 0 0 m l r e a g e n t B - p r e p a r e d f r e s h d a i l y 5. I n d i c a t o r c o n c e n t r a t e 0 . 4 % 2 - n i t r o s o - 3 - n a p h t h o l i n 9 6 % e t h o n o l 6. I n d i c a t o r s o l u t i o n 1 p a r t i n d i c a t o r c o n c e n t r a t e + 1 2 . 5 p a r t s 9 6 % e t h a n o l 7. C h l o r o f o r m - h e p t a n e s o l u t i o n - 5 p a r t s c h l o r o f o r m : 1 p a r t h e p t a n e - m u s t b e o f h i g h e s t p o s s i b l e p u r i t y 8. F r e e - F a t t y - A c i d ( F F A ) s t a n d a r d s - 0 . 1 a n d 0.2M p a l m i t i c a c i d i n D o l e ' s s o l u t i o n - t h e s a m e s t a n d a r d s o l u t i o n s w e r e u s e d f o r a l l e x p e r i m e n t s 9. A c t i v a t e d s u b s t r a t e i ) 4 p a r t s N u t r a l i p i d 1 0 % f a t e m u l s i o n : 1 p a r t r a t s e r u m i i ) i n c u b a t e d a t 3 7 0 C , 3 0 m i n u t e s , s h a k i n g a t 1 2 0 c y c l e s / m i n T h e r e s u l t i n g c o m b i n a t i o n o f l i p i d s a n d s e r u m c o f a c t o r s c a u s e d t h e f o r m a t i o n o f l i p o p r o t e i n c o m p l e x e s . T h e s u b s t r a t e w a s a c t i v a t -e d i m m e d i a t e l y b e f o r e u s e . 1 0 . R a t s e r u m B l o o d w a s r e m o v e d w i t h a n 1 8 g n e e d l e f r o m t h e b i f u r c a t i o n o f t h e a o r t a . I t w a s t h e n p l a c e d i n 1 0 % s o d i u m c i t r a t e a n d m i x e d a n d c e n t r i f u g e d f o r 10 m i n u t e s a t 2 , 0 0 0 r p m . T h e r e s u l t i n g s u p e r n a t a n t s e r u m w a s f r o z e n a n d s t o r e d a t - 2 0 ° C . 48 B . P r o c e d u r e L P L A p r e s e n t i n h o m o g e n i z e d a c e t o n e - e t h e r e x t r a c t e d c e l l s , o r L P L A w h i c h h a d b e e n e l u t e d f r o m i n t a c t f a t c e l l s ( s e e M e t h o d s , S e c t i o n : I V , B , 3 ) w a s a s s a y e d b y t h e i n c r e a s e o f F F A c o n c e n t r a t -i o n p r e s e n t i n a c t i v a t e d s u b s t r a t e a f t e r i n c u b a t i o n w i t h t h e e n z y m e s o u r c e . T h e f o l l o w i n g p r o t o c o l w a s u s e d : i ) 2 0 0 y T ' i n t a c t f a t c e l l n r r x t u r e 4 n b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n o r 2 0 0 y l a c e t o n e - e t h e r e x t r a c t e d p o w d e r s i n 0 . 0 5 M NH^ CM /NH4CI ( p H 8 . 1 ) b u f f e r i i ) a d d e d - 2 0 0 y l 5% B S A i n 2 . 1 M g l y c i n e b u f f e r , p H 8 . 3 - l O O y l 2.1M g l y c i n e b u f f e r , p H 8 . 3 - 5 0 0 y l a c t i v a t e d s u b s t r a t e i i i ) i n c u b a t e d i n a s h a k i n g - w a t e r b a t h a t 3 7 ° C f o r 1 h o u r a t 1 2 0 e y c l e s / m i n i v ) b e f o r e a n d a f t e r i n c u b a t i o n , l O O y l o f t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e w a s a d d e d t o 5 0 0 y l D o l e ' s s o l u t i o n a n d s t o r e d o n i c e . v ) t o t h e a b o v e D o ! e ' s / s a m p l e t u b e s w e r e a d d e d 6 0 0 y l h e p t a n e a n d l O O O y l d i s t i l l e d H 2 0 . v i ) a f t e r m i x i n g 6 0 0 y l o f t h e u p p e r h e p t a n e p h a s e w a s r e m o v e d a n d t o t h i s w a s a d d e d 8 0 0 y l c h 1 o r o f 0 r m - h e p t a n e a n d l O O O y l c o b a l t r e a g e n t . T h e s a m p l e s w e r e v o r t e x e d f o r 3 m i n u t e s a n d c e n t r i f u g e d f o r 15 m i n u t e s a t 2 5 0 0 r p m . . v i i ) T o 6 0 0 y l o f t h e u p p e r c h l o r o f o r m - h e p t a n e p h a s e w e r e a d d e d 75 0 y l o f i n d i c a t o r s o l u t i o n . v i i i ) A f t e r 3 0 m i n u t e s t h e c o l o u r e d s o l u t i o n s w e r e r e a d a t 5 0 0 n m i n a s p e c t r o p h o t o m e t e r . B l a n k s ( l O O y l H^O i n s t e a d o f s a m p l e i n t h e i n i t i a l D o l e ' s t u b e s ) a n d s t a n d a r d s w e r e a l s o r e a d . 49 A l e a s t - s q u a r e s c a l c u l a t o r p r o g r a m w a s u s e d t o f i t t h e b e s t l i n e t o t h e z e r o a n d s t a n d a r d v a l u e s . A l i n e a r r e g r e s s i o n c o -e f f i c i e n t o f l e s s t h a n + 0 . 9 5 r e s u l t e d i n i n v a l i d a t i o n o f t h e s t a n d a r d v a l u e s . U n k n o w n F F A v a l u e s w e r e f o u n d b y i n t e r p o l a t i o n o r e x t r a p o l a t i o n u s i n g t h e c a l c u l a t o r l e a s t - s q u a r e s p r o g r a m . I V . E x p e r i m e n t a l P r o c e d u r e s - A n i m a l S t u d i e s A . I s o l a t e d P e r f u s e d R a t . P a n c r e a s T h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s r e p r e s e n t e d a n i_n v i t r o m o d e l f o r t h e s t u d y o f t h e i s o l a t e d e f f e c t s o f s t i m u l i a n d i n -h i b i t o r s o f p a n c r e a t i c p e p t i d e s e c r e t i o n . 1. S o l u t i o n s a n d r e a g e n t s a ) K r e b s c o n c e n t r a t e 2 8 5 m l 154mM KC1 2 4 3 m l 1 0 2 . 7 m M C a C l 2 7 8 m l 154mM M g S 0 4 - 7 H 2 0 9 7 m l 154mM K H 2 P 0 4 - s t o r e d a t 4 ° C - r e p l e n i s h e d w e e k l y b ) P e r f u s a t e W e i g h t s o f D e x t r a n ( C I i n i c a l G r a d e ) a n d B S A ( R I A G r a d e ) c o r r e s p o n d i n g t o 3% a n d 0 . 2 % r e s p e c t i v e l y o f t h e p r o j e c t e d f i n a l p e r f u s a t e v o l u m e w e r e d i s s o l v e d i n 0 . 9 % s a l i n e o v e r n i g h t , a t 4 ° C . On t h e m o r n i n g o f t h e e x p e r i m e n t , K r e b s c o n c e n t r a t e , 50 N a C l , N a H C O g a n d e i t h e r g l u c o s e o r a m e t a b o l i t e ( s e e r e s u l t s s e c t i o n ) w e r e a d d e d t o y i e l d f i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f : 4.4mM KC1 2.5mM Ca C I 2 1.2mM M g S 0 4 - 7 H 2 0 1.5mM K H 2 P 0 4 25mM N.aHC0 3 120mM N a C l 0 . 2 % B S A 3% D e x t r a n G l u c o s e o r m e t a b o l i t e c o n c e n t r a t i o n s a s d e s i r e d c ) S i d e - a r m i n f u s a t e s S u b s t a n c e s w h i c h w e r e d e l i v e r e d t o t h e p a n c r e a s v i a a s i d e -a r m i n f u s i o n w e r e d i s s o l v e d i n a c o n c e n t r a t e d f o r m w h i c h w a s o f a p p r o p r i a t e c o n c e n t r a t i o n t o y i e l d t h e d e s i r e d f i n a l s u b s t a n c e c o n c e n t r a t i o n w h i c h w o u l d r e s u l t f r o m m i x i n g t h e 0'. 2 0 6 m l / m i n . i n f u s i o n w i t h t h e 4 . 0 m l / m i n . p e r f u s i o n . 2 . P r o c e d u r e  a ) S u r g i c a l p r e p a r a t i o n T h e t e c h n i q u e u s e d t o i s o l a t e a n d p e r f u s e t h e r a t p a n c r e a s w a s a m o d i f i c a t i o n o f t h e m e t h o d o r i g i n a l l y d e s c r i b e d b y G r o d s k y e t a l ( 1 9 6 3 ) . M a l e W i s t a r r a t s o f w e i g h t 2 0 0 g - 3 0 0 g w e r e f a s t e d o v e r n i g h t a n d a n a e s t h e t i z e d w i t h i n t r a p e r i t o n e a l i n j e c t i o n o f 6 0 m g / k g p h e n o b a r b i t o ! . T h e v i s c e r a w e r e e x p o s e d b y a m i d l i n e i n c i s i o n 51 f r o m p e l v i s t o s t e r n u m a n d t h e c a v i t y e n l a r g e d b y l a t e r a l i n - " c i s i o n s i n t h e b o d y w a l l s . T h e a r t e r i a l b l o o d s u p p l y t o t h e d e s c e n d i n g c o l o n w a s t e r m i n a t e d b y a l i g a t u r e p l a c e d a r o u n d t h e d e s c e n d i n g c o l o n a n d a s s o c i a t e d v e s s e l s . A d r a i n a g e t u b e w a s i n -s e r t e d i n t h e s m a l l b o w e l j u s t i n f e r i o r t o t h e l e v e l o f t h e p a n c r e a s . T h e m e s e n t e r i c a r c a d e s w e r e t h e n s y s t e m a t i c a l l y d o u b l y -l i g a t e d d i s t a l t o t h e d r a i n a g e t u b e a n d s e c t i o n e d b e t w e e n t h e l i g a t u r e s . T h e c o l o n w a s d o u b l y - 1 i g a t e d i m m e d i a t e l y c e p h a l a d o f t h e c a e c u m , s e c t i o n e d b e t w e e n t h e l i g a t u r e s , a n d r e m o v e d a l o n g w i t h a l l t h e b o w e l s e g m e n t b e t w e e n t h e d r a i n a g e t u b e a n d c o e c u m . T h e o e s o p h a g u s a n d a s s o c i a t e d a r t e r y w e r e d o u b l y - 1 i g a t e d a s f a r c e p h a l a d o f t h e s t o m a c h a s p o s s i b l e a n d s e c t i o n e d b e t w e e n t h e l i g a t u r e s . T h e s t o m a c h w a s r e m o v e d a f t e r s y s t e m a t i c d o u b l e l i g a t i o n a n d s e c t i o n i n g o f v e s s e l s a l o n g t h e g r e a t e r c u r v a t u r e a n d a f t e r s e c t i o n i n g d i s t a l t o t h e a n t r u m . S i n g l e l i g a t u r e s w e r e u s e d t o i s o l a t e t h e s p l e e n b u t t h e s p l e e n w a s n o t r e m o v e d . T h e r i g h t k i d n e y a n d a d r e n a l ' g l a n d w e r e i s o l a t e d u s i n g a s i n g l e l i g -a t u r e . T h e l e f t k i d n e y a n d a d r e n a l g l a n d v e s s e l s w e r e d o u b l y -l i g a t e d a n d s e c t i o n e d t o a l l o w e x p o s u r e o f t h e l o w e r a o r t a . A f t e r i s o l a t i o n o f t h e p a n c r e a s t h e b l o o d s u p p l y t o t h e v i s c e r a c o n t i n u e d o n l y t o t h e p a n c r e a s a n d a s m a l l s e c t i o n o f a s s o c i a t e d d u o d e n u m . S i n g l e l o o s e l i g a t u r e s w e r e p l a c e d c e p h a l a d o f t h e c o e l i a c a r t e r y ; d i s t a l t o t h e s u p e r i o r m e s e n t e r i c a r t e r y b u t c e p h a l a d o f t h e r e n a l a r t e r y s t u m p ; a n d 1.5 t o 2 . 0 c m b e l o w t h e r e n a l a r t e r y s t u m p . T h e a b d o m i n a l a o r t a w a s t h e n c a n n u l a t e d w i t h p o l y e t h y l e n e t u b i n g ( P E 1 6 0 ) t o t h e l e v e l o f t h e s u p e r i o r m e s e n -t e r i c a r t e r y t o a l l o w p e r f u s i o n o f t h e c o e l i a c a n d s u p e r i o r 52 m e s e n t e r i c a r t e r i e s . F i v e h u n d r e d m i c r o l i t r e s o f h e p a r i n s a l i n e wer.e t h e n i n j e c t e d . T h e r a t was h e m i - s e c t e d a t t h e l e v e l o f t h e d i a p h r a g m a n d t h e u p p e r h a l f o f t h e c a r c a s s d i s c a r d e d . T h e h e p a t i c p o r t a l v e i n w a s c a n n u l a t e d ( P E 90 p o l y e t h y l e n e t u b i n g ) i n o r d e r t o c o l l e c t v e n o u s e f f l u e n t . b ) A p p a r a t u s P e r f u s a t e w a s p u m p e d t h r o u g h t h e p a n c r e a s a t a r a t e o f 4 m l / m i n u s i n g a p e r i s t a l t i c p u m p . P e r f u s i o n p r e s s u r e w a s m o n i t o r e d a n d m a i n t a i n e d b e t w e e n 40 a n d 6 0 t o r r . Two s e p a r a t e s e r v o -c o n t r o l l e d t e m p e r a t u r e r e g u l a t o r s m a i n t a i n e d t h e p e r f u s a t e a n d c a r c a s s a m b i e n t t e m p e r a t u r e a t 3 7 ° C . A b u b b l e t r a p j u s t p r o x i m a l t o t h e a o r t i c c a n n u l a r e m o v e d l a r g e b u b b l e s f r o m t h e p e r f u s a t e . T h e p e r f u s a t e was g a s s e d t o p H 7 . 4 w i t h a 9 5 % 0 ^ / 5 X 0 0 2 m i x t u r e w h i c h h a d b e e n s a t u r a t e d w i t h w a t e r v a p o u r b y b e i n g f i r s t p a s s e d t h r o u g h a w a t e r - f i l l e d f l a s k . S i d e - a r m i n f u s i o n s o f c o n c e n t r a t e d s u b s t a n c e s c o u l d b e a d d e d a t t h e l e v e l o f t h e a r t e r i a l c a n n u l a u s i n g a H a r v a r d i n f u s i o n p u m p . E f f l u e n t w a s c o l l e c t e d b y a u t o m a t e d f r a c t i o n c o l l e c t i o n a f t e r o n e p a s s t h r o u g h t h e p a n c r e a t i c v a s c u l a t u r e . Two m e t h o d s w e r e u s e d t o v a r y t h e c o n c e n t r a t i o n o f p e r f u s a t e - d e l i v e r e d s u b s t a n c e s : i ) S q u a r e - w a v e c o n c e n t r a t i o n c h a n g e s T h e u s e o f t w o p a r a l l e l r e c i r c u l a t i n g p e r f u s a t e s y s t e m s c o n t a i n i n g d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f s u b s t a n c e s a l l o w e d f o r r a p i d s w i t c h i n g . ( e s s e n t i a l 1 y a s q u a r e - w a v e c h a n g e ) o f s o l u t e c o n c e n t r a t i o n . T h e l o w s o l u t e c o n c e n t r a t i o n s y s t e m w a s i n i t i a l l y 53 p a s s e d t h r o u g h t h e p a n c r e a s w h i l e t h e h i g h c o n c e n t r a t i o n s y s t e m r e c i r c u l a t e d w i t h o u t p a s s i n g t h r o u g h t h e p a n c r e a s . A t t h e ! d e s i r e d t i m e t h e t w o s y s t e m s w e r e i n t e r c h a n g e d a t t h e l e v e l o f t h e f i l t e r b u b b l e - t r a p a n d t h e p a n c r e a s w a s p r e s e n t e d ' w i t h a s q u a r e - w a v e c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e . i i ) L i n e a r g r a d i e n t c o n c e n t r a t i o n c h a n g e s I n p l a c e o f t h e d u a l r e c i r c u l a t i n g s y s t e m s , t w o l i n k e d i d e n t i c a l c h a m b e r s ( A a n d B) w e r e c o n n e c t e d a t t h e b a s e b y 1cm p o l y e t h y l e n e t u b i n g . P e r f u s a t e w a s p u m p e d f r o m c h a m b e r A t o t h e p a n c r e a s , a n d w a s c o n t i n u o u s l y f e d f r o m c h a m b e r B . T h e l i n e a r i t y o f t h e g r a d i e n t d e p e n d e d o n a n e q u a l v o l u m e i n e a c h c h a m b e r , s o a t t h e d e s i r e d t i m e o f c o m m e n c e m e n t o f t h e g r a d i e n t a c o n c e n t r a t -e d s o l u t i o n o f t h e g r a d i e n t s o l u t i o n w a s a d d e d t o c h a m b e r B a n d a n e q u a l v o l u m e o f p e r f u s a t e t o c h a m b e r A . , c ) E q u i l i b r a t i o n I n a l l p e r f u s i o n e x p e r i m e n t s a 10 m i n u t e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d p r e c e d e d c o l l e c t i o n o f t h e p a n c r e a t i c e f f l u e n t i n o r d e r t o a l l o w a n y e f f e c t s c a u s e d b y s u r g i c a l t r a u m a t o t h e p a n c r e a s t o s u b s i d e . B. E x p e r i m e n t s u s i n g i s o l a t e d r a t f a t c e l l s  1. I n c u b a t i o n o r M a s h i n g M e d i u m R e a g e n t F i n a l m o l a r i t y (mM) N a C l 1 2 5 KC1 5 C a C l 2 1 54 Mg C I 2 2 . 5 K H 2 P 0 4 1 T r i s - H C l 2 5 T h e pH o f t h i s " b a l a n c e d s a l t s o l u t i o n " ( B S S ) w a s a d j u s t e d t o 7 .4 - 7 . 6 w i t h 2MHC1 o r I M t r i s b a s e . F o u r p e r c e n t B S A w a s a d d e d t o t h e s o l u t i o n f o r s o m e u s e s ( B S A - B S S ) . 2. I s o l a t i o n o f R a t F a t C e l l s T h e m e t h o d o f R o d b e l l ( 1 9 7 2 ) w a s u s e d . R a t s w e r e k i l l e d b y c e r v i c a l d i s l o c a t i o n . T h e a b d o m i n a l c a v i t y w a s o p e n e d a n d e p i d i d y m a l f a t p a d s q u i c k l y r e m o v e d . C a r e w a s t a k e n n o t t o i n -c l u d e m a j o r b l o o d v e s s e l s . T h e t i s s u e w a s c h o p p e d u n d e r B S A - B S S w i t h f i n e s c i s s o r s a n d t h e i n f r a n a t a n t w a s a s p i r a t e d b y s i l i c o n -i z e d p a s t e u r p i p e t t e . T h e m i n c e d c e l l s w e r e p o u r e d i n t o p l a s t i c s c i n t i l l a t i o n v i a l s c o n t a i n i n g 1 0 0 y 1 o f 2 5 m g / m l c o l l a g e n a s e ( i n B S S ) a n d 3 m l s B S A - B S S . p e r f a t p a d . T h e c o v e r e d v i a l s w e r e i n c u -b a t e d a t 3 7 ° f o r 4 5 m i n u t e s i n a s h a k e r b a t h s e t a t 1 3 0 c y c l . e s / m i n A t t h e e n d o f t h e i n c u b a t i o n p e r i o d t h e c e l l s w e r e f i l t e r e d t h r o u g h a s i l k s c r e e n ( m e s h s i z e 7 x l O x ) a t t a c h e d t o a p l a s t i c 1 0 m l s y r i n g e . T h e f i l t r a t e w a s d e c a n t e d i n t o p l a s t i c c e n t r i f u g e t u b e s a n d g e n t l y s p u n i n a d e s k t o p c e n t r i f u g e . T h e i n f r a n a t a n t w a s a s p i r a t e d w i t h a s i l i c o n i z e d p a s t e u r p i p e t t e a t t a c h e d t o a w a t e r - f a u c e t v a c u u m . T h e c e l l s w e r e r e s u s p e n d e d i n f r e s h B S A - B S S a n d t h e c e n t r i f u g a t i o n / a s p i r a t i o n p r o c e d u r e r e p e a t e d u n t i l a l l t h e c o l l a g e n a s e h a d b e e n r e m o v e d ( 3 o r 4 w a s h e s ) . C e l l s w e r e a g a i n f i l t e r e d t h r o u g h a s i l k s c r e e n a n d w e r e t h e n r e a d y f o r u s e i n e i t h e r l i p o p r o t e i n - l i p a s e o r b i n d i n g e x p e r i m e n t i n c u b a t i o n s . 55 I t w a s i m p o r t a n t t h a t f a t c e l l s c a m e i n c o n t a c t o n l y - w i t h p l a s t i c o r s i l i c o n i z e d g l a s s , s i n c e c o n t a c t w i t h u n s i 1 i c o m ' z e d g l a s s c a u s e d c e l l l y s i s . 3. L i p o p r o t e i n - 1 i p a s e s t u d i e s M e a s u r e m e n t o f 1 i p o p r o t e i n - 1 i p a s e - 1 i k e a c t i v i t y ( L P L A ) i n r e s p o n s e t o i n c u b a t i o n w i t h G I P w a s m e a s u r e d i n t w o m a n n e r s . O n e m e a s u r e m e n t w a s o f h e p a r i n - e l u t a b l e L P L A f r o m i n t a c t f a t c e l l s , r e p r e s e n t i n g p r e s u m a b l y t h e p h y s i o l o g i c a l l y a c t i v e e n z y m e p r e s e n t i n r e s p o n s e t o G I P . T h e s e c o n d m e a s u r e m e n t w a s o f L P L A p r e s e n t i n a c e t o n e - e t h e r e x t r a c t e d p o w d e r f r o m h o m o g e n i z e d f a t c e l l s , r e -p r e s e n t i n g t h e s u m o f b o t h t h e h e p a r i n - e l u t a b l e a n d i n t r a c e l l u l a r e n z y m e c o n t e n t . I n c u b a t i o n o f t h e c e l l s w i t h G I P w a s i d e n t i c a l f o r e a c h f o r m o f m e a s u r e m e n t : i ) t h e i s o l a t e d c e l l s w e r e c o u n t e d a s f o l l o w s : t e n m i c r o l i t r e s o f a 1 : 1 0 d i l u t i o n w a s p l a c e d o n a g l a s s s l i d e u n d e r a s t e r e o -s c o p i c m i c r o s c o p e a t 40 x m a g n i f i c a t i o n . C e l l s w e r e d i l u t e d w i t h B S A - B S S t o y i e l d a f i n a l i n c u b a t i o n c o n c e n t r a t i o n o f 0.5 - 5 x 1 0 5 e e l l s / m l . i i ) i n p l a s t i c i n c u b a t i o n t u b e s w e r e p l a c e d : 1 m l f a t c e l l s o l u t i o n 3mU p o r c i n e i n s u l i n i n l O O y l B S A - B S S 2 0 y l 1 0 m g / m l H e p a r i n i n s a l i n e 1.5ml o x y g e n a t e d B S A - B S S c o n t a i n i n g 2 0 0 m g % g l u c o s e I n c u b a t i o n s p r o c e e d e d f o r 1 h o u r a t 3 7 ° C a n d s h a k i n g a t 8 0 ' c y c l e s / m i n u t e . 56 D e t e r m i n a t i o n o f e l u a t e L P L A w a s d o n e u s i n g 2 0 0 y l o f t h e p o s t i n c a b a t i o n f a t c e l l m i x t u r e ( s e e S e c t i o n : I I I , B ) . D e t e r m i n a t i o n o f a c e t o n e - e t h e r L P L A w a s p e r f o r m e d a f t e r t h e e x t r a c t i o n p r o c e d u r e : i ) t h e f a t c e l l m i x t u r e r e m a i n i n g a f t e r r e m o v a l o f 2 0 O y 1 f o r e l u a t e L P L A m e a s u r e m e n t w a s f i r s t h o m o g e n i z e d i n T r i s HC1 ( 0 . 0 6 7 M ) p H 7 . 4 : r a t s e r u m ( 3 : 1 ) a n d i c e - c o l d ' a c e t o n e , i i ) t h e p r e c i p i t a t e f o r m e d w a s s e d i m e n t e d b y c e n t r i f u g a t i o n f o r t w o m i n u t e s ( ^ 3 0 0 0 r p m ) i n a d e s k - t o p c e n t r i f u g e . T h e s u p e r -n a t a n t a c e t o n e l a y e r w a s r e m o v e d a n d t h e s e d i m e n t w a s h e d , h o m o g e n i z e d , c e n t r i f u g e d a n d e x t r a c t e d t w i c e m o r e w i t h i c e -c o l d a c e t o n e a n d o n c e w i t h i c e - c o l d e t h e r , i i i ) t h e r e s u l t a n t p o w d e r w a s d r i e d f o r 30 m i n u t e s u n d e r v a c u u m , i v ) t h e d r i e d p o w d e r w a s r e s u s p e n d e d b y h o m o g e n i z a t i o n i n 2 0 0 y l o f M H 4 0 H / N H 4 C 1 b u f f e r ( 0 . 0 5 M , p H 8 . 1 ) a n d i n 5 - 1 0 U ( 2 0 y l ) o f H e p a r i n . L P L A d e t e r m i n a t i o n w a s t h e n p e r f o r m e d a s d i s c u s s e d i n S e c t i o n ' I I I , B :. 4. B i n d i n g s t u d i e s A f t e r i s o l a t i o n i t w a s p o s s i b l e t o i n c u b a t e t h e f a t c e l l s 12 5 w i t h I - G I P a n d t h e n t o m e a s u r e r a d i o a c t i v i t y w h i c h r e m a i n e d a s s o c i a t e d w i t h t h e c e l l s . S e p a r a t i o n o f c e l l u l a r - b o u n d r a d i o -a c t i v i t y a n d f r e e r a d i o a c t i v i t y w a s a c c o m p l i s h e d b y t w o d i f f e r e n t t e c h n i q u e s - v a c u u m f i l t r a t i o n a n d o i l f l o t a t i o n . I n c u b a t i o n o f t h e f a t c e l l s p r e c e d i n g s e p a r a t i o n f o l l o w e d t h e s a m e p r o t o c o l r e g a r d l e s s o f t h e s e p a r a t i o n t e c h n i q u e u s e d . I n p l a s t i c i n c u b a t i o n t u b e s w e r e i n c u b a t e d : l O O y l o f f a t c e l l s ( 0 . 5 - 5 x 1 0 5 c e l l s / m l ) 57 l O O y l 1 2 5 1 - G l P i n B S A - B S S ( M 0 7 c p m ) 2 0 0 y l o x y g e n a t e d B S A - B S S c o n t a i n i n g 200mg%- g l u c o s e , l O m g / m l H e p a r i n a n d 3% T r a s y l o l a p r o t i n i n l O O y l p o r c i n e G I P o r B S A - B S S b u f f e r I n c u b a t i o n s w e r e p e r f o r m e d i n a s h a k e r - b a t h a t 3 0 ° C f o r 30 m i n u t e s a t 80 c y c l e s / m i n u t e . S t a r t i n g a n d f i n i s h i n g ' t i m e s o f t u b e s w e r e s t a g g e r e d ' s o t h a t a c c u r a t e 3 0 m i n u t e i n c u b a t i o n t i m e s c o u l d b e a c h i e v e d . a ) V a c u u m f i l t r a t i o n T h e r e a c t i o n w a s s t o p p e d b y a d d i t i o n o f 2 m l i c e - c o l d B S S t o e a c h i n c u b a t i o n t u b e . T h e m i x t u r e w a s t h e n p o u r e d o n t o a M i l l i -p o r e EAWP n i t r o c e l l u l o s e f i l t e r ( l y m p o r e s i z e ) u n d e r v a c u u m . T h e i n c u b a t i o n t u b e w a s r i n s e d t w i c e w i t h 5ml o f c o l d B S S a n d t h e w a s h e s a l s o f i l t e r e d . R a d i o a c t i v i t y r e m a i n i n g o n t h e f i l t e r w a s c o u n t e d a n d e x p r e s s e d a s a p e r c e n t o f t h e t o t a l r a d i o a c t i v i t y p r e s e n t i n t h e i n i t i a l i n c u b a t i o n t u b e . NSB t u b e s c o n t a i n i n g no f a t c e l l s w e r e a l s o t r e a t e d i n a s i m i l a r m a n n e r . b ) O i l f l o t a t i o n A n a l t e r n a t i v e s e p a r a t i o n t e c h n i q u e u s e d d i n o n y l p t h a l a t e o i l , w h i c h w a s o f i n t e r m e d i a t e d e n s i t y b e t w e e n f a t c e l l s a n d t h e B S A - B S S i n c u b a t i o n m e d i u m . A t t h e e n d o f a n i n c u b a t i o n , 2 x 2 0 0 y l o f t h e f a t e e l 1 m i x t u r e w e r e r e m o v e d f r o m t h e t u b e a n d e a c h p l a c e d i n m i c r o f u g e t u b e s c o n t a i n i n g l O O y l d i n o n y l p t h a l a t e . T h e t u b e s w e r e i m m e d i a t e l y c e n t r i f u g e d f o r 15 s e c o n d s i n a m i c r o -c e n t r i g u e -. c a u s i n g t h e f a t c e l l s a n d b o u n d r a d i o a c t i v i t y t o f l o a t t o t h e t o p o f t h e u p p e r o i l p h a s e . T h e p h a s e s w e r e 58 i m m o b i l i z e d t h r o u g h i m m e r s i o n o f t h e t u b e s i n l i q u i d n i t r o g e n . T h e t u b e s w e r e c u t j u s t a b o v e t h e o i l / B S A - B S S i n t e r f a c e a n d t h e r e s u l t i n g b o u n d ( o i l p h a s e ) a n d f r e e ( B S A - B S S p h a s e ) r a d i o a c t i v e c o u n t s d e t e r m i n e d . 59 A P P E N D I X TO M E T H O D S - C h e m i c a l S o u r c e s C h e m i c a l G r a d e * S o u r c e A c e t o n e A n a l a R BDH A c e t o n i t r i l e ( f o r H P L C ) O m n i s o l v e BDH A m m o n i um a c e t a t e A n a l a R BDH A r g i n i n e - E a s t m a n B o v i n e s e r u m a l b u m i n R I A S i gma C a C U - F i s h e r C a r b o n D e c o l o u r i z i n g N o r i t - F i s h e r C h i o r a m i n e - T - E a s t m a n C i t r a t e ( f r o m c i t r i c a c i d , t r i s o d i u m s a l t ) S i gma C i t r i c a c i d _ S i g m a C M - c e l l u l o s e 52 - P h a r m a c i a C o n c e n t r a t e d HC1 A r i s t a r BDH C o ( N O j ? - 6 H 0 0 A n a l a R BDH d b c A M P c _ S i gma D e x t r a n C l i n i c a l S i gma D e x t r a n T - 7 0 - S e r o n o D - g l y c e r a l d e h y d e - S i gma 3,5 D i i o d o L - t y r o s i n e S i g m a D i n o n y l p t h a l a t e 9 9 % BDH E t h e r , A n h y d r o u s , P u r i f i e d - B a k e r G l a c i a l a c e t i c a c i d A r i s t a r BDH G l u c o s e ( D e x t r o s e ) - F i s h e r G l y c i n e - S i gma H 2 0 ( f o r H P L C ) O m n i s o l v e BDH H e p a r i n L a b o r a t o r y F i s h e r H e p t a n e H P L C F i s h e r I n s u l i n ( p o r c i n e ) - N o v o I n s u l i n ( r a t ) - N o v o I s o p r o p y l a l c o h o l P h o t r e x B a k e r « k e t o g l u a r a t e ( s o d i u m ) s a l t ) - E a s t m a n 2 - k e t o c a p r o a t e - S i g m a 2 - k e t o i s o c a p r o a t e - S i gma K ? S 0 4 - B a k e r KC1 4 - F i s h e r K H 9 P 0 „ - F i s h e r KO 2! 4 - F i s h e r L - g l u t a m i n e I l l 9 9 - 1 0 0 % S i g m a L - l e u c i n e S i g m a 3 - M o n o i o d o L - t y r o s i n e - S i g m a M a l e i c a c i d - E a s t m a n M e r t h i o l a t e ( E t h y l m e r u r i t h i o s a l i c y l i c A c i d ) - E a s t m a n M g S O * 7 H 2 0 - F i s h e r 2 - n i t r o s o - g - n a p t h o l - S i g m a N a 2 S 0 4 - MCB L o t # ( i f a p p l i c a b l e ) 8 2 3 3 4 - 0 7 4 0 C 9 A A 5 7 3 6 0 F - 0 5 8 1 9 6 0 1 2 0 1 / 6 6 4 6 1 2 9 C - 7 2 7 0 1 2 4 C - 0 2 3 7 0 0 7 8 7 8 7 9 3 0 1 9 3 0 F - 0 2 8 9 7 0 6 6 3 7 9 5 2 C9 A 9 9 C - 5 0 1 8 2 7 C - 5 0 0 9 7 0 3 6 9 7 0 F - 5 4 4 1 0 S C - 0 1 1 3 D8B B 8 A 7 5 4 8 1 4 7 9 C - 0 3 1 1 6 H I 0 C h e m i c a 1 60 G r a d e * S o u r c e L o t # ( i f a p p l i c a b l e ) " s p e c i a l l y p u r e " Na I i n NaOH N a H ? P 0 . N a H C O -NaOH J N u t r a 1 i p i d P a l m i t i c a c i d P o t a s s i u m i o d i d e " P r o n a s e " - P r o t e a s e f r o m s t r e p t o m y c e s g r i s e u s P y r u v a t e ( s o d i u m s a l t ) Q U SO m i c r o f i n e s i l i c a G 32 S e p h a d e X y G - 1 0 S o d i u m I o d i d e S o d i u m a c e t a t e ( F u s e d - a n h y d r o u s ) S o d i u m a z i d e P r a c t i c a l S o d i u m b a r b i t a 1 S o d i u m c h l o r i d e S o d i u m m e t a b i s u l p h i t e S o m a t o s t a t i n - c y c l i c -s y n t h e t i c S u c c i n i c - a c i d T h e o p h y l l i n e B T r a s y l o l -T r i e t h a n o l a m i n e T r i - f l u o r o a c e t i c a c i d S e q u e n a l T r i i o d o t h y r o n i n e T r i s - H C l T r i z m a b a s e T y r - 1 - s o m a t o s t a t i n ( s y n t h e t i c ) A m e r s ham F i s h e r A m a c h e m F i s h e r P h a r m a c i a B DH N i c h o l s S i g m a E a s t m a n P h i l a d e l - " p h i a Q u a r t z P h a r m a c i a F i s h e r F i s h e r B a k e r F i s h e r F i s h e r F i s h e r K a b i S i g m a C a 1 b i o c h e m M i l e s S i gma P i e r c e S i g m a S i g m a S i gma S e r o n o 6 2 3 8 4 0 0 5 0 9 5 5 8 C - 0 0 3 9 A 9 6 G E - 1 9 4 5 8 7 5 1 3 4 9 8 0 1 1 O Z 7 7 6 2 7 1 6 2 C - 3 6 7 0 3 0 0 2 3 1 6 0 F 0 2 4 9 2 4 C - 0 0 6 4 2 2 F - S 0 4 9 6 9 C - 5 0 0 3 * w h e r e u n s p e c i f i e d , c h e m i c a l s w e r e o f s t a n d a r d r e a g e n t - g r a d e p u r i t y 61 R e s u l t s I . I s o l a t e d P e r f u s e d R a t P a n c r e a s E x p e r i m e n t s A_. I n s u l i n R e l e a s e M e t a b o l i c c o m p o u n d s a n d G I P a ) E f f e c t o f D - g l y c e r a l d e h y d e a n d G I P D - g l y c e r a l d e h y d e d i s s o l v e d i n p e r f u s a t e , w a s p r e s e n t e d t o t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s a t t w o c o n c e n t r a t i o n s . F i v e m i l l i m o l a r D - g l y c e r a 1 d e h y d e w a s p e r f u s e d f o r 1 5 m i n u t e s a f t e r w h i c h t h e c o n c e n t r a t i o n w a s r a p i d l y s w i t c h e d t o lOmM D - g l y c e r a 1 d e -h y d e . T h e 1OmM D - g l y c e r a l d e h y d e p e r f u s i o n c o n t i n u e d f o r '40 m i n u t e s . T h e f i r s t 10 m i n u t e s o f t h e 5mM D - g l y c e r a l d e h y d e p e r f u s i o n w a s t r e a t e d a s a n e q u i l i b r a t i o n p e r i o d a n d t h e e f f l u e n t f r o m t h e p a n -c r e a s w a s d i s c a r d e d d u r i n g t h i s t i m e . D - g l y c e r a l d e h y d e i n d u c e d a b i p h a s i c i n c r e a s e i n i n s u l i n o u t -p u t f r o m t h e p a n c r e a s ( F i g u r e 3, T a b l e 1 ) , c h a r a c t e r i z e d b y a s l o w d e c l i n e i n i n s u l i n o u t p u t a s t h e p e r f u s i o n p r o g r e s s e d . A 15 m i n u t e s i d e - a r m i n f u s i o n o f 5 n g / m l G I P d u r i n g p e r f u s i o n w i t h lOmM D - g l y c e r a l d e h y d e p r o d u c e d a f u r t h e r s i g n i f i c a n t ( < 0 . 0 5 ) i n c r e a s e i n i n s u l i n o u t p u t ( F i g u r e 3, T a b l e 1 ) . T h i s i n c r e a s e p r e s e n t e d si w i t h i n 2 m i n u t e s o f t h e s t a r t o f t h e G I P i n f u s i o n a n d w a s a b o l i s h e d w i t h i n 3 m i n s . o f t e r m i n a t i o n o f t h e i n f u s i o n . " b ) E f f e c t o f 2 - k e t o i s o c a p r o a t e a n d G I P 2 - k e t o i s o c a p r o a t e , d i s s o l v e d i n p e r f u s a t e , w a s p r e s e n t e d t o t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s a t t w o c o n c e n t r a t i o n s . A c o n -c e n t r a t i o n o f 2 - k e t o i s o c a p r o a t e w a s p e r f u s e d f o r 15 m i n u t e s a f t e r 62 20 30 Time (min) 40 F I G U R E 3: E f f e c t o f D - G l y c e r a l d e h y d e a n d G I P o n i n s u l i n r e l e a s e ( s e e T a b ! e 1 ) c i r c l e s : D - g l y c e r a l d e h y d e a l o n e ( n = 4 ) t r i a n g l e s : D - g l y c e r a l d e h y d e + G I P ( n = 5 ) * d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e b e t w e e n g r o u ps p o i n t s r e p r e s e n t m e a n ± S E M 63 T a b l e ' 1 : I n s u l i n r e l e a s e i n r e s p o n s e t o D - g l y c e r a l d e h y d e a n d G I P C o l u m n A : M i n u t e s f o l l o w i n g t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d . C o l u m n B : M e a n I R I o u t p u t ( y U / m i n ) ( n = 4 ) . ( x ) m i n . 1 - 5 : 5mM D - g l y c e r a l d e h y d e m i n . 6 - 4 5 : 1OmM D - g l y c e r a l d e h y d e C o l u m n C : S t a n d a r d e r r o r m e a n f o r C o l u m n B ( S E M ) C o l u m n D: x I R I ( y U / m i n ) ( n = 5 ) m i n . 1 - 5 : 5mM D - g l y c e r a l d e h y d e m i n . 6 - 4 5 : lOmM D - g l y c e r a l d e h y d e m i n . 2 0 - 3 5 : 5 n g / m l G I P C o l u m n E : S E M f o r C o l u m n D C o l u m n F : * d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e b e t w e e n C o l u m n s B a n d D 64 TABLE 1 A. . ... B. . . C. D. . . .E. . . 1 114 45 123 21 2 141 52 1 68 29 3 157 59 244 26 4 186 50 255 30 5 345 50 243 66 6 975 111 641 1 84 7 1475 1 90 745 200 * 8 1135 139 672 1 49 9 805 1 83 795 236 1 0 940 346 866 248 1 1 840 321 729 206 12 965 385 813 237 1 3 1 021 428 801 208 1 4 955 388 746 204 1 5 845 214 704 1 48 1 6 879 154 630 135 1 7 1095 231 674 1 38 1 8 950 220 634 142 1 9 830 161 689 160 20 700 208 665 137 21 965 278 1715 233 22 889 264 2288 97 * 23 1053 323 2386 1 79 * 24 975 295 1745 11 5 * 25 . 903 287 1607 1 69 * 26 885 337 1 733 11 7 * 27 730 288 1 949 99 * 28 830 302 2365 231 * 29 639 205 1950 138 * 30 636 163 1 848 1 22 * 31 707 220 1507 92 * 32 81 5 276 1918 259 * 33 725 241 1 600 7 3 * 34 548 157 1 558 128 * 35 527 121 1 302 166 * 36 51 2 122 1062 1 73 * 37 51 9 1 04 624 107 38 547 143 613 1 1 7 39 548 141 608 90 40 1 523 182 564 123 41 513 179 520 1 10 42 430 147 404 70 43 501 1 75 424 75 44 509 1 89 306 43. 45 409 149 347 60 65 w h i c h t h e c o n c e n t r a t i o n w a s r a p i d l y s w i t c h e d t o 5.0mM 2 - k e t o i s o -c a p r o a t e . T h e 5.0mM p e r f u s i o n o f 2 - k e t o i s o c a p r o a t e c o n t i n u e d f o r 4 0 m i n u t e s . T h e f i r s t 1 0 m i n u t e s o f t h e 2.5mM 2 - k e t o i s o c a p r o a t e p e r f u s i o n w a s t r e a t e d as: a n e q u i l i b r a t i o n p e r i o d a n d t h e e f f l u e n t f r o m t h e p a n c r e a s w a s d i s c a r d e d d u r i n g t h i s t i m e . I n s u l i n s e c r e t i o n f r o m t h e p a n c r e a s w a s n o t e v o k e d b y 2.5mM 2 - k e t o i s o c a p r o a t e . T h e p r e s e n c e o f 5.0mM 2 - k e t o i s o c a p r o a t e i n t h e p e r f u s a t e p r o d u c e d a n i n c r e a s e i n r a d i o i m m u n a s s a y a b l e i n s u l i n f r o m t h e p a n c r e a s ( F i g u r e 4, T a b l e 2 ) . A 20 m i n u t e , s i d e -a r m i n f u s i o n o f 5 n g / m l G I P d u r i n g p e r f u s i o n w i t h 5.0mM 2 - k e t o -i s o c a p r o a t e p r o d u c e d a f u r t h e r s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) i n c r e a s e i n i n s u l i n o u t p u t f r o m t h e p a n c r e a s ( F i g u r e 4, T a b l e 2 ) . T h i s i n -c r e a s e w a s s i g n i f i c a n t w i t h i n 3 m i n u t e s o f t h e s t a r t o f t h e G I P i n f u s i o n , r e m a i n e d e l e v a t e d d u r i n g t h e G I P i n f u s i o n a n d w a s a b o l i s h e d w i t h i n 2 m i n u t e s o f t e r m i n a t i o n o f t h e G I P i n f u s i o n . c ) E f f e c t o f 2 - k e t o c a p r o a t e a n d G I P 2 - k e t o c a p r o a t e , d i s s o l v e d i n t h e p e r f u s a t e , w a s p r e s e n t e d t o t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s a t 2.5mM a n d 5.0mM c o n c e n -t r a t i o n s . A 15 m i n u t e p e r f u s i o n o f 2.5mM 2 - k e t o c a p r o a t e w a s p e r f o r m e d . T h e f i r s t 1 0 m i n u t e s o f t h i s p e r f u s i o n w a s c o n s i d e r e d t o b e a n e q u i l i b r a t i o n p e r i o d a n d t h e e f f l u e n t f r o m t h e p a n c r e a s w a s d i s c a r d e d d u r i n g t h i s t i m e . A f t e r p e r f u s i o n w i t h 2.5mM 2 - k e t o c a p r o a t e t h e p a n c r e a s w a s p e r f u s e d w i t h 5.0mM 2 - k e t o c a p r o a t e f o r 4 0 m i n u t e s . I n s u l i n s e c r e t i o n w a s n o t c h a n g e d b y i n f u s i o n o f 2.5mM 2 - k e t o c a p r o a t e . T h e p r e s e n c e o f 5.0mM 2 - k e t o c a p r o a t e i n t h e p e r -66 F I G U R E 4: E f f e c t o f 2 - k e t o i s o c a p r o a t e a n d G I P o n i n s u l i n r e l e a s e ( s e e T a b l e 2 ) c i r c l e s : 2 - k e t o i s o c a p r o a t e a l o n e ( n = 6 ) t r i a n g l e s : 2 - k e t o i s o c a p r o a t e + G I P ( n = 5 ) * d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) ' d i f f e r e n c e p o i n t s r e p r e s e n t m e a n ± S E M 67 T a b l e 2: I n s u l i n r e l e a s e i n r e s p o n s e t o 2 - k e t o i s o c a p r o a t e a n d G I P C o l u m n A : M i n u t e s f o l l o w i n g t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d C o l u m n B : X I R I ( y U / m i n ) n=6 m i n . 1 - 5 : 2.5mM 2 - k e t o i s o c a p r o a t e m i n . 6 - 4 5 : 5.0mM 2 - k e t o i s o c a p r o a t e C o l u m n C : S E M f o r B C o l u m n D: x I R I ( y U / m i n ) n=5 m i n . 1 - 5 : 2.5mM 2 - k e t o i s o c a p r o a t e m i n . 6 - 4 5 : 5.0mM 2 - k e t o i s o c a p r o a t e m i n . 1 6 - 3 5 : 5 n g / m l G I P Co 1umn E : S E M f o r D C o l u m n F : * d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e b e t w e e n C o l u m n s B a n d D 68 TABLE 2 B . E . 1 26 ' 3 44 10 2 27 6 38 8 3 28 5 43 1 6 4 31 7 27 8 5 24 3 25 6 6 29 8 25 9 7 330 1 1 8 375 1 1 7 8 552 135 798 276 9 690 217 71 7 1 58 10 6 54 1 209 603 11 7 11 51 6 1 91 460 1 11 12 494 232 277 75 1 3 467 1 70 226 64 14 472 104 393 149 1 5 356 92 531 163 16 350 74 582 124 1 7 344 45 550 1 00 18 396 123 713 98 1 9 453 65 990 101 20 425 38 990 1 77 21 439 33 1 1 58 106 22 412 55 793 105 23 410 41 1 467 338 24 596 88 2050 347 25 1234 426 2767 422 26 1072 2 46 2293 416 27 842 1 80 1 303 1 67 28 674 101 1263 1 82 29 458 11 2 1 930 485 30 460 1 1 5 2487 418 31 522 149 2488 265 32 690 77 2347 234 33 742 87 2155 354 34 726 49 1 870 1 69 35 688 55 1 710 269 36 998 31 0 2092 446 37 1 408 449 2273 472 38 1 144 257 1 490 341 39 1636 120 1253 239 40 856 1 33 1 247 224 41 892 1 55 1 763 345 42 668 39 1 577 375 43 726 77 1 400 497 44 840 123 980 1 41 45 936 1 76 792 1 07 69 f u s a t e p r o d u c e d a b i p h a s i c i n c r e a s e i n I R I i n t h e p a n c r e a t i c v e n o u s e f f l u e n t ( F i g u r e 5, T a b l e 3 ) . A 20 m i n u t e s i d e - a r m i n f u s i o n o f 5 n g / m l G I P d u r i n g p e r f u s i o n o f 5.0mM 2 - k e t o c a p r o a t e d i d n o t e v o k e a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n i n s u l i n o u t p u t f r o m t h e p a n c r e a s ( F i g u r e 5, T a b l e 3 ) . T h e i n t e g r a t e d i n s u l i n o u t p u t p r o d u c e d o v e r 4 0 m i n -u t e s b y 5.0mM 2 - k e t o c a p r o a t e w a s s i g n i f i c a n ' t l y . . ( P < . 0 0 0 1 ) g r e a t e r t h a n t h e i n t e g r a t e d i n s u l i n o u t p u t p r o d u c e d o v e r 4 0 m i n u t e s b y 5.0mM 2 - k e t o i s o c a p r o a t e ( F i g u r e 6 ) . d ) E f f e c t o f L - l e u c i n e , L - g l u t a m i n e a n d G I P  i ) L - l e u c i n e A 15 m i n u t e p e r f u s i o n o f t h e p a n c r e a s w i t h 8 0 m g / d l D - g l u c o s e w a s f o l l o w e d b y p e r f u s i o n f o r 4 0 m i n u t e s w i t h 20mM L - 1 e u c i n e . An i n c r e a s e i n i n s u l i n o u t p u t f r o m t h e p a n c r e a s w a s n o t e v o k e d a b o v e a b a s a l l e v e l b y 20mM L - l e u c i n e ( T a b l e 4 ) . T h e p r e s e n c e o f a 2 0 m i n u t e s i d e - a r m G I P i n f u s i o n d u r i n g p e r f u s i o n w i t h 20mM L - 1 e u c i n e d i d n o t p r o d u c e a n y c h a n g e i n t h i s b a s a l i n s u l i n o u t p u t ( T a b l e 4 ) . i i ) L - g l u t a m i n e P e r f u s i o n o f t h e p a n c r e a s f o r 15 m i n u t e s w i t h D - g l u c o s e , f o l l o w e d b y p e r f u s i o n f o r 4 0 m i n u t e s w i t h lOmM L - g l u t a m i n e a l o n e d i d n o t e v o k e m e a s u r a b l e i n s u l i n o u t p u t f r o m t h e p a n c r e a s . T h e p r e s e n c e o f a 2 0 m i n u t e s i d e - a r m G I P i n f u s i o n d u r i n g p e r f u s i o n w i t h lOmM L - g l u t a m i n e d i d n o t p r o d u c e a n y i n c r e a s e i n i n s u l i n o u t -p u t f r o m t h e p a n c r e a s ( T a b l e 9 ) . i i i ) L - l e u c i n e a n d L - g l u t a m i n e T h e p a n c r e a s w a s e x p o s e d t o 1OmM L - g 1 u t a m i n e , d i s s o 1 v e d i n p e r f u s a t e , f o r 5 5 m i n u t e s . T h e f i r s t 10 m i n u t e s o f t h i s p e r f u s i o n w a s t r e a t e d a s a n e q u i 1 i b r a t i o n p e r i o d a n d t h e e f f l u e n t w a s n o t 70 F I G U R E 5: E f f e c t o f 2 - k e t o c a p r o a t e a n d G I P o n i n s u l i n r e l e a s e ( s e e T a b 1e 3 ) c i r c l e s : 2 - k e t o c a p r o a t e a l o n e ( n = 6 ) t r i a n g l e s : 2 - k e t o c . a p r o a t e + G I P ( n = 5 ) n o s i g n i f i c a n t ' ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e b e t w e e n p o i n t s p o i n t s r e p r e s e n t m e a n ± S E M 71 T a b l e 3 : I n s u l i n r e l e a s e i n r e s p o n s e t o 2 - k e t o c a p r o a t e a n d G I P C o l u m n A : M i n u t e s f o l l o w i n g t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d C o l u m n B : x I R I ( y U / m i n ) n=6 m i n . 1 - 5 : 2.5mM 2 - k e t o c a p r o a t e m i n . 6 - 4 5 : 5.0mM 2 - k e t o c a p r o a t e . C o l u m n C : S E M f o r B C o l u m n D: x I R I ( y U / m i n ) n=5 m i n . 1 - 5 : 2.5mM 2 - k e t o c a p r o a t e m i n . 6 - 4 5 : 5.0mM 2 - k e t o c a p r o a t e m i n . 1 6 - 3 5 : 5 n g / n l G I P C o l u m n E : S E M f o r D No s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e ( p < 0 . 0 5 ) b e t w e e n C o l u m n s B a n d D 72 TABLE 3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 1 2 13 14 1 5 16 1 7 1 8 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36' 37 38 39 40 41 42 43 44 45 105 94 50 91 79 724 2531 1613 1114 776 868 1214 1 898 171 1 1 346 1 483 1 444 1437 2233 21 63 1855 1 849 2253 2382 2100 1 866 1 881 1 658 2096 1 91 7 2549 2709 2289 2128 2175 2129 2297 2155 2694 2705 2716 2337 231 4 2579 241 0 45 30 33 16 1 7 243 489 85 86 261 329 230 440 440 259 285 266 305 458 483 234 385 533 486 335 497 344 310 496 269 388 1 89 350 365 436 420 333 31 4 325 41 6 535 439 481 591 314 33 35 1 6 56 49 363 1 720 1167 873 560 700 950 1 050 1 080 973 986 1 1 86 1230 1 479 1 768 2163 2200 231 0 2266 2396 2376 2435 2013 2273 2244 2171 2382 2807 2244 2235 2695 2354 2251 1 962 1 91 4 2105 2024 1 797 1 646 1 929 1 0 9 1 5 1 8 1 0 99 315 1 71 1 73 200 197 1 91 83 1 08 1 58 179 1 77 1 86 283 357 479 259 220 405 403 378 441 359 368 325 283 21 3 352 289 353 583 289 548 301 392 436 345 430 502 480 73 80000 £ O => 40000 cr 0 >-2-Ketoisocaproate 5.0 mM 2-Ketocaproate 5.0 m M F I G U R E 6: I n s u l i n r e l e a s e d b y 2 - k e t o i s o c a p r o a t e o r 2 - k e t o c a p r o a t e i n t e g r a t e d o v e r 4 0 m i n u t e s . R e s u l t s a r e s h o w n a s m e a n i n t e g r a t e d I R I ± S E M . 2 - k e t o i s o c a p r o a t e : 2 5 , 9 7 4 ± 3 0 4 5 j i U I R I / 4 0 ' m i n . ( n = 6 ) 2 - k e t o c a p r o a t e : 7 9 , 0 1 1 ± 9 8 4 9 u U I R I / 4 0 "mi n ( n = 6 ) 2 - k e t o c a p r o a t e i n d u c e d s i g n i f i c a n t l y , g r e a t e r i n s u l i n o u t p u t ( p ^ T O O l ) t h a n d i d 2 - k e t o i s o c a p r o a t e . 74 Tab!e 4: I n s u l i n s e c r e t i o n i n re sponse to L - l e u c i n e and GIP Column A: M inutes f o l l o w i n g the e q u i l i b r a t i o n p e r i o d Column B: x IRI (yU/min) n=3 m i n . 1-5: 80mg/dl g l u c o s e m in . 6 -45: 2 0mM L - l e u c i n e Column C: SEM f o r B Column D: x IRI (yU/min) n=7 m in . 1-5: 80mg/dl g l u c o s e m in . 6 -45 : 2 0mM L - l e u c i n e m in . 16 -35 : 5ng/ml GIP Column E: SEM f o r D No s i g n i f i c a n t ' ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e between Columns B and D 75 TABLE 4 A. B. C. D. E. 1 26 1 1 31 8 2 33 1 3 31 1 0 3 43 1 4 33 10 4 33 13 23 7 5 31 1 3 26 6 6 31 9 1 8 6 7 39 1 5 1 7 6 8 25 10 20 7 9 30 9 24 8 10 39 1 5 1 6 8 1 1 35 1 3 20 5 12 ' 29 1 1 11 6 1 3 35 8 1 9 6 1 4 31 1 5 1 7 8 1 5 30 14 14 7 .1 6 1 6 11 1 4 4 1 7 22 5 38 1 8 1 8 37 1 9 33 14 1 9 37 1 9 37 9 20 32 1 3 33 8 21 30 1 4 48 8 22 1 9 1 5 44 9 23 1 0 3 47 1 2 24 25 9 48 12 25 30 1 2 48 1 3 26 27 1 4 39 1 1 27 22 8 46 14 28 24 22 51 1 5 29 29 1 3 51 1 7 30 1 7 1 5 60 1 8 31 53 30 67 20 32 35 1 8 66 20 33 41 21 57 21 34 27 1 6 55 1 5 35 41 22 50 14 36 45 23 51 1 3 37 47 24 52 1 4 38 44 22 50 14 39 51 23 52 1 3 40 37 1 3 48 14 41 48 22 39 7 42 44 22 33 1 1 43 41 1 5 38 7 44-: 48 22 39 1 1 45 38 14 38 12 76 a s s a y e d f o r i n s u l i n c o n t e n t . F i v e m i n u t e s a f t e r t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d , 20mM L - l e u c i n e , d i s s o l v e d i n p e r f u s a t e , w a s a l s o p r e s e n t e d t o t h e p a n c r e a s . E x p o s u r e t o 20mM L - l e u c i n e c o n t i n u e d f o r 4 0 m i n u t e s . T h e p r e s e n c e o f t h e L - l e u c i n e / L - g T u t a m i n e m i x t u r e e v o k e d a s l i g h t i n c r e a s e i n . i n s u l i n o u t p u t c o m p a r e d t o t h a t p r o d u c e d b y e i t h e r 20mM L - l e u c i n e o r 1OmM L - g l u t a m i n e a l o n e ( F i g u r e 7, T a b l e 5 ) . T h i s i n c r e a s e t o o k t h e f o r m o f a s l o w l y r i s i n g b a s a l i n s u l i n o u t p u t . A 2 0 m i n u t e , s i d e - a r m 5 . 0 n g / m l G I P i n'fus i o n ' e v o k e d a m a r k e d a n d s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) i n c r e a s e i n i n s u l i n o u t p u t f r o m t h e p a n c r e a s ( F i g u r e 7, T a b l e 5 ) . T h i s i n c r e a s e w a s s i g n i f i c a n t w i t h i n 2 m i n u t e s o f t h e s t a r t o f t h e G I P i n f u s i o n , a n d r e m a i n e d s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e d t h r o u g h o u t t h e G I P i n f u s i o n a n d u n t i l t e r m i n a t i o n o f t h e p e r f u s i o n , 10 m i n u t e s a f t e r c e s s a t i o n o f t h e G I P i n f u s i o n . e ) E f f e c t o f L - l e u c i n e , L - g l u t a m i n e a n d d i b u t y r y l c A M P T h e p a n c r e a t a w e r e e x p o s e d t o L - l e u c i n e , L - g l u t a m i n e a n d i 6 2 1 N ,0 - D i b u t y r y l A d e n o s i n e 3 ' - 5 ' - c y c l i c m o n o p h o s p h a t e ( d b c A M P ) i n a p r o t o c o l i d e n t i c a l t o t h a t u s e d i n t h e p r e c e d i n g s e c t i o n , e x c e p t f o r t h e s u b s t i t u t i o n o f 2 m M d b c A M P f o r 5 n g / m l G I P . 2 m M d b c A M P s i g -n i f i c a n t l y ( p < 0 . 0 5 ) e l e v a t e d i n s u l i n c o n t e n t i n t h e p e r f u s a t e w i t h -i n 2 m i n u t e s o f t h e b e g i n n i n g o f t h e i n f u s i o n . I n s u l i n o u t p u t c o n t i n u e d t o r i s e d u r i n g t h e d u r a t i o n o f t h e d b c A M P i n f u s i o n - a t r e n d w h i c h w a s n o t r e v e r s e d - w i t h i n t h e 1 0 m i n u t e p e r i o d f o l l o w i n g t e r m i n a t i o n o f t h e i n f u s i o n ( F i g u r e 8, T a b l e 5 ) . f ) E f f e c t o f p y r u v a t e , g l u c o s e a n d sip i ) I n f u s i o n o f 8 0 m g / d 1 g l u c o s e , p y r u v a t e a n d G I P 77 IOmM L - G u t a m i n e L -Leuc ine 2 0 m M GT P b n a / m l r i r i Time (min) F I G U R E 7: E f f e c t o f G I P a n d g l u t a m i n e + l e u c i n e o n i n s u l i n s e c r e t i o n ( s e e T a b l e 5 ) c i r c l e s : L - g l u t a m i n e + L - l e u c i n e ( n = 7 ) t r i a n g l e s : L - g l u t a m i n e + L - l e u c i n e a n d G I P ( n = 6 ) * d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 0 5 ) d i f f e r e n c e P o i n t s r e p r e s e n t m e a n ± S E M 78 I n s u l i n s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o L - l e u c i n e , L - g T u t a m i n e , dbcA'MP a n d G I P M i n u t e s f o l l o w i n g t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d x I R I ( y U / m i n ) n=7 m i n . 1 - 5 : lOmM L - g l u t a m i n e m i n . 6 - 4 5 : lOmM L - g l u t a m i n e + 20mM L - l e u c i n e S E M f o r B x I R I ( y U / m i n ) n=6 m i n . 1 - 5 : lOmM L - g l u t a m i n e m i n . 6 - 4 5 : 1OmM L - g l u t a m i n e + 2 0mM L - l e u c i n e m i n . 1 6 - 3 5 : 5 n g / m l G I P S E M f o r D x I R I ( y U / m i n ) n=7 m i n . 1 - 5 : lOmM L - g l u t a m i n e m i n . 6 - 4 5 : lOmM L - g T u t a m i n e + 20mM L - l e u c i n e m i n . 1 6 - 3 5 : 2mM d b c A M P S E M f o r F * d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e f r o m C o l u m n B 79 TABLE 5 A. B. C. D. . . . E. . F. G. 1 14 7 12 5 1 3 4 2 22 9 1 8 6 1 7 7 3 29 10 1 7 5 1 8 9 4 22 1 0 1 7 4 1 7 7 5 26 11 16 5 14 7 6 1 6 1 0 1 8 6 9 5 7 21 9 24 1 4 1 5 7 8 27 10 17 7 10 4 9 1 7 8 24 12 12 7 1 0 1 9 9 22 1 0 1 8 6 11 35 12 47 24 29 8 12 37 10 55 26 33 9 13 36 12 77 39 38 12 14 24 9 86 54 33 11 1 5 23 9 65 45 37 1 3 1 6 21 7 79 49 47 25 17 38 8 534 * 264 147 * 44 1 8 58 19 610 * 269 206 * 31 1 9 72 24 1 084 * 321 265 * 26 20 88 30 1 380 * 422 397 * 32 21 90 32 1 607 * 544 725 * 102 22 81 23 1 321 * 465 1 063 * 1 93 23 72 21 1525 * 488 1 654 * 402 24 90 1 5 1 324 * 342 1 804 * 444 25 11 6 27 1477 * 360 1 81 0 * 294 26 1 1 5 31 1073 * 285 1 856 * 128 2 7 128 29 1410 * 365 1 943 * 284 28 1 33 • 46 1684 * 468 1 561 * 79 29 137 45 1 431 * 272 1 695 * 305 3.0 134 43 1 243 * 223 2442 * 355 31 1 86 45 1 072 * 1 70 1 947 * 449 32 179 50 1395 * 224 2398 * 91 33 168 43 1 700 * 448 3423 * 329 34 145 24 1 721 * 41 8 3174 * 328 35 157 23 1 770 * 299 371 3 * 589 36 1 83 46 1 747 * 443 2889 * 368 37 1 79 46 1 359 * 255 3660 * 866 38 257 63 1 197 * 201 3597 * 826 39 274 76 1 923 * 390 4660 * 996 40 289 69 1 828 * 368 5497 * 600 41 262 47 1653 * 510 5944 * 694 42 1 89 27 1 491 * 448 4631 * 805 43' 225 36 1405 * 328 4605 * 705 44 265 45 1221 * 31 3 4146 * 584 45 271 45 1140 * 261 4904 * 861 80 10 mM L-Glutamine L -Leucine 2 0 m M 2 m M dbcAMP r i r Z. + 6000-. 5000-d "E 4000-3 3000-i i 2000-cr i—i 1 000-0-1 20 30 Time (min) FIGURE 8: E f f e c t o f dbcAMP and L - l e u c i n e + L - g l u t a m i n e on i n s u l i n s e c r e t i o n (.see T a b l e 5) c i r c l e s : L - g l u t a m i n e + L - l e u c i n e (n=7) t r i a n g l e s : L - g l u t a m i n e + L - l e u c i n e and dbcAMP (n=7) * d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p < 6 . 0 5 ) d i f f e r e n c e p o i n t s r e p r e s e n t mean ± SEM 81 P e r f u s a t e c o n t a i n i n g 8 0 m g / d l g l u c o s e w a s a d m i n i s t e r e d t o p a n c r e a t a f o r 4 5 m i n u t e s f o l l o w i n g a 10 m i n u t e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d . I n f u s i o n o f p y r u v a t e a t a f l o w r a t e o f 0 . 2 0 6 m l / m i n . t o a c h i e v e a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 30mM w a s b e g u n 10 m i n u t e s a f t e r t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d . T h i s p e r f u s i o n c o n t i n u e d f o r 2 5 m i n -u t e s . O n e g r o u p o f r a t s a l s o r e c e i v e d a 15 m i n u t e 5 n g / m l s i d e -a r m G I P i n f u s i o n d u r i n g t h e 30mM p y r u v a t e i n f u s i o n . No s i g n i f i c a n t i n s u l i n r e l e a s e ( p < 0 . 0 5 ) w a s n o t e d i n r e s p o n s e t o 8 0 m g / d l g l u c o s e a n d 30mM p y r u v a t e e i t h e r i n t h e p r e s e n c e o r i n t h e a b s e n c e o f 5 n g / ml G I P ( T a b l e 6 ) . i i ) I n f u s i o n o f 16 0 m g / d l g l u c o s e , p y r u v a t e a n d G I P T h e p r o t o c o l o f t h e s e e x p e r i m e n t s w a s i d e n t i c a l t o t h a t u s e d i n t h e p r e c e d i n g s e c t i o n , e x c e p t f o r t h e s u b s t i t u t i o n o f 1 6 0 m g / d l g l u c o s e f o r 8 0 m g / d l g l u c o s e 5 m i n u t e s a f t e r t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d . T h e c o m b i n a t i o n o f 30mM p y r u v a t e , 5 n g / m l G I P a n d 1 6 0 m g / d l g l u c o s e e v o k e d s i g n i f i c a n t l y ( p < 0 . 0 5 ) m o r e i n s u l i n r e l e a s e f r o m t h e p a n c r e a t a t h a n d i d 30mM p y r u v a t e a n d 1 6 0 m g / d l g l u c o s e a l o n e ( T a b l e 8 ) . H o w e v e r , t h e i n s u l i n r e l e a s e d b y 30mM p y r u v a t e , 5 n g / m l G I P a n d 1 6 0 m g / d l g l u c o s e d i d ' n o t d i f f e r i n a s u s t a i n e d - s i g n i f i c a n t m a n n e r f r o m t h a t r e l e a s e d b y 5 n g / m l G I P a n d 1 6 0 m g / d l g l u c o s e - a l o n e ( T a b l e s 7 a n d 8 ) . S i m i l a r l y , i n s u l i n r e l e a s e d b y 1 6 0 m g / d l g l u c o s e a n d 30mM p y r u v a t e d i d n o t d i f f e r s i g n i f i c a n t l y f r o m t h a t r e l e a s e d b y 1 6 0 m g / d l g l u c o s e a l o n e ( T a b l e s 7 a n d 8 ) . g ) O t h e r m e t a b o l i t e s B i o a s s a y s o f t h e i n s u 1 i n o t r o p i c e f f e c t o f s e v e r a l m e t a b o -l i t e s w e r e p e r f o r m e d . T h e m e t a b o l i c c o m p o u n d s i n v e s t i g a t e d h a d 82 T a b l e 6: I n s u l i n s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o 8 0 m g / d l g l u c o s e ' , 30mM p y r u v a t e a n d G I P C o l u m n A : C o l u m n B : C o l u m n C: C o l u m n D: M i n u t e s f o l l o w i n g t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d x I R I ( y U / m i n ) n=6 m i n . 1 - 4 5 : 8 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 1 1 - 3 5 : 30mM p y r u v a t e S E M f o r B x I R I ( y U / m i n ) n=6 m i n . 1 - 4 5 : 8 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 1 1 - 3 5 : 30mM p y r u v a t e m i n . 1 6 - 3 0 : 5 n g / m l G I P . C o l u m n E : SE M f o r D No s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e b e t w e e n C o l u m n s B a n d D 83 T A B L E 6 A . B. C. D. , E . 1 29 5 61 28 2 29 8 44 22 3 29 6 41 21 4 26 6 43 28 5 24 3 38 21 6 18 7 34 1 6 7 1 9 7 33 1 7 8 1 5 6 32 1 9 9 26 1 4 28 1 5 10 24 6 24 1 0 11 1 8 7 25o 9 1 2 29 1 0 89 27 13 27 6 1 02 70 14 26 4 97 58 1 5 1 7 7 44 14 1 6 1 9 9 41 1 3 1 7 23 6 27 1 0 1 8 20 8 37 13 1 9 29 9 23 6 30 28 7 101 38 21 55 1 7 49 1 0 22 55 1 1 48 7 23 59 14 79 14 24 57 14 82 19 25 50 1 5 1 47 48 26 66 5 1 85 84 27 71 1 4 143 45 28 54 5 176 62 29 60 1 2 94 1 7 30 58 6 78 27 31 49 9 1 56 58 32 68 1 5 134 57 33 59 6 120 61 34 47 7 85 21 35 51 8 1 58 73 36 35 4 47 1 0 37 34 6 36 10 38 30 7 36 10 39 28 1 0 25 7 40 26 7 35 1 5 41 22 8 44 1 5 42 1 8 6 29 1 5 43 24 3 1 9 7 44 26 9 1-4 3 45 23 7 18 8 84 T a b l e 7 : I n s u l i n s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o 8 0 m g / d l a n d 1 6 0 m g / d l g l u c o s e a n d G I P C o l u m n A: C o l u m n B : C o l u m n C; C o l u m n D: M i n u t e s f o l l o w i n g t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d x I R I ( y U / m i n ) n = 6 m i n . 1 - 5 : 8 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 6 - 4 5 : 1 6 0 m g / d l g l u c o s e S E M f o r B x I R I ( y U / m i n ) n=6 m i n . 1 - 5 : 8 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 6 - 4 5 : 16 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 1 6 - 3 0 : 5 n g / n l G I P C o l u m n E S E M f o r C * d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e b e t w e e n C o l u m n s B a n d D 85 TABLE 7 A. •B. C. 1 36 10 2 25 12 3 38 1 1 4 47 16 5 36 5 6 1 92 21 7 571 83 8 632 97 9 841 1 06 10 263 1 08 11 591 191 1 2 427 203 1 3 31 6 68 14 • 289 107 1 5 317 1 09 1 6 240 1 05 1 7 441 1 89 1 8 801 201 1 9 441 105 20 382 86 21 765 73 22 488 42 23 732 56 24 819 78 25 901 99 26 731 1 03 27 862 1 51 28 769 121 29 1010 89 30 790 78 31 684 89 32 801 77 33 705 65 34 761 1 03 35 531 38 36 480 69 37 716 1 09 38 387 72 39 705 38 40 561 96 41 438 87 42 592 64 43 708 1 03 44 502 72 45 187 45 D. • • . • ' E . F 42 12 29 13 41 9 52 6 28 14 107 28 421 89 369 57 453 82 208 96 321 105 362 38 298 57 308 62 288 1 01 53 3 89 1 062 189 * 731 201 800 56 * 952 93 * 1 428 198 * 1 837 205 * 2010 306 * 2121 212 * 2876 398 * 2217 265 * 281 2 1 08 * 1978 1 06 * 2001 1 83 * 2100 1 09 * 1 731 271 * 1 51 1 1 87 * 1 81 3 106 * 1 097 1 52 * 831 1 07 * 941 96 * 732 97 531 62 410 91 377 86 231 71 381 68 1 72 94 271 23 286 37 86 T a b l e 8: I n s u l i n s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o 8 0 m g / d l a n d 1 6 0 m g / d l g l u c o s e , 30mM p y r u v a t e a n d G I P C o l u m n A C o l u m n B; C o l u m n C C o l u m n D M i n u t e s p e r i o d f o l l o w i n g t h e e q u i l i b r a t i o n x I R I ( y U / m i n ) n=6 m i n . 1 - 5 : 8 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 6 - 4 5 : 1 6 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 1 1 - 3 5 : 30mM p y r u v a t e S E M f o r B x I R I ( y U / m i n ) n=6 min m i n , m i n , m i n , I - 5 : 6 - 4 5 : I I - 3 5 1 6 - 3 0 8 0 m g / d l g l u c o s e 1 6 0 m g / d l g l u c o s e : 30mM p y r u v a t e : 5 n g / n l G I P C o l u m n E S E M f o r D * d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e b e t w e e n C o l u m n s B a n d D. + d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e b e t w e e n C o l u m n D a n d C o l u m n D o f T a b l e 7. 87 TABLE 8 A. B. C. D. . . . E. .". . . F . 1 0 31 9 27 8 30 10 37 10 L •3 25 11 27 9 O A 23 7 25 8 H r 1 8 4 22 8 0 c 91 35 94 33 0 7 1 1 7 42 338 1 07 / 8 Q 127 47 332 1 52 111 26 256 119 y 10 11 12 1 3 14 1 5 1 6 17 1 8 1 9 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 80 35 1 82 76 1 47 88 1 1 4 32 373 1 8 206 87 380 65 265 96 290 38 403 210 137 61 276 135 1 1 2 8 819 278 170 70 11 73 303 * 472 178 971 214 * 507 137 1116 380 * 700 105 1215 430 * 727 214 2899 808 * 696 271 3504 570 * + 933 377 3299 693 * 628 177 3660 . 509 * + 853 335 2942 509 * 1 040 465 2147 31 4 * 1 029 595 2381 356 * 760 356 2079 594 * 693 231 2488 542 * 813 41 7 2424 528 * 973 399 1 891 270 * 885 294 1 883 367 * 740 295 2005 467 * 749 372 1 967 490 * 903 434 1157 265 740 325 920 322 593 360 539 238 660 1 1 1 523 281 787 1 07 277 77 707 91 292 1 04 590 90 433 126 603 84 21 5 37 51 0 1 02 172 24 535 1 1 9 217 47 727 11 0 238 83 88 b e e n r e p o r t e d a s l a c k i n g i n s u l i n - s t i m u l a t i n g a b i l i t y a n d q u i c k c h e c k s ( n £ 2 ) w e r e p e r f o r m e d i n o r d e r t o c o n f i r m ' t h e s e r e p o r t s . T h e r e s u l t s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 9. No v a r i a t i o n w a s f o u n d f r o m p r e v i o u s l y p u b l i s h e d r e s u l t s . 2_. H P L C - p u r i f i e d G I P c o m p o n e n t s H P L C - p u r i f i e d G I P i _ 4 2 a n d G I P 3 _ 4 2 ( s e e R e s u l t s : S e c t i o n I I , B) w e r e p r e s e n t e d t o t h e i s o l a t e d p e r f u s e d p a n c r e a s i n t h e p r e -s e n c e o f 1 6 0 m g / d l g l u c o s e . T h e H P L C - p u r i f i e d G I P c o m p o n e n t s w e r e a d m i n i s t e r e d i n t h e f o r m o f a 30 m i n u t e l i n e a r g r a d i e n t b e t w e e n c o n c e n t r a t i o n s o f 0 n g / m l a n d 10 n g / m l . A f t e r e q u i 1 i b r a t i o n a n d 5 m i n u t e s o f p e r f u s i o n w i t h 8 0 m g / d l g l u c o s e , t h e p e r f u s a t e g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n w a s i n c r e a s e d t o '! . 16 0 m g / d l . A f t e r 10 m i n u t e s o f p e r f u s i o n w i t h 1 6 0 m g / d l g l u c o s e , t h e H P L C - p u r i f i e d G I P c o m p o n e n t w a s d i s s o l v e d i n t h e g r a d i e n t d e v i c e , p r o v i d i n g t h e O ^ - l O n g / m l l i n e a r g r a d i e n t w h i c h t e r m i n a t e d a f t e r 4 0 m i n u t e s o f p e r f u s i o n w i t h 1 6 0 m g / d l g l u c o s e . a ) G I P - | _ 4 ? I n s u l i n o u t p u t f r o m t h e p a n c r e a s w a s s i g n i f i c a n t l y ( p < 0 . 0 5 ) i n c r e a s e d 4 m i n u t e s a f t e r t h e s t a r t o f t h e G I P -j .42 g r a d i e n t ( F i g -u r e 9, T a b l e 1 0 ) . T h i s c o r r e s p o n d e d t o a G I P - | _ 4 2 c o n c e n t r a t i o n o f a p p r o x i m a t e l y 1 . 3 3 n g / m l . I n s u l i n o u t p u t f r o m t h e p a n c r e a s i n t h e p r e s e n c e o f G I P •] _ 4 2 c o n t i n u e d t o i n c r e a s e - r e l a t i v e t o t h e c o n -t r o l f o r t h e d u r a t i o n o f t h e g r a d i e n t . b ) GIP3 I n s u l i n o u t p u t f r o m t h e p a n c r e a s w a s s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d ( p < 0 . 0 5 ) t h i r t e e n m i n u t e s a f t e r t h e s t a r t o f t h e G I P 3 _ 4 2 g r a d i e n t 89 Table 9: E f f e c t of va r ious m e t a b o l i c compounds s e c r e t i o n on i n s u l i n M e t a b o l i t e s I n s u l i n response 1 OmM 1 OmM 20mM 20mM 20mM 20mM 20mM 20mM 20mM 30mM 30mM 30mM 30mM L-g lutamine L-g1utarni ne L - l e u c i n e L - l e u c i n e + L - leu c ine + L -Teuc i ne + L - l e u c i n e + + 5ng/ml GIP 80mg/dl g lucose 5mM theophy l1 i ne 5ng/ml GIP 1OmM L-g lutamine L - l e u c i n e + lOmM L-g lutamine L - l e u c i n e + lOmM L-g lutamine a-k e t o g l u t a r i c a c i d s u c c i n i c a c i d c i t r i c a c i d p y r u v i c a c i d (-) 5ng/nl GIP 2mM dbcAMP + + 30 0mg/dl g lucose in T - - t r e a t e d ra t s Key: - no i n s u l i n response + i n s u l i n response (-) i n s u l i n response took form of r i s i n g b a s e l i n e (see R e s u l t s , S e c t i o n : I A l d , i i i ) 1 f i r s t phase of i n s u l i n r e l e a s e o n l y . No su s t a i ned i n s u l i n r e l e a s e (see R e s u l t s , I A,3) 80 160 ma/dl Glucose 0-IOna/ml HPLC-GIP F I G U R E 9: E f f e c t o f 1 6 0 m g / d l g l u c o s e a n d 0 ^ 1 0 n g / m l G I P ] _ 4 2 a n d ^ ^ P 3 42 o n i n s u l i n s e c r e t i o n ( s e e ' T a b l e 1 0 ) c l o s e d c i r c l e s : g l u c o s e a l o n e ( n = 6 ) t r i a n g l e s : g l u c o s e + G l P 3 _ 4 2 g r a d i e n t ( n = 6 ) o p e n c i r c l e s : g l u c o s e + G I P ^ 4 2 g r a d i e n t ( n = 6 ) * d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e f r o m s a m p l e s e x p o s e d t o g l u c o s e a l o n e p o i n t s r e p r e s e n t m e a n + S E M 91 T a b l e 1 0 : I n s u l i n s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o 8 0 m g / d l 1 6 0 m g / d l g l u c o s e . w i t h " 0 + l O n g / m l G I P G I P 3 - 4 2 l i n e a r g r a d i e n t s 1 - 4 2 a n d a n d C o l u m n A: C o l u m n B: C o l u m n C C o l u m n D C o l u m n E: C o l u m n F: M i n u t e s f o l l o w i n g t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d x I R I ( y U / m i n ) n=6 m i n . 1 - 5 : 8 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 6-4 5: 1 6 0 m g / d l g l u c o s e S E M f o r B x I R I ( y U / m i n ) n=6 m i n . 1 - 5 : 8 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 6 - 4 5 : 1 6 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 1 6 - 4 5 : 0 + l O n g / n l G I P 1 - 4 2 S E M f o r D x I R I ( y U / m i n ) n=6 m i n . 1 - 5 : 8 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 6 - 4 5 : 1 6 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 1 6 - 4 5 : 0 - ^ 1 0 n g / m l G I P 3 - 4 2 * d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e f r o m C o l u m n A 92 TABLE 10 c . D.. E. F. G. 4 1 2 3 25 7 4 12 3 22 6 4 1 9 3 22 4 3 23 7 26 7 4 12 4 22 7 12 208 45 1 06 31 21 531 66 602 72 37 701 82 831 64 25 232 24 501 38 29 209 31 1 1 9 1 7 1 9 137 27 97 11 8 105 1 3 1 05 1 9 1 7 o 161 21 1 81 22 22 182 29 1 96 26 23 1 91 37 203 21 31 1 89 42 1 85 38 30 208 48 211 35 42 253 51 1 91 36 41 434 * 83 203 42 29 541 * 1 00 210 38 65 985 * 157 1 98 27 28 1 635 * 354 165 81 67 2906 * 721 170 73 71 3143 * 677 222 91 81 4210 * 760 94 33 83 5000 * 1 01 5 493 195 76 4905 * 958 660 256 67 4436 * 485 560 * 11 6 81 5088 * 646 763 * 310 102 4981 * 425 723 * 203 71 5640 * 549 853 * 31 3 191 5968 * 1 050 747 * 1 76 202 6040 * 689 783 * 1 93 1 82 741 6 * 985 820 * 162 191 6228 * 463 993 * 1 83 204 6693 * 771 1 090 * 208 231 6349 * 496 1 023 * 1 71 202 6564 * 586 1 023 1 99 315 7251 * 1 1 60 1 817 * 336 218 8480 * 1 324 1690 * 366 1 74 8971 * 1110 1497 * 1 98 191 8896 * 715 1 360 * 107 1 86 9616 * 1263 1 647 * 249 197 10183 * 1453 1 847 * 348 202 1 0086 * 1 337 1747 * 301 1 1 7 2 17 3 1 8 4 17 5 19 6 191 7 472 8 698 9 437 10 210 11 109 12 88 13 121 14 103 15 151 16 162 17 163 18 174 19 169 20 175 21 181 22 170 23 169 24 202 25 1 86 26 207 27 265 28 284 29 293 30 307 31 412 32 41 3 33 469 34 509 35 521 36 534 37 708 38 826 39 982 40 891 41 905 42 91 2 43 986 44 984 45 991 93 ( F i g u r e 9 , Table 10). This corresponded to a GIP3_42 concentrat-ion of approximately 4.33ng/ml . I n s u l i n output from the pancreas in the presence of GIP3_4 2 remained s i g n i f i c a n t l y e levated above the c o n t r o l f o r the duration of the g r a d i e n t . I n s u l i n s e c r e t i o n evoked by GI P 3 _ 4 2 was markedly l e s s . t h a n that evoked by GIP - ]_4 2 . c) EGI I -> I I I , F r a c t i o n A a A s i de-f ra ct i on , ' EGI I ->- I I I , F r a c t i o n A , from the p u r i f i - . c a t i o n of GIP was p u r i f i e d by HPLC and a f r a c t i o n ( a ) correspond-ing to the e l u t i o n time of GIP (see R e s u l t s : S e c t i o n I I , B, 3, b) was assayed fo r i nsu 1 i n o t ropi c a c t i v i t y . EGI I I I I , F r a c t i o n A a was administered as a 0 lOOng/ml l i n e a r gradient in an i d e n t i c a l f a s h i o n to that used f o r GI P -, _ 4 2 (see Res u 1 ts :' Sect i on I I , 2, a, i ) . A s i g n i f i c a n t (p<0.05) increase in i n s u l i n output r e l a t i v e to the c o n t r o l was observed a f t e r 3 minutes of the EGII -* I I I , F r a c t i o n A a g r a d i e n t - c o r r e s p o n d i n g to a p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n of approximately lOng/ml. I n s u l i n output continued to i n c r e a s e f o r the duration of the p e r f u s i o n (Table 11, Figure 10).. d) Iodinated EGIII components HPLC p u r i f i c a t i o n ' of i o d i n a t e d EGIII y i e l d e d two f r a c t i o n s (see R e s u l t s : S e c t i o n I I , E, 3) which were assayed f o r i n s u l i n o -t r o p i c a c t i v i t y : 1 ? 7 i i ) I—EGI11 A 10 minute e q u i l i b r a t i o n period with 80mg/dl D-glucose was followed by a 5 minute p e r f u s i o n with 80mg/dl D-glucose and by a 40 minute p e r f u s i o n with 300mg/dl D-glucose. A side-arm, 1 2 7 square-wave, 5.0ng/ml i n f u s i o n of I-E G111 a f t e r ten minutes 94 8 0 160 ma/dl Glucose 0 ~ •OOna/ml EG I - H , Fraction A a 6 0 0 0 - i 20 Time (min) l I 1 1 30 40 F I G U R E 1 0 : E f f e c t o f 1 6 0 m g / d l g l u c o s e a n d 0 + 1 0 0 n g / n l E G I I + I I I , F r a c t i o n A 1* o n i n s u l i n s e c r e t i o n ( S e e T a b l e s 1 0 a n d 1 1 ) c l o s e d , c i r c l e s : g l u c o s e a l o n e ( n = 6 ) ( T a b l e 1 0 ) o p e n c i r c l e s : g l u c o s e + E G I I - > I I I , F r a c t i o n A « ( n = 6 ) ( T a b l e 1 1 ) r e s u l t s s h o w n r e p r e s e n t m e a n ± S E M * d e n o t e s s i g n i f i c a n t l y ( p < 0 . 0 5 ) h i g h e r t h a n c o n t r o l 95 T a b l e 1 1 : I n s u l i n s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o 8 0 m g / d 1 a n d 1 6 0 m g / d 1 g l u c o s e a n d a 0 -»- l O O n g / m l l i n e a r E G I I -»• I I I , F r a c t i o n Aa g r a d i e n t C o l u m n A C o l u m n B : M i n u t e s f o l l o w i n g t h e e q u i 1 i b r a t i o n p e r i o d x I R I ( y U / m i n ) n=6 m i n . 1 - 5 : 8 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 6 - 4 5 : 1 6 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 1 6 - 4 5 : 0 -> 1 O O n g / m l E G I I •+ III, F r a c t i o n A C o l u m n C S E M f o r B * d e n o t e s C o l u m n B s i g n i f i c a n t l y ( p < 0 . 0 5 ) h i g h e r t h a n C o l u m n B o f T a b l e 10 + d e n o t e s C o l u m n B s i g n i f i c a n t 1 y ( p < 0 . 0 5 ) l o w e r t h a n C o l u m n B o f T a b l e 10 96 TABLE 11 A. B. 1 69 2 60 3 74 4 62 5 56 6 134 7 . 252 8 250 9 290 1 0 303 11 346 12 350 1 3 330 14 306 1 5 238 1 6 290 1 7 360 1 8 856 1 9 788 20 860 21 1 646 22 1 488 23 2008 24 1 91 8 25 2121 26 2130 27 2103 28 2508 29 3027 30 2622 31 291 3 32 3546 33 3423 34 3142 35 301 0 36 2825 37 2772 38 451 4 39 4594 40 5042 41 5535 42 4770 43 431 2 44 4752 45 4521 C. D. 29 21 29 25 1 6 20 54 77 + 1 20 82 1 02 94 74 63 38 58 121 104 * \128 * 1 02 * 247 * 275 * 352 * 269 * 339 * 659 * 218 * 364 * 597 * 339 * 466 * 808 * 544 * 579 * 81 5 * 625 * 257 * 748 * 925 * 1073 * 816 * 857 * 331 * 1096 * 1 100 * 97 o f 3 0 0 m g / d l D - g l u c o s e p e r f u s i o n p r o d u c e d a s i g n i f i c a n t e l e v a t i o n o f i n s u l i n o u t p u t f r o m t h e p a n c r e a s . T h e e l e v a t i o n w a s s i g n i f -i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) w i t h i n 6 m i n u t e s o f t h e b e g i n n i n g o f t h e i n f u s i o n , r e m a i n e d e l e v a t e d t h r o u g h o u t t h e r e m a i n d e r o f t h e 20 m i n u t e i n -f u s i o n , a n d was a b o l i s h e d 2 m i n u t e s a f t e r t e r m i n a t i o n o f t h e i n -f u s i o n ( T a b l e 1 2 , - F i g u r e 1 1 ) . i i ) O x i d i z e d - E G I 1 1 A 5 n g / m l i n f u s i o n o f t h e H P L C c o m p o n e n t c o r r e s p o n d i n g t o o x i d i z e d , u n i o d i n a t e d E G I I I was a p p l i e d i n an i d e n t i c a l f a s h i o n t o 12 7 t h a t u s e d f o r I-_E G1 1 1 ( s e e a b o v e ) . T h e o x i d i z e d - E G I 11 p r o d u c e d a s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) s u s t a i n e d e l e v a t i o n i n i n s u l i n o u t p u t f r o m t h e p a n c r e a s a f t e r 6 m i n u t e s . T h i s i n c r e a s e was a b o l i s h e d 1 m i n -u t e a f t e r t e r m i n a t i o n o f t h e i n f u s i o n . No s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e 1 2 7 was p r e s e n t b e t w e e n t h e i n s u l i n o u t p u t s e v o k e d by I - E G1 1 1 a n d o x i d i z e d - E G I 1 1 a t a n y t i m e d u r i n g t h e p e r f u s i o n s ( T a b l e 1 2 , F i g u r e I T ) . 3 . I n t e r a c t i o n o f G I P a n d D - g l y c e r a 1 d e h y d e • i n t r i i o d o t h y r o n i n e -t r e a t e d r a t s I n s u l i n r e l e a s e i n r e s p o n s e t o D - g l y c e r a 1 d e h y d e a n d G I P w a s m e a s u r e d i n t h e i s o l a t e d p e r f u s e d p a n c r e a t a o f n o r m a l r a t s a n d o f r a t s w h i c h h a d r e c e i v e d 5 0 0 y g / k g / d a y i n t r a p e r i t o n e a l l y i n j e c t e d t r i i o d o t h y r o n i n e ( T 3 ) . D - g l y c e r a l d e h y d e was p r e s e n t e d t o a l l e x -p e r i m e n t a l g r o u p s a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g p r o t o c o l : D - g l y c e r a l d e h y d e , d i s s o l v e d i n p e r f u s a t e , was p e r f u s e d a t 5mM c o n c e n t r a t i o n f o r 15 m i n u t e s , t h e f i r s t 10 m i n u t e s o f t h i s p e r i o d b e i n g t r e a t e d a s an e q u i l i b r a t i o n p e r i o d f o l l o w i n g s u r g e r y . 98 F I G U R E 1 1 : E f f e c t o f H P L C - p u r i f i e d E G I I I c o m p o n e n t s o n i n s u l i n r e l e a s e i n t h e p r e s e n c e o f 3 0 0 m g / d l g l u c o s e ( S e e T a b l e 1 2 ) c l o s e d c i r c l e s : g l u c o s e a l o n e ( n = 7 ) t r i a n g l e s : g l u c o s e + H P L C ( o x i d i z e d ) E G I I I (n=8) 12 7 o p e n c i r c l e s : g l u c o s e + H P L C ( I ) E G I I I ( n = 7 ) 99 T a b l e 1 2 : E f f e c t o f H P L C - p u r i f i e d I - E G I I I and o x i d i z e d E G I I I on i n s u l i n s e c r e t i o n i n t h e p r e s e n c e o f 300mg/d l g l u c o s e Co lumn A Co lumn B Co lumn C Co lumn D: Co lumn E: Co lumn F M i n u t e s f o l l o w i n g t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d x IR I ( u U / r n i n ) n = 7 m i n . 1 - 5 : 8.0mg/dl g l u c o s e m i n . 6 - 4 5 : 300mg/d l g l u c o s e SEM f o r B x IR I ( y U / m i n ) n=7 m i n , m i n , m i n , 1 - 5 : 80mg/dl g l u c o s e 6 - 4 5 : 300mg/d l g l u c o s e i - 3 5 : 5nq/ml a * 7 I -16- EGI 11 SEM f o r D x IR I ( y U / m i n) n = 8 m i n . 1 - 5 : 80mg/dl g l u c o s e m i n . 6 - 4 5 : 300mg/d l g l u c o s e m i n . 1 6 - 3 5 : 5ng/ml o x i d i z e d E G I I I Co lumn G SEM f o r F * d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p<0 . 05 ) d i f f e r e n c e f r o m Column B 100 TABLE 12: B. C. D. E. F. 43 8 28 8 9 47 1 0 32 8 1 0 46 8 16 5 6 41 8 1 7 6 9 36 8 24 7 8 1 79 1 04 ; 141 48 1 1 553 223 870 333 277 459 126 744 234 31 5 427 1 02 556 209 234 457 1 68 483 133 270 489 200 487 147 275 432 145 41 0 116 329 351 76 406 73 458 453 112 457 93 441 393 87 470 121 550 586 1 43 569 1 29 585 51 7 1 00 889 344 910 413 44 800 1 69 1155 62 9 1 34 1 132 304 1195 737 217 1 331 354 1 348 574 1 47 1 391 * 347 1238 650 121 1 534 * 386 1610 694 1 1 8 1 885 * 507 1 960 695 124 1 734 * 339 1519 663 1 40 1932 * 451 T808 793 213 1912 * 390 1819 690 129 1 81 7 * 426 1 923 765 1 63 1 91 1 * 489 1 901 763 . 106 1 891 * 405 1 766 993 1 81 1 775 * 349 1 834 1084 247 1 71 1 285 2199 1127 1 87 1845 * 333 1 949 1 053 1 48 1 959 * 41 6 1971 1249 223 1 963 * 500 2042 1207 213 1 487 293 2079 1 061 201 1 786 * 271 1 649 1229 270 1 51 7 233 2043 1 375 312 1 51 3 238 1957 1223 374 1 466 1 80 2084 1 629 347 1 822 369 21 68 1555 311 1474 246 2213 1421 293 1 324 224 2326 1467 322 1435 268 21 65 1 870 474 1 606 305 2463 1 643 588 1 809 372 2224 G. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1 1 2 13 14 1 5 1 6 17 1 8 1 9 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 3 3 2 2 2 3 86 68 76 97 90 97 1 06 100 1 62 1 53 314 393 391 41 0 272 536 622 332 438 41 3 492 587 230 293 338 316 331 359 324 224 457 464 51 7 576 493 536 661 629 704 101 T h e p e r f u s a t e D - g l y c e r a l d e h y d e c o n c e n t r a t i o n w a s t h e n r a p i d l y r a i s e d t o lOmM a n d t h i s c o n t i n u e d f o r 4 0 m i n u t e s . A g r o u p o f n o r m a l p a n c r e a t a a n d a g r o u p o f T ^ - t r e a t e d p a n c r e a t a r e c e i v e d D-g l y c e r a l d e h y d e a l o n e . A d d i t i o n a l g r o u p s o f n o r m a l a n d T g - t r e a t e d p a n c r e a t a r e c e i v e d a 5 n g / m l s i d e - a r m G I P i n f u s i o n f o r 2 0 m i n u t e s d u r i n g t h e 1OmM D - g l y c e r a l d e h y d e p e r f u s i o n . T e n m i l l i m o l a r D - g l y c e r a l d e h y d e a l o n e e v o k e d b i p h a s i c i n s u l i n r e l e a s e w h i c h d i d n o t d i f f e r i n m a g n i t u d e b e t w e e n n o r m a l a n d T . j - t r e a t e d p a n c r e a t a ( F i g u r e 1 2 , T a b l e . 1 3 ) . W h i l e 5 n g / m l G I P i n f u s i o n s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d ' i n s u l i n o u t p u t f r o m t h e p a n c r e a s i n t h e T g - t r e a t e d g r o u p r e l a t i v e t o t h e c o n t r o l ( T a b l e 1 4 ) , i n s u l i n o u t p u t f r o m t h e T g - t r e a t e d p a n c r e a t a - d u r i n g t h e G I P i n f u s i o n w a s n o t s i g n i f i c a n t l y h i g h e r ( p < 0 . 0 5 ) t h a n t h a t f r o m t h e n o r m a l p a n c r e a t a d u r i n g t h e G I P i n f u s i o n ( T a b l e 1 4 , F i g u r e 1 3 ) . T h e t h y r o t o x i c s t a t e o f t h e T g - t r e a t e d r a t s w a s c o n f i r m e d b y t h e a b s e n c e o f a s u s t a i n e d i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t o f 3 0 0 m g / d l g l u c o s e i n t h e p e r f u s e d p a n c r e a t a o f 2 T g - t r e a t e d r a t s ( T a b l e 9 ) . B . S o m a t o s t a t i n r e T e a s e _]_. T h e o p h y l 1 i n e , g T u c o s e a n d G I P A l l p a n c r e a t a w e r e e x p o s e d t o g l u c o s e i n t h e f o l l o w i n g m a n n e r : a 10 m i n u t e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d w a s f o l l o w e d b y 5 m i n u t e s o f p e r f u s i o n w i t h 8 0 m g / d T g l u c o s e . T h e p e r f u s a t e g l u c o s e c o n c e n -t r a t i o n w a s t h e n r a p i d l y r a i s e d t o 1 6 0 m g / d l a n d p e r f u s i o n w i t h t h i s g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n c o n t i n u e d f o r 4 0 m i n u t e s . T h o s e p a n c r e a t a w h i c h w e r e u s e d a s c o n t r o l s r e c e i v e d s i d e -a r m i n f u s i o n s o f e i t h e r 2.5mM o r 5.OmM t h e o p h y l l i n e b e g i n n i n g 14 m i n u t e s a f t e r t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d a n d c o n t i n u i n g f o r 15 102 F I G U R E 1 2 : E f f e c t o f D - g l y c e r a l d e h y d e o n i n s u l i n s e c r e t i o n f r o m n o r m a l a n d T ^ - t r e a t e d p a n c r e a t a ( S e e T a b l e 1 3 ) o p e n c i r c l e s : n o r m a l r a t s ( n = 6 ) c l o s e d c i r c l e s : T ^ - t r e a t e d r a t s ( n = 6 ) p o i n t s r e p r e s e n t m e a n ± S E M n o s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e b e t w e e n p o i n t s 103 T a b l e 1 3 : E f f e c t o f D - g l y c e r a l d e h y d e o n i n s u l i n s e c r e t i o n f r o m n o r m a l a n d T ^ - t r e a t e d p a n c r e a t a C o l u m n A : M i n u t e s f o l l o w i n g t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d C o l u m n B : x I R I ( y U / m i n ) n=6 m i n . 1 - 5 : 5mM D - g l y c e r a l d e h y d e m i n . 6 - 4 5 : lOmM D - g l y c e r a l d e h y d e - n o r m a l r a t s C o l u m n C : S E M f o r B C o l u m n D: x I R I ( y U / m i n ) n=6 m i n . 1 - 5 : 5mM D - g l y c e r a l d e h y d e m i n . 6 - 4 5 : 1OmM D - g l y d e r a l d e h y d e - T g - t r e a t e d r a t s C o l u m n E : S E M f o r D No s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e b e t w e e n C o l u m n s B ~ a ri d . D 104 TABLE 13 A. B. C. D. E. 1 2 30 21 34 8 21 5 35 7 53 1 9 96 43 •J A 51 1 9 1 71 92 t; 71 14 222 122 fi 388 101 470 1 63 U 7 996 274 1 726 585 / 8 g 632 95 936 527 540 89 444 172 10 1 1 1 2 13 14 1 5 1 6 17 18 1 9 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 636 94 666 304 596 126 508 160 564 84 508 1 43 496 1 01 418 1 56 520 95 524 148 520 122 476 122 576 1 03 476 99 592 84 496 1 11 580 86 568 1 86 588 107 432 1 00 656 82 504 1 04 672 93 664 137 644 85 632 120 756 1 07 688 129 628 139 536 1 68 544 11 5 584 120 688 125 640 163 612 168 692 1 53 664 1 49 706 301 684 1 30 684 204 736 213 720 1 82 728 234 682 1 1 9 672 1 80 61 6 1 34 544 142 492 137 588 176 444 11 2 532 152 600 1 1 3 436 167 604 11 9 37 498 1 82 632 1 1 3 38 504 142 552 161 39 40 41 42 43 44 45 608 131 568 1 61 556 124 625 1 76 552 123 465 11 5 468 142 41 5 1 31 476 1 47 586 1 93 488 145 61 6 122 436 150 508 1 87 105 T a b l e 1 4 : E f f e c t o f G I P a n d D - g l y c e r a l d e h y d e o n i n s u l i n s e c r e t i o n f r o m n o r m a l a n d T , - t r e a t e d p a n c r e a t a C o l u m n A : M i n u t e s f o l l o w i n g t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d C o l u m n B : x I R I ( y U / m i n ) n=6 m i n . 1 - 5 : 5mM D - g l y c e r a l d e h y d e m i n . 6 - 4 5 : 1OmM D - g l y c e r a d l e h y d e m i n . 1 6 - 3 5 : 5 n g / m l G I P - n o r m a l r a t s C o l u m n C: S E M f o r B C o l u m n D: x I R I ( y U / m i n ) n=6 m i n . 1 - 5 : 5mM D - g l y c e r a l d e h y d e m i n . 6 - 4 5 : lOmM D - g l y c e r a l d e h y d e m i n . 1 6 - 3 5 : 5 n g / m l G I P - T g - t r e a t e d r a t s C o l u m n E : S E M f o r D No s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e b e t w e e n C o l u m n s B a n d D * d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e b e t w e e n C o l u m n D a n d C o l u m n D o f T a b l e 13 106 T A B L E 14 D, 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 3 14 1 5 1 6 17 1 8 1 9 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 0 41 42 43 4 4 45 47 4 9 79 73 83 2 3 5 3 5 8 3 4 3 3 5 0 4 4 0 31 8 3 0 5 2 6 3 3 1 8 3 2 3 3 3 0 4 8 4 8 6 0 1331 1111 7 2 6 9 0 8 1 2 3 2 1 2 8 7 1 9 8 0 2 0 4 8 1 8 9 2 2 0 4 2 1 4 0 8 9 9 0 1 2 7 6 1 3 7 7 1 6 0 6 1 342 1 1 33 996 731 6 7 5 590 6 2 0 4 4 5 3 8 5 3 7 0 310 3 4 0 8 26 31 25 24 94 141 1 00 90 145 82 70 74 1 30 1 0 4 83 1 60 3 7 5 5 8 7 3 9 4 1 77 2 5 8 31 8 3 3 0 7 7 2 7 3 6 7 4 0 9 5 6 6 0 0 2 4 3 4 0 7 5 4 3 791 701 4 8 5 3 5 6 2 3 9 211 2 1 0 2 6 8 1 47 149 1 53 1 0 8 1 31 114 99 1 05 1 50 2 9 4 652 1 0 1 0 4 2 5 41 9 5 0 3 4 0 7 6 1 0 5 9 9 6 2 3 51 4 6 3 9 702 991 1 3 9 0 1 8 7 0 1 9 2 0 2 0 1 0 2 3 6 7 2 5 0 8 2 9 8 3 2 8 9 0 2 8 3 4 2 9 1 9 3 2 4 6 2 1 9 9 201 8 2 4 6 4 2 4 9 4 3 0 8 5 2 7 0 2 2 7 7 9 1 6 6 2 I 7 5 3 1 0 3 6 I I 72 11 04 7 64 6 84 7 3 7 6 2 8 79 71 57 46 141 1 87 5 6 7 2 0 2 191 231 187 3 0 3 1 9 4 261 1 28 1 97 2 1 3 2 6 5 2 6 9 5 6 6 61 2 6 9 7 7 4 4 7 3 7 7 5 9 7 7 6 781 9 2 8 9 6 0 5 1 3 3 5 2 5 7 3 8 3 4 8 8 8 5 7 0 8 2 0 5 8 5 6 0 5 2 8 3 521 4 8 8 242 2 5 0 3 0 5 2 5 5 107 5 lOmM D-Glyceraldehyde 5 n q / m l G IP 20 30 Time (min) T" 40 FIGURE 13: E f f e c t o f D - g l y c e r a l d e h y d e and GIP on i n s u l i n s e c r e t i o n from normal and T g - t r e a t e d p a n c r e a t a (See Tab l e 14) open c i r c l e s : normal r a t s (n=6) c l o s e d c i r c l e s : T g - t r e a t e d r a t s (n = 6) p o i n t s r e p r e s e n t mean ± SEM no s i g n i f i c a n t (p<0.05) d i f f e r e n c e between p o i n t s 108 m i n u t e s . A d d i t i o n a l g r o u p s o f p a n c r e a t a a l s o r e c e i v e d a 5 n g / m l s i d e - a r m G I P i n f u s i o n b e g i n n i n g 5 m i n u t e s a f t e r t h e t h e o p h y l l i n e i n f u s i o n a n d t e r m i n a t i n g a f t e r - 1 0 m i n u t e s . T h e p r e s e n c e o f 5 n g / m l G I P a n d 5.0mM t h e o p h y l l i n e w a s a c c o m p a n i e d b y s i g n i f i c a n t l y ( p < 0 . 0 5 ) m o r e r a d i o i m m u n o a s s a y a b l e s o m a t o s t a t i n ( S L I ) t h a n i n t h e p r e s e n c e o f 5.0mM t h e o p h y l l i n e a l o n e ( T a b l e 1 5 , F i g u r e 1 4 ) . No e l e v a t i o n o f s o m a t o s t a t i n o u t p u t f r o m t h e p a n c r e a t a w a s e v i d e n t w h e n t h e e f f e c t s o f 2.5mM t h e o p h y l -l i n e a n d 5 n g / m l G I P w e r e c o m p a r e d w i t h t h e e f f e c t s o f 2.5mM t h e o p h y l l i n e a l o n e ( T a b l e 1 6 , F i g u r e 1 5 ) . No s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e w a s n o t e d b e t w e e n t h e s o m a t o s t a t i n s e c r e t i o n e l i c i t e d b y 2.5mM t h e o p h y l l i n e a n d t h a t e l i c i t e d b y 5.0mM t h e o p h y l l i n e . 109 80 160 mq/dl Glucose 5 0 rr M Theoohvlline 5na/ml GIP Time (min) F I G U R E 1 4 : E f f e c t o f g l u c o s e , G I P a n d 5.0mM t h e o p h y l l i n e o n s o m a t o s t a t i n s e c r e t i o n ( S e e T a b l e 1 5 ) o p e n c i r c l e s : g l u c o s e a n d t h e o p h y l l i n e a l o n e (,n = 6 ) c l o s e d c i r c l e s : g l u c o s e , t h e o p h y l l i n e a n d G I P ( n = 6 ) p o i n t s r e p r e s e n t m e a n ± S E M * d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e b e t w e e n p o i n t s 110 T a b ! e 1 5 : E f f e c t o f g l u c o s e , G I P a n d 5.0mM t h e o p h y l l i n e o n s o m a t o s t a t i n s e c r e t i o n C o l u m n A : M i n u t e s f o l l o w i n g t h e e q u i l i b r a t i o n p e r i o d C o l u m n B : x S L I ( p g / m i n ) ( n = 6 ) m i n . 1 - 5 : 8 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 6 - 4 5 : 1 6 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 1 5 - 3 4 : 5.0mM t h e o p h y l l i n e C o l u m n C : S E M f o r B C o l u m n D: x S L I ( p g / m i n ) ( n = 6 ) m i n . 1 - 5 : 8 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 6 - 4 5 : 1 6 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 1 5 - 3 4 : 5.0mM t h e o p h y l l i n e m i n . 2 0 - 3 0 : 5 n g / m l G I P C o l u m n E : S E M f o r D * d e n o t e s b e t w e e n s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e C o l u m n s B a n d D m TABLE 15 A. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 1 3 14 15 16 17 1 8 1 9 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 B. 24 66 20 48 57 53 45 1 7 1 3 26 1 6 28 20 21 1 7 43 81 50 73 105 41 73 96 55 75 58 53 48 76 82 82 83 1 06 1 03 85 50 65 1 1 0 30 57 84 31 28 44 27 C. 16 53 24 33 32 34 31 36 27 26 28 41 27 27 27 40 30 33 35 42 12 23 30 20 29 20 25 21 23 32 20 1 9 37 35 43 28 22 36 1 2 28 48 1 1 1 5 1 9 1 3 34 52 45 48 42 52 31 25 22 22 1 7 21 22 21 51 45 33 53 69 195 202 161 1 84 1 69 159 204 255 285 215 197 241 1 49 1 62 1 42 148 87 75 80 65 60 50 40 32 30 22 E 1 4 1.7 1 7 21 1 9 21 1 1 22 18 1 8 1 5 14 1 5 12 30 23 20 22 31 52 33 * 30 * 34 * 30 * 33 * 32 * 32 * 41 * 36 * 41 * 32 * 35 * 38 * 22 32 33 1 5 1 2 1 6 20 1 7 1 9 1 6 1 8 1 6 112 8 0 160 mq/dl Glucose Theophylline 2.5 mM GIP 5ng/ml c E Q_ CO 10 2 0 3 0 Time (min) 4 0 F I G U R E 1 5 : E f f e c t o f g l u c o s e , G I P a n d 2.5mM t h e o p h y l l i n e o n s o m a t o s t a t i n s e c r e t i o n ( S e e T a b l e 1 6 ) o p e n c i r c l e s : g l u c o s e a n d t h e o p h y l l i n e a l o n e ( n = 5 ) c l o s e d c i r c l e s : g l u c o s e , t h e o p h y l l i n e a n d G I P (n=8) p o i n t s r e p r e s e n t m e a n ± S E M no s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e b e t w e e n p o i n t s 113 T a b ! e 1 6 : E f f e c t o f g l u c o s e , G I P a n d 2 o n s o m a t o s t a t i n s e c r e t i o n 5mM t h e o p h y l l i n e C o l u m n A C o l u m n B C o l u m n C C o l u m n D M i n u t e s p e r i o d f o l l o w i n g t h e e q u i l i b r a t i o n x S t I ( p g / m i n ) ( n = 5 ) m i n . 1 - 5 : 8 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 6 - 4 5 : 1 6 0 m g / d 1 g l u c o s e m i n . 1 5 - 3 4 : 2.5mM t h e o p h y l l i n e S E M f o r B x S L I ( p g / m i n ) ( n = 8 ) m i n . 1 - 5 : 8 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 6 - 4 5 : 1 6 0 m g / d l g l u c o s e m i n . 1 5 - 3 4 : 2.5mM t h e o p h y l l i n e m i n . 2 0 - 3 0 : 5 n g / n l G I P C o l u m n E S E M f o r D no s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) d i f f e r e n c e b e t w e e n C o l u m n s B a n d D 114 TABLE 16 A. B . C. D. E. 1 58 33 103 33 2 39 28 96 24 3 40 33 93 34 4 106 40 90 33 5 94 40 1 02 31 6 90 35 82 31 7 64 29 52 20 8 56 26 61 20 9 60 25 53 1 8 1 0 74 32 42 14 1 1 55 27 32 9 12 60 30 46 1 2 13 64 36 44 1 6 1 4 60 23 43 1 3 1 5 68 29 66 21 1 6 111 30 43 21 17 1 1 4 39 51 21 1 8 109 36 73 27 1 9 128 41 90 28 20 170 30 104 29 21 11 9 31 82 23 22 1 47 50 114 32 23 98 42 86 1 8 24 1 03 35 90 22 25 1 1 5 32 114 36 26 1 1 2 32 1 05 29 27 95 16 127 31 28 80 40 1 36 3 7 29 123 35 77 31 30 72 32 94 28 31 126 29 83 28 32 121 29 55 21 33 128 34 86 41 34 1 43 30 121 34 35 163 32 137 41 36 128 22 97 26 37 129 30 64 28 38 1 36 48 73 25 39 104 43 67 25 40 78 51 63 30 41 1 63 51 67 29 42 102 31 51 25 43 94 29 51 27 44 87 38 46 22 45 1 07 38 58 30 115 I I . H P L C A . G r a d i e n t F o r m a n d T e r m i n o l o g y 1 . T e r m i n o ! o g y H P L C t r a c e s p r e s e n t e d i n t h e r e s u l t s s e c t i o n a r e a c c o m -p a n i e d b y a b r i e f d e s c r i p t i o n o f t h e c o n d i t i o n s u s e d t o o b t a i n t h e m . U n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d t h e f o l l o w i n g c o n d i t i o n s w e r e s t a n d a r d f o r a l l t r a c e s : a ) t r a c e s r e p r e s e n t a b s o r b a n c e ( 2 2 5 n m ) v e r s u s t i m e b ) s e n s i t i v i t y o f d e t e c t o r : 0.1 A U F S ( A r b i t r a r y U n i t s F u l l S c a l e ) c ) s o l v e n t f l o w r a t e : 2 . 0 m l / m i n d ) s o l v e n t p r e s s u r e : 2 9 0 0 - 3 5 0 0 P S I e ) a c e t o n i t r i l e g r a d i e n t s w e r e l i n e a r b e t w e e n i n i t i a l a n d f i n a l a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n s T h e H P L C t r a c e s a r e a c c o m p a n i e d b y a b r i e f d e s c r i p t i o n o f t h e s o l v e n t g r a d i e n t o r i s o c r a t i c s y s t e m u s e d a n d t h e t i m e p e r i o d o v e r w h i c h t h e g r a d i e n t w a s p r o g r a m m e d t o o c c u r : "0 -* 7 0 % C H g C N , 9 m i n u t e s " w o u l d r e f e r t o a l i n e a r a c e -t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n g r a d i e n t r u n n i n g f r o m 0% a c e t o n i t r i l e t o 7 0 % a c e t o n i t r i l e o v e r a 9 m i n u t e p e r i o d - a 7 . 7 8 % m i n . a c e -t o n i t r i 1 e . g r a d i e n t . 2 . I n t r i n s i c a r t e f a c t s T h e H P L C s y s t e m u s e d ( s e e M e t h o d s : S e c t i o n I C , 2 ) p r o d u c e d s e v e r a l t y p e s o f a r t e f a c t s w h i c h a p p e a r e d c o n s i s t e n t l y i n t h e 116 a b s o r b a n c e t r a c e s . A n e x a m p l e c o n t a i n i n g a l l t h e s e a r t e f a c t s i s s h o w n i n F i g u r e 1 6 . a ) L a g t i m e I n j e c t i o n o f a s a m p l e i n t o t h e H P L C d e v i c e w a s a l w a y s m a d e a t t h e s a m e t i m e a s a n a c e t o n i t r i l e g r a d i e n t w a s b e g u n . T h e l a g t i m e b e t w e e n t h e p r o g r a m m e d b e g i n n i n g o f a g r a d i e n t a n d i t s d e -t e c t i o n b y t h e s p e c t r o p h o t o m e t e r l o c a t e d j u s t d i s t a l t o t h e c o l u m n wa s a l w a y s a p p r o x i m a t e l y 8.5 m i n u t e s . T h i s m e a n t t h a t a l l i n -j e c t e d s a m p l e s w e r e f i r s t e x p o s e d t o a n i s o c r a t i c a c e t o n i t r i l e f l o w a t t h e c o n c e n t r a t i o n a t w h i c h t h e g r a d i e n t w a s t o b e g i n f o r 8.5 m i n u t e s p r i o r t o t h e s t a r t o f t h e g r a d i e n t . T h i s l a g t i m e a p p e a r e d a s an 8 . 5 m i n u t e c o n s t a n t a b s o r b a n c e , a n d w a s o f t e n f o l l o w e d b y a b i p h a s i e d e f l e c t i o n a s t h e s o l v e n t g r a d i e n t r e a c h e d t h e d e t e c t o r . b ) B a c k g r o u n d a b s o r b a n c e A t t h e w a v e l e n g t h s u s e d , a c e t o n i t r i l e h a d a h i g h e r a b s o r b -a n c e t h a n w a t e r . A . l i n e a r a c e t o n i t r i l e g r a d i e n t p r o d u c e d a r i s i n g b a s e l i n e . T h i s b a s e l i n e w a s c l o s e t o l i n e a r i t y b u t n o t c o m p l e t e l y l i n e a r . T h i s p h e n o m e n o n w a s a t t r i b u t a b l e t o t h e d i f f e r e n t c o m -p r e s s - a b i l i t i e s o f t h e t w o s o l v e n t s . T h e l o w e r o p e r a t i n g p r e s s u r e p r o d u c e d b y p u m p i n g a s o l v e n t m i x t u r e w i t h a h i g h a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n p r o d u c e d a s l i g h t c u r v i 1 i n e a r i t y i n t h e g r a d i e n t b a c k g r o u n d . T h i s c u r v i 1 i n e a r i t y w a s n e g l i g i b l e o v e r m o s t o f t h e g r a d i e n t s w h i c h w e r e u s e d . c ) S o l v e n t P e a k s H i g h l y p u r i f i e d ' H P L C s o l v e n t s ( s e e A p p e n d i x t o M e t h o d s ) 117 .ooa Time (minutes) F I G U R E 1 6 : A r t e f a c t s a n d b a c k g r o u n d 1: i n j e c t i o n m a r k e r s p i k e 2 : i n j e c t i o n a r t e f a c t 3 : l a g p e r i o d 4: d e f l e c t i o n f o l l o w i n g l a g p e r i o d 5 : s o l v e n t p e a k s g r a d i e n t : 0*70% C H - C N , 30 m i n . 118 r e t a i n e d s e v e r a l u n i d e n t i f i e d c o m p o n e n t s w h i c h e l u t e d a t s e v e r a l r e p r o d u c t i b l e a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n s . T h e s e p e a k s w e r e i d e n t i f i e d b y r u n n i n g ' g r a d i e n t s i n w h i c h n o s a m p l e w a s i n j e c t e d . T h e " b a c k g r o u n d " p e a k s " e l u t e d a t a n a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n r a n g e d i f f e r e n t f r o m t h a t a t w h i c h p e p t i d e m i x t u r e s e l u t e d . d ) I n j e c t i o n a r t e f a c t s I n j e c t i o n o f a s a m p l e i n t o t h e H P L C s y s t e m c a u s e d a n e l e c t r o n i c a l l y - g e n e r a t e d d e f l e c t i o n o f t h e c h a r t r e c o r d e r . T h i s " s p i k e " was u s e d t o m a r k t h e b e g i n n i n g o f a g r a d i e n t . A p p r o x -i m a t e l y 1.8 m i n u t e s a f t e r i n j e c t i o n , a d r o p i n a b s o r b a n c e w o u l d o c c u r , c o r r e s p o n d i n g t o a v o i d v o l u m e f l o w o f s o l v e n t f r o m t h e i j e c t e d s a m p 1 e . ( u s u a 1 1 y w a t e r ) t h r o u g h t h e s y s t e m . I t s h o u l d b e n o t e d t h a t t h e p e r i o d f r o m t h e m a r k e r s p i k e t o t h e i n j e c t i o n a r t e f a c t , o r t o t h e e n d o f t h e l a g p e r i o d ( s e e a b o v e ) , w a s a f u n c t i o n o f s o l v e n t f l o w r a t e ( s t a n d a r d 2 . 0 m l / m i n ) . B_. P u r i f i c a t i o n S t a g e s o f G I P F r a c t i o n s a n d s i d e - f r a c t i o n s f r o m t h e p u r i f i c a t i o n o f G I P w e r e s u b j e c t e d t o H P L C a n a l y s i s . T h e p u r i f i c a t i o n s c h e m e u s e d w a s t h a t o f B r o w n e t a l ( 1 9 7 0 ) w i t h t h e a d d i t i o n o f a n e x t r a p u r i f i c a t i o n s t e p o n G - 2 5 . A s u m m a r y o f t h i s p u r i f i c a t i o n m e t h o u s i n g t h e n o m e n c l a t u r e a d o p t e d i n t h i s s e c t i o n i s s h o w n i n F i g u r e 1 7 . 1 . P u r i f i c a t i o n s t a g e s H P L C a n a l y s e s o f E G I , EG 1 1 , E G I I I a n d G I P 1 _ 4 2 ( F i g u r e s 1 8 2 1 ) r e v e a l e d i s o l a t i o n o f a s i n g l e m o n o c o m p o n e n t p e a k ( G I P - j 4 2 ) f r o m a n E G I I I m i x t u r e c o n t a i n i n g t w o m a j o r c o m p o n e n t s a n d s o m e 119 HOG D U O D E N A L T J E J U N A L T I S S U E E x t r a c t i o n p r o c e d u r e s E G I C M - c e l l u l o s e w i t h 1OmM' N H 4 H C 0 3 pH 7.8 • E G I - + I I , F r a c t i o n s A , C E G I I ( E G I + I I , F r a c t i o n B ) S e p h a d e x G 2 5 200mM a c e t i c a c i d X2 • E G I I + I I I , F r a c t i o n A E G I I I ( E G I I + I I I , F r a c t i o n B ) H P L C > - G I P g 4 2 » e a r 1 y p e a k s G I P 1 - 4 2 F I G U R E 1 7 : P u r i f i c a t i o n s c h e m e f o r G I P ( r e v i s e d f r o m i n f o r m a t i o n p r e s e n t e d i n B r o w n e t a l , 1 9 7 0 ) 120 F I G U R E 1 8 : E G I 5 0 y g E G I 0->70% C H 3 C N , 60 m i n . * G I P 121 •Ol-i O < <D O C CO n L. o (0 < 10 30 Time (minutes) F I G U R E 1 9 : E G I I l O y g E G I I 0 + 7 0 % C H 3 C N , 60 m i n . * G I P l - 4 2 122 F I G U R E 2 0 : E G I I I 5yg E G I I I 0 + 7 0 % C H 3 C N , 60 m i n . * G I P l - 4 2 123 F I G U R E 2 1 : G I P ] _ 4 2 5 y g G I P 1 _ 4 2 0 + 7 0 % C H g C N , 30 m i n . * G I P l - 4 2 124 a s s o c i a t e d m i n o r c o n t a m i n a n t s . A m a j o r p e a k i n t h e h e t e r o g e n o u s E G I I m i x t u r e e l u t e d a t t h e s a m e t i m e a s d i d t h e m a j o r p e a k s o f t h e E G I I I m i x t u r e . I d e n t i f i c a t i o n o f t h i s p e a k i n E G I w a s e q u i -v o c a l d u e t o t h e h e t e r o g e n e i t y o f t h e m i x t u r e . 2. P u r i f i c a t i o n p r o c e s s f o r GIP-) 4 2 T h e p u r i f i c a t i o n o f G I P - | _ 4 2 f r o m E G I I I w a s a c c o m p l i s h e d b y f i r s t r e s o l v i n g t h e c o m p o n e n t s o f E G I I I . a ) E l u t i o n c o n d i t i o n s V a r i a t i o n o f t h e a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n b y 2% c a u s e d a m a r k e d d i f f e r e n c e i n r e s o l u t i o n a n d e l u t i o n t i m e o f t h e E G I I I p e a k s ( F i g u r e 2 1 ) . E G I I I w a s f o u n d t o c o n s i s t o f t w o m a j o r p e a k s , G I P -j 4 2 a n d G I P 3 4 2 , w h i c h h a d p r e v i o u s l y b e e n i d e n t i f i e d b y J o r n v a i l e t a l (1:980)', a s w e l l a s a c l u s t e r o f m i n o r " e a r l y p e a k s " a n d a n u n i d e n t i f i e d m i n o r p e a k w h i c h e l u t e d b e t w e e n G I P 3 _ 4 2 a n d G I P 1 _ 4 2 ( F i g u r e 2 2 ) . b ) P u r i f i c a t i o n P u r i f i c a t i o n o f G I P -j 4 2 w a s p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d i n M e t h o d s : S e c t i o n I , C , 4 . T h e l a r g e a m o u n t s o f p r o t e i n s i n j e c t e d r e s u l t e d i n p e a k b r o a d e n i n g ( F i g u r e 2 3 ) . T h e e f f l u e n t c o n t a i n i n g GIP-j 4 2 w a s p o o l e d f o l l o w i n g t h e s h o u l d e r ' c o n t a i n i n g t h e u n i d e n t i -f i e d m i n o r p e a k ( F i g u r e 2 3 ) a n d r e - c h r o m a t o g r a p h y o f t h i s f r a c t -i o n f o l l o w i n g 1 y o ph i 1 i z a t i o n r e v e a l e d t h e m o n o c o m p o n e n t GI P -j _ ^ 2 p e a k o f F i g u r e 2 1 . c ) Y i e l d 72.3% b y w e i g h t o f t h e i n j e c t e d E G I I I w a s r e c o v e r e d a s 125 F I G U R E 2 2 : E G I I I a t t w o d i f f e r e n t a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n s A : 35% C H 3 C N 5pg E G I I I B : 33% C H 3 C N 5yg E G I I I 3 : G I P 3 _ 4 2 1: G I P 1 _ 4 2 U : " u n i d e n t i f i e d m i n o r p e a k " 126 F I G U R E 2 3 : P u r i f i c a t i o n o f G I P 1 _ 4 2 f r o m E G I I I 3 0 0 y g E G I I I 3 3 % C H 3 C N e : e a r l y p e a k s g : G l P 3 _ 4 2 P e a k p : p o o l e d GI P -, A 9 p e a k 127 G I P 1 _ 4 2 * 3_. S i d e f r a c t i o n s f r o m t h e p u r i f i c a t i o n o f GIP a) EGI -f I I , F r a c t i o n C A n a l y s i s o f EGI -* I I , F r a c t i o n C was p e r f o r m e d ( F i g u r e 24) s i n c e a g a l l b l a d d e r - c o n t r a c t i n g p r o t e i n was i s o l a t e d f r o m t h i s s i d e f r a c t i o n ( s e e L-CCK - R e s u l t s : S e c t i o n I I , C ) . The m i x t u r e , t h o u g h h e t e r o g e n o u s , c o n t a i n e d a s i n g l e l a r g e peak e l u t i n g a t a s i m i l a r t i m e t o t h a t o f t h e L-CCK peak e v e n t u a l l y p u r i f i e d f r o m t h e s i d e f r a c t i o n . b) EGI I -» I I I , F r a c t i o n A C o m p a r i s o n o f t h e e l u t i o n p r o f i l e s o f E G I I I and EGI I -> I I I , F r a c t i o n A ( F i g u r e 25) a l l o w e d t h e s e p a r a t i o n o f t h e EG I I + I I I , F r a c t i o n A peak s i n t o two c a t e g o r i e s . The " a " peak s e l u t e d p r e -v i o u s t o t h o s e o f E G I I I , w h i l e t h e " g " peak s e l u t e d a t a s i m i l a r t i m e t o t h a t o f E G I I I . P u r i f i c a t i o n ( F i g u r e 26) o f t h e " E G I I -* I I I F r Act" peak s r e s u l t e d i n a p u t a t i v e l y G I P - f r e e m i x t u r e w h i c h was a s s a y e d f o r i n s u l i n o t r o p i c a c t i v i t y ( s e e R e s u l t s : S e c t i o n I, A , 2 , C ) . C. L-CCK Column c h r o m a t o g r a p h y ( F i g u r e 27) was p e r f o r m e d on EGI ->-I I , F r a c t i o n C i n o r d e r t o c o n c e n t r a t e a f r a c t i o n w i t h g a l l b l a d -d e r - c o n t r a c t i n g b i o a c t i v i t y . HPLC was u s e d t o c h a r a c t e r i z e t h e h e t e r o g e n e i t y o f t h e c h r o m a t o g r a p h e d f r a c t i o n s , t o compare t h e e l u t i o n t i m e s o f t h e f r a c t i o n s w i t h t h o s e o f t h e v a r i o u s CCK h o m o l o g u e s , and as a f i n a l p u r i f i c a t i o n s t e p i n t h e p r o c e d u r e . 128 F I G U R E 2 4 : E G I + I I , f r a c t i o n C l O y g E G I + I I , f r a c t i o n C 0 + 7 0 % C H , C N , 30 m i n . 1 2 9 .006-Time (minutes) F I G U R E 2 5 : C o m p a r i s o n o f t h e e l u t i o n p r o f i l e s o f E G I I I a n d E G I 1 * 1 1 1 , f r a c t i o n A . 2 4 y g E G I I +111 f r a c t i o n A 3 2 % C H 3 C N 2 0 5 nm 3 m l / m i n . B : 5 y g E G I I I 3 2 % C H 3 C N 2 0 5 nm 3 m l / m i n . 1 3 0 241 CO CD O c CC .Q o CO -Q < 0 h A M H B 0 10 Time (minutes) F I G U R E 2 6 : P u r i f i c a t i o n o f E G I I + I I I A f r o m E G I I ^ I I I , f r a c t i o n A . 3 0 0 p g E G I I + I I I , f r a c t i o n A 3 3 % C H g C N 2 0 5 n m 3 m 1 / m i n . A : F r a c t i o n a p e a k s B : F r a c t i o n B p e a k s 1 31 E G I + I I ( F r a c t i o n C ) C M - 1 1 , N H 4 H C 0 3 pH 7.8 - • F r a c t i o n A , C F r a c t i o n B G - 2 5 , 0.2M C H 3 C 0 0 H • F r a c t i o n A F r a c t i o n B H P L C y L - C C K E a r l y p e a k s , l a t e p e a k s F I G U R E 2 7 : P u r i f i c a t i o n s c h e m e f o r L - C C K 1 3 2 1 . P u r i f i c a t i o n s t a g e s a ) E G I + I I , F r a c t i o n C - s e e F i g u r e 2 4 b ) A f t e r CM-11 a n d G-2 5 F i g u r e 2 8 r e v e a l s a c o n c e n t r a t i o n o f t w o l a r g e p e a k s c a u s e d b y t h e CM-11 c h r o m a t o g r a p h y w h e n c o m p a r e d t o E G I + I I , F r a c t i o n C. S u b s e q u e n t g e l f i l t r a t i o n o n G - 2 5 g r e a t l y c o n c e n -t r a t e d o n e s e t o f p e a k s ( F i g u r e 2 9 ) c o r r e s p o n d i n g i n e l u t i o n t i m e t o t h e m a j o r p e a k s o b s e r v e d a f t e r t h e CM-11 c h r o m a t o g r a p h y . 2_. H P L C p u r i f i c a t i o n o f L - C C K a ) R e s o l u t i o n o f c o m p o n e n t p e a k s A g r a d i e n t s y s t e m s u i t a b l e f o r r e s o l v i n g t h e c o m p o n e n t p e a k s o f t h e p o s t - G - 2 5 m i x t u r e w a s f o u n d u s i n g t h e t e c h n i q u e d e s c r i b e d i n t h e M e t h o d s ( S e c t i o n I , C , 3 , 2 ) . I t r e v e a l e d a s e t o f p e a k s ( F i g u r e 3 0 ) , a c l u s t e r o f p e a k s a n d a s i n g l e l a r g e m o n o -c o m p o n e n t p e a k . N o n e o f t h e s e p e a k s e l u t e d a t t h e s a m e t i m e a s d i d p o r c i n e C C K 3 3 , C C K 3 g o r C C K g ( F i g u r e s 3 1 , 3 2 , 3 3 ) a l t h o u g h t h e s m a l l , e a r l y " L - C C K o n G - 2 5 " p e a k e l u t e d n e a r t o t h a t o f C C K - 8 . b ) P u r i f i c a t i o n P e a k s e l u t i n g p r i o r t o t h e l a r g e m o n o c o m p o n e n t p e a k w e r e p o o l e d a n d d e s i g n a t e d a s " e a r l y p e a k s ' 1 . T h e e l u a t e b e t w e e n t h e e a r l y p e a k s a n d t h e f i r s t t h i r d o f t h e a s c e n d i n g l i m b o f t h e m o n o -c o m p o n e n t p e a k w a s d i s c a r d e d . T h e m o n o c o m p o n e n t p e a k , d e s i g n a t e d " L - C C K " w a s p o o l e d , a n d p r o t e i n s e l u t i n g a f t e r t h i s p e a k w e r e p o o l e d a n d d e s i g n a t e d " l a t e p e a k s " ( F i g u r e 3 4 ) . R e c h r o m a t o g r a p h y 1 3 3 F I G U R E 2 8 : L - C C K P u r i f i c a t i o n S t a g e s - a f t e r CM ( s e e F i g u r e 2 7 ) l O u g L - C C K a f t e r C M - I T 0 + 7 0 % C H 3 C N , 3 0 m i n . •01-1 Time (minutes) FIGURE 29 : L-CCK P u r i f i c a t i o i r S t a g e s - a f t e r Sephadex G-25 ( s e e f i g u r e 27) l Oyg - L - CCK a f t e r Sephadex G-25 0+70% CH 3 CN, 30 m i n . 1 3 5 ~ .0041 co LL Time (minutes) F I G U R E 3 0 : R e s o l u t i o n o f L - C C K c o m p o n e n t p e a k s 5 p g L - C C K a f t e r G - 2 5 3 0 + 3 9% C H 3 C N , 10 m i n . 1 3 6 F I G U R E 3 1 : C C K - 8 I p g C C K - 8 3 0+3 9% C H , C N , 10 m i n . 137 FIGURE 32 : CCK-33 5yg CCK-33 30+39%, CH-CN, 10 m i n . •158 F I G U R E 3 3 : C C K - 3 9 5 p g C C K - 3 9 3 0 + 3 9 % : C H 3 C N , 10 m in . 1 3 9 .004n Time (minutes) F I G U R E 3 4 : H P L C p u r i f i c a t i o n o f L - C C K T O y g L - C C K a f t e r G - 2 5 31 + 3 7 % , C H 3 C N , 10 m i n . D u r i n g p u r i f i c a t i o n t h e f o l l o w i n g a r e a s w e r e p o o l e d o r d i s c a r d e d : a : n e a r l y p e a k s " b : d i s c a r d e d c : " L - C C K " d : d i s c a r d e d e : " l a t e p e a k s " 140 o f t h e p u r i f i e d L - C C K p e a k a f t e r l y o p h i 1 i z a t i o n r e v e a l e d a s i n g l e p e a k ( F i g u r e 3 5 ) . c ) P r o p e r t i e s o f L - C C K P r e l i m i n a r y i n v e s t i g a t i o n s o f t h e H P L C - p u r i f i e d L - C C K p e a k r e v e a l e d s o m e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e p e p t i d e . i ) T h e f r a c t i o n l a c k e d g a l l b l a d d e r c o n t r a c t i l e a c t i v i t y . T h i s a c t i v i t y w a s c o n c e n t r a t e d i n t h e o t h e r H P L C p e a k s . i i ) A m i n o a c i d a n a l y s i s r e v e a l e d a n a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n u n -l i k e o t h e r i d e n t i f i e d G E P p e p t i d e s . C o n f i r m a t i o n o f i t s c o m p o s i t -i o n a w a i t s f u r t h e r a n a l y s e s , h o w e v e r i t i s l i k e l y t h a t t h e m o l e -c u l e c o n t a i n s a r e l a t i v e l y l a r g e a m o u n t o f p r o l i n e . i i i ) A t t e m p t s t o i d e n t i f y a n N - t e r m i n a l a m i n o a c i d r e s i d u e b y t h e p h e n y l t h i o c y a n a t e m e t h o d o f G r a y ( 1 9 7 6 ) h a v e n o t a s y e t b e e n s u c c e s s f u l . d ) H P L C u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y T h e d e v e l o p m e n t o f a p u r i f i c a t i o n s y s t e m f o r L - C C K w a s f a c -i l i t a t e d b y H P L C a n a l y s i s o f c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y f r a c t i o n s ( s e e R e s u l t s : S e c t i o n I I , C , 1 ) . D i v i s i o n o f t h e c o l u m n f r a c t i o n s i n t o l o t s f o r p o o l i n g w a s a i d e d b y H P L C a n a l y s i s o f t h e c o l u m n f r a c t -i o n s d u r i n g e l u t i o n . T h e c o l u m n f r a c t i o n s ' a b s o r b a n c e w a s f i r s t r e a d a t 2 0 8 n m . An a b s o r b a n c e o f 1.8 w a s t a k e n a s b e i n g e q u i v a l e n t t o l u g / u l o f p r o t e i n . F r a c t i o n s a m p l e s c o n t a i n i n g 1 0 y g o f p r o t e i n w e r e i n j e c t e d i n t o t h e H P L C b y f i r s t c a 1 c u 1 a t i n g • t h e n e c e s s a r y v o l u m e o f f r a c t i o n f r o m t h e a b s o r b a n c e o f t h e p a r t i c u l a r f r a c t i o n . T h e c h a n g i n g p r o t e i n p r o f i l e i n t h e r e s u l t a n t f r a c t i o n r e v e a l e d a t w h i c h p o i n t c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y h a d b e s t c o n c e n t r a t e d a d e s i r -141 FIGURE 35: L-CCK a f t e r HPLC p u r i f i c a t i o n 10u_g L-CCK 31+37%, CH-CN, 10 min 142 e d p r o t e i n c o n s t i t u e n t ( F i g u r e s 3 6 , 3 7 , 3 8 , 3 9 ) . e ) M o d i f i c a t i o n s o f L - C C K i ) T r y p t i c d i g e s t i o n A t r y p t i c d i g e s t o f H P L C - p u r i f i e d L - C C K r e v e a l e d a t l e a s t 4 p e a k s [ F i g u r e 4 0 ) w h e n c o m p a r e d w i t h b a c k g r o u n d ( F i g u r e 4 1 ) . S o m e a d d i t i o n a l s m a l l d e f l e c t i o n s m a y h a v e i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f s e c o n d a r y c l e a v a g e s o f 1 o r 2 o f t h e 4 m a j o r p e a k s . T h e h e t e r o g e n o u s n a t u r e o f t h e p o s t - G - 2 5 L - C C K m i x t u r e i s s h o w n b y t h e n u m e r o u s p e a k s p r o d u c e d b y a t r y p t i c d i g e s t i o n o f t h i s f r a c t i o n ( F i g u r e 4 2 ) . i i ) N - c h 1 o r o s u c c i n i m i d e d i g e s t i o n D i g e s t i o n o f L - C C K w i t h N - c h l o r o s u c c i ni.mi d e u n d e r c o n d i t - . i o n s w h i c h r e s u l t e d i n c l e a v a g e o f E G I I I ( s e e R e s u l t s : S e c t i o n I I , D , 2 ) r e s u l t e d i n a n i n c o m p l e t e c l e a v a g e o f t h e p e p t i d e ( F i g u r e 4 3 ) . R e c h r o m a t o g r a p h y o f t h e c l e a v e d m i x t u r e a f t e r p u r i f i c a t i o n o n S e p h a d e x G - 2 5 r e v e a l e d t h a t t h e s i n g l e l a r g e p e a k p r e s e n t i n f i g u r e 4 3 ( p r e s u m a b l y u n c l e a v e d ' L - C C K ) h a d b e e n r e m o v e d ( F i g u r e 4 4 ) . D_. M o d i f i c a t i o n s o f G l P J_. C y a n o g e n B r o m i d e ( C N B r ) N o n - e n z y m a t i c c l e a v a g e o f G I P w i t h C N B r w a s p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d e l s e w h e r e ( S c h u b e r t , 1 9 7 4 ) . T h e r e s u l t i n g m i x t u r e w a s s u b j e c t e d t o c h r o m a t o g r a p h y o n c a r b o x y m e t h y l e e l 1 u l o s e ( C M 1 1 ) w i t h N H 4 H C 0 3 b u f f e r ( 0 . 0 1 M , p H 7 . 0 ; 0 . 0 1 M , p H 7 . 8 ; 0 . 2 M , p H 7 . 8 ) a n d t h e r e s u l t a n t s p e c t r o p h o t o m e t r i c p e a k s p o o l e d . T h e s e t h r e e p e a k s 1 4 3 a> u c (0 n o (0 £1 < 0 J \ / \ • I / \ / \ 0 10 30 50 Fract ion number F I G U R E 3 6 : E l u t i o n p r o f i l e o f a " p o s t - G 2 5 " f r a c t i o n B ( s e e F i g u r e 2 7 ) T h i s L - C C K - c o n t a i n i n g f r a c t i o n w a s e l u t e d f r o m a C M - S e p h a d e x C - 2 5 c o l u m n w i t h a 0 . 0 5 M + 0 . 2 M H N 4 H C 0 3 g r a d i e n t c o m m e n c i n g a t m i n u t e 1 5 . F r a c t i o n s 2 1 , 2 5 , 3 0 ( e n c i r c l e d ) w e r e s u b s e q u e n t l y a n a l y z e d v i a H P L C ( F i g u r e s 37 , 3 8 , 3 9 ) . 1 4 4 F I G U R E 3 7 : A n a l y s i s o f f r a c t i o n 21 f r o m f i g u r e 36 l O y g ( 1 2 8 u ' l ) o f f r a c t i o n 21 3 0 + 3 4 % C H 3 C N , 10 m i n . A b s o r b a n c e o f f r a c t i o n : 0 . 1 4 1 1 45 .004 Time (minutes) FIGURE 3 8 : A n a l y s i s o f f r a c t i o n 25 from f i g u r e lOyg ( 3 4 y 1 ) o f f r a c t i o n 2 5 30+34% CH 3 CN, 10 m i n . Absorbance o f f r a c t i o n : 0 . 5 3 0 1 46 FIGURE 39: A n a l y s i s o f f r a c t i o n 30 from f i g u r e 36 lOyg ( 65 .9y1 ) o f f r a c t i o n 30 30+34%, CH 3 CN, 10 m in . Absorbance o f f r a c t i o n : 0.273 147 Time (minutes) F I G U R E 4 0 : T r y p t i c d i g e s t o f L - C C K l O y g t r y p t i c d i g e s t 0 + 7 0 % C H 3 C N , 30 m i n . * t r y p t i c d i g e s t p e a k s b a c k g r o u n d p e a k s a l s o v i s i b l e i n F i g u r e 41 148 .012-1 Time (minutes) F I G U R E 4 1 : B a c k g r o u n d f o r f i g u r e s 40 a n d 42 l O y l H 2 0 0 + 7 0 % C H 3 C N , 30 m i n . 149 .012n CO 3 < CO o c to n < 15 Time (minutes) F I G U R E 4 2 : T r y p t i c d i g e s t o f L - C C K a f t e r G - 2 5 1 0 y g , L - C C K a f t e r G - 2 5 0+70% C H 3 C N , 30 m i n . 150 Time (minutes) F I G U R E 4 3 ; N - c h 1 o r o s u e c t n a m i d e d i g e s t o f L - C C K 1 O y g o f s a m p l e 0 + 7 0 % C H 3 C N , 30 m i n . A : a c e t i c a c i d / u r e a p e a k B : N- c h 1 o r o s u c c d . n a m i d e p e a k C: N - a c e t y l - L - m e t h i o n i n e p e a k 151 .008n Time (minutes) F I G U R E 4 4 : N - c h l o r o s u c c i . n a m i d e d i g e s t o f L - C C K a f t e r G - 2 5 . l O y g o f s a m p l e 0 + 7 0 % C H 3 C N , 30 m i n . * d e n o t e s b a c k g r o u n d p e a k 1 5 2 h a d p r e v i o u s l y b e e n i d e n t i f i e d a s c o n t a i n i n g , i n o r d e r o f e l u t i o n , N - t e r m i n a l G I P r e s i d u e s 1 - 1 4 , u n c l e a v e d G I P a n d C - t e r m i n a l G I P r e s i d u e s 1 5 - 4 3 ( S c h u b e r t , 1 9 7 4 ) . H P L C w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e p u r i t y o f t h e s e p a r a t e d c l e a v a g e p r o d u c t s . T h e C - t e r m i n a l f r a c -t i o n ( F i g u r e 4 5 ) d e m o n s t r a t e d 2 p e a k s , b o t h e l u t i n g e a r l i e r t h a n E G I I I ( F i g u r e 4 7 ) . T h i s w o u l d i n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f 2 c l e a v a g e p r o d u c t s o f l e s s h y d r o p h o b i c i t y t h a n E G I I I , a n d t h e r e f o r e p r o b a b l y o f s m a l l e r s i z e t h a n E G I I I . T h e N - t e r m i n a l f r a c t i o n ( F i g u r e 46) p o s s e s s e d a c l u s t e r o f p e a k s , o n e o f w h i c h w a s m u c h l a r g e r t h a n t h e r e s t , w h i c h e l u t e d e a r l i e r t h a n d i d t h e C - t e r m i n a l p e a k s . A n a p p r o x i m a t e l y e q u i v a l e n t s e t o f p e a k s e l u t e d a t t h e s a m e t i m e a s E G I I I , i n d i c a t i n g p r o b a b l y t h e p r e s e n c e o f u n c l e a v e d E G I I I . T h e C N B r - c l e a v a g e f r a g m e n t s d i d n o t a p p e a r t o b e o f h i g h p u r i t y w h e n a n a l y z e d b y H P L C . 2_. N - c h 1 o r o s u c c i n a m i d e (N CS ) P e a k s c a u s e d b y a c e t i c a c i d / u r e a , N - c h l o r o s u c c i n a m i d e a n d N - a c e t y l - m e t h i o n i n e w e r e i d e n t i f i e d b y i n j e c t i n g t h o s e s u b s t a n c e s i n t o t h e H P L C a p p a r a t u s u n d e r t h e c o n d i t i o n s t o b e u s e d i n a n a l y z i n g t h e p u r i t y o f t h e N C S - c l e a v e d G I P ( F i g u r e s 4 8 , 4 9 , 5 0 ) . T h e N C S -c l e a v e d G I P d e m o n s t r a t e d s e v e r a l s e t s o f p e a k s u n d e r H P L C a n a l y s i s ( F i g u r e 51 ) . 3_. P r o n a s e I n a n a t t e m p t t o m o n i t o r t h e c o m p l e t e n e s s o f t h e p r o n a s e -d i g e s t i o n p r o c e d u r e d e s c r i b e d i n t h e " m e t h o d s " ( S e c t i o n I , B , 2 ) s a m p l e s w e r e w i t h d r a w n f r o m t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e a n d a n a l y z e d b y 153 FIGURE 45:; I .004i FIGURE 4 6 : FIGURE 47 a Time (minutes) - F I G U R E 4 5 : C N B r - c l e a y e d G I P : C - t e r m i n a l f r a g m e n t TOyg , 20+35% CH 3 CN , 10 m i n . FIGURE 4 6 : C N B r - c l e a v e d G I P : N - t e r m i n a l f r a g m e n t l O y g , 20+35%, C H 3 C N , 10 m i n . FIGURE 4 7 : E G I I I 5 y g , 20+35%, C H - C N , 10 m i n . 1 54 .006-. Time (minutes) F I G U R E 4 8 : N C S - r e a g e n t s l O y l 3 0 % a c e t i c a c i d i n 5M u r e a 0 + 7 0 % C H 3 C N , 30 m i n . 1 5 5 Time (minutes) F I G U R E 4 9 : N C S - r e a g e n t s 1 0 y l 3 0 % a c e t i c a c i d i n 5M u r e a w i t h 2 . 8 8 mg/ml N - c h l o r o s u c c i n a m i d e 0 + 7 0 % C H 3 C N , 3 0 m i n . 1 56 .006 co LL z> < CD O C CO .Q i _ O CO .Q < 0 0 15 Time (minutes) F I G U R E 5 0 : N C S - r e a g e n t s l O y l 3 0% a c e t i c a c i d i n 5M u r e a w i t h 2 . 8 8 mg/ml N - c h l o r o s u c c i n a m i d e a n d e x c e s s N - a c e t y l m e t h i o n i n e 0->7 0% C H , C N , 30 m i n . 157 F I G U R E 51 ; N C S - c l e a v e d G I P 10ug-, 0->70% C H 3 C N , 30 m i n . A : u r e a / a c t i c a c i d B : N - c h 1 o r o s u c c i n am i d e C: N - a c e t y l m e t h i o n i n e 1 5 8 H P L C . A " b l a n k " ( F i g u r e 5 2 ) c o n t a i n i n g p r o n a s e a n d n o E G I I I r e v e a l -e d a n u m b e r o f p e a k s - p o s s i b l y d u e t o d i g e s t i o n o f t h e e n z y m e . Two l a r g e l a t e - e l u t i n g p e a k s p r o b a b l y c o r r e s p o n d e d t o t h e u n -c l e a v e d e n z y m e w h i c h w a s p r e s e n t i n m i l l i g r a m q u a n t i t i e s . Com-p a r i s o n o f t h i s t r a c e w i t h t h a t o f a n E G I I I - c o n t a i n i n g s a m p l e t a k e n a f t e r 1 0 s e c o n d s e x p o s u r e t o p r o n a s e ( F i g u r e 5 3 ) r e v e a l e d m a n y s m a l l a d d i t i o n a l p e a k s , i n d i c a t i n g t h a t a s u b s t a n t i a l , n e a r - i n s t a n t -a n e o u s c l e a v a g e o f E G I I I h a d o c c u r r e d . E x p o s u r e t o p r o n a s e f o r a n y l o n g e r p e r i o d s o f t i m e r e s u l t e d i n s u c h a h i g h d e g r e e o f h e t e r o -g e n e i t y t h a t - H P L C a n a l y s i s w a s i m p o s s i b l e . 4_. T r y p s i n H P L C a n a l y s i s o f t r y p s i n - d i g e s t e d G I P ( F i g u r e 5 4 ) r e v e a l e d f i v e m a j o r p e a k s a s w e l l a s s e v e r a l m i n o r p e a k s . 5_. S t o r a g e d e g r a d a t i o n E G I I I , s t o r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e a t a c o n c e n t r a t i o n o f l y g / y l i n h i g h l y p u r i f i e d , s t e r i l e H^O i n a p l a s t i c 1ml m i c r o - t e s t -t u b e w a s d e g r a d e d i n t o s m a l l e r p e p t i d e s . A f t e r t h r e e d a y s ( F i g u r e 5 5 ) a n u m b e r o f e a r l y a n d l a t e e l u t i n g m i n o r p e a k s w e r e o b s e r v e d i n a d d i t i o n t o t h e E G I I I p e a k . A f t e r o n e w e e k ( F i g u r e 5 6 ) , n o i n t a c t E G I I I w a s o b s e r v e d , w h i l e t h e s i z e o f t h e e a r l y p e a k s h a d i n c r e a s e d s u b s t a n t i a l l y . A d d i t i o n a l l y , l a r g e v o i d v o l u m e p e a k s h a d a p p e a r e d , i n d i c a t i n g t h e f o r m a t i o n o f h y d r o p h i l i c d e g r a d a t i o n p r o d u c t s - p r o b a b l y s m a l l f r a g m e n t s o r a m i n o a c i d s . 1 59 F I G U R E 5 2 : P r o n a s e b l a n k : 10 s e c o n d s a f t e r p r o n a s e a d d i t i o n 5 0 y l , 0 + 7 0 % CH--.CN , 30 m i n . 1 6 0 F I G U R E 5 3 : E G I I I ; 1 0 s e c o n d s a f t e r p r o n a s e a d d i t i o n 5 0 y l ( 5 y g ) , 0->70% C H j C N , 3 0 m i n . * d e n o t e s p e a k s n o t p r e s e n t i n F i g u r e 52 161 F I G U R E 5 4 : T r y p s i n - c l e a v e d G I P T O y g , 0 + 7 0 % C H 3 C N , 30 mi n . * d e n o t e s m a j o r t r y p t i c p e p t i d e s 1 6 2 i .016-, j Time (minutes) F I G U R E 5 5 : S t o r a g e - d e g r a d e d E G I I I a f t e r 3 d a y s 1 O y g , 0 + 7 0 % C H 3 C N , 30 m i n . * d e n o t e s b a c k g r o u n d p e a k 163 Time (minutes) FIGURE 56 : S t o r a g e - d e g r a d e d E G I I I a f t e r one week l O y g , 0+70% CHgCN, 30 m i n . * d e n o t e s b a c k g r o u n d peak 1 64 E . I o d i n a t e d G I P C o m p o n e n t s 1 . E l u t i o n c h a r a c t e r i s t i e s 1 2 7 a ) C o m p a r i s o n o f E G I I I ( F i g u r e 57) w i t h I - E G111 ( F i g u r e 5 8 ) r e v e a l e d t h a t i o d i n a t i o n p r o d u c e d a s e t o f a t l e a s t 2 c o m -p o n e n t s , b o t h e l u t i n g s l i g h t l y b e f o r e E G I I I . An e a r l y l a r g e p e a k 1 2 7 i n t h e I - E G111 m i x t u r e w a s i d e n t i f i e d a s c h l o r a m i n e - T b y c o m -p a r i n g t h i s t r a c e w i t h t h a t p r o d u c e d b y a n e q u i v a l e n t a m o u n t o f c h l o r a m i n e - T ( F i g u r e 5 9 ) . A p r e l i m i n a r y a t t e m p t t o i d e n t i f y t h e 12 7 12 7 I - E G111 c o m p o n e n t s w a s m a d e b y c o m p a r i n g t h e I - E G111 p e a k s w i t h t h o s e o b t a i n e d f r o m m i x t u r e s w h e r e t h e r e a c t i o n i n g r e d i e n t s h a d b e e n a l t e r e d . A n o x i d i z e d , n o n - i o d i n a t e d E G I I I ( o x - E G I I I ) 1 27 c o m p o u n d w a s o b t a i n e d b y r e p l a c i n g t h e Na I w i t h p h o s p h a t e b u f -f e r . H P L C a n a l y s i s o f t h i s m i x t u r e ( F i g u r e 6 0 ) r e v e a l e d a g r e a t l y 1 2 7 e n l a r g e d f i r s t p e a k a n d r e d u c e d s e c o n d p e a k w h e n c o m p a r e d t o I -E G I I I ( F i g u r e 5 8 ) . On t h i s b a s i s t h e f i r s t 1 2 7 I - E G I I I p e a k w a s t e n t a t i v e l y i d e n t i f i e d a s a n o x - E G I I I peako A c o n t r o l m i x t u r e w a s a n a l y z e d w h e r e t h e o x i d i z i n g ( C T ) a n d r e d u c i n g ( N a M e t ) a g e n t s w e r e a d d e d i n r e v e r s e d o r d e r , s o t h a t n e i t h e r o x i d a t i o n n o r i o d i n a t i o n o f t h e m o l e c u l e w e r e p o s s i b l e ( F i g u r e 6 1 ) . T h e s h a p e o f t h e p r o t e i n p e a k d i d n o t d i f f e r s u b s t a n t i a l l y f r o m t h a t o f E G I I I . T h e s e m i x t u r e s w e r e s u b s e q u e n t l y a n a l y z e d o n a g r a d i e n t s y s t e m g i v i n g b e t t e r r e s o l u t i o n o f t h e c o m p o n e n t p e a k s . A g a i n , 12 7 I - E G I I I , ( F i g u r e 6 2 ) d e m o n s t r a t e d a s e t o f a t l e a s t t w o c o m -p o n e n t s , t h e f i r s t e l u t i n g p r i o r t o E G I I I ( F i g u r e 6 3 ) . 1 6 5 Time (minutes) F I G U R E 5 7 : E G I I I 2 y g , 0 + 7 0 % C H 3 C N , 2 0 m i n . f l o w r a t e : 2 . 5 m l / m i . n . 1 66 Time (minutes) FIGURE 58: ' " ' i - E G I I I 2yg, 0+70% CH 3 CN, 20 m in . Flow r a t e 2.5 m l /m in . a:-: c h l o r a m i n e - T b: 1 2 7 I - E G I I I peaks 1 6 7 j Time (minutes) F I G U R E 5 9 : C h l o r a m i n e - T l O y l i o d i n a t i o n m i x t u r e , 0 + 7 0 % C H 3 C N , 2 0 m i n . F l o w r a t e 2 . 5 m l / m i n . 1 6 8 Time (minutes) ' . i F I G U R E 6 0 : O x i d i z e d , n o n - i o d i n a t e d E G I I I 2 p g , 0+7 0% C H 3 C N , 2 0 m i n . F l o w r a t e 2 . 5 m l / m i n . a : c h l o r a m i n e - T b : o x E G I I I p e a k s 169 I Time (minutes) FIGURE 61 : EGIII with reversed-order o x i d i z i n g and reducing agents 2yg, 0+70% CH 3CN, 20 min. Flow rate 2.5 ml/min. a: chloramine-T b: EGIII peaks 1 7 0 0 13 26 Time (minutes) F I G U R E 6 2 : 1 2 7 I - E G I I I 2 y g , 0->50% C H 3 C N , 2 0 m i n . F l o w r a t e 2 . 5 m l / m i n . a : c h l o r a m i n e - T 1 2 7 b : I - E G I I I c o m p o n e n t s 171 Time (minutes) F I G U R E 6 3 : E G I I I 5 y g , 0+50% CH^CN , 20 mi n . F l o w r a t e 2 .5 m l / m i n . 1 72 T h e e f f e c t o f l o n g e r e x p o s u r e s t o t h e o x i d i z i n g a g e n t w a s m o n i t o r e d i n t h e a b s e n c e o f i o d i n e . I n c r e a s i n g t h e o x i d a t i o n t i m e f r o m z e r o ( i . e . f r o m E G I I I ) t o 4 5 s e c o n d s b y 15 s e c o n d i n t e r v a l s ( F i g u r e s 6 4 , 6 5 , 6 6 ) p r o g r e s s i v e l y d e c r e a s e d t h e s i z e o f t h e s e c o n d o x - E G I I I p e a k r e l a t i v e t o t h e f i r s t p e a k . E l u t i o n o f t h i s f i r s t p e a k w a s a d v a n c e d b y a l m o s t 1 m i n u t e w h e n t h e E G I I I a n d t h e 4 5 s e c o n d o x - E G I I I t r a c e s w e r e c o m p a r e d ( F i g u r e s 6 3 , 6 6 ) . 2_. I d e n t i f i c a t i o n o f c o m p o n e n t s A g r a d i e n t s y s t e m ( 2 6 3 5 % C H 3 C H , 10 m i n u t e s ) w a s f o u n d w h i c h w a s c a p a b l e o f r e s o l v i n g t h e t w o s e t s o f p e a k s 12 7 p r e s e n t i n t h e I - E G111 i o d i n a t i o n m i x t u r e . I d e n t i f i c a t i o n o f 12 7 p e a k s c o r r e s p o n d i n g t o I - E G I I I , o x - E G I I I a n d E G I I I w e r e i d e n t i f i e d t h r o u g h H P L C a n a l y s i s o f s a m p l e s c o n t a i n i n g m i x t u r e s o f t h e s e c o m p o n e n t s a n d c o m p a r i n g e l u t i o n t i m e s a n d p r o f i l e s w i t h t h o s e o b t a i n e d f r o m t h e s e c o m p o n e n t s s i n g l y . E G I I I ( F i g u r e 6 7 ) d e m o n s t r a t e d t h e u s u a l p r o f i l e o f t w o m a j o r p e a k s p r e c e d e d b y m i n o r c o n t a m i n a t i o n . T h e e l u t i o n t i m e o f 1 2 7 t h e m a j o r GIP-| 4 2 P e a k 1'n t h i s s y s t e m w a s 1 4 . 5 m i n u t e s . I - E G111 ( F i g u r e 6 8 ) , i n a d d i t i o n t o a v o i d v o l u m e c h l o r a m i n e - T p e a k , d e m o n -s t r a t e d a l a r g e p e a k w i t h a s h o u l d e r ( i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f a t l e a s t t w o c o m p o n e n t s ) w h i c h e l u t e d a f t e r a p p r o x i m a t e l y 12 m i n -u t e s , 55 s e c o n d s . A s e c o n d s m a l l e r c l u s t e r o f a t l e a s t 4 p e a k s w a s o b s e r v e d , t h e l a r g e s t o f t h e s e e l u t i n g 1 4 m i n u t e s a n d 4 0 s e c -1 27 o n d s a f t e r i n j e c t i o n . T h e e a r l y - e l u t i n g l a r g e p e a k i n t h e I -E G I I I m i x t u r e e l u t e d a t a t i m e c o m p a r a b l e t o t h a t o f t h e l a r g e e a r l y - e l u t i n g p e a k i n t h e o x - E G I I I m i x t u r e ( F i g u r e 6 9 ) . T h i s m i x -1 7 3 13 Time (minutes) 26 F I G U R E 6 4 : o x - E G I I I : 1 5 s e c o n d s e x p o s u r e 2 y g , 0 + 5 0 % C H g C N , 2 0 m i n F l o w r a t e 2 . 5 m l / m i n . a : c h l o r a m i n e - T b : o x - E G I I I c o m p o n e n t s 1 74 Time (minutes) FIGURE 6 5 : o x - E G I I I : 30 s e c o n d s e x p o s u r e 2 p g , 0+50% C H 3 C N , 20 m i n . 2 .5 m l /m i n . •a: c h l o r a m i n e - T b: o x - E G I I I c o m p o n e n t s 175 O-L-r- 1 . , 0 13 26 Time (minutes) F I G U R E 6 6 : o x - E G I I I 45 s e c o n d e x p o s u r e 2 y g , 0+50% C H 3 C N , 20 m i n . F l o w r a t e : 2 .5 m l / m i n . a : c h l o r a m i n e - T b : o x - E G I I I c o m p o n e n t s 1 7 6 006n Time (minutes) F I G U R E 6 7 : E G I I I 5 y g , 2 6 + 3 5% C H ^ G N , 1 0 m i n . F l o w r a t e 2 . 5 n i i l / m i n . 3 1 77 | Time (minutes) F I G U R E 6 8 : I - E G I I I l O y g , 2 6 + 3 5 % C H ^ C N F I o w r a t e : 2 . 5 m l / m i n . A : c h l o r a m i n e - T B : l a r g e t w o c o m p o n e n t p e a k C : s m a l l c l u s t e r p e a k s 1 7 8 .004n CO L L CD o c CO _ o i _ o CO < 0 0 Time (minutes) — i 16 F I G U R E 6 9 : o x - E G I I I l O y g , 2 6 + 3 5 % CHg.CN, 10 m i n F l o w r a t e 2 . 5 m l / m i n . c h l o r a m i n e - T l a r g e t w o - c o m p o n e n t p e a k s m a l 1 c l u s t e r p e a k s 1 7 9 t u r e a l s o c o n t a i n e d a s e c o n d s m a l l s e t o f p e a k s e l u t i n g n e a r t h e 14 m i n u t e , 4 0 s e c o n d s m a r k . T h e s e p e a k s w e r e s m a l l e r t h a n t h o s e 1 2 7 o b t a i n e d i n t h e I - E G I I I a n a l y s i s . a ) I d e n t i f i c a t i o n o f o x - E G I I I p e a k 1 2 7 T h e l a r g e , e a r l y - e l u t i n g p e a k o f t h e I - E G I I I a n d o x -E G I I I m i x t u r e s w a s s h o w n t o e l u t e d i f f e r e n t l y t h a n E G I I I a n d t o b e i n d i s t i n g u i s h a b l e b e t w e e n t h e 2 m i x t u r e s : H P L C a n a l y s i s o f a m i x t u r e o f o x - E G I I I a n d E G I I I ( F i g u r e 7 0 ) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e t w o d i f f e r e n t c o m p o n e n t s c o u l d b e r e s o l v -e d b y t h e g r a d i e n t s y s t e m u s e d . A c o m b i n a t i o n o f t h e o x - E G I I I a n d 12 7 I - E G I I I m i x t u r e s ( F i g u r e 7 1 ) g r e a t l y i n c r e a s e d ' t h e s i z e o f t h e f i r s t p e a k w h i c h w a s i n d i s t i n g u i s h a b l e i n f o r m o r e l u t i o n t i m e 1 2 7 f r o m t h e e a r l y - e l u t i n g p e a k i n e i t h e r t h e o x - E G I I I o r t h e I -E G I I I p e a k s . T h i s p e a k w a s t h e r e f o r e p r e s e n t a s a r e s u l t o f ox-i d a t i o n o f E G I I I , d i d n o t c o n t a i n u n - o x i d i z e d E G I I I a n d w a s o n e 1 2 7 c o m p o n e n t o f t h e I - E G I I I m i x t u r e . b ) I d e n t i f i c a t i o n o f i o d i n a t e d E G I I I T r a c e i o d i n a t i o n ( c . 80 , 0 0 0 c p m ) o f l O u g ' E G I I I w a s p e r f o r m e d . H P L C a n a l y s i s ( 2 6 -> 3 5 % C H ^ C N , 10 m i n u t e s ) w i t h s i m u l t a n e o u s c o l l e c t i o n o f e f f l u e n t a l l o w e d c o r r e l a t i o n o f s p e c t r o p h o t o m e t r i c a n d r a d i o i s o t o p i c m e a s u r e m e n t o f H P L C s e p a r a t i o n o f • ^ ^ " ' ^ I - E G I I I c o m p o n e n t s . A n a l y s i s o f t h e r e s u l t s ( F i g u r e 7 2 ) s h o w e d a s i n g l e n a r r o w i n c r e a s e i n e f f l u e n t r a d i o a c t i v i t y i n t h e v o i d v o l u m e , 1 2 5 p r o b a b l y c o r r e s p o n d i n g t o f r e e , u n i n c o r p o r a t e d I . A l a r g e i n -c r e a s e i n e f f l u e n t r a d i o a c t i v i t y b e g a n a f t e r 11 m i n u t e s , a t a t i m e w h e n t h e o x - E G I I I p e a k h a d a l r e a d y r e a c h e d i t s h i g h e s t l e v e l . 180 FIGURE 7 0 : ox-EGI I I and E G I I I l O y g o x - E G I I I + l O y g E G I I I , 26+35% C H 3 C N , 10 m i n . F l ow r a t e : 2 .5 m l / m i n . a : c h l o r a m i n e - T b: o x - E G I I I : l a r g e two componen t peak c: E G I I I peak s 181 .OO&i CO LL CD O c CO n v. o CO . o < 0-J B O" 16 Time (minutes) F I G U R E 7 1 : o x - E G I I I a n d 1 2 7 I - E G 1 1 1 1 2 7 . l O y g o x - E G I I I + l O y g I - E G I I I , 2 6 + 3 5 % C H 3 C N , 10 m i n F l o w r a t e 2 . 5 m l / m i n . c h l o r a m i n e - T l a r g e t w o c o m p o n e n t p e a k ( o x i d i z e d E G I I I ) s m a l l c l u s t e r o f p e a k s 1 8 2 Time (minutes) F I G U R E 7 2 : 1 2 5 / 1 2 7 1 - E G 1 1 1 l O y g ( 8 0 , 3 9 0 c p m ) o f s a m p l e F l o w r a t e : 2 . 5 m l / m i n 2 6 + 3 5 % CH' C N , 10 m i n ; t h e n a n e i g h t m i n u t e d e l a y f o l l o w e d 5 y 3 5 + 9 0 % C H 3 C N , 1 m i n . E f f l u e n t r a d i o a c t i v i t y p e r 30 s e c o n d f r a c t i o n ( s h a d e d a r e a ) i s s u p e r i m p o s e d o n a b s o r b a n c e . S e e d e s c r i p t i o n i n t e x t ( R e s u l t s : S e c t i o n I I , E , 2 , b ) . 1 8 3 T h i s r a d i o a c t i v i t y r e a c h e d p e a k v a l u e a p p r o x i m a t e l y f i f t e e n m i n u t e s a f t e r s a m p l e i n j e c t i o n , c o r r e s p o n d i n g e x a c t l y t o t h e p e a k a b s o r b -1 2 7 a n c e o f t h e s e c o n d s e t o f c o m p o n e n t s o f t h e I - E G I I I m i x t u r e . R a d i o a c t i v i t y l e v e l s i n t h e e f f l u e n t d i d n o t d e c l i n e s m o o t h l y a f t e r t h i s p o i n t , s u g g e s t i n g t h e p r e s e n c e o f s e c o n d a r y s m a l l p e a k s p r e -s e n t b e l o w t h e l e v e l o f r e s o l u t i o n - p o s s i b l y c o r r e s p o n d i n g t o t h e s m a l l a b s o r p t i o n p e a k s p r e s e n t a t t h i s t i m e . A t t h e e n d o f t h e g r a d i e n t , a f t e r 8 m i n u t e s o f t h e f i n a l g r a d i e n t a c e t o n i t r i l e c o n -c e n t r a t i o n (35%), t h e a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n w a s r a p i d l y r a i s e d t o 9 0 % . T h e r a d i o a c t i v i t y i n t h e e f f l u e n t , w h i c h h a d d e c l i n e d t o z e r o , r o s e a g a i n b r i e f l y - i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f a s m a l l a m o u n t o f u n i d e n t i f i e d m a t e r i a l m o r e h y d r o p h o b i c t h a n ^ ^ ^ ^ I - E G I I I . c ) O t h e r a s p e c t s T h e b i p h a s i c n a t u r e o f t h e o x - E G I I I p e a k w a s a t t r i b u t a b l e t o t h e d i f f e r e n t e l u t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e o x i d i z e d G I P ^ ^ a n d o x i d i z e d GIP-j ^ c o n t a i n e d i n t h e m i x t u r e , s i n c e a n o x i d i z e d p u r e G I P -| ^ m i x t u r e p r o d u c e d a s i n g l e o x i d i z e d p e a k ( F i g u r e 7 3 ) 1 2 7 e l u t i n g a t t h e s a m e t i m e a s t h e l a r g e o x - E G I I I p e a k o f I - E G I I I ( F i g u r e 7 4 ) . T h e i d e n t i t y o f t h e s m a l l c l u s t e r o f p e a k s e l u t i n g a f t e r G I P ^ ^ w a s u n k n o w n . C o m p a r i s o n o f E G I I I ( F i g u r e 7 5 ) w i t h t h e o x - G I P - | _ 4 2 p r o f i l e ( F i g u r e 7 3 ) r e v e a l e d t h a t E G I I I d i d n o t s h a r e a c o m m o n e l u t i o n t i m e o r p r o f i l e w i t h t h e s e s m a l l p e a k s , s u g g e s t i n g t h a t t h e s m a l l p e a k s d i d n o t r e p r e s e n t u n o x i d i z e d E G I I I , b u t r a t h e r p r o d u c t s d i f f e r i n g f r o m t h e m a j o r o x i d i z e d -GIP-j 4 2 p r o d u c t . FIGURE 73 : o x i d i z e d GI P -j _ 4 2 lOyg , 26+35% CH3'CN , 10 min . F low r a t e : 2.5 m l / m i n . a : c h l o r a m i n e - T b : s i n g l e - c o m p o n e n t o x i d i z e d GIP-j ^ peak c : s m a l l c l u s t e r o f component s 185 FIGURE 74: ' I - EG I 11 l O y g , 26+35% CH 3 CN, 10 m i n . Flow r a t e 2.5 m1/min . A: c h l o r a m i n e - T B: ox -EG I I I peaks C: 1 2 7 I - E G I I I peaks .008 1 8 6 i Time (minutes) F I G U R E 7 5 : E G I I I l O y g , 2 6 + 3 5 % G H ^ C N , 1 0 m i n . F l o w r a t e 2 . 5 m l / m i n . 1 87 3_. P u r i f i c a t i o n o f c o m p o n e n t s a) P u r i f i c a t i o n s y s t e m A t w o - s t a g e i s o c r a t i c s o l v e n t s y s t e m was u s e d t o s e p a r a t e 1 27 and p u r i f y t h e o x - E G I I I and I -E G111 c o m p o n e n t s o f t h e i o d i n a t e d E G I I I m i x t u r e . The s y s t e m u t i l i z e d a 30% CH^CN i s o c r a t i c f l o w f o r 11 m i n u t e s , f o l l o w e d by a r a p i d (1 m i n u t e ) c h a n g e t o 32% CHgCN. 12 5/127 Figure 75B. r e v e a l s t h a t c h l o r a m i n e - T , ' I and o x - E G I I I we re e l u t e d a t 30% C H 3 C N , w h i l e t h e 1 a t e r - e l u t i n g 1 2 5 / 1 2 7 I - E G I 1 1 was e l u t e d d u r i n g t h e r i s e i n a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n f r o m 30% t o 3 2 % . A s u b s e q u e n t i n c r e a s e i n CH^CN c o n c e n t r a t i o n t o 72% o v e r 1 m i n u t e c a u s e d a s h o r t r i s e i n e f f l u e n t r a d i o a c t i v i t y . b) P u r i f i c a t i o n f o r b i o a s s a y 1 2 7 U s i n g t h e t w o - s t a g e i s o c r a t i c s y s t e m , 2 5 0 y g o f a I -i o d i n a t i o n m i x t u r e was s e p a r a t e d i n t o " o x i d i z e d " and " i o d i n a t e d " f r a c t i o n s ( F i g u r e 7 6 ) . T h e s e f r a c t i o n s r e p r e s e n t e d a l m o s t e q u i v -a l e n t i n t e g r a t e d a r e a s u n d e r t h e a b s o r b a n c e c u r v e when c o m p a r e d t o t h e b a s e l i n e ( F i g u r e 7 7 ) . T h i s i n d i c a t e d a h i g h e r d e g r e e o f 1 2 7 i n c o r p o r a t i o n o f I i n t o t h e m o l e c u l e s when i o d i n a t i o n r e a g e n t s we re u s e d i n t h e amoun t s and c o n c e n t r a t i o n s n e e d e d t o o b t a i n t h e r e l a t i v e l y l a r g e q u a n t i t y o f p e p t i d e r e q u i r e d f o r p u r i f i c a t i o n ( s e e M e t h o d s : S e c t i o n I I , B ) . R e s u l t s o f t h e i n s u l i n o t r o p i c a c t i v -i t y o f t h e two f r a c t i o n s a r e shown i n R e s u l t s : S e c t i o n I , A , 2 , d . 12 5/127 c ) P u r i f i c a t i o n o f I -E G111 f o r a n a l y s i s o f i o d i n a t i o n s t a t e 1 2 5/127 To d e t e r m i n e w h e t h e r t h e c l u s t e r o f I - E G111 peak s r e p r e s e n t e d d i f f e r e n t i o d i n a t i o n s t a t e s o f t h e E G I I I m o l e c u l e an 1 88 CO Li. < CO o c CO o CO < .008i 20 Time (minutes) ab FIGURE 7 5B 12 5/127 Two s tage i s o c r a t i c s e p a r a t i o n of ' I -EGI I I components 1 0 u g , 32% CH 3CN f o r 11 m i n . ; then 32+34% CH 3CN f o r 1 m i n . ; then 34% CH 3CN f o r 14 m i n . ; then 34+72% CH 3CN f o r 1 m i n . Flow r a t e : 2.5 m l/min . R a d i o a c t i v i t y i n the f r a c t i o n a t e d e f f l u e n t i s super imposed on absorbance (shaded a r e a ) . a: c h l o r a m i n e - T b: ox -EG I I I c : 1 2 5 / 1 2 7 I - E G I I I 12 5/127 b a s e l i n e beneath 1 I -EGI I I peak, e s t i m a t e d by s u p e r i m p o s i n g a p r e v i o u s b a s e l i n e t r a c e . 1 8 9 F I G U R E 7 6 : • P u r i f i c a t i o n o f ' ' " ' I - E G I I I c o m p o n e n t s 2 5 0 y g ; g r a d i e n t s y s t e m a s F i g u r e 75b a: c h l o r a m i n e - T b: e f f l u e n t p o o l e d f o r " o x i d i z e d E G I I I " p e a k c. : e f f l u e n t p o o l e d f o r " i o d i n a t e d E G I I I " p e a k 190 LL CD O C CO _Q o 5 o-< o 10 20 Time (minutes) F I G U R E 77: B a s e l i n e f o r F i g u r e 7 6 l O O y l H ? 0 ; g r a d i e n t s y s t e m a s F i g u r e 75b, -no c h l o r a m T n e ' T p r e s e n t 191 12 5 / 1 2 7 H P L C - r e s o l v e d s a m p l e o f I - E G I 11 w a s c o l l e c t e d i n 0.5 m i n u t e f r a c t i o n s ( F i g u r e 7 8 ) . S e v e r a l o f t h e f r a c t i o n s w e r e s a v e d a n d l a t e r s u b j e c t e d t o p r o n a s e d i g e s t i o n a n d a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y t o d e t e r m i n e m o n o - a n d d i - i o d o t y r o s i n e c o n t e n t ( s e e R e s u l t s : S e c t i o n I V , A ) . d ) P u r i f i c a t i o n f o r u s e i n b i n d i n g e x p e r i m e n t s T h e i o d i n a t i o n m i x t u r e a l i q u o t s t o be p u r i f i e d b y H P L C f o r u s e i n b i n d i n g e x p e r i m e n t s ( s e e M e t h o d s : S e c t i o n I I , A , 3 ) c o n t a i n e d t o o l i t t l e p r o t e i n t o m a k e s p e c t r o p h o t o m e t r y d e t e c t i o n o f t h e r e s o l v e d c o m p o n e n t s p o s s i b l e , I n s t e a d i t w a s n e c e s s a r y t o c o m p a r e 1 2 5 t h e r a d i o a c t i v e p r o f i l e s o b t a i n e d f r o m t h e I - c o n t a i n i n g a l i q u o t p u r i f i c a t i o n s w i t h t h o s e o f a t r a c e - i o d i n a t e d E G I I I p r e p a r a t i o n w h i c h h a d b e e n a n a l y z e d b o t h s p e c t r o p h o t o m e t r i c a 1 1 y a n d t h r o u g h m e a s u r e m e n t o f e l u a t e r a d i o a c t i v i t y a n d w h i c h w a s r u n j u s t p r e v i o u s -l y t o t h e a l i q u o t p u r i f i c a t i o n s . 12 5 / 1 2 7 F i g u r e 79 s h o w s a I - i o d i n a t i o n w i t h g o o d r e s o l u t i o n • i n t e r m s o f b o t h a b s o r b a n c e a n d r a d i o a c t i v i t y o f t h e ^ 2 ^ ^ 2 7 I - E G I I I 1 2 5 p e a k s . F i g u r e 80 s h o w s t h e r a d i o a c t i v e e l u t i o n p r o f i l e s o f 3 I -E G I I I c o n t a i n i n g a l i q u o t s o n a n H P L C s y s t e m i d e n t i c a l a n d r u n j u s t s u b s e q u e n t t o t h a t u s e d i n F i g u r e 7 9 . R e s o l u t i o n o f t h e r a d i o a c t i v e p e a k s w a s n o t a s s h a r p a s i n F i g u r e 7 9 , b u t t h e o v e r a l l t i m i n g a n d s h a p e o f t h e r a d i o a c t i v e e l u t i o n p r o f i l e s w a s s i m i l a r . A l l t h e f r a c t i o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h e v a r i o u s i o d i n a t e d p e a k s w e r e p o o l e d f o r u s e i n b i n d i n g e x p e r i m e n t s . 1 9 2 Time (minutes) F I G U R E 7 8 : 1 2 5 ^ 1 2 7 1 - E G 1 1 1 p u r i f i c a t i o n f o r a n a l y s i s o f i o d i n a t i o n s t a t e l O y g , 3 2 + 4 0 % C H 3 C N , 9 rain.; 4 0 % C H 3 C N i s o e r a t i c f o r 2 m i n . ; 4 0 + 7 0 % C H ^ C N , 1 m i n . c h l o r a m i n e - T o x - E G I I I 1 2 5 / 1 2 7 . I - E G I I I E f f l u e n t r a d i o a c t i v i t y ( s h a d e d a r e a ) i s s u p e r i m p o s e d o n a b s o r b a n c e . F r a c t i o n s a , b , a n d c w e r e s u b s e q u e n t l y s u b j e c t e d t o p r o t e o l y s i s a n d a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y . ( R e s u l t s S e c t i o n V , A , 2 ) . 1 9 3 F I G U R E 7 9 : I - E G I I I c o m p o n e n t s l O y g , 3 2 + 4 0 % C H g C N , 9 m i n . ; t h e n 4 m i n u t e s a t 4 0 % C H g C N ; t h e n 4 0 + 9 0 % C H , C N , 1 m i n . I 3 E f f l u e n t r a d i o a c t i v i t y ( s h a d e d a r e a ) i s s u p e r i m p o s e d o n a b s o r b a n c e . 1 94 F I G U R E 8 0 : , t y I - E G I I I : r a d i o a c t i v e e l u t i o n p r o f i l e s 1 2 5 H P L C s e p a r a t i o n o f t h r e e I - E G I I I , a l i q u o t s , e a c h c o n t a i n i n g a p p r o x i m a t e l y 2 x 1 0 c p m i n 2 0 y l . G r a d i e n t c o n d i t i o n s i d e n t i c a l t o t h o s e o f F i g u r e 7 9 . F r a c t i o n s w e r e p o o l e d b e t w e e n s l a s h m a r k s . 1 9 5 I I I . L i p o p r o t e i n L i p a s e S t u d i e s L i p o p r o t e i n l i p a s e - l i k e a c t i v i t y ( L P L A ) w a s m e a s u r e d i n r e -s p o n s e t o G I P ( E G I I I ) i n p o w d e r s f r o m a c e t o n e - e t h e r e x t r a c t s o f r a t a d i p o c y t e s a n d i n h e p a r i n - e l u t a b l e f o r m f r o m t h e m e d i u m s u r r o u n d i n g i n t a c t r a t a d i p o c y t e s ( s e e M e t h o d s , S e c t i o n : I V , B , 3 ) . F i g u r e s 81 a n d 82 s h o w t h e e f f e c t s o f G I P o n r a t a d i p o s e t i s s u e L P L A i n t h e a b s e n c e a n d p r e s e n c e o f I m U / m l p o r c i n e i n s u l i n . A d o s e - d e p e n d e n t i n c r e a s e i n b o t h h e p a r i n - e l u t a b l e a n d a c e t o n e - e t h e r p o w d e r L P L A w a s o b s e r v e d i n b o t h s i t u a t i o n s . I n t h e p r e s e n c e o f i n s u l i n ( F i g -u r e 8 1 , T a b l e 1 7 ) , a s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) e l e v a t i o n o f L P L A w a s o b s e r v e d i n t h e a c e t o n e - e t h e r p o w d e r s i n r e s p o n s e t o 2 5 n g / m l G I P , a n d i n t h e h e p a r i n e l u a t e s i n r e s p o n s e t o 5 0 n g / m l G I P . M a x i m a l L P L A e l e v a t i o n o c c u r r e d w i t h 2 0 0 n g / m l G I P , w i t h a s u b s e q u e n t r e -d u c t i o n o f L P L A r e s u l t i n g a s t h e G I P d o s e w a s i n c r e a s e d t o 1 2 0 0 n g / m l . A q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r p r o f i l e o f a n i n c r e a s e d L P L A r e s p o n s e t o G I P w a s o b s e r v e d i n t h e a b s e n c e o f i n s u l i n ( F i g u r e 8 2 , T a b l e 1 8 ) w h e r e a s i g n i f i c a n t e l e v a t i o n o f L P L A o c c u r r e d w i t h 5 0 n g / m l G I P , a m a x i m a l r e s p o n s e w i t h 2 0 0 n g / m l , a n d a l o s s o f s i g -n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) w i t h 1 2 0 0 n g / m l G I P . T h e d i f f e r e n c e s i n L P L A f o r a g i v e n d o s e o f G I P b e t w e e n s a m p l e s i n c u b a t e d i n t h e p r e s e n c e o f i n s u l i n a n d i n t h e a b s e n c e o f i n s u l i n a r e s h o w n i n T a b l e 1 9 . T h i s " A L P L A " w a s e s s e n t i a l l y c o n s t a n t a m o n g t h e e l u a t e s a n d a m o n g t h e a c e t o n e - e t h e r p o w d e r s f o r G I P d o s e s b e t w e e n 5 0 n g / m l a n d 1 2 0 0 n g / m l . A L P L A v a l u e s w e r e s o m e -w h a t l o w e r t h a n t h e s e c o n s t a n t v a l u e s i n t h o s e s a m p l e s c o n t a i n i n g n o G I P . 1 9 6 F I G U R E 8 1 : E f f e c t o f G I P o n L P L A i n t h e p r e s e n c e o f I m U / m l i n s u l i n ( S e e T a b l e 1 7 ) o p e n c i r c l e s : h e p a r i n - e l u t a b l e L P L A ( n = 5 t o 1 2 ) c l o s e d c i r c l e s : a c e t o n e - e t h e r p o w d e r L P L A ( n = 5 t o 1 2 ) p o i n t s r e p r e s e n t m e a n + S E M * d e n o t e s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r ( p < : 0 . 0 5 ) L P L A t h a n t h a t o b t a i n e d w i t h O n g / m l G I P 1 97 T a b l e 17: E f f e c t o f GIP on LPLA i n t h e a b s e n c e o f i n s u l i n Column A : dose o f GIP g i v e n ( n g / m l ) Column B: x ± SEM LPLA ( y m o l e s F F A / h / 1 0 6 c e l 1 s ) ' (n = 5) * d e n o t e s s i g n i f i c a n t i n c r e a s e (p<0 .05 ) o v e r Ong/ml GIP s a m p l e s T-93 TABLE 1 7 A. B • El uates 0 5.41 + 0.59 50 7.12 + 0.39 * 200 8.66 + 0.71 * 600 8.81 + 0.94 * 1 200 6.62 + 1 .24 Powders 0 12.54 + 0. 80 50 1 5.96 + 1.15 * 200 17.51 + 2.07 * 600 1 6.60 + 2.03 * 1200 1 4.40 + 2.18 F I G U R E 8 2 : E f f e c t o f G I P o n L P L A i n t h e a b s e n c e o f i n s u l i n ( S e e T a b l e 1 8 ) o p e n c i r c l e s : ' h e p a r i n - e l u t a b l e L P L A ( n = 5 ) c l o s e d • c i r c l e s : a c e t o n e - e t h e r p o w d e r L P L A ( n = 5 ) p o i n t s r e p r e s e n t m e a n ± S E M * d e n o t e s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r ( p < 0 . 0 5 ) ; L P L A t h a n t h a t o b t a i n e d w i t h O n g / m l G I P 2 0 0 T a b l e 1 8 : E f f e c t o f G I P o n L P L A i n t h e p r e s e n c e o f 1 m i l / m l i n s u l i n C o l u m n A C o l u m n B C o l u m n C d o s e o f G I P g i v e n ( n g / m l ) x ± S E M L P L A (.umoles F F A / h / 1 0 6 c e l 1 s ) n u m b e r o f e x p e r i m e n t s u s e d t o c a l c u l a t e C o l u m n B * d e n o t e s s i g n i f i c a n t ( p < 0 . 0 5 ) i n c r e a s e o v e r O n g / m l G I P s a m p l e s TABLE 18 A. B. C. Eluates 0 6. 90 + 0. ,31 1 2 25 8. ,18 + 0. ,86 7 50 11 . ,92 + 0. ,25 * 1 2 125 12. ,89 + 0. ,72 * 7 200 14. ,31 + 1, .21 * 12 600 13. ,59 + 1, .23 * 5 1200 8. ,92 ± 1, .30 5 Powders 0 15, .57 + 0, .99 1 2 25 19, .39 + 1, .26 * 7 50 26, .05 + 1 .81 * 12 125 27 , .90 + 2 . 85 * 7 200 30, .46 + 3 .05 * 1 2 600 26 .05 + 3 .65 * 5 1 200 25 .25 + 5 .05 * 5 202 T a b l e 1 9 : A L P L A C o l u m n A : D o s e o f G I P g i v e n ( n g / m l ) C o l u m n B : " A L P L A " n u m b e r s r e p r e s e n t s u b t r a c t i o n o f m e a n s o f C o l u m n B , T a b l e 1 8 , f r o m C o l u m n B , T a b l e 1 7 . ± t h e s u m o f t h e s t a n d a r d e r r o r m e a n s f r o m t h e s e C o l u m n s . 203 TABLE 19 A. B. Eluates 0 1 .49 + .90 50 4.80 + .64 200- 5.65 + 1 .92 600 4.78 + 2.17 1200 2 . 30 + 2 .54 Powders 0 3.03 + 1.79 50 10.09 + 2.96 200 12.95 + 5.12 600 9.45 + 5.68 1 200 11.10 + 7.24 204 I V . C h a r a c t e r i z a t i o n o f i o d i n a t e d GIP A_. A d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f HPLC 1 2 5 / 1 2 71 - E G111 1_. C a l i b r a t i o n o f c o l u m n ( s e e a l s o M e t h o d s : S e c t i o n I , B , 3) P r o n a s e d i g e s t i o n o f r a d i o i o d i n a t e d E G I I I w o u l d be e x p e c t e d t o p r o d u c e 4 d i f f e r e n t r a d i o a c t i v e compounds w h i c h c o u l d be s e p a r a t e d by G-10 a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y . T h e s e w e r e : 12 5 m o n o i o d o t y r o s i n e ( M I T ) , d i i o d o t y r o s i n e ( D I T ) , f r e e I o d i n e 1 ? R / 1 ? 7 u n c l e a v e d o r p a r t i a l l y c l e a v e d ' I - E G I I I . The e l u t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e s e compounds we re d e t e r m i n e d i n t h e f o l l o w i n g m a n n e r : S p e c t r o p h o t o m e t r i c d e t e c t i o n a t 297nm f o r MIT and 312nm f o r DIT a l l o w e d d e t e r m i n a t i o n o f t h e e l u t i o n t i m e s o f n o n r a d i o -a c t i v e , c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e , p u r e MIT and p u r e DIT ( F i g u r e 8 3 ) . 1 2 5 The e l u t i o n t i m e o f f r e e I was d e t e r m i n e d t h r o u g h a p p l i c a t i o n 1 2 5 o f Na I t o t h e G-10 c o l u m n w i t h s u b s e q u e n t m e a s u r e m e n t o f r a d i o -a c t i v i t y i n t h e c o l u m n e f f l u e n t ( F i g u r e 8 4 ) . U n c l e a v e d o r 12 5/127 p a r t i a l l y c l e a v e d I - E G I I I w o u l d be e x p e c t e d t o e l u t e i n t h e 1 2 5 v o i d v o l u m e , p r i o r t o t h e I p e a k . 2_. C h r o m a t o g r a p h y o f p r o n a s e - d i g e s t e d HPLC s a m p l e s HPLC was p e r f o r m e d on a s a m p l e o f t r a c e - i o d i n a t e d E G I I I The g r a d i e n t s y s t e m w h i c h was u s e d was one c a p a b l e o f r e s o l v i n g i o d i n a t e d E G I I I f r o m o x i d i z e d E G I I I ( o x - E G I I I ) ( s e e R e s u l t s : S e c t i o n I I , E , 3 , c ) . The e l u a t e was c o l l e c t e d i n 30 s e c o n d f r a c t i o n s ( l . O m l / f r a c t i o n ) w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e f i r s t f r a c t i o n w h i c h r e p r e s e n t e d t h e p o o l e d v o i d v o l u m e HPLC e l u e n t ( 2 . 0 m l ) . The v o i d 2 0 5 1.2-, CO .61 JQ < 0 0 MIT * 1 9 \ m I 9 \ DIT A. 20 40 Fraction number 60 F I G U R E 8 3 : E l u t i o n p r o f i l e o f M I T a n d D I T s t a n d a r d s . A s d e s c r i b e d i n M e t h o d s : S e c t i o n I , B , 3, M I T a n d D I T w e r e e l u t e d f r o m a G - 1 0 c o l u m n w i t h 0 . 0 5 M T r i s m a l e a t e b u f f e r c o n t a i n i n g 1% Na A z i d e . A b s o r b a n c e ( M I T - 2 9 7 n m , D I T - 3 1 2 n m ) i s p l o t t e d v e r s u s f r a c t i o n n u m b e r . F r a c t i o n v o l u m e = 4 m I s . I d e n t i c a l e l u t i o n c o n d i t i o n s w e r e u s e d i n t h e c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s e s u s e d i n f i g u r e s 8 4 - 8 7 , 8 9 , a n d 9 0 . 2 0 6 180-i o CO E o a | o 90 CO CO DC O H ID CM 20 40 60 Fraction number 12 5 -1GU R E 8 4 : A d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f Na I on S e p h a d e x G - 1 0 , T e c h n i q u e i n M e t h o d s : S e c t i o n I I , B 2 0 7 v o l u m e r a d i o a c t i v e p e a k ( A ) a n d t w o a d d i t i o n a l r a d i o a c t i v e p e a k s 12 5 / 1 2 7 ( B a n d C) w h i c h e l u t e d d u r i n g t h e ' I - E G I I I s p e c t r o p h o t o m e t r i c p e a k ( F i g u r e 7 8 ) w e r e e a c h p r o n a s e - d i g e s t e d a n d s u b j e c t e d t o a d -s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y o n G - 1 0 . R a d i o a c t i v e p e a k s f r o m t h e G - 1 0 e f f l u e n t w e r e i d e n t i f i e d r e l a t i v e t o t h e c a l i b r a t i o n p e a k s : c o l u m n f r a c t i o n s 3-11 c o n t a i n e d u n c l e a v e d a n d p a r t i a l l y c l e a v e d G I P ; f r a c t i o n s 1 2 - 1 5 c o n t a i n e d f r e e 12 5 I ; f r a c t i o n s 2 0 - 3 0 c o n t a i n e d M I T ; a n d f r a c t i o n s 4 1 - 5 6 c o n t a i n e d D I T - w i t h a s t a n d a r d f r a c t i o n v o l u m e o f 4 m l a n d a b u f f e r f l o w r a t e o f 1 6 m l / h r . T h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f r a d i o a c t i v i t y f o u n d i n t h e f o r m o f t h e s e f o u r g r o u p s w a s c a l c u l a t e d a n d t h e r e s u l t s t a b u l a t e d i n T a b l e s 20 a n d 2 1 . T h e r a d i o a c t i v e e l u t i o n p r o f i l e s o f t h e t h r e e d i g e s t e d H P L C f r a c t i o n s a r e s h o w n i n F i g u r e s 8 5 , 8 6 a n d 8 7 . T h e v o i d v o l u m e H P L C f r a c t i o n ( A ) c o n t a i n e d p r i m a r i l y f r e e 12 5 I r a d i o a c t i v i t y ( 6 4 . 9 % ) w i t h l e s s e r a m o u n t s o f M I T r a d i o a c t i v i t y ( 2 0 . 8 % ) a n d D I T r a d i o a c t i v i t y ( 1 4 . 4 % ) . H P L C f r a c t i o n B c o n t a i n e d p r i m a r i l y M I T r a d i o a c t i v i t y ( 8 4 . 9 % ) w i t h a s m a l l a m o u n t o f b o t h 12 5 I r a d i o a c t i v i t y ( 6 . 6 % ) a n d D I T r a d i o a c t i v i t y ' ( 8 . 5 % ) . T h e s u b -s e q u e n t H P L C f r a c t i o n ( C ) c o n t a i n e d a n i n c r e a s e d a m o u n t o f D I T r a d i o a c t i v i t y ( 2 8 . 8 % ) w i t h c o r r e s p o n d i n g d e c r e a s e s i n b o t h M I T 12 5 r a d i o a c t i v i t y (.6 7 . 4 % ) a n d I r a d i o a c t i v i t y ( . 3 . 8 % ) . S i n c e D I T p o s s e s s e d t w i c e t h e n u m b e r o f i o d i n e a t o m s a s d i d M I T , t h e r a t i o o f t h e t w o a m i n o a c i d s i n H P L C f r a c t i o n s B a n d C c o u l d t h e n b e c a l c u l a t e d : 2 0 8 F r a c t i o n B ( M I T : D I T ) 2 0 0 : 1 0 F r a c t i o n C ( M I T : D I T ) 4 7 : 1 0 T h i s c a l c u l a t i o n w a s m a d e u s i n g t h e d a t a i n T a b l e 2 0 , S e c t i o n C on Q ? O 0 ( e . g . , f o r F r a c t i o n B : - p y y ^ = H H ^ = 2 0 0 : 1 0 ) w h i c h r e p r e s e n t -e d o n l y r a d i o a c t i v i t y a c t u a l l y i n c o r p o r a t e d i n t o t y r o s i n e s . B_. A d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f p r o n a s e - d i g e s t e d f r a c t i o n s 1 2 5 f r o m t h e p u r i f i c a t i o n o f I - E G I I I f o r u s e i n r a d i o - i m m u n o a s s a y 12 5 T h e p r e p a r a t i o n o f I - E G I I I f o r u s e i n G I P r a d i o i m m u n o -a s s a y i n v o l v e d a f i n a l p u r i f i c a t i o n s t e p o n a C M - S e p h a d e x 52 c o l u m n ( F i g u r e 8 8 ) . T o d e t e r m i n e w h e t h e r t h i s s t e p r e s u l t e d i n a d e s i r -a b l e c o n c e n t r a t i o n o f t h e M I T - c o n t a i n i n g f o r m o f t h e p e p t i d e , f r a c t i o n s I a n d I I f r o m t h e C M - 5 2 c o l u m n w e r e p r o n a s e c l e a v e d a n d s u b j e c t e d t o a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y . T h e r e s u l t s ( F i g u r e s 8 9 a n d 9 0 ; T a b l e 2 0 ) d i d n o t i n d i c a t e a n y l a r g e d i f f e r e n c e i n t h e r e l a t i v e M I T a n d D I T c o m p o s i t i o n o f t h e t w o CM-52 c o l u m n f r a c t i o n s : F r a c t i o n I ( M I T : D I T ) 5 4 : 1 0 F r a c t i o n I I ( M I T : D I T ) 5 2 : 1 0 2 0 9 T a b l e 2 0 : R a d i o a c t i v i t y i n p e a k f r a c t i o n s f r o m a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f p r o n a s e -d i g e s t e d G I P m o l e c u l e s 1 2 5 S e c t i o n A : N u m b e r s i n t h e I c o l u m n r e p r e s e n t o f t h e c o u n t s p e r g r o u p o f f r a c t i o n s m i n u t e . A l l o t h e r n u m b e r s r e p r e s e n t o f t h e c o u n t s p e r g r o u p o f f r a c t i o n s m i n u t e . t h e p e r t h e p e r s um 0.1 s um 1 S e c t i o n B S e c t i o n C' N u m b e r s r e p r e s e n t t h e a m o u n t o f r a d i o a c t i v i t y p r e s e n t i n t h e d e s i g n a t e d g r o u p s o f f r a c t i o n s a s a p e r c e n t a g e o f t o t a l r a d i o a c t i v i t y i n a l l f r a c t i o n s ( i . e . f r a c t i o n s 1 + 6 0 i n S e c t i o n A ) " T o t a l i n c o r p . ' ( 2 0 -> 3 0 ) f r o m i s t h e S e c t i o n s u m A . o f ( 4 1 + 5 6 ) + %MU r a d i o a c t i v i t y 2 0 + 30 1 00 T o t a l i n c o r p . % D I T r a d i o a c t i v i t y 41 5 6 1 0 0 T o t a l i n c o r p 210 TABLE 20 A G - l 0 f r a c t i o n number s HPLC f r a c t i o n A HPLC f r a c t i o n B HPLC f r a c t i o n C CM52 f r a c t i o n I CM52 f r a c t i o n 11 ] 2 5 j 3 + 11 2001 3 9044 1 5843 84645 58831 841 12 + 15 1 791 6 5377 2332 3221 4 51 348 198520 20 + 30 5739 68875 41 147 539556 676760 -41 + 56 3967 6902 1 7582 201522 259984 -1 + 60 60255 94996 7931 5 869934 1056518 202076 B 3 + 11 33 . 2 9 .5 2 0 . 0 9 .7 5.6 0 .4 12 + 15 2 9 . 7 5.6 2 .9 3.7 4 . 9 98 . 2 20 + 30 9 .5 72 . 5 51 .9 62 . 0 64 . 1 -41 + 56 6.6 7 .3 2 2 . 2 2 3 . 2 2 4 . 6 -C T o t a l i n c o r p . 9706 75777 58729 741078 936744 % MIT 59 . 1 90 . 9 72.1 72 . 8 72 .2 -% DIT 4 0 . 9 9.1 2 9 . 9 2 7 . 2 2 7 . 8 _ 2 1 1 T a b l e 2 1 : R a d i o a c t i v i t y i n peak f r a c t i o n s f r o m a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f p r o n a s e - d i g e s t e d , H P L C - p u r i f i e d 1 2 5 / 1 2 7 I _ E G i n f r a c t i o n s # S e c t i o n A: Numbers r e p r e s e n t t h e sum o f c p m /group o f f r a c t i o n s " t o t a l " + (12 -> 15) + (20 + 30) + (41 -> 56) S e c t i o n B: % f r e e I r a d i o a c t i v i t y = 1 2 T ] 5 x 100 J t o t a l % MIT r a d i o a c t i v i t y = ^^J 0 x 100 % DIT r a d i o a c t i v i t y = 4 ] T i 6 x 100 J t o t a l T h i s t a b l e r e p r e s e n t s t h e c o n t e n t o f HPLC f r a c t i o n s A, B a n d C a f t e r r a d i o a c t i v i t y f r o m u n c l e a v e d 1 2 5 / 1 2 7 I - E G 1 1 1 has b e e n r e m o v e d . 2 1 2 TABLE 21 A G-10 f r a c t i o n s f r A f r b f r C 12 15 17916 5337 2332 20 30 5739 68875 41147 41 56 3967 6902 17582 t o t a l 27622 81114 61061 B % f r e e I r a d i o a c t i v i t y 64.9 6.6 3.8 % MIT r a d i o a c t i v i t y 20.8 84.9 67.4 % DIT r a d i o a c t i v i t y 14.4 8.5 28.8 213 10-i o CO o LO CM £ Q. O co tr o 5H 0 20 40 ^ 0 Fract ion number FIGURE 85: A d s o r p t i o n ch romatography o f pronase d i g e s t e d HPLC f r a c t i o n A on Sephadex G-10. Techn ique i n Methods : S e c t i o n I I , B 214 24 > ° c (0 b o a H 3 LO CNJ 0 20 F r a c t i on number FIGURE 86: Adso rp t i on chromatography of p r o n a s e - d i g e s t e d HPLC f r a c t i o n B on Sephadex G-10 Technique in Methods: S e c t i o n I I , B 2 1 5 12-, 20 Fract ion number 40 F I G U R E 8 7 : A d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f p r o n a s e - d i g e s t e d HPL f r a c t i o n C o n S e p h a d e x G - 1 0 T e c h n i q u e i n M e t h o d s : S e c t i o n I I , B 216 100-1 > o E CO Q. o o 50-H in CM 22 Fraction number 44 FIGURE 88: CM-Sephadex 52 chromatography of ' ^ I - G I P Th i s i o d i n a t e d GIP m i x t u r e was e l u t e d from the CM-Sephadex column w i t h a 0 002M +2M Ammonium A c e t a t e (pH 4.6) g r a d i e n t s t a r t i n g - a f t e r f r a c t i o n 5. F r a c t i o n volume = 1ml , F r a c t i o n s I, II and I I I were poo led between s l a s h marks and f r a c t i o n s I and II s u b j e c t e d to p r o t e a s e d i g e s t i o n and a d s o r p t i o n chromatography ( f i g u r e s 89 and 9 0 ) . 2 1 7 16i F I G U R E 8 9 : A d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f p r o n a s e - d i g e s t e d CM52 f r a c t i o n I o n S e p h a d e x G - 1 0 . T e c h n i q u e i n M e t h o d s : S e c t i o n I I , B 2 1 8 2Cn F I G U R E 9 0 : A d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f p r o n a s e - d i g e s t e d CM52 f r a c t i o n I I o n S e p h a d e x G - 1 0 T e c h n i q u e i n M e t h o d s : S e c t i o n I I , B 2 1 9 V_. B i n d i n g s t u d i e s A . N o n - s p e c i f i c b i n d i n g ]_. F i l t r a t i o n s y s t e m M i l l i p o r e EAWP f i l t e r s ( 0 . 4 5 } d p o r e s i z e ) w e r e s e l e c t e d 12 5 12 5 f o r s e p a r a t i o n o f c e l l u l a r - b o u n d I - G I P a n d f r e e I - G I P , s i n c e m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n r e v e a l e d t h a t t h e f i l t r a t e d i d n o t c o n t a i n a d i p o c y t e s a n d s i n c e f i l t r a t i o n p r o c e e d e d r a p i d l y w i t h o u t c l o g g i n g w h e n v a c u u m w a s a p p l i e d . N o n - s p e c i f i c b i n d i n g ( N S B ) o f 1 2 5 I - G I P t o t h e s e f i l t e r s w a s m e a s u r e d u n d e r s e v e r a l c o n d i t i o n s : P r e v i o u s ( 3 0 m i n ) s o a k i n g o f t h e f i l t e r s i n 0 . 9 % N a C l s o l u t i o n r e s u l t e d i n a n NSB o f 8 7 . 4 + T . 8 % . P r e v i o u s s o a k i n g ( 3 0 m i n ) o f t h e f i l t e r s i n 1 0 % B S A i n B S S ( s e e M e t h o d s : S e c t i o n I V , B , 1) r e d u c e d NSB t o 2.2 ± 0 . 1 % . 2_. O i l f l o t a t i o n s y s t e m I n t h e a b s e n c e o f c e l l s a n NSB f i n t h e o r d e r o f 2% w a s 1 2 5 o b s e r v e d w h e n r a d i o a c t i v i t y f r o m an I - G I P , B S A - B S S s o l u t i o n w a s m e a s u r e d i n t h e u p p e r , w a t e r p h a s e o f t h e o i l f l o t a t i o n t u b e s . 3 . A d h e r e n c e t o i n c u b a t i o n v e s s e l s N o n - s p e c i f i c b i n d i n g t o i n c u b a t i o n a n d s t o r a g e v e s s e l s w a s o b s e r v e d u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s . T r a n s f e r o f t h e a c i d ( p H 2 ) 1 2 5 H P L C - p u r i f i e d I - G I P a l i q u o t s b e t w e e n p l a s t i c , g l a s s o r s i l i c o n -i z e d g l a s s v e s s e l s r e s u l t e d i n a d h e r e n c e o f a p p r o x i m a t e l y 1 0 % o f t h e t o t a l r a d i o a c t i v i t y t o t h e o r i g i n a l v e s s e l . T r a n s f e r o f a 12 5 n e u t r a l i z e d ( p H . 7 ) I - G I P s o l u t i o n u n d e r t h e s a m e c o n d i t i o n s r e s u l t e d i n a d h e r e n c e o f a p p r o x i m a t e l y 7 0 % o f t o t a l r a d i o a c t i v i t y 12 5 t o t h e o r i g i n a l v e s s e l . A d d i t i o n o f 1% B S A t o t h e I - G I P s o l u t i o n p r i o r t o n e u t r a l i z a t i o n r e d u c e d t h i s a d h e r e n c e t o a p p r o x -i m a t e l y 2 % o f t o t a l r a d i o a c t i v i t y . 220 B. A t t e m p t s t o d e m o n s t r a t e d i s p l a c e a b l e b i n d i n g 1. F i l t r a t i o n s y s t e m a . H P L C - p u r i f i e d 1 2 5 I - G I P 12 5 An a l i q u o t o f HPLC p u r i f i e d I -G IP ( s e e R e s u l t s : S e c t i o n I I , E, 3 , d) o b t a i n e d by p o o l i n g f r a c t i o n s f r o m a l l t h e 1 25 I-E G111 peak s was d i l u t e d t o y i e l d a c a l c u l a t e d GIP c o n t e n t -1 5 i n t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e o f 141 pg/ml ( 2 8 x 10 M) b a s e d on t h e a s s u m p t i o n s o f an a v e r a g e o f 2 i o d i n e m o l e c u l e s i n c o r p o r a t e d / GIP m o l e c u l e and o f t h e a b s e n c e o f n o n i o d i n a t e d G I P . The f i r s t a s s u m p t i o n was b a s e d on a c o n s e r v a t i v e e s t i m a t e o b t a i n e d f r o m a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f p r o n a s e - d i g e s t e d HPLC s a m p l e s . E r r o r i n t h i s q u a n t i t y w o u l d p r o b a b l y r e s u l t i n u n d e r e s t i m a t i o n o f t h e q u a n t i t y o f GIP p r e s e n t and w o u l d t h e r e f o r e r e s u l t i n a 12 5 I -G IP c o n c e n t r a t i o n t h a t w o u l d n o t be t o o l ow t o d e m o n s t r a t e m e a s u r a b l e b i n d i n g t o c e l l s . The s e c o n d a s s u m p t i o n was b a s e d on p r e v i o u s i d e n t i f i c a t i O n o f o x - E G I I I and I-E G111 s p e c t r o p h o t o -m e t r y peak s o n ' H P L C ( s e e R e s u l t s : S e c t i o n I I , E, 2 ) . An a t t e m p t t o d e m o n s t r a t e b i n d i n g d i s p l a c e a b l e by n o n i o d i n a t e d E G I I I 1 25 i s shown i n f i g u r e 9 1 . A g e n e r a l d e c r e a s e i n I -G IP b i n d i n g t o c e l l s was e v i d e n t as' t h e c o n c e n t r a t i o n o f n o n i o d i n a t e d GIP ( [ G I P ] C 0 - | c j ) was i n c r e a s e d . Howeve r none o f t h e p o i n t s d i f f e r e d s i g n i f i c a n t l y f r o m t h e NSB, i n d i c a t i n g t h e l i k e l i h o o d o f t h e " d i s p l a c e m e n t " r e p r e s e n t i n g m i n o r f l u c t u a t i o n s i n an NSB v a l u e . Many o f t h e d i s p l a c e d " b i n d i n g " p o i n t s f e l l b e l o w t h a t o f t h e NSB. No d i s p l a c e a b l e b i n d i n g c o u l d be d e m o n s t r a t e d i n s u b s e q u e n t r e p e t i t i o n s - o f t h e e x p e r i m e n t . 2 2 1 52-, F I G U R E 9 1 : B i n d i n g o f I - G I P t o a d i p o c y t e s i n t h e p r e s e n c e o f n o n i o d i n a t e d G I P . E a c h p o i n t r e p r e s e n t s x ± S E M o f 6 s a m p l e s f r o m 2 e x p e r i m e n t s . NSB h a s n o t b e e n s u b t r a c t e d f r o m t h e v a l u e ; i n s t e a d i t i s p l o t t e d a t t h e r i g h t o f t h e c u r v e . 3 o u n d a n d f r e e r a d i o a c t i v i t y w e r e s e p a r a t e d b y v a c u u m f i l t r a t i o n . ( p [ G I P ] r e p r e s e n t s t h e n e g a t i v e l o g a r i t h m o f t h e n o n i o d i n a t e d G I P c o n c e n t r a t i o n ( m o l e / l i t r e ) 2 2 2 b . q U S O - p u r i f i e d 1 2 5 I - G I P A s i m i l a r e x p e r i m e n t w a s p e r f o r m e d u s i n g a G I P i o d i n a t i o n m i x t u r e w h i c h h a d b e e n p u r i f i e d t h r o u g h a d h e s i o n t o QUSO m i c r o -12 5 f i n e s i l i c a . T h e I - G I P w a s p r e s e n t i n t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e - 9 a t a c o n c e n t r a t i o n o f 3 x 10 M a n d a t t e m p t s w e r e m a d e t o - 6 — 1 3 d i s p l a c e t h i s u s i n g 1 0 " -> 1 0 " M n o n i o d i n a t e d G I P . T h e r e s u l t s ( f i g u r e 9 2 ) d e m o n s t r a t e b i n d i n g a b o v e NSB i n a l l t u b e s o n t h e o r d e r o f 1% t o 2% o f t o t a l . No d i s p l a c e m e n t w a s o b s e r v e d , 12 5 i n s t e a d b i n d i n g o f I - G I P i n c r e a s e d w i t h i n c r e a s i n g c o n c e n t r a -t i o n s o f n o n i o d i n a t e d G I P . T h i s p h e n o m e n o n w a s a l s o p r e s e n t w i t h e i t h e r 7% T r a s y T o l , o r l O O y g / m l b a c i t r a c i n i n t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e . T h i s i n d i c a t e d t h a t i n c r e a s i n g t h e [ G I P ] ^ w a s n o t 12 5 12 5 c a u s i n g i n c r e a s e d I - G I P b i n d i n g b y p r o t e c t i n g I - G I P f r o m p r o t e o l y t i c d i g e s t i o n b y t h e e n z y m e s w h i c h c o u l d b e i n h i b i t e d b y e i t h e r T r a s y l o l o r b a c i t r a c i n . 2. O i l f l o t a t i o n s y s t e m 1 2 5 A t t e m p t s t o d e m o n s t r a t e d i s p l a c e a b l e I - G I P b i n d i n g u s i n g t h e o i l f l o t a t i o n s y s t e m t o s e p a r a t e b o u n d a n d f r e e r a d i o -a c t i v i t y d i d n o t p r o d u c e r e s u l t s d e m o n s t r a b l y d i f f e r e n t t h a n t h o s e u s i n g t h e f i l t r a t i o n s y s t e m . _ Q M e a s u r e m e n t o f t h e d i s p l a c e m e n t o f 3 . 4 x 10 M QUSO-12 5 p u r i f i e d I - i n s u l i n b y n o n i o d i n a t e d i n s u l i n ( f i g u r e 9 3 ) u n d e r 1 2 5 c o n d i t i o n s i d e n t i c a l t o t h a t u s e d f o r I - G I P d e m o n s t r a t e d a d i s p l a c e a b l e b i n d i n g c u r v e a f t e r s u b t r a c t i o n o f N S B . C_. S u mm a r y 1 2 5 B i n d i n g l e v e l s o f I - G I P t o r a t a d i p o c y t e s w a s 223 2.Ch CD 1°L O H-" 1 1 1 1 1 1 r O 13 11 9 7 pIGI PI FIGURE 9 2 : B i n d i n g o f I-GIP to a d i p o c y t e s i n the pres ence o f u n i o d i n a t e d GIP - s e p a r a t i o n by o i l f l o t a t i o n - p o i n t s r e p r e s e n t mean ± SEM a f t e r s u b t r a c t i o n of NSB (1.1 ± .1%) (n=6) 224 - s e p a r a t i o n by o i l f l o t a t i o n - points represent mean ± SEM a f t e r s u b t r a c t i o n of NSB (n = 6) - b i n d i n g as % of t o t a l i s p l o t t e d vs. the negative logarithm of the noniodinated i n s u l i n c o n c e n t r a t i o n 225 d e m o n s t r a t e d t o b e h i g h e r t h a n t h e NSB p r e s e n t i n c e l l - f r e e c o n t r o l s . T h i s b i n d i n g w a s n o t d i s p l a c e a b l e , i n d i c a t i n g t h a t i t m a y h a v e r e p r e s e n t e d a d d i t i o n a l NSB t o t h e a d i p o c y t e s p r e s e n t 12 5 i n t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e . I - i n s u l i n u n d e r i d e n t i c a l c o n d i t i o n s d e m o n s t r a t e d d i s p l a c e a b l e b i n d i n g - o f h i g h e r l e v e l s t h a n t h e N S B . 2 2 6 D I S C U S S I O N T h e d e m o n s t r a t i o n o f a n i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t o f G I P i n h u m a n s ( D u p r e e t a ! . , 1 9 7 3 ) w a s f o l l o w e d b y e v i d e n c e o f a s i m i 1 a r 0 ' e f f e c t i n d o g ( P e d e r s o n e t a l . , 1 9 7 5 ) a n d i n t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s ( P e d e r s o n a n d B r o w n , 1 9 7 6 ) . S u b s e q u e n t s t u d i e s r e v e a l e d t h e p h y s i o l o g i c a l r e l e v a n c e o f G I P i n t h e e n t e r o - i n s u l a r a x i s a n d h a v e i n d i c a t e d t h a t a b n o r m a l G I P s e c r e t i o n p a t t e r n s h a v e b e e n f o u n d i n a s s o c i a t i o n w i t h c e r t a i n p a t h o l o g i c a l s t a t e s . H o w e v e r , t h e m e c h a n i s m b y w h i c h G I P e x e r t e d a n i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t h a s n o t b e e n i n v e s t i g a t e d . G I P p o t e n t i a t e d i n s u l i n r e l e a s e i n v i v o o n l y i n t h e p r e s e n c e o f h y p e r g l y c a e m i a i n t h e d o g ( P e d e r s o n e t a l . , 1 9 7 5 ) a n d i n man ( E l a h i e t a l . , 1 9 7 9 ) . U s i n g t h e i n v i t r o , i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s t e c h n i q u e P e d e r s o n a n d B r o w n ( 1 9 7 6 ) d e m o n s t r a t e d t h a t a p e r f u s a t e g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n o f a t l e a s t 5mM w a s n e c e s s a r y b e f o r e a p o t e n t i a t i o n o f i n s u l i n r e l e a s e b y 5 n g / m l G I P c o u l d b e o b s e r v e d . T h e p o t e n t i a t i n g a c t i o n o f G I P o n i n s u l i n s e c r e t i o n w a s s h o w n b y t h e m t o b e m a x i m a l a t a g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n o f a p p r o x i m a t e l y 16mM, a n d r e s u l t e d i n a n i n s u l i n o u t p u t f r o m t h e p a n c r e a s g r e a t e r t h a n c o u l d b e a c h i e v e d w i t h ' g l u c o s e a l o n e . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e r e s u l t s p r o v i d e d s o m e i n f o r m a t i o n a b o u t t h e m e c h a n i s m o f t h e i n s u l i n o t r o p i c a c t i o n o f G I P . B e c a u s e t h e i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t o f G I P r e q u i r e d t h e p r e s e n c e o f g l u co se G I P c o u l d b e g r o u p e d w i t h a n u m b e r o f o t h e r " p o t e n t i a t o r s " o f i n s u l i n r e l e a s e . T h i s g r o u p o f p o t e n t i a t o r s i n c l u d e d c A M P , 227 t h e o p h y l l i n e , v a r i o u s a m i n o a c i d s a n d t h e h o r m o n e g l u c a g o n -w h i c h s h a r e s p a r t i a l s e q u e n c e h o m o l o g y w i t h G I P . T h e p o s s i b i l i t y e x i s t e d t h a t G I P s h a r e d a common p o t e n t i a t i v e m e c h a n i s m w i t h o n e o r m o r e o f t h e s e i n s u l i n o t r o p i c a g e n t s b e c a u s e o f t h e s i m i l a r c o n d i t i o n s t h a t w e r e n e c e s s a r y p r e r e q u i s i t e s f o r t h e i n s u l i n -p o t e n t i a t i n g r e s p o n s e . T h e s i m i l a r i t y b e t w e e n t h e t h r e s h o l d g l u c o s e c o n c e n t r a t i o n r e q u i r e d f o r i n s u l i n s t i m u l a t i o n a n d t h a t r e q u i r e d f o r G I P - i n d u c e d p o t e n t i a t i o n o f i n s u l i n s e c r e t i o n l e d t o t h e h y p o t h e s i s t h a t i n i t i a t i o n o f i n s u l i n r e l e a s e by g l u c o s e w a s a p r e r e q u i s i t e o f t h e i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t o f G I P . O f i n t e r e s t , t h e n , wa s t h e ' m e c h a n i s m by w h i c h g l u c o s e i n d u c e d i n s u l i n s e c r e t i o n s i n c e i n t e r a c t i o n w i t h t h i s m e c h a n i s m w a s p r o b a b l y an e s s e n t i a l p a r t o f t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f G I P . The, " s u b s t r a t e - s i t e " h y p o t h e s i s o f g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n s e c r e t i o n p r o v i d e d an e x p e r i m e n t a l f r a m e w o r k - u s e f u l f o r t h e i n v e s t i g a t i o n o f t h i s i n t e r a c t i o n . E v e n t s i n t h e s t i m u l u s -s e c r e t i o n c o u p l i n g o f g 1 u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e c o u l d be d i v i d e d i n t o s e v e r a l c a t e g o r i e s w i t h i n t h i s f r a m e w o r k . T h e f i r s t s e t o f e v e n t s i n v o l v e d t h e m e t a b o l i s m o f g l u c o s e a n d t h e c h a n g e s e v o k e d b y m e t a b o l i s m w i t h i n t h e B c e l l . T h e s u b s t r a t e - s i t e m o d e l p o s t u l a t e d t h a t t h e i n c r e a s e d g l y c o l y t i c a n d o x i d a t i v e f l u x e v o k e d by i n t r a c e l l u l a r g l u c o s e w a s t h e p r i m e s t i m u l u s f o r i n s u l i n s e c r e t i o n a n d t h a t o t h e r t y p e s o f e v e n t s w i t h i n t h e B c e l l , s u c h a s i o n m o v e m e n t s a n d m o t i l e e v e n t s , w e r e s e c o n d a r y t o n u t r i e n t m e t a b o l i s m . T h e m a n n e r i n w h i c h m e t a b o l i c , i o n i c a n d m o t i l e e v e n t s w e r e c o u p l e d w a s s u b j e c t t o c o n j e c t u r e . I f t h e ' p r e s e n c e o f a. c e r t a i n m e t a b o l i t e o f g l u c o s e r e p r e s e n t e d t h e i m p o r t a n t s i g n a l 228 which coupled metabolic and i o n i c events, then other metabolic initiators!, of i n s u l i n s e c r e t i o n might be expected to share part, of the g l u c o s e - o x i d a t i v e pathway c o n t a i n i n g t h i s m e t a b o l i t e . The d i s c o v e r y of a number of m e t a b o l i z a b l e i n i t i a t o r s of i n s u l i n r e l e a s e that did not share o x i d a t i v e routes with glucose rendered the hypothesis of a s i n g l e " t r i g g e r " m e tabolite u n l i k e l y , although the p o s s i b i l i t y of the co-existence of several d i f f e r e n t such meta b o l i t e s remained. Another p o s s i b l e l i n k between metabolic and i o n i c events which has r e c e i v e d much a t t e n t i o n is the "energy charge" of the B c e l l , a term used to r e f e r to the a l t e r e d redox s t a t e of i n t r a c e l l u l a r compounds r e s u l t i n g from o x i d a t i v e metabol-ism. C o r r e l a t i o n between i n s u l i n s e c r e t i o n and the i n c r e a s e d eel 1ular c o n c e n t r a t i o n of reduced p y r i d i n e n u c l e o t i d e s evoked by many metabol i zeab'l e compounds has tended to support t h i s h y p othesis. The model would represent a t e l e o 1 o g i c a l l y a p p r o p r i a t e scheme since the presence of any c i r c u l a t i n g n u t r i e n t s capable of p r o v i d i n g eel 1u1 ar energy through metabolism wouTd i n i t i a t e the s e c r e t i o n of an a p p r o p r i a t e hormone to r e g u l a t e c i r c u l a t i n g glucose 1 e v e l s . Secondary to the metabolic events i n i t i a t e d by n u t r i e n t s would be the s e r i e s of i o n i c events which had been detected w i t h i n the B c e l l , notably an accumulation of C a + + , which in turn would a c t i v a t e an e f f e c t o r system c o n t r o l l i n g the t r a n s l o c a t i o n and e x o c y t o s i s of i n s u l i n - c o n t a i n i n g s e c r e t o r y g r a n u l e s . D e t a i l e d examination of these secondary events i s s t i l l r e q u i r e d to produce c l a r i f i c a t i o n of the c o u p l i n g mechanism of g l u c o s e - s t i m u l a t e d i n s u l i n s e c r e t i o n . 2 2 9 M a n y p o s s i b l e l o c a t i o n s f o r a n i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e e f f e c t s o f G I P a n d t h e s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g m e c h a n i s m o f g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e c o u l d e x i s t . H o w e v e r , i n v e s t i -g a t i o n o f a n i n t e r a c t i o n w i t h i o n i c a n d m o t i l e e v e n t s w i t h i n t h e B c e l l w o u l d b e h a m p e r e d b y t h e l a c k o f a G l P - r e s p o n s i v e i s o l a t e d i s l e t p r e p a r a t i o n . I n s t e a d , e x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e p o s s i b i l i t y o f G I P i n t e r a c t i n g w i t h m e t a b o l i c i n i t i a t o r s o t h e r t h a n g l u c o s e , s i n c e t h i s t y p e o f e x p e r i m e n t w a s s u i t e d t o i n v e s t i g a t i o n u s i n g t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s . T h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t G I P w a s c a p a b l e - o f p o t e n t i a t i n g i n s u l i n r e l e a s e w h i c h h a d b e e n e v o k e d b y a n u m b e r o f d i f f e r e n t c o m p o u n d s . O n e s u c h c o m p o u n d , D - g l y c e r a l d e h y d e , w a s p h o s p h o r y l a t e d b y t h e i s l e t s a n d e n t e r e d g l y c o l y s i s a t t h e t r i o s e p h o s p h a t e l e v e l ( A s h c r o f t e t a l . 1 9 7 3 ) . D - g l y c e r a l d e h y d e i n d u c e d p r o - i n s u l i n 45 b i o s y n t h e s i s , C a u p t a k e a n d b i p h a s i c i n s u l i n s e c r e t i o n i n a m a n n e r s i m i l a r t o g l u c o s e ( M a l a i s s e e t a l . , 1 9 7 6 ) . A t c o n c e n t r a -t i o n s o f e q u i v a l e n t i n s u l i n o t r o p i c p o t e n c y , D - g l y c e r a l d e h y d e a n d g l u c o s e w e r e o x i d i z e d a t r a t e s y i e l d i n g c o m p a r a b l e o u t p u t s o f l a c t a t e a n d ^^CQ^ ( M a l a i s s e e t a l . , 1 9 7 6 ) . A s w a s p r e d i c t e d b y t h e s u b s t r a t e - s i t e h y p o t h e s i s , m a n n o h e p t u l o s e - w h i c h b l o c k e d g l u c o s e p h o s p h o r y l a t i o n a n d g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n s e c r e t i o n -h a d no e f f e c t o n a D - g 1 y c e r a 1 d e h y d e - i n d u c e d i n s u l i n s e c r e t i o n ( A s h c r o f t e t a l . , 1 9 7 3 ; M a l a i s s e e t a l . , 1 9 7 6 ; H e l m a n e t a l . , 1 9 7 4 ) . S i n c e g l u c o s e a n d D - g l y c e r a l d e h y d e s h a r e d a c o m m o n c a t a -b o l i c p a t h w a y a n d s i m i l a r e f f e c t s o n i n s u l i n s e c r e t i o n i t w a s n o t s u r p r i s i n g t h a t G I P p o t e n t i a t e d t h e i n s u l i n r e l e a s e e v o k e d b y D - g l y c e r a l d e h y d e ( f i g u r e 3 ) . T h e lOmM D - g l y c e r a l d e h y d e c o n c e n t r a -2 3 0 t i o n u s e d t o i n i t i a t e i n s u l i n r e l e a s e w a s c h o s e n s i n c e i t w a s t h e c o n c e n t r a t i o n k n o w n t o p r o d u c e a m a x i m a l i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t ( M a l a i s s e e t a l . , 1 9 7 6 ) . D - g l y c e r a l d e h y d e , i n t h a t s t u d y , e x h i b -i t e d a b i p h a s i c d o s e - r e s p o n s e c u r v e w i t h r e l a t i v e i n h i b i t i o n o f m a x i m u m i n s u l i n r e l e a s e o c c u r r i n g a t c o n c e n t r a t i o n s a b o v e l O m M , a n e f f e c t p o s s i b l y a t t r i b u t a b l e t o t h e l o w e r i n g o f i s l e t A T P c o n t e n t a t t h e s e c o n c e n t r a t i o n s ( A s h c r o f t e t a l . , 1 9 7 3 ) . I f G I P e x e r t e d i t s i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t b y a c c e l e r a t i n g t h e f l u x o f m e t a b o l i t e s o r i g i n a t i n g a t D - g l y c e r a l d e h y d e , t h e n i t i s l i k e l y t h a t t h i s w o u l d m i m i c t h e e f f e c t o f i n c r e a s i n g t h e D - g l y c e r a l d e -h y d e c o n c e n t r a t i o n b e y o n d lOmM a n d w o u l d t h e r e f o r e n o t r e s u l t i n i n c r e a s i n g t h e i n s u l i n s e c r e t i o n e v o k e d b y t h e t r i o s e . C e r t a i n l y t h e a b i l i t y o f G I P t o e v o k e i n s u l i n s e c r e t i o n a b o v e t h e m a x i m u m o b t a i n a b l e w i t h g l u c o s e ( P e d e r s o n a n d B r o w n , 1 9 7 6 ) o r D - g l y c e r a l d e h y d e w o u l d i n d i c a t e t h a t t h e p o t e n t i a t i v e m e c h -a n i s m o f G I P w a s n o t i d e n t i c a l t o t h e i n i t i a t i v e m e c h a n i s m s o f t h e s e c o m p o u n d s . M e a s u r e m e n t o f c h a n g e s o f i n t r a c e l l u l a r o x i d a t i v e f l u x i n r e s p o n s e t o G I P w e r e n o t p o s s i b l e u s i n g t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s . S t u d i e s o f t h e s u b s t r a t e s p e c i f i c i t y o f t h e p o t e n t i a t i v e a c t i o n o f G I P w e r e u n d e r t a k e n t o d e t e r m i n e i f a n y p a r t i c u l a r s i t e i n i n t e r m e d i a r y m e t a b o l i s m w a s l i n k e d t o the„ i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t o f G I P . T h e f i n d i n g t h a t G I P p o t e n t i a t e d 5mM 2 - k e t o i s o c a p r o a t e -i n d u c e d i n s u l i n s e c r e t i o n ( f i g u r e 4 ) i n d i c a t e d t h a t t h e i n s u l i n -o t r o p i c a c t i o n w a s n o t c o n f i n e d t o g l u c o s e a n d g l u c o s e m e t a b o l i t e s a l o n e . 2 - k e t o i s o c a p r o a t e m e t a b o l i s m s h a r e d w i t h g l u c o s e o n l y t h e t r i c a r b o x y l i c a c i d c y c l e a s a c o m m o n m e t a b o l i c p a t h w a y 231 ( H u t t o n a n d M a l a i s s e , 1 9 8 0 ) . M e t a b o l i c d e g r a d a t i o n o f 2 - k e t o -i s o c a p r o a t e i n i s l e t s ( H u t t o n e t a l , 1 9 7 9 ) a n d o t h e r c e l l s ( M e i s t e r , 1 9 6 5 ) h a s b e e n t h o u g h t t o p r o c e e d t h r o u g h o x i d a t i v e d e c a r b o x y l a t i o n t o i s o v a l e r y l - C o A a n d v i a s u b s e q u e n t r e a c t i o n s t o f o r m a c e t o a c e t a t e a n d a c e t y l - C o A . D e s p i t e t h e d i s p a r i t y o f m e t a b o l i c r o u t e s , g l u c o s e a n d 2 - k e t o i s o c a p r o a t e i n d u c e d a n u m b e r o f s i m i l a r c h a n g e s i n t h e B c e l l a n d w e r e s u s c e p t i b l e i n i d e n t i -c a l f a s h i o n t o a n u m b e r o f m e t a b o l i c i n h i b i t o r s , l e a d i n g t o t h e t h e o r y t h a t t h e t w o s u b s t a n c e s i n i t i a t e d i n s u l i n s e c r e t i o n t h r o u g h a s i m i l a r m e c h a n i s m ( H u t t o n e t a l . , 1 9 8 0 ) . T h e i n s u l i n r e l e a s e e v o k e d b y 2 - k e t o i s o c a p r o a t e i n t h i s s t u d y w a s b i p h a s i c a n d s i m i l a r i n f o r m a n d m a g n i t u d e t o t h a t p r e v i o u s l y r e p o r t e d b y L e n z e n ( 1 9 7 8 a ) . G I P i n c o m b i n a t i o n w i t h 2 - k e t o i s o c a p r o a t e i n d u c e d a f u r t h e r b i p h a s i c i n c r e a s e i n i n s u l i n s e c r e t i o n s i m i l a r t o t h a t e v o k e d w h e n G I P w a s i n f u s e d . i n c o m b i n a t i o n w i t h g l u c o s e ( P e d e r s o n a n d B r o w n , 1 9 7 6 ) . I n c o n t r a s t , G I P d i d n o t p o t e n t i a t e t h e i n s u l i n s e c r e -t i o n w h i c h h a d b e e n i n i t i a t e d b y 5mM 2 - k e t o c a p r o a t e ( f i g u r e 5 ) . T h e m e t a b o l i s m o f t h i s s t r a i g h t c h a i n m o n o c a r b o x y l i c a c i d h a s ' b e e n t h o u g h t t o d i f f e r f r o m t h a t o f t h e b r a n c h e d c h a i n m o n o c a r b -o x l y i c a c i d , 2 - k e t o i s o c a p r o a t e . 2 - k e t o c a p r o a t e m e t a b o l i s m p r o b a b l y p r o c e e d e d t h r o u g h c o n v e r s i o n t o v a l e r y l - C o A a n d t h e n t h r o u g h s u b s e q u e n t r e a c t i o n s t h r o u g h p r o p i o n y 1 - G o A , D- a n d L -m e t h y l - m a l o n y l C o A t o s u c c i n y l - C o A a n d s u c c i n a t e - a c o n s t i t u e n t o f t h e t r i c a r b o x y l i c a c i d c y c l e [ P a n t e n , 1 9 7 5 ) . T h e f i n d i n g t h a t G I P d i d n o t p o t e n t i a t e 2 - k e t o c a p r o a t e - i n d u c e d i n s u l i n s e c r e t i o n w o u l d i n d i c a t e t h a t t h e e f f e c t s o f t h i s s u b s t a n c e i n t h e B - c e l l 2 3 2 m u s t h a v e d i f f e r e d f r o m t h o s e c a u s e d b y g l u c o s e , D - g l y c e r a l d e -h y d e a n d • 2 - k e t o i s o c a p r o a t e . O n e i n d i c a t i o n o f t h i s d i f f e r e n c e w a s t h e f i n d i n g t h a t 2 - k e t o c a p r o a t e w a s a m o r e p o t e n t i n s u l i n s e c r e t a g o g u e t h a n e q u i m o l a r 2-k'e t o i s o c a p r o a t e ( f i g u r e 6 ) . A d d i t i o n a l l y , H u t t o n e t a l . , ( 1 9 8 0 ) n o t e d t h a t t h e t w o k e t o -a c i d s d i d n o t s h a r e s i m i l a r e f f e c t s o n p r o i n s u l i n b i o s y n t h e s i s , ' 4 5 Ca u p t a k e a n d i n s u l i n r e l e a s e . T h e c o n c l u s i o n m a y b e d r a w n t h a t 2 - k e t o c a p r o a t e m e t a b o l i s m e i t h e r l a c k e d o r i n s o m e w a y i n h i b i t e d a c r i t i c a l ' f a c t o r p r e s e n t i n t h e m e t a b o l i s m o f t h e o t h e r n u t r i e n t s , w h i c h w a s n e c e s s a r y f o r a n i n t e r a c t i o n w i t h t h e p o t e n t i a t i v e m e c h a n i s m o f G I P . I d e n t i f i c a t i o n o f t h i s f a c t o r w o u l d b e d i f f i c u l t s i n c e l i n k s b e t w e e n m e t a b o l i c a n d s u b s e q u e n t e v e n t s i n t h e s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g s c h e m e a r e s t i l l u n c l e a r . I t w o u l d s e e m u n l i k e l y t h a t G I P r e q u i r e d t h e p r e s e n c e o f a s i n g l e m e t a b o l i c c o m p o u n d t o p o t e n t i a t e i n s u l i n r e l e a s e s i n c e g l u c o s e , D - g l y c e r a l d e h y d e a n d 2 - k e t o i s o c a p r o a t e s h a r e d o n l y t h e t r i c a r b o x y l i c a c i d c y c l e a s a c o m m o n m e t a b o l i c p a t h w a y a n d . t h i s c y c l e w a s a l s o a p a r t o f 2 - k e t o c a p r o a t e m e t a b o l i s m . T h e s i t e o f i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e i n i t i a t i v e e f f e c t s o f t h e s e c r e t a g o g u e s a n d t h e p o t e n t i a t i v e e f f e c t o f G I P w o u l d t h e n b e a m o n g t h e e v e n t s t h a t w e r e s u b s e q u e n t t o m e t a b o l i s m o f t h e s e c r e t a g o g u e s . T h e f i n d i n g t h a t a n o n - m e t a b o l i z a b l e . l e u c i n e a n a l o g u e , 2 - a m i n o b i c y c l o [ 2 ,2 , 1 2 ] h e p t a n e - 2 - c a r b o x y l i c a c i d ( B C H ) w a s c a p a b l e o f i n d u c i n g i n s u l i n r e l e a s e ( C h r i s t e n s e n a n d C u l l e n , 1 9 6 9 ; C h r i s t e n s e n e t a l . , 1 9 7 1 ) s e e m e d t o c o n f l i c t w i t h t h e s u b s t r a t e -s i t e h y p o t h e s i s u n t i l i t w a s s h o w n t h a t b o t h BCH a n d L - l e u c i n e 2 3 3 w e r e c a p a b l e o f a l l o s t e r i c a c t i v a t i o n o f i s l e t g l u t a m a t e d e h y d r o -g e n a s e ( S e n e r a n d M a l a i s s e , 1 9 8 0 ) . T h i s w o u l d h a v e t h e e f f e c t o f i n c r e a s i n g c a t a b o l i c f l u x t h r o u g h a c t i v a t i o n o f a n N A D ( P ) H -d e p e n d e n t e n z y m e . W h i l e b o t h 2 0mM l e u c i n e ( t a b l e 4; L e n z e n 1 9 7 9 ) a n d 1 0 mM L - g l u t a m i n e ( t a b l e 9; S o m e r s e t a l . , 1 9 8 2 ) i n d i v i d u a l l y d i d n o t i n i t i a t e i n s u l i n r e l e a s e i n t h e p r e s e n c e o r a b s e n c e o f G I P , t h e t w o a m i n o a c i d s i n c o m b i n a t i o n w i t h 5 n g / m l G I P ( f i g u r e 7 ) o r 2mM d b c A M P e v o k e d a p o t e n t i a t i o n o f i n s u l i n s e c r e t i o n a t a p o i n t w h e r e o n l y b a s a l i n s u l i n s e c r e t i o n h a d b e e n i n i t i a t e d b y t h e L - 1 e u c i n e / L - g 1 u t a m i n e m i x t u r e . T h i s w a s i n c o n t r a s t t o t h e e f f e c t o f G I P o n i n s u l i n r e l e a s e e v o k e d b y o t h e r m e t a b o l i z a b l e s u b s t a n c e s w h e r e G I P a f f e c t e d o n l y t h a t i n s u l i n r e l e a s e w h i c h h a d b e e n s t i m u l a t e d a b o v e a b a s a l l e v e l . A t l e a s t t w o p o s s i b l e e x p l a n a t i o n s f o r t h i s p h e n o m e n o n p r e s e n t t h e m s e l v e s . G I P c o u l d h a v e h a d t h e e f f e c t o f r e n d e r i n g t h e p o s t - m e t a b o l i c s e c r e t i o n " m a c h i n e r y " m o r e s e n s i t i v e t o t h e m e t a b o l i c f l u x e v o k e d b y L -l e u c i n e s t i m u l a t i o n o f L - g l u t a m i n e m e t a b o l i s m o r G I P c o u l d h a v e h a d a n e f f e c t a t t h e l e v e l o f t h e m e t a b o l i s m o f L - g l u t a m i n e . T h e i n i t i a l e v e n t i n t h e m e t a b o l i s m o f L - g l u t a m i n e h a s b e e n s h o w n t o b e d i f f u s i o n o f L - g l u t a m i n e i n t o t h e i s l e t s w h e r e i n c o n -v e r s i o n t o L - g l u t a m a t e o c c u r r e d ( M a l a i s s e e t a l . , 1 9 8 0 ) . T h e c o n -c u r r e n t p r e s e n c e o f L - l e u c i n e c a u s e d a l l o s t e r i c i n d u c t i o n o f g l u t a m a t e d e h y d r o g e n a s e ( S e n e r e t a l . , 1 9 8 1 ) w h i c h c a t a l y z e d a n i n c r e a s e d c o n v e r s i o n o f L - g l u t a m a t e t o 2 - k e t o g l u t a r i c a c i d . I f , a s w a s s u g g e s t e d b y t h e 2 - k e t o c a p r o a t e a n d 2 - k e t o i s o c a p r o a t e r e s u l t s , t h e p o t e n t i a t i v e e f f e c t o f G I P w a s l o c a t e d p o s t - m e t a b o l i c a l t h e n i n t e r a c t i o n w i t h L - g l u t a m a t e m e t a b o l i s m w o u l d o c c u r a s a r e s -u l t o f t h e c o u p l i n g b e t w e e n m e t a b o l i c a n d i o n i c e v e n t s . I n d e e d a 2 3 4 s i m i l a r i t y i n p o s t - m e t a b o l i c e v e n t s - r e d u c e d c y t o s o l i c r e d o x c o u p l e s , c e l l u l a r c a l c i u m a c c u m u l a t i o n a n d m i c r o t u b u l a r e f f e c t o r s y s t e m a c t i v a t i o n - c a u s e d b y g l u c o s e o r b y g l u t a m a t e d e h y d r o g e n a s e -c a t a l y z e d g l u t a m a t e m e t a b o l i s m h a s b e e n r e p o r t e d ( S e n e r a n d M a l a i s s e , 1 9 8 0 ) . A s e c o n d , a n d n o t e x c l u s i v e , p o s s i b i l i t y w a s t h a t G I P i t -s e l f a f f e c t e d t h e a c t i v i t y o f g l u t a m a t e d e h y d r o g e n a s e . T h i s e n z y m e w a s s h o w n t o b e s e n s i t i v e t o a n u m b e r o f e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s ( S e n e r e t a l . , 1 9 8 2 ) i n c l u d i n g a p o t e n t i a t o r o f i n s u l i n s e c r e t i o n , t h e o p h y l l i n e . T h e p o t e n t i a t i o n o f i n s u l i n s e c r e t i o n b y 2 m M d b c A M P w a s t h e n n o t u n e x p e c t e d , s i n c e b o t h d b c A M P a n d t h e o p h y l l i n e w o u l d b e e x p e c t e d t o e l e v a t e c e l l u l a r c A M P l e v e l s . H o w e v e r , c a u t i o n m u s t b e s h o w n i n a t t r i b u t i n g a s i m i l a r e f f e c t t o G I P s i n c e t h e o p h y l l i n e , a n d n o t G I P , p o t e n t i a t e d L - l e u c i n e - i n d u c e d - i n s u l i n r e l e a s e ( t a b l e 9; L e n z e n , 1 9 7 9 ) i n d i c a t i n g t h a t G I P a n d t h e o p h y l l i n e d i d n o t e x e r t i d e n t i c a l e f f e c t s w i t h i n t h e B - c e l l . A s e c o n d i n t e r e s t i n g a s p e c t o f t h e p o t e n t i a t i o n o f L - g 1 u t a m i n e / L - 1 e u c i n e - i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e b y G I P o n d b c A M P w a s t h e r e l a t i v e e l e v a t i o n o f i n s u l i n s e c r e t i o n w h i c h c o n t i n u e d a f t e r t h e p o t e n t i a t o r s w e r e r e m o v e d . P o t e n t i a t i o n o f i n s u l i n r e l e a s e e v o k e d b y o t h e r m e t a b o l i t e s i n c o m b i n a t i o n w i t h G I P w a s a b o l i s h e d w i t h i n m i n u t e s o f c e s s a t i o n o f t h e G I P i n f u s i o n , b u t e l e v a t i o n o f i n s u l i n s e c r e t i o n r a t e s i n t h e L - l e u c i n e / L - g l u t a m i n e e x p e r i m e n t s r e m a i n e d f o r a t l e a s t 1 0 m i n u t e s f o l l o w i n g c e s s a t i o n o f G I P o r d b c A M P i n f u s i o n . A p o s s i b l e e x p l a n a t i o n o f t h i s p h e n o m e n o n c o u l d e x i s t i n t h e r e c e n t l y d e m o n s t r a t e d B - c e l l " m e m o r y " f o r L - g l u t a m i n e ( S o m e r s e t a l . , 1 9 8 2 ) . I n t h i s r e p o r t i t w a s s h o w n t h a t p r e v i o u s e x p o s u r e ( a t l e a s t 2 5 m i n ) t o L - g l u t a m i n e 235 s i g n i f i c a n t l y enhanced L-1eucine/L-glutamine s t i m u l a t e d i n s u l i n r e l e a s e . This i n d i c a t e d that the c e l l u l a r s e n s i t i v i t y to L-1eucine/L-glutamine could be " r e s e t " by exposure to a n u t r i e n t . I f a s i m i l a r r e s e t t i n g of s e n s i t i v i t y to L - l e u c i n e / L-glutamine could occur in response to GIP or dbcAMP then removal of the p o t e n t i a t o r s would r e s u l t in a higher basal s e c r e t i o n r a t e . An enhancement of s e n s i t i v i t y to L-glutamate metabolism by GIP was hypothesized e a r l i e r to ex p l a i n GIP-induced poten-t i a t i o n of the basal i n s u l i n s e c r e t i o n evoked by L- l e u c i n e and L-glutamine. However, such explanations are merely s p e c u l a t i v e . Pyruvate, though metabolized in the B-eel I s , was a weak i n s u l i n secretagogue by v i r t u e of i t s i n h i b i t o r y e f f e c t upon the o x i d a t i o n of endogenous n u t r i e n t s (Sener et al . , 1 978). GIP has no notable e f f e c t upon i n s u l i n s e c r e t i o n evoked by 3OmM pyruvate in combination with substimu1atory or suprathresho 1d glucose c o n c e n t r a t i o n s . Although GIP p o t e n t i a t e d the basal i n s u l i n s e c r e t i o n evoked by the L-1eucine/L-glutamine mixture no such e f f e c t was observed in the presence of glucose and pyruvate. The r e s u l t s obtained from the study of the i n t e r a c t i o n of GIP with metabolized i n i t i a t o r s of i n s u l i n s e c r e t i o n l e d to several c o n c l u s i o n s . The a b i l i t y of GIP to p o t e n t i a t e i n s u l i n r e l e a s e which had been evoked by glucose, D-glyceraldehyde and 2-ke t o i s o c a p r o a t e , but not by 2^ketocaproate, led to the conclu-sion that the p o t e n t i a t i v e e f f e c t of GIP was l o c a t e d in a step in the s t i m u l u s - s e c r e t i o n coupling mechanism d i s t a l to metabolic events. 2-ketocaproate e i t h e r bypassed or i n h i b i t e d the c r u c i a l 2 3 6 e v e n t ( s ) a t t h e s i t e o f i n t e r a c t i o n b e t w e e n i n i t i a t i v e a n d p o t e n t i a t i v e m e c h a n i s m s . N o t e n o u g h i n f o r m a t i o n a b o u t . c o u p l i n g b e t w e e n m e t a b o l i c a n d s u b s e q u e n t e v e n t s f o r 2 - k e t o c a p r o a t e -i n d u c e d i n s u 1 i n s e c r e t i o n w a s a v a i l a b l e t o a l l o w d e t e r m i n a t i o n o f t h e i n t e r a c t i v e s i t e ( . s ) . T h e p o t e n t i a t i v e e f f e c t o f G I P o n L-1 e u c i n e / L - g l u t a m i . n e - s t i m u l a t e d i n s u l i n r e l e a s e d i f f e r e d f r o m t h a t o f G I P o n i n s u l i n s e c r e t i o n s t i m u l a t e d - b y t h e o t h e r i n i t i a -t o r s . G I P i n d u c e d i n s u l i n s e c r e t i o n i n t h e a b s e n c e o f p r i o r i n i t i a t i o n b y t h e a m i n o a c i d m i x t u r e a n d t h i s e f f e c t w a s n o t q u i c k l y r e v e r s e d b y r e m o v a l o f G I P . S e v e r a l s p e c u l a t i v e m e c h a n -i s m s f o r t h e s e e f f e c t s w e r e d i s c u s s e d , b u t s i n c e t h e y w o u l d r e q u i r e m e a s u r e m e n t o f p o s t - m e t a b o l i c i n t r a c e l l u l a r e v e n t s t h e y c o u l d n o t b e i n v e s t i g a t e d u s i n g t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s - t h e s o l e i n v i t r o , G I P - s e n s i t i v e e x p e r i m e n t a l m o d e l . M c i n t o s h e t a l . ( 1 9 7 9 ) d e m o n s t r a t e d t h e a b i l i t y o f G I P t o i n d u c e t h e s e c r e t i o n o f s o m a t o s t a t i n - 1 i k e i m m u n o r e a c t i v i t y ( S L I ) f r o m t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t s t o m a c h . I n v e s t i g a t i o n o f S L I i n e f f l u e n t f r o m t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s , u s i n g t h e s a m e a n t i s e r u m , r e v e a l e d a s i m i l a r e f f e c t o f G I P o n p a n c r e a t i c S L I i f a b a c k g r o u n d o f t h e o p h y l l i n e w a s p r e s e n t ( f i g u r e 1 4 ) . M a x i m u m l e v e l s o f p a n c r e a t i c S L I p r o d u c e d i n r e s p o n s e t o 5 n g / m l G I P w e r e t e n f o l d l e s s t h a n t h a t p r o d u c e d b y t h e s a m e d o s e o f G I P a d m i n i s t e r e d t o t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t s t o m a c h ( M c i n t o s h e t a l . , 1 9 7 9 ) . T h e s e p a n c r e a t i c S L I l e v e l s w e r e a t t h e l o w e r l e v e l o f d e t e c t i o n o f t h e r a d i o i m m u n o a s s a y a n d w e r e o b t a i n e d o n l y w h e n t h e t h e o p h y l l i n e b a c k g r o u n d w a s a s h i g h a s 5.OmM. A l t h o u g h t h e r e s u l t i n d i c a t e d t h a t a n i n t e r a c t i o n b e t w e e n G I P a r i d p a n c r e a t i c 2 3 7 S L I c o u l d o c c u r , t h e p r e s e n c e o f t h e p h o s p h o d i e s t e r a s e i n h i b i t o r d i d n o t a l l o w c o n c l u s i o n s t o b e m a d e r e g a r d i n g t h e p h y s i o l o g i c a l r e l e v a n c e o f t h e e f f e c t . A s u b s e q u e n t s l i g h t d r i f t i n t h e s e n s i -t i v i t y o f t h e r a d i o i m m u n o a s s a y r e n d e r e d f u r t h e r a t t e m p t s a t m e a s u r e m e n t o f p a n c r e a t i c S L I i m p o s s i b l e . I t w a s a l s o n o t p o s s i b l e t o e x a m i n e t h e h y p o t h e s i s o f B r o w n e t a l . ( 1 9 8 0 ) t h a t a G I P -i n d u c e d S L I s u r g e c o u l d - p r o d u c e a t r a n s i e n t i n h i b i t i o n o f i n s u l i n r e l e a s e w h i c h w o u l d r e s u l t i n t h e b i p h a s i c p r o f i l e o f G I P -p o t e n t i a t e d , g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n s e c r e t i o n . T h e p r e s e n c e o f t h e 5.0mM t h e o p h y l l i n e n e e d e d t o e l e v a t e t h e G I P - i n d u c e d e f f e c t o n S L I o u t p u t t o d e t e c t a b i l i t y r a i s e d i n s u l i n s e c r e t i o n t o v e r y h i g h l e v e l s . A s i m i l a r S L I s u r g e w a s s h o w n t o o c c u r b e t w e e n t h e p h a s e s o f g 1 u c o s e '• i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e ( S o r e n s o n e t a l . , 1 9 8 0 ) . H o w e v e r t h e m a x i m u m l e v e l o f S L I s e c r e t i o n w h i c h o c c u r r e d ( 3 0 0 pg>(ml) w a s s i m i l a r t o t h a t i n d u c e d i n t h i s s t u d y b y G I P a n d w a s s h o w n b y S o r e n s o n e t a l . t o b e " i n s u f f i c i e n t t o s i g n i f i c a n t l y a l t e r g l u c o s e - s t i m u l a t e d i n s u l i n r e l e a s e i n t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s " . C o n f i r m a t i o n o f t h e r e l a t i o n s h i p o f G I P , p a n c r e a t i c S L I a n d I R I a w a i t s a n a s s a y o f s u f f i c i e n t s e n s i t i v i t y t o d e t e c t p a n c r e a t i c S L I l e v e l s w i t h o u t p r i o r e l e v a t i o n b y t h e o p h y l l i n e . C h r o n i c a d m i n i s t r a t i o n o f t r i i o d o t h y r o n i n e ( J 3 ) h a s b e e n s h o w n t o r e d u c e g l u c o s e - s t i m u l a t e d i n s u l i n r e l e a s e f r o m r a t i s l e t s ( M a l a i s s e e t a l . , 1 9 6 7 ) a n d f r o m t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s ( L e n z e n e t a l . , 1 9 7 6 a ) . T h i s e f f e c t w a s n o t p r e s e n t w h e n T 3 w a s i n f u s e d a c u t e l y , a n d s t u d i e s b y L e n z e n ( 1 9 7 8 b ) r e v e a l e d t h a t a l a g t i m e o f s e v e r a l d a y s w a s r e q u i r e d b e f o r e t h e 2 3 8 T g - i n d u c e d s u p p r e s s i o n o f i n s u l i n s e c r e t i o n o c c u r r e d . T h i s s u p p r e s s i o n w a s ' s p e c i f i c f o r t h e s e c o n d , m a j o r , ' p h a s e o f ' i n s x i T i n s e c r e t i o n w h i l e t h e t r a n s i e n t f i r s t p h a s e r e m a i n e d i n t a c t . I d e n t i f i c a t i o n - o f t h e m e c h a n i s m - t h r o u g h w h i c h c h r o n i c T ^ a d m i n -i s t r a t i o n i n t e r f e r e d w i t h g l u c o s e - s t i m u 1 a t e d i n s u 1 i n r e l e a s e h a s n o t b e e n p o s s i b l e . T h e i n h i b i t i o n w o u l d s e e m t o h a v e b e e n r e l a t i v e l y s p e c i f i c f o r g l u c o s e - s t i m u l a t e d i n s u l i n r e l e a s e s i n c e i n s u l i n s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o D - g l y c e r a l d e h y d e , D - m a n n o s e a n d t o l b u t a m i d e w e r e u n a f f e c t e d b y c h r o n i c T ^ a d m i n i s t r a t i o n ( L e n z e n e t a l . , 1 9 7 6 b ) . M u e l l e r e t a l . ( 1 9 8 2 ) r e p o r t e d t h a t t h e i n s u l i n -o t r o p i c a c t i o n o f 5 n g / m l G I P w a s n o t b l o c k e d b y c h r o n i c T ^ a d m i n i s t r a t i o n e v e n t h o u g h t h e s e c o n d p h a s e o f i n s u l i n s e c r e t i o n i n r e s p o n s e t o g l u c o s e w a s s t r o n g l y s u p p r e s s e d . T ^ - t r e a t m e n t a c c o r d i n g t o t h e s c h e d u l e u s e d b y M u e l l e r e t a l . ( 1 9 8 2 ) d i d n o t p r o d u c e a c h a n g e i n i n s u l i n s e c r e t i o n f r o m t h e i s o l a t e d p e r -f u s e d p a n c r e a s i n r e s p o n s e t o D - g l y c e r a l d e h y d e i n t h e p r e s e n c e ( f i g u r e 1 3 ) o r a b s e n c e ( f i g u r e 1 2 ) o f G I P . T h e r e s u l t s w o u l d s e e m t o c o n f i r m t h a t c h r o n i c T ^ t r e a t m e n t , w h i l e i n t e r f e r i n g w i t h t h e i n s u 1 i n o . t r o p i c a c t i o n o f g l u c o s e , d i d n o t i n t e r f e r e w i t h t h e i n s u 1 i n o t r o p i c a c t i o n s o f D - g l y c e r a l d e h y d e a n d G I P - r e s u l t s w h i c h c o u l d b e a n t i c i p a t e d f r o m t h e p r e v i o u s s t u d i e s . S i n c e t h e m e c h a n i s m s o f g l u c o s e - a n d D - g l y c e r a l d e h y d e - i n d u c e d i n s u l i n s e c r e t i o n p r o b a b l y d i f f e r e d o n l y i n t h a t t h e D - g l y c e r a l d e h y d e p a t h w a y l a c k e d t h e s t e p s o f g l y c o l y s i s i n t e r v e n i n g b e t w e e n t h e t w o m e t a b o l i t e s ( M a l a i s s e e t a l . , 1 9 7 6 ) i t i s l i k e l y t h a t T ^ i n t e r f e r e d w i t h t h e a c t u a l m e t a b o l i s m o f g l u c o s e w i t h i n t h e e a r l y s t e p s o f g l y c o l y s i s . M u e l l e r e t a l . ( 1 9 8 2 ) d e m o n s t r a t e d t h e 239 m a n n o h e p t u l o s e - s u s c e p t i b i l i t y o f t h e i n s u l i n o t r o p i c a c t i o n o f G I P i n b o t h T ^ - t r e a t e d a n d c o n t r o l r a t s . I f t h e a c t i o n o f m a n n o h e p t u l o s e w a s c o n f i n e d p r i m a r i l y t o i n h i b i t i o n o f t h e h i g h K m h e x o k i n a s e .(Mats-chinsky a n d E l l e r m a n , 1 9 6 8 ) t h e n t h i s a c t i o n i n T ^ - t r e a t e d r a t s m u s t h a v e b l o c k e d a c o m p o n e n t o f g l u c o s e m e t a b o l i s m w h i c h w a s n o r m a l l y i n t a c t a f t e r t r e a t m e n t . T h e i n s u l i n o t r o p i c a c t i o n o f G I P i n T ^ - t r e a t e d r a t s w o u l d t h e n b e v i e w e d a s a r e s u l t o f t h e i n t e r a c t i o n o f G I P w i t h g l u c o s e m e t a -b o l i c f l u x w h i c h h a d b e e n r e d u c e d , b u t n o t a b o l i s h e d , b y t h e t h y r o t o x f e i t y : \ , . S u p p o r t f o r t h i s h y p o t h e s i s i s g i v e n b y t h e f a c t t h a t T ^ t r e a t m e n t d i d ' n o t t o t a l l y a b o l i s h g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n s e c r e t i o n f r o m t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s , b u t m e r e l y s h i f t e d t h e d o s e - r e s p o n s e c u r v e t o t h e r i g h t ( L e n z e n , 1 9 7 8 b ) . T h e d e m o n s t r a t i o n t h a t e n d o g e n o u s l y r e l e a s e d I R - G I P w a s n o t i n s u l i n o t r o p i c i n t h e a b s e n c e o f h y p e r g l y c a e m i a ( B r o w n , 1 9 7 4 ) w a s a c c o m p l i s h e d b y t h e i n i t i a t i o n o f e n d o g e n o u s I R - G I P s e c r e t i o n t h r o u g h i n g e s t i o n o f a t r i g l y c e r i d e s o l u t i o n ( L i p o m u l ) . S u b s e q u e n t i n v e s t i g a t i o n h a s l e a d t o t h e c o r r e l a t i o n o f f a t d i g e s t i o n a n d I R - G I P r e l e a s e i n n o r m a l man ( O ' D o r i s i o e t a l . , 1 9 7 6 ) , a n d i n p a t h o l o g i c a l s t a t e s s u c h a s c h r o n i c p a n c r e a t i t i s w h e r e i m p a i r e d f a t d i g e s t i o n w a s a c c o m p a n i e d b y r e d u c e d s e r u m I R - G I P ( E b e r t e t a l . , 1 9 7 6 ) . T h e p o s s i b i l i t y e x i s t e d t h a t f a t - r e l e a s e d I R - G I P c o u l d h a v e h a d f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e f o r p h y s i o l o g i c a l h a n d l i n g o f p o s t - p r a n d i a l t r i g l y c e r i dae'mi a . T h e e n z y m e l i p o p r o t e i n l i p a s e c o n t r o l l e d t h e r a t e -l i m i t i n g s t e p i n t h e r e m o v a l o f t r i a c y l g l y c e r o l f a t t y a c i d s 2 4 0 f r o m t h e c i r c u l a t i o n ( R o b i n s o n , 1 9 7 0 ) t h r o u g h e x t r a c e l l u l a r h y d r o l y s i s o f p l a s m a 1 i p o p r o t e i n - t r i a c y l g l y c e r o l c o m p l e x e s . A l t e r a t i o n s i n l i p o p r o t e i n l i p a s e a c t i v i t y c o r r e l a t e d w e l l w i t h m o d i f i c a t i o n s i n t h e r a t e o f u p t a k e o f t r i a c y l g l y c e r o l f a t t y a c i d s b y a d i p o s e t i s s u e ( C r y e r e t a l . 1 9 7 6 ) , s o m o d u l a t i o n o f 1 i p o p r o t e i n 1 i p a s e a c t i v i t y c o u l d r e p r e s e n t a n i m p o r t a n t p o i n t i n t h e c o n t r o l o f t r i g l y c e r i d a e m i a . L i p o p r o t e i n l i p a s e a c t i v i t y w a s s e n s i t i v e t o a n u m b e r o f n u t r i t i o n a l , e n v i r o n m e n t a l , g e n e t i c , p a t h o l o g i c a l a n d h o r m o n a l f a c t o r s ( C r y e r , 1 9 8 1 ) . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e r e l e v a n c e o f m a n y o f t h e e f f e c t s i n t h e p h y s i o l o g i c a l s e t t i n g r e m a i n e d u n c l e a r . S p e c u l a t i o n r e g a r d i n g t h e p o s s i b i l i t y o f i n t e r a c t i o n o f s i g n a l s a r i s i n g f r o m t h e g a s t r o i n t e s t i n a l t r a c t w i t h l i p o p r o t e i n l i p a s e a c t i v i t y p r o m p t e d E c k e l e t a l . ( 1 9 7 9 ) t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o f G I P o n c u l t u r e d p r e a d i p o c y t e s . T h e y r e a s o n e d t h a t t h e i n c r e a s e d G I P r e l e a s e s e e n a f t e r f a t - f e e d i n g ( F a l k o e t a l . , 1 9 7 5 ) c o u l d h a v e h a d f u n c t i o n a l s i g n i f i c a n c e f o r p o s t - p r a n d i a l u p t a k e o f t r i g l y c e r i d e f a t t y a c i d s b y a d i p o s e t i s s u e . T h e y d e m o n s t r a t e d t h a t G I P i n c r e a s e d t o t a l l i p o p r o t e i n l i p a s e a c t i -v i t y i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r f r o m c u l t u r e s o f a m o u s e e m b r y o f i b r o b l a s t c e l l l i n e ( 3 T 3 - L 1 ) . T h i s c e l l l i n e h a d b e e n s h o w n t o m a t u r e i n t o a n a d i p o c y t e - 1 i k e c e l l t y p e . M o r e d i r e c t e v i d e n c e o f a s t i m u l a t o r y e f f e c t o f G I P o n r a t a d i p o c y t e L P L A w a s o b t a i n e d u s i n g a n i n c u b a t e d , i s o l a t e d , f a t c e l l m i x t u r e . T h e c o l o u r i m e t r i c p r o c e d u r e u s e d i n t h e s e s t u d i e s f o r d e t e r m i n a t i o n o f L P L A t h r o u g h m e a s u r e m e n t o f f r e e -f a t t y a c i d l i b e r a t i o n f r o m t r i g l y c e r i d e w a s c a p a b l e o f d e t e c t i n g a n i n c r e a s e i n L P L A i n r e s p o n s e t o 50 n g / m l G l P ( f i g u r e 8 2 ) . 2 4 1 N u t r i t i o n a l s t a t u s h a s b e e n s h o w n t o a f f e c t l i p o p r o t e i n l i p a s e a c t i v i t y . I n t h e f e d s t a t e , l i p o p r o t e i n l i p a s e a c t i v i t y i n c r e a s e d i n a d i p o s e t i s s u e a n d d e c l i n e d i n m u s c l e ( R o b i n s o n , 1 9 7 0 ) l e a d i n g t o t h e p r e f e r e n t i a l u p t a k e o f t r i a c y l g l y c e r o l f a t t y a c i d s f o r s t o r a g e i n a d i p o c y t e s . R e v e r s a l o f t h i s s i t u a t i o n i n t h e f a s t e d s t a t e l e d t o p r e f e r e n t i a l u p t a k e o f t r i a c y l g l y c e r o l f a t t y a c i d s b y m u s c l e f o r o x i d a t i v e u s e . I n a d d i t i o n t o G I P , s e v e r a l o t h e r G E P p e p t i d e s h a v e b e e n s h o w n t o e x e r t e f f e c t s u p o n a d i p o s e t i s s u e L P L A . F o r e m o s t a m o n g t h e s e w a s i n s u l i n , p l a s m a l e v e l s o f w h i c h c o r r e l a t e d p o s i t i v e l y w i t h L P L A i n v i v o . ( C r y e r e t a l . , 1 9 7 6 ) , a n d w h i c h s t i m u l a t e d L P L A f r o m a d i p o s e t i s s u e i n v i t r o ( S a l a m a n a n d R o b i n s o n , 1 9 6 6 ) . I t i s p o s s i b l e t h a t p o s t - p r a n d i a 1 i n c r e a s e s i n L P L A i n v i v o c o u l d b e d u e i n p a r t t o t h e s t i m u l a t o r y a c t i o n o f i n s u l i n , b u t t h e c o m p l e x i t y o f i n t e r a c t i o n w i t h o t h e r s t i m u l -a t o r y a n d i n h i b i t o r y f a c t o r s w o u l d m a k e t h i s e f f e c t e q u i v o c a l . O n e t e c h n i q u e u s e d d u r i n g t h e d e v e l o p m e n t o f a G I P - s e n s i t i v e s y s t e m f o r t h e d e t e c t i o n o f L P L A f r o m i s o l a t e d r a t f a t p a d a d i p o c y t e s i n c l u d e d p r e - i n c u b a t i o n w i t h 1 mU/ml p o r c i n e i n s u l i n . L P L A o b t a i n e d i n t h e s e s a m p l e s ( f i g u r e ' 8 ' 1 ) w a s g r e a t e r t h a n f o r t h e c o r r e s p o n d i n g d o s e s o f G I P i n t h o s e s a m p l e s n o t p r e - i n c u b a t e d w i t h i n s u l i n ( f i g u r e 8 2 ) . K i n e t i c a n a l y s i s o f t h e t w o s i t u a t i o n s w a s n o t p o s s i b l e • b e c a u s e o f t h e b i p h a s i c n a t u r e o f t h e d o s e -r e s p o n s e c u r v e s , s o a n i n d e x o f t h e e f f e c t o f c o m b i n e d i n s u l i n a n d G I P o n L P L A w a s o b t a i n e d b y c o m p a r i n g t h e d i f f e r e n c e s i n L P L A o b t a i n e d f o r a g i v e n d o s e o f G I P i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f i n s u l i n ( t a b l e 1 9 ) . I n b o t h e l u t a b l e a n d a c e t o n e - e t h e r e x t r a c t a b l e f o r m s , L P L A w a s e n h a n c e d t o a p p r o x i m a t e l y t h e s a m e 242 d e g r e e b y i n s u l i n r e g a r d l e s s o f t h e d o s e o f G I P . T h e r e s u l t s m i g h t s u g g e s t t h a t no p o t e n t i a t i v e e f f e c t e x i s t e d b e t w e e n G I P a n d i n s u l i n . C e r t a i n l y t h e e l e v a t i o n b y i n s u l i n o f m a x i m a l G I P - s t i m u 1 a t e d L P L A w o u l d i n d i c a t e t h a t t h e t w o p e p t i d e s e l e v a t e d L P L A b y d i f f e r e n t m e c h a n i s m s . Two t e c h n i q u e s o f m e a s u r i n g L P L A f r o m i s o l a t e d a d i p o -c y t e s w e r e u s e d i n t h e s e s t u d i e s . T h e f i r s t m e a s u r e d h e p a r i n -e l u t a b l e L P L A , a q u a n t i t y t h o u g h t t o c o r r e s p o n d t o t h e p h y s i o l o g i c a l l y a c t i v e , e x t r a c e l l u l a r e n z y m e . T h e s e c o n d m e a s -u r e d t o t a l c e l l u l a r L P L A b y q u a n t i t a t i o n o f a c t i v i t y i n a c e t o n e -e t h e r e x t r a c t s o f t h e c e l l s . T h i s q u a n t i t y i s t h o u g h t t o r e p r e s e n t a s u m o f t h e h e p a r i n - e l u t a b l e L P L A a n d t h e i n t r a c e l l u l a r i n a c t i v e L P L A . I n b o t h c a s e s L P L A w a s e l e v a t e d b y G I P . R e s u l t s f r o m t h e s e s t u d i e s w o u l d i n d i c a t e t h a t G I P i s c a p a b l e o f i n c r e a s -i n g L P L A f r o m r a t a d i p o c y t e s i n v i t r o . U n d e r s t a n d i n g o f G I P ' s r o l e i n v i v o i n t h i s r e g a r d a w a i t s f u r t h e r e x p e r i m e n t a t i o n . T h e r e s o l v i n g p o w e r o f h i g h p r e s s u r e l i q u i d c h r o m a -t o g r a p h y ( H P L C ) h a s l e d t o i t s u t i l i z a t i o n i n t h e i n v e s t i g a t i o n o f a m u l t i p l i c i t y o f s c i e n t i f i c f i e l d s . A p p l i c a t i o n o f t h i s t e c h n i q u e t o t h e s t u d y o f v a r i o u s a s p e c t s o f G E P p e p t i d e s h a s b e c o m e w i d e - s p r e a d w i t h i n t h e l a s t ; f i v e y e a r s . I m p e t u s f o r t h i s p r o c e s s h a s c o m e i n p a r t f r o m t e c h n o l o g i c a l a d v a n c e s , s u c h a s t h e c o m m e r c i a l a v a i l a b i l i t y o f h i g h q u a l i t y s i l i c a - C - j g h i g h p r e s s u r e c o l u m n p a c k i n g s , a n d i n p a r t f r o m t h e o b v i o u s s u p e r i o r -i t y o f t h e r e s o l u t i o n o b t a i n e d f r o m r e v e r s e d - p h a s e H P L C . T h e r e s o l v i n g p o w e r o f r e v e r s e d - p h a s e g r a d i e n t H P L C w a s u s e d i n t h e s e s t u d i e s t o a n a l y z e , p u r i f y a n d i d e n t i f y p e p t i d e c o m p o n e n t s w h i c h w o u l d p r o b a b l y h a v e b e e n o t h e r w i s e i n d i s t i n g u i s h a b 1 e . 2 4 3 O n e i n s t r u c t i v e u s e o f H P L C r e s o l u t i o n w a s i n t h e a n a l y s i s o f t h e p u r i f i c a t i o n s t a g e s o f G I P . F i g u r e s 1 8 , 19 a n d 20 r e v e a l t h e e f f e c t o f c o n v e n t i o n a l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y i n e l i m i n a t i n g t h e m a j o r i t y o f p r o t e i n a c e o u s c o m p o n e n t s f r o m t h e h e t e r o g e n o u s s t a r t i n g m a t e r i a l . F u r t h e r u s e o f H P L C c o u l d t h e n a l l o w f i n a l p u r i f i c a t i o n o f a s i n g l e - c o m p o n e n t GI P -j ^ m o l e c u l e ( f i g u r e s 2 1 , 2 3 ) . S i m i l a r l y , H P L C w a s u s e d t o m o n i t o r t h e e f f e c -t i v e n e s s o f c o n v e n t i o n a l c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y i n c o n c e n t r a t i n g L - C C K f r o m t h e G I P s i d e - f r a c t i o n E G I + I I , f r a c t i o n C , a n d a l l o w e d t h e f i n a l p u r i f i c a t i o n o f m i l l i g r a m q u a n t i t i e s o f a s i n g l e p e p t i d e f r o m a r e l a t i v e l y h e t e r o g e n o u s m i x t u r e ( R e s u l t s : S e c t i o n I I , C ) . O n e i n t e r e s t i n g t e c h n i q u e - d e v e l o p e d i n t h i s r e g a r d w a s t h e H P L C a n a l y s i s o f c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y f r a c t i o n s d i r e c t l y f r o m t h e c o l u m n e l u a t e , w h i c h a l l o w e d q u i c k d e t e r m i n a t i o n o f t h e c o n t e n t o f f r a c t i o n s p r i o r t o p o o l i n g ( f i g u r e s 3 6 - 3 9 ) . T h e i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f L - C C K - o f w h i c h t h e H P L C s t u d i e s i n t h i s t h e s i s c o n s t i t u t e d o n l y o n e p a r t - r e p r e s e n t e d a r e v e r s a l o f t h e t r a d i t i o n a l s e q u e n c e o f e v e n t s i n v o l v e d i n i d e n t i f y i n g a G E P p e p t i d e . T h e i s o l a t i o n o f m o s t s u c h p e p t i d e s r e s u l t e d f r o m a s e a r c h f o r a m e d i a t o r o f a b i o l o g i c a l e v e n t o r , m o r e r e c e n t l y , a s e a r c h f o r a p e p t i d e i d e n t i f i e d a n d c h a r a c t e r i z e d i n o t h e r t i s s u e s . L - C C K i s a p e p t i d e w i t h , a s y e t , u n k n o w n b i o l o g i c a l a c t i v i t i e s . I t s p u r i f i c a t i o n r e s u l t e d f r o m i t s c h e m -i c a l p r o p e r t i e s a n d p r e s e n c e i n s i d e - f r a c t i o n s w h e r e CCK w a s t h o u g h t t o e x i s t . A s s u c h , i t j o i n e d t w o r e c e n t l y d i s c o v e r e d g u t ' p e p t i d e s , P H I a n d P Y Y , w h i c h a l s o w e r e i s o l a t e d o n t h e b a s i s o f c h e m i c a l p r o p e r t i e s ( C - t e r m i n a l a m i d e s ) ( M u t t , 1 9 8 1 ) . 2 4 4 L i t t l e c a n b e s a i d a b o u t t h e p r o p e r t i e s o f L - C C K s i n c e r e s e a r c h i n t o t h e a c t i o n s o f t h e p e p t i d e a r e j u s t b e g i n n i n g . T h e a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f t h e p e p t i d e w h i c h w a s o b t a i n e d f r o m t h e H P L C - p u r i f i e d s a m p l e ( B r o w n e t a l . ) d i d n o t r e s e m b l e C C K o r o t h e r G E P p e p t i d e s . T r y p t i c d i g e s t i o n o f t h e p e p t i d e ( f i g u r e 6 7 ) r e s u l t e d i n a p p r o x i m a t e l y f o u r m a j o r c o m p o n -e n t s w h e n a n a l y z e d b y H P L C . L - C C K d i d n o t c o - e l u t e w i t h C C K g , C C K ^ g o r C C K ^ g ( f i g u r e s 3 1 , 3 2 , 3 3 ) a l t h o u g h e a r l y p u r i f i c a t i o n a t t e m p t s h a d b e e n a i m e d a t c o n c e n t r a t i n g g a l l b l a d d e r - c o n t r a c t i n g a c t i v i t y . P r e s e n t i n d i c a t i o n s w o u l d s u g g e s t t h a t g a l 1 b l a d d e r -c o n t r a c t i n g b i o a c t i v i t y w a s c o n c e n t r a t e d i n t h o s e p r o t e i n c o m p o n e n t s w h i c h w e r e r e m o v e d b y H P L C p u r i f i c a t i o n . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n s i n t o p r o p e r t i e s a n d a c t i o n s o f L - C C K w i l l p r o b -a b l y b e c o n c e r n e d w i t h e s t a b l i s h i n g b i o a c t i v i t y , c e l l u l a r l o c a l i z a t i o n , a m i n o a c i d s e q u e n c e a n d s t r u c t u r e . H P L C d e m o n s t r a t e d t h a t m a n y c o m p o n e n t p e a k s e x i s t e d i n t h e i n i t i a l G I P p u r i f i c a t i o n s t a g e , E G I . L - C C K , GIP-j ^ a n d G I P g ^ w o u l d r e p r e s e n t o n l y t h r e e o f t h o s e c o m p o n e n t s , s o i t w a s e v i d e n t t h a t t h e s i d e - f r a c t i o n s r e m o v e d f r o m E G I a n d E G I I d u r i n g G I P p u r i f i c a t i o n c o n t a i n e d a ' v a r i e t y o f u n i d e n t i f i e d p r o t e i n s . W h i l e s o m e o f t h e s e p r o t e i n p e a k s m a y h a v e r e p r e s e n t e d k n o w n G E P p e p t i d e s ( l i k e G I P ^ 42) ^ 1 S p o s s i b l e t h a t o t h e r s r e p r e s e n t " n e w " g u t d e r i v e d p r o t e i n s . C e r t a i n l y t h e s e p r e p a r a t i o n s r e p r e s e n t e d a s o u r c e o f m a t e r i a l c o n t a i n i n g p o s s i b l e u n k n o w n m o d u l a t o r s o f p h y s i o l o g i c a l e v e n t s . A p r e l i m i n a r y a t t e m p t w a s m a d e t o c h e c k t h e i n s u l i n o -t r o p i c p o t e n c y o f a G I P - f r e e s i d e - f r a c t i o n ( f i g u r e s 1 0 , 2 5 , 2 6 ) . 245 T h e a p p r o a c h u s e d w a s t o i d e n t i f y t h e e l u t i o n t i m e o f G I P ^ ^ a n d G I P ^ 42 f ° r a p a r t i c u l a r i s o c r a t i c a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n a n d t o p o o l t h e p r o t e i n s e l u t i n g p r i o r t o t h e t w o G I P m o l e c u l e s . T h e r e s u l t i n g m i x t u r e w a s b i o a s s a y e d u s i n g a g r a d i e n t s y s t e m f o r p r e s e n t a t i o n t o i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s . A p p l i c a t i o n o f t h e G I P - f r e e m i x t u r e ( t e r m e d E G I I + I I I A a ) i n a l i n e a r 0-*l O Ong/m) -g r a d i e n t o v e r 30 m i n u t e s r e s u l t e d i n a s i g n i f i c a n t i n s u l i n o t r o p i c r e s p o n s e o b s e r v e d a t a s l o w a p e p t i d e c o n c e n t r a t i o n a s l O n g / m l . T h e r e s u l t s m u s t b e . v i e w e d a s p r e l i m i n a r y f o r s e v e r a l r e a s o n s . F i r s t , t h e p o s s i b i l i t y o f s m a l l c o n t a m i n a t i o n o f t h e p r e p a r a t i o n w i t h G I P g 42 P r o b a b l y c a n n o t b e e x c l u d e d u n t i l i s o l a t i o n o f t h e p r o t e i n c o m p o n e n t s o f E G I I + I I I A a b y H P L C i s c o m p l e t e . S e c o n d , t h e p o s s i b i l i t y c o u l d e x i s t o f a n o t h e r i n s u l i n o t r o p i c G I P h o m o l d g u e s i m i l a r , b u t l e s s h y d r o p h o b i c , t h a n G I P ^  42 n a v i " n 9 e l u t e d i n t h e m i x t u r e . P u r i f i c a t i o n o f t h e u n k n o w n i n s u l i n o t r o p i c a g e n t b y c o n v e n t i o n a l c h r o m a t o g r a p h y a n d b i o a s s a y w o u l d b e d i f f i c u l t s i n c e e n s u r i n g a G I P - f r e e i n s u l i n o t r o p i c p r e p a r a t i o n w o u l d n o t b e p o s s i b l e . T h e u s e o f l a r g e p r e p a r a t o r y H P L C c o l u m n s now a v a i l a b l e f o r t h e p u r i f i c a t i o n o f l a r g e a m o u n t s o f p r o t e i n m i g h t r e p r e s e n t a b e t t e r a p p r o a c h f o r t h e d e t e c t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f a n u n k n o w n i n s u l i n o t r o p i c a g e n t i n " G I P - f r e e " E G I I + I I I , f r a c t i o n A . C o m p a r i s o n o f t h e e l u t i o n c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e a g e n t w i t h t h o s e o f o t h e r i n s u 1 i n o t r o p i c G E P p e p t i d e s w o u l d b e a n o t h e r n e c e s s a r y s t e p i n s u c h a p u r i f i c a t i o n . T h e i d e n t i f i c a t i o n b y J & r n v a l l e t a l . ( 1 9 8 1 ) o f t h e m a j o r c o n t a m i n a n t o f E G I I I a s G I P ^ 42 p r o m p t e d a n i n v e s t i g a t i o n o f t h e r e l a t i v e i n s u 1 i n o t r o p i c p o t e n c i e s o f t h e t w o s u b s t a n c e s . 2 4 6 T h e l i n e a r g r a d i e n t s y s t e m o f a d m i n i s t r a t i o n o f p e p t i d e s o r g l u c o s e t o t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s w a s d e v e l o p e d b y D r . R. P e d e r s o n a n d p r o b a b l y a p p r o x i m a t e d t h e p h y s i o l o g i c a l s i t u a t i o n b e t t e r t h a n w o u l d a s q u a r e - w a v e p a t t e r n o f i n f u s i o n . T h e g r a d i e n t s y s t e m w o u l d s e e m a n a p p r o p r i a t e m o d e l f o r a p p r o x i -m a t e d e t e r m i n a t i o n o f t h e t h r e s h o l d p e p t i d e c o n c e n t r a t i o n n e e d e d t o c r e a t e a n i n s u l i n o t r o p i c r e s p o n s e a t a g i v e n g l u c o s e c o n c e n -t r a t i o n . D e t e r m i n a t i o n o f t h e t h r e s h o l d c o n c e n t r a t i o n w o u l d b e a p p r o x i m a t e b e c a u s e o f t h e l a g t i m e , i n t h e o r d e r o f 1 0 0 s e c , w h i c h h a s b e e n t h o u g h t t o e x i s t b e t w e e n a n i n s u l i n o t r o p i c s t i m u l u s a n d i t s r e s p o n s e ( G r o d s k y e t a l . , 1 9 6 3 ) . N e v e r t h e l e s s , d i f f e r e n c e s i n t h e t h r e s h o l d - c o n c e n t r a t i o n s a n d r e l a t i v e i n s u l i n o t r o p i c p o t e n c i e s o f G I P -j 4 2 a n c l G I P 3 _ 4 2 w e r e r e a d i l y a p p a r e n t ( f i g u r e 9 ) . T h e t h r e s h o l d - GIP-| ^ c o n c e n t r a t i o n r e q u i r e d t o s i g n i f i c a n t l y e l e v a t e i n s u l i n r e l e a s e w a s c a l c u l a t e d a s b e i n g a p p r o x i m a t e l y 1 . 3 3 n g / m l . T h e t h r e s h o l d G I p 3 _ 4 2 c o n c e n t r a t i o n w a s a p p r o x i m a t e l y 4 . 3 3 n g / m l . A m a r k e d d i f f e r e n c e i n t h e i n s u l i n s e c r e t i o n e v o k e d b y s i m i l a r c o n c e n t r a t i o n s o f t h e t w o p e p t i d e s w a s e v i d e n t a s t h e g r a d i e n t c o n t i n u e d , i n d i c a t i n g t h a t G I P ^ 42 w a s a r e l a -t i v e l y p o o r i n s u l i n s e c r e t a g o g u e . S i m i l a r l y i t h a d b e e n s h o w n t h a t G I P 3 42 c o m p l e t e l y l a c k e d t h e a b i l i t y t o s t i m u l a t e s o m a t o -s t a t i n s e c r e t i o n f r o m t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t s t o m a c h ( B r o w n e t a l . , 1 9 8 1 b ) . I t s e e m e d l i k e l y t h a t G I P 3 4 2 , w h i c h l a c k e d t h e t w o N - t e r m i n a l a m i n o a c i d s ( T y r - A l a ) o f G I P ^ 4 2> h a d a g r e a t l y r e d u c e d b i o l o g i c a l a c t i v i t y . S u c h a n e f f e c t w o u l d p r o b a b l y r e s u l t f r o m c h a n g e s i n t h e t e r t i a r y s t r u c t u r e o f G I P a s a r e s u l t o f r e m o v a l o f t h e t w o N - t e r m i n a l a m i n o a c i d s . S p e c u l a t i o n a b o u t 2 4 7 t h e f u n c t i o n o f t h e s e a m i n o a c i d s i n t h i s r e g a r d i s p o s s i b l e -t y r o s i n e , a t n e u t r a l p H , i s c a p a b l e o f f o r m i n g h y d r o g e n b o n d s w i t h t h e c a r b o x y l g r o u p s o f o t h e r a m i n o a c i d s a n d t h e l a c k o f s u c h b o n d i n g i n G I P ^ ^ c o u l d a l t e r t h e c o n f i r m a t i o n o f t h e m o l e c u l e . M o r e k n o w l e d g e a b o u t t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p o f G I P c o u l d b e o b t a i n e d i f f u r t h e r a t t e m p t s a t c h e m i c a l s y n t h e s i s a r e m a d e , a t t e m p t s w h i c h w o u l d b e m o d e l l e d o n t h e r e v i s e d s e q u e n c e o f J o r n v a i l e t a l . ( 1 9 8 1 ) . H P L C w a s u s e d t o a n a l y z e t h e r e s u l t o f m o d i f i c a t i o n s m a d e i n G I P b y v a r i o u s c h e m i c a l p r o c e d u r e s . C y a n o g e n b r o m i d e ( C N B r ) t r e a t m e n t h a d b e e n s h o w n t o c l e a v e t h e p e p t i d e c h a i n s a t t h e C - t e r m i n a l s i d e o f m e t h i o n i n e r e s i d u e s ( G r o s s , 1 9 6 7 ) . T h e s o l e m e t h i o n i n e r e s i d u e i n G I P w a s l o c a t e d a t p o s i t i o n 1 4 , s o t h e C N B r p r o c e d u r e w o u l d b e e x p e c t e d t o y i e l d t w o p e p t i d e f r a g m e n t s . H P L C a n a l y s i s o f t h e f r a g m e n t s w h i c h h a d b e e n s e p a r -a t e d b y c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y r e v e a l e d t w o p e a k s w i t h i n t h e C - t e r m i n a l m i x t u r e a n d t h e p r e s e n c e o f s e v e r a l p e a k s w i t h i n t h e N - t e r m i n a l m i x t u r e - o n e s e t o f w h i c h c o e l u t e d a p p r o x i m a t e l y w i t h u n c l e a v e d E G I I I ( f i g u r e s 4 5 - 4 7 ) . T h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t p r i o r p u r i f i c a t i o n h a d r e s u l t e d i n d i f f e r e n t c o m p o n e n t s b e i n g p r e s e n t i n t h e N - t e r m i n a l a n d C - t e r m i n a l m i x -t u r e s . T h e m i x t u r e s t h e m s e l v e s c o n t a i n e d s e v e r a l c o m p o n e n t s o f u n k n o w n i d e n t i t y w h i c h c o u l d i n t h e f u t u r e b e f u r t h e r s e p a r a t e d b y H P L C . S i n c e o x i d a t i o n o f t r y p t o p h a n ( r e s i d u e s 25 a n d 3 6 ) w a s a p o s s i b i l i t y w i t h C N B r t r e a t m e n t , t h e d u a l p e a k s o f t h e C - t e r -m i n a l m i x t u r e c o u l d r e f l e c t t h i s s t a t e . H P L C a n a l y s i s o f N - c h l o r o s u c c i n i m i d e ( N C S ) - c l e a v e d G I P 248 w a s p r e v i o u s l y p e r f o r m e d b y J o r n v a l 1 e t . a l . ( 1 9 8 1 ) u s i n g a n a m m o n i u m a c e t a t e , e t h a n o l a n d a c e t i c a c i d s y s t e m . NCS w a s u s e d t o c l e a v e t h e p e p t i d e c h a i n a t t r y p t o p h a n , s o t h e s u b s e q u e n t p r e s e n c e o f a v a r i e t y o f p e p t i d e p r o d u c t s w h e n a n a l y z e d o n t h e a c e t o n i t r i l e , w a t e r a n d t r i f l u o r o a c e t i c a c i d s y s t e m ( f i g u r e 5 1 ) c o u l d h a v e r e s u l t e d f r o m c o m b i n a t i o n s o f c l e a v a g e s a t d i f f e r e n t t r y p t o p h a n r e s i d u e s . J o r n v a l l e t a l . f o u n d a s i m i l a r p r o f i l e o f l a r g e a n d s m a l l c l e a v a g e p r o d u c t s , a n d w e r e a b l e t o i d e n t i f y t w o o f t h e m a s G I p 2 6 36 a n ^ G I P ^ A s i n t h e c a s e o f C N B r c l e a v a g e o f G I P , H P L C c o u l d b e u s e d i n t h e f u t u r e a s a m e t h o d o f p u r i f i c a t i o n o f c l e a v a g e f r a g m e n t s f o r u s e i n t h e s t u d y o f s t r u c t u r e - f u n c t i o n r e l a t i o n s h i p s i n t h e G I P m o l e c u l . e . T r y p t i c d i g e s t i o n o f G I P r e s u l t e d i n t h e p r o d u c t i o n o f e i g h t p e p t i d e s w h e n s e p a r a t e d b y h i g h v o l t a g e p a p e r e l e c t r o -p h o r e s i s a n d s t a i n e d w i t h c a d m i u m - n i n h y d r i n ( B r o w n , 1 9 7 1 ) . H P L C a n a l y s i s o f a r e c e n t t r y p t i c c l e a v a g e o f G I P r e v e a l e d 5 m a j o r p e a k s a s w e l l a s s e v e r a l m i n o r p e a k s a t t h e l i m i t o f d e t e c t i o n s e n s i t i v i t y ( f i g u r e 5 4 ) . A g a i n t h e s e p e a k s c o u l d b e s u f f i c i e n t l y r e s o l v e d b y H P L C t o a l l o w p u r i f i c a t i o n o f t h e p e p t i d e s i f d e s i r e d . No u n c l e a v e d G I P w a s p r e s e n t i n t h e m i x t u r e . T h e s u s c e p t i b i l i t y o f G I P t o d e g r a d a t i o n w h e n l e f t i n s o l u t i o n a t r o o m t e m p e r a t u r e ( f i g u r e s 5 5 , 5 6 ) i n d i c a t e d t h e i m p o r t a n c e o f 1 y o p h i 1 i z a t i o n f o r p r o t e c t i o n o f t h e m o l e c u l e d u r i n g s t o r a g e . C l e a v a g e o f t h e m o l e c u l e t o l e s s h y d r o p h o b i c c o m p o n e n t s w a s c o m p l e t e w i t h i n o n e w e e k . T h e m e c h a n i s m b y w h i c h s u c h c l e a v a g e o c c u r r e d i s u n c l e a r . 2 4 9 I n c o r p o r a t i o n o f r a d i o n u c l i d e s o f i o d i n e h a s b e e n t h e m e t h o d o f c h o i c e f o r p r o d u c i n g r a d i o a c t i v e l y l a b e l l e d p o l y p e p t i d e m o l e c u l e s f o r u s e i n r a d i o i m m u n o a s s a y a n d i n b i o l o g i c a l s t u d i e s . T h e r e h a v e b e e n s e v e r a l a d v a n t a g e s w h i c h l e d t o t h e c h o i c e o f r a d i o i o d i n e s a s " l a b e l l i n g " a g e n t s . F o r e m o s t a m o n g t h e s e h a s b e e n t h e h i g h s p e c i f i c a c t i v i t y o b t a i n e d f r o m r a d i o i o d i n a t e d p e p t i d e s - - a n e c e s s a r y r e q u i r e m e n t f o r t h e m e a s u r e m e n t o f p i c o m o l a r o r f e m t o m o l a r p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n s b y r a d i o i m m u n o -a s s a y . T h e l o n g e r h a l f - l i f e ( 6 0 d a y s ) a n d c o u n t i n g e f f i c i e n c y ( 8 0 % ) , i n a N a l w e l l - t y p e s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r , o f t h e i s o t o p e 12 5 I h a v e g e n e r a l l y l e d t o i t s p r e f e r e n t i a l u s e o v e r t h e i s o t o p e 131 I . A l t h o u g h u n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n s i o d i n e m a y r e a c t w i t h s u l p h y d r y l g r o u p s , h i s t i d i n e o r t r y p t o p h a n , r e a c t i o n c o n d i t i o n s h a v e u s u a l l y b e e n c h o s e n t o f a v o u r t h e c h e m i s t r y o f s u b s t i t u t i o n o f i o d i n e i n t o t y r o s i n e g r o u p s b y o p e r a t i n g a t s l i g h t l y a l k a l i n e p H . H o w e v e r , t h i s p r o c e d u r e h a s h a d s e v e r a l a s s o c i a t e d d i s a d -v a n t a g e s . i n t e r m s o f b o t h h o m o g e n e i t y o f i o d i n a t i o n a n d d e r i v a -t i z a t i o n o f a m i n o a c i d r e s i d u e s . T h e e f f e c t s o f i o d i n a t i o n o r d e r i v a t i z a t i o n o n b i o l o g i c a l o r i m m u n o l o g i c a l a c t i v i t y h a v e v a r i e d w i t h t h e p e p t i d e t r e a t e d . F o r e x a m p l e : i o d i n a t i o n h a s r e c e n t l y b e e n s h o w n t o d e c r e a s e h u m a n p r o l a c t i n b i o a c t i v i t y a n d r a d i o r e c e p t o r b i n d i n g a s s a y a c t i v i t y t o 7 5 % a n d 6 8 % r e s p e c t i v e l y o f n o r m a l w h i l e a l t e r i n g h u m a n g r o w t h h o r m o n e b i o a c t i v i t y a n d r a d i o r e c e p t o r a s s a y b i n d i n g a c t i v i t y t o 9 0 % a n d 1 1 4 % r e s p e c t i v e l y o f n o r m a l ( H u g h e s e t a l , 1 9 8 2 ) . T h i s e f f e c t w a s s h o w n t o b e a r e s u l t o f i o d i n a t i o n a n d n o t o f o x i d a t i o n . I n a l l , a n u m b e r o f f a c t o r s c o u l d a l t e r t h e b i o l o g i c a l o r i m m u n o l o g i c a l p r o p e r t i e s 2 5 0 o f a n i o d i n a t e d p e p t i d e : 1. C o n f i r m a t i o n a l c h a n g e s r e s u l t i n g f r o m t h e a d d i t i o n o f a b u l k y h a l o g e n m o l e c u l e 2 . L o w e r i n g o f t y r o s y l pK d u e t o i n t r o d u c t i o n o f i o d i n e 3. R a d i a t i o n d a m a g e 4. D a m a g e d u e t o o x i d a t i o n a n d r e d u c t i o n 5. H e t e r o g e n e i t y o f i o d i n e d i s t r i b u t i o n o n v a r i o u s t y r o s i n e r e s i d u e s i n t h e m o l e c u l e . I d e n t i f i c a t i o n a n d a v o i d a n c e o f s u c h c h a n g e s w o u l d b e a v a l u a b l e a i d i n t h e d e v e l o p m e n t o f s e n s i t i v e ' c o m p e t i t i v e b i n d i n g t e c h -n i q u e s f o r u s e i n v a r i o u s s y s t e m s . H P L C w a s c h o s e n a s a p o s s i b l e m e t h o d f o r s e p a r a t i n g a n d i d e n t i f y i n g v a r i o u s c o m p o n e n t s o f i o d i n a t e d G I P m i x t u r e s . T h e c h l o r a m i n e - T m e t h o d o f i o d i n a t i o n ( H u n t e r a n d G r e e n -w o o d , 1 9 8 2 ) h a s b e e n t h o u g h t t o r e l y o n t h e s l o w c o n v e r s i o n i n a q u e o u s s o l u t i o n o f t h i s N - m o n o c h 1 o r o d e r i v a t i v e o f p - t o l u e n e s u l p h o n a m i d e t o t h e m i l d o x i d i z i n g a g e n t h y p o c h l o r o u s a c i d . T h i s o x i d a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f m i l d l y a l k a l i n e c o n d i t i o n s ( p H 7 . 5 ) w o u l d a l s o r e s u l t i n f o r m a t i o n o f I + f r o m N a l a n d i n i o n i z a t i o n o f a s m a l l p r o p o r t i o n o f t h e t y r o s i n e r e s i d u e s i n t h e m i x t u r e . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e i o d i n a t i o n r e a c t i o n p r o c e e d s t h r o u t h i s s m a l l p r o p o r t i o n o f i o n i z e d g r o u p s ( R u d i n g e r , 1 9 7 1 ) . R e a c -t i o n c o n d i t i o n s h a v e u s u a l l y b e e n t a i l o r e d t o i n d i v i d u a l p e p t i d e s w i t h t h e a i m o f p r o v i d i n g a s h o r t e x p o s u r e t o m i l d o x i d i z i n g c o n d i t i o n s t o m i n i m i z e d e r i v a t i z a t i o n o f a m i n o a c i d r e s i d u e s a n d t o r e d u c e i o d i n e i n c o r p o r a t i o n t o o n e m o l e c u l e p e r m o l e c u l e o f p e p t i d e . 2 5 1 O x i d i z i n g c o n d i t i o n s c o u l d p o t e n t i a l l y r e s u l t i n s e v e r a l a l t e r a t i o n s i n a m i n o a c i d f o r m ( f i g u r e 9 4 ) . A s i n t h e c a s e o f i o d i n a t i o n , t h e e f f e c t o f o x i d a t i o n u p o n b i o l o g i c a l a n d i m m u n o l o g i c a l a c t i v i t y ' v a r i e d w i t h t h e p e p t i d e t r e a t e d . O x i d a -t i o n o f m e t h i o n i n e t o m e t h i o n i n e s u l p h o x i d e r e s u l t e d i n a l o s s o f b i o a c t i v i t y i n t h e c a s e o f g a s t r i n ( M o r l e y , 1 9 7 0 ) b u t o x i d a -t i o n w a s w i t h o u t e f f e c t o n t h e b i o a c t i v i t y o f h u m a n g r o w t h h o r m o n e a n d h u m a n p r o l a c t i n ( H u g h e s e t a l . , 1 9 8 2 ) . O x i d a t i o n d e c r e a s e d t h e h y d r o p h o b i c i t y o f t h e G I P m o l e c u l e a s e v i d e n c e d b y i t s e l u t i o n a t p r o g r e s s i v e l y l o w e r a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n s a s t h e p e r i o d o f e x p o s u r e t o c h l o r -a m i n e - T w a s i n c r e a s e d ( f i g u r e s 6 4 - 6 5 ) . P r e s u m a b l y t h e i n c r e a s e d h y d r o p h i l i c n a t u r e o f t h e m o l e c u l e a f t e r o x i d a t i o n r e s u l t e d f r o m t h e i n c r e a s e d p o l a r i t y o f t h e d e r i v a t i z e d a m i n o a c i d s t o w h i c h o x y g e n h a d b e e n a d d e d . H P L C d i d n o t d e t e c t t h e p r e s e n c e o f u n o x i d i z e d G I P i n t h e o x i d i z e d m i x t u r e . H o w e v e r , o x i d a t i o n o f t e n p r o d u c e d a h e t e r o g e n e o u s " c l u s t e r " o f s m a l l c o m p o n e n t s e l u t i n g a t h i g h e r a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n s t h a n d i d t h e - m a j o r o x i d i z e d G I P c o m p o n e n t ( f i g u r e 7 3 ) . T h i s m a y h a v e r e s u l t e d f r o m t h e p r e s e n c e o f s m a l l a m o u n t s o f m e t h i o n i n e s u l p h o n e , w h i c h w o u l d b e p r o d u c e d i n t h e p r e s e n c e o f s t r o n g e r o x i d i z i n g c o n d i t i o n s t h a n t h o s e w h i c h w o u l d p r o d u c e m e t h i o n i n e s u l p h o x i d e , o r f r o m f r a g m e n t a t i o n o f t h e m o l e c u l e , w h i c h c o u l d p o t e n t i a l l y r e s u l t f r o m d e s t r u c t i o n o f t h e t r y p t o p h a n y l p e p t i d e b o n d ( S a v i g e a n d F o n t a n a , 1 9 7 7 ) . I o d i n a t i o n o f G I P p r o d u c e d a s e c o n d s e t o f s p e c t r o -p h o t o m e t r y p e a k s c o - e l u t i n g w i t h r a d i o a c t i v e p e a k s . T h e i n c r e a s e d h y d r o p h o b i c i t y o f t h e s e p e a k s ' r e l a t i v e t o t h e o x i d i z e d 252 0 H 2N-C,H-C-0H Oxy i n d o l yla 1 am" ne ( f r o m t r y p t o p h a n ) H 2 N - C H - C - 0 H C H 2 i C H ? S + 0 I CH, 0 M e t h i o n i n e S u l p h o x i d e 3 ( f r o m m e t h i o n i n e ) 0 M e t h i o n i n e S u l p h o n e H N-CH-C-OH ( f r o m m e t h i o n i n e ) i C H ? C H 2 0 = S + 0 C H 3 FIGURE 9 4 : Some P o t e n t i a l D e r i v a t i z a t i o n s o f Amino A c i d s i n ' R e s p o n s e t o O x i d a t i o n 2 5 3 G I P p e a k s w o u l d r e s u l t f r o m t h e a d d i t i o n o f t h e r e l a t i v e l y b u l k y h a l o g e n a t o m ( s ) o f i o d i n e . . T h e h e t e r o g e n o u s n a t u r e o f t h e p e a k s p r o b a b l y r e p r e s e n t e d v a r y i n g d e g r e e s o f i n c o r p o r a t i o n o f i o d i n e a m o n g t h e G I P m o l e c u l e s . H o w e v e r , a l a r g e p r o p o r t i o n o f t h e p e p t i d e w i t h i n t h e m i x t u r e w a s n o t i o d i n a t e d b u t m e r e l y o x i d i z e d , a s e v i d e n c e d b y t h e r e l a t i v e a r e a s b e n e a t h t h e o x i d i z e d a n d i o d i n a t e d s p e c t r o p h o t o m e t r y p e a k s . A f t e r p u r i f i c a t i o n o f t h e t w o s e t s o f c o m p o n e n t s ( f i g u r e 7 6 ) t h e i n s u l i n o t r o p i c a c t i v i t y o f t h e o x i d i z e d a n d i o d i n a t e d E G I I I p r o t e i n s w a s a s s a y e d u s i n g t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n -c r e a s ( f i g u r e 1 1 ) . B o t h c o m p o u n d s w e r e o f e q u i v a l e n t i n s u l i n o -t r o p i c p o t e n c y w h e n i n f u s e d a t 5 n g / m l c o n c e n t r a t i o n i n c o m b i n a t i o n w i t h 3 0 0 m g / d T ' g l u c o s e . T h e i n s u l i n r e l e a s e e v o k e d b y e i t h e r 1 2 7 o x i d i z e d o r I - i o d i n a t e d G I P w a s o f s i m i l a r m a g n i t u d e t o t h a t e v o k e d b y 5 n g / m l G I P a n d 3 0 0 m g / d l g l u c o s e . T h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t i o d i n a t e d G I P p o s s e s s e d b i o l o g i c a l a c t i v i t y a n d t h a t t h i s a c t i v i t y w a s n o t t h e r e s u l t o f c o n t a m i n a t i o n b y o x i d i z e d , u n i o d i n -a t e d G I P - a f i n d i n g t h a t w o u l d h a v e b e e n d i f f i c u l t t o d e m o n s t r a t e w i t h o u t t h e r e s o l v i n g p o w e r o f H P L C . T h e r e s u l t s w o u l d f u r t h e r 1 2 7 i n d i c a t e t h a t I - i o d i n a t i o n d i d n o t s u b s t a n t i a l l y a l t e r b i o l o g i -c a l a c t i v i t y i n c o m p a r i s o n w i t h o x i d i z e d G I P . U s e o f H P L C t o p r o d u c e i o d i n a t e d G I P w o u l d b e e x p e c t e d t o y i e l d a p r o d u c t w i t h h i g h s p e c i f i c a c t i v i t y s i n c e t h e p r e s e n c e o f t h e s u b s t a n t i a l c o n t a m i n a n t , o x i d i z e d G I P , c o u l d b e e x c l u d e d . D e t e c t i o n o f s e v e r a l c o m p o n e n t s w i t h i n t h e i o d i n a t e d G I P m i x t u r e c o u l d h a v e r e p r e s e n t e d t h e p r e s e n c e o f m u l t i p l e i o d i n a t e d f o r m s o f G I P . S i n c e e a c h a d d i t i o n o f a n i o d i n e a t o m 2 5 4 w o u l d b e e x p e c t e d t o i n c r e a s e t h e h y d r o p h o b i c i t y o f t h e G I P m o l e c u l e , i t w a s h y p o t h e s i z e d t h a t t h o s e p e a k s e l u t i n g a t p r o -g r e s s i v e l y h i g h e r a c e t o n i t r i l e c o n c e n t r a t i o n s r e p r e s e n t e d p e a k s p o s s e s s i n g p r o g r e s s i v e l y h i g h e r n u m b e r s o f i n c o r p o r a t e d i o d i n e s . 12 5 / 1 2 7 T o t e s t t h i s t h e o r y , f r a c t i o n s f r o m ' I - E G I I I w h i c h h a d b e e n r u n t h r o u g h t h e H P L C p u r i f i c a t i o n s y s t e m w e r e p r o n a s e -d i g e s t e d a n d a n a l y z e d f o r m o n o - a n d d i - i o d i n a t e d t y r o s i n e s ( M I T a n d D I T ) . T h e r e s u l t s i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f p r e d o m i n -a n t l y u n i n c o r p o r a t e d i o d i n e i n t h e v o i d v o l u m e r a d i o a c t i v i t y 12 5 / 1 2 7 p e a k . T h r e e f r a c t i o n s e l u t e d d u r i n g t h e I - E G I I I s p e c t r o -p h o t o m e t r y p e a k s w h i c h c o n t a i n e d e n o u g h r a d i o a c t i v i t y t o b e a n a l y z e d i n t h i s f a s h i o n . T h e f i r s t t w o f r a c t i o n s c o n t a i n e d p r e d o m i n a n t l y M I T r a d i o a c t i v i t y ( f i g u r e 8 6 ) b u t t h e p r o p o r t i o n o f D I T r a d i o a c t i v i t y i n c r e a s e d i n t h e s e c o n d f r a c t i o n . C a l c u l -a t i o n s i n d i c a t e d t h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f M I T a n d D I T i n t h e s e t w o f r a c t i o n s t o b e i n t h e r a t i o o f 2 0 0 : 1 0 ( M I T : D I T ) i n t h e f i r s t f r a c t i o n a n d 4 7 : 1 0 ( M I T : D I T ) i n t h e f o l l o w i n g f r a c t i o n . T h e s u b s e q u e n t , t h i r d f r a c t i o n w a s d a m a g e d d u r i n g t h e d i g e s t i o n p r o c e d u r e s o t h e t r e n d c o u l d n o t b e c o n f i r m e d . T h e r e s u l t s i n d i c a t e d - t h a t H P L C h a d t h e p o t e n t i a l t o i s o l a t e a p r e d o m i n a n t l y m o n o i o d i n a t e d G I P m o l e c u l e . H o w e v e r , t h i s i s o l a t i o n w o u l d d i s -c a r d p e r h a p s 9 0 % o f t h e p e p t i d e o r i g i n a l l y p r e s e n t i n a n i o d i n a t i o n m i x t u r e , b a s e d o n t h e r e l a t i v e a r e a s p r e s e n t u n d e r t h e v a r i o u s s p e c t r o p h o t o m e t r i c p e a k s . I f t h e p u r e m o n o i o d i n a t e d p e p t i d e w a s t o b e i s o l a t e d , i t w o u l d - h a v e t o b e i n r e s p o n s e t o 1 2 5 a r e q u i r e m e n t f o r v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n s o f I - G I P , o r a s a r e s u l t o f a n i o d i n a t i o n p r o c e s s w h i c h g r e a t l y i n c r e a s e d 2 5 5 m o n o i o d o - i n c o r p o r a t i o n . S i m i l a r a n a l y s i s b y p r o n a s e d i g e s t i o n a n d G - 1 0 a d s o r p -t i o n c h r o m a t o g r a p h y o f i n c o r p o r a t i o n o f i o d i n e i n t o m o n o - o r d i - i o d o f o r m s o f t y r o s i n e r e v e a l e d t h a t t h e C M - 5 2 c o l u m n p u r i -1 2 5 f i c a t i o n s t e p i n t h e p r e p a r a t i o n o f I - G I P f o r r a d i o i m m u n o a s s a y d i d n o t a l t e r t h e r e l a t i v e p r e p a r a t i o n s o f M I T a n d D I T p r e s e n t i n G I P . T h i s c o u l d s u g g e s t t h a t c a l c u l a t i o n s o f s p e c i f i c a c t i v i t y b y R I A o f f r a c t i o n s f r o m r a d i o i m m u n o a s s a y t r a c e r p u r i -f i c a t i o n m a y n o t h a v e r e f l e c t e d a m e a s u r e m e n t o f i o d i n a t i o n s t a t e o f t h e p e p t i d e s o m u c h a s t h e y m i g h t h a v e r e f l e c t e d c o n t a m i n a t i o n o f t h e p r e p a r a t i o n b y u n i o d i n a t e d G I P . A m o r e p r u d e n t c o u r s e i n t h e p r e p a r a t i o n o f i o d i n a t e d t r a c e r m o l e c u l e s w o u l d i n v o l v e H P L C a n a l y s i s o f t h e a m o u n t o f p e p t i d e a c t u a l l y i o d i n a t e d i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e u s e o f a d s o r p t i o n c h r o m a t o g r a p h y a s a n i n d e x o f t h e i o d i n a t i o n s t a t e o f c o n s t i t u e n t t y r o s i n e s . O n e o f t h e a i m s o f t h e i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f 1 2 5 a b i o a c t i v e , p u r e I - G I P m o l e c u l e w a s t h e u s e o f s u c h a m o l e -c u l e i n t h e s t u d y o f b i n d i n g r e a c t i o n s w i t h i s o l a t e d r a t f a t 1 27 c e l l s . G i v e n t h e d e m o n s t r a t e d b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f I - G I P i n t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s , a n d t h e d i s c o v e r y o f a b i o l o g i c a l r e s p o n s e t o G I P i n t e r m s o f i n d u c i n g L P L A f r o m i s o l a t e d r a t f a t p a d a d i p o c y t e s , b i n d i n g s t u d i e s u s i n g H P L C - p u r i f i e d 1 2 5 I - G I P w e r e u n d e r t a k e n i n t h e h o p e o f d e m o n s t r a t i n g t h e p r e s e n c e o f a G I P ' r e c e p t o r m o l e c u l e i n t h e s e c e l l s . T h e e x p e r i m e n t s w e r e b o t h p r e l i m i n a r y a n d u n s u c c e s s f u l . T h e e x p e r i m e n t s may b e r e g a r d e d a s p r e l i m i n a r y b e c a u s e 1 2 7 t h e b i o a c t i v i t y o f I - G I P o n a d i p o c y t e s w a s n o t d e m o n s t r a t e d . 2 5 6 1 2 7 T h e a m o u n t o f I - G I P r e q u i r e d t o s t i m u l a t e a m e a s u r a b l e i n c r e a s e i n L P L A ( 5 0 n g / m l ) w a s t e n t i m e s t h a t u s e d t o p r o d u c e a b i o -r e s p o n s e i n t h e i s o l a t e d p e r f u s e d r a t p a n c r e a s , s o t h e p r o d u c t i o n 1 2 7 o f a I - G I P / L P L A d o s e - r e s p o n s e c u r v e w o u l d h a v e r e q u i r e d 1 2 7 s u b s t a n t i a l l y m o r e I - G I P t h a n i t w a s p o s s i b l e t o i s o l a t e b y 12 7 H P L C . U n l e s s t h e b i o a c t i v i t y o f I - G I P i s d e m o n s t r a t e d i n i s o l a t e d r a t a d i p o c y t e s t h e p o s s i b i l i t y w i l l r e m a i n t h a t t h e 12 5 l a c k o f I - G I P b i n d i n g i n t h i s s y s t e m w a s d u e t o i n a c t i v a t i o n o f G I P b y t h e i o d i n a t i o n p r o c e s s . T o d a t e , n o s p e c i f i c o r d i s -p l a c e a b l e b i n d i n g a c t i v i t y o f G I P h a s b e e n d e m o n s t r a t e d i n a n y c e l l t y p e . T h e e x i s t e n c e o r n a t u r e o f a G I P r e c e p t o r r e m a i n s u n p r o v e n . R e t u r n i n g t o t h e c o n c e p t o f G I P a s a n i n t e s t i n a l m o d u l a t o r o f n u t r i e n t h o m e o s t a s i s , s e v e r a l a s p e c t s o f t h e m e c h a n i s m o f a c t i o n o f t h i s h o r m o n e m a y b e s u m m a r i z e d . T h e i n c r e t i n - 1 i k e e f f e c t o f G I P h a s b e e n t h e m o s t e x t e n s i v e l y s t u d i e d b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f t h e p e p t i d e , y e t t h e m e c h a n i s m b y w h i c h G I P p o t e n t i a t e d g l u c o s e -s t i m u l a t e d i n s u l i n r e l e a s e h a d n o t b e e n w e l 1 - c h a r a c t i z e d . I t now s e e m s l i k e l y t h a t G I P - i n d u c e d e f f e c t s w i t h i n t h e B c e l l i n t e r a c t e d w i t h g l u c o s e - o x i d a t i o n a t a l o c a t i o n d i s t a l t o m e t a b o l i c d e g r a d a -t i o n . S u c h a m e c h a n i s m w o u l d e x p l a i n , i n p a r t , t h e m e t a b o l i t e -d e p e n d e n t n a t u r e o f t h e i n s u l i n o t r o p i c e f f e c t , s i n c e o x i d a t i o n o f a n i n i t i a t o r o f i n s u l i n s e c r e t i o n w o u l d b e a p r e r e q u i s i t e o f G I P -i n d u c e d p o t e n t i a t i o n . T h e p o s s i b i 1 i t y o f a s i m i l a r i n v o l v e m e n t i n t h e c o n t r o l o f f a t d i g e s t i o n a n d s t o r a g e i s s u g g e s t e d b y t h e d e m o n s t r a t i o n o f a n i n c r e a s e d l i p o p r o t e i n - l i p a s e s e c r e t i o n f r o m a d i p o c y t e s i n v i v o i n r e s p o n s e t o G I P a d m i n i s t r a t i o n . W h i l e t h e p h y s i o l o g i c a l r e l e v a n c e 257 o f such an e f f e c t r e m a i n s u n p r o v e n , t he e x i s t e r i c e : o f a ' s y m m e t r y between G l P - m e d i a t e d i n t e s t i n a 1 modu1 a t i o n o f b o t h g l y c a e m i a and t r i g 1 y c e r i da em i a i s " p 6 s s i b 1 e . 2 5 8 R E F E R E N C E S A n d e r s o n DK, E l a h i D, B r o w n J C , T o b i n J D , A n d r e s R ( 1 9 7 8 ) O r a l g l u c o s e a u g m e n t a t i o n o f i n s u l i n s e c r e t i o n . I n t e r a c t i o n s o f g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e w i t h a m b i e n t g l u c o s e a n d i n s u l i n l e v e l s . J C l i n I n v e s t 6 2 : 1 5 2 - 1 6 1 . A s h c r o f t S J H ( 1 9 8 0 ) G l u c o r e c e p t o r m e c h a n i s m s a n d t h e c o n t r o l o f i n s u l i n r e l e a s e a n d b i o s y n t h e s i s . D i a b e t o l o g i a 1 8 : 5 - 1 5 A s h c r o f t S J H ( 1 9 8 1 ) M e t a b o l i c c o n t r o l s o f i n s u l i n s e c r e t i o n . I n : C o o p e r s t e i n S J , W a t k i n s D ( e d s ) T h e i s l e t s o f L a n g e r h a n s . A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , L o n d o n , T o r o n t o , S y d n e y , S a n F r a n c i s c o , p p 1 1 7 - 1 4 8 A s h c r o f t S J H , W e e r a s i n g h e C C , R a n d l e P J ( 1 9 7 3 ) I n t e r r e l a t i o n s h i p o f i s l e t m e t a b o l i s m , a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e c o n t e n t a n d i n s u l i n r e l e a s e . B i o c h e m J 1 3 2 : 2 2 3 - 2 3 1 . B a g b y G, L i u M-S, S p i t z e r J A ( 1 9 7 7 ) L i p o p r o t e i n l i p a s e a c t i v i t y i n r a t h e a r t m y o c y t e s . L i f e S c i 2 1 : 4 6 7 - 4 7 4 B l o b e l G, S a b a t i n i DD ( 1 9 7 1 ) R i b o s o m e - m e m b r a n e i n t e r a c t i o n i n e u k a r y o t i c e e l 1 s . I n : M a n s o n LA ( e d ) B i o m e m b r a n e s , V o l 2 . P l e n u m P u b l i s h i n g C o r p . , New Y o r k , pp 1 9 3 - 1 9 5 B r o w n J C ( 1 9 7 1 ) A g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e . I . T h e a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n a n d t h e t r y p t i c p e p t i d e s . C a n J B i o c h e m 4 9 : 2 5 5 - 2 6 1 B r o w n J C ( 1 9 7 4 ) G a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e ( G I P ) . I n : T a y l o r S ( e d ) E n d o c r i n o l o g y 1 9 7 3 . H e i n e m a n n , L o n d o n , p p 2 7 6 - 2 8 4 B r o w n J C , D a h l M, K w a u k S, M c i n t o s h C H S , M u l l e r M, O t t e S C , P e d e r s o n RA ( 1 9 8 1 ) P r o p e r t i e s a n d a c t i o n s o f G I P . I n : B l o o m S R , P o l a k JM ( e d s ) G u t h o r m o n e s ( 2 n d E d i t i o n ) . C h u r c h i l l L i v i n g s t o n e , E d i n b u r g h , L o n d o n , M e l b o u r n e , New Y o r k , pp 2 4 8 - 2 5 5 B r o w n J C , D a h l M, K w a u k S , M c i n t o s h C H S , O t t e S C , P e d e r s o n RA ( 1 9 8 1 b ) A c t i o n s o f G I P . P e p t i d e s 2 ( S u p p l . 2) : 241 - 2 45 B r o w n J C , D r y b u r g h J R , M o c c i a P, P e d e r s o n RA ( 1 9 7 5 a ) T h e c u r r e n t s t a t u s o f G I P . I n : T h o m p s o n J C ( e d ) G a s t r o i n t e s t i n a l H o r m o n e s , U n i v e r s i t y o f T e x a s P r e s s , A u s t i n , p p 5 3 7 - 5 4 7 B r o w n J C , D r y b u r g h J R , R o s s S E , D u p r e J ( 1 9 7 5 b ) I d e n t i f i c a t i o n a n d a c t i o n s o f g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e . R e c e n t P r o g H o r m R e s 31 : 4 8 7 - 5 3 2 B r o w n J C , K o o p H, M c i n t o s h C H S , O t t e S C , P e d e r s o n RA ( 1 9 8 0 ) P h y s i o l o g y o f g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e . F r o n t H o r m R e s 7 : 1 3 2 - 1 4 4 2 5 9 B r o w n J C , M u t t V , P e d e r s o n RA ( 1 9 7 0 ) F u r t h e r p u r i f i c a t i o n o f a p o l y p e p t i d e d e m o n s t r a t i n g e n t e r o g a s t r o n e a c t i v i t y . J P h y s i o l 2 0 9 : 5 7 - 6 4 B r o w n J C , P e d e r s o n . RA, J o r p e s E , M u t t V ( 1 9 6 9 ) P r e p a r a t i o n o f h i g h l y a c t i v e e n t e r o g a s t r o n e . C a n J P h y s i o l P h a r m a c 4 7 : 1 1 3 - 1 1 4 B r o w n J C , P e d e r s o n RA ( 1 9 7 0 ) A m u l t i p a r a m e t e r s t u d y o n t h e a c t i o n o f p r e p a r a t i o n s c o n t a i n i n g c h o l e c y s t o k i n i n - p a n c r e o z y m i n . S c a n d J G a s t r o e n t . 5 : 5 3 7 - 5 4 1 B u f f a R, P o l a k J M , P e a r s e A G E , S o l c i a E , G r i m e l i u s L , C a p e l l a C ( 1 9 7 5 ) I d e n t i f i c a t i o n o f t h e i n t e s t i n a l c e l l s t o r i n g g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e . H i s t o c h e m i s t r y 4 3 : 2 4 9 - 2 5 5 C a m b l e R, C o t t o n R, D u t t a A S , G o r m l e y J J , H a y w a r d C F , M o r l e y J C , S m i t h e r s MJ ( 1 9 7 3 ) On t h e s y n t h e s i s o f a p o r c i n e g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e . I n : H a n s o n H, J a k u b k e HD ( e d s ) P e p t i d e 1 9 7 2 . N o r t h H o l l a n d P u b l i s h i n g C o . , A m s t e r d a m , pp 2 0 0 - 2 0 9 . C a t a l a n d S, C r o c k e t t S E , B r o w n J C , M a z z a f e r r i E L ( 1 9 7 4 ) G a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e ( G I P ) s t i m u l a t i o n b y o r a l g l u c o s e i n m a n . J C l i n E n d o c r i n o l M e t a b 3 9 : 2 2 3 - 2 2 8 . C h r i s t e n s e n HN, C u l l e n AM ( 1 9 6 9 ) B e h a v i o r i n t h e r a t o f a t r a n s p o r t - s p e c i f i c , b i c y c l i c a m i n o a c i d . H y p o g l y c e m i c a c t i o n . J . B i o l C h e m 2 4 4 :1 521 -1 5 2 6 C h r i s t e n s e n HN, H e l l m a n B , L e r m a r k A , S e h l i n J , T a g e r HS , T a l j e d a l I - B ( 1 9 7 1 ) I_n_ v i t r o s t i m u l a t i o n o f i n s u l i n r e l e a s e b y n o n - m e t a bo 1 i z a b 1 e , t r a n s p o r t - s p e c i f i c a m i n o a c i d s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 2 4 1 : 3 4 1 - 3 4 8 C o o p e r CW, S c h w e s i n g e r WH, M a l g o u b AM, O n t j e s DA ( 1 9 7 1 ) T h y r o -c a l c i t o n i n : s t i m u l a t i o n o f r e l e a s e b y g a s t r i n . S c i e n c e 1 7 2 : 1 2 3 8 - 1 2 4 0 C r y e r A ( 1 9 8 1 ) T i s s u e l i p o p r o t e i n l i p a s e a c t i v i t y a n d i t s a c t i o n i n l i p o p r o t e i n m e t a b o l i s m . I n t J . B i o c h e m 1 3 : 5 2 5 - 5 4 1 . C r y e r A , R i l e y S E , W i l l i a m s E R , R o b i n s o n DS ( 1 9 7 6 ) E f f e c t o f n u t r i t i o n a l s t a t u s o n r a t a d i p o s e t i s s u e , m u s c l e a n d p o s t h e p a r i n p l a s m a c l e a r i n g - f a c t o r l i p a s e a c t i v i t i e s : t h e i r r e l a t i o n s h i p t o t r i g l y c e r i d e f a t t y a c i d u p t a k e b y f a t c e l l s a n d t o p l a s m a i n s u l i n c o n c e n t r a t i o n s . C l i n S c i M o l e c M e d 5 0 : 2 1 3 - 2 2 1 D a v i e s P, C r y e r A , R o b i n s o n DS , ( 1 9 7 4 ) H o r m o n a l c o n t r o l o f a d i p o s e t i s s u e ' d e a r i n g f a c t o r l i p a s e a c t i v i t y . F E B S L e t t 4 5 : 2 7 1 - 2 7 5 260 Dennis AR, Young JA (1978) M o d i f i c a t i o n of s a l i v a r y duct e l e c t r o l y t e t r a n s p o r t i n r a t and r a b b i t by p h y s a l a e m i n , V IP , GIP and o t h e r en te roho rmones . P f l u g e r s Arch 376:73-80 Dryburgh JR (1977) Immuno log ica l t e c h n i q u e s i n the i n v e s t i g a t i o n o f the p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s o f g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y -p e p t i d e and m o t i l i n . Ph.D. These s . U n i v e r s i t y o f B r i t i s h Co 1umbi a . Dupre J , Ross SA, Watson D, Brown JC (1973) S t i m u l a t i o n o f i n s u l i n s e c r e t i o n by g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e i n man. J C l i n E n d o c r i n o l Metab 37:826-828 Ebe r t R, C r e u t z f e l d t W, Brown J C , F r e r i c h s H, A r n o l d R (1976a) Response o f g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e (GIP) to t e s t meal i n c h r o n i c p a n c r e a t i t i s - r e l a t i o n s h i p to e n d o c r i n e and e x o c r i n e i n s u f f i c i e n c y . D i a b e t o l o g i a 12:609-612 Ecke l RH, Fu j imo to WY, B r u n z e l l JD (1979) G a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e enhanced l i p o p r o t e i n l i p a s e a c t i v i t y i n c u l t u r e d p r e a d i p o c y t e s . D i abe te s 28:1141-1142 E l a h i D, Anderson DK, Brown J C , Debas HT, He r shcop f R J , Ra i ze s GS, Tob in JD, Andres R (1979) P a n c r e a t i c a- a n d 3 - c e l l re sponses to GIP i n f u s i o n i n normal man. 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I n : H i r s CHW (ed) Methods i n Enzymology, Volume X I , Academic P r e s s , New York and London, pp139-151 Grodsky GM, B a t t s AA, Bennet LL , V c e l l a C, McW i l l i ams NB , Smith DF (1963) E f f e c t s o f c a r b o h y d r a t e s on s e c r e t i o n o f i n s u l i n from i s o l a t e d r a t p a n c r e a s . Am J P h y s i o l 205:638-644 Gross E (1967) The cyanogen bromide r e a c t i o n . I n : H i r s CHW (ed) Methods i n Enzymology, Academic P r e s s , New York and London, pp 238-242 261 H e d e s k o v CV ( 1 9 8 0 ) M e c h a n i s m o f g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n s e c r e t i o n . P h y s i o l o g i c a l R e v i e w s 6 0 : 4 4 2 - 5 0 9 . H e l l m a n B , I d a h l L - A , L e r n m a r k A , S e h l i n J , T a l j e d a l I - B ( 1 9 7 4 ) T h e p a n c r e a t i c 3 - c e l l r e c o g n i t i o n o f i n s u l i n s e c r e t a g o g u e s . V I I . C o m p a r i s o n s o f g l u c o s e w i t h g l y c e r a l d e h y d e i s o m e r s a n d d i h y d r o x y a c e t o n e . A r c h B i o c h e m B i o p h y s 1 6 2 : 4 4 8 - 4 5 7 H e l l m a n B , L e r n m a r k A , S e h l i n J , T a l j e d a l I - B , W h i s t l e r RL ( 1 9 7 3 b ) T h e p a n c r e a t i c 3 - c e l l r e c o g n i t i o n o f i n s u l i n s e c r e t a g o g u e s . I I I . E f f e c t s o f s u b s t i t u t i n g s u l p h u r f o r o x y g e n i n t h e D-g l u c o s e m o l e c u l e . B i o c h e m P h a r m a c o l 2 2 : 2 9 - 3 5 H e l l m a n B , S e h l i n J , T a l j e d a l I - B ( 1 9 7 1 ) E v i d e n c e f o r m e d i a t e d t r a n s p o r t o f g l u c o s e i n m a m m a l i a n p a n c r e a t i c 3 - e e l I s . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 2 4 1 :1 4 7 - 1 54 H e l l m a n B , S e h l i n J , T a l j e d a l I - B ( 1 9 7 3 a ) T r a n s p o r t o f 3 - 0 - m e t h y l -D - g l u c o s e i n t o m a m m a l i a n p a n c r e a t i c 3 - c e l l s . P f l u e g e r s A r c h 3 4 0 : 5 1 - 5 8 H e l m o n C A , B a r b e z a t GO ( 1 9 7 7 ) T h e e f f e c t o f g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e o n h u m a n j e j u n a l w a t e r a n d e l e c t r o l y t e t r a n s p o r t . G a s t r o e n t e r o l o g y 7 2 : 3 7 6 - 3 7 9 H o r n T , V a s s e i MP, S t r u b l e ME, C r e a R, S m a l l B , K l e i d D, P o w e r s D, L e v i n e H L , M c i n t o s h C H S , P e d e r s o n RA, O t t e S C , B u c h a n A M J , B r o w n J C ( 1 9 8 2 ) P r o d u c t i o n o f a n i m m u n o l o g i c a l l y a n d b i o l o g i -c a l l y a c t i v e G I P i n E s c h e r i c h i a Co 1 i t h r o u g h e x p r e s s i o n o f a c h e m i c a l l y s y n t h e s i z e d g e n e . I n : P r o c e e d i n g s o f t h e 4 t h I n t e r n a t i o n a l S y m p o s i u m o f G a s t r o i n t e s t i n a l H o r m o n e s , S t o c k h o l m , 1 9 8 2 . H u g h e s J P , T a n a k a T , G o u t PW, B e e r C T , N o b l e R L , F r i e s e n HG ( 1 9 8 2 ) E f f e c t o f i o d i n a t i o n o n h u m a n g r o w t h h o r m o n e a n d p r o l a c t i n : c h a r a c t e r i z e d b y b i o a s s a y , r a d i o i m m u n o a s s a y , a n d e l e c t r o p h o r e s i s . E n d o c r i n o l o g y 1 1 1 : 8 2 7 - 8 3 2 H u n t e r WM, G r e e n w o o d F C ( 1 9 6 2 ) P r e p a r a t i o n o f i o d i n e - 1 3 1 l a b e l l e d h u m a n g r o w t h h o r m o n e o f h i g h s p e c i f i c a c t i v i t y . N a t u r e 1 9 4 : 4 9 5 -4 9 6 H u t t o n J C , M a l a i s s e . W J ( 1 9 8 0 ) D y n a m i c s o f 0 ? c o n s u m p t i o n i n r a t p a n c r e a t i c i s l e t s . D i a b e t o l o g i a 1 8 : 3 9 5 - 4 0 5 H u t t o n J C , S e n e r A , H e r c h u e l z A , A t w a t e r I , B o s c h e r o A C , S o m e r s G, D e v i s G, M a l a i s s e WJ ( 1 9 8 0 ) S i m i l a r i t i e s i n t h e s t i m u l u s -s e c r e t i o n c o u p l i n g m e c h a n i s m s o f g l u c o s e - a n d 2 - k e t o a c i d -i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e . E n d o c r i n o l o g y 1 0 6 : 2 0 3 - 2 1 9 H u t t o n J C , S e n e r A , M a l a i s s e WJ ( 1 9 7 9 ) T h e m e t a b o l i s m o f 4 - m e t h y l -2 - o x o p e n t a n o a t e i n r a t p a n c r e a t i c i s l e t s . B i o c h e m J 1 8 4 : 2 9 1 -301 2 6 2 I r v i n e GB , M u r p h y R F ( 1 9 8 1 ) M u l t i p l e f o r m s o f g a s t r o e n t e r o -p a n c r e a t i c h o r m o n e s . G u t 2 2 : 1 0 4 8 - 1 0 6 9 J ' d r n v a l l H, C a r l q u i s t M, K w a u k S , O t t e S C , M c i n t o s h C H S , B r o w n J C , M u t t V ( 1 9 8 1 ) A m i n o a c i d s e q u e n c e a n d h e t e r o g e n e i t y o f g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e ( G I P ) . F E B S L e t t e r s 1 2 3 : 2 0 5 - 2 1 0 K u z i o M, D r y b u r g h J R , M a l l o y KM, B r o w n J C ( 1 9 7 4 ) R a d i o i m m u n o a s s a y f o r g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e . G a s t r o e n t e r o l o g y 6 6 : 3 5 7 -3 6 4 K o m p i a n g I P , B e n s a d o u n A , Y o u n g M-WW ( 1 9 7 6 ) E f f e c t o f a n a n t i -l i p o p r o t e i n l i p a s e s e r u m o n p l a s m a t r i g l y c e r i d e r e m o v a l . J L i p i d R e s 1 7 : 4 9 8 - 5 0 5 K o s a k a T , L i m RKS ( 1 9 3 0 ) On t h e m e c h a n i s m o f t h e i n h i b i t i o n o f g a s t r i c s e c r e t i o n b y f a t . T h e r o l e o f b i l e a n d c y s t o k i n i n . C h J P h y s i o l I V : 2 7 3- 2 2 0 L a b a r r e J ( 1 9 3 2 ) S u r l e s p o s s i b i l i t i e s d - u n t r a i t m e n t du d i a b e t e s p a r V i n c r e t i n e . B u l l A c a d r M e d B e l g 1 2 : 6 2 0 - 6 3 4 L e n z e n S ( 1 9 7 8 a ) E f f e c t s o f ° = - k e t o c a r b o x y l i c a c i d s a n d 4 - p e n t e n o i c a c i d o n i n s u l i n s e c r e t i o n f r o m t h e p e r f u s e d r a t p a n c r e a s . B i o c h e m P h a r m a c o l 2 7 : 1 3 2 1 - 1 3 2 4 L e n z e n S ( 1 9 7 8 b ) D o s e - r e s p o n s e s t u d i e s o n t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f t h y r o i d h o r m o n e s o n i n s u l i n s e c r e t i o n i n t h e r a t . M e t a b o l i s m 2 7 : 8 1 - 8 8 L e n z e n , S ( 1 9 7 9 ) I n s u l i n s e c r e t i o n b y i s o l a t e d p e r f u s e d r a t a n d m o u s e p a n c r e a s . Am J P h y s i o l 2 3 6 : E 3 9 1 - E 4 0 0 L e n z e n S , J o o s t H G , H a s s e l b l a t t A ( 1 9 7 6 a ) T h y r o i d f u n c t i o n a n d i n s u l i n s e c r e t i o n f r o m t h e p e r f u s e d p a n c r e a s i n t h e r a t . E n d o c r i n o l o g y 9 9 : 1 2 5 - 1 2 9 L e n z e n S , J o o s t H G , H a s s e l b l a t t A ( 1 9 7 6 b ) T h e i n h i b i t i o n o f i n s u l i n s e c r e t i o n f r o m t h e p e r f u s e d r a t p a n c r e a s a f t e r t h y r o x i n e t r e a t m e n t . D i a b e t o l o g i a 1 2 : 4 9 5 - 5 0 0 L i n g a p p a V R . L i n g a p p a J R , B l o b e l G ( 1 9 7 9 ) C h i c k e n o v a l b u m i n c o n t a i n s a n i n t e r n a l s i g n a l s e q u e n c e . N a t u r e 2 8 1 : 1 1 7 - 1 2 1 L u n d P K , G o o d m a n RH, H a b e n e r J F ( 1 9 8 1 ) P a n c r e a t i c p r e - p r o g l u c a g o n s a r e e n c o d e d b y t w o s e p a r a t e m R N A s . J B i o l C h e m 2 5 6 : 6 5 1 5 - 6 5 1 8 M a l a i s s e W J , H e r c h u e l z - A , L e v y J , S e n e r A , P i p e l e e r s DG, D e v i s G, S o m e r s G, V a n O b b e r g h e n E ( 1 9 7 6 ) T h e s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g o f g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e . X I X . T h e i n s u l i n o -t r o p i c e f f e c t o f g l y c e r a l d e h y d e . M o l e c C e l l E n d o c r i n o l 4 : 1 - 1 2 M a l a i s s e W J , M a i a i s s e - L a g a e F , M c C r a w E F [ 1 9 6 7 ) E f f e c t s o f t h y r o i d f u n c t i o n u p o n i n s u l i n s e c r e t i o n . D i a b e t e s 1 6 : 6 4 3 - 4 6 2 6 3 M a l a i s s e W J , S e n e r A , K o s e r M, R a v a z z o l a M, M a i a i s s e - L a g a e F , ( 1 9 7 7 ) T h e s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g o f g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e . I n s u l i n r e l e a s e d u e t o g l y c o g e n o l y s i s i n g l u c o s e - d e p r i v e d i s l e t s . B i o c h e m J 1 6 4 : 4 4 7 - 4 5 4 M a l a i s s e W J , S e n e r A , Ma.hy M ( 1 9 7 4 ) T h e s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g o f g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e . S o r b i t o l m e t a b o l i s m i n i s o l a t e d i s l e t s . E u r J B i o c h e m 4 7 : 3 6 5 - 3 7 0 M a l a i s s e W J , S e n e r A , C a r p i n e l l i A R , A n j a n e y u T u K, L e b r u n P, H e r c h u e l z A , C h r i s t o p h e J ( 1 9 8 0 ) T h e s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g o f g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e X L V I . T h e p h y s i o -l o g i c a l r o l e o f L - g l u t a m i n e a s a f u e l f o r p a n c r e a t i c i s l e t s . M o l a n d C e l l E n d o c r i n o l 2 0 : 1 7 1 - 1 8 9 M a t s c h i n s k y FM, E l l e r m a n J E ( 1 9 6 8 ) M e t a b o l i s m o f g l u c o s e i n t h e i s l e t s o f L a n g e r h a n s . J B i o l C h e m 2 4 3 : 2 7 3 0 - 2 7 3 6 M a t s c h i n s k y FM, E l l e r m a n J E , S t i 1 l i n g s S , R a y b a u d F , P a c e C, Z a w i l i c h W ( 1 9 7 5 ) H e x o s e s a n d i n s u l i n s e c r e t i o n . I n : H a z z e l b l a t t A , v o n B r u c h h a u s e n F ( e d s ) H a n d b o o k o f E x p e r i m e n t a l P h a r m a c o l o g y , V o l X X X I I / 2 , S p r i n g e r - V e r l a g , B e r l i n , H e i d e l b e r g , New Y o r k pp 7 9 - 1 1 4 M a x w e l l V , S h u l k e s A , B r o w n J C , S o l o m o n T E , W a l s h J H , G r o s s m a n MI ( 1 9 8 0 ) E f f e c t o f g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e o n p e n t a g a s t r i n -s t i m u l a t e d a c i d s e c r e t i o n i n m a n . D i g D i s S c i 2 5 : 1 1 3 - 1 1 6 M e i s t e r A ( 1 9 6 5 ) i n : B i o c h e m i s t r y o f t h e A m i n o A c i d s , 2 n d e d . , p p 7 2 9 - 7 5 7 , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k M o o r e B , E d i e E S , A b r a m J H ( 1 9 0 6 ) On t h e t r e a t m e n t o f d i a b e t e s m e l l i t u s b y a c i d e x t r a c t o f d u o d e n a l m u c o u s m e m b r a n e . B i o c h e m J 1 : 2 8 - 3 8 M o r l e y J S ( 1 9 7 0 ) I o d i n a t i o n a n d t h e b i o l o g i c a l a c t i v i t y o f g a s t r i n . N a t u r e 2 2 8 : 5 8 - 5 9 M o r o d e r L , H a l l e t t A , Thamm P, W i 1 s c h o w i t z " L , B r o w n J C , W u n s c h E ( 1 9 7 8 ) S t u d i e s o n g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e : s y n t h e s i s o f t h e o e t a t r i a c o n t r a - p e p t i d e G I P 1 - 3 8 w i t h f u l l i n s u 1 i n o t r o p i c a c t i v i t y . S c a n d J G a s t r o e n t e r o l 1 3 , S u p p l 4 9 : 1 2 9 M u e l l e r MK, P e d e r s o n RA, B r o w n J C ( 1 9 8 2 ) I n t e r a c t i o n o f g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e a n d a r g i n i n e w i t h g l u c o s e i n t h e p e r f u s e d p a n c r e a s o f r a t s t r e a t e d w i t h t r i i o d o t h y r o n i n e . C a n J P h y s i o l P h a r m a c o l 6 0 : 2 9 7 - 3 0 1 M u t t V ( 1 9 8 1 ) New a v i a n a n d m a m m a l i a n p e p t i d e s . i n ; B l o o m S R , P o l a k JM ( 1 9 8 1 ) G u t H o r m o n e s , C h u r c h i l l L i v i n g s t o n e , E d i n b u r g h , L o n d o n , M e l b o u r n e a n d New Y o r k M c D a i i i e l ML, K i n g S, A n d e r s o n S , F i n k J , L a c y PE ( 1 9 7 4 ) E f f e c t o f c y t o c h a l a s i n B o n h e x o s e t r a n s p o r t a n d g l u c o s e m a n a g e m e n t i n p a n c r e a t i c i s l e t s . D i a b e t o l o g i a 1 0 : 3 0 3 - 3 0 8 264 M c i n t o s h C, A r n o l d R, Bothe E, Becke r H, K ' obber l ing J , C r e u t z f e l d t W ( 1 978) G a s t r o i n t e s t i n a l s o m a t o s t a t i n : e x t r a c t i o n and r a d i o -immunoassay i n d i f f e r e n t s p e c i e s . Gut 19:665-663 M c i n t o s h CHS, Pederson RA, Koop H, Brown JC (1979) I n h i b i t i o n o f GIP s t i m u l a t e d s o m a t o s t a t i n - 1 i k e immunoreact i y i t y ( SL I ) by a c e t y l c h o l i n e and v aga l s t i m u l a t i o n . I n : M i y o s h i A (ed) Gut P e p t i d e s , Tokyo: Kodansha L t d and Amsterdam: E l s e v i e r / N o r t h H o l l a n d B i o m e d i c a l P r e s s , p 100-104 ' M c l n t y r e N, Ho l d swo r th CD, Turner DS (1964) New i n t e r p r e t a t i o n o f o r a l g l u co s e t o l e r a n c e . Lancet i i : 2 0 - 2 1 N e s t e l P J , A u s t i n W (1969) R e l a t i o n s h i p between ad i po se l i p o p r o t e i n l i p a s e a c t i v i t y and compounds which a f f e c t i n t r a c e l l u l a r l i p o l y s i s . L i f e S c i ( I I ) 8:157-164 Novak M (1965) C o l o u r i m e t r i c u l t r a m i c r o method f o r the d e t e r m i n a t i o n o f f r e e f a t t y a c i d s . J L i p i d Res 6:431-433 O ' D o r i s i o TM, C a t a l a n d S, S tevenson M, M a z z a f e r r i EL (1976) G a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e ' ( . G I P ) . I n t e s t i n a l d i s t r i b u t i o n and s t i m u l a t i o n by amino a c i d s and med ium-cha in t r i g l y c e r i d e s . Amer J Dig Dis 21 : 761 - 765 Panten V (19 7 5) E f f e c t s . o f a l p h a - k e t o m o n o c a r b o x y l i c a c i d s upon i n s u l i n s e c r e t i o n and metabo l i sm o f p a n c r e a t i c i s l e t s . Naunyn-S chm iedebe r g 1 s A r c h . Pharmacol 291:405-420 Pederson RA, Brown JC (1972) I n h i b i t i o n ' o f h i s t a m i n e - , p e n t a g a s t r i n - , and i n s u l i n - s t i m u l a t e d c an i ne g a s t r i c s e c r e t i o n by pure " g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e " . G a s t r o e n t e r o l o g y 62:393-400 Pederson RA, Brown JC (1976) The i n s u l i n o t r o p i c a c t i o n o f g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e i n the p e r f u s e d i s o l a t e d r a t p a n c r e a s . E n d o c r i n o l o g y 99:780-785 Pederson RA, S chube r t HE, Brown JC (1975) G a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y -p e p t i d e . I t s p h y s i o l o g i c a l r e l e a s e and i n s u 1 i n o t r o p i c a c t i o n i n the dog. D i abe te s 24:1050-1056 Po lak JM, Bloom SR, Kuz io M, Brown J C , Pear se AGE (1973) C e l l u l a r l o c a l i z a t i o n o f g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e i n . t h e duodenum and j e j u n a m . Gut 14:284-288 P r i c e S (1973) P a n c r e a t i c i s l e t membranes: e x t r a c t i o n o f a p o s s i b l e g l u c o r e c e p t o r . B i o ch im B iophys Ac ta 318:459-463 R a b i n o v i t c h A, Dupre J (19 72) I n s u T i n o t r o p i c and g l u c a g o n o t r o p i c a c t i v i t i e s i n c rude p r e p a r a t i o n s - ' o f c h o Te c y s t o k i n i n - p a n c r eo z ym i n . C l i n Res 20:945 Randle P J , A s h c r o f t S JH , G i l l JR (1968) Ca rbohyd ra te metabo l i sm and r e l e a s e o f hormones. I n : D i ckens F, Rand le P J , Whelan WJ (eds ) Ca rbohyd r a t e metabo l i sm and i t s D i s o r d e r s , Academic P r e s s , London and New Yo r k , p 427-447 2 6 5 R e h f e l d J F ( 1 9 8 1 ) H i s t o r i c a l B a c k g r o u n d . I n : B l o o m S R , P o l a k JM ( e d s ) G u t H o r m o n e s ( S e c o n d E d i t i o n ) , C h u r c h i l l L i v i n g s t o n e , E d i n b u r g h , L o n d o n , M e l b o u r n e a n d New Y o r k , p 1 0 - 1 6 R e h f e l d J F , U v n a s - W a l l e n s t e n K ( 1 9 7 8 ) G a s t r i n s i n c a t a n d d o g : e v i d e n c e f o r a b i o s y n t h e t i c r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e l a r g e m o l e c u l a r f o r m s o f g a s t r i n a n d h e p t a d e c a p e p t i d e g a s t r i n . J P h y s i o l 2 8 3 : 3 7 9 - 9 6 R o b i n s o n DS ( 1 9 7 0 ) T h e f u n c t i o n o f t h e p l a s m a t r i g l y c e r i d e s i n f a t t y a c i d t r a n s p o r t . Comp B i o c h e m 1 8 : 5 1 - 1 1 6 R o d b e l l M ( 1 9 6 4 ) L o c a l i z a t i o n o f l i p o p r o t e i n l i p a s e i n f a t c e l l s o f r a t a d i p o s e t i s s u e . J B i o l C hem 2 3 9 : 7 5 3 - 7 5 5 R o d b e l l M ( 1 9 7 2 ) M e t h o d s f o r t h e i s o l a t i o n o f r a t l i v e r p l a s m a m e m b r a n e s a n d f a t c e l l " g h o s t s " ; a n a s s a y m e t h o d f o r a d e n y l a t e c y c l a s e i n : C h a s i n M ( e d ) M e t h o d s i n M o l e c u l a r B i o l o g y , V o l . 3 , M a r c e l D e k k e r I n c , New Y o r k , p p 1 0 1 - 1 2 4 R o d b e l l M, K r i s h n a G ( 1 9 7 4 ) P r e p a r a t i o n o f i s o l a t e d f a t c e l l s a n d f a t c e l l " g h o s t s " ; m e t h o d s f o r a s s a y i n g a d e n y l a t e c y c l a s e a c t i v i t y a n d l e v e l s o f c y c l i c AMP. I n : F I e i s c h e r S , P a c k e r L ( e d s ) M e t h o d s i n E n z y m o l o g y , V o l u m e X X X I , B i o m e m b r a n . e s . A c a d e m i c P r e s s : New Y o r k , S a n F r a n c i s c o , L o n d o n pp 1 0 3 - 1 1 4 R o s s S A , S h a f f e r EA ( 1 9 8 1 ) T h e i m p o r t a n c e o f • - t r i g l y c e r i d e h y d r o l y s i s f o r t h e r e l e a s e o f g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e . G a s t r o e n t e r o l o g y 8 0 : 1 0 8 - 1 1 1 R o t h m a n S S , W e l l s H ( 1 9 6 7 ) E n h a n c e m e n t o f p a n c r e a t i c e n z y m e s y n t h e s i s b y p a n c r e o z y m i n . Am J P h y s i o l 2 1 3 : 2 1 5 - 2 1 8 R u d i n g e r J ( 1 9 7 1 ) I n : K i r k h a m K E , H u n t e r WM ( e d s ) R a d i o i m m u n o a s s a y M e t h o d s , C h u r c h i l l L i v i n g s t o n e , E d i n b u r g h , 1 0 4 S a l a m a n MR, R o b i n s o n DS ( 1 9 6 6 ) C l e a r i n g f a c t o r l i p a s e i n a d i p o s e t i s s u e . A m e d i u m i n w h i c h t h e e n z y m e a c t i v i t y o f t i s s u e f r o m s t a r v e d r a t s i n c r e a s e s i n v i t r o . B i o c h e m J 9 9 : 6 4 0 - 6 4 7 S a v i g e WE, F o n t a n a A ( 1 9 7 7 ) M o d i f i c a t i o n o f t r y p t o p h a n t o o x i ' n d o l y l a l a n i n e b y d i m e t h y l s u l f o x i d e - h y d r o c h l o r i d e a c i d i n : H i r s CHW, T i m a s h e f f SN ( e d s ) M e t h o d s i n E n z y m o l o g y , V o l . 4 7 , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k a n d L o n d o n , pp 4 4 2 - 4 5 3 S c h e e l e GA ( 1 9 8 0 ) B i o s y n t h e s i s , s e g r e g a t i o n , a n d s e c r e t i o n o f e x p o r t a b l e p r o t e i n s b y t h e e x o c r i n e p a n c r e a s . Am J P h y s i o l 2 3 8 : G 4 6 7 - 4 7 7 S c h o t z MC, Twu J - S , P e d e r s e n ME, C h e n C - H , G a r f i n k e l A S , B o r e n s z t a j n J ( 1 9 7 7 ) A n t i b o d i e s t o l i p o p r o t e i n l i p a s e . A p p l i c a t i o n t o . p e r f u s e d h e a r t . B i o c h i m B i o p h y s A c t a 4 8 9 : 2 1 4 - 2 2 4 . S c h u b e r t HE ( 1 9 7 4 ) S t u d i e s o n t h e P h y s i o l o g i c a l R e l e a s e a n d I n s u 1 i n o t r o p i c A c t i o n o f G a s t r i c I n h i b i t o r y P o l y p e p t i d e . M S c . T h e s i s . U B C . p 9, 31 2 6 6 S e n e r . A , D e v i ' s G, S o m e r s G, M a l a i s s e WJ ( 1 9 7 7 ) T h e i n s u l i n o t r o p i c a c t i o n o f D - E r y t h r o s e . D i a b e t o l o g i a 1 3 : 1 2 5 - 1 3 0 S e n e r A , K a w a z u S , H u t t o n J C , B o s c h e r o A C , D e v i ' s G, S o m e r s G, H e r s c h u e l z A , M a l a i s s e WJ ( 1 9 7 8 ) T h e s t i m u 1 u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g o f g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e . E f f e c t o f e x o g e n o u s p y r u v a t e o n i s l e t f u n c t i o n . B i o c h e m J 1 7 6 : 2 1 7 - 2 3 2 S e n e r A , L e v y J , M a l a i s s e WJ ( 1 9 7 6 ) T h e s t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g o f g l u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e . D o e s ' g l y c o l y s i s c o n t r o l c a l c i u m t r a n s p o r t i n t h e B - c e l l ? B i o c h e m J 1 5 6 : 5 2 1 - 5 2 5 S e n e r A , M a l a i s s e WJ ( 1 9 8 0 ) L - l e u c i n e a n d a n o n m e t a b o l i z e d a n a l o g u e a c t i v a t e p a n c r e a t i c i s l e t g l u t a m a t e d e h y d r o g e n a s e . N a t u r e 2 8 8 : 1 8 7 - 1 8 9 S e n e r A , Ma 1 a i s s e - L a g a e F , M a l a i s s e WJ ( 1 9 8 1 ) S t i m u l a t i o n o f p a n c r e a t i c i s i e t m e t a b o l i s m a r i d i n s u l i n" r e l e a s e b y a n o h - !" m e t a b o l i z a b l e a m i n o a c i d . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 7 8 : 5 4 6 0 - 5 4 6 4 S e n e r A , Ma 1 a i s s e - L a g a e F , M a l a i s s e WJ ( 1 9 8 2 ) T h e s t i m u 1 u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g o f g 1 u c o s e - i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e . B i o c h e m J 2 0 2 : 3 0 9 - 3 1 6 S o l c i a E , C a p e l l a C, V a s s a l l o G, B u f f a R ( 1 9 7 5 ) E n d o c r i n e c e l l s o f t h e g a s t r i c m u c o s a . I n t R e v C y t o l 4 2 : 2 2 3 - 2 8 6 S o m e r s G, C a r p i n e l l i A R , D e v i ' s G, S e n e r A , M a l a i s s e WJ ( 1 9 8 2 ) S t i m u l u s - s e c r e t i o n c o u p l i n g o f a m i n o ' a c i d - i n d u c e d i n s u l i n r e l e a s e V I I . T h e B - c e l l m e m o r y f o r " L - G l u t a m i n e . M e t a b o l i s m 3 1 : 2 2 9 - 2 3 7 S o o n - S h i o n g P, D e b a s H T , B r o w n - J C ' ( 1 9 7 9 a ) T h e e v a l u a t i o n o f G a s t r i c I n h i b i t o r y P o l y p e p t i d e ( G I P ) a s t h e E n t e r o g a s t r o n e . J S u r g R e s 2 6 : 6 8 1 - 6 8 6 S o o n - S h i o n g P, D e b a s H T , B r o w n J C ( 1 9 7 9 b ) C h o l i n e r g i c i n h i b i t i o n o f g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e ( G I P ) a c t i o n . G a s t r o e n t e r o l o g y 7 6 : 1 2 5 3 S o r e n s o n R L , L i n d e l l DV, E l d e RP ( 1 9 8 0 ) G l u c o s e s t i m u l a t i o n o f s o m a t o s t a t i n a n d i n s u l i n r e l e a s e f r o m t h e i s o l a t e d , p e r f u s e d r a t p a n c r e a s . D i a b e t e s 2 9 : 7 4 7 - 7 5 1 T e p p e r m a n J ( 1 9 8 0 ) I n : M e t a b o l i c a n d E n d o c r i n e P h y s i o l o g y . F o u r t h E d i t i o n . Y e a r B o o k M e d i c a l P u b l i s h e r s , I n c . , C h i c a g o , L o n d o n , p 3 0 5 T h o m a s F B , S h o o k D F , 0 ' D o r i s t o T M , C a t a l a n d S , M e k h j i a n H S , C a l d w e l l J H , M a z z a f e r r i E L ( 1 9 7 7 ) L o c a l i z a ' t i o n o f g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e r e l e a s e b y i n t e s t i n a l g l u c o s e p e r f u s i o n i n m a n . G a s t r o e n t e r o l o g y 7 2 : 4 9 - 5 4 U n g e r RH, E i s e n t r a u t AM ( 1 9 6 9 ) E n t e r o - i n s u l a r a x i s . A r c h I n t e r n M e d 1 2 3 : 2 6 1 - 2 6 6 2 6 7 V i l l a r H V, F e n d e r HR, R a y f o r d P L , B l o o m S R , R a m u s N I , T h o m p s o n J C , ( 1 9 7 6 ) S u p p r e s s i o n o f g a s t r i n r e l e a s e a n d g a s t r i c s e c r e t i o n b y g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e ( G I P ) . a n d v a s o a c t i v e i n t e s t i n a l p o l y p e p t i d e ( V I P ) . A n n S u r g 1 8 4 : 9 7 - 1 0 2 W i n g DR, R o b i n s o n DS ( 1 9 6 8 ) C I e a r i n g - f a c t o r l i p a s e i n a d i p o s e t i s s u e . S t u d i e s w i t h p u r o m y c i n a n d a c t i n o m y c i n . B i o c h e m J 1 0 6 : 6 6 7 - 6 7 6 Y a j i m a H, O g a w a H, K u b o t a M, T o b e T , F u j i m u r a M, H e n m i K, T o r i z u k a K, A d a c h c i H , I m u r a H , T a m i n o t o T , ( 1 9 7 5 ) S y n t h e s i s o f t h e t r i t e t r a c o n t a p e p t i d e c o r r e s p o n d i n g t o t h e e n t i r e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f g a s t r i c i n h i b i t o r y p o l y p e p t i d e . J A m e r Chem S o c 9 7 : 5 5 9 3 - 5 5 9 4 Y a n a i h a r a N , M o c h i z u k i T , Y a n i h a r a C , S a k u r a N , H a s h i m o t o T , S a k a g a m i M, K a n e k o T , K a n e t o h A , B r o w n J C ( 1 9 7 8 ) S y n t h e s i s o f G I P . I n : B l o o m SR ( e d ) G u t H o r m o n e s , C h u r c h i l l L i v i n g s t o n e , E d i n b u r g h , L o n d o n a n d New Y o r k , p 2 7 1 - 2 7 6 Z a w a l i c h WS, D y e E S , R o g n s t a d R, M a t s c h i n s k y FM ( 1 9 7 8 ) On t h e b i o c h e m i c a l n a t u r e o f t r i o s e - a n d h e x o s e - s t i m u l a t e d i n s u l i n s e c r e t i o n . E n d o c r i n o l o g y 1 0 3 : 2 0 2 7 - 2 0 3 4 

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