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Protein synthesis by human gingival fibroblasts in the presence of thiol compounds Johnson, Paul William 1983

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PROTEIN SYNTHESIS BY HUMAN GINGIVAL FIBROBLASTS IN THE PRESENCE OF THIOL COMPOUNDS By PAUL W I L L I A M JOHNSON B . S c , The U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1970 D.M.D., The U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1973 A THESIS SUBMITTED I N PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF MASTER OF SCIENCE i n THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES ( D e p a r t m e n t o f P a t h o l o g y ) We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H COLUMBIA A u g u s t 1983 © P a u l W i l l i a m J o h n s o n , 1983 In presenting t h i s thesis i n p a r t i a l f u l f i l m e n t of the requirements for an advanced degree at the University of B r i t i s h Columbia, I agree that the Library s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of t h i s t h e s i s fo r s c h o l a r l y purposes may be granted by the head of my department or by h i s or her representatives. I t i s understood that copying or p u b l i c a t i o n of t h i s thesis for f i n a n c i a l gain s h a l l not be allowed without my written permission. Department of The University of B r i t i s h Columbia 1956 Main Mall Vancouver, Canada V6T 1Y3 Date C ^ T j t // }?R ^ DE-6 (3/81) ABSTRACT H y d r o g e n s u l p h i d e a n d m e t h y l m e r c a p t a n a r e i n t e r m e d i a t e v o l a t i l e m e t a b o l i t e s p r o d u c e d i n t h e o r a l c a v i t y t h r o u g h p u t r e f a c t i v e a c t i o n o f m i c r o o r g a n i s m s o n s u l p h u r -c o n t a i n i n g p r o t e i n a c e o u s s u b s t r a t e s . T hey a r e t h e p r i n c i p a l c a u s e o f i n t e n s i f i e d m a l o d o u r a s s o c i a t e d w i t h p e r i d o n t a l d i s e a s e a n d c o r r e l a t e w i t h t h e d e p t h o f s u l c u l a r p o c k e t s and s e v e r i t y o f d i s e a s e . T h e i r c a p a c i t y t o b i n d t o t y p e I c o l l a g e n a n d t h e i r a b i l i t y t o d e p r e s s DNA s y n t h e s i s i n f i b r o b l a s t t i s s u e c u l t u r e s s u g g e s t s t h a t t h e y may p l a y a s i g n i f i c a n t r o l e i n t h e e t i o l o g y o f p e r i o d o n t i t i s . The p r e s e n t s t u d y e x a m i n e s t h e e f f e c t o f t h e s e compounds on p r o t e i n s y n t h e s i s . Human g i n g i v a l f i b r o b l a s t s w e r e g r o w n t o c o n f l u e n c y , a t t a c h e d t o d i s h e s i n e q u a l n u m b e r s , and i n c u b a t e d i n s e r u m - f r e e D u l b e c c o M o d i f i e d E a g l e ' s Medium s u p p l e m e n t e d e i t h e r w i t h L - [ ^ C ] - p r o l i n e o r L - [ ^ H ] - p r o l i n e a n d L - C ^ ^ C ] -g l y c i n e . T e s t c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d i n an a t m o s p h e r e o f 5% C 0 2 / 9 5 % a i r a d m i x e d w i t h e i t h e r h y d r o g e n s u l p h i d e o r m e t h y l m e r c a p t a n ( 1 0 n g / m l ) and c o m p a r e d t o c o n t r o l s f r e e f r o m t h i o l s . F o l l o w i n g l a b e l l i n g , m e d i a a n d c e l l - a s s o c i a t e d p r o t e i n s w e r e h a r v e s t e d and a n a l y z e d f o r t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n , c o l l a g e n a s e -d i g e s t a b l e p r o t e i n , a n d p r o c o l l a g e n s . The r e s u l t s i n d i c a t e t h a t a l t h o u g h b o t h h y d r o g e n s u l p h i d e and m e t h y l m e r c a p t a n s u p p r e s s p r o t e i n s y n t h e s i s b y f i b r o b l a s t s , t h e e f f e c t o f m e r c a p t a n i s more p r o n o u n c e d . H y d r o g e n s u l p h i d e 14 d e c r e a s e d t o t a l [ C ] i n c o r p o r a t i o n i n t o p r o t e i n o f t e s t c u l t u r e s b y 18 t o 20% w h i l e m e r c a p t a n i n h i b i t e d t h e p r o c e s s b y a p p r o x i m a t e l y 30%. T h e s e c h a n g e s were p a r a l l e l e d b y d e c r e a s e s i n c o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n s . C o m p a r i s o n o f c o n t r o l a n d m e r c a p t a n - e x p o s e d c u l t u r e s b y D E A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y i n d i c a t e d t h a t a l t h o u g h t e s t c u l t u r e s c o n t a i n e d t w i c e t h e amounts o f t y p e I p r o c o l l a g e n s , l e v e l s o f a l l o t h e r e l u t e d p r o t e i n s were m a r k e d l y d e c r e a s e d . I n v e s t i g a t i o n s o f s i m i l a r c u l t u r e s u s i n g S D S - p o l y -a c r y l a m i d e s l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s d e m o n s t r a t e d t h a t e x p o s u r e o f c u l t u r e s t o m e r c a p t a n r e s u l t e d i n marked i n c r e a s e s o f t y p e I p r o c o l l a g e n and pC c o l l a g e n a 2 c h a i n s . The i d e n t i t y o f t h e s e c o m p o u n d s was c o n f i r m e d b y p e p s i n d i g e s t i o n a n d p r o v i d e d a d d i t i o n a l e v i d e n c e t h a t m e r c a p t a n c a u s e d a c c u m u l a t i o n o f t y p e I c o l l a g e n p r e c u r s o r s i n c u l t u r e . i i i S l a b g e l p r o f i l e s f r o m m e r c a p t a n - e x p o s e d c u l t u r e s a l s o i n d i c a t e d d e c r e a s e d amounts o f t y p e I I I 'a 1 c h a i n s . T h i s o b s e r v a t i o n may r e f l e c t a d e c r e a s e d r a t e o f c o n v e r s i o n o f t y p e I I I p r o c o l l a g e n s t o c o l l a g e n , o r , as t h e D E A E - c e l l u l o s e p r o f i l e s i n d i c a t e , a g e n e r a l r e d u c t i o n i n t y p e I I I c o l l a g e n s y n t h e s i s . R e v e r s i b i l i t y o f t h e s e e f f e c t s was i n v e s t i g a t e d i n c r o s s o v e r s t u d i e s w i t h 24 h o u r p r e i n c u b a t i o n s f o l l o w e d b y 24 14 h o u r L - f C ] - p r o l i n e p u l s i n g . A n a l y s i s o f t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n s and c o n f i r m a t o r y s t u d i e s w i t h S D S - p o l y a c r y l a m i d e s l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s d e m o n s t r a t e d t h a t t h e e f f e c t s p e r s i s t e d f o r a t l e a s t 24 h o u r s i n c u l t u r e . T h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t m e t h y l m e r c a p t a n i n t e r f e r e s w i t h e n z y m a t i c c o n v e r s i o n o f t y p e I p r o c o l l a g e n s t o c o l l a g e n a n d d e c r e a s e s t y p e I I I c o l l a g e n s y n t h e s i s b y f i b r o b l a s t s . T h i s change i s a c c o m p a n i e d b y an o v e r a l l d e c r e a s e i n s y n t h e s i s o f b o t h c o l l a g e n o u s and n o n - c o l l a g e n o u s p r o t e i n . T h e s e e f f e c t s , m o r e o v e r , p e r s i s t f o r a t l e a s t 24 h o u r s i n c u l t u r e . The d a t a s u g g e s t s t h a t v o l a t i l e t h i o l compounds s u c h as m e r c a p t a n may c o n t r i b u t e t o t h e p a t h o g e n e s i s o f p e r i o d o n t a l d i s e a s e . i v T a b l e o f C o n t e n t s A b s t r a c t L i s t o f T a b l e s L i s t o f F i g u r e s A c k n o w l e d g m e n t G e n e r a l I n t r o d u c t i o n C h a p t e r I A - V o l a t i l e S u l p h u r C o m p o u n d s ( V S C ) 1 . P r o d u c t i o n a n d M e t a b o l i s m 2. Q u a n t i t a t i o n o f V S C b y G a s C h r o m a t o g r a p h y 3. O r g a n i s m s I m p l i c a t e d i n V S C P r o d u c t i o n 4. C l i n i c a l I m p l i c a t i o n s B . S t r u c t u r e a n d M e t a b o l i s m o f C o l l a g e n s 1 . S t r u c t u r e o f t h e C o l l a g e n M o l e c u l e 2. T y p e s o f C o l l a g e n 3- C h a n g e s i n G i n g i v a l T i s s u e s A s s o c i a t e d w i t h P e r i d o n t a l D i s e a s e 4. I n t r a c e l l u l a r a n d E x t r a c e l l u l a r P r o c e s s i n g o P r o c o l l a g e n s T a b l e o f C o n t e n t s ( C o n t i n u e d ) Page C. C e l l C u l t u r e s 1. C e l l T y p e s and C o l l a g e n B i o s y n t h e s i s 22 2. E f f e c t o f C u l t u r e C o n d i t i o n s on F i b r o b l a s t M e t a b o l i s m 23 D. I n t e r a c t i o n s o f V o l a t i l e S u l p h u r Compounds w i t h O r a l T i s s u e s 1. B i n d i n g o f V o l a t i l e T h i o l Compounds t o Type I C o l l a g e n 2. E f f e c t o f V o l a t i l e T h i o l Compounds on P e r m e a b i l i t y o f O r a l M u c o s a E. I n h i b i t i o n o f Enzymes b y T h i o l O x i d i z i n g A g e n t s M e t h o d s a n d M a t e r i a l s C h a p t e r I I A- F i b r o b l a s t C u l t u r e s 1. C u l t u r e o f F i b r o b l a s t C e l l L i n e s f r o m E x p l a n t s 33 2. E x p e r i m e n t a l P r o t o c o l f o r R a d i o l a b e l l i n g 35 B. C h a r a c t e r i z a t i o n o f C e l l u l a r M e t a b o l i c F u n c t i o n s 1. A n a l y s i s o f T o t a l L a b e l l e d P r o t e i n b y T r i c h -l o r o a c e t i c A c i d P r e c i p i t a t i o n 38 v i T a b l e o f C o n t e n t s ( C o n t i n u e d ) Page 2. A l t e r a t i o n s i n C o l l a g e n a s e - D i g e s t a b l e P r o t e i n 42 a . E n z y m a t i c D i g e s t i o n a n d Q u a n t i t a t i o n o f S a m p l e s 42 b . C o l l a g e n a s e S t a n d a r d C u r v e a n d V e r i f i c a t i o n o f T o t a l E n z y m a t i c D i g e s t i o n 43 3. P r o l i n e T r a n s p o r t - M e a s u r e m e n t o f Membrane A l t e r a t i o n s A f f e c t i n g A m ino A c i d U p t a k e b y C e l l s 45 4. A n a l y s i s o f R a d i o l a b e l l e d P r o t e i n s b y DEAE -C e l l u l o s e C h r o m a t o g r a p h y 46 5. P r o t o c o l f o r R e v e r s i b i l i t y S t u d i e s o n t h e E f f e c t o f M e t h y l M e r c a p t a n on C o l l a g e n S y n t h e s i s - A n a l y s i s b y S D S / P o l y a c r y l a m i d e S l a b G e l E l e c t r o p h o r e s i s (SDS/PASGE) 47 6. P e p s i n D i g e s t i o n o f L a b e l l e d C o l l a g e n s 50 C h a p t e r I I I R e s u l t s A. P r e l i m i n a r y C o n t r o l S t u d i e s 51 B A n a l y s i s o f T o t a l L a b e l l e d P r o t e i n 53 C- A l t e r a t i o n s i n C o l l a g e n a s e - D i g e s t a b l e P r o t e i n 57 D. P r o l i n e T r a n s p o r t 65 E- A n a l y s i s o f R a d i o l a b e l l e d P r o c o l l a g e n s b y DEAE -C e l l u l o s e C h r o m a t o g r a p h y 65 VII T a b l e o f C o n t e n t s ( C o n t i n u e d ) F. A n a l y s i s o f T o t a l L a b e l l e d P r o t e i n t o D e t e r m i n e R e v e r s i b i l i t y o f CH-jSH I n h i b i t i o n G. A n a l y s i s o f R a d i o l a b e l l e d P r o t e i n s b y SDS/ P o l y a c r y l a m i d e S l a b G e l E l e c t r o p h o r e s i s (SDS/ PASGE) H. P e p s i n D i g e s t o f P r o c o l l a g e n s I . S t a t i s t i c s D i s c u s s i o n C h a p t e r I V A- I m p l i c a t i o n s o f t h e S t u d y - R e l a t i o n s h i p o f VSC t o t h e P e r i o d o n t a l D i s e a s e P r o c e s s R e f e r e n c e s , Page 69 73 79 80 y i i i L i s t o f T a b l e s T i t l e P r o t e i n s y n t h e s i s f o l l o w i n g 4 8 h q u i e s c e n c e i n p r e s e n c e o f CH^SH. P e r c e n t a g e d e c r e a s e i n p r o t e i n s y n t h e s i s f o l l o w i n g 4 8h q u i e s c e n c e i n p r e s e n c e o f CH^SH. V e r i f i c a t i o n o f c o m p l e t e n e s s o f c o l l a g e n a s e d i g e s t i o n . S y n t h e s i s o f t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n a n d c o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n f o l l o w i n g 4 8 h l a b e l l i n g i n ' p r e s e n c e o f CH 3SH. P e r c e n t a g e d e c r e a s e i n t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n a n d c o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n f o l l o w i n g 4 8 h l a b e l l i n g i n p r e s e n c e o f CH^SH. D i s t r i b u t i o n o f [ 1 4 C ] a c t i v i t y b e t w e e n m e d i a a n d c e l l e x t r a c t f r a c t i o n s i n s y s t e m s u s e d t o d e t e r m i n e r e v e r s i b i l i t y o f CH^SH i n h i b i t i o n . The c o n t i n u a n c e o f CH^SH i n h i b i t i o n i n s y s t e m s u n d e r n o r m a l c u l t u r e c o n d i t i o n s . Two-way a n a l y s i s o f v a r i a n c e o f t o t a l p r o t e i n s y n t h e s i s b y f i b r o b l a s t s f o l l o w i n g 4 8 h q u i e s c e n c e i n p r e s e n c e o f CH 3SH. Two-way a n a l y s i s o f v a r i a n c e o f t o t a l p r o t e i n a n d c o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n f o l l o w i n g 4 8 h l a b e l l i n g i n p r e s e n c e o f CH^SH. Two-way a n a l y s i s o f v a r i a n c e f o r s y s t e m s d e s i g n e d t o t e s t t h e c o n t i n u a n c e o f CH^SH i n h i b i t i o n . ix L i s t o f F i g u r e s F i g u r e Number T i t l e Page 1 S D S - p o l y a c r y l a m i d e s l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f t y p e I a c i d - s o l u b l e r a t - t a i l t e n d o n c o l l a g e n C a r b o x y m e t h y l - c e l l u l o s e c o l u m n c h r o m a -t o g r a p h y o f t y p e I c o l l a g e n 14 C a r b o x y m e t h y l - c e l l u l o s e c o l u m n c h r o m a -t o g r a p h y o f t y p e I c o l l a g e n e x p o s e d t o [ S] - h y d r o g e n s u l p h i d e 27 C a r b o x y m e t h y l - c e l l u l o s e c o l u m n c h r o m a t o -g r a p h y o f n e u t r a l s a l t e x t r a c t o f t y p e I a c i d - s o l u b l e c o l l a g e n e x p o s e d t o [ 5 S ] ' - h y d r o g e n s u l p h i d e 29 A p p a r a t u s f o r i n c u b a t i o n o f t e s t a n d c o n t r o l c u l t u r e s 36 R e l e a s e o f [ 1 4 C ] f r o m L - [ 1 4 C ] - p r o l i n e l a b e l l e d f i b r o b l a s t c u l t u r e m e d i a p r o t e i n s f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h b a c t e r i a l c o l l a g e n a s e 59 D E A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n o f p r o t e i n s s y n t h e s i z e d b y c o n t r o l f i b r o b l a s t c u l t u r e s . 66 8 D E A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n o f p r o t e i n s s y n t h e s i z e d b y f i b r o b l a s t c u l t u r e s i n t h e p r e s e n c e o f CH^SH 67 9 E x p e r i m e n t a l d e s i g n u s e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e C H - ^ S H - i n d u c e d r e d u c t i o n o f c o l l a g e n o u s p r o t e i n s y n t h e s i s i s r e v e r s i b l e 74 10 S D S - s l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f c o l l a g e n o u s p r o t e i n c h a i n s f r o m m e d i a f r a c t i o n s o f s y s t e m s shown i n F i g . 9 76 x L i s t of Figures (Continued) Figure Number T i t l e Page 11 Densitometric scanning of (C),(CT),and (TC) fluorograms shown i n F i g . 10 78 12 Comparison o f c o l l a g e n s from mercaptan-exposed f i b r o b l a s t cultures before and a f t e r pepsin d i g e s t i o n . 81 xi-ACKNOWLEDGEMENT I w i s h t o e x p r e s s my g r a t i t u d e t o D r . J o s e p h T o n z e t i c h , my M. S c . s u p e r v i s o r , f o r h i s a d v i c e a n d g u i d a n c e d u r i n g my w o r k i n h i s l a b o r a t o r y . H i s u n d e r s t a n d i n g a n d i n s t r u c t i o n h a v e c o n t r i b u t e d i m m e a s u r e a b l y t o my t r a i n i n g a s a r e s e a r c h e r . T h a n k s a r e a l s o e x t e n d e d t o D r . J o h n S i l v e r a n d D r . A l f r e d O g i l v i e f o r e n a b l i n g me t o c o n t i n u e r e s e a r c h d u r i n g my s p e c i a l t y t r a i n i n g a n d f o r a l l o w i n g me t o c u l t u r e human t i s s u e f r o m p a t i e n t s i n t h e p e r i o d o n t i c s p r o g r a m m e . I n a d d i t i o n , I w o u l d l i k e t o t h a n k D r . Don B r u n e t t e f o r u s e o f t h e c u l t u r e f a c i l i t i e s i n h i s l a b o r a t o r y and Mr. Tony Ng f o r p r e p a r i n g t h e f i g u r e s w h i c h a r e a p a r t o f t h i s t h e s i s . S p e c i a l t h a n k s a r e e x p r e s s e d t o Ms. D i a n n e P r i c e a n d Ms. H o l l y M a l e d y , t h e " f u n g i r l s " down t h e h a l l , f o r t h e i r l a u g h t e r and e n c o u r a g e m e n t w h i c h h e l p e d make l o n g w o r k i n g h o u r s seem s h o r t e r . I a l s o w i s h t o a c k n o w l e d g e f i n a n c i a l s u p p o r t r e c e i v e d f r o m t h e M e d i c a l R e s e a r c h C o u n c i l o f C a n a d a . x i i CHAPTER I GENERAL INTRODUCTION A. V o l a t i l e S u l p h u r Compounds (VSC) 1. P r o d u c t i o n and M e t a b o l i s m I t i s g e n e r a l l y a c c e p t e d t h a t t h e o r a l c a v i t y i s t h e p r i n c i p a l s o u r c e o f b o t h p h y s i o l o g i c a l a n d p a t h o l o g i c a l o r a l a n d b r e a t h m a l o d o u r ( 7 ) . T h i s c o n d i t i o n i s a t t r i b u t e d t o t h e p r e s e n c e o f v o l a t i l e compounds p r o d u c e d t h r o u g h p u t r e f a c t i o n o f p r o t e i n a c e o u s m a t e r i a l b y o r a l m i c r o f l o r a ( 2 6 ) . The p r o c e s s , w h i c h i n v o l v e s b o t h h y d r o l y s i s a n d p u t r e f a c t i o n o f p r o t e i n , o c c u r s n o r m a l l y i n t h e o r a l c a v i t y b u t i s i n t e n s i f i e d i n i n f l a m m a t o r y c o n d i t i o n s ( 6 0 ) . D e g e n e r a t i o n o f s o f t t i s s u e s , a s o b s e r v e d i n p e r i o d o n t a l d i s e a s e , i n c r e a s e s o d o u r p r o d u c t i o n and i s c h a r a c t e r i z e d b y a c h a n g e i n m i c r o f l o r a a c c o m p a n i e d b y i n c r e a s e d l e v e l s o f d e s q u a m a t e d h o s t c e l l s and b l o o d ( 6 0 ) . M o u t h a i r i s a c o m p l e x m i x t u r e o f v o l a t i l e compounds p r e s e n t i n t h e o r a l c a v i t y o f a l l i n d i v i d u a l s a t v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n s , g e n e r a l l y i n t h e p a r t s p e r b i l l i o n ( p p b ) r a n g e . T h e s e c o n c e n t r a t i o n s v a r y t h r o u g h o u t t h e d a y d e p e n d i n g o n 1 c o n d i t i o n s o f t h e o r a l e n v i r o n m e n t . I n c r e a s e d p r o d u c t i o n h a s b e e n o b s e r v e d d u r i n g p e r i o d s o f a b s t i n e n c e f r o m f o o d and l i q u i d , d e c r e a s e d s a l i v a f l o w , a n d r e d u c e d c a r b o h y d r a t e i n t a k e - a l l o f w h i c h f a c i l i t a t e i n c r e a s e d m e t a b o l i s m o f p r o t e i n ( 3 2 ) . H e n c e , maximum s t a g n a t i o n o c c u r s d u r i n g s l e e p and m o s t i n t e n s e o r a l m a l o d o u r i s a p p a r e n t i m m e d i a t e l y upon a r i s i n g i n t h e m o r n i n g . W i t h d r a w a l o f d i e t a r y c a r b o h y d r a t e a l s o e l e v a t e s o d o u r l e v e l s b y i n c r e a s i n g d e g r a d a t i o n o f e n d o g e n o u s p r o t e i n ( 6 2 ) . A l t h o u g h p u t r e s c e n t s a l i v a c o n t a i n s a l a r g e v a r i e t y o f v o l a t i l e p r o d u c t s , t h e m a j o r c a u s e o f o r a l m a l o d o u r i s a s s o c i a t e d w i t h v o l a t i l e a c i d i c compounds ( 6 2 ) . F o l l o w i n g 4 h o u r s a l i v a i n c u l a t i o n s a t 37°C b o t h t h e h e a d - s p a c e ( c l o s e d a t m o s p h e r e a b o v e t h e f l u i d ) a n d t h e l i q u i d m e d i u m p h a s e d e m o n s t r a t e p o s i t i v e n i t r o p r u s s i d e r e a c t i o n s f o r t h i o l g r o u p s . E v a l u a t i o n o f h e a d - s p a c e v a p o u r f r o m b o t h s a l i v a a n d p l a q u e i n c u b a t i o n s y s t e m s h a s i m p l i c a t e d v o l a t i l e s u l p h u r compounds ( V S C ) a s t h e m a j o r c a u s e o f o b j e c t i o n a l m a l o d o u r ( 7 3 ) . S u b s e q u e n t s t u d i e s h a v e a t t r i b u t e d t h e n i t r o p r u s s i d e - p o s i t i v e r e a c t i o n t o " m e t h y l m e r c a p t a n ( C H 3 S H ) and h y d r o g e n s u l p h i d e ( H 2 S ) , t h e t w o m a j o r compounds r e s p o n s i b l e f o r o r a l m a l o d o u r ( 6 2 ) . T h e s e s u b s t a n c e s a r e d e r i v e d f r o m d e g r a d e d p r o t e i n s t h r o u g h d e t h i o l a t i o n and d e m e t h i o l a t i o n o f s u l p h u r - c o n t a i n i n g a m i n o a c i d s ( 6 9 ) . 2 C h e m i c a l a n a l y s e s o f s u l p h u r c o n t e n t o f s a l i v a h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t t h i o l a n d d i s u l p h i d e g r o u p s c o n s t i t u t e o n l y a p p r o x i m a t e l y 5% o f t h e t o t a l s u l p h u r , most o f w h i c h i s i n a r e d u c e a b l e d i s u l p h i d e f o r m ( 6 6 ) . A l t h o u g h s a l i v a f i l t r a t e h a s t h e t o t a l s u l p h u r , t h i s compounds b u t l o w i n t h i o l b e e n shown t o b e a p o o r p u t r e f a c t i v e o d o u r s i n c e p r o t e i n a c e o u s p r e c u r s o r s u t i l i z e d f o r o d o u r p r o d u c t i o n a r e a s s o c i a t e d w i t h s u b s t a n c e s c o n t a i n e d w i t h i n c e l l u l a r c o m p o n e n t s o f t h e s a l i v a r y s e d i m e n t . T h i s f r a c t i o n c o n t a i n s b a c t e r i a , p r e c i p i t a t e d m u c i n s , l e u c o c y t e s and e x f o l i a t e d e p i t h e l i a l c e l l s w i t h . t h e l a t t e r c o n s i t u t i n g o v e r 98% o f t h e v o l u m e o f t h e s e d i m e n t . The s u b s t r a t e i s n o n - d i a l y z a b l e , p r e d o m i n e n t l y i n t h e d i s u l p h i d e f o r m , and p a n b e r e l e a s e d b y v i g o r o u s s o n i c a t i o n o f t h e s e d i m e n t ( 6 6 ) . 2. Q u a n t i t a t i o n o f VSC b y Gas C h r o m a t o g r a p h y I n i t i a l a t t e m p t s t o q u a n t i t a t e VSC o f m outh a i r w e r e h i n d e r e d b y t h e l a c k o f m e t h o d o l o g y s u f f i c i e n t l y s e n s i t i v e t o d e t e c t l e v e l s o f s u l p h u r compounds p r e s e n t i n t h e ppb r a n g e ( 5 2 ) . A l t h o u g h m a s s s p e c t r o m e t r i c a n a l y s i s s u g g e s t e d t h e p r e s e n c e o f VSC i n m o u t h a i r , t h e c o n c e n t r a t i o n s w e r e t o o l o w t o b e e n shown t o c o n t a i n o v e r 8 0 % o f f r a c t i o n i s h i g h i n i n o r g a n i c s u l p h u r and d i s u l p h i d e . F i l t r a t e h a s a l s o s u b s t r a t e f o r p r o d u c t i o n o f VSC and 3 p e r m i t p o s i t i v e i d e n t i f i c a t i o n a n d q u a n t i t i a t i o n . D e t e c t i o n a n d q u a n t i t a t i o n o f t h e s e compounds i n n a n o g r a m amounts was l a t e r e s t a b l i s h e d b y T o n z e t i c h ( 6 2 ) u s i n g a g a s c h r o m a t o g r a p h e q u i p p e d w i t h a f l a m e p h o t o m e t r i c d e t e c t o r s p e c i f i c f o r d e t e r m i n a t i o n o f s u l p h u r . D i r e c t a n a l y s i s o f s a m p l e s d e m o n s t r a t e d t h e p r e s e n c e o f h y d r o g e n s u l p h i d e , m e t h y l m e r c a p t a n , and d i m e t h y l s u l p h i d e i n — 8 —10 m outh a i r o f a l l i n d i v i d u a l s a t r a n g e s o f 10 t o 10 g r a m s s u l p h u r p e r 10 m l s a m p l e . H y d r o g e n s u l p h i d e a n d m e t h y l m e r c a p t a n , w h i c h a c c o u n t e d f o r o v e r 90% o f VSC, w e r e p r e s e n t i n c o n c e n t r a t i o n s w h i c h w e r e s u f f i c i e n t l y h i g h t o a c c o u n t f o r o r a l m a l o d o u r o f more t h a n 50% o f a d u l t p o p u l a t i o n s u p o n a r i s i n g i n t h e m o r n i n g . The t h r e s h o l d o f o b j e c t i o n a b i l i t y f o r CHgSH and H 0 S i s 40 a n d 1 2 0 p p b , r e s p e c t i v e l y . H e a d - s p a c e a n a l y s i s o f s a l i v a a n d p l a q u e i n c u b a t i o n s y s t e m s s u p p l e m e n t e d w i t h s u l p h u r - c o n t a i n i n g s u b s t r a t e s d e m o n s t r a t e d t h e p r e s e n c e o f s i m i l a r VSC and i n d i c a t e d t h a t t h e o d o u r p r o d u c t i o n c o u l d b e a l t e r e d b y t y p e a n d q u a n t i t y o f t h e p r o t e i n s u p p l e m e n t ( 6 9 ) . A l t h o u g h s a l i v a r y s e d i m e n t i s t h e p r i n c i p a l s o u r c e o f s u b s t r a t e i n w h o l e s a l i v a , t h e p r e s e n c e o f f i l t r a t e i s r e q u i r e d t o a f f e c t p u t r e f a c t i o n . Use o f s a l i v a r y f i l t r a t e s i n o c u l a t e d w i t h p l a q u e m i c r o o r g a n i s m s p r o v i d e d a r e l i a b l e s y s t e m f o r s t u d y i n g t h e o r i g i n o f d i f f e r e n t VSC c o m p o n e n t s . G a s c h r o m a t o g r a p h i c p r o f i l e s o f VSC r e s u l t i n g f r o m i n c u b a t i o n s o f 4 p l a q u e - i n o c u l a t e d f i l t r a t e s u p p l e m e n t e d w i t h m e t h i o n i n e i n d i c a t e d t h a t t h i s a m i no a c i d i s p r o b a b l y t h e m a j o r s o u r c e o f m e t h y l m e r c a p t a n i n h e a d - s p a c e o f s a l i v a a n d m o u t h a i r ( 6 5 ) . H o w e v e r , i n c y s t e i n e and c y s t i n e - c o n t a i n i n g s y s t e m s t h e m a j o r p r o d u c t was h y d r o g e n s u l p h i d e . As m o s t o f t h e s u b s t r a t e p r e c u r s o r s i n s a l i v a a r e i n d i s u l p h i d e s t a t e , t h e m e c h a n i s m o f VSC p r o d u c t i o n f i r s t r e q u i r e s r e d u c t i o n o f d i s u l p h i d e s t o t h i o l s p r i o r t o d e t h i o l a t i o n . The d e g r a d a t i o n o f c y s t e i n e i n s a l i v a h a s b e e n shown t o b e m e d i a t e d v i a a s e r i n e s u l p h y d r a s e w h i c h c l e a v e s o f f t h e t h i o l g r o u p t o y i e l d h y d r o g e n s u l p h i d e and s e r i n e ( 6 8 ) . The enzymes i n v o l v e d i n t h e p r o d u c t i o n o f m e t h y l m e r c a p t a n f r o m m e t h i o n i n e h a v e , a s y e t , n o t b e e n c h a r a c t e r i z e d . 3. O r g a n i s m s I m p l i c a t e d i n VSC P r o d u c t i o n O d o u r p r o d u c t i o n i s d e p e n d e n t o n n u m e r o u s p r o t e o l y t i c m i c r o o r g a n i s m s ( 2 ) . W h i l e many s p e c i e s o f b a c t e r i a a r e c a p a b l e o f p r o d u c i n g VSC, t h e s t r o n g e s t a c t i v i t y i s p r o d u c e d b y a m i x e d f l o r a , s u g g e s t i n g a p o s s i b l e s y m b i o t i c r e l a t i o n s h i p b e t w e e n s t r a i n s . B l o o d and b l o o d p r o d u c t s h a v e b e e n shown t o e n h a n c e t h e g r o w t h o f c e r t a i n o d o u r - p r o d u c i n g b a c t e r i a a n d e l e v a t e VSC ( 1 5 ) . S i n c e b l e e d i n g i s a s s o c i a t e d w i t h p e r i o d o n t a l d i s e a s e , e n h a n c e d g r o w t h o f s u c h b a c t e r i a i s c o n s i d e r e d a n i m p o r t a n t f a c t o r i n t h e m a l o d o u r a s s o c i a t e d w i t h o r a l i n f l a m m a t i o n . 5 Maximum o d o u r p r o d u c t i o n o c c u r s a t p h y s i o l o g i c and s l i g h t l y b a s i c pH and i s i n h i b i t e d b e l o w pH6.5 ( 3 5 ) . T h i s o b s e r v a t i o n i s i n a c c o r d w i t h c l i n i c a l s t u d i e s w h i c h a s c r i b e h a l i t o s i s t o b a c t e r i a l d e g r a d a t i o n o f p r o t e i n a t n e u t r a l pH. A c i d i c pH l e v e l s r e s u l t i n g f r o m m e t a b o l i s m o f e x o g e n o u s c a r b o h y d r a t e a r e n o t a s s o c i a t e d w i t h o d o u r p r o d u c t i o n ( 6 4 ) . P e r i o d o n t a l d i s e a s e i s c h a r a c t e r i z e d b y a c h a n g e i n t h e b a c t e r i a l p o p u l a t i o n i n t h e g i n g i v a l s u l c u s f r o m g r a m - p o s i t i v e c o c c i t o m o t i l e g r a m - n e g a t i v e a n a e r o b i c r o d s and s p i r o c h e t e s ( 3 1 ) . The g r a m - n e g a t i v e o r g a n i s m s a r e p r o t e o l y t i c and h a v e b e e n i m p l i c a t e d a s t h e p r i m a r y a g e n t s r e s p o n s i b l e f o r VSC a n d o d o u r p r o d u c t i o n ( 3 5 ) . G i n g i v a l c r e v i c e s c r a p i n g s h a v e b e e n shown t o c o n t a i n s e v e r a l s t r a i n s o f B a c t e r i o d e s m e l a n i n o g e n i c u s w i t h v a r i a b l e p a t h o g e n i c p o t e n t i a l . The p a t h o g e n i c s p e c i e s h a v e b e e n i m p l i c a t e d i n t h e e t i o l o g y o f p e r i o d o n t a l d i s e a s e ( 5 8 ) . They e x h i b i t b o t h p r o t e o l y t i c and c o l l a g e n o l y t i c a c t i v i t y , h a v e t h e a b i l i t y t o p r o d u c e l a r g e a m o u n t s o f VSC, a n d a r e d e c i d e d l y d i f f e r e n t f r o m n o n - p a t h o g e n i c s t r a i n s i n o d o u r p r o d u c i n g c a p a b i l i t y ( 7 1 ) . The p a t h o g e n s a l s o m e t a b o l i z e g r e a t e r a m o unts o f s u l p h u r - c o n t a i n i n g a m i n o a c i d s a n d e m i t up t o e i g h t t i m e s m ore t o t a l VSC t h a n t h e n o n - p a t h o g e n s . I n a d d i t i o n , p a t h o g e n i c s p e c i e s p r o d u c e l a r g e amounts o f m e t h y l m e r c a p t a n and d i m e t h y l d i s u l p h i d e w h i l e c o l l a g e n a s e - n e g a t i v e s t r a i n s e m i t o n l y h y d r o g e n 6 s u l p h i d e a n d l i m i t e d a m o u n t s o f m e t h y l m e r c a p t a n . T h e s e o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e t h a t g a s c h r o m a t o g r a p h y c a n b e c o n v e n i e n t l y u s e d t o a s s e s s p a t h o g e n i c p o t e n t i a l o f s u c h b a c t e r i a l s t r a i n s a n d t h a t m e t h y l m e r c a p t a n i s t h e m a j o r c o m p o n e n t o f o d o u r f r o m s p e c i e s c a u s i n g t i s s u e d e s t r u c t i o n . The p o s s i b i l i t y a l s o e x i s t s t h a t m e r c a p t a n may b e a t o x i c i n t e r m e d i a t e w h i c h c o u l d a d v e r s e l y a f f e c t o r a l s o f t t i s s u e . 4. C l i n i c a l I m p l i c a t i o n s C l i n i c i a n s h a v e o b s e r v e d i n c r e a s e d i n t e n s i t y o f mouth o d o u r a s s o c i a t e d w i t h many i n f l a m m a t o r y p e r i o d o n t a l d i s e a s e s . T h e s e f i n d i n g s w e r e c o n f i r m e d b y a n e a r l y s t u d y w h i c h m e a s u r e d h y d r o g e n s u l p h i d e p r o d u c t i o n i n p e r i o d o n t a l p o c k e t s u s i n g f i l t e r p a p e r s t r i p s i m p r e g n a t e d w i t h l e a d a c e t a t e ( 5 3 ) . R i z z o i n v e s t i g a t e d t h e r a t e o f h y d r o g e n s u l p h i d e p r o d u c t i o n i n p e r i o d o n t a l p o c k e t s b y o b s e r v i n g t h e a p p e a r a n c e o f b r o w n t o b l a c k d i s c o l o u r a t i o n o f p a p e r d u e t o f o r m a t i o n o f l e a d s u l p h i d e . G r e a t e s t a m o u n t s o f I^S w e r e d e t e c t e d i n a r e a s o f mos t s e v e r e p e r i o d o n t a l d e s t r u c t i o n . F u r t h e r e v i d e n c e h a s b e e n p r o v i d e d b y t h e s t u d i e s o f T o n z e t i c h a n d S p o u g e who e m p l o y e d g a s c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s i s o f mouth a i r f o r a s s e s s m e n t o f s e v e r i t y o f p e r i o d o n t a l i n v o l v e m e n t i n human s u b j e c t s ( 7 4 ) . T h i s 7 i n v e s t i g a t i o n e s t a b l i s h e d a p o s i t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n VSC c o n c e n t r a t i o n a n d d e g r e e o f p e r i o d o n t a l i n v o l v e m e n t . I n a d d i t i o n , r o u t i n e p e r i o d o n t a l t h e r a p y c a u s e d a p r o g r e s s i v e d e c r e a s e i n b a s e l i n e l e v e l s o f o d o u r - a s s o c i a t e d compounds and r e d u c e d VSC c o n t e n t o f mouth a i r t o n e a r - n o r m a l v a l u e s . A l t h o u g h t h e s e o b s e r v a t i o n s d e m o n s t r a t e t h a t VSC a r e i n d i c a t i v e o f s e v e r i t y o f p e r i o d o n t a l i n v o l v e m e n t , s t u d i e s on t h e c h e m i c a l and b i o l o g i c a l e f f e c t s o f t h i o l compounds s u g g e s t t h a t t h e y may a l s o c o n t r i b u t e t o t h e e t i o l o g y o f t h e d i s e a s e . I n s o l u b l e and a c i d - s o l u b l e c o l l a g e n t r e a t e d w i t h c y s t e a m i n e (6 -m e r c a p t o e t h y l a m i n e ) h a v e b e e n shown t o be c o n v e r t e d t o _ more s o l u b l e p r o d u c t s w h i c h c a n be e x t r a c t e d i n n e u t r a l s a l t s o l u t i o n s ( 1 3 ) . A n a l y s i s o f f u n c t i o n a l g r o u p s h a s i n d i c a t e d t h a t t h e r e a c t i o n p r o d u c t s c o n t a i n e l e v a t e d l e v e l s o f f r e e a l d e h y d e . T h i s o b s e r v a t i o n s u g g e s t s t h a t t h e t h i o l s may be c a p a b l e o f c l e a v i n g a l d o l c o n d e n s a t i o n c r o s s - l i n k a g e s w i t h s u b s e q u e n t e x p o s u r e o f f r e e a l d e h y d e g r o u p s . Such a r e a c t i o n w o u l d a l s o i n c o r p o r a t e s u l p h u r i n t o t h e c o l l a g e n m o l e c u l e . H y d r o g e n s u l p h i d e h a s b e e n shown t o r e a c t w i t h c o l l a g e n b y a s i m i l a r m e c h a n i s m (70) and may be c a p a b l e o f a l t e r i n g i t s p r o t e i n s t r u c t u r e t o a f o r m more s u s c e p t i b l e t o e n z y m a t i c d e g r a d a t i o n . 8 B. S t r u c t u r e and M e t a b o l i s m o f C o l l a g e n s 1. S t r u c t u r e o f t h e C o l l a g e n M o l e c u l e The t e r m " c o l l a g e n " d e n o t e s a g r o u p o f h e t e r o g e n e o u s m o l e c u l e s s e g r e g a t e d i n t o d i f f e r e n t t y p e s b y p r i m a r y s t r u c t u r e , f i b r i l a r r a n g e m e n t , a n d t i s s u e o f o r i g i n . . N u m e r o u s c o m p r e h e n s i v e r e v i e w a r t i c l e s h a v e b e e n w r i t t e n r e g a r d i n g t h i s s u b j e c t ( 7 7 , 4 8 , 3 6 ) . The f o l l o w i n g d i s c u s s i o n i s t h e r e f o r e i n t e n d e d o n l y a s a b a s i c i n t r o d u c t i o n d i r e c t e d t o w a r d i n f o r m a t i o n r e l e v e n t t o t h e t h e s i s . M o s t k n o w l e d g e r e g a r d i n g c o l l a g e n s t r u c t u r e was o b t a i n e d t h r o u g h s t u d i e s o f t y p e I c o l l a g e n s b e c a u s e o f t h e i r a b u n d a n c e i n m a t u r e v e r t e b r a t e s . B a s i c c o l l a g e n m o l e c u l e s o r t r o p o c o l l a g e n s c o n s i s t o f t h r e e p o l y p e p t i d e a c h a i n s o f a p p r o x -i m a t e l y lOOO a m i n o a c i d s i n l e n g t h c o i l e d i n t o a l e f t h a n d e d t r i p l e h e l i x . The c h a i n s a r e c o mposed o f r e p e a t i n g t r i p l e t s t r u c t u r e s s y m b o l i z e d a s X - Y - G l y i n w h i c h e v e r y t h i r d a m i n o a c i d r e s i d u e i s g l y c i n e w i t h t h e Y p o s i t i o n o f t e n o c c u p i e d b y h y d r o x y p r o l i n e o r h y d r o x y i y s i n e a n d t h e X p o s i t i o n o f t e n o c c u p i e d b y p r o l i n e . I n a d d i t i o n t o t h e t r i p l e h e l i c a l r e g i o n w h i c h c o m p r i s e s m o s t o f t h e m o l e c u l e , s h o r t n o n - h e l i c a l e x t e n s i o n s d e s i g n a t e d a s t e l o p e p t i d e s a r e p r e s e n t a t t h e N t ^ -and COOH - t e r m i n a l e n d s . 9 T h e s e domains a r e s i t e s o f h y d r o x y l y s i n e - d e r i v e d i n t r a m o l e c u l a r a n d i n t e r m o l e c u l a r c r o s s - l i n k s w h i c h a r e r e s p o n s i b l e f o r " m a t u r a t i o n " o f c o l l a g e n o r d e c r e a s e i n s o l u b i l i t y r e l a t e d t o e x t e n s i v e i n t e r c o n n e c t i n g o f f i b r e b u n d l e s . S i n c e c r o s s - l i n k a g e a r e a s a r e n o t i n t r i p l e - h e l i c a l c o n f i g u r a t i o n , t h e y a r e more s u s c e p t i b l e t o e n z y m a t i c d e g r a d a t i o n w h e r e a s t h e m a i n t r i p l e - h e l i c a l domain o f t h e m o l e c u l e i s o f t e n l e f t i n t a c t . T h i s c o n c e p t f o r m s t h e b a s i s f o r l i m i t e d p e p s i n d i g e s t i o n - one o f t h e more commonly u s e d p r o c e d u r e s f o r e x t r a c t i o n o f c o l l a g e n p r e p a r a t i o n s f r o m mature i n s o l u b l e c o l l a g e n . 2. . T y p e s o f C o l l a g e n A l t h o u g h c o l l a g e n s a r e r e m a r k a b l y s i m i l a r i n s u b u n i t s i z e , h e l i c a l s t r u c t u r e a n d , t o some e x t e n t , i n a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n , d i f f e r e n t t i s s u e s f r o m t h e same o r g a n i s m a r e c h a r a c t e r i z e d b y g e n e t i c a l l y d i f f e r e n t c o l l a g e n t y p e s . I n a d d i t i o n , c e l l c u l t u r e s o r d i s e a s e d t i s s u e s may p r o d u c e a b n o r m a l s p e c i e s o r may a l t e r t h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f t h o s e w h i c h a r e n a t u r a l l y p r e s e n t . 1 0 T y p e I C o l l a g e n T y p e I c o l l a g e n i s t h e m o s t u b i q u i t o u s o f a l l s p e c i e s and h a s b e e n i s o l a t e d f r o m many a d u l t c o n n e c t i v e t i s s u e s i n c l u d i n g s k i n , b o n e , t e n d o n , p e r i o d o n t a l l i g a m e n t a n d g i n g i v a . The t r o p o c o l l a g e n m o l e c u l e i s c o m p r i s e d o f t w o i d e n t i c a l a.l c h a i n s and one a 2 c h a i n a b b r e v i a t e d a s [ a l ( I ) ] and [ «2 ( I ) ] . The c o m p l e t e m o l e c u l e i s d e s i g n a t e d a s [ a l ( l ) ] 2 a 2 ( I ) . D i m e r s o f a l and a 2 c o m p o n e n t s , c r o s s - l i n k e d i n t h e t e l o p e t i d e r e g i o n , c a n a l s o b e d e m o n s t r a t e d i f t h e m o l e c u l e i s d e n a t u r e d a n d f r a c t i o n -a t e d b y e i t h e r S D S / p o l y a c r y l a m i d e s l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( S D S / P A S G E ) o r c a r b o x y m e t h y l - c e l l u l o s e ( C M - c e l l u l o s e ) c h r o m a t o g r a p h y . T h e s e c o m p o n e n t s a r e i d e n t i f i e d a s 311 o r 3 12 w i t h t h e s u b s c r i p t s r e f e r i n g t o t h e i n d i v i d u a l c h a i n s i n t h e d i m e r ( S e e F i g . 1 a n d F i g 2 ) . T r i m e r s c o m p o s e d o f t h r e e a c h a i n s a r e a l s o p r e s e n t and a r e t e r m e d Y c h a i n s . H i g h e r o r d e r a g g r e g a t e s and Y c h a i n s m i g r a t e o n l y s l i g h t l y f r o m t h e o r i g i n i n 5-7% g e l s ( 2 5 ) w h i l e 3 and a c h a i n s m i g r a t e w i t h o t h e r c o l l a g e n o u s p r o t e i n s and s e p a r a t e o n t h e b a s i s o f m o l e c u l a r w e i g h t . S i n c e t h e m o l e c u l e c o n t a i n s no c y s t e i n e , t h e r e i s no n e c e s s i t y t o u s e r e d u c i n g a g e n t s s u c h a s 3 - m e r c a p t o e t h a n o l t o c l e a v e d i s u l p h i d e b o n d s t o v i s u a l i z e a c h a i n s b y SDS/PASGE. I n c o n t r a s t , v i s u a l i z a t i o n o f a c h a i n s o f t y p e I I I c o l l a g e n r e q u i r e s r e d u c t i o n o f d i s u l p h i d e b o n d s w h i c h a r e p r e s e n t i n t h e h e l i c a l r e g i o n o f t h e m o l e c u l e . 11 F i g . 1. SDS - p o l y a c r y l a m i d e s l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f t y p e I a c i d - s o l u b l e r a t - t a i l t e n d o n c o l l a g e n . T ype I a c i d - s o l u b l e r a t - t a i l t e n d o n c o l l a g e n was d i s p e r s e d i n s a m p l e b u f f e r ( 2 5 mM T r i s / g l y c i n e r e s e r v o i r b u f f e r , 2 M u r e a , 2% s o d i u m d o d e c y l s u l p h a t e (SDS) and 1% b r o m o p h e n o l b l u e ) a n d h e a t e d t o 55°C f o r 15 m i n u t e s . A l i q u o t s o f 1 0 0 y l c o n t a i n i n g a p p r o x i m a t e l y l O O y g o f s a m p l e w e r e s e p a r a t e d b y SDS/PASGE a t 50V f o r 1 8 h . C o l l a g e n c h a i n s w e r e d e t e c t e d b y s t a i n i n g w i t h 0.25% (w/v) C o o m a s s i e B l u e . G e l s e x h i b i t t y p i c a l a and 3 c h a i n s o f t y p e I c o l l a g e n . 12 8-, F R A C T I O N N U M B E R F i g . 2. C a r b o x y m e t h y l - c e l l u l o s e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y o f t y p e I c o l l a g e n L y o p h i l i z e d a c i d - s o l u b l e r a t - t a i l t e n d o n c o l l a g e n was r e c o n s t i t u t e d i n 2.5 m l b u f f e r ( 4 0 mM s o d i u m a c e t a t e / 4 M u r e a , pH 4.8) and i n c u b a t e d f o r one h o u r a t 56° C. D e n a t u r e d c h a i n s w e r e e l u t e d f r o m a j a c k e t e d 0.9 x 9.Ocm c o l u m n n a t 42°C w i t h a l i n e a r g r a d i e n t c o n s i s t i n g o f 100ml s t a r t i n g b u f f e r and 100ml 120 mM N a C l . F r a c t i o n s o f 2.5ml w e r e c o l l e c t e d a t a f l o w r a t e o f 6.0ml/h. A b s o r b a n c e r e a d i n g s w e r e d e t e r m i n e d a t 223nm w i t h a U n i c a m SP 800-B U l t r a v i o l e t S p e c t r o p h o t o m e t e r . The e l u t e d p e a k s f r o m f r a c t i o n s 25 t o 50 c o r r e s p o n d t o a l , 311 , 3 12 and a 2 c h a i n s , r e s p e c t i v e l y . 14 T y p e I I I C o l l a g e n T y p e I I I c o l l a g e n , t h e s e c o n d m o s t p r e v a l e n t c o l l a g e n i n h e a l t h y p e r i o d o n t a l l i g a m e n t a n d g i n g i v a l t i s s u e ( 9 ) , i s s y n t h e s i z e d s i m u l t a n e o u s l y w i t h t y p e I c o l l a g e n b y f i b r o b l a s t c u l t u r e s ( 1 4 ) . The t y p e I I I t r o p o c o l l a g e n m o l e c u l e i s composed o f t h r e e i d e n t i c a l a 1 - c h a i n s a nd i s a b b r e v i a t e d [ a 1 l t l l l ) ] ^ . A n a l y s i s o f e x t r a c t s o f t y p e I I I c o l l a g e n i n d i c a t e t h a t i t i s a l w a y s f o u n d i n c l o s e a s s o c i a t i o n w i t h t y p e I , a l t h o u g h o t h e r c o l l a g e n s a s s o c i a t e d w i t h b a s e m e n t m e m b r a n e s may a l s o b e p r e s e n t . As m e n t i o n e d p r e v i o u s l y , t h e t r i p l e h e l i c a l p o s i t i o n o f t h e m o l e c u l e c o n t a i n s t w o c y s t e i n y l r e s i d u e s a t t h e - COOH t e r m i n a l e n d w h i c h p a r t i c i p a t e i n i n t r a m o l e c u l a r c r o s s - l i n k i n g ( 3 6 ) . T y p e I I I c o l l a g e n h a s b e e n i s o l a t e d f r o m n u m e r o u s s o u r c e s i n c l u d i n g g i n g i v a ( 3 8 ) a n d p e r i o d o n t a l l i g a m e n t ( 9 ) w h e r e i n h e a l t h i t n o r m a l l y c o m p r i s e s 2 0 - 3 0 % o f t h e c o l l a g e n c o n t e n t . T h i s s p e c i e s i s m o s t p r e v a l e n t i n t i s s u e s s u c h a s a o r t a ( 3 4 ) w h i c h r e q u i r e e l a s t i c i t y f o r n o r m a l f u n c t i o n . D e f e c t s r e l a t e d t o t h i s m o l e c u l e h a v e b e e n s e e n i n T y p e I V E h l e r s - D a n l o s Syndrome (EDS I V ) w h i c h i s c h a r a c t e r i z e d b y a d e f i c i e n c y o f t y p e I I I c o l l a g e n ( 4 7 ) . T h e a f f e c t e d p a t i e n t s h a v e f r a g i l e , i n e x t e n s i b l e c o n n e c t i v e t i s s u e a n d n o r m a l l y d i e f r o m r u p t u r e o f 15 l a r g e a r t e r i e s o r b o w e l , e l a s t i n s i n c e t h i s p r o t e i n t i s s u e o f EDS I V a o r t a . A p p a r e n t l y , f o r m s a m a j o r t h e d e f e c t p a r t o f t h e i s n o t i n c o n n e c t i v e T y pe I T r i m e r T y p e I t r i m e r i s composed o f t h r e e i d e n t i c a l a 1 ( 1 ) c h a i n s o r o f t h r e e c h a i n s r e s e m b l i n g a 1 ( 1 ) w i t h t h e n o r m a l a 2 c h a i n s u b s t i t u t e d b y a n a d d i t i o n a l a l p e p t i d e u n i t . T h i s m o l e c u l e i s p r o d u c e d b y f i b r o b l a s t c e l l c u l t u r e s o f p o t e n t i a l l y a b n o r m a l c e l l s c a r r i e d t h r o u g h l a r g e n u m b e r s o f p a s s a g e s ( 3 3 ) . The s p e c i e s h a s a l s o b e e n i s o l a t e d in v i v o f r o m t i s s u e s u n d e r p a t h o l o g i c c o n d i t i o n s ( 3 8 ) a n d h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h i n f l a m m e d g i n g i v a . The m o l e c u l e d o e s n o t a p p e a r t o r e s u l t f r o m r e a r r a n g e m e n t o f s e c r e t e d t y p e I c o l l a g e n s u b u n i t s s i n c e a p r o c o l l a g e n f o r t y p e I t i m e r h a s b e e n i s o l a t e d a n d i n d i c a t e s t h a t t h e m o s t l i k e l y c a u s e i s d e v i a n t g e n e e x p r e s s i o n ( 1 0 ) . C o l l a g e n T y p e s I I , I V , a n d V A l t h o u g h t y p e I I c o l l a g e n i s n o t a c o m p o n e n t o f p e r i o d o n t a l t i s s u e s , i t i s i n c l u d e d i n t h i s d e c r i p t i o n o f c o l l a g e n s b e c a u s e i t i s a m a j o r member o f t h e c o l l a g e n f a m i l y . T h i s m o l e c u l e i s n o r m a l l y a s s o c i a t e d w i t h c a r t i l a g e ( 7 5 ) and i s composed o f t h r e e 16 i d e n t i c a l a l c h a i n s d e s i g n a t e d a s [ a 1 ( H ) ] . • The p r i m a r y s t r u c t u r e o f t h e s e s u b u n i t s i s n o t o n l y d i s t i n c t l y d i f f e r e n t f r o m Type I c o l l a g e n b u t a l s o d e m o n s t r a t e s g r e a t i n t e r n a l a m i n o a c i d s e q u e n c e v a r i a b i l i t y . T h i s v a r i a b i l i t y i s p r e s e n t n o t o n l y b e t w e e n s p e c i e s b u t a l s o w i t h i n t h e same t i s s u e s o f i d e n t i c a l s p e c i e s ( 3 6 ) . A t l e a s t t w o a d d i t i o n a l c o l l a g e n t y p e s h a v e b e e n i s o l a t e d f r o m b a s e m e n t membranes. I n c o n t r a s t t o t y p e s I , I I , a n d I I I w h i c h a r e s y n t h e s i z e d b y f i b r o b l a s t s , t h e s e p r o t e i n s a r e f o r t h e m o s t p a r t , s e c r e t e d b y e p i t h e l i a l c e l l s . B o t h o f t h e s e c o l l a g e n s , t y p e I V a n d V, e x h i b i t e l e v a t e d l e v e l s o f t r a n s - 3 - h y d r o x y p r o l i n e a l t h o u g h t h i s a m i n o a c i d i s a l s o p r e s e n t i n l e s s e r a m o u n t s i n o t h e r n o r m a l c o l l a g e n s a s w e l l a s i n t h e a ( I ) - t r i m e r ( 1 0 ) . The c l a s s i c a l t y p e I V c o l l a g e n i s d e p i c t e d t o c o n s i s t o f t h r e e i d e n t i c a l a c h a i n s . H o w e v e r , t y p e I V m o l e c u l e s h a v e a l s o b e e n i s o l a t e d w h i c h c o n t a i n a m i x t u r e o f s u b u n i t s ( 1 2 ) . The f i f t h c o l l a g e n t y p e , c omposed o f c h a i n s d e s i g n a t e d a s a A a n d a B , was i n i t i a l l y i s o l a t e d f r o m s a l t f r a c t i o n a t e d e x t r a c t s o f p l a c e n t a . I t h a s b e e n r e p o r t e d t o h a v e t h e s t r u c t u r e [ a ( B ) ] 2 a (A) o r A B 2 ( 8 ) b u t o t h e r c o n f o r m a t i o n s s u c h as (a A ) ^ and (aB) ^  h a v e a l s o b e e n d o c u m e n t e d a l o n g w i t h a t h i r d c h a i n , t h e ctC c h a i n ( 5 1 , 5 5 ) . N o m e n c l a t u r e f o r t h e s e s u b u n i t s v a r i e s s i n c e a A, a B and a C c h a i n s h a v e a l s o b e e n d e s i g n a t e d 17 as « 1 ( V ) , t * 2 ( V ) , and a 3 ( V ) i n t h e l i t e r a t u r e . I n s h o r t , i s o l a t i o n s o f c o l l a g e n s a s s o c i a t e d w i t h b a s e m e n t membranes h a v e r e v e a l e d a h e t e r o g e n e o u s m i x t u r e o f s u b u n i t s w h i c h h a v e v a r i a b l e a n d c o m p l e x i n t e r a c t i o n s . T h e r e l a t i o n s h i p o f t h e s e a g g r e g a t i o n s t o f u n c t i o n i s , a t p r e s e n t , a m a t t e r o f s p e c u l a t i o n . 3. C h a n g e s i n G i n g i v a l T i s s u e s A s s o c i a t e d W i t h P e r i o d o n t a l D i s e a s e I n f l a m m a t i o n o f g i n g i v a l t i s s u e h a s a marked i n f l u e n c e on t h e c o n t e n t o f c o l l a g e n w i t h i n t h e a f f e c t e d a r e a s and on t h e s p e c i e s o f c o l l a g e n s p r e s e n t . As e a r l y as 4 d a y s a f t e r t h e i n i t i a l a c c u m u l a t i o n o f d e n t a l p l a q u e , t h e r e i s a r a p i d l o s s o f 6 0 - 7 0 % o f c o l l a g e n a t t h e a f f e c t e d s i t e ( 4 3 ) . T h i s i s c h a r a c t e r i z e d b y a d r a s t i c r e d u c t i o n i n a c i d - s o l u b l e a n d i n s o l u b l e c o l l a g e n - t h e m a t u r e , more c r o s s - l i n k e d f o r m s o f t h e m o l e c u l e ( 3 8 ) . Whether t h i s phenomenum i s a r e f l e c t i o n o f a l t e r a t i o n s i n c o l l a g e n s y n t h e s i s o r d e g r a d a t i o n i s a m a t t e r f o r s p e c u l a t i o n . T h e e v i d e n c e i n d i c a t e s t h a t t h e d e s t r u c t i v e mechanisms l i k e l y p l a y t h e more i m p o r t a n t r o l e . 18 N o r m a l human g i n g i v a e a n d p e r i o d o n t a l l i g a m e n t c o n t a i n 2 0 % t o 30% t y p e I I I c o l l a g e n w i t h m o s t o f t h e r e m a i n d e r c omposed o f t y p e I ( 9 ) . E x p e r i m e n t a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f c o l l a g e n s f r o m f i b r o b l a s t s o f n o r m a l a n d d i s e a s e d g i n g i v a h a v e r e v e a l e d t h a t i n f l a m m e d t i s s u e s c o n t a i n o n l y 4% t y p e I I I c o l l a g e n ( 3 8 ) . I n a d d i t i o n , t y p e I t r i m e r , a m o l e c u l e b e l i e v e d t o b e a s s o c i a t e d w i t h a b n o r m a l c e l l m e t a b o l i s m , h a s b e e n i s o l a t e d b o t h f r o m i n f l a m m e d g i n g i v a l t i s s u e a n d f r o m f i b r o b l a s t s c u l t u r e d f r o m d i s e a s e d t i s s u e . S i n c e t h i s c o l l a g e n a p p e a r s more s o l u b l e t h a n t h e n o r m a l t y p e I s p e c i e s , i t i s s u g g e s t e d t h a t i t may b e more s u s c e p t i b l e t o e n z y m a t i c d e g r a d a t i o n ( 3 8 ) . D i s e a s e d g i n g i v a e a l s o c o n t a i n a b n o r m a l l y h i g h a m o u n t s o f o t h e r c o l l a g e n s . D u r i n g p e r i o d o n t i s a A and a B t y p e V c h a i n s become t h e s e c o n d m a j o r c o l l a g e n a f t e r t y p e I , a c c o u n t i n g f o r 8% o f t h e t o t a l c o l l a g e n c o n t e n t o f i n f l a m m e d g i n g i v a l t i s s u e ( 4 0 ) . They, t h e r e f o r e , r e p l a c e t y p e I I I a s t h e s e c o n d m a j o r c o l l a g e n s p e c i e s . The r a p i d l o s s o f c o n n e c t i v e t i s s u e d u r i n g i n f l a m m a t i o n i s p r e s u m e a b l y r e l a t e d t o t h e i n o r d i n a t e l y h i g h t u r n o v e r o f c o l l a g e n s i n p e r i o d o n t a l t i s s u e . R a d i o i s o t o p e and b i o c h e m i c a l s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t t h e h a l f l i f e o f c o l l a g e n i s 1 d a y i n p e r i o d o n t a l l i g a m e n t a n d 5 d a y s i n g i n g i v a . T h i s t u r n o v e r i s much more r a p i d t h a n i n o t h e r t i s s u e s u c h a s s k i n w h e r e t h e c o r r e s p o n d i n g h a l f l i f e i s f i f t e e n d a y s ( 5 9 ) . H e n c e , 19 e v e n a s m a l l i n c r e a s e i n t h e r a t e o f d e s t r u c t i o n o r a d e c r e a s e i n s y n t h e s i s w o u l d be r a p i d l y r e f l e c t e d i n t o t a l c o l l a g e n c o n t e n t o f t h e s e t i s s u e s . 4- I n t r a c e l l u l a r a n d E x t r a c e l l u l a r P r o c e s s i n g o f P r o c o l l a g e n s M a t u r e c o l l a g e n i s f o r m e d b y m u l t i p l e b i o s y n t h e t i c p r o c e s s e s i n i t i a l l y i n v o l v i n g p r e c u r s o r p r o c o l l a g e n m o l e c u l e s . R e v i e w a r t i c l e s ( 7 7 , 4 8 ) l i s t i n t r a c e l l u l a r e v e n t s a s e n c o m p a s s i n g : a- A s s e m b l y o f 3 p o l y p e p t i d e p r o a c h a i n s ( p r e c u r s o r c o l l a g e n c h a i n s ) o f a p p r o x i m a t e l y 1300 a m i n o a c i d s e a c h . b . P a r t i a l h y d r o x y l a t i o n o f p r o l y l a nd l y s y l r e s i d u e s i n t h e Y p o s i t i o n o f t h e X - Y - G l y s e q u e n c e s o f t h e p r o c o l l a g e n c h a i n s . c. A d d i t i o n o f d i s a c c h a r i d e g l u c o s e - g a l a c t o s e c h a i n s t o some h y d r o x y l y s y l r e s i d u e s . d. S y n t h e s i s o f i n t r a m o l e c u l a r d i s u l p h i d e b o n d s b e t w e e n p r o c o l l a g e n t e r m i n a l e x t e n s i o n s ( f r a g m e n t s l a t e r r e m o v e d b y e n z y m a t i c d i g e s t i o n ) . e. T r i p l e h e l i c a l f o r m a t i o n b e t w e e n a c h a i n s o f t h e p r o c o l l a g e n p r e c u r s o r s . 20 The p r o c o l l a g e n m o l e c u l e c o n s i s t s o f a c o l l a g e n c o r e ( t h r e e c o l l a g e n p r o - a c h a i n s i n a t r i p l e h e l i x ) w i t h p e p t i d e e x t e n s i o n s a t b o t h t h e "NH^ and - COOH e x t r e m i t i e s . P r o c e s s i n g o f p r o c o l l a g e n s r e m o v e s b o t h t e r m i n a l e x t e n s i o n s r e s u l t i n g i n f o r m a t i o n o f t r o p o c o l l a g e n w h i c h t h e n u n d e r g o e s f u r t h e r c r o s s l i n k i n g . P r e c u r s o r c o l l a g e n s i n c l u d e b o t h t h e p r o c o l l a g e n s and p - c o l l a g e n s w h i c h a r e i d e n t i f i e d a s e i t h e r pN c o l l a g e n s ( w h i c h c o n t a i n o n l y i n t a c t N - t e r m i n a l e x t e n s i o n s ) o r pC c o l l a g e n s ( w h i c h c o n t a i n e x t e n s i o n s o n l y a t t h e C - t e r m i n a l e n d ) . S e p a r a t i o n o f t h e s e p r e c u r s o r s i n t o t y p e I a n d I I I c o l l a g e n s i s p o s s i b l e u s i n g d i e t h y l a m i n o e t h y l (DEAE) c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y ( 2 7 ) . T h e s e i n t e r m e d i a t e s c a n a l s o b e s e p a r a t e d o n SDS/PASGE g e l s . P r o c o l l a g e n s a r e e x p o r t e d f r o m t h e c e l l a n d a r e c o n v e r t e d t o c o l l a g e n a c h a i n s b y e x t r a c e l l u l a r r e m o v a l o f t e r m i n a l e x t e n s i o n s ( 4 2 ) . E n z y m a t i c r e m o v a l o f t h e N - t e r m i n a l p r o p e p t i d e p r e c e d e s r e m o v a l o f t h e C - t e r m i n a l end and o c c u r s e i t h e r a t t h e c e l l s u r f a c e o r d u r i n g s e c r e t i o n o f t h e m o l e c u l e ( 3 7 ) . C e r t a i n d i s e a s e s t a t e s h a v e b e e n c h a r a c t e r i z e d b y d e f i c i e n c i e s o f t h e s e e n z y m e s . F o r e x a m p l e , d e r m a t o s p a r a x i s i s a g e n e t i c d e f e c t a s s o c i a t e d w i t h l a c k o f p r o c o l l a g e n N - p r o t e i n a s e . T h i s d i s o r d e r i s c h a r a c t e r i z e d b y l a r g e wounds as a r e s p o n s e t o m i n o r i n j u r i e s s i n c e r e t e n t i o n o f t h e p r o p e p t i d e f r a g m e n t p r e v e n t s n o r m a l 21 e x t r a c e l l u l a r c r o s s l i n k i n g a n d i n h i b i t s f o r m a t i o n o f m a t u r e c o l l a g e n f i b r i l s ( 2 4 ) . C. C e l l C u l t u r e s 1. C e l l T y p e s and C o l l a g e n B i o s y n t h e s i s C e l l m o r p h o l o g y i n v i t r o i s a m a j o r c r i t e r i a f o r d e f i n i n g c e l l t y p e . F o r e x a m p l e , c e l l s g r o w n f r o m g i n g i v a l e x p l a n t s o f t e n c o n t a i n m i x t u r e s o f f i b r o b l a s t s a n d e p i t h e l i a l c e l l s w h i c h a r e s e p a r a t e d f r o m e a c h o t h e r b y t h e i r r e l a t i v e r e s i s t a n c e t o r e m o v a l b y t r y p s i n . Once s e p a r a t e d , f i b r o b l a s t - l i k e c e l l s a r e c h a r a c t e r i z e d b y l o n g c y t o p l a s m i c e x t e n s i o n s w i t h s p i n d l e - s h a p e d c e l l u l a r o u t l i n e s . E p i t h e l i a l c e l l s , o n t h e o t h e r h a n d , a r e more c o m p a c t and r h o m b o i d . M o r p h o l o g y o f some c e l l t y p e s h a s b e e n shown t o c h a n g e i n c u l t u r e and may r e f l e c t a c h a n g e i n t h e g e n e t i c t y p e o f c o l l a g e n s y n t h e s i z e d b y a c e l l ( 8 0 ) . G e n e r a l l y , f i b r o b l a s t s s y n t h e s i z e c o l l a g e n s c o n t a i n e d w i t h i n t h e i r t i s s u e o f o r i g i n b u t c e l l g r o w t h i r i v i t r o may a l t e r s y n t h e t i c p a t h w a y s . F o r e x a m p l e , a l t h o u g h f r e s h l y d i s s o c i a t e d c h i c k embryo t e n d o n f i b r o b l a s t s s e c r e t e o n l y t y p e I c o l l a g e n ( 7 8 ) , a f t e r 3 p a s s a g e s i n m o n o l a y e r c u l t u r e a p p r o x i m a t e l y 8 0% o f t h e s e c e l l s s e c r e t e t y p e I I I a s 22 w e l l ( 1 9 ) . S i n c e f i b r o b l a s t s a r e a b l e t o s y n t h e s i z e t y p e s I a n d I I I c o l l a g e n s s i m u l t a n e o u s l y ( 1 4 ) , u n c e r t a i n t y e x i s t s a s t o w h e t h e r t h i s r e f l e c t s a l t e r e d c e l l c h a r a c t e r i s t i c s o r s e l e c t i o n o f s p e c i f i c f i b r o b l a s t c l o n e s . The A and B c o l l a g e n s h a v e a l s o b e e n d e m o n s t r a t e d a s p r o d u c t s o f f i b r o b l a s t s y n t h e s i s a n d may b e a t y p e p r o d u c e d b y mos t c o l l a g e n - p r o d u c i n g c e l l s ( 1 1 ) . E p i t h e l i a l c e l l s p r o d u c e p r o t e i n s a s s o c i a t e d w i t h b a s e m e n t membrane and a r e u s u a l l y c o n c e r n e d w i t h s y n t h e s i s o f t y p e s I V and V c o l l a g e n s ( 5 4 ) . H o w e v e r , l i k e f i b r o b l a s t s , some c e l l l i n e s c a n m a n u f a c t u r e a d d i t i o n a l o r e n t i r e l y d i f f e r e n t c o l l a g e n s i n c u l t u r e ( 3 6 ) . 2. E f f e c t o f C u l t u r e C o n d i t i o n s o n F i b r o b l a s t M e t a b o l i s m C o l l a g e n p r o d u c t i o n b y f i b r o b l a s t s c a n b e d r a m a t i c a l l y a l t e r e d b y c u l t u r e c o n d i t i o n s . As p r e v i o u s l y i n d i c a t e d , t h e r a t i o o f t y p e I t o I I I c o l l a g e n s may be i n f l u e n c e d s i m p l y b y g r o w t h i n v i t r o o r b y i n c r e a s i n g numbers o f c e l l p a s s a g e s ( 1 9 ) . T o t a l p r o t e i n s y n t h e s i s i s a l s o i n f l u e n c e d b y c e l l d e n s i t y s i n c e l o w d e n s i t y c u l t u r e s h a v e b e e n shown t o s y n t h e s i z e o n l y o n e t h i r d as much c o l l a g e n p e r c e l l as c u l t u r e s o f h i g h d e n s i t y ( 5 7 ) . C u l t u r i n g c e l l s i n h i g h d e n s i t y , h o w e v e r , i n c r e a s e s s y n t h e s i s o f t y p e I I I c o l l a g e n s ( 1 ) . 23 M e d i a c o n s t i t u e n t s h a v e a d r a m a t i c e f f e c t n o t o n l y o n t o t a l c o l l a g e n p r o d u c t i o n a n d p r o t e i n s y n t h e s i s b u t a l s o o n r a t i o o f c o l l a g e n t y p e s . F o r e x a m p l e , t h e a d d i t i o n o f 30PM a s c o r b a t e h a s b e e n shown t o i n c r e a s e t o t a l c o l l a g e n p r o d u c t i o n b y f o u r - f o l d a n d i n c r e a s e r e l a t i v e c o l l a g e n t o p r o t e i n s y n t h e s i s f r o m 9% t o 32% o f t o t a l p r o t e i n ( 4 6 ) . T h i s e f f e c t i s n o t r e l a t e d t o i n c r e a s e s i n t h e a c t i v i t y o f l y s y l a n d p r o l y l h y d r o x y l a s e s , and a s y e t i s n o t t o t a l l y u n d e r s t o o d . C o l l a g e n p r o d u c t i o n c a n a l s o b e m a x i m i z e d i f f i b r o b l a s t s a r e g r o w n i n h i g h g l u c o s e m e d i a c o n t a i n i n g a p p r o x i m a t e l y 5 mg/ml g l u c o s e ( 7 9 ) . T h i s b e n e f i t i s , h o w e v e r , a c c o m p a n i e d b y a 3 0 - 5 0 % i n c r e a s e i n t y p e I I I p r o c o l l a g e n . S i m i l a r l y , l o w e r i n g s e r u m c o n t e n t o f c u l t u r e s t o b e l o w 0.5% n o t o n l y o p t i m i z e s c o l l a g e n p r o d u c t i o n ( 5 7 ) b u t a l s o i n c r e a s e s p r o d u c t i o n o f t y p e I I I c o l l a g e n s ( 3 9 ) . G e n e r a l l y , e f f e c t s w h i c h t e n d t o i n c r e a s e c o l l a g e n p r o d u c t i o n a l s o i n f l u e n c e t h e t y p e s o f c o l l a g e n s s y n t h e s i z e d . I t i s e s s e n t i a l , t h e r e f o r e , t h a t t e s t a n d c o n t r o l c u l t u r e s be c a r r i e d o u t i n m e d i a o f s i m i l a r c o m p o s i t i o n a n d a t s i m i l a r o r i d e n t i c a l c e l l d e n s i t i e s . 24 D. I n t e r a c t i o n s o f V o l a t i l e S u l p h u r Compounds w i t h O r a l T i s s u e s 1. B i n d i n g o f V o l a t i l e T h i o l Compounds t o Type I C o l l a g e n A l t h o u g h t h i s t h e s i s d e a l s p r i m a r i l y w i t h c o l l a g e n s y n t h e s i s , i n i t i a l e x p e r i m e n t a t i o n i n t o t h e i n t e r a c t i o n o f VSC w i t h i n t a c t c o l l a g e n was deemed e s s e n t i a l t o an u n d e r s t a n d i n g o f e f f e c t s a s s o c i a t e d w i t h t h e s e t h i o l c o m p o u n d s . S o l u b i l i z a t i o n o f c o l l a g e n b y s u l p h y d r y l c o m p o u n d s h a d b e e n d e m o n s t r a t e d p r e v i o u s l y (13) a n d h a d . r e s u l t e d i n i n c o r p o r a t i o n o f s u l p h u r i n t o t h e c o l l a g e n m o l e c u l e . A l t h o u g h a s i m i l a r m e c h a n i s m h a d n o t b e e n d e m o n s t r a t e d f o r VSC, i n i t i a l b i n d i n g s t u d i e s u s i n g 3 5 r S l - H ^ S i n d i c a t e d t h a t t h i s m o l e c u l e was c a p a b l e o f 3 5 i n c o r p o r a t i n g [ S] i n t o s a l i v a r y p r o t e i n s a s w e l l a s Type I c o l l a g e n ( 7 0 ) . P r e l i m i n a r y p r o b e s i n v e s t i g a t e d t h i s e f f e c t u s i n g i n c u b a t i o n s y s t e m s w h i c h c o n t a i n e d o n l y T y p e I c o l l a g e n s u s p e n d e d i n a p h y s i o l o g i c b u f f e r e x p o s e d t o a h e a d - s p a c e o f 3 5 r S j - H ^ S . P a p e r c h r o m a t o g r a p h y d e m o n s t r a t e d t h a t n o n -d i a l y z a b l e r a d i o a c t i v i t y was i n c o r p o r a t e d i n t o p r o t e i n a n d r e m a i n e d s t a t i o n a r y a t t h e o r i g i n , i n c o n t r a s t t o i o n i c c o n s t i t u e n t s w h i c h m i g r a t e d i n t h e s o l v e n t s y s t e m s and c o u l d b e r e m o v e d b y d i a l y s i s . The i n c o r p o r a t i o n was n o t enzyme d e p e n d e n t 25 and r e p r e s e n t e d a c h e m i c a l r e a c t i o n b e t w e e n t h e s e two m o l e c u l e s . F u r t h e r e x p e r i m e n t s i n d i c a t e d t h a t d i m e t h y l d i s u l p h i d e , a n o x i d i z e d VSC c o m p o n e n t , was p o o r l y i n c o r p o r a t e d i n t o c o l l a g e n . T h e o n l y i n c o r p o r a t i o n a s s o c i a t e d w i t h t h e s e s y s t e m s was a p p r o x i m a t e l y e q u a l t o a s m a l l amount o f m e t h y l m e r c a p t a n c o n t a m i n a n t i n t h e i s o t o p e s a m p l e . The b i n d i n g o f VSC t o c o l l a g e n w a s , t h e r e f o r e , deemed t o p r o c e e d v i a f r e e s u l p h y d r y l g r o u p s s i n c e t h e d i m e t h y l d i s u l p h i d e was e s s e n t i a l l y i n e r t . I n i t i a l s t u d i e s d i d n o t c o n s t i t u t e d e f i n i t i v e p r o o f f o r i n t e r a c t i o n o f h y d r o g e n s u l p h i d e w i t h c o l l a g e n s i n c e t r a c e c o n t a m i n a n t p r o t e i n s i n t h e c o l l a g e n p r e p a r a t i o n c o u l d a l s o b e r e a c t i v e w i t h t h i o l s . R e a c t i o n m i x t u r e s c o n t a i n i n g l y o p h i l i z e d 3 5 a c i d - s o l u b l e t y p e I r a t - t a i l t e n d o n c o l l a g e n a n d [ S ] - H 2 S w e r e t h e r e f o r e a n a l y z e d b y C M - c e l l u l o s e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y and SDS-PASGE. F r a c t i o n s e l u t e d o f f C M - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h i c c o l u m n s w e r e a n a l y z e d b y l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g t o d e t e c t a n y b o u n d r a d i o a c t i v i t y and b y o p t i c a l d e n s i t y r e a d i n g s (OD) t o q u a n t i t a t e e l u t e d p r o t e i n p e a k s . E l u t i o n p r o f i l e s ( s e e F i g . 3) c l e a r l y show 3 5 S - r a d i o a c t i v i t y b o u n d w i t h t h e a 1/ g H / £ 12, and a2 c h a i n s o f T y p e I c o l l a g e n . E l u t i o n p a t t e r n s f r o m r e a c t i o n s e x p o s e d t o h i g h l e v e l s o f H 2S a n d e x t r a c t e d w i t h 26 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 FRACTION NUMBER F i g . 3. C a r b o x y m e t h y l - c e l l u l o s e ^ ^ o l u m n chromatography o f type I c o l l a g e n exposed t o [ S] - hydrogen s u l p h i d e . M i x t u r e s o f 15mg type I a c i d - s o l u b l e r a t - t a i l tendon c o l l a g e n were suspended i n 2.0 ml b u f f e r (0.02M Tris/0.134M NaCl, pH 7.4) and exposed f o r 4 days a t 4°C t o 120 ml of head-space c o n t a i n i n g [ 3 5 S]-H 2s (1.9 x 1 0 6 cpm, 44.3 x 10- 9 moles o f H 2 S ) . F o l l o w i n g e x t r a c t i o n o f the supernate i n 0. 5M NaCl, sediments were washed twice with g l a s s - d i s t i l l e d water and d i s s o l v e d i n 0.5M a c e t i c a c i d a t 4°C. L y o p h i l i z e d sediment f r a c t i o n s were analyzed by C M - c e l l u l o s e chromatography as d e s c r i b e d i n F i g . 2. Absorbance re a d i n g s at 232mm were compared w i t h peaks o f e l u t e d sulphur-35 r a d i o a c t i v i t y analyzed by l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o unting (LSC). Peaks o f e l u t e d a c t i v i t y corresponded t o absorbance r e a d i n g s o f denatured c o l l a g e n c h a i n s . n e u t r a l s a l t ( s e e F i g . 4) i n d i c a t e d t h a t t e s t s a m p l e s h a d h i g h e r l e v e l s o f n e u t r a l s a l t - s o l u b l e c o l l a g e n . F u r t h e r m o r e , t h i s more 35 s o l u b l e p r o d u c t a l s o c o n t a i n e d i n c o r p o r a t e d S i n d i c a t i n g t h a t t h e i n t e r a c t i o n o f w i t h a c i d - s o l u b l e c o l l a g e n h a d s o l u b i l i z e d p o r t i o n s o f t h e m o l e c u l e and i n t h e p r o c e s s h a d i n c o r p o r a t e d s u l p h u r i n t o t h e c o l l a g e n s t r u c t u r e . S l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s a n d a m o d i f i e d f l u o r o g r a p h y a n a l y s i s ( 5 ) s u b s t a n t i a t e d t h e s e f i n d i n g s a n d a g a i n r e v e a l e d t h a t i n c o r p o r a t e d r a d i o a c t i v i t y m i g r a t e d w i t h a , B , Y a n d c h a i n s o f t y p e I c o l l a g e n . S i m i l a r e x p e r i m e n t s w e r e n o t p e r f o r m e d w i t h m e t h y l m e r c a p t a n a s c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e i s o t o p e p r e p a r a t i o n s w e r e f o u n d . c o n t a m i n a t e d w i t h 5 0 % h y d r o g e n s u l p h i d e a n d h e n c e w e r e u n s u i t a b l e f o r a n a l y s i s . 2. E f f e c t o f V o l a t i l e T h i o l Compounds o n P e r m e a b i l i t y o f O r a l M u c o s a R e c e n t s t u d i e s b y Ng and T o n z e t i c h ( 4 1 ) i n d i c a t e t h a t VSC c a n a l s o a l t e r t h e p e r m e a b i l i t y o f o r a l m u c o s a , c o n s i s t i n g o f n o n - k e r a t i n i z e d e p i t h e l i u m , b a s e m e n t membrane a n d c o n n e c t i v e t i s s u e . E x p o s u r e o f p o r c i n e t i s s u e t o c o n c e n t r a t i o n s o f h y d r o g e n s u l p h i d e and m e t h y l m e r c a p t a n c o m p a r a b l e t o t h o s e e m p l o y e d i n t h e f o l l o w i n g f i b r o b l a s t s t u d i e s r e s u l t e d i n a n 3 5 i n c r e a s e d p e r m e a b i l i t y t o [ S ] - s u l p h a t e b y 6 0 % a n d 1 0 0 % 28 F i g . 4. C a r b o x y m e t h y l - c e l l u l o s e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y o f n e u t r a l s a l t ^ ^ e x t r a c t o f t y p e I a c i d - s o l u b l e c o l l a g e n e x p o s e d t o f S ] - h y d r o g e n s u l p h i d e 35 T y pe T a c i d - s o l u b l e c o l l a g e n was r e a c t e d w i t h [ S l - F ^ S u n d e r s i m i l a r c o n d i t i o n s t o t h o s e e m p l o y e d i n F i g . 3 e x c e p t t h a t H S c o n c e n t r a t i o n s w e r e i n c r e a s e d t e n - f o l d . The d e p i c t e d e l u t i o n p r o f i l e f o r p r o t e i n s e x t r a c t e d i n 0.5M N a C l i n d i c a t e s t h a t p e a k s 3 5 o f T S i - a c t i v i t y a g a i n c o r r e s p o n d t o p r o t e i n f r a c t i o n s d e t e c t e d b y a b s o r b a n c e r e a d i n g s . N e u t r a l s a l t e x t r a c t s o f m i x t u r e s r e a c t e d u n d e r c o n d i t i o n s e m p l o y e d i n F i g . 3 d i d n o t c o n t a i n a d e q u a t e p r o t e i n f o r d e t e c t i o n b y t h i s m e t h o d . I n c r e a s e d c o n c e n t r a t i o n s o f H 2 S ' h o w e v e r , r e s u l t e d i n i n c r e a s e d s o l u b i l i z a t i o n o f c o l l a g e n w h i c h was e x t r a c t e d i n 0.5M N a C l . 29 r e s p e c t i v e l y . T h e s e e x p e r i m e n t s i n d i c a t e , n o t o n l y t h a t p r o d u c t s o f VSC m e t a b o l i s m c a n g a i n a c c e s s t o c o n n e c t i v e t i s s u e , b u t a l s o t h a t t h e y h a v e a d e l e t e r i o u s e f f e c t on t h e m u c o s a l b a r r i e r b e t w e e n t h e g i n g i v a l c r e v i c e and t h e u n d e r l y i n g l a m i n a p r o p r i a . E. I n h i b i t i o n o f Enzymes b y T h i o l O x i d i z i n g A g e n t s The r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f r e d u c e d and o x i d i z e d t h i o l p r o t e i n s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d t o be an i m p o r t a n t c e l l u l a r r e g u l a t o r y m e c h a n i s m ( 4 9 ) . G l u t a t h i o n e , a m o l e c u l e w h i c h i s s y n t h e s i z e d b y c e l l s and w h i c h i s a s s o c i a t e d w i t h r e g u l a t o r y f u n c t i o n s , h a s b e e n shown t o i n t e r a c t w i t h o t h e r i n t r a c e l l u l a r p r o t e i n s t h r o u g h f r e e s u l p h y d r y l g r o u p s . O x i d a t i o n o f t h i o l g r o u p s b y d i a m i d e , a s p e c i f i c o x i d a n t f o r c e l l u l a r g l u t a t h i o n e , i n h i b i t s c e r t a i n c e l l u l a r a c t i v i t i e s . T h i s e f f e c t h a s b e e n d e m o n s t r a t e d i n s e a u r c h i n e ggs w h i c h e x h i b i t r e d u c e d c e l l d i v i s i o n and d e c r e a s e d m i c r o t u b u l e a s s e m b l y i n t h e p r e s e n c e o f d i a m i d e . C e l l u l a r enzymes w h i c h i n c r e a s e t h e r e d u c e d f o r m o f g l u t a t h i o n e h a v e a l s o b e en shown t o f l u c t u a t e d u r i n g t h e c e l l c y c l e and a r e l i k e l y an i m p o r t a n t f a c t o r i n r e g u l a t i o n o f c e l l d i v i s i o n i n t h i s s p e c i e s ( 2 1 ) . 30 R e d u c e d g l u t a t h i o n e h a s a l s o b e e n f o u n d a s s o c i a t e d w i t h f u n c t i o n o f p o l y m o r p h o n u c l e a r l e u c o c y t e s ( 5 0 ) . N - e t h y l m a l e i m i d e (NEM), a s u l p h y d r y l a l k y l a t i n g a g e n t , h a s b e e n shown t o d e p r e s s r e d u c e d g l u t a t h i o n e l e v e l s t o 30% o f n o r m a l i n t h e s e c e l l s . T h i s o x i d a t i o n i n h i b i t s d i g e s t i o n o f p h a g o c y t o s e d p a r t i c l e s . The i m p l i c a t i o n i s t h a t t h e l y s o s o m a l s e c r e t i o n p r o c e s s r e q u i r e s t h i o l s t o a c t i v a t e p h a g o s o m e - r e l a t e d d i g e s t i o n . E x p e r i m e n t s c o n d u c t e d w i t h r a t k i d n e y s l i c e s h a v e d e m o n s t r a t e d a n i m p o r t a n t t r a n s p o r t m e c h a n i s m w h i c h c a n b e i n h i b i t e d b y s i m i l a r o x i d i z i n g a g e n t s ( 4 5 ) . Membrane t r a n s p o r t o f s u g a r s and a m i n o a c i d s i n t h e s e t i s s u e s h a s b e e n shown t o i n c r e a s e w i t h a d d i t i o n o f e x o g e n o u s c y c l i c a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e ( A M P ) . S t u d i e s h a v e i n d i c a t e d t h a t d i a m i d e c a n r e v e r s i b l y i n h i b i t t h i s t r a n s p o r t . The m e c h a n i s m o f a c t i o n i s , h o w e v e r , n o t d i r e c t e d a g a i n s t g l u t a t h i o n e b u t t o w a r d o x i d a t i o n o f t h i o l s i n a r e n a l p r o t e i n k i n a s e . The p r o p o s e d m o d e l f o r t h i s p r o c e s s i n d i c a t e s t h a t c y c l i c AMP a c t i v a t e s t h e p r o t e i n k i n a s e w h i c h t h e n p h o s p h o r y l a t e s a c a r r i e r p r o t e i n a nd c a u s e s a c t i v e t r a n s p o r t o f s u b s t r a t e s i n t o t h e c e l l . S i n c e m e t h y l m e r c a p t a n and h y d r o g e n s u l p h i d e c a n a l s o r e a c t w i t h o t h e r t h i o l s , t h e p o s s i b i l i t y e x i s t s t h a t VSC c o u l d i n t e r a c t w i t h f r e e s u l p h y d r y l g r o u p s i n much t h e same manner a s 31 d i a m i d e o r NEM. The e f f e c t s o f s u c h an i n t e r a c t i o n may d i f f e r d e p e n d i n g on w h e t h e r t h e m e r c a p t a n o r h y d r o g e n s u l p h i d e i s p r e s e n t . Any i n t e r a c t i o n s w i t h h y d r o g e n s u l p h i d e w o u l d f o r m a c o m p l e x w h i c h c o u l d s t i l l c o n t a i n e x p o s e d f r e e t h i o l s . M e t h y l m e r c a p t a n , h o w e v e r , w o u l d a c t a s an a l k y l a t i n g a g e n t and t h u s may p o t e n t i a l l y b e t h e more d a m a g i n g o f t h e two VSC s p e c i e s . 32 CHAPTER I I METHODS AND MATERIALS A. F i b r o b l a s t C u l t u r e s 1. C u l t u r e o f F i b r o b l a s t C e l l L i n e s f r o m E x p l a n t s A l l f i b r o b l a s t c e l l c u l t u r e s e m p l o y e d i n t h i s s t u d y w e r e d e r i v e d f r o m h e a l t h y b u c c a l g i n g i v a l t i s s u e r e m o v e d b y p e r i o d o n t a l s u r g e r y a t a s i n g l e a p p o i n t m e n t . The p a t i e n t was a h e a l t h y 32 y e a r o l d m a l e r e q u i r i n g c r o w n l e n g t h e n i n g o f t e e t h f o r r o u t i n e r e s t o r a t i v e p r o c e d u r e s . T i s s u e s w e r e j u d g e d t o be h e a l t h y b y n o r m a l c l i n i c a l c r i t e r i a ; n a m e l y , a b s e n c e o f b l e e d i n g on p e r i o d o n t a l p r o b i n g , no v i s i b l e s i g n s o f i n f l a m m a t i o n , and m i n i m a l s u l c u s d e p t h . I n a d d i t i o n , a p o r t i o n o f t i s s u e was s u b m i t t e d f o r b i o p s y a n d was f o u n d n o r m a l b y a n o r a l p a t h o l o g i s t . B i o p s y m a t e r i a l was c u t i n t o s m a l l p i e c e s , i m m o b i l i z e d w i t h c o v e r s l i p s f a s t e n e d t o t h e b o t t o m o f F a l c o n 3002 c u l t u r e d i s h e s b y s i l i c o n g r e a s e , and c u l t u r e d f o r 2 w e e k s a t 37°C i n a 9 5 % 33 a i r / 5 % CO 2 a t m o s p h e r e . D u r i n g t h i s p e r i o d t h e e x p l a n t s w e r e s u b m e r g e d i n a m o d i f i e d c u l t u r e medium i n w h i c h n o r m a l g r o w t h medium a n t i b i o t i c s w e r e r e p l a c e d w i t h p e n i c i l l i n ( 4 0 0 v i g / m l ) , g e n t a m y c i n s u l p h a t e ( 2 0 0 y g / m l ) a nd a m p h o t e r a c i n B ( 3 y g / m l ) . The e m p l o y e d n o r m a l g r o w t h medium c o n s i s t e d o f m i x t u r e s o f 92ml D u l b e c c o ' s M o d i f i e d E a g l e Medium ( g l u c o s e 4.5mg/ml) s u p p l e m e n t e d w i t h 3 . 0 m l 7 . 5 % s o d i u m b i c a r b o n a t e , 1 . 0 m l p e n i c i l l i n / 4 s t r e p t o m y c i n ( 1 0 u n i t s / m l a n d 10 mg/ml r e s p e c t i v e l y , G i b c o L a b o r a t o r i e s ) , 2 . 0 m l g l u t a m i n e ( 0 . 2 M , G i b c o ) , 1 . 0 m l s o d i u m p y r u v a t e ( l l g m / l , G i b c o ) , 1 . 0 m l n o n - e s s e n t i a l a m i n o a c i d s ( L - a l a n i n e , 0.89mg/ml, L - a s p a r a g i n e . H ^ O , 1.5mg/ml, L - a s p a r t i c a c i d , 1 . 3 3 m g / m l , L - g l u t a m i c a c i d , 1 . 4 7 m g / m l , L - g l y c i n e , 0.75mg/ml, L - p r o l i n e , 1.15mg/ml, and L - s e r i n e , 1.05mg/ml, G i b c o L a b o r a t o r i e s ) , . 1.0ml a s c o r b a t e (5mg/ml) a n d 10ml f e t a l b o v i n e s e r u m ( F B S ) h e a t i n a c t i v a t e d f o r 1 h o u r a t 56°C. Medium was c h a n g e d t w o t i m e s a week and a t t h e e n d o f t h e s e c o n d week t h e e x p l a n t medium was r e p l a c e d b y n o r m a l g r o w t h medium. A f t e r one month o f i n c u b a t i o n t h e f i b r o b l a s t s w e r e h a r v e s t e d b y r e m o v i n g m e d i a , r i n s i n g p r i m a r y c u l t u r e s t h r i c e w i t h p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) , a n d c o l l e c t i n g c e l l s w h i c h w e r e s p h e r u l i z e d a n d d e t a c h e d b y 5 m i n u t e e x p o s u r e t o a 0.05% t r y p s i n s o l u t i o n ( G i b c o ) . C e l l s w e r e p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n f o r 2 m i n u t e s a t 200 g , t h e s u p e r n a t e was d e c a n t e d , and c e l l s w e r e r e s u s p e n d e d i n 2 2 25cm F a l c o n f l a s k s . F o l l o w i n g t w o a d d i t i o n a l p a s s a g e s m 75cm 34 f l a s k s t h e h a r v e s t e d c e l l s were f a s t f r o z e n i n m e d i a c o n t a i n i n g 8% d i m e t h y l s u l p h o x i d e and s t o r e d a t -70°C u n t i l r e q u i r e d . F i b r o b l a s t s u s e d i n a l l s t u d i e s were f r o m c u l t u r e s o f l e s s t h a n e i g h t p a s s a g e s . 2. E x p e r i m e n t a l P r o t o c o l f o r R a d i o l a b e l l i n g C o n f l u e n t c u l t u r e s w e r e t r y p s i n i z e d , p o o l e d , a n d c e l l c o n c e n t r a t i o n p e r u n i t v o l u m e was d e t e r m i n e d b y C o u l t e r c o u n t i n g . T h e n a l i q u o t s o f e q u a l number o f c e l l s w e r e r e - s u s p e n d e d i n g r o w t h medium c o n t a i n i n g 10% FBS and a l l o w e d t o a t t a c h o v e r n i g h t p r i o r t o i n c u b a t i o n u n d e r t e s t o r c o n t r o l c o n d i t i o n s . F o l l o w i n g a t t a c h m e n t , medium was r e m o v e d , , c e l l s were washed t h r e e t i m e s w i t h PBS, and t h e n o v e r l a y e d w i t h s e r u m - f r e e medium. T h i s was f o l l o w e d b y a l a b e l l i n g p e r i o d i n s e r u m - f r e e medium w h i c h l a c k e d L - p r o l i n e b u t was s u p p l e m e n t e d w i t h l y C i / m l L - [ 1 4 C ] p r o l i n e (230mCi/mmole; I C N , I r v i n e , C a l i f . ) a n d 6 - a m i n o p r o p i o n i t r i l e ( 5 0 u g / m l ; S i g m a C h e m i c a l Co. , S t . L o u i s , M O ) . P r o t o c o l f o r p u l s i n g o f c e l l s v a r i e d d e p e n d i n g on t h e p a r a m e t e r u n d e r i n v e s t i g a t i o n . I n a l l i n s t a n c e s t e s t and c o n t r o l c u l t u r e s were i n c u b a t e d s i m u l t a n e o u s l y i n s e p a r a t e s e a l e d c h a m b e r s p e r f u s e d w i t h a t m o s p h e r e f r o m a common 95% a i r / 5 % CO2 c y l i n d e r ( s e e F i g . 5 ) . The l i n e l e a d i n g t o t h e t e s t chamber was e q u i p p e d w i t h a c a l i b r a t e d p e r m e a t i o n t u b e w h i c h e m i t t e d a f i x e d c o n c e n t r a t i o n 35 REGULATION OF ATMOSPHERE FOR TEST a CONTROL CULTURES A" 9 5 % AIR 5% C O , MIXTURE H 2S PERMEATION TUBE 14-7 ng/ml 3 0 " C 60 ml/min flow 60 ml/min flow EXCESS FLOW VENTED ^ INCUBATOR (37°C) 6 0 0 ml RESERVOIR PIN CONTROU CULTURE CHAMBER TEST I F i g . 5. A p p a r a t u s f o r i n c u b a t i o n o f t e s t a n d c o n t r o l c u l t u r e s T e s t and c o n t r o l c u l t u r e s v/ere e n c l o s e d i n s e p e r a t e 2000ml c h a m b e r s m a i n t a i n e d a t 37°C i n a s t a n d a r d t e m p e r a t u r e - c o n t r o l l e d i n c u b a t o r . A d d i t i o n a l 600ml r e s e r v o i r s w e r e i n s e r t e d i n t o g a s l i n e s l e a d i n g t o c u l t u r e s t o e n s u r e e q u i l i b r a t i o n o f g a s m i x t u r e s t o 37°C p r i o r t o e n t e r i n g t h e c u l t u r e c h a m b e r s . Chambers w e r e p e r f u s e d b y a c o n t i n u o u s f l o w o f 9 5 % a i r / 5 % CO^ a t 60 m l / m i n . A p e r m e a t i o n t u b e a d d e d t o t h e l i n e l e a d i n g t o t e s t c u l t u r e s d e l i v e r e d a c o n t i n u o u s f i x e d c o n c e n t r a t i o n o f e i t h e r o r CH^SH t o g a s e s p e r f u s i n g f i b r o b l a s t s i n V S C - e x p o s e d s y s t e m s . 36 o f e i t h e r h y d r o g e n s u l p h i d e o r m e t h y l m e r c a p t a n t o t h e a i r m i x t u r e p e r f u s i n g t h e t i s s u e c u l t u r e s . The f l o w r a t e f o r g a s e s i n b o t h c h a m b e r s was 6 0 m l / m i n u t e . F o r t e s t c u l t u r e s , t h e a i r / C G ^ a t m o s p h e r e was a d m i x e d w i t h l O n g o f t h e a p p r o p r i a t e VSC p e r m l o f t h e a i r / C C ^ m i x t u r e . T h i s amount c o r r e s p o n d e d t o 2 9 n m o l e s h y d r o g e n s u l p h i d e o r 2 0 n m o l e s m e t h y l m e r c a p t a n p e r 1 0 0 m l h e a d - s p a c e . A l t h o u g h v a l u e s f o r VSC i n m o u t h a i r o f p e r i o d o n t a l p a t i e n t s n o r m a l l y r e a c h 2 n m o l e s p e r 1 0 0 m l , t h e h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s w e r e c h o s e n f o r e x p e r i m e n t a t i o n s i n c e g a s c h r o m a t o g r a p h i c p r o f i l e s f r o m p a t i e n t s d e p i c t o n l y v o l a t i l e s p r e s e n t i n t h e o r a l c a v i t y . S u c h g a s e s a r e s u b j e c t t o d i l u t i o n a n d a r e l i k e l y n o t r e p r e s e n t a t i v e o f c o n c e n t r a t i o n s p r e s e n t i n t h e g i n g i v a l c r e v i c e w h i c h i s a p r o t e c t e d a r e a a n d i s t h e r e g i o n a c t i v e l y a s s o c i a t e d w i t h p e r i o d o n t a l d i s e a s e . F u r t h e r m o r e , a n a l y s i s o f h e a d - s p a c e o f p u t r i f i e d s a l i v a s y s t e m s e x h i b i t s VSC l e v e l s up t o 1000 t i m e s g r e a t e r t h a n t h o s e p r e s e n t i n m outh a i r . S i n c e i n i t i a l s t u d i e s d e m o n s t r a t e d c h a n g e s i n c e l l u l a r m e t a b o l i s m r e l a t e d t o t e m p e r a t u r e , 6 0 0 m l r e s e r v o i r s w e r e i n s e r t e d i n t o t e f l o n l i n e s l e a d i n g t o b o t h c h a m b e r s t o p r e h e a t g a s e s t o 37°C p r i o r t o e n t r y i n t o t i s s u e c h a m b e r s . P e t r i d i s h e s c o n t a i n i n g d i s t i l l e d w a t e r w e r e p l a c e d i n l o w e r l e v e l s o f e a c h c h a m b e r t o h u m i d i f y g a s e s and r e d u c e e v a p o r a t i o n o f m e d i a . 37 B. C h a r a c t e r i z a t i o n o f C e l l u l a r M e t a b o l i c F u n c t i o n s 1. A n a l y s i s o f T o t a l L a b e l l e d P r o t e i n b y T r i c h o l o r o a c e t i c A c i d P r e c i p i t a t i o n I n i t i a l i n v e s t i g a t i o n s w e r e d i r e c t e d t o w a r d q u a n t i t a t i n g a m o u nts o f r a d i o a c t i v i t y i n c o r p o r a t e d i n t o p r o t e i n f o l l o w i n g a 24h p u l s e o f c u l t u r e s w i t h L - C ^ 4 C ] - p r o l i n e . A l t h o u g h p r e l i m i n a r y s t u d i e s i n v o l v e d p u l s i n g t h e c e l l s i m m e d i a t e l y f o l l o w i n g t r y p s i n i z a t i o n and a t t a c h m e n t , t h i s a p p r o a c h was l a t e r m o d i f i e d t o i n c l u d e an i n i t i a l 24h i n c u b a t i o n i n s e r u m - f r e e m e d i u m a f t e r a t t a c h m e n t h a d o c c u r r e d f o l l o w e d b y a 2 4 h 14 L - [ C l - p r o l i n e p u l s e . D u r i n g t h i s p e r i o d c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d u n d e r e i t h e r t e s t o r c o n t r o l c o n d i t i o n s . T h e s e a d j u s t m e n t s a l l o w e d i n v e s t i g a t i o n s i n t o r e v e r s i b i l i t y o f m e r c a p t a n - r e l a t e d i n h i b i t i o n . R e s u l t s a l s o i n d i c a t e d t h a t t h e s e c o n d i n c u b a t i o n p r o d u c e d e f f e c t s w h i c h w e r e g r e a t e r t h a n t h o s e s e e n i n t h e i n i t i a l 24h l i k e l y b e c a u s e t h e c e l l s w e r e e x p o s e d l o n g e r t o VSC. I n a d d i t i o n t o t h e s e e x p e r i m e n t s w h i c h i n v o l v e d 24h p u l s i n g p e r i o d s , t e s t s w e r e a l s o c o n d u c t e d w i t h 3h i s o t o p e p u l s e s f o l l o w i n g 4 8h o f q u i e s c e n c e . E q u a l numbers o f c e l l s ( a p p r o x i m a t e l y 5 x 10 c e l l s ) w e r e p l a t e d o n t o 60mm P e t r i d i s h e s a n d a t t a c h e d i n medium c o n t a i n i n g 38 10% f e t a l c a l f s e r u m . F o l l o w i n g a t t a c h m e n t , c u l t u r e s w e r e washed t h r e e t i m e s w i t h PBS and i n c u b a t e d i n 1.5 m l o f t h e s e r u m - f r e e , L - [ ^ 4 C ] - p r o l i n e s u p p l e m e n t e d D u l b e c c o ' s M o d i f i e d E a g l e medium d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . E x p e r i m e n t s w e r e r e p e a t e d a t l e a s t t h r i c e . E a r l y e s t i m a t i o n s o f p r o t e i n s y n t h e s i s w e r e c o n d u c t e d o n 18 t e s t a n d 18 c o n t r o l c u l t u r e s f r o m t h r e e d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s , w h i c h w e r e i n c u b a t e d f o r 4 8 h i n medium w i t h o u t s e r u m t o make c e l l s s y n c h r o n o u s and q u i e s c e n t . D u r i n g t h i s t i m e t e s t c u l t u r e s w e r e e x p o s e d t o l O n g CH^SH/ml o f 9 5 % a i r / 5 % CG^ w h i l e c o n t r o l c u l t u r e s r e c e i v e d o n l y a i r / C C ^ a l o n e . C e l l s w e r e t h e n l a b e l l e d f o r 3h w i t h 5 V C i L - [ H ] - p r o l i n e i n 1.5ml m e d i u m c o n t a i n i n g 50 P g / m l a s c o r b i c a c i d a n d B - a m i n o p r o p i o n i t r i l e . F o l l o w i n g r e m o v a l o f t h e medium, c e l l s w e r e e x t r a c t e d i n t w o 0.3ml p o r t i o n s o f 0.2N NaOH. P r o t e i n s i n medium and c e l l s w e r e p r e c i p i t a t e d w i t h 1 0 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d ( T C A ) / l % t a n n i c a c i d a n d 0.2% f e t a l c a l f s e r u m ( i n d i c a t e d p e r c e n t a g e s a r e f o r f i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f r e a g e n t s i n s o l u t i o n ) . P e l l e t s w e r e t h e n w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h 1 0 % TCA/1% t a n n i c a c i d a n d d i s s o l v e d i n 1.0ml 0.05 N NaOH. A l i q u o t s o f 0.25ml w e r e d r i e d o n f i l t e r p a p e r s t r i p s a n d q u a n t i t a t e d b y l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g ( L S C ) . A m o d i f i e d p r o t o c o l was d e s i g n e d t o a s c e r t a i n i f e f f e c t s o b s e r v e d i n t h e i n i t i a l q u i e s c e n c e e x p e r i m e n t s c o u l d b e r e v e r s e d b y r e t u r n i n g t e s t c u l t u r e s t o c o n t r o l c o n d i t i o n s . L a b e l l i n g 39 p r o c e d u r e s w e r e s l i g h t l y a l t e r e d t o i n c r e a s e r a d i o a c t i v i t y i n c o r p o r a t e d i n t o p r o t e i n a n d c e l l s w e r e l a b e l l e d d u r i n g q u i e s c e n c e t o m i n i m i z e a n y e f f e c t s w h i c h m i g h t b e r e l a t e d t o g r o w t h . T h i r t y s e p a r a t e c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d i n g r o u p s o f 5 i n s e r u m - f r e e medium a c c o r d i n g t o t h e f o l l o w i n g p r o t o c o l : a) C o n t r o l c u l t u r e s l a b e l l e d f o r 48h i n a i r / C O ( C „ 0 ) . Z 4 o b ) T e s t c u l t u r e s l a b e l l e d f o r 48h i n a i r / C 0 2 / C H 3 S H t e s t a t m o s p h e r e ( T ^ g ) . c ) C o n t r o l (C) c u l t u r e s i n c u b a t e d f o r 2 s u c c e s s i v e 24h p e r i o d s i n a i r / C O ^ w i t h f r e s h L - [ 1 4 C ] - p r o l i n e s u p p l e m e n t e d m e d i a a d d e d a f t e r 2 4 h . d) T e s t c u l t u r e (T) i n c u b a t e d f o r 2 s u c c e s s i v e 24h p e r i o d s i n t e s t a t m o s p h e r e w i t h L - [ ^ ^ C ] - p r o l i n e - s u p p l e m e n t e d m e d i a a f t e r 2 4 h . e) T e s t / C o n t r o l (TC) c u l t u r e s e x p o s e d a s t e s t s f o r i n i t i a l 24h f o l l o w e d b y a 24h l a b e l l i n g w i t h f r e s h m e d i a i n a i r / C 0 2 . f ) C o n t r o l / T e s t (CT) c u l t u r e s i n c u b a t e d f i r s t i n a i r / C C > 2 f o r 24h a n d t h e n l a b e l l e d i n f r e s h m e d i a f o r 24h i n p r e s e n c e o f CH^SH. 40 Medium was c o l l e c t e d a f t e r 24 and 48h o r a f t e r 4 8 h o n l y . F o l l o w i n g t h e 4 8 h c o l l e c t i o n , p r o t e i n s i n t h e c e l l l a y e r w e r e e x t r a c t e d i n 1.5ml o f 0.5M a c e t i c a c i d o v e r n i g h t a t 4°C. E x p e r i m e n t s w e r e r e p e a t e d on t h r e e d i f f e r e n t o c c a s i o n s . A f t e r c o l l e c t i o n f e t a l c a l f s e r u m w a s a d d e d t o 0 . 2 % c o n c e n t r a t i o n t o s e r v e a s a c a r r i e r p r o t e i n t h e n a l l s a m p l e s w e r e t h e n p r e c i p i t a t e d b y t h e a d d i t i o n o f 50% t r i c h l o r o a c e t i c a c i d ( T C A ) / 5 % t a n n i c a c i d t o 1 0 % / l % . F o l l o w i n g 30 m i n u t e s o f c e n t r i f u g a t i o n ( B r i n k m a n , E p p e n d o r f 5142 M i c r o C e n t r i f r i g e ) , p r e c i p i t a t e d p r o t e i n s w e r e washed t w i c e w i t h 10% t r i c h l o r o a c e t i c a c i d / 1 % t a n n i c a c i d and o n c e w i t h i c e c o l d a c e t o n e . The f i n a l p e l l e t was d i s s o l v e d i n 1.0ml 0.1N NaOH a n d 0.5ml a l i q u o t s w e r e d r i e d on. f i l t e r p a p e r s t r i p s , t h e n a n a l y z e d b y l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g u s i n g a M o d e l 3375 P a c k a r d T r i - C a r b L i q u i d S c i n t i l l a t i o n C o u n t e r ( P a c k a r d I n s t r u m e n t Co., Downers G r o v e 111.) ( 6 3 ) . A c t i v i t y l o c a t e d i n t h e p e l l e t r e p r e s e n t e d t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n ( 2 0 ) . To q u a n t i t a t e a n y l o s s a s s o c i a t e d w i t h p r e c i p i t a t i o n s , 20 ml o f l a b e l l e d medium e x t r a c t e d a f t e r a 24h i n c u b a t i o n i n t i s s u e c u l t u r e was e x h a u s t i v e l y d i a l y z e d a g a i n s t 0. 5N a c e t i c a c i d t o 14 remove a n y u n b o u n d C - a c t i v i t y . A l i q u o t s o f 1.0ml e a c h w e r e p r e c i p i t a t e d and r e m a i n i n g a c t i v i t y i n t h e s u p e r n a t a n t m e a s u r e d a f t e r p e l l e t i n g p r o c e d u r e s . 41 2. A l t e r a t i o n s i n C o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e P r o t e i n a ) E n z y m a t i c D i g e s t i o n a n d Q u a n t i t a t i o n o f S a m p l e s C h a n g e s i n c o l l a g e n o u s p r o t e i n w e r e q u a n t i t a t e d u s i n g a m o d i f i e d c o l l a g e n a s e d i g e s t i o n p r o c e d u r e ( 1 6 , 2 0 ) . F o r t h i s 5 s t u d y e q u a l numbers o f f i b r o b l a s t s (7 x 10 c e l l s ) w e r e a t t a c h e d o v e r n i g h t i n g r o w t h m e d i u m i n 60mm p l a s t i c p e t r i d i s h e s . F o l l o w i n g a t t a c h m e n t , c e l l s w e r e i n c u b a t e d f o r 48h i n 1.5ml s e r u m - f r e e m e d i u m d e v o i d o f L - g l y c i n e a n d L - p r o l i n e b u t s u p p l e m e n t e d w i t h L - [ * 4 C ] g l y c i n e a n d L - [ "*"4C] p r o l i n e . F o l l o w i n g i n c u b a t i o n , l a b e l l e d medium was r e m o v e d a n d p r o t e i n s a s s o c i a t e d w i t h t h e c e l l u l a r l a y e r e x t r a c t e d o v e r n i g h t i n 1.5ml o f 0.5N a c e t i c a c i d a t 4°C. Then t h e medium a n d c e l l e x t r a c t s a m p l e s w e r e e x h a u s t i v e l y d i a l y z e d a t 4°C a g a i n s t b u f f e r c o n t a i n i n g 0.05M T r i s - H C l , pH7.4, 0.005M C a C l 2 , a n d 0. 2M N a C l . I n c u b a t i o n m i x t u r e s c o n s i s t i n g o f 0.4ml s a m p l e , 0.ImM ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) N - e t h y l m a l e i m i d e , a n d 0 . 1 m l ( 2 5 u n i t s ) c o l l a g e n a s e i n c o l l a g e n a s e b u f f e r w e r e i n c u b a t e d 4h a t 37°C i n E p p e n d o r f m i c r o c e n t r i f u g e t u b e s . Enzyme e m p l o y e d f o r t h i s p r o c e d u r e was h i g h l y p u r i f i e d S i g m a t y p e V I I b a c t e r i a l c o l l a g e n a s e . Enzyme a c t i v i t y was c a l i b r a t e d a s h a v i n g 9 9 . 9 % c o l l a g e n a s e a c t i v i t y a n d l e s s t h a n 0.1% a c t i v i t y a s s o c i a t e d w i t h o t h e r p r o t e a s e s . F o l l o w i n g 42 i n c u b a t i o n , s a m p l e s were b r o u g h t t o 0.2% i n f e t a l c a l f serum and 1 0 % / l % i n t r i c h l o r o a c e t i c a c i d / t a n n i c a c i d . A f t e r o v e r n i g h t p r e c i p i t a t i o n a t 4°C, d i g e s t s were p e l l e t e d b y c e n t r i f u g a t i o n f o r 40 m i n u t e s i n an E p p e n d o r f 5412 m i c r o c e n t r i f u g e (Beckman I n s t r u m e n t s ) . R a d i o a c t i v i t y r e m a i n i n g i n t h e s u p e r n a t a n t was q u a n t i t a t e d b y l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g , w i t h d i f f e r e n c e s b etween t h e c o l l a g e n a s e - d i g e s t e d s u p e r n a t a n t s and c o r r e s p o n d i n g b l a n k s u s e d as a measurement o f c o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n . The a m o u n t o f t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n was d e t e r m i n e d b y measurement o f r a d i o a c t i v i t y o f e x h a u s t i v e l y d i a l y z e d s a m p l e s p r e c i p i t a t e d b y t r i c h l o r o a c e t i c a c i d / t a n n i c a c i d . R e s u l t s were d e t e r m i n e d f o r 60 t e s t and c o n t r o l c u l t u r e s i n t h r e e d i f f e r e n t e x p e r i m e n t s . b) C o l l a g e n a s e S t a n d a r d C u r v e a n d V e r i f i c a t i o n o f T o t a l E n z y m a t i c D i g e s t i o n . C o n d i t i o n s f o r enzyme d i g e s t i o n were s i m i l a r t o t h o s e employed b y Huey e t a l . (20) and were v e r i f i e d b y p r e p a r a t i o n o f an enzyme d i g e s t c u r v e . F o r t h i s s t u d y , 20ml o f s e r u m - d e f i c i e n t 14 medium l a b e l l e d w i t h L - [ C ] - p r o l i n e f o r 72h i n c u l t u r e was d i a l y z e d f o r 3 d a y s a g a i n s t t h r e e 1000ml c h a n g e s o f c o l l a g e n a s e b u f f e r . A l i q u o t s o f 0.4ml were i n c u b a t e d u n d e r a s s a y c o n d i t i o n s f o r 30,60,120,180, and 240 m i n u t e s . A f t e r p e l l e t i n g , 43 r a d i o a c t i v i t y r e m a i n i n g i n t h e s u p e r n a t a n t was p l o t t e d f o r d u p l i c a t e t e s t and c o n t r o l s a m p l e s a s a f u n c t i o n o f t i m e o f i n c u b a t i o n . To v e r i f y t h a t e nzyme d i g e s t i o n was c o m p l e t e , 0.4ml a l i q u o t s o f l a b e l l e d m e d i u m f r o m f i b r o b l a s t c u l t u r e w e r e r-14 - l s u p p l e m e n t e d w i t h | C J - l a b e l l e d c o l l a g e n o f a p p r o x i m a t e l y e q u a l a c t i v i t y . M i x t u r e s c o n s i s t i n g o f medium a l o n e , c o l l a g e n a l o n e , a n d m e d i a p l u s a d d e d c o l l a g e n w e r e i n c u b a t e d u n d e r a s s a y c o n d i t i o n s and compared w i t h c o r r e s p o n d i n g b l a n k s f o r r e l e a s e o f a c t i v i t y . S i n c e f ^ 4 C ] - p r o l i n e p r e c i p i t a t e d b y T C A / t a n n i c a c i d m i g h t be c o - p r e c i p i t a t e d w i t h p r o t e i n s r a t h e r t h a n b e i n g c o v a l e n t l y i n c o r p o r a t e d i n t o p r o t e i n , a c o l d t a r g e t c o m p e t i t i o n s t u d y was d e s i g n e d t o v e r i f y t h a t t h e l a b e l was f i r m l y b o u n d . A s s a y s were s u p p l e m e n t e d w i t h 0.09mg (7.8 x 10 ^ m o l e s ) L - p r o l i n e and a c t i v i t y was m e a s u r e d f o l l o w i n g c o l l a g e n a s e d i g e s t i o n . T h i s amount was e q u i v a l e n t t o 1 0 0 - t i m e s t h e L - p r o l i n e c o n c e n t r a t i o n n o r m a l l y p r e s e n t i n g r o w t h medium. 44 3. P r o l i n e T r a n s p o r t - M e a s u r e m e n t o f Membrane A l t e r a t i o n s a f f e c t i n g Amino A c i d U p t a k e b y C e l l s Amino a c i d u p t a k e b y c e l l s i s a m e m b r a n e - a s s o c i a t e d a c t i v e t r a n s p o r t s y s t e m d e p e n d e n t on m u l t i p l e , i n t e r c o n n e c t i n g enzyme a c t i v i t i e s . B e c a u s e c h a n g e s i n p r o l i n e u p t a k e w o u l d be e x p e c t e d t o i n d u c e a l t e r a t i o n s i n c o l l a g e n s y n t h e s i s , measurements o f t r a n s p o r t a c t i v i t y were d e t e r m i n e d f o r t e s t and c o n t r o l s y s t e m s ( 2 3 ) . 5 F q u a l numbers o f c e l l s (7 x 10 ) were a t t a c h e d i n 60mm P e t r i d i s h e s and made q u i e s c e n t and s y n c h r o n o u s b y i n c u b a t i o n f o r 48h i n 2.0ml medium w i t h o u t serum. C e l l s were t h e n i n c u b a t e d f o r 15 m i n u t e s w i t h 1.5 P C i L - [ " * " 4 C ] - p r o l i n e i n 1.5ml medium c o n t a i n i n g 10% f e t a l c a l f serum. F o l l o w i n g s u b s e q u e n t r e m o v a l o f t h e medium, t h e c e l l s were washed f i v e t i m e s w i t h PBS and s c r a p e d i n t o two a l i q u o t s o f 0.75ml 10% TCA/1% t a n n i c a c i d . F o l l o w i n g p r e c i p i t a t i o n o f p r o t e i n s b y c e n t r i f u g a t i o n f o r 30 m i n u t e s i n t h e E p p e n d o r f 5412 m i c r o f u g e , r a d i o a c t i v i t y r e t a i n e d b y t h e s u p e r n a t e was d e t e r m i n e d b y L S C . S i n c e u n i n c o r p o r a t e d l a b e l i n t h e medium had b e en removed b y w a s h i n g p r o c e d u r e s , and r a d i o a c t i v i t y a t t a c h e d t o membrane a n d p r o t e i n s was p r e c i p i t a t e d , t h e measured a c t i v i t y r e p r e s e n t e d L - p r o l i n e 45 t r a n s p o r t e d i n s i d e t h e c e l l s d u r i n g t h e 15 m i n u t e l a b e l l i n g p e r i o d . 4. A n a l y s i s o f R a d i o l a b e l l e d P r o t e i n s b y D E A E - C e l l u l o s e C h r o m a t o g r a p h y D i e t h y l a m i n o e t h y l ( D E A E ) - c e l l u l o s e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y h a s b e e n e m p l o y e d f o r s e p a r a t i o n o f t y p e I and I I I p r o c o l l a g e n s whose t h e pC, pN and p r o c o l l a g e n c h a i n s e l u t e as a s i n g l e peak f o r e a c h c o l l a g e n t y p e ( 7 2 ) . C o n f l u e n t f i b r o b l a s t c u l t u r e s (3 x 6 2 10 c e l l s ) w e r e t r y p s i n i z e d , a t t a c h e d o v e r n i g h t i n 75 cm f l a s k s , and i n c u b a t e d f o r 24h i n s e r u m - f r e e medium as t e s t s a m p l e s e x p o s e d t o m e t h y l m e r c a p t a n o r as c o n t r o l s . D u r i n g a s e c o n d 24h p e r i o d c e l l s w e r e e x p o s e d t o 1 0 m l s e r u m - f r e e , p r o l i n e - f r e e medium s u p p l e m e n t e d w i t h I ^ - C ^ C ] - p r o l i n e ( l y C i / m l ) and were a g a i n i n c u b a t e d as t e s t and c o n t r o l c u l t u r e s . Medium a l s o c o n t a i n e d g - a m i n o p r o p i o n i t r i l e t o p r e v e n t c r o s s l i n k i n g as w e l l a s t h e a s c o r b i c a c i d (50 y g / m l ) w h i c h i s r e q u i r e d f o r c o l l a g e n s y n t h e s i s . F o l l o w i n g c o l l e c t i o n o f c u l t u r e medium, t h e d i g e s t i o n o f p r o c o l l a g e n s was p r e v e n t e d b y t h e a d d i t i o n o f p r o t e i n a s e i n h i b i t o r s p h e n y l m e t h a n e s u l p h o n y l f l u o r i d e (PMSF) and p - h y d r o x y -m e r c u r i b e n z o a t e (PCMB) a t f i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f 50 y g / m l . 46 A f t e r a d d i t i o n o f 2mg r a t s k i n a c i d - s o l u b l e c o l l a g e n a s c a r r i e r p r o t e i n , s o l i d ( N H 4 ) 2 S 0 4 was a d d e d t o 3 0 % s a t u r a t i o n a n d r a d i o a c t i v e c o l l a g e n o u s p r o t e i n s were i s o l a t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 40,000 g f o r 20 m i n u t e s a t 4 ° C . Samples were t h e n d i s s o l v e d i n 5ml b u f f e r c o n s i s t i n g o f 2M u r e a , 1. OmM d i s o d i u m e t h y l -e n e d i a m i n e - t e t r a c e t i c a c i d ( E D T A ) a n d 3 O m M - T r i s / H C 1 b u f f e r (pH7.4) and d i a l y z e d f o r 2h a g a i n s t 3 c h a n g e s o f 500ml o f b u f f e r . The s a m p l e s were t h e n a p p l i e d t o i n d i v i d u a l 0.75 x 8cm columns p a c k e d w i t h m i c r o g r a n u l a r ( p r e - s w o l l e n ) D E A E - c e l l u l o s e (DE52, Whatman B i o c h e m i c a l s L t d . ) . P r o t e i n s were e l u t e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o f 0-200mM-NaCl i n ' t h e T r i s / H C I / U r e a / E D T A b u f f e r 1 o v e r a volume o f 300ml. The f l o w r a t e was 7ml/h and t h e e l u t e d p r o t e i n s were c o l l e c t e d i n 5ml f r a c t i o n s . R a d i o a c t i v i t y was q u a n t i t a t e d b y s p o t t i n g 0.5ml o f e a c h f r a c t i o n on i n d i v i d u a l f i l t e r p a p e r s t r i p s a n d m e a s u r i n g b y l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g ( 6 7 ) . 5. P r o t o c o l f o r R e v e r s i b i l i t y S t u d i e s on t h e E f f e c t o f M e t h y l M e r c a p t a n on C o l l a g e n S y n t h e s i s - A n a l y s i s b y S D S / P o l y a c r y l a m i d e S l a b G e l E l e c t r o p h o r e s i s (SDS/PASGE) 2 F o r t h e s e s t u d i e s c o n f l u e n t c u l t u r e s i n 75cm f l a s k s were t r y p s i n i z e d , r e - a t t a c h e d i n e q u a l numbers (3 x 10 c e l l s ) and 47 i n c u b a t e d u n d e r c o n d i t i o n s d e s i g n e d t o e x a m i n e e f f e c t s o f m e t h y l m e r c a p t a n on p r e c u r s o r c o l l a g e n s y n t h e s i s and t h e r e v e r s i b i l i t y o f s u c h e f f e c t s ( s e e F i g . 9 ) . G r o u p s o f f i v e t e s t a n d c o n t r o l c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d s i m u l t a n e o u s l y i n e a c h s e r i e s o f r u n s . C u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d i n s e r u m - f r e e medium u n d e r t h e f o l l o w i n g c o n d i t i o n s : a) 24h a s a c o n t r o l i n s e r u m - f r e e medium f o l l o w e d b y a 24h l a b e l l i n g p e r i o d i n new medium a s a c o n t r o l (C) b) 24h a s a c o n t r o l f o l l o w e d b y 24h l a b e l l i n g i n f r e s h m e d i a a s a t e s t s y s t e m (T) c) 48h c o n t i n u o u s l a b e l l i n g a s a c o n t r o l (£43) d) 24h a s a t e s t f o l l o w e d b y 24h l a b e l l i n g a s a c o n t r o l i n f r e s h medium (TC) e) 24h a s a c o n t r o l f o l l o w e d b y 24h l a b e l l i n g a s a t e s t i n f r e s h medium (CT) A l l m e d i a c o n t a i n e d 5 0 y g / m l a s c o r b a t e and 5 0 y g / m l 3 - a m i n o -p r o p i o n i t r i l e t o p r e v e n t c r o s s - l i n k i n g . F o l l o w i n g i n c u b a t i o n t h e e n t i r e 10ml o f medium was c o l l e c t e d , p r o t e i n a s e i n h i b i t o r s w e r e a d d e d , a n d medium was d i a l y z e d a g a i n s t 0.5N a c e t i c a c i d o v e r 3 d a y s a nd t h r e e 1000ml v o l u m e s c h a n g e s . F r a c t i o n s w e r e t h e n c o n c e n t r a t e d b y d e s s i c a t i o n a n d r e c o n s t i t u t e d i n t h e SDS/PASGE s a m p l e b u f f e r . 48 S D S / p o l y a c r y l a m i d e s l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s was p e r f o r m e d u s i n g 15cm l o n g 7.5% p o l y a c r y l a m i d e s e p a r a t i n g s l a b g e l s a n d 5% s t a c k i n g g e l s ( 2 5 ) . S a m p l e s c o n t a i n i n g 10,000 t o 30,000 cpm f ^ 4 C l - a c t i v i t y i n c o r p o r a t e d i n t o p r o t e i n w e r e d i s s o l v e d i n 5 0 ) j l s a m p l e b u f f e r (25mM T r i s / g l y c i n e r e s e r v o i r b u f f e r c o n t a i n i n g 2. 0M u r e a , 2.0% s o d i u m d o d e c y l s u l p h a t e , a n d 1.0% b r o m o p h e n o l b l u e ) and h e a t e d t o 55°C f o r 15 m i n u t e s . A f t e r d i s p e n s i n g s a m p l e s i n t o s a m p l e w e l l s a n d e l e c t r o p h o r e s i n g c o l l a g e n s i n t o t h e g e l s a t 100 V f o r 1.5h, t h e c u r r e n t was i n t e r r u p t e d a n d b u f f e r i n t h e w e l l s was r e p l a c e d b y 20% ( v / v ) 2 - m e r c a p t o e t h a n o l a n d l e f t s t a n d i n g 0.5h ( 7 3 ) . The r e s e r v o i r b u f f e r was r e p l a c e d , s a m p l e s w e r e r u n f o r a n o t h e r 0.5h a t 9 0 V , a n d t h e n e l e c t r o p o r e s i s was c o n t i n u e d a t 50 v o l t s f o r 1 6 h . I m m e d i a t e l y u p o n t e r m i n a t i o n o f e l e c t r o p h o r e s i s , g e l s w e r e s o a k e d i n 2,5 d i p h e n y l o x a z o l e / d i m e t h y l s u l p h o x i d e ( 5 ) , d r i e d o n t o f i l t e r p a p e r , t h e n e x p o s e d t o 8 x 10 i n c h Kodak X-Omat AR-5 f i l m ( E a s t m a n K o dak Co., R o c h e s t e r , N.Y.) a t -70°C f o r 2 w e e k s . F o l l o w i n g d e v e l o p m e n t , f i l m s w e r e s c a n n e d u s i n g a d e n s i t o m e t e r 377 ( I n s t r u m e n t a l L a b o r a t o r y ) a n d t h e r a d i o a c t i v i t y w a s q u a n t i t a t e d f r o m p e a k a r e a s . 49 6. P e p s i n D i g e s t i o n o f L a b e l l e d C o l l a g e n s 2 C o n f l u e n t c u l t u r e s i n 75 cm f l a s k s were i n c u b a t e d f o r 24h i n p r e s e n c e o f m e t h y l m e r c a p t a n i n s e r u m - f r e e and L - p r o l i n e f r e e g r o w t h m e d i a s u p p l e m e n t e d w i t h L - C ^ C l - p r o l i n e . Then 2.Omg r a t s k i n c o l l a g e n c a r r i e r was added t o medium s a m p l e s , t h e p r o t e i n s were p r e c i p i t a t e d i n 30% (NH^^SO^, d i s s o l v e d i n 0. 5M a c e t i c a c i d , and d i a l y z e d e x h a u s t i v e l y a g a i n s t 0.5 M a c e t i c a c i d . The r e s u l t i n g d i a l y s a t e s were t h e n d i g e s t e d f o r 6h and 24h a t 22°C w i t h l O O y g / m l p e p s i n . D i g e s t e d s a m p l e s and u n d i g e s t e d c o n t r o l s were d r i e d and a n a l y z e d by SDS/PASGE. 50 CHAPTER I I I RESULTS A. P r e l i m i n a r y C o n t r o l S t u d i e s The o b j e c t i v e o f i n i t i a l i n v e s t i g a t i o n s was t o a s c e r t a i n w h e t h e r t h e VSC c o u l d a f f e c t c e l l m e t a b o l i s m and t o e n s u r e t h a t t h e e f f e c t s were n o t r e l a t e d t o anomalous a l t e r a t i o n s i n t i s s u e c u l t u r e c o n d i t i o n s . S i n c e t h e em p l o y e d g a s e s a r e w e a k l y a c i d i c , i t was n e c e s s a r y t o a s c e r t a i n w h e t h e r t h e o b s e r v e d c h a n g e s i n p r o t e i n s y n t h e s i s were p o s s i b l y r e l a t e d t o c h a n g e s i n pH d u r i n g i n c u b a t i o n . T h i s was o b v i a t e d as i t was f o u n d t h a t t h e pH o f t e s t m e dia e x p o s e d t o b o t h m e r c a p t a n and h y d r o g e n s u l p h i d e d u r i n g t h e employed p e r i o d s o f i n c u b a t i o n r e m a i n e d c o n s t a n t . I n a d d i t i o n c u l t u r e s were i n c u b a t e d w i t h and w i t h o u t g -amino-p r o p i o n i t r i l e t o e n s u r e t h a t c h a n g e s i n l a b e l l e d p r o t e i n were n o t d ue t o an unknown s i d e - e f f e c t o f t h i s r e a g e n t . A l t h o u g h t h e s u r f a c e o f c u l t u r e v e s s e l s was n o t deemed i m p o r t a n t i n t h e s e s t u d i e s , p r o t e i n s y n t h e s i s b y f i b r o b l a s t s was compared i n c u l t u r e s a t t a c h e d and l a b e l l e d i n r e g u l a r p l a s t i c b a s e t i s s u e c u l t u r e f l a s k s t o t h o s e t r e a t e d i n an i d e n t i c a l 51 manner i n P e t r i Perm d i s h e s . The l a t t e r c o n t a i n e r s a r e e q u i p p e d w i t h a s p e c i a l s e m i - p e r m e a b l e membrane b a s e w h i c h a l l o w s c e l l s d i r e c t c o n t a c t b o t h w i t h VSC a n d w i t h t h e a i r / C 0 2 i n t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e . S i n c e VSC p r o d u c e d s i m i l a r c h a n g e s i n p r o t e i n s y n t h e s i s i n b o t h t y p e s o f c o n t a i n e r s , t h e r e s u l t s d i d n o t a p p e a r t o b e r e l a t e d t o c u l t u r e s u r f a c e . I n a d d i t i o n , e f f e c t s w e r e n o t a s s o c i a t e d w i t h o x y g e n d e p l e t i o n i n t e s t c u l t u r e s s i n c e f i b r o b l a s t s i n t h e perm d i s h e s w e r e i n d i r e c t c o n t a c t w i t h g a s e s a n d d i d n o t r e q u i r e o x y g e n t o d i s s o l v e i n m e d i a . I n i t i a l l y , p r o t e i n d e c r e a s e s w e r e q u a n t i t a t e d b y m e a s u r i n g 14 . . C - a c t i v i t y o f e x h a u s t i v e l y d i a l y z e d c u l t u r e e x t r a c t s . R a d i o a c t i v i t y a s s o c i a t e d w i t h p r o t e i n s was a l s o d e t e r m i n e d b y T C A / t a n n i c a c i d p r e c i p i t a t i o n . As t h e s e p r o c e d u r e s g a v e s i m i l a r r e s u l t s , t h e o b s e r v e d e f f e c t s w e r e n o t a t t r i b u t a b l e t o n o n - s p e c i f i c l o s s d u r i n g q u a n t i t a t i o n p r o c e d u r e s . A l t h o u g h f a c t o r s s u c h as c e l l d e n s i t y o r c o m p o s i t i o n o f m e d i a c a n a l t e r t y p e s a n d a m o u n t s o f c o l l a g e n s s y n t h e s i z e d , t h i s v a r i a b l e was c o n t r o l l e d b y c o n d u c t i n g a l l e x p e r i m e n t s u n d e r s i m u l t a n e o u s t e s t a n d c o n t r o l i n c u b a t i o n s . C e l l s w e r e o b t a i n e d f r o m e q u a l a l i q u o t s o f a common c e l l p o o l t o e n s u r e t h a t numbers 52 f o r 24h w i t h L . - [ 1 4 C ] T p r o l i n e i n p r e s e n c e o r a b s e n c e o f i n a g i v e n e x p e r i m e n t a l r u n were i d e n t i c a l . T e s t s a m p l e s were compared w i t h t h e i r c o r r e s p o n d i n g i n t e r n a l c o n t r o l s t o a v o i d s p u r i o u s r e s u l t s r e l a t e d t o c u l t u r e c o n d i t i o n s . C o m p a r i s o n s o f t e s t and c o n t r o l SDS/PASGE g e l s o r DEAE c e l l u l o s e c o l u m n e l u t i o n p r o f i l e s w e r e o n l y made b e t w e e n c u l t u r e s r u n u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s . B. A n a l y s i s o f T o t a l L a b e l l e d P r o t e i n 2 C o n f l u e n t c u l t u r e s i n 75cm f l a s k s w e r e t r y p s i n i z e d , a t t a c h e d o v e r n i g h t i n g r o w t h medium, and l a b e l l e d i n a b s e n c e o f serum VSC. F o r t h e s e p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s , r a d i o a c t i v i t y r e m a i n i n g i n medium o r c e l l e x t r a c t was q u a n t i t a t e d b y LSC o f s a m p l e s d i a l y z e d e x h a u s t i v e l y a g a i n s t 0. 5N a c e t i c a c i d . A l t h o u g h s u b s e q u e n t e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d , u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n s , t h e s e i n i t i a l s t u d i e s e s t a b l i s h e d t r e n d s w h i c h were c o n f i r m e d r e p e a t e d l y b y s u c c e s s i v e a n a l y s e s . Samples i n c u b a t e d w i t h h y d r o g e n s u l p h i d e and compared w i t h c o r r e s p o n d i n g c o n t r o l s d e m o n s t r a t e d a r e d u c t i o n i n t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n o f 19.3%. A s i m i l a r d e c r e a s e o f 19.2% was o b s e r v e d i n t e s t and c o n t r o l c u l t u r e s i n c u b a t e d i n t h e p r e s e n c e o f 3 - a m i n o p r o p i o n i t r i l e (50 y g / m l ) . A l t h o u g h t h e s e i n c u b a t i o n s 2 were p e r f o r m e d on c o n f l u e n t c u l t u r e s i n 75cm f l a s k s 53 (3 x 10^ c e l l s ) , c o r r e s p o n d i n g d e c r e a s e s were o b s e r v e d when c u l t u r e s were grown i n 60mm P e t r i d i s h e s (5 x 10 c e l l s ) . I n a d d i t i o n , i n c u b a t i o n s i n P e t r i perm d i s h e s , c o n t a i n e r s w i t h s e m i - p e r m e a b l e membrane b a s e , d e m o n s t r a t e d s i m i l a r r e d u c t i o n s o f 19.3%. M e t h y l m e r c a p t a n s y s t e m s c o n s i s t e n t l y e x h i b i t e d g r e a t e r i n h i b i t i o n b o t h i n p r e s e n c e and a b s e n c e o f g - a m i n o p r o p i o n i t r i l e and y i e l d e d d i f f e r e n c e s b e t w e e n t e s t and c o n t r o l c u l t u r e s o f 25% o r more. I n b o t h H 2 S and C H 3 S H t r e a t e d c u l t u r e s , t h e d e c r e a s e i n r a d i o a c t i v i t y c o u l d b e d e m o n s t r a t e d i n t h e medium and c e l l e x t r a c t and was d i s t r i b u t e d b e t w e e n t h e two f r a c t i o n s . E x p o s u r e t o VSC d i d n o t a f f e c t t h e p e r c e n t a g e d i s t r i b u t i o n o f l a b e l l e d p r o t e i n b e t w e e n medium and c e l l - a s s o c i a t e d s a m p l e s . A l t h o u g h t e s t s a m p l e s c o n s i s t e n t l y r e t a i n e d l e s s a c t i v i t y a f t e r d i a l y s i s , r a t i o s o f r a d i o a c t i v i t y i n c e l l e x t r a c t and c o r r e s p o n d i n g medium f r a c t i o n s were s i m i l a r i n t e s t and c o n t r o l c u l t u r e s . S i n c e VSC d i d n o t a l t e r t h e p a r t i t i o n o f p r o t e i n b e t w e e n c e l l and medium f r a c t i o n s , t h e s e a g e n t s d i d n o t a f f e c t t r a n s p o r t o f s y n t h e s i z e d p r o t e i n o u t o f t h e c e l l a nd i n t o e x t r a c e l l u l a r f l u i d s . The r e s u l t s w e r e b a s e d o n a n a l y s i s o f a t l e a s t q u a d r u p l i c a t e c u l t u r e s . 54 G e n e r a l l y , m o s t o f t h e - q u a n t i t a t i o n s o f [ C] i n c o r p o r a t e d i n t o p r o t e i n s w e r e b a s e d o n r a d i o a c t i v i t y p r e c i p i t a t e d b y 1 0 % T C A / 1 % t a n n i c a c i d s o l u t i o n . T h i s a p p r o a c h f a c i l i t a t e d p r o c e s s i n g o f t h e l a r g e n u m b e r s o f s a m p l e s s u i t a b l e f o r s t a t i s t i c a l a n a l y s i s o f d a t a . R e c o v e r y f o l l o w i n g t h e p r o c e d u r e 14 was t e s t e d b y p r e c i p i t a t i n g [ C ] - p r o l i n e l a b e l l e d m e d i a a f t e r 2 4 h i n c u b a t i o n w i t h f i b r o b l a s t c u l t u r e s . P r i o r t o p r e c i p i t a t i o n , t h e medium was e x h a u s t i v e l y d i a l y z e d a g a i n s t 0.5N a c e t i c a c i d a n d t h e t o t a l n o n - d i a l y z a b l e r a d i o a c t i v i t y was d e t e r m i n e d b y L S C . F o l l o w i n g T C A / t a n n i c a c i d p r e c i p i t a t i o n o f medium c o n t a i n i n g 10,557 cpm/ml, t h e a s s a y e d s u p e r n a t e r e t a i n e d 610 cpm ["*" 4C]/ml w h i c h r e p r e s e n t e d a p o t e n t i a l l o s s o f 5.8%. A d d i t i o n a l w a s h i n g w i t h 1 0 % TCA/1% t a n n i c a c i d o r 5 0 % ( N H 4 ) 2 SC>4 r e s u l t e d i n a l o s s o f 2 6 4 a n d 2 6 9 c p m / m l r e s p e c t i v e l y , e q u i v a l e n t t o a f u r t h e r l o s s o f 2.5% a s s o c i a t e d w i t h w a s h i n g p r o c e d u r e s . The e f f e c t o f CH^SH o n t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n c o n t e n t was d e t e r m i n e d f o r 18 t e s t a n d 18 c o n t r o l c u l t u r e s f r o m t h r e e s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . P r o t e i n s y n t h e s i s was e v a l u a t e d a f t e r a n i n i t i a l 48 h o u r q u i e s c e n c e i n t h e p r e s e n c e o f CH^SH f o l l o w e d b y 3 a 3 h o u r p u l s e w i t h L - [ H ] - p r o l i n e . R e s u l t s f r o m t h e s e e x p e r i m e n t s ( s e e T a b l e 1) i n d i c a t e t h a t a p p r o x i m a t e l y t w o - t h i r d s o f t h e p r e c i p i t a b l e a c t i v i t y was l o c a t e d i n t h e c e l l e x t r a c t p o r t i o n . 55 T a b l e 1: P r o t e i n s y n t h e s i s f o l l o w i n g 4 8 h q u i e s c e n c e i n p r e s e n c e o f C H 3SH S y s t e m F r a c t i o n M edium C e l l s T o t a l ( m e d i a & c e l l s ) cpm % o f t o t a l cpm % o f t o t a l cpm C o n t r o l 850 26 2390 74 3240 T e s t 750 36 1370 64 2120 Q u i e s c e n t c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d a s t e s t s e x p o s e d t o CH^SH/ a i r / C 0 2 o r a s c o n t r o l s e x p o s e d t o a i r / C 0 2 a l o n e . F o l l o w i n g 4 8 h o f q u i e s c e n c e , c e l l s w e r e p u l s e d f o r 3h w i t h 5 y C i L - [ H ] - p r o l i n e i n 1.5ml medium s u p p l e m e n t e d w i t h a s c o r b i c a c i d a n d 3 - a m i n o -p r o p i o n i t r i l e . Then t h e medium was r e m o v e d , c e l l s w e r e e x t r a c t e d i n 0.2N NaOH, a n d p r o t e i n f r o m b o t h e x t r a c t s was p r e c i p i t a t e d b y 10% TCA/1% t a n n i c a c i d u s i n g 0.2% f e t a l c a l f s e r u m a s c a r r i e r . F o l l o w i n g w a s h i n g o f t h e p e l l e t w i t h T C A / t a n n i c a c i d , r a d i o a c t i v i t y i n t h e p r e c i p i t a t e w a s q u a n t i t a t e d b y L S C . A c t i v i t y i s e x p r e s s e d a s cpm p e r 60mm P e t r i d i s h f o r 18 t e s t and 18 c o n t r o l c u l t u r e s c o m p i l e d f r o m t h r e e s e p a r a t e r u n s . 56 T h i s e f f e c t was n o t o b s e r v e d i n s t u d i e s w i t h p u l s i n g p e r i o d s l o n g e r t h a n 3 h o u r s where t h e a c t i v i t y was e v e n l y d i s t r i b u t e d b e t w e e n medium and c e l l e x t r a c t ( s e e T a b l e 6 ) . A c o m p a r i s o n o f r a d i o a c t i v i t i e s a s s o c i a t e d w i t h t e s t a n d c o n t r o l s a m p l e s i n d i c a t e s t h a t b o t h m e d i a and c e l l - e x t r a c t f r a c t i o n s e x h i b i t e d r e d u c t i o n s i n t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n o f 11% and 43% r e s p e c t i v e l y ( s e e T a b l e 2 ) . T h e s e d e c r e a s e s , when c a l c u l a t e d f o r t h e t o t a l s y s t e m , r e p r e s e n t e d a 32% r e d u c t i o n i n a c t i v i t y w h i c h c o u l d be p r e c i p i t a t e d b y T C A / t a n n i c a c i d . C. A l t e r a t i o n s i n C o l l a g e n a s e D i g e s t a b l e P r o t e i n S i n c e CH^SH a l t e r e d t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n s y n t h e s i s b y f i b r o b l a s t s , a n a l y s e s were p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e i f c h a n g e s i n t o t a l c o l l a g e n were a l s o p r e s e n t . C o l l a g e n o u s p r o t e i n s were a s s a y e d b y r e l e a s e o f r a d i o a c t i v i t y f o l l o w i n g e x p o s u r e t o b a c t e r i a l c o l l a g e n a s e , an enzyme w h i c h s p e c i f i c a l l y d e g r a d e s t h e s e p r o t e i n s i n t o f r a g m e n t s w h i c h a r e t o o s m a l l t o be p r e c i p i t a t e d b y T C A / t a n n i c a c i d . S t a n d a r d c u r v e s were p r e p a r e d b y q u a n t i t a t i n g r e l e a s e o f a c t i v i t y f r o m m e d i a o f c o n f l u e n t 14 f i b r o b l a s t c u l t u r e s l a b e l l e d w i t h L - [ C ] - p r o l i n e o v e r 72 h o u r s ( s e e F i g 6 ) . T h e s e c u r v e s i n d i c a t e t h a t d i g e s t i o n i s c o m p l e t e f o l l o w i n g 2 h o u r s o f i n c u b a t i o n and t h a t no a d d i t i o n a l a c t i v i t y i s r e l e a s e d b e t w e e n 2 and 4 h o u r s . F u r t h e r m o r e , t h e b a c k g r o u n d 57 T a b l e 2: P e r c e n t a g e d e c r e a s e i n p r o t e i n s y n t h e s i s f o l l o w i n g 4 8 h q u i e s c e n c e i n p r e s e n c e o f CH-SH S y s t e m F r a c t i o n T o t a l M e d i a C e l l s ( m e d i a & c e l l s ) cpm % d e c r e a s e cpm % d e c r e a s e cpm % d e c r e a s e C o n t r o l 8 5 0 2390 3240 T e s t 750 11 1370 43 2120 32 The d a t a d e p i c t e d i n T a b l e 1 i s p r e s e n t e d f o r c o m p a r i s o n b e t w e e n r a d i o a c t i v i t i e s i n t e s t a n d c o n t r o l c u l t u r e s . T e s t c u l t u r e s w e r e c h a r a c t e r i z e d b y a t o t a l d e c r e a s e i n l a b e l l e d p r o t e i n o f a p p r o x i m a t e l y 3 0 % . T h i s d e c r e a s e was more p r o n o u n c e d i n c e l l e x t r a c t s t h a n i n t h e m e d i a . 58 o e Q- o (J > < O cu o c k— cu CL n CO / / . . X -• f Collagenaa* dlgo»1ed Samples Undigested oamplat i 4 0 2 3 Time (hours) F i g . 6 R e l e a s e o f [ C ] f r o m L - [ C ] - p r o l i n e l a b e l l e d f i b r o b l a s t c u l t u r e m e d i a f o l l o w i n g t r e a t m e n t w i t h b a c t e r i a l c o l l a g e n a s e R e a c t i o n m i x t u r e s c o n s i s t i n g o f 0.4 m l d i a l y z e d , l a b e l l e d medium c o n t a i n i n g s y n t h e s i z e d [ ^ C ] - p r o l i n e l a b e l l e d p r o t e i n s f r o m i 3 f i b r o b l a s t c u l t u r e s ( 5 . 0 3 x IO c p m ) , O . l m l N - e t h y l m a l e i m i d e ( O . l m M ) , a n d 0 . 1 m l ( 2 5 u n i t s ) b a c t e r i a l c o l l a g e n a s e w e r e i n c u b a t e d a t 37°C f o r i n d i c a t e d t i m e p e r i o d s . C o n t r o l s y s t e m s w e r e i d e n t i c a l i n c o m p o s i t i o n e x c e p t t h a t t h e c o l l a g e n a s e was r e p l a c e d w i t h s a m p l e b u f f e r . A l l r e a c t i o n s w e r e t e r m i n a t e d b y t h e a d d i t i o n o f 0.2ml i c e - c o l d T C A / t a n n i c a c i d ( 1 0 % / l % ) and 0 . 0 2 m l f e t a l c a l f s e r u m ( 0 . 2 % ) . F i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f r e a g e n t s a r e i n d i c a t e d i n p a r e n t h e s e s . F o l l o w i n g c e n t r i f u g a t i o n o • 14 a t 2 C f o r 30 m i n u t e s , C - a c t i v i t y r e m a i n i n g i n s u p e r n a t e s was d e t e r m i n e d on d u p l i c a t e s a m p l e s b y LSC 59 c o u n t s f r o m u n d i g e s t e d b l a n k s t e n d s t o i n c r e a s e m a r g i n a l l y w i t h t i m e s u g g e s t i n g t h a t n o n - s p e c i f i c r e l e a s e o f a c t i v i t y r e l a t i n g t o d e n a t u r a t i o n o f n o n - c o l l a g e n o u s p r o t e i n s may o c c u r a t o n p r o l o n g e d i n c u b a t i o n . . S i n c e t h e i n c r e a s e i n b a c k g r o u n d was m i n i m a l b e t w e e n 2 a n d 4 h o u r s , 4 h o u r s was s e l e c t e d f o r i n c u b a t i o n s t o e n s u r e c o m p l e t e d i g e s t i o n o f c o l l a g e n o u s p r o t e i n s w i t h m i n i m a l a l t e r a t i o n o f t h e b a c k g r o u n d . A f u r t h e r s t u d y was a l s o made t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e d i g e s t i o n o f c o l l a g e n b y c o l l a g e n a s e was c o m p l e t e ( T a b l e 3 ) . F o r t h i s p u r p o s e , t h e d i g e s t i o n a n d r e l e a s e o f a c t i v i t y was 14 p e r f o r m e d o n t r i p l i c a t e s a m p l e s c o n t a i n i n g [ C ] - l a b e l l e d t y p e I 14 c o l l a g e n , [ C ] - p r o l i n e l a b e l l e d p r o t e i n f r o m f i b r o b l a s t c u l t u r e m e d i u m , a n d a c o m b i n a t i o n w i t h b o t h m e d i u m a n d l a b e l l e d c o l l a g e n . The n u m e r i c a l sum o f t h e medium and l a b e l l e d c o l l a g e n s y s t e m s was f o u n d t o b e w i t h i n 40 cpm o f t h e e x p e r i m e n t a l s y s t e m c o n t a i n i n g a m i x t u r e o f b o t h ( t o t a l cpm 4 5 3 0 ) . T h i s a c c o u n t e d f o r a 0.9% d i f f e r e n c e a n d i n d i c a t e d t h a t d i g e s t i o n i n a l l t h r e e s y s t e m s was c o m p l e t e and r e p r o d u c e a b l e . To e n s u r e t h a t t h e r e l e a s e o f a c t i v i t y r e p r e s e n t e d d i g e s t i o n o f p r o t e i n and n o t n o n - s p e c i f i c r e l e a s e o f r a d i o a c t i v e p r o l i n e i n l o o s e a s s s o c i a t i o n w i t h p r o t e i n , a c o l d t a r g e t c o m p e t i t i o n s t u d y was c o n d u c t e d i n w h i c h 100 t i m e s t h e p r o l i n e 60 T a b l e 3: V e r i f i c a t i o n o f c o m p l e t e n e s s o f c o l l a g e n a s e d i g e s t i o n . S y s t e m D i g e s t e d Sample T o t a l R e l e a s e d A c t i v i t y (cpm) 1 r 1 4 C ] - c o l l a g e n 2130 2 f 1 4 C ] - p r o l i n e l a b e l l e d medium 2360 3 [ 1 4 C l - c o l l a g e n / [ 1 4 C ] p r o l i n e l a b e l l e d medium m i x t u r e 4530 4 T C] - p r o l i n e l a b e l l e d medium p l u s L - p r o l i n e 2410 C o m p l e t e d i g e s t i o n o f c o l l a g e n o u s p r o t e i n s b y b a c t e r i a l 14 c o l l a g e n a s e was v e r i f i e d b y c o m p a r i s o n o f [ C] r e l e a s e f r o m t r i p l i c a t e s a m p l e s c o n s i s t i n g o f : 1. [ 1 4 C ] - l a b e l l e d t y p e I c o l l a g e n (0.02 ml, 2.2x 1 0 3 cpm) 1 4 2. D i a l y z e d T C ] - p r o l i n e l a b e l l e d p r o t e i n f r o m 3 f i b r o b l a s t c u l t u r e m e d i a (0.4 m l , 5.7 x 10 cpm) 14 3. D i a l y z e d [ C ] - p r o l i n e l a b e l l e d c u l t u r e m e d i a (0.4ml) s u p p l e m e n t e d w i t h 0.02ml ["*"4C] - l a b e l l e d t y p e I c o l l a g e n . 14 4. D i a l y z e d [ C ] - p r o l i n e l a b e l l e d m e d i a (0.4ml) s u p p l e m e n t e d w i t h L - p r o l i n e (9mg, 7.8 x IO"* m o l e s ) . Samples were d i g e s t e d w i t h 25 u n i t s o f b a c t e r i a l c o l l a g e n a s e a t 37°C f o r 4h and t h e a c t i v i t y r e l e a s e d i n t o t h e s u p e r n a t e was d e t e r m i n e d b y LSC f o l l o w i n g p r e c i p i t a t i o n s w i t h T C A / t a n n i c a c i d . N u m e r i c a l sum o f s y s t e m s 1 and 2 was 4490 cpm compared w i t h 4530 cpm f o r s y s t e m 3. R e l e a s e d a c t i v i t y f r o m s y s t e m 2 was 2360 cpm compared w i t h 2410 cpm f o r s y s t e m 4. c o n c e n t r a t i o n p r e s e n t i n c u l t u r e m e d i a was a d d e d t o t h e d i g e s t i o n m i x t u r e ( s e e T a b l e 3 ) . A c t i v i t y r e l e a s e d f r o m c o n t r o l and p r o l i n e - s u p p l e m e n t e d d i g e s t i o n s was w i t h i n 50 cpm. The c o m p a r i s o n o f t h i s d i f f e r e n c e w i t h t h e t o t a l o f 2360 cpm p r e s e n t i n c o n t r o l s r e p r e s e n t s a d i f f e r e n c e o f 2%, an amount w i t h i n e x p e r i m e n t a l e r r o r . C o m p a r i s o n o f a c t i v i t y r e l e a s e d f r o m C H 3 S H - e x p o s e d and c o n t r o l c u l t u r e s i n d i c a t e s t h a t t e s t c u l t u r e s e x h i b i t a 26% d e c r e a s e i n c o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n ( s e e T a b l e 5 ) . The d i s t r i b u t i o n o f c o l l a g e n o u s p r o t e i n b e t w e e n medium and c e l l e x t r a c t i n d i c a t e s t h a t a p p r o x i m a t e l y e q u a l amounts . o f c o l l a g e n s a r e a s s o c i a t e d w i t h e a c h f r a c t i o n ( s e e T a b l e 4 ) . C o m p a r i s o n o f t o t a l r a d i o a c t i v i t y a s s o c i a t e d w i t h c o l l a g e n s t o t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n i n t e s t and c o n t r o l c u l t u r e s i n d i c a t e s t h a t a c t i v i t y a s s o c i a t e d w i t h c o l l a g e n a c c o u n t s r e s p e c t i v e l y f o r 25% and 30% o f l a b e l i n t h e s e s y s t e m s . C o m p a r i s o n o f c o m b i n e d m e d i a p l u s c e l l e x t r a c t f r a c t i o n s i n d i c a t e s t h a t i n h i b i t i o n o f t e s t s y s t e m s a c c o u n t e d f o r a r e d u c t i o n o f 4780 cpm i n t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n and 3460 cpm i n c o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n . R e d u c t i o n s i n c o l l a g e n s t h e r e f o r e c o m p r i s e d 72% o f t h e t o t a l . 62 t T a b l e 4. S y n t h e s i s o f t o t a l . l a b e l l e d p r o t e i n a n d c o l l a g e n a s e d i g e s t a b l e p r o t e i n f o l l o w i n g 48h l a b e l l i n g i n p r e s e n c e o f C H 3 S H . S y s t e m F r a c t i o n T o t a l M e d i a C e l l s ( m e d i a & c e l l s ) cpm % d i s t r i b u t i o n cpm % d i s t r i b u t i o n cpm T o t a l p r o t e i n : C o n t r o l 2 3 , 1 6 0 53 2 0 , 2 5 0 47 4 3 , 4 1 0 T e s t 2 0 , 7 3 0 54 17,890 46 3 8 , 6 3 0 C o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n : C o n t r o l 6,330 48 6,910 52 1 3 , 2 4 0 T e s t 5,340 55 4,440 45 9,780 E q u a l numbers o f f i b r o b l a s t s w e r e l a b e l l e d a s t e s t s o r c o n t r o l s f o r 4 8h i n 1.5ml s e r u m - f r e e medium d e v o i d o f L - g l y c i n e a n d 14 L - p r o l i n e b u t s u p p l e m e n t e d w i t h 1.5 V C i L - [ C] p r o l i n e ( 2 3 0 mCi/mmole) a n d 1 . 5 v C i L - [ ^ 4 C ] g l y c i n e ( 9 5 m C i / m m o l e ) . L a b e l l e d medium and c e l l u l a r e x t r a c t s w e r e e x h a u s t i v e l y d i a l y z e d a g a i n s t c o l l a g e n a s e b u f f e r a n d d i g e s t e d 4h w i t h b a c t e r i a l c o l l a g e n a s e u n d e r c o n d i t i o n s d e s c r i b e d i n F i g . 6. R e a c t i o n s w e r e t e r m i n a t e d b y T C A / t a n n i c a c i d p r e c i p i t a t i o n a n d C ^ C ] a c t i v i t i e s r e m a i n i n g i n s u p e r n a t e s f r o m d i g e s t e d s a m p l e s and c o r r e s p o n d i n g u n d i g e s t e d b l a n k s w e r e q u a n t i t a t e d b y L S C . C o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n was d e t e r m i n e d b y c a l c u l a t i n g d i f f e r e n c e s b e t w e e n a c t i v i t i e s o f d i g e s t e d a n d u n d i g e s t e d s u p e r n a t e s . E s t i m a t i o n s o f t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n w e r e a l s o d e t e r m i n e d b y L S C f o l l o w i n g p r e c i p i t a t i o n o f p r o t e i n s f r o m 0.1ml a l i q u o t s o f medium o r c e l l e x t r a c t b y T C A / t a n n i c a c i d ( 1 0 % / l % ) . 63 T a b l e 5. P e r c e n t a g e d e c r e a s e i n t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n and c o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n f o l l o w i n g 4 8h l a b e l l i n g i n p r e s e n c e o f CH^SH. S y s t e m F r a c t i o n T o t a l M e d i a C e l l s ( m e d i a & c e l l s ) cpm % d e c r e a s e cpm % d e c r e a s e cpm % d e c r e a s e T o t a l p r o t e i n : C o n t r o l 2 3 ,160 20, 250 ,'43.410 T e s t 20,7 30 11 1 7 , 8 9 0 12 , 3 8 , 6 30 11 C o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n : C o n t r o l 6,330 6,910 13,240 T e s t 5,340 16 4,440 36 9,780 26 C h a n g e s i n c o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n and t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n a r e d e p i c t e d f o r c u l t u r e s d e s c r i b e d i n T a b l e 4. C o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n was r e d u c e d b y a p p r o x i m a t e l y 2 5 % i n m e r c a p t a n - e x p o s e d c u l t u r e s a n d was a c c o m p a n i e d b y a n 1 1 % d e c r e a s e i n t o t a l p r o t e i n . A c t i v i t i e s a r e e x p r e s s e d a s cpm p e r 60mm p e t r i d i s h f o r 30 t e s t a n d 30 c o n t r o l c u l t u r e s r u n o n t h r e e s e p a r a t e o c c a s i o n s . 64 D. P r o l i n e T r a n s p o r t A l t h o u g h e v a l u a t i o n o f t e s t c u l t u r e s i n d i c a t e d t r e n d s t o w a r d d e c r e a s e d p r o l i n e u p t a k e i n c u l t u r e s e x p o s e d b o t h t o CH 3SH and H 2 S , t h e s e e f f e c t s w e r e w i d e l y d i s t r i b u t e d and w e r e c h a r a c t e r i z e d b y s m a l l d i f f e r e n c e s . S t a t i s t i c a l a n a l y s i s i n d i c a t e s t h a t t h e c h a n g e s a r e i n s i g n i f i c a n t . I t m u s t , t h e r e f o r e , b e c o n c l u d e d t h a t a l t h o u g h v a r i a t i o n s i n p r o l i n e t r a n s p o r t may e x i s t a n d r e s u l t s i n d i c a t e t r e n d s i n t h i s d i r e c t i o n , t h i s i n f o r m a t i o n c a n n o t b e r e p o r t e d a s p r o v e n a t th-JTs t i m e . F u r t h e r m o r e , t h e a s s a y d o e s n o t d e t e c t a c t i v i t y i n c o r p o r a t e d i n t o p r o t e i n d u r i n g t h e l a b e l l i n g p e r i o d a n d may n o t a d e q u a t e l y r e f l e c t t o t a l t r a n s p o r t o f p r o l i n e a c r o s s t h e c e l l membrane. E. A n a l y s i s o f R a d i o l a b e l l e d P r o c o l l a g e n s b y D E A F - C e l l u l o s e C h r o m a t o g r a p h y D E A E - c e l 1 u l o s e c h r o m a t o g r a p h y h a s b e e n e m p l o y e d f o r s e p a r a t i o n o f t y p e s I a n d I I I p r o c o l l a g e n s . E l u t i o n p r o f i l e s f o r m e d i a f r o m c o n t r o l c u l t u r e s ( s e e F i g 7) and s a m p l e s f r o m s i m u l t a n e o u s l y i n c u b a t e d t e s t c u l t u r e s e x p o s e d t o CH-^SH ( s e e F i g S) i n d i c a t e a d r a m a t i c a l t e r a t i o n i n p r o t e i n p r o d u c t i o n . B o t h m e d i a f r a c t i o n s w e r e s e p a r a t e d b y 3 0 % ammonium s u l p h a t e p r e c i p i t a t i o n and t h e p e l l e t a n a l y z e d b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y . The r e m a i n i n g s u p e r n a t e was d i a l y z e d a g a i n s t c o l u m n b u f f e r a n d a l s o a p p l i e d t o t h e c o l u m n t o e n s u r e t h a t a n y u n p r e c i p i t a t e d p r o t e i n was a l s o i n c l u d e d i n t h e a n a l y s i s . F i g . 7. D E A F . - c e l l u l o s e c h r o m o t o g r a p h i c s e p a r a t i o n o f p r o t e i n s s y n t h e s i z e d b y c o n t r o l f i b r o b l a s t c u l t u r e s A f t e r a t t a c h m e n t and s u b s e q u e n t 24h e x p o s u r e t o an a t m o s p h e r e o f 5% COp/95% a i r s e r u m - f r e e medium was removed and r e p l a c e d w i t h medium l a c k i n g L - p r o l i n e and f e t a l c a l f serum b u t s u p p l e m e n t e d 14 w i t h L - T C] p r o l i n e and - a m i n o p r o p i o n i t r i l e . F o l l o w i n g an a d d i t i o n a l 24h l a b e l l i n g p e r i o d , p r o t e i n s p r e c i p i t a t e d f r o m m e d i a by 30% ( N H 4 ) 2 S 0 4 were r e c o n s t i t u t e d i n 5ml c o l u m n b u f f e r and s e p a r a t e d b y DEAE c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y . F i v e ml f r a c t i o n s were e l u t e d w i t h a l i n e a r g r a d i e n t o f O t o 200mM N a C l i n 300ml c o l u m n b u f f e r . S u p e r n a t e s r e m a i n i n g a f t e r ( N H ^ ^ S O ^ p r e c i p i t a t i o n were a l s o c h r o m a t o g r a p h e d i n a s i m i l a r manner ( * ~ " ~ " ) . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d as cpm [ ^ 4 C ] - l a b e l l e d p r o t e i n p e r c u l t u r e f l a s k . 66 X Z 0 . o o at UJ 1 _i _J UJ m 3 2 H —1 I I I I I 1 ~ T~ ~ ~ 1 I 10 IS 2 0 2 5 3 0 3 5 4 0 4 5 5 0 5 5 6 0 F R A C T I O N N U M B E R F i g . 8. D E A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h i c s e p a r a t i o n o f p r o t e i n s s y n t h e s i z e d b y f i b r o b l a s t c u l t u r e s i n t h e p r e s e n c e o f CH 3SH C u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d s i m u l t a n e o u s l y and p r o c e s s e d i d e n t i c a l l y t o t h o s e d e p i c t e d i n F i g . 7 e x c e p t t h a t d u r i n g t h e 24h l a b e l l i n g p e r i o d f i b r o b l a s t s w e r e e x p o s e d t o an a t m o s p h e r e o f 5% 00^/95% a i r a d m i x e d w i t h CH^SH ( l O n g / m l ) . R e s u l t s a r e e x p r e s s e d a s cpm 14 T C l - l a b e l l e d p r o t e i n p e r c u l t u r e f l a s k . 67 I n i t i a l r e c o v e r i e s f r o m c o l u m n s e m p l o y e d f o r a n a l y s i s w e r e a p p r o x i m a t e l y 30%. T h i s was p a r t l y a r e f l e c t i o n o f t h e s i z e o f c o l u m n u s e d i n m o s t p u b l i s h e d p r o c e d u r e s ( 2 9 ) . R e d u c i n g c o l u m n s i z e f r o m 1.5 x 30cm t o 0.75 x 8cm i n c r e a s e d r e c o v e r y b u t d i d n o t p r o v i d e t o t a l e l u t i o n o f a p p l i e d s a m p l e . Maximum r e c o v e r y was a p p r o x i m a t e l y 7 0 % . T h i s was a c h i e v e d a f t e r w i t h m u l t i p l e u s e s o f t h e same c o l u m n , s e v e r a l " p r e - r u n s " b e f o r e a p p l y i n g t h e s a m p l e , and r e d u c t i o n o f c o l u m n s i z e a s h a s b e e n i n d i c a t e d . I t i s n o t e w o r t h y t h a t m o r e r e c e n t l i t e r a t u r e p e r t a i n i n g t o s e p a r a t i o n o f p r o c o l l a g e n s u s i n g t h i s t e c h n i q u e t e n d s t o r e p o r t t h e u s e o f much s m a l l e r c o l u m n s t h a n h a d b e e n p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 1 , 6 ) . C o m p a r i s o n o f t e s t and c o n t r o l s y s t e m s showed t h a t CH^SH c a u s e d a g e n e r a l d e p r e s s i o n o f p r o t e i n s y n t h e s i s i n c l u d i n g t y p e I I I p r o c o l l a g e n s l o c a t e d i n f r a c t i o n number 4 8 . The o n l y c o m p o n e n t w h i c h was e l e v a t e d i n t e s t s y s t e m s was f r a c t i o n number 37 w h i c h c o r r e s p o n d s t o t y p e I p r o c o l l a g e n s w h i c h was t w i c e t h e a c t i v i t y o f t h e c o n t r o l . T h e s e p r o f i l e s t h e r e f o r e s u g g e s t t h a t CH^SH i n c r e a s e s t h e l e v e l s o f t y p e I p r o c o l l a g e n s b u t d e p r e s s e s p r o d u c t i o n o f a l l o t h e r e l u t e d p r o t e i n s i n c l u d i n g t y p e I I I p r o c o l l a g e n s . The p r o f i l e s a l s o i n d i c a t e t h a t p r e c i p i t a t i o n w i t h ammonium s u l p h a t e d i d n o t r e m o v e a l l p r o t e i n f r o m t h e s o l u t i o n s i n c e a s m a l l p e a k was a l s o p r e s e n t on c o l u m n s l o a d e d w i t h d i a l y z e d s u p e r n a t e s a m p l e s . The d e p i c t e d p r o f i l e s a r e f o r 68 s i m u l t a n e o u s l y i n c u b a t e d t e s t a n d c o n t r o l c u l t u r e s . E l u t i o n p a t t e r n s w e r e o b t a i n e d on s u c c e s s i v e r u n s on t h e same c o l u m n w i t h r e c o v e r i e s a p p r o x i m a t i n g t h e maximum a t t a i n a b l e (>70%) w i t h t h i s s y s t e m . F. A n a l y s i s o f T o t a l L a b e l l e d P r o t e i n f o r A s s e s s m e n t o f R e v e r s i b i l i t y o f C H 3 S H I n h i b i t i o n E x p e r i m e n t s w e re c o n d u c t e d on q u i e s c e n t s y s t e m s s i m i l a r t o t h o s e e m p l o y e d i n t h e i n v e s t i g a t i o n o f t h e e f f e c t o f CH-^SH o n t o t a l p r o t e i n s y n t h e s i s . The p u r p o s e o f t h e s e s t u d i e s was, h o w e v e r , t o e x a m i n e t h e e f f e c t s a s s o c i a t e d w i t h l o n g e r p e r i o d s o f l a b e l l i n g and t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e p r e v i o u s l y o b s e r v e d C H ^ S H - i n d u c e d i n h i b i t i o n was r e v e r s i b l e . F o r t h i s s e r i e s , c u l t u r e s w e r e l a b e l l e d f o r 24 o r 48 h o u r s d u r i n g q u i e s c e n c e t o a v o i d e x t r a n e o u s f a c t o r s a s s o c i a t e d w i t h d i f f e r e n c e s i n g r o w t h r a t e s b e t w e e n c u l t u r e s . As p r e v i o u s l y d e s c r i b e d , t e s t c u l t u r e s t h a t w e r e e x p o s e d t o m e r c a p t a n d u r i n g l a b e l l i n g p e r i o d s o f 48 h o u r s w e r e c o m p a r e d w i t h s i m u l t a n e o u s l y - l a b e l l e d c o n t r o l s . F o u r o t h e r g r o u p s o f f i v e c u l t u r e s w e r e c o m p a r e d u n d e r c o n d i t i o n s o f C , T , T C , o r CT a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y . A l l e x p e r i m e n t s w e r e r e p e a t e d t h r e e t i m e s . 69 L a b e l l e d p r o t e i n s y n t h e s i s r e s u l t s b a s e d on T C A / t a n n i c a c i d p r e c i p i t a t i o n ( T a b l e s 6 a n d 7) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e i n h i b i t i o n o v e r 48 h o u r s o f l a b e l l i n g was s i m i l a r t o t h a t o b s e r v e d w i t h 3 h o u r s o f l a b e l l i n g a f t e r a 4 8 h o f u n l a b e l l e d q u i e s c e n c e . T o t a l p e r c e n t a g e d e c r e a s e b y CH^SH i n c o m b i n e d c e l l - a s s o c i a t e d a n d medium f r a c t i o n s was 3 2 % f o r c u l t u r e s l a b e l l e d f o r 3 h o u r s a n d 3 3 % f o r c u l t u r e s l a b e l l e d 48 h o u r s ( s e e T a b l e s 2 and 7 ) . The d i s t r i b u t i o n o f a c t i v i t y b e t w e e n medium arid c e l l - a s s o c i a t e d f r a c t i o n s , h o w e v e r , d i f f e r e d f o r 3 a n d 48 h o u r l a b e l l i n g p e r i o d s . A p p r o x i m a t e l y t w o t h i r d s o f t h e t o t a l r a d i o a c t i v i t y was a s s o c i a t e d w i t h t h e c e l l s a t 3 h o u r s ( s e e T a b l e 1) w h e r e a s c e l l e x t r a c t a c t i v i t y a c c o u n t e d f o r l e s s t h a n h a l f t h e t o t a l a t 48h ( s e e T a b l e 6 ) . T h i s c h a n g e l i k e l y r e f l e c t s a c c u m u l a t i o n o f s e c r e t e d p r o t e i n i n m e d i a when f i b r o b l a s t s w e r e p u l s e d f o r l o n g e r p e r i o d s o f t i m e . S i m i l a r l y c o m p a r i s o n o f i n h i b i t i o n s a s s o c i a t e d w i t h medium and c e l l e x t r a c t s i n d i c a t e s t h a t c e l l e x t r a c t s w e r e i n h i b i t e d more t h a n t h e medium a t 3h ( s e e T a b l e 2) b u t e x h i b i t e d l e s s e r p e r c e n t a g e r e d u c t i o n a t 48h ( s e e T a b l e 7 ) . I n o t h e r w o r d s , g r e a t e r e f f e c t s c o u l d be d e t e c t e d i n medium f r a c t i o n s f o l l o w i n g p r o l o n g e d l a b e l l i n g p e r i o d s . A m a j o r d e d u c t i o n f r o m t h e o b s e r v e d i n h i b i t i o n r e s u l t s i s t h a t t h e r e d u c t i o n o f t o t a l p r o t e i n s y n t h e s i s d o e s n o t a p p e a r t o 70 T a b l e 6: D i s t r i b u t i o n o f [ C] a c t i v i t y b e t w e e n m e d i a and c e l l e x t r a c t f r a c t i o n s i n s y s t e m s u s e d t o d e t e r m i n e r e v e r s i b i l i t y o f CH-SH i n h i b i t i o n . S y s t e m cpm M e d i a F r a c t i o n C e l l s T o t a l ( m e d i a & c e l l s ) % o f t o t a l cpm % o f t o t a l cpm C48 8 2 4 0 58 6000 4 2 . 1 4 2 4 0 T48 5050 53 4 4 1 0 47 9460 C 6 2 7 0 53 5570 47 11840 T 4 6 3 0 52 4 2 4 0 48 8870 TC 4090 45 5040 55 9 1 3 0 CT 4 2 2 0 45 5180 55 9400 C u l t u r e s w e r e l a b e l l e d w i t h L - [ C ] - p r o l i n e i n s e r u m - f r e e medium f o r e i t h e r 4 8 h a s c o n t r o l o r t e s t c u l t u r e s ( C 4 8 a n d T 4 8 r e s p e c t i v e l y ) o r f o r 24h f o l l o w i n g i n i t i a l 24h i n c u b a t i o n a s c o n t r o l s (C, CT) o r t e s t s (T, T C ) . S a m p l e s d e s i g n a t e d a s C o r T w e r e i n c u b a t e d f o r t w o 24h p e r i o d s as c o n t r o l a n d t e s t c u l t u r e s w i t h medium c h a n g e a f t e r t h e f i r s t 24h a n d l a b e l l i n g i n t h e s e c o n d 2 4 h . S a m p l e s d e s i g n a t e d a s TC and CT w e r e i n t e r c h a n g e d b e t w e e n t e s t a n d c o n t r o l i n c u b a t o r s w i t h e i t h e r i n i t i a l 24h i n c u b a t i o n s a s t e s t s a n d l a b e l l i n g i n a s e c o n d 24h a s c o n t r o l s (TC) o r i n i t i a l 2 4 h i n c u b a t i o n s a s c o n t r o l s a n d l a b e l l i n g i n a s e c o n d 24h as t e s t s y s t e m s ( C T ) . R e s u l t s a r e a v e r a g e s f o r t h r e e d i f f e r e n t r u n s w i t h f i v e s e p a r a t e c u l t u r e s i n e a c h c a t e g o r y i n e a c h r u n . A c t i v i t i e s w e r e d e t e r m i n e d f o l l o w i n g p r e c i p i t a t i o n w i t h T C A / t a n n i c a c i d a n d a r e e x p r e s s e d a s cpm p e r 60mm P e t r i d i s h . T a b l e 7: The c o n t i n u e n c e o f CH^SH i n h i b i t i o n i n s y s t e m s u n d e r n o r m a l c u l t u r e c o n d i t i o n s . S y s t e m cpm M e d i a F r a c t i o n C e l l s T o t a l ( m e d i a & c e l l s ) % d e c r e a s e cpm % d e c r e a s e cpm % d e c r e a s e C48 8240 6000 14240 T48 5050 39 4 4 1 0 27 9460 34 C 6270 5560 • 1 1 8 4 0 T 4630 27 4 2 4 0 24 88 7 0 25 TC 4090 35 5040 10 91 3 0 23 CT 4220 33 5180 7 9400 21 D a t a f r o m T a b l e 6 i s p r e s e n t e d a s a c o m p a r i s o n b e t w e e n c u l t u r e s e x p o s e d t o CH^SH a n d c o r r e s p o n d i n g c o n t r o l s i n c u b a t e d i n a i r / C 0 2 ' E x p o s u r e t o CH^SH b e f o r e l a b e l l i n g r e s u l t s i n p e r s i s t e n c e o f i n h i b i t i o n o f p r o t e i n s y n t h e s i s e v e n i f c u l t u r e s a r e l a b e l l e d i n c o n t r o l a t m o s p h e r e s f o l l o w i n g t e s t i n c u b a t i o n s . 72 b e r e v e r s i b l e f o r a t l e a s t 24 h o u r s f o l l o w i n g e x p o s u r e t o CH^SH. T h i s a s p e c t was i n v e s t i g a t e d i n t h r e e s e p a r a t e t r i a l s c o n t a i n i n g f o u r g r o u p s o f f i v e c u l t u r e s e a c h . F o l l o w i n g a 24 h o u r p r e - i n c u b a t i o n i n s e r u m - f r e e m e d i a u n d e r t e s t o r c o n t r o l c o n d i t i o n s , c e l l s w e r e l a b e l l e d i n a s e c o n d 24 h o u r p e r i o d i n w h i c h two g r o u p s w e r e c r o s s e d o v e r f r o m t e s t t o c o n t r o l o r c o n t r o l t o t e s t i n c u b a t i o n s ( s e e F i g 9 ) . R e s u l t s d e p i c t e d o n T a b l e 7 i n d i c a t e t h a t c u l t u r e s e x p o s e d t o CH^SH d u r i n g a n y p e r i o d p r o d u c e d l e s s l a b e l l e d p r o t e i n t h a n t h e c o n t r o l g r o u p . T h i s o b s e r v a t i o n was e s p e c i a l l y s i g n i f i c a n t f o r t h e TC g r o u p s i n c e t h e s e c u l t u r e s w e r e l a b e l l e d i n an a i r / C C > 2 a t m o s p h e r e d e v o i d o f CH 3SH. G. A n a l y s i s o f R a d i o l a b e l l e d P r o t e i n s b y SDS/ P o l y a c r y l a m i d e S l a b G e l E l e c t r o p h o r e s i s (SDS/PASGE) The e f f e c t o f m e t h y l m e r c a p t a n on m e t a b o l i s m o f c o l l a g e n o u s p r o t e i n s was f u r t h e r i n v e s t i g a t e d u s i n g SDS/PASGE. G e l s w e r e d e s i g n e d t o d e m o n s t r a t e a n y r e v e r s i b i l i t y o f CH^SH e f f e c t s a s w e l l a s a n y a l t e r a t i o n s i n c o l l a g e n s ( s e e F i g . 9 ) . I d e n t i f i c a t i o n o f c o l l a g e n o u s b a n d s was made t h r o u g h c o m p a r i s o n w i t h p u b l i s h e d e l e c t r o p h o r e t i c m i g r a t i o n p a t t e r n s ( 2 8 ) . C h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o c o l l a g e n s was f u r t h e r c o n f i r m e d b y p e p s i n d i g e s t i o n ( 6 , 2 8 ) . C o m p a r i s o n o f p r o f i l e s o b t a i n e d f r o m c o n t r o l 73 0 HR 24 HR 4 8 H R 0 HR 24 HR 48 HR F i g . 9. E x p e r i m e n t a l d e s i g n u s e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e C F ^ S H - i n d u c e d r e d u c t i o n o f p r o t e i n s y n t h e s i s i s r e v e r s i b l e . The s y s t e m (C) r e p r e s e n t s a c o n t r o l i n c u b a t e d f o r 48h i n p r e s e n c e o f C C ^ / a i r w i t h medium c h a n g e d a f t e r 24h o f i n c u b a t i o n ; (CT) was i n c u b a t e d f o r t h e f i r s t 24h i n C C ^ / a i r a t m o s p h e r e , t h e n medium was r e p l a c e d and t h e e n s u i n g 24 t o 4 8 h i n c u b a t i o n was c o n d u c t e d i n C H ^ S H / C O ^ / a i r a t m o s p h e r e ; ( C ^ g ) c e l l s w e r e s u b j e c t e d f o r t h e e n t i r e 48h i n c u b a t i o n p e r i o d w i t h o u t medium c h a n g e , i n C O ^ / a i r ; (TC) i n c u b a t i o n f o r t h e i n i t i a l 24h was c a r r i e d o u t i n p r e s e n c e o f C H 3 S H / C 0 2 / a i r , t h e n t h e medium was r e p l a c e d and c e l l s w e r e s u b j e c t e d t o C C > 2 / a i r d e v o i d o f CH^SH; and (T) was s u b j e c t e d f o r t h e e n t i r e 4 8 h t o C H g S H / C O ^ / a i r w i t h medium c h a n g e a f t e r ?4h o f i n c u b a t i o n . The a t m o s p h e r e o f c o n t r o l and t e s t s y s t e m s was 5% C 0 2 / 9 5 % a i r a n d l O n g CH 3SH/ml 5%CC> 2/95% a i r r e s p e c t i v e l y . 74 and m e r c a p t a n - e x p o s e d c u l t u r e s ( s e e F i g 10) i n d i c a t e s c h a n g e s i n p r o c o l l a g e n b a n d i n g p a t t e r n s and t y p e I I I c o l l a g e n a c h a i n s . T e s t c u l t u r e s e x h i b i t e d m a r k e d i n c r e a s e s i n t y p e I p r o c o l l a g e n and pC c o l l a g e n a2 c h a i n s . S i n c e a 2 c h a i n s a r e o n l y p r e s e n t i n t y p e I and n o t t y p e I I I c o l l a g e n s and s i n c e t h i s a r e a i s s p e c i f i c f o r t y p e I p r o c o l l a g e n s , t h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t m e r c a p t a n - e x p o s e d s y s t e m s h a v e a n a c c u m u l a t i o n o f t y p e I c o l l a g e n p r e c u r s o r s . T h i s o b s e r v a t i o n i s c o n f i r m e d b y c o m p a r i s o n o f d e n s i t o m e t r i c s c a n s ( s e e F i g 11) w h i c h i n d i c a t e e l e v a t e d peak a r e a s i n t h i s r e g i o n o f t h e g e l . T h i s i s a l s o i n a c c o r d w i t h i n v e s t i g a t i o n s u s i n g D E A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y w h i c h d e p i c t e d a c c u m u l a t i o n o f t y p e I c o l l a g e n p r e c u r s o r s and i n d i c a t e d t h a t m e r c a p t a n - t r e a t e d c u l t u r e s h a v e t w i c e as much t y p e I p r o c o l l a g e n s as t h e c o n t r o l s . A l t h o u g h s l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s d o e s n o t s e p a r a t e c h a i n s o f t y p e I and t y p e I I I p r o c o l l a g e n s , a d e c r e a s e o f c o m b i n e d pC a l c o l l a g e n s was o b s e r v e d i n t e s t c u l t u r e s . The e f f e c t on p C a l ( I and I I I ) c o l l a g e n s and p r o a2 ( I ) and pC a2 ( I ) c o l l a g e n s was p r e s e n t i n a l l c u l t u r e s e x p o s e d t o m e r c a p t a n . T h i s i s a g a i n s i g n i f i c a n t i n TC c u l t u r e s w h i c h m e t a b o l i z e d 14 L-T C l - p r o l i n e as t e s t s a m p l e s e v e n t h o u g h t h e l a b e l l i n g was p e r f o r m e d u n d e r c o n t r o l c o n d i t i o n s . 75 F i g . 10. S D S - s l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f c o l l a g e n o u s c h a i n s f r o m m e d i a f r a c t i o n s o f s y s t e m s shown 9 . p r o t e i n i n F i g . L a b e l l e d p r o t e i n s f r o m medium f r a c t i o n s o f (C) 24-48h,(CT) 2 4 - 4 8 h , ( C 4 8 ) 0 - 4 8 h , ( T C ) 2 4 - 4 8 h , a n d (T) 24-48h i n c u b a t i o n p e r i o d s were c o n c e n t r a t e d and r e c o n s t i t u t e d i n sample b u f f e r . F o l l o w i n g d e n a t u r a t i o n , 50 PI v o l u m e s were e l e c t r o p h o r e s e d o v e r n i g h t u s i n g r e d u c i n g SDS-7.5% p o l y a c r y l a m i d e s l a b g e l s . The i n d i c a t e d b a n d s were d e v e l o p e d b y f l u o r o g r a p h y (2 wks, - 70°C, Kodak XAR - 5 f i l m ) . The a r e a d e p i c t e d i n t h e p h o t o g r a p h e n c o m p a s s e s t h e p o r t i o n o f t h e s l a b g e l o c c u p i e d b y c o l l a g e n o u s p r o t e i n s . 76 <- p ro a i ( l & <r Pc at (I & III) j pro a2(|); P c a 2 ( l ) Pn aj (I) <- a x (MI) <r aj (I) <-a2(|) 77 0-24 HR TEST/24-48 HR CONTROL F i g . 1 1. D e n s i t o m e t r i c s c a n n i n g o f ( C ) , ( C T ) , a n d ( T C ) f l u o r o g r a p h s shown i n F i g . 10. P e n s i t o m e t r i c s c a n s o f ( C ) , ( C T ) , a n d (TC) f l u o r o g r a p h s w e r e compared t o d e t e r m i n e r e v e r s i b i l i t y o f i n h i b i t i n g e f f e c t o f CP^SH. The p r o f i l e s i n d i c a t e c h a n g e s i n p c a l , p r o a2 a n d P G a 2 and a 1 ( I I I ) r e g i o n s o f t h e f l u o r o g r a p h . D i r e c t c o m p a r i s o n o f 2 4-48h m e d i a s a m p l e s o f t h e t h r e e d e p i c t e d s y s t e m s c l e a r l y shows t h a t t h e CH^SF e f f e c t was n o t r e v e r s e d d u r i n g t h e 24h o f i n c u b a t i o n o f (TC) i n C O ^ / a i r . 78 B o t h r e d u c i n g s l a b g e l s and d e n s i t o m e t r i c s c a n s ( F i g 10 and 11) i n d i c a t e a d e c r e a s e i n t y p e I I I c o l l a g e n a 1 c h a i n s i n t e s t s a m p l e s . As p r e v i o u s l y i n d i c a t e d , t y p e I I I and I p r o c o l l a g e n and pC c o l l a g e n a 1 c h a i n s a r e s u p e r i m p o s e d i n e l e c t r o p h o r e s i s p r o f i l e s . The r e d u c t i o n i n t y p e I I I c o l l a g e n a 1 c h a i n s , b a s e d on s l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s a l o n e , c o u l d be e x p l a i n e d e i t h e r b y a d e c r e a s e d c o n v e r s i o n o f t y p e I I I p r e c u r s o r s t o m a t u r e a c h a i n s o r b y a g e n e r a l i z e d d e c r e a s e i n t y p e I I I c o l l a g e n s y n t h e s i s . D E A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y h a s , h o w e v e r , i n d i c a t e d a g e n e r a l i z e d s u p p r e s s i o n o f s y n t h e s i s o f a l l e l u t e d m o l e c u l e s e x c e p t f o r t y p e I p r o c o l l a g e n s . The r e s u l t s a r e , t h e r e f o r e , c o n s i s t e n t w i t h a r e d u c t i o n i n t y p e I I I c o l l a g e n s y n t h e s i s r a t h e r t h a n i n h i b i t i o n o f c o n v e r s i o n o f t y p e I I I p r e c u r s o r s t o a l c h a i n s . As was a p p a r e n t w i t h t h e e f f e c t on t y p e I c o l l a g e n s , t h e i n f l u e n c e o f m e r c a p t a n on t y p e I I I c o l l a g e n s y n t h e s i s i s n o t r e v e r s e d f o l l o w i n g e x p o s u r e o f t e s t c u l t u r e s t o a i r / C C ^ a t m o s p h e r e s . H. P e p s i n D i g e s t o f P r o c o l l a g e n s Samples t o b e p e p s i n d i g e s t e d were l a b e l l e d i n p r e s e n c e o f CH.jSH s i n c e r e v e r s i b i l i t y s l a b g e l s i n d i c a t e d t h a t t h e s e c o n d i t i o n s m a x i m i z e d a m o u n t s o f p r o a 2 ( 1 ) a n d p c a 2 ( I ) p r o c o l l a g e n s . S i n c e t h i s a r e a r e p r e s e n t e d t h e o n l y p o r t i o n o f t h e s l a b g e l 79 s p e c i f i c f o r t y p e I c o l l a g e n , p r e c u r s o r s , t h e e x p e r i m e n t was d e s i g n e d t o e n s u r e t h a t d i s a p p e a r a n c e o f t h i s b and w o u l d be r e a d i l y a p p a r e n t f o l l o w i n g r e m o v a l o f p r o c o l l a g e n N H 2 and COOH 2 t e r m i n a l e x t e n s i o n s and c o n v e r s i o n o f t h e p r o c o l l a g e n s t o <* c h a i n s . F l u o r o g r a p h s c l e a r l y i n d i c a t e t h e d i s a p p e a r a n c e o f t h i s p e a k i n s a m p l e s d i g e s t e d b o t h f o r 6h and 24h. R e s i d u a l 6 b a n d s a r e a l s o p r e s e n t i n d i g e s t e d s a m p l e s i n a r e a s o c c u p i e d by p r o d l ( I ) , p r o a i ( I I I ) , a n d P c h a i n s . ( s e e F i g . 12) I . S t a t i s t i c s C ombined medium and c e l l e x t r a c t f r a c t i o n s were a n a l y z e d i n e a c h s t u d y u s i n g a two-way a n a l y s i s o f v a r i a n c e . A n a l y s e s f o r d i f f e r e n c e s i n t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n f o l l o w i n g 48h q u i e s c e n c e i n d i c a t e d t h a t t e s t and c o n t r o l c u l t u r e s were s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a t t h e p<0.001 l e v e l ( s e e T a b l e 8 ) . T o t a l p r o t e i n and c o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n s t u d i e s a l s o e x h i b i t e d d i f f -e r e n c e s w h i c h were s i g n i f i c a n t a t t h i s l e v e l ( s e e T a b l e 9 ) . R e v e r s i b i l i t y e x p e r i m e n t s ( s e e T a b l e 10) were a l l s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a t t h i s l e v e l e x c e p t f o r a n a l y s e s w h i c h compared T, TC, a n d CT. S i n c e T, TC, and CT d i d n o t d i f f e r a t a s i g n i f i c a n t , l e v e l , t h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t a l l c u l t u r e s w h i c h ha d b e en e x p o s e d t o m e r c a p t a n e i t h e r p r i o r t o o r d u r i n g l a b e l l i n g e x h i b i t e d s i m i l a r d e c r e a s e s i n p r o t e i n s y n t h e s i s . C u l t u r e s w e r e, h o w e v e r , d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l s (C) w h i c h were n o t e x p o s e d t o VSC. 80 F i g u r e 1 2 . C o m p a r i s o n o f c o l l a g e n s f r o m m e r c a p t a n f i b r o b l a s t c u l t u r e s b e f o r e a n d a f t e r p e p s i n d i g e s t i o n . - e x p o s e d P r o t e i n s l a b e l l e d w i t h L - C ^ ^ C l - p r o l i n e f r o m s e r u m - f r e e f i b r o b l a s t c u l t u r e m e d i a i n c u b a t e d i n p r e s e n c e o f m e t h y l m e r c a p t a n w e r e p r e c i p i t a t e d w i t h 3 0 % ( N H ^ ^ S O ^ . P r e c i p i t a t e s w e r e r e c o n s t i t u t e d i n 0.5M a c e t i c a c i d a n d d i a l y z e d e x h a u s t i v e l y . P o r t i o n s o f t h e a c e t i c a c i d d i a l y s a t e s w e r e t h e n d i g e s t e d f o r 6h and 24h a t 22°C w i t h lOOugm/ml p e p s i n . D i g e s t s w e r e c o n c e n t r a t e d a n d a n a l y z e d b y SDS/PASGE a n d f l u o r o g r a p h y . The f o l l o w i n g ' s a m p l e s a r e d e p i c t e d on t h e f l u o r o g r a m : S l o t 1 S l o t 2 S l o t 3 S l o t 4 S l o t 5 U n d i g e s t e d p r e c i p i t a t e P r e c i p i t a t e d i g e s t e d w i t h p e p s i n f o r 24h P r e c i p i t a t e d i g e s t e d w i t h p e p s i n f o r 6h U n d i g e s t e d p r e c i p i t a t e P r e c i p i t a t e d i g e s t e d w i t h p e p s i n f o r 24h 81 82 T a b l e 8: Two-way a n a l y s i s o f v a r i a n c e o f t o t a l p r o t e i n s y n t h e s i s b y f i b r o b l a s t s f o l l o w i n g 48h q u i e s c e n c e i n p r e s e n c e o f CH_SH. S y s t e m E x p e r i m e n t E x p e r i m e n t 1 E x p e r i m e n t 2 E x p e r i m e n t 3 C o n t r o l 2300 ± 380 2350 ± 390 5160 + 1150 T e s t 1670 ± 470 1700 + 400 2990 + 790 F v a l u e 25.91 P<0.001 D a t a d e p i c t e d i n T a b l e s 1 and 2 was a n a l y z e d b y a two-way a n a l y s i s o f v a r i a n c e . V a l u e s r e p r e s e n t a c t i v i t i e s p r e c i p i t a t e d b y 10% TCA/1% t a n n i c a c i d i n c o m b i n e d medium and c e l l a s s o c i a t e d f r a c t i o n s . 83 T a b l e 9: Two-way a n a l y s i s o f . v a r i a n c e o f t o t a l p r o t e i n and c o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n f o l l o w i n g 4 8 h l a b e l l i n g i n p r e s e n c e o f CH-SH S y s t e m E x p e r i m e n t E x p e r i m e n t 1 E x p e r i m e n t 2 E x p e r i m e n t 3 T o t a l p r o t e i n : C o n t r o l 4 2 2 7 0 + 4300 4 4 9 3 0 ± 8 0 1 0 33390 ± 5680 T e s t 3 7 0 9 0 + 3 9 2 0 4 0 4 0 0 + 4 5 1 0 / 2 6 8 9 0 + 2 9 0 0 C o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n : C o n t r o l 12800 + 1320 7150 + 1560 16620 ± 2260 T e s t 9 6 4 0 + 1340 5740 1 1360 11230 ± 1710 C o m p a r i s o n : F v a l u e : T o t a l p r o t e i n 15.92 p<0.001 C o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n 60.29 p<0.001 D a t a d e p i c t e d i n T a b l e s 4 and 5 was a n a l y z e d b y a two-way a n a l y s i s o f v a r i a n c e . Means a n d s t a n d a r d d e v i a t i o n s r e p r e s e n t p r e c i p i t a b l e p r o t e i n i n c o m b i n e d medium and c e l l - a s s o c i a t e d f r a c t i o n s . 84 T a b l e 10: Two-way a n a l y s i s o f v a r i a n c e f o r s y s t e m s d e s i g n e d t o t e s t t h e c o n t i n u a n c e o f CH_SH i n h i b i t i o n . S y s t e m E x p e r i m e n t E x p e r i m e n t 1 E x p e r i m e n t 2 E x p e r i m e n t 3 C48 5830 + 208 17700 + 1860 20470 + 2350 T48 1910 + 2 20 1 5 1 1 0 + 1120 11360 + 710 C 2640 + 430 15510 + 650 17420 + 207O T 1280 + 270 1 3 4 0 0 + 1690 11684 + 820 TC 1380 + 410 1 3 9 2 0 + 1460 13120 + 1160 CT 1 2 0 6 0 + 1460 12640 + 1190 C o m p a r i s o n : F v a l u e : C48, T48 74. 27 p<0.001 C,T,TC,CT 2 2.40 p<0.001 T,TC,CT 2.11 p<0.140 C, T 4 6 . 9 2 p<0.001 C, TC 26.31 p<0.001 C, CT 30. 04 p<0.001 D a t a d e p i c t e d i n T a b l e s 6 a n d 7 was a n a l y z e d b y a two-way a n a l y s i s o f v a r i a n c e . V a l u e s r e p r e s e n t p r e c i p i t a b l e a c t i v i t i e s f r o m c o m b i n e d medium a n d c e l l a s s o c i a t e d f r a c t i o n s . 85 CHAPTER I V DISCUSSION A. I m p l i c a t i o n s o f S t u d i e s i n t h e T h e s i s - R e l a t i o n s h i p o f VSC t o t h e P e r i o d o n t a l D i s e a s e P r o c e s s P e r i o d o n t a l d i s e a s e i s g e n e r a l l y c o n s i d e r e d t o b e a n o n - s p e c i f i c i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e t o b a c t e r i a l f a c t o r s p r o d u c e d b y d e n t a l p l a q u e m i c r o o r g a n i s m s ( 3 0 ) . A l t h o u g h t h i s p r o c e s s may h a v e m u l t i p l e e t i o l o g i e s , m o s t s t u d i e s a s s o c i a t e g i n g i v a l i n f l a m m a t i o n a n d r e l a t e d p e r i o d o n t a l d e s t r u c t i o n w i t h a l t e r a t i o n s i n t h e m i c r o b i a l f l o r a o f t h e g i n g i v a l c r e v i c e ( 3 1 ) . I n p a r t i c u l a r , t h e b a c t e r i a l p o p u l a t i o n c h a n g e s f r o m a e r o b e s c o n s i s t i n g p r e d o m i n e n t l y o f g r a m p o s i t i v e c o c c i t o a n a e r o b i c g r a m n e g a t i v e r o d s and s p i r o c h e t e s . Gram n e g a t i v e s p e c i e s p r o d u c e a v a r i e t y o f s u b s t a n c e s . w h i c h c a n a l t e r t h e e p i t h e l i a l b a r r i e r o f t h e g i n g i v a l c r e v i c e a n d c r e a t e c h a n g e s i n t h e u n d e r l y i n g l a m i n a p r o p r i a . E n d o t o x i n , i n p a r t i c u l a r , seems t o b e a l i k e l y c a n d i d a t e f o r i n d u c t i o n o f t h i s i n f l a m m a t o r y p r o c e s s . 86 A g e n t s i n i t i a t i n g p e r i o d o n t a l d e s t r u c t i o n a r e , h o w e v e r , n o t t h e o n l y f a c t o r s a s s o c i a t e d w i t h i t s e t i o l o g y . Once t h e i n i t i a l l e s i o n b e c o m e s e s t a b l i s h e d , t h e p r o c e s s i s m o d i f i e d b y d e s t r u c t i v e e l e m e n t s a s s o c i a t e d w i t h t h e immune r e s p o n s e , f u r t h e r c h a n g e s i n m i c r o b i a l f l o r a , and a v a r i e t y o f c o m p l e x a l t e r a t i o n s w i t h i n t h e d i s e a s e d , t i s s u e . The b a s i c p r e m i s e o f t h i s t h e s i s i s t h a t v o l a t i l e s u l p h u r compounds a r e a r e s u l t o f s u c h i n t e r a c t i o n s and c o n t r i b u t e t o t h e e t i o l o g y o f p e r i o d o n t a l d i s e a s e b y p o t e n t i a t i n g d e s t r u c t i o n i n i t i a t e d b y b a c t e r i a l p l a q u e . A l t h o u g h t h e p u r p o s e o f t h e s e i n v e s t i g a t i o n s i s t o examine t h e e f f e c t o f VSC on c o l l a g e n s y n t h e s i s , o t h e r s t u d i e s h a v e shown t h a t t h i o l compounds h a v e m u l t i p l e d e l e t e r i o u s e f f e c t s . P r e v i o u s work h a s d e m o n s t r a t e d t h a t h y d r o g e n s u l p h i d e w i l l b i n d t o i n t a c t t y p e I c o l l a g e n and r e s u l t i n i t s s o l u b i l i z a t i o n b y a n o n - e n z y m a t i c c h e m i c a l r e a c t i o n ( 2 2 ) . C u r r e n t i n v e s t i g a t i o n s b y o t h e r w o r k e r s i n d i c a t e t h a t b o t h m e t h y l m e r c a p t a n and h y d r o g e n s u l p h i d e c a n a l t e r e p i t h e l i a l p e r m e a b i l i t y a n d r e s u l t i n i n c r e a s e d p e n e t r a t i o n o f i o n s i n t o u n d e r l y i n g t i s s u e ( 4 1 ) . A d d i t i o n a l i n v i t r o s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t h y d r o g e n s u l p h i d e i n t e r a c t s w i t h c u l t u r e d f i b r o b l a s t s and s u p p r e s s e s o r d e l a y s s y n t h e s i s o f DNA ( 7 2 ) . T h e s e i n v e s t i g a t i o n s c o l l e c t i v e l y i m p l i c a t e v o l a t i l e s u l p h u r 87 compounds as a p o t e n t i a l l y s i g n i f i c a n t d e s t r u c t i v e f a c t o r i n p e r i o d o n t a l d i s e a s e . C o n f i r m a t o r y e v i d e n c e h a s b e e n p r o v i d e d b y i n v i v o s t u d i e s w h i c h h a v e r e l a t e d s e v e r i t y o f p e r i o d o n t a l d i s e a s e t o l e v e l s o f VSC i n mouth a i r and i n p e r i o d o n t a l p o c k e t s (53, 7 4 ) . T h e r a p y d i r e c t e d t o w a r d i m p r o v i n g p e r i o d o n t a l h e a l t h i n t h e s e p a t i e n t s a l s o r e s u l t e d i n d e c r e a s e d o r a l m a l o d o r . O t h e r c l i n i c a l s t u d i e s h a v e a s s o c i a t e d p a t h o g e n i c s t r a i n s o f B a c t e r i o d e s m e l a n i n o -g e n i c u s w i t h a d v a n c e d p e r i o d o n t a l d i s e a s e . T h e s e o r g a n i s m s a r e p r o l i f i c p r o d u c e r s o f VSC and, s i g n i f i c a n t l y , p r o d u c e f i f t e e n t i m e s as much m e t h y l m e r c a p t a n as n o n - p a t h o g e n i c s p e c i e s ( 7 1 ) . I n i t i a l i n v e s t i g a t i o n s w i t h h y d r o g e n s u l p h i d e and m e r c a p t a n h a v e shown t h a t b o t h o f t h e s e compounds i n h i b i t t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n s y n t h e s i s i n f i b r o b l a s t t i s s u e c u l t u r e s . M e t h y l m e r c a p t a n , however, p r o d u c e s g r e a t e r i n h i b i t i o n and a p p e a r s t o h a v e a more d e s t r u c t i v e p o t e n t i a l . I n a d d i t i o n , t h e i n h i b i t i o n i s n o t r e s t r i c t e d t o c o l l a g e n s s i n c e c o l l a g e n a s e - d i g e s t a b l e p r o t e i n d o e s n o t a c c o u n t f o r t h e t o t a l d e c r e a s e i n r a d i o a c t i v i t y i n t h e s e s y s t e m s ( s e e T a b l e 5 ) . A l t e r a t i o n s i n n o n - c o l l a g e n o u s p r o t e i n may p r o d u c e e f f e c t s w h i c h a r e a s i m p o r t a n t as d e c r e a s e s i n c o l l a g e n s s i n c e t h e e x t r a c e l l u l a r m a t r i x r e l i e s on m o l e c u l e s s u c h a s p r o t e o g l y c a n s t o c o n t r o l t h e f l o w o f i n t e r s t i t i a l w a t e r 88 ( 1 7 ) . A g g r e g a t i o n o f p r o t e o g l y c a n s h a s b e e n shown t o d e p e n d o n d i s u l p h i d e l i n k a g e s a n d c a n b e b l o c k e d b y r e d u c t i o n a n d a l k y l a t i o n ( 1 8 ) . D i s a g g r e g a t i o n o f s u c h m o l e c u l e s c o u l d a c c o u n t f o r t h e p e r m e a b i l i t y c h a n g e s o f c r e v i c u l a r e p i t h e l i u m a s s o c i a t e d w i t h p e r i o d o n t a l d i s e a s e (43) a s w e l l a s t h e i n c r e a s e i n p e r m e a b i l i t y w h i c h h a s b e e n o b s e r v e d f o l l o w i n g t r e a t m e n t o f o r a l m u c o s a w i t h C H gSH ( 4 1 ) . G l y c o p r o t e i n c o m p l e x e s a r e a l s o d i s u l p h i d e - l i n k e d and may c o n s t i t u t e a n a d d i t i o n a l m e c h a n i s m b y w h i c h a g e n t s s u c h a s m e t h y l m e r c a p t a n c o u l d a d v e r s e l y a f f e c t o r a l t i s s u e s . An i n h i b i t i o n o f f i b r o b l a s t s y n t h e s i s o f n o n - c o l l a g e n o u s p r o t e i n may, t h e r e f o r e , p r o d u c e e f f e c t s w h i c h a r e a s d e l e t e r i o u s t o t h e f u n c t i o n o f o r a l m ucosa a s d e c r e a s e s i n c o l l a g e n s . A s m a l l p o r t i o n o f t h e r e d u c t i o n i n t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n c o u l d b e r e l a t e d t o c e l l d e a t h . Trump e t a l . (76) h a v e i n d i c a t e d t h a t i n c r e a s e s i n membrane p e r m e a b i l i t y and d e p r e s s i o n o f p r o d u c t i o n o f ATP a r e t h e t w o m a j o r e f f e c t s w h i c h l e a d t o l y s i s o f c e l l s . I t i s o f i n t e r e s t t h a t t w o o f t h e m a j o r c e l l u l a r e f f e c t s a s s o c i a t e d w i t h o x i d a t i o n o f t h i o l s a r e a n a l t e r a t i o n o f a c t i v e m e m b r a n e t r a n s p o r t s y s t e m s ( 4 5 ) a n d i n h i b i t i o n o f e n z y m e s a s s o c i a t e d w i t h r e g u l a t i o n o f c e l l u l a r l e v e l s o f ATP ( 4 9 ) . I n t h i s i n s t a n c e , h o w e v e r , c e l l d e a t h d o e s n o t p r o v i d e a p l a u s a b l e e x p l a n a t i o n f o r a number o f e x p e r i m e n t a l 89 r e s u l t s . S t u d i e s o f t e s t and c o n t r o l c u l t u r e s s t a i n e d w i t h T r y p a n B l u e i n d i c a t e a t r e n d t o w a r d d e c r e a s e d v i a b i l i t y o f c e l l s e x p o s e d t o VSC i n w h i c h s t a i n e d c e l l s c o n s t i t u t e d a maximum o f 6% o f t h e t o t a l . T h i s p r o p o r t i o n w o u l d n o t a c c o u n t f o r a d e c r e a s e i n p r o t e i n s y n t h e s i s w h i c h i s t h r e e o r f o u r f o l d g r e a t e r . I n a d d i t i o n , d a t a o b t a i n e d f r o m s l a b g e l e l e c t r o -p h o r e s i s a n d D E A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y i n d i c a t e a p r o p o r t i o n a l i n c r e a s e r a t h e r t h a n d e c r e a s e i n c e r t a i n c o l l a g e n p r e c u r s o r p r o t e i n s . T h i s i s n o t c o n s i s t e n t w i t h a n o n - s p e c i f i c d e p r e s s i o n o f c e l l u l a r a c t i v i t y o r w i t h c h a n g e s r e l a t e d t o d e a t h . C e l l membrane e f f e c t s c o u l d a l s o p l a y a r o l e i n t h e o b s e r v e d i n h i b i t i o n . As i n d i c a t e d p r e v i o u s l y , o x i d i z i n g a g e n t s h a v e b e e n shown t o i n h i b i t p r o t e i n k i n a s e enzymes w h i c h a r e r e s p o n s i b l e f o r a c t i v e t r a n s p o r t a c r o s s membranes ( 4 5 ) . S i n c e a g e n t s s u c h as m e t h y l m e r c a p t a n h a v e t h e p o t e n t i a l t o c o n v e r t f r e e t h i o l g r o u p s t o d i s u l p h i d e s , d e c r e a s e d amino a c i d t r a n s p o r t a c r o s s c e l l membranes w o u l d o f f e r a p l a u s a b l e e x p l a n a t i o n f o r t h e r e d u c t i o n i n t o t a l p r o t e i n s y n t h e s i s . I n a d d i t i o n , m e r c a p t a n i s l i p i d s o l u b l e and h e n c e w o u l d r e a d i l y p e n e t r a t e membranes and i n t e r a c t w i t h i n t r a c e l l u l a r o r g a n e l l e s . E x p e r i m e n t s w i t h t h e p r o l i n e t r a n s p o r t a s s a y were d e s i g n e d t o m e a s u r e c h a n g e s i n amino a c i d u p t a k e . A l t h o u g h t h e r e were t r e n d s t o w a r d d e c r e a s e d 90 i n c o r p o r a t i o n o f p r o l i n e i n t o c e l l s , t h e s e t r e n d s were n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t . W h e t h e r t h i s r e f l e c t s a l a c k o f s e n s i t i v i t y i n t h e a s s a y o r i n d i c a t e s t h a t t h e m e r c a p t a n e f f e c t i s n o t o n l y on t h e membrane i s u n c e r t a i n . A t t h i s t i m e , h o w e v e r , t h e o b s e r v e d i n h i b i t i o n c a n n o t t o t a l l y be a t t r i b u t e d t o a l t e r a t i o n s i n a c t i v e t r a n s p o r t s y s t e m s . O x i d a t i o n o f i n t r a c e l l u l a r s u l p h y d r y l s h a s b e e n a s s o c i a t e d w i t h a l t e r a t i o n s i n c e l l d i v i s i o n and ATP m e t a b o l i s m ( 4 9 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e t h a t f r e e t h i o l s a r e i m p o r t a n t t o t h e f u n c t i o n o f enzymes w h i c h r e g u l a t e a number o f b a s i c c e l l p r o c e s s e s . A l t h o u g h enzymes r e l a t i n g t o p r o t e i n s y n t h e s i s h a v e n o t b e e n w e l l i n v e s t i g a t e d w i t h r e g a r d t o t h e i m p o r t a n c e o f s u l p h u r g r o u p s t o f u n c t i o n , i n t e r a c t i o n o f t h i o l g r o u p s c o u l d l i k e l y p l a y an i m p o r t a n t r o l e i n p r o t e i n m e t a b o l i s m . The r e s u l t s o f b o t h s l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s and D E A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y i n d i c a t e t h a t t h e r e i s a p o o l i n g o f p r e c u r s o r t y p e I c o l l a g e n m o l e c u l e s i n c u l t u r e s w h i c h h a v e b e e n e x p o s e d t o m e r c a p t a n . The i m p l i c a t i o n o f t h e s e o b s e r v a t i o n s i s t h a t enzymes r e s p o n s i b l e f o r c o v e r t i n g p r o c o l l a g e n s i n t o c o l l a g e n s h a v e b e e n i n h i b i t e d and now no l o n g e r f u n c t i o n a t n o r m a l l e v e l s o f a c t i v i t y . Whether t h i s i s a t t r i b u t a b l e t o a d i r e c t enzyme e f f e c t o r i s a c t i n g a t t h e l e v e l o f p r o t e i n s y n t h e s i s and r e f l e c t s a d e c r e a s e d i n t r a c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n s o f t h e s e 91 enzymes c a n n o t be a s c e r t a i n e d b y t h i s s t u d y . The f a c t t h a t t y p e I p r o c o l l a g e n s h a v e i n c r e a s e d seems t o i n d i c a t e t h a t s y n t h e s i s o f t h e t y p e I c o l l a g e n p r e c u r s o r s i s u n i m p a i r e d b u t t h a t p o s t t r a n s l a t i o n a l m o d i f i c a t i o n s h a v e b e e n a f f e c t e d . T h e e f f e c t i s f u r t h e r c o m p l i c a t e d b y e v i d e n c e w h i c h i n d i c a t e s t h a t i n t r a c e l l u l a r d e g r a d a t i o n i s a n i m p o r t a n t r e g u l a t o r y m e c h a n i s m f o r t o t a l c o l l a g e n s e c r e t i o n b y f i b r o b l a s t s . S t u d i e s b y B i e n k o w s k i e t a l . (3,- 4) h a v e i n d i c a t e d t h a t 30% o f n e w l y s y n t h e s i z e d c o l l a g e n s a r e d e g r a d e d i n t r a c e l l u l a r l y and a r e n e v e r t r a n s p o r t e d i n t o t h e i n t e r s t i t i a l s p a c e s . A n a l y s i s o f c o l l a g e n s d e s c r i b e d i n t h i s t h e s i s i s f r o m m e d i a f r a c t i o n s o f c e l l c u l t u r e s a n d h e n c e p r o v i d e s no i n d i c a t i o n o f t h e d e g r a d a t i v e a c t i v i t y o f i n t r a c e l l u l a r enzymes. I n a d d i t i o n , t h e r e d u c e d p r o t e i n r e c o v e r y i n c u l t u r e s e x p o s e d t o m e r c a p t a n c o u l d , r e f l e c t a l t e r a t i o n s i n t h e c o l l a g e n m o l e c u l e r a t h e r t h a n d i r e c t enzyme e f f e c t s . B i e n k o w s k y e t a l . (4) e x p o s e d f i b r o b l a s t c u l t u r e s t o a z e t i d i n e - 2 - c a r b o x y l i c a c i d , a p r o l i n e a n a l o g u e , w h i c h was i n c o r p o r a t e d i n t o c o l l a g e n p r o d u c e d b y t h e c e l l s . The i n t r a c e l l u l a r d e g r a d a t i o n o f t h i s a l t e r e d c o l l a g e n was shown t o be t w i c e t h a t o b s e r v e d f o r c o l l a g e n s f r o m c u l t u r e s p u l s e d w i t h L - p r o l i n e . The i m p l i c a t i o n s o f t h i s s t u d y a r e t h a t f i b r o b l a s t s c a n r e c o g n i z e d e f e c t i v e c o l l a g e n m o l e c u l e s and d e g r a d e them p r i o r t o s e c r e t i o n . S i n c e VSC c a n b i n d t o 92 i n t a c t c o l l a g e n m o l e c u l e s (67) and a l t e r t h e i r s o l u b i l i t y ( 2 2 ) , i t i s c o n c e i v e a b l e t h a t t h e s e a l t e r a t i o n s c o u l d a f f e c t t h e s t r u c t u r e o f t h e c o l l a g e n m o l e c u l e and s i g n i f i c a n t l y a l t e r b o t h i n t r a c e l l u l a r and e x t r a c e l l u l a r d e g r a d a t i o n . A n o t h e r n o t a b l e o b s e r v a t i o n i s t h a t a l t h o u g h b o t h SDS/PASGE and DEAE c e l l u l o s e p r o f i l e s i n d i c a t e an i n c r e a s e o f t y p e I p r o c o l l a g e n s , t h e y a l s o show a d e c r e a s e i n b o t h t y p e I I I p r o c o l l a g e n s and t y p e I I I c o l l a g e n a 1 c h a i n s . The s t r u c t u r e . o f t y p e I and I I I c o l l a g e n s may p l a y an i m p o r t a n t r o l e i n t h i s d i f f e r e n c e s i n c e , a l t h o u g h p r o c o l l a g e n e x t e n s i o n s c o n t a i n d i s u l p h i d e s , o n l y t y p e I I I and n o t t y p e I c o l l a g e n , c o n t a i n s d i s u l p h i d e l i n k a g e s . Hence, t h e h e l i c a l c o n f i g u r a t i o n o f t y p e I I I c o l l a g e n d e p e n d s on d i s u l p h i d e b o n d s a n d may b e a d v e r s e l y a f f e c t e d b y t h i o l t o t h i o l i n t e r a c t i o n s . . One f u r t h e r p o s s i b l e e x p l a n a t i o n e x i s t s f o r t h e d i f f e r e n c e i n p r o t e i n p r o d u c t i o n b e t w e e n c o n t r o l and V S C - t r e a t e d c u l t u r e s . S i n c e t h e c u l t u r e s were n o t d e r i v e d f r o m f i b r o b l a s t c l o n e s , t h e r e i s a p o s s i b i l i t y t h a t t h i o l compounds c o u l d be a d v e r s e l y a f f e c t i n g a s u b - p o p u l a t i o n o f f i b r o b l a s t s r a t h e r t h a n a l l c e l l s i n t h e c u l t u r e . T ype I I I c o l l a g e n p r o d u c t i o n f r o m s u b c u l t u r e s o f p e r i o d o n t a l l i g a m e n t f i b r o b l a s t s h a s b e e n shown t o c h a n g e f r o m 20 t o 8% o f c o l l a g e n s f o l l o w i n g s e v e n p a s s a g e s i n c u l t u r e ( 2 8 ) . The a u t h o r s a t t r i b u t e t h i s i n s t a b i l i t y o f t h e c o l l a g e n 93 p h e n o t y p e t o s e l e c t i o n o f r a p i d l y d i v i d i n g c e l l t y p e s w h i c h may d i f f e r f r o m t h e o r i g i n a l h e t e r o g e n e o u s p o p u l a t i o n o f f i b r o b l a s t s . S i n c e VSC c o u l d a c t as an e n v i r o n m e n t a l s e l e c t i o n a g e n t , t h e r e s u l t s c o u l d r e p r e s e n t a t o t a l s u p p r e s s i o n o f 30% o f c e l l s i n c u l t u r e r a t h e r t h a n a 30% s u p p r e s s i o n o f t h e t o t a l c u l t u r e . A s i g n i f i c a n t a s p e c t o f t h e o b s e r v e d c h a n g e s i n p r o c o l l a g e n a n d t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n i s t h a t t h e s e e f f e c t s a r e n o t r e v e r s i b l e f o r a t l e a s t f o r 24 h o u r s f o l l o w i n g e x p o s u r e t o m e r c a p t a n . S l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s d e m o n s t r a t e s t h a t c u l t u r e s w h i c h were i n c u b a t e d as t e s t s h a d s i m i l a r p r o c o l l a g e n m e t a b o l i s m t o t e s t / c o n t r o l s ( c u l t u r e s i n c u b a t e d 24h w i t h m e r c a p t a n b u t l a b e l l e d d u r i n g a s e c o n d 24h p e r i o d u n d e r c o n t r o l c o n d i t i o n s ) . P r o c o l l a g e n p r o f i l e s f o r any c u l t u r e e x p o s e d t o m e r c a p t a n e i t h e r d u r i n g o r p r i o r t o l a b e l l i n g were d e c i d e d l y d i f f e r e n t f r o m c o n t r o l s . D u p l i c a t e c o n t r o l c u l t u r e s were r u n f o r 24 and 48h l a b e l l i n g p e r i o d s t o e n s u r e t h a t d u r a t i o n o f l a b e l l i n g d i d n o t a f f e c t b a n d i n g p r o f i l e s . The i r r e v e r s i b i l i t y i s n o t e w o r t h y b e c a u s e VSC l e v e l s w i l l c y c l e d u r i n g a 24 h o u r p e r i o d and may be r e d u c e d f o r b r i e f t i m e s d u r i n g t h e d a y . The e f f e c t o f s u c h compounds, ho w e v e r , i s n o t r e d u c e d and a c t s a s a c o n s t a n t s t i m u l u s f o r p e r i o d o n t a l b r e a k d o w n . 94 The l a c k o f r e v e r s i b i l i t y i s a l s o c o n s i s t e n t w i t h t h e c h e m i c a l s t r u c t u r e o f m e t h y l m e r c a p t a n ( C H 3 S H ) . A l t h o u g h t h e i n t e r a c t i o n o f t h i s m o l e c u l e w i t h o t h e r o r g a n i c m o l e c u l e s i s v i a t h e f r e e t h i o l g r o u p , t h e p r e s e n c e o f t h e m e t h y l g r o u p e f f e c t i v e l y e n s u r e s t h a t a n y r e a c t i v e s i t e s a r e b l o c k e d f o l l o w i n g o x i d a t i o n . Hence, m e r c a p t a n i s c a p a b l e o f n o t o n l y o x i d i z i n g f r e e t h i o l s b u t a l s o m e t h y l a t i n g a c t i v e s i t e s o f e n z y m e s w h i c h m i g h t b e a s s o c i a t e d w i t h t h i o l g r o u p s . A l t e r n a t i v e l y , i t c o u l d a l t e r enzyme a c t i v i t y b y p e r m a n e n t l y d i s t o r t i n g t e r t i a r y s t r u c t u r e o f d i s u l p h i d e - c o n t a i n i n g p r o t e i n s . The m a j o r p u r p o s e o f t h i s t h e s i s i s t o i n v e s t i g a t e t h e i n t e r a c t i o n o f VSC w i t h f i b r o b l a s t t i s s u e c u l t u r e s and t o d e t e r m i n e i f t h e s e compounds c o u l d be a s s o c i a t e d w i t h t h e p a t h o g e n e s i s o f p e r i o d o n t a l d i s e a s e . A l t h o u g h any m o d e l h a s i n h e r e n t s h o r t c o m i n g s , a n a l y s i s o f f i b r o b l a s t m e t a b o l i s m i n c u l t u r e h a s become a f u n d a m e n t a l method o f e x a m i n i n g a l t e r a t i o n s i n c o n n e c t i v e t i s s u e . O b s e r v a t i o n s made i n v i t r o a r e , h o w e v e r , o n l y m e a n i n g f u l i f t h e y c a n be c o r r e l a t e d w i t h s t u d i e s i n v i v o a n d m u s t r e f l e c t c h a n g e s w h i c h a r e c h a r a c t e r i s t i c o f t h e c l i n i c a l s i t u a t i o n . P e r i o d o n t a l d i s e a s e i s a s s o c i a t e d w i t h a r a p i d i n i t i a l l o s s o f a p p r o x i m a t e l y 70% o f t h e g i n g i v a l c o l l a g e n ( 4 3 ) . Whether 95 t h i s l o s s i s c o n c e r n e d p r i m a r i l y w i t h s y n t h e s i s o r d e g r a d a t i o n o f c o l l a g e n i s u n c l e a r a l t h o u g h b o t h mechanisms l i k e l y p l a y m a j o r r o l e s . The p r o c e s s i s a l s o c h a r a c t e r i z e d b y s y n t h e s i s o f a b n o r m a l c o l l a g e n s s u c h a s T y p e I t r i m e r w h i c h a r e m o re s u s c e p t i b l e t o e n z y m a t i c d e g r a d a t i o n ( 3 8 ) . E x p e r i m e n t s w i t h t i s s u e c u l t u r e s e x p o s e d t o b o t h h y d r o g e n s u l p h i d e and m e t h y l m e r c a p t a n e x h i b i t a n e t r e d u c t i o n i n t o t a l l a b e l l e d p r o t e i n and c o l l a g e n . T h i s r e d u c t i o n i s a p p a r e n t w i t h i n 24 h o u r s f o l l o w i n g e x p o s u r e o f c u l t u r e s t o VSC and p e r s i s t s f o l l o w i n g r e m o v a l o f t h e e t i o l o g i c a g e n t . I n a d d i t i o n , b o t h s l a b g e l e l e c t r o p h o r e s i s and DEAE c e l l u l o s e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y i n d i c a t e t h a t t h e r e i s a d r a m a t i c i n c r e a s e o f t y p e I p r o c o l l a g e n s i n c u l t u r e . S u c h c o l l a g e n s w o u l d be i n c a p a b l e o f f o r m i n g s t a b l e c r o s s l i n k a g e s and w o u l d be h i g h l y s u s c e p t i b l e t o e n z y m a t i c d e g r a d a t i o n . The e f f e c t s s e e n w i t h t i s s u e c u l t u r e s y s t e m s , t h e r e f o r e , p a r a l l e l o b s e r v a t i o n s o f t h e i n v i v o s i t u a t i o n b o t h f r o m t h e a s p e c t o f i n i t i a l l o s s o f c o n n e c t i v e t i s s u e and t h e f o r m a t i o n o f a b n o r m a l c o l l a g e n s . I n a d d i t i o n , a n a l y s i s o f p e r i o d o n t a l l y d i s e a s e d t i s s u e s h a s i n d i c a t e d t h a t t h e r e i s a n e t l o s s o f t y p e I I I c o l l a g e n ( 3 8 ) . R e l a t i v e p r o p o r t i o n o f t h i s c o l l a g e n d e c r e a s e s f r o m 30% t o 3% o f c o l l a g e n s p r e s e n t . F i b r o b l a s t c u l t u r e s e x p o s e d t o m e t h y l m e r c a p t a n e x h i b i t a d e c r e a s e b o t h i n t y p e I I I p r o c o l l a g e n s , as 96 s e e n on D E A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y , and t y p e I I I a 1 c h a i n s , as s e e n b y SDS/PASGE. T h i s d e c r e a s e i s a g a i n a p p a r e n t w i t h i n 24 h o u r s o f i n c u b a t i o n . I n a d d i t i o n , SDS/PASGE i n d i c a t e s t h a t t h e d e c r e a s e i n t y p e I I I <* 1 c h a i n s p e r s i s t s f o l l o w i n g r e m o v a l o f m e r c a p t a n and now becomes a c h a r a c t e r i s t i c o f c o l l a g e n s y n t h e s i s i n t h e s e t i s s u e c u l t u r e s . Such o b s e r v a t i o n s a r e f u r t h e r s t r e n g t h e n e d b y t h e f a c t t h a t c o n c e n t r a t i o n s o f VSC emp l o y e d i n t h e s e s t u d i e s a r e w i t h i n t h e r a n g e w h i c h c a n be p r o d u c e d i n p e r i o d o n t a l p o c k e t s . The d a t a i n d i c a t e s t h a t t h e s e compounds c a n m i m i c a number o f e f f e c t s a s s o c i a t e d w i t h p e r i o d o n t a l d i s e a s e and t h a t t h e y may p r o v e t o be an i m p o r t a n t e t i o l o g i c f a c t o r i n i t s p a t h o g e n e s i s . 97 REFERENCES 1 Abe, S., S t e i n m a n n , B.U., W a h l , L.M., a n d M a r t i n , G.R. 1979. H i g h c e l l d e n s i t y a l t e r s t h e r a t i o o f t y p e I I I t o I c o l l a g e n s y n t h e s i s b y f i b r o b l a s t s . N a t u r e 2 7 9 , 4 4 2 . 2 B e r g , M. and F o s d i c k , L . S . 1 9 4 6 . S t u d i e s i n p e r i o d o n t a l d i s e a s e I I . P u t r e f a c t i v e o r g a n i s m s i n t h e m o u t h . J . D e n t R e s . 25, 7 3 . 3 B i e n k o w s k i , R.S., Baum, B . J . , a n d C r y s t a l , R.G. 1 9 7 8 . F i b r o b l a s t s d e g r a d e n e w l y s y n t h e s i z e d c o l l a g e n w i t h i n t h e c e l l b e f o r e s e c r e t i o n . N a t u r e 276, 4 1 3 . 4 B i e n k o w s k i , R.S., Cowan, M.J., M c D o n a l d , J . A . , a n d C r y s t a l , R.G. 1978. D e g r a d a t i o n o f n e w l y s y n t h e s i z e d c o l l a g e n . J . B i o l . Chem. 253, 4 3 5 6 . 5 B o n n e r , W.M. and L a s k e y , R.A. 1974. A f i l m d e t e c t i o n m e t hod f o r t r i t i u m - l a b e l l e d p r o t e i n s a n d n u c l e i c a c i d s i n p o l y a c r y l a m i d e g e l s . E u r . J . B i o c h e m . 4 6 , 8 3 . 6 B o o t h , B.A., P o l a k , K.L., a n d U i t t o , J . 1980. C o l l a g e n b i o s y n t h e s i s b y human s k i n f i b r o b l a s t s . 1. O p t i m i z a t i o n o f t h e c u l t u r e c o n d i t i o n s f o r s y n t h e s i s o f t y p e I and t y p e I I I p r o c o l l a g e n s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t s . 6 0 7 , 1 4 5 . 7 B r e n i n g , R.H., S u l s e r , G.F., a n d F o s d i c k , L . S . 1 9 3 9 . The d e t e r m i n a t i o n o f h a l i t o s i s b y u s e o f t h e o s m o s c o p e and t h e c r y o s c o p i c m e t h o d . J . D e n t . R e s . 18, 127. 8 B u r g e s o n , R.E., E l A d l i , F . A., K a i t i l a , I . I . , a n d H o l l i s t e r , D.W. 1 9 7 6 . F e t a l m e m b r a n e c o l l a g e n s : I d e n t i f i c a t i o n o f t w o new c o l l a g e n a l p h a c h a i n s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 7 3 , 2 5 7 9 . 9 B u t l e r , W.T., B i r k e d a l - H a n s e n , H. , B e e g l e , W.F., T a y l o r , R.E., a n d Chung, E. 1 9 7 5 . P r o t e i n s o f t h e p e r i o d o n t i u m . I d e n t i f i c a t i o n o f c o l l a g e n s w i t h t h e [ a 1 ( I ) ] 2 a 2 a n d [ a l ( H I ) ] 3 s t r u c t u r e s i n b o v i n e p e r i o d o n t a l l i g a m e n t . J . B i o l . Chem. 250, 8 9 0 7 . 10 C r o u c h , E. and B o r n s t e i n , P., 1 9 7 8 . C o l l a g e n s y n t h e s i s b y human a m n i o t i c f l u i d c e l l s i n c u l t u r e : c h a r a c t e r i z a t i o n o f a p r o c o l l a g e n w i t h t h r e e i d e n t i c a l p r o o. l ( I ) c h a i n s . B i o c h e m i s t r y 17, 5 4 9 9 . 98 11 C r o u c h , E . , and B o r n s t e i n , P. 1979. C h a r a c t e r i z a t i o n o f a t y p e IV p r o c o l l a g e n s y n t h e s i z e d b y human a m n i o t i c f l u i d c e l l s i n c u l t u r e . J . B i o l . Chem. 254, 4197. 12 C r o u c h , E . J . , Sage, H. , and B o r n s t e i n , P. 1980. S t r u c t u r a l b a s i s f o r a p p a r e n t h e t e r o g e n e i t y o f c o l l a g e n s i n human b a s e m e n t m e m b r a n e s : T y p e I V p r o c o l l a g e n c o n t a i n s two d i s t i n c t c h a i n s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 77, 745. 13 Peshmukh, K., and N i m n i , M. 1968. S o l u b l e c o l l a g e n w i t h h i g h a l d e h y d e c o n t e n t e x t r a c t e d f r o m i n s o l u b l e c o l l a g e n w i t h m e r c a p t o e t h y l a m i n e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 154, 258. 14 Gay, S, M a r t i n , G.R., M u l l e r , P.K., T i m p l , R., and Kuhn, K. 1976. S i m u l t a n e o u s s y n t h e s i s o f t y p e I and t y p e I I I c o l l a g e n b y f i b r o b l a s t s i n c u l t u r e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 73, 4037. 15 G i b b o n s , J.R., and M a c D o n a l d , J . B . 1960. Hemin and v i t a m i n K compounds as r e q u i r e d f a c t o r s f o r c u l t i v a t i o n o f c e r t a i n s t r a i n s o f b a c t e r i o d e s m e l a n i n o g e n i c u s . J . B a c t e r i o l . 83, 167. 16 G i s s l o w , M.T., and M c B r i d e , B.C. 1975. A r a p i d s e n s i t i v e c o l l a g e n a s e a s s a y . A n a l y t . B i o c h e m . 68, 70. 17 H a r d i n g h a m T., 1 9 8 1 . P r o t e o g l y c a n s : t h e i r s t r u c t u r e , i n t e r a c t i o n s a n d m o l e c u l a r o r g a n i z a t i o n i n c a r t i l a g e . B i o c h e m . S o c . T r a n s . 9, 489. 18 H a s c a l l , V.C., and S a j d e r a , S.W. 1969. P r o t e i n p o l y -s a c c h a r i d e c o m p l e x f r o m b o v i n e n a s a l c a r t i l a g e . T h e f u n c t i o n o f g l y c o p r o t e i n i n t h e f o r m a t i o n o f a g g r e g a t e s . J . B i o l . Chem. 224, 2384. 19 Herrmann, H. , D e s s a u , W., F e s s l e r , L . I . , and v o n d e r Mark, K. , 1980. S y n t h e s i s o f t y p e s I , I I I , and AB~ c o l l a g e n b y c h i c k t e n d o n f i b r o b l a s t s i n v i t r o . E u r . J . B i o c h e m . 105, 63. 20 Huey, J . , N a r a y a n a n , A.S., J o n e s , K., and Page, R.C. 1980. E f f e c t o f e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r on t h e s y n t h e t i c a c t i v i t y o f human f i b r o b l a s t s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 632, 227. 21 I i , I . and S a k a t , H. 1974. G l u t a t h i o n e r e d u c t a s e i n t h e s e a u r c h i n egg I I . C l e a v a g e - a s s o c i a t i n g f l u c t u a t i o n o f t h e a c t i v i t y and i t s p o s s i b l e r e g u l a t o r y mechanism. B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 350, 151. 99 22 J o h n s o n , P.W., and T o n z e t i c h , J . 1979. S o l u b i l i z a t i o n o f a c i d - s o l u b l e c o l l a g e n b y H_S. J . Dent. Res. ( S p e c i a l I s s u e A) 58, 283. 23 Ko, S.D., Page, R . C , and N a r a y a n a n , A.S. 1977. F i b r o b l a s t h e t e r o g e n e i t y a n d p r o s t a g l a n d i n r e g u l a t i o n o f s u b p o p u l a t i o n s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 74, 3429. 24 Kohn, L.D., I s e r s k y , C , Z u p n i k , G., L e n a e r s , A., L e e , G., and L a p i e r e , C M . 1974. C a l f t e n d o n p r o c o l l a g e n p e p t i d a s e : i t s p u r i f i c a t i o n and e n d o p e p t i d a s e mode o f a c t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 71, 40. 25 L a e m m l i , U.K. 1970. C l e a v a g e o f s t r u c t u r a l p r o t e i n s d u r i n g t h e a s s e m b l y o f t h e h e a d o f t h e b a c t e r i o p h a g e T4. N a t u r e 227, 680. 26 Law, D.B., B e r g , M.S., and F o s d i c k , L . S . 1943. C h e m i c a l s t u d i e s i n p e r i o d o n t a l d i s e a s e . J . D e n t . Re s . 22, 373. 27 L i c h t e n s t e i n , J.R., B y e r s , P.H., S m i t h , B.D., and M a r t i n , G.R. 1975. I d e n t i f i c a t i o n o f t h e c o l l a g e n o u s p r o t e i n s s y n t h e s i z e d b y c u l t u r e d c e l l s from human s k i n . B i o c h e m i s t r y 14, 1589. 28 L i m e b a c k , H.F., and Sodek, J . 1979. P r o c o l l a g e n s y n t h e s i s and p r o c e s s i n g i n p e r i o d o n t a l l i g a m e n t i n v i v o and xn v i t r o . A c o m p a r a t i v e s t u d y u s i n g s l a b - g e l f l u o r o g r a p h y . E u r . J . B i o c h e m . lOO, 541. 29 L i m e b a c k , H.F., Sodek, J . , and B r u n e t t e , D.M. 1978. N a t u r e o f c o l l a g e n s s y n t h e s i z e d b y monkey p e r i o d o n t a l - l i g a m e n t f i b r o b l a s t s i n v i t r o . B i o c h e m . J . 170, 63. 30 L i n d h e , J . , Hamp, S-E., and L o e , H. 197 3. E x p e r i m e n t a l p e r i o d o n t i t i s i n t h e b e a g l e d o g . J . P e r i o d o n t . R e s . 8,1. 31 L o e , H., T h e i l a d e , E . , and J e n s e n , S.B. 1965. E x p e r i m e n t a l g i n g i v i t i s i n man. J . P e r i o d o n t . 36, 177. 32 M a s s l e r , M., E m s l i e , R.D., and B o l d e n , T . E . 1951. F e t o r ex o r e . O r a l S u r g . 4, 110. 33 Mayne, R.L., V a i l , M.S., and M i l l e r , E . J . 1975. A n a l y s i s o f c h a n g e s i n c o l l a g e n b i o s y n t h e s i s t h a t o c c u r when c h i c k c h o n d r o c y t e s a r e grown i n 5 - b r o m o - 2 - d e o x y u r i d i n e . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 72, 4511. 100 34 M c C u l l a g h , K.A., a n d B a l i a n , G. 1 9 7 5 . C o l l a g e n c h a r a c t e r i z a t i o n a n d c e l l t r a n s f o r m a t i o n i n h uman a t h e r o s c l e r o s i s . N a t u r e 2 5 8 , 73. 35 McNamara, T.F., A l e x a n d e r , J . F . , and L e e , M. 1 9 7 2 . The r o l e o f m i c r o o r g a n i s m s i n t h e p r o d u c t i o n o f o r a l m a l o d o u r . O r a l S u r g . 34, 4 1 . 36 M i l l e r , E . J . 1 9 7 6 . B i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d b i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e o f t h e g e n e t i c a l l y - d i s t i n c t c o l l a g e n s . M o l . and C e l l B i o c h e m . 13, 1 6 5 . 37 M o r r i s , N.P., F e s s l e r , L . I . , W e i n s t o c k , A., a n d F e ' s s l e r , J.H. 1 9 7 5 . P r o c o l l a g e n a s s e m b l y and s e c r e t i o n i n e m b r y o n i c c h i c k b o n e . J . B i o l . Chem. 25 0 , 5 7 1 9 . 38 N a r a y a n a n , A . S . a n d P a g e , R.C. 1 9 7 6 . B i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f c o l l a g e n s y n t h e s i z e d b y f i b r o b l a s t s d e r i v e d f r o m n o r m a l and d i s e a s e d human g i n g i v a . J . B i o l . Chem. 2 5 1 , 5 4 6 4 . 39 N a r a y a n a n , A.S. and P a g e , R.C. 19 7 7 . Serum m o d u l a t e s c o l l a g e n t y p e s i n human g i n g i v a l f i b r o b l a s t s . FEBS L e t t 8 0 , 2 2 1 . 40 N a r a y a n a n , A.S., P a g e , R . C , and M y e r s , D.F. 1 9 8 0 . A and B a r e s e c o n d m a j o r c o l l a g e n s i n d i s e a s e d g i n g i v a . W e s t e r n C o n n e c t i v e T i s s u e S o c i e t y M e e t i n g , C o r o n a d o CA, a b s t r a c t #6. 41 Ng , W., a n d T o n z e t i c h , J . 1 9 8 3 . E f f e c t o f H 2 S o n p e r m e a b i l i t y o f o r a l m u c o s a . J . D e n t . R e s . 6 2 , 2 7 5 . 42 N i s t , C , v o n d e r M a r k , K., Hay, E.D., O l s e n , B.R., B o r n s t e i n , P., R o s s , R., a n d Dehm, P. 1 9 7 5 . L o c a t i o n o f p r o c o l l a g e n i n c h i c k c o r n e a l and t e n d o n f i b r o b l a s t s w i t h f e r r a t i n - c o n j u g a t e d a n t i b o d i e s . J . C e l l . B i o l . 6 5 , 7 5 . 43 P a g e , R.C. and S c h r o e d e r , H.E. 1976. P a t h o g e n e s i s o f i n f l a m m a t o r y p e r i o d o n t a l d i s e a s e . A summary o f c u r r e n t w o r k . L a b . I n v e s t . 34, 2 3 5 . 44 P e t e r k o f s k y , B., a n d D i e g e l m a n n , R. 1 9 7 1 . Use o f a m i x t u r e o f p r o t e i n a s e - f r e e c o l l a g e n a s e s f o r t h e s p e c i f i c a s s a y o f r a d i o a c t i v e c o l l a g e n i n t h e p r e s e n c e o f o t h e r p r o t e i n s . B i o c h e m i s t r y 10, 9 8 8 . 45 P i l l o n , D . J . , L e i b a c h , F.H., v o n T e r s c h , F., and M e n d i c i n o , J . 1 9 7 6 . I n h i b i t i o n o f p r o t e i n k i n a s e a c t i v i t y a n d a m i n o a c i d a n d a - m e t h y l - D - g l u c o s i d e t r a n s p o r t b y d i a m i d e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a . 4 1 9 , 104. 101 46 P i n n e l l , S.R. 1982. R e g u l a t i o n o f c o l l a g e n s y n t h e s i s . J . I n v e s t . D e r m a t o l . 79, 73S. 47 P o p e , F.M., M a r t i n , G.R., a n d L i c h t e n s t e i n , J . R . 1975 P a t i e n t s w i t h F h l e r s - D a n l o s syndrome t y p e IV l a c k t y p e I I I c o l l a g e n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 72, 1314. 48- P r o c k o p , D . J . , K i v i r i k k o , K . I . , Tuderman, L, and Guzman, N.A. 1979. The b i o s y n t h e s i s o f c o l l a g e n and i t s d i s o r d e r s . N. E n g l . J . Med. 301, 77. 49 Rebhun, L . I . , M i l l e r , M., S c h n a i t m a n , T.C., N a t h , J . , and M e l l o n , M. 1976. C y c l i c n u c l e o t i d e s , t h i o s u l p h i d e s t a t u s o f p r o t e i n s and c e l l u l a r c o n t r o l p r o c e s s e s . J . Sup. S t r u c t . 5, 199 ( 1 5 1 ) . 50 Reed, P.W. 1969. G l u t a t h i o n e and t h e h e x o s e m o n o p h o s p h a t e s h u n t i n p h a g o c y t i z i n g and h y d r o g e n p e r o x i d e - t r e a t e d r a t l e u k o c y t e s . J . B i o l . Chem. 244, 2459. 51 R h o d e s , R.K. a n d M i l l e r , E . J . 1 9 7 8 . P h y s i o c h e m i c a l c h a r a c t e r i z a t i o n and m o l e c u l a r o r g a n i z a t i o n o f c o l l a g e n A and B c h a i n s . B i o c h e m i s t r y 17, 3442. 52 R i c h t e r , V . J . , and T o n z e t i c h , J . 1964. The a p p l i c a t i o n o f i n s t r u m e n t a l t e c h n i q u e f o r t h e e v a l u a t i o n o f o d o r i f e r o u s v o l a t i l e s f r o m s a l i v a and b r e a t h . A r c h . O r a l B i o l . 9, 47. 53 R i z z o , A.A. 1967. The p o s s i b l e r o l e o f h y d r o g e n s u l p h i d e i n human p e r i o d o n t a l d i s e a s e . 1. H y d r o g e n s u l p h i d e p r o d u c t i o n i n p e r i o d o n t a l p o c k e t s . P e r i o d o n t i c s 5, 233. 54 Sage, H. 1982. C o l l a g e n s o f basement membranes. J . I n v e s t . D e r m a t o l . 79, 51S. 55 Sage, H. , and B o r n s t e i n , P. 1979. C h a r a c t e r i z a t i o n o f a n o v e l c o l l a g e n c h a i n i n human p l a c e n t a and i t s r e l a t i o n t o AB c o l l a g e n . B i o c h e m i s t r y 18, 3815. 56 S c h r o e d e r , H.E., M u n z e l - P e d r a z z o l i , S., and Page, R.C. 1973. C o r r e l a t e d m o r p h o m e t r i c and b i o c h e m i c a l a n a l y s i s o f g i n g i v a l t i s s u e s i n e a r l y c h r o n i c g i n g i v i t i s i n man. A r c h . O r a l B i o l . 18, 899. 57 S c h w a r z , R . I . , and B i s s e l , M.J. 1977. Dependence o f t h e d i f f e r e n t i a t e d s t a t e on t h e c e l l u l a r e n v i r o n m e n t : M o d u l a t i o n o f c o l l a g e n s y n t h e s i s i n t e n d o n c e l l s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . USA 74, 4453. 102 58 S o c r a n s k y , S.S., and G i b b o n s , R . J . 1965. R e q u i r e d r o l e o f b a c t e r i o d e s m e l a n i n o g e n i c u s i n mixed a n a e r o b i c i n f e c t i o n s . I n f e c t . D i s . 115, 247. 59 Sodek, J . 1977. A c o m p a r i s o n o f t h e r a t e s o f s y n t h e s i s and t u r n o v e r o f c o l l a g e n and n o n - c o l l a g e n p r o t e i n s i n a d u l t r a t p e r i o d o n t a l t i s s u e s and s k i n u s i n g a m i c r o - a s s a y . A r c h . O r a l B i o l . 22, 655. 60 S u l s e r , G.F., B r e n i n g , K.H., and F o s d i c k , L . S. 1939. Some c o n d i t i o n s t h a t a f f e c t t h e o d o r c o n c e n t r a t i o n o f t h e b r e a t h . J . De n t . Res. 18, 355. 61 S y k e s , B., P u d d l e , B., F r a n c i s , M., and S m i t h , R. 1976. The e s t i m a t i o n o f two c o l l a g e n s f r o m human d e r m i s b y i n t e r r u p t e d g e l e l e c t r o p h o r e s i s . B i o c h e m . B i o p h y s . R es. Comm. 72, 1472. 62 T o n z e t i c h , J . 1971. D i r e c t g a s c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s i s o f s u l p h u r compounds i n mouth a i r i n man. 1971. A r c h . O r a l B i o l . 16, 587. 3 5 63 T o n z e t i c h , J , 1972. D e t e r m i n a t i o n o f S - l a b e l l e d compounds o f a queous i o n i c s o l u t i o n s b y l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g . A n a l y t . B i o c h e m . 47, 584. 64 T o n z e t i c h , J . 1978. O r a l M a l o d o r : an i n d i c a t o r o f h e a l t h s t a t u s and o r a l c l e a n l i n e s s . I n t . Dent. J . 28, 309. 65 T o n z e t i c h , J . and C a r p e n t e r , P.A.W. 1971. P r o d u c t i o n o f v o l a t i l e s u l p h u r c o m p o u n d s f r o m c y s t e i n e , c y s t i n e a n d m e t h i o n i n e b y human d e n t a l p l a q u e . A r c h . O r a l B i o l . 16, 599. 66 T o n z e t i c h , J . and J o h n s o n , P.W. 1977. C h e m i c a l a n a l y s i s o f t h i o l , d i s u l p h i d e , a n d t o t a l s u l p h u r c o n t e n t o f human s a l i v a . A r c h . O r a l B i o l . 22, 125. 67 T o n z e t i c h , J . and J o h n s o n , P.W. 1980. E f f e c t o f v a r i o u s a g e n t s on s t a b i l i t y o f H „ S c o l l a g e n c o m p l e x . J . D e n t . R e s . ( S p e c i a l I s s u e A) 59, 353. 68 T o n z e t i c h , J . , J o h n s o n , P.W., and Ng, S.K. 1979. Pathways o f c y s t i n e m e t a b o l i s m i n human s a l i v a . A r c h . O r a l B i o l . 24, 35. 69 T o n z e t i c h , J . and Kestenbaum, R.C. 1969. by human s a l i v a r y f r a c t i o n s and p l a q u e . 14, 815. Odour p r o d u c t i o n A r c h . O r a l B i o l . 103 70 T o n z e t i c h , J . and L o , K.K.C. 1978. R e a c t i o n o f h y d r o g e n s u l p h i d e w i t h p r o t e i n s - a s s o c i a t e d w i t h t h e human mouth. A r c h . O r a l B i o l . 23, 875. 71 T o n z e t i c h , J . and M c B r i d e , B.C. 1981. C h a r a c t e r i z a t i o n o f v o l a t i l e s u l p h u r p r o d u c t i o n b y p a t h o g e n i c and n o n - p a t h o g e n i c s t r a i n s o f o r a l b a c t e r i o d e s . A r c h . O r a l B i o l . 26, 963. 72 T o n z e t i c h , J . , N a r a y a n a n , A . S . , a n d P a g e , R.C. 1 9 8 2 . S u p p r e s s i o n o f DNA s y n t h e s i s o f human f i b r o b l a s t by I ^ S . J . De n t . R e s . 61, 260. 73 T o n z e t i c h , J . a n d R i c h t e r , V . J . 1 9 6 4 . v o l a t i l e o d o r i f e r o u s components o f s a l i v a . 9, 39. 74 T o n z e t i c h , J . and Spouge, J.D. 1979. E f f e c t o f p e r i o d o n t a l t h e r a p y on v o l a t i l e s u l p h u r c o n t e n t o f mouth a i r . J . Dent. Res . ( S p e c i a l I s s u e A) 58, 175. 75 T r e l s t a d , R.L., Kang, A.H., I g a r a s h i , S. a n d G r o s s , J . 1970. I s o l a t i o n o f two d i s t i n c t c o l l a g e n s f r o m c h i c k c a r t i l a g e . B i o c h e m i s t r y 9, 4993. 76 Trump, B.F., Kauno, A.L., M e r g n e r , W.J., and A r s t i l a , A.U. 1974. S t u d i e s on t h e s u b c e l l u l a r p a t h o p h y s i o l o g y o f a c u t e l e t h a l c e l l i n j u r y . B e i t r . P a t h . Bd. 152, 243. 77 U i t t o , J . a n d L i c h t e n s t e i n , J.R. 1976. D e f e c t s i n t h e b i o c h e m i s t r y o f c o l l a g e n s i n d i s e a s e s o f c o n n e c t i v e t i s s u e . J . I n v e s t . D e r m a t o l . 66, 59. 78 U i t t o , J . , L i c h t e n s t e i n , J . R . a n d B a u e r , E.A. 1 9 7 6 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o c o l l a g e n s y n t h e s i z e d b y m a t r i x - f r e e c e l l s i s o l a t e d f r o m c h i c k embryo t e n d o n s . B i o c h e m i s t r y 15, 4935. 79 V i l l e e , D.B. and Powers, M.L. 1977. E f f e c t o f g l u c o s e and i n s u l i n on c o l l a g e n s e c r e t i o n b y human s k i n f i b r o b l a s t s i n v i t r o . N a t u r e 268, 156. 80 von d e r Mark, K., Gauss, V., 1 v o n d e r Mark, H., and M u l l e r , P. 1977. R e l a t i o n s h i p b e t w e e n c e l l s h a p e and t y p e o f c o l l a g e n s y n t h e s i z e d as c h o n d r o c y t e s l o s e t h e i r c a r t i l a g e p h e n o t y p e i n c u l t u r e . N a t u r e 267, 531. E v a l u a t i o n o f A r c h . O r a l B i o l . 104 List of Publications Papers 1. Johnson, P.W. and Smith, The reaction of 2, 4-dinitrofluorobenzine with nucleotides. Chem. Comm. 379, 1971. 2. Johnson, P.W., von Tigerstrom, R. and Smith, M. Reaction of a nucleoside 2, 4-dinitrophenyl phosphate with fluoride; a convenient method for the preparation of the nucleoside phosphorfluoridate. Nucleic Acids Research, Vol. II, 10:1745, 1975. 3. Tonzetich, J . and Johnson, P.W. Chemical analysis of thiol , disulphide and total sulphur content of human saliva. Archs. Oral Biol. 22:125, 1977. 4. Tonzetich, J . , Johnson, P.W. and Ng, S.K. Pathways of cystine metabolism in human saliva. Archs. Oral Biol. 24:35, 1979. 5. Johnson, P.W., Tonzetich, J . and Pearce, R.H. Characterization of hydrogen sulphide reaction with rat tail tendon type I collagen i_n vitro. Prepared for publication. 6. Tonzetich, J . and Johnson, P.W. Stability of h^S-Collagen Complex in Chromatographic Solvent Systems. Prepared for publication. Abstracts 1. Tonzetich, J . and Johnson, P.W. Determination of sulphydral, disulphide and total sulphur content of saliva. J „ Dent. Res. 51:282. 1972. 2. Tonzetich, J . and Johnson, P.W. Uptake of sulphur compounds by salivary proteins. J . Dent. Res. 52:92, 1973. 3. Tonzetich, J . , Johnson, P.W. and Ng, S.K. Non-volatile products of cystine metabolism in saliva. J . Dent. Res. (Special Issue B) 56:B222, 1977. 4. Johnson, P.W., Tonzetich, J . and Pearce, R.H. Solubilization of acid-soluble collagen by H2$- J- Dent. Res. (Special Issue A) 58:283, 1979. 5. Tonzetich, J . , Johnson, P.W., and Pearce, R.H. Effect of various agents on stability of H2S-collagen complex. J . Dent. Res. (Special Issue A) 59:353, 1980. 6. Johnson, P.W. and Tonzetich, J . Uptake of (3 5S)-labelled volatile sulphur compounds by collagen. J . Dent. Res. (Special Issue A) 60:336. 1981. .7. Tonzetich, J . , Johnson, P.W, and Mg, W. Chromatographic evidence for H2S reaction with type I collagen. J . Dent. Res, (Special Issue A) 60:336, 1981. 8. Johnson, P.W. and Tonzetich, J . Effect of H^ S on protein synthesis by gingival fibroblasts. J . Dent. Res. 61:736, 1982.' 9. Tonzetich, J . and Johnson, P.W. "Interference of Protein Synthesis by Methyl Mercaptan". J . Dent. Res. 62:275, 1983 (Abstract #956). 1 0 . Johnson, P.W. and Tonzetich, 0 . "Protein Synthesis by Human Gingival Fibroblasts in Presence of Thiol Compounds". J . Dent. Res. 62:275, 1983 (Abstract #955). 1 1 . Johnson, P.W. and Tonzetich, J . "Cl-^Srl-induced Inhibition of Total and Collagensse-Digestible Protein Synthesis by Fibroblasts". Submitted for publication in J . Dent. Res., 1984. 12. Tonzetich, J . and Johnson, P.W. "Irreversibility of Ch^SH-Induced Inhibition of Protein Synthesis by Fibroblast cultures". Submitted for publication in J . Dent. Res., 1984. 

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