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Enzyme design for the steady-state of metabolism Ballantyne, James Stuart 1981

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E N Z Y M E D E S I G N F O B T H E S T E A D Y - S T A T S O f H E T A B O L I S H B Y J A M E S S X O A B T E A L L A 8 T X N E B . S c U n i v e r s i t y o f G u e l p h , G u e l j h , C a n a d a , 1 9 7 3 M . S c . U n i v e r s i t y o f G u e l p h , G u e l p h , C a n a d a , 1 9 7 6 A T H E S I S S U B M I S T I D I N P A B T I A I F O I f I L 1 H E 8 T C P T H E B E Q U I B E H E N T S P C I T B I B E G B 1 E O F C G C T O B O F P H I L O S O P H Y I D T H E F A C U L T Y C P G B A D O A I E S T U D I E S ( D e p a r t m e n t o f Z o o l o g y ) We a c c e p t t h e t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a J a n u a r y 1981 (c) James S t u a r t B a l l a n t y n e 1981 I n p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r a n a d v a n c e d d e g r e e a t t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , I a g r e e t h a t t h e L i b r a r y s h a l l m a k e i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e a n d s t u d y . I f u r t h e r a g r e e t h a t p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e c o p y i n g o f t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y p u r p o s e s m a y b e g r a n t e d b y t h e h e a d o f m y d e p a r t m e n t o r b y h i s o r h e r r e p r e s e n t a t i v e s . I t i s u n d e r s t o o d t h a t c o p y i n g o r p u b l i c a t i o n o f t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l n o t b e a l l o w e d w i t h o u t m y w r i t t e n p e r m i s s i o n . D e p a r t m e n t o f T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a 2 0 7 5 W e s b r o o k P l a c e V a n c o u v e r , C a n a d a V 6 T 1W5 D a t e D E - 6 ( 2 / 7 9 ) i i T h e s t e a d y - s t a t e o f m e t a b o l i s m h a s b e e n i n v e s t i g a t e d - T h e e q u i l i b r i u m t h e r m o d y n a m i c p r o p e r t i e s o f m e t a b o l i c e n z y m e s h a v e b e e n r e l a t e d t o t h e i r r o l e i n t h e s t e a d y - s t a t e o f m e t a b o l i s m . S i m p l i f i e d f r e e e n e r g y p r o f i l e s t h a t i n c l u d e t h e r e v e r s e r e a c t i o n h a v e b e e n c o n s t r u c t e d f o r t h e e n z y m e f u m a r a s e u n d e r a v a r i e t y o f c o n d i t i o n s u s i n g t h e t h e r m o d y n a m i c i n t e r p r e t a t i o n o f t h e H a l d a n e r e l a t i o n s h i p . T h e d i f f e r e n c e i n t h e G i b b s f r e e e n e r g y c h a n g e o f a c t i v a t i o n f o r w a r d c o m p a r e d t o t h a t o f t h e r e v e r s e d i r e c t i o n l&Qfg) h a s b e e n f o u n d n o t t o e q u a l t h e G i b b s f r e e e n e r g y c h a n g e r e a c t a n t s t o p r o d u c t s . T h e b i n d i n g o f s u b s t r a t e m a y b e p e r t u r b e d i n d e p e n d e n t l y o f t h e c a t a l y t i c e v e n t . I t i s s u g g e s t e d t h a t t h i s i s i m p o r t a n t i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f _ _ G £ . _ f G £ _ a y b e p e r t u r b e d t o a c o n s i d e r a b l e e x t e n t i n f u m a r a s e -T h e i m p o r t a n c e o f ^ G p , i s s u g g e s t e d t o l i e i n t h e s t e a d y - s t a t e o f m e t a b o l i s m . M a n y s t e a d y - s t a t e s , g i v i n g d i f f e r e n t a f f i n i t i e s a r e t h e o r e t i c a l l y p o s s i b l e . B i o l o g i c a l s y s t e m s h a v e s e l e c t e d a c o n t i n u o u s s t e a d y - s t a t e w h e r e ^ G g i s n u m e r i c a l l y e q u a l t o a f f i n i t y o v e r a r a n g e o f v e l o c i t i e s . I n o r d e r t o a c h i e v e t h i s s t e a d y - s t a t e t w o i m p o r t a n t c o n d i t i o n s m u s t b e i m p o s e d o n t h e d e s i g n o f t h e t w o e n z y m e s s h a r i n g a g i v e n s u b s t r a t e . T h e f i r s t i s t h a t t h e Km f o r t h e s h a r e d s u b s t r a t e m u s t b e t h e s a m e i n b o t h e n z y m e s . T h e s e c o n d i s t h a t e n z y m e c o n c e n t r a t i o n m u s t b e a d j u s t e d . When t h e s e t w o c o n s t r a i n t s a r e i m p o s e d o n t h e d e s i g n o f t h e e n z y m e s t h e m a g n i t u d e o f t h e s t e a d y - s t a t e a f f i n i t y e q u a l s t h e s i z e o f ^ G ^ . i i i TABLE OF CONTENTS ABSTRACT i i L I S T OF TABLES v L I S T OF FIGURES v i ACKNOWLEDGEMENTS vli CHAPTER 1. GENERAL INTRODUCTION 1 CHAPTER 2. EQUILIBRIUM THERMODYNAMICS OF ENZYMES 6 CHAPTER 3. THE RELATIONSHIP BETWEEN BINDING AND CATALYSIS INTRODUCTION 11 MATERIALS AND METHODS 12 Enzyme a s s a y s 12 K i n e t i c a n d t h e r m o d y n a m i c c a l c u l a t i o n s 12 RESULTS AND DISCUSSION 14 P e r t u r b a t i o n o f *>G a n d £ G 14 R e l a t i o n s h i p b e t w e e n ^G and G 14 F r e e e n e r g y p r o f i l e s 15 CHAPTER 4. P e r t u r b a t i o n o f ^ G R INTRODUCTION 21 MATERIALS AND METHODS 23 RESULTS AND DISCUSSION 23 CHAPTER 5. ENZYME DESIGN AND METABOLISM INTRODUCTION 30 MATERIALS AND METHODS 30 RESULTS AND DISCUSSION 31 T h r e e d i m e n s i o n a l r e p r e s e n t a t i o n o f an enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n 31 The g e n e r a l . s t e a d y - s t a t e 32 i v The r o l e o f a f f i n i t y 33 The s t e a d y - s t a t e o f m e t a b o l i s m 35 C o n s t a n c y o f a f f i n i t y d u r i n g s t e a d y - s t a t e t r a n s i t i o n s 39 The s t a b i l i t y o f t h e s t e a d y - s t a t e o f m e t a b o l i s m 41 CONCLUSIONS 4 2 SUMMARY 4 3 REFERENCES CITED '....52 ABBREVIATIONS USED 55 APPENDIX 1 56 V L I S T OF TABLES T a b l e 2-1 H a l d a n e r e l a t i o n s h i p s a n d t h e r m o d y n a m i c i n t e r p r e t a t i o n o f s e v e r a l enzyme r e a c t i o n m e c h a n i s m s 10 T a b l e 3-1 The e f f e c t s o f p e r t u r b i n g c o n d i t i o n s on a n d ^ G f o r t h e f u m a r a s e r e a c t i o n 17 T a b l e 3-2 G i b b s f r e e e n e r g y c h a n g e s f o r t h e f u m a r a s e r e a c t i o n u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s 18 T a b l e 4-1 C o m p a r i s o n o f ^Gjj.and/G° f o r s e v e r a l enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n s 22 T a b l e 4-2 I n d e p e n d e n t m o d u l a t i o n o f b i n d i n g o f s u b s t r a t e and p r o d u c t i n t h e f u m a r a s e r e a c t i o n 26 T a b l e 4-3 I n d e p e n d e n t p e r t u r b a t i o n o f ^Qf w i t h r e s p e c t t o ^ G y f o r t h e f u m a r a s e r e a c t i o n 27 v i L I S T OF FIGURES F i g u r e 3 - l a E x a m p l e of v e l o c i t y v e r s u s s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n f o r t h e f u m a r a s e r e a c t i o n 19 3- l b E x a m p l e o f m o d i f i e d C o r n i s h - B o w d e n / E i s e n t h a l p l o t f o r Km and Vmax d e t e r m i n a t i o n 19 F i g u r e 3-2 S i m p l i f i e d f r e e e n e r g y p r o f i l e f o r t h e r e a c t i o n c a t a l y z e d by f u m a r a s e 20 F i g u r e 4 - l a E f f e c t o f t e m p e r a t u r e on I n (Vmaxf/Vmaxr) f o r f u m a r a s e u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s 28 4- l b v a n ' t H o f f p l o t o f f u m a r a s e r e a c t i o n u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s 28 F i g u r e 4-2 The r o l e o f e n t h a l p y and e n t r o p y i n p e r t u r b a t i o n s •of A G 3 . 29 F i g u r e 5-1 Enzyme r e a c t i o n s u r f a c e f o r a s i m p l e u n i - u n i m e c h anisms 45 F i g u r e 5-2 The g e n e r a l s t e a d y - s t a t e 46 F i g u r e 5-3 ^ G j ^ v e r s u s a f f i n i t y f o r enzymes and m e t a b o l i t e s f r o m s e v e r a l t i s s u e s 47 F i g u r e 5-4 The e f f e c t o f c h a n g i n g Km f o r t h e s h a r e d s u b s t r a t e on t h e s t e a d y - s t a t e 48 F i g u r e 5-5 The e f f e c t o f enzyme c o n c e n t r a t i o n on t h e a c h i e v e m e n t o f t h e c o n t i n u o u s - s t e a d y - s t a t e 49 F i g u r e 5-6 The i n t e r s e c t i o n o f E l and E2 50 F i g u r e 5-7 T h r e e d i m e n s i o n a l p l o t o f t h e s t e a d y - s t a t e t o d e m o n s t r a t e s t a b i l i t y 51 v i i ACKNOWLEDGEMENTS I s h o u l d l i k e t o t h a n k D r . P e t e r H o c h a c h k a f o r t h e f r e e d o m t o p u r s u e t h e s e i n v e s t i g a t i o n s a n d f o r c r e a t i n g t h e . e n v i r o n m e n t i n w h i c h t h e y c o u l d b e p u r s u e d . I b e n e f i t e d f r o m many s t i m u l a t i n g d i s c u s s i o n s w i t h M a r y C h a m b e r l i n , D r . C h r i s F r e n c h , D r . J o h n G o s l i n e , J o h n H a n r a h a n , D r . Tom Mommsen, E r i c S h o u b r i d g e a n d D r . R a u l S u a r e z . P r o f e s s o r s D a v e R a n d a l l , J o h n G o s l i n e a n d L i o n e l H a r r i s o n made many u s e f u l s u g g e s t i o n s c o n t r i b u t i n g t o t h e f i n a l f o r m o f t h e t h e s i s . D r . C h r i s F r e n c h h e l p e d w i t h some o f t h e a s s a y s i n C h a p t e r 3. F i n a l l y , I s h o u l d e s p e c i a l l y l i k e t o t h a n k M a r y C h a m b e r l i n , p r i m u s i n t e r p a r e s . 1 CHAPTER 1 GENERAL INTRODUCTION The s t e a d y - s t a t e o f m e t a b o l i s m i s one of t h e s i m p l e s t f o r m s i n w h i c h m e t a b o l i s m may be d i s c u s s e d . T h e r e a r e many e x a m p l e s o f s t u d i e s o f s t e a d y - s t a t e t r a n s i t i o n s ( R o b e r t s , 1 9 7 7 ) b u t few s t u d i e s o f t h e b a s i c p r o p e r t i e s o f t h e s t e a d y - s t a t e i t s e l f . I n t h e c a s e o f m e t a b o l i s m t h e s t e a d y - s t a t e i s t h a t s t a t e w h e r e i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f m e t a b o l i t e s and t h e i r r a t e s o f i n t e r c o n v e r s i o n a r e c o n s t a n t . One b a s i c q u e s t i o n s t e mming f r o m t h i s d e f i n i t i o n i s how t h i s h o m e o s t a s i s i s a c h i e v e d . How a r e enzyme c o n c e n t r a t i o n s o f two s e q u e n t i a l enzymes i n a p a t h w a y r e l a t e d ? Why a r e some enzymes, n o t a b l y t h e r e g u l a t o r y e n z y m e s , p r e s e n t i n l o w e r a c t i v i t y t h a n n o n - r e g u l a t o r y enzymes? S i m i l a r l y , i t i s n o t known what k i n e t i c p a r a m e t e r s a r e c r u c i a l t o t h e a c h i e v e m e n t o f t h e m e t a b o l i c s t e a d y - s t a t e . Mass a c t i o n e f f e c t s , c o f a c t o r a v a i l a b i l i t y a n d f e e d b a c k i n h i b i t i o n h ave been v a r i o u s l y i n v o k e d t o e x p l a i n a s p e c t s o f m e t a b o l i c r e g u l a t i o n ( A t k i n s o n , 1 9 7 7 ) . The s t e a d y - s t a t e o f m e t a b o l i s m p r e s e n t s an e x a m p l e o f t h e p r i n c i p l e o f l e a s t a c t i o n upon w h i c h much o f o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e l a w s o f p h y s i c s r e s t . As s u c h , t h e s t e a d y -s t a t e may s i m p l y be a d e s i g n f e a t u r e o f t h e n o n - r e g u l a t o r y enzymes i n a p a t h w a y . I f so i t may n o t be n e c e s s a r y t o p o s t u l a t e o t h e r e f f e c t o r s t o e x p l a i n t h e s t e a d y - s t a t e . The p u r p o s e o f t h i s t h e s i s i s t o d e s c r i b e some of t h e p r o p e r t i e s o f t h e s t e a d y - s t a t e of m e t a b o l i s m and what f e a t u r e s o f enzyme d e s i g n a r e r e q u i r e d t o p r o d u c e t h e s t e a d y - s t a t e o f m e t a b o l i s m . The n a t u r e o f t h e s t e a d y - s t a t e i t s e l f n e e d s f u r t h e r d e f i n i t i o n . I s i t s t a b l e o r 2 u n s t a b l e ? When a t r a n s i t i o n f r o m one s t e a d y - s t a t e t o a n o t h e r o c c u r s i s i t a l o n g a p r e d i c t a b l e and s t a b l e p a t h ? C h e m i c a l s y s t e m s a r e a f f e c t e d by t h e same f o r c e s w h i c h a f f e c t most p h y s i c a l s y s t e m s . Of t h e s e , t e m p e r a t u r e and p r e s s u r e a r e t h e most f r e q u e n t l y i n v e s t i g a t e d . C h e m i c a l s y s t e m s a r e a l s o s u b j e c t t o a n o t h e r f o r c e w h i c h has been c a l l e d t h e a f f i n i t y ( a f f i n i t y = A 3 = RT l n ( m a s s a c t i o n r a t i o / K e q ) . De D onder and v a n R y s s e l b e r g h e (1936) have a d e q u a t e l y shown t h a t t h i s f o r c e h a s a l l t h e a t t r i b u t e s o f a s t a t e f u n c t i o n . Most o f t h e p r e v i o u s work on enzyme t h e r m o d y n a m i c s has c o n c e n t r a t e d on t h e e f f e c t s o f t e m p e r a t u r e a n d p r e s s u r e on enzyme d e s i g n and f u n c t i o n . W h i l e t e m p e r a t u r e and p r e s s u r e do a f f e c t b i o l o g i c a l s y s t e m s i t i s t h e a f f i n i t y w h i c h p r o v i d e s t h e m a j o r d r i v i n g f o r c e f o r l i v i n g s y s t e m s . To d a t e I am aware of no work on t h e r o l e o f t h e a f f i n i t y o f a c h e m i c a l r e a c t i o n on t h e d e s i g n o f t h e enzyme c a t a l y z i n g i t . R o t t e n b e r g (1973) has i n v e s t i g a t e d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e r a t e of an enzyme r e a c t i o n and i t s d r i v i n g f o r c e o r a f f i n i t y . He h a s shown t h e r a t e o f r e a c t i o n t o be a l i n e a r f u n c t i o n of t h e a f f i n i t y o v e r a r a n g e o f more t h a n 2 k c a l / m o l . I t i s i m p o r t a n t t h e r e f o r e , t o i n v e s t i g a t e t h e r e l a t i o n s h i p b e t ween t h e a f f i n i t y o f a c h e m i c a l r e a c t i o n in v i v o and t h e enzymes t h a t c a t a l y z e i t . T h i s mus,t be done w i t h i n t h e c o n s t r a i n t s i m p o s e d by t h e c o n c e p t o f t h e s t e a d y - s t a t e . I t i s w i d e l y assumed t h a t enzymes b e h a v e e s s e n t i a l l y a s o t h e r c a t a l y s t s . A l l o f t h e known c a t a l y s t s f u n c t i o n t o s p e e d t h e a p p r o a c h t o e q u i l i b r i u m . A l l enzymes o f c o u r s e , do t h i s when o u t s i d e o f t h e o r g a n i s m ( e x o e n z y m e s o r o t h e r s i_n v i t r o ) b u t t h e r e i s a l a r g e c l a s s o f enzymes w h i c h a r e d e s i g n e d t o f u n c t i o n 3 i n s i d e o f t h e c e l l ; t h e y a r e d e s i g n e d n o t t o s i m p l y s p e e d t h e a p p r o a c h t o e q u i l i b r i u m b u t t o c o n t r o l t h e r a t e o f f l u x and m a i n t a i n t h e c o n c e n t r a t i o n s o f a l l m e t a b o l i c a l l y u s e f u l compounds c o n s t a n t . A l t h o u g h m e t a b o l i c enzymes a r e c l e a r l y c a p a b l e o f f u n c t i o n a t d i f f e r e n t s t e a d y - s t a t e s , most p r e v i o u s work on m e t a b o l i c r e g u l a t i o n h a s e m p h a s i z e d i n s t e a d t h e t r a n s i e n t s t a t e ( A t k i n s o n , 1 9 7 7 ) . From t h i s h a s a r i s e n t h e i d e a t h a t m e t a b o l i c enzymes f a l l i n t o two g e n e r a l c a t e g o r i e s w h i c h a r e t e r m e d r e g u l a t o r y a n d n o n - r e g u l a t o r y ; t h e f o r m e r b e i n g s u b j e c t t o a c t i v a t i o n o r i n h i b i t i o n by v a r i o u s m e t a b o l i c ' s i g n a l s ' ( h o r m o n e s , c a t i o n s , m e t a b o l i t e s e t c . ) a r e c o n s i d e r e d t o p l a y a much more i m p o r t a n t r o l e i n m e t a b o l i c r e g u l a t i o n t h a n do n o n - r e g u l a t o r y e nzymes. I n p a r t i c u l a r any g i v e n s t e a d y - s t a t e , i t i s p r o p o s e d (Newsholme and S t a r t , 1973; A t k i n s o n , 1977) i s m a i n t a i n e d by a b a l a n c e b e t w e e n s u b s t r a t e a v a i l a b i l i t y , m o d u l a t o r c o n c e n t r a t i o n , and o t h e r s u c h f a c t o r s . As I s h a l l show i n g r e a t e r d e t a i l l a t e r ( C h a p t e r 5 ) , t h i s r o l e f o r r e g u l a t o r y enzymes i s c r i t i c a l b u t i s i n s u f f i c i e n t t o e x p l a i n how non-r e g u l a t o r y enzymes p a c e e a c h o t h e r and p a c e r e g u l a t o r y o n e s . F o r t h i s r e a s o n , and b e c a u s e t h i s s t u d y r e p r e s e n t s an i n i t i a l e x p l o r a t i o n o f t h e p r o b l e m , I w i l l m a i n l y c o n c e n t r a t e on t h e f u n c t i o n a l p r o p e r t i e s o f n o n - r e g u l a t o r y enzymes r e q u i s i t e f o r t h e d e v e l o p m e n t and m a i n t e n a n c e o f any g i v e n s t e a d y - s t a t e . I m p l i c i t i n an u n d e r s t a n d i n g o f t h e s t e a d y - s t a t e . i s t h a t i t i s a f l u x s i t u a t i o n . A t e v e r y p o i n t i n a p a t h w a y c a t a l y z e d by an enzyme t h e n e t f l u x t h r o u g h t h a t p o i n t i s d e s c r i b e d by t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e f l u x p r o d u c e d by t h e f o r w a r d r e a c t i o n and t h e f l u x p r o d u c e d by t h e r e v e r s e r e a c t i o n . T h i s s i m p l e s t c o n c e p t 4 has been a l m o s t u n i v e r s a l l y i g n o r e d i n t h e s t u d y o f enzyme d e s i g n . To u n d e r s t a n d t h e s t e a d y - s t a t e o f m e t a b o l i s m i t i s t h e r e f o r e n e c e s s a r y t o u n d e r s t a n d t h e f u n c t i o n a l d e s i g n o f t h e enzymes w h i c h g o v e r n i t . B o t h f o r w a r d and r e v e r s e r e a c t i o n s must be t a k e n i n t o a c c o u n t a n d r e l a t e d . T h e s e r e l a t i o n s h i p s have been a n a l y z e d u s i n g c o m p u t e r s i m u l a t i o n s o f model s y s t e m s . U s i n g t h i s a p p r o a c h some o f t h e d e s i g n f e a t u r e s o f m e t a b o l i c enzymes have been d e t e r m i n e d . I n t h i s g e n e r a l c o n t e x t , t h e n , I s e t o u t t o a n s w e r t h e f o l l o w i n g q u e s t i o n s . 1) What r e l a t i o n s h i p s e x i s t b e t ween t h e t h e r m o d y n a m i c p r o p e r t i e s o f s e q u e n t i a l n o n - r e g u l a t o r y enzymes i n a m e t a b o l i c p a t h w a y a l l o w i n g f u n c t i o n a t d i f f e r e n t s t e a d y - s t a t e s ? 2) What r e l a t i o n s h i p s e x i s t b e t w e e n t h e k i n e t i c p r o p e r t i e s o f s e q u e n t i a l n o n - r e g u l a t o r y enzymes i n a m e t a b o l i c p a t h w a y a l l o w i n g f u n c t i o n a t d i f f e r e n t s t e a d y - s t a t e s ? 3) How a r e t h e c o n c e n t r a t i o n s o f s e q u e n t i a l enzymes r e l a t e d t o a l l o w f u n c t i o n a t d i f f e r e n t s t e a d y - s t a t e s ? 4) Does t h e a f f i n i t y f o r any g i v e n r e a c t i o n c h a n g e a t d i f f e r e n t s t e a d y - s t a t e s ? 5) I s t h e s t e a d y - s t a t e p e r t u r b e d by f l u c t u a t i o n s i n c o n c e n t r a t i o n o f p a t h w a y i n t e r m e d i a t e s o r i s i t a s t a b l e s t a t e ? 6) Why do t h e maximum a c t i v i t i e s o f enzymes i n any g i v e n p a t h w a y v a r y by up t o f o u r o r d e r s o f m a g n i t u d e (Guppy e t a_l.,1979) when i n t h e s t e a d y - s t a t e t h e y a l l must f u n c t i o n a t t h e same r a t e s ? I f o u n d r e m a r k a b l y s i m p l e a n s w e r s t o a l l t h e s e q u e s t i o n s by a p p r o a c h i n g them w i t h t h e use o f m o d e l s y s t e m s . I n t h e f i r s t p l a c e , I u s e d f u m a r a s e a s a 'model' n o n - r e g u l a t o r y enzyme. A 5 t h e r m o d y n a m i c a p p r o a c h was e m p l o y e d f o r t h i s p a r t o f t h e t h e s i s s i n c e i t p r o v i d e s a way o f c o m p a r i n g d i f f e r e n t t y p e s o f p r o c e s s e s i n t e r m s o f t h e same u n i t s ( c a l o r i e s ) . I n t h i s p a r t o f s t u d y I f o u n d t h a t t h e d i f f e r e n c e i n t h e G i b b s f r e e e n e r g y o f a c t i v a t i o n i n t h e f o r w a r d d i r e c t i o n c o m p a r e d t o t h e r e v e r s e d i r e c t i o n (AG^) i s n o t n e c e s s a r i l y e q u a l t o ^ G * . T h a t t h i s o b s e r v a t i o n h a d m e t a b o l i c i m p a c t I e s t a b l i s h e d by c o m p a r i n g t h e v a l u e o f ^ G f j _ w i t h i_n v i v o a f f i n i t y f o r a s e r i e s o f t w e l v e m e t a b o l i c enzymes. T h i s p a r t o f t h e s t u d y showed t h a t — G ^ i s n u m e r i c a l l y e q u a l t o t h e in v i v o a f f i n i t y f o r t h e r e a c t i o n . To e x p l o r e how t h i s s o r t o f s t e a d y - s t a t e may be a c h i e v e d i n  v i v o , I u s e d a c o m p u t e r m o d e l i n g scheme f o r two s e q u e n t i a l n o n -r e g u l a t o r y enzymes and f o u n d t h a t two c o n s t r a i n t s must be i m p o s e d on s u c h a s e q u e n c e o f enzymes t o a l l o w s t e a d y - s t a t e f u n c t i o n w h e r e i n i s e q u a l n u m e r i c a l l y t o a f f i n i t y . The f i r s t i s t h a t t h e Km f o r t h e s h a r e d s u b s t r a t e must be t h e same; t h e s e c o n d i s t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e two enzymes must be a p p r o p r i a t e l y a d j u s t e d w i t h r e s p e c t t o e a c h o t h e r . 6 CHAPTER 2 EQUILIBRIUM THERMODYNAMICS OF ENZYMES  INTRODUCTION F o r t h e s i m p l e s t f u l l y r e v e r s i b l e enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n i s: k, k r k 3 A + E EA T=* EB E + B ( 2 - 1 ) k., k._ k - 3 . Where Vmaxf = E A k z , Vmaxr = EBk , Ka = k |/k_| a n d Kb = k s / k ^ . The n e t f l u x o f A t o B i s g i v e n by: v= V m a x f ( [ A ] / K a ) - V m a x r ( [ B ] / K b ) ( 2 - 2 ) 1 + ( [ A ] / K a ) + ( [ B j / K b ) E q u a t i o n ( 2 - 2 ) d e s c r i b e s t h e r a t e o f r e a c t i o n i n t h e p r e s e n c e o f b o t h r e a c t a n t s a n d p r o d u c t . When one o r t h e o t h e r i s t o t a l l y a b s e n t e q u a t i o n ( 2 - 2 ) r e d u c e s t o t h e M i c h a e l i s - M e n t e n e q u a t i o n . A t e q u i l i b r i u m t h e f l u x i s z e r o . I f t h e l e f t h a nd s i d e o f e q u a t i o n ( 2 - 2 ) i s s e t e q u a l t o z e r o and r e a r r a n g e d t h e f o l l o w i n g e q u a t i o n i s o b t a i n e d : [ B ] / [ A ] = Keq = VmaxfKb ( 2 - 3 ) VmaxrKa E q u a t i o n ( 2 - 3 ) i s t h e H a l d a n e r e l a t i o n s h i p ( H a l d a n e , 1930) f o r t h i s t y p e o f r e a c t i o n . H a l d a n e r e l a t i o n s h i p s e x i s t f o r a l l t y p e s o f enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n s . The H a l d a n e r e l a t i o n s h i p h a s p r e v i o u s l y o n l y been u s e d t o v e r i f y t h e v a l i d i t y o f k i n e t i c 7 d e t e r m i n a t i o n s o f i t s c o n s t i t u e n t c o n s t a n t s o r t o d e t e r m i n e t h e Keq o f r e a c t i o n s i n w h i c h i t i s o t h e r w i s e d i f f i c u l t ( P u r i c h e_t a l . , 1 9 7 3 ) . S i n c e e q u a t i o n ( 2 - 3 ) r e p r e s e n t s t h e e q u i l i b r i u m s t a t e , i t may be s i m p l y e x p r e s s e d i n t h e r m o d y n a m i c t e r m s : RT I n Keq = RT I n (VmaxfKb) ( 2 - 4 ) (VmaxrKa) I f e q u a t i o n ( 2 - 4 ) i s e x p a n d e d a n d t h e t e r m s s e p a r a t e d RT I n Keq = RT I n Vmaxf + RT I n Kb -RT I n Vmaxr -RT I n Ka) ( 2 - 5 ) r e a r r a n g i n g ( 2 - 5 ) g i v e s , RT I n Keq = RT I n (Vmaxf/Ka) - RT I n (Vmaxf/Kb) ( 2 - 6 ) F e r s h t (1977) d e s c r i b e d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e f r e e b * e n e r g y o f b i n d i n g (*G ) and t h e f r e e e n e r g y o f a c t i v a t i o n (^G ) i n t e r m s of k c a t a nd Km. S i n c e , Vmax = k c a t / ( e n z y m e c o n c e n t r a t i o n ) - ( 2 - 7 ) RT I n ( k c a t f / K a ) = RT I n ( k T / h ) - (^Gf-^G a) ( 2 - 8 ) The l e f t h a nd s i d e o f e q u a t i o n ( 2 - 8 ) c l o s e l y r e s e m b l e s e i t h e r p a r t o f t h e r i g h t hand s i d e o f e q u a t i o n ( 2 - 9 ) s e p a r a t e d by t h e m i n u s s i g n . S i n c e F e r s h t w o r k e d w i t h i r r e v e r s i b l e p r o t e a s e s t h i s t y p e o f e q u a t i o n a d e q u a t e l y d e s c r i b e s t h o s e enzymes. M o s t m e t a b o l i c enzymes h o w e v e r , a r e r e v e r s i b l e a n d t h e r e v e r s e r e a c t i o n may a l s o be d e s c r i b e d by a F e r s h t i a n e q u a t i o n w i t h o p p o s i t e s i g n : TT b -RT I n ( k c a t r / K b ) = -RT I n ( k T / h ) + (^Gr+^Gy) ( 2 - 9 ) S u b s t i t u t i n g ( 2 - 6 ) , ( 2 - 8 ) and ( 2 - 9 ) i n ( 2 - 6 ) g i v e s : * b RT I n Keq = RT I n ( k T / h ) - ( AGf+ * G a ) - RT I n ( k T / h ) ( 2 - 1 0 ) 8 * b + ( ^ G r+ <*G_ ) S i m p l i f y i n g ( 2 - 1 0 ) RT I n Keq -*Gv.+*G^-( ^ G f + ^ G * ) (2 - 1 1 ) The t e r m s kT/h r e p r e s e n t s t h e r a t e o f d e c a y o f t h e a c t i v a t e d c o m p l e x a nd i s t h e same f o r a l l c h e m i c a l r e a c t i o n s ( J o h n s o n , E y r i n g and S t o v e r , 1 9 7 4 ) . T h i s t e r m d i s a p p e a r s i n e q u a t i o n ( 2 -11) s i n c e i t i s i d e n t i c a l b u t o f o p p o s i t e s i g n f o r t h e r e v e r s e r e a c t i o n . S i n c e , -RT I n Keq = ^G° (2- 1 2 ) e q u a t i o n ( 2 - 1 1 ) may be r e a r r a n g e d and w r i t t e n , * b * k • 4 Q f + ^Gj,= ^G r+ ^Gfc+ ^G ( 2 - 1 3 ) E q u a t i o n ( 2 - 1 3 ) d e s c r i b e s t h e f r e e e n e r g y p r o f i l e f o r an enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n a s d e p i c t e d i n F i g u r e 3-1. The G i b b s f r e e e n e r g y o f b i n d i n g o f b o t h s u b s t r a t e a n d p r o d u c t a r e n e g a t i v e a s i s ^ G . The f r e e e n e r g i e s o f a c t i v a t i o n i n b o t h t h e f o r w a r d a n d r e v e r s e d i r e c t i o n s a n d p o s i t i v e . I n a s i m i l a r way t h e G i b b s f r e e e n e r g y p r o f i l e s may be d e r i v e d f r o m t h e H a l d a n e r e l a t i o n s h i p s o f more c o m p l e x r e a c t i o n s . T a b l e 2-1 p r e s e n t s t h e t h e r m o d y n a m i c e q u a t i o n s d e s c r i b i n g t h e s e r e a c t i o n s a t e q u i l i b r i u m . The t e r m i n o l o g y u n i -u n i , b i - b i , e t c . i s t h a t o f C l e l a n d (1970) a nd r e f e r s t o t h e number o f k i n e t i c a l l y i m p o r t a n t r e a c t a n t s i n t h e f o r w a r d a n d r e v e r s e d i r e c t i o n s ( i e . One r e a c t a n t i n t h e f o r w a r d and one i n t h e r e v e r s e i s d e s i g n a t e d a u n i - u n i m e c h a n i s m ; two r e a c t a n t s i n t h e f o r w a r d and one i n t h e r e v e r s e i s a b i - u n i m e c h a n i s m and so o n ) . I n t h e c a s e o f b i - r e a c t i o n s t h e o r d e r o f b i n d i n g o f r e a c t a n t s may be random o r o r d e r e d . The T h e o r r e l l - C h a n c e 9 m e c h a n i s m i s s i m i l a r t o t h e o r d e r e d b i - b i t y p e e x c e p t t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e t e r n a r y c o m p l e x i s v a n i s h i n g l y l o w . I f a l l s u b s t r a t e s b i n d b e f o r e any p r o d u c t s a r e r e l e a s e d t h e r e a c t i o n i s t e r m e d s e q u e n t i a l and i f some p r o d u c t i s r e l e a s e d b e f o r e a l l s u b s t r a t e s h a v e bound t h e m e c h a n i s m i s t e r m e d p i n g - p o n g . The M i c h a e l i s c o n s t a n t s f o r a l l s u b s t r a t e s a n d p r o d u c t s a r e assumed t o e q u a l t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s . The o c c u r e n c e o f i n h i b i t o r y t e r n a r y c o m p l e x e s i n t h e s e m e c hanisms r e s u l t s i n t h e c o e f f i c i e n t s 1/2 b e f o r e t h e b i n d i n g f r e e e n e r g i e s o f t h a t l i g a n d . The s t r e n g t h o f b i n d i n g o f t h e s u b s t r a t e t o i t s " p r o p e r " s i t e i s n o t t h e same a s b i n d i n g i n t h e u n p r o d u c t i v e t e r n a r y c o m p l e x . The e f f e c t i v e b i n d i n g o f t h e p a r t i c u l a r l i g a n d i s t h e r e f o r e t h e a v e r a g e o f t h e p r o p e r b i n d i n g a n d t h e i n h i b i t o r y b i n d i n g , t h u s t h e sum o f t h e f r e e e n e r g i e s o f b i n d i n g w i t h c o e f f i c i e n t s o f 1/2. The H a l d a n e r e l a t i o n s h i p t h e r e f o r e p r o v i d e s a u s e f u l a p p r o a c h t o u n d e r s t a n d i n g t h e e q u i l i b r i u m c h a r a c t e r s i t i c s o f enzymes. A s t u d y o f t h e p r o p e r t i e s o f enzymes a t e q u i l i b r i u m i s e s s e n t i a l t o an u n d e r s t a n d i n g o f t h e i r f u n c t i o n i n s i t u a t i o n s d i s p l a c e d f r o m e q u i l i b r i u m and w i l l u l t i m a t e l y l e a d t o an u n d e r s t a n d i n g o f t h e i r f u n c t i o n i n t h e s t e a d y - s t a t e o f , m e t a b o l i s m . 10 T a b l e 2-1 H a l d a n e r e l a t i o n s h i p s a n d t h e r m o d y n a m i c i n t e r p r e t a t i o n s o f s e v e r a l enzyme r e a c t i o n m e c h a n i s m s M e c h a n i s m H a l d a n e * Thermodynamic i n t e r p r e t a t i o n T h e o r e l l - C h a n c e V I K p K i p K q K i q AG°=^JG.f + l / 2 4 G a + 1/2&G%^ + Keq= , £ N o n - s e q u e n t i a l V 2 K a K i a K b K i b 1/2 G^ +1/2 G^ - ( A G r + P i n g - p o n g l/24Gp + l / 2 A G j + 1/2AG<^ + Random b i - b i 1/24G!J, ) * b il O r d e r e d u n i - b i V I K p K i p K q K i q AG°=AG.f +1/2AG* +l/2&Gg. -Keq= i b ^ V 2 K a K i a (AGJT +l/2AGp + l/2AGj> + 1/2AG* + 1 / M G ^ ) •* b it B i - u n i V I K p K i p dG°= A G f +1/2AG A + l/2AGft. + Keq= {, ,'{> V 2 K a K i a K b K i b 1/2AG^•+l/2AGfc -(AG,. + l / 2 A G p +1/2AG*^ ) * see l i s t o f a b b r e v i a t i o n s a t end o f t h e s i s f o r d e s c r i p t i o n s of p a r a m e t e r s . 11 CHAPTER 3 THE RELATIONSHIP BETWEEN BINDING AND CATALYSIS I n t r o d u c t i o n An i m p o r t a n t c h a r a c t e r i s t i c o f a c a t a l y s t i s i t s a b i l i t y t o l o w e r t h e G i b b s f r e e e n e r g y o f a c t i v a t i o n . H a l d a n e (1930) s t a t e d t h a t enzymes (and o t h e r c a t a l y s t s ) c a n n o t a l t e r t h e t r u e e q u i l i b r i u m p o s i t i o n o f a r e a c t i o n . He a l s o s t a t e d t h a t enzymes a c c e l e r a t e t h e r e v e r s e r e a c t i o n t o t h e same e x t e n t a s t h e f o r w a r d g i v i n g s e v e r a l e x a m p l e s i n w h i c h t h i s was shown. S i n c e enzymes b i n d s u b s t r a t e s and p r o d u c t s w i t h d i f f e r i n g a f f i n i t i e s i t w o u l d seem l i k e l y t h a t i n d e p e n d e n t p e r t u r b a t i o n o f b i n d i n g o f s u b s t r a t e and p r o d u c t c o u l d o c c u r . S u r p r i s i n g l y , t h e r e l a t i o n s h i p s between t h e two enzyme p r o p e r t i e s , t e r m e d Km and k c a t r e s p e c t i v e l y ( t h e b i n d i n g and c a t a l y t i c c o n s t a n t s f o r t h e enzymes d i s p l a y i n g M i c h a e l i s k i n e t i c s ) h a v e n o t been c l a r i f i e d f o r b o t h t h e f o r w a r d and t h e r e v e r s e r e a c t i o n s . F o r enzymes whose f u n c t i o n i s t o t u r n o v e r l a r g e q u a n t i t i e s of s u b s t r a t e q u i c k l y , F e r s h t ( 1 9 7 7) and C r o w l e y ( 1 9 75) e n v i s a g e d t h a t t h e r a t i o o f k c a t / K m i s h i g h i n o r d e r t o m a x i m i z e r e a c t i o n r a t e s . T h e i r c o n c l u s i o n , i m p l y i n g a d i r e c t r e l a t i o n s h i p b e t ween k c a t and Km, was b a s e d on c a t a l y s i s by p r o t e a s e s i n o n l y one d i r e c t i o n ; t h e c o n s e q u e n c e s t o t h e r e v e r s e r e a c t i o n of m a x i m i z i n g r a t e s i n t h e f o r w a r d d i r e c t i o n were n o t c o n s i d e r e d . O t h e r w o r k e r s ( C o r n i s h - B o w d e n , 1975) have c o n c l u d e d t h a t m a x i m i z i n g k c a t / K m i s n o t n e c e s s a r i l y a d v a n t a g e o u s a n d , on t h e o r e t i c a l g r o u n d s , h a v e shown t h a t Km and k c a t c a n be t r e a t e d 12 as i n d e p e n d e n t v a r i a b l e s . H o wever, t h e p o s s i b l e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n Km a n d k c a t were n o t i n v e s t i g a t e d e x p e r i m e n t a l l y . As a f i r s t a p p r o a c h t o i m p r o v i n g o u r u n d e r s t a n d i n g o f t h e r e l a t i o n s h i p s b e t ween Km a n d k c a t , a r e l a t i v e l y s i m p l e m e t a b o l i c enzyme, f u m a r a s e (E.C. 4.2.1.2) was s e l e c t e d w h i c h c a t a l y z e s t h e r e v e r s i b l e h y d r a t i o n o f f u m a r a t e . f o r w a r d f u m a r a t e + H20 ^=---___' m a l a t e r e v e r s e A v a r i e t y o f c o n d i t i o n s were u s e d t o p e r t u r b e i t h e r Km o r k c a t , o r b o t h , i n o r d e r t o e x p l o r e t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n them. MATERIALS AND METHODS Enzyme a s s a y s . P u r i f i e d p i g h e a r t f u m a r a s e ( E . C . 4 . 2 . 1 . 2 ) was o b t a i n e d f r o m t h e Sigma C h e m i c a l Co., S t . L o u i s , Mo. I t was a s s a y e d i n a 50 mM p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r a t pH 7.3 u n l e s s o t h e r w i s e s t a t e d . The c h a n g e i n a b s o r b a n c e a t 240 nm i n t h e m a l a t e d i r e c t i o n u s i n g t h e m i l l i m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t 2.44 a n d a t 280 nm i n t h e f u m a r a t e d i r e c t i o n w i t h t h e m i l l i m o l a r e x t i n c t i o n c o e f f i c i e n t 0.26 was f o l l o w e d w i t h a U n i c a m SP 1800 r e c o r d i n g s p e c t r o p h o t o m e t e r . C u v e t t e t e m p e r a t u r e was k e p t c o n s t a n t (+0.1 0 C) w i t h a L a u d a c o n s t a n t t e m p e r a t u r e b a t h a n d c i r c u l a t o r . K i n e t i c and t h e r m o d y n a m i c c a l c u l a t i o n s . Km and Vmax were d e t e r m i n e d i n t r i p l i c a t e a t f i v e t e m p e r a t u r e s f r o m 20° C t o 40° C u s i n g t h e m o d i f i e d C o r n i s h - B o w d e n / E i s e n t h a l p l o t ( C o r n i s h -13 Bowden and E i s e n t h a l , 1 9 7 8 ) . An e x a m p l e i s p r e s e n t e d i n F i g u r e 3-1. S u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s r a n g e d f r o m one t e n t h o f t h e Km t o two o r t h r e e t i m e s t h e Km. ^G° was d e t e r m i n e d f r o m t h e Keq u s i n g t h e r e l a t i o n s h i p = -{RT ln(}(VVf) + RT I n K e q } . S i n c e t h e pKa o f m a l a t e a n d f u m a r a t e a r e s i m i l a r ( S o b e r , 1970) t h e a c t i v i t y c o e f f i c i e n t s Vm and Vf were assumed t o be e q u a l . The r e l a t i o n s h i p t h e n s i m p l i f i e s t o ^ G° = - RT I n Keq. Keq f o r t h e r e a c t i o n was d e t e r m i n e d i n b o t h t h e f o r w a r d a n d r e v e r s e d i r e c t i o n s . The G i b b s f r e e e n e r g y o f b i n d i n g was d e t e r m i n e d f r o m b t h e Km v a l u e s u s i n g t h e r e l a t i o n s h i p ^G = - RT I n (1/Km) . The Km i s e x p r e s s e d i n m o l a r u n i t s . F u m a r a s e o b e y s M i c h a e l i s - M e n t e n k i n e t i c s a t s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s b e l o w f i v e t i m e s t h e Km ( H i l l a n d T e i p e l , 1971) and e q u i l i b r i u m d i a l y s i s b i n d i n g s t u d i e s ( T e i p e l a n d H i l l , 1968) i n d i c a t e t h a t t h e Km i s e q u a l t o t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t . The k c a t was d e t e r m i n e d f r o m Vmax u s i n g k c a t / ( e n z y m e c o n c e n t r a t i o n ) . The G i b b s f r e e e n e r g y o f a c t i v a t i o n was d e t e r m i n e d u s i n g t h e method o f Low et. aJL. (1973) w h e r e : A H = Ea - RT Ea was d e t e r m i n e d f r o m A r r h e n i u s p l o t s o f l o g k c a t v e r s u s 1/T u s i n g t h e l e a s t s q u a r e s r e g r e s s i o n a n a l y s i s . As = 4.576 ( l o g k c a t - 10.753 - l o g T + Ea / -4.756 T) where k c a t ( i n 1 / s e c . ) = Vmax/mg enzyme x m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e enzyme (194,000 f o r f u m a r a s e ) x 10 mmol/ m o l . X l m i n . / 6 0 s e c . A S a n d ' A H were s u b s t i t u t e d i n t o t h e f o l l o w i n g e q u a t i o n t o o b t a i n A G . AG = A H - TdS 14 RESULTS AND DISCUSSION P e r t u r b a t i o n o f AG a n d AG . By p e r t u r b i n g t h e r e a c t i o n c a t a l y z e d by f u m a r a s e w i t h s a l t , pH o r t e m p e r a t u r e i t i s p o s s i b l e t o a l t e r ^G a n d ^G . I f t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n ^G a n d ^ G ^ i s n o t f i x e d by c h e m i c a l n e c e s s i t y t h e n t h e two c a n c h a n g e i n d e p e n d e n t l y and f o u r p r i m a r y r e l a t i o n s h i p s a r e p o s s i b l e : 1. I n c r e a s i n g aG w i t h d e c r e a s i n g ^G 2. No c h a n g e i n *> G w i t h i n c r e a s i n g *• G 3. I n c r e a s i n g ^G w i t h no c h a n g e i n /G ir A 4. I n c r e a s i n g ^G w i t h i n c r e a s i n g ^G The f i v e o t h e r p o s s i b l i t i e s a r e s i m p l y t h e o p p o s i t e s o f t h e a b o v e p l u s t h e c a s e where no c h a n g e i n e i t h e r p a r a m e t e r o c c u r s . S i n c e no h y s t e r e s i s h a s been o b s e r v e d u n d e r any o f t h e s e c o n d i t i o n s , i t i s a ssumed t h a t a l l n i n e a r e p o s s i b l e b u t o n l y f o u r a r e c o n c e p t u a l l y i m p o r t a n t . F o r f u m a r a s e , i t was p o s s i b l e t o o b t a i n a l l f o u r p a t t e r n s ( T a b l e 3 - 1 ) . The f i r s t and s e c o n d r e l a t i o n s h i p s o c c u r i n t h e r e v e r s e r e a c t i o n w i t h s a l t a nd t e m p e r a t u r e t r a n s i t i o n s r e s p e c t i v e l y ; t h e t h i r d a nd f o u r t h r e l a t i o n s h i p s h o l d i n t h e f o r w a r d r e a c t i o n d u r i n g t h e same t r a n s i t i o n s . The r e l a t i o n s h i p b e t w e e n _-G^ and A G ^ . The f a c t t h a t a l l b # p o s s i b l e c o m b i n a t i o n s o f c h a n g e s i n ^G and ^G were o b t a i n e d ( T a b l e 3 - 1 ) c a n b e s t be e x p l a i n e d by a s s u m i n g t h a t t h e a c t i v e s i t e c o n t a i n s two f u n c t i o n a l d o m a i n s , t h e f i r s t c o n c e r n e d w i t h s u b s t r a t e b i n d i n g and t h e s e c o n d w i t h c a t a l y s i s . T h i s c o n c e p t a g r e e s w i t h o t h e r s t u d i e s ( H i l l a n d T e i p e l , 1971) w h i c h c o n s i d e r t h e f u m a r a s e a c t i v e s i t e t o be s p e c i a l i z e d i n t o b i n d i n g r e g i o n s 15 ( i n t e r a c t i n g w i t h t h e c a r b o x y l g r o u p s o f t h e s u b s t r a t e ) a n d c a t a l y t i c r e g i o n s ( i n v o l v e d i n h y d r a t i o n o r d e h y d r a t i o n o f f u m a r a t e o r m a l a t e r e s p e c t i v e l y ) . I n s u c h e v e n t , t h e p o s s i b i l i t y o f c h a n g e s i n *> G i n d e p e n d e n t o f c h a n g e s i n *>G c a n e a s i l y be e n v i s a g e d . A l t h o u g h t h e m o d e l i s u s e f u l i n u n d e r s t a n d i n g t h e s p e c i f i c r e l a t i o n s h i p s o b s e r v e d b e t w e e n ^ G and *>G f o r f u m a r a s e , i t i s w i d e l y a p p l i c a b l e s i n c e a c h a r a c t e r i s t i c o f many, i f n o t a l l enzymes i s t h e s p a t i a l a n d f u n c t i o n a l s e p a r a t i o n o f b i n d i n g a n d c a t a l y s i s ( H o l b r o o k e_t a _ l . , 1 9 7 6 ) . S u c h a s e p a r a t i o n may be an i m p o r t a n t d e s i g n c o n s t r a i n t on t h e a c t i v e s i t e o f ' enzymes f o r w i t h o u t i t , p e r t u r b a t i o n o f ^G s h o u l d a l w a y s l e a d t o s i m i l a r c h a n g e s m ^ G and v i c e v e r s a , a s i t u a t i o n t h a t w o u l d n o t a l l o w f o r t h e i n d e p e n d e n t m o d u l a t i o n o f b i n d i n g a n d a c t i v a t i o n . I n d e p e n d e n t b i n d i n g ' a n d . c a t a l y s i s s h o u l d a l l o w g r e a t e r f l e x i b i l i t y i n t h e d e s i g n o f enzymes s u i t e d t o f u n c t i o n i n d i f f e r e n t e n v i r o n m e n t s , s i n c e a d j u s t m e n t s may be made i n e i t h e r p a r a m e t e r w i t h o u t n e c e s s a r i l y a f f e c t i n g t h e o t h e r . I n a d d i t i o n i t may f a c i l i t a t e t h e d e s i g n o f m e t a b o l i c enzymes i n w h i c h s t r o n g b i n d i n g i n t e r a c t i o n s a r e i m p o r t a n t w i t h o u t s a c r i f i c i n g c a t a l y t i c e f f i c i e n c y . F r e e e n e r g y p r o f i l e s S i m p l i f i e d f r e e e n e r g y p r o f i l e s f o r t h e r e a c t i o n c a t a l y z e d by f u m a r a s e ( F i g u r e 3-2) c a n be c o n s t r u c t e d u s i n g t h e e q u a t i o n : * b * b *G fum +*G fum =^G mal + ^G mal + ^G° ( 3 - 1 ) b t B e c a u s e a nd ^ G were d e t e r m i n e d f o r b o t h t h e f o r w a r d a n d t h e r e v e r s e r e a c t i o n s , i t i s i m p o r t a n t t o p o i n t o u t t h a t t h e ^ G ° 16 c a l c u l a t e d f r o m e q u a t i o n ( 3 - 1 ) i s i n g ood a g r e e m e n t w i t h t h e v a l u e d e t e r m i n e d e x p e r i m e n t a l l y , i n d e p e n d e n t l y o f e i t h e r a n d ^G. T h i s e q u i v a l e n c e s u p p l i e s an i n d e p e n d e n t c h e c k o f t h e v a l i d i t y o f ^G and ^G e s t i m a t e s and of t h e f r e e e n r g y p r o f i l e i t s e l f ( T a b l e 3 - 2 ) . An a n a l y s i s o f t h e f r e e e n e r g y p r o f i l e s f o r f u m a r a s e u n d e r a v a r i e t y o f c o n d i t i o n s ( T a b l e 3-2) r e v e a l s s e v e r a l p o i n t s o f i n t e r e s t . The b i n d i n g of s u b s t r a t e s p r o c e e d s w i t h n e g a t i v e G i b b s f r e e e n e r g y . The G i b b s f r e e e n e r g y o f a c t i v a t i o n i n b o t h t h e f o r w a r d and r e v e r s e d i r e c t i o n i s p o s i t i v e . The d i f f e r e n c e i n t h e G i b b s f r e e e n e r g i e s o f a c t i v a t i o n o f t h e f o r w a r d c o m p a r e d t o t h e r e v e r s e d i r e c t i o n s (<^Gg) d o e s n o t e q u a l t h e f r e e e n e r g y d r o p o f r e a c t a n t s t o p r o d u c t s (^G°), a r e s u l t o f t h e b i n d i n g o f l i g a n d s i n t h e r e a c t i o n . C h a p t e r 4 w i l l d e a l w i t h t h e m e c h a n i s m by w h i c h t h i s i s a c h i e v e d . T h i s n o n - e q u i v a l e n c e o f ^ G ^ a n d ^ G 0 i n enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n s a p p e a r s t o have e s c a p e d g e n e r a l n o t i c e s i n c e most k i n e t i c d a t a a r e n o t e x p r e s s e d i n t h e r m o d y n a m i c t e r m s , where t h e r e l a t i o n s h i p i s most o b v i o u s . * The i n d e p e n d e n t m o d u l a t i o n o f b i n d i n g a n d c a t a l y s i s i s a c r u c i a l p r e r e q u i s i t e f o r d e s i g n o f r e v e r s i b l e enzymes w h i c h must f u n c t i o n i n a s t e a d y - s t a t e . O t h e r f e a t u r e s r e q u i r e d f o r c o m p l e t e f r e e d o m of d e s i g n w i l l be d e a l t w i t h i n t h e n e x t c h a p t e r . 17 T a b l e 3-1. The e f f e c t s o f p e r t u r b i n g c o n d i t i o n s on M G a n d M G f o r t h e f u m a r a s e r e a c t i o n . Two k i n d s o f s t e p - w i s e t r a n s i t i o n s w i t h a n d w i t h o u t 0.25 M s a l t , a n d low v s . h i g h t e m p e r a t u r e were u t i l i z e d . A A G^ andA&G^ were o b t a i n e d f r o m t h e d i f f e r e n c e i n t h e r m o d y n a m i c p a r a m e t e r s o b t a i n e d i n t h e i n t i a l s t a t e a n d u n d e r t h e p e r t u r b i n g c o n d i t i o n s . A l l a s s a y c o n d i t i o n s and c a l c u l a t i o n s a r e g i v e n i n t h e t e x t . V a l u e s a r e s u b t r a c t e d means f o r w h i c h t h e m a x i m a l s t a n d a r d e r r o r i s + 2.7%. T r a n s i t i o n c o n d i t i o n s G 4 A G ( c a l / m o l ) ( c a l / m o l ) m a l a t e , pH 7.3, 30°C 0-0.25 M K C l 945 -645 m a l a t e , pH 8.0 20-40°C 220 f u m a r a t e , pH 7.3, 30°C 0-0.25 M K C l 210 -10 f u m a r a t e , pH 8.0 270 220 20-40°C 18 T a b l e 3-2. G i b b s f r e e e n e r g y c h a n g e s o f b i n d i n g a n d a c t i v a t i o n u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s . A s s a y c o n d i t i o n s a n d c a l c u l a t i o n s a r e g i v e n i n t h e t e x t . The c a l c u l a t e d v a l u e s f o r A G ° were o b t a i n e d u s i n g e q u a t i o n ( 3 - 1 ) V a l u e s g i v e n a r e means + s t a n d a r d e r r o r . £T AGf AG A G ' A G 1 A G , C o n d i t i o n s ' c a l c u l a t e d o b s e r v e d c a l / m o l c a l / m o l c a l / m o l c a l / m o l c a l / m o l c a l / m o l c a l / m o l pH 7.3, 20°C -4010 13100 -3235 13425 -1100 -930 -325 + 42 + 76 + 151 + 95 + 81 + 10 + 110 30°C -3980 13245 -3375 13510 -865 -790 -265 + 36 + 51 + 72 + 74 + 55 ± 16 + 46 40°C -3915 13420 -3275 13560 -780 -680 -140 i 35 + 51 + 57 + 61 + 52 + 20 + 34 pH 7.3,+ 0.25 M K C l 20°C -4025 13420 -4150 14545 -1000 -975 -1125 + 78 + 132 + 44 + 76 + 85 + 20 + 159 30°C -3985 13455 -4020 14455 -965 -835 -1000 + 54 + 93 + 91 + 101 + 99 + 23 + 139 40°C -3565 13465 -3980 14410 -525 -725 -945 + 212 + 115 + 39 + 122 + 330 + 21 + 219 pH 8.0, 20°C 30°C 40°C •4135 + 61 •3865 + 73 13405 + 56 -4075 13600 + 53 + 14 13625 + 115 -3050 + 22 -2835 + 90 -2775 + 74 13165 + 23 13150 + 38 13170 + 111 845 -875 240 + 29 + 18 + 34 •795 -785 450 + 77 + 24 + 24 •640 -700 455 + 23 + 25 + 54 19 F i g u r e 3-1 E x a m p l e o f v e l o c i t y v e r s u s s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n a) and m o d i f i e d C o r n i s h - B o w d e n / E i s e n t h a l p l o t s b) f o r Km and Vmax d e t e r m i n a t i o n s w i t h f u m a r a s e . 300 20 F i g u r e 3-2. S i m p l i f i e d f r e e e n e r g y p r o f i l e f o r t h e r e a c t i o n c a t a l y z e d by f u m a r a s e a t 40°C, pH 7.3, a n d 50 mM KP04. S y m b o l s a r e e x p l a i n e d i n t h e t e x t . ibbs Free Energy (kcal mol' 1) 21 CHAPTER 4 INDEPENDENT MODULATION OF FORWARD AND REVERSE BINDING I n t r o d u c t i o n The o b s e r v a t i o n made i n t h e l a s t c h a p t e r t h a t ^ G ^ f ^G° i s w o r t h y o f f u r t h e r c o n s i d e r a t i o n . F i r s t l y , i t i s a w i d e s p r e a d phenomenon o f m e t a b o l i c enzymes a s T a b l e 4-1 d e m o n s t r a t e s . T h i s i m p l i e s t h a t s u c h a d e s i g n f e a t u r e must have i m p o r t a n t f u n c t i o n s i n m e t a b o l i s m . The t h e o r e m t h a t : k l / k - l - K e q ( 4 - 1 ) has been w i d e l y assumed t o h o l d n o t o n l y f o r c h e m i c a l r e a c t i o n s b u t a l s o f o r enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n s . E a r l y w o r k e r s ( O e s p e r and M e y e r h o f , 1950) even u s e d t h i s m ethod t o c a l c u l a t e t h e Keq f o r an enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n u s i n g Vmax v a l u e s f o r t h e f o r w a r d a n d r e v e r s e r e a c t i o n s a s t h e r a t e c o n s t a n t s k l and k-1 r e s p e c t i v e l y . G adsby e t a l . ( 1 9 4 6) d e a l i n g w i t h h e t e r o g e n o u s c a t a l y s i s a n d l a t e r Manes, H o f e r a n d W e l l e r ( 1 9 5 0) a n d H o r i u t i (1957) s u g g e s t e d t h a t e q u a t i o n ( 4 - 1 ) i s a s p e c i a l c a s e o f t h e more g e n e r a l e q u a t i o n ( k l / k - 1 ) = Keq ( 4 - 2 ) I n t h e c a s e o f enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n s t h e f a c t o r z may be e x p r e s s e d a s l n ( K b ) ( k - 1 ) + 1 ( 4 - 3 ) Z = ( K a ) ( k l ) 22 T a b l e 4-1. C o m p a r i s o n of A G ^ * a n d A c f o r s e v e r a l enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n s . Enzyme ( c a l / m o l ) Ref . A G 0 ( c a l / m o l ) Ref . p h o s p h o g l u c o m u t a s e -618 1 -1746 1 p y r u v a t e k i n a s e -2410 2 -5263 3 p h o s p h o g l y c e r a t e k i n a s e -613 4 -4767 4 l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e -850 5 -4955 5 * A G J J was d e t e r m i n e d f r o m p u b l i s h e d Vmaxf/Vmaxr u s i n g t h e e q u a t i o n A G J J = RT I n ( V m a x f / V m a x r ) , where Vmaxf and Vmaxr a r e d e t e r m i n e d a t t h e same c o n c e n t r a t i o n s o f enzyme. 1. Lowry,O.H. and J . V . P a s s o n n e a u . 1 9 6 9 . P h o s p h o g l u c o m u t a s e w i t h , t h e p h o s p h a t e s of f r u c t o s e , g l u c o s e , mannose, r i b o s e , and g a l a c t o s e . J . B i o l . C h e m . 2 4 4 : 9 1 0 - 9 1 6 . 2. D y s o n , R . D . , J . M . C a r d e n a s , and R . J . B a r s o t t i . 1 9 7 5 . The r e v e r s i b i l i t y o f s k e l e t a l m u s c l e p y r u v a t e k i n a s e and a s a s s e s s m e n t o f i t s c a p a c i t y t o s u p p o r t g l y c o n e o g e n e s i s . J . B i o l . C h e m . 2 5 0 : 3 3 1 6 - 3 3 2 1 . 3. M c Q u a t e , J . T . and M . F . U t t e r . 1959. E q u i l i b r i u m and k i n e t i c s t u d i e s o f t h e p y r u v a t e k i n a s e r e a c t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 3 4 : 2 1 5 1 -2157. 4. K r i e t s c h , W . K . G . and T . B u c h e r . 1970. 3 - p h o s p h o g l y c e r a t e k i n a s e f r o m r a b b i t s k e l e t a l m u s c l e and y e a s t . E u r . J . B i o c h e m . 1 7 : 5 6 8 -580 5. B a l l a n t y n e , J . S . u n p u b l i s h e d d a t a . 23 When e q u a t i o n ( 4 - 2 ) i s s u b s t i t u t e d i n t o e q u a t i o n ( 4 - 1 ) and e x p r e s s e d i n t h e r m o d y n a m i c t e r m s t h e t h e r m o d y n a m i c e x p r e s s i o n o f t h e H a l d a n e r e l a t i o n s h i p r e s u l t s . E q u a t i o n ( 4 - 2 ) p e r m i t s t h e u t i l i z a t i o n o f methods w o r k e d o u t f o r c h e m i c a l s y s t e m s i n enzyme s y s t e m s . G a d s b y e t a l . (1946) and H o r i u t i (1957) b o t h h i n t e d a t . t h e p o s s i b i l i t y o f c a t a l y s i s i n h e t e r o g e n o u s s i t u a t i o n s where t h e f a c t o r Z was n o t e q u a l t o one. L i t t l e f u r t h e r work seems t o h a v e been done i n t h i s a r e a . T h i s c h a p t e r p r o b e s AGfc , u s i n g a s i m p l e enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n . MATERIALS AND METHODS The same m e t h o d o l o g y was employed- a s i n C h a p t e r 3 w i t h t h e a d d i t i o n a l use o f v a r i o u s c o n c e n t r a t i o n s of KC1 i n t h e r e a c t i o n medium. RESULTS AND DISCUSSION T a b l e 4-2 shows t h a t i t i s p o s s i b l e t o s e l e c t c o n d i t i o n s f o r f u m a r a s e w h e r e i n i t i s p o s s i b l e t o i n d e p e n d e n t l y m o d u l a t e b i n d i n g o f s u b s t r a t e and p r o d u c t . P r e s u m a b l y i f we c a n s e l e c t " a r t i f i c i a l " c o n d i t i o n s t o p e r t u r b t h e r a t i o o f Ks t o Kp, a d a p t a t i o n a l e x p e d i e n c y may a l t e r t h e amino a c i d s e q u e n c e t o e f f e c t t h e same r e s p o n s e . b S i n c e , a s we have s e e n i n C h a p t e r 3, ^G may be p e r t u r b e d w i t h r e s p e c t t o ^ G ^ i n any way and s i n c e t h e b i n d i n g o f 24 s u b s t r a t e and p r o d u c t may be i n d e p e n d e n t l y p e r t u r b e d we may n e x t a s k w h e t h e r ^G^ c a n be p e r t u r b e d i n any way w i t h r e s p e c t t o ^G r. T a b l e 4-3 shows a g a i n t h a t t h i s i s p o s s i b l e t o a c h i e v e by s e l e c t i n g t h e a p p r o p r i a t e c o n d i t i o n s . The i n v e s t i g a t i o n s o f v a n ' t H o f f i n t h e l a t e r p a r t o f t h e l a s t c e n t u r y and t h e b e g i n n i n g of t h e p r e s e n t on t h e n a t u r e o f t h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e on t h e e q u i l i b r i u m r a t i o s o f s u b s t r a t e and p r o d u c t s a r e now f u n d a m e n t a l t o o u r u n d e r s t a n d i n g o f b i o c h e m i c a l c a t a l y s i s . By p l o t t i n g t h e I n Keq v e r s u s t h e i n v e r s e of t h e a b s o l u t e t e m p e r a t u r e he was a b l e t o d e t e r m i n e t h e h e a t c h a n g e of a g i v e n c h e m i c a l r e a c t i o n . T h i s c h a n g e ( e n t h a l p y ) i s a c h a r a c t e r i s t i c o f a c h e m i c a l r e a c t i o n u n d e r a g i v e n s e t o f c o n d i t i o n s . A r r h e n i u s u s e d a s i m i l a r g r a p h i c a l t e c h n i q u e t o d e t e r m i n e t h e e n e r g y r e q u i r e d f o r t h e r a t e l i m i t i n g r e a c t i o n i n a g i v e n d i r e c t i o n . l t was a l s o p o s s i b l e t o c a l c u l a t e t h e e n t h a l p y and e n t r o p y o f t h e a c t i v a t i o n e v e n t f r o m t h e s e p l o t s . A l t h o u g h n e i t h e r v a n ' t H o f f n o r A r r h e n i u s s t u d i e d t h i s i t i s assumed t h a t a t l e a s t f o r c h e m i c a l r e a c t i o n s t h e e n t h a l p y d i f f e r e n c e s o f t h e a c t i v a t i o n e v e n t i n t h e f o r w a r d and r e v e r s e r e a c t i o n s w o u l d e q u a l t h e e n t h a l p y c h a n g e o f t h e o v e r a l l r e a c t i o n a s d e t e r m i n e d f r o m v a n ' t H o f f p l o t s . I n t h e c a s e o f b i o l o g i c a l c a t a l y s i s one may e x p e c t a d i f f e r e n t r e s u l t . F i g u r e 4-1 d e m o n s t r a t e s t h i s d i f f e r e n c e . The s l o p e o f t h e I n ( V m a x f / V m a x r ) v e r s u s t h e i n v e r s e o f a b s o l u t e t e m p e r a t u r e d o e s n o t e q u a l t h e s l o p e of I n Keq v e r s u s 1/T. A d d i t i o n a l l y , t h e p o s i t i o n on t h e o r d i n a t e i s c h a n g e d . T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t ^G f l i s d e t e r m i n e d by b o t h e n t h a l p i c and e n t r o p i c e f f e c t s . F i g u r e 4-2 shows t h e e n t h a l p i c and e n t r o p i c d i f f e r e n c e s b e tween AG^ and AG0. O v e r a l l t h e r e i s a 25 t r e n d t o w a r d s c o m p e n s a t i n g an e n t h a l p y c h a n g e w i t h a c o r r e s p o n d i n g c h a n g e o f TflS . As T a b l e 4-3 h a s a l r e a d y dp d e m o n s t r a t e d i t i s p o s s i b l e t o i n d e p e n d e n t l y p e r t u r b ^ G.f w i t h r e s p e c t t o ^Gr . T h i s means i n e f f e c t t h a t ^ G R may assume any v a l u e , p o s i t i v e , n e g a t i v e s m a l l o r l a r g e . As w i l l become a p p a r e n t l a t e r t h i s i s an i m p o r t a n t d e s i g n f e a t u r e o f enzymes and d i r e c t l y a f f e c t s t h e n a t u r e o f t h e s t e a d y - s t a t e i n t h e r e a c t i o n t h e enzyme c a t a l y z e s i n i t s s p e c i f i c m e t a b o l i c p a t h w a y . The n e x t c h a p t e r w i l l d e m o n s t r a t e how t h e i n d e p e n d e n t m o d u l a t i o n o f b i n d i n g and c a t a l y s i s and t h e f r e e d o m o f d e s i g n r e q u i r e d f o r b i o l o g i c a l c a t a l y s i s a r e n e c e s s a r y t o p e r m i t t h e s t e a d y - s t a t e and a l s o p r o v i d e f o r s t a b i l i t y d u r i n g s t e a d y - s t a t e t r a n s i t i o n s . 26 T a b l e 4-2 I n d e p e n d e n t m o d u l a t i o n o f b i n d i n g o f s u b s t r a t e a n d p r o d u c t i n t h e f u m a r a s e r e a c t i o n . V a l u e s a r e s u b t r a c t e d means f o r w h i c h t h e m a x i m a l s t a n d a r d e r r o r i s 5.9%. T r a n s i t i o n c o n d i t i o n s AAGjf. ( c a l / m o l ) b m ( c a l / m o l ) 20°C,pH 7.3-pH 8.0 pH 7.3, 0.25M KC1,30-40°C 30°C, pH 7.3, 0-0.25M KC1 pH 8.0, 20-40°C •125 420 -5 270 185 40 -645 275 T a b l e 4-3 I n d e p e n d e n t p e r t u r b a t i o n o f A w i t h r e s p e c t t o A G f o r t h e f u m a r a s e r e a c t i o n . V a l u e s a r e s u b t r a c t e d means f o r w h i c h t h e m a x i m a l s t a n d a r d e r r o r i s 0.85%. T r a n s i t i o n c o n d i t i o n s —A G^ ( c a l / m o l ) ( c a l / m o l ) pH 7.3, 20-40°C pH 7.3, 40°C, 0-0.25M KC1 20°C, pH 7.3-pH 8.0 pH 8.0, 20-40°C 320 45 305 220 135 850 •260 5 2 8 F i g u r e 4 - l a E f f e c t o f t e m p e r a t u r e on I n ( V m a x f / V m a x r ) f o r f u m a r a s e u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s . 4 - l b v a n ' t H o f f p l o t o f f u m a r a s e r e a c t i o n u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s slope - 1690 3.403 3.45 K 3 0 0 0 3 29 F i g u r e 4-2 The r o l e o f e n t h a l p y a n d e n t r o p y i n p e r t u r b a t i o n s o f ZiGj^.A p l o t o f e n t h a l p y c h a n g e (AH ) v e r s u s e n t r o p y c h a n g e (As ) u n d e r v a r i o u s c o n d i t i o n s . AH =AH e -AH° and AS = A S 0 - A S ° . 30 CHAPTER 5 ENZYME DESIGN AND METABOLISM I n t r o d u c t i o n The s t e a d y - s t a t e o f a m e t a b o l i c p a t h w a y must encompass t h e f o l l o w i n g : 1) . F l u x o f m e t a b o l i c compounds a t any p o i n t ( i . e . a t any enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n ) i n t h e p a t h w a y must be t h e same a s t h a t a t any o t h e r p o i n t i n t h e same p a t h w a y ( b r a n c h p o i n t s p r o v i d e e x c e p t i o n s ) . 2) . The c o n c e n t r a t i o n s o f a l l i n t e r m e d i a t e s must n o t c h a n g e a t any g i v e n v e l o c i t y . C hanges may o c c u r d u r i n g s t e a d y - s t a t e t r a n s i t i o n s b u t t h e y must a g a i n be c o n s t a n t a t t h e new v e l o c i t y . I d e a l l y s t r i c t c o n t r o l s h o u l d be m a i n t a i n e d d u r i n g t h e t r a n s i t i o n . I n o r d e r t o u n d e r s t a n d t h e s t e a d y - s t a t e o f m e t a b o l i s m i t i s f i r s t n e c e s s a r y t o l o o k a t a model s y s t e m t o s e e what r a n g e o f s t e a d y - s t a t e s c a n e x i s t . Once t h i s g e n e r a l s t e a d y - s t a t e h a s been e x a m i n e d t h e b i o l o g i c a l c o n s t r a i n t s c a n be i m p o s e d upon t h e s y s t e m and any d e s i g n f e a t u r e s ( t h o s e f e a t u r e s w h i c h two s e q u e n t i a l enzymes i n a p a t h w a y must have t o p e r m i t a s t e a d y -s t a t e w i t h i n t h e b i o l o g i c a l c o n s t r a i n t s ) c a n be d e t e r m i n e d . MATERIALS AND METHODS The f l u x e s f o r t h e two u n i - u n i m e c h a n i s m s c a t a l y z i n g : 31 E l E2 A v * C were c a l c u l a t e d u s i n g t h e f o l l o w i n g e q u a t i o n s : v= v = V a ( [ A 3 / K a ) - V b l ( [ B ] / K b l ) 1 + ( [ A ] / K a ) + ( I B ] / K b l ) V b l ( [ A ] / K b 2 ) ~ V c ( [ B ] / K b 2 ) 1 + ( [ A ] / K b 2 ) + ( [ B ] / K c ) (5-lb) f o r E l and E2 r e s p e c t i v e l y where Va and V b l r e f e r t o t h e m a x i m a l v e l o c i t y f o r t h e f o r w a r d and r e v e r s e r e a c t i o n s r e s p e c t i v e l y f o r E l and Vb2 and Vc r e f e r t o t h e m a x i m a l v e l o c i t y f o r t h e f o r w a r d and r e v e r s e r e a c t i o n s r e s p e c t i v e l y o f E 2 . Ka and Kc r e f e r t o t h e M i c h a e l i s c o n s t a n t s f o r s u b s t r a t e s A and C r e s p e c t i v e l y , w h i l e K b l and Kb2 r e f e r t o t h e M i c h a e l i s c o n s t a n t s f o r t h e s h a r e d s u b s t r a t e B f o r E l a n d E2 r e s p e c t i v e l y . A r b i t r a r y v a l u e s f o r t h e k i n e t i c p a r a m e t e r s were u s e d e x c e p t where s p e c i f i c r e l a t i o n s h i p s were b e i n g t e s t e d . A s u r f a c e v i s u a l i z a t i o n r o u t i n e a v a i l a b l e i n t h e p u b l i c f i l e s o f t h e UBC Computer C e n t r e was u s e d t o p r o d u c e a t h r e e d i m e n s i o n a l r e p r e s e n t a t i o n f r o m e q u a t i o n s 5 - l a , b v a r y i n g p r o d u c t c o n c e n t r a t i o n a t c o n s t a n t s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n o v e r a r a n g e of s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s . T h r e e d i m e n s i o n a l r e p r e s e n t a t i o n o f an enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n F i g u r e 5-1 shows t h e s u r f a c e s p r o d u c e d by a r e p r e s e n t a t i v e enzyme. On t h e X a x i s t h e c o n c e n t r a t i o n o f A i s r e p r e s e n t e d . The Y - a x i s r e p r e s e n t s t h e c o n c e n t r a t i o n o f B. The r e g i o n o f p o s i t i v e Z ( a b o v e t h e X-Y p l a n e ' r e p r e s e n t s p o s i t i v e f l u x i n t h e d i r e c t i o n RESULTS AND DISCUSSION 32 of B p r o d u c t i o n . R e g i o n s o f t h e n e g a t i v e Z - a x i s r e p r e s e n t f l u x i n t h e d i r e c t i o n o f A p r o d u c t i o n . The s t r a i g h t l i n e p r o d u c e d by t h e i n t e r s e c t i o n of t h e X-Y p l a n e (Z=0) and t h e enzyme r e a c t i o n s u r f a c e r e p r e s e n t s t h e e q u i l i b r i u m s i t u a t i o n ( n e t f l u x i s z e r o ) . The e q u a t i o n o f t h i s l i n e i s t h e e q u i l i b r i u m c o n s t a n t (Keq) f o r t h e r e a c t i o n . I n a c l o s e d o r i s o l a t e d s y s t e m t h e r e a c t i o n w o u l d p r o c e d e t o e q u i l i b r i u m a l o n g t h e s u r f a c e i n a p a t h d e s c r i b e d by t h e law of c o n s e r v a t i o n o f mass. The G e n e r a l S t e a d y - S t a t e F o r t h e s e q u e n c e : E l E2 - - - > A ^ = = = = =* B ^=====* C > i f t h e c o n c e n t r a t i o n s o f A and C a r e h e l d c o n s t a n t t h e s t e a d y -s t a t e w i l l e x i s t w henever t h e c o n c e n t r a t i o n o f B ( t h e s h a r e d s u b s t r a t e ) i s c o n s t a n t and t h e v e l o c i t y v f o r E l e q u a l s t h e v e l o c i t y f o r E2. U s i n g a r b i t r a r y v a l u e s f o r t h e k i n e t i c p a r a m e t e r s o f E l and E2 t h e v a l u e s ^ o f B w h i c h p e r m i t s t e a d y -s t a t e s may be c a l c u l a t e d . F i g u r e 5-2 d e m o n s t r a t e s s u c h a ' s e r i e s o f c a l c u l a t i o n s . One l i n e o f e a c h p a i r r e f e r s t o t h e r e l a t i o n s h i p b e t ween A and B a s v i n c r e a s e s and t h e o t h e r t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n B and C. C h a n g i n g t h e k i n e t i c p a r a m e t e r s o f E l a nd E2 g e n e r a t e s a n o t h e r s u c h p a i r of l i n e s , where t h i s new p a i r o f l i n e s d e f i n e s a n o t h e r e q u a l l y v a l i d s t e a d y - s t a t e . T h e r e a r e a l a r g e number o f such- r e l a t i o n s h i p s e a c h d e p e n d i n g on t h e k i n e t i c p a r a m e t e r s a s s i g n e d t o E l and E2. However, a s o u t l i n e d i n t h e n e x t s e c t i o n b i o c h e m i c a l s y s t e m s c a n n o t be so l o o s e l y d e s i g n e d . I m p o r t a n t c o n s t a i n t s a r e p l a c e d on b i o l o g i c a l s y s t e m s 33 t h a t s e v e r e l y l i m i t t h e k i n d o f s t e a d y - s t a t e s o l u t i o n s t h a t a r e a c t u a l l y o b s e r v e d i n m e t a b o l i c p a t h w a y s . I s h a l l c o n s i d e r two a p p a r e n t l y most c r i t i c a l c o n s t r a i n t s b e l o w . The r o l e o f a f f i n i t y S i n c e t h e o v e r a l l a f f i n i t y o f a p a t h w a y d e t e r m i n e s t h e d i r e c t i o n o f f l u x , p e r h a p s t h a most o b v i o u s c o n s t r a i n t s i m p o s e d on a m e t a b o l i c p a t h w a y , l i m i t i n g t h e number of p e r m i t t e d s t e a d y -s t a t e s r e l a t e t o a f f i n i t y c o n t r o l . The a f f i n i t y o f t h e p a t h w a y i s t h e sum o f a l l t h e a f f i n i t i e s i n t h e p a t h w a y , some o f w h i c h may be p o s i t i v e and o t h e r s n e g a t i v e ( P r i g o g i n e , 1 9 5 5 ) . To most e f f e c t i v e l y c o n t r o l t h e a f f i n i t y and t h e r e f o r e t h e f l u x o f a p a t h w a y a s m a l l number o f enzymes a r e i n v e s t e d w i t h t h e l a r g e s t a f f i n i t i e s i n a l l t h e p a t h w a y . These " r e g u l a t o r y " e nzymes, t h a t d e t e r m i n e t h e d i r e c t i o n o f f l u x , must be r e p l a c e d w i t h o t h e r enzymes w i t h an o p p o s i t e a f f i n i t y t o r e v e r s e t h e p a t h w a y . T h e s e l a t t e r enzymes c o n s t i t u t e t h e s o - c a l l e d by p a s s r e a c t i o n p a t h w a y s and l i k e t h e enzyme s t e p s t h e y b y - p a s s a r e u s u a l l y c l o s e l y r e g u l a t e d ( A t k i n s o n , 1 9 7 7 ) . W i t h c o n t r o l i n v e s t e d i n r e g u l a t o r y e nzymes, t h e a f f i n i t i e s o f t h e o t h e r r e a c t i o n s a r e t y p i c a l l y s m a l l ( c l o s e t o e q u i l i b r i u m v a l u e s ) . The r e a c t i o n s w i t h s t e a d y - s t a t e s c l o s e t o e q u i l i b r i u m w i l l r e q u i r e h i g h e r enzyme a c t i v i t i e s f o r a g i v e n e q u i l i b r i u m c o n s t a n t i n o r d e r t o m a i n t a i n t h e same f l u x a s t h o s e w i t h s t e a d y - s t a t e s f a r f r o m t h e e q u i l i b r i u m v a l u e . T h i s q u a l i t a t i v e o b s e r v a t i o n i s e v i d e n t i n t h e o f t c i t e d d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e r e g u l a t o r y enzymes w h i c h c a t a l y z e r e a c t i o n s w i t h s t e a d y - s t a t e s f a r f r o m e q u i l i b r i u m and a r e f o u n d i n low a c t i v i t y ( a s m e a s u r e d by Vmax) and t h e n o n -r e g u l a t o r y enzymes t h a t c a t a l y z e r e a c t i o n s c l o s e t o e q u i l i b r i u m 34 and a r e f o u n d i n g r e a t e r a c t i v i t y ( a s m e a s u r e d by Vmax). T h i s i s most e a s i l y u n d e r s t o o d w i t h r e f e r e n c e t o an enzyme r e s p o n s e s u r f a c e ( e g . F i g u r e 5-1) C l o s e t o t h e e q u i l i b r i u m v a l u e t h e f l u x i s f a r t h e r f r o m i t s Vmax v a l u e t h a n t h e f a r f r o m e q u i l i b r i u m c a s e where t h e f l u x i s much c l o s e r t o i t s Vmax v a l u e . T h e r e f o r e , when m e a s u r i n g enzyme a c t i v i t i e s by t h e Vmax method i t w i l l be o b s e r v e d t h a t r e g u l a t o r y enzymes w i l l have a l o w e r Vmax v a l u e s t h a n t h e n o n - r e g u l a t o r y enzyme ( w i t h s i m i l a r e q u i l i b r i u m c o n s t a n t ) , e v e n t h o u g h in v i v o a t s t e a d y - s t a t e b o t h f u n c t i o n a t t h e same r a t e . T h i s d i f f e r e n c e i n Vmax l e v e l s o f r e g u l a t o r y a nd n o n - r e g u l a t o r y enzymes i n d e e d i s a l w a y s o b s e r v e d (Newsholme and S t a r t , 1 9 7 9 ) . An i m p o r t a n t c o n s e q u e n c e o f t h i s o r g a n i z a t i o n ( o f v a r y i n g a f f i n i t i e s a l o n g t h e p a t h w a y ) i s t h a t t h e Vmaxf f o r one enzyme may be v e r y l a r g e w i t h r e s p e c t t o t h e Vmaxf f o r t h e n e x t enzyme i n t h e p a t h w a y , i n w h i c h c a s e t h e r a n g e o f p o s s i b l e s t e a d y - s t a t e s n a r r o w s ( d i s c u s s e d f u t h e r b e l o w ) . Thus one b i o l o g i c a l c o n s t r a i n t on c o n d i t i o n s f o r t h e s t e a d y - s t a t e r e q u i r e s enzyme f u n c t i o n a t r e l a t i v e l y s p e c i f i c a f f i n i t i e s . T h a t i s why i t i s i m p o r t a n t t o e x p l o r e t h e d e t e r m i n a n t s o f a f f i n i t y f o r any g i v e n enzyme r e a c t i o n i_n v i v o . T h i s e x p l o r a t i o n , i t t u r n s o u t i d e n t i f i e s one o f t h e most i m p o r t a n t c o n s t r a i n t s on i n  v i v o c o n d i t i o n s f o r t h e s t e a d y - s t a t e . As p o i n t e d o u t i n t h e p r e v i o u s c h a p t e r s , a c h a r a c t e r i s t i c o f m e t a b o l i c enzymes w h i c h seems t o d i s t i n g u i s h them f r o m most i f n o t a l l o t h e r k i n d s o f c a t a l y s t s i s t h e p a r a m e t e r 4 G ^ . S i n c e ^ G j ^ r e f e r s t o t h e d i f f e r e n c e i n t h e G i b b s f r e e e n e r g y o f a c t i v a t i o n o f t h e f o r w a r d c o m p a r e d t o t h e r e v e r s e r e a c t i o n , one may e x p e c t i t t o be c o r r e l a t e d i n some way w i t h s u b s t r a t e a n d 35 p r o d u c t c o n c e n t r a t i o n s _in v i v o . I n f a c t , t h i s i s o b s e r v e d . I f t h e s u b s t r a t e and p r o d u c t c o n c e n t r a t i o n r a t i o s f o r v a r i o u s r e a c t i o n s i n v i v o a r e e x p r e s s e d i n t h e r m o d y n a m i c t e r m s ( i . e . As a f f i n i t y o r d i s t a n c e f r o m e q u i l i b r i u m ) , a c o r r e l a t i o n may be s e e n t o e x i s t w i t h A G g ( F i g u r e 5 - 3 ) . T h i s i s shown f o r a s e r i e s o f 12 enzymes f o r w h i c h i_n v i v o d a t a on s u b s t r a t e l e v e l s c o u l d be o b t a i n e d . T h e s e t w e l v e enzymes v a r y i n m e t a b o l i c f u n c t i o n a s w e l l a s t h e a f f i n i t i e s a t w h i c h c a t a l y s i s o c c u r s i_n v i v o , y e t t h e r e i s a r e a s o n a b l y good r e l a t i o n s h i p ( c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t = 0.9371) b e t w e e n a f f i n i t y _i_n v i v o a n d ^ G R ( F i g u r e 5 - 3 ) . Thus f o r t h e m a i n t e n a n c e o f s t e a d y - s t a t e , a s e c o n d i m p o r t a n t c o n s t r a i n t i s t h i s r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e in_ v i v o s u b s t r a t e and p r o d u c t c o n c e n t r a t i o n s and t h e d e s i g n o f t h e enzymes c a t a l y z i n g t h e r e a c t i o n , a l l o w i n g _in v i v o e q u i v a l e n c e b e t w e e n A G j ^ a n d a f f i n i t y . U s i n g t h e s e two c o n s t r a i n t s : 1. C o n t r o l o v e r a f f i n i t y 2. E q u i v a l e n c e of A G R w i t h a f f i n i t y t h e g e n e r a l s t e a d y - s t a t e may be r e e x a m i n e d t o d e t e r m i n e t h e n a t i r e o f t h e m e t a b o l i c s t e a d y - s t a t e and t h e d e s i g n f e a t u r e s r e q u i r e d o f t h e enzymes t o a l l o w . a b i o l o g i c a l l y m e a n i n g f u l  s t e a d y - s t a t e t o , b e d e v e l o p e d and m a i n t a i n e d . The S t e a d y - s t a t e o f M e t a b o l i s m To i n v e s t i g a t e t h e enzyme r e q u i r e m e n t s f o r s t e a d y - s t a t e i n t h i s more r e s t r i c t e d c o n t e x t , t h e f o l l o w i n g scheme was u s e d t o s i m u l a t e a s e q u e n c e o f two enzymes i n m e t a b o l i s m : E l E2 36 where E l r e p r e s e n t s t h e f i r s t enzyme i n t h e s e q u e n c e b e i n g c o n s i d e r e d w h i c h c a t a l y z e s t h e c o n v e r s i o n of A t o B. S i m i l a r l y E2 c a t a l y z e s t h e c o n v e r s i o n o f B t o C. T h i s t r e a t m e n t d i f f e r s f r o m t h e p r e v i o u s t r e a t m e n t of t h e g e n e r a l s t e a d y - s t a t e i n two i m p o r t a n t ways. I n t h e f i r s t p l a c e , A a n d C c o n c e n t r a t i o n s a r e n o t h e l d c o n s t a n t . I n t h e s e c o n d c a s e , ^ G R i s i s assumed e q u i v a l e n t t o t h e a f f i n i t y . By i m p o s i n g t h e A G ^ a f f i n i t y r e l a t i o n s h i p on E l , i t i s p o s s i b l e t o c a l c u l a t e what t h e k i n e t i c p a r a m e t e r s must be f o r E2 s u c h t h a t t h e a f f i n i t y o f E2 i s a l s o e q u i v a l e n t t o A G - g f o r E2. T h i s was a c c o m p l i s h e d by i m p o s i n g , i n a d d i t i o n t o t h e s t e a d y - s t a t e c o n s t r a i n t s u s e d i n t h e c a s e o f t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e g e n e r a l s t e a d y - s t a t e , t h e a d d i t i o n a l c o n s t r a i n t s l i s t e d a b o v e . I t e r a t i v e c h a n g e s i n t h e M i c h a e l i s c o n s t a n t s and Vmax's were made • u n t i l b i o l o g i c a l l y a c c e p t a b l e r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n C a n d B were o b t a i n e d . T h r o u g h t h i s p r o c e d u r e t h e Km v a l e s and t h e c o n c e n t r a t i o n s o f b o t h enzymes were a l w a y s f o u n d t o be c r i t i c a l l y i m p o r t a n t a n d a p p a r e n t l y i n  v i v o c l o s e l y a d j u s t e d , t o s t e a d y - s t a t e f u n c t i o n . E a c h of t h e s e i s c o n s i d e r e d s e p a r a t e l y b e l o w . 1.The Km f o r t h e s h a r e d s u b s t r a t e f o r b o t h enzymes must be  t h e same. One i m p o r t a n t outcome of t h i s a n a l y s i s i s t h a t f o r t h e s e q u e n c e a t s t e a d y - s t a t e , E l E2 > A _ = = = A B _ = = = i . c > t h e Km f o r B a s p r o d u c t f o r enzyme 1 e q u a l s t h e Km f o r B a s s u b s t r a t e f o r enzyme 2. I n b i o l o g i c a l t e r m s t h i s r e l a t i o n s h i p 37 may n e e d o n l y t o be a p p r o x i m a t e d t o a c h i e v e t h e s t e a d y - s t a t e . F i g u r e 5-4a shows t h e e f f e c t on t h e p r o d u c t / s u b s t r a t e r a t i o o f i n c r e a s i n g t h e Km o f B f o r Enzyme 2 by 1, 2, 3, 4, and 5 f o l d . I n t h i s p r o c e d u r e t T h e r a t i o o f B/A i s f i x e d a t a r a t i o e q u a l t o t h e r a t i o K b l / K a and t h e v e l o c i t y c a l c u l a t e d by i n c r e a s i n g s u b s t r a t e and p r o d u c t c o n c e n t r a t i o n s . The v a l u e o f C i s t h e n c a l c u l a t e d f o r E2 w h i c h g i v e t h e same v e l o c i t y as E l a t t h e same c o n c e n t r a t i o n o f t h e s h a r e d s u b s t r a t e . The more t h e Km f o r t h e s h a r e d s u b s t r a t e d e v i a t e s f r o m t h e i d e a l r a t i o ( K b l = K b 2 ) t h e l e s s l i n e a r t h e s t e a d y - s t a t e becomes and e v e n t u a l l y t h e i n t e r s e c t i o n p a s s e s o n t o t h e r e g i o n of n e g a t i v e s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n . I n o t h e r w o r d s t h e s t e a d y - s t a t e i s n o t c o n t i n u o u s f r o m z e r o t o l a r g e s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s when K b l i s l e s s t h a n Kb2. M o r e o v e r , t h e s t e a d y - s t a t e no l o n g e r e x t e n d s o v e r t h e m e t a b o l i c a l l y i m p o r t a n t p a r t of t h e c u r v e ( l o w t o i n t e r m e d i a t e s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s ) . F i g u r e 5-4b shows t h e e f f e c t o f l o w e r i n g t h e Km f o r B o f E 2 . As t h e Km d r o p s t h e r e g i o n c l o s e t o t h e o r i g i n c u r v e s b u t becomes l i n e a r a s c o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e s . The s l o p e s o f t h e s e l i n e s a r e s i m i l a r . F i g u r e 5-4 d e m o n s t r a t e s t h a t i n c r e a s i n g Kb2 f r o m t h e i d e a l s i t u a t i o n K b 2 / K b l = 1 r e s u l t s i n a d i s c o n t i n u o u s i n t e r s e c t i o n . L o w e r i n g t h e r a t i o K b 2 / K b l by c h a n g i n g Kb2 p r o d u c e s a c c e p t a b l e i n t e r s e c t i o n o f s i m i l a r s l o p e . I f h o w e v e r , K b l i s c h a n g e d i n t h e same way a s was Kb2, i n c r e a s i n g K b l r e s u l t s i n d i s c o n t i n u o u s i n t s e c t i o n s b u t t h i s t i m e t h e r a t i o K b 2 / K b l has been l o w e r e d . From t h i s a n a l y s i s I c o n c l u d e t h a t t h e i d e a l r e l a t i o n s h i p b e t w e e n K b l a n d Kb2 i s K b l = K b 2 . A t p r e s e n t i t i s n o t p o s s i b l e t o d e t e r m i n e what t h e t o l e r a n c e s t o Km n o n - e q u i v a l e n c e a r e i_n v i v o . Km e q u i v a l e n c e i s 38 an i d e a l s i t u a t i o n w h i c h e v o l u t i o n p r e s u m a b l y w o u l d t e n d t o p r o d u c e . H owever, o t h e r f a c t o r s may p r e v e n t t h i s i d e a l f r o m a c t u a l l y b e i n g a c h i e v e d in v i v o . 2.The enzyme c o n c e n t r a t i o n o f one o r b o t h enzymes must be  a d j u s t e d t o t h e c o n t i n u o u s s t e a d y - s t a t e . T h a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f enzyme one i n t h e s e q u e n c e i s r e l a t e d t o t h a t o f enzyme two i s a n o t h e r i m p o r t a n t outcome o f t h i s a n a l y s i s . The e q u a t i o n d e s c r i b i n g t h i s r e l a t i o n s h i p i s f o r two enzymes i s (when Kb2 = K b l ) : E1V1-E2V1 = E1V2-E2V2 ( 5 - 2 ) The d e s i g n a t i o n E1V1 r e f e r s t o t h e Vmax a c t i v i t y o f enzyme one i n t h e f o r w a r d d i r e c t i o n and E1V2 i s t h e m a x i m a l a c t i v i t y o f enzyme one i n t h e r e v e r s e d i r e c t i o n . F i g u r e ( 5 - 5 ) shows t h e e f f e c t o f c h a n g i n g t h e amount of one enzyme away f r o m t h e i d e a l s i t u a t i o n ( e q u a t i o n 5 - 2 ) . As t h e amount o f E2 i n c r e a s e s t h e i n t e r s e c t i o n d e s c r i b i n g t h e s t e a d y - s t a t e becomes l e s s l i n e a r a n d a g a i n p a s s e s i n t o t h e r e g i o n o f n e g a t i v e s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n i m p l y i n g a d i s c o n t i n u o u s s t e a d y - s t a t e . I n c r e a s i n g t h e c o n c e n t r a t i o n o f E2 r e s u l t s i n c o n t i n u o u s i n t e r s e c t i o n s w i t h d e c r e a s i n g s l o p e s . A g a i n , i f t h e same e x p e r i m e n t i s done t o E l we w i l l f i n d t h a t i n c r e a s i n g c o n c e n t r a t i o n o f E l r e s u l t s i n a d i s c o n t i n u o u s i n t e r s e c t i o n . T h u s , p e r t u r b i n g e q u a t i o n 5-2 r e s u l t s i n d i s c o n t i n u o u s i n t e r s e c t i o n s w h i c h a r e b i o l o g i c a l l y u n a c c e p t a b l e . W h i l e e q u a t i o n ( 5 - 2 ) may be l i m i t e d t o t h i s s y s t e m o f two u n i - u n i m e c h anisms p r e s u m a b l y o t h e r s i m i l a r r e l a t i o n s h i p s e x i s t f o r o t h e r c o m b i n a t i o n s o f enzymes. An e q u a t i o n l i k e ( 5 - 2 ) p e r m i t s an e x p l a n a t i o n o f t h e o b s e r v e d c o n s t a n t r e l a t i o n s h i p 39 b e t w e e n enzyme a c t i v i t i e s i n a p a t h w a y ( t h e c o n s t a n t - p r o p o r t i o n g r o u p s o f P e t t e , ( 1 9 6 5 ) ) . Once t h e above two d e s i g n f e a t u r e s a r e i m p o s e d on t h e two s e q u e n t i a l enzymes t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n A G p and in_ v i v o i s o b t a i n e d . T h i s r e s u l t w h i c h i s a s a t i s f a c t o r y e x p l a n a t i o n o f t h e e m p i r i c a l d a t a i n f i g u r e 5-3, may be p r o v e n by s u b s t i t u t i n g v a l u e s o f : [ A ] =[ B] x a f f l a n d [ B ] = [C] x a f f 2 Where a f f l a n d a f f 2 a r e t h e p r o d u c t / s u b s t r a t e r a t i o s o f t h e r e a c t i o n s s e t e q u a l t o t h e Km r a t i o K b l / K a and Kc/Kb2 f o r E l a n d E2 r e s p e c t i v e l y . ( T h i s i s an e q u i v a l e n t s t a t e m e n t o f t h e e x p r e s s i o n AGJ J = a f f i n i t y due t o t h e H a l d a n e r e l a t i o n s h i p ) . The e q u a t i o n s d e s c r i b i n g t h e s t e a d y - s t a t e b e t w e e n E l a n d E2 a r e : V a t B x a f f l ) / K a - V b l ( B / K b l ) f l u x = ( 5 - 4 ) l + ( B x a f f l ) / K a + ( B / K b l ) V b l ( B /Kb2) - V c ( B / a f f 2 ) / K c l + ( B /Kb2) + ( B / a f f 2 ) / K c A t e v e r y p o i n t a l o n g t h e l i n e o f i n t e r s e c t i o n t h e r a t e o f s y n t h e s i s o f B by E l e q u a l s e x a c t l y t h e r a t e o f i t s u t i l i z a t i o n by E 2 . C o n s t a n c y of a f f i n i t y d u r i n g s t e a d y - s t a t e t r a n s i t i o n s I t may be s e e n f r o m F i g u r e s 5-4 and 5-5 t h a t t h e o n l y s e t o f k i n e t i c c o n s t r a i n t s s a t i s f y i n g t h e o b s e r v e d ir\ v i v o r e l a t i o n s h i p s a r e Km e q u i v a l e n c e and t h e Vmax r e l a t i o n s h i p s 40 c o n t a i n e d i n e q u a t i o n 5-2. A l l o t h e r s o l u t i o n s w h i c h g i v e s t e a d y - s t a t e s a r e e i t h e r p a r a l l e l t o t h e i d e a l s o l u t i o n ( F i g u r e 5-4) o r a r e s t r a i g h t l i n e s r a d i a t i n g f r o m t h e o r i g i n ( F i g u r e 5-5) w h i c h w i l l n e v e r c r o s s t h e l i n e w h i c h d e s r i b e s t h e A G ^ a f f i n i t y e q u i v a l e n c e o b s e r v e d i_n v i v o . I t f o l l o w s t h a t t h a t when t h i s s i m p l e r e l a t i o n s h i p i s i m p o s e d on two s e q u e n t i a l enzymes a c o n s t a n c y o f a f f i n i t y i s m a i n t a i n e d o v e r b r o a d r a n g e s o f c o n c e n t r a t i o n s o f s u b s t r a t e a n d p r o d u c t . A c c o r d i n g l y , two t h r e e d i m e n s i o n a l s u r f a c e s o f enzymes d e s i g n e d f o r t h e s t e a d y - s t a t e o f m e t a b o l i s m a r e s u p e r i m p o s e d i n F i g u r e 5-6a. I n o r d e r t o a c h i e v e t h i s t h e s h a r e d s u b s t r a t e i s p l a c e d on t h e same a x i s . The s c a l e s on t h e o t h e r a x i s a r e a d j u s t e d so t h e i n t e r s e c t i o n d e s c r i b e s t h e m e t a b o l i c s t e a d y -s t a t e . The s t e a d y - s t a t e c a n be seen t o be l i n e a r f r o m t h e o r i g i n t o i n f i n i t e c o n c e n t r a t i o n s a s v e l o c i t y i n c r e a s e s . The i n t e r s e c t i o n i s a l s o c o n t i n u o u s f r o m t h e s i d e when t h e t h r e e d i m e n s i o n a l f i g u r e i s c u t a l o n g t h e i n t e r s e c t i o n a n d v i e w e d f r o m t h e s i d e ( F i g u r e 5 - 6 b ) . As a t r a n s i t i o n f r o m one r a t e o f f l u x t o a n o t h e r o c c u r s , t h e a f f i n i t y r e m a i n s t h e same e v e n t h o u g h t h e c o n c e n t r a t i o n s o f s u b s t r a t e a n d p r o d u c t c h a n g e . T h i s r e l a t i o n s h i p e x p l a i n s a n d c o n f i r m s t h e o b s e r v a t i o n s o f s e v e r a l a u t h o r s ( L o w r y a nd P a s s o n n e a u , 1964) t h a t many s t e p s i n g l y c o l y s i s a r e m a i n t a i n e d c l o s e t o e q u i l i b r i u m e v e n d u r i n g i n c r e a s e d f l u x when t h e c o n c e n t r a t i o n o f i n t e r m e d i a t e s i n t h e p a t h w a y i n c r e a s e s u b s t a n t i a l l y (Lowry,O.H. P e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n , 1980, H i n t z , C . S . , L o w r y , C . V . , I n g , J . , F e l l , R.,Chi,M.M.-Y. And Lowry,O.H., 1 9 8 0 ) . T h i s most i m p o r t a n t r e s u l t h a s an a n a l o g y i n t h e e q u i l i b r i u m s i t u a t i o n o f most c h e m i c a l 41 s y s t e m s where k j / k - j = Keq. S t a b i 1 i t y o f t h e s t e a d y - s t a t e of m e t a b o l i s m A s t e a d y - s t a t e o f any s o r t may be u n s t a b l e i n w h i c h c a s e s m a l l p e r t u r b a t i o n s of t h e v a r i a b l e s d e t e r m i n i n g i t w i l l r e s u l t i n a new s t a t e b e i n g r e a c h e d . A l t e r n a t i v e l y , i t may be s t a b l e i n w h i c h c a s e s m a l l p e r t u r b a t i o n s w i l l l e a d back t o t h e s t e a d y -s t a t e ( B o y c e and D i P r i m a , 1 9 7 7 ) . The s t e a d y - s t a t e o f m e t a b o l i s m has t h e p r o p e r t y o f b e i n g s t a b l e w i t h r e s p e c t t o p e r t u r b a t i o n s of s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n . T h i s c o n c l u s i o n may be r e a c h e d by a d d i n g t h e s u r f a c e s g e n e r a t e d by E l and E2 ( F i g u r e 5 - 5 ) . The s t e a d y - s t a t e now a p p e a r s a s t h e i n t e r s e c t i o n o f t h e s u r f a c e w i t h t h e X-Y p l a n e . Above t h e X-Y p l a n e f l u x i s p o s i t i v e and t o w a r d s t h e s t e a d y - s t a t e . B e l o w t h e X-Y p l a n e t h e f l u x i s n e g a t i v e and t o w a r d t h e s t e a d y - s t a t e . A p e r t u r b a t i o n o f t h e s h a r e d s u b s t r a t e w i l l r e s u l t i n a new f l u x v e l o c i t y w h i c h w i l l r e t u r n t o t h e s t e a d y - s t a t e r e g a r d l e s s o f t h e d i r e c t i o n o f t h e p e r t u r b a t i o n . S i n c e t h e s t e a d y - s t a t e i s s t a b l e t h e f l u x v e l o c i t y w i l l be a r r e s t e d a t t h e s t e a d y - s t a t e c o n c e n t r a t i o n s . The s t e a d y - s t a t e i s t h e r e f o r e s e l f - s t a b i l i z i n g . I t r e s e m b l e s t h e r m o d y n a m i c e q u i l i b r i u m i n t h i s r e s p e c t . A t h e o r e t i c a l c o n t r u c t i s u s e f u l i f i t e x p l a i n s p r e v i o u s l y p e r p l e x i n g o b s e r v a t i o n s , and t h i s i n d e e d seems t o be t h e c a s e f o r t h e a b o v e t r e a t m e n t of t h e s t e a d y - s t a t e . I n t h e f i r s t i n s t a n c e , i t p r e d i c t s a c o n s t a n c y o f a f f i n i t y u n d e r d i f f e r e n t s t a t e s o f a c t i v i t y f o r t h i s i s a f u n c t i o n o f t h e s t e a d y - s t a t e and i s a d e s i g n f e a t u r e o f m e t a b o l i c e n z y m e s . I n f a c t , s u c h c o n s t a n c y has been f r e q u e n t l y r e p o r t e d b u t n e v e r a d e q u a t e l y e x p l a i n e d ( L o w r y and P a s s o n e a u , 1964; Guppy e_t a l . , 1979) 42 Whereas f e e d b a c k m e c hanisms u n d o u b t e d l y c a n i n f l u e n c e t h e m a g n i t u d e of t h e f l u x ( e g . s t a b l e o s c i l l a t i o n s i n g l y c o l t y i c f l u x a n d s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n a r e b e s t e x p l a i n e d by i n v o k i n g f e e d b a c k c o n t r o l a t t h e p h o s p h o f r u c t o k i n a s e s t e p , ( S e l ' k o v , 1 9 6 8 ) ) , i t i s e v i d e n t f r o m t h i s t r e a t m e n t t h a t t h e y a r e n o t s u f f i c i e n t t o a c c o u n t f o r t h e p r o p e r t i e s of s t e a d y - s t a t e f l u x a n d s t e a d y - s t a t e s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n . T h e s e e a r l y w o r k e r s g r o u p e d enzymes i n t o two b r o a d c l a s s e s : e q u i l i b r i u m enzymes t h a t c a t a l y z e r e a c t i o n s w i t h an a f f i n i t y c l o s e t o z e r o , and n o n - e q u i l i b r i u m enzymes whose a f f i n i t y i n t h e s t e a d y - s t a t e i s l a r g e . The t e r m " e q u i l i b r i u m " i n t h i s s e n s e i s i n a c c u r a t e a n d c o m p l e t e l y m i s l e a d i n g . S i n c e t h e s y s t e m i s an open o n e , t h e s t a t e o f l e a s t e n t r o p y p r o d u c t i o n ( s t e a d y - s t a t e f l u x ) r e p l a c e s e q u i l i b r i u m a s a s t a b l e s t a t e ( P r i g o g i n e , 1 9 5 5 ) . F i n a l l y t h i s t r e a t m e n t h e l p s u n d e r s t a n d why t h e Km v a l u e s o f s h a r e d s u b s t r a t e s a r e o f t e n t h e same ( e g . The Km f o r m a l a t e o f f u m a r a s e and m i t o c h o n d r i a l m a l a t e d e h y d r o g e n a s e ( B a l l a n t y n e 1980, u n p u b l i s h e d d a t a a nd numerous e x a m p l e s i n g l y c o l y s i s ) . CONCLUSIONS The s i x m a j o r c o n c l u s i o n s o f t h i s c h a p t e r a r e : 1. The m a g n i t u d e o f A G ^ i s e q u i v a l e n t t o t h e i_n v i v o a f f i n i t y . 2. F o r two enzymes s h a r i n g a s u b s t r a t e t h e Km's f o r t h a t s u b s t r a t e a r e t h e same. 3. The a f f i n i t y o f a r e a c t i o n i n m e t a b o l i s m r e m a i n s c o n s t a n t d u r i n g c h a n g e s i n f l u x (a c o n s t r a i n t t h a t may a p p l y o n l y t o n o n - r e g u l a t o r y e n z y m e s ) . 4. Enzymes c a t a l y z i n g r e a c t i o n s w i t h a f f i n i t i e s c l o s e t o 43 t h e e q u i l i b r i u m v a l u e s h o u l d have h i g h e r a c t i v i t i e s when m e a s u r e d by t h e Vmax method t h a n t h o s e c a t a l y z i n g r e a c t i o n s w i t h a f f i n i t i e s f a r f r o m e q u i l i b r i u m . 5. Enzyme c o n c e n t r a t i o n s o f two c o n s e c u t i v e u n i - u n i r e a c t i o n s a r e r e l a t e d by E1V1-E2V1 = E1V2-E2V2. 6. The s t e a d y - s t a t e o f m e t a b o l i s m i s s t a b l e w i t h r e s p e c t t o s u b s t r a t e f l u c t u a t i o n s . Of t h e s e , t h e f i r s t f o u r have some s u p p o r t i n g e v i d e n c e f r o m t h e l i t e r a t u r e ( v i d e s u p r a ) . More c o n c l u s i v e p r o o f o f (3) a n d (5) may o n l y be o b t a i n e d by m e a s u r i n g Km's and Vmax's u n d e r c o n d i t i o n s t h a t m i m i c t h e i n t r a c e l l u l a r m i l i e u a s c l o s e l y a s p o s s i b l e . The p r o o f o f (6) w i l l r e q u i r e a method o f p e r t u r b i n g s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n w h i l e m o n i t o r i n g f l u x a nd s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s in_ v i . v o . SUMMARY M e t a b o l i c enzymes a r e d e s i g n e d f o r t h e s t e a d y - s t a t e . The m a g n i t u d e o f t h e d i f f e r e n c e i n t h e G i b b s f r e e e n e r g y c h a n g e o f a c t i v a t i o n f o r w a r d c o m p a r e d t o r e v e r s e i s e q u a l t o t h e a f f i n i t y o f t h a t r e a c t i o n i n t h e s t e a d y - s t a t e and i s a l i n e a r f u n c t i o n f r o m z e r o t o i n f i n i t y . T h i s enzyme p a r a m e t e r i s e s s e n t i a l t o t h e a t t a i n m e n t , s t a b i l i t y a nd d i s p l a c e m e n t f r o m e q u i l i b r i u m o f t h e s t e a d y - s t a t e . W h i l e t h i s h a s been p r o v e n f o r a s i m p l e t h r e e enzyme s e q u e n c e _in v i v o m e a s u r e m e n t s s u g g e s t i t a p p l i e s t o many i f n o t a l l m e t a b o l i c s e q u e n c e s . The s t e a d y - s t a t e i s n o t an i n e v i t a b l e c o n s e q u e n c e o f s u b s t r a t e s h a r i n g . S e v e r a l enzyme d e s i g n p a r a m e t e r s , n o t a b l y t h e Km f o r t h e s h a r e d s u b s t r a t e a n d t h e enzyme c o n c e n t r a t i o n must be m o d u l a t e d t o p e r m i t c o n t r o l o v e r t h e a f f i n i t y o f t h e r e a c t i o n . The Km f o r t h e s h a r e d 44 s u b s t r a t e must be t h e same. The enzyme c o n c e n t r a t i o n must a l s o be a d j u s t e d p r e s u m a b l y by t h e i n t e r a c t i o n o f an a c c u m u l a t e d s u b s t r a t e (due t o n o n - s t e a d y - s t a t e b e h a v i o u r ) on t h e m a c h i n e r y o f p r o t e i n s y n t h e s i s o r by m e t a b o l i c a l l y e q u i v a l e n t s i g n a l s . W i t h t h e c h a r a c t e r i s t i c o f m e t a b o l i c enzymes t h a t A G J J = a f f i n i t y a s a p r e r e q u i s i t e f o r m e t a b o l i s m as we know i t , t h e s t a b l e s t e a d y - s t a t e i s a c h i e v e d . The c o n t r o l o f m e t a b o l i s m v i a t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n A G R and a f f i n i t y d e p e n d s upon t h e " p l a s t i c i t y " o f enzyme d e s i g n o u t l i n e d i n p r e v i o u s c h a p t e r s . 45 F i g u r e 5-1 Enzyme r e a c t i o n s u r f a c e f o r s i m p l e u n i - u n i m e c h a n i s m . / 46 F i g u r e 5-2 The g e n e r a l s t e a d y - s t a t e . F i v e p a i r s o f enzymes 1-5E1 a n d 1-5E2 were s i m u l a t e d . The k i n e t i c p a r a m e t e r s f o r E l were Va = 20,30,40,50,60 f o r s e t s 1-5 r e s p e c t i v e l y V b l = 10 Ka = 3 0 K b l = 50 The k i n e t i c p a r a m e t e r s f o r E2 were f o r a l l s e t s , Vb = 10 Vc = 90 Kb2 = 40 Kc = 30 The c o n c e n t r a t i o n s o f s u b s t r a t e s A f o r E l was i n c r e m e n t e d by 1,2,3,4 and 5 and t h e c o n c e n t r a t i o n r a t i o C/A m a i n t a i n e d c o n s t a n t f o r e a c h p a i r . The C/A r a t i o was 0.5,0.6,0.7,0.8, and 0.9 f o r s e t s 1-5 r e s p e c t i v e l y . The v e l o c i t y o f t h e r e a c t i o n c a t a l y z e d by E l and E2 was i n c r e m e n t e d by 1,2,3,4 an d 5 f o r s e t s 1-5 r e s p e c t i v e l y . The c o n c e n t r a t i o n o f B f o r E l and E2 was c a l c u l a t e d u s i n g t h e e q u a t i o n K b l A B = (Va - v) + (Vc +v)C Ka Kc A ( V b l + v) + (Vb2 - v) K b 2 / K b l 47 F i g u r e 5-3 AGg, v e r s u s A G f o r enzymes a n d m e t a b o l i t e s f r o m s e v e r a l t i s s u e s . D a t a s o u r c e s a r e a p p e n d e d . A G R was d e t e r m i n e d f r o m Vmaxf/Vmaxr i n t h e same way as f o r T a b l e 4-1. U n l e s s o t h e r w i s e d e s i g n a t e d a l l d a t a a r e f o r m u s c l e enzymes a nd m e t a b o l i t e s . PGI= p h o s p h o g l u c o s e i s o m e r a s e PGM= p h o s p h o g l u c o m u t a s e AK= a d e n y l a t e k i n a s e a l d = a l d o l a s e FDPase= f r u c t o s e d i p h o s p h a t a s e CPK= c r e a t i n e p h o s p h o k i n a s e LDH= l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e G3PDH= g l y c e r a l d e h y d e - 3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e TPI= t r i o s e p h o s p h a t e i s o m e r a s e PK= p y r u v a t e k i n a s e HK= h e x o k i n a s e 48 F i g u r e 5-4 The e f f e c t o f c h a n g i n g t h e Km f o r t h e s h a r e d s u b s t r a t e on t h e s t e a d y - s t a t e . E q u a t i o n 5-l»was u s e d t o compute t h e same v e l o c i t y o f E2 a s f o r E l a t t h e same c o n c e n t r a t i o n o f B w i t h t h e k i n e t i c p a r a m e t e r s b e l o w . The v e l o c i t y was c o m p u t e d f o r E l u s i n g a c o n s t a n t r a t i o o f B t o A e q u a l t o K b l / K a . The v a l u e o f Kb2 i s i n d i c a t e d b e s i d e e a c h l i n e . Va = 200 Vb2 = 200 V b l = 100 Vc = 100 Ka = 1000 Kb2 = v a r i e d K b l = 100 Kc, = v a r i e d t o s a t i s f y H a l d a n e r e l a t i o n s h i The s o l i d l i n e s i n d i c a t e t h e r e g i o n where t h e c o n c e n t r a t i o n o f s u b s t r a t e s i s p o s i t i v e . 49 F i g u r e 5-5 The e f f e c t o f enzyme c o n c e n t r a t i o n on t h e a c h i e v e m e n t o f t h e c o n t i n u o u s s t e a d y - s t a t e . E q u a t i o n 5-lb was u s e d t o compute t h e same v e l o c i t y o f E2 a s f o r E l a t t h e same c o n c e n t r a t i o n o f B w i t h t h e k i n e t i c p a r a m e t e r s b e l o w . • The v e l o c i t y was c o m p u t e d f o r E l u s i n g a c o n s t a n t r a t i o o f B t o A e q u a l t o K b l / K a . The r a t i o Vb2/Vc i s i n d i c a t e d b e s i d e e a c h l i n e . Va=300 V b 2 = v a r i e d V b l = 2 2 5 V c = v a r i e d Ka=400 Kb2=100 Kb l = 1 0 0 Kc=200 The s o l i d l i n e s i n d i c a t e where t h e c o n c e n t r a t i o n o f s u b s t r a t e s i s p o s i t i v e . SUBSFRRFE B 0.0 SD.D 1DD.Q 15D.D 2QQ.D 25D.0 300.0 50 F i g u r e 5 - 6 a ) T h r e e d i m e n s i o n a l p l o t o f t w o s i m p l e u n i - u n i m e c h a n i s m s . b ) Two d i m e n s i o n a l p l o t o f a ) v i e w e d f r o m x - a x i s . 50a g u r e 5 - 7 S t a b i l i t y o f t h e s t e a d y - s t a t e . h-• 52 REFERENCES CITED A t k i n s o n , D . E . 1977. C e l l u l a r e n e r g y m e t a b o l i s m and i t s r e g u l a t i o n . A c a d e m i c P r e s s . San F r a n c i s c o . Boyce,W.E. a n d D i P r ima,R.C. 1977 . E l e m e n t a r y d i f f e r e n t i a l e q u a t i o n s and b o u n d a r y v a l u e p r o b l e m s . J o h n W i l e y and S o n s , T o r o n t o . Cleland,W.W. 1970. S t e a d y - s t a t e k i n e t i c s . 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J.Chem.Phys. 1 8 : 1 3 5 5 - 1 3 6 1 . . Newsholme,E.A. and S t a r t , C . 1 9 7 3 . R e g u l a t i o n i n m e t a b o l i s m , J o h n W i l e y a n d S o n s . T o r o n t o . O e s p e r , P . and M e y e r h o f , 0 . 1950. The d e t e r m i n a t i o n o f t r i o s e p h o s p h a t e i s o m e r a s e . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 7 : 2 2 3 - 2 3 3 . P e t t e , D . 1 9 6 5 . P l a n und M u s t e r im z e l l u l a r e n S t o f f w e c h s e l . D i e N a t u r w i s s e n s c h a f t e n 5 2 : 5 9 7 - 6 1 6 . P r i g o g i n e . I . 1 9 5 5 . I n t r o d u c t i o n t o t h e r m o d y n a m i c s o f r e v e r s i b l e p r o c e s s e s . The R y e r s o n P r e s s , T o r o n t o . P u r i c h , D . L . , F r o m m , H . J . and R u d o l p h , F . B . 1973 . The h e x o k i n a s e s : k i n e t i c , p h y s i c a l a nd r e g u l a t o r y p r o p e r t i e s A d v . E n z y m o l . 3 9 : 2 4 9 - 3 2 6 . 54 R o b e r t s , D . V . 1 9 7 7 . Enzyme k i n e t i c s . C a m b r i d g e U n i v e r s i t y P r e s s . L o n d o n . R o t t e n b e r g , H . 1 9 7 3 . The t h e r m o d y n a m i c d e s c r i p t i o n o f enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n s . B i o p h y s . J . 1 3 : 5 0 3 - 5 1 1 . S e l ' k o v , E . E . 1 9 6 8 . S e l f - o s c i 1 l a t i o n s i n g l y c o l y s i s.1.A s i m p l e k i n e t i c m o d e l . E u r . J . B i o c h e m . 4:79-86. S o b e r , H . A . 1 9 7 0 . Handbook of B i o c h e m i s t r y . The C h e m i c a l R u b b e r C o . , C l e v e l a n d , O h i o . T e i p e l , J . W . and H i 11,R.L.1968. The number o f s u b s t r a t e a nd i n h i b i t o r - b i n d i n g s i t e s o f f u m a r a s e . J . B i o l . C h e m . 243:5679. 5 5 ABBREVIATIONS USED Vmaxf,Vmaxr V I , V2 k c a t f , k c a t r k l , k - l Ka,Kb,Kp,Rq K i a , K i b , K i p , K i q Keq R T k h A * Ik A * G p ,&G% n e t r a t e o f p r o d u c t i o n o f s u b s t r a t e o r p r o d u c t m a x i m a l v e l o c i t y o f enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n i n f o r w a r d o r r e v e r s e d i r e c t i o n . m a x i m a l v e l o c i t y o f enzyme c a t a l y z e d r e a c t i o n i n f o r w a r d (1) o r r e v e r s e (2) d i r e c t i o n , c a t a l y t i c r a t e c o n s t a n t ' f o r f o r w a r d o r r e v e r s e r e a c t i o n r a t e c o n s t a n t f o r c h e m i c a l r e a c t i o n i n f o r w a r d (1) o r r e v e r s e (-1) d i r e c t i o n M i c h a e l i s c o n s t a n t f o r s u b s t r a t e A,B,P o r Q I n h i b i t i o n c o n s t a n t f o r A,B,P o r Q E q u i l i b r i u m c o n s t a n t Gas c o n s t a n t T e m p e r a t u r e i n °K B o l t z m a n n ' s c o n s t a n t P l a n c k ' s c o n s t a n t G i b b s f r e e e n r g y c h a n g e o f a c t i v a t i o n i n f o r w a r d ( f ) o r r e v e r s e ( r ) d i r e c t i o n G i b b s f r e e e n e r g y c h a n g e o f b i n d i n g o f s u b s t r a t e A,B,P, o r Q. G i b b s f r e e e n e r g y c h a n g e o f b i n d i n g o f s u b s t r a t e A,B,P,Q i n i n h i b i t o r y mode. 56 APPENDIX Enzyme R e f e r e n c e s t o F i g u r e 5 - 3 . A G B . 4 G M e t a b o l i t e s PGI CPK PGM PK HK a i d A K ( l i v e r ) A K ( m u s c l e ) LDH G3PDH FDPase TPI 10 16 11 8 20 19 24 17 3 25 3 18 10 16 11 13 21 22 6 6 •3 15 14 9 9 9 C r e a t i n e - 2 9 12 9 4 9 AMP -2 p y r u v a t e -9 l a c t a t e -24 ' NAD -1 NADH -5 9 NAD -1 NADH -5 9 9 1. A r e s e , P . a n d A . B o s i a . 1 9 7 4 . I n : M e t h o d s o f E n z y m a t i c a n a l y s i s e d . by H.U.Bergmeyer, A c a d e m i c P r e s s , L ondon 2. A r e s e , P . , R . K i r s t e n a n d E . K i r s t e n . 1 9 6 5 . i b i d . 3. B a l l a n t y n e , J . S . 1980. u n p u b l i s h e d d a t a . 4. B e i s , I . a n d E.A.Newsholme.1975. The c o n t e n t s o f a d e n i n e n u c l e o t i d e s , p h o s p h a g e n s a nd some g l y c o l y t i c i n t e r m e d i a t e s 57 i n r e s t i n g m u s c l e s f r o m v e r t e b r a t e s and i n v e r t e b r a t e s . B i o c h e m . J . .152:23.-32. 5. T i s c h l e r , M . E . , D . F r i e d r i c h s , K . C a l l and J . R . W i l l i a m s o n . 1977. P y r i d i n e n u c l e o t i d e d i s t r i b u t i o n s and enzyme mass a c t i o n r a t i o s i n h e p a t o c y t e s f r o m f e d and s t a r v e d r a t s . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 8 4 : 2 2 2 - 2 3 6 . 6. C a l l a g h a n , 0 . H . and G.Weber.1959. K i n e t i c s t u d i e s on r a b b i t - m u s c l e m y o k i n a s e . B i o c h e m . J . 7 3 : 4 73-485. 7. C o r i , C . F . , S . F . V e l i c k and G . T . C o r i . 1950. The c o m b i n a t i o n of d i p h o s p h o p y r i d i n e n u c l e o t i d e w i t h g l y c e r a l d e h y d e p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a 4:160-169. 8. D y s o n , R . D . , J . M . C a r d e n a s , and R . J . B a r s o t t i . 1 9 7 5 . The r e v e r s i b i l i t y o f s k e l e t a l m u s c l e p y r u v a t e k i n a s e and an a s s e s s m e n t o f i t s c a p a c i t y t o s u p p o r t g l y c o n e o g e n e s i s . J . B i o l . C h e m . 2 5 0 : 3 3 1 6 - 3 3 2 1 . 9. Edington,D.W.,G.R.Ward and W . A . S a v i l i e . 1 9 7 3 . E n e r g y m e t a b o l i s m of w o r k i n g m u s c l e : c o n c e n t r a t i o n p r o f i l e s o f s e l e c t e d m e t a b o l i t e s . A m . J . P h y s i o l . 2 2 4 : 1 3 7 5 - 1 3 7 9 . 10. K a h a n a , S . E . , O . H . L o w r y , D . W . S c h u l z , J . V . P a s s o n n e a u a n d E . J . C r a w f o r d . 1960. The k i n e t i c s o f p h o s p h o g l u c o i s o m e r a s e . J . B i o l . C h e m . 2 3 5 : 2 1 7 8 - 2 1 8 4 . 11. Lowry,O.H. and J . V . P a s s o n n e a u . 1 9 6 9 . P h o s p h o g l u c o m u t a s e k i n e t i c s w i t h t h e p h o s p h a t e s o f f r u c t o s e , g l u c o s e , mannose, r i b o s e and g a l a c t o s e . J . B i o l . C h e m . 2 4 4 :910-916. 12. L o w r y , O . H . , J . V . P a s s o n n e a u , F . X . H a s s e l b e r g e r and D.W.Schulv.. 1964. E f f e c t o f i s c h e m i a on known s u b s t r a t e s a n d c o f a c t o r s o f t h e g l y c o l y t i c p a t h w a y i n b r a i n . J . B i o l . C h e m . 2 3 9 : 1 8 - 3 0 . 58 13. M c Q u a t e , J . T . and M . F . U t t e r . 1 9 5 9 . E q u i l i b r i u m a n d k i n e t i c s t u d i e s o f t h e p y r u v i c k i n a s e r e a c t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 3 4 : 2 1 5 1 - 2 1 5 7 . 14. M e y e r h o f , 0 . and R . J u n o w i c z - K o c h o l a t y . 1 9 4 3 . The e q u i l i b r i a o f i s o m e r a s e and a l d o l a s e , and t h e p r o b l e m o f t h e p h o s p h o -r y l a t i o n o f g l y c e r a l d e h y d e p h o s p h a t e . J . B i o l . C h e m . 149: 7 1-92. 15. Newsholme,E.A. and C . S t a r t . 1 9 7 3 . R e g u l a t i o n i n m e t a b o l i s m . W i l e y , T o r o n t o . 16. N i h e i , T . , L.Noda,and M . F . M o r a l e s . 1 9 6 1 . K i n e t i c p r o p e r t i e s a n d e q u i l i b r i u m c o n s t a n t o f t h e a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e -c r e a t i n e t r a n s p h o s p h o r y l a s e c a t a l y z e d r e a c t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 3 6 : 3 2 0 3 - 3 2 0 9 . 17. N o d a , L . 1 9 5 8 . A d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e - a d e n o s i n e m o n o p h o s p h a t e t r a n s p h o s p h o r y l a s e . I I I . K i n e t i c s t u d i e s . J . B i o l . C h e m . 2 3 2 : 2 3 7 - 2 5 0 . 18. O e s p e r , P . a n d O . M e y e r h o f . 1 9 5 0 . T h e d e t e r m i n a t i o n o f t r i o s e p h o s p h a t e i s o m e r a s e A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 2 7 : 2 2 3 - 2 3 3 . 19. Penhoet,E.E.,M.Kochman, and W . J . R u t t e r . 1 9 6 9 . M o l e c u l a r and c a t a l y t i c p r o p e r t i e s o f a l d o l a s e C. B i o c h e m i s t r y 8: 4 3 9 6 - 4 4 0 2 . 20. P u r i c h , D . L . , H . J . F r o m m and F . B . R u d o l p h . 1 9 7 3 . The h e x o k i n a s e s : k i n e t i c , p h y s i c a l a n d r e g u l a t o r y p r o p e r t i e s . A d v . E n z y m o l . 39: 2 49-326. 21. R o b b i n s , E . A . and P . D . B o y e r . 1 9 5 7 . D e t e r m i n a t i o n o f t h e e q u i l i b r i u m o f t h e h e x o k i n a s e r e a c t i o n and t h e f r e e e n e r g y o f h y d r o l y s i s o f a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e . J . B i o l . C h e m . 2 2 4 : 1 2 1 -1 3 1 . 59 22. R u t t e r , W . J . 1 9 6 1 . A l d o l a s e . The Enzymes 5:341-366. 23. S a c k t o r , B . , E . W o r m s e r - S h a v i t and J . I . W h i t e . 1 9 6 5 . D i p h o s p h o -p y r i d i n e n u c l e o t i d e - l i n k e d c y t o p l a s m i c m e t a b o l i t e s i n r a t l e g m u s c l e i n s i t u d u r i n g c o n t r a c t i o n and r e c o v e r y . J . B i o l . Chem. 2 4 0 : 2 6 7 8 - 2 6 8 1 . 24. S a p i c o , V . , G . L i t w u c k and W . E . C r i s s . 1 9 7 2 . P u r i f i c a t i o n o f r a t l i v e r a d e n y l a t e k i n a s e i s o z y m e I I and c o m p a r i s o n w i t h i s o z y m e I I I . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 2 5 8 : 4 3 6 - 4 4 5 . 25. V e l i c k , S . F . and C . F u r f i n e . 1 9 6 3 . G l y c e r a l d e h y d e 3 - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e . The Enzymes 7: 243-273. 

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