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TN5 insertions in ribosomal protein genes in Escherichia coli Hui, Ivy Yuk Chee 1982

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831-UBC_1982_A6_7 H84.pdf [ 3.83MB ]
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T N 5 I N S E R T I O N S I N R I B O S O M A L P R O T E I N G E N E S I N E S C H E R I C H I A C O L I b y I V Y Y U K C H E E H U I B . S c . ( H o n ) , T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1 9 8 0 A T H E S I S S U B M I T T E D I N P A R T I A L F U L F I L M E N T O F T H E R E Q U I R E M E N T S F O R T H E D E G R E E O F M A S T E R O F S C I E N C E i n T H E F A C U L T Y O F G R A D U A T E S T U D I E S D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d T H E U N I V E R S I T Y O F B R I T I S H C O L U M B I A A p r i l , 1982 © I v y Y u k C h e e H u i , 1982 In presenting t h i s thesis i n p a r t i a l f u l f i l m e n t of the requirements fo r an advanced degree at the University of B r i t i s h Columbia, I agree that the Library s h a l l make i t f r e e l y available for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of t h i s thesis for scholarly purposes may be granted by the head of my department or by his or her representatives. I t i s understood that copying or publication of t h i s thesis f o r f i n a n c i a l gain s h a l l not be allowed without my written permission. Department of &/hch-Lrn.'$i~r-> The University of B r i t i s h Columbia 1956 Main Mall Vancouver, Canada V6T 1Y3 DE-6 (.3/81) A B S T R A C T T h e g e n e t i c o r g a n i z a t i o n a n d i n t e r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e t w o r i b o s o m a l p r o t e i n t r a n s c r i p t i o n u n i t s ( t h e L 1 1 a n d t h e L 1 0 o p e r o n s ) f r o m n e a r 89 m i n o n t h e E s c h e r i c h i a c o l i c h r o m o s o m e w e r e s t u d i e d u s i n g i n s e r t i o n a l m u t a t i o n s g e n e r a t e d b y t h e k a n a m y c i n r e s i s t a n t t r a n s p o s a b l e e l e m e n t T n 5 . T h e p o l a r e f f e c t s o f T n 5 i n s e r t i o n o n t h e e x p r e s s i o n o f t h e s e r i b o s o m a l g e n e s w e r e e x a m i n e d b y : ( 1 ) T h e l e v e l o f p - g a l a c t o s i d a s e g e n e r a t e d f r o m L I Q - l a c Z a n d p-l a c Z f u s i o n p r o t e i n s ; ( 2 ) D i r e c t S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f t h e p r o t e i n s s p e c i f i e d -by t h e p l a s m i d r i b o s o m a l g e n e s . i n U V -i n a c t i v a t e d m a x i c e l l s ; ( 3 ) U r e a - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f p l a s m i d a n d c h r o m o s o m e s p e c i f i e d L 1 2 p r o t e i n s i n a n L 1 2 e l e c t r o p h o r e t i c m u t a n t ( S t r a i n J F 1 0 3 9 ) . T h e a b o v e e x p e r i m e n t s l o c a l i z e d t h e m a j o r p r o m o t e r f o r t h e L 1 0 o p e r o n b e t w e e n n u c l e o t i d e 1 2 8 0 a n d 1 3 6 0 . T h e s e i n v e s t i g a t i o n s a l s o c o n f i r m e d t h a t t h e t r a n s l a t i o n a l r e g u l a t o r y p r o t e i n s f o r t h e L 1 1 a n d L 1 0 o p e r o n s a r e L1 a n d L 1 0 r e s p e c t i v e l y . T A B L E O F C O N T E N T S A B S T R A C T i i T A B L E O F C O N T E N T S i i i L I S T O F F I G U R E S v i L I S T O F T A B L E S . . v i i A C K N O W L E D G E M E N T S v i i i I N T R O D U C T I O N ' 1 I . G e n e t i c O r g a n i z a t i o n a n d r e g u l a t i o n o f t h e L 1 1 a n d L 1 0 T r a n s c r i p t i o n U n i t s 4 A . O r g a n i z a t i o n o f T h e R i b o s o m a l G e n e s 4 B . T r a n s c r i p t i o n a l a n d P o s t - T r a n s c r i p t i o n a l C o n t r o l s . . . . 8 I I . T h e T r a n s p o s a b l e E l e m e n t T n 5 11 A . S t r u c t u r e a n d G e n e t i c O r g a n i z a t i o n o f T n 5 11 B . P r o p e r t i e s o f T n 5 I n s e r t i o n s 16 I I I . T h e P r e s e n t I n v e s t i g a t i o n 20 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S 21 I . A b b r e v i a t i o n s a n d C h e m i c a l s 21 A . A b b r e v i a t i o n s 21 B . C h e m i c a l s a n d R a d i o i s o t o p e s 22 T A B L E O F C O N T E N T S ( C o n t ' d ) I I . M e d i a a n d S o l u t i o n s 23 A . M e d i a 23 B . B u f f e r s a n d S o l u t i o n s 23 1 . P l a s m i d DNA P r e p a r a t i o n s 23 2 . C o m p e t e n t C e l l P r e p a r a t i o n s . - . 24 3 . k D N A P r e p a r a t i o n s • 25 4 . 0 - G a l a c t o s i d a s e A s s a y s 25 5 . A g a r o s e G e l E l e c t r o p h o r e s i s 25 6 . S D S - P o l y a c r y l a m i d e G e l E l e c t r o p h o r e s i s 26 7 . U r e a - P o l y a c r y l a m i d e G e l E l e c t r o p h o r e s i s 27 I I I . M e t h o d s 29 A . B a c t e r i a l S t r a i n s a n d G r o w t h C o n d i t i o n s 29 B . I s o l a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f T n 5 T r a n s p o s i -t i o n s 31 1 . T r a n s p o s i t i o n o f T n 5 f r o m X C 1 8 5 7 r e x ; ; T n 5 o n t o P l a s m i d s p N F 1 3 4 4 , P N F 1 5 7 1 a n d p N F l 9 6 2 31 2 . I s o l a t i o n o f P l a s m i d s C o n t a i n i n g T n 5 I n s e r t i o n s . . 32 a . S m a l l S c a l e P l a s m i d DNA P r e p a r a t i o n s 32 b . P r e p a r a t i o n o f C o m p e t e n t C e l l s a n d T r a n s f o r -m a t i o n o f C o m p e t e n t C e l l s w i t h P l a s m i d D N A . . . . 33 c . C h a r a c t e r i z a t i o n o f T n 5 T r a n s p o s i t i o n s 34 i v T A B L E O F C O N T E N T S ( C o n t ' d ) C . P l a s m i d - P h a g e R e c o m b i n a t i o n a n d t h e E x p r e s s i o n o f l a c Z F u s i o n P r o d u c t s 37 1 . P l a s m i d - P h a g e R e c o m b i n a t i o n a n d T r a n s d u c t i o n 37 2 . P r e p a r a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f X.DNA . . 43 3 . 0 - g a l a c t o s i d a s e M e a s u r e m e n t s 44 D . S y n t h e s i s o f P l a s m i d S p e c i f i e d P r o t e i n s i n U V -I n a c t i v a t e d C e l l s 45 E . S y n t h e s i s o f L 1 2 P r o t e i n s S p e c i f i e d b y P l a s m i d a n d C h r o m o s o m a l r p l L G e n e s 46 R E S U L T S , • 48 I . I s o l a t i o n o f T n 5 I n s e r t i o n s 48 I I . P o l a r i t y o f T n 5 I n s e r t i o n o n t h e E x p r e s s i o n o f l a c Z F u s i o n P r o d u c t s 58 I I I . P o l a r i t y o f T n 5 I n s e r t i o n s o n R i b o s o m a l P r o t e i n G e n e E x p r e s s i o n 65 I V . S y n t h e s i s o f L 1 2 R i b o s o m a l P r o t e i n s 69 D I S C U S S I O N S 74 I . R e g u l a t i o n o f t h e L l 1 T r a n s c r i p t i o n U n i t 74 I I . R e g u l a t i o n o f t h e L 1 0 T r a n s c r i p t i o n U n i t 76 B I B L I O G R A P H Y 79 v L I S T O F F I G U R E S F i g u r e 1 G e n e t i c M a p o f E . c o l i K 1 2 C h r o m o s o m e S h o w i n g L o c a t i o n s o f G e n e s f o r R i b o s o m a l R N A s , R i b o s o m a l P r o t e i n s , RNA P o l y m e r a s e S u b u n i t s , a n d P e p t i d e E l o n g a t i o n F a c t o r s 2 F i g u r e 2 O r g a n i z a t i o n o f R i b o s o m a l G e n e s i n t h e r i f R e g i o n N e a r 8 9 m i n o f t h e E . c o l i C h r o m o s o m e 5 F i g u r e 3 R e s t r i c t i o n M a p o f T n 5 . 12 F i g u r e 4 T h e G e n e t i c O r g a n i z a t i o n o f T n 5 14 F i g u r e 5 C o i n t e g r a t e M o d e l f o r T r a n s p o s i t i o n 17 F i g u r e 6 C o n s t r u c t i o n o f P l a s m i d s p N F l 3 4 4 , p N F 1 5 7 l , a n d P N F 1 9 6 2 35 F i g u r e 7 ' C o n t r u c t i o n o f T r a n s d u c i n g P h a g e s X 1 9 1 0 a n d XI 9 6 2 39 F i g u r e 8 R e c o m b i n a t i o n a l T r a n s f e r o f T n 5 f r o m P l a s m i d s t o H o m o l o g o u s P o s i t i o n s i n t h e T r a n s d u c i n g P h a g e . . . . 41 F i g u r e 9 A u t o r a d i o g r a p h y o f a 24% DNA S e q u e n c i n g G e l t o L o c a l i z e t h e P r e c i s e S i t e o f T n 5 I n s e r t i o n f o r S t r a i n P D 3 4 2 49 F i g u r e 10 D i s t r i b u t i o n o f T n 5 I n s e r t i o n s i n t h e 2 . 2 k b E c o R I F r a g m e n t o f P l a s m i d p N F 1 3 4 4 51 F i g u r e 11 L o c a t i o n o f T n 5 I n s e r t i o n s i n L 1 1 a n d L 1 0 T r a n s c r i p t i o n U n i t s 56 F i g u r e 12 R e s t r i c t i o n E n z y m e M a p p i n g o f T n 5 I n s e r t i o n i n t o H o m o l o g o u s P o s i t i o n o n P l a s m i d s a n d T r a n s d u c i n g P h a g e s 59 F i g u r e 13 A u t o r a d i o g r a p h y o f P r o t e i n s L a b e l l e d F o l l o w i n g U V - I n a c t i v a t i o n o f S t r a i n C S R 6 0 3 66 F i g u r e 14 S y n t h e s i s o f R i b o s o m a l L 7 a n d L 1 2 P r o t e i n s S p e c i f i e d b y P l a s m i d a n d C h r o m o s o m a l C o p i e s o f t h e r p l L G e n e 72 v i L I S T O F T A B L E S T a b l e I G e n o t y p e s o f B a c t e r i a l a n d V p h a g e S t r a i n s 30 T a b l e I I S e q u e n c e s F l a n k i n g T n 5 I n s e r t i o n s 54 T a b l e I I I T h e E x p r e s s i o n o f L 1 Q - l a c Z a n d fl-lacZ F u s i o n P r o t e i n w i t h Tn5 I n s e r t e d a t V a r i o u s P o s i t i o n s i n t h e L 1 1 a n d L 1 0 T r a n s c r i p t i o n U n i t s 63 v i i A C K N O W L E D G E M E N T I w i s h t o e x p r e s s my d e e p a p p r e c i a t i o n t o D r . P . P . D e n n i s f o r h i s g u i d a n c e a n d p a t i e n c e t h r o u g h o u t t h e c o u r s e o f my r e s e a r c h , a n d f o r h i s c o n c e r n a n d j u d i c i o u s a d v i c e d u r i n g t h e w r i t i n g o f my t h e s i s . I w o u l d l i k e t o t h a n k D r . N . P . F i i l f o r p r o v i d i n g t h e s t a r t i n g b a c t e r i a l s t r a i n , p l a s m i d a n d p h a g e f o r t h i s w o r k . I a l s o w i s h t o t h a n k D r . K . L . M a l t m a n f o r h i s e n c o u r a g e m e n t a n d i n v a l u a b l e d i s c u s s i o n s , a n d M i s s E . D u n s t a n -A d a m s f o r h e r t e c h n i c a l a s s i s t a n c e . v i i i 1 I N T R O D U C T I O N T h e E s c h e r i c h i a c o l i r i b o s o m e h a s a h i g h l y s p e c i a l i z e d a n d c o m p l e x s t r u c t u r e ; i t c o n s i s t s o f t h r e e s p e c i e s o f R N A s ( 1 6 S , 2 3 S , a n d 5 S ) a n d o v e r f i f t y d i s t i n c t s p e c i e s o f p r o t e i n s . E a c h r i b o s o m a l c o m p o n e n t i s p r e s e n t i n o n e c o p y p e r r i b o s o m e w i t h t h e e x c e p t i o n o f r i b o s o m a l p r o t e i n L 7 / L 1 2 ( h e r e a f t e r r e f e r r e d t o a s L 1 2 ) , w h i c h i s p r e s e n t i n f o u r c o p i e s p e r r i b o s o m e ( 3 8 ) . E a r l y s t u d i e s i n d i c a t e d t h a t i n e x p o n e n t i a l l y g r o w i n g c e l l s , t h e s y n t h e s i s o f r i b o s o m a l c o m p o n e n t s i s b a l a n c e d a n d t h a t t h e p o o l s o f f r e e r i b o s o m a l RNA a n d f r e e r i b o s o m a l p r o t e i n s a r e n e g l i g i b l y s m a l l ( 9 , 1 2 ) . C h a n g e s i n n u t r i t i o n a l c o n d i t i o n s i n c l u d i n g s h i f t u p s , s h i f t d o w n s , a n d a m i n o a c i d i n s u f f i c i e n c i e s , h a v e n b e f f e c t o n t h e c o o r d i n a t e s y n t h e s i s o f r i b o s o m a l c o m p o n e n t s ( 2 8 , 2 9 ) . E n r i c h e d n u t r i e n t c o n d i t i o n s r e s u l t i n e n h a n c e d s y n t h e s i s w h e r e a s d e f i c i e n t n u t r i e n t c o n d i t i o n s r e s u l t i n r e d u c e d s y n t h e s i s o f r i b o s o m a l c o m p o n e n t s . T o u n d e r s t a n d t h e m o l e c u l a r m e c h a n i s m o f c o n t r o l a n d r e g u l a t i o n o f r i b o s o m e b i o s y n t h e s i s , a d e t a i l e d k n o w l e d g e o f t h e g e n e t i c o r g a n i z a t i o n o f t h e r i b o s o m a l g e n e s i s r e q u i r e d . G e n e t i c m a p p i n g u s i n g X - t r a n s d u c i n g p h a g e s a n d a n t i b i o t i c r e s i s t a n c e m u t a n t s h a v e l o c a l i z e d a l a r g e n u m b e r o f r i b o s o m a l g e n e s o n t h e E . c o l i c h r o m o s o m e ( F i g . 1; R e f . 1 3 , 1 4 , 2 0 ) . 2 F i g u r e 1: G e n e t i c M a p o f E . c o l i K 1 2 C h r o m o s o m e S h o w i n g L o c a t i o n s o f G e n e s f o r R i b o s o m a l R N A s , R i b o s o m a l  P r o t e i n s , R N A p o l y m e r a s e S u b u n i t s , a n d P e p t i d e  E l o n g a t i o n F a c t o r s ( 2 1 ) . ' W h e r e i t i s k n o w n , t h e d i r e c t i o n o f t r a n s c r i p t i o n i s i n d i c a t e d b y a r r o w s . R i b o s o m a l R N A o p e r o n s a r e i n d i c a t e d b y r r n " X " ; t h e g e n e s t r u c t u r e o f e a c h o f t h e t r a n s c r i p t i o n u n i t s i s 16S g e n e , s p a c e r t r a n s f e r R N A , 2 3 S g e n e , a n d 5S g e n e . G e n e s c o d i n g f o r p r o t e i n a r e i n d i c a t e d b y t h e n a m e s o f t h e p r o d u c t s . T r a n s c r i p t i o n u n i t s i n t h e t w o m a j o r r i b o s o m a l g e n e c l u s t e r s , s t r a n d r i f , a r e i d e n t i f i e d b y t h e o p e r o n " n a m e s " . 4 I . G e n e t i c O r g a n i z a t i o n a n d R e g u l a t i o n o f t h e L 1 1 a n d L 1 0  T r a n s c r i p t i o n U n i t s ; A . O r g a n i z a t i o n o f t h e R i b o s o m a l G e n e s : T h e r e g i o n n e a r 8 9 m i n o n t h e E . c o l i c h r o m o s o m e c o n t a i n s a g e n e c l u s t e r w h i c h s p e c i f i e s f o u r 5 0 S r i b o s o m a l p r o t e i n s a n d t h e t w o l a r g e s u b u n i t s o f RNA p o l y m e r a s e ( F i g . 2 ) . E a r l y e x p e r i m e n t s u t i l i z i n g r e c o m b i n a n t X p h a g e o r p l a s m i d f o r i n f e c t i o n o f U V -i r r a d i a t e d c e l l s a n d _in v i t r o D N A d e p e n d e n t p r o t e i n s y n t h e s i s i n d i c a t e d t h a t t h e s e s i x g e n e s w e r e a r r a n g e d i n t o t w o t r a n s c r i p t i o n u n i t s w i t h t h e f o l l o w i n g o r g a n i z a t i o n : P r p l K ( L 1 1 ) , r p l A ( L l ) ; P r p l J ( L 1 0 ) , r p l L ( L 1 2 ) , r p o B U ) , r p o C ( * ' ) ( 2 0 , 2 2 , 2 3 , 2 7 ) . T h e t w o p r o m o t e r s a n d t h e mRNA s t a r t s i t e s w e r e e s t a b l i s h e d ( F i g . 2 ) f r o m DNA s e q u e n c e a n a l y s i s , j_n v i t r o t r a n s c r i p t i o n m a p p i n g , a n d RNA p o l y m e r a s e b i n d i n g a s s a y s u s i n g s h o r t r e s t r i c t i o n e n z y m e f r a g m e n t s f r o m t h i s r e g i o n ( 3 0 , 3 9 ) . I n a d d i t i o n t o t h e t w o m a j o r p r o m o t e r s , s e v e r a l g e n e t i c e x p e r i m e n t s h a v e s u g g e s t e d t h a t t h i s r e g i o n may c o n t a i n a t l e a s t t w o a d d i t i o n a l m i n o r p r o m o t e r s , i n t h e i n t e r g e n i c r e g i o n b e t w e e n L 1 0 - L 1 2 a n d L 1 2 - p , w h i c h c o u l d p l a y a n i m p o r t a n t r o l e i n g e n e r e g u l a t i o n ( 2 , 1 1 , 1 5 ) . 5 F i g u r e 2 : O r g a n i z a t i o n o f R i b o s o m a l G e n e s i n t h e r i f R e g i o n  N e a r 89 m i n o f t h e E . c o l i C h r o m o s o m e ( 2 1 ) . T h e g e n e s a r e i d e n t i f i e d b y t h e n a m e s o f t h e i r p r o d u c t s a n d a r e i n d i c a t e d b y b o x e s w h o s e l e n g t h s a r e a p p r o x i m a t e l y p r o p o r t i o n a l t o t h e e x p e c t e d l e n g t h o f e a c h g e n e b a s e d o n m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e c o r r e s p o n d i n g p r o t e i n p r o d u c t s . T h e t w o t r a n s c r i p t i o n u n i t s i n t h i s r e g i o n a r e i n d i c a t e d i n t h e l o w e r p a r t o f t h e f i g u r e b y h o r i z o n t a l a r r o w s . T h e i r p r o m o t e r s a r e d e s i g n a t e d b y " P " . 1 kb 3 C = I P P 7 I n v i t r o t r a n s c r i p t i o n e x p e r i m e n t s h a v e i d e n t i f i e d a t r a n s c r i p t i o n s t a r t s i t e f o r t h e m a j o r L 1 0 p r o m o t e r a b o u t 45 n u c l e o t i d e s b e y o n d t h e e n d o f t h e L1 g e n e ( 3 0 ) . T h e p r e s e n c e o f t h i s p r o m o t e r w a s d e m o n s t r a t e d o n l y u n d e r c o n d i t i o n s i n w h i c h t h e L 1 1 p r o m o t e r w a s n o t f u n c t i o n i n g . E x a m i n a t i o n o f t h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e a t t h e e n d o f t h e L1 g e n e f a i l s t o r e v e a l a n y t e r m i n a t o r - l i k e s e q u e n c e f o r t h e L 1 1 - L 1 mRNA t r a n s c r i p t ( 1 5 ) . R e c e n t l y , i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t e x p r e s s i o n o f t h e e n t i r e g e n e c l u s t e r m a y u n d e r c e r t a i n c o n d i t i o n t a k e p l a c e u t i l i z i n g t h e p r o m o t e r f o r t h e L 1 1 o p e r o n w i t h n o t e r m i n a t i o n o r r e i n i t i a t i o n i n t h e r e g i o n b e t w e e n L1 a n d L 1 0 g e n e s ( 3 0 ) . 8 B . T r a n s c r i p t i o n a l a n d P o s t - T r a n s c r i p t i o n a l C o n t r o l s : D u r i n g b a l a n c e d g r o w t h , t h e s t o i c h i o m e t r y o f t h e p r o t e i n s p r o d u c e d f r o m t h e L 1 1 a n d L 1 0 o p e r o n s i s 1 : 1 : 1 : 4 : 0 . 2 : 0 . 2 , f o r L 1 1 , L 1 , L 1 0 , L 1 2 , p a n d p' r e s p e c t i v e l y . T h e m e c h a n i s m r e s p o n s i b l e f o r t h e e l e v a t e d p r o d u c t i o n o f L 1 2 i s u n k n o w n w h e r e a s t h e r e d u c e d s y n t h e s i s o f t h e p a n d p' RNA p o l y m e r a s e s u b u n i t s h a s b e e n a t t r i b u t e d t o t h e p r e s e n c e o f a t r a n s c r i p t i o n a t t e n u a t i o n s i t e a n d a R N a s e I I I p r o c e s s i n g s i t e l o c a t e d b e t w e e n t h e L 1 2 a n d t h e p g e n e ( F i g . 1 1 , R e f . 2 , 3 ) . I n e x p o n e n t i a l l y g r o w i n g c e l l s , a p p r o x i m a t e l y 80% o f t h e mRNA t r a n s c r i p t s a r e t e r m i n a t e d a t t h e a t t e n u a t o r a n d t h e u n - a t t e n u a t e d f u l l l e n g t h t r a n s c r i p t s a r e c l e a v e d b y R N a s e I I I . T h i s i m p l i e s t h a t • t h e t r a n s l a t i o n o f RNA p o l y m e r a s e mRNA i s s e p a r a t e d f r o m t h e t r a n s l a t i o n o f r i b o s o m a l p r o t e i n m R N A . E a r l y e x p e r i m e n t s u t i l i z i n g c o m p o s i t e C o l E I p l a s m i d s t o a m p l i f y t h e c o p y n u m b e r o f t h e L 1 0 t r a n s c r i p t i o n u n i t ( 1 0 ) s u g g e s t e d t h a t t h e s y n t h e s i s o f L 1 0 , L 1 2 , p a n d p' p r o t e i n s i s s u b j e c t e d t o p o s t - t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t i o n . A m p l i f i c a t i o n o f t h e L 1 0 t r a n s c r i p t i o n u n i t r e s u l t e d i n s i x f o l d e l e v a t i o n i n L 1 0 o p e r o n t r a n s c r i p t i o n b u t o n l y a 30% i n c r e a s e i n L 1 2 s y n t h e s i s r a t e a n d a t w o - f o l d i n c r e a s e i n t h e p a n d p' s y n t h e s i s r a t e . T h e n o n -c o o r d i n a t e e f f e c t s o n L 1 2 , c o m p a r e d t o p a n d p' s u g g e s t t h a t t h e r i b o s o m a l p r o t e i n s a n d t h e RNA p o l y m e r a s e s u b u n i t p r o t e i n s a r e r e g u l a t e d b y s e p a r a t e p o s t -9 t r a n s c r i p t i o n a l m e c h a n i s m s . E x p e r i m e n t s w i t h o t h e r r i b o s o m a l p r o t e i n o p e r o n s h a v e c o n f i r m e d t h i s o r i g i n a l o b s e r v a t i o n a n d l e a d t o t h e g e n e r a l h y p o t h e s i s t h a t c e r t a i n k e y r i b o s o m a l p r o t e i n s r e g u l a t e t r a n s l a t i o n o f t h e i r own o p e r o n m R N A s ( 4 . 1 ) . I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t t h e s e r e g u l a t o r y r i b o s o m a l p r o t e i n s c a n b i n d t o h o m o l o g o u s s e q u e n c e s o n r i b o s o m a l RNA a n d t h e i r own m R N A . W h e n t h e p r o t e i n i s p r e s e n t i n e x c e s s o v e r r i b o s o m a l R N A , i t b i n d s t o t h e h o m o l o g o u s s e q u e n c e s o n i t s mRNA a n d p r e v e n t s f u r t h e r t r a n s l a t i o n . I n h i b i t i o n i s r e l i e v e d w h e n r i b o s o m a l R N A a g a i n b e c o m e s a v a i l a b l e . . U s i n g b o t h i_n v i t r o a n d i_n v i v o e x p e r i m e n t s , N o m u r a e t a l . ( 8 , 4 1 ) h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t L1 i s t h e r e g u l a t o r y i n h i b i t o r o f t h e L 1 1 o p e r o n m R N A . T h e t a r g e t s i t e f o r t h e L1 t r a n s l a t i o n a l r e p r e s s o r a c t i o n w a s i n f e r r e d t o b e w i t h i n t h e f i r s t 160 b a s e s o f t h e b i c i s t r o n i c mRNA ( 4 2 ) , a n d t h e p r e s e n c e o f 2 3 S r i b o s o m a l R N A , b u t n o t 16S r i b o s o m a l R N A , r e l i e v e d t r a n s l a t i o n a l i n h i b i t i o n b y L 1 1 . I t s e e m s l i k e l y t h a t L1 r e c o g n i z e s s t r u c t u r a l f e a t u r e s o n i t s mRNA t a r g e t t h a t a r e h o m o l o g o u s t o t h e L 1 - b i n d i n g s i t e o n t h e 2 3 S r i b o s o m a l R N A . T h e t r a n s l a t i o n o f t h e mRNA i s t h u s c o u p l e d t o t h e a v a i l a b i l i t y o f 2 3 S r i b o s o m a l R N A w h i c h a c t s a s a c o n t i n u o u s d r a i n o n t h e a c c u m u l a t i n g L1 r e g u l a t o r y p r o t e i n . A " s e q u e n t i a l t r a n s l a t i o n " m e c h a n i s m , i n w h i c h t h e s y n t h e s i s o f L1 r e q u i r e s t r a n s l a t i o n o f t h e p r e c e d i n g 10 L 1 1 c i s t r o n , h a s b e e n s u g g e s t e d a s a m e a n s t o g u a r a n t e e c o o r d i n a t e r e g u l a t i o n o f b o t h p r o t e i n s f r o m a s i n g l e mRNA t a r g e t s i t e . S i m i l a r l y , s e v e r a l i n d e p e n d e n t s t u d i e s ( 1 7 , 4 3 ) h a v e d e m o n s t r a t e d t h a t t h e r i b o s o m a l p r o t e i n L 1 0 ( o r t h e L 1 0 -L 1 2 c o m p l e x ) r e g u l a t e s t h e L 1 0 o p e r o n . I t a c t s b y b i n d i n g t o t h e u n i q u e r e g i o n i n t h e n o n c o d i n g l e a d e r s e q u e n c e s o f t h e m R N A , a n d t h e r e b y i n h i b i t s t r a n s l a t i o n . T h i s i s t h e o n l y r i b o s o m a l p r o t e i n o p e r o n w h e r e i t h a s s o f a r b e e n p o s s i b l e t o d e m o n s t r a t e , b y n i t r o c e l l u l o s e b i n d i n g a s s a y s , t h e p h y s i c a l a s s o c i a t i o n b e t w e e n t h e r e g u l a t o r y p r o t e i n a n d i t s own m R N A . T h i s i n t e r a c t i o n i s r e d u c e d o r a b o l i s h e d b y d e l e t i o n s w h i c h r e m o v e a l l o r p a r t o f t h e l e a d e r s e q u e n c e o f t h e mRNA o r b y t h e p r e s e n c e o f 2 3 S r i b o s o m a l R N A s . T h e b i n d i n g s i t e o n t h e mRNA s h o w s e x t e n d e d s e q u e n c e h o m o l o g y t o t h e 2 3 S r i b o s o m a l R N A . M u t a t i o n s w h i c h r e d u c e t h e t r a n s l a t i o n a l e f f i c i e n c y o f t h e L 1 0 o p e r o n mRNA i_n v i v o h a v e a l s o b e e n i s o l a t e d ( 1 1 ) . T h e s e m u t a t i o n s a p p a r e n t l y a l t e r t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f t h e l e a d e r s e q u e n c e o f t h e mRNA a n d a r e l o c a t e d n e a r o r w i t h i n t h e b i n d i n g s e q u e n c e s f o r t h e L 1 0 r e g u l a t o r y p r o t e i n . A g a i n i t a p p e a r s l i k e l y t h a t t h e r e i s t r a n s l a t i o n a l c o u p l i n g b e t w e e n t h e L 1 0 a n d L 1 2 c i s t r o n s b u t t h e r e i s n o a p p a r e n t f e a t u r e t o e x p l a i n how t h e e x t r a t r a n s l a t i o n s o f t h e L 1 2 s e q u e n c e o c c u r s ( 3 2 ) . 11 T h e T r a n s p o s a b l e E l e m e n t T n 5 : A . S t r u c t u r e a n d G e n e t i c O r g a n i z a t i o n o f T n 5 : T r a n s p o s o n T n 5 i s a d i s c r e t e m o v a b l e DNA e l e m e n t a p p r o x i m a t e l y 5 7 0 0 b p i n l e n g t h , a n d c o n t a i n s a g e n e e n c o d i n g r e s i s t a n c e t o k a n a m y c i n ( 1 , 3 4 ) . I t i s a n a t u r a l c o m p o n e n t o n a n R - f a c t o r p l a s m i d i s o l a t e d o r i g i n a l l y f r o m K l e b s i e l l a a n d h a s n o h o m o l o g y w i t h s e q u e n c e s n o r m a l l y p r e s e n t i n t h e c h r o m o s o m e o f E . c o l i K 1 2 ( 4 , 5 ) . T h e s t r u c t u r e a n d g e n e t i c o r g a n i z a t i o n o f T n 5 i s s h o w n i n F i g u r e 3 ' a n d 4 r e s p e c t i v e l y . I t h a s t w o 1 . 5 . k b t e r m i n a l i n v e r t e d r e p e a t s e q u e n c e s t h a t f l a n k a c e n t r a l u n i q u e r e g i o n o f a b o u t 2 . 3 k b . R e s t r i c t i o n e n d o n u c l e a s e a n d DNA s e q u e n c e a n a l y s e s h a v e s h o w n t h a t t h e l e f t a n d r i g h t i n v e r t e d r e p e a t s o f T n 5 a r e i d e n t i c a l e x c e p t f o r a s i n g l e - b a s e - p a i r d i f f e r e n c e . T h e l e f t i n v e r t e d r e p e a t c o n t a i n s a " s t o p " c o d o n ( T A A ) , w h e r e a s t h e r i g h t c o n t a i n s a " g l u t a m i n e " c o d o n ( G A A ) . A n a l y s i s o f i n s e r t i o n a n d s u b s t i t u t i o n d e r i v a t i v e s o f T n 5 h a v e s h o w n t h a t T n 5 c o d e s f o r t h e p r o d u c t i o n o f f i v e d i f f e r e n t p o l y p e p t i d e s . T h e i n v e r t e d r e p e a t s o f T n 5 a r e f u n c t i o n a l l y d i f f e r e n t ( 3 3 ) . T h e r i g h t i n v e r t e d r e p e a t c o d e s f o r p o l y p e p t i d e s w h i c h h a v e t r a n s - a c t i n g f u n c t i o n s n e c e s s a r y f o r t h e t r a n s p o s i t i o n o f t h e e l e m e n t t o a new s i t e ( t r a n s p o s a s e s ) ; t h e l e f t i n v e r t e d r e p e a t c o d e s f o r t w o p o l y p e p t i d e s o f u n k n o w n f u n c t i o n s . T h e s e p o l y p e p t i d e s a r e s i m i l a r t o t h o s e f r o m t h e r i g h t i n v e r t e d r e p e a t b u t 12 F i g u r e 3: R e s t r i c t i o n M a p o f Tn5 (34). T h e i n v e r t e d r e p e a t s w h i c h h a v e i d e n t i c a l r e s t r i c t i o n e n z y m e s i t e s a r e i n d i c a t e d b y t h i c k s o l i d l i n e s . T h e b o x e d r e g i o n s w e r e DNA f r a g m e n t s t h a t w e r e f o u n d t o f o r m h e p a r i n -r e s i s t a n t c o m p l e x e s w i t h RNA p o l y m e r a s e . Bgi I Hpol (Hindll) Bgl I Xho I (Ava I ) P » l I Bgl I Hind I I I Pvu I I Bgl I I P s » I Pvu I I S m a l ( A v a l ) Pvu I I P» » I S a l I ( H i n d l l ) X h o l ( A v o l ) H i n d l l Wo I B o m H - I Bgl I A v a l A v o l B g l I Ava I Bgl I I Pvu I I Hind I I I Bgl I Bgl I P»» I Xho I ( A v o l ) B g i I Hpa I ( H i n d l l ) B g l I 14 F i g u r e 4 : T h e G e n e t i c O r g a n i z a t i o n o f T n 5 ( 3 4 ) . T h e l o c a t i o n s o f t h e i n v e r t e d r e p e a t s a n d t h e p r o m o t e r f o r t h e k a n a m y c i n r e s i s t a n t g e n e a r e s h o w n . T h e r e a r e f i v e p r o t e i n s e n c o d e d b y T n 5 . P o l y p e p t i d e 1 a n d 2 a r e d i f f e r e n t f r o m t h a t o f 3 a n d 4 d u e t o t h e s i n g l e - b a s e - p a i r n o n h o m o l o g y . O n e o r b o t h o f t h e p r o t e i n s e n c o d e d b y t h e r i g h t i n v e r t e d r e p e a t (1 a n d 2 ) a r e k n o w n t o b e r e q u i r e d f o r t h e t r a n s p o s i t i o n p r o c e s s . P o l y p e p t i d e 5 i s c o d e d f o r b y t h e N e o m y c i n g e n e ( N P T I I ) w h i c h c o n f e r s k a n a m y c i n r e s i s t a n c e . 1 6 a r e s m a l l e r i n s i z e s d u e t o t h e p r e s e n c e o f t h e s t o p c o d o n g e n e r a t e d f r o m t h e s i n g l e - b a s e - p a i r d i f f e r e n c e . T h e f i f t h p o l y p e p t i d e , r e s p o n s i b l e f o r t h e e x p r e s s i o n o f k a n a m y c i n r e s i s t a n c e , i s c o d e d f o r b y t h e c e n t r a l u n i q u e r e g i o n , o f T n 5 . I t s p r o m o t e r i s g e n e r a t e d b y t h e G A A t o T A A m u t a t i o n i n t h e l e f t i n v e r t e d r e p e a t ( s e e a b o v e ) w h i c h g e n e r a t e s t h e P r i b n o w b o x s e q u e n c e T A A G G T T ( 3 1 ) f o r t r a n s c r i p t i o n o f t h e k a n a m y c i n r e s i s t a n c e g e n e . B . P r o p e r t i e s o f T n 5 I n s e r t i o n s : T r a n s p o s o n T n 5 c a n i n s e r t i n t o m a n y s i t e s o n a r e p l i c o n . T r a n s p o s i t i o n i s p r o m o t e d b y t r a n s p o s o n e n c o d e d p o l y p e p t i d e s a n d i s e n t i r e l y r e c A i n d e p e n d e n t . T h e t r a n s p o s i t i o n a p p e a r s t o p r o c e e d b y i n s e r t i o n o f t h e T n 5 s e q u e n c e i n t o a s t a g g e r e d c l e a v a g e o f a 9 b p t a r g e t s e q u e n c e . T h e f i n a l r e s u l t o f t h e t r a n s p o s i t i o n i s a d i r e c t d u p l i c a t i o n o f t h e 9 b a s e p a i r t a r g e t s e q u e n c e a t t h e e n d s o f t h e i n s e r t e d T n 5 s e q u e n c e . T h e c o i n t e g r a t e m o d e l f o r t r a n s p o s i t i o n p r o p o s e d b y S h a p i r o i s s h o w n i n F i g u r e 5 ( 3 6 ) . I n s e r t i o n o f T n 5 i n e i t h e r o f t h e t w o p o s s i b l e o r i e n t a t i o n i s f u n c t i o n a l l y e q u i v a l e n t . 1 7 F i g u r e 5: C o i n t e g r a t e Model f o r T r a n s p o s i t i o n ( 3 6 ) . I . V a r i o u s DNA r e g i o n s may be b r o u g h t i n t o c l o s e p h y s i c a l p r o x i m i t y f o r t h e s u b s e q u e n t c l e a v a g e and l i g a t i o n e v e n t s . ( S o l i d l i n e s i n d i c a t e d o n o r DNA; d a s h e d l i n e s i n d i c a t e t a r g e t DNA; t h e s m a l l boxes i n d i c a t e d t h e o l i g o n u c l e o t i d e t a r g e t s e q u e n c e . The l e t t e r s a, b, c, and d i n t h e d u p l e x arms f l a n k i n g t h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s and t a r g e t o l i g o n u c l e o t i d e s e r v e t o i n d i c a t e t h e g e n e t i c s t r u c t u r e of t h e v a r i o u s d u p l e x p r o d u c t s . ) I I . F o u r s i n g l e - s t r a n d e d c l e a v a g e s . The donor m o l e c u l e i s c l e a v e d on e i t h e r s t r a n d a t t h e e x t r e m i t y of t h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n t . The t a r g e t m o l e c u l e i s c l e a v e d a t s i t e s c h o s e n w i t h g r e a t e r o r l e s s e r s p e c i f i c i t y ( d e p e n d i n g on t h e e l e m e n t ) t o y i e l d 5- or 9- bp c o h e s i v e e n d s . F o l l o w i n g c l e a v a g e s , t h e donor and t a r g e t s t r a n d s a r e l i g a t e d t o g e n e r a t e a x-shaped s t r u c t u r e h e l d t o g e t h e r by t h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n t . (The a r r o w h e a d s i n d i c a t e 3'-h y d r o x y l ends of DNA c h a i n s and t h e d o t s i n d i c a t e 5'-p h o s p h a t e ends.) I I I . F i l l i n g i n of t h e u n p a i r e d o l i g o n u c l e o t i d e s e q u e n c e s a t t h e ends and s e m i c o n s e r v a t i v e r e p l i c a t i o n of t h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n t . The r e s u l t of t h i s r e p l i c a t i o n w i l l be two r e c o m b i n a n t d u p l e x e s e a c h c o n t a i n i n g a s e m i c o n s e r v e d . t r a n s p o s a b l e e l e m e n t a d j a c e n t t o t h e t a r g e t 5- o r 9-bp s e q u e n c e . I f t h e donor and t a r g e t m o l e c u l e s a r e b o t h i n t a c t r e p l i c o n s , a f u s e d r e p l i c o n i s f o r m e d . (The heavy b a r s a r e p a r e n t a l DNA of t h e t r a n s p o s a b l e e l e m e n t , and open b a r s a r e newly s y n t h e s i z e d DNA.) IV. S i t e - s p e c i f i c r e c i p r o c a l r e c o m b i n a t i o n t a k e s p l a c e between t h e two t r a n s p o s a b l e e l e m e n t s t o g e n e r a t e b o t h t h e o r i g i n a l d o nor m o l e c u l e and t h e t a r g e t m o l e c u l e c o n t a i n i n g an i n s e r t e d e l e m e n t f l a n k e d by a 5- or 9-bp r e p e a t . 18 c o 4 - - - - ••I0H^=OOO- • > 19 Transposons such as Tn5 are very useful tools for genetic engineering _in vivo because of the following properties (18, 26): (1) The drug-resistance gene permits a positive selectable marker for inheritance of the insertion and any mutation caused by i t . (2) The integration into a gene of an operon, not only abolishes the function of the gene, but also leads to a reduction in the a c t i v i t i e s of a l l other genes downstream in the d i r e c t i o n of transcription (polarity e f f e c t s ) . (3) Transposons can generate deletions near the insertion s i t e . (4) Insertion mutations can be obtained at high frequency after a low l e v e l of "mutagenesis" by exposure to a translocatable element. 20 I I I . T h e P r e s e n t I n v e s t i g a t i o n : I n t h i s s t u d y t h e o r g a n i z a t i o n a n d i n t e r r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n t h e r i b o s o m a l p r o t e i n a n d RNA p o l y m e r a s e g e n e s i n t h e r i f c l u s t e r w e r e e x a m i n e d i_n v i v o b y i s o l a t i n g a n d c h a r a c t e r i z i n g T n 5 i n s e r t i o n s i n t o p l a s m i d s c a r r y i n g t h e s e , r i b o s o m a l p r o t e i n o p e r o n s . T h e p o l a r e f f e c t s o f Tn'5-i n s e r t i o n s w e r e u s e d t o c o n f i r m t h e g e n e r a l o r g a n i z a t i o n o f t h e g e n e s i n t o t w o o p e r o n s a n d t h e s i t e o f t h e L 1 0 o p e r o n p r o m o t e r w a s l o c a l i z e d . T h e p o l a r e f f e c t s a n d p h y s i o l o g i c a l c h a n g e s c a u s e d b y g e n e i n a c t i v a t i o n f o l l o w i n g i n s e r t i o n w e r e s t u d i e d b y e x a m i n i n g : ( 1 ) 0 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i n f u s i o n s o f t h e l a c Z g e n e t o t h e L 1 0 r i b o s o m a l p r o t e i n a n d p RNA p o l y m e r a s e g e n e s ; ( 2 ) T h e s y n t h e s i s o f p l a s m i d s p e c i f i e d p r o t e i n s i n U V -i r r a d i a t e d m a x i c e l l s ( 3 5 ) ; ( 3 ) T h e s y n t h e s i s o f p l a s m i d s p e c i f i e d L 1 2 p r o t e i n s i n a m u t a n t s t r a i n p r o d u c i n g a n e l e c t r o p h o r e t i c a l l y a l t e r e d L 1 2 p r o t e i n f r o m t h e c h r o m o s o m a l g e n e . 21 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S I . A b b r e v i a t i o n s a n d C h e m i c a l s : A . A b b r e v i a t i o n s : B i s - a c r y l a m i d e : B i s - t r i s : D N A : . E D T A : M E S : m R N A : O N P G : S D S : T E M E D : T R I S : X G A L : N , N ' - m e t h y l e n e - b i s a c r y l a m i d e [ b i s ( 2 - h y d r o x y e t h y l ) i m i n o -t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) m e t h a n e ] d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d d i s o d i u m e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e [ 2 ( N - m o r p h o l i n e ) e t h a n e s u l f o n i c a c i d ] m e s s e n g e r r i b o n u c l e i c a c i d o - n i t r o p h e n y l - p - D - g a l a c t o s i d e s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e N , N , N ' , N ' - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e 5 - b r o m o - 4 - c h l o r o - 3 - i n d o l y 1 - p - D -g a l a c t o s i d e 22 C h e m i c a l s a n d R a d i o i s o t o p e s : A c r y l a m i d e , B i s - a c r y l a m i d e , T E M E D w e r e o b t a i n e d f r o m E a s t m a n C o r p . A g a r o s e , B i s - t r i s , ( N H „ ) 2 S „ 0 8 , M E S , O N P G , k a n a m y c i n , t e t r a c y c l i n e w e r e o b t a i n e d f r o m S i g m a . X G A L w a s o b t a i n e d f r o m B a c h e m . R a d i o a c t i v e i s o t o p e s : L - ( 3 5 S ) - m e t h i o n i n e , a - ( 3 2 P ) - d C T P w e r e o b t a i n e d f r o m New E n g l a n d N u c l e a r . 23 I I . M e dia and S o l u t i o n s : A. M e d i a : M9 m i n i m a l medium: p e r l i t e r N H „ C 1 1.0 g Na2"HPO» 7.0 g K H 2 P O « 3.0 g Na C l 0.5 g A f t e r a u t o c l a v i n g , add 0.1 ml and 0.01 ml of 1M MgSO,, and 1M C a C l 2 r e s p e c t i v e l y . NY b r o t h / a g a r : p e r l i t e r N-Z-amine 10 g Y e a s t e x t r a c t 5 g N a C l 5 g 1M NaOH 2 ml NY a g a r : 15 g a g a r p e r l i t e r of NY. B. B u f f e r s and S o l u t i o n s : 1. P l a s m i d DNA p r e p a r a t i o n s : S o l u t i o n I : p e r 100 ml f i n a l c o n e . EDTA 0.37 g 10 mM G l u c o s e 0.9 g 50 mM T r i s 0.3 g 25 mM P r e p a r e f r e s h w i t h 2 mg/ml l y s o z y m e and s t o r e a t 0°C 24 S o l u t i o n I I : pe r 100 ml f i n a l c o n e . NaOH SDS S o l u t i o n I I I : 0.8 g 1 .0 g 0.2 M 1 % pe r 100 ml f i n a l c o n e . NaOAc 40.8 g 3 M D i s s o l v e NaOAc i n m i n i m a l volume of water and t i t r a t e t o pH 4.8 w i t h g l a c i a l a c e t i c a c i d . Then b r i n g up t o 100 ml w i t h w a t e r . T r i s - E D T A b u f f e r : 1M T r i s pH 7.5 0.5M EDTA pH 8.0 pe r 100 ml f i n a l cone 1 ml 0.2 ml 1 0 mM 1 mM 2. Competent c e l l p r e p a r a t i o n s : T r i s - M q b u f f e r : 1M T r i s pH 7.5 1M M g C l 2 T r i s - M q - C a b u f f e r 1M T r i s pH 7.5 1M M g C l 2 1M C a C l 2 p e r 100 ml f i n a l cone 0. 5 ml 0.5 ml 5 mM 5 mM pe r 100 ml f i n a l cone 0.5 ml 0. 5 ml 1 0 ml 5 mM 5 mM 1 00 mM 2 5 X.DNA p r e p a r a t i o n s : B b u f f e r : 1M T r i s p H 7 . 5 1M M g S 0 4 5M N a C I 0 - g a l a c t o s i d a s e a s s a y s : Z b u f f e r : N a 2 H P O „ N a H 2 P O « K C 1 A f t e r a u t o c l a v i n g , a d d : 1M M g C l 2 100 m g / m l CM p - m e r c a p t o e t h a n o l p e r 100 m l f i n a l c o n e 1 . 0 m l 0 . 5 m l 1 . 0 m l 0 . 8 5 g 0 . 5 5 . g 0 . 0 7 5 g 0 . 1 m l 0 . 2 m l 0 . 2 7 m l 1 0 mM 5 mM 50 mM p e r 100 m l f i n a l c o n e 1 M 1 0 mM 1 mM 2 0 0 » i g / m l 38 mM A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s : 1 OX A G B b u f f e r : N a O A c T r i s E D T A p e r l i t e r f i n a l c o n e . 2 7 . 2 g 4 8 . 4 g 3 . 7 g 0 . 2 M 0 . 4 M 1 0 mM A d j u s t p H t o 8 . 0 w i t h a b o u t 12 m l o f g l a c i a l a c e t i c a c i d . . 26 0 .7% a g a r o s e g e l : p e r 1 5 0 m l f i n a l c o n e A g a r o s e 1 0 X A G B H 2 0 1 . 0 5 g 1 5 m l 1 3 5 m l 0 . 7 % 1 X H e a t t o d i s s o l v e a g a r o s e . C o o l t o a b o u t 6 0 ° C a n d a d d 4 r<l o f 10 m g / m l e t h i d i u m b r o m i d e . 6 . S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s : C r a c k i n g b u f f e r : 1 . 2 5 M T r i s p H 6 . 8 10% S D S G l y c e r o l p - m e r c a p t o e t h a n o l 0 .1% b r o m o p h e n o l b l u e p e r 100 m l f i n a l c o n e 5 m l 20 m l 1 0 m l 5 m l 1 m l 1 2 . 5 % S D S - p o l y a c r y l a m i d e s l a b g e l s 1 . 5 M T r i s ' p H 8 . 8 1 0% S D S 30% a c r y l a m i d e : 8% b i s - a c r y l a m i d e H 2 0 - - d e g a s 1% T E M E D 1% ( N H „ ) 2 S « 0 8 p e r 40 m l 10 m l 0 . 4 m l 1 6 . 6 m l 6 . 4 m l 1 . 0 m l 2 . 8 m l 0 . 0 6 2 5 M 2 %' 10 % 5 % 0 . 0 0 1 % f i n a l c o n e 0 . 3 7 5 M 0 . 1 % 1 2 . 5 % 0 . 1 % 0 . 0 7 % 27 3% S D S - p o l y a c r y l a m i d e s t a c k i n g g e l s : 1 . 2 5 M T r i s p H 6 . 8 10% S D S 30% a c r y l a m i d e : 8% b i s - a c r y l a m i d e H 2 0 — d e g a s 1% T E M E D 1% ( N H n ) 2 S u 0 8 1 OX r u n n i n g b u f f e r : T r i s G l y c i n e S D S p e r 10 m l 1 . 0 m l 0 . 1 m l 1 . 0 m l 6 . 2 m l 1 . 0 m l 0 . 7 m l 3 .0 .9 g 144 g 10 g f i n a l c o n e 0 . 1 2 5 M 0 . 1 % 3 . 0 % 0 . 1 % 0 . 0 7 % p e r l i t e r f i n a l c o n e 0 . 2 5 M 1 . 9 2 M 1 % T h e p H s h o u l d b e a t 8 . 3 w i t h o u t a d j u s t i n g 7 . U r e a - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s : 10X u p p e r b u f f e r p e r 5 0 0 m l f i n a l c o n e . B i s - t r i s 2 0 . 9 2 g 20 mM A d j u s t p H t o 7 . 0 w i t h a b o u t 44 m l o f 8 g o f M E S i n 50 m l o f w a t e r . 28 10X l o w e r b u f f e r : p e r 5 0 0 m l f i n a l c o n e . B i s - t r i s 3 0 . 3 4 g 3 0 mM A d j u s t p H t o 6 . 0 w i t h a b o u t 7 m l o f g l a c i a l a c e t i c a c i d . 2X g e l b u f f e r : p e r 50 m l f i n a l c o n e . 9M u r e a 50 m l 9 M B i s - t r i s 1 . 19 g 50 mM A d j u s t p H t o 5.0 w i t h a b o u t 0.95 m l o f g l a c i a l a c e t i c a c i d . 4% u r e a - p o l y a c r y l a m i d e g e l s : p e r 50 m l f i n a l c o n e . 9M u r e a 1 8 . 2 5 m l 3 . 3 % 30% a c r y l a m i d e : 8% b i s - a c r y l a m i d e 6 . 6 7 m l 4 . 0 % 2X g e l b u f f e r 25 m l 1 X T E M E D 50 u l 0 . 0 1 % 10% ( N H » ) 2 S , 0 B 2 5 0 u l 0 . 0 5 % 29 I I I . M e t h o d s : A . B a c t e r i a l S t r a i n s a n d G r o w t h C o n d i t i o n s : T h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e b a c t e r i a l s t r a i n s u s e d a r e l i s t e d i n T a b l e I . T h e b a c t e r i a l s t r a i n M C 1 0 0 0 was u s e d a s a g e n e r a l r e c i p i e n t f o r p l a s m i d s i n t h e c o u r s e o f t h e i n v e s t i g a t i o n . B a c t e r i a w e r e g r o w n i n NY b r o t h o r a g a r c o n t a i n i n g , w h e n a p p r o p r i a t e , t e t r a c y c l i n e ( 2 0 M g / m l ) a n d k a n a m y c i n ( 2 0 nq/ml). L y s o g e n s o f r e c o m b i n a n t p h a g e w e r e g r o w n i n M9 m i n i m a l m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 0.2% g l u c o s e , 0 .8% c a s a m i n o a c i d s , t h i a m i n e ( 0 . 5 M g / m l ) , a n d t h e r e q u i r e d a n t i b i o t i c s . T h e s y n t h e s i s o f p l a s m i d s p e c i f i e d p r o t e i n s w a s i n v e s t i g a t e d i n E . c o l i C S R 6 0 3 ( m a x i c e l l s ) , c a r r y i n g r e c A a n d u v r A m u t a t i o n s . T h e s e c e l l s a r e d e f e c t i v e i n p h o t o r e a c t i v a t i o n a n d h e n c e u n a b l e t o r e p a i r U V - i n d u c e d d a m a g e d DNA ( 3 5 ) . B a c t e r i a l c e l l s w e r e g r o w n i n M9 m i n i m a l m e d i u m s u p p l i e d w i t h a m i n o a c i d s t h r e o n i n e , l e u c i n e , p r o l i n e , h i s t i d i n e a n d a r g i n i n e ( 5 0 nq/ml). T h e s y n t h e s i s o f p l a s m i d s p e c i f i e d L 1 2 p r o t e i n w a s e x a m i n e d u s i n g a n L 1 2 e l e c t r o p h o r e t i c m u t a n t , s t r a i n J F 1 0 3 9 , i n M9 m i n i m a l m e d i u m c o n t a i n i n g t h e r e q u i r e d a m i n o a c i d s v a l i n e , i s o l e u c i n e a n d a r g i n i n e . T h i s s t r a i n p r o d u c e s f u n c t i o n a l l y a c t i v e L 1 2 p r o t e i n s w h i c h h a v e d i f f e r e n t e l e c t r o p h o r e t i c p r o p e r t i e s f r o m t h e w i l d t y p e L I 2 p r o t e i n o n u r e a p o l y a c r y l a m i d e g e l s . 30 T a b l e I : G e n o t y p e s o f B a c t e r i a l S t r a i n s . S t r a i n G e n e t i c C h a r a c t e r i s t i c s M C 1 0 0 0 a r a D I 3 9 , ( a r a B C O I C l e u ) 7 6 9 7 , ( l a c I O P Z Y ) X 7 4 , g a l U , g a l K , s t r A , t h i M C 4 1 0 0 a r a D I 3 9 , l a c U l 6 9 , s t r A , t h i , m o t , r e c A J F 1 0 3 9 i l v D , a r q H , r p l L C S R 6 0 3 t h r , l e u , t h i , p r o , a r q , p h r - 1 , r e c A 1 X r e x : : T n 5 X C I 8 5 7 r e x : : T n 5 , 0 2 9 ( a m ) , P 8 0 ( a m ) , b 2 2 1 31 B . I s o l a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f T n 5 T r a n s p o s i t i o n s : 1 . T r a n s p o s i t i o n o f T n 5 - f r o m X.CI 8 5 7 r e x : : T n 5 o n t o P l a s m i d s p N F 1 3 4 4 , p N F l 5 7 l a n d p N F l 9 6 2 : R e c i p i e n t M C 1 0 0 0 c a r r y i n g p l a s m i d s o f i n t e r e s t w e r e i n n o c u l a t e d i n t o 2 m l o f NY b r o t h i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 0 1 M M g C l 2 a n d t e t r a c y c l i n e a t 3 7 ° C . A f t e r 16 h o u r s o f g r o w t h , 0 . 5 m l o f X r e x : : T n 5 p h a g e s t o c k was a d d e d a n d i n f e c t i o n w a s a l l o w e d t o p r o c e e d a t 2 0 ° C f o r 3 0 m i n . T h e X r e x : : T n 5 p h a g e i s a c r y p t i c b a c t e r i o p h a g e w h i c h i s u n a b l e t o r e p l i c a t e o r l y s o g e n i z e t h e h o s t b a c t e r i u m . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d , r e s u s p e n d e d i n 20 . m l o f t h e a b o v e f r e s h m e d i u m w i t h o u t M g C l 2 a n d T n 5 t r a n s p o s i t i o n e v e n t s w e r e p e r m i t t e d b y g r o w i n g t h e i n f e c t e d c e l l s f o r 3 h o u r s a t 3 7 ° C . C e l l s w e r e c o n c e n t r a t e d b y c e n t r i f u g a t i o n , p l a t e d o n t o s e l e c t i v e NY p l a t e s c o n t a i n i n g k a n a m y c i n a n d t e t r a c y c l i n e , a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C , t o o b t a i n k a n a m y c i n a n d t e t r a c y c l i n e r e s i s t a n t b a c t e r i a . 32 2 . I s o l a t i o n o f P l a s m i d s C o n t a i n i n g T n 5 I n s e r t i o n s : T h e T n 5 i n f e c t e d , k a n a m y c i n a n d t e t r a c y c l i n e r e s i s t a n t b a c t e r i a o b t a i n e d h a v e T n 5 e l e m e n t s t r a n s p o s e d o r h o p p e d f r o m t h e D N A t o e i t h e r t h e p l a s m i d DNA o r t h e c h r o m o s o m a l D N A . P l a s m i d s w h i c h c o n f e r b o t h k a n a m y c i n a n d t e t r a c y c l i n e r e s i s t a n c e w e r e i s o l a t e d a n d u s e d t o t r a n s f o r m a k a n a m y c i n a n d t e t r a c y c l i n e s e n s i t i v e b a c t e r i u m t o o b t a i n k a n a m y c i n a n d t e t r a c y c l i n e r e s i s t a n t c l o n e s . a . S m a l l s c a l e p l a s m i d DNA p r e p a r a t i o n s : P l a s m i d s c r e e n i n g a n d s m a l l s c a l e ' p l a s m i d p r e p a r a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t f o l l o w i n g t h e B i r n b o i m r a p i d ' p r o c e d u r e ( 7 ) . C u l t u r e s w e r e i n n o c u l a t e d i n t o 2 m l o f NY b r o t h w i t h 0.2% g l u c o s e a n d t h e a p p r o p r i a t e a n t i b i o t i c s , a n d a l l o w e d t o g r o w o v e r n i g h t a t 3 7 ° C . C e l l s w e r e h a r v e s t e d a n d r e s u s p e n d e d i n t o 100 » i l o f l y s o z y m e s o l u t i o n ( S o l u t i o n I ) f o r 30 m i n . a t 0 ° C . T h e c e l l s w e r e l y z e d a n d t h e DNA was d e n a t u r e d b y t h e a d d i t i o n o f 2 0 0 „ 1 o f N a O H - S D S , S o l u t i o n I I , (5 m i n . , 0 ° C ) . C h r o m o s o m a l DNA w a s p r e c i p i t a t e d w i t h 150 til o f a c e t i c a c i d , S o l u t i o n I I I ( 6 0 m i n . , 0 ° C ) . T h e t o t a l r e n a t u r e d p l a s m i d DNA was s e p a r a t e d f r o m t h e b u l k o f c e l l u l a r d e b r i s a n d c h r o m o s o m a l DNA b y c e n t r i f u g a t i o n a n d w a s p r e c i p i t a t e d b y t w o v o l u m e s o f e t h a n o l ( 3 0 m i n . , - 8 0 ° C ) . T h e DNA p e l l e t w a s 33 r e s u s p e n d e d i n t o 4 0 0 y l o f 0 . 1 M N a O A c , 0 . 0 5 M T r i s p H 8 . 0 a n d p r e c i p i t a t e d a g a i n w i t h e t h a n o l ( 1 0 m i n . , - 2 0 ° C ) . T h e f i n a l p u r i f i e d D N A p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n t o 40 y l o f T r i s - E D T A b u f f e r . b . P r e p a r a t i o n o f c o m p e t e n t c e l l s a n d t r a n s f o r m a t i o n o f c o m p e t e n t c e l l s w i t h p l a s m i d D N A : R e c i p i e n t c e l l s w e r e i n n o c u l a t e d i n t o 50 m l o f NY g l u c o s e b r o t h a n d a l l o w e d t o g r o w t o a d e n s i t y o f 0 . 5 - 0 . 6 A „ 6 0 . T h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 10K f o r 3 m i n . ( 4 ° C ) . T h e p e l l e t e d c e l l s w e r e f i r s t t r e a t e d w i t h 30 m l o f T r i s - M g b u f f e r ( 1 5 m i n . , 0 ° C ) , t h e n h a r v e s t e d a n d t r e a t e d w i t h 30 m l o f T r i s - M g - C a b u f f e r ( 2 0 m i n . , 0 ° C ) . T h e f i n a l c o m p e t e n t c e l l s w e r e h a r v e s t e d a n d r e s u s p e n d e d i n 1 m l o f T r i s - M g - C a b u f f e r a n d k e p t o n i c e . T r a n s f o r m a t i o n w a s a l l o w e d b y m i x i n g 100 y l o f c o m p e t e n t c e l l s t o 1 y g ( 1 0 y 1 ) o f p l a s m i d DNA f r o m B i r n b o i m ' s m e t h o d . T h e c e l l s w e r e k e p t o n i c e f o r .1 h o u r a n d t h e n s p r e a d e d o n t o n i t r o c e l l u l o s e f i l t e r o n n o n - s e l e c t i v e NY p l a t e s a t 3 7 ° C . A f t e r 2 h o u r s • o f i n c u b a t i o n , t h e n i t r o c e l l u l o s e f i l t e r w a s t r a n s f e r r e d o n t o s e l e c t i v e NY p l a t e s w i t h t h e a p p r o p r i a t e a n t i b i o t i c s . 34 c . C h a r a c t e r i z a t i o n o f T n 5 T r a n s p o s i t i o n s : P u r i f i e d p l a s m i d s f r o m i n d i v i d u a l k a n a m y c i n a n d t e t r a c y c l i n e r e s i s t a n t c l o n e s w e r e e x a m i n e d f o r t h e p o s i t i o n o f T n 5 i n s e r t i o n b y r e s t r i c t i o n e n z y m e m a p p i n g . T h e r e s t r i c t i o n m a p s a n d t h e c o n s t r u c t i o n o f t h e p a r e n t a l p l a s m i d s b e i n g s t u d i e d a r e s h o w n i n F i g u r e 6 . T h e a p p r o x i m a t e p o s i t i o n s o f i n s e r t i o n w e r e i n i t i a l l y l o c a l i z e d w i t h r e s t r i c t i o n e n z y m e E c o R I , a n d f u r t h e r w i t h B g l l l a n d H i n d l l l . T h e p r e c i s e s i t e s o f s o m e o f t h e i n s e r t i o n s w e r e d e t e r m i n e d b y DNA s e g u e n c e a n a l y s i s , u s i n g t h e M a x a m a n d G i l b e r t p r o c e d u r e ( 2 4 ) . 35 F i g u r e 6 : C o n s t r u c t i o n o f P l a s m i d s P N F 1 3 4 4 , p N F 1 5 7 1 , a n d  p N F 1 9 6 2 . T h e c o m p o s i t e p l a s m i d s e m p l o y e d w e r e p B R 3 2 2 d e r i v a t i v e s p N F 1 3 4 4 , a n d P N F 1 5 7 1 , a n d t h e p A C Y C l 8 4 d e r i v a t i v e p N F l 9 6 2 . P l a s m i d p N F l 3 4 4 c o n t a i n s a 6 . 0 k b f r a g m e n t f r o m X . r i f d 18 i n s e r t e d i n t o t h e P s t I s i t e o f t h e v e c t o r w h e r e a s p N F 1 5 7 1 c o n t a i n s a 3 0 3 7 b p l o n g f r a g m e n t , P s t I ( n u c l e o t i d e 4 8 7 ) - E c o R I ( n u c l e o t i d e 3 5 2 4 ) , i n s e r t e d b e t w e e n t h e P s t I a n d E c o R I s i t e s o f t h e v e c t o r D N A . P l a s m i d p N F l 9 6 2 c o n t a i n s a 1 4 . 2 k b f r a g m e n t i n s e r t e d i n t o t h e E c o R I s i t e o f t h e v e c t o r p l a s m i d . T h e g e n e s i l l u s t r a t e d a s s o l i d a r e a s o n t h e r e s p e c t i v e p l a s m i d s a r e L 1 1 ( r p l K ) , L1 ( r p l A ) , L 1 0 ( r p l j ) , L 1 2 ( r p l L ) , p ( r p o B ) , p' ( r p o C ) , a n d T c ( t e t r a c y c l i n e r e s i s t a n c e ) . T h e g e n e s i l l u s t r a t e d a s h a t c h e d a r e a s a r e Z ( l a c Z ) , Y ( l a c Y ) a n d A ( l a c A ) . A l l t h e s e g e n e s a r e e x p r e s s e d i n a r i g h t t o l e f t d i r e c t i o n , w i t h t h e e x c e p t i o n o f t h e p l a s m i d t e t r a c y c l i n e g e n e , a n d a r e b e l i e v e d t o b e e x p r e s s e d u t i l i z i n g t h e t w o p r o m o t e r s P ( L 1 1 ) o r P ( L 1 0 ) ( 2 0 ) . T h e mRNA s t a r t s i t e s f o r t h e s e p r o m o t e r s a r e n u c l e o t i d e s 79 a n d 1 3 4 8 r e s p e c t i v e l y . P l a s m i d s P N F 1 5 7 1 a n d P N F 1 9 6 2 c o m m e n c e r e s p e c t i v e l y a t n u c l e o t i d e s 4 8 7 ( P s t I s i t e ) a n d 2 8 0 ( E c o R I s i t e ) a n d c o n s e q u e n t l y d o n o t c o n t a i n t h e L 1 1 p r o m o t e r a n d t h e r e f o r e d o n o t e x p r e s s t h e f r a g m e n t o f t h e L 1 1 o r t h e i n t a c t L1 g e n e s . T h e p r e s e n c e o f a ( ' ) t o t h e r i g h t o r t h e l e f t o f a g e n e d e s i g n a t e s r e s p e c t i v e l y t h e a b s e n c e o f t h e N - t e r m i n a l o r t h e C - t e r m i n a l c o d i n g p o r t i o n o f t h e g e n e . T h e p r e s e n c e o f a ( - ) b e t w e e n t w o g e n e s r e p r e s e n t s a g e n e f u s i o n a n d r e s u l t s i n p r o d u c t i o n o f a h y b r i d p o l y p e p t i d e . T h e n u c l e o t i d e b o u n d a r i e s f o r d e s i g n a t e d g e n e s a r e : L 1 1 ( 1 7 2 - 5 9 7 ) ; L1 ( 6 0 4 - 1 3 0 5 ) ; L 1 0 ( 1 7 2 1 - 2 2 1 5 ) ; L 1 2 ( 2 2 8 5 - 2 6 4 7 ) ; p ( 2 9 6 9 - ) . I n t h e RNA p o l y m e r a s e p - l a c Z f u s i o n t h e BamHI f r a g m e n t f r o m p M C 9 0 l w a s i n s e r t e d i n t o t h e S a u 3 A s i t e o f p a t n u c l e o t i d e 3 0 9 2 . T h i s f u s i o n i s i n f r a m e a n d p r o d u c e s a h y b r i d p r o t e i n c o n t a i n i n g t h e N - t e r m i n a l 42 a m i n o a c i d s o f p f u s e d t o t h e e i g h t h a m i n o a c i d o f p - g a l a c t o s i d a s e . T h e r e s t r i c t i o n s i t e s a r e i l l u s t r a t e d . 37 C . P l a s m i d - P h a g e R e c o m b i n a t i o n a n d t h e E x p r e s s i o n o f l a c Z  F u s i o n P r o d u c t s : T h e e f f e c t o f T n 5 i n s e r t i o n o n t h e e x p r e s s i o n o f r i b o s o m a l p r o t e i n L 1 0 a n d RNA p o l y m e r a s e p s u b u n i t w a s e x a m i n e d u t i l i z i n g X.1910 a n d X. 1 9 6 2 r e s p e c t i v e l y . T h e c o n s t r u c t i o n o f t h e s e t w o t r a n s d u c i n g p h a g e s i s d e s c r i b e d i n F i g u r e 7 . T h e T n 5 i n s e r t i o n s o n p l a s m i d s w e r e m o v e d t o h o m o l o g o u s p o s i t i o n o n t h e b a c t e r i o p h a g e s b y _in v i v o r e c o m b i n a t i o n s ( F i g . 8 ) a n d t h e e x p r e s s i o n o f L 1 Q - l a c Z a n d p-lacZ f u s i o n p r o t e i n s w e r e d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g t h e l e v e l o f 0 - g a l a c t o s i d a s e ' a c t i v i t y . 1. P l a s m i d - p h a g e r e c o m b i n a t i o n a n d t r a n s d u c t i o n : S t r a i n s c a r r y i n g k a n a m y c i n a n d t e t r a c y c l i n e r e s i s t a n t p l a s m i d s w e r e i n n o c u l a t e d i n t o 10 m l o f M9 m i n i m a l m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h 0 .2% m a l t o s e , 0 .8% c a s a m i n o a c i d s , t h i a m i n e ( 0 . 5 y g / m l ) a n d a n t i b i o t i c s . W h e n c e l l d e n s i t y w a s a b o u t 1 . 0 A „ 6 0 , t h e c e l l s w e r e h a r v e s t e d , w a s h e d w i t h 10 m l o f M9 m i n i m a l m e d i u m i n p r e s e n c e o f 0 . 0 1 M M g C l 2 . T h e f i n a l c e l l p e l l e t w a s r e s u s p e n d e d i n t o 1 m l o f f r e s h M 9 - M g m i n i m a l m e d i u m a n d U V - i r r a d i a t e d i n t h e d a r k f o r 30 s e c o n d s a t a d i s t a n c e o f 40 c m . T h e U V - i r r a d i a t e d c e l l s ( 0 . 5 m l ) w e r e i n f e c t e d i n t h e d a r k w i t h 5 ul o f X 1 9 1 0 o r X.1962 i n 4 . 5 m l NY g l u c o s e b r o t h w i t h 0 . 0 1 M M g C l 2 , t e t r a c y c l i n e a n d k a n a m y c i n a t 3 7 ° C . A f t e r t h r e e h o u r s o f i n f e c t i o n , t h e c e l l s w e r e c o n c e n t r a t e d b y 38 c e n t r i f l i g a t i o n a n d r e s u s p e n d e d i n t o 0 . 5 m l o f B b u f f e r . C e l l s w e r e l y z e d w i t h 2 5 y l o f C H C 1 3 a n d 1 y l o f D N a s e a t 3 7 ° C f o r 15 m i n . C e l l d e b r i s w e r e r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d t h e s u p e r n a t a n t w h i c h c o n t a i n s t h e p h a g e p a r t i c l e s was s t o r e d o v e r C H C 1 3 a t 4 ° C . T h e p h a g e i s o l a t e d w e r e u s e d t o t r a n s d u c e s t r a i n M C 4 1 0 0 , w h i c h w e r e g r o w n t o e a r l y s a t u r a t i o n i n M9 m i n i m a l m e d i u m s u p p l e m e n t e d w i t h m a l t o s e , c a s a m i n o a c i d s a n d t h i a m i n e . T o 100 y l o f t h e p h a g e s o l u t i o n , 150 y l o f t h e r e c i p i e n t c e l l s w a s a d d e d a n d i n f e c t i o n w a s a l l o w e d t o p r o c e e d a t 2 0 ° C f o r 30 m i n . T h e c e l l s w e r e g r o w n i n 0 . 5 m l o f NY g l u c o s e b r o t h f o r 3 h o u r s a t 3 0 ° C , a n d t h e n p l a t e d o n t o s e l e c t i v e NY p l a t e s c o n t a i n i n g X G A L a n d k a n a m y c i n a t 3 0 ° C . 39 F i g u r e 7 : C o n s t r u c t i o n o f T r a n s d u c i n g P h a g e s X 1 9 1 0 a n d X 1 9 6 2 . T h e r i g h t j u n c t i o n o f t h e b a c t e r i a l DNA w i t h X D N A o c c u r s a t t h e E c o R I s i t e i n L 1 1 ( n u c l e o t i d e 2 8 0 ) . T h e R N A p o l y m e r a s e p-l a c Z f u s i o n o n X 1 9 6 2 i s i d e n t i c a l w i t h t h a t o n p l a s m i d p N F 1 9 6 2 ( s e e F i g . 6 ) . T h e L 1 Q - l a c Z f u s i o n o n X 1 9 1 0 f u s e s t h e B a m H I s i t e i n l a c Z ( p r e c e d i n g c o d o n 8 ) t o a P s t I s i t e ( n u c l e o t i d e 1 7 9 1 ) a t c o d o n 2 5 i n t h e L 1 0 g e n e . T h e f u s i o n w a s a c h i e v e d a n d t h e p r o p e r r e a d i n g f r a m e e s t a b l i s h e d u s i n g a 28 n u c l e o t i d e l o n g P s t l - B g l l l l i n k e r f r a g m e n t d e r i v e d f r o m t h e L1 g e n e ( n u c l e o t i d e 8 6 9 - 8 9 7 ) . B a c t e r i a l s t r a i n s l y s o g e n i c f o r t h e s e p h a g e s e x h i b i t p-g a l a c t s i d a s e a c t i v i t y . T h e X ( r i g h t a r m ) i s d e r i v e d f r o m a d e r i v a t i v e o f X g t ( C ) w h e r e t h e E c o R I r e s t r i c t i o n s i t e s i n t h e r i g h t a r m h a v e b e e n r e m o v e d b y m u t a t i o n . T h e X ( l e f t a r m ) i s d e r i v e d f r o m X M C 2 0 9 . T h i s a r m c o n t a i n s ' l a c A l a c Y l a c Z ' a n d t h e r i g h t e n d o f t h i s f r a g m e n t i s t h e E c o R I s i t e l o c a t e d l a t e i n t h e l a c Z g e n e . T h e i n t e r m e d i a t e p h a g e i n t h e s e c o n s t r u c t i o n w a s X N F 1 9 5 5 w h i c h c o n t a i n s X ( l e f t a r m ) f r o m X g t ( C ) f u s e d t o X ( r i g h t a r m ) f r o m X M C 2 0 9 t h r o u g h t h e s i n g l e E c o R I s i t e . T h e r e c o m b i n a n t p h a g e X 1 9 1 0 a n d X 1 9 6 2 w e r e c o n s t r u c t e d b y i n s e r t i o n o f E c o R I f r a g m e n t s c o n t a i n i n g t h e i n d i c a t e d L1 Q - l a c Z o r p - - l a c Z f u s i o n s i n t o t h e s i n g l e E c o R I s i t e o f N F 1 9 5 5 a n d s e l e c i n g f o r l y s o g e n s w i t h 0 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y . 40 41 F i g u r e 8 : R e c o m b i n a t i o n a l T r a n s f e r o f T n 5 f r o m P l a s m i d s t o  H o m o l o g o u s P o s i t i o n s i n t h e T r a n s d u c i n g P h a g e . T h e T n 5 i n s e r t i o n s i n t o t h e r i b o s o m a l p r o t e i n r e g i o n o n p l a s m i d s p N F 1 3 4 4 , p N F l 5 7 1 , a n d p N F l 9 6 2 w e r e t r a n s f e r r e d t o h o m o l o g o u s p o s i t i o n s o n X 1 9 1 0 a n d X 1 9 6 2 d u r i n g l y t i c p h a g e i n f e c t i o n . S e l e c t i o n w a s m a d e f o r p r o g e n y p h a g e w h i c h t r a n s d u c e d k a n a m y c i n r e s i s t a n c e , a n d t h e p o s i t i o n o f t h e T n 5 t r a n s f e r r e d w a s c o n f i r m e d b y r e s t r i c t i o n e n z y m e m a p p i n g . A n e x a m p l e o f r e c o m b i n a t i o n a l t r a n s f e r o f T n 5 ( i n d i c a t e d b y o p e n t r i a n g l e ) f r o m t h e l e a d e r r e g i o n o f t h e L 1 0 g e n e o n p l a s m i d p N F l 3 4 4 t o X 1 9 6 2 i s i l l u s t r a t e d . p13U:TN5 L12 L10 L1 L11 /3 - LAC Z —u/ m w n ) i/////// / / / / i 1W N CI M962 A-J A Y L10 - LAC Z j i m w n n / i u n n n n i l l limit >1910 BY BACTERIAL RECOMBINATION A1962:TN5 /// A\ /[////////// I 1 LUA r o 43 2 . P r e p a r a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f X.DNA: L y s o g e n s w e r e g r o w n i n 50 m l o f NY g l u c o s e b r o t h w i t h 0 . 0 1 M M g C l 2 a n d k a n a m y c i n a t 3 0 ° C . W h e n c e l l d e n s i t y w a s a b o u t 1 . 0 A „ 6 0 , t h e t e m p e r a t u r e w a s s h i f t e d u p t o 4 2 ° C f o r 15 m i n . , a n d t h e n t o 3 7 ° C f o r 2 h o u r s . C e l l s w e r e h a r v e s t e d , r e s u s p e n d e d i n 0 . 5 m l B b u f f e r , a n d l y z e d w i t h 50 y l C H C 1 3 , a n d 1 y l D N a s e ( 1 5 m i n . , 3 7 ° C ) . P h a g e p a r t i c l e s w e r e s e p a r a t e d f r o m c e l l d e b r i s b y c e n t r i f u g a t i o n a n d s t o r e d o v e r C H C 1 3 a t 4 ° C . T o 0 . 5 m l o f t h e p h a g e s o l u t i o n , 2 0 0 y l o f T r i s -E D T A s a t u r a t e d p h e n o l a n d 50 y l o f 0 . 5 M E D T A w e r e a d d e d t o d i s r u p t t h e p h a g e p a r t i c l e s ( 1 0 m i n . , 2 0 ° C ) . T h e a q u e o u s l a y e r c o n t a i n i n g p h a g e DNA was e x t r a c t e d o n c e w i t h p h e n o l : C H C l 3 ( 1 0 0 y l : 1 0 0 y l ) , a n d t w i c e w i t h 2 0 0 y l C H C 1 3 . T h e p h a g e D N A w a s p r e c i p i t a t e d w i t h t w o v o l u m e s o f e t h a n o l i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 3 M N a C I a n d r e s u s p e n d e d i n t o 50 y l T r i s - E D T A b u f f e r . T h e p h a g e D N A p r e p a r e d f r o m s i n g l e l y s o g e n s w a s a n a l y z e d b y r e s t r i c t i o n e n z y m e d i g e s t i o n s , u s i n g E c o R I , B g l l l a n d H i n d l l l . T h e p o s i t i o n o f T n 5 i n s e r t i o n o n t h e X.DNA w a s c o m p a r e d t o t h a t o f t h e r e s p e c t i v e p a r e n t a l p l a s m i d s . 44 3 . 0 - g a l a c t o s i d a s e m e a s u r e m e n t s : S t r a i n s o f M C 4 1 0 0 l y s o g e n i c f o r v a r i o u s X 1 9 1 0 a n d X 1 9 6 2 c o n t a i n i n g T n 5 i n s e r t i o n s w e r e g r o w n e x p o n e n t i a l l y i n t h e d e f i n e d m i n i m a l m e d i a . A t c e l l d e n s i t y o f 0 . 3 - 0 . 4 A „ 6 0 , t r i p l i c a t e s a m p l e s o f 0 . 1 m l w e r e r e m o v e d f r o m t h e c u l t u r e s a n d a s s a y e d f o r 0 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y . T h e a s s a y w a s d o n e i n 1 . 4 m l o f Z b u f f e r , 50 ul o f 0 .1% SDS a n d 100 „ 1 o f C H C 1 3 a t 2 8 ° C . T h e i n c u b a t i o n t i m e w a s s t a r t e d b y t h e a d d i t i o n o f 0 . 3 m l o f 4 m g / m l O N P G a n d s t o p p e d b y 1 m l o f 1M N a 2 C 0 3 . T h e f i n a l r e a c t i o n v o l u m e w a s 2 . 8 m l . A b s o r b a n c e a t 4 2 0 nm w a s t a k e n t o m e a s u r e t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e O N P p r o d u c t . U n i t s - o f e n z y m e a c t i v i t y a r e ( A „ 2 0 X 100 ) / ( t X A 4 6 0 ) , w h e r e t i s t h e i n c u b a t i o n t i m e o f t h e a s s a y i n m i n u t e a n d A „ 6 0 i s a m e a s u r e o f t h e m a s s o f t h e b a c t e r i a c u l t u r e a t t h e t i m e o f s a m p l i n g . 45 S y n t h e s i s o f P l a s m i d S p e c i f i c P r o t e i n s i n U V - i n a c t i v a t e d  C e l l s : P l a s m i d s , w i t h a n d w i t h o u t T n 5 i n s e r t i o n s , w e r e t r a n s f o r m e d i n t o s t r a i n C S R 6 0 3 . T h e t r a n s f o r m e d C S R 6 0 3 s t r a i n s w e r e g r o w n i n d e f i n e d m i n i m a l m e d i u m a t 3 7 ° C . A t c e l l d e n s i t y o f 0 . 3 5 - 0 . 4 5 A „ 6 0 , 10 m l o f c e l l s w e r e t a k e n f o r U V - i r r a d i a t i o n f o r 15 s e c o n d s a t a d i s t a n c e o f 56 c m . T h e i r r a d i a t e d c e l l s w e r e i n c u b a t e d f o r 16 h o u r s a t 3 7 ° C , c e n t r i f u g e d a n d r e s u s p e n d e d i n t o 5 m l o f f r e s h m e d i u m . P r o t e i n l a b e l l i n g w a s d o n e i n 2 . 5 m l o f c e l l s w i t h ( 3 5 S ) - m e t h i o n i n e (5 y C i / m l ; s p e c . a c t . ~ 1 5 0 0 C i / m m o l ) f o r 1 h o u r . C e l l s w e r e h a r v e s t e d a n d l y z e d b y b o i l i n g i n 0 . 2 5 m l c r a c k i n g b u f f e r f o r 3 m i n . R a d i o a c t i v e p r o t e i n s w e r e f r a c t i o n a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s o n 12 .5% S D S -p o l y a c r y l a m i d e g e l s a t 40 mA f o r 7 - 8 h o u r s . T h e g e l s w e r e s t a i n e d f o r 15 m i n . w i t h 0 . 1 % C o o m a s s i e b l u e i n 50% T C A a n d t h e n d e s t a i n e d i n 7% a c e t i c a c i d a n d 5% m e t h a n o l . T h e g e l s w e r e d r i e d a n d a u t o r a d i o g r a m s w e r e o b t a i n e d u s i n g K o d a k X R P - 1 X - r a y f i l m . 46 E . S y n t h e s i s o f L 1 2 P r o t e i n S p e c i f i e d b y P l a s m i d a n d  C h r o m o s o m a l r p l L G e n e s : P l a s m i d s , w i t h a n d w i t h o u t T n 5 i n s e r t i o n s , w e r e t r a n s f o r m e d i n t o s t r a i n J F 1 0 3 9 . T h e t r a n s f o r m e d s t r a i n s w e r e g r o w n i n 1 . 5 m l o f t h e d e f i n e d ' m i n i m a l m e d i a . W h e n c e l l d e n s i t y i s a b o u t 0 . 3 A U 6 0 , t h e c e l l s w e r e l a b e l l e d w i t h ( 3 5 S ) - m e t h i o n i n e ( 1 0 j i C i / m l ; s p e c . a c t . ~ 1 5 0 0 C i / m m o l ) i n p r e s e n c e o f 0 . 1 » » g / i r i l c o l d m e t h i o n i n e f o r 1 h o u r . C e l l s w e r e h a r v e s t e d , w a s h e d w i t h 1 m l 50 mM T r i s p H 8 . 0 a n d r e s u s p e n d e d i n 100 u l o f 1OmM E D T A , 50mM T r i s p H 8 . 0 . T h e c e l l s w e r e d i s r u p t e d b y 3 c y c l e s o f f r e e z i n g a n d t h a w i n g i n t h e p r e s e n c e o f 100 ><g/ml l y s o z y m e . T h e m a g n e s i u m c o n c e n t r a t i o n was a d j u s t e d t o 0 . 2 M b y - t h e a d d i t i o n o f 20 >»1 o f 1M M g C l 2 a n d 20 A 2 6 0 u n i t s o f c a r r i e r r i b o s o m e s w e r e a l s o a d d e d . T h e p r o t e i n s w e r e e x t r a c t e d w i t h 2 v o l u m e s o f g l a c i a l a c e t i c a c i d a t 0 ° C f o r 1 h o u r . F o l l o w i n g c e n t r i f u g a t i o n , t h e a c i d s o l u b l e f r a c t i o n w a s d i a l y z e d f o r 18 h o u r s a g a i n s t 8M u r e a , 0 . 0 5 M p ' - m e r c a p t o e t h a n o l . T h e v o l u m e s o f t h e e x t r a c t w a s m e a s u r e d , a n d 10X u p p e r b u f f e r a n d b r o m o p h e n o l b l u e w e r e a d d e d t o a c h i e v e a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 1X a n d 0 . 0 1 % r e s p e c t i v e l y . 47 T h e a c i d s o l u b l e p r o t e i n s w e r e s e p a r a t e d o n 4% p o l y a c r y l a m i d e s l a b g e l s i n t h e p r e s e n c e o f 8M u r e a w i t h o u t c o o l i n g a t 40 mA f o r 5 - 6 h o u r s , w i t h c o n t i n u o u s c i r c u l a t i o n o f t h e u p p e r b u f f e r w i t h a 1 l i t e r e x t e r n a l r e s e r v o i r . T h e g e l s w e r e f i x e d w i t h 50% m e t h a n o l , 10% a c e t i c a c i d f o r 30 m i n . , a n d s o a k e d i n 1M s o d i u m s a l i c y l i c a c i d , p H 5 . 5 , f o r 20 m i n . t o e n h a n c e s u b s e q u e n t a u t o r a d i o g r a p h y . T h e g e l s w e r e d r i e d a n d s u b j e c t e d t o a u t o r a d i o g r a p h y . ( 48 R E S U L T S I . I s o l a t i o n o f T n 5 I n s e r t i o n s : T h e T n 5 t r a n s p o s i t i o n s i n t o t e t r a c y c l i n e r e s i s t a n t p l a s m i d s p N F 1 3 4 4 , p N F 1 5 7 l , a n d p N F 1 9 6 2 w e r e i s o l a t e d b y i n f e c t i n g p l a s m i d c o n t a i n i n g c e l l s w i t h X C I 8 5 7 r e x : : T n 5 a n d s u b s e q u e n t l y s c r e e n i n g f o r p l a s m i d s w h i c h c o n f e r r e d r e s i s t a n c e t o b o t h t e t r a c y c l i n e a n d k a n a m y c i n . T h e a p p r o x i m a t e s i t e s o f t h e T n 5 i n s e r t i o n s w e r e l o c a t e d b y r e s t r i c t i o n e n z y m e a n a l y s i s o f p l a s m i d DNA w i t h E c o R I , B g l l l a n d H i n d l l l . M a n y o f t h e i n s e r t i o n s w e r e p r e c i s e l y m a p p e d b y DNA s e q u e n c i n g ( F i g . 9 ) . I n o n e e x p e r i m e n t w h e r e o v e r 100 d i f f e r e n t p N F 1 3 4 4 : : T n 5 k a n a m y c i n a n d t e t r a c y c l i n e r e s i s t a n t c o l o n i e s w e r e s c r e e n e d , a p p r o x i m a t e l y 30% o f t h e i n s e r t i o n s w e r e i n t o t h e 2 . 2 k b E c o R I f r a g m e n t w h i c h c o n t a i n s t h e c l o n e d r i b o s o m a l g e n e c l u s t e r ( F i g . 1 0 ) . T h e f r e q u e n c y o f T n 5 i n s e r t i o n s a l o n g t h e 2 . 2 k b E c o R I f r a g m e n t w a s n o n -r a n d o m ; t h r e e r e g i o n s f a v o r e d f o r i n s e r t i o n b e t w e e n n u c l e o t i d e p o s i t i o n s 2 8 0 - 7 0 0 , 1 3 0 0 - 1 5 0 0 a n d 2 0 0 0 - 2 2 0 0 w e r e o b s e r v e d . I n c o n t r a s t , n o i n s e r t i o n s b e t w e e n n u c l e o t i d e 7 0 0 -1 3 0 0 o r 2 2 0 0 - 2 4 4 4 w e r e r e c o v e r e d o n p N F 1 3 4 4 ; - t h i s w a s p r o b a b l y t h e r e s u l t o f n e g a t i v e s e l e c t i o n o n i n s e r t i o n i n t o r e g i o n s o f t h e L1 a n d L 1 2 g e n e a s d e s c r i b e d b e l o w . P l a s m i d P N F 1 5 7 1 w h i c h l a c k t h e p r o m o t e r f o r t h e L 1 1 o p e r o n w a s u t i l i z e d t o o b t a i n T n 5 i n s e r t i o n s w i t h i n t h e L l g e n e b e t w e e n n u c l e o t i d e s 7 0 0 - 1 3 0 0 . 49 F i g u r e 9 : A u t o r a d i o g r a p h y o f a 24% D N A S e q u e n c i n g G e l t o L o c a l i z e t h e P r e c i s e S i t e o f T n 5 I n s e r t i o n f o r S t r a i n P D 3 4 2 . T h e DNA s e q u e n c e a n a l y s i s w a s c a r r i e d o u t u s i n g t h e M a x a m a n d G i l b e r t m e t h o d ( 2 4 ) o n a H i n f l - H i n f l f r a g m e n t . O n e o f t h e H i n f l s i t e w a s c u t f r o m t h e e n d o f t h e i n v e r t e d r e p e a t s o f T n 5 ( G | A C T C ) a n d t h e o t h e r i s f r o m n u c l e o t i d e 1 4 1 6 i n t h e l e a d e r r e g i o n o f t h e L 1 0 o p e r o n ( G | A G T C ) . T h i s f r a g m e n t w a s p r e f e r e n t i a l l y l a b e l l e d a t t h e 3 ' e n d o f t h e H i n f l s i t e , w h i c h i s f o u r n u c l e o t i d e s f r o m t h e T n 5 e n d , w i t h c - ( 3 2 P ) - d C T P i n t h e p r e s e n c e o f c o l d d A T P . T h e p o s i t i o n o f i n s e r t i o n w a s f o u n d t o b e a t n u c l e o t i d e 1 2 8 0 f o r s t r a i n P D 3 4 2 . T h e 9 b a s e p a i r r e p e a t a t t h e i n s e r t i o n s i t e i s i n d i c a t e d t o g e t h e r w i t h i t s c o m p l e m e n t a r y s e q u e n c e s . C T A G 51 F i g u r e 1 0 : D i s t r i b u t i o n o f T n 5 I n s e r t i o n s i n t h e 2 . 2 k b E c o R I  F r a g m e n t o f P l a s m i d p N F 1 3 4 4 . A b o u t 30% o f t h e T n 5 i n s e r t i o n s i n t o p l a s m i d p N F 1 3 4 4 i n a s i n g l e a n a l y s i s w e r e f o u n d o n t h e 2 . 2 k b E c o R I f r a g m e n t . T h e t r a n s p o s i t i o n a l e v e n t s d o n o t a p p e a r t o b e r a n d o m ; i n f a c t , t h e r e w e r e t h r e e c l u s t e r s o f T n 5 i n s e r t i o n s a r o u n d n u c l e o t i d e p o s i t i o n 2 8 0 - 6 0 0 , 1 3 0 0 - 1 5 0 0 a n d 2 0 0 0 - 2 2 0 0 . No T n 5 i n s e r t i o n s w e r e f o u n d i n t h e m i d d l e a n d t h e d i s t a l p o r t i o n o f t h e L1 g e n e , f r o m n u c l e o t i d e 7 0 0 t o 1 3 0 0 o r i n t h e L 1 2 g e n e f r o m n u c l e o t i d e 2 2 0 0 t o 2 4 4 4 . ( T h e h o r i z o n t a l a x i s o f t h e g r a p h i s t h e f r e q u e n c y o f T n 5 i n s e r t i o n ; t h e v e r t i c a l a x i s i s t h e n u c l e o t i d e p o s i t i o n w i t h r e s p e c t t o t h e 2 . 2 k b E c o R I f r a g m e n t a s i n d i c a t e d . ) 52 10 I 1 53 T h e i n s e r t i o n o f T n 5 r e s u l t s i n d u p l i c a t i o n o f t h e 9 b a s e p a i r t a r g e t DNA s e q u e n c e a t t h e e n d s o f t h e i n s e r t i o n e l e m e n t . T a b l e I I p r e s e n t s t h e s e t a r g e t s i t e s f o r i n s e r t i o n s w h i c h h a v e b e e n p r e c i s e l y l o c a t e d b y D N A s e q u e n c e a n a l y s i s ( F i g . 1 1 ) . T h e s e s e q u e n c e s a p p e a r u n r e l a t e d , s u g g e s t i n g t h a t t h e t r a n s p o s i t i o n o f T n 5 s h o w e d v e r y l i t t l e , i f a n y , s e q u e n c e s p e c i f i c i t y a t t h e t a r g e t s i t e . R a n d o m n e s s i n t h e t a r g e t s e q u e n c e h a s a l s o b e e n o b s e r v e d f o r i n s e r t i o n s i n t o t h e l a c Z g e n e ( 2 5 ) . 54 T a b l e 1 1 : S e q u e n c e s F l a n k i n g T n 5 I n s e r t i o n s . I n s e r t i o n o f T n 5 r e s u l t s i n a d i r e c t d u p l i c a t i o n o f t h e 9 b a s e p a i r t a r g e t DNA a t t h e e n d s o f t h e T n 5 s e q u e n c e ( r e p r e s e n t e d b e t w e e n t w o a s t e r i s k s " * " ) . T h e n u c l e o t i d e s a t t h e i n s e r t i o n s i t e , s e q u e n c e d b y t h e M a x a m a n d G i l b e r t m e t h o d ( 2 4 ) , s h o w v e r y l i t t l e h o m o l o g y . T h i s s u g g e s t s t h e t r a n s p o s i t i o n a l e v e n t s o f T n 5 i s r e l a t i v e l y r a n d o m . 55 D i r e c t R e p e a t P o s i t i o n CAGGA*AATCGCGCA*GACCA 495 -503 TCGCA*CTGCTGAAA*GAGCT 688 -696 GCGCG*TTGTTGGCC*AGCTG 971 -979 GGGTA*CTGTAACAC*CGAAC 1034- 1 042 TGACC*AGGCTGGCC*TGAGC 1 280- 1 288 ATAAT*GCTTAATGC*AGACG 1 360- 1 368 GCAGC*CTGATATCC*GAGAT 1 372- 1 380 ATCCA*GGCCTCCGT*CGAAG 1 532- 1 540 AAGAA*ACTTAATCC*CCTGC 1 567- 1 575 CGGTC*ACAGAACGC*TAAGA 1 591- 1599 GTCGC*CTTTGAAGG*TGAGC 2056- 2064 TGGCT*GCTGTACGC*GATGC 2189- 21 97 TCTGC*ACCGGCTGC*TCTGA 2557- 2565 ACACT*GTTTGACTA*CTGCT 2751- 2759 TCAAT*GGACAGATG*GGTCG 2930- 2938 56 F i g u r e 1 1 : L o c a t i o n o f T n 5 I n s e r t i o n s i n L 1 1 a n d L 1 0  T r a n s c r i p t i o n U n i t s . I n s e r t i o n p o s i t i o n m a r k e d w i t h (*) h a v e b e e n e s t i m a t e d f r o m r e s t r i c t i o n e n z y m e a n a l y s i s o n l y ; o t h e r - i n s e r t i o n p o s i t i o n s h a v e b e e n l o c a t e d b y M a x a m a n d G i l b e r t s e q u e n c e a n a l y s i s . T h e i n s e r t i o n s w e r e i s o l a t e d o n p l a s m i d s p N F 1 344 , P N F 1 5 7 1 , . a n d P N F 1 9 6 2 . S i t e s f o r r e s t r i c t i o n e n z y m e s E c o R I ( R , n u c l e o t i d e 2 8 0 , 2 4 4 4 , 3 5 2 4 ) , H i n d l l l ( H , 2 1 5 4 ) , B g l l l ( B , 8 9 7 ) , a n d P s t I ( P , 1 7 9 1 ) a r e i l l u s t r a t e d ; o t h e r P s t I s i t e s i n t h e r e g i o n ( n u c l e o t i d e p o s i t i o n 2 0 2 , 4 8 7 , 8 6 9 a n d 3 6 7 4 ) a r e n o t s h o w n . 3.0 2.0 — r -1.0 — r — SCALE KILOBASE PAIRS 2557 2751 2930 2189 L 12 1280 , 1360 1372 . 1532 1034 1567 . 1591 971 400* 450' 688 495 TN5 INSERTIONS L10 L1 L11 ! f RESTRICTION SITES 3000 2800 2600 L12 1700 1500 1300 I L10 T T T -L1 RNase IB (2860) ATT: (2716) 58 P o l a r i t y of Tn5 Insertion on the Expression of lacZ Fusion  Products: The polar effects of the Tn5 insertions on the expression of the LJ0 ribosomal protein gene and the RNA polymerase 0 gene were examined u t i l i z i n g fusions of the d i s t a l portion of the lacZ gene to the proximal portion of the L10 and p genes, respectively. The L10 fusion i s carried on X1910 and the p fusion i s carried on X.1962 as indicated on Figure 7. The Tn5 insertions on plasmids pNF1344, pNFl571 and pNFl962 were transferred to the homologous positions in the transducing phages by i_n vivo recombination during l y t i c phage infection (Fig. 9). The resulting recombinant and transposition phages were i d e n t i f i e d as kanamycin resistant transductants in MC4100. Bacteriophages carrying Tn5 insertions generated from legitimate recombinational events were distinguished from those generated from Tn5 transpositional events by p a r a l l e l r e s t r i c t i o n enzyme analysis of plasmid and bacteriophage DNA. The analysis was c a r r i e d out using EcoRI, H i n d l l l and B g l l l , and the DNA fragments were separated on 0.7% agarose gels, allowing unambigious location of the position of Tn5 sequences on the X.DNA. Figure 12 i l l u s t r a t e s the B g l l l digestion pattern for Tn5 insertions at three d i f f e r e n t positions within the 2.2 kb EcoRI fragment which spans from nucleotide 280 to 2444 in the ribosomal protein gene cl u s t e r . 59 Figure 12: Restr i c t i o n Enzyme Mapping of Tn5 Insertion into  Homologous Position on Plasmids and Transducing  Phages. Plasmid and phage DNAs were digested with B g l l l and fragments were separated by electrophoresis on 0.7% agarose gels. The three panels represent the digests of DNA from three separate insertions into the ribosomal protein region. The Tn5 transposon i s about 5.7 kb in length and contains two B g l l l s i t e s symmetrically located 1515 nucleotides from the ends of the inverted repeats. Digestion with B g l l l generates a 2.7 kb fragment from the internal position of Tn5. The upper arrows i l l u s t r a t e the position of this common Tn5 fragment. A unique junction fragment, i l l u s t r a t e d by the lower arrows, representing 1.5 kb of Tn5 DNA fused to DNA terminating at the B g l l l s i t e in L1 (nucleotide 897) i s evidence for each of the three insertions. The size marker fragments in lane 4 of each panel are 1.1, 1.2, 2.2, 2.7, and 6.4 kb in size. The lanes are as follows: A. 1. pNFl571::Tn5 at nucleotide 1034; 2. U9lO::Tn5 at nucleotide 1034; 3. Xl962::Tn5 at nucleotide 1034; 4. Size marker; B. 1. pNF!344::Tn5 at nucleotide 1360; 2. Xl9lO::Tn5 at nucleotide 1360; 3. Xl962::Tn5 at nucleotide 1360; 4. Size marker; C. 1. pNFl344::Tn5 at nucleotide 1576; 2. Xl9lO::Tn5 at nucleotide 1576; 3. Xl962::Tn5 at nucleotide 1576; 4. Size marker. o 1 11 I I CO 1 i l i 1 CM 11) : i * v t t t OQ 1 1 1 II CO 1 H ii CM BE? r- 1 1 1 1 t t 61 D i g e s t i o n o f p l a s m i d a n d p h a g e DNA w i t h B g l l l g e n e r a t e s a c o m m o n 2 . 7 k b f r a g m e n t f r o m t h e c e n t r a l p o r t i o n o f t h e T n 5 i n s e r t i o n s e q u e n c e ; i n a d d i t i o n , i t g e n e r a t e s a u n i q u e f r a g m e n t w h i c h i s b o u n d e d b y t h e B g l l l s i t e a t n u c l e o t i d e 8 9 7 ( w i t h i n t h e 2 . 2 k b E c o R I f r a g m e n t ) a n d t h e B g l l l s i t e i n t h e i n v e r t e d r e p e a t o f T n 5 ( l o c a t e d a t 1 5 1 5 n u c l e o t i d e f r o m t h e e n d o f t h e t r a n s p o s o n s e q u e n c e ) . T h e s i z e s o f t h e u n i q u e f r a g m e n t s i n t h e t h r e e r e s p e c t i v e i n s e r t i o n s w e r e c o n s i s t e n t w i t h i n s e r t i o n p o s i t i o n s a t n u c l e o t i d e s 1 0 3 4 , 1 3 6 0 a n d 1567 a s d e t e r m i n e d b y DNA s e q u e n c e a n a l y s i s o n t h e p l a s m i d D N A s . A l l o t h e r X l 9 l O : : T n 5 a n d X l 9 6 2 : : T n 5 p h a g e w e r e a n a l y z e d i n t h i s m a n n e r u s i n g B g l l l a s w e l l a s H i n d l l l a n d E c o R I . • T h e e f f e c t s o f T n 5 i n s e r t i o n u p o n t h e e x p r e s s i o n o f p-g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i n t h e L l Q - l a c Z a n d 0 - l a c Z f u s i o n s w e r e m e a s u r e d i n M C 4 1 0 0 s t r a i n s l y s o g e n i c f o r X l 9 l O : : T n 5 o r XJ 9 6 2 : : T n 5 . T a b l e I I I s u m m a r i z e s t h e p o s i t i o n s o f t h e r e s p e c t i v e T n 5 i n s e r t i o n s , t h e p l a s m i d o n w h i c h t h e i n s e r t i o n w a s o r i g i n a l l y i s o l a t e d a n d t h e p - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i n l y s o g e n s c a r r y i n g t h e s e i n s e r t i o n s . I n s e r t i o n s a t o r b e f o r e n u c l e o t i d e 1 2 8 0 w e r e n o t p o l a r a n d e x h i b i t e d n o r m a l e x p r e s s i o n o f 0 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i n t h e L 1 0 -l a c Z a n d p-lacZ f u s i o n l y s o g e n . I n c o n t r a s t , t h o s e i n s e r t i o n s a t o r a f t e r n u c l e o t i d e 1 3 6 0 e x h i b i t e d a m u c h l o w e r l e v e l o f p - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i n b o t h t y p e s o f l y s o g e n s . T h e a c t i v i t y w a s r e d u c e d b y 90% o r m o r e c o m p a r e d t o n o n - p o l a r i n s e r t i o n s a n d c o n t r o l l y s o g e n s . T h e s e r e s u l t s d e m o n s t r a t e d t h a t a m a j o r p r o m o t e r f o r b o t h t h e L 1 0 62 r i b o s o m a l p r o t e i n g e n e a n d t h e RNA p o l y m e r a s e p g e n e i s c o n f i n e d b e t w e e n n u c l e o t i d e s 1 2 8 0 a n d 1 3 6 0 . P r e v i o u s l y a p r o m o t e r - l i k e s e q u e n c e w i t h a n R N A s t a r t s i t e a t n u c l e o t i d e 1 3 4 8 w a s i d e n t i f i e d b y in_ v i t r o R N A p o l y m e r a s e b i n d i n g a n d i n v i t r o t r a n s c r i p t i o n ( 2 3 , 3 9 ) . T h e r e s i d u a l l e v e l . s o f p - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y f r o m X.1910 l y s o g e n s w i t h p o l a r i n s e r t i o n s o f T n 5 i n f r o n t o f L 1 0 -l a c Z f u s i o n w a s a b o u t 5% o f t h e c o n t r o l v a l u e s . I n c o n t r a s t , t h e r e s i d u a l l e v e l o f a c t i v i t y o f t h e p - l a c Z f u s i o n s w a s s o m e w h a t l a r g e r , r e p r e s e n t i n g 5-10% o f t h e c o n t r o l v a l u e s a n d i s d e p e n d e n t t o some e x t e n t o n t h e s i t e o f T n 5 i n s e r t i o n . T h e s t r o n g e r d e g r e e o f p o l a r i t y o f t h e t w o i n s e r t i o n s a t n u c l e o t i d e s 2751 a n d 2931 c o m p a r e d t o u p s t r e a m i n s e r t i o n s may r e f l e c t t h e p r e s e n c e o f a w e a k p r o m o t e r i n t h e L 1 2 - 0 i n t e r g e n i c s p a c e . S u c h a w e a k p r o m o t e r f u n c t i o n i n g a t a b o u t 2% o f t h e l e v e l o f t h e m a j o r L 1 0 p r o m o t e r h a s r e c e n t l y b e e n i d e n t i f i e d a n d c h a r a c t e r i z e d ( 1 5 ) . H o w e v e r , t h e p h y s i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e o f t h i s l o w l e v e l p r o m o t e r i s n o t k n o w n . 63 T a b l e I I I ; T h e E x p r e s s i o n o f L l Q - l a c Z a n d 0 - l a c Z F u s i o n P r o t e i n s  w i t h T n 5 I n s e r t e d a t V a r i o u s P o s i t i o n i n t h e L 1 1 a n d  L 1 0 T r a n s c r i p t i o n U n i t s . T h e e f f e c t o f T n 5 i n s e r t i o n s o n t h e e x p r e s s i o n o f L 1 0 a n d p f u s i o n p r o t e i n s w a s e x a m i n e d i n s t r a i n M C 4 1 0 0 . I n s e r t i o n s a t o r b e f o r e n u c l e o f d e 1 2 8 0 h a v e 0 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t i e s c o m p a r a b l e t o t h a t o f t h e c o n t r o l ( w i t h o u t T n 5 i n s e r t i o n s ) , w h e r e a s i n s e r t i o n s a t o r a f t e r n u c l e o t i d e 1 3 6 0 h a v e s t r o n g p o l a r e f f e c t s ( 9 0 - 9 5 % ) o n t h e e x p r e s s i o n o f b o t h L 1 0 a n d p f u s i o n p r o t e i n s i n d i c a t i n g t h e m a j o r p r o m o t e r f o r t h e L 1 0 o p e r o n i s b e t w e e n n u c l e o t i d e 1 2 8 0 a n d 1 3 6 0 . A w e a k p r o m o t e r f u n c t i o n i n g a t l e s s t h a n 2% o f t h e m a j o r p r o m o t e r l e v e l may b e p r e s e n t i n b e t w e e n n u c l e o t i d e 2 5 5 7 a n d 2751 i n . t h e i n t e r g e n i c r e g i o n o f L 1 2 a n d p g e n e s . I n c o n t r a s t t o e x p e c t a t i o n , t h e l e v e l o f 0 - g a l a c t o s i d a s e i n X. 1962 w a s o f t h e s a m e o r d e r a s t h a t o f t h e X .1910 i n s p i t e o f t h e p r e s e n c e o f a n a t t e n u a t o r . T h e r e a s o n f o r t h i s i s s t i l l u n k n o w n . 64 Strain No. Tn5 Position Plasmid Origin X. 1 9 1 0 : Strain No. :Tn5 p-gal. X.1 962: Strain No. :Tn5 p-gal. PD1 79 ~450 pNF1344 PD37 6 '46.3 PD31 8 54.5 PD287 495 pNF1344 PD377 47.3 PD363 49.4 PD290 688 pNF1344 PD364 47.2 PD378 -68.0 PD343 971 pNF1344 PD357 50.8 PD358 48.7 PD225 1 034 pNF1344 PD379 54. 1 PD1 97 49.0 PD342 1 280 pNF 1.344 PD360 46.8 PD359 42.2 PD 1 1 8 1 360 pNF1344 PD31 0 2 . 0 PD31 1 5.3 PD 1 16 1 372 pNF1344 PD309 2.4 PD203 5.0 PD 1 1 9 1 567 pNF1344 PD3 1 2 1 .5 PD204 4.5 PD1 20 2189 pNF1344 - - PD365 5.6 PD207 2557 pNF1344 - - PD323 4.6 PD21 1 2751 pNF1962 - - PD1 93 3.8 PD21 6 2930 pNF1962 - - PD1 96 3. 1 MC4100 X.1910 44.2 MC4100 X1962 56.9 MC4100 0.8 MC4100 0.8 65 I I I . P o l a r i t y o f T n 5 I n s e r t i o n s o n R i b o s o m a l P r o t e i n G e n e  E x p r e s s i o n : T h e p N F l 3 4 4 p l a s m i d s c o n t a i n i n g T n 5 i n s e r t i o n s w e r e i n t r o d u c e d i n t o s t r a i n C S R 6 0 3 i n o r d e r t o d i r e c t l y e x a m i n e t h e e f f e c t s o f i n s e r t i o n u p o n t h e e x p r e s s i o n o f r i b o s o m a l p r o t e i n g e n e s . S t r a i n C S R 6 0 3 i s a h i g h l y U V - s e n s i t i v e s t r a i n a n d i s u n a b l e t o r e p a i r U V - i n d u c e d DNA d a m a g e . M o d e r a t e l e v e l s o f i r r a d i a t i o n i n a c t i v a t e g e n e s l o c a t e d o n t h e b a c t e r i a l c h r o m o s o m e . G e n e s l o c a t e d o n p l a s m i d s e s c a p e i n a c t i v a t i o n b e c a u s e o f t h e h i g h c o p y n u m b e r a n d t h e s m a l l t a r g e t s i z e o f t h e p l a s m i d D N A . • T h e p l a s m i d p N F 1 3 4 4 ' c o n t a i n s b o t h t h e L 1 1 a n d L 1 0 o p e r o n p r o m o t e r s ; i n t h e a b s e n c e o f a n y T n 5 i n s e r t i o n s , i t s p e c i f i e s t h e s y n t h e s i s o f r i b o s o m a l p r o t e i n s L 1 1 , L 1 , L 1 0 , L 1 2 a n d RNA p o l y m e r a s e p f r a g m e n t p r o t e i n ( F i g . 1 3 ) . A n i n s e r t a t n u c l e o t i d e 4 9 5 , w i t h i n t h e L 1 1 g e n e , a b o l i s h e d t h e s y n t h e s i s o f L 1 1 a n d L1 b u t n o t t h e s y n t h e s i s o f L 1 0 , L 1 2 a n d p f r a g m e n t p r o t e i n s . A n i n s e r t a t n u c l e o t i d e 6 8 8 , w i t h i n t h e L1 g e n e , a b o l i s h e d s y n t h e s i s o f L1 a n d e n h a n c e d s y n t h e s i s o f L 1 1 ( c o m p a r e t h e L 1 1 a n d L 1 0 b a n d i n t e n s i t i e s i n t h e p N F 1 3 4 4 c o n t r o l a n d i n t h e T n 5 i n s e r t a t 6 8 8 ) . T h i s r e s u l t s u b s t a n t i a t e s p r e v i o u s o b s e r v a t i o n s t h a t t h e L 1 1 a n d L 1 g e n e s f o r m a c o m m o n t r a n s c r i p t i o n u n i t a n d t h a t L1 r e g u l a t e s t h e s y n t h e s i s o f L 1 1 ( 4 2 ) . 66 F i g u r e 1 3 : A u t o r a d i o g r a p h y o f P r o t e i n s L a b e l l e d F o l l o w i n g U V - I n a c t i v a t i o n o f S t a i n C S R 6 0 3 . P l a s m i d p N F l 3 4 4 d e r i v a t i v e s c o n t a i n i n g T n 5 i n s e r t i o n a t v a r i o u s p o s i t i o n s w e r e i n t r o d u c e d b y t r a n s f o r m a t i o n i n t o s t r a i n C S R 6 0 3 . F o l l o w i n g i n a c t i v a t i o n o f c h r o m o s o m a l g e n e s b y U V -i r r a d i a t i o n , p r o t e i n s s p e c i f i e d b y p l a s m i d g e n e s w e r e l a b e l l e d w i t h ( 3 5 S ) - m e t h i o n i n e , f r a c t i o n a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s o n 12 .5% S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l s a n d s u b j e c t e d t o a u t o r a d i o g r a p h y . T h e r i b o s o m a l p r o t e i n s L 1 , L 1 0 , L 1 1 , a n d L 1 2 , a n d t h e R N A p o l y m e r a s e 0 f r a g m e n t a r e i l l u s t r a t e d . S a m p l e s a r e l o a d e d i n d u p l i c a t e s a s f o l l o w s : A . C S R 6 0 3 ; B . C S R 6 0 3 / p B R 3 2 2 ; C . C S R 6 0 3 / p N F 1 3 4 ; D . C S R 6 0 3 / p N F 1 3 4 4 : : T n 5 ( L 1 1 , n u c l e o t i d e 4 9 5 ) ; E . C S R 6 0 3 / p N F 1 3 4 4 : : T n 5 ( L I , n u c l e o t i d e 6 8 8 ) ; F . C S R 6 0 3 / p N F l 3 4 4 : : T n 5 ( l e a d e r , n u c l e o t i d e 1 3 6 0 ) ; G . C S R 6 0 3 / p N F 1 3 4 4 : : T n 5 ( l e a d e r , n u c l e o t i d e 1 5 6 7 ) ; H . C S R 6 0 3 / p N F 1 3 4 4 : : T n 5 ( L 1 0 , n u c l e o t i d e 2 1 8 9 ) . 67 A B C D E F G H ~ ~3 fragment 68 Insertion of Tn5 into the leader region of the L10 operon, at nucleotide 1360 or 1567, abolished or reduced the synthesis of L10, LI 2 and p fragment but had no effect on L11 and L1 synthesis. An insertion into the d i s t a l portion of the . L10 gene, at nucleotide .2189, .resulted in the synthesis of a protein containing 158 amino acids from the N-terminal end of L10 and six amino acids at the C-terminal end sp e c i f i e d by the inverted repeat sequence of Tn5. This insertion also reduces the l e v e l of L12 and p fragment synthesis. Again, these results confirm that the expression of the genes specifying L10, L12 and p depends on a promoter sequence located in front of nucleotide 1360. 69 S y n t h e s i s o f L 1 2 R i b o s o m a l P r o t e i n s : H i g h c o p y n u m b e r p l a s m i d s w h i c h c a r r y a n a c t i v e L 1 0 g e n e r e q u i r e , i n a d d i t i o n , a n a c t i v e L 1 2 p l a s m i d g e n e i n o r d e r t o p r e v e n t k i l l i n g o f t h e h o s t c e l l . T h e k i l l i n g e f f e c t h a s b e e n a t t r i b u t e d t o o v e r p r o d u c t i o n o f t h e L 1 0 p r o t e i n , a n d h a s b e e n o b s e r v e d f o r p l a s m i d s w h i c h c o n t a i n E c o R I g e n e r a t e d d e l e t i o n s , r e m o v i n g t h e d i s t a l 50% o f t h e L 1 2 g e n e , o r H i n d l l l g e n e r a t e d d e l e t i o n s , r e m o v i n g t h e e n t i r e L 1 2 g e n e a n d t h e d i s t a l 10% o f t h e L 1 0 g e n e ( 1 1 ) . A p p a r e n t l y b o t h t h e c o m p l e t e a n d t h e t r u n c a t e d L 1 0 g e n e p r o d u c t i n a n L 1 2 d e f i c i e n t e n v i r o n m e n t e x h i b i t t h e s a m e d e t r i m e n t a l e f f e c t s o n c e l l v i a b i l i t y . B a s e d u p o n t h e s e p r e v i o u s o b s e r v a t i o n s i t was n o t s u r p r i s i n g t h a t i n s e r t i o n s o f T n 5 i n t o t h e L 1 2 g e n e o f t h e h i g h c o p y n u m b e r p l a s m i d s p N F 1 3 4 4 a n d P N F 1 5 7 1 w e r e n o t o b s e r v e d . A f e w i n s e r t i o n s i n t o t h e L 1 2 g e n e i n c l u d i n g t h e o n e a t n u c l e o t i d e 2 5 5 7 h a v e b e e n o b t a i n e d o n t h e l o w e r c o p y n u m b e r p l a s m i d p N F l 9 6 2 . I n c o n t r a s t , a r e l a t i v e l y h i g h n u m b e r o f T n 5 i n s e r t i o n s i n t o t h e d i s t a l r e g i o n o f t h e L 1 0 g e n e w e r e u n e x p e c t e d l y o b t a i n e d ( F i g . 1 0 ) . T h e s u r v i v a l o f c e l l s c a r r y i n g t h e s e p l a s m i d s s u g g e s t s t h a t t h e e x p r e s s i o n o f t h e i n t a c t p l a s m i d L 1 2 g e n e c o n t i n u e s i n t h e p r e s e n c e o f t h e i n s e r t i o n a t a l e v e l s u f f i c i e n t t o b a l a n c e t h e p r o d u c t i o n o f t h e L 1 0 p r o t e i n f r a g m e n t . 7 I n E . c o l i t h e L 1 2 p r o t e i n i s p a r t i a l l y a c e t y l a t e d a t t h e N - t e r m i n a l p o s i t i o n p r i o r t o a s s e m b l y i n t o r i b o s o m e s ( 4 0 ) . T h e a c e t y l a t e d a n d u n a c e t y l a t e d f o r m s a r e d e s i g n a t e d 70 L 7 a n d L 1 2 r e s p e c t i v e l y ; a c e t y l a t i o n i s n o t e s s e n t i a l o r r e q u i r e d f o r a n y k n o w n f u n c t i o n o f t h e p r o t e i n . S t r a i n J F 1 0 3 9 c a r r i e s a m u t a t i o n i n t h e c h r o m o s o m a l r p l L ( L 1 2 ) g e n e a n d p r o d u c e s a f u l l y f u n c t i o n a l b u t e l e c t r o p h o r e t i c a l l y a l t e r e d p r o t e i n o f w h i c h a b o u t 80% i s a c e t y l a t e d t o t h e L 7 f o r m . T o t e s t t h e h y p o t h e s i s s t a t e d a b o v e r e l a t i n g t o p l a s m i d e x p r e s s i o n o f t h e r p l L ( L 1 2 ) g e n e , v a r i o u s p N F 1 3 4 4 : : T n 5 o r p N F l 9 6 2 : : T n 5 p l a s m i d s w e r e i n t r o d u c e d i n t o s t r a i n J F 1 0 3 9 . T r a n s f o r m a n t s c a r r y b o t h a m u t a n t c h r o m o s o m a l L 1 2 g e n e a n d a w i l d t y p e p l a s m i d L 1 2 g e n e h a v e t h e p o t e n t i a l t o p r o d u c e b o t h m u t a n t a n d w i l d t y p e L 7 a n d L 1 2 p r o t e i n s . T h e e f f e c t s o f T n 5 i n s e r t i o n s o n t h e s y n t h e s i s o f w i l d t y p e L 7 a n d L 1 2 was e x a m i n e d b y l a b e l l i n g e x p o n e n t i a l p h a s e c e l l s w i t h ( 3 5 S ) - m e t h i o n i n e . T h e r i b o s o m a l p r o t e i n s , i n c l u d i n g L 7 a n d L 1 2 , w e r e e x t r a c t e d w i t h g l a c i a l a c e t i c a c i d , a n d s e p a r a t e d o n u r e a - p o l y a c r y l a m i d e g e l s ( F i g . 1 3 , R e f . 19). I n e x t r a c t s f r o m t h e p a r e n t a l J F 1 0 3 9 s t r a i n , o n l y t h e m u t a n t f o r m s o f L 7 a n d L 1 2 w e r e a p p a r e n t , w h e r e a s i n t h o s e f r o m t h e s t r a i n s w h i c h c o n t a i n e d t h e p N F 1 3 4 4 p l a s m i d , t h e w i l d t y p e L 7 p r o t e i n s p r e d o m i n a t e d b e c a u s e o f t h e a m p l i f i e d c o p y n u m b e r o f t h e p l a s m i d g e n e . I n s e r t i o n o f T n 5 w i t h i n t h e L 1 1 o r L1 g e n e f a i l e d t o a f f e c t t h e p l a s m i d s p e c i f i e d s y n t h e s i s o f w i l d t y p e Ll p r o t e i n w h e r e a s i n s e r t i o n i n t o t h e l e a d e r r e g i o n i n f r o n t o f t h e L 1 0 g e n e g r e a t l y d i m i n i s h e d t h e s y n t h e s i s o f w i l d t y p e L 7 . T h e m o s t i m p o r t a n t o b s e r v a t i o n h o w e v e r w a s t h a t t h e i n s e r t i o n a t n u c l e o t i d e 2 1 8 9 n e a r t h e 71 d i s t a l e n d o f t h e L 1 0 g e n e f a i l e d t o d i m i n i s h t h e s y n t h e s i s o f w i l d t y p e L 1 2 ; t h i s c o r r e l a t e s w i t h t h e u n e x p e c t e d v i a b i l i t y o f t h i s p l a s m i d a l t h o u g h i t i s d i f f i c u l t t o e x p l a i n b a s e d o n t h e g e n e r a l l y a c c e p t e d o r g a n i z a t i o n o f t h e s e g e n e s . P l a s m i d p N F l 9 6 2 l a c k s t h e L 1 1 p r o m o t o r , a n d a s e x p e c t e d , t h e T n 5 i n s e r t i o n i n t h e i n t e r g e n i c r e g i o n b e t w e e n L 1 2 a n d p ( a t n u c l e o t i d e 2 7 5 1 ) o n p l a s m i d p N F l 9 6 2 h a d n o e f f e c t o n t h e s y n t h e s i s o f t h e p l a s m i d L 7 p r o t e i n . A n i n s e r t i o n i n t h e p l a s m i d r p l L g e n e ( a t n u c l e o t i d e 2 5 5 7 o n P N F 1 9 6 2 ) g a v e r i s e t o a t r u n c a t e d p r o t e i n w i t h a n a l t e r e d m o b i l i t y . 72 F i g u r e 1 4 ; S y n t h e s i s o f R i b o s o m a l L 7 a n d L 1 2 P r o t e i n s S p e c i f i e d  b y P l a s m i d a n d C h r o m o s o m a l C o p i e s o f t h e r p l L G e n e . V a r i o u s p N F l 3 4 4 a n d p N F l 9 6 2 p l a s m i d s c o n t a i n i n g T n 5 i n s e r t i o n s w e r e t r a n s f o r m e d i n t o J F 1 0 3 9 . E x p o n e n t i a l p h a s e c u l t u r e s w e r e l a b e l l e d w i t h ( 3 5 S ) - m e t h i o n i n e ( 1 0 y C i / m l ) f o r o n e h o u r a n d t h e p r o t e i n s w e r e e x t r a c t e d a n d s e p a r a t e d b y e l e c t r o p h o r e s i s o n u r e a - p o l y a c r y l a m i d e g e l s . T h e p o s i t i o n s o f t h e p l a s m i d s p e c i f i e d w i l d t y p e r i b o s o m a l L 7 p r o t e i n i s i n d i c a t e d . T h e b r a c k e t ( [ ) i n d i c a t e s i n d e s c e n d i n g o r d e r t h e p o s i t i o n s o f c h r o m o s o m e s p e c i f i e d L 1 2 , p l a s m i d s p e c i f i e d L 1 2 a n d c h r o m o s o m e s p e c i f i e d L 7 p r o t e i n s . T h e b a n d s s h o w n h e r e a r e n o t c l e a r l y r e s o l v e d . S a m p l e s a r e a s f o l l o w s : A . J F 1 0 3 9 ; B . J F 1 0 3 9 / p N F 1 3 4 4 ; C . J F 1 0 3 9 / p N F 1 3 4 4 : D . J F 1 0 3 9 / p N F 1 344 : E . J F 1 0 3 9 / p N F . 1 3 4 4 : F . J F 1 0 3 9 / p N F 1 3 4 4 : G . J F l 0 3 9 / p N F 1 3 4 4 : H . J F 1 0 3 9 / p N F 1 9 6 2 : I . J F 1 0 3 9 / p N F 1 9 6 2 : T n 5 ( L 1 1 , n u c l e o t i d e 4 9 5 ) ; T n 5 ( L 1 , n u c l e o t i d e 6 8 8 ) ; T n 5 ( l e a d e r , n u c l e o t i d e 1 3 6 0 ) T n 5 ( l e a d e r , n u c l e o t i d e 1 5 6 7 ) T n 5 ( L 1 0 , • n u c l e o t i d e 2 1 8 9 ) ; T n 5 ( b e t w e e n L 1 2 a n d p, 2 7 5 1 ) T n 5 ( L 1 2 , n u c l e o t i d e 2 5 5 7 ) . 74 D I S C U S S I O N S I . R e g u l a t i o n o f t h e L 1 1 T r a n s c r i p t i o n U n i t : R i b o s o m a l p r o t e i n L1 h a s b e e n i d e n t i f i e d a s t h e r e g u l a t o r y p r o t e i n f o r t h e L 1 1 - L 1 t r a n s c r i p t i o n a l u n i t ( 8 , 4 2 ) . C o n s i s t e n t w i t h t h i s i s t h e o b s e r v a t i o n t h a t t h e " T n 5 i n s e r t i o n a l . i n a c t i v a t i o n o f t h e L1 g e n e o n p l a s m i d p N F l 3 4 4 r e s u l t s i n a b o u t a t w o - f o l d e l e v a t i o n i n t h e s y n t h e s i s o f L 1 1 p r o t e i n r e l a t i v e t o t h a t o f t h e p N F l 3 4 4 c o n t r o l ( F i g . 1 3 ) . T h e p o s i t i o n o f t h i s T n 5 i n s e r t i o n i s v e r y e a r l y i n t h e L1 g e n e a n d p r e s u m b a l y r e s u l t s i n t h e s y n t h e s i s o f a p e p t i d e f r a g m e n t c o n s i s t i n g o f 30 a m i n o a c i d s s p e c i f i e d b y t h e 5 ' t e r m i n a l e n d o f L1 g e n e a n d s i x a m i n o a c i d s a t t h e C -t e r m i n a l e n d s p e c i f i e d b y t h e i n v e r t e d r e p e a t s e q u e n c e o f T n 5 . T h e f a c t t h a t t h i s p l a s m i d i s a p p a r e n t l y n o t d e t r i m e n t a l t o t h e h o s t c e l l i m p l i e s t h a t e x p r e s s i o n o f t h e L 1 1 p l a s m i d g e n e i n t h e a b s e n c e o f a n i n t a c t L1 p l a s m i d g e n e i s i n c o n s e q u e n t i a l t o t h e s u r v i v a l o f t h e b a c t e r i a l c e l l . R e c e n t l y , s e v e r a l m u t a n t s t r a i n s o f E . c o l i w h i c h c o m p l e t e l y l a c k L1 p r o t e i n i n t h e i r r i b o s o m e s h a v e b e e n i s o l a t e d ; t h e s e m u t a n t s a p p e a r t o o v e r p r o d u c e L 1 1 b y a b o u t t w o - f o l d ( 1 6 , 3 7 ) . O v e r 100 i n d e p e n d e n t T n 5 i n s e r t i o n s i n t o t h e 2 . 2 k b E c o R I f r a g m e n t o n p N F 1 3 4 4 h a v e b e e n s c r e e n e d f o r i n s e r t i o n s w i t h i n t h e 7 0 2 n u c l e o t i d e l o n g L1 g e n e ; o n l y o n e i n s e r t i o n a t n u c l e o t i d e 6 8 8 h a s b e e n i d e n t i f i e d ( F i g . 1 0 , a n d D e n n i s a n d F i i l u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) . T h e a d d i t i o n a l T n 5 i n s e r t i o n s 75 w h i c h o c c u r f u r t h e r d o w n s t r e a m i n t h e L1 g e n e a t n u c l e o t i d e 9 7 1 , 1 0 3 4 a n d 1282 w e r e i s o l a t e d o n p l a s m i d p N F 1 5 7 l ; t h i s p l a s m i d l a c k s t h e p r o m o t e r f o r t h e L 1 1 o p e r o n a n d a p o r t i o n o f t h e L 1 1 g e n e ( s e e F i g . 6 ) . T h i s f a i l u r e t o i s o l a t e m o r e i n s e r t s o f T n 5 i n t o t h e L1 g e n e o n p N F 1 3 4 4 c o u l d b e a s t a t i s t i c a l p h e n o m e n o n , o r a l t e r n a t i v e l y , a n i n d i c a t i o n t h a t l a r g e p r o t e i n f r a g m e n t s o f L1 m i g h t b e d e t r i m e n t a l a n d a f f e c t s u r v i v a l o f t h e b a c t e r i a l c e l l . F o r e x a m p l e , l a r g e r L1 f r a g m e n t s m i g h t b e a b l e t o r e p r e s s t h e s y n t h e s i s o f L 1 1 b u t n o t e f f e c t i v e l y i n c o r p o r a t e d i n t o r i b o s o m e s . C o n s i s t e n t w i t h t h i s s e c o n d p o s s i b i l i t y i s t h e o b s e r v a t i o n t h a t DNA p o l y m e r a s e I g e n e r a t e d 4 b a s e p a i r i n s e r t i o n s i n t o t h e m i d d l e o f t h e L1 g e n e a t t h e B g l l l s i t e ( n u c l e o t i d e 8 9 7 ) c a n n o t b e r e c o v e r e d o n p l a s m i d p N F 1 3 4 4 . I n c o n t r a s t , t h e s e B g l l l i n s e r t i o n s h a v e b e e n i s o l a t e d o n P N F 1 5 7 1 w h i c h d o e s n o t e x p r e s s t h e L1 g e n e ( D e n n i s u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) . 76 R e g u l a t i o n o f t h e L 1 0 T r a n s c r i p t i o n U n i t : T h e e x p r e s s i o n o f a L 1 0 g e n e i n t h e a b s e n c e o f a L 1 2 g e n e o n a h i g h c o p y n u m b e r p l a s m i d h a s b e e n o b s e r v e d t o b e d e t r i m e n t a l t o t h e s u r v i v a l o f t h e h o s t c e l l ( 1 1 ) . T h i s e f f e c t w a s o b s e r v e d f o r b o t h E c o R I g e n e r a t e d p l a s m i d d e l e t i o n s w h i c h r e m o v e t h e C - t e r m i n a l h a l f o f t h e L 1 2 g e n e a n d f o r H i n d l l l g e n e r a t e d d e l e t i o n s w h i c h r e m o v e t h e e n t i r e L 1 2 g e n e a n d t h e C - t e r m i n a l 19 c o d o n s o f t h e L 1 0 g e n e . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t t h e p l a s m i d s p e c i f i e d L 1 0 f r a g m e n t a s w e l l a s t h e c o m p l e t e p r o t e i n , i s d e t r i m e n t a l t o h o s t c e l l s u r v i v a l i n t h e a b s e n c e o f c o m p e n s a t i n g p l a s m i d L 1 2 s y n t h e s i s . . F r o m t h i s i t w a s r e a s o n a b l e t o e x p e c t t h a t i n s e r t i o n o f T n 5 i n t o t h e p l a s m i d L 1 2 g e n e o r t h e d i s t a l r e g i o n o f t h e p l a s m i d L 1 0 g e n e s h o u l d b e d e t r i m e n t a l o n h i g h c o p y n u m b e r p l a s m i d . H o w e v e r , s e v e r a l i n s e r t i o n s i n t o t h e d i s t a l r e g i o n o f t h e L 1 0 g e n e h a v e b e e n r e c o v e r e d w h e r e a s n o i n s e r t i o n s o f T n 5 i n t o t h e L 1 2 g e n e o n p N F l 3 4 4 h a v e b e e n i d e n t i f i e d . How d o e s a T n 5 i n s e r t i o n i n t o t h e d i s t a l r e g i o n o f t h e L 1 0 g e n e s u r v i v e ? S u r v i v a l v e r y c l e a r l y r e s u l t s f r o m t h e f a c t t h a t s u c h i n s e r t i o n s c o n t i n u e t o e x p r e s s t h e L 1 2 p l a s m i d g e n e a t a l e v e l s u f f i c i e n t t o c o m p e n s a t e f o r t h e e x p r e s s i o n o f t h e t r u n c a t e d L 1 0 p l a s m i d g e n e . How d o e s t h e c e l l m a i n t a i n L 1 2 e x p r e s s i o n ? A p r e v i o u s s t u d y b y B e r g e t a l . ( 6 ) h a s i d e n t i f i e d a w e a k p r o m o t e r l o c a t e d w i t h i n 186 n u c l e o t i d e s o f t h e e n d s o f t h e i n v e r t e d r e p e a t s o f T n 5 . T h i s p r o m o t e r p r e s u m a b l y a c c o u n t s f o r t h e r e s i d u a l 5-10% l e v e l o f 77 0 - g a l a c t o s i d a s e a c t i v i t y i n t h e L 1 Q - l a c Z a n d i ~ l a c Z f u s i o n l y s o g e n s c a r r y i n g p o l a r T n 5 i n s e r t i o n s ( T a b l e I I I ) . N o m u r a a n d h i s c o w o r k e r s ( 4 3 ) h a v e s u g g e s t e d t h a t t h e f o u r f o l d e l e v a t e d l e v e l o f t r a n s l a t i o n o f L 1 2 mRNA s e q u e n c e o n L 1 0 o p e r o n mRNA r e q u i r e s c o n c o m i t a n t t r a n s l a t i o n o f t h e p r o x i m a l L 1 0 mRNA s e q u e n c e ; p r e s u m a b l y i t i s t h e r i b o s o m e m o v e m e n t t h r o u g h t h e L 1 0 s e q u e n c e t h a t o p e n s u p t h e d o w n s t r e a m i n i t i a t i o n s i t e a n d a l l o w s r i b o s o m e s t o b i n d a n d b e g i n t r a n s l a t i o n o f L 1 2 mRNA s e q u e n c e . T h e i n s e r t i o n o f T n 5 i n t o t h e d i s t a l r e g i o n o f t h e L 1 0 g e n e s m i g h t a l t e r o r p h y s i c a l l y r e m o v e t h e s e q u e n c e s w h i c h n o r m a l l y s e q u e s t e r t h e L 1 2 r i b o s o m e b i n d i n g s i t e . I n t h e a b s e n c e o f s e q u e s t e r i n g s e q u e n c e s , t h e L 1 2 mRNA i n i t i a t e d f r o m t h e p r o m o t e r w i t h i n t h e T n 5 e l e m e n t w o u l d b e v e r y e f f i c i e n t l y t r a n s l a t e d . T h e r e f o r e , t h e s u f f i c i e n t e x p r e s s i o n o f L 1 2 t o r e g u l a t e t h e s y n t h e s i z e d L 1 0 f r a g m e n t s w o u l d b e a c o n s e q u e n c e o f : ( 1 ) T h e h i g h c o p y n u m b e r o f t h e p l a s m i d ; ( 2 ) T h e l o w l e v e l o f t r a n s c r i p t i o n f r o m t h e T n 5 p r o m o t e r ; ( 3 ) T h e e f f i c i e n t t r a n s l a t i o n o f t h e L 1 2 s e q u e n c e . On t h e o t h e r h a n d , i n s e r t i o n s o f T n 5 i n t o t h e l e a d e r r e g i o n o f t h e o p e r o n d o n o t p r o d u c e h i g h l e v e l s o f L 1 2 a n d p p r o t e i n s a s i n d i c a t e d i n F i g u r e 13 b e c a u s e t h e T n 5 i n i t i a t e d t r a n s c r i p t s p r e s u m a b l y c o n t a i n t h e s e q u e s t e r i n g s e q u e n c e s . U n f o r t u n a t e l y e x a m i n a t i o n o f t h e n u c l e o t i d e s e q u e n c e h a s f a i l e d t o r e v e a l a n o b v i o u s c a n d i d a t e f o r a s e q u e s t e r i n g s e q u e n c e w h i c h w o u l d i n t e r a c t w i t h t h e L 1 2 i n i t i a t i o n r e g i o n . 78 I n s u m m a r y t h e e x p e r i m e n t s r e p o r t e d h e r e h a v e c o n f i r m e d t h e o r g a n i z a t i o n o f t h e f o u r r i b o s o m a l p r o t e i n a n d t w o RNA p o l y m e r a s e g e n e s i n t o t w o t r a n s c r i p t i o n u n i t s a s i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 2 . T h e s e q u e n c e r e p r e s e n t i n g m a j o r p r o m o t e r f o r t h e L 1 0 o p e r o n w a s l o c a l i z e d b e t w e e n n u c l e o t i d e 1 2 8 0 a n d 1 3 6 0 . E v i d e n c e h a s b e e n p r e s e n t e d w h i c h s u p p o r t s t h e i d e a t h a t L1 i s t h e t r a n s l a t i o n a l r e g u l a t o r y p r o t e i n f o r t h e L 1 1 o p e r o n a n d t h a t l a r g e r f r a g m e n t s o f t h e L1 p r o t e i n p r o d u c e d b y T n 5 i n s e r t i o n l a t e i n t h e g e n e c a n h a v e d e t r i m e n t a l e f f e c t s o n t h e g r o w t h o f t h e b a c t e r i u m . A n a l y s i s o f i n s e r t i o n s i n t o t h e L 1 0 o p e r o n h a v e s u p p o r t e d t h e i d e a t h a t L 1 2 p l a s m i d g e n e e x p r e s s i o n i s r e q u i r e d t o b a l a n c e L 1 0 p l a s m i d g e n e e x p r e s s i o n a n d l e a d t o t h e s u g g e s t i o n t h a t a s e q u e n c e w i t h i n t h e L 1 0 mRNA m a y i n t e r a c t w i t h a n d s e q u e s t e r t h e r i b o s o m e b i n d i n g s i t e o f t h e L 1 2 m R N A . 79 B I B L I O G R A P H Y 1 . A u e r s w a l d , E . A . , L u d w i g , G . , a n d S c h a l l e r , H . ( 1 9 8 1 ) . S t r u c t u r a l A n a l y s i s o f T n 5 . I n C o l d S p r i n g H a r b . S y m p .  Q u a n t . B i o l . 4 5 , 1 0 7 - 1 1 3 . 2 . B a r r y , G . , S q u i r e s , C . L . , a n d S q u i r e s , C . ( 1 9 7 9 ) . C o n t r o l F e a t u r e s W i t h i n t h e r p l J L - r p o B C T r a n s c r i p t i o n U n i t o f E s c h e r i c h i a c o l i . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 6 , 4 9 2 2 - 4 9 2 6 . 3 . B a r r y , G . , S q u i r e s , C , a n d S q u i r e s , C . L . ( 1 9 8 0 ) . A t t e n u a t i o n a n d P r o c e s s i n g o f RNA f r o m t h e r p l J L - r p o B C T r a n s c r i p t i o n U n i t o f E s c h e r i c h i a c o l i . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 7 , 3 3 3 1 - 3 3 3 5 . 4 . B e r g , D . E . , D a v i e s , J . , A l l e t , B . , a n d R o c h a i x , J . ( 1 9 7 5 ) . T r a n s p o s t i o n o f R - F a c t o r G e n e s t o B a c t e r i o p h a g e X.. P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 2 , 3 6 2 8 - 3 6 3 2 . 5 . B e r g , D . E . , a n d D r u m m o n d , M . ( 1 9 7 8 ) . A b s e n c e o f DNA S e q u e n c e s H o m o l o g u s t o T r a n s p o s a b l e E l e m e n t T n 5 ( K a n ) i n t h e C h r o m o s o m e o f E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 . J . B a c t e r i o l . 1 3 6 , 4 1 9 - 4 2 2 . 6 . B e r g , D . E . , W e i s s , A . , a n d C r o s s l a n d , L . ( 1 9 8 0 ) . T h e P o l a r i t y o f T n 5 I n s e r t i o n M u t a t i o n s i n E s c h e r i c h i a c o l i . J . B a c t e r i o l . 1 4 2 , 4 3 9 - 4 4 6 . 7 . B i r n b o i m , H . C , a n d D o l y , J . ( 1 9 7 9 ) . A R a p i d A l k a l i n e E x t r a c t i o n P r o c e d u r e f o r S c r e e n i n g R e c o m b i n a n t P l a s m i d D N A . N u c l . A c i d R e s . - 7 , 1 5 1 3 - 1 5 2 3 . 8 . D e a n , D . , a n d N o m u r a , M . ( 1 9 8 0 ) . F e e d b a c k R e g u l a t i o n o f R i b o s o m a l P r o t e i n G e n e E x p r e s s i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 7 , 3 5 9 0 - 3 5 9 4 . 9 . D e n n i s , P . P . ( 1 9 7 4 ) . I_n v i v o S t a b i l i t y , M a t u r a t i o n a n d R e l a t i v e D i f f e r e n t i a l S y n t h e s i s R a t e s o f I n d i v i d u a l R i b o s o m a l P r o t e i n s i n E s c h e r i c h i a c o l i B / r . J . M o l . B i o l . 8 8 , 2 5 - 4 1 . 1 0 . D e n n i s , P . P . , a n d F i i l , N . P . ( 1 9 7 9 ) . T r a n s c r i p t i o n a l a n d P o s t - T r a n s c r i p t i o n a l C o n t r o l o f RNA P o l y m e r a s e a n d R i b o s o m a l P r o t e i n G e n e s C l o n e d o n C o m p o s i t e C o l E I P l a s m i d s i n t h e B a c t e r i u m E s c h e r i c h i a c o l i . J . B i o l . C h e m . 2 5 4 , 7 5 4 0 - 7 5 4 5 . 1 1 . F i i l , N . P . , F r i e s e n , J . D . , D o w n i n g , W. L . , a n d D e n n i s , P . P . ( 1 9 8 0 ) . P o s t - T r a n s c r i p t i o n a l R e g u l a t o r y M u t a n t s i n a R i b o s o m a l P r o t e i n - RNA P o l y m e r a s e O p e r o n o f E . c o l i . C e l l 1 9 , 8 3 7 - 8 4 4 . 80 1 2 . G a u s i n g , K . ( 1 9 7 7 ) . R e g u l a t i o n o f R i b o s o m e P r o d u c t i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i : S y n t h e s i s a n d S t a b i l i t y o f R i b o s o m a l RNA a n d o f R i b o s o m a l P r o t e i n M e s s e n g e r RNA a t D i f f e r e n t G r o w t h R a t e s . J . M o l . B i o l . 1 1 5 , 3 3 5 - 3 5 4 . 1 3 . I s o n o , K . , a n d K i t a k a w a , M . ( 1 9 7 8 ) . C l u s t e r o f R i b o s o m a l P r o t e i n G e n e s i n E s c h e r i c h i a c o l i C o n t a i n i n g G e n e s f o r P r o t e i n s S 6 , S18 a n d L 9 . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 5 , 6 1 6 3 - 6 1 6 7 . 1 4 . J a s k u n a s , S . R . , F a l l o n , A . M . , a n d N o m u r a , M . ( 1 9 7 7 ) . I d e n t i f i c a t i o n a n d O r g a n i z a t i o n o f R i b o s o m a l P r o t e i n G e n e s o f E s c h e r i c h i a c o l i C a r r i e d b y X.f u s 2 T r a n s d u c i n g P h a g e . J . B i o l . C h e m . 2 5 2 , 7 3 2 3 - 7 3 3 6 . 1 5 . J i a n - C h u a n , M . , N e w m a n , A . J . , a n d H a y w a r d , R . S . I n t e r n a l P r o m o t e r s o f t h e r p o B C O p e r o n o f E s c h e r i c h i a c o l i ( i n p r e s s ) . 1 6 . J i n k s - R o b e r t s o n , S . , a n d N o m u r a , M . ( 1 9 8 1 ) . R e g u l a t i o n o f R i b o s o m a l P r o t e i n S y n t h e s i s i n a n E s c h e r i c h i a c o l i M u t a n t M i s s i n g R i b o s o m a l P r o t e i n L l . J . B a c t e r i o l . 1 4 5 , 1 4 4 5 - 1 4 4 7 . 1 7 . J o h n s e n , M . , C h r i s t e n s e n , T . , F i i l , N . P . , a n d D e n n i s , P . P . A u t o g e n o u s C o n t r o l : R i b o s o m a l P r o t e i n L 1 0 - L 1 2 C o m p l e x B i n d s t o t h e L e a d e r S e q u e n c e o f . i t s mRNA ( i n p r e s s ) . 1 8 . K l e c k n e r , N . , R o t h , J . , a n d B o t s t e i n , D . ( 1 9 7 7 ) . G e n e t i c E n g i n e e r i n g _in_ v i v o U s i n g T r a n s l o c a t a b l e D r u g - R e s i s t a n c e E l e m e n t s . New M e t h o d s i n B a c t e r i a l G e n e t i c s . J . M o l . B i o l . 1 1 6 , 1 2 5 - 1 5 9 . 1 9 . L i , K . , a n d S u b r a m a n i a n , A . R . ( 1 9 7 5 ) . S e l e c t i v e S e p a r a t i o n P r o c e d u r e f o r D e t e r m i n a t i o n o f R i b o s o m a l P r o t e i n s L 7 a n d L 1 2 . A n a l . B i o c h e m . 6 4 , 1 2 1 - 1 2 9 . 2 0 . L i n d a h l , L . , Y a m a m o t o , M . , a n d N o m u r a , M . ( 1 9 7 7 ) . M a p p i n g o f a C l u s t e r o f G e n e s f o r C o m p o n e n t s o f t h e T r a n s c r i p t i o n a l a n d T r a n s l a t i o n a l M a c h i n e r i e s o f E s c h e r i c h i a c o l i . J . M o l . B i o l . 1 0 9 , 2 3 - 4 7 . •21 . L i n d a h l , L . , a n d Z e n g e l , J . M . ( 1 9 8 2 ) . E x p r e s s i o n o f R i b o s o m a l G e n e s i n B a c t e r i a . A d v a n c e s i n G e n e t i c s 2 1 , 5 3 -1 2 1 . 2 2 . L i n n , T . , a n d S c a i f e , J . ( 1 9 7 8 ) . I d e n t i f i c a t i o n o f a S i n g l e P r o m o t e r i n E . c o l i f o r r p l J , r p l L a n d r p o B C . N a t u r e 2 7 6 , 3 3 - 3 7 . 2 3 . L i n n , T . , G o m a n , M . , a n d S c a i f e , J . G . ( 1 9 7 9 ) . S t u d i e s o n t h e C o n t r o l o f t h e G e n e s f o r T r a n s c r i p t i o n a n d T r a n s l a t i o n i n E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 . I . t u f B a n d r p l A , K h a v e S e p a r a t e P r o m o t e r s . J . M o l , B i o l . 1 3 0 , 4 0 5 - 4 2 0 . 81 2 4 . M a x a m , A . M . , a n d G i l b e r t , W . ( 1 9 7 7 ) . A New M e t h o d f o r S e q u e n c i n g D N A . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 4 , 5 6 0 - 5 6 4 . 2 5 . M i l l e r , J . H . , C a l o s , M . P . , a n d G a l a s , D . J . ( 1 9 8 1 ) . G e n e t i c a n d S e q u e n c i n g S t u d i e s o f t h e S p e c i f i c i t y o f T r a n s p o s i t i o n i n t o t h e l a c R e g i o n o f E . c o l i . I n C o l d  S p r i n g H a r b S y m p Q u a n t B i o l . 4 5 , 2 4 3 - 2 5 8 . 2 6 . N e v e r s , P . , a n d S a e d l e r , H . ( 1 9 7 7 ) . T r a n s p o s a b l e G e n e t i c E l e m e n t s a s A g e n t s o f G e n e I n s t a b i l i t y a n d C h r o m o s o m a l R e a r r a n g e m e n t s . N a t u r e 2 6 8 , 1 0 9 - 1 1 5 . 2 7 . N e w m a n , A . J . , a n d H a y w a r d , R . S . ( 1 9 8 0 ) . C l o n i n g o f DNA o f t h e r p o B C O p e r o n f r o m t h e C h r o m o s o m e o f E s c h e r i c h i a c o l i K 1 2 . M o l . G e n . G e n e t . 1 7 7 , 5 2 7 - 5 3 3 . 2 8 . N i e r l i c h , D . P . ( 1 9 7 8 ) . R e g u l a t i o n o f B a c t e r i a l G r o w t h , R N A , a n d P r o t e i n S y n t h e s i s . A n n u . R e v . M i c r o b i o l . 3 2 , 3 9 3 -4 3 2 . 2 9 . N o m u r a , M . , M o r g a n , E . A . , a n d J a s k u n a s , S . R . ( 1 9 7 7 ) . G e n e t i c s o f B a c t e r i a l R i b o s o m e s . A n n u . R e v . G e n e t . 1 1 , 2 9 7 -3 4 7 . 3 0 . P o s t , L . E . , S t r y c h a r z , G . D . ; N o m u r a , M . , L e w i s , H . , a n d D e n n i s , P . P . ( 1 9 7 9 ) . N u c l e o t i d e S e q u e n c e o f t h e R i b o s o m a l P r o t e i n G e n e C l u s t e r A d j a c e n t t o t h e G e n e f o r RNA P o l y m e r a s e S u b u n i t p i n E s c h e r i c h i a c o l i . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 6 , 1 6 9 7 - 1 7 0 1 . 3 1 . P r i b n o w , D . ( 1 9 7 5 ) . B a c t e r i o p h a g e T 7 E a r l y P r o m o t e r s : N u c l e o t i d e S e q u e n c e s o f T w o RNA P o l y m e r a s e B i n d i n g S i t e s . J . M o l . B i o l . 9 9 , 4 1 9 - 4 4 3 . 3 2 . R o b a k i s , N . , M e z a - B a s s o , L . , B r o t , N . , a n d W e i s s b a c h , H . ( 1 9 8 1 ) . T r a n s l a t i o n a l C o n t r o l o f R i b o s o m a l P r o t e i n L 1 0 S y n t h e s i s O c c u r s P r i o r t o F o r m a t i o n o f F i r s t P e p t i d e B o n d . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 8 , 4 2 6 1 - 4 2 6 4 . 3 3 . R o t h s t e i n , S . J . , J o r g e n s e n , R . A . , P o s t l e , K . , a n d R e z n i k o f f , W. S . ( 1 9 8 0 ) . T h e I n v e r t e d R e p e a t s o f T n 5 a r e F u n c t i o n a l l y D i f f e r e n t . C e l l 1 9 , 7 9 5 - 8 0 5 . 3 4 . R o t h s t e i n , S . J . , J o r g e n s e n , R . A . , Y i n J . C . P . , a n d Y o n g -D i , Z . , J o h n s o n , R . C , a n d R e z n i k o f f , W . S . ( 1 9 8 1 ) . G e n e t i c O r g a n i z a t i o n o f T n 5 . I n C o l d S p r i n g H a r b . S y m p . Q u a n t . B i o l . 4 5 , 9 9 - 1 0 5 . 3 5 . S a n c a r , A . , H a c k , A . M . , a n d R u p p , W. D . ( 1 9 7 9 ) . S i m p l e M e t h o d f o r I d e n t i f i c a t i o n o f P l a s m i d - C o d e d P r o t e i n s . J . o f -B a c t e r i o l . 1 3 7 , 6 9 2 - 6 9 3 . 82 3 6 . S h a p i r o , J . A . ( 1 9 7 9 ) . M o l e c u l a r M o d e l f o r t h e T r a n s p o s i t i o n a n d R e p l i c a t i o n o f B a c t e r i o p h a g e Mu a n d o t h e r T r a n s p o s a b l e E l e m e n t s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 6 , 1 9 3 3 -1 9 3 7 . 3 7 . S t o f f l e r , G . , H a s e n b a n k , R . , a n d D a b b s , E . R . ( 1 9 8 1 ) . E x p r e s s i o n o f t h e L 1 1 - L 1 O p e r o n i n M u t a n t s o f E s c h e r i c h i a  c o l i L a c k i n g t h e R i b o s o m a l P r o t e i n L1 o r L 1 1 . M o l . G e n . G e n e t . 1 8 1 , 1 6 4 . - 1 6 8 . 3 8 . S u b r a m a n i a n , A . R . ( 1 9 7 5 ) . C o p i e s o f P r o t e i n L 7 a n d L 1 2 a n d H e t e r o g e n e i t y o f t h e L a r g e S u b u n i t o f E s c h e r i c h i a c o l i R i b o s o m e . J . M o l . B i o l . 9 5 , 1 - 8 . 3 9 . T a y l o r , W . , a n d B u r g e s s , R . R . ( 1 9 7 9 ) . E . c o l i RNA p o l y m e r a s e B i n d i n g a n d I n i t i a t i o n o f T r a n s c r i p t i o n o n F r a g m e n t s o f X r i f d 1 8 D N A C o n t a i n i n g P r o m o t e r s f o r X G e n e s a n d f o r r r n B , t u f B , r p l K , A , r p l J , L , a n d r p o B C G e n e s . M o l . G e n . G e n e t . 6 , 3 3 1 - 3 6 5 . 4 0 . T e r h o s t , C , M o l l e r , W . , L a u r s e n , R . , a n d W i t t m a n n - L i e b o l d , B . ( 1 9 7 3 ) . T h e P r i m a r y S t r u c t u r e o f a n A c i d i c P r o t e i n f r o m 5 0 S R i b o s o m e s o f E s c h e r i c h i a c o l i • w h i c h i s I n v o l v e d i n G T P H y d r o l y s i s D e p e n d e n t o n E l o n g a t i o n F a c t o r s G a n d T . E u r . J . B i o c h e m . 3 4 , 1 3 8 - 1 5 2 . 4 1 . Y a t e s , J . L . , A r f s t e n , A . E . , a n d N o m u r a , M . ( 1 9 8 0 ) . I n  v i t r o E x p r e s s i o n o f E s c h e r i c h i a c o l i R i b o s o m a l P r o t e i n G e n e s : A u t o g e n o u s I n h i b i t i o n o f T r a n s l a t i o n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U S A 7 7 , 1 8 3 7 - 1 8 4 1 . 4 2 . Y a t e s , J . L . , a n d N o m u r a , M . ( 1 9 8 1 ) . F e e d b a c k R e g u l a t i o n o f R i b o s o m a l P r o t e i n S y n t h e s i s i n E . c o l i : L o c a l i z a t i o n o f t h e mRNA T a r g e t S i t e f o r R e p r e s s o r A c t i o n o f R i b o s o m a l P r o t e i n L 1 . C e l l 2 4 , 2 4 3 - 2 4 9 . 4 3 . Y a t e s , J . L . , D e a n , D . , S t r y c h a r z , W. A . , a n d N o m u r a , M . ( 1 9 8 1 ) . E . c o l i R i b o s o m a l P r o t e i n L 1 0 I n h i b i t s T r a n s l a t i o n o f L 1 0 a n d L 7 / L 1 2 m R N A s b y A c t i n g a t a S i n g l e S i t e . N a t u r e 2 9 4 , 1 9 0 - 1 9 2 . 

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