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The fine-structure of asexual spore development in the Choanephoraceae and Cunninghamellaceae (Mucorales Higham, Michael Thomas 1980

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cJ T H E F I N E - S T R U C T U R E O F A S E X U A L SPORE DEVELOPMENT I N T H E CHOANEPHORACEAE AND CUNNINGHAMELLACEAE ( M U C O R A L E S ) . B T S c . , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1967 M . S c , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1971 A T H E S I S S U B M I T T E D I N P A R T I A L F U L F I L L M E N T OF T H E REQUIREMENTS FOR T H E D E G R E E OF DOCTOR OF P H I L O S O P H Y i n T H E F A C U L T Y O F GRADUATE S T U D I E S D e p a r t m e n t o f B o t a n y 1' We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f i r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d T H E U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H COLUMBIA A u g u s t ,1980 © M i c h a e l T h o m a s H i g h a m , 1980 T h o m a s H i g h a m L In presenting th is thes is in p a r t i a l fu l f i lment of the requirements for an advanced degree at the Univers i ty of B r i t i s h Columbia, I agree that the L ibrary shal l make it f ree ly ava i lab le for reference and study. I fur ther agree that permission for extensive copying of th is thes is for scho la r ly purposes may be granted by the Head of my Department or by his representat ives . It is understood that copying or pub l ica t ion of th is thes is for f inanc ia l gain sha l l not be allowed without my wri t ten permission. M i c h a e l T . H i g h a m . Department of BOTANY The Univers i ty of B r i t i s h Columbia 2075 Wesbrook Place Vancouver, Canada V6T 1W5 Date A u g u s t 2 5 , 1980 i i C h a i r p e r s o n s : P r o f e s s o r K . C o l e ; P r o f e s s o r R. B a n d o n i . A B S T R A C T T h e d e v e l o p m e n t o f s p o r a n g i a a n d s p o r a n g i o l e s i s d e s c r i b e d i n t h e m u c o r a l e a n g e n e r a C h o a n e p h o r a , B l a k e s l e a , C u n n i n g h a m e l l a , a n d M y c o t y p h a . T h e f i n e - s t r u c t u r e o f s p o r e d e v e l o p m e n t i s e x a m i n e d w i t h t r a n s m i s s i o n a n d s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y . C y t o p l a s m i c c l e a v a g e i n m u l t i s p o r o u s s p o r a n g i a o f C h o a n e p h o r a a n d B l a k e s l e a i n v o l v e s f u s i o n o f c l e a v a g e v e s i c l e s t o f o r m a c l e a v a g e a p p a r a t u s . S i m i l a r c l e a v a g e e v e n t s o c c u r i n t r i s p o r o u s s p o r a n g i o l e s o f B l a k e s l e a b u t t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s i s o r i e n t e d w i t h t h e t h r e e l o n g t i t u d i n a l " s u t u r e " l i n e s o f t h e s p o r a n g i o l e w a l l . T h e o u t e r l a y e r o f s p o r e w a l l s i s d e r i v e d f r o m a f i b r o u s c o a t i n g o n t h e m e m b r a n e s o f t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s . T h e i n n e r w a l l l a y e r i s f o r m e d a f t e r d e p o s i t i o n o f t h e o u t e r l a y e r a n d i s a s s o c i a t e d w i t h t h e p r e s e n c e o f g r a n u l a r v e s i c l e s i n t h e s p o r e c y t o p l a s m . I n m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s o f C h o a n e p h o r a , C u n n i n g h a m e l l a , a n d M y c o t y p h a n o c l e a v a g e a p p a r a t u s i s p r o d u c e d . S p o r e s o f a l l g e n e r a s t u d i e d p o s s e s s a b i l a y e r e d w a l l w i t h t h e o o u t e r l * a y e r d e m o n s t r a t i n g much g r e a t e r e l e c t r o n - d e n s i t y t h a n t h e i n n e r l a y e r . T h e r e l a t i v e t h i c k n e s s e s o f t h e two w a l l l a y e r s v a r i e s g r e a t l y among g e n e r a . T h e o u t e r l a y e r i s d e p o s i t e d i n r i d g e s a n d f u r r o w s i n s p o r e s o f C h o a n e p h o r a a n d B l a k e s l e a . T h e s t r u c t u r e o f b i p o l a r s p o r e a p p e n d a g e s i s i d e n t i c a l i n i i i t h e s e two g e n e r a . T h e u l t r a s t r u c t u r e o f s p i n e s o n s p o r a n g i a l s u r f a c e s i s d e s c r i b e d . S p i n e s o n s p o r a n g i o l e s o f C u n n i n g h a m e l l a e x h i b i t a f i n e - s t r u c t u r e d i f f e r e n t f r o m t h a t o f C h o a n e p h o r a a n d B l a k e s l e a . No s p i n e s a r e p r o d u c e d o n s p o r e w a l l s o f a n y o f t h e g e n e r a s t u d i e d . T h e i d e n t i f i c a t i o n o f c e l l u l a r c o m p o n e n t s i s e x a m i n e d u s i n g p l a s t i c - s e c t i o n h i s t o c h e m i s t r y a n d l i g h t -m i c r o s c o p y , a T h e c l e a v a g e a p p a r a t u s i n i t i a l l y c o n t a i n s c a r b o h y d r a t e w h i c h d i s a p p e a r s a s t h e s p o r e s m a t u r e . B i p o l a r s p o r e a p p e n d a g e s a r e s h o w n t o b e c o m p o s e d o f c a r b o h y d r a t e , w i t h t h e i r b a s e s s t a i n i n g f o r p r o t e i n . I n a l l s p o r e s , t h e c y t o p l a s m shows i n t e n s e s t a i n i n g f o r p r o t e i n a n d weak s t a i n i n g f o r c a r b o h y d r a t e s . S p o r e w a l l s a r e d i f f i c u l t t o s t a i n w i t h a n y o f t h e p r o c e d u r e s u s e d . B a s e d o n t h e o b s e r v e d c o m p a r a t i v e u l t r a s t r u c t u r a l d e v e l o p m e n t o f a s e x u a l s p o r e s , r e c o m m e n d a t i o n s a n d comments a r e made c o n c e r n i n g t h e t a x o n o m y o f t h e M u c o r a l e s . i v T A B L E OF CONTENTS A B S T R A C T i i L I S T OF T A B L E S . v i L I S T OF F I G U R E S v i i L I S T OF COLOUR F I G U R E S x x i i ACKNOWLEDGEMENTS x x i i i I . GENERAL I N T R O D U C T I O N 1 I I . TAXONOMIC REVIEW OF T H E CHOANEPHORACEAE AND T H E C U N N I N G H A M E L L A C E A E 6 I I I . METHODS AND M A T E R I A L S 9 A . C u l t u r e s a n d m e d i a 9 B . L i g h t m i c r o s c o p i c t e c h n i q u e s 9 C . E l e c t r o n m i c r o s c o p i c t e c h n i q u e s . . . D. S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p i c t e c h n i q u e s 11 E . H i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e s 12 I V . R E P R O D U C T I V E DEVELOPMENT I N T H E CHO ANEPHO RAGEA'E £ 15 I n t r o d u c t i o n 15 R e s u l t s a n d O b s e r v a t i o n s 17 A . D e v e l o p m e n t o f m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s i n C h o a n e p h o r a  c u c u r b i t a r u m 17 B . D e v e l o p m e n t o f m u l t i s p o r o u s s p o r a n g i a i n C h o a n e p h o r a n u n u r b i t a r u m 43 V C . D e v e l o p m e n t o f t r i s p o r o u s s p o r a n g i o l e s i n B l a k e s l e a t r i s p o r a 88 D . D e v e l o p m e n t o f m u l t i s p o r o u s s p s p o r a n g i a i n B l a k e s l e a t r i s p o r a . . . 130 V . R E P R O D U C T I V E DEVELOPMENT I N T H E CUNNINGHAMELLACEAE 134 I n t r o d u c t i o n 134 R e s u l t s a n d O b s e r v a t i o n s ; 136 A . D e v e l o p m e n t o f m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s i n C u n n i n g h a m e l l a ;'. '• " e c h i n u l a t a 13 6 B . D e v e l o p m e n t o f m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s i n M y c o t y p h a  m i c r o s p o r a 173 V I . H I S T O C H E M I C A L S T A I N I N G OF R E P R O D U C T I V E S T R U C T U R E S 205 I n t r o d u c t i o n 205 R e s u l t s a n d O b s e r v a t i o n s 206 A . M o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s o f C h o a n e p h o r a 206 B . M u l t i s p o r o u s s p o r a n g i a o f C h o a n e p h o r a a n d B l a k e s l e a 2 0 8 C . T r i s p o r o u s s p o r a n g i o l e s o f B l a k e s l e a 211 D . M o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s o f C u n n i n g h a m e l l a 213 E . M o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s o f M y c o t y p h a 215 V I I . D I S C U S S I O N 219 A . T h e C h o a n e p h o r a c e a e 219 B . T h e G u n n i n g h a m e l l a c e a e 228 C . H i s t o c h e m i s t r y 234 D . Summary 238 V I I . L I T E R A T U R E C I T E D 242 v i L I S T OF T A B L E S I , T a b l e o f H i s t o c h e m i c a l P r o c e d u r e s 1 4 I I , T a b l e o f H i s t o c h e m i c a l R e s u l t s 216 I I I T a b l e o f U l t r a s t r u c t u r a l F e a t u r e s 233 VI1 L I S T OF F I G U R E S F I G U R E C h o a n e p h o r a c u c u r b i t a r u m ( F i g u r e s 1 - 115) 1. Y o u n g a m p u l l a o f C h o a n e p h o r a 26 2. P e d i c e l i n i t i a t i o n o n a m p u l l a 26 3- M a t u r e p e d i c e l s o n a m p u l l a 26 4 . S u r f a c e v i e w o f a m p u l l a 26 5. S e c t i o n t h r o u g h y o u n g p e d i c e l 26 6. T u b u l e s i n y o u n g p e d i c e l 26 7. W a l l l a y e r s o f y o u n g p e d i c e l 26 8. E x p a n s i o n o f s p o r a n g i o l e s o n p e d i c e l s 28 9- S e c t i o n o f a / y o u n g s p o r a n g i o l e 28 10. S p o r u l a t i n g " h e a d " o f C h o a n e p h o r a 28 11. Y o u n g s p o r a n g i o l e s o n t h e i r a m p u l l a e 28 12. Y o u n g s p o r a n g i o l e s a n d a m p u l l a 28 13 • S u r f a c e o f a m p u l l a a n d s p o r a n g i o l e 28 1 4 . S e c t i o n o f p e d i c e l s e p t u m o f y o u n g s p o r a n g i o l e 28 15- S e c t i o n o f p e d i c e l s e p t u m 28 16. C o m p o s i t e m i c r o g r a p h o f y o u n g s p o r a n g i o l e . . . . 3° 17. S p o r a n g i o l e s a t t a c h e d t o a m p u l l a 32 1 8 . C o m p a r i s o n o f a m p u l l a a n d s p o r a n g i o l e w a l l s . . . 32 19. A m p u l l a b e a r i n g m a t u r e s p o r a n g i o l e s 3^ 20. C y t o p l a s m i c r i b o s o m e s i n s i d e s p o r a n g i o l e w a l l 3^ 21. S t a r t o f w a l l s y n t h e s i s a n d p e d i c e l s e p t u m . . . . 3^ v i i i L I S T OF F I G U R E S F I G U R E 22. A m p u l l a ; v a c u o l a t i o n o f c y t o p l a s m 3^ 23. C o m p a r i s o n o f w a l l s s a m p u l l a , s p o r a n g i o l e a n d s p o r e 3^ 24. C y t o p l a s m o f s p o r a n g i o l e d u r i n g o u t e r w a l l f o r m a t i o n 36 25. ER a s s o c i a t i o n w i t h o u t e r w a l l s y t h e s i s 3° 26. B e a d e d ER a n d g r a n u l a r v e s i c l e s d u r i n g w a l l f o r m a t i o n 36 27. S y n t h e s i s o f i n n e r w a l l l a y e r 36 28. T h i n m i d d l e w a l l l a y e r 36 29. F o u r s p o r e w a l l l a y e r s a n d s p o r a n g i o l e w a l l . . . 36 30. M a t u r e s p o r e s i n s p o r a n g i o l e s 38 31. D e t a i l o f m a t u r e s p o r e w a l l l a y e r s 38 32. M u l t i n u c l e a r m a t u r e s p o r e i n s p o r a n g i o l e 38 33. A p i c u l a t e r e m a i n s o f p e d i c e l o n m a t u r e s p o r a n g i o l e 38 34. A m p u l l a c y t o p l a s m a t m a t u r i t y o f s p o r a n g i o l e s 40 35. C r y s t a l s i n o l d a m p u l l a 40 36. C r y s t a l d e t a i l ; o l d a m p u l l a c y t o p l a s m 40 37. S u r f a c e o f a m p u l l a a f t e r s p o r a n g i o l e r e l e a s e . . 40 38. C r y s t a l f o r m a t i o n i n a s s o c i a t i o n w i t h a m i t o c h o n d r i o n 40 39. M a t u r e s p o r a n g i o l e s o n a m p u l l a e 42 40. M a t u r e s p o r a n g i o l e s a n d s p o r a n g i o l o p h o r e 42 ix LIST OF FIGURES FIGURE 41. Spines on mature sporangiole, lateral-view 42 42. End view of sporangioles on ampulla 42 43. Germinated spore and germ tube 42 44. Detail of point of germination showing wall layers 42 45. Circinate, multisporous sporangia 57 46. Line of dehiscence around sporangium 57 47. Feulgen-stained section of young sporangium 57 48. Section of young sporangium 57 49. Spines on sporangium wall 57 50. Convoluted membranous body near sporangium wall 57 51. Lipids i n aldehyde-fixed sporangium 59 52. Endoplasmic Reticulum i n young sporangium 59 53. Section through early stage of suture l i n e . . . . 59 54. Nuclei and nuclear membrane showing pores 59 55« Vesicles i n suture area 59 56. Vesicles associated with suture formation 61 57. Tubules in area of suture 6 l 58. Section of area destined to be the columella.. 6 l 59 ' Lomasome and surface spines 61 60. Lomasome at sporangial >plasma membrane 6 l 61. Structure of surface spine 63 62. Lamellar bodies i n sporangium wall 63 X L I S T OF F I G U R E S F I G U R E 63. F i b r o u s a p p e a r a n c e o f s p o r a n g i u m w a l l 63 64. L a m e l l a r b o d i e s i n w a l l a n d s u r f a c e s p i n e s . . . . 63 65. L a m e l l a r b o d i e s a t h i g h m a g n i f i c a t i o n 63 66. S u r f a c e s p i n e s i n c r o s s - s e c t i o n 63 67. L a m e l l a r b o d i e s i n s p i n e s t r u c t u r e 65 68. S p i n e w i t h h o l l o w c e n t r e 65 69. S p i n e w i t h p l a t e - l i k e s t r u c t u r e 65 70. S p i n e w i t h f l a r e d t o p e d g e 65 71. V e s i c l e s o f c l e a v a g e a p p a r a t u s . . 67 72. C l e a v a g e a p p a r a t u s d e l i m i t i n g c o l u m e l l a a r e a . . 67 73. C l e a v a g e a p p a r a t u s i n c e n t r a l c y t o p l a s m 67 74. C l e a v a g e a p p a r a t u s i n p e r i p h e r a l c y t o p l a s m . . . . 67 75. C l e a v a g e v e s i c l e s d e l i m i t i n g a s p o r e 69 76. C l e a v a g e a p p a r a t u s " a p p r o a c h i n g " a s u t u r e l i n e 69 77. L o w p m a g n i f i c a t i o n o f c l e a v a g e a p p a r a t u s 69 78. F u t u r e s p o r e c y t o p l a s m b e i n g c l e a v e d 69 79. D e t a i l o f c l e a v a g e f u r r o w 69 80. C l e a v a g e a p p a r a t u s a t s p o r a n g i a l w a l l 71 81. A r e a o f c y t o p l a s m d e s t i n e d t o f o r m a s i n g l e s p o r e 71 8 2 . C l e a v a g e membrane a t l o w m a g n i f i c a t i o n 71 83. D e t a i l o f c l e a v a g e membrane 71 84. I n t e r d i g i t a t i o n o f c l e a v a g e m e m b r a n e i v w i t h p l a s m a membrane 73 x i L I S T OF F I G U R E S F I G U R E 85. D e t a i l o f i n t e r d i g i t a t i o n z o n e 73 86. M e m b r a n o u s s t r u c t u r e s i n e x t r a c e l l u l a r s p a c e s . , 7 3 87. C l e a v a g e f u r r o w a n d l i p i d d r o p l e t s 73 88. C l e a v a g e membrane b e t w e e n p r o s p o r e s 73 89. M e m b r a n o u s a p p e n d a g e p r e c u r s o r s i n t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s 75 9 0 . S t r u c t u r e o f a p p e n d a g e p r e c u r s o r s 75 91. S p o r a n g i u m a f t e r c y t o p l a s m c l e a v a g e 75 92. C o l u m e l l a w a l l a d j a c e n t t o s p o r e membrane 75 93- C o l u m e l l a c y t o p l a s m a f t e r s p o r a n g i a l c l e a v a g e . 75 94. F e u l g e n - s t a i n e d s p o r e s a n d c o l u m e l l a 75 95- A l d e h y d e - f i x e d c o l u m e l l a a n d s p o r e s 77 96. P e r m a n g a n a t e - f i x e d c o l u m e l l a 77 97. S p o r e c y t o p l a s m d u r i n g w a l l f o r m a t i o n 79 98. O u t e r a n d m i d d l e w a l l p r o d u c t i o n 79 99. S p o r a n g i u m w a l l c o m p a r e d t o s p o r e w a l l l a y e r s . 79 100. S p o r e s s u r r o u n d e d b y m e m b r a n e s i n t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s 79 101. A l d e h y d e - f i x e d s p o r e s h o w i n g w a l l l a y e r s 81 102. P r o d u c t i o n o f i n n e r w a l l l a y e r 81 103. G r a n u l a r v e s i c l e s n e a r s p o r e p l a s m a membrane 81 1 0 4 . T h r e e - l a y e r e d w a l l o f m a t u r e s p o r e 83 105. M u l t i l a y e r e d i n n e r w a l l o f a t y p i c a l s p o r e . . . . 83 106. D e t a i l o f m u l t i l a y e r e d i n n e r w a l l 83 x i i L I S T OF F I G U R E S F I G U R E 107. E a r l y s t a g e o f a p p e n d a g e a s s e m b l y 83 1 0 8 . D e t a i l o f s p o r e p o l a r a p p e n d a g e 83 109. L a t e s t a g e o f a p p e n d a g e a s s e m b l y 85 110. D e t a i l o f a p p e n d a g e a t t a c h m e n t a r e a 85 111. M a t u r e a p p e n d a g e i n s p o r a n g i u m 85 112. S e c t i o n a l a n d f a c e v i e w s o f a p p e n d a g e membrane 85 113. S c a n n i n g EM o f m a t u r e s p o r a n g i u m 87 1 1 4 . R a i s e d s u t u r e l i n e , s i t e o f d e h i s c e n c e 87 115* S p i n e s o n s p o r a n g i u m s u r f a c e 87 B l a k e s l e a t r i s p o r a ( F i g u r e s 116 - 211) 116. S e c t i o n o f y o u n g a m p u l l a 101 117. A m p u l l a w i t h y o u n g p e d i c e l s 101 1 1 8 . Y o u n g p e d i c e l a n d s u r r o u n d i n g c y t o p l a s m 101 1 1 9 . D e t a i l o f y o u n g p e d i c e l c y t o p l a s m 101 120. Y o u n g s p o r a n g i o l e a n d p e d i c e l 101 121. A m p u l l a w i t h y o u n g s p o r a n g i o l e s 101 122. P e r m a n g a n a t e - f i x e d a m p u l l a 103 123- A l d e h y d e - f i x e d a m p u l l a 103 1 2 4 . C r y s t a l i n a m p u l l a v a c u o l e 103 125. C r y s t a l a s s o c i a t i o n w i t h membrane 103 126. S p o r a n g i o l e w a l l a n d c y t o p l a s m 103 127. C o m p a r i s o n o f a m p u l l a a n d s p o r a n g i o l e w a l l s . . . 1 0 3 • • • X l l l LIST OF FIGURES '. FIGURE 128. Glutaraldehyde-fixed sporangiole 105 129. A c r o l e i n - f i x e d sporangiole 105 130. Permanganate-fixed sporangiole 105 1313,. Start of suture formation 105 132. Mature pedicel, glutaraldehyde-fixed 105 133. Mature pedicel, a c r o l e i n - f i x e d 105 134. L i p i d droplets inside vacuoles 107 135» Granular v e s i c l e s surrounded by vacuoles 107 136. Nuclear envelope~pores 107 137. Lomasomes at sporangiole wall 107 138. Tubule-containing vacuoles 107 139. Multitubular vacuoles near pedicel cytoplasm.. 107 140. "Granular body" containing ribosomes 109 141. Association of granular v e s i c l e s and plasma membrane 109 142. Free ribosomes i n sporangiole cytoplasm 109 143. Ribosomes i n membrane-bound "granular body"... 109 144. Rosettes of glycogen i n cytoplasm 109 145. Ribosomes near sporangiole wall 109 146. Cytoplasmic v e s i c l e s , aldehyde f i x a t i o n I l l 14?. Vesicles near suture, permanganate f i x a t i o n . . . I l l 148. Three sutures, sectioned p a r a l l e l to'.ampulla.. I l l 149. Granular body near suture I l l 150. Small granular bodies near suture I l l x i v L I S T OF F I G U R E S F I G U R E 151. A s s o c i a t i o n o f g r a n u l a r b o d y a n d s u t u r e membrane I l l 152. S t a r t o f c l e a v a g e f r o m s u t u r e s i n w a r d . . . . . . 113 153* C l e a v a g e i n p r o g r e s s , f r o m s u t u r e s i n w a r d . . , 1 1 3 154. C l e a v a g e v e s i c l e s f o r m i n g c l e a v a g e c a n a l . . . 113 155- C l e a v a g e a p p a r a t u s e x p a n d i n g t o w a r d s s u t u r e s 113 156. G r a n u l a r b o d i e s w i t h i n t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s 113 157« G r a n u l e s l l i n i n g t h e c l e a v a g e membrane 113 158. C l e a v a g e a p p a r a t u s e x p a n d i n g t o w a r d s s u t u r e s 115 159- Z o n e b e t w e e n s u t u r e a n d e x p a n d i n g c l e a v a g e a p p a r a t u s 115 160. G r a n u l a r b o d y b e t w e e n s u t u r e a n d c l e a v a g e a p p a r a t u s 115 161. C l e a v a g e v e s i c l e b e t w e e n s u t u r e a n d c l e a v a g e a p p a r a t u s 115 162. F u s i o n o f c l e a v a g e v e s i c l e s . . 115 163. C o m p l e t e d c o n n e c t i o n o f c l e a v a g e a p p a r a t u s t o s u t u r e 115 164. O r g a n e l l e s i n c l e a v a g e a p p a r a t u s 115 165. C l e a v a g e c a n a l s e p a r a t i n g two p r o s p o r e s . . . . 117 166. G r a n u l a r c o n t e n t s o f c l e a v a g e a p p a r a t u s . . . . 117 167. E x p a n d e d c l e a v a g e a p p a r a t u s b e t w e e n p r o s p o r e s 117 168. ER p a r a l l e l t o c l e a v a g e membrane 117 169. E x t e n s i o n o f c y t o p l a s m i n t o t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s 117 170. C o n n e c t i o n o f c l e a v a g e a p p a r a t u s t o t h r e e s u t u r e s 117 X V L I S T OF F I G U R E S F I G U R E 171. S p o r a n g i o l e s u r f a c e , f r e e z e d r i e d m a t e r i a l . . 1 1 9 172. S p o r a n g i o l e s u r f a c e , c r i t i c a l - p o i n t d r i e d m a t e r i a l 119 173* A m p u l l a a n d c l e a v e d s p o r a n g i o l e s 119 174. T h r e e p r o s p o r e s i n c r o s s - s e c t i o n e d s p o r a n g i o l e 119 175« D e t a i l o f m u l t i n u c l e a t e p r o s p o r e 119 176. P r o s p o r e m e m b r a n e , f o r m e r l y c l e a v a g e membrane 119 177- A m p u l l a c y t o p l a s m c o n t a i n i n g a g r a n u l a r b o d y 121 178. V a c u o l a t e c y t o p l a s m o f a m p u l l a 121 179- C r y s t a l i n c y t o p l a s m o f o l d a m p u l l a 121 1 8 0 . C r y s t a l l a t t i c e s t r u c t u r e 121 181. A m p u l l a c y t o p l a s m a f t e r s p o r e w a l l f o r m a t i o n 121 1 8 2 . S p o r a n g i o l e s d u r i n g w a l l f o r m a t i o n 123 183. S t a r t o f o u t e r w a l l r i d g e s 123 1 8 4 . S p o r e s w i t h o u t e r w a l l s 123 185- A p p e n d a g e p r e c u r s o r s b e t w e e n s p o r e s 123 186. S p o r e w i t h t h r e e w a l l l a y e r s 123 187. I n t e r l o c k i n g o f w a l l r i d g e s i n s p o r a n g i o l e . 123 188. M a t u r e s p o r e r e l e a s e d f r o m i t s s p o r a n g i o l e . 125 189. A p p e n d a g e s t r u c t u r e o f a m a t u r e s p o r e 125 190. C o m p a r i s o n o f m a t u r e s p o r e a n d s p o r a n g i o l e w a l l 125 191. S p o r e w a l l l a y e r s , a l d e h y d e - f i x e d 125 192. S p o r e w a l l l a y e r s a t h i g h m a g n i f i c a t i o n . . . . 125 193» S p o r e w a l l l a y e r s , p e r m a n g a n a t e - f i x e d 125 x v i L I S T OF F I G U R E S F I G U R E 194. SEM o f m a t u r i n g s p o r a n g i o l e s 127 195. S u t u r e l i n e s o n m a t u r e s p o r a n g i o l e s 127 196. S p o r a n g i o l e w a l l a f t e r c l e a v a g e 127 197- T o r n s u t u r e l i n e s e x p o s i n g m a t u r e s p o r e s . . . 127 1 9 8 . SEM o f m a t u r e s p o r e w a l l g r o o v e s 127 199. A m p u l l a a n d p e d i c e l s a f t e r s p o r a n g i o l e r e l e a s e 127 200. R e l e a s e d s p o r a n g i o l e a n d p e d i c e l 129 201. F r a c t u r e o f p e d i c e l a t a m p u l l a e n d 129 202. " B e a d e d " b r a n c h e s o f s p o r a n g i o l o p h o r e 129 203. M a t u r e c o l u m e l l a t e s p o r a n g i u m 129 2 0 4 . C o l u m e l l a a n d s u t u r e f r a c t u r e l i n e s 129 205. S p o r e w a l l r i d g e s a n d s p o r a n g i a l w a l l s p i n e s 129 206. C y t o p l a s m o f y o u n g s p o r a n g i u m 133 207. S p o r e s d u r i n g w a l l f o r m a t i o n 133 208. S p o r a n g i o s p o r e w a l l l a y e r s 133 209. S p o r a n g i o s p o r e w a l l n e x t t o c o l u m e l l a 133 210. G i a n t s p o r e i n m a t u r e s p o r a n g i u m 133 211. S p o r a n g i u m a n d s p o r a n g i o l e s 133 C u n n i n g h a m e l l a e c h i n u l a t a ( F i g . 212-269) 212. Y o u n g s p o r u l a t i n g c o l o n y 1 4 8 213- E a r l y a m p u l l a ; s u r f a c e v i e w 1 4 8 2 1 4 . E a r l y a m p u l l a ; t h i n - s e c t i o n 148 215. P e r i p h e r a l c y t o p l a s m o f y o u n g a m p u l l a 1 4 8 x v i i L I S T OF F I G U R E S . . F I G U R E :1216. Y o u n g p e d i c e l s ; l i g h t m i c r o s c o p e 150 .":21'7. Y o u n g p e d i c e l s ; s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e 150 2 1 8 . C y t o p l a s m n e a r y o u n g p e d i c e l s 150 2 1 9 . G r a n u l a r v e s i c l e s i n p e r i p h e r a l c y t o p l a s m . . 150 2 2 0 . G l y c o g e n v e s i c l e 152 221. A n a s t a m o s i n g g r a n u l a r v e s i c l e s n e a r p e d i c e l 152 2 2 2 . P e d i c e l c y t o p l a s m i c d e t a i l 152 223. P e d i c e l c y t o p l a s m i c d e t a i l 152 2 2 4 . E a r l y s p o r a n g i o l e s ; l i g h t m i s c r o s c o p e 1 5 4 225. A m p u l l a w i t h y o u n g s p o r a n g i o l e s 154 2 2 6 . D e t a i l o f y o u n g s p o r a n g i o l e s a n d a m p u l l a e . . 1 5 4 2 2 7 . S p i n e s o n y o u n g s p o r a n g i o l e s 154 2 2 8 . Y o u n g s p o r a n g i o l e s ; l i g h t m i c r o s c o p e 156 229. S e c t i o n o f y o u n g s p o r a n g i o l e 1 5 6 230. A m p u l l a a n d s p o r a n g i o l e s i n s e c t i o n . . . 1 5 6 231. P e d i c e l a n d s p o r a n g i o l e c y t o p l a s m 1 5 6 232. A m p u l l a c y t o p l a s m 1 5 8 233* A m p u l l a v a c u o l a t i o n . 158 234. Y o u n g s p o r a n g i o l e 1 5 8 235- C o n c e n t r i c - m e m b r a n e d b o d y 158 236. P e r i p h e r a l g r a n u l a r v e s i c l e s . . . . . 1 6 0 2 3 7 - G r a n u l a r v e s i c l e s a t s p o r a n g i o l e m e m b r a n e . . 1 6 0 238. G r a n u l a r v e s i c l e s 160 239- O u t e r s p o r e w a l l i n i t i a t i o n 1 6 0 2 4 0 . S p i n e s o n y o u n g s p o r a n g i o l e 162 x v i i i LIST OF FIGURES FIGURE 241. Nuclear association with granular vesicle.. 162 242. Sporagniole peripheral vesicles 162 243. Mitochondria i n sporangiole 162 244. Young sporangioles; surface view 164 245. Spine base and covering 164 246. Spine base structure 164 247. Spines and sporangiole wall 164 248. Sporangiole cytoplasm during wall formation 164 249. Outer spore wall and sporangiole wall 164 250. Sporangiole spines and pedicel atachment... 166 251- Sporangiole spines 166 252. Surface spines with wide base supports 166 253- Sporangiole cytoplasm 166 254. Spine fine-structure; Permanganate fixed... 166 255- Maturing sporangioles; light microscope.... 168 256. Maturing sporangioles; scanning EM 168 257. Empty pedicels of maturing sporangioles.... 168 258. Outer spore wall; aldehyde fixation 168 259- Sporangiole cytoplasm; aldehyde fixation... 168 260. Sporangiole cytoplasm; permanganate . fi::at.o fixation 168 261. Spore wall layers; aldehyde fixation 170 262. Spore wall and peripheral cytoplasm 170 263. Separation of spore and sporangiole walls.. 170 264. Nuclear condition of mature reproductive structure 170 x i x L I S T OF F I G U R E S F I G U R E 265. M a t u r e s p o r u l a t i n g s t r u c t u r e ; SEM 172 2 6 6 . D e g e n e r a t i n g p e d i c e l w a l l s 172 267. A p o s s i b l e t h i r d s p o r e w a l l l a y e r 172 2 6 8 . P e d i c e l b a s e s h o w i n g f i b r o u s w a l l s 172 269. S p o r e i n s i d e a r e l e a s e d s p o r a n g i o l e 172 M y c o t y p h a m i c r o s p o r a ( F i g s . 2 7 0 - 3 2 7 ) 2 7 0 . T e r m i n a l s w e l l i n g o f h y p h a 1 8 4 2 7 1 . T e r m i n a l s w e l l i n g ; s c a n n i n g EM 1 8 4 2 7 2 . P e d i c e l i n i t i a t i o n o n y o u n g a m p u l l a 1 8 4 273. E a r l y p e d i c e l s a n d s u r f a c e s c a l e s 1 8 4 -274. M a t u r e p e d i c e l s ; l i g h t m i c r o s c o p e 1 8 6 275. M a t u r e p e d i c e l s ; SEM 1 8 6 276. A m p u l l a s e c t i o n e d t h r o u g h p e d i c e l s 1 8 6 277. A m p u l l a c y t o p l a s m p r i o r t o s p o r a n g i o l e i n i t i a t i o n 1 8 6 278. P e d i c e l c y t o p l a s m w i t h l o m a s o m e 1 8 6 279. P e d i c e l c y t o p l a s m w i t h v e s i c l e s 1 8 6 2 8 0 . P e d i c e l c y t o p l a s m w i t h v e s i c l e s 1 8 6 2 8 1 . C y t o p l a s m i c v e s i c l e s i n a m p u l l a 1 8 8 2 8 2 . P e d i c e l a n d a m p u l l a w a l l s 1 8 8 283. S c a l e - f r e e s u r f a c e s o f p e d i c e l s 1 8 8 2 8 4 . P e r i p h e r a l c y t o p l a s m i c z o n e i n a m p u l l a 188 2 8 5 . S p o r a n g i o l e i n i t i a t i o n ; l i g h t m i c r o s c o p e . . . 1 9 0 2 8 6 . S p o r a n g i o l e i n i t i a t i o n ; s c a n n i n g EM 1 9 0 X X L I S T OF F I G U R E S F I G U R E 287. S e c t i o n t h r o u g h p r i m a r y a n d s e c o n d a r y s p o r a n g i o l e s 190 2 8 8 . N u c l e i a t p e d i c e l b a s e s 190 2 8 9 . P r i m a r y a n d i m m a t u r e s e c o n d a r y s p o r a n g i o l e s 190 290. F r a c t u r e p o i n t o f p e d i c e l 190 291. M a t u r e a m p u l l a c o v e r e d w i t h s p o r a n g i o l e s . . . 192 292. M a t u r e p r i m a r y a n d s e c o n d a r y s p o r a n g i o l e s . . 192 293. S e c t i o n o f m a t u r i n g s p o r a n g i o l e s 192 294. M i t o c h o n d r i a i n p e d i c e l b a s e a r e a 192 295* M a t u r e p r i m a r y p e d i c e l c y t o p l a s m 192 296. L o m a s o m e s i n p r i m a r y p e d i c e l 192 297« S e c o n d a r y s p o r a n g i o l e 194 2 9 8 . S e c o n d a r y p e d i c e l - s p o r a n g i o l e c o n n e c t i o n . . . 194 299. P r i m a r y s p o r a n g i o l e w i t h p e d i c e l a r e x t e n s i o n 194 300. P r i m a r y s p o r a n g i o l e . . . 194 301. O r g a n e l l e s e n t e r i n g s p o r a n g i o l e t h r o u g h p e d i c e l 194 302. O u t e r s p o r e w a l l a n d s e p t u m p r o d u c t i o n 194 303. M a t u r e s p o r a n g i o l e a n d p e d i c e l ; SEM 196 304. M a t u r e s p o r e i n . s p o r a n g i o l e 196 305. M a t u r e s p o r e s i n p r i m a r y a n d s e c o n d a r y s p o r a n g i o l e s 196 306. P l u g i n s p o r a n g i a l w a l l e x t e n s i o n 196 307. S e c o n d a r y s p o r a n g i o l e c o n t a i n i n g a m a t u r e s p o r e 198 308. S p o r e a n d s p o r a n g i a l w a l l s 198 x x i L I S T OF F I G U R E S F I G U R E 309. P r i m a r y s p o r a n g i o l e c o n t a i n i n g a s p o r e 198 310. H i g h m a g n i f i c a t i o n o f w a l l s t r u c t u r e 198 311. A m p u l l a c y t o p l a s m d u r i n g s p o r a n g i o l e m a t u r a t i o n 200 312. C r o s s - s e c t i o n o f m a t u r i n g a m p u l l a 200 313. V a c u o l a t i o n o f a m p u l l a c y t o p l a s m 200 3 1 4 . T e r m i n a l c y t o p l a s m o f m a t u r e a m p u l l a 200 315- P e r i p h e r a l c y t o p l a s m a n d v a c u o l e s 200 316. M i t o c h o n d r i a i n p e r i p h e r a l c y t o p l a s m 200 317. R e m n a n t c y t o p l a s m i n m a t u r e a m p u l l a 202 318. C r y s t a l i n e i n c l u s i o n s i n v e s i c l e s 202 319* C r y s t a l s i n m a t u r e a m p u l l a 202 320. C r y t a l s i n m a t u r e a m p u l l a 202 321. G r o u p o f a m p u l l a e a f t e r s p o r a n g i o l e r e l e a s e 202 322. P r i m a r y a n d s e c o n d a r y d e n t i c l e s o n o l d a m p u l l a 202 323« D e n t i c l e s i n s p i r a l p a t t e r n 2 0 4 324. O l d a m p u l l a b e a r i n g e i g h t h u n d r e d d e n t i c l e s 2 0 4 325. I n t e r i o r s u r f a c e o f o l d a m p u l l a w a l l 2 0 4 326. O l d p r i m a r y d e n t i c l e 2 0 4 327. O l d s e c o n d a r y d e n t i c l e w i t h s e p t u m 2 0 4 X X I 1 L I S T OF COLOUR F I G U R E S F I G U R E 1. M y c o t y p h a 2 B l a k e s l e a 3 B l a k e s l e a 4 B l a k e s l e a 5 C u n n i n g h a m e l l a 6 C u n n i n g h a m e l l a 7 C u n n i n g h a m m e l l a 8 . C h o a n e p h o r a 9 C h o a n e p h o r a 1 0 C h o a n e p h o r a 11 C h o a n e p h o r a 12 C h o a n e p h o r a 1 3 C h o a n e p h o r a 1 4 C h o a n e p h o r a 15 C h o a n e p h o r a A n i l i n e B l u e - B l a c k s t a i n i n g 6f m a t u r e a m p u l l a f o r p r o t e i n s 218 T o l u i d i n e B l u e m e t a c h r o m a t i c s t a i n i n g o f a l m o s t - m a t u r e s p o r a n g i o l e s 218 P e r i o d i c A c i d - S c h i f f ( P A S ) s t a i n i n g o f e a r l y s p o r a n g i o l e s f o r c a r b o h y d r a t e s 218 L u x o l ' s F a s t B l u e MBS s t a i n i n g o f s p o r a n g i o l e s f o r p h o s p h o r l i p i d s 218 PAS s t a i n i n g o f y o u n g s p o r a n g i o l e s f o r c a r b o h y d r a t e s 218 T o l u i d i n e B l u e m e t a c h r o m a t i c s t a i n i n g o f m a t u r e s p o r a n g i o l e s 218 A n i l i n e B l u e - B l a c k s t a i n i n g o f m a t u r i n g s p o r a n g i o l e s f o r p r o t e i n s 218 PAS s t a i n i n g o f m a t u r e m o n o -s p o r o u s s p o r a n g i o l e s 218 T o l u i d i n e B l u e m e t a c h r o m a t i c s t a i n i n g o f m a t u r e m o n o -s p o r o u s s p o r a n g i o l e s 218 PAS s t a i n i n g o f m u l t i s p o r o u s s p o r a n g i u m 218 A n i l i n e B l u e - B l a c k s t a i n i n g o f y o u n g m u l t i s p o r o u s s p o r a n g i u m . 218 PAS s t a i n i n g o f m u l t i s p o r o u s s p o r a n g i u m 218 A n i l i n e B l u e - B l a c k s t a i n i n g o f m a t u r e s p o r a n g i u m 218 A c i d F u c h s i n s t a i n i n g o f a l m o s t -m a t u r e s p o r a n g i u m 218 PAS s t a i n i n g o f m a t u r e s p o r a n g i o s p o r e s w i t h a p p e n d a g e s 218 x x i i i ACKNOWLEDGEMENTS I w i s h t o s i n c e r e l y t h a n k D r . K a t h l e e n C o l e a n d D r . R o b e r t B a n d o n i f o r t h e i r d i r e c t i o n , a d v i c e a n d s u p p o r t t h r o u g h o u t t h e c o u r s e o f t h i s s t u d y . I a l s o e x p r e s s my a p p r e c i a t i o n t o D r . G . C . H u g h e s , D r . W. B . S c h o f i e l d a n d D r . J . J . S t o c k whose e n c o u r a g e m e n t a n d g u i d a n c e h e l p e d d i r e c t t h i s r e s e a r c h . T h a n k s a r e a l s o e x t e n d e d t o M r . L . L . V e t o f o r h i s e x c e l l e n t t e c h n i c a l a s s i s t a n c e i n e l e c t r o n m i c r o s c o p y , D r . C . W. H e s s e l t i n e ( N R R L , U . S . D e p t . o f A g r i c u l t u r e , P e o r i a , I l l i n o i s ) f o r h i s g e n e r o s i t y i n s u p p l y i n g c u l t u r e s , t h e D e p a r t m e n t o f B o t a n y , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a a n d t h e P a c i f i c R e s e a r c h S t a t i o n , C a n a d a A g r i c u l t u r e f o r u s e o f e l e c t r o n m i c r o s c o p e f a c i l i t i e s , L i l l i a n K e e n a n d G a i l L o r e n s o n f o r t y p i n g t h e m a n u s c r i p t , M r . A . H a r m o n f o r h i s p r o o f - r e a d i n g o f t h e f i n a l m a n u s c r i p t , a n d f i n a l l y , t o t h e F a c u l t y , s t a f f a n d g r a d u a t e s t u d e n t s o f t h e D e p a r t m e n t o f B o t a n y who g a v e t h e i r h e l p , e n c o u r a g e m e n t a n d f r i e n d s h i p . S p e c i a l t h a n k s a a r e due t o my p a r e n t s f o r t h e i r m o r a l s u p p o r t t h r o u g h o u t my g r a d u a t e s t u d i e s . - 1 -I . GENERAL INTRODUCTION The aim of the present study is to investigate spore formation and structure i n selected genera of mucoralean fungi. The study w i l l attempt to answer the following questions for the four genera studied: 1. Are true conidia produced by any of these fungi? 2. What method of cytoplasmic cleavage occurs in sporangia and sporangioles? 3 . How does the structure of spore walls di f f e r among genera? k. What i s the structure of surface spines and where are they located? 5. What i s the structure of appendages and which spores possess them? 6 . How does cellular histochemistry change during sporulation? The answers to the above questions are discussed i n relation to taxonomic problems i n the Mucorales. Asexual reproduction i n the Mucorales i s by means of aplanospores produced i n thin-walled sporangia. The number of spores per sporangium varies greatly among genera of the fourteen families. This i s generally considered to represent an evolutionary trend from 2 l a r g e m u l t i - s p o r e d s p o r a n g i a , t h r o u g h s m a l l f e w - s p o r e d s p o r a n g i o l e s , t o s i n g l e - s p o r e d s p o r a n g i o l a . I n some g e n e r a t h e s i n g l e - s p o r e d r e p r o d u c t i v e s t r u c t u r e h a s b e e n i n t e r p r e t e d a s a c o n i d i u m , s i n c e e f f o r t s t o s h o w a d i s t i n c t , s e p a r a b l e s p o r a n g i a l w a l l h a v e b e e n u n s u c c e s s f u l . T h e s p o r a n g i u m , i n i t s v a r i o u s f o r m s , h a s g r e a t s i g n i f i c a n c e t o t h e u n d e r s t a n d i n g o f t a x o n o m y a n d e v o l u t i o n i n t h i s g r o u p o f f u n g i . T h e r e f o r e , a m o r e d e t a i l e d k n o w l e d g e o f t h e d e v e l o p m e n t o f t h e s e s t r u c t u r e s i s r e q u i r e d . S p o r e p r o d u c t i o n i s s t u d i e d i n e a c h t y p e o f " s p o r a n g i u m " . I n t h e M u c o r a l e s , t h e p r e s e n c e o f s p i n e s o n s p o r e s a n d s p o r a n g i a h a s l o n g b e e n o f i n t e r e s t t o m y c o l o g i s t s . T h e y h a v e b e e n u s e d a s a n a i d t o t a x o n o m y a n d h a v e b e e n c o n s i d e r e d i n s t u d i e s o f s p o r e r e l e a s e a n d d i s p e r s i o n ( I h g o l d , 1971? G r o v e , 1976). I n t h e p r e s e n t s t u d y p a r t i c u l a r a t t e n t i o n h a s b e e n p a i d t o t h e s t r u c t u r e a n d p o s s i b l e f u n c t i o n s o f s p o r a n g i a l - w a l l s p i n e s a n d o f s p o r e a p p e n d a g e " b r i s t l e s " p r o d u c e d b y t h e f u n g i i n v e s t i g a t e d . P u b l i s h e d r e p o r t s o n t h e h i s t o c h e m i c a l i d e n t i f i c a t i o n o f f u n g a l c e l l s t r u c t u r e s a r e r a r e . A l t h o u g h t h e r e p r o d u c t i v e s t r u c t u r e s o f h i g h e r f u n g i c a n b e s e c t i o n e d - 3 -a n d s t a i n e d f o r m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n , s t u d i e s o f t h e m i n u t e s p o r e s a n d s p o r a n g i a o f t h e l o w e r f u n g i h a v e b e e n s e v e r e l y l i m i t e d b y t e c h n i c a l d i f f i c u l t i e s . M a n i p u l a t i o n o f s u c h s m a l l s t r u c t u r e s t h r o u g h t h e m u l t i p l e s t e p s o f h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e s ( K i r k , 1966) u s u a l l y r e s u l t s i n t h e l o s s o f s p e c i m e n s . B y u t i l i z i n g t h e r e c e n t l y d e v e l o p e d p l a s t i c e m b e d d i n g t e c h n i q u e s f o r h i s t o c h e m i s t r y ( F e d e r a n d O ' B r i e n , 1968), a n a t t e m p t i s made t o c h e m i c a l l y i d e n t i f y c e l l u l a r c o m p o n e n t s d u r i n g s p o r e d e v e l o p m e n t i n t h e m u c o r a l e a n g e n e r a u n d e r s t u d y . F u n g i i n t h e o r d e r M u c o r a l e s a r e c h a r a c t e r i z e d b y a t h a l l u s o f e x t e n s i v e m y c e l i u m w i t h a e r i a l f e r t i l e h y p h a e . T h e o r d e r i s t y p i c a l l y s a p r o b i c , b u t some g e n e r a a r e o b l i g a t e p a r a s i t e s o f o t h e r f u n g i ; o t h e r s a r e p a r a s i t e s o f h i g h e r p l a n t s a n d a n i m a l s . F o u r g e n e r a n o t p r e v i o u s l y s t u d i e d w i t h t r a n s m i s s i o n a n d s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y w e r e c h o s e n a s s u b j e c t s o f t h i s i n v e s t i g a t i o n . T h e s e l e c t e d g e n e r a w e r e c h o s e n f r o m t h e f a m i l i e s C h o a n e p h o r a c e a e a n d C u n n i n g h a m e l l a c e a e b e c a u s e t h e s e two f a m i l i e s i n c l u d e f u n g i t h a t p r o d u c e a l l t h r e e t y p e s o f s p o r a n g i a l s t r u c t u r e s . T h e t h r e e g e n e r a o f t h e f a m i l y C h o a n e p h o r a c e a e ( H e s s e l t i n e a n d E l l i s , 1973) a r e weak p a r a s i t e s o n t h e f l o w e r s a n d f r u i t s o f f l o w i n g p l a n t s . A l l p r o d u c e d a r k l y p i g m e n t e d s p o r e s w i t h t u f t s o f b r i s t l e s a t t h e i r e n d s w i t h i n l a r g e m u l t i - s p o r e d s p o r a n g i a . G i l b e r t e l l a p r o d u c e s no o t h e r t y p e s o f s p o r a n g i a ; B l a k e s l e a p r o d u c e s s p o r a n g i o l e s w i t h f e w - s p o r e s , a n d C h o a n e p h o r a p r o d u c e s s i n g l e - s p o r e d " c o n i d i a " i n a d d i t i o n t o m u l t i - s p o r e d s p o r a n g i a . H o w e v e r , s i n c e t h e f i n e -s t r u c t u r e a n d d e v e l o p m e n t o f s p o r a n g i o s p o r e s i n G i l b e r t e l l a h a s a l r e a d y b e e n s t u d i e d b y B r a c k e r (1966), s p e c i e s o f B l a k e s l e a a n d C h o a n e p h o r a w e r e c h o s e n a s s u b j e c t s o f t h e p r e s e n t s t u d y . O f t h e f o u r g e n e r a i n t h e C u n n i n g h a m e l l a c e a e , ( s e n s u H e s s e l t i n e a n d E l l i s , 1973)» o n l y t h e s o i l s a p r o b e C u n n i n g h a m e l l a i s common. A l l f o u r g e n e r a p r o d u c e o n l y s i n g l e - s p o r e d " c o n i d i a " , a n d t h e s h a p e o f t h e c o n i d i u m - b e a r i n g v e s i c l e i s u s e d t o s e p a r a t e t h e s e g e n e r a t a x o n o m i c a l l y . I n C u n n i n g h a m e l l a t h e " c o n i d i a " a r e p r o d u c e d o n l a r g e s p h e r i c a l v e s i c l e s . B a i n i e r a n d S a r t o r y (1913) w e r e t h e f i r s t t o r e p o r t two s p o r e - c o v e r i n g l a y e r s i n C u n n i n g h a m e l l a ( a s M u r a t e l l a ) . S e p a r a t i o n o f t h e s p o r a n g i o s p o r e f r o m t h e s p o r a n g i a l w a l l h a s p r o v e n e x c e p t i o n a l l y d i f f i c u l t t o d e m o n s t r a t e i n t h e C u n n i n g h a m e l l a c e a e . T h e r e f o r e , C u n n i n g h a m e l l a a n d M y c o t y p h a w e r e i n c l u d e d i n t h e p r e s e n t s t u d y . C u n n i n g h a m e l l a i s a m u c h - s t u d i e d g e n u s a n d s e v e r a l e l e c t r o n - m i c r o s c o p i c s t u d i e s h a v e b e e n p u b l i s h e d d e a l i n g w i t h t h e g e r m i n a t i o n o f i t s s p o r e s ( H a w k e r , T h o m a s a n d B e c k e t t , 1970; K h a n , 1975). H o w e v e r , o n l y two b r i e f s t u d i e s h a v e c o n s i d e r e d s p o r e d e v e l o p m e n t w i t h t h e g e n u s ( K h a n a n d T a l b o t , 1975; C o o k , 1977) a n d t h e s e h a v e p r e s e n t e d c o n f l i c t i n g r e s u l t s . I n M y c o t y p h a t h e " c o n i d i a " a r e p r o d u c e d o n a n e l o n g a t e c y l i n d r i c a l v e s i c l e a n d t h e w h o l e s t r u c t u r e r e s e m b l e s a m i n i a t u r e c o r n c o b . S p o r e d e v e l o p m e n t i n t h i s g e n u s was s t u d i e d a l s o b y K h a n a n d T a l b o t (1975) a n d t h e p r e s e n t r e p o r t s u p p o r t s a n d e x t e n d s t h e i r f i n d i n g s t h a t b o t h g e n e r a d e f i n i t e l y p r o d u c e s i n g l e - s p o r e d s p o r a n g i o l a a n d n o t t r u e c o n i d i a . - 6 I I . T a x o n o m i c R e v i e w . C h o a n e p h o r a c e a e T h e g e n u s C h o a n e p h o r a C u r r e y was c o n s i d e r e d o r i g i n a l l y t o b e l o n g t o t h e F u n g i I m p e r f e c t i , o r d e r M u c e d i n e s ( C u r r e y , I 8 7 3 ) . V a n T i e g h e m a n d L e M o n n i e r (1873) o p p o s e d t h e i d e a t h a t t h i s g e n u s p r o d u c e d t r u e c o n i d i a , a n d C h o a n e p h o r a was t r a n s f e r r e d t o t h e M u c o r i n i b y C u n n i n g h a m (1878). A s e c o n d g e n u s , B l a k e s l e a , was p u b l i s h e d b y T h a x t e r (1914) a n d s e p a r a t e d f r o m C h o a n e p h o r a o n t h e b a s i s t h a t C h o a n e p h o r a p r o d u c e d c o n i d i a a n d B l a k e s l e a p r o d u c e d s p o r a n g i o l e s . T h a x t e r s u g g e s t e d t h a t t h e c o n i d i a w e r e p e r h a p s m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s . T h e p o s s i b l e s y n o n o m y o f B l a k e s l e a a n d C h o a n e p h o r a was s u g g e s t e d b y S i n h a (1940, b ) , who s h o w e d t h a t u n d e r s t a r v a t i o n c u l t u r e c o n d i t i o n s t h e s p o r a n g i o l e s o f B l a k e s l e a w e r e r e d u c e d t o t h e m o n o s p o r o u s c o n d i t i o n f o u n d i n C h o a n e p h o r a . T h e two g e n e r a w e r e t r e a t e d s e p a r a t e l y b y H e s s e l t i n e (1952, 1953) tout P o i t r a s (1955) a g a i n p r o p o s e d t h a t t h e y be s y n o n o m i z e d . H e s s e l t i n e a n d B e n j a m i n (1957) a g r e e d w i t h P o i t r a s a n d s u p p o r t e d t h e i d e a o f s y n o n o m y . M e h r o t r a a n d B a i j a l (1968) s u g g e s t e d 7 t h a t C h o a n e p h o r a a n d B l a k e s l e a b e k e p t a s s e p a r a t e g e n e r a f o r p r a c t i c a l r e a s o n s e v e n t h o u g h t h e y r e c o g n i z e d t h e c o n i d i a o f C h o a n e p h o r a t o be m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s . I n t h e m o s t r e c e n t t a x o n o m i c t r e a t m e n t ( H e s s e l t i n e a n d E l l i s , 1973) t h e two g e n e r a a r e t r e a t e d a s d i s t i n c t . H e s s e l t i n e r e c e n t l y s u p p o r t e d t h e s e p a r a t i o n o f t h e s e two g e n e r a , ( p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n - , 1975)-C u n n i n g h a m e l l a c e a e M a t r u c h o t (1903) d e s c r i b e d a f u n g u s w h i c h h e named C u n n i n g h a m e l l a a f r i c a n a a n d p l a c e d i n t h e C h o a n e p h o r e e w i t h C h o a n e p h o r a . F i t z p a t r i c k (1930) i n c l u d e d C u n n i n g h a m e l l a i n t h e C h o a n e p h o r a c e a e , b u t a s e p a r a t e f a m i l y , C u n n i n g h a m e l l a c e a e , was c r e a t e d b y Naumov (1939) t o s e p a r a t e t h e n o n - p i g m e n t e d " c o n i d i a " o f C u n n i n g h a m e l l a s p e c i e s f r o m t h e d a r k l y p i g m e n t e d " c o n i d i a " o f C h o a n e p h o r a s p e c i e s . , Z y c h a e t a l . , (1969) r e t a i n e d C u n n i n g h a m e l l a i n t h e f a m i l y C h o a n e p h o r a c e a e , b u t m o r e r e c e n t t r e a t m e n t s ( H e s s e l t i n e a n d E l l i s , 1973) f a v o u r r e t e n t i o n o f a s e p a r a t e f a m i l y f o r C u n n i n g h a m e l l a a n d i t s c l o s e r e l a t i v e s . When f i r s t p u b l i s h e d , M y c o t y p h a was p l a c e d i n t h e M u c o r a c e a e ( F e n n e r , 1932) b e c a u s e o f i t s s u s c e p t i -b i l i t y t o a t t a c k b y a m y c o p a r a s i t e , P i p t o c e p h a l i s de B a r y . H o w e v e r , H u g h e s (1953) c o n s i d e r e d i t t o b e l o n g t o t h e F u n g i I m p e r f e c t i . H e s s e l t i n e (1955) a g r e e d w i t h F e n n e r t h a t M y c o t y p h a w a s a P h y c o m y c e t e a n d p l a c e d i t i n t h e C u n n i n g h a m e l l a c e a e . W o l f (1957) q u e s t i o n e d w h e t h e r M y c o t y p h a m i g h t b e c o n g e n e r i c w i t h t h e i m p e r f e c t f u n g u s M i c r o t y p h a . B e n j a m i n (1959) p o i n t e d o u t t h a t t h e o r i g i n a l s p e c i m e n o f M y c o t y p h a was a t t a c k e d b y a f u n g a l p a r a s i t e o f P h y c o m y c e t e s a n d t h e r e f o r e m u s t b e a p h y c o m y c e t e . T h e d e s c r i p t i o n o f z y g o s p o r e p r o d u c t i o n i n M . a f r i c a n a ( N o v a k a n d B a c k u s , 1963) s u p p l i e d f i n a l p r o o f o f i t s t r u e i d e n t i t y . Z y c h a e t a l . (1969) p l a c e d M y c o t y p h a i n t h e C h o a n e p h o r a c e a e . U n t i l r e c e n t l y , t h e g e n e r a l v i e w was t h a t M y c o t y p h a b e l o n g e d i n t h e C u n n i n g h a m e l l a c e a e ( H e s s e l t i n e a n d E l l i s , 1973). h u t B e n n y a n d B e n j a m i n (1976) s u g g e s t e d t h a t i t may h a v e c l o s e r a f f i n i t i e s w i t h t h e f a m i l y T h a m n i d i a c e a e . I I I . METHODS AND M A T E R I A L S A . C u l t u r e s B l a k e s l e a t r i s p o r a T h a x t e r C u l t u r e NRRL 2895 was k i n d l y s u p p l i e d b y D r . C . W. H e s s e l t i n e , N o r t h e r n R e g i o n a l R e s e a r c h L a b o r a t o r y , U . S . D e p t . o f A g r i c u l t u r e , P e o r i a , I l l i n o i s . C u n n i n g h a m e l l a e c h i n u l a t a ( T h a x t e r ) T h a x t e r U . B . C . C u l t u r e c o l l e c t i o n N o . 92 C h o a n e p h o r a c u c u r b i t a r u m ( B e r k , a n d R a v . ) T h a x t e r U . B . C . C u l t u r e c o l l e c t i o n N o . 154 M y c o t y p h a m i c r o s p o r a F e n n e r U . B . C . C u l t u r e c o l l e c t i o n N o . 38 M e d i a A l l c u l t u r e s w e r e g r o w n o n o n e - h a l f o r o n e -q u a r t e r s t r e n g t h P o t a t o D e x r o s e A g a r ( D i f c o ) a t r o o m t e m p e r a t u r e s (18 t o 2 5 ° C ) a n d u n d e r n a t u r a l l i g h t i n g c o n d i t i o n s . T h i s m e d i u m p r o d u c e d r a p i d l u x u r i a n t g r o w t h a n d a b u n d a n t a s e x u a l r e p r o d u c t i o n . B . L i g h t M i c r o s c o p y I n o r d e r t o a v o i d w a t e r m o u n t s t h e c u l t u r e s w e r e g r o w n i n S h o e m a k e r g l a s s c h a m b e r s l i d e s . T h e - 1 0 s l i d e s w e r e p l a c e d i n s t e r i l e g l a s s m o i s t u r e c h a m b e r s t o p r e v e n t d r y i n g . A f t e r h y p h a l g r o w t h was n o t e d , s l i d e s w e r e r e m o v e d p e r i o d i c a l l y t o p h o t o g r a p h e a r l y s t a g e s o f s p o r a n g i a l d e v e l o p m e n t . P h o t o g r a p h s w e r e t a k e n w i t h a W i l d M - 2.0 P h o t o m i c r o s c o p e u s i n g K o d a k P a n a t o m i c - X f i l m . C . T r a n s m i s s i o n E l e c t r o n M i c r o s c o p y D e v e l o p i n g r e p r o d u c t i v e s t r u c t u r e s w e r e r e m o v e d f r o m c u l t u r e d i s h e s o n t h i n s l i c e s o f a g a r , u s i n g a r a z o r b l a d e . T h e s e s l i c e s w e r e i m m e d i a t e l y t a k e n t h r o u g h o n e o f t h e f o l l o w i n g f i x a t i o n s c h e d u l e s : S c h e d u l e K - 1% ( a q ) P o t a s s i u m p e r m a n g a n a t e f o r 1 h o u r a t 4 oc. S c h e d u l e G / 0 - $% G l u t a r a l d e h y d e i n 0 01 M P I P E S b u f f e r a t p H 8 . 0 ( S a l e m a a n d B r a n a o , 1 9 7 3 ) f o r 2 t o k h o u r s a t k ° C . - p o s t f i x a t i o n i n 1% Osmium t e t r o x i d e i n 0 . 0 1 M P I P E S b u f f e r a t p H 6 . 8 f o r 1 h o u r . S c h e d u l e G A / 0 - i d e n t i c a l t o s c h e d u l e G / 0 a b o v e , e x c e p t f o r t h e a d d i t i o n o f 1% A c r o l e i n t o t h e $% G l u t a r a l d e h y d e f i x a t i o n . T h e f o l l o w i n g s c h e d u l e s w e r e u s e d e x p e r i m e n t a l l y o n o c c a s i o n , a n d a f e w m i c r o g r a p h s a r e i n c l u d e d f r o m t h e s e m a t e r i a l s . S c h e d u l e A / 0 - 5% A c r o l e i n i n 0 . 0 1 M P I P E S b u f f e r a t p H 8 . 0 f o r k h o u r s . 11 S c h e d u l e A / 0 p o s t f i x a t i o n i n 1% Osmium t e t r o x i d e i n P I P E S b u f f e r a t p H 6.8 f o r 2 h o u r s . S c h e d u l e G / K 5% G l u t a r a l d e h y d e i n P I P E S b u f f e r , p H 8.0 f o r 2 h o u r s . p o s t f i x a t i o n i n 1% ( a q ) P o s t a s s i u m p e r m a n g a n a t e f o r 30 m i n u t e s a t 4 ° C . S c h e d u l e G / K / O i d e n t i c a l t o s c h e d u l e G / K e x c e p t a t h i r d f i x a t i o n was a d d e d : 1% a q u e o u s Osmium t e t r o x i d e f o r 1 h o u r . F o l l o w i n g f i x a t i o n , t i s s u e s w e r e d e h y d r a t e d i n a g r a d e d e t h a n o l s e r i e s , a n d e m b e d d e d i n S p u r r s l o w v i s c o s i t y e p o x y r e s i n ( S p u r r , 1969) . T h i n s e c t i o n s w e r e c u t o n a R e i c h e r t 0 M - U 3 U l t r a m i -c r o t o m e w i t h a D u p o n t d i a m o n d k n i f e . B e f o r e o b s e r v a t i o n , s e c t i o n s w e r e s t a i n e d w i t h U r a n y l A c e t a t e a n d L e a d C i t r a t e ( R e y n o l d s , I 9 6 3 ) . S e c t i o n s w e r e o b s e r v e d a n d p h o t o g r a p h e d i n P h i l i p s 200, H i t a c h i H S - 7 S a n d Z e i s s E M -10 e l e c t r o n m i c r o s c o p e s . D . S c a n n i n g E l e c t r o n M i c r o s c o p y S p e c i m e n s w e r e p r e p a r e d b y F r e e z e - d r y i n g o r b y C r i t i c a l - P o i n t d r y i n g ( A n d e r s o n , 1951) ' 1. F r e e z e - D r y i n g S c h e d u l e . F r e s h s p e c i m e n s w e r e i m m e r s e d i n d i m e t h y l b u t a n e c o o l e d o n a l i q u i d n i t r o g e n b a t h . A f t e r 10 s e c o n d s - 12 -o f q u i c k f r e e z i n g , t h e s p e c i m e n s w e r e t r a n s f e r r e d t o t h e p r e c o o l e d s t a g e o f a n E d w a r d s E P D - 2 v a c u u m e v a p o r a t o r , a n d f r e e z e d r i e d f o r 8 t o 12 h o u r s a t - 4 0 ° C . 2. C r i t i c a l - P o i n t D r y i n g S c h e d u l e . A l c o h o l - d e h y d r a t e d s p e c i m e n s f r o m t r a n s m i s s i o n EM f i x a t i o n s w e r e t a k e n t h r o u g h a g r a d e d e t h a n o l / a m y l a c e t a t e s e r i e s t o 1 0 0 $ a m y l a c e t a t e . T h e y w e r e i m m e d i a t e l y t r a n s f e r r e d i n t o a p r e s s u r e c h a m b e r a n d c r i t i c a l - p o i n t d r i e d u s i n g c a r b o n d i o x i d e ( C o h e n e t a l . , 1 9 6 8 ; W i c k h a m a n d W o r t h e n , 1 9 7 3 ) . F o l l o w i n g e i t h e r m e t h o d o f d r y i n g , t h e s a m p l e s w e r e a t t a c h e d t o s p e c i m e n - s t u b s u s i n g s i l v e r c o l l o i d a n d w e r e t h e n g o l d - c o a t e d u s i n g a M i k r o s V E - 10 v a c u u m e v a p o r a t o r f i t t e d w i t h a r o t a t i n g s p e c i m e n s t a g e . A l l o b s e r v a t i o n a n d p h o t o g r a p h y was p e r f o r m e d w i t h a C a m b r i d g e S t e r e o s c a n I I - A S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p e . E . H i s t o c h e m i s t r y S p e c i m e n s w e r e f i x e d i n 5% G l u t a r a l d e h y d e a n d 1% A c r o l e i n i n 0 . 0 1 M P I P E S b u f f e r a t p H 8 . 0 a t 4 ° C f o r 4 h o u r s . No o s m i u m was u s e d i n o r d e r t o a v o i d p o s s i b l e b l o c k i n g r e a c t i o n s ( S t o w a r d , 1 9 7 3 ) . - 13 F o l l o w i n g d e h y d r a t i o n i n g r a d e d e t h a n o l s e r i e s , s a m p l e s w e r e e m b e d d e d i n a g l y c o l m e t h a c r y l a t e - b u t o x y •.— e t h a n o l m i x t u r e ( P o l y s c i e n c e s I n c . ) ( R u d d e l , 1 9 6 7 ; F e d e r a n d O ' B r i e n , 1968). S e c t i o n s 1 - 2 jum t h i c k w e r e c u t u s i n g g l a s s k n i v e s o n a P o r t e r B l u m S o r v a l J B - 4 m i c r o t o m e . P l a s t i c s e c t i o n s w e r e h e a t - f i x e d o n t o c l e a n e d g l a s s s l i d e s . H i s t o c h e m i c a l s t a i n i n g , u s i n g t h e p r o c e d u r e s l i s t e d i n T a b l e 1, was f o l l o w e d b y o b s e r v a t i o n a n d p h o t o g r a p h y u s i n g a W i l d M - 20 p h o t o m i c r o s c o p e a n d K o d a c h r o m e T y p e A p r o f e s s i o n a l f i l m . P r i o r t o P . A . S . a n d F e u l g e n p r o c e d u r e s , a l l a l d e h y d e g r o u p s f o r m e d d u r i n g f i x a t i o n w e r e b l o c k e d b y t r e a t m e n t i n DIMEDONE ( F e d e r a n d O ' B r i e n , I 9 6 8 ) . C o n t r o l s u s e d w i t h t h e P . A . S . p r o c e d u r e w e r e a c e t y l a t i o n a n d s a p o n i f i c a t i o n ( C h a y e n , 1969) . S t a i n - 1 4 -T A B L E I T A B L E OF H I S T O M C H E M I C A L PROCEDURES C o m p o n e n t s I d e n t i f i e d R e f e r e n c e s P e r i o d i c A c i d / S c h i f f C a r b o h y d r a t e s , p o l y s a c c -h a r i d e s , g l y c o p r o t e i n s s t a i n r e d . A n i l i n e B l u e - B l a c k P r o t e i n s s t a i n b l u e -b l a c k F a s t G r e e n b a s i c p r o t e i n s , n u c l e o -h i s t o n e s , s t a i n g r e e n L u x o l s F a s t B l u e p h o s p h o - l i p i d s MBS s t a i n b l u e - g r e y C h a y e n , 1969 F e d e r a n d 0 ? ; B r i e n , 19 68 J e n s e n , 19^2, F i s h e r , 1968 R u t h m a n n , 1970 C l a r k , 1973 P e a r s e , 1968 N i l e B l u e A p h o s p h o l i p i d s a n d f a t t y a c i d s , s t a i n b l u e ; n e u t r a l t r i -g l y c e r i d e s , s t a i n r e d . P e a r s e , 1968 R u t h m a n n , 1970 T a i n t e r , 1971 F e u l g e n A c i d F u e h s i n DNA s t a i n s p i n k p r o t e i n s s t a i n r e d - p i n k F e d e r a n d O ' B r i e n , 1968 R o b i n o w a n d M a r a k , 1966 T o l u i d i n e B l u e A c i d i c p r o t e i n s a n d p o l y s a c c h a r i d e s , s t a i n b l u e A c i d m u c o p o l y s a c c a r d i e s , r e d N u c l e o l i , p u r p l e N u c l e i , v i o l e t F e d e r a n d O ' B r i e n , 1968 M c C u l l y , 1966 C h a m b e r l a i n a n d E v a n s , 1973 - 15 I V . R E P R O D U C T I V E DEVELOPMENT I N T H E CHOANEPHORACEAE I n t r o d u c t i o n : T h e u l t r a s t r u c t u r a l d e v e l o p m e n t o f s p o r e s i n t h e t y p i c a l l a r g e c o l u m e l l a t e s p o r a n g i u m h a s b e e n s t u d i e d i n s e v e r a l m u c o r a l e a n g e n e r a : G i l b e r t e l l a ( B r a c k e r , 1966} 1968), P h y c o m y c e s ( T u e t a l . , 1971; T u a n d M a l h o t r a , 1976), R h i z o p u s ( H a w k e r a n d A b b o t t , 1963) a n d T h a m n i d i u m ( F l e t c h e r , 1972 b , 1973)« I n t h e m e r o s p o r a n g i u m , s p o r e d e v e l o p m e n t h a s b e e n o b s e r v e d i n s p e c i e s o f P i p t o c e p h a l i s ( J e f f r i e s a n d Y o u n g , 1975). S y n c e p h a l a s t r u m ( F l e t c h e r , 1972) a n d S y n c e p h a l i s ( B a k e r e t a l . , 1977) . S p o r e s p r o d u c e d i n s i n g l e - s p o r e d s p o r a n g i o l e s o n t h e s p o r o c l a d i a o f t h e K i c k x e l l a c e a e h a v e b e e n s t u d i e d i n C o e m a n s i a ( Y o u n g , 1973). K i c k x e l l a ( Y o u n g , 1974), a n d L i n d e r i n a ( Y o u n g , 1970; B e n n y a n d A l d r i c h , 1975). S p o r e f o r m a t i o n i n f e w - s p o r e d s p o r a n g i o l e s s u c h a s i n B l a k e s l e a t r i s p o r a . o r i n m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l a s u c h a s i n C h o a n e p h o r a c u c u r b i t a r u m . h a s r e c e i v e d l i t t l e a t t e n t i o n a t t h e e l e c t r o n - m i c r o s c o p e l e v e l , t h e o n l y r e p o r t s b e i n g t h o s e o f T h a m n i d i u m s p o r a n g i o l e s b y F l e t c h e r (1972 b , 1973). - 16 S p o r e g e r m i n a t i o n s t u d i e s h a v e b e e n r e p o r t e d f o r s p o r e s f r o m l a r g e s p o r a n g i a o f M u c o r ( B a r t n i c k i - G a r c i a e t a l . , 1968), R h i z o p u s ( E k u n d a y o , 1966; B u c k l e y e t a l . , 1968; B a k e r a n d S m i t h , 1970; H e s s a n d W e b e r , 1973) a n d G i l b e r t e l l a ( B r a c k e r , 1971). G e r m i n a t i o n o f m e r o s p o r a n g i a l s p o r e s h a s b e e n s t u d i e d i n P i p t o c e p h a l i s ( J e f f r i e s a n d Y o u n g , 1976) a n d L i n d e r i n a ( Y o u n g , 1971). T h e s u r f a c e s p i n e s o n s p o r a n g i a l s t r u c t u r e s h a v e b e e n e x a m i n e d i n t h e C h o a n e p h o r a c e a e b y K a w a k a m i e t a l ; . (1956) a n d i n o t h e r f a m i l i e s o f t h e M u c o r a l e s b y Y o u n g 1968ab, 1969), B l a n d a n d C h a r l e s (1972) a n d J o n e s e t a l . (1976). O t h e r p e r t i n e n t r e p o r t s o n t h e C h o a n e p h o r a c e a e i n c l u d e s t u d i e s o f t h e n u c l e a r c y t o l o g y o f C h o a n e p h o r a ( M o r i e , 1966), c e l l w a l l c h e m i s t r y o f B l a k e s l e a ( C h e n o u d a , 1972) a n d c e l l w a l l s t r u c t u r e a n d c o m p o s t i o n o f C h o a n e p h o r a ( L e t o u r n e a u e t a l . , 1976). T h e a i m o f t h i s r e p o r t i s t o d e s c r i b e u t r a s t r u c t u r a l d e v e l o p m e n t o f s p o r e s l i n m o n o s p o r o u s , t r i s p o r o u s a n d m u l t i s p o r o u s " s p o r a n g i a " , a n d t o c o m p a r e t h e o b s e r v e d d e v e l o p m e n t w i t h t h a t r e p o r t e d f o r r e l a t e d f u n g i . - 17 A . D e v e l o p m e n t o f M o n o s p o r o u s S p o r a n g i o l e s i n C h o a n e p h o r a c u c u r b i t a r u m T h e p r o d u c t i o n o f m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s o c c u r s a t t h e s w o l l e n e n d s o f a e r i a l h y p h a e . T h e g l o b o s e s w e l l i n g , o r a m p u l l a , d e v e l o p s w e a k e n e d w a l l a r e a s w h i c h e x p a n d a s s h o r t p e g - l i k e p e d i c e l s ( F i g u r e s 1, 2 a n d 3 ) . T h e a m p u l l a s u r f a c e ( F i g u r e 4) i s r e l a t i v e l y s m o o t h a n d b e a r s no s u r f a c e s p i n e s . I n t e r n a l l y , y o u n g p e d i c e l s u s u a l l y c o n t a i n t u b u l a r s t r u c t u r e s . ( t ; F i g u r e s 5 i 6 a n d 7 ) . 25 - 50 nm i n d i a m e t e r . M i t o c h o n d r i a , n u c l e i , a n d s e v e r a l t y p e s o f c y t o p l a s m i c v e s i c l e s o c c u r i n a n d a r o u n d t h e y o u n g d e n t i c l e s ( F i g u r e s 5» 6 a n d 7 ) . T h e a m p u l l a w a l l c o n s i s t s o f o n e l a y e r , 0 .3 ,um t h i c k (AW; F i g u r e 5)- T h e p e d i c e l w a l l c o n s i s t s o f two d i s t i n c t l a y e r s ; t h e o u t e r l a y e r a p p e a r s c o n t i n u o u s w i t h t h e a m p u l l a w a l l ( F i g u r e s 5» 6 ar id 7) a n d i s 85 nm t h i c k . T h e i n n e r l a y e r a p p e a r s t o b e n e w l y s y n t h e s i z e d a t t h e p e d i c e l r e g i o n ; i t a p p e a r s e l e c t r o n t r a n s p a r e n t i n p e r m a n g a n a t e - f i x e d m a t e r i a l ( F i g u r e s 5» 6 a n d 7) a n d i s a l s o 85 nm t h i c k o n t h e p e d i c e l ( F i g u r e 7 ) . I n y o u n g p e d i c e l s ( F i g u r e 5) t h e i n n e r w a l l l a y e r i s 150-180 nm t h i c k , a n d t h i s t h i c k e r z o n e r e m a i n s v i s i b l e a t t h e b a s e o f o l d e r p e d i c e l s ( F i g u r e s 6 a n d 7 ) . - 18 -" M u l t i v e s i c u l a r " s t r u c t u r e s ( F i g u r e 7, a r r o w ) a r e s e e n i n many a r e a s o f r e p r o d u c t i v e s t r u c t u r e s . F o l l o w i n g p e d i c e l e n l a r g e m e n t , t h e p e d i c e l t i p e x p a n d s o r " i n f l a t e s " t o f o r m a s p o r a n g i o l e ( F i g u r e 8 ) . B e f o r e t h e s p o r a n g i o l e i s f u l l y e x p a n d e d , s p i n e s b e g i n t o f o r m o n i t s s u r f a c e ( F i g u r e <?)• A t t h i s s t a g e t h e e n t i r e r e p r o d u c t i v e s t r u c t u r e a p p e a r s a s i n F i g u r e 10. T h e s p o r a n g i o l e s a p p e a r a l i g h t e r c o l o u r t h a n t h e a m p u l l a e o w i n g t o d i f f e r i n g e l e c t r o n c o n d u c t i o n i n t h e s c a n n i n g E . M . T h e p r i m a r y a m p u l l a a t t h e h y p h a l e n d a p p e a r s v e r y w r i n k l e d , ( F i g u r e 11) b e c a u s e o f s h r i n k a g e d u r i n g s p e c i m e n f r e e z e - d r y i n g . S p o r a n g i o l e - b e a r i n g a m p u l l a e r e s i s t s h r i n k i n g b e c a u s e t h e y a r e l e s s v a c u o l a t e , ( F i g u r e s 11 a n d 1 2 ) . S p o r a n g i o l a r s p i n e s a r e v i s i b l e i n F i g u r e 12 b u t c a n n o t b e r e s o l v e d i n F i g u r e 13• No s p i n e s a r e v i s i b l e o n a m p u l l a e s u r f a c e s ( F i g u r e s 12 a n d 13)• O c c a s i o n a l l y a p e d i c e l s e p t u m i s e n c o u n t e r e d ( F i g u r e s 1 4 , 1 5 ) . H o w e v e r , i t s r . f u n c t i o n i s u n c l e a r a t t h i s e a r l y s t a g e o f s p o r a n g i o l e e x p a n s i o n s i n c e s e p t a l c l o s u r e o f t h e p e d i c e l d o e s n o t u s u a l l y t a k e p l a c e ( F i g u r e s 17,18'* 35) u n t i l a f t e r s p o r e w a l l s h a v e b e e n f o r . m e d ( F i g u r e 2 1 ) . - 1 9 T h e c y t o p l a s m o f t h e y o u n g s p o r a n g i o l e ( F i g u r e 16) c o n t a i n s s e v e r a l n u c l e i , n u m e r o u s m i t o c h o n d r i a , a n d t u b u l e s o f E . R. w h i c h o f t e n o c c u r n e a r n u c l e i . P o r e s a r e e v i d e n t i n n u c l e a r e n v e l o p e s ( F i g u r e 16, n e ) . N u m e r o u s t y p e s o f v e s i c l e s a n d m e m b r a n e - b o u n d i n c l u s i o n s o c c u r ( F i g u r e 16) : v e r y d a r k s t a i n i n g g r a n u l a r v e s i c l e s ( g v ) j h o m o g e n o u s v e s i c l e s ( V ) o n e o f w h i c h i i s : a s s o c i a t e d w i t h t h e n u c l e a r membrane ( F i g u r e 16, a r r o w ) ; v e s i c l e s w i t h d a r k c e n t r a l i n c l u s i o n s r e s e m b l i n g p l a n t m i c r o b o d i e ( m b ) ; a n d c o n c e n t r i c b o d i e s ( C ) . T h e y o u n g s p o r a n g i o l e i s e n c l o s e d b y a n 80 nm t h i c k w a l l , c o n t i n u o u s w i t h , a n d s t r u c t u r a l l y s i m i l a r t o , t h e o u t e r p e d i c e l w a l l . No i n n e r w a l l l a y e r i s e v i d e n t , e x c e p t i n t h e p e d i c e l ( F i g u r e 1 6 ) . S u r f a c e s p i n e s ( F i g u r e 16, S ) a r e n o t y e t a b u n d a n t . N u m e r o u s l o m a s o m e - l i k e s t r u c t u r e s o c c u r a t t h e p l a s m a m e m b r a n e , p r e s u m a b l y i n v o l v e d i n w a l l e x p a n s i o n . I n a l d e h y d e - f i x e d t i s s u e s , l a r g e l i p i d d r o p l e t s a r e p r e s e n t ( F i g u r e 1 7 , L ) b u t i n g e n e r a l t h e c y t o p l a s m i s p o o r l y p r e s e r v e d . N u m e r o u s e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t v e s i c l e s o c c u r h e r e w h i c h a r e n o t a p p a r e n t i n p e r m a n g a n a t f i x e d m a t e r i a l . T h e p e d i c e l m e a s u r e s 2 . 6 ;um l o n g a n d 1 . 2 jam i n d i a m e t e r ; i t s u p p o r t s a g l o b o s e s p o r a n g i o l e , 10 - 12 jum i n d i a m e t e r . - 20 -F i g u r e 18 s h o w s a c o m p a r i s o n o f r e l a t i v e w a l l t h i c k n e s s e s : t h e a m p u l l a w a l l ( l a r g e a r r o w ) i s 0.34 t h i c k a n d t h e s p o r a n g i o l e w a l l ( s m a l l a r r o w ) i s 0.1 urn t h i c k . When t h e s p o r a n g i o l e s h a v e e x p a n d e d ( F i g u r e 1 9 ) . w a l l f o r m a t i o n b e g i n s . T h e s p o r a n g i o l e c y t o p l a s m c o n t a i n s f r e e r i b o s o m e s (20 nm d i a m e t e r g r a n u l e s , F i g u r e 20) n e a r t h e s p o r a n g i o l e w a l l ( S W ) . A f t e r t h e s p o r e w a l l i s i n i t i a t e d , a s e p t u m ( F i g u r e 21, S ) s e a l s t h e s p o r a n g i o l e f r o m t h e p e d i c e l . T h e a m p u l l a a t t h i s s t a g e b e c o m e s i n c r e a s i n g l y v a c u l o a t e ( V ) a n d c o n t a i n s n u m e r o u s e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t v e s i c l e s ( F i g u r e 22, V e ) . T h e o u t e r s p o r e w a l l ( F i g u r e 23, 0W) i s o f v a r y i n g t h i c k n e s s , a n d t h e r e f o r e a p p e a r s r i d g e d i n m a t u r e s p o r e s . D u r i n g f o r m a t i o n o f t h e r i d g e d , d a r k - s t a i n i n g o u t e r s p o r e w a l l ( F i g u r e 25, a r r o w ) t h e t u b u l a r E . R . a p p e a r s t o b r e a k u p o r b e c o m e " b e a d e d " ( F i g u r e s 2 4 , 26 a r r o w s ) . E . R . i s o f t e n p a r a l l e l t o t h e p l a s m a membrane (PM) d u r i n g w a l l f o r m a t i o n ( F i g u r e 2 5 ) . T h e d a r k - s t a i n i n g g r a n u l a r v e s i c l e s ( G V ) a r e o f t e n i n t e r c o n n e c t e d ( F i g u r e s 2 4 , 26) a n d i n c r e a s e i n n u m b e r s d u r i n g w a l l f o r m a t i o n , u s u a l l y b e c o m i n g c o n c e n t r a t e d a l o n g t h e c e l l p e r i p h e r y ( F i g u r e 3 1 ) . 21 T h e s p o r e i n n e r w a l l l a y e r ( F i g u r e 27, IW) i s s e p a r a t e d f r o m t h e d a r k - s t a i n i n g o u t e r w a l l (OW) b y a n e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t m i d d l e l a y e r (MW). T h e s p o r a n g i o l e w a l l i s i d e n t i f i e d b y i t s s u r f a c e s p i n e s ( S W ) . T h e i n n e r m o s t w a l l ( F i g u r e s 27 - 29 i w ) i s n o t o b s e r v a b l e i n a l l s p o r e s ( F i g u r e s 20 - 32) a n d may r e p r e s e n t t h e new v e g e t a t i v e w a l l o f a g e r m i n a t i n g s p o r e a s r e p o r t e d i n M u c o r ( B a r t n i c k i - G a r c i a e t a l . , 1968) Some v a r i a t i o n i n t h e t h i c k n e s s o f s p o r e w a l l l a y e r s c a n b e n o t e d i n F i g u r e 2 8 . T h e m i d d l e l a y e r (30 ran) i s much t h i n n e r t h a n t h a t s h o w n i n F i g u r e 27, (100 nm) o r F i g u r e 29 (100 n m ) . T h e o u t e r w a l l (0W) v a r i e s , b e c a u s e o f t h e r i d g e s , f r o m 120 nm t o 300 nm i n t h i c k n e s s , w h i l e t h e i n n e r w a l l (IW) i s 130 nm t h i c k . I n some s e c t i o n s , a f o u r t h w a l l l a y e r , 4 0 nm t h i c k , i s p r e s e n t b e t w e e n t h e m i d d l e a n d i n n e r l a y e r s ( F i g u r e 29, a r r o w s ) . T h e m a t e r i a l c o m p o s i n g t h e o u t e r w a l l l a y e r a p p e a r s s i m i l a r i n t e x t u r e a n d s t a i n i n g r e a c t i o n ( F i g u r e s 2 8 , 29) t o t h e c o n t e n t s o f g r a n u l a r v e s i c l e s ( F i g u r e 2 4 , 26 g v ) . A l d e h y d e f i x a t i o n o f m a t u r e s p o r e s r e v e a l s l i t t l e c y t o p l a s m i c d e t a i l a n d s p o r e s o f t e n a p p e a r h i g h l y v a c u o l a t e ( F i g u r e 30)- I n c o n t r a s t , s p o r e s f r o m t h e same s a m p l e f i x e d i n p e r m a n g a n a t e ( F i g u r e 31, 32) show m i t o c h o n d r i a , n u c l e i , a n d p e r i p h e r a l g r a n u l a r v e s i c l e s . - 22 -T h e s p o r a n g i o l e w a l l (SW) i s c l e a r l y s e p a r a t e f r o m t h e s p o r e w a l l a n d t h e " a p i c u l a r " r e m a i n s o f t h e p e d i c e l a r e v i s i b l e ( F i g u r e 33. a r r o w ) . A s e p a r a t e s p o r a n g i o l e w a l l h a s b e e n d e m o n s t r a t e d ( G r o v e , 1976) i n C h o a n e p h o r a  c u c u r b i t a n s . ( S i n c e n o a u t h o r i t y h a s b e e n p u b l i s h e d f o r t h i s s p e c i e s , i t i s b e l i e v e d t o b e m i s n o m e r f o r C. c u c u r b i t a r u m ) . I n t h e p r e s e n t r e p o r t , a l d e h y d e f i x a t i o n o f a m p u l l a e was f o u n d t o be much m o r e s u c c e s s f u l t h a n t h a t o f s p o r e s , p r e s u m a b l y b e c a u s e o f l o w p e n e t r a b i l i t y o f t h e s p o r e w a l l s . T h e a m p u l l a e c o n t a i n d a r k - s t a i n i n g g r a n u l a r v e s i c l e s ( F i g u r e 34 g v ) , a n d a r e f i l l e d w i t h a n i n t e r c o n n e c t e d n e t w o r k o f v a c u o l e s ( V ) . T h e p e d i c e l s h o w n i n F i g u r e 34 h a s a t h i n b a s a l s e p t u m ( S ) a s s e e n i n S y n c e p h a l a s t r u m ( F l e t c h e r , 1972) b u t many p e d i c e l s a p p e a r t o f o r m o n l y a n u p p e r s e p t u m a s s h o w n i n F i g u r e 21. N u m e r o u s c r y s t a l s ( F i g u r e 35i C ) a r e f o r m e d a s v a c u o l a t i o n p r o c e e d s . A l l c r y s t a l s m e a s u r e d h a v e a l a t i c e d i m e n s i o n o f 1 4 - 15 nm ( F i g u r e s 36, 3 8 ) . T h e c r y s t a l s h o w n i n F i g u r e 38 i s i n c l o s e a s s o c i a t i o n w i t h a m i t o c h o n d r i o n (M) i n a s t a t e o f a p p a r e n t d e g e n e r a t i o n , s u g g e s t i n g i n c o r p o r a t i o n o f m i t o c h o n d r i a l p r o t e i n s i n t o l t h e c r y s t a l . - 23 T h e s u r f a c e o f a n o l d a m p u l l a , a f t e r s p o r a n g i o l e r e l e a s e , ( F i g u r e 37) b e a r s p e d i c e l r e m n a n t s a s d e n t i c l e s o r p e g s ( D ) , w i t h a t h i n p l a q u e a t t h e b a s e . T h e s p o r a n g i o l e s ( S ) s h o w n i n F i g u r e 37 a r e n o t w e l l p r e s e r v e d b e c a u s e o f p r o c e s s i n g f o r c r i t i c a l - p o i n t d r y i n g . A l t h o u g h t h i s m e t h o d p r e v e n t s c o l l a p s e o f c e l l s , f r e e z e - d r y i n g p r e s e r v e s m o r e s u r f a c e d e t a i l . I n t h e p r e s e n t s t u d y , o p t i m u m p r e s e r v a t i o n was o b t a i n e d when m a t u r e a m p u l l a - b e a r i n g s p o r a n g i o l e s ( F i g u r e s 39, 40) w e r e f r e e z e - d r i e d a f t e r t h e y h a d t u r n e d m e t a l l i c b l a c k a n d s p o r a n g i o l e s d e t a c h e d f r e e l y . T h e s p o r a n g i a l w a l l i s s o t h i n t h a t i t c o n f o r m s t o t h e r i d g e s i n t h e s p o r e w a l l a n d c a n be i d e n t i f i e d o n l y b y i t s s u r f a c e s p i n e s ( F i g u r e s 41, 4 2 ) . R i d g e s i n t h e o u t e r s p o r e w a l l l a y e r a r e c o n t i n u o u s l o n g i t u d i n a l l y , a n d do n o t s p i r a l . T h e v e r y e n d s o f t h e s p o r e s a p p e a r s m o o t h , ( F i g u r e 42), a n d no s u g g e s t i o n o f " b r i s t l e s " o r o t h e r a p p e n d a g e s c a n be s e e n i n s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o g r a p h s o r i n m i c r o g r a p h s o f s e c t i o n e d m a t e r i a l . D u r i n g t h e e x a m i n a t i o n o f m a t u r e s p o r a n g i o l e s , a n o c c a s i o n a l g e r m i n a t e d s p o r e ( F i g u r e 43) was e n c o u n t e r e d . I t was f o u n d t h a t r e m n a n t s o f t h e s p o r a n g i o l e w a l l a r e u s u a l l y a d h e r e n t t o t h e o u t e r s p o r e w a l l ( F i g u r e 44, S W ) , s u g g e s t i n g t h a t t h e " i n t a c t " s p o r a n g i o l e i s t h e u n i t o f - 2 4 -d i s e m i n a t i o n . T h e w a l l o f t h e g e r m t u b e ( G T ) h a s a d i s t i n c t i v e l a y e r e d a p p e a r a n c e ( t w ) a l t h o u g h i t i s n o t c o n t i n u o u s w i t h t h e l i g h t - s t a i n i n g i n n e r s p o r e w a l l l a y e r ( i w ) . T h e s p o r e w a l l l a y e r s a r e n o t i n v o l v e d i n t h e g e r m t u b e . T h i s i s i n t e r p r e t e d a s a t w o - l a y e r e d s p o r e w a l l : a d a r k - s t a i n i n g o u t e r w a l l a n d l i g h t -s t a i n i n g i n n e r w a l l . T h e t h i r d a n d i n n e r m o s t f i b r o u s l a y e r ( l a b e l l e d i w i n F i g u r e s 27 "to 2 9 ) i s t h e n e w l y - f o r m e d v e g e t a t i v e w a l l o f t h e g e r m t u b e ( F i g u r e 4 4 , t w ) . A s i m i l a r 3 - l a y e r e d w a l l s t r u c t u r e h a s b e e n r e p o r t e d i n g e r m i n a t i n g s p o r e s o f R h i z o p u s s p e c i e s ( B u c k l e y e t a l . , 1968) a n d i n M u c o r r o u x i i ( B a r t n i c k i - G a r c i a e t a l . , 1968) . T h i s p r o c e s s i s d i s t i n c t f r o m t h a t r e p o r t e d f o r b l a s t o c o n i d i a ( H a w k e r a n d H e n d y , 1963). C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 1 ( L M ) E a r l y a m p u l l a , s t a r t o f p e d i c e l e n l a r g e m e n t . x 730 1 0 jam b a r F i g u r e 2 ( L M ) E a r l y a m p u l l a , p e d i c e l s e n l a r g i n g . x 730 1 0 jam b a r F i g u r e 3 ( L M ) E a r l y a m p u l l a , p e d i c e l s f o r m e d , s p o r a n g i o l a r e n l a r g e m e n t j u s t s t a r t i n g . x 720 1 0 ;um b a r F i g u r e 4 ( S E M ) E a r l y a m p u l l a s u r f a c e s h o w i n g n u m b e r a n d s p a c i n g o f p e d i c e l s . x 1470 1.0 ^ m b a r F i g u r e 5 ( T E M ) S e c t i o n t h r o u g h e a r l y p e d i c e l s h o w i n g t u b u l a r e l e m e n t s ( t j a n d n u c l e u s ( N ) . ( K M n O r ) x 17 440 ' 1 .0 jam b a r F i g u r e 6 ( T E M ) T u b u l a r e l e m e n t s ( t ) a n d m i t o c h o n d r i a (m) n e a r e a r l y p e d i c e l f o r m a t i o n . (KMnO^) x 13 230 1.0 jam b a r F i g u r e 7 ( T E M ) W a l l l a y e r s o f e a r l y p e d i c e l . A r r o w i n d i c a t e s c o n c e n t r i c membrane b o d y . x 2 4 450 (KMnO^) 1.0 jum b a r - 27 C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 8 ( L M ) A m p u l l a b e a r i n g y o u n g s p o r a n g i o l e s . x 850 10 ..um b a r F i g u r e 9 ( T E M ) S e c t i o n t h r o u g h y o u n g s p o r a n g i o l e a n d i t s p e d i c e l . x 4530 1.0 ;um b a r F i g u r e 10 ( S E M ) S p o r a n g i o l a r h e a d , s h o w i n g p r i m a r y a m p u l l a a n d s p o r a n g i o l e - b e a r i n g a m p u l l a e . x 150 10 >um b a r F i g u r e 11 ( S E M ) D i c h o t o m o u s b r a n c h i n g o f s p o r a n g i o l o p h o r e s . x 427 10 ^ m b a r F i g u r e 12 ( S E M ) Y o u n g s p o r a n g i o l e s , some b e a r i n g s h o r t s p i n e s . x 1625 10 u^m b a r F i g u r e 13 ( S E M ) Y o u n g s p o r a n g i o l e a n d a m p u l l a s u r f a c e . x 7150 1.0 }im b a r F i g u r e 14 ( T E M ) S e c t i o n t h r o u g h y o u n g p e d i c e l . ( G l u t . / O s . ) x 12 130 1.0 jam b a r F i g u r e 15 ( T E M ) S e p t u m i n m a t u r e p e d i c e l . ( G l u t . / O s . ) x 13 230 1.0 jum b a r - 29 C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 1 6 ( T E M ) C o m p o s i t e o f y o u n g m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s h o w i n g n u c l e i (N) m i t o c h o n d r i a (M) a n d e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m (ER). Y o u n g s p i n e s (S) h a v e a l r e a d y f o r m e d o n t h e w a l l e x t e r i o r , a n d s e v e r a l t y p e s o f v e s i c l e s ( V ) o c c u r i n t h e c y t o p l a s m . (KMnO^) x 12 9^5 1. 0 ;um b a r — 30 -- 3 1 -C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 17 ( T E M ) Y o u n g s p o r a n g i o l e s s h o w i n g l i p i d ( L ) p r e s e r v e d b y a l d e h y d e f i x a t i o n . x 3750 ( G l u t . - A c . / O s . ) 10 jam b a r F i g u r e 18 ( T E M ) C o m p a r i s o n o f w a l l t h i c k n e s s e s o f s p o r a n g i o l e ( S m a l l a r r o w ) a n d a m p u l l a ( l a r g e a r r o w ) . N o t e h i g h l i p i d a n d m i t o c h o n d r i a l c o n t e n t o f a m p u l l a c y t o p l a s m . x 7 3 8 0 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 . 0 jam b a r - 33 C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 19 ( L M ) M a t u r i n g s p o r a n g i o l e s . x 835 10 jum b a r F i g u r e 20 ( T E M ) H i g h m a g n i f i c a t i o n o f s i n g l e -l a y e r e d s p o r a n g i o l a r w a l l a n d a s p i n e . ( G l u t . / K M n O ^ ) x 93 950 0.1 jum b a r F i g u r e 21 ( T E M ) S e c t i o n t h r o u g h m a t u r i n g s p o r a n g i o l e . P e d i c e l w a l l (PW; a n d s p o r a n g i o l e w a l l (SW) a r e c o n t i n u o u s b u t d e l i m i t e d b y t h e s e p t u m ( S ) . (KMnO^,) x 12 100 1. 0 jum b a r F i g u r e 22 ( T E M ) S e c t i o n t h r o u g h a m p u l l a s h o w i n g i n c r e a s e d v a c u o l a t i o n ( V ) a n d h i g h n u m b e r s o f l o w d e n s i t y v e s i c l e s ( V ) . ( G l u t . / K M n 0 4 ) x 3755 1 0 jum b a r F i g u r e 23 ( T E M ) C o m p a r i s o n o f a m p u l l a w a l l (AW) a n d s p o r a n g i o l a r w a l l (SW) a t t h e t i m e o f s p o r e w a l l i n i t i a t i o n . N o t e s t a r t o f c o r r u g a t i o n o f s p o r e s u r f a c e j u s t i n s i d e t h e S . W . x 12 9^0 (KMnO^) 1 .0 jum b a r 35 C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 24 ( T E M ) M a t u r i n g m u l t i n u c l e a t e ( N ) s p o r e . A r r o w s i n d i c a t e " b e a d e d " E R . (KMnO^) x 7885 1 . 0 jam b a r F i g u r e 25 ( T E M ) S p o r e w a l l ( a r r o w ) i n s i d e s p o r a n g i o l e w a l l . x 28 295 (KMnO^) 1 . 0 jum b a r F i g u r e d 6 ( T E M ) C y t o p l a s m o f m a t u r i n g s p o r e s h o w i n g n u c l e i ( N ) a n d " b e a d e d " E R . ( a r r o w ) x 7920 (KMnO^) 1 . 0 ' jam b a r F i g u r e 27 ( T E M ) W a l l l a y e r s , i n n e r ( I W ) , m i d d l e (MW), a n d o u t e r (OW) o f m a t u r e s p o r e a s s e e n a f t e r a l d e h y d e f i x a t i o n . S p o r a n g i o l a r w a l l (SW) i s i d e n t i f i e d b y i t s s p i n e s . x 1 4 030 ( G l u t . / O s . ) 1 . 0 jam b a r F i g u r e 28 ( T E M ) S p o r e w a l l l a y e r s i n s i d e s p o r a n g i o l e ( S W ) . C o r r u g a t i o n s a r e f o r m e d i n o u t e r l a y e r o n l y . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 41 0 0 0 1 . 0 jum b a r F i g u r e 29 ( T E M ) H i g h m a g n i f i c a t i o n o f F i g u r e 27 . A t h i n f o u r t h w a l l l a y e r may be i n d i c a t e d b e t w e e n t h e i n n e r a n d m i d d l e l a y e r s ( a r r o w s ) ( G l u t . - A c . / 0 s . ) x 51 8 0 0 1. 0 jam b a r - 37 C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 30 ( T E M ) M a t u r e r e l e a s e d m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s . x 11 700 1 . 0 um b a r ( G l u t o/0s, ) F i g u r e 31 ( T E M ) H i g h m a g n i f i c a t i o n o f s p o r e w a l l l a y e r s i n s i d e r e l e a s e d s p o r a n g i o l e . M i d d l e w a l l l a y e r i s n o t s e e n a f t e r p e r m a n a g a n a t e f i x a t i o n , x kl 000 (KMnO^) 0.2 um b a r F i g u r e 32 ( T E M ) C y t o p l a s m o f m u l t i n u c l e a t e s p o r a n g i o s p o r e . x 14 200 (KMnO^) l . o jam b a r F i g u r e 33 ( T E M ) R e m a i n s o f p e d i c e l ( a r r o w ) a f t e r s p o r a n g i o l e r e l e a s e . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 29 8 0 0 1. 0 jum b a r - 39 C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 3k ( T E M ) V a c u o l a t e a m p u l l a f o l l o w i n g s p o r a n g i o l e r e l e a s e P e d i c e l r e m n a n t s a r e d e n t i c u l a r . ( D ) (KMnO^) x 11 700 1.0 .". jum b a r F i g u r e 35 ( T E M ) C r y s t a l s i n h i g h l y v a c u o l a t e a m p u l l a . x 11 300 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 .0 ^im b a r F i g u r e 36 ( T E M ) H i g h m a g n i f i c a t i o n o f a t y p i c a l c r y s t a l i n o l d a m p u l l a e , x 36 888 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 .0 .jum b a r F i g u r e 37 ( S E M ) S u r f a c e v i e w o f o l d a m p u l l a s h o w i n g d e n t i c u l a r r e m n a n t s o f p e d i c e l s . E a c h d e n t i c l e h a s a r a i s e d p l a q u e a t i t s b a s e . ( S p o r a n g i o l e s ( S ) a r e n o t w e l l p r e s e r v e d i n t h i s p r e p a r a t i o n . ) x 3^30 2 . 0 ,um b a r F i g u r e 38 ( T E M ) C r y s t a l a s s o c i a t e d w i t h m i t o c h o n d r i a l m e m b r a n e s ( M ) . r ( G l u t . - A c . / O s . ) x 89 800 0.1 jum b a r 41 C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 39 ( S E M ) M a t u r e s p o r a n g i o l a r h e a d . S p o r a n g i o l e s c l o s e l y r e s e m b l e c o n i d i a . x 850 10 /j.m b a r F i g u r e 4 0 ( S E M ) P r i m a r y s w e l l i n g o f s p o r a n g -i o l o p h o r e s u r r o u n d e d b y a m p u l l a e a n d t h e i r a t t a c h e d m o n o s p o r o u s s p o r a n g -i o l e s . x 925 10 p.m b a r F i g u r e 4 l ( S E M ) S p o r e i n s i d e s p o r a n g i o l e a s i n d i c a t e d b y s u r f a c e s p i n e s . S p o r e w a l l c o r r u g a t i o n s a r e b e n e a t h t h e t h i n s p o r a n g i o l e w a l l . x 5750 1. 0 ;um b a r F i g u r e 42 ( S E M ) E n d v i e w o f m a t u r e s p o r a n g -i o l e s . I n d r i e d s p e c i m e n s t h e s p i n y s p o r a n g i o l e w a l l c o l l a p s e s a g a i n s t , a n d c o n f o r m s t o t h e c o r r u g a t e d s p o r e w a l l . x 5^50 1. 0 ;am b a r F i g u r e 43. ( T E M ) G e r m i n a t i n g s p o r a n g i o s p o r e . ( S P ) . G e r m t u b e ( G T ) w a l l i s f o r m e d i n s i d e t h e o l d s p o r e w a l l . x 6620 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 . 0 jim b a r F i g u r e 44 ( T E M ) W a l l l a y e r s o f n e w l y g e r m i n a t e d s p o r e . T h e g e r m t u b e w a l l ( T E ) i s s t r u c t u r a l l y d i s t i n c t f r o m t h e s p o r e w a l l l a y e r s ( I S , MW, 0W) a n d f r o m t h e s p o r a n g i o l e w a l l ( S W ) . ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 . 0 jum b a r * 3 B . D e v e l o p m e n t o f M u l t i s p . o r o u s S p o r a n g i o l e s i n C h o a n e p h o r a c u c u r b i t a r u m T h e p r o d u c t i o n o f t y p i c a l m u c o r a l e a n s p o r a n g i a ( F i g u r e 45) o c c u r s p r i m a r i l y a t l o w e r l e v e l s o f t h e a e r i a l m y c e l u m r a t h e r t h a n n e a r t h e m o n o s p o r a u s " c o n i d i a l " h e a d s . T h e l a r g e m u l t i s p o r o u s , c o l u m e l l a t e s p o r a n g i a a r e b o r n e c i r c i n a t e l y o n u n b r a n c h e d s p o r a n g i o p h o r e s . A t m a t u r i t y t h e y o p e n b y means o f a c i r c u m s c r i b e d " s u t u r e " l i n e o f w e a k n e s s ( F i g u r e 46) i n t o two h a l v e s r e s e m b l i n g a c l a m s h e l l . S p o r a n g i a v a r y i n s i z e f r o m 70 - 120 urn d i a m e t e r . T h e y o u n g s p o r a n g i u m c o n t a i n s h u n d r e d o f n u c l e i , ( t h e s p o r a n g i u m s h o w n i n F i g u r e 47 c o n t a i n s a l m o s t 100 n u c l e i i n a s i n g l e 1 - 2 ;um s e c t i o n ) . T h e c y t o p l a s m c o n t a i n s n u m e r o u s v e s i c l e s i n c l u d i n g m u l t i v e s i c u l a r b o d i e s ( F i g u r e 48, MV) a n d m i c r o b o d i e s ( M o l l e n h a u e r e t a l . , 1966) , a n d t h e w a l l i s c o v e r e d w i t h s p i n e s ( F i g u r e s 48, 49, 5 0 ) . T h e s u t u r e l i n e - 44 a p p e a r s i n c r o s s - s e c t i o n a s a n i n t e r n a l t h i c k e n i n g ( F i g u r e 48, a r r o w ) . S m a l l v e s i c l e s ( V ) a r e c o m m o n l y a b u n d a n t n e a r t h e s p o r a n g i u m w a l l ( F i g u r e 48, 4 9 ) . V e s i c l e s w h i c h c o n t a i n a s i n g l e s m a l l e r v e s i c l e ( F i g u r e 49, V V ) may f o r m l o m a s o m e - l i k e s t r u c t u r e s ( F i g u r e 49, a r r o w ) u p o n f u s i o n w i t h t h e p l a s m a m e m b r a n e , ( F i g u r e 49, d o u b l e a r r o w s ) . V e s i c l e s c o n t a i n i n g c o n v o l u t e d m e m b r a n e s a r e a l s o n o t e d n e a r t h e s p o r a n g i a l p l a s m a m e m b r a n e v (F i g u r e 5°> a r r o w ) , b u t n o n e a r e s e e n a c t u a l l y f u s i n g w i t h t h i s m e m b r a n e . I n a l d e h y d e - f i x e d s p o r a n g i a , n u m e r o u s l i p i d d r o p l e t s a r e a p p a r e n t ( F i g u r e 51» L ) » a n d t h e c y t o p l a s m c o n t a i n s f r e e r i b o s o m e s a n d e n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( F i g u r e 5 2 ) . N u c l e i w i t h e n v e l o p e p o r e s ( F i g u r e 52, N ) a r e a b u n d a n t b u t n o t c l e a r l y i n t e r c o n n e c t e d a s i n G i l b e r t e l l a ( B r a c k e r , 1968) . D a r k - s t a i n i n g g r a n u l a r v e s i c l e s ( G V ) a r e a l s o n u m e r o u s . I n c o m p a r i n g F i g u r e 51 ( a l d e h y d e - f i x e d ) w i t h F i g u r e 54 ( p e r m a n g a n a t e - f i x e d ) t h e s i m i l a r i t y i n s i z e a n d n u m b e r s o f l i p i d d r o p l e t s a n d g r a n u l a r v e s i c l e s - 45 -i s a p p a r e n t . H o w e v e r , i f t h e s e s t r u c t u r e s a r e i d e n t i c a l , t h e p r e s e n c e o f a b o u n d i n g membrane a r o u n d g r a n u l a r v e s i c l e s ( F i g u r e 5^» a r r o w s ) m u s t be e x p l a i n e d . T h e s u t u r e a r e a ( F i g u r e 53) c o n t a i n s c o n v o l u t e d membrane b o d i e s a n d i n l a t e r s t a g e s ( F i g u r e 55) m e m b r a n e s a p p e a r i n a d i s t i n c t c y t o p l a s m i c z o n e i m m e d i a t e l y b e n e a t h t h e s u t u r e ( F i g u r e 55» a r r o w s ) . T h i s s u t u r e z o n e ( S h o w n a t h i g h e r m a g n i f i c a t i o n i n F i g u r e 56) i s l o c a t e d o u t s i d e t h e s p o r a n g i a l p l a s m a m e m b r a n e , ( F i g u r e 56 p m ) , a n d i n s i d e t h e s p o r a n g i a l w a l l ( S W ) . A s s i m i l a r z o n e c o n t a i n s t u b u l e s ( F i g u r e 57» "t)> h u t t h e m a t r i x i s m o r e h o m o g e n o u s a n d " b l e b b i n g " o f t h e membrane i s o b s e r v a b l e ( b l ) . T h e j u n c t i o n o f t h e s p o r a n g i o p h o r e w i t h t h e s p o r a n g i u m ( F i g u r e 58) c o n s i s t s o f a r i n g o f w a l l t h i c k e n i n g ( w t ) s i m i l a r t o t h e s u t u r e l i n e . T h e s p o r a n g i o p h o r e i s h i g h l y v a c u o l a t e ( V ) b u t t h e c o l u m e l l a i s n o t y e t d i s t i n g u i s h a b l e . L o m a s o m e s ( W i l s e n a c h a n d K e s s e l , 1 9 6 5 ; M a r c h a n t a n d R o b a r d s , 1968; M a r c h a n t a n d M o o r e , 1973) o c c u r a t t h e s p o r a n g i a l w a l l a n d f r e e r i b o s o m e s a r e o b s e r v e d i n t h e c y t o p l a s m ( F i g u r e s 59 a n d 6 0 ) . - 46 ¥. S u r f a c e s p i n e s o n s p o r a n g i a a t t a i n h e i g h t s o f 0.5 - O .75 jam a n d b a s a l d i a m e t e r s o f 0.25 - 0.4 jam. I n l o n g s e c t i o n a t y p i c a l s p i n e c o n s i s t s o f a t h i c k o u t e r l a y e r c o n t i n u o u s w i t h t h e s p o r a n g i a l w a l l a n d a n i r r e g u l a r t h i n i n n e r l a y e r ( F i g u r e s 61, 6 3 ) . I n t i s s u e s f i x e d i n g l u t a r a l d e h y d e - a c r o l e i n , l a m e l l a r b o d i e s ( F i g u r e 62 L B ) a r e n o t e d i n s p o r a n g i a l w a l l s ( S W ) . E a c h l a m e l l a r b o d y c o n s i s t s o f a s t a c k o f d a r k - s t a i n i n g p l a t e s , 20 - 50 nm l o n g a n d a p p r o x i m a t e l y 1 . 0 nm t h i c k . F i g u r e 65 s h o w s e d g e v i e w s ( s m a l l a r r o w s a n d s u r f a c e v i e w s ( l a r g e a r r o w s ) o f t h e s e c y s t a l o i d b o d i e s . A t l o w e r m a g n i f i c a t i o n , a w a l l c o n t a i n i n g n u m e r o u s p l a t e s a p p e a r s a s a f i b r o u s m a t r i x ( F i g u r e 65 F M ) . P l a t e s a r e n o t d e t e c t e d i n t h e c y t o p l a s m b u t o c c u r j u s t o u t s i d e t h e p l a s m a m e m b r a n e , ( F i g u r e 64, d o u b l e a r r o w s ) , i n t h e w a l l a n d i n f o r m i n g s p i n e s ( F i g u r e 64, s i n g l e a r r o w s ) . I n c r o s s - s e c t i o n s p i n e s a p p e a r a s h o l l o w t u b e s ( F i g u r e 66). T h e i n t e r i o r c h a m b e r s o f s p i n e s h a v e f l a t b a s e s ( b ) w h i c h a r e r e c e s s e d - 47 -i n t o t h e s p o r a n g i a l w a l l 10 - 20 nm ( F i g u r e s 67, 68, 6 9 ) . L a m e l l a r b o d i e s a r e i n c o r p o r a t e d i n t o s p i n e s t r u c t u r e a l o n g t h e e n t i r e s p i n e l e n g t h ( F i g u r e 67, a r r o w s ) . T h e c r y s t a l o i d p l a t e s a p p e a r t o be i n c o r p o r a t e d i n t o t h e o u t e r s p i n e l a y e r f r o m t h e i n s i d e , a n d may t r a v e l i n t h e c h a n n e l b e t w e e n t h e two s p i n e w a l l l a y e r s ( F i g u r e s 67, 68 c h ) . Some s p i n e s c o n t a i n a p l a t e - l i k e s e c t i o n a l i z e d i n t e r i o r ( F i g u r e 69, p ) w h i l e o t h e r s h a v e f l a r e d t o p s ( F i g u r e s 68, 7 0 ) . C l e a v a g e o f s p o r a n g i a l c y t o p l a s m i n t o p r o s p o r e s i s a c c o m p l i s h e d b y a i m e t w o r k o f v a c u o l e s ( F i g u r e 71) c a l l e d t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s ( B r a c k e r , 1968) . T h e c o l u m e l l a i s a l s o d e l i m i t e d b y t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s ( F i g u r e 72 a r r o w s ) a b o v e t h e s p o r a n g i u m - s p o r a n g i o p h o r e ( S P ) j u n c t i o n . F i g u r e 73 s h o w s a l a r g e v a c u o l e o f t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s . D u r i n g c l e a v a g e t h e a p p a r a t u s i s e n l a r g e d b y f u s i o n w i t h s m a l l e r v e s i c l e s ( V ) , a n d i n t h e p r o c e s s , some s m a l l a r e a s o f c y t o p l a s m a r e c u t o f f ^ f r o m p r o s p o r e c y t o p l a s m a n d t h e o r g a n e l l e s - 48 a r e e m p t i e d i n t o t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s ( F i g u r e 73)-N e a r t h e s p o r a n g i u m w a l l , t h e c l e a v a g e v a c u o l e s do n o t i m m e d i a t e l y i n c o r p o r a t e t h e p l a s m a m e m b r a n e , b u t l e a v e a t h i n z o n e o f p e r i p h e r a l c y t o p l a s m ( F i g u r e 7 4 , P C ) a s r e p o r t e d i n G i l b e r t e l l a ( B r a c k e r , 1 9 6 8 ) . S e v e r a l v a r i a t i o n s o f c l e a v a g e may o c c u r w i t h i n t h e same s p o r a n g i u m : ( a ) f o r m a t i o n o f c l e a v a g e c h a n n e l ( F i g u r e 75 a r r o w s ) ( b ) e x p a n s i o n o f t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s t o w a r d s t h e s p o r a n g i a l p l a s m a membrane ( F i g u r e 76) a n d ( c ) i n t r u s i o n o f t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s i n t o t h e c y t o p l a s m f r o m a l l s i d e s ( F i g u r e s 78, 79. 8 0 ) . F i g u r e 79 i s a < l o w - m a g n i f i c a t i o n m i c r o g r a p h s h o w i n g a s p o r a n g i u m w i t h i t s c l e a v a g e a p p a r a t u s n e a r m i d - c l e a v a g e s t a g e . T h e c l e a v a g e a p p a r a t u s c o n t a i n s many s m a l l c y t o p l a s m i c r e m n a n t s , ( F i g u r e 7 8 , C R ) , p r e s u m a b l y e x c l u d e d f r o m p r o s p o r e s when c l e a v a g e c h a n n e l s f o r m e d a r o u n d t h e m ( F i g u r e 8 1 , s i n g l e a r r o w ) o r b y c h a n n e l s w i t h n o a p p a r e n t f u n c t i o n ( F i g u r e 8 1 , d o u b l e a r r o w ) . T h e c l e a v a g e membrane i s n o t a l w a y s - 49 -e v i d e n t ( F i g u r e s 8 0 , 8 1 ) b u t i t s f i b r o u s c o a t i n g i s e v i d e n t i n F i g u r e 82. B r a c k e r (1968) r e p o r t e d t h a t t h i s c o a t i n g i s f o r m e d b y f u s i o n o f s u r f a c e g r a n u l e s . T h e f i b r o u s c o a t t h e n b e c o m e s d o u b l e -l a y e r e d ( F i g u r e s 83 a n d 88, a r r o w s ) a n d e v e n t u a l l y f o r m s t h e o u t e r m o s t w a l l l a y e r . A t t h e s p o r a n g i u m w a l l , i n t e r d i g i t a t i o n o f t h e p l a s m a (pm) a n d c l e a v a g e m e m b r a n e s ( c m ) i s o b s e r v e d ( F i g u r e s 8 4 a n d 8 5 ) . R i b o s o m e - s i z e d g r a n u l e s ( F i g u r e 85, a r r o w ) a r e d i s c e r n i b l e o n t h e i n s i d e o f t h e c l e a v a g e m e m b r a n e . T h e s e g r a n u l e s h a v e n o t f o r m e d i n t o a f i b r o u s l a y e r b e c a u s e f u s i o n o f s p o r a n g i o l e a n d c l e a v a g e m e m b r a n e s o c c u r s much l a t e r i n t h e c l e a v a g e p r o c e s s . S i m i l a r f u s i o n o f m e m b r a n e s was d e s c r i b e d i n S a p r o l e g n i a b y G a y a n d G r e e n w o o d (1966). G r a n u l e s o n c l e a v a g e m e m b r a n e s a r e i n d i s t i n c t d u r i n g e a r l y s t a g e s a n d c a n n o t s e r v e a s d i a g n o s t i c m a r k e r s a s was p o s s i b l e i n G i l b e r t e l l a ( B r a c k e r , 1968) a n d T h a m n i d i u m ( F l e t c h e r , 1973) - 50 N e a r t h e c o m p l e t i o n o f c l e a v a g e , s p o r e s a r e m u l t i n u c l e a t e ( F i g u r e 86) a n d a r e b o u n d e d b y t h e c l e a v a g e membrane a n d i t s c o a t i n g ( F i g u r e 88, a r r o w ) . P r o s p o r e s a r e c o n n e c t e d b y b r i d g e s a s r e p o r t e d b y M o r e a u (1913). I n s i d e t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s , c u r v e d m e m b r a n o u s s t r u c t u r e s a p p e a r ( F i g u r e 86 a r r o w s ) ; t h e i r o r i g i n h a s n o t b e e n d e t e r m i n e d , b u t t h e i r f u n c t i o n i s i n v o l v e d w i t h a p p e n d a g e f o r m a t i o n f o l l o w i n g s p o r e w a l l s y n t h e s i s . T h e s e s t r u c t u r e s e x i s t i n b o t h s t r a i g h t a n d c u r l e d c o n f i g u r a t i o n s ( F i g u r e 8 9 ) . T h e s e may r e p r e s e n t two s t a g e s o f p r o d u c t i o n o r two p l a n e s o f s e c t i o n i n g . I t h a s n o t b e e n p o s s i b l e t o d e t e r m i n e w h i c h a l t e r n a t i v e i s c o r r e c t . T h e s e a p p e n d a g e p r e c u r s o r s a r e m e m b r a n o u s s h e e t s , 60 nm t h i c k a n d 1 - 2 jam l o n g . T h e i n s i d e c u r v e d s u r f a c e h a s a d e n s e r s t a i n i n g l a y e r , a p p r o x i m a t e l y 10 nm t h i c k ; ( F i g u r e 90, a r r o w s ) . A t t h i s s t a g e o f c l e a v a g e t h e s p o r a n g i u m a p p e a r s a s s h o w n i n F i g u r e 91• T h e s p o r e s h a v e no w a l l s ( F i g u r e 92 S P ) b u t t h e c o l u m e l l a w a l l h a s f o r m e d ( F i g u r e 92 CW) a n d i s u p t o 0.1 um t h i c k . T h e c o l u m e l l a c y t o p l a s m c o n t a i n s much l i p i d ( F i g u r e 93 L ) a n d h a s n o t y e t b e c o m e v a c u o l a t e . A f e u l g e n - s t a i n e d s p o r a n g i u m s h o w s t h e m u l t i n u c l e a t e c o n d i t i o n o f s p o r e s 51 a n d c o l u m e l l a ( F i g u r e 9^) . A s s p o r e w a l l s a r e f o r m e d t h e c o l u m e l l a c y t o p l a s m l-becomes f i l l e d w i t h s m a l l , e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t v e s i c l e s , s e e n i n b o t h a l d e h y d e ( F i g u r e 95 a n d p e r m a n g a n a t e - f i x e d m a t e r i a l F i g u r e 9 6 ) . E R b e c o m e s c o n c e n t r a t e d a t t h e c o l u m e l l a p e r i p h e r y ( F i g u r e 9 6 ) . F i g u r e 97 s h o w s t y p i c a l s p o r e c y t o p l a s m d u r i n g s p o r e w a l l f o r m a t i o n . N u c l e i t e n d t o b e c e n t r a l l y l o c a t e d , m i t o c h o n d r i a c o n c e n t r a t e p e r i p h e r a l l y , a n d d a r k - s t a i n i n g g r a n u l a r v e s i c l e s a r e s c a t t e r e d t h r o u g h o u t t h e c e l l . S h o r t p i e c e s o f t u b u l a r ER a r e c o n c e n t r a t e d j u s t i n s i d e t h e p l a s m a membrane ( F i g u r e s 98 a n d 99» a r r o w s ) , b u t t h e t o t a l ER c o n t e n t i s l o w i n s p o r e s . T h e o u t e r , d a r k - s t a i n i n g w a l l l a y e r (OW) i s s h o w n i n F i g u r e 98 a n d t h e e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t m i d d l e l a y e r (MW) i s a l s o p r e s e n t ( F i g u r e 9 9 ) . T h e o u t e r w a l l c o n s i s t s o f two s u b - l a y e r s . T h e o u t e r o f t h e s e s u b l a y e r s f o r m s t h e r i d g e s ( F i g u r e 9 9 ,0Wa) a n d t h e i n n e r ( O W b ) , a l e s s d e n s e l y s t a i n i n g s u b l a y e r , f o r m s t h e o u t e r w a l l i n t h e d e p r e s s i o n s b e t w e e n t h e r i d g e s . 52 T h e c l e a v a g e a p p a r a t u s ( C A ) i s now f u l l o f m e m b r a n o u s r e m n a n t s ( F i g u r e 1 0 0 ) . A n a l d e h y d e -f i x e d s p o r e ( F i g u r e 1 0 1 ) s h o w s two w a l l l a y e r s s i m i l a r t o t h o s e o f p e r m a n g a n a t e - f i x e d s p o r e s ( F i g u r e s 98, 9 9 ) . A t h i r d , i n n e r m o s t w a l l l a y e r was o b s e r v e d i n some s p o r e s . I t s t a i n s w i t h a m e d i u m d e n s i t y , m i d w a y b e t w e e n t h e d a r k o u t e r l a y e r a n d t h e l i g h t i n n e r ( i w ) l a y e r . D u r i n g p r o d u c t i o n o f t h e t h i r d w a l l l a y e r , a l m o s t a l l g r a n u l a r v e s i c l e s m i g r a t e t o t h e s p o r e p l a s m a membrane ( F i g u r e s 1 0 2 , 103) a n d a r e s e p a r a t e d f r o m i t b y s h o r t l e n g t h s o f t u b u l a r E R , ( F i g u r e 1 0 3 ) . T h e t h i r d w a l l ' l a y e r , l i k e t h e o u t e r l a y e r , i s c o m p o s e d o f two s u b l a y e r s . T h e m a i n s u b l a y e r i s a d j a c e n t t o t h e p l a s m a membrane ( d o u b l e a r r o w a n d i s 60 - 70 nm i n t h i c k n e s s . T h e o u t e r m o s t s u b l a y e r ( F i g u r e 1 0 2 , s i n g l e a r r o w ) s t a i n s s l i g h t l y d a r k e r a n d i s 20 - 30 nm t h i c k . F i g u r e 1 0 4 s h o w s a l l w a l l l a y e r s o b s e r v e d i n m a t u r e s p o r e s . 53 T h e t h i r d l a y e r may r e p r e s e n t a v e g e t a t i v e " g e r m i n a t i o n w a l l " a s p r e v i o u s l y n o t e d i n s p o r a n g i o l o s p o r e s . S p o r e s w i t h m u l t i p l e w a l l s u b l a y e r s a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 105. A l t h o u g h t h e s e s p o r e s a r e s t i l l w i t h i n t h e i r s p o r a n g i u m , t h e m u l t i l a y e r e d w a l l c l o s e l y r e s e m b l e s t h e v e g e t a t i v e w a l l o f g e r m i n a t e d s p o r e s ( F i g u r e 4 4 , t w ) . T h i s w a l l c o n s i s t s o f a t l e a s t s e v e n s u b l a y e r s ( F i g u r e 106, a t o g ) a n d p r e s u m a b l y r e p r e s e n t s s p o r e s w h i c h h a v e b e e n t r i g g e r e d t o p r o d u c e a g e r m t u b e i n n e r w a l l . ( S i n c e t h e s e m u l t i p l e w a l l l a y e r s h a v e b e e n e n c o u n t e r e d o n l y o n c e , t h e y a r e c o n s i d e r e d a t y p i c a l o f m a t u r e s p o r e s . F o l l o w i n g p r o d u c t i o n o f t h e i n n e r w a l l , s p o r e s a c q u i r e t h e i r b r i s t l e - l i k e a p p e n d a g e s ( F i g u r e 107, A ) . T h e s e a r e a s s e m b l e d f r o m t h e m e m b r a n o u s e l e m e n t s i n t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s , w h i c h now f o r m s t h e e x t r a c e l l u l a r s p a c e s b e t w e e n s p o r e s . T h e b r i s t l e s a r e , a t f i r s t , s h o r t m e m b r a n e s a t t a c h e d t o t h e o u t e r s p o r e w a l l s a t e i t h e r e n d o f t h e s p o r e ( F i g u r e 1 0 8 , A ) b u t r a p i d l y b e c o m e l o n g e r ( F i g u r e 109) a s m o r e membrane i s a t t a c h e d . - 54 T h e m e t h o d o f a t t a c h m e n t i s d i f f i c u l t t o d e t e r m i n e , s i n c e n o d i s t i n c t s t r u c t u r e s e x i s t a n d t h e o u t e r w a l l a t e a c h s p o r e e n d d o e s n o t a p p e a r t o be s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m e l s e h w h e r e o n t h e s p o r e , ( F i g u r e 1 10) . M a t u r e a p p e n d a g e s a r e n o t s t i f f a n d e r e c t w h i l e w i t h i n t h e s p o r a n g i u m ( F i g u r e 111). When p l a c e d i n w a t e r t h e m e m b r a n o u s a p p e n d a g e s become e x t e n d e d a s s t r a i g h t s t i f f b r i s t l e s . F i g u r e 112 shows a p p e n d a g e s i n l o n g - s e c t i o n ( s i n g l e a r r o w ) a n d f a c e - v i e w ( d o u b l e a r r o w ) . B u t l e r e t a l . , ( i 9 6 0 ) d e m o n s t r a t e d l o n g i t u d i n a l r i d g e s i n t h e r i b b o n - l i k e a p p e n d a g e s o f G i l b e r t e l l a . T h e m a t u r e s p o r a n g i u m , b o r n e c i r c i n a t e l y o n t h e s p o r a n g i o p h o r e ( F i g u r e 113) i s c o v e r e d w i t h s m a l l s p i n e s ( F i g u r e 115) a n d d i s p l a y e s a p r o m i n e n t s u t u r e l i n e ( F i g u r e 1 1 4 ) . F r e e z e d r y i n g c a u s e s s p o r a n g i a t o s h r i n k s l i g h t l y , w h i l e t h e t h i c k e r w a l l o f t h e s u t u r e " h o o p " r e m a i n n e a r n o r m a l i n s i z e . T h i s p r o b a b l y r e p r e s e n t s t h e m e t h o d o f d e h i s c e n c e i n n a t u r e : u n d e r d r y c o n d i t i o n s f u r t h e r s h r i n k a g e c a u s e s t h e t h i n s p o r a n g i u m w a l l t o t e a r away f r o m t h e t h i c k e r s u t u r e w a l l . U n d e r wet c o n d i t i o n s , - 55 h y g r o s c o p i c e x p a n s i o n o f s p o r a n g i a l c o n t e n t s ( b r i s t l e s a n d i n t e r s p o r e m u c o u s ) b u r s t t h e s p o r a n g i u m o p e n a l o n g t h e s u t u r e l i n e ( I n g o l d , 1971). I n ' ' o t h e r m u c o r a c e o u s f u n g i s u c h a s T h a m n i d i u m ( F l e t c h e r , 1973) t h e s p o r a n g i a l w a l l d i s i n t e g r a t e s r a t h e r t h a n d e h i s c e s . U n l i k e s p o r a n g i a l w a l l s i n G i l b e r t e l l a ( B r a c k e r , 1968) a n d ' " T h a m n i d i u m ( F l e t c h e r , 1973). t h e w a l l o f C h o a n e p h o r a d o e s n o t become a p p r e c i a b l y t h i n n e r a t m a t u r i t y ; ( c o m p a r e F i g u r e s 52 a n d 1 0 8 w h i c h a r e t h e same m a g n i f i c a t i o n ) . - 56 C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 45 ( S E M ) M u l t i - s p o r e c o l u m e l l a t e s p o r a n g i a . x 350 F i g u r e 46 ( S E M ) G r o o v e - l i k e s u t u r e a l o n g w h i c h d e h i s c e n c e w i l l o c c u r . x ?00 F i g u r e 47 ( L M ) F e u l g e n - s t a i n e d n u c l e i o f s p o r a n g i u m a f t e r c y t o p l a s m i c c l e a v a g e a n d p r i o r t o s p o r e w a l l f o r m a t i o n . x 700 10 /Am b a r F i g u r e 48 ( T E M ) S e c t i o n t h r o u g h s p o r a n g i u m m u l t i - v e s i c u l a r b o d y (MVJ a n d s u t u r e l i n e ( a r r o w ) . x 4075 ( G l u t . - A c . / O s . ) 10 um b a r F i g u r e 49 ( T E M ) S e c t i o n o f s p o r a n g i u m s h o w i n g s u r f a c e s p i n e s a n d v e s i c l e s ( V ) . ( G l u t . - A c . / 0 s . ) x 11 000 1.0 jum b a r F i g u r e 50 ( T E M ) L i p i d d r o p l e t s ( L ) a n d a c o n v o l u t e d m e m b r a n o u s b o d y ( a r r o w ) n e a r s p o r a n g i a l w a l l . x 18 300 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 .0 jum b a r 58 C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 51 i ( T E M ) A l d e h y d e f i x e d s e c t i o n o f y o u n g s p o r a n g i u m s h o w i n g . h i g h l i p i d c o n t e n t ( L ) . x 11 242 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 .0 um b a r F i g u r e 52 ( T E M ) E n d o p l a s m i c r e t i c u l u m ( E R ) a s s o c i a t e d w i t h a v a c u o l e . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 30 8 0 0 1 . 0 jam b a r F i g u r e 53 ( T E M ) S e c t i o n o f s p o r a n g i a l w a l l a t s u t u r e . x 18 335 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 . 0 jam b a r F i g u r e 54 ( T E M ) N u c l e i i n u n c l e a v e d c y t o p l a s m . (KMnO^) x 1 4 250 1 . 0 jam b a r F i g u r e 55 ( T E M ) S e c t i o n t h r o u g h s u t u r e . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 18 335 1 . 0 jum b a r - 60 C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 56 ( T E M ) H i g h m a g n i f i c a t i o n o f s u t u r e a r e a c o n t a i n i n g c o n v o l u t e d m e m b r a n e s ( G ) a n d s p o r a n g i a l w a l l ( S W ) . A r r o w i n d i c a t e s a d o u b l e - m e m b r a n e b o u n d e d v e s i c l e . x 52 950 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 .0 p i t a r F i g u r e 57 ( T E M ) T u b u l a r e l e m e n t s ( T ) a n d s p h e r i c a l v e s i c l e s ( a r r o w s ) i n s u t u r e a r e a . x 18 1 2 0 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 . 0 jam b a r F i g u r e 58 ( T E M ) J u n c t i o n o f s p o r a n g i o p h o r e w i t h s p o r a n g i u m . A r e a d e s t i n e d t o b e c o m e t h e C\„. •:>••:* - c o l u m e l l a c o n t a i n s many l i p i d d r o p l e t s ( L ) a n d v e s i c l e s ( V ) . x ?•*>•:.< ( b ) i n d i c a t e s a n a r t i f a c t o n t h e s e c t i o n . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 6765 1. 0 jum b a r F i g u r e 59 ( T E M ) L o m a s o m e - l i k e b o d y n e a r s p o r a n g i a l w a l l . x 30 890 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 .0 jam b a r F i g u r e 60 ( T E M ) L o m a s o m e - l i k e b o d y n e a r s p o r a n g i a l w a l l . x 30 890 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 .0 jam b a r - 62 -C. cucurbitarum Figure 61 (TEM) Long-section of sporangial surface spine. x 52 115 (Glut.-Ac./Os. ) 1 .0 jum bar Figure 62 (TEM) Lamellar bodies (LB) i n sporangial wall (SW). x 272 990 (Glut.-Ac./Os. ) 0.1 jam bar Figure 63 (TEM) Wall f u l l of lamellar bodies with appearance of f i b r i l l a r matrix (FM). (Glut.-Ac./Os.) x 146 725 0.1 jum bar Figure 64 (TEM) Lamellar bodies "forming" at inner wall layer (double arrows) and moving into spine (single arrows). (Glut.-Ac./Os.) x 146 275 0.1 jam bar Figure 65 (TEM) Lamellar bodies in cross-section (small arrows) and face-view (large arrows) x 272 990 (Glut.-Ac./Os. ) 0.1 jam bar Figure 66 (\TEM) Spines i n cross-section. (Glut.-Ac./Os.) x 52 115 1.0 jam bar - 64 -C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 67 ( T E M ) L a m e l l a r ( a r r o w s ) . ( G l u t . - A c . / O s . ) b o d i e s i n s p i n e x 121 1 0 0 0 . 1 jam b a r F i g u r e 68 ( T E M ) L o n g s e c t i o n o f m a t u r e s p i n e s h o w i n g f l a t b a s e a n d h o l l o w c e n t e r . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 121 4 0 0 0 . 1 jam b a r F i g u r e 69 ( T E M ) P l a t e - l i k e i n t e r n a l s t r u c t u r e o f s p i n e . x 1 4 6 725 ( G l u t . - A c . / O s . ) 0 . 1 um b a r F i g u r e 70 ( T E M ) S p i n e s h o w i n g f l a r e d t o p a n d b a s e p a r t i t i o n s . x 121 4 0 0 ( G l u t . - A c . / O s . ) 0 . 1 jam b a r 66 '-. G . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 71 ( T E M ) V e s i c l e s o f c l e a v a g e a p p a r a t u s ( C A ) i n s p o r a n g i a l c y t o p l a s m . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 4945 10 ;am b a r F i g u r e 72 ( T E M ) D e l i m i t a t i o n o f c o l u m e l l a ( a r r o w s ) . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 4945 10 jim b a r F i g u r e 73 ( T E M ) C l e a v a g e a p p a r a t u s e e n l a r g i n g b y i n c o r p o r a t i o n o f v e s i c l e s ( V ) . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 6765 1.0 /am b a r F i g u r e 74 ( T E M ) C l e a v a g e a p p a r a t u s a l o n g s p o r a n g i u m w a l l . P a r a m u r a l c y t o p l a s m ( P C ) w i l l b e e x c l u d e d f r o m s p o r e s ( G l u t . - A c . / O s . ) 6 x 36 040 1.0 jam b a r 68 C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 75 ( T E M ) S p o r e d e l i m i t a t i o n ( a r r o w s ) b y c l e a v a g e a p p a r a t u s . x 6765 ( G l u t . - A c . / O s . J 1 .0 ;um b a r F i g u r e 76 ( T E M ) S p o r e d e l i m i t a t i o n n e a r s u t u r e l i n e o f s p o r a n g i u m w a l l . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 8720 1.0 jam b a r F i g u r e 77 ( T E M ) Low m a g n i f i c a t i o n o f e a r l y s p o r a n g i a l c l e a v a g e . x 2685 ( G l u t . - A c . / O s . ) 10 jam b a r F i g u r e 78 ( T E M ) S p o r a n g i a l c l e a v a g e a p p a r a t u s . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 4945 10 jam b a r F i g u r e 79 ( T E M ) S p o r e d e l i m i t a t i o n ( G l u t . - A c . / O s . ) x 8720 1. 0 jam b a r - 70 -C• c u c u r b i t a r u m F i g u r e 8 0 ( T E M ) C l e a v a g e a l o n g s p o r a n g i u m w a l l . x 7 9 2 0 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 . 0 jam b a r F i g u r e 81 ( T E M ) E x c l u d e d c y t o p l a s m ( a r r o w ) b e t w e e n d e l i m i t e d s p o r e s . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 11 0 0 0 1 . 0 jam b a r F i g u r e 82 ( T E M ) C l e a v a g e membrane s u r r o u n d i n g d e l i m i t i n g s p o r e c y t o p l a s m . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 13 950 1.0 b a r F i g u r e 83 ( T E M ) E n l a r g e m e n t o f b o x e d a r e a i n F i g u r e 8 2 . A r r o w i n d i c a t e s c l e a v a g e m e m b r a n e . x 51 810 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 . 0 jam b a r - 72 C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 84 ( T E M ) T u b u l e s i n c l e a v a g e a p p a r a t u s . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 23 520 1. 0 jam b a r F i g u r e 85 ( T E M ) I n t e r f a c e o f s p o r a n g i u m p l a s m a membrane (PM) w i t h c l e a v a g e membrane (CM) ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 )xm b a r F i g u r e 8 6 ( T E M ) L a m e l l a t e membrane s ( a r r o w s ) i n c l e a v a g e a p p a r a t u s , d e s t i n e d t o f o r m s p o r e b r i s t l e s . x 15 6 8 0 ( G l u t . - A c . / O s . ) l . O j i m b a r F i g u r e 87 ( T E M ) C o m p l e t e d c l e a v a g e c h a n n e l b e t w e e n s p o r e s . x 34 8 4 0 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 . 0 jam b a r F i g u r e 88 ( T E M ) B e a d e d a p p e a r a n c e o f c l e a v a g e m e m b r a n e . x 5 l 8 1 0 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 . 0 jum b a r - 7k C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 89 ( T E M ) L a m e l l a t e m e m b r a n e s i n c l e a v a g e a p p a r a t u s . x Ik 950 ( G l u t . - A c . / 0 s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 90 ( T E M ) L a m e l l a t e m e m b r a n e s i n c l e a v a g e a p p a r a t u s . x 33 550 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 .0 jum b a r F i g u r e 91 ( T E M ) Low m a g n i f i c a t i o n s o f c l e a v e d s p o r a n g i u m . x 2215 ( G l u t . - A c . / O s . ) 10 jam b a r F i g u r e 92 ( T E M ) C o l u m e l l a w a l l (CM) w i t h a d j a c e n t s p o r e c y t o p l a s m . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 18 270 1.0 jam b a r F i g u r e 93 ( T E M ) C o l u m e l l a s h o w i n g v a c u o l a t i o n a n d h i g h l i p i d c o n t e n t ( L ) . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 4920 10 jam b a r F i g u r e 9^ ( L M ) F e u l g e n s t a i n s h o w i n g m u l t i -n u c l e a t e c o n d i t i o n o f s p o r e s a n d c o l u m e l l a . x 1 8 0 0 1 0 jam b a r - 76 -C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 95 ( T E M ) S p o r e s i n s p o r a n g i u m d u r i n g s p o r e w a l l f o r m a t i o n . x 2875 ( G l u t . A c . / O s ) 10 i t m b a r F i g u r e 96 ( T E M ) C o l u m e l l a c y t o p l a s m d u r i n g s p o r e w a l l f o r m a t i o n s t a g e . T h e n u c l e i ( N ) m i t o c h o n d r a (M) a n d ER c o n c e n t r a t e d p e r i p h e r a l l y . (KMnO^) x 5750 10 ;um b a r - 78 C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 97 ( T E M ) S p o r e c y t o p l a s m d u r i n g w a l l f o r m a t i o n . x 6760 (KMnO^) 1 .0 m b a r F i g u r e 98 ( T E M ) S p o r e w a l l f o r m a t i o n . A r r o w i n d i c a t e s p a r a m u r a l l o c a t i o n o f b e a d e d ? R - , x 31 575 (KMnO^) 1 .0 m b a r F i g u r e 99 ( T E M ) C o m p a r i s o n o f s p o r a n g i a l w a l l (SW) w i t h s p o r e w a l l . A r r o w s i n d i c a t e b e a d e d E . R . x 4 X (KMnO^) 1.0 jam b a r F i g u r e 100 ( T E M ) A l m o s t - m a t u r e s p o r e s . C l e a v a g e a p p a r a t u s ( C A ) i s f i l l e d w i t h m e m b r a n e s . (KMnO^) x 3380 10 jam b a r - 80 G . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 101 ( T E M ) S p o r e c y t o p l a s m d u r i n g w a l l f o r m a t i o n . x 11 500 /«•, . \ 1 , 0 Mm b a r ( G l u t . A c . / O s ) F i g u r e 1 0 2 ( T E M ) P e r i p h e r a l n u c l e i a n d m i t o c h o n d r i a d u r i n g w a l l f o r m a t i o n . ( K M n 0 4 ) x 8728 1. 0 jam b a r F i g u r e 103 ( T E M ) P a r a m u r a l v e s i c u l a r b o d i e s ( V B ) , b e a d e d ER ( d o u b l e a r r o w ) a n d w a l l l a y e r s o f s p o r e . S i n g l e a r r o w i n d i c a t e s b o u n d a r y b e t w e e n m i d d l e a n d i n n e r w a l l l a y e r s . (KMnO^) x 24 030 1. 0 jam b a r 82 C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 104 ( T E M ) S p o r e w a l l l a y e r s (KMnO^) x 31 440 1.0 jum b a r F i g u r e 105 ( T E M ) M u l t i p l e l a y e r e d i n n e r w a l l ( I W ) . x 18 335 ( K M n O ^ ) 1 . 0 jum b a r F i g u r e 106 ( T E M ) D e t a i l o f l a y e r s . M n F i g u r e 105. x 52 960 (KMnO^) 1 .0 jum b a r F i g u r e 107 ( T E M ) Pfembranous a p p e n d a g e s ( A ) a t s p o r e e n d s . x 3 2 8 0 (KMnO^) 1 0 jam b a r F i g u r e 1 0 8 ( T E M ) S p o r e a p p e n d a g e a t t a c h m e n t . (KMnO^) x 18 335 1. 0 jam b a r - 8 4 C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 109 ( T E M ) M e m b r a n e s o f c l e a v a g e a p p a r a t u s a t t a c h e d t o s p o r e a s a n a p p e n d a g e . (KMnO^) x 18 335 1.0 jum b a r F i g u r e 110 ( T E M ) M e m b r a n e a t t a c h m e n t t o o u t e r w a l l l a y e r . x 30 890 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 111 ( T E M ) S p o r e a p p e n d a g e p r i o r t o s p o r e r e l e a s e . x 13 230 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 112 ( T E M ) A p p e n d a g e m e m b r a n e s i n l o n g -s e c t i o n ( s i n g l e a r r o w ) a n d i n s u r f a c e v i e w ( d o u b l e a r r o w ) . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 17 060 1.0 jam b a r C . c u c u r b i t a r u m F i g u r e 113 ( S E M ) S u r f a c e o f m a t u r e m u l t i s p o r e d s p o r a n g i u m . x 1750 10 jam b a r F i g u r e 1 1 4 ( S E M ) S u t u r e l i n e a p p e a r s r a i s e d d u e t o p r o c e s s i n g s h r i n k a g e o f s p o r a n g i u m . x 1 0 8 0 1 0 jum b a r F i g u r e 115 ( S E M ) S u r f a c e s p i n e s . x 3260 10 jam b a r - 88 C . D e v e l o p m e n t o f T r i s p o r o u s S p o r a n g i o l e s i n B l a k e s l e a t r i s p o r a T h e y o u n g a m p u l l a o f B l a k e s l e a ( F i g u r e 116) c l o s e l y r e s e m b l e s t h e c o r r e s p o n d i n g s t r u c t u r e i n C h o a n e p h o r a , i n t h a t i t c o n t a i n s many n u c l e i , m i t o c h o n d r i a a n d g r a n u l a r v e s i c l e s . P e d i c e l s a r i s e f r o m many p o i n t s i n t h e a m p u l l a w a l l ( F i g u r e 1 1 7 ) . T h e a m p u l l a p e r i p h e r y c o n t a i n s n u m e r o u s s m a l l v e s i c l e s ( G i b a r d t , 1969; G r o v e a n d B r a c k e r , 1 9 7 0 ) w h i c h c o n t a i n s i n g l e g r a n u l e s ( F i g u r e 1 1 8 , 119 a r r o w s ) . T h e s e s m a l l v e s i c l e s a r e a b u n d a n t i n t h e p e d i c e l a n d may f u s e w i t h t h e p e d i c e l membrane t o f o r m l o m a s o m e s ( F i g u r e 1 1 9 , L ) o r may b e i n v o l v e d i n w a l l f o r m a t i o n ( H e a t h e t a l . , 1 9 7 1 ) . T u b u l e s , common i n C h o a n e p h o r a p e d i c e l s ( F i g u r e s 5i 6, 7 ) » w e r e n o t o b s e r v e d i n B l a k e s l e a . F o l l o w i n g e x p a n s i o n o f t h e p e d i c e l ( P ) , t h e s p o r a n g i o l e ( S ) i s i n i t i a t e d ( F i g u r e 1 2 0 ) . M o s t s e c t i o n s o f y o u n g s p o r a n g i o l e s show t h a t t h i s s t r u c t u r e i s n u c l e a t e d a t t h e e a r l i e s t s t a g e s o f f o r m a t i o n ( F i g u r e 1 2 0 , n ) . T h e s p o r a n g i o l e , p e d i c e l a n d a m p u l l a w a l l s a r e c o n t i n u o u s a n d o f s i m i l a r s t r u c t u r e , b u t t h i c k n e s s d e c r e a s e s f r o m 0 . 2 um o n t h e a m p u l l a t o 0.05 ;um o n p e d i c e l a n d s p o r a n g i o l e . T h e s u p p o r t i v e w a l l t h i c k e n i n g o b s e r v e d a t t h e b a s e o f C h o a n e p h o r a p e d i c e l s ( F i g u r e s 5. 6) - 89 was n o t o b s e r v e d i n p e d i c e l s o f B l a k e s l e a . B l a k e s l e a p e d i c e l s a r e b u l b o u s ( F i g u r e s 120, 130, 172) w h e r e a s t h o s e o f C h o a n e p h o r a a r e c y l i n d r i c a l ( F i g u r e s 15, 17. 19)' F i g u r e 121 s h o w s a n a m p u l l a b e a r i n g s p o r a n g i o l e s & a p p r o x i m a t e l y 75% e x p a n d e d . T h e a m p u l l a c o n t a i n s many n u c l e i ( F i g u r e 122, n ) , g r a n u l a r v e s i c l e s , a n d a n o c c a s i o n a l c r y s t a l , ( F i g u r e s 122, 1 2 4 C ) . A l d e h y d e f i x a t i o n ( F i g u r e 123) t y p i c a l l y s h o w s m o r e v a c u o l a t i o n ( V ) o f t h e a m p u l l a t h a n d o e s p e r m a n g a n a t e - f i x e d m a t e r i a l ( F i g u r e 122). D e g e n e r a t i o n o f t h e a m p u l l a c y t o p l a s m a p p e a r s t o b e g i n a t a n e a r l i e r s t a g e t h a n i n C h o a n e p h o r a . C r y s t a l s p o s s i b l y d e r i v e d f r o m c y t o p l a s m i c m e m b r a n e s ( F i g u r e 125. a r r o w ) a r e s e e n p r i o r t o a n y c y t o p l a s m i c c l e a v a g e i n t h e s p o r a n g i o l e s . T h e s e c r y s t a l s h a v e t h e same l a t t i c e d i m e n s i o n , 15 nm, a s s i m i l a r c r y s t a l s i n C h o a n e p h o r a , ( F i g u r e s 36,,38). P r i o r t o c l e a v a g e , t h e s p o r a n g i o l e s c o n t a i n n u m e r o u s g r a n u l a r v e s i c l e s ( F i g u r e 126, g v ) a n d p o s s e s s s u r f a c e s p i n e s ( F i g u r e s 126, 127). A c o m p a r i s o n o f s p o r a n g i o l e (SW) a n d a m p u l l a w a l l s (AW) i s s h o w n i n F i g u r e 127• T h e m e t h o d o f f i x a t i o n d r a m a t i c a l l y i n f l u e n c e s t h e o b s e r v e d c y t o p l a s m i c s t r u c t u r e , a s s h o w n i n F i g u r e s 128, 129 a n d 130. G l u t a r a l d e h y d e f i x a t i o n ( F i g u r e 128 s h o w s n u c l e i ( n ) , l i p i d s ( L ) a n d s m a l l e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t - 90 v e s i c l e s ( V E ) . A c r o l e i n . - t f i x e d s p o r a n g i o l e s ( F i g u r e 129) c o n t a i n l a r g e r v a c u o l e s ( V ) , n u c l e i , l i p i d s a n d m i t o c h o n d r i a b u t f e w s m a l l v e s i c l e s . P e r m a n g a n a t e f i x a t i o n ( F i g u r e 130) p r e s e r v e s m e m b r a n o u s s t r u c t u r e s , i n p a r t i c u l a r ER ( a r r o w s ) w h i c h i s h a r d t o d e t e c t i n a l d e h y d e - f i x e d m a t e r i a l , a n d g r a n u l a r v e s i c l e s w h i c h a r e n o t s e e n f o l l o w i n g a l d e h y d e f i x a t i o n . T h e f i r s t s i g n o f c y t o p l a s m i c c l e a v a g e i n s p o r a n g i o l e s i s t h e p r o d u c t i o n o f s u t u r e l i n e s , s h o w n i n c r o s s - s e c t i o n i n F i g u r e 131 ( a r r o w s ) . T h e t h r e e s u t u r e l i n e s r u n l e n g t h w i s e f r o m a common o r i g i n a t t h e t o p o f t h e s p o r a n g i o l e t o t h e p e d i c e l a t t a c h e m n t a t t h e b a s e ( s e e F i g u r e s 148, 195)* I n c r o s s - s e c t i o n t h e y c l o s e l y r e s e m b l e t h e s u t u r e l i n e s o f m u l t i s p o r o u s s p o r a n g i a o f b o t h C h o a n e p h o r a ( F i g u r e s 48, 55, 57) a n d B l a k e s l e a . T h e p e d i c e l h a s a f u l l c o m p l e m e n t o f c y t o p l a s m i c o r g a n e l l e s e x c e p t n u c l e i ( F i g u r e s 132, 133). T h e p e d i c e l w a l l i s t h i c k e n e d (0.2 - 0.3 jum) a t b o t h t h e a m p u l l a ( A ) a n d s p o r a n g i o l e e n d s ( S ) , b u t r e m a i n s t h i n (0.06 - 0.07 /um) o v e r t h e p e d i c e l s i d e s . S e v e r a l f e a t u r e s n o t e d i n p r e c l e a v g g e s p o r a n g i o l e s a r e i l l u s t r a t e d i n F i g u r e s 134 - 145. L i p i d d r o p l e t s ( L ) - 91 -l o c a t e d w i t h i n e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t v a c u o l e s are a l s o p r e s e n t ( F i g u r e 134, a r r o w s ) . A s i m i l a r s i t u a t i o n i s o b s e r v e d i n p r e m a n g a n a t e - f i x e d specimens, ( F i g u r e s 135 and 138) where g r a n u l a r v e s i c l e s appear t o be e n g u l f e d by membrane-bounded v a c u o l e s ( a r r o w s ) . F i g u r e 136 shows b o t h s e c t i o n a l and s u r f a c e views o f the n u c l e a r envelope and i t s pores ( a r r o w ) . F u s i o n of v e s i c l e s w i t h the plasma membrane t o form p a r a m u r a l lomasome-like b o d i e s i s o f t e n o b s e r v e d ( F i g u r e 137, a r r o w s ) . S m a l l , i r r e g u l a r v e s i c l e s , packed w i t h t u b u l a r e l e m e n t s , are o c c a s i o n a l l y seen i n s p o r a n g i o l e s c l o s e t o the p e d i c e l ( F i g u r e s 138, 139, double a r r o w s ) ; no f u n c t i o n has been dete r m i n e d f o r these v e s i c l e s . I n a l d e h y d e - f i x e d c e l l s , r i b o s o m e - s i z e g r a n u l e s (20 nm diameter) are o b s r e v e d i n the c y t o p l a s m ( F i g u r e s 144 and 145). S i m i l a r g r a n u l e s a l s o o c c u r i n permanganate-f i x e d c e l l s , b o t h f r e e i n the c y t o p l a s m ( F i g u r e 142) and i n membrane-bounded g r a n u l a r b o d i e s ( F i g u r e 14 3, GB). These g r a n u l e s may be b e t a - g l y c o g e n s i n c e r o s s e t t e s o f a l p h a - g l y c o g e n (50 nm diameter) are p r e s e n t ( F i g u r e 144). Glycogen has been r e p o r t e d i n Thamnidium by F l e t c h e r ( 1 9 7 3 ) and i n G i l b e r t e l l a by B r a c k e r (196 8 ) . 92 A t t h e t i m e o f s u t u r e f o r m a t i o n , t h e c y t o p l a s m c o n t a i n s i r r e g u l a r e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t v e s i c l e s ( F i g u r e 1 4 6 , V e ) f o l l o w i n g a l d e h y d e f i x a t i o n . I n p e r m a n g a n a t e -f i x e d c e l l s , t h e v e s i c l e s a r e s i m i l a r b u t a r e m o r e d i s t i n c t l y m e m b r a n e - b o u n d ( F i g u r e 1 4 7 , V e ) . F i g u r e 1 4 8 s h o w s a c r o s s -s e c t i o n o f a s p o r a n g i u m , c u t p a r a l l e l t o t h e a m p u l l a s u r f a c e , s h o w i n g a l l t h r e e e q u i d i s t a n t s u t u r e s . T h e t o p l e f t s u t u r e a n d t h e g r a n u l a r b o d y o f F i g u r e 1 4 8 a r e s h o w n a t h i g h e r m a g n i f i c a t i o n i n F i g u r e 1 4 9 . 'These g r a n u l e s , o f 20 - 25 nm d i a m e t e r ' , a r e e x c l u d e d f r o m t h e p a r a m e m b r a n e z o n e ( a r r o w s ) f o r a d i s t a n c e o f 4 0 nm. T h e m e m b r a n e o f t h e g r a n u l a r b o d y i s c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h t h e e n v e l o p e o f t h e a d j a c e n t n u c l e u s ( N ) . S m a l l e r g r a n u l a r b o d i e s ( F i g u r e 150, GB) a r e c l o s e t o t h e s u t u r e m e m b r a n e , a n d i n F i g u r e 151 ( a r r o w ) t h § two m e m b r a n e s a r e a l m o s t i n d i r e c t c o n t a c t . A s n o t e d i n c l e a v a g e o f s p o r a n g i a o f C h o a n e p h o r a ( F i g u r e s 71 - 88), c l e a v a g e may i n v o l v e t h r e e m e t h o d s ( o r c o m b i n a t i o n s ) . T h e s e a r e s ( a ) c e n t r i p e t a l g r o w t h o f t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s f r o m t h e s u t u r e s ( F i g u r e s 152, 153); ( h ) c e n t r a l e x p a n s i o n o f t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s t o w a r d s t h e s u t u r e s , ( F i g u r e s 155. 156) a n d ( c ) f u s i o n o f c l e a v a g e v e s i c l e s ( C V ) t o f o r m a n a r r o w c l e a v a g e c a n a l ( F i g u r e 15*0 • M e t h o d ( b ) was m o s t o f t e n o b s e r v e d , - 93 s o m e t i m e s i n c o m b i n a t i o n w i t h m e t h o d ( a ) . M e t h o d ( c ) was l e a s t o f t e n s e e n i n s p o r a n g i o l e s o f B l a k e s l e a . T h e c l e a v a g e a p p a r a t u s o f t e n c o n t a i n s r i b o s o m e - f i l l e d g r a n u l a r b o d i e s ( F i g u r e s 155i 156 g b ) o r m a s s e s o f f r e e r i b o s o m e s ( F i g u r e 153» a r r o w s ) . A l t h o u g h r i b o s o m e - l i k e g r a n u l e s o n t h e c l e a v a g e m e m b r a n e , a s r e p o r t e d i n G i l b e r t e l l a ( B r a c k e r , ' 1968), w e r e d i f f i c u l t t o d i s t i n g u i s h i n B l a k e s l e a o r C h o a n e p h o r a , s u c h g r a n u l e s c a n b e s e e n i n F i g u r e 157 ( a r r o w s ) . I n many m i c r o g r a p h s i n t h i s s t u d y , t h e g r a n u l a r i t y o f c l e a v a g e a p p a r a t u s c o n t e n t s a n d t h e i r s i m i l a r i t y t o r i b o s o m e d i m e n s i o n s , makes i d e n t i f i c a t i o n o f m e m b r a n e - b o u n d g r a n u l e s v e r y d i f f i c u l t . T h e c l e a v a g e a p p a r a t u s ( C A ) e x p a n d s o u t w a r d i n t h r e e d i r e c t i o n s t o w a r d s t t h e s u t u r e s , ( F i g u r e 158 a r r o w s ) b y i n c o r p o r a t i o n o f s m a l l v e s i c l e s . T h e n o r m a l v a c u o l e s a r e n o t i n v o l v e d i n c l e a v a g e , a n d t h e v a c u o l e s ( F i g u r e 158, V ) s o m e t i m e s a p p e a r t o b e s p l i t i n two b y t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s . F i g u r e 159 shows t h e a p p r o a c h o f t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s t o t h e s u t u r e , a n d t h e n u m e r o u s v e s i c l e s ( V e ) w i t h w h i c h i t l a t e r f u s e s ( a r r o w ) . S o m e t i m e g r a n u l a r b o d i e s a r e l o c a t e d n e a r s u t u r e s ( F i g u r e 160 G B ) a n d b e c o m e i n c o r p o r a t e d i n t o t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s . L a r g e c l e a v a g e v e s i c l e s ( F i g u r e s l 6 l , 162, C V ) s e e n i n a l d e h y d e - f i x e d t i s s u e s a r e p r e s u m e d t o c o r r e s p o n d t o p e r m a n g a n a t e - f i x e d g r a n u l a r b o d i e s . T h e c l e a v a g e a p p a r a t u s , l i k e t h a t i n - 94 -C h o a n e p h o r a s p o r a n g i a , o f t e n c o n t a i n s c e l l u l a r d e b r i s ( F i g u r e s 163, 164 d ) . F o l l o w i n g c l e a v a g e , t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s i s f u l l o f g r a n u l e s ( F i g u r e s 165, 166) , p r e s u m a b l y r i b o s o m e s . T h e g r a n u l e - l i n e d c l e a v a g e membrane i s p a r a l l e l e d b y ER i n t h e p r o s p o r e c y t o p l a s m ( F i g u r e s 166, 168, a r r o w s ) . I n F i g u r e 167 t h e s p o r a n g i o l e h a s b e e n s e c t i o n e d t a n g e n t i a l l y a s e v i d e n c e d b y t h e l e n g t h o f s u t u r e w a l l e x p o s e d . E x t r u s i o n o f c y t o p l a s m i n t o t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s ( F i g u r e 169, a r r o w s ) may be a m e t h o d o f r e d u c i n g s p o r e v o l u m e . I n c r o s s - s e c t i o n ( F i g u r e 170) t h e a p p a r a t u s c a n b e s e e n c o n n e c t i n g a l l t h r e e s u t u r e s , t h u s d i v i d i n g t h e s p o r a n g i o l a r c y t o p l a s m i n t o t h r e e p r o s p o r e s . D u r i n g s c a n n i n g EM p r o c e s s i n g s p o r a n g i o l e s t e n d t o c o l l a p s e i f f r e e z e - d r i e d ( F i g u r e 171) b u t c r i t i c a l -p o i n t d r y i n g p r e s e r v e s t h e i r s h a p e w e l l ( F i g u r e 172) . S u r f a c e s p i n e s c o v e r t h e s p o r a n g i o l e w a l l s b u t n o t t h e b u l b o u s p e d i c e l . T h e s h a p e o f t h e p r o s p o r e s i s v i s i b l e b e n e a t h t h e t h i n s p o r a n g i a l w a l l ( F i g u r e 172) . F i g u r e s 173 t o 176 s h o w s p e c i m e n s f i x e d i n a c o m b i n a t i o n o f a l d e h y d e a n d p e r m a n g a n a t e . No g r a n u l e s - 95 a r e v i s i b l e i n t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s a n d t h e a m p u l l a e a p p e a r , h i g h l y v a c u o l a t e . ( F i g u r e 173. V ) . P r o s p o r e s a r e m u l t i - n u c l e a t e ( F i g u r e s 174 a n d 175. n ) a n d a r e b o u n d e d b y a d i s t i n c t c l e a v a g e membrane whose g r a n u l e s h a v e e x p a n d e d t o f o r m a f i b r o u s c o a t ( B r a c k e r , 1968). A t t h i s s t a g e , p r e c u r s o r s o f s p o r e a p p e n d a g e s a r e o b s e r v e d w i t h i n t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s n e a r t h e s u t u r e s ( F i g u r e 176, a p ) . P r i o r t o s p o r e w a l l f o r m a t i o n t h e a m p u l l a c y t o p l a s m c o n t a i n s t y p i c a l c e l l o r g a n e l l e s a n d n u m e r o u s g r a n u l a r v e s i c l e s ( F i g u r e 177) . O c c a s i o n a l l y t h e a m p u l l a c o n t a i n s t h e g r a n u l a r b o d i e s ( F i g u r e 177. GB) p r e s u m e d t o c o n t a i n g l y c o g e n . D u r i n g s p o r e w a l l f o r m a t i o n , t h e a m p u l l a b e c o m e s v a c u o l a t e ( F i g u r e 178) a n d n u m e r o u s c r y s t a l s a p p e a r ( F i g u r e s 179. 180) . L a t t i c e m e a s u r e m e n t s a v e r a g i n g 15 nm a r e e q u a l t o t h o s e o b t a i n e d i n t h e o t h e r f u n g i i n t h i s s t u d y . F i g u r e 181 shows a n a m p u l l a b e a r i n g m a t u r e s p o r a n g i o l e s . T h e a m p u l l a c o n t a i n s l a r g e v a c u o l e s ( V ) b u t s t i l l , c o n t a i n s many i n t a c t o r g a n e l l e s . T h e s p o r a n g i o l e s i n F i g u r e 182 a r e a t t h e same s t a g e a s - 96 t h o s e i n F i g u r e 181, a n d c o n t a i n s p o r e s w i t h . r i d g e d o u t e r w a l l s . D u r i n g f o r m a t i o n o f t h e o u t e r w a l l l a y e r , some s p o r e s w e r e o b s e r v e d h a v i n g f i n g e r - l i k e p r o j e c t i o n s ( F i g u r e I83i a r r o w s ) a t t h e s p o r e e n d s . T h e s e may r e p r e s e n t a p p e n d a g e a t t a c h m e n t p o i n t s . T h e i n n e r s u b l a y e r o f t h e o u t e r w a l l l a y e r i s l e s s e l e c t r o n - d e n s e t h a n t h e o u t e r l a y e r . U n l i k e t h e c o r r e s -p o n d i n g s u b l a y e r i n C h o a n e p h o r a , t h e i n n e r s u b l a y e r ( o f B l a k e s l e a o u t e r s p o r e w a l l s ) i s much t h i c k e r b e n e a t h t h e w a l l r i d g e s ( F i g u r e 186). T h e i n n e r w a l l l a y e r i s e l e c t r o n t r a n s p a r e n t a n d i s o f m o r e u n i f o r m t h i c k n e s s (0.2 jum) t h a n t h e s u b l a y e r s o f t h e o u t e r w a l l . I n F i g u r e 184 t h e i n n e r w a l l a p p e a r s v e r y t h i c k b e c a u s e o f t h e t a n g e n t i a l s e c t i o n i n g a n g l e . S p o r e a p p e n d a g e p r e c u r s o r s b e c o m e m o r e d i s t i n c t a s w a l l s y n t h e s i s p r o c e e d s b u t r e m a i n l o c a l i z e d a t t h e two " p o l e s " o f t h e s p o r a n g i o l e ( F i g u r e s 185, 185 a ) . W i t h i n e a c h s p o r a n g i o l e t h e s p o r e w a l l r i d g e s a r e p e r f e c t l y i n t e r m e s h e d ( F i g u r e 18? a r r o w ) p r o v i d i n g e f f i c i e n t s p a c e u t i l i z a t i o n . T h i s may s i m p l y b e a r e s u l t o f i d e n t i c a l p e r i o d i c i t y o f r i d g e s o r c o u l d i n d i c a t e some " c o m m u n i c a t i o n " b e t w e e n s p o r e c y t o p l a s m s d u r i n g s y n t h e s i s . - 97 -M a t u r e , r e l e a s e d s p o r e s ( F i g u r e 1 8 8 ) show g r e a t r e s i s t a n c e t o f i x a t i o n , a n d f e w r e t a i n t h e i r d e l i c a t e a p p p e n d a g e s ( a ) t h r o u g h t h e E . M . e m b e d d i n g p r o c e d u r e s . F i g u r e 189 s h o w s a p p e n d a g e s t r u c t u r e a f t e r t h e s p o r e h a s b e e n r e l e a s e d f r o m i t s p r o t e c t i v e s p o r a n g i o l e . E a c h a p p e n d a g e c o n s i s t s o f a m e m b r a n o u s " b a c k b o n e " w h i c h i s e l e c t r o n t r a n s p a r e n t a n d i s 35 nm t h i c k , ( F i g u r e I89. a r r o w ) . T h i s m e m b r a n o u s b a c k b o n e s u p p o r t s a d a r k - s t a i n i n g g r a n u l a r m a t e r i a l o n o n e s i d e o n l y . T h e w a l l o f a m a t u r e s p o r e i s c o m p a r e d w i t h t h a t o f t h e s p o r a n g i o l e (SW) i n F i g u r e 190. T h e m a t u r e s p o r e w a l l ( F i g u r e s 191 - 193. a ) v a r i e s f r o m 0 . 4 t o 0.7 jam i n t h i c k n e s s a n d i s c o m p o s e d o f two m a i n l a y e r s . T h e m a t u r e i n n e r w a l l i s e l e c t r o n t r a n s p a r e n t , 175 nm t h i c k , a n d i s c o n t i n u o u s o v e r t h e e n t i r e s p o r e s u r f a c e . T h e i n n e r s u b - l a y e r o f t h e o u t e r w a l l ( F i g u r e s 191 - 193. t>) a p p e a r s g r a n u l a r a n d v a r i e s i n t h i c k n e s s f r o m 80 nm b e t w e e n r i d g e s t o 250 nm u n d e r t h e r i d g e s . T h e o u t e r m o s t s u b - l a y e r ( F i g u r e s 191 - 193, c ) i s l o c a t e d a l m o s t e n t i r e l y a t t h e r i d g e a r e a s w h e r e i t f o r m s a d e n s e l y - s t a i n i n g l a y e r a v e r a g i n g 300 nm t h i c k . I n t h e g r o o v e s b e t w e e n r i d g e s , t h e o u t e r m o s t s u b - l a y e r ( c ) i s r e d u c e d t o a t h i n 4 0 - 80 nm l a y e r . T h e d i f f e r e n c e i n a p p e a r a n c e o f t h e w a l l i n F i g u r e 193 i s t h e r e s u l t o f a l d e h y d e - f i x a t i o n c o m p a r e d t o KMnO^ - f i x a t i o n u s e d i n F i g u r e s 190 - 192. - 98 I n t h e s c a n n i n g E M , m a t u r i n g s p o r e s c a n be d i s t i n g u i s h e d b e n e a t h t h e t h i n s p o r a n g i o l e w a l l s ( F i g u r e 1 9 * 0 . A t m a t u r i t y t h e s u t u r e l i n e s ( F i g u r e 195. a r r o w s ) b e g i n t o s p l i t , e x p o s i n g t h e r i d g e d s p o r e w a l l s . T h e s p o r a n g i o l e w a l l , i d e n t i f i e d b y i t s s u r f a c e s p i n e s , i s i n t a c t a f t e r c l e a v a g e o f i t s c y t o p l a s m i n t o t h r e e s p o r e s ( F i g u r e 196) . I t o p e n s a l o n g i t s t h r e e s u t u r e l i n e s a f t e r s p o r e w a l l s a r e c o m p l e t e ( F i g u r e 197. a r r o w s ) . A s p o r e f r e e o f i t s s p o r a n g i o l e ( F i g u r e 198) b e a r s no s p i n e s o n i t s l o n g i t u d i n a l l y g r o o v e d o u t e r w a l l ( O W ) , w h e r e a s a s p o r e s t i l l s h r o u d e d i n i t s s p o r a n g i a l w a l l (SW) a p p e a r s s p i n y . S p o r e a p p e n d a g e s w e r e n o t o b s e r v e d i n t h e S E M , a f t e r f r e e z e - d r y i n g o r c r i t i c a l - p o i n t d r y i n g o f s p o r e s . D e s p i t e t h e s p l i t t i n g o f s p o r a n g i o l e s u t u r e s a t m a t u r i t y , m o s t s p o r a n g i o l e s a r e d i s s e m i n a t e d a s t r i s p o r e d u n i t s , b e i n g r e l e a s e d f r o m t h e a m p u l l a b y f r a c t u r e a b o v e o r b e l o w t h e p e d i c e l . M a n y a m p u l l a e w e r e o b s e r v e d b e a r i n g p e d i c e l s ( F i g u r e 199. p ) a n d many r e l e a s e d s p o r a n g i o l e s a l s o b o r e p e d i c e l s ( F i g u r e s 200, 201) . W h e t h e r t h e p e d i c e l b r e a k s a t t h e s p o r a n g i o l a r o r a m p u l l a r e n d may b e d e t e r m i n e d b y t h e d e g r e e o f s u t u r e s p l i t t i n g a t t h e t i m e o f r e l e a s e . F o l l o w i n g s p o r a n g i o l e r e l e a s e t h e d i s t i n c t i v e " b e a d e d " s p o r a n g i o l o p h o r e b r a n c h e s a r e e x p o s e d ( F i g u r e 202) . - 99 T h e p r e s e n c e o f t h r e e s u t u r e l i n e s h a s n o t b e e n r e p o r t e d b e f o r e . P r e v i o u s o b s e r v a t i o n s b y l i g h t m i c r o s c o p y h a v e s h o w n s p o r a n g i o l e s t o d e h i s c e i n t o "two h a l v e s " a s do s p o r a n g i a , ( I n g o l d a n d Z o b e r i , 1963; I n g o l d , 1971). S p o r a n g i o l e s do d e h i s c e when t o u c h e d b y w a t e r , b u t n o t i n t o two p a r t s o f e q u a l s i z e . P r o b a b l y t h e r u p t u r e o f o n e s u t u r e i s e n o u g h t o r e a l e a s e s p o r e s a n d t h e t h r e e s e c t i o n s o f t h e s p o r a n g i o l e w a l l a r e o b s e r v e d a s o n e s m a l l s e c t i o n j o i n e d t o a l a r g e r d o u b l e s e c t i o n . - 1 0 0 B . t r i s p o r a F i g u r e 1 1 6 ( T E M ) S e c t i o n o f a m p u l l a b e f o r e p e d i c e l f o r m a t i o n . x 6 4 3 0 (KMnO^) 1 . 0 jum b a r F i g u r e 117 ( T E M ) P e d i c e l i n i t i a t i o n . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 5000 1.0 ^im b a r F i g u r e 118 ( T E M ) A m p u l l a c y t o p l a s m i n v i c i n i t y o f p e d i c e l f o r m a t i o n . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 13 250 1.0 jam b a r F i g u r e 1 1 9 ( T E M ) V e s i c l e s w i t h g r a n u l a r i n c l u s i o n s ( a r r o w s ) . x 30 4 2 0 ( G l u t . - A c . / O x . ) 1 . 0 jam b a r F i g u r e 1 2 0 ( T E M ) E x p a n s i o n o f s p o r a n g i o l e ( S ) a b o v e p e d i c e l ( P ) . x 1 0 5 4 0 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 . 0 jam b a r F i g u r e 121 ( T E M ) A m p u l l a s u r r o u n d e d b y y o u n g s p o r a n g i o l e s o n p e d i c e l s . ( G l u t . / O s . ) x 5000 1.0 jum b a r - 102 -B . t r i s p o r a F i g u r e 122 ( T E M ) M u l t i n u c l e a t e ( N ) a m p u l l a d u r i n g s p o r a n g i o l e f o r m a t i o n . x 3870 (KMnO^) 10 jum b a r F i g u r e 123 ( T E M ) A l d e h y d e - f i x e d a m p u l l a a t t h e same s t a g e a s F i g u r e 122. ( G l u t . / O s . ) x 2360 10 jam b a r F i g u r e 1 2 4 ( T E M ) V a c u o l a t i o n o f a m p u l l a . (C = C r y s t a l ) x 3210 ( G l u t . / O s . ) 10 jam b a r F i g u r e 125 ( T E M ) M e m b r a n e a s s o c i a t i o n o f c r y s t a l i n a m p u l l a v a c u o l e . ( G l u t . / O s . ) x 27 4 4 0 1 . 0 jum b a r F i g u r e 126 ( T E M ) C y t o p l a s m o f s p o r a n g i o l e s h o w i n g s u r f a c e s p i n e s , n u c l e u s ( N ) a n d m i t o c h o n d r i a ( M ) . x 13 000 (KMnO^) 1 .0 jum b a r F i g u r e 127 ( T E M ) C o m p a r i s o n o f a m p u l l a w a l l (AW) w i t h s p o r a n g i o l e w a l l . (SW) ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 jum b a r - 1 0 4 -B . t r i s p o r a F i g u r e 128 ( T E M ) Y o u n g s p o r a n g i o l e c o n t a i n i n g n u c l e i ( N ) a n d l i p i d d r o p l e t s ( L ) . ( G l u t . / o s . ) x 6450 1.0 jum b a r F i g u r e 129 ( T E M ) S p o r a n g i o l e w i t h s u r f a c e s p i n e s a n d f o u r n u c l e i ( N ) . x 6000 ( G l u t - A c . / 0 s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 130 ( T E M ) S p o r a n g i o l e c y t o p l a s m p r i o r t o c l e a v a g e . A r r o w s i n d i c a t e p e r i p h e r a l E R . x 8585 (KMnO^) 1 .0 jam b a r F i g u r e 131 ( T E M ) S p o r a n g i o l e s s h o w i n g s u t u r e s . ( a r r o w s ) . x 5170 ( G l u t . / O s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 132 ( T E M ) P e d i c e l c y t o p l a s m . ( G l u t . / O s . ) x 8850 1.0 jam b a r F i g u r e 133 ( T E M ) P e d i c e l c y t o p l a s m , s h o w i n g s e p t u m a t s p o r e s i d e s ( S ) . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 13 440 1.0 jum b a r 106 B . t r i s p o r a F i g u r e 13^ ( T E M ) A l d e h y d e - f i x e d s p o r a n g i o l e s h o w i n g h i g h l i p i d c o n t e n t . ( G l u t . / O s . ) x 8580 1.0 jum b a r F i g u r e 135 ( T E M ) D i s t r i b u t i o n o f ER a n d m i t o c h o n d r i a i n p r e - c l e a v a g e s p o r a n g i o l e . x 9490 (KMnO^) 1 .0 jam b a r F i g u r e 136 ( T E M ) N u c l e u s ( N ) a n d n u c l e a r -membrane p o r e s ( a r r o w ) , x 94-90 (KMnO^) 1 .0 jam b a r F i g u r e 137 ( T E M ) S t a r t o f c l e a v a g e a p p a r a t u s a t s p o r a n g i a l w a l l ( a r r o w s ) x 9290 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 138 ( T E M ) P o l y t u b u l a r b o d i e s ( d o u b l e a r r o w s ) (KMnO^) x 32Q70 1.0 jam b a r F i g u r e 139 ( T E M ) P o l y t u b u l a r b o d y ( d o u b l e a r r o w ) (KMnO^) x 1 6 620 1 . 0 jum b a r - 1 0 8 -B . t r i s p o r a F i g u r e 1 4 0 ( T E M ) G r a n u l e - c o n t a i n i n g v e s i c l e s ( G V ) . (KMnOjL) x 18 2 2 0 1 . 0 urn b a r F i g u r e 1 4 1 ( T E M ) G r a n u l a r v e s i c l e ( G V ) c o n n e c t e d t o s p o r a n g i o l e w a l l . Lomasome ( L ) a l s o c o n n e c t s w i t h w a l l , x 4? 285 (KMnO^) 1.0 jam b a r F i g u r e 142 ( T E M ) M i t o c h o n d r i a (M) s u r r o u n d e d b y c y t o p l a s m i c g l y c o g e n . x 4 8 500 (KMnO^) 1.0 jam b a r F i g u r e 1 4 3 ( T E M ) G l y c o g e n - f i l l e d v a c u o l e . (KMnO^) x 4 6 8 1 0 1 . 0 jam b a r F i g u r e 1 4 4 ( T E M ) G l y c o g e n n e a r s p o r a n g i o l e w a l l . x 25 150 ( G l u t . / O s . ) 1.0 urn b a r F i g u r e 145 ( T E M ) G r a n u l a r c y t o p l a s m n e a r s p o r a n g i o l e w a l l . x 4 8 500 ( G l u t . - A c . / O s ) 1.0 jam b a r B . t r i s p o r a - 110 F i g u r e 1 4 6 ( T E M ) A r e a o f e a r l y s u t u r e f o r m a t i o n c o n t a i n i n g l i p i d s ( L ) a n d v e s i c l e s ( V ) ( G l u t . / O s . ) x 20 750 1.0 jum b a r F i g u r e 1 4 7 ( T E M ) l a t e r s u t u r e f o r m a t i o n . (KMnO^) ;x 22 180 1.0 jam b a r F i g u r e 1 4 8 ( T E M ) C r o s s - s e c t i o n o f s p o r a n g i o l e s h o w i n g i t s t h r e e s u t u r e s , a n d a l a r g e g r a n u l e b o d y ( G B ) . x 5800 (KMnO^) 1.0 Jim b a r F i g u r e 1 4 9 ( T E M ) G r a n u l a r b o d y n e a r s u t u r e . (KMnO^) x 12 510 1.0 jam b a r F i g u r e 150 ( T E M ) S m a l l g r a n u l a r b o d i e s ( G B ) a n d d a r k - s t a i n i n g g r a n u l a r v e s i c l e s ( G V ) (KMnO^) x 13 650 1.0 jam b a r F i g u r e 151 ( T E M ) A s s o c i a t i o n ( a r r o w ) o f g r a n u l a r b o d y ( G B ) w i t h s u t u r e . x 29 640 (KMnO^) l.o jam b a r - 112 ( T E M ) E n l a r g e m e n t o f s u t u r e s . ( G l u t . / O s . ) x 6450 1.0 jam b a r ( T E M ) S u t u r e e n l a r g e m e n t t o w a r d s e a c h o t h e r . E n l a r g i n g z o n e s a r e g r a n u l a r ( a r r o w s ) . x 10 150 ( G l u t . / O s . ) 1.0 yam b a r ( T E M ) C l e a v a g e v e s i c l e s d e l i m i t i n g s p o r e c y t o p l a s m . x 6l60 ( G l u t . / O s . ) 1.0 jam b a r ( T E M ) E x p a n d e d v e s i c l e s f o r m t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s ( C A ) . ( G l u t . / O s . ) x 6350 1.0 jam b a r ( T E M ) C l e a v a g e a p p a r a t u s c o n t a i n i n g s e v e r a l g r a n u l a r b o d i e s , x 4800 ( G l u t . / O s . ) 1.0 jam b a r ( T E M ) C l e a v a g e a p p a r a t u s a p p r o a c h i n g s u t u r e . N o t e b e a d e d m e m b r a n e , ( a r r o w s ) ( e i u t . / O s . ) x 17 770 1.0 jam b a r - 1 1 4 -B . t r i s p o r a F i g u r e 158 ( T E M ) E x p a n s i o n o f c l e a v a g e a p p a r a t u s t o w a r d s t h e t h r e e s u t u r e s . ( G l u t . / O s . ) x 6350 1.0 jam b a r F i g u r e 159 ( T E M ) C y t o p l a s m b e t w e e n s u t u r e a n d c l e a v a g e a p p a r a t u s . x 13 550 ( G l u t . / O s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 160 ( T E M ) G r a n u l a r b o d i e s ( G B ) b e t w e e n s u t u r e a n d c l e a v a g e a p p a r a t u s . (KMnO^) x 21 260 1.0 jum b a r F i g u r e l 6 l ( T E M ) C l e a v a g e v e s i c l e b e t w e e n s u t u r e a n d c l e a v a g e a p p a r a t u s , x 13 550 ( G l u t . / O s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 162 ( T E M ) Two f u s e d c l e a v a g e v e s i c l e ( C V ) . ( G l u t . / O s . ) x 13 550 1.0 urn b a r F i g u r e 163 ( T E M ) C o n n e c t i o n o f c l e a v a g e a p p a r a t u s w i t h s u t u r e . x 13 550 ( G l u t . / O s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 164 ( T E M ) C y t o p l a s m i c d e b r i s i n c l e a v a g e a p p a r a t u s ( d ) . x 22 580 ( G l u t . / O s . ) 1.0 jam b a r - 1 1 6 -( T E M ) C l e a v a g e a p p a r a t u s j o i n i n g two s u t u r e s . x 9100 ( G l u t . / O s . ) 1.0 jum b a r ( T E M ) I r r e g u l a r ER ( a r r o w s ) a d j a c e n t t o c l e a v a g e m e m b r a n e . x 28 8 2 0 ( G l u t . / O s . ) 1 . 0 jum b a r ( T E M ) E x p a n d i n g c l e a v a g e a p p a r a t u s . ( G l u t . / O s . ) x 9 1 0 0 1 . 0 jum b a r ( T E M ) ER p a r a l l e l t o c l e a v a g e a p p a r a t u s . x 28 8 2 0 ( G l u t . / O s . ) 1 . 0 jum b a r ( T E M ) E x p a n d e d g r a n u l a r c l e a v a g e a p p a r a t u s w i t h a p p a r e n t e x t r u s i o n o f c y t o p l a s m ( a r r o w s ) . x 6 l60 ( G l u t . / O s . ) 1 .0 jum b a r ( T E M ) C l e a v a g e a p p a r a t u s c o n n e c t i n g t h r e e s u t u r e s . x 4 8 0 0 ( G l u t . / O s . ) 1 . 0 jum b a r - 118 -B . t r i s p o r a F i g u r e 171 ( S E M ) E n d v i e w o f s p i n y s u r f a c e o f y o u n g s p o r a n g i o l e s . x 3345 10 jam b a r F i g u r e 172 ( S E M ) S i d e v i e w o f a n d p e d i c e l s . y o u n g s p o r a n g i o l e s x 3915 10 jam b a r F i g u r e 173 ( T E M ) C l e a v e d s p o r a n g i o l e s a n d v a c u o l a t e a m p u l l a ( V ) . x 2 2 4 5 ( G l u t / K M n O ^ ) 1 0 jam b a r F i g u r e 1 7 4 ( T E M ) T h r e e - w a y c l e a v a g e o f s p o r a n g i o l e , p r o d u c i n g m u l t i n u c l e a t e ( N ) p r o s p o r e s . ( G l u t . / K M n O ^ ) x 7 0 4 0 1 . 0 jam b a r F i g u r e 175 ( T E M ) P r o s p o r e c y t o p l a s m p r i o r t o w a l l f o r m a t i o n . N o t e p e r i p h e r a l l o c a t i o n o f m i t o c h o n d r i a . ( G l u t . / K M n O ^ ) x 1 0 O65 1 . 0 jum b a r F i g u r e 1?6 ( T E M ) ^ C l e a v a g e membrane ( a r r o w s ) a n d d i f f e r e n t i a t i o n w i t h i n c l e a v a g e a p p a r a t u s . x 28 8 8 0 ( G l u t . / K M n O ^ ) 1 . 0 jum b a r - 120 ( T E M ) E a r l y a m p u l l a c y t o p l a s m c o n t a i n i n g g r a n u l a r b o d y ( G B ) . (KMnOj, ) x 10 020 1.0 jam b a r ( T E M ) L a t e a m p u l l a s h o w i n g e x t e n s i v e v a c u o l a t i o n ( V ) . x 3650 ( G l u t . / O s . ) 10 jam b a r ( T E M ) C r y s t a l i n l a t e a m p u l l a c y t o p l a s m . x 35 530 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 jam b a r ( T E M ) C r y s t a l i n l a t e a m p u l l a c y t o p l a s m . x 113 38O ( G l u t . / O s . ) 0.1 jam b a r ( T E M ) A m p u l l a w i t h m a t u r e s p o r a n g i o l e s . ( G l u t . / K M n O ^ ) x 3580 10 jam b a r - 122 B . t r i s p o r a F i g u r e 182 ( T E M ) S p o r e s i n s p o r a n g i o l e s , n e a r m a t u r i t y . x 2880 (KMnO^) 10 /am b a r F i g u r e I83 ( T E M ) O u t e r w a l l p r o d u c t i o n ( a r r o w s ) . (KMhOj.) x 12 510 1.0 jam b a r F i g u r e 184 ( T E M ) S p o r e s d u r i n g w a l l p r o d u c t i o n . (KMnO^) x 5800 1.0 jam b a r F i g u r e 185 ( T E M ) M e m b r a n e r e m n a n t s i n c l e a v a g e a p p a r a t u s d e s t i n e d t o f o r m s p o r e a p p e n d a g e s ( A ) . x 17 5^0 (KMnO^) 1.0 jam b a r F i g u r e 186 ( T E M ) A l m o s t m a t u r e s p o r e p o s s e s s i n g t h r e e d i s t i n c t w a l l l a y e r s . (KMnO^) x 10 135 1.0 jam b a r F i g u r e I87 ( T E M ) I n t e r d i g i t a t i o n o f s p o r e - w a l l r i d g e s . x 10 135 (KMnO^) 1.0 jam b a r B . t r i s p o r a - 1 2 4 -F i g u r e 1 8 8 ( T E M ) M a t u r e r e l e a s e d s p o r e w i t h t e r m i n a l a p p e n d a g e ( A ) , x 6340 (KMnOi.) 1.0 jum b a r F i g u r e 1 8 9 ( T E M ) D e t a i l o f m e m b r a n o u s ( a r r o w ) a p p e n d a g e . x 37 730 ( G l u t . / K M n O ^ ) 1 .0 jam b a r F i g u r e 190 ( T E M ) M a t u r e s p o r e w i t h i n s p o r a n g i o l e w a l l ( S W ) . x 27 170 ( G l u t . / K M n O ^ ) 1 .0 yam b a r F i g u r e 191 ( T E M ) I n n e r ( A ) m i d d l e ( B ) a n d o u t e r ( C ) w a l l l a y e r s o f m a t u r e s p o r e a f t e r p e r m a n g a n a t e f i x a t i o n . ( G l u t . / K M n O ^ ) x 1 4 4 1 0 1 . 0 jum b a r F i g u r e 192 ( T E M ) S t r u c t u r e o f l o n g i t u d i n a l w a l l r i d g e . x 87 900 ( G l u t . / K M n O ^ ) 0.1 jam b a r F i g u r e 193 ( T E M ) A p p e a r a n c e o f w a l l l a y e r s a f t e r a l d e h y d e f i x a t i o n . x 36 910 ( G l u t . / O s ) 0.2 /am b a r - 1 2 6 B . t r i s p o r a F i g u r e 19^ ( S E M ) Y o u n g s p o r a n g i o l e s o n a m p u l l a . x 1125 10 jam b a r F i g u r e 1 9 5 ( S E M ) M a t u r e s p o r a n g i o l e s s p l i t t i n g a l o n g s u t u r e s ( a r r o w s ) , x 2000 10 jam b a r F i g u r e 1 9 6 ( S E M ) C o l l a p s e d s p o r a n g i o l e w a l l c o v e r e d w i t h s p i n e s . x 6625 1 . 0 jum b a r F i g u r e 1 9 7 ( S E M ) M a t u r e s p o r a n g i o l e w a l l s p l i t a l o n g s u t u r e s t o r e v e a l r i d g e d s p o r e w a l l s w i t h o u t s p i n e s . x 7 8 3 0 1 . 0 jum b a r F i g u r e 1 9 8 ( S E M ) R e l e a s e d s p o r e , l a t e r a l v i e w s h o w i n g r i d g e s o f o u t e r w a l l (0W) i n c o m p a r i s o n w i t h s p i n y s u r f a c e o f s p o r a n g i o l e w a l l ( S W ) . x 6 8 2 5 1. 0 jum b a r F i g u r e 1 9 9 ( S E M ) P e d i c e l s ( P ) o n a m p u l l a a f t e r s p o r a n g i o l e s h a v e b r o k e n o f f . x 2 8 0 0 1 0 jum b a r - 128 ( S E M ) M a t u r e s p o r a n g i o l e x 5625 1.0 )xm b a r ( S E M ) R e l e a s e d s p o r a n g i o l e . A r r o w i n d i c a t e s p e d i c e l a t t a c h m e n t p o i n t . x 5625 1.0 pxa. b a r ( S E M ) " B e a d e d ' s p o r a n g i o p h o r e b r a n c h e s , x 690 10 11m b a r ( S E M ) M u l t i s p o r o u s c o l u m e l l a t e s p o r a n g i u m s p l i t a l o n g s i n g l e s u t u r e l i n e . x 1125 10 jam b a r ( S E M ) S p i n y s p o r g a n i u m w a l l a n d s p i n e s o n t o p s e c t i o n o f s p o r a n g i o p h o r e . x 2250 10 pm b a r ( S E M ) R i d g e d s p o r e w a l l s i n s i d e s p i n y s p o r a n g i u m w a l l . x 5000 1.0 jum b a r - 130 D . D e v e l o p m e n t o f M u l t i s p o r o u s S p o r a n g i a i n B l a k e s l e a t r i s p o r a S p o r e d e v e l o p m e n t i n l a r g e c o l u m e l l a t e s p o r a n g i a ( F i g u r e 203) was f o u n d t o p r o c e e d p r e c i s e l y a s t h a t d e s c r i b e d f o r C h o a n e p h o r a . S p o r e s w i t h l o n g i t u d i n a l r i d g e s a r e r e l e a s e d b y f r a c t u r e o f t h e s p o r a n g i a l w a l l a l o n g t h e s i n g l e s u t u r e l i n e ( F i g u r e s 203, 2 0 4 ) . T h e s p o r e s u r f a c e s b e a r no s p i n e s w h i l e t h e s p o r a n g i a l w a l l i s c o v e r e d w i t h s p i n e s ( F i g u r e 205). I n t e r n a l l y t h e y o u n g s p o r a n g i u m ( F i g u r e 2 0 6 ) c o n t a i n s n u m e r o u s n u c l e i , m i t o c h o n d r i a a n d s e v e r a l t y p e s o f v e s i c l e s , a s d e s c r i b e d f o r C h o a n e p h o r a . F o l l o w i n g c l e a v a g e o f t h e c y t o p l a s m i n t o s p o r e s a n d c o l u m e l l a b y a c l e a v a g e a p p a r a t u s ( F i g u r e 2 0 7 ) s p o r e w a l l s a r e p r o d u c e d . A t a l l s t a g e s t h e s p o r a n g i a l w a l l c a n b e i d e n t i f i e d b y t h e p r e s e n c e o f s p i n e s ( F i g u r e s 2 0 6 , 2 0 7 , 208 a r r o w s ) . I n a l d e h y d e - f i x e d s p o r e s ( F i g u r e s 208 a n d 209) t h e r e i s n o d i s t i n c t m i d d l e l a y e r i n s p o r e w a l l s . T h e o u t e r l a y e r r e s e m b l e s t h a t i n C h o a n e p h o r a s p o r a n g i o s p o r e s ( F i g u r e 1 0 7 ) . No m u l t i p l e l a y e r s w e r e o b s e r v e d i n t h e i n n e r w a l l l a y e r a s w e r e n o t e d i n some C h o a n e p h o r a s p o r e w a l l s ( F i g u r e s 1 0 4 - 1 0 6 ) . 131 M a t u r e p e r m a n g a n a t e - f i x e d s p o r e s ( F i g u r e 210) show t h e t y p i c a l d a r k - s t a i n i n g w a l l r i d g e s a n d t h e c o n t i n u o u s e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t i n n e r w a l l . S e v e r a l g i a n t s p o r e s ( G S ) w e r e o b s e r v e d , p r e s u m a b l y a r e s u l t o f i n c o m p l e t e c l e a v a g e . F i g u r e 211 d e p i c t s a s p o r a n g i u m w h i c h h a s f a l l e n o n t o a s p o r a n g i o l a r h e a d . T h e s p o r a n g i o s p o r e s ( a ) d i f f e r e x t e r n a l l y o n l y i n s i z e (6.0 x 13.0 jum) f r o m s p o r a n g i o l o s p o r e s (9-0 x 20.0 jum). - 132 B . t r i s p o r a F i g u r e 206 ( T E M ) C y t o p l a s m o f y o u n g m u l t i s p o r o u s c o l u m e l l a t e s p o r a n g i u m , c o n t a i n i n g n u c l e i ( N ) v e s i c l e s ( V E ) a n d v a c u o l e s ( V ) . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 4980 10 jum b a r F i g u r e 20? ( T E M ) M a t u r i n g s p o r e s w i t h i n s p i n e -c o v e r e d ( a r r o w ) s p o r a n g i u m w a l l . ( G l u t . / O s . ) x 3300 10 jum b a r F i g u r e 208 ( T E M ) S p o r e w a l l l a y e r s w i t h i n s p o r a n g i u m w a l l ( a r r o w ) , x 6450 '~ 1.0 jum b a r ( G l u t . / O s . ) F i g u r e 209 ( T E M ) C o m p a r i s o n o f s p o r e w a l l l a y e r s , i n n e r (IW) a n d o u t e r (0W); a n d o f s p o r e c y t o p l a s m w i t h c o l u m e l l a c y t o p l a s m ( C ) . ( G l u t . / O s . ) x 39 150 1.0 jam b a r F i g u r e 210 ( T E M ) M a t u r e s p o r e s i n s p o r a n g i u m w h i c h p a r t i a l l y o p e n e d d u r i n g p r o c e s s i n g . N o t e g i a n t s p o r e ( G S ) . x 1335 ( G l u t . / K M n O ^ ) 10 jum b a r F i g u r e 211 ( S E M ) C o m p a r i s o n o f s i z e s o f s p o r a n g i o s p o r e s ( a ) a n d s p o r a n g i o l o s p o r e s ( b ) . A r r o w i n d i c a t e s s p o r a n g i o l o s p o r e e x p o s e d b y r u p t u r e o f s p o r a n g i o l e w a l l . x 1150 10 /am b a r - 134 -v - R e p r o d u c t i v e D e v e l o p m e n t i n t h e C u n n i n g h a m e l l a c e a e I n t r o d u c t i o n : P r e v i o u s u l t r a s t r u e t u r a l o b s e r v a t i o n s o f t h e C u n n i n g h a m e l l a c e a e ( s e n s u H e s s e l t i n e a n d E l l i s , 1973) h a v e b e e n r e s t r i c t e d t o t h e two g e n e r a o f t h e p r e s e n t s t u d y ; C u n n i n g h a m e l l a a n d M y c o t y p h a . I n a n e a r l y s t u d y o f s p i n e s t r u c t u r e , K a w a k a m i (1955) s u g g e s t e d t h a t s p i n e s o f C u n n i n g h a m e l l a h a d h e x a g o n a l b a s e s , a s h a p e c o n s i s t e n t w i t h a c r y s t a l l i n e c o n s t r u c t i o n . Y o u n g (1968 b ) a l s o c o n s i d e r e d t h e b a s e s t o be h e x a g o n a l . M o s t r e c e n t o b s e r v a t i o n s o f s p i n e s b y t r a n s m i s s i o n a n d s c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y ( H a w k e r e t a l . , 1970; H a w k e r , 1971) h a v e f a i l e d t o c o n f i r m t h e e x i s t e n c e o f a h e x a g o n a l b a s e s t r u c t u r e . H o w e v e r a s t u d y o f t h e s e s p i n e s u t i l i z i n g E l e c t r o n - P r o b e M i c r o a n a l y s i s ( J o n e s e t a l . , 1 9 7 6 ) h a s d e m o n s t r a t e d t h e p r e s e n c e o f c r y s t a l l i n e c a l c i u m o x a l a t e d i h y d r a t e a s a m a j o r c o n s t i t u e n t . S p o r e g e r m i n a t i o n i n C u n n i n g h a m e l l a was d e s c r i b e d b r i e f l y b y H a w k e r (1966) a n d l a t e r b y D y k s t r a (1974) a n d K h a n (1975) whose i n t e r p r e t a t i o n s o f w a l l s t r u c t u r e d i f f e r e d g r e a t l y . K a h n (I978)has r e c e n t l y d i s c u s s e d t h e o c c u r r e n c e o f G o l g i c i s t e r n a e i n g e r m i n a t i n g C u n n i n g h a m e l l a s p o r e s . - 135 I n t h e o n l y e a r l y s t u d y o f M y c o t y p h a . Y o u n g (1969 b ) r e l i e d e n t i r e l y o n r e p l i c a t e c h n i q u e s t o o b s e r v e s p o r e s u r f a c e s . D u r i n g t h e c o u r s e o f t h e p r e s e n t s t u d y , a p a p e r was p r e s e n t e d b y K h a n a n d T a l b o t (1975) w h i c h i l l u s t r a t e s s e v e r a l s t a g e s o f s p o r e p r o d u c t i o n i n C u n n i n g h a m e l l a a n d M y c o t y p h a a n d c o n c l u s i v e l y d e m o n s t r a t e s t h a t p r o p a g u l e s o f b o t h s p e c i e s a r e m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s a n d n o t c o n i d i a . A p p a r e n t l y u n a w a r e o f K h a n a n d T a l b o t ' s p a p e r , C o o k (1977) c o n s i d e r e d C u n n i n g h a m e l l a p r o p a g u l e s t o b e O e d o c e p h a l u m - t y p e c o n i d i a . T h e r e s u l t s p r e s e n t e d i n t h e p r e s e n t r e p o r t c o n f i r m t h e r e s u l t s o f K h a n a n d T a l b o t (1975) a n d e x p a n d u p o n t h e m b y u t i l i z i n g a d d i t i o n a l t e c h n i q u e s a n d b y p r o v i d i n g m o r e d e t a i l e d o b s e r v a t i o n s o f some s t a g e s o f s p o r u l a t i o n . - 136 A . D e v e l o p m e n t o f M o n s p o r o u s S p o r a n g i o l e s i n D u n n i n g h a m e l l a e c h i n u l a t a I n y o u n g s p o r u l a t i n g c o l o n i e s , s e v e r a l s t a g e s o f s p o r a n g i o l e p r o d u c t i o n o c c u r s i m u l t a n e o u s l y ; t h e l a r g e t e r m i n a l a m p u l l a e b e g i n t o f o r m p e d i c e l s w h i l e s u b t e r m i n a l a m p u l l a e a l r e a d y b e a r m a t u r i n g s p o r a n g i o l e s ( F i g u r e 2 1 2 ) . T h e s u r f a c e s o f a m p u l l a e a r e c o v e r e d w i t h s m a l l s p i n e s , s h o w n i n s u r f a c e v i e w i n F i g u r e 213 a n d i n c r o s s - s e c t i o n i n F i g u r e s 2 1 4 a n d 215. T h e s e s p i n e s a r e n o t r e s t r i c t e d t o t h e a m p u l l a e b u t e x t e n d down t h e s u r f a c e o f t h e s p o r a n g i o p h o r e . P e d i c e l . p r o d u c t i o n o c c u r s a t d i f f e r e n t t i m e s o n d i f f e r e n t p a r t s o f a n a m p u l l a ( F i g u r e 213). S e v e r a l p e d i c e l s h a v e f o r m e d o n o n e s i d e o f t h e a m p u l l a w h i l e o n l y s l i g h t bumps i n d i c a t e t h e l o c a t i o n s o f f u t u r e p e d i c e l s o n t h e r e m a i n i n g a m p u l l a s u r f a c e . I n s e c t i o n s o f y o u n g a m p u l l a e ( F i g u r e s 2 1 4 , 215) n u c l e i a r e v e r y n u m e r o u s a n d t e n d t o be l o c a t e d p e r i p h e r a l l y . T h e c e n t r a l c y t o p l a s m u s u a l l y c o n t a i n s v a c u o l a r s t r u c t u r e s . S m a l l e r v a c u o l e s o c c u r i n t h e p e r i p h e r a l c y t o p l a s m , a n d a r e o f t e n a s s o c i a t e d w i t h d a r k - s t a i n i n g g r a n u l a r v e s i c l e s ( F i g u r e 215; g v ) . Wheni ."the a m p u l l a i s c o v e r e d w i t h p e d i c e l s i t a p p e a r -a s s h o w n i n F i g u r e 216 a n d 2 1 ? i n l i g h t m i c r o s c o p e a n d - 137 s c a n n i n g EM r e s p e c t i v e l y . T h e p e d i c e l s a r e e v e n l y s p a c e d 5 Jim a p a r t o n t h e s u r f a c e , t h e i r n u m b e r s d e p e n d e n t o n t h e a m p u l l a s i z e : f i f t y t o o n e h u n d r e d b e i n g t y p i c a l . T h e w a l l o f t h e p e d i c e l a p p e a r s t o f o r m f r o m t h e o u t e r w a l l l a y e r ( F i g u r e s 221 t o 223) a s n o t e d b y K h a n a n d T a l b o t (1975) ' H o w e v e r t h e two l a y e r s o f t h e a m p u l l a w a l l a r e n o t a l w a y s d i s t i c t : t h i s l e d C o o k (1977) t o s t a t e t h a t p e d i c e l a n d a m p u l l a w e r e o n e c o n t i n u o u s s i n g l e - l a y e r e d w a l l . I n t e r n a l l y , no m e c h a n i s m f o r p e d i c e l s p a c i n g i s a p p a r e n t ( F i g u r e s 218, 219) . M i t o c h o n d r i a a n d g r a n u l a r v e s i c l e s a r e m o r e n u m e r o u s n e a r t h e p e d i c e l b a s e s , w h i l e n u c l e i a r e u s u a l l y e x c l u d e d f r o m t h e s e a r e a s o f s l i g h t l y m o r e d e n s e c y t o p l a s m . T h e d a r k -s t a i n i n g g r a n u l a r v e s i c l e s o f t e n a n a s t o m o s e a t p e d i c e l b a s e s o r i n a s s o c i a t i o n w i t h m i t o c h o n d r i a ( F i g u r e 219) . I n F i g u r e 220 a l a r g e v a c u o l e c o n t a i n i n g 80 - 100 nm g r a n u l e s i s s h o w n . S u c h v a c u o l e s w e r e r a r e l y s e e n , b u t may r e p r e s e n t a s u p p l y o f g l y c o g e n ( R e v e l , 1964) a s r e p o r t e d b y C o o k (1977). T h e t i p o f e a c h p e d i c e l c o n t a i n s n u m e r o u s s m a l l v e s i c l e s ( F i g u r e 221, a r r o w s ) a n d l o m a s o m e - l i k e s t r u c t u r e s ( F i g u r e s 222, 223, L ) . T h e g r a n u l a r v e s i c l e s - 138 s h o w n i n F i g u r e 221 a r e b o u n d e d b y d o u b l e m e m b r a n e s , perhaps of n u c l e a r o r m i t o c h o n d r i a l o r i g i n . T y p i c a l a s s o c i a t i o n s o f a g r a n u l a r v e s i c l e a n d m i t o c h o n d r a a s e s h o w n i n F i g u r e s 222 a n d 223* S t r a n d s o f E . R . ( F i g u r e 222, a r r o w s ) a r e n o t a b u n d a n t i n a m p u l l a c y t o p l a s m , b u t a r e e n c o u n t e r e d m o r e f r e q u e n t l y n e a r p e d i c e l s t h a n e l s e w h e r e . B e f o r e t h e p e d i c e l s a r e f u l l y d e v e l o p e d , t h e i r e n d s b e g i n t o s w e l l a n d f o r m t h e y o u n g s p o r a n g i o l e s . U n d e r l i g h t m i c r o s c o p y ( F i g u r e 2 2 4 ) t h e s w e l l i n g p e d i c e l t i p s a r e j u s t r e c o g n i z a b l e . When o b s e r v e d i n t h e SEM ( F i g u r e s 225 t o 227) t h e s p o r a n g i o l e s u r f a c e s a r e s e e n t o b e c o v e r e d w i t h s m a l l s p i n e s ( C o o k 1977). T h e p e d i c e l s , i n c o n t r a s t , a r e a l m o s t s p i n e - f r e e ( F i g u r e 226, P ) . A t t h i s s t a g e t h e s p o r a n g i o l a r s p i n e s a r e s m a l l e r t h a n t h o s e o n t h e a m p u l l a s u r f a c e ( F i g u r e 227)-T h e y o u n g s p o r a n g i o l e s c o n t i n u e t o e x p a n d u n t i l t h e y f o r m l a r g e s p h e r i c a l s t r u c t u r e s o n t h e i r p e d i c e l s ( F i g u r e 228) . I n t e r n a l l y t h e y o u n g s p o r a n g i o l e s c o n t a i n n u m e r o u s m i t o c h o n d r i a a n d v e s i c l e s , b u t u s u a l l y o n l y o n e n u c l e u s i s v i s i b l e a t t h i s s t a g e ( F i g u r e 2 2 9 ) . T h e w a l l o f t h e s p o r a n g i o l e i s c o n t i n u o u s w i t h t h a t o f t h e p e d i c e l ( F i g u r e 231) . T h e a m p u l l a - 139 w a l l i s a l s o c o n t i n u o u s w i t h t h e p e d i c e l w a l l , h u t i s much t h i c k e r ( F i g u r e s 230, 231). T h e s m a l l v e s i c l e s ( F i g u r e 231, a r r o w s ) a n d l o m a s o m e s ( F i g u r e 231, L ) n o t e d e a r l i e r i n p e d i c e l t i p s , a r e now f o u n d i n t h e y o u n g s p o r a n g i o l e s . A t t h i s s t a g e o f s p o r a n g i o l e d e v e l o p m e n t , t h e a m p u l l a c o n t a i n s many e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t v a c u o l e s t h r o u g h o u t i t s c y t o p l a s m ( F i g u r e s 232,233). S i m i l a r v a c u o l a t i o n o c c u r s a l o n g t h e a m p u l l a w a l l ( F i g u r e 232, a r r o w s ) a n d a t t h e b a s e s o f p e d i c e l s ( F i g u r e 23^) b u t n o t a l o n g s p o r a n g i o l a r w a l l s . O t h e r c y t o p l a s m i c s t r u c t u r e s i n t h e a m p u l l a a r e c o n c e n t r i c m e m b r a n o u s b o d i e s ( F l e t c h e r , 1973) ( F i g u r e 235» cmb) w h i c h r e s e m b l e p l a s m a l e m a s o m e s ( M a r c h a n t a n d R o b a r d s , 1968). I r r e g u l a r c h a n n e l s , a p p a r e n t l y p r o d u c e d b y f u s i o n o f s m a l l v e s i c l e s ( F i g u r e 235» a r r o w s ) , a r e a l s o common f e a t u r e s . S p o r e w a l l f o r m a t i o n o c c u r s w i t h i n t h e s p o r a n g i o l e w a l l s . G r a n u l a r v e s i c l e s a r e a b u n d a n t i n t h e p e r i p h e r a l c y t o p l a s m o f t y p i c a l s p o r a n g i o l e s ( F i g u r e 236) a n d a p p e a r t o f u s e w i t h t h e p l a s m a membrane ( F i g u r e 237, G V ) . O t h e r s e c t i o n s show g r a n u l a r v e s i c l e s f i l l i n g m o s t o f t h e s p o r a n g i o l a r c y t o p l a s m ( F i g u r e 238). T h e f i r s t new w a l l l a y e r t o b e d e t e c t e d i s t h e o u t e r w a l l ( F i g u r e 239. OW), s e p a r a t e d f r o m t h e s p o r a n g i o l e w a l l (SW) b y a s m a l l - 1 4 0 -( 0 . 1 pm) s p a c e . T h i s s p a c e may h a v e b e e n i n t e r p r e t e d a s a s p o r a n g i a l w a l l l a y e r b y C o o k (1977)• I n t h e p r e s e n t s t u d y a n d i n t h a t o f K h a n a n d T a l b o t (1975) n o i n c r e a s e i n s p o r a n g i a l w a l l t h i c k n e s s o c c u r s d u r i n g s p o r o g e n e s i s . T h e s p o r a n g i o l e w a l l i s o f t e n c o v e r e d w i t h a t h i n s u r f a c e c o a t ( S C ) c o n t i n u o u s w i t h t h e s m a l l s p i n e s ( S S ) . A t t h i s s t a g e o f w a l l f o r m a t i o n , a n i n c r e a s e i n ER i s n o t e d i n t h e p e r i p h e r a l c y t o p l a s m . M a n y s p o r a n g i o l e s w e r e o b s e r v e d t o h a v e l a r g e s u r f a c e s p i n e s ( F i g u r e 2 4 0 ) a t t h e s t a r t o f s p o r e w a l l f o r m a t i o n . I n p e r m a n g a n a t e - f i x e d m a t e r i a l , t h e s e s p i n e s a p p e a r t o b e o f s i m i l a r c o n s t r u c t i o n t o t h e s u r f a c e c o a t . B o t h t h e s u r f a c e c o a t a n d s p i n e m a t e r i a l s s t a i n i n a m a n n e r s i m i l a r t o t h e c o n t e n t s o f g r a n u l a r v e s i c l e s . T h e r e i s , h o w e v e r , a g r e a t e r a m o u n t o f t h i s m a t e r i a l a v a i l a b l e t h a n c o u l d be r e q u i r e d t o p r o d u c e t h e s p i n e s a n d s u r f a c e c o a t . I t s e e m s m o r e l i k e l y t h a t t h i s g r a n u l a r m a t e r i a l i s d e s t i n e d f o r i n c o r p o r a t i o n i n t o w a l l s . T h e p r e s e n c e o f l o m a s o m e s ( F i g u r e 2 4 l L ) a n d s m a l l v e s i c l e s ( F i g u r e 2 4 2 , a r r o w ) a l o n g t h e s p o r a n g i o l a r membrane p r i o r t o a d e t e c t a b l e s p o r e w a l l may i n d i c a t e t h e i r i n v o l v e m e n t i n s p i n e p r o d u c t i o n . - 1 4 1 I n F i g u r e 2 4 l ( a r r o w ) a n a p p a r e n t c o n n e c t i o n b e t w e e n a n u c l e u s a n d a g r a n u l a r v e s i c l e i s i l l u s t r a t e d . T h i s i n d i c a t e s a p o s s i b l e o r i g i n o f t h e d o u b l e membrane o f t h e s e v e s i c l e s . P r i o r t o t h e s t a g e o f w a l l f o r m a t i o n t h e m i t o c h o n d r i a a r e t y p i c a l l y s e e n i n t h e e l o n g a t e d o r " d u m b e l l " s h a p e ( F i g u r e 2 4 3 ) c o n t a i n i n g f e w c r i s t a e . D u r i n g w a l l f o r m a t i o n m o s t m i t o c h o n d r a a r e o v o i d w i t h m o r e a b u n d a n t c r i s t a e ( : F i g u r e s 2 4 0 , 2 4 8 ) . F i g u r e 2 4 4 s h o w s s u r f a c e s p i n e s o n y o u n g s p o r a n g i o l e s a s v i e w e d i n t h e S E M . S p i n e s t r u c t u r e i s v e r y d i f f e r e n t when p r e s e r v e d b y a l d e h y d e f i x a t i o n ( F i g u r e s 2 4 5 t o 2 4 7 ) a s c o m p a r e d t o p e r m a n g a n a t e f i x a t i o n ( F i g u r e s 2 4 2 , 2 4 8 , 2 4 9 ) . I n a l d e h y d e - p r e s e r v e d m a t e r i a l , t h e s p i n e b a s e s a r e v e r y a n g u l a r a n d d e n s e , t a p e r i n g a t t h e i r t i p s t o a t h i n m e m b r a n o u s l a y e r . I n t h e s h o r t i n c o m p l e t e l y -f o r m e d s p i n e s ( F i g u r e 245), t h i s t h i n l a y e r f o r m s a c o v e r i n g o v e r t h e a n g u l a r c a v i t y . T h e t h i c k e n e d " w a l l s " o f t h e s p i n e b a s e s , t r i a n g u l a r i n s e c t i o n , a r e i n d i r e c t c o n t a c t w i t h t h e s p o r a n g i o l e w a l l ( F i g u r e s 245 t o 2 4 7 ) . S e v e r a l s p i n e s w e r e o b s e r v e d w i t h d e n d r i t i c i n c l u s i o n s c e n t r a l l y l o c a t e d i n t h e b a s a l c a v i t y ( F i g u r e 2 4 6 , a r r o w ) . - 1 4 2 T h e a n g u l a r n a t u r e o f t h e "base c a v i t y s u g g e s t f o r m a t i o n a r o u n d a c r y s t a l l i n e s t r u c t u r e w h i c h h a s b e e n r e m o v e d b y p r o c e s s i n g t e c h n i q u e s . H e x a g o n a l e x t e r i o r s o f s p i n e b a s e s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d i n s p o r e r e p l i c a s b y Y o u n g (1968 b ) . T h i s s h a p e may b e l o s t d u r i n g p r o c e s s i n g f o r T E M o r SEM b u t p r e s e r v e d i n r e p l i c a t i o n t e c h n i q u e s . I n s e v e r a l s p o r a n g i o l e s a n a s s o c i a t i o n o f g r a n u l a r v e s i c l e s o c c u r s w i t h e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t v a c u o l e s ( F i g u r e 2 4 8 , a r r o w s ) . T h e v a c u o l e s u s u a l l y s u r r o u n d o n e e n d o f t h e g r a n u l a r v e s i c l e s . S u c h c u p - s h a p e d v e s i c l e s may r e p r e s e n t a f u n g a l f o r m o f G o l g i c i s t e r n a e a s s u g g e s t e d b y B r a c k e r (1966) a n d K h a n (1978). I n c o n t r a s t t o a l d e h y d e - f i x e d m a t e r i a l , F i g u r e 2 4 9 s h o w s t h e c o r r e s p o n d i n g w a l l a n d s p i n e s t r u c t u r e s f o l l o w i n g p e r m a n g a n a t e f i x a t i o n . T h e s p i n e h a s n e i t h e r a n g u l a r b a s e n o r t r i a n g u l a r s u p p o r t s , b u t i n s t e a d a p p e a r s m e m b r a n o u s a n d c o n t i n u o u s w i t h t h e s u r f a c e c o a t ( S C ) . No a t t a c h m e n t t o t h e s p o r a n g i a l w a l l (SW) i s e v i d e n t . S p o r a n g i a l s p i n e s a r e f o r m e d a l l o v e r t h e s u r f a c e b u t e n d a b r u p t l y a t t h e p e d i c e l ( F i g u r e 2 5 0 ) . T h e r e , i s n o a p p a r e n t d i f f e r e n c e i n w a l l s t r u c t u r e o r c y t o p l a s m i c c o n t e n t a t t h e s p o r a n g i o l e - p e d i c e l j u n c t u r e ( F i g u r e 251) . T h e s w o l l e n b a s e s o f s p i n e s e v i d e n t i n a l d e h y d e - f i x e d m a t e r i a l a r e a l s o o b s e r v e d i n f r e e z e - d r i e d SEM s p e c i m e n s ( F i g u r e 252. T h e s e b a s a l s w e l l i n g s a r e r a r e l y - 1 4 3 s e e n a f t e r p e r m a n g a n a t e - f i x a t i o n ; F i g u r e 254 s h o w s t h e e x t e n t o f b a s e p r e s e r v a t i o n . D u r i n g o u t e r s p o r e w a l l f o r m a t i o n , t h e c y t o p l a s m s h o w s l i t t l e c h a n g e f r o m e a r l i e r s t a g e s . T h e t h i n , 50 nm o u t e r w a l l i s v e r y f l e x i b l e a t t h i s s t a g e a n d i s o f t e n h i g h l y c o n v o l u t e d ( F i g u r e 253)* T h e s u r f a c e s p i n e s ( F i g u r e 254) a r e c o m p o s e d o f a h o l l o w t u b e w i t h t h i n w a l l s , 3° nm t h i c k . T h e r e a r e f o u r l a y e r s v i s i b l e i n t h e s p i n e " w a l l " : t h e o u t e r d a r k s t a i n i n g l a y e r ( l a r g e a r r o w ) 2 - 3 nm t h i c k e n c l o s e s a n e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t l a y e r 5 - 7 nm t h i c k . T h e t h i r d l a y e r ( s m a l l a r r o w ) i s a l s o e l e c t r o n - d e n s e a n d i s a p p r o x i m a t e l y 10 nm i n t h i c k n e s s . T h e f o u r t h a n d i n n e r m o s t l a y e r ( d o u b l e a r r o w s ) i s o f i n t e r m e d i a t e e l e c t r o n - d e n s i t y a n d i s 5 - 7 nm t h i c k . A n a l t e r n a t e i n t e r p r e t a t i o n i s t h a t i t c o n s i s t s o f two u n i t m e m b r a n e s w i t h e l e c t r o n - d e n s e m a t e r i a l i n b e t w e e n . I n s u f f i c i e n t m i c r o g r a p h s o f h i g h r e s o l u t i o n w e r e o b t a i n e d t o e n a b l e f u r t h e r e l u c i d a t i o n o f s p i n e c o n s t r u c t i o n . A l m o s t m a t u r e s p o r a n g i o l e s a r e i l l u s t r a t e d b y l i g h t -m i c r o s c o p y ( F i g u r e 255) a n d S c a n n i n g E M ( F i g u r e 256). I n a l d e h y d e - f i x e d s p o r a n g i o l e s t h e s p o r e o u t e r w a l l s t a i n s much d a r k e r ( F i g u r e 258, 0W) t h a n s e e n p r e v i o u s l y i n p e r m a n g a n a t e - f i x e d m a t e r i a l . A t t h i s s t a g e , n e a r m a t u r i t y , t h e p e d i c e l s a r e d e v o i d o f c y t o p l a s m a n d t h e a m p u l l a h a s b e e n s e a l e d o f f ( F i g u r e 257) b y a t h i n s e p t u m - 144 s i m i l a r t o t h a t i n S y n c e p h a l a s t r u m r a c e m o s u m ( F l e t c h e r , 1972 a ) . N e a r m a t u r i t y , many s m a l l e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t v e s i c l e s a p p e a r , b o t h i n a l d e h y d e ( F i g u r e s 258, 259 v e ) a n d p e r m a n g a n a t e - f i x e d t i s s u e s ( F i g u r e 260 v e ) . F o l l o w i n g s y n t h e s i s o f t h e t h i n , e l e c t r o n - d e n s e o u t e r w a l l l a y e r , a much t h i c k e r i n n e r l a y e r i s p r o d u c e d . T h e i n n e r w a l l i s e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t a n d 0.1 t o 0.2 um i n t h i c k n e s s ( F i g u r e 2 6 l ) . T h e s p o r a n g i o l e w a l l i s c l o s e l y a s s o c i a t e d w i t h t h e o u t e r s p o r e w a l l ; t h e two b e i n g s e p a r a t e d b y a 0.1 um s p a c e . T h r o u g h o u t t h i s s p a c e , s t r a n d s r e s e m b l i n g s p o r a n g i a l w a l l m a t e r i a l a p p e a r t o c o n n e c t t h e two w a l l s ( F i g u r e 2 6 l a n d 2 6 2 ) . T h e s p o r a n g i a l w a l l i s p h y s i c a l l y s e p a r a t e d f r o m t h e s p o r e w a l l o n l y i n t h e a r e a o f p e d i c e l a t t a c h m e n t ( F i g u r e 263) . I n t h i s a r e a t h e s p o r e w a l l f o r m s a c o n c a v i t y f a c i n g t h e p e d i c e l , t h e r e b y s e p a r a t i n g t h e two w a l l s . A f e u l g e n - s t a i n e d p l a s t i c - e m b e d d e d s e c t i o n o f m a t u r e r e p r o d u c t i v e s t r u c t u r e s ( F i g ; , 264) show t h e m u l t i n u c l e a t e c o n d i t i o n o f a m p u l l a a n d s p o r a n g i o l e s . F e u l g e n s t a i n i n g o f p l a s t i c - e m b e d d e d s e c t i o n s was f o u n d t o b e t o o i n c o n s i s t e n t t o f o l l o w t h e n u c l e a r c o n d i t i o n t h r o u g h o u t t h e r e p r o d u c t i v e p r o c e s s . . .,. When t h e s p o r a n g i o l e s a r e m a t u r e t h e y c o v e r t h e a m p u l l a c o m p l e t e l y , b u t a r e s e p a r a t e d f r o m o n e a n o t h e r b y a t l e a s t t h e l e n g t h o f t h e i r s p i n e s - 145 ( F i g u r e 265) . T h u s t h e s p i n e s p r e v e n t c o n t a c t b e t w e e n a d j a c e n t s p o r a n g i o l a r s u r f a c e s . T h e r e l e a s e o f s p o r a n g i o l e s i s b y f r a c t u r e o f t h e p e d i c e l w a l l , w h i c h b e c o m e s t h i n a n d w e a k e n e d ( F i g u r e 2 6 6 ) . B l o c k a g e o f t h e p e d i c e l b y a n i n n e r l a y e r o f s p o r a n g i a l w a l l , a s d e s c r i b e d b y C o o k (197?) was n o t o b s e r v e d . T h e a m p u l l a c y t o p l a s m i s p r e v e n t e d f r o m l e a k i n g b y t h e f o r m a t i o n o f a new w a l l . T h i s i s u s u a l l y t h i n ( F i g u r e 266) , b u t o c c a s i o n a l l y i t i s a s t h i c k a s t h e o r i g i n a l a m p u l l a w a l l ( F i g u r e 268). T h e f i b r o u s s t r u c t u r e o f t h e s e w a l l s i s a p p a r e n t i n F i g u r e 268. T h e p r e s e n c e o f t u b u l a r E R ( T ) i s u n u s u a l a t t h i s l a t e s t a g e o f d e v e l o p m e n t . T h e p e d i c e l i s e s s e n t i a l l y d e v o i d o f c y t o p l a s m e x c e p t f o r o c c a s i o n a l i s o l a t e d o r g a n e l l e s , ( F i g u r e 268 P C ) t r a p p e d b e t w e e n t h e s p o r e w a l l a n d t h e new a m p u l l a w a l l . A p o s s i b l e t h i r d l a y e r i & m a t u r e s p o r e w a l l s was o b s e r v e d i n some p r e p a r a t i o n s , ( F i g u r e s 2 6 l , 263, 267) . T h i s l a y e r i s i n n e r m o s t , i m m e d i a t e l y n e x t t o t h e s p o r e p l a s m a m e m b r a n e . I t i s e l e c t r o n - d e n s e a n d i s 15 t o 20 nm t h i c k . W a l l - l a y e r i d e n t i f i c a t i o n i s o f g r e a t i m p o r t a n c e i n s t u d i e s o f s p o r e g e r m i n a t i o n a n d t h e p r e s e n c e o f t h i s t h i r d l a y e r i s a n e x c e p t i o n t o t h e s t a n d a r d t w o - l a y e r w a l l r e p o r t e d i n o t h e r Z y g o m y c e t e s s t u d i e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y . - 1 4 6 -F i g u r e 269 d e p i c t s t h e p e d i c e l r e m n a n t o n a r e l e a s e d s p o r a n g i o l e . T h e a r e a i n t h e c o n c a v i t y o f t h e s p o r e w a l l i s much m o r e e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t t h a n t h e e m b e d d i n g m a t r i x o r p e d i c e l , s u g g e s t i n g t h e p r e s e n c e o f some i n d i s c e r n i b l e m a t e r i a l i n t h i s l o c a t i o n . - 1 4 7 C . e c h i n u l a t a F i g u r e 212 ( S E M ) M y c e l i u m w i t h y o u n g a m p u l l a e . x 4 0 0 0 . 1 mm b a r F i g u r e 213 ( S E M ) Y o u n g A m p u l l a x 3000 2.0 jam b a r F i g u r e 2 1 4 ( T E M ) S e c t i o n o f y o u n g a m p u l l a , s h o w i n g c e n t r a l v a c u o l e s y s t e m ( V ) a n d n u c l e i ( N ) . x 3300 (KMnO^) 10 jam b a r F i g u r e 215 ( T E M ) C y t o p l a s m o f y o u n g a m p u l l a , w i t h p e d i c e l ( P ) n u c l e i ( N ) v a c u o l e s ( V ) a n d d a r k - s t a i n i n g g r a n u l a r v e s i c l e s ( G V ) . x 7750 (KMnO^) 1.0 jum b a r - I f 8 -- 1 4 9 C . e c h i n u l a t a F i g u r e 216 ( L M ) E a r l y p e d i c e l f o r m a t i o n . x 2500 10 iim b a r F i g u r e 21? ( S E M ) A m p u l l a s u r f a c e w i t h y o u n g p e d i c e l s . x 38OO 10 jum b a r F i g u r e 218 ( T E M ) A m p u l l a c y t o p l a s m d u r i n g p e d i c e l f o r m a t i o n . N o t e h i g h e r d e n s i t y o f c y t o p l a s m n e a r p e d i c e l s . x 8500 (KMnO^) 1.0 j im b a r F i g u r e 219 ( T E M ) G r a n u l a r v e s i c l e s ( G V ) i n r e g i o n o f p e d i c e l f o r m a t i o n . N o t e t h i c k n e s s o f a m p u l l a w a l l (AW) b e t w e e n p e d i c e l s a n d a t p e d i c e l s . (KMnO^) x 17 150 1.0 jum b a r - 151 -C . e c h i n u l a t a F i g u r e 220 ( T E M ) G l y c o g e n b o d y ( G L Y ) i n y o u n g a m p u l l a . x 11 600 (KMnO^) 1.0 jam b a r F i g u r e 221 ( T E M ) G r a n u l a r v e s i c l e s ( G V ) a n d t u b u l e s ( a r r o w s ) i n p e d i c e l ; • (KMnO^) x 36 200 1.0 jum b a r F i g u r e 222 ( T E M ) Lomasome ( L ) a n d ER ( a r r o w s ) i n p e d i c e l . x 36 200 (KMnO^) 1.0 jum b a r F i g u r e 223 ( T E M ) C o n c e n t r a t i o n o f m i t o c h o n d r i a (M) i n p e d i c e l . x 36 200 (KMnO^) 1.0 jum b a r - 153 C . e c h i n u l a t a F i g u r e 2 2 4 ( L M ) S t a r t o f s p o r a n g i o l e e x p a n s i o n . x 2 0 0 0 10 jam b a r F i g u r e 225 ( S E M ) Y o u n g s p o r a n g i o l e s o n a m p u l l a , x 2 4 0 0 10 jam b a r F i g u r e 226 ( S E M ) E a r l y s p o r a n g i o l e s ( S ) o n p e d i c e l s ( P j . x 8500 1.0 jum b a r F i g u r e 227 ( S E M ) S p i n e s o n a m p u l l a a n d s p o r a n g i o l e s . P e d i c e l s h a v e v e r y f e w s p i n e s . x 6250 1.0 jam b a r - 155 C . e c h i n u l a t a F i g u r e 228 ( L M ) E x p a n d e d s p o r a n g i o l e s . x 2250 10 jum b a r F i g u r e 229 ( T E M ) C y t o p l a s m o f y o u n g s p o r a n g i o l e . x 17 950 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 230 ( T E M ) Y o u n g s p o r a n g i o l e s o n a m p u l l a . ( G l u t . / O s . ) x 6200 1. 0 jum b a r F i g u r e 231 ( T E M ) L o m o s o m e s ( L ) a n d n u m e r o u s s m a l l v e s i c l e s ( a r r o w s ) i n y o u n g s p o r a n g i o l e . x 17 050 ( G l u t . / O s . ) l . O j u m b a r - 157 C . e c h i n u l a t a F i g u r e 232 ( T E M ) L o n g i t u d i n a l s e c t i o n o f a m p u l l a c y t o p l a s m w i t h p a r a m u r a l v e s i c l e s ( a r r o w s ) . x 4 8 0 0 ( A c . / O s . ) 1 0 jum b a r F i g u r e 233 ( T E M ) C r o s s - s e c t i o n o f a m p u l l a . ( A c . / O s . ) x 4 8 0 0 1 0 jum b a r F i g u r e 234 ( T E M ) V a c u o l e ( V ) a t p e d i c e l b a s e . ( A c . / O s . ) x 13 650 1.0 jum b a r F i g u r e 235 ( T E M ) C o n c e n t r i c membrane b o d y (CMB) a n d v e s i c u l a r c h a n n e l ( a r r o w s ) i n a m p u l l a . x 1 8 0 0 0 ( A c . / O s . ) 1 . 0 jim b a r - 1 5 9 C . e c h i n u l a t a F i g u r e 236 ( T E M ) G r a n u l a r v e s i c l e s a t s p o r a n g i o l e w a l l . x 12 950 (KMnO^) 1.0 jam b a r F i g u r e 237 ( T E M ) A s s o c i a t i o n o f g r a n u l a r v e s i c l e s ( G V ) w i t h p l a s m a membrane (PM) a n d s p o r a n g i o l e w a l l ( S W ) . (KMnO^) x 37 080 1.0 jam b a r F i g u r e 238 ( T E M ) S p o r a n g i o l e f u l l o f d a r k s t a i n i n g g r a n u l a r v e s i c l e s . (KMnO^) x 11 700 1.0 jam b a r F i g u r e 239 ( T E M ) S u r f a c e s p i n e ( S S ) t s u r f a c e c o a t ( S C ) o n s p o r a n g i o l e w a l l ( S W ) . S p o r e o u t e r w a l l (0W) i s f o r m i n g , a n d t u b u l a r ER i s c o n c e n t r a t e d a t s p o r e p e r i p h e r y . x 28 30° (KMnO^) 1 .0 jam b a r - 161 -C . e c h i n u l a t a F i g u r e 2 4 0 ( T E M ) S p o r a n g i o l e w i t h s p i n e s , j u s t p r i o r t o s p o r e w a l l f o r m a t i o n . (KMnO^) x 16 8 5 0 1.0 jum b a r F i g u r e 241 ( T E M ) A s s o c i a t i o n o f g r a n u l a r v e s i c l e w i t h n u c l e a r e n v e l o p e ( a r r o w ) . Lomasome ( L ) a t s p o r a n g i o l e w a l l . x 40 250 (KMnO^) 1 . 0 jam b a r F i g u r e 242 ( T E M ) P e r i p h e r a l c y t o p l a s m o f s p o r a n g i o l e j u s t p r i o r t o s p o r e w a l l f o r m a t i o n . x 40 250 (KMnO^) 1 . 0 jam b a r F i g u r e 2 4 3 ( T E M ) D u m b e l l - s h a p e d m i t o c h o n d r i a i n s p o r a n g i o l e . x 63 830 (KMnO^) 1.0 jam b a r - 163 -C . e c h i n u l a t a F i g u r e 2 4 4 ( S E M ) S m a l l a m p u l l a b e a r i n g e c h i n u l a t e s p o r a n g i o l e s . x 2 0 0 0 10 jam b a r F i g u r e 245 ( T E M ) S t a r t o f s p i n e f o r m a t i o n . A n g u l a r c a v i t y i s c o v e r e d . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 88 680 0 . 1 jum b a r F i g u r e 2 4 6 ( T E M ) S p i n e w i t h c e n t r a l t r e e - l i k e c o r e . x 88 680 ( G l u t . - A c . / O s . ) 0 . 1 lira b a r F i g u r e 2 4 7 ( T E M ) T y p i c a l s p i n e s t r u c t u r e a f t e r a l d e h y d e f i x a t i o n , x 4 0 250 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 248 ( T E M ) E l e c t r o n - t r a n s p a r e n t v e s i c l e s ( a r r o w s ) a s s o c i a t e d w i t h d a r k -s t a i n i n g g r a n u l a r v e s i c l e s . ( K M n 0 4 ) x 1 6 850 1. 0 jum b a r F i g u r e 2 4 9 ( T E M ) T y p i c a l s p i n e s t r u c t u r e a f t e r p e r m a n g a n a t e f i x a t i o n , s h o w i n g l a c k o f a n g u l a r b a s e a n d p r e s e n c e o f s u r f a c e c o a t ( S C ) o n s p o r a n g i o l e w a l l ( S W ) . (OW i s s p o r e w a l l ) . x 63 830 (KMnO^) 0.1 jam b a r - 165 C . e c h i n u l a t a F i g u r e 250 ( T E M ) S p i n e s o n s p o r a n g i o l e w a l l (SW) p r i o r t o e x c l u s i o n o f c y t o p l a s m f r o m p e d i c e l . x 17 050 (KMnO^) 1.0 jum b a r F i g u r e 251 ( T E M ) S p o r a n g i o l e s p i n e s . (KMnO^) x 37 050 1. 0 ^um b a r F i g u r e 252 ( S E M ) S u r f a c e v i e w o f m a t u r e s p i n e s . B u l b o u s b a s e s ( B ) a r e n o t o f t e n s e e n i n s e c t i o n e d m a t e r i a l . x 7800 1.0 jum b a r F i g u r e 253 ( T E M ) C y t o p l a s m d u r i n g w a l l s y n t h e s i s . (KMnO^) x 28 300 1.0 jum b a r F i g u r e 254 ( T E M ) T h r e e l a y e r e d s t r u c t u r e o f s p i n e , A t h i c k , e l e c t r o n - d e n s e i n n e r l a y e r ( s i n g l e s m a l l a r r o w ) i s b o u n d e d o n e i t h e r s i d e b y t h i n n e r l a y e r s ( l a r g e a r r o w , d o u b l e a r r o w ) . x 63850 (KMnO^) 1.0 jam b a r - 16? C . e c h i n u l a t a F i g u r e 255 ( L M ) S p o r a n g i o l e s ( S ) n e a r m a t u r i t y . x 2800 10 jum b a r F i g u r e 256 ( S E M ) S u r f a c e v i e w o f s p i n e s o n a l m o s t m a t u r e s p o r a n g i o l e s . ( B a r e p a t c h e s a r e d u e t o p r o c e s s i n g d a m a g e ) . x 3^00 10 jum b a r F i g u r e 257 ( T E M ) P e d i c e l s ( P ) c o n t a i n n o c y t o p l a s m , a m p u l l a c o n t a i n s l a r g e v a c u o l e ( V ) . x 8530 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 258 ( T E M ) P e d i c e l w a l l a n d s p o r a n g i o l e w a l l (SW) a r e c o n t i n u o u s . S p o r e w a l l (0W) s t a i n s d a r k l y a f t e r a l d e h y d e f i x a t i o n . x 23 800 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 jum b a r F i g u r e 259 ( T E M ) M a t u r i n g s p o r e w i t h many e l e c t r o n -t r a n s p a r e n t v e s i c l e s ( V E ) a n d l i p i d d r o p l e t s . ( L ) x 8530 ( G l u t . - A c . / 0 s . ) 1.0 jum b a r F i g u r e 260 ( T E M ) M a t u r i n g s p o r a n g i o l e w i t h s p i n e s ( S ) a n d s u r f a c e c o a t ( s c ) o n w a l l ( s w ) . (KMnO^) x 13 000 1.0 jum b a r •i 169 C . e c h i n u l a t a F i g u r e 261 ( T E M ) M a t u r e s p o r e w i t h d a r k -s t a i n i n g o u t e r w a l l l a y e r (OW) a n d l i g h t - s t a i n i n g i n n e r w a l l l a y e r ( I W ) . S p o r a n g i a l w a l l (SW) w i t h s u r f a c e s p i n e s ( S S ) i s d i s t i n c t , x 48 500 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 262 ( T E M ) H i g h d e n s i t y a n d l i p i d c o n t e n t ( L ) o f s p o r e c y t o p l a s m a t m a t u r i t y . x 23 900 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 263 ( T E M ) P o o r p r e s e r v a t i o n o f s p i n e s o n s p o r a n g i o l e w a l l (SW) f o l l o w i n g a l d e h y d e f i x a t i o n . x 28 300 ( G l u e . - A c / O s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 264 ( L M ) F e u l g e n - s t a i n e d a m p u l l a w i t h m a t u r e s p o r a n g i o l e s s h o w i n g m u l t i n u c l e a t e c o n d i t i o n , x 1100 10 jam b a r - 171 -C . e c h i n u l a t a F i g u r e 265 ( S E M ) M a t u r e " h e a d " o f s p o r a n g i o l e s . x 1250 10 jum b a r F i g u r e 266 ( T E M ) M a t u r e s p o r e i n s i d e s p o r a n g i a l w a l l w h i c h i s c o n t i n u o u s w i t h p e d i c e l ( P ) a n d a m p u l l a ( A ) w a l l s . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 11 850 1.0 jam b a r F i g u r e 267 ( T E M ) T h i n d a r k w a l l l a y e r ( a r r o w ) n e x t t o s p o r e p l a s m a m e m b r a n e . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 4 8 500 F i g u r e 268 ( T E M ) M a t u r e p e d i c e l b a s e c o n t a i n i n g r e m a i n s o f p e d i c e l c y t o p l a s m ( P C ) . B e l o w p e d i c e l , t u b u l a r E T ( T ) o c c u r s i n a m p u l l a c y t o p l a s m ( A M P ) . N o t e f i b r o u s n a t u r e o f a m p u l l a a n d p e d i c e l w a l l s . ( K M n O j x 63 850 1.0 jam b a r F i g u r e 269 ( T E M ) S p o r a n g i o l e e n d o f p e d i c e l ( P ) i s f r e e o f c y t o p l a s m x 23 050 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 jam b a r - 173 B . D e v e l o p m e n t o f M o n o s p o r o u s S p o r a n g i o l e s i n M y c o t y p h a m i c r o s p o r a T h e f i r s t s i g n o f a r e p r o d u c t i v e s t r u c t u r e i s t h e t e r m i n a l s w e l l i n g o f a n e r e c t a e r i a l h y p h a t o p r o d u c e a n a m p u l l a ( F i g u r e 270). I n s c a n n i n g EM p r e p a r a t i o n s ( F i g u r e 271) t h e s u r f a c e i s f r e e o f s p i n e s b u t u s u a l l y a p p e a r s " b u m p y " . T h e s e bumps s o o n e x p a n d t o f o r m t h e p a p i l l i f o r m e a r l y p e d i c e l s ( F i g u r e 272). T h e s e p a p i l l a e a r e a r a n g e d i n a s p i r a l p a t t e r n w h i c h b e c o m e s m o r e e v i d e n t a t a l a t e r s t a g e . T h e a m p u l l a t i p c o n t i n u e s t o e l o n g a t e a n d r e m a i n s f r e e o f p a p i l l a e u n t i l maximum l e n g t h i s a c h i e v e d . A t h i g h m a g n i f i c a t i o n ( F i g u r e 273) t h e a m p u l l a s u r f a c e i s s h o w n t o b e c o v e r e d w i t h c i r c u l a r s c a l e s o r p l a q u e s ; t h e s e may r e p r e s e n t r e d u c e d s p i n e b a s e s . Y o u n g (1969 to) d e s c r i b e d m i n u t e s p i n e s b e t w e e n s t e r i g m a t a ( p e d i c e l s ) o n t h e a m p u l l a o f M y c o t y p h a  m i c r o s p o r a a n d M y c o t y p h a a f r i c a n a . F i g u r e 274 s h o w s a l a r g e a m p u l l a c o v e r e d w i t h m a t u r e p e d i c e l s . A s i m i l a r s t a g e ( F i g u r e 275) v i e w e d i n t h e S c a n n i n g E M s h o w s t h e p r e s e n c e o f two t y p e s o f p e d i c e l s . T h e l a r g e p r i m a r y p e d i c e l s a l t e r n a t e w i t h s m a l l e r s e c o n d a r y p e d i c e l s . A t t h i s s t a g e o f s p o r u l a t i o n , t h e a m p u l l a c y t o p l a s m i s d e n s e a n d c o n t a i n s a f u l l r a n g e o f o r g a n e l l e s a n d v a c u o l e s , ( F i g u r e s 276, 277)' D u r i n g t h e i r f o r m a t i o n , p e d i c e l s 1 7 4 -c o n t a i n l o m a s o m e s ( F i g u r e 2 7 8 ) a n d v e s i c l e s c o n t a i n i n g s m a l l g r a n u l e s ( F i g u r e s 2 7 9 a n d 2 8 0 ) . L a r g e r v e s i c l e s c o n t a i n i n g a s i n g l e i n c l u s i o n , o f t e n c r y s t a l l i n e , a r e common n e a r d e v e l o p i n g p e d i c e l s ( F i g u r e 2 7 8 ) . V e s i c l e s w i t h a c u p - s h a p e d s e c t i o n a l a p p e a r a n c e o c c u r a l o n g t h e p e r i p h e r y o f t h e a m p u l l a ( F i g u r e 2 8 1 ) a n d o f t e n a p p e a r t o b e e n g u l f i n g c y t o p l a s m ( s i n g l e a r r o w ) o r o t h e r v e s i c l e s ( d o u b l e a r r o w s ) . T h e p e d i c e l w a l l i s d e r i v e d f r o m t h e a m p u l l a w a l l , b u t u n l i k e t h e f u n g i p r e v i o u s l y d e s c r i b e d , t h e p e d i c e l w a l l £PW) i s c o n t i n u o u s w i t h t h e i n n e r a m p u l l a w a l l l a y e r ( F i g u r e 2 8 2 ) . ( I n C h o a n e p h o r a , B l a k e s l e a a n d C u n n i n g h a m e l l a t h e p e d i c e l w a l l i s d e r i v e d f r o m t h e o u t e r p a r t o f t h e a m p u l l a w a l l . ) T h e o u t e r s u r f a c e s o f p e d i c e l s a r e d e v o i d o f t h e c i r c u l a r s c a l e s a n d a p p e a r v e r y s m o o t h ( F i g u r e 2 8 3 ) . I n o n e s p e c i m e n , t h i n s e c t i o n s show a d i s t i n c t z o n e i n s i d e t h e a m p u l l a w a l l ( F i g u r e 2 8 4 ) . A t f i r s t g l a n c e t h e z o n e a p p e a r s t o b e t h e r e s u l t o f a k n i f e m a r k , b u t o n c l o s e r i n s p e c t i o n t h e b o u n d a r y - i s s p a n n e d b y a p p a r e n t l y u n a f f e c t e d m u l t i v e s i c u l a r b o d i e s (MV) a n d o r g a n e l l e s . S p o r a n g i o l e p r o d u c t i o n b e g i n s w i t h a s w e l l i n g o f t h e p r i m a r y p e d i c e l t i p s ( F i g u r e 2 8 5 ) f o l l o w e d b y a s i m i l a r e v e n t i n t h e much s h o r t e r s e c o n d a r y p e d i c e l s - 175 ( F i g u r e 2 8 6 , a r r o w s ) . F i g u r e 287 shows t h i s s t a g e i n s e c t i o n . T h e p r i m a r y s p o r a n g i o l e a n d p e d i c e l ( S I , P i ) a r e much l a r g e r t h a n t h e s e c o n d a r y s p o r a n g i o l e ( S 2 ) . N u c l e i a r e n u m e r o u s i n t h e p e r i p h e r a l c y t o p l a s m o f t h e a m p u l l a . T h e y a r e o f t e n l o c a t e d d i r e c t l y u n d e r p e d i c e l b a s e s ( F i g u r e 2 8 8 ) p r e s u m a b l y p r i o r t o e n t e r i n g t h e e x p a n d i n g s p o r a n g i o l e s . T h e p r o x i m a l p a r t o f e a c h p r i m a r y s p o r a n g i o l e ( F i g u r e 289, a ) i s e l o n g a t e d a n d f o r m s p a r t o f t h e s u p p o r t i n g p e d i c e l a p p a r a t u s . When a m a t u r e s p o r a n g i o l e i s r e l e a s e d , t h e b r e a k o c c u r s a t t h e p e d i c e l - s p o r a n g i o l e j u n c t i o n ( F i g u r e 290, a r r o w s ) . T h i s l e a v e s t h e s p o r a n g i o l e w i t h a n a p i c u i u s d e r i v e d f r o m a s p o r a n g i o l e w a l l e x t e n s i o n r a t h e r t h a n f r o m t h e t r u e p e d i c e l . S e c o n d a r y s p o r a n g i o l e s ( F i g u r e 289 b ) a l s o p r o d u c e a s i m i l a r b u t s h o r t e r w a l l e x t e n s i o n . T h e m a t u r e r e p o r d u c t i v e s t r u c t u r e s o f M y c o t y p h a a r e d i f f i c u l t t o p h o t o g r a p h b y s c a n n i n g E M . T h i s i s b e c a u s e o f p r o b l e m s i n o b t a i n i n g a d e q u a t e m e t a l c o a t i n g b e t w e e n a n d b e l o w t h e t i g h t l y p a c k e d s p o r a n g i o l e s . F i g u r e 291 shows a m a t u r e a m p u l l a a t l o w m a g n i f i c a t i o n . T h e p r i m a r y s p o r a n g i o l e s ( F i g u r e s 292 a n d 293, a ) a r e r a i s e d a b o v e t h e s e c o n d a r y s p o r a n g i o l e s ( b ) t h u s p r o d u c i n g a m o s t e f f i c i e n t u t i l i z a t i o n o f a v a i l a b l e a m p u l l a s u r f a c e a r e a . T h e o u t e r s p o r a n g i o l e w a l l h a s a s m o o t h s u r f a c e w i t h o u t s p i n e s , a s r e p o r t e d b y Y o u n g 176 (1969 b ) u s i n g r e p l i c a t e c h n i q u e s . Y o u n g c o m m e n t e d o n t h e s i m i l a r i t y o f M y c o t y p h a s p o r e s t o t h o s e o f C o k e r o m y c e s , ( T h a m n i d i a c e a e ) . M a t u r e p r i m a r y p e d i c e l s a r e O.75 t o 1.0 jum i n h e i g h t a n d c o n t a i n m i t o c h o n d r i a ( F i g u r e 294 M) a n d l o m a s o m e s ( F i g u r e s 295» 296 L ) . T h e i r w a l l s a r e u s u a l l y c o n t i n u o u s w i t h t h e i n n e r a m p u l l a w a l l ( F i g u r e 294, b ) , a s r e p o r t e d b y K h a n a n d T a l b o t (1975) t u t i n s e v e r a l c a s e s t h e p e d i c e l w a l l a l s o a p p e a r s t o h a v e a n o u t e r l a y e r c o n t i n u o u s w i t h t h e o u t e r a m p u l l a w a l l ( F i g u r e 294 a ; F i g u r e 296). A m a t u r i n g s e c o n d a r y s p o r a n g i o l e i s s h o w n ( F i g u r e 297) r e c e i v i n g a m i t o c h o n d r i o n (m) f r o m t h e a m p u l l a . T h e s p o r a n g i o l e w a l l i s now much t h i c k e r (0.1 t o 0.2 jum) t h a n t h e w a l l s o f t h e p e d i c e l o r s p o r a n g i o l e e x t e n s i o n , (60 - 70 n m ) . T h i s i s t h e r e s u l t o f t h e p r o d u c t i o n o f a n e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t i n n e r w a l l l a y e r ( K h a n a n d T a l b o t ,1975) • A s i m i l a r t h i c k e n i n g o f t h e s p o r a n g i o l e w a l l was r e p o r t e d i n C u n n i n g h a m e l l a b y C o o k (1977) a n d i n T h a m n i d i u m ( F l e t c h e r , 1973). b u t was n o t o b s e r v e d i n t h e p r e s e n t s t u d y o r b y K h a n a n d T a l b o t (1975). A s c a n b e s e e n i n F i g u r e s 298, 306, 307 a n d 309, t h e i n n e r e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t l a y e r o f s p o r a n g i o l e w a l l h a s - 177 d i s a p p e a r e d when s p o r e w a l l s h a v e b e e n c o m p l e t e d . A s i m i l a r d i s a p p e a r a n c e was r e p o r t e d i n S y n c e p h a l a s t r u m , ( F l e t c h e r , 1972 a ) a n d T h a r o n i d i u m ( F l e t c h e r , 1973). F i g u r e 298 s h o w s a h i g h e r m a g n i f i c a t i o n o f a s e c o n d a r y p e d i c e l a t a l a t e r s t a g e , i l l u s t r a t i n g t h e w a l l s o f s p o r a n g i o l e , p e d i c e l a n d s p o r a n g i o l a r e x t e n s i o n . I n s t a i n i n g r e a c t i o n , t h e e x t e n s i o n w a l l r e s e m b l e s t h e p e d i c e l a n d a m p u l l a w a l l s a n d i s u n l i k e t h e e l e c t r o n s t r a n s p a r e n t s p o r a n g i o l e w a l l . P r i m a r y s p o r a n g i o l e s w e r e s e c t i o n e d o b l i q u e l y ( F i g u r e s 299 a n d 30°) t h u s t h e p e d i c e l a t t a c h m e n t was m i s s e d . A d a r k - s t a i n i n g p l u g i s p r e s e n t i n t h e e x t e n s i o n t i p ( F i g u r e 300, a r r o w ) . T h e s p o r a n g i o l e s a r e u n i -n u c l e a t e a t t h i s s t a g e ( F i g u r e 299) a n d t h e i r c y t o p l a s m p r o v e d d i f f i c u l t t o f i x a d e q u a t e l y ; m i t o c h o n d r i a a r e t h e o n l y e a s i l y r e c o g n i z a b l e o r g a n e l l e . T h e c y t o p l a s m o f s p o r a n g i o l e s a n d a m p u l l a a p p e a r s v e r y g r a n u l a r ( F i g u r e s 298, 301) a n d i s p r e s u m a b l y f u l l o f f r e e r i b o s o m e s . When t h e s p o r a n g i o l e s a t t a i n -maximum s i z e , a t h i n s e p t u m f o r m s a c r o s s t h e p e d i c e l e x t e n s i o n w h e r e t h e c h a n n e l i s s m a l l e s t ( F i g u r e 302, S ) . A d e n s e l y -s t a i n i n g o u t e r s p o r e w a l l (0W) t h e n f o r m s w i t h i n t h e s p o r a n g i o l e w a l l ( S W ) . No s u c h s e p t u m was s e e n i n C u n n i n g h a m e l l a . - 1 7 8 T h e s u r f a c e o f a m a t u r e s p o r a n g i o l e i s s h o w n i n F i g u r e 303 • F o l l o w i n g s p o r a n g i o l e r e l e a s e , t h e p e d i c e l r e m a i n s o n t h e a m p u l l a a s a d e n t i c l e ( F i g u r e 303» D) a n d t h e s p o r a n g i o l e e x t e n s i o n b e c o m e s t h e a p i c u l u s ( F i g u r e 303» P ) . I n s e c t i o n a l v i e w , t h e m a t u r e s p o r a n g i o l e ( F i g u r e 304) c o n t a i n s a s p o r e w i t h a t h i n o u t e r w a l l (0W) a n d a t h i c k , e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t i n n e r w a l l ( I W ) . T h e s p o r a n g i o l e e x t e n s i o n c o n t a i n s p l u g m a t e r i a l ( P ) b e l o w t h e d a r k - s t a i n i n g s e p t u m . A l t h o u g h t h e s p o r e w a l l l a y e r s r e s e m b l e t h o s e o f C u n n i n g h a m e l l a , a t no t i m e w e r e g r a n u l a r v e s i c l e s o b s e r v e d d u r i n g m a t u r a t i o n o f M y c o t y p h a s p o r e s . S m a l l e r d a r k - s t a i n i n g v e s i c l e s a r e o b s e r v e d n e a r t h e i n n e r w a l l ( F i g u r e s 304, 305) "but t h e s e a r e i n a l d e h y d e - f i x e d s p e c i m e n s a n d a r e n o t o b s e r v e d i n p e r m a n g a n a t e - f i x e d m a t e r i a l . F i g u r e 306 s h o w s t h e p l u g a n d s e p t u m a r e a a n d t h e s p o r e w a l l l a y e r s . B e t w e e n t h e i n n e r a n d o u t e r w a l l s i s a n e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t z o n e w h i c h may b e a t h i r d l a y e r . M a t u r e s e c o n d a r y s p o r a n g i o l e s a l s o h a v e a p l u g g e d e x t e n s i o n b e l o w a d a r k - s t a i n i n g s e p t u m ( F i g u r e 307). T h e y a l s o c o n t a i n d a r k v e s i c l e s a t t h e s p o r e m e m b r a n e . F i g u r e 308 i l l u s t r a t e s a h i g h e r m a g n i f i c a t i o n o f t h e - 179 -w a l l a r e a s h o w n b o x e d i n F i g u r e 307. T h e c y t o p l a s m -i n n e r w a l l i n t e r f a c e a p p e a r s h i g h l y c o n v o l u t e d , a n d c o n t a i n s v e s i c u l a r a n d m e m b r a n o u s e l e m e n t s . S p o r e s w e r e i m p e r f e c t l y f i x e d c o m p a r e d t o t h e a m p u l l a ( F i g u r e 307), t h u s a d e t a i l e d s t u d y o f s p o r e c y t o p l a s m was n o t p o s s i b l e . I n t h i n s e c t i o n s , m a t u r e s p o r e s a p p e a r t o p o s s e s s two o r t h r e e n u c l e i ( F i g u r e 309) a n d i t i s d i f f i c u l t t o e s t a b l i s h w h e t h e r t h e s e a r e d i s c r e t e n u c l e i o r s e c t i o n s t h r o u g h a s i n g l e l o b e d n u c l e u s . T h e b o x e d a r e a ( F i g u r e 309) h a s b e e n e n l a r g e d i n F i g u r e 310 i n o r d e r t o i l l u s t r a t e w a l l s t r u c t u r e f o l l o w i n g a l d e h y d e f i x a t i o n . T h e s p o r a n g i a l w a l l (SW) i s u s u a l l y d i v i d e d i n t o a n o u t e r 15 - 20 nm l a y e r w h i c h s e p a r a t e s d u r i n g p r o c e s s i n g f r o m a n i n n e r 35 nm l a y e r . T h e o u t e r w a l l o f t h e s p o r e i s c o m p o s e d o f two d i s t i n c t s u b l a y e r s ; t h e o u t e r ( d o u b l e a r r o w s ) i s 10 nm t h i c k a n d s t a i n s s l i g h t l y l e s s t h a n t h e i n n e r 10 nm s u b l a y e r ( s i n g l e a r r o w ) . T h i s b i l a y e r e d o u t e r s p o r e w a l l h a s b e e n d e m o n s t r a t e d i n G i l b e r t e l l a ( B r a c k e r , 1968; B r a c k e r a n d H a l d e r s o n , 1971) a n d M u c o r ( T a k e o , 1974) s p o r a n g i o s p o r e s . T h e l e s s d e n s e i n n e r w a l l (IW) h a s a f i n e g r a n u l a r i t y a n d i s 160 - 200 nm i n t h i c k n e s s . T h e i n n e r w a l l u s u a l l y h a s a v e r y e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t - 1 8 0 z o n e 25 - 30 nm t h i c k j u s t i n s i d e t h e o u t e r w a l l . J u s t i n s i d e t h e p l a s m a m e m b r a n e a r e d a r k - s t a i n i n g g r a n u l a r b o d i e s ( F i g u r e 309, DM; F i g u r e 310). T h e s e may r e p r e s e n t w a l l - f o r m i n g m a t e r i a l s s i m i l a r t o t h e g r a n u l a r v e s i c l e s d e s c r i b e d i n t h e o t h e r f u n g i d i s c u s s e d i n t h i s r e p o r t . S i n c e w a l l f o r m a t i o n i s c o m p l e t e , t h e p r e s e n c e o f p e r i p h e r a l g r a n u l a r v e s i c l e s may i n d i c a t e t h e i r i n v o l v e m e n t i n s y n t h e s i s o f a v e g e t a t i v e w a l l p r i o r t o g e r m i n a t i o n . S i m i l a r o c c u r r e n c e o f p e r i p h e r a l v e s i c l e s was o b s e r v e d i n C h o a n e p h o r a ( F i g u r e 31 a n d 103) d u r i n g p r o d u c t i o n o f a f i b r o u s t h i r d w a l l l a y e r . T h i s i s b e l i e v e d t o b e a v e g e t a t i v e w a l l f o r m e d i n s i d e t h e n o r m a l b i l a y e r e d s p o r e w a l l . D u r i n g m a t u r a t i o n o f s p o r a n g i o l e s , t h e c y t o p l a s m o f t h e a m p u l l a u n d e r g o e s u n c r e a s i n g v a c u o l a t i o n . P r i o r t o s p o r e w a l l f o r m a t i o n t h e c y t o p l a s m c o n t a i n s n u m e r o u s s m a l l v a c u o l e s a n d m i t o c h o n d r i a ( F i g u r e 311) a n d a n o c c a s i o n a l s m a l l c r y s t a l ( C ) . T h e a m p u l l a a l s o c o n t a i n s n u m e r o u s n u c l e i ( F i g u r e 312). A t t h e t i m e o f o u t e r s p o r e - w a l l f o r m a t i o n ( F i g u r e 313) t h e c e n t r a l a r e a o f t h e a m p u l l a b e g i n s t o f o r m l a r g e v a c u o l e s ( V ) p r e s u m a b l y b y f u s i o n o f s m a l l v a c u o l e s l i k e t h o s e n o t e d i n F i g u r e 311. T h e t i p o f t h e a m p u l l a i s l a s t t o f o r m s p o r a n g i o l e s . I t a l s o r e t a i n s c y t o p l a s m when m o s t o f t h e a m p u l l a i s v a c u o l a t e ( F i g u r e 314). - 1 8 1 T h e c y t o p l a s m c o n t a i n s many s m a l l v e s i c l e s w i t h g r a n u l a r o r c r y s t a l l i n e i n c l u s i o n s ( a r r o w ) a n d f e w n u c l e i o r m i t o c h o n d r i a . A s c y t o p l a s m i s m o v e d p e r i p h e r a l l y d u r i n g v a c u o l a t i o n , t h e r e i s a g r e a t c o n c e n t r a t i o n o f o r g a n e l l e s n e a r t h e m a t u r i n g s p o r a n g i o l e s ( F i g u r e s 315. 316). T h i s may b e a m e t h o d o f d i s t r i b u t i n g o r g a n e l l e s i n t o e a c h o f t h e n u m e r o u s s p o r e s . S e v e r a l m i t o c h o n d r i a a p p e a r t o b e d i v i d i n g ( F i g u r e 316, a r r o w s ) . F o l l o w i n g s p o r e w a l l f o r m a t i o n t h e n u m b e r o f c r y s t a l l i n e i n c l u s i o n s i n c r e a s e s r a p i d l y i n t h e r e m n a n t a m p u l l a c y t o p l a s m ( F i g u r e s 317. 318, c ) . T h e s e c r y s t a l s a r e s m a l l e r t h a n t h o s e o b s e r v e d i n t h e o t h e r o r g a n i s m s i n t h i s s t u d y b u t t h e y a r e m o r e n u m e r o u s . V e s i c l e s o f t e n c o n t a i n s e v e r a l c r y s t a l s o f v a r i o u s s h a p e s ( F i g u r e s 319. 320) w i t h l a t t i c e p e r i o d s o f 12 - 1 4 nm. T h i s l a t t i c e i s l a r g e r t h a n t h a t r e p o r t e d i n P h y c o m y c e s , 10.? nm ( T u e t a l . , 1971) a n d i n E n d o g o n e s p o r e s , 8.5 nm ( M o s s e , 1970). F o l l o w i n g r e l e a s e o f s p o r a n g i o l e s , t h e a m p u l l a e a r e c o v e r e d w i t h d e n t i c l e s ( F i g u r e 321) o f two t y p e s , t h e t a l l p r i m a r y d e n t i c l e s ( F i g u r e 322,a) a n d t h e s h o r t s e c o n d a r y d e n t i c l e s ( b ) . T h e s p o r a n g i o l e s o n t h e a m p u l l a s u r f a c e w e r e d e t a c h e d d u r i n g p r o c e s s i n g o f t h e m a t e r i a l . - 182 F i g u r e 323 i l l u s t r a t e s t h e s p i r a l p a t t e r n o f d e n t i c l e s a n d s h o w s r e l a t i v e h e i g h t s o f p r i m a r y a n d s e c o n d a r y p e d i c e l s . F i g u r e 324 s h o w s a t y p i c a l a m p u l l a o n w h i c h t h e d a n t i c l e s h a v e b e e n c o u n t e d . A p p r o x i m a t e l y 4 0 0 p r i m a r y a n d 4 0 0 s e c o n d a r y s i t e s p r o v i d e a c o m p l e m e n t o f 8 0 0 s p o r a n g i o l e s o n a n a m p u l l a w i t h s u r f a c e a r e a o f 2 2 a b o u t 1 8 0 0 pm ( 0 . 0 0 1 8 mm ) . I n c o m p a r i s o n , t h e t o t a l e f f e c t i v e c r o s s - s e c t i o n a l a r e a o f s p o r a n g i o l e s i s o v e r f i v e t i m e s t h e a r e a o f t h e a m p u l l a . O l d a m p u l l a e a r e e s s e n t i a l l y h o l l o w s h e l l s a n d f a l l , w i t h t h e i r s t a l k s , t o t h e s u b s t r a t e s u r f a c e . F i g u r e 325 shows s u c h a n a m p u l l a whose i n t e r n a l s u r f a c e r e v e a l s t h e two s i z e s o f p e d i c e l s . S e c t i o n s t h r o u g h o l d p r i m a r y ( F i g u r e 326) a n d s e c o n d a r y ( F i g u r e 327) d e n t i c l e s show c y t o p l a s m i c r e m n a n t s a n d a n a m p u l l a - s e a l i n g s e p t u m b e l o w t h e s e c o n d a r y d e n t i c l e . - 183 M. microspora Figure 270 (LM) Terminal hypha starting to enlarge into an ampulla, x 5580 1.0 jum bar Figure 271 (SEM) Early ampulla. x 8370 1.0 jum bar Figure 272 (SEM) Young ampulla with pedicels (P) starting to form. x 8870 1.0 jam bar Figure 273 (SEM) Ampulla surface with young pedicels (P). x 21 250 1.0 jam bar - 1 8 5 M. m i c r o s p o r a F i g u r e 274 ( L M ) L a r g e a m p u l l a w i t h p e d i c e l s . x 2000 10 jum b a r F i g u r e 275 ( S E M ) S m a l l a m p u l l a w i t h l a r g e p r i m a r y p e d i c e l s a l t e r n a t i n g w i t h s m a l l e r s e c o n d a r y p e d i c e l s . x 3790 10 jum b a r F i g u r e 2 7 6 ( T E M ) S e c t i o n o f y o u n g a m p u l l a . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 6450 1 . 0 /am b a r F i g u r e 277 ( T E M ) S e c t i o n o f l a r g e a m p u l l a . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 2550 10 jam b a r F i g u r e 278 ( T E M ) Lomasome ( a r r o w ) i n y o u n g p e d i c e l . x 30 4 2 0 ( G l u t . - A c . / 0 s . ) 1 . 0 jum b a r F i g u r e 279 ( T E M ) V e s i c l e s ( a r r o w s ) i n y o u n g p e d i c e l . x 30 4 2 0 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 . 0 jam b a r F i g u r e 2 8 0 ( T E M ) V e s i c l e s ( a r r o w s ) i n y o u n g p e d i c e l . x 51 1 9 0 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1 . 0 jam b a r - 1 8 ? M . m i c r o s p o r a F i g u r e 281 ( T E M ) V e s i c l e s s u r r o u n d i n g c y t o p l a s m i c e l e m e n t s ( a r r o w s ) . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 13 550 1 . 0 jam b a r F i g u r e 282 ( T E M ) P e d i c e l w a l l (PW) P l a s m a membrane (PM) a n d two l o m a s o m e s . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 39 150 1.0 jam b a r F i g u r e 283 ( S E M ) P r i m a r y ; p e d i e e l s p r i o r t o s p o r a n g i o l e e x p a n s i o n . x 13 500 1.0 j im b a r F i g u r e 2 8 4 ( T E M ) A m p u l l a c y t o p l a s m p r i o r t o p r i m a r y s p o r a n g i o l e p r o d u c t i o n . M u l t i v e s i c u l a r b o d i e s (MV) may be p h a g o c y t i c v a c u o l e s . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 13 550 1.0 jam b a r - 1 8 9 M . m i c r o s p o r a F i g u r e 2 8 5 ( L M ) P r i m a r y s p o r a n g i o l e s f o r m i n g o n t h e i r p e d i c e l s . x 2 2 5 0 1 0 jum b a r F i g u r e 2 8 6 ( S E M ) S e c o n d a r y p e d i c e l s s t a r t i n g t o f o r m ( a r r o w s ) b e t w e e n p r i m a r y p e d i c e l s . x 1 6 5 0 0 1 . 0 jam b a r F i g u r e 2 8 7 ( T E M ) S e c o n d a r y s p o r a n g i o l e ( S 2 ) f o r m i n g b e t w e e n p r i m a r y p e d i c e l s a n d s p o r a n g i o l e s ( S I ) . x 13 5 5 0 ( G l u t . / K M n O ^ O s . ) 1 . 0 jam b a r F i g u r e 288 ( T E M ) N u c l e i e n t e r i n g p e d i c e l s . ( G l u t . / K M n 0 i 4 / 0 s . ) x 1 7 7 7 0 1 . 0 jam b a r F i g u r e 2 8 9 ( S E M ) P r i m a r y s p o r a n g i o l e s ( a ) o n t a l l p e d i c e l s a n d s e c o n d a r y s p o r a n g i o l e s ( b ) . x 1 0 6 9 0 1 . 0 jum b a r F i g u r e 2 9 0 ( S E M ) F r a c t u r e p o i n t ( a r r o w s ) w h e r e s p o r a n g i o l e d e t a c h e s f r o m p e d i c e l ( P ) . x 1 9 670 1 . 0 jum b a r - 191 M . m i c r o s p o r a F i g u r e 291 ( S E M ) A m p u l l a w i t h n e a r l y m a t u r e s p o r a n g i o l e s . x 1560 10 jum b a r F i g u r e 292 ( S E M ) Two l a y e r s o f s p o r a n g i o l e s o n a m p u l l a , t h e o v a l p r i m a r i e s ( a ) a n d , b e l o w t h e m , s p h e r i c a l s e c o n d a r i e s ( b ) x 11 4 0 0 1 .0 jum b a r F i g u r e 293 ( T E M ) S e c t i o n s h o w i n g a r r a n g e m e n t o f p r i m a r y ( a ) a n d s e c o n d a r y ( b ) s p o r a n g i o l e s . x 13 250 ( G l u t . / K M n 0 4 ) 1.0 jum b a r F i g u r e 294 ( T E M ) M i t o c h o n d r i a i n a n d n e a r t h e p e d i c e l o f a p r i m a r y s p o r a n g i o l e . N o t e two w a l l l a y e r s ( a , b ) . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 39 150 1.0 jim b a r F i g u r e 295 ( T E M ) L o m a s o m e ( a r r o w ) a t a p e x o f p e d i c e l . x 39 150 ( G l u t . - A c . / O s . ) l . O j u m b a r F i g u r e 296 ( T E M ) Lomasome ( L ) b o u n d e d b y d a r k -s t a i n i n g membrane ( a r r o w ) . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 51 530 1.0 j im b a r - 193 M . m i c r o s p o r a F i g u r e 297 ( T E M ) S e c o n d a r y s p o r a n g i o l e o n s h o r t p e d i c e l . A m i t o c h o n d r i o n (M) i s p a s s i n g i n t o t h e s p o r a n g i o l e . ( G l u t . / O s . ) x 21 380 1.0 iim b a r F i g u r e 298 ( T E M ) D e t a i l o f p e d i c e l c o n n e c t i o n t o s e c o n d a r y s p o r a n g i o l e . N o t e c y t o p l a s m i c g r a n u l e s . x 48 240 ( G l u t . / O s . ) 1 . 0 jum b a r F i g u r e 299 ( T E M ) P r i m a r y s p o r a n g i o l e . D i s t i n c t i o n o f s p o r e w a l l a n d s p o r a n g i o l e w a l l i s n o t e v i d e n t i n p e r m a n g a n a t e - f i x e d m a t e r i a l . x 23 340 ( G l u t . / K M n O ^ ) 1.0 yum b a r F i g u r e 300 ( T E M ) P r i m a r y s p o r a n g i o l e ; w a l l s e p a r a t e d f r o m s p o r e w a l l o n l y a t p e d i c e l ( a r r o w ) . x 23 340 ( G l u t . / K M n O ^ ) 1 . 0 jum b a r F i g u r e 301 ( T E M ) O r g a n e l l e s e n r o u t e t o s p o r a n g i o l e f r o m a m p u l l a ( A M P ) . ( G l u t . / O s . ) x 27 9 9 5 1.0 jum b a r F i g u r e 302 ( T E M ) Y o u n g s p o r a n g i o l e s a f t e r f o r m a t i o n o f o u t e r s p o r e w a l l (0W). S p o r a n g i o l e w a l l ( S W ; a p p e a r s r e l a t i v e l y t h i c k a t t h i s s t a g e . N o t e s e p t a l s t r u c t u r e s ( S ) . x 21 380 ( G l u t . / O s . ) 1 .0 jam b a r - 195 m i c r o s p o r a F i g u r e 303 ( S E M ) T o p " n e c k " p a r t o f p e d i c e l w i l l r e m a i n w i t h s p o r a n g i o l e a s a n a p i c u l u s . M a i n " b o d y " o f p e d i c e l w i l l r e m a i n o n t h e a m p u l l a a s a d e n t i c l e ( D ) . x 39 900 1.0 jam b a r F i g u r e 304 ( T E M ) C l e a r s e p a r a t i o n o f s p o r a n g i o l e w a l l (SW) f r o m s p o r e . S p o r e w a l l c o n s i s t s o f a t h i n d a r k - s t a i n i n g o u t e r l a y e r (0W) a n d a much t h i c k e r , l i g h t - s t a i n i n g i n n e r l a y e r ( I W ) . ( P i s a p e d i c e l p l u g m a t e r i a l . ) ( G l u t . - A c . / O s . ) x 32 090 1.0 jum b a r F i g u r e 305 ( T E M ) M u l t i v e s i c u l a r b o d y ( a r r o w ) i n p e d i c e l o f m a t u r e s p o r a n g i o l e . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 13 550 1.0 jam b a r F i g u r e 306 ( T E M ) D e t a i l o f p l u g i n p e d i c e l ( P ) a n d s p o r e i n n e r (IW) a n d o u t e r (0W) w a l l s . x 6? 000 ( G l u t . / K M n O y ' O s . ) 1.0 jum b a r - 197 M . m i c r o s p o r a F i g u r e 307 ( T E M ) M a t u r e s e c o n d a r y s p o r a n g i o l e . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 22 700 1.0 jam b a r F i g u r e 308 ( T E M ) D e t a i l o f b o x e d a r e a i n F i g u r e 307. x 61 580 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 11m b a r F i g u r e 309 ( T E M ) Two n u c l e i i n m a t u r e s p o r e . D a r k - s t a i n i n g m a t e r i a l (DM) i s c o n c e n t r a t e d n e x t t o s p o r e p l a s m a m e m b r a n e . x 32 380 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 310 ( T E M ) D e t a i l o f b o x e d a r e a i n F i g u r e 309. O u t e r s p o r e w a l l i s c o m p o s e d o f t w o d i f f e r e n t i a l l y -s t a i n i n g z o n e s , t h e i n n e r ( s i n g l e a r r o w ) s t a i n i n g d a r k e r t h a n t h e o u t e r ( d o u b l e a r r o w s ) . x 1*4-7 800 ( G l u t . -Ac./0s.) 0.1 jam b a r - 199 M. m i c r o s p o r a F i g u r e 311 ( T E M ) C y t o p l a s m o f a m p u l l a c o n t a i n i n g m i t o c h o n d r i a (M) a n d a s m a l l c r y s t a l ( C ) . x 17 720 ( G l u t . - A c . / O s . ) l . O j u m b a r F i g u r e 312 ( T E M ) C r o s s - s e c t i o n o f a m p u l l a p r i o r t o s p o r e w a l l s y n t h e s i s , x 8 3 O O ( G l u t . / K M n O ^ ) 1.0 jam b a r F i g u r e 313 ( T E M ) V a c u o l a t i o n ( V ) o f a m p u l l a a t t i m e o f s p o r e o u t e r w a l l s y n t h e s i s . ( G l u t . / O s . ) x 6090 1.0 jxm b a r F i g u r e 314 ( T E M ) C y t o p l a s m o f m a t u r e a m p u l l a b e a r i n g m a t u r e s p o r a n g i o l e s . ( A r r o w i n d i c a t e s a m u l t i v e s i c u l a r b o d y . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 8 3 O O 1.0 jam b a r F i g u r e 315 ( T E M ) P e r i p h e r a l c y t o p l a s m o f a m p u l l a c o n t a i n i n g n u m e r o u s m i t o c h o n d r i a . ( G l u t . / O s ) x 13 550 1.0 jam b a r F i g u r e 316 ( T E M ) D u m b e l l - s h a p e d m i t o c h o n d r i a i n a m p u l l a ( a r r o w s ; . x 10 230 ( G l u t . / O s . ) 1.0 jum b a r - 201 M. m i c r o s p o r a F i g u r e 317 ( T E M ) D e g e n e r a t i n g a m p u l l a c y t o p l a s m . ( G l u t . - A c . / O s . ) x 13 280 1.0 jum b a r F i g u r e 318 ( T E M ) C r y s t a l s i n v a c u o l e a t b a s e o f p e d i c e l . x 23 3^-0 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 jum b a r F i g u r e 319 ( T E M ) C r y s t a l s i n c y t o p l a s m i c v a c u o l e . x 37 630 ( G l u t . / O s . ) 1.0 jum b a r F i g u r e 320 ( T E M ) C r y s t a l s i n c y t o p l a s m i c v a c u o l e s a s s o c i a t e d w i t h a m i t o c h o n d r i o n ( M ) . x 67 000 ( G l u t . - A c . / O s . ) 1.0 jam b a r F i g u r e 321 ( S E M ) M a t u r e a m p u l l a c o v e r e d w i t h d e n t i c u l a r r e m a i n s o f p e d i c e l s . x 625 10 jum b a r F i g u r e 322 ( S E M ) M a t u r e s p o r a n g i o l e s a n d o l d a m p u l l a . Two h e i g h t s o f d e n t i c l e s r e m a i n , f r o m p r i m a r y ( a ) a n d s e c o n d a r y ( b ) p e d i c e l s . N o t e s p i r a l p a t t e r n o f d e n t i c l e s . x 5500 1.0 jam b a r - 203 M . m i c r o s p o r a F i g u r e 323 ( S E M ) S u r f a c e o f l a r g e c y l i n d r i c a l a m p u l l a a f t e r s p o r a n g i o l e r e l e a s e . x 7150 1.0 jum b a r F i g u r e 324 ( S E M ) O l d a m p u l l a w i t h s p i r a l a r r a n g e m e n t o n d e n t i c l e s , x 1525 10 jum b a r F i g u r e 325 ( S E M ) I n t e r i o r o f o l d a m p u l l a . x 3600 10 jum b a r F i g u r e 326 ( T E M ) S e c t i o n o f p r i m a r y d e n t i c l e o n o l d a m p u l l a . x 39 525 ( G l u t . / O s . ) 1.0 jum b a r F i g u r e 327 ( T E M ) S e c t i o n o f s e c o n d a r y d e n t i c l e o n o l d a m p u l l a . x 39 525 ( G l u t . / O s . ) 1.0 jum b a r - 2 0 5 V I . H i s t o c h e m i c a l S t a i n i n g o f R e p r o d u c t i v e S t r u c t u r e s I n t r o d u c t i o n : M o s t h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e s w e r e d e s i g n e d f o r t i s s u e s o f h i g h e r p l a n t s o r a n i m a l s ( J e n s e n , 1 9 6 2 ; P e a r s e , 1 9 6 8 ) . R e l a t i v e l y f e w f u n g a l t e c h n i q u e s h a v e b e e n d e v e l o p e d , e x c e p t a s a i d s i n i d e n t i f y i n g f u n g a l p a t h o g e n s i n h o s t t i s s u e s . K i r k ( 1 9 6 6 ) p r e s e n t e d a d e t a i l e d h i s t o c h e m i c a l a n a l y s i s o f m a r i n e P y r e n o m y c e t e s p o r e s a n d t h e i r a p p e n d a g e s . E n z y m e l o c a l i z a t i o n was d e m o n s t r a t e d b y R e i s s ( 1 9 7 2 ) a n d c e l l w a l l h i s t o c h e m i s t r y i n v e g e t a t i v e c e l l s o f D i m a r g a r i t a c e a e a n d K i c k -x e l l a c e a e was s t u d i e d b y B e n n y ( 1 9 7 2 ) . T h i s p r e s e n t s t u d y r e p r e s e n t s a n a t t e m p t t o d e t e r m i n e g r o s s l o c a l i z a t i o n o f c h e m i c a l c o m p o n e n t s i n Z y g o m y c e t e r e p r o d u c t i v e s t r u c t u r e s . E v e n u s i n g 1 jum p l a s t i c s e c t i o n s , d e t a i l e d i d e n t i f i c a t i o n o f s m a l l c e l l u l a r c o m p o n e n t s was n o t p o s s i b l e . - 206 -A . C h o a n e p h o r a : M o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s 1. L u x o l s F a s t B l u e - MBS; N i l e b l u e ( P h o s p h o l i p i d s ) W a l l o f t h e a m p u l l a a n d s p o r a n g i o l e s s t a i n s l i g h t l y , t h u s i n d i c a t i n g a p o s s i b l e p r e s e n c e o f p h o s p h o l i p i d s . C h e m i c a l a n a l y s i s o f h y p h a l w a l l s ( L e t o u r n e a u e t a l . , 1976) o f C h o a n e p h o r a i n d i c a t e d lk% l i p i d s b u t i n t h e f o r m o f f a t t y a c i d s . S p o r e w a l l s do n o t s t a i n a t m a t u r i t y . 2. A n i l i n e B l u e - B l a c k , F a s t G r e e n , A c i d F u c h s i n ( P r o t e i n ) A m p u l l a a n d s p o r a n g i o l e c y t o p l a s m s t a i n b u t s p o r e w a l l s a n d v a c u o l e s do n o t . C h e m i c a l a n a l y s i s h a s s h o w n 16% p r o t e i n i n s p o r e w a l l s ( B a r t n i c k i -G a r c i a , 1968) o f some Z y g o m y c e t e s . 3. P e r i o d i c A c i d - S c h i f f s ( C a r b o h y d r a t e s ) T h e a m p u l l a a n d s p o r a n g i o l e c y t o p l a s m s t a i n p i n k t h r o u g h o u t , a n d t h i s c o l o u r d i s a p p e a r s f o l l o w i n g a c e t y l a t i o n ( M c M a n u s a n d C a s o n , 1950)» t h u s i n d i c a t i n g t r u e c a r b o h y d r a t e s . B o t h a m p u l l a a n d s p o r e c y t o p l a s m c o n t a i n r e d - s t a i n i n g g r a n u l e s , p r e s u m a b l y v e s i c l e s o f g l y c o p r o t e i n s o r p o l y s a c c h a r i d e s . T h e a m p u l l a a l s o h a s i n t e n s e l y - 207 r e d - s t a i n i n g s t r e a m s e n t e r i n g i t f r o m t h e h y p h a . T h e s e r e t a i n c o l o u r a f t e r a c e t y l a t i o n , t h u s i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s ( Z u g i b e , 1 9 7 0 ) . A t m a t u r i t y s p o r e w a l l s a r e d a r k l y p i g m e n t e d , p r e s u m a b l y b e c a u s e o f m e l a n i n ; h o w e v e r no PAS s t a i n i n g was a c h i e v e d . C h e m i c a l l y t h e s e s p o r e w a l l s s h o u l d c o n t a i n k2% g l u c o s e a n d 10% m e l a n i n ( B a r t n i c k i - G a r c i a , 1 9 6 8 ) . P e r h a p s t h e s t a i n a b l e c a r b o h y d r a t e s a r e p r o t e c t e d f r o m t h e s t a i n r e a c t i o n b y o t h e r c o m p o n e n t s . ( C o l o u r F i g u r e 8 ) . 4 . T o l u i d i n e B l u e ( M e t a c h r o m a s i a ) S p o r e c y t o p l a s m s t a i n s p u r p l e t h r o u g h o u t , p r o b a b l y a s a r e s u l t o f t h e h i g h n u m b e r s o f f r e e r i b o s o m e s ( R N A ) . S p o r e w a l l s s t a i n b l u e i n some s a m p l e s ( C o l o u r F i g u r e 9 ) i n d i c a t i n g t h e p r e s e n c e o f a c i d i c p r o t e i n s a n d p o l y s a c c h a r i d e s . H o w e v e r , i n o t h e r s a m p l e s o n l y t h e n a t u r a l p i g m e n t a t i o n o f t h e w a l l i s e v i d e n t . - 208 B . C h o a n e p h o r a a n d B l a k e s l e a : M u l t i s p o r o u s s p o r a n g i a 1. L u x o l s F a s t B l u e - MBS; N i l e B l u e ( P h o s p h o l i p i d s ) A s f o u n d w i t h m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s , t h e a m p u l l a w a l l s a n d c y t o p l a s m s t a i n a p a l e b l u e , a s do t h e s p o r a n g i o l e w a l l s a n d c y t o p l a s m . T h e m a t u r e s p o r e w a l l s do n o t s t a i n , t h u s i n d i c a t i n g a c h e m i c a l d i f f e r e n c e a s w e l l a s p r e v i o u s l y i l l u s t r a t e d s t r u c t u r a l d i f f e r e n c e s . 2. A n i l i n e B l u e - B l a c k , F a s t G r e e n , A c i d F u c h s i n ( P r o t e i n s ) R e s u l t s a r e s i m i l a r t o t h o s e f o r m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s e x c e p t t h a t s p o r e s p r o d u c e d i n t h e l a r g e s p o r a n g i a a b s o r b t h e s e s t a i n s a t t h e p o l a r s i t e s o f a p p e n d a g e a t t a c h m e n t , ( a p p e n d a g e s a n d s p o r e w a l l s do n o t s t a i n f o r p r o t e i n ) . A t t h e : p r o s p o r e s t a g e , t h e i n t e r s p o r e m a t r i x s t a i n s w e a k l y o r n o t a t a l l , t h u s i n d i c a t i n g t h a t a l l p r o t e i n i s e n c l o s e d i n t h e d e l i m i t e d p r o s p o r e c y t o p l a s m . B u t l e r e t a l . , (I960) a l s o f o u n d t h a t a p p e n d a g e s o f G i l b e r t e l l a d i d n o t s t a i n w i t h a c i d F u c h s i n ( C o l o u r F i g u r e s 13 a n d 1 4 ) . - 209 -3 . P e r i o d i c A c i d - S c h i f f s ( C a r b o h y d r a t e s ) Y o u n g s p o r a n g i a c o n t a i n s t r e a m s o f u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s ( s t a i n i s r e t a i n e d a f t e r a c e t y l a t i o n ) m o v i n g f r o m t h e s p o r a n g i o p h o r e . I n l a r g e s p o r a n g i a , t h e s e s t r e a m s a p p e a r t o b e l o c a l i z e d i n a n d n e a r t h e c o l u m e l l a . When p r o s p o r e s b e c o m e d i s c e r n i b l e , t h e y show l i t t l e g e n e r a l c y t o p l a s m i c s t a i n i n g , b u t c o n t a i n r e d g r a n u l e s c e n t r a l l y a n d p e r i p h e r a l l y ( C o l o u r F i g u r e s 10 a n d 12). T h e s e may c o r r e s p o n d t o g r a n u l a r v e s i c l e s s e e n i n EM s e c t i o n s . T h e m a t r i x b e t w e e n p r o s p o r e s s t a i n s i n t e n s e l y r e d a t t h i s s t a g e . M a t u r e s p o r e s ( C o l o u r F i g u r e s 15 a n d 16) shows PAS - p o s i t i v e a p p e n d a g e s a n d a t t a c h e m e n t s i t e s . S p o r e w a l l s do n o t s t a i n w i t h P A S , a n d no PAS -p o s i t i v e m a t e r i a l r e m a i n s i n t h e i n t e r s p o r e m a t r i x o f t h e s p o r a n g i u m . 4. F e u l g e n ( N u c l e i ) F e u l g e n s t a i n i n g o f p l a s t i c - e m b e d d e d s e c t i o n s was f o u n d t o be v e r y e r r a t i c . E x c e l l e n t r e s u l t s w e r e a c h i e v e d i n s e v e r a l p r e p a r a t i o n s b u t o t h e r s e c t i o n s p r o c e s s e d s i m u l t a n e o u s l y w e r e u n s t a i n e d . T h o s e s p o r a n g i o s p o r e s w h i c h s t a i n e d s h o w e d 4 t o 6 n u c l e i p e r 1 jum s e c t i o n . - 210 5 . T o l u i d i n e B l u e ( M e t a c h r o m a s i s ) L i t t l e m e t a c h r o m a s i a was d e t e c t e d , b u t t h i s i s a n e x c e l l e n t a n d r a p i d g e n e r a l s t a i n f o r p l a s t i c -e m b e d d e d s e c t i o n s . C y t o p l a s m shows a g e n e r a l p a l e b l u e s t a i n , n u c l e i a r e d a r k e r - b l u e t o p u r p l e . S p o r e w a l l s do n o t s t a i n a t a l l , p e r h a p s d e m o n s t r a t i n g t h e i r i m p e r v i o u s n e s s t o c h e m i c a l r e a g e n t s . T h i s s t a i n a p p e a r s t o be m o r e u s e f u l i n t i s s u e s o f h i g h e r p l a n t s ( O ' B r i e n e t a l . , 19 64; M c C u l l y , 1966). - 211 B l a k e s l e a : t r i s p o r o u s s p o r a n g i o l e s L u x o l s F a s t B l u e MBS ( P h o s p h o l i p i d s ) T h e c y t o p l a s m o f t h e a m p u l l a a n d s p o r a n g i o l e c o n t a i n many s m a l l b l u e g r a n u l e s w h i c h a r e l a t e r l o c a t e d p e r i p h e r a l l y i n d e v e l o p i n g s p o r e s , ( C o l o u r F i g u r e 4 ) . I n m a t u r e s p o r e s a l a r g e r b l u e " g r a n u l e " i s c e n t r a l l y l o c a t e d . A n i l i n e B l u e - B l a c k , F a s t G r e e n , A c i d F u c h s i n ( P r o t e i n ^ ) T h e c y t o p l a s m o f t h e a m p u l l a a n d s p o r a n g i o l e s h o w s g e n e r a l p r o t e i n s t a i n i n g , i n c l u d i n g s m a l l i n t e n s e l y s t a i n e d " g r a n u l e s " , t h a t a r e p r e s u m a b l y n u c l e i . I n m a t u r e s p o r e s , a c e n t r a l l a r g e " g r a n u l e " s t a i n s i n t e n s e l y ; p e r h a p s t h e s e r e p r e s e n t a n a g g r e g a t i o n o f n u c l e i n o t o b s e r v e d i n EM s e c t i o n s b e c a u s e o f f i x a t i o n d i f f i c u l t i e s . P e r i o d i c A c i d - S c h i f f s ( C a r b o h y d r a t e s ) Y o u n g s p o r a n g i o l e s a n d a m p u l l a e s t a i n p i n k w i t h n u m e r o u s v e r y s m a l l r e d g r a n u l e s . V a c u o l e s do n o t s t a i n a t a l l . ( C o l o u r F i g u r e 3 ) . - 212 T o l u i d i n e B l u e ( M e t a c h r o m a s i a ) C y t o p l a s m o f d e v e l o p i n g s p o r e s s t a i n b l u e t h r o u g h o u t , w h i l e l a t e r s t a g e s c o n t a i n a n u n s t a i n e d c e n t r a l " g r a n u l e " o r v a c u o l e ( C o l o u r F i g u r e 2 ) . T h e m a t r i x o f s p o r a n g i o l e s , b e t w e e n d e v e l o p i n g s p o r e s , a l s o d o e s n o t s t a i n . Some m e t a c h r o m a s i a i s o b s e r v e d i n t h e a m p u l l a w h e r e t h i n r e d s t r a n d s o c c u r , t h u s i n d i c a t i n g a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s ( C h a m b e r l a i n a n d E v a n s , 1 9 7 3 ) ' T h i s a g r e e s w i t h t h e c o n c l u s i o n r e a c h e d c o n c e r n i n g C h o a n e p h o r a a m p u l l a e , w h i c h r e t a i n PAS s t a i n a f t e r a c e t y l a t i o n , w h i c h a l s o i n d i c a t e s a c i d m u c o p o l y -s a c c h a r i d e " s t r e a m s " . 213 D . C u n n i n g h a m e l l a : m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s 1. L u x o l s F a s t B l u e - MBS; N i l e B l u e ( P h o s p h o l i p i d s ) A m p u l l a e a n d s p o r a n g i o l e s s t a i n p a l e b l u e t h r o u g h o u t t h e i r c y t o p l a s m . D a r k e r - s t a i n i n g g r a n u l e s a r e u s u a l l y p r e s e n t . A t a l l s t a g e s , t h e l a r g e r v a c u o l e s do n o t s t a i n f o r p h o s p h o l i p i d , i n c l u d i n g t h e h i g h l y - v a c u o l a t e m a t u r e a m p u l l a . 2. A n i l i n e B l u e - B l a c k , F a s t G r e e n , A c i d F u c h s i n ( P r o t e i n ) T h e y o u n g a m p u l l a s t a i n i n t e n s e l y w h i l e y o u n g s p o r a n g i o l e s do n o t . T h i s r e s p o n s e i s r e v e r s e d a t m a t u r i t y when p r o t e i n b e c o m e s c o n c e n t r a t e d i n s p o r e s . V a c u o l e s i n a m p u l l a e a n d s p o r e s do n o t s t a i n f o r p r o t e i n , b u t many s m a l l g r a n u l e s o r v e s i c l e s s t a i n i n t e n s e l y d u r i n g a l l s t a g e s o f d e v e l o p m e n t , ( C o l o u r F i g u r e 7 ) . 3« P e r i o d i c A c i d - S c h i f f s ( C a r b o h y d r a t e s ) A m p u l l a e o f C u n n i n g h a m e l l a a l s o c o n t a i n i n t e n s e l y s t a i n i n g " s t r e a m s " b u t u n l i k e t h o s e o f C h o a n e p h o r a a n d B l a k e s l e a some o f t h e s e l o o s e t h e i r r e d c o l o u r a f t e r a c e t y l a t i o n , t h u s i n d i c a t i n g t h a t t h e s e s t r e a m s a r e n o t f a t t y a c i d s . S p o r a n g i o l e s c o n t a i n many s m a l l PAS p o s i t i v e g r a n u l e s ( C o l o u r F i g u r e 5 ) . - 2 1 4 -T o l u i d i n e B l u e ( M e t a c h r o m a s i a ) Y o u n g a m p u l l a e s t a i n a p u r p l e - b l u e w i t h d a r k p u r p l e n u c l e i . V a c u o l e s a r e u n s t a i n e d . R e d s t r a n d s r u n n i n g t h r o u g h t h e a m p u l l a c y t o p l a s m r e p r e s e n t f a t t y a c i d s a s f o u n d i n B l a k e s l e a . M a t u r e s p o r e s h a v e d a r k v i o l e t n u c l e i i n a b l u i s h - p u r p l e c y t o p l a s m ; no r e d f a t t y - a c i d s t a i n i n g i s o b s e r v e d i n s p o r a n g i o l e s o r s p o r e s , ( C o l o u r F i g u r e 6 ) . T h e p u r p l e c o l o u r o f t h e c y t o p l a s m i s m o s t l i k e l y s t a i n i n g o f t h e RNA c o n t e n t i n f r e e r i b o s o m e s s e e n i n EM s e c t i o n s . 215 E . M y c o t y p h a : m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s B e c a u s e o f t h e s m a l l s i z e o f s p o r e s i n t h i s g e n u s , o n l y v e r y g e n e r a l l o c a l i z a t i o n c o u l d be o b s e r v e d . 1. L u x o l s F a s t B l u e - MBS ( P h o s p h o l i p i d s ) C y t o p l a s m o f y o u n g a m p u l l a e s t a i n s p a l e b l u e w i t h s e v e r a l p e r i p h e r a l z o n e s o f i n t e n s e b l u e . Y o u n g s p o r a n g i o l e s s t a i n d a r k b l u e b u t a t m a t u r i t y t h e s p o r e s do n o t a c c e p t t h i s s t a i n a t a l l . T h i s may b e a r e s u l t o f t h e i m p e r v i o u s s p o r e w a l l s . 2. A n i l i n e B l u e - B l a c k , F a s t G r e e n , A c i d F u c h s i n ( P r o t e i n s ) A m p u l l a w a l l s t a i n s l i g h t l y , s p o r a n g i o l e s a n d p e d i c e l s s t a i n i n t e n s e l y . A s i n o t h e r o r g a n i s m s s t u d i e d , v a c u o l e s do n o t s t a i n f o r p r o t e i n ( C o l o u r F i g u r e 1). 3 . P e r i o d i c A c i d - S c h i f f s ( C a r b o h y d r a t e s ) T h e c y t o p l a s m o f t h e a m p u l l a s t a i n s p i n k u n t i l t h e n o n - s t a i n i n g v a c u o l e s f i l l e d t h i s s t r u c t u r e a t m a t u r i t y . T h e c y t o p l a s m o f s p o r a n g i o l e s s t a i n s i n t e n s e l y u p t o a n d i n c l u d i n g t h a t o f m a t u r e s p o r e s . W a l l s o f a m p u l l a a n d s p o r a n g i o l e s s t a i n w e a k l y b u t s p o r e w a l l s a r e t o o s m a l l t o p o s i t i v e l y o b s e r v e s t a i n i n t e n s i t y . - 216 -COMPONENTS TABLE I I TABIiE OF HISTOCHEMICAL RESULTS LOCATION 3 U O O u x : o P P. <1) co C •rH Bj -P O r H x ; —> a rH rH - <U • ' •—> to td w e to nj 3 U 3 rt 0 3 <D o o o x : rH O rH u x : r< b£ CO ^ to o p O C <D O CO P. a> P . -H P..M to c tO C d 10 Rj o ni o c •H rH C o C 3 PQ u m S o ] o u — E H W CO 3 «J| o x : %^ ft-P* to o o o, PROTEIN ampulla wall NA - + • ampulla cytoplasm NA + + + + ' sporangial wall - - - - -sporangial cytoplasm - + + + spore wall - - - - -spore cytoplasm + + + + spore appendage - - •• NA NA NA appendage bases + + PHOSP ampulla wall NA t + + LIPIDS — ampulla cytoplasm NA + •f + + sporangial wall + + t + sporangial cytoplasm + + + + spore wall - _ _ _ ± spore cytoplasm - - - - -spore appendages - _ NA NA NA appendage bases - - NA NA NA CARBO- ampulla wall NA HYDRATE ampulla cytoplasm NA + + + + sporangial wall - _ _ ± _ sporangial cytoplasm + + + + + spore wall _ _ spore cytoplasm + + + - + spore appendage + + NA NA NA appendage base + + NA NA NA FATTY ampulla vacuoles NA + + + + ACIDS sporangial vacuoles + - -NA Not Ap p l i c a b l e variable or not determined - 21? -COLOUR P L A T E C o l o u r F i g u r e 1 M y c o t y p h a 2 B l a k e s l e a 3 B l a k e s l e a 4 B l a k e s l e a 5. C u n n i n g h a m e l l a 6 C u n n i n g h a m e l l a 7 C u n n i n g h a m e l l a 8 C h o a n e p h o r a 9 C h o a n e p h o r a 1 0 C h o a n e p h o r a 11 C h o a n e p h o r a 12 C h o a n e p h o r a 13 C h o a n e p h o r a 14 C h o a n e p h o r a 15 C h o a n e p h o r a 16 C h o a n e p h o r a A n i l i n e B l u e B l a c k s t a i n i n g o f m a t u r e a m p u l l a f o r p r o t e i n s . T o l u i d i n e B l u e m e t a c h r o m a t i c s t a i n i n g o f a l m o s t m a t u r e s p o r a n g i o l e s . P e r i o d i c A c i d - S c h i f f ( P A S ) s t a i n i n g o f e a r l y s p o r a n g i o l e s f o r c a r b o h y d r a t e s . L u x o l ' s F a s t B l u e MBS s t a i n i n g s p o r a n g i o l e s f o r p h o s p h o l i p i d s . PAS s t a i n i n g o f . . y o u n g s p o r a n g i o l e s f o r c a r b o h y d r a t e s . T o l u i d i n e B l u e m e t a c h r o m a t i c s t a i n i n g o f m a t u r e s p o r a n g i o l e s . A n i l i n e B l u e - B l a c k s t a i n i n g o f m a t u r i n g s p o r a n g i o l e s f o r p r o t e i n s . PAS s t a i n i n g o f m a t u r e m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s . T o l u i d i n e B l u e m e t a c h r o m a t i c s t a i n i n g o f m a t u r e m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s . PAS s t a i n i n g o f m u l t i s p o r o u s s p o r a n g i u m . A n i l i n e B l u e - B l a c k s t a i n i n g o f y o u n g m u l t i s p o r o u s s p o r a n g i u m . PAS s t a i n i n g o f m u l t i s p o r o u s s p o r a n g i u m . A n i l i n e B l u e - B l a c k s t a i n i n g o f m a t u r e s p o r a n g i u m . A c i d F u c h s i n s t a i n i n g o f a l m o s t m a t u r e s p o r a n g i u m . PAS s t a i n i n g o f m a t u r e s p o r a n g i o -s p o r e s w i t h a p p e n d a g e s . PAS s t a i n i n g o f s p o r e a p p e n d a g e s o n r e l e a s e d s p o r e s . 2 1 9 V I I . D I S C U S S I O N A . C h o a n e p h o r a c e a e S p o r a n g i o s p o r e s o f C h o a n e p h o r a a n d B l a k e s l e a a r e f o r m e d b y t h e c l e a v a g e o f t h e s p o r a n g i u m c y t o p l a s m . T h i s c l e a v a g e i s a c c o m p l i s h e d b y f u s i o n o f v e s i c l e s t o f o r m a c l e a v a g e a p p a r a t u s s i m i l a r t o t h a t r e p o r t e d i n G i l b e r t e l l a ( B r a c k e r , 1 9 6 8 ) , t h u s s u p p o r t i n g t h e c o n c e p t t h a t t h e t h r e e g e n e r a a r e c l o s e l y r e l a t e d . T h e same p a t t e r n o f s p o r a n g i a l c l e a v a g e h a s b e e n r e p o r t e d i n s e v e r a l o t h e r P h y c o m y c e t e s : i n P h y t o p h t h o r a ( H o h l a n d H a m a m o t o , 1 9 6 7 ; E i s n e r e t a l . , 1 9 7 0 ) , A l l o m y c e s ( M o o r e , 1 9 . 6 4 ) , S a p r o l e g n i a ( G a y a n d G r e e n w o o d , 1 9 6 6 ) a n d i n P h y c o m y c e s ( T u a n d M a l h o t r a , 1 9 7 6 ) . R h i z o p u s was d e s c r i b e d a s r e p r o d u c i n g b y s p o r a n g i a l c l e a v a g e i n a l i g h t - m i c r o s c o p i c s t u d y b y S w i n g l e ( 1 9 0 3 ) , i n w h i c h h e s u g g e s t e d t h e f u s i o n o f v e s i c l e s a s t h e s o u r c e o f c l e a v a g e p l a n e s . H o w e v e r , S c h w a r z e ( 1 9 2 2 ) d e s c r i b e d c l e a v a g e i n s p o r a n g i a o f M u c o r a s a r e s u l t o f " f u r r o w -i n g " ; - 1 ' o f t h e c y t o p l a s m b y t h e s p o r a n g i u m m e m b r a n e . A l t h o u g h a l l e l e c t r o n m i c r o s c o p e s t u d i e s t o d a t e h a v e s h o w n f u s i o n o f v e s i c l e s a s t h e c l e a v a g e m e c h a n i s m , t o o f e w g e n e r a h a v e b e e n o b s e r v e d t o e x c l u d e t h e p o s s i b i l i t y t h a t o t h e r m e t h o d s e x i s t . - 2 2 0 -T h e p r e s e n c e o f s u r f a c e g r a n u l e s o n c l e a v a g e m e m b r a n e s h a s p r o v e n a u s e f u l a i d f o r t h e i r i d e n t i f i c a t i o n , a s was f i r s t s u g g e s t e d b y B r a c k e r (1968) f o r s p o r a n g i a o f G i l b e r t e l l a . S i m i l a r g r a n u l e s w e r e n o t e d i n T h a m n i d i u m ( F l e t c h e r , 1973) a n d may b e a f e a t u r e common t o c l e a v a g e m e m b r a n e s i n a l l m u c o r a l e a n s p o r a n g i a . T h e g r a n u l e s a r e s i m i l a r i n s i z e t o r i b o s o m e s a n d t h e c l e a v a g e membrane r e s e m b l e s " r o u g h " E R . S i n c e t h e g r a n u l e s a p p e a r t o a l t e r t h e i r c o n f i g u r a t i o n a n d b e c o m e i n c o r p o r a t e d i n t o s p o r e w a l l s , i t w o u l d b e o f g r e a t i n t e r e s t t o d e t e r m i n e t h e i r c h e m i c a l c o m p o s i t i o n u s i n g e l e c t r o n - m i c r o s c o p i c h i s t o -c h e m i s t r y . T h e e x p a n s i o n o f t h e g r a n u l e s i n t o a f i b r o u s l a y e r , a n d t h e i n c o r p o r a t i o n o f t h i s l a y e r i n t o t h e o u t e r -m o s t , d a r k - s t a i n i n g w a l l l a y e r o f t h e s p o r e s u g g e s t s t h a t s i m i l a r w a l l l a y e r s may be f o r m e d i n t h e same m a n n e r i n s p o r e s o f M u c o r ( B a r t n i c k i - G a r c i a , 1968); P h y c o m y c e s ( T u a n d M a l h o t r a , 1976); R h i z o p u s ( H e s s a n d W e b e r , 1973); a n d P i p t o c e p h a l i s ( J e f f r i e s a n d Y o u n g , 1976). A t w o - l a y e r e d s p o r e w a l l i s common among f u n g i , t h e i n n e r l a y e r b e i n g e l e c t r o n t r a n s p a r e n t a n d u s u a l l y t h i c k e r t h a n t h e t h i n d e n s e o u t e r l a y e r . I n t h e C h o a n e p h o r a c e a e t h e o u t e r l a y e r i s s t r i a t e d o r r i d g e d , t h e r i d g e s b e i n g f o r m e d b y e x p a n s i o n o f o n l y t h e o u t e r w a l l l a y e r . I n B l a k e s l e a t h e r e i s s i g n i f i c a n t s t r u c t u r a l - 221 d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e two s u b l a y e r s o f t h i s o u t e r w a l l l a y e r , t h u s r e p r e s e n t i n g o n e s t r u c t u r a l d i s t i n c t i o n b e t w e e n s p o r e s o f B l a k e s l e a a n d C h o a n e p h o r a . D e v e l o p m e n t o f s p o r e s i n s p o r a n g i o l e s o f B l a k e s l e a i s b a s i c a l l y t h e same a s t h a t i n m u l t i s p o r o u s s p o r a n g i a . T h e g r a n u l e - l i n e d c l e a v a g e a p p a r a t u s i s f o r m e d b u t i t i s s t r i c t l y o r i e n t e d w i t h t h e i t h r e e - l o n g i t u d i n a l s u t u r e s i n t h e s p o r a n g i o l e w a l l . I n some c a s e s t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s a p p e a r s t o e x p a n d c e n t r i p e t a l l y f r o m s u t u r e l i n e s ; i n o t h e r s t h e a p p a r a t u s e x p a n d e d f r o m t h e c e n t e r t o w a r d s s u t u r e s . I n b o t h c a s e s t h e r e s u l t i s t h e s a m e : t h e c l e a v a g e o f s p o r a n g i o l e c y t o p l a s m i n t o t h r e e p r o s p o r e s . T h e g r a n u l a r l i n i n g c h a n g e s t o a t h i n s o l i d -s p o r e c o a t w h i c h e x p a n d s t o f o r m t h e o u t e r , r i d g e d w a l l l a y e r . D a r k - s t a i n i n g g r a n u l a r v e s i c l e s d e s c r i b e d h e r e a n d i n C u n n i n g h a m e l l a r e q u i r e f u r t h e r s t u d y s i n c e s i m i l a r s t r u c t u r e s h a v e n o t b e e n n o t e d i n o o t h e r s t u d i e s o f m u c o r a l e a n f u n g i , b u t may o c c u r i n t h e T r i c h o m y c e t e H a r p e l l a m e l u s i n a e , ( R e i c h l e a n d L i c h t w a r d t , 1972). T h e s e g r a n u l e s o c c u r d u r i n g p r o d u c t i o n o f s p o r e w a l l s ( F i g u r e s 21 a n d 236) a n d a l s o a p p e a r t o b e i n v o l v e d d u r i n g g e r m i n a t i o n s t a g e s when a new v e g e t a t i v e w a l l i s p r o d u c e d ( F i g u r e 102). T h e a b s e n c e o f s i m i l a r s t r u c t u r e s i n o t h e r s t u d i e s may r e f l e c t d i f f e r e n c e s i n f i x a t i o n p r o c e d u r e s . - 222 When c o m p a r i n g t h e t r i - s p o r e d s p o r a n g i o l e o f B l a k e s l e a t o t h e m e r o s p o r a n g i f e r o u s m u c o r a l e a n f u n g i ( B e n j a m i n , 1966) s e v e r a l s i m i l a r i t i e s a r e a p p a r e n t . T h e m e r o s p o r a n g i u m f o r m s b y e v a g i n a t i o n o f t h e a m p u l l a w a l l , a n d t h e c y t o p l a s m i s d i v i d e d i n t o p r o s p o r e s b y a c l e a v a g e a p p a r a t u s . I n S y n c e p h a l a s t r u m ( F l e t c h e r , 1972 a ) t h e o u t e r s p o r e w a l l f o r m s f i r s t , f r o m t h e g r a n u l e s l i n i n g t h e c l e a v a g e a p p a r a t u s , a n d t h e i n n e r w a l l l a y e r i s d e p o s i t e d b e t w e e n t h i s o u t e r c o a t a n d t h e s p o r e m e m b r a n e . I n S y n c e p h a l i s s p h a e r i c a ( B a k e r e t a l . , 1977) s p o r a n g i a a l s o f o r m :by e v a g i n a t i o n o f a n a m p u l l a b u t t h e p r o s p o r e s a r e f o r m e d b y c e n t r i p e t a l i n v a g i n a t i o n o f t h e s p o r a n g i a l m e m b r a n e . B o t h p a t t e r n s o f p r o s p o r e d e l i m i t a t i o n a r e r e p o r t e d h e r e i n d e v e l o p i n g s p o r a n g i o l e s o f B l a k e s l e a t r i s p o r a . F o l l o w i n g c l e a v a g e , w a l l f o r m a t i o n d e s c r i b e d i n S y n c e p h a l i s b y B a k e r e t a l . , (1977) d i f f e r s g r e a t l y f r o m t h a t r e p o r t e d i n G i l b e r t e l l a ( B r a c k e r , 1968), T h a m n i d i u m ( F l e t c h e r 1973). S y n c e p h a l a s t r u m ( F l e t c h e r , 1972 a ) , a n d C h o a n e p h o r a a n d B l a k e s l e a i n t h e p r e s e n t s t u d y . B a k e r e t a l . (1977) r e p o r t e d t h a t t h e o u t e r s p o r e w a l l s o f S y n c e p h a l i s a r e l a i d down o n t h e s p o r a n g i a l w a l l p r i o r t o c l e a v a g e . T h i s i s f o l l o w e d b y c r o s s w a l l f o r m a t i o n , a n d f i n a l l y b y p r o d u c t i o n o f a n e l e c t r o n -t r a n s p a r e n t i n n e r s p o r e w a l l . S i n c e t h e e a r l y s t a g e s a n d f i n a l s p o r e s t r u c t u r e a g r e e w i t h t h o s e r e p o r t e d i n r e l a t e d - 223 f u n g i , f u r t h e r s t u d y o f w a l l d e v e l o p m e n t seems n e c e s s a r y i n S y n c e p h a l i s . T h e p o s s i b l e t a x o n o m i c u s e o f s p i n e s a n d a p p e n d a g e s m u s t be c o n s i d e r e d i n t h e l i g h t o f e l e c t r o n m i c r o s c o p y . I n t h e M u c o r a l e s , s p i n e s a r e r e p o r t e d i n s e v e r a l f a m i l i e s , b u t m o s t e v i d e n c e p o i n t s t o t h e s p o r a n g i u m a n d n o t t o t h e s p o r e a s t h e p o s s e s s o r o f t h e s e s t r u c t u r e s . S p i n e s s i m i l a r t o t h o s e r e p o r t e d h e r e i n C h o a n e p h o r a a n d B l a k e s l e a o c c u r o n s p o r a n g i a o f P i l o b o l u s ( B l a n d a n d C h a r l e s , 1972) a n d P i l a i r a ( Y o u n g , 1968 b ) , b o t h i n t h e P i l o b o l a c e a e ; o n P i p t o c e p h a l i s ( Y o u n g , 1969 a ) , o n M u c o r ( Y o u n g , 1968 b ) a n d o n T h a m n i d i u m ( F l e t c h e r , 1973)-L o n g e r a n d s l i g h t l y d i f f e r e n t s p i n e s o c c u r o n C u n n i n g h a m e l l a a n d w i l l b e d i s c u s s e d l a t e r . E a r l i e r s t u d i e s o f s p i n e s i n t h e C h o a n e p h o r a c e a e h a v e s h o w n c a p i t a t e ( = p i l e a t e ) s p i n e s ( K a w a k a m i e t a l . , 1956; Y o u n g , 1968 b ) w h i c h a p p e a r t o be c o v e r e d w i t h , a n d t o p p e d b y , e x t e r n a l c r y s t a l s . I n f i x e d a n d s e c t i o n e d m a t e r i a l t h e s e c r y s t a l s a r e a p p a r e n t l y l o s t , e x c e p t f o r some i n d i c a t i o n s o f a p i l e a t e t o p s e e n i n F i g u r e s 68 a n d 70. T h e z y g o s p o r e o f C h o a n e p h o r a  c i r c i n a n s was s t u d i e d r e c e n t l y b y K i r k (1977) a n d f o u n d t o h a v e no s p i n e s , b u t l i k e t h e a s e x u a l s p o r e s d e s c r i b e d i n t h e p r e s e n t s t u d y , i t s s u r f a c e was s h o w n t o b e r i d g e d o r s t r i a t e d . T h e o n l y s p e c i e s f o u n d b y Y o u n g (1968 b ) w i t h s p i n e s o n i t s s p o r a n g i o s p o r e s was S y z g i t e s m e g a l o c a r p u s , ( M u c o r a c e a e ) . A w i d e r s u r v e y o f s p i n e o c c u r r e n c e i s n e e d e d b e f o r e much t a x o n o m i c s i g n i f i c a n c e c a n be a t t r i b u t e d t o - 2 2 4 t h e s e s t r u c t u r e s . R e p o r t s o f m u c o r a l e a n " c o n i d i a " b e a r i n g s p i n e s s h o u l d b e v i e w e d w i t h s k e p t i c i s m u n t i l d e v e l o p m e n t a l s t u d i e s a r e c o m p l e t e d o n t h e s e g e n e r a . T h e m a t u r e s p o r a n g i o l e s o f C h o a n e p h o r a a n d B l a k e s l e a a r e r e l e a s e d i n t a c t f o r a i r d i s p e r s i o n , a s a r e t h o s e o f T h a m n i d i u m ( F l e t c h e r , 1 9 7 3 ) ' T h e i r s p i n y s u r f a c e s may s e r v e t h e f u n c t i o n o f p r e s e n t i n g a r o u g h e r s u r f a c e t o a i r c u r r e n t s . I f a s p o r a n g i o l e d e h i s c e s o n c o n t a c t w i t h w a t e r , t h e s p o r e s a r e r e l e a s e d a n d t h e i r b i p o l a r b r i s t L . e s b e c o m e e x t e n d e d , p e r h a p s a s a n a i d i n w a t e r d i s p e r s a l . A p p e n d a g e s o f s i m i l a r d e s i g n a r e common i n m a r i n e a n d f r e s h w a t e r f u n g i s u c h a s t h o s e s t u d i e d b y K i r k ( 1 9 6 6 ) . T h e r i b b o n - l i k e a p p e n d a g e s a r e n o t e r e c t i n s i d e s p o r a n g i a o r s p o r a n g i o l e s , a n d p r e s u m a b l y become e x t e n d e d b y a h y d r o p h i l i c o r h y d r o p h o b i c r e a c t i o n u p o n r e l e a s e . A p p e n d a g e s o b s e r v e d i n t h e p r e s e n t s t u d y w e r e s t r u c t u r a l l y s i m i l a r t o t h o s e r e p o r t e d f o r G i l b e r t e l l a ( B r a c k e r , 1 9 6 8 ) b u t t h e r e was a d i f f e r e n c e i n e l e c t r o n - s t a i n i n g . I n C h o a n e p h o r a a n d B l a k e s l e a t h e c o n c a v e s u r f a c e o f a p p e n d a g e s i s e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t a n d t h e c o n v e x s u r f a c e i s e l e c t r o n -d e n s e . I n G i l b e r t e l l a t h e e x a c t o p p o s i t e was d e s c r i b e d a n d B r a c k e r ( 1 9 6 8 ) s t a t e d t h a t u n p u b l i s h e d m i c r o g r a p h s b y E . E . B u t l e r h a d s h o w n a p p e n d a g e s o f B l a k e s l e a a n d C h o a n e p h o r a t o r e s e m b l e t h o s e o f G i l b e r t e l l a . M i c r o g r a p h s 225 b y B u t l e r w e r e i n c l u d e d i n a p a p e r b y G r o v e (1976) b u t w e r e o f s h a d o w e d a p p e n d a g e s , t h u s n o c o m p a r i s o n c a n be made w i t h t h e r e s u l t s o f t h e p r e s e n t s t u d y . I n C h o a n e p h o r a , s p o r a n g i o l e s a r e r e d u c e d t o t h e s i n g l e - s p o r e d c o n d i t i o n , a n d t h e y n e i t h e r d e h i s c e i n w a t e r n o r do t h e y p o s s e s s p o l a r a p p e n d a g e s . T h e m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s do n o t d e v e l o p v i a a c l e a v a g e a p p a r a t u s s i n c e n o c l e a v a g e i s r e q u i r e d . H o w e v e r , s p o r e w a l l s f o r m i n t h e same o r d e r a n d a r e s t r u c t u r a l l y s i m i l a r t o t h o s e o f s p o r e s i n s p o r a n g i a o r f e w - s p o r e d s p o r a n g i o l e s o f C h o a n e p h o r a o r B l a k e s l e a . T h e s p o r a n g i a l w a l l i s v e r y t h i n a t m a t u r i t y b u t i s s t i l l r e t a i n e d o n g e r m i n a t i n g s p o r e s ( G r o v e , 1976), a l t h o u g h no m e t h o d o f a d h e s i o n i s a p p a r e n t . T h e t h i n n e s s o f t h e s p o r a n g i a l w a l l p r e v e n t s e a s y i d e n t i f i c a t i o n b y l i g h t m i c r o s c o p y , a f a c t w h i c h n o d o u b t l e d t o t h e a p p l i c a t i o n o f " c o n i d i a l " t e r m i n o l o g y b y e a r l y m i c r o s c o p i s t s . D u r i n g g e r m i n a t i o n a n e n t i r e new w a l l i s s y n t h e s i z e d b e t w e e n t h e s p o r e w a l l a n d p l a s m a m e m b r a n e . A s i m i l a r p r o c e s s i s common, b u t n o t u n i v e r s a l , i n o t h e r f u n g i ( B a r t n i c k i - G a r c i a , 1968; K h a n , 1975*, H e s s a n d W e b e r , 1973; J e f f r i e s a n d Y o u n g , 1976: G r o v e , 1976). T h e p r o d u c t i o n o f t h i s v e g e t a t i v e w a l l o c c u r e d i n some s p o r e s s t i l l w i t h i n t h e i r s p o r a n g i a . T h i s was p r e s u m a b l y a - 226 -r e s p o n s e t o c o n d i t i o n s i n o l d c u l t u r e s . S u c h " i n s i t u " g e r m i n a t i o n m u s t b e c o n s i d e r e d when d e s c r i b i n g w a l l l a y e r s i n m a t u r e s p o r e s o r t h e v e g e t a t i v e w a l l may b e e r r o n e o u s l y c a l l e d a t h i r d l a y e r o f t h e " n o r m a l ' ' t w o - l a y e r e d s p o r e w a l l . M u l t i p l e l a y e r i n g o f t h e v e g e t a t i v e w a l l , d e s c r i b e d i n t h e p r e s e n t s t u d y , i s c o n s i d e r e d a t y p i c a l o f g e r m i n a t i n g s p o r e s a n d was p r e s u m a b l y d u e t o a d v e r s e c u l t u r e c o n d i t i o n s . I f s u c h c o n d i t i o n s c o u l d b e d u p l i c a t e d t h e r e s u l t s m i g h t b e o f i n t e r e s t t o t h o s e s t u d y i n g w a l l s y n t h e s i s o r b i o c h e m i s t r y . I n t h e d i s c u s s i o n o f t a x o n o m y i t was p o i n t e d o u t t h a t B l a k e s l e a ' z t r i s p o r a h a s b e e n t r a n s f e r r e d b a c k a n d f o r t h b e t w e e n t h e g e n e r a B l a k e s l e a a n d C h o a n e p h o r a . No s i g n i f i c a n t u l t r a s t r u e t u r a l d i f f e r e n c e s w e r e f o u n d i n m u l t i s p o r o u s s p o r a n g i a o f t h e two g e n e r a , a n d s i n c e t h e " c o n i d i a l " s t a g e o f C h o a n e p h o r a i s d e f i n i t e l y a m o n o s p o r e d s p o r a n g i o l e t h e r e a p p e a r s t o b e no s t r u c t u r a l r e a s o n f o r r e t a i n i n g B l a k e s l e a t r i s p o r a i n a s e p a r a t e g e n u s . I n a new s p e c i e s d e s c r i b e d b y M e h r o t r a a n d B a i j a l (1968) a s B l a k e s l e a m o n o s p o r a t h e s p o r a n g i o l e s w e r e r e d u c e d t o o n e s p o r e , b u t u n l i k e " c o n i d i a l " s p o r e s o f C h o a n e p h o r a s p e c i e s , t h e s e s p o r e s h a d b i p o l a r a p p e n d a g e s a n d t h e s p o r a n g i o l e s d e h i s c e d a t 227 m a t u r i t y . S i n h a ( 1 9 ^ 0 , b) a l s o r e p o r t e d t h e p r o d u c t i o n o f " c o n i d i a " i n B l a k e s l e a a f t e r s e r i a l s u b c u l t u r i n g f o r f o u r g e n e r a t i o n s . - 228 V I I I . D I S C U S S I O N B . C u n n i n g h a m e l l a c e a e I n b o t h C u n n i n g h a m e l l a a n d M y c o t y p h a . s p o r e s a r e f o r m e d w i t h i n s p o r a n g i o l e w a l l s , t h u s c o n f i r m i n g t h e r e s u l t s o f K h a n a n d T a l b o t (1975). S p o r e s a r e d i s s e m i n a t e d w i t h i n i n t a c t s p o r a n g i o l e s a n d some i n d i c a t i o n o f c h e m i c a l a d h e s i o n i s g i v e n b y t h e p r e s e n c e o f a n a m o r p h o u s m a t e r i a l b e t w e e n t h e two w a l l s ( F i g u r e s 26l, 262,and 307 t o 310). S i m i l a r a d h e s i o n was n o t s h o w n i n m o n o -s p o r o u s s p o r a n g i o l e s o f C h o a n e p h o r a s i n c e w a l l t o w a l l c o n t a c t i s r e s t r i c t e d t o t h e t o p s o f s p o r e w a l l r i d g e s ( F i g u r e s 30 t o 32). T h e i n v o l v e m e n t o f g r a n u l a r v e s i c l e s i n w a l l f o r m a t i o n i s v e r y e v i d e n t i n C u n n i n g h a m e l l a ( F i g u r e 236 e t s e q . ) . S i m i l a r s t r u c t u r e s a r e a l s o p r e s e n t i n m a t u r e s p o r e s o f M y c o t y p h a ( F i g u r e 309) h u t a r e n o t o b s e r v e d d u r i n g e a r l i e r s t a g e s o f w a l l p r o d u c t i o n . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e i r c h e m i c a l c o m p o s i t i o n was n o t p o s s i b l e u s i n g l i g h t -m i c r o s c o p e h i s t o c h e m i s t r y . T h e a p p a r e n t f u s i o n o f t h e s e v e s i c l e s w i t h t h e s p o r e membrane ( F i g u r e 237) i n d i c a t e s a n ER o r G o l g i o r i g i n f o r t h e v e s i c u l a r membrane ( F l e t c h e r , 1973 a n d r e f . c i t . ) . T h e a s s o c i a t i o n o f g r a n u l a r v e s i c l e s - 229 -w i t h ER m e m b r a n e s ( F i g u r e 2 3 9 ) a n d w i t h G o l g i c i s t e r n a e i s d i f f i c u l t t o i n t e r p r e t s i n c e t h e t y p i c a l d i c t y o s o m e s o f p l a n t s a n d a n i m a l s h a v e n o t b e e n d e m o n s t r a t e d i n Z y g o m y c e t e s ( B r a c k e r , 1 9 6 8 ; F l e t c h e r , 1 9 7 2 b ) . C u p - s h a p e d , e l e c t r o n - t r a n s p a r e n t v e s i c l e s h a v e b e e n p r o p o s e d a s G o l g i e q u i v a l e n t s b y B r a c k e r ( 1 9 6 8 ) a n d s i m i l a r s t r u c t u r e s a r e a s s o c i a t e d w i t h g r a n u l a r v e s i c l e s i n C u n n i n g h a m e l l a , ( F i g u r e 2 4 8 ) . T h e many d i f f e r e n t v e s i c l e t y p e s f o u n d i n f u n g i r e q u i r e f u r t h e r s t u d y , i n c l u d i n g EM h i s t o c h e m i s t r y o f t h e i r c o n t e n t s . T h e s h a p e a n d c o n t e n t s o f v e s i c l e s c a n v a r y c o n s i d e r a b l y w i t h f i x a t i o n p r o c e d u r e s a n d i t s e e m s p r e m a t u r e t o l a b e l v e s i c l e s a g o l g i c i s t e r n a e , m i c r o b o d i e s , g l y o x y s o m e s e t c . b a s e d s o l e l y o n t h e i r a p p e a r a n c e i n a p a r t i c u l a r m i c r o g r a p h . I n t h e C h o a n e p h o r a c e a e , t h e d a r k - s t a i n i n g o u t e r w a l l l a y e r o r i g i n a t e s f r o m i t h e f i b r o u s c o a t i n g o f t h e c l e a v a g e m e m b r a n e s . A l a y e r o f s i m i l a r s t r u c t u r e o c c u r s i n m a t u r e s p o r e s o f M y c o t y p h a a n d C u n n i n g h a m e l l a a l t h o u g h i t s p r e c i s e o r i g i n h a s n o t b e e n d e t e r m i n e d . A c l e a v a g e membrane i s n o t o b s e r v e d i n t h e s p o r a n g i o l a r d e v e l o p m e n t o f t h e s e g e n e r a s i n c e no c l e a v a g e t a k e s p l a c e . T h e s p i n e s o f C u n n i n g h a m e l l a s p o r a n g i o l e s h a v e a - 230 s o m e w h a t d i f f e r e n t s t r u c t u r e f r o m t h o s e i n t h e C h o a n e -p h o r a c e a e d e s c r i b e d e a r l i e r . C u n n i n g h a m e l l a s p i n e s a r e f o r m e d a s h o l l o w t u b e s w i t h m u l t i l a y e r e d m e m b r a n o u s s i d e s ( F i g u r e 254). T h e s p i n e b a s e s a r e s w o l l e n ( F i g u r e 252) a n d r e s e m b l e t h o s e o f M u c o r a c c o r d i n g t o H a w k e r e t a l . , (1970) a n d H a w k e r (1971). M o r e t r a n s m i s s i o n EM s t u d i e s o f s p i n e s t r u c t u r e a r e n e e d e d s i n c e s p i n e s o b s e r v e d i n r e p l i c a s o r s c a n n i n g EM p r e p a r a t i o n s s h o w o n l y g r o s s e x t e r n a l f e a t u r e s . C u n n i n g h a m e l l a a n d M y c o t y p h a a r e t h e two g e n e r a o f M u c o r a l e s m o s t o f t e n u s e d t o i l l u s t r a t e t h e c o n i d i a l s t a t e i n P h y c o m y c e t e s , ( e g . I n g o l d a n d Z o b e r i , 1963). R e c e n t o b s e r v a t i o n s p r e s e n t e d b y Y o u n g (1968 a ; 1969), K h a n a n d T a l b o t (1975) a n d t h e p r e s e n t r e p o r t o f f e r c o n v i n c i n g p r o o f t h a t b o t h g e n e r a p r o d u c e m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s w i t h c l o s e l y a p p r e s s e d s p o r a n g i o l a r w a l l s . I n a t r u e c o n i d i u m t h e w a l l o r i g i n a t e s p a r t l y f r o m t h e e x p a n d e d w a l l o f t h e p a r e n t c e l l a n d p a r t l y f r o m t h e s e p t u m u s e d t o s e a l o f f t h e c o n i d i u m ( H u g h e s a n d B i s a l p u t r a , 1 9 7 0 ) . T h e c o n i d i a l c y t o p l a s m h a s n o t b e e n s h o w n to s y n t h e s i z e i t s own w a l l i n s i d e t h e p a r e n t w a l l , a s i s t h e c a s e w i t h a s p o r e i n a s p o r a n g i o l e . I n C u n n i n g h a m e l l a n o s e p t u m i s p r o d u c e d , a n d i n M y c o t y p h a - 231 t h e s e p t u m o c c u r s a t t h e p e d i c e l - a p i c u l u s j u n c t i o n a n d i s n o t i n c o r p o r a t e d i n t o t h e s p o r e w a l l . I n a p a p e r a p p a r e n t l y a i m e d a t p r o v i n g t h e e x i s t e n c e o f t r u e c o n i d i a i n t h e M u c o r a l e s , • D y k s t r a (1974) c a l l e d t h e s p o r a n g i o l e w a l l o f H a p l o s p o r a n g i u m d e c i p i e n s T h a x t e r " r e m n a n t s h e a t h m a t e r i a l " h u t d i d n o t s t a t e i t s o r i g i n . B a s e d o n t h e c h a r a c t e r i s t i c s t h a t t r u e c o n i d i a f r a c t u r e o n l y a t t h e - v s i t e o f g e r m t u b e p r o d u c t i o n a n d do n o t p r o d u c e a new v e g e t a t i v e w a l l , h e c o n c l u d e d t h a t H a p l o s p o r a n g i u m d e c i p i e n s a n d C u n n i n g h a m e l l a v e s i c u l o s a M i s r a a r e b o t h c o n i d i a l . S i n c e a l l o t h e r g e r m i n a t i o n a n d d e v e l o p m e n t a l s t u d i e s show t h e s p o r a n g i o l a r n a t u r e o f M u c o r a l e a n " c o n i d i a " , D y k s t r a may h a v e m i s i n t e r p r e t e d t h e o r i g i n o f w a l l l a y e r s i n t h e s e two s p e c i e s . Y o u n g (1969 b ) s u g g e s t e d p l a c i n g M y c o t y p h a i n t h e T h a m n i d i a c e a e , w h i c h was l a t e r d o n e b y B e n n y a n d B e n j a m i n (1976). T h e i r r e a s o n f o r s u c h a move was t h a t M y c o t y p h a was n o t " c o n i d i a l " a n d t h e r e f o r e d i d n o t f i t i n t h e C u n n i n g h a m e l l a c e a e . S i n c e C u n n i n g h a m e l l a a l s o h a s b e e n s h o w n n o t t o be " c o n i d i a l " , c o n i d i u m p r o d u c t i o n i s n o t a r e l i a b l e c r i t e r i o n f o r p l a c i n g m u c o r a l e a n f u n g i i n f a m i l i e s . S i n c e i t now s e e m s l i k e l y t h a t no t r u e c o n i d i a a r e p r o d u c e d b y m u c o r a l e a n f u n g i , a r e v i s i o n i n f a m i l y c h a r a c t e r i s t i c s s e e m s i n o r d e r . - 232 -S e v e r a l d i f f e r e n c e s w e r e n o t e d b e t w e e n t h e a s e x u a l r e p r o d u c t i v e s t r u c t u r e s o f M y c o t y p h a a n d C u n n i n g h a m e l l a w h i c h may w a r r a n t t h e s e p a r a t i o n o f t h e s e g e n e r a i n t o d i f f e r e n t f a m i l i e s . F i r s t l y , t h e s p o r e s o f M y c o t y p h a a r e d a r k l y p i g m e n t e d a t m a t u r i t y ; C u n i n g h a m e l l a s p o r e s a r e h y a l i n e . S e c o n d l y , t h e s p o r a n g i o l e o f M y c o t y p h a i s p r o d u c e d f r o m t h e i n s i d e l a y e r o f t h e a m p u l l a ; C u n n i n g h a m e l l a s p o r a n g i o l e s f o r m f r o m t h e o u t e r l a y e r o f t h e a m p u l l a w a l l . T h i r d l y , M y c o t y p h a s p o r a n g i o l e s a r e d i m o r p h i c a n d s m o o t h - s u r f a c e d ; C u n n i n g h a m e l l a s p o r a n g i o l e s a r e ~ m o n o m o r p h i c a n d c o v e r e d w i t h s p i n e s F o u r t h l y , M y c o t y p h a s p o r a n g i o l e s a r e s e p a r a t e d f r o m t h e a m u p u l l a b y a s e p t a l w a l l w h i c h i s n o t p r e s e n t i n s p o r a n g i o l e s o f C u n n i n g h a m e l l a . On t h e b a s i s o f a s e x u a l f e a t u r e s i t i s u n c l e a r t o w h i c h f a m i l y M y c o t y p h a show t h e g r e a t e s t a f f i n i t y . - 233 T A B L E I I I T A B L E OF U L T R A S T R U C T U R A L F E A T U R E S cd H H cd CD cd •M S U cd o cd cd o cd CD xi & xi Xi CD H P p H CO CD CD CO CD •H •P CD ^) cd o cd M cd o o o c3 H x: xi H m o O S o m — ' •—' — ' ' MULTISPOROUS SPORANGIA TRISPOROUS SPORANGIOLES MONOSPOROUS SPORANGIOLES MONOSPOROUS SPORANGIOLES MONOSPOROUS SPORANGIOLES c l e a v a g e v e s i c l e s f u s e t o f o r m c l e a v a g e a p p a r a t u s + + NA NA NA g r a n u l e s a n d f i b r o u s c o a t o n c l e a v a g e m e m b r a n e s . + + NA NA NA c y t o p l a s m i c g r a n u l a r v e s i c l e s + + + + -o u t e r s p o r e v / a l l l a y e r t h i n - - - + + o u t e r l a y e r t h i c k , w i t h r i d g e s + + + - -s p o r a n g i o l e w a l l f r o m i n n e r l a y e r o f a m p u l l a w a l l - - - + s p o r a n g i o l e w a l l f r o m o u t e r l a y e r o f a m p u l l a w a l l + + + + -s p o r a n g i o l e w a l l a d h e r e n t t o s p o r e v / a l l - - - + + s e p t u m f o r m e d i n p e d i c e l NA - + - + a g o r a n g i a l s p i n e s c r y s t a l i n e + + + - NA s p o r a n g i a l s p i n e s m e m b r a n o u s - - - + NA n u m b e r o f s p o r a n g i a l w a l l s e c t i o n s 2 3 1 1 1 - 234 -V I I I . D I S C U S S I O N C . H i s t o c h e m i s t r y I n t e r p r e t a t i o n o f c h e m i c a l c h a n g e s d u r i n g s p o r e f o r m a t i o n i s l i m i t e d b y two f a c t o r s : t h e s m a l l s i z e o f t h e s t r u c t u r e s , a n d t h e l a c k o f s u p p o r t i n g b i o c h e m i c a l a n a l y s i s o f s p o r e s t r u c t u r e s . S t r e a m s o f f a t t y a c i d s o r a c i d m u c o p o l y s a c c h a r i d e s w e r e o b s e r v e d i n a m p u l l a e o f C h o a n e p h o r a , B l a k e s l e a a n d C u n n i n g h a m e l l a . T h e f a t e o f s u c h c h e m i c a l s may b e i n c o r p o r a t i o n i n t o new w a l l s a s d e t e c t e d i n C h o a n e p h o r a h y p h a l w a l l s ( L e t o u r n e a u e t a l . , 1 9 7 6 ) , i n t o s p o r e s a n d m y c e l i u m a s f o u n d i n M u c o r a n d R h i z o p u s ( S u m n e r a n d M o r g a n , 1 9 6 9 ) , o r i n t o l i p i d s t o r a g e d r o p l e t s . T h e c y t o p l a s m o f a a m p u l l a e a n d y o u n g s p o r a n g i o l e s c o n t a i n s d i f f u s e p r o t e i n s , m o s t l i k e l y i n t h e f o r m o f f r e e r i b o s o m e s . Some c a r b o h y d r a t e i s l o c a t e d d i f f u s e l y i n c y t o p l a s m , p e r h a p s i n g l y c o g e n , b u t m o s t a p p e a r s m o r e ? l o c a l i z e d i n g r a n u l e s o r v e s i c l e s . S i n c e f u n g a l w a l l s c o n t a i n a h i g h p e r c e n t a g e o f c a r b o h y d r a t e , ( B a r t n i c k i - G a r c i a , 1 9 6 8 , a , b ) , t h e s e " g r a n u l e s " may b e t h e w a l l - a s s o c i a t e d g r a n u l a r v e s i c l e s s e e n i n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s . W a l l s o f a m p u l l a e a n d s p o r a n g i o l e s s t a i n f o r l i p i d s , - 235 -p r o t e i n s a n d c a r b o h y d r a t e s , a l l o f w h i c h a r e c o m p o n e n t s o f f u n g a l h y p h a l w a l l s , ( B a r t n i c k i - G a r c i a a n d N i c k e r s o n , 1962; L e t o u r n e a u e t a l . , 1976). T h e a l m o s t t o t a l f a i l u r e o f m a t u r e w a l l s t o a c c e p t h i s t o c h e m i c a l s t a i n s may r e f l e c t t h e i r f u n c t i o n a s p r o t e c t o r s o f t h e s p o r e c o n t e n t s . C h e m i c a l l o c a l i z a t i o n i n s p o r a n g i a l s p i n e s i s n o t p o s s i b l e b y l i g h t m i c r o s c o p y s i n c e t h e y a r e s o s m a l l . U s i n g e l e c t r o n h i s t o c h e m i c a l t e c h n i q u e s , i t may b e p o s s i b l e t o s u p p o r t t h e f i n d i n g s o f e l e c t r o n p r o b e m i c r o a n a l y s i s ( J o n e s e t a l . , 1976). T h e b i p o l a r " b r i s t l e s " o f s p o r a n g i o s p o r e s a n d s p o r e s f r o m t r i - s p o r e d s p o r a n g i o l e s a p p e a r m e m b r a n o u s i n m i c r o g r a p h s , h o w e v e r t h e o n l y s t a i n i n g r e a c t i o n t h e y e x h i b i t i s f o r c a r b o h y d r a t e s ( P A S - p o s i t i v e ) . T h i s r e a c t i o n may r e p r e s e n t s t a i n i n g o f t h e a m o r p h o u s m a t e r i a l d e p o s i t e d o n t h e o o u t e r c o n v e x a p p e n d a g e s u r f a c e ( F i g u r e 189). T h e a p p e n d a g e s o f G i l b e r t e l l a w e r e s t a i n e d b y B u t l e r e t a l . , (i960) a n d a l t h o u g h t h e s e a u t h o r s d i d n o t u s e t h e PAS p r o c e d u r e , t h e y d i d show t h a t t h e a p p e n d a g e s d i d n o t s t a i n f o r p r o t e i n . T h e a t t a c h m e n t s i t e s o f a p p e n d a g e s t a i n f o r b o t h c a r b o h y d r a t e a n d p r o t e i n s , b u t n o d i s c r e t e s t r u c t u r e s a r e f o u n d a t t h e s e l o c a t i o n s i n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s , 236 ( F i g u r e s 108 t o 112 a n d 188, 189). A p p e n d a g e s o f some o f t h e m a r i n e P y r e n o m y c e t e s p o r e s o b s e r v e d b y K i r k (1966) w e r e s h o w n t o be c o m p o s e d o f c a r b o h y d r a t e s a n d t o a p p e a r m e m b r a n o u s . B y c o m b i n i n g t h e r e s u l t s o f F e u l g e n s t a i n i n g w i t h t h o s e o f o t h e r s t a i n s d e m o n s t r a t i n g n u c l e o p r o t e i n s , t h e b e h a v i o r o f n u c l e i d u r i n g s p o r o g e n e s i s c a n be d e s c r i b e d . N u c l e a r r e p l i c a t i o n o c c u r s p r i o r t o a m p u l l a o r s p o r a n g i u m f o r m a t i o n a s r e p o r t e d i n P h y c o m y c e s , ( T u - a n d M a l h o t r a , 1976); a l l a m p u l l a e c o n t a i n l a r g e n u m b e r s o f n u c l e i , h u n d r e d s i n t h e c a s e o f M y c o t y p h a . I n m u l t i -s p o r o u s s p o r a n g i a , t h e c y t o p l a s m i c c l e a v a g e r e s u l t s i n e a c h p r o s p o r e h a v i n g s e v e r a l n u c l e i , ( R o b i n o w , 1957 h ) f r o m 2 t o 5 i n B l a k e s l e a ( C u t t e r , 1942). I n s p o r a n g i o l e s , mono o r t r i s p o r o u s , s e v e r a l n u c l e i e n t e r t h r o u g h t h e p e d i c e l , t h u s p r o d u c i n g s p o r e s w i t h 2 t o 6 n u c l e i . M o r i e (1966) d e t e c t e d 4 t o 6 n u c l e i i n m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s o f C h o a n e p h o r a . P e r h a p s b e c a u s e o f t h e h i g h n u m b e r s o f s p o r e s p r o d u c e d , e a c h s p o r a n g i o l e o f M y c o t y p h a r e c e i v e o n l y o n e n u c l e u s f r o m t h e a m p u l l a . T h i s i s i d e n t i c a l t o t h e c o n d i t i o n r e p o r t e d b y . R e i s s (1976) f o r T h a m n i d i u m . M a t u r e s p o r e s o f M y c o t y p h a a p p e a r t o c o n t a i n s e v e r a l n u c l e i i n m i c r o g r a p h s , 2 3 7 i n d i c a t i n g r e p l i c a t i o n d u r i n g s p o r e m a t u r a t i o n . No n u c l e a r d i v i s i o n s w e r e o b s e r v e d i n M y c o t y p h a , b u t m a t u r e s p o r a n g i o l o s p o r e s o f T h a m n i d i u m w e r e s i m i l a r l y s h o w n t o h a v e i n c r e a s e d n u c l e a r n u m b e r s ( R e i s s , 1 9 7 6 ) u p t o k p e r s p o r e . T h i s s i m i l a r i t y i n n u c l e a r b e h a v i o r may s u p p o r t t h e t r a n s f e r o f M y c o t y p h a f r o m t h e C u n n i n g h a m e l l a c e a e t o t h e T h a m n i d i a c e a e . T h e t a x o n o m i c s i g n i f i c a n c e o f t h e n u m b e r o f n u c l e i p e r s p o r e i s n o t c l e a r ; R o b i n o w ( 1 9 5 7 a ) f o u n d two s p e c i e s o f M u c o r t o b e h a v e d i f f e r e n t l y , M u c o r h i e m a l i s s p o r e s b e i n g u s u a l l y u n i n u c l e a t e a n d M u c o r f r a g i l i s s p o r e s m u l t i n u c l e a t e . S t o r c k a n d M o r r i l l ( 1 9 7 7 ) f o u n d m o s t M u c o r s p e c i e s t o h a v e u n i n u c l e a t e s p o r e s w h i l e P h y c o m y c e s , R h i z o p u s a n d Z y g o r h y n c h u s s p o r e s w e r e m u l t i n u c l e a t e . M a n y m o r e g e n e r a m u s t b e e x a m i n e d , e s p e c i a l l y i n t h e l e s s e r k n o w n f a m i l i e s , b e f o r e a n y g e n e r a l n u c l e a r p a t t e r n c a n be d e t e r m i n e d i n t h e M u c o r a l e s . - 238 SUMMARY T r u e c o n i d i a a r e n o t p r o d u c e d b y a n y o f t h e g e n e r a s t u d i e d . I n M y c o t y p h a a n d C u n n i n g h a m e l l a t h e s p o r a n g i o l e w a l l i s s h o w n t o b e a t t a c h e d t o t h e s p o r e w a l l b y a n a m o r p h o u s m a t e r i a l . A s a r e s u l t o f t h i s r e p o r t a n d o t h e r p u b l i s h e d r e s u l t s , i t i s d o u b t e d t h a t a n y m u c o r a l e a n f u n g i p r o d u c e t r u e c o n i d i a . T r i - s p o r e d s p o r a n g i o l e s of B l a k e s l e a u n d e r g o a p r o c e s s o f c y t o p l a s m i c c l e a v a g e s i m i l a r t o t h a t o f l a r g e , c o l u m e l l a t e s p o r a n g i a . A c c l e a v a g e a p p a r a t u s i s f o r m e d b y f u s i o n o f c l e a v a g e v e s i c l e s . C l e a v a g e m e m b r a n e s a r e l i n e d w i t h g r a n u l e s w h i c h e v e n t u a l l y g a v e r i s e t o t h e o u t e r l a y e r o f s p o r e w a l l s . S i n c e s i m i l a r s t r u c t u r e s a n d e v e n t s h a v e b e e n o b s e r v e d i n a v a r i e t y o f P h y c o m y c e t e s , t h e p r e s e n t r e p o r t s u p p o r t s t h e i d e a t h a t t h i s i s t h e b a s i c c l e a v a g e m e c h a n i s m i n s p o r a n g i a . S p o r e w a l l s a r e s h o w n t o h a v e t h e same b a s i c b i l a y e r e d s t r u c t u r e r e p o r t e d i n m o s t f u n g i s t u d i e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y . T h e r i d g e s o n s p o r e s o f t h e C h o a n e p h o r a c e a e a r e d e r i v e d f r o m t h e o u t e r w a l l l a y e r . I n some g e n e r a a t h i r d w a l l l a y e r i s e v i d e n t i n h i g h - m a g n i f i c a t i o n m i c r o g r a p h s . F u t u r e s t u d i e s may c o n f i r m t h e p r e s e n c e o f t h i s a d d i t o n a l l a y e r i n r e l a t e d g e n e r a . - 239 -S u r f a c e s p i n e s a r e r e s t r i c t e d t o s p o r a n g i u m a n d s p o r a n g i o l e w a l l s , no s p i n e s a r e l o c a t e d o n s p o r e w a l l s . P r e v i o u s r e p o r t s o f s p i n y s p o r e s o f m u c o r a l e a n f u n g i s h o u l d be c o n s i d e r e d t o r e p r e s e n t m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s . S p i n e s t r u c t u r e d i f f e r s w i t h v a r i o u s f i x a t i o n m e t h o d s , b u t a l l s p i n e s a p p e a r t o i n v o l v e some c r y s t a l i n e s u b - s t r u c t u r e . S p i n e s i n t h e C h o a n e p h o r a c e a e a r e s t r u c t u r a l l y d i f f e r e n t f r o m t h o s e o f C u n n i n g h a m e l l a . T h e c o m p l e t e l a c k o f s p i n e s f r o m s p o r a n g i o l e s o f M y c o t y p h a l e n d s s u p p o r t t o i t s p r o p o s e d r e m o v a l f r o m t h e C u n n i n g h a m e l l a c e a e . S p o r e a p p e n d a g e s o r " b r i s t l e s " w e r e f o u n d o n l y i n t h e C h o a n e p h o r a c e a e , a n d o n l y o n s p o r e s p r o d u c e d b y c y t o p l a s m i c c l e a v a g e . T h u s a p p e n d a g e s a r e b o r n e b y a l l s p o r e s o f B l a k e s l e a a n d b y s p o r a n g i o s p o r e s o f C h o a n e p h o r a b u t n o t b y s p o r e s i n m o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l e s o f C h o a n e p h o r a . S p o r e s w i t h a p p e n d a g e s a r e t h e r f o r e those w h i c h a r e r e l e a s e d i n t o w a t e r b y d e h i s c e n c e o f t h e s p o r a n g i u m w a l l . D e t e r m i n a t i o n o f t h e h i s t o c h e m i s t r y o f d e v e l o p i n g r e p r o d u c t i v e s t r u c t u r e s was l i m i t e d b e c a u s e o f t h e i r s m a l l s i z e . G r o s s l o c a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n was a c c o m p l i s h e d b u t m o r e s p e c i f i c r e s u l t s r e q u i r e e l e c t r o n - m i c r o s c o p i c - 2 4 0 h i s t o c h e m i s t r y . T h e p l a s t i c e m b e d d i n g t e c h n i q u e s u s e d i n t h e p r e s e n t s t u d y s h o u l d p r o d u c e e x c e l l e n t r e s u l t s II A w i t h t h e l a r g e s t r u c t u r e s o f h i g h e r f u n g i . T h e p r e s e n c e o f d a r k - s t a i n i n g g r a n u l a r v e s i c l e s was o b s e r v e d i n t h r e e o f t h e g e n e r a s t u d i e d . R e p o r t s o n r e l a t e d f u n g i h a v e n o t n o t e d t h i s t y p e o f v e s i c l e b u t t h e y w e r e a b u n d a n t i n t h e t h r e e g e n e r a r e p o r t e d h e r e . I t i s s u g g e s t e d t h a t f u t u r e EM s t u d i e s o f f u n g i s h o u l d i n c l u d e r e s u l t s f r o m d i f f e r e n t f i x a t i o n p r o c e d u r e s . I n t h e p r e s e n t r e p o r t , c e l l s t r u c t u r e was f o u n d t o v a r y c o n s i d e r a b l y w i t h f i x a t i o n , c l e a r l y d e m o n s t r a t i n g t h e i m p o r t a n c e o f t h i s f a c t o r i n d e s c r i p t i v e c y t o l o g y o f f u n g i . A l t h o u g h s t r u c t u r e s h o u l d n o t be t h e o n l y c r i t e r i o n u s e d i n f u n g a l t a x o n o m y , r e s u l t s f r o m c y t o l o g i c a l s t u d i e s c a n be e x p e c t e d t o p r o v i d e new s t r u c t u r a l d a t a . S i n c e much o f t h e p r e s e n t t a x o n o m y was e s t a b l i s h e d p r i o r t o t h e i n t r o d u c t i o n o f e l e c t r o n - m i c r o s c o p y , r e p o r t s s u c h a s t h e p r e s e n t s t u d y w i l l u n d o u b t e d l y l e a d t o r e v i s i o n s o f t a x o n o m i c c h a r a c t e r s . A s a r e s u l t o f s i m i l a r i t i e s a n d d i f f e r e n c e s o b s e r v e d i n s p o r e d e v e l o p m e n t i n t h e f o u r g e n e r a s t u d i e s , t h e - 241 f o l l o w i n g t a x o n o m i c r e c o m m e n d a t i o n s c a n be m a d e : 1. B l a k e s l e a t r i s p o r a s h o u l d be t r e a t e d a s a n o t h e r s p e c i e s o f C h o a n e p h o r a . 2. M y c o t y p h a s h o u l d be r e m o v e d f r o m t h e C u n n i n g -h a m e l l a c e a e . 3 . T a x o n o m i c c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e f a m i l i e s o f M u c o r a l e s s h o u l d be r e v i s e d t o i n c l u d e c u r r e n t o b s e r v a t i o n s o f t h e f i n e - s t r u c t u r e o f t h e i r r e p r o d u c t i v e s t r u c t u r e s . - 242 -L I T E R A T U R E C I T E D A n d e r s o n , T . G . 1951. T e c h n i q u e s f o r t h e p r e s e r v a t i o n o f t h r e e - d i m e n s i o n a l s t r u c t u r e i n p r e p a r i n g s p e c i m e n s f o r t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p e . T r a n s . N . Y . A c a d . S c i . 13_« 130 - 1 3 4 . • B a i n i e r , G . , a n d S a r t o r y , A . 1 9 1 3 - E t u d e s m o r p h o l o g i q u e d u M a r a t e l l a e l e g a n s N . s p . B u l l . S o c . M y c o l . F r a n c e 2 9 : 129 - 13%7~ B a k e r , J . E . , a n d S m i t h , W. L . J r . 1970. H e a t - i n d u c e d u l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e s i n g e r m i n a t i n g s p o r e s o f R h y z o p u s s t o l o n i f e r a a n d M o n i l i n i a f r u c t i c o l a . P h y t o p a t h o l . 60: 8T9 - 8 7 4 . B a k e r , K . L . , H o o p e r , G . R . , a n d B e n e k e , E . S . 1977-U l t r a s t r u c t u r a l d e v e l o p m e n t o f m e r o s p o r a n g i a i n t h e m y c o p a r a s i t e S y n c e p h a l i s s p h a e r i c a ( M u c o r a l e s ) . C a n . J . B o t . 1 5 : 2207 - 2215-B a r t n i c k i - G a r c i a , S . , a n d N i c k e r s o n , W. J . 1962. I s o l a t i o n , c o m p o s i t i o n a n d s t r u c t u r e o f c e l l w a l l s o f f i l a m e n t o u s a n d y e a s t - l i k e f o r m s o f M u c o r r o u x i i . B i o c h e m . B i o p h y s . A c t a . ( A m s t . ) £ 8 : 102 - 119. B a r t n i c k i - G a r c i a , S . 1968. C e l l w a l l c h e m i s t r y , m o r p h -o g e n e s i s a n d t a x o n o m y o f f u n g i . A n n . R e v i e w o f M i c r o b i o l o g y 22: 87 - 1 0 8 . B a r t n i c k i - G a r c i a , S . , N e l s o n , N . a n d C C o t a - R o b l e s , E . 1968. E l e c t r o n M i c r o s c o p y o f S p o r e G e r m i n a t i o n a n d C e l l W a l l F o r m a t i o n i n M u c o r r o u x i i . A r c h . M i k r o b i o l . 63: 242-2-55. B e n j a m i n , R. K . 1959- T h e M e r o s p o r a n g i f e r o u s M u c o r a l e s . A l i s o 4 : 321 - 433. B e n j a m i n , R. K . 1966. T h e Me r o s p o r a n g i u m . M y c o l o g i a 58.: 1 - 4 2 . B e n n y , G . L . 1972. H i s t o c h e m i s t r y o f c e l l v / a l l a n d s e p t u m o f v e g e t a t i v e c e l l s o f s e l e c t e d s p e c i e s o f D i m a r g a r i t a c e a e a n d K i c k x e l l a c e a e . M y c o l o g i a 6 4 : 854 - 862. B e n n y , G . L . , a n d A l d r i c h , H . C . 1975- U l t r a s t r u c t u r a l o b s e r v a t i o n s o n s e p t a l a n d m e r o s p o r a n g i a l o n t o g e n y i n L i n d e r i n a p e n n i s p o r a ( K i c k x e l l a l e s , Z y g o m y c e t e s ) . C a n . J Y B o t . £ 2 r 2325 - '2335• - 243 -B e n n y , G . L . , a n d B e n j a m i n , R. K . 1976. O b s e r v a t i o n s o n T h a m n i d i a c e a e ( M u c o r a l e s ) . I I G h a e t o c l a d i u m . C o k e r o m y c e s , M y c o t y p h a , a n d P h a s c o l o m y c e s . A l i s o 8: 391 - 4 2 4 . B l a n d , C. E . , a n d C h a r l e s , T . M. 1972. F i n - , s t r u c t u r e P i l o b o l u s : s u r f a c e a n d w a l l s t r u c t u r e . M y c o l o g i a Wt 774 - 785-B r a c k e r , C . E . 1966. U l t r a s t r u c t u r a l a s p e c t s o f s p o r a n g i o s p o r e f o r m a t i o n i n G i l b e r t e l l a p e r s i c a r i a . P . 39 - 60. I n : M . F . M a d e l i n e ( e d ) , T h e F u n g u s  S p o r e , P r o c . 18th. S y m p . C o l s t o n R e s . S o c , B u t t e r w o r t h S c i . P u b l . L o n d o n . B r a c k e r , C . E . 1967. U l t r a s t r u c t u r e o f F u n g i . A n n . R e v . P h y t o p a t h o l . 5: 3^ 3 -374. B r a c k e r , C . E . 1968. T h e u l t r a s t r u c t u r e a n d d e v e l o p m e n t o f s p o r a n g i a i n G i l b e r t e l l a p e r s i c a r i a . M y c o l o g i a 60: 1016 - I O 6 7 . B r a c k e r , C. E . 1971. C y t o p l a s m i c v e s i c l e s i n g e r m i n a t i n g s p o r e s s o f G i l b e r t e l l a p e r s i c a r i a . P r o t o p l a s m £2: 381 - 397-B r a c k e r , C . E . , a n d H a l d e r s o n , N . K . 1971- W a l l f i b r i l s i n g e r m i n a t i n g S p o r a n g i o s p o r e s o f G i l b e r t e l l a  p e r s i c a r i a ( M u c o r a l e s ; . A r c h . M i k r o b i o l . 77: 366 - 376. B u c k l e y , P . M . , Sommer, N . F . , a n d M a t s u m o t o , T . T . 1968. U l t r a s t r u c t u r a l d e t a i l s i n g e r m i n a t i n g S p o r a n i o s p o r e s o f R h i z o p u s s t o l o n i f e r g a n d R h i z o p u s a r r h i z u s . J . B a c t e r i d . <?£: 2j6~5 - 2375-B u t l e r , E . E . , O g a w a , J . M . , a n d S h a l l a , T . i960. N o t e s o n G i l b e r t e l l a p e r s i c a r i a f r o m C a l i f o r n i a . B u l l . T o r r e y B o t . C l u b 8£: 397 - 4 4 0 1 . C h a m b e r l a i n , A . H . L . a n d E v a n s , L . V . 1973-A s p e c t s o f s p o r e p r o d u c t i o n i n t h e r e d a l g a C e r a m i u m . P r o t o p l a s m a 7_6: 139 - 159• C h a y e n , J . ( E d i t o r ) . 1969. A G u i d e t o P r a c t i c a l H i s t o c h e m i s t r y . O l i v e r & B o y d , E d i n b u r g h . 26l p p . C h e n o u d a , M . S . 1972. C h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e c e l l w a l l s o f c a r o t e n o g e n e s i s a n d n o n - c a r o t e n o g e n e s i s f o r m s o f ( - ) s t r a i n o f B l a k e s l e a t r i s p o r a . J . G e n . A p p l . M i c r o b i o l . 18: 143 - 153. - 2 4 4 -C l a r k , G . ( E d i t o r ) . 1 9 7 3 - S t a i n i n g P r o c e d u r e s (3rd. E d ) . W i l l i a m s a n d W i l k i n s , B a l t i m o r e . C l e m e n t s , F . E . , a n d S h e a r , C . L . 1931- T h e G e n e r a o f F u n g i . W i l s o n , New Y o r k . C o h e n , A . L . , M a r l o w D . P . , a n d G a r n e r , G . E . 1968. A r a p i d c r i t i c a l p o i n t m e t h o d o f u s i n g f l u o r o c a r b o n s ( " F r e o n s " ) a s i n t e r m e d i a t e a n d t r a n s i t i o n a l f l u i d s . J . M i c r o s c o p . i e £» 331 - 342. C o o k , B . E . 1977. T h e d e v e l o p m e n t o f O e d o c e p h a l u m - t y p e c o n i d i a i n t h e f u n g i C u n n i n g h a m e l l a e c h i n u l a t a a n d Fomes a n n o s u s . New P h y t o l . 7§: 637 - 6 4 2 . C u n n i n g h a m , D. D . I878. On t h e o c c u r r e n c e o f c o n i d i a l f r u c t i f i c a t i o n i n t h e M u c o r i n i , i l l u s t r a t e d b y C h o a n e p h o r a . T r a n s . L i n n . S o c . ( L o n d o n ) S e r . 2, B o t . 1: 409 - 4 2 2 . C u r r e y , F . I873 . On a new g e n u s i n t h e o r d e r M u c e d i n e s . J o u r . L i n n . S o c . L o n d o n , B o t . 13: 333 - 334. p i . 7; 578 p p . C u t t e r , V . M . J r . 1 9 4 2 . N u c l e a r b e h a v i o r i n t h e M u c o r a l e s . I . T h e M u c o r p a t t e r n . B u l l - . - T o r r e y B o t . C l u b 6£: 480 - 508. D y k s t r a , M . J . 1974. A n u l t r a s t r u c t u r a l e x a m i n a t i o n o f t h e s t r u c t u r e a n d g e r m i n a t i o n o f a s e x u a l p r o p a g u l e s o f f o u r M u c o r a l e a n f u n g i . M y c o l o g i a 66: 477 - 489. E k u n d a y o , J . A . 1966. F u r t h e r s t u d i e s o n G e r m i n a t i o n o f S p o r a n g i o s p o r e s o f R h i z o p u s a r r h i z u s . J . G e n . M i c r o b i o l . 4 2 : 283 - 291. E i s n e r , P . R . , V a n d e r M o l e n , G . E . , H o r t o n , J . C , a n d B o w e n , C . C . 1970. F i n e s t r u c t u r e o f P h y t o p h t h o r a  i n f e s t a n s d u r i n g s p o r a n g i a l d i f f e r e n t i a t i o n a n d g e r m i n a t i o n . P h y t o p a t h o l . 60i 1765 - 1772. F e d e r , N . , a n d O ' B r i e n , T . P . 1968. P l a n t m i c r o t e c h n i q u e : Some p r i n c i p l e s a n d new m e t h o d s . A m e r . J . B o t . 15: 123 - 1 4 2 . F e n n e r , E . A . 1932. M y c o t y p h a m i c r o s p o r a , a new g e n u s o f t h e M u c o r a c e a e . M y c o l o g i a 2 4 : 187 - 198. - 2 4 5 -F i s h e r , D . B . 1968. P r o t e i n s t a i n i n g o f r i b b o n e d e p o n s e c t i o n s f o r l i g h t m i c r o s c o p y . H i s t o c h e m i e 16: 92 - 96. F i t z p a t r i c k , H . M. 1930. T h e L o w e r F u n g i - P h y c o m y c e t e s . M c G r a w - H i l l , 331 p p . F l e t c h e r , J . 1972a. F i n e s t r u c t u r e o f d e v e l o p i n g m e r o s p o r a n g i a a n d s p o r a n g i o s p o r e s o f S y n c e p h a l a s t r u m  r a c e m o s u m . A r c h . M i k r o b i o l . 8_7_: 269 - 284. F l e t c h e r , J . 1972 b . T h e d i s t r i b u t i o n o f c y t o p l a s m i c v e s i c l e s . v m u l t i v e s i c u l a r b o d i e s a n d p a r a m u r a l b o d i e s i n e l o n g a t i n g s p o r a n g i o p h o r e s a n d s w e l l i n g s p o r a n g i a o f T h a m n i d i u m e l e g a n s L i n k . A n n . B o t . 2Z: 955 - 961. F l e t c h e r , J . 1973• U l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h s p o r e f o r m a t i o n i n s p o r a n g i a a n d s p o r a n g i o l a o f T h a m n i d i u m e l e g a n s L i n k . A n n . B o t . ( L o n d o n ) 37. 963 - 971. G a y , J . L . a n d G r e e n w o o d , A . D. 1966. S t r u c t u r a l a s p e c t s o f z o o s p o r e p r o d u c t i o n i n S a p r o l e g n i a f e r a x w i t h p a r t i c u l a r r e f e r e n c e t o t h e c e l l a n d v a c u o l a r m e m b r a n e s , p . 95 - 110. i n : M . F . M a d e l i n , ( E d . ) T h e F u n g u s S p o r e . B u t t e r w o r t h S c i . P u b l . , L o n d o n . G i b a r d t , M . 1969. D i e U l t r a s t r u k t u . r d e r A p i c a l r e g i o n v o n P i l z h y p h e n . P r o t o p l a s m ( W i e n ) 6_7_: 413 - 44?. G r o v e , S . N . 1976. F o r m a n d f u n c t i o n i n Z y g o m y c e t e s p o r e s , p . 559 - 592. I n : D . J . W e b e r a n d W. M . H e s s ( E d s . ) , T h e F u n g a l S p o r e , J o h n W i l e y &;>Sons. G r o v e , J . N . a n d B r a c k e r , C . E . 1970. P r o t o p l a s m i c o r g a n i z a t i o n o f h y p h a l t i p s : v e s i c l e s a n d s p i t z e n k o r p e r . J . B a c t . 1 0 4 : 989 - 1009. H a r p e r , R. A . 1899- C e l l - d i v i s i o n i n s p o r a n g i a a n d a s c i . A n n . B o t . 1^: 467 - 525. H a w k e r , L . E . , a n d M c V . A b b o t t , P . 1963. A n E l e c t r o n M i c r o s c o p e S t u d y o f M a t u r a t i o n a n d G e r m i n a t i o n o f S p o r a n g i o s p o r e s o f Two S p e c i e s o f R h i z o p u s . J . G e n . M i c r o b i o l . J2-. 295 - 298. - 246 -H a w k e r , L . E . , a n d H e n d y , R. J . I963. A n e l e c t r o n -m i c r o s c o p e s t u d y o f g e r m i n a t i o n o f c o n i d i a o f B o t r y t i s c i n e r e a . J . G e n . M i c r o b i o l . 3_3_: 43 - 46. H a w k e r , L . E . 1966. G e r m i n a t i o n s m o r p h o l o g i c a l a n d a n a t o m i c a l c h a n g e s , p . 151-161. Ins M . F . M a d e l i n ( e d . ) , T h e F u n g u s S p o r e , C o l s t o n P a p e r s N o . 10, B u t t e r w o r t h s , L o n d o n . H a w k e r , L . E . , T h o m a s , B . , a n d B e c k e t t , A.,1970. A n e l e c t r o n m i c r o s c o p e s t u d y o f s t r u c t u r e a n d g e r m i n a t i o n o f c o n i d i a o f C u n n i n g h a m e l l a e l e g a n s L e n d e n e r . J . G e n . M i c r o b i o l " ! 6O1 181 - 189. H a w k e r , L . E . 1971. S c a n n i n g E l e c t r o n M i c r o s c o p y o f F u n g i a n d i t s b e a r i n g o n c l a s s i f i c a t i o n , p . 237 -249. Ins V. H . H e y w o o d ( e d . ) , S c a n n i n g E l e c t r o n  M i c r o s c o p y , A c a d e m i c P r e s s , N . Y . H e a t h , I . B . , G a y , J . L . , a n d G r e e n w o o d , A . D . 1971. C e l l W a l l F o r m a t i o n i n t h e S a p r o l e g n i a l e s : C y t o p l a s m i c V e s i c l e s U n d e r l y i n g D e v e l o p i n g W a l l s . J . G e n . M i c r o b i o l . 6£s 225 - 232. H e s s , W. M . a n d W e b e r , D . J . 1973- U l t r a s t r u c t u r e o f d o r m a n t a n d g e r m i n a t e d s p o r a n g i o s p o r e s o f R h i z o p u s  a r r h i z u s . P r o t o p l a s m a ( W i e n ) 2Z: 15 - 33-H e s s e l t i n e , C . W. 1952. A S u r v e y o f t h e M u c o r a l e s . T r a n s . N . Y . A c a d . S c i . , S e r . I I , 14: 210 - 214. H e s s e l t i n e , C . W. 1953. A R e v i s i o n o f t h e C h o a n e p h o r a c e a e . A m e r . M i d l a n d N a t u r . 30: 248 - 256. H e s s e l t i n e , C . W. 1955- G e n e r a o f M u c o r a l e s w i t h n o t e s o n t h e i r s y n o n y m y . M y c o l o g i a 4_7_: 344 - 363. H e s s e l t i n e , C. W. a n d B e n j a m i n , C . R. 1957. N o t e s o n t h e C h o a n e p h o r a c e a e . M y c o l o g i a 4_9: 723 - 733. H e s s e l t i n e , C . W. a n d E l l i s , J . J . 1973. M u c o r a l e s , p 187 - 217. I n : G . C . A i n s w o r t h , F . K . S p a r r o w a n d A . S . S u s s m a n ( e d s . ) , T h e F u n g i , v o l . I V B . A c a d e m i c P r e s s , N . Y . H o h l , H . , a n d H a m a m o t o , S . 1967. U l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e s d u r i n g z o o s p o r e f o r m a t i o n i n P h y t o p h t h o r a p a r a s i t i c a . A m e r . J . B o t . 54: 1131 - 1139-- 247 -H u g h e s , G . C . , a n d B i s a l p u t r a , A - A . 1970. U l t r a -s t r u c t u r e o f h y p h o m y c e t e s . C o n i d i u m o o n t o g e n y i n P e z i z a o s t r a c o d e r m a . C a n . J . B o t . 4 8 : 361 - 366. H u g h e s , S . J . 1953' C o n i d i o p h o r e s , c o n i d i a a n d c l a s s i f i c a t i o n . C a n . J . B o t . 2kl 577 - 659. I n g o l d , C . T . , a n d Z o b e r i , M . H . 1963. T h e a s e x u a l a p p a r a t u s o f M u c o r a l e s i n r e l a t i o n t o s p o r e l i b e r a t i o n . T r a n s . B r . M y c o l . S o c . 4 6 : 115 - 134. I n g o l d , C . T . 1971- F u n g a l S p o r e s , T h e i r L i b e r a t i o n a n d D i s p e r s a l . C l a r e n d o n P r e s s . 302 p p . J e f f r i e s , P . , a n d Y o u n g , T . W. K . 1975. U l t r a s t r u c t u r e o f t h e s p o r a n g i o s p o r e s o f P i p t o c e p h a l i s u n i s p o r a ( M u c o r a l e s ) . A r c h . M i k r o b i o l . 10J1: 329 - 333-J e f f r i e s , P . , a n d Y o u n g , T . W. K . 1976. P h y s i o l o g y a n d f i n e s t r u c t u r e o f s p o r a n g i o s p o r e g e r m i n a t i o n i n P i p t o c e p h a l i s u n i s p o r a p r i o r t o i n f e c t i o n . A r c h . M i c r o b i o l . 102: 99 - 107. J e n s e n , W. A . 1962. B o t a n i c a l H i s t o c h e m i s t r y . W. H . F r e e m a n & C o . ( S a n F r a n c i s c o & L o n d o n ) 408 p p . J o n e s , D . , M c H a r d y , W. J . , a n d W i l s o n , M . J . 1976. U l t r a s t r u c t u r e a n d c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f s p i n e s i n t h e M u c o r a l e s . T r a n s . B r . M y c o l . S o c . 66: 153 - 157. K a w a k a m i , N . 1955• E l e c t r o n m i c r o s c o p y o f f u n g i . T h e S p i n e o f g e n u s C u n n i n g h a m m e l1a . B u i . o f F a c u l t y o f E n g i n e e r i n g , H i r o s h i m a U n i v . 4: 415 - 418. K a w a k a m i , N . , I n a t a , T . , a n d N e h i r a , T . 1956. E l e c t r o n m i c r o s c o p y o f f u n g i o n t h e m o r p h o l o g y o f a s e x u a l o r g a n s o f C h o a n e p h o r a c e a e . B u l l . F a c . E n g i n e e r i n g , 1 H i r o s h i m a U n i v . 359 - 366. K h a n , S . R. , a n d T a l b o t , P;?. H . B . 1975- M o n o s p o r o u s s p o r a n g i o l a i n M y c o t y p h a a n d C u n n i n g h a m e l l a . T r a n s . B r . M y c o l . S o c . 6£: 29 - 39. K h a n , S . R. 1975• W a l l S t r u c t u r e a n d g e r m i n a t i o n o f s p o r e s o f C u n n i n g h a m e l l a e c h i n u l a t a . J . G e n . M i c r o b i o l . 9_0: 115 - 1 2 4 . K h a n , S . R. 1976. U l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e s i n m a t u r i n g s p o r a n g i a i n A l b u g o Candida. A n n . B o t . 4 0 : 1285 -1292. - 248 -K h a n , S . R. 1978. T h e g o l g i c i s t e r n a e o f C u n n i n g h a m e l l a  e c h i n u l a t a . C a n . J . B o t . £6: 432 - 439. K i r k , P . M . 1977. S c a n n i n g e l e c t r o n m i c r o s c o p y o f Z y g o s p o r e f o r m a t i o n i n C h o a n e p h o r a c i r c i n a n s ( m u c o r a l e s ) . K i r k , P . W. J r . 1966. M o r p h o g e n e s i s a n d m i c r o s c o p i c c y t o c h e m i s t r y o f m a r i n e p y r e n o m y c e t e a s c o s p o r e s . B e i h . N o v a H e d w i g i a 22: 1 - 128. L e t o u r n e a u , D . R . , D e v e , J . M . , a n d M a n o c h a , M . S . 1976. S t r u c t u r e a n d c o m p o s i t i o n o f t h e c e l l w a l l o f C h o a n e p h o r a c u c u r b i t a r u m . C a n . J . M i c r o b i o l . 22: 486 - 494. M c C u l l y , M. E . 1966. H i s t o l o g i c a l s t u d i e s o n t h e g e n u s F u c u s . 1. L i g h t m i c r o s c o p y o f t h e m a t u r e v e g e t a t i v e p l a n t . P r o t o p l a s m 62: 287 - 305-M c M a n u s , J . F . A . , a n d C a s o n , J . E . 1950. C a r b o h y d r a t e h i s t o c h e m i s t r y s t u d i e d b y a c e t y l a t i o n t e c h n i q u e s . I . P e r i o d i c a c i d m e t h o d s . J . E x p . M e d . 9.1 651 - 654. M a r c h a n t , R . , a n d R o b a r d s , A . W. 1968. M e m b r a n e S y s t e m s A s s o c i a t e d w i t h t h e P l a s m a l e m m a o f P l a n t C e l l s . A n n . B o t . jJ2: 457 - 471. M a r c h a n t , R . , a n d M o o r e , R. T . 1973. L o m a s o m e s a n d p l a s m a l e m m a s o m e s i n f u n g i . P r o t o p l a s m a ( W i e n ) 26: 235 - 247. M a t r u c h o t , L . 1903- Une M u c o r i n e e p u r e m e n t c o n i d i e n n e , C u n n i n g h a m e l l a a f r i c a n a . A n n . M y c o l . 1: 45-60. M e h r o t r a , B . S . a n d B a i j a l , V . 1968. I s B l a k e s l e a a V a l i d G e n u s ? J . E l i s h a M i t c h e l l S o c . 84: 207 - 210. M o l l e n h a u e r , H . H . , M o r r e , D . J . , a n d K e l l e y , A . G . 1966. T h e w i d e s p r e a d o c c u r r e n c e o f p l a n t c y t o s o m e s r e s e m b l i n g a n i m a l m i c r o b o d i e s . P r o t o p l a s m 62: 44-52. M o o r e , R. T . 1964. Z o o s p o r e f o r m a t i o n i n t h e P h y c o m y c e t e A l l o m y c e s . J . C e l l B i o l . 2_3_: 109 - 110 ( A b s t r a c t ) . M o r e a u , F . 1913- R e c h e r c h e s s u r l a r e p r o d u c t i o n d e s M u c o r i n e e s e t de q u e l q u e s a u t r e s T h a l l o p h y t e s . B o t a n i s t e r3_: 1 - 136. - 249 -M o r i e , K . 1966. C y t o l o g i c a l s t u d y o n t h e C h o a n e p h o r a c e a e . T r a n s . M y c o l . S o c . J a p a n £ : 212 - 220. M o s s e , B . 1970. H o n e y - C o l o u r e d , S e s s i l e E n d o g o n e s p o r e s : I I . C h a n g e s i n F i n e S t r u c t u r e d u r i n g S p o r e D e v e l o p m e n t . A r c h . M i k r o b i o l . 2ikl 129 - 1 4 5 -Naumov, N . A . 1939. C l e s d e s M u c o r i n e e s ( M u c o r a l e s ) . E n c y c l . M y c o l . , £ : 1 - 137 + a p p e n d i x . P a u l L e c h e v a l i e r , P a r i s . N o v a k , R. 0., a n d B a c k u s , M . P . , 1963- A new s p e c i e s o f M y c o t y p h a w i t h a z y g o s p o r i c s t a g e . M y c o l o g i a .5_5_: 7gr0 _: 798. O ' B r i e n , T . P . , F e d e r , N . , a n d M c C u l l y , M . E . 1964. P o l y c h r o m a t i c s t a i n i n g o f p l a n t c e l l w a l l s b y T o l u i d i n e b l u e 0. P r o t o p l a s m a j&i 368 - 373-P e a r s e , A . G . E . 1968. H i s t o c h e m i s t r y - T h e o r e t i c a l a n d A p p l i e d V o l . I . C h u r c h i l l , E d i n b u r g h & L o n d o n . P o i t r a s , A . W. 1955- O b s e r v a t i o n s o n a s e x u a l a n d s e x u a l r e p r o d u c t i v e s t r u c t u r e s o f t h e C h o a n e p h o r a c e a e . M y c o l o g i a 4_Z: 702 - 713-R e i c h l e , R. E . , a n d L i c h t w a r d t , R. W. 1972. F i n e s t r u c t u r e s o f t h e T r i c h o m y c e t e , H a r p e l l a m e l u s i n a e f r o m b l a c k - f l y g u t s . A r c h . M i k r o b i o l . 8 1 : 103 -125. R e i s s , J . 1972. C y t o l o g i e v o n T h a m n i d i u m e l e g a n s L i n k . I . C y t o c h e m i s c h e u n d p h a s e k o n t r a s t m i k r o s k o p i s c h e U n t e r s u c h u n g e n a n H y p h e n , S p o r a n g i e n u n d S p o r a n g i o l e n . P r o t o p l a s m a ( W i e n ) £4: 71 - 8 4 . R e i s s , J . 1976. C y t o l o g y o f T h a m n i d i u m e l e g a n s L i n d . I I . D i s t r i b u t i o n a n d b e h a v i o r o f n u c l e i i n H y p h a e , S p o r a n g i o p h o r e s , a n d S p o r a n g i o s p o r e s . A r c h . M i c r o b i o l 108y: 133 - 139. R e v e l , J . P . 1964. E l e c t r o n m i c r o s c o p y o f g l y c o g e n . J . H i s t o c h e m . C y t o c h e m . 12: 1 0 4 - 114. R e y n o l d s , E . S . 1963. T h e u s e o f l e a d c i t r a t e a t h i g h p H a s a n e l e c t r o n - o p a q u e s t a i n i n e l e c t r o n m i c r o s c o p y . J . C e l l B i o l . 17_: 208 - 212. R o b i n o w , C . F . 1957 a . T h e s t r u c t u r e a n d b e h a v i o r o f t h e n u c l e i i n s p o r e s a n d g r o w i n g hyphae. o f M u c o r a l e s . I . M u c o r h i e m a l i s a n d M u c o r f r a g i l i s . C a n . J . M i c r o b i o l . %t 771 - 789. - 250 -R o b i n o w , C . F . 1957 b . T h e s t r u c t u r e a n d b e h a v i o r o f t h e n u c l e i i n s p o r e s a n d g r o w i n g h y p h a e o f M u c o r a l e s . I I . P h y c o m v c e s b l a k e s l e e a n u s . C a n . J . M i c r o b i o l . 3s 791 - 798. R o b i n o w , C . F . a n d M a r a k , J . 1966. A f i b r e a p p a r a t u s i n t h e n u c l e u s o f t h e y e a s t c e l l . J . C e l l B i o l . 29_: 129 - 151 R u d d e l l , C . L . 1967. H y d r o x y m e t h y l m e t h a c r y l a t e c o m b i n e d w i t h p o l y e t h y l e n e g l y c o l 4 0 0 a n d w a t e r ; a n e m b e d d i n g m e d i u m f o r r o u t i n e 1 - 2 m i c r o n s e c t i o n i n g . S t a i n T e c h n o l . 4 2 : 119 - 123-R u t h m a n n , A . 1970. M e t h o d s i n C e l l R e s e a r c h . G . B e l l a n d S o n s L t d . , L o n d o n . 368 p . S a l e m a , R . , a n d B r a n a o , I . 1973- T h e u s e o f P I P E S b u f f e r i n t h e f i x a t i o n o f p l a n t c e l l s f o r e l e c t r o n m i c r o -s c o p y . J . S u b m i c r . C y t o l . j?: 79 9 96. S c h w a r z e : , ' C . A . 1922. T h e m e t h o d o f c l e a v a g e i n t h e s p o r a n g i a o f c e r t a i n f u n g i . M y c o l o g i a 1 4 : 1 4 3 - 172. S i n h a , S . 1940. A w e t r o t o f l e a v e s o f C o l o c a s i a a n t i q u o r u m d u e t o s e c o n d a r y i n f e c t i o n b y C h o a n e p h o r a  c u c u r b i t a r u m T h a x t e r a n d C h o a n e p h o r a t r i s p o r a T h a x t e r s p . (= B l a k e s l e a t r i s p o r a T h a x t e r ) . P r o c . I n d i a A c a d . S c i . , S e c t i o n B l i s 167 - 175-S p u r r , A . R. 1969. A l o w v i s c o s i t y e p o x y r e s i n e m b e d d i n g m e d i u m f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y . J . U l t r a s t r u c t . R e s . 26: 31 - 43. S t o r c k , R . , a n d M o r r i l l , R. C . 1977- N u c l e i , n u c l e i c a c i d a n d p r o t e i n i n s p o r a n g i o s p o r e s o f M u c o r  b a c i l l i f o r m i s a n d o t h e r M u c o r s p e c i e s . P h y c o l o g i a 69_: 1031 - 104l. S t o w a r d , P . J . 1973- F i x a t i o n i n H i s t o c h e m i s t r y . C h a p m a n & H a l l ( L o n d o n ) 201 p p . S u m n e r , J . L . a n d M o r g a n , E . D . 1969. T h e F a t t y A c i d C o m p o s i t i o n o f S p o r a n g i o s p o r e a n d V e g e t a t i v e M y c e l i u m o f T e m p e r a t u r e - a d j u s t e d F u n g i i n t h e O r d e r M u c o r a l e s . J . G e n . M i c r o b i o l . 1£: 215 - 221. S w i n g l e , D . B . I903. F o r m a t i o n o f t h e s p o r e s i n t h e s p o r a n g i a o f R h i z o p u s n i g r i c a n s a n d o f P h y c o m y c e s  n i t e n s . U . S . D e p t . A g r . B u i . P l a n t I n d u s t r y 37: 1 - 4 0 . - 251 -T a i n t e r , F . H . 1971. T h e u l t r a s t r u c t u r e o f A r c e u t h o b i u m  p u s i l l u m . C a n . J . B o t . 4£: 1615 - 1622. T a k e o , K . 1974. U l t r a s t r u c t u r e o f P o l y m o r p h i c M u c o r a s O b s e r v e d b y M e a n s o f F r e e z e k E t c h i n g . I I I . D o r m a n t S p o r a n g i o s p o r e . A r c h . M i c r o b i o l . 9_9_: 99 - 107. T h a x t e r , R. 1914. New o r P e c u l i a r Z y g o m y c t e s . 3 : B l a k e s l e a , P i s s o p h o r a , a n d H a p l o s p o r a n g i u m , N o v a G e n e r a . B o t . G a z e t t e 58: 353 - 366. T i e g h e m , P . L . v a n , a n d L e M o n n i e r , G . 1873' R e c h e r c h e s s u r l e s M u c o r i n e e s . A n n . S c i . N a t . B o t . S e r . V l£i 261 - 4 0 2 . T u , J . C , M a l h o t r a , S . K . , a n d P r a s a d , S . 1971 • E l e c t r o n m i c r o s c o p y o f s t a g e I V s p o r a n g i o p h o r e o f P h y c o m y c e s . M i c r o b i o s . 3_! 1^3 - 151 T u , J . C . a n d M a l h o t r a , S . K . 1976. T h e f o r m a t i o n o f s p o r a n g i o s p o r e s i n P h y c o m y c e s . M i c r o b i o s 15: 15 - 25. W i c k h a m , M . G . a n d W o r t h e n , D . M . 1973- C o r r e l a t i o n o f s c a n n i n g a n d t r a n s m i s s i o n e l e c t r o n m i c r o s c o p y o n t h e same t i s s u e s a m p l e . S t a i n t e c h n o l 7_! 63 - 68. W i l s e n a c h , R . , a n d K e s s e l , M . 1965. T h e R o l e s o f L o m a s o m e s i n W a l l F o r m a t i o n i n P e n i c i l l i u m  v e r m i c u l a t u m . J . G e n . M i c r o b i o l . 4 0 : 4 0 1 - 4 0 4 . W o l f , F . A . 1957- I s M y c o t y p h a a P h y c o m y c e t e ? M y c o l o g i a 4_9_: 280 - 2 8 2 . Y o u n g , T . W. K . 1968 a . E l e c t r o n M i c r o s c o p i c S t u d y o f a s e x u a l s p o r e s i n K i c k x e l l a c e a e . New P h y t o l . 6Z: 823 - 836. Y o u n g , T . W. K . 1968 b . E l e c t r o n M i c r o s c o p i c S t u d y o f t h e a s e x u a l s t r u c t u r e s i n M u c o r a l e s . P r o c . L i n n . S o c . L o n d o n 1 7 9 : 1 - 9. Y o u n g , T . W. K . 1969 a . A s e x u a l s p o r e m o r p h o l o g y i n s p i n e s o f P i p t o c e p h a l i s . New P h y t o l o g i s t 68: 359 - 362. Y o u n g , T . W. K . 1969 b . E l e c t r o n a n d P h a s e - c o n t r a s t M i c r o s c o p y o f S p o r e s i n Two S p e c i e s o f t h e G e n u s M y c o t y p h a ( M u c o r a l e s ) . J . G e n . M i c r o b i o l . 55: 243 - 2 4 9 . . - 252 Y o u n g , T. W. K . 1970. U l t r a s t r u c t u r e o f t h e s p o r e w a l l o f L i n d e r i n a . T r a n s . B r . M y c o l . S o c . 54: 15 - 25-Y o u n g , T . W. K . 1971- U l t r a s t r u c t u r e o f t h e w a l l o f t h e g e r m i n a t i n g s p o r a n g i o s p o r e o f L i n d e r i n a  p e n n i s p o r a ( M u c o r a l e s ) . A n n . B o t . j£i 1 8 3 - 191 Y o u n g , T . W. K . 1973- U l t r a s t r u c t u r e o f t h e s p o r a n g i o s p o r e o f C o e m a n s i a r e v e r s a ( M u c o r a l e s ) . T r a n s . B r . M y c o l . S o c . 60: 57 - 63. Y o u n g , T . W. K . 1974. U l t r a s t r u c t u r e o f t h e s p o r a n g i o s p o r e o f K i c k x e l l a a l a b a s t r i n a ( M u c o r a l e A n n . B o t . ( L o n d o n ) 18: 873 - 876 Z u g i b e , F . T . 1970. D i a g n o s t i c H i s t o c h e m i s t r y . M o s b y C o . , S a i n t L o u i s . Z y c h a , H . , S i e p m a n n , R . , a n d L i n n e m a n n , G . 1969-M u c o r a l e s . J . C r a m e r , L e h r e . 355 PP« 

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