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The effect of two types of protein, supplementary methionine and dietary cholesterol on plasma and liver… Craig, Rosemary Eleanor Anne 1980

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831-UBC_1980_A6_7 C74.pdf [ 3.22MB ]
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THE EFFECT OF TWO TYPES OF P R O T E I N , SUPPLEMENTARY METHIONINE AND DIETARY CHOLESTEROL ON PLASMA AND L I V E R CHOLESTEROL LEVELS by ROSEMARY ELEANOR ANNE CRAIG B . S c , D a l h o u s i e U n i v e r s i t y , 1974 B . S c . ( H . E c ) , M o u n t S a i n t V i n c e n t U n i v e r s i t y , 1977 A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF MASTER OF SCIENCE i n THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES ( S c h o o l o f Home E c o n o m i c s ) I We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE UNIVERSITY OF B R I T I S H COLUMBIA J u l y 1980 (c) R o s e m a r y E l e a n o r Anne C r a i g , 1980 THE UNIVERSITY OF B R I T I S H COLUMBIA AUTHORIZATION I n p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r an a d v a n c e d d e g r e e a t t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , I a g r e e t h a t t h e L i b r a r y s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e a n d s t u d y . I f u r t h e r a g r e e t h a t p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e c o p y i n g o f t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y p u r p o s e s may be g r a n t e d by t h e Head o f my d e p a r t m e n t o r by h i s o r h e r r e p r e s e n t a t i v e s . I t i s u n d e r s t o o d t h a t c o p y i n g o r p u b l i c a t i o n o f t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l n o t be a l l o w e d w i t h o u t my w r i t t e n p e r m i s s i o n . D a t e S i g n a t u r e o f A u t h o r ABSTRACT H i g h s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s h a v e b e e n i d e n t i f i e d a s an i m p o r t a n t r i s k f a c t o r f o r a t h e r o s c l e r o s i s i n h u m a n s . The p u r p o s e o f t h i s s t u d y was t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o f p r o t e i n q u a l i t y a n d q u a n t i t y a n d d i e t a r y c h o l e s t e r o l s u p p l e m e n t a t i o n on p l a s m a a n d l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s , u s i n g a r a t m o d e l . M a l e W i s t a r r a t s , w e i g h i n g a p p r o x i m a t e l y 150 g , w e r e f e d a d l i b i t u m , w i t h f o o d i n t a k e s r e c o r d e d d a i l y a n d b o d y w e i g h t s w e e k l y . A t t h e e n d o f s i x w e e k s , p l a s m a a n d l i v e r s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d a n d a n a l y z e d e n z y m a t i c a l l y f o r c h o l e s t e r o l c o n t e n t . D i e t a r y p r o t e i n was f e d a t l e v e l s o f 10%, 15% a n d 2 0 % , u s i n g p e a n u t p r o t e i n , p e a n u t p r o t e i n w i t h m e t h i o n i n e a n d c a s e i n . M e t h i o n i n e was a d d e d t o one g r o u p o f p e a n u t p r o t e i n d i e t s t o i n c r e a s e t h e amount o f t h i s a m i n o a c i d t o t h e same l e v e l a s i s f o u n d i n a c a s e i n d i e t o f e q u i v a l e n t p r o t e i n q u a n t i t y . C h o l e s t e r o l was f e d t o t h r e e d i e t , g r o u p s : 20% p e a n u t p r o t e i n , p e a n u t p r o t e i n w i t h m e t h i o n i n e , a n d c a s e i n . R a t s w e r e a l s o f e d a l a b o r a t o r y chow d i e t t o e v a l u a t e t h e e f f e c t o f t i m e on t h e i r t i s s u e c h o l e s t e r o l l e v e l s . The r e s u l t s r e v e a l no s i g n i f i c a n t e f f e c t o f p r o t e i n q u a l i t y on p l a s m a c h o l e s t e r o l a n d o n l y a t 15% a n d 20% p r o t e i n l e v e l s d o e s l i v e r c h o l e s -t e r o l i n c r e a s e w i t h i m p r o v e m e n t s i n p r o t e i n q u a l i t y . T i m e and t h e amount o f p r o t e i n i n t h e d i e t , w h e t h e r c a s e i n o r p e a n u t p r o t e i n , had no e f f e c t on p l a s m a and l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s a l t h o u g h a t r e n d r e v e a l e d by P e a r s o n c o r r e l a t i o n a n a l y s i s showed a n e g a t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n p l a s m a c h o l e s t e r o l and p e a n u t p r o t e i n , a n d a p o s i t i v e c o r r e l a t i o n i i b e t w e e n p l a s m a a n d l i v e r c h o l e s t e r o l a n d c a s e i n . The e f f e c t o f p r o t e i n on t i s s u e c h o l e s t e r o l a p p e a r e d t o be a m i n o r one i n c o m p a r i s o n w i t h t h e e f f e c t o f d i e t a r y c h o l e s t e r o l , a l t h o u g h a c c u m u l a t i o n o f c h o l e s t e r o l i n t h e l i v e r s o f r a t s f e d d i e t s c o n t a i n i n g c h o l e s t e r o l c o u l d be d e c r e a s e d by d i e t a r y m e t h i o n i n e . TABLE OF CONTENTS C h a p t e r Page I INTRODUCTION 1 I I REVIEW OF. LITERATURE . . . '4 R a b b i t s 4 R a t s a n d M i c e 9 B i r d s . 13 Non-human P r i m a t e s 15 Humans 17 Summary 19 I I I MATERIALS AND METHODS . 2 1 A n i m a l C a r e . 2 1 D i e t s 22 T i s s u e C o l l e c t i o n 22 B i o c h e m i c a l A n a l y s i s 29 D e t e r m i n a t i o n o f P l a s m a C h o l e s t e r o l 29 D e t e r m i n a t i o n o f L i v e r C h o l e s t e r o l 29 S t a t i s t i c a l A n a l y s i s 31 IV RESULTS 33 Food C o n s u m p t i o n 33 B o d y W e i g h t a n d W e i g h t G a i n 34 Q u a l i t y o f D i e t a r y P r o t e i n a n d M e t h i o n i n e S u p p l e m e n t a t i o n 4 2 Q u a n t i t y o f D i e t a r y P r o t e i n . 45 D i e t a r y C h o l e s t e r o l 45 i v C h a p t e r P a g e V DISCUSSION 54 P r o t e i n Q u a l i t y a n d D i e t a r y M e t h i o n i n e 54 P r o t e i n Q u a l i t y . 56 D i e t a r y C h o l e s t e r o l 57 VI SUMMARY 60 BIBLIOGRAPHY 63 v L I S T OF TABLES T a b l e D e s c r i p t i o n P a g e 3 . 1 A b b r e v i a t i o n s U s e d f o r D i e t s 2 3 3 . 2 V i t a m i n s A d d e d t o D i e t s 24 3 . 3 M i n e r a l s A d d e d t o D i e t s 25 3 . 4 C o m p o s i t i o n o f P e a n u t M e a l D i e t s w i t h o u t A d d e d M e t h i o n i n e 26 3 . 5 C o m p o s i t i o n o f P e a n u t M e a l D i e t s w i t h A d d e d M e t h i o n i n e 27 3 . 6 C o m p o s i t i o n o f C a s e i n D i e t s 28 3 . 7 Enzyme R e a g e n t f o r D e t e r m i n a t i o n o f T i s s u e C h o l e s t e r o l 30 4 . 1 A v e r a g e D a i l y F o o d I n t a k e 3 5 4 . 2 P e a r s o n C o r r e l a t i o n C o e f f i c i e n t s a n d P r o b a b i l i t y L e v e l s f o r T i s s u e C h o l e s t e r o l L e v e l s a n d A v e r a g e D a i l y Food I n t a k e 36 4 . 3 I n i t i a l W e i g h t s , W e i g h t G a i n a n d S t a n d a r d i z e d W e i g h t G a i n o f D i e t G r o u p s 37 4 . 4 S t a t i s t i c a l A n a l y s i s o f S t a n d a r d i z e d W e i g h t G a i n s o f G r o u p s Fed D i e t a r y P r o t e i n a t T h r e e L e v e l s 39 4 . 5 E f f e c t o f P r o t e i n Q u a l i t y and M e t h i o n i n e S u p p l e m e n t a t i o n on P l a s m a C h o l e s t e r o l L e v e l s . . . . 43 4 . 6 E f f e c t o f P r o t e i n Q u a l i t y a n d M e t h i o n i n e S u p p l e m e n t a t i o n on L i v e r C h o l e s t e r o l L e v e l s . . . . 44 v i T a b l e D e s c r i p t i o n P a g e 4 . 7 E f f e c t o f P r o t e i n Q u a n t i t y on P l a s m a C h o l e s t e r o l L e v e l s 46 4 . 8 P e a r s o n C o r r e l a t i o n C o e f f i c i e n t s a n d P r o b a b i l i t y L e v e l s f o r P l a s m a C h o l e s t e r o l , L i v e r C h o l e s t e r o l a n d D i e t a r y P r o t e i n 49 4 . 9 E f f e c t o f P r o t e i n Q u a n t i t y on L i v e r C h o l e s t e r o l L e v e l s 50 4 . 1 0 E f f e c t o f D i e t a r y C h o l e s t e r o l on P l a s m a C h o l e s t e r o l L e v e l s 51 4 . 1 1 E f f e c t o f D i e t a r y C h o l e s t e r o l on L i v e r C h o l e s t e r o l L e v e l s 53 v i i L I S T OF FIGURES F i g u r e D e s c r i p t i o n P a g e 4 . 1 S t a n d a r d i z e d W e i g h t G a i n a t T h r e e P r o t e i n L e v e l s 40 4 . 2 R e l a t i o n s h i p B e t w e e n P r o t e i n a n d P l a s m a C h o l e s t e r o l L e v e l s f o r P e a n u t P r o t e i n a n d C a s e i n D i e t s 47 v i i i ACKNOWLEDGEMENT The a u t h o r w i s h e s t o e x p r e s s s i n c e r e a p p r e c i a t i o n t o P a t r i c k S t a p l e t o h f o r h i s s u p p o r t , d i r e c t i o n and s u p e r v i s i o n t h r o u g h o u t t h i s s t u d y . The m e m b e r s / o f th'e t h e s i s x o m m i t t e e , . . D r . I n d r a j i t D e s a i , S c h o o l o f Home E c o n o m i c s a n d D r . J o h n V a n d e r s t o e p , D e p a r t m e n t o f Food S c i e n c e , a l s o d e s e r v e t h a n k s f o r t h e i r v a l u a b l e comments a n d s u g g e s t i o n s . S p e c i a l g r a t i t u d e i s due t o R o b e r t a n d M u r i e l C r a i g , t h e a u t h o r ' s p a r e n t s , f o r t h e i r u n f a i l i n g e n c o u r a g e m e n t a n d c o n c e r n . i x CHAPTER I INTRODUCTION A t h e r o s c l e r o s i s i s one t y p e o f a r t e r i o s c l e r o s i s ( ' h a r d e n i n g o f t h e a r t e r i e s ' ) c h a r a c t e r i z e d by an a b n o r m a l a c c u m u l a t i o n o f s m o o t h m u s c l e c e l l s , l i p i d s e s p e c i a l l y c h o l e s t e r o l , a n d c a l c i u m i n t h e i n t i m a o f l a r g e - a n d m e d i u m - s i z e d a r t e r i e s . The c l i n i c a l m a n i f e s t a t i o n o f t h e s u b t l e d e g e n e r a t i o n o f t h e c i r c u l a t o r y s y s t e m i s a s p e c t r u m o f v a s c u l a r d i s e a s e s i n v o l v i n g t h e h e a r t , b r a i n , k i d n e y s a n d p e r i p h e r a l t i s s u e s ( M a r x , 1 9 7 6 ) . A number o f t h e o r i e s h a v e b e e n p r o p o s e d t o a c c o u n t f o r t h e d e v e l o p m e n t o f a t h e r o s c l e r o s i s and a c o m p o s i t e o f t h e s e s u g g e s t s t h a t an i n j u r y t o t h e e n d o t h e l i u m may e n c o u r a g e p l a t e l e t a d h e r e n c e a n d s m o o t h m u s c l e c e l l p r o l i f e r a -t i o n . U p t a k e o f l i p i d o c c u r s a t t h e damage s i t e a n d i s p r o b a b l y e n h a n c e d when b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s a r e h i g h a n d when t h e b l o o d p r e s s u r e i s e l e v a t e d ( C a n t w e l l , 1 9 7 7 ) . D e s p i t e t h e m u l t i - d i r e c t i o n a l r e s e a r c h d e v o t e d t o t e s t i n g t h e c u r r e n t t h e o r i e s , c o n c r e t e means o f e i t h e r p r e v e n t i n g o r c u r i n g a t h e r o s c l e r o s i s h a v e n o t been f o u n d . The p r o b l e m o f a t h e r o s c l e r o s i s r e m a i n s a v e r y r e a l o n e s i n c e c o r o n a r y h e a r t d i s e a s e , a k i n d o f c a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e , i s t h e p r i n c i p a l c a u s e o f d e a t h i n t h i s c o u n t r y ( C a n a d a , 1976) a n d i n m o s t i n d u s t r i a l i z e d W e s t e r n c o u n t r i e s ( W o r l d , 1 9 7 2 ) . H i g h s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s h a v e b e e n i d e n t i f i e d a s a m a j o r r i s k f a c t o r f o r a t h e r o s c l e r o s i s , a l o n g w i t h h i g h b l o o d p r e s s u r e , c i g a r e t t e s m o k i n g a n d d i a b e t e s ( M u s t a r d R e p o r t , 1 9 7 6 ; K a n n e l e t a l . , 1 9 7 9 ) . A t t e m p t s h a v e b e e n 1 2 made t o l o w e r s e r u m c h o l e s t e r o l i n o r d e r t o m o d e r a t e o r p r e v e n t t h e d e v e l o p -ment o f a t h e r o s c l e r o s i s b e c a u s e o f t h e s t r o n g r e l a t i o n s h i p t h a t e x i s t s b e t w e e n t h e l e v e l o f b l o o d c h o l e s t e r o l and a t h e r o s c l e r o s i s . B o t h human a n d e x p e r i m e n t a l a n i m a l s h a v e b e e n u s e d t o t h i s e n d , a n d t h e i n f l u e n c e o f i n h e r e n t p h y s i o l o g i c a l f a c t o r s a n d e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s h a s b e e n e v a l u a t e d . The d i e t i s u n d o u b t e d l y t h e m o s t s i g n i f i c a n t o f t h e e n v i r o n m e n t a l f a c t o r s , a n d t h e c o m p o n e n t s o f t h e d i e t t h a t - h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d i n c l u d e c h o l e s t e r o l and o t h e r f a t s , p r o t e i n , c a r b o h y d r a t e , f i b e r , a n d t r a c e m i n e r a l s . W i t h p a r t i c u l a r r e f e r e n c e t o p r o t e i n , e p i d e m i o l o g i c a l s t u d i e s h a v e shown t h a t a p o s i t i v e c o r r e l a t i o n e x i s t s b e t w e e n a n i m a l p r o t e i n i n t a k e a n d t h e i n c i d e n c e o f h e a r t d i s e a s e ( Y u d k i n , 1 9 5 7 ; Y e r u s h a l m y a n d H i l l e b o e , 1 9 5 7 ; O l s o n e t a l . , 1 9 5 8 ) . C o n n o r a n d C o n n o r ( 1 9 7 2 ) o b s e r v e d a s i m i l a r a s s o c i a t i o n b e t w e e n a n i m a l p r o t e i n and t h e m o r t a l i t y f r o m c o r o n a r y h e a r t d i s e a s e i n men a g e d 55 - 59 y e a r s , a n d a s t r o n g n e g a t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n p l a n t p r o t e i n a n d m o r t a l i t y f r o m c o r o n a r y h e a r t d i s e a s e i n t h i s g r o u p . S t u d i e s w i t h v e g e t a r -i a n s a l s o i n d i c a t e t h a t t h e i r s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s a r e s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n i n t h e n o n - v e g e t a r i a n g r o u p , a n d a s t h e d e g r e e o f n o n - v e g e t a r -i a n i s m i n c r e a s e s , s o a l s o d o e s t h e s e r u m c h o l e s t e r o l ( H a r d i n g e a n d S t a r e , 1 9 5 4 ; W e s t a n d H a y e s , 1 9 6 8 ) . I n l i g h t o f t h e e p i d e m i o l o g i c a l e v i d e n c e l i n k i n g e l e v a t e d b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s w i t h h e a r t d i s e a s e , a n d t h e i n f l u e n c e p r o t e i n h a s b e e n shown t o h a v e on t h e s e l e v e l s , t h e p u r p o s e o f t h i s s t u d y was t o f u r t h e r i n v e s t i g a t e t h e q u a l i t a t i v e a n d q u a n t i t a t i v e e f f e c t s o f p l a n t a n d a n i m a l p r o t e i n s i n an a n i m a l m o d e l u s i n g p e a n u t p r o t e i n and c a s e i n t o r e p r e s e n t t h e s e p r o t e i n s r e s p e c t i v e l y . E a c h was f e d a t t h r e e l e v e l s i n an o t h e r w i s e a d e q u a t e d i e t , 3 a n d a t t h e h i g h e s t l e v e l , t h e e f f e c t on s e r u m c h o l e s t e r o l o f d i e t a r y c h o l e s t e r o l was a l s o s t u d i e d . B l o o d a n d l i v e r s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d a n d a n a l y z e d f o r c h o l e s t e r o l ; t h e b l o o d b e c a u s e i t r e p r e s e n t s a c h o l e s t e r o l p o o l and t h e l i v e r b e c a u s e i t i s t h e s i t e o f l i p o p r o t e i n a n d e n d o g e n o u s c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s a n d c h o l e s t e r o l c a t a b o l i s m . The r a t was c h o s e n a s t h e e x p e r i m e n t a l a n i m a l , s i n c e i t s c h o l e s t e r o l m e t a b o l i s m i s more l i k e a h u m a n ' s m e t a b o l i s m , t h a n t h a t o f a r a b b i t o r b i r d ( K e y s and A n d e r s o n , 1 9 5 5 ) . The u s e o f humans w o u l d h a v e b e e n i d e a l , b u t t h i s was n e i t h e r p r a c t i c a l n o r f e a s i b l e . A n i m a l s t u d i e s c a n be p e r f o r m e d w i t h g r e a t e r e a s e s i n c e t h e s u b j e c t s a r e more r e a d i l y a v a i l a b l e . V a r i a b i l i t y among them i s r e d u c e d by u s i n g a n i m a l s f r o m t h e same s t r a i n , c o n t r o l l e d d i e t s a n d c o m p a r a b l e h o u s i n g c o n d i t i o n s . T h e t i m e p e r i o d f o r an a n i m a l e x p e r i m e n t n e e d n o t be a s l o n g a s f o r a human e x p e r i m e n t , a n d t h e e t h i c s o f s a m p l e -t a k i n g a n d e x p e r i m e n t a l d e s i g n a r e o f l e s s e r i m p o r t a n c e . R e s u l t s o b t a i n e d f r o m t h e s e e x p e r i m e n t s w i t h r a t s c o n t r i b u t e t o t h e i n f o r m a -t i o n a v a i l a b l e a b o u t c h o l e s t e r o l m e t a b o l i s m a n d t h e i n f l u e n c e s o f d i e t upon i t . T h e y d o , h o w e v e r , a p p l y o n l y t o t h i s s p e c i e s , a n d u n w a r r a n t e d i n f e r e n c e s and i m p l i c a t i o n s f o r humans s h o u l d n o t be d r a w n f r o m t h e m . CHAPTER I I REVIEW OF LITERATURE Our c u r r e n t u n d e r s t a n d i n g o f t h e e f f e c t s o f d i e t a r y p r o t e i n on b l o o d a n d l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s i s f r a g m e n t a r y a n d f r a g m e n t e d by t h e p l e t h o r a o f s t u d i e s u s i n g d i f f e r e n t s p e c i e s o f a n i m a l s i n c o u n t l e s s v a r i a t i o n s o f e x p e r i m e n t a l d e s i g n . F u r t h e r m o r e , t h e r e s u l t s o b t a i n e d a r e n o t n e c e s -s a r i l y u n a n i m o u s i n d e t e r m i n i n g t h e e x t e n t a n d d i r e c t i o n o f t h e r e s p o n s e . The p r o b l e m i s a l s o c o m p l i c a t e d by o t h e r c o m p o n e n t s o f t h e d i e t , s u c h a s c h o l e s t e r o l . T h i s r e v i e w f o c u s e s on t h e e f f e c t s o f p r o t e i n on t i s s u e c h o l e s t e r o l l e v e l s i n t h e r a b b i t , r a t , m o u s e , p i g e o n , : c h i c k e n , s e v e r a l n o n - h u m a n p r i m a t e s a n d t h e human. R a b b i t s I n 1 9 0 8 , I g n a t o w s k i s t u d i e d t h e e f f e c t s o f h i g h p r o t e i n d i e t s on r a b b i t s , and o b s e r v e d f a t t y p l a q u e s o n t h e i n t e r n a l s u r f a c e o f t h e a o r t a i n some o f t h e s e a n i m a l s , a s w e l l a s f a t t y a c c u m u l a t i o n i n t h e l i v e r . The d i e t s c o n t a i n e d m e a t , m i l k , a n d e g g s a n d he a t t r i b u t e d t h e p a t h o l o g i c a l c h a n g e s t o a d i e t r i c h i n a n i m a l p r o t e i n s . I n a n a t t e m p t t o p i n p o i n t more p r e -c i s e l y t h e c a u s e o f t h e a r t e r i a l l e s i o n s , S t u c k e y ( 1 9 1 1 ) f e d d i e t s c o n -s i s t i n g o f m i l k , e g g w h i t e , e g g y o l k s a n d m e a t j u i c e i n v a r i o u s c o m b i n a -t i o n s . He f o u n d t h a t o n l y t h e d i e t s c o n t a i n i n g e g g y o l k s p r o d u c e d f a t t y c h a n g e s i n t h e a o r t a , w h i l e m i l k , e g g w h i t e a n d m e a t j u i c e a l o n e had no d a m a g i n g e f f e c t . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t e d t h a t t h e l e s i o n s i n t h e a r t e r i e s w e r e more l i k e l y due t o t h e f a t t y f r a c t i o n o f t h e d i e t r a t h e r t h a n t o a p r o t e i n f r a c t i o n . 4 5 M o r e s u p p o r t was g i v e n t o t h e s e r e s u l t s when A n i t s c h o w and C h a l a t o w ( 1 9 1 3 ) d e m o n s t r a t e d i n r a b b i t s t h a t t h e f e e d i n g o f c h o l e s t e r o l d i s s o l v e d i n s u n -f l o w e r s e e d o i l was c a p a b l e o f p r o d u c i n g l e s i o n s i d e n t i c a l w i t h t h o s e d e s c r i b e d by I g n a t o w s k i ( 1 9 0 8 ) a n d S t u c k e y ( 1 9 1 1 ) . S i n c e no l e s i o n s d e v e l o p e d when t h e r a b b i t s w e r e f e d a c h o l e s t e r o l - f r e e d i e t , t h e y c o n -c l u d e d t h a t t h e c h o l e s t e r o l was t h e a c t i v e c o m p o n e n t a n d t h a t t h e o i l a c t e d a s a s o l v e n t . W a c k e r a n d H u e c k ( 1 9 1 3 ) r e p o r t e d t h a t p u r e c h o l e s t e r o l i n s o l i d f o r m when a d d e d t o t h e o r d i n a r y f o o d o f r a b b i t s c o u l d p r o d u c e t h i s , a r t e r i a l , d a m a g e . The c o n s e q u e n c e o f t h e s e c h o l e s t e r o l - f e e d i n g e x p e r i -m e n t s was t h a t a t t e n t i o n was d i v e r t e d f r o m p r o t e i n a n d t h e m a i n s t r e a m o f r e s e a r c h c o n c e n t r a t e d on o t h e r c o m p o n e n t s o f t h e d i e t as t h e c a u s a t i v e f a c t o r s o f a t h e r o s c l e r o s i s . H o w e v e r , n o t a l l e x p e r i m e n t a l e v i d e n c e h a s s u p p o r t e d t h e t h e o r y t h a t c h o l e s t e r o l a l o n e i s r e s p o n s i b l e f o r t h e a t h e r o s c l e r o s i s . I n 1 9 2 0 , Newburgh a n d S q u i e r f o u n d a t h e r o s c l e r o t i c p l a q u e s i n t h e a o r t a e o f r a b b i t s f e d a p o w d e r e d b e e f d i e t f o r f o u r w e e k s . I f t h e p r o t e i n s o u r c e was c a s e i n , a o r t a e w e r e n o r m a l a t t e n w e e k s , b u t d i d show t h e s i g n s o f a t h e r o s c l e r o s i s a t e l e v e n m o n t h s . I n a l a t e r s t u d y , Newburgh a n d C l a r k s o n ( 1 9 2 3 ) p r o d u c e d f a t t y l e s i o n s i n t h e a r t e r i e s o f r a b b i t s by f e e d i n g them d i e t s w h i c h c o n t a i n e d 27% p r o t e i n f r o m p o w d e r e d b e e f . T h i s o c c u r r e d a f t e r o n e y e a r . I n a d d i t i o n , t h e y f o u n d t h a t i f t h e d i e t c o n t a i n e d 36% p r o t e i n , a t h e r o s c l e r o s i s c o u l d be s e e n a t two m o n t h s . The o n l y c h o l e s t e r o l i n t h e d i e t was i n t h e d r i e d b e e f ( a b o u t 30 mg p e r d a y a t t h e 27% p r o t e i n l e v e l ) , and s i n c e t h i s a m o u n t , when f e d a l o n e , d i d n o t r e s u l t i n a r t e r i a l d a m a g e , t h e c o n c l u s i o n r e a c h e d was t h a t p r o t e i n , n o t c h o l e s t e r o l , was r e s p o n s i b l e f o r t h e damage o b s e r v e d ( C l a r k s o n a n d N e w b u r g h , 1 9 2 6 ) . 6 I t a l s o seemed t h a t t h e r a t e o f d e v e l o p m e n t o f a t h e r o s c l e r o s i s was d e p e n -d e n t on t h e amount o f p r o t e i n i n t h e d i e t . A l t h o u g h W a c k e r a n d Hueck ( 1 9 1 3 ) h a d shown t h e i n f l u e n c e o f c h o l e s t e r o l i n s o l i d f o r m , D u f f ( 1 9 3 5 ) f e l t t h a t t h e c o n c l u s i o n r e a c h e d by N e w b u r g h a n d C l a r k s o n ( 1 9 2 3 ) was i n v a l i d a t e d by t h e f a c t t h a t t h e c h o l e s t e r o l , when f e d a l o n e , was i n t h e f o r m o f a d r y p o w d e r w h i c h p r o b a b l y was n o t a s w e l l a b s o r b e d a s i t s e q u i v a l e n t i n t h e m e a t d i e t , a n d t h a t a d i r e c t e x p e r i m e n t o f f e e d i n g a d i e t r i c h i n p r o t e i n s a n d f r e e f r o m c h o l e s t e r o l was n o t c a r r i e d o u t . I t was n o t u n t i l t h e e a r l y 1 9 4 0 s t h a t t h i s d i r e c t f e e d i n g o f a c h o l e s t e r o l -f r e e , h i g h p r o t e i n d i e t was t r i e d . M e e k e r a n d K e s t e n ( 1 9 4 0 , 1941) f e d s u c h a d i e t c o n t a i n i n g 38% o f c a l o r i e s f r o m c a s e i n t o r a b b i t s f o r s i x m o n t h s . T h e y n o t e d h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a a n d t h e d e v e l o p m e n t o f a t h e r o m a t o u s l e s i o n s i n d i s t i n g u i s h a b l e f r o m t h o s e p r o d u c e d by c h o l e s t e r o l . By c o n t r a s t , r a b b i t s f e d a s o y b e a n d i e t , a t a p p r o x i m a t e l y t h e same p r o t e i n l e v e l , a n d f o r t h e same l e n g t h o f t i m e h a d t h e h i g h e r s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s b u t t h e l o w e r i n c i d e n c e a n d s e v e r i t y o f a t h e r o s c l e r o s i s . The a d d i t i o n o f c h o l e s t e r o l ( 6 0 o r 250 mg p e r d a y ) m a g n i f i e d t h e r e s p o n s e o f t h e r a b b i t s t o t h e two p r o t e i n s , b u t d i d n o t c h a n g e t h e d i r e c t i o n o f t h e r e s p o n s e . A l t h o u g h t h e s e s t u d i e s p r o v i d e d e v i d e n c e t h a t a n i m a l p r o t e i n s , s u c h a s c a s e i n a n d d r i e d b e e f , c o u l d p r o d u c e h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a a n d a t h e r o -s c l e r o s i s i n r a b b i t s , r e s e a r c h - w a s . a g a i n d i r e c t e d away f r o m p r o t e i n a n d i n t o a n o t h e r a r e a when L a m b e r t e t a l . ( 1 9 5 8 ) , a n d M a l m r o s a n d W i g a n d ( 1 9 5 9 ) r e p o r t e d t h a t h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a and a t h e r o s c l e r o s i s c o u l d be p r o d u c e d i n r a b b i t s by f e e d i n g c h o l e s t e r o l - f r e e , p u r i f i e d d i e t s 7 c o n t a i n i n g 25% c a s e i n . S i n c e b o t h e f f e c t s c o u l d be p r e v e n t e d by t h e a d d i t i o n o f s a f f l o w e r o r c o r n o i l s , i t was t h o u g h t t h a t t h e p r o b l e m was a r e l a t i v e d e f i c i e n c y o f e s s e n t i a l f a t t y a c i d s . K r i t c h e v s k y ( 1 9 6 4 ) s h o w e d t h a t t h e a t h e r o s c l e r o s i s d e v e l o p e d by r a b b i t s f e d a p u r i f i e d d i e t b u t n o t t h e c o m m e r c i a l f e e d c o u l d n o t be a t t r i b u t e d t o t h e f a t c o n t e n t o f t h e d i e t . K r i t c h e v s k y a n d T e p p e r ( 1 9 6 8 ) e x t r a c t e d t h e l i p i d f r o m P u r i n a r a b b i t chow a n d a d d e d i t t o a s e m i s y n t h e t i c d i e t c o n t a i n i n g 25% c a s e i n a n d 14% f a t . T h e y f o u n d t h a t s u b s t i t u t i o n o f t h e f a t u s u a l l y p r e s e n t i n t h e chow f o r 2% o f t h e h y d r o g e n a t e d c o c o n u t o i l u s e d i n t h e s e m i s y n t h e t i c d i e t d i d n o t a f f e c t t h e a t h e r o g e n i c i t y o f t h e d i e t . T h e y f u r t h e r s u g g e s t e d t h a t t h e d i f f e r e n c e s o b s e r v e d may be due t o n o n - 1 i p i d c o m p o n e n t s o f t h e d i e t , s u c h a s c a r b o h y d r a t e , f i b e r a n d p r o t e i n . N o t o n l y d o e s t h e l e v e l o f a p r o t e i n a p p e a r t o a f f e c t t h e i n c i d e n c e a n d s e v e r i t y o f h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a a n d a t h e r o s c l e r o s i s , b u t t h e s u b s t i t u -t i o n o f one t y p e o f p r o t e i n f o r a n o t h e r a l s o a p p e a r t o e x e r t an i n f l u e n c e . Howard e t a l . ( 1 9 6 5 ) v a r i e d t h e c o m p o s i t i o n o f t h e b a s i c s e m i s y n t h e t i c r a b b i t d i e t a n d f o u n d t h a t n o n e o f t h e a l t e r a t i o n s had a n y e f f e c t on a t h e r o s c l e r o s i s , e x c e p t f o r t h e s u b s t i t u t i o n o f c a s e i n i n t h e o r i g i n a l d i e t by e i t h e r w h o l e s o y a f l o u r o r h e x a n e - e x t r a c t e d s o y b e a n m e a l . T h e s e s o y p r o d u c t s w e r e e f f e c t i v e i n p r e v e n t i n g t h e h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a a n d a t h e r o s c l e r o s i s o f r a b b i t s f e d s e m i s y n t h e t i c d i e t s . C a r r o l l ( 1 9 7 1 ) s h o w e d t h a t t h e a d d i t i o n o f c a s e i n t o c o m m e r c i a l f e e d , i n a r a t i o o f 1 : 3 , p r o d u c e d a d e f i n i t e h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a . T h e s e r e s u l t s s u b -s t a n t i a t e t h o s e o f Howard e t a l . ( 1 9 6 5 ) w h i c h a l s o d e m o n s t r a t e d a h y p e r -c h o l e s t e r o l e m i c r e s p o n s e o f r a b b i t s t o c a s e i n e v e n i n t h e a b s e n c e o f c h o l e s t e r o l . 8 In a n o t h e r s e t o f e x p e r i m e n t s , t h e k i n d o f p r o t e i n u s e d i n t h e d i e t d e t e r m i n e d t h e e x t e n t o f a h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a r e s p o n s e . ( C a r r o l l a n d H a m i l t o n , 1 9 7 5 ; H a m i l t o n a n d C a r r o l l , 1 9 7 6 ; C a r r o l l , 1 9 7 8 a ) T h e s e d i e t s w e r e l o w i n f a t and c o n t a i n e d no c h o l e s t e r o l . I n g e n e r a l , t h e r e s u l t s showed t h a t p r o t e i n s d e r i v e d f r o m a n i m a l s p r o d u c e d h i g h e r p l a s m a c h o l e s -t e r o l l e v e l s i n r a b b i t s , w h i l e d i e t s c o n t a i n i n g p l a n t p r o t e i n s g a v e a n o r m o c h o l e s t e r o l e m i c r e s p o n s e . U n e x p e c t e d r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w i t h some o f t h e a n i m a l p r o t e i n s , p o r k p r o t e i n a n d e g g w h i t e , s i n c e t h e a n i m a l s f e d t h e d i e t s c o n t a i n i n g t h e s e p r o t e i n s h a d p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s w h i c h w e r e n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e p l a n t p r o t e i n - f e d g r o u p . H u f f e t a l . ( 1 9 7 7 ) f o u n d t h a t t h e h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a r e s p o n s e o f r a b -b i t s t o a s e m i s y n t h e t i c d i e t c o n t a i n i n g c a s e i n c o u l d be c o u n t e r a c t e d by t h e a d d i t i o n o f s o y p r o t e i n . No e l e v a t i o n o f p l a s m a c h o l e s t e r o l o c c u r r e d when t h e d i e t c o n t a i n e d 1 :1 c a s e i n : s o y b e a n p r o t e i n i s o l a t e , w h e r e a s a d i e t c o n t a i n i n g a 3 : 1 m i x t u r e o f t h e s e p r o t e i n s g a v e a p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l w h i c h was h i g h e r t h a n t h a t p r o d u c e d by t h e d i e t c o n t a i n i n g t h e 1 : 1 m i x t u r e b u t l o w e r t h a n t h a t p r o d u c e d by t h e c a s e i n d i e t . H u f f e t a l . ( 1 9 7 7 ) a l s o f o u n d t h a t an e n z y m a t i c d i g e s t o f c a s e i n o r a m i x t u r e o f L - a m i n o a c i d s e q u i v a l e n t t o c a s e i n p r o d u c e d h i g h p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s s i m i l a r t o t h o s e o b t a i n e d w i t h t h e i n t a c t p r o t e i n . By c o n t r a s t , p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s r e m a i n e d l o w i n r a b b i t s f e d on e n z y m a t i c d i g e s t o f s o y p r o t e i n , a n d w e r e m o d e r a t e l y , b u t n o t s i g n i f i -c a n t l y , h i g h e r when t h e p r o t e i n s o u r c e , w a s i n t h e f o r m o f L - a m i n o a c i d s c o r -r e s p o n d i n g t o s o y p r o t e i n . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e h y p e r c h o l e s -t e r o l e m i c r e s p o n s e t o c a s e i n was p r o b a b l y d u e t o t h e p r o t e i n c o n s t i t u e n t s o f t h e d i e t , a l t h o u g h t h e p o s s i b l i t y r e m a i n s t h a t s o m e t h i n g o t h e r t h a n 9 p r o t e i n i n t h e i s o l a t e d s o y p r o t e i n was c o n t r i b u t i n g t o t h e l o w l e v e l o f p l a s m a c h o l e s t e r o l . C a s e i n i s more h y p e r c h o l e s t e r o l e m i c t h a n s o y b e a n p r o t e i n f o r r a b b i t s , b u t t h e e f f e c t o f p r o t e i n , p e r s e , a p p e a r s t o be s e c o n d a r y t o t h e e f f e c t o f d i e t a r y c h o l e s t e r o l . Munro e t a l . ( 1 9 6 5 ) f e d a d u l t r a b b i t s d i e t s c o n t a i n i n g 8% o r 30% c a s e i n , w i t h a n d w i t h o u t 1% c h o l e s t e r o l . The r a b -b i t s f e d d i e t s c o n t a i n i n g c h o l e s t e r o l had h i g h e r b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s t h a n t h o s e f e d d i e t s w i t h no c h o l e s t e r o l a d d e d , r e g a r d l e s s o f t h e l e v e l o f p r o t e i n . S i m i l a r l y , a l a r g e amount o f c h o l e s t e r o l a c c u m u l a t e d i n t h e l i v e r s o f r a b b i t s f e d t h e c h o l e s t e r o l - e n r i c h e d d i e t s . When c h o l e s t e r o l was p a r t o f t h e d i e t , t h e h e p a t i c d e p o s i t i o n o f c h o l e s t e r o l was g r e a t e r i n t h e 30% c a s e i n - f e d g r o u p t h a n i n t h e g r o u p c o n s u m i n g t h e 8% c a s e i n d i e t , s u g g e s t i n g t h a t t h e e f f e c t o f c h o l e s t e r o l i s e n h a n c e d by h i g h e r l e v e l s o f p r o t e i n i n t h e d i e t . T h e s e r e s u l t s , h o w e v e r i n t e r e s t i n g , m u s t be k e p t i n p e r s p e c t i v e s i n c e r a b b i t s a f t e r w e a n i n g a n d u n d e r n o n - e x p e r i -m e n t a l c i r c u m s t a n c e s a r e e x p o s e d t o n e i t h e r c a s e i n n o r c h o l e s t e r o l i n t h e i r d i e t s . R a t s a n d M i c e An e a r l y s t i m u l u s t o s t u d i e s c o n c e r n i n g t h e r e l a t i o n s h i p o f d i e t a r y p r o -t e i n t o l i v e r c h o l e s t e r o l m e t a b o l i s m was t h e w o r k o f Channon e t a l . ( 1 9 3 8 ) , who n o t e d t h a t c h o l e s t e r o l a c c u m u l a t e d i n t h e l i v e r s o f r a t s f e d l o w p r o t e i n d i e t s c o n t a i n i n g e i t h e r 8% a l b u m i n o r 8% c a s e i n . T h i s p r o b l e m c o u l d be o v e r c o m e by t h e a d d i t i o n o f c a s e i n ( B e s t e t a l . , 1 9 3 6 ) o r m e t h i o n i n e ( T u c k e r a n d E c k s t e i n , 1937) t o t h e d i e t s t h a t i n d u c e d f a t t y l i v e r s . An e x p l a n a t i o n f o r t h i s seems t o l i e i n t h e p r o v i s i o n o f l a b i l e 10 m e t h y l g r o u p s f r o m e i t h e r t h e m e t h i o n i n e i n c a s e i n o r " f r e e " m e t h i o n i n e . H a r p e r ( 1 9 5 8 ) s u g g e s t s t h a t t h e s e m e t h y l g r o u p s a r e u s e d f o r t h e s y n t h e s i s o f c h o l i n e w h i c h i s an i n t e g r a l p a r t o f some p h o s p h o l i p i d s , w h i c h , i n t u r n , a r e p a r t o f l i p o p r o t e i n s u s e d i n f a t t r a n s p o r t . More r e c e n t l y , Aoyama e t a l . ( 1 9 6 9 ) s t u d i e d t h e l i p i d l e v e l i n t h e l i v e r s o f r a t s f e d a m i n o a c i d m i x t u r e s s i m u l a t i n g 7% e g g a l b u m i n a n d 7% c a s e i n . The l i v e r l i p i d l e v e l s w e r e h i g h e r i n t h e r a t s f e d t h e e g g a l b u m i n a m i n o a c i d m i x t u r e t h a n i n t h e c a s e i n a m i n o a c i d m i x t u r e , a n d t h e y a t t r i b u t e d t h e d i f f e r e n c e t o t h e h i g h e r m e t h i o n i n e c o n t e n t o f t h e c a s e i n a m i n o a c i d m i x t u r e . F i l l i o s and Mann ( 1 9 5 4 ) s t u d i e d t h e r e l a t i o n s h i p o f t h e q u a l i t y o f d i e t a r y p r o t e i n t o p l a s m a c h o l e s t e r o l m e t a b o l i s m . I n b o t h r a t s a n d m i c e , t h e y f o u n d t h a t h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a r e s u l t e d when s o y b e a n p r o t e i n was s u b s t i t -u t e d f o r c a s e i n a t b o t h 10% and 20% p r o t e i n l e v e l s . The a d d i t i o n o f m e t h i o n i n e t o t h e s o y b e a n d i e t s c o n t a i n i n g t h e two l e v e l s o f p r o t e i n c a u s e d a d r o p i n t h e s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s o f r a t s f e d t h e s e d i e t s . I n t h e m i c e , m e t h i o n i n e a d d e d t o t h e 10% s o y b e a n d i e t r e s u l t e d i n s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s b e t w e e n t h o s e f r o m a n i m a l s f e d t h e 10% s o y b e a n d i e t w i t h o u t a d d e d m e t h i o n i n e a n d t h e 10% c a s e i n d i e t . P o r t m a n a n d Mann ( 1 9 5 5 ) h a v e s u g g e s t e d t h a t t h e h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a o f r a t s f e d a s o y b e a n p r o t e i n d i e t i s due t o a s u l p h u r a m i n o a c i d d e f i c i e n c y i n t h e d i e t . T h i s t y p e o f d e f i c i e n c y , i n t u r n , l i m i t s t h e p r o d u c t i o n o f t a u r i n e , and h e n c e o f t a u r i n e - c o n j u g a t e d b i l e a c i d s . When t h i s c o n v e r s i o n i s i n h i b i t e d by a s u l p h u r a m i n o a c i d d e f i c i e n c y 11 i n t h e d i e t , c h o l e s t e r o l t e n d s t o a c c u m u l a t e i n t h e p l a s m a . T h i s , how-e v e r , s u g g e s t s t h a t a p r i o r i t y s y s t e m i s i n o p e r a t i o n f o r t h e u s e o f m e t h i o n i n e n o t i n v o l v e d i n p r o t e i n s y n t h e s i s a n d t h a t i t w i l l be c h a n -n e l l e d p r e f e r e n t i a l l y f o r t h e s y n t h e s i s o f c h o l i n e , b e f o r e b e i n g u s e d f o r t h e s y n t h e s i s o f t a u r i n e . T h i s e f f e c t seems t o h o l d a l s o when t h e q u a n t i t y o f p r o t e i n i n t h e d i e t i s c h a n g e d . M o y e r e t a l . ( 1 9 5 6 ) f o u n d t h a t a d d i t i o n a l d i e t a r y p r o t e i n s t i m u l a t e d a d r o p i n s e r u m c h o l e s t e r o l v a l u e s i n r a t s , w h e t h e r t h e a d d i t i o n a l p r o t e i n was c a s e i n o r s o y b e a n p r o t e i n . T h i s s o - c a l l e d " p r o t e c -t i v e e f f e c t o f p r o t e i n " was a l s o o b s e r v e d by F i l l i o s e t a l . ( 1 9 5 6 ) who e v a l u a t e d d i e t s c o n t a i n i n g 1 0 , 2 0 , a n d 60% c a s e i n . T h e y f o u n d t h e h i g h e s t s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s i n t h o s e r a t s f e d a 10% c a s e i n d i e t a n d t h e l o w e s t i n t h e 60% p r o t e i n g r o u p . N i s h i d a e t a l . ( 1 9 5 6 ) u s e d 1 5 , 2 0 , 3 0 , a n d 35% s o y b e a n p r o t e i n d i e t s , a n d , i n a g r e e m e n t w i t h t h e two p r e v i o u s s t u d i e s , n o t e d an i n v e r s e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n s e r u m c h o l e s t e r o l and t h e l e v e l o f p r o t e i n i n t h e d i e t . I n a d d i t i o n , t h e i n c i d e n c e o f a t h e r o -s c l e r o s i s p a r a l l e l e d t h e s e r u m c h o l e s t e r o l , o r i n o t h e r w o r d s , i t was h i g h e s t a t t h e l o w e s t l e v e l o f p r o t e i n . De G r o o t ( 1 9 5 9 ) , S e i d e l e t a l . ( 1 9 6 0 ) , N a t h e t a l . ( 1 9 6 1 ) , L e v e i l l e a n d S a u b e r l i c h ( 1 9 6 4 ) , and R e n a u d and A l l a r d ( 1 9 6 4 ) a l s o f o u n d t h a t t h e a d d i t i o n o f p r o t e i n t o a d i e t was c a p a b l e o f l o w e r i n g p l a s m a c h o l e s t e r o l . The e f f e c t o f p r o t e i n on t i s s u e c h o l e s t e r o l l e v e l s i n r a t s c a n be e x p l a i n e d i n t e r m s o f m e t h i o n i n e a v a i l a b i l i t y b u t n o t a l l s t u d i e s h a v e l e n t s u p p o r t t o t h i s t h e o r y . J o n e s e t a l . ( 1 9 5 Z ) o b s e r v e d t h a t r a t s c o n s u m i n g d i e t s c o n t a i n i n g e i t h e r 14% o r 19% c a s e i n had s e r u m c h o l e s t e r o l 12 l e v e l s o f 164 a n d 218 mg % , r e s p e c t i v e l y , when m e a s u r e d a t t h e e n d o f s i x m o n t h s . H o w e v e r , J o n e s a n d H u f f m a n ( 1 9 5 6 ) s u g g e s t t h a t a r e d u c t i o n o r e l e v a t i o n o f d i e t a r y p r o t e i n b e y o n d a m o d e s t r a n g e ( 1 2 - 18%) w i l l l e a d t o an i n c r e a s e i n s e r u m c h o l e s t e r o l . T h e y f o u n d v e r y h i g h l e v e l s o f c h o l e s t e r o l , 4 9 0 mg % , i n t h e s e r u m o f r a t s f e d 40% c a s e i n , a s w e l l a s l e s i o n s i n t h e c o r o n a r y a r t e r i e s o f o n e - t h i r d o f t h e s e a n i m a l s . N a t h e t a l . ( 1 9 5 8 ) n o t e d s i m i l a r l y h i g h s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s i n r a t s f e d a 40% c a s e i n d i e t . C o r r o b o r a t i n g t h e r e s u l t s o f J o n e s a n d H u f f m a n ( 1 9 5 6 ) , b u t c o n t r a d i c t i n g t h e i r e a r l i e r w o r k ( F i l l i o s e t a l . , 1 9 5 6 ) , F i l l i o s e t a l . ( 1 9 5 8 ) i n d i c a t e d a downward t r e n d i n s e r u m c h o l e s t e r o l when t h e c a s e i n l e v e l was i n c r e a s e d f r o m 5% t o 2 0 % , b u t t h e y f o u n d w h a t seemed t o be a r e b o u n d e f f e c t when t h e p r o t e i n l e v e l s w e r e i n c r e a s e d t o 40% a n d 6 0 % . Y a d a v a n d L i e n e r ( 1 9 7 7 ) o b t a i n e d o p p o s i t e r e s u l t s u s i n g e s s e n t i a l l y t h e same t y p e o f d i e t a s F i l l i o s a n d Mann ( 1 9 5 4 ) . T h e y f o u n d t h a t r e p l a c e -m e n t o f c a s e i n by s o y b e a n f l o u r , s o y b e a n i s o l a t e o r r o a s t e d n a v y b e a n f l o u r l e d t o a s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n s e r u m c h o l e s t e r o l . An a m i n o a c i d m i x t u r e s i m u l a t i n g s o y b e a n i s o l a t e l i k e w i s e p r o d u c e d l e v e l s o f s e r u m c h o l e s t e r o l w h i c h w e r e l o w e r t h a n t h o s e o b t a i n e d w i t h an a m i n o a c i d m i x t u r e c o r r e s p o n d i n g t o c a s e i n . T h e y s u p p o r t t h e s u g g e s t i o n t h a t t h e c h o l e s t e r o l - l o w e r i n g e f f e c t o f s o y b e a n p r o t e i n i s due t o a d i f f e r e n c e i n i t s a m i n o a c i d p r o f i l e w i t h o u t m e n t i o n i n g a p o s s i b l e m e c h a n i s m f o r t h i s e f f e c t . Mendez ( 1 9 6 4 ) i n v e s t i g a t e d t h e e f f e c t o f d i e t a r y p r o t e i n l e v e l a n d c h o l e s -t e r o l s u p p l e m e n t a t i o n on t h e r a t ' s s e r u m a n d l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s , 13 i n a s t u d y s i m i l a r t o one d e s i g n e d f o r r a b b i t s by Munro e t a l . ( 1 9 5 6 ) . He f o u n d no s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n t h e s e r u m c h o l e s t e r o l o f r a t s f e d 5% o r 20% c a s e i n . T h i s l a c k o f d i f f e r e n c e i n t h e s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s e x i s t e d w h e t h e r o r n o t c h o l e s t e r o l was a d d e d t o t h e d i e t . H o w e v e r , t h e r a t s f e d d i e t s c o n t a i n i n g c h o l e s t e r o l had s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s t h a t w e r e much h i g h e r t h a n t h o s e o f r a t s f e d a c h o l e s t e r o l - f r e e d i e t . T h i s w o u l d s u g g e s t , a s i n t h e r a b b i t , t h a t t h e e f f e c t o f p r o t e i n may be s e c o n d a r y t o t h e e f f e c t o f d i e t a r y c h o l e s t e r o l . I n t h e l i v e r , t h e c h o l e s -t e r o l l e v e l s w e r e much h i g h e r i n t h e l o w p r o t e i n g r o u p s , a n d t h e a d d i t i o n o f c h o l e s t e r o l a m p l i f i e d t h i s d i f f e r e n c e . T h i s may be due t o an i n c r e a s e d a v a i l a b i l i t y o f s u c h l i p o t r o p i c a g e n t s a s m e t h i o n i n e a t t h e h i g h e r l e v e l s o f p r o t e i n , a l t h o u g h M o r r i s a n d C h a i k o f f ( 1 9 5 9 ) r e p o r t e d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n l i v e r c h o l e s t e r o l a c c u m u l a t i o n i n r a t s f e d a d i e t c o n t a i n i n g 25% c a s e i n a n d 2% c h o l e s t e r o l . A s i m i l a r i n c r e a s e was n o t e d by F r a n t z e t a l . ( 1 9 5 4 ) w i t h a d i e t o f l a b o r a t o r y chow a n d 1% c h o l e s t e r o l . B i r d s I n c h i c k e n s , an i n d i r e c t l i n e a r r e l a t i o n s h i p seems t o e x i s t b e t w e e n s e r u m c h o l e s t e r o l and t h e i n t a k e o f p r o t e i n . Low p r o t e i n d i e t s e n h a n c e h y p e r -c h o l e s t e r o l e m i a a n d a t h e r o s c l e r o s i s w h i l e h i g h p r o t e i n d i e t s s u p p r e s s t h e s e e f f e c t s ( S t a m l e r e t a l . 1 9 5 8 a , b ; K o k a t n u r e t a l . , 1 9 5 8 ; N i s h i d a e t a l . , 1 9 5 6 ; N i s h i d a e t a l . , 1 9 5 8 ; L e v e i l l e a n d F i s h e r , 1 9 5 8 ; L e v e i l l e e t a l . , 1 9 6 0 ) . J o h n s o n e t a l . ( 1 9 5 8 ) a l s o f o u n d h i g h e r p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s i n c h i c k s f e d 10% p r o t e i n d i e t s a s c o m p a r e d t o t h o s e f e d 25% a n d 40% p r o t e i n d i e t s . The p r o t e i n s u s e d w e r e e i t h e r c a s e i n o r s o y b e a n . As t h e p r o t e i n l e v e l was i n c r e a s e d t o 25% a n d 4 0 % , t h e r e was a c o r r e s p o n d i n g d e c r e a s e i n p l a s m a c h o l e s t e r o l . The h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a o f t h e b i r d s 14 on t h e l o w p r o t e i n d i e t c o u l d be r e d u c e d by t h e a d d i t i o n o f m e t h i o n i n e , b u t i n t h e g r o w i n g c h i c k s u p p l e m e n t a r y m e t h i o n i n e was w i t h o u t e f f e c t a t t h e 25% a n d 40% p r o t e i n l e v e l s . The h y p o c h o l e s t e r o l e m i c e f f e c t o f m e t h i o n i n e i n g r o w i n g c h i c k s was a l s o o b s e r v e d by L e v e i l l e e t a l . ( 1 9 6 2 ) a n d K o k a t n u r a n d Kummerow ( 1 9 6 1 ) . I t may be t h a t a n y h y p o c h o l e s t e r o l e m i c a d v a n t a g e g a i n e d by t h e a d d i t i o n o f m e t h i o n i n e t o d i e t s c o n t a i n i n g l o w l e v e l s o f p r o t e i n s i s m a s k e d when t h e amount o f p r o t e i n i n t h e d i e t i s i n c r e a s e d . C h a i k o f f e t a l . ( 1 9 6 1 ) e x a m i n e d t h e r o l e o f p r o t e i n i n t h e n a t u r a l l y -o c c u r r i n g a o r t i c a t h e r o s c l e r o s i s t h a t c h i c k e n s d e v e l o p e v e n when t h e i r d i e t i s l o w i n c h o l e s t e r o l . I n t h i s s t u d y , two l e v e l s o f p r o t e i n , 1 4 . 5 % a n d 7 . 3 % , w e r e u s e d . The r e s u l t s i n d i c a t e t h a t a v e r a g e p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s w e r e h i g h e r i n t h e b i r d s f e d t h e l o w p r o t e i n d i e t s , i n a g r e e m e n t w i t h p r e v i o u s s t u d i e s . H o w e v e r , t h e p r o t e i n l e v e l d i d n o t a f f e c t s p o n t a n -e o u s a t h e r o s c l e r o t i c l e s i o n s i n c h i c k e n s . The d e c r e a s e i n s e r u m c h o l e s t e r o l o b s e r v e d i n c h i c k e n s a s t h e amount o f p r o t e i n i n t h e d i e t i s i n c r e a s e d may be t h e r e s u l t o f t h r e e p r o c e s s e s : a d e c r e a s e i n c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s a s m e a s u r e d by t h e i n c o r p o r a t i o n o f r a d i o a c t i v e a c e t a t e i n t o l i v e r c h o l e s t e r o l ( N i s h i d a e t a l . , 1 9 6 0 ) ; an i n c r e a s e d c o n v e r s i o n o f c h o l e s t e r o l t o b i l e a c i d s ( L e v e i l l e a n d S a u b e r l i c h , 1 9 6 1 ) ; a n d a m i n o a c i d b a l a n c e . W i t h r e g a r d t o t h e l a s t p r o c e s s , K o k a t n u r a n d Kummerow ( 1 9 6 1 ) o b s e r v e d t h a t c r y s t a l l i n e a m i n o a c i d m i x t u r e s w h i c h w e r e d e f i c i e n t o r made d e f i c i e n t by e l i m i n a t i n g a s p e c i f i c e s s e n t i a l a m i n o a c i d l e d t o e l e v a t e d s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s . C o n v e r s e l y , when t h e d e f i -c i e n c y was c o r r e c t e d , t h e r e s u l t was a l o w e r s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l . 15 As C a r r o l l a n d h i s c o - w o r k e r s s t u d i e d t h e . e f f e c t s o f p l a n t a n d a n i m a l p r o t e i n s on t h e s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s o f r a b b i t s , H e v i a a n d V i s e k ( 1 9 7 9 ) l o o k e d a t t h e same p a r a m e t e r s i n c h i c k e n s . The d i e t s c o n t a i n e d l a c t a l b u m i n , s o y b e a n p r o t e i n o r egg w h i t e s o l i d s f e d a t 25% a n d 50% l e v e l s . A l t h o u g h no s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s w e r e o b s e r v e d b e t w e e n t h e p l a s m a c h o l e s t e r o l v a l u e s a t t h e t w o l e v e l s o f p r o t e i n , s o y b e a n p r o t e i n d e p r e s s e d p l a s m a c h o l e s t e r o l , a s c o m p a r e d t o l a c t a l b u m i n a n d e g g w h i t e s o l i d s . I n p i g e o n s , t h e p i c t u r e i s somewhat d i f f e r e n t , e s p e c i a l l y when c o n s i d e r i n g t h e s t u d i e s o f L o f l a n d a n d h i s a s s o c i a t e s , u s i n g a t h e r o s c l e r o s i s - s u s c e p -t i b l e p i g e o n s . F e e d i n g d i e t s t o t h e s e b i r d s c o n t a i n i n g 5 , 1 5 , o r 30% c a s e i n , L o f l a n d e t a l . ( 1 9 6 1 ) and C l a r k s o n e t a l . ( 1 9 6 2 ) f o u n d t h a t t h e 30% c a s e i n d i e t was more a t h e r o g e n i c a n d h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a t h a n t h e 5% a n d 15% d i e t s , when 0 . 2 5 % c h o l e s t e r o l was a d d e d t o t h e s e d i e t s . A more r e c e n t s t u d y by L i t t l e and A n g e l l ( 1 9 7 7 ) u s i n g t h e same b r e e d o f p i g e o n s , n o t e d a s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n s e r u m c h o l e s t e r o l c o n c e n t r a t i o n s , a s t h e p r o t e i n l e v e l was i n c r e a s e d f r o m 10% t o 20% a n d 4 0 % . T h e y , how-e v e r , f a i l e d t o o b s e r v e t h e i n c r e a s e d a t h e r o g e n i c i t y o f d i e t s c o n t a i n i n g h i g h e r a m o u n t s o f p r o t e i n . I t seems t h a t p i g e o n s r e s p o n d l i k e r a b b i t s t o p r o t e i n a n d c h o l e s t e r o l i n t h e i r d i e t s , w h e r e a s c h i c k e n s r e s p o n d l i k e r a t s . Non-human P r i m a t e s Serum c h o l e s t e r o l r e s p o n s e t o d i e t a r y p r o t e i n h a s b e e n m e a s u r e d i n s e v e r a l d i f f e r e n t s p e c i e s o f p r i m a t e s . Mann a n d c o - w o r k e r s ( 1 9 5 3 ) o b s e r v e d t h a t C e b u s m o n k e y s f e d d i e t s c o n t a i n i n g 10% s o y b e a n p r o t e i n h a d h i g h e r s e r u m 16 c h o l e s t e r o l t h a n m o n k e y s f e d c a s e i n a t t h e same l e v e l . L a t e r w o r k h a s f o c u s s e d on t h e l e v e l o f p r o t e i n i n t h e d i e t , w i t h l i t t l e a t t e n t i o n b e i n g p a i d t o t h e e f f e c t o f p r o t e i n s w i t h d i f f e r e n t a m i n o a c i d c o m p o s i -t i o n s . M i d d l e t o n e t a l . ( 1 9 6 7 ) f e d s q u i r r e l m o n k e y s 25% o r 9% p r o t e i n d i e t s a n d f o u n d t h a t t h e l e v e l o f p r o t e i n h a d l i t t l e e f f e c t on s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s . H o w e v e r , t h e s e v e r i t y o f a t h e r o s c l e r o s i s was i n f l u e n c e d by d i e t a r y p r o t e i n when c h o l e s t e r o l ( 0 . 5 % ) was a d d e d . U n d e r t h e s e c i r c u m s t a n c e s , t h e h i g h p r o t e i n d i e t was more t h a n t w i c e a s a t h e r o g e n i c . T h i s w o u l d a g a i n s u g g e s t t h a t , i n s q u i r r e l m o n k e y s , t h e d e g r e e o f a t h e r o s c l e r o s i s i s more r e a d i l y i n f l u e n c e d by d i e t a r y c h o l e s t e r o l t h a n by d i e t a r y p r o t e i n . I n a n o t h e r p r i m a t e s t u d y , S t r o n g a n d M c G i l l ( 1 9 6 7 ) f e d b a b o o n s d i e t s c o n -t a i n i n g 10% o r 25% c a s e i n a n d 0 . 5 % o r 0 . 0 1 % c h o l e s t e r o l . A l t h o u g h t h e a n i m a l s r e c e i v i n g t h e h i g h p r o t e i n d i e t s t e n d e d t o h a v e h i g h e r s e r u m c h o l e s t e r o l v a l u e s , S t r o n g a n d M c G i l l ( 1 9 6 7 ) , i n a g r e e m e n t w i t h M i d d l e t o n e t a l . ( 1 9 6 7 ) , c o n c l u d e d t h a t t h e e f f e c t o f p r o t e i n was s m a l l i n c o m p a r i s o n w i t h t h e e f f e c t o f d i e t a r y c h o l e s t e r o l , a s m e a s u r e d by c h a n g e s i n s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s . S r i n i v a s a n e t a l . ( 1 9 7 9 ) s t u d i e d s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s i n s p i d e r m o n -k e y s f e d d i e t s c o n t a i n i n g 4 , 8 , o r 25% p r o t e i n f r o m l a b o r a t o r y chow a n d c a s e i n and 0 . 5 % c h o l e s t e r o l . T h e i r r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e l o w e s t s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l was f o u n d i n t h o s e m o n k e y s c o n s u m i n g t h e 8% p r o t e i n d i e t , and t h e h i g h e s t i n t h e 4% p r o t e i n d i e t . 17/ The d i f f e r e n c e s o b s e r v e d among t h e p r i m a t e s may be a s p e c i e s - s p e c i f i c r e s p o n s e t o p r o t e i n l e v e l s i n t h e d i e t . V a r i e d r e s p o n s e s o f s e r u m l i p i d s i n s e v e r a l s p e c i e s o f p r i m a t e s h a v e b e e n d o c u m e n t e d by S r i n i v a s a n e t a l . , 1 9 7 6 ; N i c o l o s i e t a l . , 1 9 7 7 ; a n d S r i n i v a s a n e t a l . , 1 9 7 8 . Humans T h e e v i d e n c e t h a t d i e t a r y p r o t e i n c a n i n f l u e n c e human s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s i s e q u i v o c a l . O l s o n e t a l . ( 1 9 5 7 ) f e d 100 g p r o t e i n / d a y ( m a i n l y o f a n i m a l o r i g i n ) t o s e v e n s u b j e c t s , f i v e o f whom w e r e h y p e r c h o l e s -t e r o l e m i a , f o r p e r i o d s o f s e v e r a l w e e k s . T h e y w e r e t h e n f e d a l o w p r o -t e i n d i e t , 2 5 g p r o t e i n p e r d a y ( m a i n l y o f p l a n t o r i g i n ) f o r o n e week a n d r e t u r n e d t h e r e a f t e r t o t h e c o n t r o l d i e t . A l l s h o w e d a d e c r e a s e i n s e r u m c h o l e s t e r o l d u r i n g t h e l o w p r o t e i n f e e d i n g , w i t h v a l u e s r e t u r n i n g t o w a r d o r i g i n a l v a l u e s when t h e c o n t r o l d i e t was r e i n t r o d u c e d . K e y s a n d A n d e r s o n ( 1 9 5 7 ) m a i n t a i n e d t w o g r o u p s o f p h y s i c a l l y h e a l t h y men o n a l o w e r p r o t e i n i n t a k e , 83 g p r o t e i n p e r d a y , f o r a f o u r - w e e k p e r i o d , c h a n g e d t h e m t o a h i g h e r p r o t e i n d i e t , 130 g p r o t e i n p e r d a y , a n d t h e n b a c k t o t h e l o w p r o t e i n r e g i m e n . T h e r e was no s i g n i f i c a n t c h a n g e i n t h e s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l i n e i t h e r g r o u p d u r i n g t h e e x p e r i -m e n t a l p e r i o d . I n a s i m i l a r s t u d y b y L e v e i l l e e t a l . ( 1 9 6 2 ) , s e v e n h e a l t h y m a l e s w e r e f e d a r i g i d l y c o n t r o l l e d d i e t v a r y i n g i n t h e a m o u n t o f p r o t e i n f o r t w e l v e w e e k s . T h e s u b j e c t s s t a r t e d on a l o w e r p r o t e i n d i e t , 32 g p r o t e i n p e r d a y , s w i t c h e d t o a h i g h e r p r o t e i n d i e t , 106 g p r o -t e i n p e r d a y , a n d t h e n r e t u r n e d t o t h e l o w e r p r o t e i n d i e t . A s b e f o r e , d i e t a r y p r o t e i n h a d no s i g n i f i c a n t i n f l u e n c e on p l a s m a c h o l e s t e r o l . 18 The t y p e o f d i e t a r y p r o t e i n may e x e r t a s t r o n g e r i n f l u e n c e on p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s t h a n t h e a c t u a l amount o f p r o t e i n . W a l k e r e t a l . ( 1 9 6 0 ) r e p o r t e d d i f f e r e n c e s i n c h o l e s t e r o l l e v e l s when t h e q u a n t i t y o f p r o t e i n was c o n s t a n t , b u t d e r i v e d f r o m two d i f f e r e n t s o u r c e s . I n t h i s s t u d y , y o u n g women c o n s u m i n g a d a i l y d i e t c o n t a i n i n g 50 g v e g e t a b l e p r o t e i n had l o w e r s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s a f t e r f i v e w e e k s t h a n d i d a g r o u p e a t i n g 50 g a n i m a l p r o t e i n p e r d a y . The d i f f e r e n c e i n s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s was a p p r o x i m a t e l y 20 mg % w i t h t h e f i n a l v a l u e s f o r b o t h d i e t s s t i l l w i t h i n n o r m a l p h y s i o l o g i c a l l i m i t s . H o d g e s e t a l . ( 1 9 6 7 ) o b s e r v e d an a v e r a g e d r o p o f 100 mg % i n t h e s e r u m c h o l e s t e r o l o f s i x m a l e s f e d a d i e t b a s e d on s o y b e a n p r o t e i n , b u t c o n t a i n i n g a l m o s t no f a t o r c h o l e s t e r o l . A l t h o u g h p a r t o f t h i s d e c r e a s e c a n be a t t r i b u t e d t o t h e a b s e n c e o f d i e t a r y f a t a n d c h o l e s t e r o l , t h e r e a p p e a r e d t o be a d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e p r e d i c t e d a n d o b s e r v e d d e c r e a s e , w h i c h may h a v e b e e n d u e t o d i e t a r y p r o t e i n . T r i p a t h y e t a l . ( 1 9 7 0 ) s t u d i e d t h e e f f e c t o f h i g h p r o t e i n d i e t s on t h e s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s o f t w e l v e m a l n o u r i s h e d a d u l t s . The c o n t r o l d i e t s c o n s i s t e d o f 15 - 30 g p r o t e i n p e r d a y , a n d a f t e r f o u r t o s i x w e e k s , t h e d i e t a r y p r o t e i n l e v e l was r a i s e d t o 35 - 100 g p e r d a y . W i t h i n t h r e e w e e k s , t h e r e was a h i g h l y s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s . T h i s i n c r e a s e was l i k e l y due t o i n c r e a s e d s y n t h e s i s o f t h e p r o t e i n m o i e t y o f l i p o p r o t e i n s i n t h e p r e s e n c e o f a h i g h e r p r o t e i n d i e t . A r e c e n t s t u d y by R i c k m a n e t a l . ( 1 9 7 4 ) h a s a l s o shown t h a t a h i g h p r o t e i n d i e t c a n , l e a d t o h i g h s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s . The d i e t i n t h i s c a s e i s e x t r e m e , i n t h a t i t c o n s i s t s a l m o s t e n t i r e l y o f p r o t e i n a n d a n i m a l f a t , w i t h c a r b o h y d r a t e c o n t r i b u t i n g o n l y a b o u t 2% o f t o t a l O 19 c a l o r i e s . T h i s d i e t r a i s e d t h e s e r u m c h o l e s t e r o l i n a l l s u b j e c t s s t u d i e d a n d i t seems l i k e l y t h a t t h e p r o t e i n c o m p o n e n t o f t h e d i e t i s r e s p o n s i b l e f o r a t l e a s t p a r t o f t h i s r e s p o n s e . S i r t o r i e t a l . ( 1 9 7 7 ) r e p o r t e d a 14% d e c r e a s e i n p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s a f t e r two w e e k s a n d a 21% d e c r e a s e a f t e r t h r e e w e e k s when a t e x t u r e d s o y -bean p r o t e i n was s u b s t i t u t e d f o r a n i m a l p r o t e i n i n t h e d i e t s o f t w e n t y p a t i e n t s w i t h T y p e I I h y p e r l i p o p r o t e i n e m i a . I n i t i a l l y , t h e i r d i e t s w e r e a l s o l o w i n c h o l e s t e r o l , b u t t h e a d d i t i o n o f 500 mg c h o l e s t e r o l p e r d a y i n t h e f o r m o f e g g p o w d e r d i d n o t m o d i f y t h e h y p o c h o l e s t e r o l e m i c r e s p o n s e . Munoz e t a l . ( 1 9 7 9 ) a l s o t e s t e d t h e e f f e c t o f t e x t u r e d v e g e t a b l e p r o t e i n on s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s o f t e n h e a l t h y m e n . T h e y f o u n d t h a t a d d i n g 26 g o f t e x t u r e d v e g e t a b l e p r o t e i n p e r d a y t o a m i x e d d i e t c o n t a i n i n g 16% p r o t e i n had no s i g n i f i c a n t e f f e c t on t o t a l p l a s m a c h o l e s t e r o l . The c o n t r a d i c t o r y f i n d i n g s o f t h e s e two s t u d i e s a r e p r o b a b l y due t o t h e r e p l a c e m e n t o f a l m o s t a l l t h e a n i m a l p r o t e i n by v e g e t a b l e p r o t e i n i n t h e f i r s t e x p e r i m e n t , a s c o m p a r e d t o o n l y p a r t i a l r e p l a c e m e n t i n t h e s e c o n d . S i r t o r i a n d c o - w o r k e r s u s e d s u b j e c t s who w e r e h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a a n d p r o v i d e d l i t t l e d i e t a r y c h o l e s t e r o l , s o t h a t a n y d i e t a r y m a n i p u l a t i o n s w o u l d l i k e l y r e s u l t i n more p r o f o u n d c h a n g e s i n s e r u m c h o l e s t e r o l i n t h o s e p a t i e n t s who h a d a g e n e t i c p r e d i s p o s i t i o n t o h i g h s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s . Summary R a b b i t s a n d p i g e o n s r e s p o n d t o an i n c r e a s e i n t h e q u a n t i t y o f p r o t e i n i n t h e i r d i e t s by an i n c r e a s e i n b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s . By c o n t r a s t , r a t s a n d c h i c k e n s d e m o n s t r a t e a h y p o c h o l e s t e r o l e m i c r e s p o n s e t o b o t h t h e a d d i -t i o n o f p r o t e i n a n d t h e a m i n o a c i d m e t h i o n i n e t o t h e i r d i e t s . I n n o n -20 human p r i m a t e s a n d m a n , t h e l e v e l o f d i e t a r y p r o t e i n d o e s n o t seem t o s i g n i f i c a n t l y i n f l u e n c e b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s . I n r a b b i t s , r a t s , c h i c k e n s and h u m a n s , t h e s u b s t i t u t i o n o f p l a n t p r o t e i n f o r a n i m a l p r o t e i n l e a d s t o a d e c r e a s e i n b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s , a s c o m p a r e d t o C e b u s m o n k e y s who r e s p o n d t o t h i s c h a n g e w i t h an i n c r e a s e . I t w o u l d seem t h a t t h e human h y p o c h o l e s t e r o l e m i a i n r e s p o n s e t o p l a n t p r o t e i n i n t h e d i e t i s b e s t s e e n i n t h o s e i n d i v i d u a l s who h a v e a b e r r a n t c h o l e s t e r o l l e v e l s t o b e g i n w i t h . The a v a i l a b l e d a t a ( e x c e p t i n g humans) i n d i c a t e t h a t t h e r o l e p r o t e i n p l a y s i n d e t e r m i n i n g b l o o d c h o l e s t e r o l l e v e l s may be a r e l a t i v e l y m i n o r o n e , e s p e c i a l l y when d i e t a r y c h o l e s t e r o l i s p r e s e n t . I n l i g h t o f t h e e q u i v o c a l r e s u l t s o f e x p e r i m e n t s d o c u m e n t e d i n t h e l i t e r a -t u r e , t h i s s t u d y w i t h r a t s w i l l d e t e r m i n e t h e i n f l u e n c e on p l a s m a a n d l i v e r c h o l e s t e r o l o f t h e q u a l i t y a n d q u a n t i t y o f a p l a n t p r o t e i n , a s f o u n d i n p e a n u t m e a l , when c o m p a r e d t o an a n i m a l p r o t e i n , c a s e i n . The a d d i t i o n o f m e t h i o n i n e t o t h e p e a n u t m e a l t o i m p r o v e i t s p r o t e i n q u a l i t y w i l l p r o -v i d e i n f o r m a t i o n a s t o w h e t h e r t h e d i f f e r e n c e s s e e n i n t h e t i s s u e c h o l e s -t e r o l o f r a t s a r e due t o i n h e r e n t d i f f e r e n c e s i n t h e two p r o t e i n s , r a t h e r i t h a n some o t h e r c o m p o n e n t o f t h e d i e t . The n a t u r e o f a t i s s u e c h o l e s t e r o l r e s p o n s e t o d i e t a r y c h o l e s t e r o l w i l l d e t e r m i n e w h i c h e x e r t s a g r e a t e r i n f l u e n c e , d i e t a r y p r o t e i n o r d i e t a r y c h o l e s t e r o l . CHAPTER I I I MATERIALS AND METHODS A n i m a l C a r e M a l e W i s t a r r a t s , w e i g h i n g a p p r o x i m a t e l y 150 g , w e r e o b t a i n e d f r o m C a n a d i a n B r e e d i n g F a r m s , S t e . C o n s t a n c e , Q u e b e c , h o u s e d i n w i r e - b o t t o m s t a i n l e s s s t e e l c a g e s , and p r o v i d e d w i t h f o o d and w a t e r a d l i b i t u m . T h e y w e r e w e i g h e d w e e k l y d u r i n g t h e s i x - w e e k e x p e r i m e n t a l p e r i o d , a n d f o o d i n t a k e was r e c o r d e d d a i l y . T h r e e g r o u p s o f r a t s w e r e u s e d i n t h i s d i e t s t u d y . The f i r s t g r o u p was f e d P u r i n a l a b o r a t o r y chow f o r a t w o - w e e k p e r i o d , a n d e x a m i n a t i o n by a v e t e r i n a r i a n f r o m t h e A n i m a l C a r e C e n t r e , U . B . C . c o n f i r m e d t h e p r e s e n c e o f r e s p i r a t o r y i n f e c t i o n i n t h e s e a n i m a l s . C o n s e q u e n t l y , t e t r a c y c l i n e was a d d e d t o t h e d r i n k i n g w a t e r f o r f i v e d a y s , f o l l o w e d by a n o t h e r f i v e -d a y t r e a t m e n t w i t h c h l o r a m p h e n i c o l . T h e i r c o n d i t i o n was s t a b i l i z e d a n d t h e s e a n i m a l s w e r e a s s i g n e d t o a d i e t g r o u p . As a p r e c a u t i o n a r y m e a s u r e , t h e y w e r e h o u s e d i n a s e p a r a t e room w h i c h was m a i n t a i n e d a t a b o u t 2 3 ° C . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s , l i g h t i n g c o n t r o l was n o t p o s s i b l e . A f t e r one t o t h r e e d a y s a c c l i m a t i z a t i o n w i t h P u r i n a l a b o r a t o r y chow a n d w a t e r , t h e s e c o n d a n d t h i r d g r o u p s o f r a t s ^ 150 g w e r e a s s i g n e d t o a d i e t g r o u p and h o u s e d i n an a i r - c o n d i t i o n e d room m a i n t a i n e d a t a b o u t 2 2 ° C . L i g h t i n g was r e g u l a t e d a u t o m a t i c a l l y t o p r o v i d e a l t e r n a t i n g l i g h t ( 6 am t o 6 pm) a n d d a r k (6 pm t o 6 am) p e r i o d s . 21 22 D i e t s T h i r t e e n d i e t s w e r e p r e p a r e d . T w e l v e c o n t a i n e d 10% l a r d a n d 5% c o r n o i l , 2 . 2 % v i t a m i n s ( V i t a m i n D i e t F o r t i f i c a t i o n M i x t u r e ) , a n d 5% m i n e r a l s ( B e r n h a r d t T o m a r e l l i S a l t M i x t u r e , m o d i f i e d ) . The p r o t e i n s o u r c e was e i t h e r p e a n u t meal ( a p p r o x i m a t e l y 55% p r o t e i n ) o r c a s e i n ( a p p r o x i m a t e l y 90% p r o t e i n ) . The c a s e i n d i e t s a l s o c o n t a i n e d 2% a l p h a c e l ( c e l l u l o s e ) . The t h i r t e e n t h d i e t was g r o u n d P u r i n a l a b o r a t o r y c h o w , w i t h a p r o t e i n c o n t e n t o f a p p r o x i m a t e l y 2 0 % . The a b b r e v i a t i o n s u s e d t o d e n o t e t h e d i e t s , d e t a i l e d v i t a m i n a n d m i n e r a l c o n t e n t s o f t h e d i e t , and t h e c o m p o s i t i o n o f t h e t w e l v e d i e t s a r e shown i n T a b l e s 3 . 1 t o 3 . 6 . T i s s u e C o l l e c t i o n I n t h e f i r s t g r o u p o f a n i m a l s , f e d d i e t s P 2 0 , P 2 0 C h , C 2 0 , and C 2 0 C h , s i x r a t s p e r d i e t w e r e k i l l e d on d a y 4 2 . T h e a n i m a l s w e r e a n a e s t h e t i z e d w i t h a n h y d r o u s d i e t h y l e t h e r a n d b l o o d was c o l l e c t e d by h e a r t p u n c t u r e u s i n g a h e p a r i n i z e d s y r i n g e . P l a s m a was o b t a i n e d by c e n t r i f u g a t i o n , d r a w n o f f w i t h P a s t e u r p i p e t t e s a n d s t o r e d f r o z e n i n p l a s t i c t u b e s , u n t i l a n a l y z e d f o r c h o l e s t e r o l c o n t e n t . The l i v e r s w e r e r e m o v e d i m m e d i a t e l y a f t e r t h e h e a r t p u n c t u r e , r i n s e d i n d i s t i l l e d w a t e r , b l o t t e d d r y a n d w e i g h e d . T h e y w e r e s t o r e d f r o z e n i n p l a s t i c b a g s u n t i l a n a l y z e d f o r c h o l e s t e r o l c o n t e n t . The r a t s i n t h e s e c o n d g r o u p w e r e f e d t h e P 1 0 , P 1 5 , CIO a n d C15 d i e t s ; i n t h e t h i r d g r o u p , t h e P 1 0 M , P 1 5 M , P 2 0 M , P20ChM and LC d i e t s . T h e y w e r e s a c r i f i c e d a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e d e s c r i b e d f o r t h e f i r s t g r o u p , w i t h s e v e n r a t s p e r d i e t . 2 3 T a b l e 3 . 1 A b b r e v i a t i o n s U s e d f o r D i e t s P : d i e t made w i t h p e a n u t meal ( p r o t e i n c o n t e n t a p p r o x i m a t e l y 55%) C : d i e t made w i t h c a s e i n ( p r o t e i n c o n t e n t a p p r o x i m a t e l y 90%) 10 : 10% p r o t e i n d i e t 15 : 15% p r o t e i n d i e t 20 : 20% p r o t e i n d i e t Ch : c h o l e s t e r o l a d d e d t o d i e t a t 2% l e v e l M : D L - m e t h i o n i n e a d d e d t o d i e t LC : P u r i n a l a b o r a t o r y chow 24 T a b l e 3 . 2 V i t a m i n s A d d e d t o D i e t V i t a m i n Amount A d d e d p e r Kg D i e t V i t a m i n A ( 2 0 0 , 0 0 0 U p e r g) V i t a m i n D ( 4 0 0 , 0 0 0 U p e r g) A l p h a t o c o p h e r o l V i t a m i n C I n o s i t o l C h o l i n e C h l o r i d e M e n a d i o n e P a r a - a m i n o b e n z o i c A c i d N i a c i n R i b o f l a v i n P y r i d o x i n e H y d r o c h l o r i d e T h i a m i n e H y d r o c h l o r i d e C a l c i u m P a n t o t h e n a t e B i o t i n F o l i c A c i d V i t a m i n B - 1 2 H o t a l v i t a m i n c o n t e n t o f d i e t was 2 . 2 % . ? V i t a m i n D i e t F o r t i f i c a t i o n M i x t u r e , ICN P h a r m a c e u t i c a l s , C l e v e l a n d , O h i o . 9 9 . 0 mg 5 . 5 mg 1 1 0 . 0 mg 0 . 9 9 g 1 1 0 . 0 mg 1 . 6 5 g 4 9 . 5 mg 1 1 0 . 0 mg 9 9 . 0 mg 2 2 . 0 mg 2 2 . 0 mg 2 2 . 0 mg 6 6 . 0 mg 0 . 4 4 mg 1 . 9 8 mg 0 . 0 2 9 7 mg 25 T a b l e 3 . 3 M i n e r a l s A d d e d t o D i e t M i n e r a l Amount A d d e d p e r Kg D i e t C a l c i u m C a r b o n a t e 1 . 0 5 9 C a l c i u m P h o s p h a t e 3 6 . 7 5 9 C i t r i c A c i d 1 1 3 . 5 mg C u p r i c C i t r a t e • 2% H 2 0 23 mg F e r r i c C i t r a t e • 5 H^O 279 mg M a g n e s i u m O x i d e 1 . 2 5 g M a n g a n e s e C i t r a t e 4 1 7 . 5 mg P o t a s s i u m I o d i d e • 0 . 5 0 mg P o t a s s i u m P h o s p h a t e D i b a s i c 4 . 0 5 9 P o t a s s i u m S u l p h a t e 3 . 4 0 g S o d i u m C h l o r i d e ' 1 . 5 3 g S o d i u m P h o s p h a t e 1 . 0 7 g Z i n c C i t r a t e • 2 H „ 0 6 6 . 5 mg T o t a l m i n e r a l c o n t e n t o f d i e t was 5 . 0 % . B e r n h a r d t T o m a r e l l i S a l t M i x t u r e , m o d i f i e d , ICN P h a r m a c e u t i c a l s , C l e v e l a n d , O h i o . 26 T a b l e 3 . 4 C o m p o s i t i o n o f P e a n u t M e a l D i e t s w i t h o u t A d d e d M e t h i o n i n e D i e t C o m p o s i t i o n P10 PI 5 P20 P20Ch P r o t e i n L e v e l 10% 15 20 20 P e a n u t M e a l 18% 27 37 37 V i t a m i n s 2 . 2 % 2 . 2 2 . 2 2 . 2 M i n e r a l s 5% 5 5 5 L a r d 10% 10 10 10 C o r n O i l 5% 5 5 5 C h o l e s t e r o l - - - 2% S t a r c h 5 9 . 8 % 5 0 . 8 4 0 . 8 3 8 . 8 27 T a b l e 3 . 5 C o m p o s i t i o n o f P e a n u t M e a l D i e t s w i t h A d d e d M e t h i o n i n e C o m p o s i t i o n D i e t P10M P15M P20M P20ChM P r o t e i n L e v e l 10% 15 20 20 P e a n u t M e a l 18% 27 37 37 V i t a m i n s 2 . 2 % 2 . 2 2 . 2 2 . 2 M i n e r a l s 5% 5 5 5 L a r d 10% 10 10 10 C o r n O i l 5% 5 5 5 L - M e t h i o n i n e " ' ' 0 . 2 2 % 0 . 3 4 0 . 4 6 0 . 4 6 C h o l e s t e r o l - - - 2% S t a r c h 5 9 . 5 8 % 5 0 . 4 6 4 0 . 3 4 3 8 . 3 4 A d d e d a s D L - M e t h i o n i n e . T a b l e 3 . 6 C o m p o s i t i o n o f C a s e i n D i e t s C o m p o s i t i o n D i e t CIO CI 5 C20 C20Ch P r o t e i n L e v e l 10% 15 20 20 C a s e i n 11% 17 23 23 V i t a m i n s 2 . 2 % 2 . 2 2 . 2 2 . 2 M i n e r a l s 5% • 5 5 5 L a r d 10% 10 10 10 C o r n O i l . 5% 5 5 5 C h o l e s t e r o l - - - 2% A l p h a c e l 2% 2 2 2 S t a r c h 6 4 . 8 % 5 8 . 8 5 2 . 8 5 0 . 8 29 B i o c h e m i c a l A n a l y s i s D e t e r m i n a t i o n o f P l a s m a C h o l e s t e r o l : P l a s m a c h o l e s t e r o l was d e t e r m i n e d by an e n z y m a t i c m e t h o d u s i n g a s i n g l e a q u e o u s r e a g e n t , a s d e s c r i b e d by A l l a i n e t a l . ( 1 9 7 4 ) . U s i n g t h i s m e t h o d , e s t e r s a r e h y d r o l y s e d t o f r e e c h o l e s t e r o l by c h o l e s t e r o l e s t e r h y d r o l a s e . The f r e e c h o l e s t e r o l i s o x i d i s e d by c h o l e s t e r o l o x i d a s e t o c h o l e s t - 4 - e n e -3 - o n e w i t h t h e s i m u l t a n e o u s p r o d u c t i o n o f h y d r o g e n p e r o x i d e . The l a t t e r o x i d a t i v e l y c o u p l e s w i t h 4 - a m i n o a n t i p y r i n e a n d p h e n o l i n t h e p r e s e n c e o f p e r o x i d a s e t o y i e l d a c h r o m a g e n w i t h 'a maximum a b s o r p t i o n a t 5 0 0 nm. I n t h e a s s a y f o r t o t a l p l a s m a c h o l e s t e r o l , 30 y l o f p l a s m a was i n c u b a t e d w i t h 3 . 0 ml o f enzyme r e a g e n t ( d e s c r i b e d i n T a b l e 3 . 7 ) f o r 10 m i n u t e s a t 3 7 ° C a n d t h e a b s o r b a n c e a t 5 0 0 nm was m e a s u r e d a g a i n s t a r e a g e n t b l a n k ( 3 0 y l w a t e r p l u s 3 . 0 ml enzyme r e a g e n t ) . C o n c e n t r a t i o n s o f unknown s a m p l e s w e r e d e t e r m i n e d f r o m a l i n e a r r e g r e s s i o n c u r v e c o n s t r u c t e d by u s i n g c h o l e s t e r o l (BDH ( C a n a d a ) L t d . , T o r o n t o ) s t a n d a r d s i n i s o p r o p a n o l , i n c o n c e n t r a t i o n s f r o m 50 mg% t o 5 0 0 mg%. 30 y l o f e a c h s t a n d a r d was u s e d . D e t e r m i n a t i o n o f L i v e r C h o l e s t e r o l : C a r l s o n a n d G o l d f a r b ( 1 9 7 7 ) a d a p t e d t h e e n z y m a t i c m e t h o d o f A l l a i n e t a l . ( 1 9 7 4 ) f o r t h e a n a l y s i s o f t o t a l l i v e r c h o l e s t e r o l . T h e y f o u n d t h a t t h e a d d i t i o n o f a d e t e r g e n t , L e c o n a l W e t t i n g A g e n t , ( L e c o C o r p . , S t . J o s e p h , M i c h . ) was n e c e s s a r y f o r u s e w i t h l i p i d e x t r a c t s o f t h e l i v e r s a m p l e s . I n t h i s a s s a y , s a m p l e s o f l i v e r ( 0 . 2 g ± . 0 1 g) w e r e h y d r o l y s e d f o r one h o u r a t 7 5 ° C i n c a p p e d t u b e s c o n t a i n i n g 1 ml o f a K0H s o l u t i o n (KOH/h^O, 1 : 2 w / v ) . The t u b e s w e r e c o o l e d by r e f r i g e r a t i o n , g e n e r a l l y o v e r n i g h t . 30 T a b l e 3 . 7 Enzyme R e a g e n t f o r D e t e r m i n a t i o n o f T i s s u e C h o l e s t e r o l s o d i u m c h o l a t e 1 4 - a m i n o a n t i p y r i n e 2 p h e n o l N a ^ P O ^ N a H ^ O ^ c a r b o w a x - 6 0 0 0 1 1 c h o l e s t e r o l e s t e r h y d r o l a s e " ( E . C . 3 . 1 . 1 . 1 3 ) 3 c h o l e s t e r o l o x i d a s e ( E . C . I . 1 . 3 . 6 ) p e r o x i d a s e 1 ( E . C . I . 1 1 . 1 . 7 ) 3 m m o l / I i t e r 0 . 8 2 14 50 50 0 . 1 7 33 U 117 U 6 7 0 0 0 U 1 , , S i g m a C h e m i c a l C o m p a n y , S t . L o u i s , Mo. " F i s h e r S c i e n t i f i c C o m p a n y , V a n c o u v e r , B . C . ICN P h a r m a c e u t i c a l s , C l e v e l a n d , O h i o 31 A f t e r t h e a d d i t i o n o f 1 . 5 ml 95% e t h a n o l a n d 3 ml p e t r o l e u m e t h e r ( b . p . 30 - 6 0 ° C ) , t h e t u b e s w e r e t i g h t l y c a p p e d , v o r t e x e d f o r o n e m i n u t e , a n d c e n t r i f u g e d a t l o w s p e e d f o r 5 m i n u t e s t o s e p a r a t e t h e p h a s e s . T r i p l i -c a t e a l i q u o t s ( 5 0 y l ) o f t h e p e t r o l e u m e t h e r p h a s e w e r e r e m o v e d and a l l o w e d t o e v a p o r a t e i n t h e a i r . I s o p r o p a n o l ( 5 y l ) , enzyme r e a g e n t ( 5 0 0 y l ) a n d l e c o n a l w e t t i n g a g e n t ( 5 y l ) w e r e a d d e d t o t h e d r i e d a l i q u o t s . The s a m p l e s w e r e v o r t e x e d a n d i n c u b a t e d f o r 15 m i n u t e s a t : 3 7 ° C. C o l o u r d e v e l o p m e n t was m e a s u r e d a t 500 nm a g a i n s t a r e a g e n t b l a n k ( 5 y l HgO p l u s 5 y l l e c o n a l w e t t i n g a g e n t p l u s 5 0 0 y l enzyme r e a g e n t ) . C h o l e s t e r o l s t a n d a r d s w e r e p r e p a r e d i n i s o p r o p a n o l i n c o n c e n t r a t i o n s f r o m 1 mg/ml t o 5 m g / m l , a n d 5 y l o f e a c h s t a n d a r d was u s e d . C o n c e n t r a t i o n s o f t h e unknown s a m p l e s w e r e d e t e r m i n e d f r o m a l i n e a r r e g r e s s i o n c u r v e c o n s t r u c t e d f r o m t h e s e s t a n d a r d v a l u e s . S t a t i s t i c a l A n a l y s i s The d a t a c o l l e c t e d i n t h i s s t u d y w e r e s t a t i s t i c a l l y a n a l y z e d u s i n g t h e D a l h o u s i e U n i v e r s i t y c o m p u t e r f a c i l i t i e s a n d t h e S t a t i s t i c a l P a c k a g e f o r t h e S o c i a l S c i e n c e s , v e r s i o n 7 . 0 , a s d e s c r i b e d by N i e e t a l . ( 1 9 7 5 ) . The p r o c e d u r e s u s e d w e r e S t u d e n t ' s t , a n a l y s i s o f v a r i a n c e , P e a r s o n p r o -d u c t moment c o r r e l a t i o n , and a c o n t r a s t t e s t u s i n g l e a s t - s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e . S t u d e n t ' s t i s t h e s t a t i s t i c u s e d t o t e s t w h e t h e r o r n o t t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n two s a m p l e means i s s i g n i f i c a n t . A n a l y s i s o f v a r i a n c e i s u s e d t o d e t e c t a d i f f e r e n c e i n a s e t o f more t h a n two m e a n s . I t i s a b l e t o c o p e w i t h a n o n o r t h o g o n a l d e s i g n , s u c h a s t h i s s t u d y i s , i . e . one w i t h u n e q u a l c e l l f r e q u e n c i e s . P e a r s o n p r o d u c t moment c o r r e l a -t i o n i s a m e a s u r e o f l i n e a r c o r r e l a t i o n f o r p a i r s o f v a r i a b l e s a n d t h e 32 c o e f f i c i e n t r m e a s u r e s t h e s t r e n g t h o f t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e v a r i -a b l e s . A c o n t r a s t t e s t i s a means o f c o m p a r i n g a l l p o s s i b l e p a i r s o f g r o u p m e a n s . The g r o u p s a r e r a n k e d i n homogeneous s u b s e t s , i n w h i c h t h e means o f t h e f i r s t a n d l a s t g r o u p s do n o t d i f f e r by more t h a n a c r i t i c a l v a l u e f o r a s u b s e t o f t h a t s i z e . The l e a s t - s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e p r o -c e d u r e was u s e d f o r t h e c o n t r a s t t e s t , w i t h a s i g n i f i c a n c e l e v e l o f p = 0 CHAPTER IV RESULTS The t a b l e s a n d f i g u r e s u s e d i n t h i s c h a p t e r p r e s e n t d a t a c o l l e c t e d f r o m t h e a n i m a l s , d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s , i n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f p r o t e i n q u a l i t y and q u a n t i t y , and d i e t a r y c h o l e s t e r o l on p l a s m a a n d l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s . U n l e s s s t a t e d o t h e r w i s e , t h e s i g n i f i c a n c e l e v e l u s e d t h r o u g h o u t was p = 0 . 0 1 . Food C o n s u m p t i o n The r a t s u s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s w e r e f e d t h e i r r e s p e c t i v e d i e t s f o r a s i x - w e e k p e r i o d . A v e r a g e d a i l y f o o d i n t a k e o f t h e d i e t g r o u p s r a n g e d f r o m 1 5 . 3 4 g (P10M) t o 2 3 . 3 4 g ( L C ) , a s shown i n T a b l e 4 . 1 . T h o s e a n i m a l s f e d t h e 10% p e a n u t p r o t e i n d i e t s a t e t h e l e a s t amount o f f o o d , a n d w h i l e t h i s may be e x p l a i n e d on t h e b a s i s o f a p o o r e r q u a l i t y p r o t e i n s u c h a s p e a n u t p r o t e i n , one m i g h t p r e d i c t t h a t a s i m i l a r l y l o w f o o d i n t a k e w o u l d a l s o be r e c o r d e d f o r r a t s f e d t h e CIO d i e t . T h i s was n o t t h e c a s e , a s t h e d a i l y f o o d i n t a k e f o r t h e a n i m a l s f e d t h e 10% c a s e i n d i e t was h i g h e r , a l t h o u g h n o t s i g n i f i c a n t l y s o , t h a n f o r t h o s e a n i m a l s f e d t h e C15 and C20 d i e t s (F = 3 . 2 0 6 2 , p = . 0 6 5 8 ) . A p a r t f r o m t h e a v e r a g e d a i l y f o o d i n t a k e o f t h e P10 a n d P10M d i e t g r o u p s , t h e f o o d i n t a k e o f a l l o t h e r d i e t g r o u p s c o m p a r e d f a v o u r a b l y w i t h f o o d c o n s u m p t i o n d a t a f r o m r a t s f e d 20% c a s e i n d i e t s ( S u g a n o e t a l . , 1 9 7 8 ) . T h e s e a n i m a l s a t e 1 8 . 5 - 2 1 . 3 g / d a y . T h o s e a n i m a l s f e d t h e P20M d i e t a t e s i g n i f i c a n t l y more t h a n t h o s e f e d t h e P20 d i e t ( t = 3 . 2 1 , p = . 0 0 8 ) . H o w e v e r , a s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e d i d n o t 33 34 o c c u r b e t w e e n t h e g r o u p s f e d P10 a n d P10M d i e t s ( t = . 2 2 , p = . 8 3 0 ) , a n d P15 a n d P15M d i e t s ( t = 1 . 7 4 , p = . 1 0 7 ) . The e f f e c t o f d i e t a r y c h o l e s t e r o l on f o o d i n t a k e was s i g n i f i c a n t o n l y when t h e d a i l y c o n s u m p t i o n o f r a t s f e d C20 a n d C20Ch d i e t s was c o m p a r e d ( t = 4 . 1 9 , p = . 0 0 2 ) , i n c o n t r a s t t o t h o s e a n i m a l s f e d t h e P20 a n d P20Ch d i e t s ( t = 2 . 0 3 , p = . 0 6 9 ) , a n d t h e P20M a n d P20ChM d i e t s ( t = 1 . 5 4 , p = . 1 5 0 ) . A l t h o u g h t h e c o n t r a s t t e s t ( T a b l e 4 . 1 ) a n d a n a l y s i s o f v a r i a n c e ( F = 1 0 . 0 6 5 6 , p < . 0 0 1 ) r e v e a l s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s among t h e f o o d i n t a k e s o f t h e d i e t g r o u p s , d i f f e r e n c e s i n p l a s m a a n d l i v e r c h o l e s t e r o l c a n n o t be a t t r i b u t e d t o d i f f e r e n c e s i n f o o d c o n s u m p t i o n . P e a r s o n c o r r e l a t i o n i n d i c a t e s no s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o n b e t w e e n t h e s e v a r i a b l e s a n d f o o d i n t a k e , when t h e p e a n u t p r o t e i n and c a s e i n d i e t s a r e c o n s i d e r e d s e p a r a t e l y o r t o g e t h e r ( T a b l e 4 . 2 ) . B o d y W e i g h t s and W e i g h t G a i n The d a t a i n T a b l e 4 . 3 show t h e i n i t i a l mean w e i g h t o f r a t s w i t h i n e a c h d i e t g r o u p , w e i g h t g a i n e d d u r i n g t h e e x p e r i m e n t a l p e r i o d , a n d s t a n d a r d i z e d w e i g h t g a i n ( w e i g h t g a i n a s a f u n c t i o n o f i n i t i a l w e i g h t ) . The l a t t e r was u s e d t o c o m p e n s a t e f o r d i f f e r e n c e s i n i n i t i a l w e i g h t s and t o r e p r e s e n t w e i g h t g a i n w i t h a k i n d o f f a c t o r s y s t e m . F o r e x a m p l e , a s t a n d a r d i z e d w e i g h t g a i n o f 0 . 5 w o u l d i n d i c a t e t h a t t h e d i e t g r o u p g a i n e d h a l f i t s i n i t i a l w e i g h t w h e r e a s a v a l u e o f 2 means t h e g r o u p g a i n e d d o u b l e i t s i n i t i a l w e i g h t . The l a r g e s t w e i g h t g a i n was r e c o r d e d f o r t h o s e a n i m a l s f e d t h e P20ChM d i e t , and t h e s m a l l e s t f o r t h o s e f e d t h e P10 d i e t . W h e t h e r t h e p r o t e i n was f r o m 35 T a b l e 4 . 1 A v e r a g e D a i l y Food I n t a k e D i e t G r o u p n A v e r a g e D a i l y Food I n t a k e ( g ) P10 7 15. . 5 8 + 2 , . 0 2 a P10M 7 15. . 3 4 + 2 , .11 a P15 7 18. . 4 8 + 2 , . 3 3 b P15M 7 18. . 8 0 + 2 , . 3 2 b P20 6 17. . 5 8 + . 4 1 ab P20M 7 1 9 . .77 + 1, . 6 1 c P20Ch 6 18. , 5 3 + 1, . 0 6 b P20ChM 7 2 1 . .41 + 2 , . 3 1 c d CIO 7 1 9 . .27 + 1. . 1 9 be C15 7 18. ,77 + 1. . 9 0 b C20 6 17. , 4 3 + . 1 3 ab C20Ch 6 17. , 9 3 + . 2 5 ab LC 7 2 3 . , 3 4 + 2 . . 2 8 d 1 , 2 V a l u e r e p r e s e n t s mean ± s t a n d a r d d e v i a t i o n . V a l u e s n o t s h a r i n g a common s u p e r s c r i p t l e t t e r a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t ( p < 0 . 0 1 ) by c o n t r a s t t e s t i n g , u s i n g l e a s t - s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e . 36 T a b l e 4 . 2 P e a r s o n C o r r e l a t i o n C o e f f i c i e n t s a n d P r o b a b i l i t y L e v e l s f o r T i s s u e C h o l e s t e r o l L e v e l s a n d A v e r a g e D a i l y Food I n t a k e A v e r a g e D a i l y Food I n t a k e P e a n u t P r o t e i n D i e t s C a s e i n D i e t s P e a n u t P r o t e i n a n d C a s e i n D i e t s P l a s m a C h o l e s t e r o l r - . 2 0 4 7 r = . 0 9 1 3 r = . 1 3 6 4 p = . 0 6 9 p = . 3 2 9 p = . 1 1 4 n = 54 n = 26 n = 80 L i v e r C h o l e s t e r o l r = . 2 7 2 9 r = - . 1 9 9 9 r = . 1 3 5 0 p = . 0 2 3 p = . 1 6 4 p = . 1 1 6 n = 54 n = 26 n = 80 37 T a b l e 4 . 3 I n i t i a l W e i g h t s , W e i g h t G a i n a n d S t a n d a r d i z e d W e i g h t G a i n o f D i e t G r o u p s D i e t G r o u p n I n i t i a l W e i g h t ( g ) W e i g h t G a i n ( g ) S t a n d a r d i z e d W e i g h t G a i n P10 7 1 5 9 . 1 4 ± 4 . 1 8 c d e 1 , 2 8 5 . 8 5 + 14 0 8 1 0 . 5 5 0 8 + 1 3 . 0 7 9 i , J P10M 7 1 6 6 . 4 2 ± 9 . 0 7 e 9 5 . 8 5 + 36 75 0 . 5 8 2 1 + . 2 4 4 P15 7 1 5 5 . 7 1 ± 5 . 9 3 c d e 1 7 4 . 7 1 + 44 07 1 . 1 2 8 4 + . 3 1 7 P15M 7 1 6 7 . 0 0 ± 1 2 . 8 5 e 1 8 8 . 7 1 + 39 73 1 . 1 3 3 8 + . 2 4 5 P20 6 1 2 9 . 1 6 ± 1 0 . 2 2 a 2 2 1 . 8 3 + 29 82 1 . 7 2 3 5 + . 2 3 7 P20M 7 1 4 8 . 5 7 ± 1 3 . 9 5 b e d 2 4 9 . 8 5 + 31 00 1 . 6 9 2 5 + . 2 4 2 P20Ch 6 1 4 2 . 6 6 ± 9 . 2 8 b 2 0 5 . 8 3 + 24 .77 1 . 4 3 9 0 + . 0 9 1 P20ChM 7 1 4 7 . 4 2 ± 7 . 4 8 be 3 0 2 . 2 8 + 43 . 5 0 2 . 0 4 3 9 + . 2 1 7 CIO 7 1 6 0 . 7 1 ± 4 . 7 8 de 1 5 9 . 8 5 + 23 . 2 4 0 . 9 9 8 5 + . 1 7 3 C15 7 1 5 9 . 8 5 ± 7 . 1 0 de 2 1 0 . 4 2 + 31 . 1 6 1 . 3 1 5 7 + . 1 8 3 C20 6 1 3 9 . 0 0 ± 1 0 . 2 5 ab 2 4 6 . 1 6 + 14 . 7 7 1 . 7 7 5 8 + . 1 2 3 C20Ch 6 1 5 0 . 0 0 ± 7 . 5 1 b e d 2 2 4 . 6 6 + 15 . 7 5 1 . 5 0 2 2 + . 1 4 9 LC 7 1 4 9 . 7 1 ± 7 . 8 8 b e d 2 4 0 . 0 0 + 48 . 1 6 1 . 6 1 6 8 + . 3 9 0 I n i t i a l 9 1 5 9 . 7 7 ± 7 . 4 4 c d - -V a l u e r e p r e s e n t s mean + s t a n d a r d d e v i a t i o n . V a l u e s n o t s h o w i n g a common s u p e r s c r i p t l e t t e r a r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t (p = .01) by c o n t r a s t t e s t i n g , u s i n g l e a s t - s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e . S t a n d a r d i z e d w e i g h t g a i n r e p r e s e n t s w e i g h t g a i n a s a f u n c t i o n o f i n i t i a l w e i g h t . S e e t e x t f o r f u r t h e r e x p l a n a t i o n . 38 an a n i m a l s o u r c e o r v e g e t a b l e s o u r c e , w e i g h t g a i n was d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e amount o f p r o t e i n i n t h e d i e t . P e a r s o n c o r r e l a t i o n a n a l y s i s shows a s t r o n g p o s i t i v e c o r r e l a t i o n ( p < 0 . 0 0 1 ) b e t w e e n w e i g h t g a i n a n d p e a n u t p r o t e i n , p e a n u t p r o t e i n w i t h m e t h i o n i n e , and c a s e i n d i e t s w i t h c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t s o f 0 . 8 6 9 3 , 0 . 8 7 8 6 , a n d 0 . 8 3 6 9 , r e s p e c t i v e l y . T h o s e r a t s f e d c a s e i n d i e t s g a i n e d more w e i g h t t h a n t h e i r p e a n u t p r o t e i n - f e d c o u n t e r p a r t s , b u t t h i s d i f f e r e n c e was o n l y s i g n i f i c a n t a t t h e 10% p r o t e i n l e v e l ( T a b l e 4 . 4 ) . T h i s i s a l s o i l l u s t r a t e d i n F i g u r e 4 . 1 , u s i n g l e v e l o f p r o t e i n on t h e y - a x i s a n d s t a n d a r d i z e d w e i g h t g a i n on t h e x - a x i s . M e t h i o n i n e was a d d e d t o t h e P 1 0 , P15 a n d P20 d i e t s t o i n c r e a s e t h e i r m e t h i o n i n e c o n t e n t t o t h e same l e v e l a s i s f o u n d i n a c a s e i n d i e t o f e q u i v a l e n t p r o t e i n c o n t e n t , i . e . t o i m p r o v e t h e q u a l i t y o f t h e p e a n u t p r o t e i n . A l t h o u g h m e t h i o n i n e a p p e a r e d t o e n h a n c e t h e w e i g h t g a i n o f t h o s e r a t s f e d t h e p e a n u t p r o t e i n d i e t s c o n t a i n i n g a d d i t i o n a l m e t h i o n i n e , t h e d i f f e r e n c e s i n w e i g h t g a i n a r e n o t s i g n i f i c a n t f o r t h o s e a n i m a l s f e d p e a n u t p r o t e i n d i e t s w i t h a n d w i t h o u t m e t h i o n i n e , a t a l l t h r e e p r o t e i n l e v e l s ( T a b l e 4 . 4 ) . D i e t a r y c h o l e s t e r o l a l s o had no s i g n i f i c a n t e f f e c t on w e i g h t g a i n , a l t h o u g h t h e r a t s f e d p e a n u t p r o t e i n a n d c a s e i n d i e t s w i t h c h o l e s t e r o l a d d e d t e n d e d t o g a i n l e s s w e i g h t t h a n t h o s e f e d e q u i v a l e n t d i e t s w i t h o u t c h o l e s t e r o l . D i e t a r y c h o l e s t e r o l a n d m e t h i o n i n e d i d n o t i n f l u e n c e w e i g h t g a i n when c o n s i d e r e d s e p a r a t e l y , b u t when a d d e d t o t h e same d i e t ( P 2 0 C h M ) , w e i g h t g a i n f o r a n i m a l s f e d t h i s d i e t was s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r t h a n f o r a n i m a l s f e d t h e P20Ch ( t = 4 . 7 9 , p = . 0 0 1 ) a n d C20Ch d i e t s ( t = 4 . 1 2 , p = . 0 0 2 ) . 39 T a b l e 4 . 4 S t a t i s t i c a l A n a l y s i s o f S t a n d a r d i z e d W e i g h t G a i n o f G r o u p s Fed D i e t a r y P r o t e i n a t T h r e e L e v e l s S t a n d a r d i z e d W e i g h t G a i n D i e t a r y P r o t e i n P e a n u t P r o t e i n P e a n u t P r o t e i n w i t h M e t h i o n i n e C a s e i n a t 10% l e v e l o f d i e t a r y p r o t e i n . 5 5 0 8 t . 0 7 9 1 . 5 8 2 1 + . 2 4 4 . 9 9 8 5 + . 1 7 3 F r a t i o = 1 3 . 6 9 0 7 2 p = . 0 0 0 2 t = . 3 2 3 p = . 7 5 2 a t 15% l e v e l o f d i e t a r y p r o t e i n 1 . 1 2 8 4 - . 3 1 7 1 . 1 3 3 8 t . 2 4 5 1 . 3 1 5 7 t . 1 8 3 F r a t i o = 1 . 2 2 7 8 p = . 3 1 6 3 t = . 0 4 p = . 9 7 2 a t 20% l e v e l o f d i e t a r y p r o t e i n 1 . 7 2 3 5 t . 2 3 7 1 . 6 9 2 5 t . 2 4 2 1 . 7 7 5 8 t . 1 2 3 F r a t i o = . 2 5 4 9 p = .7781 t = . 2 3 p = . 8 2 1 V a l u e r e p r e s e n t s mean t s t a n d a r d d e v i a t i o n . F r a t i o a n d p r o b a b i l i t y l e v e l f o r a n a l y s i s o f v a r i a n c e . t v a l u e a n d p r o b a b i l i t y l e v e l f o r t - t e s t b e t w e e n P & PM d i e t s . 40 F i g u r e 4 . 1 . S t a n d a r d i z e d w e i g h t g a i n a t t h r e e p r o t e i n l e v e l s 41 05 1.0 15 2J0 Standardized Weight Gain 42 Q u a l i t y o f D i e t a r y P r o t e i n a n d M e t h i o n i n e S u p p l e m e n t a t i o n The e f f e c t o f p r o t e i n q u a l i t y on t i s s u e c h o l e s t e r o l l e v e l s i s p r e s e n t e d i n T a b l e 4 . 5 . O n l y a t t h e 15% p r o t e i n l e v e l was t h e r e a s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e among t h e p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s o f t h e r a t s f e d t h e t h r e e p r o t e i n s . T h i s was p r o b a b l y due t o t h e a n o m a l o u s p l a s m a c h o l e s t e r o l v a l u e f r o m a n i m a l s f e d t h e P15M d i e t . The a d d i t i o n o f m e t h i o n i n e t o t h e p e a n u t p r o t e i n d i e t s r e s u l t e d i n an i n c r e a s e i n p l a s m a c h o l e s t e r o l a t a l l t h r e e l e v e l s o f p r o t e i n . A l t h o u g h t h i s was o n l y s i g n i f i c a n t a t t h e 15% l e v e l o f p r o t e i n , i t p o i n t s o u t a t r e n d r e l a t e d t o m e t h i o n i n e s u p p l e m e n t a t i o n o f t h e d i e t . P r o t e i n q u a l i t y had no i n f l u e n c e on l i v e r c h o l e s t e r o l v a l u e s a t t h e 10% p r o t e i n l e v e l , b u t , a t b o t h t h e 15% a n d 20% p r o t e i n l e v e l s , t h e b e t t e r t h e q u a l i t y o f t h e p r o t e i n , t h e h i g h e r t h e l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l ( T a b l e 4 . 6 ) . The g r o u p o f a n i m a l s f e d t h e LC d i e t had p l a s m a a n d l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s w h i c h w e r e v e r y s i m i l a r t o i n i t i a l v a l u e s ( T a b l e s 4 . 5 a n d 4 . 6 ) . T h i s g r o u p was i n c l u d e d i n t h i s s t u d y t o e l i m i n a t e t h e e f f e c t o f t i m e on t i s s u e c h o l e s t e r o l l e v e l s . S i n c e no s i g n i f i c a n t e f f e c t was e v i d e n t , t h e c h a n g e s i n b o t h p l a s m a a n d l i v e r c h o l e s t e r o l o c c u r r i n g i n t h e t i s s u e s o f t h e r a t s f e d t h e o t h e r d i e t s c a n n o t be a c c o u n t e d f o r on t h e b a s i s o f an i n c r e a s e o r d e c r e a s e o v e r t h e t i m e p e r i o d u s e d i n t h i s s t u d y . 4 3 . T a b l e 4 . 5 E f f e c t o f P r o t e i n Q u a l i t y a n d M e t h i o n i n e S u p p l e m e n t a t i o n on P l a s m a C h o l e s t e r o l L e v e l s D i e t G r o u p n P l a s m a C h o l e s t e r o l (mg%) P10 7 1 1 3 . 9 8 + 1 0 . 7 1 1 P10M 7 1 1 7 . 1 3 + 1 9 . 6 8 F r a t i o = 3 . 5 4 4 3 2 CIO 7 8 4 . 2 8 + 3 7 . 9 9 P = . 0 5 0 4 PI 5 7 1 0 9 . 4 9 + 4 . 8 4 P15M 7 1 3 4 . 2 1 + 2 5 . 4 5 F r a t i o = 6 . 4 8 0 8 C15 7 9 6 . 4 8 + 2 2 . 7 9 P = . 0 0 7 6 P20 6 1 0 2 . 5 1 + 8 . 1 0 P20M 7 1 1 6 . 9 0 + 1 8 . 6 7 F r a t i o = 1 . 5 6 0 0 C20 6 1 0 7 . 6 9 + 1 5 . 1 6 P = . 2 4 0 5 LC 7 8 0 . 4 2 + 7 . 5 4 t = . 8 0 3 I n i t i a l 9 7 7 . 8 7 + 5 . 2 6 P = . 4 3 8 V a l u e r e p r e s e n t s mean i s t a n d a r d d e v i a t i o n . F r a t i o a n d p r o b a b i l i t y l e v e l f o r a n a l y s i s o f v a r i a n c e . t v a l u e a n d p r o b a b i l i t y l e v e l f o r t - t e s t . 4 4 » T a b l e 4 . 6 E f f e c t o f P r o t e i n Q u a l i t y a n d M e t h i o n i n e S u p p l e m e n t a t i o n on L i v e r C h o l e s t e r o l L e v e l s D i e t G r o u p n L i v e r C h o l e s t e r o l (mg/g l i v e r w t ) P10 7 6 . 6 0 + 2 . 1 4 1 P10M 7 8 . 6 7 + 3 . 4 9 F r a t i o = . 3 2 1 6 2 CIO 7 7 . 4 9 + 7 . 3 2 P = . 7 2 9 0 PI 5 7 3 . 8 1 + 2 . 1 4 P15M 7 6 . 5 9 + 1 . 3 7 F r a t i o = 5 . 9 9 9 2 CI 5 7 1 4 . 2 1 + 9 . 7 4 P = .0101 P20 6 7 . 1 6 + 3 . 8 3 P20M 7 1 0 . 6 1 + 2 . 9 4 F r a t i o = 5 . 5 3 1 8 C20 6 1 4 . 9 1 + 5 . 2 2 P = . 0 1 4 9 LC 7 5 . 1 2 + 2 . 2 6 t = 2 . 5 6 3 I n i t i a l 9 7 . 5 1 + 1 . 4 7 P = . 0 2 3 V a l u e r e p r e s e n t s mean - s t a n d a r d d e v i a t i o n . F r a t i o and p r o b a b i l i t y l e v e l f o r oneway a n a l y s i s o f v a r i a n c e . t v a l u e a n d p r o b a b i l i t y l e v e l f o r t - t e s t . 45 Q u a n t i t y o f D i e t a r y P r o t e i n The e f f e c t o f p r o t e i n q u a n t i t y on p l a s m a c h o l e s t e r o l i s p r e s e n t e d i n T a b l e 4 . 7 . A l t h o u g h t h e r e w e r e no s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n p l a s m a c h o l e s t e r o l w i t h i n e a c h g r o u p , two o p p o s i n g t r e n d s c a n be s e e n . As t h e amount o f p e a n u t p r o t e i n i n c r e a s e d , t h e r e was a c o r r e s p o n d i n g d e c r e a s e i n p l a s m a c h o l e s t e r o l . By c o n t r a s t , a s c a s e i n l e v e l s i n c r e a s e d , s o d i d t h e p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l . T h e s e t r e n d s c a n a l s o be s e e n g r a p h i c a l l y i n F i g u r e 4 . 2 . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t , i n s p i t e of t h e s e o p p o s i n g t r e n d s , p l a s m a c h o l e s t e r o l v a l u e s f o r a n i m a l s f e d t h e 20% p r o t e i n d i e t s w e r e v e r y s i m i l a r ( t = . 7 7 , p > . 4 0 ) . P e a r s o n c o r r e l a t i o n a n a l y s i s ( T a b l e 4 . 8 ) shows a s t r o n g n e g a t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n p l a s m a c h o l e s t e r o l a n d p e a n u t p r o t e i n and a somewhat w e a k e r p o s i t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n p l a s m a c h o l e s t e r o l a n d c a s e i n . The amount o f p r o t e i n i n t h e d i e t had no s i g n i f i c a n t e f f e c t on l i v e r c h o l e s t e r o l ( T a b l e 4 . 9 ) . A l t h o u g h no p a r t i c u l a r t r e n d was a p p a r e n t i n t h e l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s o f a n i m a l s f e d t h e p e a n u t p r o t e i n d i e t s , a n a l y s i s r e v e a l e d a m o d e r a t e l y s t r o n g p o s i t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n c a s e i n i n t h e d i e t a n d l i v e r c h o l e s t e r o l ( T a b l e 4 . 8 ) . D i e t a r y C h o l e s t e r o l The a d d i t i o n o f c h o l e s t e r o l t o e a c h o f t h e p r o t e i n d i e t s , had no e f f e c t on p l a s m a c h o l e s t e r o l ( T a b l e 4 . 1 0 ) . D i e t a r y m e t h i o n i n e a p p e a r e d t o m o d e r a t e t h e e f f e c t o f d i e t a r y c h o l e s t e r o l s i n c e t h e p l a s m a l e v e l o f t h e a n i m a l s f e d t h e P20ChM d i e t t e n d e d t o be l o w e r t h a n t h o s e o f a n i m a l s f e d t h e P20Ch a n d C20Ch d i e t s . T a b l e 4 . 7 E f f e c t o f P r o t e i n Q u a n t i t y on P l a s m a C h o l e s t e r o l L e v e l s D i e t G r o u p n P l a s m a C h o l e s t e r o l (mg%) P10 7 1 1 3 . 9 8 t 1 0 . 7 1 1 PI 5 7 1 0 9 . 4 9 t 4 . 8 4 F r a t i o = . 1 0 2 9 2 P20 6 1 0 2 . 5 1 t 8 . 1 0 P = . 7 5 2 3 CIO 7 8 4 . 2 8 t 3 7 . 9 9 C15 7 9 6 . 4 8 t 2 2 . 7 9 F r a t i o = . 0 0 1 4 C20 6 1 0 7 . 6 9 t 1 5 . 1 6 P = . 9 7 0 2 I n i t i a l 9 7 7 . 8 7 t 5 . 2 6 V a l u e r e p r e s e n t s mean - s t a n d a r d d e v i a t i o n . F r a t i o a n d p r o b a b i l i t y l e v e l f o r a n a l y s i s o f v a r i a n c e . 47 F i g u r e 4 . 2 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n p r o t e i n a n d p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s f o r p e a n u t p r o t e i n a n d c a s e i n d i e t s 48 Plasma Cholesterol <mg%) 10% 15% 20% Protein Level 49 T a b l e 4 . 8 P e a r s o n C o r r e l a t i o n C o e f f i c i e n t s and P r o b a b i l i t y L e v e l s f o r P l a s m a C h o l e s t e r o l , L i v e r C h o l e s t e r o l a n d D i e t a r y P r o t e i n D i e t a r y P r o t e i n P C P l a s m a C h o l e s t e r o l r = - . 5 1 5 3 r = . 3 4 7 6 ; P = . 0 1 0 P = . 0 6 7 n = 20 n = 20 L i v e r C h o l e s t e r o l r = . 0 5 4 3 r = . 3 8 5 4 P = . 4 1 0 P = . 0 4 7 n = 20 n = 20 50 T a b l e 4 . 9 E f f e c t o f P r o t e i n Q u a n t i t y on L i v e r C h o l e s t e r o l L e v e l s D i e t G r o u p n L i v e r C h o l e s t e r o l (mg/g l i v e r w e i g h t ) P10 7 6 . 6 0 ± 2 . 1 4 1 P15 7 3 . 8 1 ± 2 . 1 4 F r a t i o = 5 . 6 2 6 9 2 P20 6 7 . 1 6 ± 3 . 8 8 P = . 0 2 9 8 CIO 7 7 . 4 9 ± 7 . 3 2 C15 7 1 4 . 2 1 ± 9 . 7 4 F r a t i o = 1 . 8 8 2 2 C20 6 1 4 . 9 1 ± 5 . 2 2 P = . 1 8 2 6 I n i t i a l 9 7 . 5 1 ± 1 . 4 7 V a l u e r e p r e s e n t s mean ± s t a n d a r d d e v i a t i o n . F r a t i o a n d p r o b a b i l i t y l e v e l f o r oneway a n a l y s i s o f v a r i a n c e . 51 T a b l e 4 . 1 0 E f f e c t o f D i e t a r y C h o l e s t e r o l on P l a s m a C h o l e s t e r o l L e v e l s D i e t G r o u p n P l a s m a C h o l e s t e r o l (mg%) P20 6 1 1 0 2 . 5 1 t 8 . 1 0 1 t = 1 . 9 5 2 P20Ch 7 1 1 6 . 6 7 ± 1 5 . 8 7 p = . 0 8 0 P20M 7 1 1 6 . 9 0 ± 1 8 . 6 7 t = . 7 8 P20ChM 7 1 0 9 . 0 6 ± 1 8 . 8 4 p = . 4 5 0 C20 6 1 0 7 . 6 7 ± 1 5 . 1 6 t = 2 . 2 2 C20Ch 7 1 2 4 . 1 4 ± 9 . 9 8 p = . 0 5 1 I n i t i a l 9 7 7 . 8 7 ± 5 . 2 6 V a l u e r e p r e s e n t s mean - s t a n d a r d d e v i a t i o n , t v a l u e a n d p r o b a b i l i t y l e v e l f o r t - t e s t . v .52 I n c o n t r a s t t o t h e l a c k o f d i f f e r e n c e b e t w e e n p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s o f r a t s i n g r o u p s f e d d i e t s w i t h a n d w i t h o u t d i e t a r y c h o l e s t e r o l , a h i g h l y s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e c o u l d be s e e n b e t w e e n t h e l i v e r c h o l e s t e r o l v a l u e s o f t h e s e t h r e e p a i r s o f d i e t g r o u p s ( T a b l e 4 . 1 1 ) . The c h a n g e i n l i v e r c h o l e s t e r o l a c c u m u l a t i o n when c h o l e s t e r o l was a d d e d t o t h e P 2 0 , P 2 0 M , a n d C20 d i e t s r a n g e d f r o m a b o u t a f o u r - t o t e n - f o l d i n c r e a s e , w i t h t h e g r e a t e r a c c u m u l a t i o n b e i n g f o u n d i n t h e l i v e r s o f t h o s e r a t s f e d t h e c a s e i n d i e t . As i n t h e p l a s m a , d i e t a r y m e t h i o n i n e a p p e a r e d t o m o d e r a t e t h i s e f f e c t s i n c e a n i m a l s f e d t h i s d i e t had l i v e r c h o l e s t e r o l v a l u e s t h a t w e r e l o w e r t h a n t h e o t h e r d i e t s t o w h i c h c h o l e s t e r o l was a l s o a d d e d . 53 T a b l e 4 . 1 1 E f f e c t o f D i e t a r y C h o l e s t e r o l on L i v e r C h o l e s t e r o l L e v e l s D i e t G r o u p n L i v e r C h o l e s t e r o l (mg/g l i v e r w e i g h t ) P20 6 7 . 1 6 ± 3 . 8 3 1 t = 8 . 3 0 2 P20Ch 7 7 6 . 0 1 ± 1 9 . 9 4 P < 0 . 0 0 0 1 P20M 7 1 0 . 6 1 ± 2 . 9 4 t = 6 . 0 6 P20MCh 7 4 5 . 9 7 ± 1 5 . 1 6 P < 0 . 0 0 0 1 C20 6 1 4 . 9 1 ± 5 . 2 2 t = 1 5 . 2 0 C20Ch 7 1 0 1 . 1 1 ± 1 2 . 8 7 P < 0 . 0 0 0 1 I n i t i a l 9 7 . 5 1 ± 1 . 4 7 V a l u e r e p r e s e n t s mean ± s t a n d a r d d e v i a t i o n , t v a l u e a n d p r o b a b i l i t y l e v e l f o r t - t e s t . CHAPTER V DISCUSSION P r o t e i n Q u a l i t y and D i e t a r y M e t h i o n i n e The f i r s t o b j e c t i v e o f t h i s s t u d y was t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f t h e q u a l i t y o f d i e t a r y p r o t e i n on p l a s m a a n d l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s . The r e s u l t s o b t a i n e d f a i l t o show a n y p a r t i c u l a r e f f e c t o f p r o t e i n r e l a t e d t o p l a s m a c h o l e s t e r o l , a l t h o u g h t h e l i t e r a t u r e h a s s u g g e s t e d on o n e hand t h a t h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a i s a c o n s e q u e n c e o f f e e d i n g r a t s a p l a n t p r o t e i n and t h a t l o w e r p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s c a n be a c h i e v e d by u s i n g an a n i m a l p r o t e i n s u c h a s c a s e i n . On t h e o t h e r h a n d , i t h a s b e e n f o u n d t h a t a p l a n t p r o t e i n o r an a m i n o a c i d m i x t u r e e q u i v a l e n t t o i t was r e s p o n s i b l e f o r l o w e r p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s t h a n c a s e i n o r an a m i n o a c i d m i x t u r e e q u i v a l e n t t o i t . I t d o e s n o t s e e m , on t h e b a s i s o f t h e p r e s e n t e v i d e n c e , t h a t d i f f e r e n c e s i n a m i n o a c i d p r o f i l e s a r e r e f l e c t e d i n d i f f e r e n c e s i n p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s . A l t e r i n g t h e q u a l i t y o f a p r o t e i n by a d d i n g a l i m i t i n g a m i n o a c i d , i n t h i s c a s e m e t h i o n i n e , was c a r r i e d o u t on t h e s u g g e s t i o n t h a t r e l a t i v e a m o u n t s o f m e t h i o n i n e w i l l i n f l u e n c e p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s . O n l y a t t h e 15% l e v e l o f p r o t e i n d i d t h e a d d i t i o n o f m e t h i o n i n e t o t h e p e a n u t p r o t e i n d i e t s i g n i f i c a n t l y c h a n g e t h e p l a s m a c h o l e s t e r o l o f r a t s f e d t h i s d i e t . H o w e v e r , t h e i n c r e a s e o b s e r v e d was o p p o s i t e t o a p r e d i c t e d h y p o c h o l e s t e r o l e m i c r e s p o n s e e x p e c t e d f r o m i m p r o v e m e n t i n p r o t e i n q u a l i t y by t h e a d d i t i o n o f m e t h i o n i n e . P l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s o f r a t s h a v e been shown t o be f a i r l y r e s i s t a n t t o c h a n g e a n d t h e d i e t a r y c o n d i t i o n s i m p o s e d w i t h r e g a r d t o p r o t e i n q u a l i t y may b e a r no r e l a t i o n t o t h e 54 55 f a c t o r s t h a t w i l l i n f l u e n c e c h o l e s t e r o l l e v e l s , d e s p i t e p r e v i o u s s t u d i e s t h a t s u g g e s t o t h e r w i s e . The e f f e c t o f p r o t e i n q u a l i t y on l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s h a s a l s o b e e n r e l a t e d t o t h e m e t h i o n i n e c o n t e n t o f t h e d i e t . The p r e s e n t d a t a show t h a t i m p r o v i n g t h e m e t h i o n i n e c o n t e n t e i t h e r by t h e a d d i t i o n o f d i e t a r y m e t h i o n i n e a s t h e f r e e a m i n o a c i d o r s u b s t i t u t i n g a p r o t e i n w i t h a l o w e r m e t h i o n i n e c o n t e n t f o r o n e w i t h a h i g h e r c o n t e n t , e g . c a s e i n , l e d t o i n c r e a s e d l i v e r c h o l e s t e r o l a c c u m u l a t i o n a t t h e 15% a n d 20% p r o t e i n l e v e l s . The l i t e r a t u r e p r o v i d e s no e x p l a n a t i o n f o r t h i s o b s e r v a t i o n p r i m a r i l y b e c a u s e t h e i n f l u e n c e s on p l a s m a c h o l e s t e r o l h a v e r e c e i v e d t h e g r e a t e r a t t e n t i o n . I t may be t h a t i m p r o v i n g t h e q u a l i t y o f a d i e t a r y p r o t e i n s t i m u l a t e s an o v e r a l l g r o w t h o r a n a b o l i c r e s p o n s e w h i c h h a s b e e n m e a s u r e d i n t h e l i v e r a s i n c r e a s e d e n d o g e n o u s c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s . I t w o u l d be i n t e r e s t i n g t o d e t e r m i n e i f t h i s i s i n d e e d t h e c a s e , p e r h a p s by m e a s u r i n g l a b e l l e d a c e t a t e i n c o r p o r a t i o n i n t o c h o l e s t e r o l . T h e r e seems t o be no c o n s i s t e n t r e l a t i o n s h i p b e t w e e n p l a s m a a n d l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s a c c o r d i n g t o t h e p r e s e n t s t u d y . S u c h a r e l a t i o n s h i p w o u l d be a n t i c i p a t e d i f t h e r e l a t i v e r a t e s o f c h o l i n e a n d t a u r i n e s y n t h e s i s w e r e d e p e n d e n t u p o n p r o t e i n q u a l i t y a n d t h e a v a i l a b i l i t y o f m e t h i o n i n e , a s h a s been s u g g e s t e d . I f m e t h i o n i n e w e r e i n s h o r t s u p p l y , i t w o u l d t e n d t o p r o d u c e an i n c r e a s e i n t i s s u e c h o l e s t e r o l a c c u m u l a t i o n s i n c e t h e s y n t h e s i s o f c h o l i n e a n d t a u r i n e was b e i n g i n h i b i t e d . C o n -v e r s e l y , w i t h m e t h i o n i n e r e a d i l y a v a i l a b l e , p l a s m a a n d l i v e r c h o l e s t e r o l 56 l e v e l s w o u l d n o t i n c r e a s e s i n c e l i p o p r o t e i n s w o u l d p r e s u m a b l y be made t o remove c h o l e s t e r o l f r o m t h e l i v e r t o t h e b l o o d a n d e n o u g h b i l e a c i d s w o u l d be a v a i l a b l e t o r e m o v e e x c e s s c h o l e s t e r o l f r o m g e n e r a l c i r c u l a t i o n , m a i n t a i n i n g a s u f f i c i e n t r a t e o f c h o l e s t e r o l t u r n o v e r t o p r e v e n t a " b a c k -u p " o f c h o l e s t e r o l i n t h e b l o o d . The p r e s e n t r e s u l t s l e n d no s u p p o r t t o t h e s e s u g g e s t i o n s a n d r e l e g a t e t h e e f f e c t o f p r o t e i n w h e t h e r f r o m an a n i m a l o r p l a n t s o u r c e a n d d i e t a r y m e t h i o n i n e on t i s s u e c h o l e s t e r o l l e v e l s t o m i n o r p o s i t i o n s . P r o t e i n Q u a n t i t y The s e c o n d o b j e c t i v e was t o s t u d y t h e e f f e c t o f t h e q u a n t i t y o f d i e t a r y p r o t e i n on p l a s m a a n d l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s . A number o f s t u d i e s h a v e i n d i c a t e d t h a t i n c r e a s i n g t h e amount o f p r o t e i n i n t h e d i e t d e c r e a s e d p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s , w h e t h e r t h e a d d i t i o n a l p r o t e i n was f r o m an a n i m a l o r v e g e t a b l e s o u r c e . O t h e r s h a v e f o u n d t h a t i n c r e a s e s i n d i e t a r y p r o t e i n w e r e p a r a l l e l e d by i n c r e a s e s i n p l a s m a c h o l e s t e r o l . I n t h i s s t u d y , t h e p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s o f r a t s w e r e f a i r l y r e s i s t a n t t o c h a n g e when t h e f a c t o r b e i n g v a r i e d i n t h e i r d i e t s was t h e amount o f p r o t e i n . The a n i m a l s f e d t h e p e a n u t p r o t e i n d i e t had p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s t h a t showed a downward t r e n d a s t h e amount o f p r o t e i n i n c r e a s e d , w h i l e t h o s e f e d c a s e i n d i e t s had p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s t h a t d e m o n -s t r a t e d an u p w a r d t r e n d . H o w e v e r , w i t h i n e a c h d i e t g r o u p , d i f f e r e n c e s among t h e p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s w e r e n o t s i g n i f i c a n t . I t i s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h a t t h e d i r e c t i o n o f t h e t r e n d a s t h e amount o f p e a n u t p r o t e i n i n c r e a s e s s u p p o r t s t h e p r e m i s e t h a t p r o t e i n h a s a 57 p r o t e c t i v e e f f e c t a g a i n s t h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a . By c o n t r a s t , t h e d i r e c t i o n o f t h e t r e n d as t h e amount o f c a s e i n i n t h e d i e t i n c r e a s e s t e n d s t o s u p p o r t t h e o p p o s i t e v i e w t h a t p l a s m a c h o l e s t e r o l i s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e amount o f p r o t e i n i n t h e d i e t . O v e r a l l , t h e r e s u l t s a g r e e w i t h t h e w o r k o f Me*ndez ( 1 9 6 4 ) who o b s e r v e d no s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e i n p l a s m a c h o l e s t e r o l a s a r e s u l t o f f e e d i n g d i e t s w i t h d i f f e r e n t l e v e l s o f p r o t e i n . B e s t e t a l . ( 1 9 3 6 ) r e p o r t e d t h a t t h e a d d i t i o n o f c a s e i n t o an 8% c a s e i n d i e t r e s u l t e d i n a d e c r e a s e i n l i v e r c h o l e s t e r o l a c c u m u l a t i o n , i n d i c a t i n g t h a t an i m p r o v e m e n t i n t h e q u a n t i t y o f p r o t e i n w o u l d be f o l l o w e d by a d e c l i n e i n l i v e r c h o l e s t e r o l . Why t h i s o c c u r r e d was a g a i n t h o u g h t t o be r e l a t e d t o t h e amount o f m e t h i o n i n e a v a i l a b l e . The d a t a on t h e e f f e c t o f p r o t e i n on l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s p r o v i d e d by t h i s s t u d y do n o t s u p p o r t t h i s s u g g e s t i o n , s i n c e l i v e r c h o l e s t e r o l was n o t s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t a t e a c h l e v e l f o r t h e two p r o t e i n s e x a m i n e d . W i t h i n c r e a s e s i n t h e amount o f t h e b e t t e r q u a l i t y p r o t e i n , c a s e i n , t h e l i v e r c h o l e s -t e r o l t e n d e d t o be h i g h e r , n o t l o w e r a s s u g g e s t e d by B e s t e t a l . ( 1 9 3 6 ) . The a c c u m u l a t i o n o f c h o l e s t e r o l i n t h e l i v e r may be a g e n e r a l g r o w t h r e s p o n s e t o c a s e i n s i m i l a r t o t h e one s u g g e s t e d f o r t h e e f f e c t o f p r o t e i n q u a l i t y on l i v e r c h o l e s t e r o l . H o w e v e r , t h i s d o e s n o t a c c o u n t f o r t h e r e l a t i v e s t a b i l i t y o f t h e l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s o f t h e r a t s f e d t h e t h r e e l e v e l s o f p e a n u t p r o t e i n . D i e t a r y C h o l e s t e r o l The t h i r d o b j e c t i v e . o f t h i s s t u d y was t o e v a l u a t e t h e e f f e c t o f d i e t a r y c h o l e s t e r o l on t i s s u e c h o l e s t e r o l l e v e l s . The a d d i t i o n o f c h o l e s t e r o l t o 58 t h e d i e t h a s been r e p o r t e d t o l e a d t o an i n c r e a s e i n b o t h p l a s m a a n d l i v e r c h o l e s t e r o l (Me"ndez, 1 9 6 4 ) . I n t h e p r e s e n t s t u d y , t h e f e e d i n g o f d i e t s w i t h a n d w i t h o u t c h o l e s t e r o l d i d n o t r e s u l t i n s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n p l a s m a c h o l e s t e r o l a l t h o u g h t h e i n c r e a s e o v e r i n i t i a l p l a s m a v a l u e s was s i g n i f i c a n t . When t h e p r o t e i n s o u r c e was e i t h e r p e a n u t p r o t e i n o r c a s e i n , t h e a n i m a l s f e d t h e d i e t s c o n t a i n i n g c h o l e s t e r o l t e n d e d t o h a v e h i g h e r p l a s m a c h o l e s -t e r o l l e v e l s . H o w e v e r , t h e a d d i t i o n o f b o t h c h o l e s t e r o l and m e t h i o n i n e t o t h e p e a n u t p r o t e i n d i e t p r o d u c e d t h e o p p o s i t e e f f e c t . T h i s s u g g e s t s t h a t m e t h i o n i n e was e x e r t i n g a m o d e r a t i n g i n f l u e n c e , a l b e i t a m i l d o n e , on p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s i n t h e p r e s e n c e o f d i e t a r y c h o l e s t e r o l . T h i s i s an e f f e c t i t d i d n o t e x e r t by i t s e l f , s i n c e p l a s m a c h o l e s t e r o l v a l u e s o f r a t s f e d t h e P20M d i e t w e r e h i g h e r t h a n t h e l e v e l s o f t h o s e f e d t h e P20ChM d i e t . The a c c u m u l a t i o n o f c h o l e s t e r o l i n t h e l i v e r was s i g n i f i c a n t l y g r e a t e r when c h o l e s t e r o l was a d d e d t o t h e d i e t , a n d t h e e f f e c t o f c h o l e s t e r o l was more p r o n o u n c e d w i t h t h e b e t t e r q u a l i t y p r o t e i n . As i n t h e p l a s m a , t h e e f f e c t o f m e t h i o n i n e a d d e d t o a d i e t a l s o c o n t a i n i n g c h o l e s t e r o l was t o m o d e r a t e t h e d e p o s i t i o n o f c h o l e s t e r o l i n t h e l i v e r . T h e r e i s a b o u t a f o u r - f o l d i n c r e a s e i n l i v e r c h o l e s t e r o l a c c u m u l a t i o n f o r r a t s i n t h e P20ChM g r o u p , i n c o n t r a s t t o a b o u t a t e n - f o l d i n c r e a s e i n t h e P20Ch d i e t g r o u p a n d a b o u t a s e v e n - f o l d i n c r e a s e i n t h e C20Ch d i e t g r o u p . F r a n t z e t a l . ( 1 9 5 4 ) , M o r r i s a n d C h a i k o f f ( 1 9 5 9 ) a n d Me"ndez ( 1 9 6 4 ) h a v e a l s o r e p o r t e d i n c r e a s e s i n l i v e r c h o l e s t e r o l s u b s e q u e n t t o t h e 59 a d d i t i o n o f d i e t a r y c h o l e s t e r o l . I t may be t h a t t h e m e t a b o l i s m o f a r a t i s n o t e q u i p p e d t o h a n d l e t h e i n f l u x o f e x o g e n o u s c h o l e s t e r o l b e c a u s e o f a r e l a t i v e s h o r t a g e o f l i p o p r o t e i n s o r i n a d e q u a t e c a t a b o l i s m a n d e x c r e t i o n v i a t h e b i l e . I t may a l s o be a t r a n s i t o r y s i t u a t i o n t h a t e v e n t u a l l y r e t u r n s t o w a r d n o r m a l w i t h p e r h a p s a c o m p e n s a t i n g r e d u c t i o n i n e n d o g e n o u s c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s . I t w o u l d b e ' i n t e r e s t i n g t o i n v e s t i g a t e t h i s p o s -s i b i l i t y f u r t h e r , s i n c e o t h e r s h a v e f o u n d t h a t d i e t a r y c h o l e s t e r o l i n h i b i t e d t h e s y n t h e s i s o f c h o l e s t e r o l f r o m a c e t a t e ( S i p e r s t e i n a n d G u e s t , 1 9 6 0 ) . I n e v a l u a t i n g t h e r e l a t i v e i n f l u e n c e s o f d i e t a r y p r o t e i n a n d c h o l e s t e r o l on t i s s u e c h o l e s t e r o l l e v e l s , t h e e f f e c t s o f e i t h e r a n i m a l o r v e g e t a b l e p r o t e i n a n d d i e t a r y m e t h i o n i n e on t i s s u e c h o l e s t e r o l a n d d i e t a r y c h o l e s -t e r o l on p l a s m a c h o l e s t e r o l a r e r e l a t i v e l y m i n o r c o m p a r e d t o t h e e f f e c t o f d i e t a r y c h o l e s t e r o l on l i v e r c h o l e s t e r o l a c c u m u l a t i o n . A l t h o u g h t h e u s e o f t h e l a b chow d i e t r u l e d o u t t h e p r o b a b i l i t y t h a t t h e i n c r e a s e s i n c h o l e s t e r o l o b s e r v e d w e r e o n l y due t o t i m e a n d t h e a g i n g o f t h e r a t , i t d o e s n o t e l i m i n a t e t h e p o s s i b i l i t y t h a t an e x t e n d e d e x p e r i m e n t a l p e r i o d w o u l d r e v e a l s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e p r o t e i n s w i t h r e s p e c t t o q u a l i t y a n d q u a n t i t y , o r r e d u c e t h e s i g n i f i c a n c e o f t h e l i v e r c h o l e s t e r o l a c c u m u l a t i o n . I t i s a f r e q u e n t c r i t i c i s m a n d a j u s t i f i a b l e one i n many c a s e s t h a t s h o r t - t e r m d i e t a r y s t u d i e s a r e j u s t t h a t , a n d do n o t a l l o w f o r s a m p l e c o l l e c t i o n s t h a t m i g h t more a c c u r a t e l y r e f l e c t a d a p t a t i o n s t o d i e t a r y m a n i p u l a t i o n s . CHAPTER VI SUMMARY AND CONCLUSIONS I n l i g h t o f t h e c u r r e n t c o n c e r n a b o u t t h e r i s k t h a t h i g h s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s p r e s e n t f o r t h e d e v e l o p m e n t o f a t h e r o s c l e r o s i s i n h u m a n s , t h i s s t u d y was u n d e r t a k e n t o d e t e r m i n e t h e r o l e d i e t a r y p r o t e i n q u a l i t y a n d q u a n t i t y a n d c h o l e s t e r o l may p l a y i n m o d i f y i n g b o t h p l a s m a a n d l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s i n r a t s . M a l e W i s t a r r a t s , w e i g h i n g a p p r o x i m a t e l y 150 g w e r e d i v i d e d i n t o g r o u p s o f 6 o r 7 and f e d d i e t s c o n t a i n i n g p r o t e i n a t l e v e l s o f 10%, 15%, a n d 2 0 % . The s o u r c e s o f p r o t e i n w e r e p e a n u t p r o t e i n ( P ) , p e a n u t p r o t e i n w i t h m e t h i o n i n e ( P M ) , c a s e i n (C) a n d l a b chow ( L C ) . M e t h i o n i n e was a d d e d t o t h e p e a n u t p r o t e i n t o i m p r o v e i t s q u a l i t y , a n d t h e amount a d d e d b r o u g h t t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h i s a m i n o a c i d t o t h e same l e v e l a s a c a s e i n d i e t o f e q u i v a l e n t p r o t e i n c o n t e n t . C h o l e s t e r o l was a l s o a d d e d a t t h e 20% p r o t e i n l e v e l t o t h e P , P M , a n d C d i e t s . T h u s t h e t h i r t e e n d i e t s u s e d i n t h i s s t u d y w e r e : P 1 0 , P 1 0 M , P 1 5 , P 1 5 M , P 2 0 , P 2 0 M , P 2 0 C h , P 2 0 C h M , C I O , C 1 5 , C 2 0 , C20Ch a n d L C . The l a s t d i e t was f e d t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t s o f t i m e a n d a g i n g on t h e t i s s u e c h o l e s t e r o l l e v e l s o f t h e r a t . Food c o n s u m p t i o n was r e c o r d e d d a i l y a n d b o d y w e i g h t s w e e k l y . P l a s m a a n d l i v e r s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d a t t h e e n d o f s i x w e e k s a n d a n a l y z e d e n z y m a t i c a l l y f o r c h o l e s t e r o l . P l a s m a c h o l e s t e r o l was u n a f f e c t e d by p r o t e i n q u a l i t y a n d o n l y a t t h e 15% a n d 20% p r o t e i n l e v e l s d i d l i v e r c h o l e s t e r o l i n c r e a s e w i t h i m p r o v e m e n t s 60 61 i n p r o t e i n q u a l i t y . The amount o f p r o t e i n i n t h e d i e t , w h e t h e r c a s e i n o r p e a n u t p r o t e i n , d i d n o t s i g n i f i c a n t l y i n f l u e n c e p l a s m a and l i v e r c h o l e s t e r o l l e v e l s , a l t h o u g h P e a r s o n c o r r e l a t i o n a n a l y s i s r e v e a l e d a n e g a t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n p l a s m a c h o l e s t e r o l a n d p e a n u t p r o t e i n , a n d a p o s i t i v e c o r r e l a t i o n b e t w e e n p l a s m a and l i v e r c h o l e s t e r o l a n d c a s e i n . T i m e d o e s n o t a p p e a r t o i n f l u e n c e t i s s u e c h o l e s t e r o l l e v e l s a n d t h e e f f e c t o f p r o t e i n seems t o be s e c o n d a r y t o t h e e f f e c t o f a d d i t i o n a l d i e t a r y c h o l e s t e r o l . A h i g h l y s i g n i f i c a n t i n c r e a s e i n l i v e r c h o l e s t e r o l a c c u m u l a t i o n r e s u l t e d f r o m c h o l e s t e r o l s u p p l e m e n t a t i o n o f t h e d i e t , a l t h o u g h t h i s e f f e c t c o u l d be m o d e r a t e d by a d d i t i o n a l d i e t a r y m e t h i o n i n e . S i n c e c o r o n a r y h e a r t d i s e a s e i s m o s t l i k e l y c a u s e d by a number o f f a c t o r s w o r k i n g t o g e t h e r , i t i s b o t h n a r r o w a n d s i m p l i s t i c t o l o o k a t j u s t a f e w c o m p o n e n t s o f t h e d i e t i n i s o l a t i o n . N o n e t h e l e s s , u n d e r t h e c o n d i t i o n s o f t h i s e x p e r i m e n t i t d o e s seem t h a t p r o t e i n q u a l i t y a n d q u a n t i t y a r e n o t i n f l u e n c e s o f p r i m a r y i m p o r t a n c e on t i s s u e c h o l e s t e r o l l e v e l s , a n d t h a t t h e i n f l u e n c e o f d i e t a r y c h o l e s t e r o l i s l i m i t e d t o i t s e f f e c t on l i v e r c h o l e s t e r o l a c c u m u l a t i o n . A l t h o u g h t h e r e s u l t s o f t h i s r e s e a r c h do n o t s u p p o r t e a r l i e r e x p e r i m e n t s t h a t s h o w e d a d i s t i n c t e f f e c t o f p r o t e i n on r a t t i s s u e c h o l e s t e r o l l e v e l s , t h e y do p o i n t o u t t h e n e e d f o r f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n i n t o t h e m e c h a n i s m s by w h i c h c h o l e s t e r o l m e t a b o l i s m i s r e g u l a t e d . I t w o u l d be i n s t r u c t i v e t o know t h e e f f e c t o f p r o t e i n a n d d i e t a r y c h o l e s t e r o l on e n d o g e n o u s c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s , w h e t h e r c h a n g e s i n t h e a m o u n t s o f t h e s e two c o m -p o n e n t s o f t h e d i e t i n f l u e n c e t h e t u r n o v e r o f c h o l e s t e r o l a n d b i l e s a l t s , a n d w h e t h e r t h e c a t a b o l i s m o f c h o l e s t e r o l i s e n h a n c e d i n r a t s f e d p e a n u t 62 p r o t e i n d i e t s . The f i b r e c o n t e n t may be i n t e r f e r i n g w i t h t h e e n t e r o h e p a t i c c i r c u l a t i o n o f - b i l e a c i d s s i n c e t h e p e a n u t p r o t e i n was i n t h e f o r m o f a m e a l r a t h e r t h a n a p u r i f i e d p r o t e i n . T h e i m p l i c a t i o n s f o r humans c a n n o t be d r a w n d i r e c t l y f r o m t h i s s t u d y b u t i n l i g h t o f t h e r e s u l t s f r o m t h e LC d i e t g r o u p , i t seems t h a t c o m p o n e n t s o f t h i s n o n - p u r i f i e d d i e t o t h e r t h a n p r o t e i n , f a t a n d c h o l e s t e r o l a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e l a c k o f d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e p l a s m a and l i v e r c h o l e s t e r o l v a l u e s o f t h i s g r o u p a n d t h e i n i t i a l t i s s u e v a l u e s . P e r h a p s r e s e a r c h i n t h e f u t u r e w i l l f o c u s on t h e s e o t h e r c o m p o n e n t s as a means o f d i s c o v e r i n g a c u r e f o r a t h e r o s c l e r o s i s . BIBLIOGRAPHY A l l a i n , C . C . , L . S . P o o n , C . S . G . C h a n , W. R i c h m o n d , a n d P . C . Fir . 1 9 7 4 . E n z y m a t i c d e t e r m i n a t i o n o f t o t a l s e r u m c h o l e s t e r o l . C l i n . Chem. 2 0 : 4 7 0 . A n i t s c h o w , N . , a n d S . C h a l a t o w . 1 9 1 3 . U e b e r e x p e r i m e n t e l l e c h o l e s t e r i n s t e a t o s e und i h r e B e d e u t u n g f i i r d i e E n t s t e h u n g e i n i g e r p a t h o l o g i s c h e r P r o z e s s e . Z e n t r a l b l . F. a l l g . P a t h o l , u . p a t h o l . A n a t . 2 4 : 1 . A o y a m a , Y . , A . Y o s h i d a , a n d K. A s h i d a . 1 9 6 9 . E f f e c t o f d i e t a r y a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n on t h e a c c u m u l a t i o n o f l i p i d s i n t h e l i v e r o f g r o w i n g r a t s . J . N u t r . 9 7 : 3 4 8 . B e s t , C . H . , R. G r a n t , a n d J . H . R i d o u t . 1 9 3 6 . The " l i p o t r o p i c " e f f e c t o f d i e t a r y p r o t e i n . J . P h y s i o l . 8 6 : 3 3 7 . C a n a d a . S t a t i s t i c s C a n a d a . 1 9 7 6 . D e a t h s by c a u s e , age a n d s e x . V i t a l S t a t i s t i c s a n d D i s e a s e R e g i s t r i e s S e c t i o n , H e a l t h D i v i s i o n . C a n t w e l l , J . D . M o d e r n C a r d i o l o g y . B o s t o n : B u t t e r w o r t h , 1 9 7 7 . C a r l s o n , S . E . , a n d S . G o l d f a r b . 1 9 7 7 . A s e n s i t i v e e n z y m a t i c m e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f f r e e a n d e s t e r i f i e d t i s s u e c h o l e s t e r o l . C l i n . C h i m . A c t a 7 9 : 5 7 5 . C a r r o l l , K . K . 1 9 7 1 . P l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s a n d l i v e r c h o l e s t e r o l b i o s y n t h e s i s i n r a b b i t s f e d c o m m e r c i a l o r s e m i s y n t h e t i c d i e t s w i t h a n d w i t h o u t a d d e d f a t s o r o i l s . A t h e r o s c l e r o s i s 1 3 : 6 7 . C a r r o l l , K . K . 1 9 7 8 a . D i e t a r y p r o t e i n i n r e l a t i o n t o p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s a n d a t h e r o s c l e r o s i s . N u t r . R e v . 3 6 : 1 . C a r r o l l , K . K . 1 9 7 8 b . The r o l e o f d i e t a r y p r o t e i n i n h y p e r c h o l e s t e r o l e m i a a n d a t h e r o s c l e r o s i s . L i p i d s 1 3 : 3 6 0 . C a r r o l l , K . K . , a n d R . M . G . H a m i l t o n . 1 9 7 5 . E f f e c t s o f d i e t a r y p r o t e i n a n d c a r b o h y d r a t e on p l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s i n r e l a t i o n t o a t h e r o -s c l e r o s i s . J . Food S c i e n c e 4 0 : 8 . C h a i k o f f , I . L . , C . W . N i c h o l s , j r . , W. G a f f e y , a n d S . L i n d s a y . 1 9 6 1 . The e f f e c t o f d i e t a r y p r o t e i n l e v e l on t h e d e v e l o p m e n t o f n a t u r a l l y -o c c u r r i n g a o r t i c a t h e r o s c l e r o s i s i n t h e c h i c k e n . J . A t h e r o s c l e r o s i s R e s . 1 : 4 6 1 . C h a n n o n , H . J . , M . C . M a n i f o l d , and A . P . P i a t t . 1 9 3 8 . The a c t i o n o f c y s t i n e and m e t h i o n i n e on l i v e r f a t d e p o s i t i o n . B i o c h e m . J . 3 2 : 9 6 9 . C l a r k s o n , S . , a n d L . H . N e w b u r g h . 1 9 2 6 . The r e l a t i o n s h i p b e t w e e n a t h e r o s c l e r o s i s a n d i n g e s t e d c h o l e s t e r o l i n t h e r a b b i t . J . E x p . M e d . 4 3 : 5 9 5 . 6 3 6 4 C l a r k s o n , T . B . , R.W. P r i c h a r d , H . B . L o f l a n d , j r . , a n d H . O . Goodman. 1 9 6 2 . I n t e r a c t i o n s b e t w e e n d i e t a r y f a t , p r o t e i n , a n d c h o l e s t e r o l i n a t h e r o s c l e r o s i s - s u s c e p t i b l e p i g e o n s : e f f e c t s on c o r o n a r y a t h e r o s c l e r o s i s . C i r c . R e s . 1 1 : 4 0 0 . C o n n o r , W . E . , a n d S . L . C o n n o r . 1 9 7 2 . The k e y r o l e o f n u t r i t i o n a l f a c t o r s i n t h e p r e v e n t i o n o f c o r o n a r y h e a r t d i s e a s e . P r e v . M e d . 1 : 4 9 . de G r o o t , A . P . 1 9 5 9 . D i e t a r y p r o t e i n a n d s e r u m c h o l e s t e r o l i n r a t s . N a t u r e 1 8 4 : 9 0 3 . D u f f , G . L . 1 9 3 5 . E x p e r i m e n t a l c h o l e s t e r o l a t h e r o s c l e r o s i s a n d i t s r e l a t i o n s h i p t o human a r t e r i o s c l e r o s i s . A r c h . P a t h . 2 0 : 8 1 . F i l l i o s , L . C . , S . B . A n d r u s , G . V . M a n n , a n d F . J . S t a r e . 1 9 5 6 . E x p e r i -m e n t a l p r o d u c t i o n o f g r o s s a t h e r o s c l e r o s i s i n t h e r a t . J . E x p . M e d . 1 0 4 : 5 3 9 . F i l l i o s , L . C . , a n d G . V . M a n n . 1 9 5 4 . I n f l u e n c e o f s u l f u r a m i n o a c i d d e f i c i e n c y on c h o l e s t e r o l m e t a b o l i s m . M e t a b o l i s m 3 : 1 6 . F i l l i o s , L . C . , C . N a i t o , S . B . A n d r u s , O.W. P o r t m a n , a n d R . S . M a r t i n . 1 9 5 8 . V a r i a t i o n s i n c a r d i o v a s c u l a r s u d a n o p h i l i a w i t h c h a n g e s i n t h e d i e t a r y l e v e l o f p r o t e i n . Am. J . P h y s i o l . 1 9 4 : 2 7 5 . F r a n t z , I . D . , j r . , H . S . S c h n e i d e r , a n d B . T . H i n k e l m a n . 1 9 5 4 . S u p p r e s -s i o n o f h e p a t i c c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s i n t h e r a t by c h o l e s t e r o l f e e d i n g . J . B i o l . Chem. 2 0 6 : 4 6 5 . H a m i l t o n , R . M . G . , a n d K . K . C a r r o l l . 1 9 7 6 . P l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s i n r a b b i t s f e d l o w f a t , l o w c h o l e s t e r o l d i e t s : e f f e c t s o f d i e t a r y p r o t e i n s , c a r b o h y d r a t e a n d f i b r e f r o m d i f f e r e n t s o u r c e s . A t h e r o -s c l e r o s i s 2 4 : 4 7 . H a r d i n g e , M . G . , a n d F . J . S t a r e . 1 9 5 4 . N u t r i t i o n a l s t u d i e s o f v e g e t a r i a n s 2 . d i e t a r y a n d s e r u m l e v e l s o f c h o l e s t e r o l . J . C l i n . N u t r . 2 : 8 3 . H a r p e r , A . E . 1 9 5 8 . N u t r i t i o n a l f a t t y l i v e r s i n r a t s . Am. J . C l i n . N u t r . 6 : 2 4 2 . H e v i a , P . , a n d W . J . V i s e k . 1 9 7 9 . D i e t a r y p r o t e i n a n d p l a s m a c h o l e s t e r o l i n c h i c k e n s . J . N u t r . 1 0 9 : 3 2 . H o d g e s , R . E . , W . A . K r e h l , D . B . S t o n e , a n d A . L o p e z . 1 9 6 7 . D i e t a r y c a r b o h y d r a t e s a n d l o w c h o l e s t e r o l d i e t s : e f f e c t s on s e r u m l i p i d s o f m a n . Am. J . C l i n . N u t r . 2 0 : 1 9 8 . H o w a r d , A . N . , G . A . G r e s h a m , D. J o n e s , a n d I . W . J e n n i n g s . 1 9 6 5 . The p r e v e n t i o n o f r a b b i t a t h e r o s c l e r o s i s by s o y a b e a n m e a l . J . A t h e r o -s c l e r o s i s R e s . 5 : 3 3 0 . 65 H u f f , M . W . , R . M . G . H a m i l t o n , a n d K . K . C a r r o l l . 1 9 7 7 . P l a s m a c h o l e s t e r o l l e v e l s i n r a b b i t s f e d l o w - f a t , c h o l e s t e r o l - f r e e , s e m i p u r i f i e d d i e t s : e f f e c t s o f d i e t a r y p r o t e i n s , p r o t e i n h y d r o l y s a t e s a n d a m i n o a c i d m i x t u r e s . A t h e r o s c l e r o s i s 2 8 : 1 8 7 . I g n a t o w s k i , A . 1 9 0 8 . I n f l u e n c e de l a n o u r r i t u r e a n i m a l e s u r 1 ' o r g a n i s m e d e s l a p i n s . A r c h . M e d . E x p . A n a t . P a t h o l . 2 0 : 1 . J o h n s o n , D . , j r . , G . A . L e v e i l l e , a n d H . F i s h e r . 1 9 5 8 . I n f l u e n c e o f a m i n o a c i d d e f i c i e n c i e s a n d p r o t e i n l e v e l on t h e p l a s m a c h o l e s t e r o l o f t h e c h i c k . J . N u t r . 6 6 : 3 6 7 . J o n e s , R . J . , a n d S . H u f f m a n . 1 9 5 6 . C h r o n i c e f f e c t o f d i e t a r y p r o t e i n on h y p e r c h o l e s t e r e m i a i n t h e r a t . P r o c . S o c . E x p e r . B i o l . M e d . 9 3 : 5 1 9 . J o n e s , R . J . , R.W. W i s s l e r , and S . H u f f m a n . 1 9 5 7 . C e r t a i n d i e t a r y e f f e c t s on t h e s e r u m c h o l e s t e r o l a n d a t h e r o g e n e s i s i n t h e r a t . A r c h . P a t h . 6 3 : 5 9 3 . K a n n e l , W . B . , W . P . C a s t e l l i , a n d T . G o r d o n . 1 9 7 9 . C h o l e s t e r o l i n t h e p r e d i c t i o n o f a t h e r o s c l e r o t i c d i s e a s e : new p e r s p e c t i v e s b a s e d on t h e F r a m i n g h a m S t u d y . A n n . I n t . M e d . 9 0 : 8 5 . K e y s , A . , a n d J . T . A n d e r s o n . 1 9 5 7 . D i e t a r y p r o t e i n a n d t h e s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l i n m a n . Am. J . C l i n . N u t r . 5 : 2 9 . K o k a t n u r , M . G . , a n d F . A . Kummerow. 1 9 6 1 . A m i n o a c i d i m b a l a n c e a n d c h o l e s t e r o l l e v e l s i n c h i c k s . J . N u t r . 7 5 : 3 1 9 . K o k a t n u r , M . G . , N . T . R a n d , F . A . Kummerow, a n d H . M . S c o t t . 1 9 5 8 . E f f e c t o f d i e t a r y p r o t e i n a n d f a t on c h a n g e s i n s e r u m c h o l e s t e r o l i n m a t u r e b i r d s . J . N u t r . 6 4 : 1 7 7 . K r i t c h e v s k y , D. 1 9 6 4 . E x p e r i m e n t a l a t h e r o s c l e r o s i s i n r a b b i t s f e d c h o l e s t e r o l - f r e e d i e t s . J . A t h e r o s c l e r o s i s R e s . 4 : 1 0 3 . K r i t c h e v s k y , D. 1 9 7 6 . D i e t a n d a t h e r o s c l e r o s i s . Am. J . P a t h . 8 4 : 3 . K r i t c h e v s k y , D . , a n d S . A . T e p p e r . 1 9 6 8 . E x p e r i m e n t a l a t h e r o s c l e r o s i s i n r a b b i t s f e d c h o l e s t e r o l - f r e e d i e t s : i n f l u e n c e o f chow c o m -p o n e n t s . J . A t h e r o s c l e r o s i s R e s . 8 : 3 5 7 . L a m b e r t , G . F . , J . P . M i l l e r , R . T . O l s e n , a n d D . V . F r o s t . 1 9 5 8 . H y p e r -c h o l e s t e r e m i a a n d a t h e r o s c l e r o s i s i n d u c e d i n r a b b i t s by p u r i f i e d h i g h f a t r a t i o n s d e v o i d o f c h o l e s t e r o l . P r o c . S o c . E x p . M e d . B i o l . 9 7 : 5 4 4 . L e v e i l l e , G . A . , A . S . F e i g e n b a u m , a n d H. F i s h e r . 1 9 6 0 . The e f f e c t o f d i e t a r y p r o t e i n , f a t a n d c h o l e s t e r o l on p l a s m a c h o l e s t e r o l a n d s e r u m p r o t e i n c o m p o n e n t s o f t h e g r o w i n g c h i c k . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 8 6 : 6 7 . 66 L e v e i l l e , G . A . , a n d H . F i s h e r . 1 9 5 8 . P l a s m a c h o l e s t e r o l i n g r o w i n g c h i c k e n s a s i n f l u e n c e d by d i e t a r y p r o t e i n a n d f a t . P r o c . S o c . E x p . M e d . B i o l . 9 8 : 6 3 0 . L e v e i l l e , G . A . , a n d H . E . S a u b e r l i c h . 1 9 6 1 . I n f l u e n c e o f d i e t a r y p r o t e i n l e v e l on s e r u m p r o t e i n c o m p o n e n t s a n d c h o l e s t e r o l i n t h e g r o w i n g c h i c k . J . N u t r . 7 4 : 5 0 0 . L e v e i l l e , G . A . , a n d H . E . S a u b e r l i c h . 1 9 6 4 . P l a s m a a n d l i v e r l i p i d s o f m i c e a s i n f l u e n c e d by d i e t a r y p r o t e i n a n d s u l f u r - c o n t a i n i n g a m i n o a c i d s . J . N u t r . 8 4 : 1 0 . L e v e i l l e , G . A . , H . E . S a u b e r l i c h , R . C . P o w e l l , a n d W . T . N u n e s . 1 9 6 2 . T h e i n f l u e n c e o f d i e t a r y p r o t e i n s on p l a s m a l i p i d s i n human s u b -j e c t s . J . C l i n . I n v e s t . 4 1 : 1 0 0 7 . L e v e i l l e , G . A . , J . W . S h o c k l e y , a n d H . E . S a u b e r l i c h . 1 9 6 2 . I n f l u e n c e o f d i e t a r y p r o t e i n l e v e l a n d a m i n o a c i d s on p l a s m a c h o l e s t e r o l o f t h e g r o w i n g c h i c k . J . N u t r . 7 6 : 3 2 1 . L i t t l e , J . M . , and E . A . A n g e l ! . 1 9 7 7 . D i e t a r y p r o t e i n l e v e l a n d e x p e r i -m e n t a l a o r t i c a t h e r o s c l e r o s i s . A t h e r o s c l e r o s i s 2 6 : 1 7 3 . L o f l a n d , H . B . , j r . , T . B . C l a r k s o n , a n d H . O . Goodman. 1 9 6 1 . I n t e r a c t i o n s among d i e t a r y f a t , p r o t e i n a n d c h o l e s t e r o l i n a t h e r o s c l e r o s i s -s u s c e p t i b l e p i g e o n s : e f f e c t s o n s e r u m c h o l e s t e r o l a n d a o r t i c a t h e r o s c l e r o s i s . C i r c . R e s . 9 : 9 1 9 . M a l m r o s , H . , a n d G. W i g a n d . 1 9 5 9 . A t h e r o s c l e r o s i s a n d d e f i c i e n c y o f e s s e n t i a l f a t t y a c i d s . L a n c e t 1 1 : 7 4 9 . M a n n , G . V . , S . B . A n d r u s , A . M c N a l l y , a n d F . J . S t a r e . 1 9 5 3 . E x p e r i -m e n t a l a t h e r o s c l e r o s i s i n C e b u s m o n k e y s . J . E x p . M e d . 9 8 : 1 9 5 . M a r x , J . L . 1 9 7 6 . C a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e a n d t h e f o r m i t t a k e s . S c i e n c e 1 9 4 : 5 1 1 . M e e k e r , D . R . , a n d H . D . K e s t e n . 1 9 4 0 . E x p e r i m e n t a l a t h e r o s c l e r o s i s a n d h i g h p r o t e i n d i e t s . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 4 5 : 5 4 3 . M e e k e r , D . R . , and H . D . K e s t e n . 1 9 4 1 . E f f e c t o f h i g h p r o t e i n d i e t s on e x p e r i m e n t a l a t h e r o s c l e r o s i s o f r a b b i t s . A r c h . P a t h . 3 1 : 1 4 7 . Me"ndez, J . 1 9 6 4 . E f f e c t o f d i e t a r y p r o t e i n l e v e l a n d c h o l e s t e r o l s u p p l e m e n t a t i o n p r i o r t o a c u t e s t a r v a t i o n on s e r u m a n d l i v e r l i p i d s i n t h e r a t . M e t a b o l i s m 1 3 : 6 6 9 . M i d d l e t o n , C . C , T . B . C l a r k s o n , H . B . L o f l a n d , j r . , a n d R.W. P r i c h a r d . 1 9 6 7 . D i e t a n d a t h e r o s c l e r o s i s o f s q u i r r e l m o n k e y s . A r c h . P a t h . 8 3 : 1 4 5 . M o r r i s , M . D . , a n d I . L . C h a i k o f f . 1 9 5 9 . The o r i g i n o f c h o l e s t e r o l i n l i v e r , s m a l l i n t e s t i n e , a d r e n a l g l a n d a n d t e s t i s o f t h e r a t : d i e t a r y v e r s u s e n d o g e n o u s c o n t r i b u t i o n s . J . B i o l . Chem. 2 3 4 : 1 0 9 5 . 67 M o y e r , A . W . , D. K r i t c h e v s k y , J . B . L o g a n , and H . R . C o x . 1 9 5 6 . D i e t a r y p r o t e i n a n d s e r u m c h o l e s t e r o l i n r a t s . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 9 2 : 7 3 6 . M u n o z , J . M . , H . H . S a n d s t e a d , R . A . J a c o b , G . M . L o g a n , j r . , S . J . R e c k , L . M . K l e v a y , F . R . D i n t z i s , G . E . I n g l e t t , a n d W . C . S h u e y . 1 9 7 9 . E f f e c t s o f some c e r e a l b r a n s a n d t e x t u r e d v e g e t a b l e p r o t e i n on p l a s m a l i p i d s . Am. J . C l i n . N u t r . 3 2 : 5 8 0 . M u n r o , H . N . , M . H . S t e e l e , and W. F o r b e s . 1 9 6 5 . E f f e c t o f d i e t a r y p r o t e i n l e v e l on d e p o s i t i o n o f c h o l e s t e r o l i n t h e t i s s u e s o f t h e c h o l e s t e r o l - f e d r a b b i t . B r . J . E x p . P a t h . 4 6 : 4 8 9 . M u s t a r d , J . F . , J . A . L i t t l e , L. H o r l i c k , J . D a v i g n o n , M.W. S p e n c e , a n d K. C h r i s t i e . 1 9 7 6 . M u s t a r d R e p o r t : R e p o r t o f t h e c o m m i t t e e on d i e t a n d c a r d i o v a s c u l a r d i s e a s e . H e a l t h a n d W e l f a r e C a n a d a . N a t h , N . , A . E . H a r p e r , a n d C A . E l v e h j e m . 1 9 5 8 . D i e t a r y p r o t e i n a n d s e r u m c h o l e s t e r o l . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 7 7 : 2 3 4 . N a t h , N . , J . C . S e i d e l , a n d A . E . H a r p e r . 1 9 6 1 . D i e t a n d c h o l e s t e r o l e m i a : VI c o m p a r a t i v e e f f e c t s o f w h e a t g l u t e n l i p i d s a n d some o t h e r l i p i d s i n p r e s e n c e o f a d e q u a t e a n d i n a d e q u a t e d i e t a r y p r o t e i n . J . N u t r . 7 4 : 3 8 9 . N e w b u r g h , L . H . , a n d S . C l a r k s o n . 1 9 2 3 . T h e p r o d u c t i o n o f a t h e r o s c l e r o s i s i n r a b b i t s by f e e d i n g d i e t s h i g h i n m e a t . A r c h . I n t . M e d . 3 1 : 6 5 3 . N e w b u r g h , L . H . , a n d T . L . S q u i e r . 1 9 2 0 . H i g h p r o t e i n d i e t s a n d a t h e r o -s c l e r o s i s i n r a b b i t s : a p r e l i m i n a r y r e p o r t . A r c h . I n t . M e d . 2 6 : 3 8 . N i c o l o s i , R . J . , J . L . H o j n a c k i , N. L l a n s a , a n d K . C . H a y e s . 1 9 7 7 . D i e t a n d l i p o p r o t e i n i n f l u e n c e on p r i m a t e a t h e r o s c l e r o s i s . P r o c . S o c . E x p . B i o l . M e d . 1 5 6 : 1 . N i e , N . H . , C . H . H u l l , J . G . J e n k i n s , K. S t e i n b r e n n e r , a n d D . H . B e n t . S t a t i s t i c a l P a c k a g e f o r t h e S o c i a l S c i e n c e s . New Y o r k : M c G r a w -H i l l , 1 9 7 5 . N i s h i d a , T . , F. T a k e n a k a , a n d F . A . Kummerow. 1 9 5 8 . E f f e c t o f d i e t a r y p r o t e i n a n d h e a t e d f a t on s e r u m c h o l e s t e r o l a n d 3 - 1 i p o p r o t e i n l e v e l s , a n d on t h e i n c i d e n c e o f e x p e r i m e n t a l a t h e r o s c l e r o s i s i n c h i c k s . C i r c . R e s . 6 : 1 9 4 . N i s h i d a , T . , F. T a k e n a k a , N . T . R a n d , a n d F . A . Kummerow. 1 9 5 6 . D i e t a r y p r o t e i n , a p o s s i b l e p r o t e c t i v e f a c t o r a g a i n s t a t h e r o s c l e r o s i s . C i r c u l a t i o n 1 4 : 4 8 9 . N i s h i d a , T . , A . U e n o , and F . A . Kummerow. 1 9 6 0 . E f f e c t o f D i e t a r y P r o t e i n on t h e M e t a b o l i s m o f Na a c e t a t e - l - l l * C i n c h i c k s . J . N u t r . 7 1 : 3 7 9 . O l s o n , R . E . , J . R . J a b l o n s k i , a n d E. T a y l o r . 1 9 5 8 . The e f f e c t o f d i e t a r y p r o t e i n , f a t , a n d c h o l i n e u p o n t h e s e r u m l i p i d s a n d l i p o p r o t e i n s o f t h e r a t . Am. J . C l i n . N u t r . 6 : 1 1 . 6 8 O l s o n , R . E . , J . W . V e s t e r , D. G u r s e y , a n d D. L o n g m a n . 1 9 5 7 . E f f e c t o f • l o w - p r o t e i n d i e t s u p o n s e r u m c h o l e s t e r o l i n m a n . J . C l i n . I n v e s t . 3 6 : 9 1 7 . P o r t m a n , O . W . , a n d G . V . M a n n . 1 9 5 5 . The d i s p o s i t i o n o f t a u r i n e - S 3 6 a n d t a u r o c h o l a t e - S 3 e i n t h e r a t : d i e t a r y i n f l u e n c e s . J . B i o l . Chem. 2 1 3 : 7 3 3 . R e n a u d , S . , a n d A l l a r d , C . 1 9 6 4 . E f f e c t o f d i e t a r y p r o t e i n l e v e l on c h o l e s t e r o l e m i a , t h r o m b o s i s , a t h e r o s c l e r o s i s a n d h y p e r t e n s i o n i n t h e r a t . J . N u t r . 8 3 : 1 4 9 . R i c k m a n , F . , N . M i t c h e l l , J . D i n g m a n , a n d J . E . D a l e n . 1 9 7 4 . C h a n g e s i n s e r u m c h o l e s t e r o l d u r i n g t h e S t i l l m a n d i e t . J . Am. M e d . A s s o c . 2 2 8 : 5 4 . S e i d e l , J . C , N. N a t h , and A . E . H a r p e r . 1 9 6 0 . D i e t a n d c h o l e s t e r o l e m i a : V e f f e c t s o f s u l p h u r - c o n t a i n i n g a m i n o a c i d s a n d p r o t e i n . J . L i p i d R e s . 1 : 4 7 4 . S i p e r s t e i n , M . D . , a n d M . J . G u e s t . 1 9 6 0 . S t u d i e s o n t h e s i t e o f t h e f e e d b a c k c o n t r o l o f c h o l e s t e r o l s y n t h e s i s . J . C l i n . I n v e s t . 3 9 : 6 4 2 . S i r t o r i , C . R . , E . A g r a d i , F. C o n t i , 0 . M a n t e r o , a n d E. G a t t i . 1 9 7 7 . S o y b e a n p r o t e i n d i e t i n t h e t r e a t m e n t o f T y p e I I h y p e r l i p o p r o t e i n e m i a . L a n c e t 1 : 2 7 5 . S r i n i v a s a n , S . R . , B . R a d h a k r i s h n a m u r t h y , E . R . D a l f e r e s , a n d G . S . B e r e n s o n . 1 9 7 9 . S e r u m a - l i p o p r o t e i n r e s p o n s e s t o v a r i a t i o n s i n d i e t a r y c h o l e s t e r o l , p r o t e i n a n d c a r b o h y d r a t e i n d i f f e r e n t n o n - h u m a n p r i m a t e s p e c i e s . L i p i d s 1 4 : 5 5 9 . S r i n i v a s a n , S . R . , B . R a d h a k r i s h n a m u r t h y , C . C . S m i t h , R . H . W o l f , a n d G . S . B e r e n s o n . 1 9 7 6 . S e r u m l i p i d a n d l i p o p r o t e i n r e s p o n s e s o f s i x n o n - h u m a n p r i m a t e s p e c i e s t o d i e t a r y c h a n g e s i n c h o l e s t e r o l l e v e l s . J . N u t r . 1 0 6 : 1 7 5 7 . S r i n i v a s a n , S . R . , B . R a d h a k r i s h n a m u r t h y , L . S . W e b b e r , E . R . D a l f e r e s , M . G . K o k a t n u r , a n d G . S . B e r e n s o n . 1 9 7 8 . S y n e r g i s t i c e f f e c t s o f d i e t a r y c a r b o h y d r a t e a n d c h o l e s t e r o l o n s e r u m l i p i d s a n d l i p o -p r o t e i n s i n s q u i r r e l and s p i d e r m o n k e y s . Am. J . C l i n . N u t r . 3 1 : 6 0 3 . S t a m l e r , J . , R. P i c k , a n d L . N . K a t z . 1 9 5 8 a . E f f e c t s o f d i e t a r y p r o t e i n s , m e t h i o n i n e and v i t a m i n s on p l a s m a l i p i d s a n d a t h e r o g e n e s i s i n c h o l e s t e r o l - f e d c o c k e r e l s . C i r c . R e s . 6 : 4 4 2 . S t a m l e r , J . , R. P i c k , a n d L . N . K a t z . 1 9 5 8 b . E f f e c t s o f d i e t a r y p r o t e i n a n d c a r b o h y d r a t e l e v e l o n c h o l e s t e r o l e m i a a n d a t h e r o g e n e s i s i n c o c k e r e l s on a h i g h - f a t , h i g h - c h o l e s t e r o l m a s h . C i r c . R e s . 6 : 4 4 7 . S t r o n g , J . P . , a n d H . C M c G i l l , j r . 1 9 6 7 . D i e t a n d e x p e r i m e n t a l a t h e r o -s c l e r o s i s i n b a b o o n s . Am. J . P a t h . 5 0 : 6 6 9 . 69 S t u c k e y , N.W. 1 9 1 1 . U e b e r d i e V e r a n d e r u n g e n d e r K a n i n c h e n a o r t a u n t e r d e r W i r k u n g r e i c h l i c h e r t i e n s c h e r N a h n u n g . C e n t r a l b l . F. a l 1 g . P a t h o l , u . p a t h o l . A n a t . 2 2 : 3 7 9 . S u g a n o , M . , T . F u j i k a w a , Y . H i r a t s u j i , a n d Y . H a s e g a w a . 1 9 7 8 . H y p o -c h o l e s t e r o l e m i c e f f e c t s o f c h i t o s a n i n c h o l e s t e r o l - f e d r a t s . N u t r . R e p . I n t . 1 8 : 5 3 1 . T r i p a t h y , K . , H . L o t e r o , a n d 0 . B o l a n o s . 1 9 7 0 . R o l e o f d i e t a r y p r o t e i n upon s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l i n m a l n o u r i s h e d s u b j e c t s . Am. J . C l i n . N u t r . 2 3 : 1 1 6 0 . T u c k e r , H . F . , a n d H . C . E c k s t e i n . 1 9 3 7 . The e f f e c t o f s u p p l e m e n t a r y m e t h i o n i n e a n d c y s t i n e on t h e p r o d u c t i o n o f f a t t y l i v e r s by d i e t . J . B i o l . Chem. 1 2 1 : 4 7 9 . W a c k e r , L . , a n d W. H u e c k . 1 9 1 3 . U e b e r e x p e r i m e n t e l l e A t h e r o s k l e r o s e und C h o l e s t e r i n a m i e . M u n c h e n . m e d . W e h n s c h r . 6 0 : 2 0 9 7 . W a l k e r , G . R . , E . H . M o r s e , a n d V . A . O v e r l e y . 1 9 6 0 . The e f f e c t o f a n i m a l p r o t e i n a n d v e g e t a b l e p r o t e i n h a v i n g t h e same f a t c o n t e n t on t h e s e r u m l i p i d l e v e l s o f y o u n g women. J . N u t r . 7 2 : 3 1 7 . W e s t , R . O . , a n d O . B . H a y e s . 1 9 6 8 . D i e t a n d s e r u m c h o l e s t e r o l l e v e l s : a c o m p a r i s o n b e t w e e n v e g e t a r i a n s a n d n o n - v e g e t a r i a n s i n a S e v e n t h -Day A d v e n t i s t g r o u p . Am. J . C l i n . N u t r . 2 1 : 8 5 3 . W o r l d H e a l t h O r g a n i z a t i o n , 1 9 7 4 . A n n u a l G l o b a l D a t a on M o r t a l i t y , 1 9 7 2 . W o r l d H e a l t h S t a t i s t i c s R e p o r t . V o l . 2 7 . Y a d a v , N . R . , a n d I . E . L i e n e r . 1 9 7 7 . R e d u c t i o n o f s e r u m c h o l e s t e r o l i n r a t s f e d v e g e t a b l e p r o t e i n o r an e q u i v a l e n t a m i n o a c i d m i x t u r e . N u t r . R e p . I n t . 1 6 : 3 8 5 . Y e r u s h a l m y , J . , a n d H . E . H i l l e b o e . 1 9 5 7 . F a t i n t h e d i e t and m o r t a l i t y f r o m h e a r t d i s e a s e . N . Y . S t a t e J . M e d . 5 7 : 2 3 4 3 . Y u d k i n , J . 1 9 5 7 . D i e t a n d c o r o n a r y t h r o m b o s i s : h y p o t h e s i s a n d f a c t . L a n c e t 1 1 : 1 5 5 . 

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