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The characterization of the aerobic-thermophilic degradation of potato wastes Yee, Sherman Jack 1980

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T H E C H A R A C T E R I Z A T I O N O F T H E A E R O B I C -T H E R M O P H I L I C D E G R A D A T I O N O F P O T A T O W A S T E S b y S H E R M A N J A C K Y E E B . S c . , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1 9 7 1 S c . ( A g r . ) , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1 9 7 A T H E S I S S U B M I T T E D I N P A R T I A L F U L F I L L M E N T O F T H E R E Q U I R E M E N T S F O R T H E D E G R E E O F M A S T E R O F S C I E N C E i n T H E F A C U L T Y O F G R A D U A T E S T U D I E S D e p a r t m e n t o f F o o d S c i e n c e We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d T H E U N I V E R S I T Y O F B R I T I S H C O L U M B I A A P R I L , 1 9 8 0 © S h e r m a n J a c k Y e e , 1 9 8 0 In presenting this thesis in partial fulfilment of the requirements for an advanced degree at the University of Brit ish Columbia, I agree that the Library shall make i t freely available for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of this thesis for scholarly purposes may be granted by the Head of my Department or by his representatives. It is understood that copying or publication of this thesis for financial gain shall not be allowed without my written permission. Department The University of Brit ish Columbia 2075 Wesbrook Place Vancouver, Canada V6T 1W5 B P 75-51 1 E ABSTRACT F e a s i b i l i t y of the b i o d e g r a d a t i o n of n e u t r a l i z e d -c a u s t i c potato p e e l waste by a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c fermenta-t i o n was examined. Fermentation temperature, pH, r a t e of s o l i d s u t i l i z a t i o n , d i s s o l v e d oxygen and t o t a l o r g a n i c n i t r o g e n were c h a r a c t e r i z e d with r e s p e c t to the fermentation p r o c e s s . Examination of these parameters showed d i s t i n c t c h a r a c t e r i s t i c behaviour, though the parameter magnitude v a r i e d between the t r i a l s . The n a t u r a l l y o c c u r r i n g f l o r a of t h e r m o p h i l i c microorganisms of the potato was s u f f i c i e n t as an inoculum, with t h e i r propagation c r e a t i n g the fermen-t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s . The s o l i d s content of the potato waste was reduced by the t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n with a n o t i c e a b l e improve-ment i n the n i t r o g e n content i n the remaining r e s i d u e . P r o t e i n and amino a c i d analyses supported the f e a s i b i l i t y of u s i n g the remaining r e s i d u e as animal feed. Increases i n the n i t r o g e n content of the sub-s t r a t e was assumed to be due to the c o n v e r s i o n of atmos-p h e r i c n i t r o g e n by n i t r o g e n - f i x i n g microorganisms w i t h i n the f e r m e n t a t i o n . M i c r o b i a l i d e n t i f i c a t i o n i n d i c a t e d that these organisms belonged to the s p e c i e s B a c i l l u s coagulans. No s t r a i n s w i t h i n t h i s s p e c i e s have been p r e v i o u s l y r e p o r t e d to f i x atmospheric n i t r o g e n . i i I t was concluded that an a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c fermentation can be u t i l i z e d as a waste treatment process f o r c a u s t i c potato p e e l waste. Besides the numerous advantages of an a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n , the v a l i d i t y f o r the u t i l i z a t i o n of t h i s f e r m e n t a t i o n process i n the treatment of potato p e e l waste i s the near t o t a l d i s p o s a l of the waste. i i i T A B L E O F C O N T E N T S P a g e I N T R O D U C T I O N 1 L I T E R A T U R E R E V I E W 7 I. T h e r m o p h i l i c B a c t e r i a 7 I I . A p p l i c a t i o n o f t h e A e r o b i c - T h e r m o p h i l i c B a c t e r i a 9 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S , , . 1 3 I . A n a l y s e s o f t h e C a u s t i c S o d a P o t a t o P e e l W a s t e s 1 3 1 . T o t a l K j e l d a h l N i t r o g e n D e t e r m i n a t i o n 1 3 2 . T o t a l C a r b o n a n d I n o r g a n i c C a r b o n D e t e r m i n a t i o n 1 3 3 . T o t a l P h o s p h o r u s D e t e r m i n a t i o n 1 6 4 . T o t a l S o d i u m D e t e r m i n a t i o n 1 7 5 . A s h D e t e r m i n a t i o n 1 9 6 . S o l i d s D e t e r m i n a t i o n 1 9 7 . M e a s u r e m e n t o f t h e p H o f t h e P l a n t S a m p l e s 1 9 I I . C o n s t r u c t i o n o f t h e F e r m e n t a t i o n S y s t e m . . 2 0 1 . C o n s t r u c t i o n o f t h e F e r m e n t e r C e l l s 2 0 2 . T o p A s s e m b l y f o r F e r m e n t e r C e l l s . . . . 2 0 3 . S y s t e m f o r S u b s t r a t e A g i t a t i o n 2 2 4 . B a f f l e s 2 8 5 . T h e P o w e r T r a i n f o r t h e A g i t a t o r . . . . 2 9 i v P a g e 6 . A e r a t i o n S y s t e m 3 1 7 . F l o w M e t e r s . 3 3 8 . S p a r g e r C o n s t r u c t i o n 3 3 9 . T u b i n g C o n n e c t i o n s 3 5 1 0 . M o n i t o r i n g 3 7 1 1 . C a l i b r a t i o n o f t h e T h e r m o c o u p l e s 3 7 1 2 . L o c a t i o n o f t h e S y s t e m 4 0 I I I . . . M e a s u r e m e n t s o f t h e S y s t e m C o n s t r u c t e d . . . 4 2 1 . M e c h a n i c a l H e a t I n p u t D e t e r m i n a t i o n . . 4 2 2 . M e c h a n i c a l H e a t I n p u t D e t e r m i n a t i o n i n t h e A b s e n c e o f A i r S p a r g i n g 4 2 3 . A d j u s t m e n t s 4 3 4 . M e c h a n i c a l H e a t I n p u t D e t e r m i n a t i o n i n t h e P r e s e n c e o f P o t a t o S o l i d s 4 3 5 . H e a t L o s t f r o m t h e F e r m e n t e r C e l l . . . . 4 4 6 . H e a t L o s s D e t e r m i n a t i o n i n t h e P r e s e n c e o f S u r f a c e F o a m 4 4 I V . A n a l y s e s o f t h e T h e r m o p h i l i c F e r m e n t a t i o n . 4 5 1 . T h e P o t a t o S u b s t r a t e 4 5 2 . S a n i t a t i o n o f t h e F e r m e n t e r V e s s e l a n d A c c e s s o r i e s P r i o r t o O p e r a t i o n 4 6 3 . M e a s u r e m e n t s T a k e n f r o m t h e F e r -m e n t a t i o n T r i a l s 4 6 i ) T e m p e r a t u r e s 4 6 v P a g e i i ) D i s s o l v e d O x y g e n a n d p H 4 7 i i i ) T o t a l S o l i d s R e m a i n i n g i n t h e F e r m e n t e r a n d T o t a l K j e l d a h l N i t r o g e n 4 7 V . " T r u e " P r o t e i n N i t r o g e n U s i n g T r i c h l o r o -a c e t i c A c i d ( T C A ) P r e c i p i t a t i o n 4 9 V I . A m i n o A c i d A n a l y s i s 5 0 V I I . M i c r o b i a l I d e n t i f i c a t i o n 5 1 1 . P r e p a r a t i o n o f I s o l a t i o n M e d i a , f o r N -F i x i n g B a c t e r i a 5 1 . i ) Y e a s t C a r b o n B a s e ( Y C B ) M e d i u m . 51 . i i ) N i t r o g e n F i x a t i o n M e d i u m f o r N o n - S y m b i o t i c S o i l M i c r o -o r g a n i s m s 5 1 i i i ) N i t r o g e n - F i x i n g M e d i u m f o r G e n e r a A z o t o b a c t e r a n d B e i j e r i n c k i a i n S o i l 5 2 2 . I s o l a t i o n o f t h e M i c r o o r g a n i s m 5 2 3 . V i s u a l A p p e a r a n c e o f t h e M i c r o b i a l C o l o n i e s 5 3 4 . G r a m R e a c t i o n 5 3 5 . S p o r e S t a i n i n g ( W i r t z - C o n k l i n ) 5 3 6 . L i p i d S t a i n i n g ( B u r d o n ' s M e t h o d ) . . . . 5 4 7 . M o t i l i t y 5 4 8 . C a t a l a s e R e a c t i o n 5 5 9 . A n a e r o b i c T e s t 55 v i P a g e 1 0 . O b l i g a t i v e A n a e r o b i c T e s t 5 5 1 1 . V o g e s - P r o s k a u e r T e s t ( V - P ) 5 6 1 2 . p H i n V o g e s - P r o s k a u e r B r o t h 5 6 1 3 . M e t h y l R e d T e s t 5 7 1 4 . T e m p e r a t u r e R a n g e D e t e r m i n a t i o n 5 7 1 5 . G r o w t h i n L y s o z y m e 5 8 1 6 . G r o w t h i n N a C l 5 9 1 7 . G r o w t h i n S o d i u m A z i d e 5 9 1 8 . p H R a n g e T e s t 5 9 1 9 . A c i d F o r m a t i o n f r o m C a r b o h y d r a t e S u b s t r a t e s 6 0 2 0 . S t a r c h H y d r o l y s i s 6 1 2 1 . U t i l i z a t i o n o f S o d i u m C i t r a t e a n d S o d i u m P r o p i o n a t e 6 2 2 2 . R e d u c t i o n o f N i t r a t e t o N i t r i t e 6 2 2 3 . D i h y d r o x y a c e t o n e P r o d u c t i o n 6 4 2 4 . P r o d u c t i o n o f I n d o l e 6 4 2 5 . D e a m i n a t i o n o f P h e n y l a l a n i n e 6 5 2 6 . D e c o m p o s i t i o n o f C a s e i n 6 6 2 7 . D e c o m p o s i t i o n o f T y r o s i n e 6 6 2 8 . R e a c t i o n i n L i t m u s M i l k 6 7 E X P E R I M E N T R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N 6 8 I. C o m p o s i t i o n o f t h e C a u s t i c S o d a P o t a t o P e e l W a s t e s 6 8 v i i P a g e 1 . C a r b o n - N i t r o g e n R a t i o , C a r b o n -P h o s p h o r u s R a t i o a n d M o i s t u r e C o n t e n t R e q u i r e m e n t s 6 8 2 . O t h e r F a c t o r s A f f e c t i n g t h e F e r -m e n t a t i o n o f t h e S u b s t r a t e 7 5 I I . A s s e m b l y a n d M e a s u r e m e n t s o f t h e T h e r m o p h i l i c F e r m e n t a t i o n S y s t e m 7 8 1 . C o n s t r u c t i o n o f t h e F e r m e n t a t i o n S y s t e m 7 8 2 . M e a s u r e m e n t s o f H e a t I n p u t f r o m t h e S y s t e m C o n s t r u c t e d 8 0 3 . M e a s u r e m e n t s o f H e a t L o s s f r o m t h e S y s t e m C o n s t r u c t e d 8 4 I I I . R e s u l t s o f t h e A e r o b i c - T h e r m o p h i l i c F e r -m e n t a t i o n s o f P o t a t o W a s t e s 8 7 1 . C o n t r o l T r i a l s o f A e r o b i c - T h e r m o p h i l i c P o t a t o F e r m e n t a t i o n s 9 1 2 . A e r o b i c - T h e r m o p h i l i c F e r m e n t a t i o n o f S o d i u m H y d r o x i d e - T r e a t e d P o t a t o 1 1 0 I V . R e s u l t s o f t h e A n a l y s e s o f t h e F e r m e n t e d R e s i d u e 1 1 5 V . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e A e r o b i c - T h e r m o p h i l i c B a c t e r i a P r e s e n t i n t h e T h e r m o p h i l i c F e r -m e n t a t i o n o f P o t a t o W a s t e s 1 2 5 G E N E R A L D I S C U S S I O N 1 3 9 C O N C L U S I O N S 1 4 3 v i i i LITERATURE CITED Page 145 APPENDICES 152 Appendix A 153 Appendix B 154 Appendix C 155 Appendix D ; 156 i x L I S T O F T A B L E S T a b l e ^ 1 C o m p o s i t i o n o f c a u s t i c p o t a t o p e e l w a s t e a n d f r e s h p o t a t o 7 0 2 C o m p a r i s o n o f t h e v a r i o u s a e r o b i c -t h e r m o p h i l i c p o t a t o f e r m e n t a t i o n s 9 4 3 A m o u n t o f n i t r o g e n i n t h e f e r m e n t e d r e s i d u e a s c o m p a r e d t o t h e i n i t i a l p o t a t o u s e d 1 1 6 4 K j e l d a h l n i t r o g e n d e t e r m i n a t i o n ( w e t b a s i s ) o f t h e " t r u e " p r o t e i n n i t r o g e n i n t h e f e r m e n t e d p o t a t o u s i n g t r i c h l o r o a c e t i c a c i d p r e c i p i t a t i o n 1 1 8 5 A m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f t h e f e r m e n t e d r e s i d u e c o m p a r e d w i t h t h e p o t a t o u s e d i n t h e f e r m e n t a t i o n 1 2 0 6 A m i n o a c i d r e q u i r e m e n t s o f c h i c k e n s c o m p a r e d t o t h e v a l u e s o f t h e f e r m e n t e d r e s i d u e s 1 2 2 7 T o x i c s o d i u m l e v e l s f o r p o u l t r y 1 2 3 x Table Page ,8 Atmospheric n i t r o g e n - f i x i n g organisms as s t a t e d i n Bergey's Manual of Determinative B a c t e r i o l o g y 126 9 C h a r a c t e r i s t i c s of the organisms i s o l a t e d on n i t r o g e n - f r e e media; Yeast Carbon Base, m o d i f i e d Meiklejohn's and Azotobacter s p e c i f i c medium 132 x i L I S T O F F I G U R E S F i g u r e P a g e 1 C a u s t i c p o t a t o p e e l w a s t e f r o m t h e m e c h a n i c a l p e e l e r 1 4 2 P o l y p r o p y l e n e f e r m e n t a t i o n v e s s e l w i t h t h e b a f f l e a s s e m b l y i n s e r t e d 2 1 3 T o p a s s e m b l y , w i t h s a m p l i n g p o r t a n d v e n t p o r t s , b o l t e d o v e r t h e f e r m e n t e r v e s s e l 2 3 4 A s s e m b l y o f t h e a l u m i n u m i m p e l l e r 2 4 5 A g i t a t o r a s s e m b l e d w i t h i m p e l l e r p o s i -t i o n e d o n a l u m i n u m s h a f t 2 6 6 I m p e l l e r i n p o s i t i o n , o v e r t h e s p a r g e r , w i t h f o a m - b r e a k i n g i m p e l l e r s i t u a t e d t o w a r d s t h e t o p o f t h e a l u m i n u m s h a f t . . . 2 7 7 D r i v e s y s t e m a s s e m b l y w i t h t h e a l u m i n u m c o u p l i n g b e t w e e n t h e d r i v e s h a f t a n d a g i t a t o r s h a f t 3 0 x i i F i g u r e P a g e 8 A e r a t i o n s y s t e m w i t h a i r r e s e r v o i r -r e g u l a t o r , t w i s t c o c k r e g u l a t o r s a n d a i r f l o w m e t e r s 3 2 9 S p a r g e r a s s e m b l i e s w i t h a l u m i n u m t u b i n g a t t a c h e d t o t h e t e f l o n s p a r g e r h e a d a n d t h e a l u m i n u m s p a r g e r h e a d 3 4 1 0 S p a r g e r h e a d a s s e m b l i e s c o n s i s t i n g o f t h e s t a i n l e s s s t e e l b a l l s , t h e t e f l o n s p a r g e r h e a d a n d t h e a l u m i n u m s p a r g e r h e a d 3 6 1 1 T h e r m o c o u p l e p o s i t i o n e d w i t h i n t h e f e r m e n t e r v e s s e l 3 8 1 2 D a t a r e c o r d e r u s e d t o m o n i t o r t h e f e r -m e n t a t i o n t e m p e r a t u r e s a l o n g w i t h t h e e l e c t r o n i c t h e r m o c o u p l e i c e p o i n t 3 9 1 3 F e r m e n t e r s a s s e m b l e d w i t h i n t h e i n s u l a t e d r o o m 4 1 1 4 D i s s o l v e d o x y g e n p r o b e c a l i b r a t i o n c u r v e f o r a i r s a t u r a t e d w a t e r a t h i g h t e m p -e r a t u r e s 4 8 x i i i F i g u r e Page 15 Thermophilic f e r m e n t a t i o n of a potato waste substrate; i n i t i a l t r i a l 73 16 Mechanical heat input 83 17 Heat l o s s d etermination from heated aqueous systems; with and without a heavy s u r f a c e foam 8 5 18 Thermophilic fermentation of a potato waste s u b s t r a t e ; no. 3 92 See psefct 19 T h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n of a potato waste s u b s t r a t e ; no. 4 106 See p ^ e L 20 Thermophilic f e r m e n t a t i o n of a potato waste s u b s t r a t e with 5 .66 percent sodium content 112See pocket 21 Gram r e a c t i o n and c e l l u l a r morphology of the i s o l a t e d organism 130 x i v ACKNOWLEDGEMENT The author wishes to express h i s s i n c e r e s t g r a t i -tude to Dr. P.M. Townsley f o r h i s enthusiasm, encouragement and guidance dur i n g the course of t h i s study. I would a l s o wish to thank the members of my committee: P r o f . T.L. Co u l t h a r d , Dr. B.J. Skura, Dr. J . Vanderstoep and former member Dr. H.S. Saben f o r t h e i r advice and wisdom. Thanks are a l s o extended to Dr. D. A l i , Mrs. L. A l p i n and Mr. B. Walsh f o r t h e i r a s s i s t a n c e . xv Dedicated with love to my l a t e Grandmother xv i 1. INTRODUCTION Ideally, many food plant wastes should be deve-loped as a u t i l i z a b l e resource, but this is not always possible due in part to unfavorable economics and to the lack of suitable technology. Generally, wastes have been treated as a management or disposal problem. A g r i c u l t u r a l wastes constitute by far the largest volume of organic wastes, amounting to over 200 m i l l i o n tons i n Canada in 1975 (42). Beef and dairy c a t t l e manure accounts for the majority of the animal wastes while the largest proportion of the plant wastes are contributed by straw residues. Of the various food industries, potato processing accounts of over 450,000 tons annually, f r u i t and other vegetable wastes exceed one m i l l i o n tons and meat processing wastes are produced at levels of 150,000 tons. Other wastes of s i g n i f i c a n t importance in r e l a t i o n to our environment are those from dairy, brewery and d i s t i l l e r y industries (42). In recent years, the disposal of large volumes of wastes has become a matter of serious economic concern to the processed potato industry. If the s o l i d potato wastes are not sold d i r e c t l y as c a t t l e feed, they must be treated by -a conventional waste disposal method in which the cost may be economically unfavourable. 2 . The composition of a waste stream from a potato p r o c e s s i n g p l a n t i s l a r g e l y determined by the process used. G e n e r a l l y , the potato process i n v o l v e s the f o l l o w i n g steps: washing of the raw potatoes; p e e l i n g , which i n c l u d e s washing to remove softened t i s s u e ; trimming, to remove d e f e c t i v e p o r t i o n s ; shaping, washing and s e p a r a t i o n ; heat treatment which i s o p t i o n a l ; f i n a l p r o c e s s i n g or p r e s e r v a -t i o n ; and packaging. The composition of waste streams from potato p r o c e s s i n g p l a n t s i s c l o s e l y r e l a t e d to the composition of the potato i t s e l f . The components which are f o r e i g n to the potato and which may be present i n the waste stream i n c l u d e d i r t or s i l t , c a u s t i c soda, f a t , c l e a n i n g and p r e s e r v i n g chemicals, and other food i n g r e -d i e n t s i n l e s s e r amounts. Normally, most streams i n the p r o c e s s i n g p l a n t are combined before being d i s c h a r g e d . The types of waste should be c o n s i d e r e d s e p a r a t e l y s i n c e they can be removed at d i f f e r e n t steps of the p r o c e s s i n g o p e r a t i o n and, i n some cases, can be t r e a t e d more e f f e c -t i v e l y i f separated w i t h i n the p l a n t . Since the p e e l i n g o p e r a t i o n generates more waste than a l l of the other potato p r o c e s s i n g o p e r a t i o n s combined, an a t t a c k on t h i s major f r a c t i o n was c o n s i d e r e d to be the most important i n a l l e v i a t i n g a p o l l u t i o n problem. The c a u s t i c p e e l waste f r a c t i o n has a pH of over 1 2 and i n t h i s form i t cannot be 3. used as l i v e s t o c k feed, and i f dumped without f u r t h e r pro-c e s s i n g i t w i l l form a g e l that i s r e s i s t a n t to decomposi-t i o n . In a d d i t i o n , with the use of c a u s t i c sodium hydroxide s o l u t i o n as a p e e l i n g agent, the hi g h sodium content i n the waste water may make the s o i l impermeable to water and t o x i c to p l a n t growth (41). Aerated lagoons and a c t i v a t e d sludge systems are treatment processes commonly used i n t h i s i n d u s t r y . However, these processes i n v o l v e a lengthy treatment before the waste i s d i s c h a r g e d . The purpose of t h i s i n v e s t i g a t i o n was to determine whether exothermic a e r o b i c t h e r m o p h i l i c waste treatment p r o c e s s i n g can be used to degrade potato wastes. The uniqueness of the t h e r m o p h i l i c process i s p r o v i d e d by the temperature of the degradation. High temperatures are c r e a t e d by the heat energy developed m e t a b o l i c a l l y by the ae r o b i c organisms i n the degr a d a t i o n of the s u b s t r a t e . This exothermal process i s i n t e n s i f i e d , w i t h i n l i m i t s , by higher s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s s i n c e the amount of heat energy i n c r e a s e s p r o p o r t i o n a l l y to the amount of organic substances being b i o c h e m i c a l l y converted (43). The i n c r e a s e d exothermic heat of the r e a c t i o n a c c e l e r a t e s the r a t e of s u b s t r a t e degradation thus i n c r e a s i n g the e f f i c i e n c y of the process over that a t t a i n e d by m e s o p h i l i c systems. The i n c r e a s e d r e a c t i o n r a t e s r e s u l t i n s h o r t e r d e t e n t i o n 4 . t i m e s i n c o m p a r i s o n t o m e s o p h i l i c s y s t e m s f o r t h e s a m e d e g r e e o f p u r i f i c a t i o n , t h u s c o n t r i b u t i n g t o d e c r e a s i n g o p e r a t i o n a l c o s t s . W i t h t h i s p r o c e s s , a s a p p l i e d t o p o t a t o w a s t e , a n i m p r o v e d s o l i d s - l i q u i d s e p a r a t i o n o c c u r s . W a t e r s e p a r a t i o n i s i m p o r t a n t i n o r d e r t o r e d u c e t h e v o l u m e o f w a s t e t o o b t a i n a h i g h s e t t l e a b l e s o l i d s c o n c e n t r a t i o n . I n p r i m a r y w a s t e t r e a t m e n t , s o m e f o r m o f c o n c e n t r a t i o n i s n o r m a l l y e m p l o y e d . B o t h c o n t i n u o u s v a c u u m f i l t e r s a n d c o n t i n u o u s c e n t r i f u g a l u n i t s a r e u s e d c o m m e r c i a l l y f o r t h i s p u r p o s e . A d d i t i o n a l d e w a t e r i n g b y p r e s s i n g i s n o t f e a s i b l e ( 6 1 ) . T h e s o l i d s w h i c h r e s u l t f r o m t h e c a u s t i c p e e l i n g p r o c e s s , w i t h i t s h i g h p H , w i l l n o t e a s i l y d e w a t e r o n a v a c u u m f i l t e r ( 6 1 ) . T h u s t h e t h e r m o p h i l i c p r o c e s s p r o v i d e s a n a d d i t i o n a l b e n e f i t i n i m p r o v i n g s o l i d s - l i q u i d s e p a r a t i o n o f t h e d i g e s t e d s l u d g e w h i c h m u s t b e d e w a t e r e d p r i o r t o f u r t h e r p r o c e s s i n g o r u l t i m a t e d i s p o s a l . G a r b e r ( 2 0 ) s h o w e d t h a t t h e r m o p h i l i c d i g e s t e d s l u d g e h a d a g r e a t l y i m p r o v e d v a c u u m f i l t e r y i e l d a s c o m p a r e d t o m e s o p h i l i c s l u d g e , t o g e t h e r w i t h a l o w e r c o a g u l a n t d e m a n d . T h e d e s t r u c t i o n o f o r g a n i s m s p a t h o g e n i c t o a n i m a l s a t t e m p e r a t u r e s a c h i e v e d i n t h e t h e r m o p h i l i c w a s t e t r e a t -m e n t s y s t e m s i s o f s p e c i a l s i g n i f i c a n c e ( 4 , 5 5 ) . A s a n a n i m a l f e e d , u t i l i z a t i o n o f t h e s l u d g e f r o m t h i s p r o c e s s 5 . i s a p o s s i b l e asset because of i t s pathogen-free q u a l i t y . Even i f the sludge was disposed on s o i l , the p u b l i c h e a l t h aspects would be of c o n s i d e r a b l y l e s s concern than the m e s o p h i l i c sludge d i s c a r d e d i n a s i m i l a r manner. In comparison, to the m e s o p h i l i c systems, the i n c r e a s e d temperatures achieved i n t h e r m o p h i l i c fermentations i s advantageous i n the o v e r a l l treatment of the waste e s p e c i a l l y d u r i n g the c o l d season. The r a t e of decomposi-t i o n accomplished at t h e r m o p h i l i c c o n d i t i o n s i s u n a f f e c t e d by low ambient temperatures p r o v i d e d s u f f i c i e n t fermenter i n s u l a t i o n i s a p p l i e d , whereas m e s o p h i l i c r e a c t i o n s may be hampered by f r e e z i n g environmental c o n d i t i o n s . The p o s s i b l e disadvantage of the t h e r m o p h i l i c pro-cess i s i t s poor process s t a b i l i t y e s p e c i a l l y w i t h r e s p e c t to temperature. I t i s w e l l known that as b i o l o g i c a l pro-cesses approach environmental extremes (pH, s a l i n i t y , etc.) i n the s u b s t r a t e , fewer species are capable of s u r v i v i n g and the fermentation becomes unstable or l e s s r e s i s t a n t to change i n the s u b s t r a t e composition. Larger i n s t a l l a t i o n s , however, show grea t e r s t a b i l i t y and temperature maintenance f o r a longer d u r a t i o n because of t h e i r i n c r e a s e d fermenta-t i o n mass. A c c o r d i n g l y , adequate c o n t r o l and m o n i t o r i n g of the treatment system i s an important requirement f o r the s u c c e s s f u l a p p l i c a t i o n of a t h e r m o p h i l i c d i g e s t i o n o p e r a t i o n . 6. The p u r p o s e o f t h i s t h e s i s was t h r e e f o l d . F i r s t , t o e s t a b l i s h t h e c o m p o s i t i o n o f t h e s u b s t r a t e , n a m e l y , t h e c a u s t i c p o t a t o p e e l w a s t e , as t o i t s n u t r i t i o n a l a v a i -l a b i l i t y t o m i c r o o r g a n i s m s . S e c o n d l y , t o c o n s t r u c t a l a b o -r a t o r y s y s t e m o f s u f f i c i e n t s i z e i n w h i c h t h e t h e r m o p h i l i c p r o c e s s has e n o u g h s t a b i l i t y and o p e r a t i o n a l c o n t r o l l a b i l i t y d u r i n g t h e d i g e s t i o n t o e n a b l e a d e q u a t e s t u d y . T h i r d l y , i f t h e r m o p h i l i c c o n d i t i o n s a r e o b t a i n a b l e w i t h t h i s s u b s t r a t e i n t h e l a b o r a t o r y s y s t e m , t o s t u d y and t o c h a r a c t e r i z e t h e t h e r m o p h i l i c d i g e s t i o n o f p o t a t o p e e l w a s t e . 7 . L I T E R A T U R E R E V I E W I. T h e r m o p h i l i c B a c t e r i a T h e t h e r m o b i o s i s p h e n o m e n o n o r t h e a b i l i t y o f b i o -l o g i c a l e n t i t i e s t o g r o w a t e l e v a t e d t e m p e r a t u r e s h a s b e e n k n o w n f o r c e n t u r i e s . T h e i n i t i a l r e c o r d e d d i s c o v e r y o f a t h e r m o p h i l i c b a c t e r i u m w a s c r e d i t e d t o M i g u e l i n 1 8 7 9 ( 1 , 1 1 , 1 9 , 2 1 ) . M o r r i s o n a n d T a n n e r ( 4 0 ) o u t l i n e d t h e m e t h o d o l o g y f o r t h e s t u d y o f a e r o b i c t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a f r o m w a t e r . R o b e r t s o n ( 4 5 ) p r e s e n t e d a c o m p l e t e b i b l i o g r a p h y o f e a r l y w o r k e r s p r i o r t o 1 9 2 7 i n w h i c h h e d e s c r i b e d b o t h t h e s p o r u -l a t i n g a n d t h e n o n - s p o r u l a t i n g t h e r m o p h i l i c b a c i l l i . G a u g h r a n ( 2 1 ) , a n d s u b s e q u e n t l y , A l l e n ( 1 ) p r e s e n t e d e x c e l -l e n t r e v i e w s o n t h e s t a t e o f t h e a r t c o n c e r n i n g t h e r m o p h i l i c m i c r o o r g a n i s m s . K o f f l e r ( 2 9 ) d i s c u s s e d s t u d i e s i n v o l v i n g t h e t h e r m a l s t a b i l i t y o f e n z y m e s a n d s t r u c t u r a l p r o t e i n s o f t h e r m o p h i l e s . C a m p b e l l a n d P a c e ( 1 1 ) r e v i e w e d t h e l i t e r a t u r e o n t h e m i c r o b i a l p h y s i o l o g y o f g r o w t h a t e l e v a t e d t e m p e r a t u r e s a n d m o r e r e c e n t l y , F a r r e l l a n d C a m p b e l l ( 1 9 ) p u b l i s h e d a r e v i e w d e s c r i b i n g t h e t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a b e l o n g i n g t o t h e g e n u s B a c i l l u s a n d t h e i r a s s o c i a t e d b a c t e r i o p h a g e s . 8. M a n y o f t h e m e n t i o n e d s t u d i e s h a v e q u e s t i o n e d h o w t h e s e m i c r o o r g a n i s m s g r o w a t h i g h t e m p e r a t u r e s , a n d i n m a n y i n s t a n c e s a r e a c t u a l l y o b l i g a t e t o t h e s e h i g h t e m p e r a -t u r e s ; t h a t i s , g r o w t h a t t e m p e r a t u r e s w h i c h w o u l d n o r m a l l y d e s t r o y o r i n a c t i v a t e t h e c e l l u l a r c o m p o n e n t s o f m o s t l i f e f o r m s . G e n e r a l l y , t w o e x p l a n a t i o n s h a v e b e e n o f f e r e d . F i r s t l y , a n d t h e m o s t o b v i o u s , i s t h a t t h e e s s e n t i a l c e l l u -l a r c o m p o n e n t s n e c e s s a r y f o r l i f e o f t h e t h e r m o p h i l i c o r g a n i s m s a r e r e l a t i v e l y m o r e h e a t s t a b l e t h a n t h e i r m e s o -p h i l i c c o u n t e r p a r t s . S e c o n d l y , t h e c e l l s a r e c a p a b l e o f r a p i d r e s y n t h e s i s o f t h e d e s t r o y e d o r i n a c t i v a t e d c e l l u l a r c o m p o n e n t s . N u m e r o u s s t u d i e s h a v e s h o w n t h e u b i q u i t o u s n a t u r e o f t h e t h e r m o p h i l i c m i c r o o r g a n i s m s . T h e y h a v e b e e n f o u n d t o o c c u r i n s u c h d i v e r s e c l i m a t e s a s i n t r o p i c a l s o i l s , i n d e s e r t s a n d s a n d i n f a l l e n s n o w . T h e r m o p h i l e s h a v e b e e n i s o l a t e d f r o m a i r , f r o m s a l t a n d f r e s h w a t e r , f r o m f e c e s o f a l l d o m e s t i c a n i m a l s a n d m a n , f r o m g r a i n s a n d f o o d s o f a l l v a r i e t i e s , f r o m r a w a n d p a s t e u r i z e d m i l k , f r o m s t o r e d v e g e t a b l e s , a n d e s p e c i a l l y f r o m m a s s e s o f d e c a y i n g p l a n t m a t e r i a l s (1,21). C l i m a t i c c o n d i t i o n s a p p a r e n t l y h a v e n o i n f l u e n c e o n t h e d i s t r i b u t i o n o f t h e t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a a n d t h e r e s e e m s t o b e l i t t l e d o u b t t h a t t h e t h e r m o p h i l e s a r e m e m b e r s o f t h e n a t u r a l l y o c c u r r i n g s o i l i n h a b i t a n t s 9. a n d c a n b e i s o l a t e d f r o m a n y m a t e r i a l w h i c h h a s c o m e i n c o n t a c t w i t h s o i l . D u e t o t h e i r u n i v e r s a l d i s t r i b u t i o n , i t i s e v i d e n t t h a t p r o l i f e r a t i o n o f t h e s e o r g a n i s m s w i l l t a k e p l a c e w h e n e v e r c o n d i t i o n s a r e f a v o u r a b l e w i t h i n a n a t u r a l o r a n a r t i f i c i a l e n v i r o n m e n t . I I . A p p l i c a t i o n o f t h e A e r o b i c - T h e r m o p h i l i c B a c t e r i a T h e a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c w a s t e w a t e r t r e a t m e n t p r o -c e s s i s a r e c e n t d e v e l o p m e n t a n d i s c o n s i d e r e d a s a m e t h o d f o r t h e t r e a t m e n t o f c o n c e n t r a t e d o r g a n i c w a s t e w a t e r ( 3 5 ) . M c C a r t y ( 3 7 ) s h o w e d t h a t t h e t h e r m o p h i l i c m i c r o o r g a n i s m s u t i l i z e d n u t r i e n t s i n w a s t e w a t e r f o r c e l l s y n t h e s i s a n d m a i n t e n a n c e . T h e e f f i c i e n c y o f t h e t r a n s f e r o f t h e c o n -t a i n e d s u b s t r a t e e n e r g y t o u s a b l e c e l l e n e r g y b y t h e m i c r o -o r g a n i s m s w a s c o n s i d e r e d t o b e i n t h e 2 0 - 4 0 p e r c e n t r a n g e , a l t h o u g h , M c C a r t y a c k n o w l e d g e d t h a t i t w a s c l o s e r t o 7 0 p e r c e n t . I t w a s o b v i o u s t h a t a s i g n i f i c a n t a m o u n t o f e n e r g y w a s l o s t t o t h e s u r r o u n d i n g e n v i r o n m e n t . R i c h a n d A n d r e w ( 4 4 ) , i n t h e i r d i s c u s s i o n o f M c C a r t y ' s p a p e r , n o t e d t h a t t h i s e s c a p e d e n e r g y w a s r e s p o n s i b l e f o r r a i s i n g t h e t e m p e r a t u r e s o f c o m p o s t i n g s o l i d w a s t e s a s h i g h a s 7 0 -7 5 ° C . I n c o n t r a s t t o c o m p o s t i n g , i n s y s t e m s w h e r e t h e r e i s a r e c o g n i z a b l e l i q u i d p h a s e , a s i n a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c 1 0 . d i g e s t i o n o f w a s t e w a t e r , i t i s m o r e d i f f i c u l t t o n o t i c e t h e h e a t l i b e r a t e d b y t h e m i c r o o r g a n i s m s s i n c e t h e h e a t i s r e a d i l y d i s s e m i n a t e d a n d l o s t t o t h e s y s t e m . K a m b h u a n d A n d r e w ( 2 8 ) s h o w e d b y a c o m p u t e r s i m u l a t i o n s t u d y o f a e r o b i c t h e r m o p h i l i c d i g e s t i o n o f s l u d g e , t h a t s u f f i c i e n t h e a t w a s g e n e r a t e d b y t h e d e s t r u c t i o n o f o r g a n i c s o l i d s t o m a k e t h e p r o c e s s s e l f - s u s t a i n i n g i n t h e t h e r -m o p h i l i c r a n g e . H o w e v e r , i n t h e i r m o d e l s t u d y o f p r i m a r y a n d a c t i v a t e d s l u d g e s o l i d s , h e a t w a s s u p p l i e d t o r a i s e t h e t e m p e r a t u r e o f t h e r e a c t o r b o d y . P S p e l a n d O h n m a c h t ( 4 3 ) w o r k i n g w i t h s e w a g e s l u d g e s , i n d u s t r i a l w a s t e s a n d l i q u i d m a n u r e , s h o w e d i n a b a t c h t e s t w i t h s l u d g e o f 1 0 . 8 % s o l i d s c o n c e n t r a t i o n t h a t t h e o r g a n i c s o l i d s c o n t e n t w a s r e d u c e d b y 9 0 1 o v e r a 1 0 . 5 d a y p e r i o d . W i t h f r e q u e n t f e e d i n g o f f r e s h s l u d g e , i t w a s p o s s i b l e t o m a i n t a i n a t e m p e r a t u r e n e a r 5 0 ° C e v e n t h o u g h t h e a m b i e n t t e m p e r a t u r e d e c r e a s e d f r o m 2 0 ° c t o 5 ° C . T h e l a t t e r a u t h o r s f o u n d t h a t t h e r e w a s a 7 5 % r e d u c t i o n o f o r g a n i c m a t e r i a l i n a s l i t t l e a s 2 1 . 5 h o u r s . S m i t h e t a l . ( 5 0 ) c o n c l u d e d t h a t a e r o b i c -t h e r m o p h i l i c d i g e s t i o n c a n a c c o m p l i s h t h e s a m e d e g r e e o f o r g a n i c s o l i d s d e s t r u c t i o n a s a n o p t i m a l l y o p e r a t e d c o n v e n -t i o n a l m e s o p h i l i c w a s t e t r e a t m e n t s y s t e m w i t h t h e s a m e a m o u n t o f o x y g e n s u p p l i e d b u t w i t h a m u c h g r e a t e r l o a d i n g i n p u t ( 4 . 6 X ) a n d i n l e s s t i m e ( 2 0 % l e s s ) . A l s o t h e s a m e 11. r e d u c t i o n o f o r g a n i c m a t t e r c o u l d b e a c c o m p l i s h e d i n a t a n k w h i c h w a s o n e - s i x t h t h e v o l u m e n o r m a l l y r e q u i r e d i n m e s o p h i l i c o p e r a t i n g s y s t e m s . O x y g e n g a s w a s u s e d i n p l a c e o f a i r i n o r d e r t o m i n i m i z e h e a t l o s s f r o m t h e d i g e s t e r a n d t o p e r m i t t h e d i g e s t i o n o f a h i g h e r s o l i d s c o n t e n t s l u d g e . L o l l ( 3 6 ) r e p o r t e d t h a t t h e t r e a t m e n t o f u n d i l u t e d s l u d g e l i q u o r s b y t h e a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c p r o c e s s r e d u c e d t h e c h e m i c a l o x y g e n d e m a n d ( C . O . D . ) b y a b o u t 7 0 1 a n d t h e b i o c h e m i c a l o x y g e n d e m a n d (B . O . D . . b y a b o u t 9 5 % . I n c o n -t r a s t w i t h a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c d i g e s t i o n , a n a e r o b i c t h e r m o -p h i l i c d i g e s t i o n r e d u c e d t h e B . O . D . , - b y o n l y 7 3 % , w h e r e a s , t h e C . O . D . r e d u c t i o n w a s a b o u t t h e s a m e ( 6 8 % ) . I n a p r e v i o u s p a p e r b y L o l l ( 3 5 ) i t w a s s h o w n , w h e n u s i n g B . O . D . , - a s a r e f e r e n c e p a r a m e t e r , a b i o l o g i c a l r e d u c t i o n o f b e t w e e n 9 5 % a n d 9 7 % w a s r e a c h e d i n b a t c h d i g e s -t i o n t e s t s w i t h y e a s t w a s t e , m o l a s s e s w a s t e a n d p i g m a n u r e . A 5 t o 7 - d a y r e t e n t i o n t i m e w a s u s e d f o r a l l t h r e e s u b s t r a t e s . M a x i m u m s u b s t r a t e t e m p e r a t u r e s o f 4 6 ° C t o 5 0 ° C w e r e r e a c h e d w i t h i n a 3 t o 5 - d a y p e r i o d a f t e r t h e b e g i n n i n g o f t h e e x p e r i -m e n t , d u r i n g w h i c h t i m e t h e a m b i e n t t e m p e r a t u r e v a r i e d b e t w e e n 1 7 ° C a n d 2 0 ° C . T h e t e m p e r a t u r e o f t h e f e r m e n t a t i o n r o s e t o a m a x i m u m a t a p o i n t w h e r e t h e b u l k o f t h e o r g a n i c s u b s t a n c e s h a d b e e n d e g r a d e d , a n d t h e n s u b s e q u e n t l y d e c r e a s e d d u e t o r e d u c e d m i c r o b i a l m e t a b o l i c a c t i v i t y . 12. Recently, the recovery of protein i n the form of bac t e r i a l c e l l s from the thermophilic aerobic treatment of high organic strength wastewater has received considerable attention. The protein content and n u t r i t i o n a l p r o f i l e of thermophilic microorganisms may be better than that obtained from mesophilic organisms ( 4 , 5 5 ) . Bellamy (4) concluded that the thermophilic protein contained r e l a t i v e l y high con-centrations of lysine, tryptophane and sulfur amino acids and should have a high n u t r i t i o n a l value for monogastric animals as well as for ruminants. Investigations on the application of the aerobic-thermophilic degradation process of organic wastewaters orig i n a t i n g from the food industry are almost non-existent in comparison to the information available on animal waste management. It is evident that the pote n t i a l of the thermophilic microbiological treatment of high strength wastewater should be of interest to the food processing industries. 1 3 . M A T E R I A L S A N D M E T H O D S I. A n a l y s e s o f t h e C a u s t i c S o d a P o t a t o P e e l W a s t e s F o u r - g a l l o n s a m p l e s o f l y e - p e e l e d p o t a t o w a s t e w e r e o b t a i n e d d i r e c t l y f r o m t h e c a u s t i c p e e l e r s ( F i g u r e 1 ) o f F r a s e r V a l l e y F r o s t e d F o o d s L t d . , C h i l l i w a c k , B . C . T h e s a m p l e s w e r e b r o u g h t t o t h e l a b o r a t o r y , a t t h e U n i v e r s i o f B r i t i s h C o l u m b i a , a n d s t o r e d i n a r e f r i g e r a t e d r o o m a t 5 ° C . T h e s e p r o c e s s i n g p l a n t s a m p l e s w e r e s u b s e q u e n t l y a n a l y z e d a n d c o m p a r e d t o f r e s h l y h o m o g e n i z e d w h o l e p o t a t o e s o f t h e s a m e v a r i e t y . ol. T o t a l K j e l d a h l N i t r o g e n D e t e r m i n a t i o n T o t a l o r g a n i c n i t r o g e n w a s d o n e i n t r i p l i c a t e a c c o r d i n g t o t h e r a p i d m i c r o - K j e l d a h l m e t h o d o f C o n c o n a n d S o l t e s s ( 1 6 ) . T h e a m o u n t o f n i t r o g e n i n e a c h d i g e s t e d s a m p l e w a s d e t e r m i n e d u s i n g a n A u t o A n a l y s e r I I ( T e c h n i c o n I n s t r u m e n t s C o r p . , T a r r y t o w n , N . Y . ) . A l l n i t r o g e n a n a l y s e s w e r e c a l c u l a t e d o n a d r y b a s i s . 2 . T o t a l C a r b o n a n d I n o r g a n i c C a r b o n D e t e r m i n a t i o n T h e s a m p l e s w e r e a n a l y z e d b y u s i n g a B e c k m a n M o d e l 9 1 5 T o t a l O r g a n i c C a r b o n A n a l y s e r c o n n e c t e d t o a 14. F i g u r e 1. C a u s t i c p o t a t o p e e l waste f r o m t h e m e c h a n i c a l p e e l e r . 1 5 . B e c k m a n I n f r a - R e d A n a l y z e r ( B e c k m a n I n s t r u m e n t s I n c . , F u l l e r t o n , C A ) . S t a n d a r d s o l u t i o n s o f p o t a s s i u m h y d r o g e n p h t h a l a t e ( 1 0 0 - 5 0 0 p p m ) a n d s o d i u m b i c a r b o n a t e ( 1 0 - 5 0 p p m ) w e r e p r e p a r e d a c c o r d i n g t o A . O . A . C . 3 3 . 0 4 7 ( 2 ) f o r t o t a l c a r b o n d e t e r m i n a t i o n a n d f o r i n o r g a n i c c a r b o n d e t e r m i n a t i o n , r e s p e c t i v e l y . C a l i b r a t i o n c u r v e s f o r t o t a l c a r b o n a n d o r g a n i c c a r b o n w e r e p r e p a r e d b y p l o t t i n g m i l l i v o l t r e a d i n g v e r s u s c o n c e n t r a t i o n o f t h e c a r b o n - c o n t a i n i n g s t o c k s o l u t i o n s . T h e p o t a t o s a m p l e s -were d r i e d a t a t m o s p h e r i c p r e s s u r e t o a c o n s t a n t w e i g h t i n a d r y i n g o v e n ( s e e s e c t i o n o n " S o l i d s d e t e r m i n a t i o n " ) a n d t h e n c r u s h e d t o a p o w d e r w i t h a m o r t a r a n d p e s t l e . A 4 0 m g p o r t i o n o f t h e p o w d e r w a s p l a c e d i n t o a 7 m l T e n - B r o e c k T i s s u e G r i n d e r ( C o r n i n g G l a s s W o r k s , C o r n i n g , N . Y . ) w i t h a s m a l l a m o u n t o f d i s t i l l e d -d e i o n i z e d w a t e r . T h e s a m p l e w a s h o m o g e n i z e d u n t i l t h e p a r t i c l e s w e r e e x t r e m e l y f i n e a n d s u s p e n d e d i n s o l u t i o n . T h i s s o l u t i o n w a s r e m o v e d f r o m t h e h o m o g e n i z e r a n d m a d e u p t o v o l u m e i n a 1 0 0 m l v o l u m e t r i c f l a s k w i t h d i s t i l l e d -d e i o n i z e d w a t e r . T w e n t y m i c r o l i t e r s o f t h i s f i n a l s a m p l e s o l u t i o n ( 4 0 0 p p m i n t e r m s o f d r i e d p o t a t o s o l i d s ) w a s i n j e c t e d i n t o t h e B e c k m a n T o t a l C a r b o n A n a l y z e r w i t h a c a l i b r a t e d H a m i l t o n s y r i n g e ( H a m i l t o n C o . , W h i t t i e r , C A ) . A l l o f t h e g l a s s w a r e u s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s w a s t h o r o u g h l y c l e a n e d b y s o a k i n g i n a p o t a s s i u m 16. dichromate-concentrated s u l f u r i c a c i d s o l u t i o n o v e r n i g h t . The glassware was removed from the chromic a c i d s o l u t i o n , r i n s e d thoroughly i n d i s t i l l e d water and then i n d i s t i l l e d -d e i o n i z e d water. 3. T o t a l Phosphorus Determination The method used f o r the p r e p a r a t i o n of the samples f o r phosphorus a n a l y s i s was s i m i l a r to those used i n the K j e l d a h l n i t r o g e n d e t e r m i n a t i o n s . Oven d r i e d samples of the c a u s t i c potato p e e l waste and f r e s h potatoes were weighed and p l a c e d i n t o K j e l d a h l d i g e s t i o n f l a s k s . A f t e r d i g e s t i o n , the samples were analyzed on the Technicon Auto-Analyzer. A blank, c o n t a i n i n g only the reagents, was prepared i n c o n j u n c t i o n with the samples. A KH^PO^ standard s o l u t i o n was prepared w i t h i n the estimated range of the phosphorus content of the potato samples. A d i l u t i o n of t h i s c o n c e n t r a t e d standard was a p p l i e d to the autoanalyzer as a r e f e r e n c e standard. A l l glassware f o r t h i s a n a l y s i s was soaked over-night i n a chromic a c i d s o l u t i o n . A f t e r r i n s i n g i n d e i o n i z e d -d i s t i l l e d water, the glassware was soaked i n a 1 to 1 aqueous s o l u t i o n of hot HCl (2) and then r i n s e d i n d e i o n i z e d - d i s t i l l e d water. 4 . T o t a l S o d i u m D e t e r m i n a t i o n A w e t a s h i n g m e t h o d ( 2 4 ) w a s u s e d f o r t h e s o d i u m a n a l y s e s o f t h e d r i e d p o t a t o s a m p l e s b y a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t r y . S a m p l e d i g e s t i o n w a s c a r r i e d o u t u s i n g a 3 0 m l v o l u m e o f a m i x t u r e o f n i t r i c - p e r c h l o r i c - s u l f u r i c a c i d s a d d e d i n t o a l o n g - n e c k K j e l d a h l d i g e s t i o n f l a s k . T h e m i x t u r e w a s a d d e d c o l d a n d t h e f l a s k w a s h e a t e d s l o w l y t o e n c o u r a g e a s m o o t h d i g e s t i o n w i t h o u t c h a r r i n g . A f t e r c o m p l e t i o n o f t h e d i g e s t i o n , t h e f l a s k w a s h e a t e d m o r e i n t e n s e l y t o r e m o v e e x c e s s n i t r i c a n d p e r c h l o r i c a c i d a n d t o r e d u c e t h e v o l u m e o f t h e s o l u t i o n . T h e e n d o f t h e d i g e s t i o n w a s i n d i c a t e d b y s u l f u r i c a c i d f u m i n g i n t h e n e c k o f t h e f l a s k . A l l t h e g l a s s w a r e f o r t h i s a n a l y s i s w a s s o a k e d o v e r n i g h t i n a s o l u t i o n o f p o t a s s i u m d i c h r o m a t e - c o n c e n t r a t e d s u l f u r i c a c i d . T h e g l a s s w a r e w a s r i n s e d i n d e i o n i z e d -d i s t i l l e d w a t e r , f o l l o w e d b y a c o n c e n t r a t e d n i t r i c a c i d s o a k t o r e m o v e a l l t h e r e m a i n i n g s o d i u m i o n s . A f i n a l r i n s e i n d e i o n i z e d - d i s t i l l e d w a t e r w a s e m p l o y e d t o r e m o v e t h e n i t r i c a c i d . A n o v e r a l l s t a n d a r d c u r v e w a s c a l i b r a t e d b y a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t r y ( M o d e l 8 2 - 8 0 0 , J a r r e l l -A s h , D i v i s i o n o f F i s h e r S c i e n t i f i c Co . . , W a l t h a m , M A ) u s i n g 1 8 . v a r i n g d i l u e n t c o n c e n t r a t i o n s o f a c o m m e r c i a l s t o c k s o l u t i o n c o m p o s e d o f s o d i u m b i c a r b o n a t e ( F i s h e r S c i e n t i f i c C o . , F a i r L a w n , N . J . ) . O n d e t e r m i n i n g t h e p r o f i l e o f t h e o v e r a l l s t a n d a r d c u r v e , i t w a s f o u n d t h a t t h e l i n e a r p o r t i o n r a n g e d f r o m 0 t o 1 0 p p m . A m o r e f i n i t e c a l i b r a t i o n w a s r e q u i r e d f o r t h i s l i n e a r p o r t i o n o f t h e s t a n d a r d c u r v e . S t a n d a r d s o l u t i o n s o f 0 t o 1 0 p p m w e r e p r e p a r e d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h i s m o r e f i n i t e s t a n d a r d c u r v e . L i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s w a s a p p l i e d t o t h e d a t a . F r o m t h i s a n a l y s i s , a s t r a i g h t l i n e e q u a t i o n w a s o b t a i n e d f o r t h e f i n i t e s t a n d a r d c u r v e ( y = 0 . 0 4 1 x - 0 . 0 0 4 ) . T h i s e q u a t i o n w a s u s e d t o c a l c u l a t e t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e s o d i u m i o n f r o m t h e r e a d i n g s o b t a i n e d f o r t h e s a m p l e s . C a u s t i c p o t a t o p e e l w a s t e , a n d p e e l i n g s a n d p u l p ( p a r e n c h y m a a n d p i t h t i s s u e ) f r o m f r e s h p o t a t o w e r e a n a l y z e d . T h e s e s a m p l e s w e r e a d j u s t e d s o t h e c o n c e n t r a t i o n o f s o d i u m w o u l d f a l l w i t h i n t h e r a n g e o f t h e f i n i t e s t a n d a r d c u r v e . D u p l i c a t e a n a l y s e s w e r e r u n f o r e a c h s a m p l e a t t w o d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s ( 2 0 p p m a n d 2 0 0 p p m , i n t e r m s o f d r i e d p o t a t o s o l i d s ) . A l o n g w i t h t h e s a m p l e s , a b l a n k w a s p r e p a r e d f o l l o w i n g t h e e x a c t g l a s s w a r e c l e a n i n g p r o c e d -u r e a n d c o n t a i n i n g t h e s a m e r e a g e n t s a s t h e s a m p l e s . 19. 5 . A s h D e t e r m i n a t i o n A c l e a n , p r e i g n i t e d a n d d e s i c c a t o r - c o o l e d p o r c e -l a i n c r u c i b l e w i t h c o v e r w a s w e i g h e d . T o t h i s a n a p p r o -p r i a t e a m o u n t o f p o t a t o s a m p l e w a s a d d e d a n d t h e n r e w e i g h e d . T h e s a m p l e w a s i g n i t e d a t 5 5 0 ° C u n t i l a c o n s t a n t c o o l e d w e i g h t w a s o b t a i n e d . 6 . S o l i d s D e t e r m i n a t i o n T h e s a m p l e s w e r e p l a c e d i n t o p r e h e a t e d a n d p r e -w e i g h e d a l u m i n u m d r y i n g d i s h e s . T h e s e w e r e d r i e d a t a t m o s -p h e r i c p r e s s u r e t o a c o n s t a n t w e i g h t a t 8 0 ° C i n a d r y i n g o v e n . T h i s t e m p e r a t u r e w a s c h o s e n t o b e r e p r e s e n t a t i v e o f t h e t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n t e m p e r a t u r e . I t a l l o w e d f o r s u f f i c i e n t d r y i n g w i t h o u t c a u s i n g p o s s i b l e h e a t a l t e r a -t i o n o f t h e s a m p l e s . T h e s e d r i e d s a m p l e s w e r e u s e d f o r t h e p r e v i o u s a n a l y s e s . 7. M e a s u r e m e n t o f t h e p H o f t h e P l a n t S a m p l e s T h e p H o f t h e c a u s t i c p o t a t o p e e l s a m p l e s o b t a i n e d f r o m t h e p r o c e s s i n g p l a n t w e r e r e c o r d e d w i t h i n 2 h o f s a m p l i n g u s i n g a p H m e t e r ( A c c u m e t . M o d e l 2 3 0 , F i s h e r S c i e n -t i f i c C o . , P i t t s b u r g h , P A ) . 2 0 . I I . C o n s t r u c t i o n o f t h e F e r m e n t a t i o n S y s t e m 1 . C o n s t r u c t i o n o f t h e F e r m e n t e r C e l l s T h e e x t e r i o r s h e l l o f t h e t w o f e r m e n t e r c e l l s w e r e c o n s t r u c t e d w i t h J " p l y w o o d , f a s t e n e d t o g e t h e r w i t h 1 J " s t e e l b r a d s a n d 5 / 8 " x 5 c o r r u g a t e d f a s t e n e r s . T h e s i z e o f t h i s o u t e r p l y w o o d s h e l l w a s m a d e t o a c c o m m o d a t e a n i n n e r p o l y p r o p y l e n e c o n t a i n e r o f 5 6 c m x 4 9 c m d i a m e t e r p l u s a p p r o x i m a t e l y 7 c m t o 1 5 c m o f i n s u l a t i o n m a t e r i a l o n t h e s i d e a n d b o t t o m o f t h e c o n t a i n e r , r e s p e c t i v e l y . T h e s e p l a s t i c c o n t a i n e r s a r e u t i l i z e d f o r d o m e s t i c b a t c h w i n e f e r m e n t a t i o n s a n d w e r e c o n s i d e r e d t o b e t h e m o s t s u i t a b l e i n t e r m s o f c o s t a n d d u r a b i l i t y ( F i g u r e 2 ) . T h e i n s u l a t i n g m a t e r i a l s u r r o u n d i n g t h e s e p l a s t i c c o n t a i n e r s w a s v e r m i c u l i t e ( Z o n o l i t e , G r a c e C o n s t r u c t i o n , S c a r b o r o u g h , O N ) . T h i s m a t e r i a l w a s c h o s e n s i n c e i t w a s i n a f r e e f o r m , i n e r t a n d w o u l d n o t s e t t l e w i t h i n t h e i n s u l a t i n g s p a c e . T h e i n s u l a t i n g o r R v a l u e o f 1 0 . 0 w a s d e t e r m i n e d f r o m t h e p a c k a g e i n s t r u c t i o n s . T h e w h o l e u n i t : w a s m o u n t e d o n w h e e l s t o f a c i l i t a t e m o b i l i t y d u r i n g l o a d i n g a n d c l e a n i n g . 2 . T o p A s s e m b l y f o r F e r m e n t e r C e l l s T h i s a s s e m b l y w a s f o u n d t o b e n e c e s s a r y i n o r d e r t o d e c r e a s e w a t e r e v a p o r a t i o n a n d m i n i m i z e s u b s t r a t e o v e r f l o w F i g u r e 2 . Polypropylene fermentation v e s s e l (A) with the b a f f l e assembly (B) i n s e r t e d . d u e t o e x c e s s i v e f o a m i n g . T h e t o p a s s e m b l y w a s c o n s i d e r e d t o h a v e a m i n i m a l e f f e c t o n h e a t r e t e n t i o n i n c o m p a r i s o n t o t h e i n s u l a t i n g e f f e c t o f f o a m , w h i c h a c c u m u l a t e d o n t h e t o p o f t h e f e r m e n t i n g l i q u i d . T h i s t o p w a s c o n s t r u c t e d f r o m a c i r c u l a r p i e c e o f \ " p l y w o o d h e a v i l y c o v e r e d w i t h a p l a s t i c - l i k e f i n i s h ( F l e c t o V a r a t h a n e , F l e c t o C o . I n c . , O a k l a n d , C A ) ( F i g u r e 3 ) . T h i s c o a t i n g p r o t e c t e d t h e w o o d f r o m a t t a c k b y c e l l u l o s i c b a c t e r i a , w h i c h m i g h t a l t e r t h e n u t r i t i o n a l p r o f i l e o f t h e s u b s t r a t e . T h e t o p w a s a t t a c h e d t o t h e f e r m e n t e r b o d y b y 5 e v e n l y s p a c e d w i n g - n u t b o l t s . T h e t o p a n d t o p e d g e o f t h e p l a s t i c c o n t a i n e r w a s s e a l e d w i t h a r u b b e r g a s k e t t o p r e v e n t l e a k a g e . F o u r h o l e s ( 2 . 5 c m d i a m e t e r ) w e r e b o r e d i n t o t h e t o p . T h e c e n t e r h o l e s e r v e d a s t h e e n t r y p o r t f o r t h e i m p e l l e r s h a f t a s s e m b l y . A n o t h e r h o l e ( 6 c m d i a m e t e r ) w a s u s e d a s a s a m p l i n g p o r t . T h e o t h e r h o l e s w e r e s t o p p e r e d w i t h t y g o n t u b i n g t o s e r v e a s a n a i r v e n t a n d t o a c t a s a c o n d e n s e r i n m i n i m i z i n g w a t e r l o s s f r o m t h e s y s t e m d u r i n g a e r a t i o n . 3 . S y s t e m f o r S u b s t r a t e A g i t a t i o n T h e i m p e l l e r w a s c o n s t r u c t e d o f 4 p i e c e s o f 2 . 5 c m x 3 . 8 c m x 2 . 5 mm a l u m i n u m p l a t e o n a c e n t r a l a l u m i n u m c o u p l i n g a s s h o w n i n F i g u r e 4 . T h e r e c t a n g u l a r 2 3 . Figure 3 . Top assembly (A) with sampling p o r t (B) and vent p o r t s (C), b o l t e d over the fermenter v e s s e l . 24. F i g u r e 4 . Assembly of the aluminum i m p e l l e r . 2 5 . p l a t e s w e r e a l u m i n u m w e l d e d o n t o t h e c o u p l i n g ( 3 . 2 c m O . D . , 1 . 6 c m I . D . x 2 . 5 c m t h i c k ) f o r m i n g 4 e q u a l q u a d r a n t s a t r i g h t a n g l e s t o e a c h o t h e r . T h e c o u p l i n g w a s a t t a c h e d t o t h e b o t t o m o f a n a l u m i n u m s h a f t , 1 . 6 c m d i a m e t e r x 5 3 . 5 c m l o n g , w i t h A l l e n s c r e w s ( F i g u r e 5 ) t o f o r m t h e a g i t a t o r . A n o t h e r s i m i l a r i m p e l l e r w i t h a l u m i n u m p l a t e s , 2 . 5 c m x 5 . 2 c m x 2 . 5 m m , w a s a t t a c h e d c l o s e t o t h e t o p h a l f o f t h e i m p e l l e r s h a f t . T h e p u r p o s e o f t h i s t o p i m p e l l e r w a s t o m e c h a n i c a l l y b r e a k t h e f o a m w h i c h b u i l t u p d u r i n g t h e c o u r s e o f t h e f e r m e n t a t i o n ( F i g u r e 6 ) . T h i s i m p e l l e r w a s p o s i t i o n e d o n t h e a l u m i n u m s h a f t s o t h a t i t w a s s l i g h t l y b e l o w t h e o p e n i n g o f t h e t o p a s s e m b l y . B o t h i m p e l l e r s w e r e p l a c e d o n t h e a l u m i n u m s h a f t i n s u c h a w a y a s t o d y n a m i c a l l y b a l a n c e t h e e n t i r e a g i t a t i o n a s s e m b l y . A b a l a n c e s y s t e m w a s r e q u i r e d t o p r e v e n t s h a f t w o b b l e d u r i n g i m p e l l e r o p e r a t i o n . T h e d i m e n s i o n s o f t h e a g i t a t i n g i m p e l l e r b l a d e s w e r e d e t e r m i n e d f r o m p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s o n t h e m e c h a n i c a l h e a t c o n t r i b u t i o n ( s e e p a g e s 4 2 a n d 4 3 ) . T h e f i n a l i m p e l l e r d i m e n s i o n s w e r e s u c h t h a t t h e g r e a t e s t a g i t a t i o n w o u l d b e p r o v i d e d w i t h m i n i m a l f r i c t i o n a l h e a t i n p u t i n t o t h e s y s t e m . D u r i n g t h e m e c h a n i c a l h e a t d e t e r m i n a t i o n e x p e r i m e n t , t h e s i z e o f t h e b l a d e s w e r e r e d u c e d a p p r o x i m a t e l y 1 / 8 " F i g u r e 5. A g i t a t o r assembled with i m p e l l e r p o s i t i o n e d on aluminum s h a f t . Impeller (A) i n p o s i t i o n , over the sparger (C), w i t h the foam-breaking i m p e l l e r (B) s i t u a t e d towards the top of the aluminum s h a f t . 2 8 . a t a t i m e ( o n a l l 4 b l a d e s t o m a i n t a i n t h e b a l a n c e ) u n t i l t h e m e c h a n i c a l h e a t i n p u t i n t o t h e s y s t e m w a s r e d u c e d t o t h e d e s i r e d l e v e l . T h e l i n e a r d i s t a n c e t r a v e l l e d b y t h e o u t s i d e e d g e o f e a c h b l a d e o f t h e i m p e l l e r w a s 1 8 9 m o v e r a p e r i o d o f 1 m i n f o r f e r m e n t e r #1 a n d 1 9 6 . 4 m / m i n f o r t h e s e c o n d f e r m e n t e r . 4 . B a f f l e s T h e f i n s f o r t h e b a f f l e w e r e c o n s t r u c t e d o f N o . 1 8 g a u g e ( B r o w n a n d S h a r p e ) a l u m i n u m p l a t e s 5 c m x 4 0 . 5 c m a n d h e l d t o g e t h e r b y c r o s s - m e m b e r i n g p i e c e s o f a l u m i n u m p l a t i n g o f t h e s a m e t h i c k n e s s , s e e F i g u r e s 2 a n d 6 . T h e s e w e r e j o i n e d w i t h a l u m i n u m p o p r i v e t s . T h e b a f f l e s w e r e f o r m e d i n t o a h o o p a n d w e r e s n u g l y f i t t e d i n t o t h e i n n e r s i d e s o f t h e p o l y p r o p y l e n e c o n t a i n e r s o f t h e f e r m e n t e r c e l l s . B a f f l e s w e r e r e q u i r e d t o p r e v e n t v o r t e x i n g o f t h e l i q u i d m e d i u m . I f t h e s u b s t r a t e " w h i r l p o o l e d " , t h e n m i x i n g w o u l d b e d e c r e a s e d . T h e b a f f l e s c r e a t e d a " W a r i n g b l e n d e r " e f f e c t i n w h i c h t h e s u b s t r a t e a t t h e s i d e w a s d e f l e c t e d t o w a r d s t h e c e n t e r o f t h e p o l y -p r o p y l e n e c o n t a i n e r . T h e r e s u l t w a s a m o r e c o n s t a n t , v i g o r o u s m i x i n g o f t h e s u b s t r a t e . 2 9 . 5 . T h e P o w e r T r a i n f o r t h e A g i t a t o r P o w e r w a s s u p p l i e d f r o m a J h . p . e l e c t r i c m o t o r ( C a n a d i a n G e n e r a l E l e c t r i c C o . , P e t e r b o r o u g h , O N ) . T h e s p e e d o f t h i s m o t o r ( 1 7 6 0 r . p . m . ) e x c e e d e d o u r r e q u i r e m e n t s a n d c r e a t e d e x c e s s i v e m e c h a n i c a l h e a t . A p u l l e y s y s t e m w a s d e v i s e d t o r e d u c e t h e s p e e d o f t h e i m p e l l e r . A 3 : 1 r a t i o ( m o t o r p u l l e y t o d r i v e s h a f t p u l l e y r a t i o ) w a s u s e d , t h u s r e d u c i n g t h e r . p . m . o f t h e a g i t a t o r b y a p p r o x i m a t e l y o n e t h i r d . T h e e x a c t n u m b e r o f r . p . m . o f t h e s h a f t . .was d e t e r m i n e d u s i n g a s t r o b e l i g h t . T h e a g i t a t o r s p e e d f o r f e r m e n t e r #1 w a s 5 8 4 r . p . m . a n d 6 0 7 r . p . m . f o r f e r m e n t e r # 2 . T h e d r i v e s h a f t a s s e m b l y w a s a n a l u m i n u m s h a f t o f t h e s a m e d i a m e t e r a s t h e a g i t a t o r s h a f t . T h i s d r i v e s h a f t w a s m o u n t e d i n a f i x e d p o s i t i o n j u x t a p o s e d t o t h e m o t o r . T w o p i l l o w b l o c k s o r c o l l a r b e a r i n g s w e r e u s e d t o a c c o m p l i s h t h i s f i x e d p o s i t i o n ( r e q u i r e d t o d e c r e a s e w o b b l i n g ) a n d a l s o t o a l l o w t h e s h a f t t o r o t a t e f r e e l y ( F i g u r e 7 ) . A n a l u m i n u m c o u p l i n g ( 3 . 8 c m d i a m e t e r x 4 . 8 c m l e n g t h ) w a s u s e d t o j o i n t h e a g i t a t o r s h a f t t o t h e d r i v e s h a f t ( F i g u r e s 6 a n d 7 ) . I t f o r m e d a s l e e v e o v e r e a c h 3 0 . F i g u r e 7 . D r i v e s y s t e m a s s e m b l y w i t h t h e a l u m i n u m c o u p l i n g ( A ) b e t w e e n t h e d r i v e s h a f t ( B ) a n d a g i t a t o r s h a f t ( C ) . 31. end of both s h a f t s to t r a n s f e r power to the i m p e l l e r and to reduce the wobbling e f f e c t . The c o u p l i n g f a c i l i -t a t e d s e t t i n g up or d i s m a n t l i n g the a g i t a t i o n system. 6. A e r a t i o n System A i r was s u p p l i e d to the fermenters by an a i r compressor (Webster.Co. , London, ON). A problem was c r e a t e d by t h i s r e c i p r o c a l compressor. The a i r f o r c e d from the compressor p u l s a t e d r a t h e r than flowed evenly. T h i s a i r a c t i o n d e t e r r e d the proper measurement of a i r flow through the a i r flow meters and a l s o caused an e x c e s s i v e v i o l e n t a c t i o n at the sparger. An a i r r e s e r v o i r system was u t i l i z e d u s i n g a 2 l i t e r p o l y v i n y l b o t t l e (Figure 8). The b o t t l e was packed with nonabsorbent c o t t o n . The c o t t o n decreased the p u l s a t i o n e f f e c t and a l s o acted as a f i l t e r a g a i n s t p a r t i c l e s from the a i r and o i l d r o p l e t s from the compressor. Two holes were bored i n t o the p l a s t i c b o t t l e , one towards the bottom and the other near the top. These holes were f i t t e d w ith p l a s t i c t u b i ng f i t t i n g s , as r e q u i r e d f o r t u b i n g attachment. The bottom hole was the a i r intake from the compressor while the top hole was the o u t l e t which l e d to the a i r flow meters. The b o t t l e top was used as a r e g u l a t o r to c o n t r o l the a i r flow. F i g u r e 8. A e r a t i o n s y s t e m w i t h a i r r e s e r v o i r - r e g u l a t o r ( A ) , t w i s t c o c k r e g u l a t o r s ( B ) a n d a i r f l o w m e t e r s ( C ) . 3 3 . 7 . F l o w M e t e r s T h e f l o w m e t e r s ( m o d e l n o . 3 , G i l m o n t I n s t r u m e n t s I n c . , G r e a t N e c k , N . Y . ) w e r e r e q u i r e d t o d e t e r m i n e t h e a m o u n t o f a i r i n p u t i n t o e a c h f e r m e n t e r . T h e y w e r e c h o s e n t o m e e t t h e s p e c i f i c c a p a c i t y r e q u i r e d i n t h e f e r m e n t a t i o n . E a c h a i r f l o w m e t e r w a s c a l i b r a t e d b y G i l m o n t a n d a g r a p h w a s s u p p l i e d t o o b t a i n t h e p r o p e r r e a d i n g s b y i n t e r p o l a t i o n . A n o t h e r r e g u l a t o r w a s a t t a c h e d p r e c e d i n g e a c h o f t h e a i r f l o w m e t e r s . B e s i d e s a c t i n g a s a i r f l o w r e g u l a t o r s , t h e t w i s t c o c k t u b i n g c o n n e c t o r s w e r e u s e d a s " c u t - o f f s " t o s t o p t h e a i r f l o w c o m p l e t e l y f r o m g o i n g i n t o t h e f e r m e n t e r ( F i g u r e 8) . 8 . S p a r g e r C o n s t r u c t i o n A i r e n t e r e d t h e f e r m e n t e r v i a t h e s p a r g e r w h i c h w a s p l a c e d o n t h e b o t t o m o f t h e f e r m e n t e r c e l l ( F i g u r e 6 ) . T h e s p a r g e r w a s c o m p o s e d o f a n a l u m i n u m t u b e w i t h a n a l u m i n u m o r h a r d t e f l o n s p a r g e r h e a d ( F i g u r e 9 ) . T h e a l u m i n u m t u b e , 7 mm O . D . x 5 mm I . D . , w a s b e n t i n t o a " J " c o n f i g u r a t i o n s o t h a t t h e s p a r g e r h e a d c o u l d b e s i t u a t e d u n d e r t h e :. i m p e l l e r . T h i s l o c a t i o n e n s u r e d d i s p e r s i o n o f t h e a i r b u b b l e s i n t h e f e r m e n t i n g l i q u o r b y t h e i m p e l l e r ( F i g u r e 6 ) . 34. F i g u r e 9. S p a r g e r a s s e m b l i e s , w i t h a l u m i n u m t u b i n g ( A ) a t t a c h e d t o t h e t e f l o n s p a r g e r h e a d ( B ) a n d t h e a l u m i n u m s p a r g e r h e a d ( C ) . 3 5 . T h e a l u m i n u m s p a r g e r h e a d w a s c o n s t r u c t e d o f a n a l u m i n u m b a r o f 1 . 3 c m d i a m e t e r . T h e c e n t e r o f t h e b a r w a s d r i l l e d ( 6 mm d i a m e t e r ) t o p r o v i d e p a s s a g e f o r t h e a i r . A l s o t h i s b o r e w a s t a p p e d f o r a t t a c h m e n t t o t h e a l u m i n u m t u b e w h i c h w a s t h r e a d e d . O n e e n d o f t h e s p a r g e r h e a d w a s c o u n t e r s u n k ( 1 c m d i a m e t e r x 6 mm d e e p ) t o r e c e i v e a s t a i n -l e s s s t e e l b a l l . T h i s b a l l b e a r i n g a c t e d a s a p l u g t o p r e -v e n t b a c k f l o w o f t h e f e r m e n t a t i o n l i q u o r i n t o t h e s p a r g e r w h i c h w o u l d i n t e r f e r e w i t h t h e a i r f l o w . T h e o u t s i d e o f t h e s p a r g e r h e a d w a s t h r e a d e d t o r e c e i v e a c a p w h i c h w a s u s e d t o r e t a i n t h e b a l l b e a r i n g i n p l a c e . E s s e n t i a l l y , t h e c a p w a s u s e d t o d i f f u s e o r b r e a k u p t h e a i r e n t e r i n g t h e s y s t e m . N u m e r o u s h o l e s ( 2 mm d i a m e t e r ) w e r e d r i l l e d i n t o t h i s c a p t o p r o v i d e t h e p r o p e r a i r d i f f u s i o n . A h a r d p l a s t i c ( t e f l o n ) s p a r g e r h e a d , s i m i l a r i n c o n s t r u c t i o n t o t h e a l u m i n u m h e a d , w a s a l s o u s e d . U n l i k e a l u m i n u m w h i c h t e n d e d t o d e c o m p o s e a f t e r s e v e r a l f e r m e n t a t i o n s , t h e h a r d p l a s t i c r e m a i n e d s t a b l e ( F i g u r e 1 0 ) . 9 . T u b i n g C o n n e c t i o n s P l a s t i c t u b i n g w a s u s e d t h r o u g h o u t t h e a e r a t i o n s y s t e m . W h e n c o n n e c t i o n s w e r e m a d e , f o r e x a m p l e , a t t h e r e g u l a t o r s o r a i r f l o w m e t e r s , e t c . , t h e s e c o n n e c t e d 36. F i g u r e 10. S p a r g e r h e a d a s s e m b l i e s c o n s i s t i n g o f t h e s t a i n l e s s s t e e l b a l l s ( A ) , t h e t e f l o n s p a r g e r h e a d ( B ) a n d t h e a l u m i n u m s p a r g e r h e a d ( C ) . j o i n t s w e r e h e l d o n w i t h w i r e s a n d t a p e t o p r e v e n t " b l o w o f f s " d u e t o t h e p r e s s u r e e x e r t e d b y t h e c o m p r e s s o r . 1 0 . M o n i t o r i n g ( s e e a l s o s e c t i o n o n " M e a s u r e m e n t s  T a k e n f r o m t h e F e r m e n t a t i o n T r i a l s " ) A c o p p e r - c o n s t a n t a n t h e r m o c o u p l e w a s u t i l i z e d t o m o n i t o r t h e t e m p e r a t u r e o f t h e s y s t e m . I t w a s a t t a c h e d t o t h e b a f f l e o n o n e o f t h e a l u m i n u m p l a t e s a n d p r o t r u d e d i n t o t h e f e r m e n t e r . I t l e d t h r o u g h a n o t c h p l a c e d i n t o t h e r u b b e r g a s k e t o n t h e t o p o f t h e f e r m e n t e r ( F i g u r e 11). A n e l e c t r o n i c t h e r m o c o u p l e i c e p o i n t ( O m e g a E n g i n e e r i n g , I n c . , S t a m f o r d , C T ) w a s u s e d a s r e f e r e n c e . T h i s w a s a t t a c h e d t o a d a t a r e c o r d e r ( D i g i t e c , U n i t e d S y s t e m s C o r p . , D a y t o n , O H ) o n w h i c h a " p r i n t o u t " w a s o b t a i n e d i n m i l l i v o l t ( m . v . ) r e a d i n g s ( F i g u r e 12). T h e s e m . v . r e a d i n g s w e r e t r a n s l a t e d i n t o t e m p e r a t u r e r e a d i n g s ( ° C ) u s i n g a c o n v e r s i o n t a b l e . 1 1 . C a l i b r a t i o n o f T h e r m o c o u p l e s T h e t h e r m o c o u p l e s u s e d w e r e c a l i b r a t e d w i t h t h e i r r e s p e c t i v e e l e c t r o n i c i c e p o i n t s a n d c h a n n e l p o s i -t i o n s o n t h e D i g i t e c r e c o r d e r . T h e e n d s o f t h e t h e r m o -c o u p l e s w e r e i m m e r s e d i n a n i c e b a t h a l o n g w i t h a 3 8 . F i g u r e 11. Thermocouples (A) p o s i t i o n e d w i t h i n the f e r -menter v e s s e l . 39. Figure 12. Data r e c o r d e r used to monitor the fermenta-t i o n temperatures along w i t h the e l e c t r o n i c thermocouple i c e p o i n t (A). 4 0 . t h e r m o m e t e r . A g i t a t i o n w a s p r o v i d e d t o b o t h t o p r e v e n t " h o t s p o t s " . T h e t h e r m o m e t e r r e a d i n g w a s r e c o r d e d s i m u l t -a n e o u s l y w i t h t h e m . v . r e a d i n g s f r o m t h e D i g i t e c . T h e m i l l i -v o l t r e a d i n g s w e r e c o n v e r t e d t o ° C u s i n g t h e c o n v e r s i o n t a b l e a n d b o t h r e s u l t s w e r e c o m p a r e d . H e a t w a s g r a d u a l l y a p p l i e d t o t h e i c e b a t h a n d t h e r e a d i n g s w e r e r e c o r d e d a n d c o m p a r e d u n t i l t h e t e m p e r a t u r e r e a c h e d a p p r o x i m a t e l y 8 0 ° C . 1 2 . L o c a t i o n o f t h e S y s t e m T h e e n t i r e f e r m e n t e r a s s e m b l y w a s l o c a t e d w i t h i n a w e l l i n s u l a t e d i n c u b a t o r r o o m ( F i g u r e 1 3 ) . H o w e v e r , t h i s p a r t i c u l a r r o o m h a d p o o r a i r c i r c u l a t i o n . T h e r e s u l t o f t h i s w a s a b u i l d u p o f a m b i e n t h e a t c a u s e d b y t h e m o t o r s a n d t h e a i r c o m p r e s s o r d u r i n g t h e o p e r a t i o n o f t h e f e r m e n t e r . T o c o n t r o l t h i s h e a t i n c r e a s e , a l a r g e f a n a n d h u m i d i f i e r w a s u s e d . T h i s n o t o n l y d e c r e a s e d t h e t e m p e r a t u r e i n t h e r o o m b u t t h e h u m i d i f i e r a l s o d e c r e a s e d t h e w a t e r l o s s f r o m t h e f e r m e n t a t i o n . T h e f a n w a s d i r e c t e d a t t h e m o t o r a n d t h e d r i v e s y s t e m t o d i s s i p a t e t h e h e a t o n t h e s y s t e m b e f o r e i t w a s c o n d u c t e d i n t o t h e f e r m e n t e r . 4 1 . F i g u r e 13. Fermenters assembled w i t h i n the i n s u l a t e d room. 4 2 . I I I . M e a s u r e m e n t s o f t h e S y s t e m C o n s t r u c t e d T h e s e t e s t s w e r e r e q u i r e d s i n c e h e a t i n p u t i n t o t h e s y s t e m b y s o u r c e s o t h e r t h a n f r o m t h e t h e r m o p h i l i c b a c -t e r i a w o u l d i n v a l i d a t e t h e e n t i r e p r o j e c t . T h e t o t a l m e c h -a n i c a l h e a t i n p u t i n t o t h e f e r m e n t e r w a s k e p t w e l l b e l o w t h e 5 0 ° C m a r k w h i c h w a s c o n s i d e r e d t o b e t h e s t a r t i n g t e m p -e r a t u r e f o r t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a l g r o w t h . 1 . M e c h a n i c a l H e a t I n p u t D e t e r m i n a t i o n F i f t y l i t r e s o f c o l d t a p w a t e r a l o n g w i t h a s m a l l a m o u n t o f b l e a c h w a s p l a c e d i n t o t h e f e r m e n t e r c e l l . T h e b l e a c h w a s u s e d t o s t o p o r i m p e d e t h e g r o w t h o f b i o l o g i c a l f l o r a , e . g . , a l g a e , b a c t e r i a , e t c . i n t h e w a t e r w h i c h m a y a f f e c t t h e d e t e r m i n a t i o n . T h e e n t i r e s y s t e m w a s a s s e m b l e d ( w i t h a s e t a i r f l o w , 9 0 0 m l / m i n ) a n d w a s o p e r a t e d u n t i l t h e t e m p e r a t u r e i n c r e a s e d t o a p l a t e a u . T h e m a x i m u m t e m p -e r a t u r e r e a c h e d w a s 4 1 . 4 ° C . T h i s w a s c o n s i d e r e d a c c e p t a b l e s i n c e i t w a s w e l l b e l o w 5 0 ° C . A d j u s t m e n t s w e r e m a d e t o t h e s y s t e m a c c o r d i n g l y t o o b t a i n t h e a b o v e t e m p e r a t u r e . 2 . M e c h a n i c a l H e a t I n p u t D e t e r m i n a t i o n i n t h e A b s e n c e  a i r s p a r g i n g M e d i u m c o o l i n g c a u s e d b y h e a t r e m o v a l t h r o u g h a e r a t i o n w a s c o n s i d e r e d t o b e a n i m p o r t a n t h e a t - l o s s 4 3 . f a c t o r . I n t h i s e v a l u a t i o n , a t a p w a t e r s y s t e m p r e v i o u s l y d e s c r i b e d w a s u s e d . T h e o p e r a t i o n o f t h e a g i t a t o r i n t h e a b s e n c e o f t h e a i r s p a r g i n g w a s m e a s u r e d . T h e s y s t e m w a s o p e r a t e d u n t i l a m a x i m u m t e m p e r a t u r e w a s r e a c h e d . T h i s v a l u e w a s c o m p a r e d t o t h e v a l u e o b t a i n e d f r o m t h e m e c h a n i -c a l h e a t i n p u t d e t e r m i n a t i o n w i t h a e r a t i o n . 3 . A d j u s t m e n t s T h e m e c h a n i c a l h e a t w a s d e c r e a s e d b y : d e c r e a s i n g t h e r a t e o f r o t a t i o n ( s p e e d o f t h e i m p e l l e r ) ; l i n e a r d i s -t a n c e t r a v e l l e d b y t h e i m p e l l e r ( i . e . , r . p . m . x i T d ) ; ( s e e s e c t i o n o n " S y s t e m f o r S u b s t r a t e A g i t a t i o n " ) a n d t h e i n s u -l a t i o n i n t h e f e r m e n t e r c e l l . 4 . M e c h a n i c a l H e a t D e t e r m i n a t i o n i n t h e P r e s e n c e  o f P o t a t o S o l i d s S i n c e i t c o u l d b e a r g u e d t h a t t h e w a t e r s y s t e m u t i l i z e d i n t h e a b o v e d e t e r m i n a t i o n w a s n o t i n d i c a t i v e o f a n a c t u a l f e r m e n t a t i o n , a m e d i u m c o n t a i n i n g 1 2 . 3 g % p o t a t o s o l i d s w a s u s e d . I t w a s t h o u g h t t h a t a d d i t i o n a l h e a t w o u l d b e c r e a t e d b y t h e i m p e l l e r w o r k i n g i n t h e " p u r e e - l i k e " p o t a t o m e d i u m . S o d i u m h y p o c h l o r i t e s o l u t i o n w a s a d d e d t o t h e p o t a t o s u b s t r a t e t o d e t e r t h e g r o w t h o f t h e m i c r o o r g a n i s m s 44. d u r i n g t h i s t e s t . N o a e r a t i o n w a s a p p l i e d t o t h e s y s t e m . T h i s d e t e r m i n a t i o n w a s c o n t i n u e d u n t i l a m a x i m u m t e m p e r a -t u r e w a s o b t a i n e d . 5 . H e a t L o s t f r o m t h e F e r m e n t e r C e l l T h e h e a t l o s t f r o m t h e f e r m e n t e r c e l l w a s d e t e r -m i n e d i n o r d e r t o e v a l u a t e t h e e f f e c t i v e n e s s o f t h e s u r -r o u n d i n g i n s u l a t i o n . F i f t y l i t e r s o f h e a t e d w a t e r , 7 9 . 5 ° C , w a s p o u r e d i n t o t h e f e r m e n t e r a n d t h e f e r m e n t e r t o p i n s t a l l e d t o g e t h e r w i t h f o u r e x h a u s t t u b i n g s . T h e a e r a t i o n s y s t e m w a s n o t a c t i v a t e d . T h e t e m p e r a t u r e d e c r e a s e w i t h i n t h e f e r m e n t e r w a s r e c o r d e d h o u r l y a s h e a t w a s l o s t f r o m t h e s y s t e m . 6 . H e a t L o s s D e t e r m i n a t i o n i n t h e P r e s e n c e o f  S u r f a c e F o a m A s a c o m p a r i s o n t o t h e p r e v i o u s d e t e r m i n a t i o n , t h e i n s u l a t i n g e f f e c t o f a f o a m l a y e r o n h e a t r e t e n t i o n w a s d e t e r m i n e d . D u r i n g a g i t a t i o n o f t h e a q u e o u s p o t a t o m e d i u m a h e a v y l a y e r o f f o a m i s f o r m e d . I n o r d e r t o i m i -t a t e t h e n o r m a l f e r m e n t a t i o n s y s t e m , a h o t w a t e r m e d i u m ( 6 9 . 6 ° C ) w a s u s e d c o n t a i n i n g a f o a m - f o r m i n g c o m m e r c i a l 4 5 . d i s h w a s h i n g d e t e r g e n t . A g i t a t i o n a n d a e r a t i o n w a s t u r n e d o n t o c r e a t e t h e h e a v y f o a m . T h r o u g h o u t t h e d e t e r m i n a t i o n , t h e s y s t e m w a s c o n t i n u a l l y r e p l e n i s h e d w i t h t h e d e t e r g e n t t o m a i n t a i n a c o n s t a n t f o a m l e v e l . I V . A n a l y s e s o f t h e T h e r m o p h i l i c F e r m e n t a t i o n s 1 . T h e P o t a t o S u b s t r a t e P o t a t o e s w e r e o b t a i n e d f r o m a l o c a l s u p e r m a r k e t u s u a l l y i n 2 2 . 7 k g ( 5 0 l b ) b o x e s . T h e g % t o t a l s o l i d s o f t h e p o t a t o e s w a s d e t e r m i n e d f o r e a c h b o x p r i o r t o t h e f e r m e n t a t i o n t r i a l s . A r a n d o m s a m p l i n g o f 5 - 6 m e d i u m s i z e p o t a t o e s w e r e o b t a i n e d f r o m t h r o u g h o u t t h e b o x . E a c h p o t a t o w a s g r o u n d a n d a p o r t i o n o f t h e m a c e r a t e p l a c e d i n t o a p r e w e i g h e d d r y i n g d i s h a n d o v e n - d r i e d a t 8 0 ° C t o a c o n s -t a n t w e i g h t a t a t m o s p h e r i c p r e s s u r e . K n o w i n g t h e g % t o t a l s o l i d s o f t h e p o t a t o e s , a s p e c i f i c a m o u n t o f p o t a t o w a s w e i g h e d f o r t h e f e r m e n t a -t i o n . T h e s e p o t a t o e s w e r e m a c e r a t e d a n d m i x e d w i t h t a p w a t e r w i t h i n t h e f e r m e n t e r . M a c e r a t i o n w a s a c c o m p l i s h e d w i t h a H o b a r t f o o d m i l l ( K i t c h e n A i d , M o d e l K 5 - A , H o b a r t M f g . C o . , T r o y , O H ) w i t h a n o . 3 s l i c i n g a t t a c h m e n t . T h e p o t a t o s l i c e s w e r e p a s s e d t h r o u g h t h e s l i c e r s e v e r a l t i m e s u n t i l s m a l l p i e c e s w e r e o b t a i n e d . T h e f i n a l w o r k i n g v o l u m e o f t h e f e r m e n t e r f o r a l l t h e f e r m e n t a t i o n t r i a l s w a s 5 0 1 . 2 . S a n i t a t i o n o f t h e F e r m e n t e r V e s s e l a n d A c c e s s o r i e s  P r i o r t o O p e r a t i o n A f t e r e a c h f e r m e n t a t i o n t r i a l , t h e f e r m e n t e r s w e r e e m p t i e d a n d t h o r o u g h l y w a s h e d w i t h c o m m e r c i a l d e t e r -g e n t . E a c h o f t h e o t h e r c o m p o n e n t s w e r e d i s m a n t l e d a n d a l s o w a s h e d . T h e e n t i r e s y s t e m w a s t h e n s o a k e d o r w a s h e d w i t h a p p r o x i m a t e l y 0 . 5 % h y p o c h l o r i t e s o l u t i o n . T h e w h o l e f l o o r a r e a a n d t h e o t h e r a f f e c t e d a r e a s ( i . e . , w a l l s a n d s h e l v e s ) o f t h e i n c u b a t o r r o o m w e r e w a s h e d w i t h h y p o c h l o r i t e . T h e f e r m e n t e r . a n d i t s c o m p o n e n t s w e r e r i n s e d f r e e o f h y p o -c h l o r i t e w i t h t a p w a t e r b e f o r e u s e . 3 . M e a s u r e m e n t s T a k e n f r o m t h e F e r m e n t a t i o n T r i a l s i ) T e m p e r a t u r e s T e m p e r a t u r e r e a d i n g s f o r t h e f e r m e n t a t i o n w e r e o b t a i n e d t h r o u g h a t h e r m o c o u p l e - r e c o r d e r s y s t e m a s p r e -v i o u s l y d e s c r i b e d . A s e c o n d t h e r m o c o u p l e w a s u s e d t o r e c o r d t h e a m b i e n t r o o m t e m p e r a t u r e o f t h e a r e a s u r r o u n d i n g t h e f e r m e n t e r . 4 7 . i i ) D i s s o l v e d O x y g e n a n d p H S a m p l e s w e r e r e m o v e d f r o m t h e f e r m e n t e r a t a p p r o x i -m a t e l y 1 2 h i n t e r v a l s . T h e h y d r o g e n i o n a c t i v i t y w a s . r e c o r d e d u s i n g a p H m e t e r . A d i s s o l v e d o x y g e n ( D . O . ) r e a d -i n g w a s a l s o t a k e n b y i m m e r s i n g t h e D . O . p r o b e d i r e c t l y i n t o t h e f e r m e n t a t i o n l i q u o r w i t h i n t h e f e r m e n t e r . T h e Y S I m o d e l 5 7 O x y g e n m e t e r a n d Y S I m o d e l 5 7 3 9 O x y g e n p r o b e ( Y e l l o w S p r i n g s I n s t r u m e n t s C o . , I n c . , Y e l l o w S p r i n g s , O H ) w a s c a l i b r a t e d u p t o 4 5 ° C b y t h e s u p p l i e r . F u r t h e r c a l i -b r a t i o n s w e r e r e q u i r e d t o m a t c h t h e t e m p e r a t u r e s e x p e c t e d f r o m t h e f e r m e n t a t i o n t o t h a t o f o x y g e n s a t u r a t i o n o f t h e m e d i u m . T h i s w a s d o n e b y , f i r s t , b u b b l i n g a i r i n t o a w a t e r b a t h a t 2 1 ° C u n t i l s a t u r a t i o n w a s r e a c h e d . T h i s r e a d i n g w a s r e c o r d e d . T h e t e m p e r a t u r e w a s t h e n i n c r e a s e d i n i n c r e -m e n t s t o a m a x i m u m o f 7 2 ° C w i t h a i r c o n t i n u o u s l y b u b b l i n g t h r o u g h t h e w a t e r b a t h . B o t h t e m p e r a t u r e a n d d i s s o l v e d o x y g e n r e a d i n g s w e r e r e c o r d e d a c c o r d i n g l y ( F i g u r e 1 4 ) . i i i ) T o t a l S o l i d s R e m a i n i n g i n t h e F e r m e n t e r  a n d T o t a l K j e l d a h l N i t r o g e n A p p r o x i m a t e l y e v e r y 1 2 h d u r i n g t h e c o u r s e o f t h e f e r m e n t a t i o n , a s a m p l e ( 2 5 0 m l ) w a s r e m o v e d f r o m t h e f e r m e n t e r . T h i s s a m p l e w a s f r o z e n a n d s t o r e d a t - 2 0 ° C p r i o r t o s u b s e q u e n t a n a l y s i s . P e r c e n t t o t a l s o l i d s w a s • — • - Instrument O—O - Calibrated o. • - o --o Ol i 1 ' 1 0 10 20 30 40 50 60 70 Temperature , °C Figure 14. Dissolved oxygen probe calibration curve for air saturated water at high temperatures. 4 9 . d e t e r m i n e d b y d r y i n g t h e s a m p l e i n a n o v e n a t 8 0 ° C t o a c o n s t a n t w e i g h t . T h e s a m e d r i e d s a m p l e w a s d i g e s t e d u s i n g t h e m e t h o d o f C o n c o n a n d S o l t e s s ( 1 6 ) p r i o r t o t h e m e a s u r e m e n t o f t o t a l K j e l d a h l n i t r o g e n w i t h t h e T e c h n i c o n A u t o A n a l y z e r . V . " T r u e " P r o t e i n N i t r o g e n U s i n g T r i c h l o r o a c e t i c A c i d ( T C A ) . . P r e c i p i t a t i o n S a m p l e s o f f e r m e n t e d p o t a t o a n d f r e s h p o t a t o e s w e r e g r o u n d i n d i v i d u a l l y i n a w a r i n g b l e n d e r . T o 5 m l o f s a m p l e , a 5 m l a l i q u o t o f a 1 0 % (W/.V) T C A w a s a d d e d . T h e . p r e p a r a t i o n w a s m i x e d a n d t h e n c e n t r i f u g e d ( I v a n S o r v a l l , N o r w a l k , C T ) a t 7 9 0 0 x g f o r 3 0 m i n . T h e r e s u l t i n g . p r e c i -p i t a t e w a s d i s c a r d e d a n d a f u r t h e r 1 m l o f 1 0 % T C A s o l u t i o n a d d e d t o e n s u r e c o m p l e t e n e s s i n p r e c i p i t a t i o n . T h e p r e p a r a t i o n w a s r e - c e n t r i f u g e d a t 7 9 0 0 x g f o r a n o t h e r 3 0 m i n a n d t h e s u p e r n a t a n t a n a l y z e d f o r n o n - p r o t e i n n i t r o g e n . T h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h i s v a l u e a n d t o t a l n i t r o g e n w a s c o n s i d e r e d t o r e p r e s e n t " T r u e p r o t e i n " n i t r o g e n . 5 0 . V I . A m i n o A c i d A n a l y s i s A n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d o n p o t a t o s a m p l e s r e m o v e d p r i o r t o t h e f e r m e n t a t i o n a n d o n t h e f e r m e n t e d r e s i d u e . S a m p l e p a r t i c l e s i z e w a s r e d u c e d u s i n g a W a r i n g b l e n d e r . T h e s a m p l e s w e r e b o i l e d t o t h e p o i n t o f s t a r c h g e l a t i n i z a - -t i o n , a n d l y o p h i l i z e d . A m i n o a c i d a n a l y s i s o f t h e s a m p l e s w a s c a r r i e d o u t i n t w o s t a g e s . A s e l e c t i v e a l k y l a t i o n o f t h e c y s t i n e a n d c y s t e i n e r e s i d u e i n t o 5 - g - ( 4 - p y r i d y l e t h y l ) - L - c y s t e i n e w a s d o n e a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f C a v i n s e t a l . ( 1 2 ) . T h e s e a u t h o r s f o u n d t h a t a l k y l a t i o n w a s r e q u i r e d t o s t a b i -l i z e t h e a b o v e r e s i d u e s u n d e r a c i d h y d r o l y s i s c o n d i t i o n s . H y d r o l y s i s o f t h e a l k y l a t e d s a m p l e s f o l l o w e d . T h i s w a s a c c o m p l i s h e d u s i n g p - t o l u e n e - s u l f o n i c a c i d a s s u g g e s t e d b y t h e , m e t h o d o f L i u a n d C h a n g ( 3 4 ) . T h i s d i g e s t e d m i x t u r e w a s t h e n f i l t e r e d t h r o u g h a n u l t r a - f i n e s i n t e r e d g l a s s f i l t e r ( A p p e n d i x A ) . T h e f i l t e r e d s a m p l e s w e r e a n a l y z e d o n a n a m i n o a c i d a n a l y z e r ( P h o e n i x P r e c i s i o n I n s t r u m e n t s C o . , P h i l a d e l p h i a , P A ) u t i l i z i n g a s i n g l e c o l u m n e l u t i o n s y s -t e m ( D u r r u m C h e m i c a l C o r p o r a t i o n , P a l o A l t o , C A ) . 51. VII. Microbial I d e n t i f i c a t i o n 1. Preparation of Isolation Media for N-Fixing Bacteria i) Yeast Carbon Base (YCB) Medium This nitrogen d e f i c i e n t media (Difco Laboratories, Detroit, MI) contains low amounts of nitrogen in the form of e s s e n t i a l nutrients and vitamins required for microbial growth. The medium was f i l t e r s t e r i l i z e d through a Type HA, 0.45 ym M i l l i p o r e membrane f i l t e r (Millipore F i l t e r Corp., Bedofrd, MA), mixed with s t e r i l e agar at 45°C and poured into s t e r i l e p e t r i dishes. i i ) Nitrogen Fixation Medium for Non-Symbiotic  S o i l Microorganisms This mineral medium was adapted from "A P r a c t i c a l Manual of S o i l Microbiology Laboratory Methods" (56) and is used for the i s o l a t i o n of Azotobacter species. A hard agar i s required for incubation of the cultures at 55°C; modification of this medium consisted of using 2.5% (W/V) agar. The media was autoclaved at 15 p s i (121°C) for 15 min, cooled to 45°C and poured in 100 mm x 15 mm s t e r i l e p l a s t i c p e t r i dishes. 5 2 . i i i ) N i t r o g e n - E i x i n g M e d i u m f o r G e n e r a A z o t o b a c t e r  a n d B e i j e r i n c k i a i n S o i l T h i s m i n e r a l m e d i u m w a s a d a p t e d f r o m M e i k l e j o h n ( 3 8 ) . I t i s c o m p o s e d o f t w o s o l u t i o n s , A a n d B , i n w h i c h 2.SI a g a r w a s u s e d i n s o l u t i o n A . B o t h s o l u t i o n s w e r e a u t o -c l a v e d s e p a r a t e l y a t 1 5 p s i (1,21 ° C ) f o r 1 5 m i n . T h e s o l u -t i o n s w e r e c o o l e d t o 5 0 ° C , a n d 1 0 m l o f s o l u t i o n B w e r e a d d e d t o A , m i x e d , a n d p o u r e d i n t o 1 0 0 mm x 1 5 mm s t e r i l e p e t r i d i s h e s . 2 . I s o l a t i o n o f t h e M i c r o o r g a n i s m A l i q u o t s o f t h e f e r m e n t a t i o n l i q u o r w e r e o b t a i n e d f r o m t h e f e r m e n t e r s u b s e q u e n t t o r e a c h i n g t h e t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e s . T h e s a m p l e s w e r e s t r e a k e d o n t o t h e 3 d i f f e r e n t p l a t e d m e d i a a n d i n c u b a t e d a t 5 5 ° C i n p l a s t i c b a g s t o p r e v e n t d e h y d r a t i o n . I n c u b a t i o n p e r i o d s r a n g e d f r o m 2 4 - 4 8 h . D u r i n g t h i s p e r i o d , v i s u a l l y d i s t i n c t c o l o n i e s w e r e i s o l a t e d a n d r e - i n o c u l a t e d o n n e w m e d i a . T h i s i s o l a t i o n p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d 6 t i m e s t o e n s u r e a p u r e c u l t u r e w h o s e g r o w t h w a s d e p e n d e n t o n t h e n u t r i e n t s s u p p l i e d b y t h e m e d i a a n d n o t b y t h e c a r r y - o v e r o f t h e f e r m e n t e r l i q u o r . 5 3 . 3 . V i s u a l A p p e a r a n c e o f t h e M i c r o b i a l C o l o n i e s I s o l a t e d m i c r o b i a l c o l o n i e s f r o m t h e 3 d i f f e r e n t m e d i a w e r e g r o w n o n B B L T r y p t i c a s e S o y A g a r ( B e c t o n , D i c k i n s o n a n d C o . , C o c k e y s v i l l e , M D ) p l a t e s . A f t e r 2 4 h o f g r o w t h , t h e c o l o n i e s w e r e e x a m i n e d f o r m o r p h o l o g y a n d c u l t u r a l c h a r -a c t e r i s t i c s a c c o r d i n g t o M i t r u k a a n d B o n n e r ( 3 9 ) . S e e A p p e n d i x B . 4 . G r a m R e a c t i o n C o l o n i e s f r o m t h e 3 m e d i a w e r e r e m o v e d a n d g r o w n o n T r y p t i c a s e S o y A g a r ( T S A ) . T h e c u l t u r e s w e r e G r a m s t a i n e d a f t e r 2 4 h a n d 4 8 h o r w h e n v i s i b l e g r o w t h o c c u r r e d . T h e G r a m r e a c t i o n , a g g l o m e r a t i o n ( g r o u p i n g s ) , a n d m o r p h o l o g y o f t h e c e l l s w e r e n o t e d . 5 . S p o r e S t a i n i n g ( W i r t z - C o n k l i n ) T h r e e t o f i v e - d a y o l d c u l t u r e s g r o w n o n T S A a t 5 5 ° C w e r e s u s p e n d e d i n a s t e r i l e w a t e r d r o p l e t a n d o b s e r v e d u n d e r p h a s e m i c r o s c o p y . T h e l o c a t i o n a n d n a t u r e o f t h e s p o r a n g i a w a s n o t e d . S p o r e s w e r e c o n f i r m e d b y s t a i n i n g w i t h a 5% s o l u t i o n o f m a l a c h i t e g r e e n a n d c o u n t e r s t a i n e d 5 4 . w i t h s a f r a n i n . T h e s p o r e s w e r e o b s e r v e d t o s t a i n g r e e n a g a i n s t r e d c y t o p l a s m u n d e r o i l i m m e r s i o n m i c r o s c o p y ( 3 3 ) . 6 . L i p i d S t a i n i n g ( B u r d o n ' s M e t h o d ) T h r e e - d a y o l d c o l o n i e s g r o w n o n T S A a t 5 5 ° C w e r e s t a i n e d f o r t h e p r e s e n c e o f l i p i d b o d i e s . S l i d e s w e r e h e a t f i x e d a n d f l o o d e d w i t h a S u d a n B l a c k B s o l u t i o n ( F i s h e r S c i e n t i f i c C o . , F a i r L a w n , N . J . ) f o r 1 0 m i n a n d x y l o l c l e a r e d . T h e y w e r e c o u n t e r s t a i n e d w i t h Z i e h l - N e e l s e n ' s C a r b o l - F u c h s i n ( 1 : 1 0 d i l u t i o n , s e e A p p e n d i x C ) f o r a p p r o x i -m a t e l y 3 s e c a n d t h e n r i n s e d . T h e c e l l s w e r e s t a i n e d r e d a n d t h e f a t g l o b u l e s w e r e b l u e - b l a c k i n c o l o u r ( 4 8 ) . 7 . M o t i l i t y A c o l o n y w a s s u s p e n d e d i n a s t e r i l e w a t e r d r o p l e t . U n d e r p h a s e m i c r o s c o p y w i t h o i l i m m e r s i o n , t h e c e l l s w e r e o b s e r v e d f o r m o v e m e n t i n e x c e s s o f B r o w n i a n m o v e m e n t . A 0.2% T S A g e l i n t u b e s w a s a l s o u s e d t o o b s e r v e c e l l m o t i l i t y . U s i n g t h i s m e t h o d , c u l t u r e s w e r e s t a b b e d i n t o t h e a g a r a n d i n c u b a t e d a t 5 5 ° C . P o s i t i v e r e s u l t s w e r e i n d i c a t e d v i s u a l l y b y d i f f u s i o n o f m i c r o b i a l c e l l s t h r o u g h t h e s o f t a g a r , ( 1 5 ) . 8. C a t a l a s e R e a c t i o n C o l o n i e s f r o m t h e 3 d i f f e r e n t c u l t u r e m e d i a w e r e g r o w n o n T S A s l a n t s a t 5 5 ° C . A f t e r s u f f i c i e n t g r o w t h w a s o b t a i n e d , a 3% h y d r o g e n p e r o x i d e s o l u t i o n w a s a d d e d t o t h e c o l o n i e s . A n i m m e d i a t e f o r m a t i o n o f b u b b l e s i n d i c a t e d a p o s i t i v e r e a c t i o n ( 3 3 ) . 9. A n a e r o b i c T e s t S t a b c u l t u r e s w e r e p r e p a r e d u s i n g t u b e s o f T S A . A f t e r i n c u b a t i o n f o r a p p r o x i m a t e l y 2 d , t h e l o c a t i o n o f g r o w t h w a s o b s e r v e d v i s u a l l y . G r o w t h o n t h e t o p o f t h e a g a r i n d i c a t e d a n a e r o b i c c u l t u r e w h e r e a s g r o w t h a l o n g t h e l e n g t h o f t h e s t a b i n d i c a t e d d e g r e e s o f a n a e r o b i s m . 10. O b l i g a t i v e A n a e r o b i c T e s t A s a c o n f i r m a t i o n . t o t h e . a b o v e t e s t , a f u r t h e r d e t e r m i n a t i o n w a s r e q u i r e d t o e s t a b l i s h w h e t h e r t h e o r g a n i s m w a s a f a c u l t a t i v e o r o b l i g a t i v e a n a e r o b e . A n a e -r o b i c j a r s w e r e u s e d w i t h a B B L G a s P a k a n d c a t a l y s t s y s t e m . A 1% m e t h y l e n e b l u e s o l u t i o n w a s i n c l u d e d i n t h e j a r a s a n i n d i c a t o r o f a n a e r o b i c c o n d i t i o n s . T S A p l a t e s w e r e i n o c u l a t e d a n d p l a c e d i n t o a n a e r o b i c j a r s b e f o r e t h e G a s P a k e n v e l o p e s w e r e a c t i v a t e d . I n c u b a t i o n w a s a t 55°C. 5 6 . 1 1 . V o g e s - P r o s k a u e r T e s t ( V - P ) T h e V o g e s - P r o s k a u e r t e s t i s u s e d t o d e t e r m i n e t h e p r e s e n c e o f a c e t y l m e t h y l c a r b i n o l ( a c e t o i n ) . A c e t o i n i s o x i d i s e d b y t h e r e a g e n t t o d i a c e t y l w h i c h p r o d u c e s a r e d c o l o u r w i t h a c o n s t i t u e n t o f t h e p e p t o n e m e d i u m ( 1 5 ) . F i v e m i l l i l i t e r s o f V - P m e d i a o f G o r d o n e t a ] ( 2 2 ) w e r e p l a c e d i n t o t e s t t u b e s , c a p p e d a n d a u t o c l a v e d a t 1 5 p s i ( 1 2 1 ° C ) f o r 1 5 m i n . T h e c u l t u r e s w e r e p r e p a r e d f r o m c o l o n i e s i s o l a t e d f r o m 3 d i f f e r e n t m e d i a . E a c h o f t h e c u l t u r e s w e r e i n o c u -l a t e d i n t r i p l i c a t e a n d i n c u b a t e d f o r 3 , 5 a n d 7 d . A t t h e e n d o f t h e s e t i m e p e r i o d s , t h e p r e s e n c e o f a c e t o i n w a s t e s t e d f o r b y a d d i n g 3 m l o f a 4 0 % ( W / V ) N a O H s o l u t i o n t o t h e c u l t u r e a l o n g w i t h a p p r o x i m a t e l y 0 . 7 5 . m g o f 9 0 % c r e a t i n e ( E a s t m a n O r g a n i c C h e m i c a l s , R o c h e s t e r , N . Y . ) . A r e d c o l o u r a f t e r 3 0 t o 6 0 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e i n d i c a t e s t h e p r e -s e n c e o f a c e t o i n . 1 2 . p H i n V o g e s - P r o s k a u e r B r o t h B e f o r e t h e c u l t u r e s w e r e t e s t e d f o r a c e t o i n , t h e p H o f t h e 7 d o l d c u l t u r e s w e r e m e a s u r e d b y u s i n g a p H m e t e r . T h e i n i t i a l p H o f t h e V - P b r o t h a f t e r s t e r i l i z a t i o n w a s a l s o m e a s u r e d t o s e r v e a s a c o n t r o l c o m p a r i s o n . 5 7 . 1 3 . M e t h y l R e d T e s t V o g e s - P r o s k a u e r m e d i a w a s u s e d f o r t h e m e t h y l r e d a c i d i t y t e s t ( s e e V o g e s - P r o s k a u e r t e s t ) . T e n m i l l i -l i t e r s o f t h e V - P b r o t h i n d u p l i c a t e t u b e s w e r e i n c u b a t e d f o r 6 d a y s . A t t h e e n d o f t h i s t i m e i n t e r v a l , 5 m l f r o m e a c h c u l t u r e w a s p i p e t t e d i n t o a s e p a r a t e e m p t y t u b e a n d 5 d r o p s o f m e t h y l r e d s o l u t i o n w e r e a d d e d a n d t h e t u b e s h a k e n . T h e m e t h y l r e d s o l u t i o n w a s c o m p o s e d o f 0 . 1 g o f m e t h y l r e d i n 3 0 0 m l e t h a n o l ( 9 5 1 ) p l u s 2 0 0 m l d i s t i l l e d w a t e r . A r e d c o l o r a t i o n i n d i c a t e s a p o s i t i v e t e s t a n d y e l l o w a n e g a t i v e t e s t . 1 4 . T e m p e r a t u r e R a n g e D e t e r m i n a t i o n T r i p l i c a t e t u b e s o f c u l t u r e s i n t r y p t i c a s e s o y b r o t h w e r e i n c u b a t e d a t a c o n s t a n t t e m p e r a t u r e i n w a t e r b a t h s a t v a r y i n g t e m p e r a t u r e s . C u l t u r e t u b e s s h o w -i n g g r o w t h a t t e m p e r a t u r e s a b o v e 5 5 ° C w e r e r e c o r d e d a f t e r a t h r e e - d a y p e r i o d . C u l t u r e s i n c u b a t i n g b e t w e e n r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 1 ° C ) t o 3 0 ° C w e r e i n c u b a t e d u p t o 2 w e e k s . D e t e r m i n a t i o n o f t h e c u l t u r e s m a x i m u m g r o w t h t e m p e r a t u r e i n v o l v e d t h e g r o w t h o f t h e d i f f e r e n t c u l t u r e s a t e a c h o f t h e f o l l o w i n g t e m p e r a t u r e s : 6 0 , 6 5 , 7 0 a n d 7 5 ° C . A t t h e s e h i g h e r t e m p e r a t u r e s , a n e t h y l e n e g l y c o l 5 8 . b a s e ( G u l f O i l , C a n a d a . L t d . , T o r o n t o , O N ) w a s u s e d i n t h e c o n s t a n t t e m p e r a t u r e w a t e r b a t h t o d e c r e a s e e v a p o r a -t i o n . T h e l o w t e m p e r a t u r e r a n g e d e t e r m i n a t i o n s i n v o l v e d g r o w t h o f t h e c u l t u r e s a t 5 5 , 5 0 , 4 5 , 4 0 , 3 5 , 3 0 , 2 5 ° C a n d a t r o o m t e m p e r a t u r e ( 2 1 ° C ) . 1 5 . G r o w t h i n L y s o z y m e T h e l y s o z y m e s o l u t i o n w a s p r e p a r e d b y a d d i n g 0 . 1 g o f l y s o z y m e ( B g r a d e , C a l b i o c h e m , L o s A n g e l e s , C A ) i n a p p r o x i m a t e l y 6 0 m l o f s t e r i l e 0 . 0 1 N H C 1 i n a 1 0 0 m l v o l u m e t r i c f l a s k . T h i s m i x t u r e w a s c a r e f u l l y b o i l e d f o r 2 0 m i n . A f t e r b o i l i n g , t h e f l a s k w a s p l u g g e d w i t h s t e r i l i z e d n o n - a b s o r b a n t c o t t o n a n d a l l o w e d t o c o o l t o r o o m t e m p e r a t u r e . T h e v o l u m e w a s m a d e u p t o 1 0 0 m l w i t h s t e r i l e 0 . 0 1 : N H C 1 . F r o m t h i s l y s o z y m e s o l u t i o n , 1 m l w a s r e m o v e d a n d m i x e d w i t h 9 9 m l o f s t e r i l e n u t r i e n t b r o t h . T h i s w a s d i s p e n s e d i n 2 . 5 m l a l i q u o t s i n t o s t e r i l e p l u g g e d t e s t t u b e s a n d i n o c u l a t e d w i t h c u l t u r e s p r e v i o u s l y g r o w n i n n u t r i e n t b r o t h . A l s o t u b e s o f 0 . 0 0 1 % l y s o z y m e a n d n u t r i e n t b r o t h w e r e i n o c u l a t e d a s c o n t r o l c o m p a r i s o n s . G r o w t h w a s r e c o r d e d a t 7 a n d 1 4 d . 5 9 . 1 6 . G r o w t h i n N a C l T u b e s c o n t a i n i n g n u t r i e n t b r o t h w e r e i n o c u l a t e d w i t h c o l o n i e s f r o m t h e 3 i s o l a t i o n m e d i a a n d i n c u b a t e d f o r 4 8 h . T h e n u t r i e n t b r o t h c u l t u r e s t h e n s e r v e d a s a n i n o c u l u m f o r n u t r i e n t b r o t h t u b e s c o n t a i n i n g 0 , 5 , 7 a n d 1 0 % ( w / v ) o f s o d i u m c h l o r i d e . P a r a f i l m w a s u s e d t o s e a l t h e c a p s o f t h e t e s t t u b e s t o d e c r e a s e e v a p o r a t i o n . T h e N a C l - b r o t h w a s i n c u b a t e d a t 5 5 ° C f o r 7 a n d 1 4 d . 1 7 . G r o w t h i n S o d i u m A z i d e A z i d e d e x t r o s e b r o t h ( F i s h e r G r a m - P a c , F i s h e r S c i e n t i f i c C o . , P i t t s b u r g , P A ) w a s p r e p a r e d a s d i r e c t e d b y t h e m a n u f a c t u r e r . D u p l i c a t e t u b e s w e r e i n o c u l a t e d w i t h c u l t u r e s p r e v i o u s l y g r o w n o n n u t r i e n t b r o t h . T h e c a p s o f t h e t e s t t u b e s w e r e w r a p p e d w i t h p a r a f i l m t o p r e v e n t d e h y -d r a t i o n . T h e t u b e s w e r e i n c u b a t e d a t 5 5 ° C a n d o b s e r v e d f o r g r o w t h a t 7 a n d 1 4 d . 1 8 . p H R a n g e T e s t B B L t r y p t i c a s e s o y b r o t h ( B e c t o n , D i c k i n s o n a n d C o . , C o c k e y s v i l l e , M D ) w a s p r e p a r e d a n d t h e p H a d j u s t e d ( i n i t i a l p H 7 . 3 ) w i t h I N H C l o r I N N a O H t o y i e l d a s e r i e s 6 0 . o f m e d i a w i t h p H r a n g i n g f r o m 3 t o 1 1 i n 1 u n i t i n c r e m e n t s . A 1 0 m l p o r t i o n o f e a c h o f t h e s e m e d i a w a s f i l t e r s t e r i -l i z e d t h r o u g h a T y p e H A , 0 . 4 5 y m M i l l i p o r e m e m b r a n e s y s t e m ( M i l l i p o r e F i l t e r C o r p . , B e d f o r d , M A ) i n t o s t e r i l e t e s t t u b e s . D u p l i c a t e t u b e s w e r e p r e p a r e d a n d i n o c u l a t e d w i t h a c u l t u r e p r e v i o u s l y g r o w n i n n u t r i e n t b r o t h f r o m t h e 3 i s o l a t i o n m e d i a . T h e c a p s o f t h e t e s t t u b e s w e r e w r a p p e d w i t h p a r a f i l m a n d t h e t u b e s w e r e i n c u b a t e d a t 5 5 ° C . C o n t r o l m e d i a t u b e s w i t h a n d w i t h o u t i n o c u l u m w e r e u s e d f o r e a c h o f t h e p H r a n g e s t e s t e d . T h e c u l t u r e t u b e s w e r e o b s e r v e d o v e r a 7 d p e r i o d f o r t h e p r e s e n c e o f g r o w t h . F o l l o w i n g t h e d e t e r m i n a t i o n o f t h e p H a t w h i c h t h e v a r i o u s c u l t u r e s s h o w e d g r o w t h i n h i b i t i o n , a m o r e f i n i t e r a n g e o f 0 . 1 p H i n c r e m e n t s w e r e u s e d t o r e d e t e r m i n e t h e s e g r o w t h s e n s i t i v e a r e a s . 1 9 . A c i d F o r m a t i o n f r o m C a r b o h y d r a t e S u b s t r a t e s A m o d i f i e d A y e r s , R u p p a n d J o h n s o n ( 3 ) b a s a l m e d i a w i t h 2 . 5 % ( w / v ) a g a r w a s p r e p a r e d . F i f t e e n m i l l i l i t e r s o f a 0 . 0 4 % ( w / v ) s o l u t i o n o f b r o m o c r e s o l p u r p l e ( E a s t m a n O r g a n i c C h e m i c a l s , R o c h e s t e r , N . Y . ) w e r e a d d e d a n d t h e m e d i u m s t e r i l i z e d a t 1 5 p s i ( 1 2 1 ° C ) f o r 1 5 m i n . T e n p e r c e n t ( w / v ) a q u e o u s s o l u t i o n s o f D ( + ) -g l u c o s e , L ( + ) - a r a b i n o s e , D ( + ) - x y l o s e a n d D ( - ) - m a n n i t o l w e r e s t e r i l i z e d b y a u t o c l a v i n g a t 1 5 p s i ( 1 2 1 ° C ) f o r 1 5 m i n . P r i o r t o s o l i d i f i c a t i o n o f t h e b a s a l m e d i u m , t h e t e s t c a r b o h y d r a t e w a s a d d e d t o y i e l d a f i n a l c o n c e n -t r a t i o n o f 0 . 5 % ( w / v ) a n d p o u r e d i n t o 1 0 0 mm x 1 5 mm s t e r i l e p l a s t i c p e t r i p l a t e s . T h e c u l t u r e g r o w t h a n d t h e p r o d u c t i o n o f a c i d o n e a c h o f t h e c a r b o h y d r a t e s w a s n o t e d a f t e r 7 d a n d 1 4 d p e r i o d s . 2 0 . S t a r c h H y d r o l y s i s S t a r c h a g a r w a s p r e p a r e d a c c o r d i n g t o B l a i r , L e n n e t t e a n d T r u a n t ( 5 ) . T h e m e d i u m w a s a u t o c l a v e d a t 1 5 p s i ( 1 2 1 ° C ) f o r 3 0 m i n a n d d i s p e n s e d i n t o 1 0 0 mm x 1 5 mm s t e r i l e p l a s t i c p e t r i d i s h e s . C o l o n i e s f r o m t h e 3 i s o l a t i o n m e d i a w e r e s t r e a k e d o n t o t h e p l a t e s a n d i n c u b a t e d a t 5 5 ° C . W h e n g o o d g r o w t h w a s o b t a i n e d , s t a r c h h y d r o l y s i s w a s t e s t e d b y f l o o d i n g a s m a l l p o r t i o n o f t h e p l a t e w i t h G r a m ' s i o d i n e . T h e a b s e n c e o f s t a r c h h y d r o l y s i s w a s i n d i c a t e d b y a d a r k b l u e c o l o r i n t h e i m m e d i a t e v i c i n i t y o f t h e c u l t u r e ; a p a r t i a l o r c o m p l e t e h y d r o l y s i s o f s t a r c h w a s i n d i c a t e d b y a r e d d i s h c o l o r o r b y n o v i s i b l e c o l o r c h a n g e i n t h e m e d i u m . 6 2 . 2 1 . U t i l i z a t i o n o f S o d i u m C i t r a t e a n d S o d i u m P r o p i o n a t e U t i l i z a t i o n o f s o d i u m c i t r a t e a n d s o d i u m p r o p i o n a t e a s c a r b o n s o u r c e s w a s m e a s u r e d b y u s i n g a m o d i f i c a t i o n o f K o s e r ' s c i t r a t e a g a r ( 3 0 ) . T h e m e d i u m i s c o m p o s e d o f 0 . 2 % ( w / v ) , s o d i u m c i t r a t e o r s o d i u m p r o p i o n a t e ; 0 . 1 % ( w / v ) , N a C l ; 0 . 0 2 1 ( w / v ) , M g S 0 4 - 7 H 2 0 ; 0 . 0 5 % ( w / v ) , ( N H 4 ) 2 H P 0 4 a n d 2 . 5 % ( w / v ) , a g a r . A l s o , 2 . 0 % ( v / v ) o f a 0 . 0 4 % ( w / v ) s o l u t i o n o f p h e n o l r e d w a s a d d e d , w i t h t h e p H o f t h e m e d i u m a d j u s t e d t o 6 . 8 p r i o r t o a u t o c l a v i n g . T h e m e d i u m w a s h e a t e d t o d i s s o l v e t h e a g a r a n d d i s p e n s e d i n t o t e s t t u b e s . I t w a s a u t o c l a v e d a t 1 5 p s i ( 1 2 1 ° C ) f o r 1 5 m i n a n d s o l i d i f i e d a s s l a n t s . C u l t u r e s g r o w n o n n u t r i e n t b r o t h f r o m t h e 3 i s o l a t i o n m e d i a w e r e s t r e a k e d o n t o t h e s l a n t s . A p a r a f i l m w a x w r a p w a s u s e d a r o u n d t h e c a p s t o p r e v e n t d e h y d r a t i o n d u r i n g i n c u b a t i o n . T h e u t i l i z a t i o n o f t h e s e t w o o r g a n i c a c i d s w a s e s t a b l i s h e d i f t h e a l k a l i n e c o l o r o f p h e n o l r e d a p p e a r e d a f t e r a 2 w e e k i n c u b a t i o n p e r i o d , v i z . , c u l t u r e s s h o w y e l l o w a t p H 6 . 8 a n d t u r n r e d a t p H 8 . 2 . 2 2 . R e d u c t i o n o f N i t r a t e t o N i t r i t e C u l t u r e s w e r e g r o w n i n a n i t r a t e b r o t h p r e p a r e d a c c o r d i n g t o G o r d o n , H a y n e s a n d P a n g ( 2 2 ) . T e n m i l l i l i t e r s 63. o f m e d i u m w a s d i s p e n s e d i n t o t e s t t u b e s a n d a u t o c l a v e d a t 1 5 p s i ( 1 2 1 ° C ) f o r 1 0 m i n . T h e i n c u b a t i o n p e r i o d w a s f o r 3 , 7 a n d 1 4 d ; t h r e e s e t s o f t r i p l i c a t e t u b e s f o r e a c h c u l t u r e f r o m t h e 3 i s o l a t i o n m e d i a w e r e m a d e . P a r a f i l m w r a p s w e r e u s e d f o r t h e c a p s t o p r e v e n t e v a p o r a -t i o n w i t h i n c u b a t i o n a t 5 5 ° C . A t t h e e n d o f e a c h i n c u b a - . . t i o n p e r i o d , t h e c u l t u r e s w e r e t e s t e d b y m i x i n g 1 m l o f c u l t u r e w i t h 3 d r o p s f r o m e a c h o f t h e f o l l o w i n g 2 t e s t s o l u t i o n s : a ) s u l f a n i l i c a c i d , 0 . 8 g ( M a l l i n c k r o d t , S t . L o u i s , M O ) d i s s o l v e d i n 1 0 0 m l . o f 5 N a c e t i c a c i d ( g l a c i a l a c e t i c a c i d a n d d i s t i l l e d w a t e r i n 1 : 2 . 5 ) ; b ) d i m e t h y l n a p t h y l a m i n e , 0 . 6 g ( S i g m a C h e m i c a l C o . , S t . L o u i s , M O ) d i s s o l v e d i n 1 0 0 m l o f 5 N a c e t i c a c i d . E i t h e r a r e d o r y e l l o w c o l o r d e v e l o p m e n t r e s p e c t i v e l y i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f n i t r i t e . I f a f t e r t h e f o u r -t e e n t h d a y , t h e c u l t u r e s d i d n o t r e a c t p o s i t i v e , 4 t o 5 m g o f z i n c d u s t w a s a d d e d t o t h e t u b e s w h i c h p r e v i o u s l y w e r e t e s t e d f o r n i t r i t e . T h i s w a s t o d e m o n s t r a t e t h e a b s e n c e o f r e d u c t i o n o r t h a t n i t r a t e w a s s t i l l p r e s e n t i n t h e m e d i a . A r e d c o l o r a t i o n w o u l d i n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f N O j . T h i s r e s i d u a l n i t r a t e t e s t i s r e q u i r e d a f t e r 1 4 d a y s b e c a u s e s o m e o r g a n i s m s c a n r e d u c e t h e n i t r a t e b e y o n d t h e n i t r i t e v e r y r a p i d l y s o t h a t t h e p r e s e n c e o f n i t r i t e m a y n o t b e d e t e c t e d a f t e r t h e t h i r d d a y o f i n c u b a t i o n . 6 4 . 2 3 . D i h y d r o x y a c t o n e P r o d u c t i o n A g l y c e r o l a g a r w a s p r e p a r e d u s i n g t h e p r o c e d u r e o f G o r d o n , H a y n e s a n d P a n g ( 2 2 ) . T h i s m e d i u m w a s a u t o c l a v e d a t 1 5 p s i ( 1 2 1 ° C ) f o r 1 5 m i n , c o o l e d a n d p o u r e d i n t o s t e r i l i z e d p l a s t i c p e t r i p l a t e s . T h e i n o c u l u m w a s s t r e a k e d o n c e a c r o s s t h e p l a t e a n d i n c u b a t e d f o r 1 0 d . A f t e r i n c u b a t i o n , t h e p l a t e s w e r e f l o o d e d w i t h F e h l i n g ' s s o l u t i o n . F e h l i n g ' s s o l u t i o n A w a s c o m p o s e d o f C u S O ^ - S F ^ O , 3 4 . 6 6 g a n d d i s t i l l e d w a t e r , 5 0 0 m l . F e h l i n g ' s s o l u t i o n B w a s c o m p o s e d o f K N a C ^ H ^ O ^ • 4 H 2 0 ( s o d i u m p o t a s s i u m t a r t r a t e o r R o c h e l l e s a l t ) , 1 7 3 g ; N a O H , 5 0 g a n d d i s t i l l e d w a t e r , 5 0 0 m l . B o t h s o l u t i o n A a n d B w e r e k e p t r e f r i g e r a t e d u n t i l n e e d e d , a n d a m i x t u r e o f A a n d B i n a 1 : 1 r a t i o w a s u s e d . A p p r o x i m a t e l y 2 h l a t e r , t h e p l a t e s w e r e e x a m i n e d f o r t h e p r e s e n c e o f a r e d h a l o a r o u n d t h e c o l o n i e s w h i c h i n d i c a t e d t h e p r o d u c t i o n o f d i h y d r o x y a c e t o n e . 2 4 . P r o d u c t i o n o f I n d o l e C u l t u r e s f r o m t h e 3 i s o l a t i o n m e d i a w e r e i n o c u -l a t e d i n t o s t e r i l e t u b e s c o n t a i n i n g 1 0 m l o f I I ( w / v ) o f t r y p t o n e b r o t h ( D i f c o ) a n d a 11 ( w / v ) o f t r y p t i c a s e s o y b r o t h ( B B L ) . T r i p l i c a t e t u b e s w e r e m a d e f o r e a c h c u l t u r e a n d i n c u b a t e d a t 5 5 ° C f o r 1 4 d . T h e c a p s w e r e 6 5 . w r a p p e d w i t h p a r a f i l m w a x . A f t e r i n c u b a t i o n , 2 m l o f a t e s t s o l u t i o n w a s a d d e d t o e a c h o f t h e c u l t u r e s a n d s h a k e n . T h i s t e s t s o l u t i o n c o n s i s t s o f p a r a d i m e t h y l -a m i n o b e n z a l d e h y d e ( E a s t m a n O r g a n i c C h e m i c a l s , R o c h e s t e r , N . Y . ) , 5 g , i s o - a m y l a l c o h o l ( J . T . B a k e r C h e m i c a l C o . , P h i l l i p s b u r g , N . J . ) , 7 5 m l a n d c o n c e n t r a t e d H C 1 , 2 5 m l . T h e p r e s e n c e o f i n d o l e w a s i n d i c a t e d w h e n t h e a l c o h o l l a y e r t u r n e d p i n k t o r e d ( 2 2 ) . 2 5 . D e a m i n a t i o n o f P h e n y l a l a n i n e S l a n t s o f p h e n y l a l a n i n e a g a r w e r e p r e p a r e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f G o r d o n , H a y n e s a n d P a n g ( 2 2 ) . D u p l i c a t e t u b e s w e r e m a d e f o r e a c h o f t h e c u l t u r e s f r o m t h e 3 i s o l a t i o n m e d i a . I n c u b a t i o n w a s f o r 7 a n d 2 1 d a t 5 5 ° C , w i t h a l l c a p s w r a p p e d i n p a r a f i l m w a x . A t e s t s o l u t i o n o f 1 0 1 ( w / v ) F e C l ^ w a s u s e d t o i n d i c a t e t h e f o r m a t i o n o f p h e n y l p y r u v i c a c i d f r o m p h e n y l a l a n i n e . F o u r o r f i v e d r o p s o f t h i s s o l u t i o n w e r e p i p e t t e d o v e r t h e g r o w t h o n t h e s l a n t s . A g r e e n c o l o r a t i o n o f t h e a g a r b e n e a t h t h e c o l o n i e s i n d i c a t e d t h e f o r m a t i o n o f p h e n y l p y r u v i c a c i d . 6 6 . 2 6 . D e c o m p o s i t i o n o f C a s e i n T e n g r a m s o f B a c t o - s k i m m i l k p o w d e r ( D i f c o ) d i s s o l v e d i n 1 0 0 m l o f d i s t i l l e d w a t e r a n d 2 . 5 g o f a g a r i n 1 0 0 m l o f d i s t i l l e d w a t e r w e r e a u t o c l a v e d s e p a r a t e l y a t 1 5 p s i ( 1 2 1 ° C ) f o r 1 5 m i n , c o o l e d t o a b o u t 4 5 ° C , m i x e d t o g e t h e r , a n d p o u r e d i n t o 6 0 mm x 1 5 mm s t e r i l e p l a s t i c p e t r i d i s h e s . T h e p l a t e s w e r e k e p t a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 d t o d r y t h e s u r f a c e o f t h e a g a r b e f o r e i n o c u l a t i o n . D u p l i c a t e p l a t e s f r o m e a c h o f t h e 3 i s o l a t e d c u l t u r e s w e r e m a d e . I n o c u l a t i o n w a s b y a s i m p l e s t r e a k a n d t h e p l a t e s w e r e i n c u b a t e d f o r 7 a n d 1 4 d . A f t e r t h e i n c u b a -t i o n p e r i o d s , t h e p l a t e s w e r e e x a m i n e d f o r c l e a r i n g a r o u n d a n d b e n e a t h t h e c o l o n i e s , i n d i c a t i n g c a s e i n d e c o m p o s i t i o n ( 2 2 ) . 2 7 . D e c o m p o s i t i o n o f T y r o s i n e O n e g r a m o f L - t y r o s i n e ( E a s t m a n O r g a n i c C h e m i c a l s , R o c h e s t e r , N . Y . ) w a s s u s p e n d e d i n 2 0 m l o f d i s t i l l e d w a t e r . S i m i l a r l y , 4 . 6 g o f n u t r i e n t a g a r ( D i f c o ) w i t h a n a d d i t i o n a l 3 g o f a g a r w a s p r e p a r e d i n 2 0 0 m l o f d i s -t i l l e d w a t e r . T h e s e w e r e a u t o c l a v e d s e p a r a t e l y a t 1 5 p s i ( 1 2 1 ° C ) f o r 1 5 m i n , c o o l e d t o a b o u t 4 5 ° C a n d t h o r o u g h l y m i x e d t o g e t h e r . T h e r e s u l t i n g m e d i a w a s p o u r e d i n t o 6 0 mm x 1 5 mm s t e r i l e p l a s t i c p e t r i d i s h e s e n s u r i n g t h a t t h e r e w a s a n e v e n d i s t r i b u t i o n o f L - t y r o s i n e c r y s t a l s t h r o u g h o u t t h e s o l i d i f i e d a g a r . T h e p l a t e s w e r e k e p t a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 3 d t o d r y t h e a g a r s u r f a c e a n d t h e n i n o c u l a t e d b y a s i n g l e s t r e a k . D u p l i c a t e p l a t e s w e r e m a d e f o r e a c h i s o l a t e d c u l t u r e . A f t e r 7 a n d 1 4 d o f i n c u b a t i o n , t h e p l a t e s w e r e e x a m i n e d f o r c l e a r i n g b e n e a t h t h e g r o w t h ( 2 2 ) . 2 8 . R e a c t i o n i n L i t m u s M i l k L i t m u s m i l k w a s p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g 1 0 0 g o f B a c t o - s k i m m i l k p o w d e r a n d 0 . 7 5 g o f l i t m u s p o w d e r ( J . T . B a k e r C h e m i c a l C o . , P h i l l i p s b u r g , N . J . ) i n t o 1 1 o f d i s t i l l e d w a t e r . F i f t e e n m i l l i l i t e r s w e r e d i s p e n s e d : ; i n t o t u b e s a n d a u t o c l a v e d a t 1 5 p s i ( 1 2 1 ° C ) f o r 1 5 m i n . . . T h e t u b e s w e r e i n o c u l a t e d , w i t h 6 r e p l i c a t e s f o r e a c h c u l t u r e . T h r e e o f t h e t u b e s w e r e c o v e r e d w i t h p a r a f f i n o i l ( F i s h e r S c i e n t i f i c C o . , F a i r L a w n , N . J . ) f o r l i t m u s r e d u c t i o n d e t e r m i n a t i o n . F o l l o w i n g i n c u b a t i o n f o r 7 a n d 1 4 d , t h e c u l t u r e s w e r e o b s e r v e d f o r c o l o r a n d r e d u c -t i o n o f t h e i n d i c a t o r , f o r m a t i o n o f c u r d , g a s a n d d i g e s -t i o n o f c a s e i n ( 2 2 ) . 6 8 . E X P E R I M E N T A L R E S U L T S A N D D I S C U S S I O N I. C o m p o s i t i o n o f t h e C a u s t i c S o d a P o t a t o P e e l W a s t e s A n a l y s e s o f t h e p r o c e s s i n g p l a n t s a m p l e s w e r e r e q u i r e d t o o b t a i n i n f o r m a t i o n o n t h e c o m p o s i t i o n o f t h e w a s t e m a t e r i a l . T h i s w a s r e q u i r e d t o d e t e r m i n e t h e s u i t a b i l i t y o f t h e c a u s t i c p o t a t o p e e l w a s t e a s a s u b s t r a t e f o r t h e t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n . F o u r w a s t e s a m p l e s w e r e r e m o v e d f r o m t h e p o t a t o p e e l e r d u r i n g t h e c o u r s e o f a l y e p e e l i n g p r o c e s s . I t w a s c o n s i d e r e d t h a t t h e s a m p l e s w e r e f a i r l y r e p r e s e n t a t i v e o f t h e w a s t e t h a t w a s d i s c h a r g e d f r o m t h i s p a r t i c u l a r p e e l i n g p r o c e s s . 1. C a r b o n - N i t r o g e n R a t i o , C a r b o n - P h o s p h o r u s R a t i o a n d  M o i s t u r e C o n t e n t R e q u i r e m e n t s U t i l i z a t i o n o f p o t a t o w a s t e a l o n e w a s q u e s t i o n -a b l e . A s a s o l e f e r m e n t a t i o n s u b s t r a t e , i t w a s c o n s i d e r e d d e f i c i e n t i n s o m e e s s e n t i a l n u t r i e n t r e q u i r e m e n t s f o r g r o w t h a n d m a i n t e n a n c e o f t h e m i c r o o r g a n i s m s . T h e r e w a s d e f i n i t e l y a q u e s t i o n c o n c e r n i n g i t s n i t r o g e n a v a i l a -b i l i t y . S i n c e t h e a v a i l a b l e n i t r o g e n i n t h e w a s t e w a s 6 9 . l o w ( a s c o m p a r e d t o c a r b o n , T a b l e 1 ) , i t w a s t h o u g h t a n i n s u f f i c i e n t a m o u n t w a s p r e s e n t t o m a i n t a i n a p r o l o n g e d f e r m e n t a t i o n . T h e l o s s o f t h e e l e m e n t i n t h e f o r m o f a m m o n i a o r s o m e o t h e r g a s e o u s b y - p r o d u c t d u r i n g t h e c o u r s e o f t h e f e r m e n t a t i o n w a s a p o s s i b i l i t y . S i n c e t h e g r o w t h a n d m a i n t e n a n c e o f t h e o r g a n i s m s d e p e n d s o n a c a r b o n t o n i t r o g e n r a t i o ( C / N ) r a n g i n g f r o m 9 . 7 : 1 t o 1 8 . 3 : 1 ( 8 ) ; i t w a s t h o u g h t t h a t t h i s r e q u i r e m e n t h a d t o b e m e t o r t h e a t t a i n m e n t a n d / o r m a i n t e n a n c e o f a t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n w o u l d b e d i f f i c u l t . E v e n a C / N r a t i o g r e a t e r t h a n 7 . 5 w a s c o n s i d e r e d n i t r o g e n l i m i t i n g ( 8 , 1 3 ) . S u r u c u e t a l ( 5 5 ) , d e v e l o p e d a c h e m i c a l l y d e f i n e d m e d i u m c o n t a i n -i n g g l u c o s e a s t h e c a r b o n s o u r c e a n d a m m o n i u m c h l o r i d e a s t h e n i t r o g e n s o u r c e f o r t h e c u l t u r i n g o f a m i x e d p o p u -l a t i o n o f t h e r m o p h i l i c o r g a n i s m s . T h e y f o u n d t h e m i x e d c u l t u r e , o b t a i n e d f r o m s o i l , s t r e a m w a t e r , r a w w a s t e w a t e r a n d s i l a g e , t o b e c o m p r i s e d o f a m i x t u r e o f o r g a n i s m s h a v i n g d i f f e r e n t a n d m o r e d e m a n d i n g n u t r i t i o n a l r e q u i r e -m e n t s f o r g r o w t h . F o r m u l a t i o n o f t h e i r m e d i u m c o n s t i t u t e s a C / N r a t i o o f 3 . 4 5 f o r t h e m i x e d t h e r m o p h i l i c c u l t u r e . T o t h ( 5 7 ) s t a t e d t h a t t h e n i t r o g e n c o n t e n t a n d t h e C / N r a t i o o f t h e o r g a n i c s w i l l l a r g e l y d e t e r m i n e t h e r a t e o f d e c o m p o s i t i o n a n d t h a t e x t r a n i t r o g e n m u s t b e a d d e d t o e n s u r e d e c o m p o s i t i o n . A l m o s t a l l o r g a n i c w a s t e t h a t 7 0 . T a b l e 1 . C o m p o s i t i o n o f c a u s t i c p o t a t o p e e l w a s t e a n d f r e s h p o t a t o . C a u s t i c P o t a t o P e e l r W a s t e , • % " D r y W e i g h t U n p e e l e d F r e s h P o t a t o , % D r y W e i g h t T o t a l K j e l d a h l N i t r o g e n 1 . 7 - 2 . 0 C a r b o n A n a l y s e s T o t a l C a r b o n I n o r g a n i c C a r b o n O r g a n i c C a r b o n 4 5 . 8 1 . 5 6 4 4 . 2 4 4 3 . 6 1 . 7 3 4 1 . 8 7 T o t a l P h o s p h o r o u s T o t a l S o d i u m A s h 0 . 0 3 1 5 . 6 6 1 9 . 9 0 . 0 2 8 ( 0 . 0 2 1 ) 0 . 0 4 ( 0 . 0 3 ) 9 . 9 ( 5 . 6 ) ' M o i s t u r e C o n t e n t 8 8 . 9 7 9 . 2 D r y M a t t e r C o n t e n t 1 1 . 1 2 0 . 8 p H 1 2 . 5 a R e s u l t s o b t a i n e d f o r f r e s h , p e e l e d p o t a t o e s . 7 1 . c o n t a i n s 1 . 5 t o 2 . 5 % t o t a l n i t r o g e n r e q u i r e s t h e a d d i t i o n o f e x t r a n i t r o g e n . T h e r e f o r e , a n a l y s e s w e r e r e q u i r e d f o r t h e a m o u n t s o f c a r b o n a n d n i t r o g e n p r e s e n t i n t h e s a m p l e . T o t a l K j e l d a h l n i t r o g e n o f t h e f o u r p l a n t s a m p l e s t e s t e d v a r i e d f r o m 1 . 7 t o 2.0%, o n . a d r y w e i g h t b a s i s , o r a n a v e r a g e o f 1.9% o r a n a v e r a g e c r u d e p r o t e i n c o n t e n t ( N x 6 . 2 5 ) o f 1 1 . 9 % . T h e s t o r e b o u g h t o r f r e s h p o t a t o e s y i e l d e d a n a v e r a g e v a l u e f o r t o t a l K j e l d a h l n i t r o g e n o f 1 . 8 % , o n a d r y w e i g h t b a s i s , s e e T a b l e 1 . T h e s e v a l u e s w e r e s i m i l a r t o r e p o r t e d l i t e r a t u r e v a l u e s o f 1.8% - 2.0% ( 4 7 , 5 1 ) . T o t a l c a r b o n a n a l y s i s o f t h e p l a n t s a m p l e s g a v e a n a v e r a g e v a l u e o f 4 5 . 8 0 1 , o n a d r y w e i g h t b a s i s . F r e s h s t o r e b o u g h t p o t a t o e s h a d a 4 3 . 6 0 1 t o t a l c a r b o n c o n t e n t . A v e r a g e v a l u e s f o r i n o r g a n i c c a r b o n f o r t h e p l a n t s a m p l e s a n d f r e s h p o t a t o e s w e r e 1 . 5 6 1 a n d 1 . 7 3 % , r e s p e c t i v e l y . T h e d i f f e r e n c e o f t h e a b o v e t w o d e t e r m i n e d v a l u e s ( t o t a l c a r b o n - i n o r g a n i c c a r b o n ) g i v e s a n a v e r a g e o r g a n i c c a r b o n v a l u e o f 4 4 . 2 4 % f o r t h e p l a n t s a m p l e s a n d 4 1 . 8 7 % f o r t h e f r e s h s t o r e b o u g h t p o t a t o . T h e r e f o r e , c o n s i d e r i n g t h e a m o u n t o f a v a i l a b l e K j e l d a h l ( o r g a n i c ) n i t r o g e n p r e s e n t i n t h e p l a n t s a m p l e a n d t h e a m o u n t o f c a r b o n p r e s e n t , t h e r a t i o o f c a r b o n t o n i t r o g e n r e p r e s e n t s 4 5 . 8 : 1 . 9 o r 2 4 . 1 : 1 ( t o t a l o r g a n i c 7 2 . C t o t o t a l o r g a n i c N r e p r e s e n t s 4 4 . 2 4 : 1 . 9 o r 2 3 . 3 : 1 ) . I t w a s t h o u g h t t h a t a d d i t i o n o f a n i t r o g e n s o u r c e w a s r e q u i r e d t o d e c r e a s e t h i s r a t i o . T h e n u t r i e n t c o n s i d e r e d w a s u r e a s i n c e i t w a s r e a d i l y a v a i l a b l e a n d f a i r l y x i n e x p e n s i v e . A n i n i t i a l f e r m e n t a t i o n t r i a l ( F i g u r e 1 5 ) w a s p e r f o r m e d w i t h f r e s h l y m a c e r a t e d p o t a t o e s . S i n c e t h e C / N r a t i o w a s s i m i l a r t o t h e p r o c e s s i n g p l a n t s a m p l e s , n o a d d i t i o n a l n i t r o g e n w a s a d d e d t o t h e s u b s t r a t e . T h i s i n i t i a l t r i a l h a d a t h r e e f o l d o b j e c t i v e : 1 ) t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e r m o p h i l i c c o n d i t i o n s w e r e o b t a i n a b l e , a n d , i f c o n d i t i o n s w e r e r e a c h e d , w h a t w o u l d b e t h e d u r a t i o n o f t h e t h e r m o p h i l i c p e r i o d ? A n d t h u s , d e t e r m i n e t h e a m o u n t o f n i t r o g e n n e e d e d t o p r o l o n g a n d i n t e n s i f y t h e f e r m e n t a -t i o n ; 2 ) t o c o r r e c t a n d i m p r o v e t h e m e c h a n i c a l c o m p o n e n t s o f t h e s y s t e m a n d 3 ) t o u t i l i z e t h e f r e s h p o t a t o f e r m e n t a -t i o n a s a c o n t r o l f o r t h e e v e n t u a l f e r m e n t a t i o n t r i a l w i t h t h e c a u s t i c s o d a - t r e a t e d p o t a t o . S u r p r i s i n g l y , e v e n i n t h e p r e s e n c e o f l o w n i t r o g e n c o n t e n t , t h e r m o p h i l i c c o n d i t i o n s w e r e r e a c h e d a n d w e r e r e a s o n a b l y p r o l o n g e d . T h i s w a s c o n s i d e r e d e x t r e m e l y i m p o r t a n t a n d a d v a n t a g e o u s , s i n c e a d d i t i o n a l c o s t s o f a n i t r o g e n s o u r c e t o t r e a t t h i s w a s t e p r o d u c t w o u l d n o t b e r e q u i r e d . F u r t h e r d i s c u s s -i o n o n t h i s i s c o n t i n u e d i n a l a t e r s e c t i o n . 10.0 8.0 I a 70 60 50 O o <u 2 40 a E 6.0 L 4.0 L 2.0 L 30 20L 10 L • — • - Temperature of fermentation A — A - pH of fermentation 'A A—AA-/ A A' / / / . A - A — A - A \ 10 20 30 40 80 90 50 60 70 Time , hours of operation Figure 15- Thermophilic fermentat ion of a potato waste substrate, initial trial 73 7 3 . .4.A.-A . -A-A • —A-A—A A-A-— A-A' -A A A'A A 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 7 4 . T h e o t h e r e l e m e n t c o n s i d e r e d e s s e n t i a l f o r p r o p e r b a c t e r i a l m e t a b o l i s m i s p h o s p h o r u s . S i n c e n i t r o g e n a n d p h o s p h o r u s a r e r e q u i r e d f o r s y n t h e s i s o f c e l l u l a r m a t e r i a l , t h e s e s u b s t a n c e s a r e n e e d e d i n a m o u n t s r e l a t e d t o t h e n e t c e l l u l a r g r o w t h w i t h i n t h e c a p a c i t y o f t h e f e r m e n t a t i o n s y s t e m . T o t a l p h o s p h o r u s d e t e r m i n a t i o n s h o w e d t h e c a u s t i c p o t a t o p e e l w a s t e f r o m t h e p r o c e s s i n g p l a n t t o b e 0 . 0 3 1 % , a s c o m p a r e d t o 0 . 0 2 8 % p h o s p h o r u s f r o m f r e s h , u n p e e l e d p o t a t o ( a n d 0 . 0 2 1 % f o r f r e s h , p e e l e d p o t a t o ) . L i t e r a t u r e ( 5 1 ) h a s c i t e d v a l u e s o f 0 . 0 9 3 % p h o s p h o r u s i n w h o l e s t a r c h g r a n u l e s o f p o t a t o e s . T h e s e v a l u e s a r e d e p e n d e n t o n n u m e r o u s f a c t o r s s u c h a s v a r i e t a l c h a r a c t e r i s t i c s , m a t u r i t y , s t o r a g e a n d p h o s p h o r u s c o n t e n t o f t h e s o i l i n w h i c h t h e p o t a t o e s w e r e g r o w n . B u s c h ( 8 ) q u o t e d r a t i o s o f 5 1 . 4 : 1 t o 8 5 . 7 : 1 o f c a r b o n t o p h o s p h o r u s a s t h e r a n g e f o r p h o s p h o r u s r e q u i r e m e n t . C o n v e r t i n g t h e v a l u e s o b t a i n e d f o r t h e c a u s t i c p o t a t o w a s t e s a m p l e s y i e l d e d a t o t a l c a r b o n t o t o t a l p h o s p h o r u s r a t i o o f 1 4 7 7 . 4 : 1 , a v a l u e w h i c h w a s f a r b e l o w t h e m i n i m u m p h o s p h o r u s r e q u i r e m e n t s . H o w e v e r , a s p r e v i o u s l y s t a t e d , t h e r m o p h i l i c c o n d i t i o n s w e r e o b t a i n e d i n t h e i n i t i a l f e r m e n t a t i o n w i t h t h e e x i s t i n g n u t r i e n t p r o f i l e . A n e s s e n t i a l r e q u i r e m e n t , i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e m e t a b o l i t e s r e q u i r e d f o r b a c t e r i a l m e t a b o l i s m , i s t h e a v a i l a b i l i t y o f w a t e r f o r t h e b i o c h e m i c a l s y s t e m s t o r e a c t . W a t e r c o n t e n t i s i m p o r t a n t i n t h i s p a r t i c u l a r f e r m e n t a t i o n i n c o n s i d e r a t i o n o f t h e p h y s i c a l n a t u r e o f t h e s u b s t r a t e . T h e m o i s t u r e c o n t e n t o f t h e s u b s t r a t e p l a y s a n i m p o r t a n t r o l e i n d e c o m p o s i t i o n r a t e s o f t h e s o l i d s . A n a l y s e s o f t h e f o u r p r o c e s s i n g p l a n t s a m p l e s s h o w e d a n a v e r a g e d r y m a t t e r c o n t e n t o f 1 1 . 1 g % , o r a m o i s t u r e c o n t e n t o f 8 8 . 9 % . T h e s o l i d m a t t e r c o n t e n t o f f r e s h p o t a t o a v e r a g e d 2 0 . 8 % o r a m o i s t u r e c o n t e n t o f 7 9 . 2 % . T h e r e f e r e n c e l i t e r a t u r e ( 5 1 ) q u o t e s a v e r a g e p e r c e n t v a l u e s f o r p o t a t o e s t o b e 2 2 . 5 g % t o t a l s o l i d s w i t h t h e w a t e r c o n t e n t o f 7 7 . 5 % . T h e h i g h e r m o i s t u r e c o n t e n t o f t h e p r o c e s s i n g p l a n t s a m p l e s c o m e s f r o m t h e w a t e r a d d e d d u r i n g p r o c e s s i n g . 2 . O t h e r F a c t o r s A f f e c t i n g t h e F e r m e n t a t i o n o f  t h e S u b s t r a t e T h e c a u s t i c p o t a t o p e e l w a s t e s a m p l e s o b t a i n e d f r o m t h e d i s c h a r g e o f t h e m e c h a n i c a l s c r u b b e r ( F i g u r e 1 ) h a d a p H o f 1 2 . 5 . T h i s p H v a l u e w a s w i t h i n t h e r a n g e ( 1 1 . 9 - 1 2 . 7 ) r e p o r t e d i n t h e l i t e r a t u r e ( 6 ) . I n o r d e r t o m a i n t a i n t h i s a l k a l i n i t y , a b o u t 2 p o u n d s o f s o d i u m h y d r o x i d e w e r e u s e d p e r 1 0 0 0 p o u n d s o f p o t a t o e s f o r t h e p e e l i n g p r o c e s s . , s u b s e q u e n t l y f o r m i n g a p p r o x i m a t e l y 1 2 5 p o u n d s o f s p e n t c a u s t i c p e e l w a s t e ( 6 ) . D u e t o t h e h i g h c o n c e n t r a t i o n o f l y e w i t h i n t h e p e e l w a s t e , p r o b l e m s a r e e n c o u n t e r e d i n f i n d i n g a s u i t a b l e m e t h o d o f d i s p o s a l . F o r e x a m p l e , t h e h i g h a l k a l i n i t y o f t h e w a s t e i n h i b i t s b a c t e r i a l i n i t i a t i o n a n d t h u s t h e f e r m e n t a t i o n o r d e g r a -d a t i o n p r o c e s s d o e s n o t s t a r t p r o m p t l y . T h e h i g h c o n c e n t r a t i o n o f s o d i u m h y d r o x i d e w i l l a l s o i n h i b i t t h e i n i t i a t i o n o f a f e r m e n t a t i o n b y t h e r m o p h i l i c o r g a n i s m s . N e u t r a l i z a t i o n o f t h e s u b s t r a t e w a s r e q u i r e d , b u t i t w a s t h o u g h t t h a t e v e n a t n e u t r a l i t y t h e h i g h s o d i u m c o n t e n t m a y s t i l l h a v e a d e t r i m e n t a l e f f e c t o n m i c r o b i a l g r o w t h . T h e a m o u n t o f s o d i u m p r e s e n t i n t h e s a m p l e s w a s d e t e r m i n e d , n o t o n l y f o r i t s e f f e c t o n t h e r m o p h i l i c m i c r o b i a l g r o w t h b u t a l s o f o r t h e p o s s i -b l e u t i l i z a t i o n o f t h e f e r m e n t e d r e s i d u e a s l i v e s t o c k f e e d . I n t h e l a t t e r c a s e , t h e d e t r i m e n t a l e f f e c t o f a h i g h s o d i u m c o n t e n t i n t h e f e r m e n t e d r e s i d u e c a n b e d i m i n i s h e d w i t h t h e a d d i t i o n o f s i l a g e . A n a l y s e s b y a t o m i c a b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o -m e t r y s h o w e d t h a t t h e p r o c e s s i n g p l a n t s a m p l e c o n t a i n e d 7 7 . a n a v e r a g e o f 5 . 6 6 % s o d i u m , a s c o m p a r e d t o 0 . 0 4 % f o r f r e s h , u n p e e l e d p o t a t o a n d 0 . 0 3 % f o r f r e s h l y p e e l e d p o t a t o . T h i s v a l u e w a s a l s o i m p o r t a n t i n t h a t f e r m e n t a t i o n s w e r e e v e n t u a l l y c o n d u c t e d d u p l i c a t i n g t h i s a m o u n t o f s o d i u m i n t h e l a b o r a t o r y e x p e r i m e n t s b y a d d i n g s o d i u m h y d r o x i d e i n t o f r e s h l y m a c e r a t e d p o t a t o . T h i s , o f c o u r s e , w a s t o s i m u l a t e t h e p r o c e s s i n g p l a n t w a s t e . T h e r e s u l t s o f t h i s f e r m e n t a t i o n w i l l b e d i s c u s s e d i n a l a t e r s e c t i o n . P r e l i m i n a r y a n a l y s e s o f t h e c o m p o s i t i o n o f c a u s t i c p o t a t o p e e l w a s t e s a n d t h e f r e s h s t o r e b o u g h t p o t a t o c o m p a r e d f a v o u r a b l y ( T a b l e 1 ) . V a r i a t i o n s o c c u r r e d i n t h e s o d i u m c o n t e n t a n d t h e a s h c o n t e n t o f t h e s a m p l e s . T h e v a l u e s o b t a i n e d f o r t h e a s h d e t e r m i n a t i o n w e r e 1 9 . 9 % f o r t h e c a u s t i c p o t a t o p e e l w a s t e v e r s u s 9 . 9 % f o r f r e s h , u n p e e l e d p o t a t o a n d 5 . 6 % f o r f r e s h , p e e l e d p o t a t o . T h e h i g h e r a s h c o n t e n t o f t h e c a u s t i c p o t a t o p e e l w a s t e c a n b e a c c o u n t e d f o r b y t h e p r e s e n c e o f t h e c a u s t i c s o d a . F r o m t h e p r e l i m i n a r y a n a l y s e s o f t h e p o t a t o w a s t e s , a g e n e r a l i d e a c a n b e o b t a i n e d a s t o w h e t h e r a f e r m e n t a t i o n c a n b e i n i t i a t e d w i t h t h e p o t a t o p e e l w a s t e i n i t s e x i s t i n g f o r m , o r , w h e t h e r t h e w a s t e r e q u i r e s a p o s s i b l e p r e - t r e a t m e n t i n t h e f o r m o f t h e a d d i t i o n o r t h e d e l e t i o n o f c e r t a i n e l e m e n t s . T h e r e s u l t s o f t 78 . the above analyses are summarized i n Table 1. Fresh, pH a d j u s t e d , potato macerate was used to simulate p r o c e s s -ing p l a n t samples on the b a s i s of the above r e s u l t s . T h i s was r e q u i r e d s i n c e seasonal manufacturing of potato c h i p s by the p r o c e s s i n g p l a n t r e s t r i c t e d the a v a i l a b i l i t y of the c a u s t i c p e e l waste samples. I I . Assembly and Measurements of the Thermophilic Fermen- t a t i o n System 1. C o n s t r u c t i o n of the Fermentation System Development of t h i s p a r t i c u l a r t h e r m o p h i l i c fermentation system to i t s present s t a t e , as s t a t e d i n the M a t e r i a l s and Methods, was by numerous t r i a l and e r r o r experiments u s i n g water and potato systems. Var i o u s components were a l t e r e d or i n c o r p o r a t e d to i n c r e a s e the e f f i c i e n c y of the system i n which u n d e s i r a b l e mechanical breakdowns were negated. These changes were adapted a l s o to improve the o p e r a t i o n a l s t a b i l i t y and the c o n t r o l -l a b i l i t y o f the f e r m e n t a t i o n d u r i n g the course of an extended t r i a l . 7 9 . For example, the top assembly was i n c o r p o r a t e d a f t e r the i n i t i a l potato f e r m e n t a t i o n t r i a l . I t was used to prevent s o l i d s being l o s t due to foaming. Subs-t r a t e foaming was the major problem encountered d u r i n g the i n i t i a l stages of the f e r m e n t a t i o n of potato waste. S o l i d s l o s t from the fermenter w i l l r e s u l t i n a higher s o l i d s degradation value than what was a c t u a l l y decomposed by the thermophiles. The problem was r e s o l v e d by s e a l i n g the foam w i t h i n the fermenter c e l l , thus c o n f i n i n g the s o l i d s . The i n c o r p o r a t i o n of a rubber s e a l around the fermenter c e l l formed a s u f f i c i e n t s e a l to prevent foam from escaping. The u t i l i z a t i o n of a mechanical foam breaker i n the form of an: i m p e l l e r , s i t u a t e d j u s t below the opening i n the top assembly, a l l e v i a t e d the foam accumulating beneath the l i d by p h y s i c a l l y d e s t r o y i n g the e x c e s s i v e foam. F i n a l l y , a sponge soaked w i t h a n t i -foam was used as a s e a l around the i m p e l l o r s h a f t opening i n the fermentor top, thus e l i m i n a t i n g any foam from escaping. The a e r a t i o n system was m o d i f i e d to i n c l u d e the i n c o r p o r a t i o n of a s t a i n l e s s s t e e l b a l l (Figure 10) i n t o the sparger head i n order to prevent the i n f i l t r a t i o n of the s u b s t r a t e i n t o the sparger l i n e s . The s t a i n l e s s 80. s t e e l b a l l acted as a p l u g to prevent the entrance of potato s o l i d s i n t o the sparger l i n e s d u r i n g l i n e p r e ssure f l u c t u a t i o n s . The entrance of the potato s u b s t r a t e i n t o the sparger l i n e s not only i n t e r f e r e d w i t h the a i r flow but a l s o i n c r e a s e d the back-pressure i n the a e r a t i o n l i n e s , r e s u l t i n g i n "blow o f f s " at t u b i n g connections. Besides the two examples p r o v i d e d above, other f a c t o r s a f f e c t i n g the f e r m e n t a t i o n were a l l e v i a t e d or decreased as much as p o s s i b l e (see M a t e r i a l s and Methods). Those v a r i a b l e s which s t i l l a f f e c t e d the outcome of the f e r m e n t a t i o n were determined and measured. 2. Measurements of Heat Input from the System  Constructed Mechanical heat produced by f r i c t i o n w i t h i n the system was an important c o n s i d e r a t i o n i n v o l v e d i n determining the thermal energy r e l e a s e d by m i c r o b i a l metabolism. The growth of the m i c r o f l o r a i n i t i a l l y found on macerated potato was e s t a b l i s h e d i n t h i s study to r e l e a s e s u f f i c i e n t energy to r a i s e the s u b s t r a t e through the m e s o p h i l i c ambient temperatures up i n t o the thermo-p h i l i c range. I f e x c e s s i v e mechanical heat was produced t. 8 1 . by the system i t would complicate the i n t e r p r e t a t i o n given to the r o l e of the heat producing organisms. That i s , i f mechanical heat input r e s u l t e d i n c r e a t i n g a fermen-t i n g medium temperature g r e a t e r than 5 0 ° C , i t c o u l d be argued t h a t the heat produced was not due to the c o n t r i -b u t i o n of the t h e r m o p h i l i c orgamisms. A l s o , i t was r e a -l i z e d that e x c e s s i v e mechanical heat may p r o g r e s s i v e l y s e l e c t orgamisms from the i n i t i a l mixed m i c r o f l o r a based on t h e i r growth r a t e s and t h e i r a b i l i t y to compete at temperatures a t t a i n e d d u r i n g the course of the f e r m e n t a t i o n . A r t i f i c i a l media systems were used to determine the mechanical heat input i n t o the s u b s t r a t e . F i f t y l i t e r s of c o l d tap water were p l a c e d i n t o the fermenter and a g i t a t e d along w i t h an input of 9 0 0 ml/min of a i r . This volume of a i r input i n 5 0 1 of water was determined to y i e l d 5 . 5 ppm of d i s s o l v e d oxygen, F i g u r e 1 4 , at the e q u i l i b r i u m mechanical heat temperature of 4 1 . 4 ° C . E x c e s s i v e a e r a t i o n can lower the temperature of the medium s u b s t a n t i a l l y (28) and a l s o cause e x c e s s i v e foam-in g . A f t e r numerous dimensional adjustments to the i m p e l l e r , d e c r e a s i n g the r a t e of a g i t a t o r r o t a t i o n and a d j u s t i n g the i n s u l a t i o n , the maximum r e s u l t a n t temperature reached by the e n t i r e , assembled system was 4 1 . 4 ° C ; w e l l 8 2 . b e l o w t h e 5 0 ° C t h e r m o p h i l i c m a r k ( F i g u r e 1 6 ) . I t w a s p o s s i b l e t o f u r t h e r l o w e r t h e m e c h a n i c a l h e a t i n p u t b y r e d u c i n g t h e i m p e l l e r s i z e a n d t h e r . p . m . o f t h e a g i t a -t o r . U n d e r t h e s e c i r c u m s t a n c e s , h o w e v e r , a g i t a t i o n o f t h e s u b s t r a t e w a s c o n s i d e r e d t o b e i n s u f f i c i e n t , r e s u l t -i n g i n t h e s e t t l i n g o f t h e h e a v i e r p o t a t o s o l i d s . A c o m p r o m i s e w a s m a d e a s t o t h e o p t i m u m b e t w e e n t h e b e s t p o s s i b l e a g i t a t i o n w i t h t h e l o w e s t p o s s i b l e m e c h a n i c a l h e a t i n p u t t e m p e r a t u r e . T h e e x t e n t o f m e d i u m c o o l i n g c a u s e d b y t h e r e m o v a l o f h e a t t h r o u g h a e r a t i o n i n r e l a t i o n t o m e c h a n i c a l h e a t i n p u t w a s c o n s i d e r e d . U s i n g t h e w a t e r s y s t e m a s b e f o r e , b u t w i t h o u t a e r a t i o n , i t w a s d e t e r m i n e d t h a t a e r a t i o n , a t 9 0 0 m l / m i n h a d m i n i m a l e f f e c t . A s s h o w n i n F i g u r e 1 6 , t h e e q u i l i b r i u m t e m p e r a t u r e f o r t h e n o n -a e r a t e d s y s t e m w a s 4 1 . 8 ° C , a n i n c r e a s e o f 0 . 4 ° C o v e r t h e a e r a t e d w a t e r s y s t e m . I t c o u l d b e a r g u e d t h a t t h e w a t e r s y s t e m w a s n o t i n d i c a t i v e o f t h e p o t a t o w a s t e s u b s t r a t e . F r i c t i o n a l h e a t c r e a t e d b y t h e i m p e l l e r a g a i n s t t h e p o t a t o s o l i d s m a y b e c o n s i d e r e d a c o n t r i b u t i n g h e a t f a c t o r . I n o r d e r t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f p o t a t o s o l i d s , t h e f e r m e n t e r w a s o p e r a t e d u s i n g 1 2 . 3 g % o f p o t a t o s o l i d s ( s i m i l a r Potato solids , 12.3 gram percent - without air input - Water - without air input 7 0 I- _ Water -a i r f low, 900 ml/min 60 L o " 5 0 L Time , hours of operat ion F igure 16. M e c h a n i c a l heat input 8 4 . t o a c t u a l f e r m e n t a t i o n t r i a l s ) , w i t h s o d i u m h y p o c h l o r i t e s o l u t i o n a d d e d t o i n h i b i t m i c r o b i a l g r o w t h . T o d e t e r a e r o b i c g r o w t h , n o a i r w a s s u p p l i e d , T h e r e w a s i n s u f f i c -i e n t f o a m c r e a t e d d u r i n g a g i t a t i o n t o c a u s e s i g n i f i c a n t h e a t r e t e n t i o n . T h e m a x i m u m t e m p e r a t u r e o b t a i n e d w i t h 1 2 . 3 g % o f p o t a t o s o l i d s w a s 4 2 . 1 ° C ( F i g u r e 1 6 ) o r a t e m p e r a t u r e i n c r e a s e o f 0 . 7 ° C o v e r t h a t o f t h e w a t e r s y s t e m . T h i s v a l u e w a s c o n s i d e r e d t o b e s a t i s f a c t o r y s i n c e a e r a t i o n w o u l d a l s o s l i g h t l y d e c r e a s e t h e t e m p e r a t u r e . 3 . M e a s u r e m e n t s o f H e a t L o s s f r o m t h e S y s t e m  C o n s t r u c t e d T h e e f f e c t i v e n e s s o f t h e i n s u l a t i o n ( R o f 1 0 f o r t h e a m o u n t o f v e r m i c u l i t e u s e d ) p l a c e d i n t h e f e r m e n -t e r c e l l w a s e v a l u a t e d i n r e g a r d s t o t h e h e a t l o s t f r o m t h e s y s t e m . I n f o r m a t i o n w a s r e q u i r e d o n t h e o p e r a t i o n a l b e h a v i o u r t o e n s u r e t h a t h e a t w a s n o t r e t a i n e d n o r t h e r a t e o f h e a t l o s s t o o s l o w . H e a t b u i l d u p i n t h e f e r m e n -t e r a t t h e i n i t i a l s t a g e s o f t h e f e r m e n t a t i o n c o u l d i n d u c e o r s e l e c t t h e g r o w t h o f t h e r m o p h i l e s . F i g u r e 1 7 s h o w s a c u r v i l i n e a r r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t e m p e r a t u r e d e c r e a s e i n t h e f e r m e n t e r w i t h t i m e . T h e r e s u l t y i e l d e d a n a v e r a g e 85. Heated water -with detergent foam Heated water -without foam ,antifoam added detergent re-added L_ 50 L_ 60 10 l_ 20 i_ 30 l 40 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 Time , hours of operation Figure 17. Heat loss determination from heated aqueous systems. with and without a heavy surface foam. 8 6 . t e m p e r a t u r e d e c r e a s e o f 0 . 4 9 ° C / h ; f r o m 7 9 . 5 ° C t o m e c h a n i c a l h e a t i n p u t t e m p e r a t u r e ( 4 1 . 4 ° C ) i n 7 7 h . T h e h e a t r e t e n t i o n c h a r a c t e r i s t i c o f s u r f a c e f o a m w a s d e t e r m i n e d w i t h t h e u s e o f a h i g h f o a m i n g , c o m m -e r c i a l d i s h w a s h i n g d e t e r g e n t . A s a c o m p a r i s o n t o t h e p r e v i o u s e x p e r i m e n t , F i g u r e 1 7 s h o w s t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t w o s y s t e m s a n d t h e i n s u l a t i n g e f f e c t o f a h e a v y s u r f a c e f o a m . T h e a v e r a g e r a t e o f t e m p e r a t u r e d e c r e a s e w a s 0 . 1 6 ° C / h f o r t h i s d e t e r m i n a t i o n o v e r t h e s a m e 7 7 h p e r i o d . O v e r t h e s a m e t i m e p e r i o d , t h i s a v e r a g e r a t e w o u l d p r o b a b l y b e s l i g h t l y h i g h e r i f t h e s t a r t i n g t e m p e r a -t u r e o f t h e h e a t e d w a t e r w a s t h e s a m e a s t h e a b o v e e x p e r i -m e n t . S i n c e t h i s w a s a l s o a c u r v i l i n e a r r e l a t i o n s h i p , t h e a v e r a g e r a t e o f t e m p e r a t u r e d e c r e a s e w o u l d p r o b a b l y b e l e s s t h a n t h e v a l u e q u o t e d w h e n d e t e r m i n e d o v e r a m o r e e x t e n d e d t i m e p e r i o d . E v e n t h o u g h t h e s t a r t i n g t e m p e r a t u r e s w e r e d i f f e r e n t b e t w e e n t h e t w o e x p e r i m e n t s , t h e a v e r a g e r a t e o f t e m p e r a t u r e d e c r e a s e w a s d e f i n i t e l y g r e a t e r i n t h e f o a m l e s s s y s t e m . A d e p r e s s i o n i n t h e h e a t l o s s c u r v e , a t 1 2 2 h , w a s c r e a t e d b y t h e a d d i t i o n o f t h e a n t i f o a m i n g a g e n t . A r a p i d t e m p e r a t u r e d r o p o c c u r r e d o n c e t h e f o a m w a s r e m o v e d f r o m t h e s y s t e m . O n r e - a d d i t i o n o f m o r e d e t e r g e n t , t h e r e c r e a t e d f o a m r e t a i n e d t h e h e a t w i t h i n t h e s y s t e m . 87. I n summary, t h i s p a r t i c u l a r f e r m e n t a t i o n s y s t e m d e v e l o p e d f o r t h i s p r o j e c t was s u f f i c i e n t t o y i e l d d a t a t h a t c a n be u t i l i z e d f o r t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f a e r o b i c -t h e r m o p h i l i c p o t a t o w a s t e f e r m e n t a t i o n s . M e c h a n i c a l b r e a k d o w n s w h i c h o c c u r r e d d u r i n g t h e c o u r s e o f t h e f e r -m e n t a t i o n were a l l e v i a t e d . F a c t o r s w h i c h a f f e c t e d t h e r e s u l t s o f t h e f e r m e n t a t i o n were c o n t r o l l e d o r s t a b i l i z e d t o a d e g r e e where i t was n o t c o n s i d e r e d an i m p o r t a n t v a r i a b l e , e . g . , f o a m i n g , a e r a t i o n , a m b i e n t h e a t b u i l d up and c o n t i n u o u s t e m p e r a t u r e r e c o r d i n g . M e c h a n i c a l h e a t was a d j u s t e d t o where i t s i n p u t was n o t c o n s i d e r e d a s e r i o u s f a c t o r i n t h e m a i n t e n a n c e o r t h e e n c o u r a g e m e n t o f an a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n t o o c c u r w i t h t h e p o t a t o w a s t e s u b s t r a t e . C o u n t e r i n g t h e i n p u t o f m e c h a n i c a l h e a t , h e a t d i s s i p a t i o n was s u f f i c i e n t w i t h i n t h e f e r m e n t e r c e l l so t h a t t e m p e r a t u r e m a i n t e n a n c e d u r i n g t h e t h e r m o p h i l i c c o n d i t i o n s were n o t due t o t h e i n s u l a t i o n b u t r a t h e r due t o t h e m e t a b o l i c a c t i v i t y o f t h e r m o p h i l i c o r g a n i s m s . I I I . R e s u l t s o f t h e A e r o b i c - T h e r m o p h i l i c F e r m e n t a t i o n s  o f P o t a t o W a s t e s To f u l l y c h a r a c t e r i z e and e x a m i n e t h e b e h a v i o u r o f t h e a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n o f p o t a t o w a s t e s , as p r e v i o u s l y s t a t e d , mechanical problems and equipment assemblies had to be sol v e d f i r s t . The f i r s t couple of t r i a l s , u s i n g macerated potatoes, were to a l l e v i a t e e x t e n s i v e foaming problems and temperature m o n i t o r i n g problems; but s u r p r i s i n g r e s u l t s were n o t i c e d from these t r i a l s . Analyses of the composition of potato showed that as a s u b s t r a t e , potato was n i t r o g e n and phosphorus l i m i t i n g . In a l l p r o b a b i l i t y , a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c tem-pe r a t u r e s were not p o s s i b l e without supplementing t h i s waste medium with an a d d i t i o n a l n i t r o g e n source. Never-t h e l e s s , t h e r m o p h i l i c temperatures were obtained, and were of a reasonably prolonged d u r a t i o n . T h i s was extremely important s i n c e t h e r m o p h i l i c c o n d i t i o n s were o b t a i n a b l e without f u r t h e r a d d i t i o n of a n u t r i e n t source. An advantage i s that i t means a p o s s i b l e cost r e d u c t i o n i n the treatment of t h i s waste product. In comparison to l a t e r t r i a l s , the d u r a t i o n and i n t e n s i t y of the t h e r m o p h i l i c temperatures of these i n i t i a l runs were r e l a t i v e l y short and heat p r o d u c t i o n was l e s s intense (Figure 15). This was due mainly to the c o n t i n u a l l o s s of potato s o l i d s from the s u b s t r a t e because of foaming. A f t e r the i n c o r p o r a t i o n of the top assembly onto the system, the d u r a t i o n and i n t e n s i t y 8 9 . o f t h e t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e s n o t i c e a b l y i n c r e a s e d . I t w a s o b v i o u s t h a t t h e k e y t o a t t a i n i n g h i g h e r t e m p e r a -t u r e s a n d a l o n g e r t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n w a s g r e a t e r n u t r i e n t a v a i l a b i l i t y . T h e a n a l o g y d r a w n b y P o p e l a n d O h n m a c h t ( 4 3 ) w a s t h a t " t o m a k e t h e f i r e h o t t e r , t h e n a n a m p l e s u p p l y o f f u e l m u s t b e s u p p l i e d " . I t w a s a l s o p o s s i b l e t h a t t e m p e r a t u r e s o b t a i n e d f r o m t h e s e i n i t i a l t r a i l s w e r e l o w e r d u e t o m a n u a l t e m p e r a t u r e r e a d i n g s . E x t e n d e d p e r i o d s o f r e a d i n g s w e r e n o t t a k e n d u e t o t h e t i m e f a c t o r . D u r i n g t h e s e o v e r n i g h t p e r i o d s , i t w a s p o s s i b l e f o r h i g h t e m p e r a t u r e s t o o c c u r w i t h o u t b e i n g n o t i c e d . T h e r e w a s a p o s s i b i l i t y t h a t c r u c i a l r e a d i n g s a t s p e c i f i c a p e x e s o f t h e t e m p e r a t u r e c u r v e w e r e a l s o m i s s i n g . A c o n t i n u o u s t h e r m o c o u p l e - d a t a r e c o r d e r m o n i t o r -i n g s y s t e m w a s e v e n t u a l l y u t i l i z e d f o r t h e f o l l o w i n g t r i a l s . U p o n a t t a i n m e n t o f t h e r m o p h i l i c c o n d i t i o n s w i t h t h i s s u b s t r a t e , s e v e r a l p o s s i b l e r a m i f i c a t i o n s o f n u t r i e n t l i m i t a t i o n s w e r e r e a l i z e d . 1 ) T h e p r e v i o u s l y q u o t e d m a x i m u m a n d m i n i m u m r e q u i r e m e n t s f o r n i t r o g e n a n d p h o s p h o r u s a r e g u i d e l i n e s a n d n e e d n o t a l w a y s j u d i c - . i o u s l y a p p l y ( 8 ) . T h e s e a r e t h e b a s i s f o r m a x i m u m s y n -t h e s i s r e q u i r e m e n t s a n d t h e y d i f f e r m a r k e d l y f r o m a m o u n t s 90. of nutrients required in continuous reaction at less than maximum synthesis. 2) Almost any amount of nitrogen and phosphorus w i l l eventually permit the completion of the conversion of soluble carbon (potato starch), although the reaction rate of the fermentation would r e f l e c t the release of these nutrients from lysed c e l l s for reuse. Therefore, the f a i l u r e to meet these quanti-tative nutrient requirements would produce a rate l i m i t a -t i o n on the conversion of the potato starch. Since the rate of c e l l l y s i s determines the rate of nutrient a v a i l a -b i l i t y and thus, the rate of carbon (potato starch) removal, i t w i l l eventually determine the detention time required to decompose the potato starch within the substrate. From the standpoint of the actual, p r a c t i c a l application of this system, one has to consider the cost of adding nutrients to shorten the detention time or consider the cost of a prolonged detention, in the sense of energy supplied for mixing and aeration and the time factor and a v a i l a b i l i t y of treatment space. In p r a c t i c e , the best solution i s the balance between the cost of nutrient addition against the cost of an increased deten-ti o n time.. For., this project, further additions of nutrients were not u t i l i z e d . It was obvious that nutrient addition w o u l d c r e a t e a t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n , s i n c e i t w a s r e a l i z e d t h a t t h e r m o p h i l i c o r g a n i s m s e x i s t e d a s p a r t o f t h e e x t e r n a l f l o r a o f p o t a t o e s . I t w a s o f i n t e r e s t t o c h a r a c t e r i z e t h e a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n o f p o t a t o w a s t e a l o n e ( w i t h o u t a d d i t i o n s ) s i n c e i t w a s n o w r e a l i z e d t h a t t h i s n u t r i e n t - l i m i t i n g s u b s t r a t e w a s c a p a b l e o f r e a c h i n g t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e s . 1 . C o n t r o l T r i a l s o f A e r o b i c - T h e r m o p h i l i c P o t a t o  F e r m e n t a t i o n s T h e b e h a v i o u r o f t h e t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n o f f r e s h p o t a t o h a d t o b e e s t a b l i s h e d f o r c o m p a r i s o n w i t h s o d i u m h y d r o x i d e - t r e a t e d p o t a t o e s . T h e s e w e r e c o n - , t r o l t r i a l s u s e d t o c h a r a c t e r i z e t h e t r e n d s o f t h e f e r m e n t a t i o n . F r o m F i g u r e 1 8 ( C o n t r o l t r i a l 3 ) , i t c a n b e o b s e r v e d t h a t a m a x i m u m t e m p e r a t u r e o f 7 5 ° C w a s o b t a i n e d . T h e t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e ( 5 0 ° C J w a s r e a c h e d a f t e r 6 4 h ( 2 . 7 d ) f r o m t h e s t a r t o f t h e f e r m e n t a t i o n a n d l a s t e d f o r 3 9 1 h ( 1 6 . 3 d ) . A n i n i t i a l t o t a l s o l i d s c o n t e n t o f 8 . 3 2 g % w a s p l a c e d i n t o t h e f e r m e n t e r w i t h a w o r k i n g v o l u m e o f 5 0 l i t e r s . A t t h e e n d o f t h e f e r m e n t a t i o n t r i a l , t h e f i n a l s o l i d s c o n t e n t o f t h e r e s i d u e w a s 2 . 0 5 g o r a d e c r e a s e o f 6 . 2 7 g % o f t h e t o t a l s o l i d s o v e r a 5 0 0 h ( 2 0 . 8 d ) d e t e n t i o n t i m e , a r e d u c t i o n o f 7 5 . 4 % o f t h e i n i -t i a l t o t a l s o l i d s . M o r e t h a n 5 0 % ( 5 0 . 6 % ) o f t h e s o l i d s w e r e d e g r a d e d a f t e r 2 7 8 h ( 1 1 . 6 d ) f r o m t h e b e g i n n i n g o f t h e f e r m e n t a t i o n o r 2 1 4 h ( 8 . 9 d ) a f t e r t h e t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e s w a s r e a c h e d . T h e o v e r a l l a v e r a g e r a t e o f s o l i d s u t i l i z a t i o n f o r t h i s p a r t i c u l a r f e r m e n t a t i o n w a s 0 . 1 2 5 g / l / h ( T a b l e 2 ) . T h i s s o l i d s d e g r a d a t i o n r a t e , o f c o u r s e , w i l l v a r y d e p e n d i n g o n t h e t e m p e r a t u r e o f t h e f e r m e n t a t i o n a n d t h e b a c t e r i a l p o p u l a t i o n w i t h i n t h e f e r m e n t a t i o n . T h i s t r i a l s e r v e d t o d e t e r m i n e : t h e e f f e c t o f a m b i e n t t e m p e r a t u r e o n t h e f e r m e n t a t i o n ; t h e p H o f t h e t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n ; t h e r a t e o f s o l i d s u t i l i -z a t i o n b y t h e t h e r m o p h i l e s ; t h e t o t a l o r g a n i c n i t r o g e n w i t h i n t h e s u b s t r a t e a t v a r i o u s s t a g e s o f t h e f e r m e n t a -t i o n a n d , o f c o u r s e , t h e t e m p e r a t u r e o f t h e t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n . E a c h o f t h e s e d e t e r m i n a t i o n s i s d e s c r i b e d i n t h e f o l l o w i n g d i s c u s s i o n . A m b i e n t t e m p e r a t u r e s w e r e m o n i t o r e d t h r o u g h o u t t h e d u r a t i o n o f t h e f e r m e n t a t i o n t o d e t e r m i n e i f t h e t e m p e r a t u r e w i t h i n t h e f e r m e n t e r : . w a s a f f e c t e d b y t h e s u r r o u n d i n g e x t e r n a l t e m p e r a t u r e . T h e v a r i o u s f l u c t u a -t i o n s i n t h e a m b i e n t t e m p e r a t u r e c u r v e w e r e d u e t o h e a t b u i l d u p i n t h e i n c u b a t o r r o o m a n d c o o l i n g d u e t o o p e n i n g T a b l e 2 . C o m p a r i s o n o f t h e v a r i o u s a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c p o t a t o f e r m e n t a t i o n s . F e r m e n t a t i o n t r i a l s P a r a m e t e r s C o n t r o l t r i a l 3 C o n t r o l t r i a l 4 W i t h 5 . 6 6 ° s N a M a x i m u m t e m p e r a t u r e , ° C T i m e t o r e a c h 5 0 ° C , h ( d ) D u r a t i o n a b o v e 5 0 ° C , h ; ( d ) D e t e n t i o n t i m e , h ( d ) T o t a l S o l i d s U t i l i z a t i o n I n i t i a l s o l i d s c o n t e n t , g % R e s i d u a l s o l i d s c o n t e n t , g % A m o u n t o f s o l i d s l o s t , g % T o t a l s o l i d s r e d u c t i o n , % O v e r a l l a v e r a g e r a t e , g / l / h 7 5 . 0 6 4 . ( 2 . 7 ) 3 9 1 ( 1 6 . 3 ) 5 0 0 ( 2 0 . 8 ) 8 . 3 2 2 . 0 5 6 . 2 7 7 5 . 4 0 . 1 2 5 6 8 . 9 1 1 0 ( 4 . 6 ) 2 5 5 ( 1 0 . 6 ) 4 5 5 ( 1 8 . 9 ) 1 0 . 6 7 8 . 3 4 2 . 3 3 2 1 . 8 0 . 0 5 1 6 3 . 2 8 2 ( 3 . 4 ) 4 8 3 ( 2 0 . 1 ) 8 6 0 ( 3 5 . 8 ) 1 6 . 5 6 6 . 6 6 9 . 9 0 5 9 . 8 0 . 1 1 5 9 5 . of the door. I t can be observed from these ambient temp-er a t u r e f l u c t u a t i o n s t hat there was no e f f e c t on the i n t e r -n a l temperature of the fermenter. The system was s u f f i -c i e n t l y i n s u l a t e d so that the f e r m e n t a t i o n was completely i s o l a t e d from e x t e r n a l i n f l u e n c e s . One of the most important advantages of a t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n i s i t s independence from ambient temperature, so that the fermentation proceeds u n a f f e c t e d even when e x t e r n a l temperatures are c l o s e to f r e e z i n g ( 4 3 ) . This i s due to the p r o c e s s , s i n c e i t i s t h e r m a l l y s e l f - s u p p o r t i n g . The temperature curves obtained f o r these a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c fermentations showed numerous depress-ions r a t h e r than the expected smooth, even curve. These d e p r e s s i o n s , i . e . , temperature decreases, were i n t e r p r e t e d as p o p u l a t i o n changes of t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a w i t h i n the medium and/or the decrease of t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a numbers. An analogy can be drawn between the temperature curve to t h a t of a growth curve. Temperature i n c r e a s e s and decreases re p r e s e n t the mixed t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a p o p u l a t i o n i n t r a n s i t i o n from e x p o n e n t i a l phase to the death phase, back through the l a g phase, e t c . Temperature decreases due to d e c r e a s i n g mixed t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a numbers are the r e s u l t of n u t r i e n t l i m i t a t i o n s . D e f i c i e n t elements such as phosphorus and 9 6 . n i t r o g e n ( v i z . , n i t r o g e n t h a t was a v a i l a b l e and not n e c e s s a r i l y a l l the n i t r o g e n present i n the s u b s t r a t e ) which was f u l l y u t i l i z e d , caused the t h e r m o p h i l i c popula-t i o n to stop growing. As a r e s u l t , the temperature stopped i n c r e a s i n g . During the death phase, the thermo-p h i l i c p o p u l a t i o n decreased i n numbers r e s u l t i n g i n a temperature decrease. C e l l l y s i s r e t u r n s r e q u i r e d n u t r i e n t s back i n t o the s u b s t r a t e causing the next i n c r e a s e i n the t h e r m o p h i l i c p o p u l a t i o n . Temperature decreases due to p o p u l a t i o n changes may a l s o occur with the emergence of a s i n g l e v a r i e t y of t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a w i t h i n the mixed p o p u l a t i o n of thermophiles. T h i s may occur when c e r t a i n c o n d i t i o n s are s u i t a b l e f o r the dominance of a p a r t i c u l a r s i n g l e v a r i e t y of b a c t e r i a . The s u i t a b l e c o n d i t i o n s may not n e c e s s a r i l y be n u t r i e n t r e l a t e d but r a t h e r other f a c t o r s , such as oxygen a v a i l a b i l i t y , a c i d i t y or a l k a l i n i t y of the medium or by-product i n h i b i t i o n are p o s s i b l e . The emergence of a s i n g l e v a r i e t y over the mixed t h e r m o p h i l i c p o p u l a t i o n r e s u l t s i n the c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n of the other thermo-p h i l e s . These p o p u l a t i o n changes were suggested by the d i f f e r e n t odors being emitted i n t o the surroundings during d i f f e r e n t times of the f e r m e n t a t i o n . The f e a s i b i l i t y of c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n occurs when s u i t a b l e c o n d i t i o n s 9 7 . a c c e n t u a t e t h e g r o w t h r a t e f o r o n e t h e r m o p h i l e c a u s i n g i t t o d o m i n a t e o v e r t h e o t h e r s . T h i s m a y c a u s e e i t h e r a d e c r e a s e o r s t o p p a g e i n g r o w t h a n d / o r t h e d e a t h o f t h e o t h e r b a c t e r i a . ( T h i s m a y a l s o b e d u e t o t h e v a r y i n g c o n -d i t i o n s d e s c r i b e d a b o v e ) . A s a r e s u l t , a d e c r e a s e i n t e m p e r a t u r e o c c u r s d u e t o t h e i n h i b i t i o n e f f e c t . T h e d o m i n a n c e o f t h i s o t h e r v a r i e t y o f t h e r m o p h i l e s r e s u l t s i n a t e m p e r a t u r e i n c r e a s e o f a g r e a t e r m a g n i t u d e d u r i n g t h e n e x t t e m p e r a t u r e c y c l e . I n c r e a s e s i n t h e m a g n i t u d e a n d d u r a t i o n o f t h e t e m p e r a t u r e c u r v e w a s a l s o d u e t o t h e f u r t h e r a v a i l a b i l i t y o f n u t r i e n t f r o m t h e p o t a t o s u b s t r a t e . M e c h a n i c a l a g i t a -t i o n a i d s i n t h e r e d u c t i o n o f t h e p a r t i c l e s i z e s o f t h e m a c e r a t e d p o t a t o p i e c e s . I n a d d i t i o n t o t h i s , t h e i n i t i a l t e m p e r a t u r e i n c r e a s e i n t o t h e t h e r m o p h i l i c r a n g e a l s o c a u s e d t h e d i s r u p t i o n o f t h e p o t a t o s t a r c h g r a n u l e s . A s t h e t e m p e r a t u r e d u r a t i o n a n d i n t e n s i t y i n c r e a s e d , p o t a t o s t a r c h g r a n u l e s g e l a t i n i z e d a n d r u p t u r e d , r e l e a s i n g f u r t h e r n u t r i e n t s i n t o t h e m e d i u m f o r t h e t h e r m o p h i l e s . T h e d r y m a t t e r o f t h e g r a n u l e c o n s i s t s o f 99.5% s t a r c h , 0 . 3 % a s h , 0 . 0 1 % n i t r o g e n ( f r o m p r o t e i n d e b r i s ) a n d a s m u c h a s o n e - t h i r d o f t h e t o t a l p h o s p h o r u s o f t h e p o t a t o i s c o m b i n e d w i t h t h e s t a r c h ( 3 1 , 4 6 , 4 7 ) . T h i s d e s c r i b e d p r o c e s s r e p r e s e n t e d t h e d e g r a d a t i o n o f t h e p o t a t o s o l i d s 98. d u r i n g the t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n . In comparison, i t would be more d i f f i c u l t f o r m e s o p h i l i c b a c t e r i a to u t i l i z e the s t a r c h without a more complete heat treatment ( g e l a t i n i z a t i o n ) of the potato waste. The pH curve produced by t h i s p a r t i c u l a r fermen-t a t i o n t r i a l c o r r e l a t e d w i t h the temperature curve. Corres-ponding i n c r e a s i n g and d e c r e a s i n g c y c l e s of both curves e x h i b i t e d a s u r p r i s i n g synchrony. Two p o s s i b l e hypotheses f o r the f l u c t u a t i o n of the pH curve correspond w i t h the hypotheses f o r the f l u c t u a t i o n s of the temperature curve. As p r e v i o u s l y mentioned, growth c o n d i t i o n s w i t h i n the fermenting s u b s t r a t e w i l l a f f e c t the t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a p o p u l a t i o n w i t h the p o s s i b l e dominance of one v a r i e t y of thermophiles, and i n h i b i t i o n of others thus l e a d i n g to f l u c t u a t i o n s o f the temperature curve. I t i s seen i n F i g u r e 18, that i n c r e a s e d pH w i l l e v e n t u a l l y r e s u l t i n a decrease i n temperature. The pH around n e u t r a l i t y or s l i g h t l y a l k a l i n e appeared to cause i n h i b i t i o n of the thermophiles p a r t i c u l a r to the potato f l o r a . The growth of other thermophiles more s u i t a b l e to these higher pH c o n d i t i o n s ( a l s o with the a v a i l a b i l i t y of f u r t h e r n u t r i e n t s ) decreases the pH due to the organic a c i d p r o d u c t i o n . A dec r e a s i n g pH would s e l e c t f o r the regrowth 99 . of the previous thermophiles or the emergence of another v a r i e t y of t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a . The i n c r e a s i n g popula-t i o n of these more a c i d o p h i l i c thermophiles r e s u l t e d i n the temperature i n c r e a s e . T h i s c y c l e appeared to be repeated three c o n s e c u t i v e times d u r i n g the f i r s t h a l f of the fermentation. Towards the l a s t h a l f of the fermenta-t i o n , the pH value tends to move i n t o the a l k a l i n e range (about pH 9) as the temperature decreased. T h i s agreed with a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c d e g r a d a t i o n of other s u b s t r a t e s , such as yeast waste, molasses wastes, p i g manure and sludge l i q u o r s (35,36).. Termination of the t h e r m o p h i l i c fermenta-t i o n may be due t o : 1) growth c o n d i t i o n s too extreme f o r r e c overy, due to i n c r e a s e d a l k a l i n i t y and by-products excreted i n t o the menstruum, and/or 2) i n s u f f i c i e n t n u t r i e n t s a v a i l a b l e (2.05 gm % t o t a l s o l i d s remaining) and 3) the i n c r e a s e d temperatures ( a f t e r the second c y c l e ) may have k i l l e d the a c i d o p h i l i c thermophiles r e q u i r e d to reduce the pH. The other reason, and perhaps the most accurate one f o r pH f l u c t u a t i o n s , i s r e l a t e d to a v a i l a b i l i t y of n u t r i e n t s . Thermophilic fermentations tend to move i n t o the a l k a l i n e pH range. However, wi t h more n u t r i e n t s at the i n i t i a l stages, i n t h i s case l a r g e r amounts of starches than other n u t r i e n t s ( v i z . , p r o t e i n s ) a r a p i d 1 0 0 . f e r m e n t a t i o n o f t h e c a r b o h y d r a t e s o c c u r s . T h e s t a r c h f e r m e n t a t i o n i n c r e a s e s o r g a n i c a c i d p r o d u c t i o n , t h u s r e d u c i n g t h e p H . I n c r e a s e s i n p H w e r e d u e t o t h e i n c r e a s e i n s u b s t r a t e n i t r o g e n ( s e e F i g u r e - 1 8 , T o t a l o r g a n i c n i t r o g e n c u r v e ) . T h i s m a y b e d u e t o t h e i n c o r p o r a t i o n o f n i t r o g e n i n t o t h e s y s t e m v i a a e r a t i o n , a n i m p o r t a n t c h a r -a c t e r i s t i c w h i c h w i l l b e d i s c u s s e d l a t e r . A l s o , a d d i t i o n a l a m m o n i a w i l l b e d e r i v e d f r o m c e l l l y s i s . A m m o n i f i c a t i o n w i l l i n v o l v e t h e h y d r o l y s i s o f c e l l u l a r p r o t e i n s a n d n u c l e i c a c i d s a n d a s a r e s u l t a m i n o a c i d s a n d n u c l e i c a c i d s a r e l i b e r a t e d i n t o t h e m e n s t r u u m . T h e s e s i m p l e r n i t r o g e n o u s c o m p o u n d s a r e f e r m e n t e d r e s u l t i n g i n t h e l i b e r a t i o n o f a m m o n i a i n t o t h e m e n s t r u u m . S o l u b i l i z a t i o n o f t h i s a m m o n i a i n t o t h e w a t e r p h a s e w i l l r e s u l t i n a b a s i c p H r e s p o n s e . T h e l a s t h a l f o f t h i s f e r m e n t a t i o n t r i a l d i d n o t f l u c t u a t e i n e i t h e r t e m p e r a t u r e o r p H b u t r a t h e r t h e t e m p e r a t u r e w a s m a i n t a i n e d f o r a p p r o x i m a t e l y 1 0 0 h ( 3 0 0 h t o 4 0 0 h a f t e r t h e s t a r t ) a b o v e 7 0 ° C a n d t h e p H d u r i n g t h i s p e r i o d i n c r e a s e d g r a d u a l l y f r o m n e u t r a l i t y t o 8 . 2 . A c c e p t i n g t h e l a t t e r o f t h e a b o v e r e a s o n s f o r p H f l u c t u a -t i o n s , t h e r e a s o n f o r t h i s d u r a t i o n w a s m a i n l y d u e t o a n u t r i t i o n a l l y b a l a n c e d s u b s t r a t e d u r i n g t h i s s t a g e o f t h e f e r m e n t a t i o n . T h e f i r s t h a l f o f t h e f e r m e n t a t i o n h a d 101. d e p l e t e d s u f f i c i e n t a m o u n t s o f t h e c a r b o n s o u r c e t o a p o i n t w h e r e t h e C / N r a t i o h a d f a l l e n w i t h i n t h e r e q u i r e m e n t r a n g e . A l s o i t w a s s e e n t h a t t h e a m o u n t o f o r g a n i c n i t r o g e n i n t h e s u b s t r a t e w a s i n c r e a s i n g , r e s u l t i n g i n f u r t h e r l o w e r i n g o f t h e C / N r a t i o . T h i s i m p r o v e d n u t r i -t i o n a l p r o f i l e r e s u l t e d i n a m a i n t a i n e d t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e d u e t o c o n t i n u a l g r o w t h ( a n d d e a t h ) o f t h e r m o -p h i l e s ( i . e . , s t a t i o n a r y p h a s e ) w i t h i n t h e s u b s t r a t e . O n e o f t h e m o s t i m p o r t a n t f i n d i n g s o f t h i s p r o -j e c t w a s t h e d i s c o v e r y o f t h e i n c r e a s i n g a m o u n t s o f t o t a l o r g a n i c n i t r o g e n d u r i n g t h e c o u r s e o f t h e f e r m e n t a t i o n . A s p r e v i o u s l y s t a t e d , t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n o f t h e s u b s t r a t e s h o u l d n o t h a v e o c c u r r e d w i t h s u c h i n t e n s i t y o r m a g n i t u d e . I t w a s r e a l i z e d t h a t c a n n i b a l i s m o f l y s e d c e l l u l a r c o m p o n e n t s w a s o c c u r r i n g t o m a i n t a i n t h e f e r -m e n t a t i o n . A n d a l s o , i t w a s t h o u g h t t h a t t h e t o t a l o r g a n i c n i t r o g e n i n i t i a l l y p r e s e n t i n t h e s y s t e m w o u l d b e f u l l y u t i l i z e d , a n d a s a r e s u l t , r e m a i n c o n s t a n t w i t h i n t h e s y s t e m , b u t m o s t l i k e l y d e c r e a s e a s a m m o n i f i c a t i o n o c c u r s d u r i n g t h e f e r m e n t a t i o n . K j e l d a h l a n a l y s e s w e r e d e c i d e d u p o n t o s h o w t h e r a t e o f p r o t e i n n i t r o g e n l o s t f r o m t h e s y s t e m , a s a m m o n i a , i n t o t h e a t m o s p h e r e . H o w e v e r , t h e c o u r s e o f t h e f e r m e n t a t i o n s h o w e d b o t h 102. d e c r e a s i n g , and s u r p r i s i n g l y , i n c r e a s i n g t o t a l o r g a n i c n i t r o g e n w i t h i n the system (Figure 18). T h i s i n c r e a s e i n t o t a l o r g a n i c n i t r o g e n was the reason the f e r m e n t a t i o n worked e f f e c t i v e l y . I t can be seen from F i g u r e 18, that d e c r e a s i n g o r g a n i c n i t r o g e n occurred c o r r e s p o n d i n g l y with i n c r e a s i n g pH and i n c r e a s i n g temperature and v i c e v e r s a . C o r r e l a t i o n of d e c r e a s i n g t o t a l o rganic n i t r o g e n to i n c r e a s i n g pH can be due to ammonia i n c o r p o r a t i o n from p r o t e i n breakdown i n t o the menstruum. The d e c r e a s i n g amounts of t o t a l organic n i t r o g e n was due to i t s u t i l i z a -t i o n by the i n c r e a s i n g t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a l p o p u l a t i o n and t h u s l y , i n c r e a s i n g the temperature. It can be asked, what caused the t o t a l o rganic n i t r o g e n to f l u c t u a t e d u r i n g the fermentation? The d e c r e a s i n g p o r t i o n s of the curve were understandable, but what causes the i n c r e a s i n g p o r t i o n s ? Since there was no f u r t h e r input of n u t r i e n t s i n t o the system, the o v e r a l l t o t a l o rganic n i t r o g e n should have been f a i r l y c o nstant. The only p o s s i b l e source of n i t r o g e n input i n t o the system i s d e r i v e d from the a i r . N i t r o g e n gas i n c o r p o r a -t i o n v i a a e r a t i o n would have s a t u r a t e d the system and the s o l u b i l i t y of n i t r o g e n i n t o the s u b s t r a t e would make i t r e a d i l y a v a i l a b l e f o r the organisms to use. However, the n i t r o g e n c o n s t i t u e n t i n the s u b s t r a t e as 103. determined by the m i c r o - K j e l d a h l method was i n a more complex form than j u s t the s o l u b l e n i t r o g e n gas form. It was b e l i e v e d that n i t r o g e n i n c o r p o r a t i o n i n t o the thermo-p h i l i c f e r m e n t a t i o n c o u l d be due to b a c t e r i a l c o n v e r s i o n of the s o l u b i l i z e d n i t r o g e n gas i n t o p r o t e i n s . The presence of t h e r m o p h i l i c n i t r o g e n f i x i n g organisms i n t h i s system was h i g h l y probable. A l l e n (1) c i t e d l i t e r a -t u r e of E. de K r u i j f f who . observed growth of t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a i n n i t r o g e n - f r e e media but was not able to o b t a i n s u f f i c i e n t n i t r o g e n f i x a t i o n f o r an i n c r e a s e i n n i t r o g e n content to be d e t e c t a b l e by a K j e l d a h l a n a l y s i s . A l s o c i t e d was a r e p o r t by H. Pringsheim, who d e t e c t e d n i t r o g e n f i x a t i o n by crude c u l t u r e s of t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a . I t was n o t i c e d that 3 to 6 mg N was f i x e d per gram of sugar u t i l i z e d . T h i s amount was a p p r e c i a b l y l e s s than that f i x e d by Azotobacter spp. at m e s o p h i l i c tempera-t u r e s . No attempts were made to i s o l a t e the c a u s a t i v e organisms i n pure c u l t u r e nor was any d e s c r i p t i o n given. A l l e n (1) concluded that thermophiles c a r r y i n g out t r a n s -formation of nitrogenous compounds are r a r e and that the c o n d i t i o n s f o r o b t a i n i n g t h e i r development are not understood. For t h i s t r i a l (Figure 18), the t o t a l o r g a n i c n i t r o g e n w i t h i n the system, from beginning to end 1 0 4 . i n c r e a s e d f r o m 1 . 4 2 % t o 4 . 0 2 % , r e s p e c t i v e l y , u p 2 . 6 0 % o r a 2 . 8 f o l d i n c r e a s e . T h e a m o u n t i n c r e a s e d w i t h i n t h e t h e r m o p h i l i c r a n g e w a s u p t o 2 . 8 0 % , a b o u t a 2 f o l d i n c r e a s e . A d i s t i n c t i n c r e a s e o f t h e n i t r o g e n o u s c o m p o u n d s w a s n o t i c e d t o w a r d s t h e e n d ( 4 8 5 h ) o f t h e t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n . T h e r e f o r e , i t w a s r e a s o n a b l e t h a t t h i s p a r t i c u l a r f e r m e n t a t i o n w i t h p o t a t o w a s t e w o r k e d v i z . , b e c a u s e o f n i t r o g e n m a i n t e n a n c e a n d / o r i n c o r p o r a t i o n i n t o t h e s y s t e m . A l s o , i t w a s i n t e r e s t i n g t o n o t e t h e s u r v i v a l o f t h i s p a r t i c u l a r o r g a n i s m w i t h i n t h e t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e s a n d c o n d i t i o n s a n d i t s g r o w t h w i t h i n t h e m e s o p h i l i c t e m p e r a t u r e s . I s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n , f r o m t h e f e r m e n t i n g s u b s t r a t e , w e r e c a r r i e d o u t f o r t h i s c a u s a t i v e o r g a n i s m ( s ) a s v e r i f i c a t i o n o f t h e e x i s t e n c e o f t h e r m o p h i l i c o r g a n i s m ( s ) w h i c h m a i n t a i n a n d / o r i n c o r -p o r a t e n i t r o g e n w i t h i n t h e s y s t e m . T h e r e s u l t s o f t h e s e m i c r o b i a l a n a l y s e s a r e d i s c u s s e d i n a l a t e r s e c t i o n . T h e l a s t p a r a m e t e r m e a s u r e d f o r t h i s c o n t r o l t r i a l w a s t h e r a t e o f s o l i d s u t i l i z a t i o n , i n g / l / h , d u r i n g t h e c o u r s e o f t h e f e r m e n t a t i o n . I t a p p e a r s t h a t t h e g r e a t e s t b r e a k d o w n o f p o t a t o s o l i d s o c c u r r e d d u r i n g t h e f i r s t h a l f o f t h e f e r m e n t a t i o n . F i g u r e 1 8 i n d i c a t e d t h a t t h e p e a k s o f t h e c u r v e o c c u r a t 1 1 4 h , 2 0 5 . 5 h a n d 1 0 5 . 2 4 1 h a f t e r t h e s t a r t o f t h e e x p e r i m e n t . T h i s c o r r e s p o n d e d w i t h i n c r e a s i n g t e m p e r a t u r e s a n d d e c r e a s i n g t o t a l o r g a n i c n i t r o g e n c o n t e n t o f t h e s u b s t r a t e . T h i s w a s s e n s i b l e s i n c e i n c r e a s i n g b a c t e r i a n u m b e r s , t h u s i n c r e a s i n g t e m p e r a -t u r e s , r e s u l t e d i n a g r e a t e r a m o u n t o f s o l i d s d e g r a d e d a n d u t i l i z e d b y t h e o r g a n i s m s . B e c a u s e o f i n c r e a s i n g b a c t e r i a l n u m b e r s , t h e a v a i l a b l e n i t r o g e n w i t h i n t h e s y s t e m w a s u t i l i z e d , a n d n i t r o g e n e m i t t e d a s a m m o n i a w i t h t h e a i r p a s s -i n g t h r o u g h t h e s y s t e m . T h e s e r a t e s w e r e o f g r e a t e r m a g -n i t u d e a t t h e f i r s t h a l f o f t h e f e r m e n t a t i o n d u e t o t h e p r e s e n c e o f l a r g e a m o u n t s o f s t a r c h . M o r e t h a n 5 0 % o f t h e s o l i d s c o n t e n t w a s u t i l i z e d a f t e r t h e t h i r d p e a k . T o w a r d s t h e l a t t e r h a l f o f t h e f e r m e n t a t i o n , t h e r a t e o f u t i l i z a -t i o n s t a b i l i z e d a l o n g w i t h m o r e s t a b l e t e m p e r a t u r e s . I t a p p e a r e d t h a t t h e m a i n t e n a n c e o f h i g h t h e r m o p h i l i c t e m p e r a -t u r e s d o e s n o t r e q u i r e a s h i g h a s o l i d s b r e a k d o w n r a t e a s c o m p a r e d t o t h e i n c r e a s i n g b a c t e r i a l p o p u l a t i o n g r o w t h ( i n c r e a s i n g t e m p e r a t u r e s ) . A n o t h e r c o n t r o l t r i a l ( c o n t r o l t r i a l 4 ) w a s p e r f o r m e d i n o r d e r t o p r o v i d e a c o m p a r i s o n t o t h e p r e v i o u s t r i a l . T h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h i s f e r m e n t a t i o n a r e s h o w n i n F i g u r e 1 9 . T h e m e a s u r e m e n t s d e t e r m i n e d w e r e : t h e p H o f t h e f e r m e n t a t i o n ; t h e d i s s o l v e d o x y g e n ( D . O . ) )<.cf- /06 Jw p o c k e t : 1 0 7 . i n t h e s u b s t r a t e ; t h e t o t a l o r g a n i c n i t r o g e n a n d t h e t e m p -e r a t u r e o f t h e f e r m e n t a t i o n . A m a x i m u m t e m p e r a t u r e o f 6 8 . 9 ° C w a s r e a c h e d w i t h t h i s t r i a l . T h e r m o p h i l i c t e m p e r a -t u r e ( 5 0 ° C ) w a s o b t a i n e d a f t e r 1 1 0 h ( 4 . 6 d ) f r o m t h e s t a r t o f t h e f e r m e n t a t i o n , i . e . , a p p r o x i m a t e l y 2 d a y s l a t e r t h a n t h e p r e v i o u s t r i a l . T h e d u r a t i o n o f t h e t h e r m o -p h i l i c t e m p e r a t u r e w a s 2 5 5 h ( 1 0 . 6 d ) , 5 . 7 d a y s s h o r t e r t h a n t h e p r e v i o u s t r i a l . T h e i n i t i a l t o t a l s o l i d s c o n -t e n t p l a c e d i n t o t h e f e r m e n t e r w a s 1 0 . 6 7 g % a n d t h e f i n a l r e s i d u e y i e l d e d a s o l i d s c o n t e n t o f 8 . 3 4 g % . T h i s w a s a 2 . 3 3 g % r e d u c t i o n i n t o t a l s o l i d s o v e r a 4 5 5 h d e t e n t i o n t i m e , o r a r e d u c t i o n o f 2 1 . 8 % o f t h e t o t a l s o l i d s i n i -t i a l l y p r e s e n t w i t h i n t h e f e r m e n t e r . T h i s y i e l d e d a n o v e r a l l a v e r a g e r a t e o f s o l i d s u t i l i z a t i o n o f 0 . 0 5 1 g / l / h , f a r l e s s t h a n t h e p r e v i o u s t r i a l ( T a b l e 2 ) . I t w a s o b v i o u s t h a t t h i s p a r t i c u l a r f e r m e n t a t i o n w a s n o t i d e n t i -c a l t o t h e p r e v i o u s c o n t r o l t r i a l . T h i s w a s l i k e l y d u e t o t h e v a r i a t i o n i n t h e b a c t e r i a l f l o r a b e t w e e n t h e t w o b a t c h e s o f p o t a t o s u b s t r a t e . A s a r e s u l t , t h e d o m i n a n c e o f d i f f e r e n t t h e r m o p h i l e s c r e a t e d l o w e r t e m p e r a t u r e s a n d o f s h o r t e r d u r a t i o n . I n t h e f i r s t t r i a l , t h e t e m p e r a t u r e m a x i m u m s a n d p r o l o n g e d h i g h t e m p e r a t u r e d e t e n t i o n s d e g r a d e d t h e b u l k o f t h e o r g a n i c s u b s t a n c e s . T h i s w a s n o t t h e c a s e 1 0 8 . f o r t h e l a t t e r t r i a l , w h e r e l o w e r t e m p e r a t u r e s d o m i n a t e d a s a r e s u l t o f l o w e r m i c r o b i a l m e t a b o l i c a c t i v i t y . I t a p p e a r s t h a t t h e s e p o t a t o f e r m e n t a t i o n s a r e n o t e x a c t l y r e p r o d u c i b l e . W i t h o u t f u r t h e r c o n t r o l s ; t e m p e r a t u r e , p H a n d s o l i d s d e g r a d a t i o n r a t e s a r e d e p e n d e n t o n t h e e x i s t i n g f l o r a o f t h e p o t a t o e s a n d " t h e d o m i n a n c e o f t h e s e i n d i v i d u a l t h e r m o p h i l e s d u r i n g t h e c o u r s e o f t h e f e r m e n t a t i o n . T h e f e r m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c s e x h i b i t e d b y t h i s s e c o n d t r i a l w e r e s i m i l a r t o t h e f i r s t ; t h e m a g n i t u d e a n d i n t e n s i t y o f t h e t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n v a r i e d o n l y s l i g h t l y . A g a i n , 3 c y c l e s w e r e n o t e d , w i t h t h e l a s t c y c l e n o t a s d i s t i n c t a s t h e f i r s t t w o . E a c h c y c l e c o n -s i s t e d o f t h e c o r r e s p o n d i n g t e m p e r a t u r e a n d p H i n c r e a s e s w i t h t h e t o t a l o r g a n i c n i t r o g e n d e c r e a s i n g . T h e a s p e c t s o f t h e s e t r a i t s w e r e d i s c u s s e d f o r t h e p r e v i o u s t r i a l a n d w o u l d a p p l y f o r t h i s f e r m e n t a t i o n . T h e a m o u n t o f t o t a l o r g a n i c n i t r o g e n i n c o r p o r a t e d i n t o t h e f i n a l r e s i d u e f o r t h i s t r i a l y i e l d e d a v a l u e o f 1 . 9 1 1 f r o m t h e i n i t i a l i n p u t o f 1 . 5 8 % n i t r o g e n u p 0 . 3 3 % , o r a 1 . 2 f o l d i n c r e a s e . A n a d d i t i o n a l p a r a m e t e r m e a s u r e d i n t h i s t r i a l w a s d i s s o l v e d o x y g e n ( D . O . ) i n t h e s u b s t r a t e . T h e r e a d i n g s o b t a i n e d w e r e c o m p a r e d w i t h t h e c a l i b r a t i o n c u r v e f o r t h e D . O . p r o b e i n F i g u r e 1 3 . A v a i l a b l e o x y g e n f o r a n a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n w a s m o n i t o r e d 1 0 9 . t o e n s u r e a n a e r o b i c c o n d i t i o n s d i d n o t o c c u r . I n f o r m a t i o n on t h e b a c t e r i a l p o p u l a t i o n was a l s o p r o v i d e d w i t h t h e D.O. r e a d i n g s . The D.O. c u r v e f i t t e d w i t h i n t h e e s t a b l i s h e d c y c l e w i t h t h e o t h e r p a r a m e t e r s . D e c r e a s i n g D.O. w i t h i n t h e s u b s t r a t e c o r r e l a t e d w i t h i n c r e a s i n g t e m p e r a t u r e ( d e c r e a s i n g t o t a l o r g a n i c n i t r o g e n and i n c r e a s i n g p H ) , and v i c e v e r s a . O b v i o u s l y , i n c r e a s i n g a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a g r o w t h w o u l d p u t a demand on t h e o x y g e n s u p p l y w i t h i n t h e s u b s t r a t e . W i t h i n c r e a s i n g t e m p e r a t u r e s , due t o i n c r e a s i n g t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a l n u m b e r s , t h e D.O. c o n t e n t o f t h e s u b s t r a t e w o u l d d e c r e a s e . L i m i t i n g o x y g e n a v a i l a b i l i t y w o u l d i n h i b i t g r o w t h , and w i t h i n c r e a s i n g t e m p e r a t u r e s , t h e amount o f o x y g e n s o l u b l e i n t h e l i q u i d s u b s t r a t e w o u l d d e c r e a s e ; s e e F i g u r e 19. T h e r e f o r e , i n h i -b i t i o n o f b a c t e r i a l g r o w t h ( v i z - . , f u r t h e r t e m p e r a t u r e i n c r e a s e ) c o u l d be due t o two f a c t o r s : 1) i n c r e a s i n g b a c t e r i a l numbers w o u l d d e p l e t e t h e amount o f o x y g e n a v a i l a b l e f o r f u r t h e r p o p u l a t i o n i n c r e a s e , a n d / o r 2) w i t h i n c r e a s i n g s u b s t r a t e t e m p e r a t u r e , t h e s o l u b i l i t y o f o x y g e n i n t h e l i q u i d d e c r e a s e s t h u s l i m i t i n g f u r t h e r a e r o b i c -t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a l g r o w t h . A e r a t i o n o f t h e medium was n o t s t a r t e d a t t h e b e g i n n i n g o f t h e f e r m e n t a t i o n b u t was i n t e n t i o n a l l y d e l a y e d u n t i l t h e m e c h a n i c a l h e a t t e m p e r a t u r e was r e a c h e d by t h e 1 1 0 . p o t a t o m e d i u m . T h i s o c c u r r e d a t 8 7 h a f t e r t h e s t a r t . W i t h a g i t a t i o n a n d a e r a t i o n , a h e a v y s t a r c h f o a m w a s c r e a t e d a t m e s o p h i l i c t e m p e r a t u r e s . T h i s f o a m p r o d u c t i o n w a s d i f f i c u l t t o c o n t r o l . T o n e g a t e t h i s i n i t i a l s o l i d s l o s s d u e t o e x c e s s i v e f o a m i n g , a e r a t i o n w a s s t a r t e d w i t h i n t h e m e c h a n i c a l h e a t t e m p e r a t u r e s , p r i o r t o a t t a i n m e n t o f t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e s . T h i s w a s i m p o r t a n t s i n c e i n t h e t r i a l w i t h t h e h i g h s o d i u m h y d r o x i d e - t r e a t e d p o t a t o , a m o r e e x t e n s i v e " s o a p y - s t a r c h y " f o a m w a s c r e a t e d . 2 . A e r o b i c - t h e r m o p h i l i c F e r m e n t a t i o n o f S o d i u m  H y d r o x i d e - t r e a t e d P o t a t o T o s i m u l a t e t h e c a u s t i c s o d a p e e l e d p o t a t o w a s t e , a c a l c u l a t e d a m o u n t o f s o d i u m h y d r o x i d e w a s a d d e d t o 5 0 1 o f m a c e r a t e d p o t a t o , y i e l d i n g a s o d i u m c o n t e n t o f 5 . 6 6 % . T h i s b a s i c m i x t u r e w a s n e u t r a l i z e d w i t h s u l f u r i c a c i d t o a p H o f a p p r o x i m a t e l y 6 . S u l f u r i c a c i d w a s u s e d i n s t e a d o f h y d r o c h l o r i c a c i d s i n c e h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f N a C l c o u l d h i n d e r g r o w t h o f t h e t h e r m o p h i l e s ( T a b l e 9 ) . H o w e v e r , i n p r a c t i c e , i f t h e r e s i d u e i s t o b e u t i l i z e d a s . a n i m a l f e e d , s u l f u r i c a c i d s h o u l d b e p a r t l y r e p l a c e d w i t h H C 1 f o r n e u -t r a l i z a t i o n s i n c e a l a r g e a m o u n t o f s u l f a t e i n t h e f e e d m a y n o t b e d e s i r a b l e ( 6 ) . I n i t i a l n e u t r a l i z a t i o n o f t h e 1 1 1 . c a u s t i c p o t a t o s u b s t r a t e w a s r e q u i r e d b e f o r e m i c r o -o r g a n i s m s c a n p r o p a g a t e o n t h e p o t a t o s u b s t r a t e . T h i s c o u l d c o n s t i t u t e a n a d d i t i o n a l c o s t i n t r e a t m e n t o f t h e w a s t e . H o w e v e r , i f a c o n t i n u o u s f e r m e n t a t i o n w a s u t i l i z e d , a f t e r t h e i n i t i a l n e u t r a l i z a t i o n , t h e c a u s t i c p o t a t o w a s t e c o u l d b e a d d e d t o t h e f e r m e n t a t i o n d u r i n g t h e h i g h o r g a n i c a c i d p r o d u c t i o n s t a g e s o f t h e f e r m e n t a t i o n . T h i s f e r m e n t a t i o n w a s p e r f o r m e d i n o r d e r t o d e t e r m i n e i f t h e t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e s w e r e a c h i e v -a b l e w i t h a h i g h s o d i u m c o n t e n t s u b s t r a t e . T h e r e s u l t s o f t h e f e r m e n t a t i o n a r e i n d i c a t e d i n F i g u r e 2 0 . T h e m a x i m u m t e m p e r a t u r e o b t a i n e d w a s 6 3 . 2 ° C . T h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e s w e r e r e a c h e d a f t e r 8 2 h ( 3 . 4 d ) f r o m t h e s t a r t o f t h e f e r m e n t a t i o n w i t h a d e t e n t i o n t i m e i n t h e r m o -p h i l i c r a n g e o f 4 8 3 h ( 2 0 . 1 d ) . A n i n i t i a l s o l i d s c o n t e n t o f 1 6 . 5 6 g % ( 1 0 . 9 0 g % p o t a t o s o l i d s a n d 5 . 6 6 % s o d i u m s o l i d s ) w a s p l a c e d i n t o t h e f e r m e n t e r r e s u l t i n g i m . a . r e s i d u e o f 6 . 6 6 g % ( 1 . 0 0 g % p o t a t o r e s i d u e a n d 5 . 6 6 % s o d i u m s o l i d s ) , a d e c r e a s e o f 9 . 9 0 g % o r a t o t a l s o l i d s r e d u c t i o n o f 5 9 . 8 % ( 9 0 . 8 % r e d u c t i o n o f t o t a l p o t a t o s o l i d s ) . T h e o v e r a l l a v e r a g e r a t e o f s o l i d s u t i -l i z a t i o n w a s 0 . 1 1 5 g / l / h , w h i c h c o m p a r e d f a v o r a b l y w i t h t h e c o n t r o l t r i a l 3 , T a b l e 2 . S i n c e t h i s c a l c u l a t e d r a t e 113 . o f s o l i d s u t i l i z a t i o n w a s b a s e d o n d e t e n t i o n t i m e , t h e r a t e f o r t h i s p a r t i c u l a r e x p e r i m e n t w a s h i g h e r t h a n c o n t r o l t r i a l 3 . A l o n g e r d e t e n t i o n t i m e ( 2 9 5 h v s . 3 0 h ) a f t e r t h e t e m p e r a t u r e h a d d r o p p e d b e l o w 5 0 ° C , w a s r e q u i r e d t o b r i n g t h e f e r m e n t a t i o n t o m e c h a n i c a l h e a t t e m p e r a t u r e s . T h i s e x t r a t i m e b e l o w t h e t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e r e d u c e d t h e v a l u e , o f t h e c a l c u l a t e d r a t e f o r s o l i d u t i l i z a t i o n . I t w a s p o s s i b l e t o - o b t a i n t h e r m o p h i l i c c o n d i -t i o n s w i t h s o d i u m h y d r o x i d e t r e a t e d p o t a t o m a c e r a t e . H o w e v e r , t h e m a g n i t u d e a n d i n t e n s i t y o f t h e o b t a i n e d v a l u e s w e r e a g a i n d i f f e r e n t f r o m t h o s e o f t h e p r e v i o u s t r i a l s . T h i s m a y b e d u e t o t h e d i f f e r e n c e o f t h e f l o r a p r e s e n t i n t h e p o t a t o s u b s t r a t e . T r e a t i n g t h e m a c e r a t e d p o t a t o w i t h s o d i u m h y d r o x i d e a n d t h e n w i t h s u l f u r i c a c i d m a y h a v e s e l e c t e d o u t o r g a n i s m s w h i c h w e r e i n c a p a b l e o f s u r v i v i n g u n d e r t h e s e e x t r e m e c o n d i t i o n s . T h e r e m a i n i n g f l o r a w e r e s h o w n t o c o n s i s t o f t h e r m o p h i l e s c a p a b l e o f s u r v i v i n g t h e l y e t r e a t m e n t p r o c e s s . T h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e f e r m e n t a t i o n p r o d u c e d b y t h e s e r e m a i n i n g t h e r m o -p h i l e s r e s e m b l e t h e c o n t r o l t r i a l s t h o u g h t h e c u r v e s w e r e m o r e l e v e l ( F i g u r e 2 0 ) . O n e o t h e r f a c t o r w h i c h m a y h a v e a f f e c t e d t h i s f e r m e n t a t i o n w a s t h e s t a b i l i z a t i o n o f 114. the pH of the substrate. There appeared to be a buffering action created in the substrate due to the ne u t r a l i z a t i o n of the sodium hydroxide with s u l f u r i c acid. The pH held constant at 5.1 throughout the fermentation. This may have further selected out the growth of high temperature producing thermophiles. Large temperature fluctuations appeared to be missing from this fermentation when compared to the control t r i a l s . However, c h a r a c t e r i s t i c s resembling those of the control runs were s t i l l present, that i s , increasing temperatures corresponding to decreas-ing D.O. and t o t a l organic nitrogen, but the cycles were not as d i s t i n c t . Likewise, the t o t a l organic nitrogen increased from 1.68% to 2.07% up 0.39%, or a 1.2 f o l d increase. It is seen that an aerobic-thermophilic fer-mentation was possible with neutralized caustic soda treated potato substrate. However, i t i s l i k e l y that the fermentation can be improved in terms of greater rate of solids u t i l i z a t i o n , higher temperature produc-tion and shorter detention times by the addition of further nutrients and probably, the addition of an inoculum consisting of thermophilic bacteria from established thermophilic fermentations of manure or potato. 1 1 5 . I V . R e s u l t s o f t h e A n a l y s e s o f t h e F e r m e n t e d R e s i d u e T h e u p g r a d i n g o f t h e p o t a t o w a s t e b y a e r o b i c -t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n w a s d u e t o t h e i n c r e a s e o f n i t r o g e n i n t h e r e s i d u e . N i t r o g e n i n c o r p o r a t i o n , a s p r e v i o u s l y s t a t e d , b y t h e t h e r m o p h i l i c o r g a n i s m s i n t o t h e m e n s t r u u m s h o w e d i n c r e a s e s o f 2 0 . 9 1 t o a s h i g h a s 183.1%, T a b l e 3, f o r t h e f e r m e n t a t i o n t r i a l s c o n d u c t e d . T h e " q u a l i t y " o f t h i s i n c o r p o r a t e d n i t r o g e n i n t o t h e s u b s t r a t e b y a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n w a s d e t e r m i n e d a s t o w h e t h e r i t w a s c o n v e r t e d i n t o p r o t e i n o r r e m a i n e d i n t h e s u b s t r a t e i n s i m p l e r f o r m s s u c h a s f r e e a m i n o a c i d o r p e p t i d e s . T r i c h l o r o a c e t i c a c i d p r e c i p i t a t i o n w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e " t r u e " a m o u n t o f p r o t e i n n i t r o g e n w i t h i n t h e f e r m e n t e d r e s i d u e . T h i s " t r u e " p r o t e i n n i t r o g e n w a s d e t e r m i n e d b y t a k i n g t h e d i f f e r e n c e b e t w e e n t o t a l K j e l d a h l n i t r o g e n a n d t h e n o n - p r o t e i n K j e l d a h l n i t r o g e n . T h e l a t t e r w a s o b t a i n e d b y T C A d e p r o t e i n i z a t i o n o f t h e f e r -m e n t e d r e s i d u e i n w h i c h t h e ( a n i o n i c ) T C A f o r m s a n i n s o l u b l e s a l t w i t h ( c a t i o n i c ) p r o t e i n s . K j e l d a h l d e t e r -m i n a t i o n w a s p e r f o r m e d o n t h e r e s u l t a n t s u p e r n a t a n t t o g i v e t h e n o n - p r o t e i n n i t r o g e n v a l u e . T h e p e r c e n t " t r u e " p r o t e i n o b t a i n e d f o r t h e c o n t r o l t r i a l s a n d w i t h 5 . 6 6 % 1 1 6 . T a b l e 3 . A m o u n t o f n i t r o g e n i n t h e f e r m e n t e d r e s i d u e a s c o m p a r e d t o t h e i n i t i a l p o t a t o u s e d . „ . ,_. T o t a l K j e l d a h l n i t r o g e n , % A m o u n t F e r m e n t a t i o n i : 2 ! . 0 t r i a l A t s t a r t I n r e s i d u e i n c r e a s e d , '„ C o n t r o l t r i a l 3 1 . 4 2 4 . 0 2 1 8 3 . 1 C o n t r o l t r i a l 4 1 . 5 8 1 . 9 1 2 0 . 9 W i t h 5 . 6 6 1 N a 1 . 6 8 2 . 0 7 2 3 . 2 1 1 7 . sodium are shown i n Table 4. These fermented r e s i d u e s showed a marked i n c r e a s e i n " t r u e " p r o t e i n content over that of the f r e s h potato sample of 68.3%. The data presented i n Table 4 were values obtained by K j e l d a h l analyses of 5 ml a l i q u o t samples. Values from the assay f o r t o t a l K j e l d a h l n i t r o g e n i n d i c a t e d t h a t the f r e s h potato sample c o n t a i n s a higher n i t r o g e n l e v e l ( i n ppm) than the fermented s u b s t r a t e . T h i s was due to the higher s o l i d s content w i t h i n the 5 ml a l i q u o t used i n the f r e s h potato a n a l y s i s as compared to the s o l i d s w i t h i n the fermented samples. These values were comparable to the t o t a l s o l i d s u t i l i z a t i o n values of Table 2 i n which r e s i d u a l s o l i d s content i n c r e a s e d from c o n t r o l t r i a l 3, ^experiment with 5 ..66% -Na to c o n t r o l t r i a l -.4,. r e s p e c t i v e l y . ...The non-p r o t e i n - v a l u e s - ( T a b l e 4) f o l l o w e d the ..same trend as-the residual s o l i d s v a l u e s . The c o n v e r s i o n of nitrogenous com-pounds i n t o " t r u e " p r o t e i n i n c r e a s e d with i n c r e a s i n g n i t r o g e n i n c o r p o r a t i o n (Table 3 ) . •The p r o t e i n n i t r o g e n determined i n the f e r -mented r e s i d u e s probably c o n t a i n a g r e a t e r p o r t i o n of b a c t e r i a l p r o t e i n than potato p r o t e i n . T h i s was c o n s i -dered to be a b e n e f i t i n that the t o t a l waste product would be f u l l y u t i l i z e d , i . e . , the r e s i d u e which was l e f t T a b l e 4 . K j e l d a h l n i t r o g e n d e t e r m i n a t i o n ( w e t b a s i s ) o f t h e " t r u e " p r o t e i n n i t r o g e n i n t h e f e r m e n t e d p o t a t o u s i n g t r i c h l o r o a c e t i c a c i d p r e c i p i t a t i o n . S a m p l e T o t a l K j e l d a h l n i t r o g e n , p p m N o n - p r o t e i n K j e l d a h l n i t r o g e n , p p m " T r u e " p r o t e i n n i t r o g e n , p p m " T r u e " p r o t e i n , o a 0 F r e s h p o t a t o C o n t r o l t r i a l 3 C o n t r o l t r i a l 4 W i t h 5 . 6 6 1 N a 8 5 . 3 3 2 . 5 7 3 . 7 5 8 . 0 2 7 . 0 6 . 0 1 8 . 0 1 2 . 0 5 8 . 3 2 6 . 5 5 5 . 7 4 6 . 0 6 8 . 3 8 1 . 5 7 5 . 8 7 9 . 9 A s p e r c e n t o f " t r u e " p r o t e i n n i t r o g e n ( p p m ) t o t o t a l K j e l d a h l n i t r o g e n ( p p m ) . 119. o v e r f r o m t h e f e r m e n t a t i o n c o u l d s e r v e a s a s i n g l e c e l l p r o t e i n ( S C P ) s o u r c e . T h u s , t h e a d v a n t a g e o f u t i l i z i n g t h e a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c p r o c e s s a s t h e t r e a t m e n t s y s t e m f o r p o t a t o w a s t e w a s n o t o n l y w i t h r e s p e c t t o r e d u c i n g t h e s o l i d s , b u t a l s o , f o r t h e c o n v e r s i o n o f t h e c a r b o h y -d r a t e w a s t e i n t o S C P . T h e f o r m a t i o n o f S C P p r e s e n t s a p o s s i b l e u t i l i z a t i o n o f t h e f e r m e n t e d r e s i d u e f o r l i v e -s t o c k f e e d . T h e i n c r e a s e d n i t r o g e n c o n t e n t i s a n i m p r o v e -m e n t o v e r t h e i n i t i a l l e v e l s i n t e r m s o f s e r v i n g a s a n a n i m a l f e e d . F o r m o n o g a s t r i e s , t h e a m i n o a c i d c o n t e n t o f t h e f e r m e n t e d r e s i d u e , a s s h o w n i n t h e p r o f i l e i n T a b l e 5 , i s i m p o r t a n t f o r n u t r i t i o n . T h e v a r i a t i o n o b s e r v e d i n t h e a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f t h e S C P c o u l d b e t h e r e s u l t o f a n u m b e r o f d i f f e r e n t f a c t o r s , e . g . , m e t h o d o f c u l t u r e , t i m e o f h a r v e s t , t h e s u b s t r a t e u t i -l i z e d a n d s t r a i n s o f b a c t e r i a ( 4 ) . T h e a m i n o a c i d s o f t h e t h r e e f e r m e n t e d s u b s t r a t e s w h i c h o c c u r r e d i n i n c r e a s e d q u a n t i t i e s o v e r t h a t o f p o t a t o w e r e : g l u t a m i c a c i d , a l a n i n e , v a l i n e a n d m e t h i o n i n e . T h o s e w h i c h s h o w e d d e c r e a s e d v a l u e s f o r t h e t h r e e f e r m e n t e d s u b s t r a t e w e r e : a s p a r t i c a c i d , t h r e o n i n e , s e r i n e , p r o l i n e , l e u c i n e a n d c y s t i n e . T h e r e m a i n d e r o f t h e a m i n o a c i d s v a r i e d b e t w e e n t h e t r i a l s . A c o m p a r i s o n o f t h e e s s e n t i a l a m i n o a c i d r e q u i r e m e n t f o r c h i c k e n s t o t h a t f o u n d i n t h e f e r m e n t e d r e s i d u e i n d i c a t e d t h a t t h e f e r m e n t e d r e s i d u e w o u l d b e T a b l e 5 . A m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f t h e f e r m e n t e d r e s i d u e c o m p a r e d w i t h t h e p o t a t o u s e d i n t h e f e r m e n t a t i o n . C o n t r o l t r i a l 3 C o n t r o l : t r i a l 4 W i t h 5 . 6 6 % N a P o t a t o R e s i d u e P o t a t o R e s i d u e P o t a t o R e s i d u e % % 0 0 % % C \ h A s p a r t i c a c i d 1 1 . , 3 6 1 0 . 1 1 1 1 , . 3 1 1 0 . 5 3 1 1 . , 4 0 1 0 , , 1 0 T h r e o n i n e 6 . , 3 6 5 . 4 0 6 , . 4 3 5 . 9 2 6 , . 2 8 5 , . 9 5 S e r i n e 5 . . 1 3 4 . 4 1 5 , . 2 7 4 . 6 0 5 , . 3 5 4 , , 7 8 G l u t a m i c a c i d 1 0 . . 0 1 1 1 . 9 7 1 0 . . 0 4 1 1 . 7 3 1 0 , . 0 4 1 1 , . 0 3 P r o l i n e 3 . . 9 0 2 . 6 8 4 , . 5 8 4 . 3 2 3 , . 5 6 2 . , 6 8 G l y c i n e 4 . . 8 0 5 . 7 4 5 . . 0 9 4 . 8 1 4 , , 7 5 4 . . 9 6 A l a n i n e 5 . . 1 1 7 . 1 2 5 , . 0 8 6 . 3 5 5 , . 0 9 6 . , 2 8 V a l i n e 5 . . 0 1 5 . 4 3 5 , . 0 6 6 . 1 3 5 , , 2 3 5 . , 5 4 M e t h i o n i n e 2 . , 3 0 2 . 8 9 2 , . 2 6 2 . 4 5 2 , . 3 2 3 , , 2 2 I s o l e u c i n e 5 . , 1 1 6 . 0 2 4 , . 6 4 6 . 0 9 5 , , 7 8 4 . , 9 2 L e u c i n e 9 . , 0 1 8 . 2 5 9 , . 0 9 8 . 5 8 8 , . 3 9 6 . , 9 1 T y r o s i n e 3 . , 5 3 4 . 7 0 4 . . 0 9 3 . 9 1 3 , . 3 7 4 . , 5 3 P h e n y l a l a n i n e 5 . . 4 1 5 . 7 3 5 . . 5 1 4 . 7 1 4 . . 5 8 3 . , 9 5 L y s i n e 6 . . 9 6 6 . 6 2 6 . . 8 9 6 . 3 1 7 , . 1 7 8 . , 3 5 H i s t i d i n e 1 . , 9 0 1 . 8 0 1 . . 9 8 2 . 4 4 2 , . 0 2 2 , , 3 5 T r y p t o p h a n 2 . . 8 1 t r a c e 2 . . 3 1 t r a c e 3 , . 0 4 3 . , 8 3 A r g i n i n e 4 . . 5 1 4 . 4 7 3 . . 5 1 4 . 4 4 4 , , 6 5 3 . , 8 9 P y r i d y l e t h y l - 1 . , 7 6 1 . 6 0 1 . . 8 5 1 . 6 6 1 , . 9 6 1 . . 7 3 L - c y s t i n e T o t a l p e r c e n t 9 4 , . 9 8 9 4 . 9 8 9 4 . . 9 8 9 4 . 9 8 9 4 , , 9 8 9 5 . , 0 0 1 2 1 . f a v o u r a b l y a c c e p t e d ( T a b l e 6 ) . F o r t h e c o n t r o l t r i a l s , t h e l i m i t i n g a m i n o a c i d a p p e a r e d t o b e t r y p t o p h a n . H o w e v e r , f o r t h e h i g h s o d i u m c o n t e n t t r i a l , t h e t r y p t o -p h a n v a l u e c a n b e c o n s i d e r e d t o b e n u t r i t i o n a l l y a d e q u a t e . U s i n g t h e r e s i d u e a s a f e e d s u p p l e m e n t , t h e p r o p o r t i o n s c a n b e a d j u s t e d a c c o r d i n g l y t o t h e a m o u n t s s h o w n i n T a b l e 6 . H o w e v e r , i n o r d e r t o f u l l y a n s w e r t h e q u e s t i o n o f w h e t h e r t h e S C P w o u l d s e r v e a s a n a d e q u a t e a n i m a l f e e d ; f u r t h e r s t u d i e s a r e r e q u i r e d o n c u l t u r e s t a b i l i t y i n p r o d u c t i o n o f S C P i n l a r g e s c a l e o p e r a t i o n s , a n i m a l a c c e p -t a n c e , a n i m a l t o x i c i t y a n d t h e q u a l i t y o f t h e a n i m a l p r o d u c t s . A n o b v i o u s a d v a n t a g e o f t h e r m o p h i l i c S C P p r o d u c -t i o n i s t h e d e s t r u c t i o n o f p a t h o g e n s d u r i n g t h e p r o c e s s , n e g a t i n g t h e n e e d f o r p a s t e u r i z a t i o n o f t h e p r o d u c t . A l s o , t h e i n i t i a l s t e r i l i z a t i o n o f t h e f e r m e n t a t i o n s u b -s t r a t e i s n o t r e q u i r e d f o r t h e t h e r m o p h i l i c S C P c u l t u r i n g . A p o s s i b l e p o t e n t i a l p r o b l e m c o n c e r n i n g u t i l i z a -t i o n o f t h e f e r m e n t e d r e s i d u e a s f e e d i s t h a t t h e s o d i u m c o n t e n t i s h i g h . T h e t o x i c l e v e l s o f v a r i o u s s o d i u m c o m p o u n d s f o r p o u l t r y i s s h o w n i n T a b l e 7 . F o r i m m a t u r e t u r k e y s , i t c a n b e s e e n t h a t a t e n - f o l d h i g h e r l e v e l o f s o d i u m , a s N a C l , c a n b e c o n s u m e d w i t h t h e f e e d a s c o m p a r e d t o i t s c o n s u m p t i o n w i t h i n w a t e r . A l e v e l o f 4 0 , 0 0 0 p p m N a C l o r 4 1 ( w / w ) w a s t o l e r a t e d w i t h i n t h e f e e d T a b l e 6 . A m i n o a c i d r e q u i r e m e n t s o f c h i c k e n s c o m p a r e d t o t h e v a l u e s o f t h e f e r m e n t e d r e s i d u e s . R e p l a c e m e n t p u l l e t s B r o i l e r s ( e g g o r m e a t t y p e ) T . , F e r m e n t e d r e s i d u e s A m i n o A c i d — — Laying a n d muno ACIQ Q _ 6 W K G 6 _ G W K S Q _ 6 W K S 6 _ u w k s U _ 2 Q w k g b r e e d i n g h e n s C o n t r o l s * W i t h N a % % % % % % % % A r g i n i n e 1 .4 1 .2 1 .2 0 . 9 5 0 . 72 0 . 8 4 . 4 4 3, . 89 G l y c i n e 1 . 1 5 1 .0 1 .0 0 .8 0 .6 ? 4 . 8 1 - 4 . .96 H i s t i d i n e 0 . 4 6 0 .4 0 . 4 0 . 32 0 . 2 4 ? 1 .80 2. .35 I s o l e u c i n e 0 . 8 6 0 . 7 5 0 . 7 5 0 .6 0 . 4 5 0 . 5 6 . 0 2 4 . .92 L e u c i n e 1 .6 1 . 4 1 .4 1 .1 0 . 84 1 . 2 8 . 2 5 6. .91 L y s i n e 1 . 2 5 1 .1 1.1 0 . 9 0 . 66 0 . 5 6 . 3 1 8. .35 M e t h i o n i n e 0 . 8 6 0 . 7 5 0 . 7 5 0 .6 0 . 4 5 0 . 5 3 2 . 4 5 3. .22 P h e n y l a l a n i n e 1 . 5 1 . 3 1 .3 1 . 0 5 0 . 7 8 ? 4 . 7 1 3. .95 T h r e o n i n e 0 . 8 0 . 7 0 . 7 0 . 5 5 0 . 42 0 . 4 5 . 40 5. .95 T r y p o t p h a n 0 . 2 3 0 .2 0 . 2 0 .16 0 . 12 0 . 1 1 t r a c e 3. .83 V a l i n e 1 . 0 0 . 8 5 0 . 8 5 0 . 7 0 .5 5 . 4 3 5. ,54 F r o m : N u t r i e n t R e q u i r e m e n t s o f D o m e s t i c A n i m a l s , " N u t r i e n t R e q u i r e m e n t s o f P o u l t r y " , 6 t h E d i t i o n , 1 9 7 1 , S u b c o m m i t t e e o n P o u l t r y N u t r i t i o n , C o m m i t t e e o n A n i m a l N u t r i t i o n , A g r i c u l t u r a l B o a r d , N a t i o n a l R e s e a r c h C o u n c i l , N a t i o n a l A c a d e m c y o f S c i e n c e s , W a s h i n g t o n , D . C . a L o w e s t v a l u e s o b t a i n e d f o r t h e t w o c o n t r o l f e r m e n t a t i o n s . M tsj T a b l e 7 . T o x i c s o d i u m l e v e l s f o r p o u l t r y . S p e c i e s A g e C o m p o u n d T o x i c l e v e l , p p m P h y s i o l o g i c a l E f f e c t C h i c k e n I m m a t u r e N a g l u t a m a t e 8 , 9 0 0 a R e d u c e d g r o w t h C h i c k e n L a y i n g h e n N a 2 S 0 4 1 2 , 0 0 0 b R e d u c e d e g g p r o d u c t i o n C h i c k e n I m m a t u r e N a C l 7 , 0 0 0 b R e d u c e d g r o w t h ; m o r t a l i t y C h i c k e n L a y i n g h e n N a C l 1 0 , 0 0 0 b R e d u c e d e g g p r o d u c t i o n T u r k e y I m m a t u r e N a C l 4 , 0 0 0 b R e d u c e d b o d y w e i g h t ; m o r t a l i t y T u r k e y I m m a t u r e N a C l 4 0 , 0 0 0 c R e d u c e d g r o w t h ; p e n d u l o u s c r o p T u r k e y M a t u r e N a C l 6 0 , 0 0 0 C R e d u c e d g r o w t h D u c k I m m a t u r e N a C l 4 , 0 0 0 b R e d u c e d b o d y w e i g h t F r o m : N u t r i e n t R e q u i r e m e n t s o f D o m e s t i c A n i m a l s , " N u t r i e n t R e q u i r e m e n t s o f P o u l t r y " 6 t h E d i t i o n , 1 9 7 1 , S u b c o m m i t t e e o n P o u l t r y N u t r i t i o n , C o m m i t t e e o n A n i m a l N u t r i t i o n , A g r i c u l t u r a l B o a r d , N a t i o n a l R e s e a r c h C o u n c i l , N a t i o n a l A c a d e m y o f S c i e n c e s , W a s h i n g t o n , D . C . 9. -D i e t l o w i n C I i o n . b I n w a t e r . c I n f e e d . 124 . f o r i m m a t u r e t u r k e y s , w h e r e a s m a t u r e t u r k e y s c a n c o n s u m e u p t o 6 0 , 0 0 0 p p m o r 61 ( w / w ) . S i n c e t h e f e r m e n t e d r e s i d u e w o u l d c o n t a i n a p p r o x i m a t e l y 5 - 6 1 ( w / w ) i t i s q u i t e f e a s i -b l e t h a t i t s u t i l i z a t i o n a s f e e d w o u l d n o t b e d e t r i m e n t a l . A l s o , w h e n u s e d a s a s u p p l e m e n t , a d i l u t i o n e f f e c t w o u l d b e p r o v i d e d a s i t i s i n c o r p o r a t e d a l o n g w i t h o t h e r f e e d m a t e r i a l . T h u s , a s a n a d d e d a d v a n t a g e , b e s i d e s t h e t r e a t -m e n t o f t h e p o t a t o w a s t e i n o r d e r t o d e c r e a s e t h e t o t a l o r g a n i c s o l i d s l o a d b y t h e a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c p r o c e s s , a b y - p r o d u c t w a s p r o d u c e d b y t h i s f e r m e n t a t i o n w h i c h i s a v a l u a b l e p r o t e i n s o u r c e f o r a n i m a l f e e d . T h i s w o u l d m e a n t h a t i t w o u l d a p p e a r p o s s i b l e t o h a v e t h e t o t a l u t i l i z a t i o n ( o r d i s p o s a l ) o f t h e e n t i r e w a s t e . H o w e v e r , o n e d i s a d v a n t a g e w o u l d b e t h e c o s t o f d e w a t e r i n g t h e f i n a l f e r m e n t e d r e s i d u e . A p o s s i b l e s o l u t i o n i n - p a r t c o u l d i n v o l v e t h e h a r v e s t i n g o f t h e h e a t p r o d u c e d b y t h e t h e r m o p h i l e s f o r t h e d r y i n g o f t h e f e r m e n t e d r e s i d u e . T h e u s e o f t h i s f e r m e n t e d r e s i d u e a s a n i m a l f e e d s h o u l d a i d i n r e d u c i n g t h e o v e r a l l c o s t o f t h e w a s t e t r e a t m e n t p r o c e s s . 1 2 5 . V . I d e n t i f i c a t i o n o f t h e A e r o b i c - T h e r m o p h i l i c B a c t e r i a  P r e s e n t i n t h e T h e r m o p h i l i c F e r m e n t a t i o n o f P o t a t o W a s t e s A s v e r i f i c a t i o n o f t h e e x i s t e n c e o f a e r o b i c -t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a t h a t i n c o r p o r a t e d n i t r o g e n w i t h i n t h e p o t a t o s u b s t r a t e , i s o l a t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f t h e o r g a n i s m ( s ) r e s p o n s i b l e f o r f i x i n g a t m o s p h e r i c n i t r o g e n w e r e c o n d u c t e d . T h i s w o u l d s e r v e a s a d d e d d e f i n i t i v e p r o o f t h a t a t m o s p h e r i c n i t r o g e n w a s i n c o r p o r a t e d i n t o t h e f e r m e n t a t i o n a n d s u b s e q u e n t l y c o n v e r t e d i n t o p r o t e i n . I t w a s r e a l i z e d f r o m t h e l i t e r a t u r e t h a t t h e m o r e c o m m o n l y k n o w n n i t r o g e n - f i x i n g o r g a n i s m s w e r e u n a b l e t o s u r v i v e u n d e r t h e a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c c o n d i t i o n s . T h e m o r e c o m m o n l y k n o w n n i t r o g e n - f i x i n g o r g a n i s m s b e l o n g t o t h e A z o t o b a c t e r a c e a e f a m i l y , c o n s i s t i n g o f t h e g e n e r a A z o t o b a c t e r a n d B e i j e r i n c k i a a n d t h e l e s s e r k n o w n A z o m o n a s a n d D e r x i a . B e r g e y ' s m a n u a l ( 7 ) s t a t e d a n o p t i m u m g r o w t h t e m p e r a t u r e o f b e t w e e n 2 0 a n d 3 0 ° C f o r t h e f i r s t t h r e e g e n e r a w i t h n o g r o w t h o c c u r r i n g a t t e m p e r a t u r e s h i g h e r t h a n 3 7 ° C . D e r x i a h a s a n o p t i m u m g r o w t h t e m p e r a t u r e a t 2 5 - 3 5 ° C a n d n o g r o w t h a t 5 0 ° C o r a b o v e . A l s o , c e r t a i n s p e c i e s o f t h e g e n e r a P s e u d o m o n a s , C l o s t r i d i u m , K l e b s i e l l a a n d B a c i l l u s a r e k n o w n t o f i x n i t r o g e n ( 7 , 2 2 , 4 9 , 5 2 ) . T h e s e a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 8 a l o n g w i t h t h e i r o p t i m u m 1 2 6 - . T a b l e 8 . A t m o s p h e r i c n i t r o g e n - f i x i n g o r g a n i s m s a s s t a t e d i n B e r g e y ' s M a n u a l o f D e t e r m i n a t i v e B a c t e r i o l o g y . S p e c i e s O p t i m u m g r o w t h t e m p e r a t u r e , °C C o m m e n t s C l o s t r i d i u m C . p a s t e u r i a n u m C . b u t y r i c u m C . a c e t o b u t y l i c u m 3 7 2 5 - 3 7 3 7 l i m i t e d f i x a t i o n o f a t m o s p h e r i c n i t r o g e n K l e b s i e l l a K . p n e u m o n i a e 3 5 - 3 7 f r o m V . B . D . S k e r m a n ( 4 8 ) P s e u d o m o n a s P . m e t h a n i t r i f i c a n s 2 0 - 3 5 ( M e t h y l o m o n a s m e t h a n i t r i f i c a n s ) B a c i l l u s B . p o l y m y x a B . m a c e r a n s 3 5 - 4 5 u n d e r a n a e r o b i c c o n -d i t i o n s b y m a j o r i t y o f s t r a i n s 4 0 - 5 0 u n d e r a n a e r o b i c c o n -d i t i o n s b y m a j o r i t y o f s t r a i n s 127. g r o w t h t e m p e r a t u r e s . H o w e v e r , o n l y c e r t a i n s t r a i n s o f t h e s e s p e c i e s f i x n i t r o g e n . T h e o t h e r w e l l k n o w n o r g a n i s m s w h i c h c a n f i x m o l e c u l a r n i t r o g e n b e l o n g t o t h e g e n u s R h i z o b i u m . H o w e v e r , t h e s e o r g a n i s m s r e q u i r e a s y m b i o t i c r e l a t i o n s h i p w i t h r o o t s o f l e g u m i n o u s p l a n t s . T h i s m u t u a l i s t i c p a r t n e r s h i p i s r e q u i r e d s i n c e n e i t h e r t h e p l a n t n o r t h e b a c t e r i a c a n f i x n i t r o g e n i n d i v i d u a l l y . O r g a n i s m s o f t h i s p a r t i c u l a r g e n u s w e r e u n l i k e l y t o h a v e o c c u r r e d w i t h i n t h e f e r m e n t a t i o n . T h e p o s s i b l e o r g a n i s m ( s ) f i x i n g n i t r o g e n w i t h i n t h e s u b s t r a t e w o u l d h a v e t o b e a n o n - s y m b i o t i c o r f r e e - l i v i n g , h i g h t e m p e r a t u r e , f a c u l t a -t i v e a e r o b i c o r a e r o b i c o r g a n i s m . T h i s w o u l d a p p e a r t o r u l e o u t t h e s p e c i e s s t a t e d i n T a b l e 8. T h e o r g a n i s m ( s ) r e s p o n s i b l e f o r n i t r o g e n f i x a -t i o n w e r e i s o l a t e d f r o m t h e f e r m e n t a t i o n o n t h r e e d i f f e r -e n t n i t r o g e n - f r e e s e l e c t i v e m e d i a . O n e o f t h e m e d i a w a s a c o m m e r c i a l l y p r e p a r e d m e d i u m , D i f c o Y e a s t C a r b o n B a s e ( Y C B ) , u s e d f o r t e s t i n g n i t r o g e n a s s i m i l a t i o n b y y e a s t s . T h i s b a s a l m e d i u m w a s f i l t e r - s t e r i l i z e d a n d i n c o r p o r a t e d i n t o s t e r i l e a g a r t o f o r m t h e s e l e c t i v e m e d i u m . T h e o t h e r t w o m e d i a w e r e s y n t h e t i c m e d i a s p e c i -f i c f o r t h e i s o l a t i o n o f n o n - s y m b i o t i c , n i t r o g e n - f i x i n g , s o i l o r g a n i s m s . O n e m e d i u m ( a b b r e v i a t e d a s A z o ) w a s s p e c i f i c f o r A z o t o b a c t e r s p e c i e s a n d t h e o t h e r 128 . ( a b b r e v i a t e d a s M e i ) , a d a p t e d f r o m M e i k l e j o h n ( 3 8 ) , w a s s p e c i f i c f o r o r g a n i s m s o f b o t h t h e A z o t o b a c t e r a n d B e i j e r i n c k i a g e n e r a . T h e c o m p o s i t i o n o f t h e s e s y n t h e t i c m e d i a w e r e v e r y s i m i l a r . T h e m o s t i m p o r t a n t r e q u i r e m e n t b e i n g m o l y b d e n u m ( 7 ) , w h i c h w a s p r e s e n t i n a l l t h r e e m e d i a i n t h e f o r m o f s o d i u m m o l y b d a t e . S i n c e t h e s e b a c -t e r i a d o n o t r e q u i r e o r g a n i c s u b s t a n c e s , s u c r o s e w a s s u i t a b l e a s t h e c a r b o n s o u r c e . T h e m e d i a w e r e f a i r l y s i m p l e a n d w e l l b u f f e r e d w i t h p h o s p h a t e a n d p o t a s s i u m s a l t s . K j e l d a h l n i t r o g e n a n a l y s e s s h o w e d t h e a b s e n c e o f a n y d e t e c t a b l e n i t r o g e n i n a n y o f t h e t h r e e m e d i a . A s a m p l e o f t h e s u b s t r a t e w a s r e m o v e d f r o m t h e f e r m e n t e r o n c e t h e f e r m e n t a t i o n w a s w e l l i n t o t h e t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e r a n g e . T h e s a m p l e w a s s t r e a k e d o n t o e a c h m e d i u m , a n d a f t e r i n c u b a t i o n a t 5 5 ° C , v i s u a l l y d i s t i n c t c o l o n i e s w e r e i s o l a t e d a n d r e s t r e a k e d o n t o f r e s h p l a t e s . A f t e r s i x t r a n s f e r s , i t w a s a s s u m e d t h a t t h e s e s u r v i v i n g c o l o n i e s g r o w i n g a t t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e s o n n i t r o g e n - f r e e m e d i a w e r e u t i l i z i n g a t m o s p h e r i c n i t r o g e n a s a s o u r c e o f n i t r o g e n . T h e s e s i x c o n s e c u t i v e t r a n s f e r s w e r e r e q u i r e d t o e n s u r e a d e q u a t e d i l u t i o n o f t h e f e r m e n t e r n i t r o g e n a n d t h u s e n s u r e t h a t t h e n e w c o l o n y f o r m a t i o n s o b t a i n e d t h e n i t r o g e n r e q u i r e d f o r g r o w t h o n l y f r o m t h e a i r . G r o w t h o n t h e l a t e r t r a n s f e r s w e r e s l o w o n a l l 1 2 9 . t h r e e m e d i a ; w i t h c o l o n i e s g r o w i n g o n t h e s y n t h e t i c m e d i a m o r e s l o w l y t h a n o n Y C B . I n c r e a s e d g r o w t h c o u l d b e d u e t o t h e p r e s e n c e o f v i t a m i n s a n d a m i n o a c i d s i n t h e Y C B c o m p o s i t i o n . A f t e r s e l e c t i v e i s o l a t i o n , t h e p u r e c u l t u r e s w e r e c l a s s i f i e d a c c o r d i n g t o t h e i r G r a m r e a c t i o n a n d c e l l m o r p h o l o g y . M i c r o s c o p i c o b s e r v a t i o n s s h o w e d t h e o r g a n i s m s t o b e G r a m v a r i a b l e , l o n g r o d s , o c c u r r i n g s i n g l y o r i n c h a i n s ( F i g u r e 2 1 ) . E n d o s p o r e f o r m a t i o n w a s n o t e d u n d e r p h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p y a l o n g w i t h m o t i l i t y ( a s o p p o s e d t o B r o w n i a n m o v e m e n t ) . T h e s e v i s u a l o b s e r v a t i o n s s u g g e s t e d t h e o r g a n i s m s t o b e l o n g t o t h e B a c i l l a c e a e f a m i l y . F u r t h e r d i f f e r e n t i a l c h a r a c t e r i s t i c s w e r e d e t e r -m i n e d i n o r d e r t o i d e n t i f y t h e g e n u s i n w h i c h t h e s e p a r -t i c u l a r o r g a n i s m s b e l o n g w i t h i n t h i s f a m i l y . S t a b c u l -t u r e s i n t o t u b e d T r y p t i c a s e S o y A g a r s h o w e d g r o w t h o n t o p o f t h e a g a r a n d a l o n g t h e e n t i r e s t a b f o r a l l t h e o r g a n i s m s i s o l a t e d . G r o w t h a l s o o c c u r r e d u n d e r a n a e r o -b i c c o n d i t i o n s a t 5 5 ° C , i n d i c a t i n g t h e b a c t e r i a t o b e f a c u l t a t i v e a n a e r o b e s . T h e s e o r g a n i s m s w e r e a l s o c a t a -l a s e p o s i t i v e . F r o m t h e a b o v e p r o p e r t i e s i t w a s c o n -c l u d e d t h a t a l l t h e i s o l a t e d c u l t u r e s f r o m t h e s e l e c t i v e m e d i a b e l o n g t o t h e g e n u s B a c i l l u s . S p e c i e s o f t h e g e n u s C l o s t r i d i u m r e s e m b l e t h e a b o v e d e s c r i p t i o n , h o w e v e r , 130. Figure 21. Gram r e a c t i o n and c e l l u l a r morphology of the i s o l a t e d organism. 131. t h e y a r e s t r i c t a n a e r o b e s a n d u s u a l l y c a t a l a s e n e g a t i v e . T h e o t h e r g e n e r a o f t h i s f a m i l y a r e e i t h e r s t r i c t a n a e r o b e s ( D e s u l f o t o m a c u l u m ) , s t r i c t a e r o b e s ( S p o r o s a r c l n a ) o r m i c r o a e r o p h i l i c , c a t a l a s e n e g a t i v e X S p o r o l a c t o b a c i l l u s ) ( 7 ) . F u r t h e r d i f f e r e n t i a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d b i o c h e m i c a l p r o f i l e s o f t h e i s o l a t e d o r g a n i s m s a r e s h o w n i n T a b l e 9 . E v a l u a t i o n o f t h i s p r o f i l e p l a c e s t h e s p e c i e s w i t h i n t h e g e n u s B a c i l l u s . T h e b i o c h e m i c a l p r o f i l e w a s c o m p a r e d t o t h e c h a r a c t e r i s t i c p r o v i d e d b y B e r g e y ' s m a n u a l ( 7 ) a n d G o r d o n e t a l . ( 2 2 ) . T h e o r g a n i s m s i s o l a t e d f r o m t h e c o n t r o l t r i a l 4 a n d f r o m t h e p o t a t o f e r m e n t a t i o n w i t h 5 . 6 6 1 s o d i u m , o n a l l t h r e e s e l e c t i v e m e d i a h a d s i m i l a r c h a r a c t e r i s t i c s ( T a b l e 9 ) . T h e s e p a r t i c u l a r o r g a n i s m s w e r e c h a r a c t e r i z e d o n t h e d i f f e r e n t i a l c h a r a c -t e r i s t i c s , a s d e s c r i b e d b y B e r g e y ' s m a n u a l ( 7 ) a n d G o r d o n e t a l . ( 2 2 ) , a n d c o n c l u d e d t o b e l o n g t o t h e s p e c i e s '. B a c i l l u s c o a g u l a n s . T h i s c o n c l u s i o n w a s r e a c h e d b y t h e f o l l o w i n g r e a s o n s : 1) O n e o f t h e m o s t d e f i n i t i v e t e s t s t o i n d i c a t e t h a t t h e o r g a n i s m s a r e o f t h i s s p e c i e s i s t h e g r o w t h t e m p e r a t u r e . T h e m a x i m u m t e m p e r a t u r e o b t a i n e d w a s 6 0 ° C ± 5 ° C . T h e r m o p h i l e s o f t h i s g e n u s c a p a b l e o f s u r v i v i n g a t t h i s t e m p e r a t u r e m a x i m u m a r e B . s t e a r o t h e r - m o p h i l u s ( 6 5 - 7 5 ° C ) , B . c o a g u l a n s ( 5 5 - 6 0 ° C ) a n d B . b r e v i s ( 4 0 - 6 0 ° C ) a n d p o s s i b l y , B . l i c h e n i f o r m i s T a b l e 9. C h a r a c t e r i s t i c s o f t h e o r g a n i s m s i s o l a t e d o n n i t r o g e n - f r e e m e d i a ; Y e a s t C a r b o n B a s e ( Y C B ) , m o d i f i e d M e i k l e j o h n ' s ( M e i ) a n d A z o t o b a c t e r s p e c i f i c m e d i u m ( A z o ) . C h a r a c t e r i s t i c s C o n t r o l t r i a l 4 Y C B M e i A z o W i t h 5 . 661 N a Y C B M e i A z o A p p e a r a n c e o f c o l o n i e s ( T S A ) : f o r m e l e v a t i o n m a r g i n A g a r s t r o k e ( T S A ) : G r o w t h i n b r o t h ( T S B ) : M i c r o s c o p i c a p p e a r a n c e : s h a p e a r r a n g e m e n t s i z e : w i d t h , u l e n g t h , y G r a m r e a c t i o n : S p o r e : s h a p e p o s i t i o n s p o r a n g i a c i r c u l a r u m b o n a t e e n t i r e f i l i f o r m c i r c u l a r u m b o n a t e e n t i r e f i l i f o r m c i r c u l a r c i r c u l a r c i r c u l a r c i r c u l a r u m b o n a t e u m b o n a t e u m b o n a t e u m b o n a t e e n t i r e e n t i r e e n t i r e e n t i r e f i l i f o r m f i l i f o r m f i l i f o r m f i l i f o r m s u s p e n s i o n s u s p e n s i o n s u s p e n s i o n s u s p e n s i o n s u s p e n s i o n s u s p e n s i o n r o d s c h a i n s 0.9-1.3 2 . 2 - 8 . 7 v a r i a b l e r o d s c h a i n s 0.9-1.3 2 . 2 - 8 . 7 r o d s c h a i n s 0.9-1.3 2 . 2 - 8 . 7 r o d s c h a i n s 0.9-1.3 2 . 2 - 8 . 7 r o d s c h a i n s 0.9-1.3 2 . 2 - 8 . 7 r o d s c h a i n s 0.9-1.3 2 . 2 - 8 . 7 v a r i a b l e v a r i a b l e v a r i a b l e v a r i a b l e v a r i a b l e c y l i n d r i c a l , c y l i n d r i c a l c y l i n d r i c a l c y l i n d r i c a l - c y l i n d r i c a l c y l i n d r i c a l t e r m i n a l . t e r m i n a l t e r m i n a l t e r m i n a l t e r m i n a l \ t e r m i n a l s w o l l e n s w o l l e n s w o l l e n s w o l l e n s w o l l e n s w o l l e n c o n t ' d T a b l e 9 ( c o n t ' d ) C o n t r o l t r i a l 4 W i t h 5 . 66% N a C h a r a c t e r i s t i c s " Y C B M e i A z o Y C B M e i A z o M o t i l i t y : + + + + + + C a t a l a s e : + + + + + + A n a e r o b i c g r o w t h : + + + + + + V P r e a c t i o n : w e a k + + w e a k + + + + M e t h y l r e d t e s t : - - - - - -p H i n V P b r o t h : 4 . 7 0 4 . 6 5 4 . 7 5 4 . 8 5 4 . 9 0 4 . 8 5 p H r a n g e f o r g r o w t h : 4 . 4 - 7 . 8 4 . 4 - 7 . 8 4 . 4 - 7 . 8 4 . 5 - 8 . 0 4 . 5 - 8 . 0 4 . 4 - 8 . 0 T e m p e r a t u r e o f g r o w t h : M a x i m u m , °C M i n i m u m , °C 5 5 - 6 0 2 5 - 3 0 6 0 - 6 5 2 5 - 3 0 6 0 - 6 5 2 5 - 3 0 6 0 - 6 5 2 5 - 3 0 6 0 - 6 5 2 5 - 3 0 6 0 - 6 5 2 5 - 3 0 c o n t ' d T a b l e 9 . c o n t ' d C o n t r o l t r i a l 4 W i t h 5 . 6 6 1 N a C h a r a c t e r i s t i c s Y C B M e i A z o Y C B M e i A z o G r o w t h i n : 0 . 0 0 1 % l y s o z y m e (14 d ) N a A z i d e ( 0 . 0 2 % ) N a C l ( 0% ) N a C l ( 2% ) N a C l (5%) N a c l ( 7% ) N a C l ( 10% ) A c i d f r o m c a r b o h y d r a t e (14. d ) G l u c o s e A r a b i n o s e X y l o s e M a n n i t o l H y d r o l y s i s o f s t a r c h : U s e o f c i t r a t e ( 14 d ) U s e o f p r o p i o n a t e ( 1 4 d ) N 0 o f r o m NCL + + + + + + + + + + + + + + + + + + ± ( p i n k ) ± + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ± ( p i n k ) - ± ( p i n k ) c o n t ' d T a b l e 9 . c o n t ' d C o n t r o l t r i a l 4 W i t h 5 . 6 6 % N a C h a r a c t e r i s t i c s Y C B M e i A z o Y C B M e i A z o + + •' + + D i h y d r o x y a c e t o n e : ( r e d d i s h / p u r p l e ) ( " ) ( " ) ( " ) ' ' ( " ) ( " ) I n d o l e : - - - - - -D e a m i n a t i o n o £ p h e n y l a l a n i n e : ( 1 w k . ) - - - -D e c o m p o s i t i o n o f : C a s e i n ( 14 dO. "- ', T y r o s i n e ( 1 4 d ) ' , L i t m u s m i l k : A c i d A c i d A c i d A c i d A c i d A c i d r e d u c t i o n o f l i t m u s + + + + + +. c u r d f o r m a t i o n + - + -+ = g r o w t h - = n o g r o w t h ± = c h a r a c t e r i n c o n s i s t e n t 136. ( 5 0 - 5 5 ° C ) a n d B . s u b t i l i s ( 4 5 - 5 5 ° C ) ( 7 , 2 2 ) . 2 ) O f t h e t h e r m o p h i l e s j u s t m e n t i o n e d , t h e o n l y o n e c a p a b l e o f g r o w t h i n 0 . 0 2 % s o d i u m a z i d e i s B . c o a g u l a n s . 3) A c i d p r o d u c t i o n i n V o g e s - P r o s k a u e r b r o t h b y B . c o a g u l a n s i s b e t w e e n p H 4 . 2 - 4 . 8 , t h e o t h e r s a r e n o t h i g h a c i d p r o - -d u c e r s . a n d 4 ) I n c o m p a r i s o n , b o t h B . s t e a r o t h e r m o p h i l u s a n d B . b r e v i s f a i l t o g r o w a n a e r o b i c a l l y . T h e p r o p e r -t i e s o f 2 2 s t r a i n s o f B . c o a g u l a n s a s s u m m a r i z e d b y G o r d o n e t a l ( 2 2 ) m a t c h e d t h e p r o p e r t i e s o f t h e i s o l a t e d o r g a n -i s m s ( A p p e n d i x D ) . T h u s , d u e t o s e l e c t i v e i s o l a t i o n o f t h i s p a r t i c u l a r s p e c i e s o n n i t r o g e n - f r e e m e d i a a n d g r o w t h o f t h i s o r g a n i s m o n a l l t h r e e m e d i a , i t w a s q u i t e p o s s i b l e t h a t a s t r a i n o f B . c o a g u l a n s f i x e s a t m o s p h e r i c n i t r o g e n . N o i n f o r m a t i o n i s p r o v i d e d i n B e r g e y ' s m a n u a l o f M a n u a l o f D e t e r m i n a t i v e B a c t e r i o l o g y ( 7 ) , G o r d o n e t a l ( 2 2 ) o r r e c e n t l i t e r a t u r e , o n a n y B . c o a g u l a n s s t r a i n s w h i c h f i x a t m o s p h e r i c n i t r o g e n . I t i s b e l i e v e d t h a t t h i s c o u l d b e a n u n r e c o r d e d s t r a i n o f B . c o a g u l a n s . T h e e x i s t e n c e o f B . c o a g u l a n s w i t h i n t h e f e r -m e n t e r m a y b e q u e s t i o n e d o n t h e b a s i s t h a t t h e m a x i m u m g r o w t h t e m p e r a t u r e o f 6 0 ° C ± 5 ° C w a s e x c e e d e d i n t h e f e r m e n t a t i o n . S i n c e t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e s w i t h i n t h e f e r m e n t a t i o n e x c e e d e d t h i s g r o w t h t e m p e r a t u r e t h e v e g e t a t i v e f o r m o f t h e b a c t e r i a w o u l d h a v e b e e n d o r m a n t 1 3 7 . o r d e s t r o y e d . T h e o r g a n i s m m a y h a v e s u r v i v e d a s s p o r e s w i t h i n t h e f e r m e n t a t i o n . I t h a s b e e n s h o w n b y D e g r y s e ( 1 7 ) t h a t B . c o a g u l a n s s p o r e s c a n t o l e r a t e 1 0 0 ° C . . H o w e v e r , t h e p r e s e n c e o f s p o r e s w i t h i n t h e m e d i u m w o u l d h o t a c c o u n t f o r t h e i n c o r p o r a t i o n o f a t m o s p h e r i c n i t r o g e n i n t o t h e f e r m e n t a t i o n . T h e r e f o r e , i t w a s h y p o t h e s i z e d t h a t t h e v e g e t a t i v e f o r m o f t h e o r g a n i s m c o u l d e x i s t w i t h i n t h e f o a m l a y e r w h e r e t e m p e r a t u r e s w e r e l o w e r a n d t h e a t m o s p h e r i c n i t r o g e n a n d n u t r i e n t s w o u l d b e i n a b u n d a n c e . G r o w t h a n d d e a t h o f t h i s o r g a n i s m m a y o c c u r w i t h i n t h i s f o a m l a y e r . W i t h t h e p e r p e t u a l b r e a k a g e a n d r e f o r m a t i o n o f t h e f o a m f r o m t h e s u b s t r a t e , t h e o r g a n i s m w o u l d b e c o n t i n u a l l y i n c o r p o r a t e d i n t o t h e s u b s t r a t e , a n d o n c e l l u -l a r l y s i s , p r o v i d e n i t r o g e n o u s c o m p o u n d s t o t h e t h e r m o -p h i l e s e x i s t i n g i n t h e s u b s t r a t e . A d d i t i o n a l i n f o r m a t i o n p r o v i d e d f r o m t h e i d e n t i -f i c a t i o n o f t h e o r g a n i s m i n d i c a t e d t h a t g r o w t h o f B . c o a g u l a n s w i t h i n a t o t a l l y h y d r o c h l o r i c a c i d n e u t r a l i z e d -c a u s t i c s o d a t r e a t e d p o t a t o w a s t e f e r m e n t a t i o n w i l l n o t b e p o s s i b l e ( T a b l e 9 ) . A S-6% s o d i u m c o n t e n t i s p r e s e n t i n t h e c a u s t i c p e e l w a s t e a n d o n H C l n e u t r a l i z a t i o n t h e a m o u n t o f N a C l f o r m e d w o u l d b e t o o l a r g e . F r o m g r o w t h s t u d i e s w i t h v a r i n g N a C l c o n c e n t r a t i o n s i n n u t r i e n t b r o t h , t h e i s o l a t e d o r g a n i s m s s h o w e d n o g r o w t h a t 5% ( w / v ) N a C l 138. ( T a b l e 9 ). T h e r e f o r e , i t w o u l d p r o b a b l y be n e c e s s a r y f o r p a r t i a l s u l f u r i c a c i d - h y d r o c h l o r i c a c i d n e u t r a l i z a -t i o n ; r a t h e r t h a n j u s t s u l f u r i c a c i d s i n c e l a r g e s u l f a t e c o n t e n t may a l s o be o b j e c t i o n a b l e as, l i v e s t o c k f e e d ( 6 ) . 139. G E N E R A L D I S C U S S I O N T h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n o f p o t a t o w e r e d e t e r m i n e d w i t h i n l a b o r a t o r y -s c a l e f e r m e n t o r s . T h e f e r m e n t a t i o n s y s t e m w a s d e v e l o p e d t o a s t a g e w h e r e s u f f i c i e n t o p e r a t i o n a l s t a b i l i t y ( f r o m f o a m i n g , a m b i e n t t e m p e r a t u r e s , m e c h a n i c a l h e a t ) a n d o p e r a -t i o n a l c o n t r o l ( t e m p e r a t u r e m o n i t o r i n g , a e r a t i o n a n d a g i t a t i o n ) w e r e o b t a i n e d . A n a l y s e s o f t h e c a u s t i c p o t a t o p e e l w a s t e i n d i c a t e d t h i s s u b s t r a t e t o b e d e f i c i e n t i n n i t r o g e n a n d p h o s p h o r u s . I n c o m p a r i s o n t o t h e t o t a l c a r b o n c o n t e n t , t h e n i t r o g e n a n d p h o s p h o r u s c o n t e n t s w e r e b e l o w t h e r e q u i r e m e n t n e c e s s a r y f o r a t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n a t t h e m a x i m u m d e g r a d a t i o n r a t e , i . e . , t h e C / N a n d C / P r a t i o s w e r e t o o h i g h . N e v e r t h e l e s s , f e r m e n -t a t i o n s w i t h m a c e r a t e d p o t a t o w i t h o u t f u r t h e r n u t r i e n t s u p p l e m e n t a t i o n w e r e c a p a b l e o f r e a c h i n g t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e s . D i s t i n c t c h a r a c t e r i s t i c s w e r e n o t i c e d i n t h e s e t r i a l s i n w h i c h t h e p H o f t h e s u b s t r a t e i n c r e a s e d w i t h t h e t e m p e r a t u r e o f t h e f e r m e n t a t i o n , w h i c h a l s o r e s u l t s i n a n i n c r e a s e d r a t e o f s o l i d s u t i l i z a t i o n . A l s o , i n c r e a s i n g t e m p e r a t u r e s w e r e a c c o m p a n i e d b y d e c r e a s i n g d i s s o l v e d o x y g e n c o n c e n t r a t i o n s w i t h i n t h e s u b s t r a t e a n d d e c r e a s i n g t o t a l o r g a n i c n i t r o g e n c o n t e n t . T h e s e 140. c y c l e s w e r e c o m m o n t o a l l t h e f e r m e n t a t i o n t r i a l s . F e r -m e n t a t i o n o f c a u s t i c s o d a - t r e a t e d p o t a t o w a s t e , n e u t r a -l i z e d w i t h s u l f u r i c a c i d , s h o w e d n o d i f f e r e n c e f r o m t h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e c o n t r o l t r i a l s . T h o u g h t h e c h a r -a c t e r i s t i c s w e r e s i m i l a r , t h e m a g n i t u d e o f t h e s e c h a r -a c t e r i s t i c s w e r e n o t a s l a r g e . A l t e r a t i o n o f t h e m i c r o -f l o r a o f t h e p o t a t o b y t h e s o d i u m h y d r o x i d e t r e a t m e n t a n d t h e s u l f u r i c a c i d n e u t r a l i z a t i o n w a s s u s p e c t e d . H o w e v e r , a s u f f i c i e n t n u m b e r o f t h e r m o p h i l e s r e s i s t e d t h e b a s e a n d a c i d t r e a t m e n t t o c r e a t e a t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n . I t w a s d i s c o v e r e d t h a t t h e n i t r o g e n c o n t e n t w i t h i n t h e s u b s t r a t e i n c r e a s e d d u r i n g c e r t a i n s t a g e s o f t h e f e r m e n t a t i o n . M o s t o f t h i s n i t r o g e n w a s d e t e r -m i n e d , b y t r i c h l o r o a c e t i c a c i d p r e c i p i t a t i o n , t o b e i n t h e f o r m o f p r o t e i n n i t r o g e n . I t w a s p o s t u l a t e d t h a t t h i s n i t r o g e n i n c o r p o r a t i o n i n t o t h e s u b s t r a t e m a i n t a i n e d t h e f e r m e n t a t i o n w i t h i n a f a v o u r a b l e C / N r a t i o , e s p e c i a l l y d u r i n g t h e . l a t t e r h a l f o f t h e f e r m e n t a t i o n . T h i s n i t r o -g e n i n c r e a s e w a s s h o w n t o b e b e n e f i c i a l i n . t h e t r e a t m e n t o f p o t a t o w a s t e s i n c e a n i n e x p e n s i v e c a r b o n s o u r c e w a s c o n v e r t e d t o b a c t e r i a l p r o t e i n ( S C P ) . T h i s f e r m e n t e d r e s i d u e , c o n t a i n i n g m o s t l y S C P a n d s o m e p o t a t o p r o t e i n , c o u l d b e u s e d a s a s u p p l e m e n t f o r a n i m a l f e e d , w h i c h 1 4 1 . can o f f s e t the cost of the waste treatment. As a r e s u l t , the t o t a l waste c o u l d be disposed of through degradation by a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n , and the remaining r e s i d u e u t i l i z e d as feed. M i c r o b i a l analyses f o r the organism r e s p o n s i -ble f o r i n c o r p o r a t i n g atmospheric n i t r o g e n w i t h i n the s u b s t r a t e suggested that i t belonged to the B. coagulans s p e c i e s . T h i s forms the f i r s t r e p o r t that a B. coagulans s t r a i n f i x e d atmospheric n i t r o g e n . I t appears that the a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c f e r -mentation of potato conducted i n t h i s study can be adapted to t r e a t c a u s t i c potato p e e l wastes emitted from food p r o c e s s i n g p l a n t s . T h i s sytem would be s u i t a b l e f o r the s m a l l e r food p l a n t s i n which space f o r waste t r e a t -ment and cost are l i m i t i n g f a c t o r s . A continuous f e r -mentation system would a l s o appear to be f e a s i b l e . With seasonal p r o c e s s i n g of potatoes by s m a l l e r food p l a n t s , the t h e r m o p h i l i c system can a l s o be used to t r e a t vegetable wastes, other than potatoes, emitted from the p l a n t . The advantages of u s i n g the a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c process f o r waste treatment are: i n c r e a s e d degradation r a t e s w i t h r e s p e c t to the d e s t r u c t i o n of o r g a n i c s o l i d s ; 142 . e l i m i n a t i o n of pathogenic organisms; improved s o l i d -l i q u i d s e p a r a t i o n f o r dewatering of the waste; convers-i o n of the waste i n t o SCP f o r u l t i m a t e d i s p o s a l , and c o n t i n u a l d i g e s t i o n d u r i n g c o l d ambient temperatures. I t i s evident t h a t t h i s process has p o t e n t i a l as a food p r o c e s s i n g p l a n t waste treatment system, but i t i s con-c e i v a b l e that the u t i l i t y of any process depends upon economic c o n s i d e r a t i o n s . 1 4 3 . C O N C L U S I O N S T h e a n a l y s e s o f t h e c a u s t i c s o d a p o t a t o p e e l w a s t e f r o m a c o m m e r c i a l p o t a t o p r o c e s s i n g p l a n t s h o w e d i t t o b e l i m i t i n g i n n i t r o g e n a n d p h o s p h o r u s . A s a s u b -s t r a t e f o r a n a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c f e r m e n t a t i o n t h e C / N r a t i o o f 2 4 . 1 : 1 a n d C / P r a t i o o f 1 4 7 7 . 4 : 1 o f p o t a t o e s a r e n o t w i t h i n t h e n u t r i e n t r e q u i r e m e n t r a n g e f o r m a x i -m u m s o l i d s d e g r a d a t i o n o f t h e w a s t e . U s i n g l a b o r a t o r y s c a l e f e r m e n t e r s , f e r m e n t a t i o n o f m a c e r a t e d p o t a t o e s r e a c h e d t h e r m o p h i l i c t e m p e r a t u r e s , w i t h t h e e x i s t i n g m i c r o f l o r a o f t h e p o t a t o a s a n i n o c u l u m . R e p e a t e d f e r m e n t a t i o n t r i a l s e x h i b i t e d s i m i l a r d i s t i n c t c h a r a c t e r i s t i c s o f t e m p e r a t u r e , p H , d i s s o l v e d o x y g e n a n d t o t a l n i t r o g e n c o n t e n t , t h o u g h t h e m a g n i t u d e s r e a c h e d b y t h e s e p a r a m e t e r s w e r e d i f f e r e n t a m o n g t h e t r i a l s . S i m u l a t i n g t h e p r o c e s s i n g p l a n t p o t a t o p e e l w a s t e , f e r -m e n t a t i o n o f s o d i u m h y d r o x i d e t r e a t e d , s u l f u r i c a c i d n e u t r a l i z e d , m a c e r a t e d p o t a t o b e h a v e d s i m i l a r l y t o t h e c o n t r o l t r i a l s . T h e p r e s e n c e o f a h i g h s o d i u m c o n t e n t i n t h e p o t a t o s u b s t r a t e d i d n o t i n t e r f e r e w i t h t h e g r o w t h o f t h e r m o p h i l e s . T h e t o t a l o r g a n i c n i t r o g e n c o n t e n t o f t h e s u b -s t r a t e i n c r e a s e d i n t h e o v e r a l l f e r m e n t a t i o n t o a s m u c h 144. as 2.8 times the i n i t i a l n i t r o g e n content. This i n c r e a s e i n the n i t r o g e n content was common to a l l the t r i a l s . "True" p r o t e i n d e t e r m i n a t i o n showed that t h i s n i t r o g e n was i n the form of p r o t e i n n i t r o g e n . I t was hypothesized that atmospheric n i t r o g e n was converted i n t o p r o t e i n n i t r o g e n . M i c r o b i a l analyses of the organism r e s p o n s i b l e f o r the f i x a t i o n of atmospheric n i t r o g e n i n t o the sub-s t r a t e i n d i c a t e d the s p e c i e s to be B a c i l l u s coagulans. No s t r a i n s of t h i s s p e c i e s have been r e p o r t e d p r e v i o u s l y to f i x atmospheric n i t r o g e n . T h i s study showed that an a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c fermentation can be obtained with potato as a s u b s t r a t e . With the numerous advantages of the a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c p r o c e s s , a p p l i c a t i o n of t h i s process f o r the treatment of the c a u s t i c potato p e e l waste i s f e a s i b l e . 1 4 5 . L I T E R A T U R E C I T E D 1 . A l l e n , M . B . 1 9 5 3 . T h e t h e r m o p h i l i c a e r o b i c s p o r e -f o r m i n g b a c t e r i a . B a c t . R e v i e w s 17_, 1 2 5 . 2 . A . O . A . C . 1 9 7 5 . O f f i c i a l m e t h o d s o f a n a l y s i s o f t h e A s s o c i a t i o n o f O f f i c i a l a n a l y t i c a l c h e m i s t s . 1 2 t h e d i t i o n , W. H o r w i t z , e d i t o r . A . O . A . C . W a s h i n g t o n , D . C . 3 . A y e r s , S . H . , R u p p , P . a n d J o h n s o n , W . T . 1 9 1 9 . A s t u d y o f t h e a l k a l i f o r m i n g b a c t e r i a f o u n d i n m i l k . U . S . D e p t . A g r . B u l l . 7 8 2 , 3 9 . 4 . B e l l a m y , W . D . 1 9 7 4 . S i n g l e c e l l p r o t e i n s f r o m c e l l u -l o s i c w a s t e s . B i o t e c h , a n d B i o e n g . 16.> 8 6 9 . 5 . B l a i r , J . E . , L e n n e t t e , E . H . a n d T r u a n t , J . P . 1 9 7 0 . M a n u a l o f c l i n i c a l m i c r o b i o l o g y . A m e r . S o c . M i c r o b i o l . B e t h e s d a , M D . 6 . B l o c h , F . , B r o w n , G . E . a n d F a r k a s , D . F . 1 9 7 3 . U t i l i -z a t i o n o f a l k a l i n e p o t a t o p e e l w a s t e b y f e r m e n t a t i o n . A m y l a s e p r o d u c t i o n b y A s p e r g i l l u s f o e t i d u s N R R L 3 3 7 , a n d a l c o h o l i c f e r m e n t a t i o n . A m e r . P o t a t o , J . 5 0 , 3 5 7 . . 7 . B u c h a n a n , R . E . a n d G i b b o n s , N . E . , ( E d . ) . 1 9 7 5 . B e r g e y ' s m a n u a l o f d e t e r m i n a t i v e b a c t e r i o l o g y . 8 t h e d i t i o n . T h e W i l l i a m s a n d W i l k i n s C o . , B a l t i m o r e , M D . 8 . B u s c h , A . W . 1 9 7 1 . A e r o b i c b i o l o g i c a l t r e a t m e n t o f w a s t e w a t e r s . O l i g o d y n a m i c s p r e s s , H o u s t o n , T X . 9 . C a m e r o n , E . J . a n d E s t y , J . R . 1 9 2 6 . T h e e x a m i n a t i o n o f s p o i l e d c a n n e d f o o d s . 2 . C l a s s i f i c a t i o n o f f l a t s o u r o r g a n i s m s f r o m n o n a c i d f o o d s . J . I n f e c -t i o u s D i s e a s e s _ 39 , 8 9 . 1 4 6 . 1 0 . C a m e r o n , E . J . a n d W i l l i a m s , C C . 1 9 2 8 . T h e t h e r m o -p h i l i c f l o r a o f s u g a r i n i t s r e l a t i o n t o c a n n i n g . C e n t r . B a k t . P a r a s i t e n k . , I I . A b t . 76.> 2 8 . 1 1 . C a m p b e l l , L . L . a n d P a c e , B . 1 9 6 8 . P h y s i o l o g y o f g r o w t h a t h i g h t e m p e r a t u r e s . J . A p p l . B a c t . 3 1 , 2 4 . 1 2 . C a v i n s , J . F . , K r u l l , L . H . , F r e e d m a n , M . , G i b b s , D . E . a n d I n g l e t t , G . E . 1 9 7 2 . S p e c t r o p h o t o m e t r i c c y s t e i n e a n a l y s i s . J . A g r i . F o o d C h e m . 20_, 1 1 2 4 . 1 3 . C h a r a c k l i s , W . G . a n d D y d e k , S . T . 1 9 7 6 . T h e i n f l u -e n c e o f c a r b o n - n i t r o g e n r a t i o o n t h e c h l o r i n a t i o n o f m i c r o b i a l a g g r e g a t e s . W a t e r R e s . 1_0, 5 1 5 . 1 4 . C l a r k , F . M . a n d T a n n e r , F . W . 1 9 3 7 . T h e r m o p h i l i c c a n n e d - f o o d s p o i l a g e o r g a n i s m s i n s u g a r a n d s t a r c h . F o o d R e s e a r c h 2, 27. 1 5 . C o l l i n s , C H . a n d L y n e , P . M . 1 9 7 6 . M i c r o b i o l o g i c a l m e t h o d s . 4 t h e d i t i o n , B u t t e r w o r t h s , L o n d o n , U K . 1 6 . C o n c o n , J . M . a n d S o l t e s s , D . 1 9 7 3 . R a p i d m i c r o -K j e l d a h l d i g e s t i o n o f c e r e a l g r a i n s a n d o t h e r b i o -l o g i c a l m a t e r i a l s . A n a l . B i o c h e m . 5_3, 3 5 . 1 7 . D e g r y s e , E . 1 9 7 6 . B a c t e r i a l d i v e r s i t y a t h i g h t e m -p e r a t u r e i n e n z y m e s a n d p r o t e i n f r o m t h e r m o p h i l i c m i c r o o r g a n i s m s . H . Z u b e r , e d i t o r . B i r k h a u s e r V e r l a g , S t u t t g a r t , G e r m a n y . 1 8 . E c k f o r d , M . K . 1 9 2 7 . T h e r m o p h i l i c b a c t e r i a i n m i l k . A m e r ; J . H y g . 7_» 2 0 1 . 1 9 . F a r r e l l , J . a n d C a m p b e l l , L . L . 1 9 6 9 . T h e r m o p h i l i c b a c t e r i a a n d b a c t e r i o p h a g e s . A d v . M i c r o . P h y s i o . 3 , 8 3 . 2 0 . G a r b e r , W . F . 1 9 5 4 . P l a n t - s c a l e s t u d i e s o f t h e r m o p h i -l i c d i g e s t i o n a t L o s A n g e l e s . S e w a g e I n d . W a s t e s 2 6 , 1 2 0 2 . 1 4 7 . 2 1 . G a u g h r a n , E . R . L . 1 9 4 7 . T h e t h e r m o p h i l i c m i c r o o r g a n -i s m s . B a c t . R e v . 1 1 . , 1 8 9 . 2 2 . G o r d o n , R . E . , H a y n e s , W . C . a n d P a n g , C . H . 1 9 7 3 . T h e g e n u s B a c i l l u s . A g r i c u l t u r e H a n d b o o k N o . 4 2 7 . A g r i c u l t u r a l R e s e a r c h S e r v i c e U n i t e d S t a t e s D e p a r t -m e n t o f A g r i c u l t u r e , W a s h i n g t o n , D . C . 2 3 . G o r s u c h , T . T . 1 9 7 0 . T h e d e s t r u c t i o n o f o r g a n i c m a t t e r . P e r g a m o n P r e s s , O x f o r d , U K . 2 4 . G o r s u c h , T . T . 1 9 7 3 . F o o d a n a l y s i s b y a t o m i c a b s o r p -t i o n s p e c t r o s c o p y . C . J . R o w e , e d i t o r . V a r i a n T e c h t r o n L t d . S p r i n g v a l e , A u s t r a l i a . 2 5 . H o w e s , A . D . a n d S a u t e r , E . A . 1 9 7 4 . U t i l i z a t i o n o f s t o r e d p o t a t o w a s t e f o r c a t t l e f e e d . V o l . 9 , N o v . 7 - 8 . O f f i c i a l p r o c e e d i n g s , N i n t h A n n u a l P a c i f i c N o r t h w e s t A n i m a l N u t r i t i o n C o n f e r e n c e , P o r t l a n d , O R . 2 6 . H o w e s , A . D . a n d S a u t e r , E . A . 1 9 7 5 . P r e s e r v i n g h i g h m o i s t u r e b y - p r o d u c t s . V o l . 1 0 , M a y 1 2 - 1 3 . O f f i c i a l p r o c e e d i n g s , T e n t h A n n u a l P a c i f i c N o r t h w e s t A n i m a l N u t r i t i o n C o n f e r e n c e , P o r t l a n d , O R . 2 7 . H u x s o l l , C C . a n d S m i t h , T . 1 9 7 5 . P e e l i n g p o t a t o e s f o r p r o c e s s i n g i n p o t a t o p r o c e s s i n g . 3 r d e d i t i o n , W . F . T a l b u r t a n d 0 . S m i t h , e d i t o r s . . A v ' i P u b l i s h i n g C o . I n c . , " W e s t p o r t , C T . 2 8 . K a m b h u , K . a n d A n d r e w , J . F . 1 9 6 9 . A e r o b i c t h e r m o -p h i l i c p r o c e s s f o r t h e b i o l o g i c a l t r e a t m e n t o f w a s t e s -s i m u l a t i o n s t u d i e s . J . W a t e r P o l l u t i o n C o n t r o l F e d . , R e s e a r c h S u p p l e m e n t , . M a y , R 1 2 7 . 2 9 . K o f f l e r , H . 1 9 5 7 . P r o t o p l a s m i c d i f f e r e n c e s b e t w e e n m e s o p h i l e s a n d t h e r m o p h i l e s . B a c t . R e v . 21, 221. 3 0 . K o s e r , S . A . 1 9 2 4 . C o r r e l a t i o n o f c i t r a t e u t i l i z a t i o n b y m e m b e r s o f t h e c o l o n - a e r o g e n e s g r o u p s w i t h o t h e r d i f f e r e n t i a l c h a r a c t e r i s t i c s a n d w i t h h a b i t a t . J . B a c t . 9 , 5 9 . 1 4 8 . 3 1 . K r o n e r , W . a n d V o l k e n , W . 1 9 5 0 . T h e p o t a t o . 2 n d e d i t i o n . J o h a n n A m b r o s i u s B a r t h , L e i p z i g , G e r m a n y . 3 2 . L e i n i n g e r , H . V . 1 9 7 6 . E q u i p m e n t , m e d i a , r e a g e n t s , r o u t i n e t e s t s a n d s t a i n s i n c o m p e n d i u m o f m e t h o d s f o r t h e m i c r o b i o l o g i c a l e x a m i n a t i o n o f f o o d s . M . L . S p e c k , e d i t o r . P r e p a r e d b y X A m e r - . P u b l i c H e a l t h A s s o c . I n t e r s o c i e t y A g e n c y C o m m i t t e e o n M i c r o b i o l o g i c a l M e t h o d s f o r F o o d s , W a s h i n g t o n , D . C . 3 3 . L e n n e t t e , E . H . , S p a u l d i n g , E . H . a n d T r u a n t , J . P . 1 9 7 4 . M a n u a l o f C l i n i c a l M i c r o b i o l o g y . 2 n d e d i t i o n . A m e r . S o c . M i c r o b i o l : W a s h i n g t o n , D . C . 3 4 . L i u , T . Y . a n d C h a n g , Y . H . 1 9 7 1 . H y d r o l y s i s o f p r o t e i n s w i t h p - t o l u e n e s u l f o n i c a c i d . J . B i o l . C h e m . 2 4 6 , 2 8 4 2 . 3 5 . L o l l , U . 1 9 7 6 . P u r i f i c a t i o n o f c o n c e n t r a t e d o r g a n i c w a s t e w a t e r s f r o m t h e f o o d s t u f f s i n d u s t r y b y m e a n s o f a e r o b i c - t h e r m o p h i l i c d e g r a d a t i o n p r o c e s s . P r o g . • • ' W a t e r " T e c h . : 8 , 3 7 3 . 3 6 . L o l l , U . 1 9 7 7 . T r e a t m e n t o f t h e r m a l l y - c o n d i t i o n e d s l u d g e l i q u o r s . W a t e r R e s . 11, 8 6 9 . 3 7 . M c C a r t y , P . L . 1 9 6 5 . T h e r m o d y n a m i c s o f b i o l o g i c a l s y n t h e s i s a n d g r o w t h . A d v a n c e s i n W a t e r P o l l u t i o n R e s e a r c h , p . 1 6 9 , V o l . 2 , e d i t e d b y J . K . B a a r s . P e r g a m o n P r e s s , O x f o r d , U K . 3 8 . M e i k l e j o h n , J . 1 9 6 5 . C o u n t i n g B e i j e r i n c k i a i n s o i l s . S o i l B i o l o g y ( m i m e o g r a p h n e w s b u l l e t i n ) 3 : 1 0 . 3 9 . M i t r u k a , B . M . a n d B o n n e r , M . J . 1 9 7 6 . M e t h o d o f d e t e c t i o n a n d i d e n t i f i c a t i o n o f b a c t e r i a . C R C P r e s s I n c . , C l e v e l a n d , O H . 4 0 . M o r r i s o n , L . E . a n d T a n n e r , F . W . 1 9 2 2 . S t u d i e s o n t h e r m o p h i l i c b a c t e r i a . J . B a c t . ] _ , 3 4 3 . 1 4 9 . 4 1 . M u n e t a , P . , W u - W e i , S . , J e n n i n g s , S . , E v e r s o n , D . a n d E d w a r d s , L . 1 9 7 7 . P o t a s s i u m h y d r o x i d e f o r p e e l i n g p o t a t o e s . A m e r . P o t a t o J . 54_, 8 3 . 4 2 . P e q u e g n a t , C . 1 9 7 5 . F o o d f r o m w a s t e . A g r o l o g i s t 4 , 1 0 . 4 3 . P S p e l , F . a n d O h n m a c h t , C . 1 9 7 2 . T h e r m o p h i l i c b a c -t e r i a l o x i d a t i o n o f h i g h l y c o n c e n t r a t e d s u b s t r a t e s . W a t e r R e s . 6 , 8 0 7 . 4 4 . R i c h , L . G . a n d A n d r e w , J . F . 1 9 6 5 . F o r m a l d i s c u s s i o n o f t h e r m o d y n a m i c s o f b i o l o g i c a l s y n t h e s i s a n d g r o w t h , b y P . L . M c C a r t y . A d v . W a t e r P o l l u t i o n . R e s . p . 1 8 7 . V o l . 2 , J . K . B a a r s , e d i t o r . P e r g a m o n P r e s s , O x f o r d , U K . 4 5 . R o b e r t s o n , A . H . 1 9 2 7 . T h e r m o p h i l i c a n d t h e r m o d u r i c m i c r o o r g a n i s m s , w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o s p e c i e s i s o l a t e d f r o m m i l k . I . R e v i e w o f l i t e r a t u r e . N . Y . S t a t e A g r . E x p t . S t a . T e c h . B u l l . N o . 1 3 0 . 4 6 . S c h w i m m e r , S . , B e v e n u e , A . a n d W e s t o n , W. 1 9 5 5 . P h o s p h o r u s c o m p o n e n t s o f t h e w h i t e p o t a t o . J . A g r . F o o d C h e m . 3, 2 5 7 . 4 7 . S c h w i m m e r , S . a n d B u r r , H . K . 1 9 6 7 . S t r u c t u r e a n d c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e p o t a t o t u b e r i n p o t a t o p r o c e s s i n g . 2 n d e d i t i o n . W . F . T a l b u r t a n d 0 . S m i t h , e d i t o r s . A v i P u b l i s h i n g C o . , W e s t p o r t , C T . 48 . . S k e r m a n , V . B . D . 1 9 6 7 . A g u i d e t o t h e i d e n t i f i c a t i o n o f g e n e r a o f b a c t e r i a . 2 n d e d i t i o n . W i l l i a m s a n d W i l l i a m s C o . , B a l t i m o r e , M D . 4 9 . S k e r m a n , V . B . D . 1 9 6 9 . A b s t r a c t s o f m i c r o b i o l o g i c a l m e t h o d s . W i l e y - I n t e r s c i e n c e , N e w Y o r k , N . Y . 5 0 . S m i t h , J . E . , Y o u n g , K . W . a n d D e a n , R . B . 1 9 7 5 . B i o l o -g i c a l o x i d t i o n a n d d i s i n f e c t i o n o f s l u d g e . W a t e r Res...; 9 , 1 7 . 1 5 0 . 5 1 . S m i t h , 0 . 1 9 6 8 . C h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e p o t a t o . P o t a t o e s : p r o d u c t i o n , s t o r i n g , p r o c e s s i n g . 0 . S m i t h , e d i t o r . A v i P u b l i s h i n g C o . , W e s t p o r t , C T . 5 2 . S t a n i e r , R . Y . , D o u d o r o f f , M . a n d A d e l b e r g , E . A . 1 9 6 3 . T h e m i c r o b i a l w o r l d , 2 n d e d i t i o n . P r e n t i c e -H a l l I n c . , E n g l e w o o d C l i f f s , N . J . 5 3 . S u b c o m m i t t e e o n p o u l t r y n u t r i t i o n , C o m m i t t e e o n a n i m a l n u t r i t i o n , A g r i c u l t u r a l B o a r d , N a t i o n a l R e s e a r c h C o u n c i l . 1 9 7 1 . N u t r i e n t r e q u i r e m e n t s o f d o m e s t i c a n i m a l s . N u t r i e n t R e q u i r e m e n t s o f P o u l t r y , 6 t h e d i t i o n . N a t - A c a d . S c i . 5 4 . S u l e r , D . J . a n d F i n s t e i n , M . S . 1 9 7 7 . E f f e c t o f t e m p e r a t u r e , a e r a t i o n a n d m o i s t u r e o n C C ^ f o r m a t i o n i n b e n c h - s c a l e , c o n t i n u o u s l y t h e r m o p h i l i c c o m p o s t i n g o f s o l i d w a s t e . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l . 3 4 5 . 5 5 . S u r u c u , G . A . , E n g l e b r e c h t , R . S . a n d C h i a n , E . S . K . 1 9 7 5 . T h e r m o p h i l i c m i c r o b i o l o g i c a l t r e a t m e n t o f h i g h s t r e n g t h w a s t e w a t e r s w i t h s i m u l t a n e o u s r e c o v e r y o f s i n g l e c e l l p r o t e i n . B i o t e c h , a n d B i o e n g . 1 7 , 1 6 3 9 . 5 6 . T h o r n , C . 1 9 6 7 . A p r a c t i c a l m a n u a l o f s o i l m i c r o -b i o l o g y l a b o r a t o r y m e t h o d , p . 5 8 . F o o d a n d A g r i c u l -t u r e O r g a n i z a t i o n o f t h e U n i t e d N a t i o n s , R o m e . 5 7 . T o t h , S . J . 1 9 7 3 . C o m p o s t i n g a g r i c u l t u r a l a n d i n d u s -t r i a l o r g a n i c w a s t e i n s y m p o s i u m : p r o c e s s i n g a g r i c u l -t u r a l a n d m u n i c i p a l w a s t e s . G . E . I n g l e t t , e d i t o r . A v i P u b l i s h i n g C o . , W e s t p o r t , C T . 5 8 . V e r h o e v e n , W . 1 9 5 0 . O n a s p o r e f o r m i n g b a c t e r i u m c a u s i n g t h e s w e l l i n g o f c a n s c o n t a i n i n g c u r e d h a m . J . M i c r o b i o l . S e r o l . 1 6 , 2 6 9 . 5 9 . W a r d , J . a n d C o c k s o n , A . 1 9 7 2 . S t u d i e s o n a t h e r m o -p h i l i c B a c i l l u s : i t s i s o l a t i o n , p r o p e r t i e s , a n d t e m p e r a t u r e c o e f f i c i e n t o f g r o w t h . J . B a c t . 1 1 2 , 1 0 4 0 . 151. 60. White, J.W. 1973. P r o c e s s i n g f r u i t and vegetable wastes i n symposium: p r o c e s s i n g a g r i c u l t u r a l and m u n i c i p a l wastes. G.E. I n g l e t t , e d i t o r . A v i P u b l i s h i n g Co. Inc., Westport, CT. 61. W i l l a r d , M.J., P a i l t h o r p , R.E. and Smith, 0. 1967. Waste d i s p o s a l i n potato p r o c e s s i n g . p. 551, 2nd e d i t i o n . A v i P u b l i s h i n g Co. Inc., Westport, CT. 1 5 2 . APPENDICES 1 5 3 . A p p e n d i x A . W a s h i n g o f t h e U l t r a - f i n e S i n t e r e d G l a s s F i l t e r s : T h e u l t r a - f i n e s i n t e r e d g l a s s f i l t e r w a s r e v e r s e f l u s h e d w i t h a I N N a O H s o l u t i o n u s i n g a v a c u u m a s p i r a t o r . T h i s w a s f o l l o w e d b y a d i s t i l l e d w a t e r r i n s e a n d n e u t r a -l i z a t i o n w i t h I N H C 1 . T h e f i l t e r w a s r i n s e d f i n a l l y w i t h d i s t i l l e d w a t e r a n d d r i e d w i t h a c e t o n e . 154. A p p e n d i x B . D e s c r i p t i o n o f t h e V i s u a l A p p e a r a n c e o f t h e C o l o n i e s : C o l o n y f o r m s c a n b e d e s c r i b e d a s p u n c t i f o r m , c i r c u l a r , f i l a m e n t o u s , i r r e g u l a r , r h i z o i d o r s p i n d l e . C o l o n y e l e v a t i o n ( o b s e r v e d f r o m t h e s i d e ) a r e d e s c r i b e d a s f l a t , r a i s e d , c o n v e x , p u l v i n a t e o r u m b o n a t e . T h e m o r p h o l o g y o f t h e c o l o n y m a r g i n s a r e d e s c r i b e d a s e n t i r e , u n d u l a t e , l o b a t e , e r a s e , f i l a m e n t o u s o r c u r l e d . T h e g r o w t h f o r m o n a n a g a r s t r o k e a r e d i f f e r -e n t i a t e d a s : f i l i f o r m , e c h i n u l a t e , b e a d e d , e f f u s e , a r b o r e -s c e n t o r r h i z o i d . S u r f a c e g r o w t h o n n u t r i e n t b r o t h a r e d e s c r i b e d a s f l o c c u l a n t , r i n g , p e l l i c l e o r m e m b r a n o u s ( 3 9 ) . 1 5 5 . A p p e n d i x C . Z i e h l - N e e l s e n ' s C a r b o l - F u c h s i n w a s c o m p o s e d o f : S o l u t i o n A B a s i c F u s c h i n ( 9 0 % d y e c o n t e n t ) 0 . 3 g E t h y l a l c o h o l ( 9 5 % ) 1 0 m l S o l u t i o n B P h e n o l c r y s t a l s 5 g D i s t i l l e d w a t e r 9 5 m l S o l u t i o n A a n d B w e r e m i x e d w h e n r e q u i r e d a n d f i l t e r e d t h r o u g h c o a r s e f i l t e r p a p e r ( 3 2 ) . 1 5 6 . A p p e n d i x D . S u m m a r y o f P r o p e r t i e s b y G o r d o n e t a l . ( 2 2 ) o f 2 2 S t r a i n s o f B . c o a g u l a n s : R o d s - G e n e r a l l y 0 . 6 y - 1 . 0 y i n w i d t h b y 2 . 5 y t o 5 . 0 y i n l e n g t h . G r a m p o s i t i v e . M o t i l e . S p o r e s - E l l i p s o i d a l o r c y l i n d r i c a l i n s h a p e . G e n e r a l l y s u b t e r m i n a l o r t e r m i n a l , s o m e t i m e s c e n t r a l i n p o s i t i o n . O n t h e l i n e d i v i d i n g G r o u p 1 ( s p o r a n g i a n o t a p p r e c i a b l y s w o l l e n b y o v a l o r c y l i n d r i c a l s p o r e s ) a n d G r o u p 2 ( s p o r a n g i a s w o l l e n b y o v a l s p o r e s ) . G r o w t h t e m p e r a t u r e s M a x i m u m , 5 5 t o 6 0 ° C . - M i n i m u m , 1 5 t o 2 5 ° C . P o s i t i v e r e a c t i o n s - C a t a l a s e ; V P ; a c i d i n V - P b r o t h ( p H 4 . 2 - 4 . 8 ) ; a n a e r o b i c g r o w t h ; a c i d f r o m g l u c o s e ; h y d r o l y s i s 1 5 7 . o f s t a r c h ; g r o w t h i n 0 . 0 2 % a z i d e ; g r o w t h a t p H 5 . 7 ; l i t m u s m i l k s h o w s a c i d a n d r e d u c t i o n o f t h e i n d i c a t o r . N e g a t i v e r e a c t i o n s G r o w t h i n 1% N a C l ; u t i l i z a t i o n o f p r o p i o n a t e ; r e s i s t a n c e t o l y s o z y m e ; p r o d u c t i o n o f d i h y d r o x y -a c e t o n e a n d i n d o l e ; d e a m i n a t i o n o f p h e n y l a l a n i n e ; a n d d e c o m p o s i t i o n o f t y r o s i n e . V a r i a b l e r e a c t i o n s F o r m a t i o n o f a c i d f r o m a r a b i n o s e , x y l o s e a n d m a n i t o l ; u t i l i z a t i o n o f c i t r a t e ; r e d u c t i o n o f n i t r a t e t o n i t r i t e ; d e c o m p o s i t i o n o f c a s e i n ; a n d c u r d l i n g o f l i t m u s m i l k . Rate of solids utilization , g/ l /h p to o CO o o In Total organic nitrogen , percent 10 O CO "O b Ul b pH to b b b 00 b o b T — Temperature Cn O o o to o to o o o I Cf o VI o 00 o o l o o to o LO o Ik. o Ul o Cf o o 00 o to o o to o to to o to LO o o l to o to o to o to 00 o to o CO o o CO o 8 CO to o CO CO I o CO o 8 IS J CO Cn I o A o> o CO VI o CO oo o CO o o o o o CO o o Cn o o o 4k. VI o 00 o qp o o o Cn 11 2. 0 -c IU CO o c o 01 o o 6.0 E Q. a c 5.0 at >. x o 4.0 3.0 2.0 1.0 -o ID > 4.0 3.0 2.0 1.0 o u 80 70 60 50 x a 8.0 L 5 40 a. E a 6.0 4.0 2.0 30 20 10 - Temperature of fermentation A-A - pH of fermentation - Dissolved oxygen in substrate o-n - Tota l organic nitrogen of substrate 10 20 . A A—A ' A-A • -A A — A A — A - •A A- -A' A A—A- - A A A-80 90 100 50 60 70 Time , hours of operation Figure 20. Thermophilic fermentation of a potato waste substrate with 5.66 percent sodium content 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 I 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 i 430 i 440 450 460 470 480 490 500 510 520 530 540 550 560 570 580 590 600 610 620 630 640 650 660 670 680 690 700 710 720 730 740 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840 850 860 / 1 

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