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Derivation of monoclonal antibodies to ferredoxin from Clostridium pasteurianum Weaver, Michael Stanley 1980

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831-UBC_1980_A6_7 W43.pdf [ 2.92MB ]
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D E R I V A T I O N OF MONOCLONAL A N T I B O D I E S TO F E R R E D O X I N FROM C L O S T R I D I U M P A S T E U R I A N U M b y M I C H A E L S T A N L E Y WEAVER B . S c , T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1 9 7 7 A T H E S I S S U B M I T T E D I N P A R T I A L F U L F I L L M E N T OF THE R E Q U I R E M E N T S FOR THE D E G R E E OF M A S T E R OF S C I E N C E i n THE F A C U L T Y OF GRADUATE S T U D I E S DEPARTMENT OF M I C R O B I O L O G Y U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H C O L U M B I A We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE U N I V E R S I T Y OF B R I T I S H C O L U M B I A A p r i l , 1 9 8 0 © M i c h a e l S t a n l e y W e a v e r , 1 9 8 0 In presenting this thesis in partial fulfilment of the requirements for an advanced degree at the University of Brit ish Columbia, I agree that the Library shall make i t freely available for reference and study. I further agree that permission for extensive copying of this thesis for scholarly purposes may be granted by the Head of my Department or by his representatives. It is understood that copying or publication of this thesis for financial gain shall not be allowed without my written permission. Department of FVcnjUloyj The University of Brit ish Columbia 2075 Wesbrook Place Vancouver, Canada V6T 1W5 Date i ° t y i m ° i i A B S T R A C T M o d i f i c a t i o n s t o t h e s t a n d a r d t e c h n i q u e s o f s o m a t i c c e l l f u s i o n a r e p r e s e n t e d w h i c h h a v e r e s u l t e d i n t h e d e r i v a t i o n o f h y b r i d c e l l l i n e s s e c r e t i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d y t o t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t a n t i g e n f e r r e d o x i n . A n t i b o d y s e c r e t e d b y o n e o f t h e s e l i n e s h a s b e e n p u r i f i e d u s i n g t h e t e c h n i q u e o f p r o t e i n - A s e p h a r o s e c h r o m a t o g r a p h y . U s i n g s t a n d a r d i m m u n o c h e m i c a l m e t h o d s i t h a s b e e n d e t e r m i n e d t h a t t h i s m o n o c l o n a l a n t i b o d y h a s a n a p p r o x i m a t e i s o -e l e c t r i c p H o f 8.5 - 8.6 a n d b e l o n g s t o t h e I g G „ , s u b c l a s s o f i m m u n o g l o b u l i n . i i i T A B L E OF CONTENTS P a g e A B S T R A C T 1 1 L I S T OF T A B L E S v L I S T OF F I G U R E S v i ACKNOWLEDGEMENTS v i i I N T R O D U C T I O N AND L I T E R A T U R E R E V I E W I. S t r a t e g i e s f o r o b t a i n i n g a n t i s e r a t o s p e c i f i c p r o t e i n s 1 I I . S i g n i f i c a n c e o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s 3 I I I . H i s t o r y o f c e l l f u s i o n a n d t e c h n i c a l i m p r o v e m e n t s 4 a ) T e c h n o l o g y o f c e l l f u s i o n 4 b ) C h a r a c t e r i s t i c s o f m y e l o m a c e l l g r o w t h i n v i t r o 5 c ) I m m u n i z a t i o n k i n e t i c s 9 M A T E R I A L S AND METHODS I. A n i m a l s 12 I I . A n t i g e n s a n d i m m u n i z a t i o n s 12 I I I . C e l l f u s i o n 12 I V . S e l e c t i o n o f h y b r i d c e l l s 1 5 V . S c r e e n i n g o f h y b r i d c u l t u r e s 16 V I . C l o n i n g o f a n t i b o d y s e c r e t i n g h y b r i d s 17 V I I . P u r i f i c a t i o n o f m o n o c l o n a l a n t i b o d y 18 a ) I m m u n o a d s o r p t i o n 1 8 b ) D E A E i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y 19 c ) P r o t e i n A - s e p h a r o s e c h r o m a t o g r a p h y 19 V I I I . I m m u n o p r e c i p i t a t i o n 20 I X . P o l y a c r y l a m i d e g e l i s o e l e c t r i c f o c u s s i n g 20 i v T A B L E OF CONTENTS ( c o n t i n u e d ) P a g e R E S U L T S AND D I S C U S S I O N 7 7 I . T e c h n i c a l f a c t o r s i n s u c c e s s f u l c e l l f u s i o n I I . D e r i v a t i o n o f s p e c i f i c h y b r i d s t o f e r r e d o x i n 2 3 I I I . C h a r a c t e r i z a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f m o n o c l o n a l a n t i b o d y t o f e r r e d o x i n ". 27 a ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f a n t i b o d y b y E L I S A 27 b ) P u r i f i c a t i o n 27 i ) I m m u n o a d s o r p t i o n 27 i i ) D E A E c h r o m a t o g r a p h y 3 3 i i i ) P r o t e i n A - s e p h a r o s e c h r o m a t o g r a p h y 35 C O N C L U D I N G REMARKS 4 1 L I T E R A T U R E C I T E D 4 3 V L I S T OF T A B L E S T a b l e T i t l e P a g e 1 C e l l l i n e s u s e d i n d e r i v i n g h y b r i d o m a s ^ v i L I S T OF F I G U R E S F i g u r e T i t l e P a g e 1 G r o w t h c u r v e o f S P 2 7 2 A m i n o a c i d s e q u e n c e o f f e r r e d o x i n 1 1 3 E L I S A o f c l o n e d h y b r i d c u l t u r e s 25 4 I n h i b i t i o n c u r v e o f m o n o c l o n a l a n t i b o d y b y f e r r e d o x i n 2 8 5 A d s o r p t i o n o f s e r u m a n t i b o d y t o F d - s e p h a r o s e 30 6 A d s o r p t i o n o f a s c i t e s a n t i b o d y t o F d - s e p h a r o s e 3 1 7 T i t r a t i o n o f i m m u n o a d s o r b e d a s c i t e s b y E L I S A 32 8 D E A E i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y o f a s c i t e s a n t i b o d y . . 3 4 9 G r a d i e n t e l u t i o n o f a s c i t e s a n t i b o d y f r o m D E A E 36 10 E l u t i o n o f a s c i t e s a n t i b o d y f r o m p r o t e i n A - s e p h a r o s e . . . 37 1 1 T i t r a t i o n o f a n t i b o d y e l u t e d f r o m p r o t e i n - A - s e p h a r o s e b y E L I S A 38 12 I s o e l e c t r i c f o c u s s i n g o f a s c i t e s f l u i d a n d i s o l a t e d f r a c t i o n s 39 13 O u c h t e r l o n y a n a l y s i s o f m a t e r i a l e l u t e d f r o m p r o t e i n - A s e p h a r o s e 40 v i i ACKNOWLEDGEMENT I w o u l d l i k e t o e x t e n d my a p p r e c i a t i o n t o t h e i n d i v i d u a l s who h a v e c o n -t r i b u t e d t o t h e e f f o r t a n d s u b s t a n c e o f t h i s r e s e a r c h i n s e v e r a l w a y s . F i r s t l y , a s my s u p e r v i s o r , D r . J u l i a G . L e v y p r o v i d e d n o t o n l y t h e m e a n s f o r t h i s p r o j e c t , b u t a l s o l e n t t h e w e i g h t o f e x p e r i e n c e a n d e n c o u r a g e m e n t t h r o u g h t h e f r e q u e n t t u r n s w h i c h t h i s p r o j e c t c h o s e t o t a k e . D r . A n n e J a c k s o n w a s a s o u r c e o f v a l u a b l e a d v i c e c o n c e r n i n g t h e E L I S A a n d r e l a t e d t e c h n o l o g y . F i n a l l y , I w o u l d l i k e t o t h a n k D r . D o u g K i l b u r n a n d t h e o t h e r c o m m i t t e e m e m b e r s f o r t h e i r t i m e a n d h e l p f u l s u g g e s t i o n s r e g a r d i n g t h e f i n a l d r a f t . 1 I N T R O D U C T I O N AND L I T E R A T U R E R E V I E W T h e p a s t d e c a d e h a s s e e n t h e i n c r e a s i n g e x t e n s i o n o f i m m u n o l o g i c a l t e c h n o -l o g y i n t o m a n y a r e a s o f r e s e a r c h . A n t i b o d i e s o f d e f i n e d s p e c i f i c i t y a r e r o u -t i n e l y u s e d a s b i o c h e m i c a l p r o b e s i n t h e s t u d y o f d i v e r s e p r o t e i n s i n c l u d i n g e u k a r y o t i c h i s t o n e s , m o u s e d i h y d r o f o l a t e r e d u c t a s e f r o m b a c t e r i a l p l a s m i d s a n d t h e T a n t i g e n o f S V 4 0 ( 1 , 2 ) . I m m u n o l o g i c a l a n a l y s i s o f p r o t e i n s h a s b e e n a d d e d t o t h e r e p e r t o i r e o f m o l e c u l a r t e c h n i q u e s f o r t w o f u n d a m e n t a l r e a s o n s . M o s t p r o t e i n s a r e i m m u n o g e n i c ; h e n c e , a n t i s e r a a r e e a s i l y r a i s e d , p r o v i d e a h i g h l y s e n s i t i v e m e a n s f o r d e t e c t i o n a n d a l l o w a f f i n i t y p u r i f i c a t i o n o f p r o t e i n s w h i c h a r e o t h e r w i s e d i f f i c u l t t o s e p a r a t e o n t h e b a s i s o f c o n v e n t i o n a l b i o p h y s i c a l p r o p e r t i e s . I n a d d i t i o n , s e r o l o g i c a l t e c h n i q u e s h a v e b e e n u s e f u l i n d e t e r m i n i n g p h y l o g e n e t i c r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n p r o t e i n s . I n g e n e r a l , i t h a s b e e n f o u n d t h a t t h e a n t i g e n i c n a t u r e o f p r o t e i n s c a n b e v e r y c o m p l e x , a n d i n a c o n t i n u i n g e f f o r t t o p r o d u c e a n d c h a r a c t e r i z e m o r e s p e c i f i c a n t i s e r a a g r o w i n g l i s t o f e x p e r i m e n t - . a l s t r a t e g i e s h a s b e e n d e v e l o p e d . I. S t r a t e g i e s f o r O b t a i n i n g A n t i s e r a t o S p e c i f i c P r o t e i n s On t h e s i m p l e s t l e v e l , p r o t e i n s e x h i b i t s t r u c t u r a l f e a t u r e s w h i c h a r e r e c o g n i z e d a s a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s i n o t h e r s p e c i e s . A n t i s e r a r a i s e d t o s u c h p r o t e i n s w i l l , t h e r e f o r e , r e g i s t e r d i f f e r e n c e s a s w e l l a s some d e g r e e o f c r o s s r e a c t i v i t y f o r r e l a t e d a n t i g e n s . W h e r e s p e c i f i c i t y i s i m p o r t a n t , t h e p r o b l e m o f c r o s s r e a c t i v i t y c a n o f t e n b e e l i m i n a t e d b y i m m u n o a d s o r p t i o n . C l a s s i c a l t i s s u e t y p i n g s e r o l o g y i s a l m o s t e n t i r e l y b a s e d u p o n t h i s a p p r o a c h . M e t h o d s u s e d t o d e f i n e t r a n s p l a n t a t i o n a n t i g e n s i n t h i s w a y h a v e r e v e a l e d a h i g h d e g r e e o f p o l y -m o r p h i s m a t t h e m a j o r h i s t o c o m p a t i b i l i t y l o c i . A n o t h e r a p p r o a c h h a s b e e n t o i m m u n i z e b e t w e e n c l o s e l y r e l a t e d i n d i v i d u a l s t h e r e b y o b t a i n i n g a n t i b o d y i n 2 r e s p o n s e t o t h e r e s t r i c t e d g e n e t i c d i f f e r e n c e s b e t w e e n a n t i g e n s ' . S y n g e n e i c i m m u n i z a t i o n u s e d t o r a i s e a n t i s e r a t o m u r i n e T - c e l l d i f f e r e n t i a t i o n a n t i g e n s h a s , h o w e v e r , b e e n h a m p e r e d b y t h e f a c t t h a t t h e a n t i s e r a o b t a i n e d a r e o f p o o r t i t r e (3) . H i g h l y s p e c i f i c a n t i s e r a h a v e b e e n r a i s e d b y i m m u n i z i n g w i t h p u r -i f i e d p e p t i d e s b e a r i n g t h e a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t i n q u e s t i o n . T h i s s t r a i g h t -f o r w a r d a p p r o a c h i s , h o w e v e r , n e c e s s a r i l y r e s t r i c t e d t o a l i m i t e d n u m b e r o f w e l l c h a r a c t e r i z e d a n d h i g h l y p u r i f i e d a n t i g e n s . I n some i n s t a n c e s , t h e a n t i g e n o f i n t e r e s t i s p o o r l y c h a r a c t e r i z e d a n d u n d e r s t o o d o n l y i n t e r m s o f i m m u n o l o g i c a l c r i t e r i a . T u m o u r - s p e c i f i c a n t i g e n s a r e a n e x a m p l e o f t h i s t y p e o f p r o t e i n . A n t i b o d y f e e d b a c k h a s b e e n s u c c e s s f u l -l y u s e d t o r a i s e a n t i s e r a s p e c i f i c f o r m u r i n e a n d h u m a n t u m o u r a n t i g e n s ( 4 ) . T h i s t e c h n i q u e r e l i e s u p o n t h e s t r o n g s p e c i e s d i f f e r e n c e t o w e a k t u m o u r a n t i g e n s a n d a n a c t i v e - m e a n s o f r e s t r i c t i n g t h e r e s p o n s e t o n o n - t u m o u r a n t i g e n s i n o r d e r t o r a i s e a n t i s e r a w i t h i m p u r e s t a r t i n g m a t e r i a l . T h e a n t i s e r a o b t a i n e d i s t h e r e f o r e o f g o o d t i t r e a n d r e q u i r e s l i m i t e d a d s o r p t i o n t o r e m o v e c r o s s r e a c t -i v i t y . T h e r e s u l t i n g s p e c i f i c a n t i s e r u m i s s u b s e q u e n t l y r e q u i s i t e i n t h e p u r i f i c a t i o n o f t h e s e p r o t e i n s . I t a p p e a r s , h o w e v e r , t h a t t h e m e t h o d i s n o t g e n e r a l l y a p p l i c a b l e t o a l l c l a s s e s o f c e l l s u r f a c e a n t i g e n ( M . W e a v e r , u n p u b l i s h e d r e s u l t s ) . M o s t a n t i s e r a , e v e n w h e n r a i s e d t o s i n g l e d e t e r m i n a n t s , a r e h e t e r o g e n e o u s i n n a t u r e ; c o n s i s t i n g o f d i f f e r e n t a n t i b o d y s p e c i e s t h a t may v a r y i n a f f i n i t y f o r t h e a n t i g e n . W i t h m u l t i d e t e r m i n a n t a n t i g e n s t h i s h e t e r o g e n e i t y may g r o w t o i n c l u d e c r o s s r e a c t i v e s p e c i f i c i t i e s t h a t c a n n o t b e e x c l u d e d b y a d s o r p t i o n . W i t h a l m o s t a n y a n t i s e r u m , t h e r e f o r e , t h e r e e x i s t s some b a s a l l e v e l o f u n - ... . c e r t a i n t y r e g a r d i n g t h e i r a c t u a l s p e c i f i c i t y . P r o p e r a n a l y t i c a l u s e o f s u c h r e a g e n t s d e m a n d s t h a t t h e i r i m m u n o l o g i c a l a c t i v i t y b e d e f i n e d i n r e l a t i o n t o a p p r o p r i a t e s p e c i f i c i t y c o n t r o l s . 3 I I . S i g n i f i c a n c e of Monoclonal An t i b o d i e s The s i g n i f i c a n c e of o b t a i n i n g monoclonal, and t h e r e f o r e t o t a l l y s p e c i f i c antibody has been known to researchers f o r some time. Immunoglobulin s e c r e t i n g plasmacytomas a r i s e w i t h high frequency i n the Balb/c s t r a i n of mice (5). These antibody producing tumours have been e x t e n s i v e l y studied from the point of view of immunoglobulin syn t h e s i s i n v i t r o . As the m a j o r i t y of these l i n e s secreted antibody of undetermined s p e c i f i c i t i e s the centre of i n t e r e s t i n t h i s research s h i f t e d towards attempts to induce monoclonal antibody of defined s p e c i f i c i t y . The k i n e t i c s of plasma c e l l d i f f e r e n t i a t i o n can be measured i n t i s s u e c u l t u r e . Spleen c e l l s c u l t u r e d w i t h antigen i n v i t r o generate antibody s e c r e t i n g c e l l s which are q u a n t i f i a b l e both i n terms of secreted product as w e l l as plaque form-ing u n i t s . Such c u l t u r e s have a very short l i f e span however, and have y i e l d e d only t r a c e amounts of antibody. In v i v o c l o n i n g of a s p e c i f i c B c e l l was reported by Askonas and coworkers (6). By s e q u e n t i a l t r a n s f e r of l i m i t i n g numbers of spleen c e l l s i n t o i r r a d i a t e d syngeneic mice, an antibody s e c r e t i n g B c e l l l i n e w i t h s p e c i f i c i t y f o r the hapten d i - n i t r o - p h e n o l (DNP) was i s o l a t e d and maintained over a period of f i v e months. Maintenance of t h i s clone r e q u i r e d an extensive programme of t r a n s p l a n t a t i o n and screening; w i t h time, antibody production decreased, presumably due to senescence of the clone. Human lymphoblastoid c e l l l i n e s are known to synthesize and secrete immunoglobulin and are presumed to a r i s e from an i n i t i a l t r ansformation event of plasma c e l l s through i n f e c t i o n w i t h Epstein-Barr v i r u s (7). S t e i n i t z (8) and Zurawski (9) attempted to o b t a i n s p e c i f i c antibody s e c r e t i n g l i n e s by in_ v i t r o transformation of p e r i p h e r a l human lymphocytes w i t h EBV f o l l o w i n g immunization w i t h tetanus t o x o i d and the n i t r o -phenyl hapten. S p e c i f i c transformation proved to be a low frequency event and most l i n e s e s t a b l i s h e d d i d not r e t a i n the a b i l i t y to secrete s p e c i f i c antibody f o r an extended period of time. While these s t u d i e s lend d i r e c t support to the 4 c l o n a l t h e o r y o f immune r e s p o n s e s , t h e s e m e t h o d s a r e l a r g e l y e x p e r i m e n t a l a n d h a v e n o t b e e n p r a c t i c a l l y a d a p t e d f o r m o r e r o u t i n e p u r p o s e s . I I I . H i s t o r y o f C e l l F u s i o n a n d T e c h n i c a l I m p r o v e m e n t s T h e d i r e c t i o n o f c l a s s i c a l s e r o l o g y w a s t r a n s f o r m e d b y t h e d e m o n s t r a t i o n b y K o h l e r a n d M i l s t e i n t h a t a n t i b o d y s e c r e t i n g c e l l l i n e s c o u l d b e d e r i v e d b y s o m a t i c c e l l h y b r i d i z a t i o n (10). S t u d i e s o f i m m u n o g l o b u l i n s y n t h e s i s h a v e b e e n l a r g e l y b a s e d o n t h e g r o w t h o f c o n t i n u o u s m u r i n e p l a s m a c y t o m a l i n e s i n v i t r o (5) . One o f t h e e a r l i e r m y e l o m a l i n e s a d a p t e d t o t i s s u e c u l t u r e g r o w t h w a s d e s i g n a t e d MOPC-21 a n d s y n t h e s i z e d a n i m m u n o g l o b u l i n o f t h e I g G ^ s u b c l a s s o f u n k n o w n b i n d i n g s p e c i f i c i t y . U s i n g t h e t e c h n i q u e o f s o m a t i c c e l l f u s i o n K o h l e r a n d M i l s t e i n f o u n d t h a t w h e n MOPC-21 w a s f u s e d w i t h a n o t h e r p l a s m a c y t o m a , t h e r e s u l t i n g h y b r i d c e l l s c o n t i n u e d t o p r o d u c e b o t h m y e l o m a p r o t e i n s a n d g r e w w e l l i n t i s s u e c u l t u r e (11). W h e n s p l e e n c e l l s f r o m m i c e w h i c h h a d b e e n i m m u n i z e d w i t h s h e e p r e d b o o d c e l l s w e r e f u s e d t o MOPC-21 t h e r e s u l t i n g h y b r i d s s e c r e t e d b o t h t h e MOPC-21 p r o t e i n a s w e l l a s a n t i b o d y t o s h e e p r e d b l o o d c e l l s (12). T h e s e h y b r i d l i n e s g r e w i n t i s s u e c u l t u r e a n d i n m i c e , w h e r e t h e y h a v e b e e n s h o w n t o i n d u c e a n t i b o d y s e c r e t i n g t u m o u r s ( h y b r i d o m a s ) . S u c h s p e c i f i c h y b r i d s r e t a i n t h e a b i l i t y t o s e c r e t e a n t i b o d y f o r e x t e n d e d p e r i o d s o f t i m e a n d s e c r e t e h i g h c o n c e n t r a t i o n s o f a n t i b o d y i n t o t h e s e r a a n d a s c i t e s f l u i d s o f t r a n s p l a n t e d m i c e . T h i s t h e s i s t a k e s a s i t s s u b j e c t i m p r o v e m e n t s i n t h e t e c h n o l o g y o f c e l l f u s i o n w h i c h h a v e r e s u l t e d i n t h e i s o l a t i o n o f h y b r i d s s e c r e t i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d y s p e c i f i c f o r t h e b a c t e r i a l a n t i g e n f e r r e d o x i n . a ) T e c h n o l o g y o f c e l l f u s i o n T h e o r i g i n a l e x p e r i m e n t s o f M i l s t e i n d e m o n s t r a t e d t h a t t h e r e w e r e c o n d i t i o n s g o v e r n i n g t h e d e r i v a t i o n o f a n t i b o d y s e c r e t i n g h y b r i d s . U s i n g m y e l o m a c e l l l i n e s s e c r e t i n g d i f f e r e n t i m m u n o g l o b u l i n s , i t w a s f o u n d t h a t i m m u n o g l o b u l i n 5 s e c r e t i o n w a s s u s t a i n e d i n f u s i o n s b e t w e e n m y e l o m a c e l l s w h e r e a s i n f u s i o n p r o d u c t s b e t w e e n a m y e l o m a a n d f i b r o b l a s t o i d l i n e i m m u n o g l o b u l i n s y n t h e s i s w a s s u p p r e s s e d ( 1 3 ) . I m m u n o c h e m i c a l a n a l y s i s o f t h e h y b r i d p r o d u c t s r e v e a l e d t h a t t h e y c o n s i s t e d o f c o m b i n a t i o n s o f h e a v y a n d l i g h t c h a i n s d e r i v e d f r o m b o t h p a r e n t a l c e l l l i n e s ( 1 1 ) . T h e s e h y b r i d m o l e c u l e s w e r e a s s u m e d t o r e p r e s e n t r a n d o m a s s e m b l y o f i n t r a c e l l u l a r h e a v y a n d l i g h t c h a i n s i n t h e h y b r i d s . When immune s p l e e n c e l l s a r e f u s e d w i t h m y e l o m a c e l l l i n e s , t h e s p e c i f i c i m m u n o -g l o b u l i n c h a i n s f r o m t h e p l a s m a c e l l p a r t n e r a r e l i a b l e t o r e c o m b i n e i n n o n -s p e c i f i c f a s h i o n w i t h h e a v y a n d l i g h t c h a i n s c o n t r i b u t e d b y t h e m y e l o m a p a r e n t a l . T h e b i n d i n g a c t i v i t y o f t h e s e h e t e r o l o g o u s a n t i b o d y m o l e c u l e s i s , t h e r e f o r e , r e d u c e d . R e c e n t l y , s u b l i n e s o f t h e M O P C - 2 1 m y e l o m a h a v e b e e n d e r i v e d w h i c h a r e d e f i c i e n t i n b o t h h e a v y a n d l i g h t c h a i n s y n t h e s i s p e r m i t t i n g t h e c o n s t r u c t i o n o f h y b r i d c e l l l i n e s w h i c h s e c r e t e i m m u n o g l o b u l i n w h i c h i s t o t a l l y d e r i v e d f r o m t h e s p l e e n c e l l p a r e n t a l i n t h e f u s i o n . S e v e r a l o f t h e s e l i n e s a r e l i s t e d i n T a b l e I. b ) C h a r a c t e r i s t i c s o f m y e l o m a c e l l g r o w t h i n v i t r o . M y e l o m a c e l l l i n e s p r o l i f e r a t e i n t i s s u e c u l t u r e o v e r a d e n s i t y r a n g e o f a p p r o x i m a t e l y 1 0 t o 1 0 c e l l s / m l . I n f i g u r e 1 a g r o w t h c u r v e f o r t h e S P 2 / 0 -A g l 4 ( S p 2 ) m y e l o m a c e l l l i n e i s p l o t t e d . F r o m l i m i t i n g d i l u t i o n e x p e r i m e n t s i t i s k n o w n t h a t m y e l o m a l i n e s w i l l g r o w a s c l o n a l l y d e r i v e d c u l t u r e s f r o m t h e s i n g l e c e l l s t a g e p r o v i d e d o p t i m u m c u l t u r e c o n d i t i o n s a r e m e t . A t l o w e r d e n s i t i e s , h o w e v e r , t h e l a g p e r i o d b e t w e e n i n o c u l a t i o n a n d o b s e r v a b l e g r o w t h 4 5 i s p r o l o n g e d . B e t w e e n 10 a n d .10 c e l l s / m l c u l t u r e s e x h i b i t a n i n c r e a s e d g r o w t h r a t e , u n d e r g o i n g l o g a r i t h m i c i n c r e m e n t s i n c e l l n u m b e r s w i t h t i m e . F r o m t h e e x p o n e n t i a l p h a s e o f t h e g r o w t h c u r v e a n a p p r o x i m a t e d o u b l i n g t i m e o f 12 h c a n b e d e r i v e d . T h i s s h o r t p h a s e o f e x p o n e n t i a l g r o w t h h a s b e e n 6 T a b l e I. C e l l L i n e s U s e d i n D e r i v i n g A n t i b o d y S e c r e t i n g H y b r i d s C e l l l i n e O r i g i n a l m y e l o m a I g O r i g i n a t o r P 3 - X 6 3 - A g . 8 M O P C - 2 1 I g G (H+L) M i l s t e i n ( 1 0 ) N S I M O P C - 2 1 L c h a i n o n l y M i l s t e i n ( 1 4 ) S P 2 / 0 - A g l 4 M O P C - 2 1 n o I g c h a i n s W i l d e ( 1 5 ) X 6 3 - A g 8 . 6 5 3 M O P C - 2 1 n o I g c h a i n s K e a r n e y ( 1 6 ) 10" 1 4 . 10-' days 0 1 in culture —^ Figure 1 . Growth curve of S P 2 . 8 r e l a t e d t o m e d i u m c o n d i t i o n i n g b y m y e l o m a c e l l s d u r i n g l o w d e n s i t y g r o w t h . M e t a b o l i t e s s e c r e t e d b y g r o w i n g m y e l o m a c e l l s a r e t h e n u t i l i z e d b y t h e c u l t u r e d u r i n g t h e p e r i o d o f r a p i d g r o w t h . T h i s same e f f e c t c a n a l s o b e p r o v i d e d b y i n e r t f e e d e r c e l l s , s u c h a s t h y m o c y t e s , t o p e r m i t t h e g r o w t h o f m y e l o m a c e l l s a t s u b o p t i m a l d e n s i t i e s a n d i s t h e b a s i s f o r t h e c l o n i n g p r o t o c o l u s e d t o i s o l a t e a n t i b o d y s e c r e t i n g h y b r i d c e l l s a s o u t l i n e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s ( 1 7 ) . A t d e n s i t i e s e x c e e d i n g 2 - 3 x 10"* c e l l s / m l e x p o n e n t i a l g r o w t h d r o p s o f f a n d t h e e f f e c t s o f c u l t u r e o v e r c r o w d i n g b e c o m e a p p a r e n t . I n h i g h d e n s i t y c u l t u r e s c e l l u l a r m o r p h o l o g y i s d i s t o r t e d a n d v i a b i l i t y i s s h a r p l y r e d u c e d . R e s u s p e n s i o n o f c e l l s i n f r e s h m e d i u m a t t h i s d e n s i t y d o e s n o t r e v i v e c u l t u r e s s u g g e s t i n g t h a t n u t r i t i o n a l f a c t o r s a r e n o t t h e p r i m e c a u s e o f g r o w t h l i m i t -a t i o n s e e n a t h i g h e r d e n s i t i e s . O v e r g r o w n c u l t u r e s c a n b e m a i n t a i n e d b y s p l i t t i n g c e l l n u m b e r s b a c k t o a l o w e r d e n s i t y ; h o w e v e r , s u c h c u l t u r e c o n d i -t i o n s may s e r i a l l y s e l e c t f o r m y e l o m a s u b - l i n e s h a v i n g g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s u n d e s i r a b l e f o r e f f i c i e n t c e l l f u s i o n . H a r v e s t i n g o f m y e l o m a c u l t u r e s d u r i n g e x p o n e n t i a l g r o w t h i s g e n e r a l l y r e p o r t e d t o b e a n i m p o r t a n t f a c t o r i n t h e s u c c e s s o f f u s i o n e x p e r i m e n t s ( 1 8 ) . V a r i o u s i n v e s t i g a t o r s h a v e r e p o r t e d t h a t m y e l o m a l i n e s v a r y i n t h e i r c a p a c i t y t o f o r m c e l l h y b r i d s ( 1 9 ) . T h r o u g h a d a p t i v e c h a n g e s i n t i s s u e c u l t u r e , l i n e s h a v e b e e n s e l e c t e d f o r f a v o u r a b l e f u s i o n c h a r a c t e r i s t i c s a n d h a v e b e e n f o u n d t o r e m a i n s t a b l e i n t h i s r e g a r d . W i t h t h e w i d e s p r e a d d i s s e m i n a t i o n o f m y e l o m a l i n e s a m o n g m a n y d i f f e r e n t l a b o r a t o r i e s t h e p o t e n t i a l f o r g e n e t i c d r i f t i n t h i s u n c o n t r o l l e d e n v i r o n m e n t i s i n c r e a s e d . T h e s t a r t i n g p o i n t f o r t h e f u s i o n s w h i c h w e r e u n d e r t a k e n a s p a r t o f t h i s t h e s i s w a s t o o b t a i n a m y e l o m a c e l l l i n e w i t h p r o v e n f u s i n g c h a r a c t e r i s t i c s f r o m a n e s t a b l i s h e d l a b o r a t o r y . T h e p r o t o c o l f o r h a n d l i n g o f t h i s l i n e s u b s e q u e n t l y h a s b e e n t o s t o r e l a r g e s t o c k s o f t h e o r i g i n a l l i n e a n d t o r e s e r v e s a m p l e s f r o m s u c c e s s f u l f u s i o n s 9 i n a n e f f o r t t o a c h i e v e some d e g r e e o f c o n t i n u i t y b e t w e e n e x p e r i m e n t s . T h e i m p o r t a n c e o f u s i n g a n a d a p t e d m y e l o m a l i n e i s i l l u s t r a t e d b y a t t e m p t s t o d e -r i v e m o n o c l o n a l a n t i b o d y o f h u m a n o r i g i n . D e s p i t e t h e e x i s t e n c e o f h u m a n m y e l o m a a n d l y m p h b l a s t o i d c e l l l i n e s , n o n e h a v e y e t b e e n f o u n d w h i c h g i v e r i s e t o a n t i b o d y s e c r e t i n g c e l l h y b r i d s ( R . N o w i n s k i , p e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n ) . M o n o c l o n a l a n t i b o d y o f h u m a n o r i g i n h a s b e e n d e r i v e d f r o m f u s i o n s w i t h m o u s e m y e l o m a l i n e s ( i b i d . ) , h o w e v e r , t h e l o w s t a b i l i t y o f t h e s e i n t e r s p e c i f i c h y b r i d s a p p e a r s t o b e a m a j o r l i m i t a t i o n , c ) I m m u n i z a t i o n k i n e t i c s S e v e r a l f a c t o r s r e l a t e d t o t h e k i n e t i c s o f h y b r i d c e l l f o r m a t i o n h a v e b e e n s t u d i e d ; some o f w h i c h a r e r e l e v a n t t o i m m u n i z a t i o n p r o c e d u r e s . I n d e r i v i n g h y b r i d s s p e c i f i c f o r s h e e p r e d b l o o d c e l l s , M i l s t e i n p r o p o s e d t h a t t h e m y e l o m a d e m o n s t r a t e d s e l e c t i v e f u s i o n t o i m m u n o g l o b u l i n s e c r e t i n g s p l e e n c e l l s ( 1 2 ) . P l a q u e f o r m i n g c e l l s o f immune m i c e n o r m a l l y c o m p r i s e a p p r o x i -m a t e l y 0 . 0 5 % o f t h e t o t a l s p l e e n c e l l p o p u l a t i o n . A s s u m i n g f u s i o n o f m y e l o m a a n d s p l e e n c e l l s t o b e a r a n d o m p r o c e s s o n e w o u l d p r e d i c t t h a t t h e n u m b e r o f h y b r i d s w o u l d b e p r o p o r t i o n a l t o t h i s r a t i o . T h e a c t u a l f r e q u e n c y o f s h e e p r e d b l o o d c e l l s p e c i f i c h y b r i d s a l t h o u g h v a r i a b l e , i s i n t h e r a n g e o f 1 0 t o 2 0 % . I t w o u l d a p p e a r t h a t t h e m a j o r i t y o f v i a b l e h y b r i d s a r e a r e s u l t o f f u s i o n w i t h o n l y a s m a l l p r o p o r t i o n o f t h e t o t a l B c e l l p o p u l a t i o n . T i m e c o u r s e s t u d i e s s h o w e d t h a t t h e m a x i m u m n u m b e r o f h y b r i d s w a s o b t a i n e d p r i o r t o t h e m a x i m u m n u m b e r o f p l a q u e f o r m i n g c e l l s i n t h e s p l e e n f o l l o w i n g s e c o n d a r y i m m u n i z a t i o n , i m p l y i n g t h a t t h e a c t u a l t a r g e t c e l l f o r f u s i o n may b e a r e l -a t i v e l y i m m a t u r e p l a s m a c e l l p r e c u r s o r ( 1 2 ) . I n g e n e r a l , l a r g e r n u m b e r s o f s p e c i f i c h y b r i d s w e r e o b t a i n e d a f t e r s e c o n d a r y i m m u n i z a t i o n . I n f u s i o n s w i t h a n t i - a l l o t y p e immune s p l e e n c e l l s immune a n d h y p e r i m m u n e m i c e w e r e c o m p a r e d a s s o u r c e s o f s p l e e n c e l l s f o r f u s i o n . H e r z e n b e r g o b s e r v e d t h a t s e c o n d a r y 1 0 i m m u n i z a t i o n w a s s u f f i c i e n t t o o b t a i n m a x i m u m n u m b e r s o f h y b r i d s w h e r e a s h y p e r -i m m u n i z a t i o n d i d n o t i n c r e a s e t h e n u m b e r o f s p e c i f i c h y b r i d s ( 2 0 ) . I V . C h a r a c t e r i s t i c s o f t h e F e r r e d o x i n A n t i g e n T h e f e r r e d o x i n m o l e c u l e i s a s m a l l e l e c t r o n t r a n s p o r t p r o t e i n i s o l a t e d f r o m C l o s t r i d i u m p a s t e u r i a n u m . T h i s m o l e c u l e h a s a t o t a l a m i n o a c i d c o n t e n t o f 5 5 r e s i d u e s a l l p r e s e n t i n a s i n g l e p o l y p e p t i d e c h a i n ( 2 1 ) . I n v i e w o f t h i s l o w m o l e c u l a r w e i g h t a n d a n t i g e n i c i t y i n s e v e r a l s p e c i e s , t h e m o l e c u l e h a s b e e n a c o n v e n i e n t s u b j e c t f o r i m m u n o l o g i c a l a n a l y s i s . a s t h e c o m p l e t e a m i n o a c i d s e q u e n c e i s k n o w n , i t w a s o f i n t e r e s t t o d e t e r m i n e t h e r e l a t i o n s h i p b e t -w e e n a n t i g e n i c i t y a n d p r i m a r y s t r u c t u r e . E q u i l i b r i u m d i a l y s i s s t u d i e s u s i n g s y n t h e t i c p e p t i d e s r e p r e s e n t i n g d i f f e r e n t r e g i o n s o f t h e a n t i g e n i n d i c a t e d t h a t s e q u e n c e s l o c a t e d n e a r t h e N - a n d C - t e r m i n i c o n s t i t u t e d t w o m a j o r a n t i -g e n i c d e t e r m i n a n t s o f t h e m o l e c u l e ( 2 2 ) . M o r e s p e c i f i c a l l y , i t w a s e s t a b l i s h e d t h a t t h e a m i n o t e r m i n a l h e p t a p e p t i d e ( H 2 N - A l a - T y r - L y s - I l e - A l a - A s p - S e r - ) a n d t h e c a r b o x y - t e r m i n a l p e n t a p e p t i d e ( - A l a - P r o - V a l - G l n - G l u - C O O H ) a c c o u n t e d f o r e s s e n -t i a l l y a l l o f t h e a n t i b o d y s y n t h e s i z e d i n r a b b i t s . T h e s p e c i f i c i t y o f t h e s e a s s i g n m e n t s h a s s i n c e b e e n s u p p o r t e d b y c h e m i c a l m o d i f i c a t i o n s t u d i e s a n d b y t h e r e s u l t s o f c e l l u l a r s t u d i e s w h i c h i n d i c a t e t h a t t h e N - d e t e r m i n a n t a p p e a r s t o b e t h e s t r o n g e r o f t h e t w o i n t e r m s o f c e l l - m e d i a t e d f u n c t i o n s , w h i l e t h e C - d e t e r m i n a n t w a s p r e d o m i n a n t i n s e r o l o g i c a l a s s a y s ( 2 3 , 2 4 ) . T h e s e r e s u l t s a r e r e p r e s e n t a t i v e o f c e l l c o o p e r a t i o n m o d e l s i n i m m u n o l o g y a n d h a v e b e e n t h e b a s i s f o r g e n e t i c i n v e s t i g a t i o n s o f f e r r e d o x i n r e s p o n s e s i n c o n g e n i c s t r a i n s o f m i c e ( 2 5 ) . I t w a s i n v i e w o f r e c e n t e v i d e n c e , s h o w i n g t h a t a n t i - f e r r e d o x i n r e s p o n s e s i n m i c e s e g r e g a t e w i t h i n t h e I - r e g i o n o f t h e m o u s e H - 2 c o m p l e x , t h a t a n a t t e m p t w a s m a d e t o r e - e v a l u a t e t h e s e e a r l i e r f i n d i n g s i n t h e m o u s e s y s t e m u s i n g a m o r e d e f i n i t i v e t e c h n o l o g y . H N - A l a - T y r - L y s - I l e - A l a - A s p - S e r - C y s - V a l - S e r - C y s - G l y - A l a - C y s - A l a - S e r - A l a - C y s - P r o - V a l - A s n 2 ( 1 ) ( 2 1 ) A l a - I l e - S e r - G l n - G l y - A s p - S e r - I l e - P h e - V a l - I l e - A s p - A l a - A s p ( 2 2 ) ( 3 5 ) T h r - C y s - I l e - A s p - C y s - G l y - A s n - C y s - A l a - A s n - V a l - C y s - P r o - V a l - G l y - A l a - P r o - V a l - G l n - G l u - C O O H ( 3 6 ) ( 5 5 ) F i g u r e 2 . T h e A m i n o A c i d S e q u e n c e o f C l o s t r i d i u m p a s t e u r i a n u m F e r r e d o x i n 12 M A T E R I A L S AND METHODS I. A n i m a l s : B I O . B R f e m a l e m i c e 6 - 8 w e e k s o l d w e r e p u r c h a s e d f r o m J a c k s o n L a b o r a t o r i e s , B a r H a r b o u r , M a i n e . T h y m o c y t e s u s e d i n c l o n i n g h y b r i d o m a s w e r e o b t a i n e d f r o m y o u n g m i c e w h i c h w e r e b r e d i n o u r a n i m a l f a c i l i t y . F ^ p r o g e n y b e t w e e n B a l b / c a n d B I O . B R m i c e w e r e u s e d f o r t h e p a s s a g i n g o f h y b r i d c e l l l i n e s i n v i v o . O n e w e e k p r i o r t o i n o c u l a t i o n w i t h 1 0 h y b r i d c e l l s F ^ m i c e w e r e g i v e n i n t r a p e r i -t o n e a l i n j e c t i o n s o f 0 . 5 m l o f 2 , 6 , 1 0 , 1 4 - t e t r a m e t h y l p e n t a d e c a n e ( P r i s t a n e -A l d r i c h ) . I I . A n t i g e n s a n d I m m u n i z a t i o n : F e r r e d o x i n f r o m C l o s t r i d i u m p a s t e u r i a n u m ( F d ) w a s i s o l a t e d a n d p u r i f i e d a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d ( 2 4 ) . B I O . B R m i c e w e r e i n i t i a l l y i m m u n i z e d w i t h 20 u g o f F d i n 50% C o m p l e t e F r e u n d ' s A d j u v a n t ( G i b c o ) a t i n t e r v a l s o f 4 w e e k s . F o l l o w -i n g t h e t h i r d i n j e c t i o n , m i c e w e r e b l e d a n d t i t r e s o f a n t i - F d a n t i b o d y i n i n d i v i d u a l s e r a w e r e d e t e r m i n e d u s i n g a n E L I S A a s s a y ( 2 6 ) . A n i m a l s s h o w i n g a s i g n i f i c a n t t i t r e o f a n t i b o d y a t t h i s p o i n t w e r e t h e n s e t a s i d e a n d r e s t e d f o r o n e m o n t h . T h r e e d a y s p r i o r t o f u s i o n t h e s e m i c e w e r e g i v e n a b o o s t i n g d o s e o f 1 0 0 u g a l u m - p r e c i p i t a t e d F d i n t r a p e r i t o n e a l l y . I I I . C e l l F u s i o n : F e t a l b o v i n e s e r u m i s a c r i t i c a l i n g r e d i e n t o f c e l l f u s i o n w o r k a s i t i s i n .mos t o t h e r a s p e c t s o f c e l l c u l t u r e . G r o w t h f a c t o r s p r e s e n t i n t h i s n u t r i e n t p r o m o t e t h e g r o w t h o f s i n g l e c e l l s i n t i s s u e c u l t u r e . T h i s a c t i v i t y i s s c r e e n e d f o r b y t e s t i n g b a t c h e s o f F C S f o r t h e a b i l i t y t o s u p p o r t 100% c l o n i n g e f f i c i e n c y o f S P 2 i n t h e a b s e n c e o f f e e d e r c e l l s . I t s h o u l d b e s t r e s s e d t h a t d i f f e r e n t l o t s o f F C S a r e n o t e q u i v a l e n t i n t h i s r e s p e c t a n d 1 3 n e i t h e r h a v e l e s s e x p e n s i v e s u b s t i t u t e s b e e n f o u n d s u i t a b l e ( h o r s e s e r u m , n e w b o r n c a l f s e r u m ) . P o l y e t h y l e n e g l y c o l i n t h e m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e o f 1 0 0 0 - 2 0 0 0 i s u s e d t o e f f e c t c e l l f u s i o n . A l t h o u g h t h i s c o m p o u n d h a s b e e n f o u n d t o b e a n e x c e l l e n t f u s i n g a g e n t , i t i s a l s o s o m e w h a t t o x i c f o r l i v i n g c e l l s . P o l y e t h y l e n e g l y c o l t h a t i s u s e d b y l a b o r a t o r i e s e n g a g e d i n r o u t i n e c e l l f u s i o n w o r k i s a v a i l a b l e f r o m s e v e r a l s o u r c e s ( B a k e r C h e m i c a l s S e r v a , BDH C h e m i c a l s , K o c h L i g h t ) . I n r e l a t i o n t o t o x i c i t y , t h e r e a r e n o c l e a r g u i d e l i n e s e x c e p t t o s t a t e t h a t a l l o f t h e a b o v e s o u r c e s p r o v i d e P E G w h i c h h a s b e e n f o u n d t o b e m o r e s u i t a b l e , a n d c o n s i d e r a b l y l e s s t o x i c t h a n , c r u d e p r e p a r a t i o n s . I n a r e c e n t p u b l i c a t i o n t h e t o x i c i t y o f P E G h a s b e e n r e l a t e d t o t h e p r e s e n c e o f C a l c i u m ( 2 7 ) . P E G s o l u t i o n s h o u l d n o t b e k e p t f o r l o n g e r t h a n 1 m o n t h a s i t s t o x i c i t y i n c r e a s e s m a r k e d l y w i t h t i m e . T h e c o n d i t i o n s f o r c e l l f u s i o n h a v e b e e n a d a p t e d f r o m t h o s e o f G a l f r e a n d M i l s t e i n ( 2 8 ) a n d a r e e s s e n t i a l l y t h e s a m e a s t h o s e o u t l i n e d b y H e r z e n b e r g ( 2 9 ) . T h e S P 2 m y e l o m a p a r e n t a l w a s g r o w n i n D u l b e c c o ' s M o d i f i e d E a g l e M e d i u m (DME) s u p p l e m e n t e d w i t h 10% f e t a l b o v i n e s e r u m ( G i b c o ) , 2 mM s o d i u m p y r u v a t e ( E a s t -man) , 2 0 mM g l u t a m i n e ( E a s t m a n ) a n d 1 0 0 u g / m l o f p e n i c i l l i n - s t r e p t o m y c i n a n t i -b i o t i c s o l u t i o n ( G i b c o ) ( C D M E ) . T h e s e c u l t u r e s w e r e s e e d e d a t a d e n s i t y o f 4 2 x 1 0 c e l l s / m l i n t o 2 5 0 m l t i s s u e c u l t u r e f l a s k s ( F a l c o n ) a n d i n c u b a t e d a t 3 7 ° C u n d e r a 10% C O ^ a t m o s p h e r e . U n d e r t h e s e c o n d i t i o n s m y e l o m a c e l l s g r o w a n d d i v i d e r a p i d l y w i t h a d o u b l i n g t i m e o f a p p r o x i m a t e l y 1 2 h . F o r c e l l f u s i o n s , m y e l o m a c u l t u r e s w e r e d i v i d e d u p o n r e a c h i n g a d e n s i t y o f 1 0 ^ c e l l s / m l - a l i m i t w h i c h i s w e l l w i t h i n t h e r a n g e o f l o g a r i t h m i c g r o w t h f o r t h i s c e l l l i n e . S a m p l e s o f m y e l o m a u s e d i n e a c h f u s i o n w e r e f r o z e n i n c r y o p r o t e c t i v e m e d i u m (DME + 10% d i m e t h y l s u l f o x i d e + 20% f e t a l b o v i n e s e r u m ) a n d k e p t u n d e r l i q u i d n i t r o g e n s t o r a g e . T h o s e f r o m f u s i o n s t h a t r e s u l t e d i n s u c c e s s f u l h y b r i d i z a t i o n s 14 w e r e r e s e r v e d a n d p r o p a g a t e d f o r u s e i n s u b s e q u e n t f u s i o n s . I n a d d i t i o n , c l o n i n g o f t h e S P 2 m y e l o m a w a s p e r f o r m e d w i t h t h e a i m o f r e g u l a r l y i s o l a t i n g s u b l i n e s o f t h e p a r e n t a l s e l e c t e d f o r g o o d f u s i n g c h a r a c t e r i s t i c s . F u s i o n o f t h e S P 2 m y e l o m a a n d s p l e e n c e l l s i s e f f e c t e d b y e x p o s u r e t o 50% p o l y e t h y l e n e g l y c o l s o l u t i o n i n DME ( B a k e r 1 5 4 0 ) ( 3 0 ) . S P 2 c e l l s a n d s p l e e n c e l l s f r o m i m m u n i z e d m i c e a r e w a s h e d 3 t i m e s i n s e r u m f r e e m e d i u m a t 3 7 ° C . A f t e r w a s h i n g , t h e s e c e l l s a r e c o m b i n e d i n a 5 : 1 r a t i o o f s p l e e n t o m y e l o m a c e l l s a n d c e n t r i f u g e d a t 4 0 0 g f o r 1 0 m i n u t e s t o f o r m a c o m p a c t m i x e d c e l l p e l l e t . W i t h t h e t u b e i m m e r s e d i n a 3 7 ° C w a t e r b a t h , 1 m l o f w a r m 50% P E G i s a d d e d a n d t h e c e l l p e l l e t g e n t l y s t i r r e d w i t h a p i p e t t e t i p , t h e a d d i t i o n o f P E G b e i n g t i m e d o v e r a p e r i o d o f o n e m i n u t e . A f t e r t h e P E G h a s b e e n a d d e d , t h e p a r t i c u l a t e s u s p e n s i o n o f a g g l u t i n a t e d c e l l s i s g e n t l y s t i r r e d f o r a n a d d i t i o n a l m i n u t e . T h e s e i n t e r v a l s h a v e b e e n s e l e c t e d b y i n v e s t i g a t o r s a s t h o s e w h i c h p r o m o t e c e l l c o n t a c t i n t h e p r e s e n c e o f t h e f u s i n g a g e n t w h i l e m i n i m i z i n g i t s t o x i c e f f e c t s ( 3 1 ) . A f t e r 2 m i n u t e s e x p o s u r e , t h e P E G i s t h e n g r a d u a l l y d i l u t e d i n o r d e r t o a v o i d l y s i n g t h e c e l l s . Two 1 m l a l i q u o t s o f s e r u m - f r e e m e d i u m w a r m e d t o 3 7 ° C a r e s l o w l y a d d e d w i t h s t i r r i n g a s b e f o r e , f o l l o w e d b y s e v e n m l o f s e r u m - f r e e m e d i u m a d d e d o v e r a p e r i o d o f 2 - 3 m i n u t e s . T h e c e l l s u s p e n s i o n i s t h e n c e n t r i f u g e d a t 4 0 0 g f o r 1 0 m i n u t e s . T e n m l o f cDME + 20% F C S i s t h e n a d d e d t o t h e c e l l p e l l e t a n d t h e t u b e g e n t l y s w i r l e d i n o r d e r t o s l o w l y r e s u s p e n d t h e c o n t e n t s . T h e f u s e d c e l l s u s p e n s i o n i s t h e n d i l u t e d t o a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 ^ c e l l s / m l r e l a t i v e t o t h e s p l e e n c e l l s . O n e -h u n d r e d y l o f t h e s u s p e n s i o n i s t h e n a l i q u o t e d i n t o 9 6 - w e l l t i s s u e c u l t u r e p l a t e s ( C o s t a r ) a n d p l a c e d i n a 10% C O ^ i n c u b a t o r o v e r n i g h t . On t h e f o l l o w i n g d a y , 0 . 1 m l o f d o u b l e s t r e n g t h HAT m e d i u m (cDME ) i s a d d e d t o e a c h m i c r o -c u l t u r e . 15 I V . S e l e c t i o n o f H y b r i d C e l l s : T h e s e l e c t i o n p r o t o c o l u s e d i n . t h i s p r o c e d u r e i s b a s e d o n L i t t l e f i e l d ' s h y p o x a n t h i n e - a m i n o p t e r i n - t h y m i d i n e ( H A T ) m e d i u m ( 3 2 ) . T h e d r u g a m i n o p t e r i n i s a s t r u c t u r a l a n a l o g u e o f d i h y d r o f o l a t e , a n e s s e n t i a l c o f a c t o r f o r DNA s y n t h e s i s , w h i c h c o m p e t i t i v e l y i n h i b i t s t h e c o n v e r s i o n o f d i h y d r o f o l a t e t o t e t r a h y d r o f o l a t e , a r e a c t i o n c a t a l y s e d b y t h e e n z y m e d i h y d r o f o l a t e r e d u c t a s e . B e c a u s e t h e f o r m a t i o n o f t h y m i d y l a t e i s p a r t i c u l a r l y s e n s i t i v e t o d e p r e s s e d l e v e l s o f t e t r a h y d r o f o l a t e , t h e s y n t h e s i s o f DNA i s g r e a t l y r e t a r d e d b y a m i n o p -t e r i n . De n o v o s y n t h e s i s o f p u r i n e s a n d p y r i m i d i n e s i s t h e r e f o r e b l o c k e d b y a m i n o p t e r i n . N o r m a l c e l l s p o s s e s s i n g a s a l v a g e p a t h w a y o f n u c l e o t i d e b i o -s y n t h e s i s a r e a b l e t o s u r v i v e i n t h e p r e s e n c e o f a m i n o p t e r i n b y u t i l i z i n g a n e x o g e n o u s s o u r c e o f h y p o x a n t h i n e a n d t h y m i d i n e . S P 2 c e l l s a r e d e f i c i e n t i n a n e s s e n t i a l s a l v a g e p a t h w a y e n z y m e , h y p o x a n t h i n e - g u a n i n e p h o p h o r i b o s y l t r a n s -f e r a s e ( H G P R T ) a n d a r e c o n s e q u e n t l y u n a b l e t o u t i l i z e t h e e x o g e n o u s n u c l e o t i d e p r e c u r s o r s p r e s e n t i n HAT m e d i u m . T h e b i o s y n t h e t i c s e l e c t i o n i n HAT m e d i u m i s t h e r e f o r e d i r e c t e d a g a i n s t t h e m y e l o m a p a r e n t a l i n t h e f u s i o n p r o c e s s . T h e g r o w t h o f n o r m a l s p l e e n c e l l s i s i n d i r e c t l y s e l e c t e d a g a i n s t a s t h e s e c e l l s h a v e o n l y a l i m i t e d g r o w t h p o t e n t i a l i n v i t r o . T h e r e s u l t o f g r o w t h i n HAT m e d i u m , t h e r e f o r e , i s s e l e c t i o n o f c e l l s p o s s e s s i n g t h e g r o w t h c h a r a c t e r i s t i c s o o f t h e S P 2 m y e l o m a a n d a m i n o p t e r i n r e s i s t a n c e c o n t r i b u t e d b y t h e s p l e e n c e l l d o n o r . A l O O x c o n c e n t r a t e o f HT p r e c u r s o r s w a s p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g t h e f o l l o w -i n g i n g r e d i e n t s i n 0 . 1 N NaOH ( p u r i n e a n d p y r i m i d i n e b a s e s a r e o n l y s p a r i n g l y s o l u b l e b e l o w pH 7 ) : h y p o x a n t h i n e ( S i g m a ) 1 3 0 m g , t h y m i d i n e ( S i g m a ) 4 0 m g , d ^ O t o 1 0 0 m l . T h e d i s s o l v e d s o l u t i o n w a s f i l t e r s t e r i l i z e d a n d s t e r i l e H E P E S b u f f e r s o l u t i o n w a s t h e n a d d e d t o a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 0 1 M . T h i s s o l u t i o n i s s t a b l e f o r s e v e r a l m o n t h s i f k e p t i n t h e d a r k a t 4 ° C . 16 A m i n o p t e r i n s o l u t i o n ( l O O O x ) w a s s e p a r a t e l y p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g 2 mg a m i n o p t e r i n ( S i g m a ) i n 1 0 m l o f p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e f o l l o w e d b y f i l t e r s t e r i l i z a t i o n . HAT s o l u t i o n w a s p r e p a r e d a s r e q u i r e d b y a d d i n g a m i n o p t e r i n l O O O x s o l u t i o n a t 1 : 1 0 d i l u t i o n t o HT l O O x s o l u t i o n . V . S c r e e n i n g o f A n t i b o d y S e c r e t i n g H y b r i d o m a s : P r i m a r y t i s s u e c u l t u r e s o f f u s e d s p l e e n a n d m y e l o m a c e l l s , a s w e l l a s c l o n e s i s o l a t e d f r o m t h e m w e r e s c r e e n e d f o r a n t i b o d y p r o d u c t i o n u s i n g a n E L I S A a s s a y . C o n j u g a t e s u s e d i n t h e E L I S A a s s a y w e r e p r e p a r e d a c c o r d i n g t o t h e p r o t o c o l o f E n g v a l l a n d P e r l m a n ( 3 3 ) . R a b b i t a n t i s e r u m t o m o u s e i m m u n o -g l o b u l i n w a s o b t a i n e d f r o m t h e s e r a o f r a b b i t s p r e v i o u s l y i m m u n i z e d w i t h p u r i f i e d p r e p a r a t i o n s o f m o u s e I g o b t a i n e d f r o m m y e l o m a l i n e s a n d i s o l a t e d b y p r e p a r a t i v e i s o e l e c t r i c f o c u s s i n g ( B i o n e t i c s ) . A n t i b o d i e s t o m o u s e i m m u n o -g l o b u l i n w a s s p e c i f i c a l l y p u r i f i e d f r o m t h e s e a n t i s e r a b y i m m u n o a d s o r p t i o n a g a i n s t m o u s e I g c o u p l e d t o S e p h a r o s e - 4 B ( P h a r m a c i a ) . F i v e mg o f a l k a l i n e p h o s p h a t a s e ( S i g m a t y p e 7 ) w a s c o m b i n e d w i t h 2 mg o f i m m u n o a d s o r b e n t p u r i f i e d a n t i b o d y a n d d i a l y s e d a g a i n s t t h r e e c h a n g e s o f p h o s p h a t e b u f f e r e d s a l i n e p H 7 . 2 + 0 . 2 g / l i t r e M g C ^ . C o n j u g a t i o n o f t h e d i a l y s e d e n z y m e w i t h a n t i b o d y w a s e f f e c t e d b y a d d i t i o n o f g l u t a r a l d e h y d e ( E M g r a d e , J . B . E M S e r v i c e s ) t o 0 . 2 % b y v o l u m e . A f t e r a p p r o x i m a t e l y 4 5 m i n u t e s o f g e n t l e s t i r r i n g t h e r e a c t i o n w a s t e r m i n a t e d b y p l a c i n g t h e s o l u t i o n i n t o d i a l y s i s a g a i n s t 0 . 0 5 M T r i s pH 8 . 0 . A f t e r o v e r n i g h t d i a l y s i s e n z y m e l a b e l l e d c o n j u g a t e w a s d i l u t e d 1 : 1 w i t h g l y c e r o l a n d s t o r e d i n g l a s s a t 4 ° C , p r o t e c t e d f r o m l i g h t . S t o r e d c o n j u g a t e s r e t a i n e d f u l l s p e c i f i c a c t i v i t y t h r o u g h o u t t h e i r p e r i o d o f u s e . P o l y s t y r e n e s u b s t r a t e p l a t e s ( C o o k e ) w e r e c o a t e d w i t h f e r r e d o x i n ( 1 ug/ml) i n c a r b o n a t e c o a t i n g b u f f e r pH 9 . 6 a t 4 ° C o v e r n i g h t . F e r r e d o x i n c o a t e d p l a t e s w e r e t h e n w a s h e d f r e e o f u n b o u n d a n t i g e n b y r i n s i n g w i t h P B S - T w e e n b u f f e r . 17 W a s h e d p l a t e s w e r e i n c u b a t e d w i t h 0 . 1 m l a l i q u o t s o f c u l t u r e s u p e r n a t a n t s f r o m h y b r i d c e l l c u l t u r e s a n d i n c u b a t e d f o r 2 h t o p e r m i t b i n d i n g o f s p e c i f i c a n t i b o d y . P l a t e s w e r e t h e n w a s h e d a s b e f o r e a n d i n c u b a t e d w i t h r a b b i t a n t i -m o u s e I g a l k a l i n e p h o s p h a t a s e c o n j u g a t e f o r a f u r t h e r 2 h . A f t e r f i n a l r i n s i n g , 0 . 1 m l p e r w e l l o f s u b s t r a t e s o l u t i o n w a s a d d e d a n d t h e p l a t e s i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n u t e s . T h e h y d r o l y s i s o f t h e n l t r o - p h e n y l - p h o s p h a t e e s t e r b y a l k a l i n e p h o s p h a t a s e g i v e s r i s e t o a n i n t e n s e l y c o l o u r e d r e a c t i o n p r o d u c t . W i t h t h e a m o u n t s o f a n t i b o d y s e c r e t e d b y h y b r i d c e l l l i n e s i n c u l t u r e , t h i s r e a c t i o n p r o d u c t i s r e a d i l y d i s c e r n i b l e : c o n s e q u e n t l y , s c r e e n i n g o f h y b r i d s b y E L I S A r e q u i r e s o n l y v i s u a l i n s p e c t i o n o f t h e t e s t p l a t e . V I . C l o n i n g o f A n t i b o d y S e c r e t i n g H y b r i d C e l l s : P o s i t i v e a n t i b o d y s e c r e t i n g h y b r i d s d e t e c t e d w i t h t h e E L I S A w e r e c l o n e d t h e f o l l o w i n g d a y . T h e m e d i u m u s e d f o r c l o n i n g w a s DME s u p p l e m e n t e d w i t h 20% F C S , HT a n d 1 0 ^ t h y m o c y t e s p e r m l . A n a v e r a g e o f 2 3 0 h y b r i d c e l l f r o m p r i m a r y c u l t u r e s w e r e s u s p e n d e d i n 4 . 6 m l o f c l o n i n g m e d i u m . T h i r t y - s i x w e l l s o f a 96 w e l l p l a t e w e r e s e e d e d w i t h 0 . 1 m l o f t h i s s u s p e n s i o n . A n a d d i t i o n a l 4 . 0 m l o f m e d i u m w a s a d d e d t o t h e r e m a i n i n g 1 . 0 m l o f c e l l s u s p e n -s i o n a n d a n o t h e r 3 6 w e l l s w e r e p l a t e d w i t h t h i s m i x t u r e . F i n a l l y , 1 . 2 m l o f c l o n i n g m e d i u m w a s a d d e d t o a n d m i x e d w i t h t h e r e s i d u a l c e l l s u s p e n s i o n a n d u s e d t o p l a t e t h e r e m a i n i n g 24 w e l l s o f t h e p l a t e . T h i s p r o c e d u r e r e s u l t s i n a 3 s t e p l i m i t i n g d i l u t i o n s e r i e s w h i c h c o n s i s t e n t l y g i v e s r i s e t o m o n o -c l o n a l g r o w t h . C l o n e d c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d i n a 10% CO2 a t m o s p h e r e a n d o b s e r v e d d a i l y u n d e r a n i n v e r t e d p h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p e f o r c h a r a c t e r i s t i c s i g n s o f g r o w t h . H y b r i d c e l l s o f t h e r e m a i n i n g p r i m a r y c u l t u r e w e r e s u s p e n d e d i n o n e m l o f c l o n i n g m e d i u m a n d s e e d e d i n t o 24 w e l l c u l t u r e d i s h e s ( L i n b r o ) a s r e p l i c a t e c u l t u r e s a n d m a i n t a i n e d i n p a r a l l e l w i t h c l o n e d l i n e s t o g u a r d 18 a g a i n s t i n a d v e r t a n t l o s s o f t h e h y b r i d l i n e s . V I I . P u r i f i c a t i o n o f H y b r i d o m a A n t i b o d y : T h r e e m e t h o d s w e r e e v a l u a t e d i n a t t e m p t i n g t o p u r i f y m o n o c l o n a l a n t i b o d y . a ) I m m u n o a d s o r p t i o n I n i t s n a t i v e f o r m f e r r e d o x i n e x i s t s i n a h a i r p i n c o n f i g u r a t i o n i n -t e r n a l l y s t a b i l i z e d b y c o o r d i n a t i o n b o n d s b e t w e e n t h e 8 s u l f u r r e s i d u e s a n d t h e 2 i r o n n u c l e i . D i s u l f i d e b o n d s a r e n o t p r e s e n t . C o u p l i n g o f f r e e t h i o l g r o u p s w i t h T h i o p r o p y l S e p h a r o s e 4 B ( P h a r m a c i a ) o c c u r s v i a t h e m e c h a n i s m o f t h i o l - d i s u l f i d e e x c h a n g e ( 3 4 ) . I n o r d e r t o f a c i l i t a t e c o u p l i n g f e r r e d o x i n w a s f i r s t c h e l a t e d t o r e m o v e i r o n a n d t h e n f u l l y r e d u c e d b e f o r e r e a c t i o n w i t h t h e g e l . I r o n - c o n t a i n i n g F d w a s d i s s o l v e d i n a s o l u t i o n o f 5% T C A , 20 mM 2 - M E a n d 1 mM E D T A . T h e m i x t u r e w a s a l l o w e d t o s t a n d a t 4 ° C f o r 1 h , t h e n c e n t r i f u g e d a n d t h e p r e c i p i t a t e w a s h e d i n d i s t i l l e d w a t e r . T h e i r o n - f r e e p r e c i p i t a t e w a s t h e n r e s u s p e n d e d i n a s o l u t i o n o f 8 M u r e a , 20 mM 2 - M E a n d 1 mM E D T A pH 8 . 5 a n d d e g a s s e d u n d e r v a c u u m . T h e d e g a s s e d s o l u t i o n w a s t h e n e q u i l i b r a t e d w i t h ]$ g a s f o r 4 h a t 2 5 ° C . A f t e r 4 h t h e p H w a s d r o p p e d t o 3 . 5 i n o r d e r t o s t a b i l i z e f r e e t h i o l g r o u p s a n d d i a l y s e d a g a i n s t t h r e e c h a n g e s o f a n a e r o b i c 0 . 0 1 M a c e t a t e b u f f e r + 1 mM E D T A t o r e m o v e a l l t r a c e s o f 2 - M E . One g r a m o f t h i o p r o p y l s e p h a r o s e 4 B ( P h a r m a c i a ) w a s s w o l l e n i n P B S b u f f e r pH 7 .2 f o r 1 5 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e . F o l l o w i n g v a c u u m f i l t r a t i o n t h e s w o l l e n g e l w a s w a s h e d a n d r e s u s p e n d e d i n 0 . 1 M T r i s b u f f e r p H 8 . 5 + 8 M u r e a a n d 1 mM E D T A . T h e s o l u t i o n w a s t h o r o u g h l y d e g a s s e d a n d e q u i l i b r a t e d w i t h N g a s f o r 3 0 m i n u t e s . R e d u c e d , i r o n - f r e e f e r r e d o x i n i n a s m a l l v o l u m e o f a c e t a t e b u f f e r w a s t h e n a d d e d t o t h e g e l a n d s t i r r e d a t r o o m t e m p e r a t u r e u n d e r N g a s f o r 4 h . T h e b e a d s w e r e t h e n w a s h e d a n d u s e d f o r i m m u n o a d s o r p t i o n . A s c i t e s f l u i d s w e r e r u n t h r o u g h F d - s e p h a r o s e b e a d s p a c k e d i n t o a 19 v e r t i c a l g l a s s c o l u m n . U n b o u n d m a t e r i a l w a s w a s h e d t h r o u g h t h e c o l u m n w i t h P B S b u f f e r p H 7 . 2 u n t i l t h e a b s o r b a n c e a t 2 8 0 nm o f t h e e f f l u e n t f e l l b e l o w 0 . 0 5 / m l . B o u n d m a t e r i a l w a s e l u t e d i n 0 . 1 M g l y c i n e b u f f e r p H 2 . 3 . F r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d a n d n e u t r a l i z e d w i t h 1 M T r i s s o l u t i o n pH 8 . 6 . E l u t i o n w a s c o n t i n u e d u n t i l 12 c o l u m n v o l u m e s h a d b e e n w a s h e d t h r o u g h t h e c o l u m n . T h e i m m u n o a d s o r b e n t w a s t h e n p u r g e d w i t h 8 M u r e a a n d w a s h e d t h o r o u g h l y w i t h P B S . B e t w e e n a d s o r p t i o n s , t h e g e l w a s s t o r e d i n P B S + 0 . 0 2 % a z i d e a t 4 ° C . b ) D E A E i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y A n t i b o d y i n a s c i t e s f l u i d w a s p r e c i p i t a t e d b y a d d i t i o n o f ( N H ^ ^ S O ^ t o 45% b y w e i g h t . P r e c i p i t a t e d p r o t e i n w a s d i a l y s e d a g a i n s t t h r e e c h a n g e s o f 0 . 0 0 5 M p h o s p h a t e b u f f e r pH 8 . 6 . D i a l y s e d p r o t e i n w a s t h e n a p p l i e d t o DE 52 ( W h a t m a n ) w h i c h h a d b e e n p r e v i o u s l y e q u i l i b r a t e d w i t h t h e same b u f f e r . A f t e r e x t e n s i v e w a s h i n g i n s t a r t i n g b u f f e r b o u n d m a t e r i a l w a s e l u t e d i n a 2 s t e p b u f f e r g r a d i e n t o f 0 . 0 0 5 / 0 . 1 6 M p h o s p h a t e pH 8 . 6 or., b y e l u t i o n i n a c o n t i n u o u s g r a d i e n t o f . 0 0 5 - . 1 6 M P O ^ b u f f e r pH 8 . 6 . c ) P r o t e i n A s e p h a r o s e c h r o m a t o g r a p h y A s c i t e s f l u i d w a s d i l u t e d 1 : 4 w i t h 0 . 0 5 M T r i s pH 8 . 6 a n d r u n t h r o u g h a c o l u m n o f p r o t e i n - A s e p h a r o s e ( P h a r m a c i a ) . U n b o u n d p r o t e i n w a s w a s h e d t h r o u g h i n s e v e r a l c o l u m n v o l u m e s o f s t a r t i n g b u f f e r . B o u n d i m m u n o -g l o b u l i n s w e r e e l u t e d u s i n g a 3 s t a g e pH g r a d i e n t . T h e f i r s t b u f f e r c o n -s i s t e d o f . 0 5 M p h o s p h a t e p H 7 . 0 + 0 . 1 5 M N a C l f o l l o w e d b y a s e c o n d b u f f e r o f 0 . 0 5 M c i t r a t e pH 5 . 5 + 1 . 5 M N a C l a n d t h e n a t h i r d b u f f e r o f 0 . 0 5 M a c e t a t e p H 4 . 3 + 0 . 1 5 M N a C l . C o l l e c t e d f r a c t i o n s w e r e n e u t r a l i z e d w i t h 1 M T r i s s o l u t i o n pH 8 . 6 . 20 V I I I . I m m u n o p r e c i p i t a t i o n : P r e c i p i t i n a n a l y s i s o f i m m u n o g l o b u l i n s u b c l a s s e s s e c r e t e d b y t h e 6 - 9 0 . 4 h y b r i d c e l l l i n e w a s p e r f o r m e d a c c o r d i n g t o c o n v e n t i o n a l O u c h t e r l o n y t e c h n i q u e ( 3 5 ) . S u b c l a s s - s p e c i f i c a n t i s e r a t o m o u s e i m m u n o g l o b u l i n s w e r e p u r c h a s e d f r o m M e l o y L a b o r a t o r i e s . T h r e e mm t h i c k l a y e r s o f 1% a g a r o s e i n P B S w e r e c a s t o n t o t h e h y d r o p h i l i c s u r f a c e o f G e l b o n d f i l m ( M a r i n e C o l l o i d s ) . H e x a g o n a l w e l l p a t t e r n s w e r e c u t i n t o t h i s l a y e r l e a v i n g a w e l l s p a c i n g o f 5 mm. D i l u t i o n o f t h e s u b c l a s s s p e c i f i c a n t i s e r a i n P B S w e r e p l a c e d i n t o t h e o u t s i d e w e l l s i n v o l u m e s o f 25 u l . T h e c e n t r a l w e l l w a s f i l l e d w i t h p u r i f i e d m o n o c l o n a l a n t i b o d y a n d p l a t e s i n c u b a t e d i n a h u m i d i f i e d c h a m b e r a t 4 ° C f o r 48 h . D e v e l o p e d p l a t e s w e r e t h e n r i n s e d a g a i n s t t w o c h a n g e s o f s a l i n e o v e r n i g h t a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d a i r d r i e d . D r i e d p l a t e s w e r e s t a i n e d w i t h a n a m i d o b l a c k s o l u t i o n . I V . P o l y a c r y l a m i d e G e l I s o e l e c t r i c F o c u s s i n g : I s o e l e c t r i c f o c u s s i n g w a s p e r f o r m e d i n a f l a t b e d a p p a r a t u s a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ' s i n s t r u c t i o n s ( 3 6 ) . A c r y l a m i d e g e l s w e r e p r e p a r e d u s i n g d i s t i l l e d , d e i o n i z e d w a t e r , 5% a m o p h o l y t e s ( L K B ) pH r a n g e 3 . 5 - 1 0 , 2 M u r e a , a n d 10% g l y c e r o l . S a m p l e s o f p r o t e i n ( 5 0 - 7 5 u g ) w e r e a p p l i e d t o t h e g e l s u r f a c e i n p r e - c a s t w e l l s . F o c u s s i n g w a s p e r f o r m e d u s i n g a 25 W a t t c o n s t a n t p o w e r s e t t i n g f o r 3 h . A f t e r f o c u s s i n g , t h e g e l s w e r e p l a c e d i n t o f i x i n g s o l u t i o n c o n s i s t i n g o f 1 7 . 3 g s u l f o s a l i c y l i c a c i d , + 5 7 . 5 g T C A i n 5 0 0 m l d H ^ O . A f t e r 1 h i n f i x i n g s o l u t i o n , g e l s w e r e t r a n s f e r r e d t o d e s t a i n i n g s o l u t i o n ( 5 0 0 m l e t h a n o l , 1 6 0 m l a c e t i c a c i d , 1 3 4 0 m l d H ^ O ) f o r 3 0 m i n u t e s , t h i s p r o c e d u r e b e i n g r e p e a t e d t o c o m p l e t e l y r e m o v e a m p h o l y t e s . T h e s t a i n i n g s o l u t i o n c o n t a i n e d 0 . 2 5 % c o o m a s s i e b r i l l i a n t b l u e R 2 5 0 d i s s o l v e d i n d e s t a i n s o l u t i o n . G e l s w e r e s t a i n e d f o r 3 0 m i n u t e s a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d t h e n 2 1 placed into destain solution on a rocker platform. Fully destained gels were air-dried onto cellophane sheets held in a specially designed frame. 22 R E S U L T S AND D I S C U S S I O N I. T e c h n i c a l F a c t o r s i n S u c c e s s f u l C e l l F u s i o n I n i t i a l f u s i o n e x p e r i m e n t s w e r e c o n d u c t e d w i t h a h i g h l y i m m u n o g e n i c a n t i -g e n i n o r d e r t h a t n u m e r o u s d e t a i l s o f t h e f u s i o n t e c h n i q u e c o u l d f i r s t b e w o r k e d o u t . T r i a l s w e r e p e r f o r m e d u s i n g B a l b / c m i c e i m m u n i z e d t o s h e e p r e d b l o o d c e l l s a n d t h e N S I m y e l o m a l i n e . S e v e r a l f u s i o n s u s i n g t h i s l i n e y i e l d e d v e r y l o w f r e q u e n c i e s o f h y b r i d i z a t i o n a n d n o s p e c i f i c a n t i b o d y s e c r e t i n g h y b r i d s . A n a l t e r n a t e m y e l o m a , S P 2 w a s t h e n a c q u i r e d f r o m L . H e r z e n b e r g , S t a n f o r d U n i v e r s i t y . T h e f i r s t a t t e m p t a t SRBC, f u s i o n w i t h S P 2 g e n e r a t e d a t o t a l o f 72 h y b r i d s f r o m 2 m i c e . T h e s e r e s u l t s c o m p a r e d w e l l w i t h t h o s e o f o t h e r i n v e s t i g a t o r s a n d a p p e a r e d t o r e p r e s e n t a n o p t i m a l y i e l d f o r t h e s y s t e m , i n d i c a t i n g t h a t t h e r e q u i s i t e p a r a m e t e r s o f s u c c e s s f u l f u s i o n h a d b e e n f u l -f i l l e d . U s i n g a n i d e n t i c a l p r o t o c o l , t h e s p l e e n s o f 2 m i c e w h i c h h a d b e e n i m m u n i z e d w i t h F d w e r e t h e n f u s e d w i t h S P 2 . T h i s f u s i o n p r o d u c e d f i v e h y b r i d s t h a t s e c r e t e d a n t i b o d y t o F d . A c c o r d i n g t o m o s t s t a n d a r d p r o c e d u r e s , p r i m a r y t i s s u e c u l t u r e s o f f u s e d c e l l s a r e a l l o w e d t o r e m a i n i n t h e i r o r i g i n a l c u l t u r e w e l l s f o r a p e r i o d o f 2 - 3 w e e k s w i t h i n t e r m i t t e n t c h a n g e s o f c u l t u r e m e d i u m t o a l l o w c u l t u r e s t o r e a c h a d e n s i t y s u i t a b l e f o r t r a n s f e r t o l a r g e r p l a t e s . A f t e r a p p r o x i m a t e l y 2 w e e k s i n c u l t u r e m o s t h y b r i d s b e g a n t o l o s e a n t i b o d y p r o d u c t i o n d e s p i t e r e g u l a r f e e d i n g . C u l t u r e s a p p e a r e d v i a b l e b u t g r o w t h i n c e l l n u m b e r s h a d s l o w e d n o t i c e a b l y . C l o n i n g o f h y b r i d s a t t h i s s t a g e f a i l e d t o r e s c u e a n t i b o d y s e c r e t i n g h y b r i d s . E x t e n s i v e s c r e e n i n g o f t h e c o n s t i t u e n t s i n c u l t u r e m e d i u m r e v e a l e d n o m e a s u r a b l e d e f i c i e n c i e s . T h e i n i t i a l s t a g e o f s e l e c t i o n i n HAT m e d i u m r e p r e s e n t s a c r i t i c a l p e r i o d i n t h e g r o w t h o f h y b r i d c e l l s . A m i n o p t e r i n , a l t h o u g h s e l e c t i v e f o r DNA s y n -t h e s i s i n t e r m s o f c o n c e n t r a t i o n , d o e s i n t e r f e r e w i t h f o l a t e - d e p e n d e n t b i o -2 3 s y n t h e s i s i n g e n e r a l . G r o w t h r a t e o f c e l l s i n t h e p r e s e n c e o f t h i s i n h i b i t o r i s n o t i c e a b l y s l o w e r e v e n i n m e d i u m c o n t a i n i n g h y p o x a n t h i n e a n d t h y m i d i n e . I n c o m m u n i c a t i o n w i t h o t h e r l a b o r a t o r i e s , i t w a s l e a r n e d t h a t d e c r e a s i n g a n t i -b o d y p r o d u c t i o n i s a g e n e r a l p h e n o m e n o n r e l a t e d t o p r o l o n g e d c u l t u r e o f h y -b r i d s i n t h e o r i g i n a l p l a t e s . L o s s o f a n t i b o d y s e c r e t i o n a p p e a r s t o b e a s u d d e n a n d i r r e v e r s i b l e e v e n t a n d c a n a l s o b e i n d u c e d b y c e r t a i n b a t c h e s o f f e t a l b o v i n e s e r u m . U s i n g c o n v e n t i o n a l s c r e e n i n g s y s t e m s m a n y r e s e a r c h e r s h a v e f o u n d t h a t a n t i b o d y i s n o t d e t e c t a b l e i n c u l t u r e s u p e r n a t e s b e f o r e 2 - 3 w e e k s o f g r o w t h a l t h o u g h a n t i b o d y c o n c e n t r a t i o n s a t t h i s s t a g e m a y b e i n e x c e s s o f 1 U g / m l . T h e E L I S A p o s s e s s e s s e n s i t i v i t y w h i c h h a s b e e n d e m o n -s t r a t e d t o b e o n t h e o r d e r o f 1 - 1 0 U g / m l ( 3 7 ) . U s i n g E L I S A , a n t i b o d y s e c r e t i n g h y b r i d s h a v e b e e n d e t e c t e d a s e a r l y a s f i v e d a y s p o s t - f u s i o n . B y v i s u a l e s t i m a t i o n , t h e s e c r e t e d a n t i b o d y d e t e c t e d t h i s e a r l y w o u l d r e p r e s e n t t h e p r o d u c t o f c o l o n i e s o f h y b r i d s a s s m a l l a s 5 0 - 1 0 0 c e l l s . T h e s e n s i t i v i t y o f t h i s d e t e c t i o n s y s t e m h a s p e r m i t t e d r o u t i n e s c r e e n i n g o f f u s e d c e l l c u l -t u r e s 7 d a y s a f t e r h y b r i d i z a t i o n . D e s p i t e t h e f a c t t h a t c o l o n i e s a t t h i s s t a g e c o n t a i n a v e r y l i m i t e d n u m b e r o f c e l l s , t h e u s e o f a n e f f i c i e n t c l o n i n g t e c h n i q u e p e r m i t s r e c o v e r y o f n e a r l y 100% o f t h e s e h y b r i d s ( 1 8 ) . E a r l y c l o n i n g o f h y b r i d c e l l l i n e s i s , t h e r e f o r e , s t r o n g l y r e c o m m e n d e d . I I . D e r i v a t i o n o f S p e c i f i c H y b r i d s t o F e r r e d o x i n T h e t w o h y b r i d s r e p o r t e d i n t h i s s t u d y w e r e p r o d u c t s o f a f u s i o n e x p e r -i m e n t u s i n g t h e s p l e e n s o f t w o B 1 0 . B R m i c e w h i c h h a d b e e n p r e v i o u s l y i m m u n i z e d w i t h F d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d s s c h e d u l e . T h r e e d a y s p r i o r t o f u s i o n , e a c h a n i m a l r e c e i v e d a d o s e o f 1 0 0 ug o f a l u m p r e c i p i t a t e d F d v i a i n t r a - p e r i t o n e a l i n j e c t i o n . A f t e r f u s i o n a n d p l a t i n g i n HAT s e l e c t i v e m e d i u m , t i s s u e c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d i n a 10% C 0 9 a t m o s p h e r e a n d o b s e r v e d u n d e r a m i c r o s c o p e f o r 2 4 s i g n s o f g r o w t h . B y d a y 5, s m a l l c o l o n i e s o f h y b r i d c e l l s c o u l d b e s e e n g r o w i n g a m i d s t t h e d e b r i s o f d e a d s p l e e n c e l l s . A t d a y 7 , 0 . 1 m l o f c u l t u r e s u p e r n a t e w a s t e s t e d f o r t h e p r e s e n c e o f a n t i - F d a n t i b o d y u s i n g t h e E L I S A . O f t h e o r i -g i n a l 3 8 4 c u l t u r e w e l l s s e e d e d w i t h f u s e d c e l l s u s p e n s i o n , 2 i n d i v i d u a l w e l l s w e r e f o u n d t o b e p o s i t i v e i n t h e E L I S A . T h e s e p r i m a r y h y b r i d s w e r e d e s i g n a t e d 6 - 9 0 a n d 6 - 2 7 3 a c c o r d i n g t o t h e i r l o c a t i o n i n t h e o r i g i n a l w e l l s . T h e c e l l u -l a r c o n t e n t s o f e a c h p o s i t i v e w e l l w e r e t h e n s e p a r a t e l y c l o n e d t h e s a m e d a y b y l i m i t i n g d i l u t i o n i n n o n - s e l e c t i v e m e d i u m c o n t a i n i n g a f e e d e r l a y e r o f t h y m o -c y t e s . B e c a u s e t h e s e c e l l s h a v e b e e n g r o w n i n t h e p r e s e n c e o f a m i n o p t e r i n , c l o n i n g m e d i u m a l w a y s c o n t a i n s h y p o x a n t h i n e a n d t h y m i d i n e w i t h o u t w h i c h h y b r i d c e l l s w o u l d d i e . F o l l o w i n g s e v e n d a y s i n c u b a t i o n , c u l t u r e s u p e r n a t e s f r o m e a c h p l a t e w e r e a s s a y e d f o r a n t i b o d y . E L I S A r e v e a l e d l a r g e n u m b e r s o f w e l l s w i t h a n t i - F d a c t i v i t y ( F i g u r e 3 ) . F o r e a c h o f t h e t w o h y b r i d s i s o l a t e d , t h e c e l l s w e r e t a k e n t h r o u g h f o u r s u c c e s s i v e c y c l e s o f c l o n i n g t o e n s u r e t h a t c u l t u r e s w e r e t r u l y m o n o c l o n a l . C l o n e s i s o l a t e d f r o m t h e f o u r t h c y c l e w e r e e x p a n d e d i n s t e p s u p t o 2 0 m l t i s s u e c u l t u r e f l a s k s a t a s t a r t i n g d e n s i t y o f 4 5 5 x 1 0 c e l l s / m l . U p o n r e a c h i n g a d e n s i t y o f 5 x 1 0 c e l l s / m l 2 0 m l c u l t u r e s y i e l d e d s u f f i c i e n t q u a n t i t i e s o f h y b r i d c e l l s f o r f r e e z i n g i n c r y o p r o t e c t i v e m e d i u m a n d i n j e c t i o n i n t o p r i s t a n e c o n d i t i o n e d B 1 0 . B R x B a l b / C F ^ m i c e f o r g r o w t h a s a s c i t e s . A s a m p l e p h o t o g r a p h o f t h e E L I S A r e s u l t s f o r t h i s c l o n i n g p r o c e d u r e i s p r e s e n t e d i n f i g u r e 3 . A s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s , d i s t r i b u t i o n o f c e l l s i n m i c r o t i t r e p l a t e w e l l s o v e r a 1 0 - f o l d r a n g e o f d e n s i t i e s r e s u l t s i n a l i m i t i n g d i l u t i o n w h e r e t h e d i s t r i b u t i o n o f s i n g l e c e l l s s h o u l d b e g o v e r n e d b y t h e P o i s s o n e q u a t i o n . A l t h o u g h h y b r i d c e l l s a r e n o t s u b j e c t t o c l u m p i n g , t h e a c t u a l d i s t r i b u t i o n c a n b e a f f e c t e d b y v a r i a b i l i t y i n t h e s u r v i v a l o f c l o n e d c e l l s . C l o n i n g e f f i c i e n c y m a y b e r e d u c e d i f t h e v i a b i l i t y 25 F i g u r e 3 : E L I S A o f c l o n e d h y b r i d c e l l c u l t u r e 6 - 9 0 . 4 . 26 o f t h e i n p u t c e l l s i s l o w . T h i s i s l a r g e l y d e t e r m i n e d b y t i s s u e c u l t u r e c o n d i t i o n s a t t h e t i m e o f c l o n i n g a n d a p p e a r s t o b e r e l a t e d t o c e l l d e n s i t y a s d e s c r i b e d a b o v e . S i m i l a r l y , t h e c l o n i n g m e d i u m u s e d m a y n o t s u p p o r t 100% g r o w t h o f t h e h y b r i d s d u e t o a n u t r i t i o n a l d e f i c i e n c y o r t o t h e p r e s e n c e o f i n h i b i t o r y f a c t o r s . I n g e n e r a l , t h i s a s p e c t o f i s o l a t i n g h y b r i d c e l l s c a n b e c o n t r o l l e d b y u s i n g o n l y s c r e e n e d b a t c h e s o f f e t a l b o v i n e s e r u m a n d f r e s h l y p r e p a r e d m e d i u m ( 1 - 2 w e e k s ) . I n p r a c t i s e , t h i s c l o n i n g p r o t o c o l r e s u l t s i n c o n s i s t e n t s u r v i v a l , a n d b y p l a t i n g c e l l s a t d i f f e r e n t d e n s i t i e s , a s u f f i c i e n t m a r g i n o f s a f e t y i s a l l o w e d f o r a n y f l u c t u a t i o n s w h i c h m i g h t o c c u r . M i c r o -s c o p i c o b s e r v a t i o n o f i n d i v i d u a l w e l l s s h o w s t h a t s i n g l e h y b r i d c e l l s , w h i c h a r e e a s i l y d i s t i n g u i s h e d f r o m t h y m o c y t e s , p r o l i f e r a t e a n d g i v e r i s e t o c o l -o n i a l g r o w t h w h i c h i s v i s i b l e a s i n d i v i d u a l f o c i o f g r o w t h . P r o v i d e d t h e s e c e l l s a r e n o t r e s u s p e n d e d b y f e e d i n g t h e g r o w t h o f i n d i v i d u a l c o l o n i e s c a n b e m o n i t o r e d . M o n o c l o n a l g r o w t h i s d e t e r m i n e d i n t h i s s y s t e m b y c o r r e l a t i n g t h e g r o w t h o f s e p a r a t e h y b r i d c e l l c o l o n i e s w i t h a n t i b o d y a c t i v i t y a s d e t e r -m i n e d b y E L I S A . S i n g l e c e l l c o l o n i e s s h o w i n g h i g h e r l e v e l s o f a n t i b o d y a c t i v i t y a r e t h e n r e c l o n e d t o e n s u r e t h a t t h e c e l l l i n e i s c l o n a l l y d e r i v e d . F o r a p u r e c l o n e t h i s c o r r e l a t i o n s h o u l d b e n e a r 1 0 0 % . O c c a s i o n a l l y , t h i s m a y b e s e e n t o d e c l i n e d u e t o t h e e m e r g e n c e o f n o n - p r o d u c i n g v a r i a n t s o f t h e h y b r i d c e l l l i n e . I n a t t e m p t i n g t o r e a c h a s t a b l e k a r y o t y p e n u m b e r , h y b r i d c e l l s u n d e r g o a p r o c e s s o f s e g r e g a t i o n i n w h i c h c h r o m o s o m e s a r e r a n d o m l y l o s t . I n t h e e v e n t a n e s s e n t i a l c h r o m o s o m e i s l o s t , a n t i b o d y s e c r e t i o n m a y b e l o s t . I n c u l t u r e s w h e r e t h i s h a s o c c u r r e d t h e n o n - s e c r e t i n g h y b r i d c e l l s d i v i d e a t a f a s t e r r a t e a n d v e r y r a p i d l y o v e r t a k e t h e g r o w t h o f s e c r e t i n g h y b r i d s . B e c a u s e o f t h i s i n s t a b i l i t y some f o r m o f q u a l i t y c o n t r o l p r o c e d u r e c o u p l e d w i t h p e r i o d i c r e - c l o n i n g o f h y b r i d c e l l l i n e s i s e s s e n t i a l . 27 I I I . C h a r a c t e r i z a t i o n a n d P u r i f i c a t i o n o f M o n o c l o n a l A n t i b o d y t o F e r r e d o x i n a ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f m o n o c l o n a l a n t i b o d y b y E L I S A i ) A n t i g e n b i n d i n g s p e c i f i c i t y o f m o n o c l o n a l a n t i b o d y T h e a n t i g e n b i n d i n g s p e c i f i c i t y o f t h e 6 - 9 0 a s c i t e s a n t i b o d y w a s a s s e s s e d b y a s t a n d a r d h a p t e n i n h i b i t i o n p r o c e d u r e . D i l u t i o n s o f a n t i -F d a n t i s e r a r a i s e d i n B I O . B R m i c e a n d a s c i t e s f l u i d f r o m m i c e c a r r y i n g t h e 6 - 9 0 . 4 h y b r i d o m a w e r e c h o s e n s u c h t h a t t h e a m o u n t o f a n t i b o d y w o u l d b e o n t h e s a t u r a t i o n p o i n t f o r t h e E L I S A . M a x i m a l b i n d i n g o f s e r u m a n d m o n o c l o n a l a n t i b o d y o c c u r r e d a t d i l u t i o n s o f 1 / 2 5 0 a n d 1 / 1 0 , 0 0 0 , r e s p e c t i v e l y . T h e s e d i l u t i o n s w e r e c h o s e n t h e n , a s t i t r a t i o n l e v e l s a g a i n s t w h i c h m a x i m a l s e n s i t i v i t y b y i n h i b i t i o n i n E L I S A c o u l d b e m e a s u r e d . O p t i m a l d i l u t i o n s o f a n t i - F d s e r u m a n d a s c i t e s f l u i d w e r e t h e n i n c u b a t e d o v e r n i g h t w i t h c o n c e n t r a t i o n s o f F d r a n g i n g f r o m 0 t o 4 u g / m l . I n t h e s e c o n d s t a g e , a n t i b o d y w h i c h w a s n o t b l o c k e d b y p r e -i n c u b a t i o n w i t h F d w a s m e a s u r e d b y E L I S A . F i g u r e 4 i l l u s t r a t e s t h e b l o c k i n g e f f e c t o f i n c r e a s i n g s o l u b l e F d c o n c e n t r a t i o n o n t h e s u b s e q u e n t t i t r a t i o n o f u n b o u n d a n t i b o d y i n t h e s e c o n d s t a g e . P r i o r i n c u b a t i o n o f e i t h e r s e r u m o r a s c i t e s f l u i d w i t h 1 - 2 u g / m l o f F d s a t u r a t e s t h e a n t i -b o d y p r e s e n t , d e f i n i n g a c u r v e w h i c h r e p r e s e n t s 100% i n h i b i t i o n . T h e c o i n c i d e n c e b e t w e e n t h e s e t i t r a t i o n s i s s t r o n g e v i d e n c e t h a t b o t h s e r u m . . .and a s c i t e s a n t i b o d i e s s h a r e s p e c i f i c i t y f o r t h e s a m e a n t i g e n . b ) P u r i f i c a t i o n o f m o n o c l o n a l a n t i b o d y T h r e e a p p r o a c h e s w e r e e v a l u a t e d i n a t t e m p t i n g t o p u r i f y a n t i - F d a n t i b o d y f r o m a s c i t e s f l u i d . i ) I m m u n o a d s o r p t i o n A n i m m u n o a d s o r b e n t o f F d i m m o b i l i z e d t o a s o l i d s u p p o r t , t h i o -p r o p y l s e p h a r o s e 4 B , w a s p r e p a r e d a s d e s c r i b e d i n M a t e r i a l s a n d M e t h o d s . T h e a d s o r p t i v e c a p a c i t y o f t h i s c o l u m n w a s e s t i m a t e d u s i n g s e r u m a n t i -28 .49 Fd/ml (a) F i g u r e 4 : I n h i b i t i o n c u r v e o f m o n o c l o n a l a n t i b o d y b y f e r r e d o x i n . O p t i m a l d i l u t i o n s o f m o u s e a n t i s e r u m o r a s c i t e s f l u i d f r o m m i c e c a r r y i n g t h e 6 - 9 0 . 4 h y b r i d o m a w e r e i n c u b a t e d o v e r n i g h t w i t h v a r y i n g c o n c e n t r a t i o n s o f f e r r e d o x i n . I n t h e s e c o n d s t a g e , a n t i b o d y w h i c h w a s n o t b l o c k e d w a s d e t e c t e d w i t h a r a b b i t a n t i - m o u s e I g a l k a l i n e p h o s p h a t a s e l a b e l l e d e n z y m e c o n j u g a t e i n a s o l i d p h a s e E L I S A u s i n g f e r r e d o x i n a s t h e c o a t i n g a n t i g e n . T h e r e a c t i v i t y e x p r e s s e d o n t h e a b s c i s s a r e p r e s e n t s t h e v a l u e o f t e s t s a m p l e s n o r m a l i z e d t o t h e a c t i v i t y o f a n t i b o d y c o n t r o l s i n c u b a t e d o v e r n i g h t i n t h e a b s e n c e o f a n t i g e n . E r r o r b a r s i n d i c a t e s t a n d a r d d e v i a t i o n s b e t w e e n t e s t s a m p l e s r u n i n t r i p l i c a t e . O B I O . B R a n t i - F d s e r u m 1 / 2 5 0 • 6 - 9 0 . 4 a s c i t e s 1 / 1 0 , 0 0 0 29 b o d y f r o m F d - i m m u n e B I O . B R m i c e . F e r r e d o x i n c o u p l e d b e a d s w e r e p a c k e d i n t o a 0 . 7 x 4 . 0 cm g l a s s c h r o m a t o g r a p h y c o l u m n ( B i o - R a d E c o n o - c o l u m n ) t o a h e i g h t o f 1 . 5 c m . O n e - h a l f m l o f F d - i m m u n e m o u s e a n t i s e r u m w a s t h e n p a s s e d t h r o u g h t h e c o l u m n . T h e r e s u l t s o f t h i s a d s o r p t i o n a r e p r e s e n t e d i n f i g u r e 5 . A f t e r - a d s o r p t i o n t h r o u g h t h e c o l u m n m o u s e a n t i -s e r u m c o n t a i n s s m a l l a m o u n t s o f a n t i - F d a c t i v i t y d e t e c t a b l e b y E L I S A , i n d i c a t i n g t h a t t h e a d s o r b e n t i s s a t u r a t e d w i t h s p e c i f i c a n t i b o d y u n d e r t h e s e c o n d i t i o n s . F o l l o w i n g e l u t i o n i n pH 2 . 3 b u f f e r t h e a n t i b o d y a c t i v i t y p e a k w a s f o u n d t o c o i n c i d e w i t h t h e p r o t e i n p e a k d e t e c t e d a t 2 8 0 nm b y s p e c t r o p h o t o m e t r y . U s i n g a c o n v e r s i o n o f &2Q0 nm ^ = f o r m o u s e i m m u n o g l o b u l i n t h e c o m b i n e d f r a c t i o n s ( 1 2 - 1 4 ) y i e l d e d a t o t a l o f a p p r o x i m a t e l y 3 4 0 y g p r o t e i n . I n r e p e a t e d a d s o r p t i o n u s i n g t h e s a m e c o l u m n t h i s c a p a c i t y h a s b e e n c o n s i s t e n t l y o b s e r v e d ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e s a m e p r o c e d u r e w a s t h e n u s e d t o a d s o r b a n t i b o d y f r o m t h e a s c i t e s f l u i d o f m i c e c a r r y i n g t h e 6 - 9 0 . 4 h y b r i d o m a . One m l o f a s c i t e s f l u i d w a s p a s s e d t h r o u g h t h e c o l u m n w h i c h w a s t h e n w a s h e d t o r e m o v e u n b o u n d p r o t e i n a n d e l u t e d w i t h pH 2 . 3 b u f f e r . A n e l u t i o n p r o f i l e o f t h i s a d s o r p t i o n i s p r e s e n t e d i n f i g u r e 6 . W h e r e a s t h e p r o t e i n e l u t e s i n c h a r a c t e r i s t i c f a s h i o n , E L I S A a c t i v i t y d o e s n o t e l u t e w i t h a n y s p e c i f i c f r a c t i o n . One e x p l a n a t i o n f o r t h i s d i s c r e p a n c y may r e l a t e t o t h e d i f f e r i n g s e n s i t i v i t i e s o f t h e t w o a s s a y s u s e d . A b s o r p t i o n s p e c t r o p h o t o m e t r y f o r p r o t e i n a t 2 8 0 nm i s n o t c o n s i d e r e d r e l i a b l e o u t s i d e t h e r a n g e o f 0 . 0 5 - 0 . 7 0 . D . o o . / m l . F o r m o u s e i m m u n o g l o b u l i n ZoU t h i s r e p r e s e n t s a l o w e r c o n c e n t r a t i o n l i m i t o f a p p r o x i m a t e l y 4 0 ug/ml. T h e s e n s i t i v i t y o f E L I S A h a s b e e n c a l i b r a t e d t o b e w i t h i n a r a n g e o f 0 . 0 1 - 1 0 U g / m l o f ; a n t i b o d y ( 3 7 ) . T h e d e g r e e o f o v e r l a p b e t w e e n t h e t w o a s s a y s i s t h e r e f o r e v e r y s m a l l . I n o r d e r t o o b t a i n a q u a n t i t a t i v e 30 F i g u r e 5 : A d s o r p t i o n o f o s e r u m a n t i b o d y t o F d - s e p h a r o s e . A 2 8 0 nm A 4 0 5 nm 31 Elution volume (ml) *• ! F i g u r e 6 : A d s o r p t i o n o f a s c i t e s a n t i b o d y t o F d s e p h a r o s e . • A 2 8 0 nm O A 4 0 5 nm 32 I " i | 1 < ' i i I 1 T 0 1 2 3 4 5 Log dilution ». F i g u r e 7: T i t r a t i o n o f i m m u n o a d s o r b e d a s c i t e s b y E L I S A . A n t i b o d y a c t i v i t y i n a s c i t e s f l u i d a s w e l l a s t h e m a t e r i a l e l u t e d f r o m F d s e p h a r o s e w e r e t i t r a t e d b y l i m i t i n g d i l u t i o n i n E L I S A i n o r d e r t o d e t e r m i n e r e l a t i v e a n t i b o d y a c t i v i t y i n e a c h f r a c t i o n . A 6-90.4 a s c i t e s u n a d s o r b e d A 6-90.4 a s c i t e s a f t e r a d s o r p t i o n O 6-90.4 a s c i t e s e l u t e d f r o m F d - s e p h a r o s e 33 c o m p a r i s o n o f t h e t w o a s s a y s , f r a c t i o n s o f a s c i t e s a n t i b o d y p r e p a r e d b y i m m u n o a d s o r p t i o n w e r e a n a l y s e d b y l i m i t i n g d i l u t i o n i n E L I S A . T h e r e s u l t s a r e p r e s e n t e d i n f i g u r e 7 . T h e E L I S A t i t r a t i o n o f a s c i t e s f l u i d b e f o r e a n d a f t e r a d s o r p t i o n o n F d - s e p h a r o s e s h o w s t h a t w h i l e F d a n t i b o d y c a n b e p u r i f i e d t o a h i g h t i t r e , t h e c a p a c i t y o f t h e c o l u m n r e l a t i v e t o t h e t o t a l a m o u n t o f a n t i b o d y p r e s e n t i n a s c i t e s f l u i d i s v e r y l o w ; h e n c e , t h e t e c h n i q u e i s u n s u i t a b l e a s a m e a n s f o r p r e p a r a t i v e i s o l a t i o n o f m o n o c l o n a l a n t i b o d y . B y i s o e l e c t r i c f o c u s s i n g ( f i g u r e 1 2 ) t h e e l u t e d s a m p l e s h o w s m a j o r b a n d s i n t h e a n t i b o d y r e g i o n o f t h e s p e c t r u m a s w e l l a s m i n o r b a n d s i d e n t i f i a b l e i n o t h e r a r e a s o f t h e pH g r a d i e n t . T h e s e e x t r a b a n d s m o s t l i k e l y c o - p u r i f y w i t h a n t i b o d y a s a r e s u l t o f i o n i c i n t e r a c t i o n s b e t w e e n n o n - s p e c i f i c s a m p l e p r o t e i n s a n d c h a r g e d g r o u p s p r e s e n t i n t h e s e p h a r o s e m a t r i x . i i ) . .DEAE i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y D E A E c e l l u l o s e ( D E 5 2 W h a t m a n ) w a s e q u i l i b r a t e d i n 0 . 0 0 5 M p h o s p h a t e b u f f e r pH 8 . 6 , .and p o u r e d i n t o a 1 . 5 x 5 cm g l a s s c h r o m a t o -g r a p h y c o l u m n ( B i o - R a d E c o n o - c o l u m n ) t o a h e i g h t o f 2 . 5 c m . T h e c o l u m n w a s t h e n l o a d e d w i t h 5 mg o f ( N H ^ ^ S O ^ p r e c i p i t a t e d a s c i t e s f l u i d ( 6 . 9 0 . 4 ) w h i c h h a d b e e n d i a l y s e d a g a i n s t 4 c h a n g e s o f s t a r t i n g b u f f e r . D u r i n g w a s h i n g n o p r o t e i n w a s d e t e c t e d i n t h e v o i d v o l u m e i n d i c a t i n g t h a t 100% o f t h e s a m p l e h a d b o u n d t o t h e c o l u m n . B o u n d p r o t e i n w a s e l u t e d i n 0 . 1 6 M p h o s p h a t e b u f f e r pH 8 . 6 a n d t h e r e s u l t s a r e p r e s e n t e d i n f i g u r e 8 . O f t h e 5 mg t o t a l p r o t e i n l o a d e d o n t o t h e c o l u m n , 4 . 7 5 mg w e r e r e c o v e r e d b y e l u t i o n : a y i e l d o f 9 5 % . B y i s o e l e c t r i c f o c u s s i n g ( f i g u r e 1 2 ) t h e s a m p l e i s v e r y h e t e r o g e n e o u s , a n d i n c o m p a r i s o n w i t h s t r a i g h t a s c i t e s f l u i d t h e p r o t e i n e l u t e d f r o m D E A E s h o w s a h i g h l e v e l o f c o n t a m i n a t i o n b y o t h e r p r o t e i n s . 34 Elution volume i Figure 8: DEAE ion exchange chromatography of a s c i t e s antibody. (NH^^SO^ p r e c i p i t a t e d a s c i t e s f l u i d was adsorbed to DEAE c e l l u l o s e and eluted i n a 0.16 M phosphate b u f f e r pH 8.6. i • A280 nm O A405 nm 35 I n a s e c o n d e x p e r i m e n t , 5 . 0 mg o f ( N H ^ ^ S O ^ p r e c i p i t a t e d a s c i t e s f l u i d w a s l o a d e d o n t o D E A E a s a b o v e , a n d e l u t e d i n a c o n t i n u o u s g r a d i e n t o f 0 . 0 0 5 - 0 . 1 6 M p h o s p h a t e b u f f e r p H 8 . 6 , 1 6 0 m l g r a d i e n t v o l u m e . I n f i g u r e 9 , g r a d i e n t e l u t i o n o f t h i s s a m p l e a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f D i s s a n a y a k e a n d H a y ( 3 8 ) f a i l e d t o r e s o l v e a n t i - F d a c t i v i t y f r o m n o r m a l m o u s e i m m u n o g l o b u l i n s . T o t a l p r o t e i n r e c o v e r y i n f r a c t i o n s 1 - 1 0 0 w a s 2 . 5 m g : a y i e l d o f 5 0 % . c ) P r o t e i n A - s e p h a r o s e c h r o m a t o g r a p h y A s c i t e s f l u i d ( 6 - 9 0 . 4 ) w a s c h r o m a t o g r a p h e d o n p r o t e i n A - s e p h a r o s e a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f E y a n d c o w o r k e r s ( 3 8 ) . P r o t e i n A - s e p h a r o s e 4 B ( P h a r m a c i a ) w a s p a c k e d i n t o a g l a s s c h r o m a t o g r a p h y c o l u m n 0 . 7 x 4 cm ( B i o - R a d E c o n o - c o l u m n ) t o a h e i g h t o f 2 . 5 c m . One m l o f a s c i t e s f l u i d w a s w a s h e d i n t o t h e c o l u m n i n 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r pH 8 . 6 . A f t e r w a s h i n g w i t h s e v e r a l v o l u m e s o f s t a r t i n g b u f f e r , t h e c o l u m n w a s e l u t e d w i t h b u f f e r s o f d e c r e a s i n g p H . T h i s e l u t i o n p r o f i l e i s p r e s e n t e d i n f i g u r e 1 0 . T h e m a j o r p r o t e i n s a m p l e e l u t i n g i n pH 4 . 3 b u f f e r r e p r e s e n t s a t o t a l o f 8 4 4 u g p r o t e i n . I n t i t r a t i o n b y E L I S A ( f i g u r e 1 1 ) t h i s m a t e r i a l p r o v e d t o b e a c t i v e o u t t o a d i l u t i o n o f 1 / 1 0 , 0 0 0 . B y i s o e l e c t r i c f o c u s s i n g ( f i g u r e 1 2 ) , t h i s s a m p l e s h o w s t h e l i m i t e d h e t e r o g e n e i t y c h a r a c t e r i s t i c o f a m o n o c l o n a l p r o d u c t ( 3 9 ) . W h e n t e s t e d a g a i n s t a n t i s e r u m s p e c i f i c f o r m o u s e i m m u n o g l o b u l i n s u b c l a s s e s b y i m m u n o d i f f u s i o n t h i s a n t i b o d y i s s t r o n g l y p r e c i p i t a t e d b y a n t i s e r u m t o t h e I g G , s u b c l a s s . Figure 9: .Gradient e l u t i o n of a s c i t e s antibody from DEAE. (NH.) SO^ pr e c i p i t a t e d a s c i t e s f l u i d was loaded onto DEAE c e l l u l o s e and recovered by e l u t i o n i n a buffer gradient of .005 - .16 M phosphate pH 8.6. A A280 nm A A405 nm 37 pH 7.0 --O--0-pH4.5 Figure 10: Elution of ascites antibody from protein-A sepharose. 0 1 2 3 4 5 Log di lut ion • Figure 11: T i t r a t i o n of antibody eluted from protein-A sepharose by ELISA. • 6-90.4 as c i t e s unadsorbed 6-90.4 as c i t e s eluted from protein A O , sepharose A non-immune serum c o n t r o l 39 Figure 12: I s o e l e c t r i c f o c u s s i n g of a s c i t e s f l u i d and i s o l a t e d f r a c t i o n s . (a) 7S mouse Ig (Miles L aboratories) (b) IgG^ myeloma p r o t e i n ( B i o n e t i c s ) (c) 6-273.4 a s c i t e s f l u i d (d) 6-90.4 a s c i t e s f l u i d (e) 6-90.4 a s c i t e s eluted from p r o t e i n A pH 4.3 (f) 6-90.4 a s c i t e s eluted from Fd sepharose (g) 6-90.4 a s c i t e s eluted from DEAE (g) 6-90.4 a s c i t e s f l u i d (NH^SO^ p r e c i p i t a t e 40 (b) (C) (a) <d) Figure 13: Ouchterlony analysis of material eluted from protein-A sepharose. 4 o o o " o 2 o 1 Outer Wells: 1) Anti-IgM A n t i - I g G 2 a 2) 3) 4) 5) Anti-IgG Rabbit anti-mouse Ig Goat anti-mouse Ig Central w e l l s : a) 7S mouse Ig c) ^gGof standard d) 6-90.4 a s c i t e s eluted from protein-A sepharose 4 1 C O N C L U D I N G R E M A R K S T h r o u g h t h e m a n i p u l a t i o n o f e u k a r y o t i c c e l l f u s i o n , C o t t o n a n d M i l s t e i n d e m o n s t r a t e d t h a t c e l l s r e s u l t i n g f r o m f u s i o n o f t w o i m m u n o g l o b u l i n s e c r e t i n g c e l l l i n e s c o n t i n u e t o e x p r e s s b o t h t y p e s o f p a r e n t a l c h a i n . T h i s n o v e l e x -p e r i m e n t a l r e s u l t w a s s u b s e q u e n t l y e x t e n d e d t o f u s i o n w i t h c e l l s s e c r e t i n g a n t i b o d y o f d e f i n e d s p e c i f i c i t y . S i n c e t h e s e e a r l y r e p o r t s s e v e r a l t e c h n o -l o g i c a l i m p r o v e m e n t s h a v e g r e a t l y f a c i l i t a t e d t h e d e r i v a t i o n o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . D r u g m a r k e d m y e l o m a c e l l l i n e s a r e n o w a v a i l a b l e w h i c h d o n o t s y n t h e s i z e a n y p a r e n t a l i m m u n o g l o b u l i n c h a i n s . H y b r i d s d e r i v e d f r o m t h e s e n o n - s e c r e t i n g m y e l o m a s , . t h e r e f o r e , s e c r e t e i m m u n o g l o b u l i n w h i c h i s w h o l l y d e r i v e d f r o m t h e s p l e e n c e l l p a r e n t a l i n t h e f u s i o n . T h i s h a s p a r t i c u l a r i m p o r t a n c e w h e r e m o n o c l o n a l a n t i b o d y i s t o b e u s e d a s s t a r t i n g m a t e r i a l f o r r a i s i n g a n t i - i d i o t y p e r e a g e n t s . T i s s u e c u l t u r e p r o c e d u r e s , i n p a r t i c u l a r s e l e c t i v e t e c h n i q u e s u s i n g f e e d e r l a y e r s , h a v e i m p r o v e d t h e s u r v i v a l o f h y b r i d c e l l s a n d , t h e r e f o r e , r e s u l t e d i n i n c r e a s e d e f f i c i e n c y i n i s o l a t i n g h y b r i d s . S e l e c t i o n a n d c l o n i n g o f h y b r i d c e l l l i n e s i n v o l v e s l e n g t h l y t i s s u e c u l t u r e a s w e l l a s e x t e n s i v e s c r e e n i n g f o r a n t i b o d y p r o d u c t i o n . T h e E L I S A u s e d i n t h i s s t u d y h a s p r o v e n t o b e t h e s y s t e m o f c h o i c e f o r m o n i t o r i n g c u l t u r e s . W i t h E L I S A , d e t e c t i o n o f h y b r i d s i s a n u n c o m p l i c a t e d p r o c e s s w h i c h e n a b l e s t h e e x p e r i m e n t e r t o m a k e r a p i d d e c i s i o n s a b o u t s e l e c t i o n a n d r e - c l o n i n g o f c u l t u r e s . A s h a s b e e n d e m o n s t r a t e d p r e v i o u s l y , t h e E L I S A p o s s e s s e s s e n s i t i -v i t y o n t h e o r d e r o f a r a d i o i m m u n e a s s a y (37) a n d i s r e a d i l y a d a p t e d t o l a r g e s c a l e s c r e e n i n g . T h e s e a d v a n t a g e s o v e r o t h e r m e t h o d s h a v e p e r m i t t e d d e t e c t i o n o f h y b r i d c e l l l i n e s a t a v e r y e a r l y s t a g e o f s e l e c t i o n ; a n i m p o r t a n t f a c t o r i n t h e r a p i d i s o l a t i o n o f c l o n e s f r o m t i s s u e c u l t u r e . W i t h t h e a p p r o p r i a t e e x p e r i e n c e , i s o l a t i o n o f h y b r i d c e l l l i n e s c a n b e a s t r a i g h t -42 f o r w a r d p r o c e s s . I n t h i s l a b o r a t o r y , t h e t e c h n i q u e h a s a l s o b e e n s u c c e s s f u l l y a p p l i e d t o t h e i s o l a t i o n o f h y b r i d s s e c r e t i n g a n t i b o d y s p e c i f i c f o r a m u r i n e t u m o u r l i n e L 1 2 1 0 . T h e p r a c t i c a l i m p o r t a n c e o f m o n o c l o n a l a n t i b o d y l i e s i n t h e f a c t t h a t t h e r e s o l v i n g p o w e r o f t h i s a n t i b o d y i s v e r y g r e a t a n d h a s r e p l a c e d o t h e r a n a l y -t i c a l m e t h o d s i n t h e s t u d y o f v e r y c o m p l e x a n t i g e n p r e p a r a t i o n s . I t s n a t i v e s p e c i f i c i t y p e r m i t s a b s o l u t e a s s i g n m e n t s o f a n t i g e n i c d e t e r m i n a n t s t o b e m a d e . F o r t h i s r e a s o n m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a r e c u r r e n t l y b e i n g u s e d t o r e - e v a l u a t e t h e s e r o l o g i c a l c l a s s i f i c a t i o n o f h u m a n t r a n s p l a n t a t i o n a n t i g e n s ( 4 0 ) . I n t h e f e r r e d o x i n s y s t e m , i m m u n o c h e m i c a l ' c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e t w o a n t i - F d h y b r i d s 6 - 9 0 a n d 6 - 2 7 3 s h o w s t h a t b o t h a n t i b o d i e s s h a r e b i n d i n g s p e c i f i c i t y f o r t h e N - t e r m i n a l d e t e r m i n a n t o f t h e m o l e c u l e ( 4 1 ) . B a s e d o n o t h e r s i m i l a r -i t i e s i n i s o e l e c t r i c pH a n d s u b c l a s s i t w o u l d a p p e a r t h a t t h e t w o a n t i b o d i e s a r e i d e n t i c a l . 4 3 L I T E R A T U R E C I T E D 1 . E r l i c h , H . A . , L e v i n s o n , J . R . , C o h e n , S . N . a n d M c D e v i t t , H . D . 1 9 7 9 . F i l t e r a f f i n i t y t r a n s f e r : A n e w t e c h n i q u e f o r t h e i n s i t u i d e n t i f i c -a t i o n o f p r o t e i n s i n g e l s . J . B i o l . C h e m . 2 5 4 : 1 1 2 , 2 4 0 . 2 . R e n a r t , J . , R e i s e r , J . a n d S t a r k , G . R . 1 9 7 9 . T r a n s f e r o f p r o t e i n s f r o m g e l s t o d i a z o b e n z y l o x y m e t h y l - p a p e r a n d d e t e c t i o n w i t h a n t i s e r a : A m e t h o d f o r s t u d y i n g a n t i b o d y s p e c i f i c i t y a n d a n t i g e n s t r u c t u r e . P r o c . N a t . A c a d . S c i . U S A 7 6 : 3 1 1 6 . 3 . S h e n , F . W . , B o y s e , E . A . a n d C a n t o r , H . 1 9 7 5 . P r e p a r a t i o n a n d u s e o f L y a n t i s e r a . I m m u n o g e n e t i c s 2 _ : 5 9 1 . 4 . A l - R a m m a h y , A . a n d L e v y , J . G . 1 9 7 9 . T h e p r e p a r a t i o n o f X e n o a n t i s e r u m s p e c i f i c f o r a m u r i n e m a s t o c y t o m a c e l l l i n e . C a n c e r I m m u n o l o g y a n d I m m u n o t h e r a p y 6_: 1 6 3 . 5 . P o t t e r , M . 1 9 7 2 . I m m u n o g l o b u l i n p r o d u c i n g t u m o u r s a n d m y e l o m a p r o t e i n s o f m i c e . P h y s i o l . R e v . 5 2 : 6 3 1 . 6 . A s k o n a s , B . A . , W i l l i a m s o n , A . R . a n d W r i g h t , B . E . G . 1 9 7 0 . S e l e c t i o n o f a s i n g l e a n t i b o d y - f o r m i n g c e l l c l o n e a n d i t s p r o p a g a t i o n i n s y n g e n e i c m i c e . P r o c . N a t . A c a d . S c i . U S A 6 7 : 1 3 9 8 . 7 . F a h e y , J . L . , B u e l l , D . N . , S o x , H . C . 1 9 7 1 . P r o l i f e r a t i o n a n d d i f f e r e n t -i a t i o n o f l y m p h o i d c e l l s : S t u d i e s w i t h h u m a n l y m p h o i d c e l l l i n e s a n d i m m u n o g l o b u l i n s y n t h e s i s . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 1 9 0 : 2 2 1 . 8 . S t e i n i t z , M . , K l e i n , G . , K o s k i m i e s , S . a n d M a k e l a , 0 . 1 9 7 7 . E p s t e i n - B a r r v i r u s i n d u c e d B l y m p h o c y t e c e l l l i n e s p r o d u c i n g s p e c i f i c a n t i b o d y . N a t u r e 2 6 9 : 4 2 0 . 9 . Z u r a w s k i , V . R . , J r . , S p e d d e n , S . E . , B l a c k , P . H . , a n d H a b e r , E . 1 9 7 8 . F r o m : C u r r e n t T o p i c s i n M i c r o b i o l o g y a n d I m m u n o l o g y . V o l . 8 1 E d . F . M e l c h e r s , M . P o t t e r a n d N . L . W a r n e r . S p r i n g e r - V e r l a g . 1 0 . K o h l e r , G . a n d M i l s t e i n , C . 1 9 7 5 . C o n t i n u o u s c u l t u r e s o f f u s e d c e l l s s e c r e t i n g a n t i b o d y o f p r e d e f i n e d s p e c i f i c i t y . N a t u r e 2 3 0 : 4 9 5 . 1 1 . C o t t o n , R . G . H . a n d M i l s t e i n , C . 1 9 7 3 . F u s i o n o f t w o i m m u n o g l o b u l i n p r o -d u c i n g c e l l l i n e s . N a t u r e 2 4 4 : 4 2 . 1 2 . K o h l e r , G . a n d M i l s t e i n , C . 1 9 7 6 . D e r i v a t i o n o f s p e c i f i c a n t i b o d y -p r o d u c i n g t i s s u e c u l t u r e a n d t u m o u r l i n e s b y c e l l f u s i o n . E u r . J . I m m u n o l . 6 _ : 5 1 1 . 1 3 . C o f f i n o , P . , K n o w l e s , B . , N a t h e n s o n , S . a n d S c h a r f f , M . D . 1 9 7 1 . S u p p r e s s -i o n o f i m m u n o g l o b u l i n s y n t h e s i s b y c e l l u l a r h y b r i d i z a t i o n . N a t u r e New B i o l . 2 3 1 : 8 7 . 44 1 4 . K o h l e r , G . , H o w e , S . C . a n d M i l s t e i n , C . 1 9 7 6 . F u s i o n b e t w e e n i m m u n o -g l o b u l i n - s e c r e t i n g a n d n o n s e c r e t i n g m y e l o m a c e l l l i n e s . E u r . J . I m m u n o l . 6 ^ : 2 9 2 . 1 5 . S h u l m a n , M . , W i l d e , ' C D . a n d K o h l e r , G . 1 9 7 8 . A b e t t e r c e l l l i n e f o r m a k i n g h y b r i d o m a s s e c r e t i n g s p e c i f i c a n t i b o d i e s . N a t u r e 2 7 6 : 2 6 9 . 1 6 . K e a r n e y , J . F . , R a d b r u c h , A . , L i e s e g a n g , B . a n d R a j e w s k y , K . 1 9 7 9 . A n e w m o u s e m y e l o m a c e l l l i n e t h a t h a s l o s t i m m u n o g l o b u l i n e x p r e s s i o n b u t p e r m i t s t h e c o n s t r u c t i o n o f a n t i b o d y - s e c r e t i n g h y b r i d c e l l l i n e s . J . I m m u n o l . 1 2 3 : 1 5 4 8 . 1 7 . L e r n h a r d t , W . , A n d e r s s o n , J . , C o u t i n h o , A . a n d M e l c h e r s , F . 1 9 7 8 . C l o n i n g o f m u r i n e t r a n s f o r m e d c e l l l i n e s i n s u s p e n s i o n c u l t u r e w i t h e f f i c i e n c i e s n e a r 1 0 0 % . E x p . C e l l R e s e a r c h 1 1 1 : 3 0 9 . 1 8 . N o w i n s k i , R . C , L o s t r o m , M . E . , T a m , M . R . , S t o n e , M . R . , a n d B u r n e t t , W . N . 1 9 7 9 . T h e i s o l a t i o n o f h y b r i d c e l l l i n e s p r o d u c i n g m o n o c l o n a l a n t i -b o d i e s a g a i n s t t h e p l 5 ( E ) p r o t e i n o f e c o t r o p i c m u r i n e l e u k e m i a v i r u s e s . V i r o l o g y 9 3 _ : 1 1 1 . 1 9 . C u r r e n t T o p i c s i n M i c r o b i o l o g y a n d I m m u n o l o g y . V o l . 1 8 : L y m p h o c y t e h y b r i d -o m a s . E d . F . M e l c h e r s , M . P o t t e r , N . L . W a r n e r . S p r i n g e r - V e r l a g , New Y o r k . 2 0 . O i , V . T . , J o n e s , P . P . , G o d i n g , J . W . , H e r z e n b e r g , L . A . , a n d H e r z e n b e r g , L . A . P r o p e r t i e s o f m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s t o m o u s e i m m u n o g l o b u l i n a l l o t y p e , H - 2 a n d l a a n t i g e n s . F r o m : C u r r e n t T o p i c s i n M i c r o b i o l o g y a n d I m m u n o l o g y . V o l . 8 1 . 2 1 . T a n a k a , M . , N a k a s h i m a , T . , B e n z o n , A . M . , M o w e r , M . F . a n d Y a s u n o b u , K . T . F r o m : A t l a s o f p r o t e i n s e q u e n c e a n d s t r u c t u r e . V o l . 4 . 1 9 6 9 , M . D a y h o f f . 2 2 . K e l l y , B . a n d L e v y , J . G . 1 9 7 1 . I m m u n o l o g i c a l s t u d i e s o n t h e m a j o r h a p t e n i c p e p t i d e s f r o m p e r f o r m i c a c i d o x i d i z e d f e r r e d o x i n f r o m C l o s t r i d i u m  p a s t e u r i a n u m . B i o c h e m . 1 0 : 3 1 9 . 2 3 . L e v y , J . C , H u l l , D . , K e l l y , B . , K i l b u r n , D . C a n d T e a t h e r , R . M . 1 9 7 2 . T h e c e l l u l a r immune r e s p o n s e t o s y n t h e t i c p e p t i d e s c o n t a i n i n g s e q u e n c e s k n o w n t o b e h a p t e n i c i n p e r f o r m i c a c i d - o x i d i z e d f e r r e d o x i n f r o m C l o s t r i d i u m p a s t e u r i a n u m . C e l l . I m m u n o l . 5_ :87 . 2 4 . N i t z , R . M . , M i t c h e l l , B . , G e r w i n g , J . a n d C h r i s t e n s e n , J . 1 9 6 9 . S t u d i e s o n t h e a n t i g e n i c i t y o f b a c t e r i a l f e r r e d o x i n s . I. T h e e f f e c t o f m o d i -f i c a t i o n o f c y s t e i n y l r e s i d u e s o n t h e a n t i g e n i c i t y o f C l o s t r i d i u m  p a s t e u r i a n u m f e r r e d o x i n . J . I m m u n o l . 1 0 3 : 3 1 9 . 2 5 . S i k o r a , L . K . a n d L e v y , J . C 1 9 8 0 . G e n e t i c c o n t r o l o f t h e immune r e s p o n s e t o f e r r e d o x i n . L i n k a g e a n d m a p p i n g ; o f t h e T - c e l l p r o l i f e r a t i o n a n d a n t i b o d y p r o d u c t i o n g e n e s t o t h e MHC i n m i c e . J . I m m u n o l . I n P r e s s . 45 2 6 . S c h n e i d e r m a n , S . , F a r b e r , J . L . a n d B a s e r g a , R . 1 9 7 9 . A s i m p l e m e t h o d f o r d e c r e a s i n g t h e t o x i c i t y o f p o l y e t h y l e n e g l y c o l i n m a m m a l i a n c e l l h y b r i d i z a t i o n . S o m a t i c C e l l G e n e t i c s 5 _ : 2 6 3 . 2 7 . V o l l e r , A . , B i d w e l l , D . , a n d B a r t l e t t , A . M i c r o p l a t e e n z y m e i m m u n o a s s a y s f o r t h e i m m u n o d i a g n o s i s o f v i r u s i n f e c t i o n s . F r o m : M a n u a l o f C l i n i c a l I m m u n o l o g y , C h . 6 9 . E d . N o e l R . R o s e . A m e r i c a l S o c i e t y f o r M i c r o b i o -l o g y , 1 9 7 6 . H e r m a n F r i e d m a n . 2 8 . G a l f r e , E . , H o w e , S . C . , M i l s t e i n , C . B u t c h e r , G . W . , H o w a r d , J . C . 1 9 7 7 . A n t i b o d i e s t o m a j o r h i s t o c o m p a t i b i l i t y a n t i g e n s p r o d u c e d b y h y b r i d c e l l l i n e s . N a t u r e 2 6 6 : 5 5 0 . 2 9 . O i , V . T . a n d H e r z e n b e r g , L . A . I m m u n o g l o b u l i n p r o d u c i n g h y b r i d c e l l l i n e s . F r o m : S e l e c t e d M e t h o d s i n C e l l u l a r I m m u n o l o g y . E d . B . B . M i s h e l l a n d S . M . S h i i g i . W . H . F r e e m a n , S a n F r a n c i s c o . I n p r e s s . 3 0 . D a v i d s o n , R . L . , a n d G e r a l d , P . S . 1 9 7 6 . I m p r o v e d t e c h n i q u e s f o r t h e i n d u c t i o n o f m a m m a l i a n c e l l h y b r i d i z a t i o n b y p o l y e t h y l e n e g l y c o l . S o m a t i c C e l l G e n e t i c s 2 ^ : 1 6 5 . 3 1 . V a u g h a n , V . L . , H a n s e , D . a n d S t a d l e r , J . 1 9 7 6 . P a r a m e t e r s o f p o l y e t h y l e n e g l y c o l i n d u c e d c e l l f u s i o n a n d h y b r i d i z a t i o n i n l y m p h o i d c e l l l i n e s . S o m a t i c C e l l G e n e t i c 2 _ : 5 3 7 . 3 2 . L i t t l e f i e l d , J . W . 1 9 6 4 . S e l e c t i o n o f h y b r i d s f r o m m a t i n g o f f i b r o b l a s t s i n v i t r o a n d t h e i r p r e s u m e d r e c o m b i n a n t s . S c i e n c e 1 4 5 : 7 0 9 . 3 3 . E n g v a l l , E . a n d P e r l m a n , P . 1 9 7 1 . E n z y m e l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ( E L I S A ) ; q u a n t i t a t i v e a s s a y f o r i m m u n o g l o b u l i n G . I m m u n o c h e m i s t r y 8 _ : 8 7 1 . 3 4 . E g o r o v , T . A . , S v e n s o n , A . , R y d e n , L . a n d C a r l s s o n , J . 1 9 7 5 . A r a p i d a n d s p e c i f i c m e t h o d f o r i s o l a t i o n o f t h i o l - c o n t a i n i n g p e p t i d e s f r o m l a r g e p r o t e i n s b y t h i o l - d i s u l f i d e e x c h a n g e o n a s o l i d s u p p o r t . P r o c . Nat . . . A c a d . S c i . U S A 7 _ 2 : 3 0 2 5 . 3 5 . O u c h t e r l o n y , 0 . a n d N i l s s o n , L . A . 1 9 7 3 . H a n d b o o k o f E x p e r i m e n t a l I m m u n o -l o g y . V o l . 1 , s e c o n d e d . 1 9 7 3 . C h . 1 9 , E d . D . M . W e i r , B l a c k w e l l S c i e n t i f i c P u b l i c a t i o n s . 3 6 . A n a l y t i c a l e l e c t r o f o c u s s i n g i n t h i n l a y e r s o f p o l y a c r y l a m i d e g e l s . . A p p l i c a t i o n n o t e N o . 2 5 0 , D e c e m b e r 1 9 7 7 . P h a r m a c i a . 3 7 . D i s s a n a y a k e , S . a n d H a y , F . C . 1 9 7 5 . I s o l a t i o n o f p u r e n o r m a l I g G ^ f r o m m o u s e s e r u m . I m m u n o c h e m . 1 2 : 1 0 1 . 3 8 . E y , P . L . , P r o w s e , S . J . , a n d J e n k i n , C R . 1 9 7 8 . I s o l a t i o n o f p u r e I g G ^ I g G „ a a n d IgG^ i m m u n o g l o b u l i n s f r o m m o u s e s e r u m u s i n g p r o t e i n - A s e p h a r o s e . I m m u n o c h e m . 1 5 : 4 2 9 . o 46 39. A w d e h , X . L . , W i l l i a m s o n , A . R . a n d A s k o n a s , B . A . 1970. One c e l l - o n e i m m u n o g l o b u l i n : o r i g i n o f l i m i t e d h e t e r o g e n e i t y o f m y e l o m a p r o t e i n s . B i o c . J . 116:241. 40. W e a v e r , M . , S i k o r a , L . a n d L e v y , J . G . 1980. F i n e s p e c i f i c i t y o f t h e f e r r e d o x i n a n t i g e n : c h a r a c t e r i z a t i o n b y s e r u m a n d m o n o c l o n a l a n t i b o d y . 1980. M a n u s c r i p t i n p r e p a r a t i o n . 41. K e l l y , B . , L e v y , J . G . a n d S i k o r a , L . 1979. T h e u s e o f e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ( E L I S A ) f o r t h e d e t e c t i o n a n d q u a n t i f i c a t i o n o f s p e c i f i c a n t i b o d y f r o m c e l l c u l t u r e s . I m m u n o l o g y 37 :45. 42. B r o d s k y , F . M . , P a r h a m , P . , B a r n s t a b l e , C . J . , C r u m p t o n , M . J . a n d B o d m e r , W . F . 1979. M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s f o r a n a l y s i s o f t h e H L A s y s t e m . I m m u n o -l o g i c a l R e v i e w s . V o l . 47. 

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