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Characterization of the very low density lipoproteins and apoproteins of egg yolk granules Kocal, James Thomas 1977

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CHARACTERIZATION OF THE VERY LOW DENSITY LIPOPROTEINS AND APOPROTEINS OF EGG YOLK GRANULES by JAMES THOMAS KOCAL i B . S c , U n i v e r s i t y o f I l l i n o i s , 1972 M . S c , U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1974 A THESIS SUBMITTED IN PARTIAL FULFILLMENT OF THE REQUIREMENTS FOR THE DEGREE OF i DOCTOR OF PHILOSOPHY i n THE FACULTY OF GRADUATE STUDIES DEPARTMENT OF FOOD SCIENCE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA We a c c e p t t h i s t h e s i s as c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d THE UNIVERSITY OF BRITISH COLUMBIA O c t o b e r , 1977 (P) James Thomas K o c a l , 1977 I n p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r an a d v a n c e d d e g r e e a t t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , I a g r e e t h a t t h e L i b r a r y s h a l l make i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e and s t u d y . I f u r t h e r a g r e e t h a t p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e c o p y i n g o f t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y p u r p o s e s may be g r a n t e d by t h e Head o f my D e p a r t m e n t o r by h i s r e p r e s e n t a t i v e s . I t i s u n d e r s t o o d t h a t c o p y i n g o r p u b l i c a t i o n o f t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l n o t be a l l o w e d w i t h o u t my w r i t t e n p e r m i s s i o n . D e p a r t m e n t o f F o o c i R n ' f t n p p The U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a 2 0 7 5 W e s b r o o k P l a c e V a n c o u v e r , C a n a d a V 6 T 1W5 D a t e - i -A B S T R A C T T h e v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s ( V L D L ( M F ) ) f r o m t h e g r a n u l e s o f h e n ' s e g g y o l k w e r e i s o l a t e d b y a c o m b i n a t i o n o f p r e p a r a t i v e u l t r a c e n t r i f u g a t i o n a n d a g a r o s e g e l f i l t r a t i o n . U l t r a c e n t r i f u g a l , e l e c t r o p h o r e t i c a n d c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d t o c h a r a c t e r i z e a n d a s s e s s t h e p u r i t y o f t h e V L D L (MF ) a n d a p o V L D L . T h e B e c k m a n P r e p UV S c a n n e r a c c e s s o r y t o t h e u l t r a c e n t r i f u g e w a s u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h a n o n - l i n e d a t a a c q u i s i t i o n s y s t e m f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f f l o t a t i o n / s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t s . T h e s o f t w a r e t h a t w a s d e v e l o p e d t o p e r m i t r a p i d d a t a a n a l y s i s u s i n g t h i s s y s t e m i s d e s c r i b e d . A n a g a r o s e d i s c g e l e l e c t r o p h o r e t i c s y s t e m w a s d e v e l o p e d w h i c h , i n c o m b i n a t i o n w i t h t h e u s e o f s u d a n b l a c k B p r e s t a i n e d l i p o p r o t e i n s , a l l o w e d f o r r a p i d e l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o f l a r g e V L D L (MF ) p a r t i c l e s . F l o t a t i o n v e l o c i t y a n a l y s i s o f V L D L (MF) i n d i c a t e d a h e t e r o g e n e o u s p r e p a r a t i o n w i t h t w o m a j o r f l o a t i n g b o u n d a r i e s ( S ^ 75 a n d 2 0 7 S ) . A l k y l a t i o n o f V L D L (MF) w i t h i o d o a c e t a m i d e t o p r e v e n t a g g r e g a t i o n d u e t o o x i d a t i o n o f s u l f h y d r y l g r o u p s d e c r e a s e d t h e f l o t a t i o n r a t e s o f t h e m a c r o m o l e c u l e s t o S^ 4 1 a n d 1 0 8 S . I t i s p o s s i b l e t h a t t h e V L D L (MF) p a r t i c l e s e x i s t i n a p a r t i a l l y a g g r e g a t e d s t a t e i n f r e s h e g g y o l k . C o n c a n a v a l i n A a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f V L D L (MF ) p r o d u c e d a r e t a i n e d a n d a n u n r e t a i n e d f r a c t i o n . T h e r e t a i n e d f r a c t i o n - i i -c o n t a i n e d t w i c e a s m u c h t o t a l c a r b o h y d r a t e a s t h e u n f r a c t i o n a t e d V L D L ( M F ) , w h i l e t h e u n r e t a i n e d V L D L (MF) c o n t a i n e d h a l f a s m u c h c a r b o h y d r a t e . A l l f r a c t i o n s w e r e g l y c o p r o t e i n s c o n t a i n i n g h e x o s e , h e x o s a m i n e a n d s i a l i c a c i d s u g a r r e s i d u e s . V L D L (MF) w a s p a r t i a l l y d e l i p i d a t e d w i t h n - h e p t a n e w h i c h p r e f e r e n t i a l l y e x t r a c t e d t h e n e u t r a l l i p i d s a n d p r e s e r v e d t h e s o l u b i l i t y o f t h e p h o s p h o l i p i d - p r o t e i n r e s i d u e s . Two f r a c t i o n s w e r e i s o l a t e d b y g e l f i l t r a t i o n a n d c h a r a c t e r i z e d b y a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n a n d b y t h e i r p h o s p h o l i p i d / p r o t e i n r a t i o s . V L D L (MF) w a s d e l i p i d a t e d u s i n g s o d i u m d e o x y c h o l a t e (NaDOC) a n d e t h a n o l - e t h e r p r o c e d u r e s . R e m o v a l o f l i p i d s b y b o t h m e t h o d s p r o d u c e d a g g r e g a t e d a p o p r o t e i n , b u t t h e NaDOC a p o p r o t e i n r e m a i n e d s o l u b l e . T h a t o b t a i n e d f r o m e t h a n o l - e t h e r w a s p r e c i p i t a t e d , b u t c o u l d b e s o l u b i l i z e d i n s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e ( SDS ) o r u r e a . T e t r a m e t h y l u r e a (TMU) w a s u s e d t o d e l i p i d a t e V L D L ( M F ) a n d d i s s o c i a t e t h e a p o p r o t e i n . E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f t h r e e a p o p r o t e i n s u b u n i t s , o n e o f w h i c h w a s a n a g g r e g a t e o f t h e o t h e r t w o . SDS e l e c t r o p h o r e s i s o f t h e p r o t e i n s e x t r a c t e d f r o m t h e TMU g e l s d e m o n s t r a t e d t h a t e a c h b a n d w a s h e t e r o g e n e o u s , c o n t a i n i n g m a n y p o l y p e p t i d e s . A p o V L D L w a s d i s s o c i a t e d i n t o 22 p o l y p e p t i d e s (MW r a n g i n g f r o m 9 , 6 0 0 - 1 3 6 , 0 0 0 d a l t o n s ) i n t h e p r e s e n c e o f u r e a , SDS a n d 2 - m e r c a p t o -e t h a n o l ( B M E ) . F o u r t e e n o f t h e s e b a n d s w e r e g l y c o p r o t e i n i n n a t u r e , s t a i n i n g p o s i t i v e l y w i t h S c h i f f r e a g e n t . I n t h e a b s e n c e o f BME, o n l y 18 b a n d s w e r e r e s o l v e d , m o s t o f w h i c h c o n t a i n e d h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t a g g r e g a t e s n o t p r e s e n t i n t h e r e d u c e d s a m p l e s . - i i i -T h e a p o V L D L w a s f r a c t i o n a t e d o n 6% a g a r o s e c o l u m n s c o n t a i n i n g 8M u r e a o r 2mM SDS . Two a p o p r o t e i n f r a c t i o n s w e r e e l u t e d f r o m t h e SDS c o l u m n , a n d t h r e e f r o m t h e - u r e a c o l u m n . T h e p r o t e i n f r o m t h e v o i d v o l u m e o f t h e u r e a c o l u m n w a s a n a g g r e g a t e o f t h e o t h e r t w o p r o t e i n s . A c o r r e l a t i o n w a s f o u n d b e t w e e n t h e f r a c t i o n s e l u t e d f r o m t h e SDS c o l u m n a n d t h e p r o t e i n s e x t r a c t e d f r o m t h e TMU g e l s . T h e m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e t w o a p o p r o t e i n s f r o m t h e SDS c o l u m n w e r e a n a l y z e d b y s e d i m e n t a t i o n e q u i l i b r i u m t e c h n i q u e s . 2 A s p l o t s o f l n c v s . r w e r e n o n l i n e a r , w e i g h t a v e r a g e m o l e c u l a r w e i g h t s w e r e c a l c u l a t e d f o r e a c h m e a s u r e d r a d i a l d i s t a n c e f r o m t h e m e n i s c u s t o t h e b o t t o m o f t h e c e l l . T h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t c o m p o n e n t r a n g e d f r o m 3 3 , 0 0 0 t o 1 6 6 , 0 0 0 d a l t o n s a n d t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c o m p o n e n t r a n g e d f r o m 6 , 0 0 0 t o 2 8 , 0 0 0 . T h e s e v a l u e s c o r r e s p o n d e d w e l l w i t h t h e m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e s o f t h e p o l y p e p t i d e s c h a r a c t e r i z e d b y SDS g e l e l e c t r o p h o r e s i s . - i v -T A B L E OF CONTENTS P a g e A B S T R A C T i T A B L E O F CONTENTS . . . i v L I S T OF T A B L E S „ v i i i L I S T OF F I G U R E S i x A B B R E V I A T I O N S AND SYMBOLS . . . x i i ACKNOWLEDGEMENTS x i v I. I NTRODUCT ION 1 I I . L I T E R A T U R E R E V I E W 3 I I I . E X P E R I M E N T A L PROCEDURES 10 A . l . I s o l a t i o n o f V L D L ( M F ) : P r e p a r a t i o n o f l i p o p r o t e i n s . .12 a . I s o l a t i o n o f y o l k g r a n u l e s 12 b . P r e p a r a t i v e u l t r a c e n t r i f u g a t i o n . 14 c. A g a r o s e g e l c h r o m a t o g r a p h y 14 d . P r e p a r a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f r e d u c i n g a g e n t s . 1 6 e . A l k y l a t i o n o f V L D L (MF ) .17 A . 2. I s o l a t i o n o f V L D L ( M F ) : F u r t h e r f r a c t i o n a t i o n s . . . . 17 a . G e l f i l t r a t i o n o n c o n t r o l l e d p o r e g l a s s b e a d s . .17 b . A f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o n C o n c a n a v a l i n A -S e p h a r o s e 4B 18 B. l . D e l i p i d a t i o n o f V L D L ( M F ) : P a r t i a l d e l i p i d a t i o n u s i n g n - h e p t a n e 19 - v -B . 2 . D e l i p i d a t i o n o f V L D L (MF ) : T o t a l d e l i p i d a t i o n 2 1 a . E t h a n o l - e t h e r d e l i p i d a t i o n 21 b . S o d i u m d e o x y c h o l a t e d e t e r g e n t d e l i p i d a t i o n . . . . . 2 3 C l . A g a r o s e g e l f i l t r a t i o n o f a p o V L D L 25 a . G e l f i l t r a t i o n o n S e p h a r o s e 6 B c o n t a i n i n g 8M u r e s . . . 2 5 b . G e l f i l t r a t i o n o n S e p h a r o s e 6B c o n t a i n i n g SDS . . . . 2 5 D . l . A n a l y t i c a l p r o c e d u r e s : E l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n o f p r e s t a i n e d l i p o p r o t e i n s 26 D . 2 . A n a l y t i c a l p r o c e d u r e s : A n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n o f V L D L (MF) „ . 2 8 a . D a t a a c q u i s i t i o n a n d h a n d l i n g o f d a t a . . 2 9 b . F l o t a t i o n / s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y u l t r a -c e n t r i f u g a t i o n 3 3 D. 3 . A n a l y t i c a l p r o c e d u r e s : P h y s i c a l s t u d i e s o f V L D L (MF) a p o p r o t e i n s 35 a . C a l i b r a t i o n o f S e p h a r o s e c o l u m n s f o r m o l e c u l a r w e i g h t d e t e r m i n a t i o n s 35 b . S e d i m e n t a t i o n e q u i l i b r i u m s t u d i e s 37 c . P o l y a c r y l a m i d e d i s c g e l e l e c t r o p h o r e s i s i n TMU . . . 3 8 i . E x t r a c t i o n o f p r o t e i n f r o m u r e a a c r y l a m i d e ge l s . 42 d . E l e c t r o p h o r e s i s i n t h e p r e s e n c e o f SDS 42 i . S t a i n i n g o f g l y c o p r o t e i n s o n a c r y l a m i d e g e l s . .45 E . l . C h e m i c a l a n a l y s e s : A m i n o a c i d a n a l y s i s 45 E . 2 . C h e m i c a l a n a l y s e s : C a r b o h y d r a t e a n a l y s i s 4 6 a . H e x o s e a n d h e x o s a m i n e d e t e r m i n a t i o n 46 b . S i a l i c a c i d d e t e r m i n a t i o n 47 - v i -E. 3. C h e m i c a l a n a l y s e s : SH and SS d e t e r m i n a t i o n . 4 8 F. 1. UV a b s o r p t i o n s t u d i e s 49 IV. RESULTS AND DISCUSSION 50 A. D a t a a c q u i s i t i o n and h a n d l i n g o f d a t a 50 B. I s o l a t i o n o f VLDL (MF) 54 1. I s o l a t i o n o f F I I f r a c t i o n 54 2. A g a r o s e g e l chromatography 55 3. A l k y l a t i o n 59 4. G e l f i l t r a t i o n on p o r o u s g l a s s beads 63 C. F l o t a t i o n v e l o c i t y u l t r a c e n t r i f u g a t i o n o f VLDL (MF) . . . 64 1. UV a b s o r p t i o n s p e c t r u m . . 64 2. F l o t a t i o n v e l o c i t y a n a l y s i s 66 D. E l e c t r o p h o r e t i c b e h a v i o r o f VLDL (MF) 74 E. A f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y on C o n c a n a v a l i n A-Sepharose 4B . .78 F. D e l i p i d a t i o n o f VLDL (MF) 85 1. P a r t i a l d e l i p i d a t i o n u s i n g n-heptane 85 2. T o t a l d e l i p i d a t i o n w i t h e t h a n o l - e t h e r . .89 3. Sodium d e o x y c h o l a t e d e t e r g e n t d e l i p i d a t i o n 91 G. Amino a c i d c o m p o s i t i o n o f apoVIDL 94 H. E l e c t r o p h o r e s i s o f VLDL (MF) i n t h e p r e s e n c e of TMU . . . 96 I . M o l e c u l a r w e i g h t e s t i m a t i o n o f apoVLDL p o l y p e p t i d e s by S D S - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s 100 J . A g a r o s e g e l f i l t r a t i o n o f apoVLDL 105 - v i i -V . SUMMARY AND CONCLUS IONS 1 1 3 L I T E R A T U R E C I T E D 1 1 6 A P P E N D I X 1 2 5 - v i i i -L I S T OF T A B L E S P a g e C l a s s i f i c a t i o n o f Human S e r u m L i p o p r o t e i n s 4 C o m m e r c i a l E q u i p m e n t u s e d i n t h e U l t r a c e n t r i f u g e - UV S c a n n e r - M i n i - C o m p u t e r S y s t e m 30 M o l e c u l a r W e i g h t M a r k e r s f o r C a l i b r a t i o n o f G e l F i l t r a t i o n C o l u m n s 36 R e a g e n t S o l u t i o n s a n d B u f f e r s f o r TMU E l e c t r o p h o r e s i s . . 4 0 M o l e c u l a r W e i g h t M a r k e r s f o r SDS E l e c t r o p h o r e s i s . . . . 4 3 E s t i m a t i o n o f SH a n d SS C o n t e n t s o f V L D L (MF ) u s i n g E l l m a n ' s R e a g e n t 62 C o m p a r a t i v e F l o t a t i o n R a t e s ( S ^ ) o f N a t i v e , R e d u c e d a n d C h e m i c a l l y M o d i f i e d V L D L (MF) 70 C a r b o h y d r a t e C o m p o s i t i o n o f A p o p r o t e i n s f r o m W h o l e a n d F r a c t i o n a t e d L i p o p r o t e i n s . 8 0 S e d i m e n t a t i o n C o e f f i c i e n t s (S , ) o f V L D L (MF ) o b s a n d V L D L (MF ) F r a c t i o n s f r o m C o n c a n a v a l i n A A f f i n i t y C h r o m a t o g r a p h y 8 2 A m i n o A c i d C o m p o s i t i o n o f A p o p r o t e i n s f r o m Y o l k G r a n u l e , Y o l k P l a s m a , W h o l e Y o l k , H e n S e r u m , Human S e r u m V L D L 95 - i x -LIST OF FIGURES F i g u r e Page 1 P r e p a r a t i o n of VLDL (MF) 13 2 U l t r a c e n t r i f u g a l r e d i s t r i b u t i o n of egg y o l k granule l i p o p r o t e i n s 15 3 Ethanol-ether d e l i p i d a t i o n of VLDL (MF) 22 4 Data f l o w from the Beckman Prep UV Scanner and U l t r a c e n t r i f u g e 31 5 UV Scanner t r a c e s and d e r i v a t i v e curves f o r (A) one and (B) two component systems 52 6 L i n e a r r e g r e s s i o n p l o t f o r two component system i n f l o t a t i o n v e l o c i t y run 53 7 E l u t i o n p r o f i l e s of y o l k granules, FI and F I I f i l t e r e d on B i o g e l A-50M columns 55 8 E l u t i o n p r o f i l e s of (A) a l k y l a t e d VLDL (MF) and (B) 2-mercaptoethanol reduced VLDL (MF) from porous g l a s s bead columns 55 9 UV a b s o r p t i o n spectrum of VLDL (MF) (A) as a f u n c t i o n of wavelength and (B) as l o g - l o g f u n c t i o n . . . 67 10 F l o t a t i o n v e l o c i t y a n a l y s i s of VLDL (MF) (A) f l o t a t i o n p a t t e r n (B) d e r i v a t i v e curve 68 11 Hydrated d e n s i t y of VLDL (MF) estimated from ^s and so l v e n t d e n s i t y at 20°C 71 12 Agarose g e l e l e c t r o p h o r e s i s p a t t e r n of (A) sudan b l a c k B p r e s t a i n e d and (B) Coomassie Blue s t a i n e d VLDL (MF) 76 13 E l u t i o n p r o f i l e o f a l k y l a t e d V L D L (MF) f r o m C o n A S e p h a r o s e 4B c o l u m n 79 14 SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f a p o V L D L i n t h e p r e s e n c e o f BME o f (U ) u n r e t a i n e d a n d (R ) r e t a i n e d f r a c t i o n s f r o m C o n A S e p h a r o s e 4B c o l u m n s t a i n e d w i t h ( A ) C o o m a s s i e B l u e a n d ( B ) P A S 84 1 5 S e p h a r o s e 4B c h r o m a t o g r a p h y o f h e p t a n e d e l i p i d a t e d V L D L (MF ) „' 86 16 ( A ) S e p a r a t i o n o f a p o V L D L a n d V L D L (MF) l i p i d s b y g e l f i l t r a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f NaDOC. ( B ) R e m o v a l o f NaDOC f r o m a p o V L D L b y g e l f i l t r a t i o n , . . . . 9 2 17 E l e c t r o p h o r e s i s o f V L D L (MF) i n t h e p r e s e n c e o f t e t r a m e t h y l u r e a (TMU) ( A ) w h o l e V L D L ( M F ) , ( B ) TMU i n s o l u b l e V L D L , a n d ( C ) TMU s o l u b l e V L D L . . . . 97 18 SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s i n t h e p r e s e n c e o f BME o f ( A ) TMU i n s o l u b l e B a n d 1 / S e p h a r o s e 6 B , F r a c t i o n A ( B ) TMU s o l u b l e B a n d 3 / S e p h a r o s e 6 B , F r a c t i o n B ( C ) TMU s o l u b l e B a n d 2 99 19 SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f a p o V L D L i n t h e p r e s e n c e o f BME a n d s t a i n e d w i t h ( A ) C o o m a s s i e B l u e a n d ( B ) PAS 1 0 2 2 0 SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f a p o V L D L c o n d u c t e d i n t h e a b s e n c e o f BME a n d s t a i n e d w i t h ( A ) C o o m a s s i e B l u e a n d ( B ) P A S 1 0 3 - x i -2 1 G e l f i l t r a t i o n o f a p o V L D L o n S e p h a r o s e 6B c o n t a i n i n g 8M u r e a 1 0 6 22 G e l f i l t r a t i o n o f a p o V L D L o r f r a c t i o n V f r o m 8M u r e a c o l u m n o n SDS S e p h a r o s e 6B 1 0 7 2 3 L o w s p e e d s e d i m e n t a t i o n e q u i l i b r i u m u l t r a -c e n t r i f u g a t i o n o f a p o p r o t e i n s i s o l a t e d b y SDS g e l c h r o m a t o g r a p h y 1 1 0 - x i i -ABBREVIATIONS AND SYMBOLS apoB the protein component of human serum low density lipoprotein; also present i n the very low density lipoproteins. apoC the major protein component of human serum very low density lipoprotein apoprotein delipidated protein moiety of a lipoprotein apoVLDL delipidated protein moiety of VLDL BIS methylenebisacrylamide BME 2-mercaptoethanol BSA bovine serum albumin Con A Concanavalin A CPG controlled pore glass DTE dithioerythritol DTU data transfer unit DVM d i g i t a l voltmeter EDTA disodium ethylenediamine tetraacetate F uncorrected flotation rate at any given density FI floating fraction from yolk granules FII subpellicle, floating fraction from yolk granules HDL high density lipoprotein LDL low density lipoprotein LDFG granule, low density fraction, composed of LDFG-1 and LDFG-2 - x i i i -L D F p l a s m a l o w d e n s i t y f r a c t i o n , c o m p o s e d o f L D L ^ ( L P L 1 ) a n d L D I ^ ( L P L 2 ) L D L g r a n u l e l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n f r a c t i o n o f F I I l p l i p o p r o t e i n MF m y e l i n f i g u r e f r a c t i o n o f F I I NaDOC s o d i u m d e o x y c h o l a t e N a N ^ s o d i u m a z i d e P v p h o s v i t i n PAS p e r i o d i c a c i d S c h i f f s t a i n p r o c e d u r e f o r . g l y c o p r o t e i n P T S p - t o l u e n e s u l f o n i c a c i d SDS s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e S j . u n c o r r e c t e d f l o t a t i o n r a t e , e x p r e s s e d i n s v e d b e r g s r ° —13 (10 c m / s e c / d y n e / g ) i n a n N a C l m e d i u m o f 1.063 g / m l d e n s i t y S ° f l o t a t i o n r a t e f u l l y c o r r e c t e d f o r e f f e c t s o f c o n c e n t r a t i o n d e p e n d e n c e t o s t a n d a r d c o n d i t i o n s SH s u l f h y d r y l SS d i s u l f i d e T B A t h i o b a r b i t u r i c a c i d T C A t r i c h l o r o a c e t i c a c i d TEMED N , N , N ' , N ' - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e TMU 1,1,3,3 - t e t r a m e t h y l u r e a T T Y t e l e t y p e V L D L v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n WSF w a t e r s o l u b l e f r a c t i o n f r o m y o l k p l a s m a - x i v -ACKNOWLEDGEMENTS I w i s h t o e x p r e s s my s i n c e r e g r a t i t u d e t o D r . S. N a k a i , a n e x c e l l e n t r e s e a r c h a d v i s e r , f o r h i s e n c o u r a g e m e n t , g u i d a n c e , a s s i s t a n c e a n d c o n s t r u c t i v e c r i t i c i s m t h r o u g h o u t t h e c o u r s e o f t h i s s t u d y . I t h a n k D r . M . A . T u n g , t o whom I owe m u c h f o r a d v i c e , e s p e c i a l l y d u r i n g t h e p r e p a r a t i o n o f t h e m a n u s c r i p t . I a l s o w i s h t o t h a n k t h o s e m e m b e r s o f my g r a d u a t e c o m m i t t e e , D r . R . J . B o s e , D r . W.D . P o w r i e , a n d D r . J . V a n d e r s t o e p f o r t h e i r v a l u a b l e s u g g e s t i o n s a n d a s s i s t a n c e . A n d f i n a l l y , I w o u l d l i k e t o d e d i c a t e t h i s t h e s i s t o my w i f e E s t a f o r h e r e n c o u r a g e m e n t , c h e e r f u l n e s s , a n d p a t i e n c e d u r i n g my y e a r s o f g r a d u a t e s t u d y , a n d e s p e c i a l l y f o r h e r w o r k i n p r e p a r a t i o n o f t h i s m a n u s c r i p t . - 1 -I. INTRODUCTION Egg yolk i s composed of approximately 16% protein, 33% l i p i d and 50% water. Less than 2% of this material i s dialysable; most of the yolk solids are macromolecular lipoproteins (Cook, 1968). Yolk i s considered a mixture of 77% soluble plasma and 23% particulate granules. The yolk plasma can be fractionated by ultracentrifugation into a low density fraction (66%), and a water soluble fraction (10.6%). The LDF consists of two low density lipoproteins; the WSF contains <*-,/ff-, and y- l i v e t i n s . Ultracentrifugation of the granules dispersed in solutions of high salt concentration, separates 3% floating low density material from the sedimenting fraction which contains 3.7% phosvitin, and 16.3% high density lipoprotein. These HDL are termed <*- and / 3 - l i p o v i t e l l i n (Saito et a l . , 1965). The LDFG has recently been further separated into two fractions termed the myelin figure and the granule low density lipoprotein (Garland, 1973). Electron microscopy was used to assess the purity and the structural integrity of these lipoprotein particles prior to their chemical analysis. The lipoprotein isolated in this study has been designated as a very low density lipoprotein (VLDL), rather than the "myelin figure" of Garland (1973), because physicochemical analysis indicates that i t s properties closely resemble those of the blood serum very low density lipoproteins. However, i t i s acknowledged that the - 2 -s t r u c t u r a l f e a t u r e s o f t h e s e t w o t y p e s o f l i p o p r o t e i n a r e n o t s i m i l a r . I n t h e p r e s e n t w o r k , u l t r a c e n t r i f u g a l , e l e c t r o p h o r e t i c a n d c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d , u n d e r a v a r i e t y o f e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s , t o c h a r a c t e r i z e a n d a s s e s s t h e p u r i t y o f t h e n a t i v e V L D L f r a c t i o n ( M F ) , a n d t h e d e l i p i d a t e d ( a p o V L D L ) p r o t e i n m o i e t i e s . - 3 -I I . L I T E R A T U R E R E V I E W L i p o p r o t e i n s a r e c o m p l e x c o m p o u n d s i n w h i c h p r o t e i n m o i e t i e s a n d l i p i d s a r e n o n c o v a l e n t l y b o u n d b y e l e c t r o s t a t i c a n d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s . L i p o p r o t e i n s a r e g e n e r a l l y d i s p e r s i b l e i n a q u e o u s a n d s a l t s o l u t i o n s . T h e v a r i o u s p r o t e i n - t o - l i p i d r a t i o s o f d i f f e r e n t l i p o p r o t e i n s d e t e r m i n e t h e i r d e n s i t i e s a n d t h u s l i p o p r o t e i n s c a n b e s e p a r a t e d i n t o d i f f e r e n t c l a s s e s b y u l t r a c e n t r i f u g a t i o n . S e r u m l i p o p r o t e i n s h a v e b e e n d i v i d e d i n t o f o u r c l a s s e s o n t h e b a s i s o f d e n s i t y ( T a b l e I ) . T h e s e a r e t h e c h y l o m i c r o n s , t h e v e r y l o w d e n s i t y , l o w d e n s i t y a n d h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n s . I m m a r i n o e t a l . ( 1 9 6 9 ) p e r f o r m e d a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o n t h e s e h u m a n s e r u m u l t r a c e n t r i f u g a l p r o d u c t s t o s h o w t h a t t h e HDL f r a c t i o n c o r r e s p o n d s t o t * - l p , t h e L D L t 0 / 5 - l p , a n d t h e V L D L t o p r e - ^ - l p w h i l e t h e c h y l o m i c r o n s r e m a i n a t t h e o r i g i n . A l e x a n d e r a n d D a y ( 1 9 7 3 ) p e r f o r m e d a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o n c h i c k e n s e r u m a n d a q u a n t i t a t i v e d i s t r i b u t i o n o f t h e l i p o p r o t e i n c l a s s e s w a s d e t e r m i n e d . C h i c k e n s e r u m w a s f o u n d t o c o n t a i n t h e same d e n s i t y c l a s s e s o f l i p o p r o t e i n s a s h u m a n s e r u m ; a s u b s t a n t i a l a m o u n t o f l i p o p r o t e i n i n t h e S^ 2 0 - 4 0 0 S c l a s s ( V L D L ) w a s f o u n d , w h i l e t h e l e v e l o f L D L w a s r e l a t i v e l y l o w . T h e c h y l o m i c r o n s a n d V L D L a r e t h e p r i n c i p a l v e h i c l e s f o r t h e t r a n s p o r t o f p l a s m a t r i g l y c e r i d e s i n man ( N i c h o l s , 1 9 6 9 ) . T h e y a r e r i c h i n t r i g l y c e r i d e s w h o s e f a t t y a c i d s c a n b e o x i d i z e d b y t i s s u e s f o r e n e r g y o r w h i c h c a n b e s t o r e d i n t h e t r i g l y c e r i d e f o r m a s e n e r g y r e s e r v e . T a b l e I . C l a s s i f i c a t i o n o f Human Serum L i p o p r o t e i n s , o E l e c t r o p h o r e t i c ^ C l a s s D e n s i t y (g/ml) S f D i a m e t e r (A) m o b i l i t y C h y l o l e s s t h a n 0.95 VLDL 0.95 - 1.006 LDL 1.006 - 1.063 HDL 1.063 - 1.21 g r e a t e r t h a n 400 20 - 400 0 - 2 0 0 - 9 e g r e a t e r t h a n 1000 300 - 900 170 - 260 40 - 100 o r i g i n p r e - ^ - l p £-lp oC-lp I I a) b) c) d) e) from Scanu e t a l . , 1974 c h y l o m i c r o n s , v e r y low d e n s i t y , low d e n s i t y , and h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n s S^ d e s i g n a t e s t h e n e g a t i v e s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t i n Svedberg u n i t s i n an N a C l s o l u t i o n of d e n s i t y 1.063 g/ml a g a r o s e g e l i n s a l t s o l u t i o n o f d e n s i t y 1.21 g/ml r a t h e r t h a n 1.063 g/ml Human s e r u m V L D L s p a n a w i d e s p e c t r u m o f p a r t i c l e s i z e s , h y d r a t e d d e n s i t i e s a n d f l o t a t i o n r a t e s ( T a b l e I ) . A v e r a g e v a l u e s f o r t h e w e i g h t c o m p o s i t i o n o f V L D L a r e 5 5 % t r i g l y c e r i d e , 2 0 % p h o s p h o l i p i d , 1 5 % c h o l e s t e r o l a n d 1 0 % p r o t e i n ( S k i p s k i , 1 9 7 2 ) . N e g a t i v e l y s t a i n e d V L D L a r e s e e n e l e c t r o n m i c r o s c o p i c a l l y a s s p h e r i c a l m a c r o m o l e c u l a r c o m p l e x e s w i t h d i a m e t e r s r a n g i n g f r o m o 3 0 0 - 9 0 0 A . T h e p a r t i c l e s s h o w n o s u b s t r u c t u r e b u t h a v e e l e c t r o n t r a n s p a r e n t c e n t e r s w i t h " g r a y i s h h a l o s " n e a r t h e p e r i p h e r y . T h e h a l o w a s i n t e r p r e t e d a s a n o u t e r m e m b r a n e - l i k e l a y e r b u t i s l i k e l y d u e t o a r t i f a c t u a l f l a t t e n i n g o f a n e a s i l y d e f o r m e d p a r t i c l e ( M o r r i s e t t et. a l . , 1 9 7 5 ) . T h e m y e l i n f i g u r e s (MF ) i s o l a t e d f r o m e g g y o l k g r a n u l e s b y G a r l a n d ( 1 9 7 3 ) c o n t a i n e d 8 6 % l i p i d a n d 1 4% p r o t e i n . L i p i d a n a l y s i s o f t h e m y e l i n f i g u r e s i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f a b o u t 3 0 % p h o s p h o l i p i d s 1 0 % c h o l e s t e r o l a n d 4 6 % t r i g l y c e r i d e . E l e c t r o n m i c r o s c o p y o f t h e o s m i u m t e t r o x i d e - s t a i n e d MF f r a c t i o n r e v e a l e d o n e o r m o r e e l e c t r o n d e n s e c o n c e n t r i c l a m e l l a e s u r r o u n d i n g a w e a k l y o s m i o p h i l i c c o r e . T h e s i m i l a r i t y o f t h e s e f i g u r e s w i t h b r a i n p h o s p h o l i p i d m y e l i n f i g u r e s t r u c t u r e s l e a d t o t h e name " m y e l i n f i g u r e " . D i m e n s i o n s o f o o 4 8 0 - 1 1 0 0 A i n w i d t h a n d 5 6 0 - 1 3 0 0 A i n l e n g t h w e r e r e p o r t e d f o r t h e e g g y o l k m y e l i n f i g u r e s . H i l l y a r d _et a l . ( 1 9 7 2 ) e x a m i n e d c h i c k e n s e r u m a n d e g g y o l k l i p o p r o t e i n s i s o l a t e d b y u l t r a c e n t r i f u g a l t e c h n i q u e s . I m m u n o c h e m i c a l m e t h o d s , a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n , e l e c t r o p h o r e s i s a n d a m i n o a c i d e n d g r o u p a n a l y s i s s h o w e d i d e n t i c a l r e s u l t s f o r s e r u m a n d e g g y o l k V L D L . - 6 -The physicochemical evidence presented in this thesis, the results of Hillyard e_t a l . (1972) and Alexander and Day (1973) mentioned above, and the physical properties of blood serum VLDL, suggest that the term VLDL (MF) i s the most suitable operational definition of this lipoprotein. Burley and Cook (1961) developed a procedure for the isolation of yolk granules by diluting yolk with an isotonic salt solution. The granules were found to disrupt in NaCl solutions of 0.3M or higher. Ultracentrifugal patterns of such a dispersion in sodium barbital buffer (pH 9.0) indicated the presence of four boundaries, three sedimenting and one floating. The floating boundary was polydisperse and represented about 12% of the yolk granules; flotation coefficients were not calculated for this fraction. Martin et_ a l . (1963) prepared the LDFG from washed yolk granules by dissolving them i n 10% NaCl prior to ultracentrifugation. Their LDFG showed two floating boundaries with S r^t = -16.8 and -9.4 20,w Svedbergs, and the total l i p i d and cholesterol contents of LDFG and LDF of yolk plasma were similar. The nitrogen and phosphorus content of the protein portion of LDFG was variable and i t was thought this fraction was contaminated with phosvitin. In another study, Saito e_t a l . (1965) studied the changes in the LDF and LDFG lipoprotein fractions of yolk during embryogenesis. Ultracentrifugal boundary patterns showed the presence of two components in each fraction although poor resolution and broad peaks prevented the detection of trends in flotation rate with - 7 -i n c u b a t i o n t i m e . P r o p o r t i o n s a n d f l o t a t i o n r a t e s ( F ) o f L D F c o m p o n e n t s i n I M N a C l ( 3 0 % o f - 3 3 S a n d 7 0 % o f - 1 8 S ) a n d i n v e r o n a l b u f f e r ( 3 0 % o f - 2 4 S a n d 7 0 % o f - 1 1 S ) w e r e c o m p a r a b l e t o v a l u e s f o r i n f e r t i l e y o l k . F l o t a t i o n r a t e s o f L D F G w e r e f o u n d t o b e s i m i l a r t o t h o s e o f L D F b u t w e r e m u c h m o r e v a r i a b l e , w i t h t h e f a s t e r c o m p o n e n t p r e s e n t i n t h e g r e a t e r a m o u n t . M a c K e n z i e a n d M a r t i n ( 1 9 6 7 ) r e m o v e d y o l k s a t v a r i o u s p h a s e s o f g r o w t h f r o m h e n ' s o v a r i e s t o s t u d y t h e l i p o p r o t e i n c o m p o s i t i o n o f y o l k a t s u c c e s s i v e s t a g e s o f m a t u r a t i o n . T h e a m o u n t o f L D F G w a s f o u n d t o i n c r e a s e s l i g h t l y d u r i n g y o l k m a t u r a t i o n , b u t w a s p r e s e n t i n a m o u n t s t o o s m a l l t o p e r m i t v a l i d c o m m e n t o n a n y c h a n g e s t h a t m i g h t h a v e o c c u r r e d . U l t r a c e n t r i f u g a l p a t t e r n s i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f t w o p o o r l y r e s o l v e d b o u n d a r i e s w i t h f l o t a t i o n c o e f f i c i e n t s ( F ) o f - 7 . 3 S a n d - 1 3 . 9 S i n I M N a C l . D u r i n g m a t u r a t i o n , t h e f l o t a t i o n r a t e s o f t h e t w o c o m p o n e n t s w e r e f o u n d t o d e c r e a s e t o - 5 . 6 S a n d - 1 1 . 7 S r e s p e c t i v e l y . H y d r o x y l a p a t i t e c h r o m a t o g r a p h y e n a b l e d G o r n a l l a n d K u k s i s ( 1 9 7 1 a , 1 9 7 1 b ) t o r e s o l v e L D F G i n t o t w o s u b f r a c t i o n s . T h e L D F G - 1 (23,%) r e m a i n e d a t t h e o r i g i n a n d t h e L D F G - 2 ( 7 7 % ) m o v e d a b o u t h a l f w a y u p t h e t h i n l a y e r p l a t e . T h e f a s t e r m i g r a t i n g L D F G - 2 c o n t a i n e d m o r e t r i g l y c e r i d e ( 7 3 % ) a n d l e s s p h o s p h o l i p i d ( 2 1 % ) t h a n L D F G - 1 ( 5 7 % a n d 3 0 % r e s p e c t i v e l y ) . T h e L D F G - 1 , h o w e v e r , c o n t a i n e d t w i c e t h e p r o p o r t i o n o f c h o l e s t e r o l f o u n d i n L D F G - 2 . U n f r a c t i o n a t e d L D F G c o n t a i n e d 8 8 % l i p i d a n d 1 2 % p r o t e i n ; L D F G - 1 h a d 8 5 % l i p i d a n d 1 5 % p r o t e i n , w h i l e L D F G - 2 h a d 9 2 % l i p i d a n d 8% p r o t e i n . L D F G - 8 -a n d L D F f r o m t h e p l a s m a w e r e s a i d t o g i v e e s s e n t i a l l y t h e s ame r e s u l t s w h e n s e p a r a t e d o n h y d r o x y l a p a t i t e e x c e p t t h a t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o f s a l t w e r e r e q u i r e d t o s o l u b i l i z e t h e L D F G f r a c t i o n . E v a n s et_ a l . ( 1 9 7 3 ) w e r e t h e f i r s t t o r e c o g n i z e t h a t t h e e g g y o l k l i p o p r o t e i n i s o l a t e d b y f l o t a t i o n i n h i g h s a l t s o l u t i o n s i n t h e u l t r a c e n t r i f u g e s h o u l d b e d e s i g n a t e d a s v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n r a t h e r t h a n a s l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n . T h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e l i p o p r o t e i n m o r e c l o s e l y a p p r o x i m a t e s t h a t o f b l o o d s e r u m V L D L t h a n t h a t o f b l o o d s e r u m l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s . A l t h o u g h t h e r e s o l u t i o n w a s p o o r w h e n t h e V L D L w e r e s e p a r a t e d b y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y ( S e p h a r o s e 4B o r B i o g e l A - 1 5 M ) , f i v e f r a c t i o n s w e r e i s o l a t e d f r o m t w o p e a k s . T h e f r a c t i o n s w i t h l a r g e r m o l e c u l a r w e i g h t l i p o p r o t e i n s c o n t a i n e d m o r e l i p i d a n d t r i g l y c e r i d e t h a n t h e f r a c t i o n s w i t h s m a l l e r m o l e c u l a r w e i g h t l i p o p r o t e i n s . T h e p r o t e i n s o f a l l f r a c t i o n s a p p e a r e d t o b e s i m i l a r . B a c o n e t a l . ( 1 9 7 3 ) a n d B a c o n a n d M u s s e r ( 1 9 7 4 ) i s o l a t e d a V L D L f r a c t i o n f r o m y o l k p l a s m a b y p r e p a r a t i v e u l t r a c e n t r i f u g a t i o n a n d r e s o l v e d t w o w e l l - d e f i n e d p r o t e i n p e a k s o n a c o l u m n o f B i o g e l A - 5 0 M . T h e s e c o n d p e a k h a d a f l o t a t i o n c o e f f i c i e n t ( F ) o f - 2 1 S a n d a m o l e c u l a r w e i g h t o f 3 m i l l i o n ; t h e f i r s t p e a k , e l u t e d i n t h e v o i d v o l u m e , w a s n o t s t u d i e d . I n a n o t h e r s t u d y , E v a n s e t a l . ( 1 9 7 4 , 1 9 7 5 a ) i s o l a t e d t h e V L D L f r o m f r e s h e g g s a n d f r o m e g g s w h i c h h a d b e e n s t o r e d i n t h e c o l d f o r s i x m o n t h s . No c h a n g e s i n s t r u c t u r e , l i p i d c o n t e n t , - 9 -m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e s o r p r o p o r t i o n s o f t h e t o t a l V L D L w e r e d e t e c t e d a f t e r c o l d s t o r a g e . P r e p a r a t i v e u l t r a c e n t r i f u g a t i o n w a s u s e d t o i s o l a t e V L D L f r o m y o l k p l a s m a ; s i x f r a c t i o n s w e r e s e p a r a t e d a n d t h e s i z e o f t h r e e o f t h e s e m o l e c u l e s w a s e s t i m a t e d b y g e l c h r o m a t o g r a p h y o n S e p h a r o s e 4 B . M o l e c u l a r w e i g h t s o f 5 , 1 0 a n d 17 m i l l i o n d a l t o n s w e r e d e t e r m i n e d , a l t h o u g h c o n s i d e r a b l e o v e r l a p o f m o l e c u l a r s i z e w a s o b s e r v e d among t h e t h r e e f r a c t i o n s . C h a n g ( 1 9 6 9 ) p e r f o r m e d e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e s o n t w o f l o a t i n g f r a c t i o n s a n d t h r e e s e d i m e n t i n g f r a c t i o n s i s o l a t e d f r o m y o l k g r a n u l e s . G a r l a n d ( 1 9 7 3 ) s e p a r a t e d C h a n g ' s F I I f r a c t i o n i n t o MF a n d ^ D L ^ c o m p o n e n t s a n d s t u d i e d t h e i r l i p i d c o m p o s i t i o n a n d e m u l s i f i c a t i o n c a p a c i t i e s . No r e p o r t s c o n c e r n i n g t h e p h y s i c a l a s p e c t s o f t h e l i p o p r o t e i n o r p r o t e i n m o i e t y o f t h e V L D L f r a c t i o n o f e g g y o l k g r a n u l e s h a v e a p p e a r e d i n t h e l i t e r a t u r e t o d a t e . T h e o b j e c t o f t h i s s t u d y , t h e r e f o r e , w a s t o a s s e s s t h e p u r i t y a n d p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f e g g y o l k g r a n u l e V L D L a n d a p o V L D L u s i n g t h e v a r i o u s e x p e r i m e n t a l t e c h n i q u e s o f u l t r a c e n t r i f u g a t i o n , e l e c t r o p h o r e s i s a n d g e l f i l t r a t i o n . - 1 0 -I I I . . EXPER IMENTAL PROCEDURES I n a l l e x p e r i m e n t s , a n a l y t i c a l g r a d e c h e m i c a l s w e r e u s e d u n l e s s a s p e c i a l p u r i t y w a s r e q u i r e d . G l a s s d i s t i l l e d , d e i o n i z e d w a t e r w a s u s e d i n a l l b u f f e r s a n d s o l u t i o n s . T h e f o l l o w i n g c h e m i c a l s , l i s t e d b y m a n u f a c t u r i n g c o m p a n y , w e r e u s e d : A m i c o n A p p l i e d S c i e n c e L a b o r a t o r i e s B i o r a d L a b o r a t o r i e s B u r d i c k a n d J a c k s o n L a b . C a l b i o c h e m E a s t m a n E l e c t r o - n u c l e o n i c s , I n c . F i s h e r I C N P h a r m a c e u t i c a l s M a l l i n c k r o d t M a t h e s o n C o l e m a n a n d B e l l PM 1 0 , PM 3 0 u l t r a f i l t r a t i o n m e m b r a n e s C a r b o w a x 20M B i o g e l A - 5 0 M , D o w e x 50W-X2 t e t r a m e t h y l u r e a m e t h y l e<-D m a n n o p y r a n o s i d e N , N 1 - m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d e , p - d i m e t h y l -a m i n o b e n z a l d e h y d e , r i b o f l a v i n , TEMED, t h i o b a r b i t u r i c a c i d o C P G - 1 0 ( 3 0 0 0 A ) 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , b r o m p h e n o l b l u e , i n s o l u b l e p o t a t o s t a r c h , p r o p y l e n e g l y c o l , s o d i u m d e o x y c h o l a t e , s u d a n b l a c k B C o o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e R, o v a l b u m i n ammon ium p e r s u l f a t e , 2 , 4 - p e n t a n e d i o n e a c r y l a m i d e , 3 - ( 2 - a m i n o e t h y l ) i n d o l e H C l , m e r c a p t o a c e t i c a c i d , p - t o l u e n e s u l f o n i c a c i d . - 1 1 -N u t r i t i o n a l B i o c h e m . C o r p . P i e r c e P h a r m a c i a F i n e C h e m i c a l s S i g m a W o r t h i n g t o n B i o c h e m . C o r p . a g a r o s e t h i o d i g l y c o l C o n c a n a v a l i n A - S e p h a r o s e 4 B , B l u e D e x t r a n 2 0 0 0 , S e p h a r o s e 2 B , 4B a n d 6 B , S e p h a d e x G - 7 5 a n d G - 2 0 0 ( s u p e r f i n e ) b o v i n e s e r u m a l b u m i n , c o n a l b u m i n , d i t h i o e r y t h r i t o l , g l u c o s a m i n e H C 1 , h u m a n y - g l o b u l i n , i o d o a c e t a m i d e , s i a l i c a c i d , c h y m o t r y p s i n o g e n l y s o z y m e - 1 2 -A . 1 . I s o l a t i o n o f V L D L ( M F ) : P r e p a r a t i o n o f l i p o p r o t e i n s ( F i g u r e 1 ) I n f e r t i l e e g g s f r o m W h i t e L e g h o r n h e n s f e d a s t a n d a r d l a y i n g r a t i o n w e r e p r o v i d e d b y t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a D e p a r t m e n t o f P o u l t r y S c i e n c e F a r m . T h e e g g s w e r e s t o r e d f o r l e s s t h a n 24 h o u r s p r i o r t o u s e . E a c h y o l k w a s c a r e f u l l y s e p a r a t e d f r o m t h e a l b u m e n a n d r o l l e d o n a b s o r b e n t p a p e r t o w e l s t o r e m o v e a n y a d h e r i n g e g g w h i t e . T h e y o l k m e m b r a n e w a s t h e n p u n c t u r e d w i t h a s p a t u l a t o s e p a r a t e t h e y o l k f r o m t h e v i t e l l i n e m e m b r a n e . T h e l i q u i d y o l k o f s e v e r a l e g g s w a s p o o l e d i n t o a c o l l e c t i n g b e a k e r . a . I s o l a t i o n o f y o l k g r a n u l e s L i q u i d y o l k w a s d i l u t e d 1 :1 ( v / v ) w i t h c o l d ( 4 ° C ) d i s t i l l e d w a t e r c o n t a i n i n g 0 . 0 2 % EDTA ( p H 7 . 0 ) a n d s t i r r e d f o r 3 0 m i n u t e s . T h e g r a n u l e s w e r e s e p a r a t e d f r o m t h e y o l k p l a s m a b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 0 , 0 0 0 x g f o r 3 0 m i n u t e s a t 4 ° C i n a S o r v a l l R C 2 - B r e f r i g e r a t e d c e n t r i f u g e . T h e s u p e r n a t a n t ( p l a s m a ) w a s r e m o v e d b y d e c a n t i n g , a n d t h e s e d i m e n t e d g r a n u l e s w e r e r e s u s p e n d e d i n m o r e EDTA s o l u t i o n ( pH 7 ) , s t i r r e d f o r 3 0 m i n u t e s a n d r e c e n t r i f u g e d . T h i s w a s h i n g p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d 2 - 3 m o r e t i m e s u n t i l a l l t h e w a t e r s o l u b l e p l a s m a w a s r e m o v e d ( E v a n s et^ a l . , 1 9 6 8 ) . - 1 3 -D I L U T E D Y O L K c e n t r i f u g e 2 0 , 0 0 0 30 m i n SED IMENT - GRANULES r e s u s p e n d s t i r 3 0 m i n 3 X r e c e n t r i f u g e SUPERNATANT P L A S M A ( d i s c a r d ) ~ 1 WASHED GRANULES SUPERNATANT r e s u s p e n d i n N a C l £ o =1 . 063 g / m l ) ( d i s c a r d ) s t i r 1 h r c e n t r i f u g e 7 8 , 0 0 0 x g 1 6 - 1 8 h r F L O A T I N G F I I F R A C T I O N B i o g e l A - 5 0 M c o l u m n I F I , F i l l , F I V , FV ( d i s c a r d ) V L D L (MF) 1 L D L g ( d i s c a r d ) F i g u r e 1 . P r e p a r a t i o n o f V L D L ( M F ) . - 14 -b. P r e p a r a t i v e u l t r a c e n t r i f u g a t i o n Washed g r a n u l e s were suspended i n 0.025M sodium p h o s p h a t e b u f f e r c o n t a i n i n g 0.01% EDTA and 0.02% NaN^ (pH 7.0). The s o l u t i o n was a d j u s t e d t o a d e n s i t y o f 1.063 g/ml w i t h N a C l . A l l s o l u t i o n s were r o u t i n e l y b u f f e r e d t o pH 7 and c o n t a i n e d EDTA t o i n h i b i t p e r o x i d a t i o n o r a g g r e g a t i o n o f l i p o p r o t e i n s ( M a u l d i n and F i s h e r , 1 9 7 0 ) . The d i s p e r s e d g r a n u l e s were t h e n c e n t r i f u g e d a t 78,000 x g f o r a p e r i o d o f 16-18 h o u r s a t 4°C i n a Beckman L2-65B o r L3-50 u l t r a c e n t r i f u g e . T h i s c e n t r i f u g a t i o n e n s u r e d q u a n t i t a t i v e f l o t a t i o n o f l i p o p r o t e i n s h a v i n g h y d r a t e d d e n s i t i e s o f 1.04 g/ml o r l e s s i n t o t h e u p p e r p a r t o f t h e p r e p a r a t i v e t u b e c o n t e n t s . Those macro-m o l e c u l a r components o f y o l k h a v i n g h y d r a t e d d e n s i t i e s g r e a t e r t h a n 1.063 g/ml were s e d i m e n t e d ( F i g u r e 2 ) . The c o n t e n t s o f t h e t u b e s were r e d i s t r i b u t e d i n t o f i v e d i s t i n c t z o n e s: two f l o a t i n g and t h r e e s e d i m e n t i n g f r a c t i o n s . The s e m i s o l i d l a y e r on t h e s u r f a c e ( F I ) was p e e l e d f r o m t h e s i d e o f t h e c e n t r i f u g e tube w i t h t h e t i p o f a s p a t u l a , and t h e opaque s o l u t i o n b e n e a t h ( F I I ) was removed w i t h a p a s t e u r p i p e t f o r f u r t h e r f r a c t i o n a t i o n . c. A g a r o s e g e l chro m a t o g r a p h y A 100 x 50 cm column o f B i o g e l A-50M ( 2 % w/v a g a r o s e , 50-100 mesh) was f i t t e d w i t h c o a r s e s i n t e r e d g l a s s f i l t e r s a t each - 15 -Figure 2. U l t r a c e n t r i f u g a l r e d i s t r i b u t i o n of egg y o l k granule l i p o p r o t e i n s . - 16 -e n d . G l a s s b e a d s ( 2 mm d i a m e t e r ) i n t h e v o i d s p a c e s u n d e r t h e f i l t e r s p r e v e n t e d c l o g g i n g d u r i n g p r o l o n g e d u s e . T h e c o l u m n w a s r u n a t r o o m t e m p e r a t u r e i n a n a s c e n d i n g f a s h i o n u n d e r a h y d r o s t a t i c p r e s s u r e h e a d o f 1 0 0 cm w a t e r . L i p o p r o t e i n F I I c o n c e n t r a t e w a s a p p l i e d i n 6 0 m l a l i q u o t s d i r e c t l y f r o m t h e u l t r a c e n t r i f u g e p r e p a r a t i o n a n d w a s e l u t e d a t 1 13 m l / h r w i t h 1 . 0 M N a C l , 0 . 0 2 5 M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) c o n t a i n i n g 0 . 0 1 % EDTA a n d 0 . 0 2 % N a N ^ . A n L K B U l t r o R a c f r a c t i o n c o l l e c t o r w a s u s e d t o c o l l e c t e l u a t e f r a c t i o n s o f 99 d r o p s ( 6 . 6 m l ) . M o n i t o r i n g o f t h e p r o t e i n - c o n t a i n i n g e l u a t e s a t 2 8 0 nm w a s c a r r i e d o u t w i t h a n I s c o M o d e l U A - 2 UV a n a l y s e r . T h e f i r s t p e a k , e l u a t e d i n t h e v o i d v o l u m e , c o n t a i n e d t h e V L D L (MF ) f r a c t i o n a n d w a s c o n c e n t r a t e d b y u l t r a c e n t r i f u g a t i o n a t 7 8 , 0 0 0 x g f o r 8 h o u r s a t 4 ° C . S a m p l e s o f t h i s V L D L (MF ) w e r e d i a l y s e d a g a i n s t d i s t i l l e d w a t e r a t 4 ° C , l y o p h i l i z e d , d e l i p i d a t e d a n d a n a l y s e d f o r a m i n o a c i d c o n t e n t a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n E . l . D i a l y s i s w a s p e r f o r m e d w i t h c o m m e r c i a l l y a v a i l a b l e m e m b r a n e s w h i c h w e r e b o i l e d i n d i s t i l l e d w a t e r c o n t a i n i n g 1 0 0 mg EDTA a n d 2 . 5 g N a H C 0 3 p e r l i t e r ( M a u l d i n a n d F i s h e r , 1 9 7 0 ) . d . P r e p a r a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f r e d u c i n g a g e n t s . T h e V L D L w e r e i s o l a t e d f r o m y o l k g r a n u l e s a n d s e p a r a t e d b y c h r o m a t o g r a p h y , a s d e s c r i b e d a b o v e , e x c e p t t h a t a l l b u f f e r s w e r e p r e p a r e d w i t h o x y g e n - f r e e w a t e r s a t u r a t e d w i t h n i t r o g e n , a n d c o n t a i n i n g 0 . 1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l . - 17 -e . A l k y l a t i o n o f V L D L (MF) V L D L (MF) w a s a l k y l a t e d w i t h i o d o a c e t a m i d e a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e o f B a t t e l e t a l . ( 1 9 6 8 ) . T h e l i p o p r o t e i n ( 1 0 m g / m l ) i n 1 . 0 M N a C l , 0 . 0 2 5 M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) w a s p a s s e d t h r o u g h a c o l u m n o f S e p h a d e x G - 7 5 t o r e m o v e BME a n d w a s t h e n r e a c t e d w i t h 10 mM i o d o a c e t a m i d e u n d e r n i t r o g e n f o r 18 h o u r s . No d e n a t u r a n t s o r r e d u c i n g a g e n t s w e r e a d d e d a t t h i s t i m e . 2 - m e r c a p t o e t h a n o l w a s a d d e d i n e x c e s s t o s t o p t h e r e a c t i o n a n d t h e a l k y l a t e d V L D L (MF ) w a s s e p a r a t e d f r o m t h e u n r e a c t e d r e a g e n t s b y d e s a l t i n g o n a c o l u m n o f S e p h a d e x G - 7 5 . T h e s u l f h y d r y l a n d d i s u l f i d e c o n t e n t o f t h e c h e m i c a l l y m o d i f i e d l i p o p r o t e i n a n d c o n t r o l s w e r e d e t e r m i n e d u s i n g E l l m a n ' s r e a g e n t ( B e v e r i d g e et: a l . , 1 9 7 0 ) a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n E . 3 . A . 2 . I s o l a t i o n o f V L D L ( M F ) : F u r t h e r f r a c t i o n a t i o n s a . G e l f i l t r a t i o n o n c o n t r o l l e d p o r e g l a s s b e a d s A p r e l i m i n a r y e x a m i n a t i o n , b y a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n , o f V L D L i s o l a t e d a s t h e v o i d v o l u m e p e a k f r o m t h e 2% a g a r o s e c o l u m n , i n d i c a t e d a n h e t e r o g e n e o u s p r e p a r a t i o n . G e l f i l t r a t i o n o f V L D L (MF) t h r o u g h a 1% a g a r o s e c o l u m n w a s e x t r e m e l y s l o w a n d d i d n o t i m p r o v e t h e p u r i t y o f t h e l i p o p r o t e i n . G e l f i l t r a t i o n t h r o u g h c o n t r o l l e d p o r e g l a s s b e a d s w a s u s e d i n a n a t t e m p t t o f u r t h e r p u r i f y t h e l i p o p r o t e i n . T r e a t m e n t o f - 18 -the glass beads with a 1% (w/v) solution of Carbowax 20M in d i s t i l l e d water, followed by a d i s t i l l e d water wash (4X) eliminated a l l adsorption problems. Two ml aliquots of VLDL (MF) or alkylated VLDL (MF) were applied to a 81 x 1.5 cm controlled pore glass bead column o (3000 A, 20-80 mesh), and eluted at 60 ml/hr with 1.0M NaCl, 0.025M sodium phosphate and 0.01% EDTA buffer (pH 7.0). The eluted samples were concentrated by ultracentrifugation when necessary, then analysed by agarose disc gel electrophoresis (section D.l.) and analytical ultracentrifugation (section D.2b). b. A f f i n i t y chromatography on Concanavalin A-Sepharose 4B Af f i n i t y chromatography was carried out according to the procedure of Shore and Shore (1973). A 9 x 1 cm column of Concanavalin A-Sepharose 4B was equilibrated at room temperature with a 0.2M NaCl, 0.1M Na-acetate buffer containing 1 mM CaC^, ImM MgCI^j and 1 mM MnCl 2. The pH was adjusted to 6.8 with acetic acid and 0.02% NaN^ was added as a preservative. The alkylated VLDL (MF) (approximately 4-6 mg protein) was dialysed against the same buffer for 36 hours at 4°C, then layered onto the column bed. The column was thoroughly washed with the equilibrating buffer, and the adsorbed substances were eluted at a flow rate of 8 ml/hr with the equilibrating buffer made to 0.2M with respect to methyl ©t-D mannopyranoside. The elution pattern was monitored by absorbance at 280 nm and 2 ml - I n -f r a c t i o n s w e r e c o l l e c t e d . T h e f r a c t i o n s o f r e t a i n e d a n d u n r e t a i n e d V L D L (MF ) w e r e e x t e n s i v e l y d i a l y s e d a g a i n s t w a t e r c o n t a i n i n g 0 . 0 1 % EDTA (pH 7 . 0 ) a t 4 ° C , l y o p h i l i z e d a n d d e l i p i d a t e d w i t h c h l o r o f o r m -m e t h a n o l ( 2 : 1 v / v ) o r e t h a n o l - e t h e r ( 3 : 1 v / v ) a s d e s c r i b e d i n s e c t i o n B . 2 a . Some s a m p l e s w e r e n o t d e l i p i d a t e d b u t c o n c e n t r a t e d b y u l t r a c e n t r i f u g a t i o n a n d l a t e r a n a l y z e d b y s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y a n a l y s i s ( s e c t i o n D . 2 b ) . T h e a p o p r o t e i n o b t a i n e d a b o v e w a s u s e d f o r c a r b o h y d r a t e a n a l y s i s ( s e c t i o n E . 2 a . a n d E . 2 b . ) a n d SDS g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( s e c t i o n D . 3 d . ) . B . l . D e l i p i d a t i o n o f V L D L ( M F ) : P a r t i a l d e l i p i d a t i o n u s i n g n - h e p t a n e I n o r d e r t o s e p a r a t e t h e p r e v i o u s l y i s o l a t e d V L D L (MF) i n t o h o m o g e n e o u s f r a c t i o n s , V L D L (MF ) w a s p a r t i a l l y d e l i p i d a t e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f G u s t a f s o n ( 1 9 6 5 ) , a n d s e p a r a t e d b y g e l f i l t r a t i o n . A l k y l a t e d V L D L (MF) w a s d i a l y s e d f o r 4 8 h o u r s a t 4 ° C a g a i n s t 4 c h a n g e s o f d i s t i l l e d w a t e r c o n t a i n i n g 0 . 0 1 % EDTA ( p H 7 . 0 ) , t h e n l y o p h i l i z e d i n t h e p r e s e n c e o f i n s o l u b l e p o t a t o s t a r c h ( 1 0 0 m g / m l l i p o p r o t e i n ) . F r e e z e d r i e d s a m p l e s w e r e s t o r e d i n a d e s i c c a t o r a t 4 ° C i n a n i n e r t a t m o s p h e r e . T h e V L D L (MF) w a s h a n d l e d u n d e r a n i t r o g e n a t m o s p h e r e a t a l l t i m e s , e s p e c i a l l y w h e n o p e n i n g t h e f r e e z e d r y e r t o p r e v e n t l i p i d o x i d a t i o n . I n s o l u b l e p o t a t o s t a r c h w a s p u r i f i e d p r i o r t o u s e t o ' r e m o v e t h e s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t u l t r a v i o l e t a b s o r b i n g m a t e r i a l , w h i c h - 2 0 -i n t e r f e r e s i n t h e UV s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y a n a l y s i s o f t h e s a m p l e s . T h e p o t a t o s t a r c h w a s w a s h e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r ( 3 - 5 X ) , 0 . 2 M T r i s - H C l pH 8 . 2 ( 3 X ) , 1 . 0 M N a C l pH 7 . 0 ( 3 X ) , d i s t i l l e d w a t e r ( 3 X ) a n d f i n a l l y e x t r a c t e d w i t h n - h e p t a n e . T h e i n s o l u b l e s t a r c h w a s t h e n l y o p h i l i z e d a n d s t o r e d i n a d e s i c c a t o r . P a r t i a l d e l i p i d a t i o n o f t h e V L D L (MF) a n d p o t a t o s t a r c h w a s a c c o m p l i s h e d b y f i v e c o n s e c u t i v e 3 0 m i n u t e e x t r a c t i o n s i n 5 0 m l a l i q u o t s o f n - h e p t a n e a t - 1 0 ° C . A f t e r e a c h e x t r a c t i o n , t h e s a m p l e s w e r e c e n t r i f u g e d a t 3 0 0 0 x g a t - 1 0 ° C , t h e s u p e r n a t a n t d e c a n t e d a n d t h e s a m p l e s r e s u s p e n d e d i n c o l d h e p t a n e . A f t e r t h e f i n a l c e n t r i f u g a t i o n , t h e s e d i m e n t w a s d r i e d u n d e r a s t r e a m o f n i t r o g e n a t 4 ° C f o r 60 m i n u t e s . T h e d r i e d m a t e r i a l ( V L D L (MF) a n d i n s o l u b l e s t a r c h ) w a s t h e n e x t r a c t e d e i t h e r w i t h 0 . 2 M T r i s - H C l b u f f e r ( p H 8 . 2 ) o r 1 . 0 M N a C l ( p H 7 . 0 ) f o r 2 h o u r s a t 4 ° C . T h e s o l u b l e p h o s p h o l i p i d -p r o t e i n r e s i d u e w a s s e p a r a t e d f r o m t h e i n s o l u b l e p o t a t o s t a r c h b y c e n t r i f u g a t i o n a s a b o v e . T h e s a m p l e s w e r e c o n c e n t r a t e d b y u l t r a c e n t r i f u g a t i o n a t 7 8 , 0 0 0 x g f o r 8 h o u r s a t 4 ° C , a n d t h e n a p p l i e d t o a 77 x 2 . 5 cm c a l i b r a t e d c o l u m n o f S e p h a r o s e 4 B ( 4 % a g a r o s e ) a n d e l u t e d a t a f l o w r a t e o f 68 m l / h r w i t h 0 . 2 M T r i s - H C l b u f f e r ( p H 8 . 2 ) . T h e e l u a t e s w e r e m o n i t o r e d a t 2 8 0 nm, a n d t h e p o o l e d f r a c t i o n s w e r e c o n c e n t r a t e d b y u l t r a c e n t r i f u g a t i o n w h e n r e q u i r e d , t h e n a n a l y z e d b y s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y a n a l y s i s a t 4 5 , 0 0 0 r p m ( s e c t i o n D . 2 b . ) . P r o t e i n c o n t e n t w a s d e t e r m i n e d b y t h e m e t h o d o f L o w r y et_ al. ( 1 9 5 1 ) a n d p h o s p h o l i p i d s b y t h e m e t h o d o f B a r t l e t t ( 1 9 5 9 ) . S a m p l e s o f t h e u n f r a c t i o n a t e d h e p t a n e - d e l i p i d a t e d V L D L w e r e e x t r a c t e d w i t h c h l o r o f o r m - m e t h a n o l - 2 1 -( 2 : 1 v / v ) . T h e l i p i d e x t r a c t w a s e x a m i n e d f o r t h e p r e s e n c e o f n e u t r a l l i p i d s b y t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y o n S i l i c a G e l G u s i n g a p e t r o l e u m e t h e r - d i e t h y l e t h e r ( 9 5 : 5 v / v ) s o l v e n t s y s t e m . B . 2 . D e l i p i d a t i o n o f V L D L ( M F ) : T o t a l d e l i p i d a t i o n a . E t h a n o l - e t h e r d e l i p i d a t i o n P r i o r t o d e l i p i d a t i o n , V L D L (MF) w a s d i a l y s e d f o r 48 h r a g a i n s t 0 . 1 5 M N a C l , 0 . 0 0 1 M E D T A (pH 7 . 0 ) . T h e s t a n d a r d d e l i p i d a t i o n c o n d i t i o n s o u t l i n e d b y S c a n u a n d E d e l s t e i n ( 1 9 7 1 ) w e r e f o l l o w e d ; a s c h e m a t i c d i a g r a m o f t h e p r o c e d u r e i s s h o w n i n F i g u r e 3 . L i p o p r o t e i n s o l u t i o n s c o n t a i n i n g 2 t o 5 mg p r o t e i n w e r e e x t r a c t e d i n 5 0 m l o f s o l v e n t m i x t u r e c o n t a i n i n g 9 5 % e t h a n o l - e t h e r ( 3 : 1 v / v ) f o r 2 h r a t - 1 0 ° C w i t h s l o w s t i r r i n g . T h e p r e c i p i t a t e d p r o t e i n w a s s e p a r a t e d f r o m t h e s u p e r n a t a n t b y c e n t r i f u g a t i o n a t 1 o 2 0 0 0 x g f o r 1 5 m i n a t - 1 0 C . T h e f i r s t s u p e r n a t a n t - s o l v e n t m i x t u r e w a s s a v e d . T h e p r e c i p i t a t e d p r o t e i n w a s t h e n r e - e x t r a c t e d f o r 2 h r w i t h t h e e t h a n o l - e t h e r s o l v e n t m i x t u r e a n d r e c e n t r i f u g e d a s a b o v e . T h e s u p e r n a t a n t w a s d i s c a r d e d a n d t h e p r e c i p i t a t e e x t r a c t e d w i t h e t h e r f o r 16 h r a t - 1 0 ° C , t h e n r e c e n t r i f u g e d t o s e p a r a t e t h e p r e c i p i t a t e d p r o t e i n . T h e s u p e r n a t a n t f r o m t h e f i r s t s o l v e n t e x t r a c t i o n w a s a d j u s t e d w i t h e t h e r t o a r a t i o o f e t h a n o l - e t h e r o f 3 : 5 ( v / v ) a n d - 22 -V L D L (MF) ( 2 - 5 rag p r o t e i n / m l ) SUPERNATANT E t h a n o l - e t h e r 2 h r a 1 v / v ) E t h a n o l - e t h e r ( 3 : 5 v / v ) 16 h r a t - 1 0 ° C SUPERNATANT-- P R E C I P I T A T E P R O T E I N P R E C I P I T A T E E t h a n o l - e t h e r 5 0 m l ( 3 : 1 v / v ) 2 h r a t - 1 0 ° C P R O T E I N P R E C I P I T A T E -P R O T E I N -5 0 m l e t h e r 16 h r a t - 1 0 ° C P R E C I P I T A T E W a s h 3 X w i t h E t h e r D r y u n d e r N„ SUPERNATANT ( d i s c a r d ) SUPERNATANT ( d i s c a r d ) T O T A L a p o V L D L ( s t o r e u n d e r N 2 a t - 1 0 ° C ) F i g u r e 3 . E t h a n o l - e t h e r d e l i p i d a t i o n o f V L D L (MF) ( f r o m S c a n u & E d e l s t e i n , 1 9 7 1 ) - 2 3 -a l l o w e d t o e x t r a c t o v e r n i g h t a t - 1 0 ° C . T h e m i x t u r e w a s t h e n c e n t r i f u g e d a s a b o v e a n d t h e p r e c i p i t a t e s w e r e c o m b i n e d , w a s h e d 3 X w i t h e t h e r , d r i e d u n d e r p u r i f i e d n i t r o g e n a n d s t o r e d a t - 1 0 ° C i n a d e s i c c a t o r . T h i s f r a c t i o n w a s t h e t o t a l a p o V L D L . T h e a m o u n t o f l i p i d r e m a i n i n g i n t h e a p o V L D L a f t e r d e l i p i d a t i o n w a s d e t e r m i n e d b y r e - e x t r a c t i o n w i t h c h l o r o f o r m - m e t h a n o l 2 : 1 ( v / v ) . T h e e x t r a c t w a s a n a l y z e d f o r t h e p r e s e n c e o f l i p i d s b y t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ( S c a n u , 1 9 6 6 ) . b . S o d i u m d e o x y c h ' o l a t e d e t e r g e n t d e l i p i d a t i o n S a m p l e s o f V L D L w e r e d i a l y s e d a g a i n s t 0 . 1 5 M N a C l , 0 . 0 5 M N a H C 0 3 ( p H 1 0 ) f o r 4 8 h o u r s a t 4 ° C ( H e l e n i u s a n d S i m o n s , 1 9 7 1 ) . S o l i d s o d i u m d e o x y c h o l a t e w a s a d d e d t o t h e l i p o p r o t e i n s o l u t i o n ( 1 1 . 5 mg NaDOC/mg V L D L ( M F ) ) a n d i n c u b a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e f o r 2 h o u r s p r i o r t o g e l f i l t r a t i o n . P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n w a s d e t e r m i n e d b y t h e m e t h o d o f L o w r y ejt a l . ( 1 9 5 1 ) u s i n g a B SA s t a n d a r d . SDS ( 0 . 1 % w / v ) w a s a d d e d t o t h e r e a c t i o n m i x t u r e t o c l e a r l i p i d o p a l e s c e n c e w h i c h i n t e r f e r e d i n t h e p r o t e i n d e t e r m i n a t i o n . T h e a p p r o x i m a t e V L D L (MF) c o n c e n t r a t i o n w a s c a l c u l a t e d b y m u l t i p l y i n g t h e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n b y t h e f a c t o r 7 . 1 4 , o b t a i n e d f r o m t h e ( p r o t e i n + l i p i d ) / p r o t e i n r a t i o . T h e V L D L (MF) p l u s NaDOC s a m p l e w a s a p p l i e d t o a 4 0 x 2 . 5 cm c o l u m n o f S e p h a d e x G - 2 0 0 s u p e r f i n e a n d e l u t e d a t a f l o w r a t e o f 4 . 4 m l / h r w i t h 0 . 0 5 M N a H C O ^ , 0 . 1 5 M N a C l ( p H 1 0 ) c o n t a i n i n g 10 mM NaDOC. - 24 -T h e g e l f i l t r a t i o n w a s p e r f o r m e d a t r o o m t e m p e r a t u r e i n a n a s c e n d i n g f a s h i o n . S a m p l e v o l u m e s w e r e l e s s t h a n 2% o f t h e t o t a l b e d v o l u m e . B l u e D e x t r a n 2 0 0 0 a n d m e r c a p t o e t h a n o l w e r e u s e d t o d e t e r m i n e t h e V a n d V p o s i t i o n s o f t h e c o l u m n . o t P r o t e i n w a s d e t e r m i n e d b y a b s o r b a n c e a t 2 8 0 n m ; p h o s p h o r u s w a s m e a s u r e d d i r e c t l y f r o m t h e e l u t e d f r a c t i o n s a c c o r d i n g t o B a r t l e t t ( 1 9 5 9 ) a n d t h e a m o u n t o f p h o s p h o l i p i d c a l c u l a t e d b y m u l t i p l y i n g t h e a m o u n t o f l i p i d p h o s p h o r u s b y 2 5 . T o t a l c h o l e s t e r o l f r o m t h e e l u a n t f r a c t i o n s w a s a s s a y e d b y t h e m e t h o d o f P e a r s o n e t a l . ( 1 9 5 3 ) . T h e b i l e s a l t w a s r e m o v e d b y c o n c e n t r a t i n g t h e p r o t e i n p e a k b y u l t r a f i l t r a t i o n (PM 3 0 m e m b r a n e ) a n d s u b j e c t i n g i t t o g e l f i l t r a t i o n i n d e t e r g e n t f r e e m e d i u m . T h e p r o t e i n - d e t e r g e n t c o m p l e x w a s a p p l i e d t o a 3 8 x 2 cm c o l u m n o f S e p h a d e x G - 7 5 a n d e l u t e d a t a f l o w r a t e o f 1 8 0 m l / h r w i t h 0 . 1 M T r i s - H C l b u f f e r ( p H 9 . 0 ) . T h e p r o t e i n p e a k , w h i c h e l u t e d i n t h e v o i d v o l u m e , w a s c o n c e n t r a t e d b y u l t r a - f i l t r a t i o n u s i n g a P M 1 0 m e m b r a n e . T h i s a p o p r o t e i n w a s t h e n s u b j e c t e d t o p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s i n t h e p r e s e n c e o f SDS ( s e c t i o n D . 3 d . ) . NaDOC i n t h e c o l u m n e l u a t e s w a s d e t e r m i n e d a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e o f M o s b a c h e t a l . ( 1 9 5 4 ) . T h e d e l i p i d a t e d - d e t e r g e n t f r e e a p o p r o t e i n w a s e x t r a c t e d b y t h e m e t h o d o f F o l c h e_t a l . ( 1 9 5 7 ) a n d t h e e x t r a c t e x a m i n e d f o r t h e p r e s e n c e o f l i p i d s b y t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y o n S i l i c a G e l G ( h e x a n e : e t h e r : a c e t i c a c i d , 9 0 : 1 0 : 1 a n d c h l o r o f o r m : m e t h a n o l : c o n c . NH^OH, 7 5 : 2 5 : 4 ) . T h e a p o p r o t e i n w a s a l s o c h e m i c a l l y e x a m i n e d f o r s p e c i f i c l i p i d c l a s s e s a s m e n t i o n e d a b o v e . - 25 -C l . A g a r o s e g e l f i l t r a t i o n o f a p o V L D L a . G e l f i l t r a t i o n o n S e p h a r o s e 6B c o n t a i n i n g 8M u r e a F o l l o w i n g d e l i p i d a t i o n w i t h e t h a n o l - e t h e r ( 3 : 1 v / v ) o r NaDOC, t h e V L D L (MF) a p o p r o t e i n w a s s o l u b i l i z e d i n 0 . 1 M T r i s - H C l , 0 . 0 0 3 M EDTA b u f f e r ( pH 8 . 6 ) c o n t a i n i n g 8M u r e a ( E d e l s t e i n e t a l . , 1 9 7 2 ) . T h e a p o p r o t e i n s o l u t i o n ( 2 5 mg p r o t e i n ) , w a s a p p l i e d t o a 8 0 x 2 cm w a t e r j a c k e t e d c o l u m n o f S e p h a r o s e 6B c o n t a i n i n g 8M u r e a a n d e l u t e d w i t h t h e s a m e b u f f e r a t a f l o w r a t e o f 8 0 m l / h r a t 1 0 ° C . P r o t e i n i n t h e e l u a t e s w a s d e t e c t e d b y a b s o r b a n c e a t 2 8 0 nm. S e v e r a l l a b o r a t o r i e s h a v e r e p o r t e d o n t h e c a r b a m y l a t i o n o f p e p t i d e s a f t e r e x p o s u r e t o u r e a s o l u t i o n s c o n t a i n i n g c y a n a t e s ( H e r b e r t e t a l . , 1 9 7 3 ; E d e l s t e i n e t a l . , 1 9 7 2 ; F i d g e , 1 9 7 6 ) . I n o r d e r t o a v o i d f o r m a t i o n o f c y a n a t e i n t h e c o n c e n t r a t e d s o l u t i o n s o f u r e a e m p l o y e d , t h e s e s o l u t i o n s w e r e a l w a y s f r e s h l y m a d e a n d f i l t e r e d t h r o u g h a m i x e d i o n - e x c h a n g e r e s i n b e f o r e u s e . F r a c t i o n a t i o n w a s c a r r i e d o u t i n T r i s b u f f e r s a t 1 0 ° C a n d t h e e l u t e d p r o t e i n f r a c t i o n w a s r a p i d l y f r e e d o f u r e a b y d i a l y s i s a g a i n s t w a t e r . b . G e l f i l t r a t i o n o n S e p h a r o s e 6B c o n t a i n i n g SDS V L D L a p o p r o t e i n w a s s o l u b i l i z e d i n 0 . 1 M T r i s - H C l , 0 . 0 1 % EDTA b u f f e r ( pH 8 . 0 ) . T h e s a m p l e w a s m a d e 0 . 1 M w i t h r e s p e c t t o SDS , a n d t h i s a p o p r o t e i n - S D S s o l u t i o n w a s i n c u b a t e d f o r 6 h r a t 3 7 ° C p r i o r t o g e l f i l t r a t i o n ( B r o w n e t a l . , 1 9 6 9 ) . T h e a p o p r o t e i n - S D S - 26 -m i x t u r e (25 mg p r o t e i n ) , was a p p l i e d t o a 100 x 2 cm c a l i b r a t e d column o f Sepharose 6B c o n t a i n i n g 2 mM SDS. The sample was e l u t e d a t a f l o w r a t e o f 30 m l / h r w i t h 0.002M SDS i n 0.1M T r i s -H C l b u f f e r and a b s o r b a n c e was m o n i t o r e d a t 280 nm. The f r a c t i o n s were c o n c e n t r a t e d b y u l t r a c e n t r i f u g a t i o n a t 78,000 x g f o r 8 h r and d i a l y z e d a g a i n s t T r i s - H C l b u f f e r i n t h e ab s e n c e o f SDS o r a g a i n s t d i s t i l l e d w a t e r . The T r i s s o l u b l e , d e t e r g e n t - f r e e a p o p r o t e i n s p r o d u c e d were s u b j e c t e d t o m o l e c u l a r w e i g h t d e t e r m i n a t i o n i n t h e a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e u s i n g UV a b s o r p t i o n o p t i c s as d e s c r i b e d i n s e c t i o n D.3b. F r a c t i o n s d i a l y z e d a g a i n s t w a t e r were l y o p h i l i z e d and s u b j e c t e d t o p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s i n t h e p r e s e n c e o f SDS ( s e c t i o n D.3d). D . l . A n a l y t i c a l p r o c e d u r e s : E l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n o f p r e s t a i n e d l i p o p r o t e i n s A GE-4 g e l e l e c t r o p h o r e s i s a p p a r a t u s ( P h a r m a c i a F i n e C h e m i c a l s ) was u s e d f o r d i s c g e l e l e c t r o p h o r e s i s . A l l e x p e r i m e n t s were c o n d u c t e d u s i n g an a g a r o s e g e l c o n c e n t r a t i o n o f 0.5% (w/v). Sudan b l a c k B s t a i n was p r e p a r e d a c c o r d i n g t o t h e method o f R i b i e r o and McDonald ( 1 9 6 3 ) . E t h y l e n e o r p r o p y l e n e g l y c o l was h e a t e d t o 100-110°C and t h e n 0.1 g o f t h e dye was added p e r 10 m l o f t h e s o l v e n t . (The s o l v e n t t e m p e r a t u r e must n o t e x c e e d 110°C o r a g e l a t i n o u s m i x t u r e w i l l r e s u l t . ) The m i x t u r e was t h o r o u g h l y s t i r r e d f o r 5 m i n and f i l t e r e d , f i r s t w h i l e h o t , t h e n a g a i n when c o o l e d t o room t e m p e r a t u r e , t h r o u g h Whatman No. 2 f i l t e r p a p e r . - 27 -T h e d y e c o n c e n t r a t i o n o f t h e f i n a l s o l u t i o n w a s a p p r o x i m a t e l y 0 . 5 % a n d w a s s t a b l e f o r o n e m o n t h w h e n s t o r e d i n t h e d a r k . A 0 . 5 % ( w / v ) a g a r o s e g e l w a s p r e p a r e d b y a d d i n g 0 . 1 1 6 g o f e l e c t r o p h o r e t i c g r a d e a g a r o s e t o 2 2 . 6 m l o f d i s t i l l e d w a t e r , a n d r e f l u x i n g f o r 15 m i n u t e s a t 1 0 0 ° C w h i l e s t i r r i n g v i g o r o u s l y t o p r e v e n t b u r n i n g ( P e a c o c k a n d D i n g m a n , 1 9 6 8 ; N o b l e , 1 9 6 8 ) . T h e a g a r o s e s o l u t i o n w a s c o o l e d s l o w l y t o a p p r o x i m a t e l y 5 5 ° C t h e n 6 . 2 m l d i s t i l l e d w a t e r a n d 3 . 2 m l b u f f e r A ( 2 4 m l I N H C l , 1 8 . 1 g T r i s , w a t e r t o 1 0 0 m l , p H 8 . 8 - 9 . 0 ) w e r e a d d e d . T h e w a r m a g a r o s e s o l u t i o n ( 1 . 5 m l ) w a s d r a w n u p i n t o a w a r m p i p e t , d e l i v e r e d i n t o g l a s s e l e c t r o p h o r e s i s t u b e s , a n d l a y e r e d w i t h w a t e r t o e n s u r e a f l a t m e n i s c u s . T h e t u b e s w e r e c o o l e d t o 4 0 - 4 5 ° C v e r y s l o w l y i n a w a t e r b a t h t o a l l o w s e t t i n g o f t h e a g a r o s e g e l . V L D L (MF ) w a s d i a l y z e d f o r 4 8 h r a g a i n s t 0 . 0 0 1 6 M T r i s , 0 . 0 0 7 9 M g l y c i n e b u f f e r ( p H 8 . 6 ) a t 4 ° C p r i o r t o p r e s t a i n i n g . P r e s t a i n i n g w a s a c c o m p l i s h e d b y s l o w l y a d d i n g a 0 . 5 m l s a m p l e o f V L D L (MF) t o 0 . 1 m l o f t h e d y e s o l u t i o n . T h e v i a l w a s f l u s h e d w i t h n i t r o g e n , s e a l e d f o r 1 h r a t r o o m t e m p e r a t u r e , t h e n s t o r e d f o r 24 h r a t 4 ° C p r i o r t o e l e c t r o p h o r e s i s . T h e e x c e s s d y e w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( F i s h e r m i n i - c e n t r i f u g e ) a t 6 0 0 0 x g f o r 5 m i n . A l i q u o t s o f 1 0 - 3 0 p i o f t h i s p r e s t a i n e d s a m p l e d w e r e a p p l i e d t o e a c h g e l . D i s c g e l e l e c t r o p h o r e s i s w a s c o n d u c t e d a t p H 9 . 5 a s d e s c r i b e d b y O r n s t e i n a n d D a v i s ( 1 9 6 4 ) e x c e p t t h a t t h e s a m p l e a n d s t a c k i n g g e l s w e r e o m i t t e d . S o l u t i o n B ( 4 8 m l I N H C l , 5 . 9 8 g T r i s , w a t e r t o 1 0 0 m l , p H 6 . 6 - 6 . 8 ) w a s d i l u t e d w i t h a 2 0 % ( w / v ) s u c r o s e s o l u t i o n - 28 -a n d w a t e r t o o b t a i n s o l u t i o n s w h i c h w e r e u s e d i n p l a c e o f t h e u p p e r g e l s o l u t i o n f o r t h e s a m p l e l a y e r . T h e V L D L (MF) s a m p l e s w e r e m i x e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f s u c r o s e - s o l u t i o n B - 2 X ( 2 0 m l s o l u t i o n B + 6 0 m l 2 0 % s u c r o s e ) . T h i r t y p i o f t h i s m i x t u r e w e r e a p p l i e d o n t o p o f t h e g e l a n d c a r e f u l l y o v e r l a y e r e d w i t h l i g h t s u c r o s e s o l u t i o n B - 1 X ( 1 0 m l s o l u t i o n B + 20 m l 2 0 % s u c r o s e + 5 0 m l d i s t i l l e d w a t e r ) ( N a r a y a n e t a l . , 1 9 6 6 ) . T r i s - g l y c i n e b u f f e r ( p H 8 . 6 ) w a s u s e d i n t h e l o w e r a n d u p p e r e l e c t r o d e b a t h s . T h e t r a c k i n g d y e ( B r o m p h e n o l b l u e ) w a s o m i t t e d f r o m t h o s e g e l s c o n t a i n i n g p r e s t a i n e d l i p o p r o t e i n s . E l e c t r o p h o r e s i s w a s p e r f o r m e d a t 2 . 5 mA p e r t u b e f o r 3 0 - 4 5 m i n ; t h e h e a t g e n e r a t e d w a s n e g l i g i b l e . When s u i t a b l e r e s o l u t i o n o f t h e V L D L (MF) w a s a c h i e v e d , t h e g e l s w e r e r e m o v e d f r o m t h e t u b e s a n d s t o r e d i n 7 . 5 % ( v / v ) a c e t i c a c i d s o l u t i o n . I n i t i a l l y , b o t h s t a i n e d a n d n o n - s t a i n e d s a m p l e s w e r e r u n i n p a r a l l e l t o s t u d y t h e e f f e c t o f t h e d y e s o l u t i o n o n t h e e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y o f V L D L ( M F ) . T h e l a t t e r g e l s w e r e t h e n s t a i n e d f o r 2 - 3 h r w i t h 0 . 2 5 % ( w / v ) C o o m a s s i e B l u e , a n d e l e c t r o p h o r e t i c a l l y d e s t a i n e d i n a P h a r m a c i a G D - 4 d e s t a i n e r u s i n g 7 . 5 % ( v / v ) a c e t i c a c i d a n d 5% ( v / v ) m e t h a n o l . T h e d e s t a i n e d g e l s w e r e t h e n s t o r e d i n 7 . 5 % ( v / v ) a c e t i c a c i d . D . 2 . A n a l y t i c a l p r o c e d u r e s : A n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n o f V L D L (MF) - 29 -a . D a t a a c q u i s i t i o n a n d h a n d l i n g o f d a t a A n o n - l i n e d a t a a c q u i s i t i o n m i n i - c o m p u t e r s y s t e m w a s d e v e l o p e d f o r u s e i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e UV a b s o r p t i o n o p t i c a l s y s t e m , w h i c h i s a n a c c e s s o r y t o t h e B e c k m a n p r e p a r a t i v e u l t r a -c e n t r i f u g e . A s e r i e s o f m i n i - c o m p u t e r p r o g r a m s w e r e w r i t t e n f o r a n a l y z i n g t h e d a t a o b t a i n e d f r o m f l o t a t i o n / s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y a n a l y s e s o f l i p o p r o t e i n s / p r o t e i n s i n t h e u l t r a c e n t r i f u g e . T a b l e I I l i s t s t h e e q u i p m e n t u s e d a n d F i g u r e 4 s h o w s a b l o c k d i a g r a m o f t h e o u t p u t , c o l l e c t i o n , s t o r a g e a n d a n a l y s i s o f d a t a f r o m t h e a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e . T h e s c a n n e r a c c e s s o r y m e a s u r e d c o n c e n t r a t i o n a s t h e a b s o r b a n c e o f UV l i g h t b y t h e p r o t e i n s a m p l e i n s o l u t i o n . T h e l i g h t s o u r c e w a s a s h o r t - a r c m e r c u r y l a m p w i t h a n i n t e r f e r e n c e f i l t e r w h i c h i s o l a t e d a n a r r o w w a v e l e n g t h a r o u n d 2 8 0 nm ( C h e r v e n k a , 1 9 7 6 ) . T h e p h o t o m u l t i p l i e r a s s e m b l y w a s m o u n t e d o n t h e s c a n n e r c a r r i a g e w h i c h m o v e d a c r o s s t h e c e l l a t a c o n s t a n t s p e e d . T h e e l e c t r o n i c s u n i t p r o c e s s e d t h e e l e c t r i c a l s i g n a l f r o m t h e p h o t o m u l t i p l i e r t u b e a n d t h e i n f o r m a t i o n w a s p l o t t e d b y t h e r e c o r d e r a s a b s o r b a n c e o f t h e s a m p l e w i t h r e s p e c t t o r a d i a l d i s t a n c e w i t h i n t h e c e n t r i f u g e c e l l . A m u l t i p l e x e r w a s u s e d t o i d e n t i f y a n d s e p a r a t e t h e o u t p u t f r o m t h e s c a n n e r i n t o c o m p o n e n t s f r o m e a c h c e l l . T h e o u t p u t f r o m t h e u l t r a c e n t r i f u g e w a s r e l a y e d t o t h e t e l e t y p e v i a t h e d i g i t a l v o l t m e t e r a n d d a t a t r a n s f e r u n i t ; t h e mv o u t p u t f r o m t h e s c a n n e r e l e c t r o n i c s u n i t w a s t r a n s f e r r e d a s a d i g i t i z e d s i g n a l t o t h e t e l e t y p e . T h e t e l e t y p e w a s e q u i p p e d w i t h - 3 0 -T a b l e I I . C o m m e r c i a l E q u i p m e n t u s e d i n t h e U l t r a c e n t r i f u g e -UV S c a n n e r - M i n i - C o m p u t e r S y s t e m . 1 ) B e c k m a n L 2 - 6 5 B p r e p a r a t i v e u l t r a c e n t r i f u g e 2 ) B e c k m a n P r e p UV S c a n n e r , e q u i p p e d w i t h : -a ) O p t i c a l u n i t i n s i d e t h e u l t r a c e n t r i f u g e c h a m b e r b ) D o o r m o u n t e d s c a n n e r u n i t c ) E l e c t r o n i c s u n i t d ) P o t e n t i o m e t r i c r e c o r d e r 3 ) S c h l u m b e r g e r - S o l a r t r o n A 2 2 0 d i g i t a l v o l t m e t e r 4 ) S c h l u m b e r g e r - S o l a r t r o n d a t a t r a n s f e r u n i t 5 ) T e x a s I n s t r u m e n t s ( m o d e l 7 3 3 A S R ) S i l e n t 7 0 0 t e l e t y p e t e r m i n a l 6 ) M o n r o e ( m o d e l 1 8 8 0 ) s c i e n t i f i c p r o g r a m m a b l e p r i n t i n g c a l c u l a t o r 7 ) M o n r o e ( m o d e l P L - 2 ) d i g i t a l X - Y p l o t t e r U L T R A C E N T R I F U G E P R E P . U . V . SCANNER M U L T I P L E X E R P O T E N T I O M E T R I C RECORDER SCANNER E L E C T R O N I C S U N I T D I G I T A L VOLTMETER (DVM) DATA T R A N S F E R U N I T (DTTJ) T E L E T Y P E ( T T Y ) H I G H SPEED P R I N T E R C A S S E T T E T A P E STORAGE MONROE CALCULATOR X - Y P L O T T E R g u r e 4 . D a t a f l o w f r o m t h e B e c k m a n P r e p U . V . S c a n n e r a n d U l t r a c e n t r i f u g e . - 3 2 -a h i g h s p e e d s i l e n t p r i n t e r , w h i c h r e c o r d e d t h e d a t a o n p a p e r ( h a r d c o p y ) a n d o n c a s s e t t e t a p e ( s o f t c o p y ) p e r m i t t i n g r e t r i e v a l o f d a t a f o r s u b s e q u e n t m a n i p u l a t i o n w i t h t h e M o n r o e c a l c u l a t o r . T h e f o l l o w i n g m i n i - c o m p u t e r p r o g r a m s w e r e w r i t t e n t o p r o c e s s t o i n c o m i n g i n f o r m a t i o n f r o m t h e a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e i n t o f l o t a t i o n / s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t s o f t h e l i p o p r o t e i n / p r o t e i n s a m p l e s : ( 1 ) T T Y - s u b r o u t i n e : A l l o w e d f o r r e t r i e v a l o f d a t a s t o r e d o n c a s s e t t e t a p e a n d t h e t r a n s f e r o f t h i s i n f o r m a t i o n t o t h e m a i n d a t a s t o r a g e r e g i s t e r s o f t h e m i n i - c o m p u t e r ( M o n r o e p r o g r a m ) . ( 2 ) D e r i v a t i v e p r o g r a m w i t h p l o t r o u t i n e : R e c a l l e d d a t a f r o m t h e m i n i - c o m p u t e r m e m o r y , c a l c u l a t e d t h e d e r i v a t i v e o f c o n c e n t r a t i o n w i t h r e s p e c t t o r a d i a l d i s t a n c e ( d c / d x ) a n d d e t e r m i n e d ( a ) t h e t i m e i n s e c o n d s a n d ( b ) t h e l n o f d i s t a n c e (cm) f r o m c e n t e r o f r o t a t i o n f o r e a c h d e r i v a t i v e p o i n t . T h e d e r i v a t i v e c u r v e f o r e a c h s c a n w a s s i m u l t a n e o u s l y p l o t t e d , a l l o w i n g f o r e a s y l o c a t i o n o f t h e b o u n d a r y p o s i t i o n w h i c h may n o t b e r e a d i l y a p p a r e n t f r o m t h e c o n c e n t r a t i o n c u r v e o b t a i n e d f r o m t h e UV s c a n n e r o u t p u t ( p r o g r a m l i s t e d i n A p p e n d i x ) . ( 3 ) L i n e a r r e g r e s s i o n w i t h p l o t r o u t i n e : U t i l i z e d t h e d a t a c a l c u l a t e d f r o m t h e p r e v i o u s d e r i v a t i v e p l o t t i n g p r o g r a m . T h e c a l c u l a t e d d a t a f r o m t h e p o i n t w h i c h w a s t h e c e n t e r o f t h e b o u n d a r y p o s i t i o n w a s p l o t t e d , r e g r e s s i o n a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d a n d t h e o b s e r v e d f l o t a t i o n / s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t c a l c u l a t e d u s i n g e q u a t i o n 1 . A s h o r t s u b r o u t i n e a t t h e e n d o f t h e p r o g r a m - 33 -c o n v e r t e d t h e o b s e r v e d f l o t a t i o n / s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t t o s t a n d a r d c o n d i t i o n s . ( M o n r o e l i n e a r r e g r e s s i o n p r o g r a m , w i t h p l o t t i n g r o u t i n e a n d Sf a n d S „ _ s u b r o u t i n e a d d e d ) . 1 d i n x S , o r F , .= — — — ( E q u a t i o n 1 ) o b s o b s ^ 2 d t M w h e r e t = t i m e i n s e c o n d s x = r a d i a l d i s t a n c e f r o m t h e c e n t e r o f r o t a t i o n ( cm) (*> = a n g u l a r v e l o c i t y ( r a d i a n s / s e c ) b . F l o t a t i o n / s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y u l t r a c e n t r i f u g a t i o n F l o t a t i o n / s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y m e a s u r e m e n t s w e r e p e r f o r m e d i n a B e c k m a n L 2 - 6 5 B u l t r a c e n t r i f u g e e q u i p p e d w i t h UV a b s o r p t i o n o p t i c s . A n a l y t i c a l r u n s w e r e m a d e u s i n g e i t h e r a n A N - D ( 2 - h o l e ) o r a n A N - F ( 4 - h o l e ) r o t o r . T h e u s e o f t h e A N - F r o t o r a l l o w e d t h r e e s e p a r a t e s a m p l e s t o b e r u n s i m u l t a n e o u s l y . T w e l v e mm d o u b l e s e c t o r c e l l s w i t h e p o n a l u m i n i u m - f i l l e d c e n t e r -p i e c e s a n d q u a r t z w i n d o w s w e r e u s e d f o r a l l r u n s . V L D L (MF) s a m p l e s w e r e d i a l y z e d a g a i n s t t h e a p p r o p r i a t e b u f f e r a n d d i l u t e d w i t h t h e d i a l y s a t e t o 0 . 5 - 0 . 9 a b s o r b a n c e u n i t s p r i o r t o a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n . A l l b u f f e r s u s e d f o r f l o t a t i o n a n a l y s i s c o n t a i n e d 0 . 0 2 5 M s o d i u m p h o s p h a t e a n d 0 . 0 1 % EDTA (pH 7 . 0 ) . C e n t r i f u g a t i o n w a s p e r f o r m e d a t 1 8 , 0 0 0 - 34 -r p m , i n N a C l s o l u t i o n s o f d e n s i t y 1 . 0 6 3 0 g / m l o r 1 . 0 3 8 5 g / m l a t 2 0 ° C . S e d i m e n t a t i o n a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d i n t h e f o l l o w i n g b u f f e r s : ( a ) 0 . 2 M T r i s - H C l ( pH 8 . 2 ) a n d ( b ) 0 . 0 1 M N a C l , 0 . 0 2 5 M T r i s - H C l ( p H 7 . 2 ) . UV s c a n s w e r e t a k e n a t 2 - 4 m i n u t e i n t e r v a l s , a n d r e c o r d e d o n p a p e r a n d c a s s e t t e t a p e . T h e o b s e r v e d f l o t a t i o n / s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t s w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e s l o p e o f t h e l i n e d e r i v e d b y p l o t t i n g t h e n a t u r a l l o g a r i t h m o f t h e d i s t a n c e f r o m t h e c e n t e r o f r o t a t i o n t o t h e a p e x o f t h e l i p o p r o t e i n p e a k ( d e r i v a t i v e p l o t ) a s a f u n c t i o n o f t i m e . T h e o b s e r v e d f l o t a t i o n c o e f f i c i e n t s w e r e c o n v e r t e d t o s t a n d a r d S^ u n i t s a s o u t l i n e d b y D e L a l l a a n d G o f m a n ( 1 9 5 4 ) u s i n g t h e s h o r t s u b r o u t i n e s i n t h e l i n e a r r e g r e s s i o n p l u s p l o t t i n g p r o g r a m . H y d r a t e d d e n s i t y , ^ , w a s d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g t h e f l o t a t i o n c o e f f i c i e n t s o f V L D L a t 4 d i f f e r e n t s o l v e n t d e n s i t i e s , o b t a i n e d b y d i a l y z i n g t h e l i p o p r o t e i n i n v a r i o u s N a C l s o l u t i o n s c o n t a i n i n g 0 . 0 1 % EDTA a n d 0 . 0 2 5 M s o d i u m p h o s p h a t e ( p H 7 . 0 ) . T h e d e n s i t i e s a n d v i s c o s i t i e s o f t h e b u f f e r s o l u t i o n s w e r e d e r i v e d f r o m p o l y n o m i a l e q u a t i o n s 2 a n d 3 ( I n t e r n a t i o n a l C r i t i c a l T a b l e s , 1 9 2 7 ) . V a l u e s f o r t h e h y d r a t e d d e n s i t y w e r e o b t a i n e d b y e x t r a p o l a t i n g t h e s?f v s /a d a t a t o z e r o f l o t a t i o n . T h e v a l u e f o r t h e p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e , v , w a s o b t a i n e d f r o m t h e r e l a t i o n v = l/^o ( L i n d g r e n et_ al., 1 9 6 9 ) . /0 = 4 . 0 6 7 x 1 0 _ 2 M - 3 . 2 2 7 x 1 0 _ 4 M 2 - 1 . 5 8 5 x 1 0 ~ 4 M 3 + 1 . 0 0 0 ( E q u a t i o n 2 ) 7 = 1 . 07 x 10~^c? + 7 . 9 0 x 10~^/> + 1 . 2 7 3 5 ( E q u a t i o n 3 ) - 35 -where ^ = s o l v e n t d e n s i t y (g/ml) = s o l v e n t v i s c o s i t y ( c e n t i p o i s e s ) M = m o l a r i t y o f N a C l s o l u t i o n D.3. A n a l y t i c a l p r o c e d u r e s : P h y s i c a l s t u d i e s o f VLDL (MF) a p o p r o t e i n s a. C a l i b r a t i o n o f Sepharose columns f o r m o l e c u l a r w e i g h t d e t e r m i n a t i o n s l i p o p r o t e i n and a p o p r o t e i n f r a c t i o n s were d e t e r m i n e d w i t h a g a r o s e g e l f i l t r a t i o n columns c a l i b r a t e d w i t h n o n - e n z y m a t i c p r o t e i n s o f known m o l e c u l a r w e i g h t s . The s t a n d a r d p r o t e i n s and t h e i r r e s p e c t i v e m o l e c u l a r w e i g h t s a r e l i s t e d i n T a b l e I I I . The v o i d volume and t o t a l bed volume were d e t e r m i n e d u s i n g B l u e D e x t r a n 2000 and t r y p t o p h a n , r e s p e c t i v e l y . The d i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n t s f o r t h e s t a n d a r d p r o t e i n s and samples were c a l c u l a t e d u s i n g e q u a t i o n 4 ( A c k e r s , 1 9 6 7 ) . The a p p r o x i m a t e m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e p a r t i a l l y d e l i p i d a t e d V - V K e o ( E q u a t i o n 4) av o where K = d i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n t av V g = e l u t i o n volume f o r t h e p r o t e i n (ml) V = v o i d volume o f t h e column (ml) o V = t h e t o t a l bed volume (ml) - 3 6 -T a b l e I I I . M o l e c u l a r W e i g h t M a r k e r s f o r C a l i b r a t i o n o f G e l F i l t r a t i o n C o l u m n s . D , „ f „ . P M o l e c u l a r W e i g h t P r o t e i n S o u r c e , , , f ( d a l t o n s ) O v a l b u m i n e g g w h i t e 4 5 , 0 0 0 C o n a l b u m i n e g g w h i t e , T y p e I 8 5 , 0 0 0 ^ - g l o b u l i n h u m a n c o h n F I I 3 1 0 , 0 0 0 - 37 -A p l o t o f K v e r s u s t h e l o g a r i t h m o f t h e m o l e c u l a r w e i g h t o f e a c h s t a n d a r d p r o t e i n w a s l i n e a r w i t h i n t h e f r a c t i o n a t i o n r a n g e o f t h e g e l s e m p l o y e d . M o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e s a m p l e s w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e l e a s t s q u a r e s f i t r e g r e s s i o n e q u a t i o n o f t h e d a t a p l o t t e d a s K v e r s u s l o g m o l e c u l a r w e i g h t , a v b . S e d i m e n t a t i o n e q u i l i b r i u m s t u d i e s S e d i m e n t a t i o n e q u i l i b r i u m s t u d i e s w e r e c a r r i e d o u t i n a B e c k m a n L 2 - 6 5 B u l t r a c e n t r i f u g e e q u i p p e d w i t h UV a b s o r p t i o n o p t i c s . E q u i l i b r i u m r u n s w e r e p e r f o r m e d a t 1 0 , 0 0 0 a n d 1 5 , 0 0 0 r p m a t 2 0 ° C u s i n g 12 mm d o u b l e s e c t o r c e l l s w i t h q u a r t z w i n d o w s f i t t e d i n a 4 -p l a c e A N - F r o t o r . P r o t e i n s w e r e s t u d i e d a t c o n c e n t r a t i o n s o f 0 . 2 - 0 . 3 a b s o r b a n c e u n i t s i n 0 . 1 M T r i s - H C l b u f f e r ( p H 8 . 0 ) . E q u i l i b r i u m w a s a s s u m e d a f t e r s u c c e s s i v e s c a n s a t 2 8 0 nm s h o w e d n o c h a n g e i n e q u i l i b r i u m p a t t e r n . T h e v a l u e s f o r t h e a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t , Mw , w e r e o b t a i n e d f r o m e q u a t i o n 5 . a p p 2RT d i n c f r , M w = o — r ( E q u a t i o n 5 ) a p p — . 2 2 ^ v * ( 1 - v / j ) a) d r w h e r e R = U n i v e r s a l g a s c o n s t a n t ( 8 . 3 1 3 x l O ^ e r g s / d e g r e e / m o l e ) T = t e m p e r a t u r e ( ° K ) v = p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e o f t h e p r o t e i n ( m l / g ) / O = s o l v e n t d e n s i t y ( g / m l ) c = c o n c e n t r a t i o n ( a b s o r b a n c e a t 2 8 0 nm) - 38 -r = r a d i a l d i s t a n c e f r o m t h e c e n t e r o f r o t a t i o n ( cm) o5 = a n g u l a r v e l o c i t y ( r a d i a n s / s e c ) 2 T h e t e r m d i n c / d r w a s o b t a i n e d f r o m t h e s l o p e o f t h e l e a s t s q u a r e s 2 r e g r e s s i o n l i n e o f t h e d a t a p l o t t e d a s l n c v s . r . A l l d a t a w e r e <, r e c o r d e d u s i n g t h e T T Y - d a t a a c q u i s i t i o n s y s t e m d e s c r i b e d i n s e c t i o n D . 2 a . A l l c o m p u t a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t i n t h e M o n r o e 1 8 8 0 c a l c u l a t o r u s i n g p r o g r a m s w r i t t e n b y v a n d e V o o r t ( 1 9 7 6 ) . 2 D a t a f r o m p l o t s o f I n c v s . r e x h i b i t i n g s u b s t a n t i a l c u r v a t u r e w e r e c o m p u t e r f i t t e d t o a l e a s t - s q u a r e s p o l y n o m i a l o f 2 2 s e c o n d o r d e r ( l n c = a + b x + c x ) , a n d v a l u e s o f d i n c / d r w e r e o b t a i n e d b y t a k i n g t h e f i r s t d e r i v a t i v e o f t h e p o l y n o m i a l a t e a c h s q u a r e d m e a s u r e d r a d i a l d i s t a n c e . T h e w e i g h t - a v e r a g e m o l e c u l a r w e i g h t , M , a t e a c h p o i n t w a s c a l c u l a t e d f r o m e q u a t i o n 6 . w M = { 2 R T / ( l - v > ) « j 2 } { d i n c / d r 2 } ( E q u a t i o n 6 ) w » c . P o l y a c r y l a m i d e d i s c g e l e l e c t r o p h o r e s i s i n t e t r a m e t h y l u r e a (TMU) U r e a g e l s w e r e p r e p a r e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f K a n e ( 1 9 7 3 ) o r K a n e e t a l . ( 1 9 7 5 ) , w h i c h i s a m o d i f i c a t i o n o f t h e D a v i s ( 1 9 6 4 ) m e t h o d . G e l s w e r e p r e p a r e d i n 1 2 0 x 6 mm o r 1 0 5 x 8 mm g l a s s t u b e s w i t h 6 5 - 7 5 mm r u n n i n g g e l s ( 5 % , 7 . 5 % o r 1 0% a c r y l a m i d e ) a n d - 39 -1 0 - 1 5 mm s t a c k i n g g e l s ( 3 . 3 % a c r y l a m i d e ) . T h e r e a c t a n t s o l u t i o n s a n d b u f f e r s u s e d a r e l i s t e d i n T a b l e I V . T h e l o w e r r u n n i n g g e l s w e r e f o r m e d b y m i x i n g e q u a l v o l u m e s o f m o n o m e r a n d T r i s - T E M E D s o l u t i o n s , a d d i n g 0 . 6 4 g u r e a / m l o f m i x t u r e a n d f i l t e r i n g t h r o u g h W h a t m a n N o . 5 f i l t e r p a p e r . E q u a l v o l u m e s o f t h i s m o n o m e r - b u f f e r m i x t u r e a n d p e r s u l f a t e s o l u t i o n , w h i c h a l s o c o n t a i n e d 0 . 6 4 g u r e a / m l , w e r e m i x e d . U r e a w a s a d d e d t o t h e s o l u t i o n s j u s t p r i o r t o m i x i n g a n d p o u r i n g o f g e l s i n o r d e r t o a v o i d c y a n a t e f o r m a t i o n . A l a y e r o f d i s t i l l e d w a t e r o n t o p o f t h e g e l a s s u r e d a l e v e l s u r f a c e . G e l a t i o n o c c u r r e d i n a p p r o x i m a t e l y 4 5 m i n u t e s . T h e u p p e r s t a c k i n g g e l s w e r e f o r m e d b y m i x i n g e q u a l v o l u m e s o f t h e m o n o m e r a n d T r i s - p h o s p h a t e s o l u t i o n s a n d a d d i n g 0 . 6 4 g u r e a / m l o f m i x t u r e . A n e q u a l v o l u m e o f r i b o f l a v i n - p e r s u l f a t e m i x t u r e ( 1 : 1 v / v ) c o n t a i n i n g 0 . 6 4 g u r e a / m l w a s a d d e d t o t h e m o n o m e r b u f f e r m i x t u r e . T h i s s t a c k i n g g e l w a s p o u r e d o v e r t h e l o w e r g e l , o v e r l a y e r e d w i t h d i s t i l l e d w a t e r a n d e x p o s e d t o a f l u o r e s c e n t l i g h t f o r 6 0 m i n u t e s t o a l l o w p h o t o p o l y m e r i z a t i o n . T h e V L D L (MF ) w a s d i a l y z e d a g a i n s t 0 . 4 M N a C l , 0 . 0 0 1 M E D T A ( p H 8 . 6 ) f o r 7 2 h r a t 4 ° C . D e l i p i d a t i o n o f V L D L (MF) w a s c a r r i e d o u t e i t h e r o n t o p o f t h e s t a c k i n g g e l o r i n a t e s t t u b e p r i o r t o a p p l i c a t i o n t o t h e g e l . D i a l y z e d s a m p l e s ( 5 0 - 2 0 0 u l ) w e r e p i p e t t e d o n t o t h e s t a c k i n g g e l s . A n e q u a l v o l u m e o f p u r e g l a s s d i s t i l l e d TMU a n d o n e - t e n t h v o l u m e o f f r e s h l y p r e p a r e d s t a n d a r d r e d u c i n g s o l u t i o n - 4 0 -T a b l e I V . R e a g e n t S o l u t i o n s a n d B u f f e r s f o r TMU E l e c t r o p h o r e s i s . R u n n i n g ( s e p a r a t i n g ) g e l s ( a ) M o n o m e r s o l u t i o n ( b ) T r i s - T E M E D s o l u t i o n ( c ) P e r s u l f a t e s o l u t i o n S t a c k i n g ( u p p e r ) g e l s ( a ) M o n o m e r s o l u t i o n ( b ) T r i s - T E M E D s o l u t i o n ( c ) P h o t o c a t a l y s t ( d ) P e r s u l f a t e s o l u t i o n E l e c t r o d e t a n k b u f f e r s ( a ) U p p e r t a n k b u f f e r ( b ) L o w e r t a n k b u f f e r R e d u c i n g s o l u t i o n s a c r y l a m i d e 0 . 4 g / m l ( 1 0 % ) 0 . 3 g / m l ( 7 . 5 % ) 0 . 2 g / m l ( 5 % ) m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d e 0 . 0 1 1 g / m l ( 0 . 2 8 % ) 2M T r i s - H C l b u f f e r p H 9 . 1 c o n t a i n i n g 0 . 0 0 3 m l T E M E D / m l - 2 6 . 2 5 x 1 0 M ammon ium p e r s u l f a t e ( 0 . 1 4 2 6 g / 1 0 0 m l ) a c r y l a m i d e 0 . 1 3 3 g / m l ( 3 . 3 % ) m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d e 0 . 0 1 1 g / m l ( 0 . 2 8 % ) 0 . 2 4 M T r i s w i t h 0 . 0 0 1 3 m l TEMED p e r m l a d j u s t e d t o pH 6 . 7 w i t h p h o s p h o r i c a c i d 0 . 0 2 7 m g / m l r i b o f l a v i n - 3 4 . 5 x 10 M ammon ium p e r s u l f a t e ( 0 . 1 0 2 7 g / 1 0 0 m l ) T r i s 0 . 0 4 2 5 M G l y c i n e 0 . 0 4 6 5 M , p H 8 . 9 1 T r i s - H C l 0 . 1 2 M , p H 8 . 0 7 ( a ) S t a n d a r d r e d u c i n g a g e n t s 0 . 0 1 0 m l / m l t h i o d i g l y c o l 0 . 0 2 5 m l / m l m e r c a p t o a c e t i c a c i d 0 . 0 2 g / m l EDTA ( d i s s o l v e d i n u p p e r e l e c t r o d e b u f f e r , pH a d j u s t e d t o 8 . 5 w i t h 4N NaOH) ( b ) 0 . 0 1 M d i t h i o e r y t h r i t o l ( c ) 0 . 1 % 2 - m e r c a p t o e t h a n o l - 4 1 -( o r 10 mM DTE o r 0 . 1 % BME) w e r e a d d e d a n d t h i s m i x t u r e w a s i n c u b a t e d f o r 6 0 m i n a t a m b i e n t t e m p e r a t u r e s . F o l l o w i n g t h i s d e l i p i d a t i o n , o n e - t e n t h v o l u m e t r a c k i n g d y e ( 0 . 0 0 1 % B r o m p h e n o l b l u e ) a n d o n e - t e n t h v o l u m e o f 8 0 % s u c r o s e ( w / v ) w e r e a d d e d a n d m i x e d t o i n c r e a s e t h e d e n s i t y o f t h e T M U - w a t e r p h a s e . T h e u p p e r t a n k b u f f e r w a s t h e n l a y e r e d o v e r t h e s a m p l e m i x t u r e . A l t e r n a t i v e l y , t h e d e l i p i d a t i o n a n d r e d u c t i o n c o u l d b e a c c o m p l i s h e d b y i n c u b a t i n g t h e V L D L (MF) s o l u t i o n w i t h t h e TMU a n d r e d u c i n g a g e n t s i n 1 0 x 1 cm g l a s s c e n t r i f u g e t u b e s . T h e s u p e r n a t a n t a n d t h e i n s o l u b l e p r o t e i n w e r e r a p i d l y s e p a r a t e d f r o m e a c h o t h e r f o l l o w i n g c o n t r i f u g a t i o n a t 5 0 0 0 x g a n d t h e s u p e r n a t a n t w a s t h e n a p p l i e d t o t h e g e l . Some s a m p l e s o f V L D L (MF ) w e r e d e n a t u r e d w i t h 8 M o r 1 0M u r e a a n d r e d u c e d w i t h 1 0 mM D T E , 0 . 1 % BME, o r w i t h t h e s t a n d a r d r e d u c i n g a g e n t s a s a l t e r n a t i v e s t o u s i n g TMU a s t h e d i s s o c i a t i n g a g e n t . A c o n s t a n t c u r r e n t o f 1 . 2 5 mA p e r g e l w a s a p p l i e d t o t h e p r e p a r e d g e l s u n t i l t h e t r a c k i n g d y e e n t e r e d t h e s t a c k i n g g e l , t h e n w a s i n c r e a s e d t o 2 . 5 mA p e r g e l . When t h e t r a c k i n g d y e b a n d h a d m o v e d t o w i t h i n a f e w mm o f t h e b o t t o m o f t h e g e l s , e l e c t r o p h o r e s i s w a s s t o p p e d a n d t h e g e l s w e r e r e m o v e d f o r i m m e d i a t e f i x a t i o n i n 2 0 % ( w / v ) s u l f o s a l i c y l i c a c i d . F o l l o w i n g 16 h r o f f i x a t i o n t h e g e l s w e r e s t a i n e d f o r 4 h r i n 0 . 2 5 % ( w / v ) C o o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e R, t h e n d e s t a i n e d i n 7 . 5 % ( v / v ) a c e t i c a c i d a n d 5% ( v / v ) m e t h a n o l . - 4 2 -c . i . E x t r a c t i o n o f p r o t e i n f r o m u r e a - a c r y l a m i d e g e l s A s e t o f g e l s f r o m TMU e l e c t r o p h o r e s i s w e r e n o t s t a i n e d b u t w e r e p r e p a r e d f o r SDS e l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o f p r o t e i n . G e l s l i c e s c o r r e s p o n d i n g t o e a c h b a n d w e r e c u t o u t a n d c r u s h e d , a n d t h e p r o t e i n w a s e x t r a c t e d w i t h 0 . 0 5 M NaHCC> 3 a n d 0 . 0 5 % SDS ( W e i n e r e t a l . , 1 9 7 2 ) . T h e c r u s h e d g e l s w e r e i n c u b a t e d a t 3 7 ° C f o r 1 2 h r a n d t h e a c r y l a m i d e r e m o v e d b y l o w s p e e d c e n t r i f u g a t i o n a t 3 0 0 0 x g f o r 10 m i n . T h e s u p e r n a t a n t w a s t h e n s u b j e c t e d t o SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ( s e c t i o n D . 3 d ) . d . E l e c t r o p h o r e s i s i n t h e p r e s e n c e o f SDS A P h a r m a c i a d i s c g e l e l e c t r o p h o r e s i s s y s t e m ( m o d e l G E - 4 ) w a s u s e d a n d t h e p r o c e d u r e f o l l o w e d w a s t h a t o f W e b e r a n d O s b o r n e ( 1 9 6 9 ) a n d W e b e r e t a l . ( 1 9 7 2 ) . A c r y l a m i d e g e l s o f 7 . 5 % o r 1 0 % w e r e p r e p a r e d i n 1 2 0 x 6 mm g l a s s t u b e s i n 0 . 1 M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r (pH, 7 . 2 ) c o n t a i n i n g 0 . 1 % SDS , r e c r y s t a l l i z e d 3 X f r o m e t h a n o l . S a m p l e s o f l i p i d - f r e e p r o t e i n ( 1 0 mg) o r s a m p l e s e x t r a c t e d f r o m t h e TMU g e l s , a n d p r o t e i n s o f k n o w n m o l e c u l a r w e i g h t s ( T a b l e V ) , w e r e b o i l e d i n s t o p p e r e d t e s t t u b e s w i t h 0 . 1 m l s a m p l e b u f f e r , 0 . 9 m l o f 8M u r e a , 0 . 0 1 m l BME, a n d 0 . 0 1 5 - 0 . 0 3 g SDS f o r 5 - 1 0 m i n ( D e u t s c h , 1 9 7 6 ) . T h e s a m p l e s o r t h e m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r p r o t e i n s ( 5 - 1 0 p l ) w e r e a p p l i e d i n d i v i d u a l l y t o t h e g e l s ; 8 - 1 0 p l o f 0 . 0 0 1 % ( w / v ) B r o m p h e n o l b l u e a n d o n e d r o p o f g l y c e r o l w e r e a d d e d a n d m i x e d . - 43 -T a b l e V . M o l e c u l a r W e i g h t M a r k e r s f o r SDS E l e c t r o p h o r e s i s P r o t e i n S o u r c e M o l e c u l a r W e i g h t ( d a l t o n s ) BSA d i m e r B SA m o n o m e r O v a l b u m i n b o v i n e b o v i n e e g g w h i t e e t - c h y m o t r y p s i n o g e n b o v i n e l y s o z y m e e g g w h i t e 134,000 67,000 45,000 25,000 14,000 - 44 -T h e g e l s w e r e s u b j e c t e d t o e l e c t r o p h o r e s i s a t c o n s t a n t c u r r e n t o f 2 mA p e r g e l f o r 3 0 m i n a n d 5 mA p e r g e l t h e r e a f t e r i n 0 . 1 M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r , 0 . 1 % SDS ( p H 7 . 2 ) . U p o n c o m p l e t i o n o f e l e c t r o -p h o r e s i s , t h e p o s i t i o n o f t h e t r a c k i n g d y e w a s m a r k e d w i t h a n e e d l e t i p d i p p e d i n I n d i a i n k . T h e g e l s w e r e f i x e d i n 2 0 % ( w / v ) s u l f o s a l i c y l i c a c i d f o r 16 h r , t h e n s t a i n e d w i t h 0 . 2 5 % ( w / v ) C o o m a s s i e B r i l l i a n t B l u e R f o r 4 h r . T h e g e l s w e r e d e s t a i n e d b y d i f f u s i o n i n 5% ( v / v ) m e t h a n o l a n d 7 . 5 % ( v / v ) a c e t i c a c i d , t h e n s c a n n e d i n a T r a n s i d y n e (TG 2 9 8 0 ) s c a n n i n g d e n s i t o m e t e r a t 5 5 0 n m . R e l a t i v e m o b i l i t i e s c o m p a r e d t o t h e t r a c k i n g d y e w e r e c a l c u l a t e d f r o m t h e d e n s i t o m e t r i c t r a c e s a n d t h e d a t a w e r e p l o t t e d a s t h e l o g a r i t h m o f m o l e c u l a r w e i g h t v e r s u s r e l a t i v e m o b i l i t y ( R m ) . A l i n e a r r e g r e s s i o n a n a l y s i s o f t h e d a t a y i e l d e d t h e b e s t f i t l i n e t h r o u g h t h e d a t a p o i n t s . A p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t s w e r e e s t i m a t e d f r o m t h e e q u a t i o n 7 . m L o g MW = a + b R m ( E q u a t i o n 7 ) w h e r e MW m o l e c u l a r w e i g h t a i n t e r c e p t b s l o p e o f t h e r e g r e s s i o n l i n e R m r e l a t i v e m o b i l i t y o f t h e p r o t e i n - 45 -d. i . S t a i n i n g o f g l y c o p r o t e i n s on a c r y l a m i d e g e l s U n s t a i n e d g e l s were t r e a t e d t o remove f r e e and bound SDS p r i o r to s t a i n i n g . Each g e l was i n c u b a t e d o v e r n i g h t a t ambient tempe r a t u r e i n a t l e a s t 80 ml of 25% (v/v) i s o p r o p y l a l c o h o l , 10% (v/v) a c e t i c a c i d . T h i s was f o l l o w e d by a 6-9 h r i n c u b a t i o n i n 10% /(v/v) i s o p r o p y l a l c o h o l , 10% (v/v) a c e t i c a c i d and a f u r t h e r o v e r n i g h t i n c u b a t i o n i n 10% a c e t i c a c i d . The c a r b o h y d r a t e s were then o x i d i z e d and s t a i n e d i n t h e d a r k a t room temperature. Each g e l was i n c u b a t e d i n a t l e a s t 80 ml of 0.5% (w/v) p e r i o d i c a c i d ( H c I 0 ^ ) f o r 2 h r , f o l l o w e d by 0.5% (w/v) -> o sodium a r s e n i t e , 5% (v/v) a c e t i c a c i d f o r 60 min. Two changes o f 1% (w/v) sodium a r s e n i t e , 5% (v/v) a c e t i c a c i d f o r 20 min each completed t h e p e r i o d i c a c i d t r e a t m e n t . The g e l s were th e n t r a n s f e r r e d t o tubes c o n t a i n i n g 20 ml S c h i f f r e a g e n t , l e f t o v e r n i g h t , t h e n r i n s e d i n 0.1% (w/v) sodium m e t a b i s u l f i t e , 0.01N HC1 t o remove e x c e s s s t a i n and r e t a r d f a d i n g . The S c h i f f r e a g e n t was p r e p a r e d by d i s s o l v i n g 16 g N a - m e t a b i s u l f i t e i n 2 l i t e r s water, a d d i n g 21 ml c o n c e n t r a t e d HC1 and 8 g b a s i c f u c h s i n , t h e n s t i r r i n g f o r 2 h r . The s o l u t i o n was a l l o w e d to s t a n d f o r 2 h r p r i o r t o d e c o l o r i z i n g w i t h a s m a l l amount o f Darco G60 c h a r c o a l f i l t e r ( F a i r b a n k s e t a l , , 1971). E . l . C h e m i c a l A n a l y s e s : Amino a c i d a n a l y s i s F r e e z e d r i e d , d e l i p i d a t e d samples were h y d r o l y z e d w i t h - 46 -p - t o l u e n e s u l f o n i c a c i d ( L i u a n d C h a n g , 1 9 7 1 ) . T h e h y d r o l y s i s m i x t u r e w a s p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g 2 . 8 5 g P T S a n d 10 mg 3 - ( 2 -a m i n o e t h y l ) i n d o l e H C l i n 2 . 5 m l o f b o i l i n g w a t e r , t h e n d i l u t i n g t o 5 m l . A 2 . 5 mg s a m p l e o f a p o V L D L w a s d i s s o l v e d i n 1 m l o f t h i s h y d r o l y s i s m i x t u r e , s e a l e d i n h y d r o l y s i s t u b i n g , a n d f r o z e n i n a d r y i c e - a c e t o n e b a t h . E a c h h y d r o l y s i s t u b e w a s e v a c u a t e d t o 2 0 - 3 0 um Hg a n d f l u s h e d 3 t i m e s w i t h n i t r o g e n . S a m p l e s w e r e h y d r o l y z e d f o r 2 2 , 24 o r 3 6 h r a t 1 1 0 ° C , t h e n a n a l y z e d o n a P h o e n i x m o d e l M 6 8 0 0 a m i n o a c i d a n a l y z e r ( P h o e n i x P r e c i s i o n I n s t r u m e n t s C o r p . ) u t i l i z i n g a s i n g l e c o l u m n e l u t i o n t e c h n i q u e . E . 2 . C h e m i c a l A n a l y s e s : C a r b o h y d r a t e a n a l y s i s a . H e x o s e a n d h e x o s a m i n e d e t e r m i n a t i o n S a m p l e s o f l i p i d - f r e e p r o t e i n w e r e h y d r o l y z e d i n s e a l e d h y d r o l y s i s t u b e s f o r 24 h r a t 1 0 0 ° C . E a c h h y d r o l y s i s m i x t u r e c o n t a i n e d 25 mg p r o t e i n , 1 .7 g D o w e x 50W-X2 ( h y d r o g e n f o r m ) c a t i o n e x c h a n g e r e s i n , a n d 3 . 3 m l o f 0 . 1 N H C l . A f t e r h y d r o l y s i s t h e c o n t e n t s o f e a c h t u b e w e r e t r a n s f e r r e d t o a g l a s s c o l u m n e q u i p p e d w i t h a p l u g o f g l a s s w o o l t o p r e v e n t t h e r e s i n f r o m b l o c k i n g t h e l o w e r c o l u m n o u t l e t . T h e h e x o s e s w e r e e l u t e d f r o m t h e r e s i n w i t h d i s t i l l e d w a t e r , a n d t h e h e x o s a m i n e s w i t h 2N H C l ( A b r a h a m e t a l . , 1 9 6 0 ) . T h e w a t e r e l u a t e w a s l y o p h i l i z e d a n d a n a l y z e d f o r h e x o s e - 47 -c o n t e n t u s i n g a m o d i f i e d A n t h r o n e r e a c t i o n ( S h i e l d s a n d B u r n e t t , 1 9 6 0 ) . A g a l a c t o s e a n d m a n n o s e m i x t u r e ( 1 : 1 w/w) a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 0 p g / m l w a s u s e d a s t h e s t a n d a r d . T h e a c i d e l u a t e w a s d r i e d i n a r o t a r y e v a p o r a t o r t o r e m o v e e x c e s s HC1 a n d a n a l y z e d f o r h e x o s a m i n e b y t h e p r o c e d u r e o f E l s o n a n d M o r g a n ( 1 9 3 3 ) . T h e d r i e d a c i d f r a c t i o n w a s d i s s o l v e d i n 2 m l w a t e r a n d 1 m l a l i q u o t s w e r e t r a n s f e r r e d t o t e f l o n l i n e d , s c r e w c a p t e s t t u b e s . One m l o f 2% ( v / v ) a c e t y l a c e t o n e i n I N s o d i u m c a r b o n a t e w a s a d d e d t o e a c h t u b e a n d t h e m i x t u r e w a s i n c u b a t e d f o r 4 5 m i n a t 9 0 ° C . A f t e r c o o l i n g t o r o o m t e m p e r a t u r e , 4 m l o f 9 5 % e t h a n o l a n d 1 m l E h r l i c h ' s r e a g e n t ( 6 7 7 . 5 mg p - d i m e t h y l a m i n o b e n z a l d e h y d e i n 2 5 m l 1 :1 e t h a n o l - c o n c e n t r a t e d H C 1 ) w e r e a d d e d a n d m i x e d t h o r o u g h l y . One h r a f t e r a d d i t i o n o f t h e E h r l i c h ' s r e a g e n t t h e a b s o r b a n c e o f t h e c o l o r e d s o l u t i o n w a s d e t e r m i n e d a t 5 4 0 nm. G l u c o s a m i n e HC1 (2 u g / u l ) w a s u s e d a s t h e s t a n d a r d . b . S i a l i c a c i d d e t e r m i n a t i o n S i a l i c a c i d w a s d e t e r m i n e d u s i n g t h e t h i o b a r b i t u r i c a c i d a s s a y o f W a r r e n ( 1 9 5 9 ) . S i a l i c a c i d ( 0 - 5 p g ) w a s u s e d a s t h e s t a n d a r d . T w e n t y mg o f l i p i d - f r e e p r o t e i n w a s h y d r o l y z e d i n 10 m l o f 0 . 1 N H^SO^ f o r 1 h r a t 8 0 ° C . A 0 . 2 m l a l i q u o t o f s a m p l e w a s m i x e d w i t h 0 . 1 m l o f a s o l u t i o n o f 0 . 2 M s o d i u m m e t a p e r i o d a t e i n 9M p h o s p h o r i c a c i d . T h e s a m p l e s w e r e i n c u b a t e d f o r 20 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e , t h e n 1 m l o f s o d i u m a r s e n i t e s o l u t i o n ( 1 0 % ( w / v ) s o d i u m a r s e n i t e i n a s o l u t i o n - 48 -o f 0 . 5 M s o d i u m s u l f a t e i n 0 . 1 N s u l f u r i c a c i d ) w a s a d d e d t o t h e t u b e s a n d s h a k e n u n t i l t h e y e l l o w c o l o r d i s a p p e a r e d . T h r e e m l o f t h e T B A s o l u t i o n ( 0 . 6 % ( w / v ) T B A i n 0 . 5 M s o d i u m s u l f a t e ) , w e r e a d d e d a n d t h e t u b e s w e r e p l a c e d i n a b o i l i n g w a t e r b a t h f o r 1 5 m i n . T h e t u b e s w e r e c o o l e d a n d 4 . 3 m l o f c y c l o h e x a n o n e w e r e a d d e d t o e x t r a c t t h e c o l o r e d c o m p l e x . T h e r e a c t i o n m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d f o r 2 m i n a t 1 0 0 0 x g a n d t h e a b s o r b a n c e o f t h e t o p ( s o l v e n t ) l a y e r w a s r e a d a t 5 4 9 nm. E . 3 . C h e m i c a l a n a l y s e s : SH a n d SS d e t e r m i n a t i o n S a m p l e s o f V L D L (MF) o r a l k y l a t e d V L D L (MF) w e r e a n a l y s e d f o r t h e i r s u l f h y d r y l a n d d i s u l f i d e c o n t e n t u s i n g E l l m a n ' s r e a g e n t ( B e v e r i d g e e t a l . , 1 9 7 4 ) . S a m p l e s w e r e d i l u t e d t o 1 0 m l w i t h 1% ( w / v ) N a C l i n T r i s - g l y c i n e b u f f e r , p H 8 . 0 , a n d 2 . 9 m l o f 0 . 5 % ( w / v ) SDS i n T r i s - g l y c i n e w a s a d d e d p e r 0 . 1 m l o f t h e d i l u t e d s a m p l e . F o l l o w i n g a d d i t i o n o f 0 . 0 2 m l o f E l l m a n ' s r e a g e n t , SH c o n t e n t w a s d e t e r m i n e d b y a b s o r b a n c e o f 4 1 2 nm ( e q u a t i o n 8 ) . M SH/g 7 3 . 5 3 x A ' 412 x D ( E q u a t i o n 8 ) C w h e r e A ' 412 a b s o r b a n c e a t 4 1 2 nm C p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n i n m g / m l D d i l u t i o n f a c t o r : 3 0 . 2 f o r SH o r 1 5 0 f o r t o t a l SH 7 3 . 5 3 = 1 0 / 1 . 3 6 x 1 0 ; w h e r e 1 . 3 6 x 10 i s t h e m o l a r a b s o r p t i v i t y a n d 1 0 i s t h e c o n v e r s i o n f r o m t h e m o l a r b a s i s t o t h e p M / m l b a s i s a n d f r o m mg t o g . - 49 -D i l u t e d s a m p l e s ( 0 . 2 m l ) f o r SS d e t e r m i n a t i o n w e r e a d d e d t o 1 m l o f 10M u r e a a n d 0 . 0 2 m l o f BME , a n d i n c u b a t e d f o r 1 h r a t r o o m t e m p e r a t u r e . T e n m l o f 1 2 % ( w / v ) T C A w e r e a d d e d t o p r e c i p i t a t e t h e p r o t e i n , w h i c h w a s s e d i m e n t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 5 0 0 0 x g f o r 1 0 m i n . T h i s w a s h i n g p r o c e d u r e w a s r e p e a t e d t w i c e t o r e m o v e BME. T h e p r e c i p i t a t e w a s d i s s o l v e d i n 3 m l o f 0 . 5 % ( w / v ) SDS , a n d d i l u t e d t o 1 0 m l w i t h t h e s a m e s o l v e n t . C o l o r w a s d e v e l o p e d b y a d d i n g 0 . 0 5 m l o f E l l m a n ' s r e a g e n t a n d a b s o r b a n c e w a s m e a s u r e d a t 4 1 2 nm. SS c o n t e n t w a s d e t e r m i n e d b y e q u a t i o n 9 . P r o t e i n c o n c e n t r a t i o n i n t h e s a m p l e s w a s m e a s u r e d b y t h e m e t h o d o f L o w r y e t a l . ( 1 9 5 1 ) . t o t a l uM SH - uM SH _ . uM S S / g = 2 * ( E q u a t i o n 9 ) F . l . UV a b s o r p t i o n s t u d i e s A b s o r b a n c e s p e c t r a o f u n m o d i f i e d V L D L (MF) s a m p l e s w e r e m e a s u r e d w i t h a B e c k m a n DB s p e c t r o p h o t o m e t e r i n s t a n d a r d q u a r t z c u v e t t e s u s i n g a h y d r o g e n l a m p w i t h a 2 0 0 - 4 0 0 nm w a v e l e n g t h r a n g e . - 50 -I V . R E S U L T S AND D I S C U S S I O N A . D a t a a c q u i s i t i o n a n d h a n d l i n g o f d a t a F l o t a t i o n a n d s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y u l t r a c e n t r i f u g a t i o n i s o n e o f t h e m o s t common p h y s i c a l m e t h o d s u s e d f o r t h e s t u d y o f p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f l i p o p r o t e i n s a n d p r o t e i n s i n s o l u t i o n . T h e t i m e a n d l a b o r i n v o l v e d i n t h e m a s s i v e c o l l e c t i o n o f d a t a a n d s u b s e q u e n t c a l c u l a t i o n s c a n b e g r e a t l y r e d u c e d b y a n a u t o m a t i c o n - l i n e d a t a c o l l e c t i n g a n d p r o c e s s i n g s y s t e m . S u c h a s y s t e m w a s d e v e l o p e d f o r u s e i n t h i s r e s e a r c h . T h e u s e o f t h e B e c k m a n P r e p UV S c a n n e r a c c e s s o r y t o t h e u l t r a c e n t r i f u g e i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e d a t a a c q u i s i t i o n e q u i p m e n t d e s c r i b e d i n s e c t i o n D . 2 a . p e r m i t t e d a u t o m a t i c r e c o r d i n g a n d p r o c e s s i n g o f t h e e x p e r i m e n t a l d a t a . T h e f i r s t a p p l i c a t i o n o f t h i s s y s t e m w a s t o c a l c u l a t e t h e d e r i v a t i v e p l o t f r o m t h e u l t r a c e n t r i f u g e s c a n d a t a . A p r o g r a m w a s w r i t t e n f o r t h e M o n r o e c a l c u l a t o r w h i c h c o n v e r t e d t h e UV s c a n n e r mv s i g n a l f r o m a p l o t o f c o n c e n t r a t i o n ( c ) v e r s u s d i s t a n c e f r o m t h e c e n t r e o f r o t a t i o n ( x ) t o t h e d e r i v a t i v e c u r v e o f d c / d x v e r s u s t h e n a t u r a l l o g a r i t h m o f t h e d i s t a n c e f r o m t h e c e n t e r o f r o t a t i o n . T h e p r o g r a m o u t p u t i n c l u d e d t h e l n o f t h e d i s t a n c e f r o m t h e c e n t e r o f r o t a t i o n , t h e t i m e i n s e c o n d s o f t h e c a l c u l a t e d p o i n t , a n d t h e d e r i v a t i v e v a l u e ( d c / d x ) . ' T h e X - Y p l o t t e r d r e w t h e d e r i v a t i v e c u r v e w h i c h i s e s p e c i a l l y u s e f u l i n r e s o l v i n g t w o c o m p o n e n t s y s t e m s t h a t a r e d i f f i c u l t t o m a n u a l l y r e s o l v e i n t o t w o b o u n d a r i e s - 5 1 -( F i g u r e 5 ) . A m i n o r r e v i s i o n o f t h e p r o g r a m w r i t t e n f o r f l o t a t i o n v e l o c i t y a n a l y s i s p e r m i t t e d s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y a n a l y s i s . T h e a x i s o n t h e X - Y p l o t t e r c o u l d b e s c a l e d a n d c a l i b r a t e d t o a n y d e s i r e d d i m e n s i o n s , t o f i t t h e d a t a . E a c h s c a n y i e l d e d o n e s u c h d e r i v a t i v e p l o t a n d o n e s e t o f p o i n t s w h i c h w e r e l a t e r u s e d f o r t h e c a l c u l a t i o n o f t h e f l o t a t i o n o r s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t . T h e s e d a t a ( I n x v s . t i m e ) w e r e t h e p o i n t s a s s o c i a t e d w i t h t h e a p e x p o s i t i o n o f t h e l i p o p r o t e i n f l o a t i n g b o u n d a r y o r p r o t e i n s e d i m e n t i n g b o u n d a r y . T h e d a t a f r o m s e v e r a l s c a n s a t d i f f e r e n t t i m e i n t e r v a l s w e r e c o l l e c t e d a n d e n t e r e d i n t o a s e c o n d p r o g r a m w h i c h c a l c u l a t e d t o o b s e r v e d f l o t a t i o n r a t e o r s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t o f t h e l i p o p r o t e i n o r p r o t e i n r e s p e c t i v e l y . T h i s p r o g r a m , t e r m e d l i n e a r r e g r e s s i o n p l u s p l o t t i n g , p l o t t e d t h e d a t a ( I n x v s . t i m e ) f r o m t h e p r e v i o u s c a l c u l a t i o n , p e r f o r m e d l e a s t s q u a r e s r e g r e s s i o n a n d c a l c u l a t e d t h e s l o p e o f t h e b e s t f i t l i n e t h r o u g h t h e d a t a p o i n t s ( F i g u r e 6 ) . T h e p r o g r a m o u t p u t i n c l u d e d t h e X - Y d a t a p a i r s , t h e a v e r a g e X a n d Y v a l u e , t h e s l o p e a n d i n t e r c e p t o f t h e r e g r e s s i o n e q u a t i o n , a n d t h e s t a t i s t i c a l p a r a m e t e r s o f s t a n d a r d d e v i a t i o n a n d c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t o f t h e p o i n t s . A s e r i e s o f s h o r t s u b r o u t i n e s w a s a d d e d a t t h e e n d o f t h e r e g r e s s i o n p r o g r a m t o c a l c u l a t e t h e o b s e r v e d f l o t a t i o n o r s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t s f r o m t h e s l o p e o f t h e d e r i v e d r e g r e s s i o n l i n e a n d t o c o r r e c t t h e c o e f f i c i e n t s t o t h e s t a n d a r d Sc o r S„_. r 2 0 , w r a t e s . M a n u a l e n t r y o f t h e r e v o l u t i o n s p e r m i n u t e ( r p m ) , t h e l n x (cm) I n x ( cm) F i g u r e 5. UV S c a n n e r t r a c e s a n d d e r i v a t i v e c u r v e s f o r ( A ) o n e a n d ( B ) t w o c o m p o n e n t s y s t e m s . - 53 -Figure 6. Linear regression plot for two component system in flotation velocity run. - 54 -density and viscosity of the buffer solution, and the partial specific volume C v ) of the lipoprotein or protein was required for these calculations. This linear regression plus plotting program i s very versatile. It could be used for manual plotting, or plotting plus regression of the data in the preparation of calibration curves from gel f i l t r a t i o n , SDS gel electrophoresis experiments or Lowry protein determinations. B. Isolation of VLDL (MF) 1. Isolation of FII fraction This investigation was concerned with the isolation and physicochemical characterization of the very low density lipoprotein from the granule fraction of egg yolk. Yolk granules were separated from the plasma by low speed centrifugation of whole yolk diluted with pH 7 water containing 0.01% EDTA. The granules were found to sediment rapidly and this proved to be a more efficient means of their isolation than ultracentrifugation of whole undiluted yolk as performed by Garland (1973). Washed granules were dispersed in 0.025M sodium phosphate buffer containing NaCl (density = 1.063 g/ml), EDTA to inhibit peroxidation of the lipoproteins and sodium azide to inhibit bacterial growth. A l l buffer solutions were routinely adjusted to - 55 -p H 7 . T h e u l t r a c e n t r i f u g e d g r a n u l e s w e r e t h e s o u r c e o f t h e F I I f r a c t i o n w h i c h w a s t h e s t a r t i n g m a t e r i a l f o r i s o l a t i o n o f V L D L ( M F ) . T h e p u r i f i c a t i o n p r o c e d u r e o f G a r l a n d ( 1 9 7 3 ) w a s m o d i f i e d t o a l l o w i s o l a t i o n o f l a r g e q u a n t i t i e s o f V L D L (MF) o n a ( 1 0 0 x 5 cm) c o l u m n o f B i o g e l A - 5 0 M . T h e d e c o m p o s i t i o n o f l i p o p r o t e i n d u r i n g i s o l a t i o n w a s r e t a r d e d b y EDTA a n d t h e p H w a s m a i n t a i n e d a t n e u t r a l i t y . T h e s a l t c o n c e n t r a t i o n o f t h e e l u a n t w a s r e d u c e d f r o m 1 . 7 1 M t o 1 . 0 M N a C l w i t h n o e f f e c t o n e l u t i o n p a t t e r n . S a t a e t a l . ( 1 9 7 0 ) a l s o o b s e r v e d n o e f f e c t o n e l u t i o n p a t t e r n s o r d i s t r i b u t i o n c o e f f i c i e n t s w h e n e v a l u a t i n g g e l c h r o m a t o g r a p h y f o r i s o l a t i o n o f h u m a n p l a s m a V L D L ( f r o m o t h e r l i p o p r o t e i n c l a s s e s ) i n e l u a n t s o f d i f f e r i n g e l e c t r o l y t e c o n c e n t r a t i o n s . 2 . A g a r o s e g e l c h r o m a t o g r a p h y Y o l k g r a n u l e s , F I a n d F I I f r a c t i o n s w e r e s u b j e c t e d t o g e l f i l t r a t i o n w i t h B i o g e l A - 5 0 M ( F i g u r e 7 ) . T h e 2 8 0 nm a b s o r b a n c e p a t t e r n o f V L D L (MF) i s a f u n c t i o n n o t o n l y o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f p r o t e i n b u t a l s o o f t h e l i g h t s c a t t e r i n g e f f e c t s o f t h e s e t u r b i d d i s p e r s i o n s . A b s o r b a n c e a t 2 8 0 n m , t h e r e f o r e , d o e s n o t t r u l y r e p r e s e n t t h e a b s o l u t e p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n , b u t i s s u i t a b l e f o r t h e d e t e c t i o n o f l i p o p r o t e i n p e a k s i s o l a t e d f r o m t h i s c o l u m n . B l u e D e x t r a n 2 0 0 0 w a s u s e d t o d e t e r m i n e t h e v o i d v o l u m e p o s i t i o n o f t h e c o l u m n a n d g a v e t w o p e a k s i n d i c a t i n g t h e i n h o m o g e n e i t y o f t h e s e p o l y s a c c h a r i d e p a r t i c l e s . - 56 -0 1 ' 1 > I I I I 1— 60 90 120 150 180 210 240 270 300 Tube Number Fig u r e 7. E l u t i o n p r o f i l e s of y o l k granules, FI and F I I f i l t e r e d on B i o g e l A-50M columns. (Bu f f e r = 1.0M NaCl, 0.025M sodium phosphate,0.01% EDTA, pH 7.0). - 57 -T h e t w o p e a k s p r o d u c e d f r o m e a c h o f t h e F I a n d F I I p r e p a r a t i o n s i n d i c a t e d h e t e r o g e n e i t y . W i t h b o t h F I a n d F I I t h e f i r s t e l u t e d l i p o p r o t e i n , t h e V L D L ( M F ) , w a s c o n t a i n e d i n t h e v o i d v o l u m e . T h e s e c o n d b r o a d l i p o p r o t e i n p e a k c o n t a i n e d t h e p o l y d i s p e r s e L D L f r a c t i o n . T h e l i p o p r o t e i n f r o m t h e F I f r a c t i o n e l u t e d e a r l i e r t h a n t h a t o f t h e F I I f r a c t i o n , i n d i c a t i n g t h a t i t w a s o f g r e a t e r m o l e c u l a r s i z e . C h a n g ( 1 9 6 9 ) o b s e r v e d t h e L D L f r o m b o t h f r a c t i o n s b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d f o u n d t h a t F I a l s o c o n t a i n e d g l o b u l e s w h i c h w e r e m u c h l a r g e r t h a n L D L m i c e l l e s . S i n c e V L D L (MF) i s p r e s e n t i n b o t h F I a n d F I I i t w a s d e c i d e d t o u s e t h e e n t i r e f l o a t i n g f r a c t i o n a s t h e s t a r t i n g m a t e r i a l f o r g e l f i l t r a t i o n e x p e r i m e n t s f o r t h e i s o l a t i o n o f V L D L ( M F ) . T h e e a r l y e l u t i o n o f t h e l i p o p r o t e i n p e a k f r o m t h e F I f r a c t i o n , h o w e v e r , l i m i t e d t h e v o l u m e o f s a m p l e t h a t c o u l d b e s e p a r a t e d w i t h o u t c o n t a m i n a t i o n o f t h e V L D L w i t h o t h e r l i p o p r o t e i n s . T h e L D L ^ p e a k o f t h e F I I f r a c t i o n , e l u t e d a t 3 X t h e v o l u m e o f t h e V L D L (MF ) p e a k , a l l o w i n g m o r e s a m p l e t o b e a p p l i e d t o t h e c o l u m n t h a n w o u l d n o r m a l l y b e p o s s i b l e i n a g e l f i l t r a t i o n e x p e r i m e n t . G e l f i l t r a t i o n o f w h o l e ( n o t u l t r a c e n t r i f u g e d ) y o l k g r a n u l e s w a s a t t e m p t e d a s a n a l t e r n a t e m e t h o d o f i s o l a t i o n . T h e V L D L (MF) p e a k e l u t e d i n t h e v o i d v o l u m e , f o l l o w e d b y t h e L D L , HDL a n d p h o s v i t i n f r a c t i o n s o f y o l k g r a n u l e s . S i n c e t h e l i p o p r o t e i n s w e r e p r e s e n t i n s m a l l e l u t i o n v o l u m e s c l o s e t o t h e V L D L (MF) p e a k , V L D L (MF ) w a s i s o l a t e d o n l y f r o m t h e F I I f r a c t i o n i n a l l t h e e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d f o r t h i s s t u d y . - 58 -E v a n s e t a l . ( 1 9 7 3 , 1 9 7 5 b ) i s o l a t e d V L D L f r o m y o l k p l a s m a b y g e l c h r o m a t o g r a p h y o n S e p h a r o s e AB o r B i o g e l A - 1 5 M c o l u m n s . T h r e e f r a c t i o n s w e r e e l u t e d h a v i n g u l t r a v i o l e t a b s o r b a n c e a t 2 8 0 nm. T h e l a r g e f r a c t i o n w h i c h e l u t e d f i r s t c o n t a i n e d t h e h i g h e s t p e r c e n t a g e o f l i p i d ( 8 9 % ) ; t h o s e e l u t i n g a f t e r w a r d c o n t a i n e d l e s s l i p i d ( 8 1 % ) . M o l e c u l a r s i z e w a s e s t i m a t e d t o r a n g e f r o m 5 - 1 7 m i l l i o n d a l t o n s . B a c o n et_ a l . ( 1 9 7 3 ) a n d B a c o n a n d M u s s e r ( 1 9 7 4 ) u s e d a 2% a g a r o s e c o l u m n ( B i o g e l A - 5 0 M ) t o s e p a r a t e l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s f r o m c r u d e L D F . T h e y i s o l a t e d a f r a c t i o n ( p r e s u m a b l y y o l k p l a s m a V L D L ) w h i c h e l u t e d i n t h e v o i d v o l u m e o f t h e c o l u m n . When t h e l i p o p r o t e i n w a s s t u d i e d b y a n a l y t i c a l d e n s i t y g r a d i e n t u l t r a -c e n t r i f u g a t i o n t e c h n i q u e s , i t f l o a t e d t o t h e m e n i s c u s o f t h e t u b e a n d t h e r e f o r e d i d n o t c o r r e s p o n d t o e i t h e r L D F ^ o r L D F ^ . No d a t a w e r e r e p o r t e d f o r t h e c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h i s f r a c t i o n . R a j u a n d M a h a d e v a n ( 1 9 7 4 ) d e v e l o p e d a p r o c e d u r e f o r t h e i s o l a t i o n o f V L D L f r o m y o l k p l a s m a u s i n g a D E A E - c e l l u l o s e c o l u m n . T h e V L D L e l u t e d i n t h e u n a d s o r b e d f r a c t i o n a n d u p o n g e l f i l t r a t i o n o n S e p h a r o s e 4 B , y i e l d e d t w o p e a k s , t h e f i r s t e l u t i n g i n t h e v o i d v o l u m e f o l l o w e d b y a s e c o n d b r o a d p e a k . T h e V L D L f r a c t i o n p r o b a b l y c o r r e s p o n d e d t o t h a t i s o l a t e d b y E v a n s e t a l _ . ( 1 9 7 3 ) . T h e u s e o f a g a r o s e g e l s a s b e d m a t e r i a l h a s e x p a n d e d t h e r a n g e o f g e l f i l t r a t i o n t o v e r y l a r g e m a c r o m o l e c u l e s . A g a r o s e , o n e o f t h e t w o m a j o r c o m p o n e n t s o f a g a r , i s a n u n c h a r g e d l i n e a r g a l a c t o s e p o l y m e r ( H j e r t e n , 1 9 6 4 ) . N o n s p e c i f i c a d s o r p t i o n o f - 59 -p r o t e i n a n d i o n - e x c h a n g e e f f e c t s a r e t h u s n o t l i k e l y t o i n t e r f e r e w i t h t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n e l u t i o n v o l u m e a n d m o l e c u l a r s i z e . A h i g h i o n i c s t r e n g t h ' b u f f e r w a s u s e d i n t h e s e s t u d i e s t o e l u t e t h e V L D L (MF) s o a s t o m i n i m i z e a d s o r p t i o n o f l i p o p r o t e i n s t o t h e a g a r o s e g e l s . T h i s p r e c a u t i o n , h o w e v e r , w a s p r o b a b l y u n n e c e s s a r y . T h e d e l i c a t e s t r u c t u r e o f l i p o p r o t e i n s p r e c l u d e s t h e u s e o f d r a s t i c f r a c t i o n a t i o n p r o c e d u r e s . I n t h e i s o l a t i o n o f V L D L b y g e l f i l t r a t i o n , t h e s a m p l e i s s u b j e c t e d o n l y t o t h e f o r c e s o f d i f f u s i o n a n d c o n s t a n t l y r e m a i n s i n a b u f f e r e d s o l u t i o n . A g a r o s e g e l f i l t r a t i o n i s w i d e l y u s e d i n t h e i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f n a t i v e h u m a n s e r u m V L D L a n d V L D L s u b f r a c t i o n s f r o m t h e o t h e r c l a s s e s o f l i p o p r o t e i n s . S e v e r a l l a b o r a t o r i e s u t i l i z e t h i s t e c h n i q u e i n c o n j u n c t i o n w i t h p r e p a r a t i v e u l t r a c e n t r i f u g a t i o n o r a s a n a l t e r n a t i v e i s o l a t i o n p r o c e d u r e ( W e r n e r , 1 9 6 6 ; M a r g o l i s , 1 9 6 7 ; K a l a b a n d M a r t i n , 1 9 6 8 b ; S a t a et_ a l . , 1 9 7 0 , 1 9 7 2 ; Q u a r f o r d t e t a l . , 1 9 7 2 ; F i d g e , 1 9 7 3 ; G l i c k m a n a n d K i r s c h , 1 9 7 4 ; a n d R u d e l e t a l . , 1 9 7 4 ) . 3 . A l k y l a t i o n I n p r e l i m i n a r y u l t r a c e n t r i f u g a l f l o t a t i o n v e l o c i t y e x p e r i m e n t s , i t w a s o b s e r v e d t h a t a s V L D L (MF) s a m p l e s a g e d , a g g r e g a t e s w e r e f o r m e d . R a j u a n d M a h a d e v a n ( 1 9 7 6 ) d i s c o v e r e d t h a t t h e a p o p r o t e i n s f r o m y o l k p l a s m a V L D L w e r e i n s o l u b l e i n a q u e o u s b u f f e r s y s t e m s , b u t w e r e s o l u b l e i n a b u f f e r s o l u t i o n c o n t a i n i n g 0 . 0 1 M 2 - m e r c a p t o e t h a n o l ( B M E ) . I t w a s s u g g e s t e d t h a t t h e i n s o l u b i l i t y o f t h e p r o t e i n s m i g h t b e p a r t l y - 6 0 -d u e t o t h e e x i s t e n c e o f i n t e r / i n t r a - m o l e c u l a r d i s u l f i d e b r i d g e s , w h i c h h i n d e r s o l u b i l i t y . T h e a g g r e g a t i o n o f V L D L (MF ) c o u l d h a v e b e e n d u e t o o x i d a t i o n o f f r e e s u l f h y d r y l g r o u p s , f o r m i n g d i s u l f i d e b r i d g e s b e t w e e n V L D L (MF) p a r t i c l e s . I t w a s s u b s e q u e n t l y o b s e r v e d t h a t t h e e x c l u s i o n o f o x y g e n a n d s t o r a g e o f s a m p l e s u n d e r n i t r o g e n h e l p e d t o d i m i n i s h t h i s e f f e c t . I t c o u l d n o t b e d e t e r m i n e d i f V L D L (MF) p a r t i c l e s e x i s t i n a p a r t i a l l y a g g r e g a t e d s t a t e i n f r e s h e g g y o l k o r i f a n y o f t h e n u m e r o u s s t e p s i n t h e i s o l a t i o n o f V L D L (MF) c o u l d c a u s e o x i d a t i o n o f t h e l i p o p r o t e i n . T h e V L D L (MF) w a s t h e r e f o r e p r e p a r e d f r o m y o l k d i l u t e d w i t h d e o x y g e n a t e d , n i t r o g e n s a t u r a t e d w a t e r c o n t a i n i n g 0 . 1 % BME a n d a l l s u b s e q u e n t h a n d l i n g o f g r a n u l e s a n d l i p o p r o t e i n s a l s o t o o k p l a c e i n d e g a s s e d b u f f e r s c o n t a i n i n g 0 . 1 % BME. A f t e r i s o l a t i o n b y g e l c h r o m a t o g r a p h y , t h e V L D L (MF) w a s a l k y l a t e d w i t h i o d o a c e t a m i d e . A d d i t i o n o f a c r y l o n i t r i l e t o V L D L (MF) r e s u l t e d i n t h e f o r m a t i o n o f a t u r b i d s u s p e n s i o n . U p o n s u b j e c t i n g t h e s u s p e n s i o n t o g e l f i l t r a t i o n , a c l e a r p r o t e i n s o l u t i o n w a s e l u t e d i n t h e v o i d v o l u m e , f o l l o w e d b y a n o p a l e s c e n t f r a c t i o n w h i c h p r o b a b l y c o n t a i n e d l i p i d m a t e r i a l . I t w a s t h e r e f o r e t h o u g h t t h a t t h e a c r y l o n i t r i l e c a u s e d d i s s o c i a t i o n o f t h e l i p i d f r o m t h e p r o t e i n m o i e t y . I o d o a c e t a m i d e w a s c h o s e n a s t h e s u l f h y d r y l - b l o c k i n g a g e n t b e c a u s e t h e r e a c t i v i t y o f s u l f h y d r y l g r o u p s w i t h i o d o a c e t a m i d e f a r e x c e e d s t h a t o f o t h e r p r o t e i n g r o u p s u n d e r a l m o s t a l l c o n d i t i o n s ( M e a n s a n d F e e n e y , 1 9 7 1 ) . I t i s p o s s i b l e t o e m p l o y a n e x t r e m e l y w i d e r a n g e o f c o n d i t i o n s a n d s t i l l o b t a i n r e a c t i o n w i t h s u l f h y d r y l - 6 1 -g r o u p s , a l t h o u g h p H 6 . 0 - 8 . 5 r e p o r t e d t o b e o p t i m a l f o r t h e r e a c t i o n . T h e r e h a v e b e e n n o p r e v i o u s r e p o r t s i n t h e l i t e r a t u r e c o n c e r n i n g t h e m o d i f i c a t i o n o f n a t i v e l i p o p r o t e i n s w i t h i o d o a c e t a m i d e ; n o r m a l l y s u c h a c h e m i c a l m o d i f i c a t i o n i s p e r f o r m e d o n t h e d e l i p i d a t e d l i p o p r o t e i n . E x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s w e r e c h o s e n s u c h t h a t t h e V L D L (MF ) r e m a i n e d i n i t s n a t i v e s t a t e ; t h e b u f f e r u s e d f o r m o d i f y i n g t h e V L D L (MF) w a s 0 . 0 2 5 M s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r c o n t a i n i n g 1 . 0 M N a C l a n d 0 . 0 1 % EDTA ( p H 7 . 0 ) . Q u a n t i t a t i v e r e a c t i o n o f V L D L (MF) s u l f h y d r y l s w i t h i o d o a c e t a m i d e w a s n o t a t t e m p t e d a s t h i s c a n o n l y b e a c c o m p l i s h e d b y t h e a d d i t i o n o f d e n a t u r a n t s s u c h a s SDS , u r e a o r g u a n i d i n e h y d r o c h l o r i d e . T h e s e d i s s o c i a t i n g a g e n t s h a v e b e e n s h o w n t o h a v e d e l e t e r i o u s e f f e c t s o n l i p o p r o t e i n s , c a u s i n g l o s s o f l i p i d a n d d i s s o c i a t i o n o f t h e p r o t e i n m o l e c u l e s ( N i c h o l s e t a l . , 197 6 ; B e r n a r d i a n d C o o k , 1 9 6 0 ) . I t w a s t h e p u r p o s e o f t h i s e x p e r i m e n t t o b l o c k o n l y t h e a c c e s s i b l e s u l f h y d r y l g r o u p s w h i c h m i g h t b e i n v o l v e d i n l i p o p r o t e i n a g g r e g a t i o n d u r i n g o x i d a t i o n , r a t h e r t h a n t h e s u l f h y d r y l g r o u p s b u r i e d i n t h e i n t e r i o r o f t h e l i p o p r o t e i n m o l e c u l e w h i c h m i g h t n o t b e r e a c t i v e . T h e SH a n d SS c o n t e n t o f t h e a l k y l a t e d V L D L (MF) a n d u n m o d i f i e d c o n t r o l s a m p l e s a r e l i s t e d i n T a b l e V I . SH c o n t e n t d e t e r m i n a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t a f t e r t h e a d d i t i o n o f SDS w h i c h a l t e r s t h e n a t i v e p r o t e i n c o n f i g u r a t i o n , e x p o s i n g p r e v i o u s l y b u r i e d SH g r o u p s . A s e x p e c t e d , t h e c o n t r o l V L D L (MF) s a m p l e h a d a h i g h c o n t e n t o f d i s u l f i d e g r o u p s c o m p a r e d t o t h e a l k y l a t e d s a m p l e . E v e n a f t e r a l k y l a t i o n , t h e V L D L (MF) h a d a m u c h g r e a t e r SH c o n t e n t - 6 2 -T a b l e V I . E s t i m a t i o n o f SH a n d SS C o n t e n t s o f V L D L U s i n g E l l m a n ' s R e a g e n t . s •, SH c o n t e n t * SS c o n t e n t * (uM/g p r o t e i n ) ( pM/g p r o t e i n ) U n m o d i f i e d V L D L (MF) 7 1 . 0 5 + 2 . 5 0 3 0 8 . 8 5 + 1 5 . 6 2 A l k y l a t e d V L D L (MF ) 4 3 4 . 5 3 + 2 0 . 2 5 8 3 . 4 7 + 4 . 4 0 A d a t a r e p o r t e d a s a m e a n o f 6 d e t e r m i n a t i o n s + s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n - 63 -t h a n t h a t o f t h e c o n t r o l . T h e h i g h SH c o n t e n t o f t h e a l k y l a t e d V L D L (MF ) w o u l d i n d i c a t e t h a t m o s t o f t h e SH g r o u p s w e r e i n a c c e s s i b l e t o t h e i o d o a c e t a m i d e w h e n t h e r e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t i n t h e a b s e n c e o f d i s s o c i a t i n g a g e n t s . T h e s e d a t a s u g g e s t t h a t m o s t o f t h e SH g r o u p s i n t h e p r o t e i n o f t h e u n m o d i f i e d V L D L (MF) s a m p l e w e r e o x i d i z e d t o SS g r o u p s , r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f l a r g e r a g g r e g a t e s o f l i p o p r o t e i n m o l e c u l e s . T h e l o w SS c o n t e n t o f a l k y l a t e d V L D L , o n t h e o t h e r h a n d , d e m o n s t r a t e s t h a t f e w SS g r o u p s w e r e p r e s e n t a n d t h a t t h e m o d i f i e d l i p o p r o t e i n s h o u l d r e m a i n i n t h e u n a g g r e g a t e d s t a t e . U l t r a c e n t r i f u g a l f l o t a t i o n v e l o c i t y a n a l y s i s o f t h e u n m o d i f i e d a n d a l k y l a t e d V L D L (MF) s a m p l e s w a s u s e d t o t e s t t h i s h y p o t h e s i s . T h e a g g r e g a t e s o f t h e u n m o d i f i e d V L D L (MF) u s u a l l y h a d f l o t a t i o n c o e f f i c i e n t s c o n g r u e n t w i t h t h o s e e x p e c t e d f o r d i s t i n c t c o m b i n a t i o n s o f t h e V L D L (MF ) l i p o p r o t e i n s . T h e a d d i t i o n o f 0 . 1 % BME r e d u c e d t h e f l o t a t i o n r a t e s , w h i c h w e r e s i m i l a r t o t h o s e o f t h e a l k y l a t e d V L D L ( M F ) . T h e a l k y l a t e d V L D L (MF ) s a m p l e s h a d f l o t a t i o n c o e f f i c i e n t s c o r r e s p o n d i n g t o t h o s e o f t h e r e d u c e d l i p o p r o t e i n s . T h e s e u l t r a c e n t r i f u g a l r e s u l t s w i l l b e p r e s e n t e d a n d f u r t h e r d i s c u s s e d i n s e c t i o n C . 2 . 4 . G e l f i l t r a t i o n o n p o r o u s g l a s s b e a d s o G l a s s b e a d s ( 3 0 0 0 A p o r e s i z e ) w e r e u s e d i n a n a t t e m p t t o s e p a r a t e t h e V L D L (MF ) p a r t i c l e s i n t o a m o r e h o m o g e n e o u s p r e p a r a t i o n t h a n c o u l d b e o b t a i n e d f r o m t h e B i o g e l c o l u m n s ( 1 % - 64 -o r 2% a g a r o s e ) . O n l y o n e p e a k w a s o b s e r v e d w h e n a l k y l a t e d V L D L (MF) w a s e l u t e d f r o m p o r o u s g l a s s b e a d s i n 1 . 0M N a C l s o d i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( F i g u r e 8 A ) . T h e a d d i t i o n o f 0 . 1 % BME t o t h e u n m o d i f i e d V L D L (MF ) p r i o r t o f i l t r a t i o n p r o d u c e d t w o p e a k s ( F i g u r e 8 B ) . T h e f i r s t t u r b i d p e a k f r o m t h e CPG c o l u m n c o n t a i n i n g BME w a s f o u n d t o c o n t a i n t h e e n t i r e V L D L (MF) f r a c t i o n (V = 8 0 m l ) ; t h e s e c o n d c l e a r p e a k ( V e = 1 3 4 m l ) e l u t e d a t t h e V p o s i t i o n a n d w a s f o u n d t o c o n t a i n o n l y BME. T h e m a j o r p e a k w a s c o n c e n t r a t e d b y u l t r a -c e n t r i f u g a t i o n , t h e n a n a l y z e d b y b o t h f l o t a t i o n v e l o c i t y u l t r a -c e n t r i f u g a t i o n a n d a g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . T h e s e r e s u l t s w i l l b e f u r t h e r d i s c u s s e d i n s e c t i o n C . 2 . a n d s e c t i o n D. No f r a c t i o n a t i o n o f t h e V L D L (MF) p a r t i c l e s w a s a c h i e v e d u s i n g t h e c o l u m n o f p o r o u s g l a s s b e a d s e v e n t h o u g h t h e p r o p e r p o r e s i z e h a d b e e n c h o s e n . T h e r e h a v e b e e n n o r e p o r t s i n t h e l i t e r a t u r e c o n c e r n i n g t h e s e p a r a t i o n o f l i p o p r o t e i n s o n g l a s s b e a d c o l u m n s ; i t may b e t h a t t h e u s e o f p o r o u s g l a s s b e a d s f o r g e l f i l t r a t i o n o f l a r g e p a r t i c l e s s u c h a s l i p o p r o t e i n s h a d a l w a y s p r o v e d u n s u c c e s s f u l . C . F l o t a t i o n v e l o c i t y u l t r a c e n t r i f u g a t i o n o f V L D L (MF ) 1 . U l t r a v i o l e t a b s o r p t i o n s p e c t r u m T h e UV a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f V L D L (MF) f r o m 2 2 0 nm t o 3 6 0 nm ( F i g u r e 9 A ) s h o w s a s m o o t h e x p o n e n t i a l c u r v e w i t h o u t a n y - 65 -Tube Number F i g u r e 8. E l u t i o n p r o f i l e s o f (A) a l k y l a t e d VLDL (MF) and (B) 2 - m e r c a p t o e t h a n o l r e d u c e d VLDL (MF) f r o m p o r o u s g l a s s bead co lumns - 66 -o b v i o u s a b s o r p t i o n p e a k a t 2 8 0 nm. T h e l o g - l o g p l o t o f a b s o r p t i o n v s w a v e l e n g t h ( F i g u r e 9B ) s h o w s a l i n e a r s e g m e n t f r o m 3 0 0 t o 3 6 0 nm. E x t r a p o l a t i o n o f t h i s l i n e t o l o w e r w a v e l e n g t h s r e p r e s e n t s t h e c o n t r i b u t i o n o f a b s o r b a n c e r e s u l t i n g f r o m l i g h t s c a t t e r i n g o f t h e l a r g e V L D L p a r t i c l e s ( T a n f o r d , 1 9 6 7 ; M a , 1 9 7 5 ) . A s m a l l r e s i d u a l p e a k a t 2 8 0 nm i s d e t e c t e d ( F i g u r e 9 A ) w h e n t h i s c o n t r i b u t i o n d u e t o l i g h t s c a t t e r i n g i s s u b t r a c t e d . T h e p e a k a t 2 8 0 nm r e p r e s e n t s o n l y 8 - 1 1 % o f t h e t o t a l a b s o r p t i o n o f t h e s e l a r g e p a r t i c l e s . 2 . F l o t a t i o n v e l o c i t y a n a l y s i s T h e p u r i t y o f V L D L (MF) w a s e x a m i n e d b y f l o t a t i o n u l t r a c e n t r i f u g a t i o n a t 1 8 , 0 0 0 r p m u s i n g UV o p t i c s . A l l a n a l y s e s w e r e c a r r i e d o u t i n b u f f e r e d N a C l s o l u t i o n s ( p H 7 . 0 ) o f d e n s i t i e s 1 . 0 3 8 5 g / m l o r 1 . 0 6 3 0 g / m l a t 2 0 ° C . T h e o b s e r v e d f l o t a t i o n c o e f f i c i e n t s w e r e c o r r e c t e d t o s t a n d a r d c o n d i t i o n s u s i n g e q u a t i o n 1 0 . S f = S 1 . 0 3 8 5 ( 1 ~ V / ° 1 . 0 6 3 ) / ( 1 - V / ° 1 . 0 3 8 5 ) ( E q u a t i o n 1 0 ) T h e t y p i c a l f l o t a t i o n p a t t e r n s o f n a t i v e V L D L ( M F ) , a l k y l a t e d V L D L (MF) o r V L D L (MF) r e c o v e r e d f r o m t h e p o r o u s g l a s s b e a d c o l u m n ( F i g u r e 1 0 A ) i n d i c a t e d t h a t a l l s a m p l e s w e r e p o l y d i s p e r s e . T h i s i s s e e n m o r e r e a d i l y i n t h e c o m p u t e r g e n e r a t e d d e r i v a t i v e p l o t ( F i g u r e 1 0 B ) , c a l c u l a t e d f r o m t h e UV o p t i c s c o n c e n t r a t i o n s c a n . N a t i v e - 67 -2 2 0 2 4 0 2 6 0 2 8 0 3 0 0 3 2 0 3 4 0 7\. (nm) 0 . 3 6 0 . 3 8 0 . 4 0 0 . 4 2 0 . 4 4 0 . 4 6 0 . 4 8 0 . 5 0 0 . 5 2 0 . 5 4 l o g ( ^ / 1 0 0 ) n m F i g u r e 9 . UV a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f V L D L (MF) ( A ) a s a f u n c t i o n o f w a v e l e n g t h a n d ( B ) a s l o g - l o g f u n c t i o n . - 68 -70 60 ( A ) 504 c o u 4J fi <1J O C o u AO 4 30 7 20 4 10 4 6.9 7.0 7.1 7.2 x ( cm) 500 1 A00 1 x 300 4 T3 U 2001 100 4 F i g u r e 10. 1— 1.931 -+-1.97A F l o t a t i o n v e l o c i t y a n a l y s i s o f V L D L (MF) ( A ) F l o t a t i o n p a t t e r n ( B ) D e r i v a t i v e c u r v e . - 69 -V L D L (MF) f l o a t e d i n t h e r a n g e o f S f 7 0 - 2 5 0 S , w i t h m a j o r p e a k s b e i n g a p p a r e n t a t S f 7 5 a n d 2 0 7 S . S a m p l e s o f V L D L (MF) w h i c h w e r e a l k y l a t e d w i t h i o d o a c e t a m i d e a l s o s h o w e d a m a r k e d h e t e r o g e n e i t y i n f l o t a t i o n r a t e s a n d f l o a t e d i n t h e r a n g e o f S^ 4 0 - 1 2 0 S . T h e f l o t a t i o n r a t e s o f t h e 2 m a j o r p e a k s w e r e d e c r e a s e d t o S f 4 1 a n d 1 0 8 S b y a l k y l a t i o n . When 0 . 1 % BME w a s a d d e d t o t h e u n m o d i f i e d V L D L ( M F ) , t h e r e w a s a d e c r e a s e i n f l o t a t i o n r a t e o f t h e s l o w c o m p o n e n t t o S^ 45S a n d t h e f a s t c o m p o n e n t t o S f 1 1 6 S ( T a b l e V I I ) . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t t h e n a t i v e V L D L (MF) a g g r e g a t e s w e r e d i s r u p t e d b y a l k y l a t i o n o f t h e e x p o s e d s u l f h y d r y l g r o u p s o r b y r e d u c t i o n o f t h e d i s u l f i d e b o n d s w i t h BME. S u l f h y d r y l a n d d i s u l f i d e a n a l y s i s o f t h e s e f r a c t i o n s c o n f i r m t h i s i n d i c a t i o n ( s e c t i o n B . 3 ) . S a m p l e s o f V L D L (MF) o r a l k y l a t e d V L D L (MF) p a s s e d t h r o u g h a c o l u m n o f p o r o u s g l a s s b e a d s s h o w e d s i m i l a r f l o t a t i o n r a t e s , i n d i c a t i n g t h a t n o f r a c t i o n a t i o n o c c u r r e d . T h e h y d r a t e d d e n s i t y o f t h e s l o w f l o a t i n g c o m p o n e n t o f V L D L (MF) w a s o b t a i n e d b y m e a s u r i n g t h e f l o t a t i o n c o e f f i c i e n t s o f t h e l i p o p r o t e i n a t d i f f e r e n t s o l v e n t d e n s i t i e s ( F i g u r e 1 1 ) . E x t r a p o l a t i o n o f t h e p l o t o f t h e p r o d u c t o f s o l v e n t v i s c o s i t y t i m e s f l o t a t i o n (^ s ) a s a f u n c t i o n o f d e n s i t y o f t h e s o l v e n t p r o d u c e d v a l u e s f o r d e n s i t y ( 1 . 0 1 4 g / m l ) a n d f o r p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e ( 0 . 9 8 6 m l / g ) , w h e r e v = . A c c u r a t e m e a s u r e m e n t o f t h e f a s t e r f l o a t i n g c o m p o n e n t w a s i m p o s s i b l e d u e t o i t s h i g h f l o t a t i o n r a t e . T h e i n s o l u b i l i t y o f V L D L (MF) a n d i n a c c u r a c y o f m e a s u r i n g t h e . p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e u s i n g a p y c n o m e t e r p r e v e n t e d d e t e r m i n a t i o n o f c o m p a r a t i v e r e s u l t s . - 7 0 -T a b l e V I I . C o m p a r a t i v e F l o t a t i o n R a t e s ( S ^ ) o f N a t i v e , R e d u c e d a n d C h e m i c a l l y M o d i f i e d V L D L ( M F ) . S a m p l e F l o t a t i o n R a t e ( S f ) S l o w C o m p o n e n t F a s t C o m p o n e n t n a t i v e V L D L ( M F ) ' 7 4 . 8 4 + 4 . 5 2 0 7 . 3 0 + 1 4 . 3 n a t i v e V L D L (MF) + 0 . 1 % B M E b 4 5 . 3 9 + 2 . 5 1 1 6 . 4 3 + 6 . 9 a l k y l a t e d V L D L (MF ) 4 0 . 5 1 + 2 . 1 1 0 7 . 6 9 + 6 . 2 a m e a n o f 2 0 d e t e r m i n a t i o n s + s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n b m e a n o f 6 d e t e r m i n a t i o n s + s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n - 7 1 -l I l l i i i , 1 . 0 1 1 . 0 2 1 . 0 3 1 . 0 4 1 . 0 5 1 . 0 6 1 . 0 7 1 . 0 8 1 . 0 9 D e n s i t y o f N a C l s o l u t i o n ( g / m l ) F i g u r e 1 1 . H y d r a t e d - d e n s i t y o f V L D L (MF) e s t i m a t e d f r o m r^s a n d s o l v e n t d e n s i t y a t 2 0 ° C . - 7 2 -T u r n e r a n d C o o k ( 1 9 5 8 ) s t u d i e d t h e e f f e c t o f l i p i d c o n t e n t o n t h e p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e o f p r o t e i n s a n d f o u n d t h a t a 1% i n c r e a s e i n t h e l i p i d p o r t i o n o f a l i p o p r o t e i n c a u s e s a n i n c r e a s e i n t h e p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e b y 0 . 0 0 3 m l / g . U s i n g t h i s f a c t o r , a n d a s s u m i n g a n a v e r a g e p r o t e i n p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e o f 0 . 7 2 4 m l / g , a t h e o r e t i c a l p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e o f 0 . 9 8 2 m l / g c o r r e s p o n d i n g t o a h y d r a t e d d e n s i t y o f 1 . 0 1 8 g / m l may b e c a l c u l a t e d . T h e s e t h e o r e t i c a l v a l u e s a r e c l o s e t o t h e e x p e r i m e n t a l l y d e r i v e d v a l u e s ; t h e d i s c r e p a n c y c o u l d h a v e a r i s e n f r o m t h e u s e o f 0 . 7 2 4 m l / g a s t h e a v e r a g e p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e o f t h e p r o t e i n . T h e c a r b o h y d r a t e b o u n d t o t h e p r o t e i n m o i e t y o f V L D L c a u s e s a d e c r e a s e i n t h e a v e r a g e p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e o f t h e p r o t e i n ( G i b b o n s , 1 9 6 6 ) ; t h u s t h e t h e o r e t i c a l v a l u e s may b e s o m e w h a t l a r g e r t h a n w o u l d h a v e b e e n c a l c u l a t e d f r o m t h e a c t u a l p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e o f t h e a p o p r o t e i n . T h e V L D L f r a c t i o n o f human s e r u m i s c o n s i d e r e d t o p o s s e s s a c o n t i n u o u s d i s t r i b u t i o n o f m o l e c u l e s w i t h d i a m e t e r s v a r y i n g f r o m o 3 0 0 - 9 0 0 A ( S c a n u e t a l . , 1 9 7 4 ) . P i g p l a s m a V L D L ( F i d g e , 1 9 7 3 ) , r a t p l a s m a V L D L ( K o g a et_ a l . , 1 9 6 9 ) , r a b b i t V L D L ( S h o r e et_ al., 1 9 7 4 ) , e g g y o l k p l a s m a V L D L ( Y a m a u c h i e t a l . , 1 9 7 6 ) , a n d c h i c k e n s e r u m V L D L ( H i l l y a r d e_t a l . , 1 9 7 2 ) w e r e a l s o h e t e r o g e n e o u s , s h o w i n g a b r o a d d i s t r i b u t i o n i n f l o t a t i o n r a t e s w i t h t w o o r t h r e e m a j o r p e a k s w h e n a n a l y z e d u s i n g t h e s c h l i e r e n o p t i c a l s y s t e m . T h e s c h l i e r e n o p t i c a l s y s t e m o n t h e a n a l y t i c a l u l t r a -c e n t r i f u g e h a s b e e n c o n v e n t i o n a l l y u s e d i n t h e d e t e r m i n a t i o n o f f l o t a t i o n r a t e s o f l i p o p r o t e i n s . T h e u s e o f t h e B e c k m a n P r e p UV - 73 -o p t i c a l s y s t e m i n t h i s s t u d y w a s t h e f i r s t a p p l i c a t i o n o f a n a b s o r p t i o n o p t i c a l s y s t e m t o d e t e r m i n e t h e f l o t a t i o n r a t e s o f V L D L (MF) p a r t i c l e s . W h i l e t h i s w o r k w a s i n p r o g r e s s , Ma e t a l . ( 1 9 7 7 ) d e s c r i b e d t h e u s e o f t h e B e c k m a n M o d e l E u l t r a c e n t r i f u g e e q u i p p e d w i t h a n u l t r a v i o l e t s c a n n e r t o d e t e r m i n e t h e f l o t a t i o n c o e f f i c i e n t d i s t r i b u t i o n f o r s a m p l e s o f human s e r u m V L D L p a r t i c l e s . T h e y p r o p o s e d c a l l i n g t h i s m e t h o d o f a n a l y s i s " t u r b i d i m e t r i c u l t r a c e n t r i f u g a t i o n " d u e t o t h e t u r b i d i t y o f s o l u t i o n s o f t h e h i g h l i p i d V L D L p a r t i c l e s . T h e y f o u n d t h e r e s u l t s o f t h e c o n v e n t i o n a l s c h l i e r e n t e c h n i q u e t o b e i n g o o d a g r e e m e n t w i t h t h e r e s u l t s o b t a i n e d f r o m t h e UV o p t i c a l s y s t e m . T h e r a t e s c a l c u l a t e d i n t h i s s t u d y w e r e n o t c o r r e c t e d f o r t h e J o h n s t o n - O g s t o n e f f e c t o r f o r c o n c e n t r a t i o n e f f e c t s , s i n c e i t w a s i m p o s s i b l e t o q u a n t i f y t h e a m o u n t o f a n y s i n g l e c o m p o n e n t i n t h i s h e t e r o g e n e o u s s y s t e m . T h e c o n c e n t r a t i o n e f f e c t i s n e g l i g i b l e h o w e v e r , s i n c e l o w c o n c e n t r a t i o n ( l e s s t h a n 2 m g / m l l i p o p r o t e i n ) w e r e u s e d i n c o m b i n a t i o n w i t h UV o p t i c s . T h e o b s e r v e d f l o t a t i o n c o e f f i c i e n t s a r e l i k e l y t o b e a g o o d a p p r o x i m a t i o n o f t h e t r u e f l o t a t i o n c o e f f i c i e n t s e v e n t h o u g h n o t c o r r e c t e d f o r t h e s e e f f e c t s ( M a , 1 9 7 5 ) . T h e r e a r e s e v e r a l a d v a n t a g e s o f u s i n g t h e UV o p t i c a l s y s t e m t o d e t e r m i n e f l o t a t i o n c o e f f i c i e n t s o f l a r g e , h e t e r o g e n e o u s p a r t i c l e s s u c h a s V L D L (MF) i n t h e u l t r a c e n t r i f u g e . S i n c e t h e r e w a s l i t t l e a b s o r p t i o n o f UV l i g h t d u e t o t h e l o w p r o t e i n c o n t e n t o f V L D L ( F i g u r e 9 A ) , t h e r e f l e c t i o n o f UV l i g h t w a s m e a s u r e d . T u r b i d i t y i s d i r e c t l y r e l a t e d t o c o n c e n t r a t i o n a n d p a r t i c l e s i z e , w h i c h g r e a t l y - 74 -m a g n i f i e s a p p a r e n t p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n . When t h e s c h l i e r e n o p t i c a l s y s t e m i s u s e d t o s t u d y l i p o p r o t e i n s , a c o n c e n t r a t i o n o f 2% i s u s u a l l y n e c e s s a r y , r e q u i r i n g c o n c e n t r a t i o n o f t h e V L D L (MF) p r e p a r a t i o n . L o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f l i p o p r o t e i n c o u l d b e u s e d w i t h t h e UV o p t i c a l s y s t e m ; t h e V L D L (MF) s a m p l e s u s u a l l y h a d t o b e d i l u t e d r a t h e r t h a n c o n c e n t r a t e d . T h e u s e o f l o w c o n c e n t r a t i o n s a l s o m e a n s t h a t c o n c e n t r a t i o n e f f e c t s a r e n e g l i g i b l e , a n d t h e l a r g e p a r t i c l e s i z e a n d s h o r t p e r i o d o f c e n t r i f u g a t i o n ( 3 0 - 4 5 m i n u t e s ) m i n i m i z e d i f f u s i v e b o u n d a r y s p r e a d i n g . T h e UV s y s t e m s c a n s t h e c e l l e v e r y 75 s e c o n d s , a l l o w i n g a l a r n u m b e r o f s c a n s t o b e c o l l e c t e d i n a s h o r t p e r i o d o f t i m e . A u t o m a t i c r e c o r d i n g a n d p r o c e s s i n g o f t h e d a t a b y t h e T T Y - d a t a a c q u i s i t i o n s y s t e m u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e UV s c a n n e r , e l i m i n a t e s t h e t e d i o u s m a n u a l l a b o r i n v o l v e d i n t a k i n g m e a s u r e m e n t s a n d p e r f o r m i n g t h e c a l c u l a t i o n s . D. E l e c t r o p h o r e t i c b e h a v i o r o f V L D L (MF) S a m p l e s o f V L D L ( M F ) , a l k y l a t e d V L D L ( M F ) , o r V L D L (MF) i s o l a t e d f r o m a p o r o u s g l a s s b e a d c o l u m n , w e r e i n i t i a l l y e l e c t r o p h o r e s e d o n 1% a g a r o s e f i l m s t r i p s u s i n g t h e A C I c a s s e t t e e l e c t r o p h o r e s i s k i t . One b r o a d b a n d , w h i c h r e m a i n e d a t t h e o r i g i n , w a s o b s e r v e d . T h i s o r i g i n c o r r e s p o n d s t o t h a t o f t h e c h y l o m i c r o n s o f human s e r u m l i p o p r o t e i n w h i c h d o n o t m i g r a t e i n a g a r o s e g e l . ( T a b l e I ) . T h e m u l t i p l e c o m p o n e n t s o f t h e V L D L (MF) f r a c t i o n d e t e c t e d i n t h e u l t r a c e n t r i f u g e ( s e c t i o n C . 2 ) c o u l d n o t b e r e s o l v e d u s i n g t h i s e l e c t r o p h o r e t i c s y s t e m . - 7 5 -M i g r a t i o n o f l i p o p r o t e i n s i n a n e l e c t r i c f i e l d i s m o d i f i e d b y t w o t y p e s o f i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e l i p o p r o t e i n s a n d t h e s u p p o r t i n g m a t e r i a l . F i r s t , p o r e s i z e o f t h e g e l may o f f e r r e s i s t a n c e t o p a s s a g e o f l a r g e l i p o p r o t e i n m o l e c u l e s a n d s e c o n d l y , p h y s i c o c h e m i c a l i n t e r a c t i o n s b e t w e e n t h e l i p o p r o t e i n s a n d s u p p o r t i n g m e d i u m c o u l d a f f e c t t h e r e s o l u t i o n . S i n c e i t i s u n l i k e l y t h a t t h e l i p o p r o t e i n s w e r e a d s o r b e d t o t h e a g a r o s e , t h e p o r e s i z e o f t h e g e l m u s t h a v e a f f e c t e d t h e r e s o l u t i o n . A s e r i e s o f e x p e r i m e n t s w a s p e r f o r m e d u s i n g c o m p o s i t e a c r y l a m i d e - a g c r o s e g e l s c o d e t e r m i n e o p t i m u m p o r e s i z e . A t l o w a c r y l a m i d e c o n c e n t r a t i o n s ( l e s s t h a n 3%) t h e p o l y m e r i z e d a c r y l a m i d e r e m a i n e d f l u i d , t h e r e f o r e a g a r o s e ( 0 . 5 % w / v ) w a s i n c o r p o r a t e d i n t o t h e g e l s t o a d d s t r e n g t h a n d p e r m i t e a s y h a n d l i n g . E l e c t r o p h o r e s i s d i d n o t r e s o l v e t h e l i p o p r o t e i n s o f a n y o f t h e V L D L (MF) s a m p l e s ; t h e p o r e s i z e w a s s t i l l t o o s m a l l t o p e r m i t e n t r y o f t h e l a r g e V L D L (MF) p a r t i c l e s . E x p e r i m e n t s w e r e p e r f o r m e d i n w h i c h t h e a c r y l a m i d e w a s e l i m i n a t e d a n d g e l s w e r e f o r m e d u s i n g o n l y 0 . 5 % a g a r o s e . T h e V L D L w a s p r e s t a i n e d w i t h s u d a n b l a c k B t o t r a c e t h e m i g r a t i o n o f t h e l i p o p r o t e i n s ( F i g u r e 1 2 ) . U n s t a i n e d s a m p l e s r u n i n p a r a l l e l w i t h t h e p r e s t a i n e d s a m p l e s w e r e l a t e r s t a i n e d f o r p r o t e i n w i t h C o o m a s s i e B l u e ( F i g u r e 1 2 ) . Two b a n d s w e r e d e t e c t e d , n o m a t t e r w h i c h V L D L (MF) s a m p l e w a s a p p l i e d t o t h e g e l s . T h e f i r s t b a n d m i g r a t e d a b o u t t h r e e - q u a r t e r s o f t h e w a y t h r o u g h t h e g e l , w h i l e t h e s e c o n d b a n d r e m a i n e d o n t o p o f t h e r u n n i n g g e l a n d d i d n o t e n t e r t h e a g a r o s e . C o o m a s s i e B l u e s t a i n e d l i p o p r o t e i n s s h o w e d t h e s ame r e s u l t s , i n d i c a t i n g t h a t p r e s t a i n i n g o f - 76 -( A ) ( B ) F i g u r e 12. A g a r o s e g e l e l e c t r o p h o r e s i s p a t t e r n o f ( A ) s u d a n b l a c k B p r e s t a i n e d a n d ( B ) C o o m a s s i e B l u e s t a i n e d V L D L ( M F ) . - l i -the. V L D L (MF ) w i t h s u d a n b l a c k B h a d n o e f f e c t o n e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y . T h e u s e o f a g a r o s e d i s c g e l s a s a n e l e c t r o p h o r e t i c m e d i u m f a c i l i t a t e d t h e r e s o l u t i o n o f V L D L (MF) i n t o t w o c o m p o n e n t s . M o l e c u l a r s i e v i n g e f f e c t s a s w e l l a s t h e e l e c t r i c c h a r g e o f t h e l i p o p r o t e i n s h a d some r o l e i n t h e r e s o l u t i o n o b t a i n e d o n t h e a g a r o s e g e l s . T h e l i p o p r o t e i n b a n d w h i c h d i d n o t e n t e r t h e g e l w a s a p p a r e n t l y t o o l a r g e t o p e n e t r a t e t h e p o r e s o f t h e a g a r o s e g e l . A g a r o s e g e l s o f l e s s t h a n 0 . 5 % ( w / v ) w e r e i m p o s s i b l e t o h a n d l e ; t h e a g a r o s e c o n t e n t w a s t o o l o w . A t t e m p t s t o a d a p t t h i s m e t h o d t o a p r e p a r a t o r y s c a l e w e r e n o t s u c c e s s f u l . A g a r o s e h a s b e e n u s e d f o r many y e a r s a s a m e d i u m f o r e l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n o f l i p o p r o t e i n s ( K a l a b a n d M a r t i n , 1 9 6 8 a ; N o b l e , 1 9 6 8 ; I m m a r i n o e t a l . , 1 9 6 9 ; a n d Y a m a u c h i e t a l . , 1 9 7 6 ) , h o w e v e r t h e a g a r o s e w a s u s u a l l y s u p p o r t e d o n m i c r o s c o p e s l i d e s o r a p l a s t i c f i l m s t r i p . P r e s t a i n i n g o f l i p o p r o t e i n s w i t h s u d a n b l a c k B f o l l o w e d b y e l e c t r o -p h o r e s i s o n a c r y l a m i d e g e l s o r p a p e r h a s b e e n u s e d b y N a r a y a n e t a l . ( 1 9 6 6 a , 1 9 6 6 b ) a n d R i b e i r o a n d M c D o n a l d ( 1 9 6 3 ) . T h e p r e s e n t s t u d y i s t h e f i r s t a p p l i c a t i o n o f a g a r o s e d i s c g e l e l e c t r o p h o r e s i s p e r f o r m e d i n c o m b i n a t i o n w i t h s u d a n b l a c k B p r e s t a i n e d l i p o p r o t e i n s . T h e d i s c g e l e l e c t r o p h o r e t i c m e t h o d i s t h e m o s t s e n s i t i v e e l e c t r o p h o r e t i c s y s t e m , r e q u i r i n g o n l y a f e w p g o f l i p o p r o t e i n . A g a r o s e f i l m s t r i p e l e c t r o p h o r e s i s r e q u i r e s t h e u s e o f a 1% s a m p l e c o n c e n t r a t i o n . S u d a n b l a c k B p r e s t a i n i n g o f t h e l i p o p r o t e i n s p r o v i d e s a n i m m e d i a t e r e s u l t a s t h e b a n d s a r e s e e n m i g r a t i n g t h r o u g h t h e g e l , t h u s e l i m i n a t i n g t h e s t a i n i n g a n d d e s t a i n i n g s t e p s n o r m a l l y c a r r i e d o u t a f t e r e l e c t r o p h o r e t i c - 78 -s e p a r a t i o n . T h e e n t i r e e x p e r i m e n t f r o m f o r m a t i o n o f t h e a g a r o s e g e l s t o t h e c o m p l e t i o n o f t h e e l e c t r o p h o r e s i s r e q u i r e s l e s s t h a n 2 h r . E . A f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o n C o n c a n a v a l i n A - S e p h a r o s e 4B A l k y l a t e d V L D L (MF) w a s a p p l i e d t o t h e C o n c a n a v a l i n A - S e p h a r o s e c o l u m n a n d t h e a d s o r b e d m a t e r i a l w a s e l u t e d w i t h 0 . 2 M m e t h y l o(-D m a n n o p y r a n o s i d e ( F i g u r e 1 3 ) . A l k y l a t e d V L D L (MF) w a s s e p a r a t e d i n t o t w o f r a c t i o n s , V L D L - U ( u n r e t a i n e d ) a n d V L D L - R ( r e t a i n e d ) . S i m i l a r p a t t e r n s h a v e b e e n o b s e r v e d w i t h h u m a n s e r u m V L D L ( M c C o n a t h y a n d A l a u p o v i c , 1 9 7 4 ) a n d p i g s e r u m V L D L ( A z u m a e t al., 1 9 7 6 ) . When s a m p l e s o f n o n - a l k y l a t e d V L D L (MF) w e r e a p p l i e d t o t h e a f f i n i t y c o l u m n , o n l y t h e u n a d s o r b e d f r a c t i o n w a s o b t a i n e d . T h e s u g a r r e s i d u e s w h i c h w o u l d n o r m a l l y b i n d t o t h e C o n c a n a v a l i n A c o l u m n may b e u n a v a i l a b l e f o r b i n d i n g d u e t o t h e a g g r e g a t i o n o f t h e l i p o p r o t e i n . C a r b o h y d r a t e a n a l y s i s o f t h e d e l i p i d a t e d f r a c t i o n s r e v e a l e d t h a t t h e a p o V L D L c o n t a i n e d a s m a l l a m o u n t o f c a r b o h y d r a t e ( 2 . 5 1 % ) ; V L D L - R c o n t a i n e d a l m o s t t w i c e a s m u c h ( 4 . 8 3 % ) , a n d V L D L - U h a d o n l y 1 . 0 3 % c a r b o h y d r a t e ( T a b l e V I I I ) . T h e m a j o r c a r b o h y d r a t e d e t e c t e d i n a l l t h r e e f r a c t i o n s w a s h e x o s e s u g a r s , w i t h l e s s e r q u a n t i t i e s o f h e x o s a m i n e a n d s i a l i c a c i d s u g a r r e s i d u e s . T h e r a t i o s o f t h e s e s u g a r s o b t a i n e d f r o m t h e t h r e e f r a c t i o n s a r e v e r y s i m i l a r , i n d i c a t i n g t h e s e p a r t i c l e s may b e o f s i m i l a r s i z e , b u t h a v e d i f f e r e n t a f f i n i t i e s f o r C o n c a n a v a l i n A . R a j u a n d M a h a d e v a n ( 1 9 7 6 ) , d e t e r m i n e d t h e c a r b o h y d r a t e c o m p o s i t i o n o f y o l k p l a s m a V L D L . T h e y f o u n d t h e s u g a r s p r e s e n t i n a 0 5 10 15 20 25 T u b e N u m b e r F i g u r e 1 3 . E l u t i o n p r o f i l e o f a l k y l a t e d V L D L (MF) f r o m C o n - A S e p h a r o s e 4B c o l u m n ( i i n d i c a t e s a p p l i c a t i o n o f 0 . 2 M m e t h y l c*. -D m a n n o p y r a n o s i d e ) T a b l e V I I I . C a r b o h y d r a t e C o m p o s i t i o n o f A p o p r o t e i n s f r o m W h o l e a n d F r a c t i o n a t e d L i p o p r o t e i n s . H e x o s e / H e x o s a m i n e / S a m p l e H e x o s e * h e x o s a m i n e * S i a l i c A c i d * T o t a l S i a l i c A c i d R a t i o (% o f p r o t e i n ) (%) V L D L (MF) ' 1 . 6 8 + 0 . 0 8 0 . 5 8 + 0 . 0 3 0 . 2 5 + 0 . 0 3 2 . 5 1 1 . 0 / 0 . 3 5 / 0 . 1 5 V L D L - U 0 . 6 7 + 0 . 0 3 0 . 2 2 + 0 . 0 2 0 . 1 4 + 0 . 0 1 1 . 0 3 1 . 0 / 0 . 3 3 / 0 . 2 1 V L D L - R 3 . 1 6 + 0 . 1 5 1 . 0 8 + 0 . 0 6 0 . 5 9 + 0 . 0 3 4 . 8 3 1 . 0 / 0 . 3 4 / 0 . 1 9 V L D L 3 1 . 91 0 . 5 2 0 . 3 9 2 . 8 2 1 . 0 / 0 . 2 7 / 0 . 2 0 ( y o l k p l a s m a ) V L D L b 1 . 0 0 0 . 5 3 0 . 3 3 1 . 8 6 1 . 0 / 0 . 5 0 / 0 . 3 0 ( c h i c k e n s e r u m ) V L D L b 1 . 3 0 0 . 6 7 0 . 3 8 2 . 3 5 1 . 0 / 0 . 5 0 / 0 . 3 0 ( w h o l e e g g y o l k ) V L D L C 2 . 2 3 1 . 67 0 . 8 3 4 . 7 3 1 . 0 / 0 . 7 5 / 0 . 3 7 ( p i g s e r u m ) V L D L - U ° 0 . 9 3 0 . 4 7 0 . 1 4 1 . 5 4 1 . 0 / 0 . 5 0 / 0 . 1 5 ( p i g s e r u m ) V L D L - R ° 4 . 2 0 3 . 2 1 2 . 0 5 9 . 4 6 1 . 0 / 0 . 7 6 / 0 . 4 9 ( p i g s e r u m ) * m e a n o f 3 d e t e r m i n a t i o n s + s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n a f r o m R a j u a n d M a h a d e v a n , 1 9 7 6 b f r o m A b r a h a m e t a l . , 1 9 6 0 c f r o m A z u m a e_t a l . , 1 9 7 6 - 8 1 -h e x o s e / h e x o s a m i n e / s i a l i c a c i d r a t i o o f 1 . 0 / 0 . 2 7 / 0 . 2 0 , v e r y s i m i l a r t o t h e r e s u l t s o f t h e p r e s e n t s t u d y o f e g g y o l k g r a n u l e V L D L ( M F ) . A b r a h a m e_t a _ l . ( 1 9 6 0 ) s t u d i e d t h e 20S a n d h i g h e r l i p o p r o t e i n c l a s s o f w h o l e e g g y o l k a n d c h i c k e n s e r u m . T h e c a r b o h y d r a t e s b o u n d t o t h e l i p o p r o t e i n s o b t a i n e d f r o m b o t h s o u r c e s w e r e p r e s e n t i n i d e n t i c a l r a t i o s ( 1 . 0 / 0 . 5 / 0 . 3 ) . T h e y c o n c l u d e d t h a t t h e s e r u m l i p o p r o t e i n w a s t h e s o u r c e o f t h e e g g y o l k l i p o p r o t e i n s . T h e c a r b o h y d r a t e c o m p o s i t i o n o f p i g s e r u m l i p o p r o t e i n f r a c t i o n s f r o m a C o n c a n a v a l i n A c o l u m n ( A z u m a e_t a l . , 1 9 7 6 ) i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f t w i c e a s m u c h t o t a l c a r b o h y d r a t e i n t h e u n f r a c t i o n a t e d a p o V L D L a n d r e t a i n e d f r a c t i o n , a n d a s i m i l a r a m o u n t i n t h e u n r e t a i n e d f r a c t i o n w h e n c o m p a r e d t o e g g y o l k V L D L (MF) f r a c t i o n s o f t h e p r e s e n t s t u d y . T h e r a t i o s o f t h e s u g a r r e s i d u e s , h o w e v e r , w e r e n o t c o n s t a n t f r o m o n e f r a c t i o n t o a n o t h e r , i n d i c a t i n g t h a t t h e r e may b e a v a r i e t y o f p a r t i c l e s i z e s i n t h e p i g s e r u m V L D L . T h e w h o l e V L D L ( M F ) , V L D L - R a n d V L D L - U l i p o p r o t e i n s f r o m t h e C o n c a n a v a l i n A a f f i n i t y c o l u m n w e r e e x a m i n e d b y s e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y u l t r a c e n t r i f u g a t i o n . UV a b s o r p t i o n o p t i c s w e r e u s e d i n c o n j u n c t i o n w i t h t h e d a t a a c q u i s i t i o n s y s t e m a n d t h e r e s u l t s a r e t a b u l a t e d ( T a b l e I X ) . Two c o m p o n e n t s w e r e d e t e c t e d i n a l l t h r e e s a m p l e s , w i t h o b s e r v e d s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t s (S , ) o f 1 3 . 8 7 ' o b s a n d 5 6 . 4 8 S f o r w h o l e V L D L ( M F ) , 1 3 . 2 9 a n d 5 3 . 1 6 S f o r V L D L - U , a n d 1 5 . 4 5 a n d 6 1 . 4 5 S f o r t h e V L D L - R f r a c t i o n . T h e s i m i l a r i t y i n s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t s c o u l d b e a t t r i b u t e d t o p a r t i c l e s o f l i p o p r o t e i n s w h i c h a r e o f s i m i l a r s i z e . D i f f e r e n t a m o u n t s o f - 8 2 -T a b l e I X . S e d i m e n t a t i o n C o e f f i c i e n t s (S , ) o f V L D L (MF) a n d o b s V L D L (MF) F r a c t i o n s f r o m C o n c a n a v a l i n A A f f i n i t y C h r o m a t o g r a p h y . S a m p l e S e d i m e n t a t i o n C o e f f i c i e n t s (S , ) o b s S l o w C o m p o n e n t * F a s t C o m p o n e n t * V L D L (MF) 1 3 . 8 7 + 0 . 6 8 5 6 . 4 8 + 2 . 5 2 V L D L - U 1 3 . 2 9 + 0 . 6 5 5 3 . 1 6 + 2 . 3 4 V L D L - R 1 5 . 4 5 + 0 . 7 6 6 1 . 4 5 + 3 . 1 5 * m e a n o f 3 d e t e r m i n a t i o n s + s t a n d a r d e r r o r o f t h e m e a n - 83 -c a r b o h y d r a t e s b o u n d t o t h e p r o t e i n m o i e t i e s , w o u l d a c c o u n t f o r t h e i r b e h a v i o r o n t h e C o n A a f f i n i t y c o l u m n . T h e p o l y p e p t i d e c o m p o s i t i o n s o f t h e V L D L - U a n d V L D L - R w e r e a n a l y z e d b y SDS g e l e l e c t r o p h o r e s i s i n t h e p r e s e n c e o f 2— m e r c a p t o e t h a n o l . T h e s e r e s u l t s a r e c o m p a r e d w i t h t h o s e o b t a i n e d o n P A S s t a i n e d g e l s ( F i g u r e 1 4 ) . T h e p o l y p e p t i d e c o m p o s i t i o n s o f t h e t w o f r a c t i o n s o f V L D L s e p a r a t e d b y a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y d i f f e r e d f r o m e a c h o t h e r a l t h o u g h f e w p o l y p e p t i d e s w e r e common t o b o t h f r a c t i o n s . I t c a n b e s e e n t h a t b a n d s 1 , 2 , 4 , 7 a n d 8 ( 1 3 6 , 0 0 0 , 1 3 0 , 0 0 0 , 7 8 , 7 0 0 , 6 0 , ; 3 0 0 a n d 3 5 , 8 0 0 r e s p e c t i v e l y ) w e r e p r e d o m i n a n t i n t h e V L D L - U p r o t e i n , w h i l e b a n d s 1 , 2 , 5 a n d 1 0 ( 1 3 6 , 1 0 0 , 1 3 1 , 1 0 0 , 7 1 , 5 0 0 a n d 3 5 , 8 0 0 r e s p e c t i v e l y ) w e r e p r e d o m i n a n t i n t h e V L D L - R f r a c t i o n . T h e o t h e r b a n d s i n t h e SDS g e l s s t a i n e d o n l y l i g h t l y f o r p r o t e i n . O n l y b a n d 1 ( 1 3 6 , 0 0 0 ) i n V L D L - U r e a c t e d s t r o n g l y w i t h t h e PAS s t a i n f o r g l y c o p r o t e i n . B a n d s 1 , 5 , 7 a n d 8 ( 1 3 6 , 0 0 0 , 7 1 , 5 0 0 , 6 5 , 2 0 0 a n d 5 9 , 5 0 0 r e s p e c t i v e l y ) w e r e s t r o n g PAS p o s i t i v e b a n d s , b u t o t h e r w e a k l y p o s i t i v e PAS b a n d s w e r e o b s e r v e d i n b o t h f r a c t i o n s . I t w a s e v i d e n t t h a t V L D L - R w a s r i c h i n g l y c o p r o t e i n w h i l e V L D L - U c o n t a i n e d a l e s s e r a m o u n t o f c a r b o h y d r a t e -c o n t a i n i n g p r o t e i n s . T h i s i s i n a g r e e m e n t w i t h t h e t o t a l c a r b o h y d r a t e c o n t e n t o f t h e s e f r a c t i o n s . C o n c a n a v a l i n A h a s a s p e c i f i c i t y f o r t h e C - 3 , C - 4 a n d C - 6 h y d r o x y g r o u p s o f t h e <*-D g l u c o p y r a n o s y l , <x-D m a n n o p y r a n o s y l o r s t e r i c a l l y r e l a t e d s u g a r r e s i d u e s ( G o l d s t e i n et_ a l _ . , 1 9 6 5 ) a n d m o l e c u l e s h a v i n g t h e s e s t r u c t u r e s a r e b o u n d t o t h e a f f i n i t y c o l u m n s . V L D L (MF) w a s r e s o l v e d i n t o u n a d s o r b e d a n d a d s o r b e d f r a c t i o n s a n d - 84 -(A) (U) 1 2 3 4 7 8 (B) 1 3 5 6 7 Band 1 2 3 4 5 6 7 8 9 MW 136,000 130,000 110,700 78,700 74,200 67,600 60,300 54,100 9,200 Band MW ( R ) 3 4 6 8 9 10 11 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 136,100 131,100 83,200 77,200 71,500 67,000 65,200 59,500 46,300 35,800 23,800 Figure 14. SDS polyacrylamide gel electrophoresis of apoVLDL in the presence of BME of (U) Unretained fraction and (R) Retained fraction from Con A Sepharose 4B column stained with (A) Coomassie Blue and (B) PAS. I - 85 -t h e d i f f e r e n c e s i n a f f i n i t y f o r C o n c a n a v a l i n A a r e s u p p o r t e d b y t h e r e s u l t s o f t h e c a r b o h y d r a t e a n a l y s i s a n d g e l e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s o f t h e i r . a p o p r o t e i n s . F . D e l i p i d a t i o n o f V L D L (MF ) 1 . P a r t i a l d e l i p i d a t i o n u s i n g n - h e p t a n e T h e h e t e r o g e n o u s V L D L (MF) p a r t i c l e s c o u l d n o t b e s e p a r a t e d i n t o s u b f r a c t i o n s b y g e l f i l t r a t i o n t e c h n i q u e s . H o w e v e r , t h e r e h a v e b e e n s e v e r a l r e p o r t s i n t h e l i t e r a t u r e c o n c e r n i n g t h e f r a c t i o n a t i o n o f p a r t i a l l y d e l i p i d a t e d l i p o p r o t e i n s ( B r o w n e t a l . , 1 9 6 9 ; K a l a b a n d M a r t i n , 1 9 6 8 b a n d A u g u s t y n i a k e t a l . , 1 9 6 4 ) . T o t a l d e l i p i d a t i o n o f l i p o p r o t e i n u s u a l l y r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f i n s o l u b l e a p o p r o t e i n s . P a r t i a l d e l i p i d a t i o n w i t h d i e t h y l e t h e r o r n - h e p t a n e , h o w e v e r , r e s u l t s i n t h e p r e f e r e n t i a l r e m o v a l o f t h e n e u t r a l l i p i d c l a s s a n d p r e s e r v e s t h e s o l u b i l i t y o f t h e p h o s p h o l i p i d - p r o t e i n r e s i d u e s , w i t h o u t n e e d f o r t h e u s e o f d e t e r g e n t s o r o t h e r d i s s o c i a t i n g a g e n t s . A l k y l a t e d V L D L (MF) w a s d e l i p i d a t e d w i t h n - h e p t a n e a c c o r d i n g t o t h e p r o c e d u r e o f G u s t a f s o n ( 1 9 6 5 ) . T h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y o f c h l o r o f o r m - m e t h a n o l e x t r a c t s o f t h e p a r t i a l l y d e l i p i d a t e d l i p o p r o t e i n s i n d i c a t e d t h e a b s e n c e o f a l l n e u t r a l l i p i d s a n d t h e p r e s e n c e o f o n l y o n e s p o t , c o r r e s p o n d i n g t o p h o s p h o l i p i d s . T h e p a r t i a l l y d e l i p i d a t e d V L D L (MF) w a s s e p a r a t e d i n t o 2 f r a c t i o n s b y g e l f i l t r a t i o n o n a c a l i b r a t e d S e p h a r o s e 4B c o l u m n ( F i g u r e 1 5 ) . P e a k I e l u t e d a t 1 . 4 1 .2 1 e c o 00 u c O w 1 . 0 1 0 . 8 1 0 . 6 t 0 . 4 t 0 . 2 t 0 . 0 4 0 — i — 1 6 0 — i — 2 0 0 — i — 2 4 0 — i — 2 8 0 oo E l u t i o n V o l u m e ( m l ) 3 0 0 3 2 0 3 6 0 f 4 0 0 V „ F i g u r e 1 5 . S e p h a r o s e 4B c h r o m a t o g r a p h y o f h e p t a n e d e l i p i d a t e d V L D L (MF) - 87 -a v o l u m e e q u i v a l e n t t o a m o l e c u l a r w e i g h t o f 2 8 5 , 7 0 0 w h i l e p e a k I I e m e r g e d a t a v o l u m e c o r r e s p o n d i n g t o a m o l e c u l a r w e i g h t o f 3 4 , 0 0 0 . P a r t i a l d e l i p i d a t i o n p r o d u c e d s o l u b l e r e s i d u e s c h a r a c t e r i z e d b y p h o s p h o l i p i d / p r o t e i n r a t i o s o f 0 . 5 9 f o r p e a k I a n d 0 . 8 3 f o r p e a k I I . N e i t h e r o f t h e a b o v e f r a c t i o n s o b t a i n e d b y g e l f i l t r a t i o n w a s h o m o g e n e o u s i n t h e a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g e ; b o t h c o n t a i n e d t w o s e d i m e n t i n g f r a c t i o n s . P e a k I c o n t a i n e d 1 5 . 5 5 S a n d 1 0 . 4 5 S c o m p o n e n t s a n d p e a k I I c o n t a i n e d 7 . 2 2 S a n d 5 . 0 3 S c o m p o n e n t s (S , ) i n 0 . 2 M T r i s -obs HC1 b u f f e r ( p H 8 . 2 ) a t 4 5 , 0 0 0 r p m a t 2 0 ° C . A t h i r d p e a k , c o n t a i n e d a t t h e v o i d v o l u m e w a s e l u t e d f r o m n o n -a l k y l a t e d h e p t a n e d e l i p i d a t e d s a m p l e s . T h i s l i p o p r o t e i n w a s l i k e l y a n a g g r e g a t e s i n c e i t d i d n o t a p p e a r i n V L D L (MF) s a m p l e s t h a t w e r e a l k y l a t e d p r i o r t o d e l i p i d a t i o n . G r a n d a a n d S c a n u ( 1 9 6 6 ) s u b j e c t e d human s e r u m V L D L t o p a r t i a l d e l i p i d a t i o n w i t h d i e t h y l e t h e r i n t h e p r e s e n c e o f 0 . 2 M SDS . T h e p r o d u c t s w e r e s o l u b l e i n a l k a l i n e b u f f e r s , w i t h t h e r e m o v a l o f a l m o s t a l l t h e c h o l e s t e r o l a n d t r i g l y c e r i d e s . S e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y a n a l y s i s a o f t h e m i x t u r e i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f 3 l i p o p r o t e i n r e s i d u e s w i t h s e d i m e n t a t i o n c o e f f i c i e n t s o f 4 . 5 S , 1 0 . 9 S a n d 1 5 . 5 S . G u s t a f s o n e t a l . ( 1 9 6 6 ) e x t r a c t e d h u m a n s e r u m V L D L w i t h h e p t a n e i n t h e p r e s e n c e o f i n s o l u b l e s t a r c h . T h r e e s o l u b l e p h o s p h o l i p i d - p r o t e i n r e s i d u e s w e r e i s o l a t e d b y g e l f i l t r a t i o n . T h e s e f r a c t i o n s h a d s e d i m e n t a t i o n r a t e s o f 4 S , 7S a n d 14S a n d - t h e i r p h o s p h o l i p i d / p r o t e i n r a t i o s w e r e 0 . 9 , 2 . 4 a n d 0 . 7 r e s p e c t i v e l y . - 88 -A q u e o u s s o l u t i o n s o f p o r c i n e V L D L ( M a r t i n a n d T a k a t s , 1 9 6 9 ) e x t r a c t e d w i t h d i e t h y l e t h e r w e r e c o m p o s e d o f t h r e e f r a c t i o n s , c o n t a i n i n g b o t h p h o s p h o l i p i d s a n d n e u t r a l l i p i d s , w i t h s e d i m e n t a t i o n r a t e s o f 3 S , 5S a n d 1 1 S . J a n a d o a n d M a r t i n ( 1 9 7 3 ) a l s o e x t r a c t e d t h e l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s f r o m p i g s e r u m w i t h d i e t h y l e t h e r . C o m p o n e n t s w i t h o b s e r v e d s e d i m e n t a t i o n r a t e s o f 1 0 S , 1 3 S , 20S a n d 30S w e r e f o u n d . T h e 13S c o m p o n e n t r e p r e s e n t e d 7 0% o f t h e e x t r a c t e d L D L a n d a p p a r e n t l y r e a s s o c i a t e d t o f o r m h e a v i e r c o m p o n e n t s . A s i m i l a r e x t r a c t i o n p r o c e d u r e w a s u s e d b y M a r t i n et_ a l . (.1963) a n d b y A u g u s t y n i a k et_ a l _ . ( 1 9 6 4 ) o n t h e l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n f r o m t h e p l a s m a o f e g g y o l k . T h r e e f r a c t i o n s w e r e i s o l a t e d h a v i n g s e d i m e n t a t i o n r a t e s o f 4 S , 7S a n d 1 3 S . N e u t r a l l i p i d s w e r e a l s o f o u n d i n t h e e t h e r e x t r a c t e d l i p o p r o t e i n s . T h e e x t r a c t i o n o f V L D L (MF) b y t h e r e l a t i v e l y n o n p o l a r s o l v e n t h e p t a n e a l l o w e d t h e p r e p a r a t i o n o f 2 p a r t i a l l y d e l i p i d a t e d V L D L (MF ) w i t h o u t d e n a t u r a t i o n o f t h e r e s i d u a l p h o s p h o l i p i d - p r o t e i n c o m p l e x . T h e a g g r e g a t i o n o f l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s h a s b e e n f o u n d t o c o i n c i d e w i t h t h e r e m o v a l o f w a t e r f r o m t h e m e d i u m , s u g g e s t i n g t h a t w a t e r may e i t h e r c o n s t i t u t e a n e s s e n t i a l p a r t o f t h e l i p o p r o t e i n s t r u c t u r e o r a c t a s a p r o t e c t i v e a g e n t , p r e v e n t i n g c o l l i s i o n s b e t w e e n l i p o p r o t e i n m o l e c u l e s . I n e i t h e r c a s e w a t e r c o n t r i b u t e s t o t h e s t r u c t u r a l s t a b i l i t y o f t h e l i p o p r o t e i n s . C o m p o u n d s s u c h a s g l u c o s e , g l y c e r o l a n d s u c r o s e h a v e b e e n f o u n d t o b e a d e q u a t e s u b s t i t u t e s f o r w a t e r t o p r o t e c t s e r u m a n d m e m b r a n e l i p o p r o t e i n s f r o m d e n a t u r a t i o n ( G u s t a f s o n , 1 9 6 5 ) . T h e w a t e r - i n s o l u b l e p o t a t o s t a r c h u s e d i n t h i s s t u d y h a s many - 89 -h y d r o x y l g r o u p s w h i c h o f f e r t h e same p r o t e c t i o n t o V L D L (MF) a s w a t e r - s o l u b l e c a r b o h y d r a t e s . S t a r c h h a s t h e a d v a n t a g e t h a t t h e p h o s p h o l i p i d - p r o t e i n r e s i d u e s c a n b e e a s i l y s e p a r a t e d f r o m t h e i n s o l u b l e s t a r c h b y c e n t r i f u g a t i o n . P a r t i a l d e l i p i d a t i o n o f a q u e o u s s u s p e n s i o n s o f l i p o p r o t e i n s w i t h d i e t h y l e t h e r u s u a l l y r e s u l t s i n i n c o m p l e t e r e m o v a l o f n e u t r a l l i p i d ( H a y a s h i e t a l . , 1 9 5 9 ) . C o m p l e t e r e m o v a l o f n e u t r a l l i p i d s f r o m V L D L (MF) w a s a c h i e v e d b y e x t r a c t i o n o f t h e f r e e z e - d r i e d s t a r c h -V L D L (MF) m i x t u r e w i t h n - h e p t a n e . T h e e x t r a c t i o n o f t h e l i p o p r o t e i n s i n t h e d r i e d s t a t e i s a m o r e e f f i c i e n t m e a n s o f e x t r a c t i o n b e c a u s e o f t h e i n c r e a s e d s u r f a c e a r e a a n d c l o s e r c o n t a c t b e t w e e n t h e h e p t a n e a n d V L D L . Z i l v e r s m i t ( 1 9 6 4 ) d e m o n s t r a t e d t h i s b y h e p t a n e e x t r a c t i o n o f c h o l e s t e r o l f r o m l i p o p r o t e i n m o n o l a y e r s s p r e a d b e t w e e n p h o s p h a t e b u f f e r a n d h e p t a n e . T h e a m o u n t o f c h o l e s t e r o l e x t r a c t e d v a r i e d f r o m 5 4 - 1 0 0 % d e p e n d i n g o n t h e c o m p l e t e n e s s o f t h e m o n o l a y e r f o r m e d b y t h e l i p o p r o t e i n . 2 . T o t a l d e l i p i d a t i o n w i t h e t h a n o l - e t h e r T h e d e l i p i d a t i o n p r o c e d u r e i s o n e o f t h e m o s t c r i t i c a l f a c t o r s i n c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p r o t e i n m o i e t i e s o f V L D L . T h e m e t h o d o f S c a n u a n d E d e l s t e i n ( 1 9 7 1 ) u s i n g 3 : 1 ( v / v ) e t h a n o l - e t h e r h a s b e c o m e o n e o f t h e s t a n d a r d m e t h o d s f o r d e l i p i d a t i o n o f v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s . S m a l l m o l e c u l a r w e i g h t p e p t i d e s f r o m V L D L a r e s o l u b l e i n t h e e t h a n o l - e t h e r m i x t u r e , h o w e v e r , l e a d i n g t o i n c o m p l e t e p r o t e i n r e c o v e r y . T h e s e p r o t e i n s may b e r e c o v e r e d b y c h a n g i n g t h e s o l v e n t - 90 -r a t i o t o 3 : 5 ( v / v ) e t h a n o l - e t h e r ( S c a n u a n d E d e l s t e i n , 1 9 7 1 ) . L o n g e x t r a c t i o n t i m e s , t h e n e e d t o w o r k a t l o w t e m p e r a t u r e s a n d t h e u t i l i z a t i o n o f l a r g e v o l u m e s o f s o l v e n t s a r e s e v e r a l d i s a d v a n t a g e s o f t h i s d e l i p i d a t i o n p r o c e d u r e . T h e a p o p r o t e i n i s p r e c i p i t a t e d b y t h i s m e t h o d , b u t may b e l a t e r s o l u b i l i z e d w i t h SDS o r u r e a . T h e c h l o r o f o r m - m e t h a n o l ( 2 : 1 v / v ) m e t h o d o f F o l c h et_ a l • ( 1 9 5 7 ) r e n d e r s a p o V L D L o n l y p a r t i a l l y s o l u b l e , e v e n i n t h e p r e s e n c e o f s u c h d i s s o c i a t i n g a g e n t s a s u r e a o r SDS . T h i s m e t h o d w a s u s e d a s a m a t t e r o f c o n v e n i e n c e , h o w e v e r , f o r d e l i p i d a t i o n o f s a m p l e s f o r c h e m i c a l a n a l y s i s i n v o l v i n g a c i d h y d r o l y s i s p r o c e d u r e s , e . g . c a r b o h y d r a t e o r a m i n o a c i d a n a l y s i s . T h e e t h a n o l - e t h e r t r e a t m e n t r e n d e r e d e v e n a l k y l a t e d V L D L i n s o l u b l e u p o n r e m o v a l o f l i p i d . T h i s i n s o l u b i l i t y i s e f f e c t e d b y p r o t e i n - p r o t e i n i n t e r a c t i o n s w h i c h a r e o f a r e v e r s i b l e n a t u r e . S o l u b i l i z a t i o n i s p r e s u m a b l y e f f e c t e d b y i n t e r a c t i o n o f u r e a o r SDS w i t h t h e m o r e h y d r o p h o b i c a r e a s o f t h e p r o t e i n w h i c h b e c o m e e x p o s e d w h e n t h e l i p i d i s r e m o v e d ( K a n e e t a l _ . , 1 9 7 0 ) . T h e a p o V L D L p r o d u c e d b y e t h a n o l - e t h e r d e l i p i d a t i o n w a s c o m p l e t e d l y s o l u b l e i n 8M u r e a o r - 3 1 0 M SDS i n T r i s - H C l b u f f e r s . O n l y t r a c e a m o u n t s o f p h o s p h o l i p i d s w e r e d e t e c t e d b y t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y i n c h l o r o f o r m - m e t h a n o l e x t r a c t s o f t h e a p o p r o t e i n . T h e d i s c g e l e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s o f t h e a p o p r o t e i n w i l l b e p r e s e n t e d a n d d i s c u s s e d i n s e c t i o n I. M a n y o t h e r d e l i p i d a t i o n p r o c e d u r e s h a v e b e e n d e v e l o p e d o v e r t h e y e a r s f o r i s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e v a r i o u s s e r u m a p o p r o t e i n s . G o t t o e t a l - ( 1 9 6 8 ) s u c c i n y l a t e d t h e l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n f r o m human s e r u m a n d o b t a i n e d a s o l u b l e a p o p r o t e i n - 9 1 -a f t e r d e l i p i d a t i o n w i t h e t h a n o l - e t h e r ( 3 : 1 v / v ) . SDS ( 0 . 0 1 M ) w a s a d d e d t o t h e p r o t e i n p r i o r t o e x t r a c t i o n o f t h e l i p i d s a n d l a t e r r e m o v e d b y d i a l y s i s . S h o r e a n d S h o r e ( 1 9 6 7 ) h a v e d e s c r i b e d t h e p r e p a r a t i o n o f t h e p r o t e i n m o i e t y o f human s e r u m l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n b y e t h a n o l - e t h e r d e l i p i d a t i o n f o l l o w e d b y r e d u c t i o n a n d a l k y l a t i o n w i t h s o d i u m b o r o h y d r i d e a n d i o d o a c e t a m i d e i n t h e p r e s e n c e o f SDS . T h e m o d i f i e d a p o p r o t e i n s c o u l d b e s o l u b i l i z e d i n t h e p r e s e n c e o f 3% SDS o n l y i f 6 - 8 M u r e a w a s a d d e d . Cham a n d K n o w l e s 0 - 9 7 6 ) d e v e l o p e d a t e c h n i q u e f o r c o m p l e t e r e m o v a l o f l i p i d s f r o m s e r u m l i p o p r o t e i n s , w i t h o u t p r o t e i n p r e c i p i t a t i o n , u t i l i z i n g a m i x t u r e o f b u t a n o l a n d d i - i s o p r o p y l e t h e r ( 2 : 3 v / v ) . D e l i p i d a t i o n t o o k p l a c e i n a q u e o u s b u f f e r s y s t e m s a n d t h e a p o p r o t e i n s r e m a i n e d i n t h e a q u e o u s p h a s e w h i l e t h e o r g a n i c p h a s e c o n t a i n e d t h e l i p i d s . T h i s p r o c e d u r e d o e s n o t a f f e c t i o n i c s t r e n g t h o r p H o f t h e b u f f e r s y s t e m c o n t a i n i n g t h e l i p o p r o t e i n s . When t h i s p r o c e d u r e w a s a p p l i e d f o r d e l i p i d a t i o n o f e g g y o l k V L D L ( M F ) , h o w e v e r , t h e a p o p r o t e i n w a s p r e c i p i t a t e d . 3 . S o d i u m d e o x y c h o l a t e d e t e r g e n t d e l i p i d a t i o n A p o V L D L w a s p r e p a r e d i n a s o l u b l e b u t a g g r e g a t e d f o r m u s i n g t h e NaDOC d e l i p i d a t i o n p r o c e d u r e a n d t h e v i s c o u s , c l e a r a m b e r s o l u t i o n p r o d u c e d was a p p l i e d t o a c o l u m n o f S e p h a d e x G - 2 0 0 . T h e p r o t e i n e l u t e d i n t h e v o i d v o l u m e a s a c l e a r s o l u t i o n w h i l e t h e p h o s p h o l i p i d s a n d c h o l e s t e r o l e l u t e d l a t e r i n a s e p a r a t e p e a k ( F i g u r e 1 6 A ) . T h e p r o t e i n c o n t a i n e d no d e t e c t a b l e n e u t r a l l i p i d s o r c h o l e s t e r o l w h e n e x a m i n e d - 92 -o T u b e N u m b e r T F i g u r e 1 6 . ( A ) S e p a r a t i o n o f a p o V L D L a n d V L D L (MF ) l i p i d s b y g e l f i l t r a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f NaDOC. ( B ) R e m o v a l o f NaDOC f r o m a p o V L D L b y g e l f i l t r a t i o n . - 93 -b y c h e m i c a l a s s a y o r b y t h i n l a y e r c h r o m a t o g r a p h y . L e s s t h a n 0 . 5 % p h o s p h o l i p i d r e m a i n e d b o u n d t o t h e a p o p r o t e i n . T h e d e t e r g e n t w a s r e m o v e d f r o m t h e a p o p r o t e i n b y g e l f i l t r a t i o n o n S e p h a d e x G - 7 5 i n a d e t e r g e n t - f r e e m e d i u m . T h e p r o t e i n e l u t e d a t t h e v o i d v o l u m e a n d t h e d e t e r g e n t e l u t e d v e r y c l o s e t o t h e t o t a l v o l u m e o f t h e c o l u m n ( F i g u r e 1 6 B ) . No NaDOC w a s d e t e c t e d w h e n t h e a p o p r o t e i n w a s a s s a y e d f o r t h e p r e s e n c e o f t h e b i l e s a l t . T h e d e t e r g e n t f r e e a p o p r o t e i n w a s h i g h l y s o l u b l e i n pH 9 . 0 T r i s - H C l b u f f e r . S e d i m e n t a t i o n v e l o c i t y a n a l y s i s o f t h e a p o p r o t e i n , h o w e v e r , s h o w e d t h e p r e s e n c e o f a r a p i d l y s e d i m e n t i n g b o u n d a r y , w h i c h i n d i c a t e d t h a t t h e p r o t e i n w a s i n a h i g h l y a g g r e g a t e d s t a t e . T h i s a g g r e g a t i o n may h a v e b e e n c a u s e d b y t h e r e m o v a l o f t h e l i p i d f r o m t h e l i p o p r o t e i n o r b y t h e p r e s s u r e a n d c o n s t a n t s t i r r i n g a s t h e s a m p l e w a s c o n c e n t r a t e d b y u l t r a f i l t r a t i o n . T h e d e t e r g e n t d e l i p i d a t e d a p o p r o t e i n w a s s u b j e c t e d t o p o l y -a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s i n t h e p r e s e n c e o f SDS ; a s a m p l e o f V L D L (MF) d e l i p i d a t e d w i t h e t h a n o l - e t h e r 3 : 1 ( v / v ) w a s c o - e l e c t r o p h o r e s e d f o r c o m p a r i s o n . T h e e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s o f t h e t w o s a m p l e s w e r e i d e n t i c a l ( s e c t i o n I ) . C h e n a n d A l a d j e m ( 1 9 7 4 ) a n d H e l e n i u s a n d S i m o n s ( 1 9 7 2 ) u s e d d e o x y c h o l a t e d e t e r g e n t d e l i p i d a t i o n i n c o n j u n c t i o n w i t h g e l f i l t r a t i o n t o o b t a i n a l i p i d f r e e p r o t e i n f r o m human s e r u m l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n . L i p i d r e m o v a l b y d e t e r g e n t t r e a t m e n t w a s p o s t u l a t e d t o b e c a u s e d b y a n e x c h a n g e i n w h i c h d e o x y c h o l a t e i s b o u n d t o h y d r o p h o b i c r e g i o n s i n t h e p r o t e i n p r e v i o u s l y o c c u p i e d b y l i p i d . T h e p r e s e n c e o f - 94 -m i c e l l a r c o n c e n t r a t i o n s o f d e t e r g e n t c a u s e d t h e f o r m a t i o n o f a p o p r o t e i n a n d d e t e r g e n t m i c e l l e s a s w e l l a s d e t e r g e n t a n d l i p i d m i c e l l e s . T h e p r o t e i n - d e t e r g e n t c o m p l e x c a n b e s e p a r a t e d f r o m t h e m i x e d m i c e l l e s b y g e l f i l t r a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f t h e d e t e r g e n t ; t h e d e o x y c h o l a t e - l i p i d m i c e l l e s a r e o f s m a l l e r s i z e a n d t h e r e f o r e e l u t e a s a s e p a r a t e p e a k . T h i s d e l i p i d a t i o n p r o c e d u r e w a s e x a m i n e d b e c a u s e d e o x y c h o l a t e i s t h o u g h t t o b e a n o n - d e n a t u r i n g d e t e r g e n t a n d t h e r e f o r e a m u c h m i l d e r t r e a t m e n t t h a n o r g a n i c s o l v e n t d i l i p i d a t i o n . H e l e n i u s a n d S i m o n s (1971) d e m o n s t r a t e d t h a t d e o x y c h o l a t e d e l i p i d a t e d L D L f r o m human s e r u m d i d n o t u n d e r g o a n y c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s ; S D S - d e l i p i d a t i o n o f L D L h o w e v e r c a u s e d d e n a t u r a t i o n o f t h e p r o t e i n m o i e t y . G . A m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f a p o V L D L T h e r e s u l t s o f a m i n o a c i d a n a l y s e s o f 24 h r h y d r o l y s a t e s o f y o l k g r a n u l e a p o V L D L a r e p r e s e n t e d i n T a b l e X . T h e a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n o f a p o V L D L i s o l a t e d f r o m y o l k p l a s m a , w h o l e y o l k , h e n s e r u m a n d human s e r u m a r e i n c l u d e d f o r c o m p a r i s o n . T h e y o l k g r a n u l e a p o V L D L h a s a n a m i n o a c i d c o m p o s i t i o n t y p i c a l o f t h e V L D L w i t h r e s p e c t t o h i g h l e v e l s o f a s p a r t i c a c i d t h r e o n i n e , s e r i n e , g l u t a m i c a c i d , a l a n i n e a n d l y s i n e , a n d l i t t l e o r n o t r y p t o p h a n . T h e l a c k o f t r y p t o p h a n r e s i d u e s i n y o l k g r a n u l e a p o V L D L w o u l d a c c o u n t f o r i t s l o w a b s o r b a n c e a t 280 nm a f t e r s u b t r a c t i n g t h e c o n t r i b u t i o n o f a b s o r b a n c e d u e t o l i g h t s c a t t e r i n g ( F i g u r e 9 ) . - 95 -T a b l e X . A m i n o A c i d C o m p o s i t i o n o f A p o p r o t e i n s f r o m Y o l k G r a n u l e , Y o l k P l a s m a , W h o l e Y o l k , H e n S e r u m a n d Human S e r u m V L D L . W e i g h t % (w/w) A m i n o Y o l k g r a n u l e Y o l k p l a s m a W h o l e y o l k H e n s e r u m Human s e r u m ' A c i d a p o V L D L a p o V L D L a p o V L D L a p o V L D L a p o V L D L A s p 1 0 . 6 5 1 1 . 1 6 1 1 . 4 0 1 0 . 9 0 1 0 . 9 4 T h r * 8 . 7 2 5 . 6 9 6 . 4 8 6 . 2 6 6 . 5 5 S e r * 8 . 2 9 6 . 5 7 7 . 5 0 7 . 0 9 8 . 3 5 G l u 1 2 . 1 5 1 0 . 5 3 1 1 . 3 0 1 1 . 3 0 1 7 . 2 7 P r o 3 . 0 0 3 . 3 6 3 . 0 2 3 . 6 2 4 . 5 0 G l y 4 . 6 5 4 . 2 4 4 . 6 1 4 . 4 4 2 . 7 9 A l a 7 . 1 5 7 . 3 5 7 . 7 9 7 . 6 5 6 . 1 0 . V a l 5 . 0 8 6 . 6 7 6 . 7 3 6 . 6 0 5 . 0 6 M e t 1 . 7 9 2 . 1 1 1 . 4 8 2 . 0 2 N . D . * * H e 5 . 7 9 6 . 4 7 6 . 8 5 6 . 5 4 3 . 1 9 L e u 9 . 2 9 1 1 . 3 0 1 0 . 3 0 1 0 . 4 0 1 1 . 1 0 T y r 4 . 0 0 4 . 6 0 2 . 1 2 3 . 4 1 2 . 8 1 P h e 4 . 5 7 4 . 0 9 4 . 1 9 4 . 2 5 5 . 5 0 L y s 8 . 8 6 9 . 9 3 7 . 7 0 7 . 0 2 9 . 2 0 H i s 1 . 4 3 1 . 3 6 1 . 4 0 1 . 1 2 1 . 5 6 T r p 0 . 0 0 N . D . * * 0 . 6 1 1 . 7 7 N . D . * * A r g 4 . 5 7 5 . 7 6 5 . 3 5 4 . 5 8 1 . 5 6 * v a l u e s f o r t h r e o n i n e a n d s e r i n e e x t r a p o l a t e d t o z e r o h y d r o l y s i s 1 ** n o t d e t e r m i n e d a f r o m R a j u a n d M a h a d e v a n , 1 9 7 6 b f r o m H i l l y a r d e t a l . , 1 9 7 2 c f r o m K a n e f i t a l . , 1 9 7 5 - 9 6 -H. E l e c t r o p h o r e s i s o f V L D L (MF) i n t h e p r e s e n c e o f TMU K a n e ( 1 9 7 3 ) d e m o n s t r a t e d t h a t TMU d e l i p i d a t e s a n d d i s s o c i a t e s l i p o p r o t e i n s f r o m human s e r u m i n t o t h e i r c h a r a c t e r i s t i c s u b u n i t s . T h e w h o l e a p o p r o t e i n ( a p o B ) o f human s e r u m l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n a s w e l l a s t h a t f r a c t i o n o f t h e a p o p r o t e i n o f h u m a n s e r u m V L D L w h i c h r e p r e s e n t s i t s L D L c o n t e n t w e r e f o u n d t o b e p r e c i p i t a t e d b y t h i s r e a g e n t . T h e r e m a i n i n g a p o p r o t e i n s ( a p o C ) o f human V L D L a r e s o l u b l e i n TMU. Y o l k g r a n u l e V L D L (MF) w a s d e l i p i d a t e d o n t o p o f t h e s t a c k i n g g e l a n d e l e c t r o p h o r e s e d o n 1 0 % a c r y l a m i d e i n t h e p r e s e n c e o f t h e d e n a t u r i n g s o l v e n t TMU. T h r e e p r o t e i n b a n d s w e r e d e t e c t e d w h e n t h e g e l s w e r e s t a i n e d w i t h C o o m a s s i e b l u e ( F i g u r e 1 7 A ) . B a n d 1 r e m a i n e d o n t o p o f t h e s t a c k i n g g e l a n d w a s t h e f r a c t i o n p r e c i p i t a t e d b y TMU. B a n d 2 w a s l o c a t e d a t t h e i n t e r f a c e o f t h e s t a c k i n g g e l a n d t h e r u n n i n g g e l a n d b a n d 3 a p p e a r e d t o b e a s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n t r a v e l l i n g t h r o u g h t h e r u n n i n g g e l w i t h t h e t r a c k i n g d y e . T h e p r e s e n c e o f b a n d 3 w a s c o n f i r m e d f r o m e x p e r i m e n t s i n w h i c h n o t r a c k i n g d y e w a s u s e d . B a n d s 2 a n d 3 r e p r e s e n t e d t h e a p o p r o t e i n f r a c t i o n s s o l u b l e i n TMU. A l t e r n a t i v e l y , V L D L (MF) w a s d e l i p i d a t e d w i t h TMU i n a t e s t t u b e a n d t h e p r e c i p i t a t e d p r o t e i n w a s s e p a r a t e d f r o m t h e s o l u b l e p r o t e i n b y c e n t r i f u g a t i o n . B o t h t h e TMU s o l u b l e a n d t h e TMU i n s o l u b l e f r a c t i o n s w e r e t h e n s u b j e c t e d t o e l e c t r o p h o r e s i s . T h e TMU i n s o l u b l e f r a c t i o n p r o d u c e d o n l y b a n d 1 ( F i g u r e 1 7 B ) , w h i c h r e m a i n e d o n t o p o f t h e ( A ) ( B ) ( C ) F i g u r e 1 7 . E l e c t r o p h o r e s i s o f V L D L (MF ) i n t h e p r e s e n c e o f t e t r a m e t h y l u r e a ( T M U ) . ( A ) w h o l e V L D L (MF) (B) TMU i n s o l u b l e V L D L ( C ) TMU s o l u b l e V L D L - 98 -s t a c k i n g g e l ; n o o t h e r p r o t e i n s w e r e e v i d e n t i n t h e s e g e l s . T h e TMU s o l u b l e f r a c t i o n p r o d u c e d 2 b a n d s ( F i g u r e 1 7 C ) w h i c h h a d m o b i l i t i e s i d e n t i c a l w i t h b a n d s 2 a n d 3 f r o m w h o l e V L D L (MF) d e l i p i d a t e d b y t h e TMU m e t h o d . B a n d 2 , w h i c h r e m a i n e d a t t h e i n t e r f a c e o f t h e s t a c k i n g g e l a n d r u n n i n g g e l , w a s b e l i e v e d t o b e a n a g g r e g a t e o f p r o t e i n s w h i c h w e r e n o t d i s s o c i a t e d h y TMU o r t h e r e d u c i n g a g e n t s ( t h i o d i g l y c o l a n d m e r c a p t o a c e t i c a c i d ) u s e d i n t h i s s y s t e m . F u r t h e r d i s s o c i a t i o n o f t h i s p r o t e i n u s i n g 8M o r 10M u r e a , i n c o m b i n a t i o n w i t h 2 - m e r c a p t o e t h a n o l o r d i t h i o e r y t h r i t o l , f o l l o w e d b y e l e c t r o p h o r e s i s , f a i l e d t o d i s s o c i a t e t h i s p r o t e i n . C h a n g i n g t h e c o m p o s i t i o n o f t h e a c r y l a m i d e g e l s t o c o n t a i n 7 . 5 % o r 5% a c r y l a m i d e d i d n o t a f f e c t t h e m o b i l i t y o f t h i s p r o t e i n . A c o r r e l a t i o n w a s f o u n d b e t w e e n t h e s e p r o t e i n b a n d s f r o m t h e TMU e l e c t r o p h o r e s i s p r o c e d u r e a n d t h e SDS g e l e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s o f t h e f r a c t i o n s e l u t e d f r o m t h e S D S - S e p h a r o s e 6B c o l u m n ( F i g u r e 1 8 ) . T h e t h r e e p r o t e i n b a n d s f r o m t h e TMU e l e c t r o p h o r e s i s w e r e s l i c e d f r o m t h e u r e a - a c r y l a m i d e g e l s , e x t r a c t e d w i t h SDS a n d e l e c t r o p h o r e s e d i n t h e p r e s e n c e o f SDS o n 1 0 % a c r y l a m i d e g e l s . T h e p r o t e i n p r e c i p i t a t e d b y TMU ( b a n d 1 ) w a s s o l u b l e i n SDS a n d w a s f o u n d t o h a v e t h e same p o l y p e p t i d e c o m p o s i t i o n a s f r a c t i o n A e l u t e d b y SDS g e l f i l t r a t i o n ( F i g u r e 1 8 A ) . T M U - s o l u b l e b a n d 3 h a d a n i d e n t i c a l p o l y p e p t i d e c o m p o s i t i o n t o t h e s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t f r a c t i o n B f r o m t h e SDS c o l u m n ( F i g u r e 1 8B ). ' T h e i n t e r f a c i a l p r o t e i n ( b a n d 2 a p p e a r e d t o b e a n a g g r e g a t e o f t h e t w o p r o t e i n s , a n d w a s f o u n d t o c o n t a i n p o l y p e p t i d e s common t o b o t h f r a c t i o n s A a n d B f r o m t h e SDS c o l u m n ( F i g u r e 1 8 C ) . - 99 -(A) 1 2 4 5 10 12 13 14 15 16 17 18 ( B ) (C) 19 -20 -21 Band MW 2 1 136,800 2 130,600 3 111,200 4 86,300 5 82,600 5 6 79,200 7 77,800 10 8 76,500 9 75,000 13 10 72,300 11 68,100 12 64,900 16 13 60,400 14 54,900 15 49,800 1 R 16 45,700 lo 17 41,000 18 35,300 19 29,800 20 24-800 20 21 21,600 22 9,700 22 22 Figure 18. SDS polyacrylamide gel el e c t r o p h o r e s i s i n the presence of BME of (A) TMU insoluble Band 1/Sepharose 6B F r a c t i o n A (B) TMU soluble Band 3/Sepharose 6B F r a c t i o n B (C) TMU soluble Band 2 - 1 0 0 -T h e m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e s e p o l y p e p t i d e s w i l l b e d i s c u s s e d i n s e c t i o n I. C o m p l e t e d i s s o c i a t i o n o f t h e a p o p r o t e i n s w i t h TMU w a s a c h i e v e d i n s t u d i e s o f t h e s u b u n i t c o m p o s i t i o n o f t h e V L D L o f h u m a n s e r u m ( K a n e e t a l . , 1 9 7 5 ) a n d r a t p l a s m a ( M a r s h , 1 9 7 6 ; M a h l e y a n d H o l c o m b e , 1 9 7 7 ) u s i n g t h i s t e c h n i q u e . I t a p p e a r s h o w e v e r t h a t d i s s o c i a t i o n o f e g g y o l k a p o V L D L w a s n o t c o m p l e t e ; t h e i n t e r f a c i a l p r o t e i n ( b a n d 2 ) w a s a n a g g r e g a t e . T h e p r o t e i n c o m p o n e n t o f V L D L w h i c h a p p e a r s t o r e p r e s e n t t h e L D L -l i k e p r o t e i n w a s p r e c i p i t a t e d , a s w a s f o u n d i n t h e a b o v e s t u d i e s . T h e L D L a p o p r o t e i n i n human s e r u m i s c l a s s i f i e d a s a p o B ( S c a n u et_ a l . , 1 9 7 4 ) , a n d a p p e a r s t o b e p r e s e n t i n V L D L i s o l a t e d f r o m h u m a n , r a t , a n d c h i c k e n s e r u m . C h a n e t a l . ( 1 9 7 6 ) i s o l a t e d a f r a c t i o n f r o m h e n p l a s m a a p o V L D L r e s e m b l i n g t h e m a j o r a p o p r o t e i n f r o m human V L D L d e s i g n a t e d a p o B ( G o t t o e t a l . , 1 9 7 2 ) . T h i s a p o B may b e s i m i l a r t o t h e f r a c t i o n p r e c i p i t a t e d b y TMU i n t h i s s t u d y , a s H i l l y a r d et_ a l . ( 1 9 7 2 ) d e m o n s t r a t e d t h a t V L D L i s o l a t e d f r o m e g g y o l k w a s i d e n t i c a l w i t h t h e V L D L i s o l a t e d f r o m c h i c k e n s e r u m . P o s i t i v e i d e n t i f i c a t i o n o f t h e e g g y o l k a p o B - l i k e p r o t e i n u s i n g i m m u n o l o g i c a l t e c h n i q u e s w o u l d c l a r i f y t h i s p o i n t . I. M o l e c u l a r w e i g h t e s t i m a t i o n o f a p o V L D L p o l y p e p t i d e s b y SDS p o l y a c r y a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s SDS g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f a p o V L D L w a s c o n d u c t e d i n t h e p r e s e n c e o f BME o n 7 . 5 % o r 1 0% a c r y l a m i d e g e l s . T h e g e l s w e r e s t a i n e d f o r t h e p r e s e n c e o f g l y c o p r o t e i n u s i n g t h e PAS s t a i n i n g p r o c e d u r e a n d - 1 0 1 -f o r p r o t e i n w i t h C o o m a s s i e B l u e . T w e n t y - t w o b a n d s w e r e d e t e c t e d w i t h C o o m a s s i e B l u e w h e n a p o V L D L w a s r e d u c e d w i t h BME ( F i g u r e 1 9 A ) . T h e m o s t i n t e n s e l y s t a i n e d b a n d s h a d m o l e c u l a r w e i g h t s o f 1 3 6 , 3 0 0 , 1 3 1 , 0 0 0 ; 8 2 , 9 0 0 ; 7 2 , 1 0 0 ; 6 5 , 2 0 0 ; 6 0 , 2 0 0 ; 4 5 , 6 0 0 ; 3 5 , 2 0 0 a n d 9 , 6 0 0 . T h e r e m a i n i n g b a n d s s t a i n e d o n l y l i g h t l y b u t w e r e p r e s e n t i n a l l p r e p a r a t i o n s . F o u r t e e n b a n d s s t a i n e d p o s i t i v e l y f o r g l y c o p r o t e i n . T h e m o s t i n t e n s e l y P A S - r e a c t i v e b a n d s c o r r e s p o n d e d t o m o l e c u l a r w e i g h t s o f 1 3 6 , 3 0 0 ; 1 1 1 , 7 0 0 ; 7 5 , 0 0 0 a n d 6 0 , 2 0 0 ( F i g u r e 1 9 B ) . T h e o t h e r b a n d s a l w a y s s t a i n e d p o s i t i v e l y w i t h PAS b u t w e r e m u c h l e s s i n t e n s e . I n t h e a b s e n c e o f BME, 18 p r o t e i n b a n d s a n d 9 g l y c o p r o t e i n b a n d s w e r e r e s o l v e d . T h e m a j o r p r o t e i n s h a d m o l e c u l a r w e i g h t s o f 1 3 6 , 8 0 0 ; 1 3 0 , 6 0 0 ; 7 3 , 5 0 0 ; 3 6 , 5 0 0 a n d 1 2 , 5 0 0 ( F i g u r e 2 0 A ) . T h e i n t e n s e l y s t a i n e d PAS b a n d s h a d m o l e c u l a r w e i g h t s o f 1 3 6 , 8 0 0 ; 7 3 , 5 0 0 a n d 3 6 , 5 0 0 ( F i g u r e 2 0 B ) . A l l o t h e r b a n d s w e r e c o n s i s t e n t l y d e t e c t e d b u t w e r e s t a i n e d l e s s i n t e n s e l y . T h e m o s t n o t i c e a b l e c h a n g e i n t h e a p o V L D L p a t t e r n d u e t o t h e o m i s s i o n o f BME f r o m t h e s a m p l e w a s t h e a b s e n c e o f t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n ( 9 , 6 0 0 ) a n d t h e f o r m a t i o n o f s e v e r a l h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s ( 1 2 , 5 0 0 ; 4 8 , 4 0 0 ; 6 2 , 7 0 0 ; 9 1 , 5 0 0 ; 9 5 , 2 0 0 a n d 9 9 , 1 0 0 ) . T h e s e l a r g e r p r o t e i n s may b e a g g r e g a t e s j o i n e d t o g e t h e r b y d i s u l f i d e b o n d s w h i c h d i s a p p e a r u p o n a d d i t i o n o f BME, r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f s m a l l e r m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s . T h e a b o v e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t a p o V L D L c o n t a i n s 9 m a j o r p o l y p e p t i d e s t h a t r a n g e i n m o l e c u l a r w e i g h t f r o m 9 , 6 0 0 t o 1 3 6 , 0 0 0 . O t h e r c o m p o n e n t s w e r e d e t e c t e d , some o f w h i c h c o u l d b e p o l y m o r p h i c f o r m s o f t h e m a j o r o r m i n o r b a n d s c a u s e d b y s l i g h t v a r i a t i o n s i n t h e c o n t e n t o f s u g a r - 102 -( A ) (B) 1 3 5 6 9 10 12 13 15 16 18 20 Band MW 1 136,300 2 131,000 3 111,700 4 86,200 5 82,800 6 79,600 7 78,000 8 76,500 9 75,000 10 72,000 11 67,900 12 65,200 13 60,200 14 54,500 15 50,400 16 45,600 17 41,300 18 35,200 19 30,000 20 24,600 21 21,800 22 9,600 21 22 Figure 19. SDS polyacrylamide gel electrophoresis of apoVLDL in the present of BME and stained with ( A ) Coomassie Blue and (B) P A S . - 1 0 3 -( A ) 4 5 7 8 9 10 11 12 13 14 1 5 ( B ) 8 9 1 0 12 1 5 B a n d MW 1 1 3 6 , 8 0 0 2 1 3 0 , 6 0 0 3 1 1 2 , 0 0 0 4 9 9 , 1 0 0 5 9 5 , 2 0 0 6 9 1 , 5 0 0 7 8 7 , 8 0 0 8 8 1 , 3 0 0 9 7 3 , 5 0 0 1 0 6 6 , 7 0 0 11 6 2 , 7 0 0 12 5 9 , 1 0 0 1 3 5 4 , 0 0 0 1 4 4 8 , 4 0 0 1 5 3 6 , 5 0 0 1 6 2 4 , 1 0 0 17 2 1 , 0 0 0 1 8 1 2 , 5 0 0 16 16 17 18 18 F i g u r e 2 0 . SDS p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f a p o V L D L c o n d u c t e d i n t h e a b s e n c e o f BME a n d s t a i n e d w i t h ( A ) C o o m a s s i e B l u e a n d ( B ) P A S . - 1 0 4 -r e s i d u e s . T h i s m i c r o h e t e r o g e n e i t y w a s d e m o n s t r a t e d b y t h e f a c t t h a t 14 b a n d s w e r e P A S - r e a c t i v e a n d s i a l i c a c i d w a s f o u n d i n t h e a p o p r o t e i n u p o n c a r b o h y d r a t e a n a l y s i s . B r o w n e t a l . ( 1 9 6 9 ) h a v e r e p o r t e d t h a t d i f f e r e n c e s i n t h e s i a l i c a c i d c o n t e n t o f o t h e r w i s e i d e n t i c a l p o l y p e p t i d e s c o u l d a c c o u n t f o r t h i s t y p e o f p o l y m o r p h i s m . H i l l y a r d e t _ a l . ( 1 9 7 2 ) , u s i n g a p h e n o l - u r e a - a c e t i c a c i d e l e c t r o p h o r e s i s s y s t e m , d e t e c t e d o n l y 4 p r o t e i n c o m p o n e n t s i n c h i c k e n s e r u m V L D L . T h e m a j o r f r a c t i o n h a d a m o l e c u l a r w e i g h t o f 2 1 , 8 0 0 w h i c h d r o p p e d t o 9 , 0 0 0 i n t h e r e d u c e d f o r m . T h e o t h e r p r o t e i n c o m p o n e n t s w e r e o f m o l e c u l a r w e i g h t 5 1 , 2 0 0 ; 6 0 , 8 0 0 a n d 7 0 , 7 0 0 . T h e m a j o r p r o t e i n f o u n d i n t h e p r e s e n t s t u d y ( m o l e c u l a r w e i g h t 9 , 6 0 0 ) may b e s i m i l a r t o t h a t o f H i l l y a r d . C h a n e t a l . ( 1 9 7 6 ) c h a r a c t e r i z e d t h e h e n p l a s m a a p o V L D L a n d f o u n d t h a t 4 3 % o f t h e t o t a l a p o p r o t e i n c o n s i s t e d o f a p r o t e i n w h i c h m i g r a t e d i n a n e l e c t r o p h o r e t i c f i e l d a s i f i t h a d a m o l e c u l a r w e i g h t o f 1 2 , 0 0 0 -1 3 , 0 0 0 . I n t h e p r e s e n c e o f d i t h i o t h r e i t o l , t h e m o l e c u l a r w e i g h t w a s r e d u c e d f r o m 1 2 , 0 0 0 t o a p p r o x i m a t e l y 6 , 0 0 0 . Y a m a u c h i j ^ t a l . ( 1 9 7 6 ) i s o l a t e d a p o V L D L f r o m e g g y o l k p l a s m a a n d d e t e c t e d 18 p o l y p e p t i d e s ( r a n g i n g f r o m 1 0 , 0 0 0 t o 1 3 5 , 0 0 0 ) o f w h i c h 5 w e r e m a j o r c o m p o n e n t s ( 1 3 5 , 0 0 0 ; 8 2 , 0 0 0 ; 7 1 , 0 0 0 ; 6 2 , 0 0 0 a n d 1 6 , 0 0 0 ) . T h e 1 3 5 , 0 0 0 a n d 7 1 , 0 0 0 m o l e c u l a r w e i g h t c o m p o n e n t s w e r e g l y c o p r o t e i n s , s i m i l a r t o t h o s e f o u n d i n t h i s s t u d y . R a j u a n d M a h a d e v a n ( 1 9 7 6 ) f o u n d 1 3 p r o t e i n b a n d s w h e n a p o V L D L f r o m e g g y o l k p l a s m a w a s s u b j e c t e d t o SDS g e l e l e c t r o p h o r e s i s i n - 1 0 5 -t h e p r e s e n c e o f BME. A s i m i l a r p r o t e i n ( 1 2 , 5 0 0 ) w a s f o u n d i n t h i s s t u d y w h e n BME w a s o m i t t e d . H o w e v e r , i t d i d n o t s t a i n a s i n t e n s e l y w i t h C o o m a s s i e B l u e a s d i d t h e 9 , 6 0 0 m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n f o u n d i n t h e r e d u c e d a p o p r o t e i n . J . A g a r o s e g e l f i l t r a t i o n o f a p o V L D L T h e V L D L (MF) a p o p r o t e i n o b t a i n e d b y d e l i p i d a t i o n w i t h e t h a n o l -e t h e r o r s o d i u m d e o x y c h o l a t e w a s c o m p l e t e l y s o l u b l e i n 0 . 1 M T r i s -H C l b u f f e r ( pH 8 . 6 ) c o n t a i n i n g 8M u r e a . S e p h a r o s e 6 B - 8 M u r e a g e l c h r o m a t o g r a p h y r e s o l v e d t h e a p o V L D L i n t o 3 d i s t i n c t p e a k s ( F i g u r e 2 1 ) . T h e f i r s t p e a k (V^ . ) , e l u t e d i n t h e v o i d v o l u m e , f o l l o w e d b y a s e c o n d w e l l s e p a r a t e d p e a k (V-j-j.) • T h e t h i r d p e a k (V^^-j.) e l u t e d a t a v o l u m e e q u a l t o t h e t o t a l b e d v o l u m e . Two p r o t e i n p e a k s w e r e o b s e r v e d w h e n f r a c t i o n V f r o m t h e 8M u r e a c o l u m n o r w h o l e a p o V L D L ( F i g u r e 2 2 ) w a s p a s s e d t h r o u g h a c a l i b r a t e d c o l u m n o f S D S - S e p h a r o s e 6 B . T h e f i r s t f r a c t i o n ( A ) w a s e l u t e d a t a v o l u m e e q u i v a l e n t t o a m o l e c u l a r w e i g h t o f a p p r o x i m a t e l y 1 1 0 , 4 0 0 . T h e s e c o n d f r a c t i o n ( B ) w a s e l u t e d f r o m t h e c o l u m n a s i f i t w e r e a s m a l l p r o t e i n a t a v o l u m e e q u a l t o t h e t o t a l b e d v o l u m e a n d h a d a m o l e c u l a r w e i g h t o f 2 6 , 8 0 0 . T h e e l u t i o n v o l u m e s o f t h e 2 p e a k s o b t a i n e d f r o m t h e v o i d v o l u m e p e a k V f r o m t h e 8M u r e a c o l u m n w e r e i d e n t i c a l t o w h o s e o f w h o l e a p o V L D L a p p l i e d t o t h e SDS c o l u m n . T h e s e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t f r a c t i o n V w a s a n a g g r e g a t e o f t w o p r o t e i n s w h i c h w a s n o t c o m p l e t e l y d i s s o c i a t e d b y 8M u r e a ; b u t w h i c h w a s c o m p l e t e l y d i s s o c i a t e d b y SDS . 1.5 ' F i g u r e 2 1 . G e l f i l t r a t i o n o f a p o V L D L o n S e p h a r o s e 6B c o n t a i n i n g 8M u r e a . - 1 0 7 -- 1 08 " T h e s e r e s u l t s a r e i n a g r e e m e n t w i t h t h o s e f r o m t h e TMU e l e c t r o p h o r e s i s . T h e p r o t e i n w h i c h w a s f o u n d a t t h e i n t e r f a c e o f t h e s t a c k i n g a n d r u n n i n g g e l s w a s a n a g g r e g a t e o f t h e o t h e r t w o p r o t e i n s ( F i g u r e 1 8 C ) . P o l y p e p t i d e s o f m o l e c u l a r w e i g h t s r a n g i n g f r o m 9 , 7 0 0 t o 1 3 0 , 6 0 0 w e r e e v i d e n t ; s ome o f t h e s e w e r e common t o b o t h b a n d 1 ( f r a c t i o n A ) a n d b a n d 3 ( f r a c t i o n B ) . A l l s a m p l e s o f a p o V L D L w e r e f r a c t i o n a t e d o n l y o n t h e SDS c o l u m n d u e t o t h e i n c o m p l e t e d i s s o c i a t i o n o f a p o V L D L i n u r e a s o l u t i o n s a n d t h e i r p o s s i b l e c h e m i c a l m o d i f i c a t i o n b y c a r b a m y l a t i o n . SDS g e l e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s , i n t h e p r e s e n c e o f BME, o f f r a c t i o n s A a n d B f r o m t h e SDS c o l u m n c o r r e s p o n d e d t o t h e p r o t e i n s e x t r a c t e d f r o m t h e TMU g e l s ( F i g u r e 1 8 A a n d 1 8 B ) . T h e c a l i b r a t i o n c u r v e u s i n g k n o w n m o l e c u l a r w e i g h t m a r k e r s i n d i c a t e d s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s i n t h e a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e f r a c t i o n s . F r a c t i o n A ( b a n d 1 f r o m t h e TMU g e l ) c o n s i s t e d m a i n l y o f t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p r o t e i n s . E i g h t e e n b a n d s w e r e d e t e c t e d , s i x o f w h i c h s t a i n e d i n t e n s e l y w i t h C o o m a s s i e B l u e ( 1 3 6 , 8 0 0 ; 1 3 0 , 6 0 0 ; 6 4 , 9 0 0 ; 6 0 , 4 0 0 ; 4 5 , 7 0 0 a n d 3 5 , 5 0 0 ) . T h e r e m a i n i n g p r o t e i n s w e r e p r e s e n t i n s m a l l q u a n t i t i e s a n d t h e r e f o r e s t a i n e d f a i n t l y . F r a c t i o n B ( b a n d 3 f r o m TMU g e l s ) c o n t a i n e d 1 m a j o r p r o t e i n w i t h a n a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t o f 9 , 7 0 0 a n d 3 f a i n t b a n d s o f m o l e c u l a r w e i g h t s 2 1 , 6 0 0 ; 2 4 , 8 0 0 a n d 2 9 , 8 0 0 . T h e s e f i g u r e s c o m p a r e d w e l l w i t h t h o s e o b t a i n e d f r o m t h e c a l i b r a t i o n c u r v e o b t a i n e d f r o m S e p h a r o s e 6B c h r o m a t o g r a p h y i n t h e p r e s e n c e o f SDS . M o l e c u l a r w e i g h t d e t e r m i n a t i o n s u s i n g c a l i b r a t e d g e l f i l t r a t i o n c o l u m n s d o n o t d e t e c t s u c h h e t e r o g e n e i t y i n m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e f r a c t i o n s b u t g i v e m o l e c u l a r w e i g h t s c o r r e s p o n d i n g t o t h e e l u t i o n - 1 0 9 -v o l u m e s o f t h e f r a c t i o n s . T h e c o m b i n a t i o n o f t h e g r e a t e r r e s o l v i n g p o w e r o f t h e g e l e l e c t r o p h o r e s i s m e t h o d a n d t h e d i s s o c i a t i o n o f t h e a p o p r o t e i n s i n t h e p r e s e n c e o f 8M u r e a , SDS a n d BME p r o v i d e a m o r e a c c u r a t e d e t e r m i n a t i o n o f t h e m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e i s o l a t e d p o l y p e p t i d e s . T h e m o l e c u l a r w e i g h t s o f f r a c t i o n s A a n d B f r o m t h e SDS c o l u m n w e r e a l s o d e t e r m i n e d b y s e d i m e n t a t i o n e q u i l i b r i u m t e c h n i q u e s . T h e a m o u n t o f d e t e r g e n t b o u n d t o t h e a p o p r o t e i n f r a c t i o n s w a s n o t k n o w n o r e a s i l y d e t e r m i n e d , s o a l l SDS w a s r e m o v e d p r i o r t o u l t r a c e n t r i f u g a l a n a l y s i s o f t h e a p o p r o t e i n s . T h e m o l e c u l a r w e i g h t s c a l c u l a t e d f r o m t h e d a t a , t h e r e f o r e , r e f l e c t t h e s t a t e o f a g g r e g a t i o n o f t h e a p o p r o t e i n s a t t h e t i m e o f t h e e x p e r i m e n t . T h e p a r t i a l s p e c i f i c v o l u m e s ( v ) o f t h e a p o p r o t e i n s w e r e a l s o u n k n o w n a n d a s s u m e d t o b e 0 . 7 2 4 m l / g , w i t h t h e r e a l i z a t i o n t h a t t h i s i s a n a p p r o x i m a t e v a l u e w h i c h may b e a f f e c t e d b y t h e c a r b o h y d r a t e b o u n d t o b e a p o p r o t e i n s . 2 P l o t s o f l n c v e r s u s r ( F i g u r e 2 3 ) e x h i b i t e d s u b s t a n t i a l c u r v a t u r e a n d w e r e t h e r e f o r e f i t t e d t o a l e a s t s q u a r e s q u a d r a t i c 2 f u n c t i o n . V a l u e s o f d i n c / d r w e r e t h e n o b t a i n e d b y t a k i n g t h e f i r s t d e r i v a t i v e o f t h e p o l y n o m i a l a t e a c h m e a s u r e d r a d i a l d i s t a n c e . T h i s a l l o w e d c a l c u l a t i o n o f t h e w e i g h t a v e r a g e m o l e c u l a r w e i g h t (M ) a t w e a c h p o i n t . W e i g h t a v e r a g e m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e a p o p r o t e i n s w e r e e s t i m a t e d t o r a n g e f r o m 3 3 , 3 0 0 t o 1 6 5 , 8 0 0 a n d f r o m 5 , 8 0 0 t o 2 8 , 1 0 0 f o r f r a c t i o n s A a n d B r e s p e c t i v e l y . T h e s e v a l u e s w e r e t a k e n f r o m t h e m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e p r o t e i n f r o m n e a r t h e m e n i s c u s (M) F i g u r e 2 3 . L o w s p e e d s e d i m e n t a t i o n e q u i l i b r i u m u l t r a c e n t r i f u g a t i o n o f a p o p r o t e i n s i s o l a t e d b y SDS g e l c h r o m a t o g r a p h y . - I l l -t o t h e b o t t o m (B ) o f t h e c e l l . T h e a p p a r e n t m o l e c u l a r w e i g h t s (Mw ) o f t h e s e f r a c t i o n s w e r e 5 5 , 8 0 0 (A ) a n d 1 3 , 2 0 0 ( B ) o r a b o u t a p p o n e - h a l f t h o s e d e t e r m i n e d b y S D S - g e l f i l t r a t i o n . T h e s e v a l u e s i n a c c u r a t e l y r e p r e s e n t t h e m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e a p o p r o t e i n s s i n c e c o n s i d e r a b l e h e t e r o g e n e i t y i n m o l e c u l a r w e i g h t s w a s o b s e r v e d . 2 T h e c a l c u l a t i o n o f Mw f r o m n o n l i n e a r p l o t s o f l n c v e r s u s r a p p i n t r o d u c e d c o n s i d e r a b l e e r r o r i n t o t h e m o l e c u l a r w e i g h t s d u e t o t h e p o l y d i s p e r s i t y o f t h e s a m p l e . T h e w e i g h t a v e r a g e m o l e c u l a r w e i g h t s c a l c u l a t e d a t e a c h r a d i a l d i s t a n c e i n t h e c e n t r i f u g e c e l l m o r e c o r r e c t l y r e p r e s e n t t h e h e t e r o g e n e i t y a n d a g g r e g a t i o n s t a t e o f t h e s a m p l e a n d a r e i n c l o s e a g r e e m e n t w i t h t h e r a n g e o f m o l e c u l a r w e i g h t s o f f r a c t i o n s A a n d B a s d e t e r m i n e d b y SDS g e l e l e c t r o p h o r e s i s . R a j u a n d M a h a d e v a n ( 1 9 7 6 ) s e p a r a t e d y o l k p l a s m a a p o V L D L b y g e l f i l t r a t i o n o n S e p h a d e x G - 2 0 0 i n 0 . 5 % SDS a n d o b t a i n e d 3 p r o t e i n p e a k s . T h e s e c o n d p e a k w a s a s h o u l d e r o f t h e f i r s t , b u t t h e t h i r d p e a k w a s w e l l s e p a r a t e d f r o m t h e f i r s t t w o . . SDS g e l e l e c t r o p h o r e s i s o f t h e e l u t e d p r o t e i n s d e m o n s t r a t e d t h a t e a c h p e a k w a s h e t e r o g e n e o u s . T h e m a j o r p r o t e i n s i n t h e s e 3 f r a c t i o n s w e r e a r b i t r a r i l y d e s i g n a t e d a p o A , a p o B a n d a p o C . A p o A c o n s i s t e d o f 2 m a j o r b a n d s o f m o l e c u l a r w e i g h t s o f 1 8 0 , 0 0 0 a n d 1 0 0 , 0 0 0 , a n d a f e w m i n o r b a n d s . A p o B c o n s i s t e d o f 4 b a n d s ; t h e 2 m a j o r b a n d s c o n t a i n e d p r o t e i n s o f m o l e c u l a r w e i g h t s o f 7 8 , 0 0 0 a n d 6 4 , 0 0 0 . A p o C c o n t a i n e d 2 b a n d s o f m o l e c u l a r w e i g h t 1 2 , 5 0 0 a n d 9 , 4 0 0 . I t w a s i n d i c a t e d t h a t t h e 1 2 , 5 0 0 m o l e c u l a r w e i g h t c o m p o n e n t w a s a d i m e r f o r m e d b y d i s u l f i d e l i n k a g e o f t w o m o n o m e r s o f 9 , 4 0 0 m o l e c u l a r w e i g h t . I n t h i s s t u d y a s i m i l a r - 1 1 2 -r a n g e o f m o l e c u l a r w e i g h t s w a s o b s e r v e d f o r f r a c t i o n s A a n d B, a l t h o u g h o n l y 2 p e a k s w e r e r e s o l v e d o n t h e S e p h a r o s e 6B c o l u m n . T h i s c o u l d b e d u e t o t h e l a r g e p o r e s i z e o f t h e a g a r o s e c o l u m n c o m p a r e d t o t h e S e p h a d e x G - 2 0 0 g e l . T h e h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t s d e t e r m i n e d b y R a j u a n d M a h a d e v a n ( 1 9 7 6 ) f o r t h e a p o V L D L f r a c t i o n s c o u l d b e t h e r e s u l t o f i r r e v e r s i b l e a g g r e g a t i o n o f t h e a p o p r o t e i n s i n t h e c h l o r o f o r m - m e t h a n o l d e l i p i d a t i o n p r o c e d u r e w h i c h w a s u s e d . I t w a s f o u n d i n t h i s s t u d y t h a t c h l o r o f o r m - m e t h a n o l d e l i p i d a t i o n o f V L D L (MF) r e s u l t s i n i r r e v e r s i b l e d e n a t u r a t i o n o f t h e a p o p r o t e i n s . T h e m o l e c u l a r w e i g h t s d e t e r m i n e d b y Y a m a u c h i e t a l . ( 1 9 7 6 ) f o r a p o V L D L f r o m e g g y o l k p l a s m a a r e i n c l o s e a g r e e m e n t w i t h t h o s e f o u n d i n t h e p r e s e n t s t u d y o f a p o V L D L f r o m y o l k g r a n u l e s . Y a m a u c h i e_t a l . ( 1 9 7 6 ) f o u n d 18 p o l y p e p t i d e s b y SDS g e l e l e c t r o p h o r e s i s , f i v e o f w h i c h w e r e m a j o r p r o t e i n s w i t h m o l e c u l a r w e i g h t s o f 1 3 5 , 0 0 0 ; 8 2 , 0 0 0 ; 7 1 , 0 0 0 ; 6 2 , 0 0 0 a n d 1 6 , 0 0 0 . T h e 1 3 5 , 0 0 0 a n d 7 1 , 0 0 0 m o l e c u l a r w e i g h t c o m p o n e n t s w e r e g l y c o p r o t e i n s . C h a n e t a l . ( 1 9 7 6 ) f r a c t i o n a t e d a p o V L D L f r o m h e n p l a s m a o n a S e p h a d e x G - 1 5 0 c o l u m n c o n t a i n i n g 2mM SDS . Two p e a k s w e r e e l u t e d f r o m t h e c o l u m n , o n e o f w h i c h e l u t e d i n t h e v o i d v o l u m e . T h i s l a r g e m o l e c u l a r w e i g h t f r a c t i o n r e p r e s e n t e d t h e L D L - l i k e p r o t e i n w h i c h i s p r e s e n t i n V L D L . T h e s e c o n d f r a c t i o n h a d a m o l e c u l a r w e i g h t o f 1 2 , 0 0 0 - 1 3 , 0 0 0 , w h i c h u p o n r e d u c t i o n d r o p p e d t o 6 , 0 0 0 . T h e s e 2 f r a c t i o n s a p p e a r t o c o r r e s p o n d t o t h e a p o p r o t e i n f r a c t i o n s r e p o r t e d i n t h i s s t u d y . - 1 1 3 -V . SUMMARY AND CONCLUS IONS T h e v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s f r o m t h e g r a n u l e s o f h e n ' s e g g y o l k w e r e i s o l a t e d b y a c o m b i n a t i o n o f p r e p a r a t i v e u l t r a -c e n t r i f u g a t i o n a n d a g a r o s e g e l f i l t r a t i o n . U l t r a c e n t r i f u g a l , e l e c t r o p h o r e t i c a n d c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s e s w e r e p e r f o r m e d t o c h a r a c t e r i z e a n d a s s e s s t h e p u r i t y o f t h e V L D L (MF) a n d a p o V L D L . F l o t a t i o n v e l o c i t y a n a l y s i s o f V L D L (MF) i n d i c a t e d t h a t t h e p r e p a r a t i o n w a s h e t e r o g e n e o u s . Two m a j o r f l o a t i n g b o u n d a r i e s w e r e r e s o l v e d h a v i n g f l o t a t i o n c o e f f i c i e n t s ( S ^ ) o f 7 5 S a n d 2 0 7 S . I t w a s d e m o n s t r a t e d t h a t u p o n a l k y l a t i o n o f V L D L (MF) t h e f l o t a t i o n r a t e s o f t h e m a c r o m o l e c u l e s d e c r e a s e d t o 41 S a n d 1 0 8 S . U p o n s t o r a g e , V L D L (MF ) s a m p l e s f o r m d i s u l f i d e a g g r e g a t e s d u e t o t h e o x i d a t i o n o f s u l f h y d r y l g r o u p s . A l k y l a t i o n o f V L D L (MF) w i t h i o d o a c e t a m i d e p r e v e n t e d t h i s a g g r e g a t i o n , h o w e v e r i t w a s b e l i e v e d t h a t t h i s V L D L (MF) p a r t i c l e may e x i s t i n a p a r t i a l l y a g g r e g a t e d s t a t e i n f r e s h e g g y o l k . P a s s i n g V L D L (MF) t h r o u g h a n a f f i n i t y c o l u m n o f C o n c a n a v a l i n A p r o d u c e d a r e t a i n e d a n d a n u n r e t a i n e d f r a c t i o n . M o r e P A S - r e a c t i v e m a t e r i a l w a s f o u n d i n t h e b o u n d f r a c t i o n t h a n i n t h e u n b o u n d f r a c t i o n . T h e r e t a i n e d f r a c t i o n c o n t a i n e d t w i c e a s m u c h t o t a l c a r b o h y d r a t e a s t h e u n f r a c t i o n a t e d V L D L ( M F ) , w h i l e t h e u n r e t a i n e d V L D L (MF) c o n t a i n e d h a l f a s m u c h c a r b o h y d r a t e . T h e l i p o p r o t e i n s w e r e f o u n d t o c o n t a i n h e x o s e , h e x o s a m i n e a n d s i a l i c a c i d r e s i d u e s a n d t h e r e f o r e c o u l d b e t e r m e d g l y c o l i p o p r o t e i n s . - 114 -V L D L (MF) w a s p a r t i a l l y d e l i p i d a t e d w i t h n - h e p t a n e , w h i c h p r e f e r e n t i a l l y e x t r a c t e d t h e n e u t r a l l i p i d s a n d p r e s e r v e d t h e s o l u b i l i t y o f t h e p h o s p h o l i p i d - p r o t e i n r e s i d u e s . Two f r a c t i o n s w e r e i s o l a t e d b y g e l f i l t r a t i o n a n d c h a r a c t e r i z e d b y a n a l y t i c a l u l t r a c e n t r i f u g a t i o n a n d b y t h e i r p h o s p h o l i p i d / p r o t e i n r a t i o s . V L D L (MF) w a s d e l i p i d a t e d u s i n g NaDOC a n d e t h a n o l - e t h e r . NaDOC w a s f o u n d t o b e a m i l d d e l i p i d a t i o n p r o c e d u r e i n c o m p a r i s o n t o t h e o r g a n i c s o l v e n t s y s t e m . T h e a p o p r o t e i n s f r o m b o t h p r o c e d u r e s w e r e a g g r e g a t e d u p o n r e m o v a l o f l i p i d , h o w e v e r t h e NaDOC d e l i p i d a t e d p r o t e i n s r e m a i n e d s o l u b l e w h i l e t h e e t h a n o l - e t h e r d e l i p i d a t e d p r o t e i n s w e r e p r e c i p i t a t e d b y t h e o r g a n i c s o l v e n t s . T h e a p o p r o t e i n w a s s o l u b i l i z e d i n SDS o r u r e a . T e t r a m e t h y l u r e a (TMU) w a s u s e d t o d e l i p i d a t e V L D L (MF) a n d d i s s o c i a t e t h e a p o p r o t e i n s i n t o s u b u n i t s . E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f 3 a p o p r o t e i n s , o n e o f w h i c h w a s a n a g g r e g a t e o f t h e o t h e r t w o . SDS e l e c t r o p h o r e s i s o f t h e p r o t e i n s e x t r a c t e d f r o m t h e TMU g e l s d e m o n s t r a t e d t h a t e a c h b a n d w a s h e t e r o g e n e o u s , c o n t a i n i n g m a n y p o l y p e p t i d e s . A p o V L D L w a s d i s s o c i a t e d i n t o 22 p o l y p e p t i d e s ( m o l e c u l a r w e i g h t s r a n g i n g f r o m 9 , 6 0 0 t o 1 3 6 , 0 0 0 d a l t o n s ) i n t h e p r e s e n c e o f u r e a , SDS a n d 2 - m e r c a p t o e t h a n o l . F o u r t e e n o f t h e s e b a n d s w e r e g l y c o p r o t e i n i n n a t u r e a n d s t a i n e d p o s i t i v e l y w i t h t h e S c h i f f r e a g e n t . T h i s m i c r o h e t e r o g e n e i t y i n • p o l y p e p t i d e c o m p o s i t i o n i s d u e t o s l i g h t d i f f e r e n c e s i n t h e c a r b o h y d r a t e b o u n d t o t h e a p o p r o t e i n . I n t h e a b s e n c e o f 2 - m e r c a p t o e t h a n o l , o n l y 18 b a n d s w e r e r e s o l v e d , m o s t o f - 1 1 5 -w h i c h c o n t a i n e d h i g h e r m o l e c u l a r w e i g h t a g g r e g a t e s n o t p r e s e n t i n t h e r e d u c e d s a m p l e s . T h e a p o V L D L w a s f r a c t i o n a t e d o n 6% a g a r o s e c o l u m n s c o n t a i n i n g 8M u r e a o r 2mM SDS . Two a p o p r o t e i n f r a c t i o n s w e r e e l u t e d f r o m t h e SDS c o l u m n , a n d 3 f r o m t h e u r e a c o l u m n . T h e p r o t e i n f r o m t h e v o i d v o l u m e o f t h e u r e a c o l u m n w a s a n a g g r e g a t e o f t h e o t h e r t w o p r o t e i n s ; u r e a w a s n o t a s g o o d a d i s s o c i a t i n g a g e n t a s SDS . A c o r r e l a t i o n w a s f o u n d b e t w e e n t h e f r a c t i o n s e l u t e d f r o m t h e SDS c o l u m n a n d t h e p r o t e i n s e x t r a c t e d f r o m t h e TMU g e l s ; t h e p o l y p e p t i d e s i d e n t i f i e d b y SDS g e l e l e c t r o p h o r e s i s h a d i d e n t i c a l e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s . T h e m o l e c u l a r w e i g h t s o f t h e t w o a p o p r o t e i n s f r o m t h e SDS c o l u m n w e r e a n a l y z e d b y s e d i m e n t a t i o n e q u i l i b r i u m t e c h n i q u e s . A s p l o t s o f l n 2 c v e r s u s r w e r e n o n l i n e a r , w e i g h t a v e r a g e m o l e c u l a r w e i g h t s w e r e c a l c u l a t e d f o r e a c h m e a s u r e d r a d i a l d i s t a n c e f r o m t h e m e n i s c u s t o t h e b o t t o m o f t h e c e l l . T h e m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e f o r t h e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t c o m p o n e n t w a s 3 3 , 3 0 0 - 1 6 5 , 8 0 0 a n d 5 , 8 0 0 - 2 8 , 1 0 0 f o r t h e l o w m o l e c u l a r w e i g h t c o m p o n e n t . T h e s e v a l u e s c o r r e s p o n d w e l l w i t h t h e m o l e c u l a r w e i g h t r a n g e s o f t h e p o l y p e p t i d e s o b s e r v e d i n SDS e l e c t r o p h o r e s i s . H i l l y a r d e_t a l . ( 1 9 7 2 ) e s t a b l i s h e d t h e i d e n t i t y b e t w e e n h e n ' s s e r u m V L D L a n d e g g y o l k V L D L b y i m m u n o c h e m i c a l m e t h o d s . C h a n et^ a l . ( 1 9 7 6 ) c h a r a c t e r i z e d h e n p l a s m a V L D L , a n d R a j u a n d M a h a d e v a n ( 1 9 7 6 ) a n d Y a m a u c h i e t a l . ( 1 9 7 6 ) s t u d i e d t h e p o l y p e p t i d e c o m p o s i t i o n o f e g g y o l k p l a s m a V L D L . F r o m t h e s e r e s u l t s a n d t h o s e o b t a i n e d i n t h i s s t u d y , i t a p p e a r s t h a t t h e a p o p r o t e i n s i s o l a t e d f r o m h e n ' s p l a s m a , e g g y o l k p l a s m a a n d e g g y o l k g r a n u l e s h a v e s i m i l a r p r o t e i n m o i e t i e s . - 1 1 6 -L I T E R A T U R E C I T E D A l e x a n d e r , C . a n d C . E . D a y . 1 9 7 3 . D i s t r i b u t i o n o f s e r u m l i p o p r o t e i n s o f s e l e c t e d v e r t e b r a t e s . Comp. B i o c h e m . P h y s i o l . 4 6 B : 2 9 5 . A b r a h a m , S . , L . A . H i l l y a r d a n d L . I . C h a i k o f f . 1 9 6 0 . C o m p o n e n t s o f s e r u m a n d e g g y o l k l i p o p r o t e i n s : g a l a c t o s e , m a n n o s e , g l u c o s a m i n e a n d s i a l i c a c i d . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 8 9 : 7 4 . A c k e r s , G . K . 1 9 6 7 . A n e w c a l i b r a t i o n p r o c e d u r e f o r g e l f i l t r a t i o n c o l u m n s . J . B i o l . Chem. 2 4 2 : 3 2 3 7 . A u g u s t y n i a k , J . , W . G . M a r t i n a n d W . H . C o o k . 1 9 6 4 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f l i p o v i t e l l e n i n c o m p o n e n t s , a n d t h e i r r e l a t i o n t o l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s t r u c t u r e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 8 4 : 7 2 1 . A z u m a , J . , N . K a s h i m u r a a n d T . K o m a n o . 1 9 7 6 . S t u d i e s o n p i g s e r u m l i p o p r o t e i n s . I I I . A f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o f n a t i v e l i p o p r o t e i n s o n C o n c a n a v a l i n A - S e p h a r o s e . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 3 9 : 3 8 0 . B a c o n , W . L . , I. B r o w n a n d M . A . M u s s e r . 1 9 7 3 . L o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s o f c h i c k e n , t u r k e y a n d q u a i l e g g y o l k . P o u l t r y S c i . 5 2 : 1 7 4 1 . B a c o n , W . L . a n d M . A . M u s s e r . 1 9 7 4 . P a r t i t i o n i n g t u r k e y b l o o d p l a s m a a n d e g g y o l k l i p o p r o t e i n s u s i n g a g a r o s e g e l . P o u l t r y S c i . 5 3 : 1 1 6 7 . B a r t l e t t , G . R . 1 9 5 9 . P h o s p h o r o u s a s s a y i n c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y . J . B i o l . Chem. 2 3 4 : 4 6 6 . B a t t e l , M . L . , C . G . Z a r k a d a s , L . B . S m i l l i e a n d N . B . M a d s e n . 1 9 6 8 . T h e s u l f h y d r y l g r o u p s o f m u s c l e p h o s p h o r y l a s e . I d e n t i f i c a t i o n o f c y s t e i n y l p e p t i d e s r e l a t e d t o f u n c t i o n . J . B i o l . C h e m . 2 4 3 : 6 2 0 2 . B e r n a r d i , G . a n d W . H . C o o k . 1 9 6 0 . M o l e c u l a r w e i g h t a n d b e h a v i o r o f l i p o v i t e l l i n i n u r e a s o l u t i o n s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 4 : 1 0 5 . B e v e r i d g e , T . , S . J . Toma a n d S. N a k a i . 1 9 7 4 . D e t e r m i n a t i o n o f S H -a n d S S - g r o u p s i n some f o o d p r o t e i n s u s i n g E l l m a n ' s r e a g e n t . J . F o o d S c i . 3 9 : 4 9 . B r o w n , W . V . , R . I . L e v y a n d D . S . F r e d r i c k s o n . 1 9 6 9 . S t u d i e s o f t h e p r o t e i n s i n h u m a n p l a s m a v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s . J . B i o l . C h e m . 2 4 4 : 5 6 8 7 . • B u r l e y , R.W. a n d W . H . C o o k . 1 9 6 1 . I s o l a t i o n a n d c o m p o s i t i o n o f a v i a n e g g y o l k g r a n u l e s a n d t h e i r c o n s t i t u e n t d- a n d / S - l i p o -v i t e l l i n s . C a n . J . B i o c h e m . P h y s i o l . 3 9 : 1 2 9 5 . r - 1 1 7 -C h a m , B . E . a n d B .R . K n o w l e s . 1 9 7 6 . A s o l v e n t s y s t e m f o r d e l i p i d a t i o n o f p l a s m a o r s e r u m w i t h o u t p r o t e i n p r e c i p i t a t i o n . J . L i p i d R e s . 1 7 : 1 7 6 . C h a n , L . , R . L . J a c k s o n , B.W. O ' M a l l e y a n d A . R . M e a n s . 1 9 7 6 . S y n t h e s i s o f v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s i n t h e c o c k e r e l . E f f e c t s o f e s t r o g e n . J . C l i n . I n v e s t . 5 8 : 3 6 8 . C h a n g , C M . 1 9 6 9 . S t u d i e s o n e g g y o l k . P h . D . T h e s i s . U n i v . o f W i s . , M a d i s o n , W i s . C h e n , C . a n d F . A l a d j e m . 1 9 7 4 . S u b u n i t s t r u c t u r e o f t h e a p o p r o t e i n o f h u m a n s e r u m l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Comm. 6 0 : 5 4 9 . C h e r v e n k a , C H . 1 9 7 6 . E v a l u a t i o n o f a UV s c a n n i n g a c c e s s o r y f o r p r e p a r a t i v e u l t r a c e n t r i f u g e s . B e c k m a n a p p l i c a t i o n d a t a , S p i n c o D S - 4 5 2 . C o o k , W . H . 1 9 6 8 . M a c r o m o l e c u l a r c o m p o n e n t s o f e g g y o l k . I n T . C C a r t e r ( E d i t o r ) , E g g Y o l k Q u a l i t y . A S t u d y o f H e n ' s E g g , O l i v e r a n d B o y d , E d i n b u r g , p . 1 0 9 . D a v i s , B . J . 1 9 6 4 . D i s k e l e c t r o p h o r e s i s I I . M e t h o d s a n d a p p l i c a t i o n t o h u m a n s e r u m p r o t e i n s . A n n . N . Y . A c a d . S c i . 1 2 1 : 4 0 4 . D e L a l l a , O . F . a n d J . W . G o f m a n . 1 9 5 4 . U l t r a c e n t r i f u g a l a n a l y s i s o f s e r u m l i p o p r o t e i n s . I n D. G l i c k ( E d i t o r ) , M e t h o d s o f B i o c h e m i c a l  A n a l y s i s , I n t e r s c i e n c e , N . Y . 1 : 4 5 9 . D e u t s c h , D. 1 9 7 6 . E f f e c t o f p r o l o n g e d 1 0 0 ° C h e a t t r e a t m e n t i n SDS u p o n p e p t i d e b o n d c l e a v a g e . A n a l . B i o c h e m . 7 1 : 3 0 0 . E d e l s t e i n , C , C T . L i m a n d A . M . S c a n u . 1 9 7 2 . On t h e s u b u n i t s t r u c t u r e o f t h e p r o t e i n o f human s e r u m h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n . I . A . s t u d y o f i t s m a j o r p o l y p e p t i d e c o m p o n e n t ( S e p h a d e x f r a c t i o n I I I ) . J . B i o l . C h e m . 2 4 7 : 5 8 4 2 . E l s o n , L . A . a n d W . T . J . M o r g a n . 1 9 3 3 . C i t e d I n E . F . N e u f e l d a n d V . G i n s b u r g ( E d i t o r s ) , 1966, M e t h o d s i n E n z y m o l o g y , V o l . V I I I , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , p . 5 6 . E v a n s , R . J . , S . L . B a n d e m e r , J . A . D a v i d s o n , K. H e i n l e i n a n d S . S . V a g h e f i . 1 9 6 8 . B i n d i n g o f l i p i d t o p r o t e i n i n t h e l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n f r o m t h e h e n ' s e g g . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 6 4 : 5 6 6 . E v a n s , R . J . , D . H . B a u e r , S . L . B a n d e m e r , S . B . V a g h e f i a n d C J . F l e g a l . 1 9 7 3 . S t r u c t u r e o f e g g y o l k v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n . P o l y -d i s p e r s i t y o f t h e v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n a n d t h e r o l e o f l i p o v i t e l l e n i n i n t h e s t r u c t u r e . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 1 5 4 : 4 9 3 . - 1 18 -E v a n s , R . J . , D . H . B a u e r a n d C . J . F l e g a l . 1 9 7 4 . T h e e g g y o l k v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s o f f r e s h a n d s t o r e d s h e l l e g g s . P o u l t r y S c i . 5 3 : 6 4 5 . E v a n s , R . J . , D . H . B a u e r a n d C . J . F l e g a l . 1 9 7 5 a . T h e i n f l u e n c e o f s t o r a g e o f s h e l l e g g s p r o d u c e d b y h e n ' s f e d c r u d e c o t t o n - s e e d o i l o n t h e v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s f r o m t h e s e e g g s . P o u l t r y S c i . 5 4 : 2 8 0 . E v a n s , R . J . , C . J . F l e g a l a n d D . H . B a u e r . 1 9 7 5 b . M o l e c u l a r s i z e s o f e g g y o l k v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s f r a c t i o n a t e d b y u l t r a c e n t r i f u g a t i o n . P o u l t r y S c i . 5 4 : 8 8 9 . F a i r b a n k s , G . , T . L . S t a c k a n d D .R . W a l l a c h . 1 9 7 1 . E l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s i s o f t h e m a j o r p o l y p e p t i d e s o f t h e h u m a n e r y t h r o c y t e m e m b r a n e . B i o c h e m . 1 0 : 2 6 0 6 . F i d g e , N . 1 9 7 3 . T h e i s o l a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f p i g p l a s m a l i p o p r o t e i n s a n d p a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e i r a p o p r o t e i n s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 2 9 5 : 2 5 8 . F i d g e , N . H . 1 9 7 6 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t a p o l i p o p r o t e i n s f r o m p i g p l a s m a v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 2 4 : 2 5 3 . F o l c h , J . , M . L e e s a n d G . H . S l o a n e - S t a n l e y . 1 9 5 7 . A s i m p l e m e t h o d f o r t h e i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f t o t a l l i p i d s f r o m a n i m a l t i s s u e . J . B i o l . C h e m . 2 2 6 : 4 9 7 . G a r l a n d , T . D . 1 9 7 3 . S t u d i e s o n e g g y o l k m y e l i n f i g u r e s a n d g r a n u l e l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s . P h . D . T h e s i s , U n i v . o f B . C . , V a n c o u v e r , B . C . G i b b o n s , R . A . 1 9 6 6 . _In A . G o t t s c h a l k ( E d i t o r ) G l y c o p r o t e i n s - T h e i r  C o m p o s i t i o n , S t r u c t u r e a n d F u n c t i o n , 2 n d E d i t i o n , E l s e v i e r , New Y o r k . G l i c k m a n , R . M . a n d K. K i r s c h . 1 9 7 4 . T h e a p o p r o t e i n s o f v a r i o u s s i z e c l a s s e s o f human c h y l o u s f l u i d l i p o p r o t e i n s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 3 7 1 : 2 5 5 . G o l d s t e i n , I . J . , C . E . H o l l e r m a n a n d E . E . S m i t h . 1 9 6 5 . P r o t e i n -c a r b o h y d r a t e i n t e r a c t i o n . I I . I n h i b i t i o n s t u d i e s o f C o n c a n a v a l i n A w i t h p o l y s a c c h a r i d e s . B i o c h e m . 4 : 8 7 6 . G o r n a l l , D .A . a n d A . K u k s i s . 1 9 7 1 a . R e s o l u t i o n o f e g g y o l k l i p o p r o t e i n s b y c h r o m a t o g r a p h y o n t h i n l a y e r s o f h y d r o x y l a p a t i t e . C a n . J . B i o c h e m . 4 9 : 4 4 . - 119 -G o r n a l l , D . A . a n d A . K u k s i s . 1 9 7 1 b . M o l e c u l a r s p e c i e s o f g l y c e r o p h o s p h a t i d e s a n d t r i g l y c e r i d e s o f e g g y o l k l i p o p r o t e i n s . C a n . J . B i o c h e m . 4 9 : 5 1 . G o t t o , A . M . , W.V . B r o w n , R . I . L e v y , M . E . B i r n b a u n e r a n d D . S . F r e d r i c k s o n . 1 9 7 2 . E v i d e n c e f o r t h e i d e n t i t y o f t h e m a j o r a p o p r o t e i n i n l o w d e n s i t y a n d v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s i n n o r m a l s u b j e c t s a n d p a t i e n t s w i t h f a m i l i a l h y p e r l i p o p r o t e i n e m i a . J . C l i n . I n v e s t . 5 1 : 1 4 8 6 . G o t t o , A . M . , R . I . L e v y a n d D . S . F r e d r i c k s o n . 1 9 6 8 . Human s e r u m B e t a -l i p o p r o t e i n ; P r e p a r a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f a d e l i p i d a t e d , s o l u b l e d e r i v a t i v e . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Comm. 3 1 : 1 5 1 . G r a n d a , J . L . a n d A . S c a n u . 1 9 6 6 . S o l u b i l i z a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f t h e a p o p r o t e i n s o f t h e v e r y l o w - a n d l o w - d e n s i t y l i p o p r o t e i n s o f human s e r u m . B i o c h e m . 5 : 3 3 0 1 . G u s t a f s o n , A . 1 9 6 5 . New m e t h o d f o r p a r t i a l d e l i p i d a t i o n o f s e r u m l i p o p r o t e i n s . J . L i p i d R e s . 6 : 5 1 2 . G u s t a f s o n , A . , P . A l a u p o v i c a n d R . H . F u r m a n . 1 9 6 6 . S t u d i e s o f t h e c o m p o s i t i o n a n d s t r u c t u r e o f s e r u m l i p o p r o t e i n s . S e p a r a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f p h o s p h o l i p i d - p r o t e i n r e s i d u e s o b t a i n e d b y p a r t i a l d e l i p i d a t i o n o f v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s o f h u m a n s e r u m . B i o c h e m . 5 : 6 3 2 . H a y a s h i , S . , F . L i n d g r e n a n d A . N i c h o l s . 1 9 5 9 . D e g r a d a t i o n o f S 2 0 0 - 4 0 0 a n d h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n s o f h u m a n s e r a b y e t h y l e t h e r . J . Am. C h e m . S o c . 8 1 : 3 7 9 3 . H e l e n i u s , A . a n d K. S i m o n s . 1 9 7 1 . R e m o v a l o f l i p i d s f r o m h u m a n p l a s m a l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s b y d e t e r g e n t s . B i o c h e m . 1 0 : 2 5 4 2 . H e l e n i u s , A . a n d K. S i m o n s . 197 2 . T h e b i n d i n g o f d e t e r g e n t s t o l i p o p h i l i c a n d h y d r o p h i l i c p r o t e i n s . J . B i o l . C h e m . 2 4 7 : 3 6 5 6 . H e r b e r t , P . N . , R . S . S h u l m a n , R . I . L e v y a n d D . S . F r e d r i c k s o n . 1 9 7 3 . F r a c t i o n a t i o n o f t h e C - a p o l i p o p r o t e i n s f r o m h u m a n p l a s m a v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s . J . B i o l . C h e m . 2 4 8 : 4 9 4 1 . H i l l y a r d , L . A . , H .M . W h i t e a n d S . A . P a n g b u r n . 1 9 7 2 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f a p o l i p o p r o t e i n s i n c h i c k e n s e r u m a n d e g g y o l k . B i o c h e m . 1 1 : 5 1 1 . H j e r t e n , S. 1 9 6 4 . T h e p r e p a r a t i o n o f a g a r o s e s p h e r e s f o r c h r o m a t o g r a p h y o f m o l e c u l e s a n d p a r t i c l e s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 7 9 : 3 9 3 . I m m a r i n o , R . M . , M . H u m p h r e y a n d P . A n t o l i k . 1 9 6 9 . A g a r g e l l i p o p r o t e i n e l e c t r o p h o r e s i s : A c o r r e l a t e d s t u d y w i t h u l t r a c e n t r i f u g a t i o n . C l i n . Chem. 1 5 : 1 2 1 8 . - 1 2 0 -I n t e r n a t i o n a l C r i t i c a l T a b l e s o f N u m e r i c a l D a t a . P h y s i c s , C h e m i s t r y a n d T e c h n o l o g y . 1 9 2 7 . E.W. W a s h b u r n ( E d i t o r ) V o l u m e I I , M c G r a w - H i l l B o o k C o m p a n y , New Y o r k . p . 3 2 8 . J a n a d o , M . a n d W . G . M a r t i n . 1 9 7 3 . E v i d e n c e f o r p r o t e i n s u b u n i t s i n l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n f r o m p i g s e r u m . A g r . B i o l . Chem. 3 7 : 2 8 3 5 . K a l a b , M . a n d W.G . M a r t i n . 1 9 6 8 a . E l e c t r o p h o r e s i s o f p i g s e r u m l i p o p r o t e i n s i n a g a r o s e g e l . A n a l . B i o c h e m . 2 4 : 2 1 8 . K a l a b , M . a n d W . G . M a r t i n . 1 9 6 8 b . G e l f i l t r a t i o n o f n a t i v e a n d m o d i f i e d p i g s e r u m l i p o p r o t e i n s . J . C h r o m a t o g . 3 5 : 2 3 0 . K a n e , J . P . 1 9 7 3 . A r a p i d e l e c t r o p h o r e t i c t e c h n i q u e f o r i d e n t i f i c a t i o n o f s u b u n i t s p e c i e s o f a p o p r o t e i n s i n s e r u m l i p o p r o t e i n s . A n a l . B i o c h e m . 5 3 : 3 5 0 . K a n e , J . P . , E . G . R i c h a r d s a n d R . J . H a v e l . 1 9 7 0 . S u b u n i t h e t e r o g e n e i t y i n human s e r u m B e t a - l i p o p r o t e i n . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 6 6 : 1 0 7 5 . K a n e , J . P . , T . S a t a , R . L . H a m i l t o n a n d R . J . H a v e l . 1 9 7 5 . A p o p r o t e i n c o m p o s i t i o n o f v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s o f h u m a n s e r u m . J . C l i n . I n v e s t . 5 6 : 1 6 2 2 . K o g a , S . , D . L . H o r o w i t z a n d A . M . S c a n u . 1 9 6 9 . I s o l a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f l i p o p r o t e i n s f r o m n o r m a l r a t s e r u m . J . L i p i d R e s . 1 0 : 5 7 7 . L i n d g r e n , F . T . , L . C . J e n s e n , R . D . W i l l s a n d N . K . F r e e m a n . 1 9 6 9 . F l o t a t i o n r a t e s , m o l e c u l a r w e i g h t s a n d h y d r a t e d d e n s i t i e s o f t h e l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s . L i p i d s 4 : 3 3 7 . L i u , T . Y . a n d Y . H . C h a n g . 1 9 7 1 . H y d r o l y s i s o f p r o t e i n s w i t h p - t o l u e n e s u l f o n i c a c i d . J . B i o l . C h e m . 2 4 6 : 2 8 4 2 . L o w r y , O . H . , N . J . R o s e n b r o u g h , A . L . F a r r a n d R . J . R a n d a l l . 1 9 5 1 . P r o t e i n m e a s u r e m e n t w i t h t h e F o l i n p h e n o l r e a g e n t . J . B i o l . C h e m . 1 9 3 : 2 6 5 . M a , S . K . 1 9 7 5 . M e a s u r e m e n t o f s i z e d i s t r i b u t i o n s o f h u m a n s e r u m v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s . P h . D . T h e s i s , U n i v . o f C a l i f . , L o s A n g e l e s , C a l i f . M a , S . K . , V . N . S c h u m a k e r a n d C M . K n o b l e r . 1 9 7 7 . T u r b i d i m e t r i c u l t r a c e n t r i f u g a t i o n . A p p l i c a t i o n t o t h e s t u d y o f human s e r u m v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n d i s t r i b u t i o n s . J . B i o l . C h e m . 2 5 2 : 1 7 2 8 . M a c K e n z i e , S . L . a n d W . G . M a r t i n . 1 9 6 7 . T h e m a c r o m o l e c u l a r c o m p o s i t i o n o f h e n ' s e g g y o l k a t s u c c e s s i v e s t a g e s o f m a t u r a t i o n . C a n . J . B i o c h e m . 4 5 : 5 9 1 . - 1 2 1 -M a h l e y , R.W. a n d K . S . H o l c o m b e . 1 9 7 7 . A l t e r a t i o n s o f t h e p l a s m a l i p o p r o t e i n s a n d a p o p r o t e i n s f o l l o w i n g c h o l e s t e r o l f e e d i n g i n t h e r a t . J . L i p i d R e s . 1 8 : 3 1 4 . M a r g o l i s , S. 1 9 6 7 . S e p a r a t i o n a n d s i z e d e t e r m i n a t i o n o f h u m a n ^ s e r u m l i p o p r o t e i n s b y a g a r o s e g e l f i l t r a t i o n . J . L i p i d R e s . 8 : 5 0 1 . M a r s h , J . B . 1 9 7 6 . A p o p r o t e i n s o f t h e l i p o p r o t e i n s i n a n o n -r e c i r c u l a t i n g p e r f u s a t e o f r a t l i v e r . J . L i p i d R e s . 1 7 : 8 5 . M a r t i n , W . G . a n d I. T a k a t s . 1 9 6 9 . P h y s i c a l - c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h e v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n o f p o r c i n e s e r u m . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 8 7 : 3 2 8 . M a r t i n , W . G . , N . H . T a t t r i e a n d W . H . C o o k . 1 9 6 3 . L i p i d e x t r a c t i o n a n d d i s t r i b u t i o n s t u d i e s o f e g g y o l k l i p o p r o t e i n s . C a n . J . B i o c h e m . P h y s i o l . 4 1 : 6 5 7 . M a u l d i n , J . a n d W.R. F i s h e r . 1 9 7 0 . p H a n d i o n i c s t r e n g t h d e p e n d e n t a g g r e g a t i o n o f s e r u m l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s . B i o c h e m . 9 : 2 0 1 5 . M c C o n a t h y , W . J . a n d P . A l a u p o v i c . 1 9 7 4 . S t u d i e s o n t h e i n t e r a c t i o n o f C o n c a n a v a l i n A w i t h m a j o r d e n s i t y c l a s s e s o f human p l a s m a l i p o p r o t e i n s . E v i d e n c e f o r t h e s p e c i f i c b i n d i n g o f l i p o p r o t e i n B i n i t s a s s o c i a t e d a n d f r e e f o r m s . F E B S L e t t e r s 4 1 : 1 7 4 . M e a n s , G . E . a n d R . E . F e e n e y . 1 9 7 1 . A l k y l a t i n g a n d s i m i l a r r e a g e n t s . I n C h e m i c a l M o d i f i c a t i o n o f P r o t e i n s . C h a p t e r 6 . H o l d e n - D a y I n c . , S a n F r a n c i s c o , p . 1 0 5 . M o r r i s e t t , J . D . , R . L . J a c k s o n a n d A . M . G o t t o . 1 9 7 5 . L i p o p r o t e i n s : S t r u c t u r e a n d F u n c t i o n . I n E . S . S n e l l ( E d i t o r ) , V . o l . 4 4 , A n n . R e v . B i o c h e m . , A n n u a l R e v i e w s , I n c . , P a l o A l t o , p . 1 8 3 . M o s b a c h , E . H . , H . J . K a l i n s k y , E . H a l p e r n a n d F . E . K e n d a l l . 1 9 5 4 . D e t e r m i n a t i o n o f d e o x y c h o l a t i c a n d c h o l i c a c i d s i n b i l e . A r c h . B i o c h e m . B i o p h y s . 5 1 : 4 0 2 . N a r a y a n , K . A . , H . L . C r e i n i n a n d F . A . Kummerow. 1 9 6 6 a . D i s k e l e c t r o p h o r e s i s o f r a t p l a s m a l i p o p r o t e i n s . J . L i p i d R e s . 7 : 1 5 0 . N a r a y a n , K . A . , W . E . D u d a c e k a n d F . A . Kummerow. 1 9 6 6 b . D i s k e l e c t r o p h o r e s i s o f i s o l a t e d r a t - s e r u m l i p o p r o t e i n s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 1 2 5 : 5 8 1 . N i c h o l s , A . V . • 1 9 6 9 . F u n c t i o n s a n d i n t e r r e l a t i o n s h i p s o f d i f f e r e n t c l a s s e s o f p l a s m a l i p o p r o t e i n s . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . 6 4 : 1 1 2 8 . - 1 2 2 -N i c h o l s , A . V . , E . L . G o n g , P . J . B l a n c h e , T . M . F o r t e a n d D.W. A n d e r s o n . 1 9 7 6 . E f f e c t s o f g u a n i d i n e h y d r o c h l o r i d e o n human p l a s m a h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 4 6 : 2 2 6 . N o b l e , R . P . 1 9 6 8 . E l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n o f p l a s m a l i p o p r o t e i n s i n a g a r o s e g e l . J . L i p i d R e s . 9 : 6 9 3 . O r n s t e i n , L . a n d B . J . D a v i s . 1 9 6 4 . I n D i s c E l e c t r o p h o r e s i s . D i s t i l l a t i o n P r o d u c t s I n d u s t r i e s , R o c h e s t e r , N . Y . P e a c o c k , A . C . a n d S.W. D i n g m a n . 1 9 6 8 . M o l e c u l a r w e i g h t e s t i m a t i o n a n d s e p a r a t i o n o f r i b o n u c l e i c a c i d b y e l e c t r o p h o r e s i s i n a g a r o s e - a c r y l a m i d e c o m p o s i t e g e l s . B i o c h e m . 7 : 6 6 8 . P e a r s o n , S . , S. S t e r n a n d T . H . M c G a v a c k . 1 9 5 3 . A r a p i d , a c c u r a t e m e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f t o t a l c h o l e s t e r o l i n s e r u m . A n a l . C h e m . 2 5 : 8 1 3 . Q u a r f o r d t , S . H . , A . N a t h a n s , M . D o w d e e a n d H . L . H i l d e r m a n . 1 9 7 2 . H e t e r o g e n e i t y o f h u m a n v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s b y g e l f i l t r a t i o n c h r o m a t o g r a p h y . J . L i p i d R e s . 1 3 : 4 3 5 . R a j u , K . S . a n d S. M a h a d e v a n . 1 9 7 4 . I s o l a t i o n o f h e n ' s e g g y o l k v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s b y D E A E - c e l l u l o s e c h r o m a t o g r a p h y . A n a l . B i o c h e m . 6 1 : 5 3 8 . R a j u , K . S . a n d S. M a h a d e v a n . 1 9 7 6 . P r o t e i n c o m p o n e n t s i n t h e v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s o f h e n ' s e g g y o l k s . I d e n t i f i c a t i o n o f h i g h l y a g g r e g a t i n g ( g e l l i n g ) a n d l e s s a g g r e g a t i n g ( n o n - g e l l i n g ) p r o t e i n s . B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 4 4 6 : 3 8 7 . R i b e i r o , L . P . a n d H . J . M c D o n a l d . 1 9 6 3 . E l e c t r o p h o r e s i s o f l i p o p r o t e i n s u s i n g p r e s t a i n e d s e r u m . J . C h r o m a t o g . 1 0 : 4 4 3 . R u d e l , L . L . , J . A . L e e , M . D . M o r r i s a n d J . M . F e l t s . 1 9 7 4 . * C h a r a c t e r i z a t i o n o f p l a s m a l i p o p r o t e i n s s e p a r a t e d a n d p u r i f i e d b y a g a r o s e c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y . B i o c h e m . J . 1 3 9 : 8 9 . S a i t o , Z . , W . G . M a r t i n a n d W . H . C o o k . 1 9 6 5 . C h a n g e s i n t h e m a j o r m a c r o m o l e c u l a r f r a c t i o n s o f e g g y o l k d u r i n g e m b r y o g e n e s i s . C a n . J . B i o c h e m . P h y s i o l . 4 3 : 1 7 5 5 . S a t a , T . , D . L . E s t r i c h , P . D . Wood a n d L .W. K i n s e l l . 1 9 7 0 . E v a l u a t i o n o f g e l c h r o m a t o g r a p h y f o r p l a s m a l i p o p r o t e i n f r a c t i o n a t i o n . J . L i p i d R e s . 1 1 : 3 3 1 . S a t a , T . , R . J . H a v e l a n d A . L . J o n e s . 1 9 7 2 . C h a r a c t e r i z a t i o n o f s u b f r a c t i o n s o f t r i g l y c e r i d e - r i c h l i p o p r o t e i n s s e p a r a t e d b y g e l c h r o m a t o g r a p h y f r o m b l o o d p l a s m a o f n o r m o l i p e m i c a n d h y p e r l i p e m i c h u m a n s . J . L i p i d R e s . 1 3 : 7 5 7 . - 1 2 3 -S c a n u , A . 1 9 6 6 . F o r m s o f human s e r u m h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n p r o t e i n . J . L i p i d R e s . 7 : 2 9 5 . S c a n u , A . M . a n d C . E d e l s t e i n . 1 9 7 1 . S o l u b i l i t y o f a q u e o u s s o l u t i o n s o f t h e s m a l l m o l e c u l a r w e i g h t p e p t i d e s o f t h e s e r u m v e r y l o w d e n s i t y a n d h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n s : R e l e v a n c e t o t h e r e c o v e r y p r o b l e m d u r i n g d e l i p i d a t i o n o f s e r u m l i p o p r o t e i n s . A n a l . B i o c h e m . 4 4 : 5 7 6 . S c a n u , A . M . , L . V i t e l l o a n d S. D e g a n e l l o . 1 9 7 4 . A p p l i c a t i o n o f p h y s i c a l m e t h o d s t o t h e s t u d y o f s e r u m l i p o p r o t e i n s . C r i t i c a l R e v . B i o c h e m . 2 : 1 7 5 . S h i e l d s , R. a n d W. B u r n e t t . 1 9 6 0 . D e t e r m i n a t i o n o f p r o t e i n - b o u n d c a r b o h y d r a t e i n s e r u m b y a m o d i f i e d a n t h r o n e m e t h o d . A n a l . C h e m . 3 2 : 8 8 5 . S h o r e , B. a n d V . G . S h o r e . 1 9 6 7 . T h e p r o t e i n m o i e t y o f h u m a n s e r u m b e t a - l i p o p r o t e i n s . B i o c h e m . B i o p h y s . R e s . Comm. 2 8 : 1 0 0 3 . S h o r e , V . G . a n d B. S h o r e . 1 9 7 3 . H e t e r o g e n e i t y o f h u m a n p l a s m a l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s . S e p a r a t i o n o f s p e c i e s d i f f e r i n g i n p r o t e i n c o m p o n e n t s . B i o c h e m . 1 2 : 5 0 2 . S h o r e , V . G . , B. S h o r e a n d R . G . H a r t . 1 9 7 4 . C h a n g e s i n a p o l i p o p r o t e i n s a n d p r o p e r t i e s o f r a b b i t v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s o n i n d u c t i o n ' o f c h o l e s t e r e m i a . B i o c h e m . 1 3 : 1 5 7 9 . S h i p s k i , V . P . 1 9 7 2 . L i p i d c o m p o s i t i o n o f l i p o p r o t e i n s i n n o r m a l a n d d i s e a s e d s t a t e s . I n G . J . N e l s o n ( E d i t o r ) , B l o o d L i p i d s a n d  L i p o p r o t e i n s : Q u a n t i t a t i o n , C o m p o s i t i o n , a n d M e t a b o l i s m . W i l e y -I n t e r s c i e n c e , New Y o r k . p . . 471 . T a n f o r d , C . 1 9 6 7 . L i g h t S c a t t e r i n g . I n P h y s i c a l C h e m i s t r y o f M a c r o m o l e c u l e s . J o h n W i l e y a n d S o n s , New Y o r k , C h a p t e r 5 , p . 2 7 5 . T u r n e r , K . J . a n d W . H . C o o k . 1 9 5 8 . M o l e c u l a r w e i g h t a n d p h y s i c a l p r o p e r t i e s o f a l i p o p r o t e i n f r o m t h e f l o a t i n g f r a c t i o n o f e g g y o l k . C a n . J . B i o c h e m . P h y s i o l . 3 6 : 9 3 7 . v a n d e V o o r t , F . 1 9 7 6 . P e r s o n a l c o m m u n i c a t i o n . W a r r e n , L . 1 9 5 9 . T h e t h i o b a r b i t u r i c a c i d a s s a y o f s i a l i c a c i d s . J . B i o l . C h e m . 2 3 4 : 1 9 7 1 . W e b e r , K. a n d M . O s b o r n e . 1 9 6 9 . T h e r e l i a b i l i t y o f m o l e c u l a r w e i g h t d e t e r m i n a t i o n s b y d o d e c y l s u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s . J . B i o l . Chem. 2 4 4 : 4 4 0 6 . - 1 2 4 -W e b e r , K . , J . R . P r i n g l e a n d M . O s b o r n e . 1 9 7 2 . M e a s u r e m e n t o f m o l e c u l a r w e i g h t s b y e l e c t r o p h o r e s i s o n S D S - a c r y l a m i d e g e l s . I n C .H .W. H i r s a n d J . N . T i m a s h e f f ( E d i t o r s ) , M e t h o d s i n  E n z y m o l o g y , P a r t C , V o l . X X V I , A c a d e m i c P r e s s , New Y o r k , p . 3 . W e i n e r , A . M . , T . P i a t t a n d K. W e b e r . 1 9 7 2 . A m i n o - t e r m i n a l s e q u e n c e a n a l y s i s o f p r o t e i n s p u r i f i e d o n a n a n o m o l e s c a l e b y g e l e l e c t r o p h o r e s i s . J . B i o l . C h e m . 2 4 7 : 3 2 4 2 . W e r n e r , M . 1 9 6 6 . F r a c t i o n a t i o n o f l i p o p r o t e i n s f r o m b l o o d b y g e l f i l t r a t i o n . J . C h r o m a t o g . 2 5 : 6 3 . Y a m a u c h i , K . , J . K u r i s a k i a n d <K. S a s a g o . 1 9 7 6 . P o l y p e p t i d e c o m p o s i t i o n o f h e n ' s e g g y o l k v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n . A g r . B i o l . Chem. 4 0 : 1 5 8 1 . Z i l v e r s m i t , D . B . 1 9 6 4 . E x t r a c t i o n o f c h o l e s t e r o l f r o m human s e r u m l i p o p r o t e i n f i l m s . J . L i p i d R e s . 5 : 3 0 0 . - 1 2 5 -A P P E N D I X U . V . D e r i v a t i v e p r o g r a m w i t h p l o t t i n g s u b r o u t i n e . 266 160 222 146 266 161 222 146 266 162 222 146 266 163 160 314 260 155 314 222 164 302 247 155 161 314 241 201 360 326 315 273 277 322 315 336 322 315 336 322 - 126 -315. 057 066' 115 022 121 013 001 001 023 001 000 024 121 013 001 000 121 022 013 001 001 020 120 015 000 001 121 015 000 001 127 022 067 045 222 130 066 045 000 120 015 000 001 377 377 222 130 066 026 024 121 013 000 010 352 021 121 013 000 on 020 120 015 000 001 121 015 000 001 127 022 067 053 222 134 066 053 000 120 - 127 -015 001 013 000 004 001 001 127 004 202 067 127 140 054 067 222 127 054 134 067 127 066 077 023 on 127 067 056 023 075 060 067 126 120 075 067 013 066 105 001 073 066 001 121 076 056 013 127 060 001 067 120 005 054 013 113 127 001 013 023 000 001 067 066 004 075 105 . 121 126 166 013 067 202 001 073 140 000 066 056 121 054 120 022 121 013 013 013 001 001 001 005 004 004 060 126 127 066 021 016 101 067 067 121 076 074 013 121 127 001 013 067 001 001 115 120 000 121 013 120 013 - 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