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A comparison of the carbohydrates of the coffee bean Coffea arabica L. and those of suspension-cultured… Kocal, James Thomas 1974

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831-UBC_1974_A6_7 K62_9.pdf [ 4.77MB ]
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A COMPARISON OF THE CARBOHYDRATES OF THE C O F F E E BEAN C O F F E A A R A B I C A L. AND THOSE OF S U S P E N S I O N - C U L T U R E D C O F F E E C E L L S b y J a m e s Thomas K o c a l B S c , U n i v e r s i t y o f I l l i n o i s , 1 9 7 2 A T h e s i s S u b m i t t e d i n P a r t i a l F u l f i l m e n t o f t h e R e q u i r e m e n t s f o r t h e D e g r e e o f MASTER OF S C I E N C E i n t h e D e p a r t m e n t o f F o o d S c i e n c e We a c c e p t t h i s t h e s i s a s c o n f o r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a M a r c h , 1 9 7 4 I n p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r t h e L i b r a r y s h a l l m a k e i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e a n d s t u d y . I f u r t h e r a g r e e t h a t p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e c o p y i n g o f t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y p u r p o s e s m a y b e g r a n t e d b y t h e H e a d o f my D e p a r t m e n t o r b y h i s r e p r e s e n t a t i v e s . I t i s u n d e r s t o o d t h a t c o p y i n g o r p u b l i c a t i o n o f t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l n o t b e a l l o w e d w i t h o u t my w r i t t e n p e r m i s s i o n . a n a d v a n c e d d e g r e e a t t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , I a g r e e t h a t D e p a r t m e n t o f T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a V a n c o u v e r 8, C a n a d a D a t e ° h u ^ A A B S T R A C T S u s p e n s i o n c u l t u r e s o f c o f f e e c e l l s d e r i v e d f r o m t h e c o f f e e p l a n t C o f f e a a r a b i c a L. w e r e g r o w n i n t h r e e m e d i a t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f h o r m o n e s o n e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n a n d c o m p o s i t i o n a n d o n t h e c o n s t i t u e n t s u g a r s o f t h e c e l l s . F x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e w a s p r o d u c e d i n b o t h t h e l o g a r i t h m i c a n d s t a t i o n a r y p h a s e s o f c e l l g r o w t h . P o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n p a r a l l e l e d c e l l g r o w t h i n a l l t h r e e m e d i a . The r a t e o f p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n d e c r e a s e d a t t h e b e g i n n i n g o f t h e s t a t i o n a r y p h a s e , s o t h a t t h e y i e l d w a s d e t e r m i n e d b y t h e d u r a t i o n o f t h e p h a s e o f r a p i d c e l l g r o w t h . M a x i m u m y i e l d s o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e o c c u r r e d a t d a y 8 a n d r a n g e d f r o m 1 3 1 - 142 mg/100 m l f o r t h e t h r e e m e d i a . A r a b i n o s e , x y l o s e , m a n n o s e , g l u c o s e , ^ g a l a c t o s e a n d g a l a c t u r o n i c a c i d w e r e d e t e c t e d a s c o m p o n e n t s o f t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e i s o l a t e d f r o m t h e m e d i a . The r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f t h e m o n o s a c c h a r i d e c o n s t i t u e n t s v a r i e d w i t h h o r m o n a l t r e a t m e n t . T h e p r e s e n c e o f 2,4-D i n t h e m e d i u m l e d t o t h e a c c u m u l a t i o n o f l a r g e a m o u n t s o f a r a b i n o s e a n d l e s s e r a m o u n t s o f h e x o s e s i n t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e f r o m t h e P R L - 4 m e d i u m . T h i s i s b e l i e v e d t o b e d u e t o a n e n h a n c e m e n t o f t h e m y o - i n o s i t o l o x i d a t i o n p a t h w a y . The e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e o f c e l l s g r o w n i n t h e F o x - 3 H m e d i u m c o n t a i n e d l a r g e a m o u n t s o f h e x o s e s u g a r s a n d l e s s e r q u a n t i t i e s o f p e n t o s e a n d g a l a c t u r o n i c a c i d . A p o o l o f f r e e i n o s i t o l w a s f o u n d w i t h i n t h e c e l l s , w h i c h i n d i c a t e s t h a t t h e m y o - i n o s i t o l p a t h w a y w a s o p e r a t i n g a t a r e d u c e d l e v e l . T h e p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c e d b y c e l l s g r o w n i n a h i g h k i n e t i n m e d i u m h a d a n i n c r e a s e d q u a n t i t y o f g l u c o s y l a n d a r a b i n o s y l u n i t s a n d a d e c r e a s e d p r o p o r t i o n o f g a l a c t o s e , x y l o s e a n d m a n n o s e . T h e c h a n g e i n c o m p o s i t i o n i n t h e p r e s e n c e o f a h i g h l e v e l o f k i n e t i n c o u l d r e s u l t f r o m s u p p r e s s i o n o f t h e a c t i v i t i e s o f e n z y m e s i n v o l v e d i n m o n o s a c c h a r i d e i n t e r c o n v e r s i o n s , t h e r e b y l i m i t i n g t h e a v a i l a b i l i t y o f g a l a c t o s e , x y l o s e a n d m a n n o s e f o r i n c o r p o r a t i o n . T h r e e p o l y s a c c h a r i d e s w e r e i s o l a t e d b y f r a c t i o n a t i o n o f t h e m i x e d p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c e d b y F o x - 3 H s u s p e n s i o n - c u l t u r e d c e l l s . T h e a c i d i c f r a c t i o n w a s s e l e c t i v e l y p r e c i p i t a t e d a s a c o p p e r s a l t . T h e n e u t r a l p o l y s a c c h a r i d e s w e r e f r a c t i o n a t e d f o l l o w i n g a b s o r p t i o n o n c e l l u l o s e ; e l u t i o n w i t h w a t e r g a v e a n a r a b i n o g a l a c t o m a n n a n a n d e l u t i o n w i t h 7M u r e a a n d 0.5N NaOH g a v e t w o x y l o g a l a c t o g l u c a n f r a c t i o n s w h i c h w e r e i n d i s t i n -g u i s h a b l e . T h e f r e e s u g a r s f o u n d w i t h i n t h e c o f f e e c e l l s w e r e s u c r o s e , f r u c t o s e , g l u c o s e a n d i n o s i t o l . F r u c t o s e a c c u m u l a t e d i n m a s s i v e q u a n t i t i e s i n t h e c e l l s a n d s p e n t m e d i a . T h e s e d a t a i n d i c a t e t h a t s u c r o s e w a s t a k e n i n t o t h e c e l l s b o t h a s t h e d i s a c c h a r i d e a n d a s m o n o s a c c h a r i d e s ( d e g r a d e d b y i n v e r t a s e ) . T h e g l u c o s e m o i e t y o f t h e s u c r o s e m o l e c u l e w a s t h e n p r e f e r e n t i a l l y u s e d a s a p r e c u r s o r t o o t h e r m e t a b o l i t e s . T h e s u g a r c o n t e n t o f g r e e n a n d r o a s t e d c o f f e e b e a n s w a s c o m p a r e d t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f r o a s t i n g o n t h i s c o m p o n e n t . S u c r o s e w a s c a l c u l a t e d t o be 6 . 5 % o f t h e g r e e n b e a n d r y w e i g h t . T r a c e s o f f r u c t o s e a n d g l u c o s e w e r e a l s o i d e n t i f i e d . O n l y t r a c e a m o u n t s o f s u c r o s e w e r e f o u n d i n t h e r o a s t e d b e a n , i n d i c a t i n g t h a t t h e s u c r o s e i s a l m o s t e n t i r e l y d e c o m p o s e d i i i . i n t h e r o a s t i n g p r o c e s s . A n a l y s i s o f t h e w a t e r s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e i s o l a t e d f r o m t h e g r e e n b e a n i n d i c a t e d t h a t i t w a s a n a r a b i n o g a l a c t o m a n n a n ( s i m i l a r t o t h a t f o u n d i n t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e ) . A w a t e r - i n s o l u b l e p e c t i n i s o l a t e d a s a n ammonium o x a l a t e e x t r a c t o f t h e g r e e n b e a n p o w d e r w a s f o u n d t o c o n s i s t o f a r a b i n o s e , r h a m n o s e , m a n n o s e , g a l a c t o s e a n d g a l a c t u r o n i c a c i d , r e s e m b l i n g t h e a c i d i c f r a c t i o n o f t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e . I n a n a t t e m p t t o i d e n t i f y some o f t h e m o r e v o l a t i l e c o n s t i t u e n t s r e s p o n s i b l e f o r c o f f e e a r o m a , 15 c o m p o u n d s w e r e s e p a r a t e d a n d t e n t a t i v e l y i d e n t i f i e d . T he e f f e c t o f r o a s t i n g o n t h e f o r m a t i o n o f t h e s e v o l a t i l e c o n s t i t u e n t s w a s d e t e r m i n e d b y a n a l y z i n g t h e v o l a t i l e s i n t h e h e a d s p a c e o v e r f r e s h l y g r o u n d c o f f e e b e a n s s a m p l e d a t e a c h m i n u t e o f r o a s t . I n g e n e r a l , t h e c o n c e n t r a t i o n o f v o l a t i l e s i n c r e a s e d w i t h r o a s t i n g t i m e a n d t e m p e r a t u r e . i v . T A B L E OF CONTENTS INT R O D U C T I O N 1 L I T E R A T U R E R E V I E W I . P l a n t c e l l w a l l s 3 I I . E x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s 5 I I I . C a r b o h y d r a t e s o f c o f f e e 9 I V . R o a s t i n g o f g r e e n c o f f e e 12 V. P r e c u r s o r s t u d i e s 15 V I . C o f f e e a r o m a 16 PART I . C O F F E E C E L L C U L T U R E A. M A T E R I A L S AND METHODS 1. C u l t u r e p r e p a r a t i o n 18 .2. C e l l s u s p e n s i o n c u l t u r e s 1 8 3. I n v i t r o e x p e r i m e n t s 19 4. M e a s u r e m e n t o f c e l l s u g a r s , s p e n t m e d i u m s u g a r s a n d p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n 19 5. H y d r o l y s i s o f p o l y s a c c h a r i d e 2 3 6. G a s c h r o m a t o g r a p h y o f t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s 25 7. Q u a l i t a t i v e c a r b o h y d r a t e a n a l y s i s : p a p e r c h r o m a t o g r a p h y , 2 7 8. C o f f e e c e l l e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n a t i o n 2 8 9. C e l l w a l l p r e p a r a t i o n 3 0 B. R E S U L T S 1. E s t a b l i s h m e n t o f c u l t u r e s 3 3 2. I n v i t r o e x p e r i m e n t s i ) P R L - 4 m e d i u m 3 4 i i ) F o x - 3 H m e d i u m 4 3 i i i ) F o x - l H m e d i u m 5 0 i v ) F o x - 3 H h i g h k i n e t i n m e d i u m 56 v ) F o x m e d i u m , n o n i t r o g e n 2,4-D 5 9 3. C o f f e e c e l l e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n a t i o n 62 4. C e l l w a l l p r e p a r a t i o n 65 C. D I S C U S S I O N ( P A R T I ) 1. C o f f e e c e l l c u l t u r e 6 7 2. P r o d u c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e i n r e l a t i o n t o c e l l g r o w t h 6 8 3. C o m p o s i t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e ( d a r k g r o w n c u l t u r e s ) 69 4. T h e e f f e c t o f l i g h t o n E P S c o m p o s i t i o n 74 5. C o m p o s i t i o n o f h o t w a t e r - e x t r a c t e d c e l l w a l l a n d t o t a l c e l l w a l l i s o l a t e 74 V. 6. E x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n a t i o n 77 7. S u g a r s o f t h e c o f f e e c e l l s a n d s p e n t m e d i u m 81 D. SUMMARY ( P A R T I ) 85 PART I I . C O F F E E BEAN S T U D I E S A. M A T E R I A L S AND METHODS 1. P o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n s o f g r e e n c o f f e e b e a n s 87 2. S o l u b l e s u g a r s o f t h e c o f f e e b e a n 8 8 3. A n a l y s i s o f t h e e f f e c t o f r o a s t i n g o n t h e v o l a t i l e c o n s t i t u e n t s o f c o f f e e 89 B. R E S U L T S 1. P o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n s o f g r e e n c o f f e e b e a n s 9 0 2. S o l u b l e s u g a r s o f t h e c o f f e e b e a n 9 0 3. A n a l y s i s o f c o f f e e a r o m a 9 1 C. D I S C U S S I O N 1. P o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n s 1 0 0 2. S o l u b l e s u g a r s 1 0 0 3. A n a l y s i s o f a r o m a . . 1 0 1 CONCLUSIONS ( P A R T I AND I I ) 1 0 6 B I B L I O G R A P H Y 1 0 8 A P P E N D I X 1 1 5 v i . L I S T OF T A B L E S I . C h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f g r e e n a n d r o a s t e d c o f f e e 14 I I . C e l l s u s p e n s i o n c u l t u r e m e d i a — s p e c i a l c o n d i t i o n s 2 0 I I I . P r o d u c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e a n d c e l l d r y w e i g h t o f a d a r k g r o w n P R L - 4 s u s p e n s i o n c u l t u r e 36 I V . R e l a t i v e c o m p o s i t i o n o f e x t r a c e l l u l a r a n d h o t w a t e r - e x t r a c t e d P R L - 4 c e l l p o l y s a c c h a r i d e s 3 8 V. S u g a r s o f P R L - 4 d a r k g r o w n c o f f e e c e l l s 4 2 V I . P r o d u c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e a n d c e l l d r y w e i g h t o f a d a r k g r o w n F o x - 3 H s u s p e n s i o n c u l t u r e 4 5 V I I . R e l a t i v e c o m p o s i t i o n s o f e x t r a c e l l u l a r a n d h o t w a t e r - e x t r a c t e d F o x - 3 H c e l l p o l y s a c c h a r i d e s 4 6 V I I I . S u g a r s o f F o x - 3 H d a r k g r o w n c o f f e e c e l l s 4 9 I X . P r o d u c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e a n d c e l l d r y w e i g h t o f a d a r k g r o w n F o x - l H s u s p e n s i o n c u l t u r e 52 X. R e l a t i v e c o m p o s i t i o n s o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s f r o m l i g h t a n d d a r k g r o w n F o x - l H c u l t u r e s 5 3 X I . S u g a r s o f F o x - l H d a r k g r o w n c o f f e e c e l l s 5 4 X I I . G r o w t h p a r a m e t e r s o f h i g h k i n e t i n F o x - 3 H c u l t u r e s 5 7 X I I I . R e l a t i v e c o m p o s i t i o n s o f t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e f r o m d a r k g r o w n F o x - 3 H h i g h k i n e t i n c u l t u r e s 5 8 X I V . C e l l s u g a r s a n d s p e n t m e d i u m s u g a r s o f d a y 9 F o x n o n i t r o g e n («f* 2,4-D) c u l t u r e s 6 0 XV. R e l a t i v e c o m p o s i t i o n s o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s f r o m F o x n o n i t r o g e n m e d i a 61 X V I . M o n o s a c c h a r i d e c o m p o n e n t s o f e x t r a c e l l u l a r p o l y -s a c c h a r i d e f r a c t i o n s 6 4 v i i . X V I I . M o n o s a c c h a r i d e c o m p o s i t i o n o f s t a t i o n a r y p h a s e F o x - 3 H c e l l w a l l s 6 6 X V I I I . R e l a t i v e c o m p o s i t i o n s o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s f r o m v a r i o u s d a r k g r o w n c u l t u r e s 70 X I X . R e l a t i v e c o m p o s i t i o n s s o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s f r o m l i g h t g r o w n c u l t u r e s 75 XX. R e l a t i v e c o m p o s i t i o n s o f h o t w a t e r - e x t r a c t e d c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s f r o m t w o d a r k g r o w n c u l t u r e s 76 X X I . R e l a t i v e c o m p o s i t i o n s o f F o x - 3 H e x t r a c e l l u l a r p o l y -s a c c h a r i d e f r a c t i o n s a n d c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s 78 X X I I . S u g a r c o n t e n t o f g r e e n a n d r o a s t e d c o f f e e 92 X X I I I . V o l a t i l e c o n s t i t u e n t s o f c o f f e e a r o m a 93 X X I V . P e r c e n t o f v o l a t i l e g r o u p s f o r m e d a t e a c h m i n u t e o f r o a s t i n g 9 7 v i i i . L I S T OF F I G U R E S 1. D e g r a d a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s o f C o l o m b i a n c o f f e e b e a n s d u r i n g r o a s t i n g 11 2. P r o c e d u r e f o r s e p a r a t i o n o f c e l l s u g a r s , s p e n t m e d i u m s u g a r s a n d p o l y s a c c h a r i d e s f r o m c o f f e e c e l l c u l t u r e s . . . . 2 1 3. The i n f l u e n c e o f a c i d h y d r o l y s i s t i m e o n c a r b o h y d r a t e c o m p o n e n t s o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e 2 4 4. P r o c e d u r e f o r f r a c t i o n a t i o n o f c o f f e e c e l l e x t r a -c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e 2 9 5. P r o c e d u r e f o r c e l l w a l l p r e p a r a t i o n 31 6. C o m p a r i s o n o f c e l l d r y w e i g h t a n d t h e p o l y s a c c h a r i d e r e l e a s e d i n t o P R L - 4 m e d i u m o v e r a 1 4 d a y c u l t u r e p e r i o d . 35 7. C h r o m a t o g r a m o f m o n o s a c c h a r i d e s p r e s e n t i n d a r k g r o w n P R L - 4 e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e h y d r o l y s a t e 39 8. R e l a t i o n s h i p b e t w e e n c e l l s u g a r s a n d c u l t u r e a g e o f d a r k g r o w n P R L - 4 c e l l s 4 0 9. C o m p a r i s o n o f c e l l d r y w e i g h t a n d t h e p o l y s a c c h a r i d e r e l e a s e d i n t o F o x - 3 H m e d i u m o v e r a 14 d a y c u l t u r e p e r i o d . 4 4 1 0 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n c e l l s u g a r s a n d c u l t u r e a g e o f d a r k g r o w n F o x - 3 H c e l l s '48 1 1 . C o m p a r i s o n o f c e l l d r y w e i g h t a n d p o l y s a c c h a r i d e r e l e a s e d i n t o F o x - i H m e d i u m o v e r a 14 d a y c u l t u r e p e r i o d . 5 1 1 2 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n c e l l s u g a r s a n d c u l t u r e a g e o f d a r k g r o w n F o x - l H c e l l s 55 1 3 . P a p e r c h r o m a t o g r a m o f m o n o s a c c h a r i d e s f r o m t h e e x t r a -c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n s 6 3 1 4 . M e t a b o l i c p a t h w a y s f r o m s u g a r s t o w a l l p o l y s a c c h a r i d e s . . 72 1 5 . T y p i c a l c h r o m a t o g r a m o f c o f f e e a r o m a 94 1 6 . I n c r e a s e i n v o l a t i l e : g r o u p s d u r i n g r o a s t i n g 96 1 7 . P e r c e n t i n c r e a s e i n t o t a l v o l a t i l e s w i t h r o a s t i n g t i m e a n d t e m p e r a t u r e 99 i x . ACKNOWLEDGEMENT I s h o u l d l i k e t o e x p r e s s my s i n c e r e g r a t i t u d e t o D r . P.M. T o w n s l e y f o r h i s e n c o u r a g e m e n t , g u i d a n c e a n d c o n s t r u c t i v e c r i t i c i s m d u r i n g t h e c o u r s e o f t h i s s t u d y . I a l s o w i s h t o a c k n o w l e d g e my a p p r e c i a t i o n f o r t h e v a l u a b l e s u g g e s t i o n s a n d a s s i s t a n c e o f D r . C.A. H o r n b y , D r . W.D. P o w r i e , D r . J . F . R i c h a r d s a n d P r o f e s s o r E . L . W a t s o n . T h a n k s a r e a l s o e x t e n d e d t o M r . a n d M r s . H a n s D i s h a r t z o f D i s h a r t z C o f f e e f o r t h e u s e o f t h e c o f f e e r o a s t i n g r q u i p m e n t a n d g e n e r o u s s u p p l y o f g r e e n c o f f e e b e a n s , a n d t o D r . S.A. N a k a i f o r h i s t e c h n i c a l a s s i s t a n c e . INTRODUCTION T h e t e c h n i q u e s o f p l a n t c e l l c u l t u r e , e s t a b l i s h e d b y G a u t h r e t ( 1 ) a n d W h i t e ( 2 ) i n 1 9 3 9 , a r e now b e i n g u s e d i n many a r e a s o f p l a n t r e s e a r c h a n d h a v e many a p p l i c a t i o n s i n a g r i c u l t u r e a n d i n d u s t r y . F o l l o w i n g W o r l d W a r I I , t h e a r e a o f i n d u s t r i a l f e r m e n t a t i o n s w a s r a p i d l y d e v e l o p e d a n d m i c r o - o r g a n i s m s w e r e u s e d t o p r o d u c e c o m m e r c i a l l y i m p o r t a n t p r o d u c t s . P l a n t t i s s u e c u l t u r e , l i k e m i c r o b i a l c u l t u r e , h a s b e e n a d v a n c e d a s a m e t h o d f o r o b t a i n i n g v a l u a b l e s u b s t a n c e s s u c h a s e s s e n t i a l o i l s , f l a v o r s , a n d d r u g s ( a l k a l o i d s , s t e r o i d s a n d h o r m o n e s ) w h i c h a r e o f p l a n t o r i g i n a n d c a n n o t b e s y n t h e s i z e d b y m i c r o - o r g a n i s m s ( 3 ) . T h e s u c c e s s f u l a p p l i c a t i o n o f t i s s u e c u l t u r e t e c h n i q u e s i n t h i s a r e a r e q u i r e s a b e t t e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e f a c t o r s w h i c h i n f l u e n c e d i f f e r e n t i a t i o n . D i f f e r e n t i a t i o n may b e d e f i n e d a s t h e f o r m a t i o n o f o r g a n s a n d e v e n t u a l l y w h o l e p l a n t s ( 4 , 5 ) , o r i t may r e f e r t o t h e s y n t h e s i s o f s e c o n d a r y p l a n t p r o d u c t s s u c h a s p h e n o l i c s a n d t e r p e n e s ( 6 ) . P l a n t c e l l s c u l t u r e d i n v i t r o a r e u s u a l l y u n d i f f e r e n t i a t e d a n d m e r i s t e m a t i c . I n t h i s s t a t e t h e c e l l s r a r e l y p r o d u c e s e c o n d a r y c o m p o u n d s i n h i g h l e v e l s , a l t h o u g h t h e y s h o u l d h a v e t h e g e n e t i c i n f o r m a t i o n t o p r o d u c e a n y c o m p o u n d t h e o r i g i n a l p l a n t c a n s y n t h e s i z e . M a n y p a p e r s h a v e e m p h a s i z e d t h e p o t e n t i a l o f p l a n t t i s s u e c u l t u r e ( 7 , 8 , 9 , 1 0 , 1 1 ) , b u t f e w h a v e c r i t i c a l l y e v a l u a t e d t h e p e r t i n e n t w o r k w i t h t h e S p e c i f i c i n t e n t i o n o f s t a t i n g t h e p r o b l e m p r e c i s e l y o r o v e r c o m i n g t h e d i f f i c u l t i e s o f i n d u c i n g t h e u n o r g a n i z e d c e l l s t o a c h i e v e a g i v e n r e s u l t o u t s i d e t h e m i l i e u : i n w h i c h t h e y a r e f o r m e d a n d w i t h i n w h i c h t h e y f u n c t i o n s p o n t a n e o u s l y ( 1 2 ) , T h r e e s p e c i e s o f t h e C o f f e a f a m i l y (C. a r a b i c a L . , C. c a n e p h o r a 2. R o b u s t a , a n d C_. l i b e r i c a B u l l , e x H i e m ) h a v e b e e n g r o w n i n v i t r o . S t a r i t s k y g r e w c o f f e e c a l l u s e s d e r i v e d f r o m t h e s t e m s o f t h e s e s p e c i e s o n a m o d i f i e d L i n s m i c a r a n d S k o o g m e d i u m ( 1 3 ) . T h e p r o d u c t i o n a n d r e l e a s e o f c a f f e i n e b y c o f f e e c a l l u s e s o f C o f f e a a r a b i c a d e r i v e d f r o m b o t h t h e p e r i c a r p a n d e n d o s p e r m o f t h e c o f f e e b e a n h a s b e e n r e p o r t e d b y K e l l e r ( 1 4 ) . I n t h i s l a b o r a t o r y , C_. a r a b i c a L . c e l l s h a v e b e e n m a i n t a i n e d a s s u s p e n s i o n c u l t u r e s i n P R L - 4 , B-5 a n d a m o d i f i e d F o x m e d i u m . C a f f e i n e , c h l o r o g e n i c a c i d a n d a m i n o a c i d c o n t e n t ( 1 5 ) , f a t t y a c i d a n d s t e r i o d c o n t e n t ( 1 6 ) h a v e b e e n d e t e r m i n e d . T o w n s l e y ( 1 7 , 1 8 ) h a s s u g g e s t e d c o m m e r c i a l a p p l i c a t i o n s o f c o f f e e s u s p e n s i o n c u l t u r e s . T h e p o t e n t i a l o f p l a n t c e l l c u l t u r e s w a s u t i l i z e d i n t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n t o s t u d y t h e e f f e c t o f h o r m o n e s o n t h e p r o d u c t i o n a n d c o m p o s i t i o n o f t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e a n d o n t h e c o n s t i t u e n t s u g a r s o f r a p i d l y d i v i d i n g c o f f e e c e l l s . T h e r e s u l t s o f t h e s e a n a l y s e s w e r e c o m p a r e d t o t h e c o n s t i t u e n t s o f g r e e n c o f f e e b e a n s a n d a n a l o g i e s d r a w n b e t w e e n t h e t w o s y s t e m s . A d d i t i o n a l y , some o f t h e v o l a t i l e s t h o u g h t t o c o n t r i b u t e t o c o f f e e a r o m a w e r e s e p a r a t e d a n d t e n t a t i v e l y i d e n t i f i e d . T h e c h a n g e s i n t h e s e c o n s t i t u e n t s o v e r t h e r o a s t i n g p e r i o d w e r e r e c o r d e d i n a n e f f o r t t o g a i n i n f o r m a t i o n o n t h e r a t e o f f o r m a t i o n o f t h e s e v o l a t i l e s . 3. L I T E R A T U R E R E V I E W I . P L A N T C E L L WALLS P l a n t c e l l w a l l s a r e f u n d a m e n t a l l y i n v o l v e d i n m a n y a s p e c t s o f p l a n t b i o l o g y i n c l u d i n g m o r p h o l o g y , g r o w t h , a n d d e v e l o p m e n t o f t h e p l a n t c e l l . B e c a u s e o f t h e b i o l o g i c a l i m p o r t a n c e o f t h e p l a n t c e l l w a l l , i t h a s b e e n t h e o b j e c t o f i n t e n s i v e s t u d y . T h e c e l l w a l l i s c o n s i d e r e d t o c o n s i s t o f t w o t y p e s , a t h i n p r i m a r y w a l l a n d a t h i c k e r s e c o n d a r y w a l l ( 1 9 ) . . T h e p r i m a r y c e l l w a l l i s t h a t p a r t o f t h e w a l l l a i d d o w n b y y o u n g , u n d i f f e r e n t i a t e d c e l l s w h i c h a r e s t i l l g r o w i n g . I t i s t r a n s f o r m e d i n t o a s e c o n d a r y w a l l a f t e r t h e c e l l h a s s t o p p e d g r o w i n g . L i g n i n i s t h e c h a r a c t e r i s t i c c o m p o n e n t o f t h e s e c o n d a r y w a l l s . A s p h l o r o g l u c i n o l s t a i n i n g o f t h e c e l l w a l l s f a i l s t o s h o w t h e p r e s e n c e o f l i g n i n i n c o f f e e c e l l s g r o w n i n l i q u i d m e d i u m , s e c o n d a r y w a l l s w i l l n o t b e d i s c u s s e d f u r t h e r . C e l l u l o s e , h e m i c e l l u l o s e , p e c t i c p o l y s a c c h a r i d e s - a n d s t r u c t u r a l p r o t e i n h a v e b e e n i d e n t i f i e d a s t h e m a j o r c o m p o n e n t s o f t h e p r i m a r y c e l l w a l l . T h e p r i m a r y c e l l w a l l s o f a w i d e v a r i e t y o f p l a n t c e l l s c o n t a i n a u n i q u e h y d r o x y p r o l i n e - r i c h g l y c o p r o t e i n . Up t o 3 0 % o f t h e a m i n o a c i d r e s i d u e s o f t h i s g l y c o p r o t e i n a r e h y d r o x y p r o l i n e , a n d t h e p r o t e i n i t s e l f a c c o u n t s f o r 2 - 1 0 % o f t h e p l a n t c e l l w a l l s ( 2 0 ) . B y p u l s i n g t o b a c c o c e l l s ( N i c o t i a n a t a b a c u m ) g r o w n i n l i q u i d c u l t u r e w i t h ^ C - p r o l i n e , O l s o n ( 2 1 ) , w a s a b l e t o d e m o n s t r a t e t h a t a l m o s t t h r e e - f o u r t h s o f t h e r a d i o a c t i v e c y t o p l a s m i c h y d r o x y p r o l i n e w a s t r a n s f e r r e d t o t h e c e l l w a l l d u r i n g c h a s e w i t h c o l d p r o l i n e . D i s k s , o f c a r r o t ( D a u c u s c a r o t a ) p h l o e m 4. p a r e n c h y m a g r o w n o n s o l i d m e d i u m w e r e s h o w n t o h a v e a 1 0 - f o l d i n c r e a s e i n c e l l w a l l h y d r o x y p r o l i n e d u e t o t h e s y n t h e s i s a n d s e c r e t i o n o f h y d r o x y p r o l i n e - c o n t a i n i n g m a c r o m o l e c u l e s ( 2 2 ) . I n s y c a m o r e c e l l s u s p e n s i o n ( A c e r p s e u d o p l a t a n u s ) , b o t h a u t o r a d i o g r a p h i c a n d c h e m i c a l t e c h n i q u e s h a v e c o n f i r m e d t h a t m o s t o f t h e p r o t e i n c o n t a i n i n g h y d r o x y -p r o l i n e i s l o c a t e d w i t h i n t h e c e l l w a l l . M o r e h y d r o x y p r o l i n e w a s i n c o r p o r a t e d i n t o t h e c e l l w a l l s o f s t a t i o n a r y p h a s e c e l l s t h a n i n t o t h o s e o f c e l l s a c t i v e l y e n g a g e d i n c e l l d i v i s i o n ( 2 3 , 2 4 ) . T h e b u l k o f t h e p r i m a r y c e l l w a l l c o n s i s t s o f n o n c e l l u l o s i c a m o r p h o u s m a t e r i a l w h i c h h a s b e e n d e s c r i b e d a s t h e c e m e n t i n g a g e n t t h a t b i n d s t h e c e l l u l o s e f i b e r s t o g e t h e r . T h e n o n c e l l u l o s i c p o l y s a c c h a r i d e s h a v e b e e n o b t a i n e d b y e x t r a c t i n g c e l l w a l l s w i t h b o i l i n g w a t e r , EDTA, o r d i l u t e a c i d ( 2 5 ) a n d t h e h e m i c e l l u l o s e s s o l u b i l i z e d b y t h e s u b s e q u e n t e x t r a c t i o n o f t h e s a m e w a l l s w i t h a l k a l i . T h e n a t u r e o f t h e h e m i c e l l u l o s e s i s o l a t e d f r o m v a r i o u s t i s s u e s d i f f e r s c o n s i d e r a b l y . C o m m o n l y o c c u r r i n g h e m i c e l l u l o s e s i n c l u d e x y l a n s , a r a b i n o x y l a n s , m a n n a n s , a r a b i n o g a l a c t a n s , g l u c o m a n n a n s a n d g a l a c t o g l u c o m a n n a n s ( 2 6 ) . P e c t i c p o l y s a c c h a r i d e s h a v e b e e n f o u n d i n e v e r y h i g h e r p l a n t c e l l w a l l t h a t h a s b e e n e x a m i n e d . T h e p e c t i c p o l y s a c c h a r i d e s a r e a c o m p l e x m i x t u r e o f a c i d i c a n d n e u t r a l p o l y m e r s w h i c h a r e c h a r a c t e r i z e d b y c h a i n s o f a l p h a - 1 , 4 - 1 i n k e d g a l a c t u r o n o s y l r e s i d u e s i n t e r s p e r s e d w i t h 2 - l i n k e d r h a m n o s y l r e s i d u e s ( 2 7 , 2 8 ) . Some o f t h e c a r b o x y l g r o u p s o f t h e g a l a c t u r o n o s y l r e s i d u e s a r e m e t h y l e s t e r i f i e d . P e c t i c f r a c t i o n s c o n t a i n a n e u t r a l p o l y s a c c h a r i d e w h i c h i s u s u a l l y , b u t n o t a l w a y s , c o v a l e n t l y a t t a c h e d t o t h e a c i d i c r h a m n o g a l a c t u r o n a n m a i n c h a i n . T h e n a t u r e o f 5. t h e n e u t r a l p o l y s a c c h a r i d e v a r i e s , b u t h a s b e e n f o u n d t o b e e i t h e r a n a r a b i n a n o r a g a l a c t a n o r a c o m b i n a t i o n o f t h e s e ( 2 5 ) . T a l m a d g e e t d ( 2 9 , 3 0 ) made a d e t a i l e d s t u d y o f t h e s t r u c t u r e o f c e l l w a l l s i s o l a t e d f r o m s u s p e n s i o n - c u l t u r e d s y c a m o r e c e l l s , u s i n g p u r i f i e d h y d r o l y t i c e n z y m e s t o i d e n t i f y a n d q u a n t i t a t e t h e m a c r o m o l e c u l a r c o m p o n e n t s . T h e s e w a l l s a r e c o m p o s e d o f 1 0 % a r a b i n a n , 2% 3 , 6 - l i n k e d a r a b i n o g a l a c t a n , 2 3 % c e l l u l o s e , 9% o l i g o - a r a b i n o s i d e s ( a t t a c h e d t o h y d r o x y -p r o l i n e ) , 8% 4 - l i n k e d g a l a c t a n , 1 0 % h y d r o x y p r o l i n e - r i c h p r o t e i n , 1 6 % r h a m n o g a l a c t u r o n a n a n d 2 1 % x y l o g l u c a n . T h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e c e l l w a l l s o f r y e g r a s s ( L o l i u m  m u l t i f l o r u m ) e n d o s p e r m g r o w n i n l i q u i d s u s p e n s i o n c u l t u r e s w a s s h o w n t o b e 9 0 % c a r b o h y d r a t e ( a s a n h y d r o g l u c o s e ) , 0 . 3 % n i t r o g e n , 1 . 9 % l i p i d a n d 4 . 3 % a s h ( 3 1 ) . T h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f n e u t r a l s u g a r s p r e s e n t i n h y d r o l y s a t e s o f t h e c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s a r e 5 0 % g l u c o s e , 1 9 % a r a b i n o s e , 2 6 % x y l o s e , a n d 5% g a l a c t o s e . A l o w u r o n i c a c i d c o n t e n t w a s f o u n d . T h i s , p l u s t h e a b s e n c e o f r h a m n o s e f r o m t h e h y d r o l y s a t e s , s u g g e s t t h a t t h e p e c t i c p o l y s a c c h a r i d e s may n o t b e p r e s e n t . E x t r a c t i o n o f t h e w a l l w i t h 7M u r e a s o l u b i l i z e d a p o l y s a c c h a r i d e c o m p o s e d o f g l u c o s e a n d m i n o r a m o u n t s o f p e n t o s e s , r e p r e s e n t i n g 1 9 % o f t h e c e l l w a l l . I I . E X T R A C E L L U L A R P O L Y S A C C H A R I D E ( E P S ) A l t h o u g h t h e g r o w t h o f p l a n t c e l l s i n s u s p e n s i o n c u l t u r e h a s b e e n s t u d i e d f o r o v e r a d e c a d e o n l y a l i m i t e d a m o u n t o f a t t e n t i o n h a s b e e n d e v o t e d t o t h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e p o l y s a c c h a r i d e s w h i c h a r e f o r m e d . T h e t e r m " e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e " u s e d t h r o u g h o u t 6. t h i s p a p e r r e f e r s t o t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y m e r i c f r a c t i o n , p r e c i p i t a t e d f r o m t h e c e l l c u l t u r e m e d i u m b y e t h a n o l . T h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c e d b y c e l l s u s p e n s i o n c u l t u r e s i s o f some i n t e r e s t i n t h e s t u d y o f p o l y s a c c h a r i d e s o f h i g h e r p l a n t s . T h e c o m p l i c a t i o n s w h i c h o c c u r i n s t u d i e s w i t h i n t a c t t i s s u e s c o n t a i n i n g c e l l s a t d i f f e r e n t s t a g e s o f d e v e l o p -m e n t , a n d t h e n e e d f o r d r a s t i c e x t r a c t i o n p r o c e d u r e s w h i c h c a n d e c r e a s e t h e d e g r e e o f p o l y m e r i z a t i o n o f t h e p o l y s a c c h a r i d e s a n d may a l s o a l t e r t h e s t r u c t u r e i n v a r i o u s w a y s a r e a v o i d e d ( 3 2 ) . I t now s e e m s l i k e l y t h a t e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s may b e d e t e c t a b l e i n t h e c u l t u r e m e d i u m f r o m m o s t p l a n t s u s p e n s i o n c u l t u r e s , b u t f e w h a v e b e e n s t u d i e d t o d a t e . B e c k e r et^ a l ( 3 2 ) f o u n d t h a t s y c a m o r e c a m b i a l c e l l s g r o w n i n s u s p e n s i o n c u l t u r e s e c r e t e d p o l y s a c c h a r i d e s i n t o t h e c u l t u r e m e d i u m . T h e c o m p o s i t i o n o f E P S w a s q u a l i t a t i v e l y s i m i l a r t o t h a t o f t h e w a l l p o l y s a c c h a r i d e s o b t a i n e d f r o m t h e c a m b i a l r e g i o n o f t h e s y c a m o r e t r e e . T h e c a m b i a l c e l l s o f t h e i n t a c t t r e e y i e l d e d a p r e d o m i n a n c e o f x y l o s e , w h i l e t h e E P S a n d c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s f r o m t h e s u s p e n s i o n - c u l t u r e d c e l l s y i e l d e d p r e d o m i n a n t l y a r a b i n o s e . T h e p r o p o r t i o n s o f t h e o t h e r s u g a r s w e r e s i m i l a r i n a l l c a s e s , e x c e p t f o r a s o m e w h a t g r e a t e r a m o u n t o f m a n n o s e i n t h e E P S . A s p i n a l l et_ a l _ ( 3 3 ) f r a c t i o n a t e d t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e f r o m t h e s y c a m o r e c e l l s i n t o a n a c i d i c a n d a n e u t r a l p o l y s a c c h a r i d e . T h e p e c t i n i c a c i d f r a c t i o n , w h i c h c o n t a i n e d 6 7 % g a l a c t u r o n i c a c i d r e s i d u e s , w a s f o u n d t o h a v e f e a t u r e s i n common w i t h o t h e r p e c t i n s , h a v i n g a r a b i n o s e , g a l a c t o s e a n d r h a m n o s e a s c o n s t i t u e n t s u g a r s . T h e n e u t r a l p o l y s a c c h a r i d e 7. w a s f r a c t i o n a t e d o n a c e l l u l o s e c o l u m n i n t o a n a r a b i n o g a l a c t a n a n d a f u c o x y l o g l u c a n . O l s o n et_ a l _ ( 3 4 ) r e p o r t e d m a c r o m o l e c u l e s s e c r e t e d i n t o t h e m e d i u m b y a n o n d i f f e r e n t i a t i n g s u s p e n s i o n c u l t u r e o f t o b a c c o c e l l s ( N i c o t i a n a  t a b a c u m v a r . X a n t h i ) . T h e m a c r o m o l e c u l e s w e r e f o u n d t o b e c o m p o s e d o f p r o t e i n a n d p o l y s a c c h a r i d e , a c c o u n t i n g f o r t h e v i s c o s i t y o f t h e m e d i u m . T h e p r o t e i n c o n t e n t w a s d e t e r m i n e d t o b e 6 - 1 8 % , w h i l e 5 - 2 5 % o f t h e m a c r o m o l e c u l e s w e r e a p e c t i c s u b s t a n c e w h o s e c a r b o x y l g r o u p s w e r e e i t h e r m e t h y l e s t e r i f i e d o r c o m b i n e d w i t h c a l c i u m . A r a b i n o s e , x y l o s e , g l u c o s e , g a l a c t o s e a n d m a n n o s e w e r e i d e n t i f i e d i n t h e a c i d h y d r o l y s a t e s o f t h e n e u t r a l p o l y s a c c h a r i d e s . R e d k i d n e y b e a n ( P h a s e o l u s v u l g a r i s ) r o o t c e l l s g r o w n i n s u s p e n s i o n c u l t u r e p r o d u c e d a m i x t u r e o f p o l y s a c c h a r i d e s f r o m w h i c h a n a r a b i n o g a l a c t a n w a s i s o l a t e d i n p u r e f o r m ( 3 5 ) . T h i s E P S w a s v e r y s i m i l a r i n c o n s t i t u t i o n t o t h a t p r o d u c e d b y s y c a m o r e c e l l s g r o w n i n s u s p e n s i o n c u l t u r e , d i f f e r i n g o n l y s l i g h t l y i n t h e a r a b i n o s e : g a l a c t o s e r a t i o . T h e r e m a i n i n g p o l y -s a c c h a r i d e m a t e r i a l c o n t a i n e d g l u c o s e , x y l o s e a n d g a l a c t o s e , b u t w a s n o t o b t a i n e d i n s u f f i c i e n t q u a n t i t y t o w a r r a n t s t u d y . S u s p e n s i o n c u l t u r e s o f b u s h b e a n c e l l s w e r e o b t a i n e d f r o m r o o t , h y p o c o t y l , a n d c o t y l e d o n s o f P h a s e o l u s v u l g a r i s c v . C o n t e n d e r . H y d r o l y s a t e s o f t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s p r o d u c e d f r o m t h e s e t h r e e c u l t u r e s a l l c o n t a i n e d g a l a c t u r o n i c a c i d , g a l a c t o s e , g l u c o s e , m a n n o s e , a r a b i n o s e a n d x y l o s e , b u t t h e r e l a t i v e a m o u n t s o f t h e s u g a r s w e r e n o t t h e same ( 3 6 ) . I n t h i s l a b o r a t o r y , a n e x t r a c e l l u l a r p e c t i n - l i k e m a t e r i a l w a s p r o d u c e d b y s u s p e n s i o n c u l t u r e s o f l i c o r i c e c e l l s ( G l y c y r r h i z a g l a b r a ) . 8. T h e m o n o s a c c h a r i d e s f o u n d i n t h e h y d r o l y s a t e i n c l u d e d g l u c o s e , f r u c t o s e , g a l a c t o s e , a r a b i n o s e , x y l o s e , g a l a c t u r o n i c a c i d a n d g l u c u r o n i c a c i d ( 3 7 ) . A c e l l - f r e e , i n s o l u b l e f r a c t i o n w a s f o u n d t o f l o a t o n t h e s u r f a c e o f s u s p e n s i o n c u l t u r e s o f s o y b e a n c e l l s ( G l y c i n e max L . M e r r i l l v a r A c m e ) ( 3 8 ) . T h e c o m p o s i t i o n o f t h e c o m p l e x w a s 4 6 % g a l a c t u r o n i c a c i d , 3 6 % p r o t e i n , 1 1 % l i g n i n , 4 . 4 % a r a b i n o s e , 0 . 5 % m e t h y l e s t e r a n d 2% a s h . T h i s c o m p l e x f r o m s o y b e a n c e l l s i s d i s t i n c t l y d i f f e r e n t f r o m a n y o f t h e s o l u b l e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s f r o m s u s p e n s i o n c u l t u r e s d e s c r i b e d h e r e . T h e s i t e o f f o r m a t i o n o f t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e i n s u s p e n s i o n c u l t u r e c e l l s i s n o t k n o w n . T h e p r e s e n c e o f t h e same m o n o s a c c h a r i d e s i n cell„wall p r e p a r a t i o n s f r o m s y c a m o r e c e l l s a s i n t h e e x t r a c e l l u l a r f r a c t i o n s u g g e s t s t h e l a t t e r a r e s y n t h e s i z e d w i t h i n t h e c e l l a n d s e c r e t e d i n t o t h e m e d i u m , ( 3 2 ) . S i m i l a r o b s e r v a t i o n s h a v e b e e n made o n s u s p e n s i o n c u l t u r e s o f t o b a c c o c e l l s a n d k i d n e y b e a n c e l l s . I t i s n o t k n o w n w h y t h e p o l y s a c c h a r i d e l e a v e s t h e c e l l s i n s u s p e n s i o n c u l t u r e s b u t n o t i n t h e i n t a c t t i s s u e . T h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e m ay r e p r e s e n t a n o r m a l p r e c u r s o r w h i c h i s n o t f o r m e d i n t o c e l l w a l l i n v i t r o , o r may b e u n i q u e t o t i s s u e c u l t u r e s y s t e m s . I n p l a n t s , t h e e x i s t e n c e o f a n i n t a c t t i s s u e s t r u c t u r e may c a u s e r e p r e s s i o n o f t h e s y s t e m f o r m i n g t h e p o t e n t i a l e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e . I t s h o u l d b e e m p h a s i z e d t h a t b o t h d i v i d i n g o r l o g p h a s e c e l l s , a n d t h e e n l a r g i n g s t a t i o n a r y p h a s e c e l l s p r o d u c e t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e i n v i t r o . T h e r e f o r e , t h e b i o s y n t h e t i c s y s t e m a p p e a r s t o w o r k i n d e p e n d e n t l y o f e x p a n s i o n g r o w t h o f t h e w a l l s . 9. I I I . CARBOHYDRATES OF C O F F E E T h e c h e m i s t r y o f t h e c o f f e e b e a n r o a s t i n g p r o c e s s i s n o t c l e a r l y u n d e r s t o o d , b u t i s u n d o u b t e d l y c o n c e r n e d i n p a r t w i t h t h e c a r b o h y d r a t e c o n t e n t o f t h e g r e e n b e a n . T h i s c a r b o h y d r a t e a c c o u n t s f o r 5 0 - 6 0 % o f t h e w e i g h t o f t h e g r e e n b e a n a n d i s m ade up o f 6-7% s u c r o s e , t r a c e s o f g l u c o s e , 5 - 1 2 % c e l l u l o s e , 2 - 3 % p e c t i c s u b s t a n c e s , 1.8 - 4 . 4 % o l i g o s a c c h a r i d e s a n d o t h e r h i g h m o l e c u l a r w e i g h t p o l y s a c c h a r i d e s . T h e c a r b o h y d r a t e s o f c o f f e e h a v e b e e n w i d e l y e x p l o r e d b y a n u m b e r o f a u t h o r s a n d t h e l i t e r a t u r e i s o f t e n c o n f l i c t i n g ( 3 9 ) . S u c r o s e i s a m a j o r c o m p o n e n t o f g r e e n c o f f e e a n d i s a l m o s t e n t i r e l y d e c o m p o s e d i n t h e r o a s t i n g p r o c e s s . G l o m a u d et^ al ( 4 0 ) i s o l a t e d a n d i d e n t i f i e d t h e o l i g o s a c c h a r i d e s r a f f i n o s e ( g a l a c t o g l u e o f r u c t o s i d e ) a r i d s t a c h y o s e ( g a l a c t o g a l a c t o g l u c o f r u c t o s i d e ) i n 1 0 v a r i e t i e s o f t h e C o f f e a s p e c i e s . T h e f a t e s o f t h e s e c o m p o u n d s d u r i n g r o a s t i n g i s u n k n o w n . W o l f r o m a n d P a t i n ( 4 1 ) f o u n d t h a t t h e m a j o r w a t e r s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e i n g r e e n c o f f e e ( C o f f e a a r a b i c a ) w a s a n a r a b i n o g a l a c t a n c o n s i s t i n g o f t w o m o l e s o f a r a b i n o s e t o f i v e m o l e s o f g a l a c t o s e . T h e L -a r a b i n o s e w a s r e m o v e d f r o m t h e p o l y s a c c h a r i d e b y d i l u t e a c i d , l e a v i n g a g a l a c t a n . C o u r t o i s et^ a l ( 4 2 ) i s o l a t e d a c o l d w a t e r s o l u b l e g l u c o -g a l a c t o m a n n a n a n d a n a r a b i n o g a l a c t a n . T h e l a t t e r h a d o n e m o l e o f a r a b i n o s e p e r 3.2 m o l e s g a l a c t o s e . A m a n n a n a c c o u n t i n g f o r 5% o f t h e w e i g h t o f t h e g r e e n b e a n w a s i s o l a t e d b y e x t r a c t i o n w i t h 1 8 % NaOH ( a q . ) f r o m a h o l o c e l l u l o s e i n s o l u b l e i n 1 0 % KOH. H y d r o l y t i c a s s a y i n d i c a t e d 9 4 % m a n n o s e a n d 2% g a l a c t o s e , a n d f u r t h e r p u r i f i c a t i o n f a i l e d t o r e d u c e t h e g a l a c t o s e c o n t e n t . I t w a s p o s t u l a t e d t h a t t h e m a n n a n e x i s t e d a s a 10. g a l a c t o m a n n a n . T h e c h a n g e i n p o l y s a c c h a r i d e c o n t e n t o f c o f f e e b e a n s d u r i n g r o a s t i n g i s g r a p h i c a l l y s u m m a r i z e d ( F i g u r e 1 ) f r o m T h a l e r ' s d a t a ( 4 3 , 4 4 ) . T h e s e p o l y s a c c h a r i d e s w e r e s e p a r a t e d a c c o r d i n g t o t h e i r s o l u b i l i t i e s . T h e c o m p l e x e s w e r e c l a s s i f i e d a s h o t w a t e r - s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e s , c h l o r i n e d i o x i d e d e g r a d a b l e p o l y s a c c h a r i d e , o r h o l o c e l l u l o s e . A n a r a b i n o g a l a c t a n w a s f o u n d t o b e t h e m a j o r w a t e r s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e i n g r e e n c o f f e e . T h e c h l o r i n e d i o x i d e d e g r a d a b l e c o m p o n e n t wa s a l s o a n a r a b i n o g a l a c t a n a n d t h e h o l o c e l l u l o s e f r a c t i o n w a s p r i m a r i l y a g a l a c t o m a n n a n ( 6 0 - 7 0 % m a n n o s e ) w i t h some c e l l u l o s e . On r o a s t i n g t h e w a t e r s o l u b l e f r a c t i o n , a r a b i n o s e , w a s d e s t r o y e d i n p r o p o r t i o n t o t h e d e g r e e o f r o a s t e m p l o y e d ; t h e g a l a c t o s e d e c r e a s e d m a r k e d l y a n d t h e m a n n o s e i n c r e a s e d f r o m 1 0 % t o 7 0 % . D u r i n g r o a s t i n g , t h e a r a b i n o s e a n d g a l a c t o s e o f t h e ClO^ d e g r a d a b l e p o l y s a c c h a r i d e s a l s o d e c r e a s e d a n d t h e m a n n a n i n c r e a s e d p r o p o r t i o n a t e l y . I n t h e h o l o c e l l u l o s e f r a c t i o n , t h e m a n n a n d e c r e a s e d s l i g h t l y , t h e g a l a c t a n w a s a l m o s t c o n s t a n t a n d t h e c e l l u l o s e ( a s i n d i c a t e d b y g l u c o s e v a l u e s ) i n c r e a s e d p r o p o r t i o n a t e l y w i t h t h e d e g r e e o f r o a s t . T h e h o l o c e l l u l o s e w a s t h e r e f o r e t h o u g h t t o b e d e r i v e d f r o m t h e c e l l w a l l s o f t h e g r e e n b e a n . H a s h i m o t o j | t a l ( 4 5 ) e x t r a c t e d r a w c o f f e e b e a n s w i t h e t h e r , b o i l i n g w a t e r a n d 1 8 % NaOH. T o t a l p o l y s a c c h a r i d e c o n t e n t r a n g e d f r o m 4 6 . 8 - 5 9 . 2 % o v e r t h e f i v e v a r i e t i e s s a m p l e d . O f t h e t o t a l , , 7 . 5 - 8 . 9 % w a s w a t e r - s o l u b l e , 2 . 1 - 4 . 8 % w a s a l k a l i - s o l u b l e a n d t h e r e m a i n i n g 3 6 . 2 - 4 5 . 6 % w a s a l k a l i -i n s o l u b l e . T h e m a i n c o m p o n e n t s o f t h e w a t e r - s o l u b l e f r a c t i o n s w e r e g a l a c t o s e , a r a b i n o s e a n d m a n n o s e ; t h e a l k a l i - s o l u b l e f r a c t i o n w a s 9 5 % 1 1 . C h l o r i n e D i o x i d e W a t e r S o l u b l e P o l y s a c c h a r i d e D e g r a d a b l e P o l y s a c c h a r i d e » 1 1 1 — i 1 1 — i 5 1 0 15 2 0 5 1 0 15 2 0 P e r c e n t W e i g h t L o s s P e r c e n t W e i g h t L o s s H o l o c e l l u l o s e 5 10 15 2 0 P e r c e n t W e i g h t L o s s F I G U R E 1. D e g r a d a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d e s o f C o l o m b i a n c o f f e e b e a n s d u r i n g r o a s t i n g ( 4 3 ) . • = g a l a c t o s e A = a r a b i n o s e O = m a n n o s e O = g l u c o s e 12. m a n n o s e a n d 3.5 - 5% g a l a c t o s e . T h e a l k a l i - i n s o l u b l e f r a c t i o n w a s c o m p o s e d o f 6 1 - 6 3 % m a n n o s e , 1 9 - 2 1 % g l u c o s e , 1 6 - 1 8 % g a l a c t o s e a n d 2 - 3 % a r a b i n o s e . T h e c a r b o h y d r a t e d a t a p r e s e n t e d h e r e w o u l d a c c o u n t , i n p a r t , f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e c o m p l e x f l a v o u r a n d a r o m a o f c o f f e e — b o t h t h e v o l a t i l e a n d n o n - v o l a t i l e c o m p o n e n t s . R e a c t i v e s u g a r s a n d a m i n o a c i d s c a n c o m b i n e i n a n u m b e r o f w a y s t o p r o d u c e many f l a v o u r s , b u t c o n d i t i o n s e x i s t i n t h e b e a n w h i c h p r o d u c e c o f f e e f l a v o u r a n d a r o m a r e g a r d l e s s o f t h e v a r i e t y o f c o f f e e . F u r t h e r s t u d y o f t h e c a r b o h y d r a t e s i s n e c e s s a r y t o e l u c i d a t e t h e s l i g h t d i f f e r e n c e s i n r e a c t a n t s w h i c h a r e r e s p o n s i b l e f o r t h e c h a r a c t e r i s t i c a r o m a s o f d i f f e r e n t v a r i e t i e s o f r o a s t e d b e a n s . I V . R O A S T I N G OF GREEN C O F F E E C o f f e e a r o m a d e v e l o p s i n t h e p r o c e s s o f r o a s t i n g g r e e n c o f f e e b e a n s a n d i s c h a r a c t e r i z e d b y t h e t y p e o f g r e e n c o f f e e . T h e c o f f e e a r o m a i s l i m i t e d t o t h e v o l a t i l e s o f c o f f e e . G r e e n c o f f e e d o e s n o t h a v e t h e s e v o l a t i l e s , b u t h a s t h e n o n v o l a t i l e p r e c u r s o r s . A l t h o u g h g r e e n c o f f e e s v a r y i n c h e m i c a l c o m p o n e n t s , t h e c h e m i c a l , a n d p h y s i c a l c h a n g e s t h e y u n d e r g o d u r i n g r o a s t i n g a r e s i m i l a r a n d v a r y o n l y i n d e g r e e . T h e i n t a c t c o f f e e b e a n h a s b e e n l i k e n e d t o a t i n y a u t o c l a v e ( 4 6 ) ; d u r i n g t h e r o a s t i n g p r o c e s s c h e m i c a l s u b s t a n c e s r e a c t w i t h i n t h e b e a n c e l l s t r u c t u r e t o p r o d u c e t h e v o l a t i l e a r o m a c o n s t i t u e n t s . R o a s t i n g o f g r e e n c o f f e e d r i v e s o f f t h e f r e e a n d b o u n d m o i s t u r e o f t h e b e a n . S i v e t z a n d F o o t e ( 4 7 ) f o u n d t h a t t h e w e i g h t l o s s d u r i n g r o a s t i n g o c c u r s a t t w o r a t e s . T h e . f i r s t i s a s l o w r a t e , w h i c h c o r r e s p o n d s t o t h e e v a p o r a t i o n o f w a t e r f r o m t h e b e a n ; t h e s e c o n d i s a f a s t r a t e d u e t o t h e p y r o l y s i s r e a c t i o n s t a k i n g p l a c e . T h e t r a n s i t i o n p o i n t b e t w e e n t h e s e t w o r a t e s o c c u r s a t t h e t i m e o f 1 0 % w e i g h t l o s s f r o m t h e g r e e n b e a n , u s u a l l y a t a t e m p e r a t u r e o f 3 6 5 - 370°F. T h e r m a l d e c o m p o s i t i o n b e g i n s w i t h i n t h e . b e a n a s t h e e x o t h e r m i c r e a c t i o n s b r i n g t h e b e a n t e m p e r a t u r e t o o v e r 400°F. When a n o t h e r 4% o f t h e b e a n w e i g h t i s l o s t t h e t y p i c a l b r o w n c o l o u r o f t h e r o a s t e d b e a n i s . d e v e l o p e d . A c c o m p a n y i n g t h i s p e r i o d o f r a p i d w e i g h t l o s s i s t h e s u d d e n e x p a n s i o n o f t h e b e a n a n d s i m u l t a n e o u s r e v e l a t i o n o f t h e c h a f f a t t h e b e a n c r e v i c e . T a b l e I s h o w s t h e c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f g r e e n a n d r o a s t e d c o f f e e b e a n s ( 4 8 ) . T h e c e l l u l o s e s a n d l i g n i n s w h i c h c o n s t i t u t e t h e w o o d y a n d f i b r o u s b i n d i n g m a t t e r o f t h e b e a n c e l l s t r u c t u r e a r e n o t a f f e c t e d b y t h e r o a s t i n g p r o c e s s . T h e . o i l c o n t e n t o f g r e e n c o f f e e i s a b o u t 1 2 % a s d e t e r m i n e d b y a h e x a n e e x t r a c t i o n . R o a s t i n g i n c r e a s e s t h e o i l c o n t e n t s l i g h t l y a s t h e r o a s t b r e a k s down a n d o p e n s u p t h e b e a n c e l l s t r u c t u r e . T h e a s h c o n t e n t o f g r e e n c o f f e e i s a b o u t 4% a n d i n c r e a s e s o n l y s l i g h t l y d u r i n g t h e r o a s t . T h e a s h c o n s i s t s o f t h e v a r i o u s m i n e r a l s i n t h e g r e e n b e a n w h i c h , d u r i n g r o a s t , a r e s e p a r a t e d f r o m t h e i r o r g a n i c o r i g i n s a n d c a t a l y z e t h e p y r o l y s i s r e a c t i o n s . S u c r o s e , w h i c h c o n s t i t u t e s a b o u t 7% o f t h e g r e e n c o f f e e b e a n , i s a l m o s t e n t i r e l y d e c o m p o s e d b y r o a s t i n g . T h e s u c r o s e i s h y d r o l y z e d t o r e d u c i n g s u g a r s w h i c h a r e t h e n p o l y m e r i z e d a n d d e g r a d e d a t p y r o l y s i s t e m p e r a t u r e s t o b r o w n i n g p i g m e n t s , v o l a t i l e o r g a n i c s a n d c a r b o n d i o x i d e g a s . I t i s t h o u g h t t h a t some o f t h e s e p r o d u c t s r e a c t w i t h p r o t e i n s a n d o t h e r d e g r a d a t i o n p r o d u c t s t o f o r m some o f t h e c o f f e e f l a v o u r a n d a r o m a 1 4 . T A B L E I . C h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f g r e e n a n d r o a s t e d c o f f e e ( 4 8 ) . CONSTITUENT PERCENT DRY WEIGHT G r e e n R o a s t e d H e m i c e l l u l o s e s 2 3 . 0 2 4 . 0 C e l l u l o s e 1 2 . 7 1 3 . 2 L i g n i n 5.6 5.8 F a t 1 1 . 4 1 1 . 9 C a f f e i n e 1.2 1.3 S u c r o s e 7.3 0.3 C h l o r o g e n i c A c i d 7.6 3.5 P r o t e i n ( 6 . 2 5 x N) 1 1 . 6 3.1 T r i g o n e l l i n e 1.1 0.7 R e d u c i n g S u g a r s 0.7 0.5 U n k n o w n 1 4 . 0 3 1 . 7 TOTAL 1 0 0 . 0 1 0 0 . 0 1 5 . c o n s t i t u e n t s . C h l o r o g e n i c a c i d s a r e r e d u c e d f r o m a b o u t 8% i n g r e e n c o f f e e t o 4% i n r o a s t e d c o f f e e . T h e c h l o r o g e n i c a c i d u n d e r g o e s h y d r o l y s i s t o c a f f e i c a c i d a n d q u i n i c a c i d . T h e s e c o m p o u n d s a r e m o r e b i t t e r a n d a s t r i n g e n t t h a n t h e y a r e a c i d i c s i n c e t h e i r c y c l i c g r o u p i s p h e n o l i c . T h e p r o t e i n c o n t e n t o f g r e e n c o f f e e i s a b o u t 1 2 % , b u t r o a s t i n g d e c r e a s e s i t t o a b o u t 3% a n d m a k e s t h e p r o t e i n s w a t e r - i n s o l u b l e . E x a m i n a t i o n o f f r e e a n d b o u n d a m i n o a c i d s s h o w s t h a t a r g i n i n e , c y s t e i n e , l y s i n e a n d s e r i n e a r e l a r g e l y d e s t r o y e d b y t h e r o a s t i n g p r o c e s s . H y d r o l y s i s o f p e p t i d e l i n k a g e s l i b e r a t e s some c a r b o n y l s a n d a m i n e s . T h e t a n n i n c o n t e n t o f t h e g r e e n b e a n d e c r e a s e s s l i g h t l y . C a f f e i n e f o r t h e m o s t p a r t i s u n a f f e c t e d b y r o a s t i n g , b u t may d e c r e a s e s l i g h t l y w h e n s m a l l q u a n t i t i e s b e c o m e s u b l i m a t e d a n d a c c u m u l a t e i n t h e r o a s t e r s t a c k s . T h e c h e m i c a l c o m p o u n d s o f g r e e n c o f f e e i n c l u d e n u m e r o u s a n d c o m p l e x s u b s t a n c e s w h i c h a r e n o n f l a v o u r f u l a n d n o n v o l a t i l e . T h e n a t u r e o f t h e s e r e a c t a n t s i n d i c a t e s t h e o c c u r r e n c e o f M a i l l a r d r e a c t i o n a n d S t r e c k e r d e g r a d a t i o n s , w h i c h a r e p e r h a p s r e g u l a t e d a l o n g uncommon p a t h w a y s b y t h e l o w m o i s t u r e e n v i r o n m e n t , l o c a l i z e d b u f f e r s y s t e m s a n d a f l u c t u a t i n g b a l a n c e o f r e a c t i o n p r o d u c t s ( 4 6 ) . V. PRECURSOR S T U D I E S R u s s w u r m ( 4 9 ) f r a c t i o n a t e d a w a t e r e x t r a c t o f f a t - f r e e c o f f e e p o w d e r o n a S e p h a d e x G-25 c o l u m n a n d f o u n d f i v e l o w m o l e c u l a r w e i g h t f r a c t i o n s a n d o n e h i g h m o l e c u l a r w e i g h t f r a c t i o n . I n a n a t t e m p t t o f i n d t h e p r e c u r s o r s o f c o f f e e a r o m a i n t h e s e f r a c t i o n s , e a c h w a s r o a s t e d a t 1 6 . 1 8 0 - 220°C a n d j u d g e d o r g a n o l e p t i c a l l y f o r a n o d o u r r e m i n i s c e n t o f c o f f e e a r o m a . O n l y o n e l o w m o l e c u l a r w e i g h t f r a c t i o n g a v e a c o f f e e a r o m a a n d t h i s w a s n o t i m p r o v e d b y r e c o m b i n a t i o n w i t h o t h e r f r a c t i o n s . S u c r o s e , f r u c t o s e , g l u c o s e , t r i g o n e l l i n e a n d a n u m b e r o f a m i n o a c i d s w e r e c h a r a c t e r i z e d i n t h i s a r o m a - y i e l d i n g f r a c t i o n . T h e a m i n o a c i d s a n d s u g a r s w e r e f u r t h e r s e p a r a t e d o n a D o w e x - 5 c o l u m n . No c o f f e e a r o m a w a s e v i d e n t f r o m e i t h e r o f t h e s e t w o f r a c t i o n s , b u t r e c o m b i n a t i o n p r o d u c e d t h e a r o m a . B u c k l a n d ( 1 5 ) e x t r a c t e d g r e e n c o f f e e w i t h w a t e r , m e t h a n o l a n d e t h a n o l i n art a t t e m p t t o i s o l a t e a n e x t r a c t w h i c h w o u l d p r o d u c e c o f f e e a r o m a w h e n r o a s t e d , a n d w o u l d t h u s c o n t a i n some o f t h e m a j o r p r e c u r s o r s o f c o f f e e a r o m a . T h e w a t e r e x t r a c t p r o d u c e d n o a r o m a ; t h e e t h a n o l e x t r a c t p r o d u c e d a n a r o m a r e m i n i s c e n t o f r o a s t e d o i l s e e d , s u c h a s p e a n u t s ; t h e m e t h a n o l e x t r a c t p r o d u c e d a s l i g h t c o f f e e a r o m a . T h e m e t h a n o l e x t r a c t c o n t a i n e d f r e e a m i n o a c i d s , some p e p t i d e s a n d o t h e r c o m p o u n d s . R o h a n a n d S t e w a r t ( 5 0 , 5 1 ) a n d R o h a n ( 5 2 ) f o u n d t h a t r o a s t i n g a m e t h a n o l e x t r a c t f r o m f e r m e n t e d c a c a o b e a n s p r o d u c e d a c o c o a a r o m a . T h e p r i m a r y p r e c u r s o r s o f c o c o a a r o m a a r e t h e f l a v o n o i d s , s u g a r s a n d a m i n o a c i d s , w h i c h h a v e b e e n i d e n t i f i e d i n t h i s m e t h a n o l i c e x t r a c t . V I . C O F F E E AROMA. A t t e m p t s t o i s o l a t e t h e c o m p o n e n t s r e s p o n s i b l e f o r t h e a r o m a o f c o f f e e w e r e f i r s t m a de m o r e t h a n 1 0 0 y e a r s a g o . S i n c e t h a t t i m e , c o n s i d e r a b l e e f f o r t h a s b e e n made t o e v a l u a t e t h e v o l a t i l e c o n s t i t u e n t s o f r o a s t e d c o f f e e , b u t p r o g r e s s i n t h i s d i r e c t i o n h a s b e e n r e l a t i v e l y s l o w 1 7 . d u e t o t h e c o m p l e x i t y o f t h e a r o m a a n d i t s p r e c u r s o r s . W i t h t h e d e v e l o p -m e n t o f n e w i n s t r u m e n t a l m e t h o d s , c o f f e e v o l a t i l e s h a v e b e e n s e p a r a t e d , i d e n t i f i e d a n d c o l l e c t e d u s i n g p r e p a r a t i v e g a s c h r o m a t o g r a p h y , a n d f u r t h e r i d e n t i f i e d u s i n g m a s s s p e c t r o p h o t o m e t r y a n d i n f r a r e d s p e c t r o p h o t o m e t r y ( 5 3 ) . T h e n u m b e r o f c o m p o u n d s i s o l a t e d f r o m a n a r o m a s a m p l e i s a f f e c t e d b y t h e m e t h o d o f v o l a t i l e e x t r a c t i o n . V o l a t i l e s h a v e b e e n c l a s s i f i e d a s h e a d s p a c e , c a r b o n d i o x i d e a n d w a t e r f r a c t i o n s ( 5 4 ) . Z l a t k i s a n d S i v e t z ( 5 5 ) o b t a i n e d a d r y v a c u u m a r o m a f r a c t i o n f r o m w h i c h m o r e t h a n 3 0 v o l a t i l e c o m p o n e n t s w e r e i d e n t i f i e d . S t o f f e l s m a e t a l ( 5 6 ) f o u n d 1 5 8 c o m p o u n d s f r o m t h e s o l v e n t e x t r a c t o f a s t e a m c o n d e n s a t e o f r o a s t e d a n d g r o u n d c o f f e e . W e i d e m a n n a n d M o h r ( 5 7 ) i s o l a t e d 3 6 3 c o m p o u n d s w h i c h t h e y g r o u p e d a s 1 3 1 a c y c l i c c o m p o u n d s , 73 i s o c y c l i c c o m p o u n d s a n d 1 5 9 h e t e r o c y c l i c c o m p o u n d s . I t h a s . b e e n g e n e r a l l y c o n c l u d e d b y a l l g r o u p s i n t e r e s t e d i n c o f f e e a r o m a t h a t t h e a r o m a i s n o t t h e r e s u l t o f a n i n d i v i d u a l c o m p o n e n t , b u t i s d u e t o n u m e r o u s c o m p o u n d s o f v a r i o u s s t r u c t u r e s a n d c o n c e n t r a t i o n s . F e l d m a n e t a l ( 4 6 ) s u g g e s t e d t h a t c o f f e e a r o m a i s a l s o i n f l u e n c e d b y n o n v o l a t i l e c o m p o n e n t s . 1 8 . P ART I P L A N T C E L L C U L T U R E A. M A T E R I A L S AND METHODS 1. C u l t u r e p r e p a r a t i o n T h e p l a n t c e l l s u s e d t h r o u g h o u t t h i s s t u d y w e r e d e r i v e d f r o m h e a l t h y C o f f e a a r a b i c a L . t r e e s g r o w i n g i n t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a h o r t i c u l t u r e g r e e n h o u s e s . A l l p r o c e d u r e s w e r e c a r r i e d o u t i n a s t e r i l e h o o d t o a v o i d c o n t a m i n a t i o n . S t e m , l e a f , a n d r i p e a n d u n r i p e p e r i c a r p a n d e n d o s p e r m t i s s u e s w e r e s e c t i o n e d i n t o a p p r o x i m a t e l y 2 cm s e g m e n t s a n d s u r f a c e s t e r i l i z e d b y s u b m e r s i o n i n 5% s o d i u m h y p o c h l o r i t e . T h e s e g m e n t s w e r e t h e n r i n s e d 3 t i m e s i n s t e r i l e d i s t i l l e d w a t e r t o r e m o v e t h e h y p o c h l o r i t e f r o m t h e t i s s u e . T h e s t e r i l e t i s s u e s e c t i o n s w e r e t r a n s f e r r e d t o t h e s u r f a c e o f s o l i d P R L - 4 , a n u n d e f i n e d m e d i u m ( A p p e n d i x ) w h i c h c o n t a i n s c o c o n u t m i l k , c a s e i n h y d r o l y s a t e a n d t h e a p p r o p r i a t e g r o w t h r e g u l a t o r ( 2 , 4 - D ) w h i c h i n d u c e s c a l l u s f o r m a t i o n . T h e c u l t u r e s w e r e i n c u b a t e d i n t h e d a r k a t 28°C a n d c a l l u s t i s s u e f o r m e d w i t h i n 3 t o 4 w e e k s . C a l l u s c u l t u r e s w e r e t r a n s f e r r e d m o n t h l y t o f r e s h s o l i d m e d i u m t o m a i n t a i n c u l t u r e v i a b i l i t y . B-5 a n d m o d i f i e d F o x ( A p p e n d i x ) , w h i c h a r e d e f i n e d m e d i a , w e r e u s e d a t t h i s s t a g e t o c o m p a r e t h e g r o w t h o f c a l l u s t i s s u e o n d i f f e r e n t s o l i d m e d i a . 2. C e l l s u s p e n s i o n c u l t u r e S u s p e n s i o n c u l t u r e s w e r e i n i t i a t e d b y t r a n s f e r r i n g s e v e r a l p i e c e s o f a c t i v e l y g r o w i n g 5 t o 6 w e e k o l d f r i a b l e c a l l u s t o a 2 5 0 m l e r l e n m e y e r f l a s k c o n t a i n i n g 1 0 0 m l o f P R L - 4 , B-5 o r m o d i f i e d F o x m e d i u m . S u s p e n s i o n 1 9 . c u l t u r e s w e r e a l s o i n i t i a t e d b y p l a c i n g s t e r i l e e x c i s e d e n d o s p e r m a n d p e r i c a r p d i r e c t l y i n t o t h e l i q u i d c u l t u r e m e d i a . T h e c u l t u r e f l a s k s w e r e i n c u b a t e d a t 28°C o n a h o r i z o n t a l r o t a r y s h a k e r ( G y r o t o r y S h a k e r M o d e l G 1 0 ) a t a s p e e d o f 1 1 0 r p m , i n a o n e i n c h c i r c u l a r o r b i t , i n t h e d a r k . T h e l i q u i d s u s p e n s i o n c u l t u r e s w e r e t r a n s f e r r e d t o f r e s h l i q u i d m e d i u m e v e r y 3 t o 4 w e e k s u n t i l a s a t i s f a c t o r y s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n c u l t u r e w a s e s t a b l i s h e d . T h e r e a f t e r , t h e t r a n s f e r s w e r e made r o u t i n e l y o n a w e e k l y b a s i s t o m a i n t a i n c u l t u r e v i g o u r . 3. I n v i t r o e x p e r i m e n t s S u s p e n s i o n - c u l t u r e d c o f f e e c e l l s w e r e g r o w n i n t h e d a r k i n a v a r i e t y o f m e d i a ( T a b l e I I ) a n d w e r e a n a l y z e d f o r c e l l s u g a r s , s p e n t m e d i u m s u g a r s , a n d p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n . Some c u l t u r e s w e r e g r o w n b o t h i n t h e l i g h t ( 9 , 8 4 0 l u m e n s a t l i g h t s o u r c e ) i n a New B r u n s w i c k E n v i r o n m e n t a l C h a m b e r a n d t h e d a r k t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t s o f l i g h t o n c e l l s u g a r s a n d p o l y s a c c h a r i d e c o m p o s i t i o n . T h e g r o w t h c u r v e s a n d t h e p a r a m e t e r s o f p H a n d c o n d u c t i v i t y o f t h e s p e n t m e d i u m h a v e b e e n r e p o r t e d b y v a n d e V o o r t ( 5 8 ) . 4. M e a s u r e m e n t o f c e l l s u g a r s , s p e n t m e d i u m s u g a r s a n d p o l y s a c c h a r i d e  p r o d u c t i o n ( F i g u r e 2) I n a t y p i c a l e x p e r i m e n t , a s e r i e s o f f l a s k s w e r e i n o c u l a t e d w i t h 2 0 m l a l i q u o t s o f c e l l s f r o m a 7 d a y o l d s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n c u l t u r e . S a m p l e f l a s k s w e r e h a r v e s t e d e v e r y o t h e r d a y f o r t h e n e x t 1 4 d a y s . T h e c e l l s w e r e s e p a r a t e d f r o m t h e s p e n t m e d i u m b y f i l t r a t i o n o n M i r a c l o t h ( C a l i b i o c h e m ) , w a s h e d w i t h c o l d a n d b o i l i n g w a t e r , t h e n f r o z e n a n d l y o p h i l i z e d i n a V i r t i s f r e e z e d r i e r . C e l l s u g a r s w e r e e x t r a c t e d w i t h 1 0 0 m l o f 8 0 % e t h a n o l p e r g r a m 20. TABLE I I . C e l l suspension culture media—special conditions. (complete formulae for media are given i n Appendix) ^ • x . MEDIUM SPECIAL CONDITIONS PRL-4 Fox-3H Fox-3H HIGH KINETIN Fox-3H NO N 2 Fox-2H NO N 2 Fox-lH 2,4-D 2 mg/\E 2 mg/L 2 mg/L .2 mg/L - 2 mg/L IAA - 2 mg/L 2 mg/L 2 mg/L 2 mg/L Kinetin - .05mg/L 2.5mg/L .05mg/L .05mg/L -Coconut Milk + - - - - -Casein Hydrolysate + - - - - -Light/Dark L/D L/D D D D L/D ANALYSIS FOR: C e l l Sugars D D D D D D Extracellular Polysaccharide L/D L/D < D D D L/D Spent Medium Sugars - - D D D -2 1 . C E L L S U S P E N S I O N f i l t e r C E L L S ' S PENT MEDIUM. cold H 20 C E L L S ^* COLD H 2 0 WASH b o i l i n g H 2 0 C E L L S f 1 a freeze dry EtOH extract f i l t e r i R E S I D U E concentrate pyridine TMS ETHERS B O I L I N G H 2 0 WASH c o n c e n t r a t e E t O H v P R E C I P I T A T E E t O H a c e t o n e e t h e r wash wash wash C E L L SUGARS C E L L U L A R P O L Y S A C C H A R I D E TMS 1 freeze dry < hydrolyze ion exchange TMS TMS ETHERS centrifuge SUPERNATANT concentrate LtOH E X T R A C E L L U L A R P O L Y S A C C H A R I D E freeze dry hydrolyze ion exchange TMS TMS ETHERS GAS CHROMATOGRAPHIC A N A L Y S I S R E C I P I T A T E discard SUPERNATANT I evaporate R E S I D U E pyridine 4-SPENT MEDIUM SUGARS TMS t TMS ETHERS F I G U R E 2. Procedure for separation of c e l l sugars, spent medium sugars and polysaccharides from coffee c e l l cultures. 2 2 . o f c e l l s f o r 2 4 h r s o n a g y r o t o r y s h a k e r . T h i s a l c o h o l i c e x t r a c t w a s f i l t e r e d a n d t h e r e s i d u e w a s h e d t w i c e w i t h 8 0 % e t h a n o l t h e n c o n c e n t r a t e d t o a r e s i d u e i n a B u c h l e r r o t a r y e v a p o r a t o r a t 40°C i n v a c u o . T h e s u g a r s w e r e e x t r a c t e d f r o m t h e r e s i d u e w i t h p y r i d i n e t h e n e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r n i t r o g e n . A s a m p l e w a s p r e p a r e d b y t r i m e t h y l s i l y l a t i o n t o TMS e t h e r s a n d a n a l y z e d b y g a s c h r o m a t o g r a p h y ( G . C . i s d e s c r i b e d l a t e r ) . T h e c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e w a s r e c o v e r e d f r o m t h e b o i l i n g w a t e r w a s h . The b o i l i n g w a t e r c e l l e x t r a c t w a s c o n c e n t r a t e d i n v a c u o a t 40°C t o o n e - t h i r d v o l u m e a n d t h e n p r e c i p i t a t e d w i t h e t h a n o l . T h e p r e c i p i t a t e w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 5 0 0 x g f o r 15 m i n a n d w a s t h e n w a s h e d o n c e w i t h 8 0 % e t h a n o l , o n c e w i t h a c e t o n e a n d o n c e w i t h ' e t h e r . T h e e t h a n o l i n s o l u b l e m a t e r i a l w a s f r e e z e d r i e d t o d e t e r m i n e t h e y i e l d . A s a m p l e w a s l a t e r p r e p a r e d f o r G . C . . a n a l y s i s . T h e f i l t e r e d s p e n t m e d i u m a n d c o l d w a t e r c e l l w a s h e s w e r e p o o l e d a n d c e n t r i f u g e d a t 2 0 , 0 0 0 x g f o r 2 0 m i n . T h e p r e c i p i t a t e w a s d i s c a r d e d a n d t h e s u p e r n a t a n t , w h i c h c o n t a i n e d t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e , w a s o c o n c e n t r a t e d i n v a c u o a t 4 0 C t o a b o u t o n e - t h i r d v o l u m e , r e c o n s t i t u t e d t o 7 0 % e t h a n o l ' ( 3 2 ) a n d a l l o w e d t o p r e c i p i t a t e o v e r n i g h t a t 4 ° C . T h e e t h a n o l i n s o l u b l e m a t e r i a l w a s c o l l e c t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 5 0 0 x g f o r 15 m i n , w a s h e d o n c e w i t h 8 0 % e t h a n o l , o n c e w i t h a c e t o n e a n d o n c e w i t h e t h e r . T h e y i e l d o f EPS w a s d e t e r m i n e d b y f r e e z e d r y i n g t h e p r e c i p i t a t e f o r 2 d a y s . A s a m p l e w a s l a t e r p r e p a r e d f o r G.C. a n a l y s i s . T h e e t h a n o l s o l u b l e s u p e r n a t a n t f r o m a b o v e w a s e v a p o r a t e d t o a r e s i d u e i n v a c u o a t 40°C i n a r o t a r y e v a p o r a t o r . T h i s r e s i d u e , c o n t a i n i n g t h e s p e n t m e d i u m s u g a r s , w a s e x t r a c e d w i t h p y r i d i n e a n d e v a p o r a t e d t o 2 3 . d r y n e s s u n d e r n i t r o g e n . A s a m p l e w a s s i l y l a t e d t o TMS e t h e r s a n d a n a l y z e d b y G.C. 5. H y d r o l y s i s o f p o l y s a c c h a r i d e T h e o p t i m u m h y d r o l y s i s t i m e w a s d e t e r m i n e d b y a u t o c l a v i n g 2 5 mg s a m p l e s o f t h e p o l y s a c c h a r i d e m a t e r i a l a t 121°C a n d 1 5 p s i f o r v a r i o u s t i m e s ( 1 , 2 , 3 , 4 , 6 a n d 8 h r s ) i n 2 m l o f I N H 2 S 0 4 ( 3 2 ) . T h e a m o u n t o f t h e i n d i v i d u a l m o n o s a c c h a r i d e c o m p o n e n t s r e l e a s e d b y h y d r o l y s i s w a s m e a s u r e d q u a n t i t a t i v e l y b y G.C. ( F i g u r e 3 ) . Two h o u r s w a s f o u n d t o b e t h e o p t i m a l h y d r o l y s i s t i m e f o r t h e r e l e a s e o f a l l s u g a r s . A l l e x p e r i m e n t a l s a m p l e s w e r e t h e r e f o r e h y d r o l y z e d u n d e r t h e s t a n d a r d c o n d i t i o n s o f 1 0 0 mg m a t e r i a l i n 8 m l I N ^ S O ^ f o r 2 h r s a t 121°C a n d 1 5 p s i . T h e s u g a r s w e r e s t a b l e u n d e r t h e h y d r o l y s i s c o n d i t i o n s . T h e r e s i d u e r e m a i n i n g a f t e r h y d r o l y s i s w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d n o t e x a m i n e d f u r t h e r . T h e s u p e r n a t a n t w a s t r a n s f e r r e d i n 1 m l a l i q u o t s t o a 1 x 2 0 cm D o w e x 1X4 ( c a r b o n a t e f o r m , 2 0 - 5 0 m e s h ) a n i o n e x c h a n g e r e s i n c o l u m n ( 5 9 ) , T h e r e s i n w a s p r e p a r e d f r o m t h e c h l o r i d e f o r m b y w a s h i n g w i t h 1M Na^CO^ i n a l a r g e c o l u m n . E a c h a l i q u o t o f p o l y s a c c h a r i d e w a s a l l o w e d t o s i n k i n t o t h e c o l u m n b e d b e f o r e t h e n e x t w a s a d d e d a n d t h e c o l u m n w a s t a p p e d g e n t l y t o a s s i s t t h e e s c a p e o f CO^. T h e c e n t r i f u g e t u b e a n d p i p e t t e w e r e r i n s e d t w i c e w i t h d i s t i l l e d w a t e r o n t o t h e c o l u m n a n d e l u t i o n w a s c o n t i n u e d w i t h w a t e r . S u l f a t e i o n s , w h i c h i n t e r f e r e w i t h G.C. a n a l y s i s , w e r e t h u s r e m o v e d f r o m t h e h y d r o l y s a t e a n d r e m a i n e d i n t h e c o l u m n . T h e c o l u m n w a s f u r t h e r e l u t e d w i t h I N HC1 t o r e m o v e a n y u r o n i c a c i d s w h i c h r e m a i n e d i n t h e c o l u m n . T h e w a t e r w a s r e m o v e d f r o m t h e c a r b o h y d r a t e m a t e r i a l e l u t e d f r o m G a l a c t o s e H y d r o l y s i s T i m e ( h r s ) F I G U R E 3. T h e i n f l u e n c e o f a c i d h y d r o l y s i s t i m e o n c a r b o h y d r a t e c o m p o n e n t s o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e . 2 5 . t h e c o l u m n b y r o t a r y e v a p o r a t i o n i n v a c u o a t 4 0 C. T h e r e s i d u e r e m a i n i n g w a s e x t r a c t e d w i t h p y r i d i n e a n d t h e n w i t h d i s t i l l e d w a t e r . T h e p y r i d i n e e x t r a c t w a s e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r n i t r o g e n a n d a s a m p l e s i l y l a t e d t o TMS e t h e r s a n d a n a l y z e d b y G.C. T h e w a t e r e x t r a c t w a s u s e d f o r a n a l y s i s o f f r e e s u g a r s b y d e s c e n d i n g p a p e r c h r o m a t o g r a p h y ( P . C . ) . 6. G a s c h r o m a t o g r a p h y o f t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s A l l g a s c h r o m a t o g r a p h y o f s u g a r s w a s c a r r i e d o u t o n a B e c k e r R e s e a r c h C h r o m a t o g r a p h - t y p e 3 8 1 0 w i t h a f l a m e i o n i z a t i o n d e t e c t o r . T h e c o l u m n u s e d t o p e r f o r m t h e s e p a r a t i o n s w a s a 1 0 f t x \ i n I . D . s t a i n l e s s s t e e l c o l u m n o f 5% OV-1 l i q u i d p h a s e a b s o r b e d o n t o g a s c h r o m Q s o l i d s u p p o r t ( 8 0 - 1 0 0 m e s h ) . T h e i n j e c t i o n p o r t t e m p e r a t u r e - w a s m a i n t a i n e d a t 270°C a n d c o m m e r c i a l l y p u r i f i e d n i t r o g e n w a s u s e d a s t h e c a r r i e r g a s . Two p r o g r a m s w e r e e m p l o y e d f o r t h e s e p a r a t i o n o f t h e s u g a r s : A . F o r f r e e s u g a r s f o u n d i n a l l h y d r o l y s a t e s : T h e c o l u m n w a s o p e r a t e d i s o t h e r m a l l y a t a t e m p e r a t u r e o f 190°C f o r 1 7 m i n , t h e n t h e t e m p e r a t u r e w a s i n c r e a s e d t o 300°C a t a r a t e o f 3°C/min. T h e f l o w r a t e o f n i t r o g e n w a s 18 m l / m i n . B. F o r c o f f e e c e l l s u g a r s a n d s p e n t m e d i u m s u g a r s : T h e c o l u m n w a s o p e r a t e d i s o t h e r m a l l y a t a t e m p e r a t u r e o f 210°C f o r 27 m i n , t h e n t h e t e m p e r a t u r e w a s i n c r e a s e d t o 325°C a t a r a t e o f 6°C/min. T h e f l o w r a t e o f n i t r o g e n w a s 3 0 m l / m i n . T h e m e t h o d o f S w e e l e y e t a l ( 6 0 ) w a s u s e d f o r t h e t r i m e t h y l s i l y a t i o n o f s u g a r s t o t h e i r TMS e t h e r s . T h e s t a n d a r d c o n d i t i o n s f o r t h e TMS r e a c t i o n a r e o u t l i n e d b e l o w . A 1 0 mg s a m p l e o f c a r b o h y d r a t e w a s t r e a t e d w i t h 1 m l a n h y d r o u s 2 6 . p y r i d i n e ( s t o r e d o v e r KOH p e l l e t s ) , 0.2 m l h e x a m e t h y l d i s i l a z a n e ( M a t h e s o n , C o l e m a n a n d B e l l C o . ) a n d 0.1 m l t r i m e t h y l c h l o r o s i l a n e ( K a n d K L a b o r a t o r i e s , I n c . ) . 3 ROH + M e 0 S i N H S i M e Q •+' M e 0 S i C l 3 R O S i M e . + NH.C1 3 - . 3 3 3 4 T h e r e a c t i o n w a s c a r r i e d o u t i n a s t o p p e r e d v i a l w h i c h w a s s h a k e n v i g o r o u s l y f o r 3 0 s e c a n d t h e n w a s a l l o w e d t o s t a n d f o r 5 m i n a t r o o m t e m p e r a t u r e p r i o r t o c h r o m a t o g r a p h y . T h e s o l u t i o n b e c a m e c l o u d y o n a d d i t i o n o f t r i m e t h y l c h l o r o s i l a n e d u e t o p r e c i p i t a t i o n o f ammonium c h l o r i d e . I t i s n o t n e c e s s a r y t o r e m o v e t h i s f i n e p r e c i p i t a t e a s i t i n no w a y i n t e r f e r e s w i t h t h e e n s u i n g c h r o m a t o g r a p h y . A l t h o u g h t h e m a j o r i t y o f h y d r o x y l c o m p o u n d s w i l l s i l y l a t e c o m p l e t e l y w i t h i n 5 m i n , some c o m p o u n d s may r e q u i r e l o n g e r r e a c t i o n t i m e s . F o r d e t e r m i n a t i o n o f t h e o p t i m u m r e a c t i o n t i m e , s a m p l e s o f CHO a n d t h e s i l y l a t i n g r e a g e n t s w e r e a l l o w e d t o r e a c t f o r . 5 , 1 5 , 3 0 a n d 6 0 m i n u t e s a n d f o r 24 h r s . T h e r e a c t i o n y i e l d w a s d e t e r m i n e d b y m e a s u r i n g t h e p e a k a r e a s . T h e q u a n t i t y o f p r o d u c t f o r m e d w a s f o u n d t o b e e s s e n t i a l l y i n d e p e n d a n t o f r e a c t i o n t i m e , s o t h e 5 m i n u t e r e a c t i o n t i m e w a s u s e d f o r a l l f u r t h e r s a m p l e s . P e a k s w e r e r e c o r d e d o n a V i t a t r o n r e c o r d e r a n d a r e a s c a l c u l a t e d b y m u l t i p l y i n g p e a k h e i g h t b y t h e w i d t h a t h a l f h e i g h t . P e a k s w e r e i d e n t i f i e d b y t r i m e t h y l s i l y l a t i o n a n d c h r o m a t o g r a p h y o f a u t h e n t i c s t a n d a r d s . R e l a t i v e r e t e n t i o n t i m e s w e r e c o m p a r e d t o i d e n t i f y t h e s u g a r s i n t h e s a m p l e s f r o m t h e s t a n d a r d s . D u e t o t h e m u l t i p l i c i t y o f p e a k s ( a l p h a , b e t a , gamma f o r m s ) f o r some s u g a r s , p o s i t i v e i d e n t i f i c a t i o n o f t a u t o m e r s w a s c o m p l e t e d b y g a s c h r o m a t o g r a p h y o f t h e i n d i v i d u a l s u g a r s e l u t e d f r o m 2 7 . p r e p a r a t i v e p a p e r c h r o m a t o g r a p h y . Q u a n t i t a t i o n w a s made b y t h e u s e o f s t a n d a r d c u r v e s . F o r t e m p e r a t u r e p r o g r a m A, t h e d e t e c t o r r e s p o n s e t o g a l a c t o s e , g l u c o s e , m a n n o s e , x y l o s e , r h a m n o s e a n d g a l a c t u r o n a t e w a s m e a s u r e d r e l a t i v e t o a r a b i n o s e . T h e d e t e c t o r r e s p o n s e w a s l i n e a r f o r t h e s e s u g a r s . F o r t e m p e r a t u r e p r o g r a m B, t h e d e t e c t o r r e s p o n s e t o g l u c o s e , i n o s i t o l , a n d s u c r o s e w a s m e a s u r e d r e l a t i v e t o f r u c t o s e . T h e d e t e c t o r r e s p o n s e w a s l i n e a r f o r t h e s e s u g a r s . 7. Q u a l i t a t i v e c a r b o h y d r a t e a n a l y s i s : p a p e r c h r o m a t o g r a p h y T h e s u g a r s p r e s e n t i n t h e w a t e r e x t r a c t o f t h e c o l u m n e l u a n t w e r e s e p a r a t e d b y d e s c e n d i n g p a p e r c h r o m a t o g r a p h y f o r 22 h r s o n a 2 0 x 57 cm Whatman N o . 1 f i l t e r p a p e r a t r o o m t e m p e r a t u r e . Two s o l v e n t s y s t e m s w e r e c o m p a r e d . t o c o m p l e m e n t t h e G.C. i d e n t i f i c a t i o n s . A. E T H YL A C E T A T E - P Y R I D I N E - H ^ O ( 8 : 2 : 1 ) ( 2 8 ) B. E T H Y L A C E T A T E - P Y R I D I N E - H 2 0 ( 1 0 : 4 : 3 ) ( 6 1 ) T h e c o m p o u n d s r e s o l v e d b y p a p e r c h r o m a t o g r a p h y w e r e i d e n t i f i e d b y t h e i r c o l o r r e a c t i o n s w i t h t h e f o l l o w i n g . r e a g e n t s : i . p - a n i s i d i n e p h t h a l i c a c i d ( 6 2 ) w h i c h s h o w s h e x o s e s a s g r e e n s p o t s , p e n t o s e s a s r e d - v i o l e t a n d u r o n i c a c i d s a s b r o w n , i i . P e r i o d a t e - b e n z i d i n e s p r a y ( 6 2 ) i n w h i c h s u g a r s c o n s u m e p e r i o d a t e a n d a p p e a r a s w h i t e s p o t s o n a b l u e f i e l d , i i i . a n i l i n e - a c i d - o x a l a t e d i p ( 6 2 ) i n w h i c h h e x o s e s a n d u r o n i c a c i d s a p p e a r b r o w n a n d p e n t o s e s a p p e a r p i n k , i v . a n i l i n e - d i p h e n y l a m i n e p h o s p h a t e ( 6 2 ) i n w h i c h r e d u c i n g s u g a r s r e a c t t o g i v e a v a r i e t y o f c o l o r s . 2 8 . S p o t s w e r e d e v e l o p e d i n a l O O ^ C o v e n f o r 1 5 m i n u t e s . F u r t h e r i d e n t i f i c a t i o n o f t h e s u g a r s w a s c a r r i e d o u t b y p r e p a r a t i v e d e s c e n d i n g c h r o m a t o g r a p h y o n W h a t m a n N o . 3 f i l t e r p a p e r a t r o o m t e m p e r a t u r e i n a n e t h y l a c e t a t e - p y r i d i n e - w a t e r s y s t e m ( 1 0 : 4 : 3 ) f o r 22 h r s . S u g a r t e s t s p o t s w e r e d e v e l o p e d w i t h p - a n i s i d i n e p h t h a l i c a c i d . A f t e r t h e i n d i v i d u a l s u g a r s h a d b e e n l o c a t e d o n t h e p a p e r , s t r i p s c o n t a i n i n g i n d i v i d u a l s u g a r s w e r e c u t o u t a n d e l u t e d w i t h p y r i d i n e . T h e s e s u g a r s w e r e t h e n s u b j e c t e d t o G.C. f o r i d e n t i f i c a t i o n o f t a u t o m e r i c f o r m s . 8. C o f f e e c e l l e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n a t i o n ( F i g u r e 4 ) T h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e m i x t u r e p r e c i p i t a t e d f r o m t h e F o x 3H s p e n t m e d i u m wa s f r a c t i o n a t e d a c c o r d i n g t o t h e m e t h o d o f A s p i n a l l a n d M o l l o y ( 3 3 ) . 6.68 gm o f t h e p o l y s a c c h a r i d e m i x t u r e w a s s t i r r e d i n 3 1 c o l d w a t e r f o r 24 h r s . T h e i n s o l u b l e m a t e r i a l r e m a i n i n g ( 2 . 4 0 gm) w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n , a n d t h e s u p e r n a t a n t p o u r e d i n t o a c e t o n e . T h e r e s u l t i n g p r e c i p i t a t e w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n , d i s s o l v e d i n w a t e r a n d f r e e z e d r i e d f o r 4 8 h r s . A s a m p l e o f t h i s m i x e d p o l y s a c c h a r i d e w a s h y d r o l y z e d a n d a n a l y z e d b y G.C. a n d P.C. 4.20 gm o f m i x e d p o l y s a c c h a r i d e w a s d i s s o l v e d i n 8 0 0 m l w a t e r a n d 2 0 0 m l 7% a q u e o u s c u p r i c a c e t a t e w a s a d d e d t o t h e m i x t u r e . T h e a c i d i c p o l y s a c c h a r i d e p r e c i p i t a t e d a s a c o p p e r s a l t and- w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n t h e n d e c o m p o s e d b y d i s s o l u t i o n i n s l i g h t l y a c i d i f i e d ( H C 1 ) w a t e r . T h e a c i d i c p o l y s a c c h a r i d e w a s r e g e n e r a t e d b y p r e c i p i t a t i o n i n 4 v o l u m e s o f e t h a n o l t h e n c e n t r i f u g e d , f r e e z e d r i e d ( y i e l d 0.22 gm) a n d a n a l y z e d . T h e s u p e r n a t a n t s o l u t i o n f r o m t h e a b o v e c u p r i c a c e t a t e p r e c i p i t a t i o n 2 9 . M I X E D P O L Y S A C C H A R I D E SUPERNATANT a c e t o n e SUPERNATANT ^ P R E C I P I T A T E 1 d i s c a r d I N S O L U B L E R E S I D U E d i s c a r d A C I D I C P O L Y S A C C H A R I D E ( a s Cu-H- s a l t ) H 2 0 7% c u p r i c a c e t a t e SUPERNATANT E t O H a c i d i f i e d ^ 0 E t O H P R E C I P I T A T E P R E C I P I T A T E ' a c i d a l c o h o l w a s h E t O H w a s h M I X E D N E U T R A L P O L Y S A C C H A R I D E c e l l u l o s e 0.5N c o l u m n NaOH w a t e r NaOH S O L U B L E P O L Y S A C C H A R I D E H C l n e u t r a l i z e d i a l i z e ( H 2 0 ) E t O H P R E C I P I T A T E 1 c e n t r i f u g e f r e e z e d r y WATER S O L U B L E P O L Y S A C C H A R I D E E t O H P R E C I I T A T E c e n t r i f u g e f r e e z e d r y A N A L Y S I S • SUPERNATANT i d i s c a r d 7M u r e a UREA S O L U B L E P O L Y S A C C H A R I D E d i a l i z e (H.,0) E t O H P R E C I P I T A T E c e n t r i f u g e f r e e z e d r y J F I G U R E 4. P r o c e d u r e f o r f r a c t i o n a t i o n o f c o f f e e c e l l e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e . 3 0 . w a s p o u r e d i n t o e t h a n o l a n d t h e r e s u l t i n g p r e c i p i t a t e w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n . T h e p r e c i p i t a t e w a s w a s h e d w i t h 1 % a c i d a l c o h o l t h e n w i t h e t h a n o l , t h e n r e d i s s o l v e d i n w a t e r a n d f r e e z e d r i e d t o g i v e a m i x t u r e o f n e u t r a l p o l y s a c c h a r i d e s ( y i e l d 3.5 gm). T h i s n e u t r a l p o l y s a c c h a r i d e m i x t u r e w a s d i s s o l v e d i n 20 m l w a t e r a n d a b s o r b e d o n t o a 2 x 3 0 cm C e l l e x MX c e l l u l o s e c o l u m n ( B i o r a d L a b o r a t o r i e s ) . T h e w a t e r s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e w a s e l u t e d f i r s t , p r e c i p i t a t e d w i t h e t h a n o l , c e n t r i f u g e d , f r e e z e d r i e d ( y i e l d 3 . 1 5 g m ) , h y d r o l y z e d a n d a n a l y z e d b y G.C. a n d P.C. Two m o r e f r a c t i o n s w e r e e l u t e d f r o m t h e c o l u m n w i t h 7M u r e a a n d w i t h 0.5N NaOH. T h e s o d i u m h y d r o x i d e f r a c t i o n ( 0 . 0 7 gm) w a s n e u t r a l i z e d w i t h HC1 a n d b o t h t h i s a n d t h e u r e a f r a c t i o n ( 0 . 0 8 gm) w e r e d i a l y z e d a g a i n s t c o l d r u n n i n g w a t e r f o r 2 d a y s . T h e p o l y s a c c h a r i d e s i n t h e t w o e l u a n t s w e r e p r e c i p i t a t e d w i t h e t h a n o l , c e n t r i f u g e d , f r e e z e d r i e d a n d a n a l y z e d b y G.C. a n d P.C. 9. C e l l w a l l p r e p a r a t i o n ( F i g u r e 5) T h e p r e p a r a t i o n o f c e l l w a l l s u g a r s w a s c a r r i e d o u t a t 4°C. C o f f e e c e l l s g r o w n o n F o x - 3 H m e d i u m f o r 1 0 d a y s w e r e h a r v e s t e d b y c e n t r i f u g a t i o n a n d w a s h e d t w i c e w i t h 1 0 v o l u m e s b y w e i g h t o f 0.1M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 0 ) . T h e c e l l s w e r e t h e n s u s p e n d e d i n 1 v o l u m e o f 0.5M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r a n d t h e s l u r r y w a s p a s s e d t h r o u g h a n A m i n c o F r e n c h P r e s s u r e C e l l a t 2 0 0 0 - 3 0 0 0 p s i . T h e r u p t u r e d c e l l s u s p e n s i o n w a s d i l u t e d w i t h 4 v o l u m e s o f 0.5M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r . M i c r o s c o p i e x a m i n a t i o n o f t h e s a m p l e e n s u r e d t h a t e s s e n t i a l l y a l l t h e c e l l s w e r e c o m p l e t e l y d i s r u p t e d . T h e s u s p e n s i o n w a s c e n t r i f u g e d f o r 1 0 m i n a t 2 0 0 0 x 3 1 . C E L L S 0.1 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e w a s h ( 2 x ) 0.5 M p o t a s s i u m p h o s p h a t e w a s h ( 2 x ) SUPERNATANT' d i s c a r d C E L L S F r e n c h P r e s s u r e C e l l 2000-3006 p s i i RUPTURED C E L L S U S P E N S I O N -SUPERNATANT-i d i s c a r d — : > m i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n >000x g / 10 m i n P E L L E T ( C E L L WALLS) 0.5M p o t a s s i u m p h o s p h a t e w a s h ( 2 x ) d i s t i l l e d w a t e r w a s h ( 4 x ) c e n t r i f u g e r F I N A L P E L L E T 1:1 c h l o r o f o r m : m e t h a n o l f i l t e r i n s i n t e r e d g l a s s f u n n e l 1;1 c h l o r o f o r m : m e t h a n o l ( 3 x ) a c e t o n e ( 3 x ) f r e e z e d r y I h y d r o l y z e i o n e x c h a n g e c o l u m n if C E L L WALL F R E E SUGARS v GAS CHROMATOGRAPHIC A N A L Y S I S F I G U R E 5. P r o c e d u r e f o r c e l l w a l l p r e p a r a t i o n 3 2 . a n d t h e s u p e r n a t a n t d i s c a r d e d . T h e p e l l e t w a s w a s h e d t w i c e w i t h 5 v o l u m e s o f 0.5M p o t a s s i u m p h o s p h a t e b u f f e r t h e n 4 t i m e s w i t h 5 v o l u m e s o f d i s t i l l e d w a t e r . T h e f i n a l p e l l e t w a s s u s p e n d e d i n 5 v o l u m e s o f 1:1 c h l o r o f o r m : m e t h a n o l a n d t r a n s f e r r e d t o a c o a r s e s i n t e r e d g l a s s f u n n e l . T h e r e s i d u e i n t h e f u n n e l w a s w a s h e d 3 t i m e s w i t h 1 0 v o l u m e s o f 1:1 c h l o r o f o r m : m e t h a n o l a n d 3 t i m e s w i t h 1 0 v o l u m e s o f a c e t o n e , t h e n f r e e z e d r i e d ( 2 9 ) . T h e c e l l w a l l m a t e r i a l w a s h y d r o l y z e d a n d a n a l y z e d b y G.C. a n d P.C. 3 3 . R E S U L T S 1. E s t a b l i s h m e n t o f c u l t u r e s T h e P R L - 4 m e d i u m w i t h c o c o n u t m i l k , c a s e i n h y d r o l y s a t e a n d 2,4-D w a s u s e d f o r t h e i n i t i a t i o n a n d s u b s e q u e n t c u l t u r e o f c a l l u s t i s s u e . C a l l u s f o r m a t i o n o c c u r e d w i t h i n 3 - 4 w e e k s i n t h e d a r k , a p p e a r i n g o n t h e e n d s o f t h e c o f f e e s t e m a n d p e r i c a r p s e g m e n t s . No c a l l u s f o r m a t i o n w a s s e e n o n t h e l e a f o r e n d o s p e r m e x p l a n t s . I n i t i a l c a l l u s g r o w t h w a s r a t h e r s l o w a n d t h e t i s s u e w a s g r a n u l a r , b e c o m i n g s o f t a n d f r i a b l e w i t h a g e . M o r e r a p i d c a l l u s g r o w t h o c c u r r e d o n s u b c u l t u r e . C a l l u s e s w e r e a l s o t r a n s f e r r e d t o B-5 a n d a m o d i f i e d F o x m e d i u m . No c a l l u s g r o w t h w a s s e e n o n t h e B-5 m e d i u m , w h i c h l a c k e d c o c o n u t m i l k a n d c a s e i n h y d r o l y s a t e . C a l l u s g r o w t h o n t h e m o d i f i e d F o x m e d i u m , w h i c h c o n t a i n s k i n e t i n a n d i n d o l e a c e t i c a c i d ( I A A ) w a s s l o w ; c a l l u s e s d i f f e r e n t i a t e d i n t o r o o t s , s t e m s a n d l e a v e s o n t h i s m e d i u m . S i n g l e c e l l s u s p e n s i o n c u l t u r e s w e r e s t a r t e d b y t r a n s f e r r i n g p i e c e s o f f r i a b l e c a l l u s g r o w n o n s o l i d P R L - 4 m e d i u m i n t o a l i q u i d f o r m o f t h e same m e d i u m . I n i t i a l g r o w t h w a s s l o w a n d w a s i n t h e f o r m o f c e l l a g g r e g a t e s r a t h e r t h a n a s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n . T h e p e r c e n t o f s i n g l e c e l l s i n c r e a s e d w i t h e a c h t r a n s f e r t o f r e s h l i q u i d m e d i u m . A n e x c e l l e n t s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n , s u i t a b l e f o r p i p e t t i n g i n m e a s u r e d a l i q u o t s t o f r e s h m e d i u m , w a s e s t a b l i s h e d a f t e r 2 m o n t h s . C o n t r a r y t o p r e v i o u s r e p o r t s ( 1 5 ) s u s p e n s i o n c u l t u r e s t r a n s f e r r e d f r o m t h e P R L - 4 m e d i u m t o B-5 m e d i u m d i d n o t g r o w . S u s p e n s i o n c u l t u r e s t r a n s f e r r e d t o t h e m o d i f i e d F o x m e d i u m g r e w f o r 2 w e e k s , a n d o n t h e t h i r d 3 4 . s u b c u l t u r e r e m a i n e d i n a q u i e s c e n t s t a t e . A d d i t i o n o f 2 mg/L o f 2,4-D t o t h e m o d i f i e d F o x m e d i u m i n d u c e d n o r m a l c e l l g r o w t h . T h e . m o d i f i e d F o x m e d i u m w i t h 2,4-D w a s d e s i g n a t e d a s t h e F o x - 3 H m e d i u m a n d w a s u s e d w i t h m o d i f i c a t i o n s f o r f u r t h e r s t u d i e s b e c a u s e i t i s a c h e m i c a l l y d e f i n e d m e d i u m , u n l i k e P R L - 4 . T h e c e l l s w e r e c a r r i e d t h r o u g h a t l e a s t 3 s u c c e s s i v e p a s s a g e s i n t h e e x p e r i m e n t a l m e d i u m , a n d a n a l y s e s c o n d u c t e d a t t h e e n d o f t h e f i n a l p a s s a g e . 2. I n v i t r o e x p e r i m e n t s i ) P R L - 4 m e d i u m C o f f e e c e l l s w e r e g r o w n i n t h i s u n d e f i n e d m e d i u m , c o n t a i n i n g 1 0 % b y v o l u m e c o c o n u t m i l k , c a s e i n h y d r o l y s a t e , a n d 2,4-D f o r a p e r i o d o f 1 y e a r . . T h e g r o w t h c u r v e a n d p a r a m e t e r s o f p H a n d c o n d u c t i v i t y h a v e b e e n p r e v i o u s l y e s t a b l i s h e d ( 5 8 ) . F i g u r e 6 a n d T a b l e I I I r e c o r d t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n t h e p r o d u c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e a n d g r o w t h p a r a m e t e r s o f t h e s u s p e n s i o n c u l t u r e g r o w n i n t h e d a r k . T h e c e l l s h a d a d o u b l i n g t i m e o f a p p r o x i m a t e l y 2 d a y s . D u r i n g t h e l o g a r i t h m i c p h a s e o f g r o w t h ( d a y s 4-8) t h e p r o d u c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e p a r a l l e l e d t h e g r o w t h o f c e l l s . M a x i m u m y i e l d s i n d r y w e i g h t o f c e l l s a n d e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e o c c u r r e d a t d a y 8. A f t e r d a y 8, t h e s e g r o w t h p a r a m e t e r s d e c r e a s e d t o d a y 1 4 . C h r o m a t o g r a p h i c p o s i t i o n a n d c o l o r r e a c t i o n s s h o w e d t h e h y d r o l y s a t e s o f t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e t o c o n t a i n g a l a c t u r o n i c a c i d , g a l a c t o s e , g l u c o s e , m a n n o s e , x y l o s e , a n d a r a b i n o s e . T h e s e s a me s u g a r s w e r e p r e s e n t i n h y d r o l y s a t e s o f t h e E P S o b t a i n e d a t a l l t i m e s i n t h e g r o w t h c u r v e f r o m l i g h t a n d d a r k g r o w n c u l t u r e s . 6 8 T i m e ( d a y s ) 10 12 14 F I G U R E 6. C o m p a r i s o n o f c e l l d r y w e i g h t a n d t h e p o l y s a c c h a r i d e r e l e a s e d i n t o P R L - 4 m e d i u m o v e r a 14 d a y c u l t u r e p e r i o d . A = c e l l d r y w e i g h t • = p o l y s a c c h a r i d e w e i g h t 36. TABLE I I I . Production of e x t r a c e l l u l a r polysaccharide and c e l l dry weight of a dark grown PRL-4 suspension c u l t u r e . SAMPLING TIME CELL DRY WEIGHT POLYSACCHARIDE PRODUCTION (days) (gm/100 ml) (mg/100 ml 0 0.16 5.0 2 0.40 16.0 4 0.80 40.0 6 1.20 85.0 8 1.58 131.0 10 1.37 128.0 12 1.10 115.0 14 1.06 110.0 T h e c o m p o s i t i o n o f t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s f r o m l i g h t a n d d a r k g r o w n c u l t u r e s a n d o f t h e h o t w a t e r e x t r a c t e d c e l l u l a r p o l y -s a c c h a r i d e f r o m t h e d a r k c u l t u r e w a s d e t e r m i n e d b y G.C. ( T a b l e I V ) . A t y p i c a l c h r o m a t o g r a m o f t h e m o n o s a c c h a r i d e s p r e s e n t i n t h e d a r k g r o w n P R L - 4 e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e h y d r o l y s a t e i s s h o w n i n F i g u r e 7. D u e t o t h e m u l t i p l i c i t y o f p e a k s ( a l p h a , b e t a , a n d gamma f o r m s ) f o r some s u g a r s , p o s i t i v e i d e n t i f i c a t i o n o f t a u t o m e r s w a s c o m p l e t e d b y G.C. o f t h e i n d i v i d u a l s u g a r s e l u t e d f r o m p r e p a r a t i v e p a p e r c h r o m a t o g r a m s . T h e w e i g h t % c o m p o s i t i o n o f x y l o s e , m a n n o s e , g a l a c t o s e , a n d g a l a c t u r o n i c a c i d a r e a p p r o x i m a t e l y t h e same i n l i g h t a n d d a r k e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s . G l u c o s e i s p r e s e n t a t a l e v e l o f 1 9 . 9 % i n t h e d a r k , a n d i n c r e a s e s t o a b o u t 3 1 . 4 5 % i n t h e l i g h t . A r a b i n o s e , o n t h e o t h e r h a n d , d e c r e a s e s f r o m 4 1 . 6 6 % t o 2 7 . 3 9 % i n t h e p r e s e n c e o f l i g h t . T h e m o l a r r a t i o s o f t h e m o n o s a c c h a r i d e s p r e s e n t i n t h e d a r k a n d l i g h t e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e a r e i n d i c a t e d i n T a b l e I V . T h e c o m p o s i t i o n o f t h e h o t w a t e r e x t r a c t e d p o l y s a c c h a r i d e f r o m t h e c u l t u r e d c e l l s i s a l s o s u m m a r i z e d i n T a b l e I V . O n l y d a r k g r o w n c e l l s w e r e a n a l y z e d . A r a b i n o s e , g a l a c t o s e a n d g l u c o s e w e r e p r e s e n t i n a m o l a r r a t i o o f 1 . 8 : 1 . 0 : 3 . 1 . T r a c e s o f x y l o s e , m a n n o s e , a n d g a l a c t u r o n i c a c i d w e r e p r e s e n t . T h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n c e l l s u g a r s a n d c u l t u r e a g e o f d a r k g r o w n P R L - 4 c o f f e e c e l l s i s s h o w n i n F i g u r e 8. T h e t o t a l s u g a r s p r e s e n t i n t h e c e l l d e c r e a s e d w i t h c u l t u r e a g e . A t d a y 6-8 i n t h e l o g a r i t h m i c p h a s e o f g r o w t h , t h e s u g a r s made up 1 5 - 2 0 % o f t h e c e l l w e i g h t . A s t h e c e l l s a g e d , t h e a m o u n t o f s u g a r s d e c r e a s e d t o a p p r o x i m a t e l y 9% o f t h e T A B L E I V . R e l a t i v e c o m p o s i t i o n o f e x t r a c e l l u l a r a n d h o t w a t e r - e x t r a c t e d P R L - 4 c e l l p o l y s a c c h a r i d e s . P E A K #* R E T E N T I O N T I M E ( m i n ) COMPONENT E X T R A C E L L U L A R POLYSACCHARIDE w e i g h t % c o m p o s i t i o n * * ( r a t i o ) L I G H T DARK HOT WATER-EXTRACTED WALL P O L Y S A C C H A R I D E ( d a r k o n l y ) 1 12 .4 a-arabinose 2 13 .8 3 - a r a b i n o s e 2 7 .39 ( 5 . 2 4 ) 4 1 .66 ( 9 . 0 4 ) 3 0 .57 ( 1 . 8 2 ) 3 15 .6 Y - a r a b i n o s e 4 17, .9 c - x y l o s e 5 2 1 , .6 3 - x y l o s e 5. .23 ( 1 . 0 0 ) 4, ,61 ( 1 . 0 0 ) t r a c e 6 2 5 . .4 a + 8 - m a n n o s e 2. .35 ( 0 . 4 5 ) 2. .55 ( 0 . 5 5 ) t r a c e 7 2 8 . ,2 a - g a l a c t o s e 9 3 0 . .8 g - g a l a c t o s e 3 0 . .03 ( 5 . 7 4 ) 2 7 . ,36 ( 5 . 9 5 ) 16. .78 ( 1 . 0 0 ) 8 2 9 . .8 a - g l u c o s e 11 3 4 . .8 g - g l u c o s e 3 1 . 45 ( 6 . 0 1 ) 1 9 . 96 ( 4 . 3 3 ) 5 2 . 65 ( 3 . 1 4 ) 10 3 3 . 4 a - g a l a c t u r o n i c a c i d 3. 55 ( 0 . 6 8 ) 3. 86 ( 0 . 8 4 ) t r a c e * s e e F i g u r e 7. ** w e i g h t % c o m p o s i t i o n c a l c u l a t e d a r e a ( f r o m c h r o m a t o g r a m ) x c o r r e c t i o n f a c t o r = c o r r e c t e d a r e a t o t a l c o r r e c t e d a r e a s f o r a l l s u g a r s = w e i g h t % c o m p o s i t i o n oo 35 3 0 2 5 2 0 15 10 5 0 T i m e ( m i n ) F I G U R E 7. C h r o m a t o g r a m o f m o n o s a c c h a r i d e s p r e s e n t i n d a r k g r o w n P R L - 4 e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e h y d r o l y s a t e . 4 0 . 9 0 J 6 " 8 10 12 14 T i m e ( d a y s ) F I G U R E 8 0 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n c e l l s u g a r s a n d c u l t u r e a g e o f d a r k g r o w n PRL-4JE. c e l l s . 0 = f r u c t o s e • = g l u c o s e A= i n o s i t o l 0 = s u c r o s e 4 1 . w e i g h t . T h e i n d i v i d u a l s u g a r s p r e s e n t i n t h e c e l l s w e r e f r u c t o s e , g l u c o s e , i n o s i t o l , a n d s u c r o s e . T h e w e i g h t % c o m p o s i t i o n o f t h e s e s u g a r s i s l i s t e d i n T a b l e V. F r u c t o s e a c c u m u l a t e d i n t h e c e l l s w i t h c u l t u r e a g e , w h i l e , g l u c o s e d e c r e a s e d . I n o s i t o l r e m a i n e d r e l a t i v e l y u n c h a n g e d u n t i l d a y 14 w h e n i t i n c r e a s e d s l i g h t l y . S u c r o s e d e c r e a s e d f r o m a l e v e l o f 2 6 % a t d a y 6, a n d i s c o m p l e t e l y a b s e n t b y t h e e n d o f t h e g r o w t h p e r i o d . 4 2 . T A B L E V. S u g a r s o f P R L - 4 d a r k g r o w n c o f f e e c e l l s . DAY F r u c t o s e G l u c o s e I n o s i t o l S u c r o s e T o t a l S u g a r ( w e i g h t % c o m p o s i t i o n ) ( m g / 1 0 0 mg c e l l s ) 6 3 9 . 9 6 3 1 . 1 2 2 . 5 1 2 6 . 4 1 19. .92 8 5 3 , 0 6 2 5 . 4 9 3.81 1 7 . 6 9 1 5 , ,21 10 6 4 . 8 8 2 1 . 5 9 4.70 8.84 9. ,88 14 8 0 . 6 9 9.31 1 0 . 0 0 0.00 8. .94 4 3 . i i ) F o x - 3 H m e d i u m T h e F o x - 3 H m e d i u m i s a c h e m i c a l l y d e f i n e d m e d i u m . T h e g r o w t h c u r v e s h o w i n g t h e c h a n g e i n c e l l d r y w e i g h t a n d e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n o v e r a 1 4 - d a y c u l t u r e p e r i o d i s s h o w n i n F i g u r e 9. G r o w t h w a s m o s t r a p i d f r o m 2-8 d a y s , w i t h a d o u b l i n g t i m e o f 2-3 d a y s , t h e n d e c r e a s e d t o 1 4 d a y s . D u r i n g t h e l o g a r i t h m i c p h a s e o f g r o w t h p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n p a r a l l e l e d t h e g r o w t h o f c e l l s . A maximum y i e l d o f p o l y -s a c c h a r i d e s a n d c e l l s w a s a t t a i n e d a t d a y 8 ( T a b l e V I ) . T h e c o m p o s i t i o n o f t h e l i g h t a n d d a r k e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s a n d t h e h o t w a t e r e x t r a c t e d c e l l p o l y s a c c h a r i d e w a s d e t e r m i n e d b y p a p e r c h r o m a t o g r a p h y a n d g a s c h r o m a t o g r a p h y o f t h e a c i d h y d r o l y s a t e s . P a p e r c h r o m a t o g r a p h y i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f t h e same s u g a r s i n t h e 3 s a m p l e s . J u d g i n g b y t h e s i z e o f t h e s p o t s a n d c o l o r i n t e n s i t y , t h e r e l a t i v e a m o u n t s o f t h e 6 s u g a r s w e r e n o t t h e same i n t h e h y d r o l y s a t e s o f t h e p o l y s a c c h a r i d e s f r o m t h e 3 d i f f e r e n t s a m p l e s . T h e r e l a t i v e c o m p o s i t i o n ( a s d e t e r m i n e d b y G.C. a n a l y s i s ) o f t h e 3 p o l y s a c c h a r i d e s i s r e c o r d e d i n T a b l e V I I . X y l o s e , m a n n o s e , a n d g l u c o s e w e r e p r e s e n t i n s i m i l a r q u a n t i t i e s i n t h e l i g h t a n d d a r k e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s . A r a b i n o s e c o n t e n t i n c r e a s e d f r o m 1 7 . 0 9 % i n t h e d a r k c u l t u r e s t o 3 0 . 3 0 % i n t h e l i g h t c u l t u r e s . G a l a c t o s e c o n t e n t d e c r e a s e d i n t h e p r e s e n c e o f l i g h t . G a l a c t u r o n i c a c i d a m o u n t e d t o 2 . 3 7 % i n t h e d a r k a n d o n l y a t r a c e o c c u r r e d i n t h e l i g h t . T h e c e l l h o t w a t e r - e x t r a c t e d p o l y s a c c h a r i d e w a s c h a r a c t e r i z e d b y a l a r g e a m o u n t o f g l u c o s e ( 4 6 % ) . A r a b i n o s e a n d g a l a c t o s e w e r e p r e s e n t a t t h e l e v e l s o f 2 0 . 3 % a n d 2 4 . 7 % r e s p e c t i v e l y , w h i l e x y l o s e a n d m a n n o s e 4 4 . F I G U R E 9. C o m p a r i s o n o f c e l l d r y w e i g h t a n d t h e p o l y s a c c h a r i d e r e l e a s e d i n t o F o x - 3 H m e d i u m o v e r a 14 d a y c u l t u r e p e r i o d . A= c e l l d r y w e i g h t D= p o l y s a c c h a r i d e w e i g h t 4 5 . T A B L E V I . P r o d u c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e a n d c e l l d r y w e i g h t o f a d a r k g r o w n F o x - 3 H s u s p e n s i o n c u l t u r e . S A M P L I N G T I M E C E L L DRY WEIGHT P O L Y S A C C H A R I D E PRODUCTION ( d a y s ) ( g m / 1 0 0 m l ) ( m g / 1 0 0 m l ) 0 0.11 6.0 2 0.42 1 4 . 0 4 0.83 3 4 . 0 6 1.19 7 2 . 0 8 1.50 1 4 2 . 0 10 1.13 1 3 1 . 0 12 1.37 1 2 1 . 0 14 . 1.39 1 1 9 . 0 4 6 . T A B L E V I I . R e l a t i v e c o m p o s i t i o n s o f e x t r a c e l l u l a r a n d h o t w a t e r -e x t r a c t e d F o x - 3 H c e l l p o l y s a c c h a r i d e s ( e x p r e s s e d a s w e i g h t % c o m p o s i t i o n a n d ( m o l a r r a t i o ) ) . COMPONENT E X T R A C E L L U L A R P O L Y S A C C H A R I D E HOT WATER-EXTRACTED WALL DARK L I G H T P O L Y S A C C H A R I D E ( d a r k ) A r a b i n o s e 1 7 . 0 9 ( 4 . 9 8 ) 3 0 . ,30 ( 9 . 0 7 ) 2 0 . 3 1 ( 7 . 9 0 ) X y l o s e 3 . 43 ( 1 . 0 0 ) 3. .34 ( 1 . 0 0 ) 2 . 5 7 ( 1 . 0 0 ) M a n n o s e 7.36 ( 2 . 1 5 ) 6. .10 ( 1 . 8 3 ) 6.49 ( 2 . 5 3 ) G a l a c t o s e 4 2 . 8 1 ( 1 2 . 4 8 ) 2 9 . .86 ( 8 . 9 4 ) 2 4 . 7 4 ( 9 . 3 6 ) G l u c o s e 2 9 . 3 1 ( 8 . 5 5 ) 3 0 . ,40 ( 9 . 1 0 ) 4 5 . 8 9 ( 1 7 . 8 6 ) G a l a c t u r o n i c a c i d 2 . 3 7 ( 0 . 6 9 ) t r a c e t r a c e 47. w e r e m i n o r c o n s t i t u e n t s o f t h i s c e l l p o l y s a c c h a r i d e . T r a c e s o f g a l a c t u r o n i c a c i d w e r e f o u n d . T h e a n a l y s i s o f t h e c e l l s u g a r s i s s h o w n i n F i g u r e 1 0 a n d T a b l e V I I I . T h e l e v e l o f t h e s u g a r s i n t h e c e l l s w a s r a t h e r e r r a t i c ; f r u c t o s e a n d s u c r o s e f i r s t d e c r e a s e d a n d t h e n i n c r e a s e d w i t h c u l t u r e a g e . T h e i n o s i t o l i n c r e a s e d w i t h a g e , w h i l e g l u c o s e i n i t i a l l y i n c r e a s e d a n d t h e n d e c r e a s e d . T h e t o t a l a m o u n t o f s u g a r s p r e s e n t i n t h e c e l l s d e c r e a s e d w i t h c u l t u r e a g e . 4 8 . 1 0 0 9 0 8 0 70 c o T i m e ( d a y s ) F I G U R E 1 0 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n c e l l s u g a r s a n d c u l t u r e a g e o f d a r k g r o w n F o x - 3 H c e l l s . 0= f r u c t o s e • = g l u c o s e A= i n o s i t o l 0= s u c r o s e 4 9 . T A B L E V I I I . S u g a r s o f F o x - 3 H d a r k g r o w n c o f f e e c e l l s . DAY F r u c t o s e G l u c o s e I n o s i t o l S u c r o s e T o t a l S u g a r w e i g h t % c o m p o s i t i o n ( m g / 1 0 0 mg c e l l s ) 6 6 2 . 7 2 5 . 8 0 3.23 2 8 . 2 6 2 4 . 4 9 8 6 1 . 4 6 1 8 . 1 3 5.08 1 5 . 3 2 1 6 . 7 1 10 4 1 . 5 6 '14.07 1 0 . 8 7 3 3 . 5 0 7.82 12 4 2 . 6 8 8.11 1 1 . 6 4 3 7 . 5 7 5.67 14 4 6 . 7 6 7.52 1 1 . 0 7 3 4 . 6 6 4.79 5 0 . i i i ) F o x - l H m e d i u m C e l l s w e r e g r o w n i n F o x - l H m e d i u m w i t h 2,4-D a s t h e o n l y g r o w t h h o r m o n e . F i g u r e 1 1 a n d T a b l e I X s h o w t h e i n c r e a s e i n c e l l d r y w e i g h t a n d e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n w i t h c u l t u r e a g e . P o l y -s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n p a r a l l e l e d c e l l g r o w t h a n d b o t h r o s e t o a m aximum a t 8 d a y s a n d d e c r e a s e d t h e r e a f t e r . T h e c e l l s h a d a d o u b l i n g t i m e o f 2 d a y s ; t h e l o g a r i t h m i c p h a s e o f g r o w t h o c c u r r e d b e t w e e n d a y s 4 a n d 8. T h e m a x i m u m y i e l d o f p o l y s a c c h a r i d e w a s 1 3 5 m g / 1 0 0 m l ( d a y 8 ) . T h e a n a l y s i s o f l i g h t a n d d a r k e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e h y d r o -l y s a t e s b y G.C. i n d i c a t e d t h a t t h e t w o p o l y s a c c h a r i d e s w e r e s i m i l a r i n w e i g h t p e r c e n t c o m p o s i t i o n o f t h e i n d i v i d u a l m o n o s a c c h a r i d e s . M a n n o s e a n d g a l a c t o s e w e r e f o u n d i n s l i g h t l y h i g h e r c o n c e n t r a t i o n i n t h e d a r k p o l y s a c c h a r i d e s , w h i l e x y l o s e a n d g l u c o s e w e r e h i g h e r i n t h e l i g h t p o l y s a c c h a r i d e s . A r a b i n o s e a n d g a l a c t u r o n i c a c i d w e r e f o u n d i n s i m i l a r c o n c e n t r a t i o n s i n b o t h m e d i a ( T a b l e X ) . T h e c e l l s u g a r s w e r e c h a r a c t e r i z e d b y a p r e d o m i n a n c e o f s u c r o s e , w h i c h w a s f o u n d t o b e p r e s e n t o n a l l d a y s o f g r o w t h . F r u c t o s e a n d g l u c o s e i n c r e a s e d i n c o n c e n t r a t i o n u n t i l d a y 1 0 a n d t h e n d e c r e a s e d . I n o s i t o l r e m a i n e d a t a l o w l e v e l a n d . w a s f o u n d t o i n c r e a s e f r o m d a y 1 0 o n w a r d . T h e t o t a l s u g a r s r e p r e s e n t e d a p p r o x i m a t e l y 2 4 % o f t h e c e l l d r y w e i g h t a t d a y 6 a n d d e c r e a s e d w i t h c u l t u r e a g e t o 4% a t d a y 1 4 . ( T a b l e X I a n d F i g u r e 1 2 ) . 5 1 . 1 3 I S To I2 is: T i m e ( d a y s ) F I G U R E 1 1 . C o m p a r i s o n o f c e l l d r y w e i g h t a n d p o l y s a c c h a r i d e r e l e a s e d i n t o F o x - l H m e d i u m o v e r a 14 d a y c u l t u r e p e r i o d . A= c e l l d r y w e i g h t • = p o l y s a c c h a r i d e w e i g h t 5 2 . T A B L E I X . P r o d u c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e a n d c e l l d r y w e i g h t o f a d a r k g r o w n F o x - l H s u s p e n s i o n c u l t u r e . S A M P L I N G T I M E C E L L DRY WEIGHT P O L Y S A C C H A R I D E PRODUCTION ( d a y s ) (gm/100 m l ) (mg/100 m l ) 0 0.09 3.0 2 0.35 2 0 . 0 4 0.63 4 4 . 0 6 1.12 6 6 . 0 8 1.60 1 3 5 . 0 10 1.38 1 3 0 . 0 12 1.43 1 2 5 . 0 14 1.17 1 0 7 . 0 5 3 . T A B L E X. R e l a t i v e c o m p o s i t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s f r o m l i g h t a n d d a r k | g r o w n F o x -•I H c u l t u r e s . COMPONENT DARK L I G H T w e i g h t % comp r a t i o w e i g h t % comp. r a t i o A r a b i n o s e 2 4 . 8 8 1 0 . 5 0 2 4 . 4 6 5.98 X y l o s e 2 . 3 7 1.00 4.09 1.00 M a n n o s e 6.79 2 . 8 7 5.82 1.42 G a l a c t o s e 3 1 . 6 0 1 3 . 3 3 2 9 . 1 9 7.14 G l u c o s e 3 4 . 3 7 1 4 . 5 0 3 6 . 4 5 8.91 G a l a c t u r o n i c t r a c e t r a c e t r a c e t r a c e a c i d 5 4 . T A B L E X I . S u g a r s o f F o x - l H d a r k g r o w n c o f f e e c e l l s . DAY F r u c t o s e G l u c o s e I n o s i t o l S u c r o s e T o t a l S u g a r w e i g h t % c o m p o s i t i o n (mg/100 mg c e l l s ) 6 3 5 . 4 9 7.30 2.45 5 4 . 4 9 2 4 . 2 6 8 4 3 . 0 1 1 4 . 0 2 2.72 6 6 . 5 7 1 7 . 9 6 10 5 3 . 0 6 1 7 . 9 3 4.26 5 6 . 7 5 9.87 12 3 3 . 1 5 1 2 . 5 3 1 0 . 0 2 4 7 . 7 2 5.49 14 2 9 . 6 4 9.11 1 5 . 4 2 4 2 . 4 1 4.15 5 5 . 1 0 0 9 0 8 0 c o •i - l •U • H to o ex. E o O CO o s-1 P-I 43 60 • r - l £ U cd 60 3 CO 70 6 0 5 0 4 0 3 0 2 0 10 8 1 0 T i m e ( d a y s ) 12 14 F I G U R E 1 2 . R e l a t i o n s h i p b e t w e e n c e l l s u g a r s a n d c u l t u r e a g e o f d a r k g r o w n F o x - l H c e l l s . 0 = f r u c t o s e • = g l u c o s e A= i n o s i t o l 0= s u c r o s e 5 6 . i v ) F o x - 3 H h i g h k i n e t i n C e l l s w e r e g r o w n i n t h e p r e s e n c e o f a n a b n o r m a l l y h i g h c o n c e n t r a t i o n o f k i n e t i n ( 2 . 5 m g / L ) . C e l l d r y w e i g h t a n d e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n w e r e m e a s u r e d a t d a y 6 a n d d a y 1 3 . H i g h k i n e t i n c e l l s u g a r s a n d s p e n t m e d i u m s u g a r s w e r e a l s o e x a m i n e d a t t h e s e t i m e s ( T a b l e X I I ) . T h e y i e l d o f c e l l s a n d p o l y s a c c h a r i d e w a s l o w , i n d i c a t i n g a s l o w g r o w t h r a t e . No s u c r o s e w a s f o u n d i n t h e c e l l s f r o m t h e s e t w o s a m p l e s . F r u c t o s e a n d g l u c o s e w e r e t h e o n l y c e l l s u g a r s p r e s e n t a t d a y 6, w i t h f r u c t o s e c o n s t i t u t i n g 7 5 % o f t h e t o t a l . A t d a y 1 3 , o n l y f r u c t o s e w a s f o u n d . X y l o s e , g l u c o s e , f r u c t o s e a n d s u c r o s e w e r e p r e s e n t i n t h e s p e n t m e d i u m o f d a y 6 c u l t u r e s . F r u c t o s e w a s f o u n d a t a l e v e l o f 4 6 . 5 % , g l u c o s e a t 3 1 . 4 % , x y l o s e a t 2 0 % a n d s u c r o s e a t 2 . 3 % . No s u c r o s e w a s f o u n d i n t h e d a y 1 3 s p e n t m e d i u m . F r u c t o s e i n c r e a s e d i n c o n c e n t r a t i o n t o 8 0 . 6 % w h i l e x y l o s e a n d g l u c o s e d e c r e a s e d w i t h c u l t u r e a g e . T h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e f r o m t h e h i g h k i n e t i n m e d i u m d i f f e r e d p h y s i c a l l y f r o m t h e o t h e r p o l y s a c c h a r i d e s , b e i n g d e n s e r w h e n p r e c i p i t a t e d a n d " m o r e g r a n u l a r i n a p p e a r a n c e . T h e r e l a t i v e c o m p o s i t i o n o f t h e E P S i s r e c o r d e d i n T a b l e X I I I . A r a b i n o s e , g a l a c t o s e , a n d g l u c o s e w e r e t h e m a j o r c o n s t i t u e n t s , w i t h x y l o s e , m a n n o s e a n d g a l a c t u r o n i c a c i d p r e s e n t i n l e s s e r q u a n t i t i e s . 5 7 . T A B L E X I I . G r o w t h p a r a m e t e r s o f h i g h k i n e t i n F o x - 3 H c u l t u r e s . DAY C E L L DRY E P S * C E L L SUGARS SPENT MEDIUM SUGARS WEIGHT F r u c t o s e G l u c o s e X y l o s e F r u c t o s e G l u c o s e S u c r o s e gm/100 m l w e i g h t % c o m p o s i t i o n 6 0.63 3 7 . 0 7 5 . 2 3 2 4 . 2 7 1 9 . 7 1 4 6 . 5 0 3 1 . 2 4 2.36 13 1.21 7 5 . 0 1 0 0 . 0 0 0.00 1 1 . 4 1 8 0 . 6 2 7.97 0.00 * EPS= e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e ( m g / 1 0 0 m l ) 5 8 . T A B L E X I I I . R e l a t i v e c o m p o s i t i o n o f t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e f r o m d a r k g r o w n F o x - 3 H h i g h k i n e t i n c u l t u r e s . COMPONENT A r a b i n o s e X y l o s e M a n n o s e G a l a c t o s e G l u c o s e G a l a c t u r o n i c a c i d WEIGHT % C O M P O S I T I O N 3 2 . 9 6 3.32 5.86 2 6 . 1 2 3 1 . 7 4 t r a c e MOLAR R A T I O 9.93 1.00 1.77 7.87 9.56 t r a c e 5 9 . v) Fox medium, no nitrogen (4- 2,4-D) Two sets of cultures were grown i n Fox medium i n the absence of nitrogen, one containing the growth regulator 2,4-D and one i n which i t was absent from the medium. Analysis of the e x t r a c e l l u l a r polysaccharide, c e l l sugars and spent medium sugars was c a r r i e d out at day 9 only. Sucrose, glucose and fructose were present i n s i m i l a r quantities i n the c e l l sugars of these two media (Table XIV). The presence of i n o s i t o l was seen only i n the medium lacking 2,4-D; i t was a minor constituent, present at a l e v e l of 1.337„. Analysis of the spent medium sugars indicated that only fructose and glucose were present. A greater quantity of glucose was found i n the medium with.*2,4-D and a higher quantity of fructose was found i n the medium lacking 2,4-D (Table XIV). The r e l a t i v e compositions of the two e x t r a c e l l u l a r polysaccharides i s shown i n Table XV. Arabinose, xylose, mannose and galacturonic acid were found i n s l i g h t l y higher concentrations i n the medium lacking 2,4-D. Galactose and glucose increased s l i g h t l y i n the presence of 2,4-D, however the two polysaccharides were remarkably s i m i l a r i n composition. 6 0 . T A B L E X I V . C e l l s u g a r s a n d s p e n t m e d i u m s u g a r s o f d a y 9 F o x n o n i t r o g e n ( + 2 , 4 - D ) c u l t u r e s . 2,4-D C E L L SUGARS ( w t . % c o m p o s i t i o n ) S u c r o s e G l u c o s e F r u c t o s e I n o s i t o l (-) 2 4 . 1 3 3 7 . 1 2 3 6 . 6 3 1.33 (+) 2 2 . 2 9 3 7 . 3 1 4 0 . 4 0 0.00 SPENT MEDIUM SUGARS ( w t . % c o m p o s i t i o n ) F r u c t o s e G l u c o s e 5 5 . 5 6 4 8 . 7 8 4 4 . 4 4 5 1 . 2 2 6 1 . T A B L E X V . R e l a t i v e c o m p o s i t i o n s o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s f r o m F o x n o n i t r o g e n m e d i a . COMPONENT A r a b i n o s e X y l o s e M a n n o s e G a l a c t o s e G l u c o s e G a l a c t u r o n i c a c i d - 2 , 4 - D w e i g h t % comp. r a t i o 7.24 1.85 1.78 1 3 . 7 5 7 3 . 3 0 1.08 1.00 t r a c e t r a c e 1.90 1 0 . 1 2 t r a c e +2,4-D w e i g h t % comp. r a t i o 6.35 1.00 0.95 t r a c e 1.12 t r a c e 1 4 . 5 0 2 . 2 8 7 7 . 0 8 1 2 . 1 4 t r a c e t r a c e 6 2 . 3. C o f f e e c e l l e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n a t i o n A n a l y s i s o f t h e m i x e d p o l y s a c c h a r i d e f r o m F o x - 3 H m e d i u m b y P.C. ( F i g u r e 1 3 ) a n d G.C. ( T a b l e X V I ) s h o w e d t h e p r e s e n c e o f x y l o s e , a r a b i n o s e , m a n n o s e , g l u c o s e , g a l a c t o s e , a n d t r a c e s o f g a l a c t u r o n i c a c i d . T h e s e s u g a r s w e r e p r e s e n t i n a m o l a r r a t i o o f l : 5 : 2.2 : 8.6 : 1 2 . 5 : 0. T h i s m i x e d p o l y s a c c h a r i d e w a s s e p a r a t e d i n t o n e u t r a l ( 3 . 5 0 gm) a n d a c i d i c ( 0 . 2 2 gm) p o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n s . H y d r o l y s i s o f t h e a c i d i c f r a c t i o n y i e l d e d 3.2 p a r t s g a l a c t u r o n i c a c i d , 9 p a r t s g a l a c t o s e , 1 p a r t m a n n o s e , a n d 3.9 p a r t s a r a b i n o s e . T h e n e u t r a l p o l y s a c c h a r i d e w a s f r a c t i o n a t e d o n a c e l l u l o s e c o l u m n i n t o a w a t e r - s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e ( 3 . 1 5 g m ) , a u r e a s o l u b l e f r a c t i o n ( 0 . 0 8 gm) a n d a s o d i u m h y d r o x i d e s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e ( 0 . 0 7 gm). H y d r o l y s i s o f t h e w a t e r - s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e y i e l d e d a n a r a b i n o -g a l a c t o m a n n a n i n a r a t i o o f 1.0 t o 2 . 2 5 , w i t h j u s t a t r a c e o f m a n n o s e . P a p e r c h r o m a t o g r a p h y o f t h e h y d r o l y s a t e i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f a r a b i n o s e a n d g a l a c t o s e ( s t r o n g s p o t s ) a n d a s m a l l a m o u n t o f m a n n o s e ( w e a k s p o t ) . T h e u r e a a n d s o d i u m h y d r o x i d e f r a c t i o n s w e r e s h o w n t o b e c h e m i c a l l y i n d i s t i n g u i s h a b l e a n d w e r e made u p o f a x y l o g a l a c t o g l u c a n ( 1 . 0 : 1.5 : 1 . 5 ) . F I G U R E 1 3 . P a p e r c h r o m a t o g r a m o f m o n o s a c c h a r i d e s f r o m t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n s . 6 4 . T A B L E X V I . M o n o s a c c h a r i d e c o m p o n e n t s o f e x t r a c e l l u l a r p o l y -s a c c h a r i d e f r a c t i o n s . MOLAR R A T I O S COMPONENT M I X E D A C I D I C N E U T R A L ( 3 . 5 gm) ( 4 . 2 gm) ( 0 . 2 2 gm) WATER UREA NaOH S O L U B L E S O L U B L E S O L U B L E ( 3 . 1 5 gm) £0.08 gm) ( 0 . 0 7 gm) A r a b i n o s e 5.0 3, .90 1.00 0, ,00 0.00 X y l o s e 1.0 0, ,00 0.00 1, ,00 1.00 M a n n o s e 2.2 1, ,00 t r a c e 0, ,00 0.00 G a l a c t o s e 1 2 . 5 9. ,00 2.25 1, .50 1.50 G l u c o s e 8.6 0. ,00 0.00 1. .50 1.50 G a l a c t u r o n i c t r a c e 3. ,20 0.00 0, .00 0.00 a c i d 6 5 . 4. C e l l w a l l p r e p a r a t i o n C e l l w a l l m o n o s a c c h a r i d e s w e r e d e t e r m i n e d f r o m c e l l w a l l s i s o l a t e d f r o m s t a t i o n a r y p h a s e ( d a y 1 0 ) s u s p e n s i o n c u l t u r e s g r o w n i n t h e F o x - 3 H m e d i u m . M i c r o s c o p i c e x a m i n a t i o n o f t h e w a l l f r a g m e n t s f o l l o w i n g p a s s a g e t h r o u g h a F r e n c h p r e s s u r e c e l l i n d i c a t e d t h a t t h e p r e p a r a t i o n w a s f r e e f r o m w h o l e c e l l s . T h i s p r e p a r a t i o n y i e l d e d c e l l w a l l , m a t e r i a l e q u a l t o a p p r o x i m a t e l y 1 % o f t h e w e i g h t o f t h e o r i g i n a l c e l l s . P a p e r c h r o m a t o g r a p h y o f a n a c i d h y d r o l y s a t e o f t h e c e l l w a l l s r e v e a l e d s p o t s c o - c h r o m a t o g r a p h i n g w i t h a r a b i n o s e , x y l o s e , m a n n o s e , g a l a c t o s e , g l u c o s e a n d g a l a c t u r o n i c a c i d . T h e g a l a c t u r o n i c a c i d s p o t w a s v e r y f a i n t . T h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f t h e m o n o s a c c h a r i d e s p r e s e n t i n t h e h y d r o l y s a t e w e r e d e t e r m i n e d b y G.C. o f t h e TMS e t h e r s ( T a b l e X V I I ) . G l u c o s e w a s t h e m a j o r c o n s t i t u e n t , f o u n d a t a l e v e l o f 5 4 % o f t h e c e l l w a l l s u g a r s . A r a b i n o s e a n d m a n n o s e w e r e f o u n d a t 2 5 % a n d 1 4 . 6 % r e s p e c t i v e l y , w h i l e x y l o s e a n d m a n n o s e w e r e o n l y m i n o r c o n s t i t u e n t s a t 4 . 6 % a n d 1 . 8 % . G a l a c t u r o n i c a c i d c o u l d n o t b e d e t e c t e d b y G.C. 6 6 . T A B L E X V I I . M o n o s a c c h a r i d e c o m p o s i t i o n o f s t a t i o n a r y p h a s e F o x - 3 H c e l l w a l l s . COMPONENT WEIGHT % C O M P O S I T I O N MOLAR R A T I O R E L A T I V E I N T E N S I T Y OF P.C. SPOTS A r a b i n o s e 2 5 . 0 2 5.46 X y l o s e 4 .58 1.00 + M a n n o s e 1.75 0.38 + G a l a c t o s e 1 4 . 5 9 3.19 -H-G l u c o s e 5 4 . 4 1 1 1 . 8 8 M i l l G a l a c t u r o n i c — — + a c i d 6 7 . D I S C U S S I O N 1. C o f f e e c e l l c u l t u r e T h e t i s s u e - c u l t u r e t e c h n i q u e i s a u s e f u l t o o l f o r s t u d y i n g v a r i o u s f u n c t i o n s o f c e l l s o r t i s s u e s d e t a c h e d f r o m t h e p h y s i o l o g i c a l s y s t e m o f t h e i n t a c t p l a n t . P R L - 4 m e d i u m w a s u s e d t o p r o m o t e c a l l u s f o r m a t i o n a n d . i n c r e a s e d y i e l d s o f c a l l u s o n s u b c u l t u r e . C a l l u s d e v e l o p m e n t w a s i n d u c e d i n r e s p o n s e t o c h e m i c a l s t i m u l i f r o m c o c o n u t m i l k l i q u i d e n d o s p e r m , c a s e i n h y d r o l y s a t e a n d 2,4-D. C a l l u s d e v e l o p m e n t i s a l s o k n o w n t o o c c u r i n r e s p o n s e t o many s y n t h e t i c a n d n a t u r a l a u x i n s a n d c y t o k i n n i n s , a s w e l l a s t o p h y s i c a l d a m a g e o r w o u n d i n g ( 6 3 ) . C a l l u s e s t r a n s f e r r e d t o a m o d i f i e d Fox. m e d i u m w i t h i n d o l e a c e t i c a c i d . ( I A A ) a n d k i n e t i n s h o w e d r o o t , s t e m a n d l e a f o r g a n o g e n e s i s . S k o o g a n d M i l l e r ( 6 4 ) d e m o n s t r a t e d t h a t t h e m a i n e f f e c t o f k i n e t i n o n m o r p h o -g e n e s i s w a s t o i n i t i a t e a n d d e v e l o p b u d s f r o m t h e c u l t u r e d t i s s u e . T h e e f f e c t o f k i n e t i n w a s d e p e n d e n t o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f I A A i n t h e m e d i u m , w h e r e a s r o o t f o r m a t i o n w a s i n d u c e d b y I A A a n d l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o r t h e a b s e n c e o f k i n e t i n . S y c a m o r e c a l l u s t i s s u e h a s a l s o b e e n i n d u c e d t o f o r m n o d u l e s o f x y l o s e a n d p h l o e m , a n d e v e n r o o t s f r o m t h e s u r f a c e o f t h e c a l l u s f o l l o w i n g t h e a d d i t i o n o f k i n e t i n ( 6 5 ) . C e l l s u s p e n s i o n c u l t u r e s w e r e e s t a b l i s h e d i n P R L - 4 m e d i u m c o n t a i n i n g 2 mg/L 2,4-D. T h e c e l l s a p p e a r e d t o h a v e a s t r i c t r e q u i r e m e n t f o r t h i s a u x i n ; w h e n t r a n s f e r r e d t o a m o d i f i e d F o x m e d i u m l a c k i n g 2,4-D t h e c e l l s g r e w n o r m a l l y f o r o n l y t w o w e e k s , a n d o n t h e t h i r d s u b c u l t u r e r e m a i n e d i n a q u i e s c e n t s t a t e . T h e a d d i t i o n o f 2,4-D t o t h e m e d i u m i n d u c e d n o r m a l c e l l g r o w t h . A p p a r e n t l y e n o u g h r e s i d u a l 2,4-D w a s p r e s e n t i n t h e c e l l s 6 8 . o r i n t h e m e d i u m t r a n s f e r r e d a l o n g w i t h t h e c e l l s i n t h e f i r s t t w o s u b c u l t u r e s t o s u s t a i n c e l l g r o w t h . 2. P r o d u c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e i n r e l a t i o n t o c e l l g r o w t h A s t u d y o f t h e p r o d u c t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e ( E P S ) i n c u l t u r e s o f c o f f e e c e l l s w a s c o n d u c t e d i n t h e d a r k o n P R L - 4 m e d i u m ( w i t h 2 , 4 - D ) , F o x - 3 H ( w i t h 2,4-D, k i n e t i n a n d I A A ) a n d F o x - l H m e d i u m ( w i t h 2,4-D o n l y ) . P o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n w a s s i m i l a r i n a l l t h r e e m e d i a ; a p p a r e n t l y E P S p r o d u c t i o n w a s n o t s t i m u l a t e d b y t h e p r e s e n c e o f k i n e t i n a n d I A A . D u r i n g t h e l o g a r i t h m i c p h a s e o f g r o w t h t h e p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n p a r a l l e l e d c e l l g r o w t h a n d t h e c e l l s h a d a d o u b l i n g t i m e o f 2 d a y s . M a x i m u m y i e l d s o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e o c c u r r e d a t d a y 8, a f t e r w h i c h . t h e r a t e o f p r o d u c t i o n d e c r e a s e d . P o l y s a c c h a r i d e p r o d u c e d r a n g e d f r o m . 1 3 1 - 1 4 2 mg/100 m l f o r t h e 3 m e d i a i n a 14 d a y c u l t u r e . B e c k e r elt a l _ ( 3 2 ) f o u n d t h a t t h e maximum p r o d u c t i o n o f E P S b y s y c a m o r e s u s p e n s i o n c u l t u r e s , a f t e r 4 w e e k s o n a s y n t h e t i c m e d i u m , wa s 1 8 8 mg/100 m l . C o f f e e a n d s y c a m o r e c e l l s u s p e n s i o n c u l t u r e s p r o d u c e E P S d u r i n g b o t h t h e l o g a r i t h m i c a n d s t a t i o n a r y p h a s e s o f t h e c u l t u r e c y c l e . T h e r a t e o f p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n , h o w e v e r , d e c r e a s e s a t t h e b e g i n n i n g o f t h e s t a t i o n a r y p h a s e , s o t h a t t h e y i e l d i s l a r g e l y d e t e r m i n e d b y t h e d u r a t i o n o f t h e p h a s e o f r a p i d c e l l d i v i s i o n . I n o t h e r c u l t u r e s y s t e m s , d i f f e r e n t p a r a m e t e r s a p p e a r t o g o v e r n p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n . M o o r e ( 3 8 ) f o u n d t h a t t h e r a t e o f a c c u m u l a t i o n o f a n e x t r a c e l l u l a r m a c r o m o l e c u l a r c o m p l e x i n c u l t u r e s o f s o y b e a n c e l l s w a s n o t d i r e c t l y r e l a t e d t o t h e g r o w t h o f t h e c e l l s . T h e a c c u m u l a t i o n o f 6 9 . t h e m a c r o m o l e c u l a r c o m p l e x w a s g o v e r n e d b y b o t h t h e m e d i u m v o l u m e a n d t h e s h a k i n g s p e e d . I n . y e t a n o t h e r s y s t e m , L i a u a n d B o l l ( 3 6 ) f o u n d t h a t B u s h b e a n s u s p e n s i o n c u l t u r e s p r o d u c e d v e r y h i g h y i e l d s o f p o l y s a c c h a r i d e . A f t e r o n l y 2 0 d a y s i n c u l t u r e , r o o t , h y p o c o t y l a n d c o t y l e d o n s u s p e n s i o n s p r o d u c e d 2 8 0 , 2 8 8 , a n d 2 9 6 mg/100 m l r e s p e c t i v e l y . I n t h e s e c u l t u r e s t h e r a t e o f p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n p e r c e l l a c t u a l l y i n c r e a s e d m a r k e d l y d u r i n g t h e s t a t i o n a r y p h a s e , l e a d i n g t o a m a s s i v e a c c u m u l a t i o n o f E P S i n t h e m e d i u m . 3. C o m p o s i t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e ( d a r k g r o w n c u l t u r e s ) T h e E P S s e c r e t e d b y s u s p e n s i o n c u l t u r e s o f p l a n t c e l l s a r e a s s u m e d t o b e e i t h e r c e l l w a l l d e g r a d a t i o n f r a g m e n t s o r c e l l w a l l p r e c u r s o r s ( 3 2 ) . T h e s e p o l y s a c c h a r i d e s a r e s y n t h e s i z e d f r o m s u c h c o m p o u n d s a s ? s u c r o s e a n d m y o - i n o s i t o l . T h e r e a r e v a r i o u s r o u t e s b y w h i c h t h e s e c o m p o u n d s c a n f o r m n u c l e o s i d e d i p h o s p h a t e s u g a r s w h i c h a c t a s d o n o r s u b s t a n c e s f o r t h e p o l y s a c c h a r i d e s y n t h e t a s e s . T h e e n z y m a t i c a c t i v i t i e s n e c e s s a r y f o r t h e f o r m a t i o n o f t h e d o n o r n u c l e o s i d e d i p h o s p h a t e s u g a r s a n d t h e a c t i v i t i e s o f t h e s y n t h e t a s e s may b e c o n t r o l l e d b y a u x i n a c t i o n ( 6 6 ) . I n t h e c o f f e e c e l l c u l t u r e s o f t h e p r e s e n t i n v e s t i g a t i o n a r a b i n o s e , x y l o s e , , m a n n o s e , g a l a c t o s e , g l u c o s e , a n d g a l a c t u r o n i c a c i d w e r e d e t e c t e d a s c o m p o n e n t s o f t h e E P S i s o l a t e d f r o m . a l l 6 m e d i a . T h e r e l a t i v e c o m p o s i t i o n s o f t h e s e p o l y s a c c h a r i d e s a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e X V I I I . T h e s u g a r c o m p o s i t i o n f r o m s y c a m o r e ( 3 2 ) , t o b a c c o ( 3 4 ) a n d b e a n ( 3 6 ) s u s p e n s i o n c u l t u r e s i s s i m i l a r , d i f f e r i n g o n l y i n t h e r a t i o s o f t h e s u g a r s . T A B L E X V I I I . R e l a t i v e c o m p o s i t i o n s o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s f r o m v a r i o u s d a r k g r o w n c u l t u r e s . C o m p o n e n t s e x p r e s s e d a s w e i g h t 7„ c o m p o s i t i o n a n d ( m o l a r r a t i o s ) . F o x - 3 H F p x - 3 H Fox-NO N I T R O G E N H I G H K I N E T I N -2,4-D +2,4-D MEDIUM P R L - 4 F o x - l H COMPONENT A r a b i n o s e 4 1 . 6 6 ( 9 . 0 4 ) 2 4 . 8 8 ( 1 0 . 0 5 ) 1 7 . 0 9 ( 4 . 9 8 ) 3 2 . 9 6 ( 9 . 9 3 ) 7.24 ( 3 . 9 1 ) 6.35 ( 6 . 6 8 ) X y l o s e 4.61 ( 1 . 0 0 ) 2 . 3 7 ( ( l . O O ) 3.43 ( 1 0 0 0 ) 3.32 ( 1 . 0 0 ) 1.85 ( 1 . 0 0 ) 0.95 ( 1 . 0 0 ) M a n n o s e 2.55 ( 0 . 5 5 ) 6.79 ( 2 . 8 7 ) 7.36 ( 2 . 1 5 ) 5.86 ( 1 . 7 7 ) 1.78 ( 0 . 9 6 ) 1.12 ( 1 . 1 8 ) G a l a c t o s e 2 7 . 3 6 ( 5 . 9 5 ) 3 1 . 6 0 ( 1 3 . 3 3 ) 4 2 . 8 1 ( 1 2 . 4 8 ) 2 6 . 1 2 ( 7 . 8 7 ) 1 3 . 7 5 ( 7 . 4 3 ) 1 4 . 5 0 ( 1 5 . 2 6 ) G l u c o s e 1 9 . 9 6 ( 4 . 3 3 ) 3 4 . 3 7 ( 1 4 . 5 0 ) 2 9 . 3 1 ( 8 ? 5 5 ) 3 1 . 7 4 ( 9 . 5 6 ) 7 3 . 3 0 ( 3 9 . 6 2 ) 7 7 . 0 8 ( 8 1 . 1 4 ) G a l a c t u r o n i c a c i d 3.86 ( 0 . 8 4 ) t r a c e 2.37 ( 0 . 6 9 ) t r a c e 1.08 ( 0 . 5 8 ) t r a c e o 7 1 . A l t h o u g h t h e c o m b i n a t i o n s o f h o r m o n e s u s e d h a d no e f f e c t o n t h e r a t e o f p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n t h e E P S f r o m P R L - 4 , F o x - l H a n d F o x - 3 H c u l t u r e s w e r e c o m p a r e d t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f 2,4-D, k i n e t i n , I A A a n d c o c o n u t m i l k o n t h e c o m p o s i t i o n o f t h e p o l y s a c c h a r i d e s . T h e P R L - 4 m e d i u m E P S h a d l a r g e r a m o u n t s o f a r a b i n o s e a n d g a l a c t u r o n i c a c i d , a n d l e s s e r a m o u n t s o f h e x o s e s u g a r s t h a n t h e t w o E P S f r o m t h e F o x m e d i a . T h i s may b e a t t r i b u t e d t o t h e p r e s e n c e o f c o c o n u t m i l k , w h i c h i s k n o w n t o c o n t a i n a n e u t r a l c o m p o n e n t c o n s i s t i n g o f h e x i t o l s ( m y o - i n o s i t o l , s c y l l o - i n o s i t o l a n d s o r b i t o l ) a n d a n a c t i v e c o m p o n e n t w h i c h i s r e g a r d e d a s a n a u x i n o r a u x i n p r e c u r s o r ( 6 7 ) . T h i s a d d i t i o n a l a m o u n t o f i n o s i t o l a n d t h e p r e s e n c e o f 2,4-D i n t h e m e d i u m may l e a d t o t h e a c c u m u l a t i o n o f t h e l a r g e a m o u n t s o f a r a b i n o s e a n d a c c o u n t f o r t h e l e s s e r a m o u n t s o f h e x o s e s i n t h e E P S . R u b e r y a n d N o r t h c o t e ( 6 6 ) a n d R o b e r t s a n d L o e w u s ( 6 8 ) h a v e s h o w n t h a t m y o - i n o s i t o l - 2 - H i n t h e p r e s e n c e o f 2,4-D i s i n c o r p o r a t e d i n t o t h e g a l a c t u r o n o s y l a n d a r a b i n o s y l u n i t s o f p o l y s a c c h a r i d e s p r o d u c e d b y s y c a m o r e c e l l s . I t w a s s u g g e s t e d t h a t 2,4-D a c t s t o f a c i l i t a t e t h e t r a n s f e r o f m y o - i n o s i t o l t h r o u g h t h e m y o - i n o s i t o l o x i d a t i o n p a t h w a y t o t h e s e u n i t s ( F i g u r e 1 4 , 6 9 ) . T h e E P S f r o m t h e F o x - l H m e d i u m h a d a g r e a t e r a r a b i n o s e c o n t e n t t h a n t h a t f r o m t h e F o x - 3 H m e d i u m , b u t b o t h c o n t a i n f e w e r a r a b i n o s y l u n i t s t h a n P R L - 4 E P S . T h i s e f f e c t c o u l d b e a t t r i b u t e d t o t h e p r e s e n c e o f 2,4-D a n d t h e a b s e n c e o f a d d i t i o n a l i n o s i t o l f r o m t h e c o c o n u t m i l k . T h e E P S f r o m t h e F o x - 3 H m e d i u m i s a h e m i c e l l u l o s e c o n t a i n i n g l a r g e a m o u n t s o f h e x o s e s a n d l e s s e r q u a n t i t i e s o f p e n t o s e s a n d g a l a c t u r o n i c a c i d . T h e r e may b e a s y n e r g i s t i c e f f e c t b e t w e e n I A A , k i n e t i n a n d 2,4-D 7 2 . SUGAR N U C L E O T I D E O X I D A T I O N PATHWAY M Y O - I N O S I T O L O X I D A T I O N PATHWAY SUCROSE 1 HEXOSE +ATP D-GLUCOSE-6-P-D-GLUCOSE-1-P +UTP m y o - I N O S I T O L - l - P U T P - g l u c o s e p y r o p h o s p h o r y l a s e U D P - g l u c o s e d e h y d r o g e n a s e UDP-GLUCOSE +2 NAD UDP-GALACTOSE U D P - A R A B I N O S E m y o - I N O S I T O L D-GLUCURONIC A C I D +ATP g l u c u r o k i n a s e D-GLUCURONIC A C I D - l - P i -^UDP-GLUCURONIC A C I D .UDP-XYLOSE UDP-GALACTURONIC A C I D WALL HEXOSES WALL PENTOSES WALL URONIDES F I G U R E 14. M e t a b o l i c p a t h w a y s f r o m s u g a r s t o w a l l p o l y s a c c h a r i d e s , ( f r o m L o e w u s , 6 9 ) 7 3 . i n t h i s c a s e , c a u s i n g a n i n c r e a s e i n t h e a c t i v i t i e s o f t h e e n z y m e s o f t h e h e x o s e m o n o p h o s p h a t e s h u n t , r e s u l t i n g i n a c h a n g e i n s u g a r r a t i o s . H o w e v e r , t h e c o f f e e c e l l s do n o t h a v e a n a b s o l u t e r e q u i r e m e n t f o r I A A a n d k i n e t i n , a s w a s d e m o n s t r a t e d b y t h e n o r m a l c e l l g r o w t h a n d r a t e o f p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n i n t h e m e d i a l a c k i n g t h e s e h o r m o n e s . C e l l s w e r e g r o w n i n a h i g h k i n e t i n m e d i u m ( 2 . 5 mg/L) t o e x a m i n e t h e e f f e c t o f a n e x c e s s o f t h i s h o r m o n e o n t h e p o l y s a c c h a r i d e c o m p o s i t i o n . C o m p a r e d t o t h e F o x - 3 H c u l t u r e s , p o l y s a c c h a r i d e y i e l d a n d c e l l g r o w t h w e r e r e d u c e d b y t h e h i g h l e v e l o f k i n e t i n . H i g h k i n e t i n c a u s e d a n i n c r e a s e i n g l u c o s y l a n d a r a b i n o s y l u n i t s a n d a d e c r e a s e i n g a l a c t o s e , x y l o s e a n d m a n n o s e i n t h e E P S . T h e c h a n g e s i n h e m i c e l l u l o s e c o m p o s i t i o n i n a n e x c e s s o f k i n e t i n c o u l d r e s u l t f r o m s u p p r e s s i o n o f t h e a c t i v i t i e s o f e n z y m e s i n v o l v e d i n m o n o s a c c h a r i d e i n t e r c o n v e r s i o n s , t h e r e b y l i m i t i n g t h e a v a i l a b i l i t y o f g a l a c t o s e , x y l o s e , a n d m a n n o s e f o r i n c o r p o r a t i o n . S i m i l a r l y , S i m k i n s a n d S t r e e t ( 7 0 ) h a v e s h o w n t h a t h i g h k i n e t i n l e v e l s a l s o r e d u c e t h e c o n t e n t o f g a l a c t o s e a n d x y l o s e a n d i n c r e a s e t h e p r o p o r t i o n o f g l u c o s e i n t h e E P S f r o m s y c a m o r e c e l l s . T h e E P S p r o d u c e d b y c e l l s g r o w n i n F o x m e d i u m l a c k i n g n i t r o g e n (*2,4-D) w e r e s i g n i f i c a n t l y d i f f e r e n t f r o m t h e E P S p r e v i o u s l y m e n t i o n e d . T h e r e w a s a m a s s i v e a c c u m u l a t i o n o f g l u c o s y l u n i t s a n d a r e d u c t i o n o f a l l o t h e r m o n o s a c c h a r i d e u n i t s i n t h e s e E P S . T h e t w o E P S t h e m s e l v e s a r e v e r y s i m i l a r i n t h e w e i g h t % c o m p o s i t i o n o f t h e i n d i v i d u a l m o n o s a c c h a r i d e s . R e s i d u a l 2,4-D p r e s e n t i n t h e c e l l s may b e r e s p o n s i b l e f o r t h e s i m i l a r i t y b e t w e e n t h e t w o E P S e v e n t h o u g h o n e l a c k e d 2,4-D i n t h e c u l t u r e m e d i u m . T h e a b s e n c e o f n i t r o g e n may r e d u c e t h e r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s a n d c e l l 7 4 . d i v i s i o n , t h u s a f f e c t i n g t h e e n z y m e s r e s p o n s i b l e f o r t h e i n t e r c o n v e r s i o n s o f s u g a r s w i t h i n t h e c e l l s . 4. T h e e f f e c t o f l i g h t o n E P S c o m p o s i t i o n C e l l s w e r e g r o w n i n t h e l i g h t i n P R L - 4 , F o x - 3 H a n d F o x - l H m e d i a t o i n v e s t i g a t e t h e e f f e c t o f l i g h t o n E P S c o m p o s i t i o n . T h e E P S f r o m t h e t h r e e m e d i a w e r e s i m i l a r t o e a c h o t h e r e x c e p t f o r s l i g h t d i f f e r e n c e s i n l e v e l s o f a r a b i n o s y l , m a n n o s y l a n d g l u c o s y l u n i t s ( T a b l e X I X ) . T h e s e EPS. w e r e c o m p a r e d t o t h o s e f r o m t h e d a r k g r o w n c u l t u r e s ( T a b l e X V I I I ) . L i g h t h a s n o i n f l u e n c e o n t h e c o m p o s i t i o n o f t h e F o x - l H E P S . T h e E P S f r o m t h e l i g h t . g r o w n P R L - 4 c e l l s s h o w e d a r e d u c e d p r o p o r t i o n o f a r a b i n o s e a n d a n i n c r e a s e d l e v e l o f g l u c o s e c o m p a r e d t o t h e d a r k g r o w n c e l l s . T h e E P S f r o m l i g h t g r o w n F o x - 3 H c e l l s w a s f o u n d t o h a v e a n i n c r e a s e d l e v e l o f a r a b i n o s e a n d a r e d u c e d l e v e l o f g a l a c t o s e . No e x p l a n a t i o n c a n b e m ade f o r t h e s e r e s u l t s . 5. C o m p a r i s o n o f t h e h o t w a t e r - e x t r a c t e d c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e t o  t o t a l w a l l i s o l a t e A h o t w a t e r e x t r a c t i o n o f c o f f e e c e l l s g r o w n i n P R L - 4 a n d F o x - 3 H m e d i a g i v e s a p o l y s a c c h a r i d e r i c h i n g l u c o s y l r e s i d u e s , a r a b i n o s e a n d g a l a c t o s e ( T a b l e X X ) . O t h e r m o n o s a c c h a r i d e s w e r e f o u n d i n t r a c e q u a n t i t i e s . A h o t w a t e r e x t r a c t o f c e l l s n o r m a l l y s o l u b i l i z e d n o n -c e l l u l o s i c ( p e c t i c ) c a r b o h y d r a t e s c o n s i s t i n g o f g a l a c t u r o n i c a c i d , g a l a c t o s e a n d a r a b i n o s e . T h e p r e s e n c e o f l a r g e a m o u n t s o f g l u c o s e w o u l d t e n d t o i n d i c a t e t h e p r e s e n c e o f a c e l l u l o s i c p o l y s a c c h a r i d e a s g l u c o s e i s a m a j o r c o m p o n e n t o f h e x o s a n s a n d i s n o r m a l l y a s s o c i a t e d w i t h g a l a c t o -g l u c o m a n n a n s ( 7 1 ) . P e r h a p s i n t h i s c a s e a r a b i n o s e s u b s t i t u t e s f o r m a n n o s e . T h i s m a t e r i a l may b e r e l a t e d t o t h e E P S , a s t h e same m o n o s a c c h a r i d e 7 5 . T A B L E X I X . R e l a t i v e c o m p o s i t i o n o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s f r o m l i g h t g r o w n c u l t u r e s ( e x p r e s s e d a s w e i g h t 7» c o m p o s i t i o n a n d ( m o l a r r a t i o s ) ) . COMPONENT PRL- 4 F o x - 3H F o x - I H A r a b i n o s e 2 7 . .39 ( 5 . 2 4 ) 3 0 . .30 ( 9 . 0 7 ) 24. .46 ( 5 . 9 8 ) X y l o s e 5. .23 (i;oo) 3. .34 ( 1 . 0 0 ) 4. .09 ( 1 . 0 0 ) M a n n o s e 2. .35 ( 0 . 4 5 ) 6. .10 ( 1 . 8 3 ) 5. .82 ( 1 . 4 2 ) G a l a c t o s e 30. .03 ( 5 . 7 4 ) 2 9 . .86 ( 8 . 9 4 ) 2 9 . .19 ( 7 . 1 4 ) G l u c o s e 3 1 . .45 ( 6 . 0 1 ) 30. .40 ( 9 . 1 0 ) 3 6 . .45 ( 8 . 9 1 ) G a l a c t u r o n i c t r a c e t r a c e t r a c e a c i d 7 6 . T A B L E X X . R e l a t i v e c o m p o s i t i o n o f h o t w a t e r - e x t r a c t e d c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s - f r o m t w o d a r k g r o w n c u l t u r e s . COMPONENT A r a b i n o s e X y l o s e M a n n o s e G a l a c t o s e G l u c o s e G a l a c t u r o n i c a c i d P R L - 4 w e i g h t % comp. r a t i o 3 0 . 5 7 1.82 t r a c e t r a c e t r a c e t r a c e 1 6 . 7 8 1.00 5 2 . 6 5 3.14 t r a c e t r a c e F o x - 3 H w e i g h t % comp r a t i o 2 0 . 3 1 7.90 2 . 5 7 1.00 6.49 2 , 5 3 2 4 . 7 4 9.63 4 5 . 8 9 1 7 . 8 6 t r a c e t r a c e 7 7 . c o n s t i t u e n t s a r e p r e s e n t i n b o t h . T h e h o t w a t e r e x t r a c t e d c e l l p o l y s a c c h a r i d e f r o m F o x - 3 H c u l t u r e d c e l l s c a n b e d i r e c t l y c o m p a r e d t o t h e w a l l s i s o l a t e d f r o m w h o l e c e l l s ( T a b l e X X I ) . T h e w h o l e c e l l w a l l s a r e r i c h i n g l u c o s e a n d c o n t a i n l a r g e a m o u n t s o f a r a b i n o s e a n d g a l a c t o s e , w i t h t r a c e s o f o t h e r m o n o s a c c h a r i d e s . T h e l o w u r o n i c a c i d c o n t e n t a n d t h e a b s e n c e o f r h a m n o s e f r o m t h e c e l l w a l l m a t e r i a l s u g g e s t s t h a t p e c t i c p o l y s a c c h a r i d e s a r e a v e r y m i n o r c o n s t i t u e n t o f c u l t u r e d c o f f e e c e l l w a l l s . R a y ( 7 2 ) f o u n d t h a t t h e p r e d o m i n a n t h o t w a t e r s o l u b l e s u g a r s i n t h e c e l l w a l l f r a c t i o n o f o a t c o l e o p t i l e s w e r e a r a b i n o s e a n d g l u c o s e , w i t h s m a l l e r a m o u n t s o f g a l a c t o s e a n d x y l o s e . T h e w h o l e c e l l w a l l p r e p a r a t i o n o f o a t c o l e o p t i l e s c o n t a i n e d m a i n l y g l u c o s e , a r a b i n o s e , g a l a c t o s e a n d g a l a c t u r o n i c a c i d w i t h l e s s e r q u a n t i t i e s o f m a n n o s e a n d x y l o s e . T h e s e r e s u l t s a r e s i m i l a r t o t h o s e f o u n d i n t h e p r e s e n t c o f f e e c e l l s t u d i e s . S i m i l a r l y , c e l l w a l l s i s o l a t e d f r o m r y e g r a s s g r o w n i n l i q u i d s u s p e n s i o n c u l t u r e w e r e f o u n d t o c o n t a i n 5 0 % g l u c o s e , 1 9 % a r a b i n o s e , 2 6 % x y l o s e a n d 5% g a l a c t o s e i n h y d r o l y s a t e s o f t h e w a l l p o l y s a c c h a r i d e s . P e c t i c p o l y s a c c h a r i d e s w e r e a b s e n t i n t h i s c a s e ( 3 1 ) , T h e c o m p o s i t i o n o f t h e c e l l w a l l s i s o l a t e d f r o m s u s p e n s i o n - c u l t u r e d s y c a m o r e c e l l s h o w e v e r i s p e c t i c i n n a t u r e . A r a b i n o s e a n d x y l o s e w e r e t h e m o s t a b u n d a n t ; g a l a c t u r o n i c a c i d , g a l a c t o s e , g l u c o s e a n d r h a m n o s e w e r e m a j o r c o n s t i t u e n t s a n d t r a c e s o f m a n n o s e a n d f u c o s e w e r e a l s o p r e s e n t ( 3 2 ) . T h i s may b e d u e t o t h e s o u r c e o f t h e c u l t u r e d c e l l s a n d t h e d i r e c t i o n o f d i f f e r e n t i a t i o n i n c u l t u r e . 6. E x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n a t i o n M o s t p l a n t c e l l c u l t u r e s p r o d u c e a m i x e d E P S . S u s p e n s i o n - c u l t u r e d T A B L E X X I . R e l a t i v e c o m p o s i t i o n s o f F o x - 3 H e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s , p o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n s a n d c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s ( e x p r e s s e d a s w e i g h t p e r c e n t c o m p o s i t i o n a n d ( m o l a r r a t i o s ) ) . P O L Y S A C C H A R I D E COMPONENTS DARK ( M I X E D ) A C I D I C F R A C T I O N N E U T RAL FRACTIONS WATER S O L U B L E 7M UREA AND 0.5N NaOH HOT WATER-EXTRACTED C E L L WALL C E L L WALL I S O L A T E A r a b i n o s e 17. ,09 ( 4 . 9 8 ) 2 2 . 8 3 ( 3 . 9 0 ) 30. .76 ( 1 . 0 0 ) 2 0 . 3 1 ( 7 . 9 0 ) 2 5 . 0 2 ( 5 . 4 6 ) X y l o s e 3. .43 ( 1 . 0 0 ) - 2 4 . 9 2 ( 1 . 0 0 ) 2.57 ( 1 . 0 0 ) 4.58 ( 1 . 0 0 ) M a n n o s e 7. .36 ( 2 . 1 5 ) 5. 86 ( 1 . 0 0 ) t r a c e 6.49 ( 2 . 5 3 ) 1.75 ( 0 . 3 8 ) G a l a c t o s e 4 2 . . 8 1 ( 1 2 . 4 8 ) 5 2 . 78 ( 9 . 0 0 ) 6 9 . .24 ( 2 . 2 5 ) 3 7 . 4 3 ( 1 . 5 0 ) 2 4 . 7 4 ( 9 . 6 3 ) 1 4 . 5 9 ( 3 . 1 9 ) G l u c o s e 2 9 . .31 ( 8 . 5 5 ) - 3 7 . 6 5 ( 1 . 5 0 ) 4 5 . 8 9 ( 1 7 . 8 6 ) 5 4 . 4 1 ( 1 1 . 8 8 ) G a l a c t u r o n i c a c i d 2. 3 7 ( 0 . 6 9 ) : 1 8 . 5 3 ( 3 . 2 1 ) - t r a c e t r a c e 79. s y c a m o r e a n d b e a n c e l l s h a v e b e e n u s e d t o s t u d y c e l l w a l l p o l y m e r s f o r s e v e r a l r e a s o n s ; t h e m o s t i m p o r t a n t i s t h a t t h e s e c e l l s a r e h o m o g e n o u s , p o s s e s s i n g p r i m a r y b u t no s e c o n d a r y c e l l , w a l l s . A s e c o n d a t t r i b u t e o f t h e s e c u l t u r e d c e l l s i s t h a t t h e y s e c r e t e i n t o t h e c u l t u r e m e d i u m p o l y s a c c h a r i d e s w h i c h a r e s i m i l a r i n c o m p o s i t i o n t o t h e p o l y s a c c h a r i d e s o f t h e c e l l w a l l . I t h a s b e e n c o n f i r m e d t h a t a t l e a s t some o f t h e s e E P S a r e s t r u c t u r a l l y r e l a t e d t o c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s ( 7 3 ) . T h e c o f f e e c e l l s u s e d i n t h i s s t u d y h a d s i m i l a r a t t r i b u t e s a n d i t s e e m s r e a s o n a b l e t o a s s u m e t h a t t h e E P S i n t h e c u l t u r e m e d i u m i s l i k e w i s e r e l a t e d t o t h e c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e . T h e m i x e d E P S p r o d u c e d b y F o x - 3 H s u s p e n s i o n - c u l t u r e d c e l l s w a s s e p a r a t e d i n t o t h r e e p o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n s . A n a c i d i c f r a c t i o n w a s s e l e c t i v e l y p r e c i p i t a t e d a s a n i n s o l u b l e c o p p e r s a l t . T h e n e u t r a l p o l y s a c c h a r i d e s w e r e f r a c t i o n a t e d f o l l o w i n g a b s o r p t i o n o n c e l l u l o s e ; e l u t i o n w i t h w a t e r g a v e a n a r a b i n o g a l a c t o m a n n a n ; e l u t i o n w i t h 7M u r e a a n d w i t h 0.5N NaOH g a v e t w o x y l o g a l a c t o g l u c a n f r a c t i o n s w h i c h w e r e i n d i s t i n g u i s h a b l e ( T a b l e X X I ) . R e d k i d n e y b e a n r o o t c e l l s p r o d u c e d a m i x t u r e o f p o l y s a c c h a r i d e s c o n t a i n i n g a n a r a b i n o g a l a c t a n a n d a n o t h e r p o l y s a c c h a r i d e c o n s i s t i n g o f s m a l l a m o u n t s o f g l u c o s e , x y l o s e a n d g a l a c t o s e ( 3 5 ) . S y c a m o r e c e l l s E P S h a s b e e n f o u n d t o c o n t a i n t h r e e f r a c t i o n s : a n a r a b i n o g a l a c t a n , a f u c o x y l o g l u c a n a n d p e c t i n i c a c i d ( 3 3 ) . T h e x y l o g a l a c t o g l u c a n f o u n d i n t h e c o f f e e c e l l E P S i s a n a l a g o u s t o t h e f u c o x y l o g l u c a n o b t a i n e d f r o m t h e s y c a m o r e c e l l w a l l s b y u r e a , e n d o g l u c a n a s e o r d i l u t e NaOH. I t may t h e r e f o r e b e s a i d t h a t t h e c o f f e e 8 0 . c e l l x y l o g a l a c t o g l u c a n b e l o n g s t o t h e x y l o g l u c a n t y p e o f p o l y s a c c h a r i d e . T h e x y l o g l u c a n a p p e a r s t o h y d r o g e n b o n d t h r o u g h i t s b e t a - l , 4 - l i n k e d g l u c a n b a c k b o n e t o t h e b e t a - l , 4 - g l u c a n c h a i n s o f c e l l u l o s e f i b r i l s o f p r i m a r y c e l l w a l l s . F u r t h e r w o r k i s n e c e s s a r y t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h i s f r a c t i o n i s p r e s e n t i n c o f f e e c e l l w a l l s . W i l d e r ( 7 3 ) o b t a i n e d a p u r i f i e d x y l o g l u c a n f r o m s u s p e n s i o n - c u l t u r e d b e a n c e l l s a n d c o m p a r e d i t t o t h e x y l o g l u c a n o f t h e v e r y d i s t i n c t l y r e l a t e d s y c a m o r e c e l l s . T h e s e a n d o t h e r s i m i l a r i t i e s f o u n d , s u g g e s t t h a t t h e p r i m a r y c e l l w a l l s o f a l l f l o w e r i n g p l a n t s a r e l i k e l y t o b e c l o s e l y r e l a t e d . T h e a c i d i c f r a c t i o n f r o m c o f f e e c e l l E P S may b e s i m i l a r t o t h e c e l l w a l l a n d E P S p e c t i c p o l y m e r s i s o l a t e d f r o m s y c a m o r e c e l l s . P e c t i n i c a c i d i s o l a t e d f r o m t h e s y c a m o r e c e l l E P S c o n t a i n e d 6 7 % g a l a c t u r o n i c a c i d , a r a b i n o s e , g a l a c t o s e , a n d s m a l l a m o u n t s o f r h a m n o s e a n d x y l o s e . T h e c o f f e e c e l l E P S a c i d i c f r a c t i o n c o n t a i n e d o n l y 1 9 % g a l a c t u r o n i c a c i d ; r h a m n o s e w a s n o t d e t e c t e d . T h e a p p a r e n t l y l o w u r o n i c a c i d c o n t e n t may b e d u e t o s p e c i e s d i f f e r e n c e s o r t o d i f f i c u l t i e s i n h y d r o l y s i s o f u r o n i d e -c o n t a i n i n g p o l y s a c c h a r i d e s . T h e s e s t e m f r o m t h e c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f t h i s c l a s s o f c o m p o u n d s , w h i c h a r e u n u s u a l l y r e s i s t a n t t o a c i d h y d r o l y s i s . R e l a t i v e l y s t r o n g a c i d s , h i g h t e m p e r a t u r e s a n d / o r e x t e n d e d t r e a t m e n t a r e n e c e s s a r y f o r t h e h y d r o l y s i s o f u r o n i d e - c o n t a i n i n g p o l y s a c c h a r i d e s . S u c h e x t r e m e c o n d i t i o n s , h o w e v e r , l e a d t o v a r i o u s u n d e s i r a b l e s i d e r e a c t i o n s e s p e c i a l l y d e g r a d a t i o n o f n e u t r a l s u g a r p o l y s a c c h a r i d e c o m p o n e n t s ( 7 4 ) . E n z y m a t i c d e g r a d a t i o n o f t h e s e p o l y s a c c h a r i d e s c o u l d b e u s e f u l i n t h i s c a s e . 8 1 . T h e a r a b i n o g a l a c t o m a n n a n i s o l a t e d f r o m c o f f e e c e l l E P S may b e a n a r a b i n o g a l a c t a n a n d a m a n n a n , b u t f u r t h e r p u r i f i c a t i o n o f t h i s f r a c t i o n i s n e c e s s a r y . A r a b i n o g a l a c t a n s may f u n c t i o n i n t h e c e l l w a l l a s a c o v a l e n t l i n k b e t w e e n a c i d i c p o l y s a c c h a r i d e c h a i n s a n d h y d r o x y p r o l i n e r i c h - w a l l p r o t e i n . M u c h o f t h e w o r k o n t h i s p o l y m e r h a s b e e n c a r r i e d o u t w i t h t h e a r a b i n o g a l a c t a n i s o l a t e d f r o m t h e E P S o f s y c a m o r e c e l l s . A m o d e l o f t h e s y c a m o r e c e l l w a l l h a s b e e n p r o p o s e d b a s e d o n t h i s e v i d e n c e ( 7 5 ) . F u r t h e r w o r k i n t h i s a r e a u s i n g d e g r a d a t i v e e n z y m e s t o o b t a i n d e f i n e d f r a g m e n t s o f t h e i s o l a t e d c e l l w a l l s a n d E P S f r o m s u s p e n s i o n -c u l t u r e d c o f f e e c e l l s i s n e c e s s a r y . 7. S u g a r s o f t h e c o f f e e c e l l s a n d s p e n t m e d i u m T h e l a c k o f a p h o t o s y n t h e t i c s y s t e m i n p l a n t c e l l c u l t u r e s m a k e s t h e a d d i t i o n o f a s u i t a b l e c a r b o h y d r a t e s o u r c e m o s t i m p o r t a n t f o r g r o w t h . S u c r o s e i s k n o w n t o b e t h e b e s t c a r b o h y d r a t e s o u r c e f o r m o s t p l a n t t i s s u e c u l t u r e s ( 7 6 ) . T h e P R L - 4 m e d i u m c o n t a i n s 2% s u c r o s e , a n d t h e . F o x m e d i u m c o n t a i n s 3 % s u c r o s e b u t c e l l g r o w t h a n d p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n a r e s i m i l a r i n b o t h m e d i a . S u c r o s e , f r u c t o s e , g l u c o s e a n d i n o s i t o l w e r e i d e n t i f i e d a s t h e f r e e s u g a r s i n c o f f e e c e l l s g r o w n i n P R L - 4 , F o x - l H , a n d F o x - 3 H m e d i a . S u c r o s e s u p p l i e d i n t h e m e d i u m c a n p r o b a b l y b e t a k e n i n t o t h e c e l l s a s t h e d i s a c c h a r i d e s i n c e t h e c e l l s c o n t a i n h i g h l e v e l s o f t h i s s u g a r ( 2 6 % , 5 5 % a n d 2 8 % r e s p e c t i v e l y a t d a y 6 ) . I n v e r t a s e , a n e n z y m e c a p a b l e o f d e g r a d i n g s u c r o s e t o f r u c t o s e a n d g l u c o s e may a l s o b e p r e s e n t , s o a p o r t i o n o f t h e s u c r o s e i s p r o b a b l y d e g r a d e d t o h e x o s e s a s i t i s t a k e n i n t o t h e c e l l . T h e p r e s e n c e o f i n v e r t a s e h a s b e e n r e p o r t e d i n many p l a n t 8 2 . t i s s u e c u l t u r e s ( 7 7 ) . I n t h e P R L - 4 c u l t u r e d c e l l s , g l u c o s e a n d s u c r o s e d e c r e a s e d i n c o n c e n t r a t i o n w i t h c u l t u r e a g e . T h e g l u c o s e m o i e t y o f s u c r o s e s e e m s t o b e p r e f e r e n t i a l l y u s e d a s a p r e c u r s o r t o o t h e r m e t a b o l i t e s a s m a s s i v e a m o u n t s o f f r u c t o s e w e r e f o u n d t o a c c u m u l a t e i n t h e c e l l s . A h i g h e r l e v e l o f s u c r o s e i s f o u n d i n t h e c e l l s g r o w n i n t h e F o x m e d i a a t d a y 6. T h i s c o u l d b e a c c o u n t e d f o r b y t h e g r e a t e r c o n c e n t r a t i o n o f s u c r o s e a v a i l a b l e t o t h e c e l l s f r o m t h e c u l t u r e m e d i u m . G l u c o s e a g a i n s e e m s t o b e u s e d p r e f e r e n t i a l l y o v e r f r u c t o s e b y t h e c o f f e e c e l l s . I n t h e t w o F o x m e d i u m s t h e s u c r o s e c o n t e n t o f t h e c e l l s a t d a y 1 4 w a s 3 5 % a n d 4 2 % o f t h e t o t a l s u g a r , w h i l e i n t h e P R L - 4 c e l l s n o s u c r o s e w a s d e t e c t e d . P r e s u m a b l y t h e P R L - 4 c e l l s h a v e u t i l i z e d a l l t h e s u c r o s e a v a i l a b l e , w h i l e t h e F o x c e l l s h a v e m o r e s u c r o s e p r e s e n t i n t h e m e d i u m . T h e P R L - 4 c e l l s h a v e a l a r g e r a m o u n t o f t o t a l c e l l s u g a r r e m a i n i n g a t d a y 1 4 t h a n t h e F o x c e l l c u l t u r e s , h o w e v e r i t i s i n t h e f o r m o f f r u c t o s e w h i c h i s n o t u s e d b y t h e c e l l s . T h e c e l l s f r o m t h e t w o F o x m e d i a a c c u m u l a t e d i n o s i t o l , w h i c h i s a n e c e s s a r y f a c t o r f o r c e l l g r o w t h . M y o - i n o s i t o l i s k n o w n t o b e a p r e c u r s o r t o u r o n o s y l a n d p e n t o s y l u n i t s i n t h e c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s ( 6 8 ) . T h e t r a c e q u a n t i t i e s o f g a l a c t u r o n i c a c i d u n i t s a n d t h e l e s s e r q u a n t i t y o f p e n t o s e u n i t s i n t h e EPS may b e a n i n d i c a t i o n t h a t t h e m y o - i n o s i t o l o x i d a t i o n p a t h w a y i s o p e r a t i n g a t a r e d u c e d r a t e , , t h u s l e a d i n g t o a p o o l o f i n o s i t o l w i t h i n t h e c e l l s . R o b e r t s a n d L o e w u s ( 7 8 ) h a v e s h o w n t h a t i t i s p o s s i b l e t o r e d u c e 14 t h e c o n t r i b u t i o n o f r a d i o - l a b e l l e d D - g l u c o s e - 6 - C t o c e l l w a l l g a l a c t u r o n i c a c i d b y r a i s i n g t h e i n t e r n a l c o n c e n t r a t i o n o f m y o - i n o s i t o l 8 3 . i n c o r n r o o t s . I n y o u n g c o r n s e e d l i n g s , t h e p e n t o s e s a n d u r o n i c a c i d s o f c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s a r e s y n t h e s i z e d v i a a p a t h w a y i n v o l v i n g myo-i n o s i t o l a n d n o t U D P - g l u c o s e a s a n i n t e r m e d i a t e ( F i g u r e 1 4 ) . C e l l s g r o w n i n t h e h i g h k i n e t i n F o x - 3 H m e d i u m c o n t a i n e d f r u c t o s e a n d g l u c o s e a t d a y 6, b u t o n l y f r u c t o s e a t d a y 1 4 . No s u c r o s e o r i n o s i t o l w a s f o u n d i n t h e s e c e l l s . T h e g l u c o s e m o l e c u l e a g a i n s e e m s t o b e u s e d p r e f e r e n t i a l l y b y t h e c e l l . A n a l y s i s o f t h e s p e n t m e d i u m s u g a r s a l s o c o n f i r m s t h i s a s f r u c t o s e a c c o u n t s f o r 8 0 % o f t h e s u g a r s , w i t h s m a l l a m o u n t s o f x y l o s e a n d g l u c o s e a l s o p r e s e n t . T h e g l u c o s e m o l e c u l e s e e m s t o b e c o n v e r t e d t o h e x o s e u n i t s a s l a r g e a m o u n t s o f g a l a c t o s e a n d g l u c o s e a r e f o u n d i n t h e E P S . T h e i n c r e a s e i n a r a b i n o s y l u n i t s i n t h e E P S , t h e p r e s e n c e o f x y l o s e i n t h e s p e n t m e d i u m a n d t h e l a c k o f a p o o l o f f r e e i n o s i t o l w i t h i n t h e c e l l s may i n d i c a t e t h a t t h e m y o - i n o s i t o l o x i d a t i o n p a t h w a y i s o p e r a t i v e i n t h i s c u l t u r e s y s t e m . S t r e e t et^ a l ( 7 9 ) h a v e i n d i c a t e d t h a t a n i n c r e a s e d l e v e l o f k i n e t i n c a n i n h i b i t t h e E m b d e n - M e y e r h o f f - P a r n a s p a t h w a y a n d i n c r e a s e t h e p e n t o s e p h o s p h a t e s h u n t i n s u s p e n s i o n - c u l t u r e d s y c a m o r e c e l l s . T h e p r e s e n c e o f x y l o s e i n t h e s p e n t m e d i u m a n d t h e h i g h e r p r o p o r t i o n o f a r a b i n o s e i n t h e E P S , c o m p a r e d t o t h a t f r o m F o x - 3 H , may i n d i c a t e s u c h a n i n c r e a s e d c o n t r i b u t i o n f r o m t h e p e n t o s e p h o s p h a t e s h u n t . C e l l s g r o w n i n a n o - n i t r o g e n F o x m e d i u m (=t 2,4-D) c o n t a i n e d a p p r o x i m a t e l y 2 5 % s u c r o s e a n d e q u a l q u a n t i t i e s o f f r u c t o s e a n d g l u c o s e a s c e l l s u g a r s a t d a y 9. A p p r o x i m a t e l y e q u a l q u a n t i t i e s o f f r u c t o s e a n d g l u c o s e w e r e p r e s e n t i n t h e s p e n t m e d i a . T h i s d a t a i n d i c a t e s t h a t b o t h 8 4 . f r u c t o s e a n d g l u c o s e w e r e b e i n g u s e d b y t h e c e l l s , n o t j u s t g l u c o s e a s w a s f o u n d i n p r e v i o u s c a s e s . T h e l a c k o f n i t r o g e n may c a u s e c h a n g e s i n t h e c a r b o h y d r a t e m e t a b o l i s m b e c a u s e o f t h e n o r m a l n i t r o g r e n r e q u i r e -m e n t f o r p r o t e i n s y n t h e s i s a n d c e l l g r o w t h . 8 5 . SUMMARY ( P A R T I ) S u s p e n s i o n - c u l t u r e d c o f f e e c e l l s p r o d u c e d a n e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e i n b o t h t h e l o g a r i t h m i c a n d s t a t i o n a r y p h a s e s o f c e l l g r o w t h . - P o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n a n d c e l l g r o w t h w e r e s i m i l a r i n t h e 3 m e d i a s t u d i e d . T h e y i e l d o f p o l y s a c c h a r i d e w a s d e t e r m i n e d b y t h e d u r a t i o n o f t h e p h a s e o f r a p i d c e l l g r o w t h a s p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n d e c r e a s e d a t t h e b e g i n n i n g o f t h e s t a t i o n a r y p h a s e . M a x i m u m y i e l d s o f e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e o c c u r r e d a t d a y 8 a n d r a n g e d f r o m 1 3 1 - 1 4 2 mg/100 m l f o r t h e t h r e e m e d i a i n a 1 4 d a y c u l t u r e c y c l e . T h e p o l y -s a c c h a r i d e p r o d u c t i o n o f s u s p e n s i o n - c u l t u r e d s y c a m o r e c e l l s i s s i m i l a r , h o w e v e r a 4 w e e k c u l t u r e c y c l e w a s u s e d l e a d i n g t o a g r e a t e r y i e l d . T h e m o n o s a c c h a r i d e c o m p o n e n t s o f t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e a s d e t e r m i n e d b y g a s c h r o m a t o g r a p h y a n d p a p e r c h r o m a t o g r a p h y , w e r e a r a b i n o s e , x y l o s e , m a n n o s e , g a l a c t o s e , g l u c o s e , a n d g a l a c t u r o n i c a c i d . T h e r e l a t i v e p r o p o r t i o n s o f t h e s e m o n o s a c c h a r i d e c o n s t i t u e n t s v a r i e d w i t h h o r m o n a l t r e a t m e n t . T h e p r e s e n c e o f 2,4-D i n t h e P R L - 4 m e d i u m , l e d t o t h e a c c u m u l a t i o n o f a r a b i n o s e a n d r e d u c e d t h e q u a n t i t i e s o f h e x o s e u n i t s i n t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e . 2,4-D i s k n o w n t o e n h a n c e ( t h e m y o - i n o s i t o l o x i d a t i o n p a t h w a y a n d t h e r e f o r e may b e r e s p o n s i b l e f o r t h i s e f f e c t . C o f f e e c e l l s g r o w n i n t h e F o x - 3 H m e d i u m a c c u m u l a t e d a p o o l o f f r e e i n o s i t o l w i t h i n t h e c e l l s . T h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c e d f r o m t h e s e c e l l s c o n t a i n e d l a r g e a m o u n t s o f h e x o s e s u g a r s a n d l e s s e r a m o u n t s o f p e n t o s e u n i t s a n d g a l a c t u r o n i c a c i d . T h i s d a t a i n d i c a t e s t h a t t h e m y o - i n o s i t o l o x i d a t i o n p a t h w a y may b e o p e r a t i n g a t a r e d u c e d l e v e l . 8 6 . A n i n c r e a s e d q u a n t i t y o f g l u c o s e a n d a r a b i n o s e a n d a d e c r e a s e i n t h e p r o p o r t i o n o f g a l a c t o s e , x y l o s e a n d m a n n o s e i n t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e w a s d e m o n s t r a t e d a s t h e e f f e c t o f a n e x c e s s i v e l e v e l o f k i n e t i n i n o n e F o x - 3 H m e d i u m . T h i s c h a n g e i n c o m p o s i t i o n i s t h o u g h t t o r e s u l t f r o m s u p p r e s s i o n o f t h e a c t i v i t i e s o f t h e e n z y m e s i n v o l v e d i n m o n o s a c c h a r i d e i n t e r c o n v e r s i o n s , l i m i t i n g t h e a v a i l a b i l i t y o f g a l a c t o s e , x y l o s e a n d m a n n o s e f o r i n c o r p o r a t i o n . ' T h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e p r o d u c e d b y F o x - 3 H s u s p e n s i o n -c u l t u r e d c e l l s w a s f o u n d t o b e a m i x e d p o l y s a c c h a r i d e c o n s i s t i n g o f a n a c i d i c f r a c t i o n , a w a t e r s o l u b l e a r a b i n o g a l a c t o m a n n a n a n d a u r e a o r d i l u t e b a s e s o l u b l e x y l o g a l a c t o g l u c a n . T h e s e f r a c t i o n s a r e s i m i l a r t o f r a c t i o n s i s o l a t e d f r o m s u s p e n s i o n - c u l t u r e d s y c a m o r e c e l l s a n d r e d k i d n e y b e a n r o o t c e l l s b y o t h e r i n v e s t i g a t o r s . T h e s e p o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n s a r e t h o u g h t t o b e r e l a t e d t o c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s . S u c r o s e , f r u c t o s e , g l u c o s e a n d i n o s i t o l w e r e f o u n d a s c o n s t i t u e n t s u g a r s i n t h e c e l l s f r o m t h e 3 m e d i a . S u c r o s e w a s t a k e n i n t o t h e c e l l s b o t h a s t h e d i s a c c h a r i d e a n d a s m o n o s a c c h a r i d e s . T h e g l u c o s e m o i e t y o f t h e s u c r o s e m o l e c u l e w a s p r e f e r e n t i a l l y u s e d a s a p r e c u r s o r t o o t h e r m e t a b o l i t e s a s f r u c t o s e a c c u m u l a t e d i n m a s s i v e q u a n t i t i e s i n t h e c e l l s a n d t h e s p e n t m e d i a . 8 7 . PART I I C O F F E E BEAN S T U D I E S A. M A T E R I A L S AND METHODS 1. P o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n s o f g r e e n c o f f e e b e a n s G r e e n c o f f e e b e a n s w e r e g r o u n d t o a p o w d e r a n d p a s s e d t h r o u g h a 4 0 m e s h s e i v e . T h e g r e e n b e a n p o w d e r w a s e x t r a c t e d 3 t i m e s w i t h 8 0 % e t h a n o l o n a s h a k e r a t 28°C. T h e m i x t u r e w a s c e n t r i f u g e d a t 2 0 , 0 0 0 x g f o r 2 0 m i n a n d t h e s u p e r n a t a n t c o n t a i n i n g t h e f r e e s u g a r s d i s c a r d e d . T h e i n s o l u b l e m a t e r i a l r e m a i n i n g w a s e x t r a c t e d 3 t i m e s w i t h a c e t o n e , c e n t r i f u g e d , a n d t h e s u p e r n a t a n t d i s c a r d e d . T h e a c e t o n e e x t r a c t c o n t a i n e d l i p i d m a t e r i a l . T h e r e s i d u e w a s f u r t h e r e x t r a c t e d 3 t i m e s w i t h 5 0 0 m l w a t e r a t 28°C. T h e s e w a t e r e x t r a c t s w e r e c o n c e n t r a t e d t o 1/3 v o l u m e a n d p o u r e d i n t o a b s o l u t e e t h a n o l ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n 7 0 % E t O H ) a n d a l l o w e d t o p r e c i p i t a t e o v e r n i g h t a t 4°C. T h e f l o c c u l e n t , c r e a m c o l o u r e d p r e c i p i t a t e w a s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n a t 2 5 0 0 x g , f r e e z e d r i e d , h y d r o l y z e d a n d a n a l y z e d i n t h e same m a n n e r a s t h e e x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s p r o d u c e d f r o m s u s p e n s i o n c u l t u r e d c o f f e e c e l l s . T h e s u p e r n a t a n t f r o m t h e 7 0 % e t h a n o l p r e c i p i t a t i o n w a s n o t f u r t h e r a n a l y z e d . T h e r e s i d u e l e f t a f t e r w a t e r e x t r a c t i o n w a s e x t r a c t e d 2 t i m e s w i t h 0 . 5 % ammonium o x a l a t e a t 90°C. T h e s e ammonium o x a l a t e e x t r a c t s w e r e c o m b i n e d , c o n c e n t r a t e d t o a s m a l l v o l u m e i n v a c u o a t 40°C a n d f r e e z e d r i e d . A l i g h t f l u f f y s o l i d w a s o b t a i n e d . A s a m p l e w a s h y d r o l y z e d a n d a n a l y z e d b y G.C. a s p r e v i o u s l y d e s c r i b e d . 8 8 . 2. S o l u b l e s u g a r s o f t h e c o f f e e b e a n T h e c o f f e e b e a n s u s e d i n t h i s i n v e s t i g a t i o n w e r e g r o w n i n t h e p r o v i n c e o f M e d e l l i n , C o l o m b i a , a n d w e r e c l a s s i f i e d a s C b f f e a a r a b i c a . T h e b e a n s w e r e k i n d l y p r o v i d e d f r o m D i s h a r t z C o f f e e , V a n c o u v e r , B.C. G r e e n b e a n s w e r e g r o u n d t o a f i n e p o w d e r i n a W i l e y M i l l ( A r t h u r H. T h o m a s C o . ) a n d p a s s e d t h r o u g h a 4 0 m e s h s e i v e . 2 5 0 g r a m s o f t h e p o w d e r w a s a d d e d t o 5 0 0 m l a b s o l u t e e t h a n o l i n a f l a s k a n d b o i l e d f o r 2-3 m i n u t e s . 7 5 0 m l o f 6 5 % e t h a n o l , 1 0 0 m l d i s t i l l e d w a t e r , 1 4 5 m l a b s o l u t e e t h a n o l a n d 2.5 gm c a l c i u m c a r b o n a t e w e r e a d d e d t o t h e f l a s k , m a k i n g a t o t a l o f 1 5 0 0 m l o f 8 0 % e t h a n o l . T h e c o n t e n t s o f t h e f l a s k w e r e b o i l e d 1-2 m i n m o r e , s e a l e d a n d p l a c e d o n a s h a k e r a t 28°C f o r 4 8 h r s t o e f f e c t e x t r a c t i o n ( 3 9 ) . T h e m i x t u r e w a s t h e n f i l t e r e d t h r o u g h m i r a c l o t h a n d t h e r e s i d u e w a s h e d w i t h 6 0 0 m l o f 8 0 % e t h a n o l . T h e f i l t r a t e w a s c o n c e n t r a t e d t o a r e s i d u e a t 40°C i n v a c u o . R o a s t e d c o f f e e b e a n s w e r e g r o u n d , p a s s e d t h r o u g h a 4 0 m e s h s e i v e a n d e x t r a c t e d w i t h 8 0 % a l c o h o l o n a s h a k e r f o r 4 8 h r s a t 28°C. T h e m i x t u r e w a s f i l t e r e d , w a s h e d w i t h 8 0 % e t h a n o l a n d c o n c e n t r a t e d i n v a c u o a s a b o v e . T h e r e s i d u e s f r o m t h e g r e e n a n d r o a s t e d c o f f e e b e a n s w e r e s t o r e d i n t h e f r e e z e r a t -4°C u n t i l u s e d . T h e s o l u b l e s u g a r s i n t h e g r e e n a n d r o a s t e d b e a n r e s i d u e s w e r e e x t r a c t e d w i t h p y r i d i n e a n d e a c h e v a p o r a t e d t o d r y n e s s u n d e r n i t r o g e n . S a m p l e s o f e a c h w e r e s i l y l a t e d t o TMS e t h e r s a n d a n a l y z e d b y G.C. u s i n g t e m p e r a t u r e p r o g r a m ( b ) a s o u t l i n e d p r e v i o u s l y . 8 9 . 3. A n a l y s i s o f t h e e f f e c t o f r o a s t i n g o n t h e v o l a t i l e c o n s t i t u e n t s  o f c o f f e e T h e g r e e n c o f f e e b e a n s w e r e r o a s t e d u n d e r n o r m a l c o n d i t i o n s f o r C o l o m b i a n b e a n s , a t D i s h a r t z C o f f e e , V a n c o u v e r , B.C. u s i n g a g a s f i r e d G a t h a t r o a s t e r . A t o t a l r o a s t i n g t i m e o f 15 m i n u t e s w a s u s e d a n d t h e t e m p e r a t u r e o f t h e r o a s t e r w a s r e c o r d e d a t e a c h m i n u t e o f r o a s t . T h e b e a n s w e r e s a m p l e d f r o m t h e r o a s t e r a t o n e m i n u t e i n t e r v a l s a n d c o o l e d i m m e d i a t e l y . T h e c o o l e d b e a n s w e r e p a c k a g e d a n d a n a l y z e d w i t h i n 24 h r s o f r o a s t i n g . 1 0 gm o f w h o l e b e a n s f r o m t h e s e s a m p l e s w e r e g r o u n d i n a W a r i n g b l e n d e r j u s t p r i o r t o a n a l y s i s . T h e v o l a t i l e s i n t h e h e a d s p a c e o v e r t h e g r o u n d c o f f e e w e r e c o l l e c t e d i n a H a m i l t o n g a s c o l l e c t i o n s y r i n g e a n d w e r e i n j e c t e d d i r e c t l y i n t o t h e G.C. ( B e c k e r R e s e a r c h C h r o m a t o g r a p h -t y p e 3 8 1 0 w i t h a f l a m e i o n i z a t i o n d e t e c t o r ) . T h e v o l a t i l e s w e r e s e p a r a t e d o n a 1 0 f t x hi i n I..D. s t a i n l e s s s t e e l c o l u m n o f 2 5 % C a r b o w a x 2 0 M l i q u i d p h a s e a b s o r b e d o n t o C h r o m o s o r b P s o l i d s u p p o r t ( 8 0 - 1 0 0 m e s h ) . T h e c o l u m n w a s o p e r a t e d a t 50°C w i t h a n i n j e c t i o n p o r t t e m p e r a t u r e o f 1 0 0 ° C . C o m m e r c i a l l y p u r i f i e d n i t r o g e n a t a f l o w r a t e o f 1 7 m l / m i n w a s u s e d a s t h e c a r r i e r g a s . P e a k s w e r e r e c o r d e d o n a V i t a t r o n r e c o r d e r a n d a r e a s c a l c u l a t e d b y m u l t i p l y i n g p e a k h e i g h t b y w i d t h a t h a l f h e i g h t . P e a k s w e r e i d e n t i f i e d b y c o m p a r i n g r e l a t i v e r e t e n t i o n t i m e s w i t h t h o s e o f s t a n d a r d s . 9 0 . B. R E S U L T S 1. P o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n s o f g r e e n c o f f e e b e a n s G r e e n b e a n p o w d e r ( 6 6 gm) w a s e x t r a c t e d w i t h 8 0 % e t h a n o l t o r e m o v e t h e s o l u b l e s u g a r s a n d o t h e r n o n - v o l a t i l e s o l i d s . T h e i n s o l u b l e m a t e r i a l r e m a i n i n g w a s s u c c e s s i v e l y e x t r a c t e d w i t h a c e t o n e , w a t e r a n d 0 . 5 % ammonium o x a l a t e . T h e a c e t o n e e x t r a c t c o n t a i n e d l i p i d m a t e r i a l a n d w a s n o t e x a m i n e d f u r t h e r . T h e w a t e r e x t r a c t s w e r e p o u r e d i n t o 8 0 % e t h a n o l t o p r e c i p i t a t e t h e w a t e r s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e s . 2.64 gm o f f l o c c u l e n t , c r e a m c o l o u r e d p r e c i p i t a t e w a s f o r m e d ; t h i s w a s 4% o f t h e o r i g i n a l g r e e n b e a n w e i g h t . H y d r o l y s i s o f a s a m p l e w i t h I N I ^ S O ^ f o l l o w e d b y G.C. a n a l y s i s o f t h e TMS d e r i v a t i v e s i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f a n a r a b i n o g a l a c t o m a n n a n c o n s i s t i n g o f a r a b i n o s e , g a l a c t o s e a n d m a n n o s e i n a m o l a r r a t i o o f 2 : 5 : 1 . T h e s u p e r n a t a n t f r o m t h e a b o v e e t h a n o l . p r e c i p i t a t i o n c o n t a i n e d p r o t e i n a c e o u s m a t e r i a l ( 3 9 ) a n d w a s n o t a n a l y z e d . T h e m a t e r i a l e x t r a c t e d b y 0 . 5 % ammonium o x a l a t e w a s f r e e z e d r i e d t o y i e l d 4 . 1 1 gm o f l i g h t f l u f f y s o l i d . G.C. a n a l y s i s o f a h y d r o l y z e d s a m p l e i n d i c a t e d 4 p a r t s a r a b i n o s e , 1 p a r t r h a m n o s e , 6 p a r t s m a n n o s e , 9.5 p a r t s g a l a c t o s e a n d 0.77 p a r t s g a l a c t u r o n i c a c i d . D i l u t e a mmonium o x a l a t e r e m o v e s t h e w a t e r - i n s o l u b l e p e c t i n m a t e r i a l f r o m t h e g r e e n b e a n , a s i n d i c a t e d b y t h e p r e s e n c e o f r h a m n o s e a n d g a l a c t u r o n i c a c i d i n t h e h y d r o l y s a t e s . T h i s p e c t i c m a t e r i a l i s t h o u g h t t o m a k e u p 2 - 3 % o f t h e g r e e n b e a n d r y w e i g h t ( 4 6 ) . 2. S o l u b l e s u g a r s o f t h e c o f f e e b e a n T h e c a r b o h y d r a t e m a t e r i a l o f t h e g r e e n c o f f e e b e a n s w a s e x t r a c t e d 9 1 . w i t h 8 0 % e t h a n o l . T h e r e s i d u e f r o m t h i s e x t r a c t c o n t a i n e d 4 5 gm o f n o n - v o l a t i l e s o l i d s w h i c h a m o u n t e d t o a p p r o x i m a t e l y 2 0 % o f t h e d r y b e a n w e i g h t . E x t r a c t i o n o f t h i s r e s i d u e w i t h p y r i d i n e g a v e 3.13 gm o f v i s c o u s a m b e r s y r u p w h i c h c o n t a i n e d t h e s o l u b l e s u g a r s o f t h e c o f f e e b e a n . G a s c h r o m a t o g r a p h i c a n a l y s i s o f t h e p y r i d i n e e x t r a c t ( T a b l e X X I I ) g a v e 9 3 . 9 3 % s u c r o s e ( 2 . 9 6 g m ) , 3 . 9 5 % g l u c o s e ( 0 . 1 3 gm) a n d 2 . 1 2 % f r u c t o s e ( 0 . 0 6 gm). F r o m t h i s d a t a , i t may b e e s t i m a t e d t h a t s u c r o s e a m o u n t s t o 6.5% o f t h e g r e e n b e a n d r y w e i g h t , w i t h g l u c o s e a n d f r u c t o s e p r e s e n t i n t r a c e a m o u n t s . T h e 8 0 % e t h a n o l e x t r a c t o f t h e r o a s t e d c o f f e e b e a n s g a v e 4 0 gm o f d a r k b r o w n r e s i d u e w h i c h a m o u n t e d t o a p p r o x i m a t e l y 1 6 % o f t h e r o a s t e d b e a n w e i g h t . T h e n o n - v o l a t i l e s o l i d s o f t h i s r e s i d u e a r e m a i n l y t h e d a r k b r o w n d e c o m p o s i t i o n p r o d u c t s o f r o a s t i n g . G.C. a n a l y s i s o f t h e p y r i d i n e e x t r a c t o f t h i s r e s i d u e s h o w e d t h a t o n l y t r a c e s o f s u c r o s e , g l u c o s e a n d f r u c t o s e w e r e p r e s e n t . T h i s d a t a w o u l d i n d i c a t e t h a t h y d r o l y s i s o f s u c r o s e h a s o c c u r r e d d u r i n g t h e r o a s t i n g p r o c e s s . 3. A n a l y s i s o f t h e e f f e c t o f r o a s t i n g o n t h e v o l a t i l e c o n s t i t u e n t s  o f c o f f e e T h e a n a l y s i s o f t h e v o l a t i l e c o n s t i t u e n t s o f c o f f e e a r o m a h a s b e e n c o n f i n e d t o t h o s e v o l a t i l e c o m p o n e n t s c o l l e c t e d f r o m t h e h e a d s p a c e o v e r f r e s h l y r o a s t e d c o f f e e , g r o u n d j u s t p r i o r t o a n a l y s i s . A r o a s t i n g t i m e o f 1 5 m i n u t e s w a s u s e d a s t h i s t r e a t m e n t p r o d u c e d t h e maximum l e v e l o f v o l a t i l e s . F i f t e e n c o m p o u n d s ( T a b l e X X I I I ) w e r e s e p a r a t e d a n d t e n t a t i v e l y i d e n t i f i e d b y t h e i r r e l a t i v e r e t e n t i o n t i m e s o n a 2 5 % C a r b o w a x 20M c o l u m n ; F i g u r e 1 5 s h o w s a t y p i c a l c h r o m a t o g r a m o f t h e c o f f e e a r o m a 9 2 . T A B L E X X I I . S u g a r c o n t e n t o f g r e e n a n d r o a s t e d c o f f e e . COMPONENT BEAN R E T E N T I O N WEIGHT PERCENT T I M E ( m i n ) C O M P O S I T I O N * WEIGHT PERCENT OF C O F F E E BEAN S u e r o s e G r e e n R o a s t e d 5 1 . 1 5 1 . 1 9 3 . 9 3 2.96 6.5 t r a c e G l u c o s e G r e e n R o a s t e d 2 2 . 4 2 2 . 4 3.95 0.13 t r a c e t r a c e F r u c t o s e G r e e n R o a s t e d 1 8 . 8 1 8 . 8 2.12 0.06 t r a c e t r a c e * d e t e r m i n e d a s w e i g h t p e r c e n t c o m p o s i t i o n o f t h e p y r i d i n e e x t r a c t . 9 3 . T A B L E X X I I I . V o l a t i l e c o n s t i t u e n t s o f c o f f e e a r o m a . P E A K R E T E N T I O N T I M E ( m i n ) COMPOUND F U N C T I O N A L GROUP 1 2.8 H y d r o g e n S u l f i d e s u l f i d e 2 3.2 I s o p r e n e 3 3.4 M e t h y l M e r c a p t a n s u l f i d e 4 4.0 A c e t a l d e h y d e a l d e h y d e 5 4.5 D i m e t h y l S u l f i d e s u l f i d e 6 8.3 F u r a n f u r a n 7 1 5 . 6 P r o p i o n a l d e h y d e a l d e h y d e 8 1 9 . 8 I s o b u t y r a l d e h y d e a l d e h y d e 9 2 3 . 7 A c e t o n e k e t o n e 10 2 9 . 0 M e t h y l F u r a n f u r a n 11 3 3 . 2 M e t h y l E t h y l K e t o n e k e t o n e 12 3 9 . 8 M e t h y l F o r m a t e e s t e r 13 4 7 . 6 M e t h a n o l a l c o h o l 1 4 6 1 . 5 D i a c e t y l k e t o n e 15 6 9 . 0 A c e t y l P r o p i o n y l k e t o n e 70 6 0 CO c o a CO Pi u CD 13 VJ O O 5i pi 5 0 4 0 3 0 2 0 1 0 8 0 55 35 T i m e ( m i n ) F I G U R E 1 5 . T y p i c a l c h r o m a t o g r a m o f c o f f e e a r o m a . i 25 9 5 . v o l a t i l e s . G.C. a n a l y s i s w a s p e r f o r m e d o n s a m p l e s t a k e n a t e a c h m i n u t e o f r o a s t a n d c o r r e l a t e d w i t h r o a s t i n g t e m p e r a t u r e . I n g e n e r a l , t h e d a t a i n d i c a t e s t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e v o l a t i l e s i n c r e a s e d w i t h r o a s t i n g t e m p e r a t u r e f o r t h e m a j o r i t y o f t h e c o m p o u n d s i d e n t i f i e d ( F i g u r e 1 6 ) . T h e p e r c e n t o f e a c h c o m p o n e n t v a r i e s w i t h r o a s t , w e i g h t l o s s . T h e r e a r e a f e w e x c e p t i o n s t o t h i s g e n e r a l t r e n d . H y d r o g e n s u l f i d e r e a c h e s a maximum c o n c e n t r a t i o n a t a b o u t 365°F a n d t h e n r a p i d l y d e c r e a s e s . M e t h y l m e r c a p t a n s h o w s a s l i g h t d e c r e a s e i n c o n c e n t r a t i o n a t 375°F a n d t h e n c o n t i n u e s t o i n c r e a s e . D i m e t h y l s u l f i d e s e e m s t o r e m a i n c o n s t a n t d u r i n g t h e r o a s t i n g p r o c e s s a n d m e t h y l f o r m a t e a n d a c e t y l p r o p i o n y l r e a c h t h e i r m a ximum c o n c e n t r a t i o n s a t r o a s t i n g t e m p e r a t u r e s i n e x c e s s o f 4 0 0 ° F . T h e v o l a t i l e c o n s t i t u e n t s w e r e d i v i d e d a c c o r d i n g t o t h e i r f u n c t i o n a l g r o u p s : a l d e h y d e s , k e t o n e s , f u r a n s , s u l f i d e s , e s t e r s a n d a l c o h o l s . T h e p e r c e n t o f e a c h v o l a t i l e g r o u p a n d t h e t o t a l v o l a t i l e s f o r m e d a t e a c h m i n u t e o f r o a s t a r e l i s t e d i n T a b l e X X I V . D u r i n g t h e f i r s t f e w m i n u t e s o f r o a s t t h e c o l d g r e e n b e a n s a b s o r b h e a t a n d t h e o n l y a r o m a p r e s e n t i s t h a t t y p i c a l o f t h e g r e e n b e a n . M o i s t u r e i s s l o w l y d r i v e n o u t o f t h e b e a n a n d a t 6 m i n u t e s (350°F) t h e g r e e n b e a n a r o m a b e g i n s t o d i s a p p e a r . O n l y 2% o f t h e t o t a l v o l a t i l e s a r e f o r m e d a t t h i s t i m e a n d t h e y c o n s i s t o f a l d e h y d e s , k e t o n e s a n d a l c o h o l s . A t 8 m i n u t e s (365°F) t h e v o l a t i l e s , l a r g e l y t h e k e t o n e s , a l c o h o l s a n d a l d e h y d e s o f t h i s s t a g e r i s e t o a l e v e l o f 7 . 2 4 % a n d t h e c o f f e e b e a n s h a v e a p e a n u t - l i k e a r o m a . B y 1 0 m i n u t e s (380°F) 1 3 . 9 6 % o f t h e v o l a t i l e s a r e f o r m e d . A s t h e t e m p e r a t u r e a p p r o a c h e s t h e p y r o l y s i s t e m p e r a t u r e , 9 6 . ^ 1 1 1 1 1 1 1 1 1 > i 6 8 10 12 14 R o a s t t i m e - t e m p e r a t u r e ( m i n - F ) F I G U R E 1 6 . P e r c e n t i n c r e a s e i n t o t a l v o l a t i l e s w i t h r o a s t i n g t i m e a n d t e m p e r a t u r e . T A B L E X X I V . P e r c e n t o f v o l a t i l e g r o u p s f o r m e d a t e a c h m i n u t e o f r o a s t i n g ( 6 m i n - 15 m i n ) . T I M E ( m i n ) 6 7 8 9 10 11 12 •• 13 14 15 TEMPERATURE (°F) 3 5 0 3 6 0 365 3 7 0 3 8 0 3 9 0 3 9 5 5 4 0 0 4 0 0 4 0 0 V O L A T I L E GROUP A l d e h y d e s 0. .92 1. ,83 2, .48 2.75 8. ,90 9.00 1 7 . 1 3 37 . ,40 K e t o n e s 0. .52 3, .32 4. ,89 5. ,24 7. .87 8.74 14. ,51 1 6 . 2 5 2 2 . 0 0 4 2 . .30 F u r a n s 0. .03 0. .03 0, .09 0.12 0. ,84 0.93 1.79 4. .20 S u l f i d e s 0. ,16 0. .27 0. .27 0.48 0. ,75 0.85 1.49 3. ,90 E s t e r s 1.13 1. .70 2.27 2 . 8 3 3. .40 A l c o h o l s 0. ,46 1. ,70 2. .32 2. .47 3. .25 3.86 4. ,17 5.10 5.56 8. ,50 T o t a l V o l a t i l e s * 2. ,06 5, .02 7. .24 9. ,84 13. ,96 1 7 . 0 8 3 0 . ,87 3 4 . 4 0 5 0 . 8 0 1 0 0 . ,00 C h a r a c t e r i s t i c A r o m a G r e e n - P e a n u t P e a n u t - F a i n t - M e d i u m - F u l l B e a n C o f f e e C o f f e e C o f f e e * S e e F i g u r e 16 f o r t o t a l v o l a t i l e s v s r o a s t i n g t i m e / t e m p e r a t u r e . 98. a b o u t 3 9 0 °F, t h e r e i s a s t e a d y i n c r e a s e i n t h e c o n c e n t r a t i o n o f t o t a l v o l a t i l e s . O n c e a t 400°F ( 1 3 m i n ) t h e b e a n s b e g i n t o c r a c k l e , r o a s t i n g i n t h e i r own g a s e s a n d h e a t e d b y t h e e x o t h e r m i c p y r o l y s i s r e a c t i o n s w h i c h a r e t a k i n g p l a c e i n t h e b e a n c e l l s . T h e v o l a t i l e s s h a r p l y i n c r e a s e t o 5 0 % a t 1 4 m i n u t e s r o a s t i n g t i m e a n d r e a c h t h e i r m aximum c o n c e n t r a t i o n s a t 1 5 m i n u t e s o f r o a s t . A l o n g e r r o a s t i n g t i m e d e c r e a s e s t h e a m o u n t o f v o l a t i l e s a s t h e y a r e d r i v e n o f f b y e x c e s s i v e t e m p e r a t u r e s . T h i s d a t a i s t y p i c a l o f t h i s t y p e o f r o a s t b u t w i l l v a r y a s t h e r o a s t i n g t i m e a n d t e m p e r a t u r e r e l a t i o n s h i p s a r e l e n g t h e n e d o r s h o r t e n e d . D i f f e r e n t b e a n s i z e s , t y p e s , m o i s t u r e c o n t e n t a n d o t h e r f a c t o r s c a n v a r y t h e r a t e a t w h i c h t h e b e a n s come t o t h e d e s i r e d l e v e l o f a r o m a d e v e l o p m e n t , f l a v o u r a n d c o l o u r . F i g u r e 1 7 i n d i c a t e s t h e c o m p o s i t i o n a l i n c r e a s e o f e a c h v o l a t i l e g r o u p u p t o i t s m aximum p e r c e n t i n t h e f i n a l s t a g e o f r o a s t ; m o s t o f t h e v o l a t i l e s a r e f o r m e d i n t h e l a s t t w o m i n u t e s o f t h e r o a s t . A t t h e e n d o f r o a s t i n g a l d e h y d e s r e p r e s e n t 3 7 % , k e t o n e s 4 3 % , a l c o h o l s a b o u t 8 . 5 % a n d t h e f u r a n s , e s t e r s a n d s u l f i d e s e a c h a b o u t 4% o f t h e t o t a l v o l a t i l e s . T h e r a p i d i n c r e a s e s i n t h e v o l a t i l e s s h o w n i n t h e l a s t f e w m i n u t e s o f r o a s t t a k e s p l a c e w h e n t h e m a j o r n o n - v o l a t i l e c o n s t i t u e n t s o f c o f f e e , t h e p r o t e i n s , s u c r o s e a n d c h l o r o g e n i c a c i d , a r e r e a c t i n g a t p y r o l y s i s t e m p e r a t u r e s t o g i v e t h e new v o l a t i l e c o n s t i t u e n t s w h i c h a r e i m p o r t a n t t o t h e q u a l i t y o f t h e b e v e r a g e . 5 0 j S u l f i d e s 4 0 30 2 0 10J, # - 1 1 A l c o h o l s A l d e h y d e s Ke t o n e s F u r a n s E s t e r s • Mil 11 1 3 15 11 13 15 11 13 15 11 13 15 11 13 15 R o a s t i n g T i m e ( m i n ) 11 13 15 VO F I G U R E 1 7 . I n c r e a s e i n v o l a t i l e g r o u p s d u r i n g r o a s t i n g . 1 0 0 . D I S C U S S I O N 1. P o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n s A n a l y s i s o f t h e w a t e r s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e i s o l a t e d f r o m g r e e n b e a n p o w d e r i n d i c a t e d i t w a s a n a r a b i n o g a l a c t o m a n n a n ( 2 : 5 : 1 ) a c c o u n t i n g f o r 4% o f t h e g r e e n b e a n w e i g h t . H a s h i m o t o et al ( 4 5 ) f o u n d t h e m a j o r w a t e r s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e ( 7 . 5 - 8 . 9 % o f t h e g r e e n b e a n w e i g h t ) t o c o n s i s t o f a r a b i n o s e , g a l a c t o s e a n d m a n n o s e . W o l f r o m a n d P a t i n ( 4 1 ) f o u n d t h a t t h e m a j o r w a t e r s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e w a s a n a r a b i n o g a l a c t a n ( 2 : 5 ) , w h i l e C o u r t o i s e t ^ a l ( 4 2 ) q u a n t i t a t e d a n a r a b i n o g a l a c t a n i n a m o l a r r a t i o o f 1 t o 3.2. T h e l i t e r a t u r e i n t h i s a r e a i s v e r y c o n f l i c t i n g , b u t t h i s may i n p a r t b e d u e t o d i f f e r e n c e s i n e x t r a c t i o n p r o c e d u r e s ( c o l d o r h o t w a t e r ) o r j u s t v a r i e t a l d i f f e r e n c e s . T h e w a t e r - i n s o l u b l e p e c t i n i s o l a t e d a s a n ammonium o x a l a t e e x t r a c t o f t h e g r e e n b e a n w a s a n a l y z e d b y G.C. a n d f o u n d t o b e 4 p a r t s a r a b i n o s e , 1 p a r t r h a m n o s e , 6 p a r t s m a n n o s e , 9.5 p a r t s g a l a c t o s e a n d 0.77 p a r t s g a l a c t u r o n i c a c i d . W o l f r o m e t a l ( 3 9 ) i s o l a t e d s i m i l a r p e c t i n f r o m g r e e n c o f f e e , a m o u n t i n g t o 1 % o f t h e b e a n d r y w e i g h t . P a p e r c h r o m a t o g r a p h y o f t h e f r e e s u g a r s o f t h e i r h y d r o l y s a t e s h o w e d t h e m t o b e t h e same s u g a r s a s a b o v e . No q u a n t i t a t i o n o f t h e s u g a r s w a s p e r f o r m e d . 2. S o l u b l e s u g a r s T h e s u g a r c o n t e n t o f g r e e n a n d r o a s t e d c o f f e e b e a n s w a s c o m p a r e d t o d e t e r m i n e t h e e f f e c t o f r o a s t i n g o n t h i s c o m p o n e n t . A n e t h a n o l e x t r a c t o f g r e e n b e a n s c o n t a i n e d l o w m o l e c u l a r w e i g h t m a t e r i a l s a m o u n t i n g 1 0 1 . t o a p p r o x i m a t e l y 2 0 % o f t h e g r e e n b e a n w e i g h t a n d c o n s i s t i n g o f s u g a r s , a m i n o a c i d s , t r i g o n e l l i n e , c h l o r o g e n i c a c i d a n d c a f f e i n e ( 3 9 ) . A p y r i d i n e e x t r a c t o f t h i s m a t e r i a l c o n t a i n e d 3 .13 gm c a r b o h y d r a t e m a t e r i a l o f w h i c h 2.96 gm w a s s u c r o s e . S u c r o s e w a s c a l c u l a t e d t o b e 6 . 5 % o f t h e g r e e n b e a n d r y w e i g h t . T r a c e s o f f r u c t o s e a n d g l u c o s e w e r e a l s o i d e n t i f i e d . T r a c e a m o u n t s o f s u c r o s e w e r e f o u n d i n t h e r o a s t e d b e a n e x t r a c t , i n d i c a t i n g t h a t t h e s u c r o s e i s a l m o s t e n t i r e l y d e c o m p o s e d i n t h e r o a s t i n g p r o c e s s . T h e s u c r o s e i s d e h y d r a t e d a n d h y d r o l y z e d t o c a r m e l i z e d a n d d e c o m p o s e d s u g a r p r o d u c t s a s t h e t e m p e r a t u r e r i s e s t o t h e p y r o l y s i s p o i n t . M a n y o f t h e s e c o m p l e x s u g a r p r o d u c t s may b e p a r t i a l l y d e g r a d e d t o v o l a t i l e o r g a n i c s a n d CO^ g a s . F r u c t o s e a n d g l u c o s e w e r e a l s o d e t e c t e d i n t h e r o a s t e d b e a n e x t r a c t . Some p y r o l y s i s p r o d u c t s r e a c t w i t h p r o t e i n s a n d o t h e r d e g r a d a t i o n p r o d u c t s t o f o r m o t h e r c o f f e e c o n s t i t u e n t s . M o o r e s a n d S t e f a n u c c i ( 4 8 ) a n a l y z e d g r e e n a n d r o a s t e d c o f f e e a n d f o u n d t h a t t h e s u c r o s e c o n t e n t d r o p p e d f r o m 7 . 3 % t o 0 . 3 % a n d t h e r e d u c i n g s u g a r s f r o m 0.7% t o 0 . 3 % o f t h e b e a n w e i g h t . I n g e n e r a l , t h e s u c r o s e c o n t e n t o f t h e g r e e n b e a n s v a r i e s f r o m 5 - 1 0 % ( 4 6 ) a n d t h a t o f t h e r o a s t e d b e a n i s l e s s t h a n 1%. 3. A n a l y s i s o f a r o m a I n a n a t t e m p t t o i d e n t i f y some o f t h e m o r e v o l a t i l e c o n s t i t u e n t s r e s p o n s i b l e f o r t h e c h e m i c a l n a t u r e o f c o f f e e a r o m a , 1 5 c o m p o u n d s w e r e s e p a r a t e d a n d t e n t a t i v e l y i d e n t i f i e d . T h e e f f e c t o f r o a s t i n g o n t h e n o n - v o l a t i l e c o n s t i t u e n t s o f t h e g r e e n b e a n r e s u l t i n g i n t h e f o r m a t i o n o f t h e v o l a t i l e c o n s t i t u e n t s o f t h e r o a s t e d b e a n w a s d e t e r m i n e d b y a n a l y z i n g 1 0 2 . t h e v o l a t i l e s i n t h e h e a d s p a c e o v e r f r e s h l y g r o u n d b e a n s s a m p l e d a t e a c h m i n u t e o f r o a s t . T h e a r o m a c o m p o n e n t s w e r e d i v i d e d a c c o r d i n g t o t h e c h e m i c a l n a t u r e o f t h e i r f u n c t i o n a l g r o u p s : a l d e h y d e s , k e t o n e s , f u r a n s , s u l f i d e s , e s t e r s a n d a l c o h o l s . T h e p e r c e n t o f e a c h v o l a t i l e g r o u p a n d t h e t o t a l a m o u n t o f v o l a t i l e s f o r m e d a t e a c h m i n u t e o f r o a s t w e r e c o r r e l a t e d w i t h t h e t e m p e r a t u r e o f r o a s t . R o a s t e d c o f f e e b e a n s a r e o n l y o n e - h a l f a s d e n s e a s g r e e n c o f f e e b e a n s . T h e g r e e n b e a n c e l l s , made u p o f w o o d y a n d f i b r o u s b i n d i n g m a t t e r , m a ke t h e b e a n s e x t r e m e l y r e s i s t a n t t o g r i n d i n g a s c o m p a r e d t o t h e v e r y b r i t t l e n a t u r e o f t h e r o a s t e d c o f f e e b e a n . D u r i n g t h e f i r s t m i n u t e s o f r o a s t i n g , h e a t p a s s e s s l o w l y t h r o u g h t h e d e n s e g r e e n b e a n a n d t h e m o i s t u r e i s g r a d u a l l y d r i v e n o u t o f t h e b e a n c e l l s . V o l a t i l e s b e g i n t o f o r m a n d i n c r e a s e s t e a d i l y w i t h r o a s t i n g t e m p e r a t u r e ( T a b l e X X I V ) . T h e t y p i c a l g r e e n b e a n a r o m a d i s a p p e a r s a t 350°F ( 6 m i n ) d u e t o t h e a p p e a r a n c e o f a l d e h y d e s , k e t o n e s a n d a l c o h o l s . A t 365-370°F ( 8 - 9 m i n ) a p e a n u t -t y p e a r o m a b e c o m e s a p p a r e n t a s f u r a n s a n d s u l f i d e s b e g i n t o f o r m a n d t h e a l d e h y d e s , k e t o n e s a n d a l c o h o l s i n c r e a s e i n c o n c e n t r a t i o n . T h e v o l a t i l e c o n s t i t u e n t s o f r o a s t e d p e a n u t s h a v e b e e n c h a r a c t e r i z e d a n d i n c l u d e a l d e h y d e s , k e t o n e s , a l c o h o l s , f u r a n s , p y r a z i n e s a n d p y r o l l e s ( 8 0 ) ; many o f t h e s e h a v e b e e n i d e n t i f i e d a s c o n s t i t u e n t s o f c o f f e e a r o m a . A t p y r o l y s i s t e m p e r a t u r e s (390-400°F) t h e c o f f e e b e a n s s u d d e n l y s w e l l t o a l m o s t t w i c e t h e i r o r i g i n a l v o l u m e , r e v e a l i n g t h e c h a f f a t t h e b e a n c r e v i c e . . , T h e t y p i c a l b r o w n c o l o u r o f t h e r o a s t e d b e a n d e v e l o p s a t t h i s t i m e . O n l y 3 5 % o f t h e t o t a l v o l a t i l e s a r e f o r m e d . A t t h e p y r o l y s i s t e m p e r a t u r e t h e b e a n s a r e r o a s t i n g i n t h e i r o w n g a s s e s a n d a r e 1 0 3 . h e a t e d b y e x o t h e r m i c r e a c t i o n s w h i c h a r e o c c u r r i n g w i t h i n t h e b e a n c e l l s . I n t h e l a s t t w o m i n u t e s o f r o a s t t h e v o l a t i l e s i n c r e a s e s h a r p l y f r o m 5 0 % t o 1007 o o f t h e t o t a l v o l a t i l e s f o r m e d d u r i n g r o a s t i n g . T h e r o a s t i n g p r o c e s s i s e s s e n t i a l l y a d r y d i s t i l l a t i o n o f t h e r m a l l y d e c o m p o s e d o r g a n i c m a t e r i a l c o n s t i t u t i n g t h e g r e e n c o f f e e b e a n ; t h i s c a n b e c o m p a r e d t o t h e d r y d i s t i l l a t i o n o f b i t u m i n o u s c o a l i n o r d e r t o p r o d u c e c o k e , o r t o w o o d b e i n g c o n v e r t e d t o c h a r c o a l ( 4 7 ) . R o a s t i n g i s t e r m i n a t e d w h e n t h e d e s i r e d l e v e l o f a r o m a i s r e a c h e d ( 1 5 m i n ) . R o a s t i n g f o r l o n g e r t i m e s c a u s e s l o s s o f a r o m a a s v o l a t i l e s a r e d r i v e n o f f b y e x c e s s i v e t e m p e r a t u r e s . T h e s e d a t a a r e t y p i c a l f o r t h e C o l o m b i a n b e a n a n d t h i s t y p e o f r o a s t . G r e e n b e a n p r o p e r t i e s may i n f l u e n c e t h e r a t e o f t h e r o a s t i n g p r o c e s s a n d t h e c o m p o s i t i o n o f t h e v o l a t i l e s ; t h e b o t a n i c a l v a r i e t y , s i z e , s h a p e a n d m o i s t u r e c o n t e n t a r e j u s t a f e w o f t h e s e f a c t o r s . T h e p e a b e r r i e s , o r c o f f e e b e a n s f r o m t h e v e r y t i p o f a b r a n c h , f o r e x a m p l e , r o a s t f a s t e r t h a n t h e n o r m a l h e m i - e l l i p s o i d a l s h a p e d b e a n s d u e t o t h e i r r o u n d s h a p e a n d s m a l l s i z e . I n g e n e r a l , i t c a n b e s a i d t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f v o l a t i l e s i n c r e a s e s w i t h r o a s t i n g t i m e a n d t e m p e r a t u r e . T h e a l d e h y d e s a n d k e t o n e s r e p r e s e n t a l m o s t 7 5 % o f t h e t o t a l v o l a t i l e s f o r m e d . H y d r o g e n s u l f i d e , m e t h y l m e r c a p t a n a n d d i m e t h y l s u l f i d e w h i c h h a v e v e r y p o t e n t o d o r s d o n o t f o l l o w t h e g e n e r a l t r e n d o f i n c r e a s i n g v o l a t i l i t y , b u t i n f a c t d e c r e a s e o r r e m a i n t h e same d u r i n g t h e r o a s t i n g p r o c e s s . T h e e s t e r s o n l y r e a c h t h e i r m aximum c o n c e n t r a t i o n s w h e n r o a s t e d f o r l o n g e r p e r i o d s o f t i m e a t t e m p e r a t u r e s i n e x c e s s o f 400°F. Th e a r o m a o f c o f f e e i s v e r y c o m p l e x , n o t t h e s o l e e f f e c t o f a n 1 0 4 . i n d i v i d u a l c o m p o n e n t . I t o r i g i n a t e s f r o m a l a r g e n u m b e r o f s u b s t a n c e s b l e n d e d t o g e t h e r , i n c l u d i n g v o l a t i l e s o f v a r i o u s s t r u c t u r e s , c o n c e n t r a t i o n s a n d v o l a t i l i t i e s . P r o g r e s s i n t h i s a r e a h a s b e e n r e l a t i v e l y s l o w b u t t h e p r o b l e m may b e r e s o l v e d t h r o u g h t h e u t i l i z a t i o n o f m o r e m o d e r n i n s t r u m e n t a t i o n s u c h a s GC-mass s p e c t r o m e t e r s y s t e m s . M e r r i t e t a l ( 8 1 ) u s e d s u c h a s y s t e m t o i d e n t i f y s e v e r a l c o m p o n e n t s o f c o f f e e a r o m a . T h e v o l a t i l e c o m p o u n d s f r o m g r o u n d r o a s t e d c o f f e e w e r e c o l l e c t e d u n d e r h i g h v a c u u m b y d i s t i l l a t i o n f r o m r o o m t e m p e r a t u r e i n t o a r e c e i v e r a t l i q u i d n i t r o g e n t e m p e r a t u r e . U s e o f v a c u u m d i s t i l l a t i o n w i t h o u t h e a t w a s t h o u g h t t o g i v e a m o r e r e p r e s e n t a t i v e s a m p l e . A n a l y s i s o f t h i s f r a c t i o n i n d i c a t e d t h e p r e s e n c e o f m o r e t h a n 2 0 c o m p o u n d s , i n c l u d i n g many o f t h e a l d e h y d e s , k e t o n e s , e t c . f o u n d i n t h e p r e s e n t s t u d y . S t o f f e l s m a e_t al_ ( 5 6 ) i s o l a t e d 1 5 8 c o m p o u n d s f r o m a s o l v e n t e x t r a c t o f t h e s t e a m c o n d e n s a t e o f r o a s t e d c o f f e e a n d i d e n t i f i e d t h e m u s i n g i n f r a -r e d s p e c t r o p h o t o m e t r y , G.C. a n d m a s s s p e c t r o p h o t o m e t r y . Z l a t k i s a n d S i v e t z ( 5 5 ) i s o l a t e d a c o f f e e a r o m a e s s e n c e l a r g e l y c o m p o s e d o f a l d e h y d e s a n d s u l f i d e s . T h i s e s s e n c e h a d a n e x t r e m e l y p o w e r f u l o d o r a n d w a s a c l e a r y e l l o w - g r e e n l i q u i d w h i c h f l o a t e d o n w a t e r . T h e e s s e n c e q u i c k l y e v a p o r a t e d a t r o o m t e m p e r a t u r e a n d w a s s u b j e c t t o r a p i d a r o m a d e t e r i o r a t i o n w h e n o x i d i z e d . When d i l u t e d i n t h e a i r t h e e s s e n c e w a s s a i d t o g i v e a t r u e c o f f e e a r o m a . N i n e t e e n c o m p o u n d s w e r e i d e n t i f i e d i n t h i s f r a c t i o n , 1 3 o f w h i c h w e r e t h e same a s t h o s e i d e n t i f i e d b y t h i s s t u d y . W e i d e m a n n a n d M b h r ( 5 7 ) i s o l a t e d 3 6 3 c o m p o u n d s f r o m h e a d s p a c e , c a r b o n d i o x i d e a n d w a t e r f r a c t i o n s o f c o f f e e a r o m a . T h e s a m p l i n g p r o c e d u r e s i n t h e a b o v e s t u d i e s e m p l o y e d h e a t , s t e a m , 1 0 5 . a n d w a t e r o r s o l v e n t e x t r a c t i o n , i n d i v i d u a l l y o r i n c o m b i n a t i o n . T h e v a r i e t y o f s a m p l i n g m e t h o d s may i n p a r t e x p l a i n t h e d i s p a r i t y o f f i n d i n g s a s t h e i n t r o d u c t i o n o f s o l v e n t s a n d t h e u s e o f s t e a m o r w a t e r may c a u s e c h e m i c a l a l t e r a t i o n o f t h e v o l a t i l e c o m p o n e n t s . M a n y n o n - v o l a t i l e b u t e x t r a c t a b l e m a t e r i a l s may a l s o b e c o l l e c t e d b y t h e s e m e t h o d s , a n d s e p a r a t i o n o f t h e s e i m p u r i t i e s a s w e l l a s t h e s o l v e n t s c o m p l i c a t e s t h e p r o c e d u r e . R h o a d e s ( 8 2 ) u s e d a m e t h o d o f s a m p l i n g w h i c h e m p l o y e d a c a r r i e r g a s ( h e l i u m ) t o s w e e p t h e v o l a t i l e m a t e r i a l f r o m h e a t e d g r o u n d c o f f e e . T h e h e l i u m a n d s a m p l e w e r e p a s s e d t h r o u g h a n i c e w a t e r c o n d e n s o r t o r e m o v e w a t e r a n d t h e v o l a t i l e s w e r e c o l l e c t e d i n a l i q u i d n i t r o g e n t r a p . T h i s s y s t e m r e q u i r e s c o n s i d e r a b l e t i m e , a n d v o l a t i l e c o m p o n e n t s may b e l o s t b y f a i l u r e . t o b e c o n d e n s e d i n t h e c o l d t r a p . T h e s e d i f f e r e n c e s i n s a m p l e p r e p a r a t i o n a n d c o l l e c t i o n a n d i n a n a l y t i c a l m e t h o d s a n d p r o c e d u r e s h a v e l e d t o t h e many q u a n t i t a t i v e d i f f e r e n c e s i n t h e n u m b e r o f v o l a t i l e s a s s o c i a t e d w i t h c o f f e e a r o m a . I n s p i t e o f t h e i d e n t i f i c a t i o n o f a l a r g e n u m b e r o f v o l a t i l e c o m p o n e n t s i n r o a s t e d c o f f e e , a r o m a r e -c o n s t i t u t i o n h a s y e t t o b e a c c o m p l i s h e d . 1 0 6 . C O NCLUSIONS (PAR T I AND I I ) T h e E P S p r o d u c e d b y s u s p e n s i o n - c u l t u r e d c o f f e e c e l l s c o n t a i n e d v a r i o u s p o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n s w h i c h a r e r e m a r k a b l y s i m i l a r t o t h e g r e e n b e a n p o l y s a c c h a r i d e s . T h e n e u t r a l a r a b i n o g a l a c t o m a n n a n f r a c t i o n f r o m t h e E P S i s q u a n t i t a t i v e l y a n d q u a l i t a t i v e l y i d e n t i c a l t o t h e g r e e n b e a n f r a c t i o n a n d b o t h h a v e m o l a r r a t i o s o f 2 : 5 : 1 . T h e a c i d i c p o l y s a c c h a r i d e f r o m t h e g r e e n b e a n c o n t a i n e d a r a b i n o s e , m a n n o s e , g a l a c t o s e , r h a m n o s e a n d g a l a c t u r o n i c a c i d ; t h a t f r o m t h e c o f f e e c e l l E P S c o n t a i n e d m o s t o f t h e s e s u g a r s b u t l a c k e d r h a m n o s e . T h e m o l a r r a t i o s o f a r a b i n o s e a n d g a l a c t o s e w e r e i d e n t i c a l . A l a r g e r p r o p o r t i o n o f g a l a c t u r o n i c a c i d w a s f o u n d i n t h e E P S f r a c t i o n w h i l e a h i g h e r l e v e l o f m a n n o s e w a s f o u n d . i n t h e g r e e n b e a n a c i d i c f r a c t i o n . T h e l a c k o f r h a m n o s e i n t h e E P S a n d t h e d i f f e r e n c e s i n g a l a c t u r o n i c a c i d l e v e l s c o u l d b e d u e t o t h e r e s i s t a n c e o f p e c t i c p o l y s a c c h a r i d e s t o a c i d h y r o l y s i s . B o t h f r a c t i o n s l a c k e d g l u c o s e a n d x y l o s e . T h e n e u t r a l x y l o g a l a c t o g l u c a n f r a c t i o n f r o m t h e E P S i s d i f f e r e n t f r o m * t h e a l k a l i s o l u b l e h o l o c e l l u l o s e o f t h e g r e e n b e a n , w h i c h i s p r i m a r i l y a g a l a c t o m a n n a n ( 6 0 - 7 0 % m a n n o s e ) . T h e d i f f e r e n c e i n t h i s f r a c t i o n m a y b e e x p l a i n e d b y t h e f a c t t h a t t h e g r e e n b e a n i s a s p e c i a l i z e d s t o r a g e o r g a n w h i l e t h e c u l t u r e d c o f f e e c e l l s a r e e m b r y o n i c o r u n d i f f e r e n t i a t e d c e l l s . T h e c e l l s f r o m g r e e n b e a n s a n d c u l t u r e d c o f f e e c e l l s a r e l e s s s i m i l a r t h a n a r e t h e i r c e l l w a l l s . T h i s i s t o b e e x p e c t e d a s c e l l w a l l s a r e s t a n d a r d e q u i p m e n t w h i l e e n d o s p e r m c e l l s s e r v e a d i f f e r e n t 1 0 7 . f u n c t i o n f r o m t h e s t e m o r p e r i c a r p c e l l s w h i c h g a v e r i s e t o t h e c u l t u r e s . T h e s u s p e n s i o n - c u l t u r e d c e l l s , a l t h o u g h u n d i f f e r e n t i a t e d , r e t a i n t h e i r i d e n t i t y a s c o f f e e c e l l s ; t h e p o l y s a c c h a r i d e f r a c t i o n s o f t h e g r e e n b e a n a n d c u l t u r e d c e l l s a r e s i m i l a r . B o t h o f t h e s e a r e d i f f e r e n t f r o m t h e p o l y s a c c h a r i d e o f a n u n r e l a t e d s p e c i e s , i . e . s y c a m o r e c e l l s . S u c r o s e i s t h e m a j o r s t o r a g e c a r b o h y d r a t e c o m p o n e n t o f t h e g r e e n b e a n s , w i t h f r u c t o s e a n d g l u c o s e p r e s e n t i n t r a c e q u a n t i t i e s . F r u c t o s e , g l u c o s e , s u c r o s e a n d i n o s i t o l h a v e b e e n i d e n t i f i e d a s t h e m a j o r c o m p o n e n t s o f c o f f e e c e l l s , w i t h f r u c t o s e a c c u m u l a t i n g i n t h e c e l l s w i t h c u l t u r e a g e . T h e s e d i f f e r e n c e s a r e e x p l a i n e d b y t h e n a t u r e a n d f u n c t i o n o f t h e c e l l s . C u l t u r e d c e l l s f r o m t h e l o g a r i t h m i c p h a s e a r e r a p i d l y d i v i d i n g a n d u t i l i z i n g s u g a r s f r o m t h e m e d i u m ; w h i l e t h e c e l l s o f t h e c o f f e e b e a n a r e q u i e s c e n t s t o r a g e u n i t s . T h e p r o d u c t i o n o f a s p e c i f i c p r o d u c t s u c h a s E P S b y c u l t u r e d c o f f e e c e l l s i m p l i e s t h a t t h e . p o t e n t i a l o f t h e c u l t u r e s y s t e m c o u l d b e e x p l o i t e d f o r t h e p r o d u c t i o n o f c o m m e r c i a l l y d e s i r a b l e p r o d u c t s . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n i n t h i s a r e a c o u l d b e m o s t r e w a r d i n g . 1 0 8 . B I B L I O G R A P H Y 1. G a u t h r e t , R . J . , 1 9 3 9 , S u r l a p o s s i b i l i t e d e r e a l i s e r l a c u l t u r e i n d e f i n i e d e s t i s s u s de t u b e r c u l e s de c a r o t t e , C.R. A c a d . S c i . ( P a r i s ) 2 0 8 : 1 1 8 . 2. W h i t e , P.R., 1 9 3 9 , P o t e n t i a l l y u n l i m i t e d g r o w t h o f e x c i s e d p l a n t c a l l u s i n a n a r t i f i c i a l n u t r i e n t , Am. J . B o t . 2 6 : 5 9 . . 3. P u h a n , Z. a n d S.M. M a r t i n , 1 9 7 1 , T h e i n d u s t r i a l p o t e n t i a l o f p l a n t c e l l c u l t u r e , i n " P r o g r e s s i n I n d u s t r i a l M i c r o b i o l o g y " , e d . D.J.D. H o c k e n h u l ( L o n s o n : J.& A. C h u r c h i l l ) V o l . 9, p . 1 4 . 4. H i l d e b r a n d t , A.C., 1 9 7 0 , C e n t r a l m e c h a n i s m s i n t h e e x p r e s s i o n o f c e l l u l a r p h e n o t y p e s , Symp. I n t . S o c . C e l l B i o l . 9: 1 4 7 . 5. H a l p e r i n , W., 1 9 6 9 , M o r p h o g e n e s i s i n c e l l c u l t u r e s , A n n . R e v . P l a n t P h y s i o l . 2 0 : 3 9 5 . 6. K r i k o r i a n , A.D. a n d F . C . S t e w a r d , 1 9 6 9 , i n " P l a n t P h y s i o l o g y " , e d . F.C. S t e w a r d , ( N . Y . : A c a d e m i c P r e s s ) V o l . V - B , p . 2 2 7 . 7. C a r e w , D.P. a n d E . J . S t a b a , 1 9 6 5 , P l a n t t i s s u e c u l t u r e : I t s f u n d a m e n -t a l s , a p p l i c a t i o n a n d r e l a t i o n s h i p t o m e d i c i n a l p l a n t s t u d i e s , L l o y d i a 2 8 : 1. 8. K l e i n , R.M., 1 9 6 0 , P l a n t t i s s u e c u l t u r e s , a p o s s i b l e s o u r c e o f p l a n t c o n s t i t u e n t s , E c o n o m i c B o t a n y 1 4 : 2 8 6 . 9. N i c k e l l , L.G., 1 9 6 2 , S u b m e r g e d g r o w t h o f p l a n t c e l l s , i n " A d v a n c e s i n A p p l i e d M i c r o b i o l o g y " , e d . D. P e r l m a n ( N . Y . : A c a d e m i c P r e s s ) V o l . 4, p . 2 1 3 . 1 0 . J o h n s o n , I . S . a n d G.B. B o d e r , 1 9 7 2 , M e t a b o l i t e s f r o m a n i m a l a n d p l a n t c e l l c u l t u r e , i n " A d v a n c e s i n A p p l i e d M i c r o b i o l o g y " , e d . D. P e r l m a n ( N . Y . : A c a d e m i c P r e s s ) V o l . 1 5 , p. 2 1 5 . 1 1 . S t a b a , E . J . , 1 9 6 3 , The b i o s y n t h e t i e p o t e n t i a l o f p l a n t t i s s u e c u l t u r e s , D e v e l o p m e n t s i n I n d u s t r i a l M i c r o b i o l o g y 4: 1 9 3 . 1 2 . I s r a e l , H.W., M.D. M a p e s a n d F . C . S t e w a r d , 1 9 6 9 , P i g m e n t s a n d p l a s t i d s o f t o t i p o t e n t c a r r o t c e l l s , Am. J . B o t . 5 6 : 9 1 0 . 1 3 . S t a r i t s k y , G., 1 9 7 0 , E m b r y o i d f o r m a t i o n i n c a l l u s t i s s u e s o f c o f f e e , A c t a B o t . N e e r l . 1 9 : 5 0 9 . 1 4 . K e l l e r , H., H. W a n n e r a n d T.W. B a u m a n , 1 9 7 2 , C a f f e i n e s y n t h e s i s i n f r u i t s a n d t i s s u e c u l t u r e s o f C o f f e a a r a b i c a , P l a n t a 1 0 8 : 3 3 9 . 1 0 9 . 1 5 . B u c k l a n d , E . L . , 1 9 7 2 , C e l l s u s p e n s i o n c u l t u r e s t u d i e s o f t h e C o f f e a a r a b i c a L . , M S c T h e s i s , D e p t . F d . S c i . , U.B.C. 1 6 . v a n . d e V o o r t , F . , 1 9 7 4 , F a t t y a c i d s a n d s t e r o l s o f c o f f e e a n d m i n t p l a n t c e l l s c u l t u r e s , M S c . T h e s i s , D e p t . F d . S c i . , U.B.C. 17 . T o w n s l e y , P.M., 1 9 7 1 , T h e a p p l i c a t i o n o f p l a n t c e l l c u l t u r e t o t h e f o o d i n d u s t r y , p r e s e n t e d t o P a c i f i c D i v i s i o n , A m e r . A s s o c . A d v . S c i . , U n i v . o f C a l i f . , S a n D i e g o . 1 8 . T o w n s l e y , P.M. a n d E . L . B u c k l a n d , 1 9 7 2 , A new s o u r c e o f c o f f e e , C a n . 1 2 9 , 9 2 0 ( p a t . p e n d . ) . 1 9 . A l b e r s h e i m , P., 1 9 6 5 , T h e s u b s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f t h e c e l l , w a l l , i n " P l a n t B i o c h e m i s t r y " , e d . J . B o n n e r a n d J . E . V a r n e r ( N . Y . : A c a d e m i c P r e s s ) p . 1 5 1 . 2 0 . L a m p o r t , D.T.A., 1 9 6 5 , The p r o t e i n c o m p o n e n t o f p r i m a r y c e l l w a l l s , A d v . B o t . R e s e a r c h 2: 1 5 1 . 2 1 . O l s o n , A . C . , 1 9 6 4 , P r o t e i n s a n d p l a n t c e l l w a l l s : p r o l i n e t o h y d r o x y -p r o l i n e i n t o b a c c o s u s p e n s i o n c u l t u r e s , P l a n t P h y s i o l . 3 9 : 5 4 3 . 2 2 . C h r i s p e e l s , M . J . , 1 9 6 9 , S y n t h e s i s a n d s e c r e t i o n o f h y d r o x y p r o l i n e c o n t a i n i n g m a c r o m o l e c u l e s i n c a r r o t s : ( 1 ) : K i n e t i c a n a l y s i s , P l a n t P h y s i o l . 4 4 : 1 1 8 7 . 2 3 . R o b e r t s , K. a n d D.H. N o r t h c o t e , 1 9 7 2 , H y d r o x y p r o l i n e : O b s e r v a t i o n s o n i t s c h e m i c a l a n d a u t o r a d i o g r a p h i c a l l o c a l i z a t i o n i n p l a n t c e l l s w a l l p r o t e i n , P l a n t a 1 0 7 : 4 3 . 2 4 . D a s h e k , W.V., 1 9 7 0 , S y n t h e s i s a n d t r a n s p o r t o f h y d r o x y p r o l i n e - r i c h c o m p o n e n t s i n s u s p e n s i o n c u l t u r e s o f s y c a m o r e m a p l e c e l l s , P l a n t P h y s i o l . 4 6 : 8 3 1 . 2 5 . A s p i n a l l , G.O., 1 9 7 0 , P e c t i n s , p l a n t gums a n d o t h e r p l a n t p o l y -s a c c h a r i d e s , i n "The C a r b o h y d r a t e s " , e d . W. P i g m a n a n d D. H o r t o n ( N . Y . : A c a d e m i c P r e s s ) V o l . I I A, p . 5 M . 2 6 . W h i s t l e r , R . L . a n d E . L . R i c h a r d s , 1 9 7 0 , H e m i c e l l u l o s e s . , i n "The C a r b o h y d r a t e s " , e d . W. P i g m a n a n d D. H o r t o n ( N . Y . : A c a d e m i c P r e s s ) V o l . I I A, p . 4 4 7 . 2 7 . S t o d d a r t , R.W., A . J . B a r r e t t a n d D.H. N o r t h c o t e , 1 9 6 7 , P e c t i c p o l y -s a c c h a r i d e s o f g r o w i n g p l a n t t i s s u e s , B i o c h e m . J . 1 0 2 : 1 9 4 . 2 8 . B a r r e t t , A . J . a n d D.H. N o r t h c o t e , 1 9 6 5 , A p p l e f r u i t p e c t i c s u b s t a n c e s , B i o c h e m . J . 9 4 : 6 1 7 . 1 1 0 . 2 9 . T a l m a d g e , K.W., K. K e e g s t r a , W.D. B a u e r a n d P. A l b e r s h e i m , 1 9 7 3 , T h e s t r u c t u r e o f p l a n t c e l l w a l l s ( I ) : T h e m a c r o m o l e c u l a r c o m p o n e n t s o f t h e w a l l s o f s u s p e n s i o n c u l t u r e d s y c a m o r e c e l l s w i t h a d e t a i l e d a n a l y s i s o f t h e p e c t i c p o l y s a c c h a r i d e s , P l a n t P h y s i o l . 5 1 : 1 5 8 . 3 0 . T a l m a d g e , K.W., W.D. B a u e r , K, K e e g s t r a a n d P. A l b e r s h e i m , 1 9 7 3 , T h e s t r u c t u r e o f p l a n t c e l l w a l l s ( I I ) . T h e h e m i c e l l u l o s e o f t h e w a l l s o f s u s p e n s i o n c u l t u r e d s y c a m o r e c e l l s , P l a n t P h y s i o l . 5 1 : 1 7 4 . 3 1 . S m i t h , M.M. a n d B.A. S t o n e , 1 9 7 3 , C h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f t h e c e l l w a l l s o f L o l i u m m u l t i f l o r u m e n d o s p e r m , P h y t o c h e m . 1 2 : 1 3 6 1 . 3 2 . B e c k e r , G.E., P.A. J u i a n d P. A l b e r s h e i m , 1 9 6 4 , S y n t h e s i s , o f . e x t r a -c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e b y s u s p e n s i o n s o f A c e r p s e u d o p l a t a n u s c e l l s , P l a n t P h y s i o l . 3 9 : 9 1 3 . 3 3 . A s p i n a l l , G.O., J . A . M o l l o y a n d J.W.T. C r a i g , 1 9 6 9 , E x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e s f r o m s u s p e n s i o n c u l t u r e d s y c a m o r e c e l l s , C a n . J . B i o c h e m . 4 7 : 1 0 6 3 . 3 4 . O l s o n , A . C . , J . J . E v a n s , D.P. F r e d e r i c k a n d E.T. J a n s e n , 1 9 6 9 , P l a n t s u s p e n s i o n c u l t u r e m e d i a m a c r o m o l e c u l e s - - p e c t i c s u b s t a n c e s , p r o t e i n a n d p e r o x i d a s e s , P l a n t P h y s i o l . 4 4 : 1 5 9 4 . 3 5 . H a w e s , G.B. a n d G.A. A d a m s , 1 9 7 2 , E x t r a c e l l u l a r a r a b i n o g a l a c t a n f r o m s u s p e n s i o n c u l t u r e d r e d k i d n e y b e a n r o o t c e l l s , P h y t o c h e m . 1 1 : 1 4 6 1 . 3 6 . L i a u , D e n g - F o n g a n d W.G. B o l l , 1 9 7 2 , E x t r a c e l l u l a r p o l y s a c c h a r i d e f r o m c e l l s u s p e n s i o n c u l t u r e s o f b u s h b e a n ( P h a s e o l u s v u l g a r i s c v . c o n t e n d e r ) , C a n . J . B o t . 5 0 : 2 0 3 1 . 3 7 . Wu, C h u i - H u i , 1 9 7 0 , T h e s i n g l e c e l l s u s p e n s i o n c u l t u r e o f t h e l i c o r i c e p l a n t , G l y c y r r h i z a g l a b r a , M S c . T h e s i s , D e p t . F d . S c i . , U.B.C. 3 8 . M o o r e , T.S. J r . , 1 9 7 3 , A n e x t r a c e l l u l a r m a c r o m o l e c u l a r c o m p l e x f r o m t h e s u r f a c e o f s o y b e a n s u s p e n s i o n c u l t u r e s , P l a n t P h y s i o l . 5 1 : 5 2 9 . 3 9 . W o l f r o m , M.L., R.A. P l u n k e t t a n d M . L . L a v e r , 1 9 6 0 , C a r b o h y d r a t e s o f t h e c o f f e e b e a n , J . A g r . F o o d Chem. 8: 5 8 . 4 0 . G l o m a u d , J . C . , F. P e r c h e r o n a n d J . E . C o u r t o i s , 1 9 6 5 , C o m p a r i s o n o f t h e o l i g o s a c c h a r i d e c o n t e n t s o f some r a w c o f f e e s , p r e l i m i n a r y s t u d y o f w a t e r - s o l u b l e p o l y s a c c h a r i d e s , P r o c . 2 n d C o l l o q , I n t e r n . C h i m . C a f e s V e r t s , T o r r e f i e s L e u r s D e r i v . , A s s o c . S c i . I n t . C a f e s ( P a r i s ) p . 3 9 . 1 1 1 . 4 1 . W o l f r o m , M.L. a n d D.L. P a t i n , 1 9 6 5 , C a r b o h y d r a t e s o f t h e c o f f e e b e a n 4. A n a r a b i n o g a l a c t a n , J . O r g a n i c Chem. 3 0 : 4 0 6 0 . 4 2 . C o u r t o i s , J . E . , F. P e r c h e r o n a n d J . C . G l o m a u d , 1 9 6 3 , P r e l i m i n a r y r e p o r t o n w a t e r s o l u b l e , o l i g o s a c c h a r i d e s a n d p o l y s a c c h a r i d e s o f g r e e n c o f f e e ( C o f f e a c a n e p h o r a v a r r o b u s t a ) , T h e C a f e , C a c a o 7: 2 3 1 . 4 3 . T h a l e r , H. a n d W. A r n e t h , 1968,. C o f f e e , and. c o f f e e s u b s t i t u t e s ( I I ) : P o l y s a c c h a r i d e s o f g r e e n C o f f e a a r a b i c a b e a n s , Z. L e b e n s m . -U n t e r s . F o r s c h 1 3 8 : 2 6 . 4 4 . T h a l e r , H. a n d W. A r n e t h , 1 9 6 7 , H i g h l y p o l y m e r i z e d c a r b o h y d r a t e s o f g r e e n a n d r o a s t e d c o f f e e , P r o c . 3 r d I n t . C o l l o q . Chem. C o f f e e , p . 1 2 7 . 4 5 . H a s h i m o t o , Y., Y. T s u j i s u k a a n d J . F u k u m o t o , 1 9 7 0 , C o m p o s i t i o n a n d c o n t e n t o f p o l y s a c c h a r i d e s i n c o f f e e b e a n s , K a g a k u To K o g y o ( O s a k a ) 4 4 : 2 3 0 . 4 6 . F e l d m a n , J . R . , W.S, R y d e r a n d J . T , K u n g , 1 9 6 9 , I m p o r t a n c e o f n o n -v o l a t i l e c o m p o u n d s t o t h e f l a v o u r o f c o f f e e , J . A g r . F o o d Chem. 1 7 : 7 3 3 . 4 7 . S i v e t z , M. a n d H. F o o t e , 1 9 6 3 , " C o f f e e P r o c e s s i n g T e c h n o l o g y " ( N . Y . : A v i P u b . C o . I n c . ) V o l . 1. 4 8 . M o o r e s , R . G . a n d A. S t e f a n u c c i ( e d s ) , 1 9 6 4 , " E n c y c l o p e d i a o f C h e m i c a l T e c h n o l o g y " (N.Y.: 1 W i l e y C o . ) V o l . V. 4 9 . R u s s w u r m , H. J r . , 1 9 6 9 , F r a c t i o n a t i o n a n d a n a l y s i s o f a r o m a p r e c u r s o r s i n g r e e n c o f f e e , P r o c . 4 t h C o l l o q . I n t e r n . C h i m . C a f e s V e r t s , T o r r e f i e s L e u r s D e r i v . , A s s o c . S c i . I n t . C a f e s ( P a r i s ) , p . 1 0 3 . 5 0 . R o h a n , T.A. a n d T. S t e w a r t , 1 9 6 6 , T h e p r e c u r s o r s o f c h o c o l a t e a r o m a : C h a n g e s i n t h e f r e e a m i n o a c i d s d u r i n g t h e r o a s t i n g o f c o c o a b e a n s , J . F o o d S c i . 3 1 : 2 0 2 . 5 1 . R o h a n , T . A . a n d T. S t e w a r t , 1 9 6 6 , T h e p r e c u r s o r s o f c h o c o l a t e a r o m a : C h a n g e s i n t h e s u g a r s d u r i n g t h e r o a s t i n g o f c o c o a b e a n s , J . F o o d S c i . 3 1 : 2 0 6 . 5 2 . R o h a n , T.A., 1 9 6 3 , C h o c o l a t e a r o m a p r e c u r s o r s , J . S c i . F o o d A g r . 1 4 : 7 9 9 . 5 3 . G a u t s c h i , F . , M. W i n t e r , A. F l a m e n t , B. W i l l h a l m a n d M. S t o l l , 1 9 6 7 , New d e v e l o p m e n t s i n c o f f e e a r o m a r e s e a r c h , J . A g r . F o o d Chem. 1 5 : 1 5 . 1 1 2 . 5 4 . M e r r i t t , C. J r . , D.H. R o b e r t s o n a n d D . J . M c A d o o , 1 9 6 9 , R e l a t i o n o f v o l a t i l e c o m p o u n d s i n r o a s t e d c o f f e e b e a n s t o t h e i r p r e c u r s o r s , P r o c . 4 t h C o l l o q . I n s t . C h i m . G a f e s V e r t s , T o r r e f i e s L e u r s D e r i v . , A s s o c . S c i . I n t . G a f e s ( P a r i s ) p . 1 4 4 . 5 5 . Z l a t k i s , A. a n d M. S i v e t z , 1 9 6 0 , A n a l y s i s o f c o f f e e v o l a t i l e s b y g a s c h r o m a t o g r a p h y , J . F o o d S c i . 2 5 : 3 9 5 . 5 6 . S t o f f e l s m a , J . , G. S i m p a , D.K. K e t t e n e s a n d J . p y p k e r , 1 9 6 8 , New v o l a t i l e c o m p o u n d s o f r o a s t c o f f e e , J . A g r . F o o d Chem. 1 6 : 1 0 0 0 -5 7 . W e i d e m a n n , H.L. a n d W. M o h r , 1 9 7 0 , S p e c i f i c i t y o f r o a s t e d c o f f e e a r o m a , a r e v i e w , L e b e n s m . - W i s s . T e c h n o l . 1 3 : 2 3 . 5 8 . v a n d e V o o r t , F. a n d P.M. T o w n s l e y , 1 9 7 4 , A g a s c h r o m a t o g r a p h i c c o m p a r i s o n o f t h e f a t t y a c i d s o f t h e g r e e n c o f f e e b e a n , C o f f e a  a r a b i c a a n d t h e s u b m e r g e d c o f f e e c e l l c u l t u r e , C a n . I n s t . F o o d S c i . T e c h . J . 7: 8 2 . 5 9 . L e v v y , G.A., A . J . H a y , J . G o n c h i e a n d I . S t r a c h a n , 1 9 7 0 , D e t e r m i n a t i o n o f t h e i n d i v i d u a l n e u t r a l a n d a m i n o s u g a r s i n c a r b o h y d r a t e s , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 2 2 2 : 3 3 3 . 6 0 . S w e e l e y , C.C., R. B e n t l y , M. M a k i t a a n d W.W. W e l l s , 1 9 6 3 , G a s l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y o f t r i m e t h y l s i l y l d e r i v a t i v e s o f s u g a r s a n d r e l a t e d s u b s t a n c e s , J . Am. Chem. S o c . 8 5 ? 2 4 9 7 . 6 1 . R a n d e r a t h , K., 1 9 6 6 , " T h i n L a y e r C h r o m a t o g r a p h y " ( N . Y . : A c a d e m i c P r e s s ) . 6 2 . Z w e i g , G. a n d J . S h e r m a ( e d s ) , 1 9 7 2 , "CRC H a n d b o o k o f C h r o m a t o g r a p h y " ( C l e v e l a n d i r ' c G R C P r e s s ) . 6 3 . S t e w a r d , F .C. a n d A.D. K r i k o r i a n , 1 9 7 1 , " P l a n t s , C h e m i c a l s a n d G r o w t h " ( N . Y . : A c a d e m i c P r e s s ) . 6 4 . S k o o g , F. a n d C.O. M i l l e r , 1 9 5 7 , C h e m i c a l r e g u l a t i o n o f g r o w t h a n d o r g a n f o r m a t i o n i n p l a n t t i s s u e c u l t u r e d i n v i t r o , Symp. S o c . E x p t l . B i o l . 1 1 : 1 1 8 . 6 5 . W r i g h t , K. a n d D.H. N o r t h c o t e , 1 9 7 2 , I n d u c e d r o o t d i f f e r e n t i a t i o n i n s y c a m o r e c a l l u s , J . C e l l S c i . 1 1 : 3 1 9 . 6 6 . R u b e r y , P.H. a n d D.H. N o r t h c o t e , 1 9 7 0 , T h e e f f e c t o f a u x i n ( 2 , 4 - D ) o n t h e s y n t h e s i s o f c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s i n c u l t u r e d s y c a m o r e c e l l s , B i o c h i m . B i o p h y s . A c t a 2 2 2 : 9 5 . 6 7 . P o l l a r d , J . K . , E.M. S h a n t z a n d F . C . S t w e a r d , 1 9 6 1 , H e x i t o l s i n c o c o n u t m i l k ; t h e i r r o l e i n n u r t u r e o f d i v i d i n g c e l l s , P l a n t P h y s i o l . 3 6 : 4 9 2 . 1 1 3 . 6 8 . R o b e r t s , R . M . a n d F. L o e w u s , 1 9 6 6 , I n o s i t o l m e t a b o l i s m i n p l a n t s I I I . C o n v e r s i o n o f m y o - i n o s i t o l - 2 - ^ H t o c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e i n s y c a m o r e c e l l c u l t u r e , P l a n t P h y s i o l . 4 1 : 1 4 8 9 . 6 9 . L o e w u s , F . , M i n - S h e n C h e n a n d M.W. L o e w u s , 1 9 7 3 , T h e m y o - i n o s i t o l o x i d a t i o n p a t h w a y t o c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s , i n " B i o g e n e s i s o f P l a n t C e l l W a l l P o l y s a c c h a r i d e s " , e d . F , L o e w u s ( N . Y . : A c a d e m i c P r e s s ) p . 1. 7 0 . S i m p k i n s , I . a n d H.E. S t r e e t , 1 9 7 0 , S t u d i e s o n t h e g r o w t h i n c u l t u r e o f p l a n t c e l l s V I I . E f f e c t s o f k i n e . t i n o n t h e c a r b o h y d r a t e s a n d n i t r o g e n m e t a b o l i s m o f A c e r p s e u d o p i a t a n u s L. c e l l s g r o w n i n s u s p e n s i o n c u l t u r e , J.. E x p t l . B o t . 2 1 : 1 7 0 . 7 1 . A l b e r s h e i m , P., 1 9 6 5 , B i o g e n e s i s o f t h e . c e l l w a l l , i n " P l a n t B i o -c h e m i s t r y " , e d . J . B o n n e r a n d J . E . V a r n e r ( N . Y . : A c a d e m i c P r e s s ) p . 2 9 8 . 72. R a y , P.M., 1 9 6 3 , S u g a r c o m p o s i t i o n o f o a t - c o l e o p t i l e r c e l l w a l l s , B i o c h e m . J . 8 9 : 1 4 4 . 7 3 . W i l d e r , B.M. a n d P. A l b e r s h e i m , 1 9 7 3 , T h e s t r u c t u r e o f p l a n t c e l l w a l l s ( I V ) : A s t r u c t u r a l c o m p a r i s o n o f t h e w a l l h e m i c e l l u l o s e o f c e l l s u s p e n s i o n c u l t u r e s o f . s y c a m o r e ( A c e r p s e u d o p l a t a n u s ) a n d o f r e d k i d n e y b e a n ( P h a s e o l u s v u l g a r i s ) , P l a n t P h y s i o l . 5 1 : 8 8 9 . 74. N i v e n s , D . J . , P.D. E n g l i s h a n d P. A l b e r s h e i m , 1 9 6 7 , T h e s p e c i f i c n a t u r e o f p l a n t c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e s , P l a n t P h y s i o l . 4 2 : 9 0 0 . 7 5 . A l b e r s h e i m , P., W.D. B a u e r , K. K e e g s t r a a n d K.W. T a l m a d g e , 1 9 7 3 , The. s t r u c t u r e o f t h e w a l l o f s u s p e n s i o n c u l t u r e d s y c a m o r e c e l l s , i n " B i o g e n e s i s o f P l a n t C e l l W a l l P o l y s a c c h a r i d e s " , e d . F. L o e w u s ( N . Y . : A c a d e m i c P r e s s ) p . 1 1 7 . 7 6 . N i c k e l l , L.G. a n d A. M a r e t z k i , 1 9 7 2 , D e v e l o p m e n t a l a n d b i o c h e m i c a l s t u d i e s w i t h c u l t u r e d s u g a r c a n e s u s p e n s i o n s , F e r m e n t . T e c h . T o d a y ' ( P r o c . I V , I F S ) p . 6 8 1 . 7 7 . T h o r p e , T.A. a n d D.D. M e i e r , 1 9 7 3 , S u c r o s e m e t a b o l i s m d u r i n g t o b a c c o c a l l u s g r o w t h , P h y t o c h e m . 1 2 : 4 9 3 . 78. R o b e r t s , R.M. a n d F. L o e w u s , 1 9 7 3 , T h e c o n v e r s i o n o f D - g l u c o s e - 6 - i ^ C t o c e l l w a l l p o l y s a c c h a r i d e m a t e r i a l i n Z e a m a y s i n t h e p r e s e n c e o f h i g h e n d o g e n o u s l e v e l s o f m y o - i n o s i t o l , P l a n t P h y s i o l . 5 2 : 6 4 6 . 7 9 . S t r e e t , H.E., H.A. C o l l i n , K. S h o r t a n d I . S i m p k i n s , 1 9 6 8 , H o r m o n a l c o n t r o l o f c e l l d i v i s i o n a n d e x p a n s i o n i n s u s p e n s i o n c u l t u r e s o f A c e r p s e u d o p l a t a n u s • L . : T h e a c t i o n o f k i n e t i n , I n " B i o c h e m i s t r y a n d P h y s i o l o g y o f P l a n t G r o w t h S u b s t a n c e s " , e d . F. W i g h t m a n a n d G. S e t t e r f i e l d ( O t t a w a : R u n g e P r e s s L t d . ) p . 4 8 9 . 1 1 4 . 8 0 . J o h n s o n , B.R., G.R. W a l l e r a n d R . L . F o l t z , 1 9 7 1 , V o l a t i l e c o n s t i t u e n t s o f r o a s t e d p e a n u t s , J . A g r . F o o d Chem. 1 9 : 1 0 2 5 . 8 1 . M e r r i t , C. J r . , M.L. B a z i n e t , J . H . S u l l i v a n a n d D.H. R o b e r t s o n , 1 9 6 3 , M a s s s p e c t r o p h o t o m e t r y d e t e r m i n a t i o n o f t h e v o l a t i l e c o m p o n e n t s f r o m g r o u n d c o f f e e , J . A g r . F o o d Chem. 1 1 : 1 5 2 . 8 2 . R h o a d e s , J.W., 1 9 5 9 , S a m p l i n g m e t h o d f o r a n a l y s i s o f c o f f e e v o l a t i l e s b y g a s c h r o m a t o g r a p h y , F o o d R e s . 2 3 : 2 5 4 . 8 3 . G a m b o r g , O.L. a n d D.E. E v e l e i g h , 1 9 6 8 , C u l t u r e m e t h o d s a n d d e t e c t i o n o f g l u c a n a s e s i n s u s p e n s i o n c u l t u r e s o f w h e a t a n d b a r l e y , C a n . J . B i o c h e m . 4 6 : 4 1 7 . 8 4 . M o t o y o s h i , F. a n d N. Oshima,, 1 9 6 8 , S u s p e n s i o n c u l t u r e o f t o b a c c o c e l l s , N i c o t i a n a t a b a c u m p i t h . , J a p a n . J J . M i c r o b i o l . 1 2 : 3 1 7 . A P P E N D I X : FORMULAE FOR C U L T U R E M E D I A F o r m u l a f o r P R L - 4 ( u n d e f i n e d ) m e d i u m , f i n a l pH 6.5 ( 8 3 ) . COMPONENT mg/L K N O 3 1 0 0 0 . 0 K C 1 3 0 0 . 0 M g S 0 4 - 7 H 2 0 2 5 0 . 0 ( N H 4 ) 2 S 0 4 2 0 0 . 0 C a C l 2 * 2 H 2 0 1 5 0 . 0 N a H 2 P 0 4 ' H 2 0 9 0 . 0 N a 2 H P 0 4 3 0 . 0 K I 0.75 2,4-D 2.0 S u c r o s e 2 0 . 0 gm C a s e i n H y d r o l y s a t e 2.0 gm C o c o n u t M i l k 1 0 0 . 0 m l V i t a m i n S o l u t i o n 1 0 . 0 m l I r o n - E D T A S o l u t i o n 5.0 m l M i c r o n u t r i e n t S o l u t i o n 1 . 0 m l ( A g a r f o r s o l i d m e d i u m ) ( 1 0 . 0 gm) F o r m u l a f o r B-5 ( d e f i n e d ) m e d i u m , COMPONENT K N 0 3 M g S 0 4 ' 7 H 2 0 NaE^PO 'E^O ( N H 4 ) 2 S 0 4 C a C l 0 ' 2 H 0 2 2 K I 2,4-D S u c r o s e V i t a m i n S o l u t i o n I r o n - E D T A S o l u t i o n M i c r o n u t r i e n t S o l u t i o n f i n a l p H 6.5 ( 8 3 ) mg/L 2 5 0 0 . 0 2 5 0 . 0 1 5 0 . 0 1 3 4 . 0 1 5 0 . 0 0.75 2.0 2 0 . 0 gm 1 0 . 0 m l 5.0 m l 1.0 m l S t o c k S o l u t i o n s f o r P R L - 4 a n d B - 5 . i . I r o n - E D T A s o l u t i o n ( k e e p f r o z e n ) N a 2 E D T A .372 mg F e S 0 4 ' H 2 0 2 7 8 mg H 2 0 ( d i s t i l l e d ) 1 0 0 m l i i . M i c r o n u t r i e n t S o l u t i o n ( k e e p c o l d ) M n S O ^ - r M ) 1 0 0 0 mg H BO, 3 0 0 mg 3 3 0 Z n S 0 4 " 7 H 2 0 3 0 0 mg N a 2 M o 0 4 ' H 2 0 25 mg C u S O ^ 2 5 mg G o C l 2 - 6 H 2 0 25 mg H 2 0 ( d i s t i l l e d ) 1 0 0 m l i i . V i t a m i n S o l u t i o n ( k e e p c o l d ) M y o - i n o s i t o l 1 0 0 0 mg T h i a m i n e HG1 1 0 0 mg N i c o t i n i c A c i d 10 mg P y r i d o x i n e H C l 10 mg H 0 ( d i s t i l l e d ) 1 0 0 m l 2 1 1 8 . D. F o r m u l a f o r m o d i f i e d F o x ( d e f i n e d ) m e d i u m , f i n a l p H 6.5 ( 8 4 ) COMPONENT mg/L NH, NO 4 3 1 0 0 0 . 0 K N 0 3 1 0 0 0 . 0 C a ( N 0 3 ) 2 ' 4 H 2 0 5 0 0 . 0 M g S 0 4 ' 7 H 2 0 3 0 0 . 0 K H 0 P O , L 4 2 5 0 . 0 KC1 5 0 . 0 N a 2 E D T A * 2 H 2 0 3 5 . 0 F e 2 ( S 0 4 ) 3 2 5 . 0 Z n S O , • 7 H 0 4 2 7.5 M r i S 0 4 - H 2 0 5.0 H 3 B 0 3 5.0 K I 0.8 G l y c i n e 3.0 N i c o t i n i c A c i d 0.5 P y r i d o x i n e HC1 0.1 T h i a m i n e H C l 0.1 I n o s i t o l 1 0 0 . 0 I n d o l e A c e t i c A c i d 2.0 K i n e t i n 0.05 S u c r o s e 3 0 . 0 ( A g a r f o r s o l i d m e d i u m ) ( 1 0 . 0 

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