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The interactions among B2-glycoprotein I, natural anticoagulants, and complement : significance for the… Sim, Derek Shu Kay 2000

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T H E I N T E R A C T I O N S A M O N G B 2 - G L Y C O P R O T E I N I, N A T U R A L A N T I C O A G U L A N T S , A N D C O M P L E M E N T : S I G N I F I C A N C E F O R T H E A N T I P H O S P H O L I P I D S Y N D R O M E b y D E R E K S H U K A Y S I M B . S c ( C o m b i n e d H o n o u r s ) , T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , 1 9 9 4 A T H E S I S S U B M I T T E D I N P A R T I A L F U L F I L M E N T O F T H E R E Q U I R E M E N T S F O R T H E D E G R E E O F D O C T O R O F P H I L O S O P H Y i n T H E F A C U L T Y O F G R A D U A T E S T U D I E S ( D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y ) W e a c c e p t t h i s t h e s i s as c o n f i r m i n g t o t h e r e q u i r e d s t a n d a r d T H E U N I V E R S I T Y O F B R I T I S H C O L U M B I A F e b r u a r y , 2 0 0 0 © D e r e k S h u K a y S i m , 2 0 0 0 I n p r e s e n t i n g t h i s t h e s i s i n p a r t i a l f u l f i l m e n t o f t h e r e q u i r e m e n t s f o r a n a d v a n c e d d e g r e e at t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a , I a g r e e t h a t t h e L i b r a r y s h a l l m a k e i t f r e e l y a v a i l a b l e f o r r e f e r e n c e a n d s t u d y . I f u r t h e r a g r e e t h a t p e r m i s s i o n f o r e x t e n s i v e c o p y i n g o f t h i s t h e s i s f o r s c h o l a r l y p u r p o s e s m a y b e g r a n t e d b y t h e h e a d o f m y d e p a r t m e n t o r b y h i s o r h e r r e p r e s e n t a t i v e s . It i s u n d e r s t o o d t h a t c o p y i n g o r p u b l i c a t i o n o f t h i s t h e s i s f o r f i n a n c i a l g a i n s h a l l n o t b e a l l o w e d w i t h o u t m y w r i t t e n p e r m i s s i o n . D e p a r t m e n t o f B i o c h e m i s t r y a n d M o l e c u l a r B i o l o g y T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a V a n c o u v e r , C a n a d a D a t e : A p r i l 26, 2 0 0 0 ABSTRACT A n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e ( A P S ) p a t i e n t s a r e p r e d i s p o s e d t o r e c u r r e n t t h r o m b o s i s a n d m i s c a r r i a g e s . E l e v a t e d l e v e l s o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n h a v e a l s o b e e n d e m o n s t r a t e d . A m a j o r a n t i g e n i c t a r g e t o f a n t i p h o s p h o l i p i d a u t o a n t i b o d i e s ( a P L ) i s B2-g l y c o p r o t e i n I ( B 2 G P I ) . I m p a i r m e n t s o f a n t i c o a g u l a t i o n b y a P L h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d ; h o w e v e r , t h e m e c h a n i s m i s u n c l e a r . A l s o , t h e in vivo f u n c t i o n s o f B 2 G P I i n t h e c o a g u l a t i o n a n d c o m p l e m e n t s y s t e m s r e m a i n t o b e e s t a b l i s h e d . T h e r e f o r e , t h e e f f e c t s o f a P L o n t h e i n t e r a c t i o n s a m o n g B 2 G P I , a n t i c o a g u l a t i o n , a n d c o m p l e m e n t s y s t e m w e r e s t u d i e d . B 2 G P I i n t e r a c t e d w i t h t w o a n t i c o a g u l a n t p r o t e i n s , a c t i v a t e d p r o t e i n C ( A P C ) a n d p r o t e i n S. B 2 G P I i n h i b i t e d t o t a l A P C a c t i v i t y b y c o m p e t i n g w i t h A P C f o r t h e p h o s p h o l i p i d s . H o w e v e r , B 2 G P I p o t e n t i a t e d A P C s p e c i f i c a c t i v i t y o n p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e a n d p h o s p h a t i d y l s e r i n e . T h e r e f o r e , B 2 G P I a p p e a r e d to i n h i b i t as w e l l as to e n h a n c e A P C . B 2 G P I a l s o i n t e r a c t e d w i t h p r o t e i n S a n d C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n ( C 4 B P ) , a c o m p l e m e n t r e g u l a t o r . C 4 B P a n d p r o t e i n S c i r c u l a t e as a c o m p l e x i n b l o o d . A n a l y s e s o f t h e i n t e r a c t i o n s a m o n g B 2 G P I , p r o t e i n S, a n d C 4 B P s h o w e d t h a t o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I p r e v e n t e d p r o t e i n S b i n d i n g t o C 4 B P b y c o m p e t i n g f o r t h e B - c h a i n o n C 4 B P . A l s o , B 2 G P I i n t e r a c t e d w i t h p r o t e i n S w h e n B 2 G P I w a s n o t o c c u p i e d b y C 4 B P . T h u s , B 2 G P I m a y h a v e a r o l e i n m a i n t a i n i n g t h e f r e e p r o t e i n S l e v e l . B e s i d e s C 4 B P , B 2 G P I a l s o i n t e r a c t e d w i t h a n o t h e r c o m p l e m e n t p r o t e i n , m a n n o s e - b i n d i n g l e c t i n ( M B L ) . M B L i s a c o m p l e m e n t a c t i v a t o r . T h e i r i n t e r a c t i o n s l e d t o w e a k in vitro c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . I n t e r a c t i o n s o f o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I w i t h A P C a n d p r o t e i n S w e r e i n h i b i t e d b y a P L . A l s o , a P L i n h i b i t e d t h e t o t a l A P C a c t i v i t y o n a p h o s p h a t i d y l s e r i n e s u r f a c e b y i n c r e a s i n g B 2 G P I d e p o s i t i o n . H o w e v e r , t h i s w a s ii a c c o m p a n i e d b y a n i n c r e a s e i n A P C s p e c i f i c a c t i v i t y . T h e r e f o r e , a P L a p p e a r e d t o i n h i b i t as w e l l as e n h a n c e a n t i c o a g u l a t i o n a c t i v i t y . A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s i n h i b i t e d C 4 B P a n d e n h a n c e d M B L b i n d i n g t o B 2 G P I . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t a P L c a n p r o m o t e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . T h i s p o s s i b i l i t y w a s f u r t h e r s u p p o r t e d b y t h e o b s e r v a t i o n o f in vitro c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n b y a P L i n p a t i e n t s ' p l a s m a . T h e r e f o r e , B 2 G P I m a y n o r m a l l y i n t e r a c t w i t h A P C , p r o t e i n S, C 4 B P , a n d M B L t o r e g u l a t e a n t i c o a g u l a t i o n a n d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . H o w e v e r , a P L m a y i n t e r f e r e w i t h t h e s e p r o t e i n i n t e r a c t i o n s , a n d t h e r e b y d i s r u p t t h e a n t i c o a g u l a t i o n m e c h a n i s m a n d e l e v a t e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . i i i T A B L E O F C O N T E N T S Abstract ii Table of Contents iv List of Tables xi List of Figures xii List of Appendix Figures xiv Abbreviations xv Acknowledgements xviii Dedication xix Chapter 1 Introduction 1 1.1 A n t i p h o s p h o l i p i d A n t i b o d i e s 1 1.1.1 H i s t o r y 1 1.1.2 A n t i p h o s p h o l i p i d A n t i b o d i e s i n A n t i p h o s p h o l i p i d S y n d r o m e 2 1.1.3 L a b o r a t o r y T e s t s f o r A n t i p h o s p h o l i p i d A n t i b o d i e s 3 1.1.4 F o r m a t i o n a n d C h a r a c t e r i s t i c s o f A n t i p h o s p h o l i p i d A n t i b o d i e s 4 1.1.5 E f f e c t s o f A n t i p h o s p h o l i p i d A n t i b o d i e s o n H e m o s t a s i s 5 1.2 A n t i p h o s p h o l i p i d S y n d r o m e 6 1.2.1 A P S C l i n i c a l M a n i f e s t a t i o n s 6 1.2.2 C l a s s i f i c a t i o n C r i t e r i a f o r A P S 8 i v 1.2.3 M a n a g e m e n t o f A P S 8 1.3 B 2 - G l y c o p r o t e i n 1 10 1.3.1 C h a r a c t e r i z a t i o n o f B 2 G P I 10 1.3.2 C a r b o h y d r a t e C o m p o s i t i o n a n d F u n c t i o n o f S u g a r R e s i d u e s 12 1.3.3 B i n d i n g o f B 2 G P I t o P h o s p h o l i p i d s 12 1.3.4 B 2 G P I P o l y m o r p h i s m a n d M u t a t i o n 13 1.3.5 P h y s i c a l S t u d i e s o f B 2 G P I 14 1.3.6 I n t e r a c t i o n s o f B 2 G P I w i t h D i f f e r e n t C e l l s , P r o t e i n s , a n d B i o c h e m i c a l s 15 1.3.7 I n t e r a c t i o n A m o n g B 2 G P I , P l a t e l e t , C o a g u l a t i o n , a n d A n t i c o a g u l a t i o n 15 1.3.8 B 2 G P I a n d F i b r i n o l y s i s 16 1.3.9 B 2 G P I a n d L i p o p r o t e i n s 17 1.3.10 B 2 G P I a n d A p o p t o s i s 18 1.3.11 A n t i - B 2 G P I B i n d i n g t o B 2 G P I 19 1.4 A n t i c o a g u l a t i o n 19 1.4.1 C o a g u l a t i o n 19 1.4.2 A c t i v a t e d P r o t e i n C 2 2 1.4.2.1 C h a r a c t e r i z a t i o n o f A c t i v a t e d P r o t e i n C 2 2 1.4.2.2 A P C C a t a l y z e d F V a a n d F V I I I a I n a c t i v a t i o n 2 3 1.4.3 P r o t e i n S 2 3 1.4.3.1 C h a r a c t e r i z a t i o n o f P r o t e i n S 2 3 1.4.3.2 P r o t e i n S as C o f a c t o r o f A c t i v a t e d P r o t e i n C 2 4 1.4.4 A n t i c o a g u l a t i o n a n d A n t i p h o s p h o l i p i d S y n d r o m e 2 5 1.5 C o m p l e m e n t 2 6 v 1.5.1 C o m p l e m e n t S y s t e m 2 6 1.5.1.1 C l a s s i c a l P a t h w a y 2 8 1.5.1.2 A l t e r n a t i v e P a t h w a y 2 9 1.5.2 C o m p l e m e n t R e g u l a t i o n 3 0 1.5.3 C 4 b - B i n d i n g P r o t e i n 3 2 1.5.3.1 C h a r a c t e r i z a t i o n o f C 4 b - B i n d i n g P r o t e i n 3 2 1.5.3.2 M e c h a n i s m o f C o m p l e m e n t I n h i b i t i o n b y C 4 B P 3 3 1.5.3.3 C 4 B P I n t e r a c t i o n w i t h P r o t e i n S 3 4 1.5.4 M B L 3 5 1.5.4.1 C h a r a c t e r i z a t i o n o f M B L 3 5 1.5.4.2 A c t i v a t i o n o f L e c t i n P a t h w a y 3 6 1.5.4.3 M B L D e f i c i e n c y 3 8 1.5.5 C o m p l e m e n t a n d A n t i p h o s p h o l i p i d A n t i b o d i e s 3 8 1.6 R a t i o n a l e a n d O v e r a l l O b j e c t i v e s 3 9 Chapter 2 Materials and Methods 41 2.1 R e a g e n t s 4 1 2.2 P u r i f i c a t i o n o f M B L 4 2 2.3 N o r m a l H u m a n P l a s m a P r e p a r a t i o n 4 2 2.4 N o r m a l H u m a n S e r u m P r e p a r a t i o n 4 2 2.5 B l o o d S a m p l e s 4 3 2.6 D e t e c t i o n o f A n t i - C a r d i o l i p i n a n d A n t i - B 2 G P I U s i n g E L I S A 4 3 2.7 I s o l a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f I g G P o o l s 4 4 2.8 S p e c i f i c i t i e s o f I g G P o o l s 4 4 v i 2.9 1 2 5 I - R a d i o l a b e l i n g o f P r o t e i n s 4 4 2.10 E f f e c t s o f C o - I n c u b a t i n g B 2 G P I a n d P r o t e i n S o n A P C A c t i v i t i e s i n P h o s p h a t i d y l s e r i n e - C o a t e d W e l l s 4 5 2.11 E f f e c t s o f B 2 G P I o n A P C A c t i v i t i e s i n P h o s p h a t i d y l c h o l i n e - , P h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e - , P h o s p h a t i d y l s e r i n e - C o a t e d W e l l s 4 6 2.12 I n t e r a c t i o n s o f A P C , P r o t e i n C , P r o t e i n S, C 4 B P , C 4 B P . B , a n d M B L w i t h E L I S A P l a t e - B o u n d B 2 G P I U n d e r D i f f e r e n t C o n d i t i o n s 4 6 2.13 E f f e c t s o f H i g h B i n d i n g E L I S A P l a t e - B o u n d B 2 G P I o n A P C A c t i v i t i e s 4 8 2.14 K i n e t i c s a n d E q u i l i b r i u m D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t s o f A P C , P r o t e i n C , P r o t e i n S, C 4 B P , M B L , a n d B S A I n t e r a c t i o n s w i t h B 2 G P I 4 8 2.15 C o m p e t i t i v e E L I S A F o r D e t e r m i n i n g A n t i - P r o t e i n C A n t i b o d y S p e c i f i c i t y F o r A P C a n d P r o t e i n C 4 9 2.16 E f f e c t s o f A n t i - B 2 G P I S e p h a r o s e B e a d s a n d B 2 G P I - S e p h a r o s e B e a d s o n P l a s m a P r o t e i n S C l o t t i n g A c t i v i t y 5 0 2.17 E f f e c t s o f a P L I g G o n A P C A c t i v i t i e s i n t h e P r e s e n c e o f B 2 G P I a n d P r o t e i n S i n P S - C o a t e d W e l l s 51 2.18 E f f e c t s o f a P L I g G o n B 2 G P I B i n d i n g t o P S - C o a t e d E L I S A W e l l s 51 2.19 E f f e c t s o f a P L I g G o n A P C , P r o t e i n S a n d C 4 B P B i n d i n g t o A c t i v a t e d P l a t e l e t s i n t h e P r e s e n c e o f B 2 G P I 5 2 2.20 B i n d i n g o f 1 2 5 I - B 2 G P I a n d 1 2 5 I - P r o t e i n S t o A c t i v a t e d P l a t e l e t s i n t h e P r e s e n c e o f a P L 53 2.21 E L I S A T o D e t e c t A n t i p h o s p h o l i p i d A n t i b o d y - M e d i a t e d C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n 53 v i i 2.22 S t a t i s t i c a l A n a l y s i s 5 4 Chapter 3 Effect of B2-Glycoprotein I on the specific activity of Activated Protein C In The Presence Of Aminophospholipids 55 3.1 E f f e c t s o f B 2 G P I a n d P r o t e i n S o n A P C A c t i v i t y o n P h o s p h o l i p i d S u r f a c e 5 5 3.2 A c t i v i t y o f A P C B o u n d t o P C - , P E - , a n d P S - C o a t e d W e l l s i n t h e P r e s e n c e o f B 2 G P I 5 9 3.3 E f f e c t o f F l u i d P h a s e B 2 G P I o n A P C a n d P r o t e i n S B i n d i n g t o O x i d i z e d E L I S A P l a t e - B o u n d B 2 G P I i n t h e A b s e n c e o f P h o s p h o l i p i d s 61 3.4 A c t i v i t y o f B 2 G P I - B o u n d A P C 6 4 3.5 I n h i b i t i o n o f A P C B i n d i n g t o B 2 G P I b y P r o t e i n S 6 8 3.6 E q u i l i b r i u m D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t D e t e r m i n a t i o n s f o r A P C , P r o t e i n C , P r o t e i n S a n d B S A B i n d i n g t o B 2 G P I 6 8 3.7 C o m p a r i s o n o f P r o t e i n C a n d A P C B i n d i n g t o B 2 G P I A P C U s i n g E L I S A 7 0 3.8 S u m m a r y 73 Chapter 4 B2GPI Interactions with C4BP and Protein S 75 4.1 A n a l y s i s o f C 4 B P a n d B 2 G P I I n t e r a c t i o n i n t h e P r e s e n c e o f P r o t e i n S 7 5 4.2 E q u i l i b r i u m B i n d i n g C o n s t a n t s 8 2 4.3 E f f e c t s o f B 2 G P I - D e p l e t i o n F r o m P l a s m a U s i n g A n t i - B 2 G P I - S e p h a r o s e B e a d s o n F u n c t i o n a l P r o t e i n S L e v e l s 8 2 4.4 E f f e c t s o f S e p h a r o s e - c o u p l e d B 2 G P I o n F u n c t i o n a l P r o t e i n S L e v e l 8 4 4.5 S u m m a r y 8 4 v i i i Chapter 5 Effects of aPL on B2GPI Interactions with A P C , Protein S, and C4BP.. 87 5.1 C h a r a c t e r i s t i c s a n d S p e c i f i c i t i e s o f I g G P o o l s 8 7 5.2 I n h i b i t i o n o f A P C , P r o t e i n S, a n d C 4 B P B i n d i n g t o B 2 G P I b y a P L I g G pool..90 5.3 E f f e c t s o f a P L o n A P C A c t i v i t y as M e a s u r e d b y C h r o m o g e n i c S u b s t r a t e S-2 3 6 6 9 0 5.4 a P L I n c r e a s e s B 2 G P I B i n d i n g t o P h o s p h o l i p i d S u r f a c e 9 5 5.5 B i n d i n g o f A P C , P r o t e i n S, a n d C 4 B P t o A c t i v a t e d P l a t e l e t s i n t h e P r e s e n c e o f a P L a n d B 2 G P I 9 7 5.6 B i n d i n g o f B 2 G P I t o A c t i v a t e d P l a t e l e t s i n t h e P r e s e n c e o f a P L I g G 9 8 5.7 S u m m a r y . 1 0 0 Chapter 6 Inhibition of C4b-Binding Protein (C4BP) and Mannose Binding Lectin (MBL) Binding to B2GPI by Antiphospholipid Antibodies.... 101 6.1 E f f e c t o f C 4 b o n C 4 B P B i n d i n g t o B 2 G P I 101 6.2 M B L B i n d i n g t o B 2 G P I i n t h e P r e s e n c e o f C a l c i u m , E D T A a n d N -a c e t y l m a n n o s a m i n e 103 6.3 B i n d i n g o f M B L t o B 2 G P I - B o u n d a P L 103 6.4 E q u i l i b r i u m D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t D e t e r m i n a t i o n s f o r M B L B i n d i n g t o B 2 G P I 1 0 6 6.5 C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n b y A n t i b o d y - B 2 G P I C o m p l e x 1 08 6.6 B 2 G P I - M e d i a t e d C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n 1 1 0 6.7 C o r r e l a t i o n s o f C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n L e v e l t o A n t i p h o s p h o l i p i d L e v e l s ..110 6.8 S p e c i f i c i t y a n d S e n s i t i v i t y o f A n t i p h o s p h o l i p i d E L I S A s R e l a t i v e t o C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n E L I S A 1 1 4 i x 6.9 S u m m a r y 1 1 6 C h a p t e r 7 D i s c u s s i o n 1 1 7 7.1 B 2 G P I I n t e r a c t i o n s w i t h A P C a n d P r o t e i n S 1 1 7 7.2 B 2 G P I I n t e r a c t i o n s w i t h P r o t e i n S a n d C 4 B P 1 2 6 7.3 E f f e c t s o f a P L o n B 2 G P I I n t e r a c t i o n s w i t h A P C , P r o t e i n S, a n d C 4 B P 1 3 0 7.4 E f f e c t s o f a P L o n B 2 G P I I n t e r a c t i o n s w i t h C o m p l e m e n t S y s t e m a n d M B L ..135 7.5 F u t u r e D i r e c t i o n s 1 4 0 C h a p t e r 8 S u m m a r y 1 4 2 R e f e r e n c e s 1 4 7 A p p e n d i x ; ^ 1 7 9 x L I S T O F T A B L E S T a b l e L P r e l i m i n a r y C l a s s i f i c a t i o n C r i t e r i a f o r D e f i n i t e A n t i p h o s p h o l i p i d S y n d r o m e . ..9 T a b l e 2. E q u i l i b r i u m D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t D e t e r m i n a t i o n s f o r A P C , P r o t e i n C , a n d P r o t e i n S B i n d i n g t o B 2 G P I 71 T a b l e 3. C h a r a c t e r i s t i c s o f a P L I g G P o o l 88 T a b l e 4. B i n d i n g o f A c t i v a t e d P r o t e i n C , P r o t e i n S a n d C 4 B P t o P l a t e l e t s as D e t e c t e d b y F l u o r e s c e n c e F l o w C y t o m e t r y i s n o t A f f e c t e d b y t h e P r e s e n c e o f a P L 9 9 T a b l e 5. C h a r a c t e r i s t i c s o f S e r u m S a m p l e s 112 T a b l e 6. C o r r e l a t i o n (r) o f C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n t o A n t i p h o s p h o l i p i d L e v e l 113 T a b l e 7. S p e c i f i c i t y a n d S e n s i t i v i t y o f A n t i p h o s p h o l i p i d E L I S A s R e l a t i v e t o C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n E L I S A 115 x i LIST OF FIGURES F i g u r e 1. P r i m a r y s t r u c t u r e o f h u m a n B 2 G P I . 11 F i g u r e 2. S c h e m e o f T i s s u e F a c t o r P a t h w a y o f C o a g u l a t i o n a n d A c t i v a t e d P r o t e i n C A n t i c o a g u l a t i o n S y s t e m 2 1 F i g u r e 3. T h e C o m p l e m e n t S y s t e m 2 7 F i g u r e 4. R e g u l a t i o n i n t h e C o m p l e m e n t S y s t e m 31 F i g u r e 5. H y d r o l y s i s o f C h r o m o g e n i c S u b s t r a t e S - 2 3 6 6 b y P S - B o u n d A P C 5 6 F i g u r e 6. S p e c i f i c A c t i v i t y o f P S - B o u n d A P C i n t h e P r e s e n c e o f B 2 G P I a n d P r o t e i n S..57 F i g u r e 7. S p e c i f i c A c t i v i t y o f p h o s p h o l i p i d - b o u n d A P C i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I i n P C - , P E - , a n d P S - C o a t e d W e l l s 6 0 F i g u r e 8. I n t e r a c t i o n B e t w e e n B 2 G P I a n d A P C 6 2 F i g u r e 9. I n t e r a c t i o n B e t w e e n B 2 G P I a n d P r o t e i n S 6 5 F i g u r e 10. A c t i v i t y o f B 2 G P I - B o u n d A P C 6 7 F i g u r e 11. I n h i b i t i o n o f A P C B i n d i n g t o B 2 G P I b y P r o t e i n S 6 9 F i g u r e 12. A P C a n d P r o t e i n C B i n d i n g t o B 2 G P I 7 2 F i g u r e 13. C o m p e t i t i v e E L I S A F o r D e t e r m i n i n g A n t i - P r o t e i n C A n t i b o d i e s S p e c i f i c i t i e s F o r A P C a n d P r o t e i n C 7 4 F i g u r e 14. I n t e r a c t i o n B e t w e e n B 2 G P I a n d C 4 B P 7 6 F i g u r e 15. I n t e r a c t i o n B e t w e e n B 2 G P I a n d C 4 B P i s d e p e n d e n t o n t h e B - s u b u n i t o f C 4 B P 7 9 F i g u r e 16. I n h i b i t i o n o f P r o t e i n S B i n d i n g t o B 2 G P I b y C 4 B P 8 0 F i g u r e 17. F u n c t i o n a l p r o t e i n S l e v e l s i n B 2 G P I - d e p l e t e d p l a s m a 83 x i i F i g u r e 18. F u n c t i o n a l p r o t e i n S l e v e l s i n p l a s m a t r e a t e d w i t h B 2 G P I - S e p h a r o s e 8 5 F i g u r e 19. S p e c i f i c i t y o f t h e a P L p o o l f o r B 2 G P I 8 9 F i g u r e 20. I n h i b i t i o n o f A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P b i n d i n g t o B 2 G P I b y a P L 91 F i g u r e 21. I n h i b i t i o n o f A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P b i n d i n g t o B 2 G P I b y a P L 9 2 F i g u r e 22. A c t i v i t y P S - B o u n d A P C i n t h e P r e s e n c e o f a P L B 2 G P I a n d P r o t e i n S 9 3 F i g u r e 23. a P L I n c r e a s e s B 2 G P I B i n d i n g t o P h o s p h o l i p i d S u r f a c e 9 6 F i g u r e 24. E f f e c t o f C 4 b o n C 4 B P b i n d i n g t o B 2 G P I 102 F i g u r e 25. M B L B i n d i n g t o B 2 G P I 1 0 4 F i g u r e 26. I n c r e a s e d B i n d i n g o f M B L t o B 2 G P I i n t h e P r e s e n c e o f a P L I g G 1 0 7 F i g u r e 27. R a b b i t A n t i - H u m a n B 2 G P I M e d i a t e d C 5 b - 9 G e n e r a t i o n 1 0 9 F i g u r e 28. B 2 G P I - M e d i a t e d C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n 111 F i g u r e 29. B 2 G P I I n c r e a s e s t h e S p e c i f i c A c t i v i t y o f A P C i n t h e P r e s e n c e o f A m i n o p h o s p h o l i p i d 1 1 8 F i g u r e 30. B 2 G P I I n t e r a c t i o n s w i t h C 4 B P a n d P r o t e i n S 1 2 8 F i g u r e 31. E f f e c t s o f a P L o n B 2 G P I i n t e r a c t i o n w i t h p r o t e i n S - C 4 B P c o m p l e x 1 4 4 F i g u r e 32. E f f e c t s o f a P L o n A P C A c t i v i t y 1 45 x i i i LIST OF APPENDIX FIGURES A p p e n d i x F i g u r e 1. P u r i t y o f B 2 G P I , A P C , p r o t e i n S, C 4 B P , C 4 B P . B , a n d M B L 1 7 9 A p p e n d i x F i g u r e 2. E f f e c t s o f A P C I o d i n a t i o n o n A P C A c t i v i t y i n P S - C o a t e d W e l l s . . 1 8 0 A p p e n d i x F i g u r e 3. D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t D e t e r m i n a t i o n f o r A P C - B 2 G P I I n t e r a c t i o n '. 181 A p p e n d i x F i g u r e 4. D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t D e t e r m i n a t i o n f o r P r o t e i n C - B 2 G P I I n t e r a c t i o n 1 82 A p p e n d i x F i g u r e 5. D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t D e t e r m i n a t i o n f o r P r o t e i n S - B 2 G P I I n t e r a c t i o n 183 A p p e n d i x F i g u r e 6. D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t D e t e r m i n a t i o n f o r C 4 B P - B 2 G P I I n t e r a c t i o n 1 8 4 A p p e n d i x F i g u r e 7. D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t D e t e r m i n a t i o n f o r M B L - B 2 G P I I n t e r a c t i o n 185 A p p e n d i x F i g u r e 8. E f f e c t s o f I o d i n a t i o n o n A P C - , p r o t e i n C-, p r o t e i n S-, C 4 B P - , a n d M B L - B i n d i n g t o B 2 G P I 1 8 6 x i v A B B R E V I A T I O N S A P C a c t i v a t e d p r o t e i n C a C L a n t i c a r d i o l i p i n a P L a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s A P T T a c t i v a t e d p a r t i a l t h r o m b o p l a s t i n t i m e A P S a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e B 2 G P I 1 3 2 - g l y c o p r o t e i n I B C A b i c i n c h o n i n i c a c i d B S A b o v i n e s e r u m a l b u m i n C 4 B P C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n C 4 B P - B C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n w i t h o u t B - c h a i n C L c a r d i o l i p i n C R P C - r e a c t i v e p r o t e i n D A F d e c a y - a c c e l e r a t i n g f a c t o r D I C d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n d R V V T d i l u t e R u s s e l l ' s v i p e r v e n o m t i m e E D T A e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d E L I S A e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y F I T C fluorescein i s o t h i o c y a n a t e G A L g a l a t o s e G l a g a m m a ( y ) - c a r b o x y l a t e d g l u t a m i c a c i d G V B 2 + V B S , 0.15 m M C a C l 2 , 1 m M M g C l 2 , 0.1 % g e l a t i n , p H 7.4 XV G V B - E D T A H R P I C A M - 1 K C T L A L p ( a ) M B L M C P M H T B M H T B - C a M I R L N A M N H I g G N H P N H S P C P E P S R b l g G R C A R T V B S , 2 0 m M E D T A , 0.1 % g e l a t i n , p H 7.4 h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e i n t r a c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e - 1 k a o l i n c l o t t i n g t i m e l u p u s a n t i c o a g u l a n t l i p o p r o t e i n (a) m a n n o s e - b i n d i n g l e c t i n , m a n n a n - b i n d i n g l e c t i n m e m b r a n e c o f a c t o r p r o t e i n m o d i f i e d H E P E S T y r o d e ' s B u f f e r ( 1 0 m M H E P E S , 1 3 7 m M N a C l , 2.7 m M K C 1 , 0.4 m M N a H 2 P 0 4 , 0 . 1 % d e x t r o s e , 0 . 2 % B S A , p H 6.5) M H T B , 2.5 m M C a C l 2 , p H 7.4 m e m b r a n e i n h i b i t o r o f r e a c t i v e l y s i s N - a c e t y l - m a n n o s a m i n e n o r m a l h u m a n I g G n o r m a l h u m a n p l a s m a n o r m a l h u m a n s e r u m p h o s p h a t i d y l c h o l i n e p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e p h o s p h a t i d y l s e r i n e r a b b i t I g G r e g u l a t i o n o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n r o o m t e m p e r a t u r e x v i S A P s e r u m a m y l o i d P S C R s h o r t c o n s e n s u s r e p e a t S L E s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s T B S t r i s - b u f f e r e d s a l i n e , ( 1 0 m M T r i s , 1 5 0 m M N a C l , p H 7.4) T B S - C a T B S , 2.5 m M C a C b . p H 7.4 T B S - C a M T B S , 2.5 m M C a C l 2 , 5 % w/v s k i m m i l k p H 7.4 T B S - E D T A M T B S , 10 m M E D T A , 5 % w/v s k i m m i l k p H 7.4 T B S - T C a T B S , 0 . 0 5 % T w e e n 20, 2.5 m M C a C l 2 > p H 7.4 T B S - T E D T A T B S , 0 . 0 5 % T w e e n 20, 10 m M E D T A , p H 7.4 T C A t r i c h l o r o a c e t i c a c i d T M t h r o m b o m o d u l i n T M B 3,3' ,5,5 ' - t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e V B S v e r o n a l b u f f e r e d s a l i n e (1.8 m M s o d i u m b a r b i t o n e , 1.56 m M s o d i u m b a r b i t u r i c a c i d , 145 m M N a C l , p H 7.4) x v i i ACKNOWLEDGEMENTS I w o u l d l i k e t o t h a n k t h e D e v i n e l a b m e m b e r s , K a t h e r i n e S e r r a n o , E l e n a L e v i n , V i c k y M o n s a l v e , N i k k y C h a h a l , N a d i n e B r o c k m a n n , E l i s a b e t h M a u r e r , M a r i a Issa, S u s a n S h i n n , a n d J i m R u p e r t . I h a v e h a d a g r e a t t i m e w o r k i n g w i t h t h e s e w o n d e r f u l p e o p l e . E v e r y d a y h a s b e e n f u n a n d i n t e r e s t i n g w o r k i n g w i t h t h i s s o m e t i m e s o b s t r e p e r o u s g r o u p . I w i s h t o t h a n k A m a n d a J. B r a d l e y f o r h e r f r i e n d s h i p a n d s u p p o r t t h a t h a v e h e l p e d m e t o c o m p l e t e t h i s p r o j e c t . I a m i n d e b t e d t o m y c o m m i t t e e m e m b e r s D r . R o s s T.A. M a c G i l l i v r a y , a n d D r . P e t e r N. M a l l e s o n f o r t h e i r t h o u g h t f u l i n p u t , a n d e s p e c i a l l y D r . C e d r i c J. C a r t e r f o r a l l h i s a d v i c e as w e l l as i n t r o d u c i n g m e t o Saccharomyces cerevisiae f e r m e n t a t i o n . A l s o , I w o u l d l i k e t o e x t e n d m y t h a n k s t o D r . D o n a l d E . B r o o k s f o r h i s a d v i c e o n b i n d i n g a s s a y s a n d t o a l l t h e m e m b e r s i n B r o o k s l a b . I n a d d i t i o n , I a m g r a t e f u l t o J i h a n M a r j a n , B r e n d a R o e c k , L i n d a S p i l l e r , J i m S i b l e y a n d n u m e r o u s o t h e r p e o p l e w h o h a v e c o n t r i b u t e d t o t h e c o m p l e t i o n o f t h i s t h e s i s . F i n a l l y , I w i s h t o t h a n k m y s u p e r v i s o r D r . D a n a V . D e v i n e f o r t h e e x c e l l e n t g u i d a n c e a n d t h e l i b e r t y o f ' h y p o t h e s i z i n g ' t h a t s h e h a s g i v e n me. It h a s b e e n a g r e a t l e a r n i n g e x p e r i e n c e f o r m e t o u n d e r t a k e m y s t u d i e s i n h e r l a b o r a t o r y . x v i i i DEDICATION To my mother Irene, father Chee Wing, and brother Kenneth. x i x C H A P T E R 1 I N T R O D U C T I O N 1.1 A n t i p h o s p h o l i p i d A n t i b o d i e s 1.1.1 H i s t o r y D e s p i t e t h e n a m e , a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d y a s s o c i a t e d w i t h a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e d o e s n o t b i n d d i r e c t l y t o p h o s p h o l i p i d . It o w e s its n a m e to i t s r e a c t i v i t y i n a s s a y s c o n t a i n i n g t h e p h o s p h o l i p i d s u s e d f o r d e t e c t i n g w h a t w e r e b e l i e v e d t o b e " t r u e " a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s . T h e s e " t r u e " a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s w e r e f i r s t i d e n t i f i e d i n a s s o c i a t i o n w i t h s y p h i l i s i n f e c t i o n s . T h e y w e r e " p h o s p h o l i p i d " a n t i b o d i e s t h a t b o u n d d i r e c t l y t o p h o s p h o l i p i d . T h e s e a n t i b o d i e s w e r e d e t e c t e d b y s e r o l o g i c t e s t f o r s y p h i l i s ( S T S ) u s i n g s a l i n e e x t r a c t o f s y p h i l i t i c l i v e r as a n t i g e n ( W a s s e r m a n n et al, 1 9 0 6 ) . T h e V e n e r e a l D i s e a s e R e s e a r c h L a b o r a t o r y ( V D R L ) test, w h i c h c o n t a i n e d c a r d i o l i p i n ( C L ) as t h e m a j o r a n t i g e n , w a s l a t e r d e v e l o p e d f o r a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d y d e t e c t i o n ( P a n g b o r n , 1 9 4 1 ) . T h u s , t h e s e a n t i b o d i e s a r e a l s o k n o w n as a n t i c a r d i o l i p i n ( a C L ) . H o w e v e r , i t b e c a m e a p p a r e n t l a t e r t h a t t h e s e tests a l s o d e t e c t e d a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s n o t a s s o c i a t e d w i t h s y p h i l i t i c i n f e c t i o n . I n d i v i d u a l s w i t h o u t e v i d e n c e o f s y p h i l i t i c i n f e c t i o n s o m e t i m e s t e s t e d p o s i t i v e f o r S T S . T h e s e c a s e s w e r e i n i t i a l l y n a m e d b i o l o g i c a l f a l s e p o s i t i v e - s e r o l o g i c tests f o r s y p h i l i s ( B F P - S T S ) ( D a v i s , 1 9 4 4 ) . S o m e o f t h e s e i n d i v i d u a l s w e r e a l s o f o u n d t o h a v e s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s ( S L E ) ( M o o r e a n d L u t z , 1 9 5 5 ) . S i n c e s o m e o f t h e s e a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s a l s o e x h i b i t e d in vitro a n t i c o a g u l a n t a c t i v i t y , t h e y w e r e n a m e d l u p u s a n t i c o a g u l a n t s ( L A ) ( F e i n s t e i n a n d R a p a p o r t , 1 9 7 2 ) . H o w e v e r , t h e n a m e l u p u s a n t i c o a g u l a n t i s c l e a r l y a m i s n o m e r b e c a u s e t h e s e a n t i b o d i e s a r e n o t c o n f i n e d t o S L E p a t i e n t s ( T r i p l e t t a n d B r a n d t , 1 9 8 8 ) a n d t h e 1 p r e v a l e n t c l i n i c a l m a n i f e s t a t i o n i s t h r o m b o s i s r a t h e r t h a n a b l e e d i n g d i s o r d e r ( B o w i e et al, 1963). T h e s e i n v e s t i g a t i o n s t o g e t h e r l e d to t h e r e a l i z a t i o n o f t h e e x i s t e n c e o f a n t i p h o s p h o l i p i d u n r e l a t e d t o s y p h i l i t i c i n f e c t i o n a n d t h e l a t e r d i s c o v e r y o f t h e a s s o c i a t i o n o f a n t i c a r d i o l i p i n a n d L A w i t h a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e ( A P S ) . 1.1.2 A n t i p h o s p h o l i p i d A n t i b o d i e s i n A n t i p h o s p h o l i p i d S y n d r o m e A n t i c a r d i o l i p i n a n d L A a r e t h e t w o m a i n c l i n i c a l g r o u p s o f a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s a n d a r e c h a r a c t e r i z e d b y t w o d i f f e r e n t a s s a y m e t h o d s . A n t i c a r d i o l i p i n i s i d e n t i f i e d b y E L I S A a n d L A i s d e t e c t e d b y c l o t t i n g a s s a y s . A l t h o u g h t h e y a r e n o r m a l l y d e s c r i b e d as a n t i - p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s , t h e i r b i n d i n g t o p h o s p h o l i p i d i s a c t u a l l y m e d i a t e d b y p r o t e i n c o f a c t o r s . A n t i c a r d i o l i p i n s a r e a n t i b o d i e s t h a t r e a c t w i t h c a r d i o l i p i n - b i n d i n g p r o t e i n s . T h e m a j o r a n t i g e n f o r a n t i c a r d i o l i p i n w a s i d e n t i f i e d t o b e B 2 - g l y c o p r o t e i n I ( B 2 G P I ) b y t h r e e g r o u p s i n d e p e n d e n t l y i n 1 9 9 0 ( G a l l i et al, 1990; M c N e i l et al, 1990; M a t s u u r a et al, 1 9 9 0 ) . T h e r e f o r e , a n t i c a r d i o l i p i n s a r e a c t u a l l y a n t i - B 2 G P I a n t i b o d i e s . H o w e v e r , n o t a l l a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s a r e d i r e c t e d a g a i n s t B 2 G P I . O t h e r a n t i g e n i c t a r g e t s o f a n t i c a r d i o l i p i n a n d a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s h a v e b e e n i d e n t i f i e d , a l b e i t l e s s c o m m o n l y . M o s t o f t h e s e a n t i g e n s s h a r e t h e p h o s p h o l i p i d - b i n d i n g c h a r a c t e r i s t i c o f B 2 G P I a n d t h e y i n c l u d e p r o t h r o m b i n ( B e v e r s et al, 1 9 9 1 ) , p r o t e i n C ( P e n g o et al, 1996; O o s t i n g et al, 1 9 9 3 ) , p r o t e i n S ( P e n g o et al, 1996; O o s t i n g et al, 1 9 9 3 ) , a n n e x i n V ( S a m m a r i t a n o et al, 1 9 9 2 ) , t h r o m b o m o d u l i n ( R u i z - A r g u e l l e s et al, 1 9 8 9 ) , k i n i n o g e n ( S u g i a n d M c l n t y r e , 1 9 9 5 ) , t h r o m b i n - a n t i t h r o m b i n c o m p l e x , C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n , a n d l i p o p o l y s a c c h a r i d e b i n d i n g p r o t e i n ( A r v i e u x et al, 1999). T h e r e f o r e , s t r i c t l y s p e a k i n g , 2 a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s a r e a g r o u p o f p r o t e i n - d e p e n d e n t a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s , w h i c h i n c l u d e s a n t i - 6 2 G P I . L A s a r e a n t i b o d i e s t h a t c a n p r o l o n g t h e c l o t t i n g t i m e o f c o a g u l a t i o n a s s a y s ( S h a p i r o , 1996; T r i p l e t t , 1 9 9 6 ) . T h e m a j o r c o a g u l a t i o n a n t i g e n f o r L A w a s i d e n t i f i e d t o b e p r o t h r o m b i n ( B e v e r s et al, 1 9 9 1 ; F l e c k et al, 1 9 8 8 ; E d s o n et al, 1984; B a j a j et al, 1 9 8 3 ) . L A s p e c i f i c f o r B 2 G P I h a v e a l s o b e e n d e s c r i b e d . T h i s i s k n o w n as a n t i c a r d i o l i p i n - t y p e A . A n t i - B 2 G P I w i t h o u t L A a c t i v i t y i s r e f e r r e d t o as a n t i c a r d i o l i p i n -t y p e B ( G a l l i et al, 1 9 9 2 ) . T h e r e f o r e , e v e n t h o u g h a n t i c a r d i o l i p i n , a n t i - B 2 G P I , L A a n d a P L a r e c l a s s i f i e d i n t o d i f f e r e n t g r o u p s , t h e y a r e c l o s e l y r e l a t e d a n t i b o d i e s w h o s e a c t i v i t y m a y o v e r l a p . 1.1.3 L a b o r a t o r y T e s t s f o r A n t i p h o s p h o l i p i d A n t i b o d i e s A n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s a r e r o u t i n e l y d e t e c t e d b y t w o d i f f e r e n t E L I S A s . O n e h a s n e g a t i v e l y c h a r g e d p h o s p h o l i p i d , u s u a l l y c a r d i o l i p i n , c o a t e d t o t h e E L I S A p l a t e , a n d u s e s f e t a l c a l f s e r u m t h a t c o n t a i n s B 2 G P I as d i l u e n t o f p l a s m a s a m p l e s ( G h a r a v i et al, 1 9 8 7 ) . T h e o t h e r o n e h a s B 2 G P I , o n e o f t h e m a j o r t a r g e t a n t i g e n s o f a n t i c a r d i o l i p i n , d i r e c t l y c o a t e d t o a n o x i d i z e d E L I S A p l a t e ( R o u b e y et al, 1 9 9 5 ; M a t s u u r a et al, 1 9 9 4 ) . T h e f o r m e r E L I S A w i l l d e t e c t a n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r B 2 G P I as w e l l as o t h e r p h o s p h o l i p i d - b i n d i n g s e r u m p r o t e i n s b e c a u s e o f t h e u s e o f f e t a l c a l f s e r u m as s a m p l e d i l u e n t . I n c o n t r a s t , t h e l a t t e r E L I S A c a n o n l y d e t e c t a n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r B 2 G P I . C o a g u l a t i o n a s s a y s u s e f u l f o r d e t e c t i n g L A i n c l u d e a c t i v a t e d p a r t i a l t h r o m b o p l a s t i n t i m e ( A P T T ) s e n s i t i v e t o L A , k a o l i n c l o t t i n g t i m e ( K C T ) , a n d t h e d i l u t e R u s s e l l ' s v i p e r v e n o m t i m e ( d R W T ) . A p r o l o n g e d A P T T c l o t t i n g t i m e s u g g e s t s t h e 3 p r e s e n c e o f L A . H o w e v e r , a m i x i n g s t u d y (1:1 m i x o f n o r m a l a n d p a t i e n t ' s p l a s m a ) n e e d s t o b e p e r f o r m e d t o e n s u r e t h a t t h e A P T T p r o l o n g a t i o n i s n o t c a u s e d b y a c o a g u l a t i o n f a c t o r d e f i c i e n c y . T h e p r e s e n c e o f a p u t a t i v e L A h a s t o b e c o n f i r m e d b y t h e n e u t r a l i z a t i o n o f i t s i n h i b i t o r y a c t i v i t y w h e n p h o s p h o l i p i d c o n c e n t r a t i o n i s i n c r e a s e d ( E x n e r et al, 1 9 9 1 ) . K C T a n d d R V V T a r e a l s o e f f e c t i v e i n d e t e c t i n g L A . I n a d d i t i o n , K C T i s e s p e c i a l l y s e n s i t i v e i n d e t e c t i n g p r o t h r o m b i n - s p e c i f i c L A w h i l e d R W T i s s e n s i t i v e f o r B 2 G P I - s p e c i f i c L A ( G a l l i et al, 1998; G a l l i et al, 1995). 1.1.4 F o r m a t i o n a n d C h a r a c t e r i s t i c s o f A n t i p h o s p h o l i p i d A n t i b o d i e s A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s ( a P L ) c a n b e g e n e r a t e d b y i m m u n i z a t i o n o f m i c e w i t h d i f f e r e n t a n t i g e n s . I n d u c t i o n o f a P L i n m i c e h a s b e e n a c h i e v e d b y i m m u n i z a t i o n w i t h h e t e r o l o g o u s B 2 G P I ( G h a r a v i et al, 1 9 9 2 ) . I m m u n i z a t i o n w i t h s y n t h e t i c v i r a l a n d b a c t e r i a l B 2 G P I - l i k e p e p t i d e s a l s o i n d u c e d a P L p r o d u c t i o n ( G h a r a v i et al, 1 9 9 9 ) . I m m u n i z a t i o n o f m i c e w i t h p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( P E ) i n t h e h e x a g o n a l II p h a s e a l s o i n d u c e d a P L g e n e r a t i o n w i t h l u p u s a n t i c o a g u l a n t a c t i v i t y ( R a u c h a n d J a n o f f , 1 9 9 0 ) . A s t u d y h a s s h o w n t h a t t h e f o r m a t i o n o f a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s i n m i c e i s m e d i a t e d b y T c e l l s ( B l a n k et al, 1 9 9 5 ) . R e c e n t l y , t h e g e n e r a t i o n o f a n t i - B 2 G P I a n t i b o d i e s i n h u m a n s w a s s h o w n t o b e B 2 G P I - s p e c i f i c , r e q u i r i n g c l a s s II m o l e c u l e s , C D 4 + T c e l l s , a n d a n t i g e n p r e s e n t i n g c e l l s ( V i s v a n a t h a n a n d M c N e i l , 1 9 9 9 ) . T h e s e t w o s t u d i e s b o t h s u p p o r t t h e p a r t i c i p a t i o n o f c e l l u l a r i m m u n i t y i n A P S . D i f f e r e n t s u b c l a s s e s o f I g G h a v e d i f f e r e n t e f f e c t o r f u n c t i o n s ( S c h u r , 1 9 8 7 ) . S t u d i e s o f a P L I g G s u b c l a s s e s i n h u m a n s h o w e d t h a t I g G 2 i s t h e m o s t p r e v a l e n t a m o n g the f o u r s u b c l a s s e s ( S a m m a r i t a n o et al, 1997; A r v i e u x et al, 1994; L e v y et al, 1990; 4 G h a r a v i et al, 1 9 8 8 ) . S i n c e I g G 2 i s a w e a k c o m p l e m e n t a c t i v a t o r c o m p a r e d t o I g G 3 ( 4 0 x ) a n d I g G l ( 6 x ) ( H a m i l t o n , 1 9 8 7 ) , a P L I g G h a s b e e n b e l i e v e d n o t t o h a v e a n i m p o r t a n t r o l e i n c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n ( A r v i e u x et al, 1 9 9 4 ) . 1.1.5 E f f e c t s o f A n t i p h o s p h o l i p i d A n t i b o d i e s o n H e m o s t a s i s A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s h a v e n u m e r o u s e f f e c t s o n h e m o s t a s i s . T h e s e i n c l u d e i n h i b i t i o n o f f a c t o r X I I a u t o a c t i v a t i o n b y a n t i - B 2 G P I i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I ( S c h o u s b o e a n d R a s m u s s e n , 1 9 9 5 ) , i n h i b i t i o n o f p r o t h r o m b i n a c t i v a t i o n b y a P L ( G o l d s m i t h et al, 1 9 9 4 ) , a n d i n h i b i t i o n o f f a c t o r X a c t i v a t i o n b y L A ( S h i et al, 1 9 9 3 ) . T h e s e s t u d i e s s h o w e d in vitro a n t i c o a g u l a t i o n e f f e c t s o f a P L . I n t e r e s t i n g l y , s e v e r a l s t u d i e s a l s o s u g g e s t e d t h a t a P L h a s p r o c o a g u l a n t e f f e c t s . T h e s e s t u d i e s i n c l u d e t h e p o t e n t i a t i o n o f f a c t o r X a c t i v a t i o n b y a n t i c a r d i o l i p i n b y i m p a i r i n g B 2 G P I i n h i b i t o r y e f f e c t ( S h i et al, 1 9 9 3 ) , s h o r t e n i n g o f p r o t h r o m b i n t i m e b y a n t i - B 2 G P I w i t h L A a c t i v i t y ( P e n g o et al, 1 9 9 9 ) , a n d t h e i n d u c t i o n o f t i s s u e f a c t o r e x p r e s s i o n o n m o n o c y t e s b y a n t i c a r d i o l i p i n ( R e v e r t e r et al, 1996; R o m b e r g et al, 1 9 9 4 ) . E l e v a t e d e x p r e s s i o n o f t i s s u e f a c t o r o n A P S p a t i e n t s ' m o n o c y t e s h a s a l s o b e e n o b s e r v e d ( C u a d r a d o et al, 1 9 9 7 ) . T h e a n t i c o a g u l a t i o n m e c h a n i s m a l s o a p p e a r s t o b e a t a r g e t o f a P L as a P L h a v e b e e n r e p o r t e d t o i n h i b i t a c t i v a t e d p r o t e i n C ( A P C ) - m e d i a t e d i n a c t i v a t i o n o f f a c t o r V a ( G a l l i et al, 1998; O o s t i n g et al, 1 9 9 3 ; M a l i a et al, 1 9 9 0 ) ( M a r c i n i a k a n d R o m o n d , 1 9 8 9 ) . V a r i o u s a s s o c i a t i o n s b e t w e e n a P L a n d p l a t e l e t f u n c t i o n h a v e b e e n r e p o r t e d . P a t i e n t s w i t h a P L h a v e i n c r e a s e d u r i n a r y s e c r e t i o n o f t h e t h r o m b o x a n e m e t a b o l i t e t h r o m b o x a n e B 2 i n u r i n e , r e f l e c t i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n ( F o r a s t i e r o et al, 1 9 9 8 ; M a r t i n u z z o et al, 1 9 9 3 ; L e l l o u c h e et al, 1991; A r f o r s et al, 1 9 9 0 ) . A l s o , a P L c a n 5 p r o m o t e in vitro t h r o m b o x a n e m e t a b o l i t e f o r m a t i o n ( L e l l o u c h e et al., 1 9 9 1 ) ( R o b b i n s et al., 1998; L e u n g et ai, 1996; M a r t i n u z z o et al, 1 9 9 3 ) . T h e s e r e p o r t s s u g g e s t p l a t e l e t -a c t i v a t i n g p r o p e r t i e s f o r a P L . A c t i v a t i o n o f e n d o t h e l i a l c e l l s b y a n t i - B 2 G P I i s a s s o c i a t e d w i t h t h e e x p r e s s i o n o f E - s e l e c t i n , v a s c u l a r c e l l a d h e s i o n m o l e c u l e - 1 ( V C A M - 1 ) , i n t r a c e l l u l a r a d h e s i o n m o l e c u l e - 1 ( S i m a n t o v et al., 1 9 9 5 ) , e x p r e s s i o n o f e n d o t h e l i a l l e u k o c y t e a d h e s i o n m o l e c u l e - 1 ( D e l P a p a et al, 1 9 9 5 ) , s e c r e t i o n o f i n t e r l e u k i n - 6 a n d 6 - k e t o - p r o s t a g l a n d i n F i a ( D e l P a p a er al, 1 9 9 7 ) , e x p r e s s i o n o f c y c l o o x y g e n a s e - 2 ( H a b i b et al, 1 9 9 5 ) , a n d u p -r e g u l a t i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s , i n c r e a s e d l e u k o c y t e a d h e r e n c e , a n d i n t e r l e u k i n - l f i s e c r e t i o n ( D e l P a p a et al, 1 9 9 7 ) . E n d o t h e l i a l c e l l a c t i v a t i o n m a y y e t b e a n o t h e r t h r o m b o g e n i c m e c h a n i s m i n A P S . 1.2 Antiphospholipid Syndrome 1.2.1 A P S C l i n i c a l M a n i f e s t a t i o n s T h e m o r e c o m m o n l y s e e n c l i n i c a l m a n i f e s t a t i o n s o f a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e ( A P S ) i n c l u d e r e c u r r e n t v e n o u s t h r o m b o s i s , r e c u r r e n t a r t e r i a l t h r o m b o s i s , t h r o m b o c y t o p e n i a a n d r e c u r r e n t f e t a l l o s s ( H a r r i s et al, 1 9 8 6 ; H a r r i s et al, 1 9 8 3 ) . N e u r o l o g i c a l , d e r m a t o l o g i c a l , h e m a t o l o g i c a l , a n d c a r d i o p u l m o n a r y c o m p l i c a t i o n s a s s o c i a t e d w i t h A P S a r e a l s o w i d e l y r e p o r t e d . T h e m o s t f r e q u e n t f o r m o f t h r o m b o s i s i s v e n o u s t h r o m b o s i s o f t h e d e e p v e i n s ( A l a r c o n - S e g o v i a et al, 1 9 8 9 ) . V e n o u s t h r o m b o s i s i n o t h e r v a s c u l a r b e d s s u c h as t h e r e n a l v e i n s ( N o c h y et al, 1999; P i e t t e et al, 1 9 9 4 ) a n d t h e h e p a t i c p o r t a l v e i n ( P e l l e t i e r et 6 al, 1 9 9 4 ) h a v e a l s o b e e n r e p o r t e d . A r t e r i a l t h r o m b o s i s o c c u r s l e s s f r e q u e n t l y t h a n v e n o u s t h r o m b o s i s ( H a r r i s , 1994; S a m m a r i t a n o et al, 1 9 9 0 ) . T r a n s i e n t i s c h e m i c a t t a c k i s a c o m m o n a r t e r i a l p r e s e n t a t i o n ( T r i m b l e et al, 1 9 9 0 ) . T h r o m b o c y t o p e n i a o c c u r s i n a b o u t 1 5 % to 2 0 % o f p a t i e n t s w i t h A P S ( C u a d r a d o et al, 1997; R o s o v e a n d B r e w e r , 1992; A l a r c o n - S e g o v i a et al, 1992; P i c i l l o et al, 1 9 9 2 ) . O b s t e t r i c c o m p l i c a t i o n s i n c l u d e r e c u r r e n t s p o n t a n e o u s a b o r t i o n a n d r e c u r r e n t f e t a l l o s s ( B r a n c h et al, 1 9 8 5 ) . N e u r o l o g i c a l m a n i f e s t a t i o n s u s u a l l y p r e s e n t as c h o r e a ( C e r v e r a et al, 1997; A s h e r s o n et al, 1 9 8 7 ) , G u i l l a i n B a r r e s y n d r o m e ( C h a l e o m c h a n et al, 1 9 9 0 ) , o r S n e d d o n ' s s y n d r o m e ( K a l a s h n i k o v a et al, 1 9 9 0 ) . D e r m a t o l o g i c a l m a n i f e s t a t i o n s i n c l u d e l i v e d o r e t i c u l a r i s , l e g u l c e r s , n e c r o t i z i n g p u r p u r a , a n d p e r i p h e r a l g a n g r e n e ( A s h e r s o n a n d C e r v e r a , 1993; S t e p h e n s , 1991; A l e g r e et al, 1 9 8 9 ) . O t h e r h e m a t o l o g i c a l m a n i f e s t a t i o n s i n c l u d e h e m o l y t i c a n e m i a ( H s u et al, 1 9 9 7 ; V a n d e n b e r g h e et al, 1 9 9 6 ; S t h o e g e r et al, 1 9 9 3 ) a n d l e u k o p e n i a ( V i l a et al, 1 9 9 9 ; D e l e z e et al, 1 9 8 9 ) . C a r d i o p u l m o n a r y c o m p l i c a t i o n s i n c l u d e v a l v u l a r l e s i o n ( K a p l a n et al, 1 9 9 2 ) a n d p u l m o n a r y h y p e r t e n s i o n ( B a d u i et al, 1995; A s h e r s o n et al, 1 9 9 0 ) . A P S c a n o c c u r i n p a t i e n t s w i t h a n o t h e r u n d e r l y i n g d i s e a s e o r w i t h o u t o t h e r c o m p l i c a t i o n s . A P S w i t h o u t a n y u n d e r l y i n g d i s e a s e i s c l a s s i f i e d as p r i m a r y a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e ( A s h e r s o n , 1 9 8 8 ) w h i l e A P S a s s o c i a t e d w i t h o t h e r d i s e a s e s , s u c h as s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s ( S L E ) o r o t h e r a u t o i m m u n e d i s e a s e s , i s c l a s s i f i e d a s s e c o n d a r y a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . A p p r o x i m a t e l y 4 0 % o f S L E p a t i e n t s p o s s e s s a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s ( L o v e a n d S a n t o r o , 1 9 9 0 ) . O f t h e s e S L E p a t i e n t s w i t h a P L , a b o u t 4 0 % d e v e l o p t h r o m b o s i s . I n c o m p a r i s o n , o n l y 12 % o f S L E p a t i e n t s w i t h o u t a P L d e v e l o p t h r o m b o s i s . 7 1.2.2 C l a s s i f i c a t i o n C r i t e r i a f o r A P S D i a g n o s i s o f A P S h a s t o s a t i s f y b o t h c l i n i c a l a n d l a b o r a t o r y c r i t e r i a . T h e p r e l i m i n a r y c r i t e r i a f o r c l a s s i f i c a t i o n o f A P S p r o p o s e d b y t h e I n t e r n a t i o n a l C o n s e n s u s W o r k s h o p i n 1 9 9 8 i s l i s t e d i n T a b l e 1 ( W i l s o n et al., 1 9 9 9 ) . 1.2.3 M a n a g e m e n t o f A P S A n t i c o a g u l a t i o n t h e r a p y w i t h l o n g t e r m u s e o f w a r f a r i n t o a c h i e v e a n I n t e r n a t i o n a l N o r m a l i z e d R a t i o ( I N R ) > 3 w i t h o r w i t h o u t l o w d o s e a s p i r i n ( 7 5 m g ) w a s f o u n d t o b e e f f e c t i v e i n p r e v e n t i n g r e c u r r e n t v e n o u s a n d r e c u r r e n t a r t e r i a l t h r o m b o s i s ( K h a m a s h t a et al, 1 9 9 5 ; R o s o v e a n d B r e w e r , 1 9 9 2 ) . C o r t i c o s t e r i o d t r e a t m e n t i s e f f e c t i v e f o r t h r o m b o c y t o p e n i a ( K h a m a s h t a , 1 9 9 6 ) ; h o w e v e r s p l e n e c t o m y m a y b e n e c e s s a r y ( G a l i n d o et al, 1 9 9 9 ) . L o w d o s e a s p i r i n a n d s u b c u t a n e o u s u n f r a c t i o n a t e d h e p a r i n h a s p r o v e n t o b e e f f e c t i v e i n p r e v e n t i n g r e c u r r e n t f e t a l l o s s ( R a i et al, 1 9 9 7 ; K u t t e h , 1996; K u t t e h a n d E r m e l , 1 9 9 6 ) . 8 T a b l e 1. P r e l i m i n a r y C l a s s i f i c a t i o n C r i t e r i a f o r D e f i n i t e A n t i p h o s p h o l i p i d S y n d r o m e ( W i l s o n etal., 1 9 9 9 ) . C l i n i c a l C r i t e r i a 1. V a s c u l a r t h r o m b o s i s : O n e o r m o r e e p i s o d e s o f a r t e r i a l , v e n o u s , o r s m a l l v e s s e l t h r o m b o s i s , i n a n y t i s s u e o r o r g a n . T h r o m b o s i s m u s t b e c o n f i r m e d b y i m a g i n g o r D o p p l e r s t u d i e s o r h i s t o p a t h o l o g y , w i t h t h e e x c e p t i o n o f s u p e r f i c i a l v e n o u s t h r o m b o s i s . F o r h i s t o p a t h o l o g i c c o n f i r m a t i o n , t h r o m b o s i s s h o u l d b e p r e s e n t w i t h o u t s i g n i f i c a n t e v i d e n c e o f i n f l a m m a t i o n i n t h e v e s s e l w a l l . 2. P r e g n a n c y m o r b i d i t y (a) O n e o r m o r e u n e x p l a i n e d d e a t h s o f a m o r p h o l o g i c a l l y n o r m a l f e t u s at o r a f t e r t h e 1 0 t h w e e k o f g e s t a t i o n , w i t h f e t a l m o r p h o l o g y d o c u m e n t e d b y u l t r a s o u n d o r b y d i r e c t e x a m i n a t i o n o f t h e f e t u s , o r (b) O n e o r m o r e p r e m a t u r e b i r t h s o f a m o r p h o l o g i c a l l y n o r m a l n e o n a t e at o r b e f o r e t h e 34' w e e k o f g e s t a t i o n b e c a u s e o f s e v e r e p r e e c l a m p s i a o r e c l a m p s i a , o r s e v e r e p l a c e n t a l i n s u f f i c i e n c y , o r (c ) T h r e e o r m o r e u n e x p l a i n e d c o n s e c u t i v e s p o n t a n e o u s a b o r t i o n s b e f o r e t h e 1 0 t h w e e k o f g e s t a t i o n , w i t h m a t e r n a l a n a t o m i c o r h o r m o n a l a b n o r m a l i t i e s a n d p a t e r n a l a n d m a t e r n a l c h r o m o s o m a l c a u s e s e x c l u d e d . L a b o r a t o r y C r i t e r i a 1. A n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d y o f I g G a n d / o r I g M i s o t y p e i n b l o o d , p r e s e n t i n m e d i u m o r h i g h t i t e r , o n 2 o r m o r e o c c a s i o n s , at l e a s t 6 w e e k s ap a r t , m e a s u r e d b y a s t a n d a r d i z e d E L I S A f o r B 2 - g l y c o p r o t e i n I - d e p e n d e n t a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d y . 2. L u p u s a n t i c o a g u l a n t p r e s e n t i n p l a s m a , o n 2 o r m o r e o c c a s i o n s at l e a s t 6 w e e k s apart, d e t e c t e d a c c o r d i n g t o t h e g u i d e l i n e s o f t h e I n t e r n a t i o n a l S o c i e t y o f T h r o m b o s i s a n d H a e m o s t a s i s ( S c i e n t i f i c S u b c o m m i t t e e o n L u p u s A n t i c o a g u l a n t s / P h o s p h o l i p i d - D e p e n d e n t A n t i b o d i e s ) , i n t h e f o l l o w i n g s t e p s : (a) P r o l o n g e d p h o s p h o l i p i d - d e p e n d e n t c o a g u l a t i o n s c r e e n i n g t e s t (e.g. a c t i v a t e d p a r t i a l t h r o m b o p l a s t i n t i m e ) , k a o l i n c l o t t i n g t i m e , d i l u t e R u s s e l l ' s v i p e r v e n o m t i m e , d i l u t e p r o t h r o m b i n t i m e , a n d T e x t a r i n t i m e . (b) F a i l u r e t o c o r r e c t t h e p r o l o n g e d c o a g u l a t i o n t i m e b y m i x i n g w i t h n o r m a l p l a t e l e t - p o o r p l a s m a . ( c ) S h o r t e n i n g o r c o r r e c t i o n o f t h e p r o l o n g e d c o a g u l a t i o n t i m e o n t h e s c r e e n i n g test b y t h e a d d i t i o n o f e x c e s s p h o s p h o l i p i d . (d) E x c l u s i o n o f o t h e r c o a g u l o p a t h i e s a s c l i n i c a l l y i n d i c a t e d e.g. f a c t o r V I I I i n h i b i t o r a n d h e p a r i n , a s a p p r o p r i a t e . D e f i n i t e a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d y s y n d r o m e i s c o n s i d e r e d t o b e p r e s e n t i f at l e a s t 1 o f t h e c l i n i c a l c r i t e r i a a n d 1 o f t h e l a b o r a t o r y c r i t e r i a a r e m et. 9 1.3 B 2 - G l y c o p r o t e i n I 1.3.1 C h a r a c t e r i z a t i o n o f B 2 G P I H u m a n B 2 - g l y c o p r o t e i n I ( B 2 G P I ) i s a l s o k n o w n as a p o l i p o p r o t e i n H ( A p o H ) . B 2 G P I i s a 5 4 k D a g l y c o p r o t e i n w i t h a p l a s m a c o n c e n t r a t i o n o f 2 0 0 p g / m L t h a t b i n d s t o n e g a t i v e l y c h a r g e d p h o s p h o l i p i d ( W u r m et al, 1 9 8 2 ) . It w a s f i r s t p u r i f i e d b y S c h u l z e et al. i n 1961 ( S c h u l z e et al, 1 9 6 1 ) . T h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f B 2 G P I h a s b e e n d e t e r m i n e d b y a m i n o a c i d s e q u e n c e a n a l y s i s ( L o z i e r et al, 1 9 8 4 ) a n d c D N A c l o n i n g ( M e h d i et al, 1991; M a t s u u r a et al, 1 9 9 1 ; K r i s t e n s e n et al, 1 9 9 1 ; S t e i n k a s s e r e r et al, 1 9 9 1 ) w i t h d i f f e r e n c e s r e p o r t e d at 2 a m i n o a c i d s . A m i n o a c i d s e q u e n c i n g s h o w e d C y s l 0 2 a n d A s n l 6 9 i n t h e s e q u e n c e w h i l e a l l c D N A c l o n i n g e x p e r i m e n t s s h o w e d S e r 102 a n d C y s l 6 9 . T h e g e n e s t r u c t u r e e n c o d i n g f o r B 2 G P I h a s a l s o b e e n d e t e r m i n e d ( O k k e l s et al, 1999). T h e m a t u r e B 2 G P I p r o t e i n i s c o m p o s e d o f 3 2 6 a m i n o a c i d s a r r a n g e d i n f i v e s h o r t c o n s e n s u s r e p e a t s ( S C R s ) w h i c h a r e a l s o k n o w n as S u s h i - d o m a i n a n d c o m p l e m e n t c o n t r o l p r o t e i n m o d u l e s ( F i g u r e 1). S C R s a r e a p p r o x i m a t e l y 6 0 a m i n o a c i d s i n l e n g t h a n d c o n t a i n f o u r c o n s e r v e d c y s t e i n e r e s i d u e s w h i c h f o r m d i s u l f i d e b r i d g e s i n C y s 1-3 a n d C y s 2-4 f a s h i o n ( R e i d et al, 1 9 8 6 ) . N u m e r o u s p r o t e i n s b e l o n g i n g t o t h e R e g u l a t i o n o f C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n ( R C A ) g e n e c l u s t e r a l s o c o n s i s t o f m u l t i p l e S C R s ( R o d r i g u e z et al, 1 9 8 5 ) . D e s p i t e t h e s t r u c t u r a l s i m i l a r i t y , B 2 G P I d o e s n o t m a p t o t h e s a m e l o c u s as t h e R C A g e n e c l u s t e r . c D N A c l o n i n g s t u d i e s m a p p e d th e s t r u c t u r a l l o c u s f o r t h i s p r o t e i n t o q 2 3 -> q t e r o n c h r o m o s o m e 17 a n d n o t p a r t o f t h e R C A c l u s t e r o n c h r o m o s o m e 1 ( N u k a t s u k a a n d N a g a s a w a , 1 9 8 7 ) . 10 F i g u r e 1. P r i m a r y s t r u c t u r e o f h u m a n B 2 G P I . B 2 G P I i s c o m p o s e d o f f i v e d o m a i n s . " C H O " i n d o m a i n III a n d d o m a i n I V r e p r e s e n t s the N - g l y c o s y l a t i o n s i t e s . T h i s s c h e m a t i c d i a g r a m i s as s h o w n b y K o i k e , T . w i t h m o d i f i c a t i o n s ( K o i k e , 1 9 9 4 ) . 11 1.3.2 C a r b o h y d r a t e C o m p o s i t i o n a n d F u n c t i o n o f S u g a r R e s i d u e s B 2 G P I h a s f o u r N - g l y c o s y l a t i o n s i t e s . T h e y ar e l o c a t e d at A s n l 4 3 , A s n l 6 4 , A s n l 7 4 o f d o m a i n III, a n d A s n 2 3 4 o f d o m a i n I V ( M e h d i et al, 1 9 9 1 ; S t e i n k a s s e r e r et al, 1 9 9 1 ) . C a r b o h y d r a t e a n a l y s e s o f B 2 G P I s h o w tha t i t i s r i c h i n c a r b o h y d r a t e s i n c l u d i n g m a n n o s e , N - a c e t y l g l u c o s a m i n e , s i a l i c a c i d , N - a c e t y l g a l a c t o s a m i n e , g a l a c t o s e , a n d f u c o s e ( G a m b i n o et al, 1997; G a m b i n o et al, 1997; G a m b i n o et al, 1 9 9 7 ) . T h e s e c a r b o h y d r a t e r e s i d u e s h a v e b e e n s u g g e s t e d t o c o n t r i b u t e t o p h o s p h o l i p i d b i n d i n g ( B r i g h t o n et al, 1 9 9 9 ) a n d t o t h e i n t e g r i t y o f t h e s e c o n d a r y s t r u c t u r e s o f B 2 G P I ( W a l s h et al, 1 9 9 0 ) b u t n o t i n t h e r e c o g n i t i o n o f B 2 G P I b y a P L ( A r v i e u x et al, 1 9 9 4 ) . O - l i n k e d c a r b o h y d r a t e s a r e a l s o p r e s e n t ; h o w e v e r , t h e O - g l y c o s y l a t i o n s i t e s r e m a i n t o b e d e t e r m i n e d ( G a m b i n o et al, 1 9 9 7 ) . 1.3.3 B i n d i n g o f B 2 G P I t o P h o s p h o l i p i d s B 2 G P I c a n i n t e r a c t w i t h a n i o n i c p h o s p h o l i p i d s s u c h as c a r d i o l i p i n ( C L ) , p h o s p h a t i d y l s e r i n e ( P S ) , p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ( P I ) , a n d p h o s p h a t i d i c a c i d ( P A ) ( W u r m , 1 9 8 4 ) . I n t e r a c t i o n w i t h p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e h a s a l s o b e e n r e p o r t e d ( H a r p e r et al, 1 9 9 8 ) . A c l u s t e r o f l y s i n e r e s i d u e s i n t h e f i f t h d o m a i n o f B 2 G P I h a s b e e n i d e n t i f i e d t o m e d i a t e p h o s p h o l i p i d b i n d i n g ( K e r t e s z et al, 1 9 9 5 ) . T h e s e l y s i n e s r e s i d e i n t h e C 2 8 1 K N K E K K C 2 8 8 s e q u e n c e . S i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s a n a l y s i s s h o w e d tha t L y s 2 8 4 , L y s 2 8 6 , a n d L y s 2 8 7 a r e c r i t i c a l f o r a n i o n i c p h o s p h o l i p i d b i n d i n g ( S h e n g et al, 1996). T h e s e l y s i n e r e s i d u e s a r e a l s o e s s e n t i a l f o r B 2 G P I b i n d i n g t o e n d o t h e l i a l c e l l s ( D e l P a p a 12 et al, 1 9 9 8 ) . A s t u d y o f b o v i n e B 2 G P I a l s o s h o w e d tha t t h e b e s i d e s t h e f i f t h d o m a i n , t h e f i r s t d o m a i n m a y a l s o b e i n v o l v e d i n p h o s p h o l i p i d b i n d i n g ( H a g i h a r a et al, 1 9 9 5 ) . A n o t h e r r e g i o n o f B 2 G P 1 h a s b e e n s u g g e s t e d t o m e d i a t e p h o s p h o l i p i d b i n d i n g . T h i s r e g i o n c o r r e s p o n d s t o a m i n o a c i d K 2 6 8 N G M L H G D K V S 2 7 8 o f t h e fifth d o m a i n w i t h H i s 2 7 3 a p p e a r i n g t o b e i n d i s p e n s a b l e f o r t h e b i n d i n g t o C L . S u b s t i t u t i o n s w i t h o t h e r a m i n o a c i d s i n t h i s p o s i t i o n d e c r e a s e t h e b i n d i n g a b i l i t y o f B 2 G P 1 w i t h a n i o n i c p h o s p h o l i p i d s ( L a u e r et al, 1 9 9 3 ) . 1.3.4 B 2 G P I P o l y m o r p h i s m a n d M u t a t i o n F o u r a l l e l e s o f B 2 G P I , A P O H * 1 T O A P O H * 4 , h a v e b e e n i d e n t i f i e d b y i s o e l e c t r i c f o c u s s i n g ( K a m b o h et al, 1 9 8 8 ) . A P O H * 3 c a n b e f u r t h e r c h a r a c t e r i z e d i n t o t w o s u b t y p e s ; A P O H * 3 W a n d A P O H * 3 b , b a s e d u p o n i t s r e a c t i v i t y w i t h m o n o c l o n a l a n t i b o d y 3 D 11. A P O F £ * 2 i s t h e m o s t p r e v a l e n t a l l e l e i n N o r t h A m e r i c a . A P O H * 1 h a s a S 8 8 N m u t a t i o n w h e r e a s A P O H * 3 W h a s a W 3 1 6 S ( S a n g h e r a et al, 1 9 9 7 ) . P h o s p h o l i p i d b i n d i n g s t u d i e s s h o w e d t h a t B 2 G P I w i t h C 3 0 6 G a n d / o r W 3 1 6 S m u t a t i o n ( s ) c a n n o t b i n d a n i o n i c p h o s p h o l i p i d . T h e W 3 1 6 S m u t a t i o n d i s r u p t s t h e c o n f o r m a t i o n o f f o u r h i g h l y c o n s e r v e d h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s s e q u e n c e a t p o s i t i o n s 3 1 3 - 3 1 6 , w h i c h i s a p o t e n t i a l p r o t e i n - l i p i d h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n s i t e ( S a n g h e r a et al, 1 9 9 7 ) . H o w e v e r , t h e B 2 G P I W 3 1 6 S m u t a t i o n d o e s n o t c o n f e r p r o t e c t i o n a g a i n s t a n t i -B 2 G P I a u t o a n t i b o d y p r o d u c t i o n e v e n t h o u g h B 2 G P I c a n n o t b i n d p h o s p h o l i p i d f o r a n t i -B 2 G P I b i n d i n g ( H o r b a c h et al, 1 9 9 8 ) . T h e C 3 0 6 G m u t a t i o n c a u s e s t h e d i s r u p t i o n o f a d i s u l f i d e b o n d b e t w e e n C y s 2 8 1 a n d C y s 3 0 6 a n d a f f e c t s t h e c o n f o r m a t i o n o f p o s i t i v e l y c h a r g e d l y s i n e r e s i d u e s a l o n g w i t h f o u r h y d r o p h o b i c a m i n o a c i d s s e q u e n c e ( S a n g h e r a et 13 al, 1 9 9 7 ) . P o l y m o r p h i c s u b s t i t u t i o n at V a l 2 4 7 b y L e u 2 4 7 h a s b e e n r e p o r t e d b u t a p p e a r e d n o t t o c o r r e l a t e w i t h t h e f o u r i s o e l e c t r i c f o c u s i n g a l l e l e s ( S t e i n k a s s e r e r et al, 1 9 9 3 ) . 1.3.5 P h y s i c a l S t u d i e s o f B 2 G P I A n i n t r i n s i c f l u o r e s c e n c e s t u d y m e a s u r i n g t h e b l u e s h i f t ( 3 4 5 t o 3 3 4 n m ) o f B 2 G P I u p o n b i n d i n g p h o s p h a t i d y l g l y c e r o l ( P G ) - c o n t a i n i n g p h o s p h o l i p i d m e m b r a n e s h o w e d tha t t r y p t o p h a n r e s i d u e s o f B 2 G P I m o v e f r o m a p o l a r t o a n o n p o l a r e n v i r o n m e n t . T h i s f i n d i n g s u g g e s t s t h a t B 2 G P I b i n d i n g t o p h o s p h o l i p i d i n v o l v e s i n s e r t i o n o f p a r t o f t h e p r o t e i n i n t o t h e P G - c o n t a i n i n g m e m b r a n e ( W a n g et al, 1 9 9 9 ) . T h i s h y d r o p h o b i c i n t e r a c t i o n b e t w e e n B 2 G P I a n d p h o s p h o l i p i d as p a r t o f t h e B 2 G P I - p h o s p h o l i p i d b i n d i n g p r o c e s s h a s a l s o b e e n s h o w n u s i n g p h o s p h o l i p i d m o n o l a y e r t e c h n i q u e a n d m e m b r a n e -i n s e r t i o n a n a l y s i s ( W a n g et al, 1 9 9 8 ) . T h e c r y s t a l s t r u c t u r e o f B 2 G P I i n d i c a t e s a r e g i o n o f 14 c a t i o n i c a m i n o a c i d r e s i d u e s f o r e l e c t r o s t a t i c i n t e r a c t i o n s w i t h a n i o n i c p h o s p h o l i p i d h e a d g r o u p s a n d a n e x p o s e d m e m b r a n e - i n s e r t i o n l o o p f o r p h o s p h o l i p i d b i n d i n g ( B o u m a et al, 1 9 9 9 ) . U s i n g i n f r a r e d s p e c t r o s c o p y , c h a n g e s i n B 2 G P I s t r u c t u r e u p o n b i n d i n g t o c a r d i o l i p i n w a s d e t e c t e d ( B o r c h m a n et al, 1 9 9 5 ) . F r e e B 2 G P I w a s c a l c u l a t e d t o c o n t a i n 1 8 % t u r n s , 3 7 % a l p h a - h e l i x , a n d 4 5 % b e t a - s h e e t s t r u c t u r e . A f t e r b i n d i n g t o c a r d i o l i p i n , t h e r e w a s a d e c r e a s e i n b e t a - s h e e t s t r u c t u r e o f B 2 G P I f r o m 4 6 % t o 2 3 % a n d a p p e a r a n c e o f 2 6 % t o 2 8 % r a n d o m s t r u c t u r e . 14 1.3.6 I n t e r a c t i o n s o f ( 3 2 G P I w i t h D i f f e r e n t C e l l s . P r o t e i n s , a n d B i o c h e m i c a l s B 2 G P I h a s a f f i n i t y t o w a r d s a v a r i e t y o f t a r g e t s i n c l u d i n g a c t i v a t e d p l a t e l e t s ( V a z q u e z - M e l l a d o et al, 1994; N i m p f et al, 1985; S c h o u s b o e , 1 9 8 3 ) , e n d o t h e l i a l c e l l s ( G e o r g e et al, 1998; D e l P a p a et al, 1998; D e l P a p a et al, 1997; D e l P a p a et al, 1997; D e l P a p a et al, 1995; L e T o n q u e z e et al, 1995), l i p o p r o t e i n s ( C a r d i g a n et al, 1998; M c N a l l y et al, 1996; P o l z et al, 1981; P o l z etal, 1980), a n i o n i c l i p o s o m e s ( B a l a s u b r a m a n i a n a n d S c h r o i t , 1998; B a l a s u b r a m a n i a n et al, 1 9 9 7 ) , as w e l l as a p o p t o t i c b o d i e s ( L e v i n e et al, 1998; R o v e r e et al, 1998; M a n f r e d i et al, 1 9 9 8 ; P r i c e et al, 1 9 9 6 ; M a n f r e d i et al.,). B 2 G P I b i n d s t o Staphylococcus aureus l e a d i n g t o s p e c u l a t i o n t h a t a P L p r o d u c t i o n m a y b e l i n k e d t o S. aureus i n f e c t i o n ( Z h a n g et al, 1 9 9 9 ) . B 2 G P I a l s o i n t e r a c t s w i t h c a l m o d u l i n i n k i d n e y , h o w e v e r , t h e p h y s i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d ( R o j k j a s r et al, 1997; K l a e r k e et al, 1997). O t h e r b i o l o g i c a l s u b s t a n c e s t h a t B 2 G P I b i n d s i n c l u d e h e p a r i n ( P o l z et al, 1980) a n d D N A ( K r o l l et al, 1 9 7 6 ) . 1.3.7 I n t e r a c t i o n A m o n g B 2 G P I . P l a t e l e t . C o a g u l a t i o n , a n d A n t i c o a g u l a t i o n N u m e r o u s e f f e c t s o f B 2 G P I o n p l a t e l e t s a n d h e m o s t a s i s h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d . T h e s e s t u d i e s s u g g e s t t h a t B 2 G P I h a s c o a g u l a t i o n i n h i b i t i o n p r o p e r t i e s . B 2 G P I i n h i b i t s f a c t o r X a c t i v a t i o n ( I e k o et al, 1998; S h i et al, 1 9 9 3 ) a n d p r o t h r o m b i n a s e a c t i v i t y o f a c t i v a t e d p l a t e l e t s ( N i m p f et al, 1 9 8 6 ) as w e l l as p l a t e l e t s e r o t o n i n r e l e a s e d u r i n g A D P -d e p e n d e n t p l a t e l e t a g g r e g a t i o n ( N i m p f etal, 1987). I n c r e a s e i n a d e n y l a t e c y c l a s e a c t i v i t y b y 6 2 G P I i n p l a t e l e t m e m b r a n e h a s b e e n a l s o r e p o r t e d ( S c h o u s b o e , 1 9 8 3 ) . B 2 G P I c a n i n h i b i t c o n t a c t a c t i v a t i o n o f t h e i n t r i n s i c p a t h w a y ( S c h o u s b o e , 1 9 8 8 ; S c h o u s b o e a n d R a s m u s s e n , 1988; S c h o u s b o e , 1 9 8 5 ) as w e l l as p r e k a l l i k r e i n a c t i v a t i o n 15 ( S c h o u s b o e , 1 9 8 8 ) . I n a d d i t i o n , B 2 G P I c a n i n h i b i t f a c t o r X I I a c t i v a t i o n b y l i p o p r o t e i n l i p a s e o n v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n s ( M c N a l l y et al, 1 9 9 6 ) . I n t h e a n t i c o a g u l a t i o n m e c h a n i s m , B 2 G P I m a y b e a n i n h i b i t o r o f a c t i v a t e d p r o t e i n C ( A P C ) ( C a n f i e l d a n d K i s i e l , 1 982). U s i n g c l o t t i n g a s s a y s , B 2 G P I i n h i b i t s A P C a n d p r o d u c e s a p r o c o a g u l a n t c o n d i t i o n ( M o r i et al, 1 9 9 6 ) . T h e s e s t u d i e s s u g g e s t a p r o c o a g u l a n t r o l e f o r B 2 G P I . I n c o n t r a s t , t h e o b s e r v a t i o n o f B 2 G P I m e d i a t e d l i b e r a t i o n o f f r e e p r o t e i n S f r o m p r o t e i n S - C 4 b b i n d i n g p r o t e i n c o m p l e x , a n i m p o r t a n t a n t i c o a g u l a t i o n c o f a c t o r , s u g g e s t s a n a n t i c o a g u l a n t r o l e f o r B 2 G P I i n a n t i c o a g u l a t i o n ( M e r r i l l et al, 1 9 9 9 ; A t s u m i et al, 1 9 9 7 ) . A l s o , i t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t i t m a y b e a n a t u r a l a n t i c o a g u l a n t ( B r i g h t o n et al, 1 9 9 6 ) . I n t h i s s t u d y , B 2 G P I l e v e l s a l o n g w i t h o t h e r a n t i c o a g u l a n t p r o t e i n s w e r e r e d u c e d i n p a t i e n t s w i t h d i s s e m i n a t e d i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n ( D I C ) . T h i s s u g g e s t e d s p e c i f i c c o n s u m p t i o n o f B 2 G P I i n in vivo c o a g u l a t i o n . T h e r e f o r e , t h e p r e c i s e r o l e ( s ) o f B 2 G P I i n c o a g u l a t i o n r e m a i n s u n c l e a r . It i s p o s s i b l e t h a t i t f u n c t i o n s a s b o t h p r o c o a g u l a n t a n d a n t i c o a g u l a n t . H o w e v e r , t h i s r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d . 1.3.8 B 2 G P I a n d F i b r i n o l y s i s B 2 G P I c o n t a i n s a c l e a v a g e s i t e f o r p l a s m i n b e t w e e n t h e r e s i d u e s L y s 3 1 7 a n d T h r 3 1 8 i n t h e f i f t h d o m a i n ( H o r b a c h et al, 1999; O h k u r a et al, 1 9 9 8 ) . T h e c l e a v a g e l e a d s t o s i g n i f i c a n t r e d u c t i o n i n B 2 G P I a f f i n i t y t o a n i o n i c p h o s p h o l i p i d ( H o r b a c h et al, 1999; O h k u r a et al, 1998; H a g i h a r a et al, 1997). I n p l a s m a o f p a t i e n t s w i t h D I C , t h e i n c r e a s e i n c l e a v e d B 2 G P I l e v e l i s a c c o m p a n i e d b y a d e c r e a s e i n t h e l e v e l o f i n t a c t B 2 G P I , s u g g e s t i n g a c t i v e c o n s u m p t i o n o f B 2 G P I b y p l a s m i n d u r i n g D I C ( H o r b a c h et al, 1999). 16 L i p o p r o t e i n (a) ( L p ( a ) ) i s s t r u c t u r a l l y s i m i l a r t o p l a s m i n o g e n ( M c L e a n et al, 1987). L p ( a ) i m p a i r s f i b r i n o l y t i c a c t i v i t y b y c o m p e t i n g w i t h p l a s m i n o g e n a n d t i s s u e t y p e - p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r f o r f i b r i n - b i n d i n g s i t e s ( L o s c a l z o et al, 1 9 9 0 ) . L p ( a ) i n t e r a c t i o n w i t h B 2 G P I h a s b e e n r e p o r t e d ( K o c h l et al, 1 9 9 7 ) . E l e v a t e d L p ( a ) ( Y a m a z a k i et al, 1 9 9 4 ) w i t h c o n c u r r e n t d e p r e s s e d f i b r i n o l y t i c a c t i v i t y as i n d i c a t e d b y l o w e r D - d i m e r a n d h i g h e r p l a s m i n o g e n a c t i v a t o r i n h i b i t o r i n A P S p a t i e n t s h a s b e e n o b s e r v e d ( A t s u m i et al, 1998). C o r r e l a t i o n s a m o n g L p ( a ) l e v e l s , B 2 G P I i m m u n e c o m p l e x l e v e l s , a n d the o c c u r e n c e o f t h r o m b o c y t o p e n i a a r e a l s o f o u n d i n A P S p a t i e n t s ( G e o r g e et al, 1999). B 2 G P I i n t e r a c t i o n s w i t h p l a s m i n a n d L p ( a ) t o g e t h e r s u g g e s t t h a t B 2 G P I m a y b e i n v o l v e d i n f i b r i n o l y s i s . 1.3.9 B 2 G P I a n d L i p o p r o t e i n s B 2 G P I b i n d s a l l m a j o r l i p o p r o t e i n d e n s i t y f r a c t i o n s , e s p e c i a l l y c h y l o m i c r o n s , v e r y l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n ( V L D L ) , a n d h i g h d e n s i t y l i p o p r o t e i n ( H D L ) ( P o l z a n d K o s t n e r , 1 9 7 9 ) a n d a c t i v a t e s l i p o p r o t e i n l i p a s e ( N a k a y a et al, 1 9 8 0 ) . B 2 G P I m a y b e i n v o l v e d i n t h e r e m o v a l o f t r i g l y c e r i d e f r o m c i r c u l a t i n g b l o o d ( W u r m et al, 1 9 8 2 ) . T h e l e v e l o f B 2 G P I i s e l e v a t e d s i g n i f i c a n t l y i n p a t i e n t s w i t h h y p e r c h o l e s t e r o l a e m i a , h y p e r t r i g l y c e r i d a e m i a , m i x e d h y p e r l i p i d a e m i a ( M c N a l l y et al, 1 9 9 4 ) , n o n - i n s u l i n d e p e n d e n t d i a b e t e s m e l l i t u s a n d i n s u l i n - d e p e n d e n t d i a b e t e s m e l l i t u s ( C a s s a d e r et al, 1997). I n d i v i d u a l s w i t h t h e A P O H * 3 a l l e l e o f B 2 G P I h a v e s i g n i f i c a n t l y h i g h e r t r i g l y c e r i d e l e v e l ( C a s s a d e r et al, 1 9 9 4 ) . D e s p i t e t h e s e o b s e r v a t i o n s o f B 2 G P I a s s o c i a t i o n s w i t h l i p o p r o t e i n , p a t i e n t s w i t h B 2 G P I d e f i c i e n c y d o n o t s h o w s i g n s o f s i g n i f i c a n t p e r t u r b a t i o n o f n o r m a l l i p o p r o t e i n m e t a b o l i s m ( H o e g et al, 1 9 8 5 ) . 17 B 2 G P I i n h i b i t s in vitro u p t a k e o f o x i d i z e d l o w d e n s i t y l i p o p r o t e i n ( L D L ) b y m a c r o p h a g e s a n d t h e p r e s e n c e o f a n t i - B 2 G P I c a n r e v e r s e t h e p r o c e s s as w e l l as a c c e l e r a t e t h e u p t a k e o f o x i d i z e d L D L b y m a c r o p h a g e s . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t a n a n t i -a t h e r o g e n i c f u n c t i o n f o r B 2 G P I t h a t c o u l d b e a b r o g a t e d b y a n t i - B 2 G P I ( H a s u n u m a et al, 1 9 9 7 ) . W i t h r e g a r d s t o o x i d i z e d l i p i d , a n t i - B 2 G P I a n t i b o d i e s h a v e i n c r e a s e d a f f i n i t y f o r B 2 G P I c o u p l e d t o o x i d i z e d c a r d i o l i p i n ( H o r k k o et al, 1 9 9 7 ) . I n a d d i t i o n , s i g n i f i c a n t l y h i g h e r l e v e l o f l i p i d p e r o x i d a t i o n h a s b e e n m e a s u r e d i n A P S p a t i e n t s ( P r a t i c o et al, 1 9 9 9 ) . T h e s e s t u d i e s t o g e t h e r s u g g e s t t h a t o x i d a t i o n o f l i p i d s e n h a n c e B 2 G P I - m e d i a t e d a n t i - B 2 G P I b i n d i n g t o l i p o p r o t e i n s o r c e l l m e m b r a n e s . A n t i - B 2 G P I a n t i b o d i e s i n d u c e a c c e l e r a t e d a t h e r o s c l e r o s i s i n a L D L - r e c e p t o r -d e f i c i e n t m o u s e m o d e l f e d o n a h i g h - c h o l e s t e r o l d i e t ( G e o r g e et al, 1999; G e o r g e et al, 1 9 9 8 ) as w e l l as i n a n a p o l i p o p r o t e i n E - k n o c k o u t m o u s e m o d e l ( G e o r g e et al, 1 9 9 9 ) . T h i s s u g g e s t s t h a t a n t i - B 2 G P I m a y i n h i b i t t h e p u t a t i v e a n t i - a t h e r o g e n i c f u n c t i o n o f B 2 G P I . 1.3.10 B 2 G P I a n d A p o p t o s i s S e v e r a l s t u d i e s h a v e r e p o r t e d t h a t B 2 G P I i s i n v o l v e d i n a p o p t o s i s . 6 2 G P I a n d a n t i - B 2 G P I d e p o s i t o n a p o p t o t i c t h y m o c y t e s ( P r i c e et al, 1 9 9 6 ) . T h e f o r m a t i o n o f a P L i s i n d u c e d i n m i c e a f t e r i m m u n i z a t i o n w i t h h e t e r o l o g o u s B 2 G P I b o u n d t o a p o p t o t i c t h y m o c y t e s ( L e v i n e et al, 1 9 9 8 ) . A l s o , B 2 G P I c a n m e d i a t e a n t i - B 2 G P I b i n d i n g t o a p o p t o t i c c e l l s f o r m a c r o p h a g e ( M a n f r e d i et al, 1 9 9 8 ; M a n f r e d i et al,) a n d d e n d r i t i c c e l l r e c o g n i t i o n ( R o v e r e et al, 1 9 9 8 ) . T h e o b s e r v a t i o n s o f B 2 G P I - m e d i a t e d c l e a r a n c e o f 18 a n i o n i c l i p o s o m e s b y m a c r o p h a g e s ( B a l a s u b r a m a n i a n a n d S c h r o i t , 1998; B a l a s u b r a m a n i a n et al, 1 9 9 7 ) f u r t h e r s u g g e s t B 2 G P I i s i n v o l v e d i n t h e a p o p t o t i c p r o c e s s . 1.3.11 A n t i - B 2 G P I B i n d i n g t o B 2 G P I B i n d i n g s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t p a t i e n t s ' a n t i - B 2 G P I b i n d s t o t h e first d o m a i n ( I v e r s o n et al, 1 9 9 8 ) , t h e f o u r t h d o m a i n ( G e o r g e et al, 1 9 9 8 ) , as w e l l as t h e fifth d o m a i n o f B 2 G P I ( Y a n g et al, 1 9 9 8 ; W a n g et al, 1 9 9 5 ) . M o n o c l o n a l a n t i b o d i e s f r o m m i c e i m m u n i z e d w i t h h u m a n B 2 G P I b i n d B 2 G P I i n t h e first t o f o u r t h d o m a i n s ( I g a r a s h i et al, 1996). T h e r e a s o n f o r t h e d i f f e r e n c e i n b i n d i n g o b s e r v e d i n t h e s e s t u d i e s a w a i t s f u r t h e r i n v e s t i g a t i o n . 1.4 A n t i c o a g u l a t i o n 1.4.1 C o a g u l a t i o n T h e c o a g u l a t i o n s y s t e m i s a c t i v a t e d i n r e s p o n s e t o v a s c u l a r d a m a g e ( F i g u r e 2). T h e i n i t i a l s t e p i n v o l v e s t h e e x p o s u r e o f t i s s u e f a c t o r at t h e i n j u r e d s i t e ( D r a k e et al, 1 9 8 9 ) f o r f a c t o r V i l a b i n d i n g ( N e m e r s o n , 1 9 8 8 ) . T h e a s s o c i a t i o n o f t h e s e t w o p r o t e i n s l e a d s t o t h e a c t i v a t i o n o f f a c t o r I X a n d f a c t o r X t o b e c o m e f a c t o r I X a a n d X a ( O s t e r u d a n d R a p a p o r t , 1 9 7 7 ) w h i c h b i n d a n i o n i c p h o s p h o l i p i d s u r f a c e s s u c h a s a c t i v a t e d p l a t e l e t s ( D i S c i p i o et al, 1 9 7 7 ) . F a c t o r X a t h e n a c t i v a t e s p r o t h r o m b i n t o t h r o m b i n ( M a n n et al, 1988). W i t h t h e g e n e r a t i o n o f t h r o m b i n , s o l u b l e f i b r i n o g e n m o l e c u l e s a r e c o n v e r t e d i n t o a n i n s o l u b l e f i b r i n m e s h at t h e i n j u r e d s i t e t o h i n d e r b l e e d i n g ( B l o m b a c k a n d B l o m b a c k , 19 1 9 7 2 ) . A t t h e s a m e t i m e , t h r o m b i n a c t i v a t e s f a c t o r V I I I ( H i l l - E u b a n k s et al, 1989) a n d f a c t o r V ( K a n e a n d D a v i e , 1 9 8 8 ) . T h e r e s u l t i n g f a c t o r V i l l a a n d f a c t o r V a b i n d t o a n i o n i c p h o s p h o l i p i d , a n d f o r m c o m p l e x e s w i t h f a c t o r I X a a n d f a c t o r X a , r e s p e c t i v e l y . T h e V H I a - I X a a n d V a - X a c o m p l e x e s a r e k n o w n a s t e n a s e a n d p r o t h r o m b i n a s e a n d a r e p o t e n t e n z y m a t i c a c t i v a t o r s f o r f a c t o r X ( 0 s t e r u d a n d R a p a p o r t , 1970; L u n d b l a d a n d D a v i e , 1 9 6 4 ) a n d p r o t h r o m b i n ( M a n n et al, 1 9 8 8 ) , r e s p e c t i v e l y . T h e g e n e r a t i o n o f t h e s e t w o c o m p l e x e s l e a d s t o a n a m p l i f i c a t i o n o f t h r o m b i n g e n e r a t i o n f o r f u r t h e r f i b r i n p r o d u c t i o n t o a r r e s t b l o o d l o s s . T h e r e f o r e , t h e V i l l a - a n d V a - c o n t a i n i n g t e n a s e a n d p r o t h r o m b i n a s e c o m p l e x p l a y a c e n t r a l r o l e i n t h e a m p l i f i c a t i o n o f t h r o m b i n g e n e r a t i o n a n d f i b r i n d e p o s i t i o n a t t h e s i t e o f i n j u r y . T h e c o a g u l a t i o n a c t i v i t i e s o f t e n a s e a n d p r o t h r o m b i n a s e a r e r e g u l a t e d b y the a n t i c o a g u l a t i o n m e c h a n i s m t o p r e v e n t u n c o n t r o l l e d p r o m o t i o n o f b l o o d c l o t t i n g . A c t i v a t e d p r o t e i n C ( A P C ) a n d p r o t e i n S a r e t h e t w o p r o t e i n s w i t h a n t i c o a g u l a n t a c t i v i t y i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n b y p r o t e o l y t i c a l l y c l e a v i n g a n d i n a c t i v a t i n g V a ( K a l a f a t i s et al, 1 9 9 4 ) a n d V i l l a ( F a y et al, 1 9 9 3 ; F a y et al, 1 9 9 1 ) o f p r o t h r o m b i n a s e a n d tenase. 2 0 F i g u r e 2. S c h e m e o f T i s s u e F a c t o r P a t h w a y o f C o a g u l a t i o n a n d A c t i v a t e d P r o t e i n C A n t i c o a g u l a t i o n S y s t e m . T h i c k a r r o w s r e p r e s e n t i n a c t i v a t i o n o f f a c t o r V i l l a a n d V a b y A P C . Tissue Factor (TF) P r o t e i n S 21 1 A.2 A c t i v a t e d P r o t e i n C 1 A.2.1 C h a r a c t e r i z a t i o n o f A c t i v a t e d P r o t e i n C A P C i s g e n e r a t e d b y t h e p r o t e o l y t i c a c t i v i t y o f t h r o m b i n - t h r o m b o m o d u l i n c o m p l e x o n its p r e c u r s o r p r o t e i n C ( E s m o n a n d O w e n , 1 9 8 1 ) . P r o t e i n C i s a 6 2 k D a p r o t e i n ( K i s i e l , 1 9 7 9 ; K i s i e l , 1 9 7 9 ) w i t h a p l a s m a c o n c e n t r a t i o n o f 4 u.g/mL ( 6 4 n M ) ( G r i f f i n et al, 1 9 8 2 ) . It b e l o n g s t o t h e v i t a m i n K - d e p e n d e n t p r o t e i n f a m i l y w h o s e m e m b e r s c o n t a i n g a m m a - c a r b o x y g l u t a m i c a c i d ( G l a ) . O t h e r p r o t e i n s t h a t b e l o n g t o t h i s f a m i l y a r e b l o o d c l o t t i n g f a c t o r II, V I I , I X , a n d X , as w e l l as t h e A P C c o f a c t o r p r o t e i n S ( M a n n et al, 1 9 8 8 ) . P r o t e i n C c o n t a i n s m u l t i p l e d o m a i n s . T h e d o m a i n s s t a r t i n g f r o m t h e N - t e r m i n u s a r e t h e G l a - d o m a i n , t w o e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r ( E G F ) - l i k e d o m a i n , a n d a s e r i n e p r o t e a s e d o m a i n ( B e c k m a n n et al, 1985; F o s t e r a n d D a v i e , 1 9 8 4 ) . It i s s y n t h e s i z e d i n t h e l i v e r as a s i n g l e p o l y p e p t i d e c h a i n o f 4 6 1 a m i n o a c i d s ( B e c k m a n n et al, 1985; F o s t e r a n d D a v i e , 1 9 8 4 ) . L y s l 5 6 a n d A r g l 5 7 a r e r e m o v e d f r o m t h e s e r i n e p r o t e a s e d o m a i n o f t h e p o l y p e p t i d e r e s u l t i n g i n a m a t u r e p r o t e i n C w i t h o n e h e a v y c h a i n a n d o n e l i g h t c h a i n l i n k e d t o g e t h e r t h r o u g h a n i n t e r - c h a i n d i s u l f i d e b r i d g e ( F o s t e r et al, 1991). T h e a c t i v a t i o n o f p r o t e i n C t o A P C r e q u i r e s t h e p r e s e n c e o f t h r o m b i n a n d a n i n t e g r a l m e m b r a n e p r o t e i n o n e n d o t h e l i a l c e l l s k n o w n as t h r o m b o m o d u l i n ( T M ) ( E s m o n a n d O w e n , 1 9 8 1 ) . A s t h e c o a g u l a t i o n r e a c t i o n p r o g r e s s e s d u r i n g b l o o d c l o t t i n g w i t h a n i n c r e a s i n g a m o u n t o f t h r o m b i n f o r m a t i o n , t h r o m b i n p r o v i d e s n e g a t i v e f e e d b a c k t o t e r m i n a t e t h e r e a c t i o n . T h r o m b i n i n h i b i t s c o a g u l a t i o n b y f o r m i n g a c o m p l e x w i t h T M . T M - b o u n d t h r o m b i n l o s e s i t s p r o c o a g u l a n t a c t i v i t y a n d a c q u i r e s p o t e n t p r o t e i n C 2 2 a c t i v a t i o n a c t i v i t y ( E s m o n et al, 1983; E s m o n et al, 1982). A s a r e s u l t o f t h r o m b i n b i n d i n g t o T M , A P C i s g e n e r a t e d f r o m p r o t e i n C . T h e t h r o m b i n - T M c o m p l e x a c t i v a t e s p r o t e i n C b y c l e a v i n g b e t w e e n A r g l 6 9 a n d L e u 1 7 0 ( K i s i e l , 1 9 7 9 ) . 1.4.2.2 A P C C a t a l y z e d F V a a n d F V I I I a I n a c t i v a t i o n T h e m a j o r r e a c t i o n s t h e A P C c a t a l y z e s a r e t h e i n a c t i v a t i o n o f F V a a n d F V I I I a . F V a a n d F V I I I a a r e h o m o l o g o u s p r o t e i n s ( K a n e a n d D a v i e , 1 9 8 8 ) . F V a h a s t h r e e c l e a v a g e s i t e s f o r A P C , n a m e l y A r g 3 0 6 , A r g 5 0 6 , a n d A r g 6 7 9 . C l e a v a g e at A r g 5 0 6 i s r e q u i r e d f o r e f f i c i e n t c l e a v a g e o f A r g 3 0 6 a n d A r g 6 7 9 . A r g 3 0 6 i s t h e m a j o r i n a c t i v a t i n g c l e a v a g e s i t e r e s u l t i n g i n t h e l o s s o f m o s t F V a a c t i v i t y a n d c l e a v a g e o f A r g 6 7 9 a c c o u n t s f o r t h e r e m a i n i n g F V a a c t i v i t y ( K a l a f a t i s et al, 1 9 9 4 ) . F V I I I a h a s t w o c l e a v a g e s i t e s f o r A P C at A r g 3 3 6 a n d A r g 5 6 2 . C l e a v a g e at A r g 3 3 6 b y A P C l e a d s t o t h e d i s s o c i a t i o n o f F V I I I a ( F a y et al, 1 9 9 3 ) , w h e r e a s t h e c l e a v a g e at A r g 5 6 2 r e m o v e s t h e i n t e r a c t i v e s i t e w i t h F I X a ( F a y et al, 1 9 9 1 ) . 1.4.3 P r o t e i n S 1.4.3.1 C h a r a c t e r i z a t i o n o f P r o t e i n S H u m a n p r o t e i n S i s a 7 5 k D a p r o t e i n s y n t h e s i z e d as a s i n g l e p o l y p e p t i d e c h a i n o f 6 3 5 a m i n o a c i d s ( D i S c i p i o a n d D a v i e , 1 9 7 9 ) i n h e p a t o c y t e s , e n d o t h e l i a l c e l l s , m e g a k a r y o c y t e s . It h a s a p l a s m a c o n c e n t r a t i o n o f 2 0 p g / m L , 2 9 0 n M ( S c h w a r z et al, 1986; F a i r a n d R e v a k , 1984; D a h l b a c k , 1 9 8 3 b ) . P r o t e i n S i s c o m p o s e d o f m u l t i p l e d i s c r e t e d o m a i n s ( S t e n f l o et al, 1987; D a h l b a c k , 1 9 8 6 ) . T h e d o m a i n s s t a r t i n g f r o m t h e N - t e r m i n u s a r e t h e v i t a m i n K - d e p e n d e n t g a m m a - c a r b o x y g l u t a m i c a c i d ( G l a ) r i c h r e g i o n 2 3 a n d f o l l o w e d b y a t h r o m b i n - s e n s i t i v e r e g i o n a n d f o u r E G F - l i k e d o m a i n s ( D o o l i t t l e et al, 1984), a n d a r e g i o n h o m o l o g o u s t o s e x h o r m o n e b i n d i n g g l o b u l i n ( S H B G ) ( B a k e r et al, 1987). T h e t h r o m b i n - s e n s i t i v e r e g i o n a n d t h e first E G F - l i k e d o m a i n s a r e t h o u g h t t o b e i n v o l v e d i n p r o t e i n S a n d a c t i v a t e d p r o t e i n C i n t e r a c t i o n s ( D a h l b a c k et al, 1 9 9 0 ) . S t u d i e s h a v e s u g g e s t e d t h a t a m i n o a c i d s 4 2 0 - 4 3 4 i n t h e S H B G - l i k e d o m a i n a r e i m p o r t a n t f o r t h e i n t e r a c t i o n w i t h C 4 B P ( G r e e n g a r d et al, 1 9 9 5 ) . I n p l a s m a , a p p r o x i m a t e l y 6 0 % o f t h e p r o t e i n S i s p r e s e n t as a 1:1 s t o i c h i o m e t r i c c o m p l e x w i t h C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n ( C 4 B P ) w i t h B - c h a i n , a n d t h e r e m a i n i n g i s p r e s e n t as f r e e p r o t e i n ( D a h l b a c k a n d S t e n f l o , 1 9 8 1 ) . T h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e p r o t e i n S a n d C 4 B P i s n o n - c o v a l e n t ; t h e C 4 B P - b o u n d p r o t e i n S l o s e s its c o f a c t o r a c t i v i t y f o r A P C . I n t h e a b s e n c e o f c a l c i u m , C 4 B P - p r o t e i n S c o m p l e x h a s a Kd o f 1 x 10" 7 M ( D a h l b a c k a n d S t e n f l o , 1 9 8 1 ) , w h e r e a s i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m , Kd i s 5 x 1 0 " 1 0 M ( D a h l b a c k , 1 9 8 3 a ) . C a l c i u m , t h e r e f o r e , p r o m o t e s t h e i r i n t e r a c t i o n d r a m a t i c a l l y . T h e l o w Kd i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m s u g g e s t s t h a t in vivo a l m o s t a l l C 4 B P w i t h B - c h a i n i s b o u n d t o p r o t e i n S, t h u s f r e e p r o t e i n S l e v e l s a r e d e t e r m i n e d b y t h e l e v e l o f B - c h a i n c o n t a i n i n g C 4 B P . 1.4.3.2 P r o t e i n S as C o f a c t o r o f A c t i v a t e d P r o t e i n C W i t h t h e a c t i v a t i o n o f t h e a n t i c o a g u l a t i o n p r o c e s s , A P C f o r m s a 1:1 s t o i c h i o m e t r i c c o m p l e x w i t h p r o t e i n S o n a n i o n i c p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s ( W a l k e r , 1 9 8 1 ) a n d c a t a l y z e s t h e p r o t e o l y t i c i n a c t i v a t i o n o f p h o s p h o l i p i d - b o u n d f a c t o r V a a n d f a c t o r V i l l a ( M a r l a r et al, 1 9 8 1 ) . P r o t e i n S i n c r e a s e s A P C a c t i v i t y b y r e l o c a t i n g t h e a c t i v e s i t e o f A P C a b o u t 1 n m c l o s e r t o t h e m e m b r a n e s u r f a c e ( Y e g n e s w a r a n et al, 1999; Y e g n e s w a r a n et al, 1 9 9 7 ) . T h i s e f f e c t i s m e d i a t e d b y t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n t h e 2 4 t h r o m b i n - s e n s i t i v e r e g i o n a n d t h e first E G F - l i k e d o m a i n i n p r o t e i n S ( D a h l b a c k et al, 1 9 9 0 ) w i t h t h e G l a - d o m a i n a n d / o r t h e first E G F - l i k e d o m a i n o f A P C ( O h l i n et al, 1990). A r g 4 9 a n d G l n 5 2 i n t h e t h r o m b i n - s e n s i t i v e r e g i o n a n d L y s 9 7 a n d P r o 1 0 6 i n t h e first E G F d o m a i n o f p r o t e i n S a p p e a r t o b e c r u c i a l f o r A P C c o f a c t o r a c t i v i t y ( H e et al, 1998). 1.4.4 A n t i c o a g u l a t i o n a n d A n t i p h o s p h o l i p i d S y n d r o m e T h e a n t i c o a g u l a t i o n a c t i v i t y o f a c t i v a t e d p r o t e i n C ( A P C ) i s i m p a i r e d b y t h e p r e s e n c e o f a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s a P L . S e v e r a l s t u d i e s h a v e d e m o n s t r a t e d that a P L c a n i n h i b i t F V a i n a c t i v a t i o n b y A P C ( G a l l i et al, 1998; O o s t i n g et al, 1993; M a l i a et al, 1990; M a r c i n i a k a n d R o m o n d , 1 9 8 9 ) . I n a n o t h e r s t u d y , 4 7 % o f 7 8 a P L i n p a t i e n t s a m p l e s b o u n d p r o t e i n C v i a B 2 G P I i n t h e p r e s e n c e o f p h o s p h o l i p i d ( A t s u m i et al, 1998). T h e r e f o r e , i n h i b i t i o n o f A P C a c t i v i t y i s a p r e v a l e n t f e a t u r e f o r A P S p a t i e n t s . C l i n i c a l d a t a f r o m p a t i e n t s w i t h p r i m a r y o r s e c o n d a r y a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e r e p o r t a v a r i a b l e d e c r e a s e i n t h e i m m u n o l o g i c a l l e v e l o f p l a s m a f r e e p r o t e i n S ( A m e s et al, 1996; G i n s b e r g et al, 1 9 9 5 ) . It h a s a l s o b e e n s u g g e s t e d t h a t p r o t e i n S - C 4 B P c o m p l e x f o r m a t i o n c a n b e d o w n - r e g u l a t e d b y 132GPI a n d t h i s d o w n - r e g u l a t i o n c a n b e d i s r u p t e d b y a n t i - ( 3 2 G P I a n t i b o d i e s ( M e r r i l l et al, 1 9 9 9 ; A t s u m i et al, 1 9 9 7 ) . 25 1.5 C o m p l e m e n t 1.5.1 C o m p l e m e n t S y s t e m T h e c o m p l e m e n t s y s t e m h a s a n i m p o r t a n t r o l e i n i n n a t e i m m u n e d e f e n s e . T h e m a j o r b i o l o g i c f u n c t i o n s o f c o m p l e m e n t i n c l u d e c y t o l y s i s , i n f l a m m a t i o n , i m m u n e c o m p l e x c l e a r a n c e , a n d p a r t i c l e o p s o n i z a t i o n . T h e c o m p l e m e n t s y s t e m c o n s i s t s o f at l e a s t 2 5 d i f f e r e n t p r o t e i n s t h a t a r e i n v o l v e d i n t h e a c t i v a t i o n a n d r e g u l a t i o n o f t h e e n z y m e c a s c a d e . T h e s y s t e m i s d i v i d e d i n t o 2 m a j o r p a t h w a y s k n o w n as t h e c l a s s i c a l p a t h w a y a n d a l t e r n a t i v e p a t h w a y . A c t i v a t i o n o f e i t h e r p a t h w a y r e s u l t s i n t h e f o r m a t i o n o f t h e c y t o l y t i c C 5 b - 9 c o m p l e x , w h i c h i s a l s o k n o w n as t h e m e m b r a n e a t t a c k c o m p l e x ( M A C ) . M A C s f o r m p o r e s i n t h e m e m b r a n e o f c e l l s t h r o u g h w h i c h i o n s a n d s m a l l m o l e c u l e s c a n p a s s i n t o t h e c e l l , c a u s e c e l l s w e l l i n g , a n d e v e n t u a l l y c e l l l y s i s . T h e c l a s s i c a l p a t h w a y c a n a l s o b e a c t i v a t e d b y m a n n o s e - b i n d i n g l e c t i n ( M B L ) ( M a t s u h i t a a n d F u j i t a , 1 9 9 2 ) . T h i s i s k n o w n as t h e l e c t i n p a t h w a y . C - r e a c t i v e p r o t e i n ( C R P ) ( O s m a n d et al, 1 9 7 7 ) a n d s e r u m a m y l o i d P ( S A P ) ( B r i s t o w a n d B o a c k l e , 1 9 8 6 ; P e p y s a n d B a l t z , 1 9 8 3 ; P e p y s et al, 1 9 8 2 ) t h a t c o n s t i t u t e t h e p e n t r a x i n p a t h w a y a r e a n o t h e r t w o p r o t e i n s t h a t a c t i v a t e t h e c l a s s i c a l p a t h w a y ( F i g u r e 3). 2 6 F i g u r e 3. T h e C o m p l e m e n t S y s t e m . Pentraxin Classical Pathway Pathway C R P / S A P I m m u n o g l o b u l i n s Lectin Pathway M B L Alternative Pathway C 3 -f C 3 h C 4 b 2 a C 2 a B a' C 3 b B b p F a c t o r D ) B y V C 3 ( H 2 0 ) B C 3 B a C 3 ( H 2 0 ) B b C 3 a C 3 a < C 3 £ C 4 b 2 a 3 b C 5 a C 3 b B b 3 b C 3 b C 5 b 6 C 5 b - 7 C 5 b - 8 C 7 C 8 C 9 C 5 b - 9 M e m b r a n e A t t a c k C o m p l e x ( M A C ) 2 7 1.5.1.1 C l a s s i c a l P a t h w a y A c t i v a t i o n o f t h e c l a s s i c a l p a t h w a y i n v o l v e s t h e s e q u e n t i a l a c t i v a t i o n o f C I , C 4 , C 2 , C 3 , a n d C 5 . A c t i v a t i o n o f t h e m u l t i - s u b u n i t C 1 c o m p l e x , w h i c h c o n t a i n s o n e C l q , t w o C l r , a n d t w o C l s , c a n b e i n i t i a t e d b y I g M , a n d I g G ( S i m a n d R e i d , 1 9 9 1 ) . I n h u m a n s , I g G 3 a n d I g G l s u b c l a s s e s a r e s t r o n g c o m p l e m e n t a c t i v a t o r s , I g G 2 i s a w e a k a c t i v a t o r , a n d I g G 4 i s g e n e r a l l y c o n s i d e r e d n o t t o a c t i v a t e c o m p l e m e n t ( H a m i l t o n , 1 9 8 7 ) . C 1 b e c o m e s a c t i v a t e d b y b i n d i n g t o a m e m b r a n e s u r f a c e o r a p a r t i c l e c o a t e d w i t h i m m u n o g l o b u l i n . A c t i v a t e d C I t h e n c l e a v e s C 4 , r e l e a s i n g C 4 a a n d C 4 b f r a g m e n t ( S c h r e i b e r a n d M u l l e r - E b e r h a r d , 1 9 7 4 ) . A f t e r t h e c l e a v a g e , C 4 b f r a g m e n t b i n d s c o v a l e n t l y t o t h e m e m b r a n e s u r f a c e c l o s e t o a c t i v a t e d C I . C 2 t h e n b i n d s t o C 4 b d e p o s i t e d o n t h e m e m b r a n e s u r f a c e a n d i s c l e a v e d b y t h e a c t i v a t e d C I n e a r b y . A f t e r t h e c l e a v a g e , C 2 b i s r e l e a s e d w i t h C 2 a r e m a i n i n g b o u n d t o C 4 b as a C 4 b 2 a c o m p l e x , w h i c h i s a l s o r e f e r r e d t o a s C 3 c o n v e r t a s e ( N a g a s a w a a n d S t r o u d , 1 9 7 7 ) . T h i s C 3 c o n v e r t a s e t h e n c o n v e r t s C 3 i n t o C 3 a a n d C 3 b f r a g m e n t s w i t h C 3 b b o u n d c o v a l e n t l y t o t h e m e m b r a n e c l o s e t o C 4 b 2 a , f o r m i n g C 5 c o n v e r t a s e . C 5 t h e n b i n d s t o th e C 3 b p o r t i o n o f t h e C 5 c o n v e r t a s e o n t h e m e m b r a n e a n d i s c l e a v e d b y th e C 2 a p o r t i o n o f t h e C 5 c o n v e r t a s e ( V o g t et al, 1 9 7 8 ) . A s a r e s u l t o f the c l e a v a g e , C 5 b i s g e n e r a t e d a n d r e m a i n e d b o u n d t o C 3 b , r e l e a s i n g C 5 a . T h e f o r m a t i o n o f C 5 b i n i t i a t e s t h e f o r m a t i o n o f a l y t i c p o r e o n c e l l s u r f a c e b y a l l o w i n g t h e a s s e m b l y o f t h e r e m a i n i n g c o m p o n e n t s o f t h e m e m b r a n e a t t a c k c o m p l e x , n a m e l y , C 6 ( L a c h m a n n a n d T h o m p s o n , 19 7 0 ) , C 7 ( D i S c i p i o et al, 1988), C 8 ( K o l b a n d M u l l e r - E b e r h a r d , 1976), a n d C 9 ( P o d a c k a n d T s c h o p p , 1 9 8 2 ) . 2 8 1.5.1.2 A l t e r n a t i v e P a t h w a y T h e s p o n t a n e o u s a c t i v a t i o n o f C 3 b y a w a t e r m o l e c u l e t o f o r m C 3 ( H 2 0 ) i s t h e f i r s t s t e p o f a l t e r n a t i v e p a t h w a y a c t i v a t i o n ( L a c h m a n n a n d H u g h e s - J o n e s , 1 9 8 4 ) . C 3 ( H 2 0 ) i n t e r a c t s w i t h f a c t o r B i n f l u i d p h a s e . O n c e f a c t o r B i s a s s o c i a t e d w i t h C 3 ( H 2 0 ) , i t i s c l e a v e d b y f a c t o r D t o b e c o m e a C 3 ( H 2 0 ) B b c o m p l e x w i t h f r a g m e n t B a r e l e a s e d ( F e a r o n et al, 1 9 7 3 ) . C 3 ( H 2 0 ) B b i s a f l u i d p h a s e C 3 c o n v e r t a s e t h a t c l e a v e s C 3 to p r o m o t e t h e d e p o s i t i o n o f C 3 b t o m e m b r a n e s u r f a c e . I f t h e C 3 b g e n e r a t e d i s d e p o s i t e d o n t o a n a c t i v a t i n g s u r f a c e s u c h a s m i c r o b i a l p a t h o g e n s o r s u r f a c e s t h a t p r o m o t e t h e b i n d i n g o f f a c t o r B , f a c t o r B t h e n a s s o c i a t e s w i t h t h e m e m b r a n e b o u n d C 3 b . F a c t o r D t h e n c l e a v e s m e m b r a n e - b o u n d f a c t o r B t o b e c o m e a s u r f a c e b o u n d C 3 b B b c o m p l e x ( F e a r o n et al, 1 9 7 3 ) . T h i s c o m p l e x i s a n a l o g o u s t o t h e C 4 b 2 a c o m p l e x i n t h a t t h e y a r e b o t h C 3 c o n v e r t a s e s t h a t c l e a v e C 3 . C 3 b B b c l e a v e s C 3 , r e l e a s i n g C 3 a , a n d b e c o m e s C 3 b B b 3 b , a C 5 c o n v e r t a s e ( D a h a et al, 1 9 7 6 ) . C 5 t h e n b i n d s t o t h e C 3 b p o r t i o n o f t h e C 5 c o n v e r t a s e o n t h e m e m b r a n e a n d i s c l e a v e d b y t h e B b p o r t i o n o f t h e C 5 c o n v e r t a s e . A s a r e s u l t o f t h e c l e a v a g e , C 5 b i s g e n e r a t e d a n d r e m a i n s b o u n d t o C 3 b , r e l e a s i n g C 5 a ( S c h r e i b e r et al, 1 9 7 8 ) . S i m i l a r t o t h e c l a s s i c a l p a t h w a y , t h e f o r m a t i o n o f C 5 b c a n i n i t i a t e t h e f o r m a t i o n o f a l y t i c p o r e o n c e l l s u r f a c e b y a l l o w i n g t h e a s s e m b l y o f t h e r e m a i n i n g c o m p o n e n t s o f t h e m e m b r a n e a t t a c k c o m p l e x , n a m e l y , C 6 , C 7 C 8 , a n d C 9 . D e s p i t e t h e c o n s t a n t a c t i v a t i o n o f C 3 t o C 3 ( H 2 0 ) , a l t e r n a t i v e p a t h w a y a c t i v a t i o n d o e s n o t o c c u r o n h o s t c e l l s u r f a c e . T h i s i s b e c a u s e C 3 ( H 2 0 ) i s o n l y g e n e r a t e d a t a v e r y l o w l e v e l . A l s o , t h e h o s t c e l l i s a p o o r s u r f a c e f o r s u p p o r t i n g a l t e r n a t i v e p a t h w a y 2 9 a c t i v a t i o n b e c a u s e h o s t c e l l s d o n o t f a v o r f a c t o r B b i n d i n g . A l s o , t h e p r e s e n c e o f c o m p l e m e n t r e g u l a t o r s w o u l d q u i c k l y d e g r a d e a n y C 3 b d e p o s i t e d o n t h e h o s t c e l l . 1.5.2 C o m p l e m e n t R e g u l a t i o n C o m p l e m e n t i s a c a s c a d e s y s t e m w i t h its a c t i o n a m p l i f i e d as t h e c a s c a d e p r o c e e d s . A l s o , t h e c o m p l e m e n t s y s t e m d o e s n o t d i s t i n g u i s h b e t w e e n h o s t c e l l s a n d i n v a d e r c e l l s . T h e r e f o r e , a s t r i n g e n t c o n t r o l m e c h a n i s m i s r e q u i r e d t o p r e v e n t u n c o n t r o l l e d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n as w e l l as l y s i s o f h o s t c e l l s . C o m p l e m e n t a c t i v a t i o n i s t i g h t l y c o n t r o l l e d b y s p e c i f i c r e g u l a t o r y p r o t e i n s t h a t a c t o n d i f f e r e n t c o m p l e m e n t p r o t e i n s i n t h e c l a s s i c a l p a t h w a y , t h e a l t e r n a t i v e p a t h w a y , a n d t h e c o m m o n p a t h w a y . T h e s e c o m p l e m e n t r e g u l a t o r s m a y b e e i t h e r p l a s m a p r o t e i n s o r m e m b r a n e b o u n d p r o t e i n o n h o s t c e l l s ( F i g u r e 4 ) . P l a s m a i n h i b i t o r s i n c l u d e C I - i n h i b i t o r ( C l - i n h ) ( S i m et al, 1979; R u d d y a n d A u s t e n , 1 9 6 9 ) , C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n ( C 4 B P ) ( F u j i t a a n d N u s s e n z w e i g , 1979; F u j i t a et al, 1978; S c h a r f s t e i n et al, 1 9 7 8 ) , f a c t o r H ( W h a l e y a n d R u d d y , 1 9 7 6 ) , f a c t o r I ( F u j i t a a n d N u s s e n z w e i g , 1 9 7 9 ) , v i t r o n e c t i n ( S - p r o t e i n ) ( P o d a c k et al, 1 9 8 4 ) , a n d c l u s t e r i n ( S P - 4 0 , 4 0 ) ( J e n n e a n d T s c h o p p , 1 9 9 2 ) . M e m b r a n e b o u n d i n h i b i t o r s i n c l u d e d e c a y - a c c e l e r a t i n g f a c t o r ( D A F , C D 5 5 ) ( N i c h o l s o n - W e l l e r et al, 1 9 8 2 ) , m e m b r a n e c o f a c t o r p r o t e i n ( M C P , C D 4 6 ) ( C o l e et al, 1 9 8 2 ) , c o m p l e m e n t r e c e p t o r 1 ( C R 1 , C D 3 5 ) ( W o n g , 1 9 9 0 ) , C D 5 9 ( m e m b r a n e i n h i b i t o r o f r e a c t i v e l y s i s ; M I R L ) ( D a v i e s et al, 1989), a n d h o m o l o g o u s r e s t r i c t i o n f a c t o r ( H R F , C 8 b i n d i n g p r o t e i n ) ( Z a i m a n et al, 1 9 8 6 ) . 3 0 F i g u r e 4. R e g u l a t i o n i n t h e C o m p l e m e n t S y s t e m . T h e s e c o m p l e m e n t r e g u l a t o r s e x i s t as p l a s m a p r o t e i n as w e l l as m e m b r a n e b o u n d p r o t e i n o n h o s t c e l l s . P l a s m a i n h i b i t o r s i n c l u d e C I - i n h i b i t o r ( C l - i n h ) , C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n ( C 4 B P ) , f a c t o r H , f a c t o r I, v i t r o n e c t i n ( S - p r o t e i n ) , a n d c l u s t e r i n ( S P - 4 0 , 4 0 ) . M e m b r a n e b o u n d i n h i b i t o r s i n c l u d e d e c a y - a c c e l e r a t i n g f a c t o r ( D A F , C D 5 5 ) , m e m b r a n e c o f a c t o r p r o t e i n ( M C P ) , c o m p l e m e n t r e c e p t o r 1 ( C R 1 ) , C D 5 9 ( m e m b r a n e i n h i b i t o r o f r e a c t i v e l y s i s ; M I R L ) , a n d h o m o l o g o u s r e s t r i c t i o n f a c t o r ( H R F ) . T h i c k a r r o w s r e p r e s e n t a c t i o n o f c o m p l e m e n t r e g u l a t o r y p r o t e i n s . Classical Pathway Alternative Pathway C 4 C 3 b F a c t o r B ^ F a c t o r D C 3 b B y C 3 b B b C 3 b B b 3 b F a c t o r H F a c t o r I S p r o t e i n ( v i t r o n e c t i n ) C l u s t e r i n ( S P - 4 0 , 4 0 ) C D 5 9 ( M I R L ) H R F ( C 8 B P ) C 5 b C 5 b 6 J-C 5 b - 7 C 5 b - 8 C 5 b - 9 31 1.5.3 C 4 b - B i n d i n g P r o t e i n 1.5.3.1 C h a r a c t e r i z a t i o n o f C 4 b - B i n d i n g P r o t e i n C 4 B P i s a n o l i g o m e r i c g l y c o p r o t e i n t h a t r e g u l a t e s t h e a c t i v a t i o n o f t h e c l a s s i c a l p a t h w a y o f t h e c o m p l e m e n t s y s t e m ( F u j i t a a n d N u s s e n z w e i g , 1979; F u j i t a et al, 1978; S c h a r f s t e i n et al, 1 9 7 8 ) . C 4 B P i s p r e s e n t i n p l a s m a at a c o n c e n t r a t i o n o f 2 5 0 p.g/mL ( 5 0 0 n M ) w i t h a c h a r a c t e r i s t i c m o l e c u l a r h e t e r o g e n e i t y . I s o f o r m s o f C 4 B P e x i s t d i f f e r i n g b y t h e n u m b e r o f c t - c h a i n s a n d p r e s e n c e o f t h e B - c h a i n . A b o u t 8 0 % o f C 4 B P h a s a m o l e c u l a r w e i g h t o f 5 9 0 k D a a n d i s c o m p o s e d o f s e v e n a - c h a i n s a n d a s i n g l e p r o t e i n S-b i n d i n g B - c h a i n j o i n e d t o g e t h e r b y i n t e r c h a i n d i s u l f i d e b r i d g e s i n t h e C - t e r m i n a l r e g i o n ( H i l l a r p a n d D a h l b a c k , 19 8 8 ; D a h l b a c k , 1 9 8 3 a ; R e i d a n d G a g n o n , 1982; S c h a r f s t e i n et al, 1 9 7 8 ) . T h e r e m a i n i n g C 4 B P i s m o s t l y a n i s o f o r m c o n t a i n i n g o n l y s e v e n a - c h a i n s t h a t e x i s t s as f r e e C 4 B P w i t h a m o l e c u l a r w e i g h t o f 5 4 0 k D a . A l t e r n a t i v e f o r m s o f C 4 B P a l s o i n c l u d e h e p t a m e r o f s i x a - c h a i n s a n d o n e B - c h a i n ( D a h l b a c k , 1 9 8 3 a ) . T h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f t h e a - c h a i n s o f C 4 B P h a s b e e n d e t e r m i n e d b y a c o m b i n a t i o n o f c D N A c l o n i n g a n d p e p t i d e s e q u e n c i n g ( L i n t i n a n d R e i d , 1986; C h u n g et al, 1 9 8 5 ) . E a c h a - c h a i n h a s 5 4 9 a m i n o a c i d r e s i d u e s . T h e N - t e r m i n a l 4 9 1 r e s i d u e s c o n t a i n e i g h t h o m o l o g o u s S C R s . T h e C - t e r m i n a l 5 8 r e s i d u e s a p p e a r t o f o r m a s t a b l e a-c h a i n c o n t a i n i n g t w o c y s t e i n e r e s i d u e s f o r i n t e r c h a i n d i s u l f i d e l i n k a g e ( C h u n g et al, 1 9 8 5 ) . T h e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f t h e B - c h a i n h a s a l s o b e e n d e t e r m i n e d b y c D N A c l o n i n g ( C h u n g et al, 1 9 8 5 ) a n d p e p t i d e s e q u e n c i n g ( C h u n g et al, 1 9 8 5 ) . T h e B - c h a i n h a s 2 3 5 a m i n o a c i d s as w e l l as f i v e p o t e n t i a l g l y c o s y l a t i o n s i t e s . H o w e v e r , a c t u a l s i t e s 3 2 t h a t a r e g l y c o s y l a t e d h a v e n o t b e e n i d e n t i f i e d . T h e N - t e r m i n u s o f t h e 6 - c h a i n c a n b e d i v i d e d i n t o t h r e e S C R s , t h e r e f o r e i t i s v e r y s i m i l a r to the a-chain, a l t h o u g h t h e l e n g t h i s s h o r t e r . F u r t h e r m o r e , t h e C - t e r m i n a l r e g i o n o f t h e B - c h a i n is a l s o v e r y s i m i l a r to t h e c o r r e s p o n d i n g r e g i o n o f t h e a-chain. T h e C - t e r m i n a l r e g i o n o f b o t h c h a i n s c o n t a i n s t w o c y s t e i n e r e s i d u e s t h a t a r e i n v o l v e d i n t h e i n t e r c h a i n d i s u l f i d e b o n d s o f t h e m o l e c u l e . 1.5.3.2 M e c h a n i s m o f C o m p l e m e n t I n h i b i t i o n b y C 4 B P C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n ( C 4 B P ) i s a c l a s s i c a l p a t h w a y a c t i v a t i o n i n h i b i t o r . C 4 B P m o d u l a t e s t h e a c t i v a t i o n b y a c c e l e r a t i n g the d i s s o c i a t i o n o f C 4 b 2 a b y c o m p e t i n g w i t h C 2 a f o r t h e b i n d i n g s i t e o n C 4 b ( G i g l i et al, 1 9 7 9 ) as w e l l as f u n c t i o n i n g as a c o f a c t o r f o r f a c t o r I i n t h e p r o t e o l y t i c d e g r a d a t i o n o f C 4 b ( N a g a s a w a et al, 1980; F u j i t a a n d N u s s e n z w e i g , 1979; F u j i t a et al, 1 9 7 8 ) . T h e a - c h a i n c o n t a i n s t h e b i n d i n g s i t e f o r c o m p l e m e n t c o m p o n e n t C 4 b a n d c o n t a i n s f a c t o r I c o f a c t o r a c t i v i t y ( F u j i t a et al, 1 9 7 8 ) , ( F u j i t a a n d N u s s e n z w e i g , 1 9 7 9 ) . U n d e r p h y s i o l o g i c a l c o n d i t i o n s , e a c h C 4 B P m o l e c u l e b i n d s a r o u n d 4.8 C 4 b ( I C j 8.3 x 10" M ) m o l e c u l e s e v e n t h o u g h i t h a s s e v e n C 4 b b i n d i n g s i t e s ( Z i c c a r d i et al, 1 9 8 4 ) . S t u d i e s u s i n g p r o t e o l y t i c f r a g m e n t s o f C 4 B P a - c h a i n g e n e r a t e d b y c h y m o t r y p s i n , t r y p s i n , a n d p e p s i n i n d i c a t e d t h a t the f a c t o r I c o f a c t o r a c t i v i t y i s l o c a t e d i n r e s i d u e s 177 - 3 2 2 ( C h u n g a n d R e i d , 1985). T h e b i n d i n g s i t e s f o r C 4 b r e p o r t e d b y d i f f e r e n t g r o u p s h a v e b e e n c o n t r a d i c t o r y . U s i n g p r o t e o l y t i c f r a g m e n t o f a - c h a i n g e n e r a t e d b y c h y m o t r y p s i n o r t r y p s i n , t h e C 4 b b i n d i n g a c t i v i t y m a y b e l o c a t e d i n r e s i d u e s 3 3 2 - 3 9 5 , c o r r e s p o n d i n g t o t h e s i x t h a n d s e v e n t h S C R s ( C h u n g et al, 1 9 8 5 ) . U s i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d y t h a t i n h i b i t s C 4 b b i n d i n g t o a-chain, t h e e p i t o p e o f t h e m o n o c l o n a l a n t i b o d y w a s m a p p e d t o a r e g i o n b e t w e e n S e r 3 3 3 a n d A r g 3 5 6 i n S C R 6 33 ( H e s s i n g et al, 1 9 9 3 ) . B o t h o f t h e s e s t u d i e s s u g g e s t C 4 b - b i n d i n g s i t e t o b e i n t h e c a r b o x y l t e r m i n a l h a l f o f t h e a - c h a i n . I n c o n t r a s t , a n e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d y o f C 4 B P - C 4 b c o m p l e x s u g g e s t e d a s i t e c l o s e r t o t h e a m i n o t e r m i n a l ( D a h l b a c k et al, 1 9 8 3 ) . A l s o , c h i m e r i c a - c h a i n s w i t h one, two, o r t h r e e S C R s r e p l a c e d b y t h e c o r r e s p o n d i n g S C R s i n t h e B - c h a i n d i d n o t s u p p o r t C 4 b b i n d i n g a n d s u g g e s t e d t h e C 4 b b i n d i n g s i t e t o b e n e a r t h e a m i n o t e r m i n a l o f a - c h a i n . I n a d d i t i o n , m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a g a i n s t S C R 1 a n d S C R 2 i n h i b i t e d C 4 b b i n d i n g ( H a r d i g et al, 1 9 9 7 ) . M u r i n e C 4 B P i s h o m o l o g o u s t o h u m a n C 4 B P (51 % i d e n t i t y ) e x c e p t f o r S C R s c o r r e s p o n d i n g t o S C R 5 a n d S C R 6 i n h u m a n a r e n o t p r e s e n t . W i t h o u t t h e s e S C R s , m u r i n e C 4 B P s t i l l h a s t h e a b i l i t y t o b i n d h u m a n C 4 b ( K r i s t e n s e n et al, 1987). T h i s s t r o n g l y s u g g e s t s t h a t t h e a m i n o t e r m i n a l i s t h e m o r e r e l e v a n t r e g i o n f o r C 4 b b i n d i n g ( M o r g a n a n d H a r r i s , 1 9 9 9 ) . 1.5.3.3 C 4 B P I n t e r a c t i o n w i t h P r o t e i n S T h e B - c h a i n a l s o c o n t a i n s t h e b i n d i n g s i t e f o r t h e a n t i c o a g u l a t i o n p r o t e i n , p r o t e i n S ( D a h l b a c k , 1 9 8 3 b ) . P r o t e i n S a n d C 4 B P f o r m a 1:1 n o n - c o v a l e n t c o m p l e x ( D a h l b a c k , 1 9 8 4 ) . T h e r e s i d u e s i n v o l v e d i n t h e c o m p l e x f o r m a t i o n a r e r e s i d u e s 31 - 4 5 ( F e r n a n d e z a n d G r i f f i n , 1 9 9 4 ) . A p p r o x i m a t e l y 6 0 % o f p r o t e i n S i s c o m p l e x e d w i t h C 4 B P , a n d c o m p l e x f o r m a t i o n e l i m i n a t e s p r o t e i n S c o f a c t o r a c t i v i t y as a n a n t i c o a g u l a n t . H o w e v e r , c o m p l e x f o r m a t i o n d o e s n o t i n t e r f e r e w i t h C 4 B P a c t i v i t y as a n i n h i b i t o r o f c o m p l e m e n t s y s t e m ( D a h l b a c k et al, 1990; D a h l b a c k a n d S t e n f l o , 1 9 8 1 ) . T h e p h y s i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e o f p r o t e i n S b i n d i n g t o t h e C 4 B P B - c h a i n i n c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n a n d a n t i c o a g u l a t i o n i s u n c l e a r t o date. It h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t p r o t e i n S m a y b e i n v o l v e d i n c o m p l e m e n t r e g u l a t i o n b y l o c a l i z i n g C 4 B P o n a n i o n i c p h o s p h o l i p i d s u r f a c e s , s u c h a s 3 4 a c t i v a t e d p l a t e l e t s u r f a c e , f o r t h e c o n t r o l o f l o c a l c l a s s i c a l p a t h w a y c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n ( D a h l b a c k , 1 9 8 4 ) . R e c e n t l y , B 2 G P I h a s b e e n s h o w n t o i n h i b i t p r o t e i n S - C 4 B P b i n d i n g a n d t o l i b e r a t e f r e e p r o t e i n S f r o m t h e C 4 B P - p r o t e i n S c o m p l e x ( M e r r i l l et al, 1 9 9 9 ) . P r o t e i n S b o u n d t o C 4 B P i s r e s i s t a n t to c h y m o t r y p s i n , l e u k o c y t e e l a t a s e a n d c a t h e p s i n G . T h i s c o u l d s u g g e s t t h a t b i n d i n g o f C 4 B P to p r o t e i n S p r o t e c t s p r o t e i n S f r o m p r o t e o l y t i c d e g r a d a t i o n at t h e s i t e o f i n f l a m m a t i o n d u r i n g i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e s b y a n i n c r e a s e d C 4 B P l e v e l s d u r i n g t h i s p e r i o d ( S t e i n k a s s e r e r et al, 1 9 9 2 ) . A r e c e n t r e p o r t s u g g e s t e d t h e h y p o t h e s i s t h a t c o n t r o l o f the p r o t e i n S s y s t e m i s a i m e d at m a i n t a i n i n g n o r m a l f r e e p r o t e i n S l e v e l d u r i n g i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e b y a n i n c r e a s e i n t h e t o t a l p r o t e i n S l e v e l ( C a r r a n d Z e k e r t , 1993). D u r i n g i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e , t h e l e v e l o f C 4 B P i n c r e a s e s . T h e i n c r e a s e i n C 4 B P i s c o u n t e r a c t e d b y a n i n c r e a s e i n t o t a l p r o t e i n S. T h u s , n o r m a l f r e e p r o t e i n S l e v e l a n d a n t i c o a g u l a t i o n c o f a c t o r a c t i v i t y a r e b o t h m a i n t a i n e d . 1.5.4 M B L 1.5.4.1 C h a r a c t e r i z a t i o n o f M B L M B L l e c t i n i s a l s o k n o w n as m a n n o s e b i n d i n g p r o t e i n , m a n n a n b i n d i n g l e c t i n , m a n n a n b i n d i n g p r o t e i n , c o r e - s p e c i f i c l e c t i n , a n d R a - r e a c t i v e f a c t o r . It i s a n o l i g o m e r i c p r o t e i n m a d e u p o f t w o t o s i x s u b u n i t s w i t h a s e r u m c o n c e n t r a t i o n o f 1 7 8 0 n g / m L (3.7 n M ) ( L a u et al, 1 9 9 5 ) . E a c h o f t h e s e s u b u n i t s ( 9 6 k D a ) i s c o m p o s e d o f t h r e e i d e n t i c a l p o l y p e p t i d e s ( 3 2 k D a ) . S t a r t i n g f r o m t h e N - t e r m i n u s , t h e p o l y p e p t i d e c h a i n i s d i v i d e d i n t o f o u r d o m a i n s , n a m e l y , t h e c y s t e i n e - r i c h d o m a i n , th e c o l l a g e n - l i k e d o m a i n , t h e 'neck' 35 r e g i o n , a n d t h e c a r b o h y d r a t e - r e c o g n i t i o n d o m a i n . T h e c o l l a g e n - l i k e d o m a i n i s a r e g i o n c o n t a i n i n g 18-20 r e p e a t s o f G l y - X a a - Y a a . T h e t h r e e p o l y p e p t i d e c h a i n s a s s e m b l e i n t o a s u b u n i t b y f o r m i n g t h e c o l l a g e n t r i p l e h e l i x c o n n e c t e d to t h e c a r b o h y d r a t e - r e c o g n i t i o n d o m a i n t h r o u g h the n e c k r e g i o n . T h e s t r u c t u r e o f t h e s u b u n i t i s s t a b i l i z e d b y t h e i n t e r c h a i n d i s u l f i d e b o n d i n g i n t h e c y s t e i n e - r i c h d o m a i n . T h e s e s u b u n i t s f u r t h e r i n t e r a c t t o a s s e m b l e a n o l i g o m e r i c s t r u c t u r e b y i n t e r - s u b u n i t d i s u l f i d e b r i d g e s a n d / o r n o n -c o v a l e n t i n t e r a c t i o n s ( T u r n e r , 1996). M B L b e l o n g s t o a f a m i l y o f p r o t e i n s k n o w n as c o l l e c t i n s , a g r o u p o f c o l l a g e n -c o n t a i n i n g m a m m a l i a n l e c t i n s . I n h u m a n , th e M B L g e n e i s e n c o d e d o n t h e l o n g a r m o f c h r o m o s o m e 10 ( K o l b l e a n d R e i d , 1993; S a s t r y et al, 1 9 8 9 ) w i t h 4 e x o n s c o r r e s p o n d i n g t o t h e f o u r d o m a i n s o f t h e p r o t e i n ( T a y l o r et al, 1989; E z e k o w i t z et al, 1 9 8 8 ) . T h i s f a m i l y i n c l u d e s t h r e e h u m a n l u n g s u r f a c t a n t p r o t e i n s S P - D , S P - A 1 , a n d S P - A 2 , b o v i n e s e r u m c o n g l u t i n i n , a n d b o v i n e s e r u m c o l l e c t i n 4 3 ( C L - 4 3 ) . T h e s e p r o t e i n s a r e s t r u c t u r a l l y s i m i l a r a n d s h a r e t h e s a m e d o m a i n o r g a n i z a t i o n ( H a n s e n a n d H o l m s k o v , 1998). A l t h o u g h n o t a l e c t i n , C l q a l s o s h a r e s a s i m i l a r c o m m o n s t r u c t u r e e x c e p t i t h a s a g l o b u l a r h e a d g r o u p th a t r e c o g n i z e s i m m u n o g l o b u l i n s r a t h e r t h a n o l i g o s a c c h a r i d e s ( L u et al, 1993). 1.5.4.2 A c t i v a t i o n o f L e c t i n P a t h w a y M a n n o s e - b i n d i n g l e c t i n ( M B L ) i s a c l a s s i c a l c o m p l e m e n t p a t h w a y a c t i v a t o r ( O h t a et al, 1990; L u et al, 1990; I k e d a et al, 1987). T h i s c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n p a t h w a y i s a l s o r e f e r r e d t o as the l e c t i n p a t h w a y . M B L c a n a c t i v a t e c o m p l e m e n t u p o n b i n d i n g t o c a r b o h y d r a t e r e s i d u e s o n m i c r o - o r g a n i s m s . B i n d i n g s t u d i e s h a v e s h o w n t h a t t h e c a l c i u m -3 6 d e p e n d e n t c a r b o h y d r a t e - r e c o g n i t i o n d o m a i n o f M B L b i n d s o n l y t o s u g a r c o n t a i n i n g a n e q u a t o r i a l 4 - O H g r o u p (e.g. N - a c e t y l m a n n o s a m i n e , m a n n o s e , N - a c e t y l g l u c o s a m i n e a n d g l u c o s e ) b u t n o t s u g a r c o n t a i n i n g a x i a l 4 - O H (e.g. N - a c e t y l g a l a c t o s a m i n e a n d g a l a c t o s e ) ( E l g a v i s h a n d S h a a n a n , 1997; K a w a s a k i et al, 1 9 8 9 ) . T h e a f f i n i t i e s o f M B L f o r t h e d i f f e r e n t s u g a r r e s i d u e s i n d e c r e a s i n g o r d e r a r e a s f o l l o w e d : N - a c e t y l g l u c o s a m i n e > m a n n o s e , N - a c e t y l m a n n o s a m i n e , a n d f u c o s e > m a l t o s e > g l u c o s e » g a l a c t o s e a n d N -a c e t y l g a l a c t o s a m i n e ( H o l m s k o v et al, 1 9 9 4 ) . T h e b i n d i n g o f a s i n g l e c a r b o h y d r a t e -r e c o g n i t i o n d o m a i n t o a s a c c h a r i d e h a s a r e l a t i v e l y l o w I C j o f IO" 5 t o 10" 3 M . I n c o n t r a s t , t h e a f f i n i t y o f t h e o l i g o m e r i c M B L t o m a n n a n i s ICj 10" 9 M b e c a u s e o f t h e i n c r e a s e d a v i d i t y p r o v i d e d b y t h e m o l e c u l e ' s o l i g o m e r i c s t r u c t u r e ( K o z u t s u m i et al, 1 9 8 0 ) . U p o n b i n d i n g t o c a r b o h y d r a t e s t r u c t u r e s , M B L a c t i v a t e s M B L - a s s o c i a t e d s e r i n e p r o t e a s e 1 ( M A S P - 1 ) a n d M A S P - 2 . T h e a c t i v a t i o n o f t h e s e t w o M A S P s w i l l e n z y m a t i c a l l y a c t i v a t e C 4 a n d C 2 a n d l e a d t o t h e a c t i v a t i o n o f t h e c l a s s i c a l c o m p l e m e n t p a t h w a y ( T h i e l et al, 1997; M a t s u s h i t a a n d F u j i t a , 1 9 9 2 ) . M B L i s a C - t y p e l e c t i n t h a t h a s i m p o r t a n t r o l e s i n t h e i n n a t e i m m u n e s y s t e m , w h i c h i s c r i t i c a l i n t h e f i r s t l i n e o f h o s t d e f e n s e s u c h as b a c t e r i c i d a l a c t i v i t y a n d o p s o n i z a t i o n . M B L h a s b e e n d e m o n s t r a t e d to b i n d r o u g h s t r a i n s o f E. coli ( K a w a s a k i et al, 1 9 8 9 ) , Candida albicans ( T a b o n a etal, 1 9 9 5 ) , H I V - 1 a n d H I V - 2 ( H a u r u m et al, 1 9 9 3 ) , i n f l u e n z a A ( A n d e r s et al, 1 9 9 4 ; H a r t s h o r n et al, 1 9 9 3 ) , Salmonella montevideo ( K u h l m a n et al, 1 9 8 9 ) , Listeria monocytogenes, Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis, a n d Neisseria cinera ( v a n E m m e r i k et al, 1 9 9 4 ) . M B L m a y b e i n v o l v e d i n r h e u m a t o i d a r t h r i t i s ( M a l h o t r a et al, 1 9 9 5 ) . A u t o a n t i b o d i e s o f I g G i s o t y p e t h a t d e v e l o p e d i n r h e u m a t o i d a r t h r i t i s u n d e r g o 3 7 g l y c o s y l a t i o n c h a n g e s t o u n m a s k t e r m i n a l N - a c e t y l g l u c o s a m i n e r e s i d u e i n t h e F c r e g i o n f o r M B L b i n d i n g . M B L m a y b i n d to t h e s e I g G s a n d a c t i v a t e c o m p l e m e n t . 1.5.4.3 M B L D e f i c i e n c y M o s t M B L d e f i c i e n c i e s a r e l i n k e d t o s t r u c t u r a l m u t a t i o n s i n c o d o n 5 4 ( G -> D ) ( S u m i y a et al, 1 9 9 1 ) o r c o d o n 5 7 ( G -> E ) ( M a d s e n et al, 1994; L i p s c o m b e et al, 1 9 9 2 ) . It i s b e l i e v e d t h a t t h e s u b s t i t u t i o n s o f g l y c i n e r e s i d u e s w i t h a s p a r t a t e o r g l u t a m a t e , w h i c h h a v e m o r e b u l k y R - g r o u p s , i n t e r f e r e w i t h t h e f o r m a t i o n o f t h e c o l l a g e n - l i k e d o m a i n a n d l e a d t o l o w e r s e r u m M B L l e v e l . A t h i r d m u t a t i o n i n c o d o n 5 2 ( R -> C ) i s a l s o l i n k e d t o M B L d e f i c i e n c y , b u t w i t h l e s s e f f e c t o n M B L l e v e l ( M a d s e n et al, 1994). M B L d e f i c i e n c y i s a s s o c i a t e d w i t h a n o p s o n i c d e f e c t ( G a r r e d et al, 1 9 9 5 ; S u p e r et al, 1 9 8 9 ) a n d a p h a g o c y t i c d e f e c t ( G a r r e d et al, 1 9 9 5 ) . D e f i c i e n c i e s o f M B L a l s o p r e d i s p o s e i n d i v i d u a l s t o S L E ( D a v i e s et al, 1997; S u l l i v a n et al, 1 9 9 6 ; L a u et al, 1 9 9 6 ) R e c e n t l y , a s s o c i a t i o n s b e t w e e n M B L d e f i c i e n c y a n d r e c u r r e n t f e t a l w a s t a g e h a v e b e e n a l s o o b s e r v e d i n d i f f e r e n t s t u d i e s ; d e f i c i e n c y o f M B L i n m a t e r n a l s e r u m i s a s s o c i a t e d w i t h u n e x p l a i n e d r e c u r r e n t m i s c a r r i a g e ( C h r i s t i a n s e n et al, 1999; K i l p a t r i c k et al, 1 9 9 5 ) a n d p r e e c l a m p s i a ( K i l p a t r i c k , 1 9 9 6 ) . 1.5.5 C o m p l e m e n t a n d A n t i p h o s p h o l i p i d A n t i b o d i e s E l e v a t e d l e v e l s o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n ( H a m m o n d et al, 1 9 8 9 ) a n d h y p o c o m p l e m e n t e m i a h a v e b e e n r e p o r t e d i n S L E p a t i e n t s w i t h A P S ( A r v i e u x et al, 1991; H a z e l t i n e et al, 1 9 8 8 ) . In vitro c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n o n t h e p l a t e l e t s u r f a c e i n 38 t h e p r e s e n c e o f a P L d u e to C 5 b - 9 d e p o s i t i o n h a s b e e n d e m o n s t r a t e d ( S t e w a r t et al, 1 9 9 7 ) . 1.6 R a t i o n a l e a n d O v e r a l l O b j e c t i v e s B 2 G P I i s o n e o f t h e m o s t c o m m o n ta r g e t s o f a P L . T h e a d s o r p t i o n o f B 2 G P I to a n o x i d i z e d s u r f a c e i s n e c e s s a r y t o e x p r e s s n e o - e p i t o p e ( s ) f o r a P L b i n d i n g ( C h a m l e y et al, 1999; I c h i k a w a et al, 1994; M a t s u u r a et al, 1994; R o u b e y , 1994; K a n d i a h a n d K r i l i s , 1 994; A r v i e u x et al, 1 9 9 1 ) . S t r o n g a s s o c i a t i o n s b e t w e e n c l i n i c a l t h r o m b o s i s a n d t h e b i n d i n g o f a P L t o s u r f a c e - a s s o c i a t e d B 2 G P I a l s o e x i s t ( D a y et al, 1998; S w a d z b a et al, 1997; P e n g o et al, 1996; C a b i e d e s et al, 1995). T h e s e o b s e r v a t i o n s l e a d t o t h e h y p o t h e s i s t h a t s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I m a y u n d e r g o c o n f o r m a t i o n c h a n g e s a n d e x p r e s s i m p o r t a n t s i t e s o f i n t e r a c t i o n w i t h p r o t e i n s i n v o l v e d i n m a i n t a i n i n g h e m o s t a s i s , w h i c h a r e t h e n d i s r u p t e d u p o n a P L b i n d i n g . T h e r e f o r e , t h e p o s s i b l e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n n e o -e p i t o p e ( s ) e x p r e s s e d b y B 2 G P I a n d o t h e r h e m o s t a t i c p r o t e i n s w e r e i n v e s t i g a t e d . T h e o b j e c t i v e o f t h i s p r o j e c t w a s to u n d e r s t a n d the i n t e r a c t i o n s o f p h o s p h o l i p i d -b o u n d o r o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I w i t h t h e a n t i c o a g u l a t i o n m e c h a n i s m as w e l l as w i t h t h e c o m p l e m e n t s y s t e m i n t h e s e t t i n g o f a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . T h e r e w e r e f o u r s p e c i f i c a i m s o f t h i s t h e s i s . (1) T h e i n t e r a c t i o n o f B 2 G P I a n d A P C w a s s t u d i e d i n t h e p r e s e n c e o f d i f f e r e n t p h o s p h o l i p i d s a n d p r o t e i n S t o e x a m i n e t h e e f f e c t o f t h e i r i n t e r a c t i o n s i n A P C a n t i c o a g u l a t i o n a c t i v i t y . (2) T h e t r i - m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n s a m o n g B 2 G P I , p r o t e i n S, a n d C 4 B P w e r e c h a r a c t e r i z e d t o e l u c i d a t e t h e s i g n i f i c a n c e o f t h e s e i n t e r a c t i o n s i n p r o t e i n S a n t i c o a g u l a t i o n a c t i v i t y . (3) T h e e f f e c t s o f a P L o n B 2 G P I 3 9 i n t e r a c t i o n s w i t h A P C as w e l l a s p r o t e i n S w e r e s t u d i e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e s e i n t e r a c t i o n s w o u l d b e i n t e r f e r e d w i t h b y a P L a n d l e a d to t h r o m b o g e n e s i s . ( 4 ) T h e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I - b o u n d a P L a n d t h e i n t e r a c t i o n s o f B 2 G P I w i t h c o m p l e m e n t p r o t e i n s C 4 B P a n d M B L w e r e i n v e s t i g a t e d t o e x a m i n e t h e o f B 2 G P I a n d a P L i n c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . 4 0 C H A P T E R 2 M A T E R I A L S A N D M E T H O D S 2.1 Reagents H u m a n 6 2 G P I ( W u r m , 19 8 4 ) , p r o t e i n S ( D a h l b a c k , 1 9 8 3 b ) , C 4 B P , a n d C 4 B P . B ( D a h l b a c k , 1 9 8 3 a ) w e r e p u r i f i e d as d e s c r i b e d . M a n n o s e - S e p h a r o s e a n d m a l t o s e -s e p h a r o s e w e r e p r e p a r e d u s i n g a p r e v i o u s l y d e s c r i b e d m e t h o d ( F o r n s t e d t a n d P o r a t h , 1 9 7 5 ) . A P C , p r o t e i n C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P w e r e o b t a i n e d f r o m H a e m a t o l o g i c T e c h n o l o g i e s ( E s s e x J u n c t i o n , V T ) . B o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) w a s p u r c h a s e d f r o m S i g m a ( O a k v i l l e , O N , C a n a d a ) . H u m a n C 4 b , a n d n o n - i m m u n o g e n i c r a b b i t I g G w e r e o b t a i n e d f r o m C e d a r l a n e ( H o r n b y , O N , C a n a d a ) . G o a t a n t i - h u m a n p r o t e i n C , s h e e p a n t i -h u m a n p r o t e i n S, g o a t a n t i - h u m a n C 4 B P , a f f i n i t y - p u r i f i e d r a b b i t - a n t i - h u m a n B 2 G P I , m o n o c l o n a l m o u s e - a n t i - h u m a n p r o t e i n S, a n d m o n o c l o n a l m o u s e - a n t i - h u m a n C 4 B P w e r e p u r c h a s e d f r o m E n z y m e R e s e a r c h L a b o r a t o r i e s ( S o u t h B e n d , I N ) . H o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e ( H R P ) - c o n j u g a t e d d o n k e y a n t i b o d i e s a g a i n s t h u m a n I g G , g o a t I g G , s h e e p I g G , m o u s e I g G , a n d f l u o r e s c e i n i s o t h i o c y a n a t e ( F I T C ) - F ( a b ' ) 2 d o n k e y a n t i - m o u s e I g G w e r e o b t a i n e d f r o m J a c k s o n I m m u n o r e s e a r c h ( W e s t G r o v e , P A ) . F I T C - l a b e l e d m o u s e -a n t i - h u m a n C D 6 2 P w a s p u r c h a s e d f r o m B e c k m a n - C o u l t e r ( M i a m i , F L ) . M o n o c l o n a l m o u s e - a n t i - h u m a n C 5 b - 9 ( c l o n e a E l l ) w a s p u r c h a s e d f r o m D a k o ( M i s s i s s a u g a , O N , C a n a d a ) . M o n o c l o n a l m o u s e - a n t i - h u m a n M B L ( c l o n e 1 3 1 ) w a s p r o v i d e d b y D r . S t e f f e n T h i e l ( U n i v e r s i t y o f A a r h u s , A a r h u s , D e n m a r k ) . P h o s p h a t i d y l c h o l i n e ( P C ) , p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e ( P E ) , a n d p h o s p h a t i d y l s e r i n e ( P S ) w e r e p u r c h a s e d f r o m A v a n t i P o l a r L i p i d s ( B i r m i n g h a m , A L ) . C h r o m o g e n i c s u b s t r a t e S - 2 3 6 6 ( L -41 p y r o g l u t a m y l - L - p r o l y l - L - a r g i n i n e - p - n i t r o a n i l i n e ) w a s p u r c h a s e d f r o m C h r o m o g e n i x ( D i a P h a r m a , W e s t C h e s t e r , O H ) . 2.2 Purification of MBL H u m a n M B L w a s p u r i f i e d as a c c o r d i n g to T a n et al. ( 1 9 9 6 ) w i t h m o d i f i c a t i o n . H u m a n s e r u m ( C a n a d i a n B l o o d S e r v i c e s , V a n c o u v e r , C a n a d a ) w a s u s e d as s t a r t i n g m a t e r i a l . A m a n n o s e - S e p h a r o s e c o l u m n a n d a m a l t o s e - S e p h a r o s e c o l u m n w e r e u s e d s e q u e n t i a l l y to i s o l a t e c r u d e M B L . T h e c r u d e M B L o b t a i n e d a f t e r t h e s e t w o c o l u m n s t e p s w a s f u r t h e r p u r i f i e d u s i n g S e p h a c r y l S-300 e q u i l i b r a t e d i n a n a c e t a t e b u f f e r ( 1 0 0 m M s o d i u m a c e t a t e , 100 m M N a C l , 5 m M E D T A , p H 5.0) t o r e m o v e M B L - a s s o c i a t e d s e r i n e p r o t e a s e ( M A S P ) . 2.3 Normal Human Plasma Preparation P o o l e d n o r m a l h u m a n p l a s m a ( N H P ) w a s p r e p a r e d f r o m 15 f e m a l e a n d 10 m a l e h e a l t h y v o l u n t e e r s . B l o o d w a s c o l l e c t e d i n t o V a c u t a i n e r ( B e c t o n - D i c k i n s o n , R u t h e r f o r d , N J ) t u b e s c o n t a i n i n g 3.8 % s o d i u m c i t r a t e , c e n t r i f u g e d at 2 0 0 0 x g f o r 15 m i n . T h e p l a s m a w a s p o o l e d a n d s t o r e d i n a l i q u o t s at -80 ° C . 2.4 Normal Human Serum Preparation P o o l e d n o r m a l h u m a n s e r u m ( N H S ) w a s p r e p a r e d f r o m b l o o d c o l l e c t e d f r o m h e a l t h y d o n o r s . B l o o d w a s c o l l e c t e d i n t o w h o l e b l o o d V a c u t a i n e r ( B e c t o n - D i c k i n s o n , R u t h e r f o r d , N J ) . T h e t u b e s w e r e l e f t at r o o m t e m p e r a t u r e ( R T ) f o r 3 0 m i n f o r c l o t t i n g 4 2 a n d w e r e t h e n c e n t r i f u g e d at 2 0 0 0 x g f o r 15 m i n . T h e s e r u m w a s r e m o v e d , p o o l e d a n d s t o r e d i n a l i q u o t s at - 8 0 ° C . 2.5 Blood Samples C o n s e c u t i v e b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f r o m p a t i e n t s w h o w e r e t e s t e d p o s i t i v e o r s u s p e c t e d t o b e p o s i t i v e f o r a n t i c a r d i o l i p i n w i t h i n f o r m e d c o n s e n t f r o m t h e p a t i e n t s . E t h i c s a p p r o v a l w a s o b t a i n e d f r o m t h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a C o m m i t t e e f o r t h e U s e o f H u m a n S u b j e c t s i n R e s e a r c h . N o r m a l s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d f r o m h e a l t h y v o l u n t e e r s . 2.6 Detection of Anti-Cardiolipin and Anti-C2GPI Using E L I S A T h e a n t i - c a r d i o l i p i n I g G a n d I g M l e v e l s f o r p a t i e n t a n d n o r m a l s a m p l e s w e r e m e a s u r e d u s i n g T h e r a T e s t E L - A C A e n z y m e i m m u n o a s s a y ( D i a S o r i n , S t i l l w a t e r , M N ) . S a m p l e s w i t h I g G > 15 G P U o r I g M > 10 M P U w e r e c o n s i d e r e d a s p o s i t i v e . G P U a n d M P U s t a n d f o r I g G p h o s p h o l i p i d u n i t s a n d I g M p h o s p h o l i p i d u n i t s , r e s p e c t i v e l y . O n e G P U i s t h e b i n d i n g a c t i v i t y o f 1 u.g/mL a C L I g G ( H a r r i s et al, 1 9 8 7 ) . M P U h a s th e s a m e d e f i n i t i o n f o r a C L I g M . T h e a n t i - B 2 G P I I g G a n d I g M l e v e l s w e r e m e a s u r e d u s i n g Q U A N T A L i t e B 2 G P I I g G a n d Q U A N T A L i t e B 2 G P I I g M ( I N O V A D i a g n o s t i c s , S a n D i e g o , C A ) . S a m p l e s w i t h I g G > 2 0 S G U o r I g M > 2 0 S M U w e r e c o n s i d e r e d a s p o s i t i v e . S G U a n d S M U s t a n d f o r s t a n d a r d I g G a n t i - B 2 G P I u n i t s a n d s t a n d a r d I g M a n t i -B 2 G P I u n i t s , r e s p e c t i v e l y . O n e S G U i s t h e b i n d i n g a c t i v i t y o f 1 u.g/mL a n t i - B 2 G P I I g G . S M U h a s th e s a m e d e f i n i t i o n f o r a n t i - B 2 G P I I g M . 4 3 2.7 Isolation and Characterization of IgG Pools S a m p l e s f r o m 10 p a t i e n t s p o s i t i v e f o r I g G a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s ( 3 5 t o > 1 5 0 G P U ) a n d a h i s t o r y o f t h r o m b o s i s w e r e p o o l e d a n d t h e I g G p u r i f i e d u s i n g p r o t e i n G - S e p h a r o s e a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ' s p u b l i s h e d p r o t o c o l ( A m e r s h a m P h a r m a c i a B i o t e c h , P i s c a t a w a y , N J ) . N o r m a l h u m a n I g G ( N H I g G ) w a s s i m i l a r l y i s o l a t e d f r o m a n o r m a l h u m a n p l a s m a p o o l o f 2 5 h e a l t h y v o l u n t e e r s w i t h n o r m a l a P L l e v e l s ( < 1 5 G P U ) . 2.8 Specificities of IgG Pools H i g h b i n d i n g m i c r o t i t r e w e l l s ( C o s t a r C o r n i n g , N Y ) w e r e c o a t e d w i t h 1 0 0 u L ( 1 0 Ug/mL) o f 132GPI, A P C , p r o t e i n S, o r C 4 B P i n T r i s - b u f f e r e d s a l i n e ( T B S ; 5 0 m M T r i s , 1 5 0 m M N a C l , p H 7.4) o v e r n i g h t at 4 ° C a n d b l o c k e d w i t h T B S - C a M ( T B S c o n t a i n i n g 2 . 5 m M C a C h , 5 % w/v s k i m m i l k p o w d e r , p H 7.4). W e l l s w e r e w a s h e d f i v e t i m e s w i t h T B S - T C a ( T B S c o n t a i n i n g 0 . 0 5 % T w e e n 2 0 a n d 2.5 m M C a C l 2 , p H 7.4). O n e h u n d r e d m i c r o l i t e r s (0.5 m g / m L ) o f p o o l e d a P L o r N H I g G i n T B S - C a M w e r e a d d e d t o t h e w e l l s a n d i n c u b a t e d w i t h s h a k i n g ( 3 6 0 r p m ) f o r 3 h r at r o o m t e m p e r a t u r e ( R T ) . W e l l s w e r e w a s h e d f i v e t i m e s w i t h T B S - T C a a n d b o u n d I g G w a s d e t e c t e d u s i n g h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e - a n t i - h u m a n I g G a n d 3 , 3 ' , 5 , 5 ' - t e t r a m e t h y l b e n z i d i n e ( T M B ) s u b s t r a t e at OD450. 2.9 125I-Radiolabeling of Proteins A P C , p r o t e i n C , p r o t e i n S, C 4 B P , M B L , B 2 G P I , a n d B S A w e r e r a d i o l a b e l e d w i t h N a 1 2 5 I ( A m e r s h a m P h a r m a c i a B i o t e c h ) u s i n g t h e I o d o g e n ( P i e r c e , R o c k f o r d , I L ) m e t h o d . A g l a s s test t u b e w a s p r e - c o a t e d w i t h 10 p g o f i o d o g e n . O n e h u n d r e d t o t w o h u n d r e d m i c r o g r a m s o f A P C , p r o t e i n C , p r o t e i n S, C 4 B P , M B L , B 2 G P I , o r B S A w e r e i n c u b a t e d 4 4 w i t h 100 p C i o f N a 1 2 5 I i n t h e i o d o g e n - c o a t e d t u b e f o r 10 m i n at R T . A n a l i q u o t o f t h e p r o t e i n w a s p r e c i p i t a t e d w i t h t r i c h l o r o a c e t i c a c i d ( T C A ) a n d s p u n d o w n b y c e n t r i f u g a t i o n . T h e r e l a t i v e a m o u n t s o f 1 2 5 I i n t h e p r o t e i n p r e c i p i t a t e p e l l e t a n d i n t h e s u p e r n a t a n t w e r e c o u n t e d t o d e t e r m i n e t h e p e r c e n t i n c o r p o r a t i o n o f 1 2 5 I i n p r o t e i n u s i n g L K B W a l l a c g a m m a c o u n t e r ( C o m p u g a m m a m o d e l 1282). S e p a r a t i o n o f f r e e 1 2 5 I f r o m 1 2 5 I - p r o t e i n w a s a c h i e v e d b y p a s s i n g t h e r e a c t i o n m i x t u r e t h r o u g h a P D - 1 0 s i z e e x c l u s i o n c o l u m n ( A m e r s h a m P h a r m a c i a ) . F r a c t i o n s w i t h m o r e t h a n 9 8 % o f t h e 1 2 5 I i n c o r p o r a t e d i n t o t h e p r o t e i n a s d e t e r m i n e d b y T C A p r e c i p i t a t i o n w e r e p o o l e d . T h e 125 c o n c e n t r a t i o n o f I - l a b e l e d p r o t e i n w a s d e t e r m i n e d u s i n g B C A p r o t e i n a s s a y ( P i e r c e , R o c k f o r d , I L ) w i t h t h e u n l a b e l e d p r o t e i n c o u n t e r p a r t as s t a n d a r d . 2.10 Effects of Co-Incubating 02GPI and Protein S on APC Activities in Phosphatidylserine-Coated Wells H i g h - b i n d i n g m i c r o t i t r e p l a t e s ( C o s t a r C o r n i n g , N Y ) c o n t a i n i n g 1 0 0 p L / w e l l o f P S ( 5 0 p g / m L i n 1 0 0 % e t h a n o l ) w e r e a i r - d r i e d at r o o m t e m p e r a t u r e a n d b l o c k e d w i t h T B S - C a M . A f t e r w a s h i n g w i t h T B S - C a ( T B S , 2.5 m M C a C l 2 , p H 7.4), 1 0 0 p X o f 1 2 5 I -t r a c e l a b e l e d A P C (2 p g / m L , 3 2 n M ) i n T B S - C a i n t h e p r e s e n c e o f 1) B 2 G P I ( 1 0 0 p g / m L , 2 u M ) , 2 ) p r o t e i n S ( 1 0 p g / m L , 145 n M ) , o r 3) B 2 G P I ( 1 0 0 p g / m L , 2 p M ) a n d p r o t e i n S ( 1 0 p-g/mL, 145 n M ) w e r e i n c u b a t e d at 3 7 ° C f o r 2 h o u r s i n P S - c o a t e d w e l l s . A f t e r t h e i n c u b a t i o n , w e l l s w e r e w a s h e d w i t h i c e - c o l d T B S - C a f o u r t i m e s . O n e h u n d r e d m i c r o l i t e r s o f c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e S - 2 3 6 6 (1 m M i n T B S - C a b u f f e r ) w e r e a d d e d a n d i n c u b a t e d f o r 6 0 m i n at R T . T h e a m o u n t o f s u b s t r a t e h y d r o l y z e d o v e r t i m e w a s m e a s u r e d b y O D 4 0 5 . T h e a m o u n t s o f A P C b o u n d w e r e m e a s u r e d w i t h a G a m m a C o u n t e r . T h e 4 5 A P C a c t i v i t i e s i n P S - c o a t e d w e l l s w i t h d i f f e r e n t a m o u n t o f A P C b o u n d w e r e a l s o m e a s u r e d b y i n c u b a t i n g P S - w e l l s w i t h 0 t o 2 p g / m L o f A P C . 2.11 Effects of B2GPI on A P C Activities in Phosphatidylcholine-, Phosphatidylethanolamine-, Phosphatidylserine-Coated Wells M i c r o t i t r e w e l l s c o n t a i n i n g 1 0 0 u L A v e l l o f P C , P E , o r P S ( 5 0 u-g/mL i n 1 0 0 % e t h a n o l ) w e r e a i r - d r i e d at r o o m t e m p e r a t u r e a n d b l o c k e d w i t h T B S - C a M . A f t e r w a s h i n g w i t h T B S - C a , 1 0 0 u L o f 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d A P C (2 u-g/mL, 3 2 u M ) w i t h o r w i t h o u t B 2 G P I ( 1 0 0 u g / m L , 2 u M ) i n T B S - C a w e r e i n c u b a t e d at 3 7 ° C f o r 2 h o u r s . T h e a m o u n t o f A P C a c t i v i t y a n d p h o s p h o l i p i d - b o u n d A P C w e r e m e a s u r e d b y h y d r o l y s i s o f c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e S - 2 3 6 6 a n d g a m m a - c o u n t i n g , r e s p e c t i v e l y , a s a b o v e . 2.12 Interactions of A P C , Protein C, Protein S, C4BP, C4BP. B , and M B L with ELISA Plate-Bound B2GPI Under Different Conditions H i g h - b i n d i n g m i c r o t i t r e w e l l s w e r e c o a t e d w i t h 1 0 0 p.L 132GPI ( 1 0 p-g/mL) i n T B S o v e r n i g h t at 4 ° C o r 2 h r at R T a n d b l o c k e d w i t h T B S - C a M ; w e l l s c o a t e d o n l y w i t h T B S - C a M s e r v e d as c o n t r o l s . A f t e r w a s h i n g w i t h T B S - T C a , 1 0 0 u L o f A P C , p r o t e i n C , p r o t e i n S, C 4 B P , C 4 B P . B , o r M B L i n T B S - C a M ( 0 t o 10 u g / m L ) w a s a d d e d a n d i n c u b a t e d w i t h s h a k i n g ( 3 6 0 r p m ) f o r 3 h r at R T . A f t e r w a s h i n g f i v e t i m e s w i t h T B S -T C a , 100 u L o f g o a t a n t i - h u m a n p r o t e i n C , s h e e p a n t i - h u m a n p r o t e i n S, g o a t a n t i - h u m a n C 4 B P , o r m o u s e - a n t i - h u m a n M B L i n T B S - C a M w e r e a d d e d f o r a n h o u r i n c u b a t i o n . W e l l s w e r e w a s h e d f i v e t i m e s w i t h T B S - T C a a n d b o u n d I g G w a s v i s u a l i z e d u s i n g a p p r o p r i a t e H R P - c o n j u g a t e d s e c o n d a r y a n t i b o d i e s i n T B S - C a M a n d T M B s u b s t r a t e . 4 6 T h e e f f e c t s o f f l u i d - p h a s e B 2 G P I o n t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n E L I S A p l a t e - b o u n d B 2 G P I a n d f l u i d p h a s e A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P w e r e s t u d i e d s i m i l a r l y b y c o -i n c u b a t i n g A P C , p r o t e i n S, o r C 4 B P ( 0 t o 10 p g / m L ) w i t h B 2 G P I ( 5 0 p g / m L ) i n B 2 G P I -c o a t e d w e l l s . T h e e f f e c t o f f l u i d - p h a s e C 4 b ( 5 0 p g / m L ) o n C 4 B P ( 0 t o 10 p g / m L ) b i n d i n g t o E L I S A p l a t e - b o u n d B 2 G P I w a s a l s o i n v e s t i g a t e d b y p r e - i n c u b a t i n g t h e C 4 b -C 4 B P m i x t u r e f o r 2 h o u r s b e f o r e a d d i n g t o E L I S A p l a t e c o a t e d w i t h B 2 G P I . T h e a m o u n t o f p r o t e i n b i n d i n g w a s m e a s u r e d u s i n g t h e p r o t o c o l a b o v e . T h e c o m p e t i t i v e b i n d i n g s o f A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P t o B 2 G P I w h e n t h e y w e r e i n t h e p r e s e n c e o f e a c h o t h e r w e r e s t u d i e d s i m i l a r l y b y c o - i n c u b a t i n g 1) A P C ( 0 t o 10 p g / m L ) a n d p r o t e i n S ( 1 0 p g / m L ) , 2 ) p r o t e i n S ( 0 t o 10 p g / m L ) a n d A P C ( 1 0 p g / m L ) , 3) p r o t e i n S (0 t o 10 p g / m L ) a n d C 4 B P ( 2 0 0 p g / m L ) , o r 4 ) C 4 B P ( 0 t o 10 p g / m L ) a n d p r o t e i n S ( 2 0 p g / m L ) i n B 2 G P I - c o a t e d w e l l s f o r 3 h o u r s at R T . T h e s a m e p r o c e d u r e w a s a l s o u s e d t o s t u d y t h e e f f e c t s o f a P L I g G ( 5 0 0 p g / m L ) o n A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P ( 0 t o 10 p g / m L ) b i n d i n g t o B 2 G P I . I n a d d i t i o n , d i f f e r e n t a m o u n t s o f a P L I g G ( 0 t o 1 m g / m L ) w e r e i n c u b a t e d w i t h A P C , p r o t e i n S, o r C 4 B P ( 5 p g / m L ) i n B 2 G P I - c o a t e d w e l l s t o s t u d y t h e d o s e e f f e c t s o f a P L I g G o n t h e s e B 2 G P I -d e p e n d e n t i n t e r a c t i o n s . N H I g G ( 5 0 0 p g / m L ) w a s u s e d as c o n t r o l . T h e e f f e c t s o f a P L I g G (1 m g / m L ) a n d N - a c e t y l m a n n o s a m i n e (0.2 M ) o n M B L b i n d i n g t o B 2 G P I w e r e e x a m i n e d s i m i l a r l y w i t h N H I g G (1 m g / m L ) a n d g a l a c t o s e ( 0 . 2 M ) a s c o n t r o l s r e s p e c t i v e l y . T h e b i n d i n g o f A P C , p r o t e i n S, C 4 B P , a n d M B L t o B 2 G P I i n t h e p r e s e n c e o f 10 m M E D T A w a s a l s o e x a m i n e d . O n e h u n d r e d m i c r o l i t e r s o f A P C , p r o t e i n S, C 4 B P , o r M B L ( 0 t o 10 p g / m L ) i n T B S - E D T A M ( T B S , c o n t a i n i n g 10 m M E D T A a n d 5 % w/v 4 7 p o w d e r e d s k i m m i l k , p H 7.4) w a s i n c u b a t e d w i t h s h a k i n g ( 3 6 0 r p m ) f o r 3 h r at R T i n w e l l s c o a t e d w i t h 6 2 G P I as a b o v e . A f t e r t h e i n c u b a t i o n , m i c r o t i t r e w e l l s w e r e w a s h e d t h r e e t i m e s w i t h T B S - T E D T A ( T B S c o n t a i n i n g 0 . 0 5 % T w e e n 2 0 a n d 10 m M E D T A , p H 7.4) a n d t w o t i m e s w i t h T B S - T C a . T h e a m o u n t o f A P C , p r o t e i n S, C 4 B P , o r M B L b o u n d w a s m e a s u r e d u s i n g t h e c o n d i t i o n as a b o v e . F o r a l l a s s a y s , t h e a m o u n t o f p r o t e i n b i n d i n g w a s r e p o r t e d a f t e r s u b t r a c t i n g OD450 o f w e l l s w i t h o u t a d d e d A P C , p r o t e i n C, p r o t e i n S, C 4 B P , C 4 B P . B , o r M B L . 2.13 Effects of High Binding ELISA Plate-Bound B2GPI on A P C Activities M i c r o t i t e r w e l l s w e r e c o a t e d w i t h 1 0 0 p L o f B 2 G P I ( 1 0 p g / m L ) i n T B S o v e r n i g h t at 4 ° C a n d b l o c k e d w i t h T B S - C a M . A f t e r w a s h i n g w i t h T B S - C a , 100 p L o f 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d A P C ( 1 0 p g / m L ) i n T B S - C a w e r e i n c u b a t e d at 3 7 ° C f o r 2 h o u r s . T h e A P C a c t i v i t i e s i n P S - c o a t e d w e l l s w i t h d i f f e r e n t a m o u n t o f A P C b o u n d w e r e u s e d as s t a n d a r d . T h e a m o u n t o f A P C a c t i v i t y a n d p h o s p h o l i p i d - b o u n d A P C w e r e m e a s u r e d b y h y d r o l y s i s o f c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e S - 2 3 6 6 a n d g a m m a - c o u n t i n g r e s p e c t i v e l y as a b o v e . 2.14 Kinetics and Equilibrium Dissociation Constants of A P C , Protein C, Protein S, C4BP, M B L , and BSA Interactions with B2GPI M i c r o t i t e r w e l l s w e r e c o a t e d w i t h 1 0 0 p L o f 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d B 2 G P I ( 1 0 p g / m L ) i n T B S o v e r n i g h t at 4 ° C a n d b l o c k e d w i t h T B S - C a M . A f t e r w a s h i n g w i t h T B S - C a , 100 p L o f 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d A P C , p r o t e i n C , p r o t e i n S, C 4 B P , M B L , o r B S A ( 1 0 p g / m L ) i n T B S - C a w e r e i n c u b a t e d at 3 7 ° C . P r o t e i n s w e r e r e m o v e d a n d w e l l s w e r e w a s h e d w i t h i c e - c o l d T B S - C a f o u r t i m e s at d i f f e r e n t t i m e p o i n t s , u p t o 3 0 0 m i n u t e s . T h e a m o u n t s o f 4 8 A P C , p r o t e i n C , p r o t e i n S, C 4 B P , M B L , a n d B S A b o u n d t o B 2 G P I w e r e q u a n t i f i e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g . T h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s f o r A P C - , p r o t e i n C-, p r o t e i n S-, C 4 B P - , M B L - , a n d B S A - B 2 G P I i n t e r a c t i o n s w e r e d e t e r m i n e d b y i n c u b a t i n g 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d A P C , p r o t e i n C , p r o t e i n S, M B L , B S A ( 0 - 80 p g / m L ) , o r C 4 B P ( 0 - 8 0 0 p g / m L ) i n w e l l s p r e v i o u s l y c o a t e d w i t h 1 0 0 p L 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d B 2 G P I ( 1 0 p g / m L ) f o r 4 h o u r s at 3 7 ° C . P r o t e i n s w e r e r e m o v e d a n d w e l l s w e r e w a s h e d w i t h i c e - c o l d T B S - C a f o u r t i m e s . T h e a m o u n t s o f p r o t e i n b o u n d w e r e m e a s u r e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g . B i n d i n g c o n s t a n t s w e r e d e t e r m i n e d b y n o n - l i n e a r c u r v e f i t t i n g u s i n g O r i g i n s o f t w a r e v e r s i o n 6.0 ( M i c r o c a l , N o r t h a m p t o n , M A ) . B i n d i n g a s s a y s u s i n g o n l y l a b e l e d p r o t e i n s o r m i x t u r e s o f l a b e l e d p r o t e i n s a n d u n l a b e l e d p r o t e i n s w e r e a l s o c a r r i e d o u t s i m i l a r l y t o e x a m i n e t h e e f f e c t s o f r a d i o l a b e l i n g o n e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s . 2.15 Competitive ELISA For Determining Anti-Protein C Antibody Specificity For A P C and Protein C M i c r o t i t r e p l a t e s w e r e c o a t e d w i t h 100 p L A P C ( 1 0 p g / m L ) i n T B S o v e r n i g h t a t 4 ° C o r 2 h r at R T a n d b l o c k e d w i t h T B S - C a M . A f t e r w a s h i n g w i t h T B S - T C a , 100 p L o f A P C o r p r o t e i n C ( 0 t o 5 0 p g / m L ) i n T B S - C a M c o n t a i n i n g g o a t - a n t i - p r o t e i n C a n t i b o d i e s ( 1 / 1 0 0 0 d i l u t i o n ) w a s a d d e d a n d i n c u b a t e d w i t h s h a k i n g ( 3 6 0 r p m ) f o r 3 h r at R T . T h e a m o u n t o f g o a t - a n t i - p r o t e i n C b o u n d w a s m e a s u r e d u s i n g t h e E L I S A p r o t o c o l a b o v e . T h i s e x p e r i m e n t w a s a l s o p e r f o r m e d u s i n g p r o t e i n C - c o a t e d m i c r o t i t r e p l a t e s . 4 9 2.16 Effects of Anti-B2GPI Sepharose Beads and B2GPI-Sepharose Beads on Plasma Protein S Clotting Activity A n t i - B 2 G P I S e p h a r o s e b e a d s w e r e p r e p a r e d b y c o u p l i n g 2 m g o f a f f i n i t y - p u r i f i e d r a b b i t - a n t i - h u m a n B 2 G P I t o 1 m L o f C N B r - S e p h a r o s e 4 B p a c k e d g e l b e a d s . F o r t h e e x p e r i m e n t , t w o h u n d r e d m i c r o l i t e r s o f N H P w a s a d d e d t o 1 m L o f p a c k e d a n t i - B 2 G P I S e p h a r o s e b e a d s e q u i l i b r a t e d i n O w r e n - K o l l e r b u f f e r (0.03 M s o d i u m b a r b i t o n e , 0.1 M s o d i u m a c e t a t e , p H 7.4). T h i s g e l s l u r r y w a s i n c u b a t e d f o r 3 0 m i n u t e s at 4 ° C o n a r o t a t o r . N H P w a s e l u t e d a n d t h e c o n c e n t r a t i o n w a s a d j u s t e d t o o n e - t e n t h o f t h e i n i t i a l N H P c o n c e n t r a t i o n w i t h O w r e n - K o l l e r b u f f e r . T h e a c t i v i t y o f f r e e p r o t e i n S r e m a i n e d i n N H P a f t e r b e i n g e x p o s e d t o a n t i - B 2 G P I g e l b e a d s w a s a s s e s s e d u s i n g S t a c l o t P r o t e i n S k i t ( D i a g n o s t i c a , S t a g o , F r a n c e ) a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ' s i n s t r u c t i o n s o n a S t a g o S T A c o a g u l a t i o n a n a l y z e r . B r i e f l y , 5 0 u L o f t h e 10 t i m e s d i l u t e d a n t i - B 2 G P I - g e l b e a d s t r e a t e d N H P w a s i n c u b a t e d at 3 7 ° C f o r 2 m i n w i t h 5 0 u L o f e a c h o f t h e f o l l o w i n g r e a g e n t s : p r o t e i n S - d e f i c i e n t h u m a n p l a s m a , h u m a n a c t i v a t e d p r o t e i n C , a n d a p r e p a r a t i o n c o n t a i n i n g b o v i n e f a c t o r V a . T h e t i m e t o f o r m a c l o t w a s m e a s u r e d a f t e r t h e a d d i t i o n o f 5 0 u L o f 0.025 M C a C h . T h e t i m e f o r c l o t t i n g i s t r a n s l a t e d i n t o a p e r c e n t a g e o f t h e N H P c o n t r o l b a s e d o n a s t a n d a r d c u r v e w h i c h i s l i n e a r b e t w e e n 2 5 - 1 2 0 %. N H P t r e a t e d w i t h n o n - i m m u n e r a b b i t I g G - g e l b e a d s a n d N H P n o t e x p o s e d t o g e l b e a d s w e r e u s e d as c o n t r o l s . T h e e f f e c t o f i n c u b a t i n g N H P w i t h B 2 G P I - c o n j u a t e d S e p h a r o s e b e a d s o n p r o t e i n S a c t i v i t y w a s a l s o s t u d i e d s i m i l a r l y . B 2 G P I - c o n j u a t e d S e p h a r o s e b e a d s w e r e p r e p a r e d b y c o u p l i n g 4 m g o f B 2 G P I t o 1 m L o f C N B r - S e p h a r o s e 4 B p a c k e d g e l b e a d s . 5 0 2.17 Effects of aPL IgG on A P C Activities in the Presence of B2GPI and Protein S in PS-Coated Wells H i g h - b i n d i n g m i c r o t i t r e p l a t e s c o n t a i n i n g 1 0 0 u L / w e l l o f P S ( 5 0 p g / m L i n 1 0 0 % e t h a n o l ) w e r e a i r - d r i e d at r o o m t e m p e r a t u r e a n d b l o c k e d w i t h T B S - C a M . A f t e r w a s h i n g w i t h T B S - C a , 1 0 0 u L o f p r o t e i n m i x c o n t a i n i n g 1) A P C + B 2 G P I + N H I g G , 2) A P C + B 2 G P I + a P L I g G , 3) A P C + B 2 G P I + N H I g G + p r o t e i n S, a n d 4 ) A P C + B 2 G P I + a P L I g G + p r o t e i n S w e r e a d d e d . T h e c o n c e n t r a t i o n s o f t h e 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d A P C , B 2 G P I , a P L I g G , a n d N H I g G u s e d w e r e 2 p g / m L , 1 0 0 u g / m L , 1 m g / m L , a n d 1 m g / m L , r e s p e c t i v e l y . A f t e r t h e i n c u b a t i o n , w e l l s w e r e w a s h e d w i t h i c e - c o l d T B S - C a f o u r t i m e s . O n e h u n d r e d m i c r o l i t e r s o f c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e S - 2 3 6 6 (1 m M i n T B S - C a b u f f e r ) w a s a d d e d a n d i n c u b a t e d f o r 6 0 m i n at R T . T h e a m o u n t o f s u b s t r a t e h y d r o l y z e d o v e r t i m e w a s m e a s u r e d b y OD405. T h e a m o u n t s o f A P C b o u n d w e r e m e a s u r e d b y g a m m a -r a d i a t i o n c o u n t i n g . T h e A P C a c t i v i t i e s i n P S - c o a t e d w e l l s w i t h d i f f e r e n t a m o u n t o f A P C b o u n d b y i n c u b a t i n g P S - w e l l s w i t h 0 t o 2 p g / m L o f A P C w e r e a l s o m e a s u r e d . 2.18 Effects of aPL IgG on B2GPI Binding to PS-Coated ELISA Wells P S - c o a t e d E L I S A p l a t e s w e r e p r e p a r e d as a b o v e . A f t e r w a s h i n g w i t h T B S - C a , 1 0 0 u L o f p r o t e i n m i x c o n t a i n i n g 1) 1 2 5 I - B 2 G P I ( 0 t o 10 p g / m L ) a n d N H I g G ( 5 0 0 u g / m L ) a n d 2) 1 2 5 I - B 2 G P I ( 0 t o 10 u g / m L ) a n d a P L I g G ( 5 0 0 p g / m L ) w e r e a d d e d . A f t e r t h e i n c u b a t i o n , w e l l s w e r e w a s h e d w i t h i c e - c o l d T B S - C a f o u r t i m e s . T h e a m o u n t s o f A P C b o u n d w e r e m e a s u r e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g . 51 2.19 Effects of aPL IgG on APC, Protein S and C4BP Binding to Activated Platelets in the Presence of B2GPI W a s h e d p l a t e l e t s w e r e p r e p a r e d f r o m c i t r a t e d b l o o d s a m p l e s c o l l e c t e d f r o m h e a l t h y v o l u n t e e r s . P l a t e l e t - r i c h p l a s m a , d i l u t e d 1:1 w i t h a c i d - c i t r a t e - d e x t r o s e , w a s c e n t r i f u g e d at 2 0 0 0 x g f o r 15 m i n , r e s u s p e n d e d i n M H T B ( m o d i f i e d H E P E S T y r o d e ' s B u f f e r ; 10 m M H E P E S , 1 3 7 m M N a C l , 2.7 m M K C 1 , 0.4 m M N a H 2 P 0 4 , 0 . 1 % d e x t r o s e , 0 . 2 % B S A , p H 6.5), a n d c e n t r i f u g e d at 2 0 0 0 x g f o r a n o t h e r 10 m i n . T h e final p l a t e l e t p e l l e t s w e r e r e s u s p e n d e d i n M H T B - C a ( M H T B , 2.5 m M C a C l 2 , p H 7.4). W a s h e d p l a t e l e t s ( 2 x 1 0 7 / m L ) w e r e i n c u b a t e d w i t h B 2 G P I ( 2 0 0 p g / m L ) , A P C (4 p g / m L ) , p r o t e i n S ( 2 0 p g / m L ) , g l y - p r o - a r g - p r o ( 2 5 p M ; N o v a b i o c h e m , S a n D i e g o , C A ) , a n d a P L I g G (1 m g / m L ) i n M H T B - C a b u f f e r a n d a c t i v a t e d b y c a l c i u m i o n o p h o r e ( A 2 3 1 8 7 ) ( 1 0 p g / m L ; S i g m a ) . N H I g G (1 m g / m L ) i n p l a c e o f a P L I g G a n d r e s t i n g p l a t e l e t s i n p l a c e o f a c t i v a t e d p l a t e l e t s w e r e u s e d as c o n t r o l s . A f t e r 1 h r o f i n c u b a t i o n at 3 7 ° C , p l a t e l e t s w e r e w a s h e d w i t h M H T B - C a a n d i n c u b a t e d w i t h F I T C - l a b e l e d m o n o c l o n a l a n t i - h u m a n C D 6 2 P t o m o n i t o r a c t i v a t i o n state, o r u n l a b e l e d m o n o c l o n a l a n t i - h u m a n p r o t e i n C o r a n t i - h u m a n p r o t e i n S. A f t e r 3 0 m i n , p l a t e l e t s w e r e w a s h e d a n d i n c u b a t e d w i t h F I T C - l a b e l e d F ( a b ' ) 2 d o n k e y a n t i - m o u s e I g G f o r t h e a n t i - h u m a n p r o t e i n C a n d t h e a n t i - h u m a n p r o t e i n S i n c u b a t i o n s f o r a n o t h e r 3 0 m i n t h e n d i l u t e d i n T B S p r i o r t o p e r f o r m i n g f l o w c y t o m e t r y . T h e e f f e c t s o f a P L o n p r o t e i n S a n d C 4 B P b i n d i n g t o p l a t e l e t s w e r e s t u d i e d u s i n g a n i d e n t i c a l p r o c e d u r e e x c e p t A P C a n d m o n o c l o n a l a n t i - p r o t e i n C w e r e r e p l a c e d b y C 4 B P ( 2 5 0 p g / m L ) a n d m o n o c l o n a l a n t i - h u m a n C 4 B P , r e s p e c t i v e l y . 5 2 2.20 Binding of 1 2 5I-B2GPI and 1 2 5I-Protein S to Activated Platelets in the Presence ofaPL W a s h e d p l a t e l e t s (4 x 1 0 7 / m L ) w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d B 2 G P I ( 2 0 0 p g / m L ) , g l y - p r o - a r g - p r o ( 2 5 u M ; N o v a b i o c h e m , S a n D i e g o , C A ) , a n d a P L I g G (1 m g / m L ) i n M H T B - C a b u f f e r a n d a c t i v a t e d b y c a l c i u m i o n o p h o r e ( A 2 3 1 8 7 ) ( 1 0 p g / m L ) i n a f i n a l v o l u m e o f 5 0 p L . N H I g G (1 m g / m L ) i n p l a c e o f a P L I g G a n d r e s t i n g p l a t e l e t s i n p l a c e o f a c t i v a t e d p l a t e l e t s w e r e u s e d as c o n t r o l s . A f t e r 1 h r o f i n c u b a t i o n at 3 7 ° C , p l a t e l e t s a m p l e s w e r e m a d e u p to 1 0 0 0 p L i n M H T B - C a a n d c e n t r i f u g e d at 2 0 0 0 x g f o r 15 m i n . N i n e h u n d r e d m i c r o l i t e r s o f s u p e r n a t a n t w e r e t r a n s f e r r e d t o a n o t h e r t u b e ( t u b e #2), l e a v i n g 1 0 0 p L o f s u p e r n a t a n t t o g e t h e r w i t h t h e p l a t e l e t p e l l e t ( t u b e #1). T h e r a d i o a c t i v i t y b o u n d to p l a t e l e t s i n e a c h s a m p l e w a s c a l c u l a t e d u s i n g t h e f o l l o w i n g f o r m u l a : = ( t u b e # 1 ) - ( t u b e #21 9 T h e b i n d i n g o f 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d B 2 G P I ( 2 0 0 p g / m L ) a n d 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d p r o t e i n S ( 2 0 p g / m L ) to a c t i v a t e d w a s h e d p l a t e l e t s w i t h o u t I g G s w a s m e a s u r e d s i m i l a r l y . 2.21 ELISA To Detect Antiphospholipid Antibody-Mediated Complement Activation E L I S A p l a t e s w e r e c o a t e d w i t h 1 0 0 p L B 2 G P I ( 1 0 p g / m L ) i n T B S o v e r n i g h t at 4 ° C o r 2 h r at R T a n d b l o c k e d w i t h G V B 2 + ( V B S , [ v e r o n a l b u f f e r e d s a l i n e , c o n t a i n i n g 1.8 m M s o d i u m b a r b i t o n e , 1.56 m M s o d i u m b a r b i t u r i c a c i d , 1 4 5 m M N a C l ] , a n d 0.15 m M C a C l 2 , 1 m M M g C l 2 , 0.1 % g e l a t i n , p H 7.4); w e l l s c o a t e d o n l y w i t h G V B 2 + s e r v e d as 53 c o n t r o l s . A f t e r w a s h i n g w i t h G V B 2 + , 100 p L o f p o s i t i v e c o n t r o l s c o n t a i n i n g s e r i a l l y d i l u t e d r a b b i t - a n t i - h u m a n 132GPI a n d 1:1 d i l u t e d p a t i e n t s e r u m s a m p l e s i n G V B - E D T A ( V B S c o n t a i n i n g 2 0 m M E D T A , 0.1 % g e l a t i n , p H 7.4) w e r e a d d e d a n d i n c u b a t e d f o r 1 h r at R T . A f t e r w a s h i n g t h r e e t i m e s w i t h G V B - E D T A , a n d t h r e e t i m e s w i t h G V B 2 + , 100 p L o f N H S d i l u t e d 1:40 i n G V B 2 + w e r e a d d e d to t h e w e l l s a n d i n c u b a t e d at 3 7 ° C f o r 1 h r f o r c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . A f t e r t h e i n c u b a t i o n , w e l l s w e r e w a s h e d 5 t i m e s w i t h T B S -T C a a n d i n c u b a t e d w i t h m o n o c l o n a l m o u s e a n t i - h u m a n C 5 b - 9 i n G V B 2 + f o r 1 hr. W e l l s w e r e w a s h e d five t i m e s w i t h T B S - T C a a n d m o u s e a n t i - h u m a n C 5 b - 9 w a s v i s u a l i z e d u s i n g H R P - d o n k e y - a n t i - m o u s e I g G i n G V B 2 + a n d T M B s u b s t r a t e . N o n - s p e c i f i c m o u s e I g G w a s u s e d as p r i m a r y a n t i b o d y c o n t r o l to e n s u r e s i g n a l s p r o d u c e b y t h e E L I S A w e r e d u e t o s p e c i f i c a n t i - C 5 b - 9 a n t i b o d y b i n d i n g t o E L I S A p l a t e - b o u n d C 5 b - 9 . C o n t r o l s w i t h o u t p r i m a r y a n t i b o d i e s w e r e a l s o p e r f o r m e d . C o n t r o l s i n w h i c h B 2 G P I - a n d G V B 2 + -c o a t e d w e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h s e r u m i n G V B 2 + o r G V B - E D T A a n d p r o b e d w i t h a n t i -C 5 b - 9 w e r e p e r f o r m e d to e x a m i n e t h e a b i l i t y o f B 2 G P I t o m e d i a t e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . 2.22 Statistical Analysis T h e s t a t i c t i c a l a n a l y s e s o f t h e d a t a w e r e p e r f o r m e d u s i n g t-test, p a i r e d t-test, A N O V A , 2 w a y A N O V A , a n d N e w m a n - K e u l ' s T e s t . T h e c a l c u l a t i o n s w e r e c a r r i e d o u t u s i n g M i c r o s o f t E x c e l 9 7 ( R e d m o n d , W A ) . 5 4 C H A P T E R 3 E F F E C T O F B2-GLYCOPROTEIN I O N T H E SPECIFIC A C T I V I T Y O F A C T I V A T E D PROTEIN C IN T H E P R E S E N C E O F AMINOPHOSPHOLIPIDS B 2 G P I m a y b e a p r o c o a g u l a n t A P C i n h i b i t o r ( M o r i et al, 1996; C a n f i e l d a n d K i s i e l , 1 9 8 2 ) as w e l l as a n a t u r a l a n t i c o a g u l a n t ( B r i g h t o n et al, 1 9 9 6 ) . A l s o , s e v e r a l s t u d i e s h a v e s h o w n tha t t h e a n t i c o a g u l a t i o n a c t i v i t y o f A P C c o u l d b e i n h i b i t e d b y a P L i n the p r e s e n c e o f B 2 G P I . H o w e v e r , t h e m e c h a n i s m t h a t m e d i a t e s t h i s i n h i b i t i o n a n d t h e r o l e o f B 2 G P I i n t h i s p h e n o m e n o n r e m a i n u n c l e a r . T h e r e f o r e , t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n A P C a n d B 2 G P I w a s i n v e s t i g a t e d t o g a i n f u r t h e r u n d e r s t a n d i n g o f t h e i r i n t e r r e l a t i o n s h i p s . 3.1 Effects of B2GPI and Protein S on A P C Activity on Phospholipid Surface T h e a c t i v i t y o f P S - b o u n d A P C w a s q u a n t i f i e d b y m e a s u r i n g t h e h y d r o l y s i s o f c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e S - 2 3 6 6 . A r e p r e s e n t a t i v e c u r v e o f t h e h y d r o l y s i s o f S - 2 3 6 6 b y d i f f e r e n t a m o u n t s o f P S - b o u n d A P C as m e a s u r e d b y OD405 a f t e r 6 0 m i n u t e s o f i n c u b a t i o n i s s h o w n i n F i g u r e 5. T h e h y d r o l y s i s o f S - 2 3 6 6 v a r i e d l i n e a r l y w i t h t h e a m o u n t o f A P C . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e m e a s u r e m e n t o f A P C a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f 1 m M S - 2 3 6 6 at r o o m t e m p e r a t u r e i s d i r e c t l y p r o p o r t i o n a l t o t h e a m o u n t o f A P C b o u n d t o P S . T h e r e f o r e , t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f A P C c a n b e d e t e r m i n e d u n d e r t h e s e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s . U s i n g t h e s a m e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s , t h e e f f e c t o f B 2 G P I o n t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f P S - b o u n d A P C w a s a s s e s s e d . I n F i g u r e 6 A , t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f P S - b o u n d A P C w a s 18 O D 4 0 5 / p g . I n c o m p a r i s o n , w h e n A P C a n d B 2 G P I w e r e c o - i n c u b a t e d i n P S -c o a t e d w e l l s , t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f P S - b o u n d A P C i n c r e a s e d 3 f o l d , t o 5 9 OD4os/pg ( p < 0.001, n=5, A N O V A ) . T h e c o - i n c u b a t i o n o f A P C a n d p r o t e i n S l e d t o t h e e x p e c t e d 55 F i g u r e 5. H y d r o l y s i s o f C h r o m o g e n i c S u b s t r a t e S - 2 3 6 6 b y P S - B o u n d A P C . P S - c o a t e d w e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d A P C ( 0 t o 2 p g / m L ) . T h e a c t i v i t y o f P S - b o u n d A P C w a s q u a n t i f i e d b y m e a s u r i n g t h e h y d r o l y s i s o f c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e S - 2 3 6 6 (1 m M ) a f t e r 6 0 m i n u t e s o f i n c u b a t i o n at R T . T h e a m o u n t s o f A P C b o u n d t o P S a f t e r t h e i n c u b a t i o n w e r e m e a s u r e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g . 0 10 20 30 40 APC (ng) 5 6 Figure 6. Specific Activity of PS-Bound APC in the Presence of B2GPI and Protein S. PS-coated wells were incubated with 1) 125I-trace labeled A P C (2 pg/mL, 32 nM), 2) APC (2 pg/mL, 32 nM) + B2GPI (100 pg/mL, 1.9 pM), 3) APC (2 pg/mL, 32 nM) + protein S (10 pg/mL, 145 nM), or 4) APC (2 pg/mL, 32 nM) + B2GPI (100 pg/mL, 1.9 pM) + protein S (10 pg/mL, 145 nM). (A) The specific activity of A P C bound to PS-wells was obtained from the total activity generated by the amount of PS-bound APC. (B) The total activity was quantified by measuring the hydrolysis of chromogenic substrate S-2366 (1 mM) after 60 minutes of incubation at RT with PS-bound APC. Data points are the mean ± 1 SD of five separate measurements. Data are representative of 3 separate experiments. f o 60 j — £0 80 70 o 0 50 « < 4 0 — o> i n O w J U a S 20 °> o* O 1 0 p < 0.001 p< 0.001} PS Wells + APC p< 0.001 PS Wells PS Wells + APC + APC + IJ2GPI + Protein S PS Wells + APC + R2GPI + Protein S B S, 0.7 O 2* 0.6 0 > 0.5 0.4 0.3 0.2 < o < n 0.1 o p< 0.001 PS Wells + APC F PS Wells + APC + (J2GPI p< 0.001 PS Wells PS Wells + APC + APC + Protein S + (12GPI + Protein S 57 i n c r e a s e i n A P C s p e c i f i c a c t i v i t y o f 2 4 O D ^ s / p g , w h i c h w a s o n l y a 1.3 f o l d i n c r e a s e c o m p a r e d to i n c u b a t i o n w i t h A P C a l o n e ( p < 0.001, n=5, A N O V A ) . I n c o m p a r i s o n t o A P C c o - i n c u b a t i o n w i t h p r o t e i n S, w h e n A P C w a s c o - i n c u b a t e d w i t h B 2 G P I a n d p r o t e i n S, t h e P S - b o u n d A P C h a d a s p e c i f i c a c t i v i t y o f 5 9 O D W p g ( p < 0.001, n=5, A N O V A ) . C o n t r o l s c o n t a i n i n g t h e s a m e p r o t e i n m i x t u r e s e x c e p t A P C s h o w e d n o A P C a c t i v i t y ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t that B 2 G P I c a n s e r v e as a n A P C c o f a c t o r t o i n c r e a s e A P C s p e c i f i c a c t i v i t y . A l s o , p u r i f i e d B 2 G P I w a s f r e e o f p r o t e i n S as i n d i c a t e d b y the a b s e n c e o f p r o t e i n S b a n d i n s i l v e r s t a i n e d g e l a n a l y s i s ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e r e f o r e , t h e i n c r e a s e i n A P C s p e c i f i c a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I w a s n o t d u e t o p r o t e i n S c o n t a m i n a t i o n i n t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e . T h i s i n c r e a s e i n A P C s p e c i f i c a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I , h o w e v e r , d i d n o t t r a n s l a t e i n t o a n i n c r e a s e i n t o t a l A P C a c t i v i t y . I n F i g u r e 6 B , t h e t o t a l a c t i v i t y g e n e r a t e d b y P S - b o u n d A P C w a s a n O D 4 0 5 o f 0.593. W h e n A P C a n d B 2 G P I w e r e c o - i n c u b a t e d t o g e t h e r i n P S - c o a t e d w e l l s , t h e t o t a l a c t i v i t y o f P S - b o u n d A P C w a s o n l y 0.462, a 2 2 % r e d u c t i o n ( p < 0.001, n=5, A N O V A ) . T h e c o - i n c u b a t i o n o f A P C a n d p r o t e i n S a l s o l e d t o a s l i g h t l y l o w e r e d t o t a l A P C a c t i v i t y o f 0.568 c o m p a r e d t o i n c u b a t i o n w i t h A P C a l o n e ; h o w e v e r t h i s w a s n o t s t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t l y . I n c o m p a r i s o n t o A P C c o - i n c u b a t i o n w i t h p r o t e i n S, w h e n A P C w a s c o - i n c u b a t e d w i t h B 2 G P I a n d p r o t e i n S, t h e P S - b o u n d A P C h a d a t o t a l a c t i v i t y o f 0.441 ( p < 0.001, n=5, A N O V A ) . T h e r e f o r e , o n a P S s u r f a c e , B 2 G P I a n d p r o t e i n S l o w e r e d A P C t o t a l a c t i v i t y . T h i s m a y b e b e c a u s e b o t h B 2 G P I a n d p r o t e i n S, s i m i l a r t o A P C , a r e a n i o n i c p h o s p h o l i p i d b i n d i n g p r o t e i n s , a n d w o u l d c o m p e t e w i t h A P C f o r P S b i n d i n g . H e n c e , l e s s A P C w a s b o u n d a n d l e s s A P C a c t i v i t y w a s d e t e c t e d i n t h e i r p r e s e n c e . 5 8 3.2 A c t i v i t y o f A P C B o u n d t o P C - , P E - , a n d P S - C o a t e d W e l l s i n t h e P r e s e n c e o f B 2 G P I T h i s e x p e r i m e n t e x a m i n e d t h e e f f e c t o f d i f f e r e n t p h o s p h o l i p i d s o n A P C s p e c i f i c a c t i v i t y . I n F i g u r e 7 A , th e s p e c i f i c a c t i v i t y o f P S - b o u n d A P C w a s 18 O D W p g . W h e n A P C a n d B 2 G P I w e r e c o - i n c u b a t e d i n P S - c o a t e d w e l l s , t h e s p e c i f i c a c t i v i t y i n c r e a s e d t o 5 9 O D W p g ( p < 0.001, n=5, t-test). I n t e r e s t i n g l y , t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f A P C b o u n d to t h e n e u t r a l P C w a s 50.7 O D ^ / p g a n d B 2 G P I d i d n o t a f f e c t t h e s p e c i f i c a c t i v i t y s i g n i f i c a n t l y . T h i s l a c k o f e n h a n c e m e n t o f A P C a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I i s p r o b a b l y d u e to t h e n e g l i g i b l e b i n d i n g o f B 2 G P I t o P C o r t h a t t h e A P C a c t i v i t y w a s a l r e a d y n e a r m a x i m a l . T h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f P E - b o u n d A P C w a s 31.9 O D W p g a n d t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I i n c r e a s e d t h e s p e c i f i c a c t i v i t y t o 44.9 O D W p g ( p <0.002, n=5, t-te s t ) . E v e n t h o u g h P C - b o u n d A P C e x h i b i t s h i g h e r s p e c i f i c a c t i v i t y t h a n P E - b o u n d a n d P S - b o u n d A P C , P C - b o u n d A P C p r o b a b l y i s a m i n o r o r e v e n n e g l i g i b l e c o n t r i b u t o r t o A P C a n t i c o a g u l a t i o n a c t i v i t y in vivo. I n F i g u r e 7 B , th e t o t a l a c t i v i t y o f P C - b o u n d A P C g e n e r a t e d o v e r 6 0 m i n u t e s w a s a n OD405 o f 0.065, c o m p a r e t o 0.316 a n d 0.593 f o r P E -b o u n d a n d P S - b o u n d A P C , r e s p e c t i v e l y . T h e r e f o r e , P C - b o u n d A P C o n l y h a d 10 to 2 0 % o f t h e t o t a l a c t i v i t y o f A P C b o u n d t o a m i n o p h o s p h o l i p i d P E a n d P S . T h i s i s b e c a u s e A P C b i n d s s t r o n g l y t o P E a n d P S , b u t n o t P C . C o n s e q u e n t l y , h i g h e r t o t a l A P C a c t i v i t y w a s o b s e r v e d i n P E - a n d P S - c o a t e d w e l l s e v e n t h o u g h P E - b o u n d a n d P S - b o u n d A P C h a v e a l o w e r s p e c i f i c a c t i v i t y . W h e n A P C w a s c o - i n c u b a t e d w i t h B 2 G P I i n P C - c o a t e d 5 9 F i g u r e 7. S p e c i f i c A c t i v i t y o f p h o s p h o l i p i d - b o u n d A P C i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I i n P C - , P E - , a n d P S - C o a t e d W e l l s . P C - , P E - , a n d P S - c o a t e d w e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h I 2 5 I - t r a c e l a b e l e d A P C (2 p g / m L , 3 2 n M ) i n t h e p r e s e n c e o f a b s e n c e o f B 2 G P I ( 1 0 0 p g / m L , 1.9 p M ) . ( A ) T h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f A P C b o u n d t o p h o s p h o l i p i d c o a t e d - w e l l s w a s o b t a i n e d f r o m t h e t o t a l a c t i v i t y g e n e r a t e d b y th e p h o s p h o l i p i d - b o u n d A P C a n d th e a m o u n t o f p h o s p h o l i p i d b o u n d A P C . ( B ) T h e t o t a l a c t i v i t y w a s q u a n t i f i e d b y m e a s u r i n g t h e h y d r o l y s i s o f c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e S - 2 3 6 6 (1 m M ) a f t e r 6 0 m i n u t e s o f i n c u b a t i o n at R T w i t h P S - b o u n d A P C . D a t a p o i n t s a r e t h e m e a n ± 1 S D o f f o u r s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s . D a t a a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . A PC Wells PC Wells PE Wells PE Wells PS Wells PS Wells + APC + APC + APC + APC + A P C + A P C PC Wells PC Wells PE Wells PE Wells PS Wells PS Wells + APC + APC + APC + APC + A P C + APC + I J 2 G P I + I J 2 G P I + G 2 G P I 6 0 w e l l s , t h e t o t a l a c t i v i t y w a s 0.0528, s l i g h t l y l o w e r t h a n i n c u b a t i o n w i t h A P C a l o n e . I n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I , t h e t o t a l a c t i v i t i e s o f P E - , a n d P S - b o u n d A P C w e r e r e d u c e d t o 0.251 ( p O . 0 0 3 , n=5, t-test) a n d 0.462 ( p <0.001, n=5, t-test), r e s p e c t i v e l y . T h e s e r e d u c t i o n s p r o b a b l y r e f l e c t t h e c o m p e t i t i o n b e t w e e n B 2 G P I a n d A P C f o r P E a n d P S . 3.3 Effect of Fluid Phase B2GPI on A P C and Protein S Binding to Oxidized ELISA Plate-Bound B2GPI in the Absence of Phospholipids T o a s s e s s w h e t h e r t h e A P C - B 2 G P I i n t e r a c t i o n w a s d e p e n d e n t o n P E a n d P S , A P C b i n d i n g t o B 2 G P I w a s e v a l u a t e d i n t h e a b s e n c e o f p h o s p h o l i p i d . U s i n g E L I S A , i n t h e p r e s e n c e o f 2.5 m M C a C h , A P C w a s f o u n d t o i n t e r a c t w i t h B 2 G P I a d s o r b e d t o o x i d i z e d h i g h - b i n d i n g p l a t e s i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r i n t h e a b s e n c e o f p h o s p h o l i p i d s ( F i g u r e 8 A ) . I n t h e p r e s e n c e o f 10 m M E D T A , A P C b i n d i n g t o B 2 G P I w a s i n h i b i t e d ( p O . 0 0 1 , t w o w a y A N O V A ) . A P C d i d n o t b i n d t o c o n t r o l w e l l s c o a t e d w i t h s k i m m i l k p r o t e i n . T h e p r e s e n c e o f 5 0 p g / m L ( 9 3 0 n M ) f l u i d p h a s e B 2 G P I d i d n o t i n h i b i t A P C ( 0 to 10 p g / m L , 0 t o 161 n M ) b i n d i n g t o B 2 G P I a d s o r b e d t o o x i d i z e d h i g h - b i n d i n g p l a t e ( p >0.05, t w o w a y A N O V A ) ( F i g u r e 8 B ) . T h i s s u g g e s t s t h a t f l u i d p h a s e B 2 G P I d o e s n o t i n t e r a c t w i t h A P C a n d f l u i d p h a s e B 2 G P I e x h i b i t s a c o n f o r m a t i o n d i f f e r e n t f r o m E L I S A p l a t e - b o u n d B 2 G P I . T h i s e x p e r i m e n t i n d i c a t e s t h a t t h e c o n f o r m a t i o n a l a l t e r a t i o n t h a t B 2 G P I u n d e r g o e s w h e n b o u n d t o a n o x i d i z e d s u r f a c e i s i m p o r t a n t f o r A P C b i n d i n g . U s i n g t h e s a m e e x p e r i m e n t a l s e t u p , p r o t e i n S w a s a l s o f o u n d t o b i n d B 2 G P I - c o a t e d w e l l s i n a c o n c e n t r a t i o n - a n d c a l c i u m - d e p e n d e n t m a n n e r b u t n o t t o c o n t r o l w e l l s c o a t e d w i t h 61 F i g u r e 8. I n t e r a c t i o n B e t w e e n B 2 G P I a n d A P C . ( A ) I n t e r a c t i o n B e t w e e n B 2 G P I a n d A P C i s C a l c i u m - D e p e n d e n t . M i c r o t i t r e w e l l s c o a t e d w i t h B 2 G P I w e r e i n c u b a t e d w i t h A P C w i t h 2.5 m M CaCh ( c l o s e d c i r c l e s ) o r 10 m M E D T A ( o p e n c i r c l e s ) . W e l l s b l o c k e d w i t h s k i m m i l k p r o t e i n ( c r o s s e s ) c o n t r o l l e d f o r n o n - s p e c i f i c b i n d i n g . T h e O D 4 5 0 r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f A P C b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e O D 4 5 o o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n A P C . ( B ) F l u i d P h a s e B 2 G P I D i d N o t A f f e c t A P C B i n d i n g t o O x i d i z e d E L I S A P l a t e - B o u n d B 2 G P I . M i c r o t i t r e w e l l s c o a t e d w i t h B 2 G P I w e r e i n c u b a t e d w i t h A P C ( 0 t o 10 p g / m L , 0 t o 161 n M ) i n t h e p r e s e n c e ( c l o s e d c i r c l e s ) o r a b s e n c e ( o p e n c i r c l e s ) o f f l u i d p h a s e B 2 G P I ( 5 0 p g / m L , 9 3 0 n M ) . D a t a p o i n t s a r e t h e m e a n s ± 1 S D o f t h r e e s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s o f t h e s a m e s a m p l e . T h e d a t a a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . T h e OD450 r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f A P C b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e O D 4 s o o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n A P C . T h e O D 4 5 0 m e a s u r e m e n t s u n d e r t h e d i f f e r e n t c o n d i t i o n s a r e v e r y c l o s e s o t h a t t h e s y m b o l s o v e r l a p p e d a n d the e r r o r b a r s a r e s m a l l e r t h a n t h e s y m b o l s . 6 2 0.4 -| A P C (ng/ml_) 63 s k i m m i l k p r o t e i n ( p < 0.001, t w o w a y A N O V A ) . T h e p r e s e n c e o f 10 m M E D T A p a r t i a l l y i n h i b i t e d t h i s i n t e r a c t i o n ( F i g u r e 9 A ) . S i m i l a r t o A P C b i n d i n g t o B 2 G P I a d s o r b e d t o a n o x i d i z e d s u r f a c e , f l u i d p h a s e B 2 G P I ( 5 0 p g / m L , 9 3 0 n M ) d i d n o t i n h i b i t p r o t e i n S ( 0 t o 10 p g / m L , 0 t o 145 n M ) b i n d i n g t o B 2 G P I a d s o r b e d t o o x i d i z e d s u r f a c e ( P >0.05, t w o w a y A N O V A ) ( F i g u r e 9 B ) . 3.4 A c t i v i t y o f B2GPI-Bound A P C I n t h i s e x p e r i m e n t , t h e e f f e c t o f o x i d i z e d E L I S A p l a t e - b o u n d B 2 G P I o n A P C w a s e x a m i n e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r o x i d i z e d E L I S A p l a t e - b o u n d B 2 G P I h a s t h e s a m e p o t e n t i a t i n g e f f e c t o n A P C s p e c i f i c a c t i v i t y as p h o s p h o l i p i d - b o u n d B 2 G P I . A P C w a s i n c u b a t e d i n B 2 G P I - c o a t e d p l a t e s a n d t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f A P C b o u n d t o B 2 G P I - c o a t e d w e l l s w a s m e a s u r e d . I n F i g u r e 10, i t c a n b e s e e n t h a t t h e a c t i v i t y o f B 2 G P I - b o u n d A P C w a s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h e e q u i v a l e n t a m o u n t o f A P C b o u n d t o P S - w e l l s ( p < 0.001). T h e r e f o r e , A P C h a s l o w e r a c t i v i t y w h e n b o u n d d i r e c t l y t o B 2 G P I c o m p a r e d t o a n e q u i v a l e n t a m o u n t o f A P C b o u n d d i r e c t l y t o P S . T h i s s u g g e s t s t h a t B 2 G P I b o u n d t o a n o x i d i z e d s u r f a c e h a s a n i n h i b i t o r y e f f e c t o n A P C w h i l e B 2 G P I b o u n d t o p h o s p h o l i p i d s h a s a p o t e n t i a t i n g e f f e c t o n A P C . 6 4 F i g u r e 9. I n t e r a c t i o n B e t w e e n B 2 G P I a n d P r o t e i n S. ( A ) I n t e r a c t i o n B e t w e e n B 2 G P I a n d p r o t e i n S i s C a l c i u m - D e p e n d e n t . M i c r o t i t r e w e l l s c o a t e d w i t h B 2 G P I w e r e i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n S w i t h 2.5 m M CaCi2 ( c l o s e d c i r c l e s ) o r 10 m M E D T A ( o p e n c i r c l e s ) . W e l l s b l o c k e d w i t h s k i m m i l k p r o t e i n ( c r o s s e s ) c o n t r o l l e d f o r n o n - s p e c i f i c b i n d i n g . T h e O D 4 5 o r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f p r o t e i n S b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e OD450 o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n p r o t e i n S. ( B ) F l u i d P h a s e B 2 G P I D i d N o t A f f e c t P r o t e i n S B i n d i n g t o O x i d i z e d E L I S A P l a t e - B o u n d B 2 G P I . M i c r o t i t r e w e l l s c o a t e d w i t h B 2 G P I w e r e i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n S ( 0 t o 10 p g / m L , 0 t o 145 n M ) i n t h e p r e s e n c e ( c l o s e d c i r c l e s ) o r a b s e n c e ( o p e n c i r c l e s ) o f f l u i d p h a s e B 2 G P I ( 5 0 p g / m L , 9 3 0 n M ) . D a t a p o i n t s a r e t h e m e a n s ± 1 S D o f t h r e e s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s o f t h e s a m e s a m p l e . T h e d a t a a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . T h e OD450 r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f p r o t e i n S b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e OD450 o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n p r o t e i n S. T h e OD450 m e a s u r e m e n t s u n d e r t h e d i f f e r e n t c o n d i t i o n s a r e v e r y c l o s e s o t h a t t h e s y m b o l s o v e r l a p p e d a n d t h e e r r o r b a r s a r e s m a l l e r t h a n t h e s y m b o l s . 6 5 1 1 Protein S (ug /mL) 6 6 F i g u r e 10. A c t i v i t y o f G 2 G P I - B o u n d A P C . M i c r o t i t e r w e l l s c o a t e d w i t h B 2 G P I ( c l o s e d c i r c l e s ) w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d A P C ( 1 0 p g / m L ) . P S - c o a t e d w e l l s ( o p e n c i r c l e s ) i n c u b a t e d w i t h 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d A P C (0 t o 10 p g / m L ) w e r e u s e d as c o n t r o l s . T h e t o t a l a c t i v i t y w a s q u a n t i f i e d b y m e a s u r i n g t h e h y d r o l y s i s o f c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e S - 2 3 6 6 (1 m M ) a f t e r 6 0 m i n u t e s o f i n c u b a t i o n at R T w i t h B 2 G P I o r P S - b o u n d A P C . T h e a m o u n t s o f A P C b o u n d w e r e m e a s u r e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g . D a t a p o i n t s a r e t h e m e a n ± 1 S D o f t h r e e s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s . D a t a a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . 6 7 3.5 Inhibition of A P C Binding to B2GPI by Protein S S i n c e b o t h A P C a n d p r o t e i n S c o u l d i n t e r a c t w i t h o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I , t h e i r t r i - m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n s w e r e e x a m i n e d . T h e b i n d i n g o f A P C ( 0 t o 10 p g / m L , 0 t o 160 n M ) t o B 2 G P I w a s i n h i b i t e d b y t h e p r e s e n c e o f 10 p g / m L ( 1 4 5 n M ) o f p r o t e i n S ( p < 0.001, t w o w a y A N O V A ) . H o w e v e r , t h e p r e s e n c e o f 10 p g / m L o f A P C d i d n o t a f f e c t p r o t e i n S (0 t o 10 p g / m L , 0 t o 145 n M ) b i n d i n g t o B 2 G P I ( F i g u r e 11). T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t p r o t e i n S c a n r e g u l a t e A P C b i n d i n g t o B 2 G P I w h e r e a s A P C d o e s n o t i n t e r f e r e w i t h p r o t e i n S b i n d i n g t o B 2 G P I . T h i s o b s e r v a t i o n , t h e r e f o r e , a l s o s u g g e s t s p r o t e i n S m a y s e r v e t o p r e v e n t o x i d i z e d s u r f a c e b o u n d - B 2 G P I f r o m i n h i b i t i n g A P C a c t i v i t y b y p e r t u r b i n g A P C b i n d i n g t o B 2 G P I . 3.6 Equilibrium Dissociation Constant Determinations for A P C , Protein C, Protein S and BSA Binding to B2GPI T o d e t e r m i n e t h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s f o r A P C , p r o t e i n C , p r o t e i n S a n d B S A b i n d i n g t o B 2 G P I a d s o r b e d t o h i g h - b i n d i n g E L I S A p l a t e s , t h e t i m e r e q u i r e d f o r 125 t h e p r o t e i n b i n d i n g t o r e a c h e q u i l i b r i u m w a s m e a s u r e d . B i n d i n g o f 10 p g / m L o f I-tr a c e l a b e l e d - A P C , p r o t e i n C , p r o t e i n S a n d B S A t o B 2 G P I r e a c h e d e q u i l i b r i u m a f t e r 6 0 m i n ( A p p e n d i x F i g u r e 3, A p p e n d i x F i g u r e 4, A p p e n d i x F i g u r e 5). T h e a m o u n t o f b i n d i n g o f A P C , p r o t e i n C, p r o t e i n S, o r B S A t o B 2 G P I w a s d e t e r m i n e d b y i n c u b a t i n g 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d A P C , p r o t e i n C , p r o t e i n S, a n d B S A ( 0 t o 8 0 p g / m L ) f o r 4 h o u r s at 6 8 F i g u r e 11. I n h i b i t i o n o f A P C B i n d i n g t o B 2 G P I b y P r o t e i n S. M i c r o t i t r e w e l l s c o a t e d w i t h B 2 G P I w e r e i n c u b a t e d w i t h : ( A ) 0 t o 10 p g / m L (0 t o 160 n M ) A P C w i t h ( o p e n c i r c l e s ) o r w i t h o u t 10 p g / m L ( 1 4 5 n M ) p r o t e i n S ( c l o s e d c i r c l e s ) ; ( B ) 0 t o 10 p g / m L ( 0 t o 145 n M ) p r o t e i n S w i t h ( o p e n c i r c l e s ) o r w i t h o u t 10 p g / m L ( 1 6 0 n M ) A P C ( c l o s e d c i r c l e s ) . D a t a p o i n t s a r e t h e m e a n + 1 S D o f t h r e e s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s o f t h e s a m e s a m p l e . D a t a a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . T h e OD450 r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t s o f A P C a n d p r o t e i n S b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e OD450 o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n A P C a n d p r o t e i n S, r e s p e c t i v e l y . 0.35 H 0 5 10 [APC] (ng/mL) 1.6 n 0 5 10 [Protein S] (i^g/mL) 6 9 3 7 ° C . T h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s a n d m o l a r r a t i o s o f t h e b i n d i n g w e r e a s s e s s e d ( T a b l e 2 ) . T h e A P C - B 2 G P I i n t e r a c t i o n h a d a Kd o f 8.72 ± 1.64 x 10" 7 M a n d a n A P G B 2 G P I m o l a r r a t i o o f 1.5 ± 0.2. T h e p r o t e i n C - B 2 G P I i n t e r a c t i o n h a d a s i m i l a r Kd o f 7.77 ± 2.76 x 10" 7 M a n d a p r o t e i n C : B 2 G P I m o l a r r a t i o o f 1.7 ± 0.4. B i n d i n g a s s a y s i n d i c a t e d t h a t A P C a n d p r o t e i n C b i n d B 2 G P I w i t h v e r y s i m i l a r d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s w i t h c o e f f i c i e n t o f v a r i a n c e o f 1 9 % a n d 3 6 % , r e s p e c t i v e l y . T h e p r o t e i n S - B 2 G P I i n t e r a c t i o n h a d a Kd o f 7.35 + 1.66 x 10" 7 M a n d a p r o t e i n S : B 2 G P I o f m o l a r r a t i o 2.9 ± 0.4. T h e b i n d i n g o f B S A t o B 2 G P I w a s m e a s u r e d as c o n t r o l . T h e r e w a s n e g l i g i b l e i n t e r a c t i o n , a n d t h e a s s o c i a t i o n o f t h e t w o p r o t e i n s w a s t o o w e a k t o m e a s u r e t h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t d e t e r m i n a t i o n u s i n g t h i s e x p e r i m e n t a l s e t u p . B i n d i n g a s s a y s w i t h o n l y l a b e l e d p r o t e i n s o r m i x t u r e s o f l a b e l e d a n d u n l a b e l e d p r o t e i n s o f d i f f e r e n t r a t i o s a l s o p r o v i d e d c o m p a r a b l e b i n d i n g c o n s t a n t s ( A p p e n d i x F i g u r e 8). 3.7 C o m p a r i s o n o f P r o t e i n C a n d A P C B i n d i n g t o B 2 G P I A P C U s i n g E L I S A T o e x a m i n e w h e t h e r A P C a n d p r o t e i n C h a v e d i f f e r e n t a f f i n i t i e s t o w a r d s B 2 G P I , a n a n t i - p r o t e i n C E L I S A w a s u s e d b e c a u s e o f t h e r e l a t i v e l y l o w c o e f f i c i e n t o f v a r i a n c e o f t h e E L I S A s e t u p . A P C w a s f o u n d t o b i n d B 2 G P I s i g n i f i c a n t l y m o r e s t r o n g l y t h a n i t s z y m o g e n c o u n t e r p a r t , p r o t e i n C ( P < 0.001, t w o w a y A N O V A ) ( F i g u r e 12). A n t i - p r o t e i n C a n t i b o d i e s w e r e u s e d t o d e t e c t t h e a m o u n t o f A P C a n d p r o t e i n C b o u n d t o B 2 G P I -c o a t e d p l a t e i n t h i s e x p e r i m e n t . T o e n s u r e t h a t t h e d i f f e r e n c e o b s e r v e d w a s n o t d u e t o t h e d i f f e r e n c e i n a n t i b o d y s p e c i f i c i t y f o r A P C a n d p r o t e i n C , t h e s p e c i f i c i t y o f a n t i - p r o t e i n C 7 0 T a b l e 2. E q u i l i b r i u m D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t D e t e r m i n a t i o n s f o r A P C , P r o t e i n C , a n d P r o t e i n S B i n d i n g t o 132GPI. K d ( M ) N / n ( m o l o f p r o t e i n / m o l o f 6 2 G P I ) A P C 8.72 ± 1.64 x 10" 7 1.5 ± 0 . 2 P r o t e i n C 7.77 ± 2.76 x 10" 7 1 . 7 1 0 . 4 P r o t e i n S 7.35 ± 1.66 x 10" 7 2.9 ± 0.4 71 F i g u r e 12. A P C a n d P r o t e i n C B i n d i n g t o I32GPI. M i c r o t i t r e w e l l s c o a t e d w i t h I 3 2 G P I w e r e i n c u b a t e d w i t h A P C ( c l o s e d c i r c l e s ) o r p r o t e i n C ( o p e n c i r c l e s ) w i t h 2.5 m M C a C b . D a t a p o i n t s a r e t h e m e a n ± 1 S D o f t h r e e s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s o f t h e s a m e s a m p l e . T h e d a t a a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . T h e O D 4 5 0 r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f A P C o r p r o t e i n C b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e OD450 o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n A P C o r p r o t e i n C , r e s p e c t i v e l y . M o s t e r r o r b a r s a r e s m a l l e r t h a n t h e s y m b o l s . 1 1 [Protein] (ug/mL) 7 2 f o r A P C o r p r o t e i n C w a s d e t e r m i n e d . U s i n g a c o m p e t i t i v e E L I S A , f l u i d p h a s e A P C a n d p r o t e i n C w a s s h o w n t o i n h i b i t a n t i - p r o t e i n C b i n d i n g t o E L I S A p l a t e - b o u n d A P C b y t h e s a m e a m o u n t . T h i s i n d i c a t e s t h e a n t i - p r o t e i n C h a s t h e s a m e s p e c i f i c i t y f o r A P C a n d p r o t e i n C. S i m i l a r r e s u l t s w e r e o b t a i n e d u s i n g a p r o t e i n C - c o a t e d E L I S A p l a t e ( F i g u r e 13). T h e r e f o r e , t h e d i f f e r e n c e i n A P C a n d p r o t e i n C b i n d i n g t o B 2 G P I w a s d u e to the d i f f e r e n c e i n d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s a n d n o t d u e t o t h e d i f f e r e n c e i n t h e s p e c i f i c i t y o f a n t i -p r o t e i n C f o r t h e d i f f e r e n t p r o t e i n s . 3.8 Summary I n s u m m a r y , B 2 G P I i n t e r a c t e d w i t h A P C a n d p r o t e i n S. B 2 G P I p o t e n t i a t e d A P C s p e c i f i c a c t i v i t y o n t h e a m i n o p h o s p h o l i p i d s P E a n d P S , b u t n o t P C . T h i s e n h a n c e m e n t o f A P C s p e c i f i c a c t i v i t y i n d i c a t e d t h a t t h e r e c o u l d b e a d i r e c t i n t e r a c t i o n b e t w e e n B 2 G P I a n d A P C . T h i s d i r e c t i n t e r a c t i o n w a s i n d e p e n d e n t o f a m i n o p h o s p h o l i p i d as A P C c o u l d b i n d d i r e c t l y t o B 2 G P I a d s o r b e d t o o x i d i z e d E L I S A p l a t e . A l s o , A P C b i n d i n g t o o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I w a s n o t i n h i b i t e d b y f l u i d p h a s e B 2 G P I . T h i s s u g g e s t e d t h a t o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I e x p r e s s e d a c o n f o r m a t i o n d i f f e r e n t f r o m t h e f l u i d p h a s e B 2 G P I t o s u p p o r t A P C b i n d i n g . P r o t e i n S c o u l d i n h i b i t A P C b i n d i n g t o B 2 G P I a d s o r b e d to a n o x i d i z e d s u r f a c e . T h e r e f o r e , p r o t e i n S m a y b e i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f t h e p o t e n t i a t i o n o f A P C s p e c i f i c a c t i v i t y b y B 2 G P I o n a m i n o p h o s p h o l i p i d s . 7 3 F i g u r e 13. C o m p e t i t i v e E L I S A F o r D e t e r m i n i n g A n t i - P r o t e i n C A n t i b o d i e s S p e c i f i c i t i e s F o r A P C a n d P r o t e i n C. Z e r o t o 5 0 p g / m L o f A P C ( c l o s e d c i r c l e s ) o r p r o t e i n C ( o p e n c i r c l e s ) w i t h g o a t - a n t i -p r o t e i n C a n t i b o d i e s ( 1 / 1 0 0 0 d i l u t i o n ) w e r e i n c u b a t e d i n m i c r o t i t r e p l a t e s w e r e c o a t e d w i t h : ( A ) A P C a n d ( B ) p r o t e i n C . T h e a m o u n t o f a n t i - p r o t e i n C b i n d i n g t o A P C - o r p r o t e i n C - c o a t e d p l a t e w a s m e a s u r e d . T h e d a t a a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . A B 0 H 1 1 1 0 20 40 60 [Protein] (ng/ml_) 7 4 C H A P T E R 4 B2GPI INTERACTIONS W I T H C4BP AND PROTETN S B 2 G P I c a n d o w n - r e g u l a t e p r o t e i n S - C 4 B P c o m p l e x f o r m a t i o n ( M e r r i l l et al, 1999; A t s u m i et al, 1997). T h e m e c h a n i s m o f t h i s t r i - m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n w a s f u r t h e r c h a r a c t e r i z e d a n d c o n f i r m e d h e r e b y i n v e s t i g a t i n g t h e i n t e r a c t i o n s o f t h e p r o t e i n S - C 4 B P s y s t e m w i t h B 2 G P I b o u n d t o o x i d i z e d s u r f a c e o r S e p h a r o s e b e a d s i n b o t h a p u r i f i e d p r o t e i n s y s t e m a n d i n p l a s m a . 4.1 Analysis of C4BP and B2GPI Interaction in the Presence of Protein S C 4 B P i n t e r a c t e d d i r e c t l y w i t h B 2 G P I b o u n d t o o x i d i z e d E L I S A p l a t e b u t n o t w i t h c o n t r o l w e l l s c o a t e d w i t h 5 % m i l k . I n t e r a c t i o n o f C 4 B P w i t h B 2 G P I w a s c a l c i u m -d e p e n d e n t as i n c l u s i o n o f 10 m M E D T A i n t h e i n c u b a t i o n r e a c t i o n p a r t i a l l y i n h i b i t e d C 4 B P b i n d i n g t o B 2 G P I ( p < 0.001, t w o w a y A N O V A ) ( F i g u r e 1 4 A ) . T h e p r e s e n c e o f 5 0 p g / m L ( 9 3 0 n M ) f l u i d p h a s e B 2 G P I d i d n o t i n h i b i t C 4 B P ( 0 t o 10 p g / m L , 0 t o 17 n M ) b i n d i n g t o B 2 G P I a d s o r b e d t o o x i d i z e d E L I S A p l a t e ( F i g u r e 1 4 B ) . T h i s s u g g e s t s t h a t f l u i d p h a s e B 2 G P I d o e s n o t i n t e r a c t w i t h C 4 B P a n d f l u i d p h a s e B 2 G P I e x h i b i t s a c o n f o r m a t i o n d i f f e r e n t f r o m E L I S A p l a t e - b o u n d B 2 G P I . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e c o n f o r m a t i o n a l a l t e r a t i o n B 2 G P I u n d e r g o e s w h e n b o u n d to a n o x i d i z e d s u r f a c e i s i m p o r t a n t f o r C 4 B P b i n d i n g . S i m i l a r t o t h e b i n d i n g o f p r o t e i n S t o C 4 B P , t h e b i n d i n g o f B 2 G P I t o C 4 B P w a s a l s o m e d i a t e d t h r o u g h t h e B - c h a i n as t h e r e w a s s i g n i f i c a n t l y l e s s b i n d i n g o f C 4 B P . B t o B 2 G P I w h e n i n c u b a t e d t o g e t h e r ( p < 0.001, t w o w a y A N O V A ) 75 F i g u r e 14. I n t e r a c t i o n B e t w e e n B 2 G P I a n d C 4 B P . ( A ) I n t e r a c t i o n b e t w e e n B 2 G P I a n d C 4 B P i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m . M i c r o t i t r e w e l l s c o a t e d w i t h B 2 G P I w e r e i n c u b a t e d w i t h C 4 B P w i t h 2.5 m M C a C l 2 ( c l o s e d c i r c l e s ) o r 10 m M E D T A ( o p e n c i r c l e s ) . D a t a p o i n t s a r e t h e m e a n s ± 1 S D o f t h r e e s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s o f t h e s a m e s a m p l e . T h e d a t a a r e r e p r e s e n t a t i v e o f >3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . T h e OD450 r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f C 4 B P b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e OD450 o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n C 4 B P . ( B ) F l u i d P h a s e B 2 G P I D i d N o t A f f e c t C 4 B P B i n d i n g t o O x i d i z e d E L I S A P l a t e - B o u n d B 2 G P I . M i c r o t i t r e w e l l s c o a t e d w i t h B 2 G P I w e r e i n c u b a t e d w i t h 0 t o 10 p g / m L ( 0 t o 17 n M ) C 4 B P w i t h ( c l o s e d c i r c l e s ) o r w i t h o u t 5 0 p g / m L ( 9 3 0 n M ) B 2 G P I ( o p e n c i r c l e s ) . D a t a p o i n t s a r e t h e m e a n s ± 1 S D o f t h r e e s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s o f t h e s a m e s a m p l e . T h e d a t a a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . T h e O D 4 5 o r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f C 4 B P b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e OD450 o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n C 4 B P . 7 6 0.25 -i 5 10 C4BP ^g/mL) 0 5 10 [C4BP] (ug/mL) 7 7 ( F i g u r e 15). T h e r e f o r e , B 2 G P I m a y p l a y a r o l e i n p r e v e n t i n g p r o t e i n S f r o m b i n d i n g C 4 B P b y c o m p e t i n g f o r t h e B - c h a i n . S i n c e b o t h C 4 B P a n d p r o t e i n S w e r e f o u n d t o b i n d t o B 2 G P I , C 4 B P a n d p r o t e i n S w e r e c o - i n c u b a t e d i n B 2 G P I - c o a t e d w e l l s t o e x a m i n e w h e t h e r t h e s e t w o p r o t e i n s w e r e b o u n d t o t h e s a m e b i n d i n g s i t e o r d i f f e r e n t b i n d i n g s i t e s o n B 2 G P I . C 4 B P ( 2 0 0 p g / m L , 3 4 0 n M ) w a s a b l e t o i n h i b i t p r o t e i n S ( 0 t o 10 p g / m L , 0 t o 145 n M ) b i n d i n g t o B 2 G P I ( p < 0.001, t w o w a y A N O V A ) ( F i g u r e 1 6 A ) . I n t e r e s t i n g l y , C 4 B P ( 0 t o 10 p g / m L , 0 t o 17 n M ) b i n d i n g t o B 2 G P I w a s n o t i n h i b i t e d b y p r o t e i n S ( 2 0 p g / m L , 2 9 0 n M ) ; t h e r e f o r e , t w o d i f f e r e n t b i n d i n g s i t e s a r e l i k e l y t o b e p r e s e n t ( F i g u r e 1 6 B ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h e p o s s i b i l i t y t h a t t h e b i n d i n g o f C 4 B P t o t h e C 4 B P - b i n d i n g s i t e o f B 2 G P I a l t e r e d t h e p r o t e i n S - b i n d i n g s i t e o n B 2 G P I a n d t h e r e b y i n h i b i t e d p r o t e i n S b i n d i n g . H o w e v e r , t h i s p r o t e i n S i n h i b i t i o n c o u l d a l s o b e d u e t o p r o t e i n S - C 4 B P c o m p l e x f o r m a t i o n d u r i n g i n c u b a t i o n . T o e x a m i n e w h e t h e r t h i s i n h i b i t i o n o f p r o t e i n S b i n d i n g w a s s o l e l y d u e t o C 4 B P b i n d i n g t o B 2 G P I , B 2 G P I - c o a t e d w e l l s w e r e p r e - i n c u b a t e d w i t h C 4 B P , w a s h e d a n d t h e n i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n S. T h i s e x p e r i m e n t w a s p e r f o r m e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e B 2 G P I - C 4 B P c o m p l e x c o u l d h a v e t h e e x a c t s a m e i n h i b i t o r y e f f e c t o n p r o t e i n S b i n d i n g . T h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t B 2 G P I b o u n d - C 4 B P p a r t i a l l y i n h i b i t e d p r o t e i n S b i n d i n g t o t h e B 2 G P I - C 4 B P c o m p l e x ( p < 0.001, t w o w a y A N O V A ) ( F i g u r e 1 6 A ) . T h i s s u g g e s t s t h a t B 2 G P I b o u n d - C 4 B P as w e l l as C 4 B P - p r o t i e n S c o m p l e x f o r m a t i o n b o t h p l a y a r o l e i n i n h i b i t i n g p r o t e i n S b i n d i n g t o B 2 G P I . T h e r e f o r e , o x i d i z e d s u r f a c e b o u n d - B 2 G P I 1) p r e v e n t e d p r o t e i n S f r o m b i n d i n g t o C 4 B P b y c o m p e t i n g f o r t h e B - c h a i n o n C 4 B P , a n d 2) i n t e r a c t e d d i r e c t l y w i t h p r o t e i n S w h e n n o t o c c u p i e d b y C 4 B P . 7 8 F i g u r e 15. I n t e r a c t i o n B e t w e e n B 2 G P I a n d C 4 B P i s d e p e n d e n t o n t h e B - s u b u n i t o f C 4 B P M i c r o t i t r e w e l l s c o a t e d w i t h B 2 G P I w e r e i n c u b a t e d w i t h C 4 B P ( c l o s e d c i r c l e s ) , C 4 B P . B ( o p e n c i r c l e s ) w i t h 2.5 m M C a C ^ . W e l l s c o a t e d w i t h b l o c k i n g s o l u t i o n o n l y ( c r o s s e s ) c o n t r o l l e d f o r n o n - s p e c i f i c b i n d i n g . D a t a p o i n t s a r e t h e m e a n s ± 1 S D o f t h r e e s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s o f t h e s a m e s a m p l e . T h e OD450 r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f C 4 B P o r C 4 B P . B b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e O D 4 5 0 o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n C 4 B P o r C 4 B P . Q , r e s p e c t i v e l y . 0 . 3 1 0 . 2 5 4 0 . 2 H * p < 0.001 o m Q 0 . 1 5 -O 0 . 1 -0 . 0 5 H 0 0 5 1 0 [C4BP] (Ug/mL) 7 9 F i g u r e 16. I n h i b i t i o n o f P r o t e i n S B i n d i n g t o B 2 G P I b y C 4 B P . M i c r o t i t r e w e l l s c o a t e d w i t h B 2 G P I w e r e i n c u b a t e d w i t h : ( A ) 0 t o 10 p g / m L ( 0 to 145 n M ) p r o t e i n S w i t h ( o p e n c i r c l e s ) o r w i t h o u t 2 0 0 p g / m L ( 3 4 0 n M ) C 4 B P ( c l o s e d c i r c l e s ) o r i n c u b a t e d w i t h 2 0 0 p g / m L ( 3 4 0 n M ) C 4 B P f o r 2 h r p r i o r t o p r o t e i n S a d d i t i o n ( c r o s s e s ) . D a t a p o i n t s a r e t h e m e a n + 1 S D o f t h r e e s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s o f t h e s a m e s a m p l e . D a t a a r e r e p r e s e n t a t i v e o f >3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . T h e OD450 r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f p r o t e i n S b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e OD450 o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n p r o t e i n S. T h e e r r o r b a r s a r e s m a l l e r t h a n t h e s y m b o l s . ( B ) 0 t o 10 p g / m L (0 t o 17 n M ) C 4 B P w i t h ( o p e n c i r c l e s ) o r w i t h o u t 2 0 p g / m L ( 2 9 0 n M ) p r o t e i n S ( c l o s e d c i r c l e s ) . D a t a a r e r e p r e s e n t a t i v e o f >3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . T h e OD450 r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f C 4 B P b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e OD450 o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n C 4 B P . 8 0 81 4.2 Equilibrium Binding Constants F r o m t i m e c o u r s e s t u d i e s , t h e b i n d i n g o f C 4 B P to B 2 G P I r e a c h e s e q u i l i b r i u m a f t e r 6 0 m i n u t e s at 3 7 ° C ( A p p e n d i x F i g u r e 6). T h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f C 4 B P b i n d i n g t o E L I S A - p l a t e i m m o b i l i z e d B 2 G P I a f t e r i n c u b a t i n g f o r 4 h o u r s at 3 7 ° C w a s 3.46 ± 0.74 x 1 0 " 7 M a n d a C 4 B P / B 2 G P I m o l a r r a t i o o f 1.0 ± 0.1. B i n d i n g a s s a y s w i t h o n l y l a b e l e d C 4 B P o r m i x t u r e s o f l a b e l e d a n d u n l a b e l e d C 4 B P o f d i f f e r e n t r a t i o s a l s o g a v e c o m p a r a b l e b i n d i n g c o n s t a n t s ( A p p e n d i x F i g u r e 8). 4.3 Effects of B2GPI-Depletion From Plasma Using Anti-B2GPI-Sepharose Beads on Functional Protein S Levels It h a d b e e n s h o w n p r e v i o u s l y b y o u r r e s e a r c h g r o u p t h a t d e p l e t i o n o f p l a s m a B 2 G P I u s i n g a n t i - B 2 G P I c o u p l e d t o S e p h a r o s e b e a d s c o u l d d e c r e a s e t h e i m m u n o l o g i c a l f r e e p r o t e i n S l e v e l ( M a r j a n , 1 9 9 4 ) . T h i s o c c u r r e d t h r o u g h t h e d i r e c t b i n d i n g o f p l a s m a p r o t e i n S t o a n t i b o d y - b o u n d B 2 G P I . A s a r e s u l t , o n l y 6 5 % o f i m m u n o l o g i c a l f r e e p r o t e i n S r e m a i n e d c o m p a r e d to c o n t r o l p l a s m a t r e a t e d w i t h n o n - i m m u n o g e n i c r a b b i t I g G - S e p h a r o s e . I n t h i s e x p e r i m e n t , t h e e f f e c t o f B 2 G P I d e p l e t i o n b y a n t i - B 2 G P I S e p h a r o s e o n p l a s m a p r o t e i n S f u n c t i o n a l a c t i v i t y l e v e l (i.e. c l o t t i n g t i m e m e a s u r e m e n t ) w a s e x a m i n e d . F u n c t i o n a l p r o t e i n S a s s a y s o n a n t i - B 2 G P I - S e p h a r o s e t r e a t e d p l a s m a d i d n o t s h o w a n y s i g n i f i c a n t c h a n g e s i n p r o t e i n S a c t i v i t y c o m p a r e d t o c o n t r o l ( F i g u r e 17). T h e s e r e s u l t s w e r e i n c o n t r a s t t o t h e i m m u n o l o g i c f r e e p r o t e i n S m e a s u r e m e n t s . T h i s s u g g e s t e d t h a t t h e d e p l e t i o n o f B 2 G P I w o u l d l e a d t o l o w e r i m m u n o l o g i c a l f r e e p r o t e i n S l e v e l s b u t u n a l t e r e d f u n c t i o n a l p r o t e i n S a c t i v i t y . T h e u n d e r l y i n g r e a s o n f o r t h e s e 8 2 F i g u r e 17. F u n c t i o n a l p r o t e i n S l e v e l s i n B 2 G P I - d e p l e t e d p l a s m a . I n s i x s e p a r a t e e x p e r i m e n t s , p l a s m a w a s i n c u b a t e d w i t h a n t i - h u m a n - B 2 G P I - S e p h a r o s e ( b l a c k b a r s ) o r n o r m a l I g G - S e p h a r o s e ( w h i t e b a r s ) t h e n t e s t e d f o r f u n c t i o n a l p r o t e i n S a c t i v i t y . E a c h s a m p l e w a s a s s a y e d i n d u p l i c a t e ; t h e m e a n v a l u e i s r e p o r t e d . 100 i Experiment Experiment Experiment Experiment Experiment Experiment 1 2 3 4 5 6 83 s e e m i n g l y o p p o s i t e o b s e r v a t i o n s m a y b e d u e t o a s e n s i t i v i t y o f f r e e p r o t e i n S a c t i v i t y to c h a n g e s i n 132GPI c o n c e n t r a t i o n . T h e d e p l e t i o n o f B 2 G P I m a y a c t u a l l y a l l o w the r e s i d u a l p r o t e i n S t o b i n d a n i o n i c p h o s p h o l i p i d s i n t h e f u n c t i o n a l a s s a y m o r e e f f i c i e n t l y b e c a u s e o f t h e l a c k o f c o m p e t i t i o n w i t h B 2 G P I . A s a r e s u l t o f t h e m o r e e f f i c i e n t b i n d i n g , p r o t e i n S m a y e x h i b i t a n o r m a l a c t i v i t y l e v e l e v e n t h o u g h t h e a c t u a l a m o u n t o f p r o t e i n S i s d e c r e a s e d . 4.4 Effects of Sepharose-coupled B 2 G P I on Functional Protein S Level T h e B 2 G P I - d e p l e t i o n s t u d i e s d e s c r i b e d a b o v e s u g g e s t e d t h a t B 2 G P I m i g h t m o d u l a t e p r o t e i n S a c t i v i t y i n p l a s m a a n d t h a t t h e r e m o v a l o f B 2 G P I c a n a f f e c t p r o t e i n S a c t i v i t y . T o e x a m i n e t h e s p e c i f i c e f f e c t o f B 2 G P I o n p r o t e i n S a c t i v i t y w i t h o u t d i s t u r b i n g t h e B 2 G P I l e v e l , p l a s m a w a s i n c u b a t e d w i t h B 2 G P I - S e p h a r o s e . A f t e r t h e i n c u b a t i o n , B 2 G P I -S e p h a r o s e w a s r e m o v e d a n d t h e p r o t e i n S a c t i v i t y i n p l a s m a w a s m e a s u r e d . T h i s p r o c e d u r e a l l o w e d i n t e r a c t i o n o f p l a s m a p r o t e i n S w i t h e x o g e n o u s B 2 G P I w i t h o u t a f f e c t i n g t h e final c o n c e n t r a t i o n o f B 2 G P I . T h i s e x p e r i m e n t w a s r e p e a t e d s i x t i m e s i n d u p l i c a t e ( F i g u r e 18). T h e p r o t e i n S a c t i v i t y i n s a m p l e s i n c u b a t e d w i t h B 2 G P I - S e p h a r o s e w a s s i g n i f i c a n t l y l o w e r t h a n t h a t o f n o r m a l I g G - S e p h a r o s e t r e a t e d s a m p l e s ( p < 0.05 b y p a i r e d t-test). 4.5 Summary B 2 G P I i n t e r a c t e d w i t h p r o t e i n S a n d C 4 B P . A n a l y s e s o f t h e i n t e r a c t i o n s a m o n g B 2 G P I , p r o t e i n S, a n d C 4 B P s h o w e d t h a t o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I 1 ) p r e v e n t e d p r o t e i n S f r o m b i n d i n g t o C 4 B P b y c o m p e t i n g f o r t h e B - c h a i n , a n d 2) i n t e r a c t e d d i r e c t l y 8 4 F i g u r e 18. F u n c t i o n a l p r o t e i n S l e v e l s i n p l a s m a t r e a t e d w i t h B 2 G P I - S e p h a r o s e . P l a s m a w a s i n c u b a t e d w i t h B 2 G P I - S e p h a r o s e ( b l a c k b a r s ) , o r n o r m a l I g G - S e p h a r o s e ( w h i t e b a r s ) t h e n f u n c t i o n a l p r o t e i n S a c t i v i t y w a s m e a s u r e d . V a l u e s f r o m s i x s e p a r a t e e x p e r i m e n t s a r e s h o w n . E a c h s a m p l e w a s a s s a y e d i n d u p l i c a t e ; m e a n v a l u e s a r e s h o w n . 100 i Experiment Experiment Experiment Experiment Experiment Experiment 1 2 3 4 5 6 8 5 w i t h p r o t e i n S w h e n B 2 G P I w a s n o t o c c u p i e d b y C 4 B P . T h u s , B 2 G P I m a y h a v e a r o l e i n m a i n t a i n i n g f r e e p r o t e i n S l e v e l . 8 6 C H A P T E R 5 E F F E C T S O F A P L ON B2GPI INTERACTIONS W I T H A P C . PROTEIN S. AND C4BP 5.1 Characteristics and Specificities of IgG Pools P l a s m a s a m p l e s f r o m 10 p a t i e n t s p o s i t i v e f o r a P L I g G ( a P L ) a n d w i t h a h i s t o r y o f t h r o m b o s e s w e r e p o o l e d . T h e c h a r a c t e r i s t i c s o f e a c h p l a s m a s a m p l e a r e s u m m a r i z e d i n T a b l e 3. T h e l e v e l s o f b o t h a n t i c a r d i o l i p i n a n d a n t i - B 2 G P I a n t i b o d i e s w e r e m e a s u r e d . A n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s w e r e d e t e c t e d b y c a r d i o l i p i n - c o a t e d E L I S A p l a t e . T h i s E L I S A d e t e c t s a n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r B 2 G P I as w e l l as o t h e r p h o s p h o l i p i d - b i n d i n g s e r u m p r o t e i n s b e c a u s e o f t h e u s e o f f e t a l c a l f s e r u m as s a m p l e d i l u e n t . A n t i - B 2 G P I a n t i b o d i e s w e r e d e t e c t e d b y B 2 G P I - c o a t e d o x i d i z e d E L I S A p l a t e . I n c o n t r a s t t o t h e a n t i c a r d i o l i p i n E L I S A , t h i s E L I S A d e t e c t s o n l y a n t i b o d i e s s p e c i f i c f o r B 2 G P I . A n t i b o d i e s d e t e c t e d i n p a t i e n t s w i t h A P S i n t e r a c t w i t h a v a r i e t y o f p h o s p h o l i p i d - b i n d i n g p r o t e i n s ( R o u b e y , 1 9 9 4 ) ; h o w e v e r , B 2 G P I i s t h e d o m i n a n t a n t i g e n o f a P L . W h e n t h e a P L I g G p o o l u s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s w a s t e s t e d f o r its a b i l i t y t o b i n d t o B 2 G P I , A P C , p r o t e i n S o r C 4 B P , o n l y w e l l s c o a t e d w i t h B 2 G P I s h o w e d i n c r e a s e d b i n d i n g o f a P L r e l a t i v e t o N H I g G ( F i g u r e 19). S p e c i f i c x e n o g e n e i c a n t i s e r a r e a d i l y d e t e c t e d t h e p r e s e n c e o f t h e p a r t i c u l a r p r o t e i n u s e d t o c o a t t h e w e l l ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e r e f o r e , t h e l a c k o f r e a c t i v i t y o f a P L w i t h p r o t e i n s o t h e r t h a n B 2 G P I w a s n o t d u e t o f a i l u r e t o c o a t t h e m i c r o t i t r e w e l l s . 87 T a b l e 3. C h a r a c t e r i s t i c s o f a P L I g G P o o l . Anti-Cardiolipin Anti-fi2GPI Patient EL SA EL SA Plasma IgG IgM IgG IgM (GPU) (MPU) (SGU) (SMU) A > 150.0 > 150.0 112.4 > 150.0 B > 150.0 5.5 > 150.0 14.4 C > 150.0 > 150 > 150.0 135.5 D 109.8 > 150.0 136.4 141.1 E > 150.0 10.9 > 150.0 89.2 F > 150.0 28.6 > 150.0 > 150.0 G > 150.0 4.3 > 150.0 2.7 H > 150.0 3.6 > 150.0 3.2 1 > 150.0 2.2 > 150.0 48.7 J 113.4 19.5 91.6 31.2 G P U I g G P h o s p h o l i p i d U n i t M P U I g M P h o s p h o l i p i d U n i t S G U S t a n d a r d I g G a n t i - B 2 G P I U n i t S M U S t a n d a r d I g M a n t i - B 2 G P I U n i t 88 F i g u r e 19. S p e c i f i c i t y o f t h e a P L p o o l f o r B 2 G P I . M i c r o t i t r e p l a t e s c o a t e d w i t h 10 p g / m L o f B 2 G P I , A P C , p r o t e i n S, o r C 4 B P w e r e i n c u b a t e d w i t h a P L I g G ( c l o s e d ) o r N H I g G ( o p e n ) a n d b i n d i n g m e a s u r e d as d e s c r i b e d i n M e t h o d s . V a l u e s r e p r e s e n t s p e c i f i c I g G b i n d i n g ( b u f f e r / s e c o n d a r y a n t i b o d y b i n d i n g c o n t r o l s s u b t r a c t e d ) a n d a r e m e a n s ± 1 S D o f t h r e e s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s o f t h e s a m e s a m p l e . T h e d a t a s h o w n a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . cn 1.2 - i R2GPI-coated APC-coated Protein S- C4bp-coated wells wells coated wells wells 8 9 5.2 Inhibition of A P C , Protein S, and C4BP Binding to B2GPI by aPL IgG pool S t u d i e s h a v e s h o w n t h a t a P L r e a c t d i r e c t l y w i t h n e o - e p i t o p e ( s ) e x p r e s s e d o n (32 G P I w h e n B 2 G P I i s b o u n d t o o x i d i z e d E L I S A p l a t e s . W h e t h e r t h i s a P L b i n d i n g w o u l d i n h i b i t t h e b i n d i n g o f A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P t o E L I S A p l a t e - b o u n d B 2 G P I w a s i n v e s t i g a t e d . A n t i p h o s p h o l i p i d I g G p o o l ( a P L I g G ) , b u t n o t n o r m a l h u m a n I g G ( N H I g G ) , i n h i b i t e d t h e i n t e r a c t i o n o f b o u n d B 2 G P I w i t h f l u i d p h a s e A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P ( p < 0.001, t w o w a y A N O V A ) ( F i g u r e 2 0 ) . T h i s i n h i b i t i o n i n c r e a s e d w i t h t h e a m o u n t o f a P L i n a d o s e - d e p e n d e n t m a n n e r ( p < 0.001, t w o w a y A N O V A ) ( F i g u r e 2 1 ) . 5.3 Effects of aPL on A P C Activity as Measured by Chromogenic Substrate S-2366 I n t h i s e x p e r i m e n t , t h e e f f e c t o f a P L I g G o n B 2 G P I p o t e n t i a t i o n o f A P C a c t i v i t y o n a P S s u r f a c e w a s e v a l u a t e d . T h e a c t i v i t y o f P S - b o u n d A P C w a s q u a n t i f i e d b y m e a s u r i n g t h e h y d r o l y s i s o f S - 2 3 6 6 , a c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e o f A P C . A s s h o w n i n F i g u r e 2 2 A , w h e n A P C w a s c o - i n c u b a t e d w i t h B 2 G P I a n d N H I g G , t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f P S - b o u n d A P C w a s 4 8 O D W p g . I n c o n t r a s t , t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f P S - b o u n d A P C i n c u b a t e d w i t h B 2 G P I a n d a P L I g G w a s 7 6 O D W p g . T h e r e f o r e , t h e p r e s e n c e o f a P L i n c r e a s e d A P C s p e c i f i c a c t i v i t y b y 5 8 % (p <0.001, t w o w a y A N O V A ) . T h e e f f e c t o f p r o t e i n S o n A P C s p e c i f i c a c t i v i t y u n d e r t h e s a m e i n c u b a t i o n c o n d i t i o n s w a s a l s o e x a m i n e d . P S - b o u n d A P C h a d a s p e c i f i c a c t i v i t y o f 4 4 O D W p g w h e n c o - i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n S, B 2 G P I a n d N H I g G , w h e r e a s t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f P S - b o u n d A P C 9 0 F i g u r e 20. I n h i b i t i o n o f A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P b i n d i n g t o B 2 G P I b y a P L . M i c r o t i t r e p l a t e s c o a t e d w i t h B 2 G P I ( 1 0 p g / m L ) w e r e i n c u b a t e d w i t h 0 t o 10 p g / m L o f A P C ( t o p p a n e l ) , p r o t e i n S ( m i d d l e p a n e l ) , o r C 4 B P ( b o t t o m p a n e l ) i n t h e p r e s e n c e o f 0.5 m g / m L o f a P L p o o l ( c l o s e d c i r c l e s ) o r N H I g G p o o l ( o p e n c i r c l e s ) . D a t a p o i n t s a r e t h e m e a n s ± 1 S D o f f o u r s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s o f the s a m e s a m p l e s . T h e d a t a s h o w n a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . T h e OD450 r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f A P C , p r o t e i n S, o r C 4 B P b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e OD450 o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n A P C , p r o t e i n S o r C 4 B P , r e s p e c t i v e l y . 0 5 10 APC (ug/mL) F i g u r e 2 1 . I n h i b i t i o n o f A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P b i n d i n g t o B 2 G P I b y a P L . M i c r o t i t e r p l a t e s c o a t e d w i t h B 2 G P I ( 1 0 p g / m L ) w e r e i n c u b a t e d w i t h 5 p g / m L o f A P C ( t o p p a n e l ) , p r o t e i n S ( m i d d l e p a n e l ) o r C 4 B P ( b o t t o m p a n e l ) i n t h e p r e s e n c e o f 0 t o 1 m g / m L o f a P L ( c l o s e d c i r c l e s ) a n d N H I g G ( o p e n c i r c l e s ) . D a t a p o i n t s a r e m e a n s ± 1 S D o f f o u r s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s o f t h e s a m e s a m p l e . T h e d a t a s h o w n a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . T h e O D 4 5 o r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f A P C , p r o t e i n S, o r C 4 B P b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e O D 4 5 0 o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n A P C , p r o t e i n S o r C 4 B P , r e s p e c t i v e l y . 0 H 1 r 0 0.5 1 [IgG] (mg/mL) 0.15 1 0 0.5 1 [IgG] (mg/mL) 9 2 F i g u r e 22. A c t i v i t y P S - B o u n d A P C i n t h e P r e s e n c e o f a P L B 2 G P I a n d P r o t e i n S. P S - c o a t e d w e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h 1) 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d A P C (2 p g / m L , 3 2 n M ) + B 2 G P I ( 1 0 0 u g / m L , 185 n M ) + N H I g G (1 m g / m L , 6.7 p M ) , 2) A P C (2 p g / m L , 3 2 n M ) + B 2 G P I ( 1 0 0 u g / m L , 185 n M ) + a P L (1 m g / m L , 6.7 u M ) , 3) A P C (2 p g / m L , 3 2 n M ) + B 2 G P I ( 1 0 0 u g / m L , 185 n M ) + p r o t e i n S ( 1 0 p g / m L , 145 n M ) + N H I g G (1 mg/mL, 6.7 p M ) , o r 4) A P C (2 p g / m L , 3 2 n M ) + B 2 G P I ( 1 0 0 p g / m L , 185 n M ) + p r o t e i n S ( 1 0 p g / m L , 6.7 p M ) + a P L (1 m g / m L , 6.7 p M ) . ( A ) T h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f A P C b o u n d t o P S - w e l l s w a s o b t a i n e d f r o m t h e t o t a l a c t i v i t y g e n e r a t e d b y t h e P S - b o u n d A P C . ( B ) T h e t o t a l a c t i v i t y w a s q u a n t i f i e d b y m e a s u r i n g t h e h y d r o l y s i s o f c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e S-2 3 6 6 (1 m M ) a f t e r 6 0 m i n u t e s o f i n c u b a t i o n at R T w i t h P S - b o u n d A P C . ( C ) T h e a m o u n t o f A P C b o u n d t o P S - c o a t e d s u r f a c e m e a s u r e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g . D a t a p o i n t s a r e m e a n ± 1 S D o f f i v e s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s . D a t a a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . 9 3 B > < o o CD Q. CO Q CD >, > -4—" O < O CL < o 100 3 o 80 CQ O CL 60 < 40 o 20 a o 0 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 CD c T3 C ZD o CQ o a. < 12 10 8 6 4 2 0 p < 0.001 p < 0.001 P S W e l l s + A P C + 8 2 G P I + N H I g G P S W e l l s + A P C + B 2 G P I + a P L p < 0.001 P S W e l l s + A P C + B 2 G P I + N H l g G P S W el ls + A P C + I32G PI + a P L p < 0.001 P S W e l l s + A P C + I32GPI + N H I g G P S W e l l s + A P C + I32GPI + a P L P S W e l l s + A P C + I32GPI + P r o t e i n S + N H I g G P S W e l l s + A P C + I32GPI + P r o t e i n S + a P L p < 0.001 P S W e l l s + A P C + I32G PI + P r o t e i n S + N H I g G p < 0.001 P S W e l l s + A P C + I32GPI + P r o t e i n S + N H l g G P S W e l l s + A P C + I32GPI + P r o t e i n S + a P L 94 i n c u b a t e d w i t h p r o t e i n S, B 2 G P I a n d a P L I g G w a s 6 8 OD4os/pg, a 5 5 % i n c r e a s e ( p <0.001, t w o w a y A N O V A ) . T h e r e f o r e , t h e a d d i t i o n o f p r o t e i n S a f f e c t e d n e i t h e r t h e A P C s p e c i f i c a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I a n d N H I g G o r a P L I g G s i g n i f i c a n t l y n o r th e a P L - p o t e n t i a t i o n o f A P C s p e c i f i c a c t i v i t y . H o w e v e r , t h i s a P L - m e d i a t e d i n c r e a s e i n A P C s p e c i f i c a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I d i d n o t l e a d i n t o a n i n c r e a s e i n t o t a l A P C a c t i v i t y . A s s h o w n i n F i g u r e 2 2 B , w h e n A P C , B 2 G P I , a n d N H I g G w e r e c o - i n c u b a t e d i n P S - c o a t e d w e l l s , t h e t o t a l a c t i v i t y g e n e r a t e d b y P S - b o u n d A P C w a s a n OD405 o f 0.390. T h e s a m e i n c u b a t i o n w i t h a P L h a d a n OD405 o f 0.344, a 13 % r e d u c t i o n ( p <0.001, t w o w a y A N O V A ) . T h i s i n h i b i t o r y e f f e c t w a s e v e n g r e a t e r f o r i n c u b a t i o n s c o n t a i n i n g p r o t e i n S. T h e c o - i n c u b a t i o n o f A P C B 2 G P I , p r o t e i n S a n d N H I g G h a d a t o t a l A P C a c t i v i t y o f 0.426 c o m p a r e d t o 0.316 o f i n c u b a t i o n w i t h a P L I g G , a 2 6 % d e c r e a s e ( p <0.001, t w o w a y A N O V A ) . T h i s d e c r e a s e i n t o t a l A P C a c t i v i t y w a s d i r e c t l y c o r r e l a t e d t o t h e d e c r e a s e i n A P C b i n d i n g t o p h o s p h o l i p i d s u r f a c e i n t h e p r e s e n c e o f a P L ( F i g u r e 2 2 C ) . 5.4 a P L I n c r e a s e s 0 2 G P I B i n d i n g t o P h o s p h o l i p i d S u r f a c e T o e x a m i n e t h e p o s s i b l e c a u s e s o f d e c r e a s e d A P C b i n d i n g t o P S i n t h e p r e s e n c e o f a P L , t h e b i n d i n g o f 1 2 5 I - B 2 G P I t o P S - c o a t e d E L I S A p l a t e i n t h e p r e s e n c e o f a P L a n d N H I g G w e r e e x a m i n e d . T h e b i n d i n g o f B 2 G P I t o P S s u r f a c e w a s s o m e w h a t e n h a n c e d b y a P L I g G ( p < 0.001, t w o w a y A N O V A ) ( F i g u r e 2 3 ) . T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t t h e d e c r e a s e o f A P C b i n d i n g t o P S p l a t e i n t h e p r e s e n c e o f a P L w a s at l e a s t i n p a r t d u e t o t h e i n c r e a s e d d e p o s i t i o n o f B 2 G P I t o P S . 95 F i g u r e 23. a P L I n c r e a s e s B 2 G P I B i n d i n g to P h o s p h o l i p i d S u r f a c e . P S - c o a t e d E L I S A p l a t e s w e r e i n c u b a t e d w i t h I - B 2 G P I ( 0 t o 10 p g / m L ) i n t h e p r e s e n c e o f 5 0 0 p g / m L a P L I g G ( c l o s e d c i r c l e s ) a n d N H I g G ( o p e n c i r c l e s ) . A f t e r t h e i n c u b a t i o n , w e l l s w e r e w a s h e d w i t h i c e - c o l d T B S - C a f o u r t i m e s . T h e a m o u n t s o f A P C b o u n d w e r e m e a s u r e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g . D a t a p o i n t s a r e m e a n ± 1 S E M o f t h r e e s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s . 2000 i cpm 1500 1000 H 500 4, 0 * p < 0.001 0 5 10 [125I-R2GPI] (pg/mL) 9 6 5.5 Binding of A P C , Protein S, and C4BP to Activated Platelets in the Presence of aPL and B2GPI A s d e s c r i b e d a b o v e , B 2 G P I i n t e r a c t e d w i t h A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P w h e n B 2 G P I w a s b o u n d to a n o x i d i z e d s u r f a c e . A l s o , m o d u l a t i o n o f p r o t e i n S - C 4 B P c o m p l e x f o r m a t i o n i n t h e f l u i d p h a s e b y B 2 G P I h a s b e e n d e m o n s t r a t e d ( M e r r i l l et al, 1 9 9 9 ) . S i n c e a P L I g G c o u l d i n h i b i t B 2 G P I i n t e r a c t i o n s w i t h A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P , t h e a b i l i t y o f a P L I g G t o i n t e r f e r e w i t h t h e b i n d i n g o f t h e s e p r o t e i n s t o t h e p h y s i o l o g i c a l l y r e l e v a n t s u r f a c e o f a c t i v a t e d p l a t e l e t s w a s e v a l u a t e d u s i n g f l o w c y t o m e t r y . W a s h e d p l a t e l e t s w e r e a c t i v a t e d w i t h c a l c i u m i o n o p h o r e , a n d t h e a c t i v a t i o n s t a t e o f p l a t e l e t s w a s f o l l o w e d b y m e a s u r i n g t h e e x p r e s s i o n o f p l a t e l e t a c t i v a t i o n m a r k e r C D 6 2 P . A P C ( 4 p g / m L , 6 4 n M ) , p r o t e i n S ( 2 0 p g / m L , 2 9 0 n M ) , a n d C 4 B P ( 2 5 0 p g / m L , 4 2 4 n M ) b i n d i n g t o p l a t e l e t s w e r e p l a t e l e t a c t i v a t i o n - d e p e n d e n t as r e s t i n g p l a t e l e t s d i d n o t s u p p o r t p r o t e i n b i n d i n g . T h e b i n d i n g o f A P C a n d p r o t e i n S to a c t i v a t e d w a s h e d p l a t e l e t s w a s n o t a f f e c t e d b y the a d d i t i o n o f a P L I g G (1 m g/mL, 6.6 p M ) c o m p a r e d to N H I g G (1 m g/mL, 6.6 p M ) . S i m i l a r l y , t h e b i n d i n g o f a m i x t u r e o f p r o t e i n S a n d C 4 B P t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s w a s a l s o n o t a f f e c t e d b y a P L I g G ( T a b l e 4 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t a P L I g G d o e s n o t i n t e r f e r e w i t h t h e b i n d i n g o f A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P t o t h e a c t i v a t e d p l a t e l e t s u r f a c e i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I . T h e r e s u l t s i n d i c a t e t h a t e v e n t h o u g h a P L I g G c o u l d i n t e r f e r e w i t h B 2 G P I i n t e r a c t i n g w i t h o t h e r p r o t e i n s o n a n o x i d i z e d s u r f a c e as w e l l as i n f l u i d p h a s e , t h e a c t i v a t e d p l a t e l e t i s n o t a s i g n i f i c a n t t a r g e t s u r f a c e w h e r e a P L I g G m a y e x e r t its t h r o m b o g e n i c e f f e c t . T h e s i g n a l s d e t e c t e d w e r e d u e t o s p e c i f i c b i n d i n g o f p r i m a r y a n d s e c o n d a r y a n t i b o d i e s t o p r o t e i n s b o u n d to a c t i v a t e d p l a t e l e t s as t h e d e t e c t i o n 9 7 o f p r o t e i n s b o u n d to a c t i v a t e d p l a t e l e t s w i t h n o n - i m m u n o g e n i c i s o t y p i c p r i m a r y a n t i b o d i e s d i d n o t p r o d u c e s i g n i f i c a n t s i g n a l s . 5.6 B i n d i n g o f B 2 G P I t o A c t i v a t e d P l a t e l e t s i n t h e P r e s e n c e o f a P L I g G T h e b i n d i n g o f B 2 G P I to a c t i v a t e d p l a t e l e t s w a s e x a m i n e d i n t h i s e x p e r i m e n t t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h i s i s t h e b a s i s o f t h e l a c k o f a P L I g G m o d u l a t i o n o f A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s i n t h e a b o v e e x p e r i m e n t . I f t h e r e i s i n d e e d n o B 2 G P I b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s , t h e n a P L I g G w i l l n o t b e a b l e t o i n h i b i t A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P b i n d i n g t o t h e c e l l s b y i n h i b i t i n g B 2 G P I f r o m i n t e r a c t i n g w i t h t h e o t h e r p r o t e i n s . W h e n c a l c i u m i o n o p h o r e - a c t i v a t e d w a s h e d p l a t e l e t s w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 ) 1 2 5 I - B 2 G P I ( 2 0 0 ug/mL), 2) 1 2 5 I - B 2 G P I a n d N H I g G (1 m g / m L ) , a n d 3) 1 2 5 I - B 2 G P I a n d a P L (1 m g / m L ) , n o I - B 2 G P I b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s w a s o b s e r v e d . T h e s a m e r e s u l t s w e r e o b t a i n e d w h e n r e p e a t e d w i t h p l a t e l e t s f r o m t h r e e n o r m a l s u b j e c t s . I n c o n t r a s t , w h e n 1 2 5 I - p r o t e i n S ( 2 0 p g / m L ) w a s i n c u b a t e d w i t h p l a t e l e t s , 10.3 ± 0.8 % o f t h e p r o t e i n S a d d e d w a s b o u n d t o c a l c i u m i o n o p h o r e - a c t i v a t e d p l a t e l e t s w h i l e o n l y 0.8 % o f p r o t e i n S w a s b o u n d t o r e s t i n g p l a t e l e t s . T h e r e f o r e , t h e r e w a s s i g n i f i c a n t p r o t e i n S b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s ( p < 0.002, p a i r e d t-test, n=3). T h e s e r e s u l t s t o g e t h e r i n d i c a t e t h a t e v e n t h o u g h a c t i v a t e d p l a t e l e t s w i t h a n i o n i c p h o s p h o l i p i d e x p o s e d o n c e l l s u r f a c e c a n s u p p o r t p r o t e i n S b i n d i n g , B 2 G P I b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s s u r f a c e d o e s n o t t a k e p l a c e at p h y s i o l o g i c a l i o n i c s t r e n g t h , p H , a n d c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n . 9 8 T a b l e 4. B i n d i n g o f A c t i v a t e d P r o t e i n C, P r o t e i n S a n d C 4 B P t o P l a t e l e t s as D e t e c t e d b y F l u o r e s c e n c e F l o w C y t o m e t r y i s n o t A f f e c t e d b y t h e P r e s e n c e o f a P L . F i n a l c o n c e n t r a t i o n s o f p r o t e i n s i n t h e r e a c t i o n m i x t u r e s w e r e 2 0 0 p g / m L (3.7 p M ) B 2 G P I , 4 p g / m L ( 6 4 n M ) A P C , 2 0 p g / m L ( 2 9 0 n M ) p r o t e i n S, 2 5 0 p g / m L ( 4 2 4 n M ) C 4 B P , a n d 1 m g / m L (6.6 p M ) o f a n t i b o d y p o o l f o r a P L o r N H I g G . W h e r e i n d i c a t e d , p l a t e l e t s w e r e a c t i v a t e d w i t h A 2 3 1 8 7 . D a t a a r e e x p r e s s e d as t h e m e a n ± o n e S D o f f o u r s e p a r a t e s a m p l e s . P l a t e l e t s i n c u b a t e d w i t h S t a i n e d w i t h A c t i v a t e d p l a t e l e t s + a P L A c t i v a t e d p l a t e l e t s + N H I g G R e s t i n g p l a t e l e t s + N H I g G A c t i v a t e d p l a t e l e t s + N H I g G ( I s o t y p i c c o n t r o l ) % p o s i t i v e f o r i n d i c a t e d a n t i b o c ly B 2 G P I , P r o t e i n S, A P C , a P L / N H I g G a n t i - C D 6 2 P 78.7 ± 3 . 0 79.5 ± 1 . 0 14.4 ± 4 . 7 3.0 ± 1.0 a n t i - P r o t e i n S 34.2 ± 5.2 34.2 ± 1.9 3.2 ± 0 . 9 3.4 ± 1.0 a n t i - P r o t e i n C 8.7 ± 3 . 4 9 ± 5 . 2 0.6 ± 0.4 0.5 ± 0 . 1 B 2 G P I , P r o t e i n S, C 4 B P , a P L / N H I g G a n t i - C D 6 2 P 71.9 ± 5 . 7 74.0 ± 8.5 11.2 ± 6 . 3 3.6 ± 1.0 a n t i - P r o t e i n S 36.6 ± 12.2 32.0 ± 8 . 7 7.2 ± 1.6 2.8 ± 0 . 5 a n t i - C 4 B P 27.5 ± 7 . 1 28.0 ± 8 . 6 5.8 ± 1.1 2.4 ± 0.4 9 9 5.7 S u m m a r y A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s i n h i b i t e d A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P b i n d i n g t o o x i d i z e d s u r f a c e b o u n d B 2 G P I i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r . A l s o , a P L w a s f o u n d t o i n c r e a s e A P C s p e c i f i c a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I o n P S - c o a t e d s u r f a c e . H o w e v e r , t h i s i n c r e a s e i n A P C s p e c i f i c a c t i v i t y d i d n o t l e a d t o a n i n c r e a s e i n A P C t o t a l a c t i v i t y b e c a u s e a P L , at t h e s a m e t i m e , i n h i b i t e d A P C b i n d i n g t o P S b y i n c r e a s i n g B 2 G P I b i n d i n g . A s a r e s u l t o f t h i s i n h i b i t i o n , t h e r e w a s a n o v e r a l l d e c r e a s e i n A P C t o t a l a c t i v i t y . T h e p r e s e n c e o f a P L d i d n o t i n t e r f e r e w i t h t h e b i n d i n g o f A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s u r f a c e . F u r t h e r m o r e , n o s i g n i f i c a n t B 2 G P I b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s w a s f o u n d a n d a P L d i d n o t e n h a n c e B 2 G P I b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s . 100 C H A P T E R 6 INHIBITION OF C4b-BINDING PROTEIN (C4BP) AND M A N N O S E BINDING L E C T I N (MBU BINDING T O B2GPI B Y ANTIPHOSPHOLIPID ANTIBODIES 6.1 Effect of C4b on C4BP Binding to B2GPI C 4 B P w a s s h o w n t o i n t e r a c t w i t h o x i d i z e d - s u r f a c e b o u n d B 2 G P I i n t h e e x p e r i m e n t s d e s c r i b e d a b o v e . T h i s i n t e r a c t i o n w a s m e d i a t e d b y t h e B - c h a i n o n C 4 B P . T h e i m p l i c a t i o n o f t h i s i n t e r a c t i o n o n c o m p l e m e n t r e g u l a t i o n i s e x a m i n e d i n t h i s s e c t i o n . T o f u r t h e r a s s e s s w h e t h e r B 2 G P I - b o u n d C 4 B P c a n r e g u l a t e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n b y b i n d i n g t o C 4 b , C 4 B P ( 0 t o 8 p g / m L , 0 t o 14 n M ) w a s p r e - i n c u b a t e d w i t h C 4 b ( 5 0 p g / m L , 2 6 0 n M ) b e f o r e a d d i n g to B 2 G P I - c o a t e d w e l l s . T h i s w a s t o i n v e s t i g a t e w h e t h e r t h e o c c u p a t i o n o f C 4 b - b i n d i n g d o m a i n s o n C 4 B P b y C 4 b w o u l d i n h i b i t C 4 B P b i n d i n g t o B 2 G P I . T h e p r e - i n c u b a t i o n o f C 4 B P w i t h C 4 b d i d n o t i n h i b i t C 4 B P b i n d i n g t o B 2 G P I c o m p a r e d t o C 4 B P b i n d i n g t o B 2 G P I i n t h e a b s e n c e o f C 4 b ( F i g u r e 2 4 ) . T h e l a c k o f i n h i b i t i o n b y C 4 b s h o w e d tha t the C 4 b - b i n d i n g d o m a i n s o n C 4 B P w e r e n o t i n v o l v e d i n C 4 B P i B 2 G P I i n t e r a c t i o n a n d f u r t h e r s u g g e s t e d t h a t t h e B - c h a i n o f C 4 B P m a y b e t h e s o l e b i n d i n g s i t e f o r B 2 G P I . T h e r e f o r e , B 2 G P I - b o u n d C 4 B P s h o u l d h a v e i t s C 4 b b i n d i n g a c t i v i t y r e t a i n e d f o r c o m p l e m e n t r e g u l a t i o n . H e n c e , t h e i n h i b i t i o n o f C 4 B P b i n d i n g t o B 2 G P I b y a P L o b s e r v e d i n p r e v i o u s e x p e r i m e n t s m a y i n t e r f e r e w i t h c o m p l e m e n t r e g u l a t i o n . 101 F i g u r e 24. E f f e c t o f C 4 b o n C 4 B P b i n d i n g t o B 2 G P I . M i c r o t i t e r p l a t e s c o a t e d w i t h B 2 G P I w e r e i n c u b a t e d w i t h C 4 B P ( 0 t o 8 p g / m L , 0 t o 14 n M ) i n t h e p r e s e n c e ( c l o s e d c i r c l e s ) a n d a b s e n c e ( o p e n c i r c l e s ) o f C 4 b ( 5 0 p g / m L , 2 6 0 n M ) . D a t a p o i n t s a r e m e a n s ± 1 S D o f f o u r s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s o f t h e s a m e s a m p l e . T h e d a t a s h o w n a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . T h e O D 4 5 0 r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t o f C 4 B P b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e O D 4 5 0 o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n C 4 B P . C4BP (ug/ml_) 102 6.2 M B L Binding to B2GPI in the Presence of Calcium, E D T A and N -acetylmannosamine U s i n g E L I S A , i n t h e p r e s e n c e o f 2.5 m M C a C b , M B L w a s f o u n d t o i n t e r a c t d i r e c t l y w i t h s u r f a c e - b o u n d 132GPI i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r b u t n o t w i t h c o n t r o l w e l l s c o a t e d w i t h s k i m m i l k p r o t e i n ( p < 0.001, t w o w a y A N O V A ) ( F i g u r e 2 5 A ) . In t h e p r e s e n c e o f 10 m M E D T A , M B L b i n d i n g t o B 2 G P I w a s i n h i b i t e d . S i n c e t h e c a r b o h y d r a t e b i n d i n g a c t i v i t y o f M B L i s c a l c i u m - d e p e n d e n t , t h e o b s e r v a t i o n o f E D T A i n h i b i t i o n o f M B L - B 2 G P I i n t e r a c t i o n s u g g e s t s that t h i s i n t e r a c t i o n c o u l d b e m e d i a t e d t h r o u g h t h e b i n d i n g o f M B L t o t h e c a r b o h y d r a t e r e s i d u e s o n B 2 G P I . T h i s p o s s i b l e m e c h a n i s m w a s a l s o e x a m i n e d u s i n g N - a c e t y l m a n n o s a m i n e , w h i c h b i n d s t o M B L a n d i n h i b i t s i t s l e c t i n a c t i v i t y . G a l a c t o s e , w h i c h i s n o t r e c o g n i z e d b y M B L , w a s u s e d as c o n t r o l . M B L b i n d i n g t o B 2 G P I w a s i n h i b i t e d b y the a d d i t i o n o f N - a c e t y l m a n n o s a m i n e b u t n o t g a l a c t o s e ( p < 0.001, t w o w a y A N O V A ) ( F i g u r e 2 5 B ) . T h e r e f o r e , M B L b i n d i n g to B 2 G P I i s l i k e l y t o b e m e d i a t e d b y t h e b i n d i n g o f M B L t o t h e s u g a r r e s i d u e s o n B 2 G P I . 6.3 Binding of M B L to B2GPI-Bound aPL I n t h e e a r l i e r e x p e r i m e n t s , a P L w a s s h o w n to p r e v e n t A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P f r o m b i n d i n g t o B 2 G P I . I n t h i s e x p e r i m e n t , t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f a P L o n M B L b i n d i n g to B 2 G P I w a s e x a m i n e d . C o n t r a r y t o t h e a P L i n h i b i t o r y e f f e c t o n A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P , a P L i n c r e a s e d M B L b i n d i n g t o B 2 G P I . W h e n M B L ( 0 to 10 p g / m L , 0 t o 2 0 n M ) w a s c o - i n c u b a t e d w i t h 1 m g / m L (6.7 p M ) o f a P L I g G p o o l ( > 150 G P U ) , t h e r e w a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e r b i n d i n g o f M B L t o B 2 G P I - c o a t e d w e l l s t h a n w i t h 1 m g / m L (6.7 p M ) 103 F i g u r e 25. M B L B i n d i n g t o B 2 G P I . ( A ) E f f e c t o f E D T A o n M B L b i n d i n g . M i c r o t i t r e w e l l s c o a t e d w i t h B 2 G P I w e r e i n c u b a t e d w i t h M B L ( 0 t o 10 u g / m L , 0 t o 2 0 n M ) i n 2.5 m M C a C l 2 ( c l o s e d c i r c l e s ) o r 10 m M E D T A ( o p e n c i r c l e s ) . W e l l s c o a t e d w i t h b l o c k i n g s o l u t i o n o n l y ( c r o s s e s ) c o n t r o l l e d f o r n o n - s p e c i f i c b i n d i n g . T h e O D 4 5 o r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t M B L b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e O D 4 5 0 o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n M B L . ( B ) E f f e c t o f N - a c e t y l m a n n o s a m i n e o n M B L B i n d i n g . M i c r o t i t r e p l a t e s c o a t e d w i t h B 2 G P I w e r e i n c u b a t e d w i t h M B L ( 0 t o 10 p g / m L , 0 t o 2 0 n M ) i n t h e p r e s e n c e o f 0.2 M N - a c e t y l m a n n o s a m i n e ( c l o s e d c i r c l e s ) o r g a l a c t o s e ( o p e n c i r c l e s ) . D a t a p o i n t s a r e the m e a n s ± 1 S D o f t h r e e s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s o f t h e s a m e s a m p l e . T h e d a t a a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . T h e O D 4 s o r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t M B L b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e O D 4 5 o o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n M B L . 1 0 4 0.2 -i 5 10 [MBL] (ug /mL) 105 o f N H I g G p o o l c o n t r o l ( p O . 0 0 1 , t w o w a y A N O V A ) ( F i g u r e 2 6 ) . T h i s i n d i c a t e s t h a t M B L h a s h i g h e r a f f i n i t y t o w a r d s t h e a P L - B 2 G P I c o m p l e x t h a n t o w a r d s B 2 G P I a l o n e . T h e r e f o r e , t h e p r e s e n c e o f a P L m a y p r o m o t e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n a n d e n h a n c e o p s o n i z a t i o n b y c o - l o c a l i z i n g M B L w i t h a P L - B 2 G P I c o m p l e x . 6.4 Equilibrium Dissociation Constant Determinations for MBL Binding to B2GPI T o d e t e r m i n e t h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s f o r M B L b i n d i n g t o B 2 G P I a d s o r b e d t o a n E L I S A p l a t e , t h e t i m e r e q u i r e d f o r t h e p r o t e i n b i n d i n g t o r e a c h e q u i l i b r i u m w a s d e t e r m i n e d . B i n d i n g o f 10 p g / m L ( 2 0 n M ) o f 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d - M B L t o B 2 G P I w a s f o u n d t o r e a c h e q u i l i b r i u m a f t e r 6 0 m i n ( A p p e n d i x F i g u r e 7 ) . T h e a m o u n t o f M B L b i n d i n g t o s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I i n t e r a c t i o n w a s d e t e r m i n e d b y i n c u b a t i n g B 2 G P I -c o a t e d w e l l s w i t h 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d M B L ( 0 t o 8 0 p g / m L , 0 t o 1 6 0 n M ) f o r 4 h o u r s at 3 7 ° C . T h e M B L - B 2 G P I i n t e r a c t i o n h a s a K d o f 7.43 ± 4.42x IO" 7 M a n d a M B L : B 2 G P I m o l a r r a t i o o f 0.6 + 0.3. T h e b i n d i n g o f 1 2 5 I - l a b e l e d B S A t o B 2 G P I w a s m e a s u r e d as c o n t r o l . T h e r e w a s a n e g l i g i b l e i n t e r a c t i o n a n d t h e a s s o c i a t i o n o f t h e t w o p r o t e i n s w a s t o o w e a k f o r e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t d e t e r m i n a t i o n u s i n g t h i s e x p e r i m e n t a l s e t u p . B i n d i n g a s s a y s w i t h o n l y l a b e l e d M B L o r m i x t u r e s o f l a b e l e d a n d u n l a b e l e d M B L o f d i f f e r e n t r a t i o s a l s o g a v e c o m p a r a b l e b i n d i n g c o n s t a n t s ( A p p e n d i x F i g u r e 8). 1 0 6 F i g u r e 26. I n c r e a s e d B i n d i n g o f M B L t o B 2 G P I i n t h e P r e s e n c e o f a P L I g G . M i c r o t i t r e p l a t e s c o a t e d w i t h B 2 G P I w e r e i n c u b a t e d w i t h M B L ( 0 t o 10 p g / m L , 0 to 2 0 n M ) i n t h e p r e s e n c e o f 1 m g / m L (6.6 p M ) o f a P L I g G p o o l ( c l o s e d c i r c l e s ) o r N H I g G p o o l ( o p e n c i r c l e s ) . D a t a p o i n t s a r e t h e m e a n s ± 1 S D o f t h r e e s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s o f t h e s a m e s a m p l e s . T h e d a t a s h o w n a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . T h e O D 4 5 0 r e p o r t e d r e p r e s e n t s t h e a m o u n t M B L b i n d i n g a f t e r s u b t r a c t i n g t h e OD450 o f c o n t r o l w e l l s t h a t d i d n o t c o n t a i n M B L . 0.25 -1 Q O o m 0.15 H 0.05 0.2 0.1 -\ 0 * p < 0.001 0 5 [MBL] (lig/mL) 10 107 6.5 Complement Activation by Antibody-B2GPI Complex T o m e a s u r e a n t i b o d y - m e d i a t e d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n , n a m e l y a P L - B 2 G P I c o m p l e x - m e d i a t e d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n , a c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n E L I S A w a s d e v e l o p e d . S i n c e r a b b i t I g G a c t i v a t e s h u m a n c l a s s i c a l c o m p l e m e n t p a t h w a y a n d h a s b e e n r o u t i n e l y u s e d t o a s s a y c o m p l e m e n t a c t i v i t y i n h u m a n s e r u m ( K e n t a n d F i f e , 1 9 6 3 ) , r a b b i t - a n t i - h u m a n - B 2 G P I w a s i n i t i a l l y u s e d t o d e v e l o p t h i s a s s a y . A f t e r r a b b i t a n t i -h u m a n B 2 G P I w a s a d d e d t o B 2 G P I - c o a t e d w e l l s t o f o r m r a b b i t - a n t i - B 2 G P I / B 2 G P I c o m p l e x , t h e a m o u n t o f C 5 b - 9 d e p o s i t i o n i n E L I S A w e l l s w h e n i n c u b a t e d w i t h h u m a n s e r u m i n c r e a s e d w i t h t h e a m o u n t o f r a b b i t a n t i - h u m a n B 2 G P I a d d e d i n i t i a l l y ( F i g u r e 2 7 ) . T h e r e f o r e , t h e a m o u n t o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n m e a s u r e d w a s d e p e n d e n t o n t h e a m o u n t o f r a b b i t - a n t i - B 2 G P I / B 2 G P I c o m p l e x u n d e r t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n u s e d . W e l l s c o n t a i n i n g r a b b i t - a n t i - B 2 G P I / B 2 G P I c o m p l e x e s g e n e r a t e d n o s i g n a l s w h e n p r o b e d w i t h n o n - s p e c i f i c m o u s e I g G as p r i m a r y a n t i b o d y o r w i t h o u t p r i m a r y a n t i b o d y a f t e r i n c u b a t i n g w i t h s e r u m . T h i s i n d i c a t e d t h a t t h e s i g n a l s g e n e r a t e d w e r e n o t d u e t o n o n - s p e c i f i c b i n d i n g o f p r i m a r y a n t i b o d y ( m o u s e - a n t i - C 5 b - 9 ) o r s e c o n d a r y a n t i b o d y ( H R P - a n t i - m o u s e - I g G ) t o t h e E L I S A p l a t e . W h e n r a b b i t - a n t i - B 2 G P I / B 2 G P I c o m p l e x e s w e r e i n c u b a t e d w i t h s e r u m i n G V B - E D T A a n d p r o b e d w i t h a n t i - C 5 b - 9 a n d t h e a p p r o p r i a t e s e c o n d a r y a n t i b o d y , n o s i g n a l w a s p r o d u c e d e i t h e r ( d a t a n o t s h o w n ) . S i n c e E D T A i n G V B - E D T A b u f f e r i n h i b i t s c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n , t h i s o b s e r v a t i o n i n d i c a t e d t h a t t h e s i g n a l g e n e r a t i o n w a s c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n - d e p e n d e n t . T h e r e f o r e , t h e s e c o n t r o l s t o g e t h e r s h o w e d t h a t s i g n a l s p r o d u c e d w e r e s p e c i f i c b i n d i n g o f a n t i - C 5 b - 9 t o C 5 b - 9 b o u n d t o E L I S A p l a t e as a r e s u l t o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . 108 F i g u r e 27. R a b b i t A n t i - H u m a n B 2 G P I M e d i a t e d C 5 b - 9 G e n e r a t i o n . B 2 G P I - c o a t e d E L I S A p l a t e s w e r e i n c u b a t e d w i t h d i f f e r e n t a m o u n t s o f r a b b i t - a n t i - h u m a n B 2 G P I i n G V B - E D T A f o r 1 h r at r o o m t e m p e r a t u r e . N H S d i l u t e d 4 0 t i m e s i n G V B 2 + w e r e a d d e d t o t h e w e l l s a n d i n c u b a t e d at 3 7 ° C f o r I h r f o r c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . T h e a m o u n t o f C 5 b - 9 g e n e r a t e d a f t e r t h e i n c u b a t i o n w a s m e a s u r e d u s i n g m o n o c l o n a l m o u s e a n t i - h u m a n C 5 b - 9 . D a t a p o i n t s a r e t h e m e a n s ± 1 S D o f f o u r s e p a r a t e m e a s u r e m e n t s o f t h e s a m e s a m p l e s . T h e d a t a s h o w n a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . 2 -i Q O O 0.5 H 1.5 H 0 0 25 50 75 100 125 Rabbit Anti-Human R2GPI(ug/mL) 109 6.6 B 2 G P I -Med iated Complement Act ivat ion T h e o b s e r v a t i o n o f d i r e c t M B L - B 2 G P I i n t e r a c t i o n s u g g e s t s t h a t B 2 G P I - c o a t e d s u r f a c e s h o u l d b e c o m p l e m e n t a c t i v a t i n g i n t h e p r e s e n c e o f s e r u m b y a c t i v a t i n g M B L . I n F i g u r e 28, B 2 G P I - c o a t e d w e l l s i n c u b a t e d w i t h s e r u m h a d s i g n i f i c a n t l y h i g h e r a m o u n t s o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n ( O D 4 5 0 o f 0.117 ± 0.017, n = 6) c o m p a r e d t o g e l a t i n - b l o c k e d c o n t r o l w e l l s ( O D 4 5 0 o f 0.080 ± 0.005, n = 5) ( p < 0.001 b y t-test). T h e r e f o r e , B 2 G P I -c o a t e d s u r f a c e m a y b e c o m p l e m e n t a c t i v a t i n g , a l b e i t w e a k i n c o m p a r i s o n t o t h e c o m p l e m e n t a c t i v a t i n g a c t i v i t y o f a n t i b o d y - B 2 G P I c o m p l e x o b s e r v e d i n t h e a b o v e e x p e r i m e n t . 6.7 Correlations of Complement Activat ion Level to Ant iphosphol ip id Levels U s i n g t h e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n E L I S A , a P L - m e d i a t e d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n b y p a t i e n t s e r u m w a s a s s e s s e d . S a m p l e s w i t h c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n l e v e l s m o r e t h a n OD450 o f 0.257 ( m e a n + 3 S D , 10 n o r m a l s e r u m s a m p l e s ) w e r e c o n s i d e r e d as p o s i t i v e . A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d y m e d i a t e d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n w a s d e t e c t e d i n 19 (47.5 % ) p a t i e n t s a m p l e s ( T a b l e 5). S e r u m s a m p l e s p o s i t i v e f o r c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n w e r e s e l e c t e d t o d e t e r m i n e t h e c o r r e l a t i o n s o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n l e v e l s t o a C L I g G , a C L I g M , a n t i - B 2 G P I I g G , a n d a n t i - B 2 G P I I g M l e v e l s . O f t h e 19 s a m p l e s p o s i t i v e f o r a P L -m e d i a t e d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n , a c o r r e l a t i o n c o e f f i c i e n t o f 0.45 w a s f o u n d b e t w e e n t h e l e v e l o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n a n d t h e l e v e l o f a n t i - B 2 G P I I g M (p<0.05). N o c o r r e l a t i o n w a s e s t a b l i s h e d b e t w e e n c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n a n d t h e l e v e l s o f a C L I g G , a C L I g M , o r a n t i - B 2 G P I I g G ( T a b l e 6). T h e r e f o r e , a n t i - B 2 G P I I g M m a y b e t h e m a i n 1 1 0 F i g u r e 28. B 2 G P I - M e d i a t e d C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n . N H S d i l u t e d 1 i n 4 0 w i t h G V B w e r e a d d e d t o B 2 G P I - c o a t e d ( n = 6 ) a n d g e l a t i n - c o a t e d ( n = 5 ) E L I S A w e l l s a n d i n c u b a t e d at 3 7 ° C f o r I h r f o r c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . T h e a m o u n t o f C 5 b - 9 g e n e r a t e d a f t e r t h e i n c u b a t i o n w a s m e a s u r e d u s i n g m o n o c l o n a l m o u s e a n t i - h u m a n C 5 b - 9 . D a t a p o i n t s a r e t h e m e a n s ± 1 S D . T h e d a t a s h o w n a r e r e p r e s e n t a t i v e o f 3 s e p a r a t e e x p e r i m e n t s . p < 0.001 c =3 O CO I .D IO O c o co > o < c <u E 0 Q. E o o a O G e l a t i n - C o a t e d Wel ls H 2 G P I - C o a t e d Wel ls 111 T a b l e 5. C h a r a c t e r i s t i c s o f S e r u m S a m p l e s . T e n n o r m a l a n d 4 0 p a t i e n t s a m p l e s w e r e a n a l y z e d u s i n g c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n E L I S A , a n t i c a r d i o l i p i n E L I S A , a n d a n t i - B 2 G P I E L I S A . S a m p l e i s p o s i t i v e i f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n > 0.257, G P U > 15, M P U >10, S G U >15, o r S M U > 15. S a m p l e s p o s i t i v e f o r Complement Anti-Carciiolipin ELISA Anti-fi2GPI ELISA Activation (OD 4 5 0) IgG (GPU) IgM (MPU) IgG (SGU) IgM (SMU) Normal 1 0.201 2.5 0.4 0.0 4.3 Normal 2 0.231 1.6 2.9 0.0 1.5 Normal 3 0.212 3.3 2.3 0.0 4.6 Normal 4 0.182 3.6 1.8 0.0 5.7 Normal 5 0.210 6.3 1.5 0.0 6.2 Normal 6 0.157 4.0 1.7 0.0 0.5 Normal 7 0.198 4.0 10.0 0.0 13.9 Normal 8 0.189 2.8 0.9 0.0 1.7 Normal 9 0.189 4.3 1.4 0.0 4.0 Normal 10 0.205 8.9 10.0 0.0 5.2 Patient 1 0.231 38.6 1.2 26.4 8.2 Patient 2 0.212 28.6 14.0 24.1 13.0 Patient 3 0.210 39.6 0.8 24.7 13.1 Patient 4 0.198 > 150.0 > 150.0 112.4 > 150.0 Patient 5 0.189 34.0 14 0.0 26.8 Patient 6 0.189 1.9 > 150.0 0.0 22.4 Patient 7 0.205 13.6 9.6 28.4 86.3 Patient 8 0.195 2.3 20.5 0.0 24.4 Patient 9 0.213 25.3 > 150.0 1.6 > 150.0 Patient 10 0.199 44.2 0.0 50.4 22.2 Patient 11 0.202 5.5 6.2 0.0 22.5 Patient 12 0.422 8.9 21.0 0.0 17.9 Patient 13 0.208 25.0 0.9 0.0 0.2 Patient 14 0.325 24.6 5.5 0.0 53.8 Patient 15 0.279 6.6 1.5 0.0 19.9 Patient 16 0.279 > 150.0 5.5 > 150.0 14.4 Patient 17 0.264 8.3 5.6 1.9 11.9 Patient 18 0.211 > 150.0 > 150 > 150.0 135.5 Patient 19 0.206 12.9 16.9 0.0 4.9 Patient 20 0.941 24.4 3.0 0.0 5.7 Patient 21 0.574 32.9 > 150.0 9.1 44.6 Patient 22 1.473 109.8 > 150.0 136.4 141.1 Patient 23 1.335 49.2 1.0 0.0 8.7 Patient 24 0.726 69.1 2.3 81.0 26.2 Patient 25 0.861 17.1 1.6 0.0 29.1 Patient 26 0.150 > 150.0 10.9 > 150.0 89.2 Patient 27 0.154 58.9 19.1 72.7 50.4 Patient 28 0.177 16.4 9.6 0.0 17.9 Patient 29 0.996 17.2 20.5 0.0 108.3 Patient 30 0.150 150 28.6 > 150.0 > 150.0 Patient 31 0.247 37.4 9.7 21.0 32.9 Patient 32 0.154 18.4 1.9 0.0 1.6 Patient 33 0.243 59.5 > 150.0 36.1 64.1 Patient 34 0.250 > 150.0 4.3 > 150.0 2.7 Patient 35 0.265 44.2 6.6 31.0 44.1 Patient 36 0.210 > 150.0 3.6 > 150.0 3.2 Patient 37 0.243 19.7 43.5 27.9 > 150.0 Patient 38 0.154 5.8 > 150.0 0.0 11.4 Patient 39 0.301 > 150.0 2.2 > 150.0 48.7 Patient 40 0.246 113.4 19.5 91.6 31.2 Patients Positive 19 31 19 21 24 (%) (47.5 %) (77.5 %) (47.5%) (52.5 %) (60.0 %) 112 T a b l e 6. C o r r e l a t i o n (r) o f C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n t o A n t i p h o s p h o l i p i d L e v e l . N i n e t e e n o f t h e f o r t y - s i x s e r u m s a m p l e s p o s i t i v e f o r c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n w e r e s e l e c t e d t o d e t e r m i n e t h e c o r r e l a t i o n o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n l e v e l s t o a n t i p h o s p h o l i p i d l e v e l s . C o r r e l a t i o n o f C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n t o A n t i p h o s p h o l i p i d L e v e l A n t i - c a r d i o l i p i n I g G 0.14 A n t i - c a r d i o l i p i n I g M 0.25 A n t i - B 2 G P I I g G 0.11 A n t i - B 2 G P I I g M 0.45* *p<0.05 113 c o m p l e m e n t a c t i v a t o r i n a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . H o w e v e r , a n t i - B 2 G P I I g M i s n o t a m a n d a t o r y a c t i v a t o r o f c o m p l e m e n t s i n c e p a t i e n t s p o s i t i v e f o r a n t i - B 2 G P I I g M ( p a t i e n t s 7, 8, 9, 10, 11, 18, 26, 27, 30, 3 1 , 33, 37, 4 0 ) d i d n o t e x h i b i t a P L - B 2 G P I c o m p l e x m e d i a t e d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . T h e o b s e r v a t i o n o f s i g n i f i c a n t c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n f o r p a t i e n t s 3, 20, 2 3 w h o w e r e n e g a t i v e f o r a n t i p h o s p h o l i p i d I g M , f u r t h e r s h o w e d that b e s i d e s I g M , a n t i p h o s p h o l i p i d o f I g G i s o t y p e c o u l d a l s o s u p p o r t c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n ( T a b l e 5). 6.8 Spec i f i c i ty a n d Sens i t i v i ty o f A n t i p h o s p h o l i p i d E L I S A s R e l a t i v e to C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n E L I S A T h e a p p l i c a t i o n o f a n t i p h o s p h o l i p i d E L I S A s ( a C L I g G , a C L I g M , a n t i - B 2 G P I I g M , a n d a n t i - B 2 G P I I g G ) i n i d e n t i f y i n g A P S p a t i e n t s a m p l e s c o n t a i n i n g c o m p l e m e n t a c t i v a t i n g a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s w a s e x a m i n e d ( T a b l e 7 A - D ) . T h e a n t i c a r d i o l i p i n I g G E L I S A h a d a s e n s i t i v i t y o f 7 8 . 9 % r e l a t i v e to t h e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n E L I S A w h i l e t h e o t h e r t h r e e E L I S A s o n l y h a d m o d e r a t e s e n s i t i v i t i e s (42.1 t o 5 7 . 9 % ) . T h e r e l a t i v e l y h i g h s e n s i t i v i t y o f a n t i c a r d i o l i p i n I g G E L I S A i n d i c a t e s t h a t c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n i s a s s o c i a t e d w i t h t h e p r e s e n c e o f a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s . T h e s p e c f i c i t i e s o f t h e s e o t h e r E L I S A s r e l a t i v e t o t h e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n E L I S A w e r e m o d e r a t e (23.8 t o 47.6 % ) . T h e l o w s p e c i f i c i t i e s i n d i c a t e t h a t n o t a l l a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s a c t i v a t e c o m p l e m e n t . E x a m i n a t i o n o f t h e p o s i t i v e p r e d i c t i v e v a l u e s o f t h e d i f f e r e n t a n t i p h o s p h o l i p i d E L I S A s r e l a t i v e t o c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n E L I S A a l s o o n l y s h o w e d m o d e r a t e v a l u e s (38.1 t o 48.4 % ) . T h e r e f o r e , n o n e o f t h e s e a n t i p h o s p h o l i p i d E L I S A s b y t h e m s e l v e s w o u l d b e a b l e t o p r e d i c t c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . 1 1 4 T a b l e 7. S p e c i f i c i t y a n d S e n s i t i v i t y o f A n t i p h o s p h o l i p i d E L I S A s R e l a t i v e t o C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n E L I S A . A C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n E L I S A + -A n t i -c a r d i o l i p i n I g G + 15 16 - 4 5 S p e c i f i c i t y = 2 3 . 8 % S e n s i t i v i t y = 78.9 % P o s i t i v e P r e d i c t i v e V a l u e = 48.4 % N e g a t i v e P r e d i c t i v e V a l u e = = 55.6 % C C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n E L I S A + -A n t i - B 2 G P I + 8 13 I g G - 11 8 S p e c i f i c i t y S e n s i t i v i t y P o s i t i v e P r e d i c t i v e V a l u e N e g a t i v e P r e d i c t i v e V a l u e = = 38.1 % = 42.1 % = 38.1 % = 42.1 % B C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n E L I S A + -A n t i -c a r d i o l i p i n I g M + 8 11 - 11 10 S p e c i f i c i t y = 47.6 % S e n s i t i v i t y = 42.1 % P o s i t i v e P r e d i c t i v e V a l u e = 42.1 % N e g a t i v e P r e d i c t i v e V a l u e = = 47.6 % D C o m p l e m e n t A c t i v a t i o n E L I S A + -A n t i - 1 3 2 G P I + 11 13 I g M - 8 8 S p e c i f i c i t y S e n s i t i v i t y P o s i t i v e P r e d i c t i v e V a l u e N e g a t i v e P r e d i c t i v e V a l u e = = 38.1 % = 57.9 % = 45.8 % = 50.0 % 1 1 5 6.9 Summary 6 2 G P I i n t e r a c t e d w i t h C 4 B P a n d M B L . A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s i n h i b i t e d C 4 B P b i n d i n g w h i l e e n h a n c i n g M B L b i n d i n g t o o x i d i z e d s u r f a c e b o u n d B 2 G P I . T h e s e m o d u l a t i o n e f f e c t s o f a P L o n 132GPI c o u l d g e n e r a t e a c o n d i t i o n t h a t p r o m o t e s c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . N i n e t e e n o u t o f f o r t y (47.5 % ) p a t i e n t s s e r u m s a m p l e s l e d to t h e g e n e r a t i o n o f C 5 b - 9 i n c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n E L I S A . A m o d e r a t e c o r r e l a t i o n w a s f o u n d b e t w e e n t h e l e v e l o f C 5 b - 9 p r o d u c e d a n d t h e l e v e l o f a n t i - B 2 G P I I g M . N o c o r r e l a t i o n s w e r e f o u n d b e t w e e n t h e l e v e l o f C 5 b - 9 p r o d u c e d a n d t h e l e v e l s o f a n t i c a r d i o l i p i n I g G / I g M a n d a n t i - B 2 G P I I g G i n t h e s e r a . 116 C H A P T E R 7 D I S C U S S I O N I n t h i s s t u d y , a n u m b e r o f i n t e r a c t i o n s o f p h o s p h o l i p i d - b o u n d o r o x i d i z e d s u r f a c e -b o u n d 6 2 G P I w i t h t h e a n t i c o a g u l a t i o n m e c h a n i s m as w e l l as w i t h t h e c o m p l e m e n t s y s t e m h a v e b e e n d e m o n s t r a t e d . B 2 G P I i n t e r a c t e d w i t h A P C a n d h a d d i f f e r e n t e f f e c t s o n A P C u n d e r d i f f e r e n t c o n d i t i o n s . A l s o , B 2 G P I a p p e a r e d to m o d u l a t e t h e f o r m a t i o n o f C 4 B P -p r o t e i n S c o m p l e x b y i n t e r a c t i n g d i r e c t l y w i t h b o t h C 4 B P a n d p r o t e i n S. F u r t h e r m o r e , B 2 G P I w a s a s s o c i a t e d w i t h t h e c o m p l e m e n t s y s t e m b y i n t e r a c t i n g w i t h C 4 B P a n d M B L . E x p e r i m e n t s h a v e s h o w n tha t t h e s e i n t e r a c t i o n s w e r e i n t e r f e r e d w i t h b y t h e p r e s e n c e o f a P L . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t i n t h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e , a P L m a y i n t e r f e r e w i t h t h e s e p r o t e i n i n t e r a c t i o n s , a n d t h e r e b y d i s r u p t t h e a n t i c o a g u l a t i o n m e c h a n i s m a n d i n c r e a s e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . 7.1 B2GPI I n t e r a c t i o n s w i t h A P C a n d P r o t e i n S T h e a n t i c o a g u l a t i o n a c t i v i t y o f A P C c a n b e i m p a i r e d b y a P L ( G a l l i et al, 1998; O o s t i n g et al, 1993; M a l i a et al, 1990; M a r c i n i a k a n d R o m o n d , 1 9 8 9 ) . H o w e v e r , th e m e c h a n i s m t h a t m e d i a t e s t h i s i n h i b i t i o n a n d t h e r o l e o f B 2 G P I i n t h i s p h e n o m e n o n r e m a i n s u n c l e a r . T h e r e f o r e , t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n A P C a n d B 2 G P I w a s e x p l o r e d t o g a i n a n u n d e r s t a n d i n g o f a P L - m e d i a t e d A P C i n h i b i t i o n . T h e e f f e c t o f B 2 G P I o n A P C a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f a m i n o p h o s p h o l i p i d ( P E a n d P S ) , P C , p r o t e i n S as w e l l as i n t h e a b s e n c e o f p h o s p h o l i p i d w a s s t u d i e d . E x p e r i m e n t s s h o w e d tha t B 2 G P I c o u l d s e r v e as a n A P C c o f a c t o r t o i n c r e a s e A P C s p e c i f i c a c t i v i t y ( F i g u r e 2 9 ) . S i n c e b o t h p r o t e i n s a r e 117 F i g u r e 29. B 2 G P I I n c r e a s e s t h e S p e c i f i c A c t i v i t y o f A P C i n t h e P r e s e n c e o f A m i n o p h o s p h o l i p i d . S-2366 (pyroGlu-Pro-Arg-/>-nitroaniline) p-nitroaniline 118 p h o s p h o l i p i d - b i n d i n g p r o t e i n s , t h i s i n c r e a s e i n s p e c i f i c a c t i v i t y m a y r e s u l t f r o m c o m p l e x f o r m a t i o n b e t w e e n A P C a n d B 2 G P I s u b s e q u e n t t o p h o s p h o l i p i d b i n d i n g . T h i s i n c r e a s e i n A P C s p e c i f i c a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I , h o w e v e r , d i d n o t t r a n s l a t e i n t o i n c r e a s e d t o t a l A P C a c t i v i t y f o r t h e in vitro a s s a y . T h i s m a y b e b e c a u s e B 2 G P I , s i m i l a r l y t o A P C , is a n a n i o n i c p h o s p h o l i p i d b i n d i n g p r o t e i n . O n a P S s u r f a c e , B 2 G P I c o m p e t e d w i t h A P C f o r P S b i n d i n g a n d b e c a u s e l e s s A P C b o u n d , l e s s t o t a l a c t i v i t y w a s o b s e r v e d . T h e r e f o r e , c o m p a r e d t o A P C i n c u b a t i o n i n a P S - w e l l a l o n e , c o - i n c u b a t i o n o f A P C a n d B 2 G P I i n a P S - w e l l l e d t o a l o w e r e d A P C t o t a l a c t i v i t y b e c a u s e o f t h e d e c r e a s e o f A P C b i n d i n g t o P S , e v e n t h o u g h B 2 G P I i n c r e a s e d A P C s p e c i f i c a c t i v i t y . T h e c o n c e n t r a t i o n s o f p r o t e i n u s e d i n t h i s e x p e r i m e n t w e r e c h o s e n t o a p p r o x i m a t e t h e p h y s i o l o g i c a l p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n r a t i o s o f B 2 G P I a n d A P C i n p l a s m a w i t h t h e a s s u m p t i o n t h a t a l l p r o t e i n C (4 p g / m L , 6 4 n M ) ( G r i f f i n et al, 1 9 8 2 ) i s a c t i v a t e d t o b e c o m e A P C . W h e t h e r t h e s e p r o t e i n s i n t e r a c t in vivo at t h i s r a t i o o r w i t h d i f f e r e n t l o c a l c o n c e n t r a t i o n r a t i o s i s u n k n o w n . T h i s p o i n t i s i m p o r t a n t b e c a u s e f o r m a x i m u m A P C p o t e n t i a t i o n , B 2 G P I a n d A P C s h o u l d i n t e r a c t at a n o p t i m u m r a t i o w h e r e a l l p h o s p h o l i p i d - b o u n d B 2 G P I w o u l d b e i n t e r a c t i n g w i t h A P C . I f t h e r e w e r e a n e x c e s s o f B 2 G P I c o m p a r e d t o A P C , B 2 G P I w o u l d a c t u a l l y r e d u c e t o t a l A P C a c t i v i t y b y c o m p e t i n g w i t h A P C f o r p h o s p h o l i p i d s i t e s r a t h e r t h a n i n c r e a s e A P C s p e c i f i c a c t i v i t y b y i n t e r a c t i n g w i t h t h e p r o t e i n . T h e r e f o r e , t h e in vivo f u n c t i o n o f B 2 G P I w o u l d d e p e n d o n t h e b a l a n c e o f B 2 G P I - m e d i a t e d A P C e n h a n c e d a c t i v i t y a n d t h e i n h i b i t i o n o f A P C b i n d i n g b y B 2 G P I t o a p r o c o a g u l a n t s u r f a c e . T h i s p h e n o m e n o n s h o u l d b e c o n s i d e r e d w h e n i n t e r p r e t i n g in vitro e x p e r i m e n t s t h a t e x a m i n e t h e e f f e c t o f B 2 G P I o n A P C a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f p h o s p h o l i p i d s i n c e A P C a c t i v i t y 1 1 9 w o u l d b e d i r e c t l y a f f e c t e d b y t h e r a t i o s o f t h e a m o u n t s o f a n y o f t h e s e c o m p o n e n t s c h o s e n f o r t h e e x p e r i m e n t s . A P C i n a c t i v a t e s m e m b r a n e b o u n d F V a b y b i n d i n g i n c l o s e p r o x i m i t y t o F V a o n t h e s a m e p r o c o a g u l a n t s u r f a c e c o n t a i n i n g a n i o n i c p h o s p h o l i p i d s s u c h as P S ( K a l a f a t i s a n d M a n n , 1993; M e s t e r s et al, 1993; F r e y s s i n e t et al, 1991; W a l k e r , 1 9 8 1 ) . P E , w h i c h h a s a n e u t r a l n e t c h a r g e at p h y s i o l o g i c a l p H , h a s a l s o b e e n r e p o r t e d t o b e a n i m p o r t a n t p h o s p h o l i p i d f o r A P C b i n d i n g ( S m i r n o v et al, 1995; H o r i e et al, 1994; S m i r n o v a n d E s m o n , 19 9 4 ) . A n a l y s i s o f A P C s p e c i f i c a c t i v i t y w h e n i t w a s b o u n d t o d i f f e r e n t p h o s p h o l i p i d s s h o w e d that A P C b o u n d t o P C h a d t h e h i g h e s t s p e c i f i c a c t i v i t y , f o l l o w e d b y P E a n d P S . F u r t h e r m o r e , s i m i l a r to P S - b o u n d A P C , t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f P E - b o u n d A P C w a s a l s o i n c r e a s e d i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I . I n c o n t r a s t , t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f P C - b o u n d A P C w a s u n c h a n g e d . T h i s s u g g e s t s t h a t B 2 G P I h a s P E - b i n d i n g a c t i v i t y t h a t e n h a n c e s A P C a c t i v i t y . T h i s P E - b i n d i n g a c t i v i t y o f B 2 G P I h a s p r e v i o u s l y b e e n r e p o r t e d u s i n g a l i p o s o m a l m o d e l ( H a r p e r et al, 1998). T h e l a c k o f e n h a n c e m e n t o f A P C a c t i v i t y i n P C - c o a t e d w e l l s i s p r o b a b l y d u e to t h e n e g l i g i b l e b i n d i n g o f B 2 G P I t o P C . T h e s e o b s e r v a t i o n s t o g e t h e r s u g g e s t B 2 G P I m a y s e r v e t o e n h a n c e A P C a c t i v i t y o n s u r f a c e s c o n t a i n i n g a m i n o p h o s p h o l i p i d s . E v e n t h o u g h P C - b o u n d A P C e x h i b i t e d h i g h e r s p e c i f i c a c t i v i t y t h a n P E - b o u n d a n d P S - b o u n d A P C , P C - b o u n d A P C p r o b a b l y i s a m i n o r o r e v e n n e g l i g i b l e c o n t r i b u t o r t o A P C a n t i c o a g u l a t i o n a c t i v i t y b y i t s e l f . T h i s i s b e c a u s e A P C b o u n n d o n l y w e a k l y t o P C b u t s t r o n g l y t o P E a n d P S . C o n s e q u e n t l y , h i g h e r t o t a l A P C a c t i v i t y w a s o b s e r v e d i n P E - a n d P S - c o a t e d w e l l s e v e n t h o u g h P E - b o u n d a n d P S - b o u n d A P C h a d a l o w e r s p e c i f i c a c t i v i t y . T h e r e f o r e , t h e t o t a l a c t i v i t y o f A P C e x h i b i t o n a p h o s p h o l i p i d s u r f a c e s h o u l d b e a f u n c t i o n o f b o t h t h e a m o u n t o f A P C d e p o s i t e d a n d t h e 120 s p e c i f i c a c t i v i t y o f A P C o n t h e p h o s p h o l i p i d . T h u s , a m i x t u r e o f p h o s p h o l i p i d t h a t a l l o w s s t r o n g A P C b i n d i n g a n d h i g h A P C s p e c i f i c a c t i v i t y s h o u l d g i v e t h e h i g h e s t t o t a l A P C a c t i v i t y . I n f a c t , t h i s m a y b e o n e o f t h e f a c t o r s f o r t h e o b s e r v a t i o n t h a t p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s c o n t a i n i n g 2 0 % P S a n d 8 0 % P C a r e t h e o p t i m u m p h o s p h o l i p i d m i x t u r e t o s u p p o r t A P C - m e d i a t e d F V a i n a c t i v a t i o n w h e r e a s v e s i c l e s w i t h e i t h e r h i g h e r o r l o w e r p e r c e n t o f P S s u s t a i n e d o n l y l o w e r A P C a c t i v i t y ( B a k k e r et al, 1 9 9 2 ) . A l s o , t h e f a c t t h a t t h e G l a - d o m a i n c o n t a i n s a c o m b i n a t i o n o f a n i o n i c p h o s p h o l i p i d b i n d i n g r e g i o n as w e l l as h y d r o p h o b i c b i n d i n g s i t e ( J a l b e r t et al, 1996; C h r i s t i a n s e n et al, 1 9 9 5 ; Z h a n g a n d C a s t e l l i n o , 1 9 9 4 ) f u r t h e r r a i s e s t h e p o s s i b i l i t y t h a t A P C m a y e x h i b i t h i g h e r e n z y m a t i c a c t i v i t y w h e n a m i x t u r e o f d i f f e r e n t p h o s p h o l i p i d s i s a v a i l a b l e f o r t h e G l a - d o m a i n . A P C b i n d i n g t o B 2 G P I w a s f o u n d t o b e i n d e p e n d e n t o f a m i n o p h o s p h o l i p i d s as A P C r e a d i l y b o u n d t o B 2 G P I a d s o r b e d t o o x i d i z e d E L I S A p l a t e s i n a c a l c i u m - d e p e n d e n t m a n n e r . T h e r e f o r e , t h e a m i n o p h o s p h o l i p i d s m a y s e r v e t o l o c a l i z e t h e t w o p r o t e i n s i n c l o s e p r o x i m i t y f o r i n t e r a c t i o n . S t u d i e s h a v e s h o w n t h a t w h e n B 2 G P I i s a d s o r b e d t o t h e o x i d i z e d p o l y m e r o f a n E L I S A p l a t e , it w i l l u n d e r g o c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s a n d e x p r e s s n e o - e p i t o p e s f o r B 2 G P I - d e p e n d e n t a n t i p h o s p h o l i p i d a u t o a n t i b o d y b i n d i n g ( C h a m l e y et al, 1999; I c h i k a w a et al, 1994; M a t s u u r a et al, 1994; R o u b e y , 1 9 9 4 ; K a n d i a h a n d R r i l i s , 1994; A r v i e u x et al, 1 9 9 1 ) . T h e i m p o r t a n c e o f t h i s B 2 G P I c o n f o r m a t i o n a l a l t e r a t i o n f o r A P C b i n d i n g w a s e x a m i n e d u s i n g a c o m p e t i t i v e E L I S A . T h e p r e s e n c e o f f l u i d p h a s e B 2 G P I d i d n o t a f f e c t A P C b i n d i n g t o s o l i d p h a s e B 2 G P I . T h i s o b s e r v a t i o n s u g g e s t s t h a t t h e c o n f o r m a t i o n a l a l t e r a t i o n t h a t B 2 G P I u n d e r g o e s u p o n a d s o r p t i o n t o a n o x i d i z e d s u r f a c e i s c r i t i c a l f o r B 2 G P I i n t e r a c t i o n w i t h A P C a n d t h a t t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I a n d f l u i d p h a s e A P C a r e m u c h s t r o n g e r t h a n t h e 121 f l u i d p h a s e i n t e r a c t i o n b e t w e e n B 2 G P I a n d A P C i f t h e l a t t e r o c c u r s at a l l . P r o t e i n S a l s o i n t e r a c t e d w i t h o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I i n a v e r y s i m i l a r m a n n e r . P r o t e i n S - B 2 G P I i n t e r a c t i o n w a s c a l c i u m - d e p e n d e n t a n d s p e c i f i c f o r t h e c o n f o r m a t i o n e x p r e s s e d b y B 2 G P I w h e n o x i d i z e d - s u r f a c e b o u n d . A P C f u n c t i o n w a s a l s o a s s e s s e d i n t h i s s y s t e m t o d e t e r m i n e w h e t h e r o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I h a s t h e s a m e p o t e n t i a t i n g e f f e c t o n A P C s p e c i f i c a c t i v i t y as p h o s p h o l i p i d - b o u n d B 2 G P I . A P C a c t i v i t y w a s i n h i b i t e d b y o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I . T h e r e f o r e , B 2 G P I b o u n d t o a n o x i d i z e d s u r f a c e e x p r e s s e d a n e f f e c t o n A P C o p p o s i t e t o B 2 G P I b o u n d t o p h o s p h o l i p i d s . T h i s i n h i b i t i o n c o u l d b e d u e t o t h e s u b o p t i m a l o r i e n t a t i o n o f A P C f o r S - 2 3 6 6 h y d r o l y s i s w h e n b o u n d t o B 2 G P I a d s o r b e d t o E L I S A p l a t e w i t h o u t p h o s p h o l i p i d . H o w e v e r , i t i s p o s s i b l e t h a t B 2 G P I e x p r e s s e s d i f f e r e n t c o n f o r m a t i o n s d e p e n d i n g o n t h e b i n d i n g s u r f a c e . I f t h i s i s c o r r e c t , B 2 G P I m a y s e r v e t o p o t e n t i a t e as w e l l as i n h i b i t A P C a c t i v i t y d e p e n d i n g w h e t h e r i t i s i n t h e A P C p o t e n t i a t i o n c o n f o r m a t i o n o r t h e A P C i n h i b i t i o n c o n f o r m a t i o n . T h i s p o s s i b i l i t y m a y h a v e a n i m p o r t a n t i m p l i c a t i o n i n t h e w a y t h a t a n t i - B 2 G P I a u t o a n t i b o d i e s a r e d e t e c t e d i n p l a s m a s a m p l e s . C u r r e n t l y , t w o d i f f e r e n t E L I S A s a r e u s e d i n d e t e c t i n g a n t i - B 2 G P I a u t o a n t i b o d i e s . O n e h a s B 2 G P I d i r e c t l y c o a t e d t o o x i d i z e d E L I S A p l a t e . T h e o t h e r o n e h a s n e g a t i v e l y c h a r g e d p h o s p h o l i p i d , u s u a l l y c a r d i o l i p i n , c o a t e d t o t h e E L I S A p l a t e a n d u s e s f e t a l c a l f s e r u m a s a s o u r c e o f B 2 G P I . T h e t w o m e t h o d s f o r a s s e s s m e n t o f B 2 G P I -d e p e n d e n t a P L m a y i n d u c e d i f f e r e n t B 2 G P I c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s a n d t h e r e f o r e , c a p t u r e d i f f e r e n t s u b s e t s o f c o n f o r m a t i o n - s p e c i f i c a P L . S i n c e b o t h A P C a n d p r o t e i n S c a n i n t e r a c t w i t h B 2 G P I , A P C a n d p r o t e i n S w e r e c o - i n c u b a t e d i n B 2 G P I - c o a t e d w e l l s t o e x a m i n e w h e t h e r t h e y c o u l d i n t e r f e r e w i t h t h e 122 b i n d i n g o f e a c h o t h e r t o B 2 G P I . W h e n 10 p g / m L ( 1 4 5 n M ) o f p r o t e i n S w a s i n c u b a t e d w i t h 10 p g / m L ( 1 6 0 n M ) o f A P C o r l e s s , A P C b i n d i n g t o B 2 G P I w a s s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d . T h e r e f o r e , i t i s l i k e l y t h a t p r o t e i n S h a s a r o l e i n i n h i b i t i n g A P C b i n d i n g t o B 2 G P I s i n c e A P C e x i s t s at a n e v e n l o w e r c o n c e n t r a t i o n i n p l a s m a t h a n i n t h i s e x p e r i m e n t . T h e c o n c e n t r a t i o n o f A P C i n c i r c u l a t i n g b l o o d i s a r o u n d 2 n g / m L ( 3 2 p M ) ( G r u b e r a n d G r i f f i n , 1 9 9 2 ) . T h e l o c a l c o n c e n t r a t i o n o f A P C at a s i t e o f c o a g u l a t i o n a c t i v a t i o n w o u l d b e p r e d i c t e d t o h a v e a h i g h e r A P C c o n c e n t r a t i o n , h o w e v e r , t h e A P C c o n c e n t r a t i o n w o u l d s t i l l b e s u b s t a n t i a l l y l o w e r t h a n t h e p r o t e i n S c o n c e n t r a t i o n at t h e c o a g u l a t i n g s u r f a c e b e c a u s e o f t h e l o w e r p l a s m a c o n c e n t r a t i o n o f its p r e c u r s o r , p r o t e i n C ( 4 p g / m L , 6 4 n M ) ( G r i f f i n et al, 1 9 8 2 ) c o m p a r e d t o p r o t e i n S ( 2 0 p g / m L , 2 9 0 n M ) ( S c h w a r z et al, 1986; F a i r a n d R e v a k , 1984; D a h l b a c k , 1 9 8 3 b ) . A l s o , A P C h a s a l o w e r a f f i n i t y f o r n e g a t i v e l y c h a r g e d p h o s p h o l i p i d (ICj o f 1.5 x 10" 7 M ) e x p o s e d at t h e i n j u r e d s i t e t h a n p r o t e i n S (ICj o f 5 x 10" 8 M ) ( W a l k e r , 1 9 8 1 ) . I n c o n t r a s t , w h e n 10 p g / m L ( 1 6 0 n M ) o f A P C w e r e i n c u b a t e d w i t h 1 0 p g / m L ( 1 4 5 n M ) o f p r o t e i n S o r l e s s , p r o t e i n S b i n d i n g t o B 2 G P I w a s u n a f f e c t e d . T h e r e f o r e , in vivo, A P C i s u n l i k e l y t o a f f e c t p r o t e i n S b i n d i n g t o B 2 G P I s i n c e t h e A P C c o n c e n t r a t i o n w o u l d n o t a t t a i n s u c h h i g h l e v e l s r e l a t i v e t o p r o t e i n S i n p l a s m a as i n t h e e x p e r i m e n t . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t A P C a n d p r o t e i n S m a y b i n d t o d i f f e r e n t b i n d i n g s i t e s o n B 2 G P I w h e r e t h e o c c u p a t i o n o f t h e p r o t e i n S b i n d i n g s i t e b y p r o t e i n S w o u l d i n h i b i t A P C i n t e r a c t i o n w i t h t h e A P C b i n d i n g s i t e b y e i t h e r s t e r i c h i n d e r a n c e o r c o n f o r m a t i o n a l a l t e r a t i o n o f A P C b i n d i n g s i t e . T h i s i n h i b i t i o n o f B 2 G P I -A P C i n t e r a c t i o n b y p r o t e i n S w a s s t u d i e d u s i n g o x i d i z e d p l a t e - b o u n d B 2 G P I . A s d i s c u s s e d a b o v e , o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I m a y e x p r e s s a c o n f o r m a t i o n d i f f e r e n t f r o m p h o s p h o l i p i d - b o u n d B 2 G P I . T h e r e f o r e , p h o s p h o l i p i d - b o u n d B 2 G P I m a y n o t b e 123 s i m i l a r l y a f f e c t e d b y p r o t e i n S. I n f a c t , u s i n g P S - c o a t e d w e l l s , t h e a d d i t i o n o f p r o t e i n S t o A P C a n d 6 2 G P I i n c u b a t i o n s h o w e d n e i t h e r i n h i b i t i o n o f B 2 G P I - m e i d a t e d p o t e n t i a t i o n o f A P C n o r a d d i t i v e o r s y n e r g i s t i c p o t e n t i a t i o n o f A P C . T h i s s u g g e s t s t h a t p r o t e i n S h a s n o e f f e c t o n B 2 G P I - A P C i n t e r a c t i o n w h e n B 2 G P I i s p h o s p h o l i p i d b o u n d . T h u s B 2 G P I m a y e x p r e s s a p r o t e i n S - b i n d i n g c o n f o r m a t i o n o n l y w h e n a d s o r b e d t o o x i d i z e d s u r f a c e b u t n o t w h e n b o u n d t o p h o s p h o l i p i d . T h e r e f o r e , p r o t e i n S m a y s e r v e t o p r e v e n t B 2 G P I o n a n o x i d i z e d s u r f a c e f r o m i n h i b i t i n g A P C w h e r e B 2 G P I i s i n t h e A P C i n h i b i t i o n c o n f o r m a t i o n b u t n o t w h e n B 2 G P I i s i n t h e A P C p o t e n t i a t i o n c o n f o r m a t i o n o n a p h o s p h o l i p i d s u r f a c e . P r o t e i n C , t h e p r e c u r s o r o f A P C , a l s o i n t e r a c t e d w i t h B 2 G P I . T h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s f o r A P C a n d p r o t e i n C b i n d i n g E L I S A p l a t e - b o u n d B 2 G P I w e r e b o t h e s t i m a t e d t o b e 8 0 0 t o 9 0 0 n M b a s e d o n t h e a s s u m p t i o n t h a t a l l B 2 G P I a d s o r b e d to t h e p l a t e w e r e i n t h e o p t i m u m o r i e n t a t i o n f o r A P C a n d p r o t e i n C b i n d i n g . T h e r e f o r e , t h e a c t u a l e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s w o u l d b e e x p e c t e d t o b e e v e n l o w e r d e p e n d i n g o n h o w o p t i m a l l y B 2 G P I w a s o r i e n t e d f o r i n t e r a c t i o n . T h e p l a s m a c o n c e n t r a t i o n s o f B 2 G P I a n d p r o t e i n C a r e 3.7 p M a n d 7 0 n M r e s p e c t i v e l y . T h e r e f o r e , t h e b i n d i n g c o n s t a n t p r e d i c t s a n o t a b l e a m o u n t o f i n t e r a c t i o n b e t w e e n p r o t e i n C a n d B 2 G P I . T h i s i s a l s o t r u e f o r A P C a n d B 2 G P I i n t e r a c t i o n s a s s u m i n g A P C i s p r e s e n t at a l o c a l c o n c e n t r a t i o n s i m i l a r t o t h e p r o t e i n C p l a s m a c o n c e n t r a t i o n d u r i n g a n t i c o a g u l a t i o n . In vivo, t h r o m b o m o d u l i n -t h r o m b i n c o m p l e x a c t i v a t e s p r o t e i n C t o g e n e r a t e A P C ( E s m o n a n d O w e n , 19 8 1 ) . W h e t h e r t h e p r o t e i n C - B 2 G P I i n t e r a c t i o n i s a l s o i n v o l v e d i n t h i s r e a c t i o n r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d . P r o t e i n S i n t e r a c t e d w i t h B 2 G P I w i t h a m o l e c u l a r r a t i o o f 2.9 ± 0.4 ( p r o t e i n S / B 2 G P I ) . S i n c e B 2 G P I i s a m o d u l a r p r o t e i n c o n s i s t i n g o f f i v e S C R d o m a i n s , t h i s p r o t e i n 124 S - G 2 G P I m o l e c u l a r r a t i o c o u l d h a v e r e s u l t e d f r o m i n t e r a c t i o n s o f m o r e t h a n o n e p r o t e i n S m o l e c u l e w i t h d i f f e r e n t S C R d o m a i n s o n t h e s a m e B 2 G P I m o l e c u l e . T h e b i n d i n g o f 1.5 ± 0.2 A P C m o l e c u l e s t o o n e B 2 G P I w a s p r o b a b l y t h e r e s u l t o f A P C - B 2 G P I i n t e r a c t i o n i n a s i m i l a r m a n n e r , n a m e l y a n a v e r a g i n g o f t h e c o m b i n a t i o n o f 2:1 a n d 1:1 b i n d i n g . A n a n a l o g o u s o b s e r v a t i o n o f t w o d i s t i n c t b i n d i n g s i t e s f o r C 3 b a n d o n e C 4 b b i n d i n g s i t e o n c o m p l e m e n t r e c e p t o r 1, a p r o t e i n w i t h 3 0 S C R d o m a i n s , h a s b e e n r e p o r t e d ( K l i c k s t e i n et al, 1988). A l s o , t h e b i n d i n g o f C 4 b ( H a r d i g et al, 1997, K r i s t e n s e n et al, 1987, D a h l b a c k et al, 1 9 8 3 ) a n d f a c t o r I ( C h u n g a n d R e i d , 1 9 8 5 ) t o d i f f e r e n t S C R d o m a i n s o n C 4 B P f u r t h e r d e m o n s t r a t e t h e i n t e r a c t i o n s o f p r o t e i n s w i t h d i f f e r e n t S C R s o n t h e s a m e m o l e c u l e . I n s u m m a r y , B 2 G P I c a n p o t e n t i a t e A P C s p e c i f i c a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f a m i n o p h o s p h o l i p i d , n a m e l y P E a n d P S . A m i n o p h o s p h o l i p i d s a r e n o r m a l l y s e q u e s t e r e d t o t h e i n n e r l e a f l e t o f t h e p h o s p h o l i p i d b i l a y e r o f p l a t e l e t s a s w e l l as o t h e r c e l l s a n d o n l y e x p r e s s e d w h e n c e l l s a r e a c t i v a t e d o r l y s e d . T h e r e f o r e , t h e p o t e n t i a t i o n o f A P C a c t i v i t y b y B 2 G P I p r o b a b l y o c c u r s as a c o o r d i n a t e d e v e n t a s s o c i a t e d w i t h t h e c o n c o m i t a n t e v e n t o f a m i n o p h o s p h o l i p i d e x p r e s s i o n d u r i n g p l a t e l e t a c t i v a t i o n o r a p o p t o s i s . T h e p e r t u r b a t i o n o f t h i s B 2 G P I - A P C i n t e r a c t i o n b y B 2 G P I - b i n d i n g a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s m a y e x p l a i n i m p a i r e d A P C a c t i v i t y a n d i n c r e a s e d r i s k o f t h r o m b o s i s o b s e r v e d i n p a t i e n t s w i t h a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . H o w e v e r , t h e a s s o c i a t i o n o f B 2 G P I d e f i c i e n c y a n d t h r o m b o t i c r i s k h a s y e t to b e e s t a b l i s h e d . E v e n t h o u g h B 2 G P I d e f i c i e n c y w a s i n i t i a l l y r e p o r t e d n o t t o b e a r i s k f a c t o r f o r t h r o m b o s i s ( B a n c s i et al, 1 9 9 2 ) , t h e r e i s n o w g r o w i n g e v i d e n c e that t h e l e v e l o f B 2 G P I m a y b e l i n k e d w i t h t h r o m b o t i c r i s k 125 ( B r i g h t o n et al, 1 9 9 6 ; M c N a l l y et al, 1995; M c N a l l y et al, 1995; V l a c h o y i a n n o p o u l o s etal, 1 9 9 2 ) . 7.2 B 2 G P I I n t e r a c t i o n s w i t h P r o t e i n S a n d C 4 B P B 2 G P I h a s b e e n s h o w n t o d o w n - r e g u l a t e p r o t e i n S - C 4 B P c o m p l e x f o r m a t i o n ( M e r r i l l et al, 1999; A t s u m i et al, 1 9 9 7 ) . T h e m e c h a n i s m o f t h i s t r i - m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n w a s f u r t h e r c h a r a c t e r i z e d a n d c o n f i r m e d h e r e b y i n v e s t i g a t i n g t h e i n t e r a c t i o n s o f t h e p r o t e i n S - C 4 B P s y s t e m w i t h B 2 G P I b o u n d t o a n o x i d i z e d s u r f a c e o r t o S e p h a r o s e b e a d s i n b o t h a p u r i f i e d p r o t e i n s y s t e m a n d p l a s m a . R e s u l t s i n d i c a t e t h a t B 2 G P I c a n i n t e r a c t w i t h C 4 B P i n a c a l c i u m - d e p e n d e n t m a n n e r . A l s o , B 2 G P I c a n p r e v e n t t h e f o r m a t i o n o f t h e p r o t e i n S - C 4 B P c o m p l e x b y c o m p e t i n g w i t h p r o t e i n S f o r t h e B - c h a i n o f C 4 B P . A s a r e s u l t o f t h i s c o m p e t i t i o n , B 2 G P I m a y f u n c t i o n t o i n c r e a s e f r e e p r o t e i n S l e v e l b y p r o m o t i n g t h e d i s s o c i a t i o n o f p r o t e i n S f r o m p r o t e i n S - C 4 B P c o m p l e x . C o n f o r m a t i o n a l a l t e r a t i o n o f B 2 G P I b y a d s o r b i n g t o a n o x i d i z e d s u r f a c e w a s a n i m p o r t a n t p r e - r e q u i s i t e f o r t h i s i n t e r a c t i o n s i n c e f l u i d p h a s e B 2 G P I d i d n o t i n h i b i t C 4 B P f r o m b i n d i n g t o B 2 G P I a d s o r b e d t o t h e p l a t e . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e c o n f o r m a t i o n a l l y a l t e r e d B 2 G P I a d s o r b e d t o o x i d i z e d s u r f a c e s c a n b i n d t o f l u i d p h a s e C 4 B P m o r e r e a d i l y t h a n f l u i d p h a s e B 2 G P I d o e s . T a k e n t o g e t h e r , t h e s e f i n d i n g s s u g g e s t t h a t o x i d i z e d s u r f a c e b o u n d - B 2 G P I 1) p r e v e n t e d p r o t e i n S f r o m b i n d i n g t o C 4 B P b y c o m p e t i n g f o r t h e B - c h a i n o n C 4 B P , a n d 2) i n t e r a c t e d d i r e c t l y w i t h p r o t e i n S w h e n B 2 G P I w a s n o t o c c u p i e d b y C 4 B P ( F i g u r e 3 0 ) . T h e s e r e s u l t s h o w e v e r a r e i n d i s c r e p a n c y w i t h t h e r e p o r t b y M e r r i l l et a l ( M e r r i l l et al, 1 9 9 9 ) tha t s h o w e d B 2 G P I i n f l u i d p h a s e c a n i n h i b i t p r o t e i n S b i n d i n g t o 126 C 4 B P . T h i s d i s c o r d a n c e p e r h a p s d e m o n s t r a t e s t h a t B 2 G P I c a n m o d u l a t e p r o t e i n S - C 4 B P c o m p l e x f o r m a t i o n i n t w o d i f f e r e n t w a y s . I n f l u i d p h a s e , B 2 G P I m a i n t a i n s t h e f r e e p r o t e i n S l e v e l b y c o n t r o l l i n g p r o t e i n S b i n d i n g t o C 4 B P s y s t e m i c a l l y . W h e n a s u i t a b l e s u r f a c e o r b i o l o g i c a l p r o c e s s a l t e r s t h e B 2 G P I c o n f o r m a t i o n , t h e d i s s o c i a t i o n o f p r o t e i n S f r o m C 4 B P b e c o m e s m u c h m o r e r a p i d a n d l e a d s t o a d r a m a t i c i n c r e a s e i n f r e e p r o t e i n S l o c a l c o n c e n t r a t i o n . S u r f a c e s t h a t m a y a l l o w B 2 G P I b i n d i n g i n c l u d e a c t i v a t e d p l a t e l e t s ( V a z q u e z - M e l l a d o et al, 1994; N i m p f et al, 1985; S c h o u s b o e , 1 9 8 3 ) , e n d o t h e l i a l c e l l s ( M e r o n i et al, 1998; G e o r g e et al, 1998; D e l P a p a et al, 1 9 9 8 ; D e l P a p a et al, 1997; D e l P a p a et al, 1997; D e l P a p a et al, 1995; L e T o n q u e z e et al, 1 9 9 5 ) , l i p o p r o t e i n s ( G a m b i n o et al, 1999; C a r d i g a n et al, 1998; H a s u n u m a et al, 1997; M c N a l l y et al, 1996; P o l z et al, 1 9 8 1 ; P o l z et al, 1980), a p o p t o t i c b o d i e s ( L e v i n e et al, 1998; B a l a s u b r a m a n i a n a n d S c h r o i t , 1998; M a n f r e d i et al, 1998; B a l a s u b r a m a n i a n et al, 1997; P r i c e et al, 1 9 9 6 ) , as w e l l as c e r t a i n s t r a i n s o f Staphylococcus aureus ( Z h a n g et al, 1 9 9 9 ) . E x p o s u r e o f p l a s m a t o a n t i - B 2 G P I S e p h a r o s e a l s o d e c r e a s e d t h e i m m u n o l o g i c a l l y m e a s u r a b l e f r e e p r o t e i n S l e v e l s c o m p a r e d to c o n t r o l s , a n o t h e r i n d i c a t i o n o f d i r e c t B 2 G P I - p r o t e i n S i n t e r a c t i o n ( M a r j a n , 1 9 9 4 ) . H o w e v e r , f u n c t i o n a l p r o t e i n S a s s a y s o f a n t i - B 2 G P I - S e p h a r o s e t r e a t e d p l a s m a d i d n o t s h o w a n y s i g n i f i c a n t c h a n g e s i n p r o t e i n S a c t i v i t y c o m p a r e d to c o n t r o l . T h e s e r e s u l t s w e r e i n c o n t r a s t t o t h e i m m u n o l o g i c f r e e p r o t e i n S m e a s u r e m e n t s . T h i s s u g g e s t e d t h a t t h e d e p l e t i o n o f B 2 G P I w o u l d l e a d t o l o w e r i m m u n o l o g i c a l f r e e p r o t e i n S l e v e l b u t u n a f f e c t e d f u n c t i o n a l p r o t e i n S a c t i v i t y . T h e u n d e r l y i n g r e a s o n f o r t h e s e s e e m i n g l y o p p o s i t e o b s e r v a t i o n s m a y b e d u e t o a s e n s i t i v i t y o f f r e e p r o t e i n S a c t i v i t y t o c h a n g e s i n B 2 G P I c o n c e n t r a t i o n . T h e d e p l e t i o n o f B 2 G P I 127 F i g u r e 30. B 2 G P I I n t e r a c t i o n s w i t h C 4 B P a n d P r o t e i n S. 128 m a y a c t u a l l y a l l o w t h e r e s i d u a l p r o t e i n S to b i n d a n i o n i c p h o s p h o l i p i d s i n t h e f u n c t i o n a l a s s a y m o r e e f f i c i e n t l y b e c a u s e o f t h e l a c k o f c o m p e t i t i o n w i t h 132GPI. A s a r e s u l t o f m o r e e f f i c i e n t b i n d i n g , p r o t e i n S w o u l d e x h i b i t a n o r m a l a c t i v i t y l e v e l e v e n t h o u g h t h e a c t u a l a m o u n t o f p r o t e i n S w a s d e c r e a s e d . T h e r e f o r e , B 2 G P I m a y m o d u l a t e p r o t e i n S a c t i v i t y i n p l a s m a a n d t h e r e m o v a l o f B 2 G P I c o u l d a f f e c t p r o t e i n S a c t i v i t y . T h e s p e c i f i c e f f e c t o f B 2 G P I o n p r o t e i n S a c t i v i t y w a s t h e n e x a m i n e d b y i n c u b a t i n g p l a s m a w i t h B 2 G P I - S e p h a r o s e . A f t e r t h e i n c u b a t i o n , B 2 G P I - S e p h a r o s e w a s r e m o v e d a n d p r o t e i n S a c t i v i t y i n p l a s m a w a s m e a s u r e d w i t h o u t d i s t u r b i n g t h e B 2 G P I l e v e l . F u n c t i o n a l p r o t e i n S a s s a y s o f t h e s e s a m p l e s s h o w e d tha t p l a s m a i n c u b a t e d w i t h B 2 G P I - S e p h a r o s e h a d l o w e r p r o t e i n S a c t i v i t y l e v e l s ; t h u s t h e l e v e l o f B 2 G P I m a y m o d u l a t e f r e e p r o t e i n S a c t i v i t y i n s u c h a s s a y s . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t B 2 G P I , p r o t e i n S, a n d a n i o n i c p h o s p h o l i p i d t o g e t h e r a r e i n t r i c a t e l y b a l a n c e d i n t h e a n t i c o a g u l a t i o n m e c h a n i s m . A l s o , t h e f a c t t h a t p r o t e i n S i n t e r a c t e d w i t h B 2 G P I - S e p h a r o s e s u g g e s t s t h a t t h e c r o s s l i n k i n g o f B 2 G P I to S e p h a r o s e m a y a l s o i n d u c e s c o n f o r m a t i o n a l a l t e r a t i o n s o n B 2 G P I s i m i l a r t o t h o s e c a u s e d b y t h e a d s o r p t i o n t o a n o x i d i z e d s u r f a c e . T h e e x p e r i m e n t s i n t h i s s t u d y d e m o n s t r a t e d t h a t c o n f o r m a t i o n a l l y a l t e r e d B 2 G P I w a s a b l e t o p r e v e n t p r o t e i n S - C 4 B P c o m p l e x f o r m a t i o n as w e l l as i n t e r a c t w i t h p r o t e i n S. H o w e v e r , w h e t h e r B 2 G P I - b o u n d p r o t e i n S s t i l l p o s s e s s e s a n t i c o a g u l a n t a c t i v i t y u p o n b i n d i n g r e m a i n s t o b e d e t e r m i n e d . T h i s i n t e r a c t i o n c o u l d b e p r o c o a g u l a n t b y c a u s i n g t h e l o c a l r e d u c t i o n i n p r o t e i n S c o n c e n t r a t i o n i n t h e p r e s e n c e o f c o n f o r m a t i o n a l l y a l t e r e d B 2 G P I w i t h a c o n c o m i t a n t l o s s o f f r e e p r o t e i n S c o f a c t o r a c t i v i t y . A l t e r n a t i v e l y , B 2 G P I -p r o t e i n S i n t e r a c t i o n m i g h t f o r m a c o m p l e x t h a t i s a n t i c o a g u l a n t . T h e l a t t e r s c e n a r i o 1 2 9 s e e m s m o r e l i k e l y c o n s i d e r i n g t h e o b s e r v a t i o n o f i n c r e a s e d p r o t e i n S a c t i v i t y w h e n e x o g e n o u s B 2 G P I w a s a d d e d ( M e r r i l l et al, 1999). 7.3 E f f e c t s o f a P L o n B 2 G P I I n t e r a c t i o n s w i t h A P C , P r o t e i n S, a n d C 4 B P S t r o n g a s s o c i a t i o n s b e t w e e n th e p r e s e n c e i n a p a t i e n t ' s b l o o d o f a n t i b o d i e s w i t h r e a c t i v i t y t o B 2 G P I o n a n E L I S A p l a t e a n d t h r o m b o s i s h a v e b e e n r e p o r t e d ( D a y et al, 1998; A r n o u t et al, 1998; T a k e y a et al, 1997; S w a d z b a et al, 1997; W i l l e m s et al, 1996; P e n g o et al, 1996; C a b i e d e s et al, 1995). S t u d i e s h a v e i n d i c a t e d t h a t s t r o n g b i n d i n g o f a P L t o B 2 G P I i s m e d i a t e d b y t h e e x p r e s s i o n o f n e o - e p i t o p e ( s ) o n B 2 G P I w h e n b o u n d t o o x i d i z e d s u r f a c e ( I c h i k a w a et al, 1994; M a t s u u r a et al, 1994; R o u b e y , 1994; K a n d i a h a n d K r i l i s , 1994; A r v i e u x et al, 1991). E x p e r i m e n t s h a v e s h o w n h e r e t h a t a n a P L I g G p o o l c o u l d i n h i b i t A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P b i n d i n g t o o x i d i z e d s u r f a c e b o u n d B 2 G P I i n a c o n c e n t r a t i o n - d e p e n d e n t m a n n e r . S i n c e A P C a n d p r o t e i n S a r e i m p o r t a n t p h y s i o l o g i c a n t i c o a g u l a n t s , t h e i n t e r f e r e n c e o f t h e n o r m a l i n t e r a c t i o n s o f B 2 G P I w i t h t h e s e h e m o s t a t i c p r o t e i n s m a y l e a d t o t h r o m b o g e n e s i s . I n v e s t i g a t i o n s o f t h e t h r o m b o g e n i c m e c h a n i s m s i n v o l v e d i n A P S s u g g e s t e d t h a t A P C a c t i v i t i e s c o u l d b e i m p a i r e d b y a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s ( a P L ) . S i x t y - t w o p e r c e n t o f 4 2 A P S p a t i e n t s i n t h e s t u d y o f G a l l i et a l ( G a l l i et al, 1 9 9 8 ) , 2 3 % o f 3 0 A P S p a t i e n t s i n t h e s t u d y o f O o s t i n g et a l ( O o s t i n g et al, 1993), 7 8 % o f 9 A P S p a t i e n t s i n t h e s t u d y o f M a l i a et a l ( M a l i a et al, 1990), a n d 100 % o f 15 p a t i e n t s p o s i t i v e f o r L A i n t h e s t u d y o f M a r c i n i a k et a l ( M a r c i n i a k a n d R o m o n d , 19 8 9 ) e x h i b i t e d i n h i b i t i o n o f A P C -m e d i a t e d F V a i n a c t i v a t i o n . I n a n o t h e r s t u d y , 4 7 % o f 7 8 a P L p o s i t i v e p a t i e n t s a n t i b o d i e s 130 b o u n d p r o t e i n C v i a B 2 G P I ( A t s u m i et al, 1 9 9 8 ) . T h e r e f o r e , i n h i b i t i o n o f A P C a c t i v i t y i s a p r e v a l e n t f e a t u r e f o r A P S p a t i e n t s . A r e d u c t i o n i n t o t a l A P C a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f p o o l e d a P L I g G w a s a l s o o b s e r v e d u s i n g t h e A P C a c t i v i t y E L I S A d e v e l o p e d f o r t h i s s t u d y . D e s p i t e t h e d e c r e a s e i n t o t a l A P C a c t i v i t y , a c o n c o m i t a n t i n c r e a s e i n A P C s p e c i f i c a c t i v i t y a s s o c i a t e d w i t h t h e a d d i t i o n o f b y a P L I g G i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I w a s o b s e r v e d . T h i s i n c r e a s e i n A P C s p e c i f i c a c t i v i t y , h o w e v e r , d i d n o t l e a d t o a h i g h e r t o t a l A P C a c t i v i t y . T h i s i s b e c a u s e a P L I g G i n h i b i t e d A P C b i n d i n g t o t h e P S - c o a t e d w e l l s at s a m e t i m e . A s a r e s u l t o f t h i s i n h i b i t i o n , t h e r e w a s a n o v e r a l l d e c r e a s e i n A P C t o t a l a c t i v i t y . T h e r e f o r e , c o m p a r e d t o A P C i n c u b a t i o n i n P S - w e l l c o - i n c u b a t e d w i t h B 2 G P I a n d N H I g G , c o - i n c u b a t i o n o f A P C , B 2 G P I a n d a P L I g G i n P S - w e l l l e d t o a l o w e r A P C t o t a l a c t i v i t y b e c a u s e o f t h e d e c r e a s e o f A P C b i n d i n g t o P S , e v e n t h o u g h t h e p r e s e n c e o f a P L i n c r e a s e d A P C s p e c i f i c a c t i v i t y . T h i s e n h a n c e m e n t o f A P C s p e c i f i c a c t i v i t y w a s p r o b a b l y m e d i a t e d b y t h e i n c r e a s e i n B 2 G P I s u r f a c e d e n s i t y o n p h o s p h o l i p i d i n t h e p r e s e n c e o f a P L . W h e n B 2 G P I w a s i n c u b a t e d w i t h a P L , m o r e B 2 G P I w a s b o u n d t o t h e P S - c o a t e d s u r f a c e , a n e f f e c t w h i c h h a s a l s o b e e n d e m o n s t r a t e d p r e v i o u s l y b y d i f f e r e n t g r o u p s u s i n g d i f f e r e n t e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s ( A r n o u t et al, 1998; T a k e y a et al, 1997; W i l l e m s et al, 1 9 9 6 ) . T h e r e s u l t o f t h e i n c r e a s e d s u r f a c e d e n s i t y o f B 2 G P I o n P S - c o a t e d s u r f a c e m a y b e t o p r o m o t e e f f i c i e n t i n t e r a c t i o n b e t w e e n B 2 G P I a n d A P C a n d , c o n s e q u e n t l y , i n c r e a s e A P C s p e c i f i c a c t i v i t y . H o w e v e r , t h i s i n t e r p r e t a t i o n i s c o n t r a d i c t e d b y t h e o b s e r v a t i o n t h a t a P L c o u l d b l o c k A P C f r o m i n t e r a c t i n g w i t h B 2 G P I b o u n d t o a n o x i d i z e d s u r f a c e i n t h i s s t u d y . T h i s s e e m i n g l y c o n t r a d i c t o r y i n f o r m a t i o n m a y o r i g i n a t e f r o m t h e h e t e r o g e n e i t y o f a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s . S t u d i e s o f m o n o c l o n a l a P L I g G g e n e r a t e d f r o m A P S p a t i e n t s s h o w e d t h a t p a t i e n t s p o s s e s s e d i n t r a - a n d i n t e r - i n d i v i d u a l 131 h e t e r o g e n e i t y o f a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s a n d t h a t d i f f e r e n t c l o n e s o f a n t i b o d i e s a r e s p e c i f i c f o r B 2 G P I i n d i f f e r e n t c o n f o r m a t i o n s o r b o u n d t o d i f f e r e n t s u r f a c e s ( Z h u et al, 1999; S h a n et al, 1 9 9 8 ) . F o r e x a m p l e , s o m e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a r e s p e c i f i c f o r B 2 G P I b o u n d t o e i t h e r a n i o n i c p h o s p h o l i p i d o r a n o x i d i z e d E L I S A p l a t e w h i l e s o m e m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s a r e o n l y s p e c i f i c f o r B 2 G P I b o u n d t o o n e t y p e o f s u r f a c e o r t h e o t h e r . A s a r e s u l t , i t i s p o s s i b l e t h a t the a n t i b o d i e s that b l o c k e d A P C f r o m b i n d i n g to B 2 G P I b o u n d t o o x i d i z e d s u r f a c e w o u l d l o s s t h e i n h i b i t o r y e f f e c t w h e n B 2 G P I i s b o u n d t o p h o s p h o l i p i d . T h e r e f o r e , t o g a i n c l e a r u n d e r s t a n d i n g o f t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n a P L s p e c i f i c i t y a n d t h r o m b o g e n i c m e c h a n i s m i n v o l v e d , a n a l y s e s o f t h e s p e c i f i c i t i e s o f c l o n e s o f a u t o a n t i b o d i e s i n d i v i d u a l l y f r o m p a t i e n t s w o u l d b e e s s e n t i a l . T h e n e e d t o u s e m o n o c l o n a l a P L t o d i s s e c t t h e c o m p l e x p a t h o g e n i c m e c h a n i s m o f t h e s e a u t o a n t i b o d i e s h a d b e e n d i s c u s s e d b y Z h u e t a l ( Z h u et al, 1 9 9 9 ) . A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s o f d i f f e r e n t i s o t y p e s , s u b c l a s s e s , a n d s p e c i f i c i t i e s h a v e b e e n g e n e r a t e d b y d i f f e r e n t g r o u p s ( O l e e et al, 1 9 9 6 ; H a r m e r et al, 1995; I c h i k a w a et al, 1994; H a s e g a w a et al, 1 9 9 4 ) . T h e s e a n t i b o d i e s w i l l b e i n d i s p e n s a b l e i n t h e e l u c i d a t i o n o f t h e p a t h o g e n i c m e c h a n i s m b y a l l o w i n g t h e i d e n t i f i c a t i o n c l o n e s o f a P L t h a t a r e s p e c i f i c f o r d o m a i n s o n B 2 G P I c r i t i c a l f o r t h e m a i n t e n a n c e o f h e m o s t a t i c b a l a n c e . A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d y b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I h a d b e e n d e t e c t e d u s i n g f l o w c y t o m e t r y ( R e v e r t e r et al, 1995). R a d i o l a b e l e d a n t i - B 2 G P I a P L b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I w a s o b s e r v e d ( S h i et al, 1993). D i r e c t B 2 G P I b i n d i n g a n d B 2 G P I - m e d i a t e d a P L b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s w e r e a l s o r e p o r t e d u s i n g f l o w c y t o m e t r y a n d F I T C - l a b e l e d B 2 G P I a n d a P L ( V a z q u e z -M e l l a d o et al, 1 9 9 4 ) . F u r t h e r m o r e , a n t i - B 2 G P I w i t h l u p u s a n t i c o a g u l a n t a c t i v i t y w a s 132 d e m o n s t r a t e d t o i n h i b i t p r o t h r o m b i n a s e a c t i v i t y o n a c t i v a t e d p l a t e l e t s u r f a c e ( G a l l i et al, 1 9 9 3 ) . T h e s e o b s e r v a t i o n s t o g e t h e r s t r o n g l y s u g g e s t t h a t a c t i v a t e d p l a t e l e t s c a n s u p p o r t B 2 G P I - m e d i a t e d a n t i - B 2 G P I a u t o a n t i b o d i e s d e p o s i t i o n o n a c t i v a t e d p l a t e l e t s u r f a c e a n d m o d u l a t i o n o f c o a g u l a t i o n a c t i v i t y as a r e s u l t o f t h i s b i n d i n g . S i n c e a P L c o u l d i n h i b i t B 2 G P I i n t e r a c t i o n s w i t h A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P , t h e a b i l i t y o f a P L t o i n t e r f e r e w i t h t h e b i n d i n g o f t h e s e p r o t e i n s t o the s u r f a c e o f a c t i v a t e d p l a t e l e t s u s i n g f l o w c y t o m e t r y i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I w a s t e s t e d . H o w e v e r , t h e p r e s e n c e o f a P L d i d n o t i n t e r f e r e w i t h A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P b i n d i n g to a c t i v a t e d p l a t e l e t s . T h i s r e s u l t s u g g e s t s t h a t e v e n t h o u g h a P L c o u l d i n t e r f e r e w i t h B 2 G P I i n t e r a c t i n g w i t h o t h e r p r o t e i n s o n o x i d i z e d s u r f a c e i n t h e a b o v e e x p e r i m e n t s as w e l l as i n f l u i d p h a s e ( M e r r i l l et al, 1 9 9 9 ) , a c t i v a t e d p l a t e l e t s a r e n o t t h e t a r g e t s u r f a c e w h e r e a P L e x e r t its t h r o m b o g e n i c e f f e c t . R e c e n t s t u d i e s h a v e s u g g e s t e d t h a t B 2 G P I d o e s n o t b i n d s i g n i f i c a n t l y t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s ( B r i g h t o n et al, 1999; H a r p e r et al, 1 9 9 8 ) . P l a t e l e t b i n d i n g e x p e r i m e n t s c o n f i r m e d s t u d i e s r e p o r t i n g t h a t e v e n t h o u g h a c t i v a t e d p l a t e l e t s w i t h a n i o n i c p h o s p h o l i p i d e x p o s e d o n c e l l s u r f a c e c a n s u p p o r t p r o t e i n S b i n d i n g , B 2 G P I d o e s n o t b i n d s i g n i f i c a n t l y t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s at p h y s i o l o g i c a l i o n i c s t r e n g t h , p H , a n d c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n (2.5 m M C a 2 + ) . A l s o , a P L h a d n o e f f e c t o n B 2 G P I b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s . T h i s i s i n d i s c o r d a n c e w i t h s t u d i e s t h a t s h o w e d a P L a n d B 2 G P I b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s ( R e v e r t e r et al, 1995; V a z q u e z - M e l l a d o et al, 1994; G a l l i et al, 1993; S h i et al, 1 9 9 3 ) . T h i s d i s c r e p a n c y m a y o r i g i n a t e f r o m v a r i a t i o n s i n t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f c a l c i u m i o n u s e d i n t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e s . B 2 G P I b i n d i n g t o a n i o n i c p h o s p h o l i p i d i s v e r y s e n s i t i v e t o the p r e s e n c e o f c a l c i u m i o n s . U s i n g d i f f e r e n t t e c h n i q u e s , m a r k e d i n h i b i t i o n o f b i n d i n g w a s o b s e r v e d at p h y s i o l o g i c c a l c i u m 133 c o n c e n t r a t i o n c o m p a r e d t o t h e a b s e n c e o f c a l c i u m ( W a n g et al, 1999; H a r p e r et al, 1998; N i m p f et al, 1985; W u r m , 19 8 4 ) . I n s t u d i e s t h a t s h o w e d a P L a n d 132GPI b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s ( R e v e r t e r et al, 1995; V a z q u e z - M e l l a d o et al, 1 9 9 4 ; S h i et al, 1993), c a l c i u m w a s n o t i n c l u d e d i n t h e i n c u b a t i o n m i x t u r e . T h i s m a y a l l o w i n c r e a s e d B 2 G P I b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s . A r e c e n t s t u d y f u r t h e r u n d e r l i n e d t h e i m p o r t a n c e o f c a l c i u m o n th e a c t i v i t y o f a n t i - B 2 G P I l u p u s a n t i c o a g u l a n t ( P e n g o et al, 1 9 9 9 ) . I n t h i s s t u d y , a n t i - B 2 G P I l u p u s a n t i c o a g u l a n t s w e r e s h o w n t o e x h i b i t l u p u s a n t i c o a g u l a n t a c t i v i t y i n t h e d R V V T c l o t t i n g a s s a y o n l y w h e n p l a s m a a n d a n t i b o d i e s w e r e i n c u b a t e d w i t h p h o s p h o l i p i d b e f o r e c a l c i u m i o n s w a s a d d e d as t h e c l o t t i n g i n i t i a t o r . W h e n p h o s p h o l i p i d w a s i n c u b a t e d w i t h c a l c i u m p r i o r b e i n g e x p o s e d t o p l a s m a a n d a n t i b o d i e s , a n t i - B 2 G P I w a s n o t a b l e t o e x h i b i t L A a c t i v i t y . T h e l o s s o f a n t i - B 2 G P I l u p u s a n t i c o a g u l a n t a c t i v i t y i n t h e d R V V T c l o t t i n g a s s a y b y a s i m p l e a l t e r a t i o n o f i n c u b a t i o n s e q u e n c e o f c a l c i u m s h o w e d that c a l c i u m i s a n i m p o r t a n t m o d u l a t o r o f t h e in vitro a n t i c o a g u l a n t a c t i v i t y o f a n t i - B 2 G P I a u t o a n t i b o d i e s . T h i s e f f e c t i s l i k e l y t o b e c a u s e d b y c a l c i u m i n h i b i t i o n o f B 2 G P I b i n d i n g t o p h o s p h o l i p i d . W h e n c a l c i u m i s n o t p r e s e n t , B 2 G P I c a n b i n d t o p h o s p h o l i p i d i n t h e p r e s e n c e o f a n t i - B 2 G P I u n i m p e d e d , w h e r e a s t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m w o u l d i n h i b i t B 2 G P I b i n d i n g . S i n c e B 2 G P I c o u l d n o t b i n d t o P L i n t h e p r e s e n c e o f c a l c i u m , a n t i - B 2 G P I w o u l d n o t b e a b l e t o e x e r t L A a c t i v i t y o n P L s u r f a c e . T h e s e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t B 2 G P I b i n d i n g a s w e l l a s B 2 G P I - m e d i a t e d a n t i - B 2 G P I b i n d i n g to a c t i v a t e d p l a t e l e t s w o u l d a l s o b e s t r o n g l y a f f e c t e d b y c a l c i u m . T h u s , a n t i - B 2 G P I a n d B 2 G P I m a y n o t b e a b l e t o b i n d t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s at t h e p h y s i o l o g i c a l c o n c e n t r a t i o n o f c a l c i u m . B e s i d e s t h e c o n c e n t r a t i o n o f c a l c i u m , o t h e r f a c t o r s m a y a l s o c o n t r i b u t e t h e d i f f e r e n c e i n B 2 G P I a n d a P L b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s i n d i f f e r e n t s t u d i e s . O n e o f t h e 1 3 4 m a j o r f a c t o r s i s t h e a c t i v i t y o f t h e a P L u s e d i n t h e v a r i o u s s t u d i e s . D i f f e r e n t a m o u n t s o f t o t a l a P L a c t i v i t i e s w e r e u s e d a n d t h i s m a d e c o m p a r i s o n o f t h e d i f f e r e n t s t u d i e s d i f f i c u l t . T h e r e f o r e , t o b e t t e r e v a l u a t e t h e b i n d i n g o f B 2 G P I a n d a P L t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s , the c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n a n d t h e a c t i v i t y o f a P L r e q u i r e d t o i n d u c e in vitro a n t i c o a g u l a n t a c t i v i t y o r in vivo p r o c o a g u l a n t a c t i v i t y n e e d t o b e r e - e x a m i n e d w i t h t h e s e f i n d i n g s i n m i n d . 7.4 Effects of aPL on B2GPI Interactions with Complement System and M B L E l e v a t e d l e v e l s o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n ( H a m m o n d et al., 1 9 8 9 ) a n d h y p o c o m p l e m e n t e m i a h a v e b e e n r e p o r t e d f o r p a t i e n t s w i t h A P S ( A r v i e u x et al., 1991; H a z e l t i n e et al., 1 9 8 8 ) . T h e r e f o r e , t h e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n p r o c e s s i n A P S a n d t h e p o s s i b l e r o l e o f B 2 G P I w e r e e x a m i n e d t o g a i n m o r e u n d e r s t a n d i n g o f t h e u n d e r l y i n g m e c h a n i s m . E x p e r i m e n t s s h o w e d t h a t C 4 B P c o u l d i n t e r a c t w i t h o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I t h r o u g h t h e B - c h a i n o f C 4 B P a n d t h a t t h e C 4 b - b i n d i n g s i t e s o f C 4 B P w e r e n o t i n v o l v e d i n C 4 B P - B 2 G P I i n t e r a c t i o n . F r o m t h e s e o b s e r v a t i o n s , t h e C 4 b - b i n d i n g s i t e s o n B 2 G P I - b o u n d C 4 B P a p p e a r e d t o b e u n o c c u p i e d a n d a v a i l a b l e f o r c o m p l e m e n t r e g u l a t i o n . T h u s , B 2 G P I m a y p l a y a r o l e i n l o c a l i z i n g C 4 B P t o s u r f a c e s t h a t p e r m i t B 2 G P I b i n d i n g . H o w e v e r , t h i s i n t e r a c t i o n c a n b e i n h i b i t e d b y a P L . P e r t u r b a t i o n o f t h i s i n t e r a c t i o n b y a P L c a n p o t e n t i a l l y d y s r e g u l a t e c o m p l e m e n t r e g u l a t i o n a n d l e a d t o t h e e l e v a t e d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n i n A P S . M a n n o s e b i n d i n g l e c t i n ( M B L ) i s a n o l i g o m e r i c p r o t e i n i n v o l v e d i n t h e c l a s s i c a l c o m p l e m e n t p a t h w a y a c t i v a t i o n ( O h t a et al., 1990; L u et al., 1 9 9 0 ; I k e d a et al, 1987). 135 P u r i f i c a t i o n o f B 2 G P I u s i n g a n t i - h u m a n B 2 G P I i m m u n o a f f i n i t y S e p h a r o s e b e a d s l e d t o t h e c o - i m m u n o p r e c i p i t a t i o n o f M B L ( M a r j a n , 1 9 9 4 ) . T h u s , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e r e i s a s p e c i f i c i n t e r a c t i o n b e t w e e n M B L a n d B 2 G P I . U s i n g E L I S A s , d i r e c t M B L - B 2 G P I i n t e r a c t i o n w a s f o u n d t o p r o c e e d i n a c a l c i u m - d e p e n d e n t f a s h i o n . B i n d i n g s t u d i e s h a v e s h o w n that t h e c a l c i u m - d e p e n d e n t c a r b o h y d r a t e r e c o g n i t i o n d o m a i n o f M B L b i n d s o n l y to s u g a r c o n t a i n i n g a n e q u a t o r i a l 4 - O H g r o u p (e.g. N - a c e t y l m a n n o s a m i n e , m a n n o s e , N -a c e t y l g l u c o s a m i n e a n d g l u c o s e ) b u t n o t s u g a r c o n t a i n i n g a n a x i a l 4 - O H (e.g. N -a c e t y l g a l a c t o s a m i n e a n d g a l a c t o s e ) ( E l g a v i s h a n d S h a a n a n , 1997; K a w a s a k i et al, 1 9 8 9 ) . S i n c e M B L - B 2 G P I i n t e r a c t i o n w a s i n h i b i t e d b y N - a c e t y l m a n n o s a m i n e b u t n o t g a l a c t o s e i n t h e e x p e r i m e n t s p e r f o r m e d h e r e , t h e i n t e r a c t i o n w a s m o s t l i k e l y m e d i a t e d b y t h e c a r b o h y d r a t e r e c o g n i t i o n d o m a i n s o n M B L a n d t h e s u g a r r e s i d u e s o n B 2 G P I . C a r b o h y d r a t e a n a l y s e s o f B 2 G P I f r o m o t h e r s t u d i e s i n d e e d s h o w t h a t B 2 G P I c o n t a i n s s u g a r r e s i d u e s t h a t c a n i n t e r a c t w i t h M B L , n a m e l y t e r m i n a l m a n n o s e a n d t e r m i n a l f u c o s e r e s i d u e s ( G a m b i n o et al, 1997; G a m b i n o et al, 1997; G a m b i n o et al, 1997). M B L -B 2 G P I i n t e r a c t i o n h a d a ICj o f 7.43 ± 4.42x 1 0 " 7 M a n d a M B L / B 2 G P I m o l a r r a t i o 0.6 ± 0.3 at 3 7 ° C . T h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r M B L b i n d i n g t o a s t r a i n o f E. coli r i c h i n m a n n o s e - d e r i v a t i v e s o n t h e b a c t e r i a s u r f a c e i s 6 x 10" 9 M ( K a w a s a k i et al, 1 9 8 9 ) . T h e r e f o r e , M B L b i n d i n g t o E. coli i s t w o o r d e r s o f m a g n i t u d e s t r o n g e r t h a n b i n d i n g t o B 2 G P I . H o w e v e r , M B L a l s o h a s p h o s p h o l i p i d b i n d i n g a c t i v i t y ( K i l p a t r i c k , 1 9 9 8 ) . T h e s t r o n g e r a f f i n i t y o b s e r v e d f o r M B L b i n d i n g t o s u g a r r e s i d u e s o n E, coli t h a n b i n d i n g t o s u g a r r e s i d u e s o n p u r i f i e d B 2 G P I m a y r e s u l t f r o m a c o m b i n e d e f f e c t o f M B L b i n d i n g t o s u g a r r e s i d u e s t o g e t h e r w i t h M B L b i n d i n g t o p h o s p h o l i p i d s o f E. coli. 136 I n t h e p r e s e n c e o f a P L , a n i n c r e a s e d a m o u n t o f M B L d e p o s i t i o n t o B 2 G P I - c o a t e d s u r f a c e w a s o b s e r v e d . T h i s m a y h a v e i m p l i c a t i o n s i n e l e v a t e d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n a n d e n h a n c e d o p s o n i z a t i o n o n M B L - a P L - B 2 G P I c o a t e d s u r f a c e s , s u c h as a c t i v a t e d p l a t e l e t s . It h a s b e e n s h o w n t h a t w h e n M B L i s d e p o s i t e d o n a c e l l s u r f a c e , i t c a n a c t as a n o p s o n i n t o f a c i l i t a t e t h e p h a g o c y t o s i s a n d c l e a r a n c e o f t h e c o a t e d p a r t i c l e s ( T e n n e r et al, 1995; M a l h o t r a et al, 1 9 9 0 ) . D i f f e r e n t m e c h a n i s m s m a y l e a d t o t h e i n c r e a s e i n M B L b i n d i n g t o a P L - B 2 G P I c o m p l e x . A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s m a y h a v e i n d u c e d c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s o n B 2 G P I f o r M B L b i n d i n g t o t h e B 2 G P I s u g a r r e s i d u e s m o r e e f f i c i e n t l y o r m o r e a v i d l y . A l s o , i t i s p o s s i b l e t h a t t h e B 2 G P I - b o u n d a P L c o n t r i b u t e s i t s s u g a r r e s i d u e s , t o g e t h e r w i t h t h e s u g a r r e s i d u e s o n B 2 G P I f o r M B L t o b i n d m o r e a v i d l y t o t h e a P L - B 2 G P I c o m p l e x . A u t o a n t i b o d i e s o f t h e I g G i s o t y p e d e v e l o p e d i n r h e u m a t o i d a r t h r i t i s ( r h e u m a t o i d f a c t o r s ) h a v e b e e n s h o w n to u n d e r g o g l y c o s y l a t i o n c h a n g e s t o u n m a s k t h e t e r m i n a l N - a c e t y l g l u c o s a m i n e r e s i d u e i n t h e F c r e g i o n f o r M B L b i n d i n g ( M a l h o t r a et al, 1 9 9 5 ) . A s a r e s u l t , t h e s e I g G s c a n a c t i v a t e t h e c l a s s i c a l c o m p l e m e n t p a t h w a y b y M B L t h r o u g h t h e l e c t i n p a t h w a y ( S a t o et al, 1 9 9 7 ) . W h e t h e r t h e m e c h a n i s m i n v o l v e d i n t h e e l e v a t e d M B L b i n d i n g t o a P L - B 2 G P I c o m p l e x i s m e d i a t e d b y t h e g l y c o s y l a t i o n c h a n g e s o n a P L s i m i l a r t o t h e a u t o a n t i b o d i e s i n r h e u m a t o i d a r t h r i t i s r e m a i n s t o b e f u r t h e r i n v e s t i g a t e d . A s s o c i a t i o n s b e t w e e n M B L d e f i c i e n c y a n d r e c u r r e n t f e t a l w a s t a g e h a v e b e e n o b s e r v e d i n d i f f e r e n t s t u d i e s . T h e d e f i c i e n c y o f M B L i n m a t e r n a l s e r u m i s a s s o c i a t e d w i t h u n e x p l a i n e d r e c u r r e n t m i s c a r r i a g e ( C h r i s t i a n s e n et al, 1 9 9 9 ; K i l p a t r i c k et al, 1 9 9 5 ) a n d p r e - e c l a m p s i a ( K i l p a t r i c k , 1 9 9 6 ) . R e c u r r e n t f e t a l w a s t a g e a n d p r e - e c l a m p s i a ( A l s u l y m a n et al, 1996; L i m a et al, 1996; K o n et al, 1 9 9 5 ) a r e a l s o c o m m o n 137 m a n i f e s t a t i o n s i n a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . T h e r e f o r e , t h e p o s s i b i l i t y o f a P L - B 2 G P I c o m p l e x c a u s i n g r e c u r r e n t m i s c a r r i a g e b y s e q u e s t e r i n g M B L f r o m b l o o d a n d i n d u c i n g M B L - d e f i c i e n c y d e s e r v e s f u r t h e r a t t e n t i o n ( M a l h o t r a et al, 1 9 9 4 ) . T h e o b s e r v a t i o n o f a P L - m e d i a t e d e n h a n c e d M B L b i n d i n g t o B 2 G P I m a y p o s s i b l y h a v e a c a u s a l r e l a t i o n s h i p w i t h p r e g n a n c y c o m p l i c a t i o n s i n A P S . U s i n g t h e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n E L I S A , s e r a c o n t a i n i n g p o p u l a t i o n s o f a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s t h a t c o u l d a c t i v a t e c o m p l e m e n t b y f o r m i n g a P L - B 2 G P I c o m p l e x e s w e r e i d e n t i f i e d . T h e a c t i v a t i o n o f c o m p l e m e n t a n d f o r m a t i o n o f C 5 b - 9 m a y l e a d t o p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d t h r o m b o s i s , as C 5 b - 9 i s a n e f f e c t i v e p l a t e l e t a c t i v a t o r ( S i m s et al, 1 9 8 8 ) . A n a l y s i s o f s e r u m s a m p l e s p o s i t i v e f o r c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n E L I S A r e v e a l e d a m o d e r a t e c o r r e l a t i o n o f a n t i - B 2 G P I I g M t i t e r t o c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . H o w e v e r , a c o r r e l a t i o n o f a n t i - B 2 G P I I g G t i t e r t o c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n c o u l d n o t b e e s t a b l i s h e d . A l a c k o f c o r r e l a t i o n b e t w e e n a P L t i t e r a n d t h e a P L - m e d i a t e d C 5 b - 9 d e p o s i t i o n o n c a r d i o l i p i n - c o a t e d p o l y s t y r e n e b e a d s h a s a l s o b e e n p r e v i o u s l y b e e n o b s e r v e d u s i n g f l o w c y t o m e t r y ( S t e w a r t et al, 1 9 9 7 ) . T h a t r e p o r t s u g g e s t e d t h a t t h i s c o u l d b e c a u s e d b y t h e d i f f e r e n c e i n a v i d i t y o f a P L i m m u n o g l o b u l i n i n t h e d i f f e r e n t s a m p l e s . A s a r e s u l t , s a m p l e s w i t h a P L i m m u n o g l o b u l i n s o f h i g h a v i d i t y w o u l d e x h i b i t s t r o n g c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n w h e r e a s s a m p l e s w i t h a P L i m m u n o g l o b u l i n s o f l o w a v i d i t y w o u l d e x h i b i t w e a k c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . T h e o b s e r v a t i o n o f t h e b i n d i n g o f C 4 B P t o B 2 G P I s u g g e s t s i t i s a l s o p o s s i b l e t h a t t h e l e v e l o f C 4 B P i n p a t i e n t s ' s e r u m s a m p l e s c o u l d a f f e c t t h e r e l a t i o n s h i p b e t w e e n a P L t i t e r a n d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . W h e n s e r u m s a m p l e s w e r e i n c u b a t e d i n B 2 G P I - c o a t e d w e l l s , a P L a n d C 4 B P w o u l d b i n d t o t h e w e l l s c o n c o m i t a n t l y . T h e r e f o r e , i t i s p o s s i b l e t o h a v e w e a k c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n e v e n f o r a 1 3 8 h i g h a P L t i t e r s a m p l e i f t h e a m o u n t o f B 2 G P I - b o u n d C 4 B P i s h i g h . A l s o , t h e l a c k o f c o r r e l a t i o n m a y b e c a u s e d b y d i f f e r e n c e s i n t h e r e l a t i v e a m o u n t o f t h e d i f f e r e n t I g G s u b c l a s s i n a P L I g G . A m o n g t h e f o u r I g G s u b c l a s s e s , t h e c o m p l e m e n t C l q a c t i v a t i n g a c t i v i t y o f t h e d i f f e r e n t s u b c l a s s e s i s i n t h e f o l l o w i n g o r d e r : I g G 3 ( 4 0 x ) , I g G l ( 6 x ) , I g G 2 ( l x ) a n d I g G 4 ( u n d e t e c t a b l e ) ( H a m i l t o n , 1987). T h e r e f o r e , t h e e x t e n t o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n b y a P L i n s e r u m s a m p l e w i l l d e p e n d o n n o t o n l y t h e a P L l e v e l , b u t the r e l a t i v e a m o u n t s o f I g G 3 , I g G l a n d I g G 2 t o I g G 4 o f a P L . S t u d i e s h a v e s h o w n tha t a P L o c c u r s i n a l l f o u r s u b c l a s s e s w i t h t h e w e a k c o m p l e m e n t a c t i v a t o r I g G 2 s u b c l a s s ( 8 0 % ) as t h e m o s t p r e v a l e n t t y p e ( S a m m a r i t a n o et al, 1997; A r v i e u x et al, 1994; L e v y et al, 1990; G h a r a v i et al, 1 9 8 8 ) . O n e o f t h e s e s t u d i e s a l s o s h o w e d t h a t i n a b o u t 2 5 % o f t h e p a t i e n t s p o s i t i v e f o r b o t h a n t i c a r d i o l i p i n a n d a n t i - B 2 G P I , a P L I g G s u b c l a s s w a s s k e w e d t o w a r d s I g G 3 ( 3 0 t o 6 0 % o f t o t a l a n t i c a r d i o l i p i n I g G ) ( A r v i e u x et al, 1 9 9 4 ) . T h e r e f o r e , it i s p o s s i b l e t h a t a s a m p l e w i t h h i g h a P L t i t e r w o u l d g e n e r a t e l o w c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n i f I g G 2 i s t h e p r e d o m i n a n t I g G s u b c l a s s w h i l e a l o w a P L t i t e r s a m p l e w o u l d g e n e r a t e h i g h c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n i f t h e a P L I g G s u b c l a s s d i s t r i b u t i o n w a s s k e w e d t o w a r d s s t r o n g c o m p l e m e n t a c t i v a t i n g s u b c l a s s e s I g G 3 . T h i s s k e w i n g o f a P L I g G s u b c l a s s m a y a l s o e x p l a i n t h e l a c k o f c o r r e l a t i o n o f a P L I g G t i t e r a n d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . T h e a p p l i c a t i o n o f a n t i p h o s p h o l i p i d E L I S A s ( a C L I g G , a C L I g M , a n t i - B 2 G P I I g M , a n d a n t i - B 2 G P I I g G ) i n d e t e r m i n i n g w h i c h A P S s a m p l e s w i l l c o n t a i n t h e s e c o m p l e m e n t a c t i v a t i n g a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s w a s i n e f f e c t i v e . N o n e o f t h e E L I S A s w a s a s t r o n g p r e d i c t o r o f t h e p r e s e n c e o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i n g a P L . T h i s i n d i c a t e s t h a t t h e c o m p l e m e n t a c t i v a t i n g p o p u l a t i o n o f a n t i b o d i e s i s n o t r e s t r i c t e d t o a n t i c a r d i o l i p i n o r a n t i - B 2 G P I . F u r t h e r m o r e , t h e c o m p l e m e n t a c t i v a t i n g p r o p e r t y o f a n t i p h o s p h o l i p i d w a s 1 3 9 n e i t h e r c o n f i n e d t o I g M n o r I g G i s o t y p e . I n c o n t r a s t , p o s i t i v i t y i n t h e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n E L I S A w a s s t r o n g l y p r e d i c t i v e o f t h e p r e s e n c e o f a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s . T h e r e f o r e , o n l y s o m e o f t h e A P S p a t i e n t s w i l l h a v e s u b s e t s o f a P L t h a t i n d u c e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . I n s u m m a r y , 6 2 G P I m a y p l a y a u n i q u e r o l e i n t h e c o m p l e m e n t s y s t e m b y i n t e r a c t i n g w i t h C 4 B P a n d M B L s i m u l t a n e o u s l y t o b a l a n c e t h e i n h i b i t i o n a n d t h e a c t i v a t i o n o f c o m p l e m e n t o n B 2 G P I - e n r i c h e d s u r f a c e . T h e p r e s e n c e o f a P L m a y d i s r u p t t h i s b a l a n c e a n d p r o m o t e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n a n d C 5 b - 9 f o r m a t i o n . C o m p l e m e n t a c t i v a t i o n o n t h e p l a t e l e t s u r f a c e i n t h e p r e s e n c e o f a P L as a r e s u l t o f C 5 b - 9 d e p o s i t i o n h a s b e e n d e m o n s t r a t e d ( S t e w a r t et al, 1 9 9 7 ) . 7.5 F u t u r e D i r e c t i o n s I n t h i s s t u d y , B 2 G P I w a s f o u n d t o m o d u l a t e A P C a c t i v i t y a n d r e g u l a t e p r o t e i n S-C 4 B P c o m p l e x f o r m a t i o n . O n e o f t h e m a j o r f i n d i n g s i s t h a t B 2 G P I c a n e n h a n c e a n t i c o a g u l a t i o n b y i n c r e a s i n g A P C s p e c i f i c a c t i v i t y as w e l l as i n h i b i t a n t i c o a g u l a t i o n b y d e c r e a s i n g A P C b i n d i n g t o p h o s p h o l i p i d . A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s a l s o e x h i b i t e d t h i s d u a l e f f e c t o n A P C . H o w e v e r , t h e p r e c i s e c o n d i t i o n s u n d e r w h i c h o n e e f f e c t w o u l d b e d o m i n a n t o v e r t h e o t h e r a r e u n k n o w n . T h e d e t e r m i n a t i o n o f c o n d i t i o n s u n d e r w h i c h t h e s e t w o c o m p e t i n g e f f e c t s w o u l d b e i n e q u i l i b r i u m w o u l d g i v e i n s i g h t i n t o t h e c o n d i t i o n t h a t w o u l d c h a n g e a n a n t i t h r o m b o t i c e n v i r o n m e n t i n t o a p r o t h r o m b o t i c one. A l s o , the c h a r a c t e r i z a t i o n o f B 2 G P I - m e d i a t e d A P C p o t e n t i a t i o n w i t h t h e p h y s i o l o g i c a l s u b s t r a t e F V a w o u l d y i e l d i n s i g h t i n t o t h e e n z y m a t i c m e c h a n i s m i n v o l v e d . 1 4 0 P h o s p h o l i p i d - b o u n d a n d o x i d i z e d E L I S A p l a t e - b o u n d B 2 G P I e x h i b i t e d d i f f e r e n t e f f e c t s o n A P C a n d p r o t e i n S. T h i s i s p r o b a b l y d u e t o t h e d i f f e r e n t c o n f o r m a t i o n B 2 G P I e x p r e s s e d w h e n b o u n d t o d i f f e r e n t s u r f a c e s . S t r u c t u r a l s t u d i e s c o u l d b e u n d e r t a k e n t o g a i n u n d e r s t a n d i n g o f t h e i n t e r r e l a t i o n s h i p s b e t w e e n d i f f e r e n t c o n f o r m a t i o n s a n d B 2 G P I a c t i v i t i e s . M o n o c l o n a l a n t i - B 2 G P I a n t i b o d i e s c a n a l s o b e u s e d t o m a p e p i t o p e s t h a t a r e e x p r e s s e d o n l y a f t e r c o n f o r m a t i o n a l a l t e r a t i o n . T h i s m a y h e l p i n i d e n t i f y i n g d o m a i n s o n B 2 G P I i m p o r t a n t f o r m o d u l a t i n g A P C a n d p r o t e i n S a c t i v i t y as w e l l as p i n p o i n t i n g r e g i o n s w h e r e t h r o m b o g e n i c a P L m i g h t b i n d . A l s o , t h e c o n f o r m a t i o n a l c h a n g e s o f B 2 G P I w h e n b o u n d t o d i f f e r e n t s u r f a c e s , s u c h as e n d o t h e l i a l c e l l s , a p o p t o t i c b o d i e s , l i p o p r o t e i n s , a n d S. aureus, w o u l d p r o v i d e k n o w l e d g e a b o u t t h e r o l e o f B 2 G P I o n t h e s e s u r f a c e s . 141 C H A P T E R 8 S U M M A R Y P a t i e n t s w i t h A P S a r e p r e d i s p o s e d t o r e c u r r e n t t h r o m b o s i s , t h r o m b o c y t o p e n i a , a n d r e c u r r e n t m i s c a r r i a g e s . E l e v a t e d l e v e l s o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n a n d h y p o c o m p l e m e n t e m i a h a v e a l s o b e e n r e p o r t e d i n p a t i e n t s w i t h A P S . T h e a d s o r p t i o n o f B 2 G P I to a n o x i d i z e d s u r f a c e i s n e c e s s a r y t o e x p r e s s n e o - e p i t o p e ( s ) f o r a P L b i n d i n g ( C h a m l e y et al, 1999; I c h i k a w a et al, 1994; M a t s u u r a et al, 1994; R o u b e y , 1994; K a n d i a h a n d K r i l i s , 1994; A r v i e u x et al, 1 9 9 1 ) . S t r o n g a s s o c i a t i o n s b e t w e e n t h r o m b o s i s a n d a P L b i n d i n g t o B 2 G P I E L I S A a l s o e x i s t ( D a y et al, 1998; S w a d z b a et al, 1997; P e n g o et al, 1996; C a b i e d e s et al, 1 9 9 5 ) . T h e r e f o r e , t h e p o s s i b l e i n t e r a c t i o n s a m o n g n e o - e p i t o p e ( s ) e x p r e s s e d b y B 2 G P I a n d A P C , p r o t e i n S, C 4 B P , a n d M B L w e r e i n v e s t i g a t e d . B 2 G P I i n t e r a c t e d w i t h t w o a n t i c o a g u l a t i o n p r o t e i n s , A P C a n d p r o t e i n S. B 2 G P I p o t e n t i a t e d A P C s p e c i f i c a c t i v i t y o n t h e a m i n o p h o s p h o l i p i d s P E a n d P S , b u t n o t P C . T h i s e n h a n c e m e n t o f A P C s p e c i f i c a c t i v i t y i n d i c a t e d t h a t t h e r e c o u l d b e a d i r e c t i n t e r a c t i o n b e t w e e n B 2 G P I a n d A P C . T h i s d i r e c t i n t e r a c t i o n w a s c o n f i r m e d t o b e i n d e p e n d e n t o f a m i n o p h o s p h o l i p i d as A P C c o u l d b i n d d i r e c t l y t o B 2 G P I a d s o r b e d t o o x i d i z e d E L I S A p l a t e (K<j 8.7 x 10" 7 M ) . T h e r e f o r e , t h e a m i n o p h o s p h o l i p i d s s e r v e d o n l y t o l o c a l i z e t h e t w o p r o t e i n s i n c l o s e p r o x i m i t y f o r i n t e r a c t i o n . I n a d d i t i o n , A P C b i n d i n g to o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I w a s n o t i n h i b i t e d b y f l u i d p h a s e B 2 G P I . T h i s s u g g e s t e d that o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I e x p r e s s e d a c o n f o r m a t i o n d i f f e r e n t f r o m t h e f l u i d p h a s e B 2 G P I to s u p p o r t A P C b i n d i n g . F u r t h e r i n v e s t i g a t i o n r e v e a l e d t h a t p r o t e i n S c o u l d i n h i b i t A P C b i n d i n g t o B 2 G P I a d s o r b e d t o a n o x i d i z e d s u r f a c e . T h e r e f o r e , p r o t e i n S m a y 142 b e i n v o l v e d i n t h e r e g u l a t i o n o f t h e p o t e n t i a t i o n o f A P C s p e c i f i c a c t i v i t y b y B 2 G P I o n a m i n o p h o s p h o l i p i d s . B 2 G P I a l s o i n t e r a c t e d w i t h p r o t e i n S (Kd 7.35 x 10" 7 M) as w e l l a s C 4 B P (Kd 3.46 x 10" 7 M), a c o m p l e m e n t r e g u l a t o r . C 4 B P a n d p r o t e i n S c i r c u l a t e as a c o m p l e x i n b l o o d . A n a l y s e s o f t h e i n t e r a c t i o n s b e t w e e n B 2 G P I , p r o t e i n S, a n d C 4 B P s h o w e d tha t o x i d i z e d s u r f a c e - b o u n d B 2 G P I 1) p r e v e n t e d p r o t e i n S f r o m b i n d i n g t o C 4 B P b y c o m p e t i n g f o r t h e B - c h a i n , a n d 2) i n t e r a c t e d d i r e c t l y w i t h p r o t e i n S w h e n B 2 G P I w a s n o t o c c u p i e d b y C 4 B P . T h u s , B 2 G P I m a y h a v e a r o l e i n m a i n t a i n i n g f r e e p r o t e i n S l e v e l ( F i g u r e 3 1 ) . A P C i n h i b i t i o n i s a p r e v a l e n t f e a t u r e o f p a t i e n t s w i t h A P S . H o w e v e r , t h e m e c h a n i s m i n v o l v e d h a s n o t b e e n e s t a b l i s h e d . A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s i n h i b i t e d A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P b i n d i n g t o o x i d i z e d s u r f a c e b o u n d B 2 G P I i n a c o n c e n t r a t i o n -d e p e n d e n t m a n n e r . A l s o , a P L w a s f o u n d t o i n c r e a s e A P C s p e c i f i c a c t i v i t y i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I o n P S - c o a t e d s u r f a c e . H o w e v e r , t h i s i n c r e a s e i n A P C s p e c i f i c a c t i v i t y d i d n o t l e a d t o a n i n c r e a s e i n A P C t o t a l a c t i v i t y b e c a u s e a P L , at t h e s a m e t i m e , i n h i b i t e d A P C b i n d i n g t o P S b y i n c r e a s i n g B 2 G P I b i n d i n g . A s a r e s u l t o f t h i s i n h i b i t i o n , t h e r e w a s a n o v e r a l l d e c r e a s e i n A P C t o t a l a c t i v i t y ( F i g u r e 3 2 ) . U s i n g f l o w c y t o m e t r y , t h e e f f e c t o f a P L o n A P C , p r o t e i n S, a n d C 4 B P b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s i n t h e p r e s e n c e o f B 2 G P I w a s e x a m i n e d . T h e p r e s e n c e o f a P L d i d n o t i n t e r f e r e w i t h t h e b i n d i n g o f t h e s e p r o t e i n s t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s u r f a c e . F u r t h e r m o r e , n o s i g n i f i c a n t B 2 G P I b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s w a s f o u n d a n d a P L d i d n o t e n h a n c e B 2 G P I b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s . T h e s e o b s e r v a t i o n s t o g e t h e r i n d i c a t e d t h a t e v e n t h o u g h a P L c a n i n h i b i t A P C a c t i v i t y , a P L d o e s n o t e x e r t its t h r o m b o g e n i c e f f e c t t h r o u g h a c t i v a t e d p l a t e l e t s . 143 Figure 31. Effects of aPL on B2GPI interaction with protein S-C4BP complex. (A) In the absence of aPL, B2GPI may function to prevent protein S from binding to C4BP by competing for the B-chain, and to interact directly with protein S when B2GPI is not occupied by C4BP. Thus, B2GPI may have a role in maintaining free protein S level. (B) In the presence of aPL, B2GPI may be inhibited from interacting with protein S-C4BP complex by aPL. As a result, B2GPI would not increase free protein S level. (A) In the absence of aPL (B) In the presence of aPL 144 F i g u r e 32. E f f e c t s o f a P L o n A P C A c t i v i t y . ( A ) B 2 G P I m a y n o r m a l l y f u n c t i o n t o p o t e n t i a t e A P C a n t i c o a g u l a t i o n a c t i v i t y b y f o r m i n g B 2 G P I - A P C c o m p l e x . (B) T h e p r e s e n c e o f a P L w o u l d i n h i b i t A P C b i n d i n g b y i n c r e a s i n g B 2 G P I d e p o s i t i o n o n t h e a n i o n i c p h o s p h o l i p i d a n d l e a d t o l o w e r t o t a l A P C a c t i v i t y . B2GPI Potentiation of APC 145 B e s i d e s C 4 B P , B 2 G P I a l s o i n t e r a c t e d w i t h a n o t h e r c o m p l e m e n t p r o t e i n , M B L (ICj 7.43 x 1 0 ~ 7 M ) . M B L is a c o m p l e m e n t a c t i v a t o r . A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s i n h i b i t e d C 4 B P b i n d i n g w h i l e e n h a n c i n g M B L b i n d i n g to o x i d i z e d s u r f a c e b o u n d 132GPI. T h e s e m o d u l a t i o n e f f e c t s o f a P L o n B 2 G P I c o u l d g e n e r a t e a c o n d i t i o n t h a t p r o m o t e s c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . B 2 G P I - c o a t e d E L I S A w e l l s w e r e u s e d t o c a p t u r e a P L f r o m p a t i e n t s e r u m s to f o r m a P L - B 2 G P I c o m p l e x e s . T h e s e a P L - B 2 G P I c o m p l e x e s w e r e i n c u b a t e d w i t h n o r m a l h u m a n s e r u m a n d t h e l e v e l s o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n w e r e q u a n t i f i e d b y m e a s u r i n g C 5 b - 9 f o r m a t i o n . N i n e t e e n o u t o f f o r t y (47.5 % ) p a t i e n t s s e r u m s a m p l e s c o n t a i n e d a P L t h a t c o u l d l e a d t o t h e g e n e r a t i o n o f C 5 b - 9 . A m o d e r a t e c o r r e l a t i o n w a s f o u n d b e t w e e n th e l e v e l o f C 5 b - 9 p r o d u c e d a n d t h e l e v e l o f a n t i - B 2 G P I I g M . N o c o r r e l a t i o n s w e r e f o u n d b e t w e e n th e l e v e l o f C 5 b - 9 p r o d u c e d a n d t h e l e v e l s o f a n t i c a r d i o l i p i n I g G / I g M a n d a n t i - B 2 G P I I g G i n t h e sera. H o w e v e r , C 5 b - 9 f o r m a t i o n w a s o n l y o b s e r v e d i n s a m p l e s c o n t a i n i n g a P L . T h e i n t e r a c t i o n s a m o n g B 2 G P I , C 4 B P , M B L , a n d a P L m a y h a v e s i g n i f i c a n c e f o r c l i n i c a l m a n i f e s t a t i o n s o f A P S s u c h as c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n , p l a t e l e t a c t i v a t i o n , t h r o m b o c y t o p e n i a , a n d r e c u r r e n t p r e g n a n c y l o s s . I n s u m m a r y , B 2 G P I m a y n o r m a l l y i n t e r a c t w i t h A P C , p r o t e i n S, C 4 B P , a n d M B L t o m a i n t a i n a n t i c o a g u l a t i o n a n d r e g u l a t e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . H o w e v e r , i n A P S p a t i e n t s , a P L m a y i n t e r f e r e w i t h t h e s e p r o t e i n i n t e r a c t i o n s , a n d t h e r e b y d i s r u p t t h e a n t i c o a g u l a t i o n m e c h a n i s m , p r e d i s p o s i n g A P S p a t i e n t s to t h r o m b o s e s , a n d i n c r e a s e c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . 146 REFERENCES A l a r c o n - S e g o v i a , D., D e l e z e , M., O r i a , C.V., S a n c h e z - G u e r r e r o , J., G o m e z - P a c h e c o , L., C a b i e d e s , J., F e r n a n d e z , L., a n d P o n c e , d.L. ( 1 9 8 9 ) A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s a n d t h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e i n s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . A p r o s p e c t i v e a n a l y s i s o f 5 0 0 c o n s e c u t i v e p a t i e n t s . Medicine (Baltimore) 68, 3 5 3 -3 6 5 . 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A m e s , P.R., T o m m a s i n o , C , I a n n a c c o n e , L., B r i l l a n t e , M., C i m i n o , R., a n d B r a n c a c c i o , V . ( 1 9 9 6 ) C o a g u l a t i o n a c t i v a t i o n a n d f i b r i n o l y t i c i m b a l a n c e i n s u b j e c t s w i t h i d i o p a t h i c a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s — a c r u c i a l r o l e f o r a c q u i r e d f r e e p r o t e i n S d e f i c i e n c y . Thromb Haemost 76, 1 9 0 - 1 9 4 . A n d e r s , E.M., H a r t l e y , C.A., R e a d i n g , P.C., a n d E z e k o w i t z , R.A. ( 1 9 9 4 ) C o m p l e m e n t -d e p e n d e n t n e u t r a l i z a t i o n o f i n f l u e n z a v i r u s b y a s e r u m m a n n o s e - b i n d i n g l e c t i n . J Gen Virol 75 (Pt 3), 6 1 5 - 6 2 2 . A r f o r s , L., V e s t e r q v i s t , O., J o h n s s o n , H., a n d G r e e n , K . ( 1 9 9 0 ) I n c r e a s e d t h r o m b o x a n e f o r m a t i o n i n p a t i e n t s w i t h a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . Eur J Clin Invest 20, 6 0 7 -6 1 2 . A r n o u t , J., W i t t e v r o n g e l , C , V a n r u s s e l t , M., H o y l a e r t s , M., a n d V e r m y l e n , J. ( 1 9 9 8 ) B e t a - 2 - g l y c o p r o t e i n I d e p e n d e n t l u p u s a n t i c o a g u l a n t s f o r m s t a b l e b i v a l e n t a n t i b o d y b e t a - 2 - g l y c o p r o t e i n I c o m p l e x e s o n p h o s p h o l i p i d s u r f a c e s . Thromb Haemost 79, 79-86. A r v i e u x , J., P e r n o d , G., R e g n a u l t , V., D a r n i g e , L., a n d G a r i n , J . ( 1 9 9 9 ) S o m e a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s r e c o g n i z e a c o m b i n a t i o n o f p h o s p h o l i p i d s w i t h t h r o m b i n - m o d i f i e d a n t i t h r o m b i n , c o m p l e m e n t C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n , a n d l i p o p o l y s a c c h a r i d e b i n d i n g p r o t e i n . Blood 93, 4 2 4 8 - 4 2 5 5 . A r v i e u x , J., R o u s s e l , B., J a c o b , M.C., a n d C o l o m b , M . G . ( 1 9 9 1 ) M e a s u r e m e n t o f a n t i -p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s b y E L I S A u s i n g b e t a 2- g l y c o p r o t e i n I as a n a n t i g e n . J Immunol Methods 143, 2 2 3 - 2 2 9 . 1 4 7 A r v i e u x , J., R o u s s e l , B., P o n a r d , D., a n d C o l o m b , M.G. ( 1 9 9 1 ) R e a c t i v i t y p a t t e r n s o f a n t i - p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s i n s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s s e r a i n r e l a t i o n t o e r y t h r o c y t e b i n d i n g a n d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . Clin Exp Immunol 84, 4 6 6 - 4 7 1 . A r v i e u x , J., R o u s s e l , B., P o n a r d , D., a n d C o l o m b , M.G. ( 1 9 9 4 ) I g G 2 s u b c l a s s r e s t r i c t i o n o f a n t i - b e t a 2 g l y c o p r o t e i n 1 a n t i b o d i e s i n a u t o i m m u n e p a t i e n t s . Clin Exp Immunol 95, 3 1 0 - 3 1 5 . A s h e r s o n , R.A. ( 1 9 8 8 ) A 'pri m a r y ' a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e ? J Rheumatol 15, 1742-1746. A s h e r s o n , R.A. a n d C e r v e r a , R. ( 1 9 9 3 ) A n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . J Invest Dermatol 100, 2 1 S - 2 7 S . 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( 1 9 9 8 ) B i n d i n g o f a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s t o p r o t e i n C v i a b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I ( b e t a 2 - G P I ) : a p o s s i b l e m e c h a n i s m i n t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s o n th e p r o t e i n C s y s t e m . Clin Exp Immunol 112, 3 2 5 - 3 3 3 . A t s u m i , T., K h a m a s h t a , M.A., A m e s , P.R., I c h i k a w a , K., K o i k e , T., a n d H u g h e s , G.R. ( 1 9 9 7 ) E f f e c t o f b e t a 2 g l y c o p r o t e i n I a n d h u m a n m o n o c l o n a l a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d y o n th e p r o t e i n S / C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n s y s t e m . Lupus 6, 3 5 8 - 3 6 4 . A t s u m i , T., K h a m a s h t a , M.A., A n d u j a r , C , L e a n d r o , M.J., A m e n g u a l , O., A m e s , P.R., a n d H u g h e s , G.R. ( 1 9 9 8 ) E l e v a t e d p l a s m a l i p o p r o t e i n ( a ) l e v e l a n d i t s a s s o c i a t i o n w i t h i m p a i r e d f i b r i n o l y s i s i n p a t i e n t s w i t h a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . J Rheumatol 25, 69-73. B a d u i , E., S o l o r i o , S., M a r t i n e z , E., B r a v o , G., E n c i s o , R., B a r i l e , L., G u t i e r r e z - V o g e l , S., a n d M i r a n d a , J. ( 1 9 9 5 ) T h e h e a r t i n t h e p r i m a r y a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . Arch Med Res 26, 115-120. B a j a j , S.P., R a p a p o r t , S.I., F i e r e r , D.S., H e r b s t , K.D., a n d S c h w a r t z , D.B. ( 1 9 8 3 ) A m e c h a n i s m f o r t h e h y p o p r o t h r o m b i n e m i a o f t h e a c q u i r e d h y p o p r o t h r o m b i n e m i a -l u p u s a n t i c o a g u l a n t s y n d r o m e . Blood 61, 6 8 4 B a k e r , M.E., F r e n c h , F.S., a n d J o s e p h , D.R. ( 1 9 8 7 ) V i t a m i n K - d e p e n d e n t p r o t e i n S i s s i m i l a r t o r a t a n d r o g e n - b i n d i n g p r o t e i n . Biochem J 243, 2 9 3 - 2 9 6 . 148 B a k k e r , H.M., T a n s , G., J a n s s e n - C l a e s s e n , T., T h o m a s s e n , M G . , H e m k e r , H.C., G r i f f i n , J.H., a n d R o s i n g , J. ( 1 9 9 2 ) T h e e f f e c t o f p h o s p h o l i p i d s , c a l c i u m i o n s a n d p r o t e i n S o n r a t e c o n s t a n t s o f h u m a n f a c t o r V a i n a c t i v a t i o n b y a c t i v a t e d h u m a n p r o t e i n C. Eur J Biochem 208, 171-178.. B a l a s u b r a m a n i a n , K., C h a n d r a , J., a n d S c h r o i t , A . J . ( 1 9 9 7 ) I m m u n e c l e a r a n c e o f p h o s p h a t i d y l s e r i n e - e x p r e s s i n g c e l l s b y p h a g o c y t e s . T h e r o l e o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I i n m a c r o p h a g e r e c o g n i t i o n . J Biol Chem 272, 3 1 1 1 3 - 3 1 1 1 7 . B a l a s u b r a m a n i a n , K. a n d S c h r o i t , A . J . ( 1 9 9 8 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f p h o s p h a t i d y l s e r i n e -d e p e n d e n t b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I m a c r o p h a g e i n t e r a c t i o n s . I m p l i c a t i o n s f o r a p o p t o t i c c e l l c l e a r a n c e b y p h a g o c y t e s . J Biol Chem 273, 29272-29277'. B a n c s i , L.F., v a n , d.L., I, a n d B e r t i n a , R.M. ( 1 9 9 2 ) B e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I d e f i c i e n c y a n d t h e r i s k o f t h r o m b o s i s . Thromb Haemost 67, 6 4 9 - 6 5 3 . B e c k m a n n , R.J., S c h m i d t , R.J., S a n t e r r e , R.F., P l u t z k y , J., C r a b t r e e , G.R., a n d L o n g , G.L. ( 1 9 8 5 ) T h e s t r u c t u r e a n d e v o l u t i o n o f a 4 6 1 a m i n o a c i d h u m a n p r o t e i n C p r e c u r s o r a n d i t s m e s s e n g e r R N A , b a s e d u p o n t h e D N A s e q u e n c e o f c l o n e d h u m a n l i v e r c D N A ' s . Acids Res 13, 5 2 3 3 - 5 2 4 7 . B e v e r s , E.M., G a l l i , M., B a r b u i , T., C o m f u r i u s , P., a n d Z w a a l , R.F. ( 1 9 9 1 ) L u p u s a n t i c o a g u l a n t IgG's ( L A ) a r e n o t d i r e c t e d t o p h o s p h o l i p i d s o n l y , b u t t o a c o m p l e x o f l i p i d - b o u n d h u m a n p r o t h r o m b i n . Thromb Haemost 66, 6 2 9 - 6 3 2 . B l a n k , M., K r a u s e , I., L a n i r , N., V a r d i , P., G i l b u r d , B., T i n c a n i , A., T o m e r , Y., a n d S h o e n f e l d , Y . ( 1 9 9 5 ) T r a n s f e r o f e x p e r i m e n t a l a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e b y b o n e m a r r o w c e l l t r a n s p l a n t a t i o n . T h e i m p o r t a n c e o f t h e T c e l l . Arthritis Rheum 38, 115-122. B l o m b a c k , B . a n d B l o m b a c k , M . ( 1 9 7 2 ) T h e m o l e c u l a r s t r u c t u r e o f f i b r i n o g e n . Ann N Y Acad Sci 202, 77-97. B o r c h m a n , D., H a r r i s , E.N., P i e r a n g e l i , S.S., a n d L a m b a , O.P. ( 1 9 9 5 ) I n t e r a c t i o n s a n d m o l e c u l a r s t r u c t u r e o f c a r d i o l i p i n a n d b e t a 2- g l y c o p r o t e i n 1 ( b e t a 2 - G P 1 ) . Clin Exp Immunol 102, 3 7 3 - 3 7 8 . B o u m a , B., d e G r o o t , P.G., v a n D e n E l s e n , J.M., R a v e l l i , R.B., S c h o u t e n , A., S i m m e l i n k , M.J., D e r k s e n , R.H., K r o o n , J., a n d G r o s , P. ( 1 9 9 9 ) A d h e s i o n m e c h a n i s m o f h u m a n b e t a ( 2 ) - g l y c o p r o t e i n I t o p h o s p h o l i p i d s b a s e d o n i t s c r y s t a l s t r u c t u r e . EMBOJ18, 5 1 6 6 - 5 1 7 4 . B o w i e , E.J.W., T h o m p s o n , J.H., P a s c u z z i , C.A., a n d O w e n , C A . ( 1 9 6 3 ) T h r o m b o s i s i n s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s d e s p i t e c i r c u l a t i n g a n t i c o a g u l a n t s . J Lab Clin Med 62,416-430. B r a n c h , D.W., a n d S i l v e r , R.M. ( 1 9 9 6 ) C r i t e r i a f o r a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e : e a r l y p r e g n a n c y l o s s , f e t a l l o s s , o r r e c u r r e n t p r e g n a n c y l o s s ? Lupus 5, 4 0 9 - 4 1 3 . 1 4 9 B r i g h t o n , T.A., D a i , Y.P., H o g g , P.J., a n d C h e s t e r m a n , C.N. ( 1 9 9 9 ) M i c r o h e t e r o g e n e i t y o f beta-2 g l y c o p r o t e i n I: i m p l i c a t i o n s f o r b i n d i n g to a n i o n i c p h o s p h o l i p i d s . BiochemJ 340, 59-67. B r i g h t o n , T.A., H o g g , P.J., D a i , Y.P., M u r r a y , B.H., C h o n g , B.H., a n d C h e s t e r m a n , C.N. ( 1 9 9 6 ) B e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I i n t h r o m b o s i s : e v i d e n c e f o r a r o l e as a n a t u r a l a n t i c o a g u l a n t . Br J Haematol 93, 185-194. B r i s t o w , C L . a n d B o a c k l e , R.J. ( 1 9 8 6 ) E v i d e n c e f o r t h e b i n d i n g o f h u m a n s e r u m a m y l o i d P c o m p o n e n t t o C l q a n d F a b g a m m a . Mol Immunol 23, 1 0 4 5 - 1 0 5 2 . C a b i e d e s , J., C a b r a l , A.R., a n d A l a r c o n - S e g o v i a , D . ( 1 9 9 5 ) C l i n i c a l m a n i f e s t a t i o n s o f the a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e i n p a t i e n t s w i t h s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s a s s o c i a t e m o r e s t r o n g l y w i t h a n t i - b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n - I t h a n w i t h a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s . J Rheumatol 22, 1 8 9 9 - 1 9 0 6 . C a n f i e l d , W.M. a n d K i s i e l , W. ( 1 9 8 2 ) E v i d e n c e o f n o r m a l f u n c t i o n a l l e v e l s o f a c t i v a t e d p r o t e i n C i n h i b i t o r i n c o m b i n e d F a c t o r V / V I I I d e f i c i e n c y d i s e a s e . Journal of Clin Invest 70, 1 2 6 0 - 1 2 7 2 . C a r d i g a n , R.A., D o n o h o e , S., P u r d y , G., M a c k i e , I.J., a n d M a c h i n , S.J. ( 1 9 9 8 ) T h e a s s o c i a t i o n o f f a c t o r V i l a , f a c t o r X l l a a n d b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n - l w i t h t r i g l y c e r i d e -r i c h l i p o p r o t e i n s i n n o r m o l i p i d a e m i c s u b j e c t s . Blood Coagul Fibrinolysis 9, 3 2 3 -3 3 2 . C a r r , M.E.J, a n d Z e k e r t , S.L. ( 1 9 9 3 ) P r o t e i n S a n d C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n l e v e l s i n p a t i e n t s w i t h s t r o k e : i m p l i c a t i o n s f o r p r o t e i n S r e g u l a t i o n . Haemostasis 23, 159-167. C a s s a d e r , M., R u i u , G., G a m b i n o , R., G u z z o n , F., P a g a n o , A., V e g l i a , F., P a g n i , R., a n d P a g a n o , G. ( 1 9 9 4 ) I n f l u e n c e o f a p o l i p o p r o t e i n H p o l y m o r p h i s m o n l e v e l s o f t r i g l y c e r i d e s . Atherosclerosis 110,45-51. C a s s a d e r , M., R u i u , G., G a m b i n o , R , V e g l i a , F., a n d P a g a n o , G. ( 1 9 9 7 ) A p o l i p o p r o t e i n H l e v e l s i n d i a b e t i c s u b j e c t s : c o r r e l a t i o n w i t h c h o l e s t e r o l l e v e l s . Metabolism 46, 5 2 2 - 5 2 5 . C e r v e r a , R., A s h e r s o n , R.A., F o n t , J., T i k l y , M., P a l l a r e s , L., C h a m o r r o , A., a n d I n g e l m o , M . ( 1 9 9 7 ) C h o r e a i n t h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . C l i n i c a l , r a d i o l o g i c , a n d i m m u n o l o g i c c h a r a c t e r i s t i c s o f 5 0 p a t i e n t s f r o m o u r c l i n i c s a n d t h e r e c e n t l i t e r a t u r e . Medicine (Baltimore) 76, 2 0 3 - 2 1 2 . C h a l e o m c h a n , W., H e m a c h u d h a , T., S a k u l r a m r u n g , R., a n d D e e s o m c h o k , U . ( 1 9 9 0 ) A n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s i n p a t i e n t s w i t h r a b i e s v a c c i n a t i o n i n d u c e d n e u r o l o g i c a l c o m p l i c a t i o n s a n d o t h e r n e u r o l o g i c a l d i s e a s e s . J Neurol Sci 96, 143-151. 1 5 0 C h a m l e y , L.W., D u n c a l f , A.M., K o n a r k o w s k a , B., M i t c h e l l , M.D., a n d J o h n s o n , P.M. ( 1 9 9 9 ) C o n f o r m a t i o n a l l y a l t e r e d b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I i s t h e a n t i g e n f o r a n t i -c a r d i o l i p i n a u t o a n t i b o d i e s . Clin Exp Immunol 115, 5 7 1 - 5 7 6 . C h r i s t i a n s e n , O.B., K i l p a t r i c k , D . C , S o u t e r , V., V a n n i n g , K., T h i e l , S., a n d J e n s e n i u s , J . C ( 1 9 9 9 ) M a n n a n - b i n d i n g l e c t i n d e f i c i e n c y i s a s s o c i a t e d w i t h u n e x p l a i n e d r e c u r r e n t m i s c a r r i a g e . Scand J Immunol 49, 193-196. C h r i s t i a n s e n , W.T., J a l b e r t , L.R., R o b e r t s o n , R.M., J h i n g a n , A., P r o r o k , M., a n d C a s t e l l i n o , F.J. ( 1 9 9 5 ) H y d r o p h o b i c a m i n o a c i d r e s i d u e s o f h u m a n a n t i c o a g u l a t i o n p r o t e i n C th a t c o n t r i b u t e t o i t s f u n c t i o n a l b i n d i n g t o p h o s p h o l i p i d V e s i c l e s . Biochemistry 34, 1 0 3 7 6 - 1 0 3 8 2 . C h u n g , L.P., B e n t l e y , D.R., a n d R e i d , K . B . ( 1 9 8 5 ) M o l e c u l a r c l o n i n g a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e c D N A c o d i n g f o r C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n , a r e g u l a t o r y p r o t e i n o f t h e c l a s s i c a l p a t h w a y o f t h e h u m a n c o m p l e m e n t s y s t e m . Biochem J 230, 133-141. C h u n g , L.P., G a g n o n , J., a n d R e i d , K . B . ( 1 9 8 5 ) A m i n o a c i d s e q u e n c e s t u d i e s o f h u m a n C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n : N - t e r m i n a l s e q u e n c e a n a l y s i s a n d a l i g n m e n t o f t h e f r a g m e n t s p r o d u c e d b y l i m i t e d p r o t e o l y s i s w i t h c h y m o t r y p s i n a n d t h e p e p t i d e s p r o d u c e d b y c y a n o g e n b r o m i d e t r e a t m e n t . Molecular.Immunology 22, 4 2 7 - 4 3 5 . C h u n g , L.P. a n d R e i d , K . B . ( 1 9 8 5 ) S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l s t u d i e s o n C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n , a r e g u l a t o r y c o m p o n e n t o f t h e h u m a n c o m p l e m e n t s y s t e m . Biosci Rep 5, 8 5 5 - 8 6 5 . C o l e , J.L., H o u s l e y , G.A., D y k m a n , T.R., M a c D e r m o t t , R.P., a n d A t k i n s o n , J.P. ( 1 9 8 2 ) I d e n t i f i c a t i o n o f a n a d d i t i o n a l c l a s s o f C 3 - b i n d i n g m e m b r a n e p r o t e i n s o f h u m a n p e r i p h e r a l b l o o d l e u k o c y t e s a n d c e l l l i n e s . Proc Natl Acad Sci USA 82, 8 5 9 - 8 6 3 . C u a d r a d o , M.J., L o p e z - P e d r e r a , C , K h a m a s h t a , M.A., C a m p s , M.T., T i n a h o n e s , F., T o r r e s , A., H u g h e s , G.R., a n d V e l a s c o , F. ( 1 9 9 7 ) T h r o m b o s i s i n p r i m a r y a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e : a p i v o t a l r o l e f o r m o n o c y t e t i s s u e f a c t o r e x p r e s s i o n . Arthritis Rheum 40, 8 3 4 - 8 4 1 . C u a d r a d o , M.J., M u j i c , F., M u n o z , E., K h a m a s h t a , M.A., a n d H u g h e s , G.R. ( 1 9 9 7 ) T h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . Ann Rheum Dis 56, 194-196. C u c h a c o v i c h , M., G a t i c a , H., G r i g g , D.M., P i z z o , S.V., a n d G o n z a l e z - G r o n o w , M . ( 1 9 9 6 ) P o t e n t i a l p a t h o g e n i c i t y o f d e g l y c o s y l a t e d I g G c r o s s r e a c t i v e w i t h s t r e p t o k i n a s e a n d f i b r o n e c t i n i n t h e s e r u m o f p a t i e n t s w i t h r h e u m a t o i d a r t h r i t i s . J Rheumatol 23, 4 4 - 5 1 . D a h a , M.R., F e a r o n , D.T., a n d A u s t e n , K . F . ( 1 9 7 6 ) C 3 r e q u i r e m e n t s f o r f o r m a t i o n o f a l t e r n a t i v e p a t h w a y C 5 c o n v e r t a s e . J Immunol 117, 6 3 0 - 6 3 4 . 151 D a h l b a c k , B . ( 1 9 8 3 a ) P u r i f i c a t i o n o f h u m a n C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n a n d f o r m a t i o n o f its c o m p l e x w i t h v i t a m i n K - d e p e n d e n t p r o t e i n S. Biochem J 209, 8 4 7 - 8 5 6 . D a h l b a c k , B . ( 1 9 8 3 b ) P u r i f i c a t i o n o f h u m a n v i t a m i n K - d e p e n d e n t p r o t e i n S a n d its l i m i t e d p r o t e o l y s i s b y t h r o m b i n . Biochem J 209, 8 3 7 - 8 4 6 . D a h l b a c k , B . ( 1 9 8 4 ) I n t e r a c t i o n b e t w e e n v i t a m i n K - d e p e n d e n t p r o t e i n S a n d t h e c o m p l e m e n t p r o t e i n , C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n . A l i n k b e t w e e n c o a g u l a t i o n a n d the c o m p l e m e n t s y s t e m . Semin Thromb Hemost 10, 139-148. D a h l b a c k , B . ( 1 9 8 6 ) I n h i b i t i o n o f p r o t e i n C a c o f a c t o r f u n c t i o n o f h u m a n a n d b o v i n e p r o t e i n S b y C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n . J Biol Chem 261, 1 2 0 2 2 - 1 2 0 2 7 . D a h l b a c k , B., H i l d e b r a n d , B., a n d L i n s e , S. ( 1 9 9 0 ) N o v e l t y p e o f v e r y h i g h a f f i n i t y c a l c i u m - b i n d i n g s i t e s i n b e t a - h y d r o x y a s p a r a g i n e - c o n t a i n i n g e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r - l i k e d o m a i n s i n v i t a m i n K - d e p e n d e n t p r o t e i n S. J Biol Chem 265, 1 8 4 8 1 -1 8 4 8 9 . D a h l b a c k , B., H i l d e b r a n d , B., a n d M a l m , J. ( 1 9 9 0 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f f u n c t i o n a l l y i m p o r t a n t d o m a i n s i n h u m a n v i t a m i n K - d e p e n d e n t p r o t e i n S u s i n g m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s . J Biol Chem 265, 8 1 2 7 - 8 1 3 5 . D a h l b a c k , B., S m i t h , C.A., a n d M u l l e r - E b e r h a r d , H J . ( 1 9 8 3 ) V i s u a l i z a t i o n o f h u m a n C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n a n d its c o m p l e x e s w i t h v i t a m i n K - d e p e n d e n t p r o t e i n S a n d c o m p l e m e n t p r o t e i n C 4 b . Proc Natl Acad Sci USA 80, 3 4 6 1 - 3 4 6 5 . D a h l b a c k , B . a n d S t e n f l o , J. ( 1 9 8 1 ) H i g h m o l e c u l a r w e i g h t c o m p l e x i n h u m a n p l a s m a b e t w e e n v i t a m i n K - d e p e n d e n t p r o t e i n S a n d c o m p l e m e n t c o m p o n e n t C 4 b -b i n d i n g p r o t e i n . Proc Natl Acad Sci USA 78, 2 5 1 2 - 2 5 1 6 . D a v i e s , A., S i m m o n s , D.L., H a l e , G., H a r r i s o n , R.A., T i g h e , H., L a c h m a n n , P.J., a n d W a l d m a n n , H . ( 1 9 8 9 ) C D 5 9 , a n L Y - 6 - l i k e p r o t e i n e x p r e s s e d i n h u m a n l y m p h o i d c e l l s , r e g u l a t e s t h e a c t i o n o f t h e c o m p l e m e n t m e m b r a n e a t t a c k c o m p l e x o n h o m o l o g o u s c e l l s . J Exp Med 170, 6 3 7 - 6 5 4 . D a v i e s , E.J., T e h , L.S., O r d i - R o s , J., S n o w d e n , N., H i l l a r b y , M.C., H a j e e r , A., D o n n , R., P e r e z - P e m e n , P., V i l a r d e l l - T a r r e s , M., a n d O i l i e r , W.E. ( 1 9 9 7 ) A d y s f u n c t i o n a l a l l e l e o f t h e m a n n o s e b i n d i n g p r o t e i n g e n e a s s o c i a t e s w i t h s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s i n a S p a n i s h p o p u l a t i o n . J Rheumatol 24, 4 8 5 - 4 8 8 . D a v i s , B.D. ( 1 9 4 4 ) B i o l o g i c f a l s e p o s i t i v e s e r o l o g i c t e s t s f o r s y p h i l i s . Medicine 23, 3 5 9 -414. D a y , H.M., T h i a g a r a j a n , P., A h n , C , R e v e i l l e , J.D., T i n k e r , K.F., a n d A r n e t t , F.C. ( 1 9 9 8 ) A u t o a n t i b o d i e s to b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I i n s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s a n d p r i m a r y a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d y s y n d r o m e : c l i n i c a l c o r r e l a t i o n s i n c o m p a r i s o n w i t h o t h e r a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d y tests. J Rheumatol 25, 6 6 7 - 6 7 4 . 152 D e l P a p a , N., G u i d a l i , L., S a l a , A., B u c c e l l a t i , C , K h a m a s h t a , M.A., I c h i k a w a , K., K o i k e , T., B a l e s t r i e r i , G., T i n c a n i , A., H u g h e s , G.R., a n d M e r o n i , P.L. ( 1 9 9 7 ) E n d o t h e l i a l c e l l s as t a r g e t f o r a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s . H u m a n p o l y c l o n a l a n d m o n o c l o n a l a n t i - b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I a n t i b o d i e s r e a c t i n v i t r o w i t h e n d o t h e l i a l c e l l s t h r o u g h a d h e r e n t b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I a n d i n d u c e e n d o t h e l i a l a c t i v a t i o n . Arthritis Rheum 40, 5 5 1 - 5 6 1 . D e l P a p a , N., G u i d a l i , L., S p a t o l a , L., B o n a r a , P., B o r g h i , M.O., T i n c a n i , A., B a l e s t r i e r i , G., a n d M e r o n i , P.L. ( 1 9 9 5 ) R e l a t i o n s h i p b e t w e e n a n t i - p h o s p h o l i p i d a n d a n t i -e n d o t h e l i a l c e l l a n t i b o d i e s III: b e t a 2 g l y c o p r o t e i n I m e d i a t e s t h e a n t i b o d y b i n d i n g t o e n d o t h e l i a l m e m b r a n e s a n d i n d u c e s t h e e x p r e s s i o n o f a d h e s i o n m o l e c u l e s . Clin Exp Rheumatol 13, 179-185. D e l P a p a , N., R a s c h i , E., C a t e l l i , L., K h a m a s h t a , M.A., I c h i k a w a , K., T i n c a n i , A., B a l e s t r i e r i , G., a n d M e r o n i , P.L. ( 1 9 9 7 ) E n d o t h e l i a l c e l l s as a t a r g e t f o r a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s : r o l e o f a n t i - b e t a 2 g l y c o p r o t e i n I a n t i b o d i e s . Am J Reprod Immunol 38, 2 1 2 - 2 1 7 . D e l P a p a , N., S h e n g , Y.H., R a s c h i , E., K a n d i a h , D.A., T i n c a n i , A., K h a m a s h t a , M.A., A t s u m i , T., H u g h e s , G.R., I c h i k a w a , K., K o i k e , T., B a l e s t r i e r i , G., K r i l l i s , S.A., a n d M e r o n i , P.L. ( 1 9 9 8 ) H u m a n b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I b i n d s t o e n d o t h e l i a l c e l l s t h r o u g h a c l u s t e r o f l y s i n e r e s i d u e s t h a t a r e c r i t i c a l f o r a n i o n i c p h o s p h o l i p i d b i n d i n g a n d o f f e r s e p i t o p e s f o r a n t i - b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I a n t i b o d i e s . J Immunol 160, 5 5 7 2 - 5 5 7 8 . D e l e z e , M., A l a r c o n - S e g o v i a , D., O r i a , C.V., S a n c h e z - G u e r r e r o , J., F e r n a n d e z -D o m i n g u e z , L., G o m e z - P a c h e c o , L., a n d P o n c e , d.L. ( 1 9 8 9 ) H e m o c y t o p e n i a i n s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . R e l a t i o n s h i p t o a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s . J Rheumatol. 16, 9 2 6 - 9 3 0 . D i S c i p i o , R.G., C h a k r a v a r t i , D.N., M u l l e r - E b e r h a r d , H.J., a n d F e y , G.H. ( 1 9 8 8 ) T h e s t r u c t u r e o f h u m a n c o m p l e m e n t c o m p o n e n t C 7 a n d C 5 b - 7 c o m p l e x . J Biol Chem 263, 5 4 9 - 5 6 0 . D i S c i p i o , R.G. a n d D a v i e , E.W. ( 1 9 7 9 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f p r o t e i n S, a g a m m a -c a r b o x y g l u t a m i c a c i d c o n t a i n i n g p r o t e i n f r o m b o v i n e a n d h u m a n p l a s m a . Biochemistry 18, 8 9 9 - 9 0 4 . D i S c i p i o , R.G., H e r m o d s o n , M.A., a n d Y a t e s , S.G. ( 1 9 7 7 ) A c o m p a r i s o n o f h u m a n p r o t h r o m b i n , f a c t o r I X ( C h r i s t m a s f a c t o r ) , f a c t o r X ( S t u a r t f a c t o r ) , a n d p r o t e i n S. Biochemistry 16 , 6 9 8 - 7 0 6 . D o o l i t t l e , R.F., F e n g , D.F., a n d J o h n s o n , M.S. ( 1 9 8 4 ) C o m p u t e r - b a s e d c h a r a c t e r i z a t i o n o f e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r p r e c u r s o r . Nature 307, 5 5 8 - 5 6 0 . D r a k e , T.A., M o r r i s s e y , J.H., a n d E d g i n g t o n , T.S. ( 1 9 8 9 ) S e l e c t i v e c e l l u l a r e x p r e s s i o n o f t i s s u e f a c t o r i n h u m a n t i s s u e s . I m p l i c a t i o n s f o r d i s o r d e r s o f h e m o s t a s i s a n d t h r o m b o s i s . Am J Pathol 134, 1 0 8 7 - 1 0 9 7 . 153 E d s o n , J.R., V o g t , J.M., a n d H a s e g a w a , D.K. ( 1 9 8 4 ) A b n o r m a l p r o t h o m b i n c r o s s e d -i m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s i n p a t i e n t s w i t h l u p u s i n h i b i t o r s . Blood 72, 5 1 2 E l g a v i s h , S. a n d S h a a n a n , B . ( 1 9 9 7 ) L e c t i n - c a r b o h y d r a t e i n t e r a c t i o n s : d i f f e r e n t f o l d s , c o m m o n r e c o g n i t i o n p r i n c i p l e s . Trends Microbiol 22, 4 6 2 - 4 6 7 . E s m o n , C.T., E s m o n , N.L., a n d H a r r i s , K.W. ( 1 9 8 2 ) C o m p l e x f o r m a t i o n b e t w e e n t h r o m b i n a n d t h r o m b o m o d u l i n i n h i b i t s b o t h t h r o m b i n - c a t a l y z e d f i b r i n f o r m a t i o n a n d f a c t o r V a c t i v a t i o n . J Biol Chem 257, 7 9 4 4 - 7 9 4 7 . E s m o n , C T . a n d O w e n , W. ( 1 9 8 1 ) I d e n t i f i c a t i o n o f a n e n d o t h e l i a l c e l l c o f a c t o r f o r t h r o m b i n - c a t a l y z e d a c t i v a t i o n o f p r o t e i n C . Proc Natl Acad Sci USA 78, 2 2 4 9 E s m o n , N.L., C a r r o l l , R . C , a n d E s m o n , C T . ( 1 9 8 3 ) T h r o m b o m o d u l i n b l o c k s t h e a b i l i t y o f t h r o m b i n to a c t i v a t e p l a t e l e t s . J Biol Chem 258, 1 2 2 3 8 - 1 2 2 4 2 . E x n e r , T., T r i p l e t t , D.A., T a b e r n e r , D., a n d M a c h i n , S.J. ( 1 9 9 1 ) G u i d e l i n e s f o r t e s t i n g a n d r e v i s e d c r i t e r i a f o r l u p u s a n t i c o a g u l a n t s . S S C S u b c o m m i t t e e f o r t h e S t a n d a r d i z a t i o n o f L u p u s A n t i c o a g u l a n t s . Thromb Haemost 65, 3 2 0 - 3 2 2 . E z e k o w i t z , R.A., D a y , L.E., a n d H e r m a n , G.A. ( 1 9 8 8 ) A h u m a n m a n n o s e - b i n d i n g p r o t e i n i s a n a c u t e - p h a s e r e a c t a n t t h a t s h a r e s s e q u e n c e h o m o l o g y w i t h o t h e r v e r t e b r a t e l e c t i n s . 7 £ x p M e d 167, 1 0 3 4 - 1 0 4 6 . F a i r , D.S. a n d R e v a k , D.J. ( 1 9 8 4 ) Q u a n t i t a t i o n o f h u m a n p r o t e i n S i n t h e p l a s m a o f n o r m a l a n d w a r f a r i n - t r e a t e d i n d i v i d u a l s b y r a d i o i m m u n o a s s a y . Thromb Res 36, 5 2 7 - 5 3 5 . F a y , P.J., H a i d a r i s , P.J., a n d H u g g i n s , C F . ( 1 9 9 3 ) R o l e o f t h e C O O H - t e r m i n a l a c i d i c r e g i o n o f A l s u b u n i t i n A 2 s u b u n i t r e t e n t i o n i n h u m a n f a c t o r V i l l a . JBiol Chem 268, 1 7 8 6 1 F a y , P.J., S m u d z i n , T.M., a n d W a l k e r , F.J. ( 1 9 9 1 ) A c t i v a t e d p r o t e i n C - c a t a l y z e d i n a c t i v a t i o n o f h u m a n f a c t o r V I I I a n d f a c t o r V i l l a . I d e n t i f i c a t i o n o f c l e a v a g e s i t e s a n d c o r r e l a t i o n o f p r o t e o l y s i s w i t h c o f a c t o r a c t i v i t y . J Biol Chem 266, 2 0 1 3 9 -2 0 1 4 5 . F e a r o n , D.T., A u s t e n , K.F., a n d R u d d y , S. ( 1 9 7 3 ) F o r m a t i o n o f h e m o l y t i c a l l y a c t i v e c e l l u l a r i n t e r m e d i a t e b y the i n t e r a c t i o n b e t w e e n p r o p e r d i n f a c t o r s B a n d D a n d t h e a c t i v a t e d t h i r d c o m p o n e n t o f c o m p l e m e n t . J Exp Med 138, 1 3 0 5 - 1 3 1 3 . F e i n s t e i n , D.I. a n d R a p a p o r t , S.I. ( 1 9 7 2 ) A c q u i r e d i n h i b i t o r s o f b l o o d c o a g u l a t i o n . Prog Hemost Thromb 1, 75-95. F e r n a n d e z , J.A. a n d G r i f f i n , J.H. ( 1 9 9 4 ) A p r o t e i n S b i n d i n g s i t e o n C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n i n v o l v e s b e t a c h a i n r e s i d u e s 31-45. JBiol Chem 269, 2 5 3 5 - 2 5 4 0 . 154 F l e c k , R.A., R a p a p o r t , S.I., a n d R a o , L . V . ( 1 9 8 8 ) A n t i - p r o t h r o m b i n a n t i b o d i e s a n d t h e l u p u s a n t i c o a g u l a n t . Blood 72, 5 1 2 - 5 1 9 . F o r a s t i e r o , R., M a r t i n u z z o , M., C a r r e r a s , L.O., a n d M a c l o u f , J. ( 1 9 9 8 ) A n t i - b e t a 2 g l y c o p r o t e i n I a n t i b o d i e s a n d p l a t e l e t a c t i v a t i o n i n p a t i e n t s w i t h a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s : a s s o c i a t i o n w i t h i n c r e a s e d e x c r e t i o n o f p l a t e l e t - d e r i v e d t h r o m b o x a n e u r i n a r y m e t a b o l i t e s . Thromb Haemost 79, 42-45. F o r n s t e d t , N . a n d P o r a t h , J. ( 1 9 7 5 ) C h a r a c t e r i z a t i o n s t u d i e s o n a n e w l e c t i n f o u n d i n s e e d s o f V i c i a e r v i l i a . FEBS Letters. 5 7 , 1 8 7 - 1 9 1 . F o s t e r , D . a n d D a v i e , E.W. ( 1 9 8 4 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f a c D N A c o d i n g f o r h u m a n p r o t e i n C . Proc Natl Acad Sci USA 81, 4 7 6 6 - 4 7 7 0 . F o s t e r , D . C , H o l l y , R.D., S p r e c h e r , C.A., W a l k e r , K.M., a n d K u m a r , A . A . ( 1 9 9 1 ) E n d o p r o t e o l y t i c p r o c e s s i n g o f t h e h u m a n p r o t e i n C p r e c u r s o r b y t h e y e a s t K e x 2 e n d o p e p t i d a s e c o e x p r e s s e d i n m a m m a l i a n c e l l s . Biochemistry 30, 3 6 7 - 3 7 2 . F r e y s s i n e t , J.M., T o t i - O r f a n o u d a k i s , F., R a v a n a t , C , G r u n e b a u m , L., G a u c h y , J., C a z e n a v e , J.P., a n d W i e s e l , M . L . ( 1 9 9 1 ) T h e c a t a l y t i c r o l e o f a n i o n i c p h o s p h o l i p i d s i n t h e a c t i v a t i o n o f p r o t e i n C b y f a c t o r X a a n d e x p r e s s i o n o f its a n t i c o a g u l a n t f u n c t i o n i n h u m a n p l a s m a . Blood Coagul Fibrinolysis 2, 6 9 1 - 6 9 8 . F u j i t a , T., G i g l i , I., a n d N u s s e n z w e i g , V . ( 1 9 7 8 ) H u m a n C 4 - b i n d i n g p r o t e i n . II. R o l e i n p r o t e o l y s i s o f C 4 b b y C 3 b - i n a c t i v a t o r . J Exp Med 1 4 8 , 1 0 4 4 - 1 0 5 1 . F u j i t a , T. a n d N u s s e n z w e i g , V . ( 1 9 7 9 ) T h e r o l e o f C 4 - b i n d i n g p r o t e i n a n d b e t a 1 H i n p r o t e o l y s i s o f C 4 b a n d C 3 b . J Exp Med 150, 2 6 7 - 2 7 6 . G a l i n d o , M., K h a m a s h t a , M.A., a n d H u g h e s , G.R. ( 1 9 9 9 ) S p l e n e c t o m y f o r r e f r a c t o r y t h r o m b o c y t o p e n i a i n t h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . Rheumatol 38, 8 4 8 - 8 5 3 . G a l l i , M., B e v e r s , E.M., C o m f u r i u s , P., B a r b u i , T., a n d Z w a a l , R.F. ( 1 9 9 3 ) E f f e c t o f a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s o n p r o c o a g u l a n t a c t i v i t y o f a c t i v a t e d p l a t e l e t s a n d p l a t e l e t - d e r i v e d m i c r o v e s i c l e s . Br J Haematol 83, 4 6 6 - 4 7 2 . G a l l i , M., C o m f u r i u s , P., B a r b u i , T., Z w a a l , R.F., a n d B e v e r s , E . M . ( 1 9 9 2 ) A n t i c o a g u l a n t a c t i v i t y o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I i s p o t e n t i a t e d b y a d i s t i n c t s u b g r o u p o f a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s . Thromb Haemost 68, 2 9 7 - 3 0 0 . G a l l i , M., C o m f u r i u s , P., M a a s s e n , C , H e m k e r , H . C , d e B a e t s , M.H., v a n B r e d a -V r i e s m a n , P.J., B a r b u i , T., Z w a a l , R.F., a n d B e v e r s , E . M . ( 1 9 9 0 ) A n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s ( A C A ) d i r e c t e d n o t to c a r d i o l i p i n b u t t o a p l a s m a p r o t e i n c o f a c t o r . Lancet 3 3 5 , 1 5 4 4 - 1 5 4 7 . G a l l i , M., F i n a z z i , G., B e v e r s , E.M., a n d B a r b u i , T. ( 1 9 9 5 ) K a o l i n c l o t t i n g t i m e a n d d i l u t e R u s s e l l ' s v i p e r v e n o m t i m e d i s t i n g u i s h b e t w e e n p r o t h r o m b i n - d e p e n d e n t a n d b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I - d e p e n d e n t a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s . Blood 86, 6 1 7 - 6 2 3 . 155 G a l l i , M., R u g g e r i , L., a n d B a r b u i , T. ( 1 9 9 8 ) D i f f e r e n t i a l e f f e c t s o f a n t i - b e t a 2 -g l y c o p r o t e i n I a n d a n t i p r o t h r o m b i n a n t i b o d i e s o n t h e a n t i c o a g u l a n t a c t i v i t y o f a c t i v a t e d p r o t e i n C. Blood 91, 1 9 9 9 - 2 0 0 4 . G a m b i n o , R., R u i u , G , P a g a n o , G , a n d C a s s a d e r , M . ( 1 9 9 7 ) C h a r a c t e r i z a t i o n a n d r e p r e s e n t a t i v e s t r u c t u r e s o f N - o l i g o s a c c h a r i d e s b o u n d t o a p o l i p o p r o t e i n H . J Lipid Mediat Cell Signal 17, 191-205. G a m b i n o , R., R u i u , G , P a g a n o , G., a n d C a s s a d e r , M . ( 1 9 9 7 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e c a r b o h y d r a t e s t r u c t u r e s o f a p o l i p o p r o t e i n H t h r o u g h c o n c a n a v a l i n A a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y . J Lipid Mediat Cell Signal 16, 11-21. G a m b i n o , R., R u i u , G , P a g a n o , G., a n d C a s s a d e r , M . ( 1 9 9 7 ) Q u a l i t a t i v e a n a l y s i s o f t h e c a r b o h y d r a t e c o m p o s i t i o n o f a p o l i p o p r o t e i n H . J Protein Chem 16, 2 0 5 - 2 1 2 . G a m b i n o , R., R u i u , G., P a g a n o , G., a n d C a s s a d e r , M . ( 1 9 9 9 ) T h e b i n d i n g o f a p o l i p o p r o t e i n H ( b e t a 2 - G l y c o p r o t e i n I) t o l i p o p r o t e i n s . Prostaglandins Other Lipid Mediat 57, 3 5 1 - 3 5 9 . G a r r e d , P., M a d s e n , W.O., H o f m a n n , B., a n d S v e j g a a r d , A . ( 1 9 9 5 ) I n c r e a s e d f r e q u e n c y o f h o m o z y g o s i t y o f a b n o r m a l m a n n a n - b i n d i n g - p r o t e i n a l l e l e s i n p a t i e n t s w i t h s u s p e c t e d i m m u n o d e f i c i e n c y . Lancet 346, 9 4 1 - 9 4 3 . G e o r g e , J., A f e k , A., G i l b u r d , B., B l a n k , M., L e v y , Y., A r o n - M a o r , A., L e v k o v i t z , H., S h a i s h , A., G o l d b e r g , I., K o p o l o v i c , J., H a r a t s , D., a n d S h o e n f e l d , Y . ( 1 9 9 8 ) I n d u c t i o n o f e a r l y a t h e r o s c l e r o s i s i n L D L - r e c e p t o r - d e f i c i e n t m i c e i m m u n i z e d w i t h b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I. Circulation 98, 1 1 0 8 - 1 1 1 5 . G e o r g e , J., B l a n k , M., L e v y , Y., M e r o n i , P., D a m i a n o v i c h , M., T i n c a n i , A., a n d S h o e n f e l d , Y . ( 1 9 9 8 ) D i f f e r e n t i a l e f f e c t s o f a n t i - b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I a n t i b o d i e s o n e n d o t h e l i a l c e l l s a n d o n t h e m a n i f e s t a t i o n s o f e x p e r i m e n t a l a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . Circulation 91, 9 0 0 - 9 0 6 . G e o r g e , J., G i l b u r d , B., H o j n i k , M., L e v y , Y., L a n g e v i t z , P., M a t s u u r a , E., K o i k e , T., a n d S h o e n f e l d , Y . ( 1 9 9 8 ) T a r g e t r e c o g n i t i o n o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I ( b e t a 2 G P D -d e p e n d e n t a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s : e v i d e n c e f o r i n v o l v e m e n t o f t h e f o u r t h d o m a i n o f b e t a 2 G P I i n a n t i b o d y b i n d i n g . J Immunol 160, 3 9 1 7 - 3 9 2 3 . G e o r g e , J., G i l b u r d , B., L a n g e v i t z , P., L e v y , Y., N e z l i n , R., H a r a t s , D., a n d S h o e n f e l d , Y . ( 1 9 9 9 ) B e t a 2 g l y c o p r o t e i n I c o n t a i n i n g i m m u n e - c o m p l e x e s i n l u p u s p a t i e n t s : a s s o c i a t i o n w i t h t h r o m b o c y t o p e n i a a n d l i p o p r o t e i n (a) l e v e l s . Lupus 8, 116-120. G e o r g e , J., S h o e n f e l d , Y., a n d H a r a t s , D. ( 1 9 9 9 ) T h e i n v o l v e m e n t o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I ( b e t a 2 - G P I ) i n h u m a n a n d m u r i n e a t h e r o s c l e r o s i s . J Autoimmun 13, 57-60. G h a r a v i , A.E., H a r r i s , E.N., A s h e r s o n , R.A., a n d H u g h e s , G.R. ( 1 9 8 7 ) A n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s : i s o t y p e d i s t r i b u t i o n a n d p h o s p h o l i p i d s p e c i f i c i t y . Ann Rheum Dis 46, 1-6. 156 G h a r a v i , A.E., H a r r i s , E.N., L o c k s h i n , M.D., H u g h e s , G.R., a n d E l k o n , K.B. ( 1 9 8 8 ) I g G s u b c l a s s a n d l i g h t c h a i n d i s t r i b u t i o n o f a n t i c a r d i o l i p i n a n d a n t i - D N A a n t i b o d i e s i n s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . Ann Rheum Dis 47, 2 8 6 - 2 9 0 . G h a r a v i , A.E., S a m m a r i t a n o , L.R., W e n , J., a n d E l k o n , K . B . ( 1 9 9 2 ) I n d u c t i o n o f a n t i p h o s p h o l i p i d a u t o a n t i b o d i e s b y i m m u n i z a t i o n w i t h b e t a 2 g l y c o p r o t e i n I ( a p o l i p o p r o t e i n H ) . J Clin Invest 90, 1 1 0 5 - 1 1 0 9 . G h a r a v i , E.E., C h a i m o v i c h , H., C u c u r u l l , E., C e l l i , C.M., T a n g , H., W i l s o n , W.A., a n d G h a r a v i , A . E . ( 1 9 9 9 ) I n d u c t i o n o f a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s b y i m m u n i z a t i o n w i t h s y n t h e t i c v i r a l a n d b a c t e r i a l p e p t i d e s . Lupus 8, 4 4 9 - 4 5 5 . G i g l i , I., F u j i t a , T., a n d N u s s e n z w e i g , V . ( 1 9 7 9 ) M o d u l a t i o n o f t h e c l a s s i c a l p a t h w a y C 3 c o n v e r t a s e b y p l a s m a p r o t e i n s C 4 b i n d i n g p r o t e i n a n d C 3 b i n a c t i v a t o r . Proc Natl Acad Sci USA 76, 6 5 9 6 - 6 6 0 0 . G i n s b e r g , J.S., D e m e r s , C., B r i l l - E d w a r d s , P., B o n a , R., J o h n s t o n , M., W o n g , A., a n d D e n b u r g , J.A. ( 1 9 9 5 ) A c q u i r e d f r e e p r o t e i n S d e f i c i e n c y i s a s s o c i a t e d w i t h a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s a n d i n c r e a s e d t h r o m b i n g e n e r a t i o n i n p a t i e n t s w i t h s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . Am J Med 98, 3 7 9 - 3 8 3 . G o l d s m i t h , G.H., P i e r a n g e l i , S.S., B r a n c h , D.W., G h a r a v i , A.E., a n d H a r r i s , E . N . ( 1 9 9 4 ) I n h i b i t i o n o f p r o t h r o m b i n a c t i v a t i o n b y a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s a n d b e t a 2-g l y c o p r o t e i n 1. Br J Haematol 87, 548-554. G r e e n g a r d , J.S., F e r n a n d e z , J.A., R a d t k e , K.P., a n d G r i f f i n , J.H. ( 1 9 9 5 ) I d e n t i f i c a t i o n o f c a n d i d a t e r e s i d u e s f o r i n t e r a c t i o n o f p r o t e i n S w i t h C 4 b b i n d i n g p r o t e i n a n d a c t i v a t e d p r o t e i n C. Biochem J305, 3 9 7 - 4 0 3 . G r i f f i n , J.H., M o s h e r , D.F., Z i m m e r m a n , T.S., a n d K l e i s s , A . J . ( 1 9 8 2 ) P r o t e i n C , a n a n t i t h r o m b o t i c p r o t e i n , i s r e d u c e d i n h o s p i t a l i z e d p a t i e n t s w i t h i n t r a v a s c u l a r c o a g u l a t i o n . Blood 60, 2 6 1 - 2 6 4 . G r u b e r , A . a n d G r i f f i n , J.H. ( 1 9 9 2 ) D i r e c t d e t e c t i o n o f a c t i v a t e d p r o t e i n C i n b l o o d f r o m h u m a n s u b j e c t s . Blood 79, 2 3 4 0 - 2 3 4 8 . H a b i b , A., M a r t i n u z z o , M.E., C a r r e r a s , L.O., L e v y - T o l e d a n o , S., a n d M a c l o u f , J . ( 1 9 9 5 ) I n c r e a s e d e x p r e s s i o n o f i n d u c i b l e c y c l o o x y g e n a s e - 2 i n h u m a n e n d o t h e l i a l c e l l s b y a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s . Thromb Haemost 74,110-111. H a g i h a r a , Y., E n j y o j i , K., O m a s a , T., K a t a k u r a , Y., S u g a , K., I g a r a s h i , M., M a t s u u r a , E., K a t o , H., Y o s h i m u r a , T., a n d G o t o , Y . ( 1 9 9 7 ) S t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f t h e r e c o m b i n a n t fifth d o m a i n o f h u m a n b e t a 2- g l y c o p r o t e i n I: e f f e c t s o f s p e c i f i c c l e a v a g e b e t w e e n L y s 7 7 a n d T h r 7 8 . J Biochem 121,128-137. H a g i h a r a , Y., G o t o , Y., K a t o , H., a n d Y o s h i m u r a , T. ( 1 9 9 5 ) R o l e o f t h e N - a n d C -t e r m i n a l d o m a i n s o f b o v i n e b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I i n i t s i n t e r a c t i o n w i t h c a r d i o l i p i n . J Biochem 118, 129-136. 157 H a m i l t o n , R.G. ( 1 9 8 7 ) H u m a n I g G s u b c l a s s m e a s u r e m e n t s i n t h e c l i n i c a l l a b o r a t o r y . Clin Chem 33, 1 7 0 7 - 1 7 2 5 . H a m m o n d , A., R u d g e , A.C., L o i z o u , S., B o w c o c k , S.J., a n d W a l p o r t , M . J . ( 1 9 8 9 ) R e d u c e d n u m b e r s o f c o m p l e m e n t r e c e p t o r t y p e 1 o n e r y t h r o c y t e s a r e a s s o c i a t e d w i t h i n c r e a s e d l e v e l s o f a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s . F i n d i n g s i n p a t i e n t s w i t h s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s a n d t h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . Arthritis Rheum 3 2 , 2 5 9 - 2 6 4 . H a n s e n , S. a n d H o l m s k o v , U . ( 1 9 9 8 ) S t r u c t u r a l a s p e c t s o f c o l l e c t i n s a n d r e c e p t o r s f o r c o l l e c t i n s . Immunobiology 199, 165-189. H a r d i g , Y., H i l l a r p , A., a n d D a h l b a c k , B . ( 1 9 9 7 ) T h e a m i n o - t e r m i n a l m o d u l e o f t h e C 4 b -b i n d i n g p r o t e i n a l p h a - c h a i n i s c r u c i a l f o r C 4 b b i n d i n g a n d f a c t o r I - c o f a c t o r f u n c t i o n . Biochem 7 3 2 3 , 4 6 9 - 4 7 5 . H a r m e r , I.J., L o i z o u , S., T h o m p s o n , K.M., S o , A.K., W a l p o r t , M.J., a n d M a c k w o r t h -Y o u n g , C. ( 1 9 9 5 ) A h u m a n m o n o c l o n a l a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d y t h a t i s r e p r e s e n t a t i v e o f s e r u m a n t i b o d i e s a n d i s g e r m l i n e e n c o d e d . Arthritis Rheum 38, 1 0 6 8 - 1 0 7 6 . H a r p e r , M.F., H a y e s , P.M., L e n t z , B.R., a n d R o u b e y , R.A. ( 1 9 9 8 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I b i n d i n g to p h o s p h o l i p i d m e m b r a n e s . Thromb Haemost 80, 6 1 0 - 6 1 4 . H a r r i s , E.N. ( 1 9 9 4 ) D i a g n o s i s a n d m a n a g e m e n t o f a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . Hbsp Pract 2 9 , 65-66. H a r r i s , E.N., G h a r a v i , A.E., P a t e l , S.P., a n d H u g h e s , G . R ( 1 9 8 7 ) E v a l u a t i o n o f t h e a n t i -c a r d i o l i p i n a n t i b o d y test: r e p o r t o f a n i n t e r a n t i o n a l w o r k s h o p h e l d 4 A p r i l 1986. Clin Exp Immunol 68, 2 1 5 - 2 2 2 . H a r r i s , E.N., C h a n , J.K., A s h e r s o n , R.A., A b e r , V.R., G h a r a v i , A.E., a n d H u g h e s , G.R. ( 1 9 8 6 ) T h r o m b o s i s , r e c u r r e n t f e t a l l o s s , a n d t h r o m b o c y t o p e n i a . P r e d i c t i v e v a l u e o f t h e a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d y test. Arch Int Med 146, 2 1 5 3 - 2 1 5 6 . H a r r i s , E.N., G h a r a v i , A.E., B o e y , M.L., P a t e l , B.M., M a c k w o r t h - Y o u n g , C.G., L o i z o u , S., a n d H u g h e s , G.R. ( 1 9 8 3 ) A n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s : d e t e c t i o n b y r a d i o i m m u n o a s s a y a n d a s s o c i a t i o n w i t h t h r o m b o s i s i n s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . Lancet 2, 1 2 1 1 - 1 2 1 4 . H a r t s h o r n , K.L., S a s t r y , K., W h i t e , M.R., A n d e r s , E.M., S u p e r , M., E z e k o w i t z , R.A., a n d T a u b e r , A . I . ( 1 9 9 3 ) H u m a n m a n n o s e - b i n d i n g p r o t e i n f u n c t i o n s as a n o p s o n i n f o r i n f l u e n z a A v i r u s e s . J Clin Invest 9 1 , 1 4 1 4 - 1 4 2 0 . H a s e g a w a , I., S u z u k i , T., I s h i i , S., T a k a k u w a , K., a n d T a n a k a , K . ( 1 9 9 4 ) E s t a b l i s h m e n t o f t w o d i s t i n c t a n t i - c a r d i o l i p i n a n t i b o d y - p r o d u c i n g c e l l l i n e s f r o m t h e s a m e i n d i v i d u a l b y E p s t e i n - B a r r v i r u s t r a n s f o r m a t i o n . Thromb Res 74, 77-84. 158 H a s u n u m a , Y., M a t s u u r a , E., M a k i t a , Z., K a t a h i r a , T., N i s h i , S., a n d K o i k e , T. ( 1 9 9 7 ) I n v o l v e m e n t o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I a n d a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s i n o x i d a t i v e l y m o d i f i e d l o w - d e n s i t y l i p o p r o t e i n u p t a k e b y m a c r o p h a g e s . Clin Exp Immunol 107, 5 6 9 - 5 7 3 . H a u r u m , J.S., T h i e l , S., J o n e s , I.M., F i s c h e r , P.B., L a u r s e n , S.B., a n d J e n s e n i u s , J.C. ( 1 9 9 3 ) C o m p l e m e n t a c t i v a t i o n u p o n b i n d i n g o f m a n n a n - b i n d i n g p r o t e i n t o H I V e n v e l o p e g l y c o p r o t e i n s . AIDS 7, 1 3 0 7 - 1 3 1 3 . H a z e l t i n e , M., R a u c h , J., D a n o f f , D., E s d a i l e , J.M., a n d T a n n e n b a u m , H . ( 1 9 8 8 ) A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s i n s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s : e v i d e n c e o f a n a s s o c i a t i o n w i t h p o s i t i v e C o o m b s ' a n d h y p o c o m p l e m e n t e m i a . J Rheumatol 15, 80-86. H e , X., S h e n , L., V i l l o u t r e i x , B.O., a n d D a h l b a c k , B . ( 1 9 9 8 ) A m i n o a c i d r e s i d u e s i n t h r o m b i n - s e n s i t i v e r e g i o n a n d f i r s t e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r d o m a i n o f v i t a m i n K -d e p e n d e n t p r o t e i n S d e t e r m i n i n g s p e c i f i c i t y o f t h e a c t i v a t e d p r o t e i n C c o f a c t o r f u n c t i o n . J Biol Chem 273, 2 7 4 4 9 - 2 7 4 5 8 . H e s s i n g , M., K a n t e r s , D., T a k e y a , H., van,'., V , H a c k e n g , T.M., I w a n a g a , S., a n d B o u m a , B.N. ( 1 9 9 3 ) T h e r e g i o n S e r 3 3 3 - A r g 3 5 6 o f t h e a l p h a - c h a i n o f h u m a n C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n i s i n v o l v e d i n t h e b i n d i n g o f c o m p l e m e n t C 4 b . FEBS Lett 317 ,228-232. H i l l - E u b a n k s , D . C , P a r k e r , C.G., a n d L o l l a r , P. ( 1 9 8 9 ) D i f f e r e n t i a l p r o t e o l y t i c a c t i v a t i o n o f f a c t o r V H I - v o n W i l l e b r a n d f a c t o r c o m p l e x b y t h r o m b i n . Proc Natl Acad Sci U 5 ^ 8 6,6508-6512. H i l l a r p , A . a n d D a h l b a c k , B . ( 1 9 8 8 ) N o v e l s u b u n i t i n C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n r e q u i r e d f o r p r o t e i n S b i n d i n g . J Biol Chem 263, 1 2 7 5 9 - 1 2 7 6 4 . H o e g , J.M., S e g a l , P., G r e g g , R.E., C h a n g , Y.S., L i n d g r e n , F.T., A d a m s o n , G.L., F r a n k , M , B r i c k m a n , C , a n d B r e w e r , H.B.J. ( 1 9 8 5 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f p l a s m a l i p i d s a n d l i p o p r o t e i n s i n p a t i e n t s w i t h b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I ( a p o l i p o p r o t e i n H ) d e f i c i e n c y . Atherosclerosis 55, 25-34. H o l m s k o v , U., M a l h o t r a , R., S i m , R.B., a n d J e n s e n i u s , J.C. ( 1 9 9 4 ) C o l l e c t i n s : c o l l a g e n o u s C - t y p e l e c t i n s o f t h e i n n a t e i m m u n e d e f e n s e s y s t e m . . Immunol Today 15, 67-74. H o r b a c h , D.A., v a n O o r t , E., L i s m a n , T., M e i j e r s , J . C , D e r k s e n , R.H., a n d d e G r o o t , P.G. ( 1 9 9 9 ) B e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I i s p r o t e o l y t i c a l l y c l e a v e d i n v i v o u p o n a c t i v a t i o n o f f i b r i n o l y s i s . Thromb Haemost 81, 87-95. H o r b a c h , D.A., v a n O o r t , E., T e m p e l m a n , M.J., D e r k s e n , R.H., a n d d e G r o o t , P.G. ( 1 9 9 8 ) T h e p r e v a l e n c e o f a n o n - p h o s p h o l i p i d - b i n d i n g f o r m o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I i n h u m a n p l a s m a — c o n s e q u e n c e s f o r t h e d e v e l o p m e n t o f a n t i - b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I a n t i b o d i e s . Thromb* Haemost 80, 7 9 1 - 7 9 7 . 1 5 9 H o r i e , S., I s h i i , H., H a r a , H., a n d K a z a m a , M . ( 1 9 9 4 ) E n h a n c e m e n t o f t h r o m b i n -t h r o m b o m o d u l i n - c a t a l y s e d p r o t e i n C a c t i v a t i o n b y p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e c o n t a i n i n g u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s : p o s s i b l e p h y s i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e o f p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e i n a n t i c o a g u l a n t a c t i v i t y o f t h r o m b o m o d u l i n . Biochem 7 3 0 1 , 6 8 3 - 6 9 1 . H o r k k o , S., M i l l e r , E., B r a n c h , D.W., P a l i n s k i , W., a n d W i t z t u m , J.L. ( 1 9 9 7 ) T h e e p i t o p e s f o r s o m e a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s a r e a d d u c t s o f o x i d i z e d p h o s p h o l i p i d a n d b e t a 2 g l y c o p r o t e i n 1 ( a n d o t h e r p r o t e i n s ) . Proc Natl Acad Sci U SA 94, 1 0 3 5 6 - 1 0 3 6 1 . H s u , B., U d d e n , M.M., a n d L y n c h , E . C . ( 1 9 9 7 ) A u t o i m m u n e h e m o l y t i c a n e m i a , p r i m a r y a d r e n a l i n s u f f i c i e n c y , a n d t h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . Am J Med Sci 3 1 4 , 4 1 -4 3 . I c h i k a w a , K., K h a m a s h t a , M.A., K o i k e , T., M a t s u u r a , E., a n d H u g h e s , G.R. ( 1 9 9 4 ) b e t a 2 - G l y c o p r o t e i n I r e a c t i v i t y o f m o n o c l o n a l a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s f r o m p a t i e n t s w i t h t h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . Arthritis Rheum 37, 1 4 5 3 - 1 4 6 1 . I e k o , M., Y a s u k o u c h i , T., S a w a d a , K . L , a n d K o i k e , T. ( 1 9 9 8 ) T h e i n f l u e n c e o f b e t a 2 -g l y c o p r o t e i n I o n t i s s u e f a c t o r a c t i v i t y . Semin Thromb Hemost 24, 2 1 1 - 2 1 5 . I g a r a s h i , M., M a t s u u r a , E., I g a r a s h i , Y., N a g a e , H., I c h i k a w a , K., T r i p l e t t , D.A., a n d K o i k e , T. ( 1 9 9 6 ) H u m a n b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I as a n a n t i c a r d i o l i p i n c o f a c t o r d e t e r m i n e d u s i n g m u t a n t s e x p r e s s e d b y a b a c u l o v i r u s s y s t e m . Blood 87, 3 2 6 2 -3 2 7 0 . I k e d a , K., S a n n o h , T., K a w a s a k i , N., K a w a s a k i , T., a n d Y a m a s h i n a , I. ( 1 9 8 7 ) S e r u m l e c t i n w i t h k n o w n s t r u c t u r e a c t i v a t e s c o m p l e m e n t t h r o u g h t h e c l a s s i c a l p a t h w a y . JBiol Chem 2 6 2 , 7 4 5 1 - 7 4 5 4 . I v e r s o n , G.M., V i c t o r i a , E.J., a n d M a r q u i s , D.M. ( 1 9 9 8 ) A n t i - b e t a 2 g l y c o p r o t e i n I ( b e t a 2 G P I ) a u t o a n t i b o d i e s r e c o g n i z e a n e p i t o p e o n t h e f i r s t d o m a i n o f b e t a 2 G P I . Proc Natl Acad Sci USA 95, 1 5 5 4 2 - 1 5 5 4 6 . J a l b e r t , L.R., C h a n , J . C , C h r i s t i a n s e n , W.T., a n d C a s t e l l i n o , F.J. ( 1 9 9 6 ) T h e h y d r o p h o b i c n a t u r e o f r e s i d u e - 5 o f h u m a n p r o t e i n C i s a m a j o r d e t e r m i n a n t o f its f u n c t i o n a l i n t e r a c t i o n s w i t h a c i d i c p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s . Biochemistry 35, 7 0 9 3 - 7 0 9 9 . J e n n e , D .E. a n d T s c h o p p , J. ( 1 9 9 2 ) C l u s t e r i n : t h e i n t r i g u i n g g u i s e s o f a w i d e l y e x p r e s s e d g l y c o p r o t e i n . Trends in Biochemical Sci 17, 154 K a l a f a t i s , M . a n d M a n n , K . G . ( 1 9 9 3 ) R o l e o f t h e m e m b r a n e i n t h e i n a c t i v a t i o n o f f a c t o r V a b y a c t i v a t e d p r o t e i n C . JBiol Chem 2 6 8 , 2 7 2 4 6 - 2 7 2 5 7 . K a l a f a t i s , M., R a n d , M.D., a n d M a n n , K . G . ( 1 9 9 4 ) T h e m e c h a n i s m o f i n a c t i v a t i o n o f h u m a n f a c t o r V a n d h u m a n f a c t o r V a b y a c t i v a t e d p r o t e i n C . J Biol Chem 269, 3 1 8 6 9 - 3 1 8 8 0 . 160 K a l a s h n i k o v a , L.A., N a s o n o v , E.L., K u s h e k b a e v a , A.E., a n d G r a c h e v a , L . A . ( 1 9 9 0 ) A n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s i n S n e d d o n ' s s y n d r o m e . Neurology 40, 4 6 4 - 4 6 7 . K a m b o h , M.I., F e r r e l l , R.E., a n d S e p e h r n i a , B . ( 1 9 8 8 ) G e n e t i c s t u d i e s o f h u m a n a p o l i p o p r o t e i n s . I V . S t r u c t u r a l h e t e r o g e n e i t y o f a p o l i p o p r o t e i n H ( b e t a 2-g l y c o p r o t e i n I). Am J Hum Genet 42, 4 5 2 - 4 5 7 . K a n d i a h , D.A. a n d K r i l i s , S.A. ( 1 9 9 4 ) B e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I. Lupus 3, 2 0 7 - 2 1 2 . K a n e , W.H. a n d D a v i e , E.W. ( 1 9 8 8 ) B l o o d c o a g u l a t i o n f a c t o r s V a n d V I I I : S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l s i m i l a r i t i e s a n d t h e i r r e l a t i o n s h i p t o h e m o r r h a g i c a n d t h r o m b o t i c d i s o r d e r s . Blood 71, 5 3 9 - 5 5 5 . K a p l a n , S.D., C h a r t a s h , E.K., P i z z a r e l l o , R.A., a n d F u r i e , R.A. ( 1 9 9 2 ) C a r d i a c m a n i f e s t a t i o n s o f t h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . Am Heart J124, 1 3 3 1 - 1 3 3 8 . K a w a s a k i , N., K a w a s a k i , T., a n d Y a m a s h i n a , I. ( 1 9 8 9 ) A s e r u m l e c t i n ( m a n n a n - b i n d i n g p r o t e i n ) h a s c o m p l e m e n t - d e p e n d e n t b a c t e r i c i d a l a c t i v i t y . J Biochem 106, 4 8 3 -4 8 9 . K e n t , J.F. a n d F i f e , E . H . ( 1 9 6 3 ) P r e c i s e s t a n d a r d i z a t i o n o f r e a g e n t s f o r c o m p l e m e n t f i x a t i o n . Am J Trop Med 12, 103-116. K e r t e s z , Z., Y u , B.B., S t e i n k a s s e r e r , A., H a u p t , H., B e n h a m , A., a n d S i m , R.B. ( 1 9 9 5 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f b i n d i n g o f h u m a n b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I t o c a r d i o l i p i n . Biochem J 310,315-321. K h a m a s h t a , M . A. ( 1 9 9 6 ) M a n a g e m e n t o f t h r o m b o s i s i n t h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . Lupus 5, 4 6 3 - 4 6 6 . K h a m a s h t a , M.A., C u a d r a d o , M.J., M u j i c , F., T a u b , N.A., H u n t , B.J., a n d H u g h e s , G.R. ( 1 9 9 5 ) T h e m a n a g e m e n t o f t h r o m b o s i s i n t h e a n t i p h o s p h o l i p i d - a n t i b o d y s y n d r o m e [ s e e c o m m e n t s ] . N Engl J Med 332, 9 9 3 - 9 9 7 . K i l p a t r i c k , D.C. ( 1 9 9 6 ) H u m a n m a n n a n b i n d i n g p r o t e i n i n p r e - e c l a m p s i a . Immunol Lett 4 9 ,175-177. K i l p a t r i c k , D.C. ( 1 9 9 8 ) P h o s p h o l i p i d - b i n d i n g a c t i v i t y o f h u m a n m a n n a n - b i n d i n g l e c t i n . Immunol Lett 61, 191-195. K i l p a t r i c k , D . C , B e v a n , B.H., a n d L i s t o n , W.A. ( 1 9 9 5 ) A s s o c i a t i o n b e t w e e n m a n n a n b i n d i n g p r o t e i n d e f i c i e n c y a n d r e c u r r e n t m i s c a r r i a g e . Hum Reprod 1 0 ,2501-2 5 0 5 . K i s i e l , W. ( 1 9 7 9 ) H u m a n p l a s m a p r o t e i n C : i s o l a t i o n , c h a r a c t e r i z a t i o n , a n d m e c h a n i s m o f a c t i v a t i o n b y a l p h a - t h r o m b i n . J Clin Invest 64,761-769. 161 K l a e r k e , D.A., R o j k j a s r , R., C h r i s t e n s e n , L., a n d S c h o u s b o e , I. ( 1 9 9 7 ) I d e n t i f i c a t i o n o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I as a m e m b r a n e - a s s o c i a t e d p r o t e i n i n k i d n e y : p u r i f i c a t i o n b y c a l m o d u l i n a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y . Biochim Biophys Acta 1339, 2 0 3 - 2 1 6 . K l i c k s t e i n , L.B., B a r t o w , T.J., M i l e t i c , V., R a b s o n , L.D., S m i t h , J.A., a n d F e a r o n , D.T. ( 1 9 8 8 ) I d e n t i f i c a t i o n o f d i s t i n c t C 3 b a n d C 4 b r e c o g n i t i o n s i t e s i n t h e h u m a n C 3 b / C 4 b r e c e p t o r ( C R 1 , C D 3 5 ) b y d e l e t i o n m u t a g e n e s i s . J Exp Med 168, 1699-• 1717. K o c h l , S., F r e s s e r , F., L o b e n t a n z , E., B a i e r , G., a n d U t e r m a n n , G . ( 1 9 9 7 ) N o v e l i n t e r a c t i o n o f a p o l i p o p r o t e i n ( a ) w i t h b e t a - 2 g l y c o p r o t e i n I m e d i a t e d b y t h e k r i n g l e I V d o m a i n . 90, 1 4 8 2 - 1 4 8 9 . K o i k e , T . ( 1 9 9 4 ) A n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s a n d ( ^ - g l y c o p r o t e i n I. Clin Immunol Immunopathol 72, 187-192. K o l b , W.P. a n d M u l l e r - E b e r h a r d , H.J. ( 1 9 7 6 ) T h e m e m b r a n e a t t a c k m e c h a n i s m o f c o m p l e m e n t : t h e t h r e e p o l y p e p t i d e c h a i n s t r u c t u r e o f t h e e i g h t h c o m p o n e n t ( C 8 ) . J Exp Med 143, 1 1 3 1 - 1 1 3 9 . K o l b l e , K. a n d R e i d , K . B . ( 1 9 9 3 ) T h e g e n o m i c s o f s o l u b l e p r o t e i n s w i t h c o l l a g e n o u s d o m a i n s : C l q , M B L , S P - A , S P - D , c o n g l u t i n i n , a n d C L - 4 3 . Behring Inst Mitt 93, 81-86. K o n , S.P., K w a n , J.T., a n d R a f t e r y , M . J . ( 1 9 9 5 ) R e v e r s i b l e r e n a l f a i l u r e d u e t o t h e a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d y s y n d r o m e , p r e - e c l a m p s i a a n d r e n a l t h r o m b o t i c m i c r o a n g i o p a t h y . Clin Nephrol 44, 2 7 1 -273. K o p p e l , R., L i t v a k , M., a n d S o l o m o n , B . ( 1 9 9 4 ) A f f i n i t y p u r i f i c a t i o n o f a m a n n o s e -b i n d i n g p r o t e i n , a s e n s i t i v e t o o l i n t h e d i a g n o s t i c s o f I g M , v i a s i t e - d i r e c t e d p h o s p h o r y l a t e d m a n n a n b o u n d t o a l u m i n a . J Chromatogr B Biomed Appl 662, 191-196. R o m b e r g , A., B l a n k , M., K a u f m a n , S., a n d S h o e n f e l d , Y . ( 1 9 9 4 ) I n d u c t i o n o f t i s s u e f a c t o r - l i k e a c t i v i t y i n m o n o c y t e s b y a n t i - c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s . J Immunol 153, 1 3 2 8 - 1 3 3 2 . K o z u t s u m i , Y., K a w a s a k i , T., a n d Y a m a s h i n a , I. ( 1 9 8 0 ) I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a m a n n a n - b i n d i n g p r o t e i n f r o m r a b b i t s e r u m . Biochem Biophys Res Commun 95, 6 5 8 - 6 6 4 . K r i s t e n s e n , T., O g a t a , R.T., C h u n g , L.P., R e i d , K.B., a n d T a c k , B . F . ( 1 9 8 7 ) c D N A s t r u c t u r e o f m u r i n e C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n , a r e g u l a t o r y c o m p o n e n t o f t h e s e r u m c o m p l e m e n t s y s t e m . Biochemistry 26, 4 6 6 8 - 4 6 7 4 . K r i s t e n s e n , T., S c h o u s b o e , I., B o e l , E., M u l v i h i l l , E.M., H a n s e n , R.R., M o l l e r , K.B., M o l l e r , N.P., a n d S o t t r u p - J e n s e n , L . ( 1 9 9 1 ) M o l e c u l a r c l o n i n g a n d m a m m a l i a n e x p r e s s i o n o f h u m a n b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I c D N A . FEBS Lett 289, 183-186. 162 K r o l l , J., L a r s e n , J.K., L o f t , H., E z b a n , M., W a l l e v i k , K., a n d F a b e r , M . ( 1 9 7 6 ) D N A -b i n d i n g p r o t e i n s i n Y o s h i d a a s c i t e s f l u i d . Biochim Biophys Acta 434, 4 9 0 - 5 0 1 . K u h l t n a n , M., J o i n e r , K., a n d E z e k o w i t z , R.A. ( 1 9 8 9 ) T h e h u m a n m a n n o s e - b i n d i n g p r o t e i n f u n c t i o n s as a n o p s o n i n . J Exp Med 169, 1 7 3 3 - 1 7 4 5 . K u t t e h , W.H. ( 1 9 9 6 ) A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d y - a s s o c i a t e d r e c u r r e n t p r e g n a n c y l o s s : t r e a t m e n t w i t h h e p a r i n a n d l o w - d o s e a s p i r i n i s s u p e r i o r t o l o w - d o s e a s p i r i n a l o n e . AmJObstet Gynecol 174, 1 5 8 4 - 1 5 8 9 . K u t t e h , W.H. a n d E r m e l , L.D. ( 1 9 9 6 ) A c l i n i c a l t r i a l f o r t h e t r e a t m e n t o f a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i y - a s s o c i a t e d r e c u r r e n t p r e g n a n c y l o s s w i t h l o w e r d o s e h e p a r i n a n d a s p i r i n . Am JReprod Immunol 35, 4 0 2 - 4 0 4 . L a c h m a n n , P.J. a n d H u g h e s - J o n e s , N . C . ( 1 9 8 4 ) I n i t i a t i o n o f c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n . Springer Semin Immunopathol 7, 143 L a c h m a n n , P.J. a n d T h o m p s o n , R.A. ( 1 9 7 0 ) R e a c t i v e l y s i s : t h e c o m p l e m l e n t - m e d i a t e d l y s i s o f u n s e n s i t i z e d c e l l s . II. T h e c h a r a c t e i z a t i o n o f a c t i v a t e d r e a c t o r as C 5 6 a n d t h e a p r t i c a p t a i o n o f C 8 a n d C 9 . J Exp Med 131, 6 4 3 - 6 5 8 . L a u , Y.L., C h a n , S.Y., T u r n e r , M.W., F o n g , J., a n d K a r l b e r g , J . ( 1 9 9 5 ) M a n n o s e - b i n d i n g p r o t e i n i n p r e t e r m i n f a n t s : d e v e l o p m e n t a l p r o f i l e a n d c l i n i c a l s i g n i f i c a n c e . Clin Exp Immunol 102, 6 4 9 - 6 5 4 . L a u , Y.L., L a u , C.S., C h a n , S.Y., K a r l b e r g , J., a n d T u r n e r , M.W. ( 1 9 9 6 ) M a n n o s e -b i n d i n g p r o t e i n i n C h i n e s e p a t i e n t s w i t h s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . Arthritis Rheum 39, 7 0 6 - 7 0 8 . L a u e r , S.A., H e m p e l , U., G r i e s , A., a n d F r a n k , K . H . ( 1 9 9 3 ) A m i n o a c i d s e q u e n c e o f t h e r e g i o n o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n 1 ( g p l ) w h i c h m e d i a t e s b i n d i n g o f a u t o a n t i b o d i e s t o t h e c a r d i o l i p i n - g p 1 c o m p l e x i n h u m a n s . Immunology 80, 22-28. L e T o n q u e z e , M., S a l o z h i n , K., D u e y m e s , M., P i e t t e , J . C , K o v a l e v , V., S h o e n f e l d , Y., N a s s o n o v , E., a n d Y o u i n o u , P. ( 1 9 9 5 ) R o l e o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I i n t h e a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d y b i n d i n g t o e n d o t h e l i a l c e l l s . Lupus 4, 179-186. L e l l o u c h e , F., M a r t i n u z z o , M., S a i d , P., M a c l o u f , J., a n d C a r r e r a s , L.O. ( 1 9 9 1 ) I m b a l a n c e o f t h r o m b o x a n e / p r o s t a c y c l i n b i o s y n t h e s i s i n p a t i e n t s w i t h l u p u s a n t i c o a g u l a n t . Blood 78 , 2 8 9 4 - 2 8 9 9 . L e u n g , S., Z i b o h , V.A., M i l l e r - B l a i r , D.J., a n d R o b b i n s , D . L . ( 1 9 9 6 ) I s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n o f a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d y f r o m p l a s m a o f a p a t i e n t w i t h a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e : i n d u c e d g e n e r a t i o n o f p l a t e l e t t h r o m b o x a n e A 2 s y n t h e s i s . Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids 55, 3 8 5 - 3 9 3 . 163 L e v i n e , J.S., S u b a n g , R., K o h , J.S., a n d R a u c h , J. ( 1 9 9 8 ) I n d u c t i o n o f a n t i - p h o s p h o l i p i d a u t o a n t i b o d i e s b y b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I b o u n d t o a p o p t o t i c t h y m o c y t e s . J Autoimmun 11, 4 1 3 - 4 2 4 . L e v y , R.A., G h a r a v i , A.E., S a m m a r i t a n o , L.R., H a b i n a , L., Q a m a r , T., a n d L o c k s h i n , M.D. ( 1 9 9 0 ) C h a r a c t e r i s t i c s o f I g G a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s i n p a t i e n t s w i t h s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s a n d s y p h i l i s . J Rheumatol 17, 1 0 3 6 - 1 0 4 1 . L i m a , F., K h a m a s h t a , M.A., B u c h a n a n , N.M., K e r s l a k e , S., H u n t , B.J., a n d H u g h e s , G.R. ( 1 9 9 6 ) A s t u d y o f s i x t y p r e g n a n c i e s i n p a t i e n t s w i t h t h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . Clin Exp Rheumatol 14,131-136. L i n t i n , S.J. a n d R e i d , K . B . ( 1 9 8 6 ) S t u d i e s o n t h e s t r u c t u r e o f t h e h u m a n C4b-binding p r o t e i n g e n e . FEBS Lett 204,77-81. L i p s c o m b e , R.J., S u m i y a , M., H i l l , A.V., L a u , Y.L., L e v i n s k y , R.J., S u m m e r f i e l d , J.A., a n d T u r n e r , M.W. ( 1 9 9 2 ) H i g h f r e q u e n c i e s i n A f r i c a n a n d n o n - A f r i c a n p o p u l a t i o n s o f i n d e p e n d e n t m u t a t i o n s i n t h e m a n n o s e b i n d i n g p r o t e i n g e n e . Hum Mol Genet 1, 7 0 9 - 7 1 5 . L o s c a l z o , J., W e i n f e l d , M., F l e s s , G.M., a n d S c a n u , A . M . ( 1 9 9 0 ) L i p o p r o t e i n ( a ) , f i b r i n b i n d i n g , a n d p l a s m i n o g e n a c t i v a t i o n . Arteriosclerosis 10, 2 4 0 - 2 4 5 . L o v e , P.E. a n d S a n t o r o , S.A. ( 1 9 9 0 ) A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s : a n t i c a r d i o l i p i n a n d t h e l u p u s a n t i c o a g u l a n t i n s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s ( S L E ) a n d i n n o n - S L E d i s o r d e r s . P r e v a l e n c e a n d c l i n i c a l s i g n i f i c a n c e . Ann Intern Med 112, 682-698. L o z i e r , J., T a k a h a s h i , N., a n d P u t n a m , F.W. ( 1 9 8 4 ) C o m p l e t e a m i n o a c i d s e q u e n c e o f h u m a n p l a s m a b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I. Proc Natl Acad Sci U S A 81, 3 6 4 0 - 3 6 4 4 . L u , J, T h i e l , S, W i e d e m a n n , H , T i m p l , R, a n d R e i d , K . B . M . ( 1 9 9 0 ) B i n d i n g o f t h e p e n t a m e r / h e x a m e r f o r m s o f m a n n a n - b i n d i n g p r o t e i n t o z y m o s a n a c t i v a t e s t h e p r o e n z y m e Clr2Cls2 c o m p l e x , o f t h e c l a a i c a l p a t h w a y o f c o m p l e m e n t , w i t h o u t i n v o l v e m e n t o f C l q . J Immunol 144, 2 2 8 7 - 2 2 9 4 . L u , J., W i e d e m a n n , H., T i m p l , R., a n d R e i d , K . B . ( 1 9 9 3 ) S i m i l a r i t y i n s t r u c t u r e b e t w e e n C 1 q a n d t h e c o l l e c t i n s a s j u d g e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y . Behring Inst Mitt 93, 6-16. L u n d b l a d , R . L . a n d D a v i e , E.W. ( 1 9 6 4 ) T h e a c t i v a t i o n o f a n t i - h e m o p h i l i c f a c t o r ( f a c t o r V I I I ) b y a c t i v a t e d C h r i s t m a s f a c t o r ( a c t i v a t e d f a c t o r I X ) . Biochemistry 3, 1720-1725. M a d s e n , H.O., G a r r e d , P., K u r t z h a l s , J.A., L a m m , L.U., R y d e r , L.P., T h i e l , S., a n d S v e j g a a r d , A . ( 1 9 9 4 ) A n e w f r e q u e n t a l l e l e i s t h e m i s s i n g l i n k i n t h e s t r u c t u r a l p o l y m o r p h i s m o f t h e h u m a n m a n n a n - b i n d i n g p r o t e i n . Immunogenetics 40, 37-44. 1 6 4 M a l h o t r a , R., T h i e l , S., R e i d , K.B., a n d S i m , R.B. ( 1 9 9 0 ) H u m a n l e u k o c y t e C l q r e c e p t o r b i n d s o t h e r s o l u b l e p r o t e i n s w i t h c o l l a g e n d o m a i n s . J Exp Med 111, 9 5 5 - 9 5 9 . M a l h o t r a , R., W i l l i s , A.C., L o p e z , B.A., T h i e l , S., a n d S i m , R.B. ( 1 9 9 4 ) M a n n a n - b i n d i n g p r o t e i n l e v e l s i n h u m a n a m n i o t i c f l u i d d u r i n g g e s t a t i o n a n d its i n t e r a c t i o n w i t h c o l l e c t i n r e c e p t o r f r o m a m n i o n c e l l s . Immunology 82, 4 3 9 - 4 4 4 . M a l h o t r a , R., W o r m a l d , M.R., R u d d , P.M., F i s c h e r , P.B., D w e k , R.A., a n d S i m , R.B. ( 1 9 9 5 ) G l y c o s y l a t i o n c h a n g e s o f I g G a s s o c i a t e d w i t h r h e u m a t o i d a r t h r i t i s c a n a c t i v a t e c o m p l e m e n t v i a t h e m a n n o s e - b i n d i n g p r o t e i n . Nat Med 1, 2 3 7 - 2 4 3 . M a l i a , R.G., K i t c h e n , S., G r e a v e s , M., a n d P r e s t o n , F.E. ( 1 9 9 0 ) I n h i b i t i o n o f a c t i v a t e d p r o t e i n C a n d i t s c o f a c t o r p r o t e i n S b y a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s . Br J Haematol 76, 101-107. M a n f r e d i , A.A., R o v e r e , P., G a l a t i , G., H e l t a i , S., B o z z o l o , E., S o l d i n i , L., D a v o u s t , J., B a l e s t r i e r i , G., T i n c a n i , A., a n d S a b b a d i n i , M.G. ( 1 9 9 8 a ) A p o p t o t i c c e l l c l e a r a n c e i n s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . I. O p s o n i z a t i o n b y a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s . Arthritis Rheum 41, 2 0 5 - 2 1 4 . M a n f r e d i , A.A., R o v e r e , P., H e l t a i , S., G a l a t i , G , N e b b i a , G , T i n c a n i , A., B a l e s t r i e r i , G., a n d S a b b a d i n i , M . G . ( 1 9 9 8 b ) A p o p t o t i c c e l l c l e a r a n c e i n s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . II. R o l e o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I. Arthritis Rheum 41, 2 1 5 - 2 2 3 . M a n n , K.G., J e n n y , R.J., a n d K r i s h n a s w a m y , S. ( 1 9 8 8 ) C o f a c t o r p r o t e i n s i n the a s s e m b l y a n d e x p r e s i o n o f b l o o d c l o t t i n g e n z y m e c o m p l e x e s . Annu Rev Biochem 57, 9 1 5 -9 5 6 . M a r c i n i a k , E . a n d R o m o n d , E . H . ( 1 9 8 9 ) I m p a i r e d c a t a l y t i c f u n c t i o n o f a c t i v a t e d p r o t e i n C : a n e w i n v i t r o m a n i f e s t a t i o n o f l u p u s a n t i c o a g u l a n t . Blood 74, 2 4 2 6 - 2 4 3 2 . M a r j a n , J.M.J. ( 1 9 9 4 ) T h e i n t e r a c t i o n o f l i p o s o m e s w i t h c o m p l e m e n t p r o t e i n s a n d p r o t e i n S. Ph.D. Thesis Dissertation. T h e U n i v e r s i t y o f B r i t i s h C o l u m b i a . M a r l a r , R.A., K l e i s s , A.J., a n d G r i f f i n , J.H. ( 1 9 8 1 ) H u m a n p r o t e i n C : i n a c t i v a t i o n o f f a c t o r s V a n d V I I I i n p l a s m a b y t h e a c t i v a t e d m o l e c u l e . Ann N YAcad Sci 370, 3 0 3 M a r t i n u z z o , M.E., M a c l o u f , J., C a r r e r a s , L.O., a n d L e v y - T o l e d a n o , S. ( 1 9 9 3 ) A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s e n h a n c e t h r o m b i n - i n d u c e d p l a t e l e t a c t i v a t i o n a n d t h r o m b o x a n e f o r m a t i o n . Thromb Haemost 70, 6 6 7 - 6 7 1 . M a t s u s h i t a , M . a n d F u j i t a , T. ( 1 9 9 2 ) A c t i v a t i o n o f t h e c l a s s i c a l c o m p l e m e n t p a t h w a y b y m a n n o s e - b i n d i n g p r o t e i n i n a s s o c i a t i o n w i t h a n o v e l C l s - l i k e s e r i n e p r o t e a s e . J Exp Med 176, 1 4 9 7 - 1 5 0 2 . M a t s u u r a , E., I g a r a s h i , M., I g a r a s h i , Y., N a g a e , H., I c h i k a w a , K., Y a s u d a , T., a n d K o i k e , T. ( 1 9 9 1 ) M o l e c u l a r d e f i n i t i o n o f h u m a n b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I ( b e t a 2 - G P I ) b y 165 c D N A c l o n i n g a n d i n t e r - s p e c i e s d i f f e r e n c e s o f b e t a 2 - G P I i n a l t e r n a t i o n o f a n t i c a r d i o l i p i n b i n d i n g . Int Immunol?), 1 2 1 7 - 1 2 2 1 . M a t s u u r a , E., I g a r a s h i , Y., F u j i m o t o , M., I c h i k a w a , K., a n d K o i k e , T. ( 1 9 9 0 ) A n t i c a r d i o l i p i n c o f a c t o r ( s ) a n d d i f f e r e n t i a l d i a g n o s i s o f a u t o i m m u n e d i s e a s e . Lancet 336, 177-178. M a t s u u r a , E., I g a r a s h i , Y., Y a s u d a , T., T r i p l e t t , D.A., a n d K o i k e , T. ( 1 9 9 4 ) A n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s r e c o g n i z e b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I s t r u c t u r e a l t e r e d b y i n t e r a c t i n g w i t h a n o x y g e n m o d i f i e d s o l i d p h a s e s u r f a c e . J Exp Med 179, 4 5 7 -4 6 2 . M c L e a n , J.W., T o m l i n s o n , J.E., K u a n g , W.J., E a t o n , D.L., C h e n , E.Y., F l e s s , G.M., S c a n u , A.M., a n d L a w n , R.M. ( 1 9 8 7 ) c D N A s e q u e n c e o f h u m a n a p o l i p o p r o t e i n ( a ) i s h o m o l o g o u s t o p l a s m i n o g e n . Nature 330, 132-137. M c N a l l y , T., C r o o k , M., M a c k i e , I.J., I s e n b e r g , D.A., a n d M a c h i n , S.J. ( 1 9 9 4 ) B e t a 2 g l y c o p r o t e i n - I a n t i g e n i s i n c r e a s e d i n p r i m a r y h y p e r l i p i d a e m i a . Br J Haematol 88, 4 2 4 - 4 2 6 . M c N a l l y , T., M a c k i e , I.J., I s e n b e r g , D.A., a n d M a c h i n , S.J. ( 1 9 9 6 ) b e t a 2 g l y c o p r o t e i n - I i n h i b i t s f a c t o r X I I a c t i v a t i o n o n t r i g l y c e r i d e r i c h l i p o p r o t e i n s : t h e e f f e c t o f a n t i b o d i e s f r o m p l a s m a o f p a t i e n t s w i t h a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . Thromb Haemost 76, 2 2 0 - 2 2 5 . M c N a l l y , T., M a c k i e , I.J., M a c h i n , S.J., a n d I s e n b e r g , D.A. ( 1 9 9 5 ) E l e v a t e d l e v e l s o f b e t a 2 g l y c o p r o t e i n - I ( b e t a 2 G P I ) i n a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d y s y n d r o m e are d u e t o i n c r e a s e d a m o u n t s o f b e t a 2 G P I i n a s s o c i a t i o n w i t h o t h e r p l a s m a c o n s t i t u e n t s . Blood Coagul Fibrinolysis 6, 4 1 1 - 4 1 6 . M c N a l l y , T., M a c k i e , I.J., M a c h i n , S.J., a n d I s e n b e r g , D.A. ( 1 9 9 5 ) I n c r e a s e d l e v e l s o f b e t a 2 g l y c o p r o t e i n - I a n t i g e n a n d b e t a 2 g l y c o p r o t e i n - I b i n d i n g a n t i b o d i e s a r e a s s o c i a t e d w i t h a h i s t o r y o f t h r o m b o e m b o l i c c o m p l i c a t i o n s i n p a t i e n t s w i t h S L E a n d p r i m a r y a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . Br J Rheumatol 34, 1 0 3 1 - 1 0 3 6 . M c N e i l , H.P., S i m p s o n , R.J., C h e s t e r m a n , C.N., a n d K r i l i s , S.A. ( 1 9 9 0 ) A n t i -p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s a r e d i r e c t e d a g a i n s t a c o m p l e x a n t i g e n t h a t i n c l u d e s a l i p i d - b i n d i n g i n h i b i t o r o f c o a g u l a t i o n : b e t a 2- g l y c o p r o t e i n I ( a p o l i p o p r o t e i n H ) . Proc Natl Acad Sci US AST, 4 1 2 0 - 4 1 2 4 . M e h d i , H., N u n n , M., S t e e l , D.M., W h i t e h e a d , A.S., P e r e z , M., W a l k e r , L., a n d P e e p l e s , M . E . ( 1 9 9 1 ) N u c l e o t i d e s e q u e n c e a n d e x p r e s s i o n o f t h e h u m a n g e n e e n c o d i n g a p o l i p o p r o t e i n H ( b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I). Gene 108, 2 9 3 - 2 9 8 . M e r o n i , P.L., D e l P a p a , N., R a s c h i , E., P a n z e r i , P., B o r g h i , M.O., T i n c a n i , A., B a l e s t r i e r i , G., K h a m a s h t a , M.A., H u g h e s , G. R , K o i k e , T., a n d K r i l i s , S.A. ( 1 9 9 8 ) B e t a 2 -g l y c o p r o t e i n I as a ' c o f a c t o r ' f o r a n t i - p h o s p h o l i p i d r e a c t i v i t y w i t h e n d o t h e l i a l c e l l s . Lupus 1 Suppl 2, S 4 4 - S 4 7 166 M e r r i l l , J.T., Z h a n g , H.W., S h e n , C , B u t m a n , B.T., J e f f r i e s , E.P., L a h i t a , R.G., a n d M y o n e s , B . L . ( 1 9 9 9 ) E n h a n c e m e n t o f p r o t e i n S a n t i c o a g u l a n t f u n c t i o n b y b e t a 2 -g l y c o p r o t e i n I, a m a j o r t a r g e t a n t i g e n o f a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s : b e t a 2 -g l y c o p r o t e i n I i n t e r f e r e s w i t h b i n d i n g o f p r o t e i n S t o it s p l a s m a i n h i b i t o r , C 4 b -b i n d i n g p r o t e i n . Thromb Haemost 81, 7 4 8 - 7 5 7 . M e s t e r s , R.M., H e e b , M.J., a n d G r i f f i n , J.H. ( 1 9 9 3 ) I n t e r a c t i o n s a n d i n h i b i t i o n o f b l o o d c o a g u l a t i o n f a c t o r V a i n v o l v i n g r e s i d u e s 3 1 1 - 3 2 5 o f a c t i v a t e d p r o t e i n C. Protein Sci 2, 1 4 8 2 - 1 4 8 9 . M o o r e , J.E. a n d L u t z , W.B. ( 1 9 5 5 ) T h e n a t u r a l h i s t o r y o f s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s : a n a p p r o a c h t o its s t u d y t h r o u g h c h r o m i c b i o l o g i c f a l s e - p o s i t i v e r e a c t i o n s . J Chronic Dis 1,297-316. M o r g a n , B.P. a n d H a r r i s , C L . ( 1 9 9 9 ) R e g u l a t i o n i n t h e a c t i v a t i o n p a t h w a y s . In: Complement Regulatory Proteins A c a d e m i c P r e s s , S a n D i e g o , 4 1 - 1 3 6 . M o r i , T., T a k e y a , H., N i s h i o k a , J., G a b a z z a , E . C , a n d S u z u k i , K . ( 1 9 9 6 ) b e t a 2-G l y c o p r o t e i n I m o d u l a t e s t h e a n t i c o a g u l a n t a c t i v i t y o f a c t i v a t e d p r o t e i n C o n t h e p h o s p h o l i p i d s u r f a c e . Thromb Haemost 75, 49-55. N a g a s a w a , S., I c h i h a r a , C , a n d S t r o u d , R.M. ( 1 9 8 0 ) C l e a v a g e o f C 4 b b y C 3 b i n a c t i v a t o r : p r o d u c t i o n o f a n i c k e d f o r m o f C 4 b , C4b', as a n i n t e r m e d i a t e c l e a v a g e p r o d u c t o f C 4 b b y C 3 b i n a c t i v a t o r . J Immunol 125, 5 7 8 - 5 8 2 . N a g a s a w a , S. a n d S t r o u d , R.M. ( 1 9 7 7 ) C l e a v a g e o f C 2 b y C l s i n t o t h e a n t i g e n i c a l l y d i s t i n c t f r a g m e n t s C 2 a a n d C 2 b : d e m o n s t r a t i o n o f b i n d i n g o f C 2 b t o C 4 b . Proc Natl Acad Sci USA 74, 2 9 9 8 - 3 0 0 1 . N a k a y a , Y., S c h a e f e r , E.J., a n d B r e w e r , H.B.J. ( 1 9 8 0 ) A c t i v a t i o n o f h u m a n p o s t h e p a r i n l i p o p r o t e i n l i p a s e b y a p o l i p o p r o t e i n H ( b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I). Biochem Biophys Res Commun 95, 1 1 6 8 - 1 1 7 2 . N e m e r s o n , Y . ( 1 9 8 8 ) T i s s u e f a c t o r a n d h e m o s t a s i s . Blood 71, 1-8. N i c h o l s o n - W e l l e r , A., B u r g e , J., F e a r o n , D.T., W e l l e r , P.F., a n d A u s t e n , K . F . ( 1 9 8 2 ) I s o l a t i o n o f a h u m a n e r y t h r o c y t e m e m b r a n e g l y c o p r o t e i n w i t h d e c a y - a c c e l e r a t i n g a c t i v i t y f o r C 3 c o n v e r t a s e s o f t h e c o m p l e m e n t s y s t e m . J Immunol 129, 184-189. N i m p f , J., B e v e r s , E.M., B o m a n s , P.H., T i l l , U., W u r m , H., K o s t n e r , G.M., a n d Z w a a l , R.F. ( 1 9 8 6 ) P r o t h r o m b i n a s e a c t i v i t y o f h u m a n p l a t e l e t s i s i n h i b i t e d b y b e t a 2-g l y c o p r o t e i n - I . Biochim Biophys Acta 884, 142-149. N i m p f , J., W u r m , H., a n d K o s t n e r , G.M. ( 1 9 8 5 ) I n t e r a c t i o n o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n - I w i t h h u m a n b l o o d p l a t e l e t s : i n f l u e n c e u p o n t h e A D P - i n d u c e d a g g r e g a t i o n . Thromb Haemost 54, 3 9 7 - 4 0 1 . 167 N i m p f , J., W u r m , H., a n d K o s t n e r , G.M. ( 1 9 8 7 ) B e t a 2 - g l y c o p r o t e i n - I ( a p o - H ) i n h i b i t s the r e l e a s e r e a c t i o n o f h u m a n p l a t e l e t s d u r i n g A D P - i n d u c e d a g g r e g a t i o n . Atherosclerosis 63, 109-114. N o c h y , D., D a u g a s , E., D r o z , D., B e a u f i l s , H., G r u n f e l d , J.P., P i e t t e , J.C., B a r i e t y , J., a n d H i l l , G . ( 1 9 9 9 ) T h e i n t r a r e n a l v a s c u l a r l e s i o n s a s s o c i a t e d w i t h p r i m a r y a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . J Am Soc Nephrol 10, 5 0 7 - 5 1 8 . N u k a t s u k a , M . a n d N a g a s a w a , S. ( 1 9 8 7 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n h u m a n p r o t e i n S a n d C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n ( C 4 b p ) . J Biochem 102, 5 9 9 - 6 0 5 . O h k u r a , N., H a g i h a r a , Y., Y o s h i m u r a , T., G o t o , Y., a n d K a t o , H . ( 1 9 9 8 ) P l a s m i n c a n r e d u c e t h e f u n c t i o n o f h u m a n b e t a 2 g l y c o p r o t e i n I b y c l e a v i n g d o m a i n V i n t o a n i c k e d f o r m . Blood 91, 4 1 7 3 - 4 1 7 9 . O h l i n , A.K., B j o r k , I., a n d S t e n f l o , J. ( 1 9 9 0 ) P r o t e o l y t i c f o r m a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f a f r a g m e n t o f p r o t e i n C c o n t a i n i n g t h e g a m m a - c a r b o x y g l u t a m i c a c i d r i c h d o m a i n a n d t h e E G F - l i k e r e g i o n . Biochemistry 29, 6 4 4 - 6 5 1 . O h t a , M., O k a d a , M., Y a m a s h i n a , I., a n d K a w a s a k i , T. ( 1 9 9 0 ) T h e m e c h a n i s m o f c a r b o h y d r a t e - m e d i a t e d c o m p l e m e n t a c t i v a t i o n b y t h e s e r u m m a r m a n - b i n d i n g p r o t e i n . J Biol Chem 265, 1 9 8 0 - 1 9 8 4 . O k k e l s , H., R a s m u s s e n , T.E., S a n g h e r a , D.K., K a m b o h , M.I., a n d K r i s t e n s e n , T. ( 1 9 9 9 ) S t r u c t u r e o f t h e h u m a n b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I ( a p o l i p o p r o t e i n H ) g e n e . Eur J Biochem 259, 4 3 5 - 4 4 0 . O l e e , T., P i e r a n g e l i , S.S., H a n d l e y , H.H., L e , D.T., W e i , X., L a i , C.J., E n , J., N o v o t n y , W., H a r r i s , E.N., W o o d s , V . L . J . , a n d C h e n , P.P. ( 1 9 9 6 ) A m o n o c l o n a l I g G a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d y f r o m a p a t i e n t w i t h t h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e i s t h r o m b o g e n i c i n m i c e . Proc Natl Acad Sci USA 93, 8 6 0 6 - 8 6 1 1 . O o s t i n g , J.D., D e r k s e n , R.H., B o b b i n k , I.W., H a c k e n g , T.M., B o u m a , B.N., a n d d e G r o o t , P.G. ( 1 9 9 3 ) A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s d i r e c t e d a g a i n s t a c o m b i n a t i o n o f p h o s p h o l i p i d s w i t h p r o t h r o m b i n , p r o t e i n C , o r p r o t e i n S: a n e x p l a n a t i o n f o r t h e i r p a t h o g e n i c m e c h a n i s m ? Blood 81, 2 6 1 8 - 2 6 2 5 . O s m a n d , A.P., F r i e d e n s o n , B., G e w u r z , H., P a i n t e r , R.H., H o f m a n n , T., a n d S h e l t o n , E . ( 1 9 7 7 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f C - r e a c t i v e p r o t e i n a n d t h e c o m p l e m e n t s u b c o m p o n e n t C l t as h o m o l o g o u s p r o t e i n s d i s p l a y i n g c y c l i c p e n t a m e r i c s y m m e t r y ( p e n t r a x i n s ) . Proc Natl Acad Sci USA 74, 7 3 9 - 7 4 3 . O s t e r u d , B . a n d R a p a p o r t , S.I. ( 1 9 7 0 ) S y n t h e s i s o f i n t r i n s i c f a c t o r X a c t i v a t o r . I n h i b i t i o n o f t h e f u n c t i o n o f f o r m e d a c t i v a t o r b y a n t i b o d i e s t o f a c t o r V I I I a n d t o f a c t o r I X . Biochemistry 9, 1 8 5 4 - 1 8 6 1 . 168 0 s t e r u d , B . a n d R a p a p o r t , S.I. ( 1 9 7 7 ) A c t i v a t i o n o f f a c t o r I X b y t h e r e a c t i o n p r o d u c t o f t i s s u e f a c t o r a n d f a c t o r V I I : a d d i t i o n a l p a t h w a y f o r i n i t i a t i n g b l o o d c o a g u l a t i o n . Proc Natl Acad Sci USA 14, 5 2 6 0 P a n g b o r n , M . C . ( 1 9 4 1 ) A n e w s e r o l o g i c a l l y a c t i v e p h o s p h o l i p i d f r o m b e e f heart. Proc Soc Exp Biol Med 48, 4 8 4 - 4 8 6 . P e l l e t i e r , S., L a n d i , B., P i e t t e , J . C , E k e r t , P., C o u t e l l i e r , A., D e s m o u l i n s , C , F a d l a l l a h , J.P., H e r s o n , S., a n d V a l l a , D . ( 1 9 9 4 ) A n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e as t h e s e c o n d c a u s e o f n o n - t u m o r o u s B u d d - C h i a r i s y n d r o m e . J Hepatol 21, 76-80. P e n g o , V., B i a s i o l o , A., B r o c c o , T., T o n e t t o , S., a n d R u f f a t t i , A . ( 1 9 9 6 ) A u t o a n t i b o d i e s t o p h o s p h o l i p i d - b i n d i n g p l a s m a p r o t e i n s i n p a t i e n t s w i t h t h r o m b o s i s a n d p h o s p h o l i p i d - r e a c t i v e a n t i b o d i e s . Thromb Haemost 75, 7 2 1 - 7 2 4 . P e n g o , V., B r o c c o , T., B i a s i o l o , A., R a m p a z z o , P., C a r r a r o , P., a n d Z a m a r c h i , R. ( 1 9 9 9 ) P r o c o a g u l a n t E f f e c t o f A n t i - b e t a 2 - G l y c o p r o t e i n I A n t i b o d i e s W i t h L u p u s A n t i c o a g u l a n t A c t i v i t y . Blood 94,3814-3819. P e p y s , M . B . a n d B a l t z , M . L . ( 1 9 8 3 ) A c u t e p h a s e p r o t e i n s w i t h s p e c i a l r e f e r e n c e t o C -r e a c t i v e p r o t e i n a n d r e l a t e d p r o t e i n s ( p e n t a x i n s ) a n d s e r u m a m y l o i d A p r o t e i n . Adv Immunol 34, 141-212. P e p y s , M.B., B a l t z , M.L., d e B e e r , F . C , D y c k , R.F., H o l f o r d , S., B r e a t h n a c h , S.M., B l a c k , M.M., T r i b e , C.R., E v a n s , D.J., a n d F e i n s t e i n , A . ( 1 9 8 2 ) B i o l o g y o f s e r u m a m y l o i d P c o m p o n e n t . Ann N YAcad Sci 389, 2 8 6 - 2 9 8 . P i c i l l o , U., M i g l i a r e s i , S., M a r c i a l i s , M.R., L o n g o b a r d o , A., a P a l o m b a r a , F., a n d i r ri, G. ( 1 9 9 2 ) L o n g i t u d i n a l s u r v e y o f a n t i c a r d i o l i p i n a n t i o d i e s i n s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . Scand J Rheumatol 21, 2 7 1 - 2 7 6 . P i e t t e , J . C , C a c o u b , P., a n d W e c h s l e r , B . 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( 1 9 7 9 ) T h e b i n d i n g o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n - I t o h u m a n s e r u m l i p o p r o t e i n s : d i s t r i b u t i o n a m o n g d e n s i t y f r a c t i o n s . FEBS Lett 102, 183-186. 169 P o l z , E., W u r m , H., a n d K o s t n e r , G.M. ( 1 9 8 0 ) I n v e s t i g a t i o n s o n b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n - I i n t h e rat: i s o l a t i o n f r o m s e r u m a n d d e m o n s t r a t i o n i n l i p o p r o t e i n d e n s i t y f r a c t i o n s . Int J Biochem 11, 2 6 5 - 2 7 0 . P o l z , E., W u r m , H., a n d K o s t n e r , G.M. ( 1 9 8 1 ) S t u d i e s o n the c o m p o s i t i o n o f t h e p r o t e i n p a r t o f t r i g l y c e r i d e r i c h l i p o p r o t e i n s o f h u m a n s e r u m : i s o l a t i o n o f p o l y m o r p h i c f o r m s o f b e t a 2- g l y c o p r o t e i n - I . Artery 9, 3 0 5 - 3 1 5 . P r a t i c o , D., F e r r o , D., L u l i a n o , L., R o k a c h , J., C o n t i , F., V a l e n s i n i , G., F i t z G e r a l d , G.A., a n d V i o l i , F. ( 1 9 9 9 ) O n g o i n g p r o t h r o m b o t i c state i n p a t i e n t s w i t h a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s : a r o l e f o r i n c r e a s e d l i p i d p e r o x i d a t i o n . Blood 93, 3 4 0 1 - 3 4 0 7 . P r i c e , B.E., R a u c h , J., S h i a , M.A., W a l s h , M.T., L i e b e r t h a l , W., G i l l i g a n , H.M., O ' L a u g h l i n , T., K o h , J.S., a n d L e v i n e , J.S. ( 1 9 9 6 ) A n t i - p h o s p h o l i p i d a u t o a n t i b o d i e s b i n d t o a p o p t o t i c , b u t n o t v i a b l e , t h y m o c y t e s i n a b e t a 2-g l y c o p r o t e i n I - d e p e n d e n t m a n n e r . J Immunol 157, 2 2 0 1 - 2 2 0 8 . R a i , R., C o h e n , H., D a v e , M., a n d R e g a n , L . ( 1 9 9 7 ) R a n d o m i s e d c o n t r o l l e d t r i a l o f a s p i r i n a n d a s p i r i n p l u s h e p a r i n i n p r e g n a n t w o m e n w i t h r e c u r r e n t m i s c a r r i a g e a s s o c i a t e d w i t h p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s ( o r a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s ) . BMJ 3 1 4,253-257. R a u c h , J. a n d J a n o f f , A . S . ( 1 9 9 0 ) P h o s p h o l i p i d i n t h e h e x a g o n a l II p h a s e i s i m m u n o g e n i c : e v i d e n c e f o r i m m u n o r e c o g n i t i o n o f n o n b i l a y e r l i p i d p h a s e s i n v i v o . Proc Natl Acad Sci USA 87, 4 1 1 2 - 4 1 1 4 . R e i d , K . B . a n d G a g n o n , J. ( 1 9 8 2 ) H u m a n C 4 - b i n d i n g p r o t e i n : N - t e r m i n a l a m i n o a c i d s e q u e n c e a n a l y s i s a n d l i m i t e d p r o t e o l y s i s b y t r y p s i n . FEBS Letters. 137, 75-79. 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( 1 9 9 6 ) H y p e r c o a g u l a b l e state i n p a t i e n t s w i t h a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e i s r e l a t e d t o h i g h i n d u c e d t i s s u e f a c t o r e x p r e s s i o n o n m o n o c y t e s a n d t o l o w f r e e p r o t e i n s. Arterioscler Thromb Vase Biol 16, 1 3 1 9 - 1 3 2 6 . R o b b i n s , D.L., L e u n g , S., M i l l e r - B l a i r , D.J., a n d Z i b o h , V . ( 1 9 9 8 ) E f f e c t o f a n t i c a r d i o l i p i n / b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I c o m p l e x e s o n p r o d u c t i o n o f t h r o m b o x a n e A 2 b y p l a t e l e t s f r o m p a t i e n t s w i t h the a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . J Rheumatol 25, 51-56. 170 R o d r i g u e z , d . C , L u b l i n , D.M., R u b i n s t e i n , P., a n d A t k i n s o n , J.P. ( 1 9 8 5 ) H u m a n g e n e s f o r t h r e e c o m p l e m e n t c o m p o n e n t s t h a t r e g u l a t e t h e a c t i v a t i o n o f C 3 a r e t i g h t l y l i n k e d . J Exp Med 161, 1 1 8 9 - 1 1 9 5 . R o s o v e , M . H . a n d B r e w e r , P.M. ( 1 9 9 2 ) A n t i p h o s p h o l i p i d t h r o m b o s i s : c l i n i c a l c o u r s e a f t e r t h e f i r s t t h r o m b o t i c e v e n t i n 7 0 p a t i e n t s . Ann Intern Med 117, 303-308. R o u b e y , R.A. ( 1 9 9 4 ) A u t o a n t i b o d i e s t o p h o s p h o l i p i d - b i n d i n g p l a s m a p r o t e i n s : a n e w v i e w o f l u p u s a n t i c o a g u l a n t s a n d o t h e r " a n t i p h o s p h o l i p i d " a u t o a n t i b o d i e s . Blood 84, 2 8 5 4 - 2 8 6 7 . R o u b e y , R.A., E i s e n b e r g , R.A., H a r p e r , M.F., a n d W i n f i e l d , J.B. ( 1 9 9 5 ) " A n t i c a r d i o l i p i n " a u t o a n t i b o d i e s r e c o g n i z e b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I i n t h e a b s e n c e o f p h o s p h o l i p i d . I m p o r t a n c e o f A g d e n s i t y a n d b i v a l e n t b i n d i n g . J Immunol 154, 9 5 4 - 9 6 0 . R o v e r e , P., M a n f r e d i , A.A., V a l l i n o t o , C , Z i m m e r m a n n , V.S., F a s c i o , U., B a l e s t r i e r i , G., R i c c i a r d i - C a s t a g n o l i , P., R u g a r l i , C , T i n c a n i , A., a n d S a b b a d i n i , M . G . ( 1 9 9 8 ) D e n d r i t i c c e l l s p r e f e r e n t i a l l y i n t e r n a l i z e a p o p t o t i c c e l l s o p s o n i z e d b y a n t i - b e t a 2 -g l y c o p r o t e i n I a n t i b o d i e s . J Autoimmun 11, 4 0 3 - 4 1 1 . R o j k j a e r , R., K l a s r k e , D.A., a n d S c h o u s b o e , I. ( 1 9 9 7 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I a n d c a l m o d u l i n , a n d i d e n t i f i c a t i o n o f a b i n d i n g s e q u e n c e i n b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I. Biochim Biophys Acta 1339, 2 1 7 - 2 2 5 . R u d d y , S. a n d A u s t e n , K . F . ( 1 9 6 9 ) C 3 i n a c t i v a t o r o f m a n . I. H e m o l y t i c m e a s u r e m e n t b y t h e a c t i v a t i o n o f c e l l - b o u n d C 3 . J Immunol 102, 5 3 3 - 5 4 3 . R u i z - A r g u e l l e s , G.J., R u i z - A r g u e l l e s , A., D e l e z e , M., a n d A l a r c o n - S e g o v i a , D. ( 1 9 8 9 ) A c q u i r e d p r o t e i n C d e f i c i e n c y i n a p a t i e n t w i t h p r i m a r y a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . R e l a t i o n s h i p t o r e a c t i v i t y o f a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d y w i t h t h r o m b o m o d u l i n . J Rheumatol 16, 3 8 1 - 3 8 3 . S a m m a r i t a n o , L.R., G h a r a v i , A.E., a n d L o c k s h i n , M.D. ( 1 9 9 0 ) A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d y s y n d r o m e : i m m u n o l o g i c a n d c l i n i c a l a s p e c t s . Semin Arthritis Rheum 20, 81-96. S a m m a r i t a n o , L.R., G h a r a v i , A.E., S o b e r a n o , C , L e v y , R.A., a n d L o c k s h i n , M.D. ( 1 9 9 2 ) P h o s p h o l i p i d b i n d i n g o f a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s a n d p l a c e n t a l a n t i c o a g u l a n t p r o t e i n . J C l i n I m m u n o l 12, 27-35. S a m m a r i t a n o , L.R., N g , S., S o b e l , R., L o , S.K., S i m a n t o v , R., F u r i e , R., K a e l l , A., S i l v e r s t e i n , R., a n d S a l m o n , J.E. ( 1 9 9 7 ) A n t i c a r d i o l i p i n I g G s u b c l a s s e s : a s s o c i a t i o n o f I g G 2 w i t h a r t e r i a l a n d / o r v e n o u s t h r o m b o s i s . A r t h r i t i s R h e u m 40, 1 9 9 8 - 2 0 0 6 . 171 S a n g h e r a , D.K., K r i s t e n s e n , T., H a m m a n , R.F., a n d K a m b o h , M.I. ( 1 9 9 7 ) M o l e c u l a r b a s i s o f t h e a p o l i p o p r o t e i n H ( b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I) p r o t e i n p o l y m o r p h i s m . H u m G e n e t 100, 57-62. S a n g h e r a , D.K., W a g e n k n e c h t , D.R., M c l n t y r e , J.A., a n d K a m b o h , M.I. ( 1 9 9 7 ) I d e n t i f i c a t i o n o f s t r u c t u r a l m u t a t i o n s i n t h e fifth d o m a i n o f a p o l i p o p r o t e i n H ( b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I) w h i c h a f f e c t p h o s p h o l i p i d b i n d i n g . H u m M o l G e n e t 6, 3 1 1 - 3 1 6 . S a s t r y , K., H e r m a n , G.A., D a y , L., D e i g n a n , E., B r u n s , G., M o r t o n , C.C., a n d E z e k o w i t z , R.A. ( 1 9 8 9 ) T h e h u m a n m a n n o s e - b i n d i n g p r o t e i n gene. E x o n s t r u c t u r e r e v e a l s i t s e v o l u t i o n a r y r e l a t i o n s h i p t o a h u m a n p u l m o n a r y s u r f a c t a n t g e n e a n d l o c a l i z a t i o n t o c h r o m o s o m e 10. J E x p M e d 170, 1 1 7 5 - 1 1 8 9 . S a t o , R., M a t s u s h i t a , M., M i y a t a , M., S a t o , Y., K a s u k a w a , R., a n d F u j i t a , T. ( 1 9 9 7 ) S u b s t a n c e s r e a c t i v e w i t h m a n n o s e - b i n d i n g p r o t e i n ( M B P ) i n s e r a o f p a t i e n t s w i t h r h e u m a t o i d a r t h r i t i s . F u k u s h i m a J M e d S c i 43, 99-111. S c h a r f s t e i n , J., F e r r e i r a , A., G i g l i , I., a n d N u s s e n z w e i g , V . ( 1 9 7 8 ) H u m a n C 4 - b i n d i n g p r o t e i n . I. I s o l a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n . J E x p M e d 148, 2 0 7 - 2 2 2 . S c h o u s b o e , I. ( 1 9 8 3 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e i n t e r a c t i o n b e t w e e n b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I a n d m i t o c h o n d r i a , p l a t e l e t s , l i p o s o m e s a n d b i l e a c i d s . Int J B i o c h e m 15, 1 3 9 3 -1401. S c h o u s b o e , I. ( 1 9 8 3 ) E f f e c t o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I o n t h e a c t i v i t y o f a d e n y l a t e c y c l a s e i n p l a t e l e t m e m b r a n e s . T h r o m b R e s 32, 2 9 1 - 2 9 9 . S c h o u s b o e , I. ( 1 9 8 5 ) b e t a 2 - G l y c o p r o t e i n I: a p l a s m a i n h i b i t o r o f t h e c o n t a c t a c t i v a t i o n o f t h e i n t r i n s i c b l o o d c o a g u l a t i o n p a t h w a y . B l o o d 66, 1 0 8 6 - 1 0 9 1 . S c h o u s b o e , I. ( 1 9 8 8 ) I n v i t r o a c t i v a t i o n o f the c o n t a c t a c t i v a t i o n s y s t e m ( H a g e m a n f a c t o r s y s t e m ) i n p l a s m a b y a c i d i c p h o s p h o l i p i d s a n d the i n h i b i t o r y e f f e c t o f b e t a 2-g l y c o p r o t e i n I o n t h i s a c t i v a t i o n . Int J B i o c h e m 20, 3 0 9 - 3 1 5 . S c h o u s b o e , I. ( 1 9 8 8 ) I n o s i t o l p h o s p h o l i p i d - a c c e l e r a t e d a c t i v a t i o n o f p r e k a l l i k r e i n b y a c t i v a t e d f a c t o r X I I a n d its i n h i b i t i o n b y b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I. E u r J B i o c h e m 176, 6 2 9 - 6 3 6 . S c h o u s b o e , I. a n d R a s m u s s e n , M.S. ( 1 9 8 8 ) T h e e f f e c t o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I o n t h e d e x t r a n s u l f a t e a n d s u l f a t i d e a c t i v a t i o n o f t h e c o n t a c t s y s t e m ( H a g e m a n f a c t o r s y s t e m ) i n t h e b l o o d c o a g u l a t i o n . Int J B i o c h e m 20, 7 8 7 - 7 9 2 . S c h o u s b o e , I. a n d R a s m u s s e n , M.S. ( 1 9 9 5 ) S y n c h r o n i z e d i n h i b i t i o n o f t h e p h o s p h o l i p i d m e d i a t e d a u t o a c t i v a t i o n o f f a c t o r X I I i n p l a s m a b y b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I a n d a n t i -b e t a 2- g l y c o p r o t e i n I. T h r o m b H a e m o s t 73, 798-804. 172 S c h r e i b e r , R.D. a n d M u l l e r - E b e r h a r d , H.J. ( 1 9 7 4 ) F o u r t h c o m p o n e n t o f h u m a n c o m p l e m e n t : d e s c r i p t i o n o f a t h r e e p o l y p e p t i d e c h a i n s t r u c t u r e . J E x p M e d 140, 1 3 2 4 - 1 3 3 5 . S c h r e i b e r , R.D., P a n g b u r n , M.K., L e s a v r e , P.H., a n d M u l l e r - E b e r h a r d , H.J. ( 1 9 7 8 ) I n i t i a t i o n o f t h e a l t e r n a t i v e p a t h w a y o f c o m p l e m e n t : r e c o g n i t i o n o f a c t i v a t o r s b y b o u n d C 3 b a n d a s s e m b l y o f t h e e n t i r e p a t h w a y f r o m s i x i s o l a t e d p r o t e i n s . P r o c N a t l A c a d S c i U S A 75, 3 9 4 8 - 3 9 5 2 . S c h u l z e , H.E., H e i d e , K., a n d H a u p t , H. ( 1 9 6 1 ) U b e r e i n b i s h e r u b e k a n n t e s n i e d e r m o l e k u l a r s B 2 - g l o b u l i n d e s h u m a n s e r u m s . N a t u r w i s s e n s c h a f t e r n 48, 7 1 9 -724. S c h u r , P.H. ( 1 9 8 7 ) I g G s u b c l a s s e s : a r e v i e w . A n n A l l e r g y 58, 89-100. S c h w a r z , H.P., H e e b , M.J., L a m m l e , B., B e r r e t t i n i , M., a n d G r i f f i n , J.H. ( 1 9 8 6 ) Q u a n t i t a t i v e i m m u n o b l o t t i n g o f p l a s m a a n d p l a t e l e t p r o t e i n S. T h r o m b H a e m o s t 56, 3 8 2 - 3 8 6 . S h a n , H., G o l d m a n , J., C u n t o , G., M a n u p p e l l o , J., C h a i k e n , I., C i n e s , D.B., a n d S i l b e r s t e i n , L . E . ( 1 9 9 8 ) H e t e r o g e n e i t y o f a n t i - p h o s p h o l i p i d a n d a n t i - e n d o t h e l i a l c e l l a n t i b o d i e s . J A u t o i m m u n 11, 6 5 1 - 6 6 0 . S h a p i r o , S.S. ( 1 9 9 6 ) T h e l u p u s a n t i c o a g u l a n t / a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . A n n u R e v M e d 4 7 , 5 3 3 - 5 5 3 . S h e n g , Y., S a l i , A., H e r z o g , H., L a h n s t e i n , J., a n d K r i l i s , S.A. ( 1 9 9 6 ) S i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s o f r e c o m b i n a n t h u m a n b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I i d e n t i f i e s a c l u s t e r o f l y s i n e r e s i d u e s t h a t a r e c r i t i c a l f o r p h o s p h o l i p i d b i n d i n g a n d a n t i - c a r d i o l i p i n a n t i b o d y a c t i v i t y . J I m m u n o l 157, 3 7 4 4 - 3 7 5 1 . S h i , W., C h o n g , B.H., a n d C h e s t e r m a n , C.N. ( 1 9 9 3 ) B e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I i s a r e q u i r e m e n t f o r a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s b i n d i n g t o a c t i v a t e d p l a t e l e t s : d i f f e r e n c e s w i t h l u p u s a n t i c o a g u l a n t s . B l o o d 81, 1 2 5 5 - 1 2 6 2 . S h i , W., C h o n g , B.H., H o g g , P.J., a n d C h e s t e r m a n , C.N. ( 1 9 9 3 ) A n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s b l o c k t h e i n h i b i t i o n b y b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I o f t h e f a c t o r X a g e n e r a t i n g a c t i v i t y o f p l a t e l e t s . Thromb Haemost 70, 3 4 2 - 3 4 5 . S i m , R.B., A r l a u d , G.J., a n d C o l o m b , M . G . ( 1 9 7 9 ) C I i n h i b i t o r - d e p e n d e n t d i s s o c i a t i o n o f h u m a n c o m p l e m e n t c o m p o n e n t C I b o u n d t o i m m u n e c o m p l e x e s . Biochem J179, 4 4 9 - 4 5 7 . S i m , R.B. a n d R e i d , K . B . ( 1 9 9 1 ) C I : m o l e c u l a r i n t e r a c t i o n s w i t h a c t i v a t i n g s y s t e m s . Immunol Today 12, 3 0 7 - 3 1 1 . 173 S i m a n t o v , R., L a S a l a , J.M., L o , S.K., G h a r a v i , A.E., S a m m a r i t a n o , L.R., S a l m o n , J.E., a n d S i l v e r s t e i n , R.L. ( 1 9 9 5 ) A c t i v a t i o n o f c u l t u r e d v a s c u l a r e n d o t h e l i a l c e l l s b y a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s . J Clin Invest 96, 2 2 1 1 - 2 2 1 9 . S i m s , P.J., F a i o n i , E.M., W i e d m e r , T., a n d S h a t t i l , S.J. ( 1 9 8 8 ) C o m p l e m e n t p r o t e i n s C 5 b -9 c a u s e r e l e a s e o f m e m b r a n e v e s i c l e s f r o m t h e p l a t e l e t s u r f a c e t h a t a r e e n r i c h e d i n t h e m e m b r a n e r e c e p t o r f o r c o a g u l a t i o n f a c t o r V a a n d e x p r e s s p r o t h r o m b i n a s e a c t i v i t y . J Biol Chem 263, 1 8 2 0 5 - 1 8 2 1 2 . S m i r n o v , M.D. a n d E s m o n , C T . ( 1 9 9 4 ) P h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e i n c o r p o r a t i o n i n t o v e s i c l e s s e l e c t i v e l y e n h a n c e s f a c t o r V a i n a c t i v a t i o n b y a c t i v a t e d p r o t e i n C . J Biol Chem 269, 8 1 6 - 8 1 9 . S m i r n o v , M.D., T r i p l e t t , D.T., C o m p , P . C , E s m o n , N.L., a n d E s m o n , C T . ( 1 9 9 5 ) O n t h e r o l e o f p h o s p h a t i d y l e t h a n o l a m i n e i n t h e i n h i b i t i o n o f a c t i v a t e d p r o t e i n C a c t i v i t y b y a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s . J Clin Invest 95, 3 0 9 - 3 1 6 . S t e i n k a s s e r e r , A., C o c k b u r n , D.J., B l a c k , D.M., B o y d , Y., S o l o m o n , E., a n d S i m , R.B. ( 1 9 9 2 ) A s s i g n m e n t o f a p o l i p o p r o t e i n H ( A P O H : b e t a - 2 - g l y c o p r o t e i n I) t o h u m a n c h r o m o s o m e 1 7 q 2 3 — q t e r ; d e t e r m i n a t i o n o f t h e m a j o r e x p r e s s i o n sit e . Cytogenet Cell Genet 60,31-33. S t e i n k a s s e r e r , A., D o r n e r , C , W u r z n e r , R., a n d S i m , R.B. ( 1 9 9 3 ) H u m a n b e t a 2-g l y c o p r o t e i n I: m o l e c u l a r a n a l y s i s o f D N A a n d a m i n o a c i d p o l y m o r p h i s m . Hum Genet 91, 4 0 1 - 4 0 2 . S t e i n k a s s e r e r , A., E s t a l l e r , C , W e i s s , E.H., S i m , R.B., a n d D a y , A . J . ( 1 9 9 1 ) C o m p l e t e n u c l e o t i d e a n d d e d u c e d a m i n o a c i d s e q u e n c e o f h u m a n b e t a 2- g l y c o p r o t e i n I. Biochem Jill, 3 8 7 - 3 9 1 . S t e n f l o , J., L u n d w a l l , A., a n d D a h l b a c k , B . ( 1 9 8 7 ) b e t a - H y d r o x y a s p a r a g i n e i n d o m a i n s h o m o l o g o u s t o t h e e p i d e r m a l g r o w t h f a c t o r p r e c u r s o r i n v i t a m i n K - d e p e n d e n t p r o t e i n S. Proc Natl Acad Sci USA 84 , 3 6 8 - 3 7 2 . S t e p h e n s , C J . ( 1 9 9 1 ) T h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . C l i n i c a l c o r r e l a t i o n s , c u t a n e o u s f e a t u r e s , m e c h a n i s m o f t h r o m b o s i s a n d t r e a t m e n t o f p a t i e n t s w i t h t h e l u p u s a n t i c o a g u l a n t a n d a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s . Br J Dermatol 125, 199-210. S t e w a r t , M.W., E t c h e s , W.S., a n d G o r d o n , P.A. ( 1 9 9 7 ) A n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d y -d e p e n d e n t C 5 b - 9 f o r m a t i o n . Brit J Haematol 96, 4 5 1 - 4 5 7 . S t h o e g e r , Z., S t h o e g e r , D., G r e e n , L., a n d G e l t n e r , D. ( 1 9 9 3 ) T h e r o l e o f a n t i c a r d i o l i p i n a u t o a n t i b o d i e s i n t h e p a t h o g e n e s i s o f a u t o i m m u n e h e m o l y t i c a n e m i a i n s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . J Rheumatol. 20, 2 0 5 8 - 2 0 6 1 . 174 S u g i , T. a n d M c l n t y r e , J.A. ( 1 9 9 5 ) A u t o a n t i b o d i e s t o p h o s p h a t i d y l e f h a n o l a m i n e ( P E ) r e c o g n i z e a k i n i n o g e n - P E c o m p l e x . Blood 86, 3 0 8 3 - 3 0 8 9 . S u l l i v a n , K.E., W o o t e n , C , G o l d m a n , D., a n d P e t r i , M . ( 1 9 9 6 ) M a n n o s e - b i n d i n g p r o t e i n g e n e t i c p o l y m o r p h i s m s i n b l a c k p a t i e n t s w i t h s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . Arthritis Rheum 39, 2 0 4 6 - 2 0 5 1 . S u m i y a , M., S u p e r , M., T a b o n a , P., L e v i n s k y , R.J., A r a i , T., T u r n e r , M.W., a n d S u m m e r f i e l d , J.A. ( 1 9 9 1 ) M o l e c u l a r b a s i s o f o p s o n i c d e f e c t i n i m m u n o d e f i c i e n t c h i l d r e n . Lancet 337, 1 5 6 9 - 1 5 7 0 . S u p e r , M., T h i e l , S., L u , J., L e v i n s k y , R.J., a n d T u r n e r , M.W. ( 1 9 8 9 ) A s s o c i a t i o n o f l o w l e v e l s o f m a n n a n - b i n d i n g p r o t e i n w i t h a c o m m o n d e f e c t o f o p s o n i s a t i o n . Lancet 2, 1 2 3 6 - 1 2 3 9 . S w a d z b a , J., D e C l e r c k , L.S., S t e v e n s , W.J., B r i d t s , C.H., v a n C o t t h e m , K.A., M u s i a l , J., J a n k o w s k i , M., a n d S z c z e k l i k , A . ( 1 9 9 7 ) A n t i c a r d i o l i p i n , a n t i - b e t a ( 2 ) -g l y c o p r o t e i n I, a n t i p r o t h r o m b i n a n t i b o d i e s , a n d l u p u s a n t i c o a g u l a n t i n p a t i e n t s w i t h s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s w i t h a h i s t o r y o f t h r o m b o s i s . J Rheumatol 24, 1 7 1 0 - 1 7 1 5 . T a b o n a , P., M e l l o r , A., a n d S u m m e r f i e l d , J.A. ( 1 9 9 5 ) M a n n o s e b i n d i n g p r o t e i n i s i n v o l v e d i n f i r s t - l i n e h o s t d e f e n c e : e v i d e n c e f r o m t r a n s g e n i c m i c e . Immunology 8 5 ,153-159. T a k e y a , H., M o r i , T., G a b a z z a , E.C., K u r o d a , K., D e g u c h i , H., M a t s u u r a , E., I c h i k a w a , K., K o i k e , T., a n d S u z u k i , K . ( 1 9 9 7 ) A n t i - b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I ( b e t a 2 G P I ) m o n o c l o n a l a n t i b o d i e s w i t h l u p u s a n t i c o a g u l a n t - l i k e a c t i v i t y e n h a n c e t h e b e t a 2 G P I b i n d i n g t o p h o s p h o l i p i d s . J Clin Invest 99, 2 2 6 0 - 2 2 6 8 . T a n , S.M., C h u n g , M.C., K o n , O.L., T h i e l , S., L e e , S.H., a n d L u , J . ( 1 9 9 6 ) I m p r o v e m e n t s o n t h e p u r i f i c a t i o n o f m a n n a n - b i n d i n g l e c t i n a n d d e m o n s t r a t i o n o f i t s C a ( 2 + ) -i n d e p e n d e n t a s s o c i a t i o n w i t h a C l s - l i k e s e r i n e p r o t e a s e . Biochem J 319, 3 2 9 - 3 3 2 . T a y l o r , M.E., B r i c k e l l , P.M., C r a i g , R.K., a n d S u m m e r f i e l d , J.A. ( 1 9 8 9 ) S t r u c t u r e a n d e v o l u t i o n a r y o r i g i n o f t h e g e n e e n c o d i n g a h u m a n s e r u m m a n n o s e - b i n d i n g p r o t e i n . Biochem J 262, 7 6 3 - 7 7 1 . T e n n e r , A.J., R o b i n s o n , S.L., a n d E z e k o w i t z , R.A. ( 1 9 9 5 ) M a n n o s e b i n d i n g p r o t e i n ( M B P ) e n h a n c e s m o n o n u c l e a r p h a g o c y t e f u n c t i o n v i a a r e c e p t o r t h a t c o n t a i n s t h e 126,000 M ( r ) c o m p o n e n t o f t h e C l q r e c e p t o r . Immunity 3, 4 8 5 - 4 9 3 . T h i e l , S., V o r u p - J e n s e n , T., S t o v e r , C M . , S c h w a e b l e , W., L a u r s e n , S.B., P o u l s e n , K , W i l l i s , A.C., E g g l e t o n , P., H a n s e n , S., H o l m s k o v , U., R e i d , K.B., a n d J e n s e n i u s , J.C. ( 1 9 9 7 ) A s e c o n d s e r i n e p r o t e a s e a s s o c i a t e d w i t h m a n n a n - b i n d i n g l e c t i n t h a t a c t i v a t e s c o m p l e m e n t . Nature 386, 5 0 6 - 5 1 0 . 175 T r i m b l e , M., B e l l , D.A., B r i e n , W., H a c h i n s k i , V., O ' K e e f e , B., M c L a y , C , a n d B l a c k , J. ( 1 9 9 0 ) T h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e : p r e v a l e n c e a m o n g p a t i e n t s w i t h s t r o k e a n d t r a n s i e n t i s c h e m i c a t t a c k s . Am J Med 88, 5 9 3 - 5 9 7 . T r i p l e t t , D.A. ( 1 9 9 6 ) L u p u s a n t i c o a g u l a n t s / a n t i p h o s p h o l i p i d - p r o t e i n a n t i b o d i e s : t h e g r e a t i m p o s t e r s . Lupus 5, 4 3 1 - 4 3 5 . T r i p l e t t , D.A. a n d B r a n d t , J.T. ( 1 9 8 8 ) L u p u s a n t i c o a g u l a n t s : m i s n o m e r , p a r a d o x , r i d d l e , e p i p h e n o m e n o n . Hematol Pathol 2, 121-143. T u r n e r , M.W. ( 1 9 9 6 ) M a n n o s e - b i n d i n g l e c t i n : t h e p l u r i p o t e n t m o l e c u l e o f t h e i n n a t e i m m u n e s y s t e m . Immunol Today 17, 5 3 2 - 5 4 0 . v a n E m m e r i k , L.C., K u i j p e r , E.J., F i j e n , C.A., D a n k e r t , J., a n d T h i e l , S. ( 1 9 9 4 ) B i n d i n g o f m a n n a n - b i n d i n g p r o t e i n t o v a r i o u s b a c t e r i a l p a t h o g e n s o f m e n i n g i t i s . Clin Exp Immunol 97, 4 1 1 - 4 1 6 . V a n d e n b e r g h e , P., Z a c h e e , P., V e r s t r a e t e , S., D e m u y n c k , H., B o o g a e r t s , M.A., a n d V e r h o e f , G.E. ( 1 9 9 6 ) S u c c e s s f u l c o n t r o l o f r e f r a c t o r y a n d l i f e - t h r e a t e n i n g a u t o i m m u n e h e m o l y t i c a n e m i a w i t h i n t r a v e n o u s i m m u n o g l o b u l i n s i n a m a n w i t h t h e p r i m a r y a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . Ann Hematol 73, 2 5 3 - 2 5 6 . V a z q u e z - M e l l a d o , J., L l o r e n t e , L., R i c h a u d - P a t i n , Y., a n d A l a r c o n - S e g o v i a , D . ( 1 9 9 4 ) E x p o s u r e o f a n i o n i c p h o s p h o l i p i d s u p o n p l a t e l e t a c t i v a t i o n p e r m i t s b i n d i n g o f b e t a 2 g l y c o p r o t e i n I a n d t h r o u g h i t t h a t o f I g G a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d i e s . S t u d i e s i n p l a t e l e t s f r o m p a t i e n t s w i t h a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e a n d n o r m a l s u b j e c t s . JAutoimmun 7, 3 3 5 - 3 4 8 . V i l a , L.M., M a y o r , A.M., V a l e n t i n , A.H., G a r c i a - S o b e r a l , M., a n d V i l a , S. ( 1 9 9 9 ) C l i n i c a l a n d i m m u n o l o g i c a l m a n i f e s t a t i o n s i n 1 34 P u e r t o R i c a n p a t i e n t s w i t h s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . Lupus 8, 2 7 9 - 2 8 6 . V i s v a n a t h a n , S. a n d M c N e i l , H.P. ( 1 9 9 9 ) C e l l u l a r i m m u n i t y t o b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n - 1 i n p a t i e n t s w i t h t h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . J Immunol 162, 6 9 1 9 - 6 9 2 5 . V l a c h o y i a n n o p o u l o s , P.G., K r i l i s , S.A., H u n t , J.E., M a n o u s s a k i s , M.N., a n d M o u t s o p o u l o s , H.M. ( 1 9 9 2 ) P a t i e n t s w i t h a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d i e s w i t h a n d w i t h o u t a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e : t h e i r c l i n i c a l f e a t u r e s a n d b e t a 2-g l y c o p r o t e i n - I p l a s m a l e v e l s . Eur J Clin Invest 22, 4 8 2 - 4 8 7 . V o g t , W., S c h m i d t , G., V o n B u t t l a r , B., a n d D i e m i n g e r , L . ( 1 9 7 8 ) A n e w f u n c t i o n o f t h e a c t i v a t e d t h i r d c o m p o n e n t o f c o m p l e m e n t : b i n d i n g t o C 5 , a n e s s e n t i a l step f o r C 5 a c t i v a t i o n . Immunology 34, 29-40. 176 W a l k e r , F.J. ( 1 9 8 1 ) R e g u l a t i o n o f a c t i v a t e d p r o t e i n C b y p r o t e i n S. T h e r o l e o f p h o s p h o l i p i d i n f a c t o r V a i n a c t i v a t i o n . J Biol Chem 256, 1 1 1 2 8 - 1 1 1 3 1 . W a l s h , M.T., W a t z l a w i c k , H., P u t n a m , F.W., S c h m i d , K., a n d B r o s s m e r , R. ( 1 9 9 0 ) E f f e c t o f t h e c a r b o h y d r a t e m o i e t y o n th e s e c o n d a r y s t r u c t u r e o f b e t a 2- g l y c o p r o t e i n . I. I m p l i c a t i o n s f o r t h e b i o s y n t h e s i s a n d f o l d i n g o f g l y c o p r o t e i n s . Biochemistry 29, 6 2 5 0 - 6 2 5 7 . W a n g , M.X., K a n d i a h , D.A., I c h i k a w a , K., K h a m a s h t a , M , H u g h e s , G., K o i k e , T., R o u b e y , R., a n d K r i l i s , S.A. ( 1 9 9 5 ) E p i t o p e s p e c i f i c i t y o f m o n o c l o n a l a n t i - b e t a 2-g l y c o p r o t e i n I a n t i b o d i e s d e r i v e d f r o m p a t i e n t s w i t h t h e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e . J Immunol 155, 1 6 2 9 - 1 6 3 6 . W a n g , S.X., C a i , G.P., a n d S u i , S.F. ( 1 9 9 8 ) T h e i n s e r t i o n o f h u m a n a p o l i p o p r o t e i n H i n t o p h o s p h o l i p i d m e m b r a n e s : a m o n o l a y e r s t u d y . Biochem J 335, 2 2 5 - 2 3 2 . W a n g , S.X., C a i , G., a n d S u i , S. ( 1 9 9 9 ) I n t r i n s i c f l u o r e s c e n c e s t u d y o f t h e i n t e r a c t i o n o f h u m a n a p o l i p o p r o t e i n H w i t h p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s . Biochemistry 38, 9 4 7 7 -9 4 8 4 . W a s s e r m a n n , A., N e i s s e r , A., a n d B r u c k , C . ( 1 9 0 6 ) E i n e s e r o d i a g n o s t i s h e r e a k t i o n b e i s y p h i l i s . Dtsch Med Wochenschr 32, 7 4 5 - 7 4 6 . W e i s , W.I. a n d D r i c k a m e r , K . ( 1 9 9 6 ) S t r u c t u r a l b a s i s o f l e c t i n - c a r b o h y d r a t e r e c o g n i t i o n . Ann Rev Biochem 65, 4 4 1 - 4 7 3 . W h a l e y , K. a n d R u d d y , S. ( 1 9 7 6 ) M o d u l a t i o n o f t h e a l t e r n a t i v e c o m p l e m e n t p a t h w a y b y B 1 H g l o b u l i n . J Exp Med 144, 1 1 1 6 3 . W i l l e m s , G.M., J a n s s e n , M.P., P e l s e r s , M.M., C o m f u r i u s , P., G a l l i , M., Z w a a l , R.F., a n d B e v e r s , E . M . ( 1 9 9 6 ) R o l e o f d i v a l e n c y i n t h e h i g h - a f f i n i t y b i n d i n g o f a n t i c a r d i o l i p i n a n t i b o d y - b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I c o m p l e x e s t o l i p i d m e m b r a n e s . Biochemistry 35, 1 3 8 3 3 - 1 3 8 4 2 . W i l s o n , W.A., G h a r a v i , A.E., K o i k e , T., L o c k s h i n , M.D., B r a n c h , D.W., P i e t t e , J . C , B r e y , R., D e r k s e n , R., H a r r i s , E.N., H u g h e s , G.R., T r i p l e t t , D.A., a n d K h a m a s h t a , M . A. ( 1 9 9 9 ) I n t e r n a t i o n a l c o n s e n s u s s t a t e m e n t o n p r e l i m i n a r y c l a s s i f i c a t i o n c r i t e r i a f o r d e f i n i t e a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e : r e p o r t o f a n i n t e r n a t i o n a l w o r k s h o p . Arthritis Rheum 42 , 1 3 0 9 - 1 3 1 1 . W o n g , W.W. ( 1 9 9 0 ) S t r u c t u r a l a n d f u n c t i o n a l c o r r e l a t i o n o f h u m a n c o m p l e m e n t r e c e p t o r t y p e 1. J Invest Dermatol 94, 6 4 S - 6 7 S . W u r m , H. ( 1 9 8 4 ) B e t a 2 - G l y c o p r o t e i n - I ( a p o l i p o p r o t e i n H ) i n t e r a c t i o n s w i t h p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s . Int J Biochem 16, 5 1 1 - 5 1 5 . 17 7 W u r m , H., B e u b l e r , E., P o l z , E., H o l a s e k , A., a n d K o s t n e r , G. ( 1 9 8 2 ) S t u d i e s o n t h e p o s s i b l e f u n c t i o n o f b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n - I : i n f l u e n c e i n t h e t r i g l y c e r i d e m e t a b o l i s m i n t h e rat. Metabolism 3 1 , 4 8 4 - 4 8 6 . Y a m a z a k i , M., A s a k u r a , H., J o k a j i , H., S a i t o , M., U o t a n i , C., K u m a b a s h i r i , I., M o r i s h i t a , E., A o s h i m a , K., I k e d a , T., a n d M a t s u d a , T. ( 1 9 9 4 ) P l a s m a l e v e l s o f l i p o p r o t e i n ( a ) a r e e l e v a t e d i n p a t i e n t s w i t h t h e a n t i p h o s p h o l i p i d a n t i b o d y s y n d r o m e . Thromb Haemost 7 1 , 4 2 4 - 4 2 7 . Y a n g , C.D., C h e n , S.L., S h e n , N., Q i , M., a n d X u , F. ( 1 9 9 8 ) D e t e c t i o n o f a n t i -r e c o m b i n a n t b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n 1 a n d a n t i - r e c o m b i n a n t b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n 1 f i f t h - d o m a i n a n t i b o d i e s i n s e r a f r o m p a t i e n t s w i t h s y s t e m i c l u p u s e r y t h e m a t o s u s . Rheumatol Int 18, 5-10. Y e g n e s w a r a n , S., S m i r n o v , M.D., S a f a , O., E s m o n , N.L., E s m o n , C.T., a n d J o h n s o n , A . E . ( 1 9 9 9 ) R e l o c a t i n g t h e a c t i v e s i t e o f a c t i v a t e d p r o t e i n C e l i m i n a t e s t h e n e e d f o r its p r o t e i n S c o f a c t o r . A f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r s t u d y . J Biol Chem 274, 5 4 6 2 - 5 4 6 8 . Y e g n e s w a r a n , S., W o o d , G.M., E s m o n , C.T., a n d J o h n s o n , A . E . ( 1 9 9 7 ) P r o t e i n S a l t e r s t h e a c t i v e s i t e l o c a t i o n o f a c t i v a t e d p r o t e i n C a b o v e t h e m e m b r a n e s u r f a c e . A f l u o r e s c e n c e r e s o n a n c e e n e r g y t r a n s f e r s t u d y o f t o p o g r a p h y . J Biol Chem 2 7 2 , 2 5 0 1 3 - 2 5 0 2 1 . Z a l m a n , L.S., W o o d , L.M., a n d M u l l e r - E b e r h a r d , H.J. ( 1 9 8 6 ) I s o l a t i o n o f a h u m a n e r y t h r o c y t e m e m b r a n e p r o t e i n c a p a b l e o f i n h i b i t i n g e x p r e s s i o n o f h o m o l o g o u s c o m p l e m e n t t r a n s m e m b r a n e c h a n n e l s . Proc Natl Acad Sci U S A 83, 6 9 7 5 - 6 9 7 9 . Z h a n g , L . a n d C a s t e l l i n o , F.J. ( 1 9 9 4 ) T h e b i n d i n g e n e r g y o f h u m a n c o a g u l a t i o n p r o t e i n C to a c i d i c p h o s p h o l i p i d v e s i c l e s c o n t a i n s a m a j o r c o n t r i b u t i o n f r o m l e u c i n e 5 i n t h e g a m m a - c a r b o x y g l u t a m i c a c i d d o m a i n . JBiol Chem 2 6 9 , 3 5 9 0 - 3 5 9 5 . Z h a n g , L., J a c o b s s o n , K., S t r o m , K., L i n d b e r g , M., a n d F r y k b e r g , L . ( 1 9 9 9 ) S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s e x p r e s s e s a c e l l s u r f a c e p r o t e i n t h a t b i n d s b o t h I g G a n d b e t a 2 - g l y c o p r o t e i n I. Microbiology 145, 177-183. Z h u , M., O l e e , T., L e , D.T., R o u b e y , R.A., H a h n , B.H., W o o d s , V . L . J . , a n d C h e n , P.P. ( 1 9 9 9 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f I g G m o n o c l o n a l a n t i - c a r d i o l i p i n / a n t i - b e t a 2 G P l a n t i b o d i e s f r o m t w o p a t i e n t s w i t h a n t i p h o s p h o l i p i d s y n d r o m e r e v e a l s t h r e e s p e c i e s o f a n t i b o d i e s . Br J Haematol 105, 102-109. Z i c c a r d i , R.J., D a h l b a c k , B., a n d M u l l e r - E b e r h a r d , H.J. ( 1 9 8 4 ) C h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e i n t e r a c t i o n o f h u m a n C 4 b - b i n d i n g p r o t e i n w i t h p h y s i o l o g i c a l l i g a n d s . JBiol Chem 2 5 9 , 1 3 6 7 4 - 1 3 6 7 9 . 178 APPENDIX A p p e n d i x F i g u r e 1. P u r i t y o f B 2 G P I , A P C , p r o t e i n S, C 4 B P , C 4 B P . B , a n d M B L . P r o t e i n s w e r e a n a l y z e d u s i n g S D S - P A G E a g a i n s t m o l e c u l a r w e i g h t s t a n d a r d s . A r r o w s i n d i c a t e t h e p o s i t i o n o f t h e c o r r e s p o n d i n g p r o t e i n s . I n t h e c a s e o f C 4 B P , t h e u p p e r a r r o w i n d i c a t e s t h e p o s i t i o n o f t h e a - c h a i n w h e r e a s the l o w e r a r r o w i n d i c a t e s t h e p o s i t i o n o f t h e B - c h a i n . 179 A p p e n d i x F i g u r e 2. E f f e c t s o f A P C I o d i n a t i o n o n A P C A c t i v i t y i n P S - C o a t e d W e l l s . P S - c o a t e d w e l l s w e r e i n c u b a t e d w i t h 0 t o 2 5 0 n g / m L o f 1 2 5 I - l a b e l e d A P C ( c l o s e d c i r c l e s ) o r u n l a b e l e d A P C ( o p e n c i r c l e s ) . T h e a c t i v i t y o f P S - b o u n d A P C w a s q u a n t i f i e d b y m e a s u r i n g t h e h y d r o l y s i s o f c h r o m o g e n i c s u b s t r a t e S - 2 3 6 6 (1 m M ) a f t e r 6 0 m i n u t e s o f i n c u b a t i o n at R T . 1 8 0 A p p e n d i x F i g u r e 3. D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t D e t e r m i n a t i o n f o r A P C - B 2 G P I I n t e r a c t i o n . M i c r o t i t e r w e l l s w e r e c o a t e d w i t h 1 0 0 p L o f 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d B 2 G P I ( 1 0 p g / m L ) i n T B S o v e r n i g h t at 4 ° C a n d b l o c k e d w i t h T B S - C a M . A f t e r w a s h i n g w i t h T B S - C a , 100 p L o f 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d A P C ( 1 0 p g / m L ) i n T B S - C a w e r e i n c u b a t e d at 3 7 ° C . T h e a m o u n t o f A P C w a s q u a n t i f i e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g ( t o p p a n e l ) . T h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r A P C - B 2 G P I i n t e r a c t i o n w a s d e t e r m i n e d b y i n c u b a t i n g 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d A P C ( 0 - 8 0 p g / m L ) i n w e l l s p r e v i o u s l y c o a t e d w i t h 1 0 0 p L I-trace l a b e l e d B 2 G P I ( 1 0 p g / m L ) f o r 4 h o u r s at 3 7 ° C . P r o t e i n s w e r e r e m o v e d a n d w e l l s w e r e w a s h e d w i t h i c e - c o l d T B S - C a f o u r t i m e s . T h e a m o u n t s o f p r o t e i n b o u n d w e r e m e a s u r e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g . B i n d i n g c o n s t a n t s w e r e d e t e r m i n e d b y n o n - l i n e a r c u r v e f i t t i n g ( b o t t o m p a n e l ) . 4000 -3500 -APC (M) 181 A p p e n d i x F i g u r e 4. D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t D e t e r m i n a t i o n f o r P r o t e i n C - B 2 G P I I n t e r a c t i o n . M i c r o t i t e r w e l l s w e r e c o a t e d w i t h 1 0 0 p L o f 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d B 2 G P I ( 1 0 p g / m L ) i n T B S o v e r n i g h t a t 4 ° C a n d b l o c k e d w i t h T B S - C a M . A f t e r w a s h i n g w i t h T B S - C a , 1 0 0 p L o f 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d p r o t e i n C ( 1 0 p g / m L ) i n T B S - C a w e r e i n c u b a t e d at 3 7 ° C . T h e a m o u n t o f p r o t e i n C w a s q u a n t i f i e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g ( t o p p a n e l ) . T h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r p r o t e i n C - B 2 G P I i n t e r a c t i o n w a s d e t e r m i n e d b y i n c u b a t i n g 1 2 5 I -t r a c e l a b e l e d p r o t e i n C (0 - 8 0 p g / m L ) i n w e l l s p r e v i o u s l y c o a t e d w i t h 1 0 0 p L l 2 5 I - t r a c e l a b e l e d B 2 G P I ( 1 0 p g / m L ) f o r 4 h o u r s at 3 7 ° C . P r o t e i n s w e r e r e m o v e d a n d w e l l s w e r e w a s h e d w i t h i c e - c o l d T B S - C a f o u r t i m e s . T h e a m o u n t s o f p r o t e i n b o u n d w e r e m e a s u r e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g . B i n d i n g c o n s t a n t s w e r e d e t e r m i n e d b y n o n - l i n e a r c u r v e f i t t i n g ( b o t t o m p a n e l ) . 3 5 0 0 n 2.0x10'' 4.0x10'' 6.0x10"' 8.0x10'' 1.0x10'" 1.2x10'* 1.4x10'' Protein C (M ) 182 A p p e n d i x F i g u r e 5. D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t D e t e r m i n a t i o n f o r P r o t e i n S -J32GPI I n t e r a c t i o n . M i c r o t i t e r w e l l s w e r e c o a t e d w i t h 1 0 0 p L o f l 2 5 I - t r a c e l a b e l e d 132GPI ( 1 0 p g / m L ) i n T B S o v e r n i g h t at 4 ° C a n d b l o c k e d w i t h T B S - C a M . A f t e r w a s h i n g w i t h T B S - C a , 1 0 0 p L o f 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d p r o t i n S ( 1 0 p g / m L ) i n T B S - C a w e r e i n c u b a t e d at 3 7 ° C . T h e a m o u n t o f p r o t e i n S w a s q u a n t i f i e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g ( t o p p a n e l ) . T h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r p r o t e i n S - B 2 G P I i n t e r a c t i o n w a s d e t e r m i n e d b y i n c u b a t i n g 1 2 5 I -t r a c e l a b e l e d p r o t e i n S ( 0 - 8 0 p g / m L ) i n w e l l s p r e v i o u s l y c o a t e d w i t h 1 0 0 p L 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d B 2 G P I ( 1 0 p g / m L ) f o r 4 h o u r s at 3 7 ° C . P r o t e i n s w e r e r e m o v e d a n d w e l l s w e r e w a s h e d w i t h i c e - c o l d T B S - C a f o u r t i m e s . T h e a m o u n t s o f p r o t e i n b o u n d w e r e m e a s u r e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g . B i n d i n g c o n s t a n t s w e r e d e t e r m i n e d b y n o n - l i n e a r c u r v e f i t t i n g ( b o t t o m p a n e l ) . 6000 i 2.0x10'7 4.0x10"7 6.0x10'7 8.0x10"7 1.0x10"6 1.2x10'8 P rotein S (M ) 183 A p p e n d i x F i g u r e 6. D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t D e t e r m i n a t i o n f o r C 4 B P - B 2 G P I I n t e r a c t i o n . M i c r o t i t e r w e l l s w e r e c o a t e d w i t h 1 0 0 p L o f 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d B 2 G P I ( 1 0 p g / m L ) i n T B S o v e r n i g h t at 4 ° C a n d b l o c k e d w i t h T B S - C a M . A f t e r w a s h i n g w i t h T B S - C a , 1 0 0 p L o f l 2 5 I - t r a c e l a b e l e d C 4 B P ( 1 0 p g / m L ) i n T B S - C a w e r e i n c u b a t e d at 3 7 ° C . T h e a m o u n t o f C 4 B P w a s q u a n t i f i e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g ( t o p p a n e l ) . T h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r C 4 B P - B 2 G P I i n t e r a c t i o n w a s d e t e r m i n e d b y i n c u b a t i n g 1 2 5 I -t r a c e l a b e l e d C 4 B P ( 0 - 8 0 0 p g / m L ) i n w e l l s p r e v i o u s l y c o a t e d w i t h 1 0 0 p L 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d B 2 G P I ( 1 0 p g / m L ) f o r 4 h o u r s at 3 7 ° C . P r o t e i n s w e r e r e m o v e d a n d w e l l s w e r e w a s h e d w i t h i c e - c o l d T B S - C a f o u r t i m e s . T h e a m o u n t s o f p r o t e i n b o u n d w e r e m e a s u r e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g . B i n d i n g c o n s t a n t s w e r e d e t e r m i n e d b y n o n - l i n e a r c u r v e f i t t i n g ( b o t t o m p a n e l ) . 7000 -i 6000 -? 5000 -Q. O 4000 -CL ta 3000 -2000 -1000 -0.7 -o -E 0.6 -o _E 0.5 -0. 0.4 -CM cfi 0.3 -Q. CQ •t 0.2 -O -0.1 -0.0 -4 100 200 300 Time (min) 400 ~i • 1 • 1 • r 1.0x10'7 2.0x10"7 3.0x10'7 4.0x10"7 5.0x10'7 6.0x10'7 7.0x10"7 C4BP (M) 184 A p p e n d i x F i g u r e 7. D i s s o c i a t i o n C o n s t a n t D e t e r m i n a t i o n f o r M B L - B 2 G P I I n t e r a c t i o n . M i c r o t i t e r w e l l s w e r e c o a t e d w i t h 100 p L o f 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d B 2 G P I ( 1 0 p g / m L ) i n T B S o v e r n i g h t at 4 ° C a n d b l o c k e d w i t h T B S - C a M . A f t e r w a s h i n g w i t h T B S - C a , 1 0 0 p L o f 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d M B L ( 1 0 p g / m L ) i n T B S - C a w e r e i n c u b a t e d at 3 7 ° C . T h e a m o u n t o f M B L w a s q u a n t i f i e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g ( t o p p a n e l ) . T h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t f o r M B L - B 2 G P I i n t e r a c t i o n w a s d e t e r m i n e d b y i n c u b a t i n g 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d M B L ( 0 - 8 0 p g / m L ) i n w e l l s p r e v i o u s l y c o a t e d w i t h 1 0 0 p L 1 2 5 I - t r a c e l a b e l e d B 2 G P I ( 1 0 p g / m L ) f o r 4 h o u r s at 3 7 ° C . P r o t e i n s w e r e r e m o v e d a n d w e l l s w e r e w a s h e d w i t h i c e - c o l d T B S - C a f o u r t i m e s . T h e a m o u n t s o f p r o t e i n b o u n d w e r e m e a s u r e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g . B i n d i n g c o n s t a n t s w e r e d e t e r m i n e d b y n o n - l i n e a r c u r v e f i t t i n g ( b o t t o m p a n e l ) . 2000 -i 1500 -E a u 1000 -_ i CQ E 500 -0 < 0.12 -, o 0.10 4 o Q. o C N C2 _ l CO 5 0.08 0.06 0.04 0.02 0.00 100 200 300 Time (min) 400 i — • — i — • — i — > — i — i — i — • — i — i — i — i — i 0 0 2.0x10* 4.0x10* 6.0x10* 8.0x10° 1.0x10'' 1.2x10"' 1.4x10"' 1.6x10"' 1.8x1 0"! M B L (M ) 185 A p p e n d i x F i g u r e 8. E f f e c t s o f I o d i n a t i o n o n A P C - , p r o t e i n C-, p r o t e i n S-, C 4 B P - , a n d M B L - B i n d i n g t o B 2 G P I . M i c r o t i t e r w e l l s w e r e c o a t e d w i t h 1 0 0 p L o f 132GPI ( 1 0 p g / m L ) i n T B S o v e r n i g h t at 4 ° C a n d b l o c k e d w i t h T B S - C a M . A f t e r w a s h i n g w i t h T B S - C a , 1 0 0 p L o f 1 2 5 I - l a b e l e d A P C (1.87 p g / m L ) , p r o t e i n C (3.60 p g / m L ) , p r o t e i n S (0.17 p g / m L ) , C 4 B P (22.1 p g / m L ) , o r M B L (21.2 p g / m L ) i n T B S - C a w e r e i n c u b a t e d f o r 4 h o u r s at 3 7 ° C . P r o t e i n s w e r e r e m o v e d a n d w e l l s w e r e w a s h e d w i t h i c e - c o l d T B S - C a f o u r t i m e s . T h e a m o u n t o f ( A ) 1 2 5 I - A P C , ( B ) 1 2 5 I - p r o t e i n C , ( C ) 1 2 5 I - p r o t e i n S, ( D ) 1 2 5 I - C 4 B P , o r ( E ) 1 2 5 I - M B L b i n d i n g w a s q u a n t i f i e d b y g a m m a - r a d i a t i o n c o u n t i n g a n d c o m p a r e d t o t h e e x p e c t e d a m o u n t o f b i n d i n g o f t h e u n l a b e l e d c o u n t e r p a r t c a l c u l a t e d u s i n g t h e e q u i l i b r i u m d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t a n d t h e m o l e c u l a r i t y o f t h e i n t e r a c t i o n . N o s t a t i s t i c a l s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s w e r e s e e n . 3.5E-13 3E-13 2.5E-13 2E-13 1.5E-13 1E-13 5E-14 0 B T J C 3 o - Q o C <u *J o Q . 1E-12 8E-13 6E-13 4E-13 2E-13 0 O b s e r v e d E x p e c t e d O b s e r v e d E x p e c t e d D 1.4E-13 -c 3 1.2E-13 -o 1E-13 -<n B 8E-14 a o 6E-14 a. *-o 4E-14 0 2E-14 E 0 4E-13 - i 3.5E-13 c • o 3E-13 -2.5E-13 Q. m 2E-13 -o 1.5E-13 -o o 1E-13 E 5E-14 0 O b s e r v e d E x p e c t e d O b s e rved E x p e c t e d 3E-13 •o 2.5E-13 c 3 ° 2E-13 ffl 1.5E-13 S o 1E-13 o E 5E-14 0 O b s e r v e d E x p e c t e d 186 

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